Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea

GRADO EN MEDICINA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA TRABAJO FIN DE GRADO Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea Alumno: Ja ie López-Andaluz Mangas Di ec o a: M.ª Begoña Ga cía Cenado Salamanca Mayo 2024 Ja ie López-Andaluz Mangas T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” DECLARACIÓN DE AUTORÍA Decla o que he edac ado el abajo “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” pa a la asigna u a T abajo Fin de G ado en el cu so académico 2023-2024 y asumo la o iginalidad de dicho abajo, no u ilizando uen es de in o mación sin menciona de o ma cla a su o igen, an o en el ex o como en la bibliog a ía. En Salamanca, a 14 Mayo de 2024 Fdo: Ja ie López-Andaluz Mangas LOPEZ- ANDALUZ MANGAS JAVIER - 70885311R Fi mado digi almen e po LOPEZ-ANDALUZ MANGAS JAVIER - 70885311R Fecha: 2024.05.13 22:08:28 +02'00' Ja ie López-Andaluz Mangas T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” I ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1 1.1. ESTADO ACTUAL DEL PROBLEMA ....................................................... 1 1.2. REMODELACIÓN ÓSEA: FISIOLOGÍA .................................................. 2 1.2.1. CICLO DE REMODELACIÓN ÓSEA .................................................... 3 1.2.2. HOMEOSTASIS ÓSEA ........................................................................... 5 1.2.2.1. Vía BMP ................................................................................................... 5 1.3. TRATAMIENTO DE LAS ALTERACIONES DE LA REMODELACIÓN ÓSEA............................................................................................................................ 6 1.3.1. INJERTOS ÓSEOS .................................................................................. 6 1.3.2. BIOMATERIALES .................................................................................. 7 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ............................................................................... 11 3. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................. 13 4. RESULTADOS ..................................................................................................... 19 4.1 RESULTADOS MACROSCÓPICOS ........................................................ 19 4.2 RESULTADOS DE MICRO-CT ................................................................. 19 4.3. RESULTADOS HISTOLÓGICOS ............................................................. 22 4.4. RESULTADOS INMUNOHISTOQUÍMICA ............................................ 27 4.5. RESULTADOS DE BMP-2.......................................................................... 30 4.6. RESULTADOS TGF-ß................................................................................. 32 5. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 35 6. CONCLUSIONES ................................................................................................ 39 7. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................. 41 ANEXO .......................................................................................................................... 47 Anexo 1: Índice de ab e ia u as .............................................................................. 47 Ja ie López-Andaluz Mangas II T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” III ÍNDICE DE FIGURAS Figu a 1. Fac o es a o ecedo es eabso ción ................................................................. 2 Figu a 2. Fac o es des a o ables eabso ción .................................................................. 3 Figu a 3. Ciclo de emodelación ósea .............................................................................. 4 Figu a 4. Vía canónica de señalización de BMP-2 y TGF-ß ........................................... 5 Figu a 5. Acceso a la c es a de inse ción. Imagen in aope a o ia de la Os ec omía ci cula con esa e ina. ................................................................................................ 15 Figu a 6. Cie e del abo daje qui ú gico po planos ...................................................... 15 Figu a 7. Bioma e ial egene a i o ellenando el de ec o óseo. Aislamien o median e memb ana de colágeno. .................................................................................................. 16 Figu a 8. E aluación omog á ica de la mine alización pa a el GC del de ec o óseo mandibula con memb ana E olu ion (GC) .................................................................... 20 Figu a 9. E aluación omog á ica de la mine alización pa a el GIB del de ec o óseo mandibula con a mazón óseo expe imen al IB. ............................................................ 20 Figu a 10. E aluación omog á ica de la mine alización pa a el g upo de es udio del de ec o óseo mandibula (GPG), con a mazón óseo expe imen al PG 0,8 μg. .............. 21 Figu a 11. Imágenes eñidas con H&E pa a el g upo de con ol de de ec os óseos mandibula es de amaño c í ico con memb ana E olu ion (GC) a los es (GC3) y seis meses (GC6) ................................................................................................................... 23 Figu a 12. Imágenes eñidas con H&E y MT pa a el g upo de es udio de de ec os óseos mandibula es de amaño c í ico con IB a los es meses (GIB3) .................................... 24 Figu a 13. Imágenes eñidas con H&E y MT pa a el g upo de es udio de de ec os óseos mandibula es de amaño c í ico con IB a los seis meses (GIB6).................................... 24 Figu a 14. Imágenes eñidas con H&E y MT pa a el g upo de es udio de de ec os óseos mandibula es de amaño c í ico con PG (0,8 μg) a los es meses (GPG3).. .................. 25 Figu a 15. Imágenes eñidas con H&E y MT pa a el g upo de es udio de de ec os óseos mandibula es de amaño c í ico con PG (0,8 μg) a los seis meses (GPG6).................... 26 Ja ie López-Andaluz Mangas IV Figu a 16. Tinción inmunohis oquímica de ma cado es os eogénicos en el g upo con ol de de ec o óseo mandibula de a a con memb ana E olu ion. (GC) a los es (GC3) y seis meses (GC6) ................................................................................................................... 28 Figu a 17. Tinción inmunohis oquímica de ma cado es os eogénicos en el g upo de de ec o óseo mandibula de a a con Iso-Bone® (GIB) a los es (GIB3) y seis meses (GIB6).. ........................................................................................................................... 29 Figu a 18. Tinción inmunohis oquímica de ma cado es os eogénicos en el g upo de es udio de de ec os óseos mandibula es en a as con PG (0,8 μg) a los es (GPG3) y seis meses (GPG6). ................................................................................................................ 29 Figu a 19. Resul ados BMP-2........................................................................................ 31 Figu a 20. Resul ados TGF-ß ........................................................................................ 33 T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” V ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. P incipales ipos y ca ac e ís icas de Bioma e iales: Ce ámicas y cemen os .... 8 Tabla 2. P incipales ipos y ca ac e ís icas de Bioma e iales: Políme os ........................ 9 Tabla 3. Dis ibución de ma e iales en cada g upo ........................................................ 16 Tabla 4. E idencias adiológicas a los 3 y 6 meses ....................................................... 19 Tabla 5. E idencias his ológicas a los 3 y 6 meses........................................................ 22 Tabla 6. E idencias inmunohis oquímica a los 3 y 6 meses. ......................................... 27 Tabla 7. Resul ados de BMP-2 ...................................................................................... 31 Tabla 8. Resul ados de TGF-ß ....................................................................................... 33 Ja ie López-Andaluz Mangas Página 4 de 48 Figu a 3. Ciclo de emodelación ósea. (Imagen p opia) A: Ac i ación - B: Reabso ción - C: Re e sión - D: Fo mación - E: Te minación. Ac i ación: El os eoblas o, que inicialmen e se encuen a en eposo apizando la supe icie ósea, comienza a e ae se, a o eciendo la ac i ación os eoclás ica que se á el p ime paso pa a la c eación de la URO. La ac i ación se p oduce median e la in e acción OPG-RANKL-RANK y ac ua án sob e el espacio gene ado po los os eoblas os comenzando la eabso ción del hueso dañado. En es a ase de ac i ación p e alece la unión RANKL-RANK en e a la OPG. Reabso ción: Fa o ecido po la unión RANKL-RANK y la ac i ación del os eoclas o, se p oduce la eabso ción ósea. Re e sión: Finalizada la eabso ción, el os eoclas o su e apop osis y es eliminado po los mac ó agos. Fo mación: Los os eoblas os comienzan a deposi a se en la ca idad gene ada po los os eoclas os y comienzan a libe a sus ancia os eoide. Te minación: La sus ancia os eoide se á mine alizada po el depósi o de calcio y os o o, inalizando de es e modo la emodelación ósea. T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 5 de 48 1.2.2. HOMEOSTASIS ÓSEA 1.2.2.1. Vía BMP BMP son ac o es de c ecimien o, que pe enecen a la supe amilia de TGF-ß, implicados en la egulación de la emodelación ósea, pa icula men e en la co ec a egulación en e eabso ción y o mación ósea, en e o as unciones. (12) Las ías de señalización de BMP-2 y TGF-ß apa ecen ecogidas en la Figu a 4. Figu a 4. Vía canónica de señalización de BMP-2 y TGF-ß. (Imagen p opia). TGF-ß, a a és de su ía canónica, o ma el complejo Smad 2/3/4 que se asloca á al núcleo e in e iene en las células óseas, egulando su supe i encia y, po an o, la emodelación ósea. Po su pa e, Smad7 egula nega i amen e la señalización Smad al impedi la o mación del Complejo Smad 2/3/4, lle ándolo a la deg adación po medio del complejo ubiqui ina-p o eosoma. (13) . Po su pa e, BMP, o ma á el complejo Smad 1-5-8 que as la unión a Smad 4 se asloca á al núcleo y egula á la exp esión de genes, en el caso la p o eína BMP- 2, induc o es de la os eogénesis (Runx2 y Osx1). Todo es o puede se inhibido po Smad 6 y 7 y la ubiqui ina E3. (13–15) BMP-2, es uno de los componen es u ilizado en nues o es udio, ya que se ha demos ado que su inco po ación en bioma e iales puede induci la di e enciación os eogénica y la mejo a de o mación de hueso, a a és del eclu amien o de os eoblas os median e la di e enciación de MSC en os eoblas os a a és de ías de señalización que inalizan con la ac i ación de genes os eogénicos como Runx2 y Osx1. Además, mejo a la in eg ación Ja ie López-Andaluz Mangas Página 6 de 48 en e angiogénesis y os eogénesis, esencial pa a una adecuada emodelación ósea, al acili a la o mación de asos ipo H, que pe mi en una mayo in il ación de las células os eop ogeni o as. (16–18) La FDA ap obó el uso de hBMP-2 en odon ología pa a po encia la egene ación ósea. El p incipal incon enien e es que las BMP son p o eínas pleio ópicas, es deci , in luyen en a ias ías implicadas en la egene ación ósea po lo que, a dosis ele adas, pueden di undi a ejidos ce canos gene ando e ec os ad e sos, en e ellos, el más ecuen e es la o mación de hueso ec ópico. Po es o suele usa se en combinación con bioma e iales (como políme os) que pe mi an una libe ación sos enida de BMP-2. (19–21) 1.3. TRATAMIENTO DE LAS ALTERACIONES DE LA REMODELACIÓN ÓSEA 1.3.1. INJERTOS ÓSEOS An e la di icul ad de cu ación espon ánea del hueso en de e minadas si uaciones, se es án buscando al e na i as, basadas undamen almen e en inje os óseos na u ales o sin é icos (bioma e iales), pa a acele a la egene ación ósea. El au oinje o es la écnica de elección. Es á lib e de echazo au oinmune y a o ece la emodelación ósea g acias a sus p opiedades os eogénicas, os eoinduc i as y os eoconduc i as. Sin emba go, la limi ada disponibilidad ósea, así como las posibles como bilidades asociadas a su ex acción, hace que se ese e su u ilización pa a casos limi ados. (22–24) Como p incipal al e na i a es á el aloinje o, ob enido de un donan e i o o cadá e , gené icamen e dis in os pe o pe enecien es a la misma especie. Des aca la capacidad de ob ene mayo es can idades de ejido, sin emba go, no es án exen os de posibles inmuno eacciones y ansmisión de en e medades. La lio ilización, pa a a enua es os iesgos, disminuye su po encial os eoinduc i o y di icul an su os eoin eg ación. (22,25) Po úl imo, es án los xenoinje os, ob enidos a pa i de especies no humanas, gene almen e animales. Su ob ención es p ác icamen e ilimi ada, p omue e e icazmen e la cu ación de de ec os óseos, sin emba go, los p ocesos pa a disminui el echazo T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 7 de 48 suponen una disminución de la os eoinducción, haciendo que no haya alcanzado aún los ni eles de egene ación ósea que el au oinje o y el xenoinje o. (26) 1.3.2. BIOMATERIALES La ingenie ía de ejidos, basada en los bioma e iales, su ge pa a apo a una al e na i a biológica a la ecupe ación de las ac u as median e la c eación de un en o no ideal que es imule la egene ación y p oli e ación celula . (27) Pa a su aplicación, los bioma e iales deben cumpli : (22,27–29) - Os eoinducción, os eoconducción y os eoin eg ación: Es o implica se capaz de induci la di e enciación os eogénica, p opo cionando un ambien e adecuado pa a pe mi i el c ecimien o óseo, e i ando la o mación de ejido ib oso. - Biocompa ible y biodeg adable: Debe eje ce su unción sin gene a espues a inmune en el huésped y, además, una ez ha a o ecido la o mación de hueso nue o, debe descompone se. - Po oso y angiogénico: A mayo po osidad, mayo in il ación de células os eogénicas y de nue os asos sanguíneos. La angiogénesis es esencial pa a una buena os eoinducción, pe mi iendo el c ecimien o de MSC que pos e io men e se di e encia án en os eoblas os, además de a o ece el anspo e de nu ien es y oxígeno necesa io pa a el c ecimien o del hueso. Sin emba go, es complicado desa olla un bioma e ial que cumpla odas es as ca ac e ís icas. La incong uencia mecánica en e el hueso y el andamio puede gene a un es és que di icul e la pos e io eabso ción del bioma e ial, además, la inadecuada in e acción ambién puede es a a o ecida po una mala po osidad, que di icul a la comunicación celula y el c ecimien o del ejido, al di icul a la angiogénesis y la mig ación celula y de ac o es os eoinduc i os. (30) En unción del o igen del bioma e ial podemos dis ingui dos g upos: Na u ales, donde des acan los de i ados de o igen co alino que poseen un exoesquele o de ca bona o cálcico, po oso, con g an po encial os eoconduc o que a o ece el depósi o ápido de nue o hueso as su implan ación, y sin é icos, siendo los más ampliamen e u ilizados es os úl imos. (31) Ja ie López-Andaluz Mangas Página 8 de 48 Den o de los bioma e iales sin é icos, las p incipales ca ac e ís icas de las ce ámicas y cemen os apa ecen ecogidas en la siguien e abla (Tabla 1). (25,31–36) Tabla 1. P incipales ipos y ca ac e ís icas de Bioma e iales: Ce ámicas y cemen os Bioma e ial Ca ac e ís icas Tipos Ce ámicas Solas no ienen ac i idad os eogénica, pe o al en a en con ac o con el hueso, a o ecen la o mación de ósea. Podemos dis ingui dos ipos: - Bioac i as: Buena os eoconduc i idad, pe o su agilidad y baja esis encia a la ca ga son sus p incipales limi aciones. - Bioine es: Albumina y Zi conia. No ecomendables Ce ámica Bioac i a: - Hid oxiapa i a: Buena os eoconducción y os eoinducción, sin emba go, se suele usa asociada a o os bioma e iales po su educida capacidad de deg adación ( eabso ción) y baja esis encia a la ca ga. - Fos a o T icálcico: Reabso bible y po oso, acele ando la emodelación ósea, pe o es ágil, po lo que se suele asocia a o os bioma e iales. - Fos a o Bi ásico: Al se una mezcla de los dos an e io es, combina la os eoconduc i idad y os eoinducción de ambos con la biodeg adabilidad de Fos a o T icálcico. - Vid io Bioac i o: Hecha a base de silicio, su buena po osidad y ápida eabso ción, lo hacen un bioma e ial in e esan e pe o su pob e os eoconducción y os eoinducción limi an su u ilidad. - Vi oce ámica: Mejo a las p opiedades del id io bioac i o y además posee más esis encia. Cemen o Se ob ienen de mezcla os a o cálcico con una solución acuosa, pe mi iendo se inyec ados di ec amen e en la zona lesionada al adop a la o ma del de ec o. Cemen o de Fos a o Cálcico: Des aca su buena adap ación en la zona del de ec o, no dejando espacios en e hueso e implan e, además de posee buenas p opiedades os eogénicas y al a biocompa ibilidad. Sin emba go, su agilidad, iesgo de eacción in lama o ia y su escasa po osidad, que e asa su adhesión celula , hace que deban se u ilizados de mane a selec i a. Dos sub ipos: - Cemen os de apa i a - Cemen os de B ushi a T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 9 de 48 Los políme os, o o g upo de bioma e iales sin é icos, son muy u ilizados po su acilidad pa a se ab icados en o ma y amaño deseado. Sus p incipales ca ac e ís icas y ipos ienen ecogidos en la siguien e abla (Tabla 2). (34,37–45) Tabla 2. P incipales ipos y ca ac e ís icas de Bioma e iales: Políme os Bioma e ial O igen Ca ac e ís icas Tipos Políme os Na u al/ Sin é ico Baja inmunogenicidad y buena eabso bilidad y po osidad. Sin emba go, escasa adhesión celula y os eoconduc i idad Na u ales: Ampliamen e usados po se biodeg adables y biocompa ibles. - Colágeno: Muy u ilizado po se ácil de ob ene y su baja inmunogenicidad, pe o sus pob es p opiedades mecánicas hacen que se use en combinación con o os bioma e iales - Qui osano: Usado undamen almen e pa a cica ización de he idas g acias a la es imulación de ci ocinas y ac o es de c ecimien o - Algina o: Se suele usa combinado con o os políme os, pe o sob e odo con ce ámicas pa a aumen a sus p opiedades os eogénicas y esis encia - Seda: Usada de o ma aislada po sus bajas p opiedades os eogénicas, que aumen a án al combina la con o os bioma e iales. Sin é icos: Mayo longe idad y posibilidad de ab ica se en ca ac e ís icas especí icas: - Poli Ácido Lác ico: Baja oxicidad, buena biocompa ibilidad y biodeg adabilidad. Asociado a hid oxiapa i a da buenos esul ados. Su p incipal limi ación es su baja esis encia que limi a su uso en las zonas de ca ga. - Poli Ácido Glicólico: No suele usa se de o ma aislada po su baja esis encia y iesgo de. Respues a in lama o ia. - Poli Ácido Lác ico-Glicólico: Buena biodeg adabilidad, biocompa ibilidad y ca ac e ís icas os eogénicas. Su baja esis encia hace que se asocie a ce ámicas e Hid oxiapa i a. Ja ie López-Andaluz Mangas Página 10 de 48 T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 11 de 48 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipó esis La u ilización de un bioma e ial cons i uido po un a mazón de HA bo ina ecubie a de qui osano y ehalosa con hBMP-2 añadido, a o ece á e inc emen a á el p oceso de egene ación ósea, consiguiendo su es i ución, en un modelo expe imen al de lesión c í ica ósea en el que la capacidad de au o egene ación es incompe en e. Obje i os - Desa olla un modelo expe imen al de lesión c í ica ósea, en la a a, que dejado a su lib e e olución no enga capacidad de egene a se. - Valo a que los iempos de es udio, pos e io es a la lesión ósea, son adecuados - De e mina las a iables a es udia que jus i iquen el éxi o/ acaso de los a amien os y los posibles mecanismos de acción. Ja ie López-Andaluz Mangas Página 12 de 48 T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 13 de 48 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. MATERIALES 3.1.1. BIOMATERIALES EMPLEADOS Memb ana E olu ion® (Os eoBiol - Tecnoss, Tu in, I aly) Su po osidad y con enido en colágeno hacen de ella un bioma e ial álido pa a el anclaje y p oli e ación de os eoblas os y la egene ación ósea. Es una éplica na u al del hueso au ólogo, que conse a la misma es uc u a y se ca ac e iza po una ele ada os eoconduc i idad. Se eabso be g adualmen e y asegu a una acción de sopo e pa a la o mación ósea, con ibuyendo a p ese a la o ma y el olumen del inje o o iginal (p opiedad os eoconduc i a). Facili a la o mación del coágulo hemá ico y la consiguien e in asión de las células epa ado as y egene ado as, a o eciendo la comple a " es i u io ad in eg um" del dé ici óseo. Iso-bone® (No icum S.L) Cons i uido po g ánulos i egula es de bo des edondeados y mic oes uc u a, mac o y mic opo osa, compues o po mine al óseo pu i icado ob enido del hueso bo ino median e la eliminación de los componen es o gánicos, p ese ando la c is alinidad y la es uc u a po osa (mac o y mic o) del hueso na i o. Desde el pun o de is a químico se puede iden i ica como ca bona o-apa i a biológica, capaz de exhibi p opiedades bioac i as y os eoconduc o as, es deci , pe mi e y es imula el c ecimien o de hueso nue o en con ac o ín imo con su supe icie. Las especi icaciones de calidad ísica y química del p oduc o de e minan una composición de: calcio en e el 36-45% - ós o o 14-18% - a io mola calcio/ ós o o 2-1,5 – me ales pesados 0,1% máximo – ca bona o 2-10% - p o eínas esiduales 0,05% máximo – amaño de los c is ales 50 nm máximo. P o eo-G a ® (No icum S.L) Es á cons i uido po una base de Iso-Bone® combinado con Qui osano, T ehalosa y hBMP-2. El Qui osano es un polisacá ido na u al de o igen animal, que imi a a la ma iz ex acelula y p omue e la di e enciación de células mad e pa a acili a la adhesión, p oli e ación y di e enciación os eogénica. BMP son ac o es de c ecimien o que pe enecen a la supe amilia de TGF-ß, no odas las BMP son os eogénicas, BMP-2 y Ja ie López-Andaluz Mangas Página 20 de 48 Obse amos una mejo e olución y egene ación del de ec o en GPG (Figu a 10), donde se e mina p oduciendo una in eg ación del bioma e ial y cu ación del de ec o, espec o al GC (Figu a 8) y GIB (Figu a 9), donde no llega a obse a se en ningún momen o egene ación. Además, den o del mismo GPG, ap eciamos que en GPG3 (Figu a 10 E) el de ec o sigue siendo iden i icable, elleno po bioma e ial sin in eg ación comple a, mien as que en GPG6 (Figu a 10F) el bioma e ial es á comple amen e in eg ado y el de ec o apenas es ap eciable. Figu a 8. E aluación omog á ica de la mine alización pa a el GC del de ec o óseo mandibula con memb ana E olu ion (GC). Las imágenes mues an la mine alización pa a los GC po mic oCT a los es y seis meses as la ci ugía (GC3 y GC6). (A. De ec o c í ico en CG3. B. De ec o c í ico en GC6). Figu a 9. E aluación omog á ica de la mine alización pa a el GIB del de ec o óseo mandibula con a mazón óseo expe imen al IB. Las imágenes mues an la mine alización pa a los GIB po mic oCT, a los es y seis meses as la ci ugía (GIB3 y GIB6). (C. De ec o c í ico en GIB3. D. De ec o c í ico en GIB6). La imagen C y D mues an el de ec o óseo sin egene a y el bioma e ial dispe so en la zona lesionada sin in eg a se. A B C D T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 21 de 48 Figu a 10. E aluación omog á ica de la mine alización pa a el g upo de es udio del de ec o óseo mandibula (GPG), con a mazón óseo expe imen al PG 0,8 μg. Las imágenes p esen an la mine alización pa a los g upos de es udio po mic oCT, a los es y seis meses as la ci ugía (GPG3 y GPG6). (E. De ec o c í ico en GPG3. F. De ec o c í ico en GPG6). La imagen E mues a que el de ec o óseo es á cubie o en su o alidad po bioma e ial, ap eciándose como es e aún no es á comple amen e in eg ado, comenzando a egene a se los bo des de la lesión. Po su pa e, en la imagen F se obse a una mejo egene ación e in eg ación del bioma e ial, siendo di ícil di e encia en e el ejido óseo p óximo a la lesión y el ejido lesionado que con iene el bioma e ial. E F Ja ie López-Andaluz Mangas Página 22 de 48 4.3. RESULTADOS HISTOLÓGICOS Los esul ados ob enidos en la His ología se mues an en la Tabla 5. Tabla 5. E idencias his ológicas a los 3 y 6 meses 3 MESES 6 MESES G upo GC Ausencia de egene ación ósea. (Figu a 11 A) Ausencia de egene ación ósea. (Figu a 11 B) G upo GIB Al ededo de los de ec os óseos hay ejido conjun i o con ib oblas os, escaso colágeno y neo o maciones ascula es de di e sos amaños. (Figu a 12) Los de ec os c í icos es án delimi ados po mayo can idad de colágeno apa eciendo además lin oci os en emezclados y asos en es e caso meno can idad de asos. (Figu a 13) G upo GPG Se ap ecia g an can idad de g ánulos del bioma e ial dis ibuidos en los de ec os c í icos, comenzando a o ma se ejido óseo inmadu o en el de ec o c í ico y exis iendo una g an can idad de ejido conjun i o al ededo de los mismos, o mado po ib oblas os. (Figu a 14) El ejido conjun i o es á cons i uido po colágeno y se ap ecia mayo neo o mación ósea, ellenando el de ec o quedando poco espacio en e los g ánulos del bioma e ial. (Figu a 15) T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 23 de 48 Obse amos como en el GC (Figu a 11), no se ap ecia egene ación ósea, co obo ando los esul ados ob enidos en las p uebas adiológicas. En el GIB, a los 3 meses (Figu a 12) exis e una mayo can idad de ib oblas os, iniciado es de la egene ación, que se án sus i uidos a los 6 meses (Figu a 13) po ejido colágeno, que apo a á esis encia al hueso, exis iendo además en es e g upo una impo an e eacción in lama o ia con abundan es lin oci os. En el GPG, a los 3 meses (Figu a 14) el de ec o y el bioma e ial sigue siendo cla amen e ap eciable, aunque exis en signos de comienzo de egene ación ósea, mien as que a los 6 meses (Figu a 15) esul a di ícil di e encia el de ec o, el ejido óseo p e io y el ejido neo o mado, exis iendo así mismo una eabso ción casi o al del bioma e ial. Figu a 11. Imágenes eñidas con H&E pa a el g upo de con ol de de ec os óseos mandibula es de amaño c í ico con memb ana E olu ion (GC) a los es (GC3) y seis meses (GC6). A. Hema oxilina-eosina en GC3. B. Hema oxilina-eosina en GC6. Solo se inc us ó una le e o mación de hueso nue o en el ejido conec i o que se ex endía po el bo de del de ec o, como se e en la imagen B. Ja ie López-Andaluz Mangas Página 24 de 48 Figu a 12. Imágenes eñidas con H&E y MT pa a el g upo de es udio de de ec os óseos mandibula es de amaño c í ico con IB a los es meses (GIB3). Bioma e ial ∗; Tejido conjun i o eac i o (colágeno y ib oblas os) #. Tinción MT. Tejido conjun i o eac i o (colágeno y ib oblas os) #. Se obse an asos de di e en es calib es (ma ón). Figu a 13. Imágenes eñidas con H&E y MT pa a el g upo de es udio de de ec os óseos mandibula es de amaño c í ico con IB a los seis meses (GIB6). Bioma e ial ∗; Tejido conjun i o eac i o (colágeno y ib oblas os) #. Lin oci os que indican una eacción in lama o ia ( lechas ama illas). Tinción MT. P oli e ación más e iden e de ejido conjun i o eac i o (colágeno y ib oblas os) #. También se ap ecian lin oci os madu os ( lechas ama illas) en el ejido conjun i o. En la pa ed del de ec o además de obse a ejido colágeno y ib oblas os se obse a la exis encia de escasos asos neo o mados (que no es án en GIB3) T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 25 de 48 Figu a 14. Imágenes eñidas con H&E y MT pa a el g upo de es udio de de ec os óseos mandibula es de amaño c í ico con PG (0,8 μg) a los es meses (GPG3). Bioma e ial ∗; Tejido óseo neo o mado que ellena el de ec o y los espacios en e los g ánulos de bioma e ial (os eoci os y asos) +; Tejido conjun i o eac i o (colágeno y ib oblas os) #; Hueso (os eoblas os y asos) ˆ; Tinción MT. Tejido conjun i o eac i o (colágeno y ib oblas os) #; Ma iz ósea (os eoblas os y asos) ˆ; Hueso en e de oscu o. Tejido óseo inmadu o neo o mado en ojo ( lecha neg a); Tejido óseo neo o mado en con ac o con el bioma e ial ( lechas ojas). Ja ie López-Andaluz Mangas Página 26 de 48 Figu a 15. Imágenes eñidas con H&E y MT pa a el g upo de es udio de de ec os óseos mandibula es de amaño c í ico con PG (0,8 μg) a los seis meses (GPG6). Bioma e ial ∗; Tejido óseo neo o mado que ellena el de ec o y los pocos espacios en e los g ánulos de bioma e ial; bo de del de ec o ( lecha neg a). Tinción MT. Hueso en e de oscu o. Tejido óseo neo o mado inmadu o en ojo; Tejido óseo neo o mado en con ac o con la escasa can idad de bioma e ial T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 27 de 48 4.4. RESULTADOS INMUNOHISTOQUÍMICA Se ealizó inción inmunohis oquímica de mandíbulas descalci icadas pa a analiza los ma cado es os eogénicos Runx2 y OCN y ALP. Las inciones posi i as en los co es de ejido se iñe on de ma ón. Los esul ados ob enidos en la inmunohis oquímica se mues an en la Tabla 6. Tabla 6. E idencias inmunohis oquímica a los 3 y 6 meses. 3 MESES 6 MESES G upo GC Al no exis i o mación ósea, ausencia de inmuno eac i idad. (Figu a 16 A, B, C) Al no exis i o mación ósea, ausencia de inmuno eac i idad (Figu a 16 D, E, F) G upo GIB La exp esión de los ma cado es os eogénicos no es des acable al no exis i e iden e o mación ósea. (Figu a 17 A, B, C) La exp esión de los ma cado es os eogénicos no es des acable al no exis i e iden e o mación ósea. (Figu a 17 D, E, F) G upo GPG La ALP y RUNX2 se exp esan en el ci oplasma de los os eoblas os, mien as que OCN apa ece adhe ida a la HA del bioma e ial. (Figu a 18 A, B, C) Al es a el de ec o óseo cubie o po hueso nue o, la inmuno eac i idad de los bioma cado es se á nue amen e nega i a. (Figu a 18 D, E, F) Ja ie López-Andaluz Mangas Página 28 de 48 En las imágenes inmunohis oquímicas del g upo GC (Figu a 16) y el GIB (Figu a 17), al ca ece de o mación de ejido óseo, no exis e exp esión, ni a los 3 ni a los 6 meses, de ALP, OCN, y Runx2. No obs an e, los esul ados de inción pa a GPG3 (Figu a 18 A, B, C) son más al os que pa a GPG6 (Figu a 18 D, E, F), al exis i en es e úl imo ejido óseo neo o mado. Figu a 16. Tinción inmunohis oquímica de ma cado es os eogénicos en el g upo con ol de de ec o óseo mandibula de a a con memb ana E olu ion (GC) a los es (GC3) y seis meses (GC6). Los esul ados de inmunohis oquímica pa a la exp esión p o eica de os eogénesis en hueso a los es y seis meses, (A y D, ALP. B y E, OCN. C y F, RUNX2). No se de ec ó exp esión de ALP a los es meses A, ni a los seis meses D, ni de OCN y RUNX2 a los es meses, B y C, ni a los seis meses E y F. La ausencia de inmuno eac i idad pa a las p o eínas ALP, OCN y RUNX2 ue e iden e en los g upos con ol dada la ausencia de o mación de ejido óseo. T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 29 de 48 Figu a 17. Tinción inmunohis oquímica de ma cado es os eogénicos en el g upo de de ec o óseo mandibula de a a con Iso-Bone® (GIB) a los es (GIB3) y seis meses (GIB6). Los esul ados de inmunohis oquímica pa a la exp esión p o eica de os eogénesis en hueso a los es y seis meses, (A y D, ALP. B y E, OCN. C y F, RUNX2), no de ec a on exp esión a los es meses (A) de OCN, siendo un poco mayo a los seis meses (D) y p ác icamen e nula a los es meses, B y C, y seis meses E y F, de OCN y RUNX2, espec i amen e. Es a ausencia de inmuno eac i idad es debida a la ausencia de o mación de ejido óseo. Figu a 18. Tinción inmunohis oquímica de ma cado es os eogénicos en el g upo de es udio de de ec os óseos mandibula es en a as con PG (0,8 μg) a los es (GPG3) y seis meses (GPG6). Los esul ados de inmunohis oquímica pa a la exp esión p o eica de os eogénesis en hueso a los es meses: A, Exp esión de ALP localizada en el ci oplasma de los os eoblas os, B, OCN adhe ida a la hid oxiapa i a del bioma e ial y C, RUNX2 en el ci oplasma de los p eos eoblas os. A los seis meses: D, Sin exp esión de ec able de ALP, ni de OCN, E y RUNX2, F. Po el con a io, la ausencia de inmuno eac i idad pa a las p o eínas ALP, OCN y RUNX2 a los seis meses puede debe se a que los de ec os es aban cubie os po hueso nue o. AB C D E F Ja ie López-Andaluz Mangas Página 36 de 48 Además de su pode es abilizado , Xingguan Xu e al (50), in o man de su capacidad an iin lama o ia, sup imiendo la libe ación ci ocinas p oin lama o ias como IL-6, al mejo a la pola ización de los mac ó agos a M2, que mejo aba la o mación ósea. Los esul ados po mic o-CT nos han pe mi ido alo a como en el GPG (Figu a 10 E, F, página 21) se a desin eg ando de mane a p og esi a el bioma e ial, siendo acompañado es o de la o mación de nue o ejido óseo, y como en el GC (Figu a 8 A, B página 20) y GIB (Figu a 9, C, D página 20) no se obse a egene ación ósea. La egene ación del de ec o es á ín imamen e elacionada, además de po la u ilización o no de bioma e iales en la zona lesionada, po el iempo que pe manece es e en la lesión, así, a más iempo implan ado, mejo egene ación. Es o es demos ado po Celine S uz e al (51), que u iliza on iempos de e olución simila es a los nues os, 90,120,150 días, alo ando median e mic o-CT la egene ación ósea y obse ando que a más iempo de implan ación del bioma e ial, mejo egene ación. Su bioma e ial es aba cons i uido po una memb ana de PCL sob e la cual añadie on BMP-2 y MSC, ob eniendo mejo es esul ados en el g upo a ado con es e a mazón. Pa a e alua la deg adación del bioma e ial y la neo o mación ósea de mane a más exac a, ealizamos el es udio mic oscópico median e análisis his ológico. Obse amos en nues o es udio como el GPG mues a e iden es signos de egene ación ósea. En GPG3 (Figu a 14, página 25) exis e una mayo can idad de ejido conjun i o a expensas de ib oblas os, iniciado es de la egene ación, mien as que en GPG6 (Figu a 15, página 26) hay dos zonas di e enciadas, sepa adas po el de ec o óseo, y g an can idad de ejido conjun i o con colágeno. En GC (Figu a 11, página 23) y GIB no se ap ecian signos de egene ación ósea, ap eciándose en GIB6 (Figu a 13, página 24) una impo an e eacción in lama o ia con abundan es lin oci os. Tian Ding e al (52) alo a on la egene ación ósea u ilizando un bioma e ial que incluía en el g upo es udio BMP-2 y FGF cubie os po dos políme os, PLGA y PLLA, que poseen buenas p opiedades os eogénicas. Sin emba go, como p incipal limi ación en es e es udio, encon amos su du ación, ya que alo an los esul ados en 1 y 2 semanas, lo cual en base a nues a e idencia nos esul a di ícil de jus i ica , pues o que noso os a los 3 meses es cuando comenzamos a obse a signos de egene ación. T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 37 de 48 Los ma cado es os eoblás icos u ilizados ue on Runx2, ALP y OCN. Runx2 es un ac o de ansc ipción cla e en la di e enciación de os eoblas os, al egula genes os eogénicos, ALP desempeña un papel impo an e en la mine alización ósea y es el ma cado bioquímico, de exp esión emp ana, más elacionado con la ac i idad de los os eoblas os. OCN es una p o eína ijado a de calcio que se deposi a en la ma iz ósea e in o ma sob e la mine alización ósea. (53–55) La inmunohis oquimica se á posi i a, es deci , se eñi á de ma ón, cuando exis a o mación ósea. En el GC (Figu a 16, página 28) y en el GIB (Figu a 17, página 29), al no exis i una egene ación ósea e iden e, no hay exp esión de los ma cado es os eoblás icos. En GPG3 (Figu a 18 A, B, C, página 29) al es a p oduciéndose la o mación de hueso, si hay un inc emen o de los ma cado es os eoblás icos, mien as que en GPG6 (Figu a 18 D, E, F, página 29) al habe se p oducido ya la o mación de hueso, la inmuno eac i idad es meno . Hongwei Xu e al (56) elabo a on un andamio pa a alo a la egene ación ósea con mine ales, qui osano y polie ilenglicol, sob e el que añadie on BMP-2. Gene a on un de ec o cal a ial y alo a on los esul ados a las 4 y 8 semanas, ob eniendo mejo es esul ados en el g upo que inco po aba es e a mazón, con una mayo exp esión de los ma cado es os eogénicos. BMP-2 a o ece la os eogénesis, al indica la di e enciación de os eoblas os y ac i a Runx2, ac o de ansc ipción que a o ece de la di e enciación de os eoblas os. Sin emba go, al se una p o eína pleio ópica y ac i a di e sas ías implicadas en la egene ación ósea, es impo an e el con ol de su concen ación. Así Jim Min Seok e al (57), pa a consegui una libe ación sos enida de BMP-2 y e i a los e ec os ad e sos de i ados de su ápida libe ación, c ea on un andamio compues o de mic opa iculas biac i as. Median e análisis in i o demos a on que BMP-2 con su a mazón seguía libe ándose du an e >4 semanas, sin emba go, no alo a on sus esul ados in i o. Si alo a on in i o Rui Ma e al (58) la egene ación ósea al combina un bioma e ial de PLGA/ MBG con nanopa ículas de ZIF-8 ca gado odo con BMP-2. Obse a on que es e andamio, además de a o ece una libe ación len a y con inuada de BMP-2, mejo aba la di e enciación de los os eoblas os y la o mación y epa ación de hueso. Ob u ie on sus Ja ie López-Andaluz Mangas Página 38 de 48 esul ados a las 12 semanas, en e a nues o es udio donde nues os esul ados los alo amos a los 3 y 6 meses. Obse amos como (Figu a 19 y Tabla 7, página 31) la lesión ósea es imula la libe ación de BMP-2, mani es ado po la mayo p oducción de BMP-2 en GC y GIB espec o a GS, no obs an e, la p oducción en GC y GIB espec o a GPG es meno , ya que el bioma e ial lle a añadido BMP-2, excep o en GIB3 cuya libe ación de BMP-2 es mayo que en GPG6. Den o de la supe amilia TFG-ß, TGF-ß1 es la iso o ma más abundan e e implicada en la egene ación ósea. Al igual que sucedía con BMP-2, es undamen al el con ol de su concen ación y libe ación pa a e i a e ec os ad e sos. Así, Yongxin Tan e al (59) ealiza on un es udio in i o, con un a mazón de AL/ AH/ Col donde inco po a on TGF- ß1 y BMP-2, odo ecubie o de una mic oes e a de qui osano, pa a alo a su oxicidad y su posible uso en es udios in i o de egene ación ósea. En nues o es udio (Figu a 20 y Tabla 8, página 32), obse amos que en los GC y GIB la p oducción de TFG-ß es meno espec o a GPG, donde en es e, además, la p oducción es mayo en GPG3 espec o a GPG6, lo cual pod ía es a debido a que nues o a mazón con iene BMP-2 y a que su libe ación es mayo en las ases iniciales de la emodelación ósea, en pa e po que es cuando BMP-2 eje ce su mayo e ec o. T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 39 de 48 6. CONCLUSIONES 1. La lesión ósea gene ada cumple los c i e ios de lesión c í ica y, sin in e ención, el o ganismo no es capaz de au o egene a la. 2. Los iempos de e olución y las a iables que han sido es udiadas en nues o modelo expe imen al, han sido adecuadas. 3. El a amien o de la lesión, con bioma e ial compues o con ca bona o-apa i a, no iene capacidad de egene ación del de ec o óseo. 4. El bioma e ial P o eo-G a  (No icum S.L) cons i uido po Iso-Bone y combinado con Qui osano, T ehalosa y hBMP-2, ha conseguido una mejo egene ación ósea, consiguiendo la es i ución del de ec o óseo plan eado en el modelo expe imen al. Ja ie López-Andaluz Mangas Página 40 de 48 T abajo Fin de G ado “Bioma e ial combinado con hBMP-2: Valo ación de la egene ación ósea” Página 41 de 48 7. BIBLIOGRAFIA 1. Ho-Shui-Ling A, Bolande J, Rus om LE, Johnson AW, Luy en FP, Pica C. Bone egene a ion s a egies: enginee ed sca olds, bioac i e molecules and s em cells Cu en s age and u u e pe spec i es. Bioma e ials. 2018; 180:143–62. 2. Kanis JA, No on N, Ha ey NC, Jacobson T, Johansson H, Lo en zon M, e al. SCOPE 2021: a new sco eca d o os eopo osis in Eu ope. A ch Os eopo os. 2021;16(1). 3. Lin X, Pa il S, Gao YG, Qian A. The Bone Ex acellula Ma ix in Bone Fo ma ion and Regene a ion. F on Pha macol. 2020;11. 4. Eche e ia-Molina MI, Malolla i KG, Kom opoulos K. 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