Dosage de língenol dans les teintures meres homeopathiques de diverses especes d’euphorbia par la chromatographie liquide haute performance

DOSAGE DE L'INGENOL DANS LES TEINTURES MERES HOMEOPATHIQUES DE DIVERSES ESPECES D' EUPHORBIA PAR LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE S. PAPHASSARANG"M.A. GIRIN', Ch. OAVID-ETEVE', A. CHABOU02, J. RAYNAU02 1. Laboratoires BOIRON, 20 rue de la Libération 69110 SAINTE-FOY LES-LYON (FRANCE) 2. 0épartement de botanique et biologie cellulaire, Pharmacognosie (Matiere médicale). Faculté de Pharmacie, 8 avenue Rockefeller 69373 LYON CEOEX 08 (FRANCE) MOTS CLES: Euphorbia amygdaloi"des L. Euphorbia esula L. ; Euphorbia helioscopia L. ; Euphorbia lathyris L. ; Euphorbia palustris L. ; Euphorbia pilosa L. ; Euphorbia pilulifera L. Euphorbia resinifera Berg. ; Ingenol ; Ingenol esters ; HPLC. ABSTRACT High performance liquid chromatography has been developed for the identification and quantitation of ingenol in homoeopathic mother tinctures of 8 Euphorbia species. The ingenol es ter s were hydrolyzed with KOH in methanol and the free ingenol was analyzed by C18 RP column using methanol-water (60 : 40 V/V) as the mobile phase. The ingenol content ranged from 0. 5 �g/ml to 16. 7 �g/ml. Euphorbia resinifera Berg. mother tincture was found to be the richest in ingenol. On �he other hand, ingenol content was not significant in E. amygdaloi"des L. or E. pilulifera L. mother tinctures. 333 l. INTRODUCTION Notre travail porte sur 8 teintures meres homéopathiques fabriquées a partir des différentes especes du genre Euphorbia: Euphorbia amygdaloi"des L. , Euphorbia esula L. , 'Euphorbia helioscopia L. , Euphorbia lathyris L., Euphorbia palustris L., Euphorbia pilosa L. , Euphorbia pilulifera L. et Euphorbia resinifera Berg. Malgré l'hétérogénéité morphologique, on constate chez le gen re Euphorbia la présence sur le plan histologique de laticiferes (1). Le latex confere a ces plantes une certaine toxicité, due surtout aux dérivés terpéniques en particulier aux esters des diterpenes dérivés du phorbol et de l'ingénol (2)(3). Les esters d'ingénol sont les plus fréquernment rencontrées dans toutes les especes étudiées (4) . Le dosage direct d'ingénol sous forme d'este�s dans les teintures meres n'est pas possible. Cela est du d'une part a la diversité structurale de ces constituants et d'autre part a la non disponibilité des témoins esters d'ingénol dans le cornmerce. Par contre, il est possible de se procurer de l'ingénol et de le doser dans nos teintures meres apres sa libération. Parmi les techniques chromatographiques utilisées pour le controle, la chromatographie liquide haute performance est sans doute la technique la plus adaptée. Elle permet l'étude quantitative de ce type de constituant directement sans dérivatisation. 11. PARTIE EXPERlMENTALE -MATERIEL ET CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES * Appareillage Les analyses ont été effectuées sur un chromatographe liquide Hewlett-Packard, série 1050, équipé d'un injecteur automatique et d' un détecteur multilongueur d' onde. Ce systeme est piloté par HP ChemStation de Hewlett Packard (Hewlett-Packard, Palo-Alto, Californie, Etats-Unis) * Conditions chromatographiques Colonne Sphérisorb OOS 2, 5�, 250 x 4mm Hewlett-Packard, Palo Alto, Californie, Etats-Unis) Solvant: méthanol-eau (60:40; V/V) oébit: 1 ml/min Oétection: 204 nm Température de la colonne: 30°C Volume d'injection: 20 �l 334 -SOLUT10NS A ANALYSER * Solution témoin: L' ingénol sous forme libre est eommereialisé par les Laboratoires Sigma (st Louis, MO. , EtatsUnis). 11 est eonditionné dans des ampoules en verre seellées sous azote et se présente sous forme d'un film solide invisible adhérant aux parois. L'ingénol est solubilisé dans le méthanol et conservé ¡ moins de oOe et ¡ l'abri de la lumiere. * préparation de l'éehantillon L'ingénol est en général dans la plante sous forme de mono ou de diesters. Pour savoir la quantité d'esters d'ingénol dans les teintures meres, on peut doser l' ingénol libre apres saponifieation. La teehnique de saponifieation des teintures meres utilisées lors de ce travail dérive de eelle déerite par UPADHAY et eoll. (1980) (5): 5 ml de teinture mere sont lavés par 3 fois 5 ml d'hexane pour se débarrasser des fraetions lipidiques et triterpéniques. La phase restante est évaporée ¡ see sous pression réduite. Le résidu est saponifié par 5 ml de potas se méthanolique O, 5M pendant 45mn ¡ la température ambiante. L'exees de KOH est neutralisé par Hel lN. Apres adjonetion de 5 ml d'eau distillée, la solution obtenue est extraite par 3 fois 5 ml de diehlorométhane. La solution extraetive obtenue est évaporée ¡ see sous pression réduite et le résidu est repris par 100 �l de méthanol. La solution méthanolique obtenue ont été eonservée ¡ une température inférieure ¡ oOe et ¡ l'abri de la lumiere. 111RESULTATS ET D1SeUSS10N Dans les eonditions déerites, l'ingénol donne un pie au temps de rétention voisin de 7.23 mino Le pie de l'ingénol dans la teinture mere a été identifié par son temps de rétention. La eonfirmation a été effeetuée par la méthode d'ajout. La quantifieation d'ingénol dan s les teintures meres est faite par la méthode d'étalonnage externe. Différents essais ont été effeetués pour la validation du dosage. -Etude de la répétabilité Nous avons injeeté 10 fois de suite un volume de 20 �l d'une solution étalon d'ingénol ¡ 50 �g/ml. L'aire du pie d'ingénol a été enregistré. La moyenne de l'aire des pies et le eoeffieient de la variation (eV) de la répétabilité sont ensuite ealeulés. Le ev est de 0. 51 %. La méthode de dosage est eonsidérée eomme répétable ear le ev de la répétabilité est inférieur ¡ 1 %. 335 -Etude de la reproductibilité Nous avons réalisé une série de 9 dosages sur 3 jours d' une solution étalon d' ingénol el. 50 lJ.g/ml. L' aire correspondant au pic d'ingénol a été enregistré. Nous calculons ensuite la moyenne et le CV de la reproductibilité des réponse. Le CV trouvé est de 0.88 %. La méthode de dosage peut etre considérée comme reproductible car le coefficient de variation de la reproductibilité est inférieur el. 2 %. -étude de la linéarité Elle a été fai te avec une gamme d' étalonnage de 6 solutions témoins allant de 50 el. 670 lJ.g/ml. Chaque solution est injectée 3 fois et l'aire des pics mentionnée est la moyenne des 3 aires enregistrées. La droite d'étalonnage est linéaire dans la gamme de concentration essayée. L' équation de la droi te est de la forme: Y = aX+b a = 31.356; b = 121.399. Le coefficient de corrélation r trouvé est de 0.99. La concentration en ingénol dan 5 les teintures meres est la suivante ·(par ordre décroissantl: E. resinifera Berg. ) E. pilosa L.) E. lathyris L. ) E. helioscopa L. ) E. palustris L. ) E. esula L. ) E. amygdaloi"des L. et E. pilulifera L. Le dosage d'ingénol dans les teintures meres montre que la teneur en ingénol est tres variable suivant les teintures meres. Ainsi, l'ingénol n'est présent qu'el. l'état de traces dan 5 les teintures meres d' E. amygdaloi·des L. et d' E. pilulifera L. alors qu' il est présent en grande quantité dans les échantillons préparés el. partir de la teinture mere d'E. resinifera Berg. Cette richesse peut s'expliquer par le fait que la TM d'E. resinifera Berg est préparée el. partir du latex. IV. CONCLUSION L'ingénol est un traceur intéressant pour le controle des teintures meres d'Euphorbe en raison de son rapport avec leur toxicité. La chromatographie liquide,haute performance s'avere etre une technique bien adaptée a l'étude qualitative et quantitative de ce compasé. Elle est rapide, fiable et permet le dosage de l'ingénol directement sans faire des dérivatisations. 336 V. BIBLIOGRAPHIE 1. G. DEYSSON: Eléments d'anatomie des plantes vasculaires Edit. Sedes, Paris, 1965,266 pages 2. A. D. KINGHORN, F. J. EVANS, Planta Med. , 28 (1975), 324-335 3. E. H. SEIP, E. HECKER, Planta Med. , 46 (1982), 215-218 4. F. J. EVANS, C. J. SOPER, Lloydia. , 41 (1978) 193-233 5. R.R. UPADHYAY, F. BAKHTARAR, H. MOHSENI, A. M. SATER, N. SALEH, A. TAFAZULI, F. N. DIZAJI, G. MOHADDES, Planta Med. , 38 (1980), 151-154 337 U Sig�204,4 Ref�450,80 2400� j 2200� 2000� 1800� ! 1600� 1 1400� ! 1200� ¡ 1000� . < 800� 60J 1 40� 200J ime -> 2.000 4.000 6.000 8.000 10.'000 CP.ROMATOGRAMME DE IA SOLUTION TEMOIN D' INGENOL 338 nAU j J 700 .. J 600-1 1 J 500-1 j 400-1 j 300 .. 1 200-1 "j 1m. -> S ,;;; on <:: ,.... ':'� l'- 'cd 5.000 10.'000 15.000 i 20.000 25.000 30.000 I CHROMATOGRAMME D' UN EXTRAIT DE IA TEINTORE MERE D' EQPHORBIA PILOSA L 339 w � TENEUR EN INGENOL DANS LES TEINTURES MERES HOMEOPATHIQUES lmu!q!rnl) TENEUR NOMS DE LA TEINTURE MERE PARTIE DE PLANTES UTILISEE , EN DILUTION TENEUR EN INGENOL ETHANOL en l1g/ml Euphorbia amygdaloides L. Plante entiere fraiche 65 % 1/10 Traces Euphorbia esula L. Plante entiere fraiche 65 % 1/10 0,51 Euphorbia helioscopia L. Plante entiere fraiche 65 % 1/10 1,54 Euphorbia lathyris L. Plante entiere fraiche 65 % .1/10 3,02 Euphorbia palustris L. Plante entiere fraiche 65 % 1/10 1,27 Euphorbia pilosa L. Plante entiere fraiche 65 % 1/10 9,47 I Euphorbia pilulifera L. Plante entiere desséchée 65 % 1/10 Traces Euphorbia resinifera Berg. Résine desséchée 90 % 1/10 16,71 -