A kalciumhomeosztázis regulációjában szerepet játszó fehérjék vizsgálata porc- és vázizomsejtekben

1 EGYETEMI DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS A kalciumhomeosz ázis egulációjában sze epe já szó ehé jék izsgála a po c- és ázizomsej ekben Tó h Ad ienn Téma eze ő: P o . D . Cse noch László DEBRECENI EGYETEM MOLEKULÁRIS ORVOSTUDOMÁNY DOKTORI ISKOLA DEBRECEN 2015 2 Ta alomjegyzék Rö idí ések jegyzéke .................................................................................................................. 4 Be eze és .................................................................................................................................... 6 I odalmi á ekin és ...................................................................................................................... 6 A po c- és a ázizomszö e közös mezenhimális e ede e ...................................................... 6 A po cszö e ....................................................................................................................... 7 A po c ejlődése, áplálása, ö egedése ................................................................................ 7 A hialinpo c elépí ése ........................................................................................................ 8 A po cdi e enciálódás anulmányozásá a szolgáló modellek .......................................... 10 A po cdi e enciálódás lépései .......................................................................................... 12 A po cdi e enciálódás in acellulá is szabályozása ......................................................... 12 Az in acellulá is Ca2+-koncen áció sze epe a di e enciálódási olyama ban ................ 13 Pu in ecep o ok ................................................................................................................. 15 A ázizom ............................................................................................................................. 17 A ázizomsej ek ................................................................................................................ 17 A ázizom mo ológiai sajá ságai ..................................................................................... 18 Izom ejlődés ...................................................................................................................... 19 A ázizom éle ani sajá osságai ........................................................................................ 20 Rianodin ecep o (RyR) ................................................................................................... 21 Sza koplazma ikus e ikulum Ca2+ ATP-áz (SERCA) ..................................................... 21 Az in acellulá is kalcium sej éle ani jelen ősége az izom ejlődés so án ........................ 23 Célki űzés ................................................................................................................................. 25 Anyagok és módsze ek ............................................................................................................. 27 Sej kul ú ák ........................................................................................................................... 27 Po c enyésze .................................................................................................................... 27 C2C12 ázizomsej ek ....................................................................................................... 28 Liposzóma mediál ansz ekció ........................................................................................... 28 Immunci okémia ................................................................................................................... 30 RT-PCR analízis ................................................................................................................... 31 Fehé jemin ák készí ése ........................................................................................................ 34 Wes e n-blo analízis ............................................................................................................ 34 Egyedi sej eken ö énő luo eszcens in acellulá is [Ca2+]-mé és ....................................... 36 A sej p oli e áció és di e enciáció izsgála a ...................................................................... 40 3 Kalcineu in-enzimak i i ás mé ése ...................................................................................... 40 S a isz ikai analízis ............................................................................................................... 41 E edmények .............................................................................................................................. 42 E edmények I.-Po cszö e .................................................................................................... 42 Az IP3- ecep o on ke esz ül, a belső ak á ból elszabaduló Ca2+ spon án Ca2+- anzienseke okoz CPC sej eken ...................................................................................... 42 A belső Ca2+- ak á ehé jéinek exp essziós izsgála a .................................................... 46 A Ca2+- anziensek kialakí ásában sze epe já szó szignalizációs ú onal elde í ése ..... 46 Az ATP sze epének izsgála a a spon án Ca2+-oszcillációk kialakulásában .................... 52 E edmények II.-Vázizomszö e ........................................................................................... 53 C2C12 sej enyésze ek, ansz ekció ................................................................................ 53 A ázizom Ca2+-homeosz ázisában és di e enciálódásában ész e ő ehé jék exp essziós min áza ainak alakulása a csökken SERCA1b ehé jeszin ha ásá a ........... 54 A csökken SERCA exp esszió ha ása a Ca2+-homeosz ázis a ......................................... 56 A SERCA1b csökken exp essziója módosí ja a di e enciálódó izom nö ekedésé ....... 61 Megbeszélés ............................................................................................................................. 66 Po cszö e -kond op ogeni o sej enyésze ek ...................................................................... 66 A ci oszólikus [Ca2+] dinamikus ál ozása ....................................................................... 66 A kond op ogeni o sej ek belső Ca2+- ak á ának unkcionális jellemzése és sze epe a Ca2+-oszcilláció kialakí ásában ......................................................................................... 67 Pu ine g szignalizáció és a Ca2+-oszcilláció au ok in/pa ak in szabályozása .................. 68 Vázizomszö e -C2C12 sej enyésze ek ................................................................................ 70 A SERCA1b ehé je exp esszió csökkenése és a Ca2+-homeosz ázisban ész e ő ehé jék exp essziójá a gyako ol ha ása .......................................................................... 70 Az elek omechanikai csa olás izsgála a kon oll és SERCA1b speci ikus shRNS-sel ansz ek ál sej ekben ....................................................................................................... 72 Össze oglalás ............................................................................................................................ 75 Summa y .................................................................................................................................. 77 I odalomjegyzék ....................................................................................................................... 79 Közleménylis a ......................................................................................................................... 90 Idézhe ő, angol nyel ű absz ak ok: ..................................................................................... 92 Angol nyel ű posz e ek: ....................................................................................................... 92 Magya nyel ű posz e ek: .................................................................................................... 93 Előadások: ............................................................................................................................ 93 Köszöne nyil ání ás ................................................................................................................. 94 4 Rö idí ések jegyzéke 7TM ecep o : 7 anszmemb án doménnel endelkező ecep o [Ca2+]e: ex acellulá is kalciumkoncen áció [Ca2+]i: in acellulá is kalciumkoncen áció 2-APB: 2-aminoe hoxidi enil bo á ATP: adenozin- i osz á ATPγS: adenozin-5’-O-(3- io i osz á ) ADP: adenozin-di osz á Ado aR-1/2A/2B/3: adenozin ecep o 1/2A/2B/3 AMP: adenozin-mono osz á AM: ace oxi-me ilész e 4-AP: 4-aminopi idin BCA: bicinchoninic acid BMP: bone mo phogenic p o ein, cson mo ogene ikus ehé je BSA: bo ine se um albumin, bo júszé um albumin CaN: calcineu in, kalcineu in Ca pan: eszül ség üggő Ca2+-csa o na CCPA: 2-Chlo o-N6-cyclopen yladenosine CICR: calcium-induced calcium elease, kalcium- indukál kalcium elszabadulás CMF-PBS: Ca2+-Mg2+ ee phospha e-bu e ed saline, Ca2+-Mg2+- men es osz á pu e olda COMP: ca ilage oligome ic ma ix p o ein, po c má ix ehé je CPA: cyclopiazonic acid, ciklopiazonsa CPC: kond o p ogeni o cell, kond op ogeni o sej CRAC: Ca2+ elease ac i a ed Ca2+ channel, Ca2+- elszabadulás ál al ak i ál Ca2+-csa o na CREB: cAMP esponse elemen -binding p o ein, cAMP- e eagáló elem CSQ: calseques in, kalszek esz in DAPI: 4',6-diamidino-2- enilindole DHPR: dihyd opy idin ecep o , dihid opi idin- ecep o DMEM: Dulbecco’s modi ied Eagle’s medium, Dulbecco ál al módosí o Eagle- éle médium ECC: exci a ion-con ac ion coupling, elek omechanikai csa olás ECM: ex acellula ma ix, ex acellulá is má ix ER: endoplasmic e iculum, endoplazma ikus e ikulum ERK1/2: ex acellula signal- egula ed kinase 1 and 2, ex acellulá is szignál szabályoz a kináz 1 és 2 ESCs: emb yonic s em cells, emb ionális őssej ek FBS: oe al bo ine se um, ö ális bo júszé um FGF: ib oblas g ow h ac o , ib oblasz nö ekedési ak o FITC: luo eszcein-izo iocianá FTHM: ull ime a hal maximum, időbeli élé ékszélesség GAG: glükózaminoglikán G-p o ein: guanin nukleo id kö ő p o ein GAPDH: glice aldehid 3- osz á dehid ogenáz HD: high densi y cell cul u e, nagy sű űségű sej enyésze HMG: high mobili y g oup, nagy mobili ású csopo HRP: ho se- adish pe oxidase, o mape oxidáz HS: ho se se um, lószé um IP3: inozi ol 1,4,5- isz osz á IP3R: inozi ol 1,4,5- isz osz á ecep o IP3R-1/2/3: inozi ol 1,4,5- isz osz á ecep o 1/2/3 al ípusa JNK: c-Jun N- e minal kinase, c-jun N- e minális kináz KO egé : knockou egé MAPK: mi ogen-ac i a ed p o ein kinase, mi ogén- ak i ál p o ein kináz 5 MCIP1.4: modula o y calcineu in in e ac ing p o ein 2-MeS-ATP: 2-me il io-ATP MyoD: myogenic ansc ip ion ac o , miogenikus anszk ipciós ak o MSC: mesenchymal s em cell, humán mezenhimális őssej NFAT: nuclea ac o o ac i a ed T-cells, ak i ál T-sej ek nukleá is ak o a NCX: Na+-Ca2+ exchange , Na+-Ca2+-cse élő ehé je NMDA: N-me il-D-aszpa á NTY: no mál Ty ode-olda PBS: phospha e-bu e ed saline, osz á pu e - olda PCR: polyme ase chain eac ion, polime áz lánc eakció PKA: p o ein kináz A PKC: p o ein kináz C PLC: osz olipáz C pLP1/2: p o eolipid p o ein 1, 2 ehé jék PMCA: plazmamemb án Ca2+-ATPáz PP2A: p o ein- osz a áz 2A PP2B: p o ein- osz a áz 2B PSM: p esomi ic mesode m, p eszomí ikus mezode ma PTI: Pho on Technology In e na ional PVmax: a Ca2+-pumpa maximális anszpo kapaci ása ROCC: ecep o -ope a ed calcium channel, ligand- agy ecep o ezé el Ca2+-csa o nák RT-PCR: e e z anszk ipciós polime áz lánc eakció RyR: yanodine ecep o , ianodin ecep o RyR1/2/3: yanodine ecep o ype1/2/3, ianodin ecep o 1/2/3 al ípusa SDS-PAGE: sodium dodecyl sulpha e- polyac ylamide gel elec opho esis, Na+- dodecilszul á -poliak ilamid gélelek o o ézis SE: s anda d e o , s anda d hiba SERCA: sa co-endoplasmic e iculum Ca2+- ATPase, sza ko-endoplazma ikus e ikulum Ca2+- ATPáz SERCA1a/1b/2a/2b/3: sza ko- endoplazma ikus e ikulum Ca2+-ATPáz 1a/1b/2a/2b/3 izo o mái siRNS: kis in e e áló RNS shRNS: small hai pin RNS SMOC: second messenge -ope a ed channel, másodlagos messenge ek szabályoz a Ca2+- csa o nák SOCE: s o e-ope a ed calcium-en y, ak á ál al ezé el kalciumbelépés su amin: 8-(3-benzamido-4-me ilbenzamido)- na alén-1,3,5- iszul onsa SR: sza koplazma ikus e ikulum STIM1: s omal in e ac ion molecule 1, sz ómális kölcsönha ó molekula 1. al ípusa TG: hapsiga gin, apsziga gin TM: ansmemb ane, anszmemb án VICR: Vol age Induced Calcium Release, eszül ség ál al ki ál o kalcium elszabadulás VOCC: ol age-ope a ed calcium channel, eszül ség ezé el Ca2+-csa o nák VSVG: Vesicula s oma i is Indiana i us G- p o einje YM-58483: 4-me il-40-[3,5-bisz( i luo ome il)- 1pi azol-1-yl]-1,2,3- iadiazol-5-ka boxanilid Key wo ds: skele al muscle, sa coplasmic e iculum, SERCA1b p o ein, s o e ope a ed Ca2+- en y (SOCE), pu ine gic ecep o , single cell Ca2+-measu emen , Ca2+-oscilla ions Kulcssza ak: ázizom, sza koplazma ikus e ikulum, SERCA1b ehé je, ak á ál al ezé el kalciumbelépés (SOCE), pu in ecep o ok, egyedi sej en ö énő Ca2+-mé és, Ca2+-oszcilláció 6 Be eze és I odalmi á ekin és A po c- és a ázizomszö e közös mezenhimális e ede e A mozgássze i megbe egedések - különösképpen az ízüle i po ckopás és a különböző degene a í ízüle i be egségek - az 50 é en elüli lakosság kö ében leggyak abban elő o duló, az éle minősége jelen ősen on ó el ál ozások. Az osz eoa i isz (OA) és a euma oid a i isz az ENSZ Egészségügyi Világsze eze e jósla ai alapján 2020- a a negyedik eze ő ok lesz a mozgásko lá ozo ság kialakulásában [1,2]. Nem elhanyagolha ó o ábbá a sze ze agy ö öklö ázizombe egségek – disz ó iák, miozi iszek, miopá hiák – elő o dulási gyako isága sem, amelyek mind a üne ek alapján, mind pedig a nemek közö nagy he e ogeni ás mu a nak. Figyelembe é e az , hogy e be egségek súlyos o mái leginkább az idősebb ko osz ály é in ik, és napjaink eze ő p oblémái közé a ozik a á sadalom elö egedése, ezé ezekkel a p oblémákkal a közeljö őben még hangsúlyosabban kell oglalkoznunk. Így munkánk so án a leg on osabb céljaink közö sze epel az é in e szö e ek, így a po cszö e és izomszö e észle esebb el é képezése. A po c- és ázizomszö e egyed ejlődése a ge incesekben sok szempon ból megegyezik: a gasz uláció so án a pa axiális mezode ma elkülönül az axiális és la e ális mezode má ól, és a előcső ké oldalán szegmen ála lan mezode macsíko hoz lé e, ami az i odalom p eszomí ikus mezode mának (PSM) ne ez. A PSM kialakulásá kö e ően jön lé e ge incesekben a engely áz, alamin a ö zs- és a ég agizmok. A szegmen ála lan PSM különböző molekulá is és mo ogene ikai ál ozásokon esik á a szegmen álódásig, mely kö e kezményekén jönnek lé e a szomi ák. A 4. hé kezde é e a szomi ák en ális és mediális alá alko ó sej jei el eszí ik addigi kompak sze eződésüke , a ge inchú i ányába ándo olnak, majd kö ül eszik az lé ehoz a a szkle o omo , ami az emb ionális mezenhima laza szö e é alko ja. A mio óm és de ma óm a do zális szomi a al sej jeiből áll. A ko ai emb ionális éle so án öbb csí alemez sej jei is po cszö e é di e enciálódha nak. Tes ünk po cszö e ei a ej-nyak égió ki é elé el a középső csí alemez szá mazékai: a ö zs cson jainak ázá adó po ckezdemények a pa axiális mezode ma szegmen álódásakén lé ejö ő szomi ák szkle o om komponenseiből ejlődnek, míg a ég ag elepek po c emplá jai a la e alis mezode mából kialakul mezenhimális szö e szá mazékai. A ej-nyaki égió po cképződményeié a előléc (c is a neu alis) sej jei elelősek. Az izomszö e p eku zo 7 sej jei (p emioblasz ok) a mio óm sej jeinek osz ódásá al alakulnak ki, és o ábbi ejlődéssel és úzió al képezik a ázizom os oka [3]. A po cszö e A po cszö e egy olyan speciális szö e , amely nemcsak az emb ionális ko ban, hanem a ki ejle egyedek ese ében is sok é ű elada al bí . Ez a speciális kö ő- és ámasz ószö e a ko ai emb ionális ko ban s uk u ális ámasz nyúj , majd az egyed ejlődés egy későbbi szakaszában ebből a szö e ből, endokond iális cson osodással alakul ki a cson ok áza. Gye mek- és se dülőko ban a cson osodási olyama so án a po cszö e csak észben alakul á cson szö e é, az epi ízis-po cko ong e üle én, alamin az ízüle i po c o májában megma ad. Az epi ízis-po cko ong a gyo s hossznö ekedésé elelős, ezé csak a pube ás ko be ejez éig unkcionál, míg az ízüle i po c az egész éle ünk olyamán megma ad [4]. Po cszö e alálha ó o ábbá a ej és az a c számos e üle én (o , ül) is. A má kialakul po cszö e nem egységes: a mak oszkópos és mik oszkópos mo ológiai sajá ságok el é őek lehe nek alaki és unkcionális szempon ból, o ábbá az ex acellulá is má ixo (ECM) ekin e, sze keze i és biomechanikai szempon ból is el é ések igyelhe őek meg. Ezek alapján a po cszö e e há om nagy csopo ba so oljuk: hialinpo c (ü egpo c), elasz ikus po c és os os po c. Jelen é ekezés á gya a hialinpo c, ezé észle esen csak ezzel oglalkozom. A po c ejlődése, áplálása, ö egedése A po c kialakulásának első lépése a mezenhimális sej ek gyo s szapo odása, melyek a későbbi po c elepnek meg elelően blasz émá (sű űn elhelyezkedő sej ekből álló csopo ) képeznek. A sej ek leke ekednek, majd maguk kö ül po cmá ixo e melnek, ezál al szé olódnak egymás ól. Az így kialakul kond oblasz ok limi ál an osz ódnak, de a sej eke a kialakul po cud a má nem engedi szé olódni egymás ól. Ez a nö ekedés in e s iciális nö ekedésnek ne ezzük, amely leginkább az emb ionális ejlődés e jellemző. A po cszö e a elszín elől képződő, új po cszö e á akódásá al is nö ekedhe , ami appozicionális nö ekedésnek ne ezünk. E olyama so án a po chá ya belső é egé képező sej ek, a kond oblasz ok di e enciálódnak. A kezde ben ellapul alakból ke ekdeddé álnak. A di e enciál po csej ek a nö ekedés be ejez e u án no mális kö ülmények közö má nem osz ódnak o ább. Ezé a po c sé ülése ese én, elnő ko ban a egene áció minimális, így az elpusz ul po cszö e helyé cson - agy ömö kö őszö e öl i ki. 8 A po c é men es szö e , egészséges po cszö e ben e eke csak ki é eles ese ben alálunk. A po csej eknek, a öbbi sej ől el é ően, lassú és anae ob jellegű anyagcse éje an. A po chá ya e eiből, a kö nyező szö e ekből agy épp a szino iális olyadékból (ízüle i po cok ese ében) kapják a ápanyagoka , amelyek a po cmá ixon ke esz ül di undálnak [5]. A po cnak, úgy, min más szö e éleségeknek is, az éle olyamán bizonyos szin ű adap áció kell mu a nia a kö nyeze i meg e helésekkel szemben. A lebomló má ix egyes komponensei a po csej ek új a e melik bonyolul jelá i eli mechanizmusokon ke esz ül. A ko elő ehalad á al a kond oci ák alkalmazkodóképessége csökken, és a po cmá ix is kémiai ál ozásokon megy ke esz ül. Ezé idősebb ko ban gyak an elő o dul, hogy es ünk egyes észein a po cszö e elmeszesedik, elcson osodik. Az ízüle i po c egene ációjának csaknem eljes hiánya mia napjainkban egy e szélesebb kö ben alkalmazzák az ún. mozaikplasz ikai eljá ás . A kis és közepes po chiányok (1-2,5 cm2) kezelésé e ajánlo mű é i eljá ás alapö le e, hogy a é dízüle i po cbo í ásából azon észeke , melyek nem esznek ész a ehe iselésben, kis henge alakban szabadon el á olí a beül e ik a po chiány helyé e. A beül e e po cos-cson os henge ek a be ogadó cson ba beépülnek, és kö ülbelül él-egy é el el é el az ízüle po cbo í ása eljes egészében épnek űnik. A módsze há ánya, hogy a henge ek a sajá ízüle ből ke ülnek el á olí ás a, emia az é in e e üle en ájdalom jelen kezhe [6]. A hialinpo c elépí ése Felnő sze eze ben a hialinpo cnak há om megjelenési o mája an: ízüle i po c, állandósul po c (gége, légcső, b onchusok), alamin az endokond iális cson osodással kialakuló cson ok alakjának s abili ásá szolgáló po cok [7]. A hialinpo co a po chá ya eszi kö ül. Külső lemeze (s a um ib osum) őkén I-es ípusú kollagén os oka a almaz, sze epe a úlzo hajlí ás kö e kez ében ese legesen lé ejö ő ö és elleni édelem. Belső lemeze (s a um chond oblas icum) di e enciála lan sej eke a almaz, amelyek a po c nö ekedésének s ádiumában kond oblasz okká alakulnak, po cmá ixo e melnek. A po chá yában aláljuk az e eke és az é ző ideg égződéseke is. A po csej ek az alapállományban csopo oka alko nak, ún. kond on lé ehoz a [5]. A sej eke köz e lenül a pe icellulá is má ix ha á olja. Mi el a kond oci áka az i elhelyezkedő mak omolekulák (VI. kollagén, deko in, laminin, szul a ál p o eoglikánok) kapcsolják a má ixhoz, a pe icellula is má ix jelenlé ő nega í öl ésű molekulák igen nagy koncen ációja mia e ősen bazo il es ődésű po c okkén jelenik meg. Kö ülö e alálha juk meg a e i o iális 9 má ixo agy másné en po cud a , amely a nagy koncen ációban jelenlé ő p o eoglikánok mia szin én bazo il es ődés mu a . A kond onok közö i hal ányabb es ődésű e üle e in e e i o iális má ixnak ne ezzük, amely kollagénben gazdag [7]. 1. áb a: A po cszö e ázla os elépí ése. A kond oci a és az az kö ül e ő má ixkomponensek sze eződése. (CILP-1: pi o osz o-hid oláz 1; COMP: po c má ix ehé je; KS: ke a án szul á ; PRELP: p olin, a ginin és leucin gazdag ehé je, [8]) A csopo osan elhelyezkedő di e enciál po csej ek ke ekded alakúak, egy agy öbb sej mago a almaznak. A ia al, má ix e melésben ak í abb sej ekben ejle , du a elszínű endoplazma ikus e ikulum és e jedelmes Golgi-appa á us igyelhe ő meg. Ezek a sej ek a po chá yához közel helyezkednek el. Ezzel ellen é ben a ke ésbé ak í , idősebb sej ek öbbnyi e a po c belsejében alálha óak meg, ke esebb sej o ganellumo a almaznak, ci oplazmájuk jelen ős észé glikogén és zsí cseppek öl ik ki. A po cszö e jellegze es mechanikai sajá ságai a kollagén os ok, p o eoglikánok, a hialu onsa és a különböző glikop o einből elépülő má ix adja (1. áb a). A po cban őleg a II-es ípusú kollagén molekula o dul elő. A II-es ípusú kollagénhez a ib illumok alko ó észekén kis mennyiségben a XI-es és IX-es ípusú kollagénmolekulák csa lakoznak, melyek a öbbi má ixalko ó kapcsolják a kollagénhálóza hoz. A X-es ípusú kollagén a kollagén ib illumok szabályos hálóza ba ö énő sze ezésében já szik sze epe , és az epi ízis 16 A pu in ecep o ok osz ályozása A pu in ecep o ok, min az az i odalomból udjuk, ki ün e e sze eppel bí nak az alap e ő biológiai olyama ok lé ejö ében. A 2. áb án jól lá ha ó, hogy a pu in ecep o ok ex acellulá is nukleo idok a é zékenyek. Ezeke a ecep o oka előszö idegsej ekben edez ék el, de nem sokkal később kide ül , hogy szin e minden szö e ben meg igyelhe ő az exp essziójuk. Az immun endsze ben például a pu ine g szignalizáció ha ásá a ak i álódnak és mig álódnak a mak o ágok [52,53]. A pu in ecep o oka ké nagyobb család a osz ha juk: a P1- ecep o család adenozin a, a P2- ecep o család pedig ATP- e, ADP- e és UTP- e é zékeny. Az u óbbi csopo ké o ábbi al ípus a, a P2X- és P2Y- ecep o ok a osz ha ó [54]. A P1- ecep o ok négy különböző al ípusának mindegyike G p o einhez kapcsol , 7 anszmemb án domén a almazó ehé je. A négy ecep o ípus a kö e kező: Ado a 1 (A1R), Ado a 2 (A2AR), Ado a 2B (A2BR) és Ado a 3 (A3R) [55]. Az Ado a 1 ecep o agonis ája a CCPA (2-Klo o-N6-ciklopen iladenozin), an agonis ái a me ilxan inok. Az Ado a 2A agonis ái a DPMA (N6-(2-(3,5-dime oxi enil)-2-(2-me il enil)e il)adenozin) és a egadenozon, az an agonis ái az ATL-444 és MSX-3. Az Ado a 2B agonis ái a NECA (N- e ilka boxamidoadenozin) és a BAY 60-6583, an agonis ái az ATL-801 és MRS-1706. Az Ado a 3 agonis ái a 2-(1-hexinil)-N-me iladenozin és a CF-101, -102, an agonis ái a KF- 26777 és a MRS-545. A leg issebb i odalmi ada ok p o ek í sze epe ulajdoní anak a P1- ecep o oknak, például az a e oszkle ózisos be egeknél [56]. Az iono óp P2X ecep o oknak 7 ípusá isme jük, amelyek a P2X1-7 alegységek homo- agy he e omul ime izációjá al jönnek lé e [57]. Az alegységek ké anszmemb án domén a almaznak, in acellulá is C- és N- e minálissal, alamin egy nagy ex acellulá is hu okkal endelkeznek. Amiko az ex acellulá is oldal meg elelő helyéhez ATP kö ődik, az [Ca2+]i megnő (köz e lenül a külső é ből), és a belépő Ca2+ ionok CICR- indukálnak. A P2X ecep o ok nyi ása emelle depola izálja a sej e . Megkülönböz e ünk lassan deszenzi izálódó pu in ecep o oka , melyek közé a P2X2, P2X4, P2X5 és P2X6 ecep o a ozik. Vannak azonban gyo san deszenzi izálódó ecep o ok is, így például a P2X1 és P2X3. A P2X7 ecep o egy külön csopo ba so olha juk, mi el ez a ecep o deszenzi izáció nem mu a [58]. A P2X7 ecep o on os sze epe já szik az apop ózisban, és a umo genezisben má a el ogado umo ma ke [59]. A sze epé leí ák má pe i é iás ideg endsze i bán almakban [60], alamin szepszisben is [61]. 17 A me abo óp P2Y-csopo agjai G-p o einhez kapcsol , 7 anszmemb án doménnel endelkező ecep o ok (7-TM ecep o ok) [58]. Emlősökben eddig nyolc éle P2Y ecep o isme [62]. A P2Y legko ábban megisme 4 ípusa (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6) Gq-p o einen ke esz ül a PLC- ak i álja és így IP3- elszabadí ás é én hozza lé e a ci oplazma kalcium- koncen ációjának nö ekedésé . A másik 4 ípus (P2Y11, P2Y12, P2Y13, P2Y14) ese ében az ak i álás Gs-p o einen ke esz ül ö énik, a gá lás pedig Gi-p o einen ke esz ül alósul meg. A pu ine g ecep o ok leg on osabb agonis ái és an agonis ái az 1. ábláza ban oglal am össze. 1. ábláza : A pu ine g ecep o ok leg on osabb agonis ái és an agonis ái. (su amin: 8-(3-benzamido-4- me ilbenzamido)-na alén-1,3,5- iszul onsa ; ATPγS: adenozin-5’-O-(3- io i osz á ); 2-MeS-ATP: 2-me il io- ATP) P2X ecep o - ípusok P2X1 P2X2 P2X3 P2X4 P2X5 P2X6 P2X7 Agonis ák ATP, ATPγS An agonis ák Su amin (ki é e P2X6) P2Y ecep o - ípusok P2Y1 P2Y2 P2Y4 P2Y6 P2Y11 P2Y12 P2Y13 P2Y14 Agonis ák ATP (ki é e P2Y12) ADP UTP UTP UDP 2-MeS- ATP ADP ADP UDP- glükóz An agonis ák Su amin (ki é e P2Y4) A ázizom A ázizomsej ek Az izomsej endsze es és jól szabályozo összehúzódások a specializálódo sej éleség. A ge incesekben, szö e ani jellegze ességük alapján, az izomszö e ké ípusá különí jük el. Az egyik ípusba a ozik a ha án csíkol izomszö e , mely énymik oszkópban ha án csíkola o mu a . Ebbe a csopo ba a ozik a ázizomszö e (a cson áz axiális és pe i é iás észeihez kapcsolódik), a iszce ális ha án csíkol izomszö e (nyel , nyelőcső első észe) és a szí izomszö e . A másik ípusba a ozik a simaizomszö e , mely nem mu a a ha án csíkol izomhoz hasonló endeze sége [63]. Az izomszö e különböző módon di e enciálódo ípusai biz osí ják a soksej ű álla i sze eze ek hely ál oz a ásá és belső sze eik mozgásá . Az izomsej ek melle számos egyéb mezode mális e ede ű sej is képes az ak in- és miozin ilamen umok kölcsönha ása é én meg alósuló összehúzódás a. 18 A ázizom mo ológiai sajá ságai A ázizmo du a kö őszö e es ok, az epimízium ha á olja, melyen belül az izom os ok kö egei a pe imíziumba zá a helyezkednek el (3. áb a). A öbbmag ú izom os o az endomízium bu kolja, mely é - és nyi oke eke , alamin idegeke a almaz. Az izom os ok hosszú, henge alakú, nem elágazó ó iássej ek, melyek a sej ek szélén, a sej memb án ala ellapul sej maggal endelkeznek. A magok száma aká sok száz is lehe az izom os hosszá ól üggően, amely néhány millimé e ől aká 30-40 cm-ig is e jedhe , á mé ője pedig 10 és 100 µm közö ál ozik. Szö e ani me sze eken, speciális es ési eljá ással ilágos és sö é sá ok igyelhe őek meg a ci oplazmájában. A sö é en es ődő sá ok anizo ópok (A-sá ), a ilágosan es ődő sá ok pedig izo ópok (I-sá ). Az I-sá közepén ékony sö é onal lá ha ó, melye Z- onalnak ne ezünk. A sej ci oplazmájának, melye ázizom ese ében sza koplazmának agy mioplazmának is ne eznek, jelen ős ömegé a mio ib illumok alko ják, melyek a ékony (ak in) és as ag (miozin) mio ilamen umokból épülnek el. A mio ib illum ké Z- onala közé eső, ismé lődő szakaszoka sza kome eknek ne ezzük. A sza kome miozin a almazó észei alko ják az A-sá o (anizo óp), a csak ak in a almazó észek pedig az I-sá o (izo óp). Előbbi közepén a H-zóna, az u óbbi közepén pedig a Z- onal alálha ó. Az ak in szabályozó ehé jéi a opomiozin és a oponin. Bizonyos ehé jék ugyan nem já szanak sze epe sem a kon akció olyama ában, sem annak szabályozásában, mégis elengedhe e len sze epük an a szigo ú endeze ség enn a ásában [5]. Ilyen például a nebulin, ami alószínűleg az ak inhossz szabályozza, a i in, amely az izom os ok ugalmasságá biz osí ja, alamin az obscu in, amely a i in és az anki in megkö ésében já szik sze epe . A i in é dekessége, hogy ez az eddig isme legnagyobb polipep id (molekulasúly: 3000 kDa) [64]. Az egyes izom os oka sej memb án, a sza kolemma eszi kö ül. A sza kolemma elépí ése azonos más inge elhe ő és nem inge elhe ő memb ánoké al: lipid ke ős é eg, benne in eg áns ehé jemolekulákkal. Az izom os működése szempon jából dön ő a eszül ség üggő gyo s Na+- és a késői ípusú K+- csa o nák jelenlé e, ezek eszik lehe ő é az akciós po enciál e jedésé . A sza kolemmában Cl- és Ca2+- csa o nák, alamin külön éle ecep o molekulák is alálha ók. A ázizom igen ejle in acellulá is memb án endsze el endelkezik, mely nem más, min a sza koplazma ikus e ikulum (SR). A SR- a os hossz engelyé el pá huzamosan elhelyezkedő ékony csö ek (longi udinális, agy L- ubulusok) alko ják, melyek e minális cisz e nákban égződnek. A ansz e zális agy T- ubulusok a elszíni memb án be ü emkedései, és a e minális cisz e nákkal együ alko ják a ha án csíkol izom unkcionális egységé , a iádo , melynek 19 alap e ő sze epe an az elek omechanikai csa olás olyama aiban. Ennek észle es á gyalása „A ázizom éle ani sajá osságai” című ejeze ben alálha ó. 3. áb a: A ázizom elépí ése (www.mkk.szie.hu nyomán). A képen egy ha án csíkol izom os ázla os ajza lá ha ó a on osabb sej alko ókkal. Izom ejlődés Az izom ejlődés és –di e enciálódás, alamin a sé ülés kö e ő izom egene áció p ecízen szabályozo , öbblépcsős ejlődési olyama . A mezode mális e ede ű mezenhimális sej ek bipolá is agy o só alakú monopolá is sej ek, melyek az izom i ányú di e enciálódás első lépésekén p emioblasz okká, izom p eku zo sej ekké alakulnak. A csí alemezek kialakulásá és mig ációjá kö e ően jönnek lé e a ö zs és a ég agok izomza ának kezdeményei. A mig áció so án ezek a mezenhimális sej ek in enzí p oli e áció al jellemezhe ők, ami el pá huzamosan lé ejönnek a e minális di e enciálódás elő álló mioblasz ok. Ezen sej ek úziójá al ö énik meg a mio ubulusok képződése, előszö p ime mio ubulusok kele keznek, majd pedig a p ime izomcsö ek kö ül kialakulnak a szekunde mio ubulusok [65]. Az izomcsö ek o ábbi mioblasz okkal úzionál a nö ekszenek, majd elkezdődik az izomspeci ikus ehé jék szin ézise ( ékony és as ag ilamen umok), a sej magok a sza kolemma alá szo ulnak és megjelenik az izom os . Ez a olyama szigo ú gene ikai szabályozás ala áll [66]. A eljesen di e enciálódo izom os sza kolemmájához hozzásimul a, a lamina bazálison belül annak olyan ke éssé di e enciál sej ek, amelyekből az izom os észlegesen 20 egene álódha , ezek az ún. sza elli asej ek. Az izom os ok elszínéhez M-kadhe in sej adhéziós molekulá al kapcsolódnak. Ezek a sej ek nyug ó, a alék mioblasz oknak elelnek meg, és az egész éle so án osz ódás a képesek ma adnak. Meg elelő nö ekedési ak o ok ha ásá a ak i álódha nak, osz ódha nak és hozzájá ulha nak a sé ül izom os egene ációjához. Azonban ha az endomízium a sé ülésko szé szakad, a ká osodo e üle e ib oblasz ok ándo olnak és hegszö e alakul ki [67]. A ázizom éle ani sajá osságai A ázizomza működésének elemi megnyil ánulása az egyes izom os ok kon akciója, amelynek mind a nagysága, mind pedig a kialakulási sebessége memb ánpo enciál- üggő jelenség. Az izom os a ázizom elemi egysége, a memb ánján kialakuló akciós po enciál a a „minden agy semmi” ö ény é ényes. A sza kolemmán kele kező és e jedő akciós po enciál elszálló szá áé a e odo oxin é zékeny gyo s Na+-csa o nák ak i álódása, a epola izációé ugyanezen csa o nák eszül ség üggő inak i álódása, ille e a késői K+- csa o nák megnyílása a elelős. A elszíni memb án depola izálódása és a kon akció kialakulása közö 2-4 ms idő elik el, ami lá enciaidőnek hí unk. Ez ala az idő ala mennek égbe azon olyama ok, melyeke össze oglaló né en elek omechanikai agy exci ációs- kon akciós kapcsola nak ne ezünk. A csa olás első lépése az akciós po enciál e jedése a T- ubulusok memb ánján az izom os belsejébe. A T- ubulusok egyik unkcionális jelen ősége az, hogy lehe ő é eszik a ázizom os eljes ke esz me sze ének közel egyidejű ak i álódásá . A T- ubulus memb án depola izációjá kö e ően a Ca2+-ok in acellulá is á olóhelyek ől szabadulnak el. A e minális cisz e nák az izom os Ca2+- ak á á képzik, bennük a Ca2+ észben szabadon, észben a kalszek esz in ne ű Ca2+-kö ő ehé jéhez kö ö en alálha ó meg. A elszíni memb án depola izációjá kö e ően a mioplazmában a Ca2+-koncen áció a kon akció kialakulásá megelőzően kezd el nö ekedni. A sza kolemmán, alamin a T- ubulus memb ánon égighaladó akciós po enciál a memb ánban elhelyezkedő dihid opi idin- ecep o (DHPR) kon o máció ál ozásá okozza, és ez megnyi ja a belső Ca2+- ak á kén szolgáló sza koplazma ikus e ikulum Ca2+-csa o nájá , a ianodin ecep o (RyR). Nyugalomban a mioplazma Ca2+-koncen ációja 100 nM kö üli é ék, a kon akció kialakulásához szükséges koncen áció kb. 1 µM. Ki ejle ázizomban az in acellulá is [Ca2+] megemelkedésének o ása csaknem eljesen a sej en belüli Ca2+- ak á . A Ca2+-kiá amlás kezde én, maga a Ca2+ is ak i álha ja a RyR- pozi í isszacsa olás é én, ez a olyama o , min a a ko ábban u al unk, CICR-nak ne ezzük. A kiá amló Ca2+- 21 oka ak í anszpo olyama ju a ja issza a SR-ba a SERCA pumpa segí ségé el. Az izomkon akció alapja a endeze kon ak ilis ehé jék, ak in és a miozin egymás melle i elcsúszása, ezál al a sza kome hossz ö idülése. A ázizom os ok ak i álásának e edményekén ké éle kon akció különböz e he ünk meg: izo óniás és izome iás kon akció [68]. Rianodin ecep o (RyR) A RyR nélkülözhe e len sze epe já szik az elek omechanikai csa olás kialakí ásában. Maga a ecep o molekula a SR memb ánjában alálha ó, a molekula legnagyobb észe a ci oplazma elé néz, és a ázizomban köz e len kapcsola ba ke ül a DHPR- al. Alegységei homo e ame eke képez e hozzák lé e az ioncsa o ná , melynek ömege kb. 2,2 MDa. A ecep o nak há om ípusa isme , a ázizom a jellemző RyR1, a szí izomban elő o duló RyR2 és előszö az agyban de ek ál RyR3 [69]. Sza koplazma ikus e ikulum Ca2+ ATP-áz (SERCA) A mioplazmába kiju o Ca2+ issza é ele a SR-be ak í anszpo olyama é én alósul meg. A „ issza e ” Ca2+ nagy észe a kalszek esz inhez kapcsolódik a e minális cisz e nákban, melyhez di úzió al ju el és ezu án ismé alkalmas lesz a kö e kező kon akció lé ehozásá a. A mioplazma ikus Ca2+ koncen áció mindaddig magas ma ad, amíg a ko ábban elszabadul Ca2+ issza nem ju a SR-be. A SERCA a P ípusú ATP-ázok közé a ozik, melyek közös jellemzője, hogy in eg áns memb án ehé jék, osz o ilációjuk egy megha á ozo aszpa aginsa oldalláncon ke esz ül ö énik, aminosa so endjükben nagy okú hasonlóságo mu a nak és mindegyik gá olha ó a osz á analóg anadá al. A SERCA, szemben a plazmamemb án- kalciumpumpá al, nem igényel kalmodulinkö és működéséhez [70]. A SR-Ca2+-pumpa öbblépéses kon o máció ál ozás ál al haj o olyama ban ju a á ké Ca2+- a ci oszólból a SR belsejébe az ATP hid olíziséből szá mazó ene gia segí ségé el. A SERCA a nagy a ini ású Ca2+- anszpo endsze ekhez a ozik (Km ~400 nM), emia é zékenyen eagál a ci oszól Ca2+-koncen ációjának a meg ál ozásá a. A 110 kDa mólsúlyú anszmemb án ehé je a SR longi udinális szakaszán helyezkedik el [71]. A SERCA az embe i sze eze ben öbb izo o mában o dul elő. A SERCA1b az újszülö sze eze gyo s os jaiban an úlnyomó ész jelen. A ejlődés so án okoza osan el ál ja a SERCA1a, mely a elnő ko ban má a domináns o má jelen i. A SERCA2a a 22 szí izomsej ekben és a lassú ípusú ázizom os okban alálha ó, de nagy mennyiségben exp esszálódik a neona ális gyo s ípusú izom os okban is. A SERCA2b jelen ős mennyiségben a simaizmokban exp esszálódik, de gyako la ilag minden sej éleségben kimu a ha ó. A sze eze ben elsőso ban nem-izom ípusú sej ekben mu a ák ki a SERCA3 gén e méké [72,73,74]. A SERCA e cie sze keze é e ona koz a o hipo e ikus modell alapján 3 ő egység különí he ő el (4. áb a A): - Ci oplazma ikus ej ész, ami magába oglalja az ATP-kö ő, a osz o ilációs és az ún. ene gia anszdukciós domén . - Pen a-helikális szá , ami a nagy a ini ású Ca2+-kö ő ész a almazza és biz osí ja a kapcsola o a ej ész és az in amemb án domén közö . - In amemb án égió, melynek elada a a molekula kiho gonyzása a lipid ke ős é eghez és a Ca2+ memb ánon á ö énő á amlásának a biz osí ása. Legalább 10 anszmemb án hélixből áll. A SERCA-nak ké éle kon o mációs ál oza a an, az E1 és az E2. Az E1 kon o máció k is ályosí ha ó kalcium agy lan anida jelenlé ében. Az E2 kon o máció akko jelenik meg, ha a kalciummen es közegben anadá agy ano ganikus osz á magas koncen ációban an jelen. Az E1 és E2 közö i kon o mációs á mene ek a ehé jék másodlagos sze keze ében ke és ál ozás e edményeznek, inkább a domének csúszó és o gó mozgása igyelhe ő meg. Az E1 kon o mációs állapo ú ehé je ké Ca2+- kö meg a SR- memb án ci oplazma ikus oldalán. Ezu án a ehé je osz o ilálódik egy aszpa ilgyök bé a-ka boxil csopo ján miközben ATP- használ el. A olyama e edményekén az enzim kon o mációs állapo a meg ál ozik (E1-E2 á mene ), s ennek kö e kez ében a ké Ca2+ á ju a memb ánon és az in aluminális oldalon ledisszociál a ehé jé ől. Végül a pumpa de osz o ilálódik és magnéziumion segí ségé el új a el eszi az E1 kon o mációs állapo o . Meg elelő kö ülmények közö a olyama meg o dí ha ó, ilyenko ké Ca2+ á i ele ö énik a SR-ból a ci oplazmába miközben egy molekula ATP kele kezik (4. áb a B). 23 4. áb a: A SERCA modellje (A) A SR Ca2+ ATP-áz sze keze i modellje. A ci oplazma ikus ej ész magában oglalja az ATP –kö ő (N), a osz o ilációs (P) és az ún. ene gia- anszdukciós domén (A), alamin a p o eolí ikus hasí ási helyeke . Az in amemb án égió legalább 10 anszmemb án hélix alko ja [75]. (B) A SR Ca2+ ATP-áz ciklikus működése [76]. A SERCA nem-kompe i í inhíbi o a a apsziga gin (TG), amely nagy a ini ással és i e e zibilisen kö ődik az enzimhez [77]. A SERCA- speci ikusan blokkolja az Aspe gillus ajok ál al e mel miko oxin, a ciklopiazonsa (CPA), melynek ha ása e e zibilis és a ini ása kisebb a TG-nál. A ku a ásokban használa osak ke ésbé speci ikus blokkolók is, min a 4-aminopi idin (4-AP), a luo id, a TBQ (2,5-di( e -bu il)-1,4-benzohid okinon)[78], a anadá és a C ATP [75]. Az in acellulá is kalcium sej éle ani jelen ősége az izom ejlődés so án A di e enciálódási olyama so án a mioblasz ok úziójá al kialakuló p ime , majd szekunde mio ubulusok izomspeci ikus ehé jéke szin e izálnak [79]. Ezen olyama számos lépése Ca2+- üggő [80]. A belső Ca2+- ak á kén unkcionáló SR még ejle len, annak hálóza a, in eg i ása csak okoza osan alakul ki, ezé a miogenezis ko ai szakaszában az in acellulá is [Ca2+] nö ekedésének dön ő o ása az ex acellulá is é . A belső ak á akból a Ca2+- elszabadulás őleg az IP3 ecep o okon ke esz ül ö énhe , G-p o einhez kapcsol osz olipáz C (PLC) ak i áció kö e kez ében. A PLC öbb izo o májá ól leí ák má , hogy ak i i ásuk elengedhe e len a di e enciációs olyama ok lé ejö ében. A külső Ca2+ belépése depola izáció ha ásá a a eszül ség üggő „T”- és „L”- ípusú Ca2+-csa o nákon ke esz ül ö énik. A mioblasz okban Ca2+-belépés biz osí anak még a elszíni memb ánban di úzan elhelyezkedő niko in ípusú koline g ecep o ok, alamin a szin én Ca2+-pe meábilis P2X pu ine g ecep o ok. Az é és és a mio ubulussá ö énő di e enciálódás so án alósul meg a 24 SR olyama os sze eződése, megjelenik a Ca2+-indukál Ca2+- elszabadulás. Később, az egy e ejle ebb SR megjelenésé el dön ő sze ep ju az elek omechanikai kapcsola é én meg alósuló, RyR-on ke esz ül ö énő eszül ség-indukál Ca2+- elszabadulásnak (VICR) [81]. 25 Célki űzés Munkánk egyik észében izom enyésze eken izsgál uk az in acellulá is Ca2+- homeosz ázis , és az abban sze epe já szó kulcs ehé jék exp essziós min áza á . Munkánk másik észében pedig az Ana ómia, Szö e - és Fejlődés ani In éze Sej - és Szö e enyész ő Labo a ó iumának munka á sai al együ a humán e ede ű kond op ogeni o sej ek (CPC-k) izsgála á al oglalkoz unk. I odalmi ada okból isme , hogy bizonyos sej ípusoknál – ázizomsej eken és kond oci ákon- a di e enciálódási olyama elő e halad á al in acellulá is Ca2+- szin ál ozások igyelhe ők meg [82]. A p oli e áció és di e enciálódás ideje ala számos ho mon, ci okin, alamin különböző gének á í ódása be olyásolja a sej olyama oka , de a [Ca2+]i közpon i szabályozó sze eppel bí [83,84]. Napjaink leginkább ku a o e üle é képezik a mezenhimális őssej ek, amelyek po enciális sze epe já szanak az osz eogenikus, kond ogenikus di e enciálódási olyama okban. A mezenhimális őssej ek po csej i ányba ö énő di e enciál a ása, és e ápiás cél a ö énő alkalmazása az o os udomány egyik ia al e üle é kép iselik. A cson előből szá mazó őssej ek ese leges anszplan ációjá má öbb be egség kapcsán is anulmányozzák, például a mioka diális in a k uson á ese be egeknél [85,86], az au oimmun megbe egedéseknél [87], és e mésze esen a k ónikus ázizom és kö őszö e i megbe egedéskén számon a o osz eoa i isznél is, amely ku a ásunk egyik ő á gyá képez e. Ez az ízüle i ká osodással já ó au oimmun megbe egedés a ha an é ele iek 15%-á é in i a nyuga i populációban. A be egség kialakulásáé elsőso ban a má ixbon ó p o eináz enzimek kon ollála lan e melődése, a p o eoglikánok okoza os el esz ése, az ex acellulá is má ix á alakulása, alamin a po csej ek úlzo mé ékű di e enciálódása ehe ő elelőssé [88]. A gyulladásos olyama ok csak másodlagos üne kén alakulnak ki a be egség so án, de jelen ős mé ékben hozzájá ulha nak a üne ek súlyosbodásához. A po c- és izomszö e i e üle ek kó os el ál ozásai gyak an egymás kó kö e kezményekén jönnek lé e. A ájdalom mozgás a, e helés e okozódik, és sán í ás alakulha ki. Elő ehalado ese ben, aká mozgásko lá ozo ság is lé ejöhe . Ezen isme e ek bi okában a céljaink a kö e kezőek ol ak: 1. A kond ogenikus p ogeni o sej ek (CPC-k) Ca2+-homeosz ázisának észle es megisme ése. 2. A belső Ca2+- ak á ak unkcionális jellemzése. 3. A Ca2+- anziensek kialakí ásáé elelős szignalizációs ú onalak el é képezése. 32 (GenBank; www.ncbi.nlm.nih.go ) humán nukleo idszek enciák alapján állí o unk elő (3. ábláza ). A p ime eke P ime P emie 5.0 számí ógépes p og am segí ségé el (P emie Bioso In e na ional, Palo Al o, CA, USA) e ez ük. 3. ábláza : A speci ikus DNS-szakaszok e ősí ésé e használ p ime pá ok nukleo idszek enciái és a eakciókö ülmények. Gén P ime Nukleo id szek encia (5’→3’) GenBank ID Annelációs hőmé sékle Amplime mé e e (bp) Vázizom di e enciálódás Miosz a in sense an isense ACTGGAATCCGATCTCTGAAACTT (665-688) GACCTCTTGGGTGTGTCTGTCAC (897-875) NM_010834 58.0˚C 233 MCIP1.4 sense an isense AAGGAACCTCCAGCTTGGGCT (25-45) CCCTGGTCTCACTTTCGCTG (184-165) NM_019466.3 60.0˚C 160 Ház a ási gén-Kon oll GAPDH sense AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGG (99–121) NM_001289726.1 56.0˚C 322 an isense AATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT (420–399) Az egyenkén 50 μl össz é oga ú PCR- eakció elegyek a kö e kező össze e őke a almaz ák: 1 μl cDNS, 2 μl o wa d és e e z p ime (0,4 μM), 1 μl dNTP (200 μM), és 5 egység P omega GoTaq® DNS-polime áz pu e . A kí án DNS-szakaszok speci ikus ele ősí éséhez p og amozha ó e mosz á o használ unk (The mal Cycle C1000, Bio-Rad, Budapes , Hunga y) a kö e kező beállí ásokkal: 2 pe c 95 °C-on a kezde i dena u ációhoz, amelye ismé lődő ciklusok kö e nek: 94 °C 1 pe c, majd p ime ől üggő (3. ábláza ), op imális hőmé sékle en ö énő anneláció (1 pe c), a lánchosszabbí ás (elongáció) 72 °C-on ö én , 1,5 pe cig. Az u olsó, 35. ciklus u án o ábbi lánchosszabbí ási lépés kö e keze 72 °C-on, 10 pe cig. A PCR-min áka égül 1,5%-os aga ózgélen izsgál uk. A 10 cm á mé őjű Pe i-csészében enyész e meg elelő po ckul ú áka előszö szin én jéghideg RN-áz men es iziológiás NaCl-olda al mos uk. Ez kö e ően TRIzol (Applied Biosys ems, Fos e Ci y, CA) eagensben a sej kul ú áka összegyűj ö ük és 20%-os RN-áz men es klo o o m (Sigma-Ald ich) hozzáadásá kö e ően a min áka 10000 g-n, 15 pe cig, 4 °C-on cen i ugál uk. A o ál RNS- a almazó min áka 500 μl izop opanollal inkubál uk 1 ó án ke esz ül -20 °C-on, majd új a cen i ugálás kö e keze 10000 g melle , 10 pe cig, 4 °C-on. A elülúszó leön ésé kö e ően a pelle hez 1 ml 75%-os e anol ad unk, majd pedig az előző cen i ugálási p o okoll megismé lése kö e keze . Végül a cseppmen es e szá ad 33 pelle e nukleáz-men es ízben beoldo uk és elhasználásig -70 °C-on á ol uk. Az így nye RNS-min ából High Capaci y RT ki (Applied Biosys ems, Fos e Ci y, CA, USA) elhasználásá al cDNS- készí e ünk. A e e z anszk ip áz eakcióhoz használ olda 1000 ng RNS- , 0,25 μl RNáz inhibí o , 2 μl andom p ime , 0,8 μl dNTP Mix-e (4 mM) és 1 μl Mul iSc ibe RT- a almazo 1× RT-pu e ben 20 μl eakció ég é oga ban. Az RT elegye 2 ó án ke esz ül 37 °C-on a o uk. A speci ikus cDNS-szek enciák ampli ikációja olyan p ime ekkel ö én , amelyeke az in e ne en hozzá é he ő (GenBank; www.ncbi.nlm.nih.go ) humán nukleo idszek enciák alapján állí o unk elő (4. ábláza ). A p ime eke i is a P ime P emie 5.0 számí ógépes p og am segí ségé el e ez ük. Az ampli ikációhoz elhasznál p ime pá ok szek enciái a 4. ábláza ban oglal uk össze. 4. ábláza : A speci ikus DNS-szakaszok e ősí ésé e használ p ime pá ok nukleo idszek enciái és a eakciókö ülmények. Gén P ime Nukleo id szek encia (5’→3’) GenBank ID Annelációs hőmé sékle Amplime mé e e (bp) P2Y Me abo óp pu ine g ecep o ok P2RY5 sense an isense TAC CCA TTT AAG TCA AAG AC (358–377) TTA GCA CCA TAC TAG AAC AAG (625–605) BC070295 50.0˚C 268 P2RY8 sense an isense CAG CGT GTT GCC TTT CCA (219–236) TGC ACC GGG TAG GTG AGA T (503–485) NM_178129 60.0˚C 285 P2RY9 (LPAR4) sense an isense GGG TTT ATC ATT CCT CTA (634–651) CAC AAG GTG ATT GGG TA (893–877) NM_005296 49.0˚C 260 P2RY10 sense an isense TTG GTC GGG ATG ATT AC (583–599) CAA CGG GAC AAC TGC TA (838–822) NM_198333 52.0˚C 256 P2RY12 sense an isense AGT TCG GTC TAG TCT GGC (542–559) TTT GGC TCA GGG TGT AA (790–774) NM_176876 54.0˚C 249 P2RY13 sense an isense TTC CCA GCC CTC TAC AC (139–155) AGC CCT AAC AGC ACG AT (407–391) NM_176894 56.5˚C 269 P2RY14 sense an isense TCT GCC GTG CTC TTC TA (289–305) CCT CCC TAA CAC TCT GGT (499–482) NM_001081455 56.0˚C 211 Ház a ási gén-Kon oll GAPDH sense an isense CCA GAA GAC TGT GGA TGG CC (726–745) CTG TAG CCA AAT TC GTT GTC (1136–1117) NM_002046.4 54.0˚C 411 Az egyenkén 25 μl össz é oga ú PCR- eakció elegyek a kö e kező össze e őke a almaz ák: 1 μl o wa d és e e z p ime (10 μM), 0,5 μl cDNS, 0,5 μl dNTP Mix (200 μM) 34 és 1 egység (0,2 μl) P omega GoTaq® 1x DNS-polime áz pu e . A kí án DNS-szakaszok speci ikus ele ősí éséhez p og amozha ó e mosz á o használ unk (Labne Mul iGene 96- well G adien The mal Cycle , Labne In e na ional, Edison, NJ, USA) a kö e kező beállí ásokkal: 2 pe c 95 °C-on a kezde i dena u ációhoz, amelye ismé lődő ciklusok kö e nek: 94 °C 30 s, majd p ime ől üggő (4. ábláza ), op imális hőmé sékle en ö énő anneláció (45 s), majd lánchosszabbí ás (elongáció) 72 °C-on, 1,5 pe cig. Az u olsó, 35. ciklus u án o ábbi lánchosszabbí ási lépés kö e keze 72 °C-on, 7 pe cig. A PCR-min áka égül 1,2%-os aga ózgélen izsgál uk. Fehé jemin ák készí ése A enyésze eke jéghideg PBS-sel mos uk le, majd homogenizációs pu e ben (össze e ői: 20 mM T is-Cl, 5 mM EGTA, 1 mM 4-(2-aminoe il) benzoszul onil luo id, 20 µM leupep in, pH 7,4; Sigma Ald ich) gyűj ö ük össze. A min áka olyékony ni ogénes gyo s agyasz ás u án a elhasználásig -70 ºC-on á ol uk. A min ák el á ásá jégen, 5-szö 10- 10 másodpe cig ö énő szonikálással égez ük (B anson Soni ie , Danbu y, USA). A min ák ehé jekoncen ációjá módosí o BCA (bicinchoninic acid) p o ein assay- el (Pie ce, Rock o d, IL, USA) ha á oz uk meg, melynek so án BSA- használ unk s anda dkén . Wes e n-blo analízis A ehé jekimu a áshoz eljes sej lizá umo használ unk mindké sej ípus ese ében. A ázizom enyésze ből szá mazó min áka , szonikálás kö e ően 1/5 é oga ú, ö szö ös öménységű elek o o ézis min apu e (310 mM T is-HCl, pH 6,8; 10% SDS, 50% glice ol, 100 mM DTT, 0,01% b óm enolkék) hozzáadásá al kezel ük, és 5 pe cig 80 ºC-on őz ük. Az immunológiai de ek álásához 30 μg ehé jé szepa ál unk 7,5% SDS-PAGE gélben. A ehé jéke ni ocellulóz memb án a ansz e ál uk (BioRad, Bécs, Ausz ia). A memb ánoka PBS-ben oldo so ány ejpo 5%-os olda á al blokkol uk, majd egy éjszakán á p ime an i es ekkel (4 °C-on) inkubál uk. Há omszo 10 pe c PBST-s (0,1% Tween 20-szal kiegészí e PBS) mosás u án a memb ánoka szekunde an i es ekkel, o ma pe oxidázzal (HRP) konjugál IgG- el (Bio-Rad) inkubál uk, 1:1000 hígí ásban, 5%-os ejpo os PBS olda ban hígí a, 1 ó án á (5. ábláza ). A jeleke kemilumineszcenciás eakció al, az in éze ünkben endelkezésünk e álló Gel Logic 1500 előhí ó endsze el de ek ál uk. 35 5. ábláza : A Wes e n-blo analízis so án használ elsődleges és másodlagos an i es ek ázizom enyésze ből szá mazó min ák ese ében. Kimu a andó ehé je Elsődleges an i es Másodlagos an i es MyoD monoklonális an i-MyoD 1:200 San a C uz an i-egé IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . p-Ak monoklonális an i-p-Ak 1:1000 Cell Signaling an i-egé IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . SERCA1b monoklonális an i-SERCA1b 1:800 Szegedi Tudományegye em (Zádo E nő) an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . SERCA1 monoklonális an i-SERCA1 1:1000 The mo Scien i ic an i-egé IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K SERCA2a monoklonális an i-SERCA2a 1:20000 Uni e si y o Ro e dam (F. Wuy ack) an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . Kalcineu in (PP2B) poliklonális an i-Pan-Kalcineu in 1:1000 Cell Signaling an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . Kalszek esz in poliklonális an i-kalszek esz in 1:1000 The mo Scien i ic an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . STIM1 monoklonális an i-STIM1 1:500 BD Labo a o ies an i-egé IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K Ak in poliklonális an i-ak in 1:500 San a C uz an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . A po csej ekből szá mazó min ák ese ében a eljes sej lizá umo 2000 g melle , 10 pe cig cen i ugál uk szobahőmé sékle en, majd a sej pelle e 100 μl RIPA pu e el (Radio Immuno P ecipi a ion Assay) szuszpendál uk (150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% sodium deoxychola e, 50 mM T is, 0,1% sodium dodecyl sulpha e (SDS; pH 8,0), p o eáz inhibí o ok: ap o inin (10 µg mL-1), 5 mM benzamidine, leupep in (10 µg mL-1), ypsin inhibí o (10 µg mL-1), alamin 1 mM phenylme hylsul onyl luo ide (PMSF), 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 8 mM Na- luo ide, 1 mM Na-o ho anada e). A szonikálás kö e ően a min áka szin én 1/5 é oga ú, ö szö ös öménységű elek o o ézis min apu e hozzáadásá al kezel ük, és 5 pe cig 95 ºC-on őz ük. Az immunológiai de ek álásához 50 μg ehé jé szepa ál unk 7,5% SDS- PAGE gélben (6. ábláza ). A o ábbiakban ugyanúgy já unk el, min a ázizom enyésze ből szá mazó min ák ese ében. 36 6. ábláza : A Wes e n-blo analízis so án használ elsődleges és másodlagos an i es ek po c enyésze ből szá mazó min a ese ében. Kimu a andó ehé je Elsődleges an i es Másodlagos an i es STIM1 monoklonális an i-STIM1 1:500 BD Labo a o ies an i-egé IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . O ai1 poliklonális an i-O ai1 1:100 Sigma-Ald ich an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . IP3RI poliklonális an i-IP3RI 1:200 San a C uz an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . IP3RII poliklonális an i-IP3RII 1:200 San a C uz an i-kecske IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . IP3RIII monoklonális an i-IP3RIII 1:2000 BD Labo a o ies an i-egé IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . P2X1 poliklonális an i-P2X1 1:100 Alomone Labs an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . P2X4 poliklonális an i-P2X4 1:100 Alomone Labs an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . P2X5 poliklonális an i-P2X5 1:200 San a C uz an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . P2X6 poliklonális an i-P2X6 1:200 San a C uz an i-kecske IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . P2X7 poliklonális an i-P2X7 1:100 Alomone Labs an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . P2Y1 poliklonális an i-P2Y1 1:100 Sigma-Ald ich an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . P2Y2 poliklonális P2Y2 1:200 Alomone Labs an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . P2Y4 poliklonális P2Y4 1:200 San a C uz an i-kecske IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . P2Y6 poliklonális P2Y6 1:200 San a C uz an i-kecske IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . Ak in poliklonális an i-ak in 1:200 San a C uz an i-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hunga y K . Egyedi sej eken ö énő luo eszcens in acellulá is [Ca2+]-mé és A CPC sej enyésze ek, alamin a ázizom enyésze ek (C1 klón, C5 klón, Sc és kon oll sej ek) sej jeinek in acellulá is [Ca2+]- ál ozásai Fu a-2-AM luo eszcens Ca2+-kö ő es ék segí ségé el mé ük. A mé és alapel e, hogy a Ca2+- kö ö es ék abszo pciós maximuma (380 nm) el é a Ca2+- nem kö ö es éké ől (340 nm), így a ké hullámhosszon ö énő ge jesz és kö e ően emi ál luo eszcens ény in enzi ásának hányadosából megha á ozha ó az in acellulá is [Ca2+]. A mé éshez a CPC sej enyésze eke és a 37 ázizom enyésze eke azonos módon készí e ük elő. A sej eke 30 mm-es ü eg edőlemezen enyész e ük. A el öl éshez Fu a 2-AM es ék 10 µM-os ö zsolda ából 10 μl égkoncen áció alkalmaz unk, a es ék ace oxime ilész e o mája biz osí ja a sej memb ánon ke esz üli es ék el é el . A 2 ml inkubációs ápolda o – mely megegyezik a sej ek enyész ő ápolda á al – o ábbi 4 μl, 150 nM-os neos igminnel egészí e ük ki, az ese legesen jelenle ő ex acellulá is ace ilkolin-ész e áz gá lása céljából. A el öl és 37 ºC- on, e mosz á ban, 90 pe cen á égez ük. A el öl ö sej eke egy in e áló luo eszcens mik oszkóp áll ányá a helyez ük, majd 40 x-es olajimme ziós objek í segí ségé el égez ük a o ábbi izsgála oka . A sej ekbe ju a o es ék 340 és 380 nm hullámhosszúságok közö ál akozó ge jesz ésé a Pho on Technology In e na ional (PTI) Del a ScanTM ke ős monok omá o os be endezése biz osí o a (7. áb a). Fény o áskén a endsze xenonlámpája szolgál , melynek ényé egy o gó ük ös sugá osz ó ké nyaláb a osz ja. A kele kező suga ak külön-külön monok omá o on halad ak á , melyek e edménye a mé éseinkhez szükséges 340 és 380 nm hullámhosszúságú énynyaláb. A monok omá o okból op ikai szálak eze ik a ény egy csa oló egységen, alamin egy dik oikus ük ön ke esz ül a mik oszkóp á gyasz alán elhelyeze sej ek e. A Fu a-2 ál al kibocsá o luo eszcens ény 510 nm-en, in e e enciaszű ő közbeik a ásá al, egy o oelek on-sokszo ozó (PMT) segí ségé el de ek ál uk. A jeleke 10 Hz gyako isággal egisz ál uk. A há é luo eszcenciá a á gylemezek sej men es helyein mé ük, ez a p og am au oma ikusan le on a a mé luo eszcenciaé ékekből. A mé éseke szobahőmé sékle en égez ük. 38 7. áb a: A PTI mé ő endsze elépí ése. A sej ekben lé ő Ca2+-é zékeny es éke 340 és 380 nm hullámhosszon ge jesz jük, majd az emisszió 510 nm-en de ek ál a, a hányadosukból az in acellulá is Ca2+- koncen áció kiszámí ha ó. A ké hullámhosszon ö énő ge jesz és so án mé luo eszcenciaé ékek hányadosából (R=F340/F380) az alábbi egyenle alapján kiszámí ha ó az in acellulá is [Ca2+]: [Ca2+]i=KD∙β∙(R-Rmin)/(Rmax-R), (1.) ahol KD a es ék disszociációs állandója, Rmax az a luo eszcencia hányados, ahol a es ék Ca2+-mal elí e , Rmin az a luo eszcenciahányados, ahol a es ék egyál alán nem kö Ca2+-o , R a mé luo eszcenciaé ékek hányadosa, β a endsze e jellemző állandó. A kísé le i kö ülmények (olda ok) az 1-4 napos CPC sej enyésze ek, alamin a ázizom enyésze ek ese én különbözőek ol ak. Vázizom enyésze ek ese én az in acellulá is [Ca2+]- alamin a sej ek álaszaikén megjelenő Ca2+- anzienseke no mál Ty ode-olda ban (137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11,8 mM HEPES, 1 g/L glükóz, pH 7,4) és Ca2+-men es Ty ode- olda ban izsgál uk. U óbbi ese ben a CaCl2 elhagyása melle az olda 5 mM EGTA- a almazo . Depola izáló ha ású olda kén 120 mM koncen ációjú KCl- a almazó olda o alkalmaz unk, melye no mál Ty ode-olda ból készí e ünk azonos mennyiségű NaCl 39 elhagyásá al. Az olda ok adagolásához lokális pe úziós endsze használ unk (Val e Bank™ 8 e sion 2.0, Au oMa e Scien i ic, USA), a izsgál anyagok olda á egy ékony lokál-pe úziós ű (belső á mé ő: 250 μm, á amlási sebesség: 1,5 μL/s, Pe usion Pencil™, Au oMa e Scien i ic) segí ségé el ju a uk a mé ni kí án sej ek köz e len közelébe. A mé ési e edményeke egy a Deb eceni Egye em Éle ani In éze ében ki ejlesz e p og am segí ségé el é ékel ük ki. CPC sej enyésze ek ese ében a mé éseke no mál Ty ode- agy Ca2+-men es Ty ode- olda ban égez ük. Az aspeci ikus IP3R inhibí o , a 2-aminoe hoxidi enil bo á o (2-APB) Ca2+-men es Ty ode-olda ban 75 μM égkoncen ációban ( ö zsolda : 1M, DMSO-ban); a nem speci ikus TRPC an agonis á , a YM-58483- 1 μM égkoncen ációban ( ö zsolda : 1 mM, DMSO-ban); az aspeci ikus Ca2+-csa o na blokkoló LaCl3 – pedig 500 μM égkoncen ációban ( ö zsolda : 300 mM, DMSO-ban) no mál Ty ode-olda ban oldo uk be. A no mál Ty ode-ból készí e ko ein-olda o (30 mM) a RyR s imulálásá a, alamin a P1 adenozin ecep o an agonizálásá a használ uk. A sza koplazma ikus/endoplazma ikus e ikulum Ca2+-ATP-áz (SERCA) inhibí o a a ciklopiazon sa (CPA; 10 μM) Ca2+-men es Ty ode-olda ban ke ül alkalmazás a ( ö zs: 10 µM, DMSO-ban). Az ál alánosan használ P2X és P2Y pu ine g ecep o agonis a ATP- (180 μM) no mál és Ca2+-men es Ty ode- olda ban is beoldo uk, hasonlóan a P2Y pu ine g ecep o agonis ához (ADP, UTP, UDP; mindegyik 100 μM égkoncen ációjú). A Ca2+-men es ATP, ADP, UDP és UTP alkalmazásá megelőzően a sej ek e 150 másodpe cig adagol unk Ca2+-men es Ty ode- olda o . Az aspeci ikus, P2X és P2Y pu ine g ecep o ok inhibí o akén isme su amin- olda o no mál Ty ode-olda ból készí e ük 10 μM égkoncen ációban. A Ca2+-men es ATP adagolás megelőzően a sej eke 150 másodpe cig Ca2+-men es Ty ode-olda ban a o uk. A P1 ecep o agonis ájakén isme adenozin 100 μM égkoncen ációban, no mál Ty ode- olda ban használ uk. Az [Ca2+]i és a Ca2+-pumpa ak i i ásának analizálása Az [Ca2+]i számí ásá a luo eszcencia in enzi ás hányadosából (R=F340/F380), az (1.) egyenle segí ségé el in i o kalib ál uk. A kalib áció so án kapo é ékek a kö e kezők ol ak: Rmin=0.2045, Rmax=8.315, Kd×β=1183 nM. A Ca2+-pumpa ak i i ásá és a Ca2+- luxus , az in acellulá is kö őhelyek Ca2+-kö ésé , alamin az in acellulá is é ből ö énő Ca2+-el á olí ás munkacsopo unk ko ábban publikál közleményei alapján ha á oz uk meg [47,92]. A Ca2+-kö ődés mé ékének megha á ozásánál igyelembe e ük a SERCA-pumpa, a oponin C, a pa albumin és a es ék ál al megkö ö Ca2+- , alamin annak el á olí ásá is. A 40 Ca2+-pumpa maximális anszpo kapaci ása (PVmax) a Ca2+- anziensek leszálló szá á a illesz e gö béből ha á ozha ó meg, az in éze ünk ál al ki ejlesz e , a legkisebb négyze ek módsze é alapul e ő számí ógépes p og am segí ségé el. A modell öbbi pa amé e é állandókén kezel ük az i odalomból e ada oka elhasznál a [93]. A sej p oli e áció és di e enciáció izsgála a A C2C12 sej eke 3 cm á mé őjű műanyag Pe i-csészékben enyész e ük, és a enyész és 1. napjá ól az 5. napig el é eleke készí e ünk, a ázis kon asz mik oszkóphoz csa lakoz a o ényképezőgép segí ségé el (Canon EOS-300D, Japan). A nem ansz ek ál sej ek melle a SERCA1b shRNS-el ansz ek ál sej eke (C1, C5, Sc ) is nyomon kö e ük, kon oll és ciklospo innal (CSA) kezel kö ülmények közö egya án . A 200 nM-os CSA olda al minden 2. nap kezel ük a sej eke . A enyész és minden egyes napján képeke készí e ünk a enyész őedények (kezel és kon oll) 5-5 éle lensze űen ki álasz o lá ó e é ől. A DAPI- al meg es e sej magoka manuálisan kö be ajzol uk, majd k an i a í analízisnek e e ük alá őke . A sej p oli e áció a sej magok számából ha á oz uk meg úgy, hogy minden sej ípus sej magszámá (C1, C5, Sc , kon oll) a sajá 24 ó ás sej magszámá a no malizál uk. A di e enciál mio ubulusok k an i a í pa amé e ei 20-20 andom lá ó é ből, 3 ügge len kísé le e edményeiből állapí o uk meg (40×olajimme ziós objek í , LSM 510 META, Zeiss). A mio ubulusok á mé őjé Image B owse (Zeiss, Obe kochen, Néme o szág) segí ségé el é ékel ük ki. Kalcineu in-enzimak i i ás mé ése Az in i o kalcineu in-enzimak i i ás (CaN) mé éséhez 10 cm á mé őjű műanyag Pe i-csészében enyész e ük a sej eke , majd iziológiás sóolda os mosás kö e ően összegyűj ö ük a min á . Cen i ugálás kö e ően a sej pelle e , 100 µl RIPA -pu e ben (150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% ná ium-deoxikolá , 50 mM T is, pH 8,0) homogenizál uk, amely a almazo még p o eáz-inhibí o oka is (ap o inin (10 ug/mL), benzamidin (5 mM), leupep in (10 µg/mL), ipszin inhibí o (10 µg/mL), PMSF (1 mM), EDTA (5 mM), EGTA (1 mM), Na- luo id (8 mM), Na-o o anadá (1 mM)). A szonikálásá kö e ően (Cole-Pa me , Illinois, USA) a min áka cen i ugál uk (10000 g, 10 pe c, 4°C), s a elülúszó ehé je koncen ációjának megha á ozásá (BCA) kö e ően égez ük az enzimak i i ás mé és . A kalcineu in ak i i ás de ek álásához RII osz opep id szubsz á o ad unk a min ákhoz, és megha á oz uk a elszabaduló PO43- mennyiségé malachi e g een kolo ime iás assay segí ségé el (Abcam, Camb idge, UK). Az assay ú mu a ójá kö e e minden mé ési 41 csopo ban 6 db enyésze e használ unk el, 2 ügge len kísé le i so oza ban. A de ek álás 650 nm-en égez ük Mul i unc ional pla e eade (Chameleon Hidex, Tu ku Finland) segí ségé el. S a isz ikai analízis Minden é éke az á lag ± az á lagok s anda d hibája (SE) o mában ad unk meg. A s a isz ikai szigni ikanciá S uden - éle -p óbá al számol uk, p<0,05 é ékeke ekin e szigni ikánsnak. Az e edményeink legalább 2 ügge len kísé le e edményei ük özik (az ese ek dön ő öbbségében 3 ügge len kísé le ). 48 ampli údójú (338 ±29 nM, n=44 sej a 48-ból, 91%) Ca2+- anziens sike ül de ek álnunk no mál Ty ode-olda ban, melye újabb ATP adagolása melle ismé el en ud unk de ek álni (4. ábláza , 12. áb a A). A anziensek á lagos idő a amá az időbeli élé ékszélességgel (FTHM, ull ime a hal maximum) jellemez ük, ami 16,1 ±2,6 s-nak adódo . Ahhoz, hogy bizonyí ani udjuk a P2X és P2Y ecep o ok unkcionális sze epé , nem-speci ikus P2 ecep o an agonis á , su amin (10 μM) alkalmaz unk. Su amin adagolásá a a Ca2+- anziensek jellemző pa amé e ei nem ál oz ak a csak ATP adagolása melle ögzí e ada so hoz képes , sem no mál, sem pedig Ca2+-men es Ty ode-olda ban egisz ál ada so okban (12. áb a B, D, E), ami a a u al, hogy a Ca2+-oszcillációk kialakulásáé a őbb su amin-inszenzi í P2 pu ine g ecep o ok (P2X4, P2X6 és/ agy P2Y4) a elelősek. A kísé le e Ca2+-men es kö ülmények közö megismé el e a epe i í anziensek ugyanúgy de ek álha óak ol ak, de a kon ollhoz képes szigni ikánsan kisebb ampli údó al (205 ±25 nM, n=35; 12. áb a D). Ugyancsak szigni ikáns különbsége apasz al unk a elszálló szá me edekségében is, a kon oll és Ca2+-men es kö ülmények közö egisz ál ada so ban (72,9 ± 12,6 nM ·s-1 s. 35,4 ± 8,8 nM ·s-1, p<0,05; 12. áb a E). Ugyanakko nem alál unk jelen ős különbsége a anziensek idő a ama közö a ké mé ési ada so ban (20,6 ±3,1 s; p=0,29). A en emlí e e edmények az sugallják, hogy mind az iono óp P2X, mind pedig a me abo óp P2Y pu ine g ecep o ok és/ agy a SOCE hozzájá ulnak a spon án Ca2+-oszcilláció kialakulásához. Azonban, amiko az IP3- ecep o inhibí o á , a 2-APB- az ATP- el együ adagol uk a sej ek e, anziens csak néhány ese ben sike ül de ek álnunk (n=2 a 19 sej ből, 10%; 12. áb a C), ezé úgy gondoljuk, hogy a anziensek lé ejö e leginkább a me abo óp P2Y ecep o ak i i ásából adódik, agy a 2-APB aspeci ikusan gá olja a Ca2+-belépés . 49 12. áb a: A P2 pu ine g ecep o ok unkcionális ka ak e izálása. (A) ATP adagolásá a bekö e kező Ca2+- anziensek ep ezen a í áb ája. (B) A P2 ecep o nem-speci ikus an agonis ájának, a su aminnak (10 µM) ha ása az ATP- el ki ál o Ca2+- anziensek e Ca2+-men es Ty ode-olda ban. (C) No mál Ty ode-olda ban mé Ca2+- anziens ATP és az aspeci ikus IP3R blokkoló 2-APB jelenlé ében. (D) Az ATP ha ásá a kialakul Ca2+- anziensek ampli údóinak é éke no mál és Ca2+-men es Ty ode-olda ban. Kon ollnak a su amin adagolása elő i Ca2+- anziens ekin e ük. (E) Az ATP- el ki ál o Ca2+- anziensek elszálló szá ának me edeksége no mál és Ca2+-men es Ty ode-olda ban. Kon ollkén a su amin adagolása elő i Ca2+- anzienseke használ uk. A zá ójelekben el ün e e számok a izsgál sej ek számá jelzik. A csillag (*) a no mál és Ca2+-men es Ty ode- olda ban egisz ál anziensek közö i szigni ikáns (p<0,05) különbsége mu a ja. 0200 400 600 800 0 100 200 300 400 500 0200 400 600 800 0 100 200 300 400 500 0100 200 300 0 100 200 300 400 500 A ATP C B ATP ATP [Ca2+]i(nM) idő (s) ATP 2-APB ATP ATP ATP ATP su amin [Ca2+]i(nM) idő (s) [Ca2+]i(nM) idő (s) 1,8 mM [Ca2+]e0 mM [Ca2+]e 1,8 mM [Ca2+]e 0 100 200 300 400 500 600 D(9)(7) * ∆[Ca2+]i(nM) * (7) (9) 0 20 40 60 80 100 120 140 Felszálló szá me edeksége (nM .s–1) * (9)(7) E (7) (9) ATP (1.8 mM [Ca2+]e) su amin+ATP (1.8 mM [Ca2+]e) ATP (0 mM [Ca2+]e) su amin+ATP (0 mM [Ca2+]e) 50 A kond op ogeni o sej ek Ca2+-homeosz ázisában kulcssze epe já szó P2Y ecep o ok sze epének o ábbi, p ecízebb elde í ésé e a kö e kező kísé le eke égez ük el. Különböző P2Y ecep o agonis áka alkalmaz unk a Ca2+-mé ések so án (7. ábláza ). Az UTP (P2Y2 és P2Y4 agonis a, 100 μM; 13. áb a A) és az ADP (P2Y1, P2Y12 és P2Y13 agonis a, 100 μM; 13. áb a B) adagolása nagy Ca2+- anzienseke ál o ki (325 ±21 nM és 284 ±25 nM) a de ek ál sej ek öbbségében (n=13 a 15 sej ből és n=18 a 20 sej ből; 13. áb a E), míg az UDP (P2Y6 agonis a, 100 μM) alkalmazása melle semmilyen [Ca2+]i ál ozás nem ud unk de ek álni (n=0 a 11 sej ből; 13. áb a C). A P1 adenozin ecep o ok unkcionális sze epé adenozin (100 μM) adagolásá al izsgál uk meg. E edményeink sze in a leg öbb sej ben lé ejö Ca2+- anziens (n=16 a 18 sej ből; 13. áb a D), melyek ampli údójának á lagos é éke 259 ±27 nM ol . A P1 ecep o blokkoló ko ein (30 mM) adenozinnal ö énő egyidejű alkalmazása melle azonban az in acellulá is kalciumkoncen áció a ki ej e ha ás elma ad (10 sej ből egy sem álaszol ). Ezekből az e edményekből a a kö e kez e ünk, hogy a P1 ecep o nak, alamin a P2Y ecep o oknak ki ün e e sze epük an a Ca2+- anziensek lé ejö ében. A mé ésekből szüle e on osabb ada oka a 7. ábláza oglalja össze. 7. ábláza : Nyugalmi ([Ca2+]i,min) és maximális ([Ca2+]i,max) Ca2+-koncen áció é ék, ampli údó és időbeli élé ékszélesség é ékek (FTHM) agonis a s imuláció ha ásá a (ATP, ADP, UDP, UTP, Adenozin). A p é ék az ATP adagolása kö e kez ében kialakul , no mál és Ca2+-men es Ty ode-olda ban egisz ál anziensek köz i különbsége mu a ja. Az ada ok az á lagoka ± az á lagok s anda d hibájá (SEM) mu a ják. [Ca2+]i,min (nM) [Ca2+]i,max (nM) Ampli údó (nM) FTHM (s) ATP, 180 μM ([Ca2+]e=1,8 mM), n=44 121,19 ± 3,47 452,80 ± 28,93 338,19 ± 28,56 16,11 ± 2,63 ATP, 180 μM ([Ca2+]e=0 mM), n=35 97,02 ± 4,20 301,68 ± 27,03 204,65 ± 25,03 20,63 ± 3,09 p 2,8*10-7 0,0002 0,0009 0,29 ADP, 100 μM ([Ca2+]e=1,8 mM), n=18 112,04 ± 3,12 396,11 ± 24,85 284,07 ± 25,02 24,13 ± 2,47 UTP, 100 μM ([Ca2+]e=1,8 mM), n=13 98,24 ± 3,86 422,83 ± 23,19 324,58 ± 20,50 23,03 ± 2,59 Ade, 100 μM ([Ca2+]e=1,8 mM), n=16 119,56 ± 11,5 378,06 ± 34,60 258,49 ± 26,71 23,04 ± 3,15 51 13. áb a: P1 és P2Y ecep o ok unkcionális ka ak e izálása. (A) UTP adagolásá kö e ően kialakul Ca2+- anziens ep ezen a í áb ája. A mé éseke minden ese ben no mál Ty ode-olda ban égez ük. (B) Ismé el ADP (100 µM) adagolásá a kialakul Ca2+- anziensek ep ezen a í áb ája. (C) 100 µM UDP ha ása az in acellulá is Ca2+-szin e. (D) Adenozin ha ásá a kialakul Ca2+- anziens, amely bizonyí ja az A1 ecep o ok unkcionális sze epé a po csej ekben. (E) Á lagos ampli údó é éke mu a ó összesí e e edmények. Az ada ok az á lagoka ± az á lagok s anda d hibájá (SEM) mu a ják. A zá ójelekben el ün e e számok a izsgál sej ek számá jelzik. 050 100 150 200 0 100 200 300 400 500 C [Ca2+]i(nM) idő (s) ADP 1,8 mM [Ca2+]e UDP 050 100 150 200 0 100 200 300 400 500 A1,8 mM [Ca2+]e UTP [Ca2+]i(nM) idő (s) 0100 200 300 400 500 0 100 200 300 400 500 B ADP ADP ADP [Ca2+]i(nM) idő (s) 1,8 mM [Ca2+]e 0 100 200 300 ADP UTP Adenozin ∆[Ca2+]i(nM) (18) (13) (16) E 050 100 150 200 0 100 200 300 400 500 D Adenozin 1,8 mM [Ca2+]e [Ca2+]i(nM) idő (s) 52 Az ATP sze epének izsgála a a spon án Ca2+-oszcillációk kialakulásában Ahogy az má ko ábban emlí e em, a humán MSC-kben az au ok in/pa ak in pu ine g szignalizációs hu ok elelős a Ca2+-oszcillációk kialakulásáé , ezé sze e ük olna meg izsgálni, hogy a pu ine g ecep o ok mikén já szanak sze epe az ismé lődő Ca2+- anziensek kialakulásában. Ennek kide í ésé e ek o-ATP-di osz ohid oláz alkalmaz unk, amely ADP-áz agy api áz né en is isme , egy plazmamemb ánhoz kö ö enzim, mely de osz o ilálja az ex acellulá is adenozin 5’- i osz á o (ATP) és adenozin 5’-di osz á o (ADP), adenozin 5-mono osz á á (AMP). Ez az enzime ko ábban CD39 né en azonosí o ák, a B-lim oci ákon alálha ó ak i ációs ma ke alapján [95]. Magá az enzime 5 U·mL-1 koncen ációban alkalmaz uk az egyedi sej en ö énő Ca2+-mé és ideje ala . Api áz jelenlé ében nem alakul ki ismé lődő Ca2+- anziens (n=5), amiből a a kö e kez e ünk, hogy az ex acellulá is ATP jelenlé e elengedhe e len a spon án Ca2+-oszcillációk kialakulásában. 53 E edmények II.-Vázizomszö e C2C12 sej enyésze ek, ansz ekció I odalmi ada okból isme , hogy a SR Ca2+-pumpájának neona ális izo o mája -a SERCA1b- megha á ozó sze epe öl be a mio ubulusok és a ia al álla ok ázizmának Ca2+- homeosz ázisában [96,97]. Kísé le eink ezen észében ezé célul űz ük ki, hogy meg izsgáljuk a SERCA1b pumpa géncsendesí ésének ese leges ha ásai . A kísé le ek ki i elezéséhez C2C12 egé e ede ű ázizomsej eke használ unk, és olyan exp essziós ek o e ez ünk, amely a almazza a SERCA1b elleni speci ikus shRNS szek enciá (pLKO.1-pu o-CMV- GFP). A sej enyésze eken liposzóma mediál ansz ekció alkalmaz unk. A ansz ekciós ha ékonyságo a SERCA1b ehé jé e speci ikusan e eze an i es el ellenő iz ük, Wes e n-blo echnika segí ségé el. A 14. áb a szemlél e i, hogy 6 klónból négyben sike ül a ehé je exp essziójá csökken enünk (C1, C3, C4 és C5 klón). 14. áb a: A csökken SERCA1b ehé je exp esszió izsgála a C2C12 mio ubulusokban. (A-B) A SERCA ehé je exp essziójának izsgála a SERCA1b-speci ikus shRNS-el ansz ek ál sej ekben Wes e n-blo echnika segí ségé el. A s abil ansz ekció kö e ően 6 klón izsgál unk, alamin a sc ambled és pool enyésze e . A 115 kDa-os izo o má ké éle an i es el de ek ál uk: az egyik kizá ólag csak a SERCA1b izo o má isme i el (A), a másik pedig mind a SERCA1a és mind az 1b izo o máka (B). Kon ollkén ak in használ unk. Bá az i odalomból isme , hogy C2C12 ázizomsej ekben csak a SERCA1b exp esszálódik [97], ennek alá ámasz ása é dekében ugyanezen min ákban a SERCA ehé je kimu a ásá megismé el ük olyan an i es el, amely elisme i a SERCA1a ( elnő sza koplazma ikus e ikulum Ca2+-ATP-áz izo o ma) és 1b szek enciáka is (14. áb a B). A ké kísé le ben hasonló e edmény kap unk, azaz a 6 klónból négyben jelen ősen csökken a ehé je exp essziója a géncsendesí és kö e ően. A Wes e n-blo e edmények k an i a í elemzésé kö e ően olyan klónoka ke es ünk, amelyekben a SERCA1b ehé je exp essziója eljesen agy csak észben csökken . Így ese a álasz ás az 1. klón a (C1), ahol szin e eljes mé ékben csökken az exp esszió, és az 5. klón a (C5), ahol csak észben sike ül lecsökken enünk a SERCA1b ehé je S d C1 C3 C4 C5 C6 C7 pool Sc Ak in SERCA1b 115 kDa 130 kDa 100 kDa 70 kDa 55 kDa 35 kDa Ak in SERCA1ab 115 kDa 130 kDa 100 kDa 70 kDa 55 kDa 35 kDa S d C1 C3 C4 C5 C6 C7 pool Sc B A 54 exp essziójá (14. áb a A). A sc ambled sej ekhez iszonyí o op ikai denzi ás mé éke az 1. klónban 6,6±0,8%, az 5. klónban pedig 14,7±1,9% ol (15. áb a). Ezeken a klónokon pu omycines szelekció haj o unk ég e és az így lé ejö s abil klónoka használ uk a sc ambled és kon oll sej ek melle a o ábbi kísé le ekhez. Minden kísé le hez kizá ólag csak e minálisan di e enciálódo mio ubulusoka használ unk el. 15. áb a: A s abilan ansz ek ál klónok denzi ome iás analízise. Az op ikai denzi ás mé éké a sc ambled sej ekhez iszonyí o uk. A hé klónból ke ő ke ül ki álasz ás a (C1, C5). Ahogy az az áb án is jól lá ha ó, a C1 sej ekben szin e eljes mé ékben csökken a SERCA1b exp esszió, míg a C5 sej ekben csak észben. A ázizom Ca2+-homeosz ázisában és di e enciálódásában ész e ő ehé jék exp essziós min áza ainak alakulása a csökken SERCA1b ehé jeszin ha ásá a Kö e kező kísé le so oza unkban meg izsgál uk azon ehé jék exp essziós szin jének a ál ozásá , amelyek on os sze epe já szanak a ázizom Ca2+-homeosz ázisában és di e enciálódásban. Vizsgál uk a kalszek esz in (CSQ), a sz ómális in e akciós molekula1 (STIM1), a miogenikus anszk ipciós ak o (MyoD), a kalcineu in (CaN), a dihid opi idin ecep o (DHPR), alamin a SERCA2a exp essziós szin jének alakulásá a SERCA1b géncsendesí és kö e ően. A CSQ a leg on osabb Ca2+-kö ő ehé je a SR-ban, a STIM1 ehé je pedig a SOCE kalcium szenzo a a SR-ban. E edményeink az mu a ják, hogy a CSQ exp essziós szin je az 1. klónban csökken az 5. klón, a sc ambled és kon oll min ákhoz iszonyí a (16. áb a A). A STIM1 exp essziós szin je hasonlóan alakul a CSQ-hez, az 1. klónban csökken exp esszió igyelhe ünk meg, míg a Sc és C5 sej ekben csak nagyon kis mé ékű a csökkenés (16. áb a A). 0 10 20 30 40 50 60 70 In enzi ás (Sc ambledhez iszonyí o %) C1 C3 C4 C5 C6 C7 pool SERCA1b 55 16. áb a: A Ca2+-homeosz ázisban és di e enciálódásban ész e ő ehé jék exp essziós min áza a és denzi ome iás analízisük. (A) A SR Ca2+-kö ő ehé je (CSQ) exp essziós izsgála a a C1, C5, Sc és kon oll sej ekben. A SOCE mechanizmusában on os sze epe já szó STIM1 molekula exp essziós min áza a. A di e enciálódás on os sze eplőinek exp essziós min áza a: MyoD és CaN, alamin a belső kon ollkén használ ak in ehé je exp essziója. A Wes e n-blo analízis so án minden min a ese ében 30 µg ehé jé , alamin kizá ólag e minálisan di e enciálódo mio ubulusoka használ unk. Az áb ák 3 ügge len kísé le e edményei ep ezen álják. (B) Az (A) panelen bemu a o ehé jék denzi ome iás analízise. A MyoD exp essziós szin je nem ál ozo a ansz ekció kö e ően, míg a CaN exp essziója az 1. és 5. klónban is jelen ős csökkenés mu a o (16. áb a A). Az e edmények k an i a í analízisé kö e ően megállapí o uk, hogy a SERCA1b géncsendesí és ha ásá a a kon ollhoz iszonyí a szigni ikánsan csökken a CSQ, a STIM1 és a CaN exp essziós szin je a C1 sej ekben (16. áb a B). Sike ül kimu a nunk a SERCA2a izo o má is, ami leginkább a lassú ípusú ha án csíkol izomban és a szí izomban o dul elő. Pozi í kon ollkén egé szí izom min á használ unk. Az egyes min ák SERCA2a exp essziós szin je közö sincs különbség (16. áb a A, B). Kísé le eink o ábbi észében a mRNS-szin ű ál ozásoka kö e ük nyomon. Ehhez speci ikus p ime pá oka e ez ünk. Vizsgál uk a ázizom di e enciálódás nega í egulá o á a miosz a in , alamin a CaN ak i i ásá jelző modula o y calcineu in in e ac ing p o ein- , az MCIP1.4- . A PCR eakció al ele ősí e amplime ek de ek álása so án az apasz al uk, hogy mind a miosz a in, mind a MCIP1.4 szin je csökkenés mu a o a C1 sej ekben a kon ollhoz iszonyí a. A denzi ome iás kié ékelés so án a kapo e edményeke mindig a GAPDH exp essziós szin jé e no malizál uk (18. áb a). C1 C5 Sc K STIM1 90 kDa CSQ 60 kDa Ak in 45 kDa MyoD 55 kDa CaN 59 kDa SERCA2a 115 kDa CSQ STIM1 MyoD CaN SERCA2a 020 40 60 80 100 120 AU C1 C5 Sc AB 56 18. áb a: mRNS-szin ű izsgála RT-PCR echnika segí ségé el. (A-B) A MSTN (A) és a kalcineu in ak i i ásá jelző MCIP1.4 ehé je (B) mRNS-szin ű izsgála a C1, C5 és Sc sej eken. Kon ollkén GAPDH- használ unk. A csökken SERCA exp esszió ha ása a Ca2+-homeosz ázis a Kö e kező kísé le einkben a SERCA1b ehé je exp esszió csökken ésének ha ásá izsgál uk az elek omechanikai csa olás a és a depola izáció ál al ö énő Ca2+- elszabadulás a a C1 és Sc sej ekben. A anzienseke 120 mM KCl ex acellulá is é be ö énő adagolásá al ál o uk ki (19. áb a A, B). A mé ések kié ékelése so án az az e edmény kap uk, hogy sem a anziensek ampli údóiban (681±105, n=10 s. 668±128 nM, n=10; kon oll és C1 sej ek ese ében), sem pedig a elszálló szá me edekségében (606±108 µM/s s. 489±149 µM/s) nincs szigni ikáns különbség (p>0,05) a C1 és a sc ambled sej ek közö (Sc enyésze ; 19. áb a C, D). 233 bp C1 C5 Sc MSTN ABC1 C5 Sc 160 bp MCIP 1.4 322 bp GAPDH 57 19. áb a: A csökken SERCA1b ehé je exp esszió ha ása a depola izáció kö e kez ében kialakul Ca2+- anziensek e. (A-B) Repe i í Ca2+- anziensek 120 mM KCl adagolása melle sc ambled és C1 mio ubulusok ese én. A mé éseke no mál Ty ode-olda ban égez ük. (C) A Ca2+- anziensek ampli údó é ékei. (D) A elszálló szá me edekségének é éke a Sc és C1 sej ek ese ében. Az ada ok az á lagoka ± az á lagok s anda d hibájá (SEM) mu a ják. A zá ójelekben el ün e e számok a izsgál sej ek számá jelzik. To ábbi izsgála ainkban a pumpa működésében ese legesen bekö e keze ál ozások ha ásai kí án uk el á ni (PVmax) a Sc , C1 és C5 sej ekben. A nyugalmi [Ca2+]i é ékei közö a anziensek kialakulása elő (108±4 nM a Sc sej ek ese ében, 109±4 nM a C1 sej ek ese ében) nem alál unk szigni ikáns különbsége . A KCl ál al ki ál o anziensek azonban a C1 mio ubulusokban lassabban é ek issza a nyugalmi [Ca2+]i szin e, ahogy az a 20. áb a A és B panelje is mu a ja. A KCl adagolásá kö e ő 20. és 40. másodpe cben a [Ca2+]i é éké megha á oz uk, s míg a kon oll sej ekben ezek az é ékek 112±3 nM-nak (20. s-ban) és 110±3 nM-nak (40. s-ban) adód ak, addig a C1 sej ek ese én 150±7 nM (20. s-ban) és 135±5 nM (40. s-ban) ol . Ezek az é ékek a SERCA1b géncsendesí e sej eken alálha ó pumpák ak i i ásá a u alnak (20. áb a C). Ennek o ábbi bizonyí ásá a megha á oz uk a PVmax é ékeke is, az „Anyagok és módsze ek” ejeze ben leí ak alapján. Szigni ikáns különbsége 050 100 150 200 250 0 200 400 600 800 0100 200 300 400 500 0 200 400 600 800 AB 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Ampli údó (∆ [Ca2+]i) nM (10) (10) Sc C1 0 100 200 300 400 500 600 700 Sc C1 Felszálló szá me edeksége (nM/s) CD KCl KCl [Ca2+]i(nM) [Ca2+]i(nM) Idő (s) Idő (s) Sc C1 64 A kalcineu in (PP2B) ő a ge jének a anszk ipciós ak o ok családjába a ozó NFAT- (Nuclea Fac o o Ac i a ed T-cell) a ják. Az NFAT osz o ilál állapo ban a ci oplazmában an jelen, az in acellulá is Ca2+-koncen áció emelkedése a kalcineu in ak i i ásá okozza, azaz a kalcineu in de osz o iláló ha ásá a, az NFAT a sej magba ju ha és anszk ipciós olyama oka indí ha be, amely a di e enciálódás elősegí éséhez eze . A PP2B legha ásosabb, legspeci ikusabb és legisme ebb inhibí o ai immunoszup esszí anyagok, ilyen pl. a ciklospo in-A (CSA), amely a kalcineu in ci oplazma ikus ecep o aikkal a ciklo ilinnel és FKBP- el alko o komplexek é én gá olja. Annak igazolásá a, hogy a SERCA1b gá lása a PP2B-n ke esz ül eze a p oli e áció csökkenéséhez, a C1, C5, Sc és kon oll sej ek p oli e ációjá meg izsgál uk ciklospo in (CSA) kezelés melle is. A CSA olda o 200 nM koncen ációban használ uk, és minden 2. nap kezel ük a sej eke . A enyész és minden napján képeke készí e ünk minden egyes Pe i-csésze (kezel és kon oll) 5-5 éle lensze űen ki álasz o lá ó e é ől (24. áb a). A kísé le ek el égzésé és kié ékelésé kö e ően az apasz al uk, hogy a CSA csökken e e mind a kon oll, mind pedig a C5 és Sc sej ek p oli e ációs á ájá , azonban a C1 sej ek o ábbi p oli e ációjának csökkenésé nem okoz a. Az e edményeink alapján a kon oll sej ek ela í sej magszáma 9,1±0,7 és 5,6±0,6 ol kon oll és CSA-kezel sej ek ese ében (p<0,05), míg a C1 sej ek ese ében ez az é ék 3,6±0,5 és 3,7±1,1-nak adódo kezel és kon oll ese ben (p>0,4), amely összhangban an a CaN csökken exp essziós szin jé el. 65 24. áb a: P oli e ációs á a izsgála a CSA kezelés melle C1, C5, Sc és kon oll mio ubulusokban. A CSA olda o 200 nM koncen ációban használ a minden 2. nap kezel ük a sej eke , és a enyész és minden napján képeke készí e ünk minden egyes Pe i-csésze 5-5 andom ki álasz o lá ó e é ől. A sej p oli e áció a ko ábban leí módsze alapján ha á oz uk meg. Ahogy az az áb án is lá ha ó, a CSA csökken e e mind a kon oll, mind pedig a C5 és Sc sej ek p oli e ációs á ájá , azonban a C1 sej ek o ábbi p oli e ációjának csökkenésé nem okoz a. 24 48 72 96 120 0 2 4 6 8 10 12 kon oll Sc C1 C5 A sej magok ela í száma lá ó e enkén Tenyész és ideje (h) 66 Megbeszélés Po cszö e -kond op ogeni o sej enyésze ek A ci oszólikus [Ca2+] dinamikus ál ozása A Ca2+ a sej ek leg öbb éle olyama ában on os szabályozó sze epe já szik, így a di e enciálódásban is ki ün e e sze eppel bí . Munkám egyik észében a a ke es ük a álasz , hogy humán e ede ű CPC-kben milyen ú onalon ke esz ül alósul meg a epe i í Ca2+-oszcilláció, és milyen ehé jék esznek ész a szabályozásban. A nem exci ábilis sej ek kalciumhomeosz ázisá al kapcsola ban ki e jed i odalommal endelkezünk, így isme jük a leg öbb anszk ipciós ak o , az NFAT, az NF-κB agy a CREB szignalizációs mechanizmusban be öl ö sze epé [98], alamin a p o ein kinázok modulációjában já szo sze epüke is [99,100]. Mindezek melle számos i odalmi ada o alálunk a a ona kozóan, hogy a Ca2+-oszcilláció hogyan alósul meg a hasnyálmi igyben alálha ó β-sej ekben [101], emb ionális őssej ekben (ESC-k) [102], kond oblasz okban [48,82], kond oci ákban [103] agy épp humán cson elő-e ede ű mezenhimális őssej ekben (MSCs) [50,104]. Munkánkban elsőkén mu a uk be és é képez ük el a CPC-k Ca2+-homeosz ázisában sze epe já szó pu ine g szignalizációs ú onala , és az abban sze epe já szó ehé jék exp esssziójá . Ahhoz, hogy ezeke a humán e ede ű osz eoa i iszes szö e ből szá mazó po csej eke el udjuk használni izsgála ainkhoz, elengedhe e len ol a sej ek len i i ális ansz ekció al ö énő immo alizációja. Mindemelle on os szempon ol az is, hogy ezek a sej ek a p oli e áció ideje ala monolaye kul ú á hozzanak lé e. Koelling és munka á sai (2009) má ko ábban el é képez ék a CPC-k kologeni ásá , mig a o ikus ak i i ásá [21], ezé célul űz ük ki a CPC-k kond ogenikus ma ke einek mRNS-szin ű de ek álásá . Ellen é ben az emb ionális csi ke ég ag elepből izolál kond ogenikus sej ek magas ek enciájú (8×10-2 Hz) Ca2+- oszcillációjá al, a CPC-kben a Ca2+-oszcilláció ek enciája jó al alacsonyabb (1.3×10-3 Hz), hasonlóan a MSC-kben leí akhoz [104,105]. Különbség o ábbá az is, hogy a CPC-k ese ében a Ca2+-oszcilláció a belső Ca2+- ak á akból elszabaduló Ca2+ szabályozza, míg az emb ionális csi ke ég ag elepből izolál kond ogenikus sej ek gyo s Ca2+-oszcillációjáé az ex acellulá is é ből beju ó Ca2+ ehe ő elelőssé, el ehe ően a jó al kisebb Ca2+- ak á mia [48,106]. 67 A kond op ogeni o sej ek belső Ca2+- ak á ának unkcionális jellemzése és sze epe a Ca2+-oszcilláció kialakí ásában Ahhoz, hogy ka ak e izálni udjuk a belső Ca2+- ak á a , meg kelle izsgálnunk a szabályozásban é in e ehé jék exp essziós min áza á . Az endoplazma ikus e ikulum (ER) ké a Ca2+- elszabadí ásban on os sze epe já szó csa o nájá izsgál uk, az IP3R al ípusai , alamin a RyR- , melynek exp essziójá nem sike ül kimu a nunk. Ezen meg igyelésünk megegyezik a MSC-kben leí e edményekkel [104,105]. Kollabo ációs pa ne einknek ko ábban az emb ionális csi ke ég ag elepből izolál kond ogenikus sej ekben csak az IP3R1 izo o májá sike ül de ek álni [15]. Az ESC-kben ezzel ellen é ben mind a há om IP3R al ípus exp esszálódik [107], alamin a RyR is [102]. A CPC-kben mind a há om IP3R al ípus de ek álha ó. A Ca2+-oszcilláció kialakulása az IP3R al ípusainak ela í exp essziós szin jé ől, ille e endogén modulá o ok, min az IP3, Ca2+ és ATP megjelenésé ől ügg. I odalmi ada ok alapján az IP3R2 e ő eljes, hosszan a ó, szabályosan ismé lődő Ca2+-oszcilláció okoz, az IP3R1 ezzel szemben ke ésbé endeze Ca2+-oszcilláció alakí ki, az IP3R3 pedig a legke ésbé é zékeny az IP3 jelenlé é e, így ez az al ípus mono ázisos Ca2+- anzienseke gene ál [108,109]. Az al ípusok elosz ásának isme e e elengedhe e len a CPC-k Ca2+- oszcillációjának jellemzéséhez ( ek encia, ampli údó). A belső Ca2+- ak á ból ö énő IP3R- mediál Ca2+- elszabadulás nélkülözhe e len a Ca2+-oszcilláció kialakulásához, ezé az egyedi sej en ö énő Ca2+-mé és so án egy aspeci ikus IP3R blokkoló , a 2-APB- használ uk, melynek ha ásá a a spon án bekö e kező Ca2+-események el űn ek. Ez az e edmény jó egyezés mu a a MSC-kben [104,107] és az ESC-kben [107] leí e edményekkel, így joggal el é elezhe jük, hogy ez a mechanizmus egy uni e zális módja a Ca2+-oszcilláció lé ejö ének az őssej ekben. Meg izsgál uk o ábbá a SOCE mechanizmusá is, amely szin én esszenciális sze epe öl be a CPC-k Ca2+-oszcillációjában. Fel é elezésünk sze in , a CPC-kben kialakuló Ca2+- oszcilláció alappillé e az IP3R-on ke esz ül ö énő Ca2+- elszabadulás, és a SOCE mechanizmus é én a ak á ál al ezé el Ca2+-belépés. Ez az elképzelésünke alá ámasz ják a CPA- al égze kísé le eink e edményei is (9. áb a). A a a ké dés e azonban, hogy a Ca2+- oszcilláció kialakulásának há e ében milyen ehé jék állnak, az i odalomban nem alál unk ada o , CPC-kben ilye még nem izsgál ak. A Ca2+-homeosz ázis enn a ásában sze epe já szó SOCE kulcs ehé jéi , a STIM1- és az O ai1- MSC-kben má leí ák [104,110], ille e a csi ke kond op ogeni o sej ekben szin én de ek ál ák má a STIM1, STIM2 és O ai1 ehé jék exp essziójá [48]. A STIM2 ehé jé ől i odalmi ada ok alapján udjuk, hogy az ER 68 Ca2+- a almának má egészen kicsi csökkenésé is é zékeli, és a csökkenés kö e kez ében azonnal ak i álódik, míg a STIM1 csak a Ca2+- ak á eljes kiü ülésé kö e ően álik ak í á [111]. A CPC-k ese ében csak a STIM1 exp essziójá sike ül kimu a nunk. A spon án Ca2+- anziensek kialakulásában a STIM1 ehé jének megha á ozó sze epe an, és esszenciális sze epe öl be az O ai1 ehé jék punk ákba ö énő endeződésénél is. Habá az O ai izo o máknak öbb ípusa isme , a CPC-k csak az O ai1- exp esszálják (10. áb a). Pu ine g szignalizáció és a Ca2+-oszcilláció au ok in/pa ak in szabályozása Humán MSC-kben a Ca2+-oszcilláció kialakulásáé egy au ok in/pa ak in pu ine g hu ok ehe ő elelőssé, ahol ATP elszabadulásá kö e ően a P2Y1 me abo óp pu ine g ecep o s imulálódik, majd a PLC ú onal ak i álódik [50]. Kollabo ációs pa ne eink ko ábbi közleményeikben hasonló au o egula o ikus ú onala izsgál ak csi ke kond op ogeni o sej ekben, ahol a P2X4 iono óp pu ine g ecep o já szo ki ün e e sze epe [17,48]. Ezen ények isme e ében kí áncsiak ol unk a a, hogy a humán CPC-kben, ahol az ex acellulá is nukleo idok gyulladásos mediá o okkal együ szabadulnak el [112], milyen sze epe öl enek be a pu ine g ecep o ok. Tekin e el a a, hogy a P1 ecep o al ípusok a kond oci ákban is exp esszálódnak [113], előszö a P1 pu ine g ecep o p o il meg izsgálásá űz ük ki célul. E edményeink sze in CPC-kben az A1 [114], A2A [115] és A2B [116] exp essziója meg igyelhe ő, ugyanúgy, min a MSC-kben, míg az A3 ecep o exp essziója nem ol de ek álha ó. Ezen e edmények jó ko eláció mu a nak az i odalmi ada okkal. I odalmi ada ok alapján ugyancsak isme , hogy az A1 és A2B ecep o -mediál szignalizáció indí ja el az MSC-k osz eogenikus di e enciációjá [114,117]. Míg az A2B ecep o ok ak i ációja az osz eogenikus gének ak i ációjá indukálja az MSC-kben, addig az A1 és A2A ecep o ok exp essziós szin jének a nö ekedése adipogenikus i ányba olja el a di e enciáció [118]. Kö e kező lépésben a P2 pu ine g ecep o oka anulmányoz uk. Fluo eszcens Ca2+- mé és so án, ex acellulá is ATP adagolásá al Ca2+- anzienseke ál o unk ki no mál és Ca2+-men es Ty ode-olda ban, ahol a Ca2+-men es kö ülmények közö szigni ikánsan kisebbnek bizonyul mind a nyugalmi, mind pedig a maximális [Ca2+]i é ék, alamin az ampli údó és az FTHM is (7. ábláza ). Ezzel a kísé le el mind a P2X, mind pedig a P2Y ecep o izo o máka izsgálni ud uk. Ezzel ellen é ben, amiko az ATP- együ alkalmaz uk 69 az IP3R nem speci ikus inhibí o á al, a 2-APB- el [119], a izsgál sej ek öbbsége nem álaszol , bizonyí a ezzel, hogy az ex acellulá is nukleo idok elsődleges kö ődési célpon jaik a me abo óp P2Y ecep o ok. To ábbi izsgála ainkban különböző P2 ecep o agonis áka (ATP, ADP, UTP és UDP, 7. ábláza )[120], alamin egy nem speci ikus an agonis á , a su amin alkalmaz uk, így sike ül igazolnunk a P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2X4 és P2X6 ecep o ok unkcionális ak i i ásá CPC-kben. Ezek az e edmények összhangban annak a Zippel és munka á sai ál al publikál e edményekkel, ahol MSC-kben izsgál ák a P2 ecep o al ípusoka és a P2X6, P2Y4, P2Y14 jelenlé é igazol ák [121]. Ezek a P2 ecep o al ípusok az adipogenikus és az osz eogenikus di e enciáció so án is eguláló sze epe öl enek be [121], így joggal el é elezhe jük, hogy a CPC-k di e enciációjában is hasonló sze epük lehe . Cicia ello és munka á sai az MSC-k adipogenikus di e enciációjá izsgál ák, ami e edményük sze in a P2Y1 és P2Y4 ecep o ok mediál ak. Ugyanakko , ha az A2B adenozin ecep o oka s imulál ák, a di e enciáció osz eogenikus i ányba olódo el [122]. A CPC-k is képesek osz eogenikus, adipogenikus és kond ogenikus i ányba is di e enciálódni [21], alamin a P1 és P2 ecep o p o iljuk is jól ko elál az i odalomban alál ada okkal. 25. áb a: Össze oglaló áb a a kond op ogeni o po csej eken égze kísé le es e edményeink ől. Az áb án jól lá ha ó a szabályozásban é in e ehé jék lokalizációja és sze epük a Ca2+-oszcilláció kialakí ásában. A SOCE mechanizmus melle a pu ine g szignalizáció is on os sze epe öl be a spon án Ca2+-oszcilláció lé ejö ében. STIM1 Ca2+ O ai1 Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ IP3R1/2/3 P2X1 P2X4 P2X5 P2X6 P2X7ATP P2Y1 P2Y2 P2Y4 PLC IP3 ATP UTP ADP Gq Gi/o IP3R1/2/3 PLC IP3 2-APB ko ein A1 A2A A2B La3+ YM58483 PMCA1 PMCA4 NCX1 NCX3 CPA SERCA1 SERCA2 SERCA3 2-APB Ca2+ ~ ~ Ca2+ Ca2+ Na+ Ca2+ Na+ Ade SOCE Ca2+ -oszcillációk IP3R1/2/3 Gs AC↑ cAMP 70 Jól isme ény az is, hogy a pu ine g ecep o ok ak i ációja számos sej ípusban Ca2+- oszcilláció hoz lé e [17,50,123,124]. Munkánk so án a a ö eked ünk, hogy elde í sük a CPC-kben kialakuló spon án Ca2+-oszcilláció há e ében álló olyama oka (25. áb a). Megállapí o uk, hogy a spon án kialakuló Ca2+-oszcilláció há e ében pu ine g szignalizáció áll. Ezek az e edmények jól illeszkednek a publikációs ada bázisban alálha ó e edményekkel [50,55]. A szignalizációban é in e ehé jéke mRNS- és ehé jeszin en is meg izsgál uk, alamin unkcionálisan is ka ak e izál uk őke . Bízunk benne, hogy ezek az e edmények hozzájá ulnak majd az osz eoa i isz so án kialakuló po cszö e degene áció cellulá is olyama ainak jobb megé éséhez. Vázizomszö e -C2C12 sej enyésze ek A SERCA izo o mák za a alan működése elengedhe e len a sej ek Ca2+- homeosz ázisának enn a ásában. A SERCA ké Ca2+- anszpo ál egy ATP hid olíziséből szá mazó ene giá al a ci oszólból a lumenbe. Jelen é ekezés második elében a neona alis SERCA izo o ma, a SERCA1b sze epé és annak exp essziójában bekö e kező csökkenés kö e kezményeinek ha ásá izsgál uk C2C12 ázizomsej eken. A SERCA1b ehé je domináns izo o ma a neona alis ko ban [125,126,127], ami ázizom ese én később a SERCA1a ál el, ugyanakko egyes i odalmi ada ok a a u alnak, hogy izom egene áció so án új a megjelenik a SERCA1b izo o ma [128]. A SERCA1b ehé je exp esszió csökkenése és a Ca2+-homeosz ázisban ész e ő ehé jék exp essziójá a gyako ol ha ása A C2C12 sej ek s abil ansz ekciójá kö e ően sike ül lé ehoznunk olyan klónoka , amelyekben eljesen (C1 sej ek) agy csak észben (C5 sej ek) csökken e ük a SERCA1b ehé je exp essziójá . A ázizom a speci ikus, SERCA1a/b an i es el meg izsgál a a min áka az apasz al uk, hogy azokban a sej ekben, ahol csökken a SERCA1b exp esszió, a SERCA1a exp essziós szin je nem nö ekede , ehá nem kompenzál a a másik izo o ma csökkenésé . Ez az e edmény összhangban an az i odalomban alál azon e edménnyel, misze in a SERCA1 izo o mák közül a C2C12 sej ekben csak a SERCA1b exp esszálódik [97]. Ugyanez a anulmány á ilágí a a, hogy ágcsálók ázizmában a elnő és a neona alis izo o ma szigo ú anszlációs kon oll ala áll, a mioblasz okban és a mio ubulusokban a SERCA1a izo o ma nem de ek álha ó, az in ak elnő izomban pedig a SERCA1b izo o ma exp essziója nem mu a ha ó ki, annak ellené e, hogy mRNS szin en meg alálha ó a meg elelő anszk ip um [97]. Egy másik izomspeci ikus SR kalciumpumpa, a SERCA2a exp essziójá 71 meg izsgál a az apasz al uk, hogy a SERCA1b exp esszió csökkenés ha ásá a a SERCA2a exp essziója sem ál ozo . In i o kö ülmények közö egene álódó izomban, mind lassú (musculus soleus, SOL), mind pedig gyo s (musculus ex enso digi o um longus, EDL) ípusú izom os okban a mio ubulusok ejlődése so án a SERCA1b ehé je exp essziója szigni ikáns nö ekedés mu a [97,129]. A SERCA1b ehé je mioblasz okban csak kis mé ékben exp esszálódik, míg mio ubulusokban ennél jó al nagyobb exp esszió mu a , bizonyí a ezzel, hogy jelenlé e elengedhe e len a mio ubulusok és a SR ejlődése so án [97]. A mioblasz ok, min a leg öbb sej ípus, exp esszálják a SERCA2b izo o má , mely alacsonyabb ATP-áz ak i i ással, de magasabb Ca2+-i án i a ini ással jellemezhe ő, összehasonlí a a lassú ípusú izom a jellemző SERCA2a izo o má al [130,131,132]. Wes e n-blo analízis segí ségé el izsgál uk a SOCE-ban é in e ehé jék exp essziós szin jé , így a STIM1- , CSQ- , DHPR- , alamin kí áncsiak ol unk még a CaN és a MyoD exp essziós szin jé e is. A kísé le eink el égzésé kö e ően az alál uk, hogy a SERCA1b shRNS-el ansz ek ál sej ekben, mind a C1, mind pedig a C5 enyésze ekben csökken a CaN exp essziója, azonban a CaN ak i i ásá jelző ma ke , az MCIP1.4 mRNS szin en csak a C1 sej ekben mu a o csökkenés . Ugyanezen sej ek ese ében exp essziós szin csökkenés apasz al unk a CSQ ehé je ese ében is, amely a SR leg on osabb Ca2+-kö ő ehé jéje. Ez a csökkenés a SR alacsonyabb Ca2+-kö ésé okozha ja (16. áb a A). A STIM1 a SOCE mechanizmus egyik kulcssze eplője. Azok a mio ubulusok, amelyekben a STIM1 molekula hiányzik, jó al alacsonyabb SR Ca2+- a alommal bí nak és á adékonyabbak is [133,134]. Leí ák o ábbá, hogy a SERCA1 endogén inhibí o ának a sza kolipinnek az exp essziós szin je a STIM1 hiányos mio ubulusokban csökken, így a SOCE ak i i ása kisebb lesz, alamin a mio ubulusok ejlődése is za a szen ed [133]. A SERCA1b-hez hasonlóan a STIM1 molekulának is elengedhe e len sze epe an az izom ejlődés so án [97]. Ez a szo os kapcsola o mege ősí ik a mi e edményeink is, hiszen o ahol a SERCA1b ehé je exp essziója csökken , a Ca2+-szenzo kén is isme STIM1 molekula exp essziója is csökken . E edményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a SERCA1b ehé je és a STIM1 molekula exp essziós szin jének csökkenése a mioplazmából egy lassabb Ca2+- issza é el e edményez. Ezzel össze üggésbe hozha ó o ábbá a ko ábban emlí e CSQ exp essziós szin csökkenése, ami a SR alacsonyabb Ca2+-szin jéé ehe ő elelőssé. Azonban a miogenikus anszk ipciós ak o , a MyoD exp essziós szin jében nem alál unk különbsége , így alószínűleg a SERCA1b nem a miogenikus di e enciációban já szik sze epe , hanem a 72 di e enciáció későbbi olyama aiban. Ugyanakko a CaN exp essziós szin je csökken a C1 mio ubulusokban, ami pedig a MCIP1.4 mRNS-szin ű csökkenésé okoz a. PCR echnika segí ségé el meg izsgál uk még az izomdi e enciálódás nega í egulá o á is, a miosz a in ehé jé , és e edményeink a a u alnak, hogy a C1 sej ekben csökken a miosz a in exp essziója. Ezen ehé je ugyan nincs köz e len kapcsola ban a SOCE- al, azonban munkacsopo unk ko ábban kimu a a, hogy a miosz a in hiányos ege ekben a SOCE meg ál ozik [135]. Az elek omechanikai csa olás izsgála a kon oll és SERCA1b speci ikus shRNS-sel ansz ek ál sej ekben Kísé le eink so án meg izsgál uk a SERCA1b géncsendesí és ha ásá az elek omechanikai csa olás a. Ismé el Ca2+- anziensek ki ál ása so án magas K+- koncen áció adagolása melle , sem a anziensek ampli údóiban, sem a elszálló szá me edekségében nem apasz al unk el é és a C1 sej ekben a Sc sej ekhez iszonyí a, így a RyR és a eszül ség- ezé el csa o nák működése el é elezhe ően nem módosul a géncsendesí és ha ásá a. Ez a a enged kö e kez e ni, hogy a SR Ca2+- ak á a még a SERCA1b hiánya ese én is bizonyos mé ékben új a öl ődik [136], alószínűleg egy másik SERCA izo o ma köz eműködésé el (SERCA2a). A kiszámol maximális pumpaak i i ás é ékek az mu a ák, hogy a csökken SERCA1b exp esszió mu a ó mio ubulusok nyugalmi Ca2+-szin je lassabban áll issza a no mál állapo a. Mi el a SERCA2a izo o ma az egye len, amely in ak o mában o dul elő a C1 sej ekben, és a nyugalmi Ca2+-szin csak lassan áll issza az e ede i állapo ba, ezé úgy gondoljuk, hogy a no mális Ca2+- issza é elben ennek az izo o mának nincs ki ün e e sze epe, míg a SERCA1b-nek annál inkább esszenciális a jelenlé e. Ez a hipo ézis e ősí i az a ény is, hogy a SERCA1 knock-ou ege ek, melyekben a SERCA1a melle a SERCA1b is é in e , Ca2+- issza é ele jó al lassabban zajló olyama [137]. A anulmányból kide ül o ábbá az is, hogy ezek az ege ek a szüle ésüke kö e ő 1-5 ó án belül meghalnak. A SERCA1b exp esszió nem (C1) agy csak észben csökken exp esszió mu a ó sej ek (C5) a kon oll sej ekhez képes csökken p oli e áció mu a ak, a mio ubulusok pedig ke esebb sej mago a almaz ak. A sej p oli e áció so án, a SERCA1b ehé je jelenlé ének esszenciális sze epe an a kalcineu in egulál jelá i eli ú onalban, me amiko a CaN gá lósze é , CSA- ad unk a ápolda hoz, a kon oll és a Sc sej ek p oli e ációja lecsökken , míg a C1 sej ek p oli e ációja nem mu a o o ábbi csökkenés . A CSA ha ása sej speci ikus, me míg idegsej ekben segí i a sej ek úlélésé [138], addig a esesej ekben egy CaN ügge len ú onalon ke esz ül oxikus ha ás mu a [139]. Ezzel ellen é ben az 73 osz eoblasz sej onalakban, és a kond ogenikus sej ekben a CSA egy po enciális CaN inhibí o [16]. I odalmi ada ok alapján udjuk, hogy a CSA- al ö énő gá lás a kond ogenikus sej ek p oli e ációs á ájá csökken i [140]. Kísé le eink so án a CSA- al ö énő kezelés ha ásá a a eljes mé ékben csökken SERCA1b exp esszió mu a ó sej ekben (C1) a p oli e ációs á a nem csökken o ább, ami a a enged kö e kez e ni, hogy a CaN ak i i ás CSA- üggő komponensé nagy mé ékben be olyásolja a SERCA1b ak i i ás (24. áb a). 26. áb a: Össze oglaló áb a a C2C12 mio ubulusokon égze kísé le es e edményeink ől. A SERCA1b ehé je jelenlé e esszenciális sze epe öl be a p oli e áció és a di e enciálódás ideje ala a C2C12 sej ekben. A ázizom di e enciálódás egyik el é ele az, hogy egy ado e üle en belül a mioblasz okból álló kul ú a kon luenssé áljon. Ekko kialakulnak a 4-6 sej magból álló p ime mio ubulusok, majd pedig a mioblasz ok o ábbi úziójá al képződnek a szekunde mio ubulusok, melyek öbb sej mago a almaznak [141]. A C1 és Sc mio ubulusok sej magszáma közö szigni ikáns különbsége alál unk. Hasonló e edmény e ju o ak Po e és munka á sai is [142], akik a SERCA pumpa gá lásá a használ apsziga ginnal kezel ék a C2C12 sej eke , és a miogenikus di e enciáció za a á apasz al ák. Meg igyeléseink sze in a SERCA1b géncsendesí e C1 mio ubulusok á lagosan ke esebb, min 5 sej mago a almaz ak. Fel é elezhe ően a p ime mio ubulus képződés szen ede za a , ezál al a későbbi di e enciálódás is gá lódo . Ez az e edmény hasonló egy, az i odalomban alál e edménnyel, misze in BC3H1 miogenikus sej ekben a szekunde mio ubulusok kialakulásáé a SERCA1a 80 16. Zákány R, Szíjgyá ó Z, Ma a C, Juhász T, Cso os C, e al. (2005) Hyd ogen pe oxide inhibi s o ma ion o ca ilage in chicken mic omass cul u es and dec eases he ac i i y o calcineu in: implica ion o ERK1/2 and Sox9 pa hways. Exp Cell Res 305: 190-199. 17. Fodo J, Ma a C, Juhász T, Oláh T, Gönczi M, e al. (2009.) Iono opic pu ine gic ecep o P2X4 is in ol ed in he egula ion o chond ogenesis in chicken mic omass cell cul u es. Cell Calcium 45: 421-430. 18. B adham D, Passani i A, Ho on WJ (1995) Mesenchymal cell chond ogenesis is s imula ed by basemen memb ane ma ix and inhibi ed by age-associa ed ac o s. Ma ix Biol 14: 561-571. 19. G igo iadis A, Hee sche J, Aubin J (1988) Di e en ia ion o muscle, a , ca ilage, and bone om p ogeni o cells p esen in a bone-de i ed clonal cell popula ion: e ec o dexame hasone. J Cell Biol 106: 2139-2151. 20. Shea C, Edga C, Einho n T, Ge s en eld L (2003) BMP ea men o C3H10T1/2 mesenchymal s em cells induces bo h chond ogenesis and os eogenesis. J Cell Biochem 90: 1112-1127. 21. Koelling S, K uegel J, I me M, Pa h J, Sadowski B, e al. (2009) Mig a o y chond ogenic p ogeni o cells om epai issue du ing he la e s ages o human os eoa h i is. Cell S em Cell 4: 324-335. 22. DeLise A, Fische L, Tuan R (2000) Cellula in e ac ions and signaling in ca ilage de elopmen . Os eoa h i is Ca ilage 8: 309-334. 23. DeLise A, Tuan R (2002) Analysis o N-cadhe in unc ion in limb mesenchymal chond ogenesis in i o. De Dyn 225: 195-204. 24. San An onio J, Tuan R (1986) Chond ogenesis o limb bud mesenchyme in i o: s imula ion by ca ions. De Biol 115: 313-324. 25. Kelley R, Fallon J (1978) Iden i ica ion and dis ibu ion o gap junc ions in he mesode m o he de eloping chick limb bud. J Emb yol Exp Mo phol 46: 99-110. 26. Haas A, Tuan R (1999) Chond ogenic di e en ia ion o mu ine C3H10T1/2 mul ipo en ial mesenchymal cells: II. S imula ion by bone mo phogene ic p o ein-2 equi es modula ion o N-cadhe in exp ession and unc ion. Di e en ia ion 64: 77-89. 27. Wali R, Bissonne e M, Jiang K, Niedziela S, Kha e S, e al. (1995) 1,25- Dihyd oxy i amin D3 s imula es he phospho yla ion o wo acidic memb ane p o eins o 42,000 and 48,000 dal ons in a colonocy es: an e ec modula ed by i amin D s a us. J Cell Physiol 162: 172-180. 81 28. Ta ella S, Bellese G, Cas agnola P, Ma in I, Piccini D, e al. (1997) Regula ed exp ession o ib onec in, laminin and ela ed in eg in ecep o s du ing he ea ly chond ocy e di e en ia ion. J Cell Sci 1997 Sep;110 ( P 18):2261-70 110: 2261-2270. 29. Mackie E, Thesle I, Chique -Eh ismann R (1987) Tenascin is associa ed wi h chond ogenic and os eogenic di e en ia ion in i o and p omo es chond ogenesis in i o. J Cell Biol 105: 2569-2579. 30. Dessau W, on de Ma k H, on de Ma k K, Fische S (1980) Changes in he pa e ns o collagens and ib onec in du ing limb-bud chond ogenesis. J Emb yol Exp Mo phol 57: 51-60. 31. Le eb e V, Beh inge RR, Bi W, Mu akami S, Huang W (2000) T ansc ip ional mechanisms o chond ocy e di e en ia ion Ma ix Biol 19: 389-394. 32. Zehen ne B, Dony C, Bu sche H (1999) The ansc ip ion ac o Sox9 is in ol ed in BMP-2 signaling. J Bone Mine Res 14: 1734-1741. 33. Lee Y, Chuong C (1997) Ac i a ion o p o ein kinase A is a pi o al s ep in ol ed in bo h BMP-2- and cyclic AMP-induced chond ogenesis. J Cell Physiol 170: 153-165. 34. New on A (1997) Regula ion o p o ein kinase C. Cu Opin Cell Biol 9: 161-167. 35. Choi B, Chun J, Lee Y, Sonn J, Kang S (1995) Exp ession o p o ein kinase C isozymes ha a e equi ed o chond ogenesis o chick limb bud mesenchymal cells. Biochem Biophys Res Commun 216: 1034-1040. 36. Zákány R, Szucs K, Bakó E, Felszeghy S, Czi a G, e al. (2002) P o ein phospha ase 2A is in ol ed in he egula ion o p o ein kinase A signaling pa hway du ing in i o chond ogenesis. Exp Cell Res 275: 1-8. 37. Chang S, Oh C, Yang M, Kang S, Lee Y, e al. (1998) P o ein kinase C egula es chond ogenesis o mesenchymes ia mi ogen-ac i a ed p o ein kinase signaling. J Biol Chem 273: 19213-19219. 38. S an on L, Unde hill T, Beie F (2003) MAP kinases in chond ocy e di e en ia ion. De Biol 263: 165-175. 39. Rusnak F, Me z P (2000) Calcineu in: o m and unc ion. Physiol Re 80: 1483-1521. 40. Tomi a M, Reinhold M, Molken in J, Naski M (2002) Calcineu in and NFAT4 induce chond ogenesis. J Biol Chem 277: 42214-42218. 41. Szabó G (2009) Sej biológia. Medicina Köny kiadó Z . 42. Jo gensen N, Geis S, Ci i elli R, S einbe g T (1997) ATP- and gap junc ion-dependen in e cellula calcium signaling in os eoblas ic cells. J Cell Biol 139: 497-506. 82 43. Bakondi E, Gönczi M, Szabó E, Bai P, Pache P, e al. (2003) Role o in acellula calcium mobiliza ion and cell-densi y-dependen signaling in oxida i e-s ess-induced cy o oxici y in HaCaT ke a inocy es. J In es De ma ol 121: 88-95. 44. Ramage L, Ma el M, Ha dingham G, Sal e D (2008) NMDA ecep o exp ession and ac i i y in os eoa h i ic human a icula chond ocy es. Os eoa h i is Ca ilage 16: 1576-1584. 45. So o F, Ga cia-Guzman M, S ühme W (1997) Cloned ligand-ga ed channels ac i a ed by ex acellula ATP (P2X ecep o s). J Memb Biol 160: 91-100. 46. Tu P, Kune -Keil C, Lucke S, B inkmeie H, Bou on A (2009) Diacylglyce ol analogues ac i a e second messenge -ope a ed calcium channels exhibi ing TRPC-like p ope ies in co ical neu ons. J Neu ochem 108: 126-138. 47. Oláh T, Fodo J, Ruzsna szky O, Vincze J, Be bey C, e al. (2011) O e exp ession o ansien ecep o po en ial canonical ype 1 (TRPC1) al e s bo h s o e ope a ed calcium en y and depola iza ion-e oked calcium signals in C2C12 cells. Cell Calcium 49: 415-425 48. Fodo J, Ma a C, Oláh T, Juhász T, Takács R, e al. (2013) S o e-ope a ed calcium en y and calcium in lux ia ol age-ope a ed calcium channels egula e in acellula calcium oscilla ions in chond ogenic cells. Cell Calcium 54: 1-16. 49. Pa ke A, Ge gely F, Taylo C (2004) Ta ge ing o inosi ol 1,4,5- isphospha e ecep o s o he endoplasmic e iculum by mul iple signals wi hin hei ansmemb ane domains. J Biol Chem 279: 23797-23805. 50. Kawano S, O su K, Ku uma A, Shoji S, Yanagida E, e al. (2006) ATP au oc ine/pa ac ine signaling induces calcium oscilla ions and NFAT ac i a ion in human mesenchymal s em cells. Cell Calcium 39: 313-324. 51. He be Z, Ma hias Z, No be S (2012) Cellula unc ion and molecula s uc u e o ec o- nucleo idases. Pu ine gic Signal 8: 437-502. 52. Junge W (2011) Immune cell egula ion by au oc ine pu ine gic signalling. Na Re Immunol 11: 201-212. 53. Idzko M, Fe a i D, El zschig H (2014) Nucleo ide signalling du ing in lamma ion. Na u e 509: 310-317 54. Desai B, Lei inge N (2014) Pu ine gic and calcium signaling in mac ophage unc ion and plas ici y. F on Immunol 5. 55. Zimme mann H, Zebisch M, S ä e N (2012) Cellula unc ion and molecula s uc u e o ec o-nucleo idases. Pu ine gic Signal 8: 437-502. 83 56. Fe a i D, Vi iello L, Idzko M, la Sala A (2015) Pu ine gic signaling in a he oscle osis. T ends Mol Med 21: 184-192. 57. No h R (2002) Molecula physiology o P2X ecep o s. Physiol Re 82: 1013-1067. 58. Rale ic V, Bu ns ock G (1998) Recep o s o pu ines and py imidines. Pha macol Re 50: 413-492. 59. Ruzsna szky O, Telek A, Gönczi M, Balogh A, Remenyik E, e al. (2011) UV-B induced al e a ion in pu ine gic ecep o s and signaling on HaCaT ke a inocy es. J Pho ochem Pho obiol B 105: 113-118. 60. Song X, Xu X, Zhu J, Guo Z, Li J, e al. (2015) Up- egula ion o P2X7 ecep o s media ing p oli e a ion o Schwann cells a e scia ic ne e inju y. Pu ine gic Signal 11: 203-213. 61. San ana P, Benjamim C, Ma inez C, Ku enbach E, Takiya C, e al. (2015) The P2X7 Recep o Con ibu es o he De elopmen o he Exace ba ed In lamma o y Response Associa ed wi h Sepsis. J Inna e Immun 7(4):417-27. doi: 10.1159/000371388. 62. Bu ns ock G (2007.) Pu ine and py imidine ecep o s. Cell Mol Li e Sci 64: 1471-1483. 63. Röhlich P (2006) Szö e an. Semmelweis Kiadó és Mul imédia S údió K . 64. Meye L, W igh N (2013) S uc u e o gian muscle p o eins. F on Physiol 4. 65. Buckingham M, Baja d L, Chang T, Daubas P, Hadchouel J, e al. (2003) The o ma ion o skele al muscle: om somi e o limb. J Ana 202: 59-68. 66. Mun oni F, B own S, Sew y C, Pa el K (2002) Muscle de elopmen genes: hei ele ance in neu omuscula diso de s. Neu omuscul Diso d 12: 438-446. 67. Péaul B, Rudnicki M, To en e Y, Cossu G, T emblay J, e al. (2007) S em and p ogeni o cells in skele al muscle de elopmen , main enance, and he apy. Mol The 15: 867-877. 68. A ila F, E zsébe L (2008) Az o osi éle an anköny e. Medicina Köny kiadó Z . 69. Fe nando J A, Pe e B S, Masahi o E, Mi suhiko I (2013) Ryanodine ecep o calcium elease channels: lessons om s uc u e– unc ion s udies. FEBS Jou nal 280. 70. Ve onika Á, László D (2004) O osi biokémia. Medicina Köny kiadó Z . 71. MacLennan D, Rice W, G een N (1997) The mechanism o Ca2+ anspo by sa co(endo)plasmic e iculum Ca2+-ATPases. J Biol Chem 272: 28815-28818 72. Ly on J, Wes lin M, Bu k S, Shull G, Maclennan D (1992) Func ional compa isons be ween iso o ms o he sa coplasmic o endoplasmic e iculum amily o calcium pumps. . J Biol Chem 267: 14483-14489. 84 73. Loukiano E, Ji Y, Bake D, Reed T, Babu J, e al. (1998) Sa co(endo)plasmic e iculum Ca2+ ATPase iso o ms and hei ole in musle physiology and pa hology. Annals NY Acad Sci 853: 251-259. 74. Wuy ack F, Raeymaeke s L, Missiaen L (2002) Molecula physiology o he SERCA and SPCA pumps. Cell Calcium 32: 279-305 75. S okes D, Zhang P, Toyoshima C, K. Y, H. O, e al. (1998) C yoelec on mic oscopy o he calcium pump om sa coplasmic e iculum: wo c ys al o ms e eal wo di e en con o ma ions. . Ac a Physiol Scand 163: 35-43. 76. Ma onosi AN, Pikula S (2003) The ne wo k o calcium egula ion in muscle. Ac a Biochem 50: 1-30. 77. Thas up O, Cullen P, D obak B, Hanley M, Dawson A (1990) Thapsiga gin,a umo p omo o ,discha ges in acellula calcium s o es by speci ic inhibi ion o he endoplasmic e iculum calcium ATPase. P oc na n Acad Sci: 2466-2470. 78. Inesi G, Saga a Y (1994) Speci ic inhibi o s o in acellula Ca2+ anspo ATPases. J Memb Biol 141: 1-6. 79. Musumeci G, Cas ogio anni P, Coleman R, Szychlinska M, Sal a o elli L, e al. (2015) Somi ogenesis: F om somi e o skele al muscle. Ac a His ochem 117: 313-328. 80. Con i F, Blumbe g W, de Gie J, Pocchia i F (1982) Physical me hods on biological memb anes and hei model sys ems. Li e Sciences Vol. 71. 81. Mu ayama T, Ogawa Y (2002) Roles o wo yanodine ecp o iso o ms coexis ing in skele al muscle. T ends Ca dio asc Med: 305-311. 82. Ma a C, Zakany R (2013) Calcium signalling in chond ogenesis: implica ions o ca ilage epai . F on Biosci (Schol Ed) 5: 305-324. 83. Jaiswal R, Jaiswal N, B ude S, Mbala iele G, Ma shak D, e al. (2000) Adul human mesenchymal s em cell di e en ia ion o he os eogenic o adipogenic lineage is egula ed by mi ogen-ac i a ed p o ein kinase. J Biol Chem 275: 9645-9652. 84. Pi enge M, Mackay A, Beck S, Jaiswal R, Douglas R, e al. (1999) Mul ilineage po en ial o adul human mesenchymal s em cells. Science 284: 143-147. 85. Uccelli A, Mo e a L, Pis oia V (2008) Mesenchymal s em cells in heal h and disease. Na Re Immunol 8: 726-736. 86. Bu R, Loh Y, Pea ce W, Beoha N, Ba W, e al. (2008) Clinical applica ions o blood- de i ed and ma ow-de i ed s em cells o nonmalignan diseases. JAMA 299: 925- 936. . 85 87. Figue oa F, Ca ión F, Villanue a S, Khou y M (2012) Mesenchymal s em cell ea men o au oimmune diseases: a c i ical e iew. Biol Res 45: 269-277. 88. Be and J, C omme C, Umlau D, F ank S, Pap T (2010) Molecula mechanisms o ca ilage emodelling in os eoa h i is. In J Biochem Cell Biol 42: 1594-1601. 89. S amme s A, Susse S, Hamm N, Hlynsky M, Kimbe D, e al. (2015) The egula ion o sa co(endo)plasmic e iculum calcium-ATPases (SERCA). Can J Physiol Pha macol 19: 1-12. 90. Ho nanian A (2007) SERCA pumps and human diseases. Subcell Biochem 45: 337-363. 91. E dei A (2012) Immunológia. Medicina Köny kiadó Z . 92. Sz e ye M, Deli T, Szen esi P, Szige i G, Cse noch L (2007) E ec o TPEN on he calcium elease o cul u ed C2C12 mouse myo ubes. J Muscle Res Cell Mo il 28: 421- 428. 93. Schuhmeie R, Die ze B, U su D, Lehmann-Ho n F, Melze W (2003) Vol age-ac i a ed calcium signals in myo ubes loaded wi h high concen a ions o EGTA. Biophys J: 1065-1078. 94. Ca oll S, Ra id K (2013.) Di e en ia ion o mesenchymal s em cells o os eoblas s and chond ocy es: a ocus on adenosine ecep o s. Expe Re Mol Med 15:e1. doi: 10.1017/e m.2013.2. 95. Goep e C, Imai M, B oua d S, Csizmadia E, Kaczma ek E, e al. (2000) CD39 modula es endo helial cell ac i a ion and apop osis. Mol Med 6: 591-603. 96. Zádo E, Mendle L, Ve Heyen M, Dux L, Wuy ack F (1996) Changes in mRNA le els o he sa coplasmic/endoplasmic- e iculum Ca(2+)-ATPase iso o ms in he a soleus muscle egene a ing om no exin-induced nec osis. Biochem J 320 107-113. 97. Zádo E, Vangheluwe P, Wuy ack F (2007) The exp ession o he neona al sa coplasmic e iculum Ca2+ pump (SERCA1b) hin s o a ole in muscle g ow h and de elopmen . Cell Calcium 41: 379-388 98. Dolme sch R, Lewis R, Goodnow C, Healy J (1997.) Di e en ial ac i a ion o ansc ip ion ac o s induced by Ca2+ esponse ampli ude and du a ion. Na u e 386: 855-858. 99. Kupzig S, Walke S, Cullen P (2005) The equencies o calcium oscilla ions a e op imized o e icien calcium-media ed ac i a ion o Ras and he ERK/MAPK cascade. P oc Na l Acad Sci U S A 102: 7577-7582. 100. Ma a C, Mobashe i A (2014) Regula ion o chond ogenesis by p o ein kinase C: Eme ging new oles in calcium signalling. Cell Signal 26: 979-1000. 86 101. S ou C, Cos an in J, Naus C, Cha les A (2002) In e cellula calcium signaling in as ocy es ia ATP elease h ough connexin hemichannels. J Biol Chem 277(12):10482-8.: 10482-10488. 102. Saue H, Ho mann C, Wa enbe g M, Wobus A, Heschele J (1998) Spon aneous calcium oscilla ions in emb yonic s em cell-de i ed p imi i e endode mal cells. Exp Cell Res 238: 13-22. 103. Nguyen C, Liebe he M, Bo da C, Vela d F, Côme D, e al. (2012) In acellula calcium oscilla ions in a icula chond ocy es induced by basic calcium phospha e c ys als lead o ca ilage deg ada ion. Os eoa h i is Ca ilage 20: 1399-1408. 104. Kawano S, Shoji S, Ichinose S, Yamaga a K, Tagami M, e al. (2002) Cha ac e iza ion o Ca(2+) signaling pa hways in human mesenchymal s em cells. Cell Calcium 32: 165- 174. 105. Tao R, Sun H, Lau C, Tse H, Lee H, e al. (2011) Cyclic ADP ibose is a no el egula o o in acellula Ca2+ oscilla ions in human bone ma ow mesenchymal s em cells. J Cell Mol Med 15: 2684-2696. 106. Va ga Z, Juhász T, Ma a C, Fodo J, Ka ona É, e al. (2011) Swi ch o ol age-ga ed K+ channel exp ession in he plasma memb ane o chond ogenic cells a ec s cy osolic Ca2+-oscilla ions and ca ilage o ma ion. PLoS One 6: 27957. 107. Kapu N, Migne y G, Banach K (2007) Cell cycle-dependen calcium oscilla ions in mouse emb yonic s em cells. Am J Physiol Cell Physiol 292: 1510-1518. 108. Miyakawa T, Maeda A, Yamazawa T, Hi ose K, Ku osaki T, e al. (1999) Encoding o Ca2+ signals by di e en ial exp ession o IP3 ecep o sub ypes. EMBO J 18: 1303- 1308. 109. Zhang S, F i z N, Iba a C, Uhlén P (2011) Inosi ol 1,4,5- isphospha e ecep o sub ype- speci ic egula ion o calcium oscilla ions. Neu ochem Res 36: 1175-1185. 110. Hu J, Qin K, Zhang Y, Gong J, Li N, e al. (2011) Down egula ion o ansc ip ion ac o Oc 4 induces an epi helial- o-mesenchymal ansi ion ia enhancemen o Ca2+ in lux in b eas cance cells. Biochem Biophys Res Commun 411: 786-791. . 111. Ho h M, Niemeye B (2013) The neglec ed CRAC p o eins: O ai2, O ai3, and STIM2. Cu Top Memb 71: 237-271. 112. Piche M, G a R, Lee G (2003) Ex acellula nucleo ide me abolism and signaling in he pa hophysiology o a icula ca ilage. A h i is Rheum 48: 2722-2736. 87 113. Rosen hal A, Hempel D, Ku up I, Masuda I, Ryan L (2010) Pu ine ecep o s modula e chond ocy e ex acellula ino ganic py ophospha e p oduc ion. Os eoa h i is Ca ilage 18: 1496-1501. 114. D'Alimon e I, Na gi E, Lannu i A, Ma chisio M, Pie domenico L, e al. (2013.) Adenosine A1 ecep o s imula ion enhances os eogenic di e en ia ion o human den al pulp-de i ed mesenchymal s em cells ia WNT signaling. S em Cell Res 11: 611-624. 115. Ka ebi M, Soleimani M, C ons ein B (2009) Adenosine A2A ecep o s play an ac i e ole in mouse bone ma ow-de i ed mesenchymal s em cell de elopmen . J Leukoc Biol 85: 438-444. 116. Ryzho S, Golds ein A, No i skiy S, Blackbu n M, Biaggioni I, e al. (2012) Role o A2B adenosine ecep o s in egula ion o pa ac ine unc ions o s em cell an igen 1- posi i e ca diac s omal cells. J Pha macol Exp The 341: 764-774. 117. Shih Y, Hwang Y, Phadke A, Kang H, Hwang N, e al. (2014) Calcium phospha e- bea ing ma ices induce os eogenic di e en ia ion o s em cells h ough adenosine signaling. P oc Na l Acad Sci U S A 111: 990-995. 118. Gha ibi B, Ab aham A, Ham J, E ans B (2011.) Adenosine ecep o sub ype exp ession and ac i a ion in luence he di e en ia ion o mesenchymal s em cells o os eoblas s and adipocy es. J Bone Mine Res 26: 2112-2124. 119. Boo man M, Collins T, Mackenzie L, Rode ick H, Be idge M, e al. (2002.) 2- aminoe hoxydiphenyl bo a e (2-APB) is a eliable blocke o s o e-ope a ed Ca2+ en y bu an inconsis en inhibi o o InsP3-induced Ca2+ elease. FASEB J 16: 1145- 1150. 120. Jacobson K, I ano A, de Cas o S, Ha den T, Ko H (2009) De elopmen o selec i e agonis s and an agonis s o P2Y ecep o s. Pu ine gic Signal 5: 75-89. 121. Zippel N, Limbach C, Ra ajski N, U ban C, Lupa ello C, e al. (2012) Pu ine gic ecep o s in luence he di e en ia ion o human mesenchymal s em cells. S em Cells De 21: 884-900. 122. Cicia ello M, Zini R, Rossi L, Sal es ini V, Fe a i D, e al. (2013.) Ex acellula pu ines p omo e he di e en ia ion o human bone ma ow-de i ed mesenchymal s em cells o he os eogenic and adipogenic lineages. S em Cells De 22: 1097-1111. 123. G ie son J, Meldolesi J (1995.) Shea s ess-induced [Ca2+]i ansien s and oscilla ions in mouse ib oblas s a e media ed by endogenously eleased ATP. J Biol Chem 270: 4451-4456. 88 124. Kwon H, Ohmiya Y, Honma K, Honma S, Nagai T, e al. (2012) Synch onized ATP oscilla ions ha e a c i ical ole in p echond ogenic condensa ion du ing chond ogenesis. Cell Dea h Dis 278. 125. Kósa M, Zádo E (2013) T ans ec ion e iciency along he egene a ing soleus muscle o he a . Mol Bio echnol 54: 220-227. 126. B andl C, G een N, Ko czak B, MacLennan D (1986) Two Ca2+ ATPase genes: homologies and mechanis ic implica ions o deduced amino acid sequences. Cell 44: 597-607. 127. Zádo E, Kósa M (2014) The neona al sa coplasmic/endoplasmic e iculum calcium ATPase (SERCA1b): a neglec ed pump in scope. P luge s A ch 467(7):1395-401. doi: 10.1007/s00424-014-1671-3. 128. Zádo E, Owsianik G, Wuy ack F (2011) Silencing SERCA1b in a ew ibe s s imula es g ow h in he en i e egene a ing soleus muscle. His ochem Cell Biol 135: 11-20 129. Mendle L, Szakonyi G, Zádo E, Gö be A, Dux L, e al. (1998) Exp ession o sa coplasmic/endoplasmic e iculum Ca2+ ATPases in he a ex enso digi o um longus (EDL) muscle egene a ing om no exin-induced nec osis. J Muscle Res Cell Mo il 19: 777-785 130. Gun eski-Hamblin A, G eeb J, Shull G (1988) A no el Ca2+ pump exp essed in b ain, kidney, and s omach is encoded by an al e na i e ansc ip o he slow- wi ch muscle sa coplasmic e iculum Ca-ATPase gene. Iden i ica ion o cDNAs encoding Ca2+ and o he ca ion- anspo ing ATPases using an oligonucleo ide p obe de i ed om he ATP-binding si e. J Biol Chem 263: 15032-15040. 131. Bu k S, Ly on J, MacLennan D, Shull G (1989) cDNA cloning, unc ional exp ession, and mRNA issue dis ibu ion o a hi d o ganella Ca2+ pump. J Biol Chem 264: 18561-18568. 132. Vangheluwe P, Sipido K, Raeymaeke s L, Wuy ack F (2006) New pe spec i es on he ole o SERCA2's Ca2+ a ini y in ca diac unc ion. Biochim Biophys Ac a 1763: 1216-1228. 133. Se h M, Li T, G aham V, Bu ch J, Finch E, e al. (2012) Dynamic egula ion o sa coplasmic e iculum Ca(2+) s o es by s omal in e ac ion molecule 1 and sa colipin du ing muscle di e en ia ion. De Dyn 241: 639-647 134. S ibe J, Hawkins A, Zhang Z, Wang S, Bu ch J, e al. (2008) STIM1 signalling con ols s o e-ope a ed calcium en y equi ed o de elopmen and con ac ile unc ion in skele al muscle. Na Cell Biol 10: 688-697. 89 135. Sz e ye M, Geye N, AlGhaadi D, Bodná D, Oláh T, e al. (2014) Ms n-Cmp Dl1Abc- Mice. A Mouse Model o S udy Muscle Weakness, Fa igue and Soce. 58 h Annual Mee ing o he Biophysical Socie y Bal imo e 661-Pos Boa d B416. 136. Colle C, Ma J (2004) Calcium-dependen acili a ion and g aded deac i a ion o s o e- ope a ed calcium en y in e al skele al muscle. Biophys J 87: 268-275 137. Pan Y, Z a i ch E, Tupling A, Rice W, de Leon S, e al. (2003) Ta ge ed dis up ion o he ATP2A1 gene encoding he sa co(endo)plasmic e iculum Ca2+ ATPase iso o m 1 (SERCA1) impai s diaph agm unc ion and is le hal in neona al mice. J Biol Chem 278: 13367-13375 138. Sachewsky N, Hun J, Cooke M, Azimi A, Za in T, e al. (2014) Cyclospo in A enhances neu al p ecu so cell su i al in mice h ough a calcineu in-independen pa hway. Dis Model Mech 7: 953-961. 139. Kim H, Choi S, Jeung E, Yoo Y (2014) Cyclospo ine A induces apop o ic and au ophagic cell dea h in a pi ui a y GH3 cells. PLoS One 9. 140. Juhász T, Ma a C, Ka ona É, Somogyi C, Takács R, e al. (2014) Pi ui a y adenyla e cyclase-ac i a ing polypep ide (PACAP) signalling enhances os eogenesis in UMR- 106 cell line. J Mol Neu osci 54: 555-573. 141. Zhang M, McLennan I (1995) Du ing seconda y myo ube o ma ion, p ima y myo ubes p e e en ially abso b new nuclei a hei ends. De Dyn 204: 168-177. 142. Po e G, Makuck R, Ri kees S (2002) Reduc ion in in acellula calcium le els inhibi s myoblas di e en ia ion. J Biol Chem 277: 28942-28947. Elek onikus hi a kozás: 1. www.mkk.szie.hu 2. h p://www.sigmaald ich.com/li e-science/ unc ional-genomics-and- nai/sh na/lib a y- in o ma ion/ ec o -map.h ml 3. www.ncbi.nlm.nih.go