Evaluación de la proliferación de células adiposas en andamios de fibrina y quitosan: Revisión sistemática

EVALUACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS ADIPOSAS EN ANDAMIOS DE FIBRINA Y QUITOSAN: REVISIÓN SISTEMÁTICA EVALUATION OF THE PROLIFERATION OF ADIPOSE CELLS IN FIBRIN AND CHITOSAN SCAFFOLDS: A SYSTEMATIC REVIEW Alfonso Rodríguez, Camilo Andrés1, 2; González Colmenares, Gretel1; Dávila, Adriana1; Marín, Claudia1; Villamarín, Sandra1; Garzón, Hernán Santiago1; Alaminos, Miguel2 1 Grupo de Investigación en Salud Oral. Facultad de Odontología. Posgrado en Periodoncia. Universidad Antonio Nariño, Bogotá, Colombia. 2 Grupo de Ingeniería Tisular. Departamento de Histología, Universidad de Granada, Granada, España. Recibido: 23/06/2020 | Revisado: 26/06/2020 | Aceptado: 27/07/2020 DOI: 10.15568/am.2020.811.rev02 Actual Med. 2020; 105(811): Revisión 209-220 Camilo Andrés Alfonso Rodríguez Coordinador posgrado en periodoncia. Universidad Antonio Nariño Carrera 3 Este # 47 A – 15 · Bogotá, Colombia. E-mail: [email protected] Correspondencia RESUMEN Introducción: Actualmente las matrices son utilizadas para la regeneración de órganos y tejidos. Dentro de los polímeros naturales más usados están el quitosán y la fibrina. Estas matrices proporcionan un ambiente tridimensional, con características biomecánicas adecuadas, las cuales permiten la proliferación, migración y diferenciación celular. El objetivo del presente estudio fue realizar una revisión sistemática de aquellos trabajos científicos que tratan de “evaluar la capacidad de proliferación in vitro de células madre adiposas sobre andamios de fibrina y quitosán”. Materiales y Métodos: Se realizó una búsqueda bibliográfica en las bases de datos PubMed, Proquest y Science direct, utilizando términos de búsqueda específicos, desde enero de 2006 hasta diciembre de 2019. Dos investigadores determinaron independientemente la elegibilidad de los estudios. Se realizó la preselección de los artículos teniendo en cuenta los criterios de inclusión y exclusión. De los artículos seleccionados se extrajo información sobre morfología celular, comportamiento del cambio dimensional del polímero, aislamiento y caracterización celular, crecimiento, viabilidad, tasa de supervivencia y evaluación /citotóxica de las células; cuando faltaron datos, se contactó con los autores de la publicación. Se tuvo en cuenta la descripción de los métodos para obtener datos de proliferación celular mediante pruebas metabólicas como: (MTT), (MTS), WST-1, LIVE-DEAD, microscopía electrónica de barrido, microscopia electrónica de transmisión o microscopia de fluorescencia. Se utilizó una lista de chequeo para la valoración de los ítems y se determinó el índice de concordancia para los dos investigadores. Resultados: La búsqueda inicial arrojó 165 publicaciones, de los cuales se excluyeron 100 por no cumplir con los criterios de inclusión. Sesenta y cinco se revisaron a texto completo, 58 fueron excluidos por encontrarse duplicados, presentar combinación de quitosán y fibrina con otros compuestos o por no encontrarse toda la información para la evaluación de la rigurosidad metodológica. Finalmente, siete artículos fueron seleccionados y se sometieron a la evaluación metodológica. Conclusión: Los estudios seleccionados demuestran las ventajas biológicas y mecánicas de los biomateriales de fibrina y quitosán y su capacidad para estimular la proliferación celular. Estos biomateriales podrían ser considerados como opciones para ser utilizados como matrices en protocolos de ingeniería tisular y medicina regenerativa. Futuras investigaciones sobre evaluación de la proliferación celular sobre cualquier biomaterial deben estar direccionadas en plantear rigurosa metodología que permita la obtención de resultados fiables. Palabras Clave: Quitosán; Fibrina; Andamio; Proliferación; Células adiposas; In vitro. Proliferación de células en andamios de fibrina y quitosan | Alfonso Rodríguez CA, et al. Actual Med. 2020; 105(811): 209-220 210 ABSTRACT Introduction: Currently the matrices are used for the regeneration of organs and tissues. Among the most used natural polymers are chitosan and fibrin. These matrices provide a three-dimensional environment, with adequate biomechanical characteristics, which allow cell proliferation, migration and differentiation. The aim of the present study was to carry out a systematic review of those scientific works that try to “evaluate the in vitro proliferation capacity of adipose stem cells on fibrin and chitosan scaffolds”. Materials and Methods: A literature search was conducted in the PubMed, Proquest and Science direct databases, using specific search terms, from January 2006 to December 2019. Two investigators independently determined the eligibility of the studies. The articles were preselected considering the inclusion and exclusion criteria. Information on cell morphology, polymer dimensional change behavior, cell isolation and characterization, growth, viability, survival rate and evaluation / cytotoxicity of cells was extracted from the selected articles; when data were missing, the authors of the publication were contacted. The description of the methods to obtain cell proliferation data using metabolic tests such as: (MTT), (MTS), WST-1, LIVE-DEAD, scanning electron microscopy, transmission electron microscopy or fluorescence microscopy was considered. A checklist was used to assess the items and the concordance index was determined for the two researchers. Results: The initial search yielded 165 publications, of which 100 were excluded because they did not meet the inclusion criteria. Sixty-five were reviewed in full text, 58 were excluded because they found duplicates, presented a combination of chitosan and fibrin with other compounds, or because not all the information was found for the evaluation of methodological rigor. Finally, seven articles were selected and submitted to methodological evaluation. Conclusion: Selected studies demonstrate the biological and mechanical advantages of fibrin and chitosan biomaterials and their ability to stimulate cell proliferation. These biomaterials could be considered as options to be used as matrices in tissue engineering and regenerative medicine protocols. Future research on the evaluation of cell proliferation on any biomaterial should be aimed at proposing rigorous methodology that allows obtaining reliable results. Keywords: Chitosan; Fibrin; Scaffold; Proliferation; Adipose cells; In vitro. 1. INTRODUCCIÓN Los matrices son estructuras de soporte fabricados artificialmente, los cuales pueden ser de origen natural o sintético (1,2). Dentro de los matrices naturales, los biopolímeros más usados son el colágeno, la gelatina, el quitosán y la fibrina (3). Los matrices deben poseer una red extensa de poros interconectados que permitan el crecimiento y la proliferación celular, facilitando la difusión de oxígeno, nutrientes y factores de crecimiento. Además, deben ser biocompatibles, exhibir un perfil de biodegradación y tener resistencia mecánica de acuerdo con la aplicación terapéutica (4,5). Estas estructuras junto con los componentes celulares y moléculas bioactivas mejoran o restauran la función de tejidos dañados de forma parcial o completa, optimizando la respuesta inmunológica (6,7). Uno de los biopolímeros más empleados es la fibrina, que desempeña un papel importante en la regeneración de la piel (8). Los medios de unión de fibrina se componen principalmente de fibrinógeno y trombina (8, 9). La fibrina permite segregar factores de crecimiento, aumentar la cantidad de proteínas estructurales de la matriz y mejorar la proliferación junto con la adhesión de células adiposas hacia el sitio de la herida (10-14). Otro de los materiales usados es el quitosán, derivado de la quitina, mediante un alto grado de desacetilación (89%), que estimula fuertemente la proliferación de los fibroblastos. La ventaja de usar quitosán es su biocompatibilidad in vivo, tiene la particularidad de degradarse de manera controlada para permitir el reemplazo progresivo en la actividad de reparación y regeneración y proveer resistencia mecánica temporal al área donde se incorporará la matriz (7,13-15). En estudios in vitro el quitosán, ha logrado mejorar adhesión, proliferación, diferenciación y modulación del crecimiento celular (16-19). En sustitutos dérmicos obtenidos a partir de copolímeros de quitosán, se ha podido determinar que este biopolímero mejora sus características biomecánicas y biológicas, sin causar respuesta inmune, permitiendo una vascularización y colonización adecuada, obteniendo así una matriz organizada con poca formación de granulación y tejido cicatrizado (20). El quitosán empleado como soporte en cultivos de células adiposas, mediante el proceso de reticulación, mejora propiedades celulares como: adhesión, diferenciación, expansión, mantenimiento y proliferación (21-22). Las células estromales o mesenquimales son multipotenciales y se pueden transformar en osteoblastos, condrocitos, adipocitos, neuronas y células musculares (23-25). Las células adiposas, consideradas células madre mesenquimales (MSC) por su capacidad de expansión in vitro e in vivo y por su alto potencial de diferenciación hacia linajes celulares especializados, son fáciles de obtener y constituyen una fuente con potencial de interés en la aplicación terapéutica en Alfonso Rodríguez CA, et al. | Proliferación de células en andamios de fibrina y quitosan Actual Med. 2020; 105(811): 209-220 211 ingeniería tisular. El tejido adiposo se deriva del mesodermo, contiene una población microvascular de células endoteliales, músculo liso y células madre. El componente celular se obtiene mediante procesos de centrifugación y filtración, además, poseen características homólogas de células de la médula ósea, en cuanto a su alto grado de proliferación (26-28). Se han reportado las propiedades de los matrices de quitosán y fibrina in vitro en cuanto a la proliferación de las células adiposas, encontrando que estos tipos de andamiaje ofrecen amplias superficies que mejoran el soporte de las células, aumentando el crecimiento, la diferenciación y la proliferación de las mismas; al igual que permite el paso de los nutrientes. (27,29-34). Sin embargo, no es claro cuál andamio presenta mejores condiciones para la proliferación de las células adiposas. El objetivo del presente estudio fue realizar una revisión sistemática de aquellos trabajos científicos que tratan de evaluar la capacidad de proliferación in vitro de células madre adiposas sobre andamios de fibrina y quitosán. 2.1. Estrategia de búsqueda Se adoptaron directrices de la guía PRISMA para llevar a cabo esta Revisión Sistemática. Se realizó una detallada búsqueda en idioma inglés usando tres bases de datos electrónicas: Science Direct, Proquest y Pubmed. Una estrategia de búsqueda fue aplicada con los términos MeSH: Células madre (“Stem cells”), matrices (scaffold), quitosán (chitosan), fibrina (fibrin), proliferación (proliferation), regeneración tisular (“tisular regeneration”) e “in vitro”, combinados usando el operador boleano “AND” (ver Tabla 1). Se incluyeron artículos publicados desde enero de 2006 hasta diciembre de 2019. Los artículos fueron seleccionados teniendo en cuenta los siguientes criterios de inclusión: 1. Estudios experimentales in vitro. 2. Estudios con datos de proliferación de células adiposas sobre matrices de quitosán y fibrina. Se excluyeron estudios donde se utilizaron fibrina y quitosán combinados con otros biomateriales. 2.2. Selección del estudio y proceso de recolección de datos En la primera fase del estudio los títulos y los resúmenes fueron evaluados por dos revisores independientes. Se eliminaron los estudios que se encontraron repetidos en las bases de datos. Los desacuerdos fueron resueltos por un revisor experto en el tema, mediante discusión hasta llegar a un consenso. De los estudios incluidos, los dos revisores examinaron los textos completos aplicando los criterios de inclusión y exclusión. Se excluyeron los informes de casos, opiniones de expertos y comentarios de la literatura. Se extrajo la información según los criterios de elegibilidad. 2.2.1. Datos de los artículos De cada artículo se extrajo información sobre: 1. autor y año de publicación, 2. metodología del estudio (tipo de matriz, grupo control, aislamiento y caracterización de las células adiposas, morfología celular, observación de la microestructura mediante microscopía, comportamiento del cambio dimensional del polímero, crecimiento, viabilidad y tasa de supervivencia, evaluación /citotóxica de células adiposas cultivadas), 3. Análisis de los datos (Tabla 2). 2. MATERIAL Y MÉTODOS Palabras y Conectores In vitro AND stem cells AND scaffolds AND fibrin In vitro AND stem cells AND scaffolds AND chitosan In vitro AND stem cells AND scaffolds AND chitosan AND fibrin Proliferation AND stem cells AND scaffolds fibrin in vitro proliferation AND stem cells AND scaffolds chitosan in vitro Tabla 1. Estrategia de búsqueda. Conformación de los Algoritmos de búsqueda Proliferación de células en andamios de fibrina y quitosan | Alfonso Rodríguez CA, et al. Actual Med. 2020; 105(811): 209-220 212 Autor/Año Diseño del Estudio Metodología del Estudio Características del Estudio Tipo de Andamio Tipo de célula H. Park et al., 2010 Cuantitativo • Aislamiento de Células adiposas (ASCs). • Caracterización de ASCs • Análisis con microscopio de fluorescencia. • Formación de constructos en 3D con hidrogel de fibrina. • Ensayo de proliferación • Inmunohistoquímica • Análisis estadístico. • Utilizaron citometría de flujo para la separación de las células madre adiposas. • Se usaron medios de diferenciación a linajes condrogénico, adipogénico y osteogénico por 14 días. • Reducción ligera de la proliferación celular en los tres primeros días de cultivo. No se observa alteración de la morfología celular. • Se usó el pase 3 (200,000 células). Cultivadas por 7 días. • Se cuantificó el total de ADN usando el ensayo de PicoGreen. • Por medio de imágenes con fluorescencia se analizó la morfología celular por medio del software ImageJ. • Análisis de varianzas Fibrina Células adiposas L. Girandon et al., 2011 Cuantitativo • Aislamiento y expansión de células madre adiposas (ASC). • Gel de fibrina • Ensayos de viabilidad celular • Análisis estadístico • Análisis de la morfología y viabilidad celular dentro de los andamios. • El tejido adiposo fue obtenido por lipoaspiración subcutánea de la región abdominal de tres mujeres donadoras (entre los 47 a 54 años). • El gel de fibrina se realizó siguiendo las instrucciones de un kit comercial. • El ensayo de LIVE/DEAD reveló que la mayoría de las células eran viables entre los 7 a 14 días de cultivo. • Test no paramétricos Mann-Whitney. • Se analizó la morfología y viabilidad celular de las ASC dentro de los andamios desarrollados en un período entre los 7 a 14 días. Se analizó la morfología celular. Geles de fibrina y geles de plasma pobre en plaquetas. La morfología observada fue fibroblastoide. Fibrina Células adiposas E Chung et al., 2015 Cuantitativo. • Cultivo celular. • Análisis morfológico de células madre adiposas (ASC). • Ensayo de proliferación celular • Análisis estadístico • Células madre adiposas humanas ASCs (PT-5006, Lonza). Pase menor a 10. • Se analizó la morfología y elongación celular durante el cultivo celular. (2, 5 y 7 días). Se encontró morfología elongada con interconexión celular. • Se utilizó inmunofluorescencia con imágenes captadas con microscopio de fluorescencia. La actividad metabólica de las ASC fue medida usando el ensayo de proliferación celular (MTS). Todos los geles construidos mostraron similar taza de proliferación celular analizados en un periodo de 10 días. • Análisis estadístico fue realizado por ANOVA. Los datos entre los geles fueron considerados significativamente diferentes cuando el valor de P fue menor de 0.05. Fibrina Células adiposas T. Debnath et al., 2015 Cuantitativo • Aislamiento y caracterización de células madre adiposas. • Análisis del crecimiento y viabilidad celular de células madre adiposas (hADSCs ) sobre hidrogeles de quitosan mediante microscopia electrónica de barrido. • Evaluación de la apoptosis y citotoxicidad de células madre adiposas sobre hidrogeles. • Análisis estadístico • Muestras de tejido graso mediante liposucción fueron obtenidas de pacientes entre 26 a 57 años. • Evaluación de la morfología y viabilidad de hADSCs cultivadas sobre hidrogeles. Se evalúo la integridad de membrana mitocondrial mediante el ensayo (JC-1). • Se analizaron los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH). Se utilizó un espectrofotómetro para la lectura a una longitud de onda de 340 nm. • Se analizó la viabilidad celular con el ensayo de MTT. • La citotocixidad del biomaterial se estimó con tinción de Annexin V FITC. Experimentos realizados por triplicado. • Se utilizó el programa estadístico SSPS para el análisis estadístico. Quitosan Células adiposas M. Mohamed et al ., 2015 Cuantitativo • Verificación del fenotipo de células madre adiposas (ASC) usando inmunocitohistoquímica. • Viabilidad celular usando ensayo LIVE/DEAD. • Cultivo de ASC sobre andamios de quitosan. Se usó pase 4. • Se encuentran diferentes marcadores típicos de células mesenquimales. • No hay análisis cuantitativo de la viabilidad celular • El quitosan se obtuvo comercialmente. La preparación se realizó según las indicaciones del fabricante. Quitosan Células adiposas M. Sheykhhasan et al., 2015 Cuantitativo • Aislamiento de células madre adiposas. Se realizan varios pases. • Ensayos de proliferación celular. • Aspirados de liposucción provenientes de tres donadores humanos con previo consentimiento informado. • Pase 3 utilizado para todos los experimentos. • MTT Fibrina Células adiposas E. A. Wahl., 2015 Semicuantitativo • Aislamiento y cultivo celular. • Caracterización celular • Ensayos de actividad metabólica celular • Análisis estadístico • Tejido adiposo obtenido de lipoaspirado de diferentes donadores. • Células incubadas por 18 días. • Caracterización celular mediante citometría de flujo. • Se utilizó el ensayo metabólico WST-1 evaluando a los 1, 3, 7 y 14 días. La muerte celular se analizó por la liberación de lactato deshidrogenasa a 1, 3 y 7 días. • Análisis de varianza (ANOVA). Quitosan y fibrina Células adiposas Tabla 2. Datos Metodológicos generales de los artículos seleccionadosFuente: Elaboración propia. Alfonso Rodríguez CA, et al. | Proliferación de células en andamios de fibrina y quitosan Actual Med. 2020; 105(811): 209-220 213 Autor/Año Diseño del Estudio Metodología del Estudio Características del Estudio Tipo de Andamio Tipo de célula H. Park et al., 2010 Cuantitativo • Aislamiento de Células adiposas (ASCs). • Caracterización de ASCs • Análisis con microscopio de fluorescencia. • Formación de constructos en 3D con hidrogel de fibrina. • Ensayo de proliferación • Inmunohistoquímica • Análisis estadístico. • Utilizaron citometría de flujo para la separación de las células madre adiposas. • Se usaron medios de diferenciación a linajes condrogénico, adipogénico y osteogénico por 14 días. • Reducción ligera de la proliferación celular en los tres primeros días de cultivo. No se observa alteración de la morfología celular. • Se usó el pase 3 (200,000 células). Cultivadas por 7 días. • Se cuantificó el total de ADN usando el ensayo de PicoGreen. • Por medio de imágenes con fluorescencia se analizó la morfología celular por medio del software ImageJ. • Análisis de varianzas Fibrina Células adiposas L. Girandon et al., 2011 Cuantitativo • Aislamiento y expansión de células madre adiposas (ASC). • Gel de fibrina • Ensayos de viabilidad celular • Análisis estadístico • Análisis de la morfología y viabilidad celular dentro de los andamios. • El tejido adiposo fue obtenido por lipoaspiración subcutánea de la región abdominal de tres mujeres donadoras (entre los 47 a 54 años). • El gel de fibrina se realizó siguiendo las instrucciones de un kit comercial. • El ensayo de LIVE/DEAD reveló que la mayoría de las células eran viables entre los 7 a 14 días de cultivo. • Test no paramétricos Mann-Whitney. • Se analizó la morfología y viabilidad celular de las ASC dentro de los andamios desarrollados en un período entre los 7 a 14 días. Se analizó la morfología celular. Geles de fibrina y geles de plasma pobre en plaquetas. La morfología observada fue fibroblastoide. Fibrina Células adiposas E Chung et al., 2015 Cuantitativo. • Cultivo celular. • Análisis morfológico de células madre adiposas (ASC). • Ensayo de proliferación celular • Análisis estadístico • Células madre adiposas humanas ASCs (PT-5006, Lonza). Pase menor a 10. • Se analizó la morfología y elongación celular durante el cultivo celular. (2, 5 y 7 días). Se encontró morfología elongada con interconexión celular. • Se utilizó inmunofluorescencia con imágenes captadas con microscopio de fluorescencia. La actividad metabólica de las ASC fue medida usando el ensayo de proliferación celular (MTS). Todos los geles construidos mostraron similar taza de proliferación celular analizados en un periodo de 10 días. • Análisis estadístico fue realizado por ANOVA. Los datos entre los geles fueron considerados significativamente diferentes cuando el valor de P fue menor de 0.05. Fibrina Células adiposas T. Debnath et al., 2015 Cuantitativo • Aislamiento y caracterización de células madre adiposas. • Análisis del crecimiento y viabilidad celular de células madre adiposas (hADSCs ) sobre hidrogeles de quitosan mediante microscopia electrónica de barrido. • Evaluación de la apoptosis y citotoxicidad de células madre adiposas sobre hidrogeles. • Análisis estadístico • Muestras de tejido graso mediante liposucción fueron obtenidas de pacientes entre 26 a 57 años. • Evaluación de la morfología y viabilidad de hADSCs cultivadas sobre hidrogeles. Se evalúo la integridad de membrana mitocondrial mediante el ensayo (JC-1). • Se analizaron los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH). Se utilizó un espectrofotómetro para la lectura a una longitud de onda de 340 nm. • Se analizó la viabilidad celular con el ensayo de MTT. • La citotocixidad del biomaterial se estimó con tinción de Annexin V FITC. Experimentos realizados por triplicado. • Se utilizó el programa estadístico SSPS para el análisis estadístico. Quitosan Células adiposas M. Mohamed et al ., 2015 Cuantitativo • Verificación del fenotipo de células madre adiposas (ASC) usando inmunocitohistoquímica. • Viabilidad celular usando ensayo LIVE/DEAD. • Cultivo de ASC sobre andamios de quitosan. Se usó pase 4. • Se encuentran diferentes marcadores típicos de células mesenquimales. • No hay análisis cuantitativo de la viabilidad celular • El quitosan se obtuvo comercialmente. La preparación se realizó según las indicaciones del fabricante. Quitosan Células adiposas M. Sheykhhasan et al., 2015 Cuantitativo • Aislamiento de células madre adiposas. Se realizan varios pases. • Ensayos de proliferación celular. • Aspirados de liposucción provenientes de tres donadores humanos con previo consentimiento informado. • Pase 3 utilizado para todos los experimentos. • MTT Fibrina Células adiposas E. A. Wahl., 2015 Semicuantitativo • Aislamiento y cultivo celular. • Caracterización celular • Ensayos de actividad metabólica celular • Análisis estadístico • Tejido adiposo obtenido de lipoaspirado de diferentes donadores. • Células incubadas por 18 días. • Caracterización celular mediante citometría de flujo. • Se utilizó el ensayo metabólico WST-1 evaluando a los 1, 3, 7 y 14 días. La muerte celular se analizó por la liberación de lactato deshidrogenasa a 1, 3 y 7 días. • Análisis de varianza (ANOVA). Quitosan y fibrina Células adiposas Tabla 2. Datos Metodológicos generales de los artículos seleccionadosFuente: Elaboración propia. Proliferación de células en andamios de fibrina y quitosan | Alfonso Rodríguez CA, et al. Actual Med. 2020; 105(811): 209-220 214 Cuando faltaron algunos datos mencionados, los autores de esta revisión se comunicaron con los investigadores obteniendo respuesta de dos ellos, según los requerimientos. 2.3. Evaluación de calidad La evaluación de la calidad del estudio metodológico se realizó utilizando los criterios propuestos por Mossman et.al (1983). Por el tipo de estudio seleccionado no se utilizó una escala para medir el riesgo de sesgo, por lo tanto, se diseñó una lista de chequeo para evaluar los criterios relevantes de la metodología (ver Tabla 3). Los criterios relevantes fueron evaluados en cada artículo y calificados como “Sí” si el criterio se cumplía y “No” si el criterio no estaba claro. Cuando se cumplió con todos los criterios se calificó como bajo riesgo de sesgo. Se tomaron solo los estudios que cumplieron todos los criterios. Los desacuerdos entre los revisores se resolvieron mediante discusión para llegar a un consenso. Se determinó como medida de resultado para la proliferación de células adiposas la absorbancia por medio de pruebas o ensayos metabólicos. Preguntas H. Park et al., 2010 L. Girandon et al., 2011 E Chung et al., 2015 T. Debnath et al., 2015 M. Mohamed et al ., 2015 M. Sheykhhasan et al., 2015 E. A. Wahl., 2015 ¿Describe el tiempo del estudio? Si Si Si Si Si Si Si ¿Describe el estudio in vitro? Si Si Si Si Si Si Si ¿Describe el grupo control? Si No es Claro Si Si No es Claro Si Si ¿Se describe el sesgo del estudio? Si Si Si Si Si No es Claro Si ¿Describen el pase celular? Si Si Si Si Si Si Si ¿Realizaron ensayos de proliferación celular? Si Si Si Si Si No es Claro Si ¿Nombran el tipo de células utilizadas y realizan caracterización celular? Si Si Si Si Si Si Si ¿Describen claramente el tipo de andamio usado? Si Si Si Si Si Si Si ¿Describen claramente la medida de resultado utilizada? Si Si Si Si Si Si Si ¿Describe el resultado de la proliferación celular? Si Si Si Si Si No es claro Si ¿Los resultados coinciden con los objetivos del estudio? Si Si Si Si No es Claro Si Si Tabla 3. Lista de chequeo con los criterios relevantes de la metodología de los artículos seleccionados. Si: Cuando cumple con los criterios de rigor metodológico No es claro: Cuando no presenta descripción detallada de los criterios de rigor metodológico Alfonso Rodríguez CA, et al. | Proliferación de células en andamios de fibrina y quitosan Actual Med. 2020; 105(811): 209-220 215 Se preseleccionaron 165 artículos de acuerdo con la búsqueda inicial, de los cuales se excluyeron 100 artículos que no cumplían con los criterios de inclusión. De los 65 artículos que fueron seleccionados, se hizo revisión a texto completo donde en 23 artículos se encontró combinación de biomateriales, 17 artículos fueron estudios in vivo, 10 estudios in vivo e in vitro y 15 duplicados (Figura 1). Finalmente, siete artículos fueron seleccionados para ser sometidos al análisis a texto completo (tabla 3); cuatro estudios: Park et. al, Chung et, Girandon et. al y Sheykhhasan et. al evaluaron la proliferación de células adiposas sobre matrices de fibrina, dos estudios Debnath et. al y Mohamed et. al evaluaron células adiposas en matrices de quitosán y el estudio de Wahl et. al comparó la proliferación celular en matrices de fibrina y quitosán. En cuanto a la morfología celular Chung et. al (2015) realiza un meticuloso análisis teniendo en cuenta el volumen, número de ramificaciones y conexiones celulares, longitud y diámetro celular. Por otro lado, Debnath et. al (2015), Wahl et. al (2015), Girandon et. al (2011) hacen descripción cualitativa de la morfología celular sin entrar en análisis detallados. El estudio realizado por Wahl et. al (2015) sólo se enfoca en describir la elongación celular mediante un programa informático sin considerar otras características morfológicas. Los trabajos de Sheykhhasan et. al (2015) y Mohamed et. al (2015).) no realizan análisis morfológico. La mayoría de los trabajos coinciden en evaluar la proliferación celular en un rango de tiempo comprendido entre los 7, 10 y 14 días. La mejor tasa de proliferación celular se presentó entre los 7 y 14 días de experimentación. De acuerdo con la medida de resultado, Chung et. al, realizó ensayo metabólico MTS dando como resultados una absorbancia de 490 nm evaluado en 2, 5 y 7 días, pero no hay una valoración expresada en porcentaje de proliferación celular. Debnath et. al, usó el ensayo JC1 (actividad mitocondrial) reportando resultados cualitativos, además utilizó el ensayo metabólico MTT mostrando resultados cuantitativos en porcentajes de proliferación celular. Finalmente, los resultados del ensayo de LDH (Lactato deshidrogenasa) los representa en microgramos por mililitro. El tiempo de evaluación fue entre 7 y 14 días. 3. RESULTADOS Figura 1. Diagrama de flujo de la estrategia de búsqueda utilizada en este estudio. Proliferación de células en andamios de fibrina y quitosan | Alfonso Rodríguez CA, et al. Actual Med. 2020; 105(811): 209-220 216 Wahl et. al, mediante ensayo metabólico de LDH reporta una proliferación celular del 70% sobre andamio de fibrina y del 50% en andamio de quitosán a los 7 días; además reporta los resultados con la técnica WST-1 (Sales de Tetrazolium/formazan) con una absorbancia de 450 nm. El tiempo de evaluación fue de 1, 3, 7 y 14 días. Park et. al, realiza pruebas metabólicas de ADN (PICOgreen) con una absorbancia de 260 nm y usa ensayos de inmunofluerescia, el tiempo de evaluación fue de 7 días. Girandon et. al, usa la técnica metabólica de LIVE-DEAD expresando sus resultados en distribución de área, pero sin presentar un porcentaje de proliferación. El tiempo evaluado fue entre 7 y 14 días. Sheykhhasan et. al en su estudio utilizó ensayo metabólico MTT presentando resultados en absorbancia sobre 570 nm. No reporta el porcentaje de proliferación celular y realiza la evaluación inicial a los 2 y 3 días luego evalúa a los 14 díasMohamed et. al, realiza ensayo metabólico LIVEDEAD, con descripción cualitativa de la proliferación, evaluada entre 1 y 4 días (24 – 96 horas). Evaluación de la calidad Cuatro artículos (Chung et. al, Debnath et. al, Wahl et. al y Park et. al) cumplieron los parámetros de la evaluación de la calidad metodológica, sin embargo, hay una variabilidad en los ensayos metabólicos que no permiten una comparación en cuanto a la expresión cuantitativa de la proliferación de las células adiposas en las dos matrices. Los cuatro estudios presentan un incremento de la proliferación respecto al intervalo de tiempo. Este trabajo tuvo como objetivo realizar una revisión sistemática de aquellos trabajos científicos que tratan de evaluar la capacidad de proliferación in vitro de células madre adiposas sobre andamios de fibrina y quitosán. Los métodos y técnicas para evaluar la proliferación resultan de gran importancia para identificar las ventajas de los biomateriales que pueden servir como matrices (35-36) y las investigaciones que se decantan por realizar diferentes ensayos y técnicas arrojarán mejor evidencia que aquellos trabajos que se limitan a realizar solamente una prueba (37). En este sentido, esta revisión sistemática se focalizó en determinar los estudios que cumplían con los mejores criterios metodológicos para analizar la proliferación en diferentes biomateriales. Se evidenció que los requisitos a tener en cuenta para desarrollar una metodología rigurosa son: 1. Se debe describir la caracterización celular cuando se utilizan células mesenquimales. 2. Se sebe describir el subcultivo utilizado en los ensayos. 3. Analizar la morfología celular midiendo las dimensiones celulares mediante microscopía o fluorescencia. 4. Usar o combinar ensayos metabólicos. 5. Tiempo de desarrollo de los experimentos. Por esta razón, los criterios incluidos en este trabajo para evaluar la proliferación celular son el análisis minucioso de la morfología celular, ensayos metabólicos como MTT, WST-1, MTS, LIVE/DEAD, LDH y evaluación mediante microscopía o fluorescencia (38). Las pruebas metabólicas se perfilan como el gold standard para evaluar la proliferación y citotoxicidad celular in vitro además de tener como característica principal de proporcionar un dato cuantitativo. Además, este tipo de ensayos no deben interferir con el compuesto a evaluar, en este caso los matrices de fibrina y quitosán. La Sociedad Internacional de Terapia Celular/ International Society for Cellular Therapy (ISCT), estableció unos criterios para identificar las células madre mesenquimales. Primero, se debe demostrar su morfología fibroblastoide y la adherencia a la superficie plástica del cultivo celular. Segundo, las células mesenquimales deben expresar como mínimo los marcadores de superficie positivos para CD105, CD90, CD73; y ser negativos para CD34 y CD45 (3). En primer lugar, este estudio encontró que, aunque los 7 artículos elegidos presentaban rigurosa calidad metodológica solo 4 ellos hicieron un análisis integral para evaluar la proliferación sobre matrices de quitosán y fibrina específicamente. Cuando buscamos cuáles estudios hicieron caracterización de las células adiposas mesenquimales se encontró que cinco investigaciones realizaban una adecuada caracterización celular Park et. al, Chung et. al, Debnath et. al, Wahl et. al, Mohamed et. al. Incluyendo técnicas de citometría de flujo y diferenciación a linaje condrogénico, adipogénico y osteogénico tal como lo exige la ISCT. Interesantemente, el estudio de Mohamed et. al realiza caracterización de células mesenquimales utilizando técnica histoquímica, el cual utiliza anticuerpos específicos CD29, CD34, CD105, CD73, CD90 para identificar células mesenquimales. Aunque no es un ensayo convencional para caracterizar este tipo de células se convierte en una técnica opcional para dicho fin. Estos resultados, contrastan con diferentes trabajos que aunque realizan caracterización celular, no presentan una adecuada metodología para evaluar comportamiento celular sobre matrices (21, 39). En segunda instancia, es importante resaltar que cuando evaluamos el ítem de si los investigadores describen el subcultivo celular utilizados para hacer los diferentes ensayos y técnicas para evaluar matri4. DISCUSIÓN Alfonso Rodríguez CA, et al. | Proliferación de células en andamios de fibrina y quitosan Actual Med. 2020; 105(811): 209-220 217 ces se pudo confirmar que todos los estudios seleccionados en esta investigación consideraron importante nombrar el subcultivo celular. Estos hallazgos ponen de manifiesto, que la descripción del subcultivo celular es un requisito importante a la hora de diseñar experimentos de proliferación sobre matrices. Estos resultados están en desacuerdo con trabajos que se limitan a desarrollar ensayos y técnicas sin descripción previa del subcultivo celular (40). En tercer lugar, la morfología celular es una característica importante que está correlacionada con importantes funciones bioquímicas involucradas en la formación de nuevo tejido, proliferación y migración celular. Además, se determinó cómo las características biológicas y biomecánicas de los matrices inciden sobre la proliferación celular observando que cuando se altera la morfología se altera la viabilidad y la tasa de proliferación celular. Es decir, los cambios morfológicos ocurridos sobre un biomaterial inciden sobre la proliferación (41). En esta revisión se encontraron tres artículos que analizaron la morfología para evidenciar el comportamiento celular sobre los matrices de fibrina y quitosán. El método más reportado para analizar la morfología celular fue la microscopía, incluida la microscopía electrónica de barrido y en segundo lugar las técnicas de fluorescencia también se posicionan como una alternativa para evaluar la morfología celular. Los trabajos de H. Park et. al (2010), E. Chung et. al (2015), y T. Debnath et. al (2015) hacen una detallada descripción cuantitativa y cualitativa de la morfología celular sobre los matrices de fibrina y quitosán. Estos estudios ponen de manifiesto que una rigurosa interpretación cuantitativa y cualitativa ofrece mejor evidencia que aquellos estudios que solo se limitan a interpretaciones cualitativas o en algunos casos no se realiza dicha interpretación (22). Sin embargo, mucho de los estudios encontrados en la literatura reportan estás técnicas para evaluar morfología celular pero no proporcionan un juicioso análisis e interpretación. (2,42) En cuarto lugar, en esta revisión sistemática los estudios de H. Park et. al (2010), E. Chung et. al (2015), T. Debnath et. al (2015), M. Sheykhhasan et. al (2015), A.Wahl et. al (2015) utilizan ensayos metabólicos para evaluar la proliferación y citotoxicidad celular de células adiposas sobre matrices de quitosán y fibrina tales como Picogreen, WST1, MTS y MTT. Por otro lado, M. Mohamed et. al (2015) y L. Girandon et. al (2011) se limitan a utilizar el ensayo de viabilidad celular LIVE/DEAD. Estos ensayos arrojan información de vital importancia de cómo influyen los biomateriales en la proliferación celular. Una de las grandes ventajas de los ensayos metabólicos es que permite obtener resultados e interpretaciones cuantitativas en valores de absorbancia o porcentajes. Mientras que la prueba de LIVE/DEAD en los estudios reportados en este trabajo los autores se limitan a hacer una interpretación cualitativa y semicuantitativa sin arrojar datos estadísticamente significativos. Adicional a esto, otro hallazgo importante que se pudo extraer de la presente investigación fue la repercusión que tienen la combinación de diferentes ensayos metabólicos en el mismo estudio. Estas combinaciones proporcionan datos relevantes y sólidos los cuales aportan mejor calidad de evidencia científica. Tal es el caso de los estudios realizados por Debnath et. al quién combina ensayos de 5,5’, 6,6’-tetrachloro-1,1’, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1) el cual es una técnica que permite evaluar la integridad de la membrana mitocondrial (43), con LDH y MTT. Y el estudio realizado por A.Wahl et. al combina ensayos metabólicos de WST-1 y LDH. A la luz de estos resultados se puede dilucidar que los ensayos metabólicos o combinación de ellos se posicionan como herramientas fundamentales para evaluar la proliferación y citotoxicidad celular. Estos hallazgos están en contraposición a aquellos estudios que no utilizan este tipo de pruebas. (44, 45, 46). Discutiendo el quinto punto de los requisitos para considerar como relevante un estudio de proliferación celular sobre matrices, en este trabajo se pudo evidenciar que los estudios que plantean diferentes tiempos para la realización de sus experimentos cumplen con rigurosidad científica. Los hallazgos encontrados en esta revisión sobre todos los trabajos seleccionados proponían dentro de su diseño experimental para evaluar proliferación rangos de tiempo representados en 1, 3, 7 y 14 días principalmente. Sin embargo, ensayos como el LIVE/DEAD, WST-1, MTT también se pueden plantear en rangos de horas 24, 48, 72 y 96 horas tal como lo demuestran varios estudios de viabilidad celular (47, 48). Los resultados encontrados en estos estudios ponen de manifiesto que la mejor taza de proliferación y viabilidad celular está contemplada en un periodo de 7 a 14 días sobre los matrices de fibrina y quitosán (2,41,49-53). Estos hallazgos están en concordancia con trabajos previamente reportados los cuales evalúan proliferación celular a diferentes rangos de días (10, 21,40). Vale la pena resaltar que en esta investigación se descartaron varios estudios debido a que no cumplieron con rigurosidad metodológica. Algunos reportes presentaron combinación de diferentes biomateriales como poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), nanopartículas de hidroxiapatita dopadas con zinc y colágeno (54). El análisis de la calidad de los estudios seleccionados permitió determinar que deben existir unos criterios mínimos a la hora de plantear investigaciones