Estudio de la influencia de factores externos en la modificación del microbioma y estado nutricional poblacional

TESIS DE DOCTORADO ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE FACTORES EXTERNOS EN LA MODIFICACIÓN DEL MICROBIOMA Y ESTADO NUTRICIONAL POBLACIONAL Paula Roca Saavedra ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN INNOVACIÓN EN SEGURIDADE E TECNOLOXÍAS ALIMENTARIAS LUGO 2017 DECLARACIÓN DO AUTOR DA TESE [Estudio de la influencia de factores externos en la modificación del microbioma y estado nutricional poblacional] Dña. Paula Roca Saavedra Presento a miña tese, seguindo o procedemento adecuado ao Regulamento, e declaro que: 1) A tese abarca os resultados da elaboración do meu traballo. 2) No seu caso, na tese se fai referencia as colaboracións que tivo este traballo. 3) A tese é a versión definitiva presentada para a súa defensa e coincide ca versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que a tese non incorre en ningún tipo de plaxio de outros autores nin de traballos presentados por min para a obtención de outros títulos. En Lugo, 19 de Decembro de 2017 Asdo. Paula Roca Saavedra AUTORIZACIÓN DO DIRECTOR / TITOR DA TESE [Estudio de la influencia de factores externos en la modificación del microbioma y estado nutricional poblacional] D. José Manuel Miranda López Dña. Alejandra Cardelle Cobas INFORMA/N: Que a presente tese, correspóndese co traballo realizado por Dna. Paula Roca Saavedra, baixo a miña dirección, e a utorizo a súa presentación , considerando que reúne os r equisitos esixidos no R egulamento de Estudos de Doutoramento da USC, e que como director desta non incorre nas causas de abstención establecidas na Lei 40/2015. En Lugo, 19 de Decembro de 2017 Asdo. José Manuel Miranda López Asdo. Alejandra Cardelle Cobas AGRADECIMIENTOS Hace casi 4 años comenzaba una etapa en mi vida como estudiante, una etapa que consistía en subir algunos peldaños más, llenos de convivencia y de aprendizaje, que con la escritura de esta tesis y posterior lectura finaliza en este descansillo. Para que esto ocurriese, tengo que dar las gracias principalmente a mis directores de tesis al Dr. José Manuel Miranda López y Dra. Alejandra Cardelle Cobas, por el gran esfuerzo que hicieron en la enseñanza, por guiarme, por los ánimos y confianza mostrados en mí, por la constancia y hasta diría por la enorme paciencia que tuvieron durante este tiempo. Una gran suerte poder haber contado con dos personas como ellos que me dirigiesen este trabajo. Quiero extender este agradecimiento a los demás profesores e investigadores del LHICA (Laboratorio de Higiene, Inspección y Control de Alimentos), así como al resto de compañeros. Especial mención al Dr. Alberto Cepeda Sáez, catedrático de la Universidad de Santiago, director del laboratorio y jefe del departamento, por mi inclusión en el mismo. A Alicia Mondragón, compañera, amiga y confidente. Por su especial apoyo en todos estos años, por su disposición, por estar en los momentos más difíciles y porque sin ella esta convivencia no sería la misma, como tampoco lo serían las reuniones con su comida mexicana, la Thermomix, ni los conciertos. A Carolina Nebot, compañera y amiga. Por amenizar las mañanas, siempre dispuesta a echar una mano, como también a dar su apoyo y punto de vista en días grises, porque de no ser por su ayuda, aún hoy, estaría peleándome con el formato de este documento. A María Veiga, compañera y amiga, agradezco su positividad, los momentos de café, las risas, e incluso compartir su deporte preferido, el rugby El agradecimiento es también para mi compañero José Julio Porto por casi 11 años compartidos, porque subir con él, dio menos vértigo. Muchos instantes juntos como estudiante, pero también en los primeros contratos enfermeros y nutricionistas. Ojalá nos sigamos encontrando durante años y años. Agradezco a mis amigos, ya que los días de desconexión también fueron necesarios, a Alba, Katy, Marcos, Iván, Jose, Clara, Tania, Sandra y Mary. Por último, es preciso agradecer a mi familia, a mis padres, porque son el motor y apoyo de todos mis pasos, sin ellos, no sería posible prácticamente nada, ni con la total tranquilidad con la que subí estos peldaños. No puedo olvidar a mis abuelos, porque sé que están deseando que presente este proyecto. Y a Abel, este último año gracias a él, conocí lo que era una genial persona, la estabilidad emocional y el empujón que me faltaba. Gracias. ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS AE: Aceites Esenciales AF: Ácido Fitánico ADI: Ingesta Diaria Admisible ADN: Ácido Desoxirribonucleico AGCC: Ácidos Grasos de Cadena Corta AMACR: Alfa - metilacil - CoA racemasa AP: Ácido Pristánico ARNt: Ácido Ribonucleico de transferente ARNr: Ácido Ribonucleico ribosomal ATCC: American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) ATP: Adenosín Trifosfato ATPasa: Adenosina Trifosfatasa BCCM: Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (Colecciones coordinadas belgas de microorganismos) DA: Dieta Atlántica DAr: Dieta Ártica DASE: Dieta Atlántica del Sur de Europa 4.1.1. Caracterización de la población en estudio ........................ 99 4.1.2. Valoración de la ingesta dietética y grado de adhesión a la DASE ......................................................................................... 101 4.1.3. Valoración de la composición de la microbiota intestinal de los sujetos participantes ............................................................. 104 4.1.4. Composición de la microbiota intestinal en sujetos con diferentes IMC ........................................................................... 106 4.1.5. Composición de microbiota intestinal en sujetos con diferente adherencia a la Dieta Atlántica del Sur de Europa ..... 108 4.1.6. Composición de la microbiota intestinal en sujetos de diferente edad ............................................................................. 109 4.2. CONSUMO DE ÁCIDO FITÁNICO Y SALUD HUMANA: RIESGOS, BENEFICIOS Y TENDENCIAS FUTURAS ............ 111 4.2.1. Fuentes alimentarias de ácido fitánico ............................. 111 4.2.2. Modificación del contenido en ácido fitánico durante la producción de alimentos ............................................................ 115 4.2.3. Riesgos del consumo de ácido fitánico para la salud humana ................................................................................................... 117 4.2.4. Beneficios de la ingestión de ácido fitánico en la salud humana ....................................................................................... 121 4.2.5. Perspectivas de futuro y conclusiones ............................. 123 4.3. DETERMINACIÓN IN VITRO DE LOS EFECTOS DE NIVELES RESIDUALES DE ANTIBIÓTICOS ESTUDIADOS SOBRE LA MICROBIOTA COLÓNICA HUMANA MEDIANTE CULTIVOS PUROS ..................................................................... 124 4.3.1. Evaluación in vitro de niveles residuales de tetraciclina en los alimentos sobre la microbiota intestinal humana mediante cultivos puros ........................................................................................... 124 4.3.2. Evaluación in vitro de niveles residuales de ampicilina en los alimentos sobre la microbiota intestinal humana mediante cultivos puros ........................................................................................... 126 4.3.3. Evaluación in vitro de niveles residuales de sulfadiacina en los alimentos sobre la microbiota intestinal humana mediante cultivos puros ............................................................................. 128 4.4. DETERMINACIÓN IN VITRO DE LOS EFECTOS DE NIVELES RESIDUALES DE ANTIBIÓTICOS ESTUDIADOS SOBRE LA MICROBIOTA COLÓNICA HUMANA MEDIANTE CULTIVOS MIXTOS ................................................................... 129 4.4.1. Evolución in vitro de la microbiota intestinal humana sin adicción de antibiótico ............................................................... 130 4.4.2. Evolución in vitro de la microbiota intestinal humana con adición de tetraciclina ................................................................ 132 4.4.3. Evolución in vitro de la microbiota intestinal humana con adición de ampicilina ................................................................. 136 4.4.4. Evolución in vitro de la microbiota intestinal humana con adición de sulfadiacina ............................................................... 138 4.5. DETERMINACIÓN IN VIVO DE LOS EFECTOS DE LOS ANTIBIÓTICOS ESTUDIADOS SOBRE LA MICROBIOTA COLÓNICA DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN ......... 141 4.5.1. Efectos de los antibióticos ensayados sobre la microbiota intestinal total ............................................................................. 141 4.5.2. Efectos de los antibióticos ensayados sobre el filo Firmicutes ................................................................................................... 143 4.5.3. Efectos de los antibióticos ensayados sobre el filo Bacteroidetes .............................................................................. 144 4.5.4. Efectos de los antibióticos ensayados sobre el filo Actinobacteria ............................................................................ 147 4.5.5. Efectos de los antibióticos ensayados sobre el filo Proteobacteria ............................................................................ 148 4.5.6. Efectos de los antibióticos ensayados sobre el género Bifidobacterium ......................................................................... 150 4.5.7. Efectos de los antibióticos ensayados sobre el género Lactobacillus .............................................................................. 152 4.6. DETERMINACIÓN DE LOS POTENCIALES EFECTOS BENEFICIOSOS DE EXTRACTOS OBTENIDOS A PARTIR DE UVA DE VINO BLANCO Y UVA DE VINO TINTO SOBRE LA MICROBIOTA INTESTINAL HUMANA .................................. 154 4.6.1. Evaluación del crecimiento de los distintos grupos bacterianos en ensayos de fermentación in vitro con cultivos mixtos (inóculos fecales) ....................................................................... 156 4.6.1.1. Evaluación del crecimiento de Bifidobacterium en ensayos de fermentación in vitro con cultivos mixtos ........... 159 4.6.1.2. Evaluación del crecimiento de Lactobacillus en ensayos de fermentación in vitro con cultivos mixtos ......................... 161 4.6.1.3. Evaluación del crecimiento de Bacteroides en ensayos de fermentación in vitro con cultivos mixtos ......................... 162 4.6.1.4. Evaluación del crecimiento de la microbiota total en ensayos de fermentación in vitro con cultivos mixtos ........... 163 4.6.1.5. Evaluación del índice prebiótico en ensayos de fermentación in vitro con cultivos mixtos.............................. 164 5. CONCLUSIONES ........................................................................ 169 6. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................... 173 RESUMEN En la actualidad, es un hecho aceptado la gran importancia que tiene llevar una alimentación adecuada en todas las etapas de nuestro ciclo vital para favorecer un óptimo crecimiento y desarrollo y ayudar al establecimiento de un correcto estado de salud durante toda nuestra vida. Además, también juega un papel fundamental en la prevención de numerosas enfermedades no transmisibles, como son la obesidad, de enfermedades metábolicas y enfermedades inflamatorias intestinales. Actualmente, estas enfermedades, forman parte de uno de los principales riesgos para la salud de la población. En consecuencia, conjuntamente con el incremento del envejecimiento de la población, constituye uno de los principales costes para los sistemas públicos de salud en los países occidentales, lo que pone en riesgo su viabilidad a largo plazo y por consiguiente, nuestro estado de bienestar. Entre las distintas causas que favorecen el desarrollo de dichas enfermedades, en los últimos años se ha prestado mucha atención por parte de la comunidad científica a la influencia que tienen los distintos grupos bacterianos presentes en el intestino humano, denominado microbiota intestinal. En función de la predominancia de unos grupos bacterianos sobre otros, varía la capacidad de asimilación, metabolización y obtención de energía a partir de los nutrientes. De este modo, además de influir sobre el estado de salud de las personas en lo relativo a las enfermedades del tracto digestivo, estos grupos bacterianos también juegan un papel destacado en su estado nutricional. El número de bacterias presentes a lo largo del aparato digestivo humano se va incrementando de modo continuo a partir del estómago, llegando a alcanzar en la parte distal del colon humano una de las comunidades más densamente pobladas. Es precisamente en la región distal del colon donde dichas bacterias juegan un papel más relevante, y cuya población se ha estudiado en más profundidad en la última década. No obstante, todavía no se conoce del todo su función sobre la salud, lo que se refleja, por ejemplo, en que todavía en nuestros días no existe un consenso entre la comunidad científica de cómo debe ser la población bacteriana en condiciones óptimas para la salud del sujeto. Si existe en cambio consenso, en que cuanto mayor sea la diversidad en la microbiota intestinal, mayor efecto beneficioso puede tener en la prevención y el control de la obesidad y otras enfermedades crónicas no transmisibles. A dicha diversidad, al igual que a su cantidad, pueden afectar un buen número de factores diferentes. Algunos de estos factores están directamente relacionados con los alimentos que ingerimos, a los que se conoce como factores dietéticos. No obstante, también existen otros factores, denominados no dietéticos, que pese a no depender del tipo de alimentos que ingerimos, también tienen la capacidad de influir sobre las bacterias intestinales. Entre los factores dietéticos, podemos enumerar el tipo, la calidad y cantidad de macro y micronutrientes que forman parte de nuestra dieta. En función de que en nuestra alimentación predominen proteínas, grasas o hidratos de carbono, estaremos favoreciendo que se multipliquen los grupos bacterianos que más adaptados están a la metabolización de los mismos. Asimismo, algunos micronutrientes, como pueden ser minerales, vitaminas o compuestos con actividad antioxidante y/o antimicrobiana, también tienen la capacidad de influir sobre la microbiota intestinal, pese a ser ingeridos en cantidades muy inferiores a los macronutrientes. También se incluyen como factores dietéticos, aquellos otros que, pese a no formar parte en sí de los alimentos, los tomamos a través de los mismos, ya que durante su proceso de producción y/o elaboración, son añadidos en forma de aditivos (de manera intencionada). Estas sustancias, si bien están presentes en cantidades extremadamente bajas, son muy activas, por lo que tienen la capacidad de alterar de un modo importante tanto la diversidad de la microbiota intestinal como influir en su metabolismo. Adicionalmente, además de aquellos factores que influyen tras su ingesta, también existen otros factores no dietéticos que pueden influir en la composición de la microbiota intestinal. Entre éstos, se ha demostrado en trabajos anteriores que juegan un papel muy importante la genética, el ambiente en el que se desenvuelva el individuo, el estrés al que esté sometido, la localización geográfica en la que vivamos, la edad del sujeto, el ejercicio físico que realice y si es un ejercicio de fondo o de fuerza, etc. Además, también podemos considerar dentro de este grupo a algunos agentes químicos, que tienen capacidad para modular la microbiota intestinal. Dentro de este grupo, podemos citar algunos pesticidas, insecticidas, y especialmente los fármacos. Existen multitud de fármacos, que cuando los tomamos, tienen efectos sobre la composición y la actividad de la microbiota intestinal. Dentro de ellos, se han descrito casos como por ejemplo algunos fármacos antidiabéticos, aunque con mucha diferencia, los que tienen una acción más directa y causan una mayor variación sobre la microbiota intestinal, son los antibióticos. En los países desarrollados, los antibióticos son uno de los grupos fármacológicos más prescritos en medicina humana (especialmente en medicina pediátrica), motivo por el cual se ha prestado mucha atención a los efectos que éstos tienen sobre la microbiota intestinal cuando son administrados a las personas a dosis terapéuticas. De hecho, algunos autores han relacionado el notable incremento de la obesidad infantil en los países desarrollados con la elevada administración de antibióticos a los niños. No obstante, paradójicamente, los efectos sobre la microbiota intestinal que pueden ocasionar los antibióticos a bajas concentraciones han recibido muy poca atención. Este hecho es muy importante, ya que además de emplear los antibióticos para tratar las infecciones que tengamos en nuestro organismo, también ingerimos antibióticos a través de los alimentos, que son empleados en medicina veterinaria para tratar o prevenir infecciones en los animales productores de alimentos. Posteriormente, estos antibióticos pueden ser eliminados a través de productos alimenticios (como la leche o el huevo), o bien permanecer en los tejidos animales (como la carne) que también empleamos como alimentos. De este modo, aún a dosis muy bajas, consumimos antibióticos de modo involuntario, que podrían tener efectos sobre nuestra microbiota intestinal. Teniendo en cuenta todos los aspectos expuestos anteriormente, durante la presente tesis doctoral se han realizado varios ensayos, empleando metodologías destinadas a investigar los efectos de algunos componentes de nuestra dieta tanto en nuestra salud como en nuestra microbiota intestinal. De este modo, se ha realizado una caracterización previa de los sujetos a estudio, una valoración del estado nutricional de dichas personas, y se les han realizado encuestas epidemiológicas, a fin de determinar la influencia de algunos factores externos sobre la modificación de su microbiota, y por ende del microbioma. Además, también se ha procedido a la recogida y tratamiento de muestras fecales humanas, con el fin de analizar la composición de su microbiota. Adicionalmente, se han llevado a cabo estudios in vitro tanto con cultivos puros como con cultivos mixtos (muestras fecales) en un sistema que simula las condiciones del colon distal humano. Finalmente, también se han realizado ensayos in vivo con animales de experimentación, los cuales han sido en condiciones controladas expuestos a bajas concentraciones de antibióticos a través de su alimentación, con el fin de comprobar los efectos que dichos antibióticos tenían en su microbiota intestinal. Mediante los estudios mencionados, se ha realizado una primera aproximación de la microbiota intestinal en muestras de sujetos que viven en la población gallega, dato de gran relevancia ya que era desconocido hasta la fecha. También se ha discutido si dicha microbiota intestinal en la población en estudio, varía en función de sus hábitos de consumo alimentario. El hecho de estudiar fundamentalmente la población gallega es debido fundamentalmente a la afinidad geográfica, y a que en esta región existen unas costumbres alimentarias tradicionales incluidas en el concepto de Dieta Atlántica, que en teoría, presentan características diferenciales con respecto al resto de España. En base a los ensayos realizados, se ha podido concluir que la dieta y la microbiota intestinal de la población gallega es diferente a la de otras poblaciones, al menos en el grupo de sujetos incluidos en el estudio. Además, su alimentación muestra diferencias con respecto a los datos publicados a nivel nacional por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, como son un menor consumo de bebidas, un mayor consumo de frutas, hortalizas, leguminosas y pescado, y un menor consumo de productos de panadería, aperitivos y precocinados. En función de los resultados obtenidos en las encuestas alimentarias, también se ha podido deducir en la población gallega la ingesta de una mayor cantidad de ácido fitánico. Dicho ácido es una molécula procedente de la clorofila, presente en alimentos producidos por animales rumiantes, especialmente cuando éstos se alimentan de pastos verdes, y en productos de la pesca, fundamentalmente en los más grasos. Esta molécula ejerce importantes efectos sobre la salud de las personas, que son discutidos en profundidad en este trabajo. También se ha podido comprobar que la composición de la microbiota intestinal puede verse influida por la edad de los sujetos, ya que las personas de mayor edad mostraron una mayor cantidad de Proteobacteria y Lactobacillus spp. que el resto de los sujetos en estudio. Por otra parte, los sujetos con mayor adherencia a la Dieta Atlántica, mostraron una mayor cantidad de Bifidobacterium spp. en su microbiota intestinal, lo cual induce a pensar que la adherencia a dicha dieta también es capaz de modificar parcialmente la microbiota intestinal. Otro de los aspectos que se tuvieron en cuenta en los ensayos realizados fue estudiar cómo los antibióticos ingeridos a través de los alimentos pueden afectar a largo plazo a las poblaciones bacterianas presentes en el intestino, aún estando éstos a bajas dosis y cumpliendo con los límites máximos de residuos permitidos por la legislación europea. Para ello, se emplearon tres de los antibióticos más usados en medicina veterinaria como son la tetraciclina, la ampicilina y la sulfadiacina, con los que se realizaron ensayos in vitro con cada uno de ellos mediante cultivos puros, cultivos mixtos y ensayos in vivo en animales de experimentación. En el primer ensayo realizado con cultivos puros, la tetraciclina fue capaz de modificar, aun a bajas dosis, la cantidad de bacterias de los géneros Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. y Clostridium perfringens, disminuyendo dichos grupos bacterianos con respecto al grupo control. La ampicilina fue capaz de modificar el crecimiento en este caso de todas las cepas estudiadas a excepción del género Bifidobacterium spp. y de la especie Enterobacter clocae, que se mantuvieron constantes tras la exposición a este antibiótico. En el caso de la sulfadiacina, su exposición ocasionó una disminución del crecimiento de Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei y Clostridium perfringens. Una vez comprobado que en cultivos puros la exposición a los tres antibióticos seleccionados tenía efectos sobre dichos cultivos, se llevó a cabo un segundo ensayo, utilizando en este caso cultivos mixtos, empleando muestras de heces humanas. Para ello, se simuló in vitro la fermentación de la parte distal del colon durante un período de 24 h. Los resultados obtenidos mostraron que, en el caso de la tetraciclina, este antibiótico causó una disminución significativa en las poblaciones bacterianas pertenecientes al filo Bacteroidetes y al filo Actinobacteria, sin embargo, se encontró un incremento en la presencia de bacterias pertenecientes al género Lactobacillus spp. Con respecto a los resultados obtenidos tras la exposición a ampicilina, dicho antibiótico provocó un descenso significativo en el filo Bacteroidetes y un descenso significativo de los géneros Lactobacillus spp. y Bifidobacterium spp. Con la aplicación de sulfadiacina, aumentó de manera significativa la cantidad de bacterias perteneciente al filo Firmicutes, el género Bacteroides sufrió un descenso, al mismo tiempo que provocó un significativo aumento en la presencia de bacterias pertenecientes al género Lactobacillus spp. en la microbiota intestinal. En un tercer ensayo, se determinaron in vivo los efectos de los antibióticos estudiados en los dos casos anteriores sobre la microbiota intestinal de animales de experimentación (ratones C57BL/6). Este ensayo tuvo una duración de 14 semanas, período durante el cual se recogieron muestras de heces de los animales semanalmente. Posteriormente, dichas muestras fueron procesadas y analizadas con el fin de comprobar la evolución de la microbiota intestinal durante este tiempo. Para este fin se determinó la presencia en dichas muestras de los filos principales que componen la microbiota colónica, así como dos géneros considerados beneficiosos para la salud del hospedador, como son el Lactobacillus spp. y Bidobacterium spp. En todos los casos, para observar de forma clara la evolución de la microbiota intestinal, se representaron cuatro semanas de todas las muestras, y una comparación de cada uno de los grupos que habían consumido antibiótico a dosis permitidas por la legislación en el pienso, con el grupo control sin adicción de ningún antibiótico. Analizando los resultados obtenidos en este ensayo, se comprobó que la evolución de la microbiota intestinal de los ratones expuestos a antibióticos fue estadísticamente diferente a los controles en los tres antibióticos estudiados. En un principio, la exposición a antibiótico provocó un descenso significativo de la microbiota total, llegando dicho descenso hasta el octavo día de exposición. A partir de dicho día, los resultados obtenidos comenzaron a ser diferentes en función del antibiótico empleado. Además, en función del filo o género bacteriano, también se ha podido comprobar que los antibióticos empleados ejercen efectos diferentes (y en algún caso, incluso antagónicos) sobre la población en estudio. De este modo, se pudo comprobar que la exposición a los tres tipos de antibióticos empleados provocó un incremento en la cantidad de bacterias pertenecientes al filo Firmicutes con respecto al grupo control. Más extraño resultó el caso de las bacterias pertenecientes al filo Bacteroidetes, los cuales, si bien vieron modificada de modo significativo su evolución ante la exposición a los antibióticos, los efectos fueron diferentes. Así, en el caso de la tetraciclina y la ampicilina, su exposición provocó un descenso significativo en la cantidad de Bacteroidetes en la microbiota fecal, pero, sorpresivamente, Paula Roca Saavedra 4 Desde que De Filippo y col. (2010) publicase que la microbiota fecal de los niños de Burkina Faso (consumidores de dietas altas en fibra) mostrase diferencias muy importantes con relación de la microbiota fecal de los niños italianos (consumidores de una dieta con alto contenido de proteínas y azúcar), la investigación referente a la MI y su relación con la nutrición y la salud humana se ha incrementado de un modo espectacular (Figura 1). Figura 1. Incremento en la actividad investigadora respecto a la microbiota intestinal humana en el período 2000-215. Fuente: ISI web of knowledge Su relación con la obesidad ha sido especialmente estudiada, ya que la obesidad es hoy en día una de las principales preocupaciones sanitarias a nivel mundial. La Organización Mundial de la Salud (OMS, 2016) define el sobrepeso y la obesidad como índices de masa corporal (IMC) mayores o iguales a 25 y 30, respectivamente. Según datos de esta misma organización, en 2014, más de 1.900 millones de adultos de 18 o más años tenían sobrepeso, de los cuales, más de 600 millones eran obesos. Además, 41 millones de niños menores de cinco años tenían sobrepeso o eran obesos. Introducción 5 Actualmente, es un hecho aceptado que la modulación de las poblaciones microbianas del intestino puede tener efectos beneficiosos en la prevención y el control de la obesidad, lo cual se ha explicado mediante diversos mecanismos. Quizás el más influyente sea la diferente capacidad de obtener energía a partir de los nutrientes ingeridos según la composición de la MI que tenga cada persona (Murphy y col., 2013). Sin embargo, hay muchos factores que pueden tener una influencia decisiva en la prevención y tratamiento de la obesidad así como en diversas enfermedades metabólicas, afectando de modo muy importante a la diversidad y al equilibrio de la MI. Algunos de los factores incluso no dietéticos que influyen, pueden ser el estrés, los viajes, la edad, el ejercicio, o las condiciones climáticas y otros factores influyentes dietéticos son los cambios en los hábitos alimentarios, la ingesta de alimentos funcionales específicos, la ingesta de probióticos y de prebióticos que tienen el potencial de influir favorablemente en el metabolismo de la MI, y por ende, del huésped. Además, también se ha demostrado que algunos componentes minoritarios de los alimentos, así como ciertos aditivos alimentarios, contaminantes químicos y otros compuestos como los antibióticos son capaces de alterar de manera significativa tanto la diversidad de la MI como su metabolismo. La presencia en el tracto gastrointestinal de algunos antibióticos, incluso a bajas concentraciones, ejerce una presión selectiva sobre la microbiota y ocasiona la selección de cepas resistentes a dichos antibióticos (Murphy y col., 2013; Wagner y col., 2008). Incluso en la Unión Europea, donde el uso de antibióticos está prohibido como promotores de crecimiento en la cría de animales de abasto, cuando se utilizan como agentes terapéuticos, cantidades residuales de estos medicamentos permanecen en los tejidos y alimentos de origen animal, siendo posteriormente ingeridos por los consumidores (Wagner y col., 2008). Este es un asunto de especial interés, ya que los organismos reguladores nacionales y las organizaciones internacionales de salud pública evalúan los potenciales riesgos para el consumidor de la ingesta de residuos mediante la evaluación de las propiedades químicas, Paula Roca Saavedra 6 farmacológicas, toxicológicas, y antimicrobianas, pero sin tomar en cuenta sus efectos sobre la MI humana en lo referente a su relación con la nutrición (Joint FAO / OMS, 2002). 1.1. MICROBIOTA INTESTINAL El tubo digestivo constituye la principal superficie de intercambio y comunicación con el medio externo que tenemos en nuestro cuerpo. De hecho, la mucosa gastrointestinal en un ser humano adulto alcanza una superficie de 300 a 400 metros cuadrados (considerando toda la superficie, con las vellosidades desplegadas) y gracias a su estructura y funciones (receptores, sensores glándulas, secreciones…) reconoce de manera específica, sustancias desde el punto de vista analítico y bioquímico que transitan por el tracto gastrointestinal (Bourlioux y col., 2003). Como resultado de ello, el ser humano obtiene dos importantes beneficios: nutrición por la digestión y absorción de nutrientes; y defensa, por el reconocimiento de sustancias extrañas y el desarrollo de sistemas de prevención y rechazo de posibles agresiones desde el medio externo. Sin embargo, hoy en día se conoce que estas funciones no dependen solo de la propia estructura del tubo digestivo si no que la presencia y actividad de comunidades microbianas que colonizan el intestino juega un papel muy importante para la homeostasis y equilibrio ambiental en el individuo (Bourlioux y col., 2003; Backhed y col., 2005). El término microflora o microbiota se define como la comunidad de microorganismos vivos residentes en un nicho ecológico determinado. La microbiota residente en el intestino humano es una de las comunidades más densamente pobladas (Ruiz Alvarez y col., 2012). Al conjunto formado por los microorganismos, sus genes y sus Introducción 7 metabolitos se le denomina microbioma. El microbioma humano se refiere a la población total de microorganismos con sus genes y metabolitos que colonizan el cuerpo humano, incluyendo el tracto gastrointestinal, el genitourinario, la cavidad oral, la nasofaringe, el tracto respiratorio y la piel (Petrosino y col., 2009). Uno de los aspectos que ha sido más estudiada la MI en los seres humanos, es su relación con la obesidad pero también se ha visto que juega un papel fundamental en diversas enfermedades derivadas de la misma (Lecomte y col., 2015). Se ha podido comprobar que influye de manera muy importante en la enteritis necrotizante (Kelly y col., 2012), en la diabetes (Quin y col., 2014), en el cáncer (Boleij y col., 2012), el síndrome metabólico (Wallace y col., 2011) y el hígado graso no alcohólico (Machado y Cortez-Pinto, 2012). Dicha MI interactúa también en el sistema inmune, proporcionando señales que promueven la maduración de varios tipos de células inmunes (principalmente linfocitos) (Cresci y Bawden., 2016) y el normal desarrollo de las funciones inmunes (Brown y Noelle, 2015; Devroka y col., 2012). En este contexto, las bacterias del intestino contribuyen a mantener la integridad del epitelio intestinal, promoviendo la reparación epitelial después de la lesión y desempeñando un papel importante en la regulación de la diferenciación de los enterocitos (Schippa y Conte, 2014). Además, las bacterias que forman parte de la MI producen un gran número de compuestos bioactivos, que pueden influir en la salud humana. Algunos de ellos (como las vitaminas sintetizadas en el colon) son beneficiosos, pero otros productos resultantes de su metabolismo son o pueden llegar a ser tóxicos (Conlon y Bird, 2015). 1.1.1. Composición de la microbiota intestinal El número de células bacterianas presentes en el intestino humano se incrementa de modo continuo, pasando de entre 101 y 103 bacterias por gramo en el estómago y duodeno, a 104 a 107 bacterias por gramo en el yeyuno y el íleon, y culminando entre 1011 y 1013 en el colon, Paula Roca Saavedra 8 especialmente en la parte distal del mismo (Abdou y col., 2016). La práctica totalidad de las bacterias que forman parte de la MI pertenecen entre 5 y 7 filos bacterianos, dependiendo del grado de diversidad que presente la persona. De modo general, la microbiota es más diversa en aquellas personas que viven en ambientes más rurales, y especialmente es mucho mayor en las poblaciones que siguen aún hoy en día con un estilo de vida cazador-recolector (Clemente y col., 2015). La mayor parte (alrededor del 90%) de las bacterias que forman parte de la MI en una persona adulta pertenecen a los filos Firmicutes y Bacteroidetes (Singh y col., 2016). Los Firmicutes (el filo predominante en las personas que viven en los países desarrollados) comprenden, en su mayoría, bacterias Gram-positivas con un ADN que tiene un bajo contenido de guanina y citosina, aunque también incluyen bacterias Gram-negativas. De entre este grupo, destacan especialmente dentro de la MI por su número y frecuencia los géneros Clostridium, Enterococcus, Lactobacillus y Ruminococcus (Power y col., 2014) Los Bacteroidetes incluyen bacterias Gram-negativas, que están representados principalmente por el género Bacteroides en el intestino humano, pero también incluyen otro género de importancia como es la Prevotella (Panda y col., 2014: Power y col., 2014). Las proporciones relativas de estos dos filos dominantes varían y pueden ser influenciados por diversos factores (Conlon y Bird, 2015). Otros filos, que son menos numerosos cuantitativamente pero también muy importantes cualitativamente, son las bacterias pertenecientes a los filos Cyanobacteria, Proteobacteria, Actinobacteria, Fusobacteria y Verrucomicrobia, que están presentes en la MI de la gran mayoría de las personas adultas (Power y col., 2014; Pérez-Chanona y Trinchieri, 2016). A nivel de género, los géneros Bacteroides, Faecalibacterium, Bifidobacterium y Eubacterium son cuantitativamente los más importantes dentro de la MI y pueden representar más del 60% de las bacterias presentes en las heces humanas. No obstante, la proporción que alcanzan dentro del total de la MI es muy variable entre los diferentes individuos (Robles Alonso y Guarner, 2013; Conlon y Bird, 2015). Otros géneros que también tienen una gran relevancia, si bien Introducción 9 son menos numerosos con Clostridium, Enterobacter y Streptococcus (Conlon y Bird, 2015). Un análisis metagenómico (el estudio MetaHit) señaló que la MI de las personas se dividen en tres enterotipos, y que cada enterotipo estaba dominado por un género bacteriano diferente: Bacteroides (enterotipo 1), Prevotella (enterotipo 2) y Ruminococcus (enterotipo 3) (Arumugam y col., 2011). Sin embargo, estudios posteriores entre los que se incluye el Human Microbiome Project (2012), han sido incapaces de confirmar dicho concepto (Huse y col., 2012), por lo que actualmente existe una importante controversia sobre si el enterotipo 3 está dominado por un único género o son en realidad varios géneros bacterianos taxonómicamente muy relacionados (Jeffery y col., 2012). Dado que las técnicas genéticas empleadas en la identificación y caracterización de dichos géneros bacterianos avanza de un modo vertiginoso, es muy probable que próximamente esta clasificación se modifique de un modo sustancial. En la Tabla 1 podemos observar los principales filos bacterianos que componen la MI y los géneros principales que los componen. Tabla 1. Clasificación de filos y géneros bacterianos principales de la microbiota intestinal La composición de la MI varía también de un modo muy importante dependiendo de la ubicación a lo largo del intestino y dependiendo de la profundidad axial (Gupta y col., 2016). Globalmente, Dominio Reino Filo Géneros Bacteria Bacteria Firmicutes Clostridium Enterococcus Lactobacillus Ruminococcus Faecalibacterium Eubacterium Roseburia Streptococcus Bacteroidetes Bacteroides Prevotella Actinobacteria Bifidobacterium Proteobacteria Escherichia Enterobacter Paula Roca Saavedra 10 la masa microbiana que una persona adulta porta en su aparato digestivo representa aproximadamente un kilogramo de peso corporal y es esencial para numerosas funciones metabólicas (Pérez-Chanona y Trinchieri, 2016). En la Figura 2 se muestra un esquema de dichas concentraciones crecientes, así como los géneros bacterianos que son predominantes en cada uno de los tramos del intestino. Figura 2. Variaciones de la microbiota a lo largo del aparato digestivo humano. Fuente: Abdou y col., 2016. A pesar de la intensa investigación que se ha venido realizando en la última década acerca de la MI y sus efectos sobre la salud humana, a día de hoy todavía no existe un consenso sobre qué características debe reunir una microbiota “saludable” (Conlon y Bird, 2016). Si existe consenso en el hecho de que ciertas fracciones de dicha microbiota están más relacionadas con la obesidad y algunos desórdenes metabólicos. De este modo, las bacterias pertenecientes al filo Firmicutes están relacionadas con el metabolismo de nutrientes abundantes de origen animal como la grasa saturada y las proteínas (Le Introducción 11 Chatellier y col., 2013), mientras que las pertenecientes al filo Bacteriodetes están más relacionadas con la metabolización de hidratos de carbono complejos (Arumugam y col., 2011). Por dicho motivo, un incremento en la proporción de Firmicutes, combinada con una reducción en la proporción de Bacteroidetes, expresada normalmente mediante valores elevados del ratio Firmicutes/Bacteroidetes (FBR), se considera una microbiota obesogénica. Además, una elevada presencia de bacterias del filo Actinobacteria se ha relacionado con personas con mayor índice de masa corporal (IMC), por lo que se cree que dicho filo está relacionado con la obesidad (Arumugam y col., 2011). También se ha publicado que el filo Proteobacteria, que incluye gran parte de las bacterias que habitualmente son consideradas patógenos de origen alimentario, juegan un papel importante en el desarrollo de la inflamación crónica de baja intensidad en el colon, y por lo tanto también favorecen la ganancia de peso (Etxeberría y col., 2015). Por el contrario, en relación con los grupos bacterianos que forman parte de una microbiota que se acerca más a lo considerado “saludable”, si existe consenso en que es mejor que dicha microbiota tenga una mayor cantidad y diversidad posible (Clemente y col., 2015). Así, diversos trabajos han demostrado que en aquellas comunidades que hoy en día siguen teniendo un patrón de alimentación del tipo cazadorrecolector, como los Hadza en Tanzania o los Yanomani en la selva amazónica, sus microbiotas intestinales son mucho más diversas que en el resto de las poblaciones, y especialmente que en las personas que viven en ámbitos urbanos (Clemente y col., 2012). Con respecto al uso de microorganismos considerados probióticos, aunque sus efectos se han demostrado con mucha mayor efectividad en el mantenimiento y potenciación de la inmunidad, algunos de ellos han demostrado tener cierto efecto en la prevención de la ganancia de peso. De este modo, Jung y col., (2013) demostraron en humanos que Lactobacillus gasseri consigue reducciones significativas en el peso corporal y en la circunferencia de la cintura tras 12 semanas de ingesta; Sánchez y col (2014) demostraron que Lactobacillus rhamnosus ayuda a reducir el peso corporal en mujeres tras 12 semanas de ingesta, Paula Roca Saavedra 12 mientras que en hombres no tuvo efecto alguno. Sobre esta misma especie bacteriana, Luoto y col. (2010) publicaron que también es útil para ayudar a prevenir la ganancia de peso en niños con sobrepeso. También se han relacionado con beneficios para la salud de los hospedadores algunas familias pertenecientes al filo Firmicutes, tales como Erysipelotrichaceae, Ruminococcaceae, Eubacteriaceae y Lachnospiraceae (Jones y col., 2014) y algunos géneros pertenecientes a diversos filos como Bifidobacterium, Lactobacillus, Clostridium de los clusters XIVa/IV, Eubacterium o Roseburia. A nivel de especie, tres especies hasta hace poco prácticamente desconocidas como Akkermansia muciniphila, Faecalibacterium prausnitzii o Roseburia intestinalis, han demostrado que previenen trastornos como la obesidad o la diabetes, así como a la contribución y mejora de la inmunidad y el estado inflamatorio (Guinane y Cotter, 2013 Hollister y col., 2014; Jones y col., 2014; Gupta y col., 2016). 1.1.2. Colonización y evolución de la microbiota intestinal Estudios recientes han publicado que la colonización del tracto digestivo por microorganismos se inicia a lo largo del curso del desarrollo fetal y continúa a partir de ese momento de manera acelerada (Endo y col., 2014, Human Microbiome Project Consortium, 2012; Huse y col., 2012). En este sentido, hoy en día conocemos que el meconio de los recién nacidos prematuros no es estéril, y presenta una composición de la microbiota diferente de la adquirida después de la primera semana de vida, lo que demuestra que durante la etapa final se produce una temprana colonización del intestino (Cresci y Bawden, 2015). A partir del nacimiento, la MI se desarrolla rápidamente y se produce una sucesiva incorporación de diferentes especies bacterianas a la misma, dependiendo de factores tanto dependientes del huésped como ambientales (Johnson y Versalovic, 2012). Introducción 13 La diversidad de la MI en el lactante es inicialmente muy baja, y está formada principalmente por microorganismos aerotolerantes, ya que el intestino contiene inicialmente oxígeno (Endo y col., 2014). No obstante, estos microorganismos aerotolerantes, después del nacimiento, son reemplazados por microorganismos anaerobios, que son típicos de la MI del adulto (Cresci y Bawden, 2015). Este reemplazo se va produciendo de un modo paulatino, alcanzando hacia los 6 meses de edad del sujeto, una composición relativamente similar a que mantendrá durante el resto de la etapa infantil (Endo y col., 2014). A esta edad, uno de los factores más importantes que contribuyen a la formación de la MI es el tipo de lactancia (Human Microbiome Project Consortium, 2012; Johns y col., 2014). La leche materna proporciona unos 1.010 microbios por litro (Cresci y Bawden, 2015; Johns y col., 2014), conteniendo hasta 600 especies diferentes de bacterias, incluyendo Bifidobacterium beneficiosos tales como Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium dentium, así como Lactobacillus spp. y Staphylococcus spp. (Cresci y Bawden, 2015). Además, los oligosacáridos presentes en la leche materna son polímeros digeribles formados por un pequeño número de diferentes monosacáridos que sirven como prebióticos, estimulando el crecimiento selectivo de los miembros del género Bifidobacterium (Cresci y Bawden, 2015). Por el contrario, los bebés alimentados con fórmulas farmacéuticas no reciben una composición bacteriana tan variada y en su intestino se induce la formación de una MI que contiene taxones bacterianos como Clostridium, Bacteroides, Enterobacter y Enterococcus, lo que distingue significativamente a los bebés alimentados con fórmula de los alimentados con leche materna (Johns y col., 2014). La composición bacteriana comienza a converger hacia una microbiota adulta hacia el final del primer año de vida y se asemeja totalmente a la microbiota del adulto entre los 2,5 y 3 años (Human Microbiome Project Consortium, 2012; Koenig y col., 2011). A dicha edad, la MI dominada por el género Bifidobacterium cambia hacia otra dominada por bacterias de los filos Bacteroidetes y Firmicutes, más Paula Roca Saavedra 20 La composición de la MI también está influenciada de un modo importante por la cantidad de fibra dietética consumida. Según la American Association of Cereal Chemists, se define fibra dietética como las partes comestibles de las plantas o carbohidratos análogos, que son resistentes a la digestión y la absorción en el intestino delgado humano, pero con fermentación parcial en el colon (AACC, 2001). 1.1.4.2. Modulación de la microbiota intestinal a través de micronutrientes Aunque los patrones dietéticos tienen un efecto importante en la MI, los efectos individuales de los componentes minoritarios de los alimentos han sido menos investigados que las diferentes proporciones de macronutrientes en la dieta (Roca-Saavedra y col., 2017). Sin embargo, los micronutrientes son fundamentales para numerosas funciones relacionadas con la salud, como por ejemplo en el metabolismo energético, el crecimiento, la diferenciación celular, y las funciones específicas de numerosos órganos, así como del sistema inmune (Russell y col., 2015). Una dieta baja en micronutrientes, pero no necesariamente baja en energía, es frecuente en poblaciones de países de bajos ingresos, pero también puede estar presente en entornos afectados por la pobreza en países de ingresos medios y altos (Biesalki, 2016). Se estima que más de tres mil millones de personas en todo el mundo sufren diversos tipos de deficiencias de micronutrientes (predominantemente vitamina A, hierro y zinc), siendo la mayoría mujeres y niños (Biesalski, 2016). De entre ellas, la deficiencia más frecuente a nivel mundial es la deficiencia de hierro (Biesalski, 2016). Aunque es difícil determinar de un modo aislado los efectos que dicha deficiencia pueda tener sobre la MI (la deficiencia de hierro está generalmente ligada a situaciones de malnutrición), si se ha comprobado que en mujeres que presentaban dicha deficiencia, y que no presentaban malnutrición, se encontró una menor cantidad de Lactobacillus en su MI (Mikkelsen y col., 2016). Por Introducción 21 su parte, también se ha comprobado que la vitamina A puede modular la respuesta inmune del intestino por las interacciones con las células inmunes y la modulación de la microbiota (Brown y Noelle, 2015). Otro mineral que es capaz de influir de modo relevante sobre la MI es el Zn. Dosis profilácticas de dicho oligoelemento en varios modelos animales demostraron que incrementaban la presencia de grupos bacterianos anaerobios facultativos Gram-negativos, la concentración de AGCC, así como la riqueza y diversidad de especies en general (Starke y col., 2014; Reed y col., 2015). Además, también se ha encontrado que miembros del filo de los Firmicutes, específicamente de Lactobacillus, incrementan su presencia en la MI, después de la administración de ZnO (Reed y col., 2015). Otros constituyentes menores de la dieta, incluyendo varios compuestos que pertenecen al grupo de los polifenoles, también muestran efectos significativos sobre las bacterias del colon (Conlon y Bird, 2015). Los polifenoles son metabolitos secundarios que se encuentran en una amplia variedad de alimentos, como frutas, verduras, hierbas, semillas, cereales, y en bebidas, como el café, el té, el cacao y el vino (Etxeberría y col., 2016). Los polifenoles no se absorben a nivel intestinal, por lo que alcanzan el colon, donde son biotranformados y aumentan su biodisponibilidad. Además, son capaces de ejercer cierta modulación sobre la composición de la MI, principalmente inhibiendo bacterias patógenas y estimulando el crecimiento de bacterias beneficiosas (Etxeberría y col., 2013; Martínez y col., 2013; Ozdal y col., 2016). De entre los diferentes compuestos pertenecientes al grupo de los polifenoles, varios de ellos han sido reconocidos como agentes antimicrobianos potenciales con efectos bacteriostáticos o bactericidas y con efectos diferentes en función del género o especie bacteriana del que estemos hablando (Ozdal y col., 2016). Específicamente, estudios demuestran que los flavonoles, la quercetina, la catequina, la puerarina, las antocianinas, los elagitaninos, el resveratrol y el trans-resveratrol, son capaces de modificar tanto la composición como las actividades de la MI (Etxeberria y col., 2015; Hsiao y col., 2013, Huang y col., 2016; Lee, 2013 Li y col., 2015; Qiao y col., 2014). Paula Roca Saavedra 22 Por ejemplo, la suplementación con quercetina resultó en una alteración en la composición de la flora intestinal a diferentes niveles taxonómicos, incluyendo el FBR e inhibiendo el crecimiento de especies bacterianas asociadas con la obesidad inducida por la dieta, como Erysipelotrichaceae, Bacillus spp. y Eubacterium cylindroides (Etxeberria y col., 2015). En otros trabajos recientes, se demostró que diferentes tipos de flavonoides pueden modular el crecimiento de diferentes filos y géneros de la MI, incrementando la abundancia relativa de Bifidobacterium y Lactobacillus y disminuyendo la de Clostridium histolyticum, que es un microorganismo potencialmente patógeno (Tzounis y col., 2011; Martin y col., 2012). Qiao y col. (2014) encontraron que el consumo de resveratrol mejoró la disbiosis en la MI de ratones que estaban siguiendo una dieta rica en grasas, que en consecuencia les había favorecido un incremento en su proporción relativa de Firmicutes. Los efectos específicos del resveratrol incluyeron una mejora en el ratio Fimicutes/ Bacteroidetes, una inhibición significativa del crecimiento de Enterococcus faecalis y un aumento del crecimiento de Lactobacillus y Bifidobacterium. Los flavonoles también pueden aumentar la abundancia relativa de Bifidobacterium y Lactobacillus a expensas de bacterias potencialmente patógenas, especialmente Clostridium histolyticum (Martin y col., 2012). Además de los ya mencionados polifenoles, otros componentes minoritarios de los alimentos también pueden modificar de un modo relevante la MI, si bien no han recibido tanta atención por parte de la comunidad científica en los últimos años. De este modo, se ha publicado que el ácido linoleico conjugado (CLA) incrementa los niveles de A. muciniphila, que se asocia con efectos beneficiosos en el metabolismo (Cani y Everard., 2016). También se encontró que la Lcarnitina, presente en carnes rojas, puede ser metabolizada a trimetilamina y óxido de trimetilamina, y aumentar de este modo el riesgo de aterosclerosis (Koenig y col., 2011). Una vez metabolizada la L-carnitina, no es este su único riesgo para la salud humana, sino que también mediante la acción de bacterias presentes en la MI, tanto la Introducción 23 dimetilamina y trimetilamina, pueden ser transformadas en dimetilnitrosamina (Abdou y col., 2016), una hepatotoxina muy potente que además es carcinógena. 1.1.4.3. Efectos de los aditivos alimentarios sobre la microbiota intestinal Una de las modificaciones más características en las dietas habituales en los países desarrollados durante el siglo XX es el aumento en el consumo de aditivos alimentarios. Estos compuestos se incorporan hoy en día a casi todos los alimentos procesados, ya sea para mejorar características importantes a la hora de su comercialización, como son su estabilidad, vida útil, sabor o textura. La base principal para el uso de estos agentes es la noción de que no causan toxicidad aguda a concentraciones razonablemente mayores que sus concentraciones aprobadas (Swithers y col., 2010). No obstante, el efecto que dichos aditivos pueden llegar a causar en la microbiota y microbioma humano es en gran medida, aún desconocido. Esto es debido a que es muy difícil la asignación de cohortes de individuos sanos que no hayan sido previamente expuestos a aditivos alimentarios. Además, no sólo es difícil encontrar personas que no hayan sido expuestos a dichos compuestos a lo largo de su vida, sino que también es necesario disponer de una cantidad de personas importante que permita realizar una estratificación lo suficientemente robusta para que los estudios no sean sesgados por factores como la genética, el estilo de vida y los patrones dietéticos (Chassaing y Gewirtz, 2016). En consecuencia, los investigadores han recurrido a modelos animales para estudiar el efecto de los aditivos alimentarios en la flora intestinal. Aun teniendo en cuenta dichas limitaciones, estudios recientes han demostrado que el consumo de edulcorantes no nutritivos (NNS) y agentes emulsionantes (EDs) puede alterar la MI, provocando inflamación intestinal y favoreciendo de este modo el desarrollo del síndrome metabólico (Chassaing y Gewirtz, 2016; Clemente y col., Paula Roca Saavedra 24 2015). Hoy en día, la mayoría de los alimentos procesados contienen uno o más agentes emulsionantes para permitir a estos alimentos mantener las texturas deseadas. Algunos autores han sugerido que éstos pueden ser un factor específico resultante de la industrialización que ha contribuido a reducir la diversidad bacteriana en la MI, y al aumento de la incidencia del síndrome metabólico y otras enfermedades inflamatorias (Foreyt y col., 2012; Swithers y col., 2010). De este modo, trabajos anteriores han demostrado que dos agentes emulsionanes, denominados carboximetilcelulosa y polisorbato 80, tuvieron un efecto significativo favoreciendo la proliferación bacteriana en el intestino delgado de ratones y facilitando la translocación de las bacterias a través del epitelio intestinal. Además de esto, se observó una reducción del espesor de la capa de moco y participaron en el inicio de la inflamación intestinal, la obesidad y la diabetes. Estos efectos también se asociaron con un aumento de la ingesta de alimentos, si bien dichos autores no pudieron determinar cuál es el mecanismo que lo origina (Swithers y col., 2010). Otro grupo de aditivos alimentarios del cual se ha incrementado de manera notable su consumo en las últimas décadas, son los NNS. Dichos compuestos se han incrementado como consecuencia del conocimiento acerca de los efectos de un consumo excesivo de azúcar para la salud humana (Chassaing y Gewirtz, 2016). Los NNS son compuestos sintéticos varios cientos de veces más dulces que la sacarosa. Por tanto, pueden utilizarse en pequeñas cantidades con un valor calórico añadido despreciable. Los NNS se excretan inalterados del cuerpo de los mamíferos y, por lo tanto, se consideran metabólicamente "inertes" (Shankar y col., 2013). Teóricamente, el consumo de NNS sólo ayudaría en la pérdida de peso, ya que el descenso que se produce en la ingesta calórica al suprimir el azúcar no se compensa mediante el incremento en el consumo de otro nutriente. No obstante, diversos autores han publicado que se produce un incremento en la ingesta de otros nutrientes como compensación de la reducción del consumo de azúcares tras su sustitución por los NNS (Abdou-Donia et al., 2008; Saad y col., 2012). Introducción 25 Quizás sea este último mecanismo el que explica por qué el consumo habitual de este tipo de edulcorante se ha relacionado con un incremento en el IMC de niños y adolescentes (Murphy y col., 2014; Saad y col., 2012). Dichos efectos también podrían estar relacionados no sólo con el incremento compensatorio de la ingesta de otros nutrientes tras reducirse la ingesta de azúcar, sino que también podrían influir de un modo importante la acción de los NNS en la MI. Los NNS, como la sacarina, la sucralosa, el aspartamo y la stevia presentan efectos bacteriostáticos (Chassaing y Gewirtz, 2016; Pepino, 2015; Yap y col., 2013), y dicho efecto bacteriostático no se limitan a la flora bacteriana de la boca, sino que se extienden a la del intestino (Borukas y col., 2015; Chassaing y Gewirtz, 2016; Li y col., 2016; Pepino, 2015). También se han investigado los efectos de otros aditivos en la MI humana. Por ejemplo, los aceites esenciales (AE), que son también compuestos que pueden tener efectos específicos en la MI humana. Estos compuestos se emplean para prevenir el crecimiento de especies bacterianas patógenas que son generalmente más sensibles a los aceites esenciales que la mayoría de las bacterias comensales (Thapa y col., 2015). De entre los AE, se ha demostrado que el thymol, que además de emplearse como aditivo alimentario también se suele usar como tratamiento complementario a la quimioterapia en el caso de cánceres en el tracto gastrointestinal. En este sentido, los pacientes que reciben quimioterapia para tratamientos contra el cáncer sufren trastornos gastrointestinales debido a daños en las células mucosas de la MI y alteran el equilibrio ecológico intestinal. En consecuencia, la quimioterapia aumenta el riesgo de infecciones bacterianas, como el crecimiento excesivo de C. difficile (Thapa y col., 2015) y mientras que disminuye algunas poblaciones microbianas beneficiosas tales como Bifidobacterium, Lactobacillus, Veillonella y F. prausnitzii. En consecuencia, los AE pueden ser explotados como agentes profilácticos y como complementos en la quimioterapia para proteger bacterias comensales, incluyendo Bifidobacterium spp. y F. prausnitzii (Roberts y col., 2010). Paula Roca Saavedra 26 Finalmente, aunque han recibido menos atención por parte de la comunidad científica que en los casos anteriores, también se han publicado efectos sobre la MI otros compuestos que, de modo intencionado o accidental, pueden estar incluídos en los alimentos que consumen las personas. De entre éstos, cabe destacar los residuos de fármacos de uso veterinario, que tras su administración a los animales productores de alimentos, pueden permanecer a bajas concentraciones en los alimentos producidos por los mismos. Los que se encuentran de manera más habitual en los alimentos de origen animal son los antibióticos (Baynes y col., 2016), de los cuales un reciente estudio demostró que los más habitualmente encontrados en alimentos de origen animal en Europa son por este orden las tetraciclinas, las penicilinas y las sulfamidas (Grave y col., 2014). 1.1.4.4. Efectos de los antibióticos sobre la microbiota intestinal Si bien existen multitud de fármacos que pueden tener efectos directos sobre la MI, como son los antidiabéticos (Forslund y col., 2015), con mucha diferencia, aquellos que tienen una acción más directa y causan una mayor variación sobre la MI son, sin lugar a duda, los antibióticos (Clemente y col., 2015; Russell y col., 2015; Saad y col., 2012). Los antibióticos, en países desarrollados, son uno de los fármacos más prescritos en medicina humana, particularmente en la edad infantil (Gibson y col., 2015; Laniro y col., 2016). Es precisamente en este colectivo, en los niños, en los cuales los antibióticos ejercen un efecto más drástico sobre la MI (Gibson y col., 2015). Estudios epidemiológicos han confirmado la relación positiva, especialmente en las primeras edades, entre el uso de antibióticos y el aumento de peso en humanos, e indicaron que incluso la exposición prenatal a antibióticos predispone al sobrepeso infantil (Cox y Blaser, 2015; Korpela y de Vos, 2016). Este efecto es aún mayor cuando la exposición ocurre tras el nacimiento durante los 6 primeros meses de Introducción 27 vida (Ajslev y col., 2011; Murphy y col., 2013; Trasandre y col., 2013). Además, también se ha demostrado que la predisposición a la obesidad derivada de la exposición a los antibióticos, son diferentes dependiendo del espectro del antibiótico (Bailey y col., 2014; Mikkelsen y col., 2016), edad del sujeto (Cox y Blaser, 2015, Korpela y de Vos, 2016) e incluso en función del sexo del paciente (Ajslev y col., 2011, Azad y col., 2014, Mikkelsen y col., 2016). Del mismo modo, el tratamiento de recién nacidos prematuros y de bajo peso al nacer con una variedad de antibióticos, incluyendo penicilina, ampicilina, cefalexina, gentamicina, amicacina, eritromicina, vancomicina, clindamicina y lincomicina, se ha relacionado con un aumento de Enterobacteriaceae, junto con una disminución de géneros bacterianos relacionados con una microbiota saludable, como Bifidobacterium, Bacillus, y Lactobacillus (Cho y col., 2012; Dethlefsen y Relman, 2011, Greenwood y col., 2014). Los tratamientos con antibióticos también pueden alterar significativamente la composición de la microbiota del adulto, causando una disminución en la diversidad microbiana entre un cuarto a un tercio del estado pre-antibiótico (Gibson y col., 2015). Sin embargo, en esta etapa de la vida, la MI es relativamente fuerte y, en la mayoría de los casos, es capaz de recuperar su estado inicial después de varias semanas de cesar el tratamiento antibiótico (Palmnäs y col., 2014). Sin embargo, otros estudios han demostrado que después de cesar el tratamiento, la microbiota requiere varios meses para recuperarse completamente (Jakobson y col., 2010; Laniro y col., 2016; Manichahn y col., 2010; Panda y col., 2014), e incluso algunos grupos bacterianos no reaparecen aún tras varios años después de la interrupción del tratamiento (Clemente y col., 2012; Cresci y Bawden, 2016; Vrieze y col., 2014). Estos efectos pueden ser incluso más graves en personas de edad avanzada, en cuya MI es menos diversa en comparación con los adultos más jóvenes y un equilibrio más inestable que fácilmente puede conducir a la aparición de diversas patologías (Claesson y col., 2011, Power y col., 2014). Paula Roca Saavedra 28 Paradójicamente, aunque los efectos de las dosis terapéuticas de los antibióticos empleados en medicina humana han sido ampliamente investigados en los últimos años, los efectos sobre la MI de los residuos de antibióticos presentes en alimentos a concentraciones permitidas, derivados de la medicina veterinaria, ha recibido poca atención. Sólo unos pocos trabajos se han centrado en los efectos de las bajas concentraciones de antibióticos en la MI (Cox y col., 2014; Dethlefsen y Relman, 2011; Van Vleck Pereira y col., 2016). Este hecho es sorprendente, ya que los antibióticos son los fármacos más empleados a nivel mundial en la industria ganadera (Baynes y col., 2016) y sus residuos, a dosis subterapéuticas, pueden llegar a los seres humanos a través de alimentos de origen animal (Cho y col., 2012). Basándose en este postulado, Ternak (2005) fue el primero en proponer que la exposición humana a los antibióticos a dosis bajas, puede estar contribuyendo al aumento de peso en humanos (Ternak, 2005). Desde la década de 1940, los agricultores han añadido dosis bajas de antibióticos a los alimentos o agua del ganado para la promoción del crecimiento de los animales de granja (Cho y col., 2012). Como consecuencia, en los países en los que se permite el uso de antibióticos como promotores del crecimiento como USA, las ventas y distribución de agentes antimicrobianos aprobados para su uso en animales productores de alimentos eran aproximadamente cuatro veces el total vendido y distribuido para el tratamiento de infecciones humanas (FDA, 2011). Incluso en la Unión Europea, en la que los antibióticos fueron prohibidos para actuar como promotores del crecimiento (Reglamento CE 1831/2003), el uso de antibióticos en medicina veterinaria es habitual y, como consecuencia, los residuos de antibióticos pueden llegar a bajas concentraciones a los seres humanos a través de alimentos o a través del agua potable (Andersson y col., 2014, Cox y Blaser, 2015). Dado que los antibióticos son ampliamente utilizados para fomentar el crecimiento del ganado, es posible que las carnes y la leche de estos animales estén contaminadas con residuos traza de estos agentes (Riley, 2013). Introducción 29 Los antibióticos ejercen acciones muy diferentes sobre los grupos individuales que constituyen la MI. En general, durante un período variable después de finalizar el tratamiento antibiótico, la microbiota tiende a recuperar su composición original. Sin embargo, en algunos individuos, se ha podido comprobar que algunas especies bacterianas que desaparecen como consecuencia del tratamiento antibiótico lo hacen de manera irreversible (Dethlefsen y Relman, 2011). Esto puede influir en la salud del huésped, sobre todo si el grupo bacteriano que se suprime afecta de modo directo a una función fisiológica relacionada con la salud humana (Clemente y col., 2012). Como efectos adicionales, Cho y col. (2012) encontraron un aumento significativo en la relación Firmicutes/ Bacteroidetes como resultado de la administración de betalactámicos y vancomicina. Otros autores (Dethlefsen y Relman, 2011) encontraron disminuciones significativas en los taxones asociados con propiedades beneficiosas para la salud, como Lactobacillus spp. y Bifidobacterium spp. y aumentos significativos de géneros incluidos en la familia Enterobacteriaceae, que incluye muchos géneros considerados potencialmente patógenos. Otros autores (Rusell y col., 2015) trataron ratones con antibióticos como amoxicilina, metronidazol, cefoperazona, y una combinación de los tres. Como resultado, las Proteobacterias y, en particular, las Enterobacteriaceae, se vuelven dominantes en el tracto intestinal de los ratones tratados, representando el 73% de la microbiota total. Dos semanas después de cesar el tratamiento del antibiótico, la microbiota de estos animales recuperó una proporción relativamente baja de Proteobacteria (5,77%), aunque permaneció considerablemente más abundante que el porcentaje de la microbiota total que representa este filo en ratones no tratados (1,2%). Aunque las proteobacterias representan generalmente alrededor del 15% de la microbiota intestinal (Hu y col., 2013), acumulan más del 35% de los genes de resistencia a los antibióticos contenidos en el microbioma. En contraste, a pesar de representar el 31% de la microbiota total, los Bacteroidetes sólo acumulan el 6% de los genes de resistencia a los antibióticos (Russell y col., 2015; Hu y col., 2013). Por lo tanto, es factible que un tratamiento antibiótico puede causar menos declive en la población de Proteobacteria (o incluso aumentar, ocupando el espacio dejado por otros grupos bacterianos más Paula Roca Saavedra 36 El espectro de los β-lactámicos incluye bacterias gram-positivas, gram-negativas y espiroquetas. No son activos sobre los micoplasmas porque éstos carecen de pared celular, ni sobre bacterias intracelulares como Chlamydia y Rickettsia. La resistencia natural de las micobacterias se debe a la producción de β-lactamasas probablemente unido a una lenta penetración por las características de la pared (Martin y Guidol, 2003). Quizás por este amplio espectro, este grupo sea uno de los más empleados en el mundo, tanto en medicina humana como en veterinaria. El más empleado de todos ellos es la ampicilina, tanto en medicina humana (Gibson y col., 2015), como en veterinaria (Economou y Gousia, 2015). Este antibiótico es capaz de penetrar en bacterias gram-positivas y algunas gram-negativas, donde es capaz de inhibir la tercera y última etapa de la síntesis de la pared celular bacteriana, que finalmente conduce a la lisis celular (Demonty, 1996; Penicillins systemic, 1994). Su elevado uso se debe a una combinación entre su bajo precio, su excelente tolerancia y su capacidad de alcanzar altas concentraciones en tejidos blandos periféricos (Martin y Guidol, 2003). 1.2.3. Sulfamidas Las sulfamidas son fármacos antimicrobianos de amplio espectro, que se utilizan tanto por sí mismos como en combinación con otros fármacos en el tratamiento de infecciones por organismos aerobios, tanto gram-positivos como gram-negativos en casi todas las especies domésticas. Son el primer ejemplo de sustancia química con acción bactericida sintetizada por el hombre. La primera sulfamida fue descubierta por Paul Gelmo en 1908 de forma accidental cuando intentaba conseguir mejores colorantes para teñir la lana. Tras él, en 1935 un patólogo alemán llamado Gerhard Domagk publicó el primer informe sobre la actividad antimicrobiana de dicho tinte, que ya había sido patentado en 1932 bajo el nombre de Prontosil (Domagk y col., 1935). Domagk demostró que dicho tinte, Introducción 37 además de su acción como tal, también era capaz de eliminar bacterias del género Streptococcus de ratones infectados. La posterior investigación concluyó que dicho producto se metabolizaba en el organismo produciendo posteriormente sulfanilamida y que este metabolito era el responsable de la acción antibacteriana (Sköld, 2000). Son antimicrobianos sintéticos, bacteriostáticos, de amplio espectro, inicialmente con actividad frente a una gran variedad de microorganismos gram-positivos y gram-negativos pero con posterior desarrollo de un amplia tasa de resistencia hacia dichos antibióticos. Su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la síntesis de los ácidos nucleicos bacterianos, gracias a su enorme similitud con el paminobenzoico, precursor del ácido fólico y de los ácidos nucleicos en las bacterias. Dentro de las sulfamidas, existen numerosos compuestos con diferentes propiedades farmacocinéticas y también muy diferentes efectos secundarios. Sin embargo, todos comparten el mismo modo de acción y por ello, es frecuente que exista resistencia cruzada entre ellos (Sköld., 2000; Greenwood, 2003). Quizás por ello, por ser consideradas ya poco efectivas en el tratamiento de infecciones en seres humanos, su uso en medicina veterinaria es hoy en día mucho mayor que en el caso de la medicina humana, siendo hoy en día muy empleadas en el ganado bovino, porcino y avícola (Grave y col., 2014). De entre todas ellas, la más empleada hoy en día es la sulfadiacina (4-amino-N-2-pirimidinilbencenosulfonamida), generalmente empleada en forma libre como una sal sódica. Esta sulfamida tiene numerosas aplicaciones como agente antibacteriano sistémico. Por ejemplo, en oftalmología se utiliza en el tratamiento del tracoma y la toxoplasmosis ocular. También se utiliza en el caso de pacientes sensibles a la penicilina y, junto con el sulfametoxazol, es la sulfamida más empleada tanto en medicina humana como en medicina veterinaria (Braga y col., 2010). Paula Roca Saavedra 38 1.2.4. Concentraciones de antibióticos según los límites máximos de residuos Tras finalizar el empleo de un agente antimicrobiano en un animal del cual se obtienen alimentos destinados al consumo humano, es necesario esperar un determinado período de tiempo antes de su sacrificio, que varía dependiendo tanto del antibiótico empleado como de la especie animal en la que se emplee y tipo de alimento que se obtenga a partir de dicho animal. Este es el denominado “período de supresión”, necesario para poder obtener alimentos con concentraciones de residuos, procedentes del uso de medicamentos, inferiores a los Límites Máximos de Residuos (LMR) establecidos en la legislación Europea. Este tiempo de espera se establece mediante estudios de depleción fijados para cada formulación comercial, a partir de las vías de administración recomendadas y para todas las especies de destino. Se determina así el período tras el cual las concentraciones detectadas son inferiores al LMR y se le añade un período de seguridad para compensar la variabilidad biológica, cuyos valores van desde un 10% a un 30% del obtenido en los estudios de depleción. Según el Reglamento 37/2010, los LMR para las tres familias de antibióticos que hemos mencionado se pueden observar en la Tabla 2. No obstante, a pesar de todas estas precauciones legales, tras la administración de un antibiótico a un animal de abasto, permanecen residuos de dichos antibióticos en los alimentos producidos por éstos que alcanzan a los seres humanos a través de su consumo. A este respecto, algunos autores han señalado la posibilidad de que la ingesta periódica de dichos residuos sea uno de los factores predisponentes al incremento de la obesidad en los países desarrollados, que habitualmente emplean sistemas de producción animal intensivos en los que habitualmente es necesario el empleo de más antibióticos (Nobel y col., 2015; Riley y col., 2013; Ternak, 2005). Evidentemente, dicho riesgo es mucho mayor si estos medicamentos han sido administrados incorrectamente o si no se ha observado el período supresión reglamentario. De hecho, la vigilancia de dichos residuos en productos destinados al consumo de animales sacrificados se ha convertido en uno Introducción 39 de los deberes más importantes de las diferentes agencias de salud pública de los países que forman parte de la UE (Calza y col., 2004; Franek y col., 1999). Tabla 2. Sustancias farmacológicamente activas y su clasificación por lo que se refiere al Límite Máximo de Residuos (LMR) según el Reglamento 37/2010 Sustancia farmacológica mente activa Residuo marcador Especie animal LMR Tejidos diana Otras disposiciones (con arreglo al artículo 14.7 del Reglamento (CE) no 470/2009) Clasificación terapéutica Ampicilina Ampicilina Todas las especies destinadas a la producción de alimentos 50 μg/kg 50 μg/kg 50 μg/kg 50 μg/kg 4 μg/kg Músculo Grasa Hígado Riñón Leche Para los peces, el LMR en el músculo se refiere a «músculo y piel en proporciones naturales». Los LMR en la grasa, el hígado y el riñón no se aplican a los peces. Para el porcino y las aves de corral, el LMR en la grasa se refiere a «piel y grasa en proporciones naturales». No debe utilizarse en animales que producen huevos para consumo humano. Antiinfecciosos/ Antibióticos) Sulfonamidas (todas las sustancias que pertenecen al grupo de las sulfonamidas) Medicamen to base Todas las especies destinadas a la producción de alimentos 100 μg/kg 100 μg/kg 100 μg/kg 100 μg/kg Músculo Grasa Hígado Riñón Los residuos combinados totales de todas las sustancias del grupo de las sulfonamidas no deben sobrepasar los 100 μg/kg. Para los peces, el LMR en el músculo se refiere a «músculo y piel en proporciones naturales». Los LMR en la grasa, el hígado y el riñón no se aplican a los peces. No debe utilizarse en animales que producen huevos para consumo humano. Antiinfecciosos/ Quimioterapéuti cos 100 μg/kg Leche Bovinos, ovinos y caprinos Tetraciclina Suma de medicamen to base y su 4-epímero Todas las especies destinadas a la producción de alimentos 100 μg/kg 300 μg/kg 600 μg/kg 100 μg/kg 200 μg/kg Músculo Hígado Riñón Leche Huevos Para los peces, el LMR en el músculo se refiere a «músculo y piel en proporciones naturales». Los LMR en el hígado y el riñón no se aplican a los peces. Antiinfecciosos/ Antibióticos Paula Roca Saavedra 42 1.2.5. Concentraciones de antibióticos que pueden estar presentes en la alimentación de un adulto según las recomendaciones nutricionales El Reglamento 2377/90/CEE define el LMR como: “el contenido máximo de concentración de residuos resultante de la utilización de un medicamento veterinario (expresado en mg/kg o µg/kg sobre la base del peso en fresco) autorizada en la UE o reconocida como admisible en un producto alimenticio” Los LMRs se basan sobre el tipo y la cantidad de residuos que se consideran sin riesgo toxicológico para la salud humana y tiene en consideración el concepto de Ingesta Diaria Admisible (ADI), como también tiene en cuenta otros riesgos relevantes para la salud pública, así como los aspectos tecnológicos y la ingesta estimada de alimentos (JEFCA, 2000). La ADI de un fármaco veterinario, hace referencia a la cantidad de dicho fármaco que, ingerido a lo largo de la vida, no representa ningún riesgo para la salud. En el caso de que el fármaco posea propiedades antimicrobianas, la ingesta representará la cantidad del mismo, que muestre no tener ningún efecto adverso sobre la MI. Estos valores se obtienen a través de los resultados provenientes de estudios in vitro o in vivo con animales de experimentación, después de administrarles el medicamento en el alimento durante períodos prolongados de tiempo (Cerniglia y Kotarski, 1999). Posteriormente, los resultados obtenidos son extrapolados al ser humano empleando unos coeficientes que dependen de la especie de animal de experimentación empleada. De esta manera se determina el nivel sin efecto observado (NOEL) y la ADI. Según la FAO (2004), se define la ADI como la máxima cantidad del medicamento que la especie experimental puede recibir sin ningún tipo de manifestación toxicológica. En general, lo que se hace es aplicar a la ingesta diaria aceptable del animal de experimentación que no se observa ningún efecto o NOEL, un factor de seguridad que se ubica normalmente en un valor de 100, aunque a veces puede ser más bajo. En casos debidamente justificados debido a existir un riesgo especial Introducción 43 para la salud humana, dicho factor de seguridad puede ser elevado a 1000. De esta manera, se obtiene la ADI para el consumidor (se refiere normalmente a una persona estándar de 60 kg), formando de este modo un concepto diferente al del LMR, si bien éste último nunca debe superar la ADI para el medicamento en cuestión. A pesar de que la ADI incluye un factor de seguridad para extrapolar los datos de estudios in vitro e in vivo con animales a seres humanos, los últimos avances metodológicos relacionados con el estudio de la microbiología en seres humanos, sugiere que tal vez sea necesaria una revisión de los niveles mínimos que un agente antimicrobiano veterinario puede interrumpir o desequilibrar el ser humano y su microbiota intestinal (Korpela y de Vos, 2016; Laniro y Gasbarrini, 2016). Además, debe señalarse que no sólo existen exposiciones puntuales sino una exposición a largo plazo, ya que cada día la población humana está expuesta a niveles traza de estos compuestos (Laniro y Gasbarrini, 2016). Otro parámetro de especial importancia, tratándose del tema que nos ocupa, es el nivel de dosis sin efecto microbiológico (NMEL), que puede definirse como la dosis que no produce efecto contra las especies bacterianas más sensibles, poniendo énfasis en las especies saprófitas del tracto gastrointestinal humano. Teniendo en cuenta los parámetros anteriormente mencionados, hemos relizado un calculo de la ingesta diaria de cada uno de los antibióticos a estudio, que se prevé que una persona ingiera acorde a una dieta en base a las actuales recomendaciones y consumos promedios según los estándares de la Dieta Atlántica, la cual geográficamente se corresponde con nuestra Comunidad Autónoma. En la tabla siguiente (Tabla 3) se resumen de forma global las raciones de cada grupo de alimentos, según las recomendaciones de la Dieta Atlántica (DA). Paula Roca Saavedra 44 Tabla 3. Raciones tomadas de la Pirámide de la Dieta Atlántica. Fuente: Tojo y Leis, 2007. Según podemos observar en la tabla anterior, existen varios tipos de alimentos que son susceptibles de llevar residuos de antibióticos en concentraciones relevantes que son consumidos de manera habitual dentro del marco de nuestra dieta. Hemos de tener en cuenta para realizar un correcto cálculo, el peso de cada uno de los alimentos mencionados, ya que es diferente, por lo que en las Tablas 4 y 5, se muestran la cantidad que en el marco de la DA (Tojo y Leis, 2007) se recomienda de cada uno de los mencionados grupos de alimentos. Grupo de alimentos Recomendaciones Dieta Atlántica Cereales (se incluye arroz, pasta, galletas, pan…) y patatas 6-8 raciones/día Frutas ≥ 3 raciones día. Verduras y hortalizas ≥ 2 raciones/día. Lácteos 3-4 raciones/día. Legumbres 2-3 raciones/semana. Huevos 3-4 raciones /semana. Carnes (principalmente magras) 3-4 raciones/semana. Pescados 3-4 raciones/semana. Frutos secos 3-6 raciones semana. Agua 6-8 raciones/día. Aceite de oliva 3-4 raciones/día. Carnes grasas, embutidos, margarina, mantequillas Alguna vez/mes. Bollería, snacks y golosinas Alguna vez/mes. Bebidas refrescantes o azucaradas Alguna vez/mes. Introducción 45 Tabla 4. Pesos de raciones y medidas caseras de los alimentos según las recomendaciones de la Dieta Atlántica, que tienen poca probabilidad de contener residuos de antibióticos. Fuente: Grupos de alimentos y pesos tomadas de Obxectivos de saúde nutricional nos comedores universitarios na USC: Dieta Atlántica (Tojo y Leis, 2007). Grupos de alimentos Peso (g) Cereales Arroz y pasta Pan y pan integral Patatas Pasta para sopa Cereales de desayuno Galletas tipo María 60g de pasta 30-40g de pan 150-200g de patatas 20g 25-30g 6g Verduras y Hortalizas Grelos, acelgas, espinacas, calabacín, champiñón, col de Bruselas, berenjena, espárrago, guisantes, zanahorias, pimiento rojo y verde, Lechuga, endivia, cebolla, Tomate 150-200g 50-100g 140g Frutas Albaricoque, kiwi, manzana, melocotón, naranja, nectarina, pera, plátano Melón, piña y sandía Cerezas, fresas y uvas 100-200g 110-150g 100-150g Frutos secos Almendras, avellanas, cacahuete, nueces, pistachos Castaña Higo seco, ciruela seca y dátil 20-30g 60g 50g Legumbres Garbanzos, lentejas, habas 60-80g Grasas Aceite de oliva Mantequilla 10ml 10-15g Paula Roca Saavedra 52 2006). El fitol se convierte primero en su aldehído y posteriormente se se convierte en AF. La producción del AF está mediada por la enzima denominada aldehído deshidrogenasa (Van den Brink y Wanders, 2006). Estos autores sugirieron que, al menos en estudios con ratones, el fitol se convierte primero en AF y después puede reducirse para producir ácido pristánico (Figura 10) (Vetter y Schröder, 2011). Sin embargo, se ha descubierto otra vía, en que un alcohol derivado del fitol denominado dihidrofitol, también puede convertirse en AF y este alcohol ha sido detectado en el rumen de las vacas, pudiendo ser el resultado de procesos bacterianos (Van den Brink y Wanders, 2006). Introducción 53 Figura 10. Vías de conversión de fitol en ácido fitánico. Fuente: Roca-Saavedra y col., 2017. En los mamíferos, el AF aparece como un producto oxidado del fitol después de la ingestión de alimentos que contienen grasas de origen animal o vegetales, y su absorción en el intestino delgado (Elmazar y col., 2013). En cuanto a los alimentos marinos, el AF deriva de especies de fitoplancton, tales como algas y microalgas, que también contienen moléculas de clorofila. Dicha clorofila procedente del fitoplancton es metabolizada una vez ingerido por los diferentes Paula Roca Saavedra 54 animales herbívoros marinos, con lo que el fitol, así como sus derivados, se depositan en los tejidos de los mismos. En última instancia esto da lugar a que dicha molécula esté presente a lo largo de la cadena alimentaria marina, como en los moluscos, peces y ballenas, y, en particular, en los aceites, grasas y derivados obtenidos de estas especies (Wander y col., 2011). Otro aspecto interesante en la degradación del fitol a AF es que existen dos diastereómeros del AF en la naturaleza, uno con la nomenclatura de (-RRR) y otro (-SRR), presentes en los alimentos que contienen AF, si bien es cierto que la proporción entre ambos diastereómeros varía. El diastereómero -SRR es la forma predominante en los animales marinos y en los mamíferos terrestres aparece en mayor proporción la forma -RRR (Vreken y col., 1998). Sin embargo, un estudio reciente no encontró esta distribución, posiblemente debido a las mejores tecnologías de determinación comparadas con las empleadas previamente (Schröder y Vetter, 2011). Además, el mismo estudio descubrió un mayor predominio del diastereómero -SRR en los grandes depredadores marinos, tales como la tortuga verde, el león marino o la marsopa, que en los encontrados en animales marinos utilizados comúnmente como alimentos, como por ejemplo el calamar, la trucha o la dorada (Schröder y Vetter, 2011). Curiosamente, también se descubrió que la distribución entre los diastereómeros del AF varía entre la leche bovina en función de su diferente origen, ya que la leche ecológica ofrece una mayor proporción del isómero -RRR en comparación con la leche convencional, que presenta mayor cantidad del diastereómero -SRR (Schröder y col., 2012), siendo este último diastereómero (-SRR) el que menos efectos tóxicos presenta a nivel del sistema nervioso central (Schroder y col., 2012). 1.3.4. Metabolismo del ácido fitánico en los seres humanos Introducción 55 La investigación sobre el AF comenzó en 1950, cuando los productos lácteos estaban siendo investigados por su contenido en ácidos grasos. Estos estudios revelaron que el AF es un constituyente principal de una variedad de productos alimenticios en la dieta humana, especialmente en productos derivados de animales de pastoreo (Van den Brink y col., 2006) y marinos (Wander y col., 2011). Después, se encontró que el AF es un ácido graso de 20 carbonos, compuesto de una cadena principal de 16 carbonos y cuatro grupos metilo adicionales. El interés por el AF aumentó considerablemente cuando se registraron niveles elevados de esta molécula en los tejidos de un paciente que sufría la enfermedad de Refsum. Una vez que se estableció que el AF se encuentra en cantidades muy elevadas en el plasma de estos pacientes, y se estableció como prueba bioquímica de diagnóstico fácil. Desde entonces, una concentración sérica elevada de AF es generalmente considerado como un marcador de la enfermedad de Refsum (Van den Brink y col., 2006). Por todo esto, hay que profundizar en el metabolismo que tiene lugar el AF en los seres humanos. El metabolismo de este ácido graso puede producirse a través de αoxidación y β-oxidación (Nagai, 2015). La α-oxidación que ocurre en algunas personas, se debe a una mutación de una enzima, denominada fitanoil-CoA-2-hidroxilasa, que causa la enfermedad de Refsum, causando síntomas neurológicos, tales como retinitis pigmentosa, polineuropatía, y ataxia cerebelosa (Wright y col., 2012). En el ser humano la α-oxidación sólo se produce en los peroxisomas, mientras que los peroxisomas y mitocondrias son capaces de β-oxidar ácidos grasos. La concentración de AF en el plasma de sujetos sanos varían entre 0.04-11.5 µM (Al-Dirbashi y col., 2008), mientras que en los pacientes con enfermedad de Refsum varía entre 240 a 1.400 µM (Nagai, 2015). Además de esto, una concentración sérica elevada de AF fue asociado con otras enfermedades, como el cáncer de próstata (Xu y col., 2005), la apoptosis de los astrocitos (Kahlert y col., 2005), patologías cardíacas (Monning y col., 2004), polineuropatía periférica (Wierzbicki y col., 2007), daño molecular oxidativo (Kataria y col., Paula Roca Saavedra 56 2015), daño del ADN (Wright y col., 2012), e implicado potencialmente en el linfoma de Hodgkin (Ollberding y col., 2013; Zomer y col., 2000). Sin embargo, en los últimos años, al igual que otros derivados del fitol, se ha demostrado que el AF también puede tener un papel positivo en los seres humanos (Islam y col., 2015). De este modo, se ha sugerido que el AF y su metabolito principal, el ácido pristánico (ácido 2,6,10,14-tetrametilpentadecanoico) pueden tener un efecto protector contra el síndrome metabólico (Capuana y col., 2014; Hellgren, 2010), favorecer la diferenciación de los adipocitos de la grasa parda (Schlüter y col., 2000b), prevenir la diabetes tipo 2 (Hellgren, 2010), así como prevenir el cáncer de mama, colon y otros tipos de cánceres (Raplh y col., 2010). Como se puede observar, algunas de estas patologías tienen una menor prevalencia en la población gallega que en el caso de la media nacional, por lo que el elevado consumo de AF a través de la DASE, podría estar jugando un papel importante. En consecuencia, dado que las funciones del AF en la salud de las personas que ingieren concentraciones elevadas de éste siguen siendo poco claras, y el elevado consumo de este compuesto graso por parte de la población en nuestra comunidad, es necesario profundizar en el conocimiento acerca de sus efectos sobre la salud humana. 2. OBJETIVOS Objetivos 59 2. OBJETIVOS El presente trabajo tiene como finalidad principal, evaluar los efectos que los antibióticos ingeridos a bajas concentraciones, en forma de residuos contenidos en los alimentos, pueden tener sobre la microbiota intestinal humana. No obstante, paralelamente, también se ha realizado otro tipo de investigaciones que constituyen un complemento importante y que son de gran interés para determinar el por qué de la especial situación de la población gallega respecto al sobrepeso. De este modo, los objetivos específicos planteados podemos enumerarlos de la siguiente manera: 1. Determinación de la composición de la microbiota intestinal en una muestra de la población gallega. 2. Estudio del papel que componentes específicos de la Dieta Atlántica pueden tener sobre la salud de la población gallega. 3. Determinación in vitro de los efectos de antibióticos a concentraciones incluidas en los LMR sobre la microbiota intestinal humana. 4. Determinación in vivo de los efectos de antibióticos a concentraciones incluidas en los LMR sobre la microbiota intestinal de animales de experimentación. 5. Determinación in vitro de los efectos de extractos polifenólicos a las concentraciones habitualmente empleadas como prebióticos sobre la microbiota intestinal humana. 3. MATERIALES Y MÉTODOS Paula Roca Saavedra 68 (AES, Counbourg, Francia) durante 5 min. Las muestras así homogeneizadas se transvasaron a tubos de ensayo estériles tapados y se mantuvieron en congelación hasta su uso. 3.1.4. Determinación y cuantificación bacteriana mediante PCR La extracción de ADN se llevó a cabo utilizando 1 mL de cada una de las muestras mediante un kit comercial (Realpure Microspin, Durviz S. L., Valencia, España) (Figura 11) siguiendo las instrucciones del fabricante. Figura 11. Kit y materiales empleados para la extracción de ADN Una vez extraído el ADN de las muestras, se procedió a la cuantificación de los distintos tipos de grupos bacterianos incluidos en el estudio, para los que se emplearon las sondas específicas que se señalan en la Tabla 7. Todas las mezclas se llevaron a cabo basándose Materiales y Métodos 69 en el método publicado por Murri y col. (2013), utilizando dichas sondas y el fluorocromo Syber Green (Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems, Reino Unido). Tabla 7. Condiciones empleadas en la PCR cuantitativa en tiempo real para la determinación de los grupos bacterianos estudiados Grupo bacteriano Sondas Cepa Referencia Condiciones de cultivo Tamaño amplicón (bp) Temperat ura anillado (ºC) Referencia Microbiota total F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAG R: ATTACCGCGGCTGCTGG Clostridium perfringens CECT376 Caldo RCM, 37◦C, 48h, anaerobio 200 60 Fierer y col. (2005) Firmicutes F: ATGTGGTTTAATTCGAAGCA R: AGCTGACGACAACCATGCAC Clostridium perfringens CECT376 Caldo RCM, 37◦C, 48h, anaerobio 126 60 Guo y col. (2008) Bacteroidetes F: CATGTGGTTTAATTCGATGAT R: AGCTGACGACAACCATGCAG Bacteroides vulgatus LMG 17767 Caldo nutritivo+ 5% sangre de cordero, 37◦C, 48h, anaerobio 126 60 Guo y col. (2008) Actinobacteria F: GCGKCCTATCAGCTTGTT R: CCGCCTACGAGCYCTTTACGC Bifidobacteriu m longum CECT 4503 Caldo MRS+ 0.05%Cys, 37◦C, 48h, anaerobio 333 60 HermannBank y col. (2013) CECT: Colección Española de Cultivos Tipo; Cys: cisteína; DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares); LMG: Bacteria Collection Laboratorium voor Microbiologie Universiteit Gent (Ghant, Belgica); MRS: De Man, Rogosa and Sharpe; RCM: Reinforced Clostridium Medium. Proteobacteria F:CATGACGTTACCCGCAGAAGAAG R: CTCTACGAGACTCAAGCTTGC Enterobacter cloacae CECT 194 Caldo nutritivo, 30◦C, 24h, aerobio 195 63 Friswell y col. (2010) Bifidobacterium F: CTCCTGGAAACGGGTGG G: GGTGTTCTTCCCGATATCTACA Bifidobacteriu m longum CECT 4503 Caldo MRS+ 0.05%Cys, 37◦C, 48h, anaerobio 550 58 Matsuki y col. (2004) Bacteroides F: GAGAGGAAGGTCCCCCAC R: CGCTACTTGGCTGGTTCAG Bacteroides vulgatus LMG 17767 Caldo nutritivo+ 5% sangre de cordero, 37◦C, 48h, anaerobio 106 60 Layton y col. (2006) Lactobacillus F: AGCAGTAGGGAATCTTCCA R: CACCGCTACACATGGAG Lactobacillus reuteri DSMZ 20016 Caldo MRS 37◦C, 24h, aerobio 341 58 Heilig y col. (2002) Paula Roca Saavedra 72 Todas las reacciones se llevaron a cabo en duplicado, siendo el volumen final de 20 µL y conteniendo 2 µL de ADN y una concentración de 100 nM de cada una de las sondas (Tabla 7). Las condiciones de la RT-qPCR, llevadas a cabo en el equipo ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) (Figura 12) fueron las descritas previamente por Murri y col. (2013) ligeramente modificadas. Así, el primer paso consistió en una etapa de desnaturalización a 95ºC durante 10 min seguida de una etapa de 45 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 10 s y temperatura óptima de anillado durante 1 min y, finalmente un análisis de las curvas de fusión mediante enfriamiento a 60ºC (0.05 ºC por ciclo) con una medida simultánea de la intensidad del fluorocromo Syber Green. La determinación del punto de fusión permitió la confirmación de la especificidad de la amplificación de los productos. Además, para cada uno de los experimentos se incluyeron controles negativos que contenían todos los reactivos con la excepción de ADN para asegurarnos la correcta amplificación en cada una de nuestras muestras. Una vez realizada la reacción de RT-qPCR, la concentración bacteriana para cada una de las muestras y los grupos objeto de estudio, se calculó mediante la comparación de los valores de ciclo umbral (Ct) obtenidos previamente para las curvas estándar (Software 7000 Sequence Detection System, SDS, Applied Biosystems). Figura 12. Equipo de PCR cuantitativa en tiempo real ABI PRISM 7000 Materiales y Métodos 73 Para la cuantificación de cada uno de los grupos bacterianos estudiados se elaboró una curva de calibración estándar, utilizando diluciones decimales de ADN bacteriano (de conocida concentración) obtenidas a partir de cultivos puros de cepas de referencia, según lo señalado en la Tabla 7. Las cepas se pusieron a crecer en el medio de cultivo de referencia bajo sus condiciones óptimas de crecimiento y se realizaron diluciones decimales para su posterior recuento en placa, empleando los medios de cultivo más adecuados para cada una de las especies. Una vez hecho el recuento se extrajo el ADN del tubo madre y se cuantificó el ADN mediante fluorescencia utilizando el fluorímetro Qubit Fluorometer (Invitrogen, Oregon, MI, USA) (Figura 12). Figura 12. Fluorímetro empleado para la cuantificación de ADN Cada una de las curvas se normalizó al número de copias del gen 16S rRNA para cada una de las especies. En cada determinación, se emplearon controles negativos que contenían todos los elementos de la mezcla excepto la alícuota de ADN, y en ningún caso fue detectada reacción positiva. Los datos, finalmente se expresaron como una media de los valores duplicados obtenidos en los análisis. La eficiencia de la reacción para todos los pares de sondas se determinó utilizando la pendiente de la curva de calibrado obtenida para cada uno de los grupos bacterianos analizados, siendo esta eficiencia E = 10 (-1/pendiente). Paula Roca Saavedra 74 Los pares de sondas demostraron una eficiencia en el rango entre el 95% (E = 1,9) y el 104% (E = 2,07) y valores de pendiente en el rango de -3,59 a -3.16. Los resultados positivos fueron obtenidos mediante series de curvas tal y como se muestra en la Figura 13. Figura 13. Representación de las curvas obtenidas en la cuantificación de Bacteroidetes 3.2. ESTUDIO DEL EFECTO DEL ÁCIDO FITÁNICO EN LA SALUD DE LOS CONSUMIDORES EN EL MARCO DE LA DIETA ATLÁNTICA DEL SUR DE EUROPA Para la determinación del estudio de la influencia del ácido fitánico en la salud de los consumidores en el marco de la DASE, se realizó una revisión bibliográfica a través de los buscadores de información científica a los que está suscritos la Universidad de Santiago de Materiales y Métodos 75 Compostela. Mediante estos buscadores se accedió en la mayor parte de los casos a las revistas científicas consultadas. En los casos en los cuales los trabajos habían sido publicados en revistas u otras fuentes a las cuales la USC no estaba suscrita, se pidió una copia al autor, bien a través del correo electrónico correspondiente o bien a través de la plataforma ResearchGate (ResearchGate GmbH, Berlín, Alemania). Con este objetivo, se han introducido las siguientes palabras clave en las bases de datos Scopus® (Elsevier, Amsterdan, Holanda) y en la Web of Knowledge® (Thompson Reuters, Philadelphia, USA): “Phytanic acid”, “phytol derivates”, “Refsum symdrome”, “Zellweger symdrome”. Tras dicha revisión bibliográfica se han encontrado más de 1.600 publicaciones científicas, de las cuales han sido seleccionadas las publicadas en los últimos cinco años (como medida para evitar incluir informaciones ya obsoletas) así como los documentos más antiguos que se encuentran entre los 25 más citados de todos los consultados. Tras eliminar duplicados y excluyendo aquellas que no figuraban incluidas en los criterios anteriormente señalados, se procedió a la revisión y la integración de la información de un total de 136 artículos científicos. La información contenida en los mismos fue recopilada, traducida, resumida y utilizada de manera discrecional. 3.3. DETERMINACIÓN DE LOS EFECTOS IN VITRO DE LOS ANTIBIÓTICOS A CONCENTRACIONES INCLUIDAS EN LOS LÍMITES MÁXIMOS DE RESIDUOS SOBRE LA MICROBIOTA INTESTINAL A fin de comprobar los efectos de bajas concentraciones de antibióticos sobre la MI, se diseñaron dos tipos de ensayos in vitro. El primero de ellos se realizó poniendo en contacto bajas concentraciones de antibióticos con cepas conocidas de diversos cultivos puros, a fin de determinar si dichas concentraciones de antibióticos son suficientes Paula Roca Saavedra 76 para causar algún tipo de inhibición en el crecimiento de dichas cepas. Posteriormente, se pusieron con contacto los mismos antibióticos con la MI procedentes de heces humanas de tres voluntarios diferentes, en un modelo de simulación de la fermentación colónica distal. Para estos ensayos, teniendo en cuenta que en Europa las tres familias de antibióticos más empleados en medicina veterinaria son las tetraciclinas, los β-lactámicos y las sulfamidas (Grave y col., 2014), se seleccionó para dichas pruebas un representante de cada una de dichas familias, la tetraciclinas en el caso de las tetraciclinas, la amoxicilina en el caso de los β-lactámicos y la sulfadiacina en el caso de las sulfamidas. Como concentraciones de referencia, dado que nuestra intención es comprobar los posibles efectos en la MI como consecuencia de su ingesta como contaminantes alimentarios, se seleccionó concentraciones dentro de los LMR establecidos mediante el Reglamento 37/2010 para dichos antibióticos en músculo (100 μg/kg en el caso de la tetraciclina y la sulfadiacina y 50 μg/kg en el caso de la ampicilina) y teniendo en cuenta la ingesta semanal recomendada de los alimentos, en el marco de la DA (Tojo y Leis, 2007). 3.3.1. Determinación de los efectos in vitro de los antibióticos sobre cultivos puros Los antibióticos empleados fueron obtenidos de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). Para la preparación de las diluciones, cada uno de los antibióticos se pesó en un tubo de vidrio previamente esterilizado en una autoclave (Raypa, Barcelona, España), a 121 ºC durante 15 minutos. Posteriormente, se añadió agua desionizada para su dilución, y posteriormente se diluye con agua Milli-Q® (Millipore, Bedford, MA, USA). Una vez realizada la dilución mediante agitación en baño de ultrasonidos (Raypa, Barcelona, España), esta se esterilizó mediante filtración con una membrana estéril Acrodisc® de 0.22 µm (Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI, USA). Una vez esterilizado, se procedió a su dilución en agua desmineralizada hasta obtener las concentraciones de Materiales y Métodos 77 100 μg/kg en el caso de la tetraciclina y la sulfadiacina y 50 μg/kg en el caso de la ampicilina, que se emplearon para realizar las pruebas de inhibición. Para determinar los efectos de dichas concentraciones de antibióticos sobre la MI, se seleccionaron un total de 12 cepas bacterianas, representativas de la MI humana (Tabla 9). Todas las cepas fueron obtenidas de la colección española de cultivos tipo (CECT, Burjassot, España) o del Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania). En todos los casos, tras su llegada al laboratorio las cepas fueron reconstituídas siguiendo las instrucciones del fabricante y mantenidas congeladas en criobolas (Oxoid, Bakingstoke, Reino Unido) a -20 ºC hasta el momento de su utilización. Previo a su utilización, cada una de las cepas incluidas en el estudio, fueron reconstituidas empleando el medio de cultivo, así como la temperatura de incubación y el tipo de atmósfera ideal para cada una de ellas, según se describe en la Tabla 9. Paula Roca Saavedra 84 tomado antibióticos, ni preni pro-bióticos durante al menos los 6 meses anteriores al ensayo y sin ningún tipo de desorden gastrointestinal. Así, 3 voluntarios (dos mujeres y un hombre) con una edad comprendida entre 32 y 50 años donaron una muestra de heces (previa firma de consentimiento informado). Se adoptaron ciertas precauciones estipuladas en las guías de buena práctica médica y la declaración de Helsinki, entre ellas la necesidad de obtener un consentimiento informado y del seguimiento de ciertas declaraciones éticas y de protección y custodia de los datos obtenidos que se detallan a continuación. 3.3.2.2. Declaraciones éticas Todas las determinaciones se llevaron a cabo tras aceptación de las condiciones de estudio, por parte de todos los participantes, a través de la firma de un consentimiento informado. El estudio se desarrolló con 3 voluntarios a los que se les asignó un código aleatorio para preservar su intimidad. La firma del consentimiento informado para la toma de heces fue realizado por personal cualificado y el uso de los datos obtenidos seguirá las normas recogidas en la Ley Española (15/1999) de protección de datos de carácter personal. 3.3.2.3. Evaluación del crecimiento bacteriano en cultivos mixtos con muestras fecales humanas Los ensayos se llevaron a cabo simulando las condiciones del colon distal humano, que es la parte del cuerpo que posee una mayor cantidad y diversidad de grupos bacterianos (Conlon y Bird, 2015) y donde se produce la mayor parte de los desórdenes gastrointestinales. El medio de cultivo (250 mL por prueba) utilizado fue el descrito por Macfarlane y col. (1998). Su composición (g/L de agua destilada) consistió en: 5 g almidón, 2 g de pectina,1 g de goma guar, 4 g de mucina (porcina Materiales y Métodos 85 gástrica tipo III), 2 g de xilano, 2 g arabinogalactano, 1 g de inulina, 3 g de caseína bovina, 5 g de peptona (Merck , Alemania), 5 g de triptona, 0,4 g de sales biliares, 4,5 g de extracto de levadura (Panreac, Barcelona, España), 4,5 g de NaCl (Panreac), 0,5 g de KH2PO4 (BDH), 1,25 g de MgSO4 7H2O (Sigma-Aldrich, Steiheim, Alemania), 0,15 g de CaCl2.2H2O, 1,5 g de NaHCO3 (Sigma-Aldrich, Steiheim, Alemania), 1 g de Tween 80 (Panreac), 0,05 g de hemina (SigmaAldrich) y 0,8 g de cisteína HCl. Dicho medio de cultivo se introdujo en un sistema de simulación in vitro del colon distal (Figura 15) y se inoculó con 2,5 mL de una muestra homogeneizada de heces (1% p/v) diluida en tampón fosfato salino (PBS) (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) (1:10). Figura 15. Sistema de simulación in vitro del colon distal por triplicado 3.3.2.4. Preparación de antibióticos Control de pH: 6,7 Control de temperatura: 37ºC Corriente de nitrógeno: anaerobiosis Paula Roca Saavedra 86 Los antibióticos empleados fueron tetraciclina, sulfadiacina y ampicilina, y las concentraciones empleadas 100, 100 y 50µg/60kg persona/día, respectivamente. Dichas concentraciones se determinaron teniendo en cuenta los niveles máximos permitidos en alimentos según la legislación europea (Reglamento UE 37/2010) y teniendo en cuenta la ingesta semanal recomendada de los alimentos, en el marco de la DA (Tojo y Leis, 2007). Posteriormente, se le añadió al medio ya inoculado con las heces procedentes de los voluntarios (1 g por persona) la cantidad correspondiente del antibiótico preparado y diluido hasta obtener la cantidad necesaria. Las condiciones de ensayo fueron las correspondientes a las del colon distal, en anaerobiosis generada mediante un suministro continuo de nitrógeno libre de oxígeno (Praxair, Madrid, España). La temperatura se mantuvo constante a 37 ºC a través de un baño termostático (Pharmacia Biotech, Holanda), a partir del cual se envía agua atemperada a las camisas de los vasos de ensayo. El pH se mantuvo constante a 6,5, controlado mediante un regulador de pH (Crison, Barcelona, España). Las tomas de muestras se hicieron a las 0 y 24 horas de ensayo, en las cuales se tomó una muestra de 3 mL de volumen, y se determinaron las diversas fracciones estudiadas de la microbiota (siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.1.4), y la concentración de ácidos grasos de cadena corta, según se describe en el apartado siguiente. 3.4. ENSAYOS IN VIVO PARA LA DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS SOBRE LA MICROBIOTA INTESTINAL DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 3.4.1. Animales de experimentación Materiales y Métodos 87 Para la realización de ensayos in vivo empleamos un total de 14 semanas en el que se administraron los tres antimicrobianos citados a dosis permitidas por la legislación. Se emplearon ratones Mus musculus C57BL/6, una cepa de ratón muy utilizada en investigación. En este caso, todos los animales fueron del mismo sexo (hembras) que compartieron jaula entre los miembros del mismo grupo siguiendo la normativa de espacio mínimo por animal. Se determinaron varias poblaciones microbianas de la flora intestinal de los animales durante y tras la ingesta de estos antimicrobianos. Previamente al inicio del estudio, fue solicitada autorización al Comité de Bioética de la Consellería do Medio Rural e do Mar, la cual fue concedida (ensayo autorizado nº MR110250), al comprobar que el protocolo presentado cumple todos los requisitos incluidos en el Real Decreto 53/2013. El procedimiento a realizar no implicó dolor, sufrimiento, angustia o daño duradero alguno para los animales, tal y como establece el Real Decreto 53/2013. No obstante, dicho Real Decreto también establece que el número de animales de experimentación utilizados se debe reducir al mínimo y se evite la duplicación inútil de procedimientos. Así, utilizamos un total de 15 animales (suministrados por el animalario central de la USC) por grupo (grupos tratados y grupo control), con un total de 4 grupos. Los 15 animales pertenecientes al grupo control fueron los mismos para todos los procedimientos. Este número de animales utilizados nos da una seguridad superior al 95%, asumiendo una formulación bilateral y estimando entre un 10-20% de pérdidas de información. 3.4.2. Preparación de antibióticos Los antibióticos empleados fueron tetraciclina, sulfadiacina y ampicilina (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) y las concentraciones empleadas 100, 100 y 50µg/kg de alimento consumido respectivamente para los cuales existe legislación ,y teniendo en cuenta la ingesta semanal recomendada de los alimentos y haciendo la media Paula Roca Saavedra 88 de la ingesta diaria. Los antimicrobianos fueron preparados en el Laboratorio de Higiene, Inspección y Control de Alimentos, y fueron administrados a los animales por vía oral a través de la alimentación, mediante el pienso que consumían. Al grupo tratado se les suministró una cantidad de 4 g/ratón y día de pienso al cual se les adicionó la dosis de antibiótico calculada según el peso medio del animal y correspondiente con el límite máximo de residuos, mientras que al grupo control se les administró el mismo pienso pero sin adición de antibiótico. La adicción del antibiótico al pienso se hizo mediante impregnación de la disolución realizada y secado en estufa (40 ºC) antes de su consumo (Figura 16). Figura 16. Diseño experimental del ensayo realizado 3.4.3. Recogida y tratamiento de las muestras de heces Las heces fueron recogidas de manera aséptica por personal del animalario una vez por semana y transportadas al laboratorio de Higiene, Inspección y Control de Alimentos en una nevera portátil, que 60g de pienso/día420 g semanales 60g de pienso/día 420 g semanales 60g de pienso/día 420 g semanales Grupo sulfadiacina Grupo control 4 g de pienso por ratón y día 15 ratones por grupo Grupo tetraciclina Grupo ampicilina 60g de pienso/día 420 g semanales 42µg de antibiótico/sem 42µg de antibiótico/sem 42µg de antibiótico/sem Materiales y Métodos 89 fueron procesadas inmediatamente tras su llegada. Se recogieron muestras de heces de cada uno de los grupos de ratones en un contenedor estéril (entre 10 y 30 g por grupo) y se procesaron antes de dos horas desde su recolección. El tratamiento de preparación para la posterior extracción de ADN y cuantificación bacteriana consistió en una dilución 1:10 en PBS (ajustado a un pH 7,2-7,4) y homogeneizadas en una bolsa estéril con un Masticator® (AES, Counbourg, Francia) durante 5 min. Las muestras así homogeneizadas se transvasaron a tubos de ensayo estériles tapados y se mantuvieron en congelación hasta su uso. Posteriormente, se realizó la extracción de ADN y cuantificación bacteriana siguiendo el protocolo descrito en el apartado 3.1.4. 3.5. ESTUDIO DE LOS POTENCIALES EFECTOS BENEFICIOSOS DE EXTRACTOS OBTENIDOS A PARTIR DE UVA DE VINO BLANCO Y UVA DE VINO TINTO SOBRE LA MICROBIOTA INTESTINAL HUMANA 3.5.1. Sustratos empleados Los sustratos utilizados para evaluar el potencial prebiótico fueron extractos secos procedentes de uva tinta (ESUT) y blanca (ESUB), concentrados proporcionados por la industria (Abrobiotec S. L, Valladolid, España). Estos extractos son obtenidos durante el proceso de elaboración del vino, siendo un residuo del mismo. Así están formados fundamentalmente por los hollejos y piel de la uva que es donde se concentran principalmente los componentes polifenólicos, siendo sus principales componentes quercetina, antocianos, antocianósidos, antocianidinas, catequinas y proantocianidinas. Paula Roca Saavedra 90 3.5.2. Microorganismos y medios de cultivo empleados Para llevar a cabo el estudio de fermentabilidad con cultivos puros de microorganismos considerados beneficiosos y constituyentes de la flora intestinal, se utilizaron diferentes cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium, obtenidos de diferentes colecciones de cultivos tipo. Así, en la Tabla 11 se exponen tanto las cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium utilizadas, como la colección o casa comercial donde se adquirieron así como las condiciones óptimas de crecimiento proporcionadas por el fabricante. Tabla 11. Cepas bacterianas utilizadas en este estudio, las fuentes correspondientes y el origen. Cepas probióticas Fuente Origen Condiciones de incubación Lactobacillus salivarius 20555 DSMZ (Braunsxhweig, Alemania) Saliva humana Caldo MRS 37ºC, 24 h Aerobio Lactobacilllus rhamnosus 20021 Productos lácteos, aguas residuales humanas y clínicas Lactobacillus reuteri 20016 Intestino humano (adulto) Lactobacillus brevis D-24 ESB-UCP, Portugal Aislado del caqui Lactobacillus paracasei LAFTI®L26 DSM (Moorebank, NSW, Australia) Productos lácteos Lactobacillus casei 431 Christian Hansen(Hørsholm, Dinamarca) Heces infantiles Lactobacillus plantarum 299v PROBI AB (Lund, Suecia) Intestino humano (adulto) Lactobacillus acidophilus LAFTIL10 DSM (Moorebank, NSW, Australia) Productos lácteos Caldo MRS 37ºC, 24 h Aerobio facultativo Bifidobacterium longum 4503 CECT (Valencia, España) Intestino adulto Caldo MRS + 0.05 % Cisteína 37ºC, 48 h Anaerobio Bifidobacterium longum subsp. Infantis 4553 CECT (Valencia, España) Intestino infantil Bifidobacterium breve 4839 CECT (Valencia, España) Intestino infantil Caldo MRS + 0.05 % Cisteína 37ºC, 24 h Anaerobio Bifidobacterium bifidum 870 CECT (Valencia, España) Heces infantiles Caldo MRS 37ºC, 48 h Anaerobio Bacteroide vulgatus 17767 LMG (Ghant, Bélgica) Heces humanas NB + Sangre de cordero 37ºC, 24 h Anaerobio Clostridium perfringens 376 CECT (Valencia, España) Bovino RCM, 37ºC, 48 h Anaerobio Enterobacter cloacae 194 CECT (Valencia, España) Fluido espinal humano NB, 30ºC, 24h, Aerobio *DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen; *CECT: Colección Española de Cultivos Tipo; *LMG: Bacterial collection/BCCM: Laboratory of Microorganism of Ghent University /Belgium Coordinated. Materiales y Métodos 93 Las cepas utilizadas para la cuantificación de las diferentes poblaciones bacterianas por RT-qPCR en los ensayos de fermentación in vitro con inóculos fecales fueron las siguientes: Bifidobacterium longum CECT 4503, Lactobacillus reuteri DSM 20016, Bacteroides vulgatus LMG 17767 y Clostridium perfringens CECT 376. Todos los cultivos se mantuvieron a -20ºC en su medio correspondiente (Cultimed, Barcelona, España) suplementados con glicerol (30%, v/v) y se subcultivaron en el mismo medio antes de su utilización bajo las condiciones proporcionadas por el fabricante (Tabla 11). 3.5.3. Comprobación de la capacidad de fermentación de probióticos empleados Previamente a las pruebas de fermentación colónica, se realizaron estudios para determinar si existe fermentación de los extractos polifenólicos como única fuente hidrocarbonada por parte de las cepas probióticas empleadas. Con este fin, las cepas bacterianas previamente preinoculadas (1% v/v) se cultivaron durante toda la noche en medio MRS. Dichos cultivos se diluyeron 100 veces en caldo MRS de fermentación sin glucosa, donde previamente se diluyeron los substratos polifenólicos estudiados al 2% (p/v). En el caso de las Bifidobacterium el medio de cultivo se suplementó también con cisteína al 0,05% (p/v). Las cepas fueron cultivadas al binomio tiempo/temperatura indicado por el fabricante (37 ºC durante 24 h en el caso de Lactobacillus y 48 h en el caso de Bifidobacterium). Como control positivo se cultivaron las cepas en MRS con glucosa, y como control negativo las cepas se cultivaron en medio MRS sin glucosa. Pasado el tiempo correspondiente de incubación, el crecimiento bacteriano se evaluó mediante recuento en placa en medio MRS enriquecido en cisteína bajo las condiciones óptimas de crecimiento (Tabla 11) tras la realización correspondiente de las diluciones en agua peptonada. Paula Roca Saavedra 100 En la Tabla 12 se puede observar, en términos globales que se trata de una población entre joven y de mediana edad, con un promedio de 28,3± 9,73 años. En relación al promedio de peso y altura, éstos se sitúan en un peso corporal medio de 68,39± 13,25 kg y una altura media de 168± 8,91 cm, lo que conduce a un IMC de 23± 1,74. Este dato caracteriza a la población de estudio con un IMC promedio en normopeso, si bien 11 de los sujetos (35,48%) se encuentran en estado de sobrepeso u obesidad (IMC>25). Este resultado es consistente con los datos publicados recientemente, en los que se encontró una tasa de obesidad de alrededor del 25% en la población adulta gallega (Aranceta-Bartrina y col., 2016). El número de alergias e intolerancias que presentaban los sujetos incluidos en el estudio alcanzó una tasa total del 25,8% encontrándose en un nivel alto. De entre las intolerancias que presentaban los sujetos, la más común fue la intolerancia la lactosa (12,9%), lo cual es inferior a los últimos datos de incidencia encontrados en el conjunto de España (alrededor del 30%) (Argüelles-Arias y col., 2014). Por otra parte, la población estudiada presentó bajos índices de tabaquismo (12,9%), cuando actualmente en la sociedad española hay cerca del 30% de fumadores (Gutiérrez-Abejón y col., 2015). El número de horas de sueño se encontró por debajo de lo recomendado para las personas de mediana edad (8 horas al día) en casi una hora de sueño y Sexo (mujer/hombre) 22/9 Fumadores (%) 12,9 Alergias alimentarias o intolerancia (%) Total 25,8; Lactosa (12,9); Gluten (6,4); Anisakis (3,2); Trehalosa (3,2) Horas de sueño 7,12 ± 0.98 Hora de acostarse 00:45 ± 1,14 Ejercicio físico (horas a la semana) 2,71 ± 1,76 Resultados y Discusión 101 día. Además, los participantes declararon irse por término medio a la cama después de la medianoche. Si tenemos en cuenta que generalmente las jornadas laborales o estudiantiles de los sujetos comenzaban a las 9:00 de la mañana, el hecho de que la población diana se acueste tan tarde es un inconveniente para el mantenimiento a largo plazo de un correcto peso corporal. Esto se debe a que según recientes investigaciones, a partir de las 20:00 horas la secreción de grelina (hormona obesogénica), se incrementa, manteniéndose elevada hasta que el sujeto se acueste (Garaulet y Gómez-Abellán, 2013). Con respecto al ejercicio físico, los sujetos informaron un promedio de 2,71 horas a la semana, lo que se traduce en un promedio de 23,23 minutos de ejercicio al día, siendo este dato promedio diario inferior al recomendado por la (SENC, 2011) para la población española. Según el consenso publicado por esta sociedad, son necesarios un mínimo de 30 minutos de ejercicio diario para la prevención del aumento de peso que ocurre con la disminución del metabolismo basal como consecuencia del envejecimiento. 4.1.2. Valoración de la ingesta dietética y grado de adhesión a la DASE Para la valoración de la ingesta dietética, se utilizó un cuestionario de frecuencia de alimentos para conocer la ingesta diaria de macro y micronutrientes. Los resultados se pueden encontrar en la Tabla 13. Tabla 13. Ingesta diaria media (g) de consumo de diferentes grupos de alimentos y nutrientes de los participantes Grupos de alimentos Cantidad diaria Bebidas sin alcohol 909,33 ± 268,84 Frutas 454,01 ± 157,97 Leche y productos lácteos 348,89 ± 161,32 Vegetales 329,50 ± 185,36 Paula Roca Saavedra 102 Como se puede observar, el consumo de bebidas (teniendo en cuenta que la encuesta separa las bebidas alcohólicas y las no alcohólicas) arroja unos datos inferiores a un litro/persona y día. Con respecto a los alimentos sólidos, el consumo de frutas (454,01 g/día), leche y productos lácteos (348,89 g/día) y hortalizas (329,50 g/día) son los más consumidos, respectivamente. El consumo de cereales (219,16 g/día), que tradicionalmente ocupa el primer lugar entre los diferentes grupos de alimentos consumidos a nivel nacional, en la población estudiada se mantuvo en el cuarto puesto. En el resto de los grupos de alimentos, destaca una ratio carne/pescado de 1,66 y un consumo muy bajo tanto de alimentos precocinados y aperitivos (20,19 g/día) como de huevos (19,93 g/día). Cereales 219,16 ± 101,59 Carne y productos cárnicos 136,12 ± 104,98 Bebidas alcohólicas 84,21 ± 86,32 Pescado y productos pesqueros 82,13 ± 13,56 Legumbres 63,61 ± 48,50 Aceites y grasas 39,15 ± 30,14 Alimentos de panadería 39,39 ± 43,80 Alimentos precocidos y bocadillos 20,19 ± 16,22 Huevos 18,93 ± 9,23 Nutrientes Energía (Kcal/d) 2756,22 ± 413,56 Proteína total (g/d) 82,57 ± 12,14 Proteína animal 53,1 ± 11,34 Proteína vegetal 29,5 ± 17,13 Grasas totales (g/d) 72,14 ± 21,78 Ácidos grasos saturados 17,0 ± 4,12 Ácidos grasos monoiinsaturados 27,2 ± 18,32 Ácidos grasos poliinsaturados 10,8 ± 3,42 Carbohidratos totales (g/d) 431,05 ± 64,28 Azúcares (g/d) 286,0 ± 42,28 Polisacáridos 145,0 ± 28,18 Fibra (g/d) 27,31 ± 7,13 Etanol (g/d) 6,8 ± 2,13 Sodio (mg/d) 3520,3 ± 1523,74 Resultados y Discusión 103 Si comparamos estos promedios de consumo con los publicados anualmente por el Panel de Consumidores del Ministerio de Agricultura, Pesca, Alimentación y Medio Ambiente (MAPAMA, 2015), los datos obtenidos no siguen una tendencia similar con el nivel promedio nacional. En primer lugar, el consumo de bebidas (considerando que la encuesta incluye tanto bebidas alcohólicas como no alcohólicas), produce datos inferiores a un litro / persona y día, lo que sugiere que los sujetos han omitido o subestimado la ingesta de algunas bebidas. En el resto de los componentes, se observó una desviación suficiente para sugerir la presencia de un patrón alimentario diferente al actual a nivel nacional. Así, las diferencias más importantes con respecto al consumo de alimentos en España, fueron el mayor consumo de frutas (454,01 g/día vs 271,5 g/día, respectivamente), hortalizas (329,5 g/día vs 260,9 g/día), leguminosas (63,61 g/ día vs 8,39 g/día) y pescado (82,13 g/día vs 70,96 g/día). Por el contrario, se encontró un menor consumo de productos de panadería (39,39 g/día vs 96,3 g/día) y alimentos precocinados y aperitivos (20,19 g/día vs 73,32 g/día) que los publicados a nivel español (Guallar-Castillón y col., 2014; MAPAMA, 2015). Teniendo en cuenta los resultados anteriores, la ingesta media de estos sujetos representa un contenido energético de 2.756,22 Kcal, en la que la mayoría sería un 63,8% de carbohidratos, 24% de grasas y 12,2% de proteínas. Esta distribución es baja en grasas y alta en carbohidratos con respecto a los objetivos establecidos por SENC para los españoles. Este patrón se relaciona con la influencia de un perfil dietético de la DASE. Los resultados de adherencia a la DASE (Tabla 14) muestran que 7 sujetos (22,6%) presentan una alta adherencia, mientras que la mayoría de los 21 participantes (67,4%) mostraron adherencia intermedia y solo 3 (9,7%) mostraron baja adherencia. Además, según el programa de cálculo dietético utilizado (EasyDiet®) los sujetos necesitan una dieta promedio de 2.767 Kcal/día debido a su edad, condiciones antropométricas y actividad física. Por lo tanto, la ingesta calórica de los sujetos es en términos globales adecuados y no justifica los altos niveles de sobrepeso y la obesidad en esta región geográfica (Aranceta-Bartrina y col., 2016, Pérez-Farinós y col., 2013). Paula Roca Saavedra 104 Tabla 14. Número y porcentaje de adhesión de los sujetos participantes a la Dieta Atlántica del Sur de Europa Tipo Adhesión Nº sujetos Porcentaje sobre total Alta 3 9,7 Media 21 67,4 Baja 7 22,6 4.1.3. Valoración de la composición de la microbiota intestinal de los sujetos participantes Según podemos observar en la Tabla 15, se cuantifican los resultados obtenidos para los principales filos y géneros de especial relevancia dentro de la microbiota intestinal de estos sujetos. Tabla 15. Resultados obtenidos en el estudio de evolución de la microbiota colónica humana Grupo bacteriano Cuantificación* Microbiota total 13,72 ± 0,7 Firmicutes 12,76 ± 0,79 Bacteroidetes 11,74 ± 1,11 Proteobacteria 7,02 ± 0,25 Actinobacteria 12,28 ± 1,05 Bacteroides spp. 10,37 ± 2,20 Bifidobacterium spp. 10,26 ± 1,29 Lactobacillus spp. 9,10 ± 1,22 *Los resultados se expresan sobre log ufc/g ± desviación estándar. Resultados y Discusión 105 Como se puede observar en la Tabla 15, con respecto al recuento de la microbiota total y la composición bacteriana, entre los participantes, los resultados obtenidos muestran un alta de cantidad log10 ufc/g, que oscila entre 12-13 (teniendo siempre en cuenta que se trata de una extrapolación a partir de copias de ADN, que no se corresponde de manera directa y exacta con las ufc/g) (Guarddon y col., 2011). Trabajos recientes realizados por otros autores han publicado recuentos totales de MI en la porción distal del colon del orden de 11 log ufc/g (Abdou y col., 2016; Arumugam y col., 2011, Power y col., 2014). El hecho de que en nuestro trabajo los recuentos totales de MI sean más altos puede deberse a una distribución de edad diferente a los sujetos estudiados por estos autores, ya que es un hecho conocido que el MI varía en cantidad y composición a lo largo del ciclo de vida (RocaSaavedra y col., 2017b). Los altos recuentos totales encontrados también pueden deberse a las particularidades de la dieta ingerida por los sujetos estudiados, ya que una infinidad de factores dietéticos influyen en la composición y cantidad de la microbiota del colon (Power y col., 2014). En cualquier caso, a pesar de que actualmente no hay un consenso sobre la composición de una MI "ideal", si se acepta que las cantidades más elevadas, con una mayor variedad son indicativos de una buena salud intestinal (Arumugam y col., 2011). Con respecto a la composición de los filos principales de la MI, se encontró que los Firmicutes, son el filo más abundante de la MI de estos sujetos. El hecho de que este filo esté abundantemente representado en los sujetos estudiados coincide con el hecho de que dicho filo suele ser el predominante en los individuos que consumen un tipo de dieta occidental, con alto contenido en alimentos ricos en grasas de origen animal (Le Chatellier y col., 2013; Power y col., 2014). Con respecto al filo Bacteroidetes, sus recuentos fueron inferiores a Firmicutes. Este resultado coincide con trabajos previos, que han publicado que los Bacteroidetes se encuentran generalmente en cantidades más bajas que los Firmicutes, si bien ambos grupos representan casi el 90% de la MI (Le Chatellier y col., 2013, Singh y col., 2016). Paula Roca Saavedra 106 Con respecto a los otros filos investigados (Actinobacteria y Proteobacteria), los resultados mostraron recuentos mayores de Actinobacteria que de Proteobacteria, y fueron significativamente mayores que los encontrados hasta ahora por otros autores (Arumugam y col., 2011, Koeth y col., 2013). La alta presencia de Actinobacteria podría estar relacionada con el alto nivel de obesidad en la población gallega, ya que algunas publicaciones demostraron previamente que este filo es especialmente abundante en personas obesas (Arumugam y col., 2011). Por otra parte, el bajo nivel de Proteobacteria encontrado es un hallazgo muy positivo, ya que este filo incluye la mayoría de las bacterias patógenas conocidas del tracto digestivo humano (Jones y col., 2014; Koeth y col., 2013). Por lo tanto, una baja presencia de este filo denota bajo riesgo de enfermedades gastrointestinales infecciosas. Además, dos géneros con una función relevante para la salud humana como Lactobacillus spp. y Bifidobacterium spp. se encontraron en elevadas cantidades (8-9 log10 ufc/g). Ambos géneros, son importantes para varias funciones fisiológicas, como es el desarrollo de la respuesta inmune (Cresci y Bawden, 2016), hasta tal punto que algunas especies pertenecientes a estos géneros se consideran probióticos (Conlon y Bird, 2015). 4.1.4. Composición de la microbiota intestinal en sujetos con diferentes IMC Con respecto a la relación de la composición de la MI (teniendo en cuenta los filos y géneros principales a estudio) y el IMC de los sujetos participantes, los resultados obtenidos se pueden ver en la Tabla 16. Resultados y Discusión 107 Tabla 16. Grupos bacterianos cuantificados en muestras fecales humanas en sujetos con diferentes índices de masa corporal (IMC) Grupo bacteriano IMC <20 (n=5) IMC 20-25 (n=15) IMC >25 (n=11) Microbiota total 13,05 ± 0,13 12,56 ± 1,40 12,71 ± 0,42 Firmicutes 12,24 ± 0,27 11,94 ± 0,51 11,68 ± 0,46 Bacteroidetes 9,71 ± 0,49b 10,06 ± 0,53a,b 10,34 ± 0,72a Actinobacteria 9,34 ± 0,27b 9,82 ± 0,93b 11,12 ± 0,32a Proteobacteria 6,46 ± 0,25 6,18 ± 0,46 5,95 ± 0,43 Bifidobacterium spp. 10,35± 0,19a 9,33 ± 0,93b 8,67 ± 0,71b Lactobacillus spp. 8,03 ± 0,02 8,15 ± 1,13 7,96 ± 1,67 *Los resultados se expresan como log10 ufc/g ± desviación estándar. a-bLos resultados con letras diferentes en la misma fila muestran resultados significativamente diferentes. En términos globales, no se encontraron diferencias significativas entre la mayor parte de los grupos bacterianos investigados en función del IMC de los sujetos. Sin embargo, se encontró que el filo de los Bacteroidetes era significativamente más alto en sujetos con sobrepeso que en sujetos con bajo peso. Este resultado está en línea con lo previamente publicado por algunos autores hasta la fecha (Le Chatellier y col., 2013). Por otra parte, el filo Actinobacteria se encontró en mayores cantidades en los sujetos con sobrepeso que en los sujetos con peso inferior y normal. Del mismo modo, los resultados obtenidos también fueron mayores a los publicados previamente por otros autores (Arumugam y col., 2011, Gupta y col., 2016). Paula Roca Saavedra 108 Con respecto a los dos géneros estudiados, se observa que Bifidobacterium spp., un género tradicionalmente relacionado con el concepto de “microbiota saludable” (Arboleya y col., 2014), presenta cantidades significativamente mayores en los sujetos con bajo peso corporal, y su presencia va disminuyendo gradualmente a medida que aumenta el IMC. En cambio, no se encontró diferencia alguna en el caso de Lactobacillus spp. 4.1.5. Composición de microbiota intestinal en sujetos con diferente adherencia a la Dieta Atlántica del Sur de Europa Como puede verse en la Tabla 17, no hay diferencias importantes en la MI de sujetos con diferente adherencia a la DASE. Se observa una ligera reducción en el número de Firmicutes y un ligero aumento en la presencia de Proteobacteria, aunque estos cambios no alcanzan niveles estadísticamente significativos. El único grupo bacteriano que si alcanza diferencias estadísticamente significativas es el género Bifidobacterium spp. que está en mayor cantidad en los sujetos con mayor adhesión a la DASE. Tabla 17. Grupos bacterianos cuantificados en muestras de heces humanas en sujetos con menor, intermedia y alta adherencia a la Dieta Atlántica del Sur de Europa. Grupo bacteriano Baja adherencia (n=3) Adherencia intermedia (n=21) Alta adherencia (n=7) Total microbiota 13,11 ± 0,38 12,44 ± 1,30 12,89 ± 0,10 Firmicutes 12,36 ± 0,38 11,80 ± 0,49 11,85 ± 0,29 Bacteroidetes 10,17 ± 0,68 10,85 ± 0,74 10,20 ± 0,22 Resultados y Discusión 109 Actinobacteria 11,09 ± 0,95 10,93 ± 1,13 11,56 ± 0,62 Proteobacteria 6,18 ± 0,14 6,22 ± 0,56 6,32 ± 0,53 Bifidobacterium spp. 8,92 ± 0,92b 9,29 ± 1,10 a,b 9,92 ± 0,43a Lactobacillus spp. 8,43 ± 1,10 8,17 ± 1,26 8,37 ± 0,44 * Los resultados se expresan como log10 ufc/g ± desviación estándar. a-b Valores en la misma fila con letras diferentes son significativamente diferentes. Como ya se ha mencionado, el género Bifidobacterium spp. se relaciona con el concepto de MI saludable (Arboleya y col., 2014), además de estar estrechamente relacionado con el consumo de lácteos, uno de los diez puntos recogidos en el decálogo de la DA. 4.1.6. Composición de la microbiota intestinal en sujetos de diferente edad Las diferentes cantidades de los grupos bacterianos investigados en sujetos con diferentes edades se pueden ver en la Tabla 18. Tabla 18. Cuantificación de grupos bacterianos en muestras de heces en sujetos con diferentes edades Edad objetivo <20 años (n=5) 20-30 años (n=15) >30 años (n=11) Total microbiota 12,83 ± 1,72 12,57 ± 1,46 12,66 ± 0,59 Firmicutes 11,88 ± 0,63 11,97 ± 0,65 11,73 ± 0,65 Paula Roca Saavedra 116 Un estudio reciente demostró que la concentración de AF en la grasa láctea aumentaba de 0,15% a 0,45% en vacas alimentadas solamente con pastos en comparación con la leche producida por vacas alimentadas con una mezcla de hierba seca y ensilado de maíz (Schröder y col., 2014). De hecho, debido a la mayor utilización de pastos verdes en la alimentación de animales productores de leche ecológica, el contenido de AF es superior al de la la leche convencional (Che y col., 2013; Werner y col., 2011). En consecuencia, tanto el fitol como su principal producto de degradación (AF) se han propuesto como marcadores de la producción extensiva y/o ecológica (Schröder y col., 2014). Así mismo, Leiber y col. (2005) han mostrado un contenido tres veces mayor de AF en la grasa de la leche (de 150 a 450 mg/100 g) cuando las vacas pasaron de una ración a base de heno, ensilado de hierba, ensilado de maíz y concentrado, a una ración basada íntegramente de hierba fresca. Tanto es así, que en algunos países nórdicos, se ha determinado un umbral de contenido de AF en la leche para ser considerada ecológica, de al menos 200 mg / 100 g (Vetter y col., 2012). También Baars y col. (2012) han demostrado un contenido de AF del doble en la grasa de la leche producida en verano comparado con la leche producida por los mismos animales en invierno (Baars y col., 2012; Che y col., 2013a; Che y col., 2013b). Con respecto a las carnes, el perfil de los ácidos grasos de la carne procedente de animales monogástricos refleja en gran medida la composición de la grasa incluida en la alimentación en los mismos. Por el contrario, la composición de los ácidos grasos de la carne de rumiantes solamente se ve afectada hasta cierto punto por la alimentación de los animales, ya que los ácidos grasos ingeridos son total o parcialmente hidrogenados por procesos microbianos en el rumen. Los datos publicados sobre el contenido de AF en carne también son escasos, pero los cálculos aproximados sugieren que puede variar desde 4 mg/100 g en la ternera magra hasta más de 300 mg/100 g en la grasa de ternera ecológica (Brown y col., 1993). Por consiguiente, puede concluirse que el contenido de AF de la carne de ternera está influenciado al menos por el tipo de producción (Che y col., 2013a; Che y col., 2013b). Resultados y Discusión 117 En cuanto a los productos lácteos, su contenido en AF depende de más factores que el contenido de la leche empleada como ingrediente para su elaboración. Así, el contenido en AF de los productos lácteos como los quesos, provienen probablemente, de cambios post-ordeño, como su degradación parcial durante el almacenamiento o el impacto de los microorganismos utilizados en el procesamiento del queso. Por tanto, el contenido en AF no es un parámetro adecuado como marcador de queso ecológico. Resultados similiares se ha encontrado para otros tipos de productos lácteos, como la mantequilla (Schröder y col., 2014). No sólo el contenido en AF depende de los métodos empleados en la producción de alimentos, sino que la proporción de los diferentes diastereoisómeros (-SRR ó –RRR, según lo explicado en la introducción) también varía. En la leche de vacas alimentadas de forma ecológica la proporción del isómero -SRR ha sido de un 47%, mientras que en la convencional, la proporción del isómero -SRR ha sido de un 85% (Schröder y Vetter, 2011). También se han encontrado diferencias en la proporción de diastereoisómeros en el queso, representado el isómero -SRR entre un 39-71% en quesos ecológicos y un 51-84% en los quesos convencionales (Lucquin y col., 2016; Schröder y Vetter, 2011). 4.2.3. Riesgos del consumo de ácido fitánico para la salud humana La ingestión y posterior acumulación del AF en personas que no pueden eliminarlo de forma correcta, se ha relacionado con efectos negativos sobre la salud humana, que se muestran en la Tabla 20. Los principales riesgos del consumo de AF están relacionados con el riesgo de daños neuronales (Busanello y col., 2010; Kahrlet y col., 2005; Nagai, 2015; Reiser y col., 2006; Ronicke y col., 2009; Selkälä, y col., 2015), daños vasculares (Idel y col., 2002; Mönnig y col., 2004), efectos tóxicos sobre la piel (Komen y col., 2007), estrés oxidativo y degenerativo (Leipnitz y col., 2010; Schönfeld y col., 2004), así como Paula Roca Saavedra 118 el riesgo de desarrollo de ciertos tipos de cáncer (Kataria y col., 2015; Ollberding col, 2013; Walsh, 2005; Wierzbicki, 2007; Wright y col., 2012; Xu y col., 2005). Tabla 20. Trabajos recientes sobre los efectos perjudiciales del ácido fitánico en modelos de cultivo de humanos, animales y celulares Referencia Diseño del estudio Número y tipo de muestra Conclusión principal Bussanello y col., 2010 In vitro Ratas Wistar preparaciones cerebrales El AF disminuye in vitro la actividad sináptica Na+, K+ -ATPasa, una enzima crucial para la neurotransmisión normal Idel y col., 2002 In vitro Células de músculo liso vasculares de ratas Wistar macho El AF induce la apoptosis dependiente del óxido nítrico en las células del músculo liso vascular Kahlert y col., 2005 In vitro Células hipocampo del cerebro obtenidas a partir de crías de rata Wistar El AF causó la muerte de la células gliales de los astrocitos Kataria y col., 2015 Ensayo clínico 81 hombres sometidos a prostatectomía radical para el tratamiento de cáncer de próstata Niveles elevados de AF son responsables de la sobre-expresión de la enzima AMACR en el cáncer de próstata Resultados y Discusión 119 Komen y col., 2007 In vitro Fibroblastos de piel humana El AF no esterificado ejerce su efecto tóxico en fibroblastos de piel humana Kruska y Reiser, 2011 In vitro Línea celular pancreática humana CFPAC1 La desregulación del Ca2+ mediada por AF puede ser uno de los mecanismos de toxicidad por AF Leipnitz y col., 2010 In vivo Ratas macho Wistar El AF provoca incremento del estrés oxidativo Mönnig y col., 2005 In vivo Ratones SCP2nulo y C57BL / 6 La acumulación de AF en las membranas del miocardio se asocia con la muerte súbita cardiaca Nagai, 2015 In vitro Neuroblastoma de ratón Neuro2a El AF aumenta la actividad de la Hdac y reduce la acetilación de histonas en células Neuro2a, causando daño neuronal Ollberding y col., 2013 Ensayo clínico 336 casos y 460 controles Alto consumo de AF puede aumentar el riesgo de LNH. Reiser y col., 2006 In vitro Células del hipocampo de crías de rata Wistar El AF causa la muerte celular de astrocitos Paula Roca Saavedra 120 Rönicke y col., 2009 In vitro Células del hipocampo de crías de rata Wistar El AF ejerce diferentes actividades tóxicas sobre las células del cerebro Schönfeld y col., 2004 In vitro Mitocondrias de cerebro y corazón de ratas adultas El AF induce la reducción en el suministro de ATP mitocondrial e induce la aparición de procesos degenerativos. Schönfeld y Reiser, 2006 In vitro Mitocondrias de cerebro y corazón de ratas adultas La exposición crónica al AF aumenta la generación de superóxido celular y causa daño oxidativo Schönfeld y col., 2006 In vitro Células del hipocampo de crías de rata Wistar El AF parece iniciar la muerte celular de astrocitos Selkälä y col., 2015 In vivo Ratones C57BL/6 con déficit de AMACR Tanto el AF como el AP a altas concentraciones causan neuropatía sensomotora, convulsiones y encefalopatía recurrente Xu y col., 2005 Ensayo clínico 104 pacientes diagnosticados con cáncer de próstata Los resultados obtenidos sugieren que elevados niveles de AF pueden estar asociados con el riesgo de cáncer de próstata Walsh, 2005 Ensayo clínico 104 pacientes con cáncer de próstata Los niveles séricos de AF entre los pacientes de cáncer de próstata fueron significativamente mayores que la de los controles no afectados Resultados y Discusión 121 Wright y col. 2012 Ensayo clínico 29.133 hombres de Finlandia que fumaban cinco o más cigarrillos al día El AF consumido en productos lácteos altos en grasa se asocia con un riesgo elevado riesgo de cáncer de próstata agresivo AF: Ácido fitánico; ATPasa: adenosina trifosfatasa; AMACR: \ alfa - metilacil - CoA racemasa; Hdac: Histona desacetilasa; LNH: Linfoma no Hodgkin; ATP: Adenosín trifosfato; AP: Ácido pristánico 4.2.4. Beneficios de la ingestión de ácido fitánico en la salud humana Las posibles propiedades potencialmente beneficiosas de la salud humana del AF se enumeran en la Tabla 21. Entre estos efectos, se ha publicado que el AF muestra efectos beneficiosos en el metabolismo de la glucosa (Jay y Ren, 2007; McCarty, 2001; Schlüter y col., 2002a), la prevención del síndrome metabólico (Heim y col., 2002), la mejora del metabolismo de los lípidos (McCarty, 2001; Islam y col., 2015), la mejora del equilibrio energético (Hellgren, 2010), ayuda a prevenir ciertos tipos de cáncer (Islam y col., 2015; Liska y col., 2012; Price y col., 2010; Renner y col., 2013; Tang y col., 2007), presenta efectos inmunomoduladores (Nakanishi y col., 2016) y contribuye a un incremento de la diferenciación de la grasa parda (Schlüter y col., 2002a, Wu y col., 2013). Tabla 21. Trabajos recientes sobre los beneficios del consumo de ácido fitánico Referencia Diseño del estudio Número y tipo de muestra Conclusión principal Che y col., 2013b In vitro Células porcinas El AF puede desempeñar un papel en la estimulación de la captación de glucosa en células musculares porcinas Paula Roca Saavedra 122 Elmazar y col., 2013 In vivo Adultos de ratas albinas Wistar macho Fitol y AF muestran actividad antidiabética Heim y col., 2002 In vitro Células CV-1 y C3H10T1 / 2 El AF tiene un papel potencial en el tratamiento de la resistencia a la insulina Liska y col., 2012 In vivo Ratas hembra Sprague-Dawley Seocalcitol en combinación con AF inhibió la progresión de tumores de mama Price y col., 2010 Ensayo clínico 566 pacientes con cáncer de próstata y 566 controles La concentración de AF en plasma no se asocia de manera significativa con riesgo de cáncer de próstata Renner y col. (2013) In vitro Células sanguíneas bovinas El AF causa la inhibición de la proliferación de células mononucleares Schlüter y col., 2002a In vitro Líneas celulares AGN19420 y BRL49653 AF puede actuar como un retinoide natural en las células adiposas, lo que sugiere un uso potencial en el tratamiento de la diabetes tipo 2 humana y la obesidad Schlüter y col. 2002b In vitro Líneas celulares AGN19420 y BRL49653 El AF es un activador de la transcripción de la proteína desacoplante 1 y la diferenciación de los adipocitos de la grasa parda Tang y col., 2007 In vitro Células epiteliales normales y de carcinoma de la próstata humana El AF inhibe la proliferación de células PC-3 en el carcinoma de próstata Resultados y Discusión 123 Zomer y col., 2000 In vitro Células COS-1 del mono y células HepG2 humanos Los resultados demuestran que tanto el ácido pristánico como el AF son ligandos de origen natural para PPAR, que están presentes en concentraciones fisiológicas. AF: Ácido fitánico; PPAR: Proliferador de peroxisoma activados los receptores 4.2.5. Perspectivas de futuro y conclusiones Tal y como se he mostrado, la bibliografía actualmente disponible apoya la hipótesis de que el consumo de AF a través de la alimentación, podría desempeñar un papel importante para mejorar el perfil metabólico. Por lo tanto, debido a la alta prevalencia de diabetes tipo 2 y del síndrome metabólico en los países desarrollados, debería resultar atractiva la inclusión de “productos altos en ácido fitánico” en la dieta de los consumidores de riesgo. No obstante, existen varios puntos controvertidos que necesitan ser aclarados en profundidad antes de poder afirmar que sería ventajoso recomendar el consumo de este ácido graso entre la población en general. En primer lugar, es muy importante que los efectos sobre el metabolismo de la glucosa y de los lípidos que se han demostrado tanto en ensayos in vitro como en modelos animales, se validen en ensayos de intervención en humanos. Es evidente que los resultados de dichos estudios deben ser tomados con cautela, ya que en muchos casos, ni los ensayos in vitro ni en animales de experimentación son directamente extrapolables a los seres humanos. Además, las posibles desventajas de la ingesta del AF en las personas que no pueden eliminarlo correctamente, en especial, las relacionadas con los efectos neurológicos, deben tenerse muy en cuenta antes de recomendar el desarrollo de los “productos altos en ácido fitánico” o establecer una relación directa entre el AF con menciones positivas, tales como los “alimentos ecológicos”. Del mismo modo, sería muy conveniente prestar más atención al contenido de AF de los alimentos en las bases de datos de su composición, particularmente en las zonas geográficas Paula Roca Saavedra 124 en las que predomina la DAr o la DA, que contienen niveles mucho más elevados de AF que otras dietas occidentales. 4.3. DETERMINACIÓN IN VITRO DE LOS EFECTOS DE NIVELES RESIDUALES DE ANTIBIÓTICOS ESTUDIADOS SOBRE LA MICROBIOTA COLÓNICA HUMANA MEDIANTE CULTIVOS PUROS Tal y como se describió en el apartado correspondiente a los materiales y métodos empleados, los estudios conducentes a la determinación de los efectos que ejercen los residuos de antibióticos sobre la MI humana se realizaron con tres antibióticos de familias diferentes. Dichas familias son las tetraciclinas, los ß-lactámicos y las sulfamidas. 4.3.1. Evaluación in vitro de niveles residuales de tetraciclina en los alimentos sobre la microbiota intestinal humana mediante cultivos puros En este trabajo se ha investigado, in vitro, el efecto que las concentraciones residuales de tetraciclina presentes en los alimentos según los LMR establecidos en la legislación europea podrían tener sobre la MI humana. Los resultados obtenidos, se muestran en la Tabla 22, dónde se puede observar el crecimiento bacteriano (ufc/ml) de principales cepas bacterianas representativas del intestino humano que tenemos tras la administración o no de tetraciclina en la dosis LMR. Resultados y Discusión 125 Tabla 22. Crecimiento bacteriano (log ufc /ml) de cultivos puros en presencia (100µg/L) o ausencia (control) de tetraciclina. Cepas bacterianas Crecimiento bacteriano (log ufc/mL) C T Lactobacillus reuteri DSMZ 20016 8,7 ± 0,01a 8,24 ± 0,14b Lactobacillus plantarum 299v (DSMZ 9843) 9,14 ± 0,05a 8,63± 0,08b Lactobacillus paracasei LAFTI® L26 8,13 ± 0,22a 7,85 ± 0,14b Lactobacillus brevis DT24 9,00± 0,10 8,84 ± 0,03 Lactobacillus casei 431® 8,66 ± 0,07 8,51 ± 0,03 Lactobacillus salivarius DSM 20555 8,96 ± 0,11 8,80 ± 0,05 Lactobacillus acidophilus LAFTI® L10 8,36± 0,02a 8,08 ± 0,08b Clostridium perfringens CECT 376 8,90 ± 0,01a 7,93 ± 0,04b Bifidobacterium longum ATCC 4503 8,53 ± 0,02a 8,34 ± 0,04b Enterobacter cloacae CECT 194 11,46 ± 0,02 11,24 ± 0,05 Bacteroides vulgatus LMG 17767 8,32 ± 0,03 8,33 ± 0,01 Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (n = 2). a-b: Los resultados en la misma fila con letras diferentes presentan diferencias estadísticamente significativas. C= grupo control; T=grupo con tetraciclina. ATCC: American Type Culture Collection; CECT: Colección Española de Cultivos Tipo; DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares); LMG: Bacterial collection/BCCM: Laboratory of Microorganism of Ghent University /Belgium Coordinated. (Labortatorio de Microorganismos de la Universidad de Gante coordinado por Bélgica) Los resultados obtenidos con los cultivos puros, en las diferentes cepas estudidadas, muestran que en algunas cepas de Lactobacillus spp. y Bifidobacterium spp. sufrieron una variación significativa en su crecimiento, disminuyendo en los tratados con tetraciclina con respecto a los controles. Además, también se comprobó que las concentraciones de tetraciclina empleadas fueron capaces de inhibir parcialmente el