Efecto de las ciclodextrinas sobre la cesión de fármacos en matrices de hidroxipropilmetilcelulosa

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica Efecto de las ciclodextrinas sobre la cesión de fármacos en matrices de hidroxipropilmetilcelulosa Beatriz Pose Vilarnovo Santiago de Compostela, 2005 ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN……………………………………………….1 1.-Las formas de liberación modificada.......................................3 1.1.-Justificación e importancia en la terapéutica actual......3 1.2.-Alternativas tecnológicas ..............................................4 2.-Los comprimidos matriciales...................................................6 2.1.-Ventajas y limitaciones de las matrices hidrofílicas.......7 2.2.-Los éteres de celulosa....................................................9 2.2.1.-La hidroxipropilmetilcelulosa..............................11 2.3.-Liberación de principios activos a partir de matrices hidrofílicas......................................................14 2.3.1.-El proceso de difusión..........................................18 2.3.2.-Factores que afectan a la liberación del fármaco a partir de matrices hidrofílicas.... 22 2.3.2.1.-Variables dependientes del proceso de elaboración.............................22 2.3.2.2.-Variables dependientes del fármaco y de los excipientes........................23 2.3.2.3.-Otras variables.............................................25 3.-Las ciclodextrinas.................................................................26 3.1.-Estructura de las ciclodextrinas ..................................26 3.2.-Propiedades de las ciclodextrinas ..............................31 3.3.-Complejos de inclusión con ciclodextrinas..................33 3.3.1.-Procedimientos de preparación ...........................37 3.3.2.-Caracterización ...................................................39 3.2.2.1.-Detección de la formación del complejo en disolución .................................39 3.2.2.2.-Detección de la formación del complejo en estado sólido ............................44 3.4.-Mejora de la eficiencia de la complejación..................46 3.4.1.-Modificación de la estructura de las ciclodextrinas ...............................................46 3.4.2.-Efecto de la ionización de fármacos ....................47 3.4.3.-Adición de ácidos carboxílicos.............................48 3.4.4.-Adición de polímeros hidrosolubles ....................49 3.4.5.-Combinación de métodos.....................................50 3.5.-Aplicaciones de las ciclodextrinas...............................50 4.-Utilización conjunta de ciclodextrinas y polímeros hidrofílicos en el desarrollo de formas de liberación modificada ........................................................55 II. BIBLIOGRAFÍA.........................................................................59 III. PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS...................................69 IV. CARACTERIZACIÓN DE LOS COMPLEJOS DE INCLUSIÓN DE DICLOFENACO SÓDICO Y SULFAMETIZOL CON - E HIDROXIPROPIL-- CICLODEXTRINAS……………………………………..75 1.- Interaction of diclofenac sodium with  - and hydroxypropyl-  -cyclodextrin in solution. S.T.P. Pharma Sci. 9: 231-236, 1999. .....................................................77 2.- Improvement of water solubility of sulfamethizole through its complexation with  - and hydroxypropyl-  -cyclodextrin. Characterization of the interaction in solution and in solid state.Eur. J. Pharm. Sci. 13: 325-331, 2001. ....................85 V. COMPORTAMIENTO DE LOS COMPLEJOS DE INCLUSIÓN DE DICLOFENACO SÓDICO Y SULFAMETIZOL CON - E HIDROXIPROPIL-- CICLODEXTRINAS EN PRESENCIA DEL POLÍMERO HIDROXIPROPILMETILCELULOSA: SISTEMAS MULTICOMPONENTE.....................………………………95 1.- Sulphamethizole-cyclodextrin-hydroxypropylmethyl cellulose multicomponent complexes.J. Therm. Anal. Cal. 68: 657-667, 2002. ..........................................................97 2.- Effect of hydroxypropylmethylcellulose on the complexation of diclofenac with cyclodextrins. J. Therm. Anal. Cal. 73: 661-670, 2003. ..............................................................111 VI. FORMULACIÓN DE DICLOFENACO SÓDICO Y DE SULFAMETIZOL CON - E HIDROXIPROPIL-- CICLODEXTRINAS EN COMPRIMIDOS MATRICIALES DE HPMC……………………………….123 1.- Modulating drug release with cyclodextrins in hydroxypropylmethylcellulose gels and tablets.J. Control. Release 94, 351-363, 2004. ............................................125 VII. CONCLUSIONES..............................................................139 1 I. INTRODUCCIÓN 2 3 1. LAS FORMAS DE LIBERACIÓN MODIFICADA 1.1. Justificación e importancia en la terapéutica actual Con frecuencia la efectividad de los fármacos que se administran en formas convencionales, es decir, aquéllas que simplemente actúan como soporte mecánico y ceden el principio activo de manera inmediata, se ve limitada por su capacidad para atravesar las barreras fisiológicas, por sus propiedades fisico-químicas o por su toxicidad. En muchos casos, el desarrollo de sistemas de liberación modificada permite solventar estas limitaciones y, en consecuencia, mejorar el efecto terapéutico (Bibby y col., 2000). Dentro de las formas de liberación modificada se suelen distinguir dos tipos: -Formas de liberación prolongada, que proporcionan un control de la velocidad de liberación. -Formas de liberación retardada, que modulan el momento en el que se inicia la liberación y el rango durante el que se prolonga. En general, con las formas de liberación modificada se consigue una menor fluctuación en los niveles plasmáticos de fármaco, y con ello, un efecto terapéutico continuo y prolongado, lo que conduce a un control más rápido de la enfermedad. Además, las pautas posológicas son más fáciles de seguir por el paciente, lo que resulta muy importante para mejorar el cumplimiento terapéutico en tratamientos crónicos. Además, la incidencia y la intensidad de efectos secundarios (siempre que no se produzca una liberación brusca de la dosis) es menor debido a que se administran cantidades más reducidas de principio activo durante el tratamiento y a que se reducen las oscilaciones en los niveles plasmáticos. Por tanto, uno de los objetivos primordiales de la Tecnología Farmacéutica actual es el desarrollo de formas de cesión modificada de 4 los fármacos, que optimicen la respuesta terapéutica y minimicen los efectos secundarios. 1.2. Alternativas tecnológicas Los dispositivos de los que se dispone en la actualidad para conseguir una cesión gradual del principio activo se pueden clasificar, desde el punto de vista de su estructura, en los grupos que se describen a continuación. 1.2.1. Formas monolíticas 1.2.1.1. Sistemas reservorio Están constituidos por una membrana polimérica que rodea un reservorio de fármaco, siendo el mecanismo principal de cesión del principio activo la difusión a través del polímero (Fig.-1). Los factores que influyen en la velocidad de cesión son el área y el espesor de la membrana, el coeficiente de difusión y el gradiente de concentración. Figura 1 .- Esquema de un sistema reservorio. 1.2.1.2. Sistemas matriciales El principio activo se encuentra disperso en una red polimérica. La cesión se produce por dos mecanismos simultáneos: la disolución del principio activo, su difusión a través de la matriz y, en el caso de las 5 matrices hidrofílicas, la erosión y desgaste de la capa de gel que se va formando con la hidratación del polímero. 1.2.1.3. Sistemas osmóticos El principio activo está rodeado por una membrana semipermeable dotada de un orificio a través del cual se produce el bombeo del fármaco al exterior, como consecuencia de la diferencia de presión osmótica. La velocidad de cesión se puede modular variando el espesor de la membrana o el tamaño del orificio. 1.2.2. Sistemas multiparticulares Se trata de partículas recubiertas o gránulos de disolución lentos que son posteriormente incluidos en cápsulas gelatinosas rígidas o en comprimidos. Las variables que regulan el proceso son la solubilidad y proporción de polímero y el espesor de la cubierta. 6 2. LOS COMPRIMIDOS MATRICIALES Se han llevado a cabo notables esfuerzos para diseñar y desarrollar formas de dosificación de liberación modificada con las que se pueda conseguir que la velocidad de liberación de fármaco se retrase y se ajuste a un perfil adecuado a las características de diferentes fármacos. Las formas monolíticas matriciales representan una aproximación interesante tanto por la simplicidad de su tecnología, como por lo reducido de su costo. Bajo la denominación de los comprimidos matriciales o tipo matriz se incluyen los siguientes sistemas: -Matrices inertes o plásticas, que no se degradan ni modifican tras la administración; la liberación del fármaco se produce por difusión del mismo a través del polímero. -Matrices hidrofílicas, el polímero al entrar en contacto con un medio líquido se hidrata formando una capa de gel; la liberación del fármaco se produce por difusión del principio activo a su través. -Matrices lipídicas, la matriz se biodegrada a la vez que se libera el fármaco; el mecanismo de liberación podría entenderse como una combinación del propio proceso de biodegradación y la difusión a través del polímero. Los comprimidos tipo matriz hidrofílica son sistemas en los que el control de la liberación de principio activo se consigue gracias a la barrera de gel que se forma, tras la hidratación del polímero, cuando se expone la forma sólida al medio acuoso. Con ello se persigue obtener un perfil de cesión modificada. El desarrollo de estos sistemas se ha visto facilitado por la existencia en el mercado de una gran cantidad de polímeros que cuentan con la aprobación de las autoridades sanitarias para su uso en formas 13 Cuando la HPMC (Fig.-2) entra en contacto con el agua, interacciones polímero-agua reemplazan las interacciones polímeropolímero. Las moléculas poliméricas adoptan una configuración más o menos extendida dependiendo de su grado de viscosidad, aumentando también su volumen hidrodinámico. Las HPMCs de alto grado de viscosidad están formadas por macromoléculas de gran tamaño y producen mucílagos de alta viscosidad (Wan y col., 1991). La hidratación de la HPMC se ve afectada de forma muy significativa por la temperatura (Lapidus y Lordi, 1968; Sarkar, 1979). A medida que la temperatura del gel se incrementa, el polímero pierde su agua de hidratación, lo que ocasiona un descenso de la viscosidad relativa. El efecto de la temperatura sobre la viscosidad de las dispersiones acuosas de los éteres de celulosa es consecuencia de las interacciones que se producen, en disolución, entre las macromoléculas y el agua (Mitchell y col., 1993ª, 1993b). A medida que el polímero pierde agua de hidratación tienen lugar interacciones polímero-polímero, primariamente causadas por los sustituyentes metoxi -de naturaleza hidrofóbicaoriginando un marcado incremento en la viscosidad relativa. Es lo que se conoce como punto gelificación térmica. Otro fenómeno que se observa en los geles de HPMC cuando aumenta la temperatura, es la precipitación de las macromoléculas, lo que se puede poner de manifiesto por medidas de transmisión de luz (Sarkar, 1979). Las temperaturas a las que la transmisión de luz de una dispersión de polímero en agua alcanza el 97.5 y el 50 % se conocen como temperatura de precipitación incipiente y “cloud point”, respectivamente. La distribución de las moléculas de agua en la cadena celulósica condiciona de forma importante las propiedades fisico-químicas del polímero y de las formas de dosificación de las que entra a formar parte. La estabilidad química y las propiedades de flujo y de compactación 14 dependen en gran medida de su contenido en humedad (Malamataris y col., 1994). 2.3. LIBERACIÓN DEL PRINCIPIO ACTIVO A PARTIR DE MATRICES HIDROFÍLICAS La liberación de un fármaco a partir de una matriz hidrofílica depende, en gran medida de su solubilidad. Así, moléculas muy solubles se liberarán siguiendo una cinética de raíz cuadrada justificada por el aumento de las zonas de difusión del principio activo con el tiempo. Cuando el comprimido matricial entra en contacto con el medio de disolución, el principio activo que se encuentra en superficie se disuelve y se produce una rápida y brusca liberación de una pequeña parte de la dosis dando lugar a lo que se conoce como efecto “burst” (Fig.- 3). Figura 3 .- Representación esquemática del efecto “burst”. Tiempo Tiempo de latencia Efecto “burst” Cantidad de p.a. liberada 15 Progresivamente, el comprimido va perdiendo su forma y adquiriendo una estructura más o menos biconvexa. A medida que en la superficie de los comprimidos el principio activo y los excipientes se van disolviendo, se forman numerosos poros de gran tamaño por donde penetra agua hacia el interior del sistema, que permanece en las fases iniciales relativamente seco y sin poros (Bain y col, 1991). Figura 4.- Representación esquemática de los frentes de erosión (C), difusión o disolución (B) e hinchamiento (A) (Colombo y col., 1995). La penetración del agua en la matriz a través de los poros provoca un proceso de relajación del polímero que se manifiesta por la gelificación e hinchamiento del sistema matricial. Se pueden distinguir tres frentes o capas (Fig.-4): a. Un frente de hinchamiento, situado en la interfase polímero secogel; desde este frente avanzará progresivamente el proceso de hidratación del polímero. b. Un frente de difusión, que marca el límite entre la zona de principio activo no disuelto y la capa de gel en la que se encuentra disuelto. 16 c. Un frente de erosión, que se sitúa en la interfase gel-medio de disolución y a partir del cual las cadenas de polímero se individualizan produciéndose la disolución del sistema matricial. A medida que las moléculas de agua van penetrando en los intersticios de la red polimérica, las moléculas de agua atrapadas en el polímero provocan la hidratación del mismo, se empieza a formar el gel y el sistema aumenta de tamaño debido a que las cadenas poliméricas empiezan a desdoblarse y a solvatarse; es decir, se produce un aumento del volumen hidrodinámico de las macromoléculas del sistema (Wan y col., 1991). Las interacciones polímero-agua se van haciendo más intensas que las interacciones polímero-polímero. Se trata, fundamentalmente, de enlaces de hidrógeno. Las fuerzas de atracción que mantienen los segmentos de polímero unidos se van reduciendo. Una vez alcanzada la fase estacionaria, continúa la penetración del medio hacia el interior del comprimido produciéndose, al mismo tiempo, la solubilización del polímero. En este momento la distancia entre los frentes de difusión y de erosión se estabiliza. Esta distancia depende de la solubilidad del principio activo y de la velocidad con la que se desplazan los frentes de difusión y erosión. Por último, el frente de agua alcanza la zona central del comprimido y la concentración del principio activo en el medio que ha penetrado en la matriz se hace menor que el coeficiente de solubilidad. A partir de este momento, la velocidad decae de forma progresiva. La cesión del fármaco a partir de este tipo de sistemas se produce básicamente gracias a dos mecanismos: 1. Erosión de las capas externas de gel. 2. Disolución del principio activo en el medio y difusión a través de la barrera de gel que se forma como consecuencia de la hidratación de los componentes hidrofílicos. 17 Teniendo en cuenta la naturaleza del principio activo y la capacidad de gelificación del polímero hidrofílico, se puede explicar el predominio de uno u otro mecanismo de liberación. Si se trata de fármacos poco solubles y de geles poco consistentes, la cesión se producirá casi exclusivamente por erosión superficial siguiendo una cinética de orden cero. Si el principio activo es muy hidrosoluble, el mecanismo mayoritariamente responsable de la liberación será la difusión (Malamataris y Ganderton, 1991). Es tal la complejidad de los procesos implicados en el proceso de liberación y tantos los factores que pueden influir sobre las principales variables, que hasta la fecha no se han desarrollado modelos adecuados que permitan describirlo de manera completa. Se dispone de aproximaciones matemáticas condicionadas por el grado de adaptación de los sistemas a los supuestos establecidos como punto de partida para el desarrollo del modelo. Para desarrollarlos se han tomado únicamente en consideración los mecanismos mayoritariamente responsables del control de la liberación. Higuchi (1963) estudió la liberación de fármacos hidrosolubles incorporados a sistemas matriciales heterogéneos a través de superficies planas. La aproximación es válida si el proceso de liberación se produce sólo por difusión. Korsmeyer y col. (1983) propusieron la utilización de la siguiente expresión exponencial para el estudio de la liberación del principio activo a partir de matrices poliméricas: n ttk M M  En esta expresión Mt / Mes la fracción liberada de principio activo, t es el tiempo, k es una constante que incorpora las características estructurales y geométricas del sistema de liberación y n es el exponente indicativo del mecanismo de cesión. 18 Cuando n se aproxima a 0.5 se habla de una difusión de tipo fickiano, mientras que si se aproxima a 1, la cinética de orden cero es la que caracteriza el proceso de cesión del principio activo. La combinación de la difusión del principio activo a través de los poros tortuosos, causando de este modo un incremento en el volumen de los poros y la erosión de la superficie de la matriz dando lugar a un acortamiento en las longitudes de los caminos de difusión, podría explicar un cambio en el modo de transporte, y por tanto, de los valores de n. En general, se acepta que los datos comprendidos dentro del rango Mt / M = 0.05-0.70 son lineales, y por lo tanto, aceptables para la determinación del exponente n por regresión lineal. En los modelos comentados no se tienen en cuenta que con anterioridad a la formación de la capa de gel, se produce una liberación inmediata de una pequeña fracción de la dosis y que es necesario que transcurra un cierto período de tiempo antes de alcanzarse el estado estacionario. Este factor es poco relevante dentro del proceso global de cesión debido a su reducida magnitud (Mitchell y col., 1990). Sin embargo, Ford y col. (1991) incorporaron este tiempo de latencia (t0) a la siguiente expresión: n tttk M M)( 0   2.3.1. EL PROCESO DE DIFUSIÓN Con el fin de desarrollar y optimizar las formulaciones de liberación modificada es de fundamental importancia el estudio del proceso de difusión. En los comprimidos matriciales el proceso de 19 difusión del principio activo al medio de disolución va a ser determinante en el proceso global de cesión del fármaco. Se puede definir difusión como el proceso por el que una sustancia es transportada de una zona a otra de un sistema como resultado de movimientos moleculares aleatorios. Siempre que en el sistema exista un gradiente de concentración, se producirá una transferencia neta de moléculas desde las zonas de concentración más alta a las de más baja. La primera ley de Fick de la difusión establece que la transferencia de la sustancia que difunde por unidad de área de una sección es proporcional al gradiente de concentración medido normal a la sección:         x C DJ donde J es la transferencia por unidad de área de superficie (flujo), C es la concentración de la sustancia que difunde, x es el espacio medido normal a la sección y D es el coeficiente de difusión. El signo negativo indica que el flujo se produce en la dirección de la concentración menor. En materiales complejos, D depende mucho de la concentración. La segunda ley de Fick reduce el número de variables a una. Cuando la difusión es unidireccional, es decir, el gradiente de concentración se mantiene a lo largo del eje x, la ecuación adquiere la siguiente forma: x C D t C     2 Los experimentos más comunes dirigidos a medir la difusión emplean una membrana que separa dos compartimentos. Si m es la masa que pasa por unidad de área a través de la membrana, dm / dt representa el flujo estable que se alcanza a tiempos largos: 20 h KDC dt dm 0  donde C0 es la concentración constante del fármaco en la solución donante, K es el coeficiente de partición del soluto entre la membrana y la solución de baño y h el espesor de la membrana. La determinación del coeficiente de difusión de un fármaco a través de un gel permitirá la predecir su velocidad de cesión. Con el fin de determinar los coeficientes de difusión de un determinado principio activo a partir de un sistema matricial, se pueden realizar ensayos en células de difusión horizontales en las que el compartimento en el que se sitúa la formulación se separa del compartimento receptor por una membrana sintética o natural (Fig.-5). Figura 5.- Representación esquemática de las células de Franz-Chien empleadas en la determinación de coeficientes de difusión. Considerando constante la velocidad de transferencia en todas las secciones de la membrana, los coeficientes de difusión se pueden calcular a partir de la siguiente expresión: h CC DJ   0 donde J es la velocidad de transferencia de sustancia por unidad de área, D el coeficiente de difusión de la sustancia difusora, C0 la concentración en una de las células, C la concentración en el compartimento receptor y 21 h el espesor de la membrana. Si se parte de que una de las concentraciones iniciales es cero, la cantidad total de sustancia (Mt) que pasa a un tiempo t vendrá dada por (Parks y col., 1997):                 D ht h C DMt6 2 0 Representando la cantidad de sustancia difundida en función del tiempo, la pendiente de dicha recta permite determinar el valor del coeficiente de difusión. También se ha utilizado la resonancia magnética nuclear (RMN) para la determinación de coeficientes de difusión en complejos multicomponentes. Esta técnica permite obtener datos sobre el mecanismo de difusión, su cinética y la estructura del gel formado (Gao y Fagerness, 1995). La viscosidad aparente de este tipo de sistemas (estimada por viscosimetría capilar) ha sido utilizada ampliamente como indicador de la resistencia del gel a la difusión. Por lo general, se observa una relación exponencial inversa entre la velocidad de cesión del principio activo y la viscosidad del gel que se forma por hidratación de los polímeros hidrofílicos que se emplean como excipiente base. Sin embargo, varios estudios (Smidt y col., 1991; Suh y Jun, 1996) han confirmado que los efectos de las moléculas poliméricas sobre las propiedades de flujo macroscópico del sistema (es decir, movimiento macroscópico) no están necesariamente correlacionadas con los efectos sobre la difusión (es decir, movimiento a escala microscópica). Esto ha llevado a que, en ocasiones, la propiedad conocida como microviscosidad (medida de viscosidad a escala microscópica) se considere mejor indicador de la velocidad de difusión del principio activo en estos geles (Smidt y Crommelin, 1991; Álvarez Lorenzo y col., 1999). 22 En soluciones poliméricas la microviscosidad es el factor que afecta en mayor medida al valor de los coeficientes de difusión (Smidt y col., 1991; Gebre Mariam y col., 1989). Entre los factores que determinan la microviscosidad se encuentran los responsables de los efectos de obstrucción y las interacciones moleculares entre el polímero y la sustancia que difunde (Smidt y col., 1991). Por tanto, el coeficiente de difusión de pequeños solutos en una solución polimérica puede ser modulado por la presencia de grandes macromoléculas, es lo que se conoce como obstrucción, y está relacionado con el volumen, la forma y el tamaño de las moléculas poliméricas presentes (Farng y Nelson, 1973). El tamaño del soluto y las interacciones polímero-soluto, especialmente si son especies cargadas, son dos factores muy importantes en la difusión del principio activo (Peppas y Wright, 1998). 2.3.2. FACTORES QUE AFECTAN A LA LIBERACIÓN DEL FÁRMACO A PARTIR DE MATRICES HIDROFÍLICAS El estudio de los factores que afectan a la liberación del fármaco a partir del sistema matricial aporta una valiosísima información sobre las posibilidades de intervenir en el proceso de cesión y, así, poder modular la velocidad de liberación del principio activo. Se trata de estudiar los factores clave que podrían afectar al perfil de disolución y considerar sus efectos potenciales a la hora de establecer una formulación. En términos generales, se puede distinguir entre variables dependientes del proceso de elaboración y variables dependientes del principio activo o de otros componentes de la formulación. 2.3.2.1. Variables dependientes del proceso de elaboración Se dispone de abundante bibliografía sobre la dependencia de las propiedades de las matrices respecto de las variables del proceso de 29 huésped. De esta manera, la -ciclodextrina puede complejar a moléculas pequeñas o cadenas laterales de tipo alifático, la - ciclodextrina compuestos aromáticos o de tipo heterocíclico y la - ciclodextrina moléculas más grandes o macrociclos como los esteroides. Ciclodextrinas Número de unidades de glucosa Diámetro de la cavidad (Å) Volumen de la cavidad (Å) PM Solubilidad acuosa (mg/mL) a 25oC 6 4.7-5.3 174 972 14.5 7 6.0-6.5 262 1135 1.85 8 7.5-8.3 427 1297 23.3 Tabla 3.- Propiedades de las ciclodextrinas naturales. La -ciclodextrina (BCD) (Fig.-9) es la CD más utilizada en aplicaciones farmacéuticas; de hecho, más de la mitad de las formulaciones farmacéuticas con CDs disponibles en el mercado contienen BCD (Loftsson, 1999). No obstante, su baja solubilidad acuosa (Loftsson y Brewster, 1996), debido a la formación de enlaces de hidrógeno entre los hidroxilos de C2 y C3 (Loftsson y col., 1998) y su toxicidad cuando se administra por vías distintas a la oral son las razones que limitan su uso. Las CDs químicamente modificadas (como las hidroxipropiladas o sulfobutiladas) son igualmente seguras para el uso tópico u oral pero son más convenientes, en su mayoría, para el uso parenteral debido a su mayor solubilidad en agua y a su reducida toxicidad. Se han sintetizado derivados de la BCD mediante la sustitución de alguno de los grupos hidroxilo de la molécula. En algunos casos la sustitución es estequiométrica, con lo que se conoce la composición de forma exacta, 30 pero en otros casos, la sustitución se produce al azar, en cuyo caso se caracterizan mediante el grado de sustitución. Se define grado de sustitución (DS) como el número medio de hidroxilos sustituidos por unidad de glucosa del anillo ciclodextrínico. Este valor representa un promedio de los obtenidos por determinaciones analíticas y teóricamente puede oscilar entre 0 y 3. Y se define grado de sustitución molar medio (MS) como el número medio de moles de sustituyente por mol de glucosa. Este número puede ser mayor que 3 por cada unidad de glucosa en las CDs sustituidas, ya que se pueden producir sustituciones en los propios sustituyentes; por ejemplo, en el caso de la HPBCD, los grupos hidroxilo de los sustituyentes hidroxipropilo pueden generar cadenas laterales poliméricas al reaccionar con el óxido propileno utilizado en la síntesis. Cuando no existen grupos reactivos adicionales, DS y MS coinciden; de hecho, la relación MS/DS es un índice del grado de polimerización de las cadenas laterales. Sin embargo, en la literatura también se ha definido grado de sustitución como el número medio de sustituyentes por molécula de CD. Para evitar posibles confusiones, Blanchard y Proniuk (1999) introducen un nuevo término, grado de sustitución total (TDS), que representa el número medio de grupos sustituidos por molécula de CD. Así, para la HPBCD este parámetro puede variar entre 0 (BCD) y más de 21. O OH HO OH O O OH HO OH O O OH OH OH O O OH OH OH O O OH OH HO O OOH OH HO O O OH HO HO O Figura 9.- Estructura química de la  -ciclodextrina. 31 O R R R O O R RR O O R R R O O R R R O O R R R O OR R R O O R R R O O OH R= Figura 10.- Estructura química de la hidroxipropil-  -ciclodextrina. La obtención de derivados a partir de la BCD implica la obtención de mezclas isoméricas de CDs polisustituidas (Loftsson y Brewster, 1996). Esta heterogénea composición parece ser uno de los factores que justifican una mejora en la seguridad (Thompson, 1997). Entre los derivados de la BCD comercializados en la actualidad, destaca la hidroxipropil--ciclodextrina (HPBCD) (Fig.-10) que tiene una elevada solubilidad acuosa (solubilidad acuosa superior a 60%), seguridad tras su administración parenteral y eficacia de complejación (Thompson, 1997). Entre otros derivados de la BCD que han sido estudiados y utilizados para complejar diversos fármacos en los últimos años se encuentran la metil--ciclodextrina (MBCD), la sulfobutiléter-- ciclodextrina (SBEBCD) y la maltosil--ciclodextrina (G2BCD). 3.2. PROPIEDADES DE LAS CICLODEXTRINAS Las CDs han sido reconocidas como un nuevo grupo de excipientes muy útil dentro del campo farmacéutico gracias a su capacidad para actuar como “envases moleculares”. Es, sin duda, esta propiedad, consecuencia de su estructura química, la que da a estas 32 moléculas un potencial único dentro del marco de la formulación farmacéutica. Además, desde hace muchos años sus monografías se recogen en las principales farmacopeas. En estado sólido, las CDs pueden presentar dos tipos de estructura cristalina: en entramado y en canal. En el primer caso, las cavidades se encuentran bloqueadas en ambas caras por las moléculas adyacentes originando cavidades aisladas. Si los cristales son tipo canal, las moléculas huésped se sitúan en el interior de los canales que se forman al apilarse unas sobre otras las moléculas ciclodextrínicas (Frommimg y Szejtli, 1994). No tienen un punto de fusión definido pero empiezan a descomponerse por encima de los 200C. Estos valores tan altos reflejan su elevada estabilidad. Son tan estables como el almidón o la sacarosa, pueden permanecer almacenadas durante años sin sufrir deterioro. Se trata de sustancias no higroscópicas, aunque en ocasiones pueden formar hidratos estables. Son muy estables en soluciones alcalinas (pH < 14) y relativamente estables en soluciones ácidas (pH > 3). Carecen de naturaleza reductora debido a que el único hidroxilo reductor (C1) forma parte del enlace (1-4). La viscosidad de sus soluciones acuosas no difiere significativamente de la del agua y en estado sólido presentan buenas propiedades de flujo. De las tres CDs naturales, ACD, BCD y GCD, el valor más bajo de solubilidad lo presenta la BCD debido al establecimiento de puentes de hidrógeno inter e intramoleculares que dan lugar a la formación de agregados moleculares en solución. La formación de ciertos derivados como consecuencia de la ruptura de esos enlaces mejora sensiblemente su solubilidad. Las CDs presentan buenas características de biocompatibilidad, propiedad muy importante en una formulación farmacéutica, ya que se 33 trata de moléculas que van a estar en contacto directo con tejidos del cuerpo humano. Diversos estudios de toxicidad han demostrado que las CDs administradas por vía oral o tópica son prácticamente atóxicas, dada su limitada absorción (su naturaleza hidrófila y su elevado tamaño dificultan la absorción gastrointestinal y su paso a través de membranas hidrófilas) (Hirayama y Uekama, 1999). Desde el punto de vista de la seguridad y toxicidad, las CDs naturales pueden utilizarse vía oral, bucal, nasal y oftálmica y en supositorios. Sin embargo, la BCD, la ACD y un número significativo de derivados alquilados presentan nefrotoxicidad y actividad hemolítica tras una administración parenteral (Irie y Uekama, 1997; Stella y Rajewski, 1997). 3.3. COMPLEJOS DE INCLUSIÓN CON CICLODEXTRINAS La propiedad más importante de estas moléculas es su capacidad para incluir en su interior diferentes moléculas. Las moléculas susceptibles de formar estos complejos de inclusión deben adaptarse total o parcialmente al interior de la cavidad troncocónica (Fig.-11). Figura 11 .- Complejación de la PGE1 con las tres ciclodextrinas naturales. OH H O O H O CH 3 H OH OH H O OH O C H 3 H O H O H H O O H O C H 3 H O H 34 La formación de un complejo de inclusión supone una verdadera encapsulación molecular del principio activo. Las CDs se comportan como cápsulas vacías de tamaño molecular que alojan en su cavidad interna una molécula o parte de ella dando lugar a lo que se conoce como complejo de inclusión. La capacidad de las CDs para formar complejos de inclusión depende de dos factores fundamentalmente, del componente estérico (tamaño relativo CD/molécula huésped) y de las interacciones termodinámicas entre los componentes del sistema (CD-molécula huésped-solvente). La complejación implica interacciones múltiples entre el principio activo, la CD y el solvente (Fig.-12). Existe una dislocación de moléculas de agua que salen de la cavidad apolar de las moléculas de CD. Además se produce una reducción de las interacciones repulsivas entre el principio activo y el medio acuoso, y en contraposición aumentan las interacciones hidrofóbicas al insertarse la molécula huésped en la cavidad apolar de la CD. Se trata de complejos no covalentes que pueden tener propiedades físicas, químicas y biológicas muy diferentes a las propias de la CD o a las de la molécula huésped. Esta complejación se puede buscar con el fin de aumentar la solubilidad y velocidad de disolución, disminuir la volatilidad, disminuir la irritación local o incrementar la estabilidad de algunos fármacos. 35 Figura 12.- Representación esquemática de la formación de un complejo de inclusión en un medio acuoso. Los complejos de inclusión pueden formarse tanto en estado sólido como en solución, en ambas fases las CDs mantienen su estructura troncocónica. Se puede producir una pequeña deformación, aunque, en general, no se modifica significativamente la estructura de la molécula hospedadora. Se trata de un proceso dinámico en el que no intervienen fuerzas ni de tipo iónico ni de tipo covalente. Las fuerzas implicadas son debidas a interacciones hidrofóbicas y a fuerzas de Van der Waals. Factores geométricos (moléculas demasiado pequeñas se deslizarían por el interior de la cavidad) más que químicos son decisivos a la hora de determinar qué tipo de molécula puede penetrar en la cavidad de la CD (Bekers y col., 1991). Sin embargo, factores como el pH (grupos funcionales de la molécula huésped pueden estar ionizados o no en función del pH), la temperatura o la presencia de un cosolvente pueden alterar la capacidad de la CD para formar el complejo de inclusión y por lo tanto, la cinética de la complejación puede variar (Johnson y col., 1994). 36 En solución acuosa los complejos se encuentran en continuo proceso de asociación-disociación (Fig.-12), se trata de un equilibrio dinámico entre los complejos formados y las moléculas libres existentes en disolución (Loftsson y Brewster, 1996) regido por la constante de estabilidad, K (Thompson, 1997). En solución acuosa los complejos fármaco-CD están continuamente formándose y disociándose en intervalos de tiempo del rango de milisegundos o inferiores. Los fármacos son liberados de sus CDs de una forma rápida y cuantitativa, especialmente después de una administración parenteral (Stella, 1999). Además está claro que las CDs no parecen alterar la farmacocinética intrínseca de las moléculas que complejan. A la liberación del fármaco a partir del complejo contribuyen varios procesos. Por una parte, la simple dilución del complejo puede ser suficiente para la cesión del principio activo, sobre todo en aquellos casos de complejos de baja estabilidad (K igual o menor de 104 M-1) (Stella, 1999; Loftsson y Masson, 2001). Una vez en el organismo la sustitución competitiva del fármaco incluido por materiales exógenos o endógenos (como sales biliares o lípidos de la piel) o la unión del fármaco a componentes de los tejidos o del plasma (proteínas) son otros procesos que contribuyen a la liberación. La entrada del fármaco lipófilo en el interior de los tejidos, que no es accesible a los complejos y a las CDs, también favorece el sentido del equilibrio hacia la disociación. También se deben considerar las contribuciones debidas a la eliminación de las CDs y a los ajustes de pH y temperatura (Stella, 1999). El proceso de complejación es exotérmico, por lo que un aumento de la temperatura podría llevar a un debilitamiento de la estabilidad incrementándose así la fracción libre. Ningún incremento en la temperatura provoca un debilitamiento del complejo y sí un incremento en la fracción libre de sustrato. La mayoría de los complejos 37 fármaco-CD son preparados y almacenados a temperatura ambiente y teniendo en cuenta que la temperatura corporal es de 37C, esa simple diferencia de temperatura es un factor que juega a favor de la disociación del complejo aunque específicamente para cada complejo haya que tener en cuenta el valor de su entalpía (Stella, 1999). En el caso de moléculas ionizables también va a tener una gran influencia el pH pero, en principio, la formación del complejo no se ve favorecida por la ionización. La contribución relativa de cada uno de estos procesos va a depender de la vía de administración, de las propiedades físico-químicas y concentración del fármaco y de la CD, de la constante de estabilidad del complejo y de la concentración eventual del agente competitivo (Stella, 1999). Por ejemplo, en el caso de la administración oftálmica la dilución es mínima. 3.3.1. Procedimientos de preparación de complejos de inclusión con ciclodextrinas Se han descrito un gran número de métodos de preparación de complejos de inclusión. La selección del método de preparación más adecuado se hace teniendo en cuenta las características fisico-químicas del principio activo y su posterior aplicación, teniendo en cuenta el medio en el que se obtiene el complejo. También hay que considerar a qué escala se está produciendo, ya que algunos métodos utilizados a nivel de laboratorio no son viables a nivel industrial y viceversa. El principio básico que permite obtener complejos de inclusión en solución es la adición de un exceso de principio activo a una solución acuosa de principio activo. La obtención de complejos en estado sólido se realiza por eliminación del disolvente de las soluciones principio 38 activo-CD mediante técnicas de evaporación, sublimación o liofilización. Entre los procedimientos más utilizados destacan: -Coprecipitación: se basa en la precipitación del complejo a partir de una solución acuosa. Su aplicación se limita a principios activos que forman complejos de inclusión con solubilidad baja. A nivel industrial se hace muy difícil su utilización por la enorme cantidad de disolvente necesaria para solubilizar el principio activo y el elevado gasto de energía que supone la agitación de la solución. -Liofilización: consiste en la preparación de una solución acuosa de CD y principio activo en cantidades estequiométricas que se somete a un proceso de liofilización. Las muestras liofilizadas suelen tener baja cristalinidad. Se trata de un método que puede ser adaptado para la obtención industrial con un elevado rendimiento. -Malaxado: consiste en mezclar el principio activo y la CD en proporciones estequiométricas en un mortero y añadir la misma cantidad en peso de una mezcla hidroalcohólica. La mezcla obtenida es amasada hasta la completa evaporación de la fase líquida dando lugar a una masa espesa, que posteriormente se deseca con el fin de conseguir la total eliminación del solvente. Aunque se trata de un procedimiento simple y barato y el rendimiento de obtención es muy elevado, el rendimiento de encapsulación suele ser bajo. -Atomización: se trata de un proceso similar al de liofilización en el que la solución acuosa de la CD y la molécula huésped es atomizada en un equipamiento adecuado que provoca la evaporación instantánea del solvente. 45 b) Difracción de rayos X Cuando hay formación de complejo los difractogramas difieren significativamente de los obtenidos individualmente para fármaco y CD (Green y col., 1991). Se produce una disminución del tamaño efectivo de cristalinidad. Generalmente se recurre a la difracción de rayos X del polvo, es decir, del complejo de inclusión pulverizado, ya que en ocasiones es imposible la obtención del monocristal del complejo. c) Espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier La utilización de esta técnica permite evidenciar la formación de los complejos de inclusión y además proporciona información sobre los grupos funcionales del fármaco o de la CD implicados directamente en el proceso de complejación en estado sólido. No obstante, en muchos casos las bandas de absorción correspondientes al principio activo y a la CD en la región del infrarrojo se superponen, lo que dificulta su utilización en estos casos. d) Microscopía electrónica de barrido Permite evaluar la morfología y el tamaño de partícula de los complejos obtenidos. Este tipo de estudios se suele completar con información obtenida por termomicroscopía. Las características morfológicas de los complejos son distintas de las que presentan la CD y el fármaco respectivamente. 46 3.4. MEJORA DE LA EFICIENCIA DE LA COMPLEJACIÓN CON CICLODEXTRINAS El empleo de las CDs permite mejorar propiedades fisicoquímicas -solubilidad, estabilidadde diferentes fármacos. Sin embargo, en algunos casos, los resultados obtenidos por simple complejación no son siempre tan satisfactorios como se requiere. Además, razones económicas, toxicológicas o de volumen de la forma de dosificación, pueden limitar la cantidad de CD a utilizar. Es por ello que se han desarrollado varias aproximaciones para aumentar la capacidad solubilizante de las CDs. 3.4.1. Modificación de la estructura de las ciclodextrinas Se han preparado muchos derivados químicos de las CDs mediante sustitución química de alguno de los enlaces de hidrógeno que forman los grupos hidroxilo. Muchos de estos derivados mejoran algunas de las propiedades de las CDs naturales como la solubilidad o la toxicidad parenteral (Szejtli, 1998). No obstante, muchos no han encontrado aplicación en la práctica por requerir procesos sintéticos muy complejos. Entre los derivados más utilizados se pueden citar: Metil-β-ciclodextrinas, como la dimetil-β-ciclodextrina (DMBCD) o la trimetil-β-ciclodextrina (TMBCD). Hidroxipropil-β-ciclodextrinas (HPBCD). Otros: CDs sulfatadas, poliméricas, ramificadas, etc. Entre ellas destaca la sulfobutil-éter-β-ciclodextrina (SBEBCD). La modificación química de las CDs ofrece otras posibilidades como por ejemplo la carboximetil-β-ciclodextrina, que por la formación de complejos de inclusión permite retrasar la liberación del fármaco a 47 Fármaco + CD Fármaco ionizado + CD Fármaco - CD Fármaco ionizado - CD K 1:1 K´ 1:1 K´ 1:1 K1:1 > pH ácido y aumentarla a pH más básico, lo que resulta muy interesante para aquellos fármacos que se absorben mayoritariamente en el intestino (Rajewski y Stella, 1996). 3.4.2. Efecto de la ionización del fármaco. Ajuste de pH Entre las técnicas disponibles para aumentar la solubilidad acuosa de fármacos ácidos, la formación de sales es una alternativa que permite incrementar la solubilidad. Sin embargo, en muchos casos las sales son poco solubles. Aunque los principios activos no ionizados forman generalmente complejos más estables que sus formas iónicas, la solubilidad total aumenta. En muchos de los estudios se ha demostrado que la complejación y la formación de sales conjuntamente permiten aumentar la solubilidad en comparación con los complejos binarios simples, incluso a valores de pH cercanos al pKa del fármaco o menor. En algunos casos, este resultado se refleja en una mayor biodisponibilidad, consecuencia de un incremento en la velocidad y en la extensión de la absorción. En otros la simple formación de la sal favorece sólo la preparación de la forma farmacéutica sin representar una ventaja significativa en términos de absorción (Redenti y col., 2001). 48 Loftsson y Brewster (1996) sostienen que un ajuste adecuado de pH permite mejorar la capacidad solubilizadora de las CDs. 3.4.3. Adición de ácidos carboxílicos La adición de determinados ácidos de bajo peso molecular (acético, málico, cítrico o tartárico) al medio acuoso puede aumentar la solubilización de fármacos de carácter básico optimizando la eficacia de la complejación. Estos ácidos dan lugar a soluciones supersaturadas que permanecen estables durante días. La capacidad de incrementar la solubilidad de la BCD mediante altas concentraciones de hidroxiácidos, en concreto ácido cítrico, ha sido estudiada por diferentes grupos investigadores (Fenyvesi y col., 1999). Se ha concluído que los hidroxiácidos tienen capacidad de modificar el sistema de enlaces de hidrógeno formado entre los hidroxilos secundarios de las CDs y afectar a las interacciones con las moléculas de agua (Redenti y col., 2000). Algunos resultados negativos y observaciones teóricas han llevado a concluir que son necesarios algunos requerimientos para explotar las propiedades de estos sistemas multicomponentes. La solubilidad del principio activo debe ser baja (menor de 0.1 mg/mL) y la formación de la sal con hidroxiácidos debe incrementar ese valor. Debe existir un relativo ajuste entre la parte de la molécula complejada y la CD (K ≥ 10 3 M-1). A partir de datos de RMN se ha concluido que el efecto sinérgico de hidroxiácidos y CDs no se debe a la acomodación simultánea de hidroxiácidos en la cavidad de la CD, como se observó en otros sistemas terciarios (Schuette y col., 1993). La solubilidad de los correspondientes complejos es mucho más elevada que la esperada por incrementar la solubilidad total del fármaco a través de sólo un ajuste apropiado del pH (Redenti y col., 2000). 49 3.4.4. Adición de polímeros hidrosolubles Varios autores han demostrado que la utilización de un polímero hidrosoluble con las CDs mejora apreciablemente la eficacia de disolución y que las constantes de estabilidad de los complejos fármacoCD ven incrementado su valor (Loftsson y Brewster, 1996). Sin embargo, todavía no se conocen en profundidad las interacciones que se producen entre el polímero y la CD. Cambios en los valores de viscosidad de soluciones acuosas de éteres de celulosa cuando se adiciona CD confirman la formación de asociaciones moleculares que son de tipo “extremo-extremo”(proceso de dimerización) en el caso de la HPMC (Hladon y Cwiertnia, 1994). Los grupos funcionales del polímero parecen participar en el desplazamiento de las moléculas de agua que se encuentran en el interior de la cavidad de la CD interaccionando con grupos químicos del borde del anillo. El proceso de autoclavado o sonicación parece mejorar las interacciones (Ganzerli y col., 1996). Loftsson afirma que el polímero participa directamente en la complejación (Loftsson, 1998). La interacción que se produce da lugar a la formación de agregados fármaco-CD-polímero observándose un comportamiento similar al que ocurre con un sistema micelar (Cappello y col., 2001). La entropía y la entalpía se hacen más negativas (Loftsson y col., 1994) además de aumentar el valor de la constante de estabilidad del complejo. En estos sistemas ternarios el incremento en la velocidad de disolución se debe a un mayor desorden de la estructura del sistema, es decir, a una activación mecánica que es optimizada por la presencia conjunta del polímero y la CD. Así, por ejemplo, la influencia de la polivinilpirrrolidona en la complejación del naproxeno con la HPBCD se ha puesto de manifiesto con interacciones mecánica y/o térmicamente inducidas más fuertes en los sistemas ternarios en los que llega a producirse una pérdida total de la cristalinidad del naproxeno (Mura y col., 2001). 50 La mejora en la eficacia de la complejación resulta de gran utilidad práctica porque permite reducir la cantidad de CD necesaria para formular un determinado fármaco en una forma sólida oral. En ocasiones, la dosis terapéutica es elevada y la cantidad de CD necesaria (el peso molecular de las CDs oscila entre 1200 y 1500) hace imposible formular el fármaco para una administración oral. 3.4.5. Combinación de métodos Se puede conseguir un efecto sinérgico si se combinan dos o más métodos de los anteriormente comentados. Por ejemplo la adición simultánea de ácidos y polímeros hidrosolubles (Ribeiro y col., 2005). 3.5. APLICACIONES DE LAS CICLODEXTRINAS La importancia de las CDs en Tecnología Farmacéutica se atribuye fundamentalmente a su capacidad para formar complejos de inclusión con numerosas moléculas con el fin de mejorar ciertas propiedades físico-químicas y biofarmacéuticas. En la actualidad, muchas moléculas formuladas con CDs se encuentran en fase de estudios clínicos con resultados muy prometedores. En la tabla 4 se recogen algunas formulaciones presentes en el mercado en las que se incluyen CDs. 51 CD/FÁRMACO Forma administración Nombre comercial y país de comercialización ACD PG1 Alprostadil IV Prostanding®, Prostavasin®, Eles® (Europa, Japón, EEUU) BCD Piroxicam Oral, rectal Brexin®, Cycladol®, Brexidol® (Europa) PGE2 Bucal Prostarmon® (Japón) Benexate Oral Ulgut®, Lonmiel® (Japón) Iodine Tópica Mena-Gargle® (Japón) Dexametasona Dérmica Glymesason® (Japón) Nitroglicerina Bucal Nitropen® (Japón) Nimesulide Oral Nimedex®, Mesulid Fast® (Europa) Ácido tiaprofénico Oral Surgamyl® (Europa) Omeprazol Oral Ombeta® (Europa) Cefalosporina ME1207 Oral Meiact® (Japón) HPBCD Itraconazol Oral, IV Sporanox® (Europa, EEUU) Cisaprida Rectal Prepulsid® (Europa) Mitomicina IV Mitozytrex® (EEUU) SBE7-BCD Ziprasidona IM Zeldox®, Geodon® (Europa, EEUU) Voriconazol IV Vfend® (Europa, EEUU) Tabla 4.- Listado de algunos productos farmacéuticos comercializados con ciclodextrinas. Incremento de la solubilidad y velocidad de disolución. En muchas ocasiones la simple mezcla física de los componentes mejora apreciablemente la solubilidad y la velocidad de disolución, aunque en general la magnitud es mayor con la formación del complejo (Esclusa Díaz y col., 1996). El sistema de clasificación biofarmacéutico de fármacos desarrollado por la FDA establece cuatro grupos de sustancias basados fundamentalmente en la capacidad para atravesar las membranas biológicas y en su solubilidad acuosa entre otros parámetros: 52 CLASE I CLASE II CLASE III CLASE IV Alta solubilidad Alta permeabilidad Baja solubilidad Alta permeabilidad Alta solubilidad Baja permeabilidad Baja solubilidad Baja permeabilidad Tabla 5 .- Clasificación biofarmacéutica de principios activos según FDA. Las CDs pueden formar complejos de inclusión con fármacos de naturaleza lipofílica insolubles en agua consiguiendo aumentar su hidrosolubilidad sin cambiar la capacidad intrínseca que poseen para atravesar las membranas biológicas. De esta manera, al incluir las CDs en las formulaciones farmacéuticas es posible desplazar moléculas desde la clase II e incluso IV a clase I. Sin embargo, no es adecuado el uso de CDs con moléculas de clase III y pueden reducir la biodisponibilidad de moléculas de clase I (Loftsson y col., 2002). Incremento de la biodisponibilidad En muchos casos una biodisponibilidad limitada es consecuencia de una baja solubilidad (el complejo formado oculta los grupos funcionales hidrofóbicos mientras que los grupos hidrofílicos permanecen expuestos al ambiente acuoso), otras veces se consigue mejorar la biodisponibilidad mejorando la permeabilidad a través de membranas o por la modificación en el lugar de liberación o también alterando el tiempo de liberación del principio activo (Soliman y col, 1997; Stella y Rajewski, 1997; Castillo y col., 1999). Incremento de la estabilidad térmica, resistencia a la oxidación, estabilidad en disolución, protección frente a la luz La complejación con CDs protege al fármaco frente a agresiones externas, lo que es especialmente importante en el caso de moléculas 53 lábiles (Loftsson y col., 1991). Generalmente, la fusión, evaporación, sublimación o descomposición del principio activo no aparecen hasta que se produce la descomposición de la CD. Cuando una molécula o parte de ella es obligada a permanecer dentro de la cavidad de la CD, se encuentra resguardada de la luz, el oxígeno o el agua, que difícilmente difunden al interior de la cavidad para reaccionar y degradar dicha molécula. Reducción de efectos secundarios Las CDs permiten atenuar la irritación local (Lin y col., 1994), lo que es de especial importancia en grupos terapéuticos como son los AINEs (Otero Espinar y col., 1991). Se reduce la concentración local del componente libre por debajo de niveles que dejan de ser irritantes. Con la formación del complejo, el contacto con los componentes biológicos es menor, se consigue así una disminución de la toxicidad. Formulaciones de liberación modificada Las CDs hidrófilas son útiles para formulaciones donde interese una cesión inmediata del principio activo, mientras que las CDs hidrófobas permiten una liberación prolongada, y con CDs de carácter iónico se puede conseguir una liberación retardada (Okimoto y col., 1998). Enmascaramiento de sabores desagradables Es una propiedad interesante para fármacos que presentan características organolépticas desagradables que pueden llevar al incumplimiento del tratamiento si la administración es oral. De esta forma, es posible ocultar frente a los receptores sensoriales los grupos 54 funcionales específicos que causan el gusto o los olores desagradables (Funasaki y col., 1999). Promoción de la absorción Las CDs pueden actuar como promotores de la absorción (Másson y col., 1999) al incrementar la biodisponibilidad del fármaco en la superficie de la membrana biológica (Sigurdardóttir y Loftsson, 1995; Loftsson y col., 1998). Así, han sido usadas con éxito en formas dérmicas tipo solución, en sistemas de administración nasal y en varias formulaciones oftálmicas. Otras aplicaciones: separaciones analíticas como la separación cromatográfica de fármacos quirales, protección de los ingredientes activos en perfumes, seguridad de sustancias explosivas, etc. 61 Djedaïne F., Perly B. Nuclear magnetic resonance of cyclodextrins derivatives and inclusion compounds. En: New trends in cyclodextrins and derivatives. Duchêne D., Ed. de Santé, París, 215, 1991. 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Patents, 9, 1697, 1999. 69 III. PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS 70 71 La complejidad de las pautas de administración constituye, con frecuencia, un importante inconveniente de la terapéutica oral y origina incumplimientos y fallos en los tratamientos. Este aspecto tiene una gran trascendencia, sobre todo en enfermedades crónicas. Con el fin de lograr regímenes posológicos más cómodos, la Tecnología Farmacéutica se ha centrado en el desarrollo de formas de dosificación de liberación modificada. Como consecuencia de ello, en la actualidad las formas de liberación modificada representan un porcentaje elevado en el total de las especialidades farmacéuticas disponibles. Las ventajas terapéuticas de las formas de liberación modificada, frente a las formas de dosificación convencionales, son numerosas. Entre ellas cabe destacar el mejor cumplimiento del tratamiento por parte del paciente, motivado por una disminución en la frecuencia de las dosis. Además, la capacidad que poseen para mantener niveles plasmáticos dentro del rango terapéutico durante períodos de tiempo razonables, lleva asociada una indiscutible mejora en la eficacia de los tratamientos. Para obtener formulaciones adecuadas se requiere el empleo de excipientes que permitan optimizar, bien retardando o bien acelerando, el proceso de cesión del principio activo. Numerosos estudios avalan la importancia de los polímeros hidrofílicos como moduladores del proceso de cesión del fármaco y el uso de las ciclodextrinas como agentes complejantes de fármacos está ampliamente documentado desde hace décadas. Más recientemente se ha demostrado que el efecto solubilizador de las ciclodextrinas se incrementa en presencia de un polímero hidrosoluble. En este trabajo se ha pretendido conjugar el potencial de las ciclodextrinas, como promotoras de la solubilidad de fármacos, con la capacidad de los polímeros hidrofílicos para controlar la cesión del 78 85 2.- Improvement of water solubility of sulfamethizole through its complexation with βand hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Characterization of the interaction in solution and in solid state. Eur. J. Pharm. Sci. 13: 325-331, 2001. 86 European Journal of Pharmaceutical Sciences 13 (2001) 325–331 www.elsevier.nl/locate/ejps Improvement of water solubility of sulfamethizole through its complexation with band hydroxypropyl-b-cyclodextrin Characterization of the interaction in solution and in solid state aa a ´´ Beatriz Pose-Vilarnovo , Iliana Perdomo-Lopez , Magdalena Echezarreta-Lopez , ab a, * Patricia Schroth-Pardo , Ernesto Estrada , Juan J. Torres-Labandeira a ´´ Departamento de Farmacia e Tecnoloxıa Farmaceutica , Fac . de Farmacia , Univ . de Santiago de Compostela , Campus Sur , E15782 Santiago de Compostela , Spain b ´´ Departamento de Quımica Organica , Fac . de Farmacia , Univ . de Santiago de Compostela , Campus Sur , E15782 Santiago de Compostela , Spain Received 13 November 2000; received in revised form 6 March 2001; accepted 7 March 2001 Abstract The aim of this study was to increase the solubility of sulfamethizole in water by complexing it with b-cyclodextrin (BCD) and 1 hydroxypropyl-b-cyclodextrin (HPBCD). The interaction of sulfamethizole with the cyclodextrins was evaluated by the solubility, H NMR spectrometry and molecular modelling. The stability constants calculated from the phase solubility method increase in order HPBCD,BCD. From the NMR studies could be concluded that the sulfamethizole:cyclodextrin mole ratio was 1:1 (mol/mol) in the BCD complex and 2:3 (mol/mol) in the HPBCD complex. In both cases the sulfamethizole moiety included in the cyclodextrin was the thiadiazole group. MM2 calculations, either in vacuum or in the presence of a solvent, support this structure. Solid inclusion complexes of sulfamethizole with BCD and HPBCD were obtained by freeze drying 1:1 (mol/mol) solutions in aqueous ammonium hydroxide. Host–guest interactions were studied in the solid state by powder X-ray diffractometry and differential scanning calorimetry. The dissolution rates of sulfamethizole increased by the complexation with BCD or HPBCD. 2001 Elsevier Science B.V. All rights reserved. Keywords : Sulfamethizole; b-Cyclodextrin; Hydroxypropyl-b-cyclodextrin; NMR; Molecular modelling; Dissolution 1. Introduction al., 1998; Lutka, 2000), for increasing bioavailability (Soliman et al., 1997; Miyake et al., 1999; Siefert et al., Sulfamethizole is a short-lived sulphonamide used in the 1999) or stability (Lu et al., 2000), or for reducing side treatment of urinary tract infections alone or in combinaeffects (Otero-Espinar et al., 1991). Specifically, the tion with other antibiotics. Its main target pathogen is interaction between sulfamethizole and band Escherichia coli. It acts by taking the place of a folic acid hydroxypropil-b-cyclodextrin have been studied in soluprecursor required for bacterial reproduction. The feasibilition and in solid state. We prepared and characterized solid ty of sustained release sulfamethizole formulations with inclusion complexes of sulfamethizole with b-cyclodextrin more convenient administration schedules is complicated (BCD) and hydroxypropyl-b-cyclodextrin (HPBCD) by by the low solubility of the drug in water (1 part in 2000 freeze-drying, comparing in particular their drug dissoluparts of water) (BIAM, 1999; Martindale, 1999). tion characteristics with those of the uncomplexed drug. In this work, we investigated whether this difficulty could be overcome by inclusion-complexation of sulfamethizole with cyclodextrin, a technique that is becom2. Materials and methods ing increasingly popular for improving the solubility of poorly soluble drugs (Stella and Rajewski, 1997; Veiga et 2.1. Materials Sulfamethizole (4-amino-N-[5-methyl-1,3,4-thiadiazol- * Corresponding author. Tel.: 134-981-563-100; fax: 134-981-5472-yl]-benzenesulphonamide) was supplied by Sigma 148. E-mail address : [email protected] (J.J. Torres-Labandeira). Chemical Co. (St. Louis, MO, USA,). b-Cyclodextrin 0928-0987/01/$ – see front matter 2001 Elsevier Science B.V. All rights reserved. PII: S0928-0987(01)00131-2 326 B . Pose-Vilarnovo et al . /European Journal of Pharmaceutical Sciences 13 (2001) 325 – 331 (BCD) was donated by Roquette-Laisa (Barcelona, Spain), 2.6. Preparation of physical mixtures and hydroxypropyl-b-cyclodextrin (HPBCD; degree of substitution 2.7) by Janssen Pharmaceutica N.V. (Beerse, Sulfamethizole and cyclodextrin were passed through Belgium). 0.5-mm meshes and equal mole amounts were mixed in a Turbula T2C mixer for 10 min. 2.2. Solubility studies 2.7. Powder X-ray diffractometry Solubility diagrams were obtained according to Higuchi Diffractograms of the solid inclusion complexes were and Connors (1965). Excess amounts of sulfamethizole obtained with a Philips PW 1710 BASED diffractometer were added to water containing various concentrations of using Cu K radiation and 2 u scans at a scan rate of a cyclodextrins and the suspensions were shaken at 378C. 28/min. After equilibrium was reached (about 7 days), drug concentration was analyzed spectroscopcally (Shimadzu UV2.8. Differential scanning calorimetry 240-Graphicord) at 264 nm (E5577.31). The appar1%,1 cm ent stability constant of the complex, K, assuming that a Differential scanning calorimetry (DSC) was performed 1:1 complex is initially formed, was calculated from the with a Shimadzu DSC-50 apparatus equipped with a TA-5 initial straight-line portion of the solubility diagrams. All WS/PC thermal analyzer. Thermograms were run between samples were prepared in duplicate. 50 and 2508C at a scan rate of 108C/min. 1 2.3. H NMR studies 2.9. Dissolution studies 1 H NMR spectra in 0.2 N solutions of NaOD in The dissolution behaviour of the complexes at 378C deuterated water were obtained at 258C with a Bruker WM were compared with that of pure sulfamethizole and of 300 apparatus operating at 300 MHz, using as internal physical sulfamethizole–cyclodextrin mixtures using transreference the peak at d 54.6 ppm due to DHO and H O parent gelatin capsules containing quantities of formulation 2 impurities. To determine the stoicheiometry of the comequivalent to 50 mg of sulfamethizole. Tests were carried plexes by the continuous variation method (Job, 1928), out in a USP23 Method II apparatus (Turu-Grau) using 23 9.7310 M solutions of BCD and sulfamethizole or 900 ml of distilled water and a stirring speed of 50 r.p.m.; 23 8.5310 M solutions of HPBCD and sulfamethizole in the capsules were enclosed in stainless steel baskets to the deuterated NaOD solution, were mixed in various prevent floating. All experiment were made in triplicate. At proportions while keeping the total concentration fixed, pre-specified times, 5-ml samples were extracted and and the changes in the most sensitive NMR signal were filtered, and the concentration of sulfamethizole was noted. determined spectrophotometrically at 264 nm. The resulting dissolution curves were characterized by the corresponding 60-min dissolution efficiency (Khan, 1975). The 2.4. Molecular modelling statistical significance of differences among formulations was estimated by one-way analysis of variance and the Using fixed geometries for b-cyclodextrin and sulStudent–Newman–Keuls test. famethizole taken from the Cambridge Structural Database, the optimal geometries of BCD–sulfamethizole complexes in vacuo and in the presence of water molecules 3. Results and discussion were calculated using MM2 force field as implemented in HyperChem (Release 3.0 for Windows). The presence of 3.1. Solubility studies water was simulated by placing the solute molecules in a ˚ 16312316 A water box with a minimum distance of 2.0 Fig. 1 shows the phase solubility diagrams of sul- ˚ A between solute and solvent molecules, which means that famethizole with the cyclodextrins used, BCD and 35 water molecules were included in the model. HPBCD, at 378C. The solubility of the drug increased linearly as a function of the CD concentration, a feature of 2.5. Preparation of inclusion complexes the A -type complex, showing that water-soluble complexL es exit in solution. These results show, in the experimental Equal mole amounts of sulfamethizole and cyclodextrin conditions used, the formation of a 1:1 (mol/mol) incluwere dissolved in 5% (w/v) aqueous ammonium hydroxsion complex with both cyclodextrins because the slope of ide, the solutions were frozen by immersion in liquid the diagrams is lower than one (Higuchi and Connors, nitrogen, and the frozen solutions were lyophilized in a 1965). The apparent 1:1 stability constant (K), calculated Labconco Lyph-lock 6 apparatus. from the initial straight-line part of the solubility curves 96 97 3.-Sulphamethizole-cyclodextrin-hydroxypropylmethylcellulose multicomponent complexes. J. Therm. Anal. Cal. 68: 657-667, 2002. 98 Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, Vol. 68 (2002) 657–667 SULPHAMETHIZOLE-CYCLODEXTRINHYDROXY PROPYLMETHYL CELLULOSE MULTICOMPONENT COMPLEXES B. Pose-Vilarnovo, C. Rodríguez-Tenreiro Sánchez, M. B. Pérez-Marcos and J. J. Torres-Labandeira* Dept. de Farmacia e Tecnoloxía Farmacéutica, Fac. de Farmacia, Univ. de Santiago de Compostela, Campus Sur, E-15706 Santiago de Compostela, Spain Abstract The effect of cyclodextrin complexation of sulphamethizole (SM) was studied. Two systems were prepared with two cyclodextrin derivatives, β-cyclodextrin (BCD) and hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPBCD): binary complexes and multicomponent systems (cyclodextrins and a hydroxypropylmethyl cellulose K4M). Inclusion complexes were prepared by freeze-drying and characterized by thermal analysis (DSC) and X-ray diffractometry. The presence of the polymer in the solution increases the effect of cyclodextrins – specially BCD – on the solubility of SM. In solid state, binary inclusion complexes enhance the dissolution behaviour of SM but, from the multicomponent complexes, the polymer controls the release of the drug. Keywords: β-cyclodextrin, cyclodextrin inclusion complexes, DSC, hydroxypropyl-β-cyclodextrin, hydroxypropylmethyl cellulose, stability constant, X-ray diffractometry Introduction Cyclodextrins (CDs) are water-soluble, hydrophobic torus-shaped cyclic oligosaccharides with a hydrophilic outer surface and a hydrophobic central cavity. In aqueous solutions CDs are capable of forming inclusion complexes with many drugs. Because of these properties CDs can be used to improve some physicochemical properties of drug molecules such as stability or aqueous solubility [1–3]. For a variety of reasons including costs, production capabilities and toxicology, CDs can be incorporated into drug formulations in a limited amount, and therefore, it is important to develop methods that allow a reduction in the amount of CDs necessary in a particular pharmaceutical formulation [4]. Among these procedures, the use of water-soluble polymers has been extensively studied to enhance the complexing abilities of the CDs. In fact, it has been proven that various pharmaceutical polymers, such as cellulose derivatives, have a significant effect on the drug–CD complex formation because, as surfactants, they increase the solubilizing power of CDs. The in1418–2874/2002/ $ 5.00 © 2002 Akadémiai Kiadó, Budapest Akadémiai Kiadó, Budapest Kluwer Academic Publishers, Dordrecht * Author for correspondence: Phone: +34 981 563 100. Fax: +34 981 547 148. E-mail: [email protected] teraction polymer-CD results in physical-chemical changes of the systems formed, and the solubility of the drug increases [5–7]. We have used a hydrophilic polymer, hydroxypropylmethyl cellulose (K4M) which is a well established pharmaceutical excipient, extensively used in controlled drug delivery systems. K4M has been previously reported useful in the improvement of CD complexation [8–10], but most of the studies carried out to analyse the effect of hydrophilic polymers on the complex formation with cyclodextrins were made in solution, not in solid state. Several papers have been published concerning the improvement of the solubility and bioavailability of drugs through the formation of binary and multicomponent complexes with cyclodextrins [11, 12]. Acid molecules – hydrochloric, citric or tartaric acids – were included in these multicomponent systems but not polymer molecules. Sulphamethizole (SM) was used as a model drug. It is a short-acting sulphonamide used in the treatment of infections of the urinary tract, sometimes in combination with other antibacterial agents. It is very slightly soluble in water and this could be a drawback to formulate it in controlled release dosage forms. Its formulation as an inclusion complex either with β-cyclodextrin (BCD) or hydroxypropyl-βcyclodextrin (HPBCD) has showed a significant increase in its aqueous solubility [13]. The aim of this study was to prepare solid multicomponent systems containing cyclodextrins (BCD and HPBCD) and hydroxypropylmethyl cellulose (K4M) to be included in solid dosage forms. These systems were prepared by freeze-drying and characterized by differential scanning calorimetry and X-ray diffractometry. Drug dissolution characteristics from binary and multicomponent complexes were compared with these of the uncomplexed drug. Experimental Materials Sulphamethizole was purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). BCD and HPBCD were a gift from Laisa-Roquette (Barcelona, Spain) and Janssen Pharmaceutiche (Belgium), respectively. Hydroxypropylmethyl cellulose K4M (Methocel) was obtained from The Dow Chemical Company (Michigan, USA). All other reagents were of analytical reagent grades. Solubility studies Solubility diagrams were obtained according to Higuchi and Connors methodology [14]. Excess amounts of sulphamethizole were added to water containing various concentrations of cyclodextrins. The suspensions were shaken at 37°C for seven days. To establish the effect of the polymer on the solubility diagrams, K4M was added (0.1% w/v). The suspensions were autoclaved at 120°C for 20 min and equilibrated for at least 3 days at room temperature, according to Loftsson et al. [15]. The stability constants K1:1 were calculated using the following relationship: J. Therm. Anal. Cal., 68, 2002 658 POSE-VILARNOVO et al.: CYCLODEXTRIN INCLUSION COMPLEXES KS 11 01 :() =− slope slope where S0represents the solubility of sulphamethizole in water without cyclodextrins. Drug concentration was analysed spectroscopically (Shimadzu UV-240-Graphicord) at 264 nm (E1%,1 cm=577.31). Preparation of the physical mixtures Sulphamethizole, cyclodextrins and hydroxypropylmethyl cellulose were passed through 0.5 mm meshes, and 1:1 SM/CD ratio with 0.1 g of K4M (equal amount that is present in the inclusion complexes) were mixed in a Turbula T2C mixer for 10 min. Preparation of the inclusion complexes Equimolar amounts of sulphamethizole and cyclodextrins – BCD and HPBCD – were dissolved in 5% (w/v) aqueous ammonium hydroxide. K4M was added to obtain a final concentration of 0.1% (w/v), and the solution was left to stand for 24 h at 4°C. The dispersions were frozen by immersion in liquid nitrogen, and lyophilized in a Labconco Lyph-lock 6 apparatus. Thermal analysis Differential scanning calorimetry (DSC) was performed on a Shimadzu DSC-50 system with a DSC equipped with a computerized data station TA-5 WS/PC. General conditions: scanning rate 10°C min–1, scanning temperature range 25–250°C. X-ray X-ray powder diffraction patterns were recorded on a Philips X-ray diffractometer (PW 1710 BASED) using CuKαradiation. In the diffractograms the relative intensity of reflexion peaks were recorded as a function of diffraction angles 2θ°. Dissolution studies The dissolution behaviour of the complexes at 37°C was compared with that of pure sulphamethizole and of physical sulphamethizole-cyclodextrin mixtures using hard shell colorless gelatin capsules containing quantities of formulation equivalent to 50 mg of sulphamethizole. Capsules were placed in a stainless steel box to avoid their flotation. Tests were carried out in a USP24 Method II apparatus (Turu-Grau) using 900 mL of distilled water and a stirring speed of 50 r.p.m. All experiments were made in triplicate. At pre-specified times, 5 mL samples were extracted and filtered, and the concentration of sulphamethizole was determined spectrophotometrically at 264 nm. The resulting dissolution curves were characterized by the corresponding 0–60 min dissolution efficiency [16]. The statistical significance of differences among formulaJ. Therm. Anal. Cal., 68, 2002 POSE-VILARNOVO et al.: CYCLODEXTRIN INCLUSION COMPLEXES 659 tions was estimated by one-way analysis of variance (one-way Anova) and the Scheffé test for multiple comparisons using SPSS for Windows (v. 10.1.3). Results and discussion Phase-solubility diagrams The effect of K4M on the solubilising effect of BCD and HPBCD is shown in Table 1. Solubilities of the drug in aqueous CD solutions (Sco) were much higher than in water (S0), but the introduction of small amounts of K4M to the solution medium improved the solubility even further. Thus, to obtain a significant increase of the solubility (up to 39% with BCD and 6% with HPBCD), the solutions have to be heated to 120°C for 20 min (autoclaving). Table 1 Effect of the addition of 0.1% (w/v) K4M to aqueous 1%(w/v) HPBCD and BCD solutions on solubilization of sulphamethizole SpSp *Sco Scp Scp *Scp/Sco Scp */Sco BCD 2.337 3.271 7.472 6.649 10.430 0.89 1.40 HPBCD 2.337 2.854 7.125 5.938 7.578 0.83 1.06 So: solubility of SM in aqueous solution (2.386 mM) Sp: solubility in aqueous 0.1% (w/v) solution of the K4M (mM) Sp *: solubility in aqueous 0.1% (w/v) solution of the K4M with autoclaving process (mM) Sco: solubility in aqueous 1% (w/v) CD solution (mM) Scp: solubility in aqueous solution containing both 0.1% (w/v) K4M and 1% (w/v) CD (mM) Scp *: solubility in aqueous solution containing both 0.1% (w/v) K4M and 1% (w/v) CD with autoclaving process (mM) Figures 1 and 2 show the phase solubility diagrams of SM in aqueous BCD and HPBCD solutions in the presence or absence of K4M. In all cases, the solubility of the drug increases linearly as a function of the CD concentration, AL-type according to Higuchi and Connors classification. The slope of the diagrams is lower than 1, and therefore, the complex is responsible for the increase in drug solubility has a 1:1 mol:mol stoichiometry [14]. K4M enhanced significantly the solubilizing effect of CDs but did not affect the type of the phase-solubility diagram. The apparent stability constants of SM-BCD and SM-HPBCD with and without K4M were calculated from the slopes of the phase-solubility diagrams assuming a 1:1 stoichiometry (Table 2). The stability constants of the inclusion complexes show an enhancement in the presence of K4M in the case of SM-BCD complex. This effect was not found for HPBCD systems, in fact, the effect of K4M was negligible. Similar results were found by Veiga [17] with HPBCD and HPMC, in disagreement with these obtained by other authors where the solubilization enhancement is more than simple, it is synergistic [10]. The concentration of SM dissolved was higher when an autoclaving process was carried out. During this autoclaving process, the rise in temperature caused a saturaJ. Therm. Anal. Cal., 68, 2002 660 POSE-VILARNOVO et al.: CYCLODEXTRIN INCLUSION COMPLEXES tion and an increase in the solubility of the drug, which could probably lead to improved interactions between SM and the CD molecules. The improved solubilization after autoclaving could be due to the various electrostatic forces involved and a facilitated fitting of the guest molecule into the cavity. For SM-HPBCD complex the increase of temperature after autoclaving could explain the lower value of the stability constant because it may well produce an overall exothermic reaction between the drug and CD [5]. J. Therm. Anal. Cal., 68, 2002 POSE-VILARNOVO et al.: CYCLODEXTRIN INCLUSION COMPLEXES 661 Fig. 1 Phase-solubility diagrams of SM in aqueous BCD solutions containing 0 and 0.1% K4M at 37°C Fig. 2 Phase-solubility diagrams of SM in aqueous HPBCD solutions containing 0 and 0.1% K4M at 37°C Table 2 Stability constants (K1:1) of SM complexes with HPBCD and BCD BCD HPBCD Without K4M 651.85 M–1 (r2=0.9684) 563.95 M–1 (r2=0.9969) With K4M 419.93 M–1 (r2=0.9948) 448.72 M–1 (r2=0.9715) With K4M and autoclaving 815.51 M–1 (r2=0.9721) 409.12 M–1 (r2=0.9626) Preparation and characterization of solid inclusion complexes. Solid inclusion complexes were obtained by freeze-drying which is a common pharmaceutical technique useful for preparing cyclodextrin inclusion complexes [18]. The drug:cyclodextrin ratio used was 1:1 mol:mol as found in the phase solubility diagrams for both CD derivatives and K4M was 0.1% w/v common polymer concentration [9, 15]. Differential scanning calorimetry and X-ray diffractometry were used to characterize the systems prepared. DSC is a widely used analytical technique in the characterization of multicomponent solid systems to analyze possible changes during heating. In the case of CDs, DSC can provide a lot of information on drug/CD interactions in the solid state. Polymers can form complexes with CDs with physicochemical properties distinct from these of individual cyclodextrin molecules [19]. Figure 3 shows the DSC curves of the physical mixtures of SM and BCD as well as these of the solid binary and multicomponent complexes prepared by the freeze-dried method. BCD shows an endothermic peak from 90 to 140°C, which may be attributed to the evaporation of the adsorbed water [20]. The endothermic peak due to fusion of the drug appears at 210°C. In the freeze-dried complexes, J. Therm. Anal. Cal., 68, 2002 662 POSE-VILARNOVO et al.: CYCLODEXTRIN INCLUSION COMPLEXES Fig. 3 DSC curves of different SM–BCD systems: a – SM, b – BCD, c – K4M, d – physical mixture SM+BCD, e – physical mixture SM+BCD/K4M, f – SM–BCD freeze-dried complex and g – SM–BCD/K4M freeze-dried complex the plots show the absence of the characteristic endothermic melting peak, as compared to the physical mixtures in which this peak is clearly visible. The disappearance of the endothermic peaks of the drug is attributed to the amorphous state and the inclusion complexation of the drug inside the cavity [18]. The results of the HPBCD systems were similar to these of BCD, the peak or the drug fusion at 210°C disappeared in the binary and multicomponent complexes. Powder X-ray diffractometry is a useful technique for the detection of CD complexation in powder or microcrystalline states. The diffraction pattern of the complex is supposed to be clearly distinct from the superposition of each component if a true complex exists. The X-ray diffraction spectra of SM-BCD binary and multicomponent complexes in comparison with the physical mixture are shown in Fig. 5. The diffraction J. Therm. Anal. Cal., 68, 2002 POSE-VILARNOVO et al.: CYCLODEXTRIN INCLUSION COMPLEXES 663 Fig. 4 DSC curves of different SM–HPBCD systems: a – SM, b – HPBCD, c – K4M, d – physical mixture SM+HPBCD, e – physical mixture SM+HPBCD/K4M, f – SM–HPBCD freeze-dried complex and g – SM-HPBCD/K4M freeze-dried complex Fig. 5 X-ray diffraction patterns of different SM–BCD systems: a – SM, b – BCD, c – K4M, d – physical mixture SM+BCD, e – physical mixture SM+BCD/K4M, f – SM–BCD freeze-dried complex and g – SM-BCD/K4M freeze-dried complex Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, Vol. 73 (2003) 661–670 EFFECT OF HYDROXYPROPYLMETHYL CELLULOSE ON THE COMPLEXATION OF DICLOFENAC WITH CYCLODEXTRINS B. Pose-Vilarnovo, C. Rodríguez-Tenreiro Sánchez, N. Diéguez Moure, J. L. Vila-Jato and J. J. Torres-Labandeira* Departamento de Farmacia e Tecnoloxía Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Sur, 15782 Santiago de Compostela, Spain Abstract The effect of a hydrophilic polymer, hydroxypropylmethyl cellulose K4M, on the complexation of diclofenac sodium with βand hydroxypropyl-β-cyclodextrins has been studied. Multicomponent systems were prepared with the drug, both cyclodextrin and the polymer. Phase solubility diagrams revealed the positive effect of the polymer on the complexation of the drug but this effect was found after autoclaving the solutions. Solid inclusion complexes were prepared by freeze-drying and characterized by thermal analysis (DSC) and X-ray diffractometry. In solid state, binary inclusion complexes enhance the dissolution behaviour of diclofenac but, from the β-cyclodextrin multicomponent complex, the polymer controls the release of the drug. In the case of hydroxypropyl-β-cyclodextrin multicomponent system, the solubility of the drugs increases significantly compared with the binary complex. Keywords: β-cyclodextrin, cyclodextrin inclusion complexes, differential scanning calorimetry, dissolution, hydroxypropyl-β-cyclodextrin, hydroxypropylmethyl cellulose, sodium diclofenac, stability constant, X-ray diffractometry Introduction Aqueous solubility becomes, for many drugs, the main drawback for its formulation either in a liquid dosage form or in a controlled release one. Multiple technological alternatives have been used to overcome this problem – inclusion in colloidal systems such as liposomes, preparation of salts, etc. Among all of them, cyclodextrin complexation has seemed to the most promising one. Cyclodextrins (CDs) are cyclic α-(1,4)-linked oligomers of D-glucopyranose, which have been previously used in drug development to increase the water solubility of lipophilic compounds [1]. For several reasons, including toxicology, dosage and cost, the amount of cyclodextrins used in most of the formulations must be limited. Therefore, it is important to develop strategies to increase the effectiveness of cyclodextrin complexation that could be reflected in a reduction in the amount of CD necessary in a particular drug formulation. 1388–6150/2003/ $ 20.00 © 2003 Akadémiai Kiadó, Budapest Akadémiai Kiadó, Budapest Kluwer Academic Publishers, Dordrecht * Author for correspondence: E-mail: [email protected] With this aim the use of water-soluble polymers [2], the preparation of drug/CD/hydroxy acid multicomponent systems [3] or the formation of CD complexes of salts of acidic drugs have been described [4]. The use of polymers has been extensively used in the recent years but the exact nature of the polymer: CD interaction is not known yet [5]. Among these polymers, hydrypropylmethyl cellulose K4M is one of the most frequently used for this purpose [6]. This cellulose derivative is a hydrophilic polymer which is well established like pharmaceutical excipient and it has been extensively used in controlled drug delivery systems. The interaction polymer–CD has been tested in solution but solid complex has not been prepared. In a previous work [7] we analyzed the effect of HPMC–CD interaction on the solubility of sulphamethizole – a slightly water soluble and non ionic drug. Our results showed that, for this particular drug, the polymer increases the solubilizing effect of the CD but, when the solid complex was prepared, the solubility of the drug decreases compared with the binary complex drug–CD. In this particular case, the polymer allows to control the drug dissolution rate. The aim of this study was to analyze the effect of hydroxypropylmethyl cellulose (K4M) on the complexation of diclofenac with two cyclodextrins, β-cyclodextrin (BCD) and hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPBCD). Diclofenac, has been selected as a model ionic drug which is widely used as nonsteroidal anti-inflammatory and analgesic. Its solubility in water is low, specially in gastric juice (about 15 µgmL –1) and, it is unstable in aqueous solution [8]. This limited solubility in acidic medium seems to be a problem in its oral bioavailability and it is a drawback in its formulation in controlled release devices. This drug forms inclusion complexes with both cyclodextrins and the complexation increases its solubility [9–11]. Solid inclusion complexes containing diclofenac, cyclodextrins and HPMC were prepared by freeze-drying and characterized by differential scanning calorimetry and X-ray diffractometry. Drug dissolution characteristics from binary and multicomponent complexes were compared with those of the uncomplexed drug. Experimental Materials Sodium diclofenac (2-[(2,6-dichlophenyl) amino]benzeneacetic acid monosodium salt) was purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). β-cyclodextrin and hydroxypropyl-β-cyclodextrin (D.S. 4.6) were a gift from Laisa-Roquette (Barcelona, Spain) and Janssen Pharmaceutiche (Belgium), respectively. Hydroxypropylmethyl cellulose K4M-Methocelwas purchased from The Dow Chemical Company (Michigan, USA). All other reagents were of analytical reagent grades. Solubility studies Solubility diagrams were obtained according to Higuchi and Connors methodology [12]. Excess amounts of diclofenac were added to artificial gastric juice (USP 24 Ed.) J. Therm. Anal. Cal., 73, 2003 662 POSE-VILARNOVO et al.: DICLOFENAC CYCLODEXTRIN COMPLEXES containing various concentrations of cyclodextrins. The suspensions were shaken at 37ºC for seven days. To establish the effect of the polymer on the solubility diagrams, K4M was added (0.1 mass/vol%). The suspensions were autoclaved at 120ºC for 20 min and equilibrated for at least 3 days at room temperature, according to Loftsson et al. [13] . The stability constants K1:1 were calculated using the following relationship: KS 11 01 :( =− slope slope) where S0represents the solubility of diclofenac in simulated gastric juice without cyclodextrins. Drug concentration was analysed spectroscopically (Shimadzu UV-240-Graphicord) at 276 nm (E1%,1 cm=283.85). Preparation of the physical mixtures Diclofenac, cyclodextrins and hydroxypropylmethyl cellulose were passed through 0.5 mm meshes and mixed in a Turbula T2C mixer for 10 min. Another sort of systems were prepared by adding K4M in the same concentration that in the inclusion complexes studied. Preparation of the inclusion complexes Equimolar amounts of diclofenac and cyclodextrins - BCD and HPBCD - were dissolved in 5% (mass/vol) aqueous ammonium hydroxide. K4M was added to obtain a final concentration of 0.1% (mass/vol), and the solution was let to stand for 24 h at 4ºC to left the system swollen. The dispersions were frozen by immersion in liquid nitrogen, and lyophilized in a Labconco Lyph-lock 6 apparatus. Thermal analysis Differential scanning calorimetry (DSC) was performed on a Shimadzu DSC-50 system with a DSC equipped with a computerized data station TA-5 WS/PC. General conditions: scanning rate 10°C min–1, scanning temperature range 25–250ºC. X-ray X-ray powder diffraction patterns were recorded on a Philips X-ray diffractometer (PW 1710 BASED) using CuKαradiation. In the diffractograms the relative intensity of reflexion peaks were recorded as a function of diffraction angles 2θ°. Dissolution studies The behaviour of diclofenac in dissolution was compared not only in the physical mixtures but also in the inclusion complexes, and all of them with the pure drug. J. Therm. Anal. Cal., 73, 2003 POSE-VILARNOVO et al.: DICLOFENAC CYCLODEXTRIN COMPLEXES 663 Hard shell colorless gelatin capsules were employed to carry out these studies. Each capsule was filled with the quantity of formulation that contained 50 mg of drug. Capsules were placed in a stainless steel box to avoid their flotation. Tests were carried out in a USP24 Method II apparatus (Turu-Grau) using 900 mL of artificial gastric juice and at 37ºC with a stirring speed of 50 rpm all experiments were made in triplicate. Samples of 5 mL were taken at pre-defined times and once they were filtered the drug was determined spectrophotometrically at 276 nm. The resulting dissolution curves were characterized by the corresponding 0–180 min dissolution efficiency [14]. The statistical significance of differences among formulations was estimated by one-way analysis of variance (one-way ANOVA) and the Scheffé test for multiple comparisons using SPSS for Windows (v. 10.1). Results and discussion Phase-solubility diagrams The effect of K4M on the solubilising effect of BCD and HPBCD is shown in Table 1. Solubilities of the drug in aqueous CD solutions (Sco) were higher than in simulated gastric juice (S0). The introduction of small amounts of K4M in the solution medium did not improve the solubility just as a physical mixture. To obtain a significant increase of the solubility, the solutions had to be heated to 120ºC for 20 min (autoclaving). Table 1 Effect of the addition of 0.1 mass/vol% K4M to 1 mass/vol% HPBCD and BCD solutions in artificial gastric juice on solubilization of diclofenac; S0– solubility of diclofenac in artificial gastric juice (mM); Sp– solubility in artificial juice 0.1 mass/vol% solution of the K4M with autoclaving process (mM); Sco – solubility in artificial gastric juice 1 mass/vol% CD solution (mM); Scp – solubility in artificial gastric juice solution containing both 0.1 mass/vol% K4M and 1 mass/vol% CD (mM); Scp *– solubility in artificial gastric juice solution containing both 0.1 mass/vol% K4M and 1 mass/vol% CD with autoclaving process (mM) SpSp *Sco Scp Scp *Scp/Sco Scp */Sco BCD 0.0157 0.0597 0.0698 0.0583 0.1369 0.8360 1.5086 HPBCD 0.0157 0.0597 0.1146 0.0838 0.1046 0.7309 0.9126 S0=0.01638 Phase solubility diagrams of diclofenac in aqueous BCD and HPBCD solutions in the presence or absence of K4M are shown in Figs 1 and 2. In all cases, the diagrams can be included in the AL-type according to Higuchi and Connors classification. The slope of the diagrams is lower than 1, and therefore, the complex responsible of the increase in drug solubility has a 1:1 mol:mol stoichiometry [12] K4M enhanced significantly the solubilizing effect of CDs but did not affect the type of the phase-solubility diagram. The apparent stability constants of diclofenac-BCD and diclofenac-HPBCD with and without K4M were calculated from the slopes of the phase-solubility diaJ. Therm. Anal. Cal., 73, 2003 664 POSE-VILARNOVO et al.: DICLOFENAC CYCLODEXTRIN COMPLEXES grams assuming a 1:1 stoichiometry (Table 2). The stability constants of the inclusion complexes show, in both cases, an enhancement in the presence of K4M. The effect has been found higher after autoclaving which makes this process necessary to obtain a good interaction between the cyclodextrin and the polymer. During this autoclaving process, the rise in temperature caused a saturation and an increase in the solubility of the drug, this fact could probably lead to improve interactions between diclofenac, the CD molecules and the polymer. The improved solubilization after autoclaving could be due to the several electrostatic forces involved and a facilitated fitting of the guest molecule into the cavity. The fact of heating the CD systems also shows a posiJ. Therm. Anal. Cal., 73, 2003 POSE-VILARNOVO et al.: DICLOFENAC CYCLODEXTRIN COMPLEXES 665 Fig. 1 Phase-solubility diagrams of diclofenac in artificial gastric juice BCD solutions containing different BCD solutions with 0 and 0.1% K4M at 37ºC Fig. 2 Phase-solubility diagrams of diclofenac in artificial gastric juice HPBCD solutions containing different HPBCD solutions with 0 and 0.1% K4M at 37ºC Table 2 Stability constants (K1:1) of diclofenac complexes with HPBCD and BCD BCD HPBCD Without K4M 100.60 M–1 (r2=0.9684) 115.80 M–1 (r2=0.9969) With K4M 330.46 M–1 (r2=0.9255) 392.03 M–1 (r2=0.9545) With K4M and autoclaving 777.17 M–1 (r2=0.9846) 488.88 M–1 (r2=0.9540) Without K4M and autoclaving 1393.44 M–1 (r2=0.9963) 630.11 M–1 (r2=0.9855) tive effect on diclofenac complexation. This methods has been extensively used to the preparation of solid inclusion complexes [15, 16]. Preparation and characterization of solid inclusion complexes Freeze-drying was chosen as the method of preparation of solid inclusion complexes. It is a common technique that allows the preparation of cyclodextrin inclusion complexes with a high yield [17]. The complexes were prepared with a 1:1 drug:cyclodextrin molar ratio, according to the phase solubility diagrams for both CD. The polymer K4M was incorporated in a 0.1 mass/vol% ratio [6, 13]. The solid inclusion complexes were characterized using differential scanning calorimetry (DSC) and X-ray diffractometry. DSC can provide a lot of information on drug/CD interactions in the solid state. The presence of hydrophilic polymer in multicomponent complexes could show different physicochemical properties from the individual cyclodextrin molecules or binary systems [18–21]. Figure 3 shows the DSC curves of the physical mixtures of Diclofenac and BCD as well as these of the solid binary and multicomponent complexes prepared by the freeze-dried method. BCD shows an endothermic peak from 90 to 140ºC, which may be attributed to the evaporation of the adsorbed water. The drug does not have any significant peak in the temperature range analyzed because the melting and decomposition point is 283–285ºC (not shown). The peaks of the evaporation of water appeared in the temperature range of 50–150ºC. A physical mixture prepared with freeze-dried diclofenac and freeze-dried cyclodextrin was analysed. The system shows a similar behaviour to the physical mixture prepared without freeze-drying the compounds. In the freezedried complexes, the plots show the absence of the characteristic endothermic melting peak, while in the physical mixtures in which this peak is clearly visible. The disappearJ. Therm. Anal. Cal., 73, 2003 666 POSE-VILARNOVO et al.: DICLOFENAC CYCLODEXTRIN COMPLEXES Fig. 3 DSC curves of different diclofenac-BCD systems: a – diclofenac; b – BCD; c – K4M; d – physical mixture diclofenac+BCD; e – physical mixture diclofenac+BCD/K4M; f – physical mixture freeze-dried diclofenac+freeze-dried BCD; g – diclofenac-BCD freeze-dried complex and h – diclofenac -BCD/K4M freeze-dried complex ance of the endothermic peaks of the drug is attributed to the amorphous state and the inclusion complexation of the drug inside the cavity [18]. The results of the HPBCD systems were similar to these of BCD (Fig. 4). Figure 5 shows the X-ray diffraction spectra of diclofenac-BCD binary and multicomponent complexes in comparison with the physical mixture. The physical mixtures show diffraction patterns that correspond to the superimposed diffractograms of diclofenac and BCD, while the ones of the freeze-dried complexes show fewer and less intense peaks. All of this indicates that all freeze-dried compounds are markedly less crystalline than the physical mixtures or the pure components. J. Therm. Anal. Cal., 73, 2003 POSE-VILARNOVO et al.: DICLOFENAC CYCLODEXTRIN COMPLEXES 667 Fig. 4 DSC curves of different diclofenac-HPBCD systems: a – diclofenac; b – HPBCD; c – K4M; d – physical mixture diclofenac+HPBCD; e – physical mixture diclofenac+HPBCD/K4M; f – physical mixture freeze-dried diclofenac+freeze-dried HPBCD; g – diclofenac-HPBCD freeze-dried complex and h – diclofenac-HPBCD/K4M freeze-dried complex Fig. 5 X-ray diffraction patterns of different diclofenac-BCD systems: a – diclofenac; b – BCD; c – K4M; d – physical mixture diclofenac+BCD; e – physical mixture diclofenac+BCD/K4M; f – physical mixture freeze-dried diclofenac+freeze-dried BCD; g – diclofenac-BCD freeze-dried complex and h – diclofenac-BCD/K4M freeze-dried complex In the same way of BCD, the X-ray diffractograms of HPBCD complexes consisted fundamentally of a single very broad band, whereas these of physical mixtures of the same compositions corresponded to superimposition of the individual components diffractograms (Fig. 6). X-ray and DSC studies indicate the formation of amorphous binary and multicomponent complexes by freeze-drying bcetween the cyclodextrins and the drug. Effect of complexation on the dissolution of diclofenac The dissolution profiles corresponding to the pure drug, physical mixtures and the inclusion complexes (binary and multicomponent systems) in simulated gastric juice are shown in Figs 7 and 8. One-way ANOVA of the dissolution efficiency 0–180 min revealed significant differences between the formulations (BCD: F4,10=88.45, α<0.05; HPBCD: F4,10=96.49, α<0.05). The Sheffé test grouped the formulations as follows: where Diclofenac+CD are the binary physical mixtures, Diclofenac–CD the binary complexes, Diclofenac+CD/K4M the multicomponent physical mixtures and Diclofenac–CD/K4M are the multicomponent complexes. The effect of the polymer in the complex depends on the cyclodextrin used. In the case of BCD, the liberation of the drug is delayed from the multicomponent system, showing the typical profile of a sustained release formulation. In fact, although J. Therm. Anal. Cal., 73, 2003 668 POSE-VILARNOVO et al.: DICLOFENAC CYCLODEXTRIN COMPLEXES Fig. 6 X-ray diffraction patterns of different diclofenac-HPBCD systems: a – DIC; b – HPBCD; c – K4M; d – physical mixture diclofenac+HPBCD; e – physical mixture diclofenac+HPBCD/K4M; f – physical mixture freeze-dried diclofenac+freeze-dried HPBCD; g – diclofenac-HPBCD freeze-dried complex and h – diclofenac-HPBCD/K4M freeze-dried complex the stability constant of BCD is higher when the polymer is present, for the multicomponent system prepared with K4M, the dissolution rate of the drug is lower compared with the binary system. It seems when the complex makes contact with the dissolution medium, K4M swells and controls the release of the drug [22] and, therefore, the effect of the CD complexation disappears. A similar behaviour has been found with both CDs in the case of a non-ionic drug such as sulphamethizole [6]. Nevertheless, HPBCD multicomponent complex significantly increases the solubility of the drug compare to the binary complex. Conclusions Our results show that K4M could enhance the complexation of diclofenac with cyclodextrins in solution. This effect on diclofenac solubility is only evident if an autoclaving process is included to promote the interaction between the cyclodextrin and the polymer. Solid multicomponent inclusion complexes with BCD or HPBCD and K4M can be obtained by freeze-drying and their formation has been probed by J. Therm. Anal. Cal., 73, 2003 POSE-VILARNOVO et al.: DICLOFENAC CYCLODEXTRIN COMPLEXES 669 Fig. 7 Dissolution profiles of DIC and different DIC-BCD systems: a – DIC; b – physical mixture DIC+BCD; c – DIC-BCD freeze-dried complex; d – physical mixture DIC+BCD/K4M and e – DIC-BCD/K4M freeze-dried complex Fig. 8 Dissolution profiles of DIC and different DIC-HPBCD systems: a – DIC; b – physical mixture DIC+HPBCD; c – DIC-HPBCD freeze-dried complex; d – physical mixture DIC+HPBCD/K4M and e – DIC-HPBCD/K4M freeze-dried complex using DSC and X-ray diffraction techniques. The solid diclofenac-BCD multicomponent systems do not improve the solubility effect of the cyclodextrin, in fact, the polymer allows to control the drug dissolution rate extending the process. Nevertheless, the polymer increases the solubilizing effect of HPBCD not only in solution but also from a solid system. *** This work was funded by the Xunta de Galicia under project PGIDT01BIO20302PR. The authors thank Roquette-Laisa España and Janssen Pharmaceutiche for generous donation of BCD and HPBCD, respectively. References 1 T. Loftsson and M. E. Brewster, J. Pharm. Sci., 85 (1996) 1017. 2 T. Loftsson, M. Másson and J. F. Sigurjónsdóttir, S. T. P. Pharma Sci., 9 (1999) 237. 3 E. Redenti, L. Szente and J. Szejtli, J. Pharm. Sci., 89 (2000) 1. 4 E. Redenti, L. Szente and J. Szejtli, J. Pharm. Sci., 90 (2001) 979. 5 M. Valero, I. Pérez-Revuelta and L. J. Rodríguez, Int. J. Pharm., 253 (2003) 97. 6 J. Savolainen, K. Kärvinen, H. Taipale, P. Jarho, T. Loftsson and T. Järvinen, Pharm. Res, 15 (1996) 1696. 7 B. Pose-Vilarnovo, C. Rodríguez-Tenreiro Sánchez, M. B. Pérez-Marcos and J. J. Torres-Labandeira, J. Therm. Anal. Cal., 68 (2002) 657. 8 C. M. Adeyeye and P. H. Li, Diclofenac sodium. In: K. Florey, Ed., Analytical Profiles of Drugs Substances, New York, Academic Press 1990, p. 123. 9 T. Backensfel, B. W. Müller and K. Kolter, Int. J. Pharm., 74 (1991) 85. 10 J. A. Arancibia and G. M. Exandar, Analyst, 124 (1999) 1833. 11 B. Pose-Vilarnovo, L. Santana-Penín, M. Echezarreta-López, M. B. Pérez-Marcos, J. L. Vila-Jato and J. J. Torres-Labandeira, S. T. P. Pharma Sci., 9 (1999) 231. 12 T. Higuchi and K. A. Connors, Adv. Anal. Chem. Instr., 4 (1965) 117. 13 T. Loftsson, H. FridriksdÙttir, S. Thórisdóttir and E. Stefánsson, Int. J. Pharm., 104 (1994) 181. 14 K. A. Khan, J. Pharm. Pharmacol., 27 (1975) 48. 15 Y. Nakai, K. Yamamoto, K. Terada and D. Watanabe, Chem. Pharm. Bull., 38 (1990) 1345. 16 Y. Nakai, K. Yamamoto, Y. Toshio, E. Yanomochi and T. Hanawa, Chem. Pharm. Bull., 35 (1987) 4609. 17 M. Kurozumi, N. Nambu and T. Nagai, Chem. Pharm. Bull., 23 (1975) 3062. 18 N. Morin, A. Chilouet, J. Millet and J.-C. Rouland, J. Therm. Anal. Cal., 62 (2000) 187. 19 T. Loftsson, T. K. Gudmundsdóttir and H. Fridriksdóttir, Drug Dev. Ind. Pharm., 22 (1996) 401. 20 T. Loftsson, Pharmazie, 53 (1998) 733. 21 E. M. Sammy and S. M. Safwat, S. T. P. Pharma Sci., 4 (1994) 458. 22 M. J. Vázquez, B. Pérez-Marcos, J. L. Gómez-Amoza, R. Martínez-Pacheco, C. Souto and A. Concheiro, Drug Dev. Ind. Pharm., 18 (1992) 1355. J. Therm. Anal. Cal., 73, 2003 670 POSE-VILARNOVO et al.: DICLOFENAC CYCLODEXTRIN COMPLEXES from Dow Chemical (USA), h-CD (molecular weight 1135, solubility in water 1.85 g/100 ml) and h-CD (4.6 d.s, solubility in water >60 g/100 ml) from RoqueteLaisa (Spain) and Janssen Pharmaceutical (Belgium), respectively, lactose from Merck (Spain) and magnesium stearate from J. Escuder (Spain). 2.1.1. Gels preparation and characterization Gels were prepared by adding, under stirring, given amounts of HPMC K4M to diclofenac (50 mg/100 ml) or sulphamethizole (10 mg/100 ml) aqueous solution, containing or not cyclodextrin (1:0, 1:0.5, 1:1 and 1:3 drug/CD mole ratio). The dispersions were stored at 4 jC for 24 h for a complete swelling of the polymer and homogenisation of the systems before characterization. 2.1.2. Apparent viscosity Cinematic viscosity measurements were carried out, by sextuplicate, in Cannon-Fenske capillary viscometers at 37 jC. 2.1.3. Cloud point Cloud point (i.e., the temperature at which the transmittance is half that at room temperature) was determined in 1.0% HPMC dispersions, without and with 1.0% drug, containing 0.25%, 0.50% or 1.0% of each cyclodextrin, by measuring the transmittance at 800 nm in a Shimadzu UV-240 (Japan) spectrophotometer, at increasing temperatures (5 jC steps until close to cloud point, then 0.2 jC steps) [18]. 2.1.4. Diffusion studies Drug diffusion profiles from the different systems were obtained by triplicate in horizontal diffusion cells (Afora, Espan ˜a), thermostatted at 37 jCand fitted with cellulose acetate filters (0.45 Am pore size, Teknokroma, Spain) after storage at the same temperature for at least 1 h. The area available for diffusion was 0.7654 cm 2 . The donor compartment contained 3 ml of gel, while the receptor compartment was filled with 3 ml deionized water. In both compartments, magnetic stirring (750 rpm) was applied. Samples of 0.5 ml were taken from the receptor medium at each predetermined sampling time, and immediately replaced with fresh medium. Diclofenac or sulphamethizole concentration in the receptor cell was determined by measurement of the absorbance at 276 nm (E 1%,1 cm = 283.85) or 264 nm (E 1%,1 cm = 577.31), respectively, in a Shimadzu UV-240 (Japan) spectrophotometer. Cyclodextrins did not interfere in the absorbance lecture. Diffusion coefficients, D, were estimated using the equation [19]: D¼B*lm=C1ð1Þ where Brepresents the slope of the release profile, l m the thickness of the cellulose membrane and C 1 the initial concentration of drug in the gels. 2.2. Preparation and characterization of matrix tablets Tablets containing 100 mg of diclofenac sodium or sulphamethizole were prepared, with 400 mg of polymer/cyclodextrin/lactose blends (Turbula T2C, Switzerland, 10 min) of different composition (Table 1), by direct compression in an instrumentalized Korsh Eko press (Germany) equipped with 12mm flat punches, applying a compression force of 4.0–4.5 kN. 2.2.1. Dimensions The dimensions of the tablets were measured by sextuplicate with a Mitutoyo (Japan) digital micrometer. 2.2.2. Friability The friability of 10 tablets from each batch was determined using a Pharma Test (Germany) model PTF10E at 20 rpm for 15 min. Table 1 Simplex centroid design used to prepare the tablet formulations Formulation no. x 1 (% HPMC) x 2 (% CD) x 3 (% Lac) 1 100 0 0 2 0 100 0 3 0 0 100 450500 550050 6 0 50 50 7 33.3 33.3 33.3 8 66.6 16.7 16.7 9 16.7 66.6 16.7 10 16.7 16.7 66.6 B. Pose-Vilarnovo et al. / Journal of Controlled Release 94 (2004) 351–363 353 Fig 1. Diffusion profiles of diclofenac sodium from gels prepared with 0.5%, 1% and 2% of HPMC. Key: (E) drug; (w) drug–CD 1:0.5; (o) drug–CD 1:1; (5) drug–CD 1:3. B. Pose-Vilarnovo et al. / Journal of Controlled Release 94 (2004) 351–363354 Fig 2. Diffusion profiles of sulphamethizole from gels prepared with 0.5%, 1% and 2% of HPMC. Key: (E) drug; (w) drug– CD 1:0.5; (o) drug–CD 1:1; (5) drug–CD 1:3. B. Pose-Vilarnovo et al. / Journal of Controlled Release 94 (2004) 351–363 355 2.2.3. Tensile strength The tensile strength was calculated for each six tablets from the equation [20], Tensile strength ¼2CS=ðpdeÞð2Þ where CS is the crushing strength determined in an Erweka (Germany) TB-2A apparatus, ddenotes the diameter of the tablet and eis its thickness (measured using a Mitutoyo digital micrometer). 2.2.4. Dissolution rate Time-course of diclofenac and sulphamethizole release were determined at 37 jCinaTuruGrau (Spain) apparatus adapted to meet the specifications of the method II of USP 24 [21] . The tablets were introduced in small metallic baskets to avoid flotation and attachment to the vessel [22]. The dissolution medium was 900 ml of distilled water, stirred at 100 rpm. The concentration of the drug in 5 ml periodically taken samples was determined spectrophotometrically as described for the diffusion tests. The release profiles between 10% and 70% release were characterized by fitting the Higuchi equation [23]: Mt=Ml¼KHt0:5ð3Þ where M t corresponds to the amount of drug released in time t,M l is the total amount of drug released after infinite time and Kdenotes a release rate constant. 2.3. Experimental design and statistical analysis Gel composition followed a 4 2 factorial design in order to study the influence of HPMC proportion (0%, 0.5%, 1.0% and 2.0%) and the drug/CD mole ratio (1:0, 1:0.5, 1:1 and 1:3) on drug diffusion coefficient. The composition of the tablet formulations was adjusted to a simplex centroid design for blends of three variables at six levels each one (Table 1) [24]. Each formulation is designed by its number mixture, followed by B (when X 2 was h-CD) or H (when X 2 was HP-h-CD), and the letters DIC or SUL depending if the formulation contains diclofenac or sulphamethizole. To quantify the effect of the variables analysed on the K H , a step-wise linear multiple regression (a< 0.05) was used (StatgraphicsRv.7.0). Applying this procedure, in the case of simplex centroid design, the parameters of the second-order canonical equations: y¼b1x1þb2x2þb3x3þb12 x1x2þb13 x1x3 þb23 x2x3ð4Þ and the reduced cubic-order canonical equations were obtained: y¼b1x1þb2x2þb3x3þb12 x1x2þb13 x1x3 þb23 x2x3þb123 x1x2x3ð5Þ where the variables x 1 ,x 2 and x 3 represent the percentage of HPMC, cyclodextrin and lactose in the mixture, respectively, and the coefficients b 1 ,b 2 and b 3 equal to the values of the response property in question for the pure HPMC, cyclodextrin or lactose tablet [24].To decide whether to use the second-order canonical model or the cubic model, we calculated the Akaike Information Criterion (AIC) [25]: AIC ¼NlnRSS þ2pð6Þ where Nis the total number of data points, RSS the residual sum of squares and pthe number of parameters Table 2 Diffusion coefficient ( 10 6 ) and viscosity of diclofenac in HPMC gels; mean value (standard deviation), n=3 0% HPMC 0.5% HPMC 1% HPMC 2% HPMC D(cm 2 s 1 )g(mPa s) D(cm 2 s 1 )g(mPa s) D(cm 2 s 1 )g(mPa s) D(cm 2 s 1 )g(mPa s) DIC 64.8 (6.9) 0.70 (0.00) 31.6 (4.3) 12.8 (0.4) 14.8 (1.0) 78.3 (1.2) 6.1 (1.0) 973 (24) DIC/h-CD 1/0.5 63.4 (0.4) 0.74 (0.00) 30.8 (6.4) 9.9 (0.0) 17.4 (1.4) 70.9 (0.9) 7.4 (0.8) 881 (16) DIC/h-CD 1/1 63.4 (1.3) 0.71 (0.00) 32.8 (2.0) 10.2 (0.2) 21.5 (1.0) 71.2 (2.2) 7.5 (0.2) 1020 (3) DIC/h-CD 1/3 67.4 (8.1) 0.71 (0.00) 31.8 (4.7) 11.8 (0.2) 21.8 (0.9) 77.4 (1.8) 5.9 (1.0) 1010 (21) DIC/HP-h-CD 1/0.5 61.1 (6.2) 0.71 (0.00) 35.5 (4.8) 9.8 (0.0) 19.0 (3.6) 70.9 (1.7) 8.6 (0.5) 895 (58) DIC/HP-h-CD 1/1 61.6 (4.8) 0.71 (0.00) 43.3 (1.4) 10.8 (0.1) 18.7 (1.4) 81.9 (0.6) 6.9 (0.4) 1080 (6) DIC/HP-h-CD 1/3 65.8 (4.4) 0.71 (0.00) 31.7 (0.4) 12.7 (0.1) 22.3 (2.9) 72.1 (2.0) 5.0 (0.8) 1160 (7) B. Pose-Vilarnovo et al. / Journal of Controlled Release 94 (2004) 351–363356 fitted. In each case, the model selected was that which gave the lowest AIC value. The data for the contour plots were generated using MATLAB 6.5 (The MathWorks, Natick, MA). 3. Results and discussion 3.1. Gels The presence of drug and cyclodextrin did not significantly modify the cloud point of 1% HPMC K4M dispersions, which was around 72.1 F0.3 jC in all gels. Changes in this parameter are related to a competition of additives with the polymer for water and with changes in conformation of its chains, which may affect the diffusion processes [26]. The data obtained indicate that the hydrophilicity and water ‘‘structure’’ around the cellulose ether did not experiment significant changes in the systems analysed. Additionally, since the concentrations of diclofenac sodium and sulphamethizole in the gels were lower than their solubility coefficient in water, the effect of drug complex formation with cyclodextrin should be mainly on the diffusivity through the HPMC network. The amount of diclofenac (Fig. 1) or sulphamethizole (Fig. 2) diffused on a given time strongly decreased as the proportion of HPMC increased. This effect becomes especially evident when calculating the diffusion coefficients corresponding to each gel (Tables 2 and 3); an exponential decay as a function of HPMC concentration is observed [27]. It is also interesting to note that in the absence of HPMC, all solutions had similar diffusion coefficients irrespectively of the nature of the drug and the cyclodextrin and also of the proportion of cyclodextrin incorporated; significantly lower diffusion coefficients were only observed for sulphamethizole in the presence of the greatest HP-h-CD proportion. Increasing HPMC concentration, high drug/CD proportions tend to promote drug diffusion, while the opposite effect is observed for low drug/CD ratios. This may be explained in terms of the mesh size of the polymer network and the possible interactions between the components of the gel. HPMC concentrations selected cover a wide range of intermolecular association states. HPMC K4M intrinsic viscosity in water at 20 jC was previously estimated to be around 7.3 dl/g [2]. This means that its overlapping concentration is approximately 0.14 % and its entanglement concentration is slightly below 1% [28]. Therefore, it can be expected that the effect of the hydrodynamic size of the diffusant will be particularly evident in the lowest mesh size and the greatest tortuosity 2% HPMC systems. On the other hand, diclofenac sodium is an amphiphilic molecule that, although completely ionised under the experimental conditions in which the studies were carried out, can establish hydrophobic interactions with the less polar regions of cellulose chains [29]. The high hydrophobicity of sulphamethizole suggests a similar behavior. Therefore, their complexation with hydrophilic CD should prevent such interaction making the diffusion easier. This explains the fact that, in general, drug/CD 1:1 formulations in 0.5% and 1% HPMC gels, and drug/CD 1:0.5 in 2% HPMC gels, show the greatest diffusion coefficients. In contrast, an excess of CD may contribute to increase the tortuosity of the diffusional path of the drug/CD complexes, especially the bulky HPh-CD in the dense 2% HPMC systems (Tables 2 and 3). The one-way ANOVA test indicated the existence Table 3 Diffusion coefficient ( 10 6 ) and viscosity of sulphamethizole in HPMC gels; mean value (standard deviation), n=3 0% HPMC 0.5% HPMC 1% HPMC 2% HPMC D(cm 2 s 1 )g(mPa s) D(cm 2 s 1 )g(mPa s) D(cm 2 s 1 )g(mPa s) D(cm 2 s 1 )g(mPa s) SUL 66.4 (5.2) 0.71 (0.00) 31.6 (1.1) 9.2 (0.0) 15.9 (2.9) 69.8 (1.9) 8.5 (0.1) 878 (13) SUL/h-CD 1/0.5 60.9 (5.2) 0.71 (0.00) 38.9 (4.6) 9.7 (0.3) 21.6 (2.5) 67.3 (1.3) 9.3 (0.3) 940 (11) SUL/h-CD 1/1 64.9 (6.4) 0.74 (0.00) 41.8 (3.9) 10.1 (0.1) 17.9 (3.5) 72.9 (0.4) 9.6 (3.5) 930 (19) SUL/h-CD 1/3 60.4 (7.2) 0.71 (0.00) 32.8 (2.4) 9.6 (0.0) 17.1 (3.5) 73.5 (2.2) 8.9 (1.4) 722 (4) SUL/HP-h-CD 1/0.5 66.4 (1.6) 0.73 (0.00) 36.3 (6.4) 9.9 (0.1) 17.7 (4.7) 77.7 (0.9) 9.6 (1.6) 796 (15) SUL/HP-h-CD 1/1 55.6 (4.4) 0.71 (0.00) 34.6 (3.7) 10.1 (0.1) 14.3 (1.8) 70.6 (0.2) 8.7 (1.9) 766 (23) SUL/HP-h-CD 1/3 49.4 (5.2) 0.70 (0.00) 27.5 (1.2) 9.5 (0.0) 19.6 (2.9) 65.8 (0.6) 7.9 (0.6) 825 (10) B. Pose-Vilarnovo et al. / Journal of Controlled Release 94 (2004) 351–363 357 of statistically significant effect (a< 0.05) of the proportion of CD on the drug diffusion coefficient, except to the SUL in 2% HPMC gels. The presence of 2% HPMC K4M in the drug dispersions increased the viscosity 1400 times. On the other hand, the microviscosity which provides information about the resistance to the drug diffusion and estimated as [2]: g¼g0 D0 Dð7Þ where g 0 is the viscosity of water, and Dand D 0 represent the drug diffusion coefficients in the gel and in water, respectively, increased less than 10 times (Tables 2 and 3). Additionally, while the differences in apparent viscosity, or macroviscosity, for a given percentage of HPMC are almost null, the changes that occur in the microenvironment through which the drug diffuses are, depending on the cyclodextrin proportion, very remarkable as shown by the different diffusion coefficients obtained. This highlights the limitations of using just macroviscosity to predict drug diffusion behavior through polymer dispersions [6]. 3.2. Tablets To prepare the matrix tablets a simplex centroid experimental design was followed (Table 1). Despite having a similar weight (0.500 F0.020 g), tablets differed in thickness (between 3.6 and 4.5 mm), friability and tensile strength. The formulations with greatest proportions of lactose (mixtures no. 3 (100%) Fig 3. Dissolution profiles of the formulations prepared with diclofenac sodium or sulphamethizole and h-CD or HP-h-CD according to the experimental design (Table 1). Key: (5) no. 1; (.) no. 2; (D) no. 3; (z) no. 4; (w) no. 5; (E) no. 6; (Z) no. 7; ( ) no. 8; (1) no. 9; (o) no. 10. B. Pose-Vilarnovo et al. / Journal of Controlled Release 94 (2004) 351–363358 and no. 10 (66.66%)) showed the greatest friability and lowest tensile strength; this effect was particularly evident in the case of sulphamethizole tablets, which friability (up to 50%) was the only above the Pharmacopoeia limit [21]. Tablets prepared with no HPMC (nos. 2, 3 and 6) did not behave as matrix systems, rapidly disintegrating and releasing in the first 15 min all drug loaded (Fig. 3). In contrast, the tablets containing just HPMC as excipient showed the most sustained profile. Similar results were observed for the release of adinazolam mesylate from HPMC K4M/ lactose tablets [5]. Lactose is a soluble excipient that facilitates the penetration of water inside the tablet and, therefore, widely used to enhance the release rate of sparingly soluble drugs. When the proportion of lactose or other hydrosoluble excipients is high, tablets disintegrate quickly. This effect has been reported for carbamazepine/h-CD in HPMC K100LV matrices containing less than 15% of polymer [30].To the best of our knowledge, no study with ternary mixtures polymer/CD/lactose has been carried out yet. Incorporation of cyclodextrins and lactose in different proportions provided a way of modulating drug release profiles, which were well fitted by the Higuchi equation [23] (correlation coefficients, r 2 >0.97). The values of the rate constant obtained, summarized in Tables 4 and 5, were statistically different (one-way ANOVA test, a< 0.01). The application of a multiple range test (StatgraphicsRv.7.0) indicated that the formulations 4B-DIC and 5B-DIC have not statistically different release rates. In the case of sulphamethizole, release rates from formulations 9B-SUL and 10B-SUL, and from 5B-SUL and 8B-SUL, were not significantly different (a< 0.01). The plots of K H versus the percentage of HPMC (Fig. 4) evidence the strong influence of this variable on drug release rate; the decrease in K H being expoTable 5 Drug release rate constant of the tablets elaborated with sulphamethizole and HPMC/CD/lactose in the ratios shown in Table 1 Formulation Experimental K H (%min 0.5 ) Predicted K H (%min 0.5 ) Formulation Experimental K H (%min 0.5 ) Predicted K H (%min 0.5 ) 1B-SUL 1.26 (0.07) 1.31 1H-SUL 1.26 (0.07) 1.26 2B-SUL – – 2H-SUL – 3B-SUL – – 3H-SUL – 4B-SUL 2.71 (0.18) 2.77 4H-SUL 3.07 (0.22) 3.07 5B-SUL 2.48 (0.19) 2.54 5H-SUL 2.59 (0.17) 2.58 6B-SUL – – 6H-SUL – 7B-SUL 3.97 (0.39) 4.14 7H-SUL 3.77 (0.34) 3.76 8B-SUL 2.37 (0.21) 2.16 8H-SUL 1.73 (0.11) 1.44 9B-SUL 5.25 (0.10) 5.19 9H-SUL 6.18 (0.42) 6.18 10B-SUL 5.28 (0.42) 5.23 10H-SUL 5.06 (0.52) 5.07 The results of the statistical analysis are shown in Fig. 4. Table 4 Drug release rate constant of the tablets elaborated with diclofenac sodium and HPMC/CD/lactose in the ratios shown in Table 1 Formulation Experimental K H (%min 0.5 ) Predicted K H (%min 0.5 ) Formulation Experimental K H (%min 0.5 ) Predicted K H (%min 0.5 ) 1B-DIC 2.62 (0.18) 2.62 1H-DIC 2.63 (0.09) 2.75 2B-DIC – – 2H-DIC – – 3B-DIC – – 3H-DIC – – 4B-DIC 3.65 (0.15) 3.65 4H-DIC 4.04 (0.08) 4.15 5B-DIC 3.74 (0.23) 3.75 5H-DIC 4.36 (0.18) 4.48 6B-DIC – – 6H-DIC – – 7B-DIC 4.18 (0.14) 4.20 7H-DIC 4.71 (0.07) 5.06 8B-DIC 3.09 (0.11) 3.07 8H-DIC 3.76 (0.06) 3.29 9B-DIC 4.96 (0.23) 4.95 9H-DIC 6.58 (0.46) 6.46 10B-DIC 5.40 (0.15) 5.40 10H-DIC 7.09 (0.49) 6.97 The results of the statistical analysis are shown in Fig. 4. B. Pose-Vilarnovo et al. / Journal of Controlled Release 94 (2004) 351–363 359 nentially as observed for the diffusion coefficients through the gels, and as can be predicted by the hydrodynamic model developed by Phillies and Clomenil [31]. Nevertheless, the plots also highlight the effect of the presence of cyclodextrins compared to lactose. Interestingly, opposite effects were observed for diclofenac and sulphamethizole. For the most hydrophilic diclofenac, a higher cyclodextrin/lactose ratio significantly decreased the release rate (Table 4; Fig. 4). The concentration of polymer in the hydrated layer surrounding a HPMC matrix has been estimated by Lindner and Lippold [32] to be around 6%. Therefore, in the case of the matrix tablets prepared with mixtures of HPMC and cyclodextrin, the decrease in diffusivity of the drug incorporated to cyclodextrin complexes through the hydrated polymer layer should be even more evident than in the 2% HPMC gels. In contrast, formulations containing sulphamethizole showed an increase in drug release rate when the cyclodextrins are present in the matrix instead of lactose. Complexation with the cyclodextrins strongly increases sulphamethizole solubility in water [17], and, consequently, this enhances the release process. This effect was particularly important in the case of the most hydrophilic cyclodextrin, HPh-CD. Rao et al. [11] also reported an increase in release rate of prednisolone from 25% HPMC K100M matrix tablets containing a highly water soluble cyclodextrin derivative, SBE-h-CD. Although the release tests are carried out using a volume of liquid much greater than the one needed to obtain a saturated solution of the drug, the release process initially involves the dissolution of the drug and, then, its diffusion through the gel layer of the hydrated tablet. During this process, cyclodextrins can act as solubilizing agents, promoting drug release, but also hinder the diffusion acting as obstacles in the diffusional path. The first effect will be dominant in the case of Fig 4. Effect of hydroxypropylmethylcellulose proportion on drug release rate from matrix tablets; for the formulations prepared incorporating CD and lactose in a different proportion (polymer percentage of 16.66% and 50%), those with a greater CD/lactose ratio (open symbols) showed lower diclofenac sodium release rates but greater sulphamethizole release rates (*significant differences at alevel of 0.01). B. Pose-Vilarnovo et al. / Journal of Controlled Release 94 (2004) 351–363360 hydrophobic drugs, and the second one in the case of hydrophilic drugs. The second-order canonical equation derived from the simplex centroid design to which the formulation composition was adjusted is shown in Fig. 5.To calculate their coefficients, we used the rate constants obtained without considering the release profiles of formulations without polymer (nos. 2, 3 and 6), i.e., a Fig 5. Contour plots of the release rate constants (K H ) estimated using the second-order canonical equations obtained by fitting to the experimental values shown in Tables 4 and 5 (x 1 : % HPMC; x 2 : % CD; x 3 : % Lactose). B. Pose-Vilarnovo et al. / Journal of Controlled Release 94 (2004) 351–363 361 constrained model that do not take into account the formulations that have no acceptable mechanical properties and do not behave as matrices. The values predicted by the canonical equations fitted quite well the experimental values of K H obtained for the formulations that contain, at least, 16.66% HPMC K4M, as can be seen in Tables 4 and 5 for values predicted with the second-order canonical equations. Since these equations had correlation coefficients, r 2 , and Fvalues as good as the third-order canonical equations, and the test points of the model, which are the data corresponding to formulation no. 7, provided values similar to the experimental ones, the secondorder canonical equations should be selected to avoid the use of unnecessary complexes equations (Akaike Information Criterion) [25]. The values of the coefficients of x 2 and x 3 and the tendency shown in the contour plots clearly corroborate that, compared to lactose, cyclodextrins, especially HP-h-CD, delay the release of diclofenac and accelerate the release of sulphamethizol. The canonical equations are particularly useful to quantify the effect of the different variables and to predict to what extent the release profile can be modulated by choosing an adequate excipient mixture. 4. Conclusions h-Cyclodextrin and hydroxypropyl-h-cyclodextrin strongly determine the diffusivity through gels and the dissolution rate from the tablets of drugs with which they can form inclusion complexes. For given HPMC and drug proportions, low CD concentrations promote drug diffusion by decreasing drug interactions with the polymer, while the opposite effect is observed for high CD concentrations; the free cyclodextrins increasing the tortuosity of the diffusional path. In the case of the tablets, an additional factor, the solubilizing capacity of cyclodextrins, needs to be considered. This effect is particularly important for the more hydrophobic sulphamethizol; the release rate being greater for HPMC matrix tablets containing cyclodextrins. In contrast, the delay in the release profile of the hydrophilic diclofenac may be attributed to the hindering effect of free cyclodextrins on drug diffusivity. The simplex centroid design used to prepare the tablets allowed to obtain the secondorder canonical equations, which are particularly useful to predict the release behavior of tablets containing mixtures of HPMC, cyclodextrin and lactose. Acknowledgements This work was financed by the Xunta de Galicia, Spain (PGIDIT02BTF20302PR; PGIDIT02BIO20302PR), and by the Ministerio de Ciencia y Tecnologı ´a, Spain (RYC 2001/8). The authors want to thank Prof. JL Gomez-Amoza for his assistance in generating the data for the contour plots, and RoqueteLaisa (Barcelona, Spain) and Janssen Pharmaceutical (Belgium) for providing samples of cyclodextrins, and to Dow Chemical for samples of HPMC. References [1] M.J. Va ´zquez, B. Pe ´rez-Marcos, J.L. Gomez-Amoza, R. Martinez-Pacheco, C. Souto, A. Concheiro, Influence of technological variables on release of drugs from hydrophilic matrixes, Drug Dev. Ind. Pharm. 18 (1992) 1355–1375. [2] C. Alvarez-Lorenzo, R. Duro, J.L. Gomez-Amoza, R. 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