Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped

T T E ESIS D D O OCTORAL E EFECTO DE LA RECOMBI N NACIÓN DE S SEGMENTOS GENÓMICOS DE BETANODAVIRUS EN LA A ADAPTACIÓN DEL VIRUS A SU HUÉSPED Fdo. ......................................................... S Sandra Souto Pereira DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA INSTITUTO DE ACUICULTURA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2015 María Isabel bandín Matos, Profesora Contratada Doutora do Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía da Universidad de Santiago de Compostela Como Directora da Tese de Doutoramento titulada “Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped” Presentada por Dna. Sandra Souto Pereira, alumna do Programa de Doutoramento de Acuicultura, Autoriza a presentación da tese indicada, considerando que reúne os requisitos esixidos no artigo 34 do regulamento de Estudos de Doutoramento, e que como Director da mesma non incurre nas causas de abstención establecidas na lei 30/1992. Asdo. Dra. María Isabel Bandín Matos El trabajo descrito en la presente memoria ha sido financiado por los proyectos Mejora del bienestar animal y de la supervivencia larvaria en el cultivo de lenguado y rodaballo: análisis del riesgo implicado por la transmisión vertical de ciertos virus patógenos de peces del Plan Galego de Investigación, Desenvolvemento e Innovación Tecnolóxica (Incite) (07MMA001E) y Estudio de la patogenicidad de betanodavirus para el rodaballo, el estudio de la interacción virus-huésped y de la influencia de factores ambientales (EM2012/005) de la Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria. AGRADECIMIENTOS En primer lugar me gustaría dar las gracias a mi directora de tesis, la Dra. Isabel Bandín Matos, por haber confiado en mí para el desarrollo de este trabajo y por su valiosa ayuda y guía a lo largo de estos años. Me gustaría agradecerle especialmente su disponibilidad para resolver dudas, su gran compromiso en la revisión del manuscrito y su preocupación por buscar los recursos que me permitieron llegar hasta el final. También me gustaría agradecer al Dr. Carlos Pereira Dopazo por su interés en mi investigación y su orientación durante la realización de la misma. Al Dr. Juan Luis Barja y al resto del grupo de Patología de peces de acuicultura de la Universidad de Santiago de Compostela. A mis compañeros del grupo de Virología del Instituto de Acuicultura: Carmen, Javi y Juanma por transmitirme su experiencia y resolver todas las dudas que iban surgiendo durante el proceso de este trabajo. A Johnny, Noelia y especialmente a Alian por su gran ayuda con los cultivos y el procesado de las muestras. A mis compañeros de doctorado Diego y María con los que compartí experiencias, muchas alegrías y también algunas frustraciones. También quiero acordarme de todos los que pasaron por el laboratorio y que han seguido por otros caminos pero que han dejado un poquito de ellos en este trabajo. A Placeres. A mis compañeros del Instituto de Acuicultura Ana, Amable, Arturo, Bea y Miguel, por ayudarme con la clonación y demás temas de bacterias. A Sol por todos los peces que sembró para mí. A John por revisar el inglés. A Susi por ayudarme con el papeleo. Me gustaría agradecer al Dr. Michel Brémont que me permitiese realizar la estancia en su laboratorio de la que guardo muy buenos recuerdos y durante la cual aprendí muchísimo. Gracias al Dr. Stéphane Biacchesi y a Emilie Merour por su dedicación y simpatía. También a Annie y Joulie por acompañarme en todo momento en el laboratorio. Y a Angella, Lela, Khalid, Janez, Clara y Jordi por hacer que mi estancia en Jouy fuera además muy divertida. Me gustaría agradecer el apoyo recibido por del grupo de Patologías de Especies Acuícolas Cultivadas de la Universidad de Málaga, al Dr. Juan José Borrego, a la Dra. Dolores Castro, la Dra. Mari Carmen Alonso, la Dra. Esther García-Rosado y el Dr. Benjamín López-Jimena por dedicarme su tiempo y por permitirme pasar unos días en su laboratorio, también gracias a Dani, Patricia y Fani por su hospitalidad durante mi breve estancia en Málaga. Gracias a Ana Riaza y Stolt Sea Farm por suministrarme los peces. A mis amigos que nunca fallan: Bea, Marta, Sharay, Silvia, Juan, María, Sanguel y Villa por cuidarme, animarme e inspirarme siempre. A Alicia y a mis amigas de facultad especialmente a Sandrita (al final lo conseguimos!). También a Ana, Moncho y mis amigos de Milladoiro siempre dispuestos a una estrella y a unas risas. A mi Reinaldito. A Óscar por acompañarme siempre, por aguantar mis nervios y hacerme olvidar las preocupaciones. También a mi familia adquirida Vane, Charly, Moncho, Jaime, Lupe y Paco por vuestro cariño y alegría. Y por encima de todo gracias a mi hermana Berta, a mis padres Carmen y Manuel y a mis abuelos que me han animado a avanzar, me han apoyado siempre y son los responsables de que haya llegado hasta aquí. A mi familia PAPER 3 169 CAPÍTULO 4 Influencia de la temperatura en la infección del lenguado por betanodavirus. CHAPTER 4 I nfluence of temperature on betanodavirus infection in Senegalese sole. 1. Introducción 193 2. Materiales y métodos 197 2.1 Cepa viral y propagación………………………………………………………… … 197 2.2 Infecciones experimentales…………………………………………………………197 2.3 Procesado de las muestras y aislamiento viral…………………………….............. 198 2.4 Cuantificación del genoma viral mediante PCR cuantitativa atiempo real (RT-qPCR)………………………………………………………………..199 2.5 Análisis estadístico…………………………………………………………………199 3. Resultados 200 3.1 Infección 1. Infección por baño y cohabitación a 22 °C, 18 °C y 16 °C. ………………………………………………….....…………………………….200 3.2 Infección 2. Infección a baja temperatura (16 °C)……………………………..…. 202 3.3 Infección 3. Efecto del incremento de la temperatura en la susceptibilidad del lenguado…………………………………………………................203 4. Discusión 206 PAPER 4 211 GENERAL DISCUSSION 219 CONCLUSIONES 23 CONCLUSIONS 23 BIBLIOGRAPHY 241 APÉNDICE 29 iv SUMMARY SUMMARY Nervous necrosis virus (NNV), genus Betanodavirus, can infect a wide range of marine farmed and wild fish species as well as some freshwater fish and invertebrates. This virus is the aetiological agent of viral nervous necrosis (VNN), also known as viral encephalopathy and retinopathy (VER). Fish affected with this pathology commonly display lesions in the central nervous system, with vacuolization and necrosis observed in the brain, retina and spinal cord, leading to a range of neurological signs such as abnormal swimming behaviour, anorexia and changes in colouration. Betanodaviruses are small non-enveloped virus and possess a two single-stranded positive-sense RNA genome. The largest segment of 3.1 kb, RNA1, encodes the RNA-dependent RNA polymerase, whereas RNA2 (1.4 kb) encodes the capsid protein (Cp). In addition, a subgenomic RNA (RNA3) is transcribed from the 3’ end of RNA1. Based on the phylogenetic analysis of a variable region within the RNA2 segment (T4 region), betanodaviruses have been clustered into four genotypes: Barfin Flounder Nervous Necrosis Virus (BFNNV), Redspotted Grouper Nervous Necrosis Virus (RGNNV), Striped Jack Nervous Necrosis Virus (SJNNV) and Tiger Puffer Nervous Necrosis Virus (TPNNV). However, the isolation of reassortant strains between RGNNV and SJNNV genotypes has been increasingly reported in recent years in the South of Europe. Most of the reassortant strains composed of RGNNV-type RNA1 and SJNNV-type RNA2 segments have been isolated from Senegalese sole (Solea senegalensis),an important farmed fish in our area. To date, there has been no information about the susceptibility of Senegalese sole to different NNV genotypes and the information on the pathogenesis and host specificity of reassortant betanodavirus is scarce. This PhD dissertation entitled Effect of reassortment on betanodavirus host adaptation was conducted with the aim to better understand the involvement of reassortment in betanodavirus infection in Senegalese sole and it focuses on three main issues: pathogenicity and host specificity, putative determinants of virulence within the capsid protein sequence and the influence of temperature on viral infection. Studies regarding pathogenicity, host specificity and virulence determinants were performed also in turbot because this fish species is closely farmed to sole in our area. The thesis manuscript consists of four chapters. In the first chapter, entitled Comparison between the susceptibility of Senegalese sole to a reassortant strain and to the parental strains, sole juveniles were experimentally challenged 3 Effect of reassortment on betanodavirus host adaptation with a reassortant RGNNV/SJNNV strain and isolates from RGNNV and SJNNV genotypes by two different ways (bath and intramuscular injection). In addition, we investigated the differences in the early stages of infection between the three isolates. In both cases, the viral RNA production and viral infectivity of the 3 betanodavirus strains was assessed. The results demonstrated that Senegalese sole is highly susceptible to all the NNV isolates tested (100% mortality was achieved in all experimental infections). However, the reassortant strain provoked the most acute symptoms, and caused mortality more quickly, especially in the bath challenge. The RGNNV/SJNNV isolate also showed less difference between the number of RNA copies and viral titre, reaching the highest titres of infective viral particles in the nervous tissue of infected animals. After the immersion challenge, both SJNNV-capsid strains were detected as early on as day 1 post-infection in the brain, even though only the Ss160.03 strain increased the viral load until the end of the experiment. The RGNNV strain was not detected in the brain until 4 d.p.i., but after 10 days this strain reached the highest viral load. However, RGNNV must experiment a reduction in its infective particle production capacity later on, because viral titers obtained from dead fish throughout the experimental infection were very low. The results obtained in this chapter suggest that the reassortant isolate is the most suited for infecting Senegalese sole. It has been previously reported that betanodavirus reassortant strains isolated from Senegalese sole exhibited a modified SJNNV capsid amino acid sequence, with two amino acid changes at positions 247 and 270. In the second chapter entitled Characterization of molecular determinants of virulence in betanodavirus, we investigated the possible role of these two residues as putative host and virulence determinants in betanodavirus reassortant strains. Recombinant viruses harbouring mutations in the coat protein sequence were generated by reverse genetics. The mutagenesis involved one nucleotide change per amino acid substitution: TCG to GCG leading to the substitution of serine to alanine at amino acid position 247 [S247A] and AGT to AAT resulting in a substitution of serine to asparagine at residue 270 [S270N] The three recombinant strains, rSs160.03247, rSs160.03270,and rSs160.03247+270 were studied in cell culture and in vivo experiments in the natural fish host, Senegalese sole. The three mutant viruses were shown to be infectious and able to replicate in E-11 cells, reaching final titres similar to the wild-type virus, although with somewhat slower replication kinetics. When the effect of the amino acid substitutions on virus pathogenicity was evaluated in sole, typical clinical signs of betanodavirus infection were observed in all 4 SUMMARY groups. However, fish mortality induced by all three mutant viruses was clearly affected. Roughly 40% of the fish survived in these 3 groups in contrast to the wild-type virus which killed 100% of the fish. The results obtained in this chapter demonstrated that these two residues of the capsid protein located in the C-terminal region (247 and 270) of the reassortant Ss160.03 play a major role in betanodavirus pathogenicity for sole. In previous chapters the high susceptibility of sole to betanodavirus was demonstrated. As Betanodavirus interspecies transmission has been previously reported, the aim of the third chapter, entitled Experimental susceptibility of turbot (Scophthalmus maximus) to betanodavirus and analysis of host-specificity and virulence determinants was to assess the susceptibility of turbot to the reassortant isolate Ss160.03, originated from Senegalese sole. A SJNNV type strain was also included in the study for comparative purposes. In addition, the three recombinant Ss160.03-derived strains (rSs160.03247, rSs160.03270270 and rSs160.03247+270) obtained in chapter 3 were used in experimental infections in order to investigate the possible role of amino acids 247 and 270 in host specificity and virulence. The effect of stress on viral replication inthebrainwasalsostudied.Fishwere challenged at 16 and 18°C. Moderate mortalities at 18 °C were caused by the reassortant strain Ss160.03 (up to 50%), 30% higher than that caused by SJNNV strain at 18 °C. At 16°C, low mortalities were observed in both groups. the recombinant strains which bear the mutation of each amino acid (S247A or S270N) had a slight effect on the mortality of turbot juveniles (a 10% reduction in both cases) in the experimental challenge . The Ss160.03 strain showed the highest capacity to replicate in brain tissues (it was detected from day 5 to 30 p.i. and reached the highest viral load with a peak of 109viral copies/g). The mutant rSs160.03270 was detected from 10 d.p.i. and the mutants rSs160.03247 and rSs160.03247+270 were not detected in the brain until 15 d.p.i. and 20 d.p.i., respectively. In contrast with the results obtained in Senegalese sole in chapter 3, the mutation of both positions reduced mortality by more than half of that observed in fish challenged with the wild strain. In addition, two important facts were demonstrated: firstly, an important mortality decrease was observed by reducing rearing temperature in turbot and secondly stress increased the replication of betanodavirus in the nervous tissues. Finally, it has been reported that the genetic diversity among betanodavirus strains reflects the existence of different viral phenotypes which may be adapted to infect different host species and/or to replicate at different temperatures. The aim of the fourth chapter, entitled 5 Effect of reassortment on betanodavirus host adaptation Influence of temperature on betanodavirus infection in Senegalese sole, was to investigate the effect of decreasing temperatures on betanodavirus infection in Senegalese sole. Sole juveniles were experimentally infected with the reassortant betanodavirus strain used in previous chapters at three different temperatures: 22 °C, 18 °C and 16 °C by bath challenge and cohabitation. The results obtained showed that virus virulence decreased by reducing the water temperature. At 22 °C mortalities reached 100%, at 18 °C they ranged from75to80% and at 16 °C only 8% of the fish died. In addition, horizontal transmission was demonstrated regardless of the rearing temperature. At 16 °C, active viral replication was detected up to 66 days post-infection, but no signs of the disease were observed and only a very low level of mortality was recorded. The increase in water temperature from 16 to 22 ºC caused a quick rise in the viral load and a subsequent outbreak of mortalities Infected fish maintained at 16 ºC for different periods of time (30 and 45 days) started to show characteristic clinical signs and mortalities before the temperature reached 22ºC. These results are in accordance with the high mortalities obtained in the immersion challenges at 18 ºC. These findings demonstrate that this reassortant betanodavirus strain can cause a persistent infection in Senegalese sole at low temperatures (16 °C) for long periods of time, and when the temperature increases, the virus is able to trigger an acute infection and provoke high mortalities. 6 INTRODUCCI Ó N GENERAL INTRODUCCIÓN GENERAL INTRODUCCIÓN1. El gran aumento de la demanda de pescado como alimento saludable para el consumo humano y la sobreexplotación de los bancos pesqueros han impulsado en las últimas décadas la expansión de la acuicultura. Desde el año 2000, se ha observado un crecimiento constante de la producción mundial de pescado en cultivo, registrándose una tasa media de crecimiento anual del 6,2 %. Se calcula que en el mundo se cultivan más de 354 especies de peces, con una producción acuícola estimada de 70,5 millones de toneladas en 2013 (FAO, 2014). Los peces producidos en cultivo supusieron el 42,2 % del total de pescado consumido en el año 2012, muy por encima del 13,4 % registrado en el año 1990. En Europa la acuicultura, aunque con un nivel inferior al de otras regiones, también ha registrado una tendencia al alza, con una tasa media de crecimiento anual del 2,9 % en el período 2000-2012. China es actualmente el país con más repercusión en este sector y su producción representa el 55,2% a nivel mundial. En los próximos años se espera que la piscicultura siga esta progresión y las previsiones indican que llegará a suministrar más del 60 % del pescado para consumo humano en 2030 (FAO, 2014). En España se registró el mayor volumen de producción en acuicultura de la UE con una producción de 264.162 t (21,0% del total de la UE) y por un valor de 395 millones (10,4% del valor obtenido en la UE) en 2012. Sin embargo, el incremento en la producción de peces en acuicultura ha disminuido en los últimos años, mientras empieza a tener un gran peso la importación de pescado procedente de otros países en los que los costos de producción son relativamente bajos. Se están haciendo grandes esfuerzos para dar un nuevo impulso a este sector aunque la acuicultura española se enfrenta a retos como la adaptación de normativas, que a menudo presenta incompatibilidades entre legislaciones autonómicas, nacionales y europeas, las trabas administrativas para la obtención de autorizaciones y permisos y las limitaciones derivadas de la gestión sanitaria en temas de uso de terapéuticos, entre otros (APROMAR, 2014). La intensificación de la acuicultura implica grandes esfuerzos encaminados a mejorar las condiciones de cultivo de las especies producidas, asegurar la sostenibilidad de la industria, la seguridad y el respeto al medio ambiente, lo que ha llevado a los diferentes países productores a establecer normas y reglamentos que controlen estos aspectos. 9 Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped dentro de este género por la ICTV, que está asociado con el síndrome inflamatorio del músculo esquelético y cardiaco (HSMI) del salmón. Familia Retroviridae Los retrovirus son virus envueltos, con dos moléculas idénticas de ARN de cadena sencilla y nucleocápside icosaédrica, poseen de 6 a 9 proteínas estructurales entre las que se incluye la enzima transcriptasa inversa. Se han descrito 13 enfermedades proliferativas en peces asociadas con 1 o más retrovirus (Coffee y col., 2013). Actualmente la familia se divide en dos subfamilias, de las cuales los virus de peces se encuentran en la subfamilia Orthoretrovirinae, en el género más reciente Epsilonretrovirus. Dentro de este género se incluyen tres especies que afectan a lucioperca americana (Sander vitreus, “Walleye” en inglés), el Virus de Sarcoma dérmico del Walleye (WDSV), especie tipo del género, que se caracteriza por el desarrollo y posterior desaparición de tumores en la piel de forma cíclica en relación con las estaciones del año, siendo máxima su expresión en primavera y mínima en otoño, y los Virus de la hiperplasia dérmica del Walleye tipo 1ytipo 2. También se han descrito, aunque no han sido todavía asignados a ningún género, el Virus de la leucemia del salmón (SLV) sugerido como agente causante de la leucemia en salmón real (Oncorhynchus tshawytscha) (Eaton y Kent, 1992), el Virus de la hiperplasia epidérmica de perca tipo 1 y tipo 2 (PEHV 1 y 2) asociado a lesiones hiperplásicas en perca canadiense (Perca flavescens), el fibrosarcoma de salmón atlántico (SSSV) aislado en salmón atlántico (Salmo salar), el retrovirus de cabeza de serpiente cabrío (Channa striatus) (SnRV) un virus exógeno observado en células de peces de cultivo y el retrovirus endógeno de pez cebra (ZFERV) (Lepa y Siwicki, 2011). Familia Togaviridae Se trata de virus envueltos de morfología esférica y simetría icosaédrica que se caracterizan por poseer un genoma compuesto de una única molécula de ARN monocatenario de cadena positiva. Dentro de la familia se encuentran dos virus de peces, el Virus de la enfermedad pancreática del salmón (SPDV), altamente patógeno para salmón atlántico de cultivo, y el Sleeping Disease Virus (SDV) que se asocia a mortalidades en trucha arcoíris y recibe este nombre debido a que los peces afectados muestran un comportamiento anormal, apoyando el cuerpo en el fondo del tanque y dando la sensación de estar dormidos (Boucher y 16 INTRODUCCIÓN GENERAL Baudin-Laurencin, 1994). Los estudios realizados han demostrado que el SPDV y el SDV en realidad son distintos aislados de una única especie (Weston y col., 2002), por lo que se ha propuesto la inclusión conjunta en una nueva especie denominada Alphavirus de salmones y además se ha sugerido la denominación Salmonid alphavirus 1 (SAV-1) para el primer subtipo y SAV-2, para el segundo.Estos virus han sido responsables de grandes pérdidas en el cultivo del salmón y trucha en Inglaterra, Irlanda, Escocia, Noruega, Francia, Italia y España. Periódicamente se establece la lista de las enfermedades de animales de declaración obligatoria a nivel de la Unión Europea, que se trasponen a la normativa española. Son enfermedades de declaración obligatoria según el Real Decreto 526/2014 (que refleja la Decisión de Ejecución 2012/737/UE de la Comisión) la anemia infecciosa del salmón (ISAV), la enfermedad causada por el herpesvirus koi (HKV), la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), la necrosis hematopoyética epizoótica (EHNV) y la septicemia hemorrágica viral (VHSV). 17 Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped VIRUS DE LA NECROSIS NERVIOSA (NNV, nervous necrosis virus)2. 2.1 ANTECEDENTES En los años 80 se empezó a estudiar la presencia de una nueva patología que afectaba a la perca loro japonesa (Oplegnathus fasciatus) y que provocaba pérdidas en la producción de cerca del 100% en Japón. En 1985, se observaron características similares en un brote infeccioso detectado en lubina (Dicentrarchus labrax) cultivada en la isla de Martinica (Bellance y Gallet de Gaint-Aurin, 1988) en el que se perdió casi toda la producción llegando a paralizar prácticamente el cultivo de esta especie. Durante los años posteriores, se observaron numerosos casos de peces que presentaban síntomas similares en los que se apreciaba oscurecimiento de la piel, comportamiento anormal y altas mortalidades. A nivel histológico los peces presentaban vacuolización y necrosis en tejidos nerviosos. Las lesiones aparecían en retina, cerebro y médula espinal mientras que en el resto de tejidos (bazo, riñón, músculo, etc.) no se observaba ninguna alteración. Mediante el estudio con microscopía electrónica se pudo observar la existencia de partículas virales en los tejidos afectados, concluyendo que se trataba de una nueva patología de etiología viral a la que le dieron el nombre de necrosis nerviosa viral (VNN del inglés viral nervous necrosis) debido a los efectos que observaron en los peces afectados (Yoshikoshi y Inoue, 1990). A lo largo de la década de los 90 se detectó la presencia de este agente viral en más de 25 especies marinas de cultivo de distintas regiones (Péducasse y col., 1999). Se observó la presencia de virus en retina y cerebro de peces en epizootias producidas en larvas y juveniles de lubina en Francia (Breuil y col., 1991), en larvas de perca gigante (Lates calcarifer) que presentaban natación anormal en Australia (Glazebrook y col., 1990) y Tahití (Renault y col., 1991). Se observaron partículas similares también en larvas de rodaballo (Scophthalmus maximus) cultivado en Noruega que presentaban falta de apetito, oscurecimiento de la piel y comportamiento anormal desencadenando mortalidades del 100% (Bloch y col., 1991), y también en mero carcelario (Epinephelus septemfasciatus) en Corea (Sohn y col., 1991) y mero malabar (E. malabaricus) en Tailandia (Boonyaratpalin y col., 1996). En 1992 Munday y col, estudiaron la aparición de grandes mortalidades en larvas y juveniles de perca gigante, y las asociaron a un agente viral que provocaba vacuolización en cerebro y retina, con características similares a las descritas por otros autores, esta nueva patología se denominó 18 INTRODUCCIÓN GENERAL encefalopatía y retinopatía viral (VER, del inglés viral encephalopathy and retinopathy), nombre oficialmente reconocido por la Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE (OIE, 2013). En el año 1992 Mori y col. caracterizaron por primera vez el virus purificado de larvas de jurel dentón (Pseudocaranx dentex), striped jack en inglés, y al que le dio el nombre de striped jack nervous necrosis virus (SJNNV). En este estudio se analizaron las propiedades morfológicas y biofísicas del virus de la necrosis nerviosa viral y demostraron que el agente etiológico de esta patología, también llamado virus de la encefalopatía y retinopatía (ERV), era un nuevo miembro de la familia Nodaviridae. 2.2 PROPIEDADES BIOFÍSICAS DEL NNV El NNV es un virus desnudo, con morfología esférica y simetría icosaédrica (número de triangulación=3) (Figura 1). La partícula viral es de pequeño tamaño (25-34 nm) y la cápside contiene 180 copias de una única proteína estructural de 42 KDa. El virión tiene un peso molecular de 8 × 106 Da, con un coeficiente de sedimentación de 134-140 Sy una densidad de flotación en CsCl de 1.31-1.36 g/cm3 (Thiéry y col., 2011). Se ha comprobado que los viriones son estables entre un pH 2 y 9, y son resistentes al calentamiento a 56 °C durante 30 minutos (Frerichs y col., 1996). Realizando la reconstrucción cristalográfica del malabaricus grouper nervous necrosis virus (MGNNV) se observó que presenta dos cubiertas, un externa con un radio entre 154 y 192 Å, y una interna, con un radio de entre 112 y 154 Å, a diferencia de los alphanodavirus que presentan una única cubierta. Además, se vio que mientras la capa externa presenta protrusiones, la interna era bastante uniforme (Tang y col., 2002). Figura 1 Reconstrucción de la estructura de betanodavirus http://viralzone.expasy.org/ (izq.), Lin y col., 2001 (dcha.) 19 Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped El NNV posee un genoma ARN de cadena sencilla y positiva que presenta dos segmentos, el ARN1 de 1,01 × 106Da y el ARN2 de 0,49 × 106Da. Ambos segmentos carecen de cola de poli-A en su extremo 3’ (Comps y col., 1994; Mori y col., 1992). Además se ha encontrado una tercera molécula de ARN subgenómica, a la que se le denominó ARN3 de aproximadamente 0,13 × 106Da que se sintetiza a partir del ARN1, y sólo ha sido observado en células de peces infectados (Figura 2). El genoma completo de NNV se ha secuenciado a partir de diferentes aislados: de jurel dentón (Iwamoto y col., 2001a), de mero lutria (E. tauvina) (Tan y col., 2001); de fletán atlántico (Hippoglossus hippoglossus) (Sommerset y Nerland, 2004), de mero carcelario, SGNNV, (Iwamoto y col., 2004), de barfin flounder (Verasper moseri) y del pez globo tigre (Takifugu rubripes) (Okinaka y Nakai, 2008), a partir de un aislado de lubina en Túnez (Chérif y col., 2010) y un aislado de mero de pintas rojas (E. akaara) en China (Liu y col., 2012). El ARN1 del virus tipo de NNV, striped jack nervous necrosis virus, está formado por 3.107 bases y presenta un marco de lectura abierta (ORF del inglés Open Reading Frame) entre la base 79 y la 3.030 flanqueado por dos secuencias no codificantes (UTRs, untranslated regions). El ORF codifica la proteína A (110 KDa), un polipéptido de 983 aminoácidos que contiene la actividad ARN polimerasa ARN dependiente viral (RdRP). El ARN2 del SJNNV, está formado por 1.421 nucleótidos que contienen un único ORF entre la base 28 y la 1.050 que codifLFDDPLQRiFLGRVTXHIRUPDQODSURWHtQDĮRSURWHtQD de la cápside (Cp). Existen 28 bases en posición 5’ y 37 bases en posición 3’ que pertenecen a secuencias no codificantes. Las bases de la región 1.416 a 1.421 son idénticas a las de la secuencia del ARN1 en su extremo 3’. Al comparar parte de la secuencia que codifica la proteína de la cápside con el resto de los aislados de NNV se vio que existe una deleción de 6 nucleótidos (posición 713-718) en aislados de “barfin flounder” y de meros. Además se encontró una región conservada (posición 83-216) que corresponde a 134 aminoácidos de la proteína con una similitud del 93% y una región variable (posición 235-315) que corresponde a 81 aminoácidos con un 62% de similitud entre los aislados (Nishizawa y col., 1995). 20 INTRODUCCIÓN GENERAL Figura 2 Esquema del genoma de betanodavirus El ARN3 es de pequeño tamaño (0,4 Kb) y se sintetiza a partir del ARN1. Se inicia en la posición 2.737 con el dinucleótido UA (al igual que el ARN1 y el ARN2) y comparte el extremo 3’ con el ARN1. Este ARN contiene dos posibles ORFs que codifican proteínas no estructurales, el primero codifica la proteína B1, de 111 aminoácidos (Liu y col., 2012), que se ha asociado con una función anti-apoptótica en la célula huésped durante la infección temprana (Chen y col., 2009). El segundo ORF, con una pauta de lectura +1 respecto al ORF1, codifica la síntesis de la proteína B2 (Iwamoto y col., 2005). Se cree que esta proteína está implicada en el bloqueo del sistema inmune del huésped a través de la represión de ARNs de silenciamiento (Fenner y col., 2006; Iwamoto y col., 2005). 2.3 TAXONOMÍA Y FILOGENIA Los virus que causan la necrosis nerviosa viral se identificaron en un primer momento como miembros de la familia Picornaviridae, debido a sus características morfológicas, su condición de virus ARN y su capacidad de replicar en el citoplasma (Bloch y col., 1991; Glazebrook y col., 1990; Renault y col., 1991). Más adelante, como se mencionó anteriormente, un estudio más profundo de sus características genómicas hizo que el virus causante de la VNN/VER se situase dentro de la familia Nodaviridae (Mori y col., 1992) en la que existía un único género denominado Nodavirus y en el que se incluían virus de insectos: el virus nodamura (NOV), virus blackbeetle (BBV), virus Flock House (FHV) y el virus boolarra (BOV) (Hendry y col., 1995). 21 Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped Al realizar la comparación del ARN2 de los dos grupos de virus, se vio una similitud entre las secuencias de la cápside de NNV respecto a los virus que afectan a insectos menor del 30% a nivel nucleotídico y del 10% a nivel aminoacídico (Nishizawa y col., 1995). Además se observó que una secuencia conservada compartida por todos los aislados de peces estaba ausente en los nodavirus de insectos. La gran similitud entre los virus de la necrosis nerviosa de peces y las diferencias a nivel nucleotídico con los encontrados en insectos hizo que se propusiera la formación de un nuevo género dentro de la familia Nodaviridae (Aspehaug y col., 1999; Grotmol y col., 2000; Nagai y Nishizawa, 1999; Nishizawa y col., 1997, 1995). Así en la 7ª revisión taxonómica viral (7th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses) se crean dos nuevos géneros dentro de la familia: el género Alphanodavirus representado por los virus que infectan insectos, y el género Betanodavirus que reúne a los virus que afectan a peces (Ball y col., 2000). Los primeros estudios que se realizaron para intentar clasificar los distintos aislados de nodavirus de peces se hicieron en base a la región variable del ARN2 (que codifica la proteína de la cápside), se trata de una secuencia de unos 420 pb a la que se denomina región T4 (Nishizawa y col., 1997). De esta forma los betanodavirus se clasificaron en cuatro grandes grupos que se designaron como SJNNV (striped jack nervous necrosis virus), TPNNV (tiger puffer nervous necrosis virus), BFNNV (barfin flounder nervous necrosis virus) y RGNNV (redspotted grouper nervous necrosis virus), siendo la similitud entre cada grupo del 95% o mayor (Nishizawa y col., 1997). Esta clasificación ha sido utilizada con posterioridad por distintos autores para tipar los betanodavirus aislados de distintas zonas geográficas (Cutrín y col., 2007; Dalla Valle y col., 2001; Gagné y col., 2004; Johnson y col., 2002; Skliris y col., 2001). Nishizawa y sus colaboradores calcularon una tasa de evolución de 2,6 × 10-3 reemplazamiento nucleotídico/lugar/año, en base a la sustitución por mutación encontrada en varios aislados japoneses de 5 años consecutivos entre 1990 y 1994. Por ello, consideraban que los cuatro grandes grupos de nodavirus de peces divergieron hace 100 a 150 años mientras que la menor divergencia entre los grupos se produjo dentro de los últimos 10 años, siendo TPNNV y SJNNV considerados grupos hermanos y los grupos más primitivos, mientras BFNNV y RGNNV serían grupos derivados, en los que está presente una deleción de 6 bases en la región T4 (Nishizawa y col., 1997). 22 INTRODUCCIÓN GENERAL Mediante el empleo de anticuerpos policlonales de conejo y pez se realizó un análisis comparativo de los distintos aislados pertenecientes a los cuatro genotipos. Se propuso el establecimiento de tres serotipos distintos: el serotipo A que se corresponde con el genotipo SJNNV, el serotipo B que se corresponde con el TPNNV y el serotipo C que reúne a los dos genotipos restantes RGNNV y BFNNV, lo cual está relacionado con la gran similitud genética que existe entre estos dos grupos (Mori y col., 2003). En el año 2004, Thiéry y col. propusieron una nueva clasificación basada también en la región T4 del ARN2 en la que se distinguían 4 grandes grupos o clados, algunos de los cuales se dividían en subgrupos. Así el clado I incluye aislados que corresponden al genotipo RGNNV y se divide en los subgrupos Ia y Ib. El clado II agrupa los aislados pertenecientes al genotipo BFNNV, distinguiéndose los subgrupos IIa, IIb y IIc. Finalmente, los clados III y IV se corresponden con los genotipos TPNNV y SJNNV, respectivamente. Diversos autores han utilizado esta clasificación para el análisis de las secuencias de nuevos aislados (Bigarré y col., 2009; Chérif y col., 2010; Moody y col., 2009; Olveira y col., 2009; Panzarin y col., 2012). En 2004, Johansen y col. publicaron la detección de betanodavirus en rodaballo. Al realizar el análisis filogenético en base a una secuencia de 823 nucleótidos del ARN2 observaron que no se agrupaba en ninguno de los cuatro genotipos y además al comparar la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína de la cápside con secuencias representativas de cada genotipo observaron una similitud del 77–78%, (Johansen y col., 2004a). Por ello propusieron la formación de un quinto genotipo denominado TNNV (turbot nervous necrosis virus). Esta secuencia ha sido incluida en otros estudios filogenéticos con el mismo resultado aunque la ausencia de una secuencia mayor y del aislamiento del virus ha impedido un estudio más detallado. Aunque la mayoría de los estudios se centran en el análisis del ARN2, existen también datos en base al ARN1. Toffolo y col. en 2007 realizaron un análisis filogenético empleando ambos segmentos, en el que se analizó una secuencia parcial del gen de la polimerasa viral de 929 nucleótidos (ARN1). En este estudio se incluyeron cepas aisladas en Europa, principalmente de lubina, junto con otras cepas ya analizadas anteriormente y cepas de referencia de los cuatro genotipos. Los datos obtenidos indicaron una clara separación de los aislados en los cuatro grandes grupos, y según la distancia genética que presentaban los 23 Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped distintos grupos determinaron que existió una primera divergencia que separaba al genotipo RGNNV del resto, más tarde ocurriría la divergencia de SJNNV y por último TPNNV y BFNNV serían grupos hermanos con una separación más reciente (Toffolo y col., 2007). Utilizando gran parte del ARN1, el análisis realizado en 2008 por Nylund y col. mantiene la clara separación de los genotipos SJNNV, RGNNV y BFNNV, en un estudio en el que se incluyeron sobre todo cepas de bacalao procedentes de las costas de Noruega junto con cepas descritas anteriormente de todos los genotipos excepto el genotipo TPNNV. El estudio de ambos segmentos realizado por Toffolo y col en 2007 reveló la existencia de dos aislados de lubina procedentes del mediterráneo que poseían un ARN1 de tipo SJNNV y un ARN2 perteneciente al genotipo RGNNV, demostrando la existencia de recombinación entre segmentos genómicos en betanodavirus. En 2009, en un estudio realizado en nuestro laboratorio, el análisis filogenético de 6 aislados de NNV, además de 16 secuencias obtenidas de la detección por RT-PCR, procedentes de lenguado senegalés (Solea senegalensis)y dorada, reveló que estos virus poseían un ARN1 perteneciente al genotipo RGNNV y un ARN2 de tipo SJNNV, confirmando la existencia de recombinantes en el sur de Europa y la existencia de recombinación distinta a la observada anteriormente (Olveira y col., 2009). Más recientemente, en 2012, en un amplio estudio realizado por Panzarin y col. (2012) en el sur de Europa, se describen 23 nuevos recombinantes entre los genotipos RGNNV y SJNNV de tipo RGNNV/SJNNV, aislados de lubina, lenguado común (Solea solea) y dos invertebrados marinos. Además, el análisis filogenético de ambos segmentos de una cepa de NNV procedente de lubina en Túnez indica que ha sufrido posiblemente recombinación entre cepas del mismo genotipo (RGNNV) (Haddad-Boubaker y col. 2013). Los resultados obtenidos en estos análisis filogenéticos demostraron la importancia de realizar un estudio de ambos fragmentos para obtener una información más precisa de la evolución de estos virus. Oficialmente dentro del género Betanodavirus se han reconocido las especies Striped jack nervous necrosis virus (SJNNV), Redspotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV), Barfin flounder nervous necrosis virus (BFNNV) y Tiger puffer nervous necrosis virus (TPNNV), y además existen además una serie de aislados que están a la espera de considerarse nuevas especies: Atlantic cod nervous necrosis virus (ACNNV), Atlantic halibut nodavirus (AHNV), Dicentrarchus labrax encephalitis virus (DIEV), Dragon grouper nervous necrosis virus (DGNNV), Greasy grouper nervous necrosis virus (GGNNV), Japanese 24 INTRODUCCIÓN GENERAL flounder nervous necrosis virus (JFNNV), Lates calcarifer encephalitis virus (LcEV), Malabaricus grouper nervous necrosis virus (MGNNV), Sea bass nervous necrosis virus (SBNNV), Solea senegalensis nervous necrosis virus (SSNNV) y Turbot nodavirus (TNV) (Thiéry y col., 2011). 2.4 EPIDEMIOLOGÍA:BREVE REVISIÓN La distribución geográfica de la necrosis nerviosa viral es muy amplia, ha sido detectado en todos los continentes: regiones del sureste asiático (Mori y col., 1991; Nakai y col., 1994; Oh y col., 2002; Ransangan y Manin, 2010; Yoshikoshi e Inoue, 1990), India (Azad y col., 2005) e Irán (Zorriehzahra y col., 2005), sur de Europa y regiones del mediterráneo que incluyen España, Francia, Italia, Grecia, Chipre, Malta, Bosnia, Croacia, Argelia, Túnez e Israel (Chérif y col., 2009; Cutrín y col., 2007; Giacopello y col., 2013; Grotmol y col., 1995; Haddad-Boubaker y col., 2013; Hodneland y col., 2011; Kara y col., 2014; Le Breton y col., 1997; Panzarin y col., 2012; Skliris y col., 2001; Ucko y col., 2004), costas del Reino Unido (Starkey y col., 2001) y Mar del Norte (Bloch y col., 1991; Grotmol y col., 1995), Australia (Munday y col., 2002), Caribe (Bellance y Gallet de Saint-Aurin, 1988), Estados Unidos (Curtis y col., 2001) y Canadá (Gagné y col., 2004; Johnson y col., 2002), Desde su descubrimiento se ha descrito la infección del virus en más de 50 especies marinas pertenecientes a 31 familias distribuidas en 15 órdenes distintos (Tabla 1). Entre las especies susceptibles se encuentran peces de gran importancia para la industria de la acuicultura como lubina (Renault y col., 1991); bacalo, Gadus morhua L, (Starkey y col., 2001); lenguado senegalés (Cutrín y col., 2007; Olveira y col., 2009); dorada, Sparus aurata (Bitchava y col., 2007; Comps y Raymond, 1996; Dalla Valle y col., 2000; Olveira y col., 2009), rodaballo (Johansen y col., 2004a) y anguila, Anguilla anguilla (Chi y col., 2003) ocasionando mortalidades y grandes pérdidas económicas. Además se ha detectado la presencia del virus en gran cantidad de especies salvajes asintomáticas (Ciulli y col., 2007; Gagné y col., 2004; Gomez y col., 2004; Nylund y col., 2008). En corvina salvaje, Argyrosomus regius, se ha detectado la existencia de cepas de los genotipos SJNNV y RGNNV (Lopez-Jimena y col., 2010a).También se ha detectado la presencia del virus en especies de invertebrados marinos (Gomez y col., 2008; Panzarin y col., 2012), ambos casos pueden constituir una importante fuente de infección para los peces cultivados. 25 Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped que se demostró adecuada para la replicación y cuantificación de algunas cepas de betanodavirus (Bandín y col., 2006). Además en esta línea celular no se ha demostrado la presencia de retrovirus lo que podría indicar que en realidad el virus no necesita de la presencia del retrovirus para poder replicar. La línea celular de un pez tropical denominada SF se ha visto que es permisiva a una cepa de nodavirus aislada de mero (Chang y col., 2001), también dos líneas procedentes de bazo de mero de pintas naranjas (Qin y col., 2006), la línea GB obtenida de cerebro de mero amarillo (Lai y col., 2001D), la línea SB obtenida de larvas de perca gigante (Chew-lim y col., 1998), las células ASBB, procedentes de cerebro de juveniles de perca gigante (Hasoon y col., 2011) y las células Gl-av obtenidas de hígado de mero (Chen y col., 2006) también son permisivas para nodavirus del genotipo RGNNV. Se ha descrito una baja permisibilidad en células de mamífero de las líneas celulares Cos-1 de simio y HeLa de carcinoma epiteloide humano, en las que se produce una baja producción de partículas virales (Delsert y col., 1997), sin embargo, Takizawa y col., (2008a) describen un nivel de propagación mayor en la línea celular derivada de un astrocitoma de murino (DBT). 2.6.3 Detección de los viriones, antígenos virales o genoma viral Microscopía electrónica.- Técnica compleja especialmente en el caso de los betanodavirus cuando se encuentran en una baja concentración. En las preparaciones de individuos con patología se pueden ver los viriones libres en el citoplasma, o unidos al retículo endoplasmático de células nerviosas muy vacuolizadas, o formando agregados cristalinos (Azad y col., 2005; Bloch y col., 1991; Glazebrook y col., 1990; Nguyen y col., 1996; Renault y col., 1991) (Figura 5). Serología.- Existen varias técnicas basadas en la unión específica antígeno-anticuerpo que se pueden utilizar para el diagnóstico de los betanodavirus. La Inmunofluorescencia (IFAT) es una técnica recomendada por la OIE en su Manual de diagnóstico de animales acuáticos (OIE, 2013) como técnica de diagnóstico. Es posible emplearla tanto para la identificación de las cepas en cultivo celular, como para la identificación directamente en cortes histológicos de tejido nervioso. 32 INTRODUCCIÓN GENERAL Por otro lado se ha descrito que la técnica de ELISA puede ser útil en la selección de reproductores libres de virus. Se han obtenido resultados satisfactorios en detección del virus en diferentes tejidos como son ovarios y en sangre (Arimoto y col., 1992; Breuil y Romestand, 1999; Watanabe y col., 2000). La ventaja principal de esta técnica es la posibilidad de procesar gran número de muestras de forma rápida y automatizada, no siendo requerido un observador experimentado para leer los resultados. Figura 5 Electromicrografía de partículas virales de NNV en retina. Las flechas señalan los viriones asociados a la membrana del retículo endoplasmático liso. Escala 100 nm (Crane y Hyatt, 2011). Técnicas moleculares.- Las técnicas moleculares están desbancado a las técnicas clásicas debido a sus múltiples cualidades: sensibilidad, especificidad, rapidez, y sencillez. El único inconveniente que se presenta es quizás su mayor coste y necesidad de inversión inicial en equipos más sofisticados. Aunque no es válido para el diagnóstico por sí sólo, como considera la OIE, sí es una herramienta indispensable en cualquier laboratorio de diagnóstico e investigación. En los últimos años se ha estado trabajando en la validación de sistemas de diagnóstico basado en estas técnicas mediante pruebas de eficiencia entre distintos laboratorios y pruebas de equivalencia respecto al método de referencia. La técnica molecular que permitió un mayor avance en el estudio y detección de los nodavirus fue la RT-PCR empleada para el diagnóstico desde 1994 (Nishizawa y col., 1994). La OIE recomienda para el diagnóstico de betanodavirus la pareja de cebadores (F2/R3) válida para el diagnóstico de los cuatro genotipos y que amplifican una región del ARN2 de 427 pb (región T4) (Nishizawa y col., 1997), aunque se ha visto que puede producir falsos negativos no siendo 33 Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped suficientemente sensible para algún genotipo, por esta razón se han propuesto cebadores alternativos (Thiery y col., 1999). Otros autores han propuesto también otros métodos testados con cepas aisladas en el mediterráneo (Dalla Valle y col., 2000), y en aislados de aguas frías (Grotmol y col., 2000). Esta técnica se ha empleado también por muchos autores como base para el análisis filogenético de los distintos aislados encontrados. Se ha descrito una técnica de RT-PCR convencional asociada a la hibridación dot-blot que además de detectar el NNV permite discriminar entre genotipos existentes en una misma muestra y siendo adecuada para la detección en peces portadores (Lopez-Jimena y col., 2010a). La técnica de la PCR en tiempo real se presenta en los últimos años como una técnica muy rápida, sencilla, sensible y que reduce el riesgo de contaminación en relación a otros métodos, pero sobre todo destaca frente a la PCR clásica por su capacidad de realizar una cuantificación precisa. Aparecen en la literatura diversos intentos de puesta a punto de esta técnica con variaciones en cuanto a la metodología: la Real-Time NASBA (nucleic acid sequence based amplification) (Starkey y col., 2004), se muestra más sensible que la RT-PCR con el inconveniente de que no detecta TPNNV, también se realizaron ensayos con SYBR Green (Ciulli y col., 2006D; Dalla Valle y col., 2005). Grove y col. (2006) desarrollaron y validaron un método de RT-PCR en tiempo real para detectar específicamente el virus de la necrosis nerviosa del fletán, aunque esta técnica se mostró ineficaz para la detección de NNV no aislados de peces de aguas frías. Hick y Whittington, (2010) optimizaron una RT-qPCR basada en TaqMan para la detección de betanodavirus, que se ha validado extensamente. La OIE recomienda el uso del método basado en TaqMan desarrollado por el Laboratorio de Referencia de la OIE, un método validado que reconoce el ARN2 de los cuatro genotipos establecidos, así como betanodavirus del bacalao del Atlántico y de fletán (Panzarin y col., 2010). Se han descrito otros sistemas de detección que se han centrado en aislados de zonas concretas o especies concretas, así Kuo y col. (2011) desarrollaron un método para la monitorización de betanodavirus aislados de las distintas especies de mero y Hodneland y col. (2011) probaron su método sólo con aislados procedentes de España. Recientemente se ha publicado un método basado en TaqMan que que reconoce el ARN1 de aislados representativos de los cuatro genotipos que además tiene la ventaja de seguir un protocolo más sencillo que realiza la transcripción inversa y la PCR en tiempo real en un único paso (Baud y col., 2015). 34 INTRODUCCIÓN GENERAL Detección de anticuerpos específicos en el suero o fluidos corporalesPuede llegar a ser una técnica útil en estudios epidemiológicos aunque con el gran desarrollo de las técnicas moleculares parece no ser muy interesante a nivel de diagnóstico. Actualmente la OIE recomienda el uso de RT-qPCR para la detección, el diagnóstico y especialmente la vigilancia de NNV. Además, para la detección y diagnóstico considera también apropiado el cultivo celular junto con la identificación del virus mediante IFAT o PCR y secuenciación. INTERACCIONES VIRUS-HUÉSPED EN NNV3. 3.1 ESPECIFICIDAD DE HUÉSPED Se ha observado una estrecha relación entre el genotipo de los aislados de NNV y la especie hospedadora. Así, el genotipo SJNNV incluye a los betanodavirus detectados en jurel dentón, que se aislaron por primera vez a partir de brotes infecciosos producidos en Japón en 1991 (Arimoto y col., 1993; Mori y col., 1992). El grupo TPNNV incluye un aislado de pez globo tigre, “tiger puffer”en inglés, (Takifugu rubripes) hallado en 1993 en Japón (Nakai y col., 1994). El grupo BFNNV incluye a los aislados encontrados en la zona atlántica relacionados con especies de aguas frías como “barfin flounder” (Verasper moseri), bacalo del Pacífico (G. macrocephalus), bacalao atlántico y fletán (Nylund y col., 2008; Sommerset y col., 2003). El grupo RGNNV incluye el mayor rango de hospedadores, principalmente especies de aguas templadas-cálidas como meros, lubina y aislados de falso halibut del Japón (Paralichthys olivaceus) (Munday y col., 2002). La especificidad de huésped se ha estudiado en infecciones experimentales realizadas con distintas especies y diferentes aislados de NNV. Banu y col. en 2007 realizaron una infección cruzada por inyección intramuscular de una cepa RGNNV aislada en mero de diente largo (E. moara) y una cepa SJNNV procedente de jurel dentón. Observaron que las infecciones en los hospedadores naturales mostraban una mayor carga viral en los órganos nerviosos, mientras en las infecciones cruzadas, se obtenían cargas virales menores, sobretodo en mero infectado con la cepa SJNNV. Lo cual confirmaría que la capacidad infectiva del genotipo SJNNV está más restringida mientras que la cepa RGNNV se adapta mejor a otros hospedadores no 35 Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped naturales. Totland y col. (1999) observaron una clara diferencia en la virulencia causada en fletán atlántico por una cepa SJNNV procedente de jurel dentón y una cepa BFNNV de fletán en jurel dentón. Tanaka y col. (2003) observaron diferencias en virulencia entre 7 especies infectadas con una misma cepa RGNNV incluyendo a los hospedadores naturales y no naturales. Se ha descrito que la especificidad de huésped en betanodavirus reside en el ARN2 (Iwamoto y col., 2004), y que está controlada específicamente por la región variable del ARN2 o región T4 (Ito y col., 2008). Se sabe que los betanodavirus están en constante evolución, generando una enorme variabilidad genética que se ha asociado con la adaptación a nuevos huéspedes. La aparición de cepas recombinantes de betanodavirus se ha relacionado con la colonización de nuevas especies como el lenguado senegalés y la dorada (Olveira y col., 2009). El análisis filogenético de aislados de distintas zonas geográficas reveló que el genoma de betanodavirus posiblemente evolucionó adaptándose a las distintas condiciones ambientales de los peces hospedadores (Panzarin y col., 2012), siendo la temperatura uno de los principales factores que influye en esta adaptación. Se ha descrito que la sensibilidad a la temperatura reside en la proteína A o polimerasa viral (Hata y col. 2010), y en betanodavirus se ha visto que la polimerasa viral tiene una tasa de evolución superior a la de la cápside (Panzarin y col., 2012). Esto también se ha podido comprobar en un análisis realizado por nuestro laboratorio en el que se observó que en cepas recombinantes RGNNV/SJNNV presentaban un ARN1 con 19 a 22 sustituciones en la proteína A respecto a la secuencia tipo de RGNNV, siendo la divergencia de la RpRd del 1,9% frente al 0,9% registrado en la proteína de la cápside (Olveira y col., 2009). 3.2 TRANSMISIÓN El NNV tiene una gran capacidad de transmitirse entre individuos (Glazebrook y col., 1990). Se ha descrito transmisión horizontal en numerosos estudios de infección experimental en larvas y juveniles. Se ha podido observar en barramundi Lates calcarifer (Glazebrook y col., 1990), jurel dentón (Arimoto y col., 1993; Totland y col., 1999), mero de pintas rojas, falso halibut del Japón y fletán (Mori y col., 1991; Arimoto y col., 1993; Nguyen y col., 1994) y lubina (Thiery y col., 1997; Peducasse y col., 1999). También se ha demostrado la existencia de transmisión vertical en jurel dentón (Nguyen y col., 1997), lubina (Breuil y col., 2002), fletán (Johansen y col., 2002) y barramundi (Azad y col., 2006). Algunos autores 36 INTRODUCCIÓN GENERAL opinan que existen otras rutas de infección posible a través de ciertos organismos que forman parte del alimento de los peces como es el caso de artemia (Skliris & Richards., 1998; Chi y col., 2003). La alimentación de los peces de cultivo a base de pescado crudo podría ser otra posible vía de infección (Mori y col., 2005). En ocasiones los peces adultos pueden actuar como portadores asintomáticos del virus constituyendo una fuente importante de mantenimiento y diseminación de la infección (Castric y col. 2001; Johansen y col. 2002). 3.3 TROPISMO La unión de un virus a la célula huésped depende del reconocimiento específico de receptores en la superficie de la célula, la interacción virus-receptor desencadena posteriormente la penetración del virus dentro de la célula generalmente por medio de un mecanismo de endocitosis empleado por la célula huésped. Los betanodavirus se consideran virus con un tropismo muy restringido (Comps y col., 1996; Iwamoto y col., 2004) Las lesiones que se observan en peces infectados por el NNV demuestran claramente un neurotropismo marcado, es decir, el virus infecta preferentemente células nerviosas, especialmente del sistema nervioso central y retina. Existe poca información acerca de las rutas de entrada del NNV. Se ha propuesto que el virus llega en primer lugar a la medula espinal, penetrando posiblemente por la piel a través de terminaciones nerviosas periféricas (Nguyen y col., 1996) o por el epitelio estratificado del intestino, al que llegarían gracias a la ingesta de agua a través de la única branquia de las larvas (Grotmol y col., 1999; Munday y col., 1992), y después a través del nervio vago se desplazarían al cerebro y finalmente a la retina (Banu y col., 2007; Nguyen y col., 1996). En mero carcelario se ha visto que la entrada del virus se produce probablemente por vía nasal (Banu y col., 2004), esta vía ha sido también propuesta en lubina después de detectar la presencia del antígenos del virus en los lóbulos olfatorios (Mladineo, 2003). Una vez dentro del hospedador se cree que el virus se transmite a través de las conexiones sinápticas y no por el torrente sanguíneo (Ikenaga y col., 2002). Aunque la dispersión del virus por el torrente sanguíneo se considera poco probable (Banu y col., 2007), se ha detectado la presencia del virus en sangre en diferentes estudios (Chi y col., 2001b; Mazelet y col., 2011; Olveira y col., 2008), también se ha relacionado el NNV con lesiones en el endocardio de fletán del atlántico que presentaban patología aguda, lo que podría indicar que 37 Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped después de la replicación inicial en los órganos diana, se produce una viremia dando lugar a una infección secundaria más generalizada (Grotmol y col., 1997). Por el contrario, Korsnes y col. (2009) sugieren la existencia de una viremia previa a la infección de tejidos nerviosos en una infección experimental de bacalao atlántico. Se cree que el NNV replica preferentemente en células nerviosas con capacidad para dividirse, lo que explicaría el hecho de que el virus sea especialmente virulento en peces que se encuentran en las fases tempranas del desarrollo (larvas y juveniles). Los peces adultos conservan esta capacidad en algunas regiones y se ha observado la existencia de NNV en agregados celulares que se corresponderían con estas zonas de proliferación (Johansen y col., 2002). Por otro lado, se cree que el virus puede adquirir un diferente tropismo en peces asintomáticos en los que se ha observado replicación en órganos no nerviosos, concretamente en gónadas, intestino, estómago, riñón e hígado (Nguyen y col., 1997). En ensayos realizados in vitro mediante neutralización con anticuerpos específicos y mediante bloqueo de receptores con VLPs (virus-like particles o partículas virales sintetizadas que no contienen genoma) se ha demostrado que la unión del virus a la célula se produce a través de receptores específicos (Lai y col., 2001E; Lu y col., 2003; Mori y col., 2003). 3.4 REPLICACIÓN VIRAL Los betanodavirus penetran en la célula hospedadora mediante endocitosis del virus en vacuolas intracelulares (Liu y col., 2005), y tras desprenderse de la cápside el genoma (ARN) es liberado en el citoplasma donde actúa como ARN mensajero para la síntesis de las proteínas virales, como molde para la síntesis de ARN de polaridad negativa y la replicación viral. Actualmente existe poca información acerca de la replicación del NNV, sin embargo, sí se han realizado extensos estudios de otros virus que infectan a insectos pertenecientes a la familia Nodaviridae, como el virus Flock House (FHV) y el virus Black beetle (BBV), que han servido de modelo teniendo en cuenta que las distintas familias de virus de ARN de cadena positiva comparten características de replicación comunes. La expresión génica y la replicación del NNV se produce en dos fases temporales: una primera fase de “replicación temprana” en la que se producen las proteínas no estructurales, incluida la polimerasa viral, y una fase de replicación “tardía” en la que se sintetizan las 38 INTRODUCCIÓN GENERAL proteínas estructurales. La replicación de los virus ARN(+) se produce generalmente en las membranas intracelulares de las células del huésped, en el retículo endoplasmático, aunque se ha visto también asociación con lisosomas, mitocondria, peroxisomas y otras membranas (Ahlquist y col., 2003). La replicación del virus FHV se produce asociada a la membrana externa de la mitocondria (Miller y Ahlquist, 2002). En NNV la polimerasa viral se asocia posiblemente también con la membrana mitocondrial (Guo y col., 2004; Mézeth y col., 2007). Inmediatamente después de la liberación del genoma en el citoplasma (infección temprana) se produce la traducción del ARN1 para sintetizar la proteína A, subunidad catalítica de la replicasa viral. A partir de ese momento comienza la replicación del ARN1 y se produce la síntesis de cadenas negativas que servirán de molde para la futura replicación del genoma viral, que será empaquetado dentro de la cápside para formar los viriones. Además, durante esta etapa temprana también se realiza la síntesis del ARN subgenómico, el ARN3, y se sintetizan las proteínas no estructurales B1 y B2. En FHV la proteína B2, aunque no es esencial, favorece la replicación (Ball, 1997). En el caso de NNV se ha observado gran acumulación de la proteína B2 durante la infección temprana en fletán atlántico (Sommerset y Nerland, 2004), y parece ejercer de antagonista de los ARN interferentes de la célula, actuando como supresor de las defensas del huésped y facilitando la acumulación intracelular de ARN viral (Fenner y col., 2006; Iwamoto y col., 2005). Más tarde, en la infección tardía, se inicia la replicación del ARN2, en este momento se suprime la replicación del ARN3 (Zhong y Rueckert, 1993), y se inicia además la síntesis de las proteínas necesarias para el ensamblaje de los nuevos viriones. En FHV se ha visto que existe una regulación de la síntesis del ARN2 por parte del ARN1, destinada a coordinar la producción de ambos segmentos genómicos de modo que no se empiece a sintetizar el segmento 2 hasta que se alcance una concentración del ARN1 suficiente (Eckerle y Ball, 2002), además se han LGHQWLILFDGR HOHPHQWRV UHJXODGRUHV HQ FLVHQ ORV H[WUHPRV ƍ \ƍ GHO $51 \ $51 TXH intervienen en la regulación de la replicación (Venter y Schneemann, 2008), aunque también existen otros elementos en la secuencia interna de ambos segmentos (Liu y col., 2009). Finalmente, se produce el ensamblaje de las 180 copias que forman la proteína Cp, en FHV las proteínas ensambladas en el provirión sufren una modificación autocatalítica para dar lugar al virus maduro infectivo (Ball, 1997), este proceso no ha sido observado en NNV. 39 Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped 3.5 BETANODAVIRUS Y CICLO CELULAR La mayoría de los virus, durante alguna fase de la infección, sintetizan proteínas que son capaces de interferir en los mecanismos celulares modificando procesos implicados en la defensa y supervivencia celular. Uno de los métodos de defensa de las células del huésped frente a la infección viral es la inducción de la apoptosis o muerte celular programada, por ello, algunos virus sintetizan moléculas que interfirieren en las rutas que desencadenan la muerte celular como estrategia para retrasar este mecanismo y disponer del tiempo necesario para multiplicarse. En otros casos, son los propios virus los que al final del ciclo infeccioso desencadenan rutas de inducción de la apoptosis, lo que ayuda a la progenie viral a dispersarse y a evadir las defensas del huésped. Habitualmente, los productos virales controlan la supervivencia celular durante la infección creando un equilibrio entre la inhibición y la inducción de la muerte celular según sus necesidades (Roulston y col., 1999). Se ha comprobado que los betanodavirus poseen mecanismos que modulan la apoptosis celular y desencadenan necrosis y muerte de las células infectadas. En células GL-av de hígado de mero se ha observado el proceso de necrosis originado en la infección de un betanodavirus RGNNV. A las 12h de la infección se produce una apoptosis inicial en la que se observa la exposición de fosfatidilserina en la superficie de la membrana celular, que actúa como un marcador de los estados iniciales de la apoptosis para que la célula sea reconocida y eliminada por los fagocitos, mientras que entre las 12 y 24h se observaron los cambios propios de la apoptosis media: pérdida del potencial de membrana en la mitocondria y alteraciones en el ADN y membrana plasmática. Entre las 24 y 48h se observó la condensación alterada de la cromatina y la ruptura de la membrana plasmática correspondientes a la post-apoptosis necrótica (Chen y col., 2006). Además, se ha observado que la pérdida de potencial de la membrana mitocondrial desencadena la liberación del citocromo c a partir de las 24 h de la infección hasta las 48 h que actúa como señal para la necrosis celular (Chen y col., 2007). Se han estudiado los mecanismos por los cuales los betanodavirus modulan la apoptosis en las células y se ha visto que la sobreexpresión de la proteína B1 produce una protección de la muerte celular en células infectadas con RGNNV; mientras que cuando se realiza el bloqueo de la expresión de esta proteína el número de células apoptóticas se incrementa (Chen y col., 2009). Por el contrario, en una infección en células GL-av se ha observado que la proteína B2 40 INTRODUCCIÓN GENERAL favorece la apoptosis mediante la inducción de la expresión del gen pro-apoptótico Bax (Su y col., 2009). En células GF-1 y embriones de pez cebra se ha visto que esta proteína reconoce específicamente la mitocondria donde bloquea el Complejo II, asociado a la membrana mitocondrial, que da lugar a la pérdida de potencial de membrana y a la inhibición de la síntesis de ATP, y finalmente a la necrosis y muerte celular (Su y Hong, 2010). Además, la proteína de la cáspside estaría implicada en este proceso bloqueando la proteína ZfBcl-xL, de la familia de las Bcl-2, una proteína antiapoptótica, dando lugar a la necrosis secundaria (Wu y col., 2008). En células GF-1 también se ha observado que la infección de un virus RGNNV desencadena la respuesta al estrés del retículo endoplasmático (Su y col., 2011) y la inducción de la producción de especies reactivas del oxígeno durante las fases iniciales de la infección (Chang y col., 2011). Por otro lado, se ha podido comprobar que el virus RGNNV interviene en la regulación de las proteínas pro-apoptóticas de la familia Bcl-2 durante la fase intermedia de la apoptosis, 48 h después de la infección de células GF-1. (Su y col., 2011). Los mecanismos de inducción de la necrosis parecen variar en función de la línea celular. Guo y col. en 2003, observaron que en la inducción de la necrosis celular de GGNNV en células SB de lubina interviene la cascada de las caspasas, lo que también se ha observado en la línea celular de aleta de mero GF-1 (Wu y col., 2008). Sin embargo, en la infección de RGNNV en células GL-av procedente de hígado de mero el proceso de inducción de la apoptosis sigue una ruta caspasa-independiente (Chen y col., 2006). En base a los resultados obtenidos in vitro parece que la expresión de las proteínas virales de betanodavirus (Cp, B1 y B2) coordina la supervivencia de las células huésped durante el proceso de infección. Así, la proteína B1, que se sintetiza durante la infección temprana, actuaría como anti-apoptótica, durante la fase de multiplicación del virus, mientras que la proteína B2 y Cp actuarían como pro-apoptóticas durante las fases finales de la infección, promoviendo la muerte celular y facilitando la liberación y propagación del virus (Sepulcre y col., 2010). 41 Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped 5-6 sustituciones aminoacídicas (3 compartidas por todos los aislados) y en la polimerasa 2022, lo que suponen un 0,9 y 1,9% de sus respectivas secuencias. De las sustituciones observadas en la cápside, 2 residuos compartidos por todas las cepas (posiciones 247 >$ODQLQDĺ6HULQD@ \  >$VSDUDJLQDĺ6HULQD@ VH HQFRQWUDEDQ HQ HO H[WUHPR FDUER[LORterminal, una región implicada en la especificidad de huésped en el NNV (Iwamoto y col., 2004; Ito y col., 2008), por lo que cabe esperar que estos cambios estén directamente relacionados con la infección de lenguado y dorada por parte de estas cepas recombinantes En este trabajo se pretende analizar la implicación de la recombinación de segmentos genómicos en la adaptación de los betanodavirus a nuevas especies. Para ello se utilizará una de las cepas recombinantes aislada de lenguado, y como animales de experimentación, el lenguado, su huésped natural, y el rodaballo, debido a que las dos especies se cultivan en áreas próximas y tienen gran importancia para la industria de la acuicultura en Galicia. 48 OBJETIVOS OBJETIVOS OBJETIVOS El principal objetivo del presente trabajo es investigar el efecto que la recombinación de segmentos genómicos tiene en la adaptación de betanodavirus a nuevos hospedadores como el lenguado senegalés, y rodaballo, la especie de cultivo más importante de la acuicultura en Galicia. Los objetivos específicos se resumen en los siguientes puntos: 1. Comparar la susceptibilidad del lenguado a una cepa recombinante RGNNV/SJNNV y a las cepas de tipo parental (RGNNV and SJNNV) usando dos rutas distintas de infección. 2. Investigar el papel de los aminoácidos 247 y 270 localizados en el extremo C-terminal de la proteína de la cápside como posibles determinantes de virulencia en las cepas recombinantes de betanodavirus. 3. Evaluar la susceptibilidad del rodaballo a un aislado recombinante procedente de lenguado senegalés e investigar el papel de los aminoácidos 247 y 270 en la especificidad de huésped. 4. Investigar el efecto de la temperatura en la infección de betanodavirus y la transmisión horizontal en lenguado senegalés. 51 AIMS AIMS AIMS The main objective of the present study was to investigate the effect of reassortment on the adaptation of betanodavirus to new host species as Senegalese sole, and turbot, the most important farmed fish species in Galician aquaculture. The specific aims could be summarized as follows: 1. Compare the susceptibility of sole to a reassortant RGNNV/SJNNV strain and WRthe twoparental strains (RGNNV and SJNNV) using two different routes of infection. 2. Investigate the possible role of amino acids 247 and 270 located in the C-terminal domain of the capsid protein as putative virulence determinants in betanodavirus reassortant strains. 3. Assess the susceptibility of turbot to a reassortant isolate originated from Senegalese sole and investigate the possible role of the amino acids 247 and 270 in host specificity. 4. Investigate the effect of temperature on betanodavirus infection and horizontal transmission in Senegalese sole. 5 CAPÍTULO 1: COMPARACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD DE LENGUADO SENEGALÉS A LA CEPA RECOMBINANTE Y GENOTIPOS PARENTALES. Experimental susceptibility of European sea bass and Senegalese sole to different betanodavirus isolates. Vet. Microbiol. 177, 53–61 (2015). Comparación de la susceptibilidad del lenguado senegalés a la cepa recombinante y genotipos parentales detección de betanodavirus se realizó usando una combinación de RT-PCR e hibridación dotblot, siguiendo las indicaciones de Lopez-Jimena y col. (2010a). Para el diagnóstico de IPNV, VHSV, e IHNV se realizó una RT-PCR seguida de nested-PCR siguiendo los procedimientos descritos por Lopez-Jimena y col. (2010b), López-Vázquez y col. (2006) y Dopazo y col (2002), respectivamente. Después de la aclimatación inicial se inició el proceso de aclimatación a 22°C (temperatura de experimentación), la temperatura del agua se incrementó a razón de 1°C/día durante 6 días empleando calentadores. Durante el desarrollo de los experimentos se siguieron las directrices marcadas por la Unión Europea (Directiva 2010/63/UE) para minimizar el sufrimiento de los animales. Además, los protocolos experimentales se llevaron a cabo con la aprobación de los Comités de bioética y de experimentación animal de la Universidad de Santiago de Compostela, así como de la Xunta de Galicia (Id Permiso. 15004AE/12/INV392MED02/ANIMAL[05]/IBM4 y Permiso Id. 15004/13/002). Los peces se mantuvieron inicialmente en tanques de almacenamiento de 300 L. Posteriormente se distribuyeron de acuerdo con las necesidades experimentales, en tranques de 100 L o 50 L. Antes de iniciar la infección experimental los peces se sometieron a un período de 24 h de ayuno. 2.4.1 Infección por baño Los lenguados de menor tamaño (peso medio 2 g) se distribuyeron en 4 tanques de 50 L (100 peces/tanque). La infección con cada una de las cepas se realizó a 22 °C mediante inmersión en un baño con una concentración viral de 105 TCID50/ml, con fuerte aireación durante 3 h. Transcurrido ese período se redujo la aireación a niveles moderados y se añadió agua hasta completar el tanque. Los peces se mantuvieron a la misma temperatura durante 30 días, durante los cuales se vigilaron los tanques para detectar individuos con signos clínicos y retirar las bajas. Los peces control se sumergieron en un baño con medio L-15 bajo las mismas condiciones que los grupos infectados. Al final del experimento los peces supervivientes se sacrificaron empleando una sobredosis de metasulfonato de tricaína (MS222, Sigma). 64 CAPÍTULO 1: Materiales y métodos 2.4.2 Infección por inyección intramuscular Los lenguados de mayor tamaño (peso medio 5 g), previamente distribuidos en tanques de 100 L (60 peces/tanque), se inocularon por inyección intramuscular con 0,1 ml de virus a una dosis de 105TCID50/pez para cada una de las cepas. Los peces se mantuvieron a 22°C durante 41 días. A los peces control se les inyectó 0,1 ml de medio L-15. Los tanques se supervisaron diariamente para anotar la aparición de signos clínicos y retirar los peces muertos. Los peces supervivientes se sacrificaron como se describe en el apartado anterior. 2.5 PROCESADO DE LAS MUESTRAS Los peces muertos se recogieron diariamente y se guardaron hasta su análisis a -80 °C. Para confirmar la presencia de betanodavirus en los peces inoculados, a los ejemplares de mayor tamaño (5 g) se les extrajo el cerebro en condiciones asépticas, mientras que a los peces de 1 g, debido a su pequeño tamaño, se les extrajo la parte anterior de la cabeza incluyendo los ojos. Los diferentes órganos/tejidos se analizaron en lotes correspondientes a 5 individuos y cada lote se consideró una muestra. Para ello, cada muestra se introdujo en una bolsa estéril de Stomacher, se pesó, y se trituró mediante rodillo manual. A continuación se realizó una dilución 1:10 p/v con tampón Earle’s suplementado con antibióticos (1000 UI/ml GHSHQLFLOLQD JPO GH HVWUHSWRPLFLQD ȝJPOGHJentamicina y 10- ȝJPOGH fungizona), y se volvió a triturar hasta obtener una mezcla lo más homogénea posible. Seguidamente la suspensión se centrifugó a baja velocidad (1.500 × g) durante 20 min a 4º C, para precipitar los restos celulares. El sobrenadante, previa separación de una alícuota para la extracción del ácido nucleico, se transfirió a un tubo estéril y se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas, para permitir la actuación de los antibióticos, y eliminar la posible contaminación bacteriana y fúngica. Transcurrido ese tiempo se conservó a -80º C. 2.6 EXTRACCIÓN DEL ARN VIRAL La extracción del ARN total se realizó con el kit comercial RNeasy® Mini Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones proporcionadas por la casa comercial, con ligeras modificaciones. A 150 μl de muestra se le añadieron 350 μl de tampón de lisis RLT, suplementado con ßmercaptoetanol (a una concentración final de 0,14 M), y se homogenizó pipeteando. A continuación se añadieron 350 μl de etanol al 70%, la mezcla se transfirió a la columna RNeasy Spin (suministrada por la casa comercial) y se centrífugo a 10.000 × g durante 15 65 Comparación de la susceptibilidad del lenguado senegalés a la cepa recombinante y genotipos parentales segundos. Tras descartar el filtrado, se añadieron 700 μl de tampón RW1 seguido de una nueva centrifugación. Se cambió el tubo colector, se añadieron 500 μl de tampón RPE y se repitió de nuevo la centrifugación. Se descartó el filtrado, nuevamente se añadieron 500 μl de tampón RPE y se centrifugó 2 minutos a 12.000 × g. Finalmente, se cambió el tubo colector, se añadieron 50 μl de H2O libre de nucleasas, se incubó 30 segundos a temperatura ambiente, y se centrifugó un minuto para eluir el ARN, que se conservó a –20ºC hasta su uso. La concentración del ARN se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm (A260GHȝO de producto de extracción en un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Thechnologies). Como blanco se usó agua libre de nucleasas (previamente usada para disolver el ARN) y para calcular la cantidad de ARN se tuvo en cuenta que la absorbancia A260=1 LQGLFDXQDFRQFHQWUDFLyQGHȝJPO Además se verificó la pureza del extraído en base a la ratio A260/A280, para estimar la presencia de contaminantes en la muestra como proteínas o disolventes orgánicos que absorben en el espectro UV, se consideró que una ratio de 1,9 a 2,1 era indicativa de pureza del ARN (Ausubel y col., 1995). 2.7 TRANSCRIPCIÓN INVERSA (RT) Para la síntesis de ADNc a partir del ARN viral se empleó el kit SuperScriptTM III Reverse Transcriptase (Invitrogen). La reacción se llevó a cabo en un termociclador MyCyclerTM (BioRad). Para ello, 1 μg de ARN se desnaturalizó a 95° C durante 5 minutos en presencia de hexámeros de nucleótidos al azar, y rápidamente, se transfirió a 4° C durante 2-3 minutos. Finalizada esta incubación, se añadieron el resto de los componentes de reacción: tampón 1u [250 mM Tris-HCl (pH 8,3 a temperatura ambiente), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2], 0,05 mM de cada nucleótido trifosfato (dTTP, dATP, dCTP, dGTP), 0,05 M de ditrioteitol (DTT), 0,2 ȝOGHHQ]LPDUHYHUVRWUDQVFULSWDVDSuperScript® III Reverse Transcriptase (200 8ȝO,y H 2O KDVWDXQYROXPHQILQDOGHȝO6HLQFXEyD&GXUDQWHPLQXWRVVHJXLGRGHPLQXWRV a 50°C. Finalmente se incubó a 85°C durante 5 minutos para inactivar la reverso transcriptasa antes de la amplificación. 66 CAPÍTULO 1: Materiales y métodos 2.8 AMPLIFICACIÓN POR PCR La ampliILFDFLyQ GHO $'1F VH UHDOL]y WUDQVILULHQGR  ȝO GH $'1F D XQD VROXFLyQ TXH contenía 1,25 U de ADN polimerasa GoTaq® Flexi DNA Polymerase (Promega), \ȝ0GH los cebadores específicos en cada caso, 1× de tampón GoTaq®, 2,5 mM de solución de MgCl2, y 0,2 mM de cada dNTP. A continuación se añadió agua libre de nucleasas hasta un YROXPHQ ILQDO GH  ȝO /D UHDFFLyQ HQ FDGHQD GH OD SROLPHUDVD 3&5 VH UHDOL]y HQ XQ termociclador MyCyclerTM (Bio-Rad) comenzando con una desnaturalización inicial a 94°C durante 4 minutos, seguida por 40 ciclos de amplificación en los cuales se incluyó desnaturalización durante 30 segundos a 94°C, hibridación de los cebadores durante 30 segundos a 58°C, y elongación de las cadenas durante 30 segundos a 72°C. Por último se realizó una extensión final de 10 minutos a 72°C. Para su visualización los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2 % en tampón Tris 1u(Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA-Na 2 mM) junto con el estándar de pesos moleculares SimplyLoad™ 100 bp DNA ladder (Lonza) durante 1 a 1,5 horas a 120 V. Seguidamente los geles se tiñeron con RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution, y las bandas se visualizaron en un transiluminador de luz UV. 2.9 CUANTIFICACIÓN DEL GENOMA VIRAL MEDIANTE PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL La cuantificación del genoma se realizó mediante la técnica de cuantificación absoluta por PCR a tiempo real realizada durante una estancia en la Universidad de Málaga. Por separado, se prepararon mezclas de reacción para la detección del ARN2 de RGNNV y SJNNV. El ARN2 de RGNNV se cuantificó siguiendo el método descrito por Lopez-Jimena y col. (2011). Se emplearon los cebadores RG-ARN2-F2 (5’-CGTCCGCTGTCCATTGACTA-3’, nucleótidos 624-643) y RG-ARN2-R2 (5’-CTGCAGGTGTGCCAGCATT-3’, nucleótidos 723-705) de acuerdo con la secuencia del aislado RG-TO91 (GenBank Acc. No. D38636), que amplifican una región de 100 pb. Mientras que para la cuantificación del ARN2 de SJNNV se utilizaron los siguientes cebadores: SJ-ARN2-F (5’-GACACCACCGC TCCAATTACTAC-3’, nucleótidos 665-687) y SJ-ARN2-R (5’-ACGAAATCCAGTG TAACCGTTGT-3’, nucleótidos 739-717, según la secuencia del aislado SJ-G91, GenBank Acc. No. D30814). Estos cebadores amplifican una región de 75 pb dentro de la región T4. Para la realización de la técnica de PCR a tiempo real basada en la tecnología SYBR se 67 Comparación de la susceptibilidad del lenguado senegalés a la cepa recombinante y genotipos parentales emplearon las condiciones previamente descritas por Lopez-Jimena y col. (2011). Se realizaron mezclas de reacción con volumen final de 25 μl. Las mezclas estaban compuestas por 12,5 μl de 2× Power SYBR  Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1,5 μl de cada cebador (concentración del stock, 15 pmol/μl), y 75 ng de ADNc. Para la obtención de la curva estándar se utilizó como molde diluciones seriadas del ADNc obtenidas a partir de ARN transcrito in vitro proporcionado por el Dr. Lopez-Jimena. Las muestras se analizaron por triplicado. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador 7500 Real-time PCR System (Applied Biosystems), en placas de 96 pocillos, siguiendo el protocolo siguiente: un primer paso de activación a 50 °C durante 2 min, seguido de 95°C durante 10 min, una amplificación de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 15 s, seguidos de hibridación y elongación a 60 °C durante 1 min. Finalmente, la temperatura de fusión (Tm) de los amplicones generados se determinó analizando las curvas de disociación usando el siguiente protocolo: 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C, con 15s de paso de 60 a 95°C cada 0,5 °C y finalmente enfriamiento de las muestras hasta 4 °C. 2.10 TITULACIÓN DE PARTÍCULAS VÍRICAS INFECTIVAS Para el análisis de recuperación de partículas infectivas se seleccionaron lotes de peces en tres puntos diferentes de las curvas de mortalidad: fase inicial, fase de estabilización, y fase finaltal como aparece reflejado en la )igura 6.Tras el procesado de las muestras la titulación se realizó según el método anteriormente descrito de TCID50, y se expresó por gramo de tejido (TCID50/g). 2.11 ANÁLISIS DE LA REPLICACIÓN EN CEREBRO DURANTE LOS PRIMEROS DÍAS DE INFECCIÓN En este experimento se infectaron un total de 100 lenguados (peso medio 1 g) con cada cepa: ERV378, Ss160.03 y SJNag93 mediante inmersión tal y como se describió anteriormente. Para analizar la replicación viral se retiraron diariamente 10 peces a partir del día 1 post infección (p.i.) y hasta el día 10 pi, que se sacrificaron con una sobredosis de anestésico como se ha descrito previamente. De cada pez se extrajo asépticamente, por separado: parte anterior de la cabeza (cerebro y ojos), branquias, una sección de piel, previamente desinfectada con alcohol, de aproximadamente 0,5 cm2situada entre la línea lateral y la aleta caudal, y órganos internos (hígado, intestino, bazo y riñón). Los tejidos 68 CAPÍTULO 1: Materiales y métodos extraídos se procesaron en lotes de 5 peces, de manera que se obtuvieron 2 réplicas por día de muestreo y cepa. El procesado, titulación, extracción de ARN total y síntesis del ADNc se realizaron como se describió anteriormente. 2.11.1 Detección del número de copias en cerebro La detección del número de copias en los distintos tejidos se realizó mediante PCR cuantitativa. Para la realización de la PCR se realizaron mezclas de reacción con volumen final de 20 μl compuestas por 10 μl de 2uiQ™ SYBR®Green Supermix (Bio-Rad), 0,5 μl de cada uno de los cebadores (concentración del stock, 200 nM), y 2 μl de ADNc. Se emplearon ORVFHEDGRUHV 6QRG5 )5 ƍ-TCCAAAAGAAAGAAGCATC -ƍƍ-TGGCATGTACCAC GGAAC-ƍGHVFULWRVSRUOlveira y col. (2013). Estos cebadores hibridan con una región del ARN1 comprendida entre las posiciones 1619 y 1758 tanto con RGNNV como con SJNNV ya que se encuentran en una región homóloga. Para la realización de la recta estándar se emplearon diluciones seriadas de orden 20 de un plásmido purificado que contenía el segmento completo del ARN1 de betanodavirus. Las reacciones se llevaron a cabo en un CFX96™ Real-time PCR detection system (BioRad) en placas de 96 pocillos siguiendo el protocolo siguiente: un primer paso de desnaturalización/activación a 95 °C durante 15 min, seguido de una amplificación de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 15 s, seguidos de hibridación y elongación a 60 °C durante 15 s. La generación de productos de PCR se monitorizó después de cada hibridación midiendo la fluorescencia emitida por la doble cadena de ADN unida al fluoróforo SYBR green. Finalmente, para el análisis de las curvas de disociación y la obtención de la temperatura de fusión (Tm) se siguió el siguiente protocolo: 1 min a 95 °C, 1 min a 55 °C, 10 s de paso de 55°C a 95 °C cada 0,2 °C. Las muestras se analizaron por triplicado, y las curvas sigmoidales obtenidas tras la amplificación se analizaron utilizando el programa Bio-Rad CFX Manager. Para realizar un control del proceso de extracción de ARN y de la síntesis de ADNc se realizó, para cada muestra, una amplificación empleando cebadores que hibridan con una región del ARN ribosómico 18S. Debido a que el ARN ribosómico se expresa constitutivamente en las células, se debería obtener un valor constante en todas las muestras. 69 Comparación de la susceptibilidad del lenguado senegalés a la cepa recombinante y genotipos parentales 2.12 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los valores de números de copias se expresaron como media±desviación estándar. Se analizó la correlación entre el número de copias de ARN2 obtenidas en qPCR y el título viral de los lotes analizados, empleando el test estadístico de correlación de Spearman. Se utilizó el programa informático Statgraphics Centurion XVI. Este coeficiente varía de -1,0 (correlación negativa perfecta) a +1,0 (correlación positiva perfecta) y se consideró significativo un valor de p<0,05. 70 CAPÍTULO 1: Resultados RESULTADOS 3. El análisis virológico y bacteriológico confirmó que los peces estaban libres de patógenos incluyendo betanodavirus. No se registró mortalidad en los peces control y tampoco se observaron signos clínicos externos o internos de enfermedad. Al final del ensayo estos peces se sacrificaron, no habiéndose detectado presencia de betanodavirus en ninguno de los individuos mediante RT-PCR seguida de nested-PCR. Tampoco se observó efecto citopático tras la inoculación en células E-11. 3.1 ANÁLISIS DE MORTALIDAD Las curvas de mortalidad acumulada se representan en la Figura 6. Se observaron signos característicos de VER en todos los grupos de peces infectados, independientemente de la ruta de infección. Tales síntomas consistieron en pérdida de apetito, inicialmente hiperactividad y posteriormente natación errática. Se observaron de una manera más severa en el grupo infectado con la cepa recombinante. En este grupo se observó una mayor proporción de peces con signos clínicos de la patología además de observarse peces afectados durante todo el experimento. El virus se detectó por RT-PCR y se aisló en cultivo celular en todos los lotes de peces muertos. 3.1.1 Infección por baño Los tres aislados provocan una mortalidad acumulada del 100% (Figura 6.A), pero con claras diferencias en el ritmo de mortalidad. Así, aunque los primeros días las curvas de mortalidad acumulada de las tres cepas mostraron una cinética muy parecida, las primeras mortalidades se registraron 5 d.p.i., en los grupos infectados con la cepas Ss160.03 y ERV378 (RGNNV) y 7 d.p.i. en el grupo infectado con SJNag93 (SJNNV), después de los 11díasla curva de la cepa Ss160.03 se situó claramente por delante de la de las otras cepas. La máxima mortalidad se alcanzó a los 18 d.p.i. en el grupo infectado por la cepa Ss160.03, seguido por el grupo de peces infectados con la cepa SJNNV (25 d.p.i.), y finalmente en el grupo infectado con la cepa RGNNV (31 d.p.i.). 71 Comparación de la susceptibilidad del lenguado senegalés a la cepa recombinante y genotipos parentales 3.1.2 Infección intramuscular La mortalidad acumulada alcanzó también el 100% en todos los grupos infectados (Figura 6.B), pero en un período de tiempo más dilatado que en la infección por baño (de 36 a 41 d.p.i.). Los signos típicos de la VER se manifestaron a partir del día 8 post infección (p.i.) y el inicio de la mortalidad se produjo 10 d.p.i. en el grupo infectado con la cepaSJNag93 (SJNNV), y 13 d.p.i. en los grupos infectados con las cepas Ss160.03 (recombinante) y ERV378 (RGNNV). Al analizar detenidamente la curva de mortalidad se observa que la cepa RGNNV provoca el 50% de la mortalidad a día 17 p.i., mucho antes que los grupos infectados con la cepa SJNNV y la cepa recombinante (a 31 y 32 d.p.i., respectivamente). Sin embargo, en este grupo, tras la fase inicial con una alta incidencia de mortalidad, se produce una estabilización y se alcanza el 100% de mortalidad más tarde (41 d.p.i.) que en los grupos infectados con las otras cepas (Ss 160.03 día 36 p.i., SJNag 38 p.i.). Figura 6 Curva de mortalidad acumulada a 22 ºC en peces infectados con los aislados de betanodavirus ERV378 (RGNNV, triángulo rojo), Ss160.03 (RGNNV/SJNNV, asterisco verde) o SJNag93 (SJNNV, rombo violeta), mediante baño (peces de 2 g) a una concentración viral de 105TCID50/ml (A) y mediante inyección intramuscular (peces de 5 g) de 100μl de virus a una concentración de 105 TCID50/pez (B). T1, T2 y T3 muestran los distintos puntos elegidos para el análisis mediante qRT-PCR y titulación viral. 72 CAPÍTULO 1: Resultados 3.2 ANÁLISIS DE REPLICACIÓN EN CEREBRO Para llevar a cabo la cuantificación del ARN2 mediante PCR en tiempo real se eligieron 3 lotes de peces que coinciden con tres fases distintas de las curvas de mortalidad (Figura 6): (i) T1, que coincide con la fase inicial de la mortalidad (4-7 y 10-15 d.p.i. en baño e inyección intramuscular, respectivamente); T2, fase de estabilización de la mortalidad (10-14 y 20-25 d.p.i. en baño e inyección intramuscular, respectivamente); y (iii) T3, mortalidad de la fase final del experimento (15-21 y 35-40 d.p.i. en baño e inyección intramuscular, respectivamente). Todas las muestras analizadas pertenecen a peces muertos ya que ningún pez infectado sobrevivió a la infección. 3.2.1 Infección por baño El número de copias del ARN2 en todos los lotes analizados alcanzó valores de entre 109y 1010 copias de ARN2/g de tejido. El valor más alto se alcanzó en los peces infectados con la cepa tipo RGNNV, en la que se observó un incremento de más de 1 logaritmo desdelafase inicial de la curva de mortalidad (T1, 2,2 × 109copias/g) hasta la fase de estabilización (T2), momento en el que alcanzó su valor máximo (4,6 × 1010 copias de ARN2/g) (Figura 7.A). La carga viral de los lotes infectados con la cepa recombinante apenas registró cambios entre las distintas fases de la curva de mortalidad con valores de 2,3-3,1 × 109copias/g. En cuanto a la cepa SJNNV, se observó un ligero incremento (menor de un logaritmo) entre el número de copias de la fase inicial y la fase final (de 3,8 × 109a 1,7 × 1010). El genoma viral no se detectó en los grupos control. 3.2.2 Infección intramuscular Los valores de replicación obtenidos por inyección intramuscular fueron, en general, menores que los registrados en la infección por baño. El valor máximo se alcanzó, al igual que en el experimento anterior, en peces infectados con la cepa RGNNV. La carga viral en esta cepa se incrementó entre la fase inicial y la fase de estabilización pasando de 4,6 × 108 copias/g en T1 a 4,6 × 109copias/g en T2 (Figura 7.B).Mientras que en la fase final de la curva de mortalidad desciende ligeramente a 1,4 × 109copias/g. En los peces infectados con las cepas de cápside SJNNV se observó una evolución en el número de copias similar, ambas alcanzaron su valor máximo en la fase inicial de la infección (6,4 × 108copias/g en peces infectados con la cepa Ss160.03 y 4,7 × 108con la cepa SJNag93) para luego decrecer en las 73 Comparación de la susceptibilidad del lenguado senegalés a la cepa recombinante y genotipos parentales DISCUSIÓN4. Es este capítulo se ha estudiado la susceptibilidad del lenguado senegalés a la infección por tres cepas de betanodavirus: una cepa recombinante RGNNV/SJNNV (aislado Ss160.03) y dos cepas representantes de los genotipos parentales, SJNNV (SJNag93) y RGNNV (ERV378). Además se han utilizado dos rutas de infección distintas: exposición mediante baño, que es la que mejor refleja la infección en condiciones naturales, e inyección intramuscular, que asegura la administración de una dosis viral estandarizada. Los resultados obtenidos demostraron que el lenguado es muy susceptible a la infección por betanodavirus, ya que las tres cepas utilizadas causaron mortalidades del 100%. Sin embargo, en la infección por baño se observaron claras diferencias en las curvas de mortalidad acumulada en función de la cepa causante de la infección. Así, en los peces infectados con el aislado recombinante el pico de mortalidad se alcanzó mucho más rápidamente (a los 18 d.p.i.) que en los grupos infectados con las cepas de los genotipos RGNNV y SJNNV (a los 25 y 31 d.p.i., respectivamente). Por el contrario, en la infección intramuscular los resultados apenas mostraron diferencias entre los distintos aislados (36 d.p.i. en el grupo de peces infectados con la cepa recombinante frente a 38-41 d.p.i. en los otros grupos), lo que sugiere que las barreras externas del lenguado podrían ser un factor importante para controlar la infección por parte de cepas del genotipo RGNNV, al menos en los estados iniciales de la infección. Independientemente de la ruta de infección utilizada, la cepa recombinante Ss160.03 causó los signos clínicos más severos: fue capaz de causar mortalidad en el menor tiempo y presentó la menor diferencia entre el número de copias genómicas y el título viral. La comparación del número de copias de ARN2 en cerebro y el título viral obtenido a partir de lotes de peces muertos en distintos tiempos de la infección experimental (T1, T2 y T3), permitió observar la existencia de correlación entre el número de copias y el título viral (p<0,05), si bien se observaron grandes diferencias entre número de copias y título. Estas diferencias han sido descritas anteriormente por otros autores en virus humanos (Falsey y col., 2003; Garcia y col., 2001), en virus de peces (Hope y col., 2010; Purcell y col., 2006) y en virus de vertebrados superiores (Achenbach y col., 2004). En lubinas infectadas con betanodavirus se describieron diferencias de 1 a 4 logaritmos (Souto y col., 2015), y resultados similares se obtuvieron con 80 CAPÍTULO 1: Discusión virus respiratorio sincitial bovino (BRSV, Bovine Respiratory Syncytial Virus) (Achenbach y col., 2004), el virus de la fiebre del valle de Rift (RVFV, Rift Valley Fever Virus) (Garcia y col., 2001) y virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) (Purcell y col., 2006). Los resultados obtenidos en lenguado muestran diferencias del orden de 5-6 logaritmos, especialmente en los lotes de peces que se infectaron por baño e infectados con las cepas RGNNV y SJNNV. Existen diversas razones que pueden explicar este fenómeno. La desviación entre el número de copias y el título en el virus de la gripe aviar H5N1 (Dovas y col., 2010) se ha asociado a la inactivación del virus bajo las condiciones ambientales del agua. En el caso de los betanodavirus se sabe que tienen una gran capacidad de sobrevivir y permanecer infectivos durante largos periodos de tiempo bajo un amplio rango de condiciones ambientales (Frerichs y col., 2000), por lo tanto es improbable que el bajo número de partículas infectivas recuperadas respecto al número de copias detectado sea por inactivación del virus durante el proceso de análisis. Otra posibilidad es la pérdida de infectividad del virus en los tejidos de individuos muertos (Rosenbergova y col., 2009). Se sabe que los peces inmediatamente después de morir sufren una rápida autolisis de los tejidos, en concreto el cerebro es uno de los tejidos que antes sufre degradación. En esta infección experimental se realizó una recogida diaria de los peces muertos, por lo que el efecto sobre el virus de la degradación en los tejidos de los ejemplares muertos durante la noche o en momentos posteriores a su recogida puede ser un factor importante que no es posible evaluar. Esta degradación es más acusada en lo peces infectados por baño debido a su menor tamaño. Alternativamente, la gran diferencia encontrada podría deberse a una gran producción de partículas defectivas o a una sobreexpresión del ARN2 como se ha descrito en RVFV para el segmento S (Garcia y col., 2001) y en BRSV con el ARN F (Achenbach y col., 2004). En base a los resultados obtenidos la posible sobreexpresión del segmento ARN2 o la generación de partículas defectivas ocurrirían principalmente en los tejidos de peces infectados con las cepas RGNNV y SJNNV. Esto podría indicar una falta de eficacia en la producción de virus debido a una peor adaptación a la especie hospedadora. Para estudiar más en profundidad las posibles diferencias en el proceso de replicación entre las tres cepas, se llevó a cabo un análisis de replicación viral durante los diez primeros días de infección en diferentes órganos y tejidos del lenguado, incluyendo cerebro, piel, branquias y órganos internos. Se sabe que los betanodavirus son virus neurotrópicos (Munday y col., 2002) que replican preferentemente en cerebro y retina (Nguyen y col., 1996; Skliris y 81 Comparación de la susceptibilidad del lenguado senegalés a la cepa recombinante y genotipos parentales Richards, 1999), y que invaden el sistema nervioso a través de las conexiones sinápticas (Ikenaga y col., 2002). Nuestro análisis reveló que las cepas con cápside SJNNV alcanzaron el cerebro a las 24h (datos de detección del genoma viral por RT-qPCR) mientras que el virus RGNNV no se detectó hasta el día 4 p.i., lo que confirmaría la hipótesis de que la cepa RGNNV debe de encontrar algún tipo de barrera que le impida llegar al cerebro con la misma facilidad que las cepas con cápside SJNNV. Además, también se recuperaron partículas infectivas en cultivo celular a las 24 horas de infección en peces infectados con la cepa SJNNV, y a las 48h con la cepa recombinante. Ambas cepas mostraron una carga viral similar durante los primeros días de infección; sin embargo, mientras la producción de la cepa SJNNV se mantuvo constante durante los 10 días de infección, la cepa recombinante Ss160.03 incrementó su carga viral hasta superar las 109copias/g a día 10 p.i. y 3,2 u107 TCID50 g/pez. Es interesante señalar que aunque la cepa RGNNV fue la que tardó más tiempo en detectarse en el cerebro, una vez iniciada la replicación fue la que alcanzó el mayor número de copias y partículas infectivas transcurridos los 10 días de infección (aproximadamente 2 log más que la cepa recombinante). Estos resultados contrastan con los bajos títulos virales obtenidos a partir de los peces muertos infectados con esta cepa, especialmente a partir de la mitad de la curva de mortalidad. Aunque los datos en un caso se han obtenido de peces sacrificados (Análisis de la replicación en cerebro durante los primeros días de la infección) y en el otro de peces muertos (Análisis de mortalidad), de la comparación de ambos podría deducirse que la alta replicación inicial de la cepa tipo RGNNV decae a medida que avanza la infección, lo que explicaría que tarde más que la recombinante en causar el 100% de mortalidad. También observamos la replicación viral de las tres cepas en órganos internos, branquias y piel durante los 10 días de infección, en general, se obtuvieron valores entre 104 y 106copias de ARN1/g de tejido. Sin embargo, la detección de partículas infectivas fue más limitada. En las branquias se observó una mayor presencia de virus infectivo al inicio de la infección en las cepas ERV378 y SJNag93, en las que se recuperó el virus a las 24 y hasta las 48h, respectivamente, lo que sugiere una posible vía de entrada del virus. La presencia de betanodavirus en piel, aleta y branquias ha sido detectada previamente (Azad y col., 2006; Chi y col., 2001; Lopez-Jimena y col., 2011; Nguyen y col., 1997) y algunos autores han propuesto que las branquias y/o la piel podrían representar la vía de entrada en la infección horizontal en peces (Grotmol y col., 1997; Mézeth y col., 2007). No se recuperó virus 82 CAPÍTULO 1: Discusión infectivo en branquias en los lotes de peces infectados con la cepa Ss160.03 durante las 2448h, y se obtuvo un único re-aislamiento a día 3 p.i., por lo que la cepa recombinante no parece utilizar esta vía. En las muestras de piel sí se observó la presencia del virus infectivo en las tres cepas al inicio de la infección, 24 h (SJNNV), 24-48 h (recombinante) y los 3 primeros días (RGNNV). La presencia de virus replicante en piel ha sido previamente observada y se ha propuesto que el virus podría llegar a la médula a través de los nervios aferentes conectados a la piel para después distribuirse por el sistema nervioso (Nguyen y col., 1996), del mismo modo que se ha sugerido que el virus IPNV podría penetrar en el rodaballo a través de los poros sensoriales del sistema de la línea lateral (Novoa y col., 1995). La diferencias entre las tres cepas a nivel de la piel podrían deberse a que mientras que la cepa recombinante parece penetrar sólo a través de la piel, las cepas SJNNV y RGNNV también lo hacen a través de las branquias, por lo que no deberían necesitar un alto nivel de replicación en la piel (por eso la cepa SJNNV sólo se recupera el primer día). Sin embargo, la cepa RGNNV replica en la piel hasta el tercer día p.i., lo que podría deberse a que los viriones se encuentran con algún tipo de dificultad para penetrar a través de esta vía, lo que confirmaría nuestra hipótesis inicial. Por otro lado, se observó producción viral en piel en los tres grupos de peces infectados cuando la infección ya estaba establecida en el cerebro, a los 8, 9 y 10 d.p.i. Esta observación concuerda con un estudio realizado por Azad y col. (2006) en el que localizaron partículas virales en regiones de la musculatura en la base de las escamas, lo que identifican como una posible ruta de salida del virus al exterior. En órganos internos se recuperaron partículas infectivas de los tres genotipos en los últimos días de la infección, la cepa SJNNVmostró una mayor presencia en estos tejidos ya que la recuperación del virus infectivo se extendió a las 48 h.p.i. y al día 6 p.i. La presencia de partículas infectivas en órganos internos se podría explicar como resultado del secuestro de virus por parte de los mecanismos de defensa del pez +~VJD÷ \ FRO . Estos resultados coinciden con los obtenidos por otros autores que detectaron el virus replicando a baja concentración en vísceras y gónadas (Azad y col., 2006; Banu y col., 2007; Lopez-Jimena y col., 2011; Nguyen y col., 1997) En conclusión, los datos obtenidos demuestran que la cepa recombinante Ss160.03 es la cepa más eficaz infectando lenguados ya que llega al cerebro con celeridad, alcanzando unos altos niveles de replicación, y es la que causa signos clínicos más acusados y mortalidad más rápidamente tras una infección por baño, la ruta más parecida a la infección natural. 83 Comparación de la susceptibilidad del lenguado senegalés a la cepa recombinante y genotipos parentales Asimismo, es la más efectiva en la producción de partículas infectivas a lo largo de todo el proceso infeccioso, como lo demuestran los títulos virales obtenidos de peces muertos en cultivo celular, y también es la que presenta menor diferencia entre partículas infectivas recuperadas y número de copias de RNA2 detectadas en el cerebro. La cepa Ss160.03 presenta una cápside tipo SJNNV pero que contiene dos sustituciones aminoacídicas en la región C-terminal con respecto a la cepa SJNag93 (Olveira y col., 2009). Se sabe que un pequeño número de sustituciones aminoacídicas en la proteína de la cápside pueden tener efectos dramáticos en la especificidad de huésped de diferentes virus animales (Baranowski, 2001). La recombinación se ha asociado a la colonización de nuevas especies por betanodavirus (Olveira y col., 2009; Panzarin y col., 2012; Toffolo y col., 2007). Nuestros resultados apoyan que las sustituciones en el extremo C-terminal de la proteína de la cápside favorecen la infección del lenguado, y por lo tanto, que la recombinación ha facilitado la colonización de esta especie. 84 PAPER 1 1. Souto, S., Lopez-Jimena, B., Alonso, M. C., García-Rosado, E. & Bandín, I. Experimental susceptibility of European sea bass and Senegalese sole to different betanodavirus isolates. Vet. Microbiol. 177, 53–61 (2015). Doi:10.1016/j.vetmic.2015.02.030 CAPÍTULO 2: CARACTERIZACIÓN DE DETERMINANTES DE VIRULENCIA EN BETANODAVIRUS. In vitro and in vivo characterization of molecular determinants of virulence in reassortant betanodavirus. J. Gen. Virol. 96, 1287–1296 (2015). Caracterización de determinantes de virulencia en betanodavirus las que el extremo 5’ estaba íntegro, liberando un 5’ monofosfato y se unió un oligonucleótido adaptador, empleando la ligasa T4. Posteriormente se realizó la transcripción inversa empleando cebadores aleatorios. En el caso del extremo 3’, ambos ARNs fueron poliadenilados empleando una poli(A) polimerasa (Invitrogen). El ADNc se sintetizó empleando un oligonucleótido que contenía un adaptador y una cola de timinas como cebador de la transcripción inversa. En todos los casos la síntesis del ADNc de los extremos se realizó con la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina Moloney (M-MLV) según las indicaciones de la casa comercial (Tabla 3). La amplificación de cada extremo se llevó a cabo en hielo: en un volumen final de 50 μl se añadieron 5 μl de tampón I 10×, 1 μl del ADNc sintetizado, 0,2 μl de enzima AccuprimeTM taq DNA polymerase High Fidelity (Thermo Fisher Scientific), y 1 μl de cada cebador a una concentración de 10 μM. La amplificación de los fragmentos 5’ se realizó empleando un cebador proporcionado por la casa comercial, en el caso del cebador directo, y cebadores específicos de nuestra secuencia como reverso. El extremo 3’ se amplificó empleando un cebador proporcionado por la casa comercial (reverso) y un cebador específico del ARN viral (directo). Los cebadores específicos empleados son los 5’FchR1 y 3’FchR1 para el ARN1 y los 5’FchR2 y 3’FhcR2 para el ARN2 (Tabla 4). Finalmente se realizó el siguiente protocolo: desnaturalización inicial a 94 °C durante 1 min, seguido de 30 ciclos de 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y extensión a 68 °C 30 s. Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,2 % teñido con RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution. Tabla 3 Reacción de transcripción inversa para generar el ADN copia (ADNc) a partir de los segmento ARN virales empleando la enzima M-MLV y protocolo de incubación. RLM-RACE (Síntesis de ADNc) Cantidad Reactivos extremo 5’ extremo 3’ 1 μg RNA con adaptador 5’ RNA poliadenilado 4 μl dNTPs dNTPs 2 μl Cebadores aleatorios Adaptador 3’RACE 2 μl Tampón de RT 10× 1 μl M-MLV transcriptasa inversa 1 μl Inhibidor nucleasas Hasta 20 μl Agua libre de nucleasas Incubación a 42 °C durante 1 hora 104 CAPÍTULO 2: Materiales y métodos Para la extracción y prurificación de los fragmentos de PCR a partir del gel de agarosa se empleó el kit comercial NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel). Las bandas extraídas se incubaron con el tampón NT1 (200 μl de tampón por cada 100 mg de agarosa) en agitación a 50 °C durante 10 min para disolver completamente la agarosa. Una vez incubada la muestra se purificó por centrifugación a través de una columna suministrada por el fabricante (11.000 × g durante 30 s). Posteriormente se realizaron 2 lavados con 700 μlde tampón NT3 (previamente suplementado con etanol) seguidos de una centrifugación a 11.000 ×g y descartando el eluido. En el segundo lavado se realizó una centrifugación durante 2 min para eliminar completamente los residuos de etanol. Finalmente se realizó la elución con 30μl de agua libre de nucleasas. La concentración de ADN se determinó en un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 como se ha descrito previamente (capítulo 1, sección 2.4.4) y la especificidad de la banda extraída se analizó en un gel de agarosa al 1% utilizando el marcador GeneRuler™ 1 Kb ladder (Thermo Scientific). 2.2.2 Clonación de los extremos Los fragmentos de PCR obtenidos para cada extremo se insertaron en el plásmido pGEM®-T Easy Vector según las instrucciones del fabricante. Posteriormente se introdujo cada plásmido de clonación en células E. coli DH5Įrealizando una transformación por electroporación (Sambrook y Russell, 2001) (Ver apéndice A). Se seleccionaron 10 clones de cada extremo para secuenciar. Se sembró una colonia de cada clon en 2 ml de medio LB con ampicilina y se incubó en agitación durante un máximo de 16 horas. Posteriormente se realizó una extracción del plásmido empleando el kit comercial GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific): en primer lugar se realizó una centrifugación a 6.800 × g durante 2 min, se vació el medio completamente y se resuspendieron las células en el primer tampón. Posteriormente se añadió el tampón de lisis, invirtiendo el tubo de 4-5 veces para homogeneizar la muestra y se incubó un máximo de 5 minutos. Se añadieron 350 μl de tampón de neutralización para detener la lisis y se mezcló por inversión hasta conseguir una muestra de aspecto lechoso. Posteriormente, se realizó una centrifugación a 12.000 × g durante 5 min para separar los restos celulares de la muestra. Se recogió el sobrenadante con cuidado para no arrastrar la fase blanquecina, se cargó en una columna de purificación suministrada por el fabricante y se centrifugó. Se realizaron 2 lavados añadiendo 500 μl de tampón de lavado seguido de una centrifugación a 12.000 × g. La última 105 Caracterización de determinantes de virulencia en betanodavirus centrifugación se realizó durante 2 min para secar completamente la membrana. El plásmido purificado se eluyó con 50 μl de agua libre de nucleasas. Tabla 4 Relación de cebadores empleados en el sistema de genética inversa Cebador Secuencia (5’Æ Æ 3’) Posición Cebadores RACE RNA1# RNA2* 5’FchR1 GGTGTTATGTGCTCGCGGCTCTTT 1448-1425 3’FchR1 GCAAAGAGCCGCGAGCACATAACACC 1423-1448 5’FchR2 GGCGACGACTGCACCACGAG 458-477 3’FchR2 TTGAGACACCTGAGGACACCACCGCT 662-687 Cebadores para la amplificación completa de los segmentos virales 5T7R1 GGATCCCCGCGGTAATACGACTCACTATAGGTAACATCACCTTCTTGCTCTG 5’RNA1 5T7R2 GGATCCCCGCGGTAATACGACTCACTATAGGTAATCTAACACCGCTTTGCAAG 5’RNA2 3NaeR1 GCCGGCCGAAGCGTAAGACAGCATAAAGC 3’RNA1 3NaeR2 GCCGGCCGAGTATTGTAGCGATCAGCGGCC 3’RNA2 Cebadores para la eliminación de dianas de NaeI RNA1# RNA2* MutNaeR1 CATTTGGTGCCGATTGCGGGCACTGGCCGTCCC 1483-1515 - MutNae1R2 GCGATTGACGTCACCTGGCCGCCTGGTACTCCTGTGTG - 552-589 MutNae2R2 CCACGGCAAATCTTGCTGCCCGCTGGCACGCTCTTCACCC - 991-1030 Cebadores para revertir cambios en el extremo 3’ 3RevR1 CATTTGGTGCCGATTGCGGGCACTGGCCGTCCC 3’RNA1 3RevR2 GCGATTGACGTCACCTGGCCGCCTGGTACTCCTGTGTG 3’RNA2 Posición respecto a la secuencia de la cepa SpSs-IAusc160.03 con número de acceso en GenBank #FJ803911 y *FJ803923 2.2.3 Secuenciación de los extremos. Antes de proceder a la secuenciación de los fragmentos se realizó una estimación de la concentración de ADN plasmídico en un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Ver capítulo 1, sección 2.4.4). En la reacción de secuenciación se utilizaron de 0,5 a 10 μl de muestra en función de la concentración de partida, teniendo en cuenta que la ratio cebador y ADN debe ser mayor o igual que 40:1 y que para ADN plasmídico la cantidad de ADN molde debe estar entre 50-100 fmol. Se utilizó 1 μl de cebador a una concentración de 0,05 μM (Tabla 5), 2 μl de DTCS Quick Start Master Mix (Beckman Coulter),y 1,5 μl de tampón de secuenciación (GenomeLabTM), por último se añadió agua destilada hasta ajustar un volumen final de 20 μl. La reacción se llevó a cabo en un termociclador MyCyclerTM (Bio-Rad), se realizó un primer paso de desnaturalización a 95° C durante 1 minuto seguido de 30 ciclos de amplificación que incluían 20 segundos a 96° C, una hibridación a 50° C durante 20 segundos y una fase de elongación durante 4 minutos a 60 °C. Finalmente se mantuvo a 4° C. El producto de la amplificación se purificó mediante precipitación con etanol. En primer lugar a los 20 μl de 106 CAPÍTULO 2: Materiales y métodos reacción se le añadieron 5 μl de una solución formada por: 2 μl de acetato de sodio 3 M, 2 μl de Na2-EDTA 100 mM (pH 8.0) y 1 μl de 20 mg/ml de glicógeno. Se mezcló y se añadió a un vial de 1,5 ml junto con 60 μl de etanol al 95% a -20 °C, se agitó vigorosamente y se centrifugó a 16.000 × g a 4° C durante 15 minutos. Posteriormente se retiró todo el sobrenadante y se realizaron dos lavados del ADN precipitado con 200 μl de etanol al 70% a -20 °C. En cada lavado se centrifugó a 16.000 × g a 4 °C durante 2 minutos. Después de centrifugar se retiró cuidadosamente todo el sobrenadante. Para eliminar los restos de etanol se introdujo en una bomba de vacío Speed Vac (Savant) hasta que la muestra se secó completamente. Por último, se resuspendió en 40 μl de solución de carga SLS (Beckman Coulter). Después de incubar las muestras durante 1 minuto a 92° C se transfirieron a una placa de secuenciación y se añadió una gota de aceite mineral a cada pocillo. La secuenciación de los fragmentos se llevó a cabo usando CEQTM 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter). La reacción de secuenciación se realizó en ambos sentidos y por duplicado. Para el ensamblaje y análisis de las secuencias se usaron los programas SeqMan II yEditSeq, incluidos en el paquete DNASTAR Lasergene v.7.2. El alineamiento de las secuencias se realizó utilizando el programa MegAlign. 107 Caracterización de determinantes de virulencia en betanodavirus Tabla 5 Relación de cebadores empleados para la detección y secuenciación de la cepa wSs160.30 y los virus recombinantes derivados (rSs160.03). Cebador Secuencia (5’Æ Æ 3’) Posición RNA 1# Posición RNA2* Fragmento (pb) Cebadores para secuenciación completa del ARN1 Nod1BR1F CGCAAGGTTACCGTTTAGC 37-55 669 Nod1BR1R CATGGTATCCTGGTTGTAGTTCC 683-705 Nod1BR2F CAAGTACTGTGTCCGGAGAGGTTA 581-604 669 Nod1BR2R GAGCAAGATCGCCAGGTTTATG 1228-1249 Nod1BR3F AACATCCGCACTGCATACGAACTG 1090-1113 651 Nod1BR3R ATGCTGGAGAACACTGGCTTTGAA 1717-1740 Nod1BR4F AATGCCCCAAATTATCCCAGGAAC 1639-1662 800 Nod1BR4R GCCCGGCACCAATGACCAATAAAA 2415-2438 Nod1BR5F CGACATTGGCTGGGCTAAGACACA 2361-2384 744 Nod1BR5R GCCGAAGCGTAAGACAGCATAAAG 3081-3104 Cebadores para secuenciación completa del ARN2 (Olveira y col. 2009) NNVs2_1f AAGTCAAAATGGTACGCAAAGGTG 20–43 527 NNVs2_1r CTTCCCGGTTGAGGTCCAGAGA 525–546 NNVs2_2f GCTTCCTGCCTGATCCAACTGA 404–425 568 NNVs2_2r GGCGCCCCAACTGTGAATGTCT 950–971 NNVs2_3f CGGTTACACTGGATTTCGTTC 732–752 655 NNVs2_3r ACATGGCGGTGGTGCTC 1370–1386 Cebadores específicos del plásmido pGEM-T M13F GTTTTCCCAGTCACGAC M13R CAGGAAACAGCTATGAC Cebadores específicos para la identificación del virus F7aATATCACGATGAGTTCACTA 1584-1603 642 R7aCGATTCACTATTTTCAAGTC 2206-2225 F2 b CGTGTCAGTCATGTGTCGCT 615-634 427 R3bCGAGTCAACACGGGTGAAGA 1022-1041 Posición respecto a la secuencia de la cepa SpSs-IAusc160.03 con número de acceso en GenBank #FJ803911 y *FJ803923. aNévarez y col. (2005); bNishizawa y col. (1994) 108 CAPÍTULO 2: Materiales y métodos 2.3 CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDOS 2.3.1 Amplificación de segmentos virales completos En base a la secuencia completa de los extremos de la cepa Ss160.03 se diseñaron cebadores que hibridaran los con extremos 5’ y 3’ de los segmentos ARN1 y ARN2. A partir de virus semipurificado (Ver apéndice B) se obtuvo el ADNc de ambos segmentos virales (ARN1 y ARN2) empleando el kit SuperScriptTM III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Posteriormente se realizó una amplificación de los segmentos virales completos empleando la enzima Platinum® Pfx DNA Polymerase (Ivitrogen), una polimerasa de alta fidelidad de copia. Se preparó en hielo la siguiente mezcla de reacción: 5 μl de tampón pfx 10×, 1,5 μl de mezcla de dNTPs, 1 μl de MgSO4, 1,5 μl de mezcla de cebadores (10 μM cada uno), 2 μl de ADNc y 0,4 μl de enzima Platinum pfx, añadiendo agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 50 μl. La amplificación se llevó a cabo con una desnaturalización inicial a 94 °C durante 1 min, seguido de 25 ciclos de 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y extensión a 68 °C 30 s. Como cebadores 5’ se diseñaron unos oligonucleótidos que contenían una diana para la enzima SacII seguida de la secuencia del promotor T7 fusionada con el extremo 5’ de los segmentos virales (cebadores T7R1 y T7R2), (Tabla 4).Además se añadieron 2 guaninas entre el promotor T7 y el extremo 5’ que se ha visto que favorecen la transcripción (Takizawa y col., 2008b). Los cebadores del extremo 3’ (3NaeR1 y 3NaeR2) se diseñaron incluyendo las secuencias del extremos 3’ con un nucleótido modificado que permitió la introducción de una diana de restricción NaeI, enzima que proporciona extremos romos. Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,2 % teñido con RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution. Las bandas obtenidas se purificaron a partir del gel (apartado 2.2.1.) y se insertaron en el vector de clonación de extremos romos pJET1.2 empleando para ello el kit CloneJET PCR Cloning (Thermo Scientific) siguiendo las recomendaciones del fabricante, dando lugar a los plásmidos denominados pJetRNA1 y pJet RNA2. Se realizó la secuenciación completa de los segmentos virales insertados en los vectores de clonación para comprobar que la secuencia era fiel a la original (depositada en el GenBank) empleando la batería de cebadores descritos en la Tabla 5. Se realizó un cultivo en medio LB con ampicilina y posterior purificación de los plásmidos, que se conservaron a -80 °C hasta su uso. 109 Caracterización de determinantes de virulencia en betanodavirus 2.3.2 Mutagénesis dirigida La mutagénesis dirigida se realizó empleando el kit comercial QuikChange Multi SiteDirected Mutagenesis (Agilent Technologies). Con la intención de eliminar las dianas de restricción para NaeI presentes en el interior de las secuencias (1 en ARN1 y 2 en ARN2 se emplearon los cebadores (MutNaeR1, MutNae1R2 y MutNae2R2, Tabla 4) que contiene un nucleótido sustituido que introducen mutaciones silenciosas puntuales de manera que se eliminan la diana de restricción sin alterar la secuencia codificante. Estas mutaciones se revertieron al final de la construcción del plásmido de expresión empleando los cebadores 3RevR1 y 3RevR2 (Tabla 4). Las reacciones de mutagénesis se realizaron utilizando como molde los plásmidos purificados pJetRNA1 y pJetRNA2. La síntesis de los plásmidos mutados se realiza en una reacción de PCR empleando la enzima PfuTurbo (Tabla 6). Tabla 6. Procedimiento de mutagénesis dirigida empleando el kit comercial Multi Site-Directed Mutagenesis. Mutagénesis dirigida Reactivo pJetRNA1 (>5Kb) pJetRNA2(<5Kb) 10× Tampón QuikChange 2,5 μl 2,5 μl Plásmido 100 ng 50 ng Cebadores mutagénicos# 100 ng 100 ng Mezcla de dNTPs 1 μl 1 μl Enzima PfuTurbo 1 μl Agua libre de nucleasas Hasta 25 μl Protocolo: Desnaturalización inicial a 95°C durante 1 min, seguido de 30 ciclos de 95 °C durante 1 min, 55 °C durante 1 min y extensión a 65 °C 2 min/Kb del plásmido. #Cebadores MutNaeR1, MutNae1R2 y MutNae2R2 (Tabla 4). Una vez realizada la PCR se incubó el producto con la enzima de restricción Dpn I durante 1 hora a 37 °C. Esta enzima de restricción tiene la diana para la secuencia 5´-Gm6ATC-3´, y por tanto digiere específicamente las cadenas que contienen metilaciones. El ADN producido en E. coli generalmente contiene estas secuencias por lo que se producirá la digestión de las cadenas parentales metiladas o de las cadenas hemimetiladas, que se corresponden con las 110 CAPÍTULO 2: Materiales y métodos cadenas que no contienen las mutaciones o mezcla de cadenas con y sin mutaciones, respectivamente; mientras que las cadenas que contienen las mutaciones, sintetizadas por la PfuTurbo DNA polimerasa suministrada en el kit, permanecerán intactas. Posteriormente, empleando 1,5 μl de cada plásmido mutado (pJetR1MutNae y pJetR2MutNae) se realizó la transformación de células E. coli por electroporación (ver apartado 2.2.2.y apéndice A). Una vez obtenidos los clones se secuenciaron para comprobar la existencia de las mutaciones deseadas. Finalmente se realizó un nuevo cultivo y purificación de los plásmidos que se conservaron a -80 °C hasta su uso. 2.3.3 Construcción de pBS160R1 y pBS160R2 El plásmido de expresión pBSįRiboT7t, cedido por el Dr. Brémont (Biacchesi y col., 2000), se utilizó para la expresión de los dos segmentos genómicos de la cepa SpSsIAusc160.03. Este plásmido contiene una secuencia antigenómica de una ribozima derivada del virus de la hepatitis į+'9TXHSHUPLWHFRUWDUORVVHJPHQWRVGH$51REWHQLGRVHQHO momento de la transcripción inmediatamente en el extremo 3’ viral, es decir, no se producirán segmentos con nucleótidos adicionales en 3’. La secuencia de la ribozima se encuentra flanqueada en su extremo 5’ por una diana de restricción de SmaI y a continuación de su extremo 3’ la secuencia de T7 terminadora (Figura 9). 2.3.3.1 /LQHDUL]DFLyQGHOS%6į5LER7W Para la linearización del plásmido se realizó una digestión con las enzimas SacII (diana de UHVWULFFLyQ&&*&Ļ**\SmaI (diana GHUHVWULFFLyQ&&&Ļ***/DGLJHVWLyQVHUHDOL]yHQ dos partes. En primer lugar el ADN plasmídico (6 μg) se incubó en presencia de 40 U de SmaI y 5 μl de tampón 10× (33 mM Tris-acetato, pH 7,9 a 37°C, 10 mM acetato de magnesio, 66 mM acetato de potasio, 0,1 mg/ml BSA) en un volumen total de 50 μl durante 1 hora y media a 30 °C. Posteriormente, se añadieron a la reacción de digestión 40 U de la enzima SacII y se dejó incubar una hora y media a 37 °C. Una vez realizada la digestión se purificó el ADN linearizado en una columna de purificación de ADN del kit QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), añadiendo 3 volúmenes de tampón PB. Seguidamente se realizaron 2 lavados con 750 μl de tampón PE, se centrifugó, se descartó el eluido y se resuspendió la muestra en 44 μl de agua libre de nucleasas. Por último para evitar la recircularización del 111 Caracterización de determinantes de virulencia en betanodavirus plásmido purificado se incubó con 1 μl de fosfatasa alcalina intestinal bovina (CIAP) (Promega) y 5 μl de tampón 10× durante 45 minutos a 37 °C. La enzima se inactivó a 80 °C durante 20 minutos. Finalmente el plásmido linearizado se guardó a -80 °C hasta su uso. 2.3.3.2 Liberación del inserto En primer lugar se liberaron los segmentos genómicos del virus a partir de los plásmidos de clonación pJetR1MutNae y pJetR2MutNae. Para ello se incubaron: 10 μg de cada ADN plasmídico con 30 U de la enzima SacII, 20 U de NaeI *&&Ļ**&, 5 μl de tampón 10× y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 50 μl a 37 °C durante 3 horas. Una vez trascurrido el tiempo de incubación se cargó en un gel de electroforesis de agarosa al 1,2 % y se recuperó el inserto. Se purificó empleado el kit de purificación de bandas de agarosa QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), para ello se recortó la banda correspondiente al tamaño del inserto. Se añadieron 3 volúmenes de tampón QG y se incubó durante 10 minutos a 50 °C. Una vez disuelto el gel se le añadió 1 ml de isopropanol y se cargó en la columna de purificación. Se hizo pasar la muestra a través de la membrana por centrifugación y se descartó el eluido. Se realizó un primer lavado con el tampón QC y posteriormente dos lavados con el tampón PE. Se descartó el eluido y finalmente se resuspendió el ADN en 30 μl de agua libre de nucleasas. El ADN copia del ARN1 y ARN2 de la cepa Ss160.03 se insertó en su correspondiente plásmido de expresión (Figura 9). Para ello se incubaron el vector (pBSįRiboT7t) y los fragmentos purificados en una ratio molar 1:3 (vector:inserto) en presencia de 1 μl de tampón 1×, 1 μl de enzima T4 ligasa (Promega) y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 10 μl durante aproximadamente 18 horas a 15 °C. 2.3.3.3 Clonación y preparación del plásmido Las ligaciones se clonaron en células competentes E. coli TG1 mediante choque térmico. Para ello se añadieron 5 μl de producto de ligación a las células TG1 en hielo y se dejaron incubar durante 1 h. Posteriormente se realizó un choque térmico de 55 s a 42 °C y se devolvieron rápidamente al hielo. Una vez que la temperatura descendió se le añadieron 250 μl de medio LB, y las bacterias se incubaron a 37°C durante 1 h en agitación para su recuperación, y se continuó con el procedimiento de clonación descrito anteriormente. Se seleccionaron al menos 5 clones de cada segmento y se secuenciaron completamente para confirmar la existencia de una copia exacta del genoma viral empleando los cebadores 112 CAPÍTULO 2: Materiales y métodos descritos en la Tabla 5. Los clones seleccionados se utilizaron para producir masivamente los plásmidos de expresión pBS160R1 y pBS160R2, que se purificaron con el kit comercial NucleoBond® PC-500 (Macherey-Nagel). Brevemente, se realizó un inóculo a partir de una colonia de los clones seleccionados en 250 ml de medio LB con ampicilina (100 μg/ml) y se incubó un máximo de 16 h. Se centrifugó a 5.000 × g durante 15 min a 4 °C y el sedimento bacteriano se resuspendió en 12 ml de tampón S1 suplementado con ARNasa A. Se le añadieron 12 ml de tampón de lisis S2 mezclando por inversión y se incubó a temperatura ambiente un máximo de 5 min. Posteriormente, se añadieron 12 ml de tampón de neutralización a 4 °C. Se observó una turbidez blanca al precipitar las proteínas y el DNA cromosómico, la muestra se pasó por un filtro de papel y se dejó decantar. Inmediatamente se pasó la fase acuosa por una columna de extracción de gran capacidad previamente equilibrada. Seguidamente se dejaron pasar por gravedad a través de la columna 32 ml del tampón N3 para lavar los restos no deseados retenidos en la misma. Se realizó la elución de los ácidos nucleicos añadiendo 5 ml del tampón N5, el eluido se recogió en un tubo de centrifugación, donde se realizó la precipitación del ADN añadiendo 11 ml de isopropanol a temperatura ambiente, y se centrifugó a 15.000 × g. Posteriormente se realizó un lavado del sedimento con 5 ml de etanol a -20 °C seguido de una nueva centrifugación. Se retiró el sobrenadante y se dejó secar completamente el precipitado. Finalmente se resuspendió el precipitado y se ajustó la concentración para obtener una solución stock de 1 μg/μl que se almacenó a -80 °C hasta su uso. 2.4 TRANSFECCIÓN EN CÉLULAS BSR-T7/5 Un día antes de realizar la transfección se preparó una placa de 6 pocillos añadiendo 106células/pocillo necesarias para obtener un tapiz confluente en 24 h. La transfección se realizó añadiendo 1 μg de cada plásmido de expresión (pBS160R1 y pBS160R2) empleando como agente transfectante Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Se prepararon 2 tubos de cristal con 125 μl de medio Opti-MEM (Gibco), a un tubo se le añadió 1 μg de cada plásmido de expresión (2 μg totales) al otro tubo se le añadió la lipofectamina (6 μl). Se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transcurridos los 5 minutos se mezclaron ambas soluciones y se incubaron otros 20 minutos. El complejo se añadió gota a gota a un pocillo de células BSRT7/5 con 1 ml de medio DMEM sin antibiótico, repartiendo la solución por todo el área del pocillo. Al mismo tiempo, y siguiendo el mismo procedimiento, se realizó una 113 Caracterización de determinantes de virulencia en betanodavirus Figura 9 Construcción de plásmidos y sistema de genética inversa. La secuencia completa del ADN copia del ARN1 y ARN2 de la cepa Ss160.03 se amplificó añadiendo el promotor T7 al extremo 5’y un lugar de corte en el extremo 3’ (diana para la enzima NaeI). Ambos segmentos se insertaron en VHQGRVSOiVPLGRVS%6š5LER7WXVDQGRORVVLWLRVGHUHVWULFFLyQGHSacII,NaeI ySmaI, de manera que el extremo 3’ de ambos segmentos se fusionó a la secuencia de la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV) seguida de la secuencia terminadora de T7. Los virus recombinantes se recuperaron de las células BSRT7/5 transfectadas con 1 μg de pBS160R1 y 1 μg pBS160R2 (pBSR2247, pBSR2270, pBSR2247+270) empleando lipofectamina (Ver Material y métodos). 120 CAPÍTULO 2: Resultados RESULTADOS3. 3.1 CONSTRUCCIÓN DE ADNC La secuencia de los extremos genómicos de la cepa Ss160.03, obtenidos empleando la técnica de 5’ y 3’ RACE, completaron las secuencias codificantes descritas en un trabajo anterior (Olveira y col., 2009) y se depositaron en la base de datos GenBank con número de acceso FJ803911 y FJ803923. Al segmento de la polimerasa, ARN1, se añadieron 3 nucleótidos (nt) al extremo 5’ y 37 nt en el extremo 3’. En el ARN2, se añadieron 22 nt y 37 nt en los extremos 5’ y 3’, respectivamente. Se realizó un análisis de la secuencia obtenida comparando cada segmento con la secuencia tipo de su genotipo correspondiente. Así, se comparó el ARN1 con la secuencia completa de una cepa tipo RGNNV, la cepa SGWak97 (Núm. Acc. NC_008040) y el ARN2 se comparó con la cepa SJNag93 de genotipo SJNNV (Núm. Acc. AB056572). No se observaron diferencias nucleotídicas en las secuencias obtenidas del extremo 5’ en el ARN1 o ARN2. Por el contrario, en el extremo 3’ sí observamos polimorfismo en varias posiciones. En el ARN1 se encontraron diferencias en los nucleótidos 3073, donde aparece una citosina en vez de una timina, y en la posición 3093, donde hay una timina en vez de una citosina. En el ARN2 se observaron 2 diferencias; una de ellas en el nucleótido 1408, en el que hay una timina, en vez de una citosina, y el nucleótido 1411 donde encontramos una adenina en vez de una timina. Destaca la posición 3093, ya que la secuencia de la cepa Ss160.03 contiene una timina que difiere de las cepas SJNag93 y SGWak97, en las que hay una citosina (Figura 10). Siguiendo el procedimiento descrito en material y métodos se obtuvo el ADNc de cada segmento viral completo. Estos segmentos se clonaron en el plásmido pBSįRiboT7t obteniendo los plásmidos de expresión pBS160R1 y pBS160R2 cuya secuencia es idéntica a la secuencia publicada de la cepa Ss160.03. La )igura 9 representa el proceso de genética inversa seguido. 121 Caracterización de determinantes de virulencia en betanodavirus Figura 10 Alineamiento de las secuencias 3’ obtenidas por RACE. Las secuencias del ARN1 están alineadas con la cepa SGWak97 (cepa de tipo RGNNV, núm. acc. NC_008040) y la secuencia de la cepa SJNag93 (cepa de tipo SJNNV, núm. de acc. AB056571). El extremo 3’ del ARN2 se comparó con la cepa SJNag93 (núm. acc. AB056572) y la cepa SGWak97 (núm. de acc. NC_008041). Los nucleótidos señalados con un recuadro azul difieren de la secuencia de referencia (la SGWak97 para el ARN1 y la secuencia SJNag93 del ARN2). En rojo las posiciones 3073 y 1408 en las que se observa homología con las secuencias de las cepas SJ93Nag y SGWak97, respectivamente. 3.2 RECUPERACIÓN DE VIRUS RECOMBINANTES Los virus recombinantes derivados de la cepa rSs160.03 se recuperaron a partir de las células BSRT7/5 transfectadas con el plásmido pBS160R1 que contiene el segmento 1 de betanodavirus junto con los plásmidos del segmento 2 (pBS160R2 o pBS160R2_247 o pBS160R2_270 o pBS160R2_247+270). El sobrenadante de las células transfectadas se inoculó en las células E-11, y transcurridas 48h se comprobó el éxito del proceso mediante inmunofluorescencia indirecta (Figura 1.A-B). Después de dos pases en E-11 se realizó la confirmación mediante RT-PCR, obteniéndose la banda esperada de 427 pb con los cebadores F2R3, (Figura 1.C). Como control se realizó una reacción omitiendo la RT para verificar que no quedaban restos de ADN plasmídico, además el ARN extraído se trató con ADNasa. Por último, se secuenciaron los virus recuperados confirmando su identidad y la presencia de las mutaciones deseadas en los recombinantes rSs160.03247, rSs160.03270, rSs160.03247+270. (Figura 1). 122 CAPÍTULO 2: Resultados Figura 1Mutaciones puntuales introducidas en la secuencia codificante del ARN2 en los virus recombinantes rSs160.03. Los electroferogramas muestran la secuencia obtenida en de los tres virus recombinantes rSs160.03247, rSs160.03270, rSs160.03247+270 La posición de los nucleótidos corresponde a la secuencia de Ss160.03 (FJ803923). Las cajas señalan las posiciones en las que se realizó la mutación y los asteriscos el nucleótido mutados. La mutagénesis realizada implica el cambio de residuos en dos posiciones aminoacídicas (247 y 270) para incorporar los aminoácidos presentes en la cepa SJNag93 (Núm. Acc. AB056572). En este proceso un único cambio nucleotídico conlleva la sustitución de un aminoácido, de tal forma que el cambio en la posición 766 hace que el triplete TCG se modifique a GCG lo que implica un cambio de serina a alanina en la posición 247 de la secuencia proteica de la cápside. Igualmente, el cambio en la posición 836 de la secuencia nucleotídica, provoca que el triplete AGT se transforme a AAT y la sustitución de la serina por una asparagina como residuo 270 de la cápside. Los títulos virales obtenidos en el pase 2 (P2) en E-11 fueron los siguientes: 1,8 × 108 TCID50/ml con la cepa rSs160.03247, y 3,2 × 107TCID50/ml para las cepas rSs160.03270 y rSs160.03247+270. La cepa recombinante rSs160.3 alcanzó el título más alto, 1,8 × 10 9 TCID50/ml. Además, se observó que la cinética de crecimiento del virus rSs160.03 era muy similar al de la cepa salvaje después de una infección a una MOI de 0,1 en células E-11 (Figura 1). 123 Caracterización de determinantes de virulencia en betanodavirus Figura 1Cinética de crecimiento del virus rSs160.03 recuperado en el 2ºpase de E-11 y comparación con la cepa salvaje wSs160.03. Las células E-11 se infectaron con los virus rSs160.03 (cruz) y wSs160.03 (asterisco) con una MOI de 0.1. Se recogieron alícuotas en los tiempos indicados y se titularon por duplicado. Los datos representan la media y la desviación estándar de dos infecciones. 124 CAPÍTULO 2: Resultados Figura 1Confirmación de la recuperación de virus rSs160.03. Inmunofluorescencia de los pocillos tratados con anticuerpos monoclonales dirigidos a la cápside de betanodavirus en células E-11. A) Células E-11 a las 48 h de la infección en el primer pase. B) inmunofluorescencia de las células infectadas. Verde: virus marcados con FITC en células infectadas. Azul: núcleos marcados con DAPI. C) Visualización en el gel de agarosa de los productos de RT-PCR y PCR obtenidos de la extracción de ARN en el segundo pase en E-11 infectadas con rSs160.03. Línea 1: RT-PCR del ARN tratado con ADNasa. Línea 2: control negativo con agua DEPC. Línea 3: control positivo de RT-PCR con la cepa wSs160.3. Línea 4: PCR omitiendo la transcipción inversa. D) Control de transfección. Células BSRT7/5 transfectadas con un plásmido que expresa una proteína de membrana. Las células con fluorescencia representan el porcentaje de células transfectadas utilizando la Lipofectamina2000. 125 Caracterización de determinantes de virulencia en betanodavirus 3.3 CURVAS DE CRECIMIENTO IN VITRO DE LOS VIRUS RECOMBINANTES La replicación después de 24 horas de infección en E-11 fue similar en todas las cepas (Figura 14). Después de las 48 horas, se observó una diferencia de 1 logaritmo entre el título de la cepa rSS160.03247+270 y la cepa rSs160.03. En el tercer día de la infección, la diferencia entre estas dos cepas se redujo. Finalmente y después de 7 días de infección no se encontraron diferencias entre los títulos de las cuatro cepas, alcanzando un valor de 107 TCID50/ml. Tampoco se observaron diferencias en el desarrollo del efecto citopático entre las cepas. Figura 14 Cinética de replicación de la cepa wSs160.03 (virus salvaje) y los virus recombinantes con o sin mutaciones generados mediante un sistema de genética inversa. Las células E-11 se infectaron con los virus rSs160.03247 (rombo),rSs160.03270 (cuadrado),rSs160.03247+270 (triángulo), rSs160.03 (cruz) y wSs160.03 (asterisco) con una MOI de 0.01. Se recogieron alícuotas en los tiempos indicados y se titularon por duplicado. Los datos representan la media y desviación estándar (DS) de dos infecciones. 3.4 COMPARACIÓN DE LA VIRULENCIA IN VIVO ENTRE LA CEPA SALVAJE Y LA CEPA RECOMBINANTE rSS160.03 Los peces empezaron a morir 5 días después de la infección en el grupo de peces infectados con la cepa salvaje wSs160.03 (Figura 15), mientras que en el grupo infectado con la cepa recombinante rSs160.03 el inicio de la mortalidad se retrasó hasta el día 11. Sin 126 CAPÍTULO 2: Resultados embargo, al final del experimento, a día 30, la tasa de mortalidad en los dos grupos alcanzó el 100%. Se pudo observar un comportamiento anormal y pérdida de apetito en ambos grupos de peces desde los primeros días de la infección hasta el final del experimento. El análisis estadístico mostró que no existían diferencias significativas entre la virulencia de la cepa salvaje y la cepa recombinante (p>0,05). Figura 15 Curva de mortalidad acumulada causada por el virus wSs160.03 y el rSs160.03. Se infectaron juveniles de lenguado en un baño con una concentración viral de 105TCID50/ml con la cepa wSs160.03 (cruz) y la cepa recuperada del sistema de genética inversa e idéntica a la original (rSs160.03, asterisco) a 22 °C. 3.5 COMPARACIÓN DE LA VIRULENCIA ENTRE LA CEPA SALVAJE Y LOS RECOMBINANTES CON MUTACIONES PUNTUALES La mortalidad se inició en todos los grupos de peces infectados entre los 2 y 4 días después de la infección. Al final del experimento, a los 35 días, la mortalidad acumulada de la cepa salvaje (wSs160.03) alcanzó el 100%, mientras en los grupos de peces infectados con las cepas recombinantes rSs160.03247, rSs160.03270 y rSs160.03247+270 aproximadamente el 40% de los peces sobrevivió a la infección (Figura 16). En todos los grupos se observaron signos clínicos característicos de la infección por betanodavirus, como son la pérdida de apetito y natación anormal. Estos signos se observaron durante todo el experimento en los grupos infectados con la cepa wSs160.03, mientras que en los grupos infectados con las tres cepas recombinantes sólo se observaron durante los 15-20 primeros días de la infección, fase aguda 127 Caracterización de determinantes de virulencia en betanodavirus de la mortalidad, y los peces supervivientes no mostraron signos externos de patología. Los peces control no mostraron ningún signo de patología y tampoco se registraron bajas entre ellos. El virus se detectó por RT-PCR y se aisló en cultivo celular a partir de todos los grupos de peces analizados, tanto peces muertos como supervivientes, con la única excepción de los peces utilizados como control negativo. Las secuencias nucleotídicas de los productos de PCR confirmaron la existencia de las mutaciones en el ARN2 de los virus recombinantes recuperados de los peces. El análisis estadístico de las curvas de mortalidad reveló que las curvas de cada cepa recombinante mostraba diferencias significativas respecto a la de la cepa salvaje wSs160.03 (p<0.002). Sin embargo, no se observaron deferencias significativas de virulencia entre la cepas mutantes rSs160.03247, rSs160.03270 yrSs160.03247+270 (p>0,05). Figura 16 Curva de mortalidad acumulada causada por el virus wSs160.03 y los virus recombinantes con mutaciones puntuales Se infectaron juveniles de lenguado en un baño con una concentración viral de 105TCID50/ml con las cepas wSs160.03 (cruz) y los virus rSs160.03247 (rombo),rSs160.03270 (cuadrado),rSs160.03247+270 (triángulo) generados a través de un sistema de genética inversa a 22 °C. Los datos representa la media y la desviación estándar de dos réplicas. 128 CAPÍTULO 2: Resultados 3.6 CARGA VIRAL EN EL CEREBRO DURANTE LOS PRIMEROS DÍAS DE INFECCIÓN Se realizó una tercera infección experimental para conocer la capacidad que tenían las distintas cepas para alcanzar el cerebro y replicar su genoma durante los primeros días de la infección (del día 1 al 10 post-infección). Las cuatro cepas (wSs160.03, rSs160.03247, rSs160.03270 y rSs160.03247+270) se detectaron en el cerebro por RT-qPCR desde las 24h posteriores a la infección (Figura 17). Durante los primeros 5 días de la infección en todos los grupos se observó una carga viral muy similar. Sin embargo, a partir del sexto día, el número de copias de genoma viral en el cerebro de los peces infectados con la cepa wSs160.03 fue claramente superior al registrado en los peces infectados con las cepas recombinantes con mutaciones. Así, mientras a día 6 post-infección esta diferencia era de 1 logaritmo entre la cepa wSs160.03 y las cepas rSs160.03247 y rSs160.03270, a día 10 post-infección, la diferencia se incrementó a más de 2 logaritmos con la cepa rSs160.03270. Figura 17 Replicación de la cepa wSs160.03 (cruz) y los recombinantes con mutaciones, rSs160.03247 (rombo),rSs160.03270 (cuadrado),rSs160.03247+270 (triángulo) en cerebro de lenguado en los primeros días de la infección (de 1 a 10 días post-infección). El eje yrepresenta el log10 del número de copias de ARN1 por gramo de tejido y en la xse representan los días post-infección. Los peces se infectaron en un baño a una concentración viral de 105TCID50/ml a 22 °C, se sacrificaron 10 peces diariamente, los datos representan la media y desviación estándar de dos lotes de 5 peces. 129 2. Souto, S., Mérour, E., Biacchesi, S., Brémont, M., Olveira, J.G. & Bandín, I. . In vitro and in vivo characterization of molecular determinants of virulence in reassortant betanodavirus. J. Gen. Virol. 96, 1287–1296 (2015). Doi: 10.1099/vir.0.000064 CAPÍTULO 3: SUSCEPTIBILIDAD DEL RODABALLO (Scophthalmus maximus) A BETANODAVIRUS Y ANÁLISIS DE DETERMINANTES DE ESPECIFICIDAD DE HUÉSPED Y VIRULENCIA. The role of reassortant in betanodavirus infection in turbot (Scophthalmus maximus). CAPÍTULO 3: Introducción INTRODUCCIÓN1. Desde su descubrimiento en los años 80, los betanodavirus se han descrito en más de 50 especies distintas, fundamentalmente especies de peces marinos aunque también se han detectado en especies de agua dulce e invertebrados marinos (Maltese y Bovo, 2007). En los capítulos anteriores se ha demostrado la gran susceptibilidad del lenguado a estos virus. Dado que la transmisión de betanodavirus entre especies ha sido descrita con anterioridad (Korsnes y col., 2012; Manin y Ransangan, 2011), el lenguado es una fuente potencial de infección de betanodavirus que podría poner en riesgo otras especies cultivadas en la misma área. El rodaballo (Scophthalmus maximus) se cultiva en distintos países europeos, especialmente en España, Portugal y Francia y más recientemente destaca la gran producción de esta especie en China (FAO, 2014). La producción de rodaballo en España, centrada fundamentalmente en Galicia, representó en el 2013 casi un 90% de la producción mundial según un informe de la Asociación Empresarial de Productores de Cultivos Marinos de España (APROMAR, 2014). En la actualidad, en Galicia, la industria del lenguado está íntimamente relacionada con el cultivo del rodaballo. Una de las primeras referencias a una infección por betanodavirus, si bien descrita como encefalomielitis, fue hecha en rodaballo por Bloch y col. en 1991, como señalan Munday y col. (2002) en su revisión. En el 2004 se produjo un brote de encefalopatía y retinopatía viral en larvas de rodaballo en Noruega, pero el virus no pudo aislarse. El análisis filogenético realizado en base a una secuencia de 823 nucleótidos del ARN2 reveló que no se agrupaba en ninguno de los cuatro genotipos establecidos, por lo que se propuso la formación de un quinto genotipo denominado TNV (Turbot necrosis virus) (Johansen y col., 2004). Esta secuencia ha sido incluida en otros estudios filogenéticos con el mismo resultado, aunque la ausencia de una secuencia mayor y del aislamiento del virus ha impedido un estudio más detallado. Recientemente nuestro grupo ha descrito el aislamiento de un betanodavirus perteneciente al genotipo RGNNV a partir de juveniles de rodaballo cultivado en la Península Ibérica (Olveira y col., 2013). Por último, diferentes infecciones experimentales han establecido la susceptibilidad del rodaballo a betanodavirus pertenecientes a los genotipo SJNNV +~VJD÷\ col., 2001) y BFNNV (Sommerset y col., 2003). 149 Susceptibilidad del rodaballo (Scophthalmus maximus) a betanodavirus y análisis de determinantes de especificidad de huésped y virulencia OBJETIVO El objetivo de este capítulo es determinar la susceptibilidad del rodaballo a la cepa Ss160.03, recombinante natural procedente de lenguado senegalés. Además, con la intención de analizar la implicación de los aminoácidos 247 y 270 en la especificidad de huésped y en la virulencia para esta especie., se realizarán infecciones experimentales con las cepas recombinantes derivadas de la cepa Ss160.03 obtenidas en el capítulo anterior mediante genética inversa (rSs160.03247, rSs160.03270 y rSs160.03247+270). Finalmente, y a efectos comparativos se utilizará también la cepa SJNag93 de tipo SJNNV. 150 CAPÍTULO 3: Materiales y métodos MATERIALES Y MÉTODOS2. 2.1 VIRUS Y CÉLULAS En este capítulo empleamos las cepas de betanodavirus descritas en la Tabla 8. Se trata de cepas ya mencionadas en capítulos anteriores, la cepa SpSs-IAusc160.03 (denominada Ss160.03 para simplificar) recombinante natural RGNNV/SJNNV, tres cepas recombinantes con mutaciones puntuales obtenidas mediante un sistema de genética inversa (rSs160.03247, rSs160.03270 y rSs160.03247+270) y una cepa del genotipo SJNNV, la cepa SJNag93. Los distintos aislados se propagaron en la línea celular E-11, tal y como se ha descrito anteriormente. (Capítulo 1, sección 2.2). Tabla 8 Relación de cepas de betanodavirus empleadas en este capítulo. 2.2 INFECCIONES EXPERIMENTALES Se obtuvieron juveniles de rodaballo con un peso medio de 2 g de una piscifactoría comercial y se mantuvieron en las instalaciones del acuario de la Universidad de Santiago de Compostela. Los peces se manejaron siguiendo los protocolos descritos previamente en los experimentos realizados con lenguados. Se realizaron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal siguiendo protocolos aprobados por la comisión de ética de la Universidad de Santiago de Compostela y la Xunta de Galicia (permiso núm. 15004/13/002). Antes de realizar los experimentos se analizaron 10 peces para descartar la presencia de virus o bacterias, como se ha descrito en el capítulo 1. Dado que la temperatura del agua en las instalaciones es de 16 °C, para aquellos experimentos realizados a 18ºC se emplearon calentadores, y la temperatura del agua se incrementó 0,5 °C/día. Cepa viral Genotipo Referencia Núm Acc. Genbank ARN1 ARN2 Ss160.03* RGNNV/SJNNV Olveira y col. (2009) FJ803911 FJ803923 rSs160.03247 RGNNV/SJNNV#Este trabajo - - rSs160.03270 RGNNV/SJNNV#Este trabajo - - rSs160.03247+270 RGNNV/SJNNV#Este trabajo - - SJNag93 SJNNV/SJNNV Iwamoto y col. (2001E) AB056571 AB056573 *SpSs-IAusc160.03. #Cepa recombinante derivada de Ss160.03 con mutaciones puntuales en la secuencia de la cápside: rSs160.03247 [S247A], rSs160.03270 [S270N], y rSs160.03247+270 [S247A/S270N]. 151 Susceptibilidad del rodaballo (Scophthalmus maximus) a betanodavirus y análisis de determinantes de especificidad de huésped y virulencia Las infecciones experimentales llevadas a cabo durante este capítulo se realizaron introduciendo los peces en un baño con el virus a una concentración de 105 TCID50/ml con fuerte aireación durante 3 h. Después de la exposición al virus los peces se devolvieron a sus respectivos tanques y el inóculo se desechó. Los grupos de peces control se manipularon del mismo modo que los peces infectados pero añadiendo medio L-15 al baño en vez del virus. Una vez realizada la infección se observaron los peces diariamente para detectar la aparición de signos de patología y para retirar las bajas. Los peces supervivientes se sacrificaron al final del experimento con una sobredosis de MS-222 según la directiva europea 2010/63/UE. Se extrajeron cerebro y ojos de los peces muertos, y de los sacrificados al final del experimento, que se procesaron en lotes de 5 peces para realizar el análisis virológico. Para cada lote, se realizó la cuantificación y aislamiento del virus por RT-qPCR y cultivo celular, respectivamente. 2.2.1 Infección experimental 1. Susceptibilidad del rodaballo al virus recombinante natural Ss160.03 a 18 y 16 °C. Se infectaron 2 grupos de 30 peces cada uno con la cepa recombinante Ss160.03 y se mantuvieron durante 35 días a dos temperaturas distintas: 18 y 16 °C. Un grupo control (n=10) se mantuvo durante toda la duración del experimento a cada temperatura. 2.2.2 Infección experimental 2. Comparación entre la susceptibilidad a la cepa recombinante Ss160.03 y a una de genotipo SJNNV Se infectaron 2 grupos de rodaballos con cada cepa, la cepa recombinante Ss160.03 de genotipo RGNNV/SJNNV y la cepa SJNag93, de genotipo SJNNV (n=30/cepa) y se mantuvieron a 18 y 16 °C. Además, se incluyó un grupo control de 10 peces a cada temperatura. 2.2.3 Infección experimental 3. Comparación entre la susceptibilidad a la cepa wSs160.03 y las cepas recombinantes derivadasI. En este experimento a la cepa Ss160.03 la denominaremos wSs160.03 de wild strain, cepa salvaje, para diferenciarla claramente de las cepas recombinantes derivadas obtenidas mediante genética inversa. 152 CAPÍTULO 3: Materiales y métodos Los rodaballos se infectaron con las cepas wSs160.03, rSs160.03247, rSs160.03270 y rSs160.03247+270 a 18 °C (n=30 peces/cepa) y a 16 °C (n=20 peces/cepa). Además, se mantuvo un grupo control de 10 peces a cada temperatura. 2.2.4 Infección experimental 4. Comparación entre la susceptibilidad a la cepa wSs160.03 y las cepas recombinantes derivadasII. Ensayo de mortalidad y replicación. Se infectaron rodaballos con las mismas cepas descritas en la infección anterior. Se realizaron dos ensayos: un ensayo de mortalidad a 18 °C y a 16 °C en el que se infectaron 30 y 20 peces por cepa, respectivamente, y un ensayo de toma de muestras para analizar la replicación a diferentes tiempos post infección. En este último se infectaron 50 peces por cepa y temperatura y se retiraron 10 peces de cada tanque a los 5, 10, 15, 20 y 30 días post infección (d.p.i.) para realizar el análisis virológico. Los peces muestreados se sacrificaron con una sobredosis de MS-222 y se procesaron en 2 lotes de 5 peces por cada día de muestreo. Al igual que en los experimentos anteriores se incluyó un grupo control de 10 peces a cada temperatura. 2.3 ANÁLISIS VIROLÓGICO Los cerebros de los peces infectados y de los peces control se procesaron en lotes correspondientes a 5 peces en una dilución 1:5 en tampón Earle’s suplementado con antibióticos (Capítulo 1. Sección 2.5). Las muestras procesadas se utilizaron por un lado para la extracción del ARN total para realizar la RT-qPCR y por otro lado se inocularon en células E-11 a una concentración final de 1:100 y 1:1000, y se incubaron a 25 °C un máximo de 7 días, hasta observar efecto citopático, y a continuación se procedió a realizar un subcultivo en una nueva placa, utilizando 0,1 ml de cada pocillo. La identidad del virus se confirmó por RTPCR. 2.4 IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS La extracción del ARN total se realizó empleando el kit comercial E.Z.N.A.®Total RNA Kit (Capítulo 2 sección 2.8.3), y la transcripción inversa se realizó empleando la enzima SuperScript® III Reverse Transcriptase (Capítulo 1 sección 2.7). Para la confirmación de las distintas cepas de betanodavirus se realizó la PCR empleando la polimerasa comercial 153 Effect of reassortment on betanodavirus host adaptation Kvellestad, A., Dannevig, B. H. & Falk, K. (2003). Isolation and partial characterization of a novel paramyxovirus from the gills of diseased seawater-reared Atlantic salmon (Salmo salar L). J Gen Virol 84, 2179–2189. Lai, Y.-S., Murali, S., Chiu, H.-C., Ju, H.-Y., Lin, Y.-S., Chen, S.-C., Guo, I.-C., Fang, K. & Chang, C.-Y. (2001a). 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Crecer un cultivo de E. coli a 37 qC con agitación vigorosa (200 rpm) utilizando un inóculo saturado fresco (incubado overnight) al 1% hasta alcanzar una OD600 de 0,50,6. ii. Después de incubar las bacterias en hielo durante 5 min centrifugar 3.000 × g durante 20 min a 4 qC. 29 APÉNDICE iii. Vaciar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender en agua bidestilada estéril manteniendo las bacterias en todo momento en hielo. Centrifugar de nuevo. iv. Resuspender de nuevo en agua bidestilada y centrifugar. v. Vaciar el sobrenadante y resuspender las bacterias en glicerol estéril al 10% a 4 qC. vi. Realizar alícuotas de 50 μl y almacenar a -80 ° 20 APÉNDICE B. PREPARACIÓN DE VIRUS SEMIPURIFICADO I. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS i. Agua bidestilada-DEPC Añadir al agua bidestilada DEPC (dietil pirocarbonato) al 0.1%. Incubar en agitación un mínimo de 12h Autoclavar dos veces ii. SSC 1×-DEPC a 4 °C Disolver 5 ml de SSC 20× en 100 ml de agua bidestilada-DEPC Solución stock de SSC-1 20×, pH 7, (100 ml): 8,8 g Citrato de sodio 17.5 g NaCl Ajustar pH 7.0 i. Sacarosa 30% en tampón SSC1-DEPC En matraz aforado se pesan 30 g de sacarosa Enrasar hasta 100 ml con SSC Agitar hasta completa disolución II. SEMIPURIFICACIÓN i. Recoger el medio de frascos de E-11 con ECP es extensivo. Realizar dos ciclos de congelación y descongelación. ii. Centrifugar a 1.500 × g durante 20 min a 4 °C. iii. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y mantener a 4 °C hasta su uso. iv. Resuspender el material precipitado con SSC 1×-DEPC y sonicar 3 pulsos de 10 segundos en hielo. v. Centrifugar a 1.500 × g durante 20 min a 4 °C, transferir el sobrenadante al tubo del paso iii. vi. Ultracentrifugar a 100.000 × g durante 1h a 4 °C en un rotor SW32 Ti (Beckman Coulter). vii. Vaciar el sobrenadante, secar las paredes del tubo y resuspender el precipitado en 500 ȝOGH SSC 1×-DEPC viii. Cargar la muestra en un tubo de centrifuga con un lecho de 5 ml de sacarosa 30% 21 APÉNDICE ix. Centrifugar a 175.000 × g durante 1 h a 4 °C en el rotor SW55Ti (Beckman Coulter). x. Vaciar el sobrenadante, secar las paredes y rHVXVSHQGHUHOSUHFLSLWDGRHQȝO de tampón SSC 1×-DEPC, transferir a un tubo nuevo y mantener a -20ͼC hasta su uso. 22