El test de transformación de los linfocitos (TTL): Algunas aplicaciones del mismo en el laboratorio de análisis biológicos

EL TEST DE TRANSFORMACION DE LOS LINFOCITOS (TTL): ALGUNAS APLICACIONES DEL MISMO EN EL LABORATORIO DE ANALISIS BIOLOGICOS C. VIADER (1), JOSEFINA SOLER, (1), F. ECHE ARNE (2), J. V. GARCIA CALDERON (2), P. A. GARCIA CALDERON (2) INTRODUCCION En é minos g-ene ales, la espues a inmune de un ü ganismo a!s la ac uación de un e·s ímulo an igénico, se caI"�c e i,za po la apa ición de un dé e minado ipo die p o eínas sé icas, conocidas CQln el nomb e de an icue posl y;'o de una¡s células sensibilizadas que E·eg egan los d-enominauos mediado es die inmunidad celula o lin oquinas. Ac ualmen e y g a.cias a los expe imen os eahzados pm a ios g upos de in es igado es: DIXON (1), GOWANS (2, 3,.7), Mc GREGOR (4, 5, 6), MILLER (8 a 23), se ha p oíundilzado en -el ·es udio de los lin oci os, es ableciéndose su di e enciación en dos p'oblaciones p in cipales: lin oci os T y lin oci os B, los cuales ienen a su ca go las eacciones de inmunidad e a' dada celula y la sín esis de an i cue pos, espec i amen e. A moda de eco da o io podemos esumi los ·conocimi-en os ac uales en es e campo· en el <!uad o siguien e: El hecho aC' ualmen e es ablecido de que los lin oci os, an íge no sensibl-es, en p esencia del mismo, su en una se ie de ans o macion-es bioquímicas y mo ol.ógicas p�sa.ndo a célula blás ica, O) Labo a o io Ga au Palma de Mallo ca (2) Labo a o io F. Eche a ne Ba celona Co espondencia: Ca los Viade . Lab. C. GARAU CI Ca o, 1-2.° Palma de Mallo ca A s Pha macéu ica. Tomo XVIII. Núm. 2. 1977. 274 ARS PHARMACEUTICA Saco i elino Higado . e al .Células p imi i as mul ipo enciales P ocesadas po / c;;] Medula osea Bolsa de Fab icio o equi alen eo• lAg + Mac ó ago I � Lin oci os T I y I Lin oci os B � --- c o-o p -e o a-ci- ó n - T- - a --'1 / lcelulas Memo ia I CPM (A) CPD ? 1,,- Célula llin oblas: o plasmá ica ¡ � o Lin oquinas: Kille MIF IgD o cell MAF IgM LT IgA FB IgE CIF PIF FQ e c • . j¡ }"C.élul� p ecu so a de las células que sin e izan IgM. ARS PHARMACEUTICA 275 se u iliza en el labo a o io como es "in i o"" de la exis encia de de e minado o de e minados an ígenos, cons i uyendo lo que se conoce con el nomb e de "Tles die 11G;nS ol TUaJción de Los lin oci os O TTL" . . 1) En 1959, NOWELL e al. (24 a 27), demos a on que la Phi o hemagl u inina (PHA), sus ancia ex aída de la Phaseolus ulga is, capaz de aglu ina los e i oci os humanos, inducía la ans o ma ción blás ica de los lin oci oS' (28 a 31). Con es e in, se u ili1zan en el labo a o io dos p epa ados de la misma; PHA-P y PHA-M., siendo la p ime a el ex ac o p o éico y la segunda el mucop o éico: Exi,s en además o a se ie de ex ac 0's ege ales como el Po!keweed Mi o:gen (de i ado de la Phy olaca Ame ica na) y la Concalna alina A (ex ac o de Lens Gulina is) que ambién inducen la ans o madón blás ica. Aldemás, oda una se ie de sus ancia's como la axin ues a ilocócica, es ep olisina S, 11- popolisacá idos bac e ian0'S e incluso iones Hg son capaces de p o Voca al pone se en ,con ac o con l0'S! lín od 0's su pase a, célula blás ica, incluso en ausencia de sensibili zación p e ia. También se han empleado como agen es mi ogénicos inespecí icos an isue, o s (sue os an ilind'0'ci a ios, an ialo ipos, he e ólogos). Las sus ancias mi ogénicas pueden se es imulan es inespecí icos dé la p<Yblación T (Concana alina A, PEA), B, (PWM ,en el a ón) o de ambos (PWM en el homb e). Ac ualmen e se iende a cambÍa los é minos de mi ógeno o bla!s ÓlgenooS po lo.s más adecuados de es imulado es o ac i ado es; especí icos' o inesped icos. 2) Además de es e p ime g upo de es imulado es inespecí i cos, cabe dis ingui a pa i de las expe iencias de PEARMAN, un se gundo g upo de es imulado es especí icos. PEARMAN e al. en 1963 (313), HIRSCHHORN (3,2) y SHERK (34), d€' nos a' on que los lin od os ob enid0's a pa i de indi iduos ube  culin + su en "in i d' la ans o mación blás i'ca al se ,en en ados a PD. Es, a ans o ma'ción no iene luga cuando se emplean indi iduos, ube culosos o no, ube culin nega i os. Ul imamen e se ealiza on can éxi o p uebas de ans o ma'ción lin oblás ica con una amplia gama de anUgenos: p o ozoos, bac e- 276 ARS PHARMACEUTICA ia's, hongos, i us, pólenes, p o eina:s di e sélJs, an ígenos sin é icos, medicamen os, sus ancia:s inha,lan es, alimen os, e c. 35 ·a 46). La es imuladón con es e ipo de agen es iene como in p i mo dial la pues a en e idencia de una hipe siens1ibilidad del indi iduo en e a un de e minado an ígeno al medi una espues a de ipo secunda io. En consecuencia, el TTL podemos ·emplea lo de mane a u i na. ia¡ pa a e idencia eacciones de hipe sensibilidad a medica men os, sus ancias alimen icias, alé genos inhalan es, e c. Técnica es a que nos da una co eladón ap. oximada del 90 po cien o en e los esul ados de la misma y la his o ia clínica, en el caiSO de sensibilidad a¡ á macos, 47, 48). 3} Po úl imo, cabe des aca que o a aplicación de es a p ue ba se conoce con el nomb e de cul i ol mix o de lin oci os (MLC) y que en líneas gene. ales consis e en el en en amien o de la pobla ción lin oide de un posible donan e p e iamen e a ada con mi o micina o i acliación con los lin oci os del p esun o ecep o . En el caso de exis i his oincompa ibilidad en e ambas poblaciones ce lula!Tes, aipa ·ece un cie o ni el de ans o madón. O a a ian e de es a úl ima ace a, se ía la: del en en amien o de oélulas a, adas como en el caso an e io , de i adas de ejidos lI1eoplásicos, con lin oci os del suje o que la-,pélJdece y en e a las que ambién egis a íamos un mayo o meno' índice de ans o  mación según ·el es ado de espues a inmune an i- umo, . Todas es as ans o maciones blás ica1s' incluyen un g an núme o de cambios bioquímicos y mo ológicos en el lin oci o (49). Bio� químicamen e, as la: adición de his onas nuclea es p ecedida de la sín esis de RNA mensaje o, apa ición de nue os enzimas lisosó micos e inc emen o de la sín esis de DNA con pos e io eplicación celula . 'Mo ológicamen e, el lin oci o pasa a célula g ande pi onino í lica, ·conocida con el nomb e de lin oblas o, yendo 'acompañado con cambios en la c oma ina nuc1ea1 , apa ición de nucleolos y subsi guien e mi osis (50). MATERIAL Y METODOS l.-SEPARACION DE LOS LINFOCITOS La sepa ación de los lin o.ci os se e .ec úa a pa i de sang e enosa p e iam·en e des ib inada en condiciones es é iles. ARS PHARMACEUTICA 2'77 Una ez des ib inada la sang e se mezcla con igual olumen de solución salina, iso ónica. Volúmenes de 6 mI de es a sang e diluida se deposi an en u bos -es é iles que con ienen 3 mI de Picoll-U og a ín. Los U!bos se cen i ugan du an e ein e minu os a empe a u a ambien e a 1.800 pm en cen í uga ho izon al. Los lin oci os apa ecen en una in e ase pe ec amen e delimi ada ( e igu a n.O 1), ecogiéndose con una pipe a Pas eu . Ul e io men e se la an x3 con medio de cul i o. Se cuen an y ajus an en el mismo medio a 5 X 106/ml. FIG-1 cen . > 2.-PREPARACION DEL FICOLL-UROGRAFIN Se añade U og a, ín (She ing') al 76 po cien o a una solución acuosa de Ficoll (Pha macia) al 8 po cien o has a log a una den sidad de 10.80. Es a mezcla se es e mza en au ocla e. 3.-PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO Se mezd8Jn: -; 50 mL de "Medium 199" 10 X con Ea le's Sal s (Gibco) -450 mI de agua des ila'da es é il -10 mI de an i-PPLO (Gibco) -12 mI de Repes 1 M (Gibco) pE = 8 El pR del medio así p epa ado debe se de 7,2 a 7,4. 278 ARS PHARMACEUTICA 4.-CULTIVO DE LOS LINFOCITOS Volúmenes de 0,1 ml de la suspensión lin O'ide se añaden a una se ie de ubos que con ienen: a ) so.lo mediO' de cul i o b) medio. de cul i a y PHA c) Diluciones del ale geno en medio de cul i o: 1/1.000, 1/5.000, 1/10.000 Y 1/50.000. Toda' es a se ie de ubos con a án a demás con un 10> po cien o de sue o e al de e ne a (FCS) (66). La se ie de ubos se mon a á en duplicado. Los ubos se incuban du an e 96 ho a's a 37°C. A pa i de aquí, pueden s'egui se doS' caminos pa a la lec u a de los esul ados. Po una pa e, se puede es udia la ans o ma ción blás icaJ mo ológicamen e o empleando, pO' o a pa e, ma  cadO' es iso ópicos. A} Dec u 'a mmJoLóg ioC1.-Bajo la acción del co espondien e mi ógeno o. sus ancia' an igénica, el lin od o su e una ans o ma ción o célula g ande pi onino ílica, conocida con d nO'mb e de lin oblas o, pudiendo obse a1 se es ipoS' de células: -El ípico lin oci o nO' mal de 8 a 10 mic as ,de diáme o. -La célula blás ica con diáme o de 20 a 30 mic as. -Tipos in e medios ,de células de apa iencia lin oblás ica y diá- me o en 'e 12 y 20 mic as. El mé odo de inción a emplea puede se : -Resuspensión de bs célulals una ez cen i ugado el ubo y de- can ado el s,ob enadan e en 0,1 mI de medio de ,cul i o. -Ag ega 0,1 mI de alzul ipán al 0,16 po cien o. � Incuba du. an e 10 minu os a 37°C. � Añadi 1 mI de cí a o sódi,co al 1 po cien o. -Cen i uga du an e 5 minu oS' y decan a el sob enadan e. -Resuspende la's células en 1 mI de me anol-alcé ico al 3: 1. Pasados 10 minu os 'cen i uga , deca n a el sob enadan e 'Y e ec ua ex ensiones. -Tamb én pueden eñi se a.s p epa aciones con Giemsa. Se conside an como posi i os aquellos lin oci os que p esen an colo ación euc omá ica, dando ,como , esul ado posi i o de sensibi- ARS PHARMACEUTICA 279 lización en e a an íg,enos los alo -es iguales o ma'yo es al 10 po cien o de los lin od os con ados. B) Mé iodJo Slo óp.iQo.-En es a a ian e se mide la can idad de imidina o leucina 3H o C14 inco po ada po las células (65). El mo� do ope a i o es el sigu en e: -T as �ncuba a: 37°C du an e 96 ho as se añade a cada ubo 2 I- Ci de imidina i iada (ac i idad especí ica 20,5 Ci/mmol. The Ra diochemical Cen e . Ame sham, England). -IncubaT nue amen e du an e 12 ho as a 37°C. -Cen i uga du an e 10 minu os a: 3.000 pm y decan a sob e- nadan e. -Resuspende el sedimen o celula en solución salina ía. -Fil a sob e il ms Wha man GFjC 2,4 cm el empleando un apa� a o de il ación Sail" o ius acoplado a una bomba de ado. -T a a el depósi o celula del il o con 20 mI de ácido iclo o- alcé ko al 5 po cien o y ,20 mI de me alnol. -Deposi a los il -os en ial,es de cen elleo líquido. -Seca du an e 60 minu os a 80°C. -Añadi a cada ial 10 mI de líquido de cen elleo (0,0379 g de POPOP; 22,74 g de PPO y 3,79 l de olueno). -La, lec u a se e i ica en un con ado de cen elleo líquido, exp e sándose el esul ado en CPM o DPM de las que se ob iene un <'índice de ans o ma'CÍón. CPM o DPM en p esencia de an ígeno IR OPM d DPM sin an ígeno En la igu a n.O 2 se encuen an esquema izados los pasos p in �i.pales de es a écnica. RESULTADOS A modo de ejemplo se p es-en an algunos esul ados ob enidos en nues o labo a o io al cul i a' lin oci os en e al PHA, penici Hna en suJe os no alé gicos, di e saS' sensibilizadone,s medicamen osas causadas po á macos a ios" ale gia:s alimen icias, ale ge nos inhalan ,es, sus ancias mi ogénicas especí icas y en e a cé lulas au ólo¡gals. 280 ARS PHARMACEUTICA En abscisas se ep esen élJ el loga i mo de las diluciones em_ pleadas y en o denadas el núme o de CPM O' Índice ob enido. La le a "C" ep e1:en .a el núme O' de OPM de la población lin oide cul. i ada s,olo en p esencia de medio de cul i o. 100 ' .. 70 20 1 :":':-.:., • ly>PHA ........ , . .......... _ .. -.. .......... _ ......... _ .. _ ... 6C_ ..... .., ....... 3 10· PENICILINA ·1 2 3 lOG DIL FIG.2 ARS PHARMACEUTICA 281 2 3 LPG. DIL. oc. , O ES REPTOMICINA s � oC '1 l ' - ----., ,..- -�2 ;-- -13- --' · '___ 4 --55 LOG. DIL, , O MARISCOS o 'C LECHE , � 5 U, � !O C L--�- �;�'� ' - � -�3���4�-� 5 ¡ LaG DIL. 50 ;,:, !J 20 CANDIDINA LOG. DIL. ..c. 5 M o "'b ';( 10 12 10 :E. n. 5 u 10 �110 '" '-',3' >- ...J , [;'j 5 o a; "1 o" P IRI" " Á ' o �RAZOLON / .4 e'2 NB 2 3 5 LOG. DIL, 2 , LOG DIL o oC. ASMATlCOS o G.CONTROL X 1,Ly.C. TU.-FCS 2,Ly+C. TU.+SUERO AUT. .,1 .,2 .2 X,1 X,2 SA MM 6 lo