Optimización de la producción de biobutanol mediante fermentación ABE utilizando bagazo de manzana como sustrato

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Escola Técnica Superior de Enxeñaría Departamento de Enxeñaría Química TRABALLO FIN DE MÁSTER Optimización de la producción de biobutanol mediante fermentación ABE utilizando bagazo de manzana como sustrato Autor: Javier Bravo Venegas Tutores: Gemma Eibes González Thelmo Lú-Chau Santiago de Compostela, junio de 2021 2 3 Índice Nomenclatura ........................................................................................................................ 9 Resumen .............................................................................................................................. 11 Resumo ................................................................................................................................ 13 Abstract ............................................................................................................................... 15 1. Introducción ............................................................................................................... 17 1.1. Contexto ............................................................................................................. 17 1.2. Biorrefinería ....................................................................................................... 18 1.3. Biocombustible .................................................................................................. 30 1.4. Fermentación ABE.............................................................................................. 36 2. Objetivos .................................................................................................................... 44 3. Materiales y métodos ................................................................................................ 45 3.1. Reactantes, sustrato y microorganismo ............................................................ 45 3.2. Metodología de trabajo ..................................................................................... 46 3.3. Métodos analíticos............................................................................................. 53 3.4. Análisis estadístico ............................................................................................. 58 4. Resultados y discusiones ........................................................................................... 59 4.1. Modelo matemático .......................................................................................... 59 4.2. Superficie de respuesta ..................................................................................... 63 4.3. Validación del modelo ....................................................................................... 68 4.4. Ruta del máximo ascenso .................................................................................. 78 5. Conclusión .................................................................................................................. 80 6. Referencias ................................................................................................................ 81 Anexos ................................................................................................................................. 87 Anexo A. Fotografías de cultivos en placa ....................................................................... 87 Anexo B. Fotografías de cultivos en medio de reactivación ............................................ 88 Anexo C. Script utilizado en RStudio para la verificación del modelo matemático ........ 89 4 5 Índice de figuras Figura 1. Preferencias en la encuesta realizada en octubre de 2019 por el Parlamento Europeo. Adaptado de (6). ..... 18 Figura 2. Comparación entre una refinería de petróleo y una biorrefinería. Adaptado de (12). .................................... 20 Figura 3. Diferentes líneas de producción posibles a partir de la separación de los principales componentes de las materias primas lignocelulósicas en el pretratamiento. Adaptado de (13). ............................................................. 20 Figura 4. Esquema de la biorrefinería multi-producto, destacados en verde, a partir de bagazo de manzana que se desea formular en el proyecto ULTREIA. Adaptado de (14). ............................................................................................... 23 Figura 5. Composición fisicoquímica aproximada del bagazo de manzana seco, indicada en % másico. Adaptado de (18). .................................................................................................................................................................................. 25 Figura 6. Clasificación y ejemplos de biocombustibles según el tipo de materia prima utilizada. Adaptado de (22). .... 32 Figura 7.A. Perfiles de crecimiento celular, formación de productos y diferenciación celular de Clostridium acetobutylicum durante el desarrollo de un cultivo batch de ABE (31). B. Ciclo celular de las bacterias productoras de solvente del género Clostridia (29). ..................................................................................................................... 38 Figura 8. Esquema de las vías catabólicas presentes en el metabolismo de las bacterias productoras de solvente del género Clostridia. Se diferencia con código de colores el flujo de carbono con flechas negras y el flujo de electrones con flechas azules. Las enzimas etiquetadas por número corresponden a: 1. Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, 2. Piruvato-ferrodoxina oxidorreductasa, 3. NADH-ferrodoxina oxidorreductasa, 4. NADPHferrodoxina oxidorreductasa, 5. Hidrogenasa, 6. Lactato deshidrogenasa, 7. Fosfato acetiltransferasa, 8. Acetato quinasa, 9. Tiolasa, 10. 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, 11. Crotonasa, 12. Butiril-CoA deshidrogenasa, 13. Fosfato butiltransferasa, 14. Butirato quinasa, 15. Acetaldehído deshidrogenasa, 16. Etanol deshidrogenasa, 17. Butiraldehído deshidrogenasa, 18. Butanol deshidrogenasa, 19. Acetoacetoil-Coa:acetato/butirato:CoA transferasa; 20. Acetoacetato descarboxilasa (29). ...................................................................................................................... 39 Figura 9. Representación de la metodología llevada a cabo en el laboratorio, se diferencia en flechas color negro los inóculos empleados en cada cultivo y en color verde el flujo de información y datos relacionados con el modelo. Nomenclatura: DBB, diseño Box-Behnken; RSM, metodología de superficie de respuesta. .................................... 46 Figura 10. Representación del procedimiento para llevar a cabo cada una de las fermentaciones ABE en el laboratorio. Nomenclatura: DDB, diseño Box-Behnken; HBM, hidrolizado de bagazo de manzana; Cond. Óp., Condiciones óptimas; Compl., Complementarias. ......................................................................................................................... 47 Figura 11. Recta de calibrado para concentración de azúcares reductores totales mediante el método DNS. .............. 54 Figura 12. Cromatograma obtenido donde se aprecian los picos característicos para una solución 10 g/L de ácido butírico, 10 g/L de ácido acético, 10 g/L de butanol, 4 g/L de etanol, 4 g/L de isopropanol y 10 g/L de acetona. ... 56 Figura 13. Rectas de calibrado para ácido butírico (●) y ácido acético (■)...................................................................... 56 Figura 14. Rectas de calibrado para butanol (●), etanol (∆), acetona (■) e isopropanol (x). .......................................... 56 Figura 15. Rectas de calibrado para la densidad óptica a 600 nm. Para medio HBM (■) y para medio P2 (●). .............. 57 Figura 16. Recta de calibrado para el transductor de presión. ....................................................................................... 58 Figura 17. Comparación entre los valores experimentales obtenidos y su valor predicho por cada modelo para la producción de butanol. ............................................................................................................................................. 63 Figura 18. Superficie de respuesta y gráfico de contornos para la concentración de butanol (g/L) considerando los efectos del pH (x1) y la [CaCO₃] (x2) cuando la temperatura (x3) se fija a 30 °C. Leyenda: . ...................................... 63 Figura 19. Superficie de respuesta y gráfico de contornos para la concentración de butanol (g/L) considerando los efectos del pH (x1) y la temperatura (x3) cuando la [CaCO₃] (x2) se fija a 8 g/L. Leyenda: . ....................................... 64 Figura 20. Superficie de respuesta y gráfico de contornos para la concentración de butanol (g/L) considerando los efectos de la [CaCO₃] (x2) y la temperatura (x3) cuando el pH (x1) se fija a 8. Leyenda: . .......................................... 64 Figura 21. Perfil del pH durante el cultivo de C. beijerinckii en medio HBM (●) y medio P2 (∆). [Valores medios] ± [SD] por triplicado. ........................................................................................................................................................... 69 Figura 22. Perfil de OD600 durante el cultivo de C. beijerinckii en medio HBM (●) y medio P2 (∆). [Valores medios] ± [SD] por triplicado. ........................................................................................................................................................... 69 Figura 23. Perfil de RTS (A) y glucosa (B) durante el cultivo de C. beijerinckii en medio HBM (●) y medio P2 (∆). [Valores medios] ± [SD] por triplicado. ................................................................................................................................... 71 Figura 24. Perfil de los productos del cultivo de C. beijerinckii en medio HBM (A) y medio P2 (B). Ácido butírico (■), ácido acético (∆), butanol (●), etanol (Ж), acetona (X) e isopropanol (◊). [Valores medios] ± [SD] por triplicado. ........... 72 Figura 25. Perfil de lactato durante el cultivo de C. beijerinckii en medio HBM (●) y medio P2 (∆). [Valores medios] ± [SD] por triplicado. ........................................................................................................................................................... 75 Figura 26. Perfil de la presión acumulada durante el cultivo de C. beijerinckii en medio HBM (●) y medio P2 (∆). [Valores medios] ± [SD] por triplicado. ................................................................................................................................... 76 6 7 Índice de tablas Tabla 1. Potencial de biomasa en la Unión Europea. Adaptado de (12). ........................................................................ 19 Tabla 2. Bioprocesos basados en el bagazo de manzana para la producción de enzimas. ............................................. 26 Tabla 3. Bioprocesos basados en el bagazo de manzana para la producción de compuestos con valor añadido. ......... 27 Tabla 4. Lista completa de los compuestos polifenólicos encontrados en el bagazo de manzana. Adaptado de (18, 21). .................................................................................................................................................................................. 30 Tabla 5. Isómeros estructurales del butanol: características generales y principales aplicaciones. Adaptado de (26). . 34 Tabla 6. Propiedades físicas y químicas de algunos alcoholes y combustibles fósiles tradicionales. Adaptado de (26). 35 Tabla 7. Comparación de la producción de biobutanol mediante fermentación a partir de materias primas lignocelulósicas en las que se emplearon diferentes tipos de pretratamiento. Adaptado de (29). .......................... 41 Tabla 8. Comparación de la producción de biobutanol mediante fermentación ABE donde se utiliza bagazo de manzana como sustrato y diferentes técnicas de pretratamiento para la liberación de azúcares reductores. Adaptado de (36). .................................................................................................................................................................................. 43 Tabla 9. Compuestos químicos utilizados, fórmula química, pureza y suministrador. .................................................... 45 Tabla 10. Composición del medio de reactivación ATCC 2107. ....................................................................................... 47 Tabla 11. Composición de la disolución principal que forma parte del medio P2. .......................................................... 49 Tabla 12. Composición de la disolución concentrada de vitaminas. ............................................................................... 49 Tabla 13. Composición de la disolución de vitaminas diluidas para el medio P2. ........................................................... 50 Tabla 14. Composición del medio de cultivo P2. ............................................................................................................. 50 Tabla 15. Diseño experimental Box-Behnken realizado para la optimización del pH, [CaCO3] y temperatura para la fermentación ABE. .................................................................................................................................................... 51 Tabla 16. Composición de la disolución principal del medio HBM. ................................................................................. 51 Tabla 17. Composición de la disolución de vitaminas diluidas para el medio HBM. ....................................................... 52 Tabla 18. Composición del medio HBM. ......................................................................................................................... 52 Tabla 19. Variables fijas, dependientes e independientes con sus respectivos valores evaluados. ................................ 60 Tabla 20. Concentración de butanol de acuerdo con el diseño experimental factorial 33. [Valores medios] ± [SD] por triplicado. .................................................................................................................................................................. 60 Tabla 21. pH y concentración (g/L) de los sustratos y productos al comienzo y al final las fermentaciones de acuerdo con el diseño experimental factorial 33. [Valores medios] ± [SD] por triplicado. ...................................................... 61 Tabla 22. Coeficientes de las ecuaciones de modelización, R, R2, F de Fisher y nivel de significancia. ........................... 62 Tabla 23. Rendimientos y productividades obtenidas para la fermentación HBM y control en condiciones óptimas. [Valores medios] ± [SD] por triplicado. ..................................................................................................................... 77 Tabla 24. Experimentos realizados que fueron propuestos por la metodología steepest ascent. .................................. 78 Tabla 25. Comparación de la concentración de butanol obtenida para los experimentos complementarios. [Valores medios] ± [SD] por triplicado. ................................................................................................................................... 79 Tabla 26. pH y concentración (g/L) de los sustratos y productos al comienzo y al final la fermentación óptima y complementarias. [Valores medios] ± [SD] por triplicado. ....................................................................................... 79 Índice de Ecuaciones Ecuación 1. Productividad de un compuesto .................................................................................................................. 53 Ecuación 2. Rendimiento de un compuesto .................................................................................................................... 53 Ecuación 3. Reacción química en que se fundamenta la medición de TRS ..................................................................... 53 Ecuación 4. Reacciones enzimáticas en que fundamenta la medición de glucosa ......................................................... 54 Ecuación 5. Concentración de glucosa en una muestra .................................................................................................. 54 Ecuación 6. Reacciones enzimáticas en que se fundamenta la medición de lactato ...................................................... 55 Ecuación 7. Concentración de lactato en una muestra ................................................................................................... 55 Ecuación 8. Ecuación de los gases ideales ....................................................................................................................... 58 Ecuación 9. Modelo matemático polinómico para Y obtenido por regresión lineal ....................................................... 62 8 9 Nomenclatura % v/w Porcentaje volumen/masa LC Lignocelulosa % w/w Porcentaje en masa LCF Materias primas lignocelulósicas [ButOH] Concentración de butanol LO Lactato oxidasa [CaCO₃] Concentración de carbonato de calcio Mg Magnesio 4-AF 4-aminofenazona Mn Manganeso 4-C 4-clorofenol MON Número de octano del motor ABE Acetona-Butanol-Etanol MTBE Metil tert -butil éter Absmuestra Absorbancia de la muestra n Cantidad de materia Abspatrón Absorbancia del petrón N2Nitrógeno molecular ACHS Pretratamiento con ácidos N2O Óxido nitroso ALHS Pretratamiento con álcalis NADH/NAD+Nicotinamida adenina dinucleótico reducida/oxidada ANOVA Análisis de varianza NaOH Hidróxido de sodio AP Apple pomace NOxÓxidos de nitrógeno APS Residuos sólidos de bagazo de manzana O2Oxígeno molecular APUS Lodo de ultrafiltración de pulpa de manzana OD600 Densidad óptica a 600 nm ATP Adenosín trifosfato P Fósforo BLW Reisduos líquidos de la industria cervecera P Presión absoluta BM Bagazo de manzana pH Potencial de hidrógeno BSG Grano gastado de cervecería POD Peroxidasa C4H9OH nbutanol R Coeficiente de correlación Ca Calcio R Constante de los gases ideales Ca(OH)2Hidróxido de calcio R2Coeficiente de correlación al cuadrado CaCO3Carbonato de calcio RON Número de octano de investigación CaO Óxido de calcio ROS Especies reactivas de oxígeno Cazúcares, 0 h Concentración de azúcares al final de la fermentación rpm Revoluciones por minuto Cazúcares,168 h Concentración de azúcares al comienzo de la fermentación RSM Metodología de superficie de respuesta Ce Variables fijas RT Reactivo de trabajo CECT Colección Española de Cultivos Tipo RTS Azúcares reductores totales Cglu Concentración de glucosa SIW Aguas residuales de la industria del almidón CH4Metano SmF Fermentación sumergida Ci, 0 h Concentración del compuesto i al comienzo de la fermentación SSF Fermentación en estado sólido Ci, t1 Concentración del compuesto i para el instante 1 T Temperatura absoluta Ci, t2 Concentración del compuesto i para el instante 2 t1instante de tiempo 2 Ci,168 h Concentración del compuesto i al final de la fermentación t2instante de tiempo 1 Clac Concentración de lactato TBHP tert -butil hidroxiperóxido CO2Dióxido de carbono TFM Trabajo de Fín de Máster CoA Coenzima A UE Unión Europea Cu Cobre URRS Unión de Repúblicas Socialistas Soviéticas DBB Diseño experimental Box-Behnken USC Universidade de Santiago de Compostela DME Dimetil éter V Volumen DNA Ácido desoxirribonucleico Vit C Vitamina C DnaK Proteína chaperona Hsp70 Vit E Vitamina E DNS Ácido dinitrosalicílico WWS Extracción de azúcares con agua caliente EMP Vía Embden-Meyerhof-Parnas x1Factor pH en valores reales ETBE Etil tert -butil éter x1* Factor pH en valores codificados fdFactor de dilución x2Factor concentración de CaCO3 en valores reales Fe Hierro x2* Factor concentración de CaCO3 en valores codificados FPU Actividad enzimatica en Filter Paper Unit x3Factor temperatura en valores reales GAE Ácido gálico equivalente x3* Factor temperatura en valores codificados GHG Gases de efecto invernadero Y Concentración de butanol GOD Glucosa oxidasa YA/S Rendimiento de sustrato en acetona GrpE Factor de intercambio de nucleótidos YABE/S Rendimiento de sustrato en ABE H2Hidrógeno molecular YB/S Rendimiento de sustrato en butanol H2O2Peróxido de hidrógeno YE/S Rendimiento de sustrato en etanol HBM Hidrolizado de bagazo de manzana YG/S Rendimiento de sustrato en gases de fermentación HCl Ácido clorhídrico YX/S Rendimiento de sustrato en biomasa HOAc/NaOAc Acetato de sodio Zn Cinc K Potasio 16 17 1. Introducción 1.1. Contexto La sociedad actual es altamente dependiente del petróleo, ya que de este recurso fósil no solamente se extraen los combustibles que de forma cotidiana se utilizan para el transporte, la calefacción y la generación eléctrica, sino que también es fuente de diversos compuestos químicos que componen la ropa, aparatos electrónicos, muebles, envases y un largo sinfín de objetos que se utilizan en prácticamente todos los ámbitos del quehacer humano. Esto se evidencia en que la demanda mundial de petróleo ha alcanzado en 2018 cerca de 4.700 millones de toneladas con una tasa de crecimiento del 1,2% respecto al año anterior, manteniéndose como la fuente de energía más utilizada y, además se estima que los presentes depósitos mundiales de crudo contienen 244.100 millones de toneladas de este material (1). Este es un número bastante significativo, sin embargo, si se considera el crecimiento anual en su consumo, y se elaboran modelos que contemplen aspectos poblacionales, económicos, energéticos y tecnológicos, entre otros, como son el crecimiento poblacional, el crecimiento del PIB, la demanda energética, la utilización de energías renovables o el cambio en el uso de suelos, es posible conjeturar diversos escenarios en donde se produce un eventual agotamiento de los recursos fósiles (2, 3). Esto se debe a que existe una velocidad de consumo que aumenta año a año, pero ninguna tasa de regeneración, lo que permite clasificar al petróleo como recurso no renovable. A lo anterior se debe agregar una segunda consideración, que los combustibles fósiles son los principales responsables de la emisión de contaminantes a la atmosfera, los que han alcanzado niveles sin parangón en los últimos 800.000 años de historia terrestre. La combustión de dichos materiales representa el 80,3 % de la energía primaria que se consume en el mundo, y el 57,7 % de este valor corresponde solamente al sector de transportes, que incluye su uso en vehículos terrestres, barcos y aviones (4). Entre los contaminantes liberados se encuentran los llamados Gases de Efecto Invernadero, conocidos como GHG por sus siglas en inglés, como son el dióxido de carbono (CO2), metano (CH4) y óxido nitroso (N2O), los cuales han sufrido un incremento en su concentración atmosférica de aproximadamente un 40%, un 150% y un 20% respectivamente desde la época previa a la revolución industrial (5). Se ha identificado que la emisión de GHG antropogénicos corresponde a la principal causa del cambio climático, debido a que de la mano del efecto invernadero provocan una alteración del balance energético del planeta, promoviendo un calentamiento de su superficie, que ha generado un incremento de 0,85 °C en la temperatura media terrestre y oceánica a nivel global entre los años 1880 y 2012. La influencia humana es clara, la alteración del sistema climático de la Tierra no solamente se manifiesta en el aumento promedio de la temperatura planetaria, sino que también en el derretimiento de los glaciales y hielos polares, en el aumento del nivel del mar, la acidificación de los océanos, la pérdida de biodiversidad, entre otras terribles consecuencias (5). La situación es de tal nivel de gravedad que los ciudadanos europeos consideran que la lucha contra el cambio climático debe ser la primera prioridad del Parlamento Europeo, incluso 18 por encima de problemas de índole social o política (6). A su vez, como se presenta en la Figura 1, dentro del ámbito ambiental, las preferencias indican que los principales desafíos en los que trabajar son aquellos que se relacionan directamente con la emisión de GHG y, por tanto, con el uso de combustibles fósiles. De hecho, recientemente el Parlamento Europeo ha aprobado medidas para disminuir la cantidad de GHG que producen los vehículos y el sector transportes en general (7), una clara evidencia de que las instituciones exigen cada día objetivos más ambiciosos respecto de las emisiones de CO2, uno de los principales GHG. Figura 1. Preferencias en la encuesta realizada en octubre de 2019 por el Parlamento Europeo. Adaptado de (6). Los mayores ejemplos de este tipo de política pública corresponden a los acuerdos multilaterales del Protocolo de Kyoto (1997) y más tarde, el Acuerdo de París (2015) cuyo principal objetivo corresponde a la reducción en las emisiones de GHG y además, propiciaron el desarrollo del mercado de los bonos de carbono. Dichas instancias son un claro ejemplo del cambio de paradigma que debe experimentar nuestra sociedad, en el que se debe pasar de un modelo lineal, de extracción, utilización y eliminación; a un modelo circular que optimice los stocks y flujos de materiales, energía y residuos, considere los impactos económicos, sociales y ambientales, e integre valores como la sostenibilidad y responsabilidad en la utilización de los recursos. Como se observará a continuación, en este segundo tipo de modelo, la biotecnología tiene significativos aportes que realizar. 1.2. Biorrefinería Si bien existen diferentes estrategias que permiten afrontar los problemas del agotamiento de los recursos fósiles y la contaminación que se genera al ser utilizados como fuente de energía, las que más se relacionan con el presente trabajo provienen de la amplia disciplina conocida como biotecnología. El Convenio sobre la Diversidad Biológica de las Naciones Unidas define biotecnología como “toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos” (8). Más recientemente se ha adoptado un patrón de colores que permite clasificar sus diversas áreas de aplicación (9), donde destaca la denominada biotecnología blanca, que se caracteriza por la utilización de microorganismos, extractos celulares o enzimas en procesos industriales con el fin de generar diversos productos como polímeros, biocombustibles, textiles, aditivos alimentarios, ente otros (10). Se estima que la biotecnología blanca jugará un rol fundamental en la economía industrial en el presente y futuro cercano, debido a que permitirá desarrollar procesos industriales 19 ambientalmente más sostenibles al utilizar materias primas de origen renovable, para generar productos de valor agregado de manera energéticamente eficiente y con bajos niveles de emisiones de CO2. De esta forma, ofrece una alternativa a la utilización de recursos fósiles, sustituyendo esta materia prima no renovable por biomasa, es decir, materiales biológicos de tipo lignocelulósico de origen vegetal, que constituyen el más abundante depósito de carbono en el planeta Tierra (11). Este tipo de recursos se clasifica como renovable, ya que constantemente se está regenerando, el dióxido de carbono se transfiere desde el aire a la biomasa al ser fijado mediante fotosíntesis, y luego vuelve a la atmósfera cuando el material final se degrada o combustiona para generar energía, fluyendo en un circuito cerrado. En general existen cuatro tipos de sustancias orgánicas que son agrupadas bajo el concepto de biomasa, incluye los productos de la industria forestal como la madera, los cultivos de granos y cereales como el trigo, el maíz y el arroz, los residuos, tanto industriales como también municipales y animales, como pueden ser los desechos alimenticios y el estiércol, y finalmente, diversas especies de algas. Es más, se estima que solamente el 3% de los 170 millones de toneladas de biomasa que se producen cada año en el mundo son aprovechadas en forma de cultivo, cosecha y aplicación tanto alimentaria como no alimentaria (12), por lo tanto, existe una cantidad significativa de recursos ambientalmente sostenibles que pueden ser explotados de forma responsable por la sociedad, esta situación se refleja de forma clara en la Tabla 1, en donde se indica y proyecta el potencial que posee la biomasa a nivel europeo. Tabla 1. Potencial de biomasa en la Unión Europea. Adaptado de (12). Una forma de procesar la biomasa y otorgarle valor añadido se realiza mediante las instalaciones denominadas biorrefinerías. En este tipo de establecimiento o red de establecimientos se convierte la biomasa en una variedad de productos químicos, materiales y energía, de manera análoga a como opera una refinería de petróleo que a partir de recursos fósiles permite obtener combustibles y sustancias químicas, situación que se ilustra en la Figura 2. Los tipos de productos generados en una biorrefinería pueden ser de diverso tipo, esto incluye compuestos de bajo valor añadido y alto volumen de producción como combustibles (biodiesel, bioetanol, biogás, etc) y químicos commodities o bulk (acetona, butanol, furfural, etc) pero también compuestos de alto valor añadido y bajo volumen de producción de tipo cosmético, nutracéutico o farmacéutico (12). Se estima que los productos industriales de base biológica sólo podrán ser competitivos con los productos de origen petroquímico si las materias primas implicadas son explotadas de forma óptima desarrollando un conjunto de cadenas de valor. 20 Figura 2. Comparación entre una refinería de petróleo y una biorrefinería. Adaptado de (12). Si bien existen diferentes tipos de biorrefinería, para efectos del actual trabajo, destaca la biorrefinería de materias primas lignocelulósicas, conocida como biorrefinería-LCF por sus siglas en inglés, en este tipo de instalación, cobra especial relevancia una selectiva separación de los componentes fundamentales de la biomasa, los cuales corresponden a celulosa, hemicelulosa y lignina. La celulosa corresponde a un polímero compuesto exclusivamente por moléculas de Dglucosa asociadas por enlaces glucosídicos β-1,4. Por otro lado, las hemicelulosas son heteropolisacáridos unidos también de forma mayoritaria por enlaces β-1,4 tanto de pentosas como hexosas, entre los que destacan la xilosa y la manosa. Finalmente, la lignina puede definirse como un polímero orgánico de tipo polifenólico, amorfo generado por la copolimerización de 3 monómeros fenil-propánicos denominados alcohol coniferílico, alcohol sinapílico y alcohol pcumarílico. Una apropiada separación de dichos compuestos es fundamental para su posterior aprovechamiento, operación denominada pretratamiento, ya que permite desarrollar las diversas líneas productivas que puede contener una biorrefinería, situación que se representa en la Figura 3. Figura 3. Diferentes líneas de producción posibles a partir de la separación de los principales componentes de las materias primas lignocelulósicas en el pretratamiento. Adaptado de (13). 21 Las biorrefinerías presentan importantes desafíos a superar, que involucran tanto las características de las materias primas implicadas, como también el estado de desarrollo de los procesos de conversión y las propiedades de los productos obtenidos. En primer lugar, es fundamental considerar la disponibilidad de la materia prima, que a diferencia de los ricos depósitos de petróleo y gas natural, ubicados en zonas geográficas específicas del planeta, la biomasa, se encuentra extensamente distribuida por el globo, en zonas de cultivo, zonas forestales, líneas de costa y múltiples fuentes de residuos orgánicos provenientes de la actividad humana y animal (12). Si bien la biomasa se ha definido como un recurso renovable, no es ilimitado. Su suministro depende de la actividad forestal y agrícola, la gestión de residuos y el manejo de tierras de cultivo, por ello cobra importancia que la obtención de este recurso no comprometa la capacidad de producir piensos y alimentos para humanos. Se considera que para superar dicha competencia entre el mercado alimentario y no-alimentario, es necesario maximizar la obtención de biomasa forestal y agrícola del terreno cultivado al seleccionar aquellas especies vegetales que sean más atractivas para el proceso productivo asociado a la biorrefinería. Además, se debe aprovechar y explotar de manera apropiada la significativa cantidad de residuos orgánicos que son producidos a nivel industrial y urbano (12). Un segundo elemento para considerar es que la biomasa se caracteriza por presentar una baja densidad aparente y un alto porcentaje de humedad, lo que se traduce en un incremento en los costes de recolección y transporte. La estrategia más utilizada es pre-procesar la materia orgánica, idealmente en el mismo lugar de recolección, mediante una molienda o una peletización. Esto no solamente incrementa la densidad del material, lo que facilita su transporte, sino que además, lo homogeniza, favoreciendo su procesado en la planta. Por otro lado, debido a la significativa cantidad de agua presente en la biomasa esta se degrada con facilidad, lo que reduce su calidad como materia prima, por lo que se recomienda su estabilización mediante un secado, para reducir el contenido de humedad al menos hasta el 25%. De esta forma, no solo se resuelve su carácter perecible, sino que también, permite almacenarla por largos periodos de tiempo, lo que cobra especial importancia para aquellos cultivos que son de tipo estacional, lo que resulta en un flujo continuo de materia prima (12). En tercer lugar, las biorrefinerías requieren aún mayor investigación y desarrollo tecnológico para que los procesos de transformación implicados puedan ser competitivos con los bien establecidos procesos petroquímicos, que presentan un alto grado de optimización técnica y económica. Estas mejoras deben incluir todas las fases del ciclo productivo de la biorrefinería. Se deben implementar pre-procesados in situ de la biomasa que pueden incluir operaciones de molienda y/o secado, pero en especial, métodos más eficientes y menos severos para fraccionar el material lignocelulósico en sus componentes fundamentales. Por otro lado, las operaciones de transformación asociadas a la biomasa requieren el perfeccionamiento de catalizadores en medio acuoso, en especial biocatalizadores como son células o enzimas, para la química de reducción que requiere esta materia prima caracterizada por un alto grado de oxidación y/o funcionalización (12). En el caso de las operaciones que impliquen un tratamiento termoquímico, la investigación se debe enfocar en el escalado y adaptación de unidades y procesos que ya existen para que sean capaces de soportar el considerable volumen del material orgánico involucrado. Para las operaciones de downstream, se necesita progresar en procesos de separación y purificación más eficientes y económicos, ya que pueden llegar a significar el 60 a 80% del coste global del proceso, esto se debe a que los productos obtenidos se caracterizan por encontrarse diluidos en una 22 mezcla compleja de compuestos orgánicos, en muchos casos, de similar naturaleza química. Finalmente, es de vital importancia que todas las actividades implicadas en el funcionamiento de la biorrefinería sean ambientalmente amigables, utilizar tecnologías limpias es fundamental para minimizar la huella ecológica asociada y así cumplir con los objetivos propuestos de reducir las emisiones de GHG (12). En cuarto lugar, existen considerables retos relacionados con los productos generados por la biorrefinería, en especial respecto de reducir los costes de producción, para que de esta forma puedan ser competitivos con los productos derivados del petróleo. Las biorrefinerías deben ser innovadoras y aprovechar las ventajas comparativas de la biomasa con el fin de desarrollar nuevas familias de productos que rompan el tradicional esquema de compuestos químicos bulk asociados a la petroquímica, como pueden ser compuestos farmacéuticos, nutracéuticos, cosméticos o alimenticios, aprovechando así cada uno de los diversos componentes de la materia prima utilizada, permitiendo que el proceso global sea rentable. Por otra parte, es fundamental que se estandarice la calidad del producto final, debido a que la biomasa se caracteriza por su variabilidad en el tiempo, de tal manera se puede ofrecer un producto homogéneo en el mercado facilitando sus posteriores aplicaciones y usos (12). Definir el tamaño óptimo de una biorrefinería es un problema complejo en el que interviene múltiples factores. En general puede ser descrito como una solución de compromiso entre el aumento del coste de transporte de la materia prima pretratada y menores costes de procesado a medida que aumenta el tamaño de la planta. Sin embargo, también es una función de la clase de biomasa utilizada, la ubicación geográfica de la instalación, el tipo de tecnología que se implementará, las presiones ejercidas por la demanda de cada producto, entre otros (12). El concepto de biorrefinería es esencial para comprender el presente trabajo. Su desarrollo se enmarca en el proyecto ULTREIA (Xunta de Galicia, ED431F 2020/6) en actual ejecución por el Grupo de Biotecnología Ambiental (GI-1613) en la Universidade de Santiago de Compostela. En él se pretende transformar el bagazo de manzana, un residuo de la industria de los zumos y la sidra, en compuestos nutracéuticos, enzimas y biocombustibles, lo que corresponde a una revalorización multi-producto (14). De esta forma, se responde a los principios de la economía circular, los residuos de una determinada industria se convierten en recursos para otra. Transformar residuos en materias primas es una de las claves para responder al cambio de modelo que debe enfrentar la humanidad. De forma más detallada, como se ilustra en la Figura 4, se pretende desarrollar una plataforma de revalorización en etapas. Se comienza con la extracción de los compuestos polifenólicos, que corresponden a sustancias químicas, típicamente encontradas en plantas, que se caracterizan por la presencia de más de un grupo fenol en su estructura molecular. Existe una cantidad significativa de evidencia que justifica su capacidad antioxidante previniendo el combatir el daño estrés oxidativo, lo que convierte a estos compuestos en una fuente ideal de nutracéuticos, aditivos cosméticos o para el tratamiento de enfermedades crónicas (14). Por ejemplo, se ha observado que estos fitoquímicos actúan por sus propiedades antioxidantes y antiproliferativas a nivel celular, sobre el DNA, en diferentes fases del cáncer colorrectal, evitando o controlando la enfermedad, un claro indicador del significativo potencial de aplicaciones que presentan los polifenoles (15). 23 Figura 4. Esquema de la biorrefinería multi-producto, destacados en verde, a partir de bagazo de manzana que se desea formular en el proyecto ULTREIA. Adaptado de (14). El bagazo libre de polifenoles es posteriormente sometido a una hidrólisis enzimática, en la que mediante la utilización de celulasas y pectinasas se obtiene una solución acuosa con una alta concentración de azúcares fermentables. Se espera que estas enzimas sean generadas en la misma biorrefinería utilizando diferentes corrientes de proceso como el bagazo en bruto, el bagazo libre de polifenoles y el sólido residual de la hidrólisis como sustrato para la realización de fermentaciones sumergidas con hongos filamentosos. Este tipo de cultivo, típico para la síntesis de enzimas hidrolíticas, empleará diferentes cepas de Penicillium y Trichoderma, y se prevé que al hacer uso de un sustrato similar que para la hidrólisis, el perfil de la mezcla enzimática sintetizada sea óptimo para los requerimientos de actividad celulolítica de la reacción. Posteriormente, el hidrolizado de bagazo de manzana es utilizado como sustrato para la fermentación acetona-butanol-etanol (ABE), en ella se transforman los azúcares del hidrolizado en solventes mediante el cultivo de Clostridia, un género de bacterias anaerobias estrictas y grampositivas. El principal producto de interés es el butanol, un biocombustible con atractivas propiedades fisicoquímicas como un alto contenido energético, baja miscibilidad en agua e higroscopicidad, además de adaptarse mejor a los motores de combustión interna de los vehículos, si es que es comparado con el bioetanol (16). Además, el biobutanol puede emplearse como solvente, o bien como materia prima (building block) para la síntesis de múltiples compuestos químicos derivados con aplicaciones en pinturas, polímeros o plásticos. La materia prima utilizada en el proyecto ULTREIA es el bagazo proveniente de la manzana, una de las frutas más consumida en el mundo. Se estima que aproximadamente 87 millones de toneladas de manzanas fueron producidas a nivel mundial en el año 2019, encabezando la lista China y los Estados Unidos. De este total, la Unión Europea (UE) aporta cerca de 17 millones de toneladas, lo que representa cerca del 20%, siendo Polonia, Francia, Italia y Alemania los países que más contribuyen a dicho valor (17). La mayor parte de esta cifra representa las denominadas manzanas de mesa, que se emplean para su consumo directo o bien para la elaboración de zumo, y solamente entre el 15 al 45% corresponden a manzanas ricas en taninos que se aprovechan para la producción de sidra (18). Otras aplicaciones corresponden también a la manufactura de mermeladas, vinagre y pulpa de manzana. 24 Aquellas manzanas que por parámetros organolépticos y/o estéticos no se consideran adecuadas para su consumo in natura son procesadas, generando una considerable cantidad de residuos orgánicos (19). El bagazo de manzana justamente corresponde a un desecho industrial proveniente de empresas manufactureras una vez que la fruta es triturada o prensada para separar su zumo. El bagazo de manzana húmedo representa hasta el 25% de la masa total de la fruta fresca, por ejemplo, en el año 2014 se procesaron más de 3 millones de toneladas de manzanas y se generaron cerca de 800.000 toneladas de bagazo (18, 20). Su disposición final como deshecho en el medio ambiente representa un importante desperdicio de biomasa, que se podría utilizar para formular diferentes metabolitos de alto valor agregado (19). Además, dicha disposición presenta importantes desafíos y dificultades debido a su gran volumen y alto contenido de humedad que facilita su rápida putrefacción (20). De manera general, el bagazo de manzana se encuentra compuesto fundamentalmente por la cáscara y pulpa alcanzando un 95% en masa, por semillas entre el 2 a 4% y por tallos, representando un 1% (15). El bagazo recién obtenido presenta un alto nivel de humedad, que puede encontrarse en el rango de 70-85% en peso. Sin embargo, si se reduce el contenido de agua hasta un valor menor al 10% es posible evitar la contaminación microbiana, manteniendo estable su calidad durante el almacenamiento (18). Si bien la composición exacta del bagazo cambia con la variedad de manzana utilizada (como podría ser Royal Gala, Red Delicious, Granny Smith, Golden Delicious, entre otras), éste se encuentra formado principalmente por fibra insoluble de tipo lignocelulósica, pero también por azúcares simples como glucosa, fructosa y sacarosa, y bajos niveles de minerales, proteínas y vitaminas (19). Como un primer acercamiento, la composición proximal del bagazo de manzana fresco corresponde a 75,6% agua, 5,1% proteínas, 4,2% lípidos, 2,8% cenizas y 12,3% carbohidratos, los cuales pueden subdividirse en 5,7% azúcares reductores, 5,1% fibra y 1,5% pectina; además se ha determinado su pH con un valor de 4,0 (19). Sin embargo, con el fin de disponer una visión más detallada se presenta en la Figura 5 la composición fisicoquímica del bagazo seco, donde se aprecia una considerable presencia de fibra dietaria, de azúcares tanto reductores como glucosa y fructosa, y no reductores como el almidón y la sacarosa (18). La fibra dietaria corresponde a una amplia diversidad de carbohidratos que no pueden ser digeridos por el sistema enzimático humano del tracto digestivo, y dependiendo de su naturaleza pueden clasificarse en soluble e insoluble. En este caso, dos tercios de la fibra dietaria del bagazo de manzana corresponde a la de tipo insoluble, que incluye la celulosa, la hemicelulosa y la lignina; la parte restante corresponde a fibra soluble en la que predomina la pectina, un heteropolisacárido tridimensional de polímeros ácidos y neutros ramificados (18). La composición de la fibra dietaria para esta biomasa corresponde a 16,67% celulosa, 8,44% lignina, 4,69% hemicelulosa y 6,09% pectinas (20). 25 Figura 5. Composición fisicoquímica aproximada del bagazo de manzana seco, indicada en % másico. Adaptado de (18). A pesar de lo anterior, no existe un consenso único respecto de la composición del bagazo, por ejemplo, de acuerdo con el trabajo de Dhillon et al., es posible identificar azúcares como arabinosa 14-23%, galactosa 6-15% y xilosa 1,1%. Además se reportaron varios minerales pertenecientes a las cenizas y micronutrientes como Ca 0,06-0,1 % w/w, Cu 1,1 mg/Kg, Fe 31,838,3 mg/Kg, K 0,4-1,0 % w/w, Mg 0,02-0,36 % w/w, Mn 3,96-9,0 % w/w, P 0,07-0,076 % w/w y Zn 15,0 mg/Kg (21). Como no hay acuerdo en esta materia, es recomendable llevar a cabo una caracterización propia de cada bagazo de manzana que se disponga, debido a que como se ha comentado, cambia según la variedad de manzana utilizada y del proceso del que proviene. En la actualidad, el bagazo de manzana se trata de forma similar que otros residuos de tipo orgánico, es decir, disposición en vertederos, incineración, compostaje, esparcimiento en tierras y alimentación animal (15, 19–21). Esto presenta varias dificultades, por un lado, en el caso de no revalorizar este desecho, las industrias deben asumir el coste de su tratamiento, transporte y/o disposición final, disminuyendo la rentabilidad del proceso. Por otro lado, su aplicación en compostaje y piensos representan revalorizaciones de bajo valor, pero además, presenta un bajo contenido de proteínas y vitaminas, y adicionalmente un valor energético menos metabolizable que otros ensilados, como el de maíz, lo que genera un alimento para animales de calidad media a baja con un bajo valor nutricional (19, 21). Solamente una pequeña proporción del bagazo de manzana se emplea como forraje o añadida al suelo como fertilizante. La mayor parte de esta biomasa de bajo coste se composta o dispone en vertederos, lo que genera inconvenientes ambientales y sociales, libera GHG y en determinados casos amenaza la salud de las personas (21). De la mano de la biotecnología ambiental es posible evitar dichas dificultades, transformándolas en una oportunidad para la producción de valiosos bio-productos, principalmente mediante la fermentación con microorganismos se puede convertir la biomasa en ácidos orgánicos, enzimas, biocombustibles o biopolímeros, y mediante diferentes tecnologías de extracción directa, compuestos bioactivos como antioxidantes. Los artículos de revisión de Vendruscolo et al. (19), de Dhillon et al. (21), de Perussello et al. (15) y de Waldbauer et al. (18) condensan la multiplicidad de esfuerzos que se han realizado con el fin de revalorizar el bagazo, 32 Figura 6. Clasificación y ejemplos de biocombustibles según el tipo de materia prima utilizada. Adaptado de (22). Los biocombustibles de 1era generación, como el bioetanol o biodiésel, ya se producen de forma significativa en una amplia variedad de países, sin embargo, presentan importantes desafíos a superar relacionados fundamentalmente con el uso de suelos y la relación con el mercado alimentario. Dado que se emplea solo una pequeña fracción de la masa vegetal para síntesis del combustible, el rendimiento de la tierra cultivada es particularmente bajo. Debido a que generan un incremento en la demanda de cultivos energéticos, que son la base alimentaria de muchas sociedades, se tiende a elevar sus precios, alterando el comportamiento normal del mercado y afectando negativamente a los consumidores, esto promueve el interés por hacer uso de biomasa no comestible y que utilice la totalidad de la especie vegetal. Siguiendo este principio, los biocombustibles de 2da generación son elaborados a partir de biomasa lignocelulósica que corresponden a los restos no comestibles de cultivos energéticos como la paja, tallos y hojas residuales, pero también, plantas completas como pastos y árboles especialmente cultivados para la producción energética (22). Este tipo de biocombustible presenta diversas ventajas como no competir con el mercado de los alimentos, se incrementa la productividad de los suelos cultivados y aumenta el rendimiento de biomasa que es convertida en biocombustible. Sin embargo, requieren procesos de transformación más sofisticados, por ejemplo, la matriz lignocelulósica debe ser fraccionada mediante un apropiado pretratamiento antes de realizar la conversión en biocombustible, se necesita más inversión por unidad de producción e instalaciones más grandes para poder compensar los costes de capital. Las dos categorías estudiadas promueven el agotamiento de los recursos hídricos, aceleran la deforestación de los bosques y generan preocupación respecto de los cambios y competencias en el uso de suelos, lo que ha llevado a investigar biocombustibles de 3era generación que emplean microorganismos que pueden acumular altas concentraciones de ácidos grasos en su interior como diversas especies de bacterias, hongos y microalgas. Por ejemplo, se han logrado identificar microalgas capaces de sintetizar 100 veces más aceite que cualquier otra planta, incluso que la soja, esto demuestra el gran potencial de este tipo de materia prima, que requiere mayores niveles de desarrollo para su eventual puesta en marcha (22). El mercado de los biocombustibles se encuentra en pleno auge. Se estima que entre 1980 y 2005, la producción global de biocombustibles aumentó en un orden de magnitud, desde 4,4 a 33 50,1 billones de litros, y se esperan notables crecimientos en los próximos años (22). El caso de la Unión Europea (UE) no es diferente, depende fundamentalmente del petróleo y gas transportado desde países política y económicamente inestables, un ejemplo de ello es que gran parte de su sistema de transporte se encuentra basado en el diésel. Esto ha llevado a que exista un amplio interés en la promoción y producción de energía renovable, entre la que se encuentra la opción de los biocombustibles. Se persiguen tres objetivos estratégicos: el combate contra el cambio climático, la reducción de la dependencia externa de la UE de los hidrocarburos importados, y la promoción del crecimiento y la creación de empleos, consolidando fuentes de energía seguras y asequibles a los consumidores (23). Un ejemplo de ello es que en marzo de 2007 el Consejo Europeo publicó la directiva que obliga a los estados miembros a alcanzar el objetivo mínimo de 10% de biocombustibles en el sector de transportes para el año 2020 (24). En la UE solamente se utilizan como biocombustibles el biodiesel, alcanzando el 76%, y producido a partir de aceites vegetales, y bioetanol llegando al 20%, derivado fundamentalmente de cultivos energéticos como el trigo, la caña de azúcar, el maíz, almidón y en menor medida desde madera y paja, ya en menor medida se encuentra el biogás sintetizado en Polonia, Alemania y otros países europeos fundamentalmente del maíz. El bioetanol puede ser utilizado hasta en una mezcla de 5% con combustibles fósiles sin tener que realizar modificaciones a los motores, esto según la norma de calidad EN228, y para alcanzar mayores concentraciones de etanol en el combustible, como puede ser E85, es decir, 85% de etanol, esta modificación se vuelve estrictamente necesaria. En el año 2012, se calcula que toda la superficie de terrenos de cultivo en la UE utilizada para la producción de biocombustibles fue de 4,4 millones de hectáreas, lo que representa un 3% de todas las áreas cultivables (23). En el año 2020 se estima que el mundo produjo cerca de 130,7 billones de litros de bioetanol y 40,3 billones de litros de biodiésel, si se observa el caso de la Unión Europea, se elaboraron 7,2 billones de litros de bioetanol y 14 billones de litros de biodiésel, lo que representa 5,57% y 34,93% respectivamente de la producción mundial, lo que permite clasificarlo como uno de los actores protagonistas en el mercado de los biocombustibles (25). El biocombustible de interés para el actual trabajo corresponde al biobutanol, es decir, butanol obtenido desde fuentes renovables como es el caso de la biomasa. Corresponde a un alcohol primario de estructura lineal cuya fórmula química corresponde a C4H9OH conocido como n-butanol, 1-butanol o de forma sistemática como butan-1-ol. Existen cuatro isómeros estructurales para esta molécula orgánica, ilustrados en la Tabla 5, de los cuales, el n-butanol, isobutanol y tert-butanol pueden utilizarse como aditivos en combustibles fósiles, sin embargo, solamente el n-butanol es el más prometedor para su uso como biocombustible ya que puede mezclarse fácilmente en una alta proporción con gasolina, sin requerir ningún tipo de modificación a los convencionales motores de ignición. Otra interesante aplicación es su capacidad para ser mezclado con diésel, lo que permitiría reducir las emisiones, fundamentalmente de hollín, debido a su mayor contenido de oxígeno. Además, presenta un más alto calor de vaporización que el ampliamente utilizado etanol, lo que es beneficioso porque permite reducir la temperatura de combustión y dificulta la generación de compuestos NOx, indeseados por sus perjudiciales efectos a la salud y el medio ambiente (26). 34 Tabla 5. Isómeros estructurales del butanol: características generales y principales aplicaciones. Adaptado de (26). El n-butanol presenta una serie de propiedades y características que otorgan ventajas y desventajas frente a los combustibles tradicionales y frente los biocombustibles, estas son resumidas en la Tabla 6. Respecto de su potencial uso como fuente de energía, resulta favorable su alto calor de combustión, este valor se incrementa a medida que una molécula tiene un mayor número de átomos de carbono, en este caso, el butanol presenta el doble que el etanol, lo que se traduce en un mayor nivel de densidad energética por volumen. De esta forma un motor que utilice butanol requerirá un menor consumo de combustible o bien, un mejor kilometraje, si es comparado con otro que funcione con etanol. Otra propiedad interesante corresponde a su baja volatilidad, de forma inversa, la volatilidad de los alcoholes disminuye a medida que se incrementa el número de carbonos, lo que se traduce en una menor tendencia a la vaporización. Si a esta situación, se añade que presenta un mayor punto de inflamabilidad que el etanol, se obtiene que el n-butanol es eventualmente más seguro para su utilización a altas temperaturas y para su transporte (26). 35 Tabla 6. Propiedades físicas y químicas de algunos alcoholes y combustibles fósiles tradicionales. Adaptado de (26). Entre las principales ventajas de la utilización de butanol como combustible está que utilizarse en altas concentraciones en los motores convencionales de chispa sin inconvenientes. Además, debido a que el calor de vaporización tiene un valor menor que el etanol o metanol, de esta forma se esperan menos problemas para un arranque del motor en frío. Por otro lado, derivado de un mayor número de átomos de carbono, el n-butanol presenta una mayor afinidad por las sustancias orgánicas, como la gasolina, y menor afinidad por el agua e higroscopicidad, lo que facilita su mezclado y previene la contaminación del biocombustible con agua durante su fase de distribución. También derivado de su estructura química, el 1-butanol presenta mayor viscosidad y lubricidad que los demás alcoholes comparados, de esta forma, el biocombustible podría proteger diversas partes del motor que están sometidas a desgaste como bombas, rieles e inyectores (26). Sin embargo, la utilización de n-butanol también presenta una serie de desafíos, entre ellos se encuentra que al presentar un menor calor de combustión que los combustibles fósiles, el desempeño del motor será menor que con las gasolinas tradicionales. Además, implicará un mayor consumo, debido a que se deberá inyectar una mayor cantidad de biocombustible por cada ciclo de operación. Si bien el butanol presenta un similar número de octano que las bencinas convencionales, valor que se relaciona con la capacidad antidetonante de la sustancia, es menor si se compara con el etanol, lo que se traduce en un menor ratio de compresión, y por lo tanto, una menor eficiencia en el funcionamiento del motor, tanto en ciudad (RON) como carretera (MON) (26). Si se compara el índice de cetano, que guarda relación con el tiempo que transcurre entre la inyección del carburante, la gasolina, y el comienzo de la combustión, se observan menores valores para el n-butanol si es comparado con el diésel lo que reduce la autoignición y potencialmente perjudica el control de la combustión. Esto se debe a que cuanto más elevado sea el número de cetano, menor es el retraso en la ignición y mejor es la calidad de la combustión. No obstante, la principal desventaja del biobutanol no se relaciona con sus propiedades como 36 combustible, sino con su fabricación, debido a que las fermentaciones que lo generan presentan valores particularmente bajos de producción si es comparada con la bien establecida fermentación que produce etanol, que tiene una tasa de producción entre 10 a 30 veces mayor, siendo un importante reto que mejorar desde el punto de vista biotecnológico. Se estima que el mercado mundial de 1-butanol presenta un tamaño de más de 2,8 millones de toneladas producidas anualmente, lo que equivale a un valor de aproximadamente 5 billones de dólares, con una tasa de crecimiento anual de 3,2%, concentrándose su demanda en América del Norte con un 28% del mercado, Europa Occidental con un 23% y el Nordeste Asiático con un elevado 35% (27). Su importancia no radica solamente, en aplicaciones convencionales, presentadas en la Tabla 5, como solvente en pinturas, plastificantes o aditivo en gasolinas, en los que es un bloque de construcción para ésteres de acrilato y metacrilato, éteres de glicol, acetato de butilo y diversos polímeros de amplia aplicación industrial, sino que también en la perspectiva futura de ser utilizado como biocombustible. En la actualidad la mayor parte del n-butanol es obtenido de forma sintética derivado de la actividad petroquímica, mediante un proceso bien establecido denominado proceso oxo basado en la hidroformilación del propileno (26). Esto se traduce en la adición de hidrógeno y un grupo formil a el doble enlace carbono-carbono del propileno, empleando monóxido de carbono e hidrógeno, obteniéndose n-butiraldehído e isobutiraldehído gracias al uso de catalizadores de cobalto y rodio a alta presión. A continuación, se hace uso de catalizadores de níquel con el fin de hidrogenar dichos aldehídos, resultando en la formación de n-butanol e iso-butanol (28). Los costes de producción y disponibilidad de butanol van de la mano con los del propileno al ser su materia prima de partida, el propileno a su vez depende fuertemente del precio del petróleo, ya que se obtiene por la termólisis de este material, por lo tanto, en el status quo en que nos encontramos el butanol se encuentra completamente supeditado al crudo. Sin embargo, uno de los nuevos paradigmas hacia los que se desplaza nuestra sociedad corresponde a la emancipación de los recursos fósiles y sus derivados, tanto por razones medioambientales como también, sociales y económicas, por ello la obtención de butanol desde fuentes renovables, como es el caso del bagazo de manzana, cobra nuevamente un especial significado (26). 1.4. Fermentación ABE El mecanismo por el cual se pretende obtener el biobutanol, es mediante la fermentación Acetona-Butanol-Etanol, mejor conocida como ABE. A pesar de haber captado el interés de investigadoras e investigadores en las últimas décadas, sus orígenes se remontan incluso hasta la segunda mitad del siglo XIX. La producción de n-butanol mediante fermentación microbiana se remonta al año 1861 siendo reportada por el propio Louis Pasteur. Entre las décadas de 1860 hasta 1910 se llevaron a cabo importantes avances en el reconocimiento de los microorganismos productores de butanol y acetona, hasta que en el año 1911 Jaim Weizmann, investigador de la Universidad de Manchester, aisló una bacteria anaerobia que posteriormente se denominó Clostridium acetobutylicum. Con ella se diseñó un proceso que presentaba altos rendimientos para generar butanol y acetona a partir de diversos sustratos ricos en almidón, fermentación que finalmente se patentó en 1915 (29). El proceso cobra importancia, a partir de la Primera Guerra Mundial, donde se instalan plantas en Reino Unido, Canadá y Estados Unidos que se basan en el proceso Weizmann para la producción de acetona, como precursor para formar cordita, un tipo de pólvora empleado en la guerra. Durante el periodo de entreguerras la patente expiró y con la llegada de la Segunda Guerra Mundial en el año 1939, la demanda de acetona volvió a incrementarse y nuevas plantas de ABE 37 fueron construidas en Japón, India, Australia, China, URRS y Sudáfrica, además de expandirse en los países existentes. Sin embargo, con el desarrollo de la industria petroquímica a comienzos de los años 1950, y por lo tanto, con el descubrimiento de la producción sintética de butanol a partir de los derivados del petróleo, la industria basada en la fermentación comenzó a decaer por el efecto combinado de un menor precio de los solventes debido al incremento en la oferta, y además por el alza en el precio de las melazas, la materia prima empleada para el crecimiento bacteriano (29). Casi un siglo de perfeccionamiento de la química del petróleo acabó casi totalmente con la industria basada en ABE, y afianzó la producción del n-butanol petroquímico a gran escala como precursor de una diversa serie de compuestos para un amplio rango de industrias. Finalmente, desde la década de los 2000, la fermentación ABE ha atraído una renovada atención como un mecanismo para generar compuestos químicos desde recursos renovables, fuentes de energía amigables con el medio ambiente y como una oportunidad para disminuir o acabar con la dependencia de los recursos fósiles (29). Los solventes butanol, acetona y etanol son formados naturalmente por un amplio número de especies del género Clostridium, como son C. saccharoacetobutylicum, C. aurantibutyricum, C. pasteurianum, C. sporogenes, C. cadaveris o C. tetanomorphum, sin embargo, destacan por su capacidad solventogénica las especies C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, y C. saccharoperbutylacetonicum, por ello son las más utilizadas para las investigaciones relacionadas con ABE. En términos generales, corresponden a bacterias anaerobias estrictas, grampositivas, con forma de bacilo y capaces de formar esporas. Se caracterizan por ser capaces de metabolizar una amplia variedad de sustratos desde monosacáridos, como hexosas y pentosas, hasta polisacáridos como el almidón. En términos generales, no son capaces de sintetizar enzimas con actividad celulolítica, por lo que no pueden utilizar directamente la celulosa como fuente de carbono y energía. Por ello es esencial un pretratamiento ácido o enzimático que promueva la hidrólisis de este material si se quiere revalorizar biomasa de tipo lignocelulósica (30). Desde un punto metabólico, estas bacterias son clasificadas como quimioorganoheterótrofas debido a que utilizan compuestos orgánicos, en ese caso diversos tipos de azúcares, como fuente de energía, carbono y equivalentes reductores para las reacciones de biosíntesis. Su crecimiento se divide en dos fases, una acidogénica seguida de otra solventogénica, cada una con un comportamiento metabólico diferente y asociada a una evolución en la morfología de la célula (29). Durante la fase acidogénica, el microorganismo mantiene un crecimiento exponencial y produce ácidos acético y butírico, a medida que consume el sustrato, por ello se evidencia también una disminución en el valor del pH. A continuación, la acumulación de ácidos orgánicos y disminución de pH llegan a un punto crítico que desencadena el cambio hacia la fase solventogénica mientras las células se encuentran en fase estacionaria. En esta fase, la bacteria con el fin de detoxificar el ambiente que le rodea, vuelve a asimilar los ácidos convirtiéndolos en los solventes acetona, butanol y etanol, siguiendo una proporción de 3:6:1 respectivamente, comportamiento que se representa en la Figura 7.A (31). 38 Figura 7.A. Perfiles de crecimiento celular, formación de productos y diferenciación celular de Clostridium acetobutylicum durante el desarrollo de un cultivo batch de ABE (31). B. Ciclo celular de las bacterias productoras de solvente del género Clostridium (29). Desde el punto de vista de la morfología celular, también representado en la Figura 7.B, las células vegetativas en crecimiento, durante la fase acidogénica, evolucionan hacia la forma denominada clostridia. A medida que el ambiente se torna adverso por la acumulación de ácidos, esa forma inicia el proceso denominado diferenciación en el que, como mecanismo de defensa, las células forman gránulos que posteriormente utilizan como reserva de carbono y energía. Una vez que se ha alcanzado la fase estacionaria y se produce el switch metabólico, las células en estado clostridial comienzan a convertir los ácidos en solventes mientras que de forma paralela se inicia el proceso de esporulación, en el que los depósitos granulares se emplean como fuente para formación de la endoespora. Finalmente, ocurre el proceso de maduración en donde se termina de desarrollar la espora y esta es liberada desde el interior de la célula, siendo capaz de sobrevivir por largos periodos de tiempo hasta que las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables y se produzca la germinación (32). Si se estudia el metabolismo de forma más detallada se observa que los azúcares son catabolizados mediante la vía Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) hasta piruvato, y luego transformado en un primer momento en acetil-CoA y CO2 mediante la enzima piruvato:ferrodoxin oxidorreductasa. Producto de la combinación de dos moléculas de acetil-CoA y la sucesión de 39 múltiples pasos enzimáticos se obtiene butiril-CoA, ambos intermediaros son fundamentales para el metabolismo de Clostridia, debido a que pueden convertirse en ácidos o solventes, dependiendo de la fase en que se encuentre la bacteria. Como resultado de esta vía glicolítica, se generan ATP, principal molécula de transferencia energética, y NADH, como poder reductor a partir de NAD+. Las moléculas de ATP son consumidas en las vías biosintéticas o anabólicas de la célula, mientras que el NAD+ debe ser regenerado para que el consumo de azúcares pueda continuar. La producción de ácido acético es la opción más favorable para la producción de ATP, mientras que la síntesis de ácido butírico permite reoxidar parte del NADH. El resto de poder reductor es consumido mediante la enzima hidrogenasa que permite combinar el exceso de protones y electrones generados por el metabolismo con la consecutiva producción de hidrógeno molecular (29). Figura 8. Esquema de las vías catabólicas presentes en el metabolismo de las bacterias productoras de solvente del género Clostridium. Se diferencia con código de colores el flujo de carbono con flechas negras y el flujo de electrones con flechas azules. Las enzimas etiquetadas por número corresponden a: 1. Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, 2. Piruvato-ferrodoxina oxidorreductasa, 3. NADH-ferrodoxina oxidorreductasa, 4. NADPH-ferrodoxina oxidorreductasa, 5. Hidrogenasa, 6. Lactato deshidrogenasa, 7. Fosfato acetiltransferasa, 8. Acetato quinasa, 9. Tiolasa, 10. 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, 11. Crotonasa, 12. Butiril-CoA deshidrogenasa, 13. Fosfato butiltransferasa, 14. Butirato quinasa, 15. Acetaldehído deshidrogenasa, 16. Etanol deshidrogenasa, 17. Butiraldehído deshidrogenasa, 18. Butanol deshidrogenasa, 19. Acetoacetoil-Coa:acetato/butirato:CoA transferasa; 20. Acetoacetato descarboxilasa (29). Diversos factores influyen para que se produzca un apropiado cambio hacia la fase solventogénica, entre ellos se encuentra el pH extra e intracelular, la concentración de ácidos productos, la limitación de nutrientes, la temperatura y el oxígeno, sin embargo, se ha reportado que el más significativo corresponde a la concentración de ácido butírico no disociado. A medida 40 que se produce la reutilización de los ácidos y la diferenciación celular, se produce acetoacetato, precursor de la acetona, y de forma paralela ambos ácidos orgánicos son reducidos hacia etanol y butanol mediante sus correspondientes enzimas deshidrogenasas (29). La fermentación ABE presenta importantes desafíos a superar, el primero de ellos y más importante corresponde a la inhibición por producto que sufren los cultivos de Clostridium. Se ha reportado que la inhibición del crecimiento y la síntesis de solventes es parcial cuando la concentración de n-butanol llega a 11 g/L y es total cuando se superan los 15 g/L. La toxicidad de este compuesto se explica en que el butanol rompe los enlaces tipo puente de hidrógeno entre fosfolípidos que componen la membrana plasmática generando la pérdida del potencial de membrana e incrementando su fluidez (29). Esto desencadena una alteración en el mantenimiento de la fuerza protón motriz, el pH interno, los niveles de ATP, la absorción de glucosa y una pérdida de actividad de las proteínas integrales de membrana, lo que finalmente se traduce en una reducción de la viabilidad celular (30). Los principales enfoques para incrementar la producción de butanol son por un lado, manipular genéticamente a los microorganismos para aumentar sus niveles de tolerancia, y por otro lado, la implementación de técnicas de remoción de producto in situ, como adsorción, absorción, líquidos iónicos, extracción líquido-líquido, entre otras, para remover el butanol del caldo de cultivo mientras es generado (27). Además de la inhibición por producto, en determinados casos durante el pretratamiento de la biomasa, también se generan una serie de compuestos inhibitorios del crecimiento de las cepas. Algunos de estas sustancias pueden ser formados al realizar una hidrólisis ácida de los componentes lignocelulósicos de la materia prima y pueden incluir furanos, como el furfural o 5hidroximetilfurfural (HMF), y ácidos orgánicos como ácido fórmico o ácido acético. Sin embargo, ciertas moléculas inhibitorias se encuentran desde el comienzo en la biomasa, este es el caso de diversos compuestos fenólicos. Con el fin de reducir este efecto inhibitorio, se puede adoptar una serie de operaciones de detoxificación del hidrolizado como son la suplementación con glicerol, la adsorción mediante carbón activado o resinas, el overliming con Ca(OH)2 o CaO, o bien realizar una extracción previa a la fermentación en el caso de los polifenoles, que permiten incrementar la producción de butanol (33). Un segundo inconveniente corresponde a la degeneración de la cepa, esto es, la pérdida de capacidad de las células para producir los solventes a medida que estas se enfocan en el proceso de esporulación. Es el resultado de una serie de cambios genéticos que ocurren al mantener las cepas de Clostridia en estado vegetativo por prolongados periodos de tiempo en un mismo cultivo o al realizar cultivos en serie, lo que provoca una paulatina disminución en la productividad de butanol a medida que se acumulan las células degeneradas en la fermentación. Por ello, cobra especial importancia la mantención de un banco celular en buen estado, para llevar a cabo las fermentaciones que sean necesarias y evitando llegar al proceso de degeneración. En tercer lugar, la infección de las bacterias por virus de tipo bacteriófago es otra importante problemática que sufren este tipo de cultivos, para ello se deben maximizar las condiciones de limpieza y esterilidad, con el fin de evitar la contaminación. Para evitar esta situación se han evaluado procesos de selección y aislamiento de mutantes que presenten mayores niveles de resistencia a la infección (30). El cuarto elemento para considerar en el cultivo de Clostridium corresponde al fenómeno llamado acid crash que ocurre justo entre la transición entre acidogénesis y solventogénesis. Ocurre cuando en una fermentación se pierde el control del pH, que a su vez provoca un detenimiento en el consumo de sustrato, la producción de ácidos y de butanol. Se ha observado que la sobreproducción de ácidos orgánicos sin disociar, con una concentración mayor a 60 mM, 41 con un bajo pH pueden corresponder a las causas principales del acid crash. Sin embargo, se requiere una concentración mínima de ácido butírico sin disociar de 1,5 g/L para dar comienzo a la solventogénesis, por lo tanto, es importante encontrarse dentro de dicho rango para que la fermentación sea exitosa. De todas formas, aún se desconocen varios aspectos como a) el pH exacto en el que ocurre el acid crash, b) a qué pH producción de butanol será la principal, c) a qué pH se impondrá la generación de ácido butírico. Lo que sí se conoce, es que el control del pH juega un rol fundamental en la producción de butanol. Entre las estrategias que existen para regularlo se encuentra la neutralización con NaOH a medida que pasa el tiempo, la suplementación del medio de cultivo con CaCO3 y la utilización acetato de sodio (HOAc/NaOAc) como tampón (34). Existe una considerable cantidad de trabajos en los que se emplea biomasa lignocelulósica como materia prima para la síntesis de biobutanol mediante fermentación ABE (22, 29, 30, 35), entre las que se encuentran: paja de arroz, paja de cebada, pulpa de remolacha azucarera, tallo de maíz, bagazo de caña de azúcar, madera de pino, madera de olmo, paja de trigo, microalgas, lodo de molienda de papel, eucaliptus, bagazo dulce de sorgo, torta de palmiste, rastrojo de maíz, grano gastado de la cerveza (BSG) y residuo de fibras de algodón. Además, se utilizan diferentes cepas de bacterias: C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, y C. saccharoperbutylacetonicum. En la Tabla 7 se presentan algunas de las materias primas renovables empleadas como sustrato para la fermentación ABE. Se observa que existe una amplia diversidad de resultados, que dependen de la materia prima utilizada, el proceso utilizado o la cantidad de azúcares iniciales. Los mejores resultados en términos de concentración se obtuvieron con paja de arroz y mazorcas de maíz, probablemente debido a la detoxificación. Los mayores rendimientos y productividades se obtuvieron también con maíz, mientras que con paja de arroz los solventes se producen a una velocidad sustancialmente menor, debido quizás a la utilización de ácidos en el pretratamiento y a la baja concentración de azúcares. Los resultados de la Tabla 7 muestran que múltiples variables afectan a la fermentación ABE tales como la composición de la materia prima, la presencia de compuestos inhibidores, la concentración inicial de sustrato, el tipo de pretratamiento, el control de pH, la temperatura, la modalidad de operación, entre otras. Tabla 7. Comparación de la producción de biobutanol mediante fermentación a partir de materias primas lignocelulósicas en las que se emplearon diferentes tipos de pretratamiento. Adaptado de (29). 48 las condiciones anaerobias mediante Anaerocult® A (Merck KGaA, 1.13829.0001) y que eran comprobadas por la presencia de un indicador Anaerotest® (Merck KGaA, 1.15112.0001), a los cuales se les debió añadir 35 y 1 mL de agua destilada respectivamente para ser activados. La jarra se incubó a 35 °C durante 5 a 7 semanas. A continuación, desde una placa ya existente en buen estado se elaboró el stock de esporas en glicerol. Para ello se preparó 50 mL de una solución ésteril de 15% glicerol y 85% suero fisiológico (9 g/L de cloruro de sodio en agua destilada). Posteriormente, bajo mechero y en campana, se añadió 1,5 mL de esta solución a tubos Eppendorf estériles. La placa Petri que se escogió no solamente contenía colonias visualmente apropiadas en términos de color, forma y textura, sino que también se comprobó al microscopio óptico Nikon Labophot, equipado con una cámara Nikkon asociada al software Nis Elements D 4.40.000, con un aumento de 10x, que la morfología principal de las bacterias era de tipo espora, dichas fotografías se adjuntan en el Anexo A. Manteniendo las condiciones de esterilidad, se tomaron una o dos colonias desde la placa, mediante el asa de siembra y se suspendieron en un tubo Eppendorf, procedimiento que se repitió con cada uno de ellos, para luego ser almacenados a -20 °C en congelador. Desde los tubos con esporas congeladas es posible comenzar con el proceso de reactivación llevado a cabo por choque térmico o heat shock. Primero, los Eppendorf se descongelaron en un baño de agua a 35 °C, para luego ser sometidos a un baño caliente de agua a 80 °C durante 10 min. Inmediatamente después, se colocaron en agua fría cercana a los 0 °C durante 5 min. En paralelo se preparó 100 mL de medio de reactivación ATCC 2107, se mantuvo en agitación hasta el viraje de color de azul a rosado, se ajustó el pH a 6,8 añadiendo NaOH 4 M y se distribuyó en tubos de vidrio de 5 mL que una vez tapados con algodón fueron autoclavados a 110 °C durante 30 min. Se añadió 1 mL del contenido de un tubo Eppendorf con esporas tratadas por heat shock, bajo campana y mechero, a cada tubo con medio de reactivación estéril. Estos se introdujeron finalmente a una jarra de anaerobiosis, que mantenía un ambiente anaerobio mediante el reactivo Anaerocult® A, era comprobado mediante el indicador Anaerotest® y fue incubada a 35 °C durante una semana. Tras observar crecimiento en los tubos se inició la etapa de crecimiento. Para ello se preparó 200 mL de medio de reactivación ATCC 2107, se ajustó el pH a 6,8 mediante una solución de NaOH 4 M y se añadió a ocho botellas que se encapsularon, cuatro que contenían 8 mL, dos con 25 mL y dos con 50 mL. A todas las botellas se les desplazó el oxígeno (O2) mediante nitrógeno (N2) con el fin de crear un ambiente anaerobio durante 40 min, con lo que se apreció un cambio de color de azul pálido a rosado, y posteriormente fueron presurizadas también con N2 durante 20 min. Las botellas se esterilizaron en autoclave a 110 °C durante 30 min. Luego, bajo condiciones de esterilidad en campana y mechero, se inoculó aquellas botellas que contenían 8 mL de medio de reactivación con el contenido de aquellos tubos de vidrio en los que se observó crecimiento, dos con un inóculo de 2 mL y las otras dos con un inóculo de 4 mL. Las cuatro botellas se incubaron durante 2 días a 35 °C. Cuando se observó crecimiento en las botellas incubadas se pasó a inocular aquellas de 25 y 50 mL, también bajo campana y mechero, y utilizando un tamaño de inóculo de 10 mL proveniente de dichas botellas. También estas cuatro botellas fueron incubadas a 35 °C durante una semana hasta que se aprecie crecimiento. Para continuar con la investigación se escogió como banco de trabajo, almacenado en cámara fría a 4 °C, una botella de volumen final de 60 mL, en la que se visualizó crecimiento celular y comprobó en microscopio su buen estado, fotografías que se incluyen en el Anexo B, mientras que las demás botellas se almacenaron como banco de respaldo. 49 A partir del banco de trabajo se desarrollaron todos los cultivos de adaptación utilizando medio P2. Este medio de cultivo se compone de tres diferentes disoluciones, una denominada “principal” que contiene la mayor parte de macro y micronutrientes, una de resazurina como indicador y una de vitaminas diluidas, de volúmenes 24 mL, 1,5 mL y 1,5 mL, respectivamente. Se comenzó con la preparación de la disolución principal cuya composición se indica en la Tabla 11 a partir de agua destilada y se ajustó el pH a 6,8 utilizando una solución de NaOH 4 M. A continuación, también en agua destilada, se preparó 100 mL de la solución de resazurina en una concentración de 0,02 g/L. En una botella de vidrio se añadió 24 mL de la solución principal y 1,5 mL de la solución de resazurina para luego encapsularse. Posteriormente, se desplazó el O2 mediante la adición de N2 durante 40 min para luego ser presurizada con el mismo gas por 20 min, donde ser observó un cambio de color de azul pálido a rosado. Las botellas se esterilizaron en autoclave a 110 °C durante 30 min y se almacenaron a 4 °C para su posterior utilización. Tabla 11. Composición de la disolución principal que forma parte del medio P2. La solución de vitaminas diluidas añadidas al medio P2 se elaboró a partir de una concentrada, cuya composición se presenta en la Tabla 12. Inicialmente se autoclavó una botella con 250 mL de agua destilada, otra botella con 99,49 mL de agua destilada y dos botellas vacías. Bajo condiciones de esterilidad en campana y mechero se preparó la solución de vitaminas concentradas en la botella con 250 mL de agua destilada, a continuación, se esterilizó por filtración, al hacerla pasar por un filtro de 0,22 μm (MILLEXGP filter unit, Millipore Express, SLG033RB). Tabla 12. Composición de la disolución concentrada de vitaminas. También bajo condiciones de esterilidad se tomó 0,51 mL de solución de vitaminas concentradas y se agregó a la botella que contenía 99,49 mL de agua destilada estéril. Nuevamente, esta solución se filtró por un poro de 0,22 μm al trasvasijarse a una botella vacía, de esta forma se obtuvo la disolución de vitaminas diluidas cuya composición se indica en la Tabla 13. Esta botella se encapsuló, se desplazó el O2 con N2 durante 40 min utilizando agujas y filtros estériles, se presurizó con el mismo gas por 20 min, y se mantuvo en almacenamiento a 4 °C junto con la de vitaminas concentradas. 50 Tabla 13. Composición de la disolución de vitaminas diluidas para el medio P2. De esta forma, en el momento de la inoculación, a las botellas que ya contenían la disolución principal con la de resazurina, bajo condiciones de esterilidad, en campana y mechero, se añadió 1,5 mL de solución de vitaminas diluidas y 3 mL de inóculo desde el banco de trabajo, obteniendo un cultivo de 30 mL totales y cuya composición se detalla en la Tabla 14. Estas botellas se incubaron a 30 °C durante tres días. Tabla 14. Composición del medio de cultivo P2. A partir de los cultivos de adaptación en medio P2 se llevaron a cabo las fermentaciones en las que se utilizó hidrolizado de bagazo de manzana (HBM) como sustrato. Se llevó a cabo un diseño experimental Box-Behnken (DBB) de tres factores a tres niveles como se presenta en la Tabla 15. Los factores pH, concentración de CaCO3 y temperatura se definieron como x1, x2 y x3, respectivamente, considerando los rangos de trabajo típicamente utilizados en bibliografía para optimizar este tipo de cultivos (34, 38–42). Por lo tanto, las características del medio de cultivo varían en función del experimento que se realizó. 51 Tabla 15. Diseño experimental Box-Behnken realizado para la optimización del pH, [CaCO3] y temperatura para la fermentación ABE. De forma análoga a la elaboración del medio P2, el medio HBM también se compone de tres disoluciones diferentes, una denominada “principal”, una de resazurina y otra de vitaminas diluidas, con un volumen de 17,83 mL, 0,085 mL y 0,085 mL respectivamente, que junto con un inóculo de 2 mL alcanzan un volumen final de 20 mL de fermentación. Se elaboró la solución principal según lo indicado en la Tabla 16 en hidrolizado de bagazo que contiene una concentración de azúcares de 67,3 g/L. Es importante mencionar que la concentración de CaCO3 varía en función del experimento realizado, por lo que se ejemplifica con la concentración requerida para los tres niveles diferentes. A dicha disolución se le ajustó el pH con la adición de NaOH 4 M o HCl 1 M. A continuación, se elaboró 100 mL la solución de resazurina a una concentración de 0,235 g/L, así en cada botella se añadió 17,83 mL de la disolución principal de HBM y 0,085 mL de la solución de resazurina para ser encapsulada. Se burbujeó con N2 por 40 min, se presurizó por 20, se esterilizó en autoclave a 110 °C por 30 min y se almacenó a 4 °C para su posterior utilización. Tabla 16. Composición de la disolución principal del medio HBM. 52 La solución de vitaminas para el medio HBM se elaboró esterilizando en autoclave un volumen 93,96 mL de agua destilada en una botella, junto con una botella vacía. A continuación, se tomó, bajo condiciones de esterilidad en campana y mechero, 6,04 mL de la solución de vitaminas concentradas preparada previamente y se añadió al agua destilada, obteniéndose la composición indicada en la Tabla 17. Posteriormente, se trasladó el contenido a la botella vacía a través de un filtro de 0,22 μm para esterilizarla. Se encapsuló, burbujeó con N2 por 40 min, se presurizó por 20 min y se almacenó en cámara fría a 4 °C. Tabla 17. Composición de la disolución de vitaminas diluidas para el medio HBM. Al momento de iniciar una fermentación, en campana y con mechero encendido, se tomó una botella que contenía la solución de HBM principal y resazurina, para añadirle 0,085 mL de la disolución de vitaminas diluidas y 2 mL de inóculo proveniente de un cultivo adaptado en medio P2, obteniendo la composición presentada para la Tabla 18 y un volumen de fermentación de 20 mL. Cada experimento se realizó por triplicado en botellas selladas de 120 mL. Luego, la botella se incubó a la temperatura correspondiente según el nivel que requería este factor durante una semana, en la que se medió la presión acumulada, el pH, la concentración de azúcares totales, glucosa, ácidos orgánicos, solventes y biomasa. Para el experimento a condiciones óptimas se ajustó el volumen añadido de cada componente del medio HBS para alcanzar un volumen final de fermentación de 30 mL. Para los experimentos del DBB y complementarios se tomaron muestras de 1,5 mL iniciales y finales, a tiempos 0 h y 168 h respectivamente, mientras que para las condiciones óptimas se tomaron cada 24 h. Tabla 18. Composición del medio HBM. A la muestra tomada se le midió el pH, y fue centrifugada a 10.000 rpm por 5 min con el fin de separar el sobrenadante, para la posterior medición de sustratos y productos, y el pellet, que se resuspendió, luego de dos lavados de biomasa, en agua destilada para la medición de OD600. La productividad volumétrica se determinó según lo indicado en la ecuación 1 como la diferencia entre la concentración de un compuesto para un intervalo de tiempo determinado. 53 𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑖=𝐶𝑖, 𝑡2− 𝐶𝑖, 𝑡1 𝑡2− 𝑡1 1 El rendimiento de un compuesto se calculó en base al cociente de la producción y el consumo de azúcares reductores totales del cultivo, como se indica en la ecuación 2. 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜𝑖=𝐶𝑖,168 ℎ − 𝐶𝑖,0 ℎ 𝐶𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠,0 ℎ − 𝐶𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠,168 ℎ 2 3.3. Métodos analíticos Concentración de azúcares reductores totales Para la medición de los azúcares reductores totales se utilizó el método del ácido dinitrosalicílico (DNS). Este se basa en la mezcla de dicho ácido con una muestra que contiene azúcares, seguido de la adición de calor para catalizar la reacción indicada en la ecuación 3, para finalmente medir la absorbancia visible de los productos obtenidos, principalmente ácido 3amino-5-nitrosalicílico, en un espectrofotómetro (46). Se utiliza ampliamente ya que es simple y rápido, siendo una herramienta versátil para la medición de azúcares reductores, como glucosa, fructosa o xilosa, provenientes de biomasa hidrolizada (47). á𝑐𝑖𝑑𝑜 3,5 − 𝑑𝑖𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠𝑎𝑙𝑖𝑐í𝑙𝑖𝑐𝑜 + 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 → á𝑐𝑖𝑑𝑜 3 − 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜 − 5 − 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠𝑎𝑙𝑖𝑐í𝑙𝑖𝑐𝑜 + 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟 𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑑𝑜 3 Para preparar el reactivo DNS se disolvieron 30 g de tartrato de potasio y sodio tetrahidrato en 20 mL de agua destilada, 1 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico en 50 mL de agua destilada, ambas en placa calefactora a 90-95 °C con agitación en botellas cerradas, y se preparó 20 mL de una solución de hidróxido de sodio 2 N. Primero se vierte la solución de tartrato sobre la de ácido dinitrosalicílico para luego añadir la de hidróxido de sodio, manteniendo la agitación y temperatura. Finalmente, el reactivo se filtró y almacenó en una botella de vidrio oscura a temperatura ambiente. Para utilizar el reactivo se añaden 100 μL de muestra a un tubo Eppendorf y luego 100 μL de reactivo DNS. Es colocado en un recipiente con agua hirviendo durante 5 min, y luego enfriado en otro recipiente con agua fría hasta temperatura ambiente. Se añade 1 mL de agua destilada para diluir y se agita utilizando el vórtex. Inmediatamente se mide su absorbancia a 540 nm, utilizando como blanco agua destilada (47). Procedimiento que se realiza por duplicado para cada muestra a analizar. La recta de calibrado del método DNS (Figura 11) se elaboró a partir de agua destilada y una solución 2 g/L de glucosa que se diluyó de forma serial para obtener los diferentes puntos de absorbancia. 54 Figura 11. Recta de calibrado para concentración de azúcares reductores totales mediante el método DNS. Concentración de glucosa La cuantificación de glucosa se realizó mediante el kit enzimático Glucosa-TR (SPINREACT. Ref. 1001190), basado en dos reacciones enzimáticas secuenciales. En primer lugar, la enzima glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de la glucosa en ácido glucónico generando además peróxido de hidrógeno (H2O2). Este compuesto se vuelve sustrato de la segunda reacción catalizada por la enzima peroxidasa (POD), que junto un aceptor cromogénico de oxígeno como el fenol-ampirona genera quinona. Como se indica en la ecuación 4, la intensidad del color formado por la quinona es proporcional a la concentración inicial de glucosa presente en la muestra medida (48). 𝛽 − 𝐷 − 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝑂2+ 𝐻2𝑂 𝐺𝑂𝐷 → á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑔𝑢𝑐ó𝑛𝑖𝑐𝑜 + 𝐻2𝑂2 𝐻2𝑂2+ 𝐹𝑒𝑛𝑜𝑙 + 𝐴𝑚𝑝𝑖𝑟𝑜𝑛𝑎 𝑃𝑂𝐷 → 𝑄𝑢𝑖𝑛𝑜𝑛𝑎 + 𝐻2𝑂 4 El kit se compone de tres reactivos diferentes, una primera solución de tampón que contiene TRIS pH 7,4 en 92 mmol/L y fenol en 0,3 mmol/L. Una solución de preparado enzimático con GOD y POD en 15.000 U/L y 1.000 U/L de actividad respectivamente junto con 4aminofenazona en concentración 2,6 mmol/L. Y una tercera solución de patrón de glucosa 100 mg/dL de agua. Se deben disolver las enzimas en el frasco que contiene el tampón para generar el reactivo de trabajo (RT), que es estable durante un mes a 4 °C (48). Para utilizar este método se añade a una cubeta de 1,5 mL y 1 cm de paso de luz un volumen de 1 mL de RT y 10 μL de patrón glucosa. En una segunda cubeta, se añade 1,5 mL de RT y 10 μL de la muestra a ensayar. Cada cubeta se cubre con parafilm y se agita con el fin de homogeneizar. Tras 25 min se mide la absorbancia a 505 nm en espectrofotómetro empleando como blanco una cubeta con 1 mL de RT frente a una de agua destilada. Cada medición se realiza por triplicado. La concentración de glucosa se determina mediante la ecuación 5, en donde se relaciona la absorbancia de la muestra, la del patrón y el factor de dilución utilizado. 𝐶𝑔𝑙𝑢 = 𝐴𝑏𝑠𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐴𝑏𝑠𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 ∙ 𝑓𝑑 5 y = 0,5305x + 0,0347 R² = 0,9993 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Absorbancia 540 (nm) Concentración azúcares reductores totales (g/L) 55 Concentración de lactato De forma análoga a la glucosa, la concentración de lactato se determinó mediante un kit enzimático Lactato LO-POD (SPINREACT, Ref. 1001330), basado, como se indica en la ecuación 6, en la oxidación de lactato a piruvato y peróxido de hidrógeno por la enzima lactato oxidasa (LO), y luego la producción de quinona en presencia de 4-aminofenazona (4-AF) y 4-clorofenol (4-C) catalizado por la enzima peroxidasa (POD). Donde la intensidad del color que se forma observado a 505 nm es proporcional a la concentración de lactato en la muestra. 𝐿 − 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜 + 𝑂2+ 𝐻2𝑂 𝐿𝑂 → 𝑝𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜 + 𝐻2𝑂2 𝐻2𝑂2+ 4 − 𝐴𝐹 + 4 − 𝐶 𝑃𝑂𝐷 → 𝑄𝑢𝑖𝑛𝑜𝑛𝑎 + 𝐻2𝑂 6 El kit se compone de tres reactivos diferentes, una solución tampón que contiene buffer PIPES pH 7,5 50 mmol/L y 4-clorofenol 4 mmol/L. En segundo lugar, un preparado enzimático con lactato oxidasa 800 U/L, peroxidasa 2000 U/L y 4-aminofenazona 0,4 mmol/L. Y una solución acuosa de calibrado con lactato 1 g/L. Se debe disolver el preparado enzimático en 10 mL de la solución tampón para generar el reactivo de trabajo (RT), que es estable durante un mes a 4 °C (49). Para utilizar este método se añade a una cubeta de 1,5 mL y 1 cm de paso de luz un volumen de 1 mL de RT y 10 μL de patrón lactato. En una segunda cubeta, se añade 1,5 mL de RT y 10 μL de la muestra a ensayar. Cada cubeta se cubre con parafilm y se agita con el fin de homogeneizar. Tras 25 min se mide la absorbancia a 505 nm en espectrofotómetro empleando como blanco una cubeta con 1 mL de RT frente a una de agua destilada. Cada medición se realiza por triplicado. La concentración de lactato se determina mediante la ecuación 7, en donde se relaciona la absorbancia de la muestra, la del patrón y el factor de dilución utilizado. 𝐶𝑙𝑎𝑐 = 𝐴𝑏𝑠𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐴𝑏𝑠𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 ∙ 𝑓𝑑 7 Concentración de solventes y ácidos Con el fin de determinar la concentración de los ácidos orgánicos, acético y butírico, y los solventes, acetona, butanol y etanol, se empleó un cromatógrafo de gases HP6890 con detector FID, equipado con una columna DB-WAX 30 m x 250 μm x 0,25 μm Agilent 122-7032E. El horno del equipo se mantiene isotérmico a una temperatura de 70 °C durante 3 min, la que se incrementa paulatinamente hasta 220 °C a una velocidad de 60 °C/min. Se utiliza un flujo de N2 de 1 L/min con una relación de Split 5:1. Las temperaturas del inyector y del detector son de 250 °C y 300 °C respectivamente. Cada una de las muestras se centrifugó a 10.000 rpm durante 5 min (Eppendorf, Centrifuge 5417 R) para separar la biomasa del caldo de cultivo, y se filtró en (MF-Millipore, 13 mm, HAWP01300) de 0,45 μm de poro. El volumen que se inyecta al cromatógrafo para medir cada muestra es de 1 μL. Con el fin de obtener las rectas de calibrado para cada uno de estos compuestos se elaboró una disolución concentrada con ácido butírico 10 g/L, ácido acético 10 g/L, butanol 10 g/L, etanol 4 g/L, isopropanol 4 g/L y acetona 10 g/L. A partir de ella se realizaron diluciones en serie para obtener los diferentes puntos de la recta. Un ejemplo de cromatograma obtenido para esta solución se adjunta en la Figura 12 donde se aprecia el tiempo de retención para cada uno de los 56 compuestos siendo respectivamente 6,3; 5,8; 4,5; 3,1; 3 y 2,6 min. Las rectas de calibrado para los ácidos orgánicos y los solventes se presentan en las Figura 13 y Figura 14, respectivamente. Figura 12. Cromatograma obtenido donde se aprecian los picos característicos para una solución 10 g/L de ácido butírico, 10 g/L de ácido acético, 10 g/L de butanol, 4 g/L de etanol, 4 g/L de isopropanol y 10 g/L de acetona. Figura 13. Rectas de calibrado para ácido butírico (●) y ácido acético (■). Figura 14. Rectas de calibrado para butanol (●), etanol (∆), acetona (■) e isopropanol (x). y = 0,0006x - 0,038 R² = 0,9989 y = 0,0015x + 0,036 R² = 0,9936 0 2 4 6 8 10 12 05000 10000 15000 20000 Concentración (g/L) Área (pA·s) y = 0,0005x + 0,1387 R² = 0,9976 y = 0,0006x + 0,097 R² = 0,9955 y = 0,0009x + 0,2079 R² = 0,9968 y = 0,0011x - 0,0592 R² = 0,9996 0 2 4 6 8 10 12 05000 10000 15000 Concentración (g/L) Área (pA·s) 57 Concentración de biomasa celular En el caso de la medición de biomasa celular, se escogió la técnica espectrofotométrica de densidad óptica a 600 nm (OD600), debido a que es el método más utilizado en bibliografía incluso en presencia de carbonato de calcio (34,50,51). Para ello se elaboraron rectas de calibrado empleando diluciones seriadas del caldo de cultivo a diferentes tiempos de fermentación, se les midió la absorbancia a 600 nm, se secaron a 115 °C durante 24 h y se determinó su peso seco. Las rectas obtenidas se presentan en la Figura 15 para el medio de cultivo HBM y medio P2. Figura 15. Rectas de calibrado para la densidad óptica a 600 nm. Para medio HBM (■) y para medio P2 (●). Para obtener las muestras de biomasa se tomó 2 mL de cada fermentación cada 24 h, se centrifugó a 10.000 rpm durante 5 min, se retiró el sobrenadante para las mediciones de azúcares, solventes y ácidos, y se realizó un lavado de biomasa empleando agua destilada. El pellet se resuspendió utilizando un disruptor (Gene disruptor, Scientific Industries, 5.707.861) para nuevamente ser centrifugado y lavado. Se midió la absorbancia de las muestras a 600 nm, empleando el sobrenadante como blanco. Las muestras medidas se almacenaron en congelador a -20 °C. La concentración de biomasa se determinó por la diferencia entre la OD600 para cada una de las muestras y la OD600 del medio de cultivo sin inocular, con el fin de restar el efecto de otros sólidos suspendidos del bagazo o del CaCO3 añadido. Otras mediciones Con el fin de conocer la evolución de la presión acumulada durante la fermentación, como una medición indirecta de los gases producidos, se utilizó un transductor de presión (Centrepoint Electronics), previamente calibrado. El transductor relaciona el potencial eléctrico a través de una pieza conductora deformada por una determinada presión a la que se somete el equipo. Se presenta en la Figura 16 la recta de calibrado del aparato. Para realizar la medición se pinchó cada una de las botellas empleando agujas estériles. y = 0,0854x + 0,012 R² = 0,9986 y = 0,1106x + 0,0127 R² = 0,9991 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0246810 12 Absorbancia 600 (nm) OD₆₀₀ (g/L) 64 Figura 19. Superficie de respuesta y gráfico de contornos para la concentración de butanol (g/L) considerando los efectos del pH (x1) y la temperatura (x3) cuando la [CaCO₃] (x2) se fija a 8 g/L. Leyenda: . Figura 20. Superficie de respuesta y gráfico de contornos para la concentración de butanol (g/L) considerando los efectos de la [CaCO₃] (x2) y la temperatura (x3) cuando el pH (x1) se fija a 8. Leyenda: . En las Figura 18 y Figura 19 se aprecia un incremento de la producción de butanol a medida que el pH aumenta, alcanzándose la máxima producción a pH 7. Este resultado es coherente con lo observado en bibliografía, en la mayoría de los trabajos en los que se estudia la optimización de otros factores como la concentración macro y micronutrientes, la agitación o la temperatura, el pH escogido para realizar las fermentaciones gira en torno a 6,7 debido a que son la condiciones que maximizan la producción (43, 45, 54, 55). Según Bankar et al. el pH óptimo de las diferentes especies de Clostridium se encuentra entre 6,8 y 7 (30). Wang y Blaschek estudiaron el efecto del pH en el rendimiento de azúcares en butanol a partir de zumo de tallo de maíz empleando Clostridium beijerinckii, mediante la metodología de superficie de respuesta, corroboraron que el pH óptimo es 6,7 (44). 65 De acuerdo a la literatura, el pH inicial del cultivo juega un rol preponderante en la ocurrencia o no del acid crash y la producción de butanol, debido a que este factor proporciona las condiciones ácidas en la fase acidogénica del cultivo que permite a las células realizar el switch hacia la fase solventogénica (41). En el presente trabajo, dicha situación se comprobó en las cuatro fermentaciones realizadas a pH 5 en el diseño experimental, en tres (experimentos 1, 5 y 7) se provocó acid crash, verificado por un descenso del pH por debajo de 4,5, un detenimiento de consumo de azúcares y el crecimiento celular y la ausencia de producción de butanol; mientras que en el experimento 3, existe una baja producción de butanol debido a que la alta concentración de CaCO₃ tiene un efecto tamponador del medio de cultivo. En términos generales, los mejores resultados se obtuvieron a los pH más altos (x₁* = 1 o 0), como es el caso de los experimentos 4, 6 o 10. Si se realizan fermentaciones sin control de pH, el pH inicial debe ser lo suficientemente alto o bien el medio debe estar suficientemente tamponado, para que cuando este parámetro disminuya durante la fase acidogénica logre superar el “punto de quiebre”, sin bajar de 4,5, para provocar la producción de solventes, ya que de otra forma, la solventogénesis no tendrá lugar y los ácidos no serán reasimilados (44). Qureshi et al. reportaron que es necesario ajustar el pH en un valor de 6,8 los cultivos de C. beijerinckii BA101 en medio P2, para que durante la ácidogénesis disminuyese en torno a 5,0-5,5 y se generara el switch a la fase solventogénica con una apropiada producción de butanol (56). Se prevé que a pH más elevados que 7 no se produciría un aumento en la producción de butanol, debido a que habría una fuerte inhibición en el crecimiento celular de Clostridia lo que provocaría una muy baja o nula generación de solventes. Por otro lado, en las Figura 18 y Figura 20, se presenta el efecto de la concentración de CaCO₃ en la producción de butanol. A medida que la concentración de CaCO₃ se incrementa se observa un aumento en la variable Y, alcanzando su máximo valor cuando x₂ es 8 g/L. No existe consenso en bilbiografía respecto de la concentración óptima de CaCO₃, debido a que puede variar en función del sustrato empleado y de la especie de Clostridium cultivada. Por ejemplo, Narueworanon et al. obtuvieron una concentración óptima es 6,6 g/L en los cultivos de C. beijerinckii TISTR 1461 empleando melazas de caña de azúcar como sustrato. También observaron que un incremento en este parámetro provoca una interacción entre el carbonato y las melazas que no favorece la generación de butanol (42). En el estudio llevado a cabo por Lin et al. la concentración óptima, empleando en hidrolizado de almidón como sustrato, tomó un valor de 5,04 g/L de CaCO₃ (43), sin embargo, la especie utilizada corresponde a Clostridium acetobutylicum, y por lo tanto puede existir una diferencia respecto de C. beijerinckii. De hecho, dichas especies presentan diferentes pH óptimos, siendo para C. acetobutylicum más bajo con un valor en torno a 5,7, lo que podría explicar también una preferencia por una menor concentración de CaCO₃ (57). De forma contraria, según el trabajo de Sirisantimethakoma et al. se llevó a cabo un diseño experimental de matriz ortogonal, en donde uno de los factores optimizados fue la concentración de CaCO₃, la fermentación ABE se llevó a cabo con zumo de sorgo dulce por C. beijerinckii TISTR 1461 a 37 °C, donde se obtuvo una concentración óptima de 7 g/L un valor bastante cercano al obtenido en este TFM (53). En el estudio llevado por El Kanouni et al. la adición de 10 g/L de CaCO₃ al medio de cultivo, empleando C. acetobutylicum, se previene la caída del pH por debajo de 4,8 pero además incrementa el consumo de xilosa y glucosa presentes en el medio de cultivo. Sus resultados indican que un exceso de este compuesto puede aumentar la tolerancia de la bacteria a la 66 inhibición por butanol, lo que se traduce en un mayor consumo de sustrato y producción (51). Además, se ha observado que en cultivos de C. acetobutylicum la suplementación de 8 g/L de CaCO₃ al medio permite extender el tiempo de crecimiento exponencial del cultivo, lo que genera un aumento en el rendimiento de ácido butírico. Se ha planteado que existe una correlación lineal entre la concentración de ácido butírico no disociado y la velocidad específica de producción de butanol, en este caso el efecto tamponador del CaCO₃ permitiría incrementar la cantidad de dichos ácidos sin disociar favoreciendo la producción del alcohol (34). Lo que está claro, es que una cantidad mínima de CaCO₃ permite potenciar la capacidad de Clostridium para sintetizar butanol. Situación que se comprobó experimentalmente, ya que, en términos generales, los resultados del DBB indican una alta concentración de butanol cuando la concentración de CaCO₃ también era elevada, como es el caso del experimento 6 donde se empleó 5 g/L y los experimentos 4 y 10 con 8 g/L, lo que se explica por diversos motivos. El CaCO₃ es escasamente soluble en agua y varía en función del pH, por ejemplo, a un valor de 6, la solubilidad en agua es de aproximadamente 2 g/L, sin embargo, a medida que el pH disminuye se incrementa la solubilización del carbonato, que consume protones y alcaliniza el medio. De esta forma, la adición de CaCO₃ en exceso de 2 g/L opera como depósito de tampón, que hace frente a la disminución natural del pH durante el transcurso de la fermentación ABE (58). Otros efectos operan a nivel celular y se relacionan con el catión Ca2+, producto de la disociación en agua del carbonato de calcio, e involucran aspectos como la división celular, la esporulación, el mantenimiento de la estructura celular, la quimiotaxis o la replicación del DNA. Se ha planteado que el ion de calcio induce la expresión de enzimas claves en el metabolismo de C. beijerinckii de la fase solventogénica, como acetato quinasa, acetoacetato descarboxilasa y CoA-transferasa, alcanzando esta última un aumento de hasta 2,3 veces en su actividad y jugando un papel fundamental en la reasimilación de acetato y butirato para su posterior transformación en butanol (33, 58). Se ha demostrado también que la concentración de Ca2+ influye en el nivel de toxicidad del butanol y la utilización de azúcares. Se conoce que el butanol afecta negativamente la integridad de la membrana celular, interrumpiendo la viabilidad de la bacteria, además de inhibir los transportadores o permeasas de xilosa y glucosa a una concentración de 8 y 12 g/L respectivamente. El ion Ca2+ tiene la capacidad de establecer puentes cruzados de tipo iónico con estructuras cargadas negativamente presentes en la membrana celular de C. beijerinckii, como los grupos fosfato, lo que ejerce un efecto estabilizador frente a la intromisión del butano y evita la lisis celular. Adicionalmente suplementar Ca2+ al medio de cultivo provoca un incremento significativo de la presencia de diversas proteínas y enzimas asociadas a la membrana, como las proteínas de unión a carbohidratos, o las enzimas glucósido hidrolasas o 6-fosfo-β-glucosidasa, involucradas en el transporte o metabolismo de los carbohidratos, lo que promueven el consumo de sustrato (58). Finalmente, de acuerdo con el estudio de Han et al., la presencia de 4 g/L o más de CaCO₃ durante la fermentación ABE con C. beijerinckii incrementa considerablemente los niveles de las proteínas DnaK y GrpE, la primera, una chaperona y proteína de choque térmico que además juega roles clave en la replicación del DNA y la división celular, y la segunda, un factor de intercambio de nucleótidos, que media en la unión de la chaperona con una proteína en estado no nativo para su correcto plegamiento. Se ha observado que este grupo de proteínas participan en la reparación de proteínas con estructura aberrante y evita el daño proteico mediado por el estrés, en este caso causado por las altas concentraciones de butanol. De esta manera, la presencia de Ca2+ induce una sobreexpresión de DnaK y GrpE, lo que a su vez provoca un 67 incremento en la replicación celular y una estabilización de la maquinaria metabólica biosintética de C. beijerinckii que se visualiza en un incremento de la biomasa y la producción de butanol (58). Respecto del efecto de la temperatura, en las Figura 19 y Figura 20, se observa un aumento de la concentración de butanol a medida que se este factor disminuye, hasta alcanzar la máxima concentración estimada por el modelo a 30 °C. Esta información es coherente con lo encontrado en bibliografía, donde se plantea que la temperatura óptima para la fermentación ABE se encuentra entre los 30 y 40 °C (30). De acuerdo con el trabajo de Wang et al. la temperatura que maximiza la producción de butanol, empleando Clostridium saccharobutylicum, es de 36 °C cuando se emplea hidrolizado de madera de álamo como sustrato (45). Mientras que, según lo estudiado por Lin et al., la temperatura óptima para la producción de butanol, para la fermentación ABE de hidrolizado de almidón utilizando C. acetobutylicum corresponde a 35 °C (43). Por lo tanto, es probable que existan diferencias para este parámetro óptimo según la cepa de Clostridium cultivada y el tipo de sustrato utilizado como fuente de carbono y energía. De los experimentos realizados en el DBB se obtienen mejores resultados a las menores temperaturas analizadas, el experimento 4 realizado a 35 °C y los experimentos 6 y 10 a 30 °C, y encuentra su fundamento en el fenómeno conocido como acid crash. Se ha determinado que los valores críticos máximos que puede alcanzar la concentración de ácidos orgánicos sin disociar se encuentra en torno a 57-60 mmol/L, por sobre este valor la solventogénesis, el crecimiento y el consumo de sustrato se detiene (59). Como ya se analizó previamente el pH juega un rol preponderante en el desarrollo del acid crash, sin embargo, el segundo factor a considerar es la velocidad de formación de dichos ácidos. Se ha observado que esta velocidad es función de la velocidad del consumo de glucosa, el crecimiento celular, la disminución en la producción de ácidos una vez que comienza la solventogénesis y su velocidad de reasimilación. Sin embargo, el comienzo de la solventogénesis requiere una concentración mínima de ácidos orgánicos cercana a 20 mmol/L, por lo tanto, la ocurrencia del acid crash, corresponde a un problema de cinética que ocurre cuando se supera el máximo mencionado. Es decir, no es que el switch no se produzca, sino que es una finalización precoz de la solventogénesis una vez que el switch ya ha ocurrido, debido a que la cinética de formación de ácidos no disminuyó lo suficiente, superando el límite de 60 mmol/L. Entre las estrategias para prevenir dicho fenómeno se encuentra disminuir la concentración de ácidos sin disociar, con un ajuste de pH, o disminuir la velocidad formación de dichos ácidos, en este caso, disminuyendo la temperatura. Realizar un cultivo a menor temperatura ralentiza la velocidad a la que ocurren los fenómenos metabólicos y el crecimiento celular, lo que le da el tiempo suficiente a la célula para responder y hacer una apropiada transición entre las dos fases de la fermentación (59). Estos mismos resultados fueron observados por González-Peñas, quién realizó fermentaciones ABE en medio P2 donde cultivó, al igual que el presente TFM, C. beijerinckii CECT 508 a 30, 34 y 37 °C. Donde concluyó que los cultivos realizados a mayor temperatura acumulan ácido butírico a mayor velocidad, que desemboca en un cese del crecimiento celular y la actividad metabólica una vez que se ha alcanzado una concentración límite. A 30 °C obtuvo los mejores resultados, alcanzando una concentración de butanol de 12 g/L, más que a 34 °C con 8 g/L, además de promover el consumo de glucosa e incrementar el nivel de tolerancia de las bacterias al butanol, lo que comprueba los resultados obtenidos en el DBB (38). Al-Shorgani et al. estudiaron el efecto de la temperatura en la fermentación ABE de residuos de molinos de aceite de palma empleando C. saccharoperbutylacetonicum N1-4 en un rango de 25 a 40 °C, observaron que la máxima producción de butanol y ABE ocurre a 30 °C, debido a que mayores temperaturas es probable que se produzca la inactivación de enzimas claves del metabolismo acidogénico o 68 solventogénico de la bacteria, y a menores temperaturas el crecimiento celular es muy lento, lo que perjudica la síntesis del alcohol (41). Ahora que se ha discutido el resultado para cada efecto individual, se puede analizar los resultados obtenidos para los puntos centrales. Los experimentos 13, 14 y 15, fueron realizados a las mismas condiciones de x1, x2 y x3; sin embargo, los resultados obtenidos distan significativamente unos de otros (Tabla 20). Esto se explica porque fueron realizados en condiciones que se encuentran en puntos intermedios entre estados que favorecen o previenen el acid crash. Es posible que para los experimentos 13 y 14, la utilización de 5 g/L de CaCO₃ permitiese controlar la concentración de ácidos orgánicos, que a su vez posibilita la transición a la fase solventogénica, pero con una baja producción de butanol, debido de la temperatura de 35 °C. Mientras que para el caso del experimento 15, puede que la velocidad de producción de ácidos en un pH inicial de 6 fuese levemente más alta y no le otorgase el tiempo suficiente al cultivo para evitar llegar al acid crash. El modelo predice también la existencia de un efecto doble entre el pH y la temperatura, cuya influencia se aprecia en la Figura 19, en donde se observan los mejores resultados cuando x1 toma el valor de 1 y x3 el valor de -1, alcanzando un valor de Y de 12,06 g/L. No obstante, existe un incremento de la concentración de butanol cuando se invierte la tendencia de dichas variables y toman los valores de -1 y 1 respectivamente, donde se consigue una concentración de 3,4 g/L, lo que permite describir la geometría de la superficie como tipo silla, donde se obtienen los peores resultados cuando ambos factores toman el valor de 1 o de -1. Respecto de este efecto doble no se encontró evidencia en bibliografía, sin embargo, no corresponde a uno de los más significativos del modelo. 4.3. Validación del modelo Con el fin de validar el modelo matemático obtenido se realizó una fermentación en medio HBM a condiciones óptimas, es decir, pH 7, concentración de CaCO₃ de 8 g/L y 30 °C. Además, se llevó a cabo una fermentación en medio sintético P2 con fines comparativos. El perfil del pH para la fermentación en medio HBM y la fermentación control, presentado en la Figura 21, indica una duración de la fase acidogénica del cultivo en medio HBM hasta las 24 h, donde el pH disminuye desde 6,34 hasta 6,05; a continuación, se eleva, lo que advierte el comienzo de la solventogénesis, hasta alcanzar el valor de 6,49 a las 168 h. Esto es congruente con lo observado por Sirisantimethakom et al., que emplearon zumo de sorgo dulce como sustrato para la fermentación de C. beijerinckii TISTR 1461 en donde se observó una disminución inicial del pH en las primeras horas de fase acidogénica desde 6,59 hasta 6,14; para luego aumentar hasta 7,15 durante la fase solventogénica (53). En el caso de la fermentación control el pH disminuye hasta las 72 h, sin embargo, el principal decrecimiento también se produce en las primeras 24 h, a continuación, no se genera un incremento significativo del pH, alcanzando un valor de 6,02 en las 168 h. Este comportamiento se encuentra ampliamente respaldado en bibliografía para diferentes especies del género Clostridium, en donde la presencia de altas concentraciones de CaCO₃ en medio P2 provoca muy pocas variaciones en el pH durante la fase solventogénica una vez que ya a descendido y ha acabado la acidogénesis (33, 34, 58, 60). También se observa que debido a la adición del inóculo el pH inicialmente ajustado en 7 disminuye inmediatamente a 6,3-6,4 para el tiempo 0 h, debido a que se añaden bacterias en plena fase exponencial de producción de ácidos orgánicos. 69 Figura 21. Perfil del pH durante el cultivo de C. beijerinckii en medio HBM (●) y medio P2 (∆). [Valores medios] ± [SD] por triplicado. En el perfil de la biomasa, medido como OD600 en la Figura 22, se observa tanto para la fermentación en medio HBM como para el control el mayor crecimiento durante las primeras 24 h, que coincide con la mayor disminución de pH lo que sostiene la identificación de dicho periodo como crecimiento exponencial y fase acidogénica. Para ambos cultivos la máxima concentración de biomasa corresponde a 1,92 g/L y 2,20 g/L para el medio HBM y P2 respectivamente. Durante la fase estacionaria hay una concentración de células levemente menor en el medio HBM que en el control, probablemente debido a la presencia de azúcares de más compleja metabolización en la biomasa revalorizada que en el medio sintético, cuya única fuente de carbono es glucosa. A partir de las 72 h se observa una paulatina disminución de la biomasa debido fundamentalmente al efecto tóxico del butanol generado. Figura 22. Perfil de biomasa durante el cultivo de C. beijerinckii en medio HBM (●) y medio P2 (∆). [Valores medios] ± [SD] por triplicado. Se ha descrito que para fermentaciones en modalidad batch se alcanzan normalmente concentraciones celulares <4 g/L lo que es congruente con el perfil observado (22). De acuerdo con el trabajo de Yang et al. que cultivó C. acetobutylicum en medio P2 suplementado con CaCO₃ se observan también la fase exponencial del cultivo fundamentalmente en las primeras 24 h, para luego alcanzar en la fase estacionaria 0,6 g/L de biomasa y más tarde una fase de muerte, comportamiento que en general concuerda con lo observado en la Figura 22 (34). De acuerdo con González-Peñas et al. que cultivó la misma cepa de C. beijerinckii CECT 508 que este TFM, en 5,7 5,8 5,9 6 6,1 6,2 6,3 6,4 6,5 6,6 050 100 150 pH Tiempo (h) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 050 100 150 Biomasa (g/L) Tiempo (h) 70 celulosa hidrolizada de madera de haya organosolv se obtuvo concentraciones máximas de biomasa en torno a los 2,79 y 2,68 g/L para el control de medio P2 y el medio hidrolizado respectivamente, valores que son cercanos a lo obtenido en este estudio, además en su trabajo observan una fase de muerte más acusada en el medio hidrolizado que en el control, situación que también concuerda con lo presentado en el perfil (61). La presencia de compuestos inhibidores en la biomasa lignocelulósica utilizada como sustrato para la fermentación ABE se encuentra ampliamente respaldada en literatura. Este tipo de sustancias puede encontrarse naturalmente en la biomasa, como es el caso de ciertos compuestos fenólicos, o bien generarse durante el pretratamiento, como es el caso del furfural, hidroximetilfurfural, ácido fórmico o el ácido levulínico (12). Debido a que la cinética de crecimiento en el medio HBS y control van a la par es posible afirmar que no existen compuestos inhibidores del crecimiento en el bagazo de manzana empleado como sustrato. De haber, se observaría un incremento de la fase de latencia que permitiría a las células adaptarse lo que desfasaría los perfiles de crecimiento, e incluso, si la concentración de inhibidores fuese suficientemente alta, no se observaría crecimiento celular. Es importante tomar en cuenta dos consideraciones respecto de la cuantificación de la biomasa celular. En primer lugar, solamente las células en estado vegetativo responden a la OD600, por lo tanto, no considera la concentración de células en otros estados morfológicos como clostridia o esporas. De esta forma, la disminución de OD600 a partir de las 48 h, puede deberse a la combinación de fenómenos como la muerte celular producto de la inhibición por butanol, pero también la transformación de bacterias vegetativas a través del proceso de esporulación como un mecanismo de defensa frente al tóxico ambiente extracelular en que se encuentran. En segundo lugar, la biomasa se midió como la diferencia entre la OD600 total en cada instante de tiempo y la OD600 del medio de cultivo a tiempo cero, donde se asumió que la concentración de sólidos que no corresponden a biomasa, como el CaCO3 o compuestos del bagazo, fueron constantes. Esto podría haber incrementado el margen de error para cada una de las mediciones tomadas, porque existe parte del material en suspensión del bagazo que es consumido durante la fermentación, lo que podría generar diferencias en la OD600. El perfil de azucares reductores totales (RTS) y glucosa, Figura 23 A y B respectivamente, muestra un consumo de sustrato, desde aproximadamente 60 g/L de RTS, casi a velocidad constante hasta las 72 h a un valor de 0,8-0,9 g/L/h, para luego detenerse completamente, donde permanece una concentración residual de azúcares de 12,5-14,6 g/L hasta las 168 h. La dinámica de consumo de RTS es casi idéntica entre el cultivo en medio HBM y el control. El punto en que se deja de consumir sustrato coincide con el detenimiento del crecimiento celular y se explica en el comienzo de la inhibición por producto. Esto se traduce en un consumo de RTS entre 48,3-49,2 g/L que equivale a cerca de un 80% de los azúcares presentes inicialmente en el sustrato. Similar perfil se observa para el consumo de glucosa, con la diferencia que para la fermentación en medio HBM la glucosa es consumida totalmente, debido a que es solo uno de los diversos tipos de azúcares presentes en el hidrolizado de bagazo de manzana. 71 A) B) Figura 23. Perfil de RTS (A) y glucosa (B) durante el cultivo de C. beijerinckii en medio HBM (●) y medio P2 (∆). [Valores medios] ± [SD] por triplicado. Esta dinámica encuentra respaldo en bibliografía en el trabajo de Veza et al., en que se emplea C. beijerinckii ATCC 35702 empleando hidrolizado de L. limnetica y O. obscura como sustrato bajo diferentes condiciones de operación y se observó un consumo de azúcares fundamentalmente hasta las 72 h, en donde la concentración de butanol ya es lo suficientemente alta para provocar una fuerte inhibición del crecimiento (62). En otro estudio en que se emplea bagazo de manzana para la fermentación ABE empleando C. beijerinckii P260 se observa un consumo de sustrato también hasta las 48-72 h, donde el cultivo alcanza el estado estacionario (36). Por lo tanto, en condiciones normales existe una clara correlación entre consumo de sustrato y la concentración de butanol inhibitoria, es más, se requiere utilizar una cepa mutante hiperproductora de butanol como C. beijerinckii BA101 para consumir totalmente los azúcares de un medio de cultivo P2 que contiene 60 g/L de glucosa, alcanzando una concentración de butanol de 13,2 g/L sin que se observe inhibición (56). En las Figura 24 A y B, se presenta el perfil de los productos de fermentación para el medio HBM y el control respectivamente. En el primer caso, se obtiene durante las 24 h iniciales una leve disminución de la concentración de ácidos orgánicos, desde una concentración de 8,5 ± 0,05 g/L y 0,84 ± 0,76 g/L para acetato y butirato respectivamente, que coincide con la disminución del pH durante la fase acidogénica. A continuación, comienza la solventogénesis que, de la mano con un aumento del pH, se aprecian las máximas productividades para los solventes. A partir de las 76 h se produce el menor incremento de las concentraciones de solventes debido a que ha cesado el consumo de sustrato, luego a partir de las 96 h las concentraciones se mantienen prácticamente constantes. Las concentraciones finales de los solventes corresponden a 6,54 ± 0,65 g/L, 11,46 ± 0,07 g/L y 0,48 ± 0,03 g/L para la acetona, butanol y etanol respectivamente a las 168 h. La 0 10 20 30 40 50 60 70 050 100 150 RTS (g/L) Tiempo (h) 0 10 20 30 40 50 60 70 050 100 150 Glucosa (g/L) Tiempo (h) 72 concentración final de ácido acético y butírico corresponde a 2,11 ± 0,11 g/L y 0,53 ± 0,01 g/L respectivamente. Además, se detectó la formación de isopropanol en bajas cantidades a partir de las 76 h, alcanzando finalmente una concentración de 0,06 ± 0,001 g/L. La concentración final de ABE es de 18,56 ± 0,55 g/L. A) B) Figura 24. Perfil de los productos del cultivo de C. beijerinckii en medio HBM (A) y medio P2 (B). Ácido butírico (■), ácido acético (∆), butanol (●), etanol (Ж), acetona (X) e isopropanol (◊). [Valores medios] ± [SD] por triplicado. En la Figura 24 B se observa una disminución constante del ácido acético desde 7,25 g/L en las primeras 48 h. Por otro lado, el ácido butírico incrementa su concentración desde 0,18 g/L hasta 0,57 g/L en el mismo periodo de tiempo. La solventogénesis comienza a las 24 h, alcanzando las mayores concentraciones de solventes a las 96 h con concentraciones de 4,66 ± 0,21 g/L; 12,47 ± 0,42 g/L y 0,4 ± 0,01 g/L para la acetona, butanol y etanol respectivamente. Las concentraciones finales de los ácidos orgánicos corresponden a 1,23 ± 0,08 g/L y 0,49 ± 0,18 g/L de ácido acético y butírico respectivamente. No se aprecia producción de isopropanol en la fermentación control. La concentración final de ABE es de 16,46 ± 0,24 g/L. Los resultados obtenidos son congruentes con otros trabajos. Se obtienen valores similares para la fermentación ABE llevada a cabo con C. beijerinckii BA101 empleando glucosa como sustrato, donde se alcanzan 11,9 g/L de butanol y 17,7 g/L de ABE (63). En el trabajo de Wang y Blaschek se cultivó C. beijerinckii 8052 en zumo de tallo de maíz tropical alcanzando una concentración de butanol de 11,5 g/L (44). En la fermentación de C. beijerinckii SE-2 llevada a cabo por Zhang y Jia utilizando hidrolizado de mazorca de maíz como sustrato se obtuvo una concentración de butanol de 11,65 g/L y total ABE de 19,22 g/L (55). Y en el estudio de Ni et al. 0 2 4 6 8 10 12 14 050 100 150 Productos (g/L) Tiempo (h) 0 2 4 6 8 10 12 14 050 100 150 Productos (g/L) Tiempo (h) 73 empleando C. saccharobutylicum DSM 13864 con melazas de caña de azúcar como sustrato se alcanza una concentración de butanol de 11,86 g/L con una concentración total de ABE de 17,88 g/L (64). Por otro lado, los resultados obtenidos son mejores que los reportados en otros estudios en los que también se emplea bagazo de manzana como sustrato para la fermentación ABE. Hijosa-Valsero et al. obtuvieron la mayor concentración de butanol pretratando el bagazo con el surfactante PEG 6000 antes de emplearlo como fuente de carbono para C. beijerinckii CECT 508, donde se alcanzó un valor de 9,11 g/L (35). Jin et al. aplicaron diferentes pretratamientos al bagazo de manzana, en un caso con ácido sulfúrico (1%, 60 min, 121 °C) y otro con hidróxido de sodio (2%, 30 min, 121 °C) y al cultivar C. beijerinckii P260 obtuvieron 10,7 g/L de ABE con 5,92 g/L de butanol y 10,8 g/L de ABE con 5,40 g/L de butanol respectivamente (36), valores significativamente menores a los obtenidos en este TFM. La proporción de los solventes generados es diferente entre el medio HBM y el medio sintético P2, y además difiere de la proporción teórica 3:6:1 para acetona, butanol y etanol respectivamente. En el caso del medio HBM, la proporción final es 3,42:6:0,25. La concentración de acetona se aproxima a la ratio, pero es superior, pero lo más llamativo es que existe una clara deficiencia en la producción de etanol. En el caso del control, la relación obtenida es de 2,19:6:0,19; es decir, existe una menor producción de acetona y una aún menor producción de etanol, esto si se toma la concentración de butanol como referencia. En este sentido es importante mencionar que la proporción teórica es solo orientativa ya que varía en función de la especie y cepa de Clostridium cultivada, del sustrato utilizado e incluso el pretratamiento aplicado. Por ejemplo, para el ya mencionado estudio de Jin et al. si el bagazo de manzana recibe un pretratamiento ácido la relación ABE es 3,09:6:1,62 mientras que si es alcalino 4,05:6:1,94 (36). La mayor producción de biobutanol en el medio control que en el medio HBS se encuentra respaldado en bibliografía. Por ejemplo, de acuerdo con lo investigado por Maiti et al. donde se utilizó hidrolizado de residuos líquidos de la industria cervecera (BLW) para la síntesis de biobutanol con C. beijerinckii NRRL B-466 mediante fermentación ABE y se comparó con un cultivo en medio P2 de la misma forma que este TFM. Observaron una mayor producción de butanol en el medio sintético debido a que la totalidad de los azúcares presentes corresponde a glucosa, que son de más fácil metabolización que la mezcla compleja de azúcares presentes en el BLW (37), situación análoga que sucede con la metabolización del medio HBS en el que coexiste glucosa, fructosa, sacarosa, xilosa, almidón entre otros tipos de carbohidratos aprovechables. La baja o ausente producción de etanol se encuentra documentada en el trabajo de González-Peñas et al. quienes cultivaron C. beijerinckii CECT 508, la misma cepa que este TFM, en medio P2 y observaron solamente producción de butanol y acetona (61). La mayor concentración de butanol obtenida en la fermentación control puede deberse fundamentalmente a mayor concentración de biomasa que alcanzó dicho cultivo, ya que como se indica en literatura, existe una fuerte correlación entre la concentración celular y la producción de butanol (34). La existencia de isopropanol, indica que C. beijerinckii CECT 508 es capaz de producir este alcohol a partir de acetona, mediante la enzima isopropanol deshidrogenasa que utiliza NADPH como cofactor. Sin embargo, la concentración obtenida es muy baja y no se compara con otras cepas de Clostridium empleadas en la fermentación isobutanol-butanol-etanol (IBE) que alcanzan concentraciones de 1,63-2,65 g/L de isopropanol (65). Para lo que sucede existen múltiples explicaciones, es posible que la cepa utilizada presente enzimas con un muy bajo nivel de actividad específica, que los genes que codifican la enzima se expresen poco, que existan mecanismos de 80 5. Conclusión Empleando hidrolizado de bagazo de manzana como sustrato se logró llevar a cabo una serie de experimentos según el diseño Box-Behnken para los factores de pH, concentración de carbonato de calcio y la temperatura que influyen en la concentración de butanol generada en la fermentación Acetona-Butanol-Etanol con Clostridium beijerinckii CECT 508. Mediante regresión lineal se obtuvo exitosamente un modelo matemático que se representó mediante la metodología de superficie de respuesta, donde se estimó una producción máxima de butanol en 12,6 g/L para las condiciones óptimas de las variables independientes estudiadas. Se llevó a cabo una fermentación a las condiciones optimizadas de pH 7, concentración de carbonato de calcio de 8 g/L y temperatura de 30 °C, donde se alcanzó una concentración de butanol de 11,46 ± 0,07 g/L lo que demostró el buen nivel de predicción del modelo estudiado con un error de 4,98%. La causa principal de que estas circunstancias favorecieran la síntesis del alcohol es evitaron el acid crash y permitieron una apropiada transición entre la fase acidogénica y solventogénica. Se logró realizar un seguimiento al cultivo para los parámetros de pH, biomasa, ácidos y solventes, lo que permitió conocer y evaluar el desarrollo de la fermentación en diferentes momentos. De forma adicional, se concluye que el monitoreo del lactato y la producción de gas aporta información valiosa sobre la evolución del cultivo a través de métodos analíticos sencillos y baratos. Se comprobó que las condiciones estudiadas fueran verdaderos óptimos mediante la realización de experimentos complementarios a condiciones fuera de la región estudiada predichos por la metodología steepest ascent. A partir de dichos resultados se observó que no se produjo un incremento en la variable respuesta, lo que confirma la ubicación del máximo. De esta forma, es posible afirmar que se logró el objetivo principal del presente Trabajo de Fin de Máster. El hidrolizado de bagazo de manzana demostró ser un sustrato apropiado para la producción de butanol mediante la fermentación ABE al mostrar resultados similares al control en medio sintético y los encontrados en bibliografía, ya que la concentración alcanzada se encontró dentro del límite máximo de inhibición de este compuesto (11-15 g/L). A pesar de que existen importantes desafíos a resolver, estos resultados demostraron el claro potencial de esta biomasa lignocelulósica para ser revalorizado en una biorefinería multicomponente que genere compuestos nutracéuticos, enzimas y biocombustible. Como proyecciones de este estudio se plantea la realización de un diseño experimental que permita evaluar la posible reducción de la concentración de carbonato de calcio utilizada sin afectar de forma significativa la producción de butanol. Además, se propone estudiar mejores pretratamientos, la composición detallada del hidrolizado de bagazo de manzana utilizado, y la evolución del consumo de los diferentes tipos de azúcar durante el cultivo, ya que dicha dinámica podría explicar varios de los fenómenos observados en la fermentación. Finalmente, sería conveniente evaluar la modalidad de cultivo feed-batch o implementar técnicas de separación insitu, como la fermentación extractiva, en medio HBS con el fin de mitigar el efecto inhibitorio del butanol lo que permitiría potenciar su producción. 81 6. Referencias 1. BP. Statistical Review of World Energy globally consistent data on world energy markets and authoritative publications in the field of energy. 2020, no. 69th edition, p. 66. Disponible en: https://www.bp.com/content/dam/bp/business-sites/en/global/corporate/pdfs/energyeconomics/statistical-review/bp-stats-review-2020-full-report.pdf. 2. Höök, M. y Tang, X. Depletion of fossil fuels and anthropogenic climate change-A review. Energy Policy. Elsevier, 2013, vol. 52, p. 797-809. DOI 10.1016/j.enpol.2012.10.046. 3. Capellán-Pérez, I. et al. Fossil fuel depletion and socio-economic scenarios: An integrated approach. Energy. Elsevier Ltd, 2014, vol. 77, p. 641-666. DOI 10.1016/j.energy.2014.09.063. 4. Escobar, J.C. et al. Biofuels: Environment, technology and food security. Renewable and Sustainable Energy Reviews. Pergamon, 2009, vol. 13, no. 6-7, p. 1275-1287. DOI 10.1016/j.rser.2008.08.014. 5. IPCC. Preguntas frecuentes Cambio climático 2013 Bases físicas Resumen para responsables de políticas. 2013. ISBN 9789291693382. Disponible en: https://www.ipcc.ch/site/assets/uploads/2018/03/WG1AR5_SummaryVolume_FINAL_SPANISH. pdf. 6. PE. Los europeos creen que el cambio climático debe ser la primera prioridad del PE | Noticias | Parlamento Europeo. En: Noticias Parlamento Europeo. 2019. [consulta: 18 mayo 2021]. Disponible en: https://www.europarl.europa.eu/news/es/press-room/20191129IPR67710/loseuropeos-creen-que-el-cambio-climatico-debe-ser-la-primera-prioridad-del-pe. 7. PE. Reducir las emisiones de los automóviles: nuevos objetivos de CO2 | Noticias | Parlamento Europeo. En: Noticias Parlamento Europeo. 2018. [consulta: 18 mayo 2021]. Disponible en: https://www.europarl.europa.eu/news/es/headlines/society/20180920STO14027/reducir-lasemisiones-de-los-automoviles-nuevos-objetivos-de-co2. 8. Naciones Unidas. Convenio sobre la diversidad biológica naciones unidas 1992. En: [en línea]. 1992, Disponible en: https://www.cbd.int/programmes/outreach/awareness/publications.shtml. 9. NSF - OLPA - Dr. Rita R. Colwell’s- «The Flag of Biotechnology,» US-EC Task Force on Biotechnology Research, Arlington, Virginia, June 25, 2003. [consulta: 18 mayo 2021]. Disponible en: https://www.nsf.gov/news/speeches/colwell/rc030625usectask.htm. 10. Heux, S. et al. White biotechnology: State of the art strategies for the development of biocatalysts for biorefining. Biotechnology Advances. Elsevier Inc., 2015, vol. 33, no. 8, p. 16531670. DOI 10.1016/j.biotechadv.2015.08.004. 11. Bazzanella, A. SusChem reaction & Process Design-Sustainable and Competitive Chemicalproduction in Europe. ChemSusChem. 2008, vol. 1, no. 8-9, p. 775-776. DOI 10.1002/cssc.200800131. 12. Clark, J. y Deswarte, F. The Biorefinery Concept: An Integrated Approach. En: Introduction to Chemicals from Biomass: Second Edition. Wiley Blackwell, 2015, p. 1-29. ISBN 9781118714478. DOI 10.1002/9781118714478.ch1. 13. Kamm, B. y Kamm, M. Principles of biorefineries. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer, 2004, vol. 64, no. 2, p. 137-145. DOI 10.1007/s00253-003-1537-7. 82 14. Biorefinery for apple pomace: nutraceuticals, enzymes and biofuels (ULTREIA) | Group of Environmental Biotechnology. [consulta: 19 mayo 2021]. Disponible en: https://biogroup.usc.es/ultreia. 15. Perussello, C.A. et al. Valorization of Apple Pomace by Extraction of Valuable Compounds. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. Blackwell Publishing Inc., 2017, vol. 16, no. 5, p. 776-796. DOI 10.1111/1541-4337.12290. 16. Okoli, C.O. y Adams, T.A. Design and Assessment of Advanced Thermochemical Plants for Second Generation Biobutanol Production Considering Mixed Alcohols Synthesis Kinetics. Industrial and Engineering Chemistry Research. 2017, vol. 56, no. 6, p. 1543-1558. DOI 10.1021/acs.iecr.6b03196. 17. FAOSTAT. En: [en línea]. 2021. [consulta: 21 mayo 2021]. Disponible en: http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC. 18. Waldbauer, K., Mckinnon, R. y Kopp, B. Apple Pomace as Potential Source of Natural Active Compounds. Planta Med. 2017, vol. 83, no. 12-13, p. 994-1010. DOI 10.1055/s-0043111898. 19. Vendruscolo, F. et al. Apple Pomace : A Versatile Substrate for Biotechnological Applications Apple Pomace : A Versatile Substrate for Biotechnological Applications. Critical Reviews in Biotechnology. 2008, vol. 28, p. 1-13. DOI 10.1080/07388550801913840. 20. Sudha, M.L. Apple Pomace (By-Product of Fruit Juice Industry) as a Flour Fortification Strategy. Flour and Breads and their Fortification in Health and Disease Prevention. Elsevier Inc., 2011, p. 395-405. DOI 10.1016/B978-0-12-380886-8.10036-4. 21. Dhillon, G.S., Kaur, S. y Brar, S.K. Perspective of apple processing wastes as low-cost substrates for bioproduction of high value products: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews. Pergamon, 2013, vol. 27, p. 789-805. DOI 10.1016/j.rser.2013.06.046. 22. Nigam, P.S. y Singh, A. Production of liquid biofuels from renewable resources. Progress in Energy and Combustion Science. Pergamon, 2011, vol. 37, no. 1, p. 52-68. DOI 10.1016/j.pecs.2010.01.003. 23. Bórawski, P. et al. Development of renewable energy sources market and biofuels in The European Union. Journal of Cleaner Production. Elsevier Ltd, 2019, vol. 228, p. 467-484. DOI 10.1016/j.jclepro.2019.04.242. 24. EU. Directive 2009/28/EC of The European Parliament and of The Council of 23 April 2009 on the promotion of the use of energy from renewable sources and amending and subsequently repealing Directives 2001/77/EC and 2003/ 30/EC. En: Off J European Union [en línea]. 2009. [consulta: 25 mayo 2021]. Disponible en: https://eur-lex.europa.eu/legalcontent/ES/TXT/HTML/?uri=CELEX:32009L0028&from=EN. 25. OECD-FAO Agricultural Outlook 2017-2026 : BIOFUEL - OECD-FAO Agricultural Outlook 2017-2026. En: [en línea]. [consulta: 25 mayo 2021]. Disponible en: https://stats.oecd.org/index.aspx?queryid=76849. 26. Trindade, W.R. da S. y Santos, R.G. dos. Review on the characteristics of butanol, its production and use as fuel in internal combustion engines. Renewable and Sustainable Energy Reviews. Elsevier Ltd, 2017, vol. 69, p. 642-651. DOI 10.1016/j.rser.2016.11.213. 27. Green, E.M. Fermentative production of butanol-the industrial perspective. Current Opinion in Biotechnology. Elsevier Current Trends, 2011, vol. 22, no. 3, p. 337-343. DOI 10.1016/j.copbio.2011.02.004. 83 28. Heaton, C.A. The Chemical Industry [en línea]. Boston, MA: Springer US, 1991. ISBN 9780-216-91803-0. [consulta: 27 mayo 2021]. Disponible en: http://link.springer.com/10.1007/9781-4615-8541-1. 29. Amiri, H. y Karimi, K. Biobutanol production. Advanced Bioprocessing for Alternative Fuels, Biobased Chemicals, and Bioproducts: Technologies and Approaches for Scale-Up and Commercialization. Elsevier, 2019, p. 109-133. DOI 10.1016/B978-0-12-817941-3.00006-1. 30. Bankar, S.B. et al. Biobutanol: The outlook of an academic and industrialist. RSC Advances. Royal Society of Chemistry, 2013, vol. 3, no. 47, p. 24734-24757. DOI 10.1039/c3ra43011a. 31. Yoo, M., Nguyen, N.-P.-T. y Soucaille, P. Trends in Systems Biology for the Analysis and Engineering of Clostridium acetobutylicum Metabolism. Trends in Microbiology. Elsevier Ltd, 2020, vol. 28, no. 2, p. 118-140. DOI 10.1016/j.tim.2019.09.003. 32. Lütke-Eversloh, T. y Bahl, H. Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum: Recent advances to improve butanol production. Current Opinion in Biotechnology. Elsevier Current Trends, 2011, vol. 22, no. 5, p. 634-647. DOI 10.1016/j.copbio.2011.01.011. 33. Su, Z. et al. Reassessment of the role of CaCO3 in n-butanol production from pretreated lignocellulosic biomass by Clostridium acetobutylicum. Scientific Reports. Nature Research, 2020, vol. 10, no. 1, p. 1-10. DOI 10.1038/s41598-020-74899-9. 34. Yang, X. et al. A comparison of three pH control methods for revealing effects of undissociated butyric acid on specific butanol production rate in batch fermentation of Clostridium acetobutylicum. AMB Express. Springer Nature, 2013, vol. 3, no. 1, p. 3. DOI 10.1186/2191-0855-3-3. 35. Hijosa-Valsero, M., Paniagua-García, A.I. y Díez-Antolínez, R. Biobutanol production from apple pomace: the importance of pretreatment methods on the fermentability of lignocellulosic agro-food wastes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag, 2017, vol. 101, no. 21, p. 8041-8052. DOI 10.1007/s00253-017-8522-z. 36. Jin, Q. et al. Acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation of soluble and hydrolyzed sugars in apple pomace by Clostridium beijerinckii P260. Fuel. Elsevier Ltd, 2019, vol. 244, p. 536544. DOI 10.1016/j.fuel.2019.01.177. 37. Maiti, S. et al. Hydrolytic pre-treatment methods for enhanced biobutanol production from agro-industrial wastes. Bioresource Technology. Elsevier Ltd, 2018, vol. 249, p. 673-683. DOI 10.1016/j.biortech.2017.09.132. 38. Peñas González, H. Solvent-based approaches to evaluate the ABE extractive fermentation. Tesis doctoral, Dept. Enxeñaría Química, Universidade de Santiago de Compostela En: [en línea]. 2019. [consulta: 17 junio 2021]. Disponible en: http://hdl.handle.net/10347/20522. 39. Botana, N. Utilización de biomasa pretratada mediante o proceso Organosolv como sustrato en cultivos Clostridium para a producción de ABE por fermentación extractiva. Trabajo de Fin de Máster, Dept. Enxeñaría Química, Universidade de Santiago de Compostela . 2017. 40. Prado, I. Utilización de bagazo de manzana para la extracción de compuestos fenólicos y para la producción de ABE en cultivos Clostridium. Trabajo de Fin de Máster, Dept. Enxeñaría Química, Universidade de Santiago de Compostela. 2021. 41. Al-Shorgani, N.K.N. et al. Process optimization of butanol production by Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564) using palm oil mill effluent in acetone-butanolethanol fermentation. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. Elsevier Ltd, 2015, vol. 4, no. 84 2, p. 244-249. DOI 10.1016/j.bcab.2015.02.004. 42. Narueworanon, P. et al. Impacts of initial sugar, nitrogen and calcium carbonate on butanol fermentation from sugarcane molasses by clostridium beijerinckii. Energies. MDPI AG, 2020, vol. 13, no. 3, p. 694. DOI 10.3390/en13030694. 43. Lin, Y.S. et al. Optimization of butanol production from corn straw hydrolysate by Clostridium acetobutylicum using response surface method. Chinese Science Bulletin. Springer, 2011, vol. 56, no. 14, p. 1422-1428. DOI 10.1007/s11434-010-4186-0. 44. Wang, Y. y Blaschek, H.P. Optimization of butanol production from tropical maize stalk juice by fermentation with Clostridium beijerinckii NCIMB 8052. Bioresource Technology. Elsevier, 2011, vol. 102, no. 21, p. 9985-9990. DOI 10.1016/j.biortech.2011.08.038. 45. Wang, Q. et al. Optimization of biobutanol production from poplar wood hydrolysate using a mutant of Clostridium saccharobutylicum. BioResources. North Carolina State University, 2016, vol. 11, no. 2, p. 2998-3012. DOI 10.15376/biores.11.2.2998-3012. 46. Wood, I.P. et al. Rapid quantification of reducing sugars in biomass hydrolysates: Improving the speed and precision of the dinitrosalicylic acid assay. Biomass and Bioenergy. Pergamon, 2012, vol. 44, p. 117-121. DOI 10.1016/j.biombioe.2012.05.003. 47. Shao, Y. y Lin, A.H.M. Improvement in the quantification of reducing sugars by miniaturizing the Somogyi-Nelson assay using a microtiter plate. Food Chemistry. Elsevier Ltd, 2018, vol. 240, p. 898-903. DOI 10.1016/j.foodchem.2017.07.083. 48. SPINREACT, S.A. /S. A.. Glucose-TR. Enzymatic colorimetric. 2013. [consulta: 8 junio 2021]. Disponible en: http://www.spinreact.com/files/Inserts/inserts_portugues/BSIS17P_GLUCOSE-TR_02-2013.pdf. 49. SPINREACT, S.A. /S. A.. Lactate LO-POD. Enzymatic colorimetric. 2013. [consulta: 12 junio 2021]. Disponible en: https://www.spinreact.com/assets/files/Inserts/Bioquimica/BSIS26_Lactato-2016.pdf. 50. Seo, S.O. et al. Characterization of a Clostridium beijerinckii spo0A mutant and its application for butyl butyrate production. Biotechnology and Bioengineering. John Wiley and Sons Inc., 2017, vol. 114, no. 1, p. 106-112. DOI 10.1002/bit.26057. 51. El Kanouni, A. et al. The improvement of glucose/xylose fermentation by Clostridium acetobutylicum using calcium carbonate. World Journal of Microbiology and Biotechnology. Kluwer Academic Publishers, 1998, vol. 14, no. 3, p. 431-435. DOI 10.1023/A:1008881731894. 52. Mee, R. y Xiao, J. Steepest Ascent for Multiple-Response Applications on JSTOR. Technometrics. 2008, vol. 50, n, p. 371-382. Disponible en: https://www.jstor.org/stable/25471497?seq=1. 53. Sirisantimethakom, L. et al. Improvement of butanol production from sweet sorghum juice by Clostridium beijerinckii using an orthogonal array design. Industrial Crops and Products. Elsevier B.V., 2016, vol. 79, p. 287-294. DOI 10.1016/j.indcrop.2015.11.012. 54. Guan, W. et al. Acetone-butanol-ethanol production from Kraft paper mill sludge by simultaneous saccharification and fermentation. Bioresource Technology. Elsevier Ltd, 2016, vol. 200, p. 713-721. DOI 10.1016/j.biortech.2015.10.102. 55. Zhang, J. y Jia, B. Enhanced butanol production using Clostridium beijerinckii SE-2 from the waste of corn processing. Biomass and Bioenergy. Elsevier Ltd, 2018, vol. 115, p. 260-266. DOI 10.1016/j.biombioe.2018.05.012. 85 56. Qureshi, N. et al. Butanol production by Clostridium beijerinckii. Part I: Use of acid and enzyme hydrolyzed corn fiber. Bioresource Technology. 2008, vol. 99, no. 13, p. 5915-5922. DOI 10.1016/j.biortech.2007.09.087. 57. Haus, S. et al. A systems biology approach to investigate the effect of pH-induced gene regulation on solvent production by Clostridium acetobutylicum in continuous culture. BMC Systems Biology. 2011, vol. 5, no. 10. DOI 10.1186/1752-0509-5-10. 58. Han, B. et al. Use of proteomic analysis to elucidate the role of calcium inacetonebutanol-ethanol fermentation by clostridium beijerinckii NCIMB 8052. Applied and Environmental Microbiology. 2013, vol. 79, no. 1, p. 282-293. DOI 10.1128/AEM.02969-12. 59. Maddox, I. et al. The cause of “Acid crash” and “Acidogenic fermentations” during the batch Acetone-Butanol-Ethanol (ABE) fermentation process. Journal of molecular microbiology and biotechnology [en línea]. 2000, vol. 2, no. 1, p. 95-100. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10937493/. 60. Wang, Y. et al. Development of a gene knockout system using mobile group II introns (Targetron) and genetic disruption of acid production pathways in Clostridium beijerinckii. Applied and Environmental Microbiology. 2013, vol. 79, no. 19, p. 5853-5863. DOI 10.1128/AEM.0097113. 61. González-Peñas, H. et al. Organosolv pretreated beech wood as a substrate for acetone butanol ethanol extractive fermentation. Holzforschung. De Gruyter, 2019, vol. 73, no. 1, p. 5564. DOI 10.1515/hf-2018-0098. 62. Veza, I., Muhamad Said, M.F. y Latiff, Z.A. Recent advances in butanol production by acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation. Biomass and Bioenergy. Elsevier Ltd, 2021, vol. 144, p. 105919. DOI 10.1016/j.biombioe.2020.105919. 63. Ezeji, T.C., Qureshi, N. y Blaschek, H.P. Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping. World Journal of Microbiology and Biotechnology. Springer, 2003, vol. 19, no. 6, p. 595-603. DOI 10.1023/A:1025103011923. 64. Ni, Y., Wang, Y. y Sun, Z. Butanol production from cane molasses by Clostridium saccharobutylicum DSM 13864: Batch and semicontinuous fermentation. Applied Biochemistry and Biotechnology. Springer, 2012, vol. 166, no. 8, p. 1896-1907. DOI 10.1007/s12010-012-9614y. 65. Youn, S.H. et al. Effective isopropanol–butanol (IB) fermentation with high butanol content using a newly isolated Clostridium sp. A1424. Biotechnology for Biofuels. 2016, vol. 9, no. 1, p. 230. DOI 10.1186/s13068-016-0650-7. 66. Dai, Z. et al. Introducing a single secondary alcohol dehydrogenase into butanol-tolerant Clostridium acetobutylicum Rh8 switches ABE fermentation to high level IBE fermentation. Biotechnology for Biofuels. BioMed Central, 2012, vol. 5, no. 1, p. 1-10. DOI 10.1186/1754-68345-44. 67. Vieira, C.F. dos S. et al. Sugarcane bagasse hydrolysates as feedstock to produce the isopropanol-butanol-ethanol fuel mixture: Effect of lactic acid derived from microbial contamination on Clostridium beijerinckii DSM 6423. Bioresource Technology. Elsevier Ltd, 2021, vol. 319, p. 124140. DOI 10.1016/j.biortech.2020.124140. 68. Sonomoto, K. et al. Efficient conversion of lactic acid to butanol with pH-stat continuous lactic acid and glucose feeding method by Clostridium saccharoperbutylacetonicum. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer, 2010, vol. 87, no. 3, p. 1177-1185. DOI 86 10.1007/s00253-010-2673-5. 69. Yoshida, T., Tashiro, Y. y Sonomoto, K. Novel high butanol production from lactic acid and pentose by Clostridium saccharoperbutylacetonicum. Journal of Bioscience and Bioengineering. Elsevier, 2012, vol. 114, no. 5, p. 526-530. DOI 10.1016/j.jbiosc.2012.06.001. 70. Zhou, Q., Liu, Y. y Yuan, W. Kinetic modeling of lactic acid and acetic acid effects on butanol fermentation by Clostridium saccharoperbutylacetonicum. Fuel. Elsevier Ltd, 2018, vol. 226, p. 181-189. DOI 10.1016/j.fuel.2018.04.019. 71. Du, G.Q. et al. Design of online off-gas analysis system for anaerobic ABE fermentation and the strategy for improving biobutanol production. Process Biochemistry. Elsevier Ltd, 2016, vol. 51, no. 5, p. 555-560. DOI 10.1016/j.procbio.2016.02.010. 72. Kudahettige-Nilsson, R.L. et al. Biobutanol production by Clostridium acetobutylicum using xylose recovered from birch Kraft black liquor. Bioresource Technology. Elsevier Ltd, 2015, vol. 176, p. 71-79. DOI 10.1016/j.biortech.2014.11.012. 73. Outram, V. et al. A comparison of the energy use of in situ product recovery techniques for the Acetone Butanol Ethanol fermentation. Bioresource Technology. Elsevier Ltd, 2016, vol. 220, p. 590-600. DOI 10.1016/j.biortech.2016.09.002. 74. Mayank, R., Ranjan, A. y Moholkar, V.S. Mathematical models of ABE fermentation: Review and analysis. Critical Reviews in Biotechnology. 2013, vol. 33, no. 4, p. 419-447. DOI 10.3109/07388551.2012.726208. 87 Anexos Anexo A. Fotografías de cultivos en placa Se realizaron empleando un microscopio microscopio óptico Nikon Labophot, equipado con una cámara Nikkon asociada al software Nis Elements D 4.40.000 con un aumento de 10x. Permiten comprobar la presencia de esporas de Clostridium beijerinckii en los cultivos en placa de Petri. Nomenclatura: 1, esporas individuales; 2, agregados celulares de esporas. 88 Anexo B. Fotografías de cultivos en medio de reactivación Se realizaron empleando un microscopio microscopio óptico Nikon Labophot, equipado con una cámara Nikkon asociada al software Nis Elements D 4.40.000, con un aumento de 10x. Permiten comprobar la presencia de diversas morfologías celulares de Clostridium beijerinckii en los cultivos de crecimiento con medio de reactivación ATCC 2107. Nomenclatura: 1, células vegetativas; 2, células con morfología clostridia; 3, endoesporas; 4, esporas individuales o agregadas. 89 Anexo C. Script utilizado en RStudio para la verificación del modelo matemático Requiere las bibliotecas de superficie de respuesta “rsm” y de optimización “minqa”. # ****************************************************************************************** # R-CRAN script # Created by Thelmo A. Lu-Chau # & edited by Javier Bravo Venegas # vie 4 Jun 2021 20:01:53 CET # # --------------------------------------------------------- # Data from "headers// x1, x2, x3, block, Y ..." data file # --------------------------------------------------------- # # ------------------------------------------------------------------------------------------------------ # In MS Windows # Include the R directory (e.g. "C:\Program Files\R\R-4.0.3\bin") in PATH # Run the script as "R.exe CMD BATCH rsm-script.R" from the directory containing the "Ydata.txt" file # ------------------------------------------------------------------------------------------------------ # library("rsm") library("minqa") # n.line <-function(n) { for (i in 1:n){cat("-")} cat("\n") } # Mean and diference values for coding Y data xl <- c(1:6) xl[1] <- 6 xl[2] <- 1 xl[3] <- 5 xl[4] <- 3 xl[5] <- 35 xl[6] <- 5 # DataTable <- read.table("Y-data.txt", header = TRUE) CR <- coded.data(DataTable, x1 ~ (pH - xl[1])/xl[2], x2 ~ (CaCO3 - xl[3])/xl[4], x3 ~ (T - xl[5])/xl[6]) # # CR <- coded.data(DataTable, x1 ~ (temp - 37.5)/12.5, x2 ~ (time - 135)/105, x3 ~ (LSR - 12.5)/7.5) # # --------------------------------------------- # rsm.1 -> First Order (FO) model # CR.rsm1 <- rsm(Y ~ FO(x1, x2, x3), data = CR) # summary (CR.rsm1) # sa1 <- steepest(CR.rsm1) # --------------------------------------------- # # rsm.2 -> Second Order (SO) model # CR.rsm2 <- rsm(Y ~ SO(x1, x2, x3), data = CR) sa1 <- steepest(CR.rsm2, dist=seq(0,3,by=0.1)) sa2 <- canonical.path(CR.rsm2, dist = seq(-2, 2, by = 0.2)) # ------------------------------------------------------------------------------------------- # maxf {1, 0] to {maximize, minimize} # maxf <- 1 p <- CR.rsm2[[1]] # # t <- c(1:17) # for (n in 1:10) {t[n] <- p[n]}