Efecto de diferentes técnicas de hemolisis sobre la actividad acetilcolinesterasa

UNIDAD DE BIOQUIMICA y FISIOLOGIA DEL PARASITISMO. INSTITUTO «LO PEZ NEYRA» DE PARASITOLOGIA, C.S.LC., GRANADA EFECTO DE DIFERENTES TECNICAS DE HEMOLISIS SOBRE LA ACTIVIDAD ACETILCOLINESTERASA M. C. LOPEZ-LoPEZ, R. HERMOSO, M. MONTEOLIVA RESUMEN Se e alua el e ec o de di e en es mé odos de up u a e i ocí ica sob e la ac i idad ace ilcolines e asa, u ilizando ejido sanguíneo humano, acuno y po cino. Los p ocedimien os ensayados son: Congelación, soni icación y agi ación con agua des ilada; u ilizándose el sis ema pH-s a como écnica de medida cuan i a i a de la ac i idad enzimá ica, con los sus a os ace ilcolina y bu i ilcolina a una concen ación de 4'2 x lO-3M. En odos los casos ob eneIl).os un alo enzimá ico mayo al de hema ies in ac os, es imando que la sonicación es la écnica más adecuada. PALABRAS CLAVES: Ace ilcolines e asa, hemolisis, pH-s a . SUMMARY The e ec o di e en e y h ocy e b eaking me hods on ace y1cholines e ase ac i i y, using human, ca le and pig blood issue, was s udied. The p ocedu es es ed we e: Deep- eezing, sonica ion and shaking in di s illed wa e ; he pH-s a sys em was used as he quan i a i e p ocedu e o measu e he enzyma ic ac i i y, wi h ace y1choline and bu i y1choline as subs a es a a concen a ion o 4.2 x lO-3M. Wi h all he echniques, a g ea e enzyma ic alue han ha co esponding o in ac e y h ocy es was ound, es ima ing sonica ion as he mos adequa e me hod. KEY WORDS: Ace ylcholines e sase, haemolysis, pH-s a . A s Pha maceu ica. Tomo XXIV. Núm. 4, 1983. 318 ARS PHARMACEUTICA RESUME Nous a ons é udié l'e e des di é en es mé hodes de up u e d'é y h ocy es su l'ac i i é acé y1cholines e ase, en u llisan du sang humain, bo in e po cino Les mé hodes éssayées son les sui an es: congéla ion, sonica ion e agi a ion dans l'eau dis illée. Le sys eme pH-s a a é é u ilisé comme p océdé de mea su e quan i a i e de l'ac i i é enzyma ique, a e e les subs a ums ace ylcholine e bu y y1choline a une concen a ion de 4.2 x lO-3M. Dans ous les cas, nous a ons ou é une aleu enzyma ique plus éle ée que celle des hémaÚes in ac es, en jugean la soni ica ion comme la mé hode la plus app op iée. MOTS eLES: Acé ylcholines e ase, hémolyse, pH-s a . INTRODUCCION Aunque se ha p og esado en la ·lucha con a los ec o es de las en e medades pa asi a ias y plagas ag ícolas po ías al e na i as no con aminan es, sigue siendo indispensable el uso de los p1aguicidas. El mecanismo de acción de los p1aguicidas o gano os o ados in e i iendo el paso de impulsos ne iosos po inhibi ción del enzima ace ilcolines e asa, es a su ez el mecanismo óxico de' dichos compues os (1, 2, 3). Es e enzima en e i oci os se en cuen a ligada a 1a-pa e in e na de la memb ana hemá ica (4, 5), Y po ello pa a de e mina un alo enzimá ico más eal es aconseja ble abaja con e i oci os hemolizados. En la nume osa bibliog a ía consul ada se obse a una g an dispa idad en cuan o a la écnica de hemolisis empleada, u ilizán dose a amien os ales como bu ano1 (6), diges ión con panc ea ina o ipsina (7,4), empleo de sus ancias ensioac i as como sa poninas, aninos, i ón X-lOO (8, 9, 10, 11), o simple agi ación con agua des ilada (12, 13); o as écnicas empleadas son la conge1ación descongelación y la sonicación (14, 15, 16). En el p esen e es udio a amos de e alua el e ec o que di e en es mé odos de hemolisis eje cen sob e la ac i idad colines e ásica de e i oci os. ARS PHARMACEUTlCA 319 MATERIAL y METODOS Mues a biológica: Sang e humana, acuna y po cina. P epa ación de las mues as: A pa i de sang e hepa inizada ob enida ecien emen e, sepa amos los e i oci os po cen i uga ción (10 min, 2.000 pm, 4°C); a con inuación son la ados es eces con solución salina 0'9% y pos e io men e se cen i ugan 10 min, 2.000 pm, 4°C. Finalmen e los e i oci os se suspenden en un o lumen de sue o isiológico al, que el núme o de ellos sea de 5 x 106 po mm3• Pa a cada mues a biológica p epa amos 10 «pool» o mados po olúmenes equi alen es de e i oci os de 10 indi iduos di e en es o cabezas de ganado. Cada «pool» es di idido en cua o pa es iguales. De es a o ma pod emos compa a la ac i idad enzimá ica en e e i oci os in ac os y hemolizados median e es p ocedi mien os. P ocedimien os de hemolisis Agua des ilada: Pa iendo de un olumen conocido de glo bulos ojos (5 x 106 po mm3), se añade un olumen doble de agua des ilada, se agi a ené gicamen e y se man iene en eposo 10 minu os. Seguidamen e adicionamos e a clo u o de ca bono en un olumen igual al de e i oci os de pa ida y as agi ación y eposo de 30 minu os, se mide la ac i idad enzimá ica en el sob enadan e. Sonicación: Empleando sonicado MSE 1.300, some emos la suspensión de e i oci os a es pe íodos ul asónicos de 45 segundos, a in e alos de 1 minu o. Congelación: Las mues as en asadas en iales, son alma cenadas en a cón congelado de -20°C. Las ac i idades se miden cuando ha anscu ido al menos un in e alo de 24 ho as desde su congelación. Técnica de medida: U ilizamos el sis ema pH-s a (12), en las condiciones desc i as po López López y col. Sus a o clo u o de ace ilcolina y iodu o de bu i ilcolina 4'2 x 10-3 M, empe a u a 3 C y pH igual a 8'0. TABLA I EFECTO DE DIFERENTES PROCEDIMIENTOS DE HEMOLISIS DE ERITROCITOS, SOBRE EL ENZIMA ACETILCOLINESTERASA HUMANA, DE GANADO VACUNO Y DE GANADO PORCINO. Ac i idad enzimá ica media (,u moles sus a o hid ol./min/ml)± SD P ocedimien o N.o HUMANA VACUNA PORCINA hemolisis ensayos Ach Buch Ach Buch Ach Buch Agua des ilada 10 5'17±0'09 0'97±0'05 2'93±0'03 0'55±0'05 2'07±0'05 0'53±0'03 Sonicación 10 5'49±0'10 1'10±0'07 3'15±0'08 0'63±0'05 2'23±0'10 0'59±0'06 Congelación 10 5'33±0'08 0'98±0'06 2'99±0'05 0'59±0'03 2'Q9±0'08 0'55±0'03 E i oci os in ac os 10 4'80±0'04 0'77±0'06 2'80±0'07 0'45±0'05 1'91±0'05 0'44±0'02 Ach: Sus a o clo u o de ace ilcolina; Buch: Sus a o iodu o de bu i ilcolina. W IV O >- � "C :I: >- � >- (l m e ::l (l >- ARS PHARMACEUTICA 321 RESULTADOS Como podemos obse a (Tabla 1), se de ec a un aumen o conside able de la ac i idad enzimá ica al hemoliza los e i oci os, ob eniéndose el alo máximo al emplea la écnica de sonicación. DISCUSION Se es udia el e ec o compa a i o de di e en es p ocedimien os de hemolisis sob e el enzima colines e asa humana, acuna y po  cina, ensayando écnicas ales como la sonicación, congelación a -20°C y agi ación con agua des ilada, a in de comp oba la idonei dad de cada una de ellas, pues como apun an algunos au o es (14, 18) no odas las ácnicas de up u a e i ocí ica son adecuadas pa a la pos e io de e minación cuan i a i a del ci ado enzima. Como se mues a en la abla 1, con cualquie a de las écnicas ensayadas se de ec an alo es enzimá icos mayo es al de hema íes in ac os, si bien las ci as ob enidas no son exac amen e iguales pa a odas ellas. La sonicación es de los ensayados el mé odo más adecuado de hemolisis pa a es e ipo de de e minaciones enzimá icas ob eniéndose con él, un alo enzimá ico supe io en odas las mues as biológicas es udiadas; ello debido a que p oduce la o u a de la memb ana hemá ica acili ando la solubilización del enzima (14). Po o a pa e, se obse a pa a las es mues as biológicas y écnicas ensayadas ( abla 1), un conside able aumen o del alo en zimá ico al emplea el sus a o ace i1colina, debido a la mayo es peci icidad po es e sus a o de la ace ilcolina hid olasa (EC 3.1.1.7), ipo de colines e asa de p esencia casi exclusi a en e i oci os (19, 20). BIBLIOGRAFIA 1. DUBOIS, K. P. (1971). Bul!. O g. Mond. San é, 44, 233-240. 2. CASIDA, J. E. (1973). Toxicology in o ma ion, 822, Na ional Ins i u es o Heal h, Uni ed S a es, 259-278. 3. HUSSAlN, M. A., BLATHERW1CK, F. J., GAUNCE, A. P. and MACKENZIE, C. J. G. (1981). J. En i on. Sci. Heal h, 16, 1-9. 4. HERZ, F., KAPLAN, E. and STEVENSON, J. H. (1963). Na u e, 200, 901-908. 5. STECK, T. L. (1974). J. Cel!o Biol., 62, 1-11. 322 ARS PHARMACEUTICA 6. COHEN, J. A. and WARRlNGA, G. P. J. (1953). Ci ado po Hen y, R. J. Qúmica clínica, 1, La ed., Jims, Ba celona, 600-608 (1969). 7. WARRlNGA, G. P. J. and COHEN, J. A. (1955). Ci ado po Go don, J. J. and Ru land, J. P. 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