Extracción de compuestos fenólicos de orujos de uva tinta y actividad antibacteriana de los extractos

TRABAJO FIN DE ESTUDIOS Título Extracción de compuestos fenólicos de orujos de uva tinta y actividad antibacteriana de los extractos Autor/es SILVIA AYUSO CAMARGO Director/es MARÍA FERNANDA RUIZ LARREA y MARÍA DEL ROCÍO FERNÁNDEZ PÉREZ Facultad Facultad de Ciencia y Tecnología Titulación Grado en Enología Departamento AGRICULTURA Y ALIMENTACIÓN Curso académico 2020-21 © El autor, 2021 © Universidad de La Rioja, 2021 publicaciones.unirioja.es E-mail: [email protected] Extracción de compuestos fenólicos de orujos de uva tinta y actividad antibacteriana de los extractos, de SILVIA AYUSO CAMARGO (publicada por la Universidad de La Rioja) se difunde bajo una Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported. Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los titulares del copyright. Título Extracción de compuestos fenólicos de orujos de uva tinta y actividad antibacteriana de los extractos Autora Silvia Ayuso Camargo Tutoras Fernanda Ruiz Larrea y María del Rocío Fernández Pérez Facultad Facultad de Ciencia y Tecnología Titulación Grado en Enología Departamento Agricultura y Alimentación Curso Académico 2020-2021 Extracción de compuestos fenólicos de orujos de uva tinta y actividad antibacteriana de los extractos, trabajo fin de grado de Silvia Ayuso Camargo, dirigido por Fernanda Ruiz Larrea y María del Rocío Fernández Pérez (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported. Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los titulares del copyright. © El autor © Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2018 publicaciones.unirioja.es E-mail: [email protected] Extracción de compuestos fenólicos de orujos de uva tinta y actividad antibacteriana de los extractos Extraction of phenolic compounds from red grape pomaces and antibacterial activity of the extracts Facultad de Ciencia y Tecnología TRABAJO FIN DE GRADO Grado en Enología Realizado por: Silvia Ayuso Camargo Tutelado por: Dra. María Fernanda Ruiz Larrea Dra. María del Rocío Fernández Pérez Logroño, julio de 2021 TRABAJO FIN DE GRADO CURSO 2020/21 GRADO EN ENOLOGÍA Índice Resumen ........................................................................................................................................ 1 Palabras clave ............................................................................................................................ 1 Abstract ......................................................................................................................................... 2 Key Words ................................................................................................................................. 2 1. Introducción .......................................................................................................................... 3 1. Estructura de la baya ......................................................................................................... 3 2. Clasificación de los compuestos fenólicos ........................................................................ 5 3. Enzimas en enología .......................................................................................................... 6 3.1. Enzimas pectolíticas .................................................................................................. 7 3.2. Utilización de enzimas comerciales en Enología ....................................................... 7 4. Variedades de V. vinífera .................................................................................................. 8 4.1. Tempranillo ............................................................................................................... 8 4.2. Merlot ........................................................................................................................ 9 5. Bacterias y antimicrobianos .............................................................................................. 9 Objetivos ..................................................................................................................................... 11 2. Materiales y métodos ......................................................................................................... 12 1. Obtención de los Orujos .................................................................................................. 12 2. Procesado de las muestras .............................................................................................. 12 2.1. Optimización del protocolo ..................................................................................... 12 2.2. Protocolo optimizado y maceración de los orujos con diferentes enzimas pectolíticas .......................................................................................................................... 14 3. Análisis Fisicoquímicos de los extractos .......................................................................... 15 3.1. Análisis del extracto ................................................................................................ 15 3.2. Análisis del residuo seco ......................................................................................... 15 4. Análisis de la actividad antimicrobiana de los extractos ................................................. 15 5. Análisis Estadístico .......................................................................................................... 18 3. Resultados ........................................................................................................................... 19 1. Procesado de las muestras .............................................................................................. 19 1.1. Dosis de enzima pectolítica comercial .................................................................... 19 1.2. Tiempo de sonicación .............................................................................................. 21 1.3. Efecto de una segunda y tercera extracción ........................................................... 24 2. Estudio comparativo de tres enzimas pectolíticas comerciales para la maceración de los orujos estudiados .................................................................................................................... 26 2.1. Tempranillo Ribera del Duero ................................................................................. 27 2.2. Merlot ...................................................................................................................... 28 2.3. Tempranillo de Rioja ............................................................................................... 31 3. Comparación estadística de los valores obtenidos para los extractos de los orujos de cada una de las variedades ..................................................................................................... 33 3.1. Índice de Color ........................................................................................................ 33 3.2. Índice de Tonalidad ................................................................................................. 34 4. Estudio del efecto microbiológico ................................................................................... 36 Conclusiones ............................................................................................................................... 39 Referencias .................................................................................................................................. 40 Anexo .......................................................................................................................................... 42 Anexo I: Fichas enzimas utilizadas para los ensayos ............................................................... 42 Anexo II: Resultados inhibición bacteriana ............................................................................. 45 Índice de Tablas Tabla 2.1: Tratamiento de muestras del ensayo sobre el tiempo de sonicación........................ 13 Tabla 2.2: Tubos resultantes del ensayo del efecto de una segunda y una tercera extracción . 14 Tabla 2.3: Esquema de la placa microtiter utilizada en el ensayo del efecto antimicrobiano de los extractos de tempranillo y merlot… ...................................................................................... 17 Tabla 3.1: Porcentaje en peso seco de material extraído con diferentes enzimas y variedades ..................................................................................................................................................... 26 3 1. Introducción 1. Estructura de la baya La baya tiene varias partes diferenciadas (Figura 1.1.) que son: el pedicelo, pincel, la pulpa, las pepitas o semillas y el hollejo que es una fina capa de células que recubre la pulpa y en la que se encuentran numerosos compuestos relacionados con el color, sabor y aroma del futuro vino. Dentro del hollejo, donde se encuentran la mayoría de estos compuestos es en la hipodermis, concretamente en disolución dentro de las vacuolas de las células de esta junto con azúcares, ácidos y sales. (Agostini, 2018) Figura 1.1: Estructura de la baya y sus partes. Tomado de (LasantaMelero, 2009) A su vez, el hollejo está formado por tres capas concéntricas: cutícula, epidermis e hipodermis (Figura 1.2). Por un lado, la cutícula está formada por células aplastadas con una pared celular muy gruesa y con un espesor total de entre 1,5 y 4 micras. La epidermis se sitúa justo debajo de está formando dos capas de células alargadas en posición transversal. Por último se encuentra la hipodermis, que está formada por varias capas de células de mayor tamaño y que forman una transición no demasiado definida con la pulpa (LasantaMelero, 2009). Figura 1.2: Estructura de la baya y sus partes. Tomado de (LasantaMelero, 2009) 4 Una vez estudiada la estructura de la baya y del hollejo, es importante conocer la estructura de las paredes celulares de las células del hollejo, ya que serán determinantes en la extracción de los compuestos fenólicos de interés que se encuentran dentro del contenido celular y para lo que será necesario romper las paredes celulares. La pared celular está formada fundamentalmente por polisacáridos complejos como pectinas, hemicelulosa y celulosa y con la función de dar rigidez y proteger las células. Dentro de la pared se pueden distinguir tres capas (Figura 1.3). La capa más externa es la lámina media, que se comparte con otras células. Es una capa formada fundamentalmente por pectinas (polímeros de ácido galacturónico metilados) junto con ramnosa, arabinosa, galactanos y arabino galactanos. A continuación de la lámina media, se encuentra la pared primaria, que forma una matriz de pectinas, celulosa, hemicelulosa y proteínas. Además puede contener otros compuestos como lignina, cutina, suberina o compuestos fenólicos. Por último se encuentra la pared secundaria que puede o no estar presente y está compuesta por la acumulación de celulosa, xilano y lignina de la pared primaria. (LasantaMelero, 2009) Figura 1.3: Estructura de la baya y sus partes. Tomado de (LasantaMelero, 2009) El grado de maduración de la uva será determinante tanto para la cantidad de compuestos fenólicos presentes en la uva que se sintetizan a lo largo de la maduración; como para la extractabilidad de estos, ya que durante la maduración del fruto se ablanda el hollejo. Esto último se da por la degradación de los polisacáridos de la lámina media y pared celular por las enzimas presentes en la propia uva, de forma que la pared se vuelve más plástica y pierde adhesión (Ishimaru & Kobayashi, 2002). Respecto a los compuestos fenólicos durante la maduración su producción es distinta en función del compuesto del que se trate, de forma que los antocianos se acumularán fundamentalmente a partir del envero dependiendo su concentración final de diversos factores climáticos como temperatura, diferencia de temperatura día y noche, radiación solar, etc (Jordao et al., 1998). Por otro lado, los taninos siguen una evolución distinta dependiendo de su localización, en el hollejo siguen una acumulación similar a los antocianos de los hollejos, aunque su máximo no coincide con éste (Hidalgo Togores, 2004); y los taninos de las pepitas, se producirán en gran cantidad antes del envero para luego disminuir hasta la madurez fisiológica de la uva (Kennedy et al., 2000). 5 2. Clasificación de los compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos son componentes del vino a los que se les presta una especial atención debido a su relevancia en el color y sabor, y sus interacciones con otros caracteres organolépticos, como puede ser la astringencia; por tanto los compuestos fenólicos desempeñan un papel muy importante en la calidad de los vinos. (Ribéreau-Gayon, 1980) A nivel químico, los compuestos fenólicos se caracterizan por la presencia de uno o varios grupos fenólicos en su estructura. En cuanto a la clasificación de los compuestos fenólicos la mayoría de los autores los clasifican en dos grupos principales, flavonoides y no flavonoides (Flanzy & Abbal, 2000a). Dentro del grupo de los compuestos no flavonoides se encuentran los ácidos fenólicos, ácidos benzoicos y ácidos cinámicos, además de otros derivados fenólicos como los estilbenos. Por un lado, los ácidos fenólicos son principalmente los ácidos hidroxicinámicos que se encuentran en las vacuolas de las células tanto de la pulpa como del hollejo formando ésteres con el ácido tartárico, siendo el ácido gálico el más relevante a nivel enológico. Por su parte, dentro de los estilbenos se encuentra el resveratrol, compuesto muy estudiado por sus efectos beneficiosos sobre la salud humana (Benbouguerra et al., 2021) Por otro lado, los compuestos flavonoides tienen una estructura base formada por un esqueleto de 15 carbonos en forma de 2-fenil benzopirona (Figura 1.4). A partir de esta estructura se desarrollan una gran variedad de compuestos que se agrupan en antocianos, 3flavanoles (flavanos-3-ol), dihidroxiflavonoles, flavonoles, flavanonoles y flavonas. Figura 1.4: Estructura base de los compuestos fenólicos flavonoides (2-fenil benzopirona). Tomado de (Flanzy & Abbal, 2000a) El grupo más importante a nivel enológico por su papel en el color del vino son los antocianos. Estos compuestos, se encuentran generalmente en el hollejo, en las 3 o 4 capas celulares de la hipodermis, aunque en las variedades tintoreras como Alicante Bouchet o Gamay también se encuentran en la pulpa. De forma general, la estructura química de los antocianos es en forma de un glicósido derivado de la estructura base de los flavonoides y cuyas formas agliconas se denominas antocianidinas o antocianidoles (Figura 1.5). En el género Vitis, las antocianidinas presentes son cianidol, el peonidol, petunidiol, delfinidol y malvidol, pero tanto su contenido (de 500 mg/kg a 3000 mg/kg) como la composición varía entre las distintas variedades (Flanzy & Abbal, 2000a). 6 Figura 1.5: Estructura básica de una antocianidina o antocianidol . Tomado de (Flanzy & Abbal, 2000a) Otro grupo también importante son los 3-flavanoles que se pueden encontrar en tanto en forma de monómeros (Figura 1.6) como de dímeros y pequeños polímeros constituyendo los taninos catequínicos. Los principales 3-flavanoles monómero son la catequina y su isómero la epicatequina. Estos monómeros formarán largos polímeros que son los denominados taninos de las pepitas. En cuanto a su localización dentro de la baya, estos se encuentran principalmente en las capas superiores de las semillas y en los hollejos de algunas variedades. En general, el contenido en flavanoles es mayor en las pepitas que en los hollejos (tanto en su forma monomérica como polimérica) aunque en algunas variedades no se cumple, por lo que la composición y el grado de polimerización varían en función de la variedad y de las condiciones agronómicas. Figura 1.6: Estructura de los flavanoles monómeros. Tomado de (Flanzy & Abbal, 2000a) 3. Enzimas en enología Las enzimas son proteínas que funcionan como catalizadores biológicos de reacciones bioquímicas y son específicas para un sustrato concreto, para un determinado tipo de reacción y a una temperatura determinada. La localización de los compuestos fenólicos en las células del hollejo de la baya y la dificultad que presentan a veces para su extracción en ciertas condiciones, como pueden ser las maceraciones prefermentativas en frío, han hecho que las casas comerciales hayan apostado por el desarrollo de preparados enzimáticos de diferente composición que ayuden a liberar estos compuestos a través de la ruptura de la pared celular de los hollejos. Por tanto, las enzimas principales utilizadas en enología son las glicohidrolasas, que se clasifican en función del sustrato sobre el que actúan (Flanzy & Abbal, 2000b) 7 3.1. Enzimas pectolíticas Las pectinasas es un grupo amplio de enzimas que actúan sobre las cadenas pectínicas de la pared celular rompiendo los enlaces glicosídicos de las cadenas de las pectinas. Suelen ser las enzimas mayoritarias dentro de los preparados enzimáticos comerciales, pero se pueden encontrar otras actividades secundarias como las pectinmetilesterasas, celulasas, hemicelulasas y por último las galactanasas que actúan sobre distintos sustratos como galactanos y arabinogalactanos. Estás actividades enzimáticas se resumen en la siguiente figura (Figura 1.7). Uno de los problemas que presentan las pectinmetilesterasas es el aumento de las concentraciones de metanol que liberan estas actividades enzimáticas y que por lo tanto siempre se evita su presencia en la formulación de los preparados enzimáticos (Ugliano, 2009) Figura 1.7: Mecanismos de acción de diferentes enzimas Pectolíticas. Tomado de (Frédéric Charrier et al., 2014) 3.2. Utilización de enzimas comerciales en Enología Durante el proceso de elaboración del vino tinto, el objetivo de la maceración de las partes sólidas de la uva en el mosto es la extracción de los polifenoles y los compuestos aromáticos varietales de las uvas que se lleva a cabo por las actividades enzimáticas que se liberan al romper las células de las bayas, por la acción del SO2 y del etanol que se va generando durante la fermentación además de otras actividades enzimáticas que presenten las levaduras. A todo ello hay que sumar las acciones mecánicas de remontados y bazuqueos que realiza el enólogo (González San José, 2005). Sin embargo, para degradar de una manera más eficiente las paredes celulares y extraer los compuestos fenólicos y aromáticos, el enólogo puede adicionar al mosto enzimas exógenas comerciales. Además, con esta estrategia de adición enzimas se OH 8 aumenta el rendimiento en la obtención del mosto en el estrujado de la uva y se facilita la posterior clarificación del vino. Para la obtención de enzimas a escala industrial se utilizan hongos filamentosos de los géneros Trichoderma y Aspergillus (autorizados por la EFSAAutoridad Europea de Seguridad Alimentaria) a través de una fermentación y posterior purificación y formulación de las enzimas (Frédéric Charrier et al., 2014). El hongo excreta estas enzimas al medio de cultivo durante su crecimiento en biorreactores durante la producción industrial de las enzimas. Se recoge el sobrenadante libre de células y con este sobrenadante se prepararán los productos secos activos, liofilizados o deshidratados (Agostini, 2018). 4. Variedades de V. vinífera Las variedades utilizadas en este trabajo fueron V. vinífera cv. Merlot y V. vinífera cv. Tempranillo. 4.1. Tempranillo La variedad Tempranillo es originaria de España pero actualmente se cultiva en muchos otros países como Francia, Portugal e Italia y también algunos países del Nuevo Mundo como Argentina, Australia, Chile o Estados Unidos, siendo la tercera variedad de vinificación más plantada en el mundo con 231.000 hectáreas (OIV, 2017). Se conocen numerosas sinonimias como de Ull de Llebre, Tinto Fino, Tinta del País (sinonimia muy extendida en Ribera del Duero), Tinta de Toro, Cencibel, Tinta Roriz entre otras (OIV, 2013). Dentro de España, es la variedad tinta mayoritaria suponiendo el 21% de la superficie total de viñedo en 2019 (Escaramilla, 2020) y está autorizada en una parte importante de las Denominaciones de Origen (56 de las 72 existentes), como la D.O. Ribera del Duero o la D.O.Ca. Rioja. Se ha demostrado que su origen está situado en España y se han reconocido como parentales de esta variedad, la variedad Albillo Mayor y la variedad Benedicto. Por su parte la Albillo Mayor (conocida como Turruntés en la D.O.Ca Rioja), es una variedad blanca que se cultiva principalmente en el centro peninsular y ha sido autorizada recientemente para la elaboración de los vinos blancos de la D.O. Ribera del Duero como única variedad blanca. Por otra parte la variedad Benedicto está casi desaparecida y solo se conserva mínimamente en Aragón. También se apunta a que el origen de la variedad tempranillo se dio probablemente en el último milenio en el valle del Ebro (Ibáñez et al., 2012) En cuanto a sus características ampelográficas, es una variedad con bayas de tamaño de medio a grande, con un hollejo grueso, una pulpa sin colorear y los racimos son grandes con los hombros marcados y compactos. Es una variedad que se caracteriza por tener un vigor elevado y un porte erguido además de ser de ciclo corto (brotación media y maduración temprana), por lo que se puede adaptar bien a zonas climáticas Winkler I y II (Viveros Barber, 2007). Es una variedad relativamente productiva y muy vigorosa que a veces puede crecer demasiado. No está adaptada a sequias extremas y además necesita una zona relativamente fresca. En zonas calidad tiene problema por su escasa acidez debido a que absorbe mucho potasio del suelo y por tanto aumenta el pH dentro de la baya (Martínez de Toda, 2019) 9 Por otro lado, en cuanto a su resistencia a ciertas plagas y enfermedades del viñedo, es especialmente sensible a las enfermedades de la madera y al Oídio, y sensible a Mildiu, polilla del racimo y acariosis. Debido a su brotación no muy temprana no se ve demasiado afectada por las heladas primaverales (Viveros Barber, 2007). Finalmente, el potencial enológico de esta variedad es bueno, obteniéndose un color rubí intenso bastante estable en producciones limitadas y que generalmente tienen una buena aptitud para el envejecimiento. Por otro lado como se ha dicho anteriormente, esta variedad se caracteriza por una acidez bastante baja por lo que será corregida en el mosto durante la elaboración. 4.2. Merlot La variedad Merlot por su parte es originaria de Francia, más concretamente de la zona de Burdeos, y es la variedad tinta mayoritaria del país. Debido a la popularidad de estos vinos, se ha extendido a numerosos países como España, Italia, Estados Unidos o Chile y está presente en 37 países. Es la segunda variedad de vinificación cultivada en el mundo con unas 266.000 hectáreas (3% de la superficie mundial) (OIV, 2017). Algunas sinonimias de esta variedad son Bigney Rouge (Rumania), Merlo Noir (Marruecos), Vitraille o Plant Medoc (BosniaHerzegovina) (OIV, 2013). Es una variedad de brotación y floración temprana con un ciclo de maduración medio y que tiende a la sobremaduración en zonas cálidas por lo que se adaptará bien en zonas climáticas Winkler I,II y III. Tiene bayas pequeñas con un hollejo medianamente espeso, lo que propicia la obtención de mostos con una intensidad colorante elevada, además de racimos de tamaño medio y cilíndricos. Es sensible a Mildiu, Botrytis y a la sequía pero presenta algo de resistencia a Oidio. De esta variedad se pueden obtener vinos estructurados y con un color muy profundo que se podrán ensamblar con vinos más tánicos y para dar cierto equilibrio. (Martínez de Toda, 2019) 5. Bacterias y antimicrobianos En este trabajo se ha estudiado la especie bacteriana Escherichia coli, la cual es una especie Gram-negativa que se puede encontrar en el intestino de humanos y otros animales, por lo que la presencia de esta bacteria será un indicador de contaminación fecal. (Briñas et al., 2002). Por otro lado, el hecho de que esté en gran variedad de huéspedes y su importancia médica hace que se utilice como indicador diseminación de resistencias genéticas a antibióticos en las poblaciones bacterianas. El uso y abuso de los antibióticos en las últimas décadas ha provocado que las bacterias hayan desarrollado mecanismos de resistencia y que se vayan diseminando estos mecanismos entre las poblaciones bacterianas, de tal modo que actualmente la resistencia bacteriana a los antibióticos se está convirtiendo en una preocupación para la salud pública (Fernández-Pérez et al., 2018). Los compuestos fenólicos son sintetizadas por la vid como defensa natural de la planta frente a la radiación solar, a condiciones de estrés y a enemigos naturales de la vid como pueden ser insectos y patógenos microbianos. Existen trabajos que indican efectos antimicrobianos de ciertos compuestos fenólicos frente a bacterias patógenas (Álvarez-Martínez et al., 2018). Por otro lado, estos compuestos fenólicos tienen una fuerte actividad antioxidante y también pueden tener otros efectos positivos para la salud humana como pueden ser su efecto 10 antiinflamatorio y potenciales efectos protectores del sistema cardiocirculatorio (Trikas et al., 2016). Posiblemente el efecto más estudiado haya sido el efecto cardioprotector de ciertos compuestos fenólicos como el resveratrol, del que se ha observado un efecto positivo sobre la presión arterial y la acumulación de grasas. Sin embargo las concentraciones presentes en la uva son insuficientes, lo que obliga a su extracción y concentración para que pudieran ser utilizados para este fin (Weaver et al., 2021). 11 Objetivos Los objetivos planteados en este TFG son los siguientes: 1) Partiendo de orujos obtenidos tras la elaboración tradicional de vinos tintos de las variedades Tempranillo y Merlot, optimizar la extracción del color y compuestos fenólicos totales de dichos orujos. 2) Comparar el efecto de tres preparados pectolíticos comerciales sobre los orujos objeto de este estudio, en la extracción del color y compuestos fenólicos totales de dichos orujos. 3) Estudiar el efecto antimicrobiano de los extractos obtenidos frente a la bacteria intestinal Escherichia coli C7577 multirresistente a diversas familias de antibióticos. 12 2. Materiales y métodos 1. Obtención de los Orujos Los orujos fueron obtenidos en las vinificaciones de uva tinta de la variedad Tempranillo de la D.O.Ca. Rioja (vendimia del 2019), de uva tinta de la variedad Merlot de la D.O. Ribera del Duero (vendimia 2013) y de la variedad Tempranillo de la D.O. Ribera del Duero (vendimia 2020). La vinificación se realizó siguiendo el método tradicional de despalillado y estrujado de la uva. Finalizada la fermentación alcohólica tras el descubado y sangrado de la parte liquida del depósito, se recogían los orujos sin pasar por la prensa. Estos orujos estaban compuestos de los hollejos de la uva, pepitas y algún trozo de raspón, que fue desechado en el procesado de las muestras. En el caso de la vinificación de tempranillo Ribera del Duero, se hizo una elaboración especialmente enfocada a la extracción de la máxima cantidad de compuestos fenólicos posible. Para empezar, se utilizó un preparado enzimático compuestos por enzimas Pectolíticas, celulasas, hemicelulasas y proteasas (Enartiszym Color Plus de Enartis) en la maceración prefermentativa. Durante la fermentación alcohólica, se hicieron inicialmente tres remontados diarios y a partir del tercer día de encubado, se pasó a hacer dos remontados diarios (uno de ellos con aireación) junto con un remontado con un equipo portátil para la introducción de CO2 bajo el sombrero y romperlo (Osiris – La Rioja). Por último, cuando la densidad llegó a 1000 kg/m3, se hizo un delestage y se descubó el depósito al día siguiente. 2. Procesado de las muestras Los orujos fueron mantenidos congelados a -20ºC hasta su procesado en el laboratorio, con el fin de obtener extractos de los compuestos fenólicos presentes en estos orujos. 2.1. Optimización del protocolo El protocolo inicial consta de una incubación de 3 g de hollejos con una dosis determinada de enzima comercial durante 2 horas, una trituración con un homogeneizador (IKA Werke GmbH & Co. KG. Alemania) en 20 mL de solución de extracción, compuesta por HCl al 0,1% en etanol del 96% de pureza. Seguidamente la muestra se somete a una sonicación y una centrifugación final para eliminar los restos sólidos. Sobre este protocolo base se hicieron diferentes ensayos modificando diferentes parámetros para optimizar este protocolo, que sería el utilizado finalmente para procesar las muestras de diferentes variedades. 2.1.1. Dosis de enzima pectolítica comercial En este primer ensayo se pretendía establecer la concentración más adecuada de enzima comercial. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Partiendo de los orujos de Tempranillo D.O. Ribera del Duero congelados a -20ºC, una vez descongelados, se pesaron 3 gramos de orujos en cada muestra y se anotó el peso exacto en un total de 9 tubos Falcon de 50 mL. A continuación, se prepararon 100 mL de dos disoluciones Stock de la enzima pectolítica comercial Lallzyme EX – V (Lallemand), una con 10 mg/100 mL y otra con 20 mg/100mL. Después se añadieron 10 mL de agua a los tubos control (C1, C2 y C3), 10 mL de disolución stock 10 mg/100 mL en otros tres tubos (TE1, TE2, TE3) y 10 mL de disolución stock 20 mg/100mL en los 3 tubos restantes (TE4, TE5, TE6). Una vez añadida la enzima comercial las muestras se agitaron con el vortex y se pusieron en incubación a temperatura ambiente durante 2 h girando en una rueda de agitación. Pasado este tiempo, se añadieron a cada tubo 19 3. Resultados 1. Procesado de las muestras A continuación, se muestran los resultados obtenidos en el proceso que se llevó a cabo para la optimización de la metodología para extraer los compuestos fenólicos de los orujos. Tal y como se ha indicado en el apartado de Material y Métodos, se estudiaron las condiciones de extracción empleando los siguientes métodos: enzimático mediante el uso de enzimas pectolíticas comerciales, trituración del material mediante un homogeneizador de laboratorio, sonicación de la muestra y extracción en la solución alcohólica ácida EtOH/HCl. Se optimizaron los siguientes parámetros: la concentración de enzima, el tiempo de sonicación y el número de extracciones en el medio alcohólico ácido. 1.1. Dosis de enzima pectolítica comercial Se comenzó con la enzima pectolítica comercial Lallzyme EX -V de Lallemand y se siguieron las indicaciones del productor. Se ensayaron diferentes dosis de enzima (10 mg/100mL y 20 mg/100 mL) y se obtuvieron los resultados que se muestran en las Figuras de la 3.1 a la 3.4: Figura 3.1: Medidas de absorbancia a 620 nm, 520 nm y 420 nm obtenidas en el ensayo empleando diferentes dosis de enzima pectolítica comercial. C: Control sin enzima; TE 1: Tratado con 10 mg/100 mL de enzima y TE 2: Tratado con 20 mg/100 mL de enzima Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 620 nm 520 nm 420 nm Absorbancia C TE 1 TE 2 a a a b b b c c c 20 Figura 3.2: Medidas del Índice de Color obtenidas en el ensayo empleando diferentes dosis de enzima pectolítica comercial. C: Control sin enzima; TE 1: Tratado con 10 mg/100 mL de enzima y TE 2: Tratado con 20 mg/100 mL de enzima Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Figura 3.3: Medidas del Índice de Tonalidad obtenidas en el ensayo empleando diferentes dosis de enzima pectolítica comercial. C: Control sin enzima; TE 1: Tratado con 10 mg/100 mL de enzima y TE 2: Tratado con 20 mg/100 mL de enzima Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Índice de Color C TE 1 TE 2 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 Tonalidad C TE 1 TE 2 a a a a a a 21 Figura 3.4: Medidas de la absorbancia a 280 nm, obtenidas en el ensayo empleando diferentes dosis de enzima pectolítica comercial. C: Control sin enzima; TE 1: Tratado con 10 mg/100 mL de enzima y TE 2: Tratado con 20 mg/100 mL de enzima Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Estos resultados muestran que no hubo diferencias estadísticamente significativas entre las muestras control y las tratadas en ninguno de los parámetros, aunque se observa que las muestras control sin tratamiento enzimático eran menos homogéneas y las desviaciones estándar obtenidas eran mayores que en las muestras tratadas con la enzima comercial. A la vista de estos resultados se decidió continuar en los siguientes ensayos con la concentración de enzima 10 mg/100 mL puesto que el aumento en la concentración del enzima no mejoró el rendimiento de la extracción. 1.2. Tiempo de sonicación En el segundo ensayo los homogenizados de los hollejos obtenidos con y sin tratamiento enzimático con Lallzyme EX–V y triturados se sometieron a sonicación durante distintos tiempos: 10 y 20 min, tal y como se describe en el apartado de Materiales y métodos. En este ensayo se utilizaron tres muestras control indicadas como CA, que no recibieron el tratamiento enzimático y se sonicaron 10 min, y las tres muestras indicadas como CE que recibieron tratamiento enzimático con la misma enzima y no se sonicaron. Además de los controles descritos, se trataron tres muestras con enzima y 10 minutos de sonicación (T 10 min) y otras tres muestras con enzima y 20 minutos de sonicación (T 20 min). Los resultados se muestran en las Figuras de la 3.5 a la 3.8. 0 2 4 6 8 10 12 Absorbancia a 280 nm C TE 1 TE 2 a a a 22 Figura 3.5: Medidas de absorbancia a 620 nm, 520 nm y 420 nm obtenidas en el ensayo empleando diferentes tiempos de sonicación. CA: Control sin enzima; CE: Control sin sonicar; T 10 min: Tratado con 10 minutos de sonicación y T 20 min: Tratado con 20 minutos sonicación. Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Figura 3.6: Medidas del Índice de Color obtenidas en el ensayo empleando diferentes tiempos de sonicación. CA: Control sin enzima; CE: Control sin sonicar; T 10 min: Tratado con 10 minutos de sonicación y T 20 min: Tratado con 20 minutos sonicación. Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Los resultados mostrados en estas dos Figuras 3.5 y 3.6 indican que las muestras que no recibieron el tratamiento de la sonicación presentaron una mayor desviación estándar de los valores medios de los parámetros estudiados que el resto de las muestras que fueron sometidas a la sonicación. 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 620 nm 520 nm 420 nm Absorbancia CA CE T 10 min T 20 min 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Índice de Color CA CE T 10 min T 20 min a a a a b b b b c c c c a a a a 23 Figura 3.7: Medidas del Índice de Tonalidad obtenidas en el ensayo empleando diferentes tiempos de sonicación. CA: Control sin enzima; CE: Control sin sonicar; T 10 min: Tratado con 10 minutos de sonicación y T 20 min: Tratado con 20 minutos sonicación. Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Figura 3.8: Medidas de la absorbancia a 280 nm obtenidas en el ensayo empleando diferentes tiempos de sonicación. CA: Control sin enzima; CE: Control sin sonicar; T 10 min: Tratado con 10 minutos de sonicación y T 20 min: Tratado con 20 minutos sonicación. Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Con respecto al tiempo de sonicación, las Figuras 3.7 y 3.8 muestran que tampoco se observan diferencias significativas entre los valores medios del Índice de Tonalidad y de la Absorbancia a 280 nm (IPT), aunque sí se observa que el efecto de sonicar durante 20 min mejora la homogeneidad de las muestras y que las desviaciones estándar de los valores son menores. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Tonalidad CA CE T 10 min T 20 min 0 2 4 6 8 10 12 280 nm Absorbancia a 280 nm CA CE T 10 min T 20 min a a a a a a a a 24 1.3. Efecto de una segunda y tercera extracción En el tercer ensayo se compararon los resultados de la extracción realizando 1, 2 y 3 extracciones sucesivas en el medio alcohólico ácido, tal y como se describe detalladamente en el apartado de Materiales y métodos. Las Figuras de la 3.9 a la 3.12 muestran los resultados obtenidos: Figura 3.9: Medidas de las absorbancias a 620 nm, 520 nm y 420 nm obtenidas en el ensayo empleando diferente número de extracciones (1ª extracción, 2ª extracción y 3ª extracción). Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Figura 3.10: Medidas del Índice de Color obtenidas en el ensayo empleando diferente número de extracciones (1ª extracción, 2ª extracción y 3ª extracción). Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 620 nm 520 nm 420 nm Absorbancias 1ª extracción 2ª extracción 3ª extracción 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 índice de Color 1ª extracción 2ª extracción 3ª extracción a b b c c d e ef f a a b 25 Figura 3.11: Medidas del Índice de Tonalidad obtenidas en el ensayo empleando diferente número de extracciones (1ª extracción, 2ª extracción y 3ª extracción). Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Figura 3.12: Medidas de la absorbancia 280 nm obtenidas en el ensayo empleando diferente número de extracciones (1ª extracción, 2ª extracción y 3ª extracción). Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Estos resultados muestran que los extractos obtenidos en la 3ª extracción tenían mucha menos concentración de compuestos fenólicos (Absorbancia a 280 nm) y menos color (Índice de Color) que los de la 1ª y 2ª extracción. Además, el pardeamiento (índice de tonalidad mostrado en la Figura 3.11) de los extractos obtenidos en la tercera extracción era significativamente mayor que en los extractos obtenidos en las dos primeras extracciones. Por otro lado, el índice de color en los extractos obtenidos con la segunda extracción era similar al de los extraídos en la primera extracción, por lo que, en el protocolo para los siguientes ensayos se mantuvo la segunda extracción y se mezcló con el extracto obtenido en la primera. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Tonalidad Extracciones 1ª extracción 2ª extracción 3ª extracción 0 2 4 6 8 10 12 14 280 nm 280 nm 1ª extracción 2ª extracción 3ª extracción b a c a a b 26 La fotografía de la Figura 3.13 muestra los restos obtenidos después del secado del material residual tras las consecutivas extracciones en el medio alcohólico ácido. Se puede observar que el sedimento es más claro después de la 3ª extracción (sedimento 3 de la Figura 3.13) respecto a los otros sedimentos como se puede observar en la fotografía. Esto nos puede indicar que en la tercera extracción no quedan apenas compuestos colorantes extraíbles en las partes sólidas. Figura 3.13: Sedimentos de la 1ª extracción (1), 2ª extracción (2) y 3ª extracción (3) Tabla 3.1: Porcentaje en peso seco de material extraído con diferentes enzimas y variedades Variedad y origen de los orujos Enzima empleada en la extracción % (peso/peso) extraído Tempranillo Enzima EX-V 23,6 Enzima GC 23,5 Enzima OE 28,3 Merlot Enzima EX-V 33,3 Enzima GC 41,5 Enzima OE 38,5 En la Tabla 3.1. se puede observar que la extracción fue mayor en el Merlot respecto al Tempranillo ya que en el primer caso se extrajo más de un 30% con todas las enzimas, mientras que en el segundo caso fue menor de ese 30%. 2. Estudio comparativo de tres enzimas pectolíticas comerciales para la maceración de los orujos estudiados Tal y como se detalla en el apartado de Materiales y métodos se estudiaron las enzimas comerciales: Lallzyme EX-V de Lallemand, Lafase HE Grand Cru de Laffort y Lallzyme OE de Lallemand en el tratamiento de los orujos de Tempranillo tinto de Ribera del Duero, Merlot y Tempranillo de Rioja. Se midieron para cada uno de los extractos obtenidos los mismos parámetros que en el apartado anterior 1.3, y se hizo una comparación de las diferentes enzimas empleadas y para cada variedad. 27 2.1. Tempranillo Ribera del Duero Del ensayo con orujos de Tempranillo de Ribera del Duero, se obtuvieron los resultados que se muestran en las siguientes Figuras. Figura 3.14: Medidas de las absorbancias a 620 nm, 520 nm, 420 nm obtenidas en el ensayo con Tempranillo Ribera del Duero empleando diferentes enzimas pectolíticas comerciales. EXV: Enzima Lallzyme EX -V de Lallemand; GC: Lafase HE Grand Cru de Laffort y OE: Lallzyme OE de Lallemand. Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Figura 3.15: Medidas del Índice de Color obtenidas en el ensayo con Tempranillo Ribera del Duero empleando diferentes enzimas pectolíticas comerciales. EXV: Enzima Lallzyme EX -V de Lallemand; GC: Lafase HE Grand Cru de Laffort y OE: Lallzyme OE de Lallemand. Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 620 nm 520 nm 420 nm Absorbancia Enzima EX-V Enzima GC Enzima OE 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Índice de Color Enzima EX-V Enzima GC Enzima OE a a a a a b b b c c c a 28 Figura 3.16: Medidas del Índice de Tonalidad obtenidas en el ensayo con Tempranillo Ribera del Duero empleando diferentes enzimas pectolíticas comerciales. EXV: Enzima Lallzyme EX -V de Lallemand; GC: Lafase HE Grand Cru de Laffort y OE: Lallzyme OE de Lallemand. Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Figura 3.17: Medidas de la absorbancia a 280 nm obtenidas en el ensayo con Tempranillo Ribera del Duero empleando diferentes enzimas pectolíticas comerciales. EXV: Enzima Lallzyme EX -V de Lallemand; GC: Lafase HE Grand Cru de Laffort y OE: Lallzyme OE de Lallemand. Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). Como puede observarse, no se obtuvieron diferencias significativas entre los extractos obtenidos con cada una de las enzimas en ninguno de los parámetros estudiados por lo que se puede decir que las tres enzimas tienen la misma efectividad para estas condiciones. 2.2. Merlot Los resultados obtenidos en el ensayo con los orujos de Merlot con las diferentes enzimas empleadas se muestran en las siguientes Figuras: 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Tonalidad Enzima EX-V Enzima GC Enzima OE 0 2 4 6 8 10 12 14 Absorbancia a 280 nm Enzima EX-V Enzima GC Enzima OE a a a a a a 35 Figura 3.28: Medidas de la absorbancia a 280 nm obtenidas en los ensayos de tres variedades distintas empleando diferentes enzimas pectolíticas comerciales. Temp Du; Tempranillo de Ribera del Duero; Merlot; Temp Rj: Tempranillo de Rioja; EXV: Lallzyme EX -V de Lallemand; GC: Lafase HE Grand Cru de Laffort y OE: Lallzyme OE de Lallemand (OE). Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas en el ANOVA (p<0,05). En el caso de la Absorbancia a 280 nm, al igual que en el Índice de Color y Tonalidad, los extractos de los orujos de Tempranillo de Ribera del Duero presentaron una menor concentración de polifenoles. A la vista de los diferentes parámetros se observan diferencias muy claras en el color y el contenido de polifenoles de los extractos de los orujos de Tempranillo de Ribera del Duero. Esto podría deberse a una vinificación más enfocada hacia la extracción de compuestos fenólicos que en la vinificación del vino de Tempranillo de Rioja. Por lo tanto se eligieron los orujos de Tempranillo de Rioja como material de partida para el ensayo de la actividad antimicrobiana. A la vista de la Figura 3.21, que muestra una menor extracción con la enzima GC de los orujos de Merlot, esta enzima no se eligió para el ensayo del efecto antibacteriano de los extractos. A la vista de la Figura 3.28 (Absorbancia a 280 nm) se eligió la enzima Lallzyme OE (Lallemand) puesto que extrajo la misma cantidad de compuestos fenólicos de los orujos de Tempranillo y de Merlot. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Enzima EX-V Enzima GC Enzima OE Absorbancia a 280 nm Temp Du Merlot TempRj a a a b b b b b c 36 De acuerdo con los datos del proveedor, Lallzyme OE es una preparación enzimática obtenida de Aspergillus niger y seleccionada para la maceración de uvas tintas y blancas, y fundamentalmente para la liberación de color y polifenoles de las paredes vegetales de las células del hollejo. De acuerdo con los datos de su composición, Lallzyme OE contiene principalmente las enzimas pectin liasa y poligalacturonasa, además de otras actividades enzimáticas complementarias: ramnogalacturonasas (activas sobre ramnogalacturonanos tipo I) y actividades xilanasa, hemicelulasa y celulasa. 4. Estudio del efecto microbiológico Tras procesar los datos generados en el ensayo de la actividad antimicrobiana de los extractos de Tempranillo y Merlot frente a la cepa E. coli C7577 se obtuvieron las correspondientes curvas de crecimiento (Figuras 3.29 y 3.30) en las que se representa el crecimiento bacteriano con las diferentes concentraciones de los extractos (detalladas en el apartado de Materiales y Métodos) tanto para la variedad Tempranillo (Tempranillo de Rioja) como para la variedad Merlot. Para las comparaciones se consideraron los valores de Absorbancia a 600 nm obtenidos tras 8 h de incubación de la bacteria ya que corresponde al final de la fase exponencial del crecimiento bacteriano. Figura 3.29: Curva de crecimiento de la bacteria E. coli C7577 en presencia de extracto fenólico de la variedad Tempranillo en distintas concentraciones. Cada punto representa el valor de la media aritmética de los ensayos por triplicado. A100: absorbancia de los ensayos controles del crecimiento de la bacteria sin ningún tipo de inhibidor. -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0 5 10 15 20 25 Absrobancia 600nm tiempo de incubación (h) 0,2 mg/ml 0,4 mg/ml 0,8 mg/ml 1,6 mg/ml 3,19 mg/ml A100 37 Figura 3.30: Curva de crecimiento de la cepa de E. coli C7577 en presencia de extracto fenólico de la variedad Merlot en distintas concentraciones. Cada punto representa el valor de la media aritmética de los ensayos por triplicado. A100: absorbancia de los ensayos controles del crecimiento de la bacteria sin ningún tipo de inhibidor. En el caso de la variedad Tempranillo, con la concentración de 3,19 mg/mL de extracto se consiguió una inhibición total del crecimiento de la E. coli C7577, y con la concentración de 1,6 mg/mL el crecimiento se redujo al 75% respecto al control de crecimiento de la bacteria (A100) tras 8 h de incubación. Por otro lado, con las concentraciones intermedias, 0,8 mg/mL y 0,4 mg/mL, se observó una menor inhibición de la cepa, obteniéndose un 57% y 31% del crecimiento respectivamente respecto al control A100. Con la menor concentración (0,2 mg/ml) no se observó ninguna diferencia respecto al control A100. Por tanto, se obtuvo un progresivo aumento de la inhibición del crecimiento al aumentar la concentración del extracto de Tempranillo, llegando a inhibirse completamente en el caso de la dosis más alta. En el caso del Merlot se consiguió un efecto parecido, aunque una ligeramente menor inhibición del crecimiento, ya que no se consiguió la inhibición total con la concentración más alta que se consiguió en el anterior caso, aunque sí se obtuvo una inhibición notable del 85% respecto al control. Las concentraciones más bajas de 0,2 y 0,4 mg/ml del extracto de Merlot no tuvieron un efecto significativo sobre el crecimiento de la bacteria. Las concentraciones intermedias de 1,6 mg/mL y 0,8 mg/mL produjeron una inhibición del 60 % y 30 % a las 8 horas respectivamente. -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0 5 10 15 20 25 Absorbancia 600nm tiempo de incubación (h) 0,2 mg/ml 0,4 mg/ml 0,8 mg/ml 1,6 mg/ml 3,19 mg/ml A100 38 Tanto con los extractos polifenólicos obtenidos de la variedad Tempranillo como de la variedad Merlot, se observa que disminuyen o incluso controlan el crecimiento bacteriano de la cepa E. coli C7577 multirresistente a los antibióticos, disminuyendo la pendiente de la curva en fase exponencial de crecimiento lo cual corresponde a una menor velocidad de crecimiento al aumentar la concentración de extracto. Tras el periodo de incubación, se sembró en placas de BHI-agar el contenido de los pocillos correspondientes a las concentraciones 6,38 mg/mL a 0,8 mg/mL. Tras 24h de incubación sí que se observó crecimiento en estas placas, demostrando que, al eliminar la presencia de los extractos en el medio, las bacterias pudieron crecer. Por tanto, el efecto de inhibición de estos extractos es bacteriostático y no bactericida, ya que las bacterias se mantienen inhibidas pero viables para crecer en otro medio más favorable. Comparando estos resultados con resultados previamente publicados y obtenidos con extractos de uvas frescas de la variedad Tempranillo de La Rioja (Fernández-Pérez et al., 2018) se han conseguido una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) menor, ya que en este ensayo se ha observado una inhibición total del crecimiento bacteriano con 3,19 mg/L en el caso del extracto de Tempranillo, mientras que con la CMI del mencionado estudio era de 6,25 mg/L. En el caso de Merlot en este TFG se ha conseguido con una concentración de 3,19 mg/mL un control bastante bueno del crecimiento bacteriano, reduciéndolo en un 85 % y en la bibliografía no se ha encontrado ninguna referencia de esta variedad y actividad antimicrobiana de la misma. Con respecto a la composición fenólica, un estudio de la composición de vinos de la variedad Merlot y de la variedad Tempranillo (Quaglieri et al., 2017) mostró que los contenidos en antocianos totales de ambas variedades se encuentran en un rango similar de magnitud (205,05 mg/L ± 92,75) y lo mismo ocurre con sus contenidos en taninos totales (4,13 mg/L ± 0,66), por lo tanto podría suponerse que los contenidos de polifenoles totales en ambas variedades de uva, y consecuentemente de los orujos obtenidos tras la fermentación, también podrían ser similares. El extracto de la variedad Tempranillo en una concentración de 3,19 mg/mL inhibió totalmente el crecimiento bacteriano, y el extracto de la variedad Merlot redujo en un 85% el crecimiento bacteriano en su fase exponencial. En todos los casos el efecto fue bacteriostático, de modo que al eliminar el extracto del medio de cultivo, las células volvieron a recuperar su actividad y se reanudó la división celular. A la vista de estos resultados, se concluye que en la extracción realizada con los orujos de uvas de la variedad Tempranillo y Merlot, empleando un paso enzimático de maceración con un preparado pectolítico, trituración mecánica, sonicación durante 20 min y extracción en medio etanólico ácido, se han conseguido dos extractos polifenólicos con unas notables actividades frente al crecimiento de la bacteria modelo E. coli C7577 de multirresistencia a los antibióticos. 39 Conclusiones Los resultados obtenidos en este TFG permiten extraer las siguientes conclusiones: 1) El método de extracción de compuestos fenólicos puesto a punto incluyó: la trituración de los orujos, la sonicación en baño de agua termostatizado durante 20 minutos con una frecuencia de 14 kHz, todo ello sumado a la maceración con una enzima pectolítica comercial de uso enológico. 2) Se probaron las enzimas pectolíticas: Lallzyme EXV (Lallemand), Lafase HE Grand Cru y Lallzyme OE (Lallemand), y los resultados mostraron que los extractos obtenidos de los orujos de las variedades Tempranillo y Merlot presentaban unos Índices de color sin diferencias estadísticamente significativas entre ellos. 3) Se encontró una diferencia significativa en el efecto de las enzimas sobre los orujos de la variedad Merlot en la extracción de compuestos fenólicos totales (medidos con respecto a la Absorbancia a 280 nm). La enzima Lallzyme EXV presentó el máximo valor de IPT, seguida por Lallzyme OE y por Lafase HE Grand Cru. 4) Los extractos de Tempranillo y de Merlot preparados siguiendo el protocolo optimizado mostraron actividad inhibidora del crecimiento de la bacteria E. coli C7577. multirresistente a los antibióticos. Este efecto resultó ser bacteriostático. 5) La concentración mínima inhibitoria del extracto de Tempranillo resultó ser de 3,19 mg/mL; lo cual indicó una actividad antimicrobiana superior a la referenciada previamente para extractos de hollejo de uva de esta variedad. 6) El extracto de la variedad Merlot en una concentración de 3,19 mg/mL presentó una actividad inhibidora del crecimiento de la bacteria E. coli C7577 del 85 %. 40 Referencias Agostini, G. L. (2018). Efecto Del Uso De Enzimas Pectoliticas Sobre El Color Del Vino. Facultad de Ciencias Agrarias - UNCuyo, 1–72. http://www.solandes.net/03bodega.htm Álvarez-Martínez, F. J., Barrajón-Catalán, E., Encinar, J. A., Rodríguez-Díaz, J. C., & Micol, V. (2018). Antimicrobial Capacity of Plant Polyphenols against Gram-positive Bacteria: A Comprehensive Review. Current Medicinal Chemistry, 27(15), 2576–2606. https://doi.org/10.2174/0929867325666181008115650 Benbouguerra, N., Hornedo-Ortega, R., Garcia, F., El Khawand, T., Saucier, C., & Richard, T. (2021). Stilbenes in grape berries and wine and their potential role as anti-obesity agents: A review. Trends in Food Science and Technology, 112(April 2020), 362–381. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2021.03.060 Briñas, L., Zarazaga, M., Sáenz, Y., Ruiz-Larrea, F., & Torres, C. (2002). β-lactamases in ampicillin-resistant Escherichia coli isolates from foods, humans, and healthy animals. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46(10), 3156–3163. https://doi.org/10.1128/AAC.46.10.3156-3163.2002 Escaramilla, V. (2020). Superficie de Viñedo plantado en España por variedades. Sevi: La Semana Vitivinícola. http://www.sevi.net/es/3570/12/15013/Superficie-de-viñedoplantado-en-España-por-variedades.htm Fernández-Pérez, R., Tenorio, C., & Ruiz-Larrea., F. (2018). Effect of wine polyphenol extracts on the growth of Escherichia coli. In Exploring Microorganisms: Recent Advances in Applied Microbiology (pp. 226–230). Flanzy, C., & Abbal, P. (2000a). Enologa fundamentos cientificos y tecnlogicos. In Compuestos fenólicos (pp. 114–133). A. Madrid Vicente. Flanzy, C., & Abbal, P. (2000b). Enologa fundamentos cientificos y tecnlogicos. In Las enzimas en Enología (pp. 245–273). A. Madrid Vicente. Frédéric Charrier, M.-A. D., (IFV), Jean-Claude Ruf, J.-C., Villettaz (OIV), M.-M. C., (UFOE), M. M. (INRA, Montpellier), Armelle Lallement, R., & Lévêque, P. P. (Oenoppia). (2014). Enzymes in œnology : Production, Regulation, applications. Institut Français de La Vigne et Du Vin. González San José, M. L. (2005). Transferencia del Color de la uva al vino. ACE: Revista de Enología, no 61. http://www.acenologia.com/ciencia72_01.htm#tabla1 Hidalgo Togores, J. (2004). Tratado de enologa. Mundi-Prensa. Ibáñez, J., Muñoz-Organero, G., Hasna Zinelabidine, L., Teresa de Andrés, M., Cabello, F., & Martínez-Zapater, J. M. (2012). Genetic origin of the grapevine cultivar tempranillo. American Journal of Enology and Viticulture, 63(4), 549–553. https://doi.org/10.5344/ajev.2012.12012 Ishimaru, M., & Kobayashi, S. (2002). Expression of a xyloglucan endo-transglycosylase gene is closely related to grape berry softening. Plant Science, 162(4), 621–628. https://doi.org/10.1016/S0168-9452(01)00608-2 41 Jordao, A. M., Da Silva, J. M. R., & Laureano, O. (1998). Evolution of anthocyanins during grape maturation of two varieties (Vitis vinifera L.), Castelao Frances and Touriga Francesa. Vitis, 37(2), 93–94. Kennedy, J. A., Matthews, M. A., & Waterhouse, A. L. (2000). Changes in grape seed polyphenols during fruit ripening. Phytochemistry, 55(1), 77–85. https://doi.org/10.1016/S0031-9422(00)00196-5 LasantaMelero, C. (2009). Tesis doctoral: Estudio y aplicación de nuevos procesos para la mejora de la elaboración de vinos tintos en zonas de clima cálido. Universidad de Cádiz. Martínez de Toda, F. (2019). Variedades de Vid. Viticultura General. Universidad de La Rioja. OIV. (2013). Liste internationale des varits de vigne et de leurs synonymes Internationale. OIV. (2017). Distribution of the world’s grapevine varieties. In Focus OIV 2017. https://www.oiv.int/public/medias/5888/en-distribution-of-the-worlds-grapevinevarieties.pdf Quaglieri, C., Prieto-Perea, N., Berrueta, L. A., Gallo, B., Rasines-Perea, Z., Jourdes, M., & Teissedre, P. L. (2017). Comparison of aquitaine and Rioja red wines: Characterization of their phenolic composition and evolution from 2000 to 2013. Molecules, 22(2). https://doi.org/10.3390/molecules22020192 Ribéreau-Gayon, J. (1980). Tratado de enologa : ciencias y tcnicas del vino. https://search.ebscohost.com/login.aspx?direct=true&db=cat03595a&AN=rio.UR000743 46&site=eds-live Trikas, E. D., Melidou, M., Papi, R. M., Zachariadis, G. A., & Kyriakidis, D. A. (2016). Extraction, separation and identification of anthocyanins from red wine by-product and their biological activities. Journal of Functional Foods, 25, 548–558. https://doi.org/10.1016/j.jff.2016.06.033 Ugliano, M. (2009). Enzymes in Winemaking. In Wine Chemistry and Biochemistry (pp. 103– 126). https://doi.org/10.1007/978-0-387-74118-5_6 Viveros Barber. (2007). Tempranillo. La tinta más importante de España. Viti Vini Cultura. https://www.vitivinicultura.net/tempranillo-uva.html Weaver, S. R., Rendeiro, C., McGettrick, H. M., Philp, A., & Lucas, S. J. E. (2021). Fine wine or sour grapes? A systematic review and meta-analysis of the impact of red wine polyphenols on vascular health. European Journal of Nutrition, 60(1), 1–28. https://doi.org/10.1007/s00394-020-02247-8 Anexo Anexo I: Fichas enzimas utilizadas para los ensayos