Adaptación metabólica del ciclo de las pentosas fosfato de corteza renal de rata. II. Efecto de diferentes situaciones patológicas sobre el comportamiento cinético de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y 6-fosfogluconato deshidrogenasa

- DEP ART AMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR. UNIVERSIDAD DE GRANADA ADAPTACIÓN METABÓLICA DEL CICLO DE LAS PENTOSAS FOSFATO DE CORTEZA RENAL DE RATA. n. EFECTO DE DIFERENTES SITUACIONES PATOLÓGICAS SOBRE EL COMPORTAMIENTO cINÉTICO DE LA GLUCOSA 6-FOSFATO DESHIDROGENASA y 6-FOSFOGLUCONATO DESHIDROGENASA Pe agón Sánchez, J.; Ga cía-Salgue o, L.; A anda Ha o, F.; Ba oso Alba acín, J. B. Y Lupiáñez Ca a, J. A. RESUMEN Se ha in es igado el e ec o de la acidosis c ónica y diabe es expe imen al, a co o y la go plazo, sob e las ac i idades deshid ogenasas del ciclo de las pen osas os a o de co eza enal de a a. A los 7 días de a amien o, la inges ión de una solución de CINH4 0.28 M p o oca un inc emen o en la ac i idad glucosa 6- os a o deshid ogenasa y 6- os oglucona o deshid ogenasa del o den del 90 y 60% espec i amen e; an o a concen ación sa u an e de sus a o como subsa u an e. La diabe es expe imen al p o ocada po la inyección in ape i oneal de alloxan (200 mg/Kg peso) induce, a los dos días, un inc emen o del 100% en la ac i idad G/PDH y del 40% en la 6PGDH an o a concen ación sa u an e como subsa u an e de sus a o. A co o plazo, no se de ec a ningún cambio en el compo amien o ciné ico de es e enzima. Las Kms pa a la glucosa 6- os a o deshid ogenasa y 6- os oglucona o deshid ogenasa en las dis in as si uaciones se man ienen sin a iaciones ap ecia bles. Se discu e la na u aleza de los cambios obse ados, así como su elación con p ocesos de c ecimien o y p oli e ación celula . SUMMARY The long- e m and sho - e m e ec s o ch onic me abolic acidosis and expe i men al diabe es on he PPC dehid ogenases ac i i ies ha e been in es iga ed. The inges ion o 0.28 M ammonium chlo ide solu ion p oduced and inc ease in he G6PDH y 6PGDH ac i i ies abou 90% and 60%, a day se en, ei he sa u a e o subsa u a e subs a e concen a ion. The alloxan induce diabe es (200 mg/Kg body weigh ) p oduced a signi ican inc ease o G6PDH and 6PGDH a ound lOO and A s Pha maceu ica. Tomo xxxn, Núms. 1-2-3 y 4,1991,53-60. 54 ARS PHARMACEUTICA 40% espec i ely, a bo h sa u a ing o subsa u a ing subs a e concen a ions. Ne e heless, no signi ican changes we e ound du ing he sho ime pe iods. Also, du ing hese pa hological si ua ions no signi ican a ia ions we e ound in he Km alues o G6PDH and 6PGDH. The na u e o hese inc eases and i s ela ionship wi h he enal hipe ophy and cellula p oli e a ion ha e been discussed. INTRODUCCIÓN La glucosa 6- os a o deshid ogenasa (G6PDH, EC 1.1.1.49) y 6- os oglucona o deshid ogenasa (6PGDH, EC 1.1.1.44) son las enzimas de la ama oxida i a del ciclo de las pen osas os a o que ca alizan las eacciones en las que se p oducen como p oduc os inales NADPHA y Ribulosa S-P. Ambos in e media ios son u ilizados bien como uen e de pode educ o o como p ecu so es es uc u ales básicos de di e en es mac omoléculas. Aunque en el hígado y o os ejidos es é cla amen e demos ada la al a capaci dad adap a i a de es a u a an e di e en es si uaciones nu icionales y ho monales (1-6), el iñón mues a una di e en e adap abilidad. Es a capacidad es á elacionada con p ocesos en los que se pone de mani ies o un aumen o en el abajo enal, c ecimien o y p oli e ación celula es (7-10). Dos si uaciones pa ológicas en las que en el iñón es án po enciados es os p ocesos son la acidosis me abólica c ónica y la diabe es expe imen al. El me abolismo de ca bohid a os en el hígado du an e es as si uaciones, ha sido ex ensamen e es udiado (11-17), pe o pocos son los abajos que in es igan el papel del ciclo de las pen osas os a o en co eza enal du an e la diabe es expe imen al y la acidosis c ónica. El g upo de McLean (9,10) ha encon ado una es echa elación en e diabe es expe imen al y el c ecimien o enal, p oli e ación celula y aumen o del lujo de glucosa a a és del ciclo e inc emen o de las ac i idades G6PDH y 6PGDH. De ahí que uno de los p opósi os del p esen e abajo haya sido es udia los e ec os de es a si uación pa ológica a co o y la go plazo sob e el compo amien o ciné ico de ambas deshid ogenasas. Una consecuencia de la diabe es es la acidosis ce ónica, un ipo pa icula de acidosis me abólica. Ambas si uaciones some en al iñón a un ele ado unciona mien o p o ocando una mayo capacidad en la p oducción de amonio y glucosa. Dichos aumen os son debidos a enómenos de inducción y ac i ación enzimá ica (16-20). Igualmen e se ha elacionado la acidosis me abólica c ónica con un au men o en el c ecimien o celula (21,22). La posible elación de odos es os enómenos con el compo amien o de las deshid ogenasas del ciclo de las pen osas os a o nos ha hecho es udia el e ec o a co o y la go plazo de dichas si uaciones sob e ambos enzimas. ARS PHARMACEUTlCA 55 MÉTODOS P ocedimien o Expe imen al Todos los expe imen os ue on lle ados a cabo en a as macho de aza Wis a , p e iamen e aclima ada a condiciones ambien ales es anda d. La diabe es expe imen al ue p o ocada po un óxico hepá ico, el alloxan, inyec ado in ape i onealmen e a una concen ación de 200 mg/Kg peso co po al, en un olumen mal de 1 mI. de solución salina (23). A los con oles solo se les inyec o ClNa 0.9%. El es ado diabé ico ue con olado midiendo glucosa en o ina y sang e. Las medidas se ealiza on a las 2 ho as y 2 días después de la inyección. La acidosis me abólica c ónica ue inducida sus i uyendo el agua de bebida po una solución de ClNH4 0.28 M (equi alen e al 15% peso/ olumen) en las que se man u o a los animales a lo la go de 7 días. Las ac i idades enzimá icas ue on ensayadas en ex ac os lib es de céhIlas ob enidos po cen i ugación a 30.000 g. du an e 30 minu os a 4°C., a pa i de homogenados isula es ob enidos de co es de co eza enal (150 mg/mI), en un medio de homogenización compues o de una solución 10 mM T is, 1 mM EDT A y 0.1 mM NADP, pH 7,6. Ensayos enzimá icos Las ac i idades glucosa 6- os a o deshid ogenasa y 6- os oglucona o deshid ogenasa a 25° C. ue on ensayadas según desc ibe Lupiañez e al (24) con algunas modi icaciones. Las concen aciones de sus a o u ilizadas ue on de 2 y 0.5 mM como sa u an e y subsa u an e espec i amen e. El medio de ensayo es aba compues o po 0.15 mI de sob enadan e, 5 mM EDTA, 0.6 mM NADP y 0.05 Y 2 mM de G6P o 6PG en un olumen inal de 1 mI. Los alo es ob enidos u ilizando G6P ue on co egidos con la ac i idad 6 PGDH. La concen ación de p o eínas en los ex ac os ue de e minada po el mé odo de Low y e al (25). Los alo es de Km y Vmax se ob u ie on aplicando la ep esen ación de Linewea e -Bu k a los esul ados ob enidos. Exp esión de los esul ados Los alo es de elocidad y ac i idad especí ica se exp esan como mU y mU/mg p o eína espec i amen e, de miéndose cada mU como la can idad de enzima nece sa ia pa a educi 1 nmol de NADP po minu o a 25° C. Todos los esul ados se ep esen an como el alo medio ± E o Es anda de la Media (SEM). Se u ilizó el es de S uden pa a calcula la signi icación es adís ica de las di e encias en e los animales a ados y los con oles. 56 ARS PHARMACEUTICA RESULTADOS y DISCUSIÓN Diabe es expe imen al y c ecimien o enal El alloxan es un ci o óxico especí ico de las células be a de los Islo es de Lange hans que induce la o u a de moléculas de DNA impidiendo la onnación de p o-insulina nonnal (26), ambién ac úa sob e la memb ana plasmá ica de es as células impidiendo la sec eción de es a honnona (27). Po es a azón se ha es udia do la in luencia a co o y la go plazo de la diabe es expe imen al, p oducida po es e óxico, sob e las ac i idades deshid o�enasas y sus pa áme os ciné icos. A los dos días de a amien o se obse a un inc emen o en la ac i idad G6PDH, ap oximadamen e de un 1 üO% a concen ación sa u an e siendo es e inc emen o semejan e al que iene luga a concen ación subsa u an e de glucosa 6- os a o. En el caso de la 6PGDH los inc emen os son de meno ango, al ededo del 40%. Es os aumen os p oducen di e encias signi ica i as en la Vmax de ambos enzimas mien as que las Kms se man ienen sin a iaciones ap eciables (Fig. 1). A co o plazo, 2 ho as de a amien o, no se obse a ningún cambio signi ica i amen e es imable. 30 � :; 5 � 20 u � .. '" w 10 o .. o '> ¡: u .. 20 ; .§ 10 E > " O .. 11 o O " � .. � ______ __ ____ � • • O� • 11 O TIEMPO (OlAS) 40 " Figu a 1.- E ec o de la diabe es expe imen al sob e el compo a mien o ciné ico de la G6PDH y 6PGDH. La concen ación de glucosa 6- os a o u ilizada como sa u an e ue de 2 mM (O) y como subsa u an e 0.05 mM (e). Km (.) y Vmas (O) se exp esan en M y m U y se ep esen an en la pa e in e io de la Figu a. Cada alo se exp esa como la media de al menos cua o expe imen os ± SEM. Di e encias signi ica i as en e animales con oles y a ados se exp esan como (*) p < 0.005 Y (**) p < 0.0005. ARS PHARMACEUTICA 57 Es e compo amien o nos hace supone que los inc emen os en la ac i idad enzimá ica sean más un p oduc o de la sín esis de nue as moléculas de enzima que de la ac i ación de las moléculas p eexis en es. Roge s e al. (28) u ilizando a as a adas con S ep ozo ocina, encuen a un inc emen o de un 30% en la can idad de p o eína mi ocond ial/g amo de ejido, e lejo de un inc emen o en el peso ela i o del iñón. Según es os au o es, es e aumen o es á ocasionado po una mayo demanda de A TP du an e el inc emen o del bombeo enal a que se e some ido es e ó gano du an e es a si uación pa ológi ca. Igualmen e se han desc i o inc emen os signi ica i os en el pe o enal, conse cuencia de enómenos de p oli e ación celula e hipe o ia de es e ó gano (8,9), así como un aumen o en el lujo de glucosa y en las ac i idades de los enzimas egulado es de es a u a (9,10). Encon ándose además, cla a elación en e es os enómenos de hipe o ia y la ac i ación de las u as de sín esis de nucleó idos de adenina (29). En de ini i a, como consecuencia del exceso de abajo al que se e some ida la co eza enal du an e es a si uación pa ológica, la ac i ación de los p ocesos de c ecimien o y p oli e ación celula es edunda á en un inc emen o de odos aquellos p ocesos de biosín esis de mac omoléculas necesa ias pa a los nue os eque imien os celula es. Las demandas de NADPH y pen osas os a o, necesa ias pa a la biosín esis de ácidos nucléicos, coles e ol, ácidos g asos, deben es a aumen adas y jus i icados así los inc emen os en las ac i idades de la G6PDH y 6PGDH posible men e p oduc o de un mecanismo de inducción enzimá ica más que de una ac i ación de las moléculas p eexis en es. Acidosis me abólica c ónica Las de e minaciones de las ac i idades enzimá icas se e ec ua on a los 3 y 7 días de consumo del ClNH4 0.28 M. Al igual que en el caso de la diabe es, obse a mos inc emen os en las ac i idades enzimá icas a la go plazo (sie e días de a amien o), an o a concen ación sa u an e como subsa u an e, del o den del 90% pa a la G6PDH y del 60% pa a la 6PGDH. A co o plazo ( es días), se man ienen los alo es cons an es. En el caso de los pa áme os ciné icos, exis en ue es inc emen os de la Vmax en e a una ausencia de al e aciones en la a inidad po sus sus a os (Km) (Fig. 2). Es o úl imo nos hace supone que los inc emen os en las ac i idades sean debidos a inc emen os en el núme o de moléculas de enzima. Du an e la acidosis me abólica c ónica, la misión del iñón adquie e especial ele ancia al se el enca gado de man ene el equilib io ácido-base del o ganismo. Además de con a es a el exceso de p o ones en el medio in e no, debe con ola el equilib io salino. La capacidad enal de sin e iza amonio y glucosa se e aumen ada (16). Es os aumen os se deben undamen almen e a inc emen os en las ac i idades de los enzimas de la u a, en unos casos son debidos a enómenos de los enzimas de la u a, en unos casos son debidos a enómenos de inducción a la go 58 30 GGPDH o 3 • • o ARS PHARMACEUTICA • 8PGOH •• ---- �.� ---- --4. 00 40 20 o TIEMPO COlAS) Figu a 2.- E ec o de la acidosis me abólica c ónica sob e el compo  amien o ciné ico de la G6PDH y 6PGDH. La concen ación de 6- us oglucona o u ilizada co no sa u an e ue de 2 nM (O) y co no subsa u an e 0.05 mM (e). Km (.) Y Vmax (O) se exp esan en M y m U y se ep esen an en la pa e in e io de la Figu a. Cada alo se exp esa co no la media de al menos cua o expe imen os ± SEM. Di e encias signi ica i as en e animales con oles y a ados se exp esan como (*) p < 0.01 Y (**) P < 0.0005. plazo (glu aminasa dependien e de os a o y glu ama o deshid ogenasa) (16,19) o de modulación co alen e, co o plazo, (18, 19). Además de es os enzimas, el ciclo de nucleó idos de pu ina es impo an e en la amoniogénesis enal en la a a, iéndose ue emen e ac i ado en si uaciones de acidosis c ónica (16, 30-31) inc emen ándose la adenil succina o sin en asa del o den de un 60% después de dos días de acidosis me abólica (16). El inc emen o en las ac i idades G6PDH y 6PGDH encon ado a la go plazo en es a si uación de al a p esión enal, puede, además, jus i ica se eniendo en cuen a a ios aspec os: a) se ha elacionado es a si uación un enómenos de hipe o ia enal (21, 22) posiblemen e elacionada con el aumen o en la p oducción de amonio y en la exc eción de p o ones. b) que du an e es a si uación me abólica es án po enciados odos aquellos mecanismos enca gados de e i a daños celula es p o ocados po el es és s oxida i o al que se encuen a some ido el iñón du an e es a si uación pa ológica (32-34). Ambas si uaciones pueden se las esponsables del inc emen o en las ac i idades deshid ogenasas del ciclo, al es a es e implicado di ec amen e an o en los enómenos de sín esis de nue as mac omoléculas como en los mecanismos de lucha con a los adicales ac i os de oxígeno. ARS PHARMACEUTICA 59 Conclusión global En es os dos abajos (7 y el p esen e), se ha pues o de mani ies o una cla a espues a adap a i a de las deshid ogenasas del ciclo de las pen osas os a o an e si uaciones es echamen e elacionadas con el c ecimien o enal y la p oli e ación celula como son el apo e masi o de aminoácidos en la die a, la acidosis c ónica y la diabe es expe imen al. Es a adap ación se p oduce a la go plazo y posiblemen e es el esul ado de un p oceso de inducción enzi ná ica. Se demues a así un papel básico de es a u a en la in aes uc u a me abólica del iñón, di e en e al encon a do en �l hígado, donde los es ímulos esponsables de sus espues as adap a i as es án más elacionados con las necesidades ene gé icas globales del o ganismo que con p ocesos básicos de c ecimien o del ó gano. AGRADECIMIENTOS Es e abajo cons i uye la publicación nº 158 del G upo de In es igación D o gas, Tóxicos Ambien ales y Me abolismo Celula . J.P. es beca io del P.F.P.I. de la Jun a de Andalucía. B iLIOGRAFÍA (1) TEPPERMAN, J. Y TEPPERMAN, H. M. (1958). Am. J. Physiol. 193,55-64. (2) RUDACK, E., cmSHOLM, E. M. Y HOLTEN, D. (1971). J. Bio. Chem. 246, pp. 1294-1254. (3) GARCÍA, D. R. Y HOLTEN, D. (1975). J. Biol. Chem. 250, pp. 3960-3965. (4) VOLPE, J. J. Y VAGELOS, P. R. (1976). Physiol. Re . 56, pp. 339-417. (5) GRIGOR, M. R. (1984). A chs. Biochem. Biophys. 229, pp. 612-622. (6) STUMPO, D. L. Y KLETZIEN, R. F. (1985). Biochem. J. 226, pp. 123-130. (7) PERAGON, J., ARANDA, F., GARCÍA-SALGUERO, L. y LUPIAÑEZ, J. A. (1989). A s Phannaceu ica. En p ensa. (8) SEYER-HANSEN, K., GUNDERSE, H. J. G. Y OSTERBY, R. (1981). Diabe ología. 21, pp. 374-375. (9) STEER, K. A., SOCHOR, R. M. Y McLEAN, P. (1985). 34, pp. 485-490. (lO) SOCHOR, M., KUNJARA, S., GREENBAU, A. L. Y McLEAN, P. (1986). Biochem. J. 234, pp. 573-577. (11) DESSI, S., CmODINO, c., BATETTA, B., LACONI, E., ENNAS, C. y PANI, P. (1985). Exp. Mole. Pa h. 43, pp. 177-186. 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