Etablierung eines 3D-Ovarialkarzinommodells zur Untersuchung der ADAM17-Inhibition in Kombination mit dem Chemotherapeutikum Paclitaxel

Aus de Klinik ü Gynäkologie und Gebu shil e (Di ek o : P o . D . Nicolai Maass) im Uni e si ä sklinikum Schleswig-Hols ei n, Campus Kiel an de Ch is ian-Alb ech s-Uni e si ä zu Kiel E ablie ung eines 3D-O a ialka zinommodells zu Un e suchung de ADAM17- Inhibi ion in Kombina ion mi dem Chemo he apeu ikum Pacli axel Inaugu aldisse a ion zu E langung de Dok o wü de de Medizin de Medizinischen Fakul ä de Ch is ian-Alb ech s-Uni e si ä zu Kiel o geleg on And eas Man ed He z aus Wi zenhausen Kiel 2023 1. Be ich e s a e : P o . D . Di k O. Baue schlag, Klinik ü Gynäkologie und Gebu shil e 2. Be ich e s a e in: P i .-Doz. D . Rena e Bu ge , Sek ion ü S ammzell ansplan a ion und Immun he apie Tag de mündlichen P ü ung: 28.10.2024 Zum D uck genehmig , Kiel, den 19.07.2024 gez.: P o . D . Di k O. Baue schlag Vo si zende de P ü ungskommission Meinen Kindhei shelden He mine und Ludwig Kosch I Inhal s e zeichnis Abkü zungs e zeichnis .................................................................................................................. III Abbildungs- und Tabellen e zeichnis.............................................................................................V 1 Einlei ung .............................................................................................................................. 1 O a ialka zinom ................................................................................................................... 1 1.1.1 Epidemiologie, Risiko ak o en und P o ek i ak o en ....................................................... 1 1.1.2 Ana omie und physiologische Funk ion des O a s ............................................................ 2 1.1.3 Pa hologie ........................................................................................................................... 2 1.1.4 The apie und P ognose ....................................................................................................... 4 A Disin eg in And Me allop o ease 17 (ADAM17) ............................................................ 5 1.2.1 Physiologische Rolle on ADAM17 .................................................................................. 5 1.2.2 Exp ession on ADAM17 im Tumo gewebe ..................................................................... 5 1.2.3 ADAM17- e mi el e Liganden eise zung des Epide mal G ow h Fac o Recep o (EGFR) ............................................................................................................................... 6 1.2.4 Rolle on ADAM17 bei de En s ehung on Chemo he apie esis enz .............................. 6 1.2.5 ADAM17 als Ang i spunk ü zielge ich e e The apieansä ze ........................................ 7 Zweidimensionale und d eidimensionale Tumo modelle zu Tes ung onkologische The apieansä ze .................................................................................................................... 8 1.3.1 Zweidimensionale Zellkul i ie ung als in i o-Tumo modell .......................................... 8 1.3.2 D eidimensionales Mul izellulä es Tumo sphe oidmodell (MTM) ................................... 8 Zielse zung de A bei ........................................................................................................ 12 2 Ma e ial und Me hoden ..................................................................................................... 13 2.1 Ma e ial ....................................................................................................................................... 13 2.1.1 Chemo he apeu ika ............................................................................................................. 13 2.1.2 Inhibi o en und de en Lösungsmi el .................................................................................. 13 2.1.3 An ibio ika .......................................................................................................................... 13 2.1.4 Fluo eszenz a bs o e ......................................................................................................... 13 2.1.5 Pipe en ............................................................................................................................... 14 2.1.6 Ve b auchsma e ialien ........................................................................................................ 14 2.1.7 Chemikalien und Reagenzien ............................................................................................. 14 2.1.8 Kul u medium ..................................................................................................................... 15 2.1.9 Ki s ...................................................................................................................................... 15 2.1.10 Ge ä e .................................................................................................................................. 15 2.1.11 Compu e p og amme .......................................................................................................... 16 2.1.12 Zelllinien ............................................................................................................................. 16 2.1.13 P imä e Zellen.................................................................................................................... 16 2.2 Me hoden.................................................................................................................................... 17 2.2.1 Zellkul i ie ung.................................................................................................................... 17 2.2.2 Ve suchsau bau de zweidimensionalen Zellkul u expe imen e......................................... 17 2.2.3 Ve suchsau bau de d eidimensionalen Zellkul u expe imen e.......................................... 19 2.2.4 ELISA.................................................................................................................................. 22 3 E gebnisse ........................................................................................................................... 22 3.1 Zweidimensionale Un e suchungen .......................................................................................... 23 3.1.1 Das Chemo he apeu ikum Pacli axel üh zu Induk ion de ADAM17-Ak i i ä ......... 23 3.1.2 Eine ADAM17-Inhibi ion sensi i ie BG-1-O a ialka zinomzellen gegenübe ............... Pacli axel ......................................................................................................................... 24 3.2 E ablie ung eines 3D-O a ialka zinommodells ...................................................................... 27 3.2.1 BG-1-O a ialka zinomzellen können Mul izellulä e Tumo sphe oide ausbilden ........... 27 II 3.2.2 Zellzahl es ung zu He s ellung Mul izellulä e Tumo sphe oide de inie e Zielg öße . 28 3.2.3 Tes ung zu E mi lung eine angemessenen Kul i ie ungszei de Mul izellulä en Tumo sphe oide bis zu Du ch üh ung eines Mediumwechsels ...................................... 29 3.2.4 Tes ung de Sphe oiduni o mi ä ...................................................................................... 30 3.2.5 O a ialka zinomzellen bilden im Mul izellulä en Tumo sphe oid Zell-Zell-Kon ak e und einen P oli e a ionsg adien en aus .................................................................................... 31 3.2.6 Cha ak e isie ung on Mul izellulä en Tumo sphe oiden mi els Fluo eszenz a bs o en .. .......................................................................................................................................... 32 3.2.7 Tes ung des Behandlungse ek s übe die Sphe oid läche im 3D-O a ialka zinommodell .......................................................................................................................................... 33 3.2.8 T ansla ionale Ansa z: Sphe oidbildung on Aszi eszellen im 3D-Kul u ansa z ........... 35 3.3 Validie ung de 2D-E gebnisse im 3D-O a ialka zinommodell ........................................... 36 3.3.1 Das Chemo he apeu ikum Pacli axel üh zu Induk ion de ADAM17-Ak i ie ung im Mul izellulä en Tumo sphe oid ........................................................................................ 36 3.3.2 Die Kombina ionsbehandlung aus Pacli axel und ADAM17-Inhibi ion bewi k einen s ä ke en Behandlungse ek auch im 3D-Kul u ansa z ................................................... 37 4 Diskussion ........................................................................................................................... 40 4.1 Ein luss des Chemo he apeu ikums Pacli axel au die ADAM17-Ak i i ä .................. 41 4.2 Un e suchung des Ein lusses eine zusä zlichen ADAM17-Inhibi ion zu kon en ionellen Chemo he apie ........................................................................................ 42 4.3 E ablie ung des 3D-O a ialka zinommodells ......................................................................... 44 4.3.1 BG-1-O a ialka zinomzellen können Mul izellulä e Tumo sphe oide ausbilden ........... 44 4.3.2 Tes ung zu E mi lung eine angemessenen Kul i ie ungszei bis zu Du ch üh ung eines Mediumwechsels ..................................................................................................... 45 4.3.3 Tes ung de Sphe oiduni o mi ä ...................................................................................... 45 4.3.4 O a ialka zinomzellen bilden im Mul izellulä en Tumo sphe oid Zell-Zell-Kon ak e und eine P oli e a ionszone aus ............................................................................................... 46 4.3.5 Cha ak e isie ung on Mul izellulä en Tumo sphe oiden mi els Fluo eszenz a bs o en .. .......................................................................................................................................... 47 4.3.6 Tes ung des Behandlungse ek s übe die Sphe oid läche im 3D-O a ialka zinommodell .......................................................................................................................................... 48 4.3.7 T ansla ionale Ansa z: Sphe oidbildung on Aszi eszellen im 3D- O a ialka zinommodell .................................................................................................... 48 4.4 Validie ung de 2D-E gebnisse im 3D-O a ialka zinommodell ........................................... 48 4.4.1 Ein luss des Chemo he apeu ikums Pacli axel au die ADAM17-Ak i i ä .................... 48 4.4.2 Un e suchung des Ein lusses eine zusä zlichen ADAM17-Inhibi ion zu kon en ionellen Chemo he apie ....................................................................................... 49 5 Zusammen assung...............................................................................................................51 6 Li e a u e zeichnis ........................................................................................................... 52 7 Anhänge ............................................................................................................................... 59 7.1 Publika ions e zeichnis ............................................................................................................. 59 7.2 Danksagung ................................................................................................................................ 60 7.3 Akademische Lebenslau ......................................................................................................... 61 III Abkü zungs e zeichnis 2D zweidimensional 3D d eidimensional ADAM A Disin eg in And Me allop o ease AREG Amphi egulin AT Ös e eich BCT Be acellulin BG-1 Bowman G ay-1 BRCA1 BReas CAnce 1 BRCA2 BReas CAnce 1 bzw. beziehungsweise CH Schweiz cm Zen ime e D Deu schland DNK Dänema k EdU 5-e hynyl-2´-deoxyu idine EGFR Epide mal G ow h Fac o Recep o EREG Epi egulin ERKs Ex acellula Signal-Regula ed Kinases FCS Fe al Cal Se um (Fö ales Kälbe se um) FIGO Fédé a ion In e na ionale de Gynécologie e d'Obs é ique GF-AFC Gly-Phe-7-Amino-4- i luo me hylcuma in GI GI254023X GW GW280264X HB-EGF Hepa in-binding EGF-like g ow h ac o HER Human Epide mal G ow h Fac o Recep o HRP Ho se adish Pe oxidase K Kel in MAPK Mi ogen-Ac i a ed P o ein Kinase ml Millili e IV MT Mul izellulä es Tumo sphe oid MTM Mul izellulä es Tumo sphe oidmodell NL Niede lande nm Nanome e L Li e O Ca O a ialka zinom PARP Poly(ADP- ibose)-Polyme ase Pen.-S . Penicillin-S ep omycin PI P opidiumiodid PI3K Phospha idylinosi ol 3-Kinase PKC P o einkinase C PLCγ Phospholipase Cγ Ra Rapidly accele a ed ib osa com Ras Ra sa coma RLU Rela i e Ligh Uni s s. siehe SD S anda d De ia ion (S anda dabweichung) STAT Signal T ansduce s and Ac i a o s o T ansc ip ion S d. S unden TACE Tumo Nec osis Fac o (TNF)-α-Con e ing Enzyme TNF Tumo Nec osis Fac o TNM Tumo -Nodus-Me as asen U Uni s UK Ve einig es König eich ULA Ul a Low A achmen USA Ve einig e S aa en on Ame ika VEGF Vascula Endo helial G ow h Fac o µg Mik og amm µm Mik ome e µM Mik omola µl Mik oli e °C G ad Celsius V Abbildungs e zeichnis Abbildung 1: Au bau des Mul izellulä en Tumo sphe oid-Modells……………………9 Abbildung 2: Dynamik de Wachs ums ak o eise zung on AREG in Abhängigkei de Pacli axelkonzen a ion……………………………………………...24 Abbildung 3: Die zusä zliche Inhibi ion on ADAM17 üh zu eine eduzie en Zell- iabili ä und eine e höh en Caspaseak i i ä …………………………..26 Abbildung 4: Pa en ale und esis en e BG-1-O a ialka zinomzellen bilden un e schied- lich kon igu ie e Tumo sphe oide aus……………………………..27 - 28 Abbildung 5: Ein luss de Zellzahl au den Sphe oiddu chmesse …………………….29 ……………………………… Abbildung 6: Ve ände ung de Fluo eszenzin ensi ä übe die Zei ohne Mediumwechsel…………………………………………………………30 Abbildung 7: Tes ung de Sphe oiduni o mi ä ………………………………………..31 Abbildung 8: Nachweis on Zell-Zell-Kon ak en und eines P oli e a ionsg adien en..32 Abbildung 9: Fluo eszenzmik oskopie zu Visualisie ung on Zell iabili ä und Zell od …………………………………………………………………………..33 Abbildung 10: Quan i izie ung des Behandlungse ek s übe die Sphe oid läche und Da - s ellung de e ände en Zella chi ek u nach Pacli axelbehandlung…...34 Abbildung 11: Aszi eszellen sind zu Ausbildung on Mul izellulä en Tumo sphe oiden be ähig ………………………………………………………………….35 Abbildung 12: Ein luss de Pacli axelbehandlung au die AREG-F eise zung im Mul i- zellulä en Tumo sphe oid.……………………………………………....37 Abbildung 13: Visualisie ung und Quan i izie ung on Behandlungse ek en de Kombina ionsbehandlung……………………………………………….39 Tabellen e zeichnis Tabelle 1: S adienein eilung des O Ca nach FIGO und TNM……………………………3 - 4 1 1 Einlei ung 1.1 O a ialka zinom 1.1.1 Epidemiologie, Risiko ak o en und P o ek i ak o en Im Jah 2016 wu den 7350 Neue k ankungen des O a ialka zinoms (O Ca) in Deu schland e zeichne [1]. Die Inzidenz diese Tumo en i ä beläu sich au e wa 8-10 Neue k ankungen p o 100.000 F auen jäh lich [2]. Dami is das O Ca das d i häu igs e gynäkologische Ka zinom hin e dem Mamma- und Endome iumka zinom sowie das ach häu igs e Ka zinom de F au. Un e den gynäkologischen Tumo en weis das O Ca mi eine ela i en 5-Jah es-Übe lebens a e on 43 % die höchs e Le ali ä au . Diese Ta sache is neben eine unspezi ischen klinischen Symp oma ik [3] insbesonde e au den Mangel an e ek i en Sc ee- ningme hoden [2] sowie dem häu ig o gesch i enen S adium bei Diagnoses ellung (bei 76 % alle Pa ien innen lieg das S adium Fédé a ion In e na ionale de Gynécologie e d'Obs é ique (FIGO) III ode IV o ) zu ückzu üh en [1]. Die E k ankung i am häu igs en pos meno- pausal au , wobei das mi le e E k ankungsal e 68 Jah e be äg [1]. Als p o ek i e Fak o en we den eine hohe Gebu enzahl, länge e S illzei en, die Einnahme on O ula ionshemme n sowie de chi u gische Ve schluss de Eilei e zu S e ilisa ion angesehen [3]. Zu den e wiesenen Risiko ak o en gehö en demgegenübe neben zunehmendem Al e , Übe gewich , Kinde losigkei beziehungsweise Un uch ba kei und Ho mone sa z he apien nach de Menopause, insbesonde e de Einsa z on Ös ogenmonop äpa a en. Da übe hinaus spiel auch die gene ische P ädisposi ion eine bedeu same Rolle. Insbesonde e F auen, de en Ve wand e e s en G ades B us - ode Eie s ockk ebs in ih e Vo geschich e au weisen ode welche be ei s in de Ve gangenhei an B us -, Gebä mu e kö pe - ode Da mk ebs e k ank sind, haben ein ges eige es Risiko am O Ca zu e k anken [3]. In e wa 10 – 15 % alle Fälle lieg ein he edi ä es O Ca, bei dem die häu igs en gene ischen Ve ände ungen in den Genen BReas CAnce 1 (BRCA1) sowie BReas Cance 2 (BRCA2) au e en. En sp echend e en die meis en O Ca spon an ohne das Vo handensein eine Keimbahnmu a ion au [2]. Die Gene BRCA1 sowie BRCA2 sind unk ionell bei de DNA-Repa a u bedeu sam und e höhen bei Vo liegen eine Keimbahnmu a ion das Risiko bes imm e Tumo en i ä en wie zum Beispiel des O a ial-, Mamma- und P os a aka zinoms. Das Risiko bis zu einem Al e on 70 Jah en an einem O Ca zu e k anken lieg beim Nachweis eine BRCA1-Keimbahnmu a ion bei 40 – 50 % beziehungsweise bei BRCA2-T äge innen bei 10 – 20 % [4]. Typische weise 8 ande en S udiena men mi ge inge e Dosis hingegen nich au . De Inhibi o INCB7839 wi d gegenwä ig im Rahmen de Phase 1 S udie NCT04295759 bei hochg adigen Gliomen un e - such . 1.3 Zweidimensionale und d eidimensionale Tumo modelle zu Tes ung onkologische The apieansä ze 1.3.1 Zweidimensionale Zellkul i ie ung als in i o-Tumo modell Die En wicklung on zweidimensionalen (2D) Zellkul u en begann du ch Pionie a bei en on Roux im Jah e 1885 sowie on Ha ison im Jah e 1907, welche die e s en in i o- Kul i ie ungen on Zellen e olg eich du ch üh en [42, 43]. Eine mögliche Anwendung is die zwei-dimensionale Kul i ie ung on Tumo zellen als simpli izie es Tumo modell. Zu den Vo eilen on zweidimensionalen Tumo zellkul i ie ungen zählen die leich e Du ch üh ba - kei , eine hohe Du chsa zgeschwindigkei , ein ge inge Kos enau wand sowie die Kon olle übe e schiedene Fak o en de Tumo mik oumgebung [44]. Demgegenübe s ehen einige Nach eile, die besonde s bei de E o schung sowie Tes ung onkologische The apien on Bedeu ung sind. Die d eidimensionale (3D) Tumo a chi ek u , die in unse em menschlichen O ganismus o zu inden is , inde in zweidimensionalen Zellkul u en keine Be ücksich igung. Au g und de lachen Bescha enhei de Zellkul u laschen zu Kul i ie ung on Tumo zellen is die Ausbildung on in e zellulä en Kon ak en sowie die Kommunika ion un e den Zellen limi ie [44]. Da übe hinaus is ein pe manen e Zugang de Zellen zu Näh s o en und Saue - s o e möglich , welche bei Tumo en in i o du ch eine insu izien e Blu e so gung häu ig eingesch änk is [44]. 1.3.2 D eidimensionales Mul izellulä es Tumo sphe oidmodell (MTM) 1.3.2.1 De ini ion Un e Mul izellulä en Tumo sphe oiden (MT) e s eh man unde, d eidimensionale, aus Tumo zellen bes ehende Agg ega e, welche e schiedene Zonen bilden und umo - ähnliche Eigenscha en au weisen [45]. Die MT können aus einzelnen ode meh e en Zella en au gebau sein. Un e schiedliche Beg i lichkei en wie Sphä en, Oncosphä en, Sphe oide, gemisch e Sphe oide, He e osphe oide, Tumo oide, Kno en und O ganoide we den in Bezug au die Kul i ie ung on unden, umo ähnlichen S uk u en e wende . Eine allgemeingül ige De ini ion espek i e Nomenkla u ha sich in de Wissenscha , ähnlich wie bei O ganoiden 9 [46], bis da o nich du chse zen können [47]. Da es in de Li e a u keine einhei liche De ini ion eines unden Agg ega es on Tumo zellen gib [48], we den in de o liegenden A bei olgende Beg i e e wende : Mul izellulä es Tumo sphe oid (MT) beziehungsweise Mul izellulä es Tumo sphe oid-Modell (MTM). 1.3.2.2 Eigenscha en des Mul izellulä en Tumo sphe oidmodells Die En wicklung des Mul izellulä en Tumo sphe oid-Modells begann An ang de 1970e Jah e du ch eine G uppe on Radiobiologen [49, 50]. In den äuße en d ei bis ün Zelllagen (75 µm) des MTM be inde sich eine Zone mi p oli e ie enden Zellen, welche an eine wei e zen al gelegene Zone ang enz , in de sich o wiegend uhende Zellen be inden. Du ch einen zum Zen um hin o sch ei enden Mangel an Saue s o [51, 52], Näh s o en sowie eine Akkumula ion on S o wechselme aboli en mi Bildung eines pH-G adien en komm es 50 bis 300 µm un e halb de Obe läche de Sphe oids zu eine zen alen Nek ose (s. Abbildung 1) [44, 53]. 0₂, Näh s o e, ATP C0₂, Azidose, Ka aboli e P oli e a ionszone Ruhende Zone Nek o isches Zen um 10 Abbildung 1: Au bau des Mul izellulä en Tumo sphe oid-Modells Die schema ische Da s ellung zeig den aus meh e en Zonen bes ehenden cha ak e is ischen Au bau eines MTM und die en s ehenden G adien en om Zen um bis zu Pe iphe ie. Du ch den Zugang zu Näh s o en und Saue s o sind die Zellen de äuße en Zone du ch P oli e a ion gekennzeichne . Du ch die ab allende Ve ügba kei on Saue s o und Näh s o en in Rich ung des Zen ums komm es e s zum Wachs umsa es und eine Zone aus uhenden Zellen, ge olg on Zellnek ose (modi izie nach Ve jans e al. [54] sowie Lin und Chang [55]). F ied ich e al. e läu e en, dass die meis en Sphe oide ab eine G öße on 500-600 µm eine zen ale sekundä e Nek ose ausbilden, dieses Phänomen abe nich bei allen Zelllinien au i [48]. Die Ausbildung e schiedene G adien en is in ähnliche Weise in Mik ome as asen, a askulä en Tumo en ode in e kapillä en Tumo egionen nachweisba [48]. In eine 1988 e ö en lich en A bei besch ieben Su he land e al. das mul izellulä e Sphe oidmodell, welches Mik ome as asen ode in e askulä e Be eiche eines g öße en Tumo s in i o imi ie- en könne und on de Komplexi ä zwischen de he kömmlichen 2D-Kul u und einem in i o- Tumo einzuo dnen sei [53]. Da Me as asen in meh als 60 % alle K ebspa ien en die Todesu sache sind [56], könn e das MTM ein geeigne es Modell zu E aluie ung on onkologischen The apien besonde s o ge- sch i ene Tumo e k ankungen da s ellen. Des Wei e en eigne sich das MTM zu E o schung on Tumo zell unk ionen sowie du ch E gänzung wei e e Zella en de Angiogenese [57] und de Tumo -Immunzell-In e ak ion [58]. Zusä zlich inde das MTM Anwendung in de Un e - suchung on Chemo he apie esis enzen [59] sowie on s ahlen he apeu ischen E ek en [44]. 1.3.2.3 Un e schiede des Mul izellulä en Tumo sphe oidmodells gegenübe 2D-Tumo modellen Obwohl nich alle Zelllinien zu Ausbildung on 3D-Tumo sphe oiden geeigne sind [59, 60] und das MTM im Ve gleich zum zweidimensionalen Tumo modell e schiedene Nach eile wie höhe e Kos en und einen e höh en Zei au wand au weisen [58], gib es demgegenübe auch einige Vo eile. MT e möglichen im Ve gleich zu 2D-Tumo modellen die Ausbildung on Zell-Zell-Kon ak en im d eidimensionalen Raum und eine in e zellulä en, äumlichen Kommunika ion. Deu liche Un e schiede zeigen sich du ch den Ein luss de d eidimensionalen A chi ek u beispielsweise neben des mo phologischen Phäno yps [61] in de Genexp ession [62, 63]. Einige S udien konn en belegen, dass die Genexp ession im MTM ehe jene aus humanen Tumo geweben als zweidimensional kul i ie en Tumo zellen en sp ich [60]. Auße dem konn e in eine S udie on B eslin und Kollegen gezeig we den, dass 11 B us umo zellen in de 2D-Kul u einen e ände en mo phologischen Phäno yp, ein e än- de es Wachs ums e hal en, ein s ä ke es Ansp echen au eine an i umo öse Behandlung du ch den Ty osinkinaseinhibi o Ne a inib und das Chemo he apeu ikum Doce axel e glichen mi den d eidimensionalen Tumo sphe oiden au weisen. Da übe hinaus konn e demons ie we - den, dass die Exp ession des EGFR, HER2 und HER3 in Sphe oiden deu lich, des HER4 dagegen leich e höh is . Da übe hinaus wu de eine e höh e Exp ession des E lux anspo e s P-Glycop o ein es ges ell [64], welche zu eine e höh en Resis enz gegenübe dem Chemo he- apeu ikum Pacli axel üh en kann [65]. Da beim O Ca die En wicklung on Chemo he apie- esis enz cha ak e is isch is , is die Eigenscha eine e höh en Resis enzbildung in MT gegen- übe Chemo he apeu ika o eilha . Eine S udie on Loessne und Kollegen un e s eich , dass MT im Ve gleich zu zweidimensional kul i ie en Tumo zellen esis en e gegenübe Chemo he apeu ika sind. Die Zell iabili ä on 3D-O a ialka zinom-Tumo sphe oiden nach eine Behandlung mi Pacli axel lag zwischen 40 - 60 %. Im Ve gleich dazu üh e die Behand- lung on Tumo zellen im zweidimensionalen Monolaye zu eine Zell iabili ä on 20 % [66]. 1.3.2.4 Me hoden zu He s ellung on Mul izellulä en Tumo sphe oiden Zu He s ellung on MT aus eine Einzelzellsuspension eine ode meh e e Zelllinien beziehungsweise p imä e Tumo zellen eignen sich un e schiedliche Me hoden, welche dadu ch gekennzeichne sind, dass die Tumo zellen nich an den Obe lächen des Zellkul u - ge äßes adhä ie en können. Du ch die Zusammenlage ung de Zellen sowie de Ausbildung on Zell-Zell-Kon ak en p äg sich in de Regel nach eine Kul i ie ungszei on ein bis sieben Tagen eine kugel ö mige S uk u aus [47]. Diese Me hoden zu Bildung on MT lassen sich in zwei Haup g uppen ein eilen: Sca old-based MT und Sca old- ee MT [67]. Sca old-based MT basie en au eine Kul i ie ung in eine de inie en Ge üs s uk u aus biologischen ode syn he ischen Poly- me en. Zu G uppe de biologischen Polyme e gehö en Aga ose, Laminin, Kollagen, Vi o- nec in, Fib onec in und Gela ine [67]. Zudem gib es auch Hyd ogele wie Ma igel, das aus sek e ie en Ex azellulä ma ixp o einen on Engelb e h-Holm-Swa m Sa komzellen bes eh . Demgegenübe s ehen Ge üs e aus syn he ischen Polyme en, zu denen das syn he ische Hyd ogel Polye hylenglycol gehö [68]. Au G undlage diese Polyme e können MT un e Ve wendung de Ma ix-on- op-Me hode, de Ma ix-embedded-Me hode, de Ma ix-encap- sula ion-Me hode, de Spinne lask-Me hode ode un e Zuhil enahme on Mic opa e ned pla es kul i ie we den [67]. 12 Un e den Sca old- ee-Me hoden zu He s ellung on MT lassen sich die Ve wendung on Mik o i e pla en mi ul anied ige Anha ung [69], die Hanging d op-Me hode [70], die Liquid o e lay-Me hode un e Ve wendung on Aga [71], Aga ose [72] ode Poly- hyd oxye hylme hac yla e [73], die Magne ic le i a ion- und 3D biop in ing-Me hode eino d- nen [67]. 1.4 Zielse zung de A bei Das e s e Ziel de o liegenden A bei wa es, den Ein luss des Chemo he apeu ikums Pacli- axel au die Ak i i ä on ADAM17 zu un e suchen. Dies e olg e übe eine Quan i izie ung des eigese z en ADAM17-Subs a es AREG. Folgende F ages ellung soll e in den Fokus de Un e suchungen ges ell we den: 1) Füh eine Behandlung mi Pacli axel zu eine ADAM17-Ak i ie ung? Im zwei en Teil de A bei soll e da übe hinaus die Wi ksamkei eine Kombina ionsbehand- lung aus dem Chemo he apeu ikum Pacli axel sowie eine ADAM17-Inhibi ion analysie we den. In diesem Kon ex soll e olgende F ages ellung un e such we den: 2) Is eine Kombina ionsbehandlung aus Pacli axel und eine ADAM17-Inhibi ion eine Einzelbehandlung aus Pacli axel bezüglich de Zell iabili ä und Caspaseak i i ä übe legen? Zweidimensionale Tumo modelle können bei de Tes ung onkologische The apieansä ze zwa eine e s e E aluie ung de Wi ksamkei e möglichen, bilden abe die Komplexi ä on in i o-Tumo en nu eingesch änk ab. Aus diesem G und wu de im d i en Teil diese A bei zu Validie ung de E gebnisse aus de zweidimensionalen Kul u ein 3D-O a ialka zinom- Tumo sphe oidmodell e ablie . Dazu wu den aus de G uppe de Sca old- ee-Me hoden Mik o i e pla en mi ul anied ige Anha ung ausgewähl . Im Anschluss an die E ablie ung des 3D-O a ialka zinommodells wu den olgende F ages ellungen un e such : 3) Kann du ch die d eidimensionale A chi ek u de Zellen de Ein luss on Pacli axel au die ADAM17-Ak i i ä gegenübe de 2D-Kul u e ände we den? 4) Is eine Kombina ionsbehandlung aus Pacli axel und eine ADAM17-Inhibi ion eine Einzelbehandlung aus Pacli axel hinsich lich de Zell iabili ä und Caspaseak i i ä auch im MT übe legen? In einem ansla ionalen Ansa z soll e zudem un e such we den, ob die Kul i ie ung p imä e O a ialka zinom-Tumo zellen im MTM möglich is . 13 2 Ma e ial und Me hoden 2.1 Ma e ial 2.1.1 Chemo he apeu ika Chemo he apeu ikum He s elle Konzen a ion Pacli axel UKSH Apo heke, Kiel, Deu schland (D) 1,71 mg ad 20 ml NaCl 0,9 %, 5 mg ad 5 ml NaCl 0,9 %, 4,25 mg ad 5 ml NaCl 0,9 % 2.1.2 Inhibi o en und de en Lösungsmi el Bezeichnung He s elle GI254023X (GI) Aobious, Glouces e , Ve einig e S aa en on Ame ika (USA) GW280264X (GW) Aobious, Glouces e , USA DMSO SIGMA-Ald ich Chemie, S einheim, D 2.1.3 An ibio ika Bezeichnung He s elle Konzen a ion Penicillin PAA Labo a o ies, Pasching, Ös e eich (AT) 30.000 U ad 500 ml RPMI-1640 S ep omycin PAA Labo a o ies, Pasching, AT 30.000 µg ad 500 ml RPMI-1640 2.1.4 Fluo eszenz a bs o e Bezeichnung He s elle Calcein-AM 50 µg BioLegend, San Diego, USA P opidiumiodid 0,5 mg/ml BioLegend, San Diego, USA Hoechs 33342 100 mg (5 mg/ml in H2O) In i ogen, Wal ham, USA 14 2.1.5 Pipe en Bezeichnung He s elle Eppendo Resea ch 0.1-10 μl Eppendo , Hambu g, D Eppendo Resea ch 10-200 μl Eppendo , Hambu g, D Eppendo Resea ch 100-1000 μl Eppendo , Hambu g, D Mul ikanal Eppendo Resea ch plus 100 µl Eppendo , Hambu g, D Mul ikanal Finnpipe e 200 µl The mo Fische Scien i ic, Wal ham, USA Pipe boy Hi schmann, Ebe s ad , D 2.1.6 Ve b auchsma e ialien Bezeichnung He s elle NUNC-IMMUNO Pla en (442404) The mo Scien i ic, Roches e , USA Se ologische Pipe en 5 ml / 10 ml / 25 ml / 50 ml Sa s ed , Nümb ech , D Biosphe eⓇ Fil e Tips Pipe en- spi zen 0,1 – 20 µl / 2 – 100 µl / 100 – 1000 µl Sa s ed , Nümb ech , D Röh chen 15 ml / 50 ml Sa s ed , Nümb ech , D Sa eSeal Reagie ge äße 2 ml Sa s ed , Nümb ech , D Reagie ge äße 1,5 ml Sa s ed , Nümb ech , D Ro ilaboⓇ-Reak ionsge äße schwa z Ca l Ro h, Ka ls uhe, D Pas eu pipe en 230 mm (No. 40567002) Glaswa en ab ik Ka l Hech , Sondheim o de Rhön, D Zellkul u lasche T75 Sa s ed , Nümb ech , D Fil opu V50 500 ml, 0,2 µm Vakuum il a ionseinhei Sa s ed , New on, USA Finn ipTM Pipe enspi zen 1000 µl The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, USA Simpo C yo ial Biozym, Oldendo , D 4515, 96 Well Black, Ul a Low A achmen (ULA) Co ning, Kennebunk, USA 7007 Clea , ULA Co ning, Kennebunk, USA Cells a ® 6 Well Mul iwell Pla en Th. Geye , Hambu g, D 96 Well Zellkul u pla e (83.3924.500) Sa s ed , Nümb ech , D 2.1.7 Chemikalien und Reagenzien Bezeichnung He s elle Phospha e bu e solu ion (PBS (14190094)) Li e Technologies, Da ms ad , D VLE-RPMI 1640 Medium 500 ml (F 1415) Bioch om, Be lin, D T ypsin EDTA Solu ion 100 ml (R001100) Li e Technologies, Da ms ad , D 15 Bo ine se um albumin (BSA) ac ion V Ca l Ro h, Ka ls uhe, D Iso one Na iumchlo id-Lösung 0,9 % BC Be lin Chemie, Be lin, D OmniPu ® WFI Quali y Wa e S e ile Fil e ed 1L EMD Millipo e, Bille ica, USA Fö ales Kälbe se um (FCS) Gibco, B asilien 2.1.8 Kul u medium Bezeichnung Bes and eile BG-1-Kul u medium + RPMI 1640 mi L-Glu amin + 10 % FCS + 30.000 U Penicillin + 30.000 µg S ep omycin BG-1 Pacli axel es.-Kul u medium + RPMI 1640 mi L-Glu amin + 10 % FCS + 30.000 U Penicillin + 30.000 µg S ep omycin + 40 ng/ml Pacli axel 2.1.9 Ki s Bezeichnung He s elle ApoLi e-Glo™ Mul iplex Assay P omega, Madison, USA Humane Amphi egulin DuoSe ELISA R&D Sys ems, Minneapolis, USA CellTi e -Glo® 3D Cell Viabili y Assay P omega, Madison, USA CellTi e -Glo® 2.0 Cell Viabili y Assay P omega, Madison, USA CellToxTM G een Cy o oxici y Assay P omega, Madison, USA RealTime-GloTM MT Cell Viabili y Assay P omega, Madison, USA 2.1.10 Ge ä e Bezeichnung He s elle Typ 1003 Wasse bad GFL, Bu gwedel, D HERAcell 150i CO2-Inkuba o The mo Scien i ic, Schwe e, D Fo ma Scien i ic 3121 The mo Scien i ic, Pinnebe g, D Type TC48 S e ilbank GELAIRE, Meckenheim, D NuAi e Class II S e ilbank NuAi e Labo a o y Equipmen Supply, Plymou h, USA Öko supe glass line (4 °C und - 20 °C) Liebhe , Ochsenhausen, D 16 SCANLAF Ma s sa e y Class2 S e ilbank LaboGene, Alle ød, Dänema k (DNK) Vakuumpumpe KNF Neube ge , F eibu g, D S ua SRT9 Ge äß olle Cole-Pa me , S a o dshi e, Ve einig es König eich (UK) Vo ex Genie 2 Scien i ic Indus ies, New Yo k, USA VIP5 Tissue Tek P3624 Saku a Fine ek Eu ope, Alphen aan den Rijn, NL Axio e 25 Zeiss, Schönki chen, D NYONE® Scien i ic SYNENTEC GmbH, Elmsho n, D He aeus Mul i uge 3 The mo Scien i ic, Schwe e, D He aeus F esco 17 The mo Scien i ic, Schwe e, D Ro ina 420R He ich, Tu lingen, D In ini e M200 PRO mic opla e eade TECAN, Männedo , Schweiz (CH) Neubaue zählkamme (MA/0640030+) Geye , Hambu g, D 2.1.11 Compu e p og amme Bezeichnung He s elle Excel ü Mac Ve sion 16.3 Mic oso , Redmond, USA i-con ol Ve sion 2.0 TECAN, Männedo , CH YT®-So wa e Ve sion 3.0.13495 SYNENTEC, Elmsho n, D 2.1.12 Zelllinien Bezeichnung He s elle BG-1 Ame ican Type Cul u e Collec ion (ATCC), Manassas, Vi ginia, USA BG-1 Pacli axel esis en In unse em Labo he ges ell e Pacli axel- esis en e Subpopula ion de BG-1-Zelllinie 2.1.13 P imä e Zellen Bezeichnung He kun UF-164 Klinik ü Gynäkologie und Gebu shil e des Uni e si ä sklinikums Schleswig-Hols ein, Campus Kiel 17 2.2 Me hoden 2.2.1 Zellkul i ie ung Zu Kul i ie ung on Tumo zelllinien wu de ein K yo öh chen de jeweiligen Zelllinie aus einem S icks o behäl e en nommen, de lüssigen S icks o bei -196 °C (77 K) beinhal e e. Die Zellsuspension in K yomedium aus 10 % DMSO und 90 % RPMI-1640-Medium wu de nach zügigem Au auen im Wasse bad in ein Sch aub öh chen mi 10 ml o gewä m en Bowman G ay (BG)-1 Kul u medium aus RPMI-1640-Medium, 10 % e alen Kälbe se um und Penicillin-S ep omycin (Pen.-S .) (30.000 U Pen. /30.000 mg S . je 500 ml RPMI-1640) ans e ie . Zu En e nung des zy o oxischen DMSO wu de nach ün minü ige Zen i uga ion bei 1250 Umd ehungen p o Minu e de Übe s and abgesaug und 3 ml o gewä m es BG-1 Zellkul u medium hinzuge üg . Nach dem Resuspendie en e olg e die Übe üh ung de Zellen in eine Zellkul u lasche, die 10 ml o gewä m es BG-1-Kul u medium en hiel . Die Zellen wu den nun in eine Zellkul u lasche in einem B u sch ank bei 37 °C Umgebungs empe a u und 5 % CO2 kul i ie . Zweimal wöchen lich wu de eine Passagie ung de Zellen bei eine Kon luenz on e wa 80 % du chge üh . Dazu wu den zunächs de Übe s and mi els eine Vakuumpumpe und anschließend nich -adhä en e Zellen nach einem Spül o gang du ch Zu- gabe on 5 ml PBS abgesaug . Um adhä en e Zellen zu lösen, wu den 4 ml de P o easelösung T ypsin-EDTA in PBS hinzugegeben und ü 5 Minu en im B u sch ank inkubie . Die einge- lei e e Reak ion wu de du ch Zugabe on 6 ml BG-1 Zellkul u medium ges opp . Zu En e - nung de T ypsin-Lösung wu den die Zellen in ein 50 ml-Röh chen übe üh , bei 1250 Umd ehungen p o Minu e ü 5 Minu en zen i ugie und nach Abnahme des Übe s andes 10 ml o gewä m es BG-1-Kul u medium hinzuge üg . Nach dem Resuspendie en de Zellen wu den diese im Ve häl nis 1:5 in zwei neue Kul u laschen mi einem Gesam olumen on jeweils 10 ml du ch Zu ügen on BG-1-Kul u medium au ge eil . Die gesam e Zellkul i ie ung e olg e an eine S e ilbank. 2.2.2 Ve suchsau bau de zweidimensionalen Zellkul u expe imen e 750.000 pa en ale BG-1-Zellen ode 1,5 Mio. Pacli axel- esis en e BG-1-Zellen wu den nach eine au oma isie en Zellzahlbes immung mi els des NYONE® Scien i ic in 2 ml BG-1- Kul u medium espek i e 2 ml BG-1-Kul u medium mi eine Pacli axelkonzen a ion on 40 ng/ml in eine 6-Well-Pla e ausgesä und bei 37 °C und 5 % CO2 kul i ie . Nach de Aus- saa wu de das Zellwachs um jede 24 S unden du ch Au nahmen mi els des au oma isie en 24 ADAM17-Ak i i ä mi s eigenden Pacli axelkonzen a ionen nich nachzuweisen, jedoch kann eine zusä zliche Inhibie ung on ADAM17 die basale F eise zung on AREG eduzie en. Abbildung 2: Dynamik de Wachs ums ak o eise zung on AREG in Abhängigkei de Pacli- axelkonzen a ion (A) Pa en ale BG-1-O a ialka zinomzellen wu den nach eine Kul i ie ungszei on 24 S unden ü insgesam 48 S unden mi Pacli axel und dem ADAM10-Inhibi o GI ode dem kombinie en ADAM10- und ADAM17-Inhibi o GW beziehungsweise eine Lösungsmi elkon olle aus DMSO behandel . Die AREG-Konzen a ion im Übe s and wu de im Anschluss an die Behandlung mi els ELISA quan i i- zie . (B) Das Expe imen wu de analog zu (A) mi Pacli axel- esis en en BG-1-O a ialka zinomzellen du chge üh und die AREG-Konzen a ion nach de Behandlung en sp echend e mi el . Die Abbildun- gen zeigen jeweils die Mi elwe e d ei oneinande unabhängige Expe imen e ± SD. 3.1.2 Eine ADAM17-Inhibi ion sensi i ie BG-1-O a ialka zinomzellen gegenübe Pacli axel Um den E ek eine Kombina ionsbehandlung aus eine ADAM17-Inhibi ion sowie Pacli axel e gleichend mi eine Einzelbehandlung aus Pacli axel zu un e suchen, wu den pa en ale und esis en e O a ialka zinomzellen neben un e schiedlichen Konzen a ionen Pacli axel zusä z- lich mi dem ADAM10-Inhibi o GI ode dem kombinie en ADAM10- und ADAM17- Inhibi o GW beziehungsweise eine Lösungsmi elkon olle aus DMSO ü insgesam 48 S unden behandel . De Behandlungse ek wu de übe die Zell iabili ä sowie die Caspase- ak i i ä quan i izie . Bei den pa en alen Zellen zeig e sich ein deu lich s ä ke e Behandlungse ek de Kombina ionsbehandlung aus GW und Pacli axel gegenübe de Behandlung mi GI und BG-1 (pa en al) BG-1 (Pacli axel- esis en ) BG-1 (pa en al) BG-1 (Pacli axel- esis en ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 AREG-Konzen a ion [pg/ml] Pacli axel-Konzen a ion [µM] DMSO GI GW 0 50 100 150 200 250 300 350 400 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 AREG-Konzen a ion [pg/ml] Pacli axel-Konzen a ion [µM] DMSO GI GW A BG-1 (pa en al) BG-1 (Pacli axel- esis en ) B 25 Pacli axel sowie de Kon olle. Diese E ek wa hinsich lich de Zell iabili ä als auch de Caspaseak i i ä messba . Die Kombina ionsbehandlung aus Pacli axel und GW üh e zu eine e wa du chschni lich zwei achen E höhung de Caspaseak i i ä sowie eine Reduk ion de Zell iabili ä um den Fak o 0,5 im Ve gleich zu Kon ollbehandlung. Die Pacli axel- esis en en BG-1-Zellen zeig en inne halb jedes Behandlungsansa zes o z s eigende Pacli axelkonzen a ionen bis zu 0,5 µM kaum eine Ve minde ung de Zell iabili ä sowie E höhung de Caspaseak i i ä . Auße dem konn e bei den Pacli axel- esis en en BG-1- Zellen beobach e we den, dass e s Pacli axelkonzen a ionen g öße gleich 5 µM eine deu liche Abnahme de Zell iabili ä espek i e E höhung de Caspaseak i i ä induzie en. Die Zell iabili ä konn e du ch die zusä zliche Behandlung mi GW um du chschni lich e wa 20 % eduzie we den, die Caspaseak i i ä im Ve gleich zu Kon ollbehandlung um du chschni lich 34 % ges eige we den. Bei de höchs en Pacli axelkonzen a ionen on 10 µM wa de s ä ke e Behandlungse ek de Kombina ionsbehandlung aus eine ADAM17- Inhibi ion und Pacli axel mi eine S eige ung de Caspaseak i i ä um 63 % im Ve gleich zu Kon olle besonde s s a k ausgep äg . Beme kenswe is auch das Resul a , dass be ei s eine Einzelbehandlung mi GW ohne Pacli axel bei pa en alen und esis en en BG-1-Zellen zu eine deu lichen Abnahme de Zell iabili ä (Abnahme bei pa en alen Zellen um 30 %, bei esis en en Zellen um 23 %) sowie eine Zunahme de Caspaseak i i ä (Zunahme bei pa en alen Zellen um 50 %, bei esis en en Zellen um 31 %) im Ve gleich zu Kon oll- behandlung aus DMSO und NaCl üh e. Zusammen assend un e s eichen diese E gebnisse, dass eine Kombina ionsbehandlung aus Pacli axel und eine ADAM17-Inhibi ion eine e gleichsweise s ä ke e minde e Zell- iabili ä sowie e höh e Apop ose a e und dami einen s ä ke en Behandlungse ek im Ve gleich zu Einzelbehandlung mi Pacli axel bewi k . Die E gebnisse bes ä igen dies sowohl ü pa en ale als auch esis en e BG-1-Tumo zellen. 26 Abbildung 3: Die zusä zliche Inhibi ion on ADAM17 üh zu eine eduzie en Zell iabili ä und eine e höh en Caspaseak i i ä Pa en ale (A, B) sowie Pacli axel- esis en e (C, D) BG-1-O a ialka zinomzellen wu den nach eine 24-s ündigen Kul i ie ungszei mi Pacli axel und dem ADAM10-Inhibi o GI ode dem kombinie en ADAM10- und ADAM17-Inhibi o GW ode eine Lösungsmi elkon olle mi DMSO ü insgesam 48 S unden behandel . De Behandlungse ek wu de übe die Zell iabili ä sowie die Caspaseak i i ä anschließend quan i izie . Die Abbildungen zeigen jeweils die Mi elwe e d ei oneinande unabhän- gige Expe imen e ± SD. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 AREG-Konzen a ion [pg/ml] Pacli axel-Konzen a ion [µM] DMSO GI GW 0 50 100 150 200 250 300 350 400 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 AREG-Konzen a ion [pg/ml] Pacli axel-Konzen a ion [µM] DMSO GI GW A B B C D A 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 No malisie e Caspaseak i i ä Pacli axelkonzen a ion [µM] DMSO GI GW 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 No malisie e Caspaseak i i ä Pacli axelkonzen a ion [µM] DMSO GI GW 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 Zell iabili ä [Rela i e Ligh Uni s (RLU)] Pacli axelkonzen a ion [µM] DMSO GI GW 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 Zell iabili ä [RLU] Pacli axelkonzen a ion [µM] DMSO GI GW BG-1 (pa en al) BG-1 (pa en al) BG-1 (Pacli axel- esis en ) BG-1 (Pacli axel- esis en ) C D A B 27 3.2 E ablie ung eines 3D-O a ialka zinommodells 3.2.1 BG-1-O a ialka zinomzellen können Mul izellulä e Tumo sphe oide ausbilden Ziel de Un e suchung wa es zu übe p ü en, ob pa en ale und esis en e BG-1-O a ial- ka zinomzellen zu Ausbildung on MT be ähig sind. Hie zu wu den pa en ale ode esis en e BG-1-Zellen in ULA-Pla en ü 144 S unden kul i ie und im Anschluss da an e olg e eine Au nahme im Hell eld du ch das au oma isie e Mik oskop NYONEⓇ Scien i ic. Dabei zeig e sich, dass sowohl pa en ale als auch esis en e BG-1-Zellen MT ausbilden können (s. Abbildung 4). Un e schiede lassen sich insbesonde e hinsich lich des Kompak hei sg ades de Tumo zellen es s ellen. In e essan e weise wa en pa en ale BG-1 Zellen dazu ähig, kompak e MT auszubilden, wäh end esis en e BG-1-Zellen ein locke es mo phologisches E - scheinungsbild au wiesen. Da eine locke e S uk u mögliche weise mi eine e minde en Ausp ägung de cha ak e is ischen Eigenscha en eines MT wie de Ausbildung di e se G adien en on de Obe läche zum Zen um hin und mi eine e höh en Pene a ion on Wi ks o en assoziie is , wu den die Expe imen e de o liegenden A bei mi pa en alen BG-1-Zellen du chge üh . B A B A C C 28 Abbildung 4: Pa en ale und esis en e BG-1-O a ialka zinomzellen bilden un e schiedlich kon i- gu ie e Tumo sphe oide aus 4000 pa en ale (A) und esis en e (B) BG-1-Zellen wu den jeweils in eine ULA-Pla e ausgesä . Nach 96 S unden e olg e ein Mediumwechsel und nach wei e en 48 S unden diese ep äsen a i e Au nahme bei 10- ache Ve g öße ung. De Maßs ab zeig eine Länge on 500 µm. Zu Beobach ung des G ößen- wachs ums de MT übe die Zei wu den 350 pa en ale BG-1-Zellen ausgesä . Das Sphe oidwachs um eines ep äsen a i en Sphe oids wu de o lau end 24-s ündlich mi els des NYONEⓇ Scien i ic bei 10- ache Ve g öße ung au genommen (C). De Maßs ab zeig hie eine Länge on 200 µm. Abbildung (D) zeig ko espondie end zum Ve such in (C) eine ep äsen a i e Auswe ung des du chschni lichen Sphe oiddu chmesse s im zei lichen Ve lau on 24 bis 144 S unden nach Zellaussaa . 3.2.2 Zellzahl es ung zu He s ellung Mul izellulä e Tumo sphe oide de inie e Zielg öße Ab eine G öße on 500 µm können MT neben einem nek o ischen Zen um e schiedene Zonen (s. Abbildung 1) und cha ak e is ische G adien en ausbilden [47]. Das Ziel diese Un e suchung wa es, MT zu e zeugen, die nach 144 S unden Kul i ie ungszei ohne Du ch- üh ung eine Behandlung einen Du chmesse zwischen 500 und 650 µm au weisen. Um eine geeigne e Zellzahl zum E eichen diese o de inie en Zielg öße zu e mi eln, wu den zwischen 100 und 2250 pa en ale BG-1-Zellen (s. Abbildung 5) ausgesä . Diese Spannwei e wu de basie end au dem Ve such un e 3.2.1 es geleg . Wie Abbildung 5 zu en nehmen is , eigne sich eine Zellzahl on 100 BG-1-O a ialka zinomzellen, um die o de inie e Sphe oid- g öße zu e eichen. Bei diese Zellzahl wu de au Basis echnische T iplika e ein Mi elwe des Du chmesse s on 548,15 µm e ziel . Bei Ve wendung de Mik o i e pla e mi ul anied ige Anha ung des He s elle s Co ning (P oduk numme 4515) hingegen is zum E eichen de o de inie en Sphe oidg öße eine Zell- zahl on 350 BG-1-Zellen nö ig (s. Abbildung 4). 0 100 200 300 400 500 600 700 24 48 72 96 120 144 Du chschni liche Sphe oiddu chmesse [µm] Kul i ie ungszei [S unden] Sphe oiden wicklung D 29 Abbildung 5: Ein luss de Zellzahl au den Sphe oiddu chmesse Zu E mi lung eine geeigne en Zellzahl, um MT eine de inie en Zielg öße zu kul i ie en, wu den die angegebenen Zellzahlen (100, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250) ausgesä . Nach eine Kul i ie ungszei on 144 S unden wu den mik oskopische Au nahmen mi els des NYONEⓇ Scien i ic gene ie und de du chschni liche Du chmesse de MT wu de übe die YT®-So wa e e mi el . Die Abbildung zeig jeweils die Mi elwe e des Sphe oiddu chmesse s d ei echnische Replika e ± SD. 3.2.3 Tes ung zu E mi lung eine angemessenen Kul i ie ungszei de Mul izellulä en Tumo sphe oide bis zu Du ch üh ung eines Mediumwechsels Um eine angemessene Kul i ie ungszei ü Tumo sphe oide bis zum Zei punk des Medium- wechsels zu e mi eln, wu den 350 BG-1-O a ialka zinomzellen ausgesä und ü insgesam 216 S unden ohne Mediumwechsel kul i ie . Neben de Quan i izie ung des Zell ods du ch den CellToxTM G een Cy o oxici y Assay wu de das Sphe oidwachs um mik oskopisch im zei - lichen Ve lau analysie . Dabei zeig e sich wie Abbildung 6 zu en nehmen is , dass die Zy o oxizi ä bis zu eine Kul i ie ungszei on 144 S unden au einem nahezu kons an en Le el e blieb und e s ab diesem Zei punk begann anzus eigen. Nach 216 S unden zeig e das Sphe oid be ei s ein locke es mo phologisches E scheinungsbild, sodass die au oma isie e E kennung de Sphe oidg enze mi els de YT®-So wa e nich meh möglich wa und in olge- dessen keine Fluo eszenzin ensi ä szunahme analog zu den mik oskopischen Au nahmen gemessen wu de. Mo phologische Einzelzell e ände ungen, die mögliche weise du ch den Mangel an Näh s o en im Medium übe die Zei au e en könn en, wa en mik oskopisch nich e kennba . Zudem e b ach en auch die Ve ände ungen des Sphe oidwachs ums übe die Zei keinen Hinweis au einen op imalen Zei punk des Mediumwechsels. Zusammen assend läss sich du ch dieses E gebnis es s ellen, dass zu Sphe oidbildung aus 350 BG-1-Zellen ein Mediumwechsel nach spä es ens 144 S unden e olgen soll e. 0 500 1000 1500 2000 2500 100 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 Sphe oiddu chmesse [µm] Zellzahl Zellzahl es 30 Abbildung 6: Ve ände ung de Fluo eszenzin ensi ä übe die Zei ohne Mediumwechsel Um einen möglichs op imalen Zei punk des e s en Mediumwechsels zu e mi eln, wu den 350 pa en- ale BG-1-Zellen je Well in ULA-Pla en ausgesä . Zu un e schiedlichen Zei punk en wu de die Sphe oiden wicklung ep äsen a i im Hell eld bei 10- ache Ve g öße ung mik oskopisch au genom- men. Nach 24-s ündige Kul i ie ungszei wu de de CellToxTM G een Cy o oxici y Assay zu Quan i- izie ung des Zell ods übe die Zei angewende , wodu ch o lau end pa allel Fluo eszenzau nahmen mi els des NYONEⓇ Scien i ic e zeug we den konn en (A: A: Hell eld, B: Fluo eszenzau nahmen, C: Übe lage ung). Zudem wu de die du chschni liche Fluo eszenzin ensi ä eines Sphe oids übe die Zei ko espondie end zu dem Ve such in (A) mi els de YT®-So wa e bes imm (B). 3.2.4 Tes ung de Sphe oiduni o mi ä Zu Quan i izie ung on Behandlungse ek en is es e o de lich, dass Sphe oide am Tag de Behandlung eine möglichs hohe Uni o mi ä hinsich lich des Du chmesse s au weisen. In diese Un e suchung wu den 350 pa en ale BG-1-Zellen je Well ausgesä und nach eine 96-s ündigen Kul i ie ungszei wu de de Sphe oiddu chmesse gemessen. Wie die E gebnisse in Abbildung 7 zeigen, is es un e diesen Ve suchsbedingungen möglich, uni o me Sphe oide mi einem Mi elwe des Sphe oiddu chmesse s on 395,9 µm und eine S anda dabweichung on 22,7 µm zu bilden. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 24 48 72 96 120 144 168 192 216 No malisie e du chschni liche Fluo eszenzin ensi ä Kul i ie ungszei [S unden] Fluo eszenzin ensi ä sen wicklung B A 31 Abbildung 7: Tes ung de Sphe oiduni o mi ä Zu Tes ung de Uni o mi ä on Sphe oiden wu den 350 pa en ale BG-1-Zellen je Well ausgesä und nach 96 S unden Kul i ie ungszei de jeweils du chschni liche Sphe oiddu chmesse on n=96 Sphe- oiden du ch die YT® -So wa e gemessen. Im Diag amm is eine Punk wolke abgebilde , in de jede Punk einen Messwe da s ell . De Mi elwe is übe die b ei e e mi le e Linie inne halb de Punk - wolke, die S anda dabweichung is übe die beiden außen liegenden Linien da ges ell . 3.2.5 O a ialka zinomzellen bilden im Mul izellulä en Tumo sphe oid Zell-Zell- Kon ak e und einen P oli e a ionsg adien en aus Zu Da s ellung und zum Nachweis on Zell-Zell-Kon ak en sowie eines P oli e a ions- g adien en inne halb on MT wu de zunächs ein Ve suchsp o okoll e ablie . Es wu den 4000 pa en ale BG-1-O a ialka zinomzellen in eine ULA-Pla e ausgesä und nach eine Zell- kul i ie ungszei on insgesam 144 S unden e olg e die his ologische Au a bei ung. Im Anschluss da an wu de eine Fä bung mi Häma oxylin-Eosin sowie eine immunhis ochemische Fä bung des epi helialen Ma ke s E-Cadhe in und des P oli e a ionsma ke s Ki-67 du chge- üh . Diese Un e suchung zeig e, dass die epi helialen O a ialka zinomzellen inne halb eines MTs in einem dich en Zell e band angeo dne sind (Abbildung 8A). De P eil in Abbildung 8A zeig einen e mu lich a i iziellen Be eich, in dem Zellkon ak e du ch die his ologische Au a bei ung gelös wu den. Da übe hinaus konn e eine s a ke memb ans ändige E-Cadhe in- Exp ession nachgewiesen we den. De epi heliale Phäno yp blieb auch in Be eichen e hal en, die deu lich übe 50 µm un e de Obe läche des MT liegen (Abbildung 8B). Zusä zlich konn e übe die Exp ession des P oli e a ionsma ke s Ki-67 gezeig we den, dass sich inne halb de Tumo sphe oide ein abnehmende P oli e a ionsg adien on de Zellobe läche hin zum Inne en des MT ausbilde . Zusammen assend zeigen diese Un e suchungen, dass pa en ale BG-1-O a ialka zinomzellen nach eine Kul i ie ungszei on 144 S unden dich e Zell-Zell-Kon ak e inne halb des MT n=96 Du chschni liche Sphe oiddu chmesse [µm] 500 450 400 300 250 350 Uni o mi ä s es ung 32 ausbilden. Zudem läss sich in diesen eine cha ak e is ische Ausbildung eines P oli e a ions- g adien en nachweisen. Abbildung 8: Nachweis on Zell-Zell-Kon ak en und eines P oli e a ionsg adien en Insgesam wu den 4000 pa en ale BG-1-Zellen nach eine Kul i ie ungszei on 144 S unden in eine ULA-Pla e in Aga ose und anschließend in Pa a in eingebe e . Da au hin wu den Pa a inschni e de MT ange e ig und es e olg e eine Fä bung mi Häma oxylin-Eosin (A) ode eine immunhis oche- mische Fä bung des epi helialen Ma ke s E-Cadhe in (B) ode des P oli e a ionsma ke s Ki-67. Die mik oskopischen Au nahmen wu den bei eine 20- achen Ve g öße ung au genommen und zeigen ep äsen a i e MT-Anschni e ohne Behandlung. De Maßs ab zeig jeweils eine Länge on 50 µm. 3.2.6 Cha ak e isie ung on Mul izellulä en Tumo sphe oiden mi els Fluo eszenz a b- s o en In diese Un e suchung soll e mi hil e on Fluo eszenz a bs o en übe p ü we den, ob MT aus pa en alen BG-1-O a ialka zinomzellen ein cha ak e is isches Ve eilungsmus e on i alen und o en Zellen du ch die en s ehenden G adien en om Zen um bis zu Pe iphe ie au weisen. Dazu wu den pa en ale BG-1-Zellen zunächs ü insgesam 144 S unden kul i ie . Im Anschluss da an wu den die Fluo eszenz a bs o e Calcein-AM (g ün luo eszie ende Fa bs o zu An ä bung i ale Zellen), PI ( o luo eszie ende Fa bs o zu An ä bung o e Zellen) sowie Hoechs 33342 (blau luo eszie ende DNA-Fa bs o zu Ke ngegen- ä bung) hinzuge üg und es wu den luo eszenzmik oskopische Au nahmen bei eine 10- achen Ve g öße ung mi els des au oma isie en Mik oskops NYONEⓇ Scien i ic e s ell . Eine hohe Fluo eszenzin ensi ä on Hoechs 33342 sowie Calcein-AM wa insbesonde e im Randbe eich de MT es zus ellen. Im zen alen Be eich hingegen wa eine leich e s ä k e Fluo eszenzin ensi ä on PI zu e zeichnen. Zusammen assend deu en die E gebnisse au einen cha ak e is ischen Au bau de MT hin A B C 33 (s. Abbildung 1). In de äuße en Zone zeig e sich e wa ungsgemäß eine e höh e Zell iabili ä , im Zen um wa eine e höh e Akkumula ion on o en Zellen nachzuweisen. Abbildung 9: Fluo eszenzmik oskopie zu Visualisie ung on Zell iabili ä und Zell od 350 pa en alen BG-1-Zellen wu den je Well in eine ULA-Pla e ausgesä und nach eine 96-s ündigen Kul i ie ungszei e olg e ein Mediumwechsel. Nach wei e en 48 S unden wu den Tumo sphe oide ü insgesam 180 Minu en mi den Flu eszenz a bs o en Calcein-AM, PI sowie Hoechs 33342 inkubie . Im Anschluss da an e olg en Au nahmen bei 10- ache Ve g öße ung im Hell eld sowie luo eszenz- mik oskopisch mi els des NYONEⓇ Scien i ic. De Maßs ab de ep äsen a i en Au nahmen zeig eine Länge on 200 µm. 3.2.7 Tes ung des Behandlungse ek s übe die Sphe oid läche im 3D-O a ial- ka zinommodell In diese Un e suchung soll e analysie we den, ob die Sphe oid läche ein geeigne es Maß zu Quan i izie ung on Behandlungse ek en sein könn e. Dazu wu den 350 BG-1-Zellen ausgesä und mi s eigenden Pacli axelkonzen a ionen sowie zu Ve gleichba kei mi de Lösungsmi - elkon olle DMSO behandel . Die E gebnisse zeigen, dass s eigende Pacli axelkonzen a ionen zu eine Abnahme de Sphe oid läche üh en. Diese E ek keh e sich alle dings bei seh hohen Pacli axelkonzen a ionen on 50 µM um und es wa dann eine Zunahme de Sphe oid- läche nachzuweisen. Die mik oskopischen Au nahmen zeigen, dass eine Konzen a ion on 50 µM Pacli axel eine Ve ände ung des Kompak hei g ades zu einem locke en Zell e band bewi k e und dami eine G ößenzunahme des MT esul ie e. Da übe hinaus konn e eine Ve - ände ung des Sphe oidkompak hei g ades du ch eine Pacli axelbehandlung mi els his o- logische Un e suchungen bes ä ig we den (s. Abbildung 10). 40 ADAM10- und ADAM17-Inhibi o GW ode de Lösungsmi elkon olle DMSO. 3 S unden o Ablau de Gesam behandlungszei on 48 S unden wu de de Fluo eszenz a bs o Calcein-AM und PI hinzu- ge üg , sodass nach insgesam 48-s ündige Behandlung luo eszenzmik oskopische Au nahmen bei 10- ache Ve g öße ung mi els des NYONEⓇ Scien i ic gene ie we den konn en (A: Obe e Reihe mi zusä zliche DMSO-Behandlung; un e e Reihe mi zusä zliche GW-Behandlung). De Maßs ab de ep äsen a i en Au nahmen zeig eine Länge on 250 µm. Zusä zlich wu den die du chschni lichen Fluo eszenzin ensi ä en nach Fä bung mi PI du ch Einsa z de YT®-So wa e bes imm (B). In Ve - suchsansa z B wu den pa en ale BG-1-O a ialka zinomzellen nach ini iale 96-s ündige Sphe oid- o ma ion ü insgesam 48 S unden mi Pacli axel behandel . Diese Behandlung wu de du ch die Zu- gabe des ADAM10-Inhibi o s GI ode des kombinie en ADAM10- und ADAM17-Inhibi o s GW beziehungsweise de Lösungsmi elkon olle DMSO e gänz . Anschließend wu de de CellToxTM G een Cy o oxici y Assay hinzuge üg und zu Quan i izie ung de Zy o oxizi ä wu de eine Fluo eszenzin en- si ä sbes immung du ch Einsa z de YT®-So wa e au G undlage on luo eszenzmik oskopischen Au nahmen du chge üh (C). Nachgeschal e e olg e die Zell iabili ä sbes immung (lumineszenz- basie ) de Tumo zellen du ch den CellTi e -Glo® Cell Viabili y Assay (D). Die Diag amme C und D zeigen jeweils die Mi elwe e d ei oneinande unabhängige Expe imen e ± SD. 4 Diskussion Das O a ialka zinom weis un e den gynäkologischen Tumo en die höchs e Le ali ä mi einem ela i en 5-Jah es-Übe leben on 43 % P ozen au . Die Häl e alle Todes älle un e den Tumo e k ankungen des weiblichen Geni als is au das O a ialka zinom zu ückzu üh en [1]. Ein wesen liche Fak o ü die schlech e P ognose de Pa ien innen is die sich häu ig en wickelnde Chemo he apie esis enz, die bei nahezu 75 % alle Pa ien innen wäh end de The apie au i . Dabei un e scheide man zwischen zwei Fo men: 1) Es wu de eine in- insische Chemo esis enz besch ieben, bei de Tumo zellen be ei s eine Resis enz gegenübe des medikamen ösen The apeu ikums au weisen. 2) Auße dem wu de eine e wo bene Chemo- esis enz nachgewiesen, die sich e s wäh end eine medikamen ösen The apie en wickel [76]. Die zug unde liegenden Mechanismen de Chemo he apie esis enz sind zum gegenwä igen Zei punk noch nich olls ändig e s anden. So spielen beispielsweise ein e ände e Me abolismus on Medikamen en übe eine Dys egula ion on me abolisie enden Enzymen wie de Cy och om P450-Enzyme, Glu a hion-S-T ans e asen und U idin Diphospho (UDP)- Glucu onosyl ans e asen, ein e minde e In lux beziehungsweise ges eige e E lux on Medikamen en du ch Memb an anspo e ode eine Dys egula ion des zellulä en Me abolis- mus on Tumo zellen eine bedeu same Rolle [27]. Demzu olge is neben de Un e suchung de molekula en Mechanismen de Chemo he apie esis enz die Iden i izie ung und he apeu ische Tes ung neue Ziels uk u en zu Umgehung on Chemo he apie esis enz on hohe Rele anz hinsich lich eine e olg eichen The apie des O a ialka zinoms. Die Me allop o ease ADAM17 41 s and als mögliche Ziels uk u zu Umgehung on Chemo he apie esis enz im Fokus de Un e suchungen. Eine Übe exp ession on ADAM17 konn e sowohl du ch lusszy ome isch in e schiedenen Tumo zelllinien solide Tumo en wie dem O a ial-, Mamma-, P os a a- und Kolonka zinom als auch in eine immunhis ochemischen Analyse on O a ialka zinom-, Mammaka zinom und P os a aka zinomgewebe gezeig we den [18]. In eine Me aanalyse konn e zudem es ges ell we den, dass eine Übe exp ession on ADAM17 im Tumo gewebe mi eine schlech en klinischen P ognose und einem e höh en Me as asie ungs isiko in un e - schiedlichen soliden Tumo en i ä en ko elie [22]. Un e suchungen konn en auße dem zeigen, dass eine Ak i ie ung on ADAM17 eine konseku i e F eise zung on e schiedenen Liganden des Ty osinkinase ezep o s EGFR wie zum Beispiel des Wachs ums ak o s AREG zu Folge ha . AREG, das zu einem de am häu igs en o kommenden ADAM17-Subs a e beim o gesch i enen O a ialka zinom zähl [29], is übe die Bindung an den EGFR dazu be ähig , eine Ak i ie ung des EGFR-Signalwegs auszulösen. Dessen ges eige e Ak i ie ung is mi de En s ehung on e wo bene Chemo he apie esis enz assoziie [28, 30]. Wang e al. konn en in diesem Zusammenhang am hepa ozellulä en Ka zinom eine du ch ADAM17- Übe exp ession e mi el e Ak i ie ung des EGFR-Signalwegs zeigen, die zu eine e s ä k en Resis enz gegenübe dem Chemo he apeu ikum Cispla in üh e [77]. Da übe hinaus konn e eine S udie aus unse e A bei sg uppe an O a ialka zinomzellen zeigen, dass das Chemo he a- peu ikum Cispla in zu einem konzen a ionsabhängigen Ans ieg de ADAM17-Ak i i ä üh en kann [30]. Da bislang aglich wa , ob auch das beim O a ialka zinom häu ig eingese z e Chemo he apeu ikum Pacli axel einen Ein luss au die ADAM17-Ak i i ä haben könn e, wu de diese F ages ellung im Zellkul u modell nähe un e such . 4.1 Ein luss des Chemo he apeu ikums Pacli axel au die ADAM17-Ak i i ä In einem e s en Sch i wu de in einem 2D-Zellkul u sys em de Ein luss des Chemo he apeu- ikums Pacli axel au die ADAM17-Ak i i ä analysie . Dazu wu de die Konzen a ion des ansmemb anä en Glykop o eins AREG, ein häu ig o kommendes ADAM17-Subs a in Aszi es beim o gesch i enen O a ialka zinom, quan i izie [29]. Es konn e gezeig we den, dass die Behandlung mi Pacli axel zu einem konzen a ionsabhängigen Ans ieg de AREG- F eise zung und dami ges eige en ADAM17-Ak i i ä üh . Einen E klä ungsansa z ü die e s ä k e AREG-F eise zung bei s eigenden espek i e hohen Pacli axelkonzen a ionen geben die S udiene gebnisse on Somme e al., die demons ie en konn en, dass eine ADAM17-Ak i e ung übe die Obe lächenexp ession on Phospha idylse in im Rahmen de 42 Apop ose e olg . Dabei konn e eine e höh e Shedding-Ak i i ä on ADAM17 übe eine ges eige e F eise zung des ADAM17-Subs a es TGF α nachgewiesen we den [78]. Übe diesen Mechanismus könn e die e höh e ADAM17- e mi el e AREG-F eise zung bei e höh en Pacli axel-induzie en Apop ose a en e klä we den. Da übe hinaus geben diese E gebnisse einen indi ek en Hinweis da au , dass die Me allop o ease ADAM17 übe die Chemo he apie- induzie e F eise zung des Wachs ums ak o s AREG eine Rolle bei de Ve mi lung on Chemo he apie esis enz spielen könn e und dami eine iel e sp echende Ziels uk u da s ell . Diese These wi d ges ü z on unse em Resul a , dass die AREG-Konzen a ion im Übe s and des Kon ollbehandlungsansa zes bei den Pacli axel- esis en en BG-1-Zellen im Ve gleich zu den pa en alen Pacli axel-sensiblen BG-1-Zellen bei gleichen Behandlungsbedingungen e höh wa , was eben alls au eine ADAM17- e mi el e Resis enzbildung hindeu en könn e. Dieses E gebnis wi d on Huang e al. ges ü z , die an humanen Chond osa komzellen zeigen konn en, dass du ch Ausp ägung eine Cispla in esis enz eine Zunahme de Amphi egulin-mRNA- Exp ession um nahezu 100 % zu beobach en is im Ve gleich zu Cispla in-sensi i en Pa en alzellen [79]. In e essan e weise läss sich in de Zusammenschau de E gebnisse eine Chemo he apie-induzie e ADAM17-Ak i ie ung unabhängig om Mechanismus des Chemo he apeu ikums e kennen. Wäh end Pacli axel eine Abbauhemmung on Mik o ubuli in de Mi osephase bewi k , en al e das Chemo he apeu ikum Cispla in die an i umo öse Wi kung übe die Inhibi ion de DNA-Replika ion du ch Que e ne zung. 4.2 Un e suchung des Ein lusses eine zusä zlichen ADAM17-Inhibi ion zu kon en ionellen Chemo he apie Zue s wu de die F ages ellung un e such , ob du ch die E gänzung eines ADAM17-Inhibi o s zu Pacli axelbehandlung die F eise zung on AREG modulie we den kann. Es konn e gezeig we den, dass die Behandlung mi Pacli axel kombinie mi dem ADAM10- und ADAM17- Inhibi o GW bei pa en alen und Pacli axel- esis en en Zellen zu eine signi ikan e minde en F eise zung des Wachs ums ak o s AREG üh e. Die Kombina ionsbehandlung aus Pacli axel und dem ADAM10-Inhibi o GI zeig e im di ek en Ve gleich zu Einzelbehandlung aus Pacli- axel bei pa en alen BG-1-Zellen nahezu keinen Un e schied bezüglich de AREG-F eise zung. Bei Pacli axel- esis en en BG-1-Zellen ha e diese Kombina ionsbehandlungsansa z eine e gleichsweise ge ing ügig e minde e AREG-F eise zung zu Folge. Diese Be unde deu en da au hin, dass die AREG-F eise zung o wiegend du ch ADAM17- e mi el wi d, eine be eiligende Rolle on ADAM10 an de AREG-F eise zung insbesonde e bei Pacli axel- 43 esis en en BG-1-Zellen jedoch nich auszuschließen is . Eine ADAM10- e mi el e F ei- se zung on AREG is in de Li e a u bislang nich besch ieben wo den. Es wu de neben de ADAM17- e mi el en F eise zung alle dings nachgewiesen, dass AREG auch ein Subs a de Me allop o ease ADAM15 is [80]. Diese Beleg könn e eine E klä ung da ü sein, dass die AREG-F eise zung in keinem de Behandlungsansä ze olls ändig blockie we den konn e. Da übe hinaus wu de un e such , ob die Kombina ionsbehandlung aus Pacli axel und eine ADAM17-Inhibi ion einen s ä ke en Behandlungse ek un e Umgehung des möglichen ADAM17- e mi el en Chemo he apie esis enzmechanismus im Ve gleich zu Einzelbehand- lung aus Pacli axel zu Folge ha . Die Ve suche an pa en alen BG-1-Zellen e gaben, dass die Kombina ionsbehandlung aus Pacli axel und GW zu einem s ä ke en Behandlungse ek bezüglich de Zell iabili ä und Caspaseak i i ä im Ve gleich zu Einzelbehandlung mi Pacli- axel üh . Die esis en en BG-1-Zellen zeig en e wa ungsgemäß hingegen im nied igen Konzen a ionsbe eich bis 0,5 µM kaum ein Ansp echen au das Chemo he apeu ikum Pacli- axel. T o z des ge ingen Ansp echens wu de in diesem nied igen Konzen a ionsbe eich du ch die E gänzung on GW eine kons an e höh e Caspaseak i i ä sowie e minde e Viabili ä und dami ein e besse es Ansp echen e ziel . Da übe hinaus konn e mi diesem Behand- lungsansa z in den höhe en Konzen a ionsbe eichen a b eine Pacli axelkonzen a ion on 1 µM eine ge inge S eige ung de Caspaseak i i ä sowie Senkung de Zell iabili ä gemessen we den. Insgesam deu en die E gebnisse da au hin, dass bei den Pacli axel- esis en en BG-1- Zellen du ch die Hinzunahme on GW ein ge ing ügig s ä ke e Behandlungse ek im Ve - gleich zu Einzelbehandlung mi Pacli axel e eich we den kann. Dami konn e ein mögliche Ansa z zu Umgehung de Pacli axel esis enz demons ie we den. Die kombinie e Behandlung aus Pacli axel und dem selek i en ADAM10-Inhibi o GI üh e sowohl bei den pa en alen als auch den esis en en BG-1-Zellen zu eine ge ing ügigen Zu- nahme de Caspaseak i i ä sowie e minde en Zell iabili ä e glichen mi de Kon ollbe- handlung. Dieses Resul a deu e da au hin, dass de s ä ke e Behandlungse ek eine Kombi- na ionsbehandlung mi Pacli axel und GW o wiegend übe die Inhibi ion on ADAM17 und nu in seh ge ingem Maße übe ADAM10 e mi el wi d. Diese E gebnisse legen nahe, dass un e Hinzunahme eine ADAM17-Inhibi ion eine Sensi i ie ung de O a ialka zinomzellen gegenübe Pacli axel und demzu olge eine e besse e Wi kung des Chemo he apeu ikums e ziel we den kann. Diese Be unde we den un e maue on eine o ausgehenden S udie unse e A bei sg uppe, in de eben alls ein s ä ke e Behandlungse ek an O a ialka zinom- zellen du ch die Kombina ionsbehandlung un e Einsa z des Chemo he apeu ikums Cispla in in Kombina ion mi dem ADAM10- und ADAM17-Inhibi o GW gezeig we den konn e [30]. 44 Ein E klä ungsansa z ü die e besse e Wi kung de Kombina ionsbehandlung is dabei die geziel e Supp ession des ADAM17- e mi el en Chemo he apie esis enzmechanismus übe eine Inhibie ung de F eise zung des Wachs ums ak o s Amphi egulin. 4.3 E ablie ung des 3D-O a ialka zinommodells Zu Validie ung de E gebnisse aus de zweidimensionalen Kul u wa ein Haup ziel diese A bei , ein d eidimensionales in i o-O a ialka zinommodell zu e ablie en, dass die Komplexi ä eines in i o-Tumo s s ä ke als he kömmliche zweidimensionale Zellkul u - modelle be ücksich ig . Dies is insbesonde e o dem Hin e g und bedeu sam, dass im Jah e 2000 lediglich 5 % alle in p äklinischen S udien ge es e en Wi ks o e eine An i umo - Ak i i ä in klinischen S udien gezeig haben [81]. Du ch die in ensi e e Nu zung d ei- dimensionale Zellkul u ansä ze könn en unp äzise und ehle ha e Resul a e de p imä en Tes ung onkologische Wi ks o e e inge we den. 4.3.1 BG-1-O a ialka zinomzellen können Mul izellulä e Tumo sphe oide ausbilden Eine Un e suchung konn e in eine zweidimensionalen Zellkul i ie ung zeigen, dass BG-1- O a ialka zinomzellen im Ve gleich zu den O a ialka zinomzelllinien A2780, SKOV3, HEY und OVCA420 keine spon ane Sphe oidbildung zeigen [82]. Paullin e al. konn en mi els de Hanging d op-Me hode demons ie en, dass BG-1-O a ialka zinomzellen kompak e Mul i- zellulä e Tumo sphe oide ausbilden können [83]. Des Wei e en konn e de He s elle InSphe o (Schlie en, Schweiz) nachweisen, dass BG-1-Zellen in de Mik o i e pla e mi ul anied ige Anha ung G a i yTRAPTM zu Fo ma ion on MT be ähig sind [84]. Fü die Mik o i e pla en mi ul anied ige Anha ung (P oduk numme 7007 und 4515) om He s elle Co ning (Tewksbu y, USA) ehlen diese Un e suchungen bislang. Unse e E gebnisse zeigen, dass pa- en ale und esis en e BG-1-Zellen MT in de Mik o i e pla e (P oduk numme 7007) ausbil- den können. Fü pa en ale BG-1-Zellen konn e dieses Resul a auch in de Mik o i e pla e mi mi de P oduk numme 4515 e ziel we den. Bei nähe e Be ach ung de mik oskopischen Au nahmen konn en bei pa en alen und esis en en BG-1-MT deu liche Un e schiede hinsich - lich de Mo phologie beobach e we den. I ascu e al. un e eil en mik o umo ähnliche S uk u en bezüglich de Mo phologie in kompak e Sphe oide, es e und locke e Agg ega e [85]. Die pa en alen BG-1-Zellen bilde en in Bezug au die I ascu-Klassi ika ion es e Agg ega e aus, wohingegen esis en e BG-1-Zellen locke e Agg ega e ausbilde en. Da die cha ak e is ische Ausbildung di e se G adien en wie zum Beispiel eines Saue s o g adien en 45 in es e en Agg ega en ehe nachzuweisen sein könn e und die Ve suche mi eine möglichs umo ähnlichen 3D-Kul u du chge üh we den soll en, wu den die 3D-Zellkul u e suche mi pa en alen BG-1-Zellen du chge üh . Leung e al. konn en anhand eines Rechenmodells zeigen, dass kompak e Sphe oide e glichen mi locke kon igu ie en Sphe oiden einen s ei- le en Saue s o g adien ausbilden [86]. Au g und de ehlenden einhei lichen Klassi izie ung on Tumo zellagg ega en besch ieben wi die BG-1-Agg ega e als MT, auch wenn dies nich die mo phologische Klassi izie ung nach I ascu be ücksich ig . 4.3.2 Tes ung zu E mi lung eine angemessenen Kul i ie ungszei bis zu Du ch üh- ung eines Mediumwechsels Ein wesen liche Fak o bei de He s ellung on MT spiel de Zei punk des Mediumwechsels. Unse e E gebnisse zeig en, dass ein Teilmediumwechsel bei 350 ausgesä en BG-1-Zellen je Well spä es ens nach 144 S unden e olgen soll e. Nach diese Kul i ie ungszei wa ein deu - liche Ans ieg des Zell ods zu e zeichnen. Beme kenswe e weise zeig en sich im Ve lau de Kul i ie ung wede s a ke Ve ände ungen de Sphe oid läche, noch zeig en sich mik oskopisch mo phologische Zell e ände ungen, anhand de e ein angemessene Zei punk des Medium- wechsels abzulei en wä e. De Zei punk des Mediumwechsels is nich eindeu ig de inie und indi iduell au die jeweilige Zelllinie anzupassen. F ied ich und Kollegen besch ieben bei- spielsweise in eine A bei , dass eine Kul i ie ungszei on insgesam 96 S unden o de Behandlung eine ep oduzie ba e Fo mie ung on Sphe oiden un e schiedliche Zell ypen e mögliche. Sie en wickel en ein P o okoll zu Kul i ie ung und Behandlung on Tumo - sphe oiden, in dem ein Teilmediumwechsel on 50 % am Behandlungs ag nach 96-s ündige Kul i ie ung emp ohlen wi d [60]. Rod íguez-Do an es e al. e ablie en ein P o okoll zu Bildung on P os a aka zinom-Sphe oiden und de inie en hingegen einen Teilmediumwechsel on 50 % alle 7 Tage [87]. 4.3.3 Tes ung de Sphe oiduni o mi ä Ein Ve suchsziel zu möglichs exak en Quan i izie ung on Behandlungse ek en wa es, dass Sphe oide am Tag de Behandlung eine ge inge Va iabili ä des Du chmesse s au weisen. Zu diesem Ziel wu de eine Tes ung de Sphe oiduni o mi ä o Behandlungsbeginn in unse em P o okoll zu He s ellung on d eidimensionalen MT e ablie . Dazu wu den die Du chmesse ü jedes MT au de G undlage de mik oskopischen Au nahmen be echne und zu Analyse de Sphe oiduni o mi ä wu den aus diesen Messwe en dann desk ip i e Pa ame e wie de 46 Mi elwe und die S anda dabweichung e mi el . Kons an e Ve suchsbedingungen konn en somi au gezeichne und nachgewiesen we den. Einen wei e en Weg zu Uni o mi ä skon olle s ell en Zanoni e al. du ch den Einsa z so wa eges ü z e Selek ion nach eine Analyse des Sphe oid olumens und de Sphe oidsphä izi ä da . Zudem konn en sie demons ie en, dass bei dem Ve suchsziel eine hohen Uni o mi ä neben des Sphe oid olumens auch die Be ück- sich igung de Sphe oid o m ( und ode nich - und) als Pa ame e on Bedeu ung sein kann. In de en Un e suchungen wiesen Sphe oide mi gleichem Volumen, abe un e schiedliche Fo m eine signi ikan un e schiedliche Zell iabili ä au [74]. Diese Pa ame e wu de in de o - liegenden A bei nich gemessen, könn e abe bei zukün igen A bei en einen wei e en Vo eil bezüglich de Uni o mi ä bedeu en. 4.3.4 O a ialka zinomzellen bilden im Mul izellulä en Tumo sphe oid Zell-Zell- Kon ak e und eine P oli e a ionszone aus Ein wei e e bedeu same Fak o zu He s ellung on MT is de Nachweis cha ak e is ische Sphe oideigenscha en. Au g und de bis da o ehlenden einhei lichen De ini ion on unden Tumo zellagg ega en sind diese nich eindeu ig de inie . In zahl eichen wissenscha lichen A bei en wu den als Cha ak e is ika on Tumo zellagg ega en die Ausbildung on Zell-Zell- Kon ak en, ein zonale Au bau (P oli e a ionszone, Ruhende Zone, Nek o isches Zen um) und die Ausbildung e schiedene G adien en wie zum Beispiel eines Saue s o - g adien en besch ieben [88, 74, 48]. In diese A bei wu den zwei Eigenscha en nähe un e - such : 1) Zell-Zell-Kon ak e 2) P oli e a ionszone. Zu Da s ellung de Sphe oida chi ek u im Übe blick wu de eine HE-Fä bung du chge üh und zum Nachweis on Zell-Zell-Kon ak en wu de übe eine immunhis ochemische Fä bung die Exp ession on E-Cadhe in analysie . Die Un e suchung zeig e, dass pa en ale BG-1 O a ialka zinomzellen inne halb eines dich en Zell- e bandes eine s a ke E-Cadhe in-Exp ession au weisen. E-Cadhe in is als ansmemb anöses P o ein an de Ausbildung on Zellkon ak en wie de Adhe ens Junc ions als auch de Desmo- somen be eilig [89]. Dass E-Cadhe in nich nu eine bedeu same Rolle bei Zell-Zell- Ve bindungen spiel , sonde n auch die Fo m on MT und de en Chemosensi i i ä on E-Cadhe in abhängig is , konn en wissenscha liche Un e suchungen un e s eichen. Lin e al. konn en an Lebe ka zinomzellen demons ie en, dass de Kompak hei sg ad on Sphe oiden mi de E-Cadhe in-Exp ession ko elie e. Unse e E gebnisse aus de 3D-Zellkul u mi pa en- alen BG-1-O a ialka zinomzellen können diesen Be und un e maue n. In e essan e weise konn e auch de Kompak ie ungsp ozess des Sphe oids du ch die Zugabe eines E-Cadhe in- An ikö pe s inhibie we den [90]. Fe ne konn en Nakamu a e al. an MT aus 47 Mammaka zinomzellen nachweisen, dass E-Cadhe in einen Ein luss au die Chemosensi i i ä haben kann. Die Chemosensi i i ä konn e in de 3D-Kul u du ch Zugabe eines E-Cadhe in- An ikö pe s signi ikan ges eige we den und en sp ach eine nahezu e gleichba en Chemo- sensi i i ä wie die de zweidimensionalen Kul u , welche im Ve gleich zu 3D-Kul u signi i- kan e höh wa [91]. Des Wei e en konn en unse e Un e suchungen einen Nachweis da übe e b ingen, dass MT aus pa en alen BG-1-Zellen eine cha ak e is ische äuße e P oli e a ions- zone ausp ägen ( gl. Abbildung 1). Die Ki-67-Exp ession wa im Be eich de Sphe oidobe - läche am höchs en ausgep äg und es konn e eine Abnahme ko elie end mi de Sphe oid ie e beobach e we den. Lau en e al. konn en an MT aus Pank easka zinomzellen zeigen, dass die Ausbildung eine äuße en P oli e a ionszone g ößenabhängig is . Wäh end kleine e Sphe oide mi einem Du chmesse on e wa 300 µm ein homogen e eil es Ki-67-P oli e a ionsmus e zeig en, konn e bei g öße en Sphe oiden mi einem Du chmesse on e wa 500 µm eine kla abg enzba e P oli e a ionszone nachgewiesen we den. Dieses Resul a konn e mi dem Thymi- din-Analogon 5-e hynyl-2´-deoxyu idine (EdU), einem wei e en P oli e a ionsma ke neben Ki-67, un e maue we den [92]. 4.3.5 Cha ak e isie ung on Mul izellulä en Tumo sphe oiden mi els Fluo eszenz- a bs o en Zu Un e suchung des zonalen Au baus eines MT (s. Abbildung 1) wu de das Ve eilungs- mus e on i alen und o en Zellen analysie . Unse e A bei sg uppe cha ak e isie e die Da en on BG-1-Zellen diese A bei e gleichend mi ie wei e en O a ialka zinomzelllinien OVCAR-8, SKOV-3, Ig o -1 und A2780 bezüglich dieses Ve eilungsmus e s und konn e zeigen, dass neben de Zelllinie BG-1 auch SKOV-3 und OVCAR-8 eine P oli e a ionszone und eine zen ale Zone on o en Tumo zellen au wiesen. Dieses Mus e konn e auch bei d ei on ie p imä en O a ialka zinompopula ionen nachgewiesen we den [88]. Indi ek könn e die hohe Dich e on o en Zellen im Zen um des MT au einen zen alen Nek osebe eich hinweisen. Die Un e suchung de Nek osezone du ch immunhis ochemische Fä bungen könn e Gegens and wei e üh ende S udien sein. Unse e Un e suchung zeig e zudem eine pe iphe e höh e Fluo eszenzin ensi ä des Fluo eszenz a bs o s Hoechs 33342. Dieses E gebnis s eh im Einklang mi unse e publizie en S udie, in de gezeig we den konn e, dass dich e e Tumo agg ega e espek i e MT aus den O a ialka zinomzelllinien BG-1, SKOV-3 und OVCAR-8 eine e höh e Fluo eszenzin ensi ä on Hoechs 33342 im Be eich de äuße s en Zellschich en au weisen. Bei locke en Tumo agg ega en de O a ialka zinomzellinien A2780 48 und Ig o -1 konn e hingegen eine hohe Fluo eszenzin ensi ä im Zen um de ek ie we den. Diese E gebnisse konn en wi an p imä en O a ialka zinomzellen bes ä igen [88]. 4.3.6 Tes ung des Behandlungse ek s übe die Sphe oid läche im 3D-O a ialka zinom- modell Ein mögliche Messpa ame e zu Quan i izie ung on Behandlungse ek en is die Sphe oid- g öße. Hi schhaeuse e al. zeig en die Wi ksamkei eines bispezi ischen An ikö pe s anhand des Sphe oid olumens, das sie aus zwei O hogonalen be echne en [93]. Unse e E gebnisse weisen hingegen da au hin, dass die Sphe oid äche bei MT aus BG-1-Zellen kein geeigne e Pa ame e zu Quan i izie ung des Behandlungse ek s da s ell . Wi konn en beobach en, dass s eigende Pacli axelkonzen a ionen zunächs zu eine Abnahme de Sphe oid läche üh en. Diese E ek keh e sich alle dings bei eine seh hohen Pacli axelkonzen a ion on 50 µM um und es wa olglich eine Zunahme de Sphe oid läche zu messen. Bei genaue e mik osko- pische Be ach ung de Mo phologie des MT konn e eine Au lösung des Kompak hei g ades es ges ell we den. Dieses Resul a könn e au eine e s ä k e Lösung de Zell-Zell-Kon ak e zu ückzu üh en sein. 4.3.7 T ansla ionale Ansa z: Sphe oidbildung on Aszi eszellen im 3D-O a ialka zi- nommodell Unse e E gebnisse zeigen, dass die Kul i ie ung on Aszi eszellen eine Pa ien in nach unse em e ablie en P o okoll zu Ausbildung on MT üh en. Da übe hinaus konn e übe die his ologische Au a bei ung eine kompak e Sphe oida chi ek u nachgewiesen we den. Dass sich dieses 3D-O a ialka zinommodell ü ansla ionale Ansä ze nu zen läss , konn en wi in eine wei e üh enden S udie demons ie en. Neben Zellen aus Aszi es wa en auch isolie e Zellen aus Tumo gewebe on O a ialka zinompa ien innen zu Ausbildung on MT be ähig [88]. 4.4 Validie ung de 2D-E gebnisse im 3D-O a ialka zinommodell 4.4.1 Ein luss des Chemo he apeu ikums Pacli axel au die ADAM17-Ak i i ä Zu wei e en Validie ung de E gebnisse aus de zweidimensionalen Kul u wu de de Ein luss on Pacli axel au die ADAM17-Ak i i ä in einem 3D-O a ialka zinommodell analysie . 49 Hie zeig e sich, dass zwa s eigende Pacli axelkonzen a ionen zu einem Ans ieg de ADAM17-Ak i i ä üh en, diese sich abe im Ve gleich zu den analogen Ve suchen im zwei- dimensionalen Zellkul u ansa z deu lich mode a e ausp äg e. Ein E klä ungsansa z da ü s ell die dich e Sphe oida chi ek u einhe gehend mi eine möglichen Einsch änkung des T ans- po s on Wachs ums ak o en inne halb des MT da . Zudem un e s eich die e gleichsweise mode a aus allende S eige ung de ADAM17-Ak i i ä du ch s eigende Pacli axel- konzen a ionen die cha ak e is ischen Resis enzeigenscha en des MT gegenübe Chemo- he apeu ika, da du ch den zonalen Au bau des MT eine Ba ie e gegenübe Chemo he apeu- ika e ich e wi d und olglich eine e minde e Pene a ion des Pha makons esul ie . Zusammen assend konn e in de d eidimensionalen Zellkul u eine ge ing ügig ausgep äg e S eige ung de ADAM17-Ak i i ä du ch das Chemo he apeu ikum Pacli axel gezeig we den. Die Induk ion de ADAM17-Ak i i ä du ch s eigende Pacli axelkonzen a ionen is e glei- chend zu zweidimensionalen Zellkul u deu lich ge inge ausgep äg , wodu ch auch eine mög- liche ADAM17- e mi el e Resis enzbildung schwäche aus äll . 4.4.2 Un e suchung des Ein lusses eine zusä zlichen ADAM17-Inhibi ion zu kon en- ionellen Chemo he apie Ein wei e es Ve suchsziel wa es, die E gebnisse aus de zweidimensionalen Kul u zu Un e - suchung des Ein lusses eine zusä zlichen ADAM17-Inhibi ion in de 3D-Kul u zu alidie en. Die Kombina ionsbehandlung aus Pacli axel und dem ADAM10- und ADAM17-Inhibi o GW e ziel e bei pa en alen 3D-kon igu ie en BG-1-Tumo zellen eine e gleichsweise mode a e e Reduk ion de AREG-Konzen a ion espek i e ADAM17-Ak i i ä . Dass eine ADAM17- Inhibie ung auch in einem komplexe en in i o-O a ialka zinom-Xenog a wi ksam is , konn en Richa ds e al. mi dem gegen ADAM17 ge ich e en An ikö pe D1 (A12) zeigen, dessen Einsa z zu eine ün achen Reduk ion de AREG-Aszi eskonzen a ion üh e [38]. De Behandlungsansa z aus Pacli axel und dem ADAM10- und ADAM17-Inhibi o GW üh e zu einem s ä ke en Behandlungse ek hinsich lich de Zy o oxizi ä im Ve gleich zu Einzel- behandlung aus Pacli axel. Da übe hinaus e ziel e de Behandlungsansa z aus Pacli axel und GW auch eine ge ing ügige Reduk ion de Zell iabili ä , die im Ve gleich zu dem analogen Ve such in de 2D-Kul u e s bei Pacli axelkonzen a ionen ab 0,01 µM beobach e we den konn e. Eine E klä ung da ü könn e die dich e Sphe oida chi ek u und die dami einhe ge- hende e minde e Pene a ion des The apeu ikums in Rich ung des Sphe oidzen ums sein, wodu ch die Sensi i ie ung de O a ialka zinomzellen gegenübe Pacli axel du ch die 56 57. 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Cance Immunol Im- muno he 59:1675–1684 59 7 Anhänge 7.1 Publika ions e zeichnis Teile diese A bei sind be ei s an olgenden S ellen e ö en lich wo den: O iginala bei en: Nina Hedemann, And eas He z, Jan Hend ik Schiepanski, Jan Di ich, Susanne Sebens, As id Demp le, Julia Feue bo n, Ch is oph Rogmans, Nils T ibian, Inken Flö kemeie , Jö g Weime , Sand a K üge , Nicolai Maass, Di k O. Baue schlag „ADAM17 Inhibi ion Inc eases he Impac o Cispla in T ea men in O a ian Cance Sphe oids” Cance s 2021, 13, 2039. Tagungsbei äge: And eas M. He z, Nina Hedemann, Reinhild Geisen, Nils T ibian, Jö g Weime , No be A nold, Nicolai Maass, Di k O. Baue schlag „Das Chemo he apeu ikum Pacli axel induzie die Ak i ie ung on A Disin eg in And Me allop o ease 17 (ADAM17) on O a ialka zionomzellen“ Vo ges ell au dem 1. Deu sche K ebs o schungskong ess (DKFK) 2019 in Heidelbe g. And eas M. He z, Nina Hedemann, Reinhild Geisen, Nils T ibian, Jö g Weime , No be A nold, Nicolai Maass, Di k O. Baue schlag „Pacli axel in Kombina ion mi eine Inhibi ion de Me allop o ease A Disin eg in And Me allop o ease 17 (ADAM17) s eige Apop ose in O a ialka zinomzellen“ Vo ges ell au de 133. Tagung de No ddeu schen Gesellscha ü Gynäkologie und Gebu s- hil e (NGGG) in Lünebu g. 60 7.2 Danksagung An e s e S elle gil ein g oße Dank meinem Dok o a e He n P o . D . Di k Baue schlag ü die Übe lassung des Themas und de Möglichkei , diese A bei in eine exzellen e ne z en Fo schungsumgebung du chzu üh en. Fü die s e ige Un e s ü zung, die on eine achlich hohen Expe ise gep äg en Impulse und die Fö de ung meines wissenscha - lichen In e esses bin ich seh dankba . Ganz besonde s möch e ich F au D . Nina Hedemann ü die he o agende Be euung danken. Die s e s p äsen e achliche Un e s ü zung und auße - gewöhnliche Hil sbe ei scha e bunden mi unzähligen kons uk i en und mo i ie enden Gesp ächen zu Planung und E aluie ung de Ve suche haben die A bei in einem auße o - den lichen Maß be eiche . Da übe hinaus danke ich dem Di ek o de Klinik ü Gynäkologie und Gebu shil e He n P o . D . Maass ü die Möglichkei , dass ich in seine Klinik p omo ie en du e. Ein wei e e Dank gil P o . D . No be A nold und D . Jö g Weime , die meine A bei mi ih e langjäh igen Expe ise im Be eich de gynäkologischen Onkologie beglei e haben und mi bei zahl eichen inhal lichen und echnischen F agen imme zu Sei e s anden. Dankba bin ich auch den ehemaligen und ak uellen Dok o anden des Onkologischen Labo s Nils T ibian, D . Ch is oph Rogmans, Julia Feue bo n, Leonie T eeck, D . Inken Flö kemeie , Jan Schiepanski, Jan Di ich und Ge i Hugendieck, die mi den Eins ieg ins expe imen elle A bei en eno m e leich e haben und du ch den eundscha lichen Aus ausch iel F eude be ei e haben. Zudem möch e ich an diese S elle den Mi a bei e n des onko- logischen Labo s Sig id Hamann, Do is Ka ow, Ca ha ina Ve kooyen und F ank Rösel danken, die mi iel Geduld und g oße Hil sbe ei scha zum Gelingen de A bei beige agen haben. Dem Ins i u ü expe imen elle Tumo o schung un e de Lei ung on F au P o . Susanne Sebens bin ich dankba ü die Mi benu zung de Räumlichkei en und Ge ä e des Ins i u s, abe o allem ü die wissenscha liche Fö de ung auch im Rahmen des Ze i ika s- s udiengangs Onkologie und das g oßa ige Engagemen bezüglich de Ve ne zung onko- logische Wissenscha le . Zahl eiche Gesp äche au achliche und pe sönliche Ebene we den mi in gu e E inne ung e bleiben. Dem Ins i u ü Pa hologie am Campus Kiel un e de Lei ung on He n P o . D . Ch is oph Röcken, insbesonde e F au Sand a K üge möch e ich ü die Un e s ü zung bei de immunhis ochemischen Au a bei ung de Tum osphe oide danken. Ein wei e Dank gil F au P o . D . Daniela Wesch und He n PD Hans-Hein ich Obe g aus dem Ins i u ü Immunologie ü die äumliche und achliche Un e s ü zung zu Beginn meine A bei . Abschließend gil ein ganz besonde e Dank meinen El e n Annema ie und Die e He z, meine F eundin Anna Be gjan, au de en Un e s ü zung ich mich jede zei e lassen konn e.