Conservación de cepas bacterianas por congelación sobre discos de celulosa

ARS PHARMACEUTICA R�VIs l'A DE LA FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE GRANADA Tomo XXV -Núm. 4 Di ec o : P o!. D . D. Jesús Cabo To es Di ec o Ejecu i o: P o!. D . D. José Luis Val e de Sec e a io de Redacción: P o!. D . D. José Jiménez Ma 1n Redacción y Adminis ación: Facul ad de Fannacia. G anada - Espa ia. Dep. Legal. GR: núm. 17-1960 ISSN 0004 -2927 Imp ime: G á icas del Su , S. A Boque ón, 6 G anada 1984 TRABAJOS ORIGINALES DE LA FA CULTAD • Conse ación de cepas bac e ianas po congelación sob e discos de celulosa, po A. Ceña, G. Al a ez de Cien uegos y A. Ramos-Co men- 1984 PAG. zana ... 389 • An i-in lama o ios: Ac i idad com pa a i a salsala o-indome acina, po Cabo, J.; Cabo, Ma ía M.; Ga cía, S.; González, A.; Mi ó, M. ... 399 • An i-in lama o ios: Es udio compa a i o de algunos agen es iogóge- nos, po Cabo, J.; Cabo, Ma ía M.; Ga cía, S.; González, A.; Mi ó, M. 403 • Mé odo de cul i o de Hyalomma (Hyalomma) ma gina um ma gina um Koch, 1844 (Aca ina: Ixodidae), po L. E. Hueli; D. C. Gue a a Be- ní ez y P. Ga cía Fe nández ... 407 • De e minación de N03- con elec odo de ión selec i o en agua de bebida de di e sas poblaciones de la p o incia de G anada, po Mu os Guadix, P.; Olea Se ano, Ma- ía R. F. Y Ga cía-Villano a, R. ... 415 • Ca ac e es bioclimá icos, eda oló gicos, geológicos y bo ánicos de la Sie a de la Sag a. (No a 1), po A. M. Neg illo .Galindo y G. Ma ín Calde ón ... 421 TRABAJOS DE COLABORACION • Es udio epidemiológico de la li ia sis en A milla (G anada), po A. Ped ajas, T. Rod íguez, J. Aguila , M. A abal y J. L. Mijan... 435 • C í ica de Lib os ... 443 TRABAJOS ORIGINALES DE LA FACULTAD DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA CONSERVACION DE CEPAS BACTERIANAS POR CONGELACION SOBRE DISCOS DE CELULOSA A. Ceña, G. Al a ez de Cien uegos y A. Ra nos-Co ncnzana RESUMEN Se es udia la conse ación de cepas bac e ianas pe enecien es a di e en es gé ne os y especies, po congelación a 30 0C u ilizando como sopo e discos de papel de celulosa. Así nismo se comp uebe si es a écnica puede se u ilizada pa a la con se ación de bac e ias es uc u al y isiologicamen e di e en es en e sí o si po el con a io no es aconsejable pa a de e minados ipos bac e ianos. Los esul ados ob enidos, mues an que la congelación de suspensiones bac e ianas sob e discos de celulosa, man iene la iabilidad en condiciones su icien e men e sa is ac o ias pa a conside a que es a écnica es un p ocedimien o e icaz de conse ación de cepas bac e ianas. Debe esal a se el hecho de que la ecupe a ción de las cepas no halo ilas , an o de Colección como de mues as clínicas, no equie e, en la mayo ía de los casos de medios de en iquecimien o. SUMMARY The conse a ion o bac e ial s ains adsc ibed o di e en genus and species, by eezing a -30 0C using disc pape o cellulose ha e been s udied. I has also es ed we he his echnique can be u ilized o main enance o nic oo ganisms wi h s uc u al and physiologic di e ences. The esul s show how he eezing o bac e ial cul u es on cellulose disc pa pe , keep he bac e ial iabili y in good condi ions. This echnique is a good way o main eneance o bac e ial s ains. I is signi ica i e ha o ecupe a ion o non halophiles s ains, no en ichmen medium is equi ed. INTRODUCCION Una de las écnicas más comunmen e u ilizadas en un labo a o io de In es iga ción, es conse a el ma e ial biológico con el que se abaja. Según el ipo de a- A s Pha maceu ica. Tomo xx . Núm. 4, 1984. 390 ARS PHARMACEUTICA bajo que se ealice, la conse ación se ha á pa a un pe iodo co o de iempo o pa a un pe iodo inde mido, en el p ime caso es amos an e lo que se denomina "man e nimien o" y solo en el segundo caso podemos habla e dade amen e de "conse  ación". La g an a iedad de écnicas y mé odos u ilizados pa a el man enimien o y conse ación de mic oo ganismos iene condicionado en g an pa e po el pe iodo de iempo p e is o pa a su conse ación y po las dis in as p opiedades biológicas de los mic oo ganismos. Los es mes básicos de la conse ación de un cul i o bac e iano son: man e ne lo iable, no con aminado y con sus ca ac e is icas biológicas inal e adas. Nin gún mé odo ga an iza de o ma absolu a la comple a es abilidad de las p opieda des iniciales de los cul i os (1) po eso es con enien e selecciona en cada caso el mé odo más adecuado. Las écnicas más ampliamen e u ilizadas en la conse ación de las cepas bac e ianas se basan en la educción de la ac i idad me abólica median e la aplicación de bajas empe a u as (2). En el p esen e abajo, hemos es udiado la conse ación de di e en es cepas bac e ianas, pe enecien es a dis in os géne os especies, po congelación a -300C, u ilizando como sopo e discos de papel de celulosa. Asímismo hemos comp oba do si la écnica seguida po noso os puede se u ilizada pa a la conse ación de bac e ias es uc u al y isiológicamen e di e en es en e sí, o si po el con a io no es aconsejable pa a un de e minado ipo bac e iano. MATERIAL Y METODOS U ilizamos 175 cepas bac e ianas, de las cuales 20 pe enecen a la Colección de nues o Depa amen o, 100 p oceden de mues as de naso a inge humanas y 55 son bac e ias halo Ilas mode adas aisladas en las salinas de San a Pola (Alican e) (Tabla 1). Las bac e ias se siemb an en los co espondien es medios líquidos pa a ob e ne un buen c ecimien o, CT pa a las cepas del géne o Myxococcus (3), MHL pa a las bac e ias mode adas (4) y el medio TSB pa a las demás cepas ensayadas. Pos e io men e, en un ial es é il que con iene discos de papel de celulosa Wa man del núme o 4 de 0,5 cm de diame o, añadimos 4 mI del cul i o bac e iano, se agi a igo osamen e du an e 15 minu os pa a consegui una buena imp egnación de los discos. El cul i o sob enadan e se elimina con ayuda de una pipe a Pas eu . Los iales se in oducen en un congelado a -300C. Comp obación de la iabilidad de las cepas conse adas: Pa a es udia la iabili dad de las cepas se hacen comp obaciones al cabo de 3 y 6 meses de habe las so me ido a congelación. T anscu ido el iempo co espondien e, los discos congela dos se colocan en placas que con ienen el medio adecuado pa a el desa ollo de la bac e ia en cues ión (CTA pa a las cepas del géne o Myxococcus, MHS pa a las ARS PHARMACEUTJCA TABLA í. Hic o cani •• oa u ilizados y .odio. de c eciaien o. Kic oo cani •• oa CEPAS DE COLECCION Hic QcQCCl1n � Mic QcOCC l8 .lYl.ü Hic PCQCCUB � S lpbylosocclIn .a.d.w:i S .óljyl ococcun Aim.ul..&n.A: S .pbylococcus .A.w:mlA 5 lpbylococc1Io Gpidemidl, s .phyloCDCC"S in omad!UI s .pbylgcgccu" n,Q opby iClIn b.s:J.l.l.wa mago a !um Ci Qb.c o � SalmoDoll. en e i idia � ma eneon. Acine ob.c g C.lco.co iQJ PacudgmgDI6 uo oncen,:, Hyxocgccun � MD-2 MyxQcQccYI:� MD-4 MUESTRAS CLINICAS li de cepas 8 12 h 10 4 UACTERIAS HALOFILAS 21 .1 11 s lI.a.c1ll.llA • pp. Co yocblc c ium .pp. S .pbylococcJln .pp. Hic QCQCCl" '1'1'; S cp ocºCQ'O '1'1'. H c ocpcC1I1 ap. pl.nocQcQII '1'1'. le4nc gblc o app. Alco11,000" '�p. Ch Ol!lobac e i". '1'1'. hl a asQo, • • pp • . Playob.c edum .pp. TSB/TSA TSB/TSA TSB/TSA TSlJ/TSA TSB/TSA TSB/TSA TSB/TSA TSB/TSA TSB/TSA TSlJ/TSA TSlJ/TSA TSB/TSA TSB/TSA TSB/TSA TSB/TSA TSB/TSA TSlJ/TSA TSB/TSA CT/CTA CT/CTA ¡SB/TSA TSB/TSA TSB/ SA TSB/TSA TSB/TSA MHL/MH$ IIHL/.MHS MHL/MHS MHL/MHS MHL/MHS MHL/MHS MHL/MHS MHL/MHS 391 392 ARS PHARMACEUTICA cepas holo Ilas mode adas y TSA pa a las es an es bac e ias), se incuban a 370C du an e un máximo de 14 días. De no exis i c ecimien o se in oducen los discos en el medio líquido adecuado. Se da como nega i a la ecupe ación si pasados 7 días no se ap ecia c ecimien o. Comp obación de la educción de la iabilidad: Hemos analizado la e icacia de es e p ocedimien o de conse ación de bac e ias, median e la comp obación del nú me o de unidades o mado as de colonias (UFC) an es y después de la conse a ción. Pa a es a comp obación se han escogido 18 cepas pe enecien es a la Colec ción de nues o Depa amen o, siguiendo la écnica de la go a pa a el ecuen o de las UFC desc i a po MILES y MISRA (5). RESULTADOS Los esul ados ob enidos en el es udio de la iabilidad de las di e en es cepas bac e ianas ensayadas, conse adas en discos de celulosa po congelación a -300C ienen indicados en la Tabla II. En ella se puede obse a que el man enimien o de la iabilidad es sa is ac o io en el caso de las cepas pe enecien es a la Colección de nues o Depa amen o y las p oceden es de mues as clínicas humanas. La iabili dad de las bac e ias haló Ilas mode adas es meno . TABLA II Po cen aje de iabilidad bac e iana de las cepas conse - adas a - 30ºC en sopo e de papel de celulosa. Bac e ias Cepas de Colección Mues as Clínicas Halo ilas Mode adas 3 meses 100 �OO 82 6 meses 95 100 64 En las igu as 1,2, 3 y 4, ep esen amos g á icamen e la e olución de las UFC a lo la go del pe iodo de conse ación en las 18 cepas de la colección de nues o De pa amen o. Se ha elegido la ep esen ación en escala semiloga i nica que e leja con mayo cla idad la e olución de los esul ados. En la Tabla III, se exponen los alo es medios de las asas de mo alidad co espondien es a cada uno de los in e alos de iempo es udiado. La u ilidad de es os da os es iba en que al no se acumula i os, nos pe mi en es udia la ciné ica U lL ::J • " lO ARS PHARMACEUTICA 12 24 Tiempo semanas ' igu a l. --E olución de la iabilidad con espec o al iempo de Hic gcQccys lll ws (.l, Hic pcQccl1s lylae (o).y�- csys a lans (o). o lL ::J . " 01 O J lO 12 24 Tiempo en semanas igu a 2.- E olucion de la iabilidad con espec o al iempo de S aphy1ococcJJS sci" i (.). S .aphylococcys simulan:; (.),- 5 aphylpcQCC,,5 "PRl!;)!§ (.), S apbylocpcc!1S cpidc midis (o), - S aphylococcus in e medius (").Y S aphylQcocc!!S sap ophy i_ � (al. 393 394 u u. J • U O> O J 100 ARS PHARMACEUTICA 12 2" Tiempo en semanas" igu a 3. - E olución de la iabilidad con espec o al iempo de Bacil1 1' mega e ium (eL Bocillu§ b e is <* , PASUIlIR ma- � (.) y 8.cillus i mys (o). u u. � . U O> O J 12 2" Tiempo semenes Figu a 4 - E olución de la iabilidad con espec o al eiempo de Ci obac e eundi i (.), Salmondla en .e i idis (*>. s.. .- [[a ia ma s;es.cens (al, Acine ,obac e calcoace icus (.) y -- PseUdQmOlli luQ escens (o). ARS PHARMACEUTICA 395 de la mo alidad debida a es e mé odo de conse ación. Los esul ados son ido neos pa a aplica el análisis es adís ico que nos pe mi a in es iga las posibles di e encias en e dis in os g upos axonómicos en cuan o a su capacidad de supe i encia. TABLA lIl TASAS MEDIAS DE MORTALIDAD POR GRUPOS TAXONOMICOS. In e alos en semanas G upo . Taxonómico e - o 1 - 1 12 12- 24 Cocos G + 0'404 + 0'356 0'068 + 0'040 0'024 + O Bacilos G + 0'460 ± 0'079 0'245 + O' 103 0'071 ± O Bacilos q 0'524 + 0'284 0'340 + O' 119 0'110 + -O Finalmen e en la Tabla IV, se ecojen los esul ados ás aplica el análisis es a dís ico de las asas medias de mo alidad al compa a es os alo es en e los es g upos es udiados y e cuales de ellos se en más a ec ados po la me odología aplicada. TABLA IV a ANALISIS ESTADISTICO DE LAS TASAS MEDIAS DE MORTALIDAD. Compa aciones Cocos G + � Bacilos G + Cocos G + � Bacilos G - Bacilos G + � Bacilos G - a.- Median e la de S uden . N.S.- No signi ica i o. In e alos en semanas - o 1 O' 323 N.S. 0'917 N.S. 0'474 N.S. 1 - 12 12- 24 10'411 1'604 0'0005 N.S. 9'060 2'065 0'0005 O'OSO 2'638 0'525 0'025 N.S. 396 ARS PHARMACEUTICA DlSCUSION Los esul ados expues os an e io men e mues a que la congelación de suspen siones bac e ianas sob e discos de. celulosa man iene la iabilidad bac e iana en condiciones su icien emen e sa is ac o ias como pa a conside a que es a écnica es un p ocedimien o e icaz de conse ación de cepas bac e ianas. Nues as expe iencias cuali a i as ponen de mani ies o que la ecupe ación de bac e ias iables,en núme o y condiciones su icien es como pa a inicia subcul i os en medios adecuados, es posible pa a la casi o alidad de las cepas ensayadas, con la no able excepción del g upo de bac e ias haló Ilas mode adas. Des acamos asímismo que es e mé odo se mues a e ec i o incluso en la con se ación de las cepas pe enecien es al géne o Myxococcus, cuyo man enimien o no es ácil y que gene almen e equie e engo osas esiemb as pe iódicas cada 4 días. En cuan o a las 100 cepas de o igen clínico incluídas en nues o es udio, la homogeneidad de los da os se co elaciona sin duda con su p opia homoneidad a xonómica, ya que 80 de ellas son cocos G am +, pe enecien es a los géne os S a phylococcus, Mic ococcus y S ep ococcus. Es imamos que es o supone una base expe imen al su icien e como pa a a i ma que es e mé odo de congelación sob e papel de celulosa es e icaz en la conse ación de cepas de cocos G am + ae obios o acul a i os, y po ex ensión, esul a ú il pa a conse a cepas de o igen clínico aisladas de in ecciones naso a íngeas. Las cepas haló Ilas mode adas plan ea on mayo es di icul ades en su ecupe a ción. A ni el pu amen e eó ico, podemos apun a la posibilidad de que in luya la especial composición ci oplasmá ica, consecuencia de la adap ación a medios con ele ada concen ación salina y que se e leja undamen almen e en la p esencia de al as mola idades de de e minados componen es ci oplasmá icos que ac uan como solu os compa ibles (6). Cabe la posibilidad de que el compo amien o del ci o plasma a empe a u as muy in e io es a la de congelación del agua, se ea muy in luenciado po la p esencia de es os solu os compa ibles. Po o a pa e, cab ía conside a que la p opia composición del medio de cul i o en que se congelan las bac e ias, con su al a osmola idad salina, juegue algún papel en la disminución de la iabilidad de las cepas congeladas. Los esul ados ob enidos en el es udio de la educción de la iabilidad mues an que exis e una pé dida de la iabilidad cuan i a i amen e impo an e en casi odas las cepas ensayadas. Las meno es educciones las p esen a on algunos de los cocos G am +ensayados. No obs an e, nues os da os no nos pe mi en gene aliza , ya que si bien las asas de mo alidad calculadas después de una semana de conse  ación, dan alo es medios de 0,404 pa a los cocos G am +, 0,460 pa a los bacilos G am -, es as di e encias some idas al análisis es adís ico no esul an signi ica i as a un ni el de con ianza del 95 po cien o. Cuando se ealizan las medidas a los es meses de congelación, los po cen ajes de educción se acen uan en odas las mues-