Aplicación de la detección ambiental del Circovirus Porcino Tipo 2 mediante el uso de la PCR cuantitativa en el estudio epidemiológico de la infección

TESIS DE DOCTORADO APLICACIÓN DE LA DETECCIÓN AMBIENTAL DEL CIRCOVIRUS PORCINO TIPO 2 MEDIANTE EL USO DE LA PCR CUANTITATIVA EN EL ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO DE LA INFECCIÓN Gonzalo López Lorenzo ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN MEDICINA Y SANIDAD VETERINARIA LUGO 2021 DECLARACIÓN DEL AUTOR/A DE LA TESIS D./Dña. Gonzalo López Lorenzo Título de la tesis: Aplicación de la detección ambiental del Circovirus Porcino Tipo 2 mediante el uso de la PCR cuantitativa en el estudio epidemiológico de la infección Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Lugo, 22 de Julio de 2021. Firma electrónica AUTORIZACIÓN DE LOS DIRECTORES DE LA TESIS Aplicación de la detección ambiental del Circovirus Porcino Tipo 2 mediante el uso de la PCR cuantitativa en el estudio epidemiológico de la infección D. Gonzalo Fernández Rodríguez D. José Manuel Díaz Cao INFORMAN: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D. Gonzalo López Lorenzo bajo nuestra dirección, y a utorizamos su presentación , considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como directores de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declaramos también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Tesis monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Lugo, 22 de Julio de 2021 Fdo. Gonzalo Fernández Rodríguez Fdo. José Manuel Díaz Cao DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES El doctorando declara no tener ningún conflicto de interés en relación a la presente Tesis Doctoral. En Lugo, a 22 de Julio de 2021 Fdo. Gonzalo López Lorenzo FINANCIACIÓN Este trabajo se ha realizado gracias a la concesión de los siguientes proyectos de investigación:  European PCV2 Award 2016. Boehringer Ingelheim Animal Health. Ingelheim, Alemania.  Ayuda para consolidación y estructuración de unidades de investigación competitivas del Sistema Universitario de Galicia (GR2015/003). Consellería de Educación e Ordenación Universitaria. Xunta de Galicia. Investigador principal: Pablo Díez Baños.  V Premio Laboratorios Ovejero de la Real Academia de Ciencias Veterinarias por el trabajo de investigación: “Distribución ambiental de PCV2 en granjas con infección subclínica”. Concedido a Gonzalo López Lorenzo. La diferencia entre tratar enfermedades y hacer frente a infecciones. AGRADECIMIENTOS Es bien sabido que una Tesis Doctoral no es solamente fruto del trabajo individual. Como tal, en este documento también están el esfuerzo y el buen hacer de todas las personas que a lo largo de estos años me han permitido realizar este trabajo que tanto me ha aportado a nivel profesional y, sobre todo, personal. Por esto todo quiero expresar mi agradecimiento en primer lugar mis dos directores de Tesis. Al Dr. Gonzalo Fernández Rodríguez por haber confiado en mí para realizar este trabajo, especialmente después de mi condición de que mi Tesis Doctoral tenía que estar directamente relacionada con el sector porcino; debo destacar la libertad que me ha proporcionado en todo momento, y sobre todo su ayuda, aportaciones, apoyo y motivación para llevar a cabo esta Tesis Doctoral y mejorar durante estos años. Al Dr. José Manuel Díaz Cao por todas las horas que me ha dedicado a pesar de estar gran parte de este tiempo a distancias de cientos y miles de kilómetros, por su inestimable ayuda con el tratamiento de datos y, sobre todo, por los provechosos momentos de tertulia para recargar energías cuando compartimos despacho. En segundo lugar quiero mencionar a unas personas que han marcado el devenir de esta Tesis Doctoral y, en cierto, modo mi trayectoria profesional: Dr. Maurice Pensaert, Dr. François Madec, Dr. Paolo Martelli, Dr. Poul Baekbo y Dr. Mathias Ritzmann. Gracias por considerar que la propuesta de esta Tesis Doctoral era una de las mejores de Europa y que así consiguiésemos la financiación para llevarla a cabo (European PCV2 Award). Además, dicha mención me permitió representar a la Facultad de Veterinaria de Lugo en un evento con las consideradas mejores facultades y escuelas de veterinaria del continente. Gracias por permitirme vivir esa experiencia. Relacionado con lo anterior, quiero agradecer a Víctor Rodríguez que, aun siendo un estudiante de 5º de Veterinaria, me informase de la existencia de esa posible fuente de financiación que, unos años después nos permitió conseguir la ayuda necesaria. Además, gracias por los ánimos durante estos años. En este punto quiero agradecer a todos los compañeros del equipo de investigación su ayuda y sobre todo el conocimiento y las ganas de aprender que me han transmitido desde que los he conocido. Al Dr. Pablo Díez Baños y a la Dra. Patrocinio Morrondo por contribuir en mi formación con su experiencia y demostrarme que incluso con una larga trayectoria se puede seguir con la curiosidad de los primeros días. A la Dra. Rosario Panadero, al Dr. Ceferino López y al Dr. Pablo Díaz por su disposición para atenderme, ayudarme y orientarme todas las veces que lo he precisado durante este tiempo. A la Dra. Ana Pérez, a la Dra. Eva Cabanelas, a la Dra. Susana Remesar, a David García y a Néstor Martínez por esos momentos de relax y desconexión que aportan cada vez que hablamos, ya sea tomando un café o en una breve visita al despacho/laboratorio. No obstante, de todos los compañeros quiero agradecer de un modo especial al Dr. Alberto Prieto y a Cynthia López. A Alberto le debo toda la formación que tengo para trabajar en un laboratorio de biología molecular, su disposición para echarme una mano desde el primer momento que llegué y sobre todo su cercanía y amistad durante estos años. A Cynthia por su disposición para acompañarme siempre en todos los “marrones que atraigo” a pesar de su tendencia a “ahogarse en un cubito de hielo” y, como no, por su paciencia con mi “shakesperiano”. Tampoco quiero olvidarme de la Dra. Maribel Quiroga, la Dra. Ana Losada y de Sandra Maceiras por dedicarme parte de su tiempo y ayudarme con el procesado y la interpretación de la histopatología. Por otro lado, quiero agradecer a todos los veterinarios y ganaderos del sector porcino por su disposición para atenderme y sobre todo por su colaboración para poder llevar a cabo este trabajo. De un modo especial, por la extensa y desinteresada ayuda y los conocimientos que me han aportado, quiero mencionar en este documento a Raquel Fernández, Elena Vázquez, Javier Padín, Silvia García, Xulia Gómez, María Castro, Jesús Pereira, Albano Longo, Martín Rodríguez, Paco Guinarte, Abelardo López, Juan Carlos Vecino, Mar Lara, José Manuel García, Ledicia Ferro, Marcial Marcos, Antonio Palomo, Manuel Martínez, Aníbal Vázquez, Daniel Souto, María Reborido, Julián Varela y a los hermanos Jesús y Juan López. También quiero incluir en estos agradecimientos a los demás doctorandos y postdocs de esta Facultad por compartir esta experiencia con ellos: Almudena, Andrea, Celia, Irene, Isa, Isidro, Luz, María, Mario, Pablo, Pedro, Saskia, Silvia y Vanesa. Finalmente quiero agradecer todo a mi familia, a los que están y a los que ya no están, por haberlo dado todo por mí, por todo lo que me han enseñado a lo largo de estos años y por permitirme realizar este trabajo, disfrutar conmigo de las experiencias tan buenas que esta Tesis Doctoral me ha permitido vivir y también por estar en los momentos que uno necesita ánimos y apoyo. Desde luego tengo que dejar claro de no ser por ellos y en muchísimos casos por lo que siempre seré, “el hijo de Óscar”, nunca hubiera llegado hasta aquí ni hubiera tenido la atención y ayuda de la mayor parte de las personas que he mencionado previamente. Espero que algún día os pueda devolver al menos la mitad de todo lo que habéis dado. ÍNDICE 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 1 1.1 El sector porcino en España ............................................................................ 3 1.1.1 Importancia del sector porcino en España ............................................. 3 1.1.2 Proceso productivo del ganado porcino .................................................. 4 1.1.3 Orientación productiva de las explotaciones de porcino ........................ 6 1.2 Etiología del PCV2 .......................................................................................... 7 1.2.1 Descripción y evolución histórica de los circovirus porcinos ................. 7 1.2.2 Organización del genoma ........................................................................ 9 1.2.3 Genotipos ................................................................................................. 9 1.2.4 Resistencia ............................................................................................ 10 1.3 Epidemiología del PCV2................................................................................ 12 1.3.1 Hospedadores del PCV2 ........................................................................ 12 1.3.2 Distribución geográfica de la infección por PCV2 ................................ 12 1.3.3 Dinámica de la infección ....................................................................... 13 1.3.3.1 Dinámica característica de la infección por PCV2 ....................... 13 1.3.3.2 Dinámica reciente de la infección por PCV2 ................................ 15 1.3.4 Transmisión del PCV2 .......................................................................... 17 1.3.4.1 Transmisión horizontal ................................................................. 18 1.3.4.2 Transmisión vertical ..................................................................... 19 1.3.5 Factores que favorecen el desarrollo de las enfermedades asociadas a la infección por PCV2 ......................................................................................... 19 1.3.5.1 Factores relacionados con el virus ................................................ 20 1.3.5.2 Factores relacionados con el hospedador ...................................... 20 1.3.5.3 Coinfecciones con otros patógenos ................................................ 21 1.3.5.4 Factores relacionados con el manejo y bioseguridad ................... 22 1.3.5.5 Modulación del sistema inmune ................................................... 23 1.4 Patogenia de la infección por PCV2 .............................................................. 24 1.4.1 Células y tejidos diana del PCV2 ......................................................... 24 1.4.1.1 Embriones y fetos .......................................................................... 24 1.4.1.2 Lechones y cerdos .......................................................................... 25 1.4.2 Replicación del PCV2 ............................................................................ 25 1.4.3 Inmunosupresión debida a la infección por PCV2 ............................... 26 1.4.4 Infección por PCV2 y respuesta inmune del organismo ...................... 26 1.4.4.1 Viremia .......................................................................................... 26 1.4.4.2 Respuesta inmune humoral a la infección por PCV2................... 27 1.4.4.3 Respuesta inmune celular a la infección por PCV2 ..................... 28 1.4.4.4 Patogenia del Síndrome de Dermatitis y Nefropatía Porcina ..... 29 1.5 Signos clínicos y lesiones asociadas a la infección por PCV2....................... 29 1.5.1 Enfermedades asociadas a la infección por PCV2 ............................... 29 1.5.2 Infección subclínica por PCV2 (PCV2-SI) ............................................ 31 1.5.3 Enfermedad Sistémica por PCV2 (PCV2-SD) ...................................... 31 1.5.4 Enfermedad Reproductiva por PCV2 (PCV2-RD) ................................ 35 1.5.5 Síndrome de Dermatitis y Nefropatía porcina (PDNS) ....................... 36 1.6 Diagnóstico de las infecciones por PCV2 ...................................................... 38 1.6.1 Muestras utilizadas en el diagnóstico de la infección por PCV2 ......... 38 1.6.1.1 Órganos y tejidos ........................................................................... 38 1.6.1.2 Sangre / suero ................................................................................ 38 1.6.1.3 Fluidos orales ................................................................................ 38 1.6.1.4 Ambientales ................................................................................... 39 1.6.1.5 Hisopos nasales, rectales, heces y leche/calostro ......................... 39 1.6.2 Técnicas de diagnóstico disponibles ..................................................... 39 1.6.2.1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ................................ 39 1.6.2.2 Inmunohistoquímica (IHC) ........................................................... 40 1.6.2.3 Hibridación in situ (ISH) .............................................................. 41 1.6.2.4 Aislamiento vírico ......................................................................... 41 1.6.2.5 Inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA) ................................ 41 1.6.2.6 Neutralización viral ...................................................................... 41 1.6.2.7 Inmunoperoxidasa en monocapa (IPMA) ..................................... 41 1.6.2.8 Inmunoadsorción ligada a enzimas de puntos (ELISPOT) .......... 42 1.6.3 Criterios para el diagnóstico de las enfermedades asociadas a PCV2 42 1.6.3.1 Infección subclínica por PCV2 (PCV2-SI) ..................................... 42 1.6.3.2 Enfermedad sistémica por PCV2 (PCV2-SD) ............................... 42 1.6.3.3 Enfermedad reproductiva por PCV2 (PCV2-RD) ......................... 43 1.6.3.4 Síndrome de Dermatitis y Nefropatía porcina (PDNS) ............... 43 1.7 Prevención y control de la infección por PCV2 ............................................. 44 1.7.1 Tratamiento .......................................................................................... 44 1.7.2 Medidas de prevención distintas a la vacunación ................................ 44 1.7.2.1 Los 20 puntos de Madec ................................................................ 44 1.7.2.2 Genética de los cerdos ................................................................... 46 1.7.2.3 Control de las coinfecciones .......................................................... 46 1.7.2.4 Modulación del sistema inmune ................................................... 46 1.7.2.5 Otras medidas ............................................................................... 47 1.7.3 Vacunación frente a PCV2 .................................................................... 47 1.7.3.1 Tipos de vacunas disponibles ........................................................ 47 1.7.3.2 Defensa inmune tras la vacunación ............................................. 49 1.7.3.3 Protocolos vacunales frente a PCV2 ............................................. 51 1.7.3.3.1 Cerdas reproductoras y nulíparas ......................................... 51 1.7.3.3.2 Lechones ................................................................................. 53 1.7.3.3.3 Cerdas y lechones ................................................................... 54 1.7.3.3.4 Verracos .................................................................................. 55 1.8 Detección ambiental de patógenos en producción de porcino ...................... 55 1.8.1 Tipos de muestras ambientales ............................................................ 56 1.8.1.1 Superficies ..................................................................................... 56 1.8.1.2 Aire ................................................................................................ 57 1.8.2 Aplicaciones de las muestras ambientales en producción porcina ...... 58 1.8.2.1 Estudio de la epidemiología de enfermedades ............................. 59 1.8.2.2 Herramienta para la vigilancia de infecciones ............................. 60 1.8.2.3 Evaluación de las medidas de bioseguridad ................................. 62 1.8.2.4 Evaluación de la eficacia las medidas de limpieza y desinfección (L+D) ......................................................................................................... 63 2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 65 3. ESTUDIO I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino .................................................................................................................. 69 3.1 Introducción y Objetivos ............................................................................... 71 3.2 Materiales y Métodos .................................................................................... 73 3.2.1 Condiciones, selección y clasificación de las granjas del estudio ........ 73 3.2.2 Toma de muestras ambientales ............................................................ 76 3.2.2.1 Protocolo de toma de muestras ambientales ................................ 76 3.2.2.2 Clasificación de las muestras ambientales .................................. 78 3.2.3 Análisis laboratorial de las muestras ................................................... 79 3.2.3.1 Muestras de órganos ..................................................................... 79 3.2.3.2 Muestras de sangre ....................................................................... 81 3.2.3.3 Muestras ambientales ................................................................... 81 3.2.3.4 PCR cuantitativa para PCV2 ........................................................ 84 3.2.3.4.1 Construcción de la recta de cuantificación de la qPCR ......... 85 3.2.3.4.2 Cálculo de la cantidad de PCV2 en cada tipo de muestra .... 86 3.2.4 Análisis estadístico ............................................................................... 87 3.3 Resultados y Discusión ................................................................................. 90 3.3.1 Características de las granjas seleccionadas ....................................... 90 3.3.2 Rectas de cuantificación de la qPCR de PCV2 ..................................... 92 3.3.3 Presencia de la infección por PCV2 en las granjas .............................. 93 3.3.3.1 Granjas sin vacunación frente a PCV2 ......................................... 93 3.3.3.2 Granjas con vacunación frente a PCV2 ........................................ 97 3.3.4 Detección del PCV2 en el ambiente de las granjas .............................. 97 3.3.4.1 Sin vacunación frente a PCV2 ...................................................... 97 3.3.4.2 Con vacunación frente a PCV2 ..................................................... 99 3.3.5 Descripción de los resultados de detección del PCV2 en muestras ambientales en las distintas enfermedades asociadas a PCV2 .................. 102 3.3.5.1 Sin vacunación frente a PCV2 (PCV2–SD / PCV2–SI) .............. 102 3.3.5.2 Con vacunación de lechones frente a PCV2 ............................... 115 3.3.6 Comparación de la contaminación ambiental por PCV2 entre las distintas situaciones sanitarias respecto a la infección .............................. 123 3.3.6.1 Comparación general de los resultados obtenidos ..................... 123 3.3.6.2 Comparación de la contaminación ambiental por PCV2 en los distintos tipos de muestras y categorías ambientales. ............................... 125 4. ESTUDIO II: Monitorización de la infección por PCV2 utilizando muestras de aire y de superficies ........................................................................................................ 135 4.1 Introducción y Objetivos ............................................................................. 137 4.2 Materiales y Métodos .................................................................................. 139 4.2.1 Descripción de las granjas ............................................................... 139 4.2.1.1 Confirmación de la infección por PCV2 en las explotaciones de cebo integradas con la granja de producción .................................................. 139 4.2.1.2 Descripción de las explotaciones de cebo incluidas en el estudio ..................................................................................................... 140 4.2.2 Monitorización de la infección por PCV2 ........................................... 140 4.2.2.1 Diseño del estudio ....................................................................... 140 4.2.2.2 Toma de muestras para monitorizar la viremia de PCV2 ......... 141 4.2.2.3 Toma de muestras para monitorizar la cantidad de PCV2 en el aire ........................................................................................................... 142 4.2.2.4 Toma de muestras para monitorizar la cantidad de PCV2 en las superficies ............................................................................................... 143 4.2.3 Análisis laboratorial ........................................................................... 144 4.2.3.1 Muestras de órganos ................................................................... 144 4.2.3.2 Muestras de sangre ..................................................................... 144 4.2.3.3 Muestras de aire.......................................................................... 144 4.2.3.4 Muestras de superficies .............................................................. 144 4.2.3.5 PCR cuantitativa para PCV2 ...................................................... 144 4.2.4 Análisis de datos ................................................................................. 146 4.2.4.1 Estimación de la prevalencia de PCV2 ....................................... 146 4.2.4.2 Análisis estadístico...................................................................... 146 4.3 Resultados ................................................................................................... 148 4.3.1. Rectas de cuantificación de la qPCR de PCV2 .................................. 148 4.3.2 Confirmación de la infección por PCV2 en las bandas previas al estudio .......................................................................................................... 148 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Evolución del sector porcino en España durante los últimos años. .............. 3 Figura 2. Evolución del sacrificio de cerdos en España y sus exportaciones ............... 4 Figura 3. Esquema de distintos tipos de producción porcina en fases ......................... 4 Figura 4. Diagrama de la producción porcina intensiva. .............................................. 5 Figura 5. ORF en el PCV2 ............................................................................................. 9 Figura 6. Eficacia in vitro de algunos desinfectantes frente a PCV2 ......................... 11 Figura 7. Países en los que se ha detectado la infección por PCV2 ............................. 13 Figura 8. Ejemplo de la dinámica de infección por PCV2 en una granja de cerdos sin vacunar. ......................................................................................................................... 14 Figura 9. Ejemplo de la dinámica de infección por PCV2 en una población de cerdos vacunados ...................................................................................................................... 15 Figura 10. Esquema de posibles situaciones en la dinámica actual de la infección por PCV2 en granjas que incluyen al PCV2 en el programa vacunal de los lechones. ..... 16 Figura 11. Fluidos en los que se puede excretar PCV2 y cantidad aproximada en cerdos no vacunados. ..................................................................................................... 17 Figura 12. Modelo de la progresión de la infección por PCV2 .................................... 26 Figura 13. Evolución de la viremia y la respuesta inmune humoral tras la infección por PCV2 ....................................................................................................................... 27 Figura 14. Cerdo afectado por PCV2-SD comparado con un cerdo sano. ................... 32 Figura 15. Depleción linfoide e inflamación granulomatosa en un ganglio linfático de un cerdo con PCV2-SD. ................................................................................................. 33 Figura 16. Neumonía intersticial por PCV2 ............................................................... 33 Figura 17. Cerdo afectado por el PDNS. ..................................................................... 37 Figura 18. Resultados de una qPCR tras una amplificación con cantidad seriada de ADN. .............................................................................................................................. 40 Figura 19. Respuesta de anticuerpos neutralizantes de cada vacuna tras su administración y posterior desafío con PCV2............................................................... 50 Figura 20. Respuesta de la producción de células secretoras de IFN-γ de cada vacuna tras su administración y posterior desafío con PCV2 .................................................. 51 Figura 21. Posibles planteamientos y pautas vacunales frente a PCV2 para las cerdas reproductoras. ............................................................................................................... 52 Figura 22. Ganancia media diaria de lechones vacunados frente a PCV2. ............... 54 Figura 23. Esquema de un colector Andersen. ............................................................ 57 Figura 24. Esquema de un AGI y un colector líquido ciclónico .................................. 57 Figura 25. Esquema de colector de filtrado. ................................................................ 58 Figura 26. Visitas realizadas a las granjas con y sin vacunación frente a PCV2 y tareas realizadas en cada una. ................................................................................................. 74 Figura 27. Dilución seriada para elaborar la recta de cuantificación de la qPCR para PCV2 .............................................................................................................................. 86 Figura 28. Rectas de cuantificación utilizadas para calcular el número de copias de PCV2 en cada muestra. ................................................................................................. 92 Figura 29. Granja E Bazo 3. Tinción H-E 4x. ............................................................ 95 Figura 30. Granja E Pulmón 3. Tinción H-E 4x. ........................................................ 95 Figura 31. Granja E Ganglio linfático Inguinal 3. Tinción H-E 4x. .......................... 96 Figura 32. Granja E Bazo 3. Tinción H-E 40x. .......................................................... 96 Figura 33. Granja E Pulmón 3. Tinción H-E 40x.. ..................................................... 96 Figura 34. Distribución del logaritmo decimal del número de copias de PCV2 en las muestras positivas en cada granja sin vacunar. .......................................................... 98 Figura 35. Distribución del logaritmo decimal del número de copias de PCV2 en las muestras positivas de cada granja que vacunaba a los lechones. ............................. 101 Figura 36. Distribución del logaritmo decimal del número de copias de PCV2 en las muestras positivas de cada categoría en la granja con PCV2-SD. ............................ 104 Figura 37. Distribución del logaritmo decimal del número de copias de PCV2 en las muestras positivas en cada categoría en las granjas con PCV2-SI. .......................... 108 Figura 38. Distribución del logaritmo decimal del número de copias de PCV2 en las muestras positivas de cada categoría en las granjas PCV2-VAC.. ............................ 119 Figura 39. Distribución del número de copias de PCV2 en las muestras positivas en cada situación sanitaria respecto a la infección por PCV2.. ...................................... 125 Figura 40. Distribución del logaritmo decimal del número de copias de PCV2 en las muestras positivas de cada categoría en cada estatus sanitario respecto a PCV2. .. 129 Figura 41. Porcentaje que representa cada categoría sobre el total de muestras positivas en cada situación sanitaria de la infección. ................................................ 129 Figura 42. Representación esquemática de los cebaderos incluidos en el estudio. . 140 Figura 43. Esquema en el que se representa el origen y el tiempo entre las bandas de cebo incluidas en el estudio. ........................................................................................ 141 Figura 44. Colector y filtros utilizados para la toma de muestras de aire. .............. 142 Figura 45. Signos clínicos compatibles con PCV2 en las bandas de producción previas al estudio ..................................................................................................................... 148 Figura 46. Bazo Cerdo 1. Tinción H-E 10x. ............................................................... 149 Figura 47. Ganglio linfático inguinal Cerdo 1. Tinción H-E 10x. ............................. 149 Figura 48. Pulmón Cerdo 1. Tinción H-E 10x. .......................................................... 149 Figura 49. Bazo Cerdo 2. Tinción H-E 10x. ............................................................... 150 Figura 50. Ganglio linfático inguinal Cerdo 2. Tinción H-E 10x. ............................. 150 Figura 51. Pulmón Cerdo 2. Tinción H-E 10x.. ......................................................... 150 Figura 52. Evolución del Log10 del promedio de copias de PCV2+1 en los Grupos A (Control), B y C. ........................................................................................................... 153 Figura 53. Correlación entre la viremia de PCV2 en la población y la cantidad de PCV2 en aire (A) y en superficies (B). ................................................................................... 160 Figura 54. Modelo de la indumentaria vestida por cada miembro de los equipos ... 174 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Revisión Bibliográfica 3 1.1 El sector porcino en España 1.1.1 Importancia del sector porcino en España Desde el año 2015 España es el tercer país del mundo con mayor censo de ganado porcino (tras China y Estados Unidos), manteniendo desde ese año una tendencia creciente en número de cerdos (Figura 1.A). Este incremento se observa en todas las categorías de cerdos, aunque especialmente en lechones y cebo, ligado al incremento de la prolificidad de las cerdas reproductoras. Paradójicamente, el número de granjas de porcino ha disminuido, situación que ocurre debido al descenso en el número de explotaciones más pequeñas; en cambio, las granjas de mayor capacidad han incrementado su número de forma progresiva. Hay menos granjas, pero con más cerdos (Figura 1.B) (Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2020). Figura 1. Evolución del sector porcino en España durante los últimos años. A. Censo de cerdos. B. Número de granjas de porcino por categoría productiva. Fuente: Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación, 2020. Estos niveles productivos y estructurales hacen que en España la producción de porcino representase durante el año 2019 el 42 % de la producción final ganadera y el 16,20 % de la producción final agraria (Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2020). Paralelamente al incremento del censo, el número de cerdos sacrificados y de producción de carne han aumentado. Los datos del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación muestran que se sacrifican más cerdos, y con mayor peso en canal (Figura 2.A). Teniendo en cuenta que el consumo de carne de cerdo en España se ha mantenido estable durante la última década (consumo per cápita mínimo en 2012, 49,70 kg, y máximo en 2018, 56,60 kg), el incremento de producción y de sacrificio conllevó que en el año 2019 se alcanzase un abastecimiento del 188 %. De esta forma, actualmente casi la mitad de la producción del sector porcino español se destina a la GONZALO LÓPEZ LORENZO 4 exportación, con una tendencia creciente (Figura 2.B), siendo sus principales destinos China, Francia, Italia, Portugal, Japón, Polonia y Filipinas (Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación, 2020). Figura 2. Evolución del sacrificio de cerdos en España y sus exportaciones. A. Número de cerdos sacrificados y del peso en canal. B. Exportaciones de carne de cerdo. Fuente: Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2020. 1.1.2 Proceso productivo del ganado porcino El proceso de producción del ganado porcino, de forma muy resumida, consta del ciclo de las cerdas reproductoras (o fase I) y las etapas de post-destete o transición (o fase II) y cebo (o fase III) (Ciria y Asenjo, 1999). Estas tres fases pueden estar localizadas en un mismo sitio, o cada una en un sitio diferente. No obstante, actualmente la situación más habitual es la producción en dos fases, estando en una granja las cerdas reproductoras y la transición de los lechones, realizando el cebo en un sitio distinto (Figura 3). En el caso de producciones en 2 y 3 fases, lo más habitual es trabajar en un régimen de integración, es decir, una granja de origen produce lechones que siempre realizan las fases de transición y/o cebo en las mismas granjas. Figura 3. Esquema de distintos tipos de producción porcina en fases. Bordes de distintos colores indican localizaciones geográficas distintas. Revisión Bibliográfica 5 El ciclo de las cerdas reproductoras incluye la cubrición (aproximadamente 5-10 días tras el destete), la gestación (115 días) y el parto-lactación (21-28 días). En los sistemas de producción intensiva, normalmente cuando los lechones tienen entre 21 y 28 días de vida se destetan y se trasladan a las dependencias de transición. En éstas permanecen hasta que tienen entre 8 y 10 semanas de edad, cuando se trasladan a las dependencias donde se realiza la fase de cebo o engorde. Cuando esos lechones se destetan, las cerdas reproductoras correspondientes a esas camadas se trasladan a una zona donde en los días posteriores se inseminan y comienzan otro ciclo reproductivo (Figura 4). Figura 4. Diagrama de la producción porcina intensiva. Las flechas azules indican el movimiento de las cerdas reproductoras; las flechas verdes el de los lechones y cerdos de cebo. Esta producción en fases tiene como objetivo facilitar el manejo de las granjas y al mismo tiempo reducir la transmisión de enfermedades, mejorando así la productividad y los rendimientos. De esta forma, cada fase productiva se aloja exclusivamente en unas salas o dependencias, garantizando así una barrera física con los demás cerdos de la granja. Además, el manejo de la mayor parte de estas salas se realiza en lo denominado “todo dentro – todo fuera”, es decir, en cada sala solo hay un lote o banda de cerdos, los cuales entran y salen de esa dependencia al mismo tiempo (Buxadé et al ., 2007). En general, en la mayoría de las granjas de porcino hay al menos las siguientes dependencias:  Salas de gestación: se localizan las cerdas gestantes y las que están en espera de cubrición (se incluyen las cerdas en post destete y antes de la cubrición). GONZALO LÓPEZ LORENZO 12 1.3 Epidemiología del PCV2 1.3.1 Hospedadores del PCV2 El PCV2 es un virus que presenta una elevada especificidad de hospedador, siendo los cerdos, los jabalíes y los pecaríes sus hospedadores, aunque sólo los dos primeros pueden desarrollar alguna enfermedad asociada a la infección (Segalés y Domingo, 2002; Schulze et al ., 2004; de Castro et al ., 2014). Los humanos, el ganado vacuno, el ovino, el caprino, el equino y el cunícola no son susceptibles (Allan et al ., 2000; Ellis et al ., 2000a; Ellis et al ., 2001; Quintana et al ., 2002). No obstante, se debe mencionar que en condiciones experimentales se ha logrado infectar a terneros que acabaron desarrollando viremia de PCV2 y lesiones en los órganos linfoides (Halami et al ., 2014). Recientemente también se ha detectado ADN de PCV2 en órganos de animales de peletería (Song et al ., 2019); no obstante, todavía no se han realizado estudios que detectasen viremia ni respuesta inmunitaria en los mismos. Así, se cree que el virus hallado en esos animales pudo proceder de la alimentación con productos de origen porcino que contenían PCV2 (Zhai et al ., 2019). Los roedores merecen una mención aparte porque, en condiciones experimentales, se han infectado e incluso se ha llegado a transmitir la infección entre ratones. No obstante, no hay un consenso en cuanto a esta información, ya que otros estudios mostraron resultados opuestos (Quintana et al ., 2002; Csagola et al ., 2008; Opriessnig et al ., 2009a). En condiciones de campo se ha detectado ADN de PCV2 en muestras de roedores presentes en granjas de cerdos, no así en los capturados en los alrededores, aunque nunca se ha demostrado que puedan transmitir PCV2 a los cerdos (Lörincz et al ., 2010; Pinheiro et al ., 2013; Zhai et al ., 2016). También se ha detectado ADN de PCV2 en moscas de granjas de cerdos, las cuales se sabe que no son susceptibles de infectarse pero sí pueden portar el virus (Blunt et al ., 2011). 1.3.2 Distribución geográfica de la infección por PCV2 Se considera que el PCV2 tiene una distribución global, siendo un virus ubicuo presente en prácticamente todas las granjas de cerdos (Figura 7) (Segalés et al ., 2005a; Gillespie et al ., 2009; Grau-Roma et al ., 2011; Afolabi et al ., 2017; Barman et al ., 2018; Oba et al ., 2020). Esta distribución mundial se debe a la intensificación de la producción porcina y al comercio internacional de cerdos, los cuales en caso de estar infectados contribuyeron a diseminar el patógeno (Schmoll et al ., 2008; Vidigal et al ., 2012). El movimiento de cerdas de determinadas líneas genéticas para los centros de producción de porcino, los cuales son la base del tejido productivo, se considera el Revisión Bibliográfica 13 principal motivo de la rápida expansión del PCV2 y de los cambios en sus genotipos predominantes cada cierto tiempo. Figura 7. Países en los que se ha detectado la infección por PCV2 (en verde). 1.3.3 Dinámica de la infección Tradicionalmente, la Enfermedad Sistémica por PCV2 (PCV2-SD) se ha utilizado como modelo para el estudio de la dinámica de los diferentes procesos asociados al PCV2, ya que ha sido la principal enfermedad causada por este patógeno (Larochelle et al ., 2003; Sibila et al ., 2004). 1.3.3.1 Dinámica característica de la infección por PCV2 En granjas con cerdos no vacunados lo más habitual es que la infección ocurra a partir de las 8 – 10 semanas de vida de los animales, coincidiendo aproximadamente con el final de la fase de transición (Rose et al ., 2012). A edades más tempranas, la cantidad de anticuerpos maternales es más elevada, motivo por el cual los lechones no son susceptibles (Mckeown et al ., 2005; Dvorak et al ., 2018). No obstante, a partir de las 8 – 10 semanas de edad, la protección conferida por los anticuerpos maternales se vuelve insuficiente para evitar la infección (Rodríguez-Arrioja et al ., 2002; Opriessnig et al ., 2004a). Los primeros cerdos infectados contagian la infección de forma exponencial entre sus compañeros. Esto, unido a una viremia persistente (en torno a 70 días), hace que a nivel de granja el pico de infección se observe entre el final de transición y la primera mitad de la fase de cebo, decayendo gradualmente a partir de ese momento (Figura 8) (Shibata et al ., 2003; Rose et al ., 2012). Además, el manejo intensivo y la facilidad de GONZALO LÓPEZ LORENZO 14 transmisión de este virus hacen que al finalizar la etapa de cebo prácticamente el 100 % de los animales se hayan infectado (Puvanendiran et al ., 2011). Figura 8. Ejemplo de la dinámica de infección por PCV2 en una granja de cerdos sin vacunar. Adaptado de Fraile et al. (2012a). El pico de infección coincide con la edad en la que se ha descrito la PCV2-SD. Cuando la infección por PCV2 provoca PCV2-SD, la morbilidad de ésta puede oscilar entre el 4 y el 30 %, dependiendo de la granja y de la banda de producción, con una letalidad de un 70 – 80 % (Madec et al ., 2000; Segalés y Domingo, 2002). En estos casos, la viremia de PCV2 es mayor que en los casos donde la infección cursa de forma asintomática (Larochelle et al ., 2003; Brunborg et al ., 2004; Grau-Roma et al ., 2009). No obstante, debido a la naturaleza multifactorial de los casos de enfermedad (necesidad de coinfecciones, razas presentes, prácticas de manejo…) no se ha podido establecer un valor umbral de viremia. Asimismo, en granjas con casos de PCV2-SD, la proporción de cerdos infectados es mayor (Sibila et al ., 2004). Además, también se ha descrito que en estas situaciones es habitual los lechones se infecten a una edad más temprana, en torno a las 7 semanas de vida (Rose et al ., 2003). No obstante, a pesar de estas ligeras diferencias, la dinámica de la infección y de su respuesta serológica es prácticamente igual en los casos asintomáticos y con enfermedad (Larochelle et al ., 2003; Grau-Roma et al ., 2009). En el caso de las cerdas reproductoras la información es contradictoria. En trabajos realizados en España antes del uso de vacunas frente a PCV2, se indica que el porcentaje de cerdas con viremia es inferior al 10 % (Rodríguez-Arrioja et al ., 2002; Calsamiglia et al ., 2007). No obstante, en estudios llevados a cabo en Estados Unidos se indica que en algunas granjas el porcentaje de cerdas infectadas puede oscilar entre el 30 y el 100 % (Shen et al ., 2010; Dvorak et al ., 2013). Posiblemente en esta diferencia influyen las condiciones productivas de cada país, por ejemplo, granjas con un gran número de cerdas reproductoras en EE.UU. y más pequeñas en España. Revisión Bibliográfica 15 La dinámica de la infección por PCV2 se puede alterar si las cerdas reproductoras se infectan en el periparto. En estas situaciones es posible una excreción de PCV2 a través de la leche y por tanto la inmunidad maternal de sus lechones es menos duradera, al infectarse más tempranamente (Gerber et al ., 2011). En cualquier caso, en condiciones naturales la gran mayoría de cerdas son seropositivas a PCV2 (Rodríguez-Arrioja et al ., 2002; Shen et al ., 2010; Dvorak et al ., 2013; Oliver-Ferrando et al ., 2018a) y, salvo casos puntuales, se considera que su exposición previa a este patógeno les proporciona una inmunidad suficiente contra reinfecciones (Eddicks et al ., 2018). En el caso de los verracos, en un estudio que se analizaron muestras de suero de 674 animales se comprobó que el 60% eran seropositivos a PCV2. Asimismo, se ha indicado que la infección en estos animales sigue la dinámica habitual (a final de transición y durante la fase de crecimiento). De hecho, debido a viremias prolongadas es más probable que los verracos menores de 16 meses excreten PCV2 a través del semen que los de mayor edad (McIntosh et al ., 2006a; Schmoll et al ., 2008). 1.3.3.2 Dinámica reciente de la infección por PCV2 En los últimos años diferentes aspectos epidemiológicos de la infección por PCV2 han evolucionado debido a la presión que ejerce el uso extendido de la vacunación, la cual en algunos países puede conllevar la vacunación de toda la cabaña porcina (Segalés, 2015). En situaciones con una adecuada pauta vacunal, respecto a la dinámica tradicional, el momento de infección por PCV2 se retrasa hasta coincidir aproximadamente con el último tercio de la fase de cebo (Figura 9). Además, la vacunación continuada ha provocado que la presión de infección por PCV2 en las granjas sea bastante reducida, motivo por el que la proporción de cerdos infectados es significativamente menor a la que se observaba tradicionalmente (Haake et al ., 2014; Feng et al ., 2016). Figura 9. Ejemplo de la dinámica de infección por PCV2 en una población de cerdos vacunados. Adaptado de Feng et al. (2016). GONZALO LÓPEZ LORENZO 16 No obstante, este cambio en la epidemiología implica que las cerdas reproductoras estén menos expuestas al PCV2 a lo largo de su vida productiva. De hecho, en trabajos recientes se ha notificado que la seroprevalencia en las cerdas adultas es menor del 30 % (Eddicks et al ., 2016; Dieste-Pérez et al ., 2018). En estas situaciones es posible que el retraso del momento de infección conlleve que algunas cerdas de reposición estén infectadas a la edad de la cubrición (≈ 230 – 240 días de vida), pudiendo darse casos de alteraciones reproductivas, el nacimiento de lechones infectados o incluso que infecten otras reproductoras si la inmunidad de éstas es insuficiente (Madson y Opriessnig, 2011) (Figura 10). También es posible que la inmunidad que las cerdas transfieren a su descendencia sea menor, siendo sus lechones más susceptibles. Así, es posible que puntualmente en algunas granjas se puedan observar casos de infecciones tempranas en lechones al inicio de la etapa de transición (Calsamiglia et al ., 2007; Chae, 2012b; Figueras et al ., 2016). Figura 10. Esquema de posibles situaciones en la dinámica actual de la infección por PCV2 en granjas que incluyen al PCV2 en el programa vacunal de los lechones. Por tanto, es posible que en determinadas granjas este cambio epidemiológico conlleve la aparición de los denominados “fallos vacunales”. Es decir, situaciones en las que la vacunación frente a PCV2 pierde parte de su eficacia, o bien que la dinámica de la infección vuelva a su presentación natural, pudiendo incluso diagnosticarse casos de PCV2-SD en granjas que sí vacunan. Estas situaciones atribuidas a “fallos vacunales” suelen deberse a que se puedan estar vacunando lechones ya infectados, con niveles demasiado elevados de anticuerpos maternales que bloqueen la acción de las vacunas o incluso que la vacunación se realice demasiado tarde (Segalés, 2016). En estas situaciones, es necesario revisar y readaptar el protocolo vacunal frente a PCV2 para corregir la situación. Revisión Bibliográfica 17 1.3.4 Transmisión del PCV2 Como cualquier otro patógeno, la transmisión del PCV2 depende de la susceptibilidad del hospedador, de la capacidad infectante del virus y de que la exposición del hospedador al virus sea favorable para la infección (tiempo de exposición, dosis infectiva…) (Thrusfield, 2008). Ser un virus que se considera presente en prácticamente todas las granjas, que alcanza elevados porcentajes de infección en casos sin vacunar, y que tras años de vacunación no se ha logrado erradicar en ninguna granja comercial, confirman que el PCV2 se transmite de forma muy eficiente. En general, se ha estimado que el ratio de reproducción (R0) para esta infección es de 5,9 y que el tiempo medio de generación de enfermedad (dT) (tiempo para que un cerdo recién infectado contagie a otro susceptible) es de 18,4 días (Andraud et al ., 2009a). Sin embargo, estos parámetros oscilan ligeramente dependiendo del grado de contacto entre cerdos y de los días tras la infección. En condiciones experimentales, el R0 entre cerdos en una misma cuadra alcanza un valor de 8,9, mientras que entre animales en distintos corrales se reduce a 1,2 (Andraud et al ., 2008); además, la transmisión es más eficiente entre los 8 y los 15 post-infección, disminuyendo a partir de ese momento, aunque aún pueden permanecer infectantes hasta los 42 días postinfección (Bolin et al ., 2001; Andraud et al ., 2009a). Este virus se excreta en gran cantidad y por numerosas vías, habiéndose detectado mediante PCR en los fluidos indicados en la Figura 11 (Madson et al ., 2008; GrauRoma et al ., 2009; Patterson et al ., 2011b; Dvorak et al ., 2013). Esta excreción tan por múltiples vías influye en los parámetros mencionados en el párrafo anterior, pues la contaminación de superficies en las que están en contacto cerdos alojados conjuntamente es una vía que contribuye a su contagio. Figura 11. Fluidos en los que se puede excretar PCV2 y cantidad aproximada en cerdos no vacunados. En cerdos que no han sido vacunados frente a PCV2, el pico de excreción se alcanza aproximadamente a los 15 días post-infección y desciende significativamente a partir GONZALO LÓPEZ LORENZO 18 de los 35 días (Patterson et al ., 2011b). No obstante, esta excreción puede ser muy duradera, habiéndose detectado en muestras de leche hasta el día 27 de lactación, en semen hasta 47 días post-infección y en heces e hisopos nasales desde los 28 hasta los 209 días de vida (Larochelle et al ., 2000; Ha et al ., 2009; Patterson et al ., 2011c). También se ha visto que la excreción es mayor en los cerdos con PCV2-SD que en los infectados de forma subclínica (Segalés et al ., 2005b); en cambio, en cerdos vacunados la excreción es más reducida y de menor duración (Fort et al ., 2008; Opriessnig et al ., 2011a; Seo et al ., 2012). 1.3.4.1 Transmisión horizontal El hecho de que el PCV2 pueda ser excretado por varias rutas, sumado a que presenta una gran resistencia en el ambiente, hace que su transmisión horizontal sea muy eficiente. Se considera que la vía naso – oral y la fecal – oral son las principales vías de transmisión del PCV2 (Segalés et al ., 2005a; Rose et al ., 2012). La principal forma de transmisión de PCV2 es el contacto directo entre cerdos infectados y susceptibles. Se ha visto que el contacto entre ambos favorece la transmisión de la infección y la aparición de signos clínicos, siendo más eficiente si los cerdos están en contacto directo que si se interpone algún elemento físico (Andraud et al ., 2008; Dupont et al ., 2009; Kristensen et al ., 2009). Se ha sugerido que la excreción de PCV2 a través de la leche podría ser el origen de la infección que ocurre tras el descenso de la inmunidad maternal. Esta hipótesis se basa en que el PCV2 quedaría latente en el organismo del lechón y se reactivaría una vez que la inmunidad maternal desciende (Madson y Opriessnig, 2011). Se ha comprobado que, al menos en fetos, las células del timo pueden estar infectadas de forma latente (Sydler et al ., 2016). No obstante, esta hipótesis no se ha podido confirmar ya que se ha comprobado que tras un destete precoz (a los 10 – 12 días de vida) y el traslado de esos lechones a unas condiciones controladas, éstos no se infectaron hasta las 15 semanas de edad, momento en que finalizó el estudio (Opriessnig et al ., 2004a). La excreción de PCV2 a través del semen es intermitente y, en base a la información hasta la fecha, insuficiente para infectar a las cerdas o a los embriones mediante inseminación artificial; no obstante podría tener repercusión en casos de monta natural, pues la concentración viral es mayor que en las dosis seminales (Madson et al ., 2009a; 2009b). Por otro lado, en los pocos estudios que se ha estudiado el PCV2 en muestras cuyo origen no son los cerdos se sugiere que varios elementos que pueden participar en una transmisión indirecta. Así, Verreault et al ., (2010) detectaron PCV2 en el aire de las granjas y sugieren que la transmisión aerógena del PCV2 podría ser factible al inhalar una cantidad elevada de PCV2. Esta hipótesis la confirmaron Kristensen et al ., (2013), Revisión Bibliográfica 19 quienes comprobaron que cerdos sin signos clínicos enfermaban al estar expuestos al aire procedente de salas con cerdos con PCV2-SD. Además, la detección del PCV2 en insectos y roedores podría ser un riesgo de transmisión en caso de ingestión de estos animales por parte de cerdos susceptibles a la infección (Opriessnig et al ., 2009a). Por otra parte, en otros virus como el del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRS), la Influenza A y el virus de la Diarrea Epidémica Porcina (DEP) se ha demostrado una transmisión indirecta a través de fómites y personas (Otake et al ., 2002a; Pitkin et al ., 2009a; Allerson et al ., 2013; Kim et al ., 2017). Teniendo en cuenta la estabilidad del PCV2 en el ambiente y su transmisión eficiente (Rose et al ., 2003), parece que esta situación también se dé con esta infección, si bien esta situación aún no ha sido demostrada. 1.3.4.2 Transmisión vertical La transmisión transplacental del PCV2 se ha demostrado en estudios experimentales al inocular a cerdas gestantes por vía nasal y provocar el nacimiento de lechones infectados (Park et al ., 2005). En condiciones de campo, se ha notificado el nacimiento de lechones virémicos procedentes de cerdas también infectadas; además, parte de esos lechones eran seropositivos y otros seronegativos, indicando que la infección se puede producir antes y después de que los fetos sean inmunocompetentes, (Shen et al ., 2010). No obstante, en los casos en los que se produce la transmisión por vía vertical lo habitual es que se observe alguna alteración reproductiva a nivel de granja, como un incremento de lechones nacidos muertos, momificados o camadas reducidas (Madson y Opriessnig, 2011; Oropeza-Moe et al ., 2017). En camadas sin alteraciones, se ha visto que el nacimiento de lechones infectados es prácticamente testimonial (Eddicks et al ., 2016; Dieste-Pérez et al ., 2018). 1.3.5 Factores que favorecen el desarrollo de las enfermedades asociadas a la infección por PCV2 Una de las principales características que muestran las enfermedades asociadas a la infección por PCV2 es su condición multifactorial (Segalés y Domingo, 2002).. Diversos cofactores como el genotipo del virus, la susceptibilidad del hospedador, las coinfecciones con otros patógenos y modulación del sistema inmune influyen decisivamente en la presentación y severidad de la enfermedad clínica (Opriessnig et al ., 2007). GONZALO LÓPEZ LORENZO 20 1.3.5.1 Factores relacionados con el virus Los distintos genotipos de PCV2 parecen tener distinta virulencia. De hecho, coincidiendo con el cambio de genotipo predominante, tanto de PCV2a a PCV2b como de PCV2b a PCV2d hubo incrementos de brotes de PCV2-SD y aumentos de la virulencia del virus (Carman et al ., 2008; Cortey et al ., 2011a; Guo et al ., 2012). Durante la sustitución de PCV2b por PCV2d se llegó a plantear que la vacunación frente a PCV2 no garantizaba protección frente al nuevo genotipo (Opriessnig et al ., 2013; Seo et al ., 2014a). No obstante, estudios posteriores mostraron que las vacunas disponibles también eran eficaces frente a este nuevo genotipo (Opriessnig et al ., 2014a, 2014b), siendo posible que otra variable interfiera en los fallos descritos. Además, cualquier pequeño cambio que ocurra en el genoma del PCV2 debido a mutaciones puntuales puede provocar un cambio en la virulencia del virus. Por ejemplo, Fenaux et al ., (2004a) observaron que un PCV2 aislado de cerdos con PCV2SD sufrió dos mutaciones en el gen que codifica para la cápside después de 120 pases en cultivos celulares. Los cerdos inoculados con esta nueva cepa mostraron menor viremia y lesiones menos severas que los inoculados con la cepa original. 1.3.5.2 Factores relacionados con el hospedador El peso al nacimiento y el sexo de los lechones fueron los primeros factores de riesgo para desarrollar PCV2-SD que se identificaron (Corrégé et al ., 2001). Los lechones con menor peso al nacimiento, al destete y al inicio de cebo eran más propensos a enfermar; asimismo, la PCV2-SD se observaba en más casos en los machos castrados que en las hembras (38 % vs 29 % respectivamente). Sin embargo, respecto a esto último, los autores también puntualizaron que otras variables como una mala praxis durante la castración podría interferir en dicha observación. Todas las razas y líneas genéticas de cerdos son susceptibles a la infección por PCV2. No obstante, se considera que los cerdos de la raza Landrace son más susceptibles para padecer PCV2-SD que los de las razas Duroc, Large White y Pietrain (Opriessnig et al ., 2006a; 2009b). También se ha descrito que los lechones con línea paterna Large White x Duroc muestran mayores tasas de mortalidad asociada a PCV2SD que los procedentes de verracos Large White x Pietrain y estos, a su vez, que los procedentes de Pietrain x Pietrain (López-Soria et al ., 2004). En cambio, en otro trabajo se comprobó que al cambiar la raza de verraco habitual por un Pietrain no influía en la aparición de casos de PCV2-SD en las granjas (Rose et al ., 2004). Estos resultados contradictorios respecto a la raza pura Pietrain pudieron deberse a otras variables involucradas y no evaluadas. La apreciación general de los veterinarios de campo es que utilizar diferentes razas conlleva un incremento o disminución de los cuadros clínicos asociados a PCV2 en una misma granja (Vidal, 2020). Revisión Bibliográfica 21 La inmunidad maternal es otro factor que favorece el desarrollo de la PCV2-SD. Ya en las primeras descripciones se sospechaba de un “efecto camada” por el cual los lechones de ciertas cerdas eran más propensos para enfermar (Madec et al ., 2000). Estudios posteriores comprobaron que la protección frente a la infección por PCV2 dependía del título de los anticuerpos maternales: a mayor título, mayor protección. De esta forma, los lechones procedentes de cerdas con bajo nivel de anticuerpos son más propensos para desarrollar PCV2-SD que los procedentes de cerdas con un nivel medio-alto (Mckeown et al ., 2005; Calsamiglia et al ., 2007). 1.3.5.3 Coinfecciones con otros patógenos En general las granjas con PCV2-SD sufren de más patologías que las no afectadas (Ellis et al ., 2004). Así, se ha detectado una gran variedad de patógenos en cerdos con PCV2-SD (Tabla 3). Algunos son agentes cuya coinfección favorece la PCV2-SD, mientras que otros aparecen en casos concretos a consecuencia de la inmunosupresión debida a dicha enfermedad (Segalés et al ., 2013). Tabla 3. Principales virus y bacterias detectados en casos de Enfermedad Sistémica por PCV2 (PCV2-SD). Patógeno Observaciones Referencias Virus Virus del PRRS Coinfección más habitual con el PCV2 en casos de PCV2-SD. Su presencia favorece la replicación de PCV2, agravando el cuadro clínico y la enfermedad. Pallarés et al., 2001; Pogranichniy et al., 2002; Wellenberg et al., 2004; GrauRoma and Segalés, 2007 Parvovirus porcino Se considera un factor desencadenante de PCV2-SD. Ellis et al., 2000b; Kim et al., 2002 Influenza porcina No incrementa la severidad de la enfermedad, los signos clínicos ni las lesiones asociadas a PCV2. Wei et al., 2010 Virus de la Diarrea epidémica porcina No incrementa la severidad de la PCV2-SD, no obstante la infección previa con PCV2 favorece su replicación. Jung et al., 2006 Torque Teno Sus virus Más habitual en granjas afectadas por PCV2SD que en las no afectadas. Sin embargo, su prevalencia y carga vírica no está completamente relacionada con PCV2-SD. Kekarainen et al., 2006; Aramouni et al., 2011 Bacterias M. hyopneumoniae Se considera desencadenante de PCV2-SD. Se ha notificado que las bacterinas utilizadas en algunas vacunas pueden incrementar la incidencia de PCV2-SD. Opriessnig et al., 2003; 2004b L. intracellularis Suele estar implicado en el cuadro clínico de la PCV2-SD secundariamente a la inmunosupresión. Opriessnig y Halbur, 2012 Salmonella spp. La infección previa por PCV2 facilita la multiplicación de esta bacteria. Opriessnig y Halbur, 2012 Glaserella parauis Coinfección más frecuente en algunos casos. No es un factor desencadenante de la PCV2-SD. Kim et al., 2002 GONZALO LÓPEZ LORENZO 28 Tras la infección se producen IgM que alcanzan su máxima concentración aproximadamente a los 10 días post-infección (Meerts et al ., 2006). En ese momento, se incrementa de forma exponencial la producción de IgG, que alcanzan su pico a las 6 – 8 semanas post-infección y después comienzan a descender de forma paulatina, aunque se mantienen durante al menos 20 semanas (Rodríguez-Arrioja et al ., 2002; Carasova et al ., 2007). Estas IgG son específicas frente a la proteína de la cápside del PCV2 (Trible et al ., 2011), pero no se relacionan con una reducción notoria de la viremia, pues son incapaces de neutralizarla completamente, motivo por el cual la viremia suele ser de larga duración (McIntosh et al ., 2006b; Seo et al ., 2012). La producción de anticuerpos neutralizantes comienza a partir de los 10 días postinfección y en algunos casos no se detectan hasta pasados 28 días (Pogranichnyy et al ., 2000). En cerdos que presentan una respuesta inmune deteriorada la producción de anticuerpos neutralizantes se retrasa, como consecuencia el PCV2 se replica más activamente y estos cerdos terminan por desarrollar la PCV2-SD (Meerts et al ., 2006; Fort et al ., 2007). Por tanto, el estado inmunitario del animal condiciona la producción de anticuerpos neutralizantes, y por tanto la viremia de PCV2: cuanto mayor es su cantidad, mayor es la protección frente a la infección por PCV2 (Fort et al ., 2007). En el caso de la vacunación, algunas vacunas son capaces de inducir una seroconversión, pero todas inducen la producción de anticuerpos neutralizantes (Opriessnig et al ., 2008a, 2009b; Martelli et al ., 2011). Cuando los cerdos que se han vacunado se infectan con PCV2, esos anticuerpos limitan la diseminación sistémica y la replicación del virus. Esta es la razón por la que la infección en cerdos vacunados es asintomática, con viremias más reducidas y de menor duración. En los fetos la respuesta inmune humoral sólo sucede si la infección ocurre después del día 75 de gestación, cuando ya son inmunocompetentes (Sánchez et al ., 2001). 1.4.4.3 Respuesta inmune celular a la infección por PCV2 La respuesta inmune celular a la infección por PCV2 es el elemento clave para superar esta infección pues los anticuerpos, exceptuando los neutralizantes, no son totalmente protectores. La respuesta inmune celular frente a PCV2 se dirige a la cápside del virus y a la proteína que codifica la replicación del virus (Fort et al ., 2010). Esta respuesta se basa en la producción de interferón gamma (IFN-γ) específico frente a PCV2 por parte los linfocitos T, el cual regula la diferenciación de los linfocitos inmaduros y la activación de los macrófagos (Steiner et al ., 2009). A partir de los 14 días post-infección se empiezan a detectar las células secretoras de IFN-γ, alcanzando su pico a los 21 días post-infección, y descendiendo gradualmente conforme se reduce la viremia (Fort et al ., 2009a). En los casos en que la linfopenia por Revisión Bibliográfica 29 la infección por PCV2 limita una secreción adecuada de IFN-γ, la respuesta inmune celular es incapaz de controlar la replicación de PCV2. Esto, unido a la tardanza en generar anticuerpos neutralizantes, hace que en esos casos la infección por PCV2 muy probablemente acabe provocando un cuadro de PCV2-SD (Kekarainen et al ., 2010). La vacunación frente a PCV2 provoca un aumento en la población de células secretoras de IFN-γ e induce la producción de IFN-γ específico frente a PCV2 (Fort et al ., 2009b; Seo et al ., 2012; Koinig et al ., 2015). Este es uno de los motivos que protege a los cerdos vacunados de la infección por PCV2. 1.4.4.4 Patogenia del Síndrome de Dermatitis y Nefropatía Porcina El PDNS se considera que se origina por una reacción de hipersensibilidad de tipo 3 al depósito de inmunocomplejos antígeno-anticuerpo de PCV2 (Chae, 2005; Gillespie et al ., 2009). Una viremia elevada y prolongada en el tiempo, junto a una producción elevada de anticuerpos frente a PCV2 conllevan una formación vertiginosa de inmunocomplejos. Esta concentración elevada de inmunocomplejos antígenoanticuerpo acaba provocando un daño en la pared vascular y en los capilares glomerulares, con los consiguientes fallos circulatorio y renal (Opriessnig et al ., 2007). 1.5 Signos clínicos y lesiones asociadas a la infección por PCV2 1.5.1 Enfermedades asociadas a la infección por PCV2 La infección por PCV2 puede pasar desapercibida a la inspección visual o provocar distintos cuadros clínicos dependiendo de la edad de los cerdos infectados. Los principales cuadros clínicos asociados a la infección por PCV2 se indican en la Tabla 5. Tradicionalmente también se diferenciaban la Enfermedad entérica por PCV2 y la Enfermedad pulmonar asociada a PCV2. Estas dos formas presentan una baja incidencia y actualmente se consideran como parte de la PCV2-SD ya que que sus signos clínicos y lesiones coinciden con los observados en esta última enfermedad (Ticó et al ., 2013). GONZALO LÓPEZ LORENZO 30 Tabla 5. Enfermedades asociadas a la infección por PCV2: principales signos clínicos y lesiones. Modificado de Segalés (2012). Enfermedad Principales signos clínicos Lesiones macroscópicas Lesiones microscópicas Infección subclínica por PCV2 (PCV2-SI)  Disminución de la ganancia de peso diaria (GMD)  No apreciable  Ninguna o muy ligera depleción linfoide con inflamación granulomatosa en los tejidos linfoides. Enfermedad Sistémica por PCV2 (PCV2-SD)  Disminución de la GMD  Desmedro y pérdida de peso progresiva  Disnea y dificultad respiratoria  Diarrea  Palidez generalizada  Aumento tamaño ganglios linfáticos  Pelo largo y áspero  Ausencia de colapso pulmonar  Atrofia y decoloración hepática  Enteritis catarral  Petequias o infartos en riñones  Modera a severa depleción linfoide con inflamación granulomatosa en tejidos linfoides.  Neumonía intersticial, fibroplastia bronquiolar, bronquiolitis  Nefritis intersticial  Hepatitis y/o fibrosis perilobular Enfermedad reproductiva por PCV2 (PCV2-RD)  Abortos o partos con momias  Retorno regular a estro  Fetos momificados o edematosos  Hepatomegalia y congestión hepática fetal  Hipertrofia cardíaca fetal con áreas del miocardio descoloridas  Ascitis, hidrotórax e hidropericardio en fetos  Fibrosis supurativa a necrotizante o miocarditis en fetos  Congestión hepática en fetos  Neumonía moderada en fetos Síndrome de Dermatitis y Nefropatía porcina (PDNS)  Pápulas y máculas en la piel, distribuidas por la región inguinal y área perineal  Edema subcutáneo en áreas afectadas  Incremento tamaño ganglios linfáticos, sobretodo inguinal superficial  Cicatrices en la piel de animales que se curan  Nefromegalia, con petequias en corteza y edema en pelvis renal  Infartos esplénicos  Vasculitis sistémica necrotizante  Glomerulitis fibrinonecrotizante  Nefritis intersticial con glomeruloesclerosis en animales que se recuperan de la fase aguda  Grado variable de depleción linfoide con inflamación granulomatosa en tejidos linfoides La diseminación del PCV2 por todo el organismo de los cerdos y su capacidad para replicarse en gran variedad de epitelios y órganos conlleva que gran variedad de sistemas orgánicos estén afectados. En la Tabla 6 se indica de forma orientativa el grado de afectación de cada sistema del organismo en cada enfermedad asociada a la infección por PCV2. Revisión Bibliográfica 31 Tabla 6. Grado de afectación de distintos sistemas orgánicos en cada enfermedad asociada a PCV2. Adaptado de Opriessnig y Langohr (2012). Órgano o sistema afectado Enfermedad PCV2-SI PCV2-SD PCV2-RD PDNS Sistema linfoide +++ + + Sistema respiratorio +++ Sistema digestivo ++ Sistema urinario + +++ Sistema cardiovascular + +++* + Sistema nervioso + Sistema reproductivo + Sistema integumentario + +++ Sistema endocrino + Las cruces indican el grado de afectación, siendo +++ una afectación grave y + una afectación leve * En fetos 1.5.2 Infección subclínica por PCV2 (PCV2-SI) Actualmente es la presentación más habitual (Segalés, 2012). De todas las enfermedades asociadas a PCV2 es la que conlleva un mayor coste económico a nivel de granja (Alarcon et al ., 2013). Cuando la PCV2-SI no coexiste con infecciones secundarias el único signo clínico es una ligera disminución del crecimiento diario de los cerdos, imperceptible a simple vista. En los casos en que la PCV2-SI coexiste con alguna infección secundaria se favorecen los signos clínicos de esta infección concomitante (Opriessnig et al ., 2007). Además, a causa de la alteración del sistema inmune, también se ha descrito que esta infección disminuye de la eficacia de algunas vacunas (Opriessnig et al ., 2006b). Macroscópicamente no se observan lesiones. A nivel microscópico se puede observar una ligera depleción linfoide e inflamación granulomatosa en uno o dos ganglios linfáticos; además, también se puede observar una leve neumonía intersticial. 1.5.3 Enfermedad Sistémica por PCV2 (PCV2-SD) Inicialmente denominada como Síndrome Multisistémico de Desmedro Postdestete (PMWS por sus siglas en inglés). Como se ha comentado en el apartado Epidemiología, se considera una enfermedad multifactorial en la que el PCV2 es el agente esencial (Segalés, 2012). De todas las enfermedades en las que está involucrado el PCV2 ésta es la más estudiada, tanto por su frecuencia de aparición antes de la disponibilidad de vacunas como por las pérdidas que ha ocasionado. GONZALO LÓPEZ LORENZO 32 En sus primeras descripciones, se mencionaba una morbilidad de entre un 4 y un 30 % de los cerdos, pudiendo llegar al 60 % en las granjas más afectadas; la tasa de mortalidad oscila entre el 4 y el 20 % (Segalés y Domingo, 2002). No obstante, en la situación actual de vacunación generalizada, la PCV2-SD no se suele observar salvo casos puntuales (Segalés, 2015). Ningún signo clínico de la PCV2-SD es patognomónico. El principal signo clínico es un adelgazamiento progresivo o “desmedro”, que suele ir acompañado de apatía, disnea, palidez de piel, diarrea y en algunos casos también ictericia (Figura 14) (Harding y Clark, 1997). Esta variedad de signos clínicos depende del grado de afectación de los órganos en que se puede replicar el PCV2. Los signos clínicos de la PCV2SD se pueden observar en cerdos desde 1 mes de vida hasta la edad de sacrificio, aunque lo más habitual es observarlos en cerdos de entre 7 y 15 semanas de edad (Madec et al ., 2000). En los primeros días post-infección se observa apatía y fiebre de hasta 41 ºC (Gillespie et al ., 2009). Una vez que la viremia se ha instaurado, el cuadro clínico avanza rápidamente. Se puede observar a simple vista un incremento del tamaño de los ganglios linfáticos inguinales, especialmente del inguinal superficial. Además, a consecuencia del adelgazamiento progresivo es frecuente observar claramente la espina dorsal del cerdo (Harding and Clark, 1997; Segalés et al ., 2004b). La disnea, la taquipnea y la palidez de piel también son muy frecuentes; en cambio, los cuadros diarreicos no son tan habituales (Madec et al ., 2000). Además, debido a la inmunosupresión que causa el PCV2, en el caso de coinfecciones que provoquen signos clínicos, el cuadro clínico de estas últimas se encuentra agravado. Los órganos que se ven más afectados son los ganglios linfáticos y los pulmones, aunque también se pueden observar lesiones en órganos del sistema digestivo, urinario e incluso a nivel sistémico (Segalés y Domingo, 2002). Sistema linfoide La principal alteración macroscópica en el sistema linfoide se observa en los ganglios linfáticos. Se trata de un incremento del tamaño, perceptible a simple vista en los ganglios inguinales y en los mesentéricos, aunque en otros como los mediastínicos y los bronquiales también suele observar esta linfadenopatía (Harding Figura 14. Cerdo afectado por PCV2-SD comparado con un cerdo sano. Revisión Bibliográfica 33 y Clark, 1997). Al corte, su superficie está ligeramente húmeda y presenta un color marrón pálido homogéneo por toda su superficie (Segalés et al ., 2005a). En los casos avanzados de PCV2-SD, los ganglios se pueden observar sin alteraciones o incluso atrofiados; además, en estas situaciones habitualmente también se observa esta atrofia en el timo (Segalés et al ., 2004b). A nivel microscópico las lesiones más características se observan en los órganos linfoides (ganglios linfáticos, bazo, placas de peyer y tonsilas): una depleción linfoide, acompañada de la pérdida de la estructura folicular, y una inflamación granulomatosa (Figura 15), ésta última a consecuencia de la infiltración y del reemplazo de los folículos por histiocitos (Harding y Clark, 1997; Sorden, 2000; Segalés et al ., 2004b). Esta depleción linfoide es evidente a partir del día 14 postinfección y se comienza a resolver en torno al día 35 post-infección (Opriessnig et al ., 2004b). Además, también es habitual observar células gigantes multinucleadas en todos los tejidos linfoides y cuerpos de inclusión en los macrófagos presentes en estos órganos (Segalés y Domingo, 2002); asimismo, en torno a un 10 % de cerdos con PCV2-SD también muestran una linfadenitis necrotizante, con necrosis en el centro de los folículos más prominentes (Segalés et al ., 2004b; Opriessnig y Langohr, 2012). Sistema respiratorio Lo más llamativo a nivel macroscópico es la ausencia de colapso pulmonar al acceder a la cavidad torácica, pulmones con consistencia gomosa, a veces con un moteado color canela y generalmente con una neumonía intersticial muy marcada (Figura 16). Además, es habitual observar bronconeumonías con consolidación cráneo-ventral asociada a infecciones secundarias (Segalés y Domingo, 2002). Microscópicamente, estas lesiones se corresponden con una bronquiolitis y una hiperplasia fibrosa peribronquiolar, que acaba generando una fibrosis y edema en los septos alveolares en los casos más Figura 15. Depleción linfoide e inflamación granulomatosa en un ganglio linfático de un cerdo con PCV2-SD. Figura 16. Neumonía intersticial por PCV2. Nótese la consolidación cráneo-ventral. GONZALO LÓPEZ LORENZO 34 avanzados (Segalés et al ., 2004b). Asimismo, se puede observar un infiltrado granulomatoso junto con cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos a nivel bronquial, bronquiolar y alveolar (Opriessnig y Langohr, 2012). Por otro lado, también se han descrito casos de neumonía proliferativa y necrotizante, en la que la neumonía intersticial se caracterizaba por la presencia de abundante sustancia hialina en la luz alveolar junto con el depósito de fibrina en los bronquiolos (Opriessnig y Langohr, 2012). Sistema digestivo Las lesiones en el sistema digestivo se limitan al hígado, estómago e intestino. Macroscópicamente la lesión más frecuente es una ulceración en la pars esofágica del estómago (Segalés y Domingo, 2002), la cual probablemente es la responsable de la anemia sufren y la palidez que muestran los cerdos con PCV2-SD (Harding, 2004). En general el hígado se encuentra sin alteraciones macroscópicas apreciables salvo en algunos casos un punteado de color amarillo en la superficie; en casos avanzados sí está afectado volviéndose flácido y más pequeño (Allan y Ellis, 2000; Quintana et al ., 2001). A nivel intestinal, macroscópicamente se pueden ver secciones acuosas y un adelgazamiento en la pared del íleon y ocasionalmente edema en el ciego (Harding y Clark, 1997). A nivel microscópico la lesión más característica es una enteritis granulomatosa caracterizada por un incremento de macrófagos y células gigantes multinucleadas en la mucosa y la submucosa del íleon (Opriessnig y Langohr, 2012). En los hepatocitos se ha descrito un infiltrado de histiocitos; a medida que avanza la infección se pueden apreciar vacuolas en el citoplasma de algunos hepatocitos junto a una desorganización de los lobulillos hepáticos. En los casos más avanzados se produce una necrosis en los hepatocitos y como consecuencia se observa el cuadro de ictericia (Allan y Ellis, 2000; Segalés et al ., 2004b). Se ha recomendado revisar siempre las lesiones microscópicas en el sistema digestivo ya que, aunque casi siempre aparecen conjuntamente con otras lesiones de PCV2-SD, es posible que sean la única alteración que provoca la infección por PCV2, limitándose los signos clínicos a un cuadro digestivo (Opriessnig y Langohr, 2012). Sistema urinario A nivel renal, macroscópicamente en algunos casos se puede apreciar un punteado blanco distribuido por toda la corteza del riñón junto a una apariencia edematosa; no obstante, es una lesión menos frecuente que las mencionadas hasta ahora (Harding y Clark, 1997; Quintana et al ., 2001). Microscópicamente estas lesiones se localizan en la región córtico-medular del parénquima renal, pudiendo extenderse hacia la corteza o la médula. Se trata de una Revisión Bibliográfica 35 nefritis intersticial granulomatosa; no se observan daños en los glomérulos pero sí cambios degenerativos en el epitelio tubular y restos celulares en su luz (Sarli et al ., 2008). Se ha indicado que las lesiones renales indican un cuadro crónico de la infección por PCV2, no observándose hasta los 35 días post-infección (Opriessnig y Langohr, 2012). Otros sistemas orgánicos También se pueden encontrar lesiones en otros órganos aunque son mucho menos frecuentes. A nivel del sistema nervioso central se han descrito edemas y hemorragias, distribuidas de forma aleatoria por las meninges y el parénquima, predominando en la sustancia gris. Microscópicamente se asocian con una vasculitis necrotizante e infiltrados de macrófagos, junto con degeneración neuronal (Corrêa et al ., 2007; Seeliger et al ., 2007). En órganos endocrinos como el páncreas, la tiroides y las glándulas adrenales no se observan lesiones macroscópicas, aunque microscópicamente se puede ver una infiltración de histiocitos y una ligera atrofia en los acini pancreáticos (Harding y Clark, 1997; Opriessnig y Langohr, 2012). 1.5.4 Enfermedad Reproductiva por PCV2 (PCV2-RD) Desde las primeras descripciones, la infección por PCV2 se ha ligado a una alteración a nivel reproductivo en las granjas (West et al ., 1999). Sin embargo, en condiciones de campo, la presentación de esta enfermedad es poco habitual (Pensaert et al ., 2004). El hecho de que una gran proporción de cerdas reproductoras se infectasen en su etapa de crecimiento tiene un efecto protector para la manifestación de PCV2-RD en edad adulta. Por ese motivo tradicionalmente era poco frecuente observar casos de PCV2-RD en cerdas reproductoras (Segalés, 2012). Cuando se observa, suele restringirse a situaciones de una alta incidencia de PCV2 o a primoinfecciones en cerdas reproductoras. Sin embargo, esta última situación se ha vuelto más frecuente en la actualidad ya que la vacunación en los lechones no protege hasta la edad adulta, de manera que las cerdas reproductoras que no hayan sido revacunadas adecuadamente pueden adquirir la infección durante la etapa reproductiva y desarrollar la PCV2-RD (Figueras et al ., 2016; Oropeza-Moe et al ., 2017; Eddicks et al ., 2018). Los signos clínicos dependerán del momento en que se produzca la infección en la cerda gestante, su viremia y la respuesta inmune del animal (Tabla 7). Así, puede haber desde repeticiones acíclicas como consecuencia de la reabsorción embrionaria, a partos prematuros, aumento de lechones momificados, de nacidos muertos e incremento del índice de mortalidad durante la fase de lactación (Harding, 2004; Chae, 2005; Opriessnig et al ., 2007). En el caso de las cerdas los signos clínicos son GONZALO LÓPEZ LORENZO 36 inaparentes, habiéndose descrito únicamente pirexia y anorexia en las cerdas que abortan (Park et al ., 2005). Tabla 7. Signos clínicos observados según el momento de infección en las cerdas gestantes. Adaptado de Madson y Opriessnig, (2011). Etapa de gestación Temprana (1 – 35 días) Media (35 – 70 días) Tardía (70 – 115 días)  Muerte embrionaria  Retorno irregular al estro  Pseudogestación  Camadas reducidas  Abortos  Fetos momificados  Fetos momificados  Nacidos muertos  Abortos  Partos tardíos  Lechones nacidos débiles  Camadas normales Las lesiones sólo se observan en los fetos que se infectan antes de ser inmunocompetentes (Pensaert et al ., 2004). Así, se suelen localizar en camadas con nacidos momificados, muertos o nacidos débiles (Madson y Opriessnig, 2011). Macroscópicamente se observa congestión y una hipertrofia cardíaca, la cual puede provocar una hepatomegalia y ascitis y/o un edema pulmonar. Las alteraciones más llamativas se observan en el corazón, el cual presenta un moteado pálido por todo el miocardio y dilatación de ambos ventrículos (Brunborg et al ., 2007; Madson et al ., 2009a). Menos frecuentemente se puede observar un incremento del tamaño de los ganglios linfáticos, edema en el colon y petequias en el bazo. A nivel microscópico las lesiones más características se localizan en el miocardio. Los cardiomiocitos están degenerados, necróticos o se han reemplazado por tejido conectivo fibroso y áreas de mineralización. Se observa una miocarditis con infiltración de linfocitos, macrófagos y células gigantes multinucleadas (West et al ., 1999; Johnson et al ., 2002; Brunborg et al ., 2007). Las lesiones microscópicas en el pulmón, hígado y los ganglios linfáticos, si están presentes, son muy similares a las descritas en los cerdos en crecimiento (Opriessnig y Langohr, 2012). 1.5.5 Síndrome de Dermatitis y Nefropatía porcina (PDNS) El PDNS se asoció por primera vez con el PCV2 en el año 2000 (Rosell et al ., 2000). La mayor parte de los casos se observan en cerdos durante la fase de cebo, aunque también se pueden observar casos puntuales en lechones de fase de transición e incluso en cerdos adultos (Chae, 2005; Gillespie et al ., 2009). Este síndrome se caracteriza por presentar una prevalencia inferior al 1% aunque con unas tasas de mortalidad muy elevadas: prácticamente del 100 % en cerdos de cebo, en pocos días tras la aparición de los primeros signos; y en torno al 50 % en lechones de menos de 3 meses, los cuales de recuperarse vuelven a ganar peso (Segalés et al ., 1998). Revisión Bibliográfica 37 Es la única manifestación clínica asociada a la infección por PCV2 que no se ha logrado reproducir experimentalmente (Opriessnig y Halbur, 2012). Los animales afectados están letárgicos, febriles (40 a 41 ºC), presentan anorexia, diarrea acuosa o heces negras y orina sanguinolenta. Lo más destacable es la aparición de máculas en la piel en las regiones posteriores y distales del cuerpo de los cerdos. En los cuadros terminales se observa incoordinación motora y temblores (Segalés et al ., 1998; Drolet et al ., 1999; Harding, 2004). Los órganos más afectados son la piel y los riñones, y en menor medida los órganos linfoides. Las lesiones macroscópicas en la piel aparecen de forma aguda y se corresponden con máculas y pápulas, que oscilan de color rojo a morado y al aumentar de tamaño pueden llegar a confluir. Estas lesiones aparecen en las extremidades posteriores, área inguinal, orejas y en algunos casos también partes distales de las extremidades anteriores (Figura 17). En los animales que sobreviven a la enfermedad, las lesiones acaban desapareciendo al cabo de pocas semanas (Segalés et al ., 1998; Drolet et al ., 1999; Harding, 2004). A nivel renal se observa una nefromegalia, los riñones presenta una consistencia firme y color pálido, observando también petequias distribuidas por la corteza y edema en la pelvis renal. Los ganglios linfáticos, especialmente los renales, están aumentados de tamaño y presentan un color rojo oscuro (Segalés et al ., 1998). A nivel microscópico, las lesiones de la piel se corresponden con una vasculitis necrotizante de los capilares de la dermis y la hipodermis, acompañada de trombosis e infartos en los tejidos circundantes (Johnstone y Lawton, 2008). En los riñones, microscópicamente las lesiones se corresponden con una glomerulonefritis fibrinosa o necrotizante y una nefritis intersticial (Segalés et al ., 1998). En los ganglios linfáticos microscópicamente hay una depleción linfoide junto con un infiltrado granulomatoso. Figura 17. Cerdo afectado por el PDNS. GONZALO LÓPEZ LORENZO 44 1.7 Prevención y control de la infección por PCV2 1.7.1 Tratamiento No existe un tratamiento eficaz frente a la infección por PCV2. Así, las acciones terapéuticas se centran en paliar los signos clínicos. En los primeros años de la década de 2000 se ensayó la seroterapia para combatir la PCV2-SD (Waddilove y Marco, 2002). Ésta consistía en inyectar subcutáneamente el suero de cerdos que habían superado la infección a los lechones que presentaban los primeros signos de enfermedad. Aunque esta medida pudo conseguir cierta reducción del índice de mortalidad, los resultados también fueron inconsistentes (Madec et al ., 2008). 1.7.2 Medidas de prevención distintas a la vacunación La infección por PCV2 necesita de cofactores para provocar un cuadro clínico de enfermedad (Segalés et al ., 2013). Por tanto, el control de las enfermedades asociadas debe tener en cuenta la influencia de un buen número de factores de diferentes orígenes: manejo, genética, estado inmunitario… De esta manera es importante disponer de protocolos integrados para el manejo del rebaño que minimicen las consecuencias de la infección por PCV2. 1.7.2.1 Los 20 puntos de Madec El plan de los 20 puntos de Madec (Madec et al ., 2000) constituye una serie de medidas de manejo que pretenden disminuir la exposición de cerdos susceptibles al PCV2, reduciendo así la incidencia de la infección y la transmisión del virus. Aunque estos puntos se describieron pensando en el control de PCV2, realmente se pueden aplicar al control de cualquier enfermedad infecciosa. En la Tabla 9 se indican los 20 puntos de Madec. Revisión Bibliográfica 45 Tabla 9. Plan de los 20 puntos de Madec. Adaptado de Segalés, (2007). Salas de partos 1. Realizar un manejo todo dentro-todo fuera con limpieza y desinfección de las instalaciones, incluyendo las fosas de purín entre lotes. 2. Lavado y desparasitación de las cerdas antes del parto. 3. Realizar adopciones sólo si es necesario y siempre en las 24 horas post-parto. Salas de transición 4. Corrales pequeños y con divisiones sólidas. 5. Realizar un manejo todo dentro-todo fuera con limpieza y desinfección de las instalaciones, incluyendo las fosas de purín entre lotes. 6. Densidad máxima de 3 lechones/m2. 7. Espacio en el comedero superior a 7 cm/cerdo. 8. Mantener una buena calidad de aire (NH3 <10 ppm; C02 <0,1 %; humedad relativa < 85 %). 9. Mejorar el control de temperatura. 10. No mezclar lotes de lechones. Salas de engorde y finalización 11. Corrales pequeños y con separación sólida. 12. Realizar un manejo todo dentro-todo fuera con limpieza y desinfección de las instalaciones, incluyendo las fosas de purín entre lotes. 13. No mezclar cerdos de cebo con cerdos procedentes de transición. 14. No mezclar cerdos de cebo de distintos corrales. 15. Superficie de al menos 0,75 m2/cerdo. 16. Mejorar la calidad del aire y la temperatura. Puntos adicionales 17. Programa vacunal adecuado a cada granja. 18. Flujo adecuado de cerdos y de aire entre los edificios de la granja. 19. Higiene estricta en cualquier manipulación de cerdos (descolmillado, vacunaciones…). 20. Rápida separación de los enfermos a las cuadras de lazareto, o eutanasia de los mismos de ser necesario. Entre esas medidas destaca la importancia del manejo en todo dentro-todo fuera y la limpieza y desinfección (L+D) de las instalaciones, siendo una medida común en todas las fases productivas y también en lo que atañe a los elementos utilizados para la manipulación de los cerdos. Las demás medidas se encaminan a una mejora del manejo, a una reducción la densidad y contacto entre animales. Así, reduciendo la manipulación de los cerdos, acompañado de una buena higiene cuando sea necesario, y minimizando el contacto entre cerdos se limita la transmisión del PCV2 y la presión de infección (Madec et al ., 2000). GONZALO LÓPEZ LORENZO 46 1.7.2.2 Genética de los cerdos Como se ha mencionado previamente, algunas razas de cerdos son más propensas a desarrollar enfermedades asociadas a PCV2 que otras. Así, una posible medida para controlar la infección por PCV2 es utilizar razas menos susceptibles (López-Soria et al ., 2004; Opriessnig et al ., 2006a). 1.7.2.3 Control de las coinfecciones Junto con el manejo y la L+D, son las medidas de mayor peso en el control de la infección por PCV2 sin recurrir a las vacunas. Dentro de estas coinfecciones, el virus del PRRS, el parvovirus porcino y M. hyopneumoniae son los patógenos clave ya que predisponen al desarrollo de PCV2-SD (Opriessnig y Halbur, 2012). Por tanto, un programa vacunal adecuado y eficaz frente a esos tres patógenos, conllevaría de forma secundaria un mejor control del PCV2 y de sus enfermedades asociadas. De forma similar, minimizar la presión de infección de otros patógenos como G. parasuis , L. intracellularis o el virus Influenza evitaría que estos microorganismos agravaran el cuadro clínico tras la infección por PCV2. Un caso extremo de estas situaciones sucede en aquellas granjas que por su situación sanitaria están libres de la infección por el virus del PRRS, de M. hyopneumoniae y de los serotipos 2, 6 y 12 de Actinobacillus pleuropneumoniae (Nielsen et al ., 2017). En estas granjas, la vacunación frente a PCV2 no proporciona una mejora de la ganancia media de peso diaria, del peso final, del índice de conversión ni de la proporción de cerdos que necesitan algún tratamiento antibiótico (Nielsen et al ., 2017). 1.7.2.4 Modulación del sistema inmune Como se ha comentado previamente, la vacunación frente a algunos patógenos puede tener un efecto sinérgico en la replicación del PCV2 y, por consiguiente, incrementar la gravedad de la infección (Opriessnig et al ., 2003). De esta forma, excluir algunas pautas vacunales sería eficaz para reducir la incidencia de PCV2. No obstante, desde un punto de vista general, esta nunca se recomienda ya que, aunque limitase la problemática del PCV2, incrementaría la casuística de las otras infecciones. No obstante, sabiendo a qué edad se produce de forma aproximada la infección por PCV2 en la granja, se podrían revisar y reajustar los programas vacunales para limitar su interacción con el virus (Chae, 2012b). Por ejemplo, se ha comprobado adelantar la vacunación frente a M. hyopneumoniae a la primera semana de vida de los lechones mejora los parámetros productivos y reduce las lesiones asociadas a PCV2 tras el desafío con el virus, respecto a si esta vacunación se realizaba en la tercera semana de vida (Kim et al ., 2011). Revisión Bibliográfica 47 1.7.2.5 Otras medidas Algunos estudios han observado una reducción de los signos clínicos de la infección por PCV2 tras la adición de Vitamina E, Selenio, plasma o ácido linoleico a la dieta de los lechones (Bassaganya-Riera et al ., 2003; Baekbo et al ., 2004; Dewey et al ., 2006). No obstante, estos estudios han perdido interés cuando se comenzaron a comercializar las vacunas frente a esta infección. Otra medida que ha resultado eficaz fue realizar un destete precoz a los 10 – 12 días de vida (Opriessnig et al ., 2004a). No obstante, la eficacia de esta medida también radica en que a continuación en que los cerdos se trasladaron a unas dependencias totalmente controladas, previa L+D y con unas medidas de bioseguridad muy elevadas. De hecho, esto último es lo equivalente a un vacío sanitario y posterior repoblación de cerdos, intentando garantizar que no se introducen lechones infectados. El vacío sanitario y la repoblación también es una medida que se ha demostrado eficaz (Patterson et al ., 2011d); no obstante, puesto que esta medida conlleva el cierre total de la granja durante un tiempo no se suele tener en cuenta salvo en situaciones muy puntuales. 1.7.3 Vacunación frente a PCV2 La vacunación es la principal herramienta para controlar la infección por PCV2. Las vacunas se desarrollaron para controlar la PCV2-SD, pero actualmente se utilizan para prevenir todas las enfermedades asociadas a PCV2 (Chae, 2012a). La vacunación frente a PCV2 proporciona casi siempre un retorno económico, motivo por el que actualmente casi todos los cerdos se vacunan, constituyendo estas vacunas el producto preventivo más utilizado en el sector porcino (Segalés, 2015). 1.7.3.1 Tipos de vacunas disponibles Actualmente en España se comercializan cinco vacunas frente a PCV2 (Tabla 10). Todas ellas son inactivadas y se basan en la expresión de la proteína de la cápside (ORF2) del genotipo PCV2a, presentando inmunidad cruzada frente a los demás genotipos (Beach y Meng, 2012; Opriessnig et al ., 2014b; Jeong et al ., 2015; Park et al ., 2019). GONZALO LÓPEZ LORENZO 48 Tabla 10. Vacunas comerciales frente a PCV2 disponibles actualmente en España. Nombre comercial Compañía farmacéutica Sustancia activa Adyuvantes Especies de destino Pauta vacunal indicada por el fabricante CircovacⓇ Ceva PCV2a inactivado Parafina líquida Cerdas nulíparas Una dosis intramuscular de 2 ml seguida por otra dosis 3 – 4 semanas después, 2 semanas antes de la cubrición. Aplicar otra dosis 2 semanas antes del parto Cerdas adultas Una dosis intramuscular de 2 ml seguida por otra dosis 3 – 4 semanas después, 2 semanas antes del parto. Revacunar en cada gestación entre 2 y 4 semanas antes del parto Lechones a partir de 3 semanas de vida Una dosis intramuscular de 0,5 ml IngelvacⓇ CircoFLEX Boehringer Ingelheim Proteína ORF2 (cápside) de PCV2a Carbómero (polímero hidrofílico) Lechones a partir de 2 semanas de vida Una dosis intramuscular de 1 ml PorcilisⓇ PCV/ PorcilisⓇ PCV ID Intervet (MSD) Proteína ORF2 (cápside) de PCV2a Parafina líquida Acetato de dl-αtocoferilo Lechones a partir de 3 semanas de vida Una dosis intramuscular de 2 ml; una dosis intradérmica de 0,2 ml en el caso de PorcilisⓇ PCV ID SuvaxynⓇ Circo Zoetis PCV1 inactivado expresando la ORF2 (cápside) de PCV2ª Escualano Polisorbato Poloxamer (polímero hidrofóbico) Lechones a partir de 3 semanas de vida Una dosis intramuscular de 2 ml MhyosphereⓇ PCV ID Hipra M. hyopneumoniae expresando la ORF2 de PCV2 Aceite mineral Lechones a partir de 3 semanas de vida Una dosis intradérmica de 0,2 ml CircovacⓇ fue la primera vacuna disponible (se introdujo en el año 2006) y se basa en un PCV2a inactivado. Inicialmente su uso se registró para cerdas nulíparas y reproductoras, aunque posteriormente también se aprobó para lechones (Fraile et al ., 2012a). IngelvacⓇ CircoFLEX y PorcilisⓇ PCV son vacunas de subunidades. Se basan en la expresión de la proteína de la cápside del PCV2 en un baculovirus y, después de la inactivación y purificación, se obtienen partículas víricas morfológicamente indistinguibles de las del PCV2 (Fort et al ., 2008; Kixmöller et al ., 2008). Actualmente Revisión Bibliográfica 49 su uso está registrado para lechones a partir de 3 semanas de vida, aunque de forma excepcional también se utilizan en cerdas nulíparas y/o reproductoras (Opriessnig et al ., 2010; Fraile et al ., 2015; Martelli et al ., 2016). SuvaxynⓇ Circo es una vacuna recombinante. Utiliza un virus quimera inactivado entre PCV1 y PCV2; se utiliza como base el PCV1 pero se reemplaza su ORF2 por la del PCV2 (Fenaux et al ., 2004b). Su uso también está únicamente registrado para lechones a partir de 3 semanas de vida, aunque excepcionalmente también se utiliza en cerdas reproductoras (Hemann et al ., 2014). Recientemente ha comenzado a comercializarse MhyosphereⓇ PCV ID. Esta vacuna utiliza una cepa recombinante e inactivada de M. hyopneumoniae , la cual expresa la proteína de la cápside del PCV2 en su citoplasma. Su uso solamente está registrado para lechones a partir de 3 semanas de vida. De las vacunas mencionadas, MhyosphereⓇ PCV ID es la única bivalente, puesto que también incluye a M. hyopneumoniae . No obstante, todas las demás también disponen de una presentación conjunta con esta bacteria, ya sea de forma combinada (PorcilisⓇ PCV M Hyo; SuvaxynⓇ Circo + MH RTU (Witvliet et al ., 2015)) o permitiendo mezclar las vacunas de PCV2 y de M. hyopneumoniae en el momento previo a su administración (IngelvacⓇ CircoFLEX + IngelvacⓇ MycoFLEX; CircovacⓇ + HyogenⓇ (Kaalberg et al ., 2017; Sibila et al ., 2020)). 1.7.3.2 Defensa inmune tras la vacunación La defensa inmune tras la vacunación frente a PCV2 se basa en la activación de las respuestas inmunes humoral y celular (Kekarainen et al ., 2010; Chae, 2012a). Exceptuando la vacuna MhyosphereⓇ PCV ID ya que hasta la fecha la información disponible es muy limitada, todas las vacunas comerciales inducen una producción eficiente de anticuerpos neutralizantes tras su administración (Figura 19) (Seo et al ., 2014b; Segalés, 2015). La producción de los anticuerpos neutralizantes sigue una dinámica similar a la que se observa en infecciones con el virus, esto es, comienza a partir de los 10 – 15 días post-vacunación. En varios estudios comparativos entre esas cuatro vacunas, se ha observado que SuvaxynⓇ Circo y CircovacⓇ tienden a provocar una mayor producción de anticuerpos neutralizantes que las vacunas de subunidades. No obstante, en todas las vacunas utilizadas se observó que la cantidad de anticuerpos neutralizantes se correlacionaba inversamente con la viremia de PCV2 (Park et al ., 2014; Seo et al ., 2014c, 2014d). GONZALO LÓPEZ LORENZO 50 Figura 19. Respuesta de anticuerpos neutralizantes de cada vacuna tras su administración y posterior desafío con PCV2. Adaptado de Park et al., (2014). En cambio, la respuesta serológica medida como IgG es diferente según la vacuna administrada. Así, las vacunas inactivadas y recombinantes pueden producir desde una seroconversión tras su administración hasta mantener estable el nivel de IgG presentes en el momento de la vacunación (Opriessnig et al ., 2009c; Fraile et al ., 2012b; Seo et al ., 2014b). En cambio, las dos vacunas de subunidades muestran un patrón distinto: por un lado, PorcilisⓇ PCV provoca una seroconversión tras su administración, mientras que IngelvacⓇ CircoFlex no provoca esta respuesta (Martelli et al ., 2011; Koinig et al ., 2015); no obstante, en este último caso, sí se observa la seroconversión si posteriormente el cerdo vacunado tiene contacto con el PCV2 (Koinig et al ., 2015). Esta diferencia entre vacunas se puede deber a la distinta naturaleza que tiene cada una respecto al PCV2 y también por los adyuvantes que utilizan (Chae, 2012a; Segalés, 2015). La respuesta de IgG que provoca cada vacuna es un punto importante para interpretar correctamente los resultados de algunas técnicas de diagnóstico como los ELISA. Así, según la vacuna utilizada, la observación de seroconversión puede ser un efecto inherente a la vacuna o bien indicar la existencia de una circulación de PCV2. Por tanto, de granjas que vacunan frente a PCV2 se debe de tener en cuenta el producto utilizado para una correcta interpretación de los resultados laboratoriales. Respecto a la inmunidad celular, también se ha comprobado que tras la vacunación se induce la producción y el mantenimiento de poblaciones de linfocitos T secretores de IFN-γ (Ferrari et al ., 2014; Seo et al ., 2014b; Segalés, 2015). No obstante, todavía no existe información disponible sobre la vacuna MhyosphereⓇ PCV ID debido a su reciente desarrollo. Al igual que sucede tras la infección por PCV2, las células secretoras de IFN-γ se detectan a partir de las 2 – 3 semanas post-vacunación, Revisión Bibliográfica 51 independientemente de la vacuna comercial utilizada (Figura 20) (Fort et al ., 2009b; Martelli et al ., 2011; Jeong et al ., 2015; Koinig et al ., 2015). Concretamente, en estudios comparativos se ha descrito que la vacuna SuvaxynⓇ Circo tiende a inducir una mayor producción de células secretoras de IFN-γ tras la vacunación que la vacuna CircovacⓇ y ésta, que las vacunas de subunidades. Asimismo, al igual que sucedía con los anticuerpos neutralizantes, en todos los casos la cantidad de células secretoras de IFN-γ estaba inversamente relacionada con la viremia de PCV2 (Park et al ., 2014; Seo et al ., 2014b, 2014c). Figura 20. Respuesta de la producción de células secretoras de IFN-γ de cada vacuna tras su administración y posterior desafío con PCV2. Adaptado de Park et al., (2014). 1.7.3.3 Protocolos vacunales frente a PCV2 1.7.3.3.1 Cerdas reproductoras y nulíparas La vacunación de las cerdas reproductoras y nulíparas puede tener tres objetivos: prevenir la infección por PCV2 en su descendencia, proteger a las cerdas frente a la PCV2-RD, y mantener una inmunidad similar en todo el colectivo. Según el objetivo que se pretenda, el momento de vacunación puede ser diferente (Figura 21). GONZALO LÓPEZ LORENZO 52 Figura 21. Posibles planteamientos y pautas vacunales frente a PCV2 para las cerdas reproductoras. En el primero de los objetivos, el fundamento de vacunar a las cerdas reproductoras entre 15 y 20 días antes del parto (siempre después de una primovacunación previa) se basa en proporcionar inmunidad pasiva a los lechones a través del calostro (Segalés, 2015); por lo tanto, siempre tiene que ir acompañada de un correcto encalostramiento de los lechones (Soraci, 2018). Así, esta pauta vacunal es la recomendada en casos de infecciones tempranas por PCV2 ya que protege a los lechones hasta una edad más avanzada. Se ha demostrado que los lechones procedentes de cerdas vacunadas tienen un mayor nivel de anticuerpos y de IFN-γ frente a PCV2 que los procedentes de cerdas no vacunadas (Opriessnig et al ., 2010; Kurmann et al ., 2011; Fraile et al ., 2012b; Oh et al ., 2012; Oliver-Ferrando et al ., 2018b). Además, esta pauta vacunal es eficaz para reducir la prevalencia de la infección por PCV2, prevenir el desarrollo de PCV2-SD y mejorar la GMD de los lechones de esas cerdas (Opriessnig et al ., 2010; Pejsak et al ., 2010; Kurmann et al ., 2011). En cambio, no impide totalmente la excreción de PCV2 a través de las secreciones lácteas, aunque sí reduce su cantidad (Gerber et al ., 2011). La situación de vacunar a las cerdas para prevenir la PCV2-RD es menos habitual ya que también lo es esta presentación de enfermedad (Chae, 2005). En estos casos lo ideal sería vacunar a las cerdas antes de la cubrición (Segalés, 2015); no obstante, se ha visto que con la pauta vacunal antes descrita o mediante una vacunación en sábana también se consigue evitar la PCV2-RD (Pejsak et al ., 2012). Así, se ha visto que la vacunación antes del parto también consigue evitar desde alteraciones reproductivas hasta proporcionar una mejora en los índices reproductivos (Kurmann et al ., 2011; Pejsak et al ., 2012; Hemann et al ., 2014; Oliver-Ferrando et al ., 2018a). El tercer objetivo de vacunar a las cerdas reproductoras, mantener un nivel estable de inmunidad frente a PCV2, pretende evitar la existencia de subpoblaciones susceptibles y puntualmente padecer fallos reproductivos o infecciones tempranas Revisión Bibliográfica 53 (Martelli et al ., 2015; Figueras et al ., 2016; Oliver-Ferrando et al ., 2018a). Aunque la pauta descrita previamente suele ser suficiente para este fin, la vacunación en sábana facilita el manejo y disminuye el riesgo de posibles interferencias con la vacunación en lechones en caso de altos niveles de anticuerpos maternales (Segalés, 2015). En el caso de las cerdas nulíparas, actualmente lo más habitual es que reciban una primera dosis cuando son lechones y después sean revacunadas durante la fase de aclimatación en la granja de producción (Segalés, 2015). Posteriormente, se decide una revacunación previa al parto o en sábana según la situación particular de cada granja. 1.7.3.3.2 Lechones La vacunación de lechones frente a PCV2 es la medida preventiva más extendida en la producción porcina. Esta medida se basa en la estimulación activa de su sistema inmune y sus efectos se observan de forma casi instantánea, mientras que para lograr un efecto similar sólo con la vacunación de las cerdas reproductoras se precisa de al menos un año de vacunación continuada (Segalés, 2015). La vacunación de los lechones está recomendada cuando la infección por PCV2 ocurre en cerdos a final de transición – inicio de cebo (Chae, 2012a). En general, las vacunas frente a PCV2 se administran a los lechones a partir de las 3 semanas de edad (Segalés, 2015). Se ha comprobado que la vacunación antes de las 8 semanas de vida es eficaz para prevenir infección por PCV2; a partir de esa edad los estudios muestran una pérdida de eficacia debido al poco tiempo entre la vacunación y el contacto con el virus (Cline et al ., 2008; Martelli et al ., 2016). Por el contrario, la vacunación frente a PCV2 antes de las 3 semanas de edad no resulta del todo eficaz debido a una interferencia con la inmunidad maternal. Respecto a este último punto la información es contradictoria: mientras unos trabajos muestran que no existe interferencia con los anticuerpos maternales (Fachinger et al ., 2008; Opriessnig et al ., 2008b; Haake et al ., 2014), otros indican que ésta si puede existir (Fort et al., 2009b; Fraile et al., 2012a). En cualquier caso, es probable que la inmunidad celular también pudiera tener un papel en esa interferencia con la vacunación de los lechones (Oliver-Ferrando et al ., 2018b). En casos muy puntuales puede ser necesario revacunar a los lechones (Horlen et al ., 2008; Opriessnig et al ., 2009c). En estas situaciones otra opción sería utilizar una vacuna intradérmica para evitar una posible interferencia con la inmunidad maternal, puesto que en la dermis no se produce la neutralización del antígeno vacunal. En cualquier caso, todas las vacunas que se administran en torno a las 3 – 4 semanas de vida proporcionan una protección eficaz contra la infección por PCV2, disminuyendo el porcentaje de cerdos infectados, la viremia y la duración de la misma. GONZALO LÓPEZ LORENZO 60 Asimismo, en otros estudios similares se ha demostrado que es posible detectar virus Influenza A, M. hyopneumoniae , virus del PRRS y virus de la DEP en muestras de aire tomadas a 2,1, 9,1, 9,2 y 16 km, respectivamente, de una granja con cerdos infectados (Dee et al ., 2009; Otake et al ., 2010; Corzo et al ., 2013a; Alonso et al ., 2014). A pesar de que la proporción de muestras de aire en que esto ocurre es muy reducida (menos del 5 %), al igual que la cantidad del patógeno, mediante un bioensayo se comprobó que el virus del PRRS y M. hyopneumoniae mantenían capacidad infectante. Por otro lado, las muestras ambientales, y en especial las de aire, han permitido comprender aspectos de la epidemiología de algunas infecciones muy importantes desde el punto de vista de la salud pública, como es la Influenza A. Por ejemplo, se ha comprobado que la vacunación de cerdos con una cepa homóloga a la circulante proporciona mayor eficacia a la hora de reducir la excreción viral que las heterólogas; cuando ocurre un brote en una granja de cerdos, los niveles del virus en el aire se mantienen elevados durante al menos 20 días, con un pico entre el día 7 y el 11 postinfección; a partir de temperaturas de 25 ºC aunque el virus siga presente en el aire y en las superficies, rápidamente su capacidad infectante debido a la desecación (Corzo et al ., 2014; Neira et al ., 2016, 2018). Este conocimiento se puede utilizar para valorar el riesgo de transmisión entre cerdos y humanos en determinadas situaciones, minimizando la probabilidad de que suceda. 1.8.2.2 Herramienta para la vigilancia de infecciones Esta aplicabilidad se ha utilizado para detectar y cuantificar la presencia de patógenos causantes de enfermedades, especialmente aquellos con capacidad zoonótica. Esto último es especialmente relevante ya que el uso de las muestras del ambiente es una forma de minimizar el contacto estrecho de las personas con los cerdos y, por consiguiente, el riesgo de infección. Se ha visto que las muestras de aire y las de superficies son buenos predictores para detectar el virus de la Influenza A respecto a la muestra utilizada como referencia, los fluidos orales (Anderson et al ., 2016; Prost et al ., 2019). En concreto, Prost et al ., (2019) obtuvieron, respecto a los fluidos orales, una sensibilidad del 75,86 % y del 86,21 % para las muestras de superficies y de aire, siendo la especificidad del 77,78 % para ambos casos. De manera similar, también estudiando Influenza A, Neira et al ., (2016) observaron una correlación positiva significativa de 0,69 entre el recuento de positivos en fluidos orales y aire, y de 0,47 entre los fluidos orales y muestras de la superficie de los tabiques. Esto indica una relación directa entre el nivel de excreción por los cerdos y la exposición a través de aerosoles y determinadas superficies. Corzo et al ., (2013b) comprobaron que, en condiciones experimentales, la posibilidad de detectar Influenza A en una muestra de aire se duplicaba por cada cerdo que se infectaba a mayores, llegando a la conclusión que la saturación del aire con Revisión Bibliográfica 61 partículas víricas depende solamente de un mínimo de cerdos infectados (Corzo et al ., 2013b). Es decir, a partir de un determinado porcentaje de cerdos infectados siempre sería posible detectar el virus en muestras de aire. Más recientemente se ha comparado el ratio de detección del virus Influenza A utilizando muestras de lechones individuales (hisopos nasales, orofaríngeos y toallitas nasales), muestras colectivas (fluidos orales, toallitas de la glándula mamaria de las cerdas lactantes y superficies como comederos, tabiques, bebederos) y muestras de aire, analizadas mediante qPCR (Garrido-Mantilla et al ., 2019). Los resultados que obtuvieron indican que las muestras de aire y de superficies muestran mejores ratios de detección que los hisopos nasales analizados en pools (Garrido-Mantilla et al ., 2019). Esta forma de vigilancia también se ha extrapolado a otros patógenos que infectan a los cerdos, como M. hyopneumoniae, A. pleuropneumoniae , S. aureus resistentes a la meticilina, S. suis , PCV2, virus PRRS, Peste Porcina Clásica y Leptospira spp. (Weesendorp et al ., 2008; Dee et al ., 2010; Verreault et al ., 2010; Friese et al ., 2012; Bonifait et al ., 2014; Damte et al ., 2014; Watt et al ., 2020; Wójcik-Fatla et al ., 2020). Concretamente, M. hyopneumoniae y A. pleuropneumoniae se han detectado en muestras de aire de granjas con cerdos infectados (Damte et al ., 2014; Watt et al ., 2020). Habitualmente el abordaje de esos dos patógenos se realiza si se observan signos clínicos respiratorios y, sobre todo, si se observan lesiones significativas en el tejido pulmonar tras el sacrificio de los cerdos (Gottschalk y Broes, 2019). De esta forma, la detección precoz de estas infecciones bacterianas se podría utilizar para mejorar su control. Lo mismo sucede con los demás patógenos mencionados. No obstante, la vigilancia de las infecciones no se refiere únicamente a la detección de determinados patógenos, sino que se incluyen las pruebas complementarias que se pueden realizar a posteriori . Por ejemplo, a partir muestras de aire tomadas en los alrededores de cuatro granjas de cerdos en áreas de alta densidad ganadera, Brito et al ., (2014) lograron secuenciar la mayor parte de las muestras con resultado positivo a virus PRRS. En las cuatro localizaciones detectaron cepas diferentes del virus, pero las de cada localización se agrupaban en un determinado clúster. Además, estos autores también detectaron en varias muestras de aire las cepas de virus PRRS que se utilizan en las vacunas vivas modificadas. Otra aplicación de estas muestras es el estudiar de los perfiles de resistencia antimicrobiana, los genes de resistencia y los factores de virulencia que portan bacterias presentes en la granjas de cerdos como Staphylococcus spp., Enterococcus spp. y Streptococcus spp. (Espinosa-Gongora et al ., 2012; Schmithausen et al ., 2015; Ruiz-Ripa et al ., 2020). Por ejemplo, ya en 2005 se había comprobado que más del 90 % de los géneros microbianos presentaban resistencia al menos a dos familias de antibióticos (Chapin et al ., 2005). Recientemente, a partir de muestras de aire, se ha GONZALO LÓPEZ LORENZO 62 comprobado que ese perfil de resistencia se sigue observando en Staphylococcus aureus aislados en granjas de cerdos (mayores porcentajes de cepas resistentes en granjas intensivas que en semiextensivas), y se añade que portan una gran variedad de genes de resistencia (Ruiz-Ripa et al ., 2020). 1.8.2.3 Evaluación de las medidas de bioseguridad Las muestras ambientales se han utilizado para evaluar la eficacia de protocolos de bioseguridad a la entrada a las granjas, riesgos inherentes al contacto con elementos externos y también la de determinados elementos constructivos para evitar la entrada de infecciones. El protocolo de toma de muestras con hisopos se ha utilizado para evaluar la eficacia de protocolos de baja, media y alta bioseguridad para evitar la transmisión e infección de cerdos con los virus Influenza A y el de la DEP (Allerson et al ., 2013; Kim et al ., 2017). De esta forma, este tipo de muestras han proporcionado importante información para la bioseguridad como que el cambio de los buzos y de calzas, acompañado de un lavado de manos, no se puede considerar suficiente para prevenir la transmisión de estos patógenos (Allerson et al ., 2013; Kim et al ., 2017). Asimismo, el protocolo de hisopado de superficies también se ha utilizado para tomar muestras de camiones que transportan cerdos de las granjas a los mataderos. En un trabajo realizado en el año 2004 se comprobó una estancia de 2 horas era suficiente para que cerdos infectados por el virus del PRRS contaminasen el camión; y que otras 2 horas eran suficientes para que cerdos susceptibles se infectasen (Dee et al ., 2004). A partir de ese trabajo se comenzó a considerar a los vehículos de transporte de cerdos como un riesgo para transmitir infecciones, y las medidas de bioseguridad se deben extremar durante las labores de carga. De hecho, en trabajos posteriores se comprobó que hasta el 6,6 y el 9 % de los vehículos estaban contaminados con ARN del virus de la DEP y con Brachyspira hyodisenteriae , respectivamente (Lowe et al ., 2014; Giacomini et al ., 2018). Pero esto no aplica solamente a los camiones de transporte, ya que utilizando la toma de muestras de superficies se ha comprobado que esto también sucede en los vehículos particulares. Dee et al ., (2002) demostraron que el virus del PRRS se puede detectar en ambientes fríos en los elementos plásticos, metálicos y las ruedas de los vehículos al menos después de 4 horas post-exposición, incluso habiendo recorrido 50 kilómetros. Así, se han podido identificar riesgos potenciales para la entrada del virus del PRRS a las granjas como la acumulación de líquido en los pediluvios tras el paso de vehículos, y la llegada de visitantes y sus enseres. Por otro lado, el análisis del aire del interior de granjas también se ha utilizado para evaluar la eficacia de los sistemas de filtración de aire, los cuáles se han comenzado a utilizar en algunas granjas de cerdos durante la última década (Dee et Revisión Bibliográfica 63 al ., 2006). En condiciones de campo, se ha demostrado que la filtración mecánica de aire es completamente eficaz para impedir la entrada del virus PRRS y de M. hyopneumoniae , mientras que la filtración antimicrobiana no presenta la misma eficacia (Dee et al ., 2010). 1.8.2.4 Evaluación de la eficacia las medidas de limpieza y desinfección (L+D) Garantizar una limpieza y desinfección correcta de las instalaciones siempre es fundamental: desde prevenir infecciones y el desarrollo de enfermedades hasta facilitar la repoblación de algunas granjas tras un brote de enfermedad (Ford, 1995). En línea con este fin, las muestras ambientales, especialmente las de superficies, son extremadamente útiles para valorar la eficacia de las medidas de limpieza y desinfección, no sólo en las granjas de cerdos, sino también en los vehículos utilizados para el transporte de animales. Por ejemplo, se ha comprobado que la limpieza en seco no es eficaz para reducir la carga microbiana en las granjas y los vehículos, si no que se requiere de limpieza en húmedo más desinfección, junto a un tiempo de secado a continuación (Dee et al ., 2004). Aun así, en condiciones de campo se ha visto que estas medidas no son totalmente eficaces ya que en un pequeño porcentaje de casos los patógenos siguen presentes (Friese et al ., 2012; Giacomini et al ., 2018). Para minimizar el riesgo de que esto último suceda, se ha sugerido que algunas medidas como incrementar el tiempo de vacío sanitario en las granjas podrían tener un efecto beneficioso que se sumaría al de la limpieza y desinfección. No obstante, la toma de muestras de superficies y su posterior análisis ha demostrado que esta medida extra no tiene ninguna repercusión más allá de la que tiene la limpieza y desinfección inicial (Luyckx et al ., 2016). 2. OBJETIVOS Objetivos 67 En esta Tesis Doctoral se plantearon los siguientes OBJETIVOS: 1º Determinar la presencia de PCV2 en diferentes superficies y fómites de las granjas a través de la detección y cuantificación de ADN del virus mediante qPCR en granjas con Enfermedad Sistémica por PCV2, con infección subclínica y en granjas que vacunan a los lechones frente a esta infección. 2º En base a los resultados obtenidos, evaluar las áreas, fómites u otros elementos que puedan tener mayor importancia en el mantenimiento la infección, en su diseminación por la granja o entre granjas, y las implicaciones que estos resultados pueden tener en la epidemiología y el control de la infección por PCV2. 3º Estimar el papel de los operarios de las granjas a medida que se mejora el control de la infección por PCV2. 4º Valorar la utilidad del muestreo del aire y de las superficies de las granjas de cebo como herramienta alternativa al muestreo de un número representativo de cerdos para estimar la situación de la infección por PCV2 en la granja. 5º Determinar las superficies y los puntos más adecuados para la toma de muestras de aire con el objetivo de detectar la infección por PCV2 en el conjunto de cerdos durante la fase de cebo. 6º Estudiar el efecto que provoca la vacunación de los cerdos en su nivel de excreción de PCV2 mediante la detección y cuantificación del virus en muestras de aire y de superficies. 7º Aplicar la detección ambiental de PCV2 para estimar la eficacia de los equipos de protección individual que utilizan de modo convencional los visitantes de las granjas de cebo de porcino y evaluar las medidas de bioseguridad a seguir en las visitas. 3. ESTUDIO I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino GONZALO LÓPEZ LORENZO 76 3.2.2 Toma de muestras ambientales El protocolo de muestreo se diseñó considerando las Normas ISO 13307, para la etapa de producción primaria; y ISO 18593, para la toma de muestras a partir de superficies utilizando placas de contacto e hisopos, así como bibliografía previa (Dee et al ., 2002; Otake et al ., 2002a; Ridley et al ., 2011; Espinosa-Gongora et al ., 2012; Bangerter et al ., 2016; Neira et al ., 2016). Todas las muestras ambientales se tomaron con hisopos de algodón con mango, de 11 milímetros de diámetro (Deltalab S.L., Barcelona, España), previamente esterilizados en autoclave a temperatura de 121ºC durante 30 minutos. El hisopo se frotó por las diferentes superficies a muestrear, en dirección vertical, diagonal y horizontal y rotándolo entre los dedos. A continuación, cada hisopo se introdujo en un tubo de 12 ml (PS Tapado FALDON B/U; Deltalab S.L., Barcelona, España), cortando el mango de madera e identificando el tubo con el nombre de la muestra, que se guardó a temperatura ambiente hasta su llegada al laboratorio. Este método fue seleccionado puesto que previamente ha demostrado su eficacia detectar virus en muestras ambientales procedentes de producciones ganaderas (Prieto et al ., 2014). 3.2.2.1 Protocolo de toma de muestras ambientales Se consideraron muestras de 39 superficies diferentes (se muestran ejemplos de cada muestra en el Anexo I), utilizando un hisopo por cada superficie. El protocolo para la toma de cada muestra ambiental fue el siguiente:  Comedero de las cerdas: en las salas de partos. Se tomaron muestras de ocho comederos diferentes, seleccionados al azar. En cada uno se delimitó una superficie de 25 x 25 cm (Espinosa-Gongora et al ., 2012) con unas plantillas de material maleable, previamente esterilizado.  Jaula de las cerdas: las muestras se tomaron de las jaulas que correspondían con las mismas cerdas que las muestras de los comederos. Se incluyeron las barras inferiores y posteriores, por el lado interior y por el exterior.  Área de descanso de los lechones: las muestras se tomaron de las mismas cerdas que las muestras de los comederos y de las jaulas. En cada camada se delimitó un área de 25 x 25 cm.  Caja de lechones: se incluyó el 50% de la superficie de su interior.  Pasillos de las salas de partos: se colocaron calzas desechables y se dieron 100 pasos (Norma ISO 13307). A continuación se pasó el hisopo por la superficie ventral de la calza en zigzag desde la punta hasta el talón, y regresando a la punta (Dee et al ., 2002).  Ventiladores de las salas de partos: se incluyeron las aspas o la rejilla protectora de al menos dos ventiladores diferentes. Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 77  Caja de utensilios: al igual que se indicó en el epígrafe “caja de lechones”, incluyendo en este caso también la superficie de jeringuillas u otros elementos que pudiese haber.  Tolvas de los lechones: en las salas de transición. Las muestras de ocho tolvas diferentes, como se indicó en el epígrafe “comedero de las cerdas”.  Pared de los corrales de transición: en los mismos ocho corrales que las tolvas de los lechones y siguiendo el mismo protocolo. Se buscó la zona limpia del corral, a la altura del hocico del lechón (Bangerter et al ., 2016).  Suelo de los corrales de transición: correspondiente zona sucia del corral. Como se indica en “pasillos partos”.  Pasillos de las salas de transición: de igual modo que en “pasillos partos”.  Polvo de los tabiques de las salas de transición: parte superior de los tabiques, en zigzag por aproximadamente 1 m de longitud.  Ventiladores de las salas de transición: como se indicó en “ventiladores de las salas de partos”.  Tolva de las cerdas: en las salas de gestación. Igual que se indicó en “comedero de las cerdas”.  Pared de los corrales de gestación: de igual modo que en la pared de los corrales de las salas de transición.  Suelo de los corrales de gestación: del mismo modo que en el suelo de los corrales de transición.  Pasillos de las salas de gestación: como se mencionó en “pasillos de las sala de partos”.  Suelo del almacén: de igual forma que se indicó en “pasillos de la sala de partos”.  Mango de los utensilios: toda la longitud del mango de al menos cinco enseres, empleando al menos diez segundos con cada uno.  Cazo de alimentación: el asa de al menos tres cazos y al menos el 50% de las vagonetas de alimentación.  Hidrolimpiadora: al menos el 50% de la superficie.  Tableros: al menos dos tableros diferentes con el mismo hisopo, muestreando en cada uno al menos el 50% de su superficie.  Manos de los trabajadores: superficie dorsal y ventral de cada mano, a lo largo de cada dedo, área ventral de las uñas y la región del carpo de un operario (Otake et al ., 2002a).  Fosas nasales: se introdujo aproximadamente 1,25 cm del hisopo en cada fosa nasal (Otake et al ., 2002a). El mismo operario que las manos.  Pelo/Gorro: el hisopo se pasó tres veces por la circunferencia de la cabeza (Otake et al . 2002a). Del mismo operario que las manos y las fosas nasales. GONZALO LÓPEZ LORENZO 78  Ropa de trabajo: área del pecho, de la parte delantera y trasera de cada pierna, desde la rodilla al tobillo, y de los antebrazos por completo empleando al menos 15 segundos en cada zona. También del mismo operario.  Botas de trabajo: la superficie ventral de cada zapato en zigzag desde la punta hasta el talón, y regresando a la punta (Dee et al ., 2002). También del mismo operario.  Ropa de calle: del mismo modo que la “ropa de trabajo”.  Calzado de calle: igual que “botas de trabajo”.  Vehículo: manilla, superficie del volante, pedales y freno de mano, junto con una superficie de 25x25 cm del salpicadero y del asiento del conductor (Ridley et al ., 2011).  Suelo de la oficina: del mismo modo que “pasillos de las salas de partos”.  Pomo de las puertas de la oficina: al menos tres pomos diferentes, empleando diez segundos en la manilla interior y en la exterior (Neira et al ., 2016).  Bolígrafos/Teclado: toda la superficie del teclado del ordenador o al menos cinco bolígrafos diferentes.  Mesa/Sillas: toda la superficie de una silla (asiento y respaldo) o de la mitad de una mesa.  Parking: se incluyó el área del parking, charcos y rodaduras de vehículos en el exterior de la granja. Se colocaron calzas desechables con las que se dieron 100 pasos, y a continuación se tomó la muestra igual que se ha descrito anteriormente.  Entrada principal: igual que “parking”, pero dentro del perímetro de la granja en el área que conduce a la entrada principal de la granja.  Cargadero: igual que “parking”, pero por la zona dedicada a la carga/descarga de cerdos, y en la zona donde estaciona el camión durante el proceso.  Cabestrante del contenedor de cadáveres: todo el área del cabestrante del contenedor.  Peldaño de los silos: al menos cinco peldaños diferentes de dos silos de almacenamiento de pienso. 3.2.2.2 Clasificación de las muestras ambientales Las muestras ambientales se corresponden a superficies de distintas dependencias de la granja; como tal, se clasificaron en varias categorías según su área de procedencia. Esta organización se hizo a priori, incluyendo cada tipo de muestra ambiental siempre en la misma categoría. En la Tabla 11 se indican las categorías ambientales, así como las muestras que se incluyen en cada una. Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 79 Tabla 11. Categorías ambientales establecidas y muestras incluidas en cada una de ellas. Categoría Muestras ambientales incluidas Sala de Partos (salas con lechones de > 10 días de vida) Comedero cerda. Jaula cerda. Área lechones. Caja lechones.* Pasillos partos. Caja utensilios. Ventiladores partos. Sala de Transición (salas con lechones de > 60 días de vida) Tolva lechones. Pared corral. Suelo corral. Pasillo transición. Polvo tabique. Ventilador transición. Sala de Gestación Tolva cerdas. Pared gestación.* Suelo gestación. Pasillo gestación. Almacén Suelo almacén. Tableros. Mango utensilios. Máquina lavar. Cazo alimentación. Trabajadores Manos. Fosas nasales. Pelo/Gorro. Ropa trabajo. Botas trabajo. Ropa calle.* Calzado calle.* Vehículo.* Oficina Suelo oficina. Pomo puertas. Mesa/Sillas. Bolígrafos/teclado. Perímetro Parking exterior. Cargadero.* Entrada principal. Peldaños silos. Cabestrante contenedor cadáveres.* *Muestras que no se utilizaron para comparar los grupos estudiados porque no se pudieron tomar en todas las granjas. 3.2.3 Análisis laboratorial de las muestras La determinación de la presencia de PCV2 mediante qPCR en todas las muestras disponibles se realizó en el laboratorio de Enfermedades Infecciosas de la Facultad de Veterinaria de Lugo. El análisis histopatológico e inmunohistoquímico de las muestras de órganos se realizó en los laboratorios de Anatomía Patológica de la Facultad de Veterinaria de Lugo y se remitió al servicio de diagnóstico de la Universidad Autónoma de Barcelona respectivamente. 3.2.3.1 Muestras de órganos Las muestras incluidas en formol tamponado al 10 % se fijaron durante 72 horas y se incluyeron en parafina siguiendo los pasos descritos en la Tabla 12. A continuación, las muestras en parafina se congelaron a -30ºC durante al menos 24 horas, se cortaron en un microtomo Microm HM 310 (GMI, Minnesota, Estados Unidos) con un grosor de 4 μm, se extendieron en baño – maría a 37 ºC y se fijaron en un portaobjetos. Tras dejarlas secar durante 24 horas a 37 ºC se tiñeron con Hematoxilina – Eosina (H-E) (Tabla 13). GONZALO LÓPEZ LORENZO 80 Tabla 12. Pasos, reactivos y tiempos utilizados para la inclusión en parafina Pasos Reactivo Tiempo Deshidratación 1º (x2) Formol 1 hora 2º Agua 1 hora 3º Etanol 70º 2 horas 4º Etanol 80º 1 hora 5º Etanol 96º 1 hora 6º Etanol 100º 1 hora 7º Etanol 100º 2 horas Aclarado 1º (x2) Xileno 1 hora 30 minutos Inclusión 1º Parafina 1 hora 2º Parafina 2 horas Reactivos suministrados por Panreac Química SLU (Barcelona, España) Tabla 13. Protocolo de tinción Hematoxilina – Eosina. Pasos Reactivo Tiempo Hidratación de la muestra 1º (x2) Xileno 10 minutos 2º (x2) Etanol 100º 4 minutos 3º (x2) Etanol 96º 4 minutos 4º Etanol 80º 4 minutos 5º Etanol 60º 4 minutos 6º Agua corriente 2 minutos Tinción 1º Hematoxilina 10 minutos 2º Carbonato de Litio 15 segundos 3º Eosina 5 minutos Deshidratación de la muestra 1º Etanol 60º 1 minuto 2º Etanol 80º 1 minuto 3º (x2) Etanol 96º 1 minuto 4º (x2) Etanol 100º 3 minutos 5º (x2) Xileno 10 minutos Reactivos suministrados por Panreac Química SLU (Barcelona, España) Finalmente, se fijaron cubreobjetos sobre las muestras con Depex Mounting Medium (VWR, Pensilvania, Estados Unidos) y se secaron a 37 ºC durante 24 horas hasta su visualización en microscopio óptico Leica DM 2500 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). A partir de las tinciones de H-E, las muestras de bazo y ganglios linfáticos se consideraron compatibles con la infección por PCV2 cuando cumplieron los criterios establecidos por Opriessnig et al . (2004b) y Grau-Roma et al . (2009):  Moderada depleción linfoide y/o pérdida de la estructura folicular.  Inflamación granulomatosa en al menos un tercio – mitad de los folículos. Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 81 A partir de las tinciones de H-E de las muestras de pulmón se comprobó la presencia de neumonía, con presencia de histiocitos y células gigantes multinucleadas en los septos alveolares y áreas peribronquial y peribronquiolar (Segalés y Domingo, 2002; Opriessnig et al ., 2004b). Por otro lado, se hizo una inmunohistoquímica con las muestras de los órganos en los laboratorios de la Universidad Autónoma de Barcelona siguiendo sus protocolos. En cuanto a las muestras de órganos previamente congeladas se utilizaron para hacer una extracción de ADN utilizando el kit comercial High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) siguiendo las instrucciones indicadas en el mismo (Tabla 14). La cantidad de PCV2 en las muestras de órganos se expresó como copias PCV2/g órgano (Ecuación 1, Pág. 86). 3.2.3.2 Muestras de sangre Las muestras de sangre procedentes de los 20 lechones de cada granja se organizaron aleatoriamente en pools de cinco animales, siguiendo recomendaciones previas (Cortey et al ., 2011b). La extracción de ADN a partir de los pools de sangre se realizó utilizando el kit comercial High Pure PCR Template Preparation Kit, siguiendo las instrucciones indicadas en el mismo (Tabla 14). La cantidad de PCV2 en los pools de sangre se expresó como copias PCV2/ml sangre (Ecuación 2, Pág. 87). 3.2.3.3 Muestras ambientales Las muestras ambientales se procesaron siempre en las primeras 24 horas tras llegar al laboratorio. El protocolo para la elución de los hisopos fue el siguiente: 1. A cada tubo con el hisopo ambiental se añadieron 5 ml de PBS estéril con 0,05% de Tween 20 (PBS-T). 2. Cada tubo se agitó en posición vertical durante 1 minuto. 3. A continuación, la suspensión se dejó reposar durante 15 minutos en posición vertical. 4. Se transfirió 1 ml de la suspensión a un tubo Eppendorf estéril, que se guardó a -30ºC hasta la extracción del ADN. Puesto que en este tipo de muestras puede haber sustancias inhibidoras de la PCR, el protocolo de extracción para las muestras ambientales se hizo siguiendo el esquema recomendado por Prieto et al ., (2017). La extracción de ADN se realizó utilizando dos kits comerciales: GONZALO LÓPEZ LORENZO 82  High Pure PCR Template Preparation Kit.  Nucleospin® Soil (Macherey-Nagel GmbH, Düren, Alemania). Todas las muestras se procesaron con el primer kit. El segundo únicamente se empleó con las muestras ambientales que fueron negativas a PCV2 después de hacer la qPCR al ADN obtenido tras la extracción realizada con el primer kit. En ambos casos se siguieron las instrucciones indicadas por el fabricante, añadiendo a cada muestra un ADN control (EXOone EXIC, EXOPOL S.L., Zaragoza, España) para identificar posibles inhibiciones de la qPCR. El protocolo de extracción de ADN a partir de muestras ambientales con el kit High Pure PCR Template Preparation Kit se indica en la Tabla 14. Tabla 14. Protocolo de extracción de ADN para el kit High Pure PCR Template Preparation Kit para cada tipo de muestra. Sangre Órganos Ambiental Un tubo Eppendorf estéril por muestra Preparar pooles: Añadir 40 μl de sangre entera de cada cerdo, hasta un volumen de 200 μl Material de inicio: 200 μl Material de inicio: 50 mg Material de inicio: 200 μl Añadir 200 μl de Tissue Lysis Buffer y 40 μl de Proteinasa K Agitar durante 1 min Incubar a 55ºC durante 1 hora con agitación de 430 x g Añadir 200 μl de Binding Buffer y 40 ul de Proteinasa K Añadir 200 μl de Binding Buffer Agitar durante 1 min Incubar a 70ºC durante 10 min con agitación de 430 x g Añadir 10 μl de EXOone Exogenous Control Añadir 100 μl de Isopropanol, agitar durante 15 s y dar un pulso de centrífuga hasta 8000 x g Transferir el contenido de cada Eppendorf a una columna de filtrado con su respectivo tubo colector Centrifugar a 8000 x g durante 1 min y desechar el contenido del tubo colector Añadir a cada columna 500 μl de Inhibitor Removal Buffer Centrifugar a 8000 x g durante 1 min y desechar el contenido del tubo colector Añadir a cada columna 500 μl de Wash Buffer Centrifugar a 8000 x g durante 1 min y desechar el contenido del tubo colector Repetir los dos pasos anteriores Centrifugar a 11000 x g durante 3 min y desechar el tubo colector Colocar las columnas en tubos eppendorf estériles y añadir a cada columna 100 μl de Elution Buffer precalentado a 70ºC Incubar durante 1 min a temperatura ambiente, centrifugar a 8000 x g durante 1 min y desechar las columnas Guardar los eppendorf con el ADN extraído a -30ºC hasta realizar la qPCR Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 83 El protocolo de extracción de ADN a partir de muestras ambientales con el kit Nucleospin® Soil fue el siguiente: 1. Preparación de las muestras. Una vez descongeladas, se agitaron durante 1 min y se transfirieron 200 μl de cada elución a un NucleoSpin® Bead Tube. 2. A cada NucleoSpin® Bead Tube se añadieron 700 μL del tampón SL1 y se agitaron en un agitador (BenchMixerTM, Benchmark Scientific, Edison, Nueva Jersey, EE.UU.) durante 5 min. Después se centrifugaron a 11000 x g durante 2 min. 3. Se añadieron 150 μl de tampón SL3 y se agitaron durante 5 s. Se incubaron a 4ºC durante 5 min y se centrifugaron a 11000 x g durante 1 min. 4. Se transfirieron 650 μl del contenido del NucleoSpin® Bead Tube a un NucleoSpin® Inhibitor Removal Column, colocado sobre un tubo Eppendorf; se centrifugaron a 11000 x g durante 1 min, desechando los NucleoSpin® Bead Tube. 5. A cada tubo Eppendorf con la muestra se añadieron 250 μl de tampón SB y 10 μL de EXOone Exogenous Control. 6. Los eppendorf se agitaron 15 s y posteriormente se sometieron a un pulso de centrífuga. 7. Se transfirieron 550 μl a un NucleoSpin® Soil Column colocado sobre un tubo colector y se centrifugaron a 11000 x g durante 1 min. Se desechó el líquido de los tubos colectores y se repitió el proceso con el resto de la muestra. 8. Se añadieron 500 μl de tampón SB a cada NucleoSpin® Soil Column. Se centrifugaron a 11000 x g durante 30 s y se desechó el líquido de los tubos colectores. 9. A cada NucleoSpin® Soil Column se añadieron 550 μl de tampón de lavado SW1, se centrifugaron a 11000 x g durante 30 s, se desechó el líquido de los tubos colectores. 10. A cada NucleoSpin® Soil Column se añadieron 700 μl de tampón de lavado SW2. Se agitaron durante 2 s, se centrifugaron a 11000 x g durante 30 s y se desechó el líquido de los tubos colectores. 11. Se repitió el proceso anterior para realizar un segundo lavado. 12. Los NucleoSpin® Soil Column con los tubos colectores se centrifugaron a 9000 x g durante 3 min. 13. Los NucleosSpin® Soil Column se colocaron en Eppendorf estériles para recoger el ADN. 14. A cada NucleosSpin® Soil Column se añadieron 100 μl de tampón SE precalentado a 80ºC. Se dejaron incubar a temperatura ambiente con las tapas abiertas y a continuación se centrifugaron a 8000 x g durante 30 s. 15. Los NucleosSpin® Soil Column se desecharon y los tubos Eppendorf con la elución del ADN se guardaron a -30ºC hasta la realización de la qPCR. GONZALO LÓPEZ LORENZO 84 La cantidad de PCV2 en las muestras ambientales se expresó como copias PCV2/hisopo (Ecuación 3, Pág. 87). 3.2.3.4 PCR cuantitativa para PCV2 Los ADN extraídos a partir de las muestras de sangre, órganos y muestras ambientales se analizaron mediante qPCR para detectar y cuantificar la presencia de ADN de PCV2. Para ello se empleó un termociclador ABI PRISMR 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems®, California, Estados Unidos) y se utilizó el kit comercial EXOone PCV2 OneMIX (EXOPOL S.L., Zaragoza, España), que detecta genes específicos del ORF2 del virus. El kit está compuesto por los reactivos indicados en la Tabla 15: Tabla 15. Reactivos del kit EXOone PCV2 OneMix Referencia Descripción PCV2 oneMix Máster mix que contiene buffer, ADN polimerasa y primers específicos para la detección de PCV2 y del control endógeno PRS2 Control positivo para PCV2 Agua Agua libre de nucleasas El protocolo de la mezcla para la qPCR fue el siguiente: 1. Preparación de los reactivos: las extracciones de ADN y los reactivos del EXOone PCV2 se retiraron del congelador a -30 ºC y se dejaron a temperatura ambiente hasta que recuperaron el estado líquido. 2. Agitación de los reactivos y extracciones de ADN durante 10 s, seguidos de un pulso de centrífuga. 3. Dispensación de 15 μl de PCV2 oneMIX en cada pocillo de una placa MicroAMP® Optical 96-Wll Reaction Plate Kit Barcode o en pocillos individuales AB-1502 8-tube Strips (Applied Biosystem®, California, Estados Unidos). 4. Adición de 5 μl de la extracción de ADN, del control positivo o del control negativo (agua libre de nucleasas). 5. Cierre de los pocillos individuales o toda la placa con un film adhesivo. 6. Centrifugación de los pocillos o placa a 1400 x g durante 1 min en centrífuga Eppendorf Centrifuge 5804 (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania). 7. Colocación de la placa en el termociclador y programación del protocolo térmico (Tabla 16) y de detección del patógeno. a. En todos los casos se utilizó como control positivo el proporcionado por el kit y como control negativo agua libre de nucleasas. Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 85 Tabla 16. Protocolo térmico de la PCR en tiempo real empleada Número de ciclos Tiempo Temperatura 1 5 minutos 95ºC 42 15 segundos 95ºC 1 minuto 60ºC La qPCR proporciona dos lecturas de fluorescencia (directamente relacionadas con la cantidad de ADN):  Canal FAM: detección de ADN de PCV2.  Canal VIC: detección de ADN del control interno positivo. El control interno detectado fue β-actina. Este gen está presente en todas las células eucariotas y se utiliza ampliamente como control interno en estudios de biología molecular (Stürzenbaum y Kille, 2001). En las muestras ambientales este ADN es el que se añade con EXOone Exogenous Control. El umbral a partir del cual se consideró una lectura de fluorescencia como positiva fue establecido en el 5% de la fluorescencia máxima del canal, la cual se obtiene con el Control Positivo. Por tanto, el Cycle threshold (Ct) de cada muestra correspondió con el ciclo de la qPCR en el que la fluorescencia del canal FAM alcanzó el 5% de la fluorescencia máxima del Control Positivo. La interpretación de los resultados se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. No obstante, en el caso de muestras ambientales se decidió incluir como positivas las muestras con Ct ≤ 42, siempre que el Ct del EXOone Exogenous Control estuviese en los valores indicados por el fabricante (Ct 31 +/- 2). 3.2.3.4.1 Construcción de la recta de cuantificación de la qPCR Para cuantificar el número de copias de PCV2 que se corresponden con cada Ct de la qPCR se construyeron rectas de cuantificación definidas por la siguiente fórmula: 𝑦 = 𝑎𝑥 +𝑏 Donde y representa el Ct, a la pendiente de la recta, x el logaritmo decimal del número de copias de PCV2 y b la ordenada en origen. Para la construcción de estas rectas de cuantificación se realizaron qPCR a partir de cantidades de ADN conocido. El control positivo del kit EXOone PCV2, una vez reconstituido, tiene una concentración de 105 copias/μl. 50 μl de este control se homogenizaron con 450 μl de agua libre de nucleasas; de esta nueva mezcla se volvieron a tomar 50 μl y se homogenizaron con otros 450 μl de agua molecular, repitiendo este paso otras 2 veces sucesivas para obtener un gradiente de 4 reducciones decimales progresivas (Figura 27). GONZALO LÓPEZ LORENZO 92 Tabla 22. Descripción de las granjas con pauta vacunal frente a PCV2. Granja F G H I Censo reproductoras 360 200 300 300 Nº edificios 3 1 1 1 Nº Salas de partos 7 6 6 6 Nº Salas de transición 6 4 6 7 Nº Salas de gestación 1 1 1 1 Almacén Si Si Si Si Oficina / vestuarios Si Si Si Si Orientación productiva Lechones Lechones Lechones Lechones Manejo en bandas Bandas 3 semanas Bandas 3 semanas Bandas 3 semanas Bandas 3 semanas Pauta vacunal PCV2 Lechones 4 semanas edad Lechones 3 semanas edad Lechones 3 semanas edad Lechones 3 semanas edad Tiempo vacunando frente a PCV2 7 – 8 años 7 – 8 años 7 – 8 años 7 – 8 años Vacuna utilizada Ingelvac CircoFLEX Ingelvac CircoFLEX Ingelvac CircoFLEX Ingelvac CircoFLEX 3.3.2 Rectas de cuantificación de la qPCR de PCV2 Se obtuvieron dos rectas de cuantificación, ambas con un ajuste muy bueno (R2 > 0,99), y una eficiencia de la amplificación del 96,64% para la primera y del 93,05% para la segunda (Figura 28). Figura 28. Rectas de cuantificación utilizadas para calcular el número de copias de PCV2 en cada muestra. Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 93 3.3.3 Presencia de la infección por PCV2 en las granjas 3.3.3.1 Granjas sin vacunación frente a PCV2 De las cinco granjas que se visitaron, sólo la Granja E presentó signos clínicos compatibles con la infección por PCV2. A su vez, esta granja también fue la única en la que se detectó un incremento de la mortalidad que afectaba a lechones de entre 7 y 10 semanas de vida. De esta granja se realizó la necropsia a tres lechones que habían fallecido en esa franja de edad. En el resto de granjas sin vacunación (Granjas A-D) no se apreciaron signos clínicos compatibles con la infección ni tampoco se reportaron incrementos de mortalidad. A su vez, en todas las granjas se detectaron cerdos infectados. En todos los pools de sangre de la Granja E se detectó ADN de PCV2; en cambio, en las granjas A, B, C y D sólo un pool fue positivo a PCV2, y nunca se alcanzó el nivel de la viremia mostrada por los de la Granja E (Tabla 23). Tabla 23. Resultados de la detección de PCV2 en granjas sin vacunación. GRANJA Signos clínicos compatibles Incremento de mortalidad a Nº pool (Edad b) Copias PCV2/ml sangre GRANJA A No No A1 (8 sem) Neg. A2 (8 sem) Neg. A3 (10 sem) Neg. A4 (10 sem) 9,77 x105 GRANJA B No No B1 (8 sem) Neg. B2 (8 sem) Neg. B3 (8 sem) Neg. B4 (11 sem) 1,38 x106 GRANJA C No No C1 (9 sem) 1,74 x106 C2 (9 sem) Neg. C3 (12 sem) Neg. C4 (12 sem) Neg. GRANJA D No No D1 (10 sem) 1,48 x106 D2 (10 sem) Neg. D3 (12 sem) Neg. D4 (12 sem) Neg. GRANJA E Sí Sí E1 (8 sem) 9,33 x108 E2 (8 sem) 4,57 x106 E3 (11 sem) 1,62 x107 E4 (11 sem) 4,27 x106 a Dato aportado por el veterinario/a responsable de la explotación b Semanas de vida de los cerdos que forman el pool GONZALO LÓPEZ LORENZO 94 En cuanto a las bajas muestreadas en la Granja E, dos de los tres lechones analizados (nº 2 y 3) resultaron positivos a PCV2 en alguno de los órganos (Tabla 24). Sin embargo, los resultados presentados por los lechones fueron variables. Las muestras de bazo y de ganglios linfáticos inguinales del lechón nº 2 fueron positivas, pero con una cantidad reducida de PCV2 (1,10 x 104 y 2,51 x 106), mientras que el lechón nº 3 presentó todos los órganos positivos con valores superiores a 108 copias PCV2/g órgano. Tabla 24. Resultados de la cuantificación de PCV2 en los órganos estudiados mediante qPCR. ID Resultado PCR Copias PCV2/g órgano G.E. Bazo 1 Negativo Neg G.E. Pulmón 1 Negativo Neg G.E. Gan. Linf 1 Negativo Neg G.E. Bazo 2 Positivo 1,10 x104 G.E. Pulmón 2 Negativo Neg G.E. Gan. Linf 2 Positivo 2,51 x106 G.E. Bazo 3 Positivo 8,49 x1011 G.E. Pulmón 3 Positivo 3,02 x1012 G.E. Gan. Linf 3 Positivo 2,77 x1012 En las Figuras 29, 30, 31, 32 y 33 se muestran las imágenes de la histología y de la inmunohistoquímica de los órganos que fueron positivos en la qPCR. Se observan lesiones compatibles con la infección por PCV2 como la depleción linfoide, inflamación granulomatosa y pérdida de la estructura folicular en el bazo y los ganglios linfáticos inguinales (Figuras 29 y 31), infiltración de histiocitos y presencia de células gigantes multinucleadas (Figura 32 y 33). Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 95 Figura 29. Granja E Bazo 3. Tinción H-E 4x. Severa depleción linfoide con pérdida de la estructura de los folículos linfoides y presencia de un infiltrado de histiocitos. La inmunohistoquímica muestra una abundante cantidad de antígeno de PCV2. Lesión compatible con PCV2 y presencia del virus en el tejido. Figura 30. Granja E Pulmón 3. Tinción H-E 4x. Neumonía con infiltración de histiocitos y presencia de células inflamatorias en la luz bronquial. La inmunohistoquímica muestra una abundante cantidad de antígeno de PCV2, localizada principalmente en el área peribronquiolar. Lesión compatible con PCV2 y presencia del virus en el tejido. GONZALO LÓPEZ LORENZO 96 Figura 31. Granja E Ganglio linfático Inguinal 3. Tinción H-E 4x. Severa depleción linfoide con pérdida de la estructura folicular del órgano. Inflamación granulomatosa en el parénquima linfoide. La inmunohistoquímica presenta una gran cantidad de antígeno de PCV2 en este órgano. Lesión compatible con PCV2 y presencia del virus en el tejido. Figura 32. Granja E Bazo 3. Tinción H-E 40x. Presencia de células gigantes multinucleadas e infiltración de histiocitos. Lesión compatible con infección por PCV2. Figura 33. Granja E Pulmón 3. Tinción H-E 40x. Presencia de células gigantes multinucledas y polimorfonucleares. Lesión compatible con infección por PCV2. Los resultados obtenidos permiten diagnosticar la presencia de la Enfermedad Sistémica por PCV2 (PCV2-SD) en la Granja E, mientras que en el resto de granjas sin vacunar frente a PCV2 se concluyó la existencia una infección subclínica por PCV2 (PCV2-SI). Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 97 3.3.3.2 Granjas con vacunación frente a PCV2 Ninguna de las cuatro granjas que vacunaban a los lechones mostró signos clínicos compatibles con la infección por PCV2 ni tampoco manifestaron un incremento de la mortalidad. Además, no se detectó ningún pool de sangre positivo a PCV2, lo que sugiere que en ninguna de estas granjas la prevalencia de infección al final de la fase de transición alcanzaba el 15%. 3.3.4 Detección del PCV2 en el ambiente de las granjas 3.3.4.1 Sin vacunación frente a PCV2 Se detectó ADN de PCV2 en las muestras ambientales de las cinco granjas sin vacunación. De un total de 179 muestras ambientales, 73 (40,78%) fueron positivas. En la Tabla 25 se resumen los resultados obtenidos en cada granja sin vacunación. Tabla 25. Resultados descriptivos de las muestras ambientales en cada granja sin vacunar frente a PCV2. Granja nº pos/nº total (% pos) Promedio* Desviación típica* Rango* A 20 / 39 (51,28 %) 1,48 x105 2,72 x105 6,84 x102 – 9,77 x105 B 11 / 34 (32,35 %) 3,43 x104 1,06 x105 1,70 x102 – 3,55 x105 C 11 / 39 (28,20 %) 3,18 x105 4,95 x105 1,66 x103 – 1,43 x106 D 5 / 36 (13,89 %) 3,32 x104 6,24 x104 2,82 x102 – 1,45 x105 E 26 / 31 (83,87 %) 3,75 x106 9,38 x106 7,59 x102 - 4,07 x107 Total 73 / 179 (40,78 %) 1,43 x106 5,80 x106 1,70 x102 - 4,07 x107 *Expresado como copias de PCV2/hisopo En la Granja E, la única en que se había diagnosticado PCV2-SD, se detectó un porcentaje de muestras ambientales contaminadas por PCV2 estadísticamente superior que en el resto de granjas, todas ellas con PCV2-SI. Además, la cantidad de PCV2 detectada en las muestras contaminadas también fue mayor de forma estadísticamente significativa que en el resto de granjas, salvo en el caso de la Granja C (Tabla 26). En la Figura 34 se representa la distribución del logaritmo decimal del número de copias de PCV2 en las muestras contaminadas en cada granja. GONZALO LÓPEZ LORENZO 98 Tabla 26. Comparaciones pareadas entre granjas sin vacunación. Se subrayan las diferencias significativas. Granjas comparadas (i / j) Proporción de muestras positivas a PCV2 (Test Chi-cuadrado) Media de copias de PCV2 (ANOVA) p-valor ajustado* ODDS Ratio Diferencia de medias (i – j) p-valor α A / B 1,000 2,203 0,926 0,246 A / C 0,370 2,681 -0,485 0,821 A / D 0,001 6,536 0,450 0,945 A / E <0,001 0,202 -1,405 0,001 B / C 1,000 0,821 -1,411 0,049 B / D 0,666 2,967 -0,476 0,949 B / E <0,001 0,092 -2,331 <0,001 C / D 1,000 2,433 0,935 0,603 C / E <0,001 0,075 -0,919 0,213 D / E <0,001 0,031 -1,855 0,016 *Ajuste del p-valor utilizando la corrección de Bonferroni α p-valor de la prueba post-hoc de Scheffé Figura 34. Distribución del logaritmo decimal del número de copias de PCV2 en las muestras positivas en cada granja sin vacunar. El color de las cajas representa el porcentaje de muestras ambientales positivas en cada granja. Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 99 Estos resultados muestran que los cerdos no vacunados frente a PCV2 son capaces de producir una considerable contaminación de las superficies e instalaciones de las granjas ambiente, incluso sin existir signos clínicos de enfermedad. Esta elevada contaminación ambiental podría explicar la presencia ubicua y endémica del virus en todas las explotaciones comerciales de porcino. El mayor porcentaje de muestras ambientales positivas y la mayor carga viral detectada en la Granja E concuerda con que en las granjas con PCV2-SD, la prevalencia de infección, la viremia y la excreción viral son mayores que en las granjas sin signos clínicos (Larochelle et al ., 2003; Segalés et al ., 2005b; Brunborg et al ., 2010), y contribuyen a una mayor presencia del virus en el ambiente de la granja. En el caso de las granjas con PCV2-SI también se observaron variaciones significativas a pesar de proceder de explotaciones con un estado sanitario similar respecto a esta infección. Probablemente otros factores que no se han controlado en este estudio, como la proximidad de las dependencias en una misma instalación, la ventilación u otros relacionados con el estado sanitario de los cerdos… han podido influir en estos resultados (Dorr et al ., 2007; Segalés et al ., 2013; Battersby et al ., 2016). Así, estos resultados sugieren la necesidad de estudios más amplios que permitan una mejor caracterización de los factores relacionados con la contaminación ambiental por PCV2. 3.3.4.2 Con vacunación frente a PCV2 En las granjas que vacunaban a los lechones frente a PCV2 también se encontró ADN del virus en muestras del ambiente. De 146 muestras ambientales, en 30 se detectó ADN de PCV2, estando presente en todas las explotaciones analizadas (Tabla 27). La carga vírica de las muestras contaminadas en cada granja se observa en la Figura 35. Destaca la Granja H, en la cual sólo se detectó PCV2 en una muestra ambiental. Esta peculiaridad implicó que en esta granja el porcentaje de muestras ambientales fuera significativamente menor que en las demás, exceptuando la Granja I. Además, no se observaron diferencias significativas en la cantidad de copias del virus en el ambiente de las granjas (Tabla 28). GONZALO LÓPEZ LORENZO 100 Tabla 27. Resultados descriptivos de las muestras ambientales en cada granja con vacunación frente a PCV2. Granja nº pos/nº total (% pos) Promedio* Desviación típica* Rango* F 10 / 34 (29,41 %) 2,06 x104 5,41 x104 2,45 x102 – 1,74 x105 G 12 / 37 (32,43 %) 2,05 x103 3,37 x103 1,70 x102 – 9,12 x103 H 1 / 38 (2,63 %) 2,34 x102 - - I 7 / 37 (18,92 %) 4,54 x106 7,96 x106 4,68 x102 – 1,95 x107 Total 30 / 146 (20,55 %) 1,07 x106 4,11 x106 1,70 x102 - 1,95 x107 *Expresado como copias de PCV2/hisopo Tabla 28. Comparaciones pareadas entre granjas con vacunación. Se subrayan las diferencias significativas. Granjas comparadas (i / j) Proporción de muestras positivas a PCV2 (Test Chi-cuadrado) Media de copias de PCV2 (ANOVA) p-valor ajustado* ODDS Ratio Diferencia de medias (i – j) p-valor α F / G 1,000 0,868 0,376 0,629 F / H 0,012 15,384 n.c. n.c. F / I 1,000 1,786 -1,442 0,263 G / H 0,006 17,857 n.c. n.c. G / I 1,000 2,057 -1,819 0,123 H / I 0,132 0,116 n.c. n.c. *Ajuste del p-valor utilizando la corrección de Bonferroni α p-valor de la prueba post-hoc de T3 de Dunnet n.c. no calculado debido a que en una granja sólo se dispuso de una muestra positiva Las diferencias observadas en la proporción de muestras contaminadas y cantidad de PCV2 entre las granjas que vacunaban a los lechones sugiere lo ya mencionado en granjas sin vacunación: a pesar de intentar disponer de granjas lo más parecidas posible en instalaciones y manejo, probablemente existieron otros factores que no hemos podido medir y que influyeron en las variaciones que se observan. La vacunación frente a PCV2 en los lechones mejora los índices productivos, reduce el número de infectados, la viremia y la excreción vírica (Chae, 2012a). Usando programas de vacunación masiva se han podido erradicar algunos virus en las granjas, como por ejemplo el de la Enfermedad de Aujeszky en España (Allepuz et al ., 2009); sin embargo, no sucede lo mismo con el PCV2. La detección de PCV2 en el ambiente de este trabajo sugiere que aunque la vacunación reduce la excreción, podría no evitarla totalmente. Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 101 Figura 35. Distribución del logaritmo decimal del número de copias de PCV2 en las muestras positivas de cada granja que vacunaba a los lechones. El color de las cajas representa el porcentaje de muestras ambientales positivas en cada granja. Se han realizado programas de vacunación masiva que aspiraban a erradicar la infección por PCV2 en las granjas. Por ejemplo, Feng et al . (2014) pusieron en marcha en una granja un programa que incluía una vacunación en sábana a todas las reproductoras, verracos y cerdas reposición cada cuatro meses y vacunación de lechones a las 4 y 7 semanas de vida. A pesar de que no se detectaron cerdos infectados al cabo de un año de implementar este programa, tras cesar la vacunación, la circulación del virus se hizo evidente de nuevo, lo que sugirió que el virus no fue completamente erradicado de la granja (Feng et al ., 2014). La persistencia ambiental del virus podría ser un factor clave en el fracaso de las medidas de control y erradicación de esta infección en la granja en granja (Horlen et al ., 2008). Nuestros resultados son compatibles con esta posibilidad al poner de manifiesto la contaminación ambiental que puede interferir con el éxito de estos programas de vacunación. De hecho, el único caso descrito de una granja que se consiguió mantener libre de PCV2 no lo consiguió utilizando vacunas, sino tras un vacío sanitario y una L+D exhaustiva de todas las instalaciones (Patterson et al ., 2011d). Una limitación de esta técnica para detectar el PCV2 es que la qPCR sólo demuestra la presencia de ADN del virus, no su viabilidad. A pesar de esta limitación, la posibilidad de que el PCV2 detectado en algunas muestras aún fuese infectante parece bastante factible debido a su gran resistencia ambiental (Welch et al ., 2006; GONZALO LÓPEZ LORENZO 108 Tabla 33. Continuación Gestación / Almacén 0,021 n.c. n.c. n.c. Gestación / Trabajador 0,016 n.c. n.c. n.c. Gestación / Oficina 0,094 n.c. n.c. n.c. Gestación / Perímetro 0,060 n.c. n.c. n.c. Almacén / Trabajador 1,000 1,076 1,918 1,000 Almacén / Oficina 0,899 1,712 9,471 1,000 Almacén / Perímetro 0,899 1,445 19,214 0,131 Trabajador / Oficina 0,757 1,590 7,554 1,000 Trabajador / Perímetro 0,899 1,340 17,297 0,107 Oficina / Perímetro 1,000 1,185 9,743 1,000 *Ajuste del p-valor utilizando la corrección de Benjamini-Hochberg α p-valor de la prueba post-hoc de Dunn n.c.: no calculado debido a que todas las muestras de al menos una categoría fueron negativas Figura 37. Distribución del logaritmo decimal del número de copias de PCV2 en las muestras positivas en cada categoría en las granjas con PCV2-SI. El color de las cajas representa el porcentaje de muestras ambientales positivas en cada granja (Adaptado de López-Lorenzo et al., 2019, con licencia CC A 4.0 IL). Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 109 En la Figura 37 se observa una reducción progresiva de la cantidad de copias de PCV2 en las muestras positivas a medida que se corresponden superficies más alejadas de las dependencias con cerdos y que presentan un contacto más esporádico con los animales y/o sus cuidadores. En las granjas sin vacunación frente a PCV2 se detectó ADN del virus en el ambiente de todas ellas. Se detectó tanto en salas como con animales como en otras dependencias de la granja en las que no hay cerdos. La excreción de virus por parte de los cerdos infectados (Segalés et al ., 2005b) explica su presencia en el ambiente de las salas con animales, mientras que su presencia en otras áreas se debe a la diseminación a través de operarios y fómites. Respecto a la granja con PCV2-SD (la Granja E), se detectó ADN de PCV2 en una proporción elevada de muestras ambientales, en todas las dependencias y con un recuento medio superior a 106 copias por hisopo. Estos valores son indicativos de una infección grave por PCV2, como había sido demostrado. En casos de PCV2-SD la excreción viral es muy elevada (Segalés et al . 2005b), lo que explica la gran cantidad detectada en el ambiente. Asimismo, la presencia del virus en el ambiente es otra posible vía de infección, pues implica que los cerdos estén expuestos a una cantidad considerable del virus. En el conjunto de granjas con PCV2-SI, el porcentaje de muestras ambientales positivas a PCV2 fue inferior al 33%. Excepto en una granja, las dependencias más contaminadas siempre fueron las salas de transición. En una infección típica de PCV2, la excreción del virus suele comenzar al final de esa fase productiva (McIntosh et al ., 2008; Prickett et al ., 2008; Csank et al ., 2013). Este trabajo muestra que en granjas de producción de lechones con PCV2-SI las salas de transición son las dependencias más contaminadas, y desde las que se disemina PCV2 hacia el resto de instalaciones. En las salas de transición, se detectó PCV2 en todas las muestras ambientales de la granja con PCV2-SD y en la mayor parte de las muestras de granjas con PCV2-SI, exceptuando una. En estas salas, el virus se encontró con más frecuencia en los pasillos, tolvas y paredes de corrales. Estas dos últimas superficies, al igual que el suelo de los corrales, están en contacto exclusivamente con los cerdos, siendo esperable hallar PCV2 en bastantes casos; no obstante, en el suelo sólo se detectó en una granja. Una explicación a este hallazgo sería la estructura de los corrales: mientras que las tolvas y la pared eran sólidas, el suelo era totalmente enrejillado; esto minimiza el área de contacto y facilita la limpieza (Bigeriego et al ., 2006). Así, se minimiza la acumulación de excreciones, entre ellas PCV2, detectando el virus en menos casos. Nuestros resultados sugieren que el PCV2 en las superficies de las cuadras facilita el contacto entre los lechones alojados conjuntamente. Esto complementa la información aportada por Andraud et al ., (2008), donde se señala que el ratio de GONZALO LÓPEZ LORENZO 110 reproducción (R0) de la infección por PCV2 se incrementa cuando los cerdos están en un mismo corral. En este sentido, se ha demostrado que medidas como alojar menos cerdos por cuadra o evitar su mezcla son eficaces para reducir la incidencia de la PCV2SD (Rose et al ., 2003; Andraud et al ., 2009b). Por tanto, los resultados de este trabajo muestran el motivo por el que esas medidas son eficaces: de forma indirecta reducen el número de cerdos en contacto indirecto a través de las superficies del corral en las que está el virus, lo que indudablemente tiene un efecto positivo en el control de la infección. Otras muestras de las salas de transición en las que se detectó PCV2 fueron los ventiladores. Tanto el PCV2 como otros microorganismos están en las partículas de polvo en forma de aerosol (Verreault et al ., 2010; Pletinckx et al ., 2011), bien procedentes de las vías respiratorias o bien de otras secreciones tras secarse y suspenderse en el polvo (Alonso et al ., 2014). Los ventiladores de las salas no se suelen considerar en la L+D (Quiles y Hevia, 2006; Mueller-Doblies et al ., 2010). Por un lado, el depósito de polvo en los mismos reduce la eficacia de la ventilación en la granja (Kim et al ., 2008); y por otro lado, contribuye contaminar con PCV2 los sistemas de ventilación. Lo observado en este trabajo guarda una línea con información previa: la persistencia de patógenos en los sistemas de ventilación supone un riesgo para posibles infecciones (Friese et al ., 2012). Además, el PCV2 en estos elementos implica que al extraer el aire se elimina PCV2 hacia el exterior y, al igual que sucede con virus como el de la DEP o del PRRS (Alonso et al ., 2014; Brito et al ., 2014), supone un riesgo de infección para las granjas cercanas, especialmente en áreas de alta densidad ganadera. Por tanto, nuestros resultados remarcan que los ventiladores de las salas se deben incluir en las medidas de L+D, especialmente en casos de PCV2-SD. Un resultado a resaltar fue que en la Granja D no se detectó PCV2 en ninguna muestra ambiental de las salas de transición, ni tampoco de partos ni de gestación. Como se había detectado viremia, surgen dos hipótesis: una infección reciente y por tanto que la presencia del virus en el ambiente todavía insuficiente para detectarla o, que en esta granja haya una inmunidad maternal capaz de proteger a los lechones durante más tiempo (Opriessnig et al., 2004a; Mckeown et al., 2005). Los resultados obtenidos en esta granja sugieren que una L+D eficaz permitiría que los lechones crezcan en un ambiente sin PCV2 lo que, unido a una buena inmunidad maternal, mantiene a los cerdos prácticamente libres de contacto con el virus hasta el cebo. En las otras dependencias con cerdos, las salas de partos y de gestación, también se detectó PCV2 en el ambiente, aunque casi todas las muestras fueron en la granja con PCV2-SD. En ésta, la mayor parte de las muestras mostraron una gran cantidad de PCV2 lo que sostiene la hipótesis, aun sin tener datos de su posible viremia, de que el PCV2 estaba circulando en esas fases productivas. Si hubiese viremia en las cerdas Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 111 gestantes el virus se podría transmitir verticalmente a su descendencia (Shen et al ., 2010), siendo esos lechones otra fuente de PCV2 en las parideras. En las salas de partos de la granja con PCV2-SD se detectó PCV2 en las jaulas de las cerdas y en el área de descanso de los lechones. Este es un hallazgo acorde con el obtenido por Dvorak et al . (2013), quienes detectaron el virus en ese mismo tipo de muestras, así como viremia en cerdas y lechones sin encalostrar. Dvorak et al ., (2013) no mencionan si en la granja había PCV2-SD, aunque nuestros resultados sugieren que probablemente fuese esa su situación. El PCV2 en estas dos superficies podría proceder del calostro y/o la leche de la cerda, contaminando la parte de la jaula donde se tomaron las muestras (Shibata et al ., 2006; Madson et al ., 2009c; Gerber et al ., 2011). Otra posibilidad es que los lechones que nacen infectados contaminen el área de descanso y durante el amamantamiento, al igual que hacen con las mamas de las cerdas, contaminen la jaula (Garrido-Mantilla et al ., 2019). En las salas de partos también se detectó PCV2 en los pasillos y en los utensilios de manejo postparto. En estas muestras el virus puede proceder de lechones de esas salas pero también ser vehiculado desde otras áreas a través de los operarios, hipótesis que se refuerza por los resultados observados en otras muestras de esa granja: en las manos y la ropa de trabajo se encontró PCV2. Al igual que sucede con virus como el PRRS (Baker et al ., 2012), estos resultados sugieren que durante el manejo post-parto, al menos en granjas con PCV2-SD, se podría inocular de forma secundaria PCV2 a los lechones. Esto agravaría la infección en la granja, ya que en los primeros días de vida ya se expondría a esos directamente al virus. Por tanto, en este estudio se muestra que en granjas con PCV2-SD es posible que los lechones se hallen expuestos a cantidad considerable de PCV2 desde que nacen. Por ello, en estas situaciones la L+D es fundamental desde la lactación; la L+D en elementos de manejo postparto debe ser lo más frecuente posible, recomendando una caja con utensilios de uso exclusivo para cada sala. Así, se minimiza el riesgo de contaminaciones y de transmisión entre bandas de producción. En cambio, los resultados obtenidos en el ambiente las salas de partos y gestación de las granjas con PCV2-SI sugieren que, en esta presentación de la enfermedad, la excreción de PCV2 en los cerdos de esas fases productivas es prácticamente nula. Esta hipótesis es coherente con los resultados de Eddicks et al . (2016) y Dieste-Pérez et al . (2018) quienes observaron que ningún lechón en lactación estaba infectado por PCV2 y que la prevalencia en las reproductoras era inferior al 1%. No obstante, en esos dos trabajos, a diferencia del presente, los lechones se vacunaban frente a PCV2 a las 3 – 4 semanas de vida, y en algún caso también las cerdas reproductoras. Posiblemente la vacunación altere la dinámica de la infección y sus resultados estén influidos por las vacunas; en cambio, en este trabajo ninguna granja incluía el PCV2 en los protocolos vacunales por lo que los resultados se deben a la dinámica de la infección natural. GONZALO LÓPEZ LORENZO 112 No obstante, en una muestra ambiental de las salas de partos se detectó PCV2: el pasillo de la Granja A. Al estudiar esto conjuntamente con las demás muestras, probablemente el virus no proceda de excreciones de los cerdos de esas salas, sino que pudo llegar a través de algún fómite contaminado o de los operarios. De hecho, las botas de trabajo, que tienen contacto directo con el suelo, fueron las muestras contaminadas en más casos y en las que se detectó mayor cantidad de PCV2 en el conjunto de granjas con PCV2-SI. Un resultado destacable en la granja con PCV2-SD y en el conjunto de granjas con PCV2-SI fue que no hubo diferencia significativa en la proporción de muestras contaminadas ni en la cantidad de PCV2 entre las muestras de Salas de transición (categoría con más contaminación ambiental), Almacén y Trabajador. Las muestras incluidas en la categoría Almacén son fómites que se usan en el manejo diario. El uso de tableros para mover animales, utensilios para alimentarlos y otros elementos no suele ser exclusivo para cada grupo de edad, su L+D no es frecuente y, tras utilizarse, se almacenan hasta nuevo uso (Casal et al ., 2007; Backhans et al ., 2015). Asimismo, parte de las muestras englobadas en Almacén están en contacto tanto con los cerdos como con los operarios de modo que ambos pueden ser el origen del virus detectado. Durante el trabajo diario parte del PCV2 que excretan los cerdos o que está en otras superficies se puede depositar en utensilios de trabajo, permanecer en ellos y, cuando se utilizan, alcanzar a otros animales. Al mismo tiempo es otra fuente de contaminación para las manos y ropa de los operarios que los manipulen. Los resultados de este trabajo muestran que los almacenes, nunca tenidos en cuenta en los programas de control de enfermedades, son dependencias donde el PCV2 se puede acumular y desde las que se puede diseminar hasta a los cerdos u otras áreas de la granja. Por tanto, la L+D de los utensilios de manejo se debe hacer siempre tras su uso. Es recomendable que los tableros de conducción, utensilios de limpieza, de alimentación… sean específicos para cada dependencia de la granja. Usar elementos de distintos colores para cada dependencia es una medida sencilla y que permite diferenciarlos rápidamente, minimizando la diseminación de patógenos. De modo similar a los almacenes, se detectó PCV2 en todas las muestras de la categoría Trabajador en la granja con PCV2-SD y en más del 40% en las granjas con PCV2-SI. El contacto con cerdos que excretan PCV2 y la presencia del virus en superficies de la granja explican que en las manos, el pelo, la ropa y el calzado se detecte PCV2. Se sabe que los operarios diseminan patógenos con sus movimientos (Allerson et al ., 2013; Kim et al ., 2017); sin embargo lo más llamativo de estos resultados fue que en las botas de trabajo se encuentra PCV2 en más casos, e incluso en mayor cantidad, que otras en muestras con contacto directo con los cerdos. Se conoce la implicación que tienen las botas de trabajo en la transmisión de otros patógenos que infectan a los cerdos (Dee y Corey, 1993; Otake et al ., 2002a; Pitkin et al ., 2009a; Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 113 Allerson et al ., 2013); por tanto probablemente también tengan un papel similar en la transmisión de PCV2. Aunque la qPCR no demuestra la viabilidad del virus (Dewulf et al ., 2005), detectar ADN de PCV2 supone un riesgo, más teniendo en cuenta que puede haber 2,29 x106 copias de PCV2 en la suela de los zapatos siendo probable que en esa cantidad aun existan partículas viables. Una recomendación general es usar pediluvios o cambiar de botas antes de entrar a las dependencias de las granjas (Hémonic et al ., 2010). Los resultados de este estudio permiten concretar más: en granjas que no se vacuna frente a PCV2 se debería hacer una L+D minuciosa de las botas de trabajo al finalizar las labores en las salas de transición. Además, esto se debería complementar con una organización de la rutina de trabajo, medida básica en los programas de control de cualquier enfermedad, aunque planteada en menos de la mitad de las granjas de producción (Sahlström et al ., 2014). Con la ropa de trabajo sucedió algo similar a lo observado con las botas. Se detectó PCV2 en más de la mitad de las granjas sin vacunación. Los resultados también sugieren que en casos de PCV2-SI la ropa de trabajo se contamina principalmente en las salas de transición. Cambiar la ropa entre las salas de la granja es una medida eficaz para evitar la transmisión de patógenos (Allerson et al ., 2013; Kim et al ., 2017) pero esto no es práctico en la rutina diaria; de hecho, lo hacen menos de un 10% de las granjas (Madec et al ., 2010; Backhans et al ., 2015). Sin embargo, usar cada día una ropa diferente sería una medida menos molesta y con una eficacia similar siempre que se acompañe de una orden en la rutina de trabajo. Estos resultados adquieren gran utilidad ya que permiten conocer en qué áreas de la granja es más fácil contaminarse por PCV2. Así podrían ser útiles para organizar la rutina de trabajo más adecuada a cada granja en concreto evitando diseminar el virus y mejorando el control de la infección. A diferencia de ropa y calzado de trabajo, en las manos sólo se detectó PCV2 en dos granjas sin vacunación. Varios trabajos que remarcan la importancia de la limpieza de manos entre fases de producción (Madec et al ., 2010; Backhans et al ., 2015; Odo et al ., 2015) aunque en este trabajo se observa que otras partes como el pelo o las fosas nasales pueden estar igualmente contaminadas. Usar mascarillas, cubrecabezas o incluso duchas entre fases de producción son medidas a considerar, pero probablemente enfocadas a granjas de orientaciones productivas concretas, como selección o multiplicación. Como se ha ido comentando, los movimientos de los operarios contribuyen a diseminar el PCV2 por las granjas y éste es probablemente el motivo por el que se detectó el virus en las oficinas. La desviación típica en esta categoría fue más reducida que en otras, lo que indica una fuente de contaminación más homogénea. Las granjas A y E fueron en las que se encontró el virus en más muestras de las oficinas; esas GONZALO LÓPEZ LORENZO 114 granjas estaban formadas por un solo edificio, por lo que probablemente la cercanía entre todas las dependencias facilita la contaminación por PCV2. En este trabajo se detectó PCV2 en la ropa y el calzado de calle. Esta contaminación probablemente se produce al cambiarse la ropa ya que la separación entre zonas “limpias” y “sucias” en los vestuarios es poco frecuente (Simon-Grifé et al ., 2013), situación de todas estas granjas. Este protocolo de muestreo se podría utilizar para detectar fallos en la bioseguridad de las granjas: al igual que el PCV2 puede salir de la granja, podría entrar a través de la ropa de calle. Definir los límites de las zonas “limpia” y “sucia” y un correcto protocolo para el cambio de ropa son medidas necesarias para evitar estos fallos de bioseguridad. Instalar barreras sólidas como puertas, un banco cruzado… junto con un sistema de lavado de manos son formas de indicar esa separación. La contaminación de la ropa y el calzado de calle en algún momento fue el origen del PCV2 detectado en el vehículo del operario de la Granja C. Se debe destacar que las muestras de los vehículos se tomaron del interior de los mismos, donde no se suele hacer L+D (Pritchard et al ., 2005; Filippitzi et al ., 2018). No obstante, la detección de PCV2 en los vehículos no se debe limitar a los trabajadores de las granjas, sino que cualquier persona que visite una granja conlleva el mismo riesgo. De hecho, ya se había sugerido que los técnicos/veterinarios podrían contribuir a la diseminación geográfica del PCV2 (Vigre et al ., 2005). En este trabajo se sugiere que medidas tan habituales como la limpieza de ruedas, arcos de desinfección… tienen una eficacia limitada ya que se demuestra que virus como el PCV2 pueden estar en el interior de los vehículos. Relacionado con la presencia de PCV2 en los vehículos está su detección en muestras del perímetro. Todos los puntos desde los que se puede acceder a las granjas suponen un riesgo para la entrada o salida de patógenos (Ellis-Iversen et al ., 2012). Por ello, las superficies de las que se tomaron las muestras incluidas en perímetro deben ser fáciles de lavar y desinfectar, tarea que se debe hacer frecuentemente. Concretamente, la L+D de estas superficies parece ser más importante en el área de carga y en el contenedor para los cadáveres, ya que fueron las muestras del perímetro en que se detectó PCV2 en más casos. En el caso del contenedor, es importante destacar que las muestras se tomaron del cabestrante, punto de contacto del camión de recogida y del contenedor, por lo que no se puede descartar que el virus procediese del camión. Éstos visitan varias granjas en su rutina diaria, sin limpiarse entre visitas; de hecho se consideran entre las cinco principales causas de introducción virus como el del PRRS a las granjas de producción (Desrosiers, 2011; Nathues et al ., 2018). Además la L+D en los contenedores de cadáveres nunca se hace en casi el 75% de las granjas (Filippitzi et al ., 2018). Sin embargo, estos resultados remarcan la necesidad de una L+D, tanto en el área de carga como en los contenedores, siempre tras estar en contacto con vehículos ajenos a la granja. Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 115 Finalmente se debe comentar un condicionante de las granjas incluidas en este estudio y que pudo influir levemente en los resultados obtenidos. Las granjas A, D y E eran de orientación productiva mixta, teniendo unas dependencias en las que alojaban parte de los cerdos de cebo y, a la vista de los resultados de viremia, probablemente estarían infectados. Aunque para la toma de muestras no se entró en las dependencias que alojaban cerdos de cebo ni se incluyeron muestras de operarios que trabajasen en dicha zona, es probable una excreción de PCV2 por parte de esos animales que también contribuiría a la diseminación del virus. No obstante, a pesar de esta peculiaridad decidimos incluir estas granjas para poder estudiar la epidemiología del virus en el ambiente de granjas con infecciones naturales, dando mayor importancia a que los resultados obtenidos no se viesen influidos por la vacunación. 3.3.5.2 Con vacunación de lechones frente a PCV2 En las granjas que vacunaban a los lechones frente a PCV2 se detectó ADN del virus en 30 de 146 muestras ambientales (20,55 %). Los resultados obtenidos en cada granja y en cada tipo de muestra se resumen en la Tabla 34. Tabla 34. Número de copias de PCV2 por hisopo en cada muestra ambiental de cada granja con PCV2-VAC. Muestra ambiental Granjas con PCV2-VAC Granja F Granja G Granja H Granja I Comedero de las cerdas Neg. Neg. Neg. Neg. Jaula de las cerda Neg. Neg. Neg. Neg. Área de los lechones Neg. Neg. Neg. Neg. Caja de lechones No muestra No muestra Neg. No muestra Pasillos salas de partos 2,45 x102 Neg. Neg. Neg. Ventiladores de partos Neg. Neg. Neg. Neg. Caja de utensilios No muestra Neg. Neg. Neg. Tolvas lechones transición Neg. Neg. Neg. Neg. Pared corrales transición Neg. Neg. Neg. Neg. Suelo corrales transición Neg. Neg. Neg. Neg. Pasillos de transición Neg. Neg. Neg. Neg. Polvo tabiques transición Neg. Neg. Neg. Neg. Ventiladores de transición Neg. Neg. Neg. Neg. Tolva cerdas gestación Neg. Neg. Neg. Neg. Pared corrales gestación No muestra No muestra No muestra No muestra Suelo corrales de gestación 2,63 x103 Neg. Neg. Neg. Pasillos de gestación 1,74 x105 Neg. Neg. Neg. Suelo del almacén 9,55 x103 Neg. Neg. 5,01 x104 GONZALO LÓPEZ LORENZO 116 Tabla 34. Continuación Mango de utensilios Neg. Neg. Neg. Neg. Cazo de alimentación 1,02 x103 Neg. Neg. Neg. Hidrolimpiadora No muestra Neg. Neg. Neg. Tableros Neg. Neg. Neg. Neg. Manos de trabajadores Neg. 1,02 x103 Neg. Neg. Fosas nasales Neg. Neg. Neg. Neg. Pelo/Gorro Neg. 1,74 x102 Neg. Neg. Ropa de trabajo 1,86 x102 9,33 x103 Neg. Neg. Botas de trabajo 1,66 x104 3,63 x102 Neg. 1,95 x107 Ropa de calle Neg. Neg. 2,34 x102 4,68 x102 Calzado de calle 7,76 x102 Neg. Neg. 1,95 x105 Vehículo Neg. Neg. Neg. Neg. Suelo de la oficina 2,04 x102 7,94 x102 Neg. 1,20 x107 Pomo de las puertas 1,45 x103 9,77 x102 Neg. Neg. Bolígrafos/Teclado Neg. 7,08 x102 Neg. Neg. Mesa/sillas Neg. 9,12 x103 Neg. Neg. Parking Neg. Neg. Neg. Neg. Entrada principal Neg. 1,70 x102 Neg. 8,13 x102 Cargadero No muestra 2,45 x102 Neg. 1,51 x103 Contenedor de cadáveres Neg. 1,10 x103 Neg. Neg. Peldaños de los silos Neg. 6,46 x102 Neg. Neg. No muestra indica que la muestra no estaba disponible Neg. indica que no se detectó ADN de PCV2 en esa muestra En muy pocas muestras ambientales de las superficies en contacto con cerdos se detectó ADN de PCV2. En cambio, las muestras más frecuentemente contaminadas fueron las botas de trabajo y el suelo de las oficinas, positivas en tres de las cuatro granjas, siendo las muestras que en el conjunto de granjas mostraron mayor promedio de copias por hisopo: 1,13 x107 y 6,94 x106 respectivamente. A pesar de que ninguna granja presentaba signos clínicos compatibles, una prevalencia de infección inferior al 15% en lechones de transición y que todas llevaban entre 7 y 8 años vacunando a todos los lechones, estos resultados confirman la ubicuidad del PCV2. Exceptuando Salas de transición, hubo muestras ambientales positivas a PCV2 en todas las categorías. El mayor porcentaje de muestras contaminadas se localizó en las muestras tomadas en la Oficina (43,75%), seguida de las incluidas en la categoría Trabajador (34,38%) (Tabla 35). Estudio I: Distribución ambiental de PCV2 en granjas comerciales de producción de porcino 117 Tabla 35. Resultados descriptivos de las muestras ambientales en cada categoría en las granjas con PCV2VAC. Categoría nº + /nº tot. (% pos) Media* Desviación típica* Rango* Sala de Partos 1 / 24 (4,17 %) 2,45 x102 - - Sala de Transición 0 / 24 (0,00 %) - - - Sala de Gestación 2 / 12 (16,67 %) 8,82 x104 1,21 x105 2,63 x103 – 1,74 x105 Almacenes 3 / 19 (15,79 %) 2,02 x104 2,62 x104 1,02 x103 – 5,01 x104 Trabajador 11 / 32 (34,38 %) 1,79 x106 5,87 x106 1,74 x102 – 1,95 x107 Oficina 7 / 16 (43,75 %) 1,72 x106 4,54 x106 2,04 x102 – 1,20 x107 Perímetro 6 / 19 (31,58 %) 7,47 x102 5,12 x102 1,70 x102 – 1,51 x103 Total 30 / 146 (20,55 %) 1,07 x106 3,13 x105 1,70 x102 - 1,95 x107 *Expresado como copias de PCV2/hisopo La proporción de muestras ambientales positivas a PCV2 fue diferente ( p < 0,001) entre las categorías. Trabajador y Oficina mostraron estadísticamente mayor proporción de muestras contaminadas que Salas de Partos y Sala de Transición (con esta última también mostró mayor proporción Perímetro). Los resultados de las comparaciones pareadas entre categorías y las Odds Ratio correspondientes se resumen en la Tabla 36. En cuanto a la cantidad no se observó diferencia significativa entre las categorías (H = 5,953; p = 0,311). No obstante, parece haber una tendencia decreciente en el número de copias de PCV2 según las muestras se alejan de los animales (Figura 38). Se debe tener en cuenta que los resultados de Sala de gestación se correspondieron sólo con una granja. GONZALO LÓPEZ LORENZO 220 Its Role in Virus-Induced Apoptosis. J Virol 79, 8262–8274. doi:10.1128/JVI.79.13.8262 López-Lorenzo, G., Díaz-Cao, J.M., Prieto, A., López-Novo, C., López, C.M., Díaz, P., Rodríguez-Vega, V., Díez-Baños, P., Fernández, G., 2019. Environmental distribution of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) in swine herds with natural infection. 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License Number 5173001438352 License date Oct 20, 2021 Licensed Content Publisher John Wiley and Sons Licensed Content Publication Transboundary and Emerging Diseases Licensed Content Title Monitoring of porcine circovirus type 2 infection through air and surface samples in vaccinated and unvaccinated fattening farms Licensed Content Author Gonzalo López‐Lorenzo, Cynthia López‐Novo, Alberto Prieto, et al 20/10/21 12:25 RightsLink Printable License https://s100.copyright.com/AppDispatchServlet 8/8 The Creative Commons Attribution Non-Commercial (CC-BY-NC)License permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited and is not used for commercial purposes.(see below) Creative Commons Attribution-Non-Commercial-NoDerivs License The Creative Commons Attribution Non-Commercial-NoDerivs License (CC-BY-NC-ND) permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited, is not used for commercial purposes and no modifications or adaptations are made. (see below) Use by commercial "for-profit" organizations Use of Wiley Open Access articles for commercial, promotional, or marketing purposes requires further explicit permission from Wiley and will be subject to a fee. Further details can be found on Wiley Online Library http://olabout.wiley.com/WileyCDA/Section/id-410895.html Other Terms and Conditions: v1.10 Last updated September 2015 Questions? customercar[email protected] or +1-855-239-3415 (toll free in the US) or +1-978-646-2777.