IC-Tagging: plataforma universal para la producción de microesferas proteicas para aplicaciones biotecnológicas

! ! ! TESIS DE DOCTORADO IC-TAGGING: PLATAFORMA UNIVERSAL PARA LA PRODUCCIÓN DE MICROESFERAS PROTEICAS PARA APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS Natalia Barreiro Piñeiro ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN MEDICINA MOLECULAR SANTIAGO DE COMPOSTELA AÑO 2018 ! ! DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS IC-TAGGING: PLATAFORMA UNIVERSAL PARA LA PRODUCCIÓN DE MICROESFERAS PROTEICAS PARA APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS Dña. Natalia Barreiro Piñeiro Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Santiago de Compostela, 02 de Julio de 2018 Fdo. Natalia Barreiro Piñeiro ! AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS IC-Tagging: plataforma universal para la producción de microesferas proteicas para aplicaciones biotecnológicas D. Jose Manuel Martínez Costas D. Javier Benavente Martínez INFORMA/N: Que la presente tesis, corresponde con el trabajo realizado por D/Dña. Natalia Barreiro Piñeiro bajo mi dirección, y a utorizo su presentación, considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 02 de Julio de 2018 Fdo. Jose Manuel Martínez Costas Fdo. Javier Benavente.Martínez ! El doctorando declara ser co-autor de las siguientes patentes desarrolladas en el ámbito de esta tesis doctoral: Ti!tulo: Método de producción de la proteína glucosa-6-fosfatasa2. Inventores/autores/obtentores: Natalia Barreiro Piñeiro; Rubén Varela Calviño; Jose Manuel Marti!nez Costas; Javier Benavente Marti!nez Nº de solicitud: P201830351 Pai!s de inscripcio!n: España Fecha de registro: 09/04/2018 C. Auto!n. / Reg. de explotacio!n: España Ti!tulo: Protein muNS that can form inclusions in the endoplasmic reticulum, methods for the use there of and uses of same Tipo de propiedad industrial: Patente de invención Inventores/autores/obtentores: Natalia Barreiro Piñeiro; Jose Manuel Martínez Costas; Javier Benavente Martínez Entidad titular de derechos: Universidad de Santiago de Compostela Cód. de referencia/registro: P11023EPPC Nº de solicitud: P11023EPPC Fecha de registro: 21/04/2017 Patente UE: Si Ti!tulo: Protein muNS that can form inclusions in the endoplasmic reticulum, methods for the use there of and uses of same Tipo de propiedad industrial: Patente de invención Inventores/autores/obtentores: Natalia Barreiro Piñeiro; Jose Manuel Martínez Costas; Javier Benavente Martínez Entidad titular de derechos: Universidad de Santiago de Compostela Cód. de referencia/registro: Nº de solicitud: P11023USPC Fecha de registro: 21/03/2017 Patente internacional no UE: Si Ti!tulo: Proteína muNS capaz de formar inclusiones en el retículo endoplasmático, métodos de uso y usos de la misma. Tipo de propiedad industrial: Patente de invención Inventores/autores/obtentores: Natalia Barreiro Piñeiro; Jose Manuel Martínez Costas; Javier Benavente Martínez Entidad titular de derechos: Universidad de Santiago de Compostela Co!d. de referencia/registro: P11023ES00 Pai!s de inscripcio!n: España Fecha de registro: 22/09/2014 Fecha de concesio!n: 14/11/2016 Patente espan"ola: Si Licencias: Si ! 9 RESUMO A metodoloxía do IC-Tagging baséase no uso de una proteína, muNS-Mi, que por si soa é capaz de formar estruturas esféricas nas células (microesferas, MS) que son facilmente purificables. Ademais podemos etiquetar calquera proteína con un tag denominado IC co cal provocamos que se modifique a localización e as proteínas etiquetadas queden incluídas nesas microesferas. No presente estudo empregouse este sistema para o desenvolvemento dun sensor de retrotranslocación de proteínas do retículo endoplasmático (RE). Para isto adaptamos o reensamblaxe de fragmentos de EGFP ó sistema IC-Tagging onde os resultados obtidos mostraron que sería un sensor pouco eficaz. Tamén adaptamos o sistema ó interior do RE para intentar desenvolver vacinas contra virus envoltos, producindo e purificando MS formadas no interior do RE cargadas con glicoproteínas. Para intentar expresar proteínas difíciles ou tóxicas, adaptamos o noso sistema para expresar e purificar proteínas en bacterias. Por último intentamos resolver a estrutura da proteína muNS-Mi e descubrir como as proteínas etiquetadas se distribúen nas mesmas. PALABRAS CLAVE IC-Tagging, retículo endoplasmático, vacinas, expresión de proteínas RESUMEN La metodología del IC-Tagging se basa en el uso de una proteína, muNS-Mi, que por sí sola es capaz de formar estructuras esféricas en las células (microesferas, MS) que son fácilmente purificables. Además podemos etiquetar cualquier proteína con un tag denominado IC con el cual provocamos que se modifique la localización de forma que las proteínas etiquetadas quedan incluidas en las microesferas. En este estudio se utilizó este sistema para el desarrollo de un sensor de retrotranslocación de proteínas del retículo endoplasmático (RE). Para esto adaptamos el reensamblaje de fragmentos de EGFP al sistema IC-Tagging donde los resultados obtenidos mostraron que sería un sensor poco eficaz. También adaptamos el sistema al interior del retículo endoplasmático para intentar el desarrollo de vacunas contra virus envueltos, produciendo y purificando MS formadas en el interior del RE cargadas con glicoproteínas. Para intentar expresar proteínas difíciles, adaptamos el sistema para expresar y purificar proteínas en bacterias. Por último intentamos resolver la estructura de la proteína muNS-Mi y descubrir como las proteínas etiquetadas se distribuyen en las mismas. PALABRAS CLAVE IC-Tagging, retículo endoplasmático, vacunas, expresión de proteínas ! ABREVIATURAS Abreviaturas ! 19 AHSV Virus de la peste equina africana ARV Reovirus aviarios Bac Baculovirus BiFC Ensayos de complementación de biomoléculas fluorescentes BSA Seroalbúmina bovina BTV Virus de la lengua azul C1 Coil 1 C2 Coil 2 CA-C Extremo C-terminal del dominio de dimerización de la proteína de la cápside del virus VIH cDNA Ácido desoxiribonucleico complementario CGFP/CEGFP Fragmento carboxiloterminal de la proteína GFP o EGFP Cos-7 Fibroblastos de riñón de mono CT Cola carboxilo terminal Cys Cisteinas DAPI 4 ',6-diamino-2-fenilindol DF-1 Fibroblastos de embrión de pollo inmortalizados DMEM Medio Eagle modificado por Dulbecco DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxiribonucleico dNTP Deoxinucleótido trifosfato Ds-Red Proteína fluorescente roja de Dicosoma dsRNA Ácido ribonucleico de doble cadena DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EGFP Proteína fluorescente verde mejorada FBS Suero bovino fetal GFP Proteína fluorescente verde h Horas h.p.i. Horas postinfección h.p.t. Horas postransfección His Histidinas HIV Virus de la inmunodeficiencia humana IC Intercoil IFNAR Ratones deficientes en el receptor de interferón Abreviaturas ! ! 20 IgG Inmunoglobulina g IGRP Glucosa-6-fosfatasa-2 IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido ISVPs Partículas subvirales intermedias kDa Kilodalton LB Luria Bertami Luc Luciferasa MCS Policonectores min Minutos ml Mililitro mM Milimolar mRFP Proteína fluorescente roja monomérica mRNA Ácído ribonucleico mensajero MRV Reovirus de mamífero MS Microesfera MVA Virus vaccinia Ankara modificado ng Nanogramo ng Nanogramos NGFP/NEGFP Fragmento aminoterminal de la proteína GFP o EGFP NLS Secuencia de localización nuclear nm Nanometros NOD Ratones diabéticos no obesos O.D. Densidad óptica ºC Grados Celsius PBS Solucion fosfato salino PCR Reacción en cadena de la polimerasa PEG Polietilenglicol RE Retículo endoplasmático RNA Ácido ribonucleico rpm Revoluciones por minuto RVFV Virus de la Fiebre del Valle del Rift SDS dodecil sulfato sódico SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS sec Secuencia señal de entrada en el retículo endoplasmático seg Segundos Abreviaturas ! 21 Sf9 Células de ovario de la oruga de la acelga SV40 Virus del simio 40 T1D Diabetes tipo 1 TAE Tris-acetato-EDTA TAg Antígeno T del SV40 TEM Microscopia electrónica de transmisión TRB - Tampón de resuspensión sin magnesio TRB + Tampón de resuspensión con magnesio TRIS Tris (hidroximetil)-aminometano TSS Solución de transformación U / ml Unidades por mililitro ufp Unidades formadoras de placas VERO Células de riñón de mono verde africano VLP Virus like particles VSV Virus de la estomatitis vesicular WT Wild type µM Micromolar µg/ml Microgramos por mililitro ! INTRODUCCIÓN Introducción ! 25 1. FAMILIA REOVIRIDAE La familia Reoviridae abarca virus capaces de infectar desde insectos y plantas hasta peces y mamíferos, produciendo diversas manifestaciones que pueden ser tanto asintomáticas como mortales. Los virus de esta familia se caracterizan por poseer un genoma fragmentado de 10 a 12 segmentos de RNA de doble cadena (dsRNA) y por ser capaces de replicar en el citoplasma de las células infectadas utilizando estrategias similares tanto para la replicación como para la expresión de su genoma. Carecen de envoltura lipídica y contienen dos o tres cubiertas proteicas dispuestas concéntricamente con un diámetro externo entre 70-80 nm. Esta familia se puede dividir en doce géneros diferentes (Tabla 1) basándose en la estructura de los viriones, en el número de segmentos que posee el genoma y las estrategias seguidas en el ciclo replicativo. Solo parte de los géneros son capaces de infectar a los humanos y otros vertebrados mientras que el resto infectan a plantas, insectos y peces. Tabla 1. Familia Reoviridae (Hulo et al., 2011). Introducción ! 32 individualmente en las células y puede reclutar a otras proteínas virales a las mismas (Tourís-Otero et al., 2004a; Tourís-Otero et al., 2004b). Las inclusiones formadas por muNS tienen un aspecto globular y aparentemente son agregados ordenados ya que no están poli-ubiquitinadas por la célula ni asociadas a cajas de vimentina (Brandariz-Nuñez et al., 2010b). Mediante análisis bioinformático, en esta proteína se predicen dos regiones con posible estructura de “coiled-coil”, localizadas entre las posiciones 451-472 y 540-599, que posiblemente estén implicadas en la formación de homo-oligómeros (Brandariz-Nuñez et al., 2010b; Tourís-Otero et al., 2004b). En las células infectadas la proteína muNS sufre un corte proteolítico catalizado por caspasas que da lugar a la formación de dos subproductos denominados como muNSN de 15 kDa, correspondiente a su extremo N-terminal y muNSC de 55 kDa y correspondiente al extremo C-terminal (Figura 5) (Busch et al., 2011; Rodríguez-Grille et al., 2014). Se desconoce la posible función de ambas versiones. Figura 5. Procesamiento proteolítico de la proteína (Adaptada de Benavente y MartínezCostas, 2007). Aparecen indicados los dos dominios coiled-coil necesarios para la formación de las inclusiones y el lugar donde se produce el procesamiento proteolítico para das los fragmentos muNSN y muNSC. Mediante estudios de delección se ha demostrado que la región C-terminal de muNS es totalmente indispensable para la formación de las inclusiones. En la región N-terminal, si eliminamos los primeros 140 aminoácidos la capacidad de formación no se ve afectada mientras que delecciones del aminoácido 380 al 447 provocan la formación de inclusiones mas pequeñas y esféricas (Figura 6). A partir del aminoácido 448 cualquier delección provoca que las inclusiones no se formen, por lo que a esta región mínima que es capaz de formarlas (448-635) se la ha denominado muNS-Mi (Brandariz-Nuñez et al., 2010b). Introducción ! 33 Figura 6. Inmunofluorescencia de delecciones de muNS y su capacidad para formar inclusiones (Adaptadas de Brandariz-Nuñez et al., 2010b). Inmunofluorescencia de diferentes versiones de la proteína muNS donde observamos que la delección de los primeros 140 aminoácidos µNS (140-635) no afecta a la capacidad de formación mientras que delecciones en los aminoácidos 380 a 447 provocan la formación de inclusiones pequeñas y esféricas. Observamos la proteína muNS en verde y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Algunos de los mutantes de delección ((µNS (84-635), µNS (112-635), µNS (208635) y µNS (271-635)) forman agregados amorfos que son poliubiquitinados por la célula para su posterior degradación (Figura 7). Esto no ocurre con la proteína original ni con las esferas formadas por muNS-Mi, lo que apoya la idea de que ambos tipos de agregados tienen un cierto grado de orden que les hace pasar desapercibidos para la célula. Figura 7. Inmunofluorescencia de delecciones de muNS (Adaptadas de Brandariz-Nuñez et al., 2010b). Delecciones de muNS que provocan la formación de agregados que posteriormente serán degradados por el proteasoma. Observamos la proteína muNS en verde y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Introducción ! 34 Como se ha comentado, muNS-Mi forma inclusiones mucho mas pequeñas y esféricas que las formadas por la proteína completa, que miden entre 1 y 4 micras, por lo que les hemos denominado microesferas (MS) y así nos referiremos a ellas de aquí en adelante (Figura 8). Esta región de muNS puede dividirse en cuatro dominios (Figura 8), basándonos en la presencia de las dos regiones “coiled coil”, a las que denominamos Coil1 (residuos 448-477 o C1) y Coil 2 (residuos 539-605, C2). C1 y C2 están separados por 61 residuos, a los que denominamos dominio Intercoil (residuos 477-539, IC). Por último, a continuación de C2 tenemos la región Cterminal que comprende los residuos 605-635 y que se denomina dominio C-terminal (CT) (Brandariz-Nuñez et al., 2010b). Figura 8. Inmunofluorescencia de inclusiones y representación esquemática de los diferentes dominios de la proteína muNS-Mi (Adaptadas de Brandariz-Nuñez et al., 2010b). En las imágenes de la izquierda podemos observar la diferencia en el tamaño y forma de las inclusiones formadas por la proteína completa muNS en contraposición a las formadas por muNS-Mi. Observamos la proteína muNS/muNS-Mi en verde y los núcleos en azul. La imagen de la derecha muestra un esquema en donde se señalan los cuatro dominios de muNS-Mi y los residuos que comprenden. En nuestro laboratorio se han realizado estudios para comprobar el papel que juega cada uno de estos dominios en la formación de inclusiones por parte de muNSMi. Se ha observado que C1 puede ser reemplazado por un dominio de dimerización como GFP o CA-C (extremo C-terminal del dominio de dimerización de la proteína de la cápside del virus HIV), lo que indica que este dominio contribuye a la generación de los oligómeros y consecuentemente la formación de las microesferas mediante auto-asociación (Figura 9 A). El dominio CT también puede ser substituido por un dominio de dimerización. Sin embargo el fenotipo de las inclusiones generadas va a depender de si el dominio sustituto es GFP (inclusiones tubulares) o CA-C Introducción ! 35 (inclusiones esféricas) lo que indica que CT está involucrado en la orientación de los contactos entre los monómeros (Figura 9 A). Por otra parte, mutagénesis puntual en los residuos His487 y Cys489 que están altamente conservados en el dominio IC provocan que tanto muNS como muNS-Mi pierdan la capacidad de formar microesferas o inclusiones y pasen a distribuirse uniformemente en el citoplasma (Figura 9 B). Figura 9. Influencia de los diferentes dominios de la proteína muNS-Mi sobre la formación de inclusiones. A. Dominios C1 y CT (Adaptadas de Brandariz-Nuñez et al., 2010b). Monocapas de células CEF se transfectaron con plásmidos que expresan las proteínas indicadas en la parte superior de cada imagen. Las células fueron sometidas a inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo policlonal contra muNS (verde) o se visualizaron directamente gracias a la presencia de GFP. Los núcleos se tiñeron con DAPI. B. Dominio IC. Monocapas de células CEF se transfectaron con plásmidos que expresan las proteínas muNS wild type (muNS 1-635) o con las versiones de esta a las que se le ha introducido la mutación puntual indicada en la foto. Las células se sometieron a inmunofluorescencia usando un anticuerpo policlonal contra muNS (verde) y los núcleos está teñidos con DAPI (azul). A B Introducción ! 36 3.2 El sistema IC-Tagging Durante el curso de la investigación destinada a determinar qué tipo de interacciones se producían entre los monómeros de muNS, se encontró que el dominio IC tiene una enorme afinidad tanto por las inclusiones de muNS como por las MS formadas por muNS-Mi, lo que condujo al desarrollo de un sistema de etiquetado molecular que tiene múltiples aplicaciones biotecnológicas (BrandarizNuñez et al., 2010b). El método tiene dos componentes, por un lado está la proteína muNS-Mi que forma MS cuando se expresa en una célula. Por otra parte, usamos como etiqueta molecular el dominio IC, que fusionamos a una proteína de interés, bien sea en su extremo N o C-terminal. La presencia del IC no cambia las características ni localización de la proteína, pero cuando se expresan simultáneamente en la misma célula una proteína etiquetada con IC y muNS-Mi, la presencia del tag provoca la relocalización de la proteína etiquetada a las MS (esquema en la Figura 10). Figura 10. A. Representación esquemática del sistema. Si expresamos muNS-Mi en las células se forman MS en su citoplasma mientras que si expresamos una proteína X etiquetada con el IC su distribución no se ve afectada. En la coexpresión de ambas la proteína etiquetada es reclutada por las MS. B. Inmunofluorescencia donde se muestra el funcionamiento del sistema. Monocapas de DF-1 se transfectaron con plásmidos que expresan las proteínas GFPIC y p53-IC en presencia o ausencia del plásmido que expresa muNS-Mi. En el caso de GFP observamos las proteínas por autofluorescencia de GFP (verde). Las células se sometieron a inmunofluorescencia indirecta en el caso de las transfecciones con p53 usando un anticuerpo policlonal contra muNS (rojo) de forma que detectamos ambas proteínas. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Observamos que ambas proteínas etiquetadas con el IC modifican su localización en presencia de las MS. A B Introducción ! 37 Una de las aplicaciones de esta metodología de etiquetado molecular es la validación de interacciones de proteínas en el interior de células vivas. Como hemos comentado, el tag IC provoca la reclusión de la proteína etiquetada en las MS. Si otra proteína no etiquetada interaccionase dentro la célula con la primera, podría verse recluida en las MS guiada por dicha interacción (Figura 11 A). De lo contrario, retendría su localización habitual. Estudios realizados en nuestro laboratorio han utilizado las proteínas p53 y el antígeno T del virus SV40 como ejemplos para demostrar esta idea. Así, al etiquetar solamente p53 con el IC provocamos el cambio de distribución de esta proteína, pasando del núcleo a las MS. Utilizando técnicas de inmunofluorescencia comprobamos que el antígeno T, cuya fuerte interacción con p53 está ampliamente descrita, a pesar de no tener IC, también se redistribuye del núcleo a las MS en presencia de muNS (Figura 11 B). Introducción ! 38 Figura 11. A. Estrategia para la validación de interacciones entre proteínas mediante IC-Tagging (Adaptadas de Brandariz-Nuñez et al., 2010c). La proteína muNS o muNS-Mi forman MS o inclusiones (Inc.) en el citoplasma celular que incorporan a su estructura a la proteína B (Bait) etiquetada con el dominio Intercoil (IC). La proteína B, secuestrada en las inclusiones, sirve como cebo para reclutar a su ligando F (Fish). B. Validación de la interacción entre p53 y antígeno T del SV40 en células vivas. Se transfectaron células Cos-7 semiconfluentes con los plásmidos que expresan las proteínas indicadas a la izquierda de las figuras. En la imagen de la izquierda se muestra el reclutamiento de en antígeno T endógeno de la célula mientras que en la imagen de la derecha se muestra el antígeno T expresado mediante un plásmido. Las células se sometieron a inmunofluorescencia indirecta con un anticuerpo monoclonal contra el antígeno T (rojo) y un anticuerpo policlonal contra muNS o muNS-Mi (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). A B ¡ Introducción ! 39 Se ha demostrado que añadiendo secuencias de localización nuclear a versiones de muNS, se puede inducir la formación de MS en el núcleo de células vivas. Además, estas inclusiones nucleares también son capaces de reclutar proteínas con el tag IC y sirven para validar interacciones proteína-proteína en el núcleo, como hemos demostrado con el mismo par de proteínas: p53 y antígeno T (Figura 11 B, Brandariz-Nuñez et al., 2010c). En nuestro laboratorio se ha comprobado que las proteínas etiquetadas con el IC y recluidas en las MS, son capaces de interactuar entre si dentro de estas estructuras. Para ello se ha estudiado como ejemplo la proteína DsRed, una proteína tetramérica que necesita de cuatro monómeros para emitir fluorescencia (Figura 12 A). Los monómeros deben interaccionar a través del extremo C-terminal para evolucionar su cromóforo y emitir fluorescencia (Yarbrough et al., 2001). Al etiquetar DsRed en su extremo C-terminal no emite fluorescencia, mientras que etiquetándola en el extremo N-terminal se comporta correctamente (Figura 12 B). Sin embargo, si la proteína etiquetada en el extremo C-terminal, se coexpresa con muNS, se incorpora a las MS liberando los extremos C-terminal y recuperando la fluorescencia, demostrando que dentro de las MS las proteínas pueden interactuar entre sí y llevar a cabo reacciones complejas (Brandariz-Nuñez et al., 2011). Introducción ! 40 Figura 12. (Adaptadas de Brandariz-Nuñez et al., 2011). A. Representación del tetrámero DsRed. Los monómeros están representados con letras mayúsculas (A,B,C y D) y los extremos C-terminal que interaccionan entre si están representados con letras minúsculas (a, b, c y d). B. Distribución de la proteína DsRed en el interior celular en ausencia de microesferas. Monocapa semiconfluentes de células VERO se transfectaron con plásmidos que expresan las proteínas indicadas a la izquierda de la figura. Las células se sometieron a inmunofluorescencia usando un anticuerpo policlonal contra muNS (verde) y tiñendo los núcleos con DAPI (azul). La proteína DsRed se visualiza sin anticuerpos (rojo). C. Expresión de la proteína DsRed en presencia de MS. Monocapas semiconfluentes de células VERO se transfectaron con plásmidos que expresan las proteínas indicadas a la izquierda de las imágenes. Las células se sometieron a inmunofluorescencia usando un anticuerpo policlonal contra muNS (verde) y se tiñeron los núcleos con DAPI (azul). La proteína DsRed se visualiza sin anticuerpos (rojo). Otra de las aplicaciones posibles para este sistema es su uso como método de purificación de proteínas. Gracias a la capacidad de expresión del sistema de baculovirus en células de insecto, somos capaces de obtener una elevada densidad de MS que podemos purificar mediante métodos mecánicos simples. De esta forma, si coexpresamos una proteína de interés etiquetada con IC podemos obtener gran A B ¡ C ¡ Introducción ! 41 cantidad de MS cargadas con la proteína etiquetada. Se ha comprobado que este sistema sirve para purificar proteínas con actividad enzimática, como la luciferasa, sin que esta desaparezca por la presencia de la etiqueta IC o por estar asociadas a las MS (Figura 13) (Brandariz-Nuñez et al., 2010a). Figura 13. Ensayos con Luciferasa (Adaptadas de Brandariz-Nuñez et al., 2010a). A. Distribución de la Luciferasa (Luc) y Luciferasa etiquetada con el IC (Luc-IC) en presencia de GFP-muNS-Mi en células Sf9. Coinfectamos células Sf9 con baculovirus recombinantes que expresan las proteínas indicadas en la parte superior de las imágenes. Tras 72 h.p.i. las células fueron sometidas a inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo policlonal contra Luciferasa (rojo), visualizándose las microesferas en verde al estar fusionadas con GFP. Los núcleos fueron teñidos en azul con DAPI. B. Purificación de LucIC a través del sistema IC-Tagging. Análisis a través del SDS-PAGE del proceso de purificación. Detalles en (Brandariz-Nuñez et al., 2010a). C. Mantenimiento de la actividad Luciferasa-IC integradas en las microesferas. Las barras representan los niveles de actividad de luciferasa de las muestras presentadas en los geles de la figura B. Las Unidades Relativas de Luz vienen indicadas a la izquierda de la gráfica. Hemos demostrado que las MS cargadas con epitopos del virus Bluetongue (BTV) sirven, de forma muy eficaz, como vacuna subunitaria contra BTV en ratones IFNAR (-/-), demostrando una capacidad adjuvante intrínseca, y abriendo la posibilidad de usar el sistema IC-Tagging como un método general de producir vacunas efectivas y seguras (Marín-López et al., 2014). A B C Objetivos ! 49 En el presente trabajo se pretende utilizar el sistema IC-Tagging como como plataforma biotecnológica para diferentes aplicaciones. Para esto se plantearon los siguientes objetivos: 1. Desarrollo de un sensor de retrotranslocación de proteínas en el retículo endoplasmático basado en IC-Tagging. 2. Adaptar el sistema IC-Tagging al interior del retículo endoplásmico. 3. Adaptar el sistema IC-Tagging a un sistema de expresión bacteriano para la expresión y purificación de proteínas difíciles. 4. Determinar la estructura de muNS-Mi y cómo se disponen las proteínas etiquetadas en las mismas. ! MATERIAL Y MÉTODOS Materiales y métodos ! 53 1. MATERIAL BIOLÓGICO 1.1 Células eucariotas - DF-1: línea celular obtenida por transformación espontánea de fibroblastos embrionarios de pollo (Gallus gallus). - Sf9: línea celular estable procedente del ovario de la oruga de la acelga (Spodoptera frugiperda). - Vero: línea celular originada a partir de células epiteliales de riñón de mono verde africano (Chlorocebus aethiops). 1.2 Células procariotas - XL1-Blue (Stratagene): cepa de Escherichia coli empleada para el crecimiento y purificación de plásmidos. Genotipo: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB laclqZΔM15 Tn10 (Tetr)]. - BL21 (DE3) Codon Plus-RP (Stratagene): cepa de Escherichia coli empleada para la expresión de proteínas en bacterias a través de la polimerasa T7. Genotipo: B FompT hsdS(rBmB-) dcm+ Tetr gal λ (DE3) endA Hte [argU prolL Camr]. - DH10Bac (Invitrogen): cepa bacteriana de Escherichia coli usada para crecer genomas de baculovirus recombinantes. Genotipo: FmcrA D (mrrhsdRMS-mcrBC) φ80dlacZDM15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139 Δ(ara, 27leu)7697 galU galK λ-rpsL nupG/bMON14272 /pMON7124. 1.3 Baculovirus - Bac-WT (wild-type) es una cepa de baculovirus que ha sido desprovista de los genes de polihedrina y P10 y que no expresa proteínas foráneas. Materiales y métodos 54 - Bac-muNS-Mi es un baculovirus recombinante que expresa la región que comprende los aminoácidos 448 a 635 de la proteína muNS del reovirus aviar S1133. 1.4 Plásmidos parentales - pCDNA3.1/Zeo (Invitrogen, Barcelona, España): vector de expresión eucariota que permite la expresión transitoria de genes clonados bajo el promotor temprano de citomegalovirus. - pFastBac I (Invitrogen, Barcelona, España): vector de expresión del sistema Bac-to-Bac utilizado para generar baculovirus recombinantes. 1.5 Anticuerpos 1.5.1 Anticuerpos primarios - En nuestro laboratorio se habían generado anticuerpos policlonales contra la proteína muNS (Tourís-Otero et al., 2004b), mediante la inmunización de conejos con la proteína muNS desnaturalizada y extraída de un gel de SDS-PAGE. Se usaron en Western-blot a diluciones entre 1:5000 y 1: 10000 y en inmunofluorescencia a diluciones entre 1:1000 y 1:5000. - Anticuerpo monoclonal contra p53 (clon PAB40) (Sigma-Aldrich, Madrid, España). Se usó 1:200 en inmunofluorescencia. - Anticuerpo monoclonal contra epitopo SV5 (clon 2F11F7) (Thermo Fisher). Se usó a 1:1000 en inmunofluorescencia y 1:5000 en Western-blot. 1.5.2 Anticuerpos secundarios - Anticuerpos de cabra contra IgG de conejo y de ratón conjugados con peroxidasa para la detección por Western-blot (Sigma-Aldrich, Madrid, España).Usados a una dilución 1:10000 Materiales y métodos ! 55 - Anticuerpos de cabra contra IgG de conejo y de ratón o anticuerpos de conejo contra IgG de cabra conjugados con diversos fluorocromos: Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594 (Invitrogen, Barcelona, España), para la detección por microscopía de fluorescencia. Todos ellos se utilizaron en diluciones que variaron entre 1:1000 y 1:20000. 2. MATERIAL NO BIOLÓGICO 2.1 Medios de cultivo Para el mantenimiento de la línea celular DF-1 se ha usado el medio DMEM (Gibco), conteniendo 2, 5 o 10 % de suero bovino fetal (Gibco), 2 mM de L-glutamina (Gibco), 100 U/ml de penicilina (Gibco) y 100 µg/ml de estreptomicina (Sigma). Para las transfecciones se utilizó medio DMEM stock (Gibco) Para el mantenimiento de la línea celular Sf9 se utilizó el medio SF-900II SFM (Gibco), conteniendo 5% de suero bovino fetal (Gibco), suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina El crecimiento de E. coli se realizó en medio de Luria-Bertani (LB). Para el crecimiento de bacterias transformadas con plásmidos, el medio se suplementó con los antibióticos ampicilina (100 µg/ml) (Sigma, Madrid, España), gentamicina (7 µg/ml) (Sigma, Madrid, España), tetraciclina (10 µg/ml) (Sigma, Madrid, España) o kanamicina (50 µg/ml) (Sigma, Madrid, España), según el método de selección para cada plásmido. Los cultivos de colonias en medio sólido se realizaron en el mismo medio conteniendo 1,5% bacto-agar (Sigma, Madrid, España) y antibióticos a las concentraciones indicadas anteriormente. La composición de estos medios se describe de forma detallada en el manual de protocolos de Sambrook (Sambrook et al., 1989). Materiales y métodos 56 2.2 Disoluciones y tampones - DAPI: preparado a 100 µg/ml en agua estéril y esterilizado a través de un filtro de 0,22 µm. - Medio de montaje: 6 g de glicerol; 2,4 g de Mowiol; 6 ml de H2O y 12 ml de 0,2 M Tris-HCl pH 8,5.  - Mowiol (Calbiochem, Madrid, España): empleado para preparar el medio de montaje. - PBS-T-Leche: PBS-T con 4 % de leche en polvo desnatada  - PBS-T: PBS con 0,05 % de Tween-20.  - PBS: 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 8 mM Na2HPO4 y 1,5 mM KH2PO4.  - Solución de transformación (TSS): 10% PEG 4000; 5% DMSO; 25 mM MgCl2; 10 % de glicerol en LB.  - Tampón de electroforesis para DNA (TAE): 40 mM Tris; 1,1%, ácido acético y 1 mM EDTA, pH 8,3.  - Tampón de electroforesis para SDS-PAGE (Tris-Glicina-SDS): 25 mM Tris-HCl pH 8,3; 192 mM glicina y 0,1 % SDS.  - Tampón de lisis para glucosidasa: 50mM de TrisHCl (pH 8,0), 150mM de NaCl, 0 !5% de SDS, inhibidor de proteasa.  - Tampón de muestra de Laemmli (sin β-mercaptoetanol): 60mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% glicerol e 0,024% azul de bromofenol.  - Tampón de muestra para DNA 6x: 15 % Ficoll; 0,25% de azul de bromofenol y 0,25% de xilencianol.  - Tampón de transferencia: 25 mM Tris-HCl pH 8,3; 192 mM glicina y 20% metanol.  - Tampón Laemmli (1x): 10% glicerol; 60 mM Tris-HCl pH 6,8; 5% β- mercaptoetanol; 0,05% azul de bromofenol y 2% SDS.  - Tampón de lisis de bacterias: 20mM Tris pH 7,5; 200mM NaCl; 1mM DTT; 2mM MgCl2; 0,25% Tween 20; 1mg/ml lisozima y 10mM inhibidor de proteasas. - Tampón TRB +: 10mM Hepes pH 7,9; 10 mM KCl y 5mM MgCl2 - Tampón TRB - : 10mM Hepes pH 7,9 y 10 mM KCl. Materiales y métodos ! 57 3. MÉTODOS 3.1 Manipulación de células bacterianas. 3.1.1 Crecimiento y mantenimiento de bacterias. Las bacterias se crecieron con agitación a 37ºC en medio LB con el antibiótico correspondiente según el método de selección para cada plásmido. Los antibióticos (Sigma-Aldrich, Madrid, España) se usaron en las siguientes diluciones: ampicilina (100 µg/ml), gentamicina (7 µg/ml), tetraciclina (10 µg/ml) o kanamicina (50 µg/ml). Las bacterias se conservaron a -80ºC en el mismo medio suplementado con 20% de glicerol. 3.1.2 Obtención de bacterias competentes y transformación La cepa bacteriana correspondiente se creció en medio LB a 37ºC durante toda la noche y el cultivo se diluyó 1/100 en el mismo medio precalentado y las bacterias se crecieron hasta alcanzar un valor de absorbancia a 600 nm de 0,3. A continuación se recogieron por centrifugación a 3000 rpm durante 15 min a 4ºC (Beckman GPR Centrifuge). Seguidamente se resuspendieron en 1/10 de su volumen original en tampón de transformación TSS previamente enfriado en hielo. Las células se guardaron congeladas a –80ºC hasta su uso. Para su transformación, las bacterias competentes se descongelaron en hielo y se mezcló una alícuota de 100 µl con el DNA transformante (1-10 ng). Después de incubar en hielo durante 30 min, se realizó un choque térmico a 42ºC durante 1 min. Tras mantenerlas de nuevo en hielo durante 2 min, se añadió 1 ml de LB y se incubaron a 37ºC durante 1 h con agitación. Por último se recogieron por centrifugación y se esparcieron en una placa de LB-agar suplementada con el antibiótico correspondiente. 3.1.3 Fijación de bacterias para microscopía electrónica de transmisión Las bacterias inducidas que expresan la proteína fueron centrifugadas a 2700 g, 5´a 4ºC. Se lavaron 3 veces en PBS 1X e incubamos con solución de fijación (2% Materiales y métodos 64 • pcDNA sec-VSV-G-SV5 / pcDNA sec-VSV-G-SV5-IC* Para esta construcción vamos a sustituir la secuencia de mRFP por la de SV5. Para ello hibridamos dos secuencias de DNA complementarias: 5´- GCCGGAATTCCGAAGGCAAACCAATCCCAAACCCACTGCTGGGCCTGGATTTGCGGC CGCAAAT-3´ y 5´- ATTTGCGGCCGCAAATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTGGGATTGGTTTGCCTTCGGAA TTCCGGC-3´ (Diana EcoRI subrayada y NotI doblemente subrayada). La hibridación la realizamos a 100ºC durante 3 minutos y dejamos enfriar lentamente. Posteriormente se clona este fragmento en el plásmido pcDNA sec-VSV-mRFP o pcDNA sec-VSV-G-mRFP-IC* para generar los plásmidos pcDNA sec-VSV-G-SV5 o pcDNA sec-VSV-G-SV5-IC* respectivamente. • pcDNA sec-SV5-Gn / pcDNA secSV5-Gn-IC* Para esta construcción se utilizó como molde el plásmido pcDNA3 sec-sv5bap-BIP cedido por el profesor Oscar Burrone (Trieste, Italia). Como cebador positive se utilizó 5´-CCCAAGCTTGAGGATGGGCTGGAGCCTG-3´ (diana HindIII subrayada y ATG iniciador doblemente subrayado) y como cebador negativo 5´- GGAATTCGGTACCCCCATCCAGGCCCAGCAG-3´ (diana EcoRI subrayada). El inserto amplificado se clonó en el plásmido pcDNA 3.1 Zeo+ para generar un pcDNA secSV5. El siguiente paso consistió en amplificar la secuencia del ectodominio de Gn del virus de la Fiebre del valle del Rift. Para ello se utilizó como molde el plásmido pCMVM4 (Alejandro Brun). Como cebador positivo se utilizó 5´- GGAATTCACCATGGAAGACCCCCATCTCAG-3´ (Diana EcoRI subrayada) y como cebador negativo 5´-TTGCGGCCGCAAAGTGTGACACTGG-3´ (diana NotI subrayada). El fragmento amplificado se clonó en el plásmido pcDNA sec-SV5 para generar un pcDNA sec-SV5-Gn. Por último pasamos a introducir la secuencia del IC mutado. Para ello utilizamos como molde de la amplificación el plásmido sec-muNS-Mi*. Como cebador positivo utilizamos 5´-TTGCGGCCGCAAGAAGATCACTTGTTGGCTTATC-3´ (diana NotI subrayada) y como cebador negativo utilizamos 5´- GCGTCTAGATTACGCTTCCACACGGGGTTC-3´ (Diana XbaI subrayada y codon stop doblemente subrayado). El fragmento amplificado se clonó en el plásmido sec-SV5Gn para generar el plásmido sec-SV5-Gn-IC* de 60 kDa. Materiales y métodos ! 65 3.3 Expresión y manipulación de proteínas 3.3.1 Creación de baculovirus recombinantes Todos los baculovirus recombinantes se generaron transfectando Sf-9 con bácmidos creados con el sistema Bac-to-Bac (Invitrogen, Barcelona, España). Para ello se clonaron los cDNAs obtenidos por PCR en el plásmido pFastBac1, tal y como se describe más adelante. Los plásmidos recombinantes se comprobaron por análisis de restricción y secuenciación y se utilizaron para transfectar células DH10BacTM competentes (Invitrogen, Barcelona, España), donde se generan los bácmidos por transposición. Las colonias positivas se replaquearon y comprobaron por PCR con cebadores comerciales M13 (Invitrogen, Barcelona, España), tal y como recomienda el fabricante en sus instrucciones. La transfección de células Sf-9 se llevó a cabo usando Lipofectamina 2000 (Thermo Fisher). Transcurridas 72 h el medio de cultivo contiene aproximadamente 1x107 ufp/ml de baculovirus recombinantes. Luego de realizar varios pases para crecer el virus y aumentar el título viral, se realizaron ensayos de expresión para seleccionar el clon a utilizar. Los stocks baculovirales se almacenaron a 4ºC en ausencia de luz. • Bac-sec-muNS-Mi* Para expresar la proteína sec-muNS-Mi* en el interior del retículo endoplasmático, el plásmido pcDNA sec-muNS-Mi* se amplificó utilizando los siguientes cebadores: el cebador positivo fue 5´- CGGGATCCACCATGGGCTGGAGCCTGATCC-3´ (diana EcoRI subrayada y ATG iniciador doblemente subrayado) y como cebador negativo 5´- TTGCGGCCGCAATCACAGATCATCCACC-3´ (diana NotI subrayada y codon stop doblemente subrayado). El producto de PCR resultante se digirió y clonó entre las dianas EcoRI y NotI del pFastBac1 para obtener pFastBac sec-muNS-Mi*, que se usó para generar el baculovirus recombinante Bac-sec-muNS-Mi que expresará la proteína denominada en resultados como sec-Mi* Materiales y métodos 66 • Bac-sec-mRFP-IC* Para expresar la proteína sec-mRFP-IC* en el interior del retículo endoplasmático, el plásmido pcDNA sec-mRFP-IC* se amplificó utilizando los siguientes cebadores: el cebador positivo fue 5´- CGGGATCCACCATGGGCTGGAGCCTGATCC-3´ y (diana EcoRI subrayada y ATG iniciador doblemente subrayado) como cebador negativo 5´- GCGTCTAGATTACGCTTCCACACGGGGTTC-3´ (diana XbaI subrayada y codon stop doblemente subrayado). El producto de PCR resultante se digirió y clonó entre las dianas EcoRI y XbaI del pFastBac1 para obtener un pFastBac sec-mRFP-IC*, que se usó para generar el baculovirus recombinante Bac-sec-mRFP-IC* que expresa la proteína denominada en resultados como sec-mRFP-IC* • Bac-IC-IGRP Para expresar la proteína IGRP etiquetada con el IC en su extremo aminoterminal, se sometió a amplificación el plásmido pCIneo-muNS (448-635) (Brandariz-Nuñez et al., 2010b). Como cebador positivo utilizamos 5´- GCATAAGAATGCGGCCGCTATCATGGCGGAAGATCACTTGTTGGCTTATC-3´ (diana NotI subrayada y ATG iniciador doblemente subrayado) y como cebador negativo utilizamos 5´-GCGTCTAGACGCTTCCACACGGGGTTCCCACTCAG-3´ (diana XbaI subrayada). El producto de PCR se clonó en el plásmido pFastBac IGRPHIS, cedido por el profesor Rubén Calviño (Santiago de Compostela, España) para generar el plásmido pFastBac IC-IGRP que se usó para generar el baculovirus recombinante Bac-IC-IGRP • Bac-Gc-IC Para expresar el ectodominio de la glucoproteína Gc del virus del Valle del Rift en el citosol, se utilizó como molde para la amplificación el plásmido pcDNA sec-SV5Gc-IC. Como cebador positivo utilizamos 5´- GGAATTCACCATGTGTTCAGAACTGATTC-3´ (diana EcoRI subrayada y ATG iniciador doblemente subrayada) y como cebador negativo 5CCGCTCGAGCGGTTACGCTTCCACACG-3´ (diana XhoI subrayada y codón stop Materiales y métodos ! 67 doblemente subrayado). El producto de PCR se clonó en el plásmido pFastBac 1 para generar el plásmido recombinante pFastBac Gc-IC que se usó para generar el baculovirus recombinante Gc-IC. 3.3.2 Expresión de proteína con baculovirus Tras determinar el título de los diferentes baculovirus recombinantes utilizados, infectamos con 5 ufp/célula un frasco con células Sf-9 en suspensión (1,5x106 células/ml) con una viabilidad superior al 99%. Las células se mantuvieron en un matraz Erlenmeyer agitándose a 120 rpm durante tres días a 28ºC, punto en el cual la expresión de proteínas bajo el promotor de la polihedrina suele alcanzar el máximo. 3.3.3 Generación de plásmidos duales para la expresión en bacterias • pET Duet 1.muNS-Mi Para expresar la proteína muNS-Mi en bacterias introducimos la secuencia de muNS-Mi en el plásmido pET Duet. El plásmido pCIneo-muNS (448-635) (BrandarizNuñez et al., 2010b) se sometió a amplificación usando como cebador positivo 5´- CATGCCATGGCACCAGCCGTACTGCTGTC-3´ (diana NcoI subrayada) y como cebador negativo 5´-TTGCGGCCGCAATCACAGATCATCCACC-3´ (diana NotI subrayada y codon stop doblemente subrayado). El producto amplificado se digirió y clonó en el plásmido pETDuet-1 para generar pET Duet 1.muNS-Mi • pET Duet 1. muNS-Mi 2. HaloTag-IC Para expresar la proteína HaloTag-IC al mismo tiempo que muNS-Mi, el plásmido recombinante pFastBac HaloTag-IC fue sometido a amplificación usando los siguientes cebadores: como cebador positivo 5´- GGAGATCTCGGATCCGAAATCGGTACAGGC-3´ (diana BglII subrayada) y como cebador negativo 5´-CCGATATCTTACGCTTCCACACGGGGTTCC-3´ (diana EcoRV subrayada y codón stop doblemente subrayado). El producto de PCR fue sometido a digestión y clonado en plásmido pET Duet 1.muNS-Mi para generar el plásmido pET Duet 1.muNS-Mi 2.HaloTag-IC. Materiales y métodos 68 • pET Duet 1. muNS-Mi 2. IC-IGRP Para expresar la proteína IC-IGRP al mismo tiempo que muNS-Mi, el plásmido pFastBac IC-IGRP se sometió a amplificación usando como cebador positivo 5´- GGAGATCTCGCGGAAGATCACTTGTTGGC-3´ (diana BglII subrayada) y como cebador negativo 5´- GGGATATCCTACTGACTCTTCTTTCCGC-3´ (diana EcoRV subrayada y codon stop doblemente subrayado). El producto amplificado se digirió y clonó en el plásmido pET Duet 1.FM para generar el plásmido pET Duet 1.muNS-Mi 2.IC-IGRP. • pET Duet 1. muNS-Mi 2. Gc-IC Para expresar la proteína Gc-IC al mismo tiempo que muNS-Mi, el plásmido pFastBac GC-IC* se sometió a amplificación usando como cebador positivo 5´- GGAGATCTCGTGTGTTCAGAACTGATTCAG-3´ (diana BglII subrayada) y como cebador negativo 5´- CCGCTCGAGCGGTTACGCTTCCACACG-3´ (diana XhoI subrayada y codon stop doblemente subrayado). El producto amplificado se digirió y clonó en el plásmido pET Duet 1.FM para generar el plásmido pET Duet 1.muNS-Mi 2.Gc-IC. 3.3.4 Expresión de proteínas con bacterias Para la expresión de proteína en bacterias se transforman BL21 DE3 Codon plus-RP (Stratagene) con el plásmido que contengan las secuencias para las proteínas de interés. Posteriormente se pone un precultivo de una colonia de esa placa y se deja en agitación a 37ºC overnight. Se diluye y se incuban a 37ºC hasta alcanzar una O.D.600: 0,4-0,6. Llegados a este punto inducimos las bacterias con 1mM de IPTG e incubamos a 37ºC en agitación durante 3 h. Las bacterias inducidas fueron centrifugadas a 3200 g durante 30´a 4ºC y lavadas dos veces con PBS 1X. Finalmente el pellet se resuspendió en tampón de lisis y se congeló antes de la purificación al menos 24 h. Materiales y métodos ! 69 3.3.5 Purificación de microesferas de bacterias El pellet de bacterias en tampón de lisis fue sonicado a amplitud máxima, 0,5 ciclos: dos sonicados de 1 min con descanso de 30 seg. Posteriormente se centrifugó a 2700 g, 5min a 4ºC. El pellet se lavó en TRB+ con 0´5% Triton X-100 y posteriormente se lavo 5 veces en TRB+. Finalmente el pellet fue resuspendido en TRB+ concentrándolo 10 veces del volumen inicial. 3.3.6 Análisis electroforético en geles SDS-PAGE La electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) se llevó a cabo tal y como describe (Laemmli, 1970). Las concentraciones de poliacrilamida o de ProtoGel (National Diagnostic, England) empleadas para el gel separador fueron del 12.5%, y para el gel concentrador del 4%. Después de la electroforesis, las proteínas se fijaron y tiñeron con 0,25% azul de Coomassie en 33% metanol y 10% ácido acético y se destiñeron en la misma disolución sin colorante. 3.3.7 Tratamiento con N-Glicosidasa Las células previamente transfectadas se recogieron en tampón de lisis que contiene 50 mM de TrisHCl (pH 8,0), 150 mM de NaCl y 0,5% de SDS. Para el tratamiento con N-Glicosidasa, se cogieron 10 µl de extracto celular y se añadió al mix: 2 unidades de N-Glicosidasa F (Roche), 6 µl del mismo buffer añadiendo 3 mM DTT, y 2 µl de 10% NP-40. Las muestras fueron incubadas a 37ºC durante 1 h y analizadas por Western-blot con los anticuerpos correspondientes. 3.4 Manipulación de cultivos celulares y virus 3.4.1 Condiciones de manipulación La manipulación de los materiales biológicos (líneas celulares y preparaciones virales) se realizó en condiciones estériles en el interior de una cabina de flujo laminar vertical. Las líneas celulares y los cultivos primarios se mantuvieron en el interior de un incubador Napco a 37ºC, con una humedad relativa del 95% y una presión parcial de CO2 del 5%. El material desechable se esterilizó en la autoclave antes de su Materiales y métodos 70 eliminación definitiva. Las células de insecto se mantuvieron en monocapa o suspensión (120rpm) en el interior de un incubador Sanyo e Innova, respectivamente, con humedad ambiental sin CO2 y a una temperatura de 28ºC. 3.4.2 Propagación y conservación de líneas celulares En el proceso de congelación, las células de los cultivos confluentes se disgregaron y se centrifugaron durante 5 min a 500 x g. Las células sedimentadas se resuspendieron en 500 µl de medio de cultivo y se añadieron 500 µL de medio de congelación (D-MEM suplementado con 40% de FBS y 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) como agente crioprotector). Las suspensiones celulares se dispensaron en alícuotas de 1 ml, en criotubos de conservación estériles. Los viales se mantuvieron a 4ºC durante 5 min, transfiriéndose posteriormente a –80ºC y, tras mantenerlos al menos 24 h a esa temperatura, se almacenaron en nitrógeno líquido para períodos largos de conservación. La descongelación de las células se realizó sumergiendo los viales en un baño de agua a 37ºC para conseguir una descongelación rápida. Posteriormente, el contenido del vial se transfirió a tubos que contenían medio de cultivo completo previamente calentado a 37ºC, y se centrifugaron durante 5 min a 500 x g para eliminar el medio de congelación. A continuación, las células sedimentadas se resuspendieron en medio de cultivo, se transfirieron a frascos de cultivo celular con medio y se incubaron a 37ºC. El medio se renovó antes de las 24 h para eliminar las posibles trazas de agente crioprotector y evitar una elevación de pH. 3.4.3 Transfección de células eucariotas con plásmidos de expresión transitoria Se crecieron monocapas semiconfluentes de células (aproximadamente 70% de confluencia), en placas de 12 pocillos. La transfección se llevó a cabo con complejos de DNA-liposomas empleando el sistema Lipofectamina 2000 (Thermo Fisher), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se mantuvieron a 37ºC durante 4 h. Al cabo de ese tiempo, se retiró la mezcla de transfección y se añadió medio suplementado con 10% FBS. Materiales y métodos ! 71 3.5 Técnicas inmunológicas 3.5.1 Transferencia de proteínas e inmunodetección por Western-blot. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana PVDF/Inmobilon-P (Millipore) en tampón de transferencia, durante 1 h a 100 voltios utilizando el sistema MiniProtean III (BioRad). Los sitios de unión inespecífica se bloquearon con 5% de leche desnatada en PBS-T (PBS conteniendo 0,05% Tween). La inmunodetección se realizó con los anticuerpos diluidos en PBS-T-leche con incubaciones entre 60-90 min y lavados con PBS-T para retirar los anticuerpos no unidos específicamente. Los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron con anticuerpos secundarios unidos a peroxidasa, y se revelaron con el sustrato Chemiluminiscent HRP Substrate (Millipore). 3.5.2 Inmunofluorescencia En el caso de inmunofluorescencia indirecta con 4% paraformaldehído (Sigma, Madrid, España) a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación se lavaron con PBS, y se permeabilizaron con 0,5% Tritón X-100 en PBS durante 5 min. Se lavaron con PBS y se incubaron en presencia de 2% BSA en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación se incubaron con una solución del anticuerpo primario diluido en 2% BSA en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Tras tres lavados con PBS, se incubaron con una solución del segundo anticuerpo y DAPI 100 µg/ml (tinción nuclear) diluidos en 2% BSA en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron cinco veces con PBS y se montaron sobre una gota de medio de montaje (ver soluciones y tampones) en un portaobjetos, para su observación al microscopio de fluorescencia. Cuando se quiso observar al microscopio de fluorescencia la proteína GFP o proteínas fusionadas a la GFP, el procedimiento fue el siguiente. Las células se fijaron con 4% paraformaldehído y tras lavar con PBS y permeabilizar con Tritón X-100 se montaron sobre una gota de medio de montaje en un portaobjetos. Materiales y métodos 72 Las imágenes se obtuvieron con una cámara digital Olympus DP-71 montada sobre un microscopio de fluorescencia Olympus BX51. Las fotos obtenidas se procesaron con Adobe Photoshop (Adobe Systems, California, USA) Las imágenes de confocal fueron obtenidas con un sistema confocal Andor Dragonfly con spinning disk montado sobre un microscopio Nikon TiE equipada con una cámara Zyla 4.2 (Andor). Las imágenes fueron procesadas con Imaris (Oxford Instruments), NIS elements (Nikon) o Adobe Photoshop (Adobe System, California, USA). 3.6 Tratamiento bioinformático de las secuencias Todas las construcciones fueron comprobadas por secuenciación de Sanger (Stab Vida, Portugal) Para el análisis básico de las secuencias obtenidas (sitios de restricción, secuencia que codifican las pautas de lectura, pesos moleculares teóricos, etc.) se utilizó el programa ApE - A plasmid Editor V2.0.53c (M. Wayne Davis). El alineamiento de secuencias de proteínas se llevó a cabo con el programa ApE - A plasmid Editor V2.0.53c (M. Wayne Davis). ! RESULTADOS Resultados ! 80 Figura 20. Estrategia I para el reensamblaje de fragmentos de GFP. A. Representación esquemática de la estrategia I. B. Análisis mediante inmunofluorescencia indirecta del reensamblaje de fragmentos de GFP. Se cotransfectaron monocapas semiconfluentes de células DF-1 con plásmidos de expresión que codifican para las proteínas indicadas a la derecha del panel. Tras 18 h.p.t. las células se fijaron y sometieron a inmunofluorescencia indirecta con el anticuerpo policlonal contra muNS (rojo) mientras que el reensamblaje de GFP se detectó por autofluorescencia de GFP (verde). Los núcleos se tiñeron de azul con DAPI. A B Resultados 81 1.3 Ambos fragmentos (CEGFP y NEGFP) etiquetados IC y coexpresados con muNS-Mi. Los resultados mostrados en el apartado anterior pueden deberse a que muNSMi es una proteína demasiado grande y podría impedir que el fragmento NEGFP estuviera totalmente accesible para reensamblarse de forma correcta con CEGFP y reconstituir la fluorescencia, o que la fusión le impida plegarse correctamente. Por ello se diseñó una segunda estrategia donde ambos fragmentos de EGFP se etiquetaron con IC, tanto en su extremo N-terminal como C-terminal (Tabla 3). Ambos se encontrarán dentro de las MS cuando se expresen junto con muNS-Mi. Tabla 3. Construcciones para el reensamblaje de fragmentos de GFP (estrategia II). En primer lugar comprobamos por Western-blot la expresión de las proteínas, tanto individualmente y en presencia o ausencia de muNS-Mi (Figura 21 A) como la expresadas conjuntamente, en presencia o ausencia de muNS-Mi (Figura 21 B). Los resultados obtenidos mostraron la correcta expresión de todas las versiones de los fragmentos en todas las circunstancias. Además se observó que los fragmentos CEGFP etiquetados con el IC se expresan a un nivel más bajo (Figura 21 A, carriles 1 y 2), que parece aumentar ligeramente cuando se coexpresan con muNS-Mi (Figura 21 A, carriles 5 y 6) lo que podría indicar que la proteína en el interior de las MS se estabiliza de alguna forma. Resultados ! 82 Figura 21. Análisis por Western-blot de la expresión de los diferentes fragmentos de GFP. A. Expresión de fragmentos individualmente en presencia y ausencia de muNS-Mi. Monocapas semiconfluentes de células DF1 se transfectaron con plásmidos que codifican para las diferentes versiones de fragmentos de GFP etiquetados con IC que se indican en la parte superior de la figura. Los fragmentos se expresaron en ausencia (carriles 1-4) o presencia (carriles 5-8) de muNS-Mi. Tras 18 h.p.t. se lisaron las células y los extractos fueron sometidos a Western-blot utilizando un anticuerpo contra muNS. B. Coexpresión de las diferentes versiones de los fragmentos individualmente en presencia y ausencia de muNS-Mi. Monocapas semiconfluentes de células DF-1 se cotransfectaron con las combinaciones de fragmentos de EGFP indicados en la parte superior de la figura, en ausencia (carriles 1-4) o presencia (carriles 5-8) de muNS-Mi. Tras 18 h.p.t. se lisaron las células y los extractos fueron sometidos a Western-blot utilizando un anticuerpo contra muNS. A B Resultados 83 Una vez comprobamos que la expresión de las proteínas es correcta, pasamos a analizar por microscopía de fluorescencia lo que ocurre al cotransfectar los fragmentos etiquetados con el IC en presencia de muNS-Mi. En primer lugar comprobamos la expresión por inmunofluorescencia de los fragmentos por separado y de las coexpresiones de los mismos en ausencia de muNS-Mi. Las células se sometieron a inmunofluorescencia indirecta y los resultados obtenidos mostraron expresión de todos los fragmentos tanto individualmente como en las diferentes combinaciones (Figura 22). Figura 22. Análisis por inmunofluorescencia de la expresión individual y coexpresión de los fragmentos de EGFP en ausencia de muNS-Mi. Se transfectaron o cotransfectaron monocapas semiconfluentes de células DF-1 con plásmidos de expresión que codifican para las proteínas indicadas a la derecha del panel. Tras 18 h.p.t. las células fueron fijadas y sometidas a inmunofluorescencia indirecta con el anticuerpo policlonal contra muNS (rojo). Los núcleos se tiñeron de azul con DAPI. Resultados ! 84 A continuación coexpresamos las diferentes combinaciones de ambos fragmentos de EGFP en presencia de muNS-Mi para comprobar si en la MS la proteína reconstituye su fluorescencia. Los resultados obtenidos de la inmunofluorescencia indirecta mostraron que a pesar de que las MS se formaban en todos los casos, en ninguna de las transfecciones encontramos fluorescencia verde, lo que nos indica que no hay reconstitución de ambos fragmentos de la proteína EGFP (Figura 23 B). Figura 23. Estrategia II para el reensamblaje de fragmentos de GFP. A. Representación esquemática de la estrategia II. B. Análisis mediante inmunofluorescencia del reensamblaje de fragmentos de GFP. Se cotransfectaron monocapas semiconfluentes de A B Resultados 85 células DF-1 con plásmidos que codifican para las proteínas indicadas a la derecha del panel. Tras 18 h.p.t. las células se fijaron y sometieron a inmunofluorescencia indirecta usando un anticuerpo policlonal contra muNS (rojo) mientras que el reensamblaje de GFP se detecta por autofluorescencia de la propia proteína al reensamblarse (verde). Los núcleos se tiñeron de azul con DAPI. Observando estos resultados pensamos en la posibilidad de introducir una secuencia de aminoácidos entre el IC y uno de los fragmentos de EGFP de forma que sirva como conector proporcionando mayor flexibilidad al fragmento de GFP correspondiente cuando esté incluido en las MS. En el laboratorio del profesor Óscar Burrone (Trieste, Italia) realizaron una construcción en la cual se introdujo una secuencia de aminoácidos correspondiente al epítopo SV5 entre el IC y el fragmento NGFP de forma que tenemos una nueva versión de uno de los fragmentos, IC-SV5NEGFP. En primer lugar comprobamos su expresión a través de Western-blot. Observamos una buena expresión individual de la proteína IC-SV5-NEGFP (Figura 24 A, carril 1) que disminuye considerablemente en las cotransfecciones con ambos fragmentos de CEGFP, teniendo estos últimos un nivel de expresión bastante bajo (Figura 24 A, carril 2 y 3). En este caso volvemos a observar que la expresión del fragmento CEGFP etiquetado aumenta en presencia de muNS-Mi (Figura 24 A, carril 4-6). Una vez comprobamos que las proteínas se expresaban, observamos por inmunofluorescencia indirecta si los fragmentos de EGFP se reensamblaban y emitían fluorescencia. Los resultados de la inmunofluorescencia mostraron que únicamente una célula de las transfectadas con los plásmidos que expresaban ICCEGFP, IC-SV5-NEGFP y muNS-Mi, mostraba fluorescencia verde y esta colocalizaba con las MS formadas por muNS-Mi (Figura 24 B). Estos datos nos llevan a pensar que el sistema funciona, pero en el estado actual no parece ser muy eficiente, por lo que no serviría para utilizar como un sensor de retrotranslocación eficaz. Resultados ! 86 Figura 24. Reensamblaje de fragmentos de EGFP (III). A. Análisis por Western-blot de la expresión de las proteínas. Se transfectaron monocapas semiconfluentes de DF-1 con plásmidos que expresan las proteínas indicadas en la parte superior de la imagen. Tras 18 h.p.t. se lisaron las células y los extractos fueron sometidos a análisis por Western-blot usando un anticuerpo contra muNS. B. Análisis del reensamblaje de fragmentos de EGFP por inmunofluorescencia. Se transfectaron capas semiconfluentes de células DF-1 con plásmidos que expresan las proteínas indicadas a la derecha de la imagen. Tras 18 h.p.t. se fijaron las células y se sometieron a inmunofluorescencia indirecta usando un anticuerpo contra muNS (rojo) y detectando el reensamblaje de EGFP por autofluorescencia de la propia proteína (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI. A B Resultados 87 2. ADAPTACIÓN DEL SISTEMA IC-TAGGING PARA EL INTERIOR DEL RETÍCULO ENDOPLÁSMICO (RE) 2.1 Introducción Las cápsides de los virus envueltos están rodeadas por una envoltura lipídica. Esta envoltura está cargada de glicoproteínas víricas, que se sintetizan dentro del lumen del RE, donde adquieren una serie de modificaciones como la adición de azúcares que son modificados posteriormente a través de la ruta secretora. Aunque la composición y la estructura final del azúcar añadido es importante para la función de las proteínas, la presencia de azúcares complejos en la envoltura lipídica de los virus envueltos también puede ser utilizada para evitar el sistema inmune del huésped (Dias et al., 2012; Murin et al., 2014). Sin embargo, la adición inicial del azúcar y el ambiente que presenta el RE, en algunas ocasiones influye en el plegamiento de la proteína (Braakman y Bulleid, 2011). En este trabajo nos propusimos adaptar nuestro método de etiquetado para el interior del RE. Como las MS se pueden usar como vacunas subunitarias libres de adjuvantes, la versión del RE abre la posibilidad de producir vacunas subunitarias seguras y estables contra virus envueltos, cuya estructura externa los convierte en un reto en el desarrollo de vacunas subunitarias. 2.2 Expresión y formación de MS dentro del RE Para la adaptación del sistema a este compartimento, lo primero que hicimos fue comprobar si la proteína muNS-Mi se podía expresar para formar MS en el interior del RE. En estudios anteriores en nuestro laboratorio se había comprobado que añadiendo a la secuencia de muNS-Mi una secuencia de localización nuclear (NLS) la hacía capaz de formar MS en el núcleo (Brandariz-Nuñez et al., 2010c). Como primera aproximación decidimos utilizar una versión de la muNS-Mi que lleva EGFP fusionada a su extremo N-terminal, GFP-muNS-Mi, para evitar el uso de anticuerpos y cualquier posible artefacto en la detección de las MS. Además, añadimos una secuencia señal o péptido señal en el extremo amino-terminal de la secuencia de GFP-muNS-Mi para dirigir la expresión de esta proteína hacia el RE. La secuencia Resultados ! 88 señal de entrada que utilizamos fue MGWSLILLFLVAVATGVHSQ y pasamos a denominar esta versión de la proteína sec-GFP-Mi (sec por “secretora”), que tiene un peso molecular de 52 kDa. El siguiente paso consistió en comprobar mediante microscopía de fluorescencia si sec-GFP-Mi dirige la formación de MS dentro del RE. Como control adicional, coexpresamos p53 etiquetada con IC que expresa en el citosol (Brandariz-Nuñez et al., 2010a) de modo que, si las MS están en el mismo compartimento citosólico, p53 quedará recluida en ellas, mientras que si están en el RE no habrá asociación entre ambas. Los resultados mostraron en primer lugar que sec-GFP-Mi forma MS perfectamente, que aparentemente son más pequeñas que las formadas por GFP-Mi (Figura 25 A, comparar los paneles superiores con los inferiores). En el caso de la cotransfección con GFP-Mi, p53-IC colocaliza con las MS además de aparecer en el núcleo como es de esperar (Figura 25 A, panel superior). Sin embargo, sec-GFP-Mi no muestra ningún tipo de colocalización con p53-IC, que se muestra en su totalidad en el núcleo celular (Figura 25 A, panel inferior), indicando que ambas proteínas están en compartimentos diferentes. Cuando una proteína se expresa dentro del RE sufre una serie de modificaciones propias de este orgánulo, fundamentalmente glicosilaciones o formación de puentes disulfuro. Para comprobar si sec-GFP-Mi presentaba alguna de estas modificaciones postraduccionales se transfectaron células DF-1 con plásmidos que expresan las proteínas sec-GFP-Mi y GFP-Mi. Las células se lisaron y los extractos obtenidos se trataron de tres formas diferentes antes de someterlos a electroforesis y Western-blot: i) en condiciones no reductoras utilizando tampón de carga de Laemmli para PAGE sin β-mercaptoetanol, ii) en condiciones reductoras, con el tampón de carga de Laemmli sin modificar y iii) en condiciones reductoras, con tampón de carga de Laemmli sin modificar y además tratándolos con NGlicosidasa F. Los extractos fueron entonces sometidos a PAGE y análisis por Western-blot, donde observamos que en condiciones no reductoras, además de aparecer la banda correspondiente al peso molecular esperado para sec-GFP-Mi (52 kDa), aparecían otras bandas de peso molecular superior, que podrían corresponder con la formación de dímeros, trímeros y tetrámeros de la proteína debido a la formación de puentes disulfuro (Figura 25 B, carril 1). Sin embargo, estas bandas no aparecían en la proteína expresada en el citosol (Figura 25 B, carril 2), lo que nos indicó que sec-GFP-Mi estaba en el interior del RE. Además, en las muestras incubadas en condiciones reductoras pudimos comprobar que sec-GFP-Mi presenta Resultados 89 un peso molecular aparentemente mayor del esperado (Figura 25 B, comparar carriles 3 y 4). Sin embargo, al tratar las muestras con N-Glicosidasa F el tamaño aparente se redujo, lo que indica que sec-GFP-Mi sufre una glicosilación que es eliminada por el enzima, lo que apoya la idea de que se encuentra en el interior del RE (Figura 25 B, comparar carriles 5 y 6). Figura 25. Expresión de la proteína sec-GFP-Mi en el interior del RE. A. Análisis por inmunofluorescencia de la formación de MS. Se transfectaron monocapas semiconfluentes de células DF-1 con plásmidos que expresan las proteínas indicadas a la derecha de la imagen. Tras 18 h.p.t. se fijaron las células y se sometieron a inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo monoclonal contra p53 (rojo) y observando las MS por autofluorescencia de GFP (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI. B. Análisis por Westernblot de la proteína sec-GFP-Mi dentro del RE. Se transfectaron monocapas semiconfluentes de células DF-1 con plásmidos que expresan las proteínas indicadas en la parte superior de la imagen. Tras 18 h.p.t. se lisaron las células y fueron tratadas en condiciones no reductoras (carriles 1 y 2) y condiciones reductoras (carriles 3-6) siendo en este caso no tratadas (carriles 3 y 4) o tratadas (carriles 5 y 6) con la enzima N-Glicosidasa F. La detección de la proteína se realizo usando un anticuerpo contra muNS. A B Resultados ! 96 2.4 Unión de glicoproteínas a MS en el interior del RE Una de las ideas que condujeron a este trabajo fue el desarrollo de vacunas contra virus envueltos, que poseen una envoltura lipídica cargada con glicoproteínas víricas. Estas glicoproteínas adquieren los azúcares tras pasar por la ruta secretora. Nuestra idea es cargar glicoproteínas víricas en las MS del RE para imitar la superficie de estos virus y así comprobar en el futuro si, al igual que las MS citosólicas, estas funcionan bien como vacunas. Para comprobarlo escogimos dos glicoproteínas diferentes: la glicoproteína G del Virus de la estomatitis vesicular (VSV) y la glicoproteína Gn del Virus de la Fiebre del Valle del Rift (RVFV). Para cargarlas en las MS decidimos sustituir sus respectivas regiones transmembrana por IC* y coexpresarlas con sec-Mi*. Para expresar el ectodominio de la glicoproteína VSV-G en el RE utilizamos su propia secuencia señal seguida del ectodominio. Además para la detección de esta proteína por inmunofluorescencia indirecta, para evitar el uso de anticuerpos, dispusimos la proteína mRFP en su extremo carboxilo terminal, y a continuación el dominio IC*. Además construimos otra versión de la proteína con la secuencia del epítopo SV5 en lugar de mRFP, lo que nos facilitaba su detección por Western-blot. Estas dos versiones de la glicoproteína las llamamos: sec-VSV-G-mRFP-IC* de 87 kDa y sec-VSV-G-SV5-IC* de 63 kDa. Una vez tenemos los plásmidos analizamos la expresión y unión de la proteína etiquetada a las MS en el interior del RE. Los estudios mediante microscopía confocal de células transfectadas mostraron que la proteína sec-VSV-G no colocalizaba con las MS (figura 30 A, panel superior), mientras que sec-VSV-G-IC* mostraba una colocalización perfecta con las mismas (Figura 30 A, panel inferior). Observando estos resultados pasamos a analizar por Western-blot si la glicoproteína se glicosilaba de igual forma cuando se asociaba con las MS. Los resultados obtenidos mostraron que el patrón de glicosilación observado es exactamente igual en ausencia de las MS, esté etiquetada con el IC* (Figura 30 B, carriles 3 y 4) o no (Figura 30 B, carriles 1 y 2). Puede observarse como la movilidad electroforética cambia cuando la proteína se trata con N-Glicosidasa F (Figura 30 B, comparar carriles 1 con 2 y 3 con 4). Cuando observamos la glicosilación en presencia de MS (Figura 30 B, carriles 5 a 8), el patrón es exactamente igual (Figura 30 B, comparar carriles 5 con 6 y 7 con 8). Esto nos indica que la glicosilación de la proteína en las MS ocurre de igual forma que cuando la proteína está libre en el RE. Resultados 97 Figura 30. Expresión y unión a MS de la proteína VSV-G en el RE. A. Análisis por microscopía confocal de la unión de la glicoproteína VSV-G a MS. Se transfectaron monocapas semiconfluentes de células DF-1 con plásmidos que expresan las proteínas indicadas a la derecha de las imágenes. Tras 18 h.p.t. fijamos las células y las sometemos a inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo policlonal contra muNS (verde) y detectando VSV-G por autofluorescencia de la proteína mRFP (rojo). Los núcleos se tiñeron con DAPI. B. Análisis de la glicosilación de la proteína VSV-G. Monocapas semiconfluentes de células DF-1 se transfectaron con plásmidos que expresan las proteínas indicadas en la parte superior de la figura. Tras 18 h.p.t. se lisaron las células en tampón de lisis de glicosidasa y se trataron en condiciones de presencia (+) o ausencia (-) de N-Glicosidasa F. La detección de la proteína sec-muNS-Mi* se realizó usando un anticuerpo policlonal contra A B Resultados ! 98 muNS, en cuanto a la detección de la glicoproteína VSV-G se detectó usando un anticuerpo monoclonal contra el tag SV5. Como un segundo ejemplo de la incorporación de proteínas víricas a MS en el RE utilizamos, como hemos comentado, el ectodomnio de la glicoproteína Gn del Virus de la Fiebre del Valle del Rift. Para introducir el ectodominio en el interior del RE lo que hicimos fue disponer una secuencia señal seguida del epítopo SV5 en el extremo aminoterminal de la proteína. Posteriormente añadimos el IC* al extremo Cterminal de la proteína. En primer lugar comprobamos el nivel de expresión de la proteína y su asociación a las MS por microscopía confocal. Los resultados obtenidos mostraron que la glicoproteína Gn se expresaba en el interior del RE perfectamente, además cuando no estaba etiquetada con IC* no mostraba colocalización con las MS (Figura 31 A, panel superior) mientras que la versión etiquetada mostró una colocalización total con las mismas (Figura 31 A, panel inferior). A continuación analizamos mediante Western-blot su patrón de glicosilación en presencia o ausencia de MS. Los resultados obtenidos mostraron que la proteína sin etiquetar presentaba un cambio en la movilidad electroforética al ser tratada con la enzima N-Glicosidasa F, tanto en ausencia (Figura 31 B, comparar carriles 1 y 2) como en presencia (Figura 31 B, comparar carriles 5 y 6) de sec-Mi*. En el caso de la proteína etiquetada, vemos como igualmente tanto en presencia como ausencia de la proteína sec-Mi*, Gn cambia la movilidad electroforética al ser tratada con la enzima N-Glicosidasa F (Figura 31 B, comparar carriles 3 con 4 y 7 con 8) y los patrones electroforéticos son exactamente iguales. Los resultados obtenidos tanto con VSV-G como con Gn nos permiten afirmar que se pueden cargar glicoproteínas en las MS dentro del RE y que los patrones de glicosilación no parecen verse afectados por su inclusión en MS. Resultados 99 Figura 31. Expresión y unión a MS de la proteína Gn en el interior de RE. A. Análisis por microscopía confocal de la unión de la glicoproteína a las MS en el interior del RE. Monocapas semiconfluentes de células DF-1 se transfectaron con plásmidos que expresan las proteínas indicadas en la parte derecha de la imagen. Tras 18 h.p.t se fijaron las células y se sometieron a inmunofluorescencia indirecta usando un anticuerpo policlonal contra muNS para detectar las MS (verde), un anticuerpo monoclonal contra SV5 para la detección de la proteína Gn (rojo). Los núcleos se tiñeron con DAPI. B. Análisis por Western-blot de la glicosilación de la proteína Gn. Monocapas semiconfluentes de células DF-1 se transfectaron con plásmido que expresan las proteínas indicadas en la parte superior de la imagen. Tras 18 h.p.t. se lisaron las células con el tampón de lisis para glicosidasa y se trataron en ausencia (-) o presencia (+) del enzima N-Glicosidasa F. Para la detección de secMi* se utilizó un anticuerpo policlonal contra muNS mientras que para la detección de Gn se utilizó un anticuerpo monoclonal contra el epítopo SV5. A B Resultados ! 100 2.5 Unión de glicoproteínas a MS en el RE - sistema de expresión de baculovirus Como una de nuestras intenciones era el posible desarrollo de vacunas contra virus envueltos, decidimos reproducir todo el sistema en el sistema de expresión de baculovirus y células de insecto, con objeto de producir cantidades suficientes de proteína para poder realizar ensayos de vacunación en el futro, como se hizo con las MS citosólicas (Marín-López et al., 2014). Para este fin, en primer lugar creamos un baculovirus para expresar la proteína sec-Mi* en células de insecto. Una vez generado el baculovirus, infectamos células Sf9 y tras 72 h.p.i. analizamos la expresión a través de inmunofluorescencia y electroforesis. Observamos que en comparación con las células infectadas con el baculovirus WT, los extractos de células infectadas con el nuevo baculovirus recombinante presentan una proteína con un peso molecular aparente de 20 kDa, que corresponde al peso de sec-Mi* (Figura 32 A, comparar carriles 1 y 2). Al analizar las células infectadas por microscopía de fluorescencia comprobamos que mientras muNS-Mi genera unas microesferas citosólicas de un tamaño considerable y que se asocian con GFP etiquetada con el IC (Figura 32 B, 1), la proteína del interior del RE genera unas microesferas mucho más pequeñas que, al estar en un compartimento diferente, no colocaliza en absoluto con la GFP-IC (Figura 32 B, 2). A continuación coinfectamos células de insecto con los baculovirus que dirigen la expresión de sec-Mi* y sec-mRFP-IC* y observamos mediante microscopía confocal que la proteína etiquetada colocaliza perfectamente con las microesferas del RE (Figura 32 B, 3) al igual que lo observado con plásmidos de expresión. Estos resultados demuestran que podemos reproducir el sistema del RE usando el sistema de expresión de baculovirus y células de insecto. Resultados 101 Figura 32. Sistema en el RE de células de insecto. A. Análisis electroforético de la expresión de sec-Mi*- Se infectaron monocapas semiconfluentes de células SF-9 con BV WT (carril 1) y BV sec-Mi* (carril 2). Tras 72 h.p.i. recogemos las células y las lisamos. Cargamos el extracto en un gel de electroforesis y posteriormente teñimos con azul de Coomassie. B. Inmunofluorescencia de células SF-9. Se infectaron monocapas de células SF-9 con los baculovirus que expresan las proteínas indicadas a la derecha de la imagen. Tras 72 h.p.i se fijaron las células y se sometieron a inmunofluorescencia indirecta usando un anticuerpo policlonal contra muNS (rojo en paneles 1 y 2 verde en panel 3) y observando las proteínas etiquetadas con el IC por autofluorescencia verde (paneles 1 y 2) o roja (panel 3). Los núcleos se tiñeron con DAPI. A B Resultados ! 102 3. EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DIFÍCILES 3.1 Introducción La obtención de proteínas de membrana tanto de eucariotas como de procariotas es un proceso extremadamente difícil. Normalmente la cantidad de estas proteínas en las células es bastante pequeña, de forma que la única manera de obtener grandes cantidades de ellas para diversas aplicaciones, como determinar su función, estructura o ser empleadas en estudios inmunológicos, pasa por su clonación en diversos vectores y la introducción de éstos en organismos que permitan expresar grandes cantidades como bacterias o levaduras. Sin embargo, la gran mayoría de estas proteínas son tóxicas una vez que se induce su sobreexpresión en distintos organismos, limitando enormemente la posibilidad de obtener cantidades apreciables de éstas. La proteína glucosa-6-fosfatasa-2 ("Islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein", IGRP) es un antígeno importante en el desarrollo de la diabetes tipo 1 (T1D) o diabetes insulino-dependiente. En esta enfermedad, el sistema inmunitario de los pacientes diabéticos destruye específicamente las células productoras de insulina de los islotes de Langerhans pancreáticos. Para que dicha destrucción tenga lugar, los linfocitos de estos pacientes son activados por distintas proteínas o antígenos expresadas por las células productoras de insulina como son la propia insulina, la isoforma de 65 kDa de la decarboxilasa del ácido glutámico (GAD65), el antígeno 2 asociado a insulinoma (IA-2) o, más recientemente IGRP, antígeno que fue identificado al descubrirse que era el objetivo reconocido por un linfocito T CD8 murino altamente diabetogénico, el clon 8.3 (Lieberman et al., 2003). Más importante es el hecho de que el número de linfocitos específicos para este antígeno en sangre periférica de ratones NOD ("Non-Obese Diabetic" mice), el modelo murino de la T1D humana, es capaz de predecir el desarrollo de síntomas clínicos de la enfermedad (Trudeau, 2003) y que en el páncreas de ratones NOD diabéticos la presencia de linfocitos T CD8 específicos para este antígeno es la población más prevalente en los primeros estadios del rechazo de trasplantes de islotes (Wong et al., 2006). Además de en el ratón NOD, este antígeno es también un objetivo de la respuesta inmunitaria en pacientes diabéticos humanos (Jarchum et al., 2008), lo Resultados 103 que hace necesaria su producción y purificación para poder realizar, entre otras cosas, estudios de la respuesta autoinmune en pacientes diabéticos o incluso su posible uso en el futuro como vacuna que pudiese prevenir el desarrollo de la enfermedad. La incapacidad de producir cantidades apreciables de IGRP han limitado en gran medida los estudios acerca de cuáles son los segmentos (péptidos) reconocidos durante la respuesta autoinmune, algo necesario para diseñar en el futuro posibles vacunas basadas en éstos. Además, al no tener proteína purificada no es posible comprobar en modelos animales, como el ratón NOD, la efectividad de una terapia a la hora de prevenir el desarrollo de síntomas clínicos de la enfermedad. Hoy en día apenas existen publicaciones donde se mencione la expresión y purificación de esta proteína. Un trabajo mencionan haber clonado la pauta de lectura abierta correspondiente a la IGRP murina y expresado dicha proteína como una proteína de fusión con la beta-galactosidasa, indicando que la proteína se encuentra en cuerpos de inclusión que los autores dicen purificar mediante electroforesis preparativa y emplear dicha proteína para obtener anticuerpos por inmunización de conejos (Martin et al., 2001). Otro grupo de investigación describe la expresión y purificación de IGRP con el sistema de baculovirus (Petrolonis et al., 2004). En ninguno de estos trabajos se describe la producción de IGRP en cantidades significativas. Por tanto, existe la necesidad de nuevos métodos para la expresión y purificación de esta proteína. 3.2 Expresión de IGRP con el sistema de baculovirus Como nuestro método consiste en incluir proteínas etiquetadas en MS, esto podría ayudar a disminuir el efecto nocivo que pudiera presentar la expresión de una proteína citotóxica, especialmente si la citotoxicidad depende de una localización celular concreta. Por tanto decidimos utilizar nuestro sistema para intentar expresar la proteína IGRP etiquetada con el IC en su extremo aminoterminal que la reclute a las MS. Para ello generamos un baculovirus que exprese la proteína IC-IGRP, que tiene un peso molecular calculado de 50 kDa. Para comprobar la expresión de la proteína infectamos células Sf9 con el baculovirus IC-IGRP o las coinfectamos con IC-IGRP y el baculovirus de muNS-Mi. Al analizar mediante PAGE los extractos de las células infectadas, comprobamos que no había expresión alguna de IC-IGRP al Resultados ! 104 expresarla individualmente, ya que no aparecía ninguna banda en comparación con los extractos de las células infectadas con el baculovirus WT (Figura 33, comparar carriles 1 y 2). Es más, sorprendentemente nos encontramos con que, en la coinfección de los BV de muNS-Mi e IGRP, no solo no se expresaba en absoluto la proteína IGRP, sino que la coinfección con el baculovirus que dirige su expresión provoca la total inhibición de la expresión de muNS-Mi (Figura 33, comparar el carril 3 con el 4), lo que a su vez impide incluir la proteína tóxica en el interior de las microesferas. Figura 33. Expresión de IC-IGRP en con el sistema de baculovirus y células de insecto. Se infectaron células de insecto con los BV WT (carril 1) IC-IGRP (carril 2), muNS-Mi (carril 3) y se coinfectaron con IC-IGRP y muNS-Mi (carril 4). A las 72 h.p.i. se lisaron las células y se cargó el extracto en un gel de electroforesis que posteriormente se tiñó con azul de Coomassie. La banda correspondiente a la proteína está indicada a la derecha de la imagen. 3.3 Adaptación del sistema IC-Tagging a bacterias Como el sistema de expresión de baculovirus y células de insecto parecía no servir para esta proteína, decidimos probar un sistema de expresión diferente, con células más resistentes como las bacterias, que además tienen un sistema metabólico completamente diferente. Para desarrollar el sistema en bacterias necesitamos de la expresión simultánea de dos proteínas. Por ello decidimos utilizar un plásmido de expresión Dual denominado pDuet-1 (Novagen) que presenta dos policonectores (MCS) diferentes, ambos controlados por el promotor T7. Lo primero que comprobamos fue si éramos capaces de expresar la proteína muNS-Mi en bacterias, Resultados 105 y si una vez expresada formaba microesferas. Para ello introdujimos la secuencia de muNS-Mi en el primer MCS del plásmido pET Duet-1. Una vez generado el plásmido, comprobamos la expresión de la proteína induciendo bacterias BL21 (DE3) Codon Plus-RP transformadas con el mismo. Tras 3 horas de inducción lisamos las bacterias y las analizamos mediante electroforesis. Los resultados obtenidos mostraron que, a diferencia de las bacterias sin plásmido donde el IPTG no inducía la expresión de proteína alguna (Figura 34 A, comparar carriles 1 y 2), las bacterias que contenían el plásmido de expresión, al ser inducidas con IPTG presentaban una banda a la altura de 20 kDa que se corresponde con el peso calculado de muNS-Mi (Imagen 34 A, comparar carriles 3 y 4). Cuando analizamos por microscopía electrónica las bacterias donde se había inducido la expresión de muNS-Mi, observamos la presencia de unas estructuras esféricas en su interior con un diámetro aproximado de 0,4 µm, que podrían corresponder con MS, aunque mucho más pequeñas que las observadas en las células eucariotas (Figura 34 B). Figura 34. Expresión de muNS-Mi en bacterias. A. Análisis electroforético de la expresión de muNS. Bacterias transformadas (carriles 3 y 4) y no transformadas (carriles 1 y 2) con el plásmido de expresión de muNS-Mi se indujeron con IPTG durante 3 horas a 37ºC en agitación. Posteriormente se lisaron y se cargó el lisado en un gel de electroforesis que se tiñó con azul de Coomassie. Las muestras inducidas están cargadas en los carriles 2 y 4. B. Análisis mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Bacterias con el plásmido de expresión de muNS-Mi inducidas con IPTG. Las estructuras esféricas se señalan con flechas. A B Resultados ! 112 correspondientes a las proteínas se indican a la derecha de la imagen. C. Análisis electroforético de la purificación de muNS-Mi y Gc-IC en bacterias. Extractos de bacterias inducidas se purificaron siguiendo el mismo protocolo descrito en la figura 30. El gel de se tiñó con azul de Coomassie. Las muestras cargadas corresponden al extracto total de las bacterias (carril 1), el sobrenadante después del lisado (carril 2), el sobrenadante del primer lavado (carril 3) y por último el material purificado. Viendo que nuestro sistema servía para expresar y purificar una proteína cuya expresión por métodos convencionales resulta complicada, quisimos comprobar si podíamos utilizarlo para expresar la proteína de membrana IGRP cuya expresión provocaba el bloqueo de la expresión de muNS-Mi en células de insecto. Lo primero fue generar un plásmido dual de expresión en bacterias para expresar conjuntamente muNS-Mi y IC-IGRP. A continuación comprobamos si existía expresión induciendo las bacterias transformadas con dicho plásmido. En principio no observamos la aparición de ninguna banda que corresponda a IC-IGRP; sin embargo, al contrario de las células Sf9, en este caso sí encontramos que había expresión de muNS-Mi (Figura 38 A, carril 2). Decidimos entonces purificar las microesferas y concentrarlas para comprobar si podíamos detectar la expresión de IC-IGRP. Cuando analizamos las MS purificadas, encontramos que además de la banda de muNS-Mi, aparecía una banda a la altura del peso molecular que corresponde a IC-IGRP (Figura 38 B, carril 4). Para comprobar si dicha banda corresponde con la proteína etiquetada, decidimos analizar mediante Western-blot utilizando un anticuerpo contra muNS que detectó esa banda de 50 kDa, lo que indicaba que se trataba de IC-IGRP. Para confirmarlo definitivamente, lavamos el gel varias veces con agua Milli-Q. Posteriormente cortamos la banda del gel de acrilamida y la analizamos mediante espectroscopia de masas CID/ETD, que os permitió obtener la secuencia de varios péptidos correspondientes a la proteína IGRP. Resultados 113 Figura 38. Análisis electroforético de la expresión de IC-IGRP en bacterias. A. Prueba de expresión. Bacterias transformadas con el plásmido de expresión dual se indujeron con 1mM de IPTG durante 3 h a 37ºC en agitación. Posteriormente se lisaron las bacterias y se analizaron mediante electroforesis que se tiñó con azul de Coomassie. Observamos las bacterias no inducidas en el carril 1 y las inducidas en el carril 2. Las bandas correspondientes a las proteínas se indican a la derecha de la imagen. B. Purificación de muNS-Mi + IC-IGRP. Bacterias inducidas se purificaron siguiendo el mismo protocolo descrito en la figura X. El gel de se tiñó con azul de Coomassie. Observamos el extracto total de las bacterias (carril 1), el sobrenadante después del lisado (carril 2), el sobrenadante del primer lavado (carril 3) y por último el purificado concentrado 10 veces el volumen inicial y desmontado con 10% SDS durante 15 min a RT. C. Western-blot de la purificación de muNS-Mi+IC-IGRP. Muestras de purificaciones de muNS-Mi y muNS-Mi + IC-IGRP desmontadas con 10% de SDS. Para detectar ambas proteínas se utilizó un anticuerpo policlonal primario contra muNS. Los plásmidos de expresión utilizados están indicados en la parte superior de la imagen y las proteínas están indicadas a la derecha de la imagen. A B C Resultados ! 114 4. CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LAS MS Con el objeto de conocer a fondo el funcionamiento de nuestro método, para poder así sacarle el mayor partido posible, nos propusimos obtener la mayor cantidad de información estructural posible de muNS-Mi, de su ensamblaje en microesferas y de cómo se asocian las proteínas etiquetadas con IC a ellas. 4.1 Observación al TEM de secciones de MS producidas en baculovirus En primer lugar nos propusimos ver qué aspecto presentaban al microscopio electrónico secciones de MS obtenidas con el sistema de baculovirus. Para ello, células Sf9 incubaron durante siete días tras haber sido infectadas con el baculovirus que expresa muNS-Mi, se centrifugaron y fijaron con glutaraldehido, tras lo cual se incluyeron en EPON, se hicieron cortes ultrafinos que se observaron al microscopio electrónico. En las imágenes obtenidas parecen observarse haces de fibras que se disponen en varias orientaciones en el espacio (Figura 39), aunque tampoco permiten sacar demasiadas conclusiones. La observación de esferas que contenían una proteína etiquetada no fue concluyente a la hora de inferir cómo se asocian las proteínas etiquetadas a las MS (no mostrado). Se generaron también MS conteniendo metalotioneína y tras incubarlas con oro (Risco et al., 2012) se observaron sin contrastar con objeto de visualizar posibles clústeres de oro que nos indicasen las posiciones de la proteína etiquetada, pero desafortunadamente no fuimos capaces de detectar nada reseñable (no mostrado). Resultados 115 Figura 39. Microscopia electrónica de transmisión de las MS. Secciones de células Sf9 conteniendo MS (ver texto). Las imágenes muestran una célula completa conteniendo una MS (imagen superior izquierda) la barra blanca corresponde a 2 µm. La imagen más ampliada corresponde a un corte de la MS (imagen grande) la barra blanca corresponde a 200 nm. 4.2 Intento de obtención de la estructura tridimensional de muNS-Mi Como hemos comentado en la sección 3.3, somos capaces de producir muNSMi en gran cantidad y podemos solubilizarla retirándole los iones divalentes. Nos pusimos en contacto con los doctores Mark van Raaij y Carmen San Martín (CNBCSIC Madrid), para intentar resolver su estructura mediante las técnicas de cristalografía de rayos X y/o reconstrucción de partícula única por cryo-EM. La cristalografía fue imposible ya que la proteína tenía una fuerte tendencia a agregarse al concentrarla, lo que imposibilitaba la formación de cristales. La observación al EM de la proteína concentrada produjo imágenes que mostraban unas estructuras en forma fibrosa (Figura 40), pero no eran lo suficientemente regulares para poder obtener información estructural detallada. Resultados ! 116 Figura 40. TEM de la proteína concentrada. La proteína expresada en bacterias tiende a agregarse lo que impide la formación de cristales. La imagen muestra lo que observamos haciendo microscopia electrónica de transmisión de la proteína concentrada. 4.3 Estudio de la distribución de las proteínas etiquetadas en el interior de las MS mediante microscopía de super-resolución Para obtener información sobre la distribución que las proteínas etiquetadas con IC tienen en las MS, nos propusimos detectar la proteína verde fluorescente etiquetada por microscopía de super-resolución. Para ello cotransfectamos células Vero simultáneamente con los plásmidos que dirigen la expresión de muNS-Mi y GFPIC. Tras 24 horas de incubación, las células se fijaron y la proteína muNS se detectó mediante immunofluorescencia indirecta y las muestras se observaron en un microscopio de super-resolución STED (en colaboración con el Dr. Francisco Rodríguez CNB-CSIC, Madrid). Como puede verse en la Figura 41, GFP-IC se distribuye por todo el volumen de la esfera, no solo en la superficie, sino que forma parte de toda la estructura de la esfera. Esto está en consonancia con nuestros resultados al purificar proteínas asociadas a esferas, donde habitualmente encontramos una relación 1:1 entre muNS-Mi y la proteína etiquetada. El anticuerpo contra muNS solo marca la corteza exterior de la esfera. Esto se debe a que las muestras se fijaron antes del marcaje y el anticuerpo es incapaz de acceder al interior. Resultados 117 Figura 41. Microscopia de super-resolución de las MS. Se transfectaron monocapas de células Vero con plásmidos de expresión para las proteínas muNS-Mi y GFP-IC. Tras 18 h.p.t. se fijaron las células y se sometieron a inmunofluorescencia indirecta usando un anticuerpo policlonal contra muNS (rojo) y observando GFP-IC por autofluorescencia de la propia proteína (verde). Las muestras se observaron en un microscopio de super-resolución. La imagen 1 muestra una reconstrucción en 3D de la microesfera mientras que en la imagen 2 observamos un corte transversal de la misma. DISCUSIÓN Discusión ! 121 1. DESARROLLO DE SENSORES BASADOS EN EL REENSAMBLAJE DE FRAGMENTOS DE GFP UTILIZANDO EL SISTEMA IC-TAGGING. La idea del reensamblaje de EGFP o de otras proteínas fluorescentes para estudiar la interacción entre proteínas, se basó en los ensayos de complementación de biomoléculas fluorescentes. Estos utilizaban cremalleras antiparalelas de leucina dispuestas de tal forma que inducen el reensamblaje de la molécula fluorescente (Figura 42). Además, estas cremalleras de leucina presentan una serie de residuos ácidos y básicos que favorecen la heterodimericación, y otros que impiden la homodimerización. Las cremalleras se unen a los fragmentos de EGFP a través de un conector que presenta un número de residuos tal que permite la flexibilidad necesaria para un buen acoplamiento (Ghosh et al., 2000; Kodama y Hu, 2012). Uno de los objetivos de este trabajo fue la adaptación de esta estrategia de reensamblaje de EGFP a partir de versiones truncadas para intentar crear un sensor de retrotranslocación de proteínas del retículo endoplasmático. En nuestro caso los fragmentos de EGFP no estaban unidos a cremalleras de leucina, sino que se aproximaban a través de la relocalización provocada por nuestro método IC-Tagging. De esta manera, la reclusión de los fragmentos en MS no solo serviría para forzar el re-ensamblaje de EGFP, sino también para concentrar la señal fluorescente en las MS, proporcionando así un resultado claro, nítido e inequívoco. En primer lugar intentamos etiquetar uno de los fragmentos con el IC mientras que el otro estaba fusionado a muNS-Mi de forma que cuando el IC se une a las MS, provoca que ambos fragmentos se acerquen para la reconstrucción de la proteína fluorescente. Los resultados que obtuvimos mostraron que no existía reensamblaje, bien porque la unión del IC a la inclusión no permite que los fragmentos queden lo suficientemente cercanos para interaccionar, que la fusión de uno de los fragmentos a muNS-Mi estorbe al plegamiento del fragmento o a la interacción con su complementario, o al conjunto de todas esas causas. Lo siguiente que intentamos fue etiquetar los dos fragmentos con la región IC y enviarlos conjuntamente a las MS formadas por muNSMi. En este caso si encontramos reensamblaje cuando en una de las construcciones etiquetadas con el IC disponíamos un linker entre el fragmento de EGFP y el IC de forma que dábamos más flexibilidad a la molécula. Sin embargo encontramos que la eficiencia en el reensamblaje era muy baja. Esto puede deberse a varias causas, la Discusión ! 128 individuales. Lo que observamos, sin embargo, fueron agregados fibrosos irregulares, lo que coincidía con lo observado en los cortes de MS formadas en células de insecto. Finalmente, y a través de una colaboración con el Dr. Francisco Rodriguez (CNB-CSIC, Madrid) realizamos microscopia de super-resolución a MS formadas en células eucariotas que integraban la proteína EGFP etiquetada con IC, con objeto una vez más, de identificar en qué zona o zonas de las MS se disponían las proteínas etiquetadas. Si las proteínas están solamente en el interior, solo en exterior o en toda la esfera es un dato a tener en cuenta a la hora de su uso como vacunas. Gracias a la microscopia de super-resolución encontramos que la proteína GFP-IC se dispone por todo el volumen de la MS, tanto en su interior como en la superficie, tal y como esperábamos. En nuestro intento de conseguir resolver la estructura cristalina de esta proteína estamos estudiando la posibilidad de utilizar otras versiones de muNS-Mi. En nuestro laboratorio hemos encontrado que eliminando uno de los dominios de muNS, bien sea el C1 como el CT, la nueva versión truncada es incapaz de formar MS o cualquier tipo de inclusiones en las células transfectadas. Por tanto, es de esperar que estas versiones tampoco tengan tanta tendencia a agregarse a concentraciones altas, lo que las convierte en candidatas ideales para intentar cristalizarla y resolver la estructura parcial por cristalografía de rayos X. También pretendemos obtener información estructural de como se pliegan diferentes regiones y dominios de la proteína mediante dicroísmo circular a partir de estas versiones de muNS-Mi soluble. Con la información obtenida, aunque parcial, esperamos obtener las pistas suficientes que nos revelen las bases de las interacciones monómeromonómero de muNS que conducen a la formación de estas inclusiones ordenadas. ! CONCLUSIONES Conclusiones ! 131 De los resultados obtenidos en el presente trabajo se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. El reensamblaje de fragmentos de GFP necesita que ambos fragmentos tengan buena movilidad para que se reconstituya la proteína. 2. La expresión de sec-GFP-Mi y sec-Mi en el interior del retículo endoplasmático provoca que la proteína se glicosile. 3. La glicosilación de sec-Mi provoca una baja eficiencia en la formación de MS que se soluciona con la mutación del sitio de glicosilación de la proteína. 4. Es posible cargar las MS formadas en el RE con glicoproteínas de forma que estas adquieren las mismas modificaciones que si son expresadas de forma individual. 5. Podemos expresar y formar MS en el interior de bacterias que son fácilmente desmontables en ausencia de cationes divalentes 6. El IC-Tagging en bacterias permite la expresión y purificación de proteínas difíciles y tóxicas cuya expresión no es posible con otros métodos convencionales. 7. Las proteínas etiquetadas con el IC se disponen tanto en la superficie de las MS como en su interior. ! REFERENCIAS Referencias ! 135 Allsopp, C.E.M., Plebanski, M., Gilbert, S., Sinden, R.E., Harris, S., Frankel, G., Dougan, G., Hioe, C., Nixon, D., Paoletti, E., Lajton, G. y Hill, A.V.S. (1996). Comparison of numerous delivery systems for the induction of cytotoxic T lymphocytes by immunization. Eur. J. Immunol., 26(8), pp.1951-1959. Barreiro-Piñeiro, N., Menaya-Vargas, R., Brandariz-Núñez, A., Otero-Romero, I., Lostalé-Seijo, I., Benavente, J. y Martínez-Costas, J.M. (2016). Using IC-Tagging Methodology for Production and Purification of Epitope-Loaded Protein Microspheres for Vaccination. Methods Mol. Biol., 1349, pp.25-34. Benavente, J. y Martínez-Costas, J. (2007). Avian reovirus: Structure and biology. Virus Res., 123(2), pp.105-119. Benavente, J. y Martínez-Costas, J. (2006). Early steps in avian reovirus morphogenesis. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 309, pp.67-85. 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