Estudio in vitro de la influencia del heterodímero de los receptores D2 de dopamina y 5-HT2A de serotonina, en aplicación a la farmacoterapia antipsicótica

FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA ESTUDIO IN VITRO DE LA INFLUENCIA DEL HETERODÍMERO DE LOS RECEPTORES D2 DE DOPAMINA Y 5-HT2A DE SEROTONINA, EN APLICACIÓN A LA FARMACOTERAPIA ANTIPSICÓTICA SONIA GÓMEZ FERNÁNDEZ 2017 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA ESTUDIO IN VITRO DE LA INFLUENCIA DEL HETERODÍMERO DE LOS RECEPTORES D2 DE DOPAMINA Y 5-HT2A DE SEROTONINA, EN APLICACIÓN A LA FARMACOTERAPIA ANTIPSICÓTICA Memoria presentada para optar al grado de Doctor SONIA GÓMEZ FERNÁNDEZ Santiago de Compostela, 2017 FACULTAD DE FARMACIA DPTO DE FARMACOLOGÍA Edificio CIMUS – Av. Barcelona s/n. 15706 Santiago de Compostela Dña. María Isabel Loza García, Catedrática en Farmacia por la Universidad de Santiago de Compostela, y D. José Manuel Brea Floriani, Doctor en Farmacia por la Universidad de Santiago de Compostela. CERTIFICAN: Que la presente memoria titulada “Estudio in vitro de la influencia del heterodímero de los receptores D2 de dopamina y 5-HT2A de serotonina, en aplicación a la farmacoterapia antipsicótica” que para optar al grado de Doctor presenta Dña. Sonia Gómez Fernández, ha sido realizada bajo su dirección en el Departamento de Farmacología de la Facultad de Farmacia y cumple los requisitos para ser presentada y juzgada por el tribunal correspondiente. En Santiago de Compostela, a 9 de febrero de 2017. Fdo: María Isabel Loza García Fdo: José Manuel Brea Floriani No hay barrera, cerradura, ni cerrojo que puedas imponer a la libertad de mi mente. Virginia Woolf AGRADECIMIENTOS Hay un proverbio chino que dice “cuando bebas agua, recuerda la fuente”. Para mí, la fuente son todas esas personas e instituciones que han allanado el camino para que este trabajo de investigación llegue a feliz término. Sin todos ellos, hoy no me dispondría en la difícil, aunque muy satisfactoria y placentera tarea de escribir estas lineas de agradecimiento. En primer lugar, me gustaría expresar mi más sincero y absoluto agradecimiento a mis directores de tesis, María Isabel Loza y José Manuel Brea, por haberme abierto las puertas del mundo científico y guiarme en mi labor investigadora. Gracias Mabel, por haber confiado plenamente en mí y haberme dado la oportunidad de formar parte de uno de los mejores equipos de investigación en el mundo, Biofarma. Gracias Pepo, por haber compartido conmigo todo tu conocimiento científico, por tu astucia, por tu comprensión, por todos tus consejos y por las tantas veces que has alabado cada éxito mío en la poyata, por pequeño que fuera. A Maribel Cadavid por todo su interés incondicional, su cercanía y su disponibilidad, y especialmente, por su participación activa que ha enriquecido enormente mi trabajo de tesis. A Juan Giménez-López por todas sus aportaciones científicas, por la premura con la que siempre ha respondido a mis vacilaciones en este trabajo, y sobretodo, por haberme cedido la línea celular que ha permitido el estudio del heterodímero D2−5HT2A, en el que se fundamenta mi tesis doctoral. A todos y cada uno de mis compañeros del grupo Biofarma, tanto a los que ya no están como a los aquí siguen (Carlos, Lucía, Amparo, Alex, Jose Ramos, Silvia, María Villar, Sonia Veiga, Lola, Javier, Inés), ha sido un verdadero placer compartir con vosotros esta etapa de mi vida. A Andrea, Marta Cimadevila, Elia y Antón, por las muchas veces que me habéis ayudado y porque es un orgullo saber que las nuevas generaciones vienen pisando fuerte. A Uxía, por su amistad, por toda su valía y humildad, por su sosiego y la tranquilidad que siempre me has infundido. A Alba, por haber sido mi profe y haberme enseñado las técnicas que han impulsado el desarrollo de este trabajo científico. A 3. SB-269970 mostró un comportamiento como antagonista competitivo en la línea celular HEK293 ..................................................................................... 162 4. Los ensayos de unión de radioligandos en célula entera confirmaron la presencia endógena del receptor 5-HT7 ................................................................. 163 5. El bloqueo del receptor 5-HT7 por SB-269970 redujo la potencia del agonista dopamina en la vía de señalización dependiente de Gi del receptor D2 ............................................................................................................................ 164 6. El bloqueo del receptor 5-HT7 por SB-269970 no afectó a la potencia de los antipsicóticos típicos y atípicos para antagonizar la vía de señalización dependiente de Gi del receptor D2 .......................................................................... 165 7. El bloqueo del receptor 5-HT7 por SB-269970 no alteró la vía de señalización dependiente de Gq del receptor 5-HT2A al ser activado por los agonistas 5-HT y (±)DOI ........................................................................................ 170 8. El bloqueo del receptor 5-HT7 por SB-269970 no modificó la vía de señalización dependiente de Gq del receptor 5-HT2A al ser antagonizado por los antipsicóticos clozapina, risperidona y aripiprazol..................................... 171 DESARROLLO DE UNA NUEVA NUEVA METODOLOGÍA ............................ 173 IV. MÉTODO MULTIPLEX DE MEDICIÓN SIMULTÁNEA DE AMPc E IPS PARA EL HETERODÍMERO D2−5-HT2A ....................................................... 173 INFLUENCIA DE LA HETERODIMERIZACIÓN DE LOS RECEPTORES D2 Y 5-HT2A EN SU FARMACOLOGÍA .................................................................. 176 V. INFLUENCIA DE LA HETERODIMERIZACIÓN D2−5-HT2A EN LA AFINIDAD DE AGONISTAS Y ANTAGONISTAGS (ANTIPSICÓTICOS) POR AMBOS RECEPTORES ................................................................................ 176 - Influencia de la expresión del receptor D2 en la afinidad de agonistas y antagonistas (antipsicóticos) por el receptor 5-HT2A ............................................. 176 1. La expresión del receptor D2 no alteró la unión de los agonistas 5-HT y (±)DOI al receptor 5-HT2A .................................................................................. 176 2. La expresión del receptor D2 no alteró la afinidad de antipsicóticos atípicos por el receptor 5-HT2A ............................................................................ 177 - Influencia de la expresión del receptor 5-HT2A en la afinidad de agonistas y antagonistas (antipsicóticos) por el receptor D2 ................................................. 178 1. La expresión del receptor 5-HT2A no alteró la afinidad de la dopamina por el receptor D2 ................................................................................................ 178 2. La expresión del receptor 5-HT2A no alteró la afinidad de antipsicóticos típicos por el receptor D2 .................................................................................... 180 3. La expresión del receptor 5-HT2A no moduló la afinidad de los antipsicóticos atípicos por el receptor D2 ........................................................... 181 4. La expresión del receptor 5-HT2A aumentó la afinidad de la clozapina por el receptor D2 ................................................................................................ 182 VI. INFLUENCIA DE LA HETERODIMERIZACIÓN D2−5-HT2A EN LA POTENCIA Y EFICACIA DE AGONISTAS Y ANTAGONISTAS (ANTIPSICÓTICOS) SOBRE AMBOS RECEPTORES ...................................... 183 - Influencia de la expresión y modulación del receptor D2 en la activación del receptor 5-HT2A por agonistas .............................................................................. 183 1. La expresión del receptor D2 no modificó la potencia y eficacia del agonista endógeno 5-HT para activar el receptor 5-HT2A .................................. 183 2. La expresión del receptor D2 aumentó la eficacia del agonista alucinógeno (±)DOI para activar el receptor 5-HT2A ......................................... 184 3. La expresión del receptor D2 no modificó la vía de señalización dependiente de Gq del receptor 5-HT2A activado por los agonistas no alucinógeno lisurida y alucinógeno LSD ....................................................... 185 4. La activación del receptor D2 no moduló la vía de señalización dependiente de Gq del receptor 5-HT2A estimulado por 5-HT o (±)DOI............. 187 5. El bloqueo del receptor D2 por sulpirida no alteró la vía de señalización dependiente de Gq del receptor 5-HT2A activado por 5-HT ............ 189 6. El bloqueo del receptor D2 por sulpirida redujo la eficacia del agonista alucinógeno (±)DOI para activar el receptor 5-HT2A ........................... 190 - Influencia de la expresión y modulación del receptor D2 en la funcionalidad del receptor 5-HT2A antagonizado por antipsicóticos ................... 191 1. La expresión del receptor D2 redujo la potencia del aripiprazol para bloquear el receptor 5-HT2A, pero no modificó la potencia de la clozapina, ni de la risperidona .............................................................................. 191 2. La activación del receptor D2 por dopamina no moduló la vía de señalización dependiente de Gq del receptor 5-HT2A antagonizado por antipsicóticos atípicos ................................................................................... 193 3. El bloqueo del receptor D2 por sulpirida no alteró la vía de señalización dependiente de Gq del receptor 5-HT2A antagonizado por antipsicóticos atípicos ................................................................................................................. 195 - Influencia de la expresión y modulación del receptor 5-HT2A en la activación del receptor D2 por agonistas ................................................................ 196 1. La expresión del receptor 5-HT2A no reguló la vía de señalización dependiente de Gi/o del receptor D2 activado por dopamina ............................... 196 2. La activación del receptor 5-HT2A por el agonista alucinógeno (±)DOI moduló la vía de señalización dependiente de Gi/o del receptor D2 estimulado por dopamina...................................................................................... 197 3. Los efectos del (±)DOI mediados por el receptor 5-HT2A sobre la funcionalidad del receptor D2 activado por dopamina no se debieron a una alteración de la afinidad del agonista endógeno por su receptor .................. 202 4. El bloqueo del receptor 5-HT2A por ketanserina moduló la vía de señalización dependiente de Gi/o del receptor D2 estimulado por dopamina ........ 204 - Influencia de la expresión y modulación del receptor 5-HT2A en la funcionalidad del receptor D2 antagonizado por antipsicóticos .............................. 206 1. La presencia del receptor 5-HT2A no moduló la vía de señalización dependiente de Gi/o del receptor D2 antagonizado por los antipsicóticos típicos haloperidol y clorpromazina .................................................................... 206 2. La presencia del receptor 5-HT2A no moduló la vía de señalización dependiente de Gi/o del receptor D2 antagonizado por lo antipsicóticos atípicos clozapina, risperidona y aripiprazol ....................................................... 208 3. La activación del receptor 5-HT2A por el agonista alucinógeno (±)DOI moduló la vía de señalización dependiente de Gi/o del receptor D2 bloqueado por los antipsicóticos típicos haloperidol y clorpromazina............... 209 4. El efecto del (±)DOI mediado por el receptor 5-HT2A sobre la funcionalidad del receptor D2 antagonizado por haloperidol no se debió a una alteración de la afinidad del antipsicótico típico ........................................ 213 5. La activación del receptor 5-HT2A por el agonista alucinógeno (±)DOI moduló el antagonismo de los antipsicóticos atípicos clozapina, risperidona y aripiprazol en la vía de señalización dependiente de Gi/o del receptor D2 ........ 214 6. El bloqueo del receptor 5-HT2A por ketanserina no alteró la vía de señalización dependiente de Gi/o del receptor D2 antagonizado por antipsicóticos típicos ............................................................................................ 217 7. El bloqueo del receptor 5-HT2A por ketanserina no modificó la potencia de los antipsicóticos atípicos para antagonizar el receptor D2 ............................ 218 DISCUSIÓN ................................................................................................................. 223 CONCLUSIONES ........................................................................................................ 243 BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 249 Índice de figuras Figura 1: Sintomatología de la esquizofrenia ......................................................... 57 Figura 2: Fases de la esquizofrenia ........................................................................ 59 Figura 3: Interrelación de los distintos productos génicos asociados con esquizofrenia .................................................................................... 62 Figura 4: Dimensiones de clusterización de los distintos síntomas de desórdenes psicóticas ......................................................................... 65 Figura 5: Circuito cortical en esquizofrenia ........................................................... 67 Figura 6: Vías dopaminérgicas y serotoninérgicas cerebrales ............................... 70 Figura 7: Vías glutamatérgicas cerebrales: a (corticotroncoencefálicas), b (cortico-estriada), c (tálamo-corticales), d (córticotalámicas) y e (corticocorticales) ............................................................................. 73 Figura 8: Porcentaje de ocupación de los receptores D2 y 5-HT2A por antipsicóticos a dosis clínicas ................................................................. 80 Figura 9: Estructura representativa de los GPCRs ................................................. 82 Figura 10: Principales familias de GPCRs ............................................................... 83 Figura 11: Ciclo funcional de actividad de proteínas G ........................................... 84 Figura 12: Vías de señalización dependientes de proteína G de los GPCRs ........... 86 Figura 13: Desensibilización, secuestro y tráfico intracelular de los GPCRs .......... 88 Figura 14: Modelos cinéticos de activación de los GPCRs ..................................... 89 Figura 15: Vías de señalización de los receptores de dopamina ............................. 94 Figura 16: Vías de señalización del receptor D2 ..................................................... 96 Figura 17: Clasificación de los receptores 5-HT ..................................................... 99 Figura 18: Señalización del receptor 5-HT2A mediada por Gq ................................ 100 Figura 19: Representación hipotética del comportamiento de los homodímeros 5-HT2A y D2 y del heterocomplejo D2−5-HT2A en controles sanos y personas con esquizofrenia ................................... 107 Figura 20: Contaje de células con el método manual de empleo de cámara de Neubauer ............................................................................... 115 Figura 21. Representación esquemática del proceso de FRET entre los reactivos d2 y Cryptate........................................................................................... 131 Índice de figuras Figura 22: Influencia de distintas concentraciones de doxiciclina sobre la expresión del receptor de serotonina 5-HT2A ..................................... 142 Figura 23: Influencia de distintos tiempos de exposición a doxiciclina 10 ng/ml sobre la expresión del receptor de serotonina 5-HT2A ............. 143 Figura 24: Linealidad de proteína para el receptor de dopamina D2 en membranas obtenidas de células sin tratar y tratadas con doxiciclina ............................................................................................... 144 Figura 25: Ensayos de saturación del receptor de dopamina D2 por el radioligando [3H]-espiperona en membranas obtenidas de células sin tratar y tratadas con doxiciclina ............................................. 145 Figura 26: Curvas de competición del agonista dopamina y los antipsicóticos haloperidol y risperidona con el radioligando [3H]-espiperona por la unión al receptor de dopamina D2 en membranas obtenidas de células sin tratar y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas ................................................................................................... 147 Figura 27: Linealidad de proteína para el receptor de serotonina 5-HT2A en membranas obtenidas de células tratadas y sin tratar con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas .................................................... 149 Figura 28: Ensayo de saturación del receptor de serotonina 5-HT2A por el radioligando [3H]-ketanserina, en membranas obtenidas de células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas .................... 150 Figura 29: Curvas de competición del agonista 5-HT y los antipsicóticos haloperidol y risperidona con el radioligando [3H]-ketanserina por la unión al receptor de serotonina 5-HT2A en membranas obtenidas de células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas ................................................................................................... 151 Figura 30: Curvas concentración-respuesta del agonista dopamina y, en presencia de dopamina 1 µM, de los antagonistas antipsicóticos típico haloperidol y atípico risperidona, sobre la acumulación de AMPc estimulada por FSK en la vía de señalización dependiente de Índice de figuras Gi del receptor de dopamina D2, en células sin tratar y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas ............................................. 153 Figura 31: Curvas concentración-respuesta del agonista 5-HT en la producción de IPs en la vía de señalización dependiente de Gq del receptor de serotonina 5-HT2A, en células tratadas con diferentes concentraciones de doxiciclina y diferentes tiempos de exposición a la misma .......................................................... 155 Figura 32: Curvas concentración-respuesta del agonista 5-HT y, en presencia de 5-HT 1 µM, de los antipsicóticos atípicos clozapina y risperidona, en la producción de IPs en la vía de señalización dependiente de Gq del receptor 5-HT2A, en células tratadas con 10 ng/ml de doxiciclina durante 24 horas ........................................ 157 Figura 33: Curvas concentración-respuesta del agonista 5-HT y del antagonista antipsicótico atípico clozapina en presencia de 5-HT 1 µM en la producción de AMPc estimulada por FSK 1 µM en células tratadas con 10 ng/ml de doxiciclina durante 24 horas ...................................................................................... 158 Figura 34: Curvas concentración-respuesta del agonista 5-HT en la producción de AMPc asociada a proteína Gs en células sin tratar y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas ................... 159 Figura 35: Curvas concentración-respuesta de antagonistas del receptor 5-HT2A ketanserina, espiperona y haloperidol en presencia de 5-HT 1 µM en la producción de AMPc en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas ................................................... 160 Figura 36: Curvas concentración-respuesta de SB-203186, SB-271046A y SB-269970 en presencia de 5-HT 1 µM en la producción de AMPc dependiente de Gs en células no tratadas con doxiciclina ........... 161 Figura 37: Representación de Schild para el compuesto SB-269970, antagonista del receptor de serotonina 5-HT7......................................... 162 Índice de figuras Figura 38: Linealidad celular para el receptor de serotonina 5-HT7 en células no tratadas con doxiciclina, utilizando como radioligando [3H]-SB269970. .................................................................. 163 Figura 39: Curvas concentración-respuesta del agonista dopamina sobre la acumulación de AMPc estimulada por FSK en la vía de señalización dependiente de Gi del receptor de dopamina D2 en ausencia y presencia del antagonista selectivo del receptor 5-HT7 SB-269970, en células no tratadas y tratadas previamente con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ............................................ 164 Figura 40: Curvas concentración-respuesta de los antipsicóticos típicos (haloperidol y clorpromazina), en presencia de dopamina 1 µM, sobre la acumulación de AMPc estimulada por FSK en la vía de señalización dependiente de Gi del receptor de dopamina D2 en ausencia y presencia de SB-269970, en células no tratadas y previamente tratadas con doxiciclina. ..................................................... 166 Figura 41: Curvas concentración-respuesta de los antipsicóticos atípicos (clozapina, risperidona y aripiprazol), en presencia de dopamina 1 µM, sobre la acumulación de AMPc estimulada por FSK en la vía de señalización dependiente de Gi del receptor de dopamina D2, en ausencia y presencia de SB-269970, en células no tratadas y previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas ........... 168 Figura 42: Curvas concentración-respuesta de los agonistas 5-HT y (±)DOI sobre la acumulación de IPs en la vía de señalización dependiente de Gq del receptor de serotonina 5-HT2A, en ausencia y presencia de SB-269970, en células previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ...................................................................... 170 Figura 43: Curvas concentración-respuesta de los antagonistas atípicos clozapina, risperidona y aripiprazol, en presencia de 5-HT 1 µM, sobre la acumulación de IPs en la vía de señalización dependiente de Gq del receptor de serotonina 5-HT2A, en ausencia y presencia de Índice de figuras SB-269970, en células previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ..................................................................... 172 Figura 44: Curvas concentración-respuesta de 5-HT y dopamina sobre la acumulación de IPs en la vía de señalización dependiente de Gq del receptor 5-HT2A y sobre la producción de AMPc en la vía de señalización dependiente de Gi/o del receptor D2, respectivamente, en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................................................................. 174 Figura 45: Curvas de competición de los agonistas endógeno no alucinógeno 5-HT y alucinógeno (±)DOI con el radioligando [3H]-ketanserina por la unión al receptor de serotonina 5-HT2A, en membranas obtenidas de células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................................................................. 177 Figura 46: Curvas de competición de antipsicóticos atípicos con [3H]-ketanserina por la unión al receptor 5-HT2A, en membranas obtenidas de células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................................................................. 178 Figura 47: Curvas de competición del agonista dopamina con el radioligando [3H]-espiperona por la unión al receptor de dopamina D2, en membranas obtenidas de células sin tratar y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas .......................... 179 Figura 48: ... Curvas de competición de los antipsicóticos típicos haloperidol y clorpromazina con el radioligando [3H]-espiperona por la unión al receptor de dopamina D2, en membranas obtenidas de células sin tratar y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas ................... 180 Figura 49: Curvas de competición de los antipsicóticos atípicos risperidona y aripiprazol con el radioligando [3H]-espiperona por la unión al receptor de dopamina D2, en membranas obtenidas de células sin tratar y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas ................... 181 Figura 50: Curvas de competición del antipsicótico atípico clozapina con el radioligando [3H]-espiperona por la unión al receptor de dopamina Índice de tablas Tabla 11: Parámetros de afinidad (Ki) por el receptor de dopamina D2 de diferentes compuestos estándares (dopamina, haloperidol y risperidona), en membranas obtenidas de células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas ................................ 148 Tabla 12: Parámetros de unión (Bmax y KD) de [3H]-ketanserina al receptor de serotonina 5-HT2A, en membranas obtenidas de células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ............................................ 150 Tabla 13: Parámetros de afinidad (Ki) por el receptor de serotonina 5-HT2A de diferentes compuestos estándares (5-HT, haloperidol y risperidona), en membranas obtenidas de células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ................................................... 151 Tabla 14: Potencia del agonista dopamina (EC50) y de los antipsicóticos típico haloperidol y atípico risperidona (IC50 y KB), en presencia de dopamina 1µM, para inhibir y activar respectivamente la producción de AMPc estimulada por FSK 1 µM dependiente de proteína Gi del receptor de dopamina D2, en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ............................... 154 Tabla 15: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) del agonista 5-HT para activar la producción de IPs dependiente del receptor 5-HT2A, en células previamente tratadas con diferentes concentraciones de doxiciclina y distintos tiempos de exposición a la misma. ........................................ 156 Tabla 16: Potencia del agonista 5-HT (EC50) y los antipsicóticos atípicos clozapina y risperidona (IC50 y KB), en presencia de 5-HT 1 µM, para activar y bloquear respectivamente la producción de IPs dependiente de la vía Gq del receptor 5-HT2A, en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ............................ 157 Tabla 17: Potencia del agonista 5-HT (EC50) y del antagonista clozapina en presencia de 5-HT 1 µM (KB) en la producción de AMPc dependiente de proteína Gs en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ...................................................................... 158 Índice de tablas Tabla 18: Potencia (EC50) del agonista 5-HT en la producción de AMPc dependiente de proteína Gs en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ............................................ 159 Tabla 19: Potencia (IC50 y KB) del antagonista SB-269970, en presencia de 5-HT 1 µM en la producción de AMPc dependiente de Gs del receptor 5-HT7. ................................................................................. 161 Tabla 20: Parámetros de competitividad del compuesto SB-269970 en base a la ecuación de Schild. ............................................................................. 163 Tabla 21: Potencia del agonista dopamina (EC50) en la inhibición de la producción de AMPc estimulada por FSK 1 µM dependiente del receptor D2, en ausencia y presencia de SB-269970 (1 µM), en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ....................................................................................................... 165 Tabla 22: Potencia (IC50) de antipsicóticos típicos (haloperidol y clorpromazina), en presencia de dopamina 1µM, en el bloqueo del receptor D2, y su efecto en la modulación de la eficacia de la dopamina (Emax DA y Emin DA), en ausencia y presencia de SB269970 (1 µM), en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .......................................................................... 167 Tabla 23: Potencia (IC50) de antipsicóticos atípicos (clozapina, risperidona y aripiprazol), en presencia de dopamina 1µM, en el bloqueo del receptor D2, y su efecto en la modulación de la eficacia de la dopamina (Emax DA y Emin DA), en ausencia y presencia de SB-269970 (1 µM), en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................. 169 Tabla 24: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) de los agonistas 5-HT y (±)DOI en la activación de la producción de IPs dependiente de la vía Gq del receptor 5-HT2A, en ausencia y presencia de SB-269970 (1 µM), en células previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ..................................................................................... 171 Índice de tablas Tabla 25: Potencia (IC50) de los antipsicóticos atípicos clozapina, risperidona y aripiprazol, en presencia de 5-HT 1 µM, del bloqueo del receptor 5-HT2A, y su efecto en la modulación de la eficacia de 5-HT (Emax 5-HT), en ausencia y presencia de SB-269970 (1 µM), en células previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .......... 172 Tabla 26: Potencia de los agonistas dopamina y 5-HT (EC50) para inhibir la producción de AMPc estimulada por FSK 1 µM dependiente de proteína Gi/o del receptor D2 y activar la producción de IPs dependiente de proteína Gq del receptor 5-HT2A, respectivamente, en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................................................................. 175 Tabla 27: Parámetros de afinidad (Ki) por el receptor de serotonina 5-HT2A del agonista endógeno no alucinógeno 5-HT y alucinógeno (±)DOI, en membranas obtenidas de células previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ................................................... 177 Tabla 28: Parámetros de afinidad (Ki) por el receptor de serotonina 5-HT2A de los antipsicóticos atípicos clozapina, risperidona y aripiprazol en membranas obtenidas de células previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ................................................... 178 Tabla 29: Parámetros de afinidad (Ki) de la dopamina por el receptor de dopamina D2, en membranas no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ...................................................................... 179 Tabla 30: Parámetros de afinidad (Ki) de los antipsicóticos típicos haloperidol y clorpromazina por el receptor de dopamina D2, en membranas no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ......... 180 Tabla 31: Parámetros de afinidad (Ki) de los antipsicóticos atípicos risperidona y aripiprazol por el receptor de dopamina D2, en membranas no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................................................................. 181 Índice de tablas Tabla 32: Parámetros de afinidad (Ki) del antipsicótico atípico clozapina por el receptor de dopamina D2, en membranas no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ............................................ 182 Tabla 33: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) del agonista endógeno 5-HT en la estimulación de la producción de IPs dependiente de la proteína Gq asociada al receptor 5-HT2A, en células previamente expuestas a doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ............................... 184 Tabla 34: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) del agonista alucinógeno del receptor 5-HT2A (±)DOI en la producción de IPs dependiente de proteína Gq, en células previamente expuestas a doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ..................................................................... 185 Tabla 35: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) de los agonistas del receptor 5-HT2A no alucinógeno lisurida y alucinógeno LSD en la producción de IPs dependiente de proteína G, en células previamente expuestas a doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .......... 186 Tabla 36: Potencia (EC50) del agonista endógeno dopamina para inhibir la producción de AMPc dependiente de la vía Gi del receptor D2, en células previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ..................................................................................... 187 Tabla 37: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) de los agonistas no alucinógeno 5-HT y alucinógeno (±)DOI para estimular la producción de IPs dependiente de Gq del receptor 5-HT2A, en ausencia y presencia de dopamina 1 µM, en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ..................................................................................... 188 Tabla 38: Potencia (EC50) del antagonista sulpirida para estimular la producción de AMPc dependiente de la vía Gi del receptor D2, en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................. 189 Tabla 39: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) del agonista endógeno 5-HT para estimular la producción de IPs dependiente de Gq del receptor 5-HT2A, en ausencia y presencia de sulpirida, en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .............................. 190 Índice de tablas Tabla 40: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) del agonista alucinógeno (±)DOI para estimular la producción de IPs dependiente de Gq del receptor 5-HT2A, en ausencia y presencia de sulpirida, en células tratadas con doxiciclina......................................................................................... 191 Tabla 41: Potencia (IC50) de los antipsicóticos atípicos clozapina, risperidona y aripiprazol, en presencia de 5-HT 1 µM, para antagonizar el receptor 5-HT2A, y su efecto en la modulación de la eficacia de 5HT 1 µM (Emax 5-HT), en células previamente expuestas a doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ................................................... 193 Tabla 42: Potencia (IC50) de los antipsicóticos atípicos clozapina, risperidona y aripiprazol, en presencia de 5-HT 1 µM, para bloquear el receptor 5-HT2A, y su efecto en la modulación de la eficacia de 5-HT 1 µM (Emax 5-HT), en ausencia y presencia de dopamina, en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ............................... 194 Tabla 43: Potencia (IC50) de clozapina, risperidona y aripiprazol, en presencia de 5-HT 1 µM, para antagonizar el receptor 5-HT2A, y su efecto en la modulación de la eficacia de 5-HT 1 µM (Emax 5-HT), en ausencia y presencia de sulpirida, en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ................................................... 196 Tabla 44: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) del agonista dopamina para inhibir la producción de AMPc estimulada por FSK 1 µM dependiente de la proteína Gi/o asociada al receptor D2, en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ........ 197 Tabla 45: Potencia (EC50) del agonista alucinógeno (±)DOI para activar la producción de IPs dependiente de la vía Gq del receptor 5-HT2A, en células previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................................................................. 198 Tabla 46: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) de la dopamina para inhibir la producción de AMPc estimulada por FSK 1 µM dependiente de Gi del receptor D2 en ausencia y presencia de (±)DOI, en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .............. 199 Índice de tablas Tabla 47: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) de la dopamina para inhibir la producción de AMPc dependiente de Gi del receptor D2 sola, en presencia de (±)DOI 0.1 µM, (±)DOI y ketanserina 0.1 µM, y (±)DOI y ketanserina 1 µM, en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ..................................................................... 202 Tabla 48: Parámetros de afinidad (Ki) por el receptor de dopamina D2 de la dopamina en ausencia y presencia de diferentes concentraciones del agonista alucinógeno del receptor 5-HT2A (±)DOI (0.1, 1 y 10 µM) en membranas obtenidas de células previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................. 203 Tabla 49: Potencia (EC50) del antagonista selectivo del receptor de serotonina 5-HT2A ketanserina para inhibir la producción de IPs dependiente dela vía Gq, en células previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .......................................................................... 204 Tabla 50: Potencia y eficacia (EC50 y Emax) de la dopamina para inhibir la producción de AMPc dependiente de Gi del receptor D2, en ausencia y presencia de ketanserina, en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .............................. 206 Tabla 51: Potencia (IC50) de los antipsicóticos típicos haloperidol y clorpromazina, en presencia de dopamina 1 µM, para bloquear el receptor D2, y su efecto en la modulación de la eficacia de la dopamina (Emax DA), en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................. 207 Tabla 52: Potencia (IC50 ) de los antipsicóticos atípicos clozapina, risperidona y aripiprazol, en presencia de dopamina 1 µM, para bloquear el receptor D2, y su efecto en la modulación de la eficacia de la dopamina 1 µM (Emax DA), en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................. 209 Tabla 53: Potencia (IC50) de los antipsicóticos típicos haloperidol y clorpromazina, en presencia de dopamina 1 µM, para bloquear el receptor D2, y su efecto en la modulación de la eficacia de la Índice de tablas dopamina (Emax DA y Emin DA), en ausencia y presencia de (±)DOI, en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................................................................. 211 Tabla 54: Potencia (IC50) del antipsicótico típico haloperidol, en presencia de dopamina 1 µM, para antagonizar el receptor D2, y su efecto en la modulación de la eficacia de la dopamina (Emax dop Emin dop), solo, en presencia de (±)DOI 0.1 µM y (±)DOI y ketanserina 0.1 µM, en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ................... 212 Tabla 55: Parámetros de afinidad (Ki) por el receptor de dopamina D2 del antipsicótico típico haloperidol, en ausencia y presencia de diferentes concentraciones del agonista alucinógeno del receptor 5HT2A (±)DOI (0.1, 1 y 10 µM), en membranas obtenidas de células previamente tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .......... 214 Tabla 56: .... Potencia (IC50) de los antipsicóticos atípicos clozapina, risperidona y aripiprazol, en presencia de dopamina 1 µM, para bloquear el receptor D2, y su efecto en la modulación de la eficacia de la dopamina (Emax DA Emin DA), en ausencia y presencia de (±)DOI, en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. .................................................................................................. 216 Tabla 57: Potencia (IC50) de los antipsicóticos típicos haloperidol y clorpromazina, en presencia de dopamina 1 µM, para bloquear el receptor D2, y su efecto en la modulación de la eficacia de la dopamina (Emax DA), en ausencia y presencia de ketanserina, en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. ....................................................................................................... 218 Tabla 58: Potencia (IC50) de los antipsicóticos atípicos clozapina, risperidona y aripiprazol, en presencia de dopamina 1 µM, para bloquear el receptor D2, y su efecto en la modulación de la eficacia de la dopamina (Emax DA), en ausencia y presencia de ketanserina, en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas ........................................................................................................ 220 Relación de abreviaturas µg: Microgramo µl: Microlitro µM: Micromolar 5-HT: 5-Hidroxitriptamina 5-HT1(A,B,D,E,F): Receptores de serotonina de los subtipos 1A, 1B, 1D, 1E y 1F 5-HT2(A,B,C): Receptores de serotonina de los subtipos 2A, 2B y 2C 5-HT3: Receptor de serotonina del subtipo 3 5-HT4: Receptor de serotonina del subtipo 4 5-HT5(A,B): Receptores de serotonina de los subtipos 5A y 5B 5-HT6: Receptor de serotonina del subtipo 6 5-HT7: Receptor de serotonina del subtipo 7 A2A: Receptor de Adenosina del subtipo A2 AA: Araquidónico AC: Adenilato Ciclasa ACTH: Hormona adrenacorticotropa AFM: Microscopía de Fuerza Atómica Akt1: Serina-treonina quinasa 1 AMPc: Adenosín monofosfato cíclico ARNm: Ácido ribonucleico mensajero Bmax: Número o densidad máxima de sitios de unión BRET: Transferencia de Energía de Resonancia Bioluminiscente BSA: Albúmina de Suero Bovino Ca+2: Ion calcio CaCl2: Cloruro de calcio CamKII: Calmodulina proteína quinasa II CB1: Receptor Canabinoide del subtipo 1 CDPPB: 3-ciano-N-(1,3-difenil-1H-pirazol-5-il)benzamida CFP: Proteína Fluorescente Cian Ci: Curio cm: Centímetro CNV: Variación en el número de copias Relación de abreviaturas CO2: Dióxido de carbono COMT: Catecol-O-Metiltransferasa CREB: Elemento de respuesta a AMPc D1,2,3,4,5: Receptor de dopamina de los subtipos 1, 2, 3, 4 y 5 D2L: Isoforma larga del receptor D2 D2S: Isoforma corta del receptor D2 DA: Dopamina DAG: Diacilglicerol DARPP-32: Fosfoproteína neuronal regulada por dopamina y AMPc DISC1: Disruptivo in schizophrenia 1 DMEM: Medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco DMSO: Dimetil sulfóxido DOI: (±)-2,5-Dimetoxi-4-yodoanfetamina DSM: Manual de diagnóstico y estadística de enfermedades mentales de la American Psychiatric Association e1, e2 y e3: Lazos extracelulares Ebasal: Efecto basal EC50: Concentración efectiva media de un agonista EDTA: Ácido Etilendiaminotetraacético eem: Error estándar de la media Emax: Efecto máximo ErbB: Factor de crecimiento epidérmico ERK: Quinasa regulada por señal extracelular FBS: Suero Fetal Bovino Fd: Factor de dilución fmol: Fentomol FRAP: Recuperación de Fluorescencia Posterior al Fotoblanqueamiento FRET: Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia FSK: Forskolina g: Gramos Relación de abreviaturas g: Unidad de medida relativa de aceleración GABA: Ácido gamma-aminobutírico GABAA,B,C: Receptores GABA de los subtipos A (ionotrópico) y B y C (metabotrópicos) GABAB(1,2): Receptores GABA de los subtipos B1 y B2 GAD67: Descarboxilasa del ácido glutámico de 67 kDa GAP: Proteína aceleradora de la actividad GTPasa GDP: Guanosín difosfato GEF: Factor intercambiador de nucleótido de guanina GluA: Receptor ionotrópico de glutamato AMPA GluA1: Subunidades 1 de los receptores AMPA GluN: Receptor ionotrópico de glutamato NMDA GluN2B: Subunidad 2B de los receptores NMDA GPCR: Receptor acoplado a proteína G GRK1-7: Quinasas Receptoras de proteínas G GSK3: Glucógeno sintasa quinasa 3 GTP: Guanosín trifosfato GTPasa: Guanosín trifosfatasa h: Hora HBSS: Solución salina balanceada de Hank HCl: Ácido clorhídrico HEK293: Células embrionarios de riñón humano 293 HEPES: 4-(2-Hidroxietil)piperazin-1-iletanosulfónico HTRF: Fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo i1, i2, i3: Lazos intracelulares 1, 2 y 3 IBMX: 3-Isobutil-1-metilxantina IC50: Concentración efectiva media de un antagonista o agonista inverso IC50: Concentración inhibitoria del 50% ICD: Clasificación Internacional de Enfermedades IP3: Inositol 1,4,5-trifosfato Justificación, Hipótesis y Objetivos 49 JUSTIFICACIÓN La esquizofrenia es un desorden mental severo con una prevalencia del 1% en la población mundial, caracterizada por psicosis (delirios y alucinaciones), apatía y retraimiento social, así como por daño cognitivo que afecta a la atención, concentración y memoria (Meyer y McCabe, 2012). Esta enfermedad se manifiesta en la edad adulta temprana y frecuentemente sigue un curso crónico. La esquizofrenia no tiene una causa única y definida, pero existen numerosas evidencias que sugieren que influencias ambientales (por ejemplo, complicaciones obstétricas o abuso de drogas), factores genéticos y elementos sociales como la pobreza contribuyen a su desarrollo (Mueser y McGurk, 2004). Su diagnóstico se basa fundamentalmente en el examen de los síntomas psicóticos que el paciente presenta, así como en la evaluación de alteraciones neurocerebrales características de esta enfermedad (agrandamiento de los ventrículos tercero y laterales, reducción del volumen del neuropilo cortical e hipocampal, etc.) (Harrison J., 1999; Lewis y Lieberman, 2000; Os y Kapur, 2009). Existen diversas hipótesis que intentan explicar la fisiopatología de la esquizofrenia, como la alteración de los principales sistemas de neurotransmisión cerebrales (hipótesis dopaminérgica, serotoninérgica y glutamatérgica, entre otras). Mientras la hipótesis dopaminérgica establece que el desarrollo de síntomas psicóticos viene dado por una hiperactivación de receptores de dopamina D2 asociada a una hiperestimulación de la vía dopaminérgica mesolímbica, la hipótesis serotoninérgica defiende el papel del receptor de serotonina 5-HT2A en el desencadenamiento de síntomas positivos, alegando que sustancias alucinógenas como LSD y DOI son agonistas de dicho receptor y su efecto psicotrópico es dependiente del mismo (Gonzalez-Maeso y cols., 2007; Bartolomeis y cols., 2013). Sin embargo, estas hipótesis no son excluyentes, pues los sistemas de neurotransmisión cerebrales están perfectamente integrados, de tal manera que alteraciones en uno de ellos modifican el funcionamiento de otros. Justificación, Hipótesis y Objetivos 50 Tanto los antipsicóticos típicos como los atípicos antagonizan el receptor de dopamina D2, pero según Meltzer, la atipicidad de los antipsicóticos de segunda generación reflejada en la menor incidencia de síntomas extrapiramidales y buena eficacia en el tratamiento de síntomas negativos y cognitivos, podría atender a un mayor bloqueo del receptor de serotonina 5-HT2A con respecto al receptor de dopamina D2 (Meltzer y cols., 1989). Por otro lado, el perfil atípico de los antipsicóticos de segunda generación se ha explicado durante años por una liberación de dopamina en las vías dopaminérgicas nigroestriatal (ausencia de síntomas extrapiramidales), mesocortical (eficiencia en el tratamiento de síntomas negativos y cognitivos) y tuberinfundibular (ausencia de hiperprolactilemia) inducida tras el bloqueo del receptor de serotonina 5-HT2A (Westerink, 2002). No obstante, actualmente algunos autores fundamentan la atipicidad de los antipsicóticos de segunda generación en la existencia del heterodímero formado por los receptores de dopamina D2 y de serotonina 5-HT2A. Investigaciones anteriores han concluido el requerimiento de la expresión del receptor de serotonina 5-HT2A para el desencadenamiento de una respuesta antipsicótica eficaz de neurolépticos convencionales como el haloperidol (Albizu y cols., 2011), cuya eficacia terapéutica ha sido tradicionalmente asociada al bloqueo del receptor de dopamina D2. Los receptores de dopamina D2 y de serotonina 5-HT2A pertenecen a la familia A de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), que recientemente se ha demostrado que pueden formar complejos constituidos por dos o más monómeros de igual o distinto tipo, habiéndose descrito, entre otros, los homodímeros de receptores 5-HT2A (Brea y cols., 2009), receptores D2 (Fonseca y Lambert, 2009), receptores 5-HT2C (Harrick-Davis y cols., 2005), receptores 5-HT7 (Teitler y cols., 2010), y los heterodímeros D2−5-HT2A (Lukasiewicz y cols., 2010; Borroto-Escuela y cols., 2010) y mGluR2−5-HT2A (González-Maeso y cols, 2008), todos ellos implicados en desórdenes psiquiátricos como la esquizofrenia. El hallazgo de la existencia de la oligomerización añadió un mayor nivel de complejidad a los mecanismos de señalización mediados por la activación, bloqueo o inhibición de los GPCRs, que adicionalmente son modulados por las distintas conformaciones que pueden adoptar Justificación, Hipótesis y Objetivos 51 los receptores, cada una de las cuales es estabilizada por ligandos diferentes, proceso conocido con el nombre de señalización dirigida por agonista o selectividad funcional. La importancia del estudio del heterodímero D2−5-HT2A recae en el hecho de que ambos receptores constituyen las principales dianas de los fármacos antipsicóticos, además de estar presentes en sistemas de neurotransmisión alterados en esquizofrenia. Tras su hallazgo in vitro, en células HEK293 transfectadas transitoriamente (BorrotoEscuela y cols., 2010; Lukasiewicz y cols., 2010), el heterodímero D2−5-HT2A se identificó in vivo (concretamente, en cerebro de rata), en regiones involucradas en la patología de desórdenes psicóticos, como el estriado dorsal y ventral, el núcleo accumbens y regiones corticales (Borroto-Escuela y cols., 2014). Por otro lado, investigaciones recientes demostraron la existencia de un crosstalk funcional en el heterocomplejo D2−5-HT2A (Borroto-Escuela y cols., 2010; Albizu y cols., 2011; Borroto-Escuela y cols., 2014), que establecieron que tras la formación del mismo, se produce una modulación de las vías de señalización de ambos receptores, estimulados o bloqueados por determinados fármacos. En relación a ello, se observó que los agonistas alucinógenos del receptor 5-HT2A activan vías de señalización específicas mediadas por el heterodímero D2−5-HT2A (Albizu y cols., 2011; Borroto-Escuela y cols., 2014). El desarrollo de nuevas herramientas, como los sistemas de expresión heterólogos on/off, siendo un ejemplo la línea celular HEK293 Flp-In T-REx empleada en este trabajo de investigación, han permitido estudiar las regulaciones interfuncionales en el heterodímero D2−5-HT2A, posibilitando el control de la expresión del receptor 5-HT2A inducible por doxiciclina. Teniendo en cuenta estos antecedentes, en la presente tesis doctoral se ha considerado de interés el estudio del heterodímero D2−5-HT2A en relación a la farmacología antipsicótica in vitro. Dilucidar nuevos aspectos en los mecanismos de señalización asociados al heterodímero D2−5-HT2A podría abrir nuevas vías de investigación en el desarrollo de fármacos antipsicóticos más eficaces en el tratamiento del conjunto de los síntomas positivos, negativos y cognitivos con ausencia de efectos secundarios. Justificación, Hipótesis y Objetivos 52 HIPÓTESIS El heterodímero D2−5-HT2A podría influir en los mecanismos de señalización implicados en la farmacología de la esquizofrenia. OBJETIVO GENERAL Caracterizar la influencia del heterodímero D2−5-HT2A en la farmacología de los antipsicóticos, mediante el desarrollo de nuevas herramientas. OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Creación de una herramienta dimérica D2−5-HT2A. 1) Definir, mediante microscopía de fluorescencia, las condiciones de inducción con doxiciclina del receptor de serotonina 5-HT2A, en la línea celular HEK293 Flp-In T-REx que expresa el receptor de dopamina D2. 2) Caracterizar la expresión y función de los receptores D2 constitutivo y 5-HT2A inducible por doxiciclina, en la línea de trabajo HEK293. 3) Caracterizar las posibles interferencias en la señalización del heterodímero D2−5-HT2A, en la línea de trabajo HEK293.  Desarrollo de una nueva metodología. 4) Desarrollar un método multiplex de medición simultánea de AMPc e IPs para el heterodímero D2−5-HT2A.  Influencia de la heterodimerización D2−5-HT2A en la farmacología de los antipsicóticos. 5) Evaluar la influencia de la heterodimerización D2−5-HT2A en la afinidad de agonistas y antagonistas (antipsicóticos) por ambos receptores. 6) Evaluar la influencia de la heterodimerización D2−5-HT2A en la potencia y eficacia de agonistas y antagonistas (antipsicóticos) sobre ambos receptores. INTRODUCCIÓN Introducción 55 I. ESQUIZOFRENIA A) ASPECTOS GENERALES La esquizofrenia es una enfermedad mental crónica que afecta aproximadamente al 1 % de la población mundial (Sawa y Snyder, 2002; Ross y cols., 2006; GonzálezMaeso y Sealfon 2009). Se caracteriza por la pérdida del sentido de la realidad (psicosis), acompañada de delirios y alucinaciones, que evoluciona a un deterioro insidioso del afecto emocional y de la cognición. Constituye una de las principales causas de discapacidad en el mundo, siendo la séptima enfermedad con mayor coste médico para nuestra sociedad (Freedman, 2003; Ross y cols. 2006). Asimismo, se ha reportado una tasa de mortalidad de los pacientes con esquizofrenia cuatro veces superior a la de la población general, debido a que el 10% mueren prematuramente por suicidio (Lewis y Lieberman, 2000; Karam y cols., 2010). Se desconocen las causas precisas que generan este trastorno mental, pero los estudios epidemiológicos destacan la asociación entre factores genéticos y ambientales en la base de su desarrollo (Stefansson y cols., 2008; International Schizophrenia Consortium, 2008; GonzálezMaeso y Sealfon 2009). El progreso en su estudio ha sido lento y limitado debido a varios factores, como su elevada heterogeneidad fenotípica y la carencia de lesiones patológicas claras, a diferencia de otros desórdenes neurodegenerativos como el Alzheimer o la enfermedad de Parkinson (Ross y cols. 2006). B) SINTOMATOLOGÍA Y FASES DE LA ENFERMEDAD La esquizofrenia se presenta al final de la adolescencia o edad adulta temprana. Los individuos afectados experimentan un amplio espectro de síntomas agrupados en varias dimensiones (Figura 1): Introducción 56  SINTOMAS POSITIVOS: representan un exceso de las funciones normales y una evaluación distorsionada y dañada de la realidad. Incluyen: Delirios: interpretación errónea de las percepciones o de la experiencia. Existen diferentes tipos de delirios, aunque el más habitual es el persecutorio.  Delirio de persecución: el individuo cree constantemente que está siendo perseguido, de tal manera que su correspondencia siempre es revisada, se hacen registros en su habitación u oficina, su teléfono es intervenido, etc.  Delirio de culpa o pecado: el individuo tiene la creencia de que ha cometido un pecado terrible, a veces sintiéndose responsable de un accidente o desastre con el cual no tiene ningún tipo de conexión.  Delirio de grandeza: el individuo tiene la percepción de poseer poderes o habilidades especiales. Cree que es un personaje famoso, un mesías, etc., o cree estar desarrollando un libro, composición musical o invento maravilloso.  Delirio religioso: el individuo está preocupado por creencias de naturaleza religiosa, como la posesión por el demonio, la reencarnación o el nirvana.  Delirios somáticos: el individuo cree que su cuerpo o alguna parte de él es anormal o ha cambiado.  Delirios de referencia: el individuo cree que detalles, frases o acontecimientos sin importancia están referidos a él.  Delirio de control: el individuo cree firmemente que sus sentimientos o acciones están controladas por una fuerza exterior. Alucinaciones: percepción ilusoria no correspondida a un estímulo exterior. Las alucinaciones pueden ocurrir en cualquiera de las cinco modalidades sensoriales, aunque las auditivas son las más comunes. Habla o discurso desorganizado: dificultad para comunicarse de manera lógica y coherente. Conducta desorganizada: realización de gestos o movimientos repetitivos y ritualistas, expresión de un afecto incongruente, vestimenta inapropiada, etc. Introducción 57  SINTOMAS NEGATIVOS: representan una pérdida o reducción de las funciones normales. Incluyen: Abulia: carencia de voluntad y de motivación. Alogia: restricciones en la fluidez verbal, lenguaje escaso y empobrecimiento del pensamiento y del contenido del discurso. Anhedonia: incapacidad de experimentar placer o disfrute, ante estímulos habitualmente positivos. Apatía: falta de interés. Embotamiento o aplanamiento afectivo: dificultad para sentir y expresar emociones. Otros: retraimiento emocional y social, escasa capacidad de contacto, falta de espontaneidad.  SINTOMAS COGNITIVOS: incluyen déficit de memoria (especialmente, memoria de trabajo), falta de atención y concentración, alteración de la capacidad ejecutiva y planificadora, incapacidad en el establecimiento de prioridades y en la modulación de la conducta en base a señales sociales. Figura 1. Sintomatología de la esquizofrenia.  Alucinaciones  Delirios  Pensamiento desorganizado  Etc.  Déficit de memoria  Falta de atención  Falta de concentración  Trastornos del leguaje  Dificultad en pensamiento inferencial  Etc.  Abulia  Alogia  Anhedonia  Apatía  Aplanamiento afectivo  Etc. Síntomas Positivos Síntomas Cognitivos Síntomas Negativos Introducción 64 Diferencia de género: aunque esta enfermedad afecta igualmente a hombres y mujeres, algunos datos sugieren que el género masculino exhibe manifestaciones de este desorden más severas, desarrolla más tempranamente la enfermedad (2-4 años antes), tiene anormalidades neuropatológicas más marcadas y responde peor al tratamiento antipsicótico (Szymanski y cols., 1995; Hafner y cols., 1999; Lewis y Liberman, 2000). Época del año (invierno y primavera): los individuos nacidos en los meses de invierno y primavera tienen un riesgo ligeramente superior de desarrollar esta patología (Torrey y cols., 1997; Bembenek, 2005). D) DIAGNÓSTICO El diagnóstico de la esquizofrenia se realiza en base al examen y seguimiento del estado mental del paciente a lo largo de un determinado periodo de tiempo (1-6 meses). No hay test de diagnóstico, ni biomarcadores disponibles para esta enfermedad. En la actualidad, hay dos sistemas de diagnóstico principales para la esquizofrenia: el Manual de Diagnóstico y Estadística de Enfermedades Mentales (DSM-V), editado por la Asociación Americana de Psiquiatría (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, DSM-V; American Psychiatric Association; 2013), y la Clasificación Internacional de Enfermedades (ICD-10), realizado por la Organización Mundial de la Salud (International Classification of Mental and Behavioural Disorders, ICD-10; World Health Organization; 1992). Aunque el DSM es más ampliamente usado (Frangou, 2008), ambos sistemas definen objetivamente los síntomas y daños característicos de la esquizofrenia, habiendo permitido una mejora de la fiabilidad de diagnóstico de este desorden mental. Las principales diferencias entre ambos son: el DSM tiene en cuenta la disfunción ocupacional y social (no incluida en la ICD-10) y considera una duración mínima de 6 meses de la enfermedad (versus 1 mes para la ICD-10) (Mueser y McGurk, 2004). Introducción 65 La esquizofrenia comparte algunos de sus síntomas con otros desórdenes mentales, como por ejemplo la psicosis, también característica del trastorno bipolar o el desorden esquizoafectivo. Los sistemas de diagnóstico tradicionales presentan ciertas limitaciones a la hora de determinar endofenotipos (o fenotipos intermedios) y establecer barreras entre las diferentes enfermedades psicóticas. En este sentido, se ha planteado un sistema alternativo de clusterización de los síntomas de los principales desórdenes psicóticos en cinco dimensiones principales (Figura 4): psicosis (síntomas positivos), síntomas negativos, daño cognitivo, manía y depresión. Mientras la esquizofrenia es establecida como un desorden no afectivo, con síntomas positivos, negativos y cognitivos, el trastorno bipolar se caracteriza fundamentalmente por psicosis y manía, siendo el desorden esquizoafectivo el que alberga una mayor heterogeneidad de síntomas de las cinco dimensiones (van Os y Kapur, 2009). Figura 4. Dimensiones de clusterización de los distintos síntomas de desórdenes psicóticas (van Os y Kapur, 2009). Introducción 66 E) NEUROPATOLOGÍA Existen numerosos estudios que establecen anormalidades en la estructura y conectividad cerebral en diferentes etapas del neurodesarrollo en individuos con esquizofrenia (McCarley y cols., 1999). En este sentido, una lesión neuronal temprana (pre o perinatal) podría incrementar la vulnerabilidad del cerebro a anomalías en procesos de neurodesarrollo tardíos (particularmente, postpubertales), que acompañadas de ciertos factores ambientales (por ejemplo, estrés o abuso de sustancias) conducirían al comienzo de la psicosis y al inicio de la enfermedad (Ross y cols., 2006). La detección de anormalidades cerebrales asociadas a esquizofrenia antes del comienzo de la enfermedad ha permitido excluir la posibilidad de que sean secundarias a su cronicidad o tratamiento (Ross y cols., 2006). En efecto, adolescentes y jóvenes adultos con alto riesgo a desarrollar esquizofrenia por virtud de su historia familiar muestran tales anomalías neuronales (Harrison, 1999). Estas anormalidades neuronales, agravadas en el género masculino (Flaum y cols., 1990; Harrison, 1999), incluyen agrandamiento de los ventrículos tercero y laterales y reducción del volumen del lóbulo temporal medial (formación hipocampal, subiculum, giro parahipocampal), del giro temporal superior (particularmente, en la izquierda) y del tálamo. Asimismo, varios estudios han establecido reducciones en el lóbulo frontal, concretamente en las regiones prefrontal y orbitofrontal (Goldstein y cols., 1999; Lewis y Lieberman, 2000; Ross y cols., 2006). Algunas investigaciones también han registrado un agrandamiento del cavum septi pullucidi y anormalidades en los ganglios basales, cuerpo calloso y cerebelo (Antonova y cols., 2004; Ross y cols., 2006). Estudios postmortem y de neuroimagen han documentado una ligera reducción bilateral en el volumen de la formación hipocampal (Harrison, 1999; McCarley y cols., 1999). Asimismo, estudios de tomografía por emisión de positrones han proporcionado evidencias de disfunción hipocampal durante ejercicios de memoria episódica en individuos con esquizofrenia (Heckers y cols., 1998). La reducción del volumen de la formación hipocampal no es atribuible a un decremento en el número de neuronas, sino más bien a una disminución del tamaño del soma (Benes y cols., 1991; Zaidel y cols., 1997), lo que sería consistente con bajos niveles de sinaptofisinas y de Introducción 67 marcadores presinápticos y dendríticos en ciertas subdivisiones del hipocampo (Weinberger, 1999; Lewis and Lieberman, 2000). La reducción de la materia gris en la corteza prefronal (PFC) no es tan acusada como en la formación hipocampal. Sin embargo, múltiples estudios del PFC han sido motivados y desarrollados a raíz de la observación de que muchos individuos con esquizofrenia muestran cierta incapacidad en determinadas tareas cognitivas, tales como aquellas que hacen uso de la memoria de trabajo. Muchos estudios postmortem en el PFC dorsal de sujetos con esquizofrenia han notificado una reducción del 5-10% en el espesor cortical, lo que se corresponde con una disminución del tamaño del soma y un incremento en la densidad celular, pero no con cambios en el número de neuronas (Selemon y Goldman-Rakic, 1999; Lewis and Lieberman, 2000) (Figura 5). Asimismo, se han encontrado bajos niveles de sinaptofisinas en el PFC de personas con esquizofrenia (Glantz y Lewis, 1997; Karson y cols., 1999). Figura 5. Circuito cortical en esquizofrenia (Ross y cols., 2006). Introducción 68 El agrandamiento del tercer ventrículo parece reflejar una reducción en el tamaño del tálamo, lo que está asociado a un menor número de proyecciones talámicas al PFC (Andreasen y cols., 1994). Estudios postmortem han revelado una reducción del 30% en el número de neuronas en el núcleo talámico mediodorsal, principal fuente de proyecciones talámicas al PFC. La eliminación de terminales axónicos presinápticos procedentes del tálamo podría ser la causa de la resorción de espinas dendríticas postsinápticas en el PFC de individuos con esquizofrenia (Lewis and Lieberman, 2000). Las investigaciones neuropatológicas de esquizofrenia no han encontrado características típicas de enfermedades neurodegenerativas, como cuerpos de inclusión, neuritas distróficas o gliosis reactiva. Sin embargo, evidencias de anomalías citoarquitectónicas en la corteza entorrinal y otras regiones corticolímbicas, así como una elevada frecuencia de neuronas aberrantes en la materia blanca subyacente al córtex prefrontal y regiones parahipocampal y temporal sugieren una migración neuronal cortical desordenada en esquizofrenia (Akbarian y cols., 1996; Arnold y cols., 1997; Arnold y cols., 2005; Ross y cols., 2006). F) NEUROBIOLOGÍA Existen diferentes hipótesis neuroquímicas que tratan de explicar la desregulación de distintos sistemas de neurotransmisores asociada a esquizofrenia:  HIPÓTESIS DOPAMINÉRGICA: Esta hipótesis establece una relación entre la desregulación en la transmisión dopaminérgica cerebral y la esquizofrenia (Carlsson, 1978; Carlsson y Carlsson, 2006; Keshavan y cols., 2008). Las principales vías dopaminérgicas cerebrales son (Figura 6): Mesolímbica: proyecta desde el área tegmental ventral del mesencéfalo al núcleo accumbens, una región del sistema límbico implicada en el circuito de recompensa y las sensaciones placenteras. La hipótesis dopaminérgica mesolímbica defiende que la hiperactividad de esta vía, que resulta en una hiperestimulación de los Introducción 69 receptores D2 (Saiz Ruiz y cols., 2010), constituye la base de generación de los síntomas positivos en esquizofrenia. Esta hipótesis se fundamenta en la observación de dos hechos importantes (Carlsson, 1978; Davis y cols., 1991; Laruelle y cols., 1999; Guillin y cols., 2007):  Los agentes potenciadores de la transmisión de catecolaminas (por ejemplo, cocaína y anfetaminas) reproducen los síntomas positivos de la esquizofrenia.  Todos los fármacos antipsicóticos conocidos son antagonistas de receptores dopaminérgicos, particularmente los receptores D2. Mesocortical: proyecta desde el área tegmental ventral al córtex prefrontal ventromedial y dorsolateral, y está implicada en la regulación de las emociones y el afecto, así como en funciones cognitivas. Algunos investigadores consideran que los síntomas negativos y cognitivos de la esquizofrenia podrían deberse a una hipoactividad de la vía dopaminérgica mesocortical (Davis y cols., 1991; Keshavan y cols., 2008) que resulta en una hipoestimulación de receptores D1 (Okubo y cols. 1997; Saiz Ruiz y cols., 2010). Sin embargo, otros autores defienden que esta deficiencia dopaminérgica podría ser secundaria al tratamiento de fármacos antipsicóticos (Lidow y cols., 1997). Nigroestriada: proyecta desde la sustancia negra del troncoencéfalo al estriado. Esta vía forma parte del sistema extrapiramidal y desempeña un papel clave en el control de los movimientos motores. En individuos con esquizofrenia no tratada, esta vía puede estar relativamente preservada. Sin embargo, pacientes que han sido tratados con antipsicóticos, especialmente los de primera generación, suelen evidenciar un déficit dopaminérgico de esta vía, que está ligado a trastornos del movimiento, como parkinsonismo, acatisia y distonía (síntomas extrapiramidales). Tuberinfundibular: esta vía proyecta desde el hipotálamo a la hipófisis anterior. Normalmente, en individuos sanos y pacientes no tratados, esta vía está activa e inhibe la liberación de prolactina a la circulación. El bloqueo de receptores D2 en esta vía por antipsicóticos implica un aumento de la secreción y liberación de prolactina en sangre, asociado a síntomas secundarios como galactorrea, amenorrea y disfunción sexual. Introducción 70  HIPÓTESIS SEROTONINÉRGICA: La serotonina es producida en el SNC principalmente por los núcleos de rafe, ubicados en el tallo encefálico, que proyectan múltiples eferencias a diversas zonas del cerebro (corteza cerebral, septo, núcleo accumbens, etc.) (Figura 6), así como a la médula espinal. Este neurotransmisor tiene un efecto modulador en las neuronas dopaminérgicas del área tegmental ventral implicadas en esquizofrenia, lo que podría justificar su importancia en la fisiopatología de este desorden mental (Alex y Pehek, 2007). La hipótesis serotoninérgica tiene su origen en el hallazgo de que determinadas sustancias alucinógenas que causan efectos psicóticos, tales como el LSD, son agonistas del receptor de serotonina 5-HT2A. Asimismo, los antipsicóticos atípicos o de segunda generación empleados en el tratamiento de la esquizofrenia, se caracterizan por su antagonismo de los receptores 5-HT2A, al que se atribuye la ausencia de efectos extrapiramidales e hiperprolactinemia, así como su mayor eficacia en la supresión de los síntomas negativos y cognitivos. Figura 6. Vías dopaminérgicas y serotoninérgicas cerebrales (Robertson, 2006). Introducción 71  HIPÓTESIS GLUTAMATÉRGICA: Esta hipótesis sugiere que la fisiopatología de la esquizofrenia está relacionada con una hipofunción de neuronas glutamatérgicas corticales capaces de regular los sistemas de neurotransmisión cerebrales restantes. Existen cinco vías glutamatérgicas específicas con relevancia en la fisiopatología de la esquizofrenia (Saiz Ruiz y cols., 2010) (Figura 7): Corticotroncoencefálicas: proyecta desde las neuronas piramidales del córtex prefrontal a centros del troncoencéfalo, que son los núcleos de rafe (responsables de la neurotransmisión serotoninérgica), Locus coeruleus (encargado de la neurotransmisión noradrenérgica), sustancia negra y área tegmental ventral (con neurotransmisión dopaminérgica). La hipótesis glutamatérgica defiende una hipofunción de los receptores NMDA en la vía corticotroncoencefálica que proyecta indirectamente a través de interneuronas inhibitorias gabaérgicas al área tegmental ventral del tracto mesolímbico. Ello resulta en una hiperactividad de la vía dopaminérgica mesolímbica, responsable de la generación de síntomas positivos en esquizofrenia. Esta hipótesis está sustentada por el hecho de que la fenciclidina (PCP) y la ketamina, antagonistas del receptor NMDA, mimetizan los síntomas positivos de la esquizofrenia (Carlsson y cols., 2000; Keshavan y cols., 2008; Karam y cols., 2010). Asimismo, se ha observado que estas drogas reproducen los síntomas negativos y cognitivos de la esquizofrenia. Esto es debido a que las neuronas corticales glutamatérgicas actúan como acelerador activando directamente las neuronas dopaminérgicas mesocorticales. En consecuencia, el bloqueo del receptor NMDA en las mismas conllevaría una hipoactividad en la vía mesocortical dopaminérgica (Saiz Ruiz y cols., 2010). Córtico-estriado y tálamocortical: estas vías actúan como moduladores del filtro sensorial talámico. Las proyecciones glutamatérgicas descienden del córtex al estriado donde activan neuronas inhibitorias gabaérgicas, que a su vez proyectan al tálamo, el cual finalmente envía eferencias glutamatérgicas al córtex. La hipofunción del receptor NMDA en esta vía reduce la inhibición de las neuronas glutamatérgicas tálamo-corticales, lo que conlleva un exceso de información Introducción 72 sensorial al córtex y la aparición de síntomas positivos en esquizofrenia (Carlsson y cols., 2000; Saiz Ruiz y cols., 2010). Córtico-talámicas y córtico-corticales: se ha descrito que la desregulación de estas vías por hipofunción de receptores NMDA también guarda relación con esquizofrenia, aunque su estudio no ha sido tan exhaustivo. Además de los receptores NMDA, hay otros receptores de glutamato que se propone que desempeñan un papel importante en esquizofrenia (Karam y cols., 2010), como mGluR2 y mGluR5. Se ha demostrado que agonistas de receptores de glutamato metabotrópicos (mGluR) revierten la hiperactividad motora inducida por PCP (Moghaddam y cols., 1998). Asimismo, estudios clínicos preliminares establecen una mejora de los síntomas positivos y negativos tras la administración de agonistas mGluR2/3 (Moghaddam y cols., 2004). Por otro lado, se ha observado una posible implicación de mGluR5 en la neurobiología de la esquizofrenia, ya que ratas KO para mGluR5 muestran un déficit en inhibición prepulso (PPI: respuesta de sobresalto reducida a un estímulo sensorial fuerte cuando éste es precedido por un estímulo escasamente detectable; este proceso de inhibición preatencional se utiliza para medir la capacidad de procesamiento de información sensorial del cerebro), similar al causado por PCP (Kinney y cols., 2003). Igualmente, ratas pretratadas con MPEP (antagonista selectivo de mGluR5) muestran un agravamiento de los síntomas cognitivos y motores, en comparación con aquellas a las que únicamente se les ha administrado PCP (Conn y cols., 2009). Adicionalmente, CDPPB (modulador alostérico positivo específico de mGluR5) bloquea la actividad locomotora inducida por anfetaminas en ratas (Kinney y cols., 2005). Introducción 73 Figura 7. Vías glutamatérgicas cerebrales: a (corticotroncoencefálicas), b (cortico-estriada), c (tálamo-corticales), d (córticotalámicas) y e (corticocorticales) (Schwartz, 2012). G) TRATAMIENTO  PSICOSOCIAL Las intervenciones psicosociales pretenden mejorar el manejo de la esquizofrenia (esto es, enfrentarse a los síntomas, prevenir recaídas, etc.) y potenciar la autosuficiencia del individuo, sus relaciones sociales, así como la búsqueda de trabajo (Mueser y McGurk, 2004). Tratamiento asertivo comunitario (TAC): los pacientes con esquizofrenia severa a menudo fracasan en la toma continua de la medicación, lo que conduce a recaídas, rehospitalizaciones e inestabilidad en el lugar de residencia. Con la intención de dar solución a este problema, el TAC lleva a cabo un cuidado continuo de los pacientes Introducción 80 Figura 8. Porcentaje de ocupación de los receptores D2 y 5-HT2A por antipsicóticos a dosis clínicas (Kuroki y cols., 2008). El tratamiento crónico con haloperidol, pero no con clozapina, incrementa el número de receptores de dopamina D2 en el estriado. Asimismo, tanto los antipsicóticos convencionales, como los atípicos, aumentan la unión de receptores D2 en el córtex frontal. Esta alza de receptores D2 podría constituir un mecanismo compensatorio de bloqueo de los mismos por los antipsicóticos (Westerink, 2002). Introducción 81 II. RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNAS G (GPCRs) Los GPCRs conforman la familia más grande y versátil de receptores de membrana y representan aproximadamente el 1% del genoma humano (Luttrell, 2008). Los GPCRs median los efectos intracelulares de un gran número de estímulos extracelulares, que incluyen hormonas, neurotransmisores, citoquinas, lípidos, pequeñas moleculas y varias señales sensoriales como luz u odorantes (Bridges y Lindsley, 2008; Panetta y Greenwood, 2008). Así, los GPCRs están implicados en la señalización y regulación de múltiples procesos fisiológicos, como el metabolismo, la neurotransmisión y la proliferación, diferenciación y muerte celular. Ello explica que mutaciones en genes que codifican para los mismos se asocien a diversas enfermedades cardiovasculares, inmunológicas, neurodegenerativas y cáncer (Luttrell, 2008). En este sentido, los GPCRs son de especial relevancia terapéutica, constituyendo importantes dianas farmacológicas, ya que el 25-40% de los fármacos comercialmente disponibles actúan sobre los mismos (Weis y Kobika, 2008). A) ESTRUCTURA Los GPCRs también son denominados receptores de 7 dominios transmembrana (7 TM), ya que todos ellos comparten una estructura básica común que consiste en una única cadena polipeptídica plegada en siete segmentos hidrofóbicos α-hélice transmembrana (TMI – TMVII) unidos por tres lazos extracelulares (e1, e2 y e3) y tres lazos intracelulares (i1, i2 e i3), con un extremo N-terminal extracelular y un extremo C-terminal intracelular (Figura 9). Los dominios transmembrana son altamente homólogos y disponen de un elevado grado de conservación entre los diferentes tipos de GPCRs, observándose una gran variabilidad en el extremo N-terminal y en menor medida en la cola C-terminal y los loops intra y extracelulares. Asimismo, las hélices transmembrana se componen de aproximadamente 24 aminoácidos, mientras que las colas C y N terminal, así como los loops intra y extracelulares pueden variar ampliamente en su longitud hasta cientos de aminoácidos (Bridges y Lindsley, 2008). La región transmembrana, así como el extremo N-terminal extracelular están Introducción 82 implicados en la unión del ligando, mientras que los dominios intracelulares son importantes en la transducción de la señal y la modulación funcional del receptor (Luttrell, 2008). Figura 9. Estructura representativa de los GPCRs (Bridges y Lindsley, 2008). B) CLASIFICACIÓN Existen varios sistemas de clasificación de los GPCRs, en base a sus ligandos o similitudes de secuencia. Sin embargo, el sistema de Kolakowski es el más ampliamente usado y agrupa los GPCRs en seis familias (A-F), siendo tres las que concentran la mayoría de los receptores humanos conocidos (Luttrell, 2008) (Figura 10): Familia A: alberga el 90% de los GPCRs, entre los cuales están los receptores de rodopsina, adrenérgicos, de neurotransmisores (dopamina, serotonina, acetilcolina, etc.), de quimioquinas, trombina y otros. Familia B: se caracteriza por la presencia de un gran loop extracelular e incluye aproximadamente 20 receptores diferentes para una variedad de hormonas peptídicas de alto peso molecular, tales como el glucagón, la calcitonina o la hormona paratiroidea. Introducción 83 Familia C: constituye el grupo más pequeño y contiene los receptores metabotrópicos de glutamato, el receptor GABAB y los receptores de feromonas y del gusto. Todos ellos presentan un dominio extracelular bilobulado a modo de Venus flytrap. Figura 10. Principales familias de GPCRs (Conn y cols., 2009). Las distintas familias se distinguen primordialmente en base a su secuencia aminoacídica. Sin embargo, la segunda mayor diferencia entre las familias concierne la localización del dominio de unión ortostérico (OBD) y la naturaleza del ligando ortostérico. Por tanto, como se muestra en la figura 9, el OBD de la familia A se localiza en el dominio 7TM, mientras que en las familia B y C se sitúa en el loop extracelular (Bridges y Lindsley, 2008). Posteriormente, en base a la secuenciación del genoma de un amplio número de especies, se ha desarrollado un sistema filogenético de clasificación de los GPCRs (sistema GRAFS) en cinco familias: Glutamato, Rodopsina, Adhesión, Frizzled/taste 2 y Secretina (Fredriksson y cols., 2003). Introducción 84 C) MECANISMOS DE SEÑALIZACIÓN  SEÑALIZACIÓN DEPENDIENTE DE PROTEÍNA G: Tras la unión del agonista, el GPCR sufre un cambio conformacional y actúa como un factor intercambiador de nucleótido de guanina (GEF), induciendo el intercambio de GDP unido a la proteína G acoplada por GTP, y en consecuencia la activación de la misma. Las proteínas G son proteínas heterotriméricas constituidas por 3 subunidades: α, β y γ. En su forma inactiva, la subunidad α que posee actividad GTPasa intrínseca, está unida a GDP y al heterodímero βγ. La estimulación del GPCR y en defecto el intercambio de GDP por GTP en la proteína G conduce a su activación y a la disociación de subunidad α/complejo βγ, interaccionando éstos con diversos sistemas efectores (adenilil ciclasas, fosfodiesterasas, fosfolipasas, canales iónicos, etc.) que ponen en marcha múltiples vías de señalización. La desactivación de éstas ocurre por medio de la hidrólisis de GTP a GDP por la actividad GTPasa intrínseca de la subunidad α, proceso que resulta potenciado por la acción de proteínas acelerantes de GTPasa (GAPs). La subunidad α en su forma inactiva unida a GDP, adquiere alta afinidad por el complejo βγ, lo que induce la reasociación de las tres subunidades y la terminación del ciclo de activación (Bridges y Lindsley, 2008) (Figura 11). Figura 11. Ciclo funcional de actividad de proteínas G (Wettschureck y Offermanns., 2005). Introducción 85 Los GPCRs tienen la capacidad de acoplarse a una o más proteínas G, permitiendo así una modulación selectiva de diferentes rutas de señalización (Figura 12). Existen distintas proteínas G en función del tipo de subunidades que las conforman. Hasta el momento, se han identificado 21 subunidades α codificadas por 16 genes, 6 subunidades β codificadas por 5 genes y 12 subunidades γ, que permiten múltiples construcciones de proteínas G, clasificadas en cuatro clases principales en base a la subunidad Gα: Gαs, Gαi/o, Gαq y Gα12/13. Las proteínas Gαs y Gαi activan e inhiben respectivamente a la adenilato ciclasa (AC), lo que da lugar a un aumento o disminución de AMPc en el interior celular. La proteína Gαq activa a la fosfolipasa Cβ (PCβ), que cataliza la reacción de conversión del fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) en diacilglicerol (DAG) e inositol-1,4,5-trifosfato (IP3), teniendo este último un efecto positivo en los canales de calcio del retículo endoplasmático, lo que se asocia a un aumento de Ca+2 citosólico. Por otro lado, las proteínas Gα12/13 están implicadas en la regulación de pequeñas GTPasas como la proteína Rho, que juega un rol importante en una amplia variedad de funciones de la célula, como el tráfico vesicular, la dinámica transcripcional y la polaridad y el ciclo celular. Adicionalmente, el complejo βγ también actúa sobre múltiples sistemas efectores, especialmente en el caso de receptores acoplados a proteínas Gαi (Dorsam y Gutkind, 2007). Introducción 86 Figura 12. Vías de señalización dependientes de proteína G de los GPCRs (Dorsam y Gutkind, 2007).  SEÑALIZACIÓN INDEPENDIENTE DE PROTEÍNA G: Los GPCRs pueden activar mecanismos de señalización independientes de proteínas G, que requieren la unión de proteínas de andamiaje (scaffolding proteins o scaffolds), entre las cuales cabe destacar las β-arrestinas, las tirosin quinasas (por ejemplo, c-Src) y las proteínas con dominios PDZ (PSD-95, Homer, etc.). La función de las proteínas scaffolds se basa en facilitar la interacción de los receptores con sus sistemas efectores, muchos de los cuales son componentes de cascadas clásicas de segundos mensajeros (proteínas G, PKA, PKC, etc.), siendo otros elementos de rutas de señalización alternativas (ERK, Akt, JNK, p38, Fus3/Kss1, etc.). Introducción 87 D) DESENSIBILIZACIÓN E INTERNALIZACIÓN DEL RECEPTOR Tras la activación del GPCR y sus vías de señalización efectoras, se produce una atenuación de la respuesta (down-regulation), proceso conocido con el nombre de desensibilización (Figura 13), que puede ser: Homóloga: es un mecanismo dependiente de la unión de ligando, que consiste en la fosforilación del receptor por quinasas receptoras de proteínas G (GRK1-7). Heteróloga: es un proceso independiente de la unión de ligando, siendo el GPCR en este caso fosforilado por quinasas alternativas a las GRKs, como por ejemplo, PKA o PKC. De este modo, la activación de un GPCR puede concluir en la desensibilización de otro receptor. El proceso de fosforilación del receptor determina el reclutamiento de β-arrestinas, que desempeñan un papel esencial en la terminación de la señal, al interrumpir la unión entre el GPCR y la proteína G acoplada (Bridges y Lindsley, 2008). Adicionalmente, las β-arrestinas están implicadas en la internalización del receptor vía vesículas revestidas de clatrina, que tras la acción de la dinamina, se desprenden de la membrana y dan lugar a endosomas, los cuales pueden ser devueltos a la superficie celular permitiendo el reciclaje del receptor o fusionarse con lisosomas donde tiene lugar la degradación del mismo. No obstante, existen otros mecanismos de secuestro e endocitosis del receptor independientes de β-arrestinas, como su internalización mediada por caveolas o incluso por vesículas no revestidas. Introducción 88 Figura 13. Desensibilización, secuestro y tráfico intracelular de los GPCRs (Luttrell y Lefkowitz, 2002). E) MODELOS DE ACTIVACIÓN DE LOS GPCRs En base a la información sustraída de la estructura cristalina de diversos receptores, la afinidad de sus ligandos, así como la funcionalidad de sus proteínas G y/o sistemas efectores, se han desarrollado diversos modelos cinéticos que explican la activación de los GPCRs (Figura 14). El modelo farmacológico clásico o simple describe la activación del GPCR a partir de la unión del agonista (A) a su estado inactivo (R), generando así el complejo (AR), que dirige un cambio conformacional en el receptor, el cual adquiere un estado activo (AR*). El modelo del complejo ternario se presenta como una extensión del modelo clásico, ya que no solamente tiene en cuenta la interacción entre el agonista y el GPCR, sino también la conexión entre el receptor en su conformación activa y la proteína G, lo que da lugar al complejo AR*G. El descubrimiento de la actividad espontánea del receptor sin requerimiento de la unión del agonista (actividad constitutiva) dio origen al modelo del complejo ternario extendido, que establece la existencia del receptor en dos estados Introducción 89 interconvertibles que son propiedad intrínseca del mismo, estado inactivo (R) y activo (R*), a los cuales se une el agonista con baja y alta afinidad, respectivamente. Por tanto, este modelo implica que el receptor, en su estado activo generado de manera espontánea, se puede acoplar a su proteína G, independientemente de la unión del agonista (R*G). Adicionalmente, el modelo del complejo ternario cúbico abarca la consideración termodinámicamente requerida (aunque fisiológicamente no relevante) de la interacción del receptor en su estado inactivo (R) con la proteína G correspondiente, sin generar ninguna respuesta. Finalmente, el modelo del complejo ternario alostérico da cabida a la modulación alostérica de los GPCRs y permite explicar la interacción entre dos ligandos (ligando ortostérico y modulador alostérico) y el receptor (Bridges y Lindsley, 2008; Casado y cols., 2007). Figura 14. Modelos cinéticos de activación de los GPCRs (Bridges y Lindsley, 2008). Introducción 96 Figura 16. Vías de señalización del receptor D2 (Beaulieu y cols., 2015). El receptor de dopamina D2 se expresa en gran medida en el estriado, en el núcleo accumbens y en el tubérculo olfatorio. En menor medida, este receptor también se localiza en la sustancia negra, área tegmental ventral, hipotálamo, áreas corticales, septum, amígdala e hipocampo (Missale y cols., 1998; Seeman, 2006; Beaulieu y Gainetdinov, 2011). El receptor de dopamina D2 está involucrado en la fisiopatología de múltiples desórdenes mentales, tales como la esquizofrenia. Numerosos estudios señalan una potenciación de la sensibilidad de los receptores D2 postsinápticos en esquizofrenia (Seeman y cols., 2007; Seeman y Seeman, 2014), tal vez debida a un incremento en la proporción de receptores D2 en un estado constitutivo de alta afinidad. Introducción 97 Adicionalmente, muchos autores subrayan un incremento en la densidad de receptores D2 en los ganglios basales de pacientes con esquizofrenia, en comparación a controles sanos (Beaulieu y Gainetdinov, 2011). La importancia del receptor D2 en esquizofrenia está ligada al hecho de que todos los antipsicóticos, típicos y atípicos, constituyen antagonistas del mismo, a excepción del aripiprazol, que a bajas concentraciones de dopamina se comporta como agonista parcial. Los antipsicóticos ejercen un bloqueo de los receptores D2 a nivel límbico, lo que conlleva una atenuación de los síntomas positivos. Como se ha comentado anteriormente, los antipsicóticos convencionales tienen efectos secundarios asociados, síntomas extrapiramidales e hiperprolactilemia vinculados al bloqueo de receptores D2 en las vías nigroestriatal y tuberoinfundibular, respectivamente. En este sentido, los antipsicóticos de segunda generación aventajan a los convencionales, pues el bloqueo del receptor 5-HT2A estimula la liberación de dopamina en dichas vías, lo que conduce a una reversión de los síntomas mencionados. G) LA SEROTONINA Y EL RECEPTOR 5-HT2A La serotonina es una monoamina biógena que actúa como neurotransmisor vía receptores de membrana en los sistemas nervioso central (SNC) y periférico (SNP), y en tejidos no neuronales (fundamentalmente, sangre, sistema gastro-intestinal, endocrino y cardiovascular) (Hoyer y cols, 2002). La primera vez que fue aislada, en 1930 por Ersparmer y Vialli, se le acuñó el término enteramina, al haber sido obtenida de las células enterocromafines de la mucosa gastrointestinal (Ersparmer y Vialli, 1937). La enteramina fue redescubierta en 1940 por el grupo de Irvin Page en el sistema circulatorio, habiendo sido éste el momento en el que se le llamó serotonina, en base a sus capacidades vasocontrictoras (Rapport y cols., 1948). Más tarde, Maurice Rapport, quien purificó, cristalizó y caracterizó la molécula a partir de muestras de sangre, encontró que enteramina y serotonina constituyen la misma entidad, habiéndole asignado el nombre de 5-hidroxitriptamina (5-HT) (Rapport, 1949). Aunque en esta época Page y sus colaboradores propusieron la presencia de serotonina en extractos de cerebro (Twarog y Page, 1953), pasaron varios años hasta que Introducción 98 Dahlstrom y Fuxe identificaron neuronas cerebrales que producen este neurotransmisor (Dahlström y Fuxe, 1964). En el SNC, la serotonina se produce en las neuronas de los núcleos de rafe, ubicados en la línea media del tronco cerebral, a partir del aminoácido esencial triptófano y por la acción secuencial de dos enzimas (triptófano hidroxilasa y Laminoácido aromático descarboxilasa). Mientras el núcleo de rafe caudal inerva la médula espinal, el medial y el dorsal proyectan múltiples y difusas eferencias a prácticamente todas las estructuras cerebrales. En el SNC, la serotonina tiene un papel fundamental en una amplia variedad de funciones que incluyen desarrollo neuronal, regulación de la temperatura, control motor, sueño, apetito, adicción, regulación de las emociones y del estado del ánimo, control conductual y cognición. Por ello, alteraciones en su función así como en los receptores sobre los cuales actúa se han asociado con varios desórdenes psiquiátricos como esquizofrenia, depresión, ansiedad, desórdenes de la alimentación, trastorno obsesivo-compulsivo y suicidio (Cools y cols., 2008; Nichols D. y Nichols C. 2008; Hannon y Hoyer, 2008). La acción biológica de la serotonina está mediada por una gran variedad de receptores clasificados en base a su estructura, farmacología y transducción de señales en siete clases pertenecientes a dos grandes grupos (Barnes y Sharp, 1999; Hoyer y cols, 2002) (Figura 17): Los GPCRs pertenecientes a la familia A:  5-HT1 (5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1E y 5-HT1F): acoplados a la proteína Gi/o, que inhibe la producción de AMPc al inactivar a la AC.  5-HT2 (5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT2C): acoplados a la proteína Gq para incrementar la hidrolisis de PIP2 y elevar los niveles de Ca+2 citosólico.  5-HT4, 5-HT6 y 5-HT7: se acoplan positivamente a la AC, por lo que su acción es mediada por la proteína Gs.  5-HT5 (5-HT5A y 5-HT2B): la proteína G a la cual se acoplan preferencialmente no ha sido todavía establecida, pudiendo ser Gi/o o posiblemente Gs. Receptor ionotrópico: 5-HT3. Introducción 99 Figura 17. Clasificación de los receptores 5-HT (Hoyer y cols., 2002).  EL RECEPTOR 5-HT2A: El receptor 5-HT2A está codificado por un gen localizado en el cromosoma humano 13 y comprende 471 aminoácidos en ratones, ratas y humanos. Es uno de los receptores de serotonina más estudiados y se encuentra altamente conservado en las distintas especies. Este receptor está ampliamente distribuido por los distintos tejidos nerviosos y no neuronales (Hoyer y cols, 2002; Hannon y Hoyer, 2008). Al igual que los restantes receptores pertenecientes a la familia 5-HT2, el receptor 5-HT2A se acopla fundamentalmente a la proteína Gαq, lo que conlleva una activación de la PLC, que cataliza la degradación de PIP2 a IP3 y DAG. El IP3 activa los canales de calcio del retículo endoplasmático, generando así un incremento de los niveles de Ca+2 citosólico y en definitiva la estimulación de la calmodulina y otras proteínas citosólicas. El DAG está implicado en la activación de la protein kinasa C, lo que conduce a la estimulación de la proteína kinasa activada por mitógeno (MAPK) y factores de transcripción tales como CREB (Barnes y Sharp, 1999; Nichols y Elaine, 2001) (Figura 18). Asimismo, la activación del receptor 5-HT2A se asocia a la estimulación de otras fosfolipasas, como la fosfolipasa D (PLD) y la fosfolipasa A2 Introducción 100 (PLA2) (Felder y cols., 1990; Berg y cols., 1998). Por otro lado, hay evidencias de que el receptor 5-HT2A pueda regular vías de señalización dependientes de la proteína Gi al ser activado por drogas alucinógenas (LSD y DOI) (González Maeso y cols., 2007). En contraste con la mayoría de los GPCRs, el receptor 5-HT2A entra en un proceso de desensibilización, no sólo en respuesta a la unión de agonistas, sino también de antagonistas (Nichols E. y Nichols D., 2008). Figura 18. Señalización del receptor 5-HT2A mediada por Gq (Nichols y Bush, 2001) Los estudios de unión de radioligandos, inmunohistoquímicos e hibridación in situ han permitido determinar la localización del receptor 5-HT2A en el SNC de ratón, rata, humanos y otras especies. Así, el receptor 5-HT2A se expresa principalmente en el córtex cerebral, especialmente en las láminas I y IV-Va, en el córtex piriforme y entorrinal, así como en el claustrum, núcleo endopiriforme y bulbo olfatorio. Algunos núcleos del tronco cerebral también muestran altas señales de este receptor: pontino, facial e hipoglosal. Asimismo, se han observado niveles intermedios del receptor 5HT2A en el sistema límbico y en los ganglios basales, esto es, núcleo accumbens y caudado. Sin embargo, su expresión en el hipocampo es baja, estando ausente en el cerebelo y núcleo talámico (Hoyer y cols., 2002; Hannon y Hoyer, 2008). Introducción 101 En el SNC, se ha demostrado que el receptor 5-HT2A está implicado en esquizofrenia. Se ha observado que drogas alucinógenas como LSD, DOI y psilocibina, que reproducen los síntomas positivos de dicho desorden mental, son agonistas del receptor 5-HT2A. Asimismo, la respuesta head-twitch de ratones generada por estas drogas es dependiente del receptor 5-HT2A, pues no se observa en ratones KO para el mismo (González-Maeso y cols., 2007), ni se detecta cuando el animal Wild-type ha sido tratado con antagonistas selectivos, como ketanserina o MDL 100907 (Green y Heal, 1985; Barnes y Sharp, 1999). Adicionalmente, varias investigaciones confirman que el receptor 5-HT2A desempeña un papel importante en la acción antipsicótica. En cuanto al tratamiento antipsicótico típico, se ha observado que este receptor podría ser necesario en la efectividad del mismo, habiendo sido demostrada una reducción de la respuesta a haloperidol en ratones KO del receptor 5-HT2A con hiperlocomoción inducida por MK-801. Por otro lado, se ha establecido que este receptor parece ser esencial en la ausencia de síntomas extrapiramidales y en el tratamiento de los síntomas negativos y cognitivos asociados a la medicación antipsicótica atípica. Así, la gran mayoría de los antipsicóticos de segunda generación se diferencian de los convencionales por tener mayor afinidad por el receptor 5-HT2A en comparación al receptor D2. Otros procesos neuronales en los que está implicado el receptor 5-HT2A son: regulación de la temperatura y del sueño, respuesta neuroendocrina tales como incremento de la secreción de cortisol, ACTH, renina y prolactina. En tejidos periféricos no nerviosos, el receptor 5-HT2A se expresa principalmente en los vasos sanguíneos, pero también en intestino, desempeñando un papel importante en la respuesta contráctil de los vasos sanguíneos, así como del músculo liso intestinal, bronquial, uterino y urinario. Adicionalmente, el receptor 5-HT2A participa en la agregación plaquetaria, así como en el incremento de la permeabilidad de los capilares. Introducción 102 H) OLIGOMERIZACIÓN DE LOS GPCRs Históricamente, se consideraba que los GPCRs funcionan como entidades monoméricas acopladas a una única proteína G con una estequiometría 1:1. Sin embargo, aunque no se excluye la existencia de monómeros y su posible función fisiológica, desde los años 1980s, se han recogido numerosas evidencias que confirman el hecho de que los GPCRs pueden constituir complejos funcionales que incluyen más de una unidad monomérica (dímeros y oligómeros de mayor orden). Se han utilizado diversas herramientas metodológicas que sustentan y evidencian la oligomerización de GPCRs: ensayos de unión de radioligandos, de coinmunoprecipitación, de transferencia de energía de fluorescencia (FRET) y de bioluminiscencia (BRET), así como el desarrollo de sistemas de expresión heterólogos el líneas celulares permanentes, estudios de co-internalización y de microscopía de fuerza atómica (AFM). La dimerización puede producirse entre monómeros idénticos (homodimerización), como por el ejemplo los homodímeros de los receptores 5-HT2A (Brea y cols., 2009), 5-HT7 (Teitler y cols., 2010) o 5-HT2C (Herrick-Davis y cols., 2004), o entre unidades distintas (heterodimerización), como sería el caso de los heterodímeros D2−5-HT2A (Lukasiewicz y cols., 2010; Borroto-Escuela y cols., 2010) y mGluR2−5-HT2A (González-Maeso y cols., 2008). En general, los GPCRs de la familia A (receptores de dopamina, serotonina, etc.) funcionan tanto como entidades monoméricas, como homo/heteroméricas que alcanzan un equilibrio definido por el tipo celular que los contiene, el entorno donde se ubican y la presencia/ausencia de ligandos que los modulan. Sin embargo, numerosos estudios han establecido que los GPCRs de la familia C (receptores metabotrópicos de glutamato, receptores GABA, etc.), en oposición a los de la familia A, existen y funcionan estrictamente como dímeros. El receptor GABAB solamente es funcional cuando se encuentra como heterodímero, constituido por GABAB1 y GABAB2 (Marshall y cols., 1999; Galvez y cols., 2001). Investigaciones recientes también sugieren que los receptores mGlu se expresan en la membrana plasmática como dímeros constitutivos (Kniazeff y cols., 2004), que pueden interaccionar con otros subtipos de receptores (por ejemplo, el receptor 5HT2A) formando oligómeros de mayor orden. Adicionalmente, estudios de BRET y Introducción 103 FRET han determinado la expresión de receptores de dopamina D2 como oligómeros (Guo y cols., 2003 y 2008). Otra cuestión importante relativa a la estructura y función de los GPCRs concierne la estabilidad estado dimérico/oligomérico (Vilardaga y cols., 2010). La técnica de recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueamiento (FRAP) ha demostrado que mientras los homodímeros del receptor β1-adrenérgico existen de manera transitoria, los receptores β2-adrenérgico se expresan como oligómeros estables en células HEK (Dorsch y cols, 2009). Asimismo, esta técnica también ha puesto recientemente de relieve la existencia de un equilibrio dinámico entre monómeros y homodímeros/oligómeros de receptores D2 en células HEK293 (Fonseca y Lambert, 2009). La dimerización/oligomerización de los GPCRs puede afectar a los perfiles de unión de los ligandos, al acoplamiento de proteínas G y otros mecanismos de señalización independientes de éstas, así como a la expresión y localización de los receptores, lo que añade un mayor nivel de complejidad a los mecanismos que desencadenan las respuestas fisiológicas de múltiples enfermedades. Por ello, se ha llevado a cabo un estudio exhaustivo de diversos heterómeros y oligómeros que podrían tener cierta relevancia en la comprensión de la patología de desórdenes psiquiátricos tales como la esquizofrenia y aportar nuevos targets en el diseño de fármacos para su tratamiento (Moreno y cols., 2013). Algunos de los heterodiméricos que tienen mayor repercusión en esquizofrenia se describen a continuación:  HETERODÍMERO A2A−D2: Tras la demostración de la existencia del heterómero de los receptores de adenosina A2A y de dopamina D2 in vitro e in vivo (Ferre y cols., 1994; Canals y cols., 2003), se comprobó que tenía lugar una modulación funcional (crosstalk) con implicación en la farmacología antipsicótica entre ambos receptores. En concreto, se observó que el agonista CGS21680 del receptor A2A reduce la actividad hiperlocomotora inducida por anfetamina o PCP (Rimondini y cols., 1997; Stills y cols., 2001). Paralelamente, se han descrito evidencias que sugirieron que el efecto antipsicótico a través del heterodímero A2A-D2 podría ser mediado por la inhibición de Introducción 104 la señalización del receptor de dopamina D2 en neuronas GABAérgicas estriatopalidales (Ferre, 1997).  HETERÓMERO A2A−D2-CB1: Diversos estudios de coinmunoprecipitación, BRET y FRET sugirieron la heterodimerización de receptores coexpresados en estructuras cerebrales implicadas en desórdenes psicóticos: el heterodímero de los receptores canabinoide CB1 y de adenosina A2A en terminales glutamatérgicas corticoestriatales (Carriba y cols., 2007; Tebano y cols 2009) y el heterodímero de los receptores canabinoide CB1 y de dopamina D2 en neuronas GABAérgicas estriatopalidales ventrales (Ferre, 1997; Julian y cols., 2003; Yin y cols., 2006; Pickel y cols., 2006; Moreno y cols., 2013). Estudios bioquímicos y de señalización celular indicaron que los efectos inducidos por la activación del receptor CB1 en estriado son dependientes del receptor A2A (Carriba y cols., 2007; Tebano y cols 2009). Asimismo, varios estudios reportaron interacciones antagonistas entre los receptores CB1 y D2 (Marcellino y cols., 2008), habiéndose sugerido la implicación del receptor A2A en las mismas (Navarro y cols., 2008), lo que fue sustentado por el hecho de que este receptor interactúa directamente tanto con receptores CB1 (Carriba y cols., 2007) como con receptores D2 (Canals y cols, 2003; Moreno y cols., 2013).  HETERODÍMERO D1−D2: El heterodímero de los receptores de dopamina D1 y D2 constituye un ejemplo de heterocomplejo implicado en enfermedades psicóticas asociado a vías de señalización distintas a las desencadenadas cuando los receptores funcionan como monómeros. En este sentido, se determinó que la estimulación por agonista de los receptores coexpresados D1 y D2 resulta en un incremento de los niveles de calcio intracelulares vía señalización dependiente de proteína Gq, la cual es activada cuando los receptores se expresan como monómeros o cuando uno de los receptores colocalizados es activado por agonistas selectivos (Lee y cols., 2004; Moreno y cols., 2013). Asimismo, varios autores observaron un incremento en la sensibilidad y actividad del heterodímero D1D2 en desórdenes psiquiátricos, concretamente en el globo pálido de pacientes con Introducción 105 esquizofrenia y en el estriado de ratas tratadas crónicamente con anfetaminas (Perreault y cols., 2010; Szafran y cols., 2013).  HETERODÍMERO mGluR2−5-HT2A: Se demostró la existencia del heterodímero mGluR2−5-HT2A en células HEK293 y la colocalización de ambos receptores en neuronas piramidales corticales de ratón (González-Maeso y cols., 2008). Como se ha comentado anteriormente, varios estudios establecieron que determinadas drogas alucinógenas (LSD, DOI, mescalina y psilocibina) constituyen agonistas del receptor 5-HT2A y tienen la capacidad de inducir una conducta head-twitch en ratones, extrapolable a los síntomas positivos en esquizofrenia (González-Maeso y cols., 2003 y 2007). Asimismo, se observó que esta respuesta psicótica a sustancias alucinógenas no aparece en ratones KO 5-HT2A y también está significativamente reducida en ratones KO mGluR2 (Moreno y cols., 2011). Adicionalmente, se estableció la recuperación de la conducta head-twitch tras el rescate de la expresión del receptor mGluR2 en el córtex frontal de ratones KO mGluR2 (Moreno y cols., 2012). También, se observó que los agonistas alucinógenos del receptor 5-HT2A, a diferencia de los no alucinógenos, inducen no solamente vías de señalización dependientes de Gq, sino también de Gi/o, además de estimular la expresión de genes específicos (egr-1 y egr-2) (González-Maeso y cols., 2003). Por otro lado, se determinó que la co-expresión del receptor mGluR2 potencia la vía de señalización Gi/o estimulada por el receptor 5-HT2A al ser activado por agonistas alucinógenos. Sin embargo, se estableció que este mecanismo de señalización y la expresión de genes específicos de drogas psicoestimulantes desaparece tras la activación de mGluR2 (González-Maeso y cols., 2008). Otro hecho que podría sustentar la desregulación del heterodímero mGluR2−5-HT2A en esquizofrenia es el incremento de receptores 5-HT2A y la disminución de receptores mGluR2 en cerebro humano postmortem de individuos con esta patología no tratada (Moreno y cols., 2013). Material y Métodos 112 proteínas, lípidos o factores de crecimiento, por lo que requiere ser suplementado con 10% de FBS (Fetal Bovine Serum) dializado (Thermo-Fisher) libre de trazas de tetraciclina y 5-HT que podrían generar una alteración de los resultados por estimulación no deseada del receptor de serotonina 5-HT2A. Adicionalmente, se le añadió geniticina G418 1 mg/ml (Invivogen) al medio con el objetivo de seleccionar solamente aquellas células que contuviesen su gen de resistencia, que son aquellas que fueron transfectadas exitosamente con el gen que codifica para el receptor de dopamina D2 unido a la proteína amarilla fluorescente o YFP. Por otro lado, también se adicionó al medio blasticidina 1 mg/ml (Invivogen), con el fin de seleccionar exclusivamente las células que expresan el receptor c-Myc-5-HT2A marcado con la proteína cian fluorescente o CFP, que son las que contienen el gen de resistencia a dicho antibiótico. Por último, el medio de cultivo fue enriquecido con penicilinaestreptomicina (Sigma Aldritch) 1% e higromicina B 100 mg/ml (Invivogen), para evitar una posible contaminación bacteriana. B) DESCONGELACIÓN DE LAS CÉLULAS El proceso de descongelación se realizó a partir de criotubos de células congeladas en nitrógeno líquido o en congeladores de -80 ºC. Estos viales de células se descongelaron en un baño a 37 ºC, del modo más rápido posible para evitar la acción nociva del DMSO, y seguidamente se resuspendieron en 8-10 mL de medio completo en tubos de centrífuga de 15 ml. A continuación, se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos, proceso tras el cual se retiró el sobrenadante. Consecutivamente, el pellet fue resuspendido en 1-2 ml de medio completo y se sembró en un “flask” de 75 cm2 o en una placa de 150 cm2, en el/la que previamente se habían adicionado 15-20 ml de medio completo. Es conveniente siempre indicar en el “flask” o placa el tipo de línea celular que se siembra (en este caso, HEK293), el receptor que sobreexpresa (en este caso, de manera constitutiva el receptor de dopamina D2), el pase (indicativo del número de veces que las células han sido tripsinizadas y por tanto, de la edad celular), la fecha y el nombre de la persona que realiza el proceso. Finalmente, las células Material y Métodos 113 sembradas se mantuvieron en un incubador a una temperatura de 37 ºC, 5% de CO2 y 95% de humedad relativa. C) EXPANSIÓN CELULAR Cuando la confluencia celular llega a ser del 80% en el “flask”, es conveniente expandir el cultivo a 1 o más “flasks” o placas de cultivo de 150 mm, a los que previamente se les ha añadido 15-20 ml de medio, diluyendo así las células entre 5 y 10 veces. No es recomendable que la placa alcance una confluencia superior al 80%, ya que este tipo de células suelen crecer en grupos y superpuestas, lo que conllevaría una inhibición de su crecimiento o incluso muerte de las que quedan en capas inferiores. Por otro lado, el sobrecrecimiento celular puede afectar a la expresión del receptor de interés. El primer paso en el proceso de expansión celular consistió en aspirar el medio de la placa madre. A continuación, se llevó a cabo un lavado de las células con 8-10 ml de PBS, que constituye un tampón fosfato salino (NaCl 136 mM; KH2PO4 1.47 mM; NaH2PO4 8 mM, KCl 2.68 mM). Una vez retirado el PBS, se adicionaron 2.5 ml de tripsina (Sigma Aldritch), una enzima proteolítica cuya función consiste en romper la unión entre las células, así como la adherencia entre éstas y la base del “flask” o placa. Transcurrido un tiempo de aproximadamente 2 minutos de incubación celular con tripsina, se añadieron 8-10 ml de medio con el fin de frenar la reacción enzimática de tripsinización y homogeneizar y recoger la suspensión celular para transferirla a otro/a/os/as “flask/s” o placa/s en el/la/los/las que anteriormente se había añadido 1520 ml de medio completo, aumentando así el número de pase de las células. Finalmente, el/los “flask/s” o placa/s se mantuvieron en un incubador a 37 ºC, 5% CO2 y 95% de humedad relativa. Material y Métodos 114 D) CRIOGENIZACIÓN DE LAS CÉLULAS La criogenización de las células es necesaria para hacer un stock de las mismas y poder trabajar con ellas cuando sea necesario. Así, la congelación de las células se realiza cuando el “flask” o placa alcanza una confluencia del 80%, debido a los motivos indicados anteriormente. Tras haber aspirado el medio de cultivo y tripsinizado las células, se añadió medio nuevo y se recogió la suspensión celular en un tubo Falcon® de 15 ml que se centrifugó a 1000 rpm durante 8 minutos. Una vez retirado el sobrenadante, el pellet se resuspendió en 1 ml de medio de congelación (medio de cultivo completo suplementado con 10% de DMSO) y se transfirió a un criotubo que se congeló gradualmente utilizando dos posibles métodos alternativos, un contenedor de congelación (Mr Frosty®; Nalgene, Rochester, USA) con un compartimento intermedio de isopropanol que permite reducir progresivamente la temperatura de las células en un congelador de -80ºC (-1ºC/minuto) o congelar el criovial durante 4 horas en un congelador de -20ºC para finalmente pasarlo a uno de -80ºC. E) SIEMBRA CELULAR Previamente a la realización de la siembra celular, se llevó a cabo el tratamiento de la placa (96 o 384 pocillos) con poli-D-lisina (Sigma Aldritch), un compuesto sintético que mejora la adherencia de las células a la superficie basal de la misma. La poli-Dlisina se comercializa en forma sólida, por lo que anteriormente a su utilización fue necesario reconstituirla en 50 ml de agua destilada esterilizada por filtración. Seguidamente, se realizó una dilución 1:5 en PBS, que se añadió a todos los pocillos de las placas en los que se sembraría células (25-50 µl/pocillo, en función del tamaño del pocillo). El tratamiento de la placa con poli-D-lisina es de 15-30 minutos, tiempo tras el cual se aspiró la solución, dejando ligeramente abierta la placa para permitir que su base se secase por completo. Una vez tripsinizadas y centrifugadas las células como se ha hecho en los procesos de descongelación, expansión y congelación celular, el pellet se resuspendió en 1.1-5.1 Material y Métodos 115 ml de medio completo y consecutivamente se preparó la disolución de contaje (0.1 ml de Trypan blue, 0.3 ml de medio y 0.1 suspensión celular). El Trypan blue (Sigma Aldritch) o azúl de tripano es un colorante que se utiliza para teñir las células y estudiar su viabilidad, pudiendo así diferenciar las que están vivas de las que están muertas. En las células vivas, la membrana plasmática impide la incorporación del azul de tripano al interior celular, por lo que éstas no se tiñen. Sin embargo, la membrana plasmática de las células muertas es permeable al azul de tripano, por lo que este colorante penetra al medio intracelular, tiñendo por completo las células no viables. El contaje celular se realizó empleando una cámara de Neubauer contando los cuatro campos y calculando la media de éstos (Figura 20). A continuación, el recuento de células se calculó en base a la siguiente fórmula: N = c x Fd x A siendo N el número total de células/ml, c la media de recuento de los campos, Fd el factor de dilución del pellet (1-5) y A el factor de corrección de la cámara (en cámara de Neubauer, 10000). Figura 20. Contaje de células con el método manual de empleo de cámara de Neubauer (Besoiu S., 2010). Material y Métodos 116 Una vez conocida la concentración de células, se llevó a cabo la dilución necesaria para poder sembrar el número de células por pocillo requerido en función del tipo de ensayo y del tamaño del pocillo en cada caso (en los ensayos de microscopía, 8000 células/pocillo; en los ensayos funcionales de AMPc, 30000 células/pocillo en placa half-area de 96; en los ensayos funcionales de IPs, 65000 células/pocillo en placa estándar de 96; en los ensayos de binding en célula entera, desde 25000 hasta 200000 en placa estándar de 96; en el método multiplex AMPc/IPs, 65000 células/pocillo en placa estándar de 96). III. ENSAYOS DE MICROSCOPÍA DE ALTO RENDIMIENTO Los ensayos de microscopía fluorescente tuvieron por objetivo determinar las condiciones óptimas de inducción del receptor de serotonina 5-HT2A, es decir, qué concentración y durante cuánto tiempo deben estar las células expuestas a doxiciclina para expresar adecuadamente dicho receptor inducible. Primeramente, se llevó a cabo la siembra de 8000 células/pocillo en una placa previamente tratada con poli-D-lisina de 386 pocillos válida para realizar ensayos de fluorescencia, en este caso, Cell carrierTM 384 negra de fondo transparente estéril (Perkin Elmer). Adicionalmente, en el día de la siembra las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de doxiciclina (10, 30, 60 y 100 ng/ml) (Sigma Aldritch). Tras haber determinado en el primer ensayo de microscopía de fluorescencia que la concentración óptima para inducir el receptor de serotonina 5-HT2A es 10 ng/ml, se realizó otro ensayo en el que se expusieron las células a diferentes tiempos de doxiciclina 10 ng/ml (24, 48 y 72 horas), habiéndose establecido que el tiempo adecuado de tratamiento son 24 horas. En el ensayo de microscopía, se ha empleado el microscopio de fluorescencia de alto rendimiento Operetta (Perkin Elmer), con un objetivo 60x NA. Los canales de lectura utilizados fueron el de campo claro, el de YFP (Yellow Fluorescence Protein) y el de CFP (Cerulean Fluorescence Protein). La proteína fluorescente YFP tiene su pico de excitación a una longitud de onda de 514 nm y su pico de emisión a 527 nm. Por Material y Métodos 117 otro lado, la proteína fluorescente CFP presenta su pico de excitación a 433 nm y el de emisión a 475 nm. Así, en la detección de estos campos, se empleó para la proteína YFP una longitud de onda de excitación de 500 nm y de emisión de 540 nm, y para la proteína CFP 428 y 480 nm respectivamente. En los diferentes ensayos, se optimizó el tiempo de exposición de cada canal de lectura, así como la altura de medición en función de la intensidad de la señal celular, siendo la intensidad de la lámpara del 100%. Se seleccionaron todos los pocillos en los que se había sembrado células y dentro de cada pocillo tres campos de diferentes zonas. Las imágenes se procesaron de modo remoto mediante el software Columbus (Perkin Elmer), obteniendo los valores medios de todos los campos para cada pocillo de cada uno de los parámetros cuantificados. IV. ENSAYOS DE UNIÓN DE RADIOLIGANDOS Los ensayos de unión de radioligando constituyen una importante herramienta en la caracterización farmacológica de los receptores, posibilitando la cuantificación de los distintos receptores implicados en diferentes procesos fisiológicos y patológicos, así como la definición de la selectividad y afinidad que el radioligando y otros compuestos de interés tienen por el receptor objeto de estudio. Los principales parámetros determinados en las técnicas de binding son los siguientes: densidad del receptor (es una medida que nos indica la cantidad de receptor en la muestra de estudio), saturación del receptor por el radioligando (definida por la constante de disociación del radioligando o KD) y afinidad de distintos ligandos por el receptor (establecida por la constante de afinidad o Ki de cada compuesto). Las técnicas de unión de radioligando se basan en reacciones químicas reversibles entre un compuesto (fármaco, neurotransmisor, etc.) marcado por un radioisótopo (3H, 14C, 35S, 125I, etc.) y un receptor o lugar específico de unión situado en un sistema celular, derivados de células (como las membranas celulares) o tejidos purificados. El radioligando, cuyo marcaje radiactivo no altera las características del ligando, se caracteriza por ser fácilmente detectable gracias a la técnica de contaje por centelleo Material y Métodos 118 líquido, y especialmente por su alta selectividad por el receptor objeto de estudio, permitiendo así la discriminación entre éste y otros receptores que se encuentren en el sistema celular o tejido. Estas reacciones tienen lugar en un medio en el que se han fijado previamente determinados valores como la concentración del radioligando y la suspensión proteica, pH, temperatura, concentración de iones, etc. En este trabajo, se ha hecho uso de las técnicas de binding con el fin de definir la saturación del receptor por el radioligando, así como las propiedades de afinidad de agonistas y antipsicóticos típicos y atípicos por el receptor de dopamina D2 constitutivo y de serotonina 5-HT2A inducible por doxiciclina, pudiendo valorar si los parámetros obtenidos se corresponden con los establecidos en la literatura científica. Por otro lado, los ensayos de unión de radioligando en nuestra línea celular nos han permitido corroborar la presencia del receptor endógeno 5-HT7, cuyo vía de señalización principal es mediada por la proteína Gs y por tanto por AMPc, motivo por el cual su bloqueo es necesario para evitar interferencias en la medición de este segundo mensajero. ENSAYOS DE UNIÓN DE RADIOLIGANDOS EN MEMBRANAS A) PREPARACIÓN DE MEMBRANAS Previamente a la realización de los ensayos de unión de radioligando, se llevó a cabo una preparación de homogenados de membranas a partir de dos tipos celulares:  Células HEK293 que expresan constitutivamente el receptor D2.  Células HEK293 que expresan constitutivamente el receptor D2 y de forma inducible por exposición a doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas el receptor 5-HT2A. Las células fueron sembradas, crecidas y expandidas en placas de cultivo de tamaño 150 x 25 mm. El día previo a la preparación de membranas, se llevó a cabo un cambio de medio de cultivo de las placas por medio de igual composición, pero en el Material y Métodos 119 caso de las placas con células en las que se debía inducir el receptor 5-HT2A, se añadió doxiciclina a una concentración de 10 ng/ml. El día de la preparación de membranas, tras retirar el medio de cultivo de las placas y realizar un lavado de las mismas con PBS a 4 ºC, se procedió a su rascado celular con la misma solución salina. Seguidamente, la suspensión celular fue centrifugada a 800 x g a 4 ºC durante 15 minutos. A continuación, el pellet obtenido fue resuspendido en PBS y centrifugado en las mismas condiciones. Después de haber retirado el sobrenadante, el pellet se resuspendió en buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.4 y se rompieron las células en el polytrón PT 10-35 GT a 30,000 rpm, en hielo. Posteriormente, el homogenado se centrifugó a 48,000 x g durante 40 minutos a 4ºC, siendo resuspendido el pellet en el mismo buffer y obtenida finalmente la preparación de membranas. Por último, se determinó la concentración de proteínas de la misma por triplicado empleando el método de Bradford (Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad)). La absorbancia de la reacción colorimétrica se estableció a 595 nm, haciendo uso de una curva patrón de albúmina sérica bovina (BSA), en un espectofotómetro Ultrospec 4000 UV/Visible Spectrophotometer (Pharmacia Biotech). B) LINEALIDAD DE PROTEÍNA Los ensayos de linealidad de proteína se basan en la utilización de diferentes concentraciones de proteína para poder seleccionar la cantidad óptima de la misma a utilizar en experimentos consecutivos, en base al ratio más adecuado ventana / concentración de proteína. Para conocer la especificidad del radioligando por el receptor objeto de estudio, se utiliza un compuesto muy selectivo de dicho receptor, que compite con la molécula marcada radiactivamente por la unión al mismo, definiendo así la unión específica (SB). La señal radiactiva que permanece tras el desplazamiento del radioligando por el compuesto específico determina la unión no específica (NSB). SB (Specific Binding) = TB (Total Binding) – NSB (NonSpecific Binding) Material y Métodos 120 La concentración de radioligando que se utiliza en los ensayos de linealidad de proteína es equivalente al valor de la constante de disociación (KD) obtenida de la bibliografía científica (IUPHAR database). 1. LINEALIDAD DE PROTEÍNA DEL RECEPTOR DE DOPAMINA D2 El primer paso en la optimización de los ensayos de unión de radioligando ha sido determinar la concentración de membrana a utilizar en posteriores experimentos. Así, se incubaron dos tipos de membranas (aquellas que expresan exclusivamente el receptor D2 y las que expresan adicionalmente el receptor 5-HT2A) en diferentes cantidades (10, 20, 40 y 80 μg/pocillo). Se utilizó como radioligando 3H-Espiperona (73 Ci/mmol, Perkin-Elmer, Massachusetts, USA) a una concentración de 0.2 nM, correspondiéndose ésta al valor de la constante de disociación (KD) obtenida de la literatura científica (IUPHAR database). La determinación de la inespecificidad se llevó a cabo en presencia de sulpirida 10 μM. Los ensayos se realizaron por triplicado en una placa de polipropileno de 96 pocillos con un volumen final de 250 µl, habiéndose utilizado como tampón de incubación una solución compuesta por 50 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2 y 1 mM EDTA pH 7.4 (Tabla 4). Tras un tiempo de incubación de 2 horas a 25 ºC y 1200 rpm, se traspasaron 200 µl de la placa de incubación a una placa MultiscreenHTS con filtros GF/C (Merck Millipore, Billerica, USA) pretratada con polietilenimina al 0.5% y 15 minutos antes del filtrado con tampón de incubación (250 µl/pocillo). Tras filtrar el contenido del ensayo, se realizaron 4 lavados de 250 µl/punto con tampón de filtración (50 mM Tris-HCl; 0.9% NaCl; pH 7.4). Los filtros se secaron en una estufa durante 1 hora a 60ºC y fueron tratados con 30 µl de líquido de centelleo Universol (MP Biomedicals, Santa Ana, USA) para poder ser así cuantificada la radiactividad de las reacciones en un contador Microbeta Trilux (Perkin-Elmer). Material y Métodos 121 Tabla 4. Tabla resumen del ensayo de linealidad de proteína del receptor dopamina D2 en membranas obtenidas de células previamente tratadas y no tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. 2. LINEALIDAD DE PROTEÍNA DEL RECEPTOR 5-HT2A Con el objetivo de determinar la concentración óptima de membrana que expresa el receptor de serotonina 5-HT2A a utilizar en ensayos de binding consecutivos, se incubaron diferentes cantidades de la misma (10, 20, 40 y 80 μg/pocillo) en una placa de polipropileno de 96 pocillos y en un tampón de incubación 50 mM Tris-HCl pH 7.5. Como radioligando, se empleó [3H]-ketanserina (50.3 Ci/mmol, Perkin-Elmer, Massachusetts, USA) a una concentración 1 nM correspondiente al valor de la constante de disociación (KD) de dicho radioligando por el receptor 5-HT2A registrado en bases de datos científicas (IUPHAR database). Las reacciones se realizaron por triplicado, con un volumen final de 250 µl, siendo la unión no específica determinada en presencia de metisergida 1 µM (Tabla 5). Las mismas fueron incubadas durante 30 minutos, a una temperatura de 37 ºC y agitación de 1200 rpm, tiempo tras el cual se traspasó y filtró un volumen de 200 µl en una placa MultiscreenHTS con filtros GF/B (Merck Millipore, Billerica, USA) pretratada con polietilenimina al 0.5% y con tampón de incubación 15 minutos antes del filtrado (250 µl/pocillo). Seguidamente, se realizaron 6 lavados de 250 µl/pocillo con tampón de filtración (50 mM Tris-HCl; pH 6.6). Tras el secado de los filtros en una estufa durante hora y media a una temperatura de 60ºC, se añadió 30 µl/pocillo de líquido de centelleo Universol (MP Biomedicals, Santa Ana, USA). Finalmente, se procedió al contaje de la radiactividad de las reacciones en un contador Microbeta Trilux (Perkin-Elmer). Tampón Incubación Sulpirida (10 µM) [3H]-Espiperona (0.2 nM) Membranas Unión Total (TB) 125 µl - 25 µl 100 µl Unión No Específica (NSB) 100 µl 25 µl 25 µl 100 µl Material y Métodos 128 ENSAYOS DE UNIÓN DE RADIOLIGANDOS EN CÉLULAS 24 horas antes del día del ensayo, se llevó a cabo la siembra de células HEK293 sin tratar con doxiciclina en medio de cultivo a diferentes densidades (25000, 50000, 100000 y 200000 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos estándar transparente y estéril. Tras finalizar la siembra de células, éstas se mantuvieron en un incubador en condiciones de 37 ºC, 5% de CO2 y 95% de humedad relativa. En el día del ensayo, primeramente se volteó la placa con el fin de retirar el medio de cultivo. Como buffer de ensayo, se empleó medio de cultivo comercial libre, es decir, sin suplementar con FBS dializado ni antibióticos, siendo el volumen final de las soluciones en placa 200 µl/pocillo. Se añadió el radioligando [3H]-SB269970 (45.8 Ci/mmol, Perkin-Elmer, Massachusetts, USA) a una concentración de 2 nM, correspondiéndose ésta al valor de la constante de disociación (KD) obtenida de la literatura científica (IUPHAR database). La inespecificidad se determinó mediante SB-269970 1 µM. Seguidamente, las células se incubaron durante 60 minutos a una temperatura de 37ºC. Pasado el tiempo de incubación, se lavó la placa 3 veces con NaCl 0.9% frío y a continuación se llevó a cabo la lisis celular, para lo cual se probaron dos productos de igual efectividad: etanol absoluto frío y tritón (100 µl/pocillo). 20 minutos después, se recogió una alícuota de 20 µl/pocillo de la placa y se pasó a una flexiplate, en la que seguidamente se añadieron 100 µl/pocillo de Optiphase. Finalmente, se puso la placa a agitar y se realizó el contaje de radiactividad en el contador de placa Microbeta Trilux (Perkin Elmer). V. ENSAYOS FUNCIONALES Estos ensayos tienen el objetivo de estudiar la funcionalidad de los receptores, esto es, evaluar las principales vías de señalización que activan los mismos. En la presente tesis doctoral, se realizó un estudio de la funcionalidad de los receptores de dopamina D2 constitutivo y de serotonina 5-HT2A inducible por Material y Métodos 129 doxiciclina, dependientes de las proteínas Gi/o y Gq, respectivamente. Adicionalmente, se evaluó la influencia de la heterodimerización D2−5-HT2A en la farmacología de agonistas y antagonistas (antipsicóticos típicos y atípicos). A) ENSAYOS FUNCIONALES DE MEDIDA DE AMPc En este trabajo, los ensayos funcionales de medida de AMPc han tenido la finalidad de estudiar las vías de señalización dependientes de las proteínas Gi y/o Gs, que inhiben y estimulan la adenilato ciclasa respectivamente, reduciendo o aumentando los niveles de este segundo mensajero. 1. CARACTERIZACIÓN DEL RECEPTOR CONSTITUTIVO D2 El receptor de dopamina D2 está acoplado a la proteína Gi/o, de tal manera que su activación implica la inhibición de la adenilato ciclasa y en definitiva una reducción de los niveles de AMPc. La caracterización funcional del receptor de dopamina D2 exige la medida del segundo mensajero al cual está asociado, es decir, la medición de los niveles de AMPc, que en este trabajo, se llevó a cabo haciendo uso del kit AMPc Cisbio (Bioassays, Codolet, France), basado en la tecnología HTRF (Homogenous Time-Resolved Fluorescence) y siguiendo las indicaciones especificadas por el protocolo asociado. 24 horas antes del ensayo, se realizó una siembra de células HEK293 tratadas y/o no tratadas con doxiciclina, a una densidad de 30000 células/pocillo en medio OptiMEM (Invitrogen, Life Technologies S.A.) en una placa de 96 pocillos half-area (Sigma Aldritch) pretratada con poli-D-lisina (Sigma Aldritch). Tras la siembra, las células se mantuvieron en un incubador hasta el día siguiente (37 ºC, 5% de CO2 y 95% de humedad relativa). En el día del ensayo, primeramente las células fueron incubadas durante 5 minutos a 37 ºC en el buffer de ensayo de AMPc: Opti-MEM en el que previamente se disolvió mediante sonicación de 30 minutos 3-isobutil-1-metilxantina 500 µM (IBMX) (Sigma Aldritch), un inhibidor de fosfodiesterasas (PDEs) que previene la degradación de Material y Métodos 130 AMPc. Debido a que el receptor de dopamina D2 inhibe la enzima adenilato ciclasa, fue necesario el tratamiento de las células con forskolina (FSK) a una concentración 1 µM para incrementar los niveles de AMPc en el citosol y así poder contabilizar este segundo mensajero tras la activación o bloqueo del receptor. Los niveles basales de AMPc fueron evaluados en ausencia de FSK. Seguidamente, se incubaron las células a 37 ºC con los compuestos a evaluar:  Curvas de antagonistas (antipsicóticos típicos y atípicos): concentraciones gradualmente crecientes de antagonistas a los que se expusieron las células durante 5 minutos, tiempo tras el cual se añadió el agonista competidor durante 20 minutos.  Curvas de agonistas (dopamina y quinpirol): concentraciones gradualmente mayores de agonistas, con un tiempo de incubación de 20 minutos. Consecutivamente, las células fueron incubadas durante 60 minutos con los fluoróforos d2 (ligado a AMPc comercial) y Cryptate (marcado con anti-AMPc) disueltos en el buffer lisis del kit, a una concentración 1/20 del stock almacenado en un congelador a -80 ºC. Finalmente, se midió el ratio de intensidad de emisión fluorescente 665/662 nm de longitud de onda en el lector de microplacas Ultra Evolution (TECAN, Männedorf, Switzerland). Este método consiste en un inmunoensayo competitivo entre el AMPc nativo producido por las células y el AMPc ligado al fluoróforo d2 por la unión al anti-AMPc unido a Crypate (Figura 21). Cuando los niveles de AMPc intracelulares son elevados, la mayor parte de AMPc que se une al Cryptate no está ligado a d2, de tal manera que la señal de fluorescencia es baja. Por el contrario, cuando hay poca cantidad de AMPc en el interior celular, la mayor parte del AMPc que se une al anti-AMPc del Cryptate está marcado con d2, produciéndose FRET entre d2 y Cryptate, y detectándose por tanto una elevada señal de fluorescencia. En definitiva, la señal específica o señal de transferencia entre d2 y Cryptate es inversamente proporcional a la concentración de AMPc en el citoplasma de las células. Material y Métodos 131 Figura 21. Representación esquemática del proceso de FRET entre los reactivos d2 y Cryptate (http://www.cisbio.com/usa/drug-discovery/product-insert-camp-dynamic-2-kit-20000-tests) 2. CARACTERIZACIÓN DEL RECEPTOR ENDÓGENO 5-HT7 En la caracterización funcional de los receptores de dopamina D2 y de serotonina 5-HT2A que es potencialmente capaz de expresar la línea de trabajo HEK293, se encontró una interferencia en los ensayos funcionales de medición de AMPc. Tras la detección de curvas dosis-respuesta de 5-HT y clozapina en ausencia de forskolina, se dedujo que dicha interferencia consistía en la presencia de un receptor endógeno de serotonina acoplado a proteína Gs (5-HT4R, 5-HT6R o 5-HT7R). Se realizaron ensayos de AMPc con ligandos selectivos para los tres receptores de serotonina acoplados a proteína Gs (SB-203186, SB-271046A y SB-269970, respectivamente), que Material y Métodos 132 permitieron confirmar la expresión en la membrana plasmática de un receptor endógeno adicional, el receptor 5-HT7. Análisis de datos Los niveles de AMPc se calcularon a partir de la relación de fluorescencia 665/620 nm, expresada como ratio de las distintas muestras y el control negativo (blanco del ensayo): Ratio = A665 nm B620 nm x 104 , Delta F = Ratio - Rationeg Rationeg x 100 , Una vez obtenida la curva estándar del ensayo tras haber representado los valores de Delta F frente a concentraciones gradualmente mayores de AMPc, se llevó a cabo la extrapolación de los valores de Delta F de las distintas muestras en la curva de calibración, pudiendo así haberse obtenido los niveles de AMPc de las mismas. B) ENSAYOS FUNCIONALES DE MEDIDA DE IPs DEL RECEPTOR 5-HT2A Como se desarrolla en la introducción de la tesis doctoral, el receptor de serotonina 5-HT2A está acoplado principalmente a la proteína Gq, de modo que la activación de ésta supone la estimulación de la PLC que cataliza la reacción de escisión del fosfolípico PIP2, ubicado en la cara interna de la membrana plasmática, en DAG e IP3. Este último difunde hacia el citosol y activa los canales de calcio del retículo endoplasmático, produciendo un aumento de los niveles de Ca+2 en el interior celular y en última estancia la estimulación de la calmodulina y otras proteínas citosólicas. El DAG, debido a su carácter hidrofóbico, queda retenido en la membrana plasmática, donde actúa como un activador fisiológico de la PKC. Material y Métodos 133 En este trabajo, se ha realizado la caracterización funcional del receptor de serotonina 5-HT2A mediante la medición de los niveles de IPs tras su activación por los agonistas 5-HT, DOI, LSD o lisurida o bloqueo por los antipsicóticos atípicos clozapina, risperidona y aripiprazol. En primer lugar, se realizó una siembra de células HEK293 tratadas y no tratadas con doxiciclina (control), a una densidad de 65000 células/pocillo en medio de cultivo en una placa estándar de 96 pocillos transparente estéril. Seguidamente, las células se mantuvieron en un incubador a 37ºC, 5% de CO2 y 95% de humedad relativa. Al día siguiente, se aspiró el medio de cultivo de la placa y se reemplazó por medio de cultivo libre con 10 µCi/mL [3H]myo-inositol (15-20 Ci/mmol, Perkin Elmer) durante 24 horas. En el día del ensayo, se llevó a cabo un lavado de las células a 37 ºC con HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution; Sigma Aldritch) suplementado con HEPES 20 mM, LiCl 20 mM y BSA (Bovine Serum Albumine; Sigma Aldritch) libre de ácidos grasos al 2% con un pH de 7.55, con el fin de retirar el [3H]myo-inositol que no fue incorporado en el ciclo de los inositoles fosfatos. Mientras el HEPES es requerido como regulador del pH en el buffer de ensayo, el LiCl es necesario en el bloqueo del ciclo de los inositoles fosfatos que permite la acumulación y posterior contaje de IP3 e IP4 marcados radiactivamente. Adicionalmente, también se añadió BSA libre de ácidos grasos al 2% con el objetivo de no modificar las condiciones iniciales del ensayo, puesto que en un principio también se estudiaba la vía de señalización acoplada a la proteína Gα11 asociada a la fosfolipasa A (PLA). En este caso, se aprovecha la capacidad de la BSA libre de ácidos grasos para arrastrar al exterior celular el ácido araquidónico (AA) liberado en el citosol tras la acción de la PLA, el cual atraviesa la membrana plasmática por ósmosis. Después del lavado, las células fueron incubadas a 37 ºC durante 20 minutos con los compuestos a ensayar, concentraciones gradualmente crecientes de agonistas o antagonistas (en el caso de estos últimos, fue necesario la adición de un agonista competidor), a excepción de aquellas que actúan como controles para estudiar la concentración basal de IPs. Seguidamente, se retiraron los compuestos diluidos en el buffer experimental, tras lo cual las células fueron tratadas con ácido fórmico 100 mM Material y Métodos 134 durante 30 ºC a 4 ºC, con el fin de generar su lisis y desprotonar o acidificar los grupos fosfatos de los IP3 e IP4. A continuación, se transfirió una alícuota de 20 µl/pocillo de la placa de ensayo a una placa flexiplate, en la que consecutivamente se añadieron 80 µl/pocillo de una dilución 1:16 de RNA binding YSi SPA beads (Sigma Aldritch), que al estar cargadas positivamente atraen los fosfatos de 3H-IP3 e 3H-IP4 cargados negativamente, cuya radiactividad causa la excitación del líquido de centelleo contenido en el interior de las mismas. La radiactividad y en definitiva los niveles de 3H-IPs fueron cuantificados haciendo uso del contador Microbeta Trilux (Perkin Elmer). Análisis de datos Se construyeron curvas concentración-respuesta de los distintos compuestos y se utilizó el programa GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software Inc.) para analizar los datos, seleccionando en el mismo el mejor ajuste de regresión no lineal. La medida de la potencia se realizó en base a la siguiente ecuación: E = Ebasal + Emax-Ebasal 1+10 log EC50 - x , En estos experimentos, los datos se normalizaron y se consideró el 100% la respuesta Emax obtenida de diferentes valores en función del tipo de ensayo funcional y del ligando:  Ensayos de AMPc: Receptor de dopamina D2  Curvas dosis-respuesta de agonistas: se consideró el 100% el valor de AMPc correspondiente a FSK 1 µM y el 0% los niveles basales de AMPc.  Curvas dosis-respuesta de antagonistas: se fijó el 100% en el valor de AMPc correspondiente a FSK 1 µM y el 0% los niveles de AMPc obtenidos por la exposición al agonista endógeno competititivo dopamina 1 µM. Material y Métodos 135 Receptor de serotonina 5-HT7  Curva dosis-respuesta de agonistas: se determinó que el 100% era el valor de AMPc correspondiente a 5-HT 100 µM y el 0% la concentración basal de AMPc.  Curva dosis-respuesta de antagonistas: se estableció que el 100% era el valor de AMPc obtenido de 5-HT 1 µM y el 0% los niveles basales de AMPc.  Ensayos de IPs: Receptor de serotonina 5-HT2A  Curva dosis-respuesta de agonistas: se consideró el 100% el valor de IPs correspondiente a 5-HT 100 µM y el 0% la concentración basal de IPs.  Curva dosis-respuesta de antagonistas: se fijó el 100% en el valor de IPs obtenido de 5-HT 1 µM y el 0% los niveles basales de IPs. VI. MÉTODO MULTIPLEX FUNCIONAL DE MEDIDA SIMULTÁNEA DUAL DE AMPc E IPs En este trabajo, se ha desarrollado una técnica de medición simultánea de las principales vías de señalización de los receptores de dopamina D2 constitutivo y de serotonina 5-HT2A inducible por doxiciclina asociadas a AMPc dependiente de proteína Gi/o e IPs dependiente de proteína Gq, respectivamente. Así, se ha conseguido integrar en una única técnica dos tipos ensayos funcionales diferentes, de tal manera que además de economizar recursos y tiempo, se han podido homogenizar las condiciones para dos experimentos distintos en cuanto a material y pase de la línea celular se refiere. Adicionalmente, esta técnica dual de medida de AMPc e IPs ha permitido corroborar el bloqueo del receptor de serotonina 5-HT7 en los ensayos funcionales de estudio del receptor 5-HT2A activado por serotonina y antagonizado por clozapina, risperidona y aripiprazol, al ratificar paralelamente ausencia de señal de AMPc tras el tratamiento con SB-269970. Material y Métodos 136 48 horas antes del ensayo, se realizó la siembra de células HEK293 tratadas y/o no tratadas con doxiciclina en medio de cultivo en una placa de 96 pocillos estéril transparente con una densidad de 65.000 células/pocillo. A continuación, las células se mantuvieron en un incubador a 37 ºC, 5% CO2 y 95% de humedad relativa, hasta el día siguiente. 24 horas antes del ensayo, se reemplazó el medio de cultivo de la placa sembrada de 96 pocillos por medio libre con 10 µCi/mL [3H]myo-inositol (15-20 Ci/mmol, Perkin Elmer), al cual fueron expuestas las células hasta el día siguiente (24 horas). En el día del ensayo, se realizó un lavado de las células a 37ºC con el buffer empleado en el método estándar de medición de IPs (HBSS, HEPES 20 mM, LiCl mM y BSA 2%; pH 7.55), pudiendo así eliminar todos los IPs marcados radiactivamente que no fuesen incorporados en el ciclo de los inositoles fosfato. A continuación, las células fueron incubadas con los distintos compuestos durante 20 minutos y a 37 ºC, tiempo tras el cual se retiró el medio en el que estaban disueltos los fármacos y se añadió un buffer que provocase la lisis celular. Primeramente, se probó ácido fórmico 100 mM para lisar las células. No obstante, tras comprobar ausencia de señal de AMPc, se dedujo que el ácido fórmico generaba su destrucción y descartamos su empleo en el método multiplex. Así, se decidió utilizar como medio de lisado de las células el buffer lisis incorporado en el kit de AMPc CISBIO, que definitivamente fue útil, ya que permitía no solo medir AMPc, sino también IPs, sin provocar la degradación o alterar los niveles de este último. Por tanto, tras retirar el medio con los compuestos, se añadió 100 µl/pocillo de buffer lisis y se incubó la placa a temperatura ambiente durante 60 minutos. Seguidamente, se trasvasó una alícuota de 50 µl/pocillos de la placa de ensayo a una placa half área, a la que finalmente se le añadieron los trazadores d2 y Cryptate disueltos en buffer lisis, pudiendo realizarse la lectura del ratio de intensidad de emisión fluorescente 665/662 nm tras una hora de incubación. Por otro lado, a los 50 µl/pocillo restantes de la placa de ensayo se les añadió ácido fórmico 133 mM, con el fin de reducir el pH del medio, consiguiendo así que los grupos fosfato de los IPs quedasen cargados negativamente. Por último, se transfirió una alícuota de 20 µl a una placa flexiplate, a la cual se añadieron seguidamente 80 µl de RNA SPA beads 1:16 por pocillo, cuya carga positiva provocaba la unión de IPs Material y Métodos 137 cargados negativamente por la acción del ácido fórmico. La excitación del líquido de centelleo albergado en el interior de las SPA beads por efecto de la radiación de los 3H-IPs permitió el contaje de estos últimos en el contador Microbeta Trilux (Perkin Elmer). VII. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos obtenidos de los ensayos de unión de radioligando, así como de los experimentos funcionales, fueron expresados como la media ± eem. El análisis estadístico se realizó mediante el programa informático IBM SPSS Statistics Versión 23 (SPSS software Inc., Chicago, USA). Las comparaciones entre la afinidad, potencia o eficiencia de 5-HT para activar el receptor de serotonina inducible 5-HT2A ante distintas concentraciones y tiempos de exposición de las células al antibiótico inductor doxiciclina, se realizaron aplicando el test estadístico ANOVA de un factor. Adicionalmente, también se recurrió al test ANOVA de un factor para realizar una comparativa entre la afinidad de la dopamina y el haloperidol por el receptor de dopamina D2 en presencia de diferentes concentraciones del agonista alucinógeno del receptor 5-HT2A DOI. En todos los casos, se fijó un nivel de significación de p<0.05. Sin embargo, en el estudio de la co-expresión de los receptores de dopamina D2 y de serotonina 5-HT2A y en la evaluación de la influencia de la heterodimerización D2−5-HT2A en la señalización de ambos receptores activados por sus respectivos agonistas o antagonizados por antipsicóticos típicos y atípicos, se empleó el test estadístico t de Student, ya que éste es el adecuado para comparar únicamente dos grupos de muestras. En general, se fijó un nivel de significación de p<0.05, de modo que cuando se estableció un nivel de significación distinto, se hizo constar en el texto. Resultados 144 II) EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE LOS RECEPTORES D2 CONSTITUTIVO Y 5-HT2A INDUCIBLE POR DOXICICLINA, EN LA LÍNEA DE TRABAJO HEK293 Con el objetivo de confirmar la expresión de los receptores D2 y 5-HT2A en membranas obtenidas de células tratadas y sin tratar con doxiciclina (10 ng/ml durante 24 horas), se realizaron experimentos de unión de radioligandos que incluyen linealidades de proteína, ensayos de saturación y de competición. 1. Los ensayos de binding demostraron la expresión del receptor constitutivo D2. La caracterización del receptor de dopamina D2 se ha realizado mediante estudios de binding (linealidad de proteína, saturación y competición de compuestos de referencia), con el fin de establecer la presencia del mismo en membranas obtenidas de células tratadas y sin tratar con doxiciclina. Para ello, se ha utilizado el radioligando [3H]-espiperona, que tiene una elevada afinidad por los receptores de dopamina. Ensayos de linealidad de proteína Se observó un incremento lineal de la señal específica de [3H]-espiperona a mayores concentraciones de proteína. Así, 10 µg de membrana por punto permitieron obtener una ventana de trabajo adecuada en los ensayos de unión de radioligandos en ausencia y presencia del receptor 5-HT2A (Figura 24). Figura 24. Linealidad de proteína para el receptor de dopamina D2 en membranas obtenidas de células sin tratar (A) y tratadas (B) con doxiciclina. A B 020 40 60 80 100 0 500 1000 1500 2000 g proteína / punto cpm 020 40 60 80 100 0 500 1000 1500 2000 TB NSB g proteína / punto cpm Resultados 145 Ensayos de saturación Los ensayos de saturación se realizaron con el objetivo de conocer el nivel de expresión del receptor de dopamina D2, así como la afinidad de [3H]-espiperona por el mismo, pudiendo establecer la cantidad óptima de radioligando a utilizar en experimentos posteriores. De esta manera, se observó que el valor de KD de [3H]- espiperona por el receptor D2 en membranas obtenidas de la línea celular HEK293 empleada en el presente trabajo (Figura 25, Tabla 10) fue cercano al obtenido en la bibliografía científica (0.06 nM (Bunzow y cols., 1988; Hoare y cols., 2000; Zhen y cols., 2010)). Asimismo, se determinó que la concentración de [3H]-espiperona conveniente a utilizar en los ensayos consecutivos de competición fue 0.2 nM, esto es, una cantidad de radioligando aproximada a la constante de disociación en el equilibrio (KD). Por otro lado, los ensayos de saturación determinaron que la coexpresión del receptor de serotonina 5-HT2A no afectó a los parámetros de unión (Bmax y KD) del radioligando [3H]-espiperona al receptor D2, pues no hubo diferencias entre ellos cuando se compararon los resultados en membranas obtenidas de células tratadas y sin tratar con doxiciclina. Figura 25. Ensayos de saturación del receptor de dopamina D2 por el radioligando [3H]-espiperona en membranas obtenidas de células sin tratar (A) y tratadas (B) con doxiciclina. Se muestra la representación gráfica de un ensayo realizado con puntos por triplicado. A B 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0 1000 2000 3000 4000 5000 [3H]-Espiperona (nM) fmol / mg proteína 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0 1000 2000 3000 4000 5000 TB NSB SB [3H]-Espiperona (nM) fmol / mg proteína Resultados 146 Tabla 10. Parámetros de unión (Bmax y KD) de [3H]-espiperona al receptor de dopamina D2, en membranas obtenidas de células sin tratar y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. Se muestran los resultados sustraídos de un experimento realizado con puntos por triplicado. . Ensayos de competición En los ensayos de competición, se observó que los compuestos de referencia utilizados (el agonista dopamina, y los antipsicóticos típico haloperidol y atípico risperidona) mostraron una afinidad por el receptor de dopamina D2 determinada por el valor Ki (Figura 26, Tabla 11) similar a la registrada en otras líneas celulares (dopamina: 63.1-31622 nM (Sautel y cols., 1995; Burris y cols., 1995); haloperidol: 1.6-39.8 nM (Freedman y cols., 1994; Mierau y cols., 1995); risperidona: 0.3-6.4 nM (Seeman y cols., 1997; Fernández y cols., 2005)). Por otro lado, se estableció que la presencia del receptor de serotonina 5-HT2A no afectó a la afinidad de los compuestos por el receptor de dopamina D2, de tal manera que no hubo diferencias significativas en sus valores de Ki en función de la coexpresión del receptor 5-HT2A. -DOX +DOX Bmax (fmol/mg proteína) 3928 3486 KD (nM) 0.22 0.18 A Resultados 147 Figura 26. Curvas de competición del agonista dopamina y los antipsicóticos haloperidol y risperidona con el radioligando [3H]-espiperona por la unión al receptor de dopamina D2, en membranas obtenidas de células sin tratar (A) y tratadas (B) con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. Se muestra un experimento representativo de un total de tres ensayos independientes (n=3) realizado con puntos por duplicado. -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -25 0 25 50 75 100 125 Log [Haloperidol] % Unión Específica -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -25 0 25 50 75 100 125 Log [Haloperidol] % Unión Específica -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -25 0 25 50 75 100 125 Log [Risperidona] % Unión Específica B -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 -25 0 25 50 75 100 125 Log [Dopamina] % Unión Específica -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 -25 0 25 50 75 100 125 Log [Dopamina] % Unión Específica A -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 125 Log [Risperidona] % Unión Específica Resultados 148 Tabla 11. Parámetros de afinidad (Ki) por el receptor de dopamina D2 de diferentes compuestos estándares (dopamina, haloperidol y risperidona), en membranas obtenidas de células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. Se muestra la media ± eem de un total de tres (n=3) experimentos independientes realizados con puntos por duplicado. 2. Los ensayos de unión de radioligandos confirmaron la expresión del receptor 5-HT2A en membranas obtenidas de células HEK293 previamente expuestas a doxiciclina. Con la finalidad de estudiar la expresión del receptor de serotonina 5-HT2A y determinar su presencia exclusivamente en membranas obtenidas de células HEK293 previamente tratadas con doxiciclina, se han realizado ensayos de binding (linealidad de proteína, saturación y competición de compuestos estándares), en los que se ha utilizado como radioligando [3H]-ketanserina, siendo el compuesto unido al tritio un antagonista altamente selectivo por el receptor 5-HT2A. Ensayos de linealidad de proteína Se observó un aumento lineal de la unión específica del radioligando [3H]- ketanserina al receptor de serotonina 5-HT2A a mayores concentraciones de proteína, habiéndose establecido que la cantidad de proteína a la cual se obtiene una ventana de trabajo adecuada fue 80 µg de membrana por punto (Figura 27). Por otro lado, también se determinó la ausencia de expresión del receptor de serotonina 5-HT2A en membranas obtenidas de células no tratadas previamente con doxiciclina. -DOX +DOX COMPUESTOS Ki (nM) pKi Ki (nM) pKi Dopamina 22940 ± 6215 4.6 ± 0.1 28840 ± 3720 4.5 ± 0.1 Haloperidol 7.5 ± 2.5 8.1 ± 0.1 4.0 ± 0.0 8.4 ± 0.0 Risperidona 15.2 ± 6.1 7.8 ± 0.2 20.2 ± 2.8 7.7 ± 0.1 Resultados 149 Figura 27. Linealidad de proteína para el receptor de serotonina 5-HT2A, en membranas obtenidas de células tratadas (A) y sin tratar (B) con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. Ensayos de saturación Los ensayos de saturación se llevaron a cabo con el propósito de conocer el nivel de expresión del receptor de serotonina 5-HT2A y la afinidad de [3H]-ketanserina por el mismo, lo que permitió determinar la cantidad de radioligando a utilizar en ensayos posteriores. Así, se observó que el nivel de expresión del receptor 5-HT2A fue menor que el del receptor D2, ya que la unión máxima (Bmax) de [3H]-ketanserina al primero (Figura 28, Tabla 12) fue inferior a la de [3H]-espiperona al receptor D2. Por otro lado, se estableció que la cantidad de [3H]-ketanserina a utilizar en experimentos de competición posteriores fue 0.3 nM, es decir, su valor de KD por la unión al receptor 5HT2A. Por otro lado, se observó que la coexpresión del receptor de dopamina D2 no moduló la afinidad del radioligando [3H]-ketanserina por el receptor 5-HT2A en la línea HEK293 empleada en el presente trabajo, mostrando un valor de KD similar al definido en otras líneas celulares donde el receptor 5-HT2A se expresa solo (0.2-2.9 nM (Rashid y cols., 2003; Knight y cols., 2004)). 020 40 60 80 100 0 500 1000 1500 2000 g proteína / punto cpm 020 40 60 80 100 0 500 1000 1500 2000 TB NSB g proteína / punto cpm A B Resultados 150 Figura 28. Ensayo de saturación del receptor de serotonina 5-HT2A por el radioligando [3H]- ketanserina, en membranas obtenidas de células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. Se muestra la representación gráfica de un ensayo realizado con puntos por triplicado. Tabla 12. Parámetros de unión (Bmax y KD) de [3H]-ketanserina al receptor de serotonina 5-HT2A, en membranas obtenidas de células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. Se muestran los resultados sustraídos de un experimento realizado con puntos por triplicado. Ensayos de competición En base a los resultados obtenidos de los ensayos de competición realizados en membranas procedentes de células HEK293 previamente tratadas con doxiciclina, se determinó que los distintos compuestos de referencia empleados (el agonista 5-HT y los antipsicóticos típico haloperidol y atípico risperidona) mostraron unos valores de Ki (Figura 29, Tabla 13) consistentes con la bibliografía existente (5-HT: 7-42 nM (Ki alta) – 2622-200000 (Ki baja) (Roth y cols., 1987; Roth y cols., 1997); haloperidol: 25130 nM (Seeman y cols., 1997; Campiani y cols., 2004); risperidona: 0.1-0.5 nM (Seeman y cols., 1997; Davies y cols., 2004)). Por otro lado, se observó que la presencia del receptor de dopamina D2 no alteró la afinidad de dichos compuestos por el receptor de serotonina 5-HT2A, pues sus valores de Ki no difirieron de los establecidos en líneas donde el receptor 5-HT2A se expresa solo (indicados en el párrafo anterior). +DOX Bmax (fmol/mg proteína) 429.8 KD (nM) 0.3 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 0 250 500 750 1000 1250 1500 TB NSB SB [3H]-Ketanserina (nM) fmol / mg proteína Resultados 151 Figura 29. Curvas de competición del agonista 5-HT y los antipsicóticos haloperidol y risperidona con el radioligando [3H]-ketanserina por la unión al receptor de serotonina 5-HT2A, en membranas obtenidas de células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. Se muestra un experimento representativo de un total de tres ensayos independientes (n=1-3) realizado con puntos por duplicado. Tabla 13. Parámetros de afinidad (Ki) por el receptor de serotonina 5-HT2A de diferentes compuestos estándares (5-HT, haloperidol y risperidona), en membranas obtenidas de células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas. Se muestra la media ± eem de un total de tres (n=3) experimentos independientes realizados con puntos por duplicado. +DOX COMPUESTOS Ki alta(nM) Ki baja(nM) pKi alta pKi baja 5-HT 55.8 622.0 7.2 6.2 Ki (nM) pKi Haloperidol 97.1 ± 26.0 7.0 ± 0.1 Risperidona 0.8 ± 0.4 9.1 ± 0.2 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -25 0 25 50 75 100 125 Log [Haloperidol] % Unión Específica -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -25 0 25 50 75 100 125 Log [Risperidona] % Unión Específica -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -25 0 25 50 75 100 125 Log [5-HT] % Unión Específica Resultados 152 Una vez confirmada la presencia del receptor de dopamina D2 y del receptor de serotonina 5-HT2A inducible por doxiciclina en la membrana celular, se ha procedido al estudio de la funcionalidad de ambos receptores, mediante la medida de segundos mensajeros regulados por sus principales vías de señalización asociadas (AMPc e IPs, respectivamente). 3. El receptor D2 constitutivo reguló los niveles de AMPc en el interior celular vía proteína Gi/o. Como se ha explicado con anterioridad en la introducción, el receptor de dopamina D2 está acoplado a la proteína Gi/o, que al ser activada inhibe a la AC, lo que deriva en una disminución de los niveles de AMPc (Beaulieu y Gainetdinov, 2011). Por ello, los estudios de funcionalidad del receptor D2 se han realizado mediante la medición del segundo mensajero AMPc utilizando como herramienta metodológica la técnica de HTRF y como compuestos de referencia para su activación o inhibición el agonista endógeno dopamina y los antagonistas antipsicóticos típico (haloperidol) y atípico (risperidona), respectivamente. En base a los resultados derivados de los ensayos funcionales de AMPc, se observó que la potencia (EC50 para dopamina; KB para haloperidol y risperidona) de los distintos compuestos de referencia para modular el receptor de dopamina D2 (Figura 30, Tabla 14) se correspondió con la registrada en otras líneas celulares (dopamina: 0.6-470 nM (Möller y cols., 2014; van Wieringen y cols., 2014); haloperidol: 0.2 nM (Masri y cols., 2008); risperidona: 1.08 nM (Masri y cols., 2008)). Adicionalmente, el análisis estadístico realizado por el test t de Student determinó que la coexpresión del receptor de serotonina 5-HT2A no modificó significativamente la potencia de dichos compuestos para activar o inhibir el receptor de dopamina D2. Resultados 153 Figura 30. Curvas concentración-respuesta del agonista dopamina y, en presencia de dopamina 1 µM, de los antagonistas antipsicóticos típico haloperidol y atípico risperidona, sobre la acumulación de AMPc estimulada por FSK en la vía de señalización dependiente de Gi/o del receptor de dopamina D2, en células sin tratar (A) y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas (B). Se muestra un experimento representativo de un total de tres (n=3) ensayos independientes realizados por puntos por triplicado. -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 125 Log [Dopamina] % Acumulación de AMPc estimulado por FSK (1 M) -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 125 Log [Dopamina] % Acumulación de AMPc estimulado por FSK (1 M) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100 125 Log [Haloperidol] % Acumulación de AMPc estimulado por FSK (1 M) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -25 0 25 50 75 100 125 150 Log [Haloperidol] % Acumulación de AMPc estimulado por FSK (1 M) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -25 0 25 50 75 100 125 Log [Risperidona] % Acumulación de AMPc estimulado por FSK (1 M) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -25 0 25 50 75 100 125 Log [Risperidona] % Acumulación de AMPc estimulado por FSK (1 M) A B Bibliografía 256 Gogos JA, Santha M, Takacs Z, Beck KD, Luine V, Lucas LR, Nadler J V, Karayiorgou M (1999) The gene encoding proline dehydrogenase modulates sensorimotor gating in mice. 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