Influencia del tiempo de almacenamiento y de la congelación/descongelación sobre la composición en ácidos grasos de fosfolípidos de membranas de eritrocito y microsomas hepáticos de rata

DEPARTAMENTO INTERFACULTATIVO DE BIOQUIMICA INFLUENCIA DEL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO Y DE LA CONGELACION-DESCONGELACIÓN SOBRE. LA COMPOSICION EN ACIDOS GRASOS DE FOSFOLIPIDOS DE MEMBRANAS DE ERITROCITO Y MICROSOMAS HEPA TICOS DE RATA J.L. Pe iago, S. Molina, C. De-Lucchi y M.O. Suá ez RESUMEN Se ha de e minado el po cen aje en ácidos g asos p esen es en os olípi dos de memb anas de e i oci o y mic osomas hepá icos de a a y el e ec o que el iempo de conse ación a -36°C y la congelación-descongelación de las mues as ienen sob e la composición acídica. Así mismo, se compa a la in luencia del ampón hipo ónico usado en la ob ención de memb anas de e i oci o, sob e la es abilidad a la oxidación de las mismas. Los esul ados e e lan la es abilidad de los mic osomas a la oxidación, así como la con eniencia de u iliza un ampón T is hipo ónico en la ob ención de memb anas de e i o ci o, al con e i les una mayo es abilidad. SUMMARY Fa y acid composi ion in a ed blood cell memb anes and hepa ic mi c osomes was de e mined, as well as he e ec ha a s o age ime a -36°C and eezing and hawing ha e had on he acidic composi ion o samples. Li kewise, he in luence ha wo di e en hypo onic bu e , used in ob aining ed bolld cell memb anes, ha e had on s abili y agains oxida ion o a y acids has been s udied. Ou esul s demons a e a highe s abili y o a y acid mic osomes han o ed blood cell memb anes, aswell as showing ha i is ad isable o use a hipo onic T is bu e ins ead o a Phospha e bu e when p e pa ing ed blood cell memb anes. INTRODUCCION Es un hecho comp obado que la composición en ácidos g asos de los lípi dos de depósi o y es uc u ales se modi ica po la composición en ácidos g a sos de los lípidos de la die a. Es a modi icación es impo an e an o en unción de la p e ención de las en e medades co ona ias como en los cambios que pueda expe imen a la " luidez" de memb anas celula es. 290 ARS PHARMACEUTICA Los es udios compa a i os en e dis in as die as suelen hace se en plas ma, memb anas de e i oci o y mic osomas hepá icos (1). El plasma es quizás el que es á suje o a mayo es luc uaciones en la composición acídica de las acciones lipídicas, siendo po an o, las memb anas de e i oci o, dada la a cilidad y el escaso iesgo que p esen a su ob ención, unos indicado es iables, en an o, que pueden se un iel e lejo de la composición acídica de los lípidos de o as memb anas celula es. La elección de mic osomas hepá icos adica en que es en el e ículo endoplásmico en donde ienen luga las eacciones de' elongación y desa u ación de moléculas en ácidos g asos, ya sean de sín esis endógena o de p ocedencia die a ia. La ob ención y la ado de las memb anas e i oci a ias se ealiza, no mal men e, con ampón T is hipo ónico; sin emba go, ha sido desc i o ecien e men e po Bu on y col. (2) que memb anas de e i oci os pod ían ob ene se, p ác icamen e exen as de hemoglobina ( ac o al amen e oxidan e), con am pón Fos a o hipo ónico de concen aciones mola es dec ecien es. Pa a com p oba la alidez de es e mé odo en a as, se han ob enido es as memb anas al e na i amen e con las dos soluciones ampón, comp obándose su es abili dad en e a eacciones de oxidación que ienen luga du an e el almacena mien o p olongado (3). Se ha es udiado la in luencia que es e almacenamien o, así como los p ocesos de congelación-descongelación pueden ene an o sob e mic osomas como memb anas de e i oci os, en la medida en que pue den induci e o es en la in e p e ación de los esul ados. MATERIAL Y METODOS El es udio ha sido ealizado en a as macho de la aza Wis a de 150 g. de peso ap oximadamen e. Las mues as de sang e se ob u ie on po punción de la ao a abdominal con una je inguilla hepa inizada, ex ayéndose ápidamen e el hígado y con se ándolo en solución salina al 0,9 C1!o en ío. Pa a la ob ención de mic osomas hepá icos se ha seguido el mé odo des c i o po Phillip y Shapi o (4) y pa a ob ene las memb anas de e i oci os se han seguido al e na i amen e los mé odos de Hanahan y Ekholm (5) emplean do ampón T is y de Bu on e Ingold (2) que emplea ampón Fos a o. Una ez ob enidas las mues as se sepa a on cua o alícuo as de cada una de ellas que ,pe manecie on congeladas a -36°C has a el momen o de se ana lizadas: la l. a alícuo a al día siguien e, la 2. a a los cua o meses y la 3. a a los diez meses de su ob ención. La 4. a alícuo a ue la su ió el p oceso de congelación-descongelación epe ido, e ec uado dos meses an es de cada pe iodo escogido pa a su análisis. En la ex acción lipídica el mé odo empleado ha sido el desc i o po Haan y col. (6). La sepa ación de os olípidos del ex ac o lipídico se ha ealizado po c oma og a ía en capa ina (7), ob eniéndose pos e io men e los és e es me ílicos de los ácidos g asos de es a acción (8) que ue on analizados po c oma og a ía gaseosa en un c oma óg a o Hewle -Packa d modelo 5880A ARS PHARMACEUTICA 291 do ado con de ec o de ionización de llama y conec ado a un o denado HP5880 se ie OC e minal. La columna u ilizada, ellena con una ase es acio na ia de SP2330 al 10 % sob e Ch omoso b WA W 100/120 mesh, enía unas dimensiones de 4 m. de longi ud y 2 mm. de diáme o in e io . Las condiciones de abajo ue on pe ec amen e con oladas, ijándose los ijujos de ni ógeno e hid ógeno en 30 ml/min. y el de ai e en 400 ml/min. El p og ama de T. a empleado ue el siguien e: T. a inicial de 185°C du an e 10 minu os, aumen o a azón de 5°C/min. has a alcanza los 240°C, donde se man iene du an e 10 minu os. En el a amien o es adís ico, los es de signi icación empleados co espon den a la -s uden , conside ándose alo es signi ica i os a pa i de p < 0,05. RESULTADOS y DISCUSION Mic osomas La composiciÓn en ácidos g asos de los os olípidos de mic osomas hepá icos queda e lejada en la abla l. Acldo o (1 dial i (4 meses) II (lO meses) dI dl .. oso 16:0 16.52±0.97 16.41 +0.94 18.14±0.89 16.58+0.98 19.62±0.86 16:lw7 0.99±0.14 0.972 0.17 0.99±0.18 0.99+0.12 1.25+0.18 18:0 32.50±0.61 32.42+0.56 32.57 +0.70 32.92+0.70 31.45±0.56 18:lw9 7.07±-0.42 6.80+0.49 7.17+0.42 7.04+0.53 9.17±0.87 18:2w6 8.80±0.31 8.77 +0.54 8.94+0.42 8.81 +0.50 8.59±0.29 20:3w6 1.13±0.18 1.13±0.18 0.85+0.16 1.13+0.19 0.85+0.12 22:4w6 0.50±0.04 0.50+0.03 0.34±0.04 (al,bl) 0.49±0.03 0.31 + 0.02 (a2,c2) 22:Sw6 0.93±0.04 0.992 0.05 0.82±0.04 (bl) 0.96±0.07 0.80 + 0.05 22:Sw3 0.62±0.04 0.63�0.06 0.45±0.04 (al,bl) 0.57 +0.05 0.40±0.04 (al,cl) 22:6w3 4.79±0.42 4.962 0.48 4.70+0.41 4.67 +0.47 4.02±0.32 TABLA 1.- Composición en ácidos g asos de mic osomas hepá icos. Los esul ados se exp esan como la medida del po cen aje de cua o de e minaciones + SD. Siendo: a, ni el de signi icación espec o a 10; b, ni el de signi icación espec o a i; c, ni el de signi i cación espec o a di; d, ni el de signi icación espec o a 2. El subíndice l co espon de a un alo de p < 0.05, el 2 a un alo de p < 0.01 yel 3 a un alo de p < 0.001. Mues as analizadas a los cua o meses que han su ido una descongelación congelación a los dos meses. Mues as analizadas a los 10 meses que han su ido dos descongelaciones congelaciones, una a los dos meses y o a a los ocho. 292 ARS PHARMACEUTICA Los esul ados e elan la es abilidad de los mic osomas a la au ooxida ción. La congelación-descongelación les a ec a nega i amen e, pe o en meno g ado que a las memb anas de e i oci o. % 25 23 21 Fig.l.- T T T 1�: • 1 I 1 ¡a, 1 o 4 10 Meses " a iaci6n en el 11/0 de ácido a aquid6nico (20:4w6) en os olipidos de mic osomas hepá icos con espec o al iempo de almacenamien o. O -alicuo as man enidas a -36°C. • -alicuo as man enidas a -36°C some idas a un p oceso de congelaci6n descongelaci6n. El ácido 20:4w6 (Fig. 1) p esen a al igual que los demás ácidos g asos una es abilidad en e a las eacciones de au ooxidación, cuando las mues as son almacenadas a -36°C du an e un la go pe iodo de iempo. F en e a los p o cesos de congelación-descongelación expe imen a un p oceso signi ica i o en sus ni eles. Po lo, an o, los esul ados ob enidos ponen de mani ies o que la compo sición en ácidos g asos de los mic osomas no se e a ec ada po el iempo de almacenamien o y siemp e que las mues as pe manezcan a -36°C. La congelación-descongelación a ec a nega i amen e a la es abilidad de los mic osomas, aunque en meno cuan ía que a las memb anas de e i oci os, po lo que debe e i a se en odo momen o. ARS PHARMACEUTICA 293 Memb anas de E i oci o. La composición en ácidos g asos de os olípidos de memb anas de e i o ci o ob enidas con ampón Fos a o y ampón T is, quedan e lejadas en las a blas II y III. Addo ..... To (1 di.) TI (4 meses) Tl (10 meses) di dl 16:0 29. 28.±.0.74 28.14�1.16 33.(X>+0.32 (S2,bl) 27.94.±.0.27 37.53.±.3.25 (el) 16:lw7 0.81.±.0.02 O. 77� 0.22 0.48.±. 0.25 0.48+0.10 0.52+0.27 18:0 18.46.±.1.S1 17.79�0.60 21.75.±.0.73 (bl) 18.10+0.67 23.91+2.37 18:1w9 ·1l.1O.±.0.68 13.142 0.73 12.86+0.14 12.26+0.92 11.92+0.77 l8:lw6 8.73+0.69 8.3720.46 9.13 + 0.73 8.93+0.57 0.08+0.86 lO:3w6 0.80+0.05 1.0820.21 1.14+0.13 1.36+0.24 0.67+0.34 1l:4w6 1.S3.±.0.20 1.962 0.17 1.28+0.06 (bl) 2.27.±. 0'T2 (al) 0.86.±. 0.43 (CI) 1l:'w6 1.02.±.0.15 1.73 .0.29 0.76.±.0.13 (bl) 1.45.±.0.13 0.49.±.0.25 (el) 1l:6w3 1. 04.±.0. 21 1.S02 0.16 0.79+0.08 (bl) 1.68 +0.21 0.49.±.0.25 (el) ll:4w6 0.50.±.0.04 . 0.5020.03 0.34 + 0.04 (al) 0.49 + 0.03 0.31.±.0.02 (al) TABLA 11.- Composición en ácidos g asos de memb anas de e i oci o ob enidas con ampón Fos a o. Los esul ados se exp esan como la medida del po cen aje de es de e mi naciones + SD. Siendo: a, ni el de signi icación espec o a 10; b, ni el de signi ica ción espec o a i; c, ni el de signi icación espec o a di; d, ni el de signi icación es-' pec o a d2. El subíndice 1 co esponde a un alo de p O.OS, el 2 a un alo de p 0.01 Y el 3 a un alo de p 0.001. AddCl ..... 16:0 16:lw7 18:0 18:1w9 18:lw6 lO:3w6 1l:4w6 1l:'w6 1l:6w3 Mues as analizadas a los cua o meses que han su ido una descongelación congelación a los dos meses. Mues as analizadas a los diez meses que han su ido dos descongelaciones congelaciones, una a los dos meses y o a a los ocho. To (1 di.) TI (4 meses) Tl (10 meses) dl dl 31.02.±. 0.50 27.5�0.7S (1) 31.71.±.0.60 (bl) 27.52+ UO 33.59.±. 0.89 (CI) 0.82+0.06 0.872 0.09 0.64+0.04 1.03 +0.07 0.63.±. 0.04 (Cl) 17.68+0.56 17.082 O.SI 2O.07.±. 0.63 (al,bl) 17.26+0.37 21.31.±. 0.12 (az,C3) 11.22+0.45 12.112 0.10 12.04+0.14 12.01 +0.32 11.95 +0.21 9.10+0.23 8.932 0.08 9.91 +0.71 9.04+0.37 8.72+0.23 0.75 +0.04 1.122_0.07 (al) 1.65+0.46 1.23.±. 0.16 (al) 0.91 +0.30 U9+0.10 2.48�0.14 (az) U3.±. 0.15 (bl) 2.4O.±. 0.18 (al) 1.61.±. 0.21 (CI) 0.95+0.09 1.422_0.08 (al) 0.79±0.08 (bl) 1.36±0.06 (al) 0.87 ± 0.06 (el) 0.95+0.11 1.66� 0.08 (az) 1.11 +0.28 1.65.±. 0.12 (al) 0.77 .±. 0.13 (Cl) TABLA 111.- Composición en ácidos g asos de memb anas de e i oci o ob enidas con ampón T is. Los esul ados se exp esan como la medida del po cen aje de es de e mina ciones + SD. Siendo: a, ni el de signi icación espec o a o; b, ni el de signi icación espec o a i; c, ni el de signi icación espec o a di; d, ni el de signi icación espec o a 2. El subíndice 1 co esponde a un alo de p <O.OS, el 2 a un alo de p< 0.01 yel 3 a un alo de p < 0.001. Mues as analizadas a los cua o meses que han su ido una descongelación ,congelación a los dos meses. Mues as analizadas a los diez meses que han su ido dos descongelaciones Congelaciones, una a los dos meses y o a a los ocho. 294 ARS PHARMACEUTICA Es de in e és comp oba cómo los ácidos g asos sa u ados mayo i a ios C16:0 y C18:0, y más conc e amen e su suma, se ele a a los 10 meses de su al macenamien o desde un 48 010 a un 54 % ( ampón Fos a o) y un 51 % ( ampón T is). La congelación-descongelación conlle a, pa a el mismo iempo, un aumen o desde un 48 % a un 61 % ( ampón Fos a o) y un 55 % ( ampón T is). El po cen aje de ácido a aquidónico, 20:4w6, ácido g aso poliinsa u ado mayo i a io, nos da una idea di �c a de las eacciones de au ooxidación que se hayan podido p oduci du an e el pe iodo de almacenamien o. Se obse a que a los 10 meses de la ob ención de memb anas, los ni eles de es e ácido g aso poliinsa u ado disminuyen, siendo es e descenso más acusado en las memb a nas ob enidas con ampón Fos a o (Fig. 2 y 3). % 24 20 16 Fig. 2.- o 4 10Meses Va iaci6n con espec o al iempo en el OJo de ácido a aquid6nico (20:4w6) en os olí pidos de memb anas de e i oci o ob enida con amp6n Fos a o. O - alícuo as man enida a -36°C. • -alícuo as man enidas a -36°C some idas a un p oceso de congelaci6n ·descongelaci6n. % 24 22 20 18 Fig. 3.- ARS PHARMACEUTICA 295 o 4 10 Meses Va iaci6n con espec o al iempo en el 1170 de ácido a aquid6nico (20:4w6) en os olí pidos de memb anas de e i oci o ob enidas con amp6n T is. O -alícuo as man enidas a -36°C. • -alícuo as man enidas a -36°C some idas a un p oceso de congelaci6n descongelaci6n. Pues o que los alo es de los ácidos g asos se exp esan como OJo, el inc e men o expe imen ado po los ácidos g asos sa u ados mayo i a ios es án en elación in e sa con la disminución que su en el 20:4w6 como consecuencia de las eacciones de au ooxidación. Los esul ados ponen de mani ies o la con eniencia de u iliza un ampón T is hipo ónico en la ob ención de memb anas de e i oci o, así como e ec ua el análisis c oma og á ico de las acciones lipídicas en un iempo no supe io a los 4 meses. Así mismo, la congelación-descongelación de las mues as incide nega i amen e sob e la es abilidad de las mismas, po lo que debe e i a se. El di e en e compo amien o que expe imen an las memb anas de e i o ci o, según su modo de ob ención, puede se explicado en base a la exis encia de una mayo can idad de hemoglobina en aquéllas ob enidas con ampón Fos a o que conduci ía a una ápida oxidación de las mues as así p epa adas. 296 ARS PHARMACEUTICA BIBLIOORAFIA 1. 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