Líneas germinales, ciclo reproductivo y sucesión de sexos en Ostrea edulis (Linnaeus, 1758)

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A su vez se hace un estudio de su sexualidad, proponiendo una clasificación de clases sexuales y explicando como “cambia de sexo”. Se estudia el ciclo reproductivo natural de dos clases de edad (0 años y 1 año) de Ostrea edulis cultivada en suspensión en Santa Pola, Alicante, determinando la estacionalidad, tanto del desarrollo gametogénico como de la sexualidad. En base a esto se hacen acondicionamientos para establecer la influencia de los factores medioambientales, así como de la edad, en el desarrollo gametogénico y sexo de Ostrea edulis, desacoplando el efecto del fotoperiodo y de la temperatura. Por último también se estudió el uso y distribución de los recursos, tanto en el medio natural como en acondicionamiento.        Universidad�de�Santiago�de�Compostela��������������������Instituto�Español�de�Oceanografía� ��������������Instituto�de�Acuicultura�������������������������������������Centro�Oceanográfico�de�A�Coruña�� � � � � Óscar� García� Martín         �Joaquín�Espinosa�Gallego              Guillermo�Román�Cabello,�  �  �    �“�Líneas�germinales,�ciclo�reproductivo�y�sucesión�de�sexos� en�Ostrea� 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Memoria�presentada�por�la�Licenciada�Sara�Silva�Salvado�para�optar�al�título�de�Doctora� en�Biología�por�la�Universidad�de�Santiago�de�Compostela� � � � � � � � � � Sara�Silva�Salvado� � � � � Santiago�de�Compostela,�2015�        Universidad�de�Santiago�de�Compostela��������������������Instituto�Español�de�Oceanografía� ��������������Instituto�de�Acuicultura�������������������������������������Centro�Oceanográfico�de�A�Coruña�� � � � � Óscar� García� Martín         �Joaquín�Espinosa�Gallego              Guillermo�Román�Cabello,�  �  �    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(2008 -2010). Así mismo, el trabajo experimental ha obtenido recursos económicos del Proyecto “Optimización y mejora de la extracción productiva y rentabilidad en la explotación de los bancos naturales, autorizaciones y zonas intermareales de bivalvos comerciales de arena. Gestión sostenible y mejora de la gestión o conservación de los recursos”, financiado por el Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino y dirigido por AGAMAR (asociación gallega de mariscadoras) (2011-2013)  Esta Tesis se realizó en el marco del Proyecto “Bivalve conditioning and settlement-keys to competitive hatchery production (SETTLE)”, financiado por el programa de la Unión Europea: Capacities - Research for the Benefit of Specific Groups (in particular SMEs) Call FP7-SME-2007-1. (2008 -2010). Así mismo, el trabajo experimental ha obtenido recursos económicos del Proyecto “Optimización y mejora de la extracción productiva y rentabilidad en la explotación de los bancos naturales, autorizaciones y zonas intermareales de bivalvos comerciales de arena. Gestión sostenible y mejora de la gestión o conservación de los recursos”, financiado por el Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino y dirigido por AGAMAR (asociación gallega de mariscadoras) (2011-2013) Agradecimientos: A mis directores: Oscar, por su confianza y apoyo todos estos años; Joaquín, por aceptarme en su “familia” y compartir parte de sus conocimientos; y Guillermo, por aceptar a esta última doctoranda. A todas aquellas personas que, en algún momento formaron parte del Laboratorio de Fisiología de la Facultad de Farmacia de la USC y aportaron su granito de arena a esta Tesis: Rosa e Iria, por su trabajo técnico, iniciarme en el procesado histológico y su apoyo; Paula y Ángeles, por su ayuda cuando las ostras nos superaban en número; y a Yaiza y Jesús, por dedicar parte de sus prácticas de ciclo a la ostra. A la empresa Ostres de la Bahía, Santa Pola, por el suministro puntual y eficiente de las ostras objeto de este estudio. A Gustavo Hernández, por iniciarme en la microscopía óptica y contestar a todas mis preguntas. A mis abuelos, por apoyarme y permitirme llegar hasta aquí. A Inés y Javier, por ser y estar. A Cristian, porque le tocó una bióloga. A todos mis amigos biólogos que me acompañaron y apoyaron en algún momento de esta parte de mi vida. A todos mis amigos y familiares no biólogos, por apoyarme e interesarse por la “animada” vida de las ostras. Y por último, a todas esas personas que me pararon por el pasillo o por la calle para preguntarme por mi Tesis y darme ánimos. Agradecimientos: A mis directores: Oscar, por su confianza y apoyo todos estos años; Joaquín, por aceptarme en su “familia” y compartir parte de sus conocimientos; y Guillermo, por aceptar a esta última doctoranda. A todas aquellas personas que, en algún momento formaron parte del Laboratorio de Fisiología de la Facultad de Farmacia de la USC y aportaron su granito de arena a esta Tesis: Rosa e Iria, por su trabajo técnico, iniciarme en el procesado histológico y su apoyo; Paula y Ángeles, por su ayuda cuando las ostras nos superaban en número; y a Yaiza y Jesús, por dedicar parte de sus prácticas de ciclo a la ostra. A la empresa Ostres de la Bahía, Santa Pola, por el suministro puntual y eficiente de las ostras objeto de este estudio. A Gustavo Hernández, por iniciarme en la microscopía óptica y contestar a todas mis preguntas. A mis abuelos, por apoyarme y permitirme llegar hasta aquí. A Inés y Javier, por ser y estar. A Cristian, porque le tocó una bióloga. A todos mis amigos biólogos que me acompañaron y apoyaron en algún momento de esta parte de mi vida. A todos mis amigos y familiares no biólogos, por apoyarme e interesarse por la “animada” vida de las ostras. Y por último, a todas esas personas que me pararon por el pasillo o por la calle para preguntarme por mi Tesis y darme ánimos. f) El género sexual influye firmemente, en extensión e intensidad, sobre las características de un organismo, y lo hace a nivel de su desarrollo embrionario, estirpes celulares, histología, anatomía, fisiología y comportamiento; siendo tal influencia tanto mayor cuanto superior es la complejidad del organismo. El organismo manifiesta esta influencia en los niveles antes mencionados mostrando unos caracteres que se denominan caracteres sexuales, que son determinados por, y específicos para, cada uno de los dos géneros sexuales. g) Definimos como sexualización de un organismo tanto a los procesos como a los efectos finales que el género sexual produce en el organismo. La sexualización de un organismo produce sus caracteres sexuales, es realizada por sus genes sexuales y ocurre mediante la expresión directa de tales genes y, también, a través de las regulaciones que dichos genes efectúan sobre la expresión de otros genes no-sexuales del genotipo. Por tanto, decimos que el genero sexual sexualiza al organismo. Durante la evolución, la sexualización de los organismos ha sido proporcional a la complejidad de estos, abarcando cada vez mayores áreas de su economía. h) Los dos primeros niveles donde la sexualización afecta a un organismo metazoo son: a) en la especificación de sus series gametogénicas, como masculina o femenina, para producir los gametos masculinos o femeninos, respectivamente; b) en la formación de un sistema endocrino, aunque sea elemental, para elaborar las hormonas sexuales (andrógenos y estrógenos). i) Moluscos bivalvos y sexualización.- Los moluscos bivalvos son organismos sexualizados acorde a su complejidad, y su sexualización es exigua comparada con la que se observa en organismos más complejos. Por ahora sabemos que la sexualización de los moluscos bivalvos sólo alcanza a: a) la especificación de las series gametogénicas que producen los gametos; b) la formación de un sistema endocrino elemental, productor de hormonas sexuales (andrógenos y estrógenos) y cuyas estirpes celulares aún no se han identificado. 3. Gonias*.- Es un término general que se utiliza para denominar las estirpes celulares de las espermatogonias y de las ovogonias, ya sea de modo individual a cada estirpe o a las dos estirpes conjuntamente. 4. Línea germinal sexual (LG).- Definimos como línea germinal sexual (LG) a una línea germinal embrionaria constituida por células embrionarias que, además de proliferar por mitosis, han retenido la capacidad de hacer meiosis y originan, por diferenciación, las espermatogonias y las ovogonias. Las células de la línea germinal se originan durante la embriogénesis temprana del organismo y sólo tienen vida embrionaria, no pasan al organismo nacido. En el embrión de los organismos bisexuales se forma una línea germinal masculina (LG�) y una línea germinal femenina (LG�), siendo tales líneas independientes entre sí. La LG� produce las espermatogonias y la LG� produce las ovogonias. En el embrión de los organismos unisexuales sólo se forma una línea germinal, masculina o femenina. Las espermatogonias y las ovogonias son las primeras células germinales sexuales que tiene el animal nacido, y en adelante el organismo adulto durante su historia de vida. Las células de una LG retienen la capacidad de hacer meiosis y esta condición la transmiten a las células que derivan de ellas. Sin embargo, no todas las células germinales ejecutan esta capacidad, sólo la realizan las espermatogonias y las ovogonias. Opinamos que las líneas germinales se sexualizan durante la embriogénesis bajo la influencia de los géneros sexuales (masculino o femenino), es decir, bajo la acción de los genes que codifican el género sexual. La sexualización de una línea germinal es un proceso por el que una célula de la secuencia celular de la línea germinal es determinada a expresar un género sexual concreto (masculino o femenino), y esto implica hacer la meiosis de una determinada manera y producir un determinado tipo de gameto, masculino o femenino. Las espermatogonias y las ovogonias son células germinales sexualizadas. El animal recién nacido, y en adelante el animal adulto en todos sus ciclos reproductivos, ya están implementados con células germinales sexuadas: las espermatogonias y las ovogonias. Opinamos que la sexualización de una línea germinal es realizada por un género sexual. 5. Células germinales*.- Una célula germinal es cualquier estirpe celular perteneciente a una línea germinal de un organismo metazoo. La primera célula germinal que surge y funda una línea germinal de un organismo durante su embriogénesis se denomina célula germinal primordial. Desde una célula germinal primordial hasta el espermatozoide, así como desde una célula germinal primordial hasta el ovocito, todas estas células son células germinales. 6. Serie gametogénica (SG).- Definimos una serie gametogénica (SG) como un sistema celular que tiene una trayectoria secuencial de estirpes celulares sexuales, que se genera a partir de una célula inicial –fundadora de la serie– y se desarrolla de modo progresivo hasta producir las células funcionales finales de la serie, que son los gametos. La célula inicial puede ser una espermatogonia (género sexual masculino) o una ovogonia (género sexual femenino). Una serie gametogénica es un sistema celular que evoluciona con el paso del tiempo. La situación inicial del sistema es una célula fundadora estable, espermatogonia u ovogonia, y su situación final es la producción de los gametos, espermatozoides u ovocitos, respectivamente. La evolución del sistema consiste en que su célula fundadora –al principio, estable– entra en una situación de inestabilidad que se resuelve alcanzando otra situación de estabilidad, que es la producción de los gametos de la serie. El paso del sistema desde su situación inestable a la estable es realizado por una serie secuencial de procesos celulares que constituyen la evolución del sistema. El desencadenamiento de tales procesos celulares está sometido a regulación por factores externos al sistema (regulación endocrina y regulación por factores externos al organismo, o sea, por el medio ambiente). Hay dos tipos de series gametogénicas: a) la serie gametogénica masculina (SG�), que empieza en una espermatogonia –célula fundadora de la serie– y finaliza produciendo múltiples espermatozoides; b) la serie gametogénica femenina (SG�), que empieza en una ovogonia –célula fundadora de la serie– y finaliza produciendo uno o varios huevos. En la evolución de una SG� ocurren los procesos de proliferación gonial, Meiosis I (MeI), Meiosis II (MeII) y espermiogénesis. En la evolución de una SG� ocurren los procesos de proliferación gonial, Meiosis I (MeI), frenadas meióticas (primera y segunda) y vitelogénesis (en los ovocitos que la experimentan). En algunos organismos los ovocitos no realizan la segunda frenada meiótica y finalizan la meiosis haciendo la Meiosis II (MeII), es el caso del erizo de mar. Una serie gametogénica está madura cuando ha producido los gametos maduros, o sea, funcionales. Conforme una serie gametogénica avanza en su desarrollo decimos que madura. A medida que una serie gametogénica madura se agotan los elementos celulares anteriores de la serie y finalmente sólo quedan los gametos. Una SG pasa por los estados de inmadurez (gonias), maduración (meiosis y espermiogénesis, en machos; meiosis y vitelogénesis, en hembras) y madurez (gametos). La serie gametogénica es la unidad funcional de una fase sexual. f) El género sexual influye firmemente, en extensión e intensidad, sobre las características de un organismo, y lo hace a nivel de su desarrollo embrionario, estirpes celulares, histología, anatomía, fisiología y comportamiento; siendo tal influencia tanto mayor cuanto superior es la complejidad del organismo. El organismo manifiesta esta influencia en los niveles antes mencionados mostrando unos caracteres que se denominan caracteres sexuales, que son determinados por, y específicos para, cada uno de los dos géneros sexuales. g) Definimos como sexualización de un organismo tanto a los procesos como a los efectos finales que el género sexual produce en el organismo. La sexualización de un organismo produce sus caracteres sexuales, es realizada por sus genes sexuales y ocurre mediante la expresión directa de tales genes y, también, a través de las regulaciones que dichos genes efectúan sobre la expresión de otros genes no-sexuales del genotipo. Por tanto, decimos que el genero sexual sexualiza al organismo. Durante la evolución, la sexualización de los organismos ha sido proporcional a la complejidad de estos, abarcando cada vez mayores áreas de su economía. h) Los dos primeros niveles donde la sexualización afecta a un organismo metazoo son: a) en la especificación de sus series gametogénicas, como masculina o femenina, para producir los gametos masculinos o femeninos, respectivamente; b) en la formación de un sistema endocrino, aunque sea elemental, para elaborar las hormonas sexuales (andrógenos y estrógenos). i) Moluscos bivalvos y sexualización.- Los moluscos bivalvos son organismos sexualizados acorde a su complejidad, y su sexualización es exigua comparada con la que se observa en organismos más complejos. Por ahora sabemos que la sexualización de los moluscos bivalvos sólo alcanza a: a) la especificación de las series gametogénicas que producen los gametos; b) la formación de un sistema endocrino elemental, productor de hormonas sexuales (andrógenos y estrógenos) y cuyas estirpes celulares aún no se han identificado. 3. Gonias*.- Es un término general que se utiliza para denominar las estirpes celulares de las espermatogonias y de las ovogonias, ya sea de modo individual a cada estirpe o a las dos estirpes conjuntamente. 4. Línea germinal sexual (LG).- Definimos como línea germinal sexual (LG) a una línea germinal embrionaria constituida por células embrionarias que, además de proliferar por mitosis, han retenido la capacidad de hacer meiosis y originan, por diferenciación, las espermatogonias y las ovogonias. Las células de la línea germinal se originan durante la embriogénesis temprana del organismo y sólo tienen vida embrionaria, no pasan al organismo nacido. En el embrión de los organismos bisexuales se forma una línea germinal masculina (LG�) y una línea germinal femenina (LG�), siendo tales líneas independientes entre sí. La LG� produce las espermatogonias y la LG� produce las ovogonias. En el embrión de los organismos unisexuales sólo se forma una línea germinal, masculina o femenina. Las espermatogonias y las ovogonias son las primeras células germinales sexuales que tiene el animal nacido, y en adelante el organismo adulto durante su historia de vida. Las células de una LG retienen la capacidad de hacer meiosis y esta condición la transmiten a las células que derivan de ellas. Sin embargo, no todas las células germinales ejecutan esta capacidad, sólo la realizan las espermatogonias y las ovogonias. Opinamos que las líneas germinales se sexualizan durante la embriogénesis bajo la influencia de los géneros sexuales (masculino o femenino), es decir, bajo la acción de los genes que codifican el género sexual. La sexualización de una línea germinal es un proceso por el que una célula de la secuencia celular de la línea germinal es determinada a expresar un género sexual concreto (masculino o femenino), y esto implica hacer la meiosis de una determinada manera y producir un determinado tipo de gameto, masculino o femenino. Las espermatogonias y las ovogonias son células germinales sexualizadas. El animal recién nacido, y en adelante el animal adulto en todos sus ciclos reproductivos, ya están implementados con células germinales sexuadas: las espermatogonias y las ovogonias. Opinamos que la sexualización de una línea germinal es realizada por un género sexual. 5. Células germinales*.- Una célula germinal es cualquier estirpe celular perteneciente a una línea germinal de un organismo metazoo. La primera célula germinal que surge y funda una línea germinal de un organismo durante su embriogénesis se denomina célula germinal primordial. Desde una célula germinal primordial hasta el espermatozoide, así como desde una célula germinal primordial hasta el ovocito, todas estas células son células germinales. 6. Serie gametogénica (SG).- Definimos una serie gametogénica (SG) como un sistema celular que tiene una trayectoria secuencial de estirpes celulares sexuales, que se genera a partir de una célula inicial –fundadora de la serie– y se desarrolla de modo progresivo hasta producir las células funcionales finales de la serie, que son los gametos. La célula inicial puede ser una espermatogonia (género sexual masculino) o una ovogonia (género sexual femenino). Una serie gametogénica es un sistema celular que evoluciona con el paso del tiempo. La situación inicial del sistema es una célula fundadora estable, espermatogonia u ovogonia, y su situación final es la producción de los gametos, espermatozoides u ovocitos, respectivamente. La evolución del sistema consiste en que su célula fundadora –al principio, estable– entra en una situación de inestabilidad que se resuelve alcanzando otra situación de estabilidad, que es la producción de los gametos de la serie. El paso del sistema desde su situación inestable a la estable es realizado por una serie secuencial de procesos celulares que constituyen la evolución del sistema. El desencadenamiento de tales procesos celulares está sometido a regulación por factores externos al sistema (regulación endocrina y regulación por factores externos al organismo, o sea, por el medio ambiente). Hay dos tipos de series gametogénicas: a) la serie gametogénica masculina (SG�), que empieza en una espermatogonia –célula fundadora de la serie– y finaliza produciendo múltiples espermatozoides; b) la serie gametogénica femenina (SG�), que empieza en una ovogonia –célula fundadora de la serie– y finaliza produciendo uno o varios huevos. En la evolución de una SG� ocurren los procesos de proliferación gonial, Meiosis I (MeI), Meiosis II (MeII) y espermiogénesis. En la evolución de una SG� ocurren los procesos de proliferación gonial, Meiosis I (MeI), frenadas meióticas (primera y segunda) y vitelogénesis (en los ovocitos que la experimentan). En algunos organismos los ovocitos no realizan la segunda frenada meiótica y finalizan la meiosis haciendo la Meiosis II (MeII), es el caso del erizo de mar. Una serie gametogénica está madura cuando ha producido los gametos maduros, o sea, funcionales. Conforme una serie gametogénica avanza en su desarrollo decimos que madura. A medida que una serie gametogénica madura se agotan los elementos celulares anteriores de la serie y finalmente sólo quedan los gametos. Una SG pasa por los estados de inmadurez (gonias), maduración (meiosis y espermiogénesis, en machos; meiosis y vitelogénesis, en hembras) y madurez (gametos). La serie gametogénica es la unidad funcional de una fase sexual. 7. Fase sexual.- Definimos fase sexual (FS) como la expresión celular de un género sexual (masculino o femenino) en toda la gónada de un animal, en este caso, de un molusco bivalvo. Una fase sexual es el conjunto de series gametogénicas (SG) correspondientes a un género sexual que actualmente están en desarrollo, o son ya maduras, en la gónada de un molusco. La fase sexual es un concepto global, se expresa en toda la gónada del animal y reúne a todas las series gametogénicas correspondientes a un género sexual (GS). La fase sexual se expresa en sus series gametogénicas. Hay una fase sexual masculina (FS�) y una fase sexual femenina (FS�). La FS� es el conjunto de series gametogénicas masculinas (SG�), y la FS� es el conjunto de series gametogénicas femeninas (SG�). Una fase sexual puede tener diferentes grados de desarrollo en función del nivel de desarrollo de las series gametogénicas que la constituyen. Asímismo, una fase sexual puede tener diferentes cohortes de series gametogénicas que difieren entre sí en su grado de desarrollo. Una gónada está madura cuando su fase sexual está madura, es decir, cuando las series gametogénicas que constituyen la fase sexual han producido los gametos, o sea, han madurado. 8. Madurez gonadal, gónada madura.- Una gónada está madura cuando su fase sexual, o una de sus dos fases sexuales (moluscos bisexuales), está madura, es decir, cuando las series gametogénicas que constituyen la fase sexual han producido los gametos, o sea, han madurado. 9. Cohortes.- Definimos como cohorte de espermatogonias o de ovogonias a un contingente u hornada de cada una de estas estirpes celulares, que se han producido en un tiempo breve y su función es iniciar o repoblar una fase sexual mediante el desarrollo de series gametogénicas. En la formación y desarrollo de una fase sexual intervienen varias cohortes de gonias. Una cohorte de gonias, masculinas o femeninas, produce una cohorte de series gametogénicas masculinas o femeninas, respectivamente. 10. Dioicismo*, monoicismo* y fases sexuales.- Los moluscos bivalvos dioicos tienen la capacidad de expresar sólo una fase sexual en su gónada, que puede ser masculina o femenina. Los moluscos bivalvos monoicos, bisexuales o ambisexuales tienen la capacidad de expresar dos fases sexuales en su gónada, una fase sexual masculina y otra femenina. 11. Moluscos ambisexuales, fase sexual funcional (FSF) y fase sexual no-funcional.- Un molusco ambisexual puede expresar las dos fases sexuales con igual o diferente grado de desarrollo de sus respectivas series gametogénicas. Si lo hace con el mismo grado de desarrollo se denomina hermafrodita simultáneo o funcional. Si lo hace con diferente nivel de desarrollo, entonces la fase sexual que tiene mayor grado de desarrollo –la más avanzada hacia la madurez– la denominamos fase sexual funcional (FSF). La fase sexual funcional determina el sexo funcional del molusco, y es la fase sexual que descargará sus gametos en la próxima puesta. La fase sexual con menor grado de desarrollo, y que no emitirá sus gametos en la próxima puesta, la denominamos fase sexual no-funcional, y esta fase, aunque está presente, no determina el sexo funcional del molusco. Puede haber dos fases sexuales funcionales: fase sexual funcional masculina (FSF�) y fase sexual funcional femenina (FSF�). 12. Moluscos ambisexuales, sexo funcional y sexo no-funcional.- Definimos como sexo funcional de un molusco ambisexual, que no es hermafrodita simultáneo, al sexo correspondiente a su fa- . El sexo funcional es un sexo actual, no es el sexo del individuo, porque realmente tiene dos sexos. El sexo funcional indica el tipo de gametos que el molusco descargará en la próxima puesta y, por tanto, cómo el animal se comportará sexualmente en dicha puesta, si como macho o como hembra. Definimos como sexo no-funcional de un molusco ambisexual, que no es hermafrodita simultáneo, al sexo correspondiente a su fase sexual no-funcional. El sexo no-funcional indica el tipo de gametos que el molusco no-descargará en la próxima puesta. Los moluscos ambisexuales que son hermafroditas simultáneos no tienen sexo funcional ni tampoco sexo no-funcional porque desarrollan, maduran y descargan las fases sexuales masculina y femenina simultáneamente. 13. Moluscos ambisexuales hermafroditas* y no-hermafroditas*.- Un molusco ambisexual que produce sus dos fases sexuales con igual grado de desarrollo es un animal hermafrodita, hermafrodita simultáneo, hermafrodita funcional o hermafrodita estricto. Un molusco que no lo hace así, o sea, que desarrolla sus dos fases sexuales con diferente grado de desarrollo no es un molusco hermafrodita, sólo es un molusco ambisexual o bisexual. Son hermafroditas estrictos los pectínidos Pecten maximus (vieira) y Aequipecten opercularis (volandeira). No son hermafroditas estrictos, sólo son ambisexuales, los bivalvos del género Ostrea y el pectínido Chlamys varia (Iglesias, 2012). Elementos para elaborar estos conceptos proceden de Coe (1943b). 14. Moluscos ambisexuales y folículos gonadales*.- Los moluscos ambisexuales pueden desarrollar sus dos fases sexuales en un mismo folículo gonadal o en folículos diferentes. Cuando lo hacen en un mismo folículo se denominan, además, intersexuales. Para los moluscos que lo hacen en folículos diferentes no hay actualmente un término que lo designe. Son moluscos intersexuales los bivalvos del género Ostrea, el pectínido Chlamys varia (zamburiña) (Iglesias, 2012) y el larvíparo –broma ("shipworm")– Teredo navalis. Los pectínidos Pecten maximus (vieira) y Aequipecten opercularis (volandeira) desarrollan las dos fases sexuales en folículos gonadales diferentes. Elementos para elaborar este concepto proceden de Policansky (1982). 15. Moluscos ambisexuales, cambio de fase sexual y cambio de sexo a) Los bivalvos ambisexuales que son hermafroditas estrictos nunca cambian de fase sexual, ni de sexo, ni dentro de un mismo periodo reproductivo, ni de un periodo reproductivo al siguiente. En cada ciclo reproductivo desarrollan y descargan ambas fases sexuales, la masculina y la femenina. b) Hay bivalvos que cambian de fase sexual pero no cambian de sexo, y hay otros que cambian de fase sexual y esto implica el cambio de sexo. La cuestión estriba en que el cambio de fase sexual no siempre implica un cambio de sexo. c) Definimos el cambio de fase sexual como un cambio de fase sexual funcional, es decir, como el cambio de una fase sexual funcional de un sexo a la fase sexual funcional del otro sexo; o sea, el cambio de la FSF� a la FSF� o a la inversa. Para que ocurra el cambio de fase sexual funcional tiene que suceder lo siguiente: a) el molusco desarrolla la fase sexual funcional de un sexo, por ejemplo la FSF�, y realiza la descarga (puesta) de esta fase; b) seguidamente desarrolla la fase sexual funcional del otro sexo, en este caso la FSF�, para realizar posteriormente su descarga (puesta). Cuando se cumplen estas dos condiciones decimos que ocurre un cambio de fase sexual. Los cambios de fase sexual suceden después y a continuación de las puestas. 7. Fase sexual.- Definimos fase sexual (FS) como la expresión celular de un género sexual (masculino o femenino) en toda la gónada de un animal, en este caso, de un molusco bivalvo. Una fase sexual es el conjunto de series gametogénicas (SG) correspondientes a un género sexual que actualmente están en desarrollo, o son ya maduras, en la gónada de un molusco. La fase sexual es un concepto global, se expresa en toda la gónada del animal y reúne a todas las series gametogénicas correspondientes a un género sexual (GS). La fase sexual se expresa en sus series gametogénicas. Hay una fase sexual masculina (FS�) y una fase sexual femenina (FS�). La FS� es el conjunto de series gametogénicas masculinas (SG�), y la FS� es el conjunto de series gametogénicas femeninas (SG�). Una fase sexual puede tener diferentes grados de desarrollo en función del nivel de desarrollo de las series gametogénicas que la constituyen. Asímismo, una fase sexual puede tener diferentes cohortes de series gametogénicas que difieren entre sí en su grado de desarrollo. Una gónada está madura cuando su fase sexual está madura, es decir, cuando las series gametogénicas que constituyen la fase sexual han producido los gametos, o sea, han madurado. 8. Madurez gonadal, gónada madura.- Una gónada está madura cuando su fase sexual, o una de sus dos fases sexuales (moluscos bisexuales), está madura, es decir, cuando las series gametogénicas que constituyen la fase sexual han producido los gametos, o sea, han madurado. 9. Cohortes.- Definimos como cohorte de espermatogonias o de ovogonias a un contingente u hornada de cada una de estas estirpes celulares, que se han producido en un tiempo breve y su función es iniciar o repoblar una fase sexual mediante el desarrollo de series gametogénicas. En la formación y desarrollo de una fase sexual intervienen varias cohortes de gonias. Una cohorte de gonias, masculinas o femeninas, produce una cohorte de series gametogénicas masculinas o femeninas, respectivamente. 10. Dioicismo*, monoicismo* y fases sexuales.- Los moluscos bivalvos dioicos tienen la capacidad de expresar sólo una fase sexual en su gónada, que puede ser masculina o femenina. Los moluscos bivalvos monoicos, bisexuales o ambisexuales tienen la capacidad de expresar dos fases sexuales en su gónada, una fase sexual masculina y otra femenina. 11. Moluscos ambisexuales, fase sexual funcional (FSF) y fase sexual no-funcional.- Un molusco ambisexual puede expresar las dos fases sexuales con igual o diferente grado de desarrollo de sus respectivas series gametogénicas. Si lo hace con el mismo grado de desarrollo se denomina hermafrodita simultáneo o funcional. Si lo hace con diferente nivel de desarrollo, entonces la fase sexual que tiene mayor grado de desarrollo –la más avanzada hacia la madurez– la denominamos fase sexual funcional (FSF). La fase sexual funcional determina el sexo funcional del molusco, y es la fase sexual que descargará sus gametos en la próxima puesta. La fase sexual con menor grado de desarrollo, y que no emitirá sus gametos en la próxima puesta, la denominamos fase sexual no-funcional, y esta fase, aunque está presente, no determina el sexo funcional del molusco. Puede haber dos fases sexuales funcionales: fase sexual funcional masculina (FSF�) y fase sexual funcional femenina (FSF�). 12. Moluscos ambisexuales, sexo funcional y sexo no-funcional.- Definimos como sexo funcional de un molusco ambisexual, que no es hermafrodita simultáneo, al sexo correspondiente a su fa- . El sexo funcional es un sexo actual, no es el sexo del individuo, porque realmente tiene dos sexos. El sexo funcional indica el tipo de gametos que el molusco descargará en la próxima puesta y, por tanto, cómo el animal se comportará sexualmente en dicha puesta, si como macho o como hembra. Definimos como sexo no-funcional de un molusco ambisexual, que no es hermafrodita simultáneo, al sexo correspondiente a su fase sexual no-funcional. El sexo no-funcional indica el tipo de gametos que el molusco no-descargará en la próxima puesta. Los moluscos ambisexuales que son hermafroditas simultáneos no tienen sexo funcional ni tampoco sexo no-funcional porque desarrollan, maduran y descargan las fases sexuales masculina y femenina simultáneamente. 13. Moluscos ambisexuales hermafroditas* y no-hermafroditas*.- Un molusco ambisexual que produce sus dos fases sexuales con igual grado de desarrollo es un animal hermafrodita, hermafrodita simultáneo, hermafrodita funcional o hermafrodita estricto. Un molusco que no lo hace así, o sea, que desarrolla sus dos fases sexuales con diferente grado de desarrollo no es un molusco hermafrodita, sólo es un molusco ambisexual o bisexual. Son hermafroditas estrictos los pectínidos Pecten maximus (vieira) y Aequipecten opercularis (volandeira). No son hermafroditas estrictos, sólo son ambisexuales, los bivalvos del género Ostrea y el pectínido Chlamys varia (Iglesias, 2012). Elementos para elaborar estos conceptos proceden de Coe (1943b). 14. Moluscos ambisexuales y folículos gonadales*.- Los moluscos ambisexuales pueden desarrollar sus dos fases sexuales en un mismo folículo gonadal o en folículos diferentes. Cuando lo hacen en un mismo folículo se denominan, además, intersexuales. Para los moluscos que lo hacen en folículos diferentes no hay actualmente un término que lo designe. Son moluscos intersexuales los bivalvos del género Ostrea, el pectínido Chlamys varia (zamburiña) (Iglesias, 2012) y el larvíparo –broma ("shipworm")– Teredo navalis. Los pectínidos Pecten maximus (vieira) y Aequipecten opercularis (volandeira) desarrollan las dos fases sexuales en folículos gonadales diferentes. Elementos para elaborar este concepto proceden de Policansky (1982). 15. Moluscos ambisexuales, cambio de fase sexual y cambio de sexo a) Los bivalvos ambisexuales que son hermafroditas estrictos nunca cambian de fase sexual, ni de sexo, ni dentro de un mismo periodo reproductivo, ni de un periodo reproductivo al siguiente. En cada ciclo reproductivo desarrollan y descargan ambas fases sexuales, la masculina y la femenina. b) Hay bivalvos que cambian de fase sexual pero no cambian de sexo, y hay otros que cambian de fase sexual y esto implica el cambio de sexo. La cuestión estriba en que el cambio de fase sexual no siempre implica un cambio de sexo. c) Definimos el cambio de fase sexual como un cambio de fase sexual funcional, es decir, como el cambio de una fase sexual funcional de un sexo a la fase sexual funcional del otro sexo; o sea, el cambio de la FSF� a la FSF� o a la inversa. Para que ocurra el cambio de fase sexual funcional tiene que suceder lo siguiente: a) el molusco desarrolla la fase sexual funcional de un sexo, por ejemplo la FSF�, y realiza la descarga (puesta) de esta fase; b) seguidamente desarrolla la fase sexual funcional del otro sexo, en este caso la FSF�, para realizar posteriormente su descarga (puesta). Cuando se cumplen estas dos condiciones decimos que ocurre un cambio de fase sexual. Los cambios de fase sexual suceden después y a continuación de las puestas. d) Cambio de fase sexual pero sin cambio de sexo.- Hay moluscos que desarrollan dos o más fases sexuales funcionales de diferente sexo en un mismo periodo reproductivo, es el caso de las ostras larvíparas (Ostra edulis, Ostrea lurida). Estos bivalvos cambian de fase sexual pero no cambian de sexo. e) Cambio de fase sexual con cambio de sexo.- Hay bivalvos que en cada ciclo reproductivo sólo desarrollan una fase sexual funcional, es el caso de las ostras ovíparas (Ostrea virginica, Crassostrea gigas, Ostrea angulata) y del pectínido Chlamys varia (Iglesias, 2012). Cuando estos moluscos desarrollan una fase sexual funcional de un sexo durante un periodo reproductivo y en el ciclo reproductivo siguiente producen la fase sexual funcional del otro sexo, entonces decimos que ocurrió un cambio de sexo, o sea, el animal cambió de sexo. En estos bivalvos el cambio de fase sexual funcional conlleva el cambio de sexo y, así mismo, el cambio de sexo implica el cambio de fase sexual funcional. Cuando hay cambio de sexo, éste ocurre a continuación de la puesta de la fase sexual funcional. f) El concepto de cambio de sexo impone tres condiciones: a) el individuo tiene que desarrollar sólo una fase sexual funcional de un sexo durante un periodo reproductivo; b) en el siguiente ciclo reproductivo tiene que desarrollar la fase sexual funcional del otro sexo; c) en un mismo periodo reproductivo no tiene que desarrollar dos fases sexuales funcionales. g) Por tanto, el cambio de sexo es un cambio de sexo funcional y sólo ocurre de un periodo reproductivo al siguiente, o sea, entre periodos reproductivos contiguos; nunca sucede dentro de un mismo periodo reproductivo. El cambio de sexo sólo ocurre después de la puesta. h) Así que, el cambio de fase sexual funcional no siempre implica un cambio de sexo funcional, pero el cambio de sexo funcional siempre requiere un cambio de fase sexual funcional. Wesley R. Coe es el autor que con mayor extensión trata el cambio de sexo en los moluscos bivalvos, pero no se detiene a definirlo; aún así, en sus publicaciones (Coe, 1932, 1934, 1943a, 1943b) se vislumbra parte del concepto que aquí definimos. 16. Ciclo reproductivo, ciclo gonadal y periodo reproductivo.- La gónada de los moluscos bivalvos es un sistema que exhibe una evolución temporal recurrente, es decir, una evolución en la que el sistema retorna sin cesar a un estado próximo, o semejante, a otros que ya ha visitado en el pasado; en consecuencia, la gónada realiza ciclos que tienen un periodo temporal asociado. Definimos como ciclo reproductivo de un molusco bivalvo a la totalidad de procesos celulares que ocurren en la gónada del animal y conducen a la producción y descarga de gametos; estos procesos suceden de forma secuencial y cíclica, de ahí su nombre. Como en un ciclo reproductivo la gónada hace un ciclo de tales procesos celulares, también al ciclo reproductivo se le denomina ciclo gonadal. También, se alude al ciclo reproductivo con el nombre de ciclo gametogénico, pero no es correcto hacerlo porque el campo de ambos conceptos sólo se superpone en el caso de los moluscos dioicos; en los bivalvos monoicos el concepto de ciclo reproductivo es más amplio que el de ciclo gametogénico. Además, la gametogénesis es un fenómeno que ocurre dentro de un ciclo reproductivo o ciclo gonadal. Definimos como periodo reproductivo a la extensión temporal en la que ocurre un ciclo reproductivo, es decir, a la duración de un ciclo reproductivo. a) Un ciclo gonadal dura aproximadamente 1 año, por tanto, el periodo reproductivo es de 1 año, y generalmente se extiende desde el inicio del otoño de un año hasta el final del verano del año siguiente. b) Un ciclo gonadal se inicia con la formación o restauración de la gónada, continúa con la gametogénesis y finaliza con la descarga de los gametos. c) En cada periodo reproductivo el molusco construye una única gónada que, a su vez, sólo hace un ciclo gonadal. Es decir, cuando se cumple un periodo reproductivo, la gónada retorna a su situación inicial y emprende un nuevo ciclo. d) Si el molusco es dioico, en cada ciclo gonadal el animal desarrolla, madura y descarga sólo una fase sexual, masculina o femenina. e) Si el molusco es monoico –ambisexual, bisexual– en cada ciclo reproductivo el animal puede desarrollar y descargar una, dos o más fases sexuales; si desarrolla dos o más fases sexuales, normalmente son de distinto sexo y estas fases se suceden alternándose. 17. Clase sexual.- El concepto de clase sexual se aplica a los moluscos bivalvos ambisexuales que no son hermafroditas simultáneos, o sea, se aplica a los moluscos bivalvos que son intersexuales y asincrónicos. La determinación de la clase sexual requiere el estudio histológico de la gónada del animal. a) Definimos como clase sexual a una combinación del grado de desarrollo de las fases sexuales masculina y femenina en la gónada del molusco. La clase sexual es un concepto funcional que contempla el número de fases sexuales en desarrollo y su grado de progreso. b) La asignación de clases sexuales a este tipo de moluscos es una herramienta útil para estudiar cómo el molusco maneja el desarrollo de sus fases sexuales en un ciclo reproductivo natural, en su historia de vida y en los experimentos de acondicionamiento. c) Un individuo ambisexual que tiene sexualidad consecutiva –el pectínido Chlamys varia (Iglesias, 2012)– o sexualidad alternativa (Ostrea virginica, Crassostrea gigas, Ostrea angulata) (Coe, 1943b), puede experimentar una o más clases sexuales en su historia de vida; también, la especie –o una población de la misma– puede estar constituida por individuos que tienen clases sexuales diferentes. d) Un individuo ambisexual que tiene sexualidad consecutiva rítmica (Coe, 1943b) –caso de Ostrea edulis y de Ostrea lurida– puede experimentar varias clases sexuales en un ciclo reproductivo, así como en su historia de vida. También, la especie –o una población de la misma– puede estar estructurada en un momento determinado por individuos con clases sexuales diferentes. e) El concepto de clase sexual que aquí definimos es análogo al concepto de condición sexual utilizado, pero no definido, por Wesley R. Coe (Coe, 1943b). 18. Sexualidad de un molusco bivalvo ambisexual.- Definimos la sexualidad de un molusco bivalvo ambisexual como el modo de expresión de sus fases sexuales, masculina y femenina, durante su historia de vida. Partiendo de aquí, la conjunción de la sexualidad de los moluscos bivalvos ambisexuales con su periodo reproductivo genera los tipos de sexualidad de tales moluscos. En cuanto a estos tipos de sexualidad, aceptamos los tipos de sexualidad propuestos por Wesley R. Coe (Coe, 1943b), que damos aquí por reproducidos, y no tenemos nada más que añadir. d) Cambio de fase sexual pero sin cambio de sexo.- Hay moluscos que desarrollan dos o más fases sexuales funcionales de diferente sexo en un mismo periodo reproductivo, es el caso de las ostras larvíparas (Ostra edulis, Ostrea lurida). Estos bivalvos cambian de fase sexual pero no cambian de sexo. e) Cambio de fase sexual con cambio de sexo.- Hay bivalvos que en cada ciclo reproductivo sólo desarrollan una fase sexual funcional, es el caso de las ostras ovíparas (Ostrea virginica, Crassostrea gigas, Ostrea angulata) y del pectínido Chlamys varia (Iglesias, 2012). Cuando estos moluscos desarrollan una fase sexual funcional de un sexo durante un periodo reproductivo y en el ciclo reproductivo siguiente producen la fase sexual funcional del otro sexo, entonces decimos que ocurrió un cambio de sexo, o sea, el animal cambió de sexo. En estos bivalvos el cambio de fase sexual funcional conlleva el cambio de sexo y, así mismo, el cambio de sexo implica el cambio de fase sexual funcional. Cuando hay cambio de sexo, éste ocurre a continuación de la puesta de la fase sexual funcional. f) El concepto de cambio de sexo impone tres condiciones: a) el individuo tiene que desarrollar sólo una fase sexual funcional de un sexo durante un periodo reproductivo; b) en el siguiente ciclo reproductivo tiene que desarrollar la fase sexual funcional del otro sexo; c) en un mismo periodo reproductivo no tiene que desarrollar dos fases sexuales funcionales. g) Por tanto, el cambio de sexo es un cambio de sexo funcional y sólo ocurre de un periodo reproductivo al siguiente, o sea, entre periodos reproductivos contiguos; nunca sucede dentro de un mismo periodo reproductivo. El cambio de sexo sólo ocurre después de la puesta. h) Así que, el cambio de fase sexual funcional no siempre implica un cambio de sexo funcional, pero el cambio de sexo funcional siempre requiere un cambio de fase sexual funcional. Wesley R. Coe es el autor que con mayor extensión trata el cambio de sexo en los moluscos bivalvos, pero no se detiene a definirlo; aún así, en sus publicaciones (Coe, 1932, 1934, 1943a, 1943b) se vislumbra parte del concepto que aquí definimos. 16. Ciclo reproductivo, ciclo gonadal y periodo reproductivo.- La gónada de los moluscos bivalvos es un sistema que exhibe una evolución temporal recurrente, es decir, una evolución en la que el sistema retorna sin cesar a un estado próximo, o semejante, a otros que ya ha visitado en el pasado; en consecuencia, la gónada realiza ciclos que tienen un periodo temporal asociado. Definimos como ciclo reproductivo de un molusco bivalvo a la totalidad de procesos celulares que ocurren en la gónada del animal y conducen a la producción y descarga de gametos; estos procesos suceden de forma secuencial y cíclica, de ahí su nombre. Como en un ciclo reproductivo la gónada hace un ciclo de tales procesos celulares, también al ciclo reproductivo se le denomina ciclo gonadal. También, se alude al ciclo reproductivo con el nombre de ciclo gametogénico, pero no es correcto hacerlo porque el campo de ambos conceptos sólo se superpone en el caso de los moluscos dioicos; en los bivalvos monoicos el concepto de ciclo reproductivo es más amplio que el de ciclo gametogénico. Además, la gametogénesis es un fenómeno que ocurre dentro de un ciclo reproductivo o ciclo gonadal. Definimos como periodo reproductivo a la extensión temporal en la que ocurre un ciclo reproductivo, es decir, a la duración de un ciclo reproductivo. a) Un ciclo gonadal dura aproximadamente 1 año, por tanto, el periodo reproductivo es de 1 año, y generalmente se extiende desde el inicio del otoño de un año hasta el final del verano del año siguiente. b) Un ciclo gonadal se inicia con la formación o restauración de la gónada, continúa con la gametogénesis y finaliza con la descarga de los gametos. c) En cada periodo reproductivo el molusco construye una única gónada que, a su vez, sólo hace un ciclo gonadal. Es decir, cuando se cumple un periodo reproductivo, la gónada retorna a su situación inicial y emprende un nuevo ciclo. d) Si el molusco es dioico, en cada ciclo gonadal el animal desarrolla, madura y descarga sólo una fase sexual, masculina o femenina. e) Si el molusco es monoico –ambisexual, bisexual– en cada ciclo reproductivo el animal puede desarrollar y descargar una, dos o más fases sexuales; si desarrolla dos o más fases sexuales, normalmente son de distinto sexo y estas fases se suceden alternándose. 17. Clase sexual.- El concepto de clase sexual se aplica a los moluscos bivalvos ambisexuales que no son hermafroditas simultáneos, o sea, se aplica a los moluscos bivalvos que son intersexuales y asincrónicos. La determinación de la clase sexual requiere el estudio histológico de la gónada del animal. a) Definimos como clase sexual a una combinación del grado de desarrollo de las fases sexuales masculina y femenina en la gónada del molusco. La clase sexual es un concepto funcional que contempla el número de fases sexuales en desarrollo y su grado de progreso. b) La asignación de clases sexuales a este tipo de moluscos es una herramienta útil para estudiar cómo el molusco maneja el desarrollo de sus fases sexuales en un ciclo reproductivo natural, en su historia de vida y en los experimentos de acondicionamiento. c) Un individuo ambisexual que tiene sexualidad consecutiva –el pectínido Chlamys varia (Iglesias, 2012)– o sexualidad alternativa (Ostrea virginica, Crassostrea gigas, Ostrea angulata) (Coe, 1943b), puede experimentar una o más clases sexuales en su historia de vida; también, la especie –o una población de la misma– puede estar constituida por individuos que tienen clases sexuales diferentes. d) Un individuo ambisexual que tiene sexualidad consecutiva rítmica (Coe, 1943b) –caso de Ostrea edulis y de Ostrea lurida– puede experimentar varias clases sexuales en un ciclo reproductivo, así como en su historia de vida. También, la especie –o una población de la misma– puede estar estructurada en un momento determinado por individuos con clases sexuales diferentes. e) El concepto de clase sexual que aquí definimos es análogo al concepto de condición sexual utilizado, pero no definido, por Wesley R. Coe (Coe, 1943b). 18. Sexualidad de un molusco bivalvo ambisexual.- Definimos la sexualidad de un molusco bivalvo ambisexual como el modo de expresión de sus fases sexuales, masculina y femenina, durante su historia de vida. Partiendo de aquí, la conjunción de la sexualidad de los moluscos bivalvos ambisexuales con su periodo reproductivo genera los tipos de sexualidad de tales moluscos. En cuanto a estos tipos de sexualidad, aceptamos los tipos de sexualidad propuestos por Wesley R. Coe (Coe, 1943b), que damos aquí por reproducidos, y no tenemos nada más que añadir. Índice 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 27 1.1 Cultivo de moluscos ............................................................................................................................ 29 1.2 La Ostricultura..................................................................................................................................... 30 1.3 Ostricultura en España ....................................................................................................................... 33 1.4 Condiciones climatológicas de Alicante .......................................................................................... 34 1.5 Ostrea edulis ........................................................................................................................................ 38 1.5.1 Clasificación ................................................................................................................................ 38 1.5.2 Características morfológicas ..................................................................................................... 39 1.5.3 Biología ........................................................................................................................................ 39 1.5.4 Ciclo vital .................................................................................................................................... 42 1.5.5 Cultivo de Ostrea edulis ............................................................................................................ 44 1.5.6 Distribución geográfica y limitaciones en la producción de Ostrea edulis ........................ 49 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................... 55 3. MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................................................................... 59 3.1 Material biológico ............................................................................................................................... 61 3.1.1 Medio natural ............................................................................................................................. 61 3.1.2 Acondicionamientos .................................................................................................................. 64 3.2 Procesado histológico de las muestras ............................................................................................. 68 3.3 Recogida de datos ................................................................................................................................ 71 3.4 Procesado de datos .............................................................................................................................. 73 4. MORFOGÉNESIS DE LA GÓNADA .................................................................................................... 77 4.1 Origen de la gónada, líneas germinales sexuales, espermatogonias y ovogonias ....................... 79 4.2 Morfogénesis de la gónada ................................................................................................................. 83 4.3 Evolución (crecimiento) de la gónada .............................................................................................. 86 4.4 Tejido de reserva.................................................................................................................................. 89 4.5 Discusión .............................................................................................................................................. 90 5. LÍNEAS GERMINALES Y GAMETOGÉNESIS ................................................................................... 91 5.1 Génesis de las espermatogonias y de las ovogonias ........................................................................ 93 5.2 Origen de la gónada y procedencia de la masa celular conjuntiva (MCC ................................... 95 5.3 Sexualización de las espermatogonias primarias y de las ovogonias ........................................... 95 5.4 Evolución de las espermatogonias primarias y de las ovogonias en el seno de la masa celular conjuntiva (MCC ........................................................................................................................................... 95 5.5 Composición de la masa celular conjuntiva (MCC) en espermatogonias primarias y en ovogonias .......................................................................................................................................................97 5.6 Espermatogénesis y serie gametogénica masculina ........................................................................ 98 5.6.1 Espermatogonias primarias y secundarias ........................................................................... 103 5.6.2 Espermatocitos primarios ....................................................................................................... 103 5.6.3 Meiosis ....................................................................................................................................... 103 5.7 Fagocitosis de espermatozoides ....................................................................................................... 110 5.8 Ovogonias, ovogénesis y serie gametogénica femenina ............................................................... 111 5.8.1 Ovogonias ................................................................................................................................. 111 5.8.2 Ovogénesis y serie gametogénica femenina ......................................................................... 112 5.8.2.1 Meiosis, vitelogénesis y cuerpos de Balbiani ............................................................ 115 5.9 Atresia ovocitaria ............................................................................................................................... 124 5.10 Fecundidad de Ostrea edulis. Huevos: tamaño, cantidad y modalidad de puesta. Desarrollo embrionario .................................................................................................................................................. 125 5.11 Discusión .......................................................................................................................................... 129 5.11.1 Origen de las espermatogonias y de las ovogonias ........................................................... 129 5.11.2 Masa celular conjuntiva ........................................................................................................ 131 5.11.3 Serie gametogénica masculina ............................................................................................ 131 5.11.4 Serie gametogénica femenina .............................................................................................. 132 5.11.5 Cuerpos de Balbiani .............................................................................................................. 133 5.11.6 Atresia ovocitaria .................................................................................................................. 133 5.11.7 Dinámica de las fases sexuales masculina y femenina ..................................................... 133 6. CLASES SEXUALES Y REPOSO Y RESTAURACIÓN DE LA GÓNADA ..................................... 135 6.1 Conceptos de Clase Sexual y de Sexo Funcional, y su aplicación a Ostrea edulis .................... 137 6.2 Descripción de las clases sexuales que se proponen para Ostrea edulis .................................... 139 6.2.1 Clase sexual sin fases sexuales en desarrollo ........................................................................ 139 6.2.2 Clases sexuales con una fase sexual en desarrollo ............................................................... 140 6.2.3 Clases sexuales con dos fases sexuales en desarrollo...........................................................142 6.2.4 Reposo y Restauración de la gónada ..................................................................................... 152 6.3 Discusión ............................................................................................................................................ 159 7. CAMBIO DE SEXO Y ESTADIO DE REPOSO-RESTAURACIÓN ................................................ 167 7.1 Planteamiento del cambio de sexo en Ostrea edulis ..................................................................... 169 7.2 Cambio de sexo y estadio de Reposo-Restauración en el medio natural .................................. 169 7.2.1 Cambio de sexo y estadio de Reposo-Restauración en animales de 0 años ..................... 171 7.2.2 Cambio de sexo y estadio de Reposo-Restauración en animales de 1 año ....................... 174 7.2.3 Cambio de sexo y estadio de Reposo-Restauración en animales de 2 años ..................... 176 7.3 Cambio de sexo y estadio de Reposo-Restauración en los experimentos de acondicionamiento ...177 7.3.1 Estadio de Reposo-Restauración en las ostras de 0 años sometidas a acondicionamiento ......179 7.3.2 Estadio de Reposo-Restauración en las ostras de 1 año sometidas a acondicionamiento .......179 7.3.3 Cambio de Fase Sexual de macho a hembra y viceversa en ostras de 0 años sometidas a acondicionamiento ...................................................................................................................................... 182 7.3.4 Cambio de Fase Sexual de macho a hembra y viceversa en ostras de 1 año sometidas a acondicionamiento ...................................................................................................................................... 185 7.4 Discusión ............................................................................................................................................ 189 7.4.1 Estadio de Reposo-Restauración ........................................................................................... 189 7.4.2 Cambio de Fase Sexual ............................................................................................................ 189 8. CICLO NATURAL .................................................................................................................................. 191 8.1 Fases Sexuales funcionales ............................................................................................................... 193 8.1.1 Población Junio 08 .................................................................................................................... 193 8.1.1.1 Resumen de los resultados de la evolución de las fases sexuales funcionales de la población 08 en el medio natural .............................................................................................................. 200 8.1.2 Población Junio 07 .................................................................................................................... 200 8.1.2.1 Resumen de los resultados de la evolución de las fases sexuales funcionales de la población 07 en el medio natural .............................................................................................................. 206 8.1.3 Población Junio 09 ................................................................................................................... 206 8.1.3.1 Resumen de los resultados de la evolución de las fases sexuales funcionales de la población 09 en el medio natural .............................................................................................................. 208 8.1.4 Resumen general de la estacionalidad de las Fases Sexuales .............................................. 208 8.2 Sexo funcional y clases sexuales ...................................................................................................... 209 8.2.1 Población Junio 08 ................................................................................................................... 210 8.2.1.1 Resumen de los resultados de la evolución de las funcionalidades sexuales y las clases sexuales de la población 08 en el medio natural .......................................................................... 217 8.2.2 Población Junio 07 .................................................................................................................... 219 8.2.2.1 Resumen de los resultados de la evolución de las funcionalidades sexuales y las clases sexuales de la población 07 en el medio natural .......................................................................... 226 8.2.3 Población Junio 09 ................................................................................................................... 227 8.2.3.1 Resumen de los resultados de la evolución de las funcionalidades sexuales y las clases sexuales de la población 09 en el medio natural .......................................................................... 230 8.2.4 Resumen general de la funcionalidad sexual y las clases sexuales .................................... 231 8.3 Discusión ............................................................................................................................................ 232 9. ACONDICIONAMIENTOS .................................................................................................................. 243 9.1 Acondicionamiento 1: Efecto del fotoperiodo, la temperatura y la edad .................................. 245 9.1.1 Efecto del acondicionamiento 1 sobre el desarrollo de las Fases Sexuales ....................... 246 9.1.1.1 Resumen de los efectos del acondicionamiento 1 sobre el desarrollo de las Fases Sexuales ......................................................................................................................................................... 255 9.1.2 Efecto del acondicionamiento 1 sobre el sexo (funcionalidad sexual) y las clases sexuales ..... 256 9.1.2.1 Resumen de los efectos del acondicionamiento 1 sobre la funcionalidad y las clases sexuales ......................................................................................................................................................... 266 9.2 Acondicionamiento 2: Efecto del fotoperiodo y la edad .............................................................. 270 9.2.1 Efecto del acondicionamiento 2 sobre el desarrollo de las Fases Sexuales ....................... 270 9.2.1.1 Resumen de los efectos del acondicionamiento 2 sobre las fases sexuales a través de sus series gametogénicas ....................................................................................................................... 279 9.2.2 Efecto del fotoperiodo sobre el sexo (funcionalidad sexual) y las clases sexuales .......... 280 9.2.2.1 Resumen de los efectos del acondicionamiento 2 sobre la funcionalidad sexual y las clases sexuales ........................................................................................................................................ 287 9.3 Acondicionamiento 3: Efecto del fotoperiodo sobre la gónada en desarrollo .......................... 289 Capítulo 1 La producción de moluscos se extiende por todos los continentes, y cada país destaca por la producción de una o varias especies. Estas especies pueden ser autóctonas o importadas para su cultivo, por su alta capacidad de adaptación y crecimiento en la región a introducir (Fig. 1.3). Principales países productores de moluscos Países Especies España, Francia, Holanda y Filipinas Mejillones Mytilus edulis Mytilus smaragdinus Japón, Corea, España, Francia, Portugal, Gran Bretaña, Australia, Nueva Zelanda, Estados Unidos Ostras Ostrea edulis Crassostrea angulata Crassostrea gigas Crassostrea virginica Crassostrea commercialis Sudeste Asiático, España, Francia, Gran Bretaña, Estados Unidos Almejas Tapes decussata Tapes pullastra Tapes japonica Mercenaria nercenaria Japón Abulones Haliotis discus Fig. 1.3. Tabla de los principales países productores de moluscos. Fuente: Cifuentes et al, 2006 1.2 La ostricultura El consumo de ostras como producto de lujo se estableció en el Imperio Romano. En esta época, la ostricultura se limitaba a recolectar ostras del medio natural y engordarlas en estanques de pantanos salados (FAO, 2006). En el siglo XVIII, el consumo de ostras llegó a su punto máximo (Cifuentes 4 Introducción et al, 2006). Durante los S. XVIII y XIX, se produjo una sobreexplotación de los bancos naturales de ostras, con lo que fue preciso desarrollar sistemas para la captura de semilla de ostras para su posterior engorde (FAO, 2006). Existen un alto número de especies de ostras cultivadas con distinto grado de interés comercial (alimentación, producción de perlas…) (Fig. 1.4). Ostras y ostiones de interés comercial Ostrea edulis Ostra plana o europea Ostrea lurida Ostra de California Ostrea angulata Ostra portuguesa Ostrea crynusi Ostra de Córcega Ostrea commercialiis Ostra de Argentina Ostrea nippona Ostra de Japón Crassostrea virginica Ostión americano Crassostrea rhizophorae Ostra del mangle Crassostrea gigas Ostión japonés Crassostrea madresensis Ostión de Filipinas Fig. 1.4. Tabla de los ostreidos de interés comercial. Fuente: Cifuentes et al, 2006 Cada especie tiene unos requerimientos de temperatura, fotoperiodo, alimentación y salinidad específicos; estos requerimientos son los que determinan la distribución natural de las distintas especies, y por lo tanto su cultivo (Fig. 1.5). Hay especies que tienen una buena adaptación, en relación a la reproducción y el crecimiento, en áreas geográficas donde no se localizan naturalmente; en caso de que estas especies tengan un interés comercial pueden ser importadas para su cultivo. 5 30 Capítulo 1 La producción de moluscos se extiende por todos los continentes, y cada país destaca por la producción de una o varias especies. Estas especies pueden ser autóctonas o importadas para su cultivo, por su alta capacidad de adaptación y crecimiento en la región a introducir (Fig. 1.3). Principales países productores de moluscos Países Especies España, Francia, Holanda y Filipinas Mejillones Mytilus edulis Mytilus smaragdinus Japón, Corea, España, Francia, Portugal, Gran Bretaña, Australia, Nueva Zelanda, Estados Unidos Ostras Ostrea edulis Crassostrea angulata Crassostrea gigas Crassostrea virginica Crassostrea commercialis Sudeste Asiático, España, Francia, Gran Bretaña, Estados Unidos Almejas Tapes decussata Tapes pullastra Tapes japonica Mercenaria nercenaria Japón Abulones Haliotis discus Fig. 1.3. Tabla de los principales países productores de moluscos. Fuente: Cifuentes et al, 2006 1.2 La ostricultura El consumo de ostras como producto de lujo se estableció en el Imperio Romano. En esta época, la ostricultura se limitaba a recolectar ostras del medio natural y engordarlas en estanques de pantanos salados (FAO, 2006). En el siglo XVIII, el consumo de ostras llegó a su punto máximo (Cifuentes 4 Introducción et al, 2006). Durante los S. XVIII y XIX, se produjo una sobreexplotación de los bancos naturales de ostras, con lo que fue preciso desarrollar sistemas para la captura de semilla de ostras para su posterior engorde (FAO, 2006). Existen un alto número de especies de ostras cultivadas con distinto grado de interés comercial (alimentación, producción de perlas…) (Fig. 1.4). Ostras y ostiones de interés comercial Ostrea edulis Ostra plana o europea Ostrea lurida Ostra de California Ostrea angulata Ostra portuguesa Ostrea crynusi Ostra de Córcega Ostrea commercialiis Ostra de Argentina Ostrea nippona Ostra de Japón Crassostrea virginica Ostión americano Crassostrea rhizophorae Ostra del mangle Crassostrea gigas Ostión japonés Crassostrea madresensis Ostión de Filipinas Fig. 1.4. Tabla de los ostreidos de interés comercial. Fuente: Cifuentes et al, 2006 Cada especie tiene unos requerimientos de temperatura, fotoperiodo, alimentación y salinidad específicos; estos requerimientos son los que determinan la distribución natural de las distintas especies, y por lo tanto su cultivo (Fig. 1.5). Hay especies que tienen una buena adaptación, en relación a la reproducción y el crecimiento, en áreas geográficas donde no se localizan naturalmente; en caso de que estas especies tengan un interés comercial pueden ser importadas para su cultivo. 5 31 Capítulo 1 Condiciones para la reproducción de las principales especies de ostras comerciales Especies Época de reproducción Temperatura en ºC Salinidad (0/00) Ostrea edulis Junio-septiembre 20 o + 25 o + Ostrea commercialiis Junio-diciembre 21-23 15-30 Crassostrea virginica Abril-noviembre 20 ó + 10-32 Crassostrea rizophorae Mayo-septiembre 20 ó + 22-40 Crassostrea gigas Mayo-septiembre 19-25 23-28 Fig. 1.5. Requerimientos ambientales para la reproducción de las principales especies de ostras comerciales. Fuente: Cifuentes et al, 2006 Sin embargo, estas condiciones pueden variar según la región geográfica donde se localicen, es decir, una misma especie puede tener distintos requerimientos según el área geográfica donde se desarrolla, es lo que se denominan razas fisiológicas (Loosanoff, 1962). Según las condiciones ambientales propias de cada región geográfica, y las condiciones requeridas por las distintas especies, cada país destaca por la producción de una o varias especies, que son las que tienen un mejor rendimiento en reproducción y crecimiento (Fig. 1.6). País Especie Francia, Japón, Estados Unidos Crassostrea gigas Australia Crassostrea commercialiis Nigeria Ostrea gasar Ostrea tilipa Cuba y Venezuela Crassostrea rhizophorae México Crassostrea virginica Crassostrea chilensis Crassostrea cortiziensis Crassostrea gigas Fig. 1.6. Especies de ostras cultivadas por los mayores productores .Tabla realizada según los datos de la FAO 2010 6 Introducción 1.3 Ostricultura en España España es el 14º productor mundial de ostra y el 3º de la UE (Fig. 1.7). Fig. 1.7. Gráficos de la cantidad de ostras producidas por los mayores productores, mundiales y de la Unión Europea. Fuente: FAO, 2010 En el año 1999, España produjo 4.070 toneladas de ostras, lo que ha significado un incremento del 12 por ciento en relación a 1998. Esta producción representa un récord de la ostricultura española en la década de los 90, aunque el máximo histórico fue alcanzado en 1972, con 6.700 toneladas (Polanco et al, 2002). Principalmente se cultivan dos especies de ostra: la ostra plana (Ostrea edulis) y el ostión japonés (Crassostrea gigas). La ostra plana es la más importante, y representó, en el año de 1999, el 82 por ciento de la producción, mientras que la ostra japonesa sólo el 17 por ciento (Polanco et al, 2002) La producción de la ostra plana se centra, principalmente, en Galicia. El ostión japonés se reparte entre Galicia, la costa cantábrica, el Delta del Ebro y la región sur atlántica. De la producción total de ostras, en 1999, el 10,8 por ciento correspondió a capturas (Polanco et al, 2002) La industria de la ostricultura española consta, principalmente de pequeñas empresas familiares, lo que determina las características y tecnología de la producción. De hecho, la tecnología utilizada continúa siendo de carácter artesanal. Como consecuencia de esta tecnología desfasada, la producción de ostra prácticamente se limita al engorde de semilla procedente de países mediterráneos, con los consecuentes problemas de importación de patógenos asociados (Polanco et al, 2002) Sin embargo, en el Cantábrico, en la ría de Tinamenor, hay una experiencia pionera, donde se producen larvas y semilla de ostra, con lo que se cierra el ciclo biológico del animal y se optimiza la producción, con lo que España posee la tecnología necesaria, pero esta no está extendida (Polanco et al, 2002) Galicia tiene un gran potencial para la producción de ostra, sin embargo en la realidad, este cultivo es muy limitado. Principalmente por la competencia de la producción del mejillón, por la carencia de empresas que produzcan y suministren semilla y la escasez de bancos naturales. Esta baja presencia de bancos naturales se debe a la alta explotación y la mortalidad causada por patógenos introducidos con la semilla importada (Polanco et al, 2002) 7 32 Capítulo 1 Condiciones para la reproducción de las principales especies de ostras comerciales Especies Época de reproducción Temperatura en ºC Salinidad (0/00) Ostrea edulis Junio-septiembre 20 o + 25 o + Ostrea commercialiis Junio-diciembre 21-23 15-30 Crassostrea virginica Abril-noviembre 20 ó + 10-32 Crassostrea rizophorae Mayo-septiembre 20 ó + 22-40 Crassostrea gigas Mayo-septiembre 19-25 23-28 Fig. 1.5. Requerimientos ambientales para la reproducción de las principales especies de ostras comerciales. Fuente: Cifuentes et al, 2006 Sin embargo, estas condiciones pueden variar según la región geográfica donde se localicen, es decir, una misma especie puede tener distintos requerimientos según el área geográfica donde se desarrolla, es lo que se denominan razas fisiológicas (Loosanoff, 1962). Según las condiciones ambientales propias de cada región geográfica, y las condiciones requeridas por las distintas especies, cada país destaca por la producción de una o varias especies, que son las que tienen un mejor rendimiento en reproducción y crecimiento (Fig. 1.6). País Especie Francia, Japón, Estados Unidos Crassostrea gigas Australia Crassostrea commercialiis Nigeria Ostrea gasar Ostrea tilipa Cuba y Venezuela Crassostrea rhizophorae México Crassostrea virginica Crassostrea chilensis Crassostrea cortiziensis Crassostrea gigas Fig. 1.6. Especies de ostras cultivadas por los mayores productores .Tabla realizada según los datos de la FAO 2010 6 Introducción 1.3 Ostricultura en España España es el 14º productor mundial de ostra y el 3º de la UE (Fig. 1.7). Fig. 1.7. Gráficos de la cantidad de ostras producidas por los mayores productores, mundiales y de la Unión Europea. Fuente: FAO, 2010 En el año 1999, España produjo 4.070 toneladas de ostras, lo que ha significado un incremento del 12 por ciento en relación a 1998. Esta producción representa un récord de la ostricultura española en la década de los 90, aunque el máximo histórico fue alcanzado en 1972, con 6.700 toneladas (Polanco et al, 2002). Principalmente se cultivan dos especies de ostra: la ostra plana (Ostrea edulis) y el ostión japonés (Crassostrea gigas). La ostra plana es la más importante, y representó, en el año de 1999, el 82 por ciento de la producción, mientras que la ostra japonesa sólo el 17 por ciento (Polanco et al, 2002) La producción de la ostra plana se centra, principalmente, en Galicia. El ostión japonés se reparte entre Galicia, la costa cantábrica, el Delta del Ebro y la región sur atlántica. De la producción total de ostras, en 1999, el 10,8 por ciento correspondió a capturas (Polanco et al, 2002) La industria de la ostricultura española consta, principalmente de pequeñas empresas familiares, lo que determina las características y tecnología de la producción. De hecho, la tecnología utilizada continúa siendo de carácter artesanal. Como consecuencia de esta tecnología desfasada, la producción de ostra prácticamente se limita al engorde de semilla procedente de países mediterráneos, con los consecuentes problemas de importación de patógenos asociados (Polanco et al, 2002) Sin embargo, en el Cantábrico, en la ría de Tinamenor, hay una experiencia pionera, donde se producen larvas y semilla de ostra, con lo que se cierra el ciclo biológico del animal y se optimiza la producción, con lo que España posee la tecnología necesaria, pero esta no está extendida (Polanco et al, 2002) Galicia tiene un gran potencial para la producción de ostra, sin embargo en la realidad, este cultivo es muy limitado. Principalmente por la competencia de la producción del mejillón, por la carencia de empresas que produzcan y suministren semilla y la escasez de bancos naturales. Esta baja presencia de bancos naturales se debe a la alta explotación y la mortalidad causada por patógenos introducidos con la semilla importada (Polanco et al, 2002) 7 33 Capítulo 1 1.4 Condiciones climatológicas de Alicante Como las condiciones ambientales son tan importantes para el desarrollo de los moluscos se pasará a relatar brevemente el clima la región de Alicante, provincia a la que pertenece Santa Pola, el área de donde se obtuvieron los muestreos. Santa Pola pertenece a la Comunidad Valenciana, provincia de Alicante, al sureste de la Península Ibérica. Está bañada por el Mar Mediterráneo, lo que la dota de un clima característico. Fig. 1.8. Mapa de España indicando la localización de Santa Pola. Fig. 1.9. Mapa de Alicante indicando la situación de Santa Pola. 8 Introducción El clima mediterráneo, en Alicante, es una variedad del clima subtropical (clima mediterráneo típico). Se caracteriza por sus inviernos templados; y los veranos secos y calurosos, dominados por el anticiclón de las Azores. Se caracteriza por tener una pluviosidad bastante escasa (500 mm) y concentrada en las estaciones intermedias (primavera y otoño), coincidiendo con el predominio de los vientos del Oeste. Concretamente, Alicante cuenta con un clima mediterráneo árido, las temperaturas oscilan entre los 16,8º C y 6,2º C de enero y los 30,6º C y 20,4º C de agosto, siendo la temperatura media anual de 17,8º C, contándose como excepcionales tanto las heladas como las temperaturas por encima de los 40º C. La oscilación térmica diaria es muy pequeña debido a la influencia marítima, aunque en episodios ocasionales de viento de poniente puede superar los 15ºC (Fig. 1.10). Las precipitaciones son de 336 mm anuales, siendo septiembre y octubre los meses más lluviosos debido al fenómeno conocido como “gota fría”, pudiéndose alcanzar más de 200 mm en 24 horas, lo que puede provocar inundaciones. Esta irregularidad es lo que explica que al año sólo haya 37 días lluviosos mientras que las horas de sol son 2.864 (wikipedia). La nieve es un fenómeno extremadamente raro; se produjo en enero de 1885, diciembre de 1926 (la mayor nevada de los últimos 2 siglos que cuajo en toda la ciudad) y en enero de 1945. Datos climáticos de Alicante 0 5 10 15 20 25 30 35 En ero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Temperatura (ºC) 0 10 20 30 40 50 60 Pl uvi osi sdad (mm) Pluviosidad Tª mínima Tª media Tª máxima Fig. 1.10. Gráfico de las condiciones meteorológicas de Alicante. Fuente: Gráfico realizado con los datos históricos de la Agencia Estatal de Meteorología de 1971-2000 Además de la temperatura y la pluviosidad, otro factor determinante del clima es el fotoperiodo, es decir, el número de horas de luz. El día más corto del año es el 21 de diciembre, momento en que las horas de luz son las mínimas. A partir de este momento, la luz se irá aumentando, hasta el 21 de junio, día más largo del año, y por lo tanto con mayor número de horas de luz; para luego disminuir de nuevo hasta el 21 de diciembre. 9 34 Capítulo 1 1.4 Condiciones climatológicas de Alicante Como las condiciones ambientales son tan importantes para el desarrollo de los moluscos se pasará a relatar brevemente el clima la región de Alicante, provincia a la que pertenece Santa Pola, el área de donde se obtuvieron los muestreos. Santa Pola pertenece a la Comunidad Valenciana, provincia de Alicante, al sureste de la Península Ibérica. Está bañada por el Mar Mediterráneo, lo que la dota de un clima característico. Fig. 1.8. Mapa de España indicando la localización de Santa Pola. Fig. 1.9. Mapa de Alicante indicando la situación de Santa Pola. 8 Introducción El clima mediterráneo, en Alicante, es una variedad del clima subtropical (clima mediterráneo típico). Se caracteriza por sus inviernos templados; y los veranos secos y calurosos, dominados por el anticiclón de las Azores. Se caracteriza por tener una pluviosidad bastante escasa (500 mm) y concentrada en las estaciones intermedias (primavera y otoño), coincidiendo con el predominio de los vientos del Oeste. Concretamente, Alicante cuenta con un clima mediterráneo árido, las temperaturas oscilan entre los 16,8º C y 6,2º C de enero y los 30,6º C y 20,4º C de agosto, siendo la temperatura media anual de 17,8º C, contándose como excepcionales tanto las heladas como las temperaturas por encima de los 40º C. La oscilación térmica diaria es muy pequeña debido a la influencia marítima, aunque en episodios ocasionales de viento de poniente puede superar los 15ºC (Fig. 1.10). Las precipitaciones son de 336 mm anuales, siendo septiembre y octubre los meses más lluviosos debido al fenómeno conocido como “gota fría”, pudiéndose alcanzar más de 200 mm en 24 horas, lo que puede provocar inundaciones. Esta irregularidad es lo que explica que al año sólo haya 37 días lluviosos mientras que las horas de sol son 2.864 (wikipedia). La nieve es un fenómeno extremadamente raro; se produjo en enero de 1885, diciembre de 1926 (la mayor nevada de los últimos 2 siglos que cuajo en toda la ciudad) y en enero de 1945. Datos climáticos de Alicante 0 5 10 15 20 25 30 35 En ero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Temperatura (ºC) 0 10 20 30 40 50 60 Pl uvi osi sdad (mm) Pluviosidad Tª mínima Tª media Tª máxima Fig. 1.10. Gráfico de las condiciones meteorológicas de Alicante. Fuente: Gráfico realizado con los datos históricos de la Agencia Estatal de Meteorología de 1971-2000 Además de la temperatura y la pluviosidad, otro factor determinante del clima es el fotoperiodo, es decir, el número de horas de luz. El día más corto del año es el 21 de diciembre, momento en que las horas de luz son las mínimas. A partir de este momento, la luz se irá aumentando, hasta el 21 de junio, día más largo del año, y por lo tanto con mayor número de horas de luz; para luego disminuir de nuevo hasta el 21 de diciembre. 9 35 Capítulo 1 Número medio de horas de luz/día en Alicante 0 2 4 6 8 10 12 Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Fig. 1.11. Gráfico de las horas de luz (fotoperido) en Alicante. Fuente: Gráfico realizado con los datos históricos de la Agencia Estatal de Meteorología de 1971-2000 Como se puede ver, en Alicante, el mínimo de horas de luz, se produce en el mes de diciembre con, aproximadamente, 5 horas de luz, y el máximo, corresponde a julio, con casi 11 horas de luz (Fig. 1.11). El fotoperiodo es uno de los dos factores que determinan la estacionalidad de muchas actividades fisiológicas de organismos marinos; el otro es la temperatura del agua de mar. Esta fluctúa a lo largo del año siguiendo el mismo patrón que la temperatura ambiental. En la Fig. 1.12 se representa la temperatura superficial del mar desde 1996 hasta 2006. Los meses de enero y febrero son los más fríos, con una temperatura por debajo de los 16º C, a finales de febrero y principios de marzo la temperatura comienza a subir progresivamente hasta alcanzar su máximo en agosto, alcanzando casi los 22º C. A partir de septiembre la temperatura desciende de nuevo hasta alcanzar su mínimo en enero-febrero. 10 Temperatura superficial del Mar Mediterráneo tomada en Andalucía Fig. 1.12. Representación gráfica de la serie mensual de climatologías (promedio de la Temperatura Superficial del Mar de cada mes de la serie temporal 1998-2006) y Fuente: Red de información de Andalucía. Consejería de Medio Ambiente, 2008. la media mensual de la Temperatura Superficial del Mar para cada año. Introducción Temperatura superficial del Mar Mediterráneo tomada en Andalucía Fig. 1.12. Representación gráfica de la serie mensual de climatologías (promedio de la Temperatura Superficial del Mar de cada mes de la serie temporal 1998-2006) y Fuente: Red de información de Andalucía. Consejería de Medio Ambiente, 2008. la media mensual de la Temperatura Superficial del Mar para cada año. Introducción 36 Capítulo 1 Número medio de horas de luz/día en Alicante 0 2 4 6 8 10 12 Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Fig. 1.11. Gráfico de las horas de luz (fotoperido) en Alicante. Fuente: Gráfico realizado con los datos históricos de la Agencia Estatal de Meteorología de 1971-2000 Como se puede ver, en Alicante, el mínimo de horas de luz, se produce en el mes de diciembre con, aproximadamente, 5 horas de luz, y el máximo, corresponde a julio, con casi 11 horas de luz (Fig. 1.11). El fotoperiodo es uno de los dos factores que determinan la estacionalidad de muchas actividades fisiológicas de organismos marinos; el otro es la temperatura del agua de mar. Esta fluctúa a lo largo del año siguiendo el mismo patrón que la temperatura ambiental. En la Fig. 1.12 se representa la temperatura superficial del mar desde 1996 hasta 2006. Los meses de enero y febrero son los más fríos, con una temperatura por debajo de los 16º C, a finales de febrero y principios de marzo la temperatura comienza a subir progresivamente hasta alcanzar su máximo en agosto, alcanzando casi los 22º C. A partir de septiembre la temperatura desciende de nuevo hasta alcanzar su mínimo en enero-febrero. 10 Temperatura superficial del Mar Mediterráneo tomada en Andalucía Fig. 1.12. Representación gráfica de la serie mensual de climatologías (promedio de la Temperatura Superficial del Mar de cada mes de la serie temporal 1998-2006) y Fuente: Red de información de Andalucía. Consejería de Medio Ambiente, 2008. la media mensual de la Temperatura Superficial del Mar para cada año. Introducción Temperatura superficial del Mar Mediterráneo tomada en Andalucía Fig. 1.12. Representación gráfica de la serie mensual de climatologías (promedio de la Temperatura Superficial del Mar de cada mes de la serie temporal 1998-2006) y Fuente: Red de información de Andalucía. Consejería de Medio Ambiente, 2008. la media mensual de la Temperatura Superficial del Mar para cada año. Introducción 37 Capítulo 1 1.5 Ostrea edulis 1.5.1 Clasificación Ostrea edulis (Linnaeus, 1758), denominada ostra común, ostra plana, por su morfología, u ostra europea, por su localización, taxonómicamente se enmarca en: Reino Animalia Filum Mollusca Clase Bivalvia Subclase Pteriomorphia Orden Ostreoida Suborden Ostreina Superfamilia Ostreoidea Familia Ostreidae 1.5.2 Características morfológicas O. edulis es un molusco bivalvo de forma más o menos redondeada, con una concha de superficie escamosa, constituida por dos valvas calcáreas desiguales, la izquierda, cóncava, se fija al sustrato, y la derecha es plana (Fao, 2010). Ambas valvas se articulan entre si en la región dorsal mediante una charnela sin dientes. Un ligamento elástico mantiene las valvas juntas en su parte más estrecha, mientras que un gran músculo central las cierra (FAO, 2010). El color de la concha entra dentro de las gamas de blanco y crema, variando según la región de crecimiento. Suelen presentar fauna epífita asociada (Fig. 1.13). Fig. 1.13. Fotografías, exteriores e interiores, de las dos valvas de una Ostrea edulis. Justo por debajo de la concha se sitúa el manto, constituído por tejido conjuntivo y responsable de la formación de la misma. El manto tiene dos lóbulos que se sueldan en la región anterodorsal para dar el capuchón cefálico, que recubre la boca y los palpos labiales. Entre los dos lóbulos se forma la cavidad paleal, dividida en dos por las branquias, una ventral o inhalante y otra dorsal o exhalante. Las branquias presentan cilios microscópios, cuyos movimientos permiten la nutrición (Polanco et al, 2002). Internamente al manto, en la región anterior, se sitúa la gónada (Fig. 1.14). 12 Introducción Fuente: Polanco et al, 2002 Fig. 1.14. Esquema y fotografía de la anatomía de Ostrea edulis. Antes del primer desarrollo, la gónada consiste en una serie de canales tubulares, llamados canales gonadales que se extienden en el tejido conjuntivo, entre la epidermis y el digestivo (Cole, 1942). El tejido conjuntivo está compuesto por células de almacenamiento de reservas energéticas, y tiene numerosos canales hemolinfáticos (Franco et al, 2008). Los gametos maduros se expulsan a través de un único gonoducto mediante el movimiento ciliar de las células que lo tapizan (Polanco et al, 2002) Por debajo de la gónada se localiza el hepatopáncreas o glándula digestiva. El sistema digestivo está constituido por un orificio bucal con dos pares de palpos, un corto esófago, un estómago con un estilete cristalino, un hepatopáncreas constituido por una masa de divertículos digestivos y un orificio anal (Polanco et al, 2002). 1.5.3 Biología Ostrea edulis es hermafrodita simultáneo, tiene potencialidad para producir gametos masculinos y femeninos, los cuales no maduran simultáneamente (Polanco y col, 2002). Esta potencialidad para producir gametos masculinos y femeninos la maneja con una sexualidad consecutiva rítmica (Coe, 1943b), es decir, desarrollan y maduran la fase macho y hembra varias veces a lo largo de su vida, es decir, cambian de sexo. El primer sexo en desarrollarse en la gónada primaria es el macho, con lo que la primera puesta siempre es como macho, aunque en la gónada existan células de la serie hembra inmaduras (Orton, 1933). Esto define a Ostrea edulis como organismo de reproducción consecutiva rítmica protándrica (Coe. 1943b) En otras especies del mismo género, como Ostrea chilensis, ocurre lo mismo, es decir, tienen una sexual sexualidad consecutiva rítmica protándrica (Chaparro et al., 2008), pero no presentan tejido femenino hasta que los individuos no alcanzan los 3,5 cm. (Saavedra, 2002). Gónada recubriendo el Hepatopáncreas Capuchón cefálico Músculo aductor Branquias 13 38 Capítulo 1 1.5 Ostrea edulis 1.5.1 Clasificación Ostrea edulis (Linnaeus, 1758), denominada ostra común, ostra plana, por su morfología, u ostra europea, por su localización, taxonómicamente se enmarca en: Reino Animalia Filum Mollusca Clase Bivalvia Subclase Pteriomorphia Orden Ostreoida Suborden Ostreina Superfamilia Ostreoidea Familia Ostreidae 1.5.2 Características morfológicas O. edulis es un molusco bivalvo de forma más o menos redondeada, con una concha de superficie escamosa, constituida por dos valvas calcáreas desiguales, la izquierda, cóncava, se fija al sustrato, y la derecha es plana (Fao, 2010). Ambas valvas se articulan entre si en la región dorsal mediante una charnela sin dientes. Un ligamento elástico mantiene las valvas juntas en su parte más estrecha, mientras que un gran músculo central las cierra (FAO, 2010). El color de la concha entra dentro de las gamas de blanco y crema, variando según la región de crecimiento. Suelen presentar fauna epífita asociada (Fig. 1.13). Fig. 1.13. Fotografías, exteriores e interiores, de las dos valvas de una Ostrea edulis. Justo por debajo de la concha se sitúa el manto, constituído por tejido conjuntivo y responsable de la formación de la misma. El manto tiene dos lóbulos que se sueldan en la región anterodorsal para dar el capuchón cefálico, que recubre la boca y los palpos labiales. Entre los dos lóbulos se forma la cavidad paleal, dividida en dos por las branquias, una ventral o inhalante y otra dorsal o exhalante. Las branquias presentan cilios microscópios, cuyos movimientos permiten la nutrición (Polanco et al, 2002). Internamente al manto, en la región anterior, se sitúa la gónada (Fig. 1.14). 12 Introducción Fuente: Polanco et al, 2002 Fig. 1.14. Esquema y fotografía de la anatomía de Ostrea edulis. Antes del primer desarrollo, la gónada consiste en una serie de canales tubulares, llamados canales gonadales que se extienden en el tejido conjuntivo, entre la epidermis y el digestivo (Cole, 1942). El tejido conjuntivo está compuesto por células de almacenamiento de reservas energéticas, y tiene numerosos canales hemolinfáticos (Franco et al, 2008). Los gametos maduros se expulsan a través de un único gonoducto mediante el movimiento ciliar de las células que lo tapizan (Polanco et al, 2002) Por debajo de la gónada se localiza el hepatopáncreas o glándula digestiva. El sistema digestivo está constituido por un orificio bucal con dos pares de palpos, un corto esófago, un estómago con un estilete cristalino, un hepatopáncreas constituido por una masa de divertículos digestivos y un orificio anal (Polanco et al, 2002). 1.5.3 Biología Ostrea edulis es hermafrodita simultáneo, tiene potencialidad para producir gametos masculinos y femeninos, los cuales no maduran simultáneamente (Polanco y col, 2002). Esta potencialidad para producir gametos masculinos y femeninos la maneja con una sexualidad consecutiva rítmica (Coe, 1943b), es decir, desarrollan y maduran la fase macho y hembra varias veces a lo largo de su vida, es decir, cambian de sexo. El primer sexo en desarrollarse en la gónada primaria es el macho, con lo que la primera puesta siempre es como macho, aunque en la gónada existan células de la serie hembra inmaduras (Orton, 1933). Esto define a Ostrea edulis como organismo de reproducción consecutiva rítmica protándrica (Coe. 1943b) En otras especies del mismo género, como Ostrea chilensis, ocurre lo mismo, es decir, tienen una sexual sexualidad consecutiva rítmica protándrica (Chaparro et al., 2008), pero no presentan tejido femenino hasta que los individuos no alcanzan los 3,5 cm. (Saavedra, 2002). Gónada recubriendo el Hepatopáncreas Capuchón cefálico Músculo aductor Branquias 13 39 Capítulo 1 La disponibilidad de alimento, y su calidad, determina viabilidad de los ovocitos y la supervivencia de las larvas. El preacondicionamiento, en bivalvos, con dietas de alta calidad de alimento, incrementa las reservas necesarias para el estadio de vitelogénesis (Utting y Milllican, 1997). En el berberecho (Cerastoderma edule), el ciclo reproductivo está, en gran medida, determinado por las condiciones de alimentación. De tal forma que la gametogénesis en invierno se desarrollará si durante el verano anterior la reposición de las reservas de glucógeno ha sido suficiente (Navarro et al, 1989). Pouvreau et al (2000b), afirman que la maduración de los gametos y la puesta, en bivalvos, es controlada principalmente por la temperatura del agua y el aporte nutricional, y secundariamente por la salinidad y el fotoperiodo. Es decir clasifica los tres factores y añade la salinidad. Más específicamente, Delaporte (2006), vio que en Crassostrea gigas la disponibilidad de alimento, junto a la temperatura, es un factor ambiental crítico para la gametogénesis. Apoyando estos resultados, Ostrea chilensis, al igual que O. edulis, presenta una alta estacionalidad, con un lento desarrollo en invierno y máximo desarrollo, con puesta, en primavera-verano. Este animal sufre una alternancia de sexos por fluctuación de la temperatura del agua y el alimento disponible (Saavedra, 2000). Hay otros autores que concuerdan en la importancia de la temperatura del agua; sin embargo, afirman que este factor actúa simultáneamente con el fotoperiodo. Entre ellos destaca Fabioux (2005), que, en Crassostrea gigas, estudió el efecto del fotoperido y la temperatura sobre el ciclo reproductor, y vio que estos dos factores actúan conjuntamente. Unas condiciones de invierno (bajas temperaturas y fotoperiodo corto) ralentizan el desarrollo gonadal, mientras que unas condiciones de verano (altas temperaturas y fotoperiodo largo) aceleran el desarrollo. Por otro lado, al someter a C. gigas, durante el otoño a 17,5º C y 16 horas de luz se obtuvieron un 42% de individuos con ovocitos maduros en octubre, 56% en noviembre y 96% en diciembre, mientras que en el medio natural (8,5º C y 8 horas de luz) en diciembre sólo el 8% de los individuos tenían ovocitos maduros (Chávez-Villalba et al, 2002). Por último, hay autores que afirman que el principal factor determinante de la reproducción en moluscos es la temperatura del agua. Hopkins, 1936, con sus trabajos, afirmó que hay una temperatura mínima o crítica que hace que la puesta hembra no ocurra, y esta temperatura mínima varía con las especies y la localización geográfica. Pouvreau y col, 2000, en sus estudios de la ostra perlífera tropical (Pinctada margaritifera) vieron que unas temperaturas por encima del nivel crítico permiten puestas durante todo el año. En Sonora, México, el aumento de temperatura del agua hasta 23º C induce, en C. gigas, a los ovocitos a pasar rápidamente del inicio de la gametogénesis a la fase de crecimiento y maduración (Chávez et al, 2007). Así mismo, en el Norte del Golfo de México, Crassostera virginica, muestra una alta dependencia de la temperatura del mar. El desarrollo gonadal empieza cuando la temperatura alcanza los 20º C (Hayes y Menzel, 1981). Respecto a la teoría de que la temperatura es la que determina la reproducción de moluscos, hay que tener en cuenta que, además de necesitar una temperatura mínima o crítica para el desarrollo gonadal, un cambio de temperatura puede desencadenar la puesta. La población de ostras jóvenes de C. virginica, en el norte del Golfo de México, pueden poner en otoño como respuesta a un posible cambio de temperatura (Hayes et al,1981). Nelson (1928), observó que Ostrea virginica ponía cuando el agua alcanzaba una temperatura de 20º C. Pero para que se produjeran puestas posteriores era necesario que la temperatura se incrementara aproximadamente 2º C. Otros ejemplos de moluscos no ostreidos, pueden ser Aequipecten irradians, que si se recogen en invierno (14º C) y se someten a 23 +/- 1ºC madura a los 26 días y pone (Sastry, 1963). En O. virginica, para obtener puestas, se acondicionan en agua templada (25-27 ºC) (Galtsoff, 1938). Sin embargo, hay estudios que afirman que tiene que ser la combinación de varios factores la que controle la reproducción en moluscos. En O. virginica, el 50% de los machos no respondió al único 20 Introducción estimulo de la subida de la temperatura del agua, y sólo un porcentaje de hembras respondió a la subida de temperatura (Galtsoff, 1938). Maneiro (2008) en su Tesis Doctoral, vio que la temperatura alta (18ºC) favorece el desarrollo gonadal, acelerándolo, en O. edulis. Este mismo efecto lo producía el fotoperiodo largo (16 horas), actuando a su vez de homogenizador de la puesta. Sin embargo, no se detectó una interacción significativa entre estos dos factores. En conclusión, se demostró, en diferentes especies de moluscos, que los tres factores mencionados anteriormente (alimento, temperatura y fotoperiodo) afecta a la reproducción de estos (Fig. 1.21). - La disponibilidad de alimento sería un factor limitante. - La temperatura, como único factor, o en combinación con otros, puede ralentizar el desarrollo gonadal (bajas temperaturas) o acelerarlo, favoreciendo las puestas (altas temperaturas). - El fotoperiodo, combinado con la temperatura puede ralentizar el desarrollo en condiciones de invierno (frío y fotoperiodo corto) o acelerardo en condiciones de primavera-verano (calor y fotoperiodo largo). Factores implicados Alimento Temperatura Fotoperiodo Autores Moluscos bivalvos Utting and Millican, 1997 Moluscos bivalvos Pouvreau et al, 2000 C. gigas, Ostrea chilensis Delaporte, 2006; Saavedra, 2002 C. gigas Fabiaux, ChávezVillalba et al, 2002 Especies estudiadas Pinctada margaritifera, C. gigas, C. virginica, Aequipecten irradians, O. virginica Hopkins, 1936; Pouvreau et al, 2000; Chávez el al, 2007; Hayes and Winston, 1981; Sastry, 1963; Galtsoff, 1938 Fig. 1.21. Tabla resumen de los estudios sobre el efecto en la reproducción del alimento, temperatura y/o fotoperio en distintas especies. En lo que respecta al factor limitante de la disponibilidad de alimento, hay que añadir, además del requerimiento de alimento por parte de los reproductores, el de las larvas. Venerupis crenata, en Sydney, tiene puestas más intensas en verano y otoño, coincidiendo con la máxima concentración de fitoplancton (Hadfield y Anderson, 2006). Anomia descripta tiene su máxima puesta en otoño, coincidiendo con el máximo pico de fitoplancton (Hadfield y Anderson, 2006). En México, C. gigas 21 46 Capítulo 1 La disponibilidad de alimento, y su calidad, determina viabilidad de los ovocitos y la supervivencia de las larvas. El preacondicionamiento, en bivalvos, con dietas de alta calidad de alimento, incrementa las reservas necesarias para el estadio de vitelogénesis (Utting y Milllican, 1997). En el berberecho (Cerastoderma edule), el ciclo reproductivo está, en gran medida, determinado por las condiciones de alimentación. De tal forma que la gametogénesis en invierno se desarrollará si durante el verano anterior la reposición de las reservas de glucógeno ha sido suficiente (Navarro et al, 1989). Pouvreau et al (2000b), afirman que la maduración de los gametos y la puesta, en bivalvos, es controlada principalmente por la temperatura del agua y el aporte nutricional, y secundariamente por la salinidad y el fotoperiodo. Es decir clasifica los tres factores y añade la salinidad. Más específicamente, Delaporte (2006), vio que en Crassostrea gigas la disponibilidad de alimento, junto a la temperatura, es un factor ambiental crítico para la gametogénesis. Apoyando estos resultados, Ostrea chilensis, al igual que O. edulis, presenta una alta estacionalidad, con un lento desarrollo en invierno y máximo desarrollo, con puesta, en primavera-verano. Este animal sufre una alternancia de sexos por fluctuación de la temperatura del agua y el alimento disponible (Saavedra, 2000). Hay otros autores que concuerdan en la importancia de la temperatura del agua; sin embargo, afirman que este factor actúa simultáneamente con el fotoperiodo. Entre ellos destaca Fabioux (2005), que, en Crassostrea gigas, estudió el efecto del fotoperido y la temperatura sobre el ciclo reproductor, y vio que estos dos factores actúan conjuntamente. Unas condiciones de invierno (bajas temperaturas y fotoperiodo corto) ralentizan el desarrollo gonadal, mientras que unas condiciones de verano (altas temperaturas y fotoperiodo largo) aceleran el desarrollo. Por otro lado, al someter a C. gigas, durante el otoño a 17,5º C y 16 horas de luz se obtuvieron un 42% de individuos con ovocitos maduros en octubre, 56% en noviembre y 96% en diciembre, mientras que en el medio natural (8,5º C y 8 horas de luz) en diciembre sólo el 8% de los individuos tenían ovocitos maduros (Chávez-Villalba et al, 2002). Por último, hay autores que afirman que el principal factor determinante de la reproducción en moluscos es la temperatura del agua. Hopkins, 1936, con sus trabajos, afirmó que hay una temperatura mínima o crítica que hace que la puesta hembra no ocurra, y esta temperatura mínima varía con las especies y la localización geográfica. Pouvreau y col, 2000, en sus estudios de la ostra perlífera tropical (Pinctada margaritifera) vieron que unas temperaturas por encima del nivel crítico permiten puestas durante todo el año. En Sonora, México, el aumento de temperatura del agua hasta 23º C induce, en C. gigas, a los ovocitos a pasar rápidamente del inicio de la gametogénesis a la fase de crecimiento y maduración (Chávez et al, 2007). Así mismo, en el Norte del Golfo de México, Crassostera virginica, muestra una alta dependencia de la temperatura del mar. El desarrollo gonadal empieza cuando la temperatura alcanza los 20º C (Hayes y Menzel, 1981). Respecto a la teoría de que la temperatura es la que determina la reproducción de moluscos, hay que tener en cuenta que, además de necesitar una temperatura mínima o crítica para el desarrollo gonadal, un cambio de temperatura puede desencadenar la puesta. La población de ostras jóvenes de C. virginica, en el norte del Golfo de México, pueden poner en otoño como respuesta a un posible cambio de temperatura (Hayes et al,1981). Nelson (1928), observó que Ostrea virginica ponía cuando el agua alcanzaba una temperatura de 20º C. Pero para que se produjeran puestas posteriores era necesario que la temperatura se incrementara aproximadamente 2º C. Otros ejemplos de moluscos no ostreidos, pueden ser Aequipecten irradians, que si se recogen en invierno (14º C) y se someten a 23 +/- 1ºC madura a los 26 días y pone (Sastry, 1963). En O. virginica, para obtener puestas, se acondicionan en agua templada (25-27 ºC) (Galtsoff, 1938). Sin embargo, hay estudios que afirman que tiene que ser la combinación de varios factores la que controle la reproducción en moluscos. En O. virginica, el 50% de los machos no respondió al único 20 Introducción estimulo de la subida de la temperatura del agua, y sólo un porcentaje de hembras respondió a la subida de temperatura (Galtsoff, 1938). Maneiro (2008) en su Tesis Doctoral, vio que la temperatura alta (18ºC) favorece el desarrollo gonadal, acelerándolo, en O. edulis. Este mismo efecto lo producía el fotoperiodo largo (16 horas), actuando a su vez de homogenizador de la puesta. Sin embargo, no se detectó una interacción significativa entre estos dos factores. En conclusión, se demostró, en diferentes especies de moluscos, que los tres factores mencionados anteriormente (alimento, temperatura y fotoperiodo) afecta a la reproducción de estos (Fig. 1.21). - La disponibilidad de alimento sería un factor limitante. - La temperatura, como único factor, o en combinación con otros, puede ralentizar el desarrollo gonadal (bajas temperaturas) o acelerarlo, favoreciendo las puestas (altas temperaturas). - El fotoperiodo, combinado con la temperatura puede ralentizar el desarrollo en condiciones de invierno (frío y fotoperiodo corto) o acelerardo en condiciones de primavera-verano (calor y fotoperiodo largo). Factores implicados Alimento Temperatura Fotoperiodo Autores Moluscos bivalvos Utting and Millican, 1997 Moluscos bivalvos Pouvreau et al, 2000 C. gigas, Ostrea chilensis Delaporte, 2006; Saavedra, 2002 C. gigas Fabiaux, ChávezVillalba et al, 2002 Especies estudiadas Pinctada margaritifera, C. gigas, C. virginica, Aequipecten irradians, O. virginica Hopkins, 1936; Pouvreau et al, 2000; Chávez el al, 2007; Hayes and Winston, 1981; Sastry, 1963; Galtsoff, 1938 Fig. 1.21. Tabla resumen de los estudios sobre el efecto en la reproducción del alimento, temperatura y/o fotoperio en distintas especies. En lo que respecta al factor limitante de la disponibilidad de alimento, hay que añadir, además del requerimiento de alimento por parte de los reproductores, el de las larvas. Venerupis crenata, en Sydney, tiene puestas más intensas en verano y otoño, coincidiendo con la máxima concentración de fitoplancton (Hadfield y Anderson, 2006). Anomia descripta tiene su máxima puesta en otoño, coincidiendo con el máximo pico de fitoplancton (Hadfield y Anderson, 2006). En México, C. gigas 21 47 Capítulo 1 presenta el máximo de maduración coincidiendo con la máxima concentración de clorofila a (marcador de fitoplancton) en el medio (Chávez-Villalba et al, 2007). Fig. 1.22. Esquema del ciclo de cultivo de Ostrea edulis. Fuente: FAO, 2010. Una vez obtenenida la semilla, sea cual sea su origen, se procede al engorde. Para ello se utilizan dos tipos principales de técnicas de producción para Ostrea edulis: sobre el fondo y alejadas del fondo (Poza, 1995): - Sobre el fondo: Consiste en utilizar los fondos marinos como soporte del cultivo. Los fondos pueden ser emergentes o sumergidos. En ostra es posible cuando los fondos son duros. El tamaño común de siembra, la cual es generalmente en mayo-junio, es 1 cm y alrededor de 1 año de edad (FAO, 2010). Tienen la desventaja del impacto de los depredadores (Poza, 1995). Las prácticas tradicionales de manejo incluyen el uso de redes de algodón para recolectar estrellas de mar depredadoras, y marcos de acero con dientes, que se arrastran dragando sobre los terrenos de la concesión. El cultivo en aguas profundas maximiza la tasa de crecimiento, dado que la enfermedad por Bonamia reduce drásticamente la tasa de sobrevivencia de las ostras de 3-4 años de edad. Así, las ostras de 2 años de edad (60-80 g) se cosechan por dragado antes que ocurra la mortalidad inducida por la enfermedad. A pesar de esta cosecha temprana, las tasas de sobrevivencia permanecen bajas, alrededor de 5 por ciento después de un ciclo de crianza de 3 años (FAO, 2010). - Alejadas del fondo: Se utilizan diversas estructuras para evitar el contacto de los moluscos con un fondo poco apropiado o para evitar el acceso de los depredadores (Poza, 1995). Las ostras 22 Introducción pueden depositarse en bandejas o balsas flotantes, longlines, cuerdas suspendidas, linternas o cestas plásticas colgadas desde las balsas, caballetes intermareales y bolsas de ostras. En España y, concretamente en Santa Pola, se usan balsas flotantes para el cultivo de ostra, como aquellas usadas también para cultivo de mejillón. Consiste en fijar, manualmente, las ostras de 5 cm. a cuerdas con cemento, estas cuerdas se cuegan desde las balsas, limpiándolas periódicamente y raleándolas a medida que crecen (FAO, 2010) 1.5.6 Distribución geográfica y limitaciones en la producción de Ostrea edulis Ostrea edulis se distribuye, naturalmente, a lo largo de la costa oeste de Europa, desde Noruega a Marruecos, abarcando el Atlántico noroeste y el Mediterráneo. También se puede encontrar, por introducción intencionada, en el este de Norte América, desde Maine a Rhode Island (FAO, 2010). Cada región geográfica posee sus propias condiciones ambientales, lo que redefine el ciclo natural de la ostra. Los principales países productores de O. edulis son los siguientes: América África Europa Noruega Países Bajos Marruecos Reino Unido Irlanda Francia España Croacia Bosnia Herzegovina Estados Unidos Sudáfrica Grecia Fig. 1.23. Tabla de los principales países productores de Ostrea edulis. Fuente: FAO, estadística pesquera, 2006) 23 48 Capítulo 1 presenta el máximo de maduración coincidiendo con la máxima concentración de clorofila a (marcador de fitoplancton) en el medio (Chávez-Villalba et al, 2007). Fig. 1.22. Esquema del ciclo de cultivo de Ostrea edulis. Fuente: FAO, 2010. Una vez obtenenida la semilla, sea cual sea su origen, se procede al engorde. Para ello se utilizan dos tipos principales de técnicas de producción para Ostrea edulis: sobre el fondo y alejadas del fondo (Poza, 1995): - Sobre el fondo: Consiste en utilizar los fondos marinos como soporte del cultivo. Los fondos pueden ser emergentes o sumergidos. En ostra es posible cuando los fondos son duros. El tamaño común de siembra, la cual es generalmente en mayo-junio, es 1 cm y alrededor de 1 año de edad (FAO, 2010). Tienen la desventaja del impacto de los depredadores (Poza, 1995). Las prácticas tradicionales de manejo incluyen el uso de redes de algodón para recolectar estrellas de mar depredadoras, y marcos de acero con dientes, que se arrastran dragando sobre los terrenos de la concesión. El cultivo en aguas profundas maximiza la tasa de crecimiento, dado que la enfermedad por Bonamia reduce drásticamente la tasa de sobrevivencia de las ostras de 3-4 años de edad. Así, las ostras de 2 años de edad (60-80 g) se cosechan por dragado antes que ocurra la mortalidad inducida por la enfermedad. A pesar de esta cosecha temprana, las tasas de sobrevivencia permanecen bajas, alrededor de 5 por ciento después de un ciclo de crianza de 3 años (FAO, 2010). - Alejadas del fondo: Se utilizan diversas estructuras para evitar el contacto de los moluscos con un fondo poco apropiado o para evitar el acceso de los depredadores (Poza, 1995). Las ostras 22 Introducción pueden depositarse en bandejas o balsas flotantes, longlines, cuerdas suspendidas, linternas o cestas plásticas colgadas desde las balsas, caballetes intermareales y bolsas de ostras. En España y, concretamente en Santa Pola, se usan balsas flotantes para el cultivo de ostra, como aquellas usadas también para cultivo de mejillón. Consiste en fijar, manualmente, las ostras de 5 cm. a cuerdas con cemento, estas cuerdas se cuegan desde las balsas, limpiándolas periódicamente y raleándolas a medida que crecen (FAO, 2010) 1.5.6 Distribución geográfica y limitaciones en la producción de Ostrea edulis Ostrea edulis se distribuye, naturalmente, a lo largo de la costa oeste de Europa, desde Noruega a Marruecos, abarcando el Atlántico noroeste y el Mediterráneo. También se puede encontrar, por introducción intencionada, en el este de Norte América, desde Maine a Rhode Island (FAO, 2010). Cada región geográfica posee sus propias condiciones ambientales, lo que redefine el ciclo natural de la ostra. Los principales países productores de O. edulis son los siguientes: América África Europa Noruega Países Bajos Marruecos Reino Unido Irlanda Francia España Croacia Bosnia Herzegovina Estados Unidos Sudáfrica Grecia Fig. 1.23. Tabla de los principales países productores de Ostrea edulis. Fuente: FAO, estadística pesquera, 2006) 23 49 Capítulo 1 Fig. 1.24. Mapa de los principales países productores de Ostrea edulis. Fuente: FAO, estadística pesquera, 2006) Los problemas que limitan la producción de Ostrea edulis son: a. La obtención de semilla que no proceda del medio natural. Ya existen numerosos criaderos productores de semilla de ostra, sin embargo, su producción es poco estable, debido a la alternancia cíclica de sexos. Relacionado con la obtención de semilla en criaderos, está el problema de la supervivencia larvaria. Parece que esta está altamente relacionada con la calidad de los ovocitos, y ambas con la alimentación. En Crassostrea gigas se encontraron evidencias de la relación entre el índice de condición, el total de lípidos y la viabilidad de las larvas velígeras. Esto parece indicar que la supervivencia de las larvas es altamente dependiente de la cantidad inicial de lípidos endógenos totales suministrados a los ovocitos durante la vitelogénesis. La misma relación se observó con las proteínas ovocitarias, mientras que con los carbohidratos no se vio (Massapina et al, 1999). En cambio, el requerimiento alimenticio varía con las especies, ya que para el berberecho (Ceratoderma edule), parece que son los carbohidratos los que determinan la gametogénesis. En invierno, esta especie tendrá desarrollo gametogénico si durante el verano anterior la reposición de glucógeno es suficiente para satisfacer los requerimentos energéticos asociados con el desarrollo gonadal (Navarro et al, 1989). b. Las patologías, destacando las parasitosis. Históricamente, Marteilia refringens provocó una gran mortalidad en Francia entre los años 1970 y 1988. Cuando la producción se estaba recuperando, Bonamia ostreae produjo una nueva mortalidad. Este mismo suceso se reflejó en España, debido a la importación de semilla de ostra francesa (Polanco et al, 2002). 24 Introducción La Marteiliosis afecta tanto al aspecto de la concha como al cuerpo, destacando la detención del crecimiento, la despigmentación de la masa digestiva o la reducción de peso. La concha tiene un aspecto denso, sin laminilla de crecimiento (Polanco et al, 2002). Se trata de un esquizonte, observable microscópicamente en el exterior de los hemocitos del hepatopáncreas, esférico con gránulos en su interior (Perkins, 1976). La Bonamiosis fue introducida desde California, Estados Unidos, a Francia, desde donde se extendió por toda Europa (Polanco y col, 2002). Esta parasitosis no tiene unos efectos tan visibles como la anterior, lo único que la caracteriza macroscópicamente es la presencia de una cámara de gas en el interior de la concha con mal olor cuando se rompe. Microscópicamente, el parásito aparece en el hepatopáncreas y dentro de los hemocitos. Da Silva (2005), observó una relación entre la parasitación por Bonamia y la clase sexual: en altos grados de infección la clase predominante era la femenina. En nuestro caso no se observa esta relación, ya que los casos de bonamiosis fueron muy escasos y con una afección baja. Estos dos parásitos se encontraron en la población de estudio, pero con un impacto muy reducido. Sin embargo, si se detectó una importante presencia del parásito Bucephalus spp. que usa a la ostra como huésped intermediario. Este parásito es un trematodo dioico que tiene un molusco, en este caso la ostra, como primer hospedador intermediario; como segundo hospedador intermediario un pez y como hospedador final otro pez. Los huevos salen del hospedador definitivo, un pez carnívoro, con las heces. De estos nacen larvas móviles ciliadas (miracidios), que no se alimentan, hasta que encuentran al primer hospedador, un molusco bivalvo; entonces pierde la epidermis ciliada, transformándose en un esporocisto (Da Costa, 2008). En Ostrea edulis entran como larvas, pasan a la fase de esporocisto, posteriormente a la de redia y sale como cercaria (Tennet, 1906). Los esporocistos son sacos ovales que se presentan en forma de filamentos ramificados con dilataciones de color naranja y que poseen en su interior numerosas células germinativas que permanecen indeterminadas (Da Costa, 2008). Estas células germinales aumentan su número mediante sucesivas divisiones mitóticas y se transforman en esferas germinativas, cada una aumentando de tamaño y diferenciándose en cercarias (Da Costa, 2008). Los esporocistos invaden cavidades como vasos sanguíneos, intestino, glándula digestiva, cámaras branquiales, gonoductos y folículos gonadales (García y Magalhaes, 2008). La cercaria tiene forma de pera y es relativamente móvil. Su longitud varía de 0,29 a 0,41 mm. En el extremo posterior se observan unas extensiones simétricas, flexibles y muy contráctiles que el parásito usa para anclarse al huésped (Samuel, 1978) ((Fig. 1.25). La emisión de las cercarias es mediante un estímulo favorable (Da Costa, 2008). 25 50 Capítulo 1 Fig. 1.24. Mapa de los principales países productores de Ostrea edulis. Fuente: FAO, estadística pesquera, 2006) Los problemas que limitan la producción de Ostrea edulis son: a. La obtención de semilla que no proceda del medio natural. Ya existen numerosos criaderos productores de semilla de ostra, sin embargo, su producción es poco estable, debido a la alternancia cíclica de sexos. Relacionado con la obtención de semilla en criaderos, está el problema de la supervivencia larvaria. Parece que esta está altamente relacionada con la calidad de los ovocitos, y ambas con la alimentación. En Crassostrea gigas se encontraron evidencias de la relación entre el índice de condición, el total de lípidos y la viabilidad de las larvas velígeras. Esto parece indicar que la supervivencia de las larvas es altamente dependiente de la cantidad inicial de lípidos endógenos totales suministrados a los ovocitos durante la vitelogénesis. La misma relación se observó con las proteínas ovocitarias, mientras que con los carbohidratos no se vio (Massapina et al, 1999). En cambio, el requerimiento alimenticio varía con las especies, ya que para el berberecho (Ceratoderma edule), parece que son los carbohidratos los que determinan la gametogénesis. En invierno, esta especie tendrá desarrollo gametogénico si durante el verano anterior la reposición de glucógeno es suficiente para satisfacer los requerimentos energéticos asociados con el desarrollo gonadal (Navarro et al, 1989). b. Las patologías, destacando las parasitosis. Históricamente, Marteilia refringens provocó una gran mortalidad en Francia entre los años 1970 y 1988. Cuando la producción se estaba recuperando, Bonamia ostreae produjo una nueva mortalidad. Este mismo suceso se reflejó en España, debido a la importación de semilla de ostra francesa (Polanco et al, 2002). 24 Introducción La Marteiliosis afecta tanto al aspecto de la concha como al cuerpo, destacando la detención del crecimiento, la despigmentación de la masa digestiva o la reducción de peso. La concha tiene un aspecto denso, sin laminilla de crecimiento (Polanco et al, 2002). Se trata de un esquizonte, observable microscópicamente en el exterior de los hemocitos del hepatopáncreas, esférico con gránulos en su interior (Perkins, 1976). La Bonamiosis fue introducida desde California, Estados Unidos, a Francia, desde donde se extendió por toda Europa (Polanco y col, 2002). Esta parasitosis no tiene unos efectos tan visibles como la anterior, lo único que la caracteriza macroscópicamente es la presencia de una cámara de gas en el interior de la concha con mal olor cuando se rompe. Microscópicamente, el parásito aparece en el hepatopáncreas y dentro de los hemocitos. Da Silva (2005), observó una relación entre la parasitación por Bonamia y la clase sexual: en altos grados de infección la clase predominante era la femenina. En nuestro caso no se observa esta relación, ya que los casos de bonamiosis fueron muy escasos y con una afección baja. Estos dos parásitos se encontraron en la población de estudio, pero con un impacto muy reducido. Sin embargo, si se detectó una importante presencia del parásito Bucephalus spp. que usa a la ostra como huésped intermediario. Este parásito es un trematodo dioico que tiene un molusco, en este caso la ostra, como primer hospedador intermediario; como segundo hospedador intermediario un pez y como hospedador final otro pez. Los huevos salen del hospedador definitivo, un pez carnívoro, con las heces. De estos nacen larvas móviles ciliadas (miracidios), que no se alimentan, hasta que encuentran al primer hospedador, un molusco bivalvo; entonces pierde la epidermis ciliada, transformándose en un esporocisto (Da Costa, 2008). En Ostrea edulis entran como larvas, pasan a la fase de esporocisto, posteriormente a la de redia y sale como cercaria (Tennet, 1906). Los esporocistos son sacos ovales que se presentan en forma de filamentos ramificados con dilataciones de color naranja y que poseen en su interior numerosas células germinativas que permanecen indeterminadas (Da Costa, 2008). Estas células germinales aumentan su número mediante sucesivas divisiones mitóticas y se transforman en esferas germinativas, cada una aumentando de tamaño y diferenciándose en cercarias (Da Costa, 2008). Los esporocistos invaden cavidades como vasos sanguíneos, intestino, glándula digestiva, cámaras branquiales, gonoductos y folículos gonadales (García y Magalhaes, 2008). La cercaria tiene forma de pera y es relativamente móvil. Su longitud varía de 0,29 a 0,41 mm. En el extremo posterior se observan unas extensiones simétricas, flexibles y muy contráctiles que el parásito usa para anclarse al huésped (Samuel, 1978) ((Fig. 1.25). La emisión de las cercarias es mediante un estímulo favorable (Da Costa, 2008). 25 51 Capítulo 1 Fig. 1.25. Distintas vistas de la cercaria de Bucephalus haimeanus. Fuente: Samuel, 1978. Cuando las cercarias maduran, rompen los tejidos del molusco e infestan al segundo hospedador (García et Magalhaes, 2008). En C. madrasensis causa esterilidad. No se observan ni ovocitos ni espermatozoides. Sin embargo, las ostras parasitadas pesan más (Samuel, 1978). Fig. 1.26. Efecto a lo largo de las estaciones de Bucephalus parasitando a Perna perna,. Fuente: da Silva et al, 2002. RT: Tejido reproductivo, CT: Tejido conectivo, PT: Tejido del parásito. 26 Introducción 27 Según los estudios de Da Silva et al (2009), en Perna perna, Bucephalus presentaría una cierta estacionalidad, siendo más intenso en primavera (Fig. 1.26). La infestación por Bucephalus reduce el tejido conjuntivo interfolicular, por desgaste nutricional, este hecho se demostró en Perna perna (García y Magalhaes, 2008). 52 Capítulo 1 Fig. 1.25. Distintas vistas de la cercaria de Bucephalus haimeanus. Fuente: Samuel, 1978. Cuando las cercarias maduran, rompen los tejidos del molusco e infestan al segundo hospedador (García et Magalhaes, 2008). En C. madrasensis causa esterilidad. No se observan ni ovocitos ni espermatozoides. Sin embargo, las ostras parasitadas pesan más (Samuel, 1978). Fig. 1.26. Efecto a lo largo de las estaciones de Bucephalus parasitando a Perna perna,. Fuente: da Silva et al, 2002. RT: Tejido reproductivo, CT: Tejido conectivo, PT: Tejido del parásito. 26 Introducción 27 Según los estudios de Da Silva et al (2009), en Perna perna, Bucephalus presentaría una cierta estacionalidad, siendo más intenso en primavera (Fig. 1.26). La infestación por Bucephalus reduce el tejido conjuntivo interfolicular, por desgaste nutricional, este hecho se demostró en Perna perna (García y Magalhaes, 2008). 53 CAPÍTULO 2: OBJETIVOS CAPÍTULO 2: OBJETIVOS Capítulo 3 - Población 07: Se recibieron muestras desde el 12 de noviembre del 2008 al 12 de enero del 2010. Al inicio del estudio hasta julio, tenían 1 año de edad, y de julio hasta finales del experimento 2 años. En fase de 2 años, como ya se indicó en la introducción, el impacto de la bucefalosis fue menor, debido al cambio efectuado en los muestreos, con lo que pudimos estudiar la evolución de una población de 2 años de edad desde julio del 2009 hasta enero del 2010. - Población 08: Se recibieron muestras del 12 de noviembre del 2008 al 17 de marzo del 2010. Estas ostras se fijaron en julio del 2008, con lo que tienen 0 años desde el primer muestreo hasta el mes de julio, y luego, hasta finales del muestreo, tienen 1 año. - Población 09: Se recibieron muestras del 14 de octubre del 2009 hasta el 17 de marzo del 2010. Esta población se incorporó al experimento para continuar con el estudio de ostras de 0 años de edad, ya que la población 08, en julio ya tenía 1 año. En su mayoría aún no iniciaran la primera gónada. Las ostras se enviaban desde su lugar de producción al laboratorio mediante transporte con sistema de refrigeración. Con estas ostras se estudió el ciclo vital natural, y su variación estacional. Las condiciones estacionales (variación de temperatura; Fig. 3.2) de la región de estudio fueron las siguientes: Temperatura media ambiental en Alicante 10 12 14 16 18 20 22 24 26 sep08 oct08 nov08 dic08 ene09 feb09 m ar09 abr09 m ay09 jun09 jul09 ago09 sep09 oct09 nov09 dic09 ene10 feb10 m ar10 Otoño Invierno Primavera Verano Otoño Invierno Fig. 3.2. Esquema de la temperatura media en Alicante. Como ya se vio las variaciones de temperatura son muy marcados. Respecto al fotoperiodo (Fig. 3.3), las máximas horas de luz se producen a finales de primavera y verano. 4 Material y Métodos Horas medias de luz en Alicante 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Enero Febr Mar Abr May Jun Jul Agos Sept Oct Nov Dic Horas de luz Fig. 3.3. Gráfico de las horas de luz medias diarias (fotoperiodo) en Alicante. No fue posible obtener las temperaturas del agua del periodo de estudio, ya que las instituciones que las toman no las hacen públicas por estarlas utilizando en estudios de cambio climático aún sin publicar. Si fue posible obtener algunos datos del año 2008, que fueron recogidos por la empresa productora que suministró las muestras y datos históricos del Instituto Hidrográfico de la Marina (Fig. 3.4, 3.5 y 3.6): Temperatura del mar en el Otoño del 2008 en Santa Pola 14 15 16 17 18 19 20 21 22 13nov08 14nov08 15nov08 16nov08 17nov08 18nov08 19nov08 20nov08 21nov08 22nov08 23nov08 24nov08 25nov08 26nov08 27nov08 28nov08 29nov08 30nov08 1dic08 2dic08 3dic08 4dic08 5dic08 6dic08 7dic08 8dic08 9dic08 Otoño Fig. 3.4. Gráfico de la temperatura del mar a una profundidad media de 14 m en Santa Pola durante el otoño del 2008. 5 62 Capítulo 3 - Población 07: Se recibieron muestras desde el 12 de noviembre del 2008 al 12 de enero del 2010. Al inicio del estudio hasta julio, tenían 1 año de edad, y de julio hasta finales del experimento 2 años. En fase de 2 años, como ya se indicó en la introducción, el impacto de la bucefalosis fue menor, debido al cambio efectuado en los muestreos, con lo que pudimos estudiar la evolución de una población de 2 años de edad desde julio del 2009 hasta enero del 2010. - Población 08: Se recibieron muestras del 12 de noviembre del 2008 al 17 de marzo del 2010. Estas ostras se fijaron en julio del 2008, con lo que tienen 0 años desde el primer muestreo hasta el mes de julio, y luego, hasta finales del muestreo, tienen 1 año. - Población 09: Se recibieron muestras del 14 de octubre del 2009 hasta el 17 de marzo del 2010. Esta población se incorporó al experimento para continuar con el estudio de ostras de 0 años de edad, ya que la población 08, en julio ya tenía 1 año. En su mayoría aún no iniciaran la primera gónada. Las ostras se enviaban desde su lugar de producción al laboratorio mediante transporte con sistema de refrigeración. Con estas ostras se estudió el ciclo vital natural, y su variación estacional. Las condiciones estacionales (variación de temperatura; Fig. 3.2) de la región de estudio fueron las siguientes: Temperatura media ambiental en Alicante 10 12 14 16 18 20 22 24 26 sep08 oct08 nov08 dic08 ene09 feb09 m ar09 abr09 m ay09 jun09 jul09 ago09 sep09 oct09 nov09 dic09 ene10 feb10 m ar10 Otoño Invierno Primavera Verano Otoño Invierno Fig. 3.2. Esquema de la temperatura media en Alicante. Como ya se vio las variaciones de temperatura son muy marcados. Respecto al fotoperiodo (Fig. 3.3), las máximas horas de luz se producen a finales de primavera y verano. 4 Material y Métodos Horas medias de luz en Alicante 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Enero Febr Mar Abr May Jun Jul Agos Sept Oct Nov Dic Horas de luz Fig. 3.3. Gráfico de las horas de luz medias diarias (fotoperiodo) en Alicante. No fue posible obtener las temperaturas del agua del periodo de estudio, ya que las instituciones que las toman no las hacen públicas por estarlas utilizando en estudios de cambio climático aún sin publicar. Si fue posible obtener algunos datos del año 2008, que fueron recogidos por la empresa productora que suministró las muestras y datos históricos del Instituto Hidrográfico de la Marina (Fig. 3.4, 3.5 y 3.6): Temperatura del mar en el Otoño del 2008 en Santa Pola 14 15 16 17 18 19 20 21 22 13nov08 14nov08 15nov08 16nov08 17nov08 18nov08 19nov08 20nov08 21nov08 22nov08 23nov08 24nov08 25nov08 26nov08 27nov08 28nov08 29nov08 30nov08 1dic08 2dic08 3dic08 4dic08 5dic08 6dic08 7dic08 8dic08 9dic08 Otoño Fig. 3.4. Gráfico de la temperatura del mar a una profundidad media de 14 m en Santa Pola durante el otoño del 2008. 5 63 Capítulo 3 Temperatura del mar en Primavera del 2008 en Santa Pola 14 15 16 17 18 19 20 21 22 16-may-08 17-may-08 18-may-08 19-may-08 20-may-08 21-may-08 22-may-08 23-may-08 24-may-08 25-may-08 26-may-08 27-may-08 28-may-08 29-may-08 30-may-08 31-may-08 1-jun-08 2-jun-08 3-jun-08 4-jun-08 5-jun-08 6-jun-08 7-jun-08 8-jun-08 9-jun-08 10-jun-08 11-jun-08 12-jun-08 13-jun-08 14-jun-08 15-jun-08 16-jun-08 17-jun-08 Primavera Fig. 3.5. Gráfico de la temperatura del mar a una profundidad media 14 m en Santa Pola durante el primavera del 2008. Valores de temperatura media mensual del mar 10 12 14 16 18 20 22 24 26 ENERO FEBRERO MARZO ABRIL MAYO JUNIO JULIO AGOSTO SEPTIEMBRE OCTUBRE NOVIEMBRE DICIEMBRE Tª histórica a 15 m Tª histórica a 10m Tª 2008 a 14m Fig. 3.6. Representación gráfica de la temperatura media del mar a distintas profundidades, históricas en el área de Cabo de Palos (fuente: Instituto Hidrográfico de la Marina, año 1983) y en los meses de mayo, junio, noviembre y diciembre del 2008 en Santa Pola. 3.1.2 Acondicionamientos Se llevaron a cabo 3 acondicionamientos para determinar el efecto de las condiciones ambientales y la edad en el ciclo natural de O. edulis. Se tomó una porción de las poblaciones estudiadas en el medio natural, es decir, poblaciones 09, 08 y 07 y se acondicionaron bajo parámetros conocidos. Esta parte de la experimentación se llevó a cabo en las instalaciones del Instituto Español de Oceanografía de A Coruña. Como control se usaron los muestreos del mismo periodo temporal procedentes del medio natural. 6 Material y Métodos Los parámetros de los acondicionamientos fueron los siguientes: Acondicionamiento 1: El 10 de Diciembre del 2008 el Oceanográfico recibió 368 ostras de dos clases de edad, la mitad era de la población 08, es decir, 0 años de edad, y la otra mitad, de la población 07, de 1 año de edad. Tener dos clases de edad nos permitiría estudiar el posible efecto de la edad sobre el desarrollo de las ostras y sobre la influencia de los factores ambientales. Ambas clases de edad se acondicionaron bajo los mismos parámetros, de temperatura y fotoperiodo. Se usaron dos temperaturas, una caliente (aproximadamente 18º C) y una fría (aproximadamente 14º C), y dos fotoperiodos, un largo (16 horas de luz) y uno corto (8 horas de luz) (Fig. 3.7 y 3.8). Temperaturas de acondicionamiento 1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 10-dic-08 15-dic-08 20-dic-08 25-dic-08 30-dic-08 4-ene-09 9-ene-09 14-ene-09 19-ene-09 24-ene-09 29-ene-09 3-feb-09 8-feb-09 13-feb-09 Calor Frío Fig. 3.7. Gráfica de las dos clases de temperatura utilizadas en el primer acondicionamiento. Los factores ambientales se combinaron del siguiente modo: -Condiciones adversas o “Frío corto (Fc)”: Se representa el invierno del ciclo natural, durante el cual, supuestamente, la actividad reproductora es mínima. Las ostras se mantuvieron a una media de 14º C y 8 horas de luz. -Condiciones favorables o “Calor largo (Cl)”: Se representa la primavera-verano del ciclo natural, donde, supuestamente la actividad reproductora es máxima. Se sometieron a una media de 20º C y 16 horas de luz. -Condiciones mixtas: Para determinar si la temperatura y el fotoperiodo tienen un efecto conjunto o independiente sobre el desarrollo de las ostras se desacoplaron estos dos factores: Temperatura favorable y fotoperiodo desfavorable o “Calor corto (Cc)”: Se mantuvieron a una temperatura media de 20º C y a un fotoperiodo de 8 horas de luz. 7 64 Capítulo 3 Temperatura del mar en Primavera del 2008 en Santa Pola 14 15 16 17 18 19 20 21 22 16-may-08 17-may-08 18-may-08 19-may-08 20-may-08 21-may-08 22-may-08 23-may-08 24-may-08 25-may-08 26-may-08 27-may-08 28-may-08 29-may-08 30-may-08 31-may-08 1-jun-08 2-jun-08 3-jun-08 4-jun-08 5-jun-08 6-jun-08 7-jun-08 8-jun-08 9-jun-08 10-jun-08 11-jun-08 12-jun-08 13-jun-08 14-jun-08 15-jun-08 16-jun-08 17-jun-08 Primavera Fig. 3.5. Gráfico de la temperatura del mar a una profundidad media 14 m en Santa Pola durante el primavera del 2008. Valores de temperatura media mensual del mar 10 12 14 16 18 20 22 24 26 ENERO FEBRERO MARZO ABRIL MAYO JUNIO JULIO AGOSTO SEPTIEMBRE OCTUBRE NOVIEMBRE DICIEMBRE Tª histórica a 15 m Tª histórica a 10m Tª 2008 a 14m Fig. 3.6. Representación gráfica de la temperatura media del mar a distintas profundidades, históricas en el área de Cabo de Palos (fuente: Instituto Hidrográfico de la Marina, año 1983) y en los meses de mayo, junio, noviembre y diciembre del 2008 en Santa Pola. 3.1.2 Acondicionamientos Se llevaron a cabo 3 acondicionamientos para determinar el efecto de las condiciones ambientales y la edad en el ciclo natural de O. edulis. Se tomó una porción de las poblaciones estudiadas en el medio natural, es decir, poblaciones 09, 08 y 07 y se acondicionaron bajo parámetros conocidos. Esta parte de la experimentación se llevó a cabo en las instalaciones del Instituto Español de Oceanografía de A Coruña. Como control se usaron los muestreos del mismo periodo temporal procedentes del medio natural. 6 Material y Métodos Los parámetros de los acondicionamientos fueron los siguientes: Acondicionamiento 1: El 10 de Diciembre del 2008 el Oceanográfico recibió 368 ostras de dos clases de edad, la mitad era de la población 08, es decir, 0 años de edad, y la otra mitad, de la población 07, de 1 año de edad. Tener dos clases de edad nos permitiría estudiar el posible efecto de la edad sobre el desarrollo de las ostras y sobre la influencia de los factores ambientales. Ambas clases de edad se acondicionaron bajo los mismos parámetros, de temperatura y fotoperiodo. Se usaron dos temperaturas, una caliente (aproximadamente 18º C) y una fría (aproximadamente 14º C), y dos fotoperiodos, un largo (16 horas de luz) y uno corto (8 horas de luz) (Fig. 3.7 y 3.8). Temperaturas de acondicionamiento 1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 10-dic-08 15-dic-08 20-dic-08 25-dic-08 30-dic-08 4-ene-09 9-ene-09 14-ene-09 19-ene-09 24-ene-09 29-ene-09 3-feb-09 8-feb-09 13-feb-09 Calor Frío Fig. 3.7. Gráfica de las dos clases de temperatura utilizadas en el primer acondicionamiento. Los factores ambientales se combinaron del siguiente modo: -Condiciones adversas o “Frío corto (Fc)”: Se representa el invierno del ciclo natural, durante el cual, supuestamente, la actividad reproductora es mínima. Las ostras se mantuvieron a una media de 14º C y 8 horas de luz. -Condiciones favorables o “Calor largo (Cl)”: Se representa la primavera-verano del ciclo natural, donde, supuestamente la actividad reproductora es máxima. Se sometieron a una media de 20º C y 16 horas de luz. -Condiciones mixtas: Para determinar si la temperatura y el fotoperiodo tienen un efecto conjunto o independiente sobre el desarrollo de las ostras se desacoplaron estos dos factores: Temperatura favorable y fotoperiodo desfavorable o “Calor corto (Cc)”: Se mantuvieron a una temperatura media de 20º C y a un fotoperiodo de 8 horas de luz. 7 65 Capítulo 3 Temperatura desfavorable y fotoperiodo favorable o “Frío largo (Fl): Se sometieron a una temperatura media de 14º C y un fotoperiodo de 16 horas de luz. 14º C 20º C 0 años 8 horas Condiciones desfavorables (Fc) Condiciones mixtas (Cc) 1 año 0 años 16 horas Condiciones mixtas (Fl) Condiciones favorables (Cl) 1 año Fig. 3.8. Tabla resumen de la combinación de factores aplicada en el primer acondicionamiento. Se mantuvieron durante 30 días y se analizaron 10 individuos de cada grupo, 80 en total. Sin embargo, se observó que el desarrollo era demasiado rápido y que el período de muestreo era demasiado largo, con lo que se llevó a cabo otro muestreo a los 15 días (45 días de acondicionamiento), en el que se incrementó también el tamaño de muestra a 15 individuos de cada grupo. A los 60 días de acondicionamiento se llevó a cabo el último muestreo, donde se analizaron todos los individuos que quedaban. Las muestras de los acondicionamientos eran entregadas en origen, en mano justo después de su recogida. Acondicionamiento 2 En este acondicionamiento se mantuvo la temperatura ambiente, de otoño-invierno, y se estudiaron las variaciones del fotoperiodo; esto se hizo ante la hipótesis del importante papel de la luz en el desarrollo gametogénico de Ostrea edulis, y ante la limitación en la manipulación de la temperatura, ya que no se poseía un sistema de enfriamiento (Fig. 3.9). Temperatura del segundo acondicionamiento 10 12 14 16 18 20 15-oct-09 22-oct-09 29-oct-09 5-nov-09 12-nov-09 19-nov-09 26-nov-09 3-dic-09 10-dic-09 17-dic-09 24-dic-09 31-dic-09 7-ene-10 14-ene-10 0 h. 8 h . 16 h. 24 h. Fig. 3.9. Gráfico de la temperatura de los cuatro grupos, a distintas horas de luz, durante el segundo acondicionamiento. 8 Material y Métodos El 14 de octubre del 2009, el Oceanográfico de A Coruña recibió 540 ostras de dos clases de edad, 0 años (población 09) y 1 año de edad (población 08). Las de clase 0 años de edad, además, tenían la particularidad de que su gónada estaba sin desarrollar, y las de 1 año de edad estaban predominantemente en Reposo. Es decir, en general tenían escaso o nulo desarrollo gonadal. Estas ostras se acondicionaron durante 90 días, con alimentación ad libitum, temperatura ambiente y el siguiente fotoperiodo ((Fig. 3.10): - Ausencia de luz, 0 horas de luz: Un cuarto de cada clase de edad se mantuvo en condiciones de oscuridad total, con el fin de observar si la ausencia de luz impedía el desarrollo gametogénico. - Condiciones desfavorables de luz, 8 horas de luz: Se reprodujo el fotoperiodo corto del medio natural. - Condiciones favorables de luz, 16 horas de luz: Se reprodujo el fotoperiodo largo del medio natural. - Luz permanente, 24 horas de luz: Se llevó a cabo para observar si el posible efecto positivo de la luz era exponencial o si llegaba a saturación. 0 años Fotoperiodo 0 horas 8 horas 16 horas 24 horas 1 año Fig. 3.10. Tabla resumen de las condiciones aplicadas al segundo acondicionamiento. Cada 15 días, hasta el día 90, se extraía una muestra de 10 individuos de cada grupo, 80 en total, excepto el último muestreo, en el que se procesaron todas las ostras que quedaban. Se obtuvieron en total 6 muestreos. Acondicionamiento 3 Se realizó para observar el posible efecto diferenciado de la luz sobre individuos con la gónada sin desarrollar (acondicionamiento 2) e individuos con la gónada desarrollada. Al igual que en el acondicionamiento 2 se uso agua a temperatura ambiente (Fig. 3.11) y se alimentó ad libitum. Pero se usó sólo la clase de edad 0 años. 9 66 Capítulo 3 Temperatura desfavorable y fotoperiodo favorable o “Frío largo (Fl): Se sometieron a una temperatura media de 14º C y un fotoperiodo de 16 horas de luz. 14º C 20º C 0 años 8 horas Condiciones desfavorables (Fc) Condiciones mixtas (Cc) 1 año 0 años 16 horas Condiciones mixtas (Fl) Condiciones favorables (Cl) 1 año Fig. 3.8. Tabla resumen de la combinación de factores aplicada en el primer acondicionamiento. Se mantuvieron durante 30 días y se analizaron 10 individuos de cada grupo, 80 en total. Sin embargo, se observó que el desarrollo era demasiado rápido y que el período de muestreo era demasiado largo, con lo que se llevó a cabo otro muestreo a los 15 días (45 días de acondicionamiento), en el que se incrementó también el tamaño de muestra a 15 individuos de cada grupo. A los 60 días de acondicionamiento se llevó a cabo el último muestreo, donde se analizaron todos los individuos que quedaban. Las muestras de los acondicionamientos eran entregadas en origen, en mano justo después de su recogida. Acondicionamiento 2 En este acondicionamiento se mantuvo la temperatura ambiente, de otoño-invierno, y se estudiaron las variaciones del fotoperiodo; esto se hizo ante la hipótesis del importante papel de la luz en el desarrollo gametogénico de Ostrea edulis, y ante la limitación en la manipulación de la temperatura, ya que no se poseía un sistema de enfriamiento (Fig. 3.9). Temperatura del segundo acondicionamiento 10 12 14 16 18 20 15-oct-09 22-oct-09 29-oct-09 5-nov-09 12-nov-09 19-nov-09 26-nov-09 3-dic-09 10-dic-09 17-dic-09 24-dic-09 31-dic-09 7-ene-10 14-ene-10 0 h. 8 h . 16 h. 24 h. Fig. 3.9. Gráfico de la temperatura de los cuatro grupos, a distintas horas de luz, durante el segundo acondicionamiento. 8 Material y Métodos El 14 de octubre del 2009, el Oceanográfico de A Coruña recibió 540 ostras de dos clases de edad, 0 años (población 09) y 1 año de edad (población 08). Las de clase 0 años de edad, además, tenían la particularidad de que su gónada estaba sin desarrollar, y las de 1 año de edad estaban predominantemente en Reposo. Es decir, en general tenían escaso o nulo desarrollo gonadal. Estas ostras se acondicionaron durante 90 días, con alimentación ad libitum, temperatura ambiente y el siguiente fotoperiodo ((Fig. 3.10): - Ausencia de luz, 0 horas de luz: Un cuarto de cada clase de edad se mantuvo en condiciones de oscuridad total, con el fin de observar si la ausencia de luz impedía el desarrollo gametogénico. - Condiciones desfavorables de luz, 8 horas de luz: Se reprodujo el fotoperiodo corto del medio natural. - Condiciones favorables de luz, 16 horas de luz: Se reprodujo el fotoperiodo largo del medio natural. - Luz permanente, 24 horas de luz: Se llevó a cabo para observar si el posible efecto positivo de la luz era exponencial o si llegaba a saturación. 0 años Fotoperiodo 0 horas 8 horas 16 horas 24 horas 1 año Fig. 3.10. Tabla resumen de las condiciones aplicadas al segundo acondicionamiento. Cada 15 días, hasta el día 90, se extraía una muestra de 10 individuos de cada grupo, 80 en total, excepto el último muestreo, en el que se procesaron todas las ostras que quedaban. Se obtuvieron en total 6 muestreos. Acondicionamiento 3 Se realizó para observar el posible efecto diferenciado de la luz sobre individuos con la gónada sin desarrollar (acondicionamiento 2) e individuos con la gónada desarrollada. Al igual que en el acondicionamiento 2 se uso agua a temperatura ambiente (Fig. 3.11) y se alimentó ad libitum. Pero se usó sólo la clase de edad 0 años. 9 67 Capítulo 3 Temperaturas del tercer acondicionamiento 10 12 14 16 18 20 25-ene-10 30-ene-10 4-feb-10 9-feb-10 14-feb-10 19-feb-10 24-feb-10 1-mar-10 6-mar-10 11-mar-10 0 h. de luz 16 h. de luz Fig. 3.11. Gráfico de la temperatura para el tercer acondicionamiento. El 21 de enero del 2010 el Oceanográfico de A Coruña recibió 122 ostras de la población 09, 0 años de edad. Estas ostras se dividieron en dos grupos y se sometieron a 0 horas de luz y a 16 horas de luz respectivamente (Fig. 3.12). Cada 15 días se extraían y procesaban 15 individuos de cada grupo, hasta los 60 días de acondicionamiento. Fotoperiodo 0 horas 16 horas 0 años Fig. 3.12. Tabla resumen de las condiciones aplicadas en el tercer acondicionamiento. 3.2. Procesado histológico de las muestras Se le aplicó el mismo procesado a todas las muestras, ya fueran del medio natural o de acondicionamiento. Las muestras se enviaban a través de una empresa de transporte rápido y con sistema de refrigeración (Fig. 3.13), con lo que las ostras llegaban al laboratorio vivas. Fig. 3.13. Sistema de embalaje para el envío de muestras. 10 Material y Métodos Inmediatamente se identificaban individualmente con un código que indicaba el muestreo al que pertenecían y al número de individuo. A continuación se procedía a la toma de datos físicos, de peso total y longitud. Posteriormente se abrían con la ayuda de un abreostras o un cuchillo y se tomaban datos del peso de la concha y la vianda de cada individuo. Se diseccionaba la gónada, junto con el hepatopáncreas, ya que la gónada lo recubre. No se recogieron los pesos de las gónadas, ya que al estar unidas al hepatopáncreas el peso sería conjunto y no se podría establecer la variación de los pesos de las gónadas. Inmediatamente después de la disección se llevaba a cabo el procesado histológico. En primer lugar, la gónada se introducía en botes, individuales e identificados, para su fijación con Bouin con el fin de facilitar las posteriores fases de procesado, las gónadas-hepatopáncreas más grandes se cortaron a la mitad o se eliminó la parte central, hepatopáncreas en su mayoría. Composición del Bouin: - Solución saturada de ácido pícrico en agua de mar: 750 mL - Formaldehído al 40 %: 250 mL - Ácido acético glacial: 50 mL Una vez fijadas correctamente, las gónadas-hepatopáncreas se extraían del Bouin y se llevaban a cabo sucesivos lavados en alcohol de 70 %, para la eliminación del ácido pícrico de las muestras, compuesto que da un color amarillo y puede interferir posteriormente con la tinción. El alcohol se cambiaba a medida que el pícrico pasaba de las gónadas-hepatopáncreas a este. Los lavados en alcohol de 70 % se llevaron a cabo en varios días y se realizaron hasta que las muestras perdieron el tono amarillo, es decir, eliminaron todo el pícrico. Una vez aclaradas, las muestras se sometían a una deshidratación, en la cual se mantenían durante una hora en alcoholes de menor a mayor graduación y finalmente en xilol (Fig. 3.14). Líquido Tiempo Alcohol 96º 1 hora Alcohol 100º 1 hora Xilol 30 min Fig. 3.14. Tabla resumen del proceso de deshidratación. Una vez finalizada la deshidratación las muestras se incluyeron en bloques de parafina, para ello, en primer lugar se realiza una infiltración en parafina, durante el cual, la parafina ocupa los huecos intra y extracelulares. Las muestras se introducían en parafina y se mantenían en una estufa a 58 ºC, realizando un cambio de parafina (Fig. 3.15). 11 68 Capítulo 3 Temperaturas del tercer acondicionamiento 10 12 14 16 18 20 25-ene-10 30-ene-10 4-feb-10 9-feb-10 14-feb-10 19-feb-10 24-feb-10 1-mar-10 6-mar-10 11-mar-10 0 h. de luz 16 h. de luz Fig. 3.11. Gráfico de la temperatura para el tercer acondicionamiento. El 21 de enero del 2010 el Oceanográfico de A Coruña recibió 122 ostras de la población 09, 0 años de edad. Estas ostras se dividieron en dos grupos y se sometieron a 0 horas de luz y a 16 horas de luz respectivamente (Fig. 3.12). Cada 15 días se extraían y procesaban 15 individuos de cada grupo, hasta los 60 días de acondicionamiento. Fotoperiodo 0 horas 16 horas 0 años Fig. 3.12. Tabla resumen de las condiciones aplicadas en el tercer acondicionamiento. 3.2. Procesado histológico de las muestras Se le aplicó el mismo procesado a todas las muestras, ya fueran del medio natural o de acondicionamiento. Las muestras se enviaban a través de una empresa de transporte rápido y con sistema de refrigeración (Fig. 3.13), con lo que las ostras llegaban al laboratorio vivas. Fig. 3.13. Sistema de embalaje para el envío de muestras. 10 Material y Métodos Inmediatamente se identificaban individualmente con un código que indicaba el muestreo al que pertenecían y al número de individuo. A continuación se procedía a la toma de datos físicos, de peso total y longitud. Posteriormente se abrían con la ayuda de un abreostras o un cuchillo y se tomaban datos del peso de la concha y la vianda de cada individuo. Se diseccionaba la gónada, junto con el hepatopáncreas, ya que la gónada lo recubre. No se recogieron los pesos de las gónadas, ya que al estar unidas al hepatopáncreas el peso sería conjunto y no se podría establecer la variación de los pesos de las gónadas. Inmediatamente después de la disección se llevaba a cabo el procesado histológico. En primer lugar, la gónada se introducía en botes, individuales e identificados, para su fijación con Bouin con el fin de facilitar las posteriores fases de procesado, las gónadas-hepatopáncreas más grandes se cortaron a la mitad o se eliminó la parte central, hepatopáncreas en su mayoría. Composición del Bouin: - Solución saturada de ácido pícrico en agua de mar: 750 mL - Formaldehído al 40 %: 250 mL - Ácido acético glacial: 50 mL Una vez fijadas correctamente, las gónadas-hepatopáncreas se extraían del Bouin y se llevaban a cabo sucesivos lavados en alcohol de 70 %, para la eliminación del ácido pícrico de las muestras, compuesto que da un color amarillo y puede interferir posteriormente con la tinción. El alcohol se cambiaba a medida que el pícrico pasaba de las gónadas-hepatopáncreas a este. Los lavados en alcohol de 70 % se llevaron a cabo en varios días y se realizaron hasta que las muestras perdieron el tono amarillo, es decir, eliminaron todo el pícrico. Una vez aclaradas, las muestras se sometían a una deshidratación, en la cual se mantenían durante una hora en alcoholes de menor a mayor graduación y finalmente en xilol (Fig. 3.14). Líquido Tiempo Alcohol 96º 1 hora Alcohol 100º 1 hora Xilol 30 min Fig. 3.14. Tabla resumen del proceso de deshidratación. Una vez finalizada la deshidratación las muestras se incluyeron en bloques de parafina, para ello, en primer lugar se realiza una infiltración en parafina, durante el cual, la parafina ocupa los huecos intra y extracelulares. Las muestras se introducían en parafina y se mantenían en una estufa a 58 ºC, realizando un cambio de parafina (Fig. 3.15). 11 69 Capítulo 3 Infiltración en estufa Tiempo Parafina. 1 uso 4-5 horas Parafina nueva 12-24 horas Fig. 3.15. Tabla resumen del proceso de infiltración. A continuación, se realizaba la inclusión de las muestras individuales en tacos de parafina, con la ayuda de moldes metálicos. Una vez obtenidos los bloques de parafina, estos se enfriaban a 6-7 ºC, para facilitar el corte. Cada individuo se cortaba a espesores de corte de 3 μm, con un Microtomo Microm modelo “HM-340E”. Se depositan los cortes en un baño de flotación, con agua a 40-42 ºC, para su estiramiento y selección. A continuación se colocaban en un portaobjetos y se codificaban, de cada individuo se sacaron 3 ó 4 portas con 2 ó 3 cortes cada uno. Una vez obtenidos los cortes era preciso teñirlos (Fig. 3.16); para ello, en primer lugar, los portas se introducían en la estufa a 58º C, 15 minutos hasta que la parafina estaba completamente derretida. A continuación se realizaban dos lavados en xilol para eliminar la parafina, y se rehidrataban pasándolas por alcoholes de mayor a menor graduación, para permitir la actuación del tinte, en nuestro caso se usó el tricrómico de Wheatley (1951). La solución tricrómica de Wheatley es una modificación de la tinción tricrómica de Gomori (1950) y su formulación es la siguiente: - Chromotrope 2R: 0,6 g - Light green SF: 0,15 g - Fast green FC: 0,15 g - Ácido fosfotúngstico: 0,7 g - Ácido acético glacial: 1,0 mL - Agua destilada: 100 mL La formulación del colorante tricrómico de Wheatley se adquirió comercialmente como producto comercial Para-Pak Trichrome Stain (Meridian Bioscience, Inc., USA). El Cromotropo 2R tiene afinidad por la cromatina, tiñéndola de rojo o rojo púrpura, mientras que el Ligth Green y el Fast Green tiñen los citoplasmas de color verde azulado. Así mismo esta tinción tricrómica resalta muy bien los fibroblastos y las fibras de colágeno. La tinción se detenía con Solución B (ácido acético al 10% v/v en etanol del 90%). Se realiza un pase en esta solución durante 30-60 segundos y con agitación suave. Por último, se deshidrataban de nuevo, pasándolos por alcoholes de menor a mayor graduación y terminando con xilol. 12 Material y Métodos Número cubeta Contenido cubeta Tiempo 1º Xilol 5 minutos 2º Xilol 5 minutos 3º Alcohol 100º 5 pases 4º Alcohol 100º 5 minutos 5º Alcohol 96º 5 minutos 6º Alcohol 70º 5 minutos 7º Alcohol 70º 5 minutos 8º Tricrómico 5 segundos 9º Solución b 15 segundos 10 Alcohol 96º 15 segundos 11º Alcohol 96º 5 minutos 12º Alcohol 100º 5 minutos 13 Xilol 5 minutos 14º Xilol 5 minutos Fig. 3.16. Tabla resumen del proceso de tinción. Una vez teñidos, se procedió al montaje de los portas, para proteger y conservar los cortes. Como medio de montaje se utilizó una resina artificial, el DPX, del cual se ponían unas gotas en el cubreobjetos, y a continuación, se colocaba sobre el portaobjetos, cubriendo totalmente los cortes histológicos y cuidándose de que no quedaran burbujas. Una vez secos, se pasaba a su estudio, y al posterior almacenaje. 3.3. Recogida de datos Los portaobjetos fueron estudiados al microscopio óptico Olympus, modelo “BX-50”, equipado con óptica Plan-apoacromática y un sistema fotográfico PM-20, con objetivos de 10x, 20x, 40x, 60x de inmersión en aceite y 100x de inmersión en aceite. 13 70 Capítulo 3 Infiltración en estufa Tiempo Parafina. 1 uso 4-5 horas Parafina nueva 12-24 horas Fig. 3.15. Tabla resumen del proceso de infiltración. A continuación, se realizaba la inclusión de las muestras individuales en tacos de parafina, con la ayuda de moldes metálicos. Una vez obtenidos los bloques de parafina, estos se enfriaban a 6-7 ºC, para facilitar el corte. Cada individuo se cortaba a espesores de corte de 3 μm, con un Microtomo Microm modelo “HM-340E”. Se depositan los cortes en un baño de flotación, con agua a 40-42 ºC, para su estiramiento y selección. A continuación se colocaban en un portaobjetos y se codificaban, de cada individuo se sacaron 3 ó 4 portas con 2 ó 3 cortes cada uno. Una vez obtenidos los cortes era preciso teñirlos (Fig. 3.16); para ello, en primer lugar, los portas se introducían en la estufa a 58º C, 15 minutos hasta que la parafina estaba completamente derretida. A continuación se realizaban dos lavados en xilol para eliminar la parafina, y se rehidrataban pasándolas por alcoholes de mayor a menor graduación, para permitir la actuación del tinte, en nuestro caso se usó el tricrómico de Wheatley (1951). La solución tricrómica de Wheatley es una modificación de la tinción tricrómica de Gomori (1950) y su formulación es la siguiente: - Chromotrope 2R: 0,6 g - Light green SF: 0,15 g - Fast green FC: 0,15 g - Ácido fosfotúngstico: 0,7 g - Ácido acético glacial: 1,0 mL - Agua destilada: 100 mL La formulación del colorante tricrómico de Wheatley se adquirió comercialmente como producto comercial Para-Pak Trichrome Stain (Meridian Bioscience, Inc., USA). El Cromotropo 2R tiene afinidad por la cromatina, tiñéndola de rojo o rojo púrpura, mientras que el Ligth Green y el Fast Green tiñen los citoplasmas de color verde azulado. Así mismo esta tinción tricrómica resalta muy bien los fibroblastos y las fibras de colágeno. La tinción se detenía con Solución B (ácido acético al 10% v/v en etanol del 90%). Se realiza un pase en esta solución durante 30-60 segundos y con agitación suave. Por último, se deshidrataban de nuevo, pasándolos por alcoholes de menor a mayor graduación y terminando con xilol. 12 Material y Métodos Número cubeta Contenido cubeta Tiempo 1º Xilol 5 minutos 2º Xilol 5 minutos 3º Alcohol 100º 5 pases 4º Alcohol 100º 5 minutos 5º Alcohol 96º 5 minutos 6º Alcohol 70º 5 minutos 7º Alcohol 70º 5 minutos 8º Tricrómico 5 segundos 9º Solución b 15 segundos 10 Alcohol 96º 15 segundos 11º Alcohol 96º 5 minutos 12º Alcohol 100º 5 minutos 13 Xilol 5 minutos 14º Xilol 5 minutos Fig. 3.16. Tabla resumen del proceso de tinción. Una vez teñidos, se procedió al montaje de los portas, para proteger y conservar los cortes. Como medio de montaje se utilizó una resina artificial, el DPX, del cual se ponían unas gotas en el cubreobjetos, y a continuación, se colocaba sobre el portaobjetos, cubriendo totalmente los cortes histológicos y cuidándose de que no quedaran burbujas. Una vez secos, se pasaba a su estudio, y al posterior almacenaje. 3.3. Recogida de datos Los portaobjetos fueron estudiados al microscopio óptico Olympus, modelo “BX-50”, equipado con óptica Plan-apoacromática y un sistema fotográfico PM-20, con objetivos de 10x, 20x, 40x, 60x de inmersión en aceite y 100x de inmersión en aceite. 13 71 Morfogénesis de la gónada 4.1 Origen de la gónada, líneas germinales sexuales, espermatogonias y ovogonias La gonadogénesis es el proceso de formación de la gónada por el molusco, generando una unidad histoanatómica funcional que se erige en un órgano propio del animal. Ostrea edulis hace una gonadogénesis que implica dos procesos que, según revelan los resultados de este estudio, ocurren de modo prácticamente simultáneo: a) la fabricación de la infraestructura de los gonoductos y de los folículos gonadales; y b) la gametogénesis, que es la producción de las series gametogénicas, masculina y femenina, que originarán, respectivamente, los espermatozoides y los huevos. Para abordar el estudio de la construcción de la gónada por el molusco, así como su evolución, se propone un modelo de espacios anatómicos en una ostra adulta (Fig. 4.6.). Definimos un espacio anatómico como un lugar del soma del molusco que este asigna para realizar un conjunto de funciones fisiológicas específicas. Este espacio tiene un perfil histológico y funcional característico, y en él se encuentran las células que realizan las funciones fisiológicas propias de dicho espacio. Para Ostrea edulis se formulan los siguientes espacios anatómicos: a) el canal genital; b) el espacio del manto; c) el espacio gonadal; d) el espacio de la glándula digestiva. Siendo el eje central de este modelo el canal genital, y relativo a él se disponen el resto de espacios.. Estos espacios se ilustran con un esquema en la Fig. 4.6. Desde que el juvenil de Ostrea edulis construye su primera gónada, y en los sucesivos ciclos reproductivos que el animal adulto hace en su historia de vida, la gónada es un órgano que surge, se forma, se desarrolla y permanece en el seno del tejido conjuntivo. Tiene entidad histoanatómica propia y es un sistema cerrado dentro de la anatomía del animal, es decir, significando con ello que las células germinales macho (espermatogonias) y hembra (ovogonias), siempre están en su interior (Fig. 4.4 B; 4.5 A y B; 4.8 A y B) y no se han observado tales células libres en el tejido conjuntivo, como ha sido propuesto para Crassostrea gigas (Fabioux, 2004). En este estudio, las primeras células de las series gametogénicas masculina y femenina que observamos en la gónada primaria del animal juvenil y en la gónada del molusco adulto son las espermatogonias y las ovogonias, respectivamente; no hemos visto células germinales anteriores a ellas de las que pudiesen derivar, como observa y propone Fabioux (2004) para Crassostrea gigas. Por tanto, al menos a partir del animal juvenil, en Ostrea edulis la serie gametogénica masculina (SG �) comienza con una espermatogonia – que denominamos espermatogonia 1 (Spg1)– y la serie gametogénica femenina (SG �) arranca con una ovogonia (Ovg); además ambas series gametogénicas son independientes entre sí, significando con ello que no se derivan de una célula común a las dos que tenga bipotencialidad sexual. De aquí se deduce que la espermatogonia 1 (Spg1) y la ovogonia (Ovg) son las células iniciales fundadoras, respectivamente, de la serie gametogénica masculina y de la serie gametogénica femenina, y que deben quedar determinadas durante la embriogénesis del animal, para que cuando se forme el juvenil ya esté equipado con estas células germinales. Ni en Ostrea edulis, ni en la mayoría de los moluscos bivalvos, se conoce el origen tanto de la gónada como de las células de la línea germinal sexual. Opinamos que, para esclarecer estos asuntos, hay que rastrear hasta la embriología temprana del animal, y que esta cuestión no se ha abordado en profundidad generando una amplia confusión en la literatura científica. En un intento de dar un marco explicativo a nuestros resultados, exponemos a continuación los antecedentes acerca de lo que se conoce sobre la embriología de la gónada y de las líneas germinales sexuales en un molusco bivalvo. Hasta donde llega nuestra información, sólo Farris H. Woods (Woods, 1931) ha hecho un estudio extenso, profundo y minucioso acerca del origen embrionario de las células de la línea germinal sexual en un molusco bivalvo; también este autor fue el primero en preocuparse por el esclareci3 Morfogénesis de la gónada 4.1 Origen de la gónada, líneas germinales sexuales, espermatogonias y ovogonias La gonadogénesis es el proceso de formación de la gónada por el molusco, generando una unidad histoanatómica funcional que se erige en un órgano propio del animal. Ostrea edulis hace una gonadogénesis que implica dos procesos que, según revelan los resultados de este estudio, ocurren de modo prácticamente simultáneo: a) la fabricación de la infraestructura de los gonoductos y de los folículos gonadales; y b) la gametogénesis, que es la producción de las series gametogénicas, masculina y femenina, que originarán, respectivamente, los espermatozoides y los huevos. Para abordar el estudio de la construcción de la gónada por el molusco, así como su evolución, se propone un modelo de espacios anatómicos en una ostra adulta (Fig. 4.6.). Definimos un espacio anatómico como un lugar del soma del molusco que este asigna para realizar un conjunto de funciones fisiológicas específicas. Este espacio tiene un perfil histológico y funcional característico, y en él se encuentran las células que realizan las funciones fisiológicas propias de dicho espacio. Para Ostrea edulis se formulan los siguientes espacios anatómicos: a) el canal genital; b) el espacio del manto; c) el espacio gonadal; d) el espacio de la glándula digestiva. Siendo el eje central de este modelo el canal genital, y relativo a él se disponen el resto de espacios.. Estos espacios se ilustran con un esquema en la Fig. 4.6. Desde que el juvenil de Ostrea edulis construye su primera gónada, y en los sucesivos ciclos reproductivos que el animal adulto hace en su historia de vida, la gónada es un órgano que surge, se forma, se desarrolla y permanece en el seno del tejido conjuntivo. Tiene entidad histoanatómica propia y es un sistema cerrado dentro de la anatomía del animal, es decir, significando con ello que las células germinales macho (espermatogonias) y hembra (ovogonias), siempre están en su interior (Fig. 4.4 B; 4.5 A y B; 4.8 A y B) y no se han observado tales células libres en el tejido conjuntivo, como ha sido propuesto para Crassostrea gigas (Fabioux, 2004). En este estudio, las primeras células de las series gametogénicas masculina y femenina que observamos en la gónada primaria del animal juvenil y en la gónada del molusco adulto son las espermatogonias y las ovogonias, respectivamente; no hemos visto células germinales anteriores a ellas de las que pudiesen derivar, como observa y propone Fabioux (2004) para Crassostrea gigas. Por tanto, al menos a partir del animal juvenil, en Ostrea edulis la serie gametogénica masculina (SG �) comienza con una espermatogonia – que denominamos espermatogonia 1 (Spg1)– y la serie gametogénica femenina (SG �) arranca con una ovogonia (Ovg); además ambas series gametogénicas son independientes entre sí, significando con ello que no se derivan de una célula común a las dos que tenga bipotencialidad sexual. De aquí se deduce que la espermatogonia 1 (Spg1) y la ovogonia (Ovg) son las células iniciales fundadoras, respectivamente, de la serie gametogénica masculina y de la serie gametogénica femenina, y que deben quedar determinadas durante la embriogénesis del animal, para que cuando se forme el juvenil ya esté equipado con estas células germinales. Ni en Ostrea edulis, ni en la mayoría de los moluscos bivalvos, se conoce el origen tanto de la gónada como de las células de la línea germinal sexual. Opinamos que, para esclarecer estos asuntos, hay que rastrear hasta la embriología temprana del animal, y que esta cuestión no se ha abordado en profundidad generando una amplia confusión en la literatura científica. En un intento de dar un marco explicativo a nuestros resultados, exponemos a continuación los antecedentes acerca de lo que se conoce sobre la embriología de la gónada y de las líneas germinales sexuales en un molusco bivalvo. Hasta donde llega nuestra información, sólo Farris H. Woods (Woods, 1931) ha hecho un estudio extenso, profundo y minucioso acerca del origen embrionario de las células de la línea germinal sexual en un molusco bivalvo; también este autor fue el primero en preocuparse por el esclareci3 79 Capítulo 4 miento de los factores determinantes de tal línea germinal en el embrión y de utilizarlos como marcadores para detectar el surgimiento de las células de línea germinal para seguirlas hasta su ubicación final en el esbozo de la gónada que se forma en el embrión (Woods, 1932). Asímismo, este autor, establece cómo y cuando se forma la gónada en el embrión, distinguiendo claramente entre lo que es la estructura de la gónada y lo que son las células de la línea germinal sexual que están en su seno. Woods realizó ambos trabajos en el molusco bivalvo ambisexual de agua dulce Sphaerium striatinum. Al estudiar la embriogénesis de las células germinales sexuales en dicho molusco, Woods (Woods, 1931) establece claramente que sus líneas germinales masculina y femenina se originan durante la embriogénesis temprana del animal formando dos grupos de células germinales primordiales que: a) no tienen un origen embrionario mesodérmico, sino que tienen un origen común con el mesodermo, porque tanto ambos grupos de células germinales, como parte del mesodermo, se originan a partir de un micrómero que él denomina el micrómero d.4 (M) ó célula M. Esta célula da origen a ambas líneas germinales así como a parte del mesodermo; b) ambos grupos de células germinales aparecen durante la blastulación del embrión, y en la gastrulación ya están formados; c) las células germinales de cada grupo son sexualmente unipotenciales, un grupo origina la línea germinal masculina, y el otro origina la línea germinal femenina, pero el autor no es capaz de pronosticar qué grupo de células germinales origina a cual línea germinal; d) aunque ambas líneas germinales proceden de la célula M, son independientes entre sí desde el momento en que se forman; e) en la gastrulación del embrión, momento en que empieza la formación de la gónada, las dos líneas germinales, masculina y femenina, ya están formadas y son independientes; f) no encuentra diferencias citológicas entre las células germinales primordiales y las espermatogonias y las ovogonias que, posteriormente, tendrá el individuo adulto, sólo observa que estas células tienen menor tamaño que las células germinales primordiales; o sea, que las espermatogonias y las ovogonias son, de hecho, células germinales primordiales; lo que claramente significa que las espermatogonias y las ovogonias son tejido germinal embrionario indiferenciado que está presente en el animal adulto. Del trabajo de este autor se desprende que: a) cuando se origina la larva trocófora, las líneas germinales masculina y femenina ya se han producido y son independientes entre sí y, además, ya se está formando el esbozo de la gónada, esbozo que contiene a las células germinales primordiales de ambas líneas germinales; b) la gónada es un órgano anatómico cerrado que contiene en su interior a las espermatogonias y a las ovogonias, y ya está formado en el embrión en el nivel de desarrollo de larva trocófora; c) las paredes fibroblásticas que formarán tanto el canal genital como los gonoductos son de origen mesodérmico; d) las espermatogonias y las ovogonias no son de origen mesodérmico sino que tienen un principio común con él; por tanto, la línea germinal sexual es una línea celular embrionaria en sí misma, además y aparte de las hojas embrionarias ectodermo, mesodermo y endodermo; e) en el interior de la gónada hay células mesodérmicas y, además hay fibroblastos que son de origen mesodérmico. Opinamos que los resultados que presenta esta tesis sobre el desarrollo tanto de la gónada primaria, por el individuo juvenil, como el de las sucesivas gónadas por el individuo adulto de Ostrea edulis, pueden recibir explicación a partir de estos hallazgos de Woods (Woods, 1931) en Sphaerium striatinum. También fue Woods (Wood, 1932) el primero en establecer un marcador citológico para detectar la formación de las células de la línea germinal sexual en el embrión, este consistía en un conjunto de mitocondrias presentes en el ovocito sin fecundar, lo que denominó nube mitocondrial. Ahora sabemos que, además de las mitocondrias, esta nube está compuesta por otros elementos celulares, tanto las mitocondrias, como los elementos celulares –que ahora describiremos– se incluyen actualmente en la denominada hipótesis de la preformación, que trata de explicar la determinación de la línea germinal sexual en el embrión. La determinación de la línea germinal durante la embriogénesis de un animal se ha estudiado en invertebrados y en vertebrados, y actualmente hay dos hipótesis para interpretar los datos disponi4 Morfogénesis de la gónada bles: la hipótesis de la epigénesis y la hipótesis de la preformación (Extavour & Akam, 2003, revisión). La hipótesis de la epigénesis trata de explicar la determinación de la línea germinal en las especies cuyos ovocitos no tienen plasma germinal, o no se ha observado con claridad, como es el caso de los vertebrados. La hipótesis de la preformación pretende explicar las observaciones realizadas en la mayoría de los invertebrados, como es el caso de moluscos, insectos y gusano Caenorhabditis elegans; se fundamenta en una herencia maternal, y formula que las células de la línea germinal sexual son determinadas en el embrión a partir de un plasma germinal que procede del ovocito antes de ser fecundado. Durante la segmentación del zigoto, los constituyentes de este plasma germinal no se distribuyen uniformemente entre todos los blastómeros, sino que pasan en conjunto, prácticamente en su totalidad, de unos determinados blastómeros a otros a lo largo de una línea particular de blastómeros hasta un blastómero concreto que produce la línea germinal. Este plasma germinal es una región citoplasmática concreta y yuxtaperinuclear del ovocito que contiene organelas (mitocondrias, retículo endoplasmático rugoso, fracciones del aparato de Golgi), ribosomas, transcritos de ARNm y proteínas específicas procedentes de estos ARNm. Fue Farris Woods (Woods, 1932) quien, en Sphaerium striatinum, primero identificó a las mitocondrias como componente de este plasma germinal, y las utilizó como marcador para rastrear el tránsito del plasma germinal desde el ovocito, y por los blastómeros de la segmentación del zigoto, hasta llegar al micrómero d.4, que origina la línea germinal o las líneas germinales. La región del plasma germinal existente en el citoplasma del ovocito sin fecundar origina una estructura citoplasmática que se tiñe, identifica y diferencia claramente mediante adecuadas técnicas histológicas para microscopía óptica. Así lo hizo el embriólogo E.G. Balbiani en 1864, quien la estudió extensamente en los ovocitos de arácnidos y de miriápodos (Balbiani, 1864), aunque no describió sus componentes organelares ni moleculares, asunto que varios autores realizaron posteriormente (Kloc, M. et al. 2004b, revisión). Actualmente, esta estructura se denomina principalmente cuerpo de Balbiani, o cuerpos de Balbiani en el caso de que la estructura se observe fragmentada en el ovocito, como con frecuencia ocurre. Los cuerpos de Balbiani también se denominan en la literatura, como: cuerpos densos, cuerpos cromatoides, nube mitocondrial, "nuage", cuerpos vitelinos y núcleos vitelinos (De Smedt et al, 2000; Extavour y Akam, 2003, revisión; Kloc et al, 2004a; Kloc et al, 2004b, revisión). En los cuerpos de Balbiani de varias especies de invertebrados se han encontrado genes determinantes de la línea germinal, sus transcritos de ARNm y las proteínas que éstos codifican, entre ellos el gen vasa, el ARNm vasa y la proteína vasa (Extavour y Akam, 2003, revisión; Kloc et al, 2004b, revisión). En el bivalvo Crassostrea gigas se ha encontrado un homólogo del gen vasa, pero no se han descrito cuerpos de Balbiani (Fabioux, 2004b,c). Con todo esto se deduce que la presencia de cuerpos de Balbiani en los ovocitos sin fecundar, libres o aún en la gónada, es un indicador de que esa especie determina la línea o las líneas germinales sexuales mediante un proceso de preformación. Así opinamos que podría suceder en Ostrea edulis, ya que los ovocitos vitelogénicos y postvitelogénicos de Ostrea edulis muestran cuerpos de Balbiani (Fig. 4.1); estos se localizan en la región yuxtaperinuclear del citoplasma, tienen forma de barra y se tiñen de rojo. Este color se debe a que la tinción tricrómica da este color a las estructuras celulares que contienen elevada cantidad de ácidos nucleicos (ADN, ARN), como es el caso de los cromosomas y nucleolo, con lo que la tinción roja de los cuerpos de Balbiani podría indicar la presencia de ARNm y de ribosomas en ellos. Normalmente, los cuerpos de Balbiani constituyen una nube que rodea total o parcialmente al núcleo, pero como resultado del procesado de la muestra para histología, tinción y corte, dicha nube se fragmenta, así, dependiendo del plano de la sección, en las preparaciones se pueden observar ninguna, una o más fracciones. 5 80 Capítulo 4 miento de los factores determinantes de tal línea germinal en el embrión y de utilizarlos como marcadores para detectar el surgimiento de las células de línea germinal para seguirlas hasta su ubicación final en el esbozo de la gónada que se forma en el embrión (Woods, 1932). Asímismo, este autor, establece cómo y cuando se forma la gónada en el embrión, distinguiendo claramente entre lo que es la estructura de la gónada y lo que son las células de la línea germinal sexual que están en su seno. Woods realizó ambos trabajos en el molusco bivalvo ambisexual de agua dulce Sphaerium striatinum. Al estudiar la embriogénesis de las células germinales sexuales en dicho molusco, Woods (Woods, 1931) establece claramente que sus líneas germinales masculina y femenina se originan durante la embriogénesis temprana del animal formando dos grupos de células germinales primordiales que: a) no tienen un origen embrionario mesodérmico, sino que tienen un origen común con el mesodermo, porque tanto ambos grupos de células germinales, como parte del mesodermo, se originan a partir de un micrómero que él denomina el micrómero d.4 (M) ó célula M. Esta célula da origen a ambas líneas germinales así como a parte del mesodermo; b) ambos grupos de células germinales aparecen durante la blastulación del embrión, y en la gastrulación ya están formados; c) las células germinales de cada grupo son sexualmente unipotenciales, un grupo origina la línea germinal masculina, y el otro origina la línea germinal femenina, pero el autor no es capaz de pronosticar qué grupo de células germinales origina a cual línea germinal; d) aunque ambas líneas germinales proceden de la célula M, son independientes entre sí desde el momento en que se forman; e) en la gastrulación del embrión, momento en que empieza la formación de la gónada, las dos líneas germinales, masculina y femenina, ya están formadas y son independientes; f) no encuentra diferencias citológicas entre las células germinales primordiales y las espermatogonias y las ovogonias que, posteriormente, tendrá el individuo adulto, sólo observa que estas células tienen menor tamaño que las células germinales primordiales; o sea, que las espermatogonias y las ovogonias son, de hecho, células germinales primordiales; lo que claramente significa que las espermatogonias y las ovogonias son tejido germinal embrionario indiferenciado que está presente en el animal adulto. Del trabajo de este autor se desprende que: a) cuando se origina la larva trocófora, las líneas germinales masculina y femenina ya se han producido y son independientes entre sí y, además, ya se está formando el esbozo de la gónada, esbozo que contiene a las células germinales primordiales de ambas líneas germinales; b) la gónada es un órgano anatómico cerrado que contiene en su interior a las espermatogonias y a las ovogonias, y ya está formado en el embrión en el nivel de desarrollo de larva trocófora; c) las paredes fibroblásticas que formarán tanto el canal genital como los gonoductos son de origen mesodérmico; d) las espermatogonias y las ovogonias no son de origen mesodérmico sino que tienen un principio común con él; por tanto, la línea germinal sexual es una línea celular embrionaria en sí misma, además y aparte de las hojas embrionarias ectodermo, mesodermo y endodermo; e) en el interior de la gónada hay células mesodérmicas y, además hay fibroblastos que son de origen mesodérmico. Opinamos que los resultados que presenta esta tesis sobre el desarrollo tanto de la gónada primaria, por el individuo juvenil, como el de las sucesivas gónadas por el individuo adulto de Ostrea edulis, pueden recibir explicación a partir de estos hallazgos de Woods (Woods, 1931) en Sphaerium striatinum. También fue Woods (Wood, 1932) el primero en establecer un marcador citológico para detectar la formación de las células de la línea germinal sexual en el embrión, este consistía en un conjunto de mitocondrias presentes en el ovocito sin fecundar, lo que denominó nube mitocondrial. Ahora sabemos que, además de las mitocondrias, esta nube está compuesta por otros elementos celulares, tanto las mitocondrias, como los elementos celulares –que ahora describiremos– se incluyen actualmente en la denominada hipótesis de la preformación, que trata de explicar la determinación de la línea germinal sexual en el embrión. La determinación de la línea germinal durante la embriogénesis de un animal se ha estudiado en invertebrados y en vertebrados, y actualmente hay dos hipótesis para interpretar los datos disponi4 Morfogénesis de la gónada bles: la hipótesis de la epigénesis y la hipótesis de la preformación (Extavour & Akam, 2003, revisión). La hipótesis de la epigénesis trata de explicar la determinación de la línea germinal en las especies cuyos ovocitos no tienen plasma germinal, o no se ha observado con claridad, como es el caso de los vertebrados. La hipótesis de la preformación pretende explicar las observaciones realizadas en la mayoría de los invertebrados, como es el caso de moluscos, insectos y gusano Caenorhabditis elegans; se fundamenta en una herencia maternal, y formula que las células de la línea germinal sexual son determinadas en el embrión a partir de un plasma germinal que procede del ovocito antes de ser fecundado. Durante la segmentación del zigoto, los constituyentes de este plasma germinal no se distribuyen uniformemente entre todos los blastómeros, sino que pasan en conjunto, prácticamente en su totalidad, de unos determinados blastómeros a otros a lo largo de una línea particular de blastómeros hasta un blastómero concreto que produce la línea germinal. Este plasma germinal es una región citoplasmática concreta y yuxtaperinuclear del ovocito que contiene organelas (mitocondrias, retículo endoplasmático rugoso, fracciones del aparato de Golgi), ribosomas, transcritos de ARNm y proteínas específicas procedentes de estos ARNm. Fue Farris Woods (Woods, 1932) quien, en Sphaerium striatinum, primero identificó a las mitocondrias como componente de este plasma germinal, y las utilizó como marcador para rastrear el tránsito del plasma germinal desde el ovocito, y por los blastómeros de la segmentación del zigoto, hasta llegar al micrómero d.4, que origina la línea germinal o las líneas germinales. La región del plasma germinal existente en el citoplasma del ovocito sin fecundar origina una estructura citoplasmática que se tiñe, identifica y diferencia claramente mediante adecuadas técnicas histológicas para microscopía óptica. Así lo hizo el embriólogo E.G. Balbiani en 1864, quien la estudió extensamente en los ovocitos de arácnidos y de miriápodos (Balbiani, 1864), aunque no describió sus componentes organelares ni moleculares, asunto que varios autores realizaron posteriormente (Kloc, M. et al. 2004b, revisión). Actualmente, esta estructura se denomina principalmente cuerpo de Balbiani, o cuerpos de Balbiani en el caso de que la estructura se observe fragmentada en el ovocito, como con frecuencia ocurre. Los cuerpos de Balbiani también se denominan en la literatura, como: cuerpos densos, cuerpos cromatoides, nube mitocondrial, "nuage", cuerpos vitelinos y núcleos vitelinos (De Smedt et al, 2000; Extavour y Akam, 2003, revisión; Kloc et al, 2004a; Kloc et al, 2004b, revisión). En los cuerpos de Balbiani de varias especies de invertebrados se han encontrado genes determinantes de la línea germinal, sus transcritos de ARNm y las proteínas que éstos codifican, entre ellos el gen vasa, el ARNm vasa y la proteína vasa (Extavour y Akam, 2003, revisión; Kloc et al, 2004b, revisión). En el bivalvo Crassostrea gigas se ha encontrado un homólogo del gen vasa, pero no se han descrito cuerpos de Balbiani (Fabioux, 2004b,c). Con todo esto se deduce que la presencia de cuerpos de Balbiani en los ovocitos sin fecundar, libres o aún en la gónada, es un indicador de que esa especie determina la línea o las líneas germinales sexuales mediante un proceso de preformación. Así opinamos que podría suceder en Ostrea edulis, ya que los ovocitos vitelogénicos y postvitelogénicos de Ostrea edulis muestran cuerpos de Balbiani (Fig. 4.1); estos se localizan en la región yuxtaperinuclear del citoplasma, tienen forma de barra y se tiñen de rojo. Este color se debe a que la tinción tricrómica da este color a las estructuras celulares que contienen elevada cantidad de ácidos nucleicos (ADN, ARN), como es el caso de los cromosomas y nucleolo, con lo que la tinción roja de los cuerpos de Balbiani podría indicar la presencia de ARNm y de ribosomas en ellos. Normalmente, los cuerpos de Balbiani constituyen una nube que rodea total o parcialmente al núcleo, pero como resultado del procesado de la muestra para histología, tinción y corte, dicha nube se fragmenta, así, dependiendo del plano de la sección, en las preparaciones se pueden observar ninguna, una o más fracciones. 5 81 Capítulo 4 Fig. 4.1. A: Cuerpo de Balbiani en un ovocito vitelogénico tardío. B: Cuerpo de Balbiani en un ovocito postvitelogénico. Se conocen varios genes que intervienen en la determinación de las líneas germinales sexuales durante la embriogénesis de vertebrados y de invertebrados (Williamson y Lehmann, 1996; Saffman y Lasko, 1999; Wylie, 1999; Raz, 2000; Extavour y Akam, 2003). La función de estos genes es determinar qué células van a realizar la meiosis, es decir las que van a desarrollar gametos. Sin embargo, para la mayoría de estos organismos se ignoran los genes que especifican el género sexual, o sea, que determinan qué células germinales producirán espermatogonias y cuales originarán ovogonias. Si las líneas germinales sexuales de Ostrea edulis siguen el patrón de desarrollo embrionario de Sphaerium striatinun (Woods, 1931), en el juvenil de este molusco la separación de las dos líneas sexuales, masculina y femenina, ya está establecida desde el estadio embrionario de larva trocófora a través de las células germinales primordiales y, por tanto, antes del inicio del primer desarrollo gonadal que realiza el individuo juvenil. De esto se hablará más ampliamente en el capítulo Series Gametogénicas. Las células germinales primordiales sólo tienen vida embrionaria y, en el caso de un molusco ambisexual como Ostrea edulis, son las que originarán, mediante diferenciación sexual y también durante la embriogénesis, las espermatogonias y las ovogonias (gonias, ambas). Las gonias son las células fundadoras de las series gametogénicas, es decir, son el primer eslabón celular hacia el desarrollo de los gametos. Hay una gonia (espermatogonia) que generará la serie gametogénica macho, y otra gonia (ovogonia) que producirá la serie gametogénica hembra. En la Fig. 4.2 se muestra un esquema que ilustra la probable secuencia de formación de las espermatogonias y de las ovogonias durante la embriogénesis de Ostrea edulis. Espermatogonias Fig. 4.2. Ilustración de la probable secuencia de formación de las espermatogonias y de las ovogonias durante la embriogénesis de Ostrea edulis. BlástulaOvocito Ovocito con Cuerpos de Balbiani Zigoto y segmentación Determinación de las Líneas Germinales Ovogonias Zigoto Gónada 6 Morfogénesis de la gónada A lo largo de toda su vida, y desde que el molusco hace su primera gónada, los individuos de Ostrea edulis siempre mantienen un reservorio de gonias iniciales, macho y hembra, adosadas a las paredes fibroblásticas de los folículos y del canal gonadal, que aseguran la capacidad de generar tanto series gametogénicas macho como hembra. 4.2 Morfogénesis de la gónada En Ostrea edulis, la gónada se ubica y se desarrolla en el espacio gonadal (Fig. 4.6) y en el seno del tejido conjuntivo, tiene una entidad histoanatómica propia y es un sistema cerrado, es decir, una vez formada, la gónada no recibe células germinales desde regiones anatómicas externas a la misma. La gónada se encuentra situada entre el canal genital (constituyente, asímismo, de la gónada) y la glándula digestiva (hepatopáncreas); el manto rodea a la gónada por la parte externa del canal genital, y la gónada, a su vez, recubre a la glándula digestiva (Fig. 4.3. A). Cuando comienza el desarrollo de la primera gónada, ésta consiste en una serie de canales tubulares interconectados, llamados canales genitales, que se extienden en el tejido conjuntivo entre el manto y la glándula digestiva, observación que ya ha sido descrita en Ostrea lurida (Coe, 1931, 1932a, 1934; 1943a) y, también, en Ostrea edulis (Cole, 1942). Asímismo, ambos autores, y para dichas especies, describen la existencia de lo que denominan tejido conectivo vesicular, que actualmente nombramos como células vesiculares (VC). En nuestros resultados se observan estas células VC en el espacio gonadal y se muestran en las Fig. 4.3 B, 4.4 B, 4.5, 4.7 A y 4.8 A. También en Crassostrea gigas se ha descrito la existencia de células VC en lo que nosotros denominamos espacio gonadal (Franco et al, 2008). Los canales genitales están formados por un epitelio ciliado, y en parte secretor, en su región externa y próxima al manto, y por una pared fibroblástica y aciliada en la región más próxima al espacio gonadal (Fig. 4.2. B). En Crassostrea gigas estos canales son continuos, y forman un anillo tridimensional continuo alrededor del espacio gonadal; sin embargo, en Ostrea edulis, los canales de este sistema son discontinuos (Fig. 4.3.A). 7 82 Capítulo 4 Fig. 4.1. A: Cuerpo de Balbiani en un ovocito vitelogénico tardío. B: Cuerpo de Balbiani en un ovocito postvitelogénico. Se conocen varios genes que intervienen en la determinación de las líneas germinales sexuales durante la embriogénesis de vertebrados y de invertebrados (Williamson y Lehmann, 1996; Saffman y Lasko, 1999; Wylie, 1999; Raz, 2000; Extavour y Akam, 2003). La función de estos genes es determinar qué células van a realizar la meiosis, es decir las que van a desarrollar gametos. Sin embargo, para la mayoría de estos organismos se ignoran los genes que especifican el género sexual, o sea, que determinan qué células germinales producirán espermatogonias y cuales originarán ovogonias. Si las líneas germinales sexuales de Ostrea edulis siguen el patrón de desarrollo embrionario de Sphaerium striatinun (Woods, 1931), en el juvenil de este molusco la separación de las dos líneas sexuales, masculina y femenina, ya está establecida desde el estadio embrionario de larva trocófora a través de las células germinales primordiales y, por tanto, antes del inicio del primer desarrollo gonadal que realiza el individuo juvenil. De esto se hablará más ampliamente en el capítulo Series Gametogénicas. Las células germinales primordiales sólo tienen vida embrionaria y, en el caso de un molusco ambisexual como Ostrea edulis, son las que originarán, mediante diferenciación sexual y también durante la embriogénesis, las espermatogonias y las ovogonias (gonias, ambas). Las gonias son las células fundadoras de las series gametogénicas, es decir, son el primer eslabón celular hacia el desarrollo de los gametos. Hay una gonia (espermatogonia) que generará la serie gametogénica macho, y otra gonia (ovogonia) que producirá la serie gametogénica hembra. En la Fig. 4.2 se muestra un esquema que ilustra la probable secuencia de formación de las espermatogonias y de las ovogonias durante la embriogénesis de Ostrea edulis. Espermatogonias Fig. 4.2. Ilustración de la probable secuencia de formación de las espermatogonias y de las ovogonias durante la embriogénesis de Ostrea edulis. BlástulaOvocito Ovocito con Cuerpos de Balbiani Zigoto y segmentación Determinación de las Líneas Germinales Ovogonias Zigoto Gónada 6 Morfogénesis de la gónada A lo largo de toda su vida, y desde que el molusco hace su primera gónada, los individuos de Ostrea edulis siempre mantienen un reservorio de gonias iniciales, macho y hembra, adosadas a las paredes fibroblásticas de los folículos y del canal gonadal, que aseguran la capacidad de generar tanto series gametogénicas macho como hembra. 4.2 Morfogénesis de la gónada En Ostrea edulis, la gónada se ubica y se desarrolla en el espacio gonadal (Fig. 4.6) y en el seno del tejido conjuntivo, tiene una entidad histoanatómica propia y es un sistema cerrado, es decir, una vez formada, la gónada no recibe células germinales desde regiones anatómicas externas a la misma. La gónada se encuentra situada entre el canal genital (constituyente, asímismo, de la gónada) y la glándula digestiva (hepatopáncreas); el manto rodea a la gónada por la parte externa del canal genital, y la gónada, a su vez, recubre a la glándula digestiva (Fig. 4.3. A). Cuando comienza el desarrollo de la primera gónada, ésta consiste en una serie de canales tubulares interconectados, llamados canales genitales, que se extienden en el tejido conjuntivo entre el manto y la glándula digestiva, observación que ya ha sido descrita en Ostrea lurida (Coe, 1931, 1932a, 1934; 1943a) y, también, en Ostrea edulis (Cole, 1942). Asímismo, ambos autores, y para dichas especies, describen la existencia de lo que denominan tejido conectivo vesicular, que actualmente nombramos como células vesiculares (VC). En nuestros resultados se observan estas células VC en el espacio gonadal y se muestran en las Fig. 4.3 B, 4.4 B, 4.5, 4.7 A y 4.8 A. También en Crassostrea gigas se ha descrito la existencia de células VC en lo que nosotros denominamos espacio gonadal (Franco et al, 2008). Los canales genitales están formados por un epitelio ciliado, y en parte secretor, en su región externa y próxima al manto, y por una pared fibroblástica y aciliada en la región más próxima al espacio gonadal (Fig. 4.2. B). En Crassostrea gigas estos canales son continuos, y forman un anillo tridimensional continuo alrededor del espacio gonadal; sin embargo, en Ostrea edulis, los canales de este sistema son discontinuos (Fig. 4.3.A). 7 83 Capítulo 4 Fig. 4.3. A: Morfogénesis de la gónada de Ostrea edulis antes del primer desarrollo gametogénico. Posición y discontinuidad del canal genital (CG). B: Detalle del canal genital de Ostrea edulis sin desarrollo gametogénico. CG: Canal genital; EpC: Epitelio ciliado del canal genital; EpFb: Epitelio de fibroblastos; G: Espacio gonadal con células vesiculares (VC); HP: Hepatopáncreas (glándula digestiva); M: Manto. Cuando el juvenil de Ostrea edulis forma su primera gónada, comienza produciendo simultáneamente dos estructuras: el sistema de canales genitales y un conglomerado celular que denominamos masa celular conjuntiva (MCC). El primero ya lo hemos descrito, y la MCC es un conglomerado celular de aspecto conjuntivo que aflora en el interior de los canales genitales, está constituido por fibroblastos y células de apariencia mesodérmica, y en su seno hay espermatogonias primarias (Spg1) y ovogonias (Ovg) (Fig. 4.4 A y B; Fig. 4.8 A y B). La formación de la primera gónada por el individuo juvenil podría ser una continuación del esbozo gonadal que ya se constituyó durante la vida embrionaria del molusco (estadio de larva velígera), en el caso de que se reproduzca la situación ya demostrada en el esbozo gonadal que forma Sphaerium striatinum (Woods, 1931); y parece que así ocurre, por las siguientes razones: a) el esbozo gonadal es un sistema cerrado, y la formación de la primera gónada también lo es; b) las paredes de la gónada en el esbozo gonadal están constituidas por fibroblastos, y la pared interior de los canales genitales también lo está; c) en el interior del esbozo gonadal hay células mesodérmicas, y en la MCC hay fibroblastos y células de aspecto mesodérmico; d) en el seno del mesodermo del esbozo gonadal están las espermatogonias y las ovogonias, y en la MCC también hay espermatogonias y ovogonias; e) en el esbozo gonadal no se advierten células germinales que no sean espermatogonias y ovogonias, también en la MCC sólo se observan espermatogonias y ovogonias, no habiendo células germinales anteriores a ellas de las que pudieran proceder; y f) en el esbozo gonadal, las espermatogonias y las ovogonias desarrollan vidas independientes entre sí, y lo mismo parecen hacer en la MCC. Cuando se inicia el desarrollo de la gónada primaria, las espermatogonias y las ovogonias se dividen y desarrollan las series gametogénicas masculina y femenina, respectivamente, que no son más que el conjunto de las células en desarrollo que darán lugar a los gametos. 8 Morfogénesis de la gónada Fig. 4.4. A. Disposición de la Masa Celular Conjuntiva en el canal genital de Ostrea edulis. B. Detalle de la Masa Celular Conjuntiva, donde se disponen las gonias (espermatogonias y ovogonias). CG: Canal genital; EpC: Epitelio ciliado del canal genital; Fb: Fibroblastos; HP: Hepatopáncreas (glándula digestiva); MCC: Masa Celular Conjuntiva; VC: Células Vesiculares. La formación de la gónada y el desarrollo gametogénico son procesos prácticamente simultáneos. Para formar la gónada los canales genitales diverticulan a partir de su pared fibroblástica y se evaginan (Fig. 4.5 A y B); estos divertículos crecen y se alargan desde el canal genital hacia el interior del espacio gonadal, originando así los folículos gonadales. Cada nueva serie de folículos se dispone, en el espacio gonadal, entre el canal genital y la glándula digestiva, de forma que los primeros folículos son los más cercanos a dicha glándula (Fig. 4.6. y 4.7.). A medida que se forman los folículos gonadales, éstos también diverticulan, y así se forman folículos lobulados y plurilobulados. 9 84 Capítulo 4 Fig. 4.3. A: Morfogénesis de la gónada de Ostrea edulis antes del primer desarrollo gametogénico. Posición y discontinuidad del canal genital (CG). B: Detalle del canal genital de Ostrea edulis sin desarrollo gametogénico. CG: Canal genital; EpC: Epitelio ciliado del canal genital; EpFb: Epitelio de fibroblastos; G: Espacio gonadal con células vesiculares (VC); HP: Hepatopáncreas (glándula digestiva); M: Manto. Cuando el juvenil de Ostrea edulis forma su primera gónada, comienza produciendo simultáneamente dos estructuras: el sistema de canales genitales y un conglomerado celular que denominamos masa celular conjuntiva (MCC). El primero ya lo hemos descrito, y la MCC es un conglomerado celular de aspecto conjuntivo que aflora en el interior de los canales genitales, está constituido por fibroblastos y células de apariencia mesodérmica, y en su seno hay espermatogonias primarias (Spg1) y ovogonias (Ovg) (Fig. 4.4 A y B; Fig. 4.8 A y B). La formación de la primera gónada por el individuo juvenil podría ser una continuación del esbozo gonadal que ya se constituyó durante la vida embrionaria del molusco (estadio de larva velígera), en el caso de que se reproduzca la situación ya demostrada en el esbozo gonadal que forma Sphaerium striatinum (Woods, 1931); y parece que así ocurre, por las siguientes razones: a) el esbozo gonadal es un sistema cerrado, y la formación de la primera gónada también lo es; b) las paredes de la gónada en el esbozo gonadal están constituidas por fibroblastos, y la pared interior de los canales genitales también lo está; c) en el interior del esbozo gonadal hay células mesodérmicas, y en la MCC hay fibroblastos y células de aspecto mesodérmico; d) en el seno del mesodermo del esbozo gonadal están las espermatogonias y las ovogonias, y en la MCC también hay espermatogonias y ovogonias; e) en el esbozo gonadal no se advierten células germinales que no sean espermatogonias y ovogonias, también en la MCC sólo se observan espermatogonias y ovogonias, no habiendo células germinales anteriores a ellas de las que pudieran proceder; y f) en el esbozo gonadal, las espermatogonias y las ovogonias desarrollan vidas independientes entre sí, y lo mismo parecen hacer en la MCC. Cuando se inicia el desarrollo de la gónada primaria, las espermatogonias y las ovogonias se dividen y desarrollan las series gametogénicas masculina y femenina, respectivamente, que no son más que el conjunto de las células en desarrollo que darán lugar a los gametos. 8 Morfogénesis de la gónada Fig. 4.4. A. Disposición de la Masa Celular Conjuntiva en el canal genital de Ostrea edulis. B. Detalle de la Masa Celular Conjuntiva, donde se disponen las gonias (espermatogonias y ovogonias). CG: Canal genital; EpC: Epitelio ciliado del canal genital; Fb: Fibroblastos; HP: Hepatopáncreas (glándula digestiva); MCC: Masa Celular Conjuntiva; VC: Células Vesiculares. La formación de la gónada y el desarrollo gametogénico son procesos prácticamente simultáneos. Para formar la gónada los canales genitales diverticulan a partir de su pared fibroblástica y se evaginan (Fig. 4.5 A y B); estos divertículos crecen y se alargan desde el canal genital hacia el interior del espacio gonadal, originando así los folículos gonadales. Cada nueva serie de folículos se dispone, en el espacio gonadal, entre el canal genital y la glándula digestiva, de forma que los primeros folículos son los más cercanos a dicha glándula (Fig. 4.6. y 4.7.). A medida que se forman los folículos gonadales, éstos también diverticulan, y así se forman folículos lobulados y plurilobulados. 9 85 Capítulo 4 Figura 4.5. A y B . Diverticulaciones del Canal genital en Ostrea edulis durante la formación de la gónada primaria y el primer desarrollo gametogénico. CG: Canal genital; Dt: Divertículos; FG: Folículos gonadales; HP: Hepatopáncreas (glándula digestiva); M: Manto con células vesiculares. El conjunto de series gametogénicas masculinas* constituyen lo que denominamos fase sexual masculina*, y el conjunto de series gametogénicas femeninas* componen la fase sexual femenina*. Con cada nuevo desarrollo, maduración y puesta de una o ambas fases sexuales se generarán nuevas diverticulaciones y nuevas capas de folículos gonadales que incrementarán el espacio gonadal (Fig. 4.5. y Fig. 4.6.). De esta manera es posible intuir la magnitud de la actividad gametogénica de un animal según el tamaño del espacio gonadal y el número de capas de folículos gonadales. Ostrea edulis tiene capacidad para producir gametos de ambos sexos, es decir, tiene potencialidad para desarrollar los dos tipos de series gametogénicas, por lo tanto es bisexual. Hay bivalvos, como Pecten maximus (la vieira) y Aequipecten opercularis (la volandeira) que al ser bisexuales pueden desarrollar los dos tipos de series gametogénicas, pero siempre lo hacen en diferentes folículos. En cambio, Ostrea edulis, al igual que Chlamys varia (la zamburiña) (Iglesias, 2012), desarrolla los dos tipos de series gametogénicas en un mismo folículo; este fenómeno se denomina intersexualidad (Policansky, 1982). En algunos casos, el desarrollo de los folículos es tan extenso que los folículos se crecen en el interior del espacio de la glándula digestiva, intercalados entre sus acinos. 4.3 Evolución (crecimiento) de la gónada En el juvenil de Ostrea edulis, cuando inicia el desarrollo de su primera gónada, sólo se observan los canales genitales con la MCC en su interior, todavía no hay formación de folículos gonadales, éste es un estadio de la gónada que denominamos G0 (Fig. 4.4 A y B). En el seno de la MCC hay espermatogonias y ovogonias que proliferan por mitosis (Fig. 4.8 A y B). 10 Morfogénesis de la gónada Fig. 4.6. Esquema del modelo de espacios anatómicos para Ostrea edulis en el que, a efectos de este estudio, se formulan los siguientes espacios anatómicos: a) Canal genital; b) Espacio del manto; c) Espacio gonadal; d) Espacio de la glándula digestiva. Asímismo, el esquema contempla el desarrollo de un nuevo ciclo gametogénico, es decir, ya ocurrió la maduración y puesta de la gónada primaria –porque ya existe una capa de folículos gonadalesy están prosperando nuevas series gametogénicas (representado por el entramado). También se representa la formación de folículos gonadales, mediante diverticulación, a partir del canal genital. Dt: Divertículo; FG: Folículos gonadales. Fig. 4.7. A. Imagen real del desarrollo de un ciclo gametogénico en la gónada de la ostra plana. CG: Canal genital; Dt: Divertículo; EG: Espacio gonadal con células vesiculares; FG: Folículo gonadal; M: Manto con células vesiculares. FG Dt Canal Genital Espacio Gonadal Glándula Digestiva Manto 11 86 Capítulo 4 Figura 4.5. A y B . Diverticulaciones del Canal genital en Ostrea edulis durante la formación de la gónada primaria y el primer desarrollo gametogénico. CG: Canal genital; Dt: Divertículos; FG: Folículos gonadales; HP: Hepatopáncreas (glándula digestiva); M: Manto con células vesiculares. El conjunto de series gametogénicas masculinas* constituyen lo que denominamos fase sexual masculina*, y el conjunto de series gametogénicas femeninas* componen la fase sexual femenina*. Con cada nuevo desarrollo, maduración y puesta de una o ambas fases sexuales se generarán nuevas diverticulaciones y nuevas capas de folículos gonadales que incrementarán el espacio gonadal (Fig. 4.5. y Fig. 4.6.). De esta manera es posible intuir la magnitud de la actividad gametogénica de un animal según el tamaño del espacio gonadal y el número de capas de folículos gonadales. Ostrea edulis tiene capacidad para producir gametos de ambos sexos, es decir, tiene potencialidad para desarrollar los dos tipos de series gametogénicas, por lo tanto es bisexual. Hay bivalvos, como Pecten maximus (la vieira) y Aequipecten opercularis (la volandeira) que al ser bisexuales pueden desarrollar los dos tipos de series gametogénicas, pero siempre lo hacen en diferentes folículos. En cambio, Ostrea edulis, al igual que Chlamys varia (la zamburiña) (Iglesias, 2012), desarrolla los dos tipos de series gametogénicas en un mismo folículo; este fenómeno se denomina intersexualidad (Policansky, 1982). En algunos casos, el desarrollo de los folículos es tan extenso que los folículos se crecen en el interior del espacio de la glándula digestiva, intercalados entre sus acinos. 4.3 Evolución (crecimiento) de la gónada En el juvenil de Ostrea edulis, cuando inicia el desarrollo de su primera gónada, sólo se observan los canales genitales con la MCC en su interior, todavía no hay formación de folículos gonadales, éste es un estadio de la gónada que denominamos G0 (Fig. 4.4 A y B). En el seno de la MCC hay espermatogonias y ovogonias que proliferan por mitosis (Fig. 4.8 A y B). 10 Fig. 4.6. Esquema del modelo de espacios anatómicos para Ostrea edulis en el que, a efectos de este estudio, se formulan los siguientes espacios anatómicos: a) Canal genital; b) Espacio del manto; c) Espacio gonadal; d) Espacio de la glándula digestiva. Asímismo, el esquema contempla el desarrollo de un nuevo ciclo gametogénico, es decir, ya ocurrió la maduración y puesta de la gónada primaria –porque ya existe una capa de folículos gonadalesy están prosperando nuevas series gametogénicas (representado por el entramado). También se representa la formación de folículos gonadales, mediante diverticulación, a partir del canal genital. Dt: Divertículo; FG: Folículos gonadales. Fig. 4.7. A. Imagen real del desarrollo de un ciclo gametogénico en la gónada de la ostra plana. CG: Canal genital; Dt: Divertículo; EG: Espacio gonadal con células vesiculares; FG: Folículo gonadal; M: Manto con células vesiculares. FG Dt Canal Genital Espacio Gonadal Glándula Digestiva Manto 11 87 Morfogénesis de la gónada Capítulo 5 adulto, las espermatogonias y las ovogonias que surgen en la MCC son los objetos celulares básicos y primarios que originarán, respectivamente, las series gametogénicas masculina (SG) y femenina (SG), así como las fases sexuales masculina (FS) y femenina (FS). Reiteramos que, tanto en el molusco juvenil como en el adulto, en la MCC no advertimos células que pudiesen ser antecesoras de las espermatogonias y de las ovogonias que en ella observamos. Por razones que más adelante explicaremos, a las espermatogonias de la MCC las denominamos espermatogonias primarias (Spg1) y a las ovogonias las denominamos, simplemente, ovogonias (Ovg) (Fig. 5.1). Fig. 5.1. Espermatogonias primarias (Spg1) y ovogonias (Ovg) ubicadas en el canal genital (CG). Obsérvense dos proliferaciones iniciales de espermatogonias secundarias con reducción de tamaño (PRT), correspondientes a sendas series gametogénicas masculinas (SG). Nótese una posible célula auxiliar (CA) adherida a una ovogonia (Ovg). Para una gonia inicial (Spg1) se marcan varios de sus componentes celulares. Ctp: Citoplasma; Gonia i: Gonia inicial, es una espermatogonia primaria (Spg1); Mncl: membrana nuclear; Nclo: nucleolo; HHtc: hebras de heterocromatina. Las Spg1 y las Ovg son estirpes celulares sexuadas independientes entre sí y que, probablemente, se originan durante, y provienen de, la embriogénesis del molusco (epígrafe 4.1). Por tanto, Ostrea edulis tiene dos líneas germinales separadas e independientes entre sí: una línea germinal masculina y otra femenina. La célula fundadora de la línea germinal masculina es la Spg1, y la célula fundadora de la línea germinal femenina es la Ovg. ¿Qué función tienen los fibroblastos de la MCC? Los fibroblastos de núcleo rojo tienen una citología más característica de fibroblasto (célula alargada, citoplasma estrecho, prolongaciones celulares) y es posible que se comporten como tales, en el sentido conocido de producir matriz celular, incluyendo la elaboración de colágeno, y de tener una función estructural y de sostén. Sin embargo, los fibroblastos de núcleo gris-oscuro exhiben menos el perfil fibroblástico típico, son más redondeados, y pensamos, como más adelante expondremos, que estas células podrían devenir en células auxiliares de los ovocitos. 4 Líneas germinales y gametogénesis 5.2 Origen de la gónada y procedencia de la masa celular conjuntiva (MCC) A la edad de tres meses los individuos de Ostrea edulis ya producen gónada con MCC en su interior, pero ¿de dónde proceden ambas, cómo surgen en el animal juvenil? Opinamos que ambas son la continuación desarrollada de los procesos de gonadogénesis y de formación de las células germinales (Spg1 y Ovg) que se iniciaron durante la embriogénesis del molusco. Conforme a la información actual de que disponemos, el desarrollo embrionario de Ostrea edulis está sin estudiar, pero si asumimos, como orientación, el estudio del desarrollo embrionario de Sphaerium striatinum (Woods, 1931, 1932), sería posible que en Ostrea edulis ocurriera lo siguiente: a) Cuando el individuo está en el estadio de larva trocófora ya se ha formado el esbozo de la gónada que, a su vez, contiene a las espermatogonias primarias (Spg1) y a las ovogonias (Ovg); asímismo, incluye células de origen mesodérmico. b) Los constituyentes celulares de la MCC que observamos en el juvenil ya están presentes en la larva trocófora, porque aquí están las Spg1, las Ovg y las células mesodérmicas, células que, opinamos, devendrán en los fibroblastos de núcleo rojo y de núcleo gris-oscuro. c) Por tanto, las Spg1 y las Ovg que observamos en la MCC de los individuos juveniles y de los adultos son, realmente, células embrionarias –no han perdido su carácter embrionario– que han perdurado desde el embrión hasta los individuos juveniles y, desde aquí, hasta los adultos. Para la ostra del pacífico, Crassostrea gigas, se ha formulado una hipótesis que contempla la existencia, tanto en los juveniles como en los adultos, de células antecesoras de las espermatogonias y de las ovogonias, y a tales células se las ha denominado "germinal stem cells" (GSC) (Fabioux, 2004a; Fabioux et al., 2004b, 2004c). Según estos autores, tales células se diferenciarían, en los juveniles y en los adultos, en espermatogonias y en ovogonias. Opinamos que éste no es el caso en Ostrea edulis, en los moluscos de esta especie, ni en los juveniles ni en los adultos, no hemos encontrado células antecesoras de las espermatogonias ni de las ovogonias; por tanto, afirmamos que los individuos de Ostrea edulis no tienen células tipo GSC. 5.3 Sexualización de las espermatogonias primarias y de las ovogonias Las espermatogonias primarias y las ovogonias de la MCC de los juveniles que producen su primera gónada ya son células sexualizadas porque, tales células son las fundadoras, respectivamente, de las series gametogénicas masculinas y femeninas que originarán los gametos. Y, el proceso de sexualización de estas células tuvo que ocurrir durante la embriogénesis del molusco. Por tanto, cuando el molusco juvenil elabora su primera gónada ya está equipado, desde su embriogénesis, con espermatogonias y con ovogonias y, en nuestra opinión, ni el juvenil ni el adulto tienen células antecesoras de las espermatogonias o de las ovogonias. En consecuencia, no hay que esperar que en los individuos juveniles y en los adultos ocurran fenómenos de diferenciación celular que den lugar a las espermatogonias y a las ovogonias ni, tampoco, a su sexualización. 5.4 Evolución de las espermatogonias primarias y de las ovogonias en el seno de la masa celular conjuntiva (MCC) En las Figuras 4.4B, 4.8A y B, 5.2 A y B se muestra cómo aparecen las espermatogonias primarias (Spg1) y las ovogonias (Ovg) en la MCC de un juvenil cuando inicia la formación de su primera gónada. En esta etapa las Spg1 y las Ovg pueblan la MCC y en ella tienen una distribución no ordenada. Las Spg1 y las Ovg aparecen entre la masa de fibroblastos y parece que cada una de estas estirpes celulares lleva un curso de vida individual, es decir, las Spg1 son independientes entre sí y de las Ovg y, asímismo, las Ovg son independientes entre sí y de las Spg1. 5 94 Capítulo 5 adulto, las espermatogonias y las ovogonias que surgen en la MCC son los objetos celulares básicos y primarios que originarán, respectivamente, las series gametogénicas masculina (SG) y femenina (SG), así como las fases sexuales masculina (FS) y femenina (FS). Reiteramos que, tanto en el molusco juvenil como en el adulto, en la MCC no advertimos células que pudiesen ser antecesoras de las espermatogonias y de las ovogonias que en ella observamos. Por razones que más adelante explicaremos, a las espermatogonias de la MCC las denominamos espermatogonias primarias (Spg1) y a las ovogonias las denominamos, simplemente, ovogonias (Ovg) (Fig. 5.1). Fig. 5.1. Espermatogonias primarias (Spg1) y ovogonias (Ovg) ubicadas en el canal genital (CG). Obsérvense dos proliferaciones iniciales de espermatogonias secundarias con reducción de tamaño (PRT), correspondientes a sendas series gametogénicas masculinas (SG). Nótese una posible célula auxiliar (CA) adherida a una ovogonia (Ovg). Para una gonia inicial (Spg1) se marcan varios de sus componentes celulares. Ctp: Citoplasma; Gonia i: Gonia inicial, es una espermatogonia primaria (Spg1); Mncl: membrana nuclear; Nclo: nucleolo; HHtc: hebras de heterocromatina. Las Spg1 y las Ovg son estirpes celulares sexuadas independientes entre sí y que, probablemente, se originan durante, y provienen de, la embriogénesis del molusco (epígrafe 4.1). Por tanto, Ostrea edulis tiene dos líneas germinales separadas e independientes entre sí: una línea germinal masculina y otra femenina. La célula fundadora de la línea germinal masculina es la Spg1, y la célula fundadora de la línea germinal femenina es la Ovg. ¿Qué función tienen los fibroblastos de la MCC? Los fibroblastos de núcleo rojo tienen una citología más característica de fibroblasto (célula alargada, citoplasma estrecho, prolongaciones celulares) y es posible que se comporten como tales, en el sentido conocido de producir matriz celular, incluyendo la elaboración de colágeno, y de tener una función estructural y de sostén. Sin embargo, los fibroblastos de núcleo gris-oscuro exhiben menos el perfil fibroblástico típico, son más redondeados, y pensamos, como más adelante expondremos, que estas células podrían devenir en células auxiliares de los ovocitos. 4 Líneas germinales y gametogénesis 5.2 Origen de la gónada y procedencia de la masa celular conjuntiva (MCC) A la edad de tres meses los individuos de Ostrea edulis ya producen gónada con MCC en su interior, pero ¿de dónde proceden ambas, cómo surgen en el animal juvenil? Opinamos que ambas son la continuación desarrollada de los procesos de gonadogénesis y de formación de las células germinales (Spg1 y Ovg) que se iniciaron durante la embriogénesis del molusco. Conforme a la información actual de que disponemos, el desarrollo embrionario de Ostrea edulis está sin estudiar, pero si asumimos, como orientación, el estudio del desarrollo embrionario de Sphaerium striatinum (Woods, 1931, 1932), sería posible que en Ostrea edulis ocurriera lo siguiente: a) Cuando el individuo está en el estadio de larva trocófora ya se ha formado el esbozo de la gónada que, a su vez, contiene a las espermatogonias primarias (Spg1) y a las ovogonias (Ovg); asímismo, incluye células de origen mesodérmico. b) Los constituyentes celulares de la MCC que observamos en el juvenil ya están presentes en la larva trocófora, porque aquí están las Spg1, las Ovg y las células mesodérmicas, células que, opinamos, devendrán en los fibroblastos de núcleo rojo y de núcleo gris-oscuro. c) Por tanto, las Spg1 y las Ovg que observamos en la MCC de los individuos juveniles y de los adultos son, realmente, células embrionarias –no han perdido su carácter embrionario– que han perdurado desde el embrión hasta los individuos juveniles y, desde aquí, hasta los adultos. Para la ostra del pacífico, Crassostrea gigas, se ha formulado una hipótesis que contempla la existencia, tanto en los juveniles como en los adultos, de células antecesoras de las espermatogonias y de las ovogonias, y a tales células se las ha denominado "germinal stem cells" (GSC) (Fabioux, 2004a; Fabioux et al., 2004b, 2004c). Según estos autores, tales células se diferenciarían, en los juveniles y en los adultos, en espermatogonias y en ovogonias. Opinamos que éste no es el caso en Ostrea edulis, en los moluscos de esta especie, ni en los juveniles ni en los adultos, no hemos encontrado células antecesoras de las espermatogonias ni de las ovogonias; por tanto, afirmamos que los individuos de Ostrea edulis no tienen células tipo GSC. 5.3 Sexualización de las espermatogonias primarias y de las ovogonias Las espermatogonias primarias y las ovogonias de la MCC de los juveniles que producen su primera gónada ya son células sexualizadas porque, tales células son las fundadoras, respectivamente, de las series gametogénicas masculinas y femeninas que originarán los gametos. Y, el proceso de sexualización de estas células tuvo que ocurrir durante la embriogénesis del molusco. Por tanto, cuando el molusco juvenil elabora su primera gónada ya está equipado, desde su embriogénesis, con espermatogonias y con ovogonias y, en nuestra opinión, ni el juvenil ni el adulto tienen células antecesoras de las espermatogonias o de las ovogonias. En consecuencia, no hay que esperar que en los individuos juveniles y en los adultos ocurran fenómenos de diferenciación celular que den lugar a las espermatogonias y a las ovogonias ni, tampoco, a su sexualización. 5.4 Evolución de las espermatogonias primarias y de las ovogonias en el seno de la masa celular conjuntiva (MCC) En las Figuras 4.4B, 4.8A y B, 5.2 A y B se muestra cómo aparecen las espermatogonias primarias (Spg1) y las ovogonias (Ovg) en la MCC de un juvenil cuando inicia la formación de su primera gónada. En esta etapa las Spg1 y las Ovg pueblan la MCC y en ella tienen una distribución no ordenada. Las Spg1 y las Ovg aparecen entre la masa de fibroblastos y parece que cada una de estas estirpes celulares lleva un curso de vida individual, es decir, las Spg1 son independientes entre sí y de las Ovg y, asímismo, las Ovg son independientes entre sí y de las Spg1. 5 95 Capítulo 5 Fig. 5.2. A. Espermatogonias primarias (Spg1) en el canal genital. Para una Spg1 se señalan los nucleolos y un posible cuerpo de Balbiani. B: Ovogonias (Ovg) adosadas a la pared folicular (PF) de un folículo gonadal. Se marca un clon (una bola) de espermatocitos primarios que están realizando el proceso de la Meiosis I (Spc1-MeI). Nclo: nucleolo. Prueba de que las células que identificamos como Spg1 y Ovg en la MCC son tales, es que dichas células tendrían que proliferar y, de hecho, encontramos figuras de mitosis que, con bastante probabilidad, se pueden atribuir a tales células. Hemos encontrado figuras de mitosis en los estadios de profase (Fig. 4.8A, 5.3A) y de metafase (Fig. 4.8B, 5.3A). No tenemos la certeza de que tales mitosis correspondan a Spg1 o a Ovg, porque hay otras células, como los fibroblastos, que también proliferan, pero el espacio mitótico nos puede orientar. Vemos que el espacio mitótico es del tamaño 6 Líneas germinales y gametogénesis que se corresponde con el de las Spg1 y las Ovg, porque los fibroblastos son más pequeños que tales células; por tanto, es probable que las mitosis que mostramos conciernan a Spg1 o a Ovg. Fig. 5.3. Masa celular conjuntiva (MCC) en el interior del canal genital. Se señalan las espermatogonias primarias (Spg1), las ovogonias (Ovg), los fibroblastos (Fb) y las figuras de mitosis. Una mitosis está en profase (M-Pro) y la otra en metafase (M-Met); por el tamaño del espacio mitótico, estas mitosis pueden ser de espermatogonias primarias o de ovogonias. Al principio de la formación de la MCC, las Ovg, además de proliferar, inician el proceso de meiosis, quedando frenadas en el estadio de profase de la Meiosis I (MeI); de hecho, hemos observado ovocitos previtelogénicos muy iniciales; en cambio, las Spg1 son más tardías en empezar la marcha de la formación de gametos. 5.5 Composición de la masa celular conjuntiva (MCC) en espermatogonias primarias y en ovogonias Las Spg1 y las Ovg que pueblan la MCC surgen en oleadas de cohortes, y las cantidades numéricas de cada uno de estos tipos celulares pueden diferir bastante tanto en un individuo como entre individuos. Esta relación entre las cantidades de Spg1 y de Ovg que emergen en la MCC afecta decisivamente a la cuantía de las series gametogénicas masculinas y femeninas que va a desarrollar el molusco, lo que, a su vez, repercute globalmente en la cantidad de fase sexual masculina y femenina que finalmente tendrá el animal; es decir, en un individuo la carga de Spg1 y de Ovg que tiene la MCC determina el número de las series gametogénicas para cada uno de sus dos sexos, así como la cantidad de fase sexual masculina o femenina que producirá. Como consecuencia de lo dicho, en los individuos de Ostrea edulis hemos encontrado las siguientes situaciones de predominio entre las fases sexuales masculina y femenina: a) individuos que muestran un predominio alto de la fase sexual masculina sobre la femenina. Esta condición ocurre principal y frecuentemente en animales juveniles que producen su primera gónada; b) moluscos donde ambas fases sexuales están cuantitativamente equilibradas; c) animales donde la fase sexual feme7 96 Capítulo 5 Fig. 5.2. A. Espermatogonias primarias (Spg1) en el canal genital. Para una Spg1 se señalan los nucleolos y un posible cuerpo de Balbiani. B: Ovogonias (Ovg) adosadas a la pared folicular (PF) de un folículo gonadal. Se marca un clon (una bola) de espermatocitos primarios que están realizando el proceso de la Meiosis I (Spc1-MeI). Nclo: nucleolo. Prueba de que las células que identificamos como Spg1 y Ovg en la MCC son tales, es que dichas células tendrían que proliferar y, de hecho, encontramos figuras de mitosis que, con bastante probabilidad, se pueden atribuir a tales células. Hemos encontrado figuras de mitosis en los estadios de profase (Fig. 4.8A, 5.3A) y de metafase (Fig. 4.8B, 5.3A). No tenemos la certeza de que tales mitosis correspondan a Spg1 o a Ovg, porque hay otras células, como los fibroblastos, que también proliferan, pero el espacio mitótico nos puede orientar. Vemos que el espacio mitótico es del tamaño 6 Líneas germinales y gametogénesis que se corresponde con el de las Spg1 y las Ovg, porque los fibroblastos son más pequeños que tales células; por tanto, es probable que las mitosis que mostramos conciernan a Spg1 o a Ovg. Fig. 5.3. Masa celular conjuntiva (MCC) en el interior del canal genital. Se señalan las espermatogonias primarias (Spg1), las ovogonias (Ovg), los fibroblastos (Fb) y las figuras de mitosis. Una mitosis está en profase (M-Pro) y la otra en metafase (M-Met); por el tamaño del espacio mitótico, estas mitosis pueden ser de espermatogonias primarias o de ovogonias. Al principio de la formación de la MCC, las Ovg, además de proliferar, inician el proceso de meiosis, quedando frenadas en el estadio de profase de la Meiosis I (MeI); de hecho, hemos observado ovocitos previtelogénicos muy iniciales; en cambio, las Spg1 son más tardías en empezar la marcha de la formación de gametos. 5.5 Composición de la masa celular conjuntiva (MCC) en espermatogonias primarias y en ovogonias Las Spg1 y las Ovg que pueblan la MCC surgen en oleadas de cohortes, y las cantidades numéricas de cada uno de estos tipos celulares pueden diferir bastante tanto en un individuo como entre individuos. Esta relación entre las cantidades de Spg1 y de Ovg que emergen en la MCC afecta decisivamente a la cuantía de las series gametogénicas masculinas y femeninas que va a desarrollar el molusco, lo que, a su vez, repercute globalmente en la cantidad de fase sexual masculina y femenina que finalmente tendrá el animal; es decir, en un individuo la carga de Spg1 y de Ovg que tiene la MCC determina el número de las series gametogénicas para cada uno de sus dos sexos, así como la cantidad de fase sexual masculina o femenina que producirá. Como consecuencia de lo dicho, en los individuos de Ostrea edulis hemos encontrado las siguientes situaciones de predominio entre las fases sexuales masculina y femenina: a) individuos que muestran un predominio alto de la fase sexual masculina sobre la femenina. Esta condición ocurre principal y frecuentemente en animales juveniles que producen su primera gónada; b) moluscos donde ambas fases sexuales están cuantitativamente equilibradas; c) animales donde la fase sexual feme7 97 Capítulo 5 nina tiene un alto predominio sobre la masculina, generando así la percepción de que el molusco es una "hembra pura". Esta situación la hemos observado, en un porcentaje del 20%, en individuos juveniles que hacen su primera gónada. Esta circunstancia de "hembra pura" no se opone a la realidad ambisexual del molusco, porque la fase sexual masculina, aunque muy escasa, está presente. 5.6 Espermatogénesis y serie gametogénica masculina Una vez que las espermatogonias primarias (Spg1) y las ovogonias (Ovg) aparecen en la masa celular conjuntiva (MCC), que circula por el canal genital y por los folículos gonadales, parece que cada una de las células de estas estirpes celulares emprende una vida propia e independiente de las demás. Las espermatogonias primarias y las ovogonias son células que tienen un componente de inestabilidad que les hace desencadenar un proceso de evolución celular que resulta en la producción de células estables –los gametos–, que en el caso de las espermatogonias son los espermatozoides, y en el caso de las ovogonias son los huevos. El proceso de producción de espermatozoides a partir de una espermatogonia primaria se denomina espermatogénesis, y al de producción de huevos a partir de una ovogonia se le llama ovogénesis. Figura 5.4. Esquema que ilustra las estirpes celulares y la secuencia de procesos celulares que se proponen para la espermatogénesis y el desarrollo de la serie gametogénica masculina (SG�) de Ostrea edulis. Cuando una espermatogonia primaria emprende una espermatogénesis produce lo que denominamos una serie gametogénica masculina* (SG�). Una serie gametogénica masculina la inicia una espermatogonia primaria y finaliza con la producción de espermatozoides, y comprende, de forma secuencial, todas las estirpes celulares que surgen en la cadena de producción de los espermatozoides, así como todos los procesos celulares que intervienen. En un folículo gonadal hay tantas series gametogénicas masculinas como espermatogonias primarias que las producen, resultando que la relación es 1 espermatogonia primaria : 1 serie gametogénica masculina. En la Figura 5.4 se ilustra con un esquema la serie gametogénica masculina que proponemos para la espermatogénesis de Ostrea edulis y que, a continuación, pasamos a describir. La célula fundadora y productora de una serie gametogénica masculina (SG�) es la espermatogonia primaria (Spg1), pero para que una Spg1 origine una SG� tiene que comprometerse a hacerlo, y antes de ello las Spg1 se multiplican por mitosis (Fig. 5.3) generando así un proceso de amplificación de las Spg1; además, incluso, las Spg1 pueden entrar en latencia; esta latencia hace que una fracción de las Spg1 pase desde una fase sexual masculina a la siguiente fase sexual masculina (Fig. 5.4 y 5.5 A). 8 Líneas germinales y gametogénesis Fig. 5.5. A. Grupo de espermatogonias primarias (Spg1) en el canal genital (CG). B. Se muestran varios clones de espermatogonias secundarias (c/Spg2) en desarrollo que están haciendo proliferación con reducción de tamaño (PRT); nótese que estos clones están rodeados por fibroblastos (Fb). C. Se presenta un clon de espermatogonias secundarias (c/Spg2-M), en el seno de una PRT en formación, cuyas células están haciendo mitosis, nótese la sincronización de las mitosis en el seno del clon, la mayoría están en profase; asímismo, obsérvese que el clon está rodeado por fibroblastos (Fb); en la base del clon, y adheridos a la pared folicular (PF) se muestran ovogonias (Ovg) y un ovocito previtelogénico (Ovp). 9 98 Capítulo 5 nina tiene un alto predominio sobre la masculina, generando así la percepción de que el molusco es una "hembra pura". Esta situación la hemos observado, en un porcentaje del 20%, en individuos juveniles que hacen su primera gónada. Esta circunstancia de "hembra pura" no se opone a la realidad ambisexual del molusco, porque la fase sexual masculina, aunque muy escasa, está presente. 5.6 Espermatogénesis y serie gametogénica masculina Una vez que las espermatogonias primarias (Spg1) y las ovogonias (Ovg) aparecen en la masa celular conjuntiva (MCC), que circula por el canal genital y por los folículos gonadales, parece que cada una de las células de estas estirpes celulares emprende una vida propia e independiente de las demás. Las espermatogonias primarias y las ovogonias son células que tienen un componente de inestabilidad que les hace desencadenar un proceso de evolución celular que resulta en la producción de células estables –los gametos–, que en el caso de las espermatogonias son los espermatozoides, y en el caso de las ovogonias son los huevos. El proceso de producción de espermatozoides a partir de una espermatogonia primaria se denomina espermatogénesis, y al de producción de huevos a partir de una ovogonia se le llama ovogénesis. Figura 5.4. Esquema que ilustra las estirpes celulares y la secuencia de procesos celulares que se proponen para la espermatogénesis y el desarrollo de la serie gametogénica masculina (SG�) de Ostrea edulis. Cuando una espermatogonia primaria emprende una espermatogénesis produce lo que denominamos una serie gametogénica masculina* (SG�). Una serie gametogénica masculina la inicia una espermatogonia primaria y finaliza con la producción de espermatozoides, y comprende, de forma secuencial, todas las estirpes celulares que surgen en la cadena de producción de los espermatozoides, así como todos los procesos celulares que intervienen. En un folículo gonadal hay tantas series gametogénicas masculinas como espermatogonias primarias que las producen, resultando que la relación es 1 espermatogonia primaria : 1 serie gametogénica masculina. En la Figura 5.4 se ilustra con un esquema la serie gametogénica masculina que proponemos para la espermatogénesis de Ostrea edulis y que, a continuación, pasamos a describir. La célula fundadora y productora de una serie gametogénica masculina (SG�) es la espermatogonia primaria (Spg1), pero para que una Spg1 origine una SG� tiene que comprometerse a hacerlo, y antes de ello las Spg1 se multiplican por mitosis (Fig. 5.3) generando así un proceso de amplificación de las Spg1; además, incluso, las Spg1 pueden entrar en latencia; esta latencia hace que una fracción de las Spg1 pase desde una fase sexual masculina a la siguiente fase sexual masculina (Fig. 5.4 y 5.5 A). 8 Líneas germinales y gametogénesis Fig. 5.5. A. Grupo de espermatogonias primarias (Spg1) en el canal genital (CG). B. Se muestran varios clones de espermatogonias secundarias (c/Spg2) en desarrollo que están haciendo proliferación con reducción de tamaño (PRT); nótese que estos clones están rodeados por fibroblastos (Fb). C. Se presenta un clon de espermatogonias secundarias (c/Spg2-M), en el seno de una PRT en formación, cuyas células están haciendo mitosis, nótese la sincronización de las mitosis en el seno del clon, la mayoría están en profase; asímismo, obsérvese que el clon está rodeado por fibroblastos (Fb); en la base del clon, y adheridos a la pared folicular (PF) se muestran ovogonias (Ovg) y un ovocito previtelogénico (Ovp). 9 99 Capítulo 5 Cuando una espermatogonia primaria (Spg1) se compromete a desarrollar una espermatogénesis y, por tanto, a originar una SG, el primer paso que realiza consiste en ejecutar una serie secuencial de mitosis de proliferación con reducción de tamaño, que denominamos PRT (proliferación con reducción de tamaño). El proceso de PRT consiste en una secuencia de mitosis donde las células hijas de cada división, aún siendo espermatogonias, tienen menor tamaño que su progenitora, con lo cual se reduce progresivamente el tamaño de las células hijas. Así, después de un número de mitosis (8-10 divisiones) se produce un clon de espermatogonias pequeñas que contiene 256-1024 células, respectivamente. En cada mitosis, y desde la primera que realiza la Spg1 comprometida, las células hijas no se independizan (la citoquinesis es incompleta) sino que quedan unidas entre sí por puentes citoplasmáticos; de este modo, al final de una PRT se produce un conjunto de espermatogonias pequeñas, todas unidas entre sí, que denominamos clon de espermatogonias (Fig. 5.5 B). Cada espermatogonia que surge de un nivel numérico de mitosis en una PRT podríamos nombrarla secundaria, terciaria,..., y así sucesivamente, pero, para aligerar la nomenclatura, a todas las espermatogonias que se forman en una PRT, independientemente del nivel de mitosis donde surgen, las denominamos espermatogonias secundarias (Spg2), y al grupo final de espermatogonias pequeñas que produce una PRT lo denominamos clon de espermatogonias secundarias (c/Spg2); queda aquí explicado el por qué a las espermatogonias primarias (Spg1) las nombramos así, y debíamos esta aclaración porque en epígrafes anteriores (epígrafe 4.1, 4.4, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5) hemos utilizado esta denominación para referirnos a tal estirpe celular sin explicar el por qué, y allí no se hizo porque el contexto del epígrafe no era el apropiado; las Figuras 5.1, 5.5B, 5.5C y 5.6 muestran procesos de PRT en diferentes estadios de desarrollo, así como clones de espermatogonias secundarias (Spg2). Acorde a lo expuesto, consideramos que en la serie gametogénica masculina sólo hay dos clases de espermatogonias: la espermatogonia primaria (Spg1) –fundadora de la serie– y las espermatogonias secundarias (Spg2). Cuando una PRT se está formando como consecuencia de las mitosis sucesivas que realizan sus Spg2, hay una sincronización muy alta entre las mitosis que realizan estas células, e incluso entre los estadios de cada una de las mitosis (Fig. 5.5 C). Una PRT es iniciada por una Spg1 comprometida y, realmente, es un proceso de amplificación de espermatogonias, pero es un proceso de amplificación particular; y lo es porque parece que es un proceso que “conserva memoria” del número de mitosis que se realizan, de tal modo que después de un determinado número de mitosis, la siguiente división que harán las espermatogonias será una meiosis; o sea, finalizada una PRT, las espermatogonias producidas entran en meiosis, con lo cual la PRT es la antesala del proceso de meiosis. A las últimas espermatogonias producidas en una PRT que, en lugar de hacer una mitosis, entran en meiosis se las denomina espermatocitos primarios (Spc1) cuando realmente han iniciado el proceso meiótico. Según esto, un clon de Spg2 (c/Spg2) deviene en un clon de espermatocitos primarios (c/Spc1) (Fig. 5.4); un clon de Spc1 se muestra en la Figura 5.6. 10 Líneas germinales y gametogénesis Fig.5.6. Clon de espermatocitos primarios (Spc1), y varios clones de espermatogonias secundarias (c/Spg2) que están iniciando su desarrollo. El clon de espermatocitos primarios está rodeado por fibroblastos (Fb). PF: pared folicular. Cuando una Spg1 inicia la espermatogénesis inaugura la formación de una estructura PRT que se mantiene hasta la formación de los espermatozoides. Esta estructura se agranda conforme aumenta el número de Spg2, se mantiene y, además, evoluciona a medida que sus células experimentan el proceso meiótico y, finalmente, la espermiogénesis para producir los espermatozoides. Por tanto, una PRT es la unidad estructural y funcional de la espermatogénesis, es una estructura histológica independiente y transitoria en cuyo seno ocurre toda la espermatogénesis. La PRT tiene una forma, un aspecto, unos constituyentes celulares y un dinamismo celular. La forma es esférica o levemente elipsoidal, lo que hace que reciba el nombre de bola ("ball", inglés), aplicado a estadios avanzados de su desarrollo, hablándose entonces de "bola de espermátidas" (spermatid-ball) y de "bola de espermatozoides o de esperma" (sperm-ball), véanse las Figuras 5.1, 5.5 B, 5.5 C, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 5.10, 5.11, y 5.14 A. Cuando una PRT se inicia, al principio su tamaño es pequeño y sus Spg2 son grandes, pero a medida que el número de sus Spg2 aumenta, éstas son más pequeñas y el tamaño de la PRT crece. El aspecto de la PRT cambia conforme se transforman las células que la integran, y sus constituyentes son: a) las Spg2, que progresivamente aumentan su número, así como las células que secuencialmente derivan de ellas; b) una red laxa de fibroblastos; c) un material extracelular cementante. En el seno de una PRT se desarrolla secuencialmente todo el dinamismo celular en que consiste la espermatogénesis, y esta estructura se mantiene cohesionada durante todo este proceso, en ningún momento se separan las células que la constituyen; a esta cohesión contribuyen: a) los puentes citoplasmáticos laxos (producidos por citoquinesis incompletas); b) la red tridimensional de fibroblastos que rodea y penetra en la estructura; c) un material acelular cementante que se dispone entre las células. La presencia de fibroblastos se muestra en las Figuras 5.5 B, 5.5 C, 5.6, 5.9 C. Los tenues puentes citoplasmáticos que existen entre las células espermatogénicas de una PRT facilitan la comunicación intercelular y hacen que esta estructura se comporte como un sincitio funcional, lo que resulta en la sincronización celular de los procesos de la espermatogénesis (mitosis, 11 100 Capítulo 5 Cuando una espermatogonia primaria (Spg1) se compromete a desarrollar una espermatogénesis y, por tanto, a originar una SG, el primer paso que realiza consiste en ejecutar una serie secuencial de mitosis de proliferación con reducción de tamaño, que denominamos PRT (proliferación con reducción de tamaño). El proceso de PRT consiste en una secuencia de mitosis donde las células hijas de cada división, aún siendo espermatogonias, tienen menor tamaño que su progenitora, con lo cual se reduce progresivamente el tamaño de las células hijas. Así, después de un número de mitosis (8-10 divisiones) se produce un clon de espermatogonias pequeñas que contiene 256-1024 células, respectivamente. En cada mitosis, y desde la primera que realiza la Spg1 comprometida, las células hijas no se independizan (la citoquinesis es incompleta) sino que quedan unidas entre sí por puentes citoplasmáticos; de este modo, al final de una PRT se produce un conjunto de espermatogonias pequeñas, todas unidas entre sí, que denominamos clon de espermatogonias (Fig. 5.5 B). Cada espermatogonia que surge de un nivel numérico de mitosis en una PRT podríamos nombrarla secundaria, terciaria,..., y así sucesivamente, pero, para aligerar la nomenclatura, a todas las espermatogonias que se forman en una PRT, independientemente del nivel de mitosis donde surgen, las denominamos espermatogonias secundarias (Spg2), y al grupo final de espermatogonias pequeñas que produce una PRT lo denominamos clon de espermatogonias secundarias (c/Spg2); queda aquí explicado el por qué a las espermatogonias primarias (Spg1) las nombramos así, y debíamos esta aclaración porque en epígrafes anteriores (epígrafe 4.1, 4.4, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5) hemos utilizado esta denominación para referirnos a tal estirpe celular sin explicar el por qué, y allí no se hizo porque el contexto del epígrafe no era el apropiado; las Figuras 5.1, 5.5B, 5.5C y 5.6 muestran procesos de PRT en diferentes estadios de desarrollo, así como clones de espermatogonias secundarias (Spg2). Acorde a lo expuesto, consideramos que en la serie gametogénica masculina sólo hay dos clases de espermatogonias: la espermatogonia primaria (Spg1) –fundadora de la serie– y las espermatogonias secundarias (Spg2). Cuando una PRT se está formando como consecuencia de las mitosis sucesivas que realizan sus Spg2, hay una sincronización muy alta entre las mitosis que realizan estas células, e incluso entre los estadios de cada una de las mitosis (Fig. 5.5 C). Una PRT es iniciada por una Spg1 comprometida y, realmente, es un proceso de amplificación de espermatogonias, pero es un proceso de amplificación particular; y lo es porque parece que es un proceso que “conserva memoria” del número de mitosis que se realizan, de tal modo que después de un determinado número de mitosis, la siguiente división que harán las espermatogonias será una meiosis; o sea, finalizada una PRT, las espermatogonias producidas entran en meiosis, con lo cual la PRT es la antesala del proceso de meiosis. A las últimas espermatogonias producidas en una PRT que, en lugar de hacer una mitosis, entran en meiosis se las denomina espermatocitos primarios (Spc1) cuando realmente han iniciado el proceso meiótico. Según esto, un clon de Spg2 (c/Spg2) deviene en un clon de espermatocitos primarios (c/Spc1) (Fig. 5.4); un clon de Spc1 se muestra en la Figura 5.6. 10 Líneas germinales y gametogénesis Fig.5.6. Clon de espermatocitos primarios (Spc1), y varios clones de espermatogonias secundarias (c/Spg2) que están iniciando su desarrollo. El clon de espermatocitos primarios está rodeado por fibroblastos (Fb). PF: pared folicular. Cuando una Spg1 inicia la espermatogénesis inaugura la formación de una estructura PRT que se mantiene hasta la formación de los espermatozoides. Esta estructura se agranda conforme aumenta el número de Spg2, se mantiene y, además, evoluciona a medida que sus células experimentan el proceso meiótico y, finalmente, la espermiogénesis para producir los espermatozoides. Por tanto, una PRT es la unidad estructural y funcional de la espermatogénesis, es una estructura histológica independiente y transitoria en cuyo seno ocurre toda la espermatogénesis. La PRT tiene una forma, un aspecto, unos constituyentes celulares y un dinamismo celular. La forma es esférica o levemente elipsoidal, lo que hace que reciba el nombre de bola ("ball", inglés), aplicado a estadios avanzados de su desarrollo, hablándose entonces de "bola de espermátidas" (spermatid-ball) y de "bola de espermatozoides o de esperma" (sperm-ball), véanse las Figuras 5.1, 5.5 B, 5.5 C, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 5.10, 5.11, y 5.14 A. Cuando una PRT se inicia, al principio su tamaño es pequeño y sus Spg2 son grandes, pero a medida que el número de sus Spg2 aumenta, éstas son más pequeñas y el tamaño de la PRT crece. El aspecto de la PRT cambia conforme se transforman las células que la integran, y sus constituyentes son: a) las Spg2, que progresivamente aumentan su número, así como las células que secuencialmente derivan de ellas; b) una red laxa de fibroblastos; c) un material extracelular cementante. En el seno de una PRT se desarrolla secuencialmente todo el dinamismo celular en que consiste la espermatogénesis, y esta estructura se mantiene cohesionada durante todo este proceso, en ningún momento se separan las células que la constituyen; a esta cohesión contribuyen: a) los puentes citoplasmáticos laxos (producidos por citoquinesis incompletas); b) la red tridimensional de fibroblastos que rodea y penetra en la estructura; c) un material acelular cementante que se dispone entre las células. La presencia de fibroblastos se muestra en las Figuras 5.5 B, 5.5 C, 5.6, 5.9 C. Los tenues puentes citoplasmáticos que existen entre las células espermatogénicas de una PRT facilitan la comunicación intercelular y hacen que esta estructura se comporte como un sincitio funcional, lo que resulta en la sincronización celular de los procesos de la espermatogénesis (mitosis, 11 101 Capítulo 5 meiosis y espermiogénesis), hecho que se muestra en las Figuras 5.1, 5.5 B, 5.5 C, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 5.10, 5.11, 5.14 A. Cuando una Spg1 comprometida se divide para iniciar una PRT, las dos células hijas quedan unidas por puentes citoplasmáticos, y así ocurre en todas las divisiones subsiguientes. Estas comunicaciones citoplasmáticas se mantienen hasta la formación de los espermatozoides. Además, a partir de la división de la Spg1, las dos células hijas son rodeadas por fibroblastos, y conforme la PRT crece en número de Spg2, también lo hace la red fibroblástica que, a su vez, penetra en el interior de la PRT (Fig. 5.1, 5.5 B, 5.6). Parece que cada Spg1 tiene que hacer necesariamente una PRT, que genera un clon de espermatocitos primarios (c/Spc1) con capacidad de realizar la meiosis; ya que no hemos visto meiosis de Spg1 ni de Spg2. Cuando los espermatocitos primarios (Spc1) finalizan la primera división meiótica (MeI), producen los espermatocitos secundarios (Spc2), que rápidamente entran en la segunda división meiótica (Me II), por lo que son células difíciles de observar en los cortes histológicos de la gónada de Ostrea edulis (Fig. 5.8A y B). Como resultado de la MeII de los espermatocitos secundarios se producen las espermátidas tempranas (Spd-t) (Fig. 5.9A, B y C), que experimentan un proceso de diferenciación, denominado espermiogénesis, que acaba originando los espermatozoides. Este proceso consiste en una serie secuencial de transformaciones morfológicas graduales que producen primeramente las espermátidas tardías (Spd-td) (Fig. 5.9C y D) y continúan para elaborar finalmente los gametos masculinos o espermatozoides (Spz) (Fig. 5.10, 5.11). La secuencia de estos procesos se ilustra con un esquema en la Figura 5.4. Cuando una espermatogénesis es emprendida por una Spg1 comprometida, aún teniendo un tiempo de duración, no se detiene, no se frena, hasta culminar en la formación de la bola de espermatozoides (Sperm-ball o Spz-ball) al final de la cadena de producción en que consiste este proceso. La estructura de PRT se mantiene cohesionada durante todo el proceso hasta producir la bola de espermatozoides, en ningún momento, ni en ninguno de los estadios por los que pasa, se disocian sus células. Tampoco los espermatozoides se disocian de las Sperm-balls, sino que se mantienen cohesionados en el conglomerado mediante un material acelular cementante (Fig. 5.10, 5.11). Cuando el animal hace la puesta de la fase sexual masculina, los espermatozoides no se emiten individualmente, sino que se descargan en el formato de bolas de espermatozoides (Sperm-balls). Las PRTs se forman de modo independiente entre sí, y lo hacen allí donde hay Spg1 comprometidas que las originan. Se producen libres en la luz del canal genital y de los folículos gonadales y, también, próximas o adheridas a las paredes fibroblásticas del canal genital y de los folículos. Para que una Spg1 produzca una PRT no es necesario que esté adherida a una pared fibroblástica, ya sea del canal genital o de un folículo gonadal. Conforme a lo expuesto hasta ahora en este epígrafe, podemos establecer la siguiente relación: 1 Spg1 : 1 Espermatogénesis : 1 PRT : 1 Bola espermática (Sperm-ball) : 1 Serie gametogénica masculina (SG) El progreso de una espermatogénesis en el trayecto de una serie gametogénica masculina (SG�) hacia la formación de una sperm-ball (bola espermática) lo denominamos maduración de la serie gametogénica. También, decimos que una serie gametogénica masculina está madura, que ha alcanzado la madurez, cuando se forma la sperm-ball, o sea, cuando la serie gametogénica llega al final de la espermatogénesis. De la población de Spg1 que en un momento dado tiene una gónada no todas se activan simultáneamente para formar PRTs, la producción de PRTs es un proceso gradual que se acelera, paulatinamente cada vez es mayor el número de Spg1 que entran a formar PRTs, por ello la maduración de la fase sexual masculina* es gradual y progresiva. Las Spg1 de 12 Líneas germinales y gametogénesis una fase sexual masculina no se agotan en formar PRTs, una fracción de ellas permanece inactiva y pasa a la fase sexual masculina siguiente, ya sea en el mismo ciclo reproductivo o en el siguiente. Hemos observado que en individuos de 3 meses de edad las Spg1 ya tienen capacidad para producir PRTs. 5.6.1 Espermatogonias primarias y secundarias Las espermatogonias primarias (Spg1) y las ovogonias (Ovg) se distinguen claramente, y se diferencian entre sí, desde que emergen en la masa celular conjuntiva (MCC), siendo limitados los casos de confusión entre Spg1 y Ovg. Se muestran imágenes de Spg1 en las Figuras 5.1, 5.2A, 5.3, 5.5A. Las Spg1 aparecen individuales en el canal genital (Fig. 5.3, 5.5A) y en los folículos gonadales (Fig. 5.1, 5.2A). Su tamaño varía entre 3 y 7 μm, siendo frecuente el de 5 μm; tienen escaso citoplasma y la relación núcleo/citoplasma es alta; con la tinción tricrómica, el nucleoplasma es oscuro-denso, tiene finas hebras de heterecromatina cuya densidad llega a ser alta y contiene, al menos, dos nucleolos que se disponen separados y en la periferia del nucleoplasma. Cuando la sección histológica es favorable, se observa una pequeña mácula en la región yuxta-perinuclear del citoplasma (Fig. 5.2A); tal mácula podría corresponder a un cuerpo de Balbiani. Como ya hemos relatado (epígrafe 4.1) estos cuerpos contienen material determinante de línea germinal y se hacen visibles en ovogonias y, principalmente, en ovocitos. No es de extrañar que tales cuerpos también aparezcan en las Spg1, porque estas células son células de línea germinal que se originan durante la embriogénesis del animal y de allí proceden; sin embargo, parece que el material integrante de estos cuerpos se desvanece o desaparece durante la espermatogénesis y los espermatozoides ya no lo tienen, situación que no ocurre en el caso de las ovogonias ni de los ovocitos donde sí permanece. Cuando una Spg1 se compromete a hacer una PRT aumenta de tamaño y emprende la producción de las espermatogonias secundarias (Spg2), que siempre permanecen en el interior de la PRT (Fig. 5.1, 5.5B, 5.6). Las primeras Spg2 que surgen en la PRT como resultado de las primeras mitosis son semejantes a las Spg1, e incluso se observa en ellas al menos un nucleolo; pero, conforme el número de mitosis aumenta las Spg2 disminuyen en tamaño, su citoplasma es muy escaso, el nucleoplasma deviene más oscuro y ya no se observan nucleolos. La última división mitótica en la PRT produce la última generación de Spg2 y, así, la PRT queda completa. Cuando la PRT está completa, sus Spg2 tienen un tamaño, pequeño y uniforme, en torno a los 2.5-3 μm de diámetro. 5.6.2 Espermatocitos primarios La última división mitótica en la PRT produce la última generación de Spg2 y, así, la PRT queda completa. Cuando las Spg2 de una PRT completa inician el proceso de Meiosis, éstas células pasan a denominarse espermatocitos primarios (Spc1), y al conjunto lo denominamos clon de espermatocitos primarios (c/Spc1) (Fig. 5.6). En la PRT, la entrada de las Spg2 en meiosis y, por tanto, la formación de los Spc1 es un proceso que está muy sincronizado (Fig. 5.6). El tamaño de los Spc1 (2,5-3 μm de diámetro) es similar al de las últimas Spg2 de la PRT, pero su núcleo es diferente; como los Spc1 ya han iniciado la meiosis, han duplicado los cromosomas y éstos comienzan a hacerse evidentes, en un estadio que se denomina preleptoteno, esto da al núcleo un aspecto rojizo y denso (tinción tricrómica) donde los cromosomas comienzan a traslucirse. 5.6.3 Meiosis La entrada de los espermatocitos primarios en meiosis se distingue claramente del proceso de mitosis porque los cromosomas tienen aspecto filamentoso en lugar de esférico, que es como se presentan en la mitosis (profase). Cuando en el seno de un clon de espermatocitos primarios (c/Spc1) se desencadena el proceso de meiosis, el grado de sincronismo intercelular en su ejecución por parte 13 102 Capítulo 5 meiosis y espermiogénesis), hecho que se muestra en las Figuras 5.1, 5.5 B, 5.5 C, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 5.10, 5.11, 5.14 A. Cuando una Spg1 comprometida se divide para iniciar una PRT, las dos células hijas quedan unidas por puentes citoplasmáticos, y así ocurre en todas las divisiones subsiguientes. Estas comunicaciones citoplasmáticas se mantienen hasta la formación de los espermatozoides. Además, a partir de la división de la Spg1, las dos células hijas son rodeadas por fibroblastos, y conforme la PRT crece en número de Spg2, también lo hace la red fibroblástica que, a su vez, penetra en el interior de la PRT (Fig. 5.1, 5.5 B, 5.6). Parece que cada Spg1 tiene que hacer necesariamente una PRT, que genera un clon de espermatocitos primarios (c/Spc1) con capacidad de realizar la meiosis; ya que no hemos visto meiosis de Spg1 ni de Spg2. Cuando los espermatocitos primarios (Spc1) finalizan la primera división meiótica (MeI), producen los espermatocitos secundarios (Spc2), que rápidamente entran en la segunda división meiótica (Me II), por lo que son células difíciles de observar en los cortes histológicos de la gónada de Ostrea edulis (Fig. 5.8A y B). Como resultado de la MeII de los espermatocitos secundarios se producen las espermátidas tempranas (Spd-t) (Fig. 5.9A, B y C), que experimentan un proceso de diferenciación, denominado espermiogénesis, que acaba originando los espermatozoides. Este proceso consiste en una serie secuencial de transformaciones morfológicas graduales que producen primeramente las espermátidas tardías (Spd-td) (Fig. 5.9C y D) y continúan para elaborar finalmente los gametos masculinos o espermatozoides (Spz) (Fig. 5.10, 5.11). La secuencia de estos procesos se ilustra con un esquema en la Figura 5.4. Cuando una espermatogénesis es emprendida por una Spg1 comprometida, aún teniendo un tiempo de duración, no se detiene, no se frena, hasta culminar en la formación de la bola de espermatozoides (Sperm-ball o Spz-ball) al final de la cadena de producción en que consiste este proceso. La estructura de PRT se mantiene cohesionada durante todo el proceso hasta producir la bola de espermatozoides, en ningún momento, ni en ninguno de los estadios por los que pasa, se disocian sus células. Tampoco los espermatozoides se disocian de las Sperm-balls, sino que se mantienen cohesionados en el conglomerado mediante un material acelular cementante (Fig. 5.10, 5.11). Cuando el animal hace la puesta de la fase sexual masculina, los espermatozoides no se emiten individualmente, sino que se descargan en el formato de bolas de espermatozoides (Sperm-balls). Las PRTs se forman de modo independiente entre sí, y lo hacen allí donde hay Spg1 comprometidas que las originan. Se producen libres en la luz del canal genital y de los folículos gonadales y, también, próximas o adheridas a las paredes fibroblásticas del canal genital y de los folículos. Para que una Spg1 produzca una PRT no es necesario que esté adherida a una pared fibroblástica, ya sea del canal genital o de un folículo gonadal. Conforme a lo expuesto hasta ahora en este epígrafe, podemos establecer la siguiente relación: 1 Spg1 : 1 Espermatogénesis : 1 PRT : 1 Bola espermática (Sperm-ball) : 1 Serie gametogénica masculina (SG) El progreso de una espermatogénesis en el trayecto de una serie gametogénica masculina (SG�) hacia la formación de una sperm-ball (bola espermática) lo denominamos maduración de la serie gametogénica. También, decimos que una serie gametogénica masculina está madura, que ha alcanzado la madurez, cuando se forma la sperm-ball, o sea, cuando la serie gametogénica llega al final de la espermatogénesis. De la población de Spg1 que en un momento dado tiene una gónada no todas se activan simultáneamente para formar PRTs, la producción de PRTs es un proceso gradual que se acelera, paulatinamente cada vez es mayor el número de Spg1 que entran a formar PRTs, por ello la maduración de la fase sexual masculina* es gradual y progresiva. Las Spg1 de 12 Líneas germinales y gametogénesis una fase sexual masculina no se agotan en formar PRTs, una fracción de ellas permanece inactiva y pasa a la fase sexual masculina siguiente, ya sea en el mismo ciclo reproductivo o en el siguiente. Hemos observado que en individuos de 3 meses de edad las Spg1 ya tienen capacidad para producir PRTs. 5.6.1 Espermatogonias primarias y secundarias Las espermatogonias primarias (Spg1) y las ovogonias (Ovg) se distinguen claramente, y se diferencian entre sí, desde que emergen en la masa celular conjuntiva (MCC), siendo limitados los casos de confusión entre Spg1 y Ovg. Se muestran imágenes de Spg1 en las Figuras 5.1, 5.2A, 5.3, 5.5A. Las Spg1 aparecen individuales en el canal genital (Fig. 5.3, 5.5A) y en los folículos gonadales (Fig. 5.1, 5.2A). Su tamaño varía entre 3 y 7 μm, siendo frecuente el de 5 μm; tienen escaso citoplasma y la relación núcleo/citoplasma es alta; con la tinción tricrómica, el nucleoplasma es oscuro-denso, tiene finas hebras de heterecromatina cuya densidad llega a ser alta y contiene, al menos, dos nucleolos que se disponen separados y en la periferia del nucleoplasma. Cuando la sección histológica es favorable, se observa una pequeña mácula en la región yuxta-perinuclear del citoplasma (Fig. 5.2A); tal mácula podría corresponder a un cuerpo de Balbiani. Como ya hemos relatado (epígrafe 4.1) estos cuerpos contienen material determinante de línea germinal y se hacen visibles en ovogonias y, principalmente, en ovocitos. No es de extrañar que tales cuerpos también aparezcan en las Spg1, porque estas células son células de línea germinal que se originan durante la embriogénesis del animal y de allí proceden; sin embargo, parece que el material integrante de estos cuerpos se desvanece o desaparece durante la espermatogénesis y los espermatozoides ya no lo tienen, situación que no ocurre en el caso de las ovogonias ni de los ovocitos donde sí permanece. Cuando una Spg1 se compromete a hacer una PRT aumenta de tamaño y emprende la producción de las espermatogonias secundarias (Spg2), que siempre permanecen en el interior de la PRT (Fig. 5.1, 5.5B, 5.6). Las primeras Spg2 que surgen en la PRT como resultado de las primeras mitosis son semejantes a las Spg1, e incluso se observa en ellas al menos un nucleolo; pero, conforme el número de mitosis aumenta las Spg2 disminuyen en tamaño, su citoplasma es muy escaso, el nucleoplasma deviene más oscuro y ya no se observan nucleolos. La última división mitótica en la PRT produce la última generación de Spg2 y, así, la PRT queda completa. Cuando la PRT está completa, sus Spg2 tienen un tamaño, pequeño y uniforme, en torno a los 2.5-3 μm de diámetro. 5.6.2 Espermatocitos primarios La última división mitótica en la PRT produce la última generación de Spg2 y, así, la PRT queda completa. Cuando las Spg2 de una PRT completa inician el proceso de Meiosis, éstas células pasan a denominarse espermatocitos primarios (Spc1), y al conjunto lo denominamos clon de espermatocitos primarios (c/Spc1) (Fig. 5.6). En la PRT, la entrada de las Spg2 en meiosis y, por tanto, la formación de los Spc1 es un proceso que está muy sincronizado (Fig. 5.6). El tamaño de los Spc1 (2,5-3 μm de diámetro) es similar al de las últimas Spg2 de la PRT, pero su núcleo es diferente; como los Spc1 ya han iniciado la meiosis, han duplicado los cromosomas y éstos comienzan a hacerse evidentes, en un estadio que se denomina preleptoteno, esto da al núcleo un aspecto rojizo y denso (tinción tricrómica) donde los cromosomas comienzan a traslucirse. 5.6.3 Meiosis La entrada de los espermatocitos primarios en meiosis se distingue claramente del proceso de mitosis porque los cromosomas tienen aspecto filamentoso en lugar de esférico, que es como se presentan en la mitosis (profase). Cuando en el seno de un clon de espermatocitos primarios (c/Spc1) se desencadena el proceso de meiosis, el grado de sincronismo intercelular en su ejecución por parte 13 103 Capítulo 5 La cabeza del espermatozoide la constituye el núcleo de la célula porque prácticamente no tiene citoplasma; de la cabeza surgen el acrosoma y el flagelo; la cabeza es esférica, levemente abellotada, y su tamaño está en torno a 1,3 μm (longitud) x 1μm (anchura); el acrosoma es pequeño, corto, triangular y puntiagudo; el flagelo es largo, tiene una longitud en torno a 70 μm (Fig. 5.10, 5.11). Con la tinción tricrómica, la cabeza tiñe en rosa-violeta, el acrosoma en negro y el flagelo en verde-azulado. Como los espermatozoides no se desprenden de la bola, los flagelos salen a su periferia y le dan un aspecto de esfera, o esfera ligeramente elipsoidal, decorada con penachos de flagelos. Cuando en la puesta las bolas de espematozoides son descargadas al medio, los flagelos, que en el interior de la gónada son inmóviles, adquieren movilidad y propulsan, mueven, a las bolas. Cuando en la gónada la fase sexual masculina está madura, las bolas de espermatozoides se ubican en la luz del canal genital y en las luces de los folículos gonadales. Los espermatozoides son las células finales y estables que resultan del proceso de espermatogénesis que emprende una espermatogonia primaria (Spg1). Recordemos cuando anteriormente explicamos que una Spg1 produce una bola que contiene entre 256-1024 espermatogonias secundarias (Spg2), lo que hace otros tantos espermatocitos primarios (Spc1); como cada Spc1, en la meiosis, produce cuatro espermátidas que, a su vez y mediante espermiogénesis, devienen en espermatozoides, tenemos que una espermatogonia primaria origina una bola espermática que puede contener entre 10244096 espermatozoides; aquí tenemos el proceso de amplificación que supone que una Spg1 emprenda un proceso de espermatogénesis. 5.7 Fagocitosis de espermatozoides Los espermatozoides pueden ser fagocitados por hemocitos, la Figura 5.11 muestra una imagen de este fenómeno; en ella se observa un hemocito nucleado y el citoplasma de otro, y en este citoplasma se ven dos espermatozoides fagocitados. Los hemocitos no atacan a las bolas espermáticas pero sí lo hacen a los espermatozoides que se desligan de ellas. Fig. 5.11. Fagocitosis de espermatozoides por hemocitos. La imagen muestra varias sperm-ball (SB) y dos hemocitos (Hc). Se marca la fagocitosis de dos espermatozoides por un hemocito (Spz/Fg). Hemos observado fagocitosis de espermatozoides en el canal genital y en los folículos gonadales; en ambos lugares, la población hemocitaria es pequeña cuando el molusco está produciendo la fase sexual masculina, y en este caso las fagocitosis son escasas; pero, después de la puesta de la fase sexual masculina, la población hemocitaria aumenta en el canal genital y en los folículos gonadales, y es cuando se produce mayor cantidad de fagocitosis de los espermatozoides que no fueron descar20 Líneas germinales y gametogénesis gados; esta fagocitosis se facilita porque las bolas espermáticas que no fueron emitidas experimentan degradación y se desprenden e individualizan sus espermatozoides. 5.8 Ovogonias, ovogénesis y serie gametogénica femenina Fig. 5.12. Esquema que ilustra las estirpes celulares y la secuencia de procesos celulares que se proponen para la ovogénesis y el desarrollo de la serie gametogénica femenina (SG�) de Ostrea edulis. En el epígrafe 5.1 expusimos que en la gónada de individuos de 3 meses ya se observan espermatogonias primarias (Spg1) y ovogonias (Ovg) en la masa celular conjuntiva (MCC) que transita por el canal genital y por los folículos gonadales ya formados y en formación; también alegamos que las Spg1 y las Ovg se identifican claramente y se distinguen entre sí. En el epígrafe 5.6 comentamos que cada una de las células de estas dos estirpes celulares emprende una vida propia e independiente de las demás. Al igual que las Spg1, las Ovg también son células inestables que desencadenan un proceso de evolución celular, denominado ovogénesis, que resulta en la producción de células estables que son los gametos femeninos o huevos. 5.8.1 Ovogonias La población de Ovg aparece en la MCC (Fig. 5.3) y, seguidamente, las ovogonias se asientan individualmente en el canal genital y en los folículos gonadales (Fig. 5.1, 5.2B, 5.5C, 5.13, 5.14A-E, 5.15A y B). Allá donde se encuentren, las ovogonias evolucionan independientemente entre sí, y también lo hacen independientemente de las espermatogonias primarias; esto conduce a que los procesos de espermatogénesis y de ovogénesis también transcurren de modo independiente entre sí. Las ovogonias (Fig. 5.1, 5.2B, 5.3, 5.13, 5.14A) tienen un diámetro celular de 4-7 μm y la relación núcleo/citoplasma es alta; el núcleo tiene una membrana nuclear marcada, su nucleoplasma claro, prácticamente blanco, su heterocromatina es escasa y fibrilar, y tiene 2 nucleolos (a veces, según la sección, sólo se observa uno); tienen poco citoplasma y es agranular. Cuando las Ovg están en la MCC ocupan cualquier lugar en su seno, pero, paulatinamente, tienden a adherirse a la pared fibroblástica del canal genital y de los folículos gonadales, siendo esta tendencia mayor que la que muestran las espermatogonias primarias. 21 110 Capítulo 5 La cabeza del espermatozoide la constituye el núcleo de la célula porque prácticamente no tiene citoplasma; de la cabeza surgen el acrosoma y el flagelo; la cabeza es esférica, levemente abellotada, y su tamaño está en torno a 1,3 μm (longitud) x 1μm (anchura); el acrosoma es pequeño, corto, triangular y puntiagudo; el flagelo es largo, tiene una longitud en torno a 70 μm (Fig. 5.10, 5.11). Con la tinción tricrómica, la cabeza tiñe en rosa-violeta, el acrosoma en negro y el flagelo en verde-azulado. Como los espermatozoides no se desprenden de la bola, los flagelos salen a su periferia y le dan un aspecto de esfera, o esfera ligeramente elipsoidal, decorada con penachos de flagelos. Cuando en la puesta las bolas de espematozoides son descargadas al medio, los flagelos, que en el interior de la gónada son inmóviles, adquieren movilidad y propulsan, mueven, a las bolas. Cuando en la gónada la fase sexual masculina está madura, las bolas de espermatozoides se ubican en la luz del canal genital y en las luces de los folículos gonadales. Los espermatozoides son las células finales y estables que resultan del proceso de espermatogénesis que emprende una espermatogonia primaria (Spg1). Recordemos cuando anteriormente explicamos que una Spg1 produce una bola que contiene entre 256-1024 espermatogonias secundarias (Spg2), lo que hace otros tantos espermatocitos primarios (Spc1); como cada Spc1, en la meiosis, produce cuatro espermátidas que, a su vez y mediante espermiogénesis, devienen en espermatozoides, tenemos que una espermatogonia primaria origina una bola espermática que puede contener entre 10244096 espermatozoides; aquí tenemos el proceso de amplificación que supone que una Spg1 emprenda un proceso de espermatogénesis. 5.7 Fagocitosis de espermatozoides Los espermatozoides pueden ser fagocitados por hemocitos, la Figura 5.11 muestra una imagen de este fenómeno; en ella se observa un hemocito nucleado y el citoplasma de otro, y en este citoplasma se ven dos espermatozoides fagocitados. Los hemocitos no atacan a las bolas espermáticas pero sí lo hacen a los espermatozoides que se desligan de ellas. Fig. 5.11. Fagocitosis de espermatozoides por hemocitos. La imagen muestra varias sperm-ball (SB) y dos hemocitos (Hc). Se marca la fagocitosis de dos espermatozoides por un hemocito (Spz/Fg). Hemos observado fagocitosis de espermatozoides en el canal genital y en los folículos gonadales; en ambos lugares, la población hemocitaria es pequeña cuando el molusco está produciendo la fase sexual masculina, y en este caso las fagocitosis son escasas; pero, después de la puesta de la fase sexual masculina, la población hemocitaria aumenta en el canal genital y en los folículos gonadales, y es cuando se produce mayor cantidad de fagocitosis de los espermatozoides que no fueron descar20 Líneas germinales y gametogénesis gados; esta fagocitosis se facilita porque las bolas espermáticas que no fueron emitidas experimentan degradación y se desprenden e individualizan sus espermatozoides. 5.8 Ovogonias, ovogénesis y serie gametogénica femenina Fig. 5.12. Esquema que ilustra las estirpes celulares y la secuencia de procesos celulares que se proponen para la ovogénesis y el desarrollo de la serie gametogénica femenina (SG�) de Ostrea edulis. En el epígrafe 5.1 expusimos que en la gónada de individuos de 3 meses ya se observan espermatogonias primarias (Spg1) y ovogonias (Ovg) en la masa celular conjuntiva (MCC) que transita por el canal genital y por los folículos gonadales ya formados y en formación; también alegamos que las Spg1 y las Ovg se identifican claramente y se distinguen entre sí. En el epígrafe 5.6 comentamos que cada una de las células de estas dos estirpes celulares emprende una vida propia e independiente de las demás. Al igual que las Spg1, las Ovg también son células inestables que desencadenan un proceso de evolución celular, denominado ovogénesis, que resulta en la producción de células estables que son los gametos femeninos o huevos. 5.8.1 Ovogonias La población de Ovg aparece en la MCC (Fig. 5.3) y, seguidamente, las ovogonias se asientan individualmente en el canal genital y en los folículos gonadales (Fig. 5.1, 5.2B, 5.5C, 5.13, 5.14A-E, 5.15A y B). Allá donde se encuentren, las ovogonias evolucionan independientemente entre sí, y también lo hacen independientemente de las espermatogonias primarias; esto conduce a que los procesos de espermatogénesis y de ovogénesis también transcurren de modo independiente entre sí. Las ovogonias (Fig. 5.1, 5.2B, 5.3, 5.13, 5.14A) tienen un diámetro celular de 4-7 μm y la relación núcleo/citoplasma es alta; el núcleo tiene una membrana nuclear marcada, su nucleoplasma claro, prácticamente blanco, su heterocromatina es escasa y fibrilar, y tiene 2 nucleolos (a veces, según la sección, sólo se observa uno); tienen poco citoplasma y es agranular. Cuando las Ovg están en la MCC ocupan cualquier lugar en su seno, pero, paulatinamente, tienden a adherirse a la pared fibroblástica del canal genital y de los folículos gonadales, siendo esta tendencia mayor que la que muestran las espermatogonias primarias. 21 111 Capítulo 5 A las ovogonias se les adhieren fibroblastos procedentes de la MCC (Fig. 5.1, 5.15A), cosa que nunca les ocurre a las Spg1 ni a las Spg2; posiblemente, serán estos fibroblastos los que devendrán posteriormente en células auxiliares de los ovocitos. 5.8.2 Ovogénesis y serie gametogénica femenina La ovogénesis es el proceso mediante el que una 1 ovogonia produce 1 huevo (la relación es 1:1), y en esta marcha ocurren dos subprocesos que están coordinados, y son: la meiosis y la vitelogénesis. Cuando una ovogonia emprende una ovogénesis produce lo que denominamos una serie gametogénica femenina* (SG). Una serie gametogénica femenina la inicia una ovogonia y finaliza con la producción de un huevo, y comprende los procesos de meiosis y de vitelogénesis. En un folículo gonadal hay tantas series gametogénicas femeninas como ovogonias que las producen, resultando que la relación es 1 ovogonia : 1 serie gametogénica femenina. En la Figura 5.12 se ilustra con un esquema la serie gametogénica femenina que proponemos para la ovogénesis de Ostrea edulis y que, a continuación, pasamos a describir. La célula fundadora y productora de una serie gametogénica femenina (SG) es la ovogonia, y lo es tanto en el juvenil, que hace su primera fase sexual femenina, como en las siguientes fases sexuales femeninas que producirá el animal en su ciclo de vida. Tanto en los juveniles como en los adultos no se ha observado una célula germinal anterior a la ovogonia de la que ésta derive; si tal célula existe debe hallarse durante la embriogénesis del molusco. Fig. 5.13. Proliferación clonal fracasada de una ovogonia (PCf) en el interior de un folículo gonadal (FG). 22 Líneas germinales y gametogénesis 23 112 Capítulo 5 A las ovogonias se les adhieren fibroblastos procedentes de la MCC (Fig. 5.1, 5.15A), cosa que nunca les ocurre a las Spg1 ni a las Spg2; posiblemente, serán estos fibroblastos los que devendrán posteriormente en células auxiliares de los ovocitos. 5.8.2 Ovogénesis y serie gametogénica femenina La ovogénesis es el proceso mediante el que una 1 ovogonia produce 1 huevo (la relación es 1:1), y en esta marcha ocurren dos subprocesos que están coordinados, y son: la meiosis y la vitelogénesis. Cuando una ovogonia emprende una ovogénesis produce lo que denominamos una serie gametogénica femenina* (SG). Una serie gametogénica femenina la inicia una ovogonia y finaliza con la producción de un huevo, y comprende los procesos de meiosis y de vitelogénesis. En un folículo gonadal hay tantas series gametogénicas femeninas como ovogonias que las producen, resultando que la relación es 1 ovogonia : 1 serie gametogénica femenina. En la Figura 5.12 se ilustra con un esquema la serie gametogénica femenina que proponemos para la ovogénesis de Ostrea edulis y que, a continuación, pasamos a describir. La célula fundadora y productora de una serie gametogénica femenina (SG) es la ovogonia, y lo es tanto en el juvenil, que hace su primera fase sexual femenina, como en las siguientes fases sexuales femeninas que producirá el animal en su ciclo de vida. Tanto en los juveniles como en los adultos no se ha observado una célula germinal anterior a la ovogonia de la que ésta derive; si tal célula existe debe hallarse durante la embriogénesis del molusco. Fig. 5.13. Proliferación clonal fracasada de una ovogonia (PCf) en el interior de un folículo gonadal (FG). 22 Líneas germinales y gametogénesis 23 113 Capítulo 5 Fig. 5.14. A. Ovogonia (Ovg) adherida a la pared folicular (PF) donde se marcan los fibroblastos (Fb) de la misma; también se señala un clon de espermátidas tardías (Spd-td). B. Mitosis (profase) de una ovogonia adosada a la pared folicular de un folículo gonadal (FG); también se marcan ovogonias (Ovg) y un ovocito previtelogénico (Ovp). C. Mitosis (profase) de una ovogonia (Ovg/M) próxima a la pared folicular (PF). D. Clon de ovogonias (Ovg) producido por una proliferación clonal (PC); se marca la pared folicular (PF). E. Proliferaciones clonales de ovogonias (PC). Para que una ovogonia origine una SG� tiene que comprometerse a hacerlo, y antes de ello la mayoría de las ovogonias se multiplican por mitosis (Fig. 5.3, 5.14B y C), generando así un proceso de amplificación de las ovogonias; además, incluso, las ovogonias pueden entrar en latencia; esta latencia hace que una fracción de las ovogonias pase desde una fase sexual femenina a la siguiente fase sexual femenina (Fig. 5.12). Las ovogonias proliferan mediante dos procesos que denominamos: proliferación independiente (PI) y proliferación clonal (PC). En la proliferación independiente, las ovogonias hacen mitosis independientes entre sí y las células hijas no reducen su tamaño ni se adosan entre sí; cuando las ovogonias hacen PI aún no están comprometidas a hacer ovogénesis (Fig. 5.12). La proliferación clonal es una proliferación por mitosis que hace una ovogonia comprometida a hacer ovogénesis; la ovogonia, antes de iniciar la meiosis I, desarrolla un proceso de divisiones mitóticas donde las células hijas, que a su vez hacen mitosis, no reducen su tamaño pero quedan adosadas entre sí; como resultado de este proceso surge un grupo, colonia o nido de ovogonias, todas iguales a la ovogonia 24 Líneas germinales y gametogénesis original que inició el proceso, que denominamos clon de ovogonias (c/Ovg) (Fig. 5.12) (Fig. 5.14D y E) . La PI no genera un clon de ovogonias, sólo produce dos ovogonias hijas individuales por cada ovogonia madre; en cambio, la PC sí produce un clon de ovogonias hijas, adosadas entre sí, por cada ovogonia madre. Cuando observamos una mitosis atribuible a una ovogonia, no podemos predecir con certeza si ésta célula hace una proliferación independiente (PI) o emprende una proliferación clonal (PC); sin embargo, acorde a lo que hemos visto repetidamente en las preparaciones, cuando la mitosis ocurre en el seno de la masa celular conjuntiva (MCC) (Fig. 5.3) es probable que se trate de una PI, en cambio, cuando la mitosis la hace una ovogonia adosada a la pared folicular de un folículo gonadal (Fig. 5.14B y C) es probable que la ovogonia acometa una PC. Cuando una ovogonia realiza una proliferación clonal las células hijas resultantes de las mitosis permanecen adosadas entre sí y, además, se observa una cinta fina de material cementante alrededor del clon que contribuye a mantenerlo (Fig. 5.14D y E). A veces, la proliferación clonal de una ovogonia fracasa y el clon no sigue adelante; ocurre cuando el clon tiene pocas células y deviene en una estructura atrofiada que acaba degenerando y se reabsorbe (Fig. 5.13). Al contrario de lo que ocurre en las PRTs que realizan las espermatogonias primarias, el número de divisiones mitóticas en el seno de una proliferación clonal de ovogonias es pequeño (4-5 mitosis), y, además, las ovogonias hijas no reducen su tamaño. Realizadas estas mitosis, todas las ovogonias del clon entran simultáneamente en meiosis. Por el aspecto morfológico que presentan las ovogonias en las proliferaciones clonales y por el acompasamiento de los procesos celulares que en ellas ocurre, parece que una proliferación clonal se comporta como un sincitio funcional; y esto se observa bien porque las ovogonias de una PC entran en meiosis simultáneamente y la desarrollan de forma sincronizada. En cuanto al inicio de la ovogénesis por las ovogonias hemos observado dos situaciones (Fig. 5.12): a) las ovogonias entran individualmente en meiosis (Fig. 5.15A); b) las ovogonias antes de entrar en meiosis realizan una proliferación clonal (PC) y, a continuación, todas las ovogonias del clon entran sincronizadamente en meiosis (Fig. 5.15B), siendo esta situación la más frecuente. 5.8.2.1 Meiosis, vitelogénesis y cuerpos de Balbiani Meiosis: inicio del proceso Cuando una ovogonia comprometida entra en meiosis recibe el nombre de ovocito primario (Ovp, Fig. 5.12), situación que se corresponde con la de espermatocito primario en el caso de la espermatogénesis; por tanto, realmente, las ovogonias que están haciendo meiosis, ya sea de modo independiente (Fig. 5.15A) o en el seno de una proliferación clonal (Fig. 5.15 B) son ovocitos primarios (Ovp). Como una proliferación clonal (PC) la hace una ovogonia originando un clon de ovogonias, y como seguidamente todas las ovogonias del clon entran sincronizadamente en meiosis, al final lo que se produce es un clon de ovocitos primarios (Fig. 5.15B). 25 114 Capítulo 5 Fig. 5.14. A. Ovogonia (Ovg) adherida a la pared folicular (PF) donde se marcan los fibroblastos (Fb) de la misma; también se señala un clon de espermátidas tardías (Spd-td). B. Mitosis (profase) de una ovogonia adosada a la pared folicular de un folículo gonadal (FG); también se marcan ovogonias (Ovg) y un ovocito previtelogénico (Ovp). C. Mitosis (profase) de una ovogonia (Ovg/M) próxima a la pared folicular (PF). D. Clon de ovogonias (Ovg) producido por una proliferación clonal (PC); se marca la pared folicular (PF). E. Proliferaciones clonales de ovogonias (PC). Para que una ovogonia origine una SG� tiene que comprometerse a hacerlo, y antes de ello la mayoría de las ovogonias se multiplican por mitosis (Fig. 5.3, 5.14B y C), generando así un proceso de amplificación de las ovogonias; además, incluso, las ovogonias pueden entrar en latencia; esta latencia hace que una fracción de las ovogonias pase desde una fase sexual femenina a la siguiente fase sexual femenina (Fig. 5.12). Las ovogonias proliferan mediante dos procesos que denominamos: proliferación independiente (PI) y proliferación clonal (PC). En la proliferación independiente, las ovogonias hacen mitosis independientes entre sí y las células hijas no reducen su tamaño ni se adosan entre sí; cuando las ovogonias hacen PI aún no están comprometidas a hacer ovogénesis (Fig. 5.12). La proliferación clonal es una proliferación por mitosis que hace una ovogonia comprometida a hacer ovogénesis; la ovogonia, antes de iniciar la meiosis I, desarrolla un proceso de divisiones mitóticas donde las células hijas, que a su vez hacen mitosis, no reducen su tamaño pero quedan adosadas entre sí; como resultado de este proceso surge un grupo, colonia o nido de ovogonias, todas iguales a la ovogonia 24 Líneas germinales y gametogénesis original que inició el proceso, que denominamos clon de ovogonias (c/Ovg) (Fig. 5.12) (Fig. 5.14D y E) . La PI no genera un clon de ovogonias, sólo produce dos ovogonias hijas individuales por cada ovogonia madre; en cambio, la PC sí produce un clon de ovogonias hijas, adosadas entre sí, por cada ovogonia madre. Cuando observamos una mitosis atribuible a una ovogonia, no podemos predecir con certeza si ésta célula hace una proliferación independiente (PI) o emprende una proliferación clonal (PC); sin embargo, acorde a lo que hemos visto repetidamente en las preparaciones, cuando la mitosis ocurre en el seno de la masa celular conjuntiva (MCC) (Fig. 5.3) es probable que se trate de una PI, en cambio, cuando la mitosis la hace una ovogonia adosada a la pared folicular de un folículo gonadal (Fig. 5.14B y C) es probable que la ovogonia acometa una PC. Cuando una ovogonia realiza una proliferación clonal las células hijas resultantes de las mitosis permanecen adosadas entre sí y, además, se observa una cinta fina de material cementante alrededor del clon que contribuye a mantenerlo (Fig. 5.14D y E). A veces, la proliferación clonal de una ovogonia fracasa y el clon no sigue adelante; ocurre cuando el clon tiene pocas células y deviene en una estructura atrofiada que acaba degenerando y se reabsorbe (Fig. 5.13). Al contrario de lo que ocurre en las PRTs que realizan las espermatogonias primarias, el número de divisiones mitóticas en el seno de una proliferación clonal de ovogonias es pequeño (4-5 mitosis), y, además, las ovogonias hijas no reducen su tamaño. Realizadas estas mitosis, todas las ovogonias del clon entran simultáneamente en meiosis. Por el aspecto morfológico que presentan las ovogonias en las proliferaciones clonales y por el acompasamiento de los procesos celulares que en ellas ocurre, parece que una proliferación clonal se comporta como un sincitio funcional; y esto se observa bien porque las ovogonias de una PC entran en meiosis simultáneamente y la desarrollan de forma sincronizada. En cuanto al inicio de la ovogénesis por las ovogonias hemos observado dos situaciones (Fig. 5.12): a) las ovogonias entran individualmente en meiosis (Fig. 5.15A); b) las ovogonias antes de entrar en meiosis realizan una proliferación clonal (PC) y, a continuación, todas las ovogonias del clon entran sincronizadamente en meiosis (Fig. 5.15B), siendo esta situación la más frecuente. 5.8.2.1 Meiosis, vitelogénesis y cuerpos de Balbiani Meiosis: inicio del proceso Cuando una ovogonia comprometida entra en meiosis recibe el nombre de ovocito primario (Ovp, Fig. 5.12), situación que se corresponde con la de espermatocito primario en el caso de la espermatogénesis; por tanto, realmente, las ovogonias que están haciendo meiosis, ya sea de modo independiente (Fig. 5.15A) o en el seno de una proliferación clonal (Fig. 5.15 B) son ovocitos primarios (Ovp). Como una proliferación clonal (PC) la hace una ovogonia originando un clon de ovogonias, y como seguidamente todas las ovogonias del clon entran sincronizadamente en meiosis, al final lo que se produce es un clon de ovocitos primarios (Fig. 5.15B). 25 115 Capítulo 5 Fig. 5.15. A. Meiosis de ovogonias individuales (Ovg/Me) en el estadio de Zigoteno-Paquiteno de la Meiosis I; se señalan la pared folicular (PF) del folículo gonadal y una posible célula auxiliar (CAux). B. Clon de ovogonias, surgido de una proliferación clonal, cuyas ovogonias han entrado sincronizadamente en meiosis, todas las ovogonias están en el estadio de Zigoteno-Paquiteno de la Meiosis I (Ovg/Me); se señala la pared folicular (PF) del folículo gonadal y una posible célula auxiliar (CAux). Los ovocitos primarios (Ovp) inician la meiosis I, y del estadio de profase realizan los subestadios de leptoteno, zigoteno-paquiteno, diploteno y diacinesis; no llegan a la metafase porque la meiosis queda detenida en diacinesis, siendo ésta la primera frenada meiótica de las dos que experimenta el ovocito durante su evolución. Adelantamos que el ovocito de Ostrea edulis, en todo su desarrollo y hasta que deviene en huevo, no finaliza la meiosis I. Describimos a continuación los subestadios de la profase, donde, como corresponde, en ninguno de ellos desaparece la membrana nuclear, el núcleo siempre conserva su integridad: 1. Leptoteno.- Al iniciar la meiosis, el ovocito primario (Ovp) aumenta de tamaño, el núcleo es grande y el citoplasma es escaso; el nucleoplasma es claro; aparecen los cromosomas, que son filamentos largos, finos y curvados que, a veces, se enmadejan; se observa el nucleolo. 2. Zigoteno-paquiteno.- Describimos conjuntamente estos dos subestadios porque con microscopía óptica es difícil diferenciarlos entre sí. El nucleoplasma continúa claro; los cromosomas engruesan y se acortan, y se observan sus contactos con la membrana nuclear; el nucleolo permanece. 26 Líneas germinales y gametogénesis 3. Diploteno.- Los cromosomas se acortan y engruesan más; el nucleoplasma permanece claro; continúa observándose el nucleolo. 4. Diacinesis.- Los cromosomas prácticamente se desvanecen, de ellos sólo se observan unos cuerpos esféricos pequeños, o "puntitos", que aparecen en el nucleoplasma y, a veces, adosados a la cara interna de la membrana nuclear (Fig. 5.18B), llamamos a estos cromosomas cromosomas diacinéticos (CrD). Cuando la sección es favorable, los CrDs se observan en los ovocitos previtelogénicos y en los postvitelogénicos (Fig. 5.18B). Cuando el ovocito primario (Ovp) está en diacinesis detiene la meiosis I, siendo ésta la primera frenada meiótica del ovocito. Conforme a la información disponible, los ovocitos de los organismos que se reproducen sexualmente realizan la primera frenada meiótica en el subestadio de diacinesis de la profase de la meiosis I (Fig. 5.20) (Greenstein, 2005; Masui & Clarke, 1979; Masui, 1985; Masui, 2001; Mehlmann, 2005, revisión), y aquí mostramos que también lo hacen así los ovocitos de Ostrea edulis. El ovocito frenado en diacinesis puede permanecer un tiempo prolongado en este subestadio, prolongación temporal que, según la especie, dura días, meses e incluso años; esta situación de permanencia prolongada en diacinesis se denomina dictioteno. El dictioteno no es un estadio ni subestadio de la meiosis, sino que es un estado, un estado de persistencia del ovocito frenado en diacinesis; al ovocito que está en esta situación se le llama ovocito dictioténico. En Ostrea edulis, los ovocitos dictioténicos acometen el proceso de vitelogénesis y aquí, antes de continuar, conviene precisar y aclarar la terminología al uso en la bibliografía para denominar a los ovocitos, así como especificar la que a este respecto utilizamos en este estudio; veamos: a) Ovocito primario.- Es un ovocito que está realizando la meiosis I; es un concepto relativo al proceso de meiosis. b) Ovocito dictioténico.- Es un ovocito que está detenido en su primera frenada meiótica, tiene la meiosis I frenada en el estadio de profase y subestadio de diacinesis; es un concepto referente a la persistencia temporal del ovocito en su primera frenada meiótica. c) Ovocito previtelogénico.- Es un ovocito dictioténico que aún no ha iniciado la vitelogénesis; es un concepto relativo al proceso de vitelogénesis que realiza el ovocito. d) El ovocito realiza toda la vitelogénesis, hasta finalizarla, siendo un ovocito primario y, también, dictioténico. e) Durante el curso de la vitelogénesis, el ovocito, como veremos, recibe varias denominaciones según el grado de progresión del proceso; así, tenemos: ovocitos previtelogénicos, vitelogénicos y postvitelogénicos. f) En este estudio utilizamos la abreviatura Ovp para referirnos tanto al ovocito primario como al ovocito previtelogénico (Fig. 5.12), en adelante la empleamos para designar al ovocito previtelogénico. 27 116 Capítulo 5 Fig. 5.15. A. Meiosis de ovogonias individuales (Ovg/Me) en el estadio de Zigoteno-Paquiteno de la Meiosis I; se señalan la pared folicular (PF) del folículo gonadal y una posible célula auxiliar (CAux). B. Clon de ovogonias, surgido de una proliferación clonal, cuyas ovogonias han entrado sincronizadamente en meiosis, todas las ovogonias están en el estadio de Zigoteno-Paquiteno de la Meiosis I (Ovg/Me); se señala la pared folicular (PF) del folículo gonadal y una posible célula auxiliar (CAux). Los ovocitos primarios (Ovp) inician la meiosis I, y del estadio de profase realizan los subestadios de leptoteno, zigoteno-paquiteno, diploteno y diacinesis; no llegan a la metafase porque la meiosis queda detenida en diacinesis, siendo ésta la primera frenada meiótica de las dos que experimenta el ovocito durante su evolución. Adelantamos que el ovocito de Ostrea edulis, en todo su desarrollo y hasta que deviene en huevo, no finaliza la meiosis I. Describimos a continuación los subestadios de la profase, donde, como corresponde, en ninguno de ellos desaparece la membrana nuclear, el núcleo siempre conserva su integridad: 1. Leptoteno.- Al iniciar la meiosis, el ovocito primario (Ovp) aumenta de tamaño, el núcleo es grande y el citoplasma es escaso; el nucleoplasma es claro; aparecen los cromosomas, que son filamentos largos, finos y curvados que, a veces, se enmadejan; se observa el nucleolo. 2. Zigoteno-paquiteno.- Describimos conjuntamente estos dos subestadios porque con microscopía óptica es difícil diferenciarlos entre sí. El nucleoplasma continúa claro; los cromosomas engruesan y se acortan, y se observan sus contactos con la membrana nuclear; el nucleolo permanece. 26 Líneas germinales y gametogénesis 3. Diploteno.- Los cromosomas se acortan y engruesan más; el nucleoplasma permanece claro; continúa observándose el nucleolo. 4. Diacinesis.- Los cromosomas prácticamente se desvanecen, de ellos sólo se observan unos cuerpos esféricos pequeños, o "puntitos", que aparecen en el nucleoplasma y, a veces, adosados a la cara interna de la membrana nuclear (Fig. 5.18B), llamamos a estos cromosomas cromosomas diacinéticos (CrD). Cuando la sección es favorable, los CrDs se observan en los ovocitos previtelogénicos y en los postvitelogénicos (Fig. 5.18B). Cuando el ovocito primario (Ovp) está en diacinesis detiene la meiosis I, siendo ésta la primera frenada meiótica del ovocito. Conforme a la información disponible, los ovocitos de los organismos que se reproducen sexualmente realizan la primera frenada meiótica en el subestadio de diacinesis de la profase de la meiosis I (Fig. 5.20) (Greenstein, 2005; Masui & Clarke, 1979; Masui, 1985; Masui, 2001; Mehlmann, 2005, revisión), y aquí mostramos que también lo hacen así los ovocitos de Ostrea edulis. El ovocito frenado en diacinesis puede permanecer un tiempo prolongado en este subestadio, prolongación temporal que, según la especie, dura días, meses e incluso años; esta situación de permanencia prolongada en diacinesis se denomina dictioteno. El dictioteno no es un estadio ni subestadio de la meiosis, sino que es un estado, un estado de persistencia del ovocito frenado en diacinesis; al ovocito que está en esta situación se le llama ovocito dictioténico. En Ostrea edulis, los ovocitos dictioténicos acometen el proceso de vitelogénesis y aquí, antes de continuar, conviene precisar y aclarar la terminología al uso en la bibliografía para denominar a los ovocitos, así como especificar la que a este respecto utilizamos en este estudio; veamos: a) Ovocito primario.- Es un ovocito que está realizando la meiosis I; es un concepto relativo al proceso de meiosis. b) Ovocito dictioténico.- Es un ovocito que está detenido en su primera frenada meiótica, tiene la meiosis I frenada en el estadio de profase y subestadio de diacinesis; es un concepto referente a la persistencia temporal del ovocito en su primera frenada meiótica. c) Ovocito previtelogénico.- Es un ovocito dictioténico que aún no ha iniciado la vitelogénesis; es un concepto relativo al proceso de vitelogénesis que realiza el ovocito. d) El ovocito realiza toda la vitelogénesis, hasta finalizarla, siendo un ovocito primario y, también, dictioténico. e) Durante el curso de la vitelogénesis, el ovocito, como veremos, recibe varias denominaciones según el grado de progresión del proceso; así, tenemos: ovocitos previtelogénicos, vitelogénicos y postvitelogénicos. f) En este estudio utilizamos la abreviatura Ovp para referirnos tanto al ovocito primario como al ovocito previtelogénico (Fig. 5.12), en adelante la empleamos para designar al ovocito previtelogénico. 27 117 Capítulo 5 Fig. 5.16. A y B. Ovocitos previtelogénicos (Ovp). PF: Pared Folicular Se muestran imágenes de ovocitos previtelogénicos (Ovp) en las Figuras 5.5C, 5.14B, 5.16A y B, 5.17B, 5.18A. Los ovocitos previtelogénicos que observamos en la gónada de Ostrea edulis provienen de dos fuentes (Fig. 5.12): a) de ovocitos primarios independientes que iniciaron la meiosis; b) de ovocitos primarios que se formaron en un clon de ovogonias resultante de una proliferación clonal y que, seguidamente, entraron en meiosis, siendo esta situación la más frecuente. Cuando en una proliferación clonal, los ovocitos devienen dictioténicos, se desgajan del clon y, también, se hacen independientes entre sí. Como resultado de ambas situaciones, al final lo que tenemos en la gónada son ovocitos previtelogénicos independientes; estos ovocitos, aún cuando sean vecinos, inician una vida independiente entre sí y, la mayoría, si no lo están ya, se adhieren a la pared fibroblástica de los folículos gonadales o del canal genital. Seguidamente, estos ovocitos emprenden la vitelogénesis. Vitelogénesis En el proceso de vitelogénesis los ovocitos dictioténicos producen el vitelo; acorde al progreso de este proceso distinguimos varios estados de desarrollo de los ovocitos, que son: 1. Ovocitos previtelogénicos (Ovp).- Estos ovocitos aún no hacen vitelo ni forman la envoltura vitelina (EV); su tamaño es un poco mayor que el de las ovogonias, tienen un diámetro en torno a 9-10 μm; su forma es redondeada o suavemente elipsoidal, ya que aún no se han aplanado contra la pared folicular; el citoplasma es muy escaso; el núcleo es grande, prominente (6-7 μm), el nucleoplasma es claro y la mayoría de la cromatina está descondensada; el nucleolo o los nucleolos (a veces se observan dos) aumentan de tamaño, siendo mayor que el de las ovogonias. Cuando sólo se observa un nucleolo ocupa la posición central del núcleoplasma o está ligeramente desplazado; cuando se ven dos nucleolos, se disponen en la periferia del nucleoplasma, en lugares opuestos y distantes entre sí; cuando la sección es favorable, en el nucleoplasma se observan los cromosomas diacinéticos. A partir de este estado de desarrollo del ovocito, a su núcleo también se le llama vesícula germinal (Fig. 5.5C, 5.14B, 5.16A y B, 5.17B, 5.18A). Dos realidades aparecen con los ovocitos previtelogénicos, y son: a) Las células auxiliares.- Son células que se observan adheridas íntimamente a la periferia de los Ovp y de los ovocitos vitelogénicos jóvenes (Fig. 5.17A); no hay certeza acerca de la función de estas células respecto de los ovocitos, aunque, en el caso de Pecten maximus, se les han atribuido funciones en la vitelogénesis (Dorange & Le Pennec, 1989). En este estudio, también hemos observado este tipo de células en las siguientes situaciones: a) adheridas a la membrana celular de las ovogonias (Fig. 5.1); b) adosadas a ovocitos primarios individuales que están en meiosis (Fig. 5.15A); c) asociadas a ovocitos primarios que están haciendo meiosis en el seno de una proliferación clonal (Fig. 5.15B). Opinamos que estas células son un tipo de fibroblasto, perteneciente a la masa celular conjuntiva (MCC), que 28 Líneas germinales y gametogénesis establecen una relación funcional con las ovogonias, continúan con ella durante la meiosis de los ovocitos primarios y la mantienen con los ovocitos durante la vitelogénesis. b) Los cuerpos de Balbiani.- Ya en los ovocitos previtelogénicos se observan los cuerpos de Balbiani (epígrafe 4.1); aparecen, según la sección, como corpúsculos redondeados o alargados, teñidos de rosa-violeta intenso, que se sitúan en la región yuxtaperinuclear del citoplasma (Fig. 5.18A). Si las secciones son favorables, estos cuerpos se demuestran durante toda la vitelogénesis, y aumentan de tamaño conforme lo hace el ovocito, si bien, se manifiestan claramente en los ovocitos postvitelogénicos (Fig. 5.18A y B). 2. Ovocitos vitelogénicos.- Se denominan así a los ovocitos que están haciendo el vitelo, recordemos que son ovocitos dictioténicos. Aquí hemos de decir que así como una espermatogonia sólo tiene una tarea, consistente en hacer la meiosis y producir los espermatozoides, una ovogonia tiene dos, que son: a) hacer la meiosis, y b) realizar la vitelogénesis para producir el vitelo, y ambas tareas tienen que ser coordinadas secuencialmente; si esta coordinación no ocurre, el ovocito aborta y entra en atresia fisiológica. Durante la vitelogénesis, el ovocito continúa siendo dictioténico y, progresivamente, hace cuatro labores destacadas: a) produce el vitelo; b) fabrica la envoltura vitelina (EV); c) el nucleolo aumenta y disminuye de tamaño, hasta que prácticamente desaparece, es decir, el nucleolo experimenta una transformación; y d) el ovocito aumenta de tamaño hasta adquirir su tamaño final. La transformación del nucleolo ocurre porque esta organela sintetiza el ARN-ribosómico necesario para la producción de la elevada cantidad de ribosomas que se requiere durante la vitelogénesis. La vitelogénesis es un proceso de intensa actividad biosintética que precisa de ribosomas, y el ARN-ribosómico de éstos es producido por los organizadores nucleolares (NOR) de los cromosomas (Raska et al., 2006). La evolución del tamaño del nucleolo muestra una curva de crecimiento-decrecimiento que discurre paralela a la de la vitelogénesis; así, conforme la vitelogénesis progresa aumenta el tamaño del nucleolo, y a medida que la vitelogénesis disminuye, también lo hace el tamaño del nucleolo, hasta desaparecer en los ovocitos postvitelogénicos (Fig. 5.5A, 5.14B, 5.16A y B, 5.17A-E, 5.18A-C). 29 118 Capítulo 5 Fig. 5.16. A y B. Ovocitos previtelogénicos (Ovp). PF: Pared Folicular Se muestran imágenes de ovocitos previtelogénicos (Ovp) en las Figuras 5.5C, 5.14B, 5.16A y B, 5.17B, 5.18A. Los ovocitos previtelogénicos que observamos en la gónada de Ostrea edulis provienen de dos fuentes (Fig. 5.12): a) de ovocitos primarios independientes que iniciaron la meiosis; b) de ovocitos primarios que se formaron en un clon de ovogonias resultante de una proliferación clonal y que, seguidamente, entraron en meiosis, siendo esta situación la más frecuente. Cuando en una proliferación clonal, los ovocitos devienen dictioténicos, se desgajan del clon y, también, se hacen independientes entre sí. Como resultado de ambas situaciones, al final lo que tenemos en la gónada son ovocitos previtelogénicos independientes; estos ovocitos, aún cuando sean vecinos, inician una vida independiente entre sí y, la mayoría, si no lo están ya, se adhieren a la pared fibroblástica de los folículos gonadales o del canal genital. Seguidamente, estos ovocitos emprenden la vitelogénesis. Vitelogénesis En el proceso de vitelogénesis los ovocitos dictioténicos producen el vitelo; acorde al progreso de este proceso distinguimos varios estados de desarrollo de los ovocitos, que son: 1. Ovocitos previtelogénicos (Ovp).- Estos ovocitos aún no hacen vitelo ni forman la envoltura vitelina (EV); su tamaño es un poco mayor que el de las ovogonias, tienen un diámetro en torno a 9-10 μm; su forma es redondeada o suavemente elipsoidal, ya que aún no se han aplanado contra la pared folicular; el citoplasma es muy escaso; el núcleo es grande, prominente (6-7 μm), el nucleoplasma es claro y la mayoría de la cromatina está descondensada; el nucleolo o los nucleolos (a veces se observan dos) aumentan de tamaño, siendo mayor que el de las ovogonias. Cuando sólo se observa un nucleolo ocupa la posición central del núcleoplasma o está ligeramente desplazado; cuando se ven dos nucleolos, se disponen en la periferia del nucleoplasma, en lugares opuestos y distantes entre sí; cuando la sección es favorable, en el nucleoplasma se observan los cromosomas diacinéticos. A partir de este estado de desarrollo del ovocito, a su núcleo también se le llama vesícula germinal (Fig. 5.5C, 5.14B, 5.16A y B, 5.17B, 5.18A). Dos realidades aparecen con los ovocitos previtelogénicos, y son: a) Las células auxiliares.- Son células que se observan adheridas íntimamente a la periferia de los Ovp y de los ovocitos vitelogénicos jóvenes (Fig. 5.17A); no hay certeza acerca de la función de estas células respecto de los ovocitos, aunque, en el caso de Pecten maximus, se les han atribuido funciones en la vitelogénesis (Dorange & Le Pennec, 1989). En este estudio, también hemos observado este tipo de células en las siguientes situaciones: a) adheridas a la membrana celular de las ovogonias (Fig. 5.1); b) adosadas a ovocitos primarios individuales que están en meiosis (Fig. 5.15A); c) asociadas a ovocitos primarios que están haciendo meiosis en el seno de una proliferación clonal (Fig. 5.15B). Opinamos que estas células son un tipo de fibroblasto, perteneciente a la masa celular conjuntiva (MCC), que 28 Líneas germinales y gametogénesis establecen una relación funcional con las ovogonias, continúan con ella durante la meiosis de los ovocitos primarios y la mantienen con los ovocitos durante la vitelogénesis. b) Los cuerpos de Balbiani.- Ya en los ovocitos previtelogénicos se observan los cuerpos de Balbiani (epígrafe 4.1); aparecen, según la sección, como corpúsculos redondeados o alargados, teñidos de rosa-violeta intenso, que se sitúan en la región yuxtaperinuclear del citoplasma (Fig. 5.18A). Si las secciones son favorables, estos cuerpos se demuestran durante toda la vitelogénesis, y aumentan de tamaño conforme lo hace el ovocito, si bien, se manifiestan claramente en los ovocitos postvitelogénicos (Fig. 5.18A y B). 2. Ovocitos vitelogénicos.- Se denominan así a los ovocitos que están haciendo el vitelo, recordemos que son ovocitos dictioténicos. Aquí hemos de decir que así como una espermatogonia sólo tiene una tarea, consistente en hacer la meiosis y producir los espermatozoides, una ovogonia tiene dos, que son: a) hacer la meiosis, y b) realizar la vitelogénesis para producir el vitelo, y ambas tareas tienen que ser coordinadas secuencialmente; si esta coordinación no ocurre, el ovocito aborta y entra en atresia fisiológica. Durante la vitelogénesis, el ovocito continúa siendo dictioténico y, progresivamente, hace cuatro labores destacadas: a) produce el vitelo; b) fabrica la envoltura vitelina (EV); c) el nucleolo aumenta y disminuye de tamaño, hasta que prácticamente desaparece, es decir, el nucleolo experimenta una transformación; y d) el ovocito aumenta de tamaño hasta adquirir su tamaño final. La transformación del nucleolo ocurre porque esta organela sintetiza el ARN-ribosómico necesario para la producción de la elevada cantidad de ribosomas que se requiere durante la vitelogénesis. La vitelogénesis es un proceso de intensa actividad biosintética que precisa de ribosomas, y el ARN-ribosómico de éstos es producido por los organizadores nucleolares (NOR) de los cromosomas (Raska et al., 2006). La evolución del tamaño del nucleolo muestra una curva de crecimiento-decrecimiento que discurre paralela a la de la vitelogénesis; así, conforme la vitelogénesis progresa aumenta el tamaño del nucleolo, y a medida que la vitelogénesis disminuye, también lo hace el tamaño del nucleolo, hasta desaparecer en los ovocitos postvitelogénicos (Fig. 5.5A, 5.14B, 5.16A y B, 5.17A-E, 5.18A-C). 29 119 Capítulo 5 Fig. 5.21. Huevos sin fecundar de Ostrea edulis extraídos de la cavidad paleal. En el interior de algunos huevos se observa claramente una mancha blanquecina: es la vesícula germinal, que aún no ha desaparecido; este hecho soporta nuestra afirmación de que los huevos emitidos en la puesta tienen la meiosis frenada en la etapa de GVBD. Hemos observado que la cantidad y el tamaño de los huevos que produce Ostrea edulis podría depender de la edad del animal, ya que las ostras de menos de un año (0 años) producen menos huevos y de menor tamaño que las ostras que tienen 1 año o más. Esta observación encaja en el amplio estudio que ya en 1941 realizó H. A. Cole sobre la fecundidad de Ostrea edulis (Cole, 1941). En este estudio, Cole expuso que el número de embriones producido por un individuo de esta especie aproximadamente se duplica cada año hasta que la ostra tiene 4 años de edad, que es cuando el autor la considera una ostra adulta; a continuación trasladamos aquí unas estimas hechas por este autor sobre los embriones producidos por los individuos de Ostrea edulis según las clases de edad: Fecundidad de Ostrea edulis (Cole, 1941) Clase de edad Número de embriones Ostras con 1 año cumplido 91.600 Ostras con 2 años cumplidos 218.100 Ostras con 3 años cumplidos 462.600 Ostras con 4 años cumplidos 902.900 En nuestro estudio se han examinado ostras procedentes directamente del medio natural, con edades de: menos de 1 año (clase 0), 1 año cumplido (clase 1) y dos años cumplidos (clase 2). En los experimentos de acondicionamiento se han utilizado ostras de las clases 0 y 1. La edad de los individuos se empieza a contar a partir de la fecha en que se fijan. En Crassostrea gigas, se ha observado que el tamaño de los ovocitos está vinculado al estado del progenitor, en cuanto a tamaño, peso y condición nutritiva (Cardoso et al, 2007). Por otro lado, en Crassostrea virginica, se ha informado que la cantidad de huevos que producen los individuos depende del tamaño del individuo, aduciendo que esto es debido a que la cantidad de huevos producida está limitada por el volumen de la cavidad del manto (Davis & Hanley, 1956). 36 Líneas germinales y gametogénesis En cuanto al modo como Ostrea edulis realiza la puesta de la fase sexual femenina, hemos observado que los individuos descargan los huevos en bloque, de una vez, es decir, los huevos no se liberan progresivamente, sino en conjunto, con lo que las puestas hembra son relativamente rápidas y la gónada queda vacía. Fig. 5.22. A. Ejemplar de Ostrea edulis con desarrollo de embriones en la cavidad paleal; los embriones están en la fase embrionaria de mórulas (color amarillo-pastel). B. Individuo de Ostrea edulis con larvas metamórficas en la cavidad paleal (color gris oscuro). En Ostrea edulis, la fecundación de los huevos y el desarrollo embrionario ocurre en la cavidad paleal; en la disección de los individuos, la existencia de una puesta de la fase sexual femenina se observa como una masa, de color blanquecino a gris, presente en el interior de dicha cavidad. El color de esta masa, o sea, de la puesta de huevos, varía según el grado de desarrollo de las larvas que la componen, de este modo, cuanto menor es el grado de desarrollo de las larvas más blancopálido será el aspecto general de dicha masa (Fig. 5.22A), y a medida que el desarrollo de las larvas avanza, su aspecto se va oscureciendo en una escala de grises, adquiriendo progresivamente un gris más intenso (Fig. 5.22B). Este colorido de la puesta de huevos que hace Ostrea edulis ya fue descrito por H. A. Cole (Cole, 1941). A continuación se muestran diferentes estados de desarrollo de los embriones de Ostrea edulis extraídos de la cavidad paleal de individuos que, durante este estudio, hicieron una puesta de huevos. Los embriones se observaron con microscopía óptica de bajo aumento. Como se puede ver, el estado más avanzado de desarrollo del embrión que se encontró en el interior de las valvas fue el de larva metamórfica (Fig. 5.23). 37 126 [Document text truncated for crawler view.]