Mise en evidence d’une 5-lipoxygenase dans les graines de cicer arietinum

.MISE EN EVIDENCE D 'UNE S-LIPOXYGENASE DANS LES GRAINES DE CICER ARIETINUM" HAFIDI Naima, BENEYTOUT J.L. e TIXIER Ma ie Facul é de Pha macie de LIMOGES 2, Rue du Doc eu Ma cland 87025 LIMOGES CEDEX FRANCE Les lipoxygénases son des dioxygénases a e non héminique qui ca alysen l'oxygéna ion des acides g as polyinsa u és con enan au moins un sys eme 1-4- cis, cis pen adiene, en p oduisan un hyd ope oxyde conjugué cis- ans. Ces enzymes son abond8llllllen p ésen s dans le monde i an égé al e animal (1,9) . Mais, si leu in e en ion dans.le mé abolisme cellulai e animal es assez bien connu, aucun Ole physiologique p écis n'a pu e e a ibué aux lipoxygénases égé ales. La plupa des a aux e ec ués su les lipoxygénases égé ales on en é d' explique les mécanismes d' ac ion de ces enzymes e de connai e les e e s biologiques des mé aboli es don ils ca alysen la o ma ion ; ceci dans le bu de anspose é en uellemen les ésul a s ob enus aux lipoxygénases animales, plus di iciles d' acces. Il au di e que les enzymes égé aux se son a é és � e d'excellen s modeles d'é ude pou les enzymes animaux. Quelques a aux on mon é, d'au e pa , une é olu ion de l'ac i i é lipoxygénasique au cou s de la ge mina ion de g aines (2,6-11) d'ou un Ole possible des lipoxygénases dans les p ocessus ge mina i s (5) . Dans ce a ail, a é é é udiée l'ac i i é lipoxygénasique des g aines de Cice A ie ilJUID (Pois Chiche -Chicl pea -Bengale bean) e ses modi ica ions au cou s de la ge mina ion 1 -Ex ac iolJ de l'elJzyme Des essais p éliminai es ayan mon é la es g ande solubili é dans l'eau de la lipoxygénase de Pois Chiche, l' ex ac ion a é é éalisée de a�on es simple pa de l'eau dis illée en p ésence de B ij 99. 2 -Ac i i é lipoxygénasique L'ex ai b u ainsi ob enu possede déja une ac i i é lipoxygénasique es impo an e (3500 U/mg de p o éine) e pe me d'é udie es p op ié és de l'enz 1De : pH op imum, e e de la empé a u e, conse a ion, ac ion des inhib1 eu s spéci iques . a Au pH op imum de 6 O, l'acide linoléique e l'acide a achidon!que son ans o més en hyd ope oxydes. Le spec e d'abso p ion mon e un pic a 234 nm, co es�ondan aux di enes conjugués e un au e p1C, e s 280 nm qui co espond aux cé odienes ou aux cé o ienes e dispa ai ap es éduc ion pa le NaBH. (Fig. 1). Figu e 1. Spec e U.V. des diénes conjugués (234 nm) e cé odiénes (280nm) o mé s pa ac ion de la LOX de Cice a ie inum , a pH 6,0 ,su l'acide linoléique. 428 ¡, I 1.' o .• o., o., . .. L'analyse pa HPLC-PI des p odui s de la éae ion mon e la p ésenee de 2 hyd ope oxydes : 13-LOOH e 9-LOOH a pa i de l'aeide linoléique, 1S-HPETE e S-HPETE a pa i de l'aeide a achidonique, émoignan de 1'exis enee simul anée de deux isoenzymes, une 1S-Lipoxy�énase (1S-LOX) e une S-Lipoxygénase (S-LOX). Au 9H op imum de 6,0 ,1'ae 1 i é 5-LOX es p épondé an e (65l) alo s qu' a pH aleahn, ee e ae in é ne ep ésen e plus que 18l de l' ae i i é o a1e ( Fig. 2) ==s;- -- '5 Figu e 2- Ch oma og aphie HPLC-PI des p odui s d'oxygéna ion de l'acide a ac i idonique pa l'ex ai de g aines o ales de Cice a ie inum á pH=6,0 (a) e á pH=B, O (b); ClS phase e e se; 235 nm; sol an : Me hanol / H20 / acide i luo oacé ique ( BO/20/0.1 , / / ) BORTHAKUR (3 4) a ai déja dée i dans les g aines de Cice a ie inum, une ae i i é lipoxyg é nase due a la p ésenee de 2 iso o mes, eonduisan a des p odui s di é en s ( 9 e 13 LOOH a pa i d'aeide lino1éique). Nous a ons ou1u oi si les 2 isoenzymes é aien p ésen s dans des pa i es di é en es de1a g aine. L'ex ai ob enu a �a i de la a ine de Pois chiche p i ée de la cu ieu1e p ésen e une ae i i é hpoxygénase plus aible ( 900 U/mg de p o éine) au pH op imum de 8,0 e ou ni su ou du 15-HPETE a pa i d'aeide a achidonique. A pH 6,0, ee ex ai de a ine es peu ae i e ou ni p incipalemen du 5-HPETE (Fig. 3) L . == - i • §§§j! §§ í . �!�� ." ES ____ 'a�·���� - - - - - _ . - =. l. .E : = Figu e 3- Ch oma o g a � hie HPLC-PI des p odui s d'oxygéna ion de l'aclde a achidonique pa la a lne de g aines p i ées de leu cu icule, á pH=6,0 (a) e á pH=8,0 (b) ; 235nm;C18 phase e e se;sol an : CH30H / H20 / CF3COOH ( 80/20/0.1, / / ). L'ae i i é 5-LOX semb1e done é e su ou loea1isée dans la zone ex e ne de la g aine e dan s la eu ieu1e. 429 3 -E olu iolJ au cou s de la ge milJS ion Les g aines, ap es empage dans l'eau dis illée A + 4"C pendan 2 heu es, on é é mises en ge me . Des p éle emen s on pe mis de sui e l' ac i i é lipoxygénasique. Ce e ac i i é augmen e pendan les p emie es heu es de ge mina ion pou a eind e un maximum en e 24 e 32 heu es) e déc oi es apidemen ensui e pou ne ep ésen e a 50 heu es que 20� de l'ac i i é maximum.(Fig. 4). Figu e 4- Ac i i és lipoxygénasiques au cou s de la ge mina ion des g aines de Cice a ie inUII1 .L- _____ ----= ====--- - o .. L'analyse pa HPLC-PI des p odui s o mé s mon e une modi ica ion �o an e des pou cen ages d'ac i i é e es deux isoenzymes. Au cou s de la ge Dl1na ion, l'ac i i é de la l5-LOX s'e ond e es apidemen e ap es 24 heu es de ge mina ion ,il se o me, aussi bien a pH 6,0 qu'a pH 8,0 p esque exclusi emen du s-HPETE, aduisan une augmen a ion es impo an e de l'ac i i é de la 5- LOX des les p emie es de ge mina ion (Fig. 5) c 1) '� , I L 1 lile - �: " -, I ' � ! , I , � -¿ � I ,� l�: ,', ;jii - . : 8 ;:1 i:: - � - � ¡i � + H -/,--I-'-c- � #� -+ -F- - " ' -¡- ' - ' : - - � - � �� Figu e 5- Ch oma og aphie HPLC-PI des p odui s d'oxygéna ion de l'acide a ac iidonique pa l' ex ai ' de g aines de Cice a ie inuII1 á 24 heu es de ge mina ion e á pH=6,O (a) e pH=8,O lb) Ce e modi ica ion de l'ac i i é des lipoxygénases au cou s de la ge mina ion condui a s'in e oge su la signi ica ion de ce double phénomene. 430 1. E olu ion en onc ion du emps de ge mina ion de l' ac i i é lipoxygénasique o ale. Ce e a ia ion a déja é é obse ée pou d'au es g aines g e mées (2,3,4,5) . En e e , au cou s de la ge mina ion des g aines de Lupin (2J, l'ac 1 1 é enzyma ique augmen e pou a eind e un maximum (+ 50 'J a 48 heu es. Ce e ac i i é diminue apidemen ensui e pou é e a peine décelable A 72 heu es de ge mina ion. 2. Modi ica ion dans l' ac i i é des isoenzymes, a ec dispa i ion p og essi e de la l5-lipoxygénase e augmen a ion de la 5-lipoxygénase a 24 heu es puis le phénoméne s' in e se. Des a ia ions dans les ac i i és espec i e s des isoenzymes de lipoxygénase on é é déc i es au cou s de la ge mina ion des g aines d'o ge, de mais, de soja, de 1upin (2,6,8) . Se10n GAILLIARD (5), la 1ipoxygénase pou ai joue un Ole impo an dan s la é�ula ion de la p02 dans ce aines g aines en ge mina ion. C'es ainsi que 1 augmen a ion de l'ac i i é de la 5-LOX pou ai , en cap an l'oxygéne, main eni une p02 basse e assu e les condi ions d'anoxie nécessai es pendan les p emdé es heu es de ge mina ion. Mais de an la chu e b u a1e de l'ac i i é enzyma ique o a1e de la g aine de pois Chiche ge mée, la p ésence des molécules inhibi ices des lipoxygénases ( chéla eu s du e , an ioxydan s, scayenge s de adicaux ... ) a é é en isagée. Que1ques ésul a s p éliminai es écen s semblen con o e ce e hypo hése : en e e l' ex ai aqueux b u de g aines de poi s chiche ge mées inhibe, in i o, la lipoxygénase de soja e la lipoxygénase de g aines non ge mées a leu pH op imum (Fig. 6) . ABSORBAN CE (23" nm) 1 "- 0.8 - 0.8 0.4 0.2 l ,0.;--�� 4 V /' . Q _ A - o � � I.� __ '--'--" o 20 .. O 80 80 '100 120 Temps (see) Figu e 6- Inhibi ion de l' ae i i é lipoxygénasique pa un ex ai de g aines ge mées de Ciee a ie inum 1 - Témoin: lipoxygénase de soja + aeide linoléique + ampon pH 6,0 2 -Lipoxygénase de soja + ex ai de g aines ge mées(lOO h)+aeide linoléique + ampon pH 6", O 3 - Lipoxygénase de g aines seehes de Ciee a ie inum + acide linoléique + ampon pH 6,0 4 -Lipoxygénase de g aines seehes + ex ai de g aines ge mées (100 h) + aeide linoléique + ampon pH 6,0 L'isolemen e l'iden i ica ion des molécules esponsables de ee phénoméne aon en cou s. BIBLIOGRAPHIE l. ANDRIANARISON R.H., BENEYTOUT J.L. and TIXIER M. Données éeen es su les sys emes d'oxyda ion des aeides g as polyinsa u és ehez les égé aux. Rega d su la biochimie, 1991, 4, 44-49 431 2. BENEYTOUT J.L., NAJID A. and TIXIER M. Changes in lipoxygenase Ac i i y Du ing Seedling De elopmen o Lupinus Albus. P1an Science, 1988, 58, 35-41 3. BORTHAKUR A ' RAMADOSS C.S. and RAO A.G.A. The posi iona speci ici ies o oxygena ion o linoleic acid ca alysed by wo o ms o lipoxygénase isola ed om Bengal g am (Cice a ie inum) J.Biosci., 1987, 257-263. 4. BORTHAKUR A.,RAMADOSS C.S. and RAO A.G.A. Physico-chemical s udies on wo o ms o Bengal g am lipoxygenase:implica ion o s uc u al di é ences. Biochim.Biophys.Ac a, 1988, 958, 40-51. S. GAILLIARD T and H.W.S. CHAN Li�oxygenases in The Biochemis y o plan s. Vol. 4 P.K. STUMPF ed1 eu Academic P ess 1980, pp 131-161. 6. HAILSTONES M.D. and SMITH M.T. Lipid pe oxyda ion in ela ion o declinig igou in seeds o soya (Glycine max L.) ans cabbage (B asica ole acea l.) J. P1an . Physio1., 1988, 133, 452-456 7. HOLMAN R. T . Lipoxygenase Ac i i y and Fa Composi ion o Ge mina ing Soy Beans. A ch. Biochem., 1948, 17, 459-466 8. OHTA H., IDA SHOJI, MIKAMI M. and MORITA Y. Changes in Lipoxygenase Componen s o Rice Seed1ings du ing Ge mina ion. P1an . Ce11. Physio1., 1986, 27(5), 911-918 9. POCA E., RABINOVITCH-CHABLE H., COOK-MOREAU J., MONTSERRAT P. and RIGAUD M. Lipoxygenase om Zea mays L. Pu i ica ion and Physiochemical Cha ac e is ics. Biochim Biophys Ac a., 1990, 1045, 107-114 10. SAMUELSON B. Leuko ienes : media o s o immedia e hype sensi i i y eac ion and in lamma ion. . Science (Washing on D.C.), 1983, 220, 568-575 11. YABUUCHI S. Occu ence o a New Lipoxygenase Isoenzyme in Ge mina ing Ba ley Emb yos. Ag . Bio1. Chem., 1976, 40 (10), 1987-1992 432