Efecto del envejecimiento sobre la organización y proliferación celular de la zona ventricular-subventgricular (V-SVZ) del cerebro del ratón

TRABAJO DE FIN DE GRADO Grado en Medicina Facultad de Ciencias de la Salud Universitat Jaume I EFECTO DEL ENVEJECIMIENTO SOBRE LA ORGANIZACIÓN Y PROLIFERACIÓN CELULAR DE LA ZONA VENTRICULAR-SUBVENTRICULAR (V-SVZ) DEL CEREBRO DE RATÓN Autor: Víctor Merino Murgui Tutor: Vicente Herranz Pérez Unidad Predepartamental de Medicina ! TRABAJO DE FIN DE GRADO (TFG) - MEDICINA EL/LA PROFESOR/A TUTOR/A hace constar su AUTORIZACIÓN para la Defensa Pública del Trabajo de Fin de Grado y CERTIFICA que el/la estudiante lo ha desarrollado a lo largo de 6 créditos ECTS (150 horas) TÍTULO del TFG: “Efecto del envejecimiento sobre la organización y proliferación celular de la zona ventricular-subventricular (V-SVZ) del cerebro de ratón”. ALUMNO/A: Víctor Merino Murgui DNI: 21004373Z PROFESOR/A TUTOR/A: Vicente Herranz Pérez Castelló de la Plana, 26 de mayo de 2018 Fdo (Tutor/a): Vicente Herranz Pérez ! ! ! ! V AGRADECIMIENTOS Indiscutiblemente quien debe encabezar los agradecimientos es mi tutor Vicente Herranz Pérez, por haberme dedicado tanto tiempo y paciencia. Por mostrarme que con humildad e ilusión se pueden llevar a cabo grandes proyectos. Y porque sin él este TFG no hubiese sido posible. A su recién llegada hija por prestármelo más tiempo del que seguramente necesitaba. A mis padres por apoyarme incondicionalmente y queriendo entender en qué consistía mi trabajo. Quiero agradecer también a la Universitat Jaume I por prestarnos las instalaciones cuando las hemos necesitado sin problemas. Y finalmente, a mi amigo, Alejandro Golfe por traerme tantos cafés cuando más lo he necesitado. ! ! ! VII ÍNDICE ABREVIATURAS XIII RESUMEN XV EXTENDED SUMMARY XIX 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1 Contextualización histórica 1 1.2 Nichos neurogénicos: la zona ventricular-subventricular 2 1.2.1 Desarrollo embrionario y perinatal 2 1.2.2 Organización celular de la V-SVZ 3 1.3 Nichos neurogénicos: el giro dentado del hipocampo 7 1.3.1 Desarrollo embrionario y perinatal 7 1.3.2 Organización celular del giro dentado y la zona subgranular 7 1.4 Regulación de la neurogénesis adulta 9 1.4.1 Factores intracelulares 11 1.4.2 Factores intercelulares (célula-célula) 12 1.4.3 Factores extracelulares 12 LCR 13 Microvascularización 13 Inflamación crónica y estrés oxidativo 13 Ejercicio físico y enriquecimiento ambiental 14 1.5 Efecto de la edad sobre la neurogénesis adulta 14 1.6 Función de la neurogénesis adulta 15 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 17 3. MATERIAL Y MÉTODOS 19 3.1 Animales de experimentación 19 3.2 Microscopía electrónica de transmisión 19 3.3 Microscopía electrónica de barrido 20 3.4 Estudios de proliferación 20 ! ! ! VIII 3.5 Detección inmunohistoquímica 20 3.6 Análisis estadístico 22 4. RESULTADOS 23 4.1 Efecto del envejecimiento en la organización celular de la V-SVZ 23 4.2 Efecto del envejecimiento en la expresión de marcadores moleculares 29 4.3 Efecto del envejecimiento en la proliferación celular de la V-SVZ 30 5. DISCUSIÓN 33 5.1 El envejecimiento afecta a la estructura y capacidad proliferativa de la V-SVZ 33 5.2 Implicaciones de la neurogénesis adulta en el cerebro humano 36 5.3 Conclusiones 38 6. BIBLIOGRAFÍA 39 ! ! ! IX ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Desarrollo del sistema nervioso central y sus componentes celulares 3 Figura 2. Estructura de la V-SVZ y evolución de sus componentes celulares 3 Figura 3. Representación de las diferentes capas del giro dentado 8 Figura 4. Esquema sobre la organización celular de la zona subgranular 9 Figura 5. Esquema de las interacciones que participan en la regulación de la neurogénesis en la V-SVZ 10 Figura 6. Organización celular de la V-SVZ en ratones jóvenes y envejecidos 24 Figura 7. Cambios característicos del envejecimiento a nivel subcelular 25 Figura 8. El número y disposición de las células ependimarias y neuroblastos es distinta en la V-SVZ de ratones de 2 y 24 meses de edad 27 Figura 9. Imágenes de microscopía electrónica de barrido mostrando la superficie de las paredes ventriculares de ratones de 2 y 24 meses de edad 28 Figura 10. Marcaje por inmunofluorescencia de la V-SVZ de ratones de 2 y 24 meses 30 Figura 11. Cuantificación de la proliferación de la V-SVZ en ratones de 2 y 24 meses mediante marcaje con BrdU 31 ! ! ! XVII ABSTRACT Introduction: Adult neurogenesis is the generation of new neurons from neural stem cells that, after maturing, integrate into pre-existing neural circuits. In the brain of mammals, two neurogenic niches have been identified: the ventricular-subventricular zone (V-SVZ) and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus. The activity of these regions is finely regulated and is affected by various factors, such as aging, which affects their neurogenic capacity. Objective: Our aim was to prove if aging affects the structure and proliferative capacity of the V-SVZ. Material and methods: We studied the V-SVZ of 2and 24-month-old mice. The cellular organization of this region was compared by electron microscopy. Likewise, the presence of different cell types was studied by immunohistochemical detection of specific molecular markers. Finally, the proliferative capacity of the V-SVZ was quantified in both experimental groups. Results: We observed that aging causes a slimming of the V-SVZ and other changes at the subcellular level, which are accompanied by a decrease in the proliferative capacity of the region. Conclusion: Aging affects the proliferative capacity of V-SVZ. Further studies are required in order to ascertain the physiopathological implications of these changes in the brain. KEYWORDS Adult neurogenesis, ventricular-subventricular zone, aging, neural stem cells. ! ! ! XIX EXTENDED SUMMARY Background Adult neurogenesis is the process by which new neurons are generated from neural stem cells. After maturing, these new cells are able to integrate into pre-existing neural circuits. For many years, neuroscientists believed that the central nervous system was unable to generate new neurons, thus limiting our view about neuron replacement and brain repair. In the 1960’s, Joseph Altman started paving the way for changing this conception by providing evidence for the incorporation of new neurons to the olfactory bulb and the hippocampal dentate gyrus. Decades later, with the development of new techniques, independent research groups were able to demonstrate, in rodents, that the source of these new neurons were neural stem cells located in the ventricular-subventricular area (V-SVZ) of the lateral ventricles and the subgranular zone of the dentate gyrus, respectively. The V-SVZ, an extensive region lining the lateral wall of the lateral ventricles, is the largest germinal niche in the adult mammalian brain. In the V-SVZ, neural stem cells (NSCs) correspond to a subpopulation of specialized astrocytes derived from radial glia. NSCs divide generating transit amplifying cells, which in turn, give rise to migrating neuroblasts. In rodents, neuroblasts migrate tangentially through the rostral migratory stream to the olfactory bulb, where they differentiate and integrate into neural circuits participating in olfactory processing. In contrast to rodents, adult neurogenesis in the human V-SVZ is relatively scarce. Only during the first 18 months after birth many young neuroblasts can be found adjacent to the human V-SVZ, migrating to the olfactory bulb, but also to extensive areas of the prefrontal cortex. In the hippocampal dentate gyrus, NSCs are located in the subgranular zone, the interface between the granule cell layer and the hilus. In this region, radial astrocytes function as NSCs and, similar to the V-SVZ, generate intermediate precursors which divide and progressively mature giving rise to young neurons. These new neurons integrate in the granule cell layer, participating in learning and memory processes. There is great interest in understanding how the production of new neurons is regulated. Many known chemical signals affect the generation, migration and integration of new neurons, most of them linked to the special vasculature present in the neurogenic niches. However, there are other complex factors, such as mental activity, physical exercise and aging, that also have an effect on adult neurogenesis. ! ! ! XX Several studies have reported a decline in neurogenesis associated with age, yet the causes of this phenomenon remain unknown. In this work, we focused on how aging affects the organization and proliferative activity of the mouse V-SVZ. Material and methods We studied the V-SVZ of young adult (2-month-old) and aged (24-month-old) mice. We first compared the cellular organization of this region by electron microscopy. We also determined, by fluorescent immunohistochemistry, the abundance of two of the main cell types in the V-SVZ using the specific molecular markers DCX (for neuroblasts) and GFAP (for astrocytes). On the other hand, we assessed the proliferative capacity of the niche by quantifying the incorporation of BrdU (BrdU is a synthetic nucleoside analog of thymidine, which is incorporated into the DNA of cells in the S phase of the cell cycle). Results Our main finding was that aged mice showed an extraordinarily thin V-SVZ, with decreased cell density in this brain region. We also observed subcellular changes in different cell types of the aged mice. For example, we detected an accumulation of dense bodies in the cytoplasm of different cell types; higher intermediate filament density in astrocytes; and a general stretching of ependymal cells which resulted in a lower density of cilia in the ventricular surface. Furthermore, immunohistochemical analyses revealed a lower number of DCX-labeled neuroblasts in the aged V-SVZ, consistent with a significant decrease in the number of BrdU label-retaining cells in this experimental group. Discussion and conclusion We confirm previous studies reporting a significant reduction in the neurogenic potential of the V-SVZ in aged mice. Our results suggest that aging leads to structural and functional changes in the V-SVZ. These changes involve remarkable differences in the cell organization and proliferative activity of this neurogenic niche. While the underlying causes for these events remain elusive, we speculate about the existence of physical and chemical signals that might be altered by the normal process of aging, leading to a reduction in the number of neural progenitor cells and/or their entrance in a quiescent state with decreased proliferative activity. On the other hand, the existing literature about the effect of aging in the human neurogenic niches is controversial. Therefore, future studies still have much to teach us about when and how adult neurogenesis starts to decline during life. This new information may help us to better understand age-related neurological diseases and how to prevent them. ! ! ! 1 1. INTRODUCCIÓN La neurogénesis adulta es el proceso por el que se generan nuevas neuronas que migran, maduran y se integran en un circuito neural preexistente. Fisiológicamente, este fenómeno parece contribuir a mecanismos de plasticidad neural más que en la reparación del cerebro. Sin embargo, llegar a entenderla y modularla supondría una potente herramienta para su uso con fines terapéuticos. 1.1 Contextualización histórica Hasta finales del siglo XX imperaba la idea de que una vez completado el desarrollo, el sistema nervioso central (SNC) era incapaz de generar nuevas neuronas. Fue entonces cuando Joseph Altman, gracias al uso de la timidina tritiada (un nucleósido radiactivo que se incorpora al ADN de las células durante la fase S del ciclo celular) pudo identificar nuevas células con morfología neuronal en el bulbo olfatorio (BO) y en el giro dentado (GD) del hipocampo (1–3). No se consiguió localizar con exactitud la procedencia de esas células hasta que años después, con los avances técnicos, pudo establecerse que estas nuevas neuronas derivan de células madre neurales (CMN) localizadas, en el caso de los mamíferos, en la zona ventricular-subventricular (V-SVZ) de los ventrículos laterales (4–7) y en la zona subgranular (ZSG) del giro dentado del hipocampo (8–11). Aunque se ha observado proliferación celular en otras zonas del SNC como las paredes del tercer ventrículo (12) o el canal central de la médula espinal (13,14), no se tienen evidencias suficientes que confirmen la capacidad neurogénica de estas regiones. Una vez se aceptó que el cerebro adulto podía ser capaz de generar nuevas neuronas, el interés se centró en establecer la naturaleza de las células madre neurales y su completa caracterización. Algunos autores apuntaron que las CMN tenían características astrocitarias (15), mientras que otros propusieron que correspondían a células ependimarias (16). No obstante, estudios como el de Spassky et al. (17) determinaron que las células ependimarias son células postmitóticas, diferenciadas, y sin capacidad proliferativa. Por otra parte, ante la pregunta de si la neurogénesis adulta era un fenómeno común en otras especies, se llevaron a cabo múltiples estudios que encontraron neurogénesis en diversas regiones del cerebro en todos los grupos vertebrados estudiados, desde peces hasta primates (18–20). ! ! ! 2 1.2 Nichos neurogénicos: la zona ventricular-subventricular 1.2.1 Desarrollo embrionario y perinatal El sistema nervioso central deriva de una lámina formada por células progenitoras (células neuroepiteliales) que se pliega formando el tubo neural. La luz de dicho tubo neural dará lugar, posteriormente, al sistema ventricular cerebral y al canal central de la médula espinal. Como se ilustra en la Figura 1, durante el desarrollo embrionario las células neuroepiteliales tienen morfología radial y contactan tanto con la superficie ventricular como con la superficie pial. Al principio del desarrollo del SNC, estas células neuroepiteliales se dividen simétricamente aumentando el número de células progenitoras, mientras que, más adelante, se transforman en células de glía radial que comienzan a dividirse de forma asimétrica, dando lugar a una célula madre que se mantiene adyacente a la cavidad ventricular y a una célula hija que migra tangencialmente alejándose del ventrículo (21–23). Además, las fibras radiales de las células de glía radial facilitan, junto a los vasos sanguíneos, la migración de nuevas neuronas hacia la corteza cerebral (24). Al aproximarse el nacimiento, se ha observado que en ratones la mayoría de células de glía radial pierden su contacto con la cavidad ventricular y migran hacia la corteza cerebral. Tan solo un pequeño porcentaje de células mantiene su contacto apical con el ventrículo y, con ello, su capacidad de actuar como células madre multipotentes, pudiendo dar lugar a los diferentes tipos celulares de la línea neural. Durante el desarrollo postnatal y en el adulto, las CMN se mantienen en la V-SVZ estableciendo un nicho celular con una organización muy característica (25). 1.2.2 Organización celular de la V-SVZ En la edad adulta, la V-SVZ corresponde a la región que tapiza la pared lateral de los ventrículos laterales. Está compuesta por cuatro tipos celulares: las células E o ependimarias, células B o astrocitos, células C o células de amplificación transitoria (TAC) y Células A o neuroblastos (Figura 2) (15). En varias especies de mamíferos, estos neuroblastos o neuronas inmaduras migran rostralmente hacia el bulbo olfatorio a lo largo de la corriente migratoria rostral (CMR), a través de la cual los neuroblastos se desplazan rodeados por astrocitos que forman gliotubos, que facilitan dicho proceso (4). Una vez alcanzan el BO, gracias a factores tróficos no bien conocidos, los neuroblastos se dispersan y terminan de diferenciarse formando neuronas maduras que se integran en circuitos preexistentes (5). ! ! ! 3 Figura 1. Desarrollo del sistema nervioso central y sus componentes celulares. Se muestra un diagrama que describe la secuencia de formación del SNC a partir de las células neuroepiteliales y de glía radial a lo largo del desarrollo. (MA) manto; (MZ), zona marginal; (NE), neuroepitelio; (nIPC) célula intermediaria progenitora de neuronas; (oIPC) célula intermediaria progenitora de neuronas; (RG) glía radial; (SVZ) zona subventricular; (VZ) zona ventricular. Extraído de Kriegstein y Álvarez-Buylla (25). Figura 2. Estructura de la V-SVZ y evolución de sus componentes celulares. (A) Localización, a nivel macroscópico, de la V-SVZ en la pared lateral de los ventrículos laterales (LV). (B) Organización de la V-SVZ: las células ependimarias (gris) tapizan la pared del ventrículo y tienen su superficie apical cubierta por cilios. Por debajo de éstas ! ! ! 4 encontramos células tipo B (astrocitos, azul), algunas de ellas en contacto con la cavidad ventricular por medio de un cilio primario (flecha). Esta subpoblación (células B1) corresponde a las CMN, y se divide dando lugar a precursores intermedios (células tipo C, verde), que a su vez se multiplican dando lugar a neuronas inmaduras o neuroblastos (células A, rojo). Los neuroblastos se agrupan formando cadenas de migración rodeadas por astrocitos (B). Más profundamente podemos encontrar vasos sanguíneos (BV) a los que suelen estar asociadas las expansiones basales de las células B. (C) Evolución del proceso neurogénico. Los astrocitos (B) tienen capacidad autorregenerativa, y además pueden dar lugar a precursores intermedios (C) y éstos a su vez a neuroblastos (A). Imagen modificada de Álvarez-Buylla y Lim (26). Las células ependimarias (tipo E) son células de gran tamaño y morfología cuboidal, y forman un epitelio monoestratificado que tapiza la pared ventricular. En su superficie apical presentan microvellosidades y un penacho de cilios que, mediante un movimiento de batido, impulsan el líquido cefalorraquídeo (LCR) a través del sistema ventricular del cerebro. Tienen una cromatina poco densa y están fuertemente unidas unas a otras mediante interdigitaciones y complejos de unión (15). Aunque existen estudios que inicialmente describieron estas células como las bona fide CMN (16), o que al menos podían actuar como tales ante determinadas condiciones patológicas (27,28), posteriormente se ha concluido que son células derivadas de la glía radial y que no tienen actividad proliferativa (17,29). No obstante, ante un daño en esta capa, se ha observado que las células B1 son capaces de modificar la secuencia B à C à A, formando células con un fenotipo intermedio entre ependimario y astrocitario (ependymary-like cells). Estas células tienen rasgos de células E pero también otros, como los filamentos intermedios (FI), más típicos de las B (30). Los astrocitos de la V-SVZ (células B) son células con citoplasma claro y abundante. Poseen una morfología muy irregular debido a que se sitúan entre los diferentes componentes celulares. Tradicionalmente se ha considerado a los astrocitos como un grupo celular bastante homogéneo. Sin embargo, posteriormente se ha observado que existen diversas subpoblaciones especializadas y con distintas funciones (31,32). En la V-SVZ encontramos dos subpoblaciones, las células B1 y las células B2 (15); todas ellas expresan el marcador GFAP (glial fribrillary acidic protein). A día de hoy, está ampliamente aceptado que las células B1 son las bona fide CMN (33). Son células también derivadas de la glía radial (34) que mantienen un contacto con la ! ! ! 5 superficie ventricular mediante proyecciones citoplasmáticas que se intercalan entre las células ependimarias (CE) y que terminan con un cilio primario en la luz del ventrículo lateral (Vl) (15). Se sugiere que dicho cilio primario puede estar implicado en la transducción de señales sistémicas mediadas por morfógenos o factores de crecimiento. Se sabe, por ejemplo, que el cilio primario es esencial para la señalización por Hedgehog (Hh) (35). Las células B1 son capaces de autorrenovarse, pero también de dar lugar a nuevos astrocitos, neuronas y oligodendrocitos, no sólo en condiciones fisiológicas, sino también en respuesta a daños cerebrales como traumatismos o ictus (36–39). Las células B2, como decíamos, también tienen características astrocitarias, si bien en este caso no contactan con la cavidad ventricular, por lo que inicialmente fueron consideradas como astrocitos quiescentes con función estructural (15). A pesar de ello, estudios recientes usando técnicas de marcaje clonal indican que con el paso del tiempo, algunas células B1 pierden su contacto apical con la cavidad ventricular dando lugar a células B2, y que éstas también podrían tener cierta capacidad neurogénica (40). Por otra parte, es también bien conocido que tanto las células B1 y B2 tienen expansiones basales que contactan con la red vascular asociada a la V-SVZ, la cual interviene en la transmisión de señales sistémicas que regulan la actividad del nicho (41). Las células de amplificación transitoria (células C) poseen un núcleo irregular con profundas invaginaciones y cromatina laxa (15). Son las células con mayor tasa proliferativa de la V-SVZ y dan lugar a múltiples neuroblastos (células A) tras varias divisiones mitóticas. Por ello se pueden localizar frecuentemente cercanas a cadenas de neuroblastos. Esto pudo ser demostrado gracias a una serie de experimentos con antimitóticos que eliminaban por completo la población de células C de la V-SVZ, que posteriormente eran restauradas gracias a la presencia de células B quiescentes capaces de regenerar el nicho neurogénico (42). Con el envejecimiento, las células C se encuentran de forma más aislada y con una capacidad proliferativa menor (43). Algunos estudios llevaron a cabo una caracterización más profunda, observando que al menos durante los primeros 12 meses de vida (en ratones) la población de células C se mantenía constante, y que a partir de ahí se veía reducida (44). Las células tipo A, células migradoras o neuroblastos, tienen un soma fusiforme, con un citoplasma denso y escaso, y expresan Doblecortina (DCX), una proteína asociada a microtúbulos. Su núcleo es regular, con 2 o más nucleolos y con cromatina laxa. Como diferencia ante las células B, no presentan filamentos intermedios en el citoplasma y su ! ! ! 12 Otro aspecto implicado en la capacidad proliferativa de las CMN viene determinado por el mantenimiento de su integridad cromosómica por medio de la actividad telomerasa. En relación a esto ha sido descrito que CMN obtenidas a partir de la V-SVZ de ratones transgénicos deficientes en actividad enzimática telomerasa tienen una drástica disminución en su actividad proliferativa in vitro debido al acortamiento de telómeros (62). Por el contrario, la restauración de la telomerasa en ratones transgénicos deficientes en dicha actividad produce la reactivación de las CMN y de la neurogénesis en la V-SVZ (63). 1.4.2 Factores intercelulares (célula-célula) Otra serie de factores implicados en la regulación de la actividad neurogénica consiste en las interacciones intercelulares entre células de los nichos donde residen las CMN, estableciendo una regulación de tipo paracrino con un feedback continuo. En la V-SVZ existe una multitud de vías de señalización que regulan finalmente la actividad de los distintos tipos celulares del nicho (64). Los factores intercelulares comprenden incluso las interacciones de células de los nichos neurogénicos con células relativamente alejadas de éstos. Tanto la V-SVZ como la ZSG poseen aferencias de axones procedentes de distintas áreas cerebrales. Por ejemplo, ha sido descrito que neuronas serotoninérgicas del núcleo del rafe proyectan axones supraependimarios que entran en contacto con las células de la V-SVZ regulando la actividad de las células B1 (65). Por otra parte, también ha sido descrita la existencia de axones de neuronas dopaminérgicas procedentes de la sustancia negra que contactan con células de la V-SVZ liberando dopamina en dicha región (66). Finalmente, hay que señalar que no sólo los factores químicos regulan la neurogénesis, sino que los complejos unión entre las células también lo hacen. Ha sido observado que los vasos sanguíneos adyacentes a la V-SVZ forman un plexo especial con el que contactan las células B1 y C, pero no con las de tipo A. Esta interacción neurovascular es una especialización que contribuye a la regulación de la actividad de la V-SVZ (67). 1.4.3 Factores extracelulares Probablemente éste sea el grupo de factores sobre el que más información se dispone. Sin embargo, supone un gran reto encajar toda esta información para poder comprender los mecanismos globales de la regulación neurogénica. A continuación, se desarrollan algunos de los principales factores que intervienen en la fisiología de la V-SVZ con especial énfasis en su potencial implicación en los cambios que se producen en el proceso de envejecimiento. ! ! ! 13 LCR El LCR es un medio acuoso incoloro que baña el SNC por medio del espacio subaracnoideo, el sistema ventricular y el canal ependimario de la médula espinal. Tiene diversas funciones y se forma principalmente en los plexos coroideos (PC). En su composición han sido identificadas multitud de moléculas implicadas en la actividad de las CMN de la V-SVZ (47). Esta composición cambia con el envejecimiento; en el estado embrionario, por ejemplo, predomina el factor de crecimiento insulínico tipo 2 (IGF2) y con el tiempo se añade el factor de crecimiento transformante (TGF), Sonic Hedgehog (SHH), Wnts y BMP, entre otras. Muchas de estas moléculas son segregadas por los propios PC, que a su vez poseen receptores para regular su producción. A pesar de que estas moléculas se han visto implicadas en procesos de diferenciación y migración, no se ha podido determinar con exactitud su función exacta (6,30,67). Microvascularización La interacción LCR-vascularización es un sistema complejo con gran cantidad de vías de regulación que confluyen en la V-SVZ, por lo que lograr entenderlo y poder controlarlo es un reto interesante para proponer diferentes abordajes a problemas derivados del neuroenvejecimiento. La vascularización de la V-SVZ y la ZSG tiene una serie de características concretas que difieren de otras áreas del SNC. Al contrario de lo que cabría esperar, ha sido descrito que la V-SVZ tiene una menor vascularización que otras áreas cerebrales y que, por lo tanto, es un poco más hipóxica. En cambio, la barrera hematoencefálica (BHE) de los vasos sanguíneos de esta región es más permeable, permitiendo la difusión de moléculas que influyen en la regulación neurogénica (68). En el GD también se ha visto cómo con el envejecimiento la microvascularización se va tornando más permeable, abriendo el paso a sustancias proinflamatorias (69). Además, con la edad se produce una reducción en la angiogénesis y la plasticidad (70) paralela a la observada en la capacidad neurogénica. Inflamación crónica y estrés oxidativo Una de las hipótesis que se barajan para explicar el declive neurogénico asociado a la edad es que éste podría responder a procesos neuroinflamatorios. Diversos estudios han advertido que la inflamación crónica y/o el estrés oxidativo excesivo produce un aumento de la microglía reactiva, y que ésta contribuye a la liberación de diferentes citoquinas que influyen en la neurogénesis, tanto en la V-SVZ (29,71,72) como en el GD (59). Así pues, al inhibir la microglía se ha observado que hay un aumento de la neurogénesis (73). ! ! ! 14 Otro parámetro relacionado y que está ampliamente estudiado es el cortisol. Una exposición prolongada a altos niveles de cortisol (no fisiológicos) acelera el neuroenvejecimiento (74). También se ha visto que los glucocorticoides aumentan con la edad en el ratón (75). Por otra parte, se ha descrito que la presencia de receptores de corticoides es mayor en etapas adultas, y que bloqueando los mismos se mejora la neurogénesis, la plasticidad y la cognición de ratas envejecidas (76), dando idea de la importancia del estrés en el SNC y, en particular, sobre la actividad neurogénica. Ejercicio físico y enriquecimiento ambiental Se ha demostrado que el estímulo que produce la actividad tanto física como mental frena el declive de la neurogénesis (74,77–80), aunque se desconoce cuál es la vía que produce dicho efecto o si existen diferencias entre distintos tipos de ejercicio físico o mental. Algunos estudios han intentado averiguar cuál es el momento más eficiente para estimular a los ratones con un ambiente favorable para incrementar la neurogénesis, que parece ser más efectivo durante las 2-3 primeras semanas de vida, aunque la integración completa de las nuevas neuronas generadas en los circuitos neuronales existentes lleva más tiempo (50). Por otra parte, la exposición de ratas a un ambiente enriquecido durante las primeras etapas de su vida podría tener efectos a largo plazo (81). Por tanto, parece claro que tener un estilo de vida activo sería beneficioso también desde el punto de vista de la neurogénesis adulta. 1.5 Efecto de la edad sobre la neurogénesis adulta En general, existe bastante consenso en cuanto a que hay un declive de la neurogénesis asociado al envejecimiento, sin embargo, no se conocen con exactitud las causas de este fenómeno. La mayor tasa proliferativa en la V-SVZ se alcanza en las primeras etapas postnatales. Progresivamente, se observa una reducción de esta capacidad y en la senectud, la cantidad de precursores ya ha disminuido drásticamente (29,82). Desde el punto de vista de la edad, varios trabajos han demostrado que existe una disminución en el número de nuevas células que se producen tanto en la V-SVZ como en el GD a lo largo de la vida (29,30,43,61). Dicha reducción parece tener relación con la aparición de algunas enfermedades degenerativas como la enfermedad de Alzheimer o el Parkinson (83). Las diferencias con la edad no sólo son cuantitativas, también se producen cambios a nivel estructural característicos del envejecimiento, como puede ser la reducción del número de células tipo C y A de la V-SVZ, mientras que la población astrocítica y ependimaria se mantiene (84,85). Por su parte, el GD del ratón experimenta una reducción ! ! ! 15 similar en su capacidad proliferativa, si bien ésta es menor y no tan lineal a lo largo de los años (86). En el caso del GD humano, existe una gran controversia sobre el periodo durante el cual esta estructura es capaz de generar nuevas neuronas. Mientras algunos trabajos sostienen que la actividad neurogénica se mantiene en niveles relativamente altos a lo largo de toda la vida (70,87), otros indican que la incorporación de nuevas neuronas disminuye drásticamente durante los primeros años de vida, siendo prácticamente nula en el adulto (88,89). 1.6 Función de la neurogénesis adulta La función de la neurogénesis adulta es una cuestión que sigue sin una respuesta clara. En cualquier caso, está claro que ésta difiere entre la V-SVZ y el GD, y también entre distintas especies, pero parece un proceso clave para el mantenimiento de la homeostasis en el SNC y su déficit está asociado a diferentes patologías (90). Se tiene constancia, por ejemplo, de que la pérdida de la neurogénesis causa déficits cognitivos importantes (91). También se ha visto cómo la neurogénesis tiene un efecto antidepresivo y que el bloqueo de la misma anula los efectos de los antidepresivos (92,93). Siguiendo con esta línea, por medio de resonancia magnética nuclear se ha visto como los humanos con depresión crónica tienen una reducción del tamaño de su hipocampo (94). No hay que olvidar que el hipocampo forma parte del sistema límbico que regula el comportamiento anímico. ! ! ! 17 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS En vista de la bibliografía publicada y tras establecer un marco conceptual sobre el problema que suscita el envejecimiento en el SNC y más concretamente en los nichos neurogénicos, planteamos la hipótesis de que el envejecimiento provoca cambios estructurales en la V-SVZ del ratón, en su organización celular y, en consecuencia, en su capacidad proliferativa. Para comprobar dicha hipótesis definimos los siguientes objetivos generales: 1) Evaluar los cambios morfológicos que ocurren en la V-SVZ con el envejecimiento y su potencial implicación en la capacidad neurogénica. 2) Evaluar las posibles diferencias en la composición y organización celular de la V-SVZ de ratones envejecidos. 3) Determinar el efecto del envejecimiento en la capacidad proliferativa de la V-SVZ. Para abordar los anteriores objetivos utilizaremos técnicas morfológicas basadas en el uso de microscopía electrónica de transmisión (MET) y de barrido (MEB). Por otra parte, determinaremos si existen diferencias en cuanto a la composición celular de la V-SVZ de ratones envejecidos mediante marcaje inmunohistoquímico de neuroblastos (DCX) y células tipo B (GFAP). Finalmente, evaluaremos si existe una reducción en la proliferación celular de la V-SVZ en ratones envejecidos. Para ello usaremos el marcador de proliferación 5bromo-2-desoxiuridina (BrdU) y posteriormente cuantificaremos las células marcadas al microscopio óptico. ! ! ! 19 3. MATERIAL Y MÉTODOS Todos los reactivos utilizados fueron adquiridos en la compañía Sigma-Aldrich salvo que se especifique lo contrario. 3.1 Animales de experimentación Para el estudio presentado en este trabajo de fin de grado se utilizó material biológico previamente obtenido en proyectos de investigación anteriores. El procesamiento llevado a cabo comenzó a partir de secciones de cerebro fijadas, que habían sido conservadas en tampón fosfato 0.1 M (PB) con azida sódica 0.05% a 4 ºC hasta el momento de su utilización. Los animales a partir de los cuales se obtuvo dicho material, se estabularon bajo ciclos de 12 h de luz/oscuridad, con disponibilidad de comida y agua ad libitum y a una temperatura de 20-24 ºC. Se utilizaron 12 ratones (machos y hembras) de la cepa C57BL/6, distribuidos en dos grupos de edad (2 y 24 meses). Todos los procedimientos se llevaron a cabo en cumplimiento de la normativa de la Comisión Europea 2010/63/UE y fueron aprobados por el Comité Ético de Bienestar Animal de la Universitat de València. 3.2 Microscopía electrónica de transmisión Para el procesamiento de muestras para su estudio por medio de MET se anestesió profundamente a los animales (n=3 ratones por grupo experimental) con pentobarbital sódico (100 mg/Kg; Eutanax, Fatro) y a continuación se perfundieron de forma intracardiaca con solución salina (0.9%) seguido de una solución fijadora consistente en paraformaldehído 2%, glutaraldehído 2.5% en PB (0.1 M, pH 7.4). Una vez finalizada la perfusión, se extrajo el cerebro de los animales y se postfijó en la misma solución fijadora durante toda la noche. Al día siguiente, los cerebros fueron lavados con tampón PB 0.1 M y uno de los hemisferios de cada animal fue reservado para procesarlo para MEB, mientras que el otro fue cortado en secciones de 200 μm con un vibratomo Leica VT1000 S para, una vez seleccionados niveles correspondientes a la V-SVZ, procesarlos para MET. Para ello, las secciones fueron postfijadas con tetraóxido de osmio 2% en PB 0.1 M durante 1 h 30 min, lavadas con agua, deshidratadas en soluciones de concentración creciente de etanol y contrastadas con acetato de uranilo 2% en etanol 70% durante 2 h 30 min. Posteriormente, las secciones fueron infiltradas en resina epoxy Durcupan (Fluka), dejándose durante 72 h en una estufa a 70 ºC. Una vez endurecida esta resina, se procedió a obtener cortes ultrafinos (60-70 nm) mediante una cuchilla de diamante en un ultramicrotomo Leica Ultracut UC6. Posteriormente, los cortes ultrafinos fueron contrastados con citrato de plomo (solución de ! ! ! 20 Reynolds) y analizados con un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai G2Spirit equipado con una cámara digital Morada (Olympus). 3.3 Microscopía electrónica de barrido A partir del hemisferio reservado en el apartado anterior, se diseccionó la V-SVZ tratando de no dañar la superficie de la pared ventricular. El proceso llevado a cabo para la preparación de muestras para MEB fue similar al descrito para MET hasta el momento en que el tejido fue deshidratado en etanol 100%. Una vez en este paso, las muestras fueron sometidas a un secado por punto crítico de CO2. A continuación, las V-SVZ fueron montadas en portas metálicos mediante cinta adhesiva de doble cara y se llevó a cabo un sombreado metálico de oro-paladio justo antes de su observación. Por último, se examinó la superficie de las paredes ventriculares mediante un microscopio electrónico de barrido Hitachi S-4800 equipado con un sistema de captación digital de imágenes Quantax 400 (Bruker). 3.4 Estudios de proliferación Para detectar la proliferación celular en la V-SVZ se inyectó BrdU. La BrdU es un nucleósido sintético análogo de la timidina que se incorpora al ADN de las células en la fase S del ciclo celular. La BrdU fue preparada a una concentración de 5 mg/mL en solución salina 0.9% y administrada por vía intraperitoneal (50 mg/Kg de peso). Los animales se sacrificaron 2 h después de la inyección, pudiendo detectar posteriormente la incorporación de BrdU mediante el uso de un anticuerpo específico. 3.5 Detección inmunohistoquímica Los animales fueron fijados con paraformaldehído 4% en PB (0.1 M, pH 7.4) mediante perfusión intracardiaca, del mismo modo al anteriormente descrito. Una vez fijados, los cerebros fueron lavados con PB 0.1 M y crioprotegidos con sacarosa 30% durante 24 h a 4 ºC antes de ser cortados. A continuación, se obtuvieron cortes de 25 μm con un criostato Leica CM 1860 UV. Se usaron cortes en flotación en los que se detectaron los marcadores moleculares de interés. Para la detección de DCX y GFAP por inmunofluorescencia (n=3 ratones por grupo experimental), los cortes fueron lavados con PB 0.1 M y se bloquearon las peroxidasas endógenas con H2O2 3% y metanol 10%. A continuación, las muestras fueron bloqueadas con caseína 1% y suero de cabra 5%. Las incubaciones con los anticuerpos primarios (Tabla 3) se realizaron durante toda la noche a 4 ºC. Tras varios lavados y un nuevo bloqueo con suero y caseína, se incubó con anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos (Tabla 4) durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, se hicieron lavados con PB 0.1 M y ! ! ! 21 agua destilada, y se incubaron los cortes con DAPI (4',6-diamino-2-fenilindol) durante 10 minutos. Por último, se realizó el montaje de los cortes con FluorSaveTM (Millipore). Tabla 3. Listado de anticuerpos primarios empleados. Anticuerpo Especie y dilución Casa comercial (referencia) Especificidad GFAP Ratón, 1:500 Millipore (MAB360) Astrocitos DCX Conejo, 1:200 Cell Signalling (AV41333) Neuroblastos BrdU Ratón, 1:150 Dako (MO744) Células en fase S Tabla 4. Listado de anticuerpos secundarios empleados. Anticuerpo Especie y dilución Casa comercial (referencia) Marcaje Anti-ratón, IgG Cabra, 1:500 Invitrogen (A11001) Alexa 488 Anti-conejo, IgG Cabra, 1:500 Invitrogen (A21428) Alexa 555 Anti-ratón, IgG Cabra, 1:400 Vector Labs (BA-9200) Biotinilado Para la detección inmunohistoquímica de BrdU, las secciones se incubaron en HCl 2 N durante 30 minutos a 37 ºC, seguido de tampón borato (pH 8.5) e incubación en tampón bloqueo consistente en: Tritón X-100 0.2%, caseína 1% y NGS 5% en tampón fosfato salino 0.1 M (PBS, pH 7.4). Posteriormente, fueron incubadas durante toda la noche a 4 ºC con el anticuerpo primario correspondiente (Tabla 3) y al día siguiente se realizó la incubación (de 1 h) con el anticuerpo secundario biotilinado (Tabla 4). A continuación, se llevó a cabo una amplificación de la señal mediante el complejo avidina/biotina (ABC, Vector) y se reveló con 3,3’-diaminobenzidina (0.05%, DAB). Por último, los cortes fueron deshidratados con concentraciones crecientes de alcohol etílico y aclarados en xileno, para finalmente ser montados con Eukitt. Una vez montadas, las muestras fueron examinadas usando un microscopio Nikon Eclipse 80i equipado con una fuente de fluorescencia, y se obtuvieron fotomicrografías usando una cámara Nikon CCD DS-Qi1Mc. ! ! ! 28 flecha) y los cilios son también más escasos que en animales jóvenes (flecha azul). (C) Se muestra una cadena con abundantes neuroblastos (células tipo A) de un ratón joven, con los característicos espacios libres a su alrededor. (D) Detalle de las interdigitaciones (línea negra discontinua) formadas por las células ependimarias en animales envejecidos. Se observan también mitocondrias (flechas rojas) más dispersas que animales jóvenes. Barras de escala: (A) y (B) 5 μm, (C) 2 μm, (D) 1 μm. Como se puede observar en la Figura 9A, en el ratón joven de 2 meses de edad, las células ependimarias que forman la pared ventricular tenían la superficie apical prácticamente cubierta por penachos de cilios, más o menos equidistantes unos con otros. Entre estos penachos de cilios, podrían observarse pequeñas microvellosidades. Sin embargo, en ratones de 24 meses observamos que los penachos de cilios estaban mucho más distantes unos de otros, quedando la superficie celular mucho más expuesta que en el caso del otro grupo experimental (Figura 9B). Incluso encontramos células que carecían de cilios, y daba la impresión de que la superficie que abarca cada célula es mayor en este caso, pudiendo delimitar cada célula por un ribete de microvellosidades en la periferia de éstas. Por otra parte, los penachos de cilios de las células ependimarias de ratones envejecidos, parecen estar adheridos unos con otros, a diferencia de lo que observamos en los animales jóvenes, si bien no descartamos que este aspecto podría responder a un artefacto de la técnica empleada. Figura 9. Imágenes de microscopía electrónica de barrido mostrando la superficie de las paredes ventriculares de ratones de 2 y 24 meses de edad. En estas dos imágenes se visualiza la superficie de las paredes laterales del ventrículo lateral, por lo que estamos ! ! ! 29 observando células ependimarias y sus cilios y microvellosidades. (A) En el ratón de 2 meses de edad, se observa una gran densidad de penachos de cilios; teóricamente cada penacho corresponde a una célula ependimaria. (B) En el ratón de 24 meses se observa una reducción en el número de penachos debido a la pérdida de células ependimarias. Además, los cilios parecen apelmazados unos con otros. En la superficie de las células observamos también ribetes de pequeñas microvellosidades que delimitan el contorno de las células, y largas fibras que corresponden a axones supraependimarios. Barra de escala: 10 μm. 4.2 Efecto del envejecimiento en la expresión de marcadores moleculares Para investigar de forma más profunda los cambios observados en la organización celular de la V-SVZ de animales envejecidos, nos propusimos llevar a cabo un estudio de la expresión de marcadores moleculares específicos de algunos de los tipos celulares de esta región neurogénica. Para ello, realizamos un marcaje por inmunofluorescencia mediante el marcador de neuronas inmaduras DCX, y el marcador de astrocitos GFAP. Además, incluimos un marcaje nuclear con DAPI para poder identificar el núcleo del resto de células en la V-SVZ. Así pues, en la Figura 10A se puede observar en una imagen panorámica la amplia distribución de neuroblastos a lo largo de toda la V-SVZ en los animales de 2 meses de edad. En mayor detalle, en este mismo grupo experimental, observamos que los neuroblastos se encuentran mayoritariamente agrupados y confinados a la V-SVZ (Figura 10B). Intercalados entre éstos, podemos encontrar células positivas para GFAP, correspondientes a astrocitos. Por último, encontramos algunas células cuyo núcleo está marcado con DAPI, pero negativas para DCX y GFAP, que corresponden a otros tipos celulares. Cuando comparamos con el ratón de 24 meses de edad, observamos que los neuroblastos son mucho menos frecuentes en los animales más viejos, existiendo grandes distancias entre unas agrupaciones y otras (Figura 10C). Curiosamente, en este último panel se pueden observar dos células marcadas con DCX localizadas en el estriado adyacente, hecho que contrasta con la localización de estas células en animales jóvenes. ! ! ! 30 Figura 10. Marcaje por inmunofluorescencia de la V-SVZ de ratones de 2 y 24 meses. Los tres paneles corresponden a un marcaje doble con un marcador de neuroblastos (DCX, rojo) y astrocitos (GFAP, verde). En azul se tiñeron los núcleos con DAPI. (A) Imagen panorámica de la V-SVZ de ratón de dos meses. A la derecha de ésta se encuentra el ventrículo lateral (VL) y a la izquierda el estriado (Str). A lo largo de la S-SVZ se pueden identificar numerosas células positivas para DCX correspondientes a neuroblastos. (B) Detalle de cadenas de neuroblastos (flechas) y astrocitos intercalados con numerosas expansiones citoplasmáticas en un ratón de 2 meses de edad. (C) En el ratón de 24 meses de edad, las cadenas de neuroblastos son mucho menos numerosas y pobladas (flechas). Barras de escala: 100 μm. 4.3 Efecto del envejecimiento en la proliferación celular de la V-SVZ Finalmente, con la intención de llevar a cabo un análisis cuantitativo de la proliferación celular en la V-SVZ, inyectamos BrdU a ratones de 2 y 24 meses de edad, sacrificándolos a las 2 horas de la inyección (Figura 11A). ! ! ! 31 La incorporación de BrdU a las células de la V-SVZ en división fue detectada inmunohistoquímicamente con DAB. Como resultado, el núcleo de las células que durante esas 2 horas tras la inyección entraron en fase de síntesis incorporando BrdU en su ADN se marcaron con un color marrón oscuro (Figura 11B y 11C). A continuación, realizamos una cuantificación del número de células positivas para BrdU, observando un número significativamente menor en el grupo de ratones de 24 meses de edad (Figura 11D; tstudent, p=0.0009). Estos resultados sugieren que en ratones el envejecimiento está acompañado de una disminución en la capacidad proliferativa de la V-SVZ. Figura 11. Cuantificación de la proliferación en la V-SVZ en ratones de 2 y 24 meses mediante marcaje con BrdU. (A) Diagrama indicando el protocolo de administración de ! ! ! 32 BrdU. (B y C) Se pueden identificar en marrón oscuro los núcleos de las células que han incorporado BrdU (cabeza de flecha). En el caso del animal joven destaca el hecho de que encontramos grandes agrupaciones de células positivas para BrdU (rodeadas con línea discontinua). (D) La cuantificación del número de células positivas para BrdU en animales de 2 y 24 meses de edad indica una disminución de la proliferación con el envejecimiento (grupo 2 meses, n=3 ratones, media ± SEM 71.18 ± 5.31; grupo 24 meses, n=3 ratones, media ± SEM 22.42 ± 1.28). *** indica p < 0.001. Barra de escala: 100 μm. ! ! ! 33 5. DISCUSIÓN 5.1 El envejecimiento afecta a la estructura y capacidad proliferativa de la V-SVZ El envejecimiento es un concepto no bien definido desde el punto de vista biológico, y hay que diferenciar el proceso que ocurre de forma fisiológica, de los procesos neurodegenerativos que, a pesar de tener fisiopatología bien estudiada, no responden al proceso “normal” de senescencia. Dicho proceso ocurre de forma continua, sin embargo, la mayoría de estudios en el campo de la neurogénesis adulta analizan edades extremas para la obtención de datos, perdiendo información importante que se recogería mediante un seguimiento continuo a lo largo de la vida. No obstante, este tipo de estudios implican una dificultad intrínseca que muchas veces los hace inviables. En este sentido, nuestro estudio analiza ratones de 2 y 24 meses, edades que vienen a reflejar la madurez del ratón, y estadios senescentes. En nuestros experimentos hemos encontrado resultados que concuerdan con la literatura existente en cuanto al efecto del envejecimiento sobre la neurogénesis adulta. En primer lugar, hemos observado mediante MET un adelgazamiento de la V-SVZ que puede tener un doble motivo: por un lado, la disminución en el número de células progenitoras y, por lo tanto, una menor incorporación de nuevas células; y por otro lado, la muerte de las células preexistentes. Existen varios trabajos publicados indicando disminuciones similares en la densidad celular de los nichos neurogénicos (29,84,85). A nivel celular y subcelular hemos encontrado interesantes diferencias entre los grupos de 2 y 24 meses de edad. En los astrocitos de ratones envejecidos resultó llamativa la abundante presencia de filamentos intermedios en su citoplasma, así como de cuerpos densos, hecho que concuerda con la bibliografía, y que sugiere la pérdida de algunas de las características propias de las CMN (29,30). Según nuestro análisis, estas células parecen corresponder a astrocitos de tipo reactivo (31). Por otra parte, la gran cantidad de cuerpos densos o de lipofuscina encontrados en los astrocitos de estos ratones podría ser producto de procesos de degradación celular que no se han podido eliminar y que han ido acumulándose en el citoplasma a lo largo de la vida de la célula. La pérdida de astrocitos B1 en la V-SVZ del cerebro envejecido podría indicar una capacidad regenerativa disminuida, la cual contribuiría al adelgazamiento e hipocelularidad observados en la V-SVZ. Es posible también que dicha alteración en la estructura u organización celular del nicho neurogénico pudiera dar lugar a la alteración de los mecanismos de regulación que controlan la proliferación de las células B1 y C en ! ! ! 34 condiciones fisiológicas en el adulto joven. Por ejemplo, cabe señalar que las células B1 tienen contacto con el Vl por medio de un cilio primario que actúa como receptor de diferentes señales provenientes del LCR (35,95), por lo que la alteración estructural del nicho podría afectar a dicho mecanismo de regulación. De modo parecido, tanto las expansiones basales de las células B1, como las células B2 localizadas en las zonas más internas de la V-SVZ, están en contacto con los vasos sanguíneos que irrigan el nicho (15,67), por lo que la alteración de la organización celular podría afectar también a la regulación mediada por señales a través de la BHE. Otra alteración característica del envejecimiento que hemos observado afecta a las células ependimarias. Por un lado, el cambio de su morfología cúbica a aplanada puede ser explicada debido a que al ser células sin capacidad de autorregeneración (17,29), la pérdida progresiva de las mismas podría generar un problema espacial. Como la superficie ventricular deber seguir estando tapizada con un menor número de células, puede que las CE se “estiren” para ocupar el espacio de las células perdidas. Estas células también albergan cambios interesantes en su parte apical. En nuestro estudio de la superficie de la pared ventricular mediante MEB apreciamos una reducción en la densidad de penachos de cilios, lo cual puede responder al mismo motivo que acabamos de señalar. Sin embargo, no sólo se ve una reducción en la densidad de cilios, sino que también se aprecia que los cilios están más compactados entre sí, lo que se podría traducir en una disfuncionalidad de los mismos y, por lo tanto, peor eficiencia para batir el LCR. Bien es sabido que un flujo de LCR deficiente está relacionado con patologías inflamatorias, vasculares y degenerativas del SNC (96). Una explicación alternativa para la reducción de la densidad ciliar, y posiblemente la alteración de su función, podría responder a las diferencias en la distribución de las mitocondrias asociadas a los corpúsculos basales de los cilios. En el ratón joven las encontramos cercanas a la membrana apical de las CE, frecuentemente asociadas a dichos corpúsculos basales (15), probablemente para aportarles la energía necesaria para su batido. En cambio, en animales envejecidos las mitocondrias son menos numerosas y adquieren una distribución más aleatoria, lo que sugiere que el batido ciliar podría estar también afectado. La morfología que hemos observado en los neuroblastos y las cadenas que éstos forman desde la V-SVZ hasta el BO a lo largo de la corriente migratoria rostral también concuerda con la literatura. Su aspecto fusiforme y los abundantes espacios intercelulares libres son característicos de células en migración (15). En ratones envejecidos, observamos una drástica disminución en el número de estas neuronas jóvenes marcadas con DCX. Este ! ! ! 35 hecho parece lógico en base a nuestros datos sobre la proliferación celular en la V-SVZ de ratones de 24 meses, que indican una significativa reducción en la producción de nuevas células. No obstante, este último experimento tiene a su vez ciertas limitaciones. Por un lado, nosotros cuantificamos células que han entrado en división mediante el uso del marcador BrdU, el cual mantiene sus niveles en sangre durante unas 2 horas en el ratón (97), tras las cuales sacrificamos al animal. Ese tiempo es sustancialmente más corto que la duración del ciclo celular de las células de la V-SVZ (98), por lo que no estaríamos marcando todas las células activas con esa única dosis de BrdU. Por otra parte, para establecer qué fracción de las células marcadas corresponden a la población de neuroblastos deberíamos haber hecho un doble marcaje con BrdU y DCX. No obstante, la intención de nuestro estudio consistía en comparar la capacidad proliferativa entre ratones adultos jóvenes y envejecidos, por lo que una cuantificación más precisa se escapaba al propósito de nuestro estudio. Por último, varios autores apuntan que existe un pool de células precursoras quiescentes (99–101), a la espera de recibir una señal de activación, por lo que en cualquier caso estaríamos subestimando el potencial proliferativo de la V-SVZ incluso utilizando protocolos de marcaje más prolongados. Por qué se produce este bloqueo en la neurogénesis sigue siendo una pregunta sin una respuesta clara, si bien la explicación más sencilla sería la de mantener un reservorio de CMN ante una futura demanda. En cualquier caso, parece necesario un mayor conocimiento de los mecanismos que controlan la transición entre CMN quiescentes y activas, y viceversa. La neurogénesis adulta tiene una compleja regulación basada en una gran red de interacciones, por lo que estudiar y entender unos pocos factores aislados fuera de un contexto fisiológico, puede dar lugar a resultados dispares. Por ejemplo, algo que bibliográficamente está bien demostrado es el efecto inductor del ejercicio físico y la actividad mental sobre la neurogénesis adulta (78–80). Sin embargo, la mayoría de experimentos en este sentido, se realizan con ratones estabulados con ruedas para correr de forma voluntaria, y juguetes para estimular la exploración y la resolución de problemas, comparado con un grupo control de animales estabulados en prácticamente ausencia de estímulos. Ambos grupos viven en condiciones muy artificiales respecto a las de ratones en libertad. Cabría preguntarse si este tipo de experimentos serían extrapolables a la especie humana, mucho más heterogénea en sus hábitos y estilos de vida. Es más, incluso aceptando el hecho de que el ejercicio y el enriquecimiento ambiental puedan tener un efecto inductor en la neurogénesis adulta, seguimos sin responder cuestiones como qué tipo ! ! ! 36 de deporte es más favorable, qué cantidad sería necesaria, y si es igualmente favorable en cualquier etapa de la vida. De la reflexión anterior surge también la pregunta sobre cuánto de lo aprendido a partir de los experimentos realizados con modelos animales como el ratón (el organismo en el que se ha realizado la mayoría de estudios sobre neurogénesis adulta) son extrapolables a la especie humana. Si bien es cierto que ambas especies comparten una gran parte de su genoma, existen diferencias importantes tanto a nivel neuroanatómico como funcional. Por ello, aunque totalmente necesarios, la interpretación de datos obtenidos a partir de organismos modelo siempre conlleva ciertas limitaciones, especialmente en el campo de la medicina regenerativa (102,103). 5.2 Implicaciones de la neurogénesis adulta en el cerebro humano El estudio de la neurogénesis adulta en humanos representa un problema con muchas aristas, principalmente por la dificultad que entraña la obtención de muestras de un órgano poco accesible como el cerebro, que en el caso de la especie humana implica una serie de limitaciones. La más importante de ellas es, probablemente, la dificultad de recolectar muestras post mortem en condiciones óptimas, ya que existe un deterioro tanto a nivel morfológico como molecular inherente al tiempo legal necesario para procesar este tipo de tejido (106,107). Además de estos problemas técnicos, nos encontramos también con el de la variabilidad interpersonal. Puesto que la neurogénesis es un proceso regulado por una serie de factores altamente intrincados (47), es difícil encontrar cohortes de muestras humanas con unas características homogéneas. Factores como la dieta, el estilo de vida, el ejercicio físico, el estrés, o la exposición a tóxicos o fármacos pueden resultar en una variabilidad interindividual que dificulte la interpretación de los resultados obtenidos. Por todo ello, se hacen necesarios estudios que obtengan y analicen muestras obtenidas de un modo sistemático y reproducible. La primera evidencia de la incorporación de nuevas neuronas a la capa granular del GD del hipocampo fue aportada en 1998 por el grupo de Fred H. Gage estudiando pacientes oncológicos que habían recibido una pequeña dosis de BrdU con fines diagnósticos. El GD de cinco de estos pacientes fue analizado post mortem, encontrando abundantes células marcadas con BrdU, que además expresaban el marcador neuronal NeuN y que presentaban morfología de neuronas granulares (48). Más recientemente, el grupo dirigido por Jonas Frisén utilizó un ingenioso sistema para datar la edad de las neuronas hipocampales de 55 cerebros humanos de distintas edades. El método que utilizaron está ! ! ! 37 basado en la incorporación de 14C al DNA de células que entran en división a lo largo de la vida. Comparando los niveles de dicho isótopo en el DNA de neuronas hipocampales, con los valores de concentración atmosférica de 14C a lo largo del siglo XX, pudieron estimar mediante un modelo matemático el recambio neuronal que habría en el hipocampo humano (87). No obstante, ambos estudios han sido cuestionados con posterioridad por la dificultad para ser replicados por otros grupos independientes (88). En cualquier caso, estos dos trabajos defienden la capacidad neurogénica del cerebro humano incluso en edades avanzadas (superiores a los 80 años), lo que implicaría que el envejecimiento podría no afectar de forma drástica a la producción de nuevas neuronas en los humanos. Nuestros resultados, con sus limitaciones, sugieren que existe una disminución significativa en la proliferación de las células de la V-SVZ, sin embargo, en ratones de 24 meses de edad todavía fue posible encontrar células que habían incorporado BrdU, lo cual concuerda con estos dos estudios en humanos. Otros estudios realizados en ratones (29,30) coinciden con la idea de una disminución en la capacidad neurogénica de la V-SVZ, la cual conlleva una importante reducción en la densidad celular de la CMR (44). Curiosamente, estudios recientes utilizando 59 y 44 muestras humanas respectivamente (88,89), han observado una disminución drástica en el número de neuronas jóvenes presentes en el GD durante los primeros años de vida, concluyendo que la neurogénesis era muy escasa o incluso nula en la edad adulta. Estos trabajos han abierto de nuevo un gran debate en el campo, especialmente por la publicación casi simultánea de otro estudio que analizaba el mismo aspecto en el hipocampo de 28 donantes de entre 14 y 79 años de edad. Dicho trabajo concluye que la neurogénesis persiste en el hipocampo humano incluso con el envejecimiento, indicando que el número de progenitores neurales, neuronas inmaduras, neuronas granulares, y el volumen del DG se mantienen estables a lo largo de toda la vida (70). Los autores de dicho trabajo, y otros, argumentan que sus resultados concuerdan con los obtenidos mediante técnicas indirectas mediante datación con 14C (70,87,108). Sin embargo, otros autores observan disminuciones en la neurogénesis similares a las descritas por Sorrells et al., tanto en el GD (109-111) como en la V-SVZ (45,111,112). La explicación a estas llamativas discrepancias todavía no está clara. Algunos de estos trabajos ponen en cuestión aspectos como la fiabilidad de determinados marcadores moleculares, la buena preservación del tejido, o los antecedentes personales de los donantes (108). Por ejemplo, se ha observado que el marcador DCX podría no ser específico únicamente de precursores neuronales en el hipocampo humano adulto, siendo ! ! ! 44 Neurogenesis in the Aged Brain. Aging Dis. 2010 Dec 1;1(3):232–44. 60. Palmer TD, Willhoite AR, Gage FH. Vascular niche for adult hippocampal neurogenesis. J Comp Neurol. 2000 Oct 2;425(4):479–94. 61. Bouab M, Paliouras GN, Aumont A, Forest-Bérard K, Fernandes KJL. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche: evidence for quiescence-associated changes between early and mid-adulthood. 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