Estudio de factores implicados en los mecanismos de virulencia de virus tipo IPNV

TESE DE DOUTORAMENTO ESTUDIO DE FACTORES IMPLICADOS EN LOS MECANISMOS DE VIRULENCIA DE VIRUS TIPO IPNV María del Carmen Lago Lorenzo ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN AVANCES EN BIOLOXÍA MICROBIANA E PARASITARIA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2020 DECLARACIÓN DO AUTOR/A DA TESE ESTUDIO DE FACTORES IMPLICADOS EN LOS MECANISMOS DE VIRULENCIA DE VIRUS TIPO IPNV D./Dna. MARÍA DEL CARMEN LAGO LORENZO Presento a miña tese, seguindo o procedemento axeitado ao Regulamento, e declaro que: 1) A tese abarca os resultados da elaboración do meu traballo. 2) De selo caso, na tese faise referencia ás colaboracións que tivo este traballo. 3) A tese é a versión definitiva presentada para a súa defensa e coincide coa versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que a tese non incorre en ningún tipo de plaxio doutros autores nin de traballos presentados por min para a obtención doutros títulos. En Santiago de Compostela, 23 de Xullo de 2020 Asdo. AUTORIZACIÓN DO DIRECTOR / TITOR DA TESE ESTUDIO DE FACTORES IMPLICADOS EN LOS MECANISMOS DE VIRULENCIA DE VIRUS TIPO IPNV D./Dna. Carlos Pereira Dopazo INFORMA/N: Que a presente tese, correspóndese co traballo realizado por D/Dna. María del Carmen Lago Lorenzo, baixo a miña dirección, e a utorizo a súa presentación , considerando que reúne os r equisitos esixidos no R egulamento de Estudos de Doutoramento da USC, e que como director desta non incorre nas causas de abstención establecidas na Lei 40/2015. En Santiago de Compostela, 23 de Xullo de 2020. Asdo. DECLARACIÓN DE INTERESES El doctorando declara no tener ningún conflicto de interés en relación con la tesis doctoral. En Santiago de Compostela, 23 de Xullo de 2020 Asdo. 1 AGRADECIMIENTOS El destino ha querido que me haya tocado hacer este apartado en tiempos de pandemia. El confinamiento y los cambios bruscos que nos ha tocado vivir con toda esta situación, el estar recluída en casa y privada de todos esos “privilegios” en lo que a la vida social se refiere, te hacen pensar en la vida, en su recorrido, y darle valor a cada cosa que te haya tocado vivir en cada momento, y mucho más aún, darle valor a todas y cada una de las personas con las que en un momento u otro de tu vida, te ha tocado convivir. Mis más sinceras GRACIAS a todas y cada una de ellas, pues de todas ellas he aprendido algo. Empiezo dando gracias a mi familia, porque lo son todo para mí, y hoy en día soy lo que soy gracias a ella. Este trabajo, y todos mis logros en la vida, os los debo a vosotros. ¡Esto ha sido un trabajo en equipo! Mención especial a mi padre, que por desgracia, hoy no puede compartir esta victoria conmigo; pero no hace falta tenerlo a mi lado para saber lo orgulloso que se siente, y por eso le dedico este trabajo. Gracias, como no, a David, mi compañero de vida; en lo sentimental, por ser el pilar que sostiene mi mundo, e incluso en lo profesional, que su trabajo ha tenido con esta tesis. A mis amigos, mil gracias. Desde aquellos que se mantienen a mi lado desde la infancia, a los que han pasado por mi vida durante mi carrera y años de laboratorio, a aquellos con los que comparto fiestas y cañas, o los que me acompañan en el ámbito laboral. Sin su fuerza y apoyo, nada habría sido posible. En cuanto a este trabajo se refiere, gracias a Carlos e Isa por darme la oportunidad de formar parte de vuestro grupo y marcarme el camino a seguir. Sobre todo a Carlos, director de esta tesis, por su trabajo, su esfuerzo y su paciencia. A todos mis compañeros de laboratorio, por su colaboración en este trabajo, y sobre todo por haber sido parte de esa familia, con la que he compartido los mejores y peores momentos de mi vida. ¡Siempre os estaré agradecida! A Alián, 8 Secuenciación genómica de novo ................................. 42 VP5 las distintas cepas ................................................. 44 Análisis de la secuencia de aa en las regiones de VP2 relacionadas con la virulencia .................................................... 46 Análisis de los residuos de VP1 relacionados con la virulencia .................................................................................... 48 Replicación diferencial ................................................. 50 1.4 Discusión ..................................................................................... 51 ............................................................................... 57 2. Materiales y métodos ................................................................. 59 Resultados .................................................................................. 68 2.4 Discusión ..................................................................................... 84 Introducción ............................................................................... 91 Materiales y métodos ................................................................. 92 3.2.1 Líneas celulares y cepas virales .................................... 92 3.2.2 Titulación viral ............................................................. 93 3.2.3 Purificación viral .......................................................... 93 3.2.4 Análisis del contenido genómico de las fracciones F3-F6 94 3.2.5 Análisis del contenido proteico de las fracciones F1-F6 94 9 3.2.6 Microscopía electrónica ................................................ 95 3.2.7 Infección experimental ................................................. 96 3.2.8 Detección viral a partir de muestras de tejido .............. 97 3.2.9 Purificación viral a partir de tejido de peces infectados ... 99 3.3 Resultados ................................................................................ 100 3.3.1 Composición de las fracciones virales en CsCl .......... 100 3.3.2 Análisis del contenido proteico de las fracciones F1-F6 .. 102 3.3.3 Análisis de la composición genómica de las fracciones F1-F6 103 3.3.4 Tamaño de las partículas de las fracciones F3-F6 ...... 104 3.3.5 Replicación in vitro .................................................... 107 3.3.6 Virulencia in vivo........................................................ 107 3.3.7 Análisis de las fracciones obtenidas por purificación de virus a partir de tejido ............................................................... 109 3.4 Discusión ................................................................................... 111 CONCLUSIONES .......................................................................... 129 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................ 131 PERMISOS FIGURAS .................................................................. 151 ANEXO ............................................................................................ 155 10 11 INTRODUCCIÓN Los virus son entidades simples con complejas estrategias que les proporcionan capacidad adaptativa y modulan su virulencia. Además de las distintas estructuras capsidales, existe una gran variedad de organizaciones genómicas. La mayoría de los virus conocidos poseen un genoma de RNA, que a su vez puede ser monocatenal o bicatenal y de polaridad negativa o positiva. Los virus DNA también pueden ser monoo bicatenales, y algunos de ellos pueden incluso alternar entre RNA y DNA en las distintas fases de su ciclo. Su gran variabilidad genética se la aportan tres mecanismos evolutivos muy activos en este tipo de entidades: las mutaciones en la secuencia genómica, la recombinación génica y el reassortment (que implica el intercambio de segmentos genómicos completos, en virus con genomas segmentados) (Wei y col., 2006). Esta característica es la que hace que, de entre las enfermedades infecciosas que afectan a peces, sean las de origen viral las de mayor transcendencia, ya que su elevada variabilidad genética dificulta el desarrollo de tratamientos y métodos de prevención efectivos, causando así elevadas mortalidades. De entre todas las familias virales, son los virus RNA los que poseen una mayor capacidad adaptativa, debido al pequeño tamaño y a la sencillez de sus genomas, pero sobre todo, a la falta de acción correctora de las RNA polimerasas. Por el contrario, los virus DNA poseen genomas más grandes y complejos, que se mantienen más estables debido a la elevada fidelidad de sus enzimas de replicación (con excepción de los virus DNA monocatenal). Las principales familias virales que afectan a peces son: Adenoviridae, Iridoviridae y Herpesviridae dentro de las de genoma DNA, y Birnaviridae, Orthomyxoviridae, Paramixoviridae, Rhabdoviridae, Retroviridae, Nodaviridae, Reoviridae y Togaviridae entre los virus RNA. 12 La familia Birnaviridae es el objeto de estudio de nuestro trabajo, y más concretamente el género Aquabirnavirus, cuya especie tipo es el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), agente etiológico de enfermedades infecciosas que afectan a distintas especies de peces marinos y cultivados. Estos virus son patógenos conocidos por provocar grandes pérdidas en acuicultura, fundamentalmente en salmónidos, aunque también han sido aislados de otras especies tanto marinas como de agua dulce. Debido a su elevada variabilidad genética, son capaces de replicar en un amplio rango de hospedadores, causando distintas patologías, por lo que debe hacerse una diferenciación entre los aislados de salmónidos que causan la patología clásica (virus tipo IPNV), y los aislados de no salmónidos, que deben considerarse birnavirus acuáticos o acuabirnavirus, al menos, hasta que exista evidencia de que causan necrosis pancreática (Hill y Way, 1995). Debido a las características epidemiológicas y la elevada diversidad de los birnavirus acuáticos, no existen tratamientos terapéuticos ni vacunas preventivas eficaces. Para desarrollar una vacuna efectiva es imprescindible establecer e identificar los factores de virulencia del patógeno, siendo éste el motivo principal para el desarrollo de este trabajo de tesis doctoral. FAMILIA BIRNAVIRIDAE El nombre de esta familia fue aprobado por el Comité Internacional de Taxonomía Vírica (ICTV) en el año 1986, con el virus IPNV como especie tipo. Este nombre hace referencia a la naturaleza genómica del virus, ya que el prefijo “birna” se debe a su genoma de RNA bicatenal bisegmentado. Esta familia comprende cuatro géneros diferentes, relacionados con el tipo de hospedador (Dobos y col., 1979; Murphy y col., 1995; Delmas y col., 2018): -G. Avibirnavirus: La especie tipo de este género es el virus de la bursa de los pollos (IBDV) (Cheville, 1967), enfermedad que afecta a aves y distribuída a nivel mundial. -G. Entomobirnavirus: La única especie dentro del género es el virus X de Drosophila (DVX), que fue aislado por primera vez en 1979 en la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) (Dobos y col., 1979), 13 aunque su rango de hospedadores es más amplio y puede afectar a otros tipos de insectos. -G. Aquabirnavirus: Constituye el grupo más grande de esta familia. La especie tipo es el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), pero también incluye otros virus que afectan a peces, como el de la ascitis del medregal del Japón (YAV), y los virus de tellina (TV) y de ostra (OV), siendo ambos de moluscos bivalvos. Causan necrosis pancreática infecciosa en salmónidos, incluyendo miembros de los géneros Salmo, Salvalinus y Oncorhynchus, y branquionefritis en anguilas. El virus ha sido asociado también a enfermedades en otras especies de peces, moluscos y crustáceos cultivados y salvajes de todo el mundo. -G.Blosnavirus: Este es el último género descrito en esta familia e incluye virus que infectan a peces de la especie cabeza de serpiente (snake head, Channa maculata). BIRNAVIRUS ACUÁTICOS Las primeras descripciones de birnavirus acuáticos surgen con el descubrimiento de la necrosis pancreática infecciosa (Wood y col., 1955), enfermedad sistémica contagiosa que afecta principalmente a salmónidos salvajes y cultivados. Esta enfermedad provoca un nivel de mortalidad inversamente proporcional a la edad, siendo muy frecuente en peces jóvenes (causando altas tasas de mortalidad en alevines) y rara en adultos, donde la enfermedad es prácticamente inaparente, y actuando los individuos supervivientes como portadores asintomáticos. El virus IPNV se aisló por primera vez en 1958, siendo el primer virus de peces cultivado in vitro (Wolf y col., 1959); aunque la cepa que luego se consideraría como cepa tipo, se aisló en 1960 en una epidemia en trucha arcoiris en Leetown (Virginia), siendo depositada en la ATCC (American Type Culture Collection) y designada como VR-299. Desde entonces, tanto el virus como la patología asociada han ido extendiéndose por todo el mundo; de este modo, virus IPNV -o tipo IPNVhan sido aislados a partir de una gran variedad de animales poiquilotermos, incluyendo peces salmónidos, no salmónidos, moluscos y crustáceos (Hill, 1982). Su temperatura de replicación se encuentra entre 4 y 27,5 ºC (Scherrer y col., 1974), con la óptima 14 alrededor de 15 ºC; además, se ha demostrado que el virus tolera incluso la temperatura de animales homeotermos (Sonstegard y col., 1972). Al tratarse de un virus desnudo, es muy resistente a solventes lipídicos y a temperaturas y pH extremos. La demostrada estabilidad de estos virus en ambientes naturales, tanto de agua dulce como marina, facilita enormemente su transmisión (Desautels y MacKelvie, 1975; Toranzo y Metricic, 1982). Organización genómica El genoma, de unos 4,8×106 Da, constituye entre un 9 y un 10% del peso total de la partícula, que es de alrededor de 55×106 Da (Dobos y col., 1977a). Se trata de RNA de doble cadena, formado por dos segmentos independientes de alrededor de 3,0×103 Da y 2,6×103 Da (segmentos A y B, respectivamente) (Moss y Gravell, 1969; Cohen y col., 1973; Dobos y col., 1977a). Figura 1. Organización genómica de IPNV. El segmento A contiene dos ORFs: el primero de ellos, codifica la proteína no estructural VP5 y el segundo, la poliproteína, que sufre una modificación co-traduccional mediante la actividad autoproteásica de la región la VP4 de la poliproteína, originando las proteínas pVP2, VP3 y VP4. El segmento B tiene un único ORF que codifica la proteína VP1. (1) Posiciones de los ORF. (2) Final de las regiones codificantes. (3) Puntos de corte de la proteasa NS (VP4). 15 El segmento A, de unas 3000 pb, es bicistrónico; contiene dos pautas de lectura abierta (ORFs) solapadas (Figura 1). La menor se encuentra en el extremo 5´ del segmento y codifica una proteína no estructural de 17 kDa, la VP5 (Magyar y Dobos, 1994; Heppell y col., 1995a). El segundo ORF, el mayor y más conocido, codifica la poliproteína PP, de 106 kDa (NH2-pVP2-NS-VP3-COOH), la cual es precursora de las proteínas estructurales VP2, NS (VP4) y VP3 mediante modificación cotraduccional gracias a la actividad proteolítica de la región NS (VP4) (Figura 1). Los puntos de corte en la poliproteína se localizan en las posiciones Ala-Ser 508-509 y 734-735 (según la secuencia de VP4 de la cepa Sp con código de acceso U56907); además, se han encontrado dos puntos de corte adicionales para VP2 entre dos alaninas, en posiciones 495-496 y 486-487 (secuencia U56907) (Petit y col., 2000; Imajoh y col., 2007). La secuencia de este segmento (más concretamente de la región VP2) determina el serotipo del virus, habiéndose demostrado, además, su relación con el trofismo celular y la virulencia del virus (Sano y col., 1992; Santi y col., 2004). El segmento B, el más pequeño de los dos, formado por 2748 nucleótidos en la cepa Jasper, posee un único ORF que codifica la polimerasa viral de 94 kDa conocida como VP1, y que puede encontrarse en forma de polipéptido libre (VP1) o covalentemente unida al extremo 5´de ambos segmentos genómicos (VPg) (Figura 1). Este segmento es el más conservado de los dos y la mayoría de las mutaciones que se producen en él no implican cambios aminoacídicos (Shwed y col., 2002; Zhang y Suzuki, 2003). Estructura y proteínas estructurales IPNV es un virus icosaédrico, desnudo, con un diámetro de entre 55 y 74 nm, aunque el tamaño más frecuente es de 60 nm (Lightner y Post, 1969; Moss y Gravell, 1969). Su cápside está formada por 132 capsómeros y su arquitectura se describe, al igual que la de la mayoría del resto de virus icosaédricos, por el principio de cuasiequivalencia propuesto por Caspar y Klug (1962), siendo su número de triangulación T=13. El virión está constituído por cuatro tipos de proteínas estructurales que se han denominado de VP1 a VP4 (Cohen y col., 1973; Dobos y 16 col., 1977; Dobos y Rowe, 1977; Chang y col., 1978; Hedrick y col., 1983) (Figura 2A). Figura 2. Estructura de la cápside de birnavirus y proteínas estructurales. A. Proteínas estructurales del virión: VP1 (94 kDa), VP2 (54 kDa), VP3 (31 kDa) y VP4 (29 kDa). B. Estructura tridimensional de la partícula con la distribución de los distintos tipos de trímeros (Castón y col., 2001). C. Imagen de microscopía electrónica de virus purificados (escala 100 nm). [Imagen B tomada de “C Terminus of Infectious Bursal Disease Virus Major Capsid Protein VP2 Is Involved in Definition of the T Number for Capsid Assembly” (Castón y col. 2001)(permiso de la editorial)]. Bötcher y col. (1997) proponen un modelo estructural para la cápside de birnavirus basado en criomicroscopía, equivalente para IPNV e IBDV. En él se propone que la proporción de las distintas proteínas en la cápside sería 51% de VP2, 40% de VP3, 6% de VP4 y solo un 3% de VP1. La parte externa de la cápside estaría formada por 780 subunidades de VP2 organizadas en 260 trímeros, que se dividen en cinco clases dependiendo de su localización (denominados de “a” a “e”), (Figura 2B). Los trímeros tipo “a” se encuentran en los ejes de simetría 5 de la partícula; los tipo “e”, en los ejes de simetría 3, y están en contacto con los tres trímeros vecinos (tipo “d”); los trímeros tipo “c” se encuentran en los ejes de simetría 2; y por último, los “b” establecen contactos entre tres trímeros próximos. En este modelo, la proteína VP3 podría encontrarse en la cara interna de la cápside, o bien en su interior interactuando con el RNA. Este modelo fue posteriormente reproducido por Castón y col. (2001), confirmando que la cara interna de la cápside está formada por VP3, quien actúa de intermediario entre VP1 y VP2. En ambos modelos se describe la aparición de poros en la superficie de la cápside, poros que algunos 17 autores sugieren que pueden usarse para la extrusión del RNA recién sintetizado (Garriga y col., 2006). 1. Proteína VP1 La proteína VP1, la de mayor tamaño (94 kDa), es la RNA polimerasa viral y representa el 4% de las proteínas del virión. Se encuentra en forma libre o ligada al genoma mediante un enlace serina5´GMP fosfodiéster (denominada entonces VPg) (Persson y Macdonald, 1982; Calvert y col., 1991) y se ha sugerido que es su extremo C´terminal el que puede interaccionar con el RNA, debido a su alto contenido en aminoácidos básicos (Duncan y col., 1991). Es una proteína globular que alterna regiones hidrofílicas e hidrofóbicas y que sigue la conformación típica de las RNA polimerasas RNA dependientes (RdRps) (Figura 3) que recuerda a una mano derecha con sus dominios palma, pulgar y dedos (Kohlstaedt y col., 1992; O’Reilly y Kao, 1998; Butcher y col., 2001). Figura 3. Estructura de VP1. A. Representación de una molécula de VP1, con los dominios palma en rojo, pulgar en verde y dedos en azul. También se indican los extremos amino terminal (N´) y carboxilo terminal (C´). B. Representación esquemática de la interacción con los iones de Mg+2 en la región del centro activo (rojo) y K+ entre los dominios de palma y dedos. [Imagen tomada de “The N-Terminus of the RNA polymerase from infectious pancreatic necrosis virus is the determinant of genome attachment” (Graham y col., 2011)(permiso de la editorial)] Sin embargo, esta polimerasa difiere de las canónicas en que no posee, en la región de la palma, el dominio Gly-Asp-Asp (GDD), que se cree que es un elemento esencial para el centro activo (Duncan y col., 1991; Shwed y col., 2002) y que el número de iones Mg+2 en el centro activo A B 24 Posteriormente, Blake y col. (2001) propusieron una nueva clasificación basada en las relaciones filogenéticas entre las distintas cepas, mediante la secuenciación completa del segmento A. En ella, las distintas cepas de referencia, junto con una serie de aislados, se agrupan en 6 genogrupos. Dentro del primero de ellos, llegan a diferenciarse hasta 4 genotipos diferentes (Figura 5). Figura 5. Clasificación genotípica de Blake y col. Cladograma representando las relaciones filogenéticas de birnavirus acuáticos propuesto por Blake y col., 2001. [Tomado de Blake y col., 2001(permiso de la editorial)]. Así, basándose en las similitudes en la región VP2, se definieron 6 genogrupos. En el genogrupo 1 se encuentran los aislados americanos y la cepa Jasper (Ja), correspondiéndose con el serotipo A1. El genogrupo 2 contiene aislados europeos y asiáticos y se corresponde con el serotipo A3. En el genogrupo 3 se encuentran las cepas canadienses C1 y ASV pertenecientes al serotipo A6, y la cepa europea Te del serotipo A5. Otras cepas canadienses C2 y C3 (serotipos A7 y 25 A8 respectivamente) se agrupan en el genogrupo 4. En el genogrupo 5 se encuentran los miembros del serotipo A2, incluyendo cepas europeas y un aislado asiático. Por último, el genogrupo 6 está compuesto únicamente por la cepa He (serotipo A4). Análisis posteriores realizados con cepas de MABV aislados de peces marinos describen la existencia de un séptimo genogrupo formado por aislados de peces y moluscos de Japón y Corea. En este genogrupo 7 se encuentra, además, la cepa de referencia YTAV (Yellowtail ascites virus) (Zhang y Suzuki, 2004; Nishizawa y col., 2005). Patología Aunque originalmente la patología provocada por IPNV se relacionó con peces salmónidos, se han encontrado virus tipo IPNV en más de una treintena de familias de peces, 11 especies de moluscos y 4 especies de crustáceos. También se ha descrito su aislamiento a partir de protozoos, e incluso se ha detectado por RT-PCR en zooplacton marino, postulándose su papel como reservorio. En general, replica en animales poiquilotermos, aunque se comprobó que el virus resiste la temperatura de homeotermos y puede ser transmitido a mamíferos a través de aves (Sonstegard y col., 1972; Eskildsen y VestergardJorgensen, 1973). IPNV es un virus altamente contagioso. La transmisión puede ser una combinación entre vertical y horizontal, por contacto con heces, orina o productos sexuales de peces infectados (Reno y col., 1978). El virus penetra a través de las branquias y la boca, o pasando también por los poros sensoriales del sistema de la línea lateral (Wolf, 1988; Novoa y col., 1995a). Bowers y col. (2008), detectaron replicación viral en las aletas pectorales tan solo 24 h post-infección, sugiriendo la base de la aleta como otra posible vía de entrada para IPNV, como ya se ha descrito en otros virus. Los órganos de replicación temprana son el riñón anterior, los ciegos pilóricos, el hígado y el bazo (Shankar y Yamamoto, 1994), detectándose posteriormente en otros órganos y siendo en el páncreas donde se producen las principales lesiones, al menos, en salmónidos. 26 La necrosis pancreática infecciosa es la enfermedad de etiología viral reconocida como de mayor impacto en el cultivo de salmónidos a nivel mundial. La enfermedad varía desde inaparente o subclínica a virulenta, donde la mortalidad es elevada o incluso total; la primera indicación de una epidemia es la elevada mortalidad de los alevines. Los factores que determinan el nivel de gravedad de la enfermedad son la edad, el estado fisiológico del hospedador, la temperatura del agua y la variedad o cepa involucrada. La enfermedad se manifiesta externamente por una extrema delgadez de los individuos afectados, acompañada de exolftalmia moderada, distensión abdominal, frecuente presencia de hemorragias abdominales y pigmentación oscura con palidez en las branquias. Internamente, se observan hemorragias y petequias a través de la masa visceral, junto con palidez de riñones, hígado, corazón y bazo; el tracto digestivo aparece desprovisto de alimento y lleno de un fluído mucoso blanquecino procedente de la descamación intestinal (McKnight y Roberts, 1976). Los valores del hematocrito aparecen bajos (Wolf, 1988). En ocasiones, aparecen petequias en el tejido adiposo anterior y pueden aparecer ascites en la cavidad peritoneal. La necrosis pancreática es, quizás, el signo más característico de la infección, pero los cambios histológicos se extienden a los tejidos renal, excretor y hematopoyético (Wolf y Quimby, 1971). Se ha observado, además, degeneración del músculo esquelético y cambios de comportamiento que llevan a la postración del pez y la natación errática, débil y lenta, describiendo una trayectoria en espiral. Ellis y col. (2010), mediante un estudio histológico en salmón atlántico, propusieron, al igual que lo habían hecho con anterioridad Santi y col. (2005a), que el hígado es el principal órgano diana de IPNV y que el resultado de la infección (aguda o persistente) depende del balance de hepatocitos infectados al principio de la infección y la respuesta inmune del hospedador. Así, si al inicio de la infección hay un alto número de hepatocitos infectados, se inhibe la respuesta inmune del hospedador, por lo que las células periféricas son más sensibles a la infección y se desencadena apoptosis en respuesta a la presencia del RNA viral, llevando esto a un fallo hepático y a la muerte. Sin embargo, si el número de hepatocitos infectados al principio es bajo, se produce 27 el suficiente IFN para que la respuesta inmune en las células vecinas sea la suficiente para inhibir la replicación viral, impidiendo la apoptosis y promoviendo la recuperación, por lo que el individuo supera la infección. Estos autores también sugieren que el alto título viral en el riñón se debe a que el virus pasa de los hepatocitos infectados al torrente sanguíneo y por éste llegan al riñón, donde quedan concentrados en el retículo endotelial. Ahí, en la cabeza del riñón se establece una primera línea de defensa frente al virus y éste pasa a infectar los macrófagos; por eso se considera el principal órgano de detección del virus, incluso en individuos portadores asintomáticos (Julin y col., 2009). Todos estos signos son típicos de alevines y juveniles tempranos afectados; peces de más de seis meses desarrollan síntomas subclínicos e infecciones inaparentes. Esto puede deberse a que en alevines y juveniles el hígado y el páncreas son metabólicamente más activos, lo que hace que el virus replique más rápido, o bien, a que los hepatocitos sean más sensibles al IFN favoreciendo la apoptosis en defensa a la infección; también podría ser porque en individuos jóvenes se expresan más receptores de IFN en hepatocitos y células acinares del páncreas, por lo que su efecto se ve incrementado, generando apoptosis en este tipo de células (Ellis y col., 2010). Los peces adultos pueden ser infectados por el virus, pero las mortalidades son bajas o inexistentes (Krogsrud y Håstein, 1989; Ledo y col., 1990; Smail y col., 1992; Rivas y col., 1993). Por otro lado, los supervivientes de una infección pueden desarrollar una infección crónica y convertirse en portadores, difundiendo el virus dentro del agua vía heces, orina y productos sexuales (Yamamoto, 1975). La mortalidad y los síntomas varían en función de la cepa y la especie del hospedador. En peces no salmónidos no provocan necrosis pancreática, pero sí necrosis en tejidos hematopoyéticos, así como en riñón y bazo (Novoa y col., 1995b). Esta es la característica clave para hacer diferenciación entre virus IPNV o tipo IPNV, entre los que se incluyen los birnavirus acuáticos y los “marine birnavirus”. Factores de virulencia Debido a las características epidemiológicas de IPNV y los birnavirus acuáticos en general, no existen tratamientos terapéuticos 28 eficaces, ni vacunas preventivas. La elevada variabilidad genética y el desconocimiento de todos los factores de virulencia de este tipo de virus son los principales hándicaps a la hora de desarrollar una vacuna efectiva. Son muchos los estudios enfocados en el análisis de factores de virulencia de virus tipo IPNV, pero hasta el momento, los existentes asocian la virulencia del virus única y exclusivamente a la secuencia genómica de la región hipervariable del segmento A, y a residuos específicos de VP2 y la región VP2-NS. Santi y col., (2004), mediante estudios de genética reversa, encontraron en la región de VP2 unos motivos que determinan la virulencia (y/o persistencia) en las posiciones 217, 221 y 247. Entre ellos, las combinaciones T (treonina)217-A (alanina)221 y P (prolina)217A (alanina)221 se corresponden con fenotipos de alta y baja virulencia, respectivamente. En esos motivos, la combinación P217-T221 determina la persistencia y T217-A221 la virulencia. De entre estos dos residuos, 217 sería el principal determinante de la virulencia y 221 parece estar más relacionado con la adaptación al huésped, ya que se observó que tras varios pases por cultivo celular se produce un cambio de Ala a Thr, lo que implica atenuación. Posteriormente, Song y col. (2005), confirmaron que el establecimiento de persistencia se relaciona con el residuo 221, siendo T221 el determinante de persistencia y A221 el de virulencia. En 2013, varios autores vuelven a relacionar estos motivos con la virulencia/persistencia. Gadan y col. (2013) mediante mutaciones dirigidas en el residuo 221, observaron que mutando la combinación relacionada con la persistencia, T217-T221 a T217-A221, la cepa revertía a virulenta y además, tenía una mayor capacidad de fijación a la superficie celular. Mutoloki y col. (2013), asociaron las combinaciones T217-A221 y P217-T221 con infecciones clínicas y subclínicas, respectivamente. A pesar de la clara relación de la virulencia con la secuencia de la región VP2, otros autores han propuesto otros posibles determinantes de la virulencia en estos virus. Shivappa y col. (2004), analizando la secuencia genómica del segmento A de tres aislados diferentes de la cepa Sp, encontraron que la proteína VP5 poseía dos posibles codones de iniciación y un codón de terminación prematuro, originando así tres 29 tipos posibles de VP5, la esperada de 17 kDa, y dos formas truncadas de 15 kDa y 12 kDa, y relacionaron las distintas formas de VP5 con cepas de alta y baja virulencia, respectivamente. Otros autores habían sugerido previamente la implicación de esta proteína en la virulencia, al detectar que algunas cepas no codificaban esta proteína y mostraban un bajo nivel de virulencia (Santi y col., 2004; Zhang y Suzuki, 2004). Posteriormente, otros autores demostraron que esta proteína no es esencial para la virulencia ni la persistencia del virus en el hospedador (Santi y col., 2005b). Shivappa y col. (2004), en su caracterización de las distintas cepas de Sp, también encontraron 5 sustituciones aminoacídicas en VP1, y asociaron mutaciones en las posiciones 125, 154 y 240 con cepas de elevada y baja virulencia, sugiriendo la implicación de VP1 en la virulencia. Sí se ha demostrado el efecto de VP1 sobre la virulencia en IBDV (Hon y col., 2006; Le Nouën y col., 2006), pero hasta el momento no hay ningún trabajo en IPNV que pruebe su implicación. 30 31 OBJETIVOS El objetivo global de esta tesis doctoral ha sido establecer e identificar los factores de virulencia de birnavirus acuáticos, para entender mejor el mecanismo de adaptación al hospedador. Para ello, hemos desglosado este objetivo primordial en los tres siguientes: 1. Analizar la presencia, en aislados propios, de los determinantes de virulencia descritos por otros autores y comprobar si existe una relación con los niveles de virulencia y capacidad replicativa de las cepas. 2. Confirmar la implicación del reassortment, o recombinación intermolecular, en la regulación de la virulencia de estos virus y determinar su frecuencia ex vivo. Al mismo tiempo, hemos querido estudiar el mecanismo de intercambio y encapsidación de segmentos durante la replicación. 3. Determinar la existencia de poliploidía en cepas salvajes de birnavirus acuáticos y analizar su posible implicación en la virulencia y capacidad replicativa del virus. 32 33 CAPÍTULO 1: DETERMINANTES DE VIRULENCIA EN LA SECUENCIA GENÓMICA 1.1 INTRODUCCIÓN Tras la publicación de Sano y col. (1981), en la que se vinculaba la virulencia del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) al segmento A, multitud de autores han examinado la secuencia nucleotídica de este segmento, para determinar las diferencias en la secuencia aminoacídica que pueden justificar los distintos niveles de virulencia observados entre las distintas cepas de este virus. Los estudios de Bruslind y Reno (2000), Santi y col. (2004) y Shivappa y col. (2004), limitan estos residuos a tres, en posiciones 217, 221, 247, aunque se han descrito otras variaciones de secuencia que también podrían estar relacionadas. De estos residuos, es el 217 el que estaría directamente relacionado con la virulencia, y algunos autores sugieren, incluso, que puede estar relacionado con la unión eficiente a receptores celulares (Bruslind y Reno, 2000); en este aspecto, la mayoría de los autores concuerdan en que la localización de una treonina, Thr (T), en esta posición, se relaciona con altos niveles de virulencia, y si es una prolina, Pro (P), con niveles de virulencia moderados; sin embargo, ya se han comunicado situaciones en las que cepas con Pro en posición 217 manifiestan altos niveles de virulencia (Julin y col., 2015). El residuo en posición 221 parece estar relacionado con la adaptación al hospedador y el establecimiento de persistencia; se ha visto que este residuo cambia de alanina, Ala (A), a Thr tras el pase por cultivo celular, lo que según Santi y col. (2004) y Julin y col. (2015), implica una adaptación. Además, se considera que las cepas con Thr en esta posición son avirulentas, independientemente del aa situado en 217 40 Amplificación de fragmentos genómicos Para la extracción del RNA viral, se empleó el kit comercial RNeasy® Mini Kit (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante y eluyendo el RNA final en 50 µl de H2O libre de RNasas. La síntesis de cDNA, se llevó a cabo con el kit comercial SuperScriptTM III FirstStrand Synthesis System (Invitrogen) en un volumen final de reacción de 20 µl: 9 µl de RNA, 1 μl de Random Primers (en un primer paso) y 4 μl de tampón 5X, 1 μl de DTT, 1 μl de dNTPs, 0,2 μl de transcriptasa inversa SSIII y 3,8 μl de agua libre de RNasas (segundo paso). El RNA y los cebadores se incubaron durante 5 min a 95 ºC, para favorecer la desnaturalización de RNA y cebadores, pasando inmediatamente a 4 ºC. A continuación, se añadió la mezcla elaborada en el paso 2 y se prosiguió con el programa, con otras tres fases: rehibridación a 25 ºC durante 5 min, un ciclo de elongación de 50 min a 50 ºC y un tratamiento final a 85 ºC durante 5 min. La PCR se llevó a cabo con el kit Go Taq Flexi DNA Polymerase (Promega). Para ello, se preparó la siguiente mezcla de reacción: 4 µl de cDNA, 10 µl de tampón de PCR 5X Green GoTaq®, 5 µl de MgCl2, 1 µl de dNTP, 0,5 µl de cada cebador, 0,25 µl de Go Taq Flexi DNA polimerasa y H2O libre de RNasas hasta 50 µl. Las mezclas de reacción se sometieron a una desnaturalización inicial de 95 ºC, durante 4 min y a 30 ciclos de amplificación, cada uno consistente en una fase de desnaturalización a 95 ºC durante 30 s, rehibridación a 58 ºC durante 30 s y extensión a 72 ºC durante 30 s. Por último, se aplicó una extensión final a 72 ºC, 10 min. Purificación de fragmentos amplificados Los productos de amplificación se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2% en tampón TAE 1X, a 120 V durante 1 h, en paralelo con el marcador de peso molecular BrenchTop 100 bp DNA ladder (Promega). Los geles se tiñeron con Red safe (iNtRON Biotechnology), un análogo del bromuro de etidio, se visualizaron en un transiluminador de luz UV y las bandas se recortaron para purificar el fragmento amplificado. La purificación se llevó a cabo con el kit comercial Nucleospin Gel and PCR Clean-up (Macherey Naguel), siguiendo las instrucciones del fabricante y resuspendiendo el DNA 41 purificado en 40 µl de tampón TRIS-HCl, pH 8,5. La concentración se midió mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%, usando el marcador de peso molecular y concentración 100 bp DNA Mass Ladder Marker (MBiotech). Reacción de secuenciación Una vez cuantificada la concentración de cada producto de PCR, éste se sometió a secuenciación mediante el método de incorporación de terminadores dideoxi marcados con colorantes, empleando el kit comercial Genome Lab TM DTCS-Quick Start Kit (Beckman). Para ello, a una cantidad de 10 ng de DNA por cada 100 pb de fragmento a secuenciar, se le añadieron 4 µl de DTCS, 1 µl de Sequencing Reaction Buffer, 1 µl de cada uno de los cebadores (los usados para PCR) y agua libre de RNasas hasta 20 µl. Las mezclas de reacción se sometieron a 30 ciclos de desnaturalización a 96 ºC durante 20 s, hibridación a 50 ºC durante 20 s y elongación a 60 ºC durante 4 min. El producto de amplificación se precipitó en etanol al 95% (a -20 ºC), añadiendo 2 µl de acetato sódico, 2 µl de EDTA y 1 µl de glucógeno, por reacción, y centrifugando a 18000 g durante 15 min. Posteriormente, se aplicaron dos lavados con etanol al 75% (a -20 ºC), centrifugando a 18000 g 2 min, para eliminar los nucleótidos no incorporados. Una vez retirado el etanol, el DNA se secó en SpeedVac (Savant) y se resuspendió en 40 µl de tampón SLS (Beckman). Por último, se desnaturalizó a 92 ºC durante 2 min y se analizó en un secuenciador CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman). Análisis de las secuencias Las secuencias nucleotídicas obtenidas se analizaron utilizando los programas SeqMan, EditSeq y MegAlin (Lasergene). El análisis de VP5 y de los residuos relacionados con la virulencia se hizo mediante alineamiento y comparación de todas las secuencias usando el programa MegAlin (Lasergene). En el segmento A se analizaron los distintos tipos de VP5 presentes en cada cepa y los dominios aminoacídicos presentes en las regiones de VP2 y NS relacionadas con la virulencia propuestos por Santi y col., (2004): 217, 221, 247, 496 y 500. En el 42 segmento B, se analizaron los residuos que Shivappa y col. (2004), relacionaron con la virulencia: 125, 154, 187, 240 y 690. La cepa N1 no se incluyó en el análisis de los residuos de VP1 relacionados con la virulencia, por no disponer de la secuencia del segmento B. Replicación diferencial de cepas de birnavirus acuáticos Para evaluar si las diferencias de secuencia entre las distintas cepas incluídas en el análisis afectaban a su fenotipo, se llevó a cabo un análisis de la capacidad replicativa. Para ello, placas de 48 pocillos con monocapas semiconfluentes de BF-2, se inocularon con las distintas cepas a una MOI de 0,1 virus/célula (6 réplicas por cepa). Para comparar la capacidad de adhesión a la célula y de replicación de cada cepa, se titularon de nuevo (por triplicado), como se ha descrito en el apartado 1.2.1, a tiempos pre-y postadsorción, al inicio del efecto citopático y tras la destrucción del tapiz celular. 1.3 RESULTADOS Las secuencias genómicas de las cepas 2290, 1146, 24R, 88R, N1, Ab, Sp y WB ya estaban disponibles en la GenBank al inicio de este trabajo, con excepción de la secuencia del segmento B de la cepa N1 (códigos de acceso en el apartado 1.2.3). Las secuencias de las cepas 19G4, 20G3 y 20G7 se determinaron en el laboratorio con las 14 parejas de cebadores diseñadas para este fin. Para completar la secuencia de la cepa 88R, se usaron también las dos primeras parejas diseñadas para el segmento A, ya que no poseía la región codificante de VP5 completa. Se obtuvieron así, para el segmento A, secuencias de 3027 nucleótidos en la cepa 19G4, 2946 en la cepa 20G3 y 2995 en 20G7; todas ellas abarcaban la región codificante de VP5 completa, así como las regiones de VP2-NS con los residuos vinculados a la virulencia a analizar en este capítulo. El fragmento secuenciado para completar la región de VP5 de la cepa 88R obtenido con las parejas de cebadores 1 y 2, fue de 760 nucleótidos. 43 Para el segmento B, se obtuvieron secuencias de 2631 nucleótidos en la cepa 19G4, 2572 en 20G3 y 2589 en la cepa 20G7, todas ellas con la región codificante de VP1 completa. La secuenciación de ambos segmentos permitió un completo tipado de las 3 cepas del Flemish Cap (Terranova), resultando una -19G4del tipo salvaje WB (con ambos segmentos del mismo tipo WB/WB), otra -20G3de tipo Ab (Ab/Ab) y la tercera -20G7un recombinante con el segmento A de tipo WB y el B de tipo Ab (WB/Ab) (Tabla 3). Tabla 3. Tipos virales de las cepas del Flemish Cap, deducidos por secuenciación de ambos segmentos genómicos. Cepa Seg A Seg B Tipo 19G4 WB WB WB 20G7 WB Ab R (WB/Ab) 20G3 Ab Ab Ab La homología entre las secuencias del segmento A obtenidas para las cepas 19G4 y 20G7 fue muy elevada (99,8%), al igual que entre estas cepas y la cepa de referencia WB (99,8% y 99,9% respectivamente), mientras que la secuencia del segmento A de 20G3 (tipo Ab) mostró una homología de un 99,6% con su cepa de referencia Ab. La homología con los otros aislados tipo Ab (2290 y 24R) fue de un 99,5% (Tabla 4A). En el caso del segmento B, la secuencia obtenida para 19G4 mostró un 100% de homología con WB, y las secuencias de 20G3 y 20G7 mostraron una homología con Ab del 98,6% (Tabla 4B). En este caso es de destacar, que las homologías de las secuencias de estos dos aislados son mayores con las de los otros aislados tipo Ab de distinto origen, que con la propia cepa de referencia (99,9% con 2290 y 24R). 44 Tabla 4. Porcentaje de homología entre las secuencias genómicas de las distintas cepas. A. Segmento A B. Segmento B Cepa 19G4 20G3 20G7 Cepa 19G4 20G3 20G7 19G4 - - 99,8 19G4 - - - 20G3 - - - 20G3 - - 100 20G7 99,8 - - 20G7 - 100 - 2290 - 99,5 - 2290 - 99,9 99,9 1146 - - - 1146 - - - 88R - - - 88R - - - 24R - 99,5 - 24R - 99,9 99,9 N1 - - - N1 - - - Ab - 99,9 - Ab - 98,6 98,6 Sp - - - Sp - - - WB 99,8 - 99,9 WB 100 - - Como paso inicial, se llevó a cabo un estudio previo de las secuencias genómicas conocidas de las cepas de referencia WB, Sp, N1 y Ab, con el fin de determinar los tipos de ORF correspondientes a la región codificante de VP5. Como se muestra en la Figura 8, entre estas cepas se encontraron 3 tipos de ORF. El primero, es un ORF truncado de 45 nucleótidos, con el codón de iniciación en la posición 79-81, pero que se encuentra en la misma pauta de lectura con un codón de terminación en posición 124-126; este tipo se encuentra en la cepa WB. En ella, también encontramos un segundo tipo, un ORF de 399 nucleótidos (correspondiente a una proteína de 133 aa), que se encuentra en una pauta de lectura distinta, comenzando en el nucleótido 123 y finalizando con un codón de terminación en posición 522-524; este ORF también estuvo presente en las cepas de referencia Ab y Sp. En Sp y Ab se encontró además un tercer tipo de ORF, más largo, de 444 nucleótidos (148 aa), comenzando en el nucleótido 79 y finalizando en el 522 (codón de terminación en posición 523-525), siendo también este tercer ORF el único presente en la cepa N1. En base a las secuencias obtenidas, pudieron determinarse los codones de iniciación y terminación que dan lugar a las distintas formas de VP5 presentes en cada una las 4 cepas secuenciadas (19G4, 20G7, 45 20G3 y 88R). Así mismo, se analizaron las secuencias de los otros aislados obtenidos en el laboratorio (Figura 7). Figura 7. Esquema de los distintos tipos de VP5 presentes en las cepas incluidas en el análisis. Como se muestra en la Figura 8, entre los aislados analizados se encontraron los tres tipos de ORF para VP5. En 19G4 y 20G7 se observaron las dos formas características de la cepa de referencia WB: la forma truncada de 45 nucleótidos, correspondiente a una VP5 de tan solo 15 aa, y el segundo tipo de ORF, codificante de una proteína de 133 aa. En los aislados 20G3, 2290, 1146 y 24R se observó el patrón característico de las cepas Ab y Sp, formado por el segundo ORF codificante de una proteína de 133 aa, y el tercer tipo de ORF, codificante de una proteína de 148 aa, siendo este último ORF el único que se hayó en las cepas N1 y 88R. A p.a. ep. r. c.r. 46 Figura 8. Tipos de ORF para VP5 presentes entre los aislados virales. A. Regiones con los codones de inicio para las dos formas de VP5 y la PP. B. Regiones con los codones de terminación para la proteína VP5. Las flechas indican las secuencias obtenidas en el laboratorio. Los aislados se obtuvieron de portadores asintomáticos (p.a.), epizootias (ep.) y reservorios (r.) y se compararon con 4 cepas de referencia (c.r). CT: codón de terminación (TGA). En este apartado se analizaron las secuencias aminoacídicas correspondientes a VP2 en los aislados objeto de estudio, para determinar los aa presentes en los residuos 217, 221, 247, 496, y 500 de la región de VP2, y elucidar si se corresponden o no con el tipo de residuos relacionados con la virulencia descritos por Santi y col. (2004). Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 9 y la Tabla 5. Ninguna de las cepas incluídas en el análisis posee Thr en posición 217, considerado el mayor determinante de virulencia; los aa observados en esta posición fueron Pro (en las cepas 20G3, 2290, 1146, 88R, 24R, N1 y Sp), Ala (en 19G4, 20G7 y Ab) o glicina (Gly, G) (en WB). La posición 221 está ocupada por el aa Thr en todas las cepas, residuo relacionado con cepas avirulentas y con el establecimiento de la persistencia. Las posiciones 247 y 496 están ocupadas por Ala (A), menos en el caso de la cepa 20G3, dónde la A496 se sustituye por arginina (Arg, R). La posición 500 es un poco más variable: en el residuo 500, el aa más frecuente es tirosina (Tyr, Y), seguido de histidina (His, H) (en 2290, 88R y N1), apareciendo también Leu (L) en la cepa 20G3. Además de las diferencias observadas en los residuos relacionados con la virulencia, hemos observado unos residuos próximos a éstos, altamente variables, que hemos tenido en consideración y cuyos aa se reflejan también en la Figura 9 y la Tabla 5. Estos residuos se CT B p.a. ep. r. c.r. 47 encuentran en las posiciones 243, 249, 250 y 473. Los resultados parecen indicar que estas posiciones pueden estar relacionadas con la determinación del genotipo-serotipo, ya que todas las cepas tipo WB poseen la combinación T243 E249 V250 A473 y todas las cepas tipo Ab contienen la combinación S243 N249 T250 V473, con la excepción del aislado 20G3 en donde la posición 473 cambia a serina (Ser, S). Por último, todas las cepas del serotipo Sp poseen la combinación N243 Q249 A250 M473, salvo la cepa Sp donde la posición 473 está ocupada por el aa Thr. Figura 9. Residuos aminoacídicos presentes en la región VP2-NS con posible relación con la virulencia. En rojo se marcan las posiciones 217, 221, 247, 496 y 500, que en la literatura se han relacionado con la virulencia y que fueron analizadas en este capítulo. En verde se enmarcan residuos altamente variables observados en este análisis y que han sido tenidos en consideración. 48 Tabla 5. Aminoácidos observados en los residuos de VP2 relacionados con la virulencia. En la zona sombreada se muestran los aminoácidos adicionales, observados en este análisis en regiones muy variables. Cepa Tipo 217 221 247 496 500 243 249 250 473 19G4 WB/WB Ala Thr Ala Ala Tyr Thr Glu Val Ala 20G7 WB/Ab Ala Thr Ala Ala Tyr Thr Glu Val Ala 20G3 Ab/Ab Pro Thr Ala Arg Leu Ser Asn Thr Ser 2290 Ab/Ab Pro Thr Ala Ala His Ser Asn Thr Val 1146 Sp/Sp Pro Thr Ala Ala Tyr Asn Gln Ala Met 88R Sp/Sp Pro Thr Ala Ala His Asn Gln Ala Met 24R Ab/Ab Pro Thr Ala Ala Tyr Ser Asn Thr Val N1 Sp/Sp Pro Thr Ala Ala His Asn Gln Ala Met Ab Ab/Ab Ala Thr Ala Ala Tyr Ser Asn Thr Val Sp Sp/Sp Pro Thr Ala Ala Tyr Asn Gln Ala Thr WB WB/WB Gly Thr Ala Ala Tyr Thr Glu Val Ala El análisis de la secuencia de aminoácidos de la proteína VP1 reveló muy poca variabilidad entre estas cepas (Tabla 6 y Figura 10). Tan solo se observaron diferencias en la posición 690, encontrándose en esta el aa fenilalanina (Phe, F) en la mayoría de las cepas y el aa glutamina (Glu, E) en la cepa Ab, y Ala en WB y 19G4. En las otras posiciones se repite la combinación I125 I154 P187 H240 (isoleucina/ isoleucina/ prolina/ histidina). Además de estos residuos, en las posiciones correspondientes a los descritos por Shivappa y col. (2004), vinculados con la virulencia del virus, hemos observado en la secuencia aminoacídica de estas cepas otras tres regiones que difieren bastante entre las cepas analizadas. Estos residuos, en posiciones 85, 176 y 658, parecen estar relacionados con la determinación del serotipo/genotipo ya que las cepas tipo Ab presentan la combinación E85 A176 N658, mientras que las tipo Sp y WB presentan la combinación D85 G176 T658 (Figura 11 y Tabla 6). 49 Figura 10. Aminoácidos presentes en las regiones de VP1 relacionadas con la virulencia. En rojo se marcan las posiciones que en la literatura se han relacionado con la virulencia (Shivappa y col., 2004) y que fueron analizadas en este capítulo. Figura 11. Residuos variables observados en la región codificante de VP1. En verde se enmarcan 3 residuos que no se mencionan en la literatura, pero en los que se ha observado una gran variabilidad en este análisis y, por ello, se han tenido en consideración. Tabla 6. Aminoácidos observados en los residuos de VP1. En la zona sombreada se reflejan tres residuos, que no se mencionan en la literatura, pero que se han tomado en consideración. Cepa 125 154 187 240 690 85 176 658 19G4 Ile Ile Pro His Ala Asp Gly Thr 20G7 Ile Ile Pro His Phe Glu Ala Asn 20G3 Ile Ile Pro His Phe Glu Ala Asn 2290 Ile Ile Pro His Phe Glu Ala Asn 1146 Ile Ile Pro His Phe Asp Gly Thr 88R Ile Ile Pro His Phe Asp Gly Thr 24R Ile Ile Pro His Phe Glu Ala Asn Ab Ile Ile Pro His Glu Glu Ala Asn Sp Ile Ile Pro His Phe Asp Gly Thr WB Ile Ile Pro His Ala Asp Gly Thr 56 57 CAPÍTULO 2: REASSORTMENT 2.1 INTRODUCCIÓN El reassortment es un tipo de recombinación genética que implica el intercambio de segmentos genómicos entre cepas de un mismo virus. Este fenómeno fue descrito por primera vez en acuabirnavirus por Romero-Brey y col. (2009), quien, haciendo un análisis genético de acuabirnavirus aislados de poblaciones naturales de peces en el banco pesquero Flemish Cap, comprobó que parte de los acuabirnavirus analizados poseían un genoma compuesto por segmentos procedentes de dos tipos distintos. Desde entonces, se han detectado multitud de cepas recombinantes en diferentes localizaciones de todo el planeta (Cutrín y col., 2010; Lago y col., 2014; Moreno y col., 2014). En el año 2015 se confirmó la presencia de reassortment también en avibirnavirus, otro género de la familia Birnaviridae (Lu y col., 2015) . Este fenómeno también fue descrito en otras familias virales y con frecuencias muy diferentes. Así, hantavirus, lassa virus, tenuivirus poseen bajas tasas de reassortment, mientras que Influenza A, rotavirus A y cystovirus poseen altas tasas (Simon-Loriere y Holmes, 2011) y constituye, junto con las mutaciones secuenciales y la recombinación genética, uno de los mecanismos de evolución de virus de RNA bicatenal (Wei y col., 2006) y uno de los principales mecanismos para modificar la estructura de los genes y genomas, contribuyendo a la diversidad genética de este tipo de virus (Devold y col., 2006). Desafortunadamente, los mecanismos del reassortment continúan siendo desconocidos. Se han descrito dos tipos de reassortment, uno en el que la incorporación de los segmentos durante la replicación ocurre al azar y otro donde la incorporación está mediada por una serie de señales que permiten la selección de segmentos específicos (Pérez-Losada y col., 2015). Hasta la fecha, se han observado muchos indicios para el 58 segundo de ellos. Las señales de incorporación para acuabirnavirus no se conocen, pero sí se han sido descrito en otras familias virales: en reovirus el reassortment depende de tres nucleótidos en su región terminal UTR 5´ y de determinadas mutaciones en dicha región (Roner y col., 2004), mientras que en nodavirus se han propuesto una serie de substituciones en ambos segmentos genómicos que pueden estar involucradas en el proceso de intercambio (Olveira y col., 2009). Además de factores específicos del virus, en el proceso de reassortment influyen otros factores como las condiciones ambientales, el sistema inmune del huésped e, incluso en el caso de algunos virus, la posible presión selectiva que ejercen las vacunas (Wei y col., 2006). En cuanto a las condiciones ambientales, se ha descrito que, condiciones como el régimen de coinfección que a su vez depende de la distribución geográfica, pueden influír en el proceso (Díaz-Muñoz y col., 2013; Goedhals y col., 2014). En el caso del virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV), se ha sugerido que las condiciones de estrés y confinamiento constituyen un entorno ideal para la evolución viral y, por lo tanto, para que se produzca este fenómeno (Cárdenas y col., 2014). Se ha propuesto que el reassortment facilita el salto entre especies permitiendo al virus adquirir nuevas condiciones antigénicas que le permiten infectar nuevos huéspedes (Pérez-Losada y col., 2015). Además, juega un papel importante en la emergencia y expansión de nuevas cepas, alterando la antigenicidad y/o patogenicidad (Ramig, 1997; Ohashi y col., 2004; Nikolakaki y col., 2005). Se ha descrito en diversas familias la aparición de nuevos fenotipos tras el proceso de reassortment entre cepas altamente patogénicas y cepas avirulentas (Le Nouën y col., 2006; Wei y col., 2008; Kirsanovs y col., 2010; Coetzee y col., 2014; Park y col,, 2014), sugiriendo una modificación de la virulencia mediante este proceso de evolución. La implicación del reassortment en la virulencia en acuabirnavirus, ya ha sido propuesta por nuestro grupo en varias ocasiones (Lago y col., 2010; 2013). Por ello, ante los resultados poco concluyentes de la primera parte del estudio, nos planteamos un nuevo objetivo para esta fase, que es determinar el mecanismo (aleatorio o dirigido) de 59 encapsidación de segmentos, analizar la frecuencia de reassortment en condiciones ex vivo y su posible efecto sobre la virulencia del virus. Los datos resultantes de este capítulo fueron publicados en el artículo “In vitro reassortment between Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV) strains: The mechanisms involved and its effect on virulence” que se puede consultar en el Anexo de esta tesis. 2.2 MATERIALES Y MÉTODOS Para la producción y titulación viral se usaron monocapas semiconfluentes de BF-2 (Tronco caudal de blueguill, Lepomis macrochirus) y CHSE-214 (embrión de salmón chinook, Oncorhynchus tshawytscha), que se cultivaron a 20 ºC y 15 ºC respectivamente, en medio esencial de Eagle (EMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. La producción viral se llevó a cabo en frascos de 25 cm2 usando las cepas 19G4, 20G3 y 20G7, tres aislados naturales obtenidos de gallineta (Sebastes mentella), procedente del Flemish Cap (Terranova), que se corresponden con los tipos WB/WB, Ab/Ab y WB/Ab respectivamente (segmento A/segmento B), (Romero-Brey y col., 2009). Además, para los estudios de coinfección y generación de recombinantes ex vivo, se llevó a cabo también la propagación de las cepas de referencia de IPNV Ab, C1, Sp y WB. Para los ensayos de reassortment in vitro, se usaron dos clones de BF-2: uno con más de 200 pases, que en adelante se denominará “clon viejo”, y un nuevo clon (“clon nuevo”) comprado ex profeso a la ECACC. La titulación viral se llevó a cabo en placas de 96 pocillos, mediante el método de dosis infectiva 50 o TCID50/ml. Para ello, se realizaron diluciones seriadas del virus en tampón de Earle suplementado con 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Cada dilución se inoculó por triplicado y las células se incubaron a 15 ºC durante 10 días, tras los cuales se leyó el título viral por el método de Reed y Müench (1938). 60 Se llevaron a cabo cuatro sets de coinfección, los cuales se indican en la Tabla 8, en tapices celulares en frascos de 25 cm2, a una multiplicidad de infección (MOI) entre 0,01 y 0,1 virus/célula: A. Coinfecciones en CHSE-214 y secuenciación por método Sanger: Se llevaron a cabo las coinfecciones Ab:WB, Ab:Sp y Sp:WB a ratio 1:1 (igualando el título viral) y una segunda ronda con la coinfección Ab:2WB (ratio 1:2). Tras visualizar el efecto citopático (ECP), la suspensión viral se clonó en placas de 48 pocillos usando el mismo clon de células y el método de punto final de diluciones seriadas. Para ello, se aplicaron diluciones seriadas de cada coinfección y se inocularon 5 réplicas de cada una por placa (diluciones 10-3 a 10-10), en un total de 10 placas, para disponer de 50 clones para secuenciar. Las placas se incubaron durante 10 días a 15 ºC y, tras la incubación, se recogió el último pocillo con ECP en cada dilución (asumiendo que el ECP de ese pocillo se debe a la replicación de una única partícula viral) y se analizó mediante secuenciación por el método de Sanger, previa amplificación por RT-PCR. Para ello, se llevó a cabo la extracción del RNA viral usando el kit comercial RNeasy® Mini Kit (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante, y eluyendo el RNA final en 50 µl de H2O libre de RNasas. La síntesis de cDNA se llevó a cabo con el kit comercial SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen), en un volumen final de reacción de 20 µl: 9 µl de RNA, 1 μl de Random Primers (en un primer paso) y 4 μl de tampón 5X, 1 μl de DTT, 1 μl de dNTPs, 0,2 μl de transcriptasa inversa SSIII y 3,8 μl de agua libre de RNasas. La PCR se llevó a cabo con el kit Go Taq Flexi DNA Polymerase (Promega); para ello, se preparó una mezcla de reacción con 4 µl de cDNA, 10 µl de tampón de PCR 5X Green GoTaq®, 5 µl de MgCl2, 1 µl de dNTP, 0,5 µl de cada cebador, 0,25 µl de Go Taq Flexi DNA polimerasa y 61 H2O libre de RNasas hasta 50 µl. Para la amplificación se usó la pareja de cebadores descrita por Heppell y col. (1992), 5´AGAGATCACTGACTTCACAAGTGAC 3´(forward) y 5´ CTCAGTAGAAAGGACACCACGTGT 3´ (reverse) para el segmento A, y la pareja 5´ GAATCCMAACAAGACTCC 3´ (forward) y 5´ CACCATTGATAGYARTAGG 3´ (reverse), en posiciones 643 y 1105 en la cepa Jasper (M58756), para el segmento B. Los productos amplificados se visualizaron en geles de agarosa al 2% mediante tinción con Red Safe (iNtRON Biotechnology) y recuperados usando el kit Nucleospin Gel and PCR Clean-up de Machery Nagel (siguiendo las instrucciones del fabricante). Los fragmentos purificados se sometieron a secuenciación mediante el método de Sanger, usando el kit Genome Lab TM DTCSQuick Start (Beckman) con mezclas de reacción compuestas por una cantidad de 10 ng de DNA por cada 100 pb de fragmento a secuenciar, 4 µl de DTCS, 1 µl de Sequencing Reaction Buffer, 1 µl de cada uno de los cebadores y agua libre de RNasas hasta 20 µl. El producto de amplificación fue precipitado en etanol al 95% (a -20 ºC) (añadiendo por reacción 2 µl de acetato sódico, 2 µl de EDTA y 1 µl de glucógeno) y centrifugando a 18000 g durante 15 min. Posteriormente, se hicieron dos lavados con etanol al 75% (a -20 ºC), centrifugando a 18000 g 2 min, para eliminar los nucleótidos no incorporados. El DNA se secó en SpeedVac (Savant) y se resuspendió en 40 µl de tampón SLS (Beckman). Por último, se desnaturalizó a 92 ºC durante 2 min y se analizó en un secuenciador CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman). Las secuencias nucleotídicas obtenidas se analizaron utilizando los programas SeqMan y MegAlin del software Lasergene. B. Coinfecciones en BF2-clon viejo y secuenciación por método Sanger: Utilizando un clon viejo de células BF-2, se llevaron a cabo las coinfecciones Ab:WB, Sp:Ab y 62 Sp:WB a ratios 1:1, y un segundo set de coinfecciones Ab:2Sp (1:2) y 2Ab:WB y 2Sp:WB (2:1). La progenie fue clonada y secuenciada como se describió en el apartado anterior. C. Coinfecciones en BF2-clon nuevo y secuenciación por método Sanger: Usando un clon nuevo de células BF-2, se llevaron a cabo 6 coinfecciones diferentes: las tres coinfecciones a ratio 1:1 descritas en los pasos anteriores, Ab:WB, Sp:Ab y Sp:WB, y una nueva coinfección de estas tres cepas con la cepa C1 (Ab:C1, WB:C1 y Sp:C1). El método de clonación y secuenciación fue el mismo que en los apartados anteriores. D. Coinfecciones en BF2-clon nuevo y secuenciación por método Illumina: Empleando un clon nuevo de células BF2, se realizaron las coinfecciones Ab:WB, Sp:Ab y Sp:WB, Ab:C1, WB:C1 y Sp:C1. Para el análisis de la progenie resultante, se realizó la extracción de RNA a partir del virus crudo (sin clonación), y a continuación se llevó a cabo la amplificación de fragmentos genómicos de ambos segmentos mediante PCR, del modo descrito anteriormente y usando la pareja de cebadores: 5´AAAGGCATGGGGCTGGAGAG 3´ (forward) y 5´ TGTGCACCACAGGAAAGATGACTC 3´ (reverse) para el segmento A, en posiciones 1439 y 1761 en la secuencia de la cepa Jasper (M18049), y para el segmento B 5´ GAATCCMAACAAGACTCC 3´ (forward) y 5´ GTAGGGTAGGCCGGCTGAGGACTT 3´ (reverse), en posiciones 643 y 853 en la cepa Jasper (M58756); todos marcados mediante la adición en el extremo 5´ de las colas: TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG y GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG para cebadores forward y reverse, respectivamente. Los productos de amplificación se purificaron con el kit comercial Nucleospin Gel and PCR Clean-up (Macherey 63 Naguel) y se analizaron mediante el sistema de secuenciación MiSeq, mediante librerías illumina (Sistemas Genómicos). Para analizar la distribución de los distintos tipos virales en la progenie, se analizaron los porcentajes obtenidos por el método de secuenciación Illumina, aplicando un algoritmo matemático desarrollado específicamente para este análisis (David Pazos). Tabla 8. Coinfecciones llevadas a cabo y método de análisis para cada una de ellas: Coinfección Línea celular Ratio Análisis Experimento Ab+Sp CHSE-214 BF-2 BF-2* 1:1 1:1-1:2 1:1 Clonación-secuenciación A B C Ab+WB CHSE-214 BF-2 BF-2* 1:11:2 1:12:1 1:1 Clonación-secuenciación A B C Sp+WB CHSE-214 BF-2 BF-2* 1:1 1:12:1 1:1 Clonación-secuenciación A B C Ab+C1 BF-2* 1:1 Clonación-secuenciación C Sp+C1 BF-2* 1:1 Clonación-secuenciación C WB+C1 BF-2* 1:1 Clonación-secuenciación C Ab+Sp BF-2* 1:1 Sec. Librerías Illumina D Ab+WB BF-2* 1:1 Sec. Librerías Illumina D Sp+WB BF-2* 1:1 Sec. Librerías Illumina D Ab+C1 BF-2* 1:1 Sec. Librerías Illumina D Sp+C1 BF-2* 1:1 Sec. Librerías Illumina D WB+C1 BF-2* 1:1 Sec. Librerías Illumina D BF2*nuevo clon celular Los porcentajes de distribución de los segmentos A y B de cada población originada por coinfección se compararon estadísticamente con los valores esperados en un proceso de reassortment aleatorio, con el fin de determinar si la encapsidación de estos segmentos se realiza de modo dirigido o al azar. Para ello, se aplicó un test chi-cuadrado (χ2) usando el programa GraphPad Prism vs 7.0 (La Jolla California USA). 64 Tras el proceso de clonación en los primeros dos experimentos, se seleccionó un clon recombinante originado por cada una de las coinfecciones: WB/Ab, Ab/Sp y WB/Sp (segmento A/ segmento B) y se inocularon junto con las tres cepas de referencia en placas de 48 pocillos, a MOI 0,1 virus/célula (6 réplicas por cepa) con monocapas confluentes del tipo de célula correspondiente en cada caso. Se recogió un pocillo inoculado de cada cepa a tiempos prey postadsorción (1 h) y una vez observado el ECP. Al final del experimento cada una de las alícuotas obtenidas se tituló por triplicado mediante el método de TCID50/ml, en placas de 96 pocillos con monocapas confluentes del correspondiente tipo celular, con el fin de comparar la capacidad de adsorción y de replicación de cada una de las cepas. El análisis del efecto del reassortment sobre la virulencia de birnavirus acuáticos se llevó a cabo de dos maneras, en primer lugar, comparando la virulencia entre cepas recombinantes y no recombinantes aisladas de peces salvajes y, en segundo lugar, evaluando la virulencia de cepas recombinantes obtenidas por el proceso de coinfección y clonación, y comparándola con la virulencia de cepas de referencia. El análisis de virulencia de las cepas salvajes se llevó a cabo en 6 experimentos de infección en rodaballo (Scophthalmus maximus), uno en salmón atlántico (Salmo salar) y uno en lenguado (Solea senegalensis). La comparación de la virulencia de las cepas de referencia y sus cepas recombinantes obtenidas por coinfección y clonación se hizo mediante dos experimentos de infección, uno en salmon atlántico y otro en lenguado (Tabla 9). 65 Tabla 9. Experimentos realizados para analizar el efecto del reassortment en la virulencia Exp.1 Especie Nº peces2 Cepas3 Vía 4 Dosis Tiempo 1 Rodaballo (25 g) 20 19G4, 20G3, 20G7 i.p. 107 60 2 Rodaballo (25 g) 20 19G4, 20G3, 20G7 i.p. 105 60 3 Rodaballo (5 g) 30 19G4, 20G3, 20G7 baño 105 50 4 Rodaballo (25 g) 40 19G4, 20G3, 20G7 i.p. 105 25 5 Rodaballo (25 g) 40 19G4, 20G3, 20G7 i.p. 105 25 6 Rodaballo (25 g) 30 19G4, 20G3, 20G7 i.p. 105 30 7 Salmón (7 cm) 60 19G4, 20G3, 20G7 i.p. 105 35 8 Lenguado (2 g) 50 19G4, 20G3, 20G7 i.p. 105 40 9 Salmón (7 cm) 40 Ab,Sp,WB, WB/Ab, Ab/Sp WB/Sp i.p. 105 40 10 Lenguado (2 g) 30 Ab,Sp,WB, WB/Ab, Ab/Sp WB/Sp i.p. 105 30 1. Experimento. 2. Número de peces infectados por cepa. 3. 19G4 (WB/WB), 20G3 (Ab/Ab), 20G7 (WB/Ab) 4. Vía de infección: i.p: inyección intraperitoneal o baño (inmersión). * La zona sombreada representa los experimentos llevados a cabo con las cepas de referencia y sus recombinantes obtenidos por coinfección-clonación. Todos los peces procedían de piscifactorías monitorizadas por nuestro laboratorio durante años y declaradas libres de virus. Tras su transporte, fueron aclimatados en las instalaciones del acuario de la USC al menos 7 días. Durante este tiempo se mantuvieron a un máximo de densidad de 100 peces por cada 100 litros de agua, a 15 ºC, en continua aireación y con alimentación comercial. Previo a la infección, se testaron 5 individuos por especie, mediante RT-PCR y nested-PCR para los virus IPNV, virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV), virus de la 72 Tabla 10. Análisis estadístico χ2 de la distribución de segmentos genómicos en la progenie, asumiendo como H0: distribución aleatoria de segmentos. Exp A: Sanger en CHSE Coinfección Segmento A Segmento B P Interpretación Ab:WB Ab WB Ab WB 100 0 100 0 <0,0001 No-aleatoria Ab:2WB Ab WB Ab WB 0 100 91 9 <0,0001 No-aleatoria Ab:Sp Ab Sp Ab Sp 77 23 77 23 <0,0001 No-aleatoria Sp:WB Sp WB Sp WB 70 30 100 0 <0,0001 No-aleatoria Exp B: Sanger en BF-2 [clon viejo] Coinfección Segmento A Segmento B P Interpretación Ab:WB Ab WB Ab WB 0 100 0 100 <0,0001 No-aleatoria 2Ab:WB Ab WB Ab WB 43 57 43 57 0,2702 H 0 (aleatoria) no descartable Ab:Sp Ab Sp Ab Sp 100 0 100 0 <0,0001 No-aleatoria Ab:2Sp Ab Sp Ab Sp 89 11 72 28 <0,0001 No-aleatoria Sp:WB Sp WB Sp WB 0 100 0 100 <0,0001 No-aleatoria 2Sp:WB Sp WB Sp WB 4 96 8 92 <0,0001 No-aleatoria Exp C: Sanger en BF-2 [clon nuevo] Coinfección Segmento A Segmento B P Interpretación Ab:WB Ab WB Ab WB 98 2 100 0 <0,0001 No-aleatoria Ab:Sp Ab Sp Ab Sp 0 100 35 65 <0,0001 No-aleatoria Sp:WB Sp WB Sp WB 100 0 76 24 <0,0001 No-aleatoria Ab:C1 Ab C1 Ab C1 0 100 15 85 <0,0001 No-aleatoria Sp:C1 Sp C1 Sp C1 5 95 0 100 <0,0001 No-aleatoria WB:C1 WB C1 WB C1 10 90 100 0 <0,0001 No-aleatoria Exp D: Illumina en BF-2[clon nuevo] Coinfección Segmento A: Segmento B P Interpretación Ab:WB Ab WB Ab WB 99.62 0.38 99.99 0.01 <0,0001 No-aleatoria Ab:Sp Ab Sp Ab Sp 1.16 98.84 31.58 68.41 <0,0001 No-aleatoria Sp:WB Sp WB Sp WB 97.17 2.83 77.84 22.16 <0,0001 No-aleatoria Ab:C1 Ab C1 Ab C1 0.68 99.32 15.37 84.63 <0,0001 No-aleatoria Sp:C1 Sp C1 Sp C1 5.67 94.33 0 100 <0,0001 No-aleatoria WB:C1 WB C1 WB C1 9.36 90.64 99.63 0.37 <0,0001 No-aleatoria 73 Para determinar si existe algún tipo de asociación entre segmentos genómicos que pueda afectar al proceso de recombinación, se aplicó un segundo test estadístico basado en el estudio de Lubeck y col. (1979). Para ello, con las frecuencias de los distintos tipos virales observados en la progenie en los experimentos A-C se calcularon las frecuencias de todos los tipos virales esperados mediante un proceso de encapsidación aleatoria (multiplicando las frecuencias de cada segmento con cada tipo viral posible) y comparando las distribuciones mediante un test χ2, asumiendo que H0: no hay diferencias en la distribución, corresponde con un proceso aleatorio en el que no hay ningún tipo de asociación entre segmentos genómicos (Tabla 11). En el caso de las coinfecciones en las que se produce ausencia de alguno de los tipos virales en la progenie, se asume que las frecuencias virales esperadas son iguales a las observadas por lo que no puede aplicarse el análisis de Lubeck. Para justificar esto, se aplica la siguiente deducción matemática (desarrollada por Carlos Pereira Dopazo para la publicación) en una coinfección entre cepas A1/B1:A2/B2: I) Frecuencias virales observadas en la progenie fo(A1B1) / fo(A1B2) / fo(A2B1) / fo(A2B2) II) Frecuencias virales de cada segmento deducidas en la progenie f(A1) = fo(A1B1) + fo(A1B2) f(A2) = fo(A2B1) + fo(A2B2) f(B1) = fo(A1B1) + fo(A2B1) f(B2) = fo(A1B2) + fo(A2B2) III) Frecuencias esperadas en la progenie (calculadas a partir de la frecuencia de los segmentos) fe(A1B1) = f(A1) . f(B1) fe(A1B2) = f(A1) . f(B2) fe(A2B1) = f(A2) . f(B1) fe(A2B2) = f(A2) . f(B2) 74 IV) Si uno de los tipos virales no aparece en la progenie (por ejemplo, si B2=0) no pueden representarse los tipos virales observados con B2, afectando a las ecuaciones de la sección II: fo(A1B2) = 0 ⇒ f(A1) = fo(A1B1) fo(A2B2) = 0 ⇒ f(A2) = fo(A2B1) Ni tampoco podrían representarse los tipos virales con B2 en las ecuaciones de la sección III, si f(B2) = 0 fe(A1B2) = 0, and fe(A2B2) = 0 V) Esto significa que en la sección III, solo pueden usarse dos ecuaciones fe(A1B1) = f(A1) . f(B1) ⇒ f(B1) = fe(A1B1)/ f(A1) fe(A2B1) = f(A2) . f(B1) ⇒ f(B1) = fe(A2B1)/ f(A2) entonces, fe(A1B1)/ f(A1) = fe(A2B1)/ f(A2) y usando las ecuaciones de la sección IV.1, fe(A1B1)/ fo(A1B1) = fe(A2B1)/ fo(A2B1) Entonces, si no hay virus tipo B2 (tanto observado, como esperado; sección IV), fe(A1B1) + fe(A2B1) = 1 ⇒ fe(A2B1) = 1fe(A1B1) fo(A1B1) + fo(A2B1) = 1 ⇒ fo(A2B1) = 1fo(A1B1) entonces, fe(A1B1)/ fo(A1B1) = [1 - fe(A1B1)]/[1 - fo(A1B1)] ⇒ fe(A1B1) - fe(A1B1) . fo(A1B1) = fo(A1B1) - fe(A1B1) . fo(A1B1) y finalmente: fe(A1B1) = fo(A1B1) En todos los demás casos en los que el análisis pudo ser aplicado, la hipótesis nula H0 se rechazó con una p<0,0001, por lo que puede descartarse un proceso de empaquetamiento de segmentos random o al azar. 75 Debemos destacar que hay una diferencia a tener en consideración entre los experimentos C y D. En ambos se analizan las mismas coinfecciones pero mediante distintos métodos. En el experimento C se analizó la progenie resultante mediante secuenciación Sanger, tras haber hecho clonación. Esto implica que los segmentos genómicos analizados estaban encapsidados dentro de partículas infectivas completas. En el experimento D se analizó la progenie mediante secuenciación Illumina, sin haber hecho clonación, lo que significa que los segmentos analizados serían tanto encapsidados como sin encapsidar. Por ello, se hizo un último análisis de las frecuencias observadas en estos dos experimentos, considerando H0: no hay diferencias entre las dos distribuciones, para demostrar que no hay una selección específica o preferencia en la encapsidación de un tipo viral frente a otro (Tabla 12). El resultado demostró que no se puede rechazar la hipótesis nula (p>0,05), por lo que no podemos descartar que el empaquetamiento de segmentos se realice por un mecanismo aleatorio, o al azar. Finalmente, se realizó un último análisis estadístico cuyos resultados se muestran en la Tabla 13; la finalidad en este caso fue demostrar si el tipo de progenie viral observada dependía del tipo celular utilizado para la coinfección. El análisis reveló diferencias significativas en todos los casos, a excepción de la coinfección Ab:WB en las líneas CHSE-214 y BF-2 “clon viejo” (p=0,7968 y p=0,5102, respectivamente). Como se muestra en la Tabla 14, todas las cepas mostraron altas tasas de adsorción en las distintas líneas celulares ensayadas. Los tres tipos salvajes y el recombinante Ab/Sp mostraron tasas en torno a 75% e incluso superior, correspondiendo los valores de adsorción más bajos a las cepas recombinantes con segmento A tipo WB (WB/Ab y WB/Sp) (en torno a 40-50%). A pesar de las diferencias en la adsorción, todas las cepas mostraron niveles similares de replicación, alcanzando títulos de en torno a 108-109 TCID50/ml, siendo incluso más alto en el caso de la cepa Sp/Ab. A pesar de la alta capacidad replicativa, se observaron 76 diferencias entre los clones al analizar su tasa de producción de partículas virales en la progenie, con respecto a las parentales (tasa de producción; calculada con el cociente entre los títulos tras ECP y el virus fijado); en este aspecto, son los recombinantes con segmento B tipo Sp (WB/Sp y Ab/Sp) los que muestran las tasas de producción más bajas, por debajo de 15000 progenie/parental (pg/pr). Los tipos WB/WB, Ab/Ab y WB/Ab, mostraron las mayores tasas de producción, en CHSE-214: ≥50000 pg/pr. Cabe destacar que las cepas tipo Sp, con la mayor capacidad de adsorción (>90%), mostraron las menores tasas de producción en ambos tipos celulares (342 pg/pr y 494 pg/pr, respectivamente). Mediante el cálculo de las tasas mostradas en la Tabla 14, hemos podido estimar la eficiencia de replicación de cada uno de los tipos virales de la progenie, siendo la secuencia observada: WB/Ab > WB/WB > Ab/Ab > Sp/Ab> WB/Sp > Sp/Sp. 77 Tabla 11. Análisis estadístico de la distribución de tipos virales en la progenie según Lubeck y col. (1979). Se aplica χ2 con H0: no hay asociación entre segmentos genómicos (aleatorio). Frecuencias de los segmentos Coinf. Tipos virales observados Seg A Seg B Tipos virales esperados P Interpretación Exp.A: Sanger en CHSE Ab:WB Ab/Ab Ab/WB WB/Ab WB/WB Ab WB Ab WB Ab/Ab Ab/WB WB/Ab WB/WB 2 no aplicable* 100 0 0 0 100 0 100 0 100 0 0 0 * Ab:2WB Ab/Ab Ab/WB WB/Ab WB/WB Ab WB Ab WB Ab/Ab Ab/WB WB/Ab WB/WB 2 no aplicable* 0 0 91 9 0 100 91 9 0 0 91 9 * Ab:Sp Ab/Ab Ab/Sp Sp/Ab Sp/Sp Ab Sp Ab Sp Ab/Ab Ab/Sp Sp/Ab Sp/Sp No-aleatorio 77 0 0 23 77 23 77 23 59,29 17,71 17,71 5,29 <0.0001 Sp:WB Sp/Sp Sp/WB WB/Sp WB/WB Sp WB Sp WB Sp/Sp Sp/WB WB/Sp WB/WB 2 no aplicable* 70 0 30 0 70 30 100 0 70 0 30 0 * Exp.B: Sanger en BF-2 (viejas) Ab:WB Ab/Ab Ab/WB WB/Ab WB/WB Ab WB Ab WB Ab/Ab Ab/WB WB/Ab WB/WB χ2 no aplicable* 0 0 0 100 0 100 0 100 0 0 0 100 * 2Ab:WB Ab/Ab Ab/WB WB/Ab WB/WB Ab WB Ab WB Ab/Ab Ab/WB WB/Ab WB/WB No-aleatorio 43 0 0 57 43 57 43 57 18,49 24,51 24,51 32,49 <0.0001 Ab:Sp Ab/Ab Ab/Sp Sp/Ab Sp/Sp Ab Sp Ab Sp Ab/Ab Ab/Sp Sp/Ab Sp/Sp χ2 no aplicable* 100 0 0 0 100 0 100 0 100 0 0 0 * Ab:2Sp Ab/Ab Ab/Sp Sp/Ab Sp/Sp Ab Sp Ab Sp Ab/Ab Ab/Sp Sp/Ab Sp/Sp No-aleatorio 72 17 0 11 89 11 72 28 64,08 24,92 7,92 3,08 <0.0001 Sp:WB Sp/Sp Sp/WB WB/Sp WB/WB Sp WB Sp WB Sp/Sp Sp/WB WB/Sp WB/WB χ2 no aplicable* 0 0 0 100 0 100 0 100 0 0 0 100 * 2Sp:WB Sp/Sp Sp/WB WB/Sp WB/WB Sp WB Sp WB Sp/Sp Sp/WB WB/Sp WB/WB No-aleatorio 4 0 4 92 4 96 8 92 0,32 3,68 7,68 88,32 0.0007 Exp.B: Sanger en BF-2 (nuevas) Ab:WB Ab/Ab Ab/WB WB/Ab WB/WB Ab WB Ab WB Ab/Ab Ab/WB WB/Ab WB/WB χ2 no aplicable* 98 0 2 0 98 2 100 0 98 0 2 0 * Ab:Sp Ab/Ab Ab/Sp Sp/Ab Sp/Sp Ab Sp Ab Sp Ab/Ab Ab/Sp Sp/Ab Sp/Sp χ2 no aplicable* 0 0 35 65 0 100 35 65 0 0 35 65 * Sp:WB Sp/Sp Sp/WB WB/Sp WB/WB Sp WB Sp WB Sp/Sp Sp/WB WB/Sp WB/WB χ2 no aplicable* 76 24 0 0 100 0 76 24 76 24 0 0 * Ab:C1 Ab/Ab Ab/C1 C1/Ab C1/C1 Ab C1 Ab C1 Ab/Ab Ab/C1 C1/Ab C1/C1 χ2 no aplicable* 0 0 15 85 0 100 15 85 0 0 15 85 * Sp:C1 Sp/Sp Sp/C1 C1/Sp C1/C1 Sp C1 Sp C1 Sp/Sp Sp/C1 C1/Sp C1/C1 χ2 no aplicable* 0 5 0 95 5 95 0 100 0 5 0 95 * WB:C1 WB/WB WB/C1 C1/WB C1/C1 WB C1 WB C1 WB/WB WB/C1 C1/WB C1/C1 χ2 no aplicable* 10 0 90 0 10 90 100 0 10 0 90 0 * 78 Tabla 12. Análisis estadístico para comparar las frecuencias de segmentos genómicos observados en los experimentos C y D. Se aplica χ2, asumiendo H0:no hay diferencias entre los experimentos. Frecuencia observada (exp C) Frecuencia observada (exp D) Segmento A Segmento B Segmento A Segmento B P Interpretación Ab:WB Ab WB Ab WB Ab WB Ab WB 98 2 100 0 99,62 0,38 99,99 0,01 0,0737 H 0 (aleatorio) no puede rechazarse Ab:Sp Ab Sp Ab Sp Ab Sp Ab Sp 0 100 35 65 1,16 98,84 15,62 31,58 0,6336 H 0 (aleatorio) no puede rechazarse Sp:WB Sp WB Sp WB Sp WB Sp WB 100 0 76 24 97,17 2,83 77,84 22,16 0,3752 H 0 (aleatorio) no puede rechazarse Ab:C1 Ab C1 Ab C1 Ab C1 Ab C1 0 100 15 85 0,68 99,32 15,37 84,63 0,8743 H 0 (aleatorio) no puede rechazarse Sp:C1 Sp C1 Sp C1 Sp C1 Sp C1 5 95 0 100 5,67 94,33 0 100 0,9926 H 0 (aleatorio) no puede rechazarse WB:C1 WB C1 WB C1 WB C1 WB C1 10 90 100 0 9,36 90,64 99,63 0,37 0,9362 H 0 (aleatorio) no puede rechazarse 79 Tabla 13. Comparación de la progenie viral observada en las distintas líneas celulares. Se aplica χ2 con H0: no hay diferencias entre líneas celulares. Coinf. Línea Tipos salvajes Recombinantes p (comparación)2 CHSE-214 BF-2[viejas] BF-2[nuevas] Ab:WB Ab/Ab WB/WB Ab/WB WB/Ab <0,0001 <0,0001 0,5102 CHSE-214 100 0 0 0 - <0,0001 <0,0001 BF-2[viejas] 0 100 0 0 <0,0001 - <0,0001 BF-2[nuevas] 98 0 0 2 0,7968 <0,0001 - Ab:Sp Ab/Ab Sp/Sp Ab/Sp Sp/Ab <0,0001 <0,0001 <0,0001 CHSE-214 77 23 0 0 - <0,0001 <0,0001 BF-2[viejas] 100 0 0 0 <0,0001 - <0,0001 BF-2[nuevas] 0 65 0 35 <0,0001 <0,0001 - Sp:WB Sp/Sp WB/WB Sp/WB WB/Sp <0,0001 <0,0001 <0,0001 CHSE-214 70 0 0 30 - <0,0001 <0,0001 BF-2[viejas] 0 100 0 0 <0,0001 - <0,0001 BF-2[nuevas] 76 0 24 0 <0,0001 <0,0001 - 80 Tabla 14. Resultados de la replicación in vitro de las tres cepas de referencia y sus cepas recombinantes Inóculo3 Adsorción4 Producción viral5 Clon Línea cel. TCID50/ml1 Log±desv2 TCID50/ml Log±desv Adsorc (%)6 TCID50/ml Log±desv Producción7 Ratio8 WB/WB CHSE-214 9,63×103 3,98±0.29 7,16×103 3,85±0.27 74,4 8,82×108 8,95±0.38 1,23x105 360 BF-2 3,21×104 4,51±0.36 2,49×104 4,40±0.37 77,4 1,61×109 9,21±0.25 6,50x104 132* Ab/Ab CHSE-214 2,23×104 4,35±0.14 1,91×104 4,28±0.33 85,7 8,57×108 8,93±0.41 4,49x104 131 BF-2 2,86×104 4,46±0.32 2,56×104 4,41±0.31 89,6 7,74×108 8,89±0.06 3,02x104 61* Sp/Sp CHSE-214 4,38 ×105 5,64±0.17 4,01×105 5,60±0.24 91,6 1,37×108 8,14±0.29 3,42x102 1 BF-2 5,22×105 5,72±0.22 4,87×105 5,69±0.23 93,3 2,40×108 8,38±0.36 4,94x102 1* WB/Ab CHSE-214 3,97×103 3,60±0.14 2,20×103 3,34±0.19 55,4 3,97×108 8,60±0.14 1,80x105 526 WB/Sp CHSE-214 5,50×104 4,74±0.29 2,34×104 4,37±0.39 42,5 1,17×108 8,07±0.45 5,85x103 17 Sp/Ab BF-2 2,29×105 5,36±0.43 1,85×105 5,27±0.52 80,8 2,64×109 9,56±0.50 1,43x104 42 (32*) Los resultados se expresan como media TCID50/ml (1) y media Log10 (TCID50/ml) ± desviación entre seis réplicas del inóculo (2), tras la adsorción (3), replicación (4) y tras la aparición de ECP (5). La eficiencia de adsorción se calculó con la diferencia entre la alícuota tomada tras la adsorción y el inóculo inicial. La tasa de producción (7) se calculó mediante el cociente entre virus producidos y fijados. Por último, la tasa relativa de producción (8) se calculó mediante el cociente de cada tasa de producción y el valor más bajo observado para esta tasa (tipo Sp). Los valores con “*” se calcularon con los tipos parentales en células BF-2. 81 Las mortalidades observadas en los experimentos llevados a cabo en Scophthalmus maximus (rodaballo) con las tres cepas aisladas de gallineta salvaje (19G4: WB/WB, 20G3: Ab/Ab y 20G7: WB/Ab) se reflejan en la Figura 14. En los experimentos 5 y 6, llevados a cabo con rodaballo de 25 g inyectado intraperitonealmente con la dosis 105 TCID50/ml, no se produjo mortalidad, por lo que las curvas se corresponden con los experimentos 1 a 4. En estos experimentos, es la cepa 19G4 (tipo WB) la que alcanza mayores valores de mortalidad acumulativa final (MAc), siendo también una de las primeras en iniciar la mortalidad en la mayoría de los experimentos. Las cepas 20G3 (tipo Ab) y 20G7 (recombinante) se comportan de manera variable, dependiendo del experimento. Así, en los experimentos 2 y 3 (Figura 13B y C, respectivamente) la cepa recombinante (20G7) alcanzó valores de mortalidad acumulativa similares a los de la cepa 19G4, siendo la cepa 20G3 la que inició más tarde la mortalidad y alcanzó niveles finales inferiores. En el experimento 4, por el contrario, la que presentó valores de mortalidad más próximos a 19G4 fue la cepa 20G3, alcanzando, al igual que 19G4, un 100% de mortalidad (Figura 13D). En el primero de los experimentos, 20G3 y 20G7 presentaron niveles de mortalidad muy bajos, inferiores al 25% (Figura 13A). A B días % mortalidad 88 c) Asociación de segmentos, construcción de RNP e inhibición cruzada de RNPs: En algunos tipos virales como reovirus o el virus de la lengua azul de rumiantes (Nibert y col., 1996; Nomikou y col., 2015), la asociación de segmentos genómicos explica por qué unos recombinantes son más frecuentes que otros. En IPNV también parece existir cierta asociación entre segmentos, lo que podría explicar el desplazamiento de un tipo viral de la progenie. Otro mecanismo que puede explicar un mecanismo de reassortment dirigido fue descrito por Jaruampornpan y col. (2014) en influenza. En este caso, en una coinfección de tipos virales A y B, el tipo B de nucleoproteína (BNP) interacciona con el A (ANP), produciendo una inhibición cruzada que lleva a una disminución en la replicación del tipo A. Gavazzi y col. (2013) revelaron también la existencia de interacciones entre segmentos genómicos de virus influenza que conllevan una regulación preferencial del empaquetamiento genómico. En la misma línea, Gerber y col., (2014) demuestran que la recombinación entre virus poco relacionados filogenéticamente puede ser desfavorable. Nosotros hemos observado resultados similares en este estudio. De hecho, para demostrar si el mecanismo de recombinación se veía favorecido entre virus filogenéticamente más próximos, hicimos una nueva coinfección con la cepa canadiense C1, más relacionada con el tipo americano WB que con los europeos Ab y Sp (Blake y col., 2001). Nuestros resultados demuestran esta hipótesis, ya que las coinfecciones con C1 desplazan los tipos europeos Ab y Sp, apareciendo éstos en frecuencias muy bajas, mientras que en la coinfección C1:WB los resultados parecen ser opuestos, ya que el tipo más frecuente en la progenie es el recombinante entre ambas cepas C1/WB. ¿Podría la interacción entre proteínas heterólogas de IPNV (VP1 tipo 1 y VP3 tipo 2) inhibir la captura o/y replicación de un tipo viral? Esta inhibición justificaría un proceso de recombinación dirigida, sin embargo, aunque es una hipótesis realmente atractiva para justificar 89 nuestras observaciones, no podemos usarla hasta que se demuestre la existencia de estos mecanismos en birnavirus. Finalmente, queríamos saber si la recombinación era un mecanismo de adaptación entre especies, motivo por el que realizamos las infecciones experimentales en salmón y lenguado. En este aspecto, cabe destacar que las cepas Sp y WB, que deberían ser altamente virulentas en salmón, mostraron una muy baja mortalidad en ambos experimentos, situación que podría justificarse mediante el elevado número de pases de las cepas utilizadas. Por el contrario, la cepa salvaje 19G4 (WB), aislada en nuestro laboratorio y con un número de pases inferior a 10, resultó ser la más virulenta en ambas especies. Las cepas tipo Ab (cepa de referencia Ab y 20G3) mostraron también elevada virulencia en ambas especies, mientras que las cepas recombinantes mostraron niveles intermedios de virulencia, incluso en la cepa salvaje 20G7. Todos los recombinantes resultaron estar formados por un segmento A de una cepa de baja virulencia y un segmento B de una cepa de alta virulencia (Wei y col., 2006). Algunos autores defienden que la recombinación del segmento B puede ser la razón de la expansión e incremento de virulencia de IBDV. En este aspecto, podemos destacar que las cepas recombinantes obtenidas en este experimento, al igual que los recombinantes naturales con los que hemos trabajado, fueron aisladas de peces asintomáticos, lo que sugiere que la regulación de la virulencia en estas cepas ha podido suponer un mecanismo de persistencia en el huésped. Los resultados de los ensayos in vivo sugieren que, además del reassortment, puede haber otro tipo de mecanismos que afecten a la virulencia de acuabirnavirus, como demostraremos en el siguiente capítulo. En base a nuestros resultados, podemos concluir, por lo tanto, que en acuabirnavirus la recombinación o reassortment supone un mecanismo de adaptación a nuevos huéspedes. Además, podemos decir que este proceso no se produce al azar y que parece depender del tipo celular, lo que sugiere un mecanismo de eficiencia selectiva en el reconocimiento entre los diferentes RNAm y los ribosomas celulares, que además, probablemente, pueda depender de la interacción entre segmentos genómicos o inhibición cruzada de RNPs. A pesar de ello, 90 los mecanismos continúan siendo desconocidos, por lo que futuras investigaciones deben ir enfocadas a la demostración de la existencia de mecanismos de regulación, observados en otras familias virales, también en birnavirus acuáticos. 91 CAPÍTULO 3: POLIPLOIDÍA INTRODUCCIÓN Como hemos visto en los capítulos anteriores, a pesar de la amplia distribución de los birnavirus acuáticos y su alto impacto en acuicultura, hay pocos estudios sobre los factores que afectan a su virulencia, y los que hay se han centrado, fundamentalmente, en la relación existente entre la secuencia genómica de la región VP2-NS y la virulencia (Bruslind y Reno, 2000; Santi y col., 2004; Shivappa y col., 2004). Otros estudios han analizado, además, otros factores como los distintos tipos de ORF codificantes de VP5 y su relación con la virulencia (Shivappa y col., 2004). Sin embargo, la baja reproducibilidad de los resultados observados a lo largo de nuestros estudios, trabajando con las mismas cepas y el mismo hospedador, o en hospedadores diferentes, nos hicieron sospechar de la existencia de otros factores que podrían no estar teniéndose en consideración. Tras el análisis del efecto sobre la virulencia del reassortment o reordenamiento molecular, comprobamos nuevamente que debían existir otros factores todavía inexplorados y que podrían tener un papel adicional en la regulación de la virulencia de birnavirus acuáticos. En este contexto, el trabajo de Luque y col. (2009), demostrando que el virus de la bursitis infecciosa del pollo (IBDV) es un virus poliploide que puede llegar a empaquetar hasta 4 segmentos de RNA bicatenal (dsRNA), y que esta poliploidía tenía implicación en la virulencia, nos abrió una nueva vía de estudio para entender la complejidad de los sistemas de regulación de virulencia en este tipo de virus. Estos autores, mediante purificación en gradientes de cloruro de cesio de viriones procedentes de cultivos celulares infectados, o de la bursa de Fabricio de aves infectadas, observaron 6 poblaciones de IBDV. Dichas poblaciones tenían la misma composición proteica, pero se diferenciaban en la densidad y el coeficiente de sedimentación, 92 diferencias que demostraron estar relacionadas con el número de copias de segmentos genómicos empaquetados. Ciertas observaciones en algunos de nuestros estudios previos concordaban con las de estos autores, ya que, en ocasiones, purificando virus tipo IPNV en gradientes de CsCl, habíamos observado patrones de bandeado con al menos dos bandas, patrón que no podíamos explicar. Además, trabajando con geles de acrilamida se observaban distintos patrones de bandeado de ambos segmentos genómicos, en los cuales, a veces, la densidad de la banda superior parecía ser el doble de la inferior. Aunque en pocos casos, además de en IBDV (Luque y col., 2009), se ha descrito que virus de otras familias, como los paramixovirus, ortomixovirus o filovirus, desarrollan poliploidía como una herramienta que les permite regular su virulencia (Enami y col., 1991; Rager y col., 2002; Beniac y col., 2012). Por ello, el objetivo de este estudio era descubrir si los birnavirus acuáticos podrían ser también poliploides y analizar el efecto de la poliploidía sobre la replicación y virulencia del virus, con la esperanza de demostrar que la virulencia de acuabirnavirus es mucho más compleja que la mera intervención de un simple parámetro. Los datos resultantes de este capítulo fueron publicados en el artículo “Aquabirnavirus polyploidy: a new strategy to modulate virulence?” que se puede consultar en el Anexo de esta tesis. MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.1 Líneas celulares y cepas virales Para la producción, titulación y purificación viral, se usaron monocapas semiconfluentes de BF-2 (tronco caudal de Bluegill, Lepomis macrochirus, ATCC-CCL 91). Las células se cultivaron a 20 ºC en medio esencial de Eagle (EMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Para este estudio, se emplearon las cepas de referencia Ab y WB, así como la cepa recombinante 5B1E (segmento A tipo WB y segmento B tipo Ab) aislada de bacalao salvaje (Gadus morhua) en el banco pesquero Flemish Cap (Romero-Brey y col., 2009). Las inoculaciones 93 se realizaron a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 virus/célula, y las células infectadas se mantuvieron a 15 ºC hasta la visualización de ECP. 3.2.2 Titulación viral Para la titulación viral, mediante el método de TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50), se emplearon placas de 96 pocillos con monocapas semiconfluentes de BF-2. Para ello, se realizaron diluciones seriadas del virus en tampón de Earle’s suplementado con 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina, y se inoculó cada dilución por triplicado. Las células se incubaron a 15 ºC durante 10 días, tras los cuales se calculó el título viral por el método de Reed y Müench (1938). 3.2.3 Purificación viral Para cada purificación, se inocularon una media de 20-25 frascos de 150 cm2 de BF-2. Una vez observado el efecto citopático, la suspensión viral se centrifugó a 3000 g durante 10 min y el sobrenadante se incubó, durante 24 h a 4 ºC, con polietilenglicol 8000 al 5 % y 0,5 M de NaCl, en agitación. Tras la incubación, el virus se centrifugó a 8000 g durante 30 min y el precipitado se resuspendió en tampón PES (25 mM piperazina-N, N-bis [2-ácido etanosulfónico] pH 6,2, 150 mM NaCl, y 20 mM CaCl2) suplementado con inhibidores de proteasas (Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche), y se volvió a precipitar a través de un lecho de sacarosa al 25% en tampón PES, a 35000 rpm en un rotor SW55Ti (Beckman Coulter), durante 1 h a 4 ºC. El precipitado se resuspendió en 500 µl de tampón PES y se cargó en un gradiente de CsCl (1,33 g/ml) que se centrifugó a 31000 rpm durante 20 h, a 4 ºC, en un rotor SW32Ti (Bekman Coulter). Tras la purificación, las distintas bandas, que se visualizaron mediante un haz de luz fría desde el fondo del tubo, a través de su eje longitudinal, se recuperaron mediante punción con jeringuilla y se dializaron en tampón PES durante 24 horas a 4 ºC, en continua agitación, tras lo cual, los viriones purificados se almacenaron a 4 ºC hasta su posterior análisis. La nomenclatura usada para las bandas fue de F1 a F6, desde la parte superior a la inferior del tubo (de menor a mayor densidad). 94 3.2.4 Análisis del contenido genómico de las fracciones F3-F6 El contenido genómico de las fracciones se analizó mediante separación de ambos segmentos genómicos por electroforesis en geles de poliacrilamida. Previamente a la electroforesis, se igualaron las fracciones F3 a F6 en base a su contenido proteico, usando el kit comercial BCA (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando la proteína seroalbúmina como patrón. Una alícuota de cada fracción se sometió a digestión con proteinasa K a una concentración de 2 mg/ml, en presencia de 0,5% de SDS, durante 12 h a 37 ºC. A continuación, las muestras se desnaturalizaron a 98 ºC durante 5 min y se cargaron, con tampón de carga 4× (250 mM TRIS HCl, pH 6,8, 8% SDS, 40% glicerol, 20% β-mercaptoetanol, 0,004% azul bromofenol en H2O Milli-Q), en geles de acrilamida al 7,5% y se sometieron a electroforesis a 150V durante 4 h (Laemmli, 1970). Las bandas se visualizaron usando dos tinciones diferentes: tinción con Red Safe (iNtRON Biotechnology), un análogo del bromuro de etidio, y tinción con nitrato de plata, usando el kit comercial Silver Stain PlusTM kit (BIO-RAD), siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis y normalización de los geles para la cuantificación de las bandas se hizo usando el software Multi Gauge V3.0 (Fujifilm) e Image J software (NIH). Así, las proporciones entre el contenido genómico de las distintas fracciones se calcularon mediante normalización usando la fraccción F3 como referencia, por ser esta, previsiblemente, la de menor número de segmentos genómicos, además de ser la primera fracción en estar compuesta únicamente por partículas virales T=13 y no por subpartículas virales (SVPs). 3.2.5 Análisis del contenido proteico de las fracciones F1-F6 Para el análisis del contenido proteico, una alícuota de cada fracción se desnaturalizó a 98 ºC durante 3 min; inmediatamente después, se mezcló con el tampón de carga 2 × (2,5 ml Tris HCl pH 6,8; 4 ml SDS 10%; 2 ml glicerol; 1ml β-mercaptoetanol; 0,1 ml rojo fenol 0,5%; 1,4 ml H2O Milli-Q) y se sometió a electroforesis en gel vertical de poliacrilamida al 12 %, durante 90 min a 150 V. Las bandas se 95 visualizaron mediante tinción con azul Coomasie coloidal (EZBlueTM Gel Staining Reagent, Sigma-Aldrich) siguiendo las instrucciones del fabricante, y con azul coomasie al 2,5 g/l en solución de metanolacético (45% metanol, 45% H2O, 10% ácido acético), usando para el desteñido una solución de 25% etanol, 25% ácido acético y 50% H2O; para ello, los geles se incubaron una hora en la solución de teñido y a continuación se aplicaron consecutivos lavados hasta alcanzar el nivel tinción deseado. En paralelo, otros geles se sometieron a electrotransferencia a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF), en una célula de electrotransferencia, con tampón de transferencia (192 mM glicina, 20% v/v metanol, 25 mM Tris-HCl, pH 8,3), a 100 V, durante 1h a 4 ºC. A continuación, se aplicó Western Blot; brevemente: tras bloqueo mediante incubación durante 30 min en leche en polvo al 5% en PBS, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario (anticuerpo policlonal, obtenido en conejo en nuestro laboratorio, frente a la cepa Sp) diluído 1/500 en solución de bloqueo, durante 1h. Tras 3 lavados en PBS, las membranas se incubaron durante 1h con un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa (Goat anti-rabbit IgG-Peroxidase antibody, Sigma-Aldrich) diluído 1/2000 en solución de bloqueo, y se volvió a lavar del mismo modo. Para el revelado, se usó el método de quimioluminiscencia ECL (Amersham ECL Western Blotting detection reagents and analysis system, GE Healthcare), siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.2.6 Microscopía electrónica Para la visualización, bajo microscopía electrónica, de las partículas virales de las fracciones, una alícuota de 2 µl de cada fracción se cargó en una rejilla de cobre con membrana de carbono, cargada negativamente mediante descarga iónica con el sistema Spulter Coater Quorum 150 TS. Tras una incubación de 2-3 min, se secó el exceso de muestra mediante el contacto del borde de la rejilla con un papel de filtro y posteriormente se lavó dos veces con agua, repitiendo la operación de secado. Por último, se tiñó con acetato de uranilo al 2% en agua y, tras una incubación de 2-3 min, se retiró el exceso de líquido y se dejó secar. 96 Las rejillas se visualizaron en microscopios JEOL JEM-2010 y ZEISS Libra 200 FE OMEGA del servicio de microscopía electrónica de la USC, operando a 120 kV. 3.2.7 Infección experimental Para evaluar el efecto de la poliploidía sobre la virulencia, se llevaron a cabo dos infecciones experimentales, la primera con 200 alevines de salmón (Salmo salar) de 7 cm y la segunda con 150 lenguados de 2 g (Solea senegalensis), en ambos casos procedentes de piscifactorías sometidas por nuestro laboratorio a controles periódicos. Los peces se sometieron a un período de aclimatación de 7 días a 15 ºC, distribuídos en tanques a una densidad máxima de 100 peces por 100 l de agua, y suministrándole una dieta comercial. En ese período de tiempo se testaron, mediante RT-PCR y nested-PCR, para descartar la presencia de los virus IPNV, VNNV (virus de la necrosis nerviosa viral) y VHSV (virus de la septicemia hemorrágica viral), y también se aplicó una siembra bacteriológica para descartar presencia de patógenos bacterianos. Tras este período, y habiendo confirmado que los peces estaban libres de patógenos, los especímenes se inocularon vía inyección intraperitoneal con 100 μl del inóculo viral correspondiente a cada fracción (igualadas a una dosis de 105 TCID50/ml); un grupo control se inyectó con medio L-15. Tras la infección, los peces se distribuyeron en lotes de 40 individuos, en el caso de los salmones, y de 30, en el caso de los lenguados; los lotes inoculados se nombraron con el nombre de la fracción con la que fueron inoculados y se mantuvieron a 15 ºC durante 40 días, en el caso de los salmones, y 30, en el caso de los lenguados; en todo este período, se llevó a cabo un seguimiento diario para detectar signos de la enfermedad y recoger los peces muertos, que se mantuvieron a -80 ºC hasta el momento de su análisis. En el caso de los salmones, y debido a la ausencia de mortalidad (a día 20 p.i.), se llevó a cabo una segunda ronda de infección con la fracción correspondiente, continuando con muestreos (de 5 peces por fracción/día) a días 30, 33 y 35 p.i (10, 13, 15 tras la segunda infección). 97 Al final del experimento, los peces supervivientes y los peces control se sacrificaron con una sobredosis del anestésico etil 3aminobenzoato metanosulfonato (MS-222, Sigma). Toda la fase experimental se llevó a cabo siguiendo la directiva 2010/63/UE, relativa a la protección de animales utilizados para fines científicos, realizando todos los esfuerzos para reducir el sufrimiento animal, y siguiendo un protocolo aprobado por el Comité Gallego de Bioética de la Xunta de Galicia (Licencia ID 15004/13/002). 3.2.8 Detección viral a partir de muestras de tejido Para confirmar la presencia del virus en los peces inoculados, se muestrearon los lotes de riñón, hígado y bazo de 5 individuos, extraídos en condiciones asépticas. Para el procesado de las muestras de tejidos, se siguió el protocolo establecido por Ledo y col. (1987). Tras la homogenización con rodillo, los órganos se resuspendieron en tampón Earle’s suplementado con antibióticos (1000 UI/ml de penicilina, 1000 μg/ml de estreptomicina, 500 μg/ml de gentamicina y 10 μg/ml de anfotericina D); el ratio de resuspensión fue 1/10 p/v en aquellas muestras que pesaron menos de 1,5 g y 1:1 p/v en las de mayor peso. A continuación, se volvió a triturar el contenido de la bolsa para obtener una mezcla homogénea. La suspensión se centrifugó a baja velocidad (7500 g) durante 15 min a 4 ºC para precipitar los restos de tejido. El sobrenadante se transfirió a un tubo estéril y se incubó a 4 ºC durante 16 h, para permitir la actuación de los antibióticos y eliminar la posible contaminación bacteriana y/o fúngica. Transcurrido ese tiempo, se separó una alícuota de cada muestra para su análisis virológico y el resto se conservó a -20 ºC. Para el aislamiento en cultivo celular, los homogenados clarificados se diluyeron 1/10 y 1/100 en tampón de Earle suplementado con antibióticos, y se inocularon 100 μl de cada dilución, por triplicado, en placas de 48 pocillos. Como control positivo, se inoculó una cepa de referencia de IPNV, y como control negativo se mantuvieron tres pocillos sin inocular. La incubación se realizó a 15 ºC durante 15 días, visualizando diariamente en busca de aparición de efecto citopático. Tras la destrucción del tapiz celular, se recogió el contenido del pocillo (virus crudo) y se realizó un segundo y tercer pase (de ser necesario). 104 cantidad de genoma de las fracciones F4, F5 y F6 era 1,58±0,13, 2,18±0,13, y 3,04±0,33 veces mayor que en F3, respectivamente. Figura 19. Patrones de RNA obtenidos por electroforesis SDS-PAGE teñidos con nitrato de plata. A.- Gel en el que se muestran las bandas correspondientes a ambos segmentos genómicos de las fracciones F1 a F6 (cepa 5B1E) y el patrón de proporciones entre las fracciones F3-F6 con respecto a la fracción F3: 1,58±0,13, 2,18±0,13 y 3,04±0,33 para las fracciones F4 a F6, respectivamente. B.- Réplica en la cepa 5B1E. C.- Patrón observado en la cepa Ab. D.-Patrón observado en la cepa WB Estos datos sugieren, por lo tanto, que el número de equivalentes genómicos por fracción sería 1, 1,5, 2 y 3 (de F3 a F6), lo que demuestra que los birnavirus acuáticos son capaces de encapsidar hasta 3 copias de dsRNA (2 segmentos genómicos en F3, 3 en F4, 4 en F5 y 6 en F6). El incremento de los distintos segmentos genómicos no es equimolar, ya que en la fracción 4 se incorpora únicamente una copia del segmento A, poseyendo esta fracción dos copias del segmento A y una del segmento B. Las imágenes de microscopía electrónica de las distintas fracciones obtenidas a partir de más de 30 réplicas de purificación, a partir de las 3 cepas ensayadas (5B1E, Ab, WB), revelaron que las fracciones F3 a F6 estaban constituídas por partículas completas T=13 con un rango de tamaños muy variable, intrae interfracción (Tabla 15). A B C D 105 Tabla 15. Tamaño (nm) de las partículas virales detectadas en cada fracción. TAMAÑO FRACCIÓN F3 F4 F5 F6 Mínimo 55 55 65 65 Máximo 80 80 90 80 Rangos1 55, 65-70, 70-75, 75, 80 55, 70, 7075, 75-80 65-70, 70, 70-75, 75, 80, 90 65-70, 70, 7075, 80 Media2 70,66±1,68 75,67±0,9 75,99±1,43 75,86±0,93 1-Rango de tamaños observado 2Tamaño media ± desviación estándar En la fracción F3 se visualizaron partículas de entre 55 y 80 nm, encontrándose la mayoría (alrededor del 85%) de las partículas en el rango 65-75 nm (media del tamaño 70,66±1,68 nm). Las partículas de 55 nm, minoritarias en esta fracción, también se observaron en F4, en muy baja proporción (0,9%). En esta fracción, el rango de tamaños varía también hasta 80 nm (aunque este tamaño fue muy minoritario), siendo el tamaño más frecuente el de 75nm (75,67±0,9). Las fracciones F5 y F6 carecen de partículas de 55 nm y su rango de tamaños oscila entre 65 y 80 nm para F6, y entre 65 nm y 90 nm en F5, fracción en la que se observaron los mayores tamaños de partícula (88-95 nm), (Figura 20). La media del tamaño de partículas mayoritarias en estas fracciones fue de 75,99±1,43 en F5 y 75,86±0,93 en F6. A pesar de que no hay un rango bien definido entre las distintas fracciones, se observa que la media de los tamaños de las partículas es ligeramente mayor en aquellas fracciones que incorporan más de un equivalente genómico, siendo las fracciones con un mayor número de segmentos en las que se observa un aumento del porcentaje de partículas dentro de los mayores tamaños observados. Así, en la fracción F3, la mayoría de las partículas (un 85%) se encuentra en un rango de tamaño de 65-75 nm; en F4 un 92 % se encuentra en el rango 70-75 nm; en F5 el 86% de las partículas miden entre 70-85 nm y, por último, en F6 el 96% de los virus se encuentran en el rango 70-80 nm. 106 Figura 20. Imagen de microscopía electrónica de las poblaciones F3 a F6. La escala equivale a 100nm. Las flechas de punta curvada en color blanco, indican un tamaño de alrededor de 55 nm y en negro en torno a 65 nm. Las flechas con punta triangular de color blanco se corresponden con tamaños de 65-70 nm, y en negro de 70 nm. Flechas largas con punta curvada en blanco indican tamaños entre 70 y 75 nm y en negro en torno a 75 nm. Con punta triangular largas en color blanco indican tamaños de entre 75 y 80 nm, y en negro de aproximadamente 80 nm. Por último, las negras de doble punta tamaños próximos a 90 nm. F3 F4 F5 F6 107 Las fracciones F3 a F6, igualadas en función de su contenido proteico, se titularon directamente, sin pase previo por cultivo celular. Todas ellas desarrollaron el efecto citopático característico de este tipo de virus en la línea celular BF-2. Como se refleja en la Tabla 16, el título observado en las distintas fracciones se incrementó al mismo tiempo que el número de equivalentes genómicos. Tabla 16. Títulos de las fracciones obtenidas tras la purificación de virus tipo IPNV Fracción F1 F2 F3 F4 F5 F6 Nº equivalentes - - 1 1,5 2 3 Título (TCID50/ml) 3,16×105 9,7×106 6,3×107 8,9×108 3,2×109 1×1010 Logaritmo 5,55 6,7±0,7 7,8± 0,51 8,95± 0,37 9,5± 0,18 10± 0,88 Al haber igualado las fracciones F3-F6 por su contenido proteico, se asume que a la hora de titularlas todas contienen el mismo número inicial de partículas virales, por lo que los distintos títulos observados (6,3×107 TCID50/ml con F3, 8,9×108 TCID50/ml con F4, 3,2×109 con F5 y 1×1010 con F6) se deben a la diferente capacidad replicativa de las partículas que constituyen cada fracción. Las fracciones F1 y F2, pese a ser excluídas del resto de los análisis por no poder ser igualadas por su contenido proteico, también se titularon y alcanzaron valores de alrededor de 105 y 106 TCID50/ml, respectivamente, lo que confirma la presencia de partículas virales completas, como se observó bajo microscopía electrónica. Las inoculaciones experimentales realizadas en lenguado y salmón se llevaron a cabo con las 3 cepas empleadas en este estudio, habiendo aplicado 2 repeticiones solo en el caso de la cepa recombinante 5B1E. Son precisamente los resultados de esta cepa los que se muestran en este capítulo, aunque fueron similares con las cepas de referencia Ab y WB. 108 Las tasas de mortalidad en los experimentos de infección fueron en general bajas, especialmente en lenguados y en las fracciones F4 y F5 (Figura 21). En lenguados las mortalidades acumulativas (MAc) de las cuatro fracciones ensayadas no rebasaron el 25 %. Las mortalidades se iniciaron al mismo tiempo (4 días p.i.) en todas las fracciones excepto F4, siendo la fracción F6 la que alcanzó mayores niveles de mortalidad anumulativa (MAc de 20%). Las fracciones F3 y F5 dieron valores de MAc de 7% y 3% respectivamente, mientras que la fracción F4 no causó ninguna baja durante los 30 días del experimento (Figura 21A). Los peces no mostraron los típicos síntomas de la enfermedad IPN durante todo el experimento; los únicos signos de la enfermedad observados fueron anorexia y natación errática en algunos lenguados infectados con la fracción F6. A pesar de la baja mortalidad, el virus se aisló en cultivo celular y se detectó en todos los lotes tanto por RT-PCR, como por qPCR. En el caso de los salmones, debido a la ausencia de mortalidad en los 20 primeros días tras la infección, se llevó a cabo una segunda inoculación con la fracción correspondiente. Por lo tanto, los datos que se reflejan en la Figura 21B, se corresponden con las mortalidades acumulativas en el segundo período de infección (días 20 a 40 del comienzo del experimento). En este caso, las mortalidades también se iniciaron poco después de la infección con todas las fracciones, excepto F4, en la cual se inicia a día 14. De nuevo, son las fracciones F4 y F5, las que presentan menores tasas de mortalidad, alcanzando valores de MAc finales de 17% y 4% respectivamente. F6 y F3, al igual que en lenguados, son las que provocaron un mayor número de bajas, alcanzando el 100% de los peces no muestreados con F6 a día 15 p.i. y el 57% con F3. Solo algunos individuos inoculados con las fracciones F3 y F6, presentaron signos claros de la infección, como pigmentación oscura, exoftalmia y natación errática. El virus se aisló en cultivo celular y se detectó por RT-PCR y qPCR en todos los lotes. 109 Figura 21. Curvas de mortalidad de las fracciones F3-F6 en las dos especies de peces ensayadas. Se representa en el eje X el tiempo post-infección, en días, y en el eje Y la mortalidad acumulativa en porcentaje (MAc). (A) Curvas de mortalidad acumulativa (MAc) en lenguado (Solea Senegalensis). (B) Curvas de MAc en salmón (Salmo salar). Tras repetidas purificaciones a partir del tejido de truchas infectadas con virus tipo IPNV, se logró la separación de 1 a 3 bandas muy tenues (fracciones T1 a T3, de menor a mayor densidad), no habiendo logrado la penetración en el gradiente de la mayoría de las partículas virales. Al analizar el contenido de las bandas por microscopía electrónica, se comprobó que las fracciones estaban compuestas principalmente por partículas virales rotas y restos celulares. También se observaron partículas completas, aunque en muy baja concentración (Figura 22). Los títulos virales de las tres fracciones recuperadas en una purificación fueron de 102 TCID50/ml para T1 y T2 y de 103 TCID50/ml, con T3, lo que confirma que contienen partículas completas y funcionales, encontrándose la mayor concentración de virus en la parte superior del gradiente, sin penetrar (105 TCID50/ml). A B % mortalidad días 110 Figura 22. Imágenes de microscopía electrónica de las fracciones recuperadas tras la purificación de virus tipo IPNV, a partir de tejidos de trucha infectada. En estas fracciones se observó una gran cantidad de restos celulares y partículas virales rotas. En menor proporción también se observaron partículas completas. Escala: 200 nm. En los geles de proteínas de las tres fracciones recuperadas tras la purificación a partir de los tejidos de truchas infectadas, no aparece el patrón de bandeado característico de este tipo de virus, tan solo se observan dos bandas tenues que podrían representar las proteínas pVP2 y VP2 (Figura 23). Figura 23. Gel de proteínas de las tres fracciones virales recuperadas tras purificación a partir de tejido de trucha infectada con IPNV. T1, T2 y T3: fracciones recuperadas, de menor a mayor densidad; Sfracción superior de virus que no penetra en el gradiente. Las flechas indican las bandas que pueden representar las proteínas pVP2 y VP2. Los análisis mediante RT-PCR de las muestras tomadas en los distintos pasos del proceso de purificación (fracción acuosa tras la centrifugación 111 con freón, precipitado y sobrenadante tras el precipitado de la fase acuosa del freón, precipitado del lecho de sacarosa y fracción purificada) revelaron la presencia de virus en todos los pasos, además de la pérdida de una gran cantidad de partículas en el proceso de purificación, como se comprobó por la intensidad de las bandas obtenidas por RT-PCR (Figura 24). Figura 24. Productos de PCR de las distintas alícuotas recogidas durante la purificación. 1. Precipitado tras la centrifugación del PEG (que se mezcla con freón). 2. Sobrenadante de la centrifugación del PEG (que se descarta) 3. Fase acuosa recuperada en la centrifugación con freón. 4. Sobrenadante de la posterior centrifugación (se descarta), previo a la carga en el lecho de sacarosa. 5. Virus purificado DISCUSIÓN En capítulos anteriores, hemos analizado factores moleculares que podrían estar implicados en la modulación de la virulencia de virus IPNV, incluyendo regiones y dominios específicos de la secuencia genómica defendidos por otros autores (Sano y col., 1992; Bruslind y Reno, 2000; Santi y col., 2004; Shivappa y col., 2004; Song y col., 2005), así como la propiedad de reassortment o reordenamiento molecular, defendida por nuestro grupo como un factor más de virulencia de este virus. Sin embargo, los resultados, en ocasiones poco reproducibles, nos hicieron sospechar que debía existir algún otro mecanismo viral modulador del nivel de virulencia. En este capítulo, se ha estudiado un nuevo factor que podría regular la virulencia de birnavirus acuáticos junto con residuos aminoacídicos específicos y el reordenamiento molecular. Este factor, la poliploidía, presente en muy pocas familias virales, ya se había demostrado con antelación en el género Avibirnavirus de la misma familia, Birnaviridae, que el IPNV y que, al igual que otras familias virales, utiliza este recurso para modular su virulencia (Enami y col., 1991; Rager y col., 2002; Luque y col., 2009; Beniac y col., 2012). Para analizar si esta característica estaba también presente en el género Aquabirnavirus, llevamos a cabo una 112 búsqueda de fracciones virales de distinta densidad mediante la aplicación una serie de purificaciones en gradientes de CsCl, analizando las 2 a 6 poblaciones (fracciones) resultantes. En nuestro estudio, el mayor o menor número de bandas visualizadas en los gradientes de CsCl estaba relacionado con la cantidad inicial de virus: los patrones de 5 y 6 bandas solo se observaron cuándo se partía de un stock mayor de virus para someter a purificación. Entre estas 6 fracciones, solo F1 y F2 mostraron el patrón proteico de las SVPs (subpartículas virales) descritas por Coulibaly y col. (2010), que resultaron ser los componentes mayoritarios de dichas fracciones. El patrón proteico esperado para virus IPNV se observó en el resto de fracciones, compuestas por partículas icosaédricas T=13 completas. Por esta razón, fueron estas cuatro fracciones, F3-F6, las seleccionadas para el análisis estequiométrico de la composición genómica. Los resultados del análisis del contenido genómico de las fraccciones F3 a F6, igualadas en cuanto a su contenido proteico, demostraron claramente que el número de segmentos genómicos encapsidados aumentaba de las fracciones de menor a mayor densidad. Así, relativizando el contenido genómico con respecto a la fracción F3 (la de menor contenido), y asumiendo que los virus de esta fracción incorporarían una copia de cada uno de los segmentos (un equivalente genómico), el número de equivalentes genómicos para las demás fracciones analizadas sería 1,5, 2 y 3, de F4 a F6, respectivamente; así, los viriones F4 tendrían dos copias del segmento A y una única del B, mientras que las partículas F5 tendrían dos copias de ambos segmentos, y las F6 tres. Estos resultados demostraron que la poliploidía también está presente en el género Aquabirnavirus, pudiendo encapsidar hasta tres copias de su propio genoma. En el estudio previo de Luque y col. (2009), se demostró que los viriones de IBDV pueden empaquetar hasta 4 copias de dsRNA, lo que corresponde con 2 equivalentes genómicos, y que todas las fracciones incorporan una cantidad equimolar de cada uno de los segmentos. En el caso de esos autores, la fracción tomada como referencia fue F2, ya que esta estaba formada por partículas virales completas; en cambio, en nuestro estudio la composición de esta fracción (formada principalmente por SVPs) hizo que tuviésemos que descartarla del 113 análisis y que la fracción de referencia fuese F3. Aún asumiendo que la fracción F2 tuviese una mínima cantidad de partículas T=13, tomando esta como referencia y asumiendo que las fracciones F3-F6 incorporaran un número creciente de equivalentes genómicos, los resultados observados diferirían de los observados en IBDV. No obstante, lo realmente trascendental es la demostración de que la poliploidía es un fenómeno que también está presente en IPNV. La poliploidía puede conllevar un problema en la encapsidación del genoma durante la morfogénesis, ya que cabe esperar que el aumento del contenido genómico implique un incremento en el tamaño de la partícula. Este es un fenomeno muy conocido en células eucariotas, donde se ha observado que un incremento de 2Í en el contenido genómico implica un aumento de 1,6 veces del tamaño nuclear (Comai, 2005). Este hecho no representa un problema en virus con nucleocápsides helicoidales, ya que estas son más permisivas a las variaciones en la cantidad del genoma. Los filovirus constituyen un ejemplo claro de este hecho, ya que la partícula modifica su longitud, manteniendo su diámetro constante, permitiendo encapsidar hasta 22 copias genómicas (Beniac y col., 2012); sin embargo, este hecho no siempre está relacionado con el incremento de la virulencia, ya que se ha visto que en ocasiones los niveles más altos de virulencia están asociados a los filamentos más cortos (Kiley y col., 1982). Tal incremento del volumen de la cápside tiene más limitaciones en virus icosaédricos, ya que contienen un volumen de carga bien definido. De hecho, en el caso de IBDV, que puede encapsidar hasta 4 copias de dsRNA, las partículas virales mantienen un diámetro constante (Luque y col., 2009); este hecho es posible gracias a que el volumen de la partícula es muy superior al necesario para empaquetar una única copia del genoma, lo que, a su vez, permite la movilización del dsRNA durante la replicación (Castón y col., 1997). En nuestro estudio, los viriones de IPNV fueron capaces de encapsidar hasta 3 copias del genoma; sin embargo, a diferencia de IBDV, las partículas de IPNV incrementan su tamaño al incorporar más de un equivalente. En la bibliografía se han descrito tamaños variables, de 55 a 74 nm, para la cápside de IPNV, siendo su tamaño más frecuente 60 nm (Lightner y Post, 1969; Moss y Gravell, 1969; Kelly y Loh, 1972; 120 Si hablamos de los residuos de la región VP2-NS implicados en virulencia, nos encontramos la misma situación de controversia en la literatura. A pesar de que se ha determinado que los principales residuos aminoacídicos del segmento A relacionados con la virulencia son los de las posiciones 217, 221, 247 (Bruslind y Reno, 2000; Santi y col., 2004; Shivappa y col., 2004) y que la presencia de Thr en posiciones 217 y 247 está asociado con un alto nivel de virulencia, mientras que en 221 se relaciona con cepas avirulentas, otros autores han observado que no siempre se cumplen (Salgado-Miranda y col., 2014; Ruane y col., 2014). Nuestros resultados parecen no seguir tampoco las pautas de virulencia propuestas para estos tres residuos, ya que, a pesar de que poseen Thr en la posición 221, y no presentan Thr en la posición 217, lo que podría relacionarse con una baja virulencia, todas ellas, con excepción de Ab, muestran altos niveles de adsorción y replicación en la línea celular BF-2. Otra observación importante podría ser que la presencia de una Pro en posición 217 implica una mayor eficiencia en la adsorción a la célula, ya que las cepas con este aminoácido en 217 mostraron los porcentajes de adsorción más altos, por encima del 90%. Sin embargo, no hemos encontrado ninguna relación entre la variación de secuencia en estas posiciones y su capacidad replicativa. Hemos analizado también otras dos posiciones, 496 y 500, descritas por Santi y col. (2004) como potencialmente implicadas en virulencia. Con respecto a estas posiciones, la única observación resaltable sería que la combinación observada en el aislado 20G3, Arg496 Leu500, podría relacionarse con una replicación más lenta, ya que esta cepa tarda 3 días en iniciar el desarrollo de ECP, siendo éste, además, de evolución más lenta (8 días para completar el ECP). En VP2 hemos observado, además, ciertas diferencias de las cepas aisladas del Flemish Cap con respecto a sus cepas de referencia correspondientes: un cambio de Gly (G) a Ala (A) en posición 217 de la cepa WB respecto a 19G4 y 20G7, y un cambio de A496 Y500 de la cepa Ab a R496 L500 en la cepa 20G3, que podrían justificar las diferencias en los valores de adsorción y cinética de replicación en estas cepas (sobre todo, para justificar la replicación lenta observada en 20G3). 121 Aparte de las posiciones descritas por otros autores, hemos encontrado otras posiciones altamente variables 243, 249, 250 y 473, que tampoco parecen estar relacionadas con la virulencia de las cepas ensayadas, ya que no justifican las diferencias de adsorción y replicación observadas, aunque podrían estar relacionadas con el serotipo de la cepa. En cuanto a la influencia de la polimerasa viral en la eficiencia de replicación y la virulencia, ya demostrada en IBDV (Liu y Vakharia, 2004; Boot y col., 2005; Wei y col., 2006), nos hemos encontrado con una escasa biliografía que la demuestre en IPNV. Solo Shivappa y col. (2004) asociaron ciertos residuos de VP1 con la virulencia (125, 154, 187, 240 y 690), estando este hecho aún sin demostrar. Nuestro grupo ya ha sugerido en el pasado la implicación del segmento B en la virulencia, tras varias infecciones experimentales con cepas recombinantes y parentales aisladas en el banco pesquero Flemish Cap, en las que se observaron patrones de virulencia que podrían relacionarse con la secuencia del segmento B (Lago y col., 2010); pero, hasta el momento, no se habían analizado los residuos relacionados con la virulencia en estas cepas. Analizando dichos residuos, solo se observaron diferencias en los aa del residuo 690, donde la presencia de Glu/Ala (no en todos los casos) podría conllevar una disminución de la capacidad de adsorción de las partículas y cierta desventaja replicativa, observándose en este caso, inferiores títulos al inicio del ECP y en el momento de lisis total del tapiz celular. Hemos observado, también en esta región, una serie de residuos altamente variables en estas cepas, en posiciones 85, 176 y 658 que, al igual que los residuos variables observados en la región VP2-NS, parecen estar relacionados con la determinación del serotipo-genotipo de la cepa. La escasez de resultados concluyentes sobre la implicación de estos residuos en la virulencia de birnavirus acuáticos nos ha impulsado a estudiar otros factores ya conocidos, como es el caso del reassortment y su posible repercusión en la virulencia, ya que cada vez parece estar más claro que la regulación de la virulencia de este virus es el resultado de la conjunción de distintos factores. En cuanto a la presencia de este fenómeno en IPNV, ya había sido demostrada por nuestro grupo en el año 2009 (Romero-Brey y col., 2009) siendo aún desconocidos, antes 122 del presente estudio, los mecanismos que dirigen dicho proceso en este tipo de virus y su implicación en la virulencia; temas que hemos abordado en el segundo capítulo de esta tesis. Este fenómeno es ampliamente conocido en distintas familias virales (Yamaguchi y col., 1997; Hon y col., 2006; Wei y col., 2006; 2008; Toffolo y col., 2007; Olveira y col., 2009; Greenbaum y col., 2012; Plarre y col., 2012; Kasanga y col., 2013; Pérez-Losada y col., 2014), donde se ha observado que permite la adaptación a nuevos hospedadores y la modulación de la virulencia. Nuestro estudio es el primero realizado en virus tipo IPNV, y el objetivo no es únicamente determinar la dinámica del proceso sino también analizar su repercusión, in vitro e in vivo, sobre la infectividad y virulencia de las cepas. Nuestros resultados in vitro, demuestran que el reassortment es un fenómeno que se produce en porcentajes variables, de 10 a 28%, que parecen depender del hospedador. También se observa una gran diferencia en el nivel de reasorción (reassortment) asociado al número de pases que ha sufrido la línea celular empleada, siendo casi inexistente en el clon de BF2 envejecido. Si hablamos del método de secuenciación, es el sistema Illumina el que proporciona mejores resultados, por ser más sensible y permitir identificar tipos virales minoritarios en la progenie, que pasarían desapercibidos con el método tradicional de clonación-secuenciación Sanger. Los análisis estadísticos llevados a cabo con los porcentajes de distribución de los distintos tipos virales en la progenie arrojan algo de luz sobre cómo se produce este tipo de recombinación en birnavirus acuáticos, pero no podemos demostrar cual es el mecanismo que dirige la recombinación de los segmentos genómicos en este tipo de virus. Estos porcentajes permiten concluir que el reassortment es un proceso no-aleatorio, ya que determinados tipos virales aparecen con mayor representación en la progenie viral e incluso en ocasiones algún tipo se ve desplazado en la progenie. Si esto se debe a que unos segmentos se producen en mayor cantidad durante la replicación o a la posible interacción entre distintos tipos de segmentos para dirigir la encapsidación, no queda del todo claro en este estudio. Los análisis estadísticos llevados a cabo a este respecto (Lubeck y col., 1979), demuestran que en algunos casos sí se observa cierta asociación entre 123 segmentos homólogos, lo que podría justificar este fenómeno noaleatorio; sin embargo, en dos de los experimentos (C y D), el empaquetamiento de segmentos parece realizarse al azar, por lo que esa no parece ser la única justificación. Para poder explicar este hecho, hemos recurrido una vez más a la bibliografía y nos hemos planteado 3 hipótesis diferentes. En primer lugar, valoramos la posibilidad de que esta regulación se lleve a cabo durante la fase de transcripción del RNA, de tal modo que durante la fase de síntesis, la eficiencia de replicación de los genomas de los distintos tipos virales sea diferente. Esto podría deberse al complejo de ribonucleoproteína (RNP) o a la propia polimerasa del mismo (Wong y col., 2011). Pero, si esto ocurriese, la distribución de la progenie debería ser independiente del tipo celular utilizado en el proceso de coinfección; sin embargo, en nuestros experimentos sí que aparecen diferencias significativas entre los dos tipos celulares ensayados. Además, cabría esperar que estos tipos virales aparecieran en porcentajes más elevados en la progenie, por lo que la eficiencia de la replicación, por sí sola, no nos permite explicar los resultados observados en nuestros experimentos de coinfección. La segunda de las hipótesis sería la posibilidad de que el nivel de traducción proteica difiriera entre las distintas cepas, lo que podría justificarse con una diferente afinidad al ribosoma, como ya se demostró en otros virus (Tacken y col., 2004). En nuestro caso, esta diferencia de afinidad podría deberse a la interacción del RNA con las proteínas virales VP1 y VP3, aunque esta hipótesis no nos permite justificar la ausencia de algún tipo viral en la progenie, ya que todos se mostraron replicativos a elevados títulos en las líneas celulares ensayadas. La última de las hipótesis se basa en la posibilidad de que la asociación de segmentos y la formación de RNP produzca una inhibición cruzada entre distintas RNPs de la progenie, lo que sí explicaría que unos tipos de recombinantes sean más frecuentes que otros, y explicaría también la ausencia de algunos de ellos en la progenie (Nibert y col., 1996; Nomikou y col., 2015). Este hecho quedó reflejado en las coinfecciones con la cepa canadiense C1, más relacionada con el tipo americano WB, que con los europeos Ab y Sp, ya que la cepa C1 desplaza los tipos europeos en la progenie, apareciendo estos en frecuencias muy bajas, mientras que en la 124 coinfección C1:WB los resultados parecen ser opuestos, ya que el tipo más frecuente en la progenie es el recombinante entre ambas cepas C1/WB, demostrándose así que el mecanismo de recombinación se veía favorecido entre virus filogenéticamente más próximos. Nuestras observaciones podrían indicar que la interacción entre proteínas heterólogas de IPNV (VP1 tipo 1 y VP3 tipo 2) puede inhibir la captura o/y replicación de un tipo viral, lo que justificaría un proceso de recombinación intermolecular no-aleatoria; pero, a día de hoy este mecanismo de interacción aún no ha sido descrito en birnavirus, lo cual lo convierte en una hipótesis interesante, aunque no demostrada hasta el momento. Tras el descubrimiento del reassortment en birnavirus acuáticos (Romero-Brey y col., 2009), nuestro estudio ha permitido entender en cierta medida, cómo se produce este fenómeno in vitro, no pudiendo definir del todo los mecanismos que lo regulan. En cuanto a su implicación en la infectividad y virulencia, tampoco hemos obtenido resultados determinantes. Las cepas recombinantes, tanto salvajes como obtenidas por clonación en el laboratorio, mostraron niveles intermedios de virulencia en ambas especies estudiadas (salmón y lenguado), alcanzándose los mayores niveles de mortalidad acumulativa en las cepas de origen salvaje, siendo también estas las que causaron claros signos de la infección en los peces. Además, todos los recombinantes resultaron estar formados por un segmento A de una cepa de baja virulencia y un segmento B de una cepa de alta virulencia, lo que, teniendo en cuenta que estas cepas fueron aisladas de peces asintomáticos, parece indicar que la regulación de la virulencia en estas cepas ha podido suponer un mecanismo de persistencia en el huésped. Son precisamente los resultados in vivo los que nos hacen pensar que, al igual que lo que ocurría con los determinantes de la secuencia genómica en las regiones VP2-NS y VP1, el reassortment, por sí solo, no permite explicar la regulación de la virulencia en birnavirus acuáticos. Esto señala directamente a que deben entrar en juego otros factores. Es por ello que, en el tercer capítulo de la tesis hemos abordado el estudio de la poliploidía en birnavirus acuáticos, fenómeno ya demostrado en otro miembro de la misma familia, IBDV (Luque y col., 125 2009), y que creíamos que podía estar también presente en IPNV y representa un componente más en el mecanismo regulador de la virulencia de este tipo de virus. Son pocos los virus que presentan esta cualidad de poliploidía; las pocas familias virales que la poseen, Filoviridae, Paramyxoviridae, Ortomyxoviridae poseen cápsides helicoidales o pleomórficas, que permiten albergar mayores volúmenes y, por lo tanto, múltiples copias de su genoma. Con el estudio de Luque y col. (2009) se demostró la existencia de este fenómeno también en virus icosaédricos. En dicho estudio, se encontraron 6 poblaciones de IBDV mediante purificación en gradientes de cloruro de cesio de viriones procedentes de cultivos celulares infectados, o de la bursa de Fabricio de pájaros infectados. Dichas poblaciones tenían la misma composición proteica, pero se diferenciaban en la densidad y el coeficiente de sedimentación, diferencias que demostraron estar relacionadas con el número de copias de dsRNA empaquetadas. En este caso, tomando la fracción F2 como referencia, por ser la primera formada por partículas virales completas, observaron que IBDV es capaz de incorporar hasta 4 copias de dsRNA, lo que corresponde con 2 equivalentes genómicos, y que todas las fracciones incorporan una cantidad equimolar de cada uno de los segmentos. En nuestro análisis demostramos que la poliploidía está también presente en el género Aquabirnavirus (al menos ex vivo), pudiendo ser una característica de la familia Birnaviridae. Las múltiples purificaciones en gradientes de CsCl llevadas a cabo con las cepas de referencia Ab y WB, así como la cepa 5B1E (aislada de bacalao salvaje en el banco pesquero Flemish Cap), con la que se aplicó un mayor número de repeticiones, nos han llevado a la visualización de un número variable de bandas, de 3 a 6, en función de la concentración original de virus, obteniéndose en la mayoría de los casos 6 poblaciones que denominamos fracciones F1-F6. A pesar de observar el mismo patrón de bandeado que en IBDV, son muchas las diferencias detectadas en IPNV en los distintos análisis. En primer lugar, en el caso de nuestras cepas, los análisis de microscopía electrónica y de composición proteica revelaron que las fracciones F1 y F2 estaban formadas principalmente por SVPs, acompañadas de cápsides vacías y, 126 en menor concentración, viriones completos (observados en mayor cantidad en F2). La primera fracción compuesta únicamente por partículas virales completas fue F3, por lo que fueron las fracciones F3F6 con las que se llevó a cabo el correspondiente análisis de la composición genómica (igualando la cantidad proteica de las fracciones con respecto a F3). Los resultados del análisis del contenido genómico de las fraccciones F3 a F6, igualadas en cuanto a su contenido proteico, demuestran que el número de segmentos genómicos encapsidados aumenta de las fracciones de menor a mayor densidad. El número de equivalentes genómicos para las fracciones analizadas sería de 1 en F3, 1,5 en F4, 2 en F5 y 3 en F6, demostrando así que IPNV puede encapsidar hasta tres copias de su contenido genómico. Otra diferencia es que, en este caso, el incremento de los segmentos genómicos no se hace de manera equimolar, como ocurría en IBDV. Pero, quizá, una de las observaciones más relevantes, y otra de las principales diferencias con respecto a los resultados obtenidos en IBDV, fue que en nuestras repeticiones hemos encontrado un amplio rango de tamaño de partículas para las distintas fracciones purificadas, lo que parece demostrar que en el caso de virus tipo IPNV, el aumento del contenido genómico implica un incremento en el tamaño de la partícula viral. Este es un hecho no observado hasta el momento en otras familias virales, ya que otros virus poliploides como filovirus, ortomyxovirus y paramyxovirus poseen cápsides helicoidales o pleomórficas que son más permisivas en el incremento de la cantidad del genoma. En el caso de IBDV, las partículas virales encapsidan hasta dos copias del genoma, manteniendo su diámetro constante, gracias a que el volumen de la partícula es mucho mayor al necesario para empaquetar una única copia del genoma, lo que a su vez permite la movilización del dsRNA durante la replicación (Castón y col., 1997). Pero, en nuestro caso, los viriones de IPNV incrementan su tamaño al incorporar más de un equivalente. Las partículas de las fracciones purificadas en nuestros experimentos oscilan entre 55 y 85 nm (observándose incluso partículas de más de 90 nm en F5), siendo los tamaños más frecuentes 70 nm en F3 y en torno a 75 nm en las demás fracciones, y observándose un número creciente de partículas de 127 alrededor de 80 nm de F3 a F6. Por lo tanto, parece existir una relación directa entre el incremento de equivalentes genómicos y el tamaño de las partículas, indicando la necesidad de un incremento del volumen de la cápside, que en este caso pasaría a ser, de F3 a F6: 2,720, 2,783, 2,787 y 2,785 nm3, respectivamente. La amplia variedad de tamaños observados en las distintas purificaciones, incluso dentro de cada fracción, nos ha permitido demostrar el cambio de tamaño de partícula con el incremento del contenido genómico, sin embargo, muy a nuestro pesar, el desconocimiento de la arquitectura de estas partículas purificadas hace que no podamos explicar estas observaciones. Para determinar el efecto de la poliploidía sobre la virulencia, hemos llevado a cabo experimentos ex vivo e in vivo con las distintas fracciones purificadas. Trabajando con cultivos celulares (BF-2), hemos observado que todas las fracciones son funcionales y capaces de replicar, incluso las fracciones F1 y F2, lo que indica que ambas poseen viriones completos. Además, hemos observado que el incremento en el número de equivalentes conlleva un incremento de la infectividad de la partícula, siendo las partículas con un mayor contenido genómico las que alcanzan los mayores títulos, al igual que ocurría en IBDV. En los ensayos con peces, llevados a cabo en salmón y lenguado, las mortalidades fueron inferiores a las esperadas: solo la fracción F6 (con 3 equivalentes) muestra una elevada virulencia en ambas especies; las otras fracciones mostraron niveles de mortalidad intermedios, siendo especialmente bajos en F4 y F5. Basándonos en estos resultados, no podemos sugerir una relación clara entre el número de equivalentes genómicos y la virulencia, como cabría esperar tras los análisis de replicación ex vivo, lo que sugiere la necesidad de más experimentación en esta línea de trabajo. 128 129 CONCLUSIONES 1. La virulencia de las cepas de birnavirus acuáticos estudiadas no parece estar determinada por los residuos aminoacídicos presentes en las proteínas virales, relacionados hasta ahora con la virulencia; o, al menos, este no parece ser el único mecanismo que interviene en su regulación. 2. El reassortment en birnavirus acuáticos sí parece estar implicado en la regulación de virulencia, suponiendo un mecanismo de adaptación al hospedador, y favoreciendo la persistencia del virus. La frecuencia de este fenómeno ex vivo oscila entre un 10 y un 30%, y varía en función del tipo celular y el número de pases del clon celular. 3. Los análisis estadísticos revelan que el proceso de encapsidación de los segmentos durante la replicación viral no es un proceso al azar sino dirigido, y parece depender del tipo celular. Sin embargo, tras haber demostrado que la asociación de segmentos sí es un proceso aleatorio, y habiendo estudiado tres posibles escenarios que justifiquen un proceso de recombinación dirigido, queda pendiente demostrar cómo se produce esta regulación. 4. Queda demostrada la presencia de poliploidía en birnavirus acuáticos, observándose en estos virus poblaciones capaces de incorporar un número creciente de segmentos genómicos, hasta encapsidar 3 equivalentes genómicos completos. Este fenómeno supone además un cambio morfológico en la partícula viral, observándose poblaciones de entre 60 a 90 nm, aunque no tenemos datos para explicar cómo se produce este aumento de volumen de la partícula. 136 Garriga, D., Querol-Audí, J., Abaitua, F., Saugar, I., Pous, J., Verdaguer, N., Castón, J. 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