Regulation der Aktivität des Anti-Sigmafaktors RsiX aus Bacillus subtilis

Regula ion de Ak i i ä des An i-Sigma ak o s RsiX aus Bacillus sub ilis DISSERTATION zu E langung des G ades Dok o de Na u wissenscha en - D . e . na . - de Fakul ä ü Biologie, Chemie und Geowissenscha en de Uni e si ä Bay eu h o geleg on Diplom-Biochemike in Ka ha ina Schä e Bay eu h, 2011 Die o liegende A bei wu de in de Zei on Juni 2007 bis No embe 2011 am Leh s uhl ü Gene ik de Uni e si ä Bay eu h un e de Lei ung on He n P o . D . Thomas Wiege (Hochschule Zi au/Gö li z) ange e ig . Volls ändige Abd uck de on de Fakul ä ü Biologie, Chemie und Geowissenscha en de Uni e si ä Bay eu h genehmig en Disse a ion zu E langung des akademischen G ades eines Dok o s de Na u wissenscha en (D . e . na .). Disse a ion einge eich am: 04.11.2011 Zulassung du ch die P omo ionskommission: 16.11.2011 Wissenscha liches Kolloquium am: 30.03.2012 Am ie ende Dekanin: P o . D . Bea e Lohne P ü ungsausschuss: P o . D . Thomas Wiege (E s gu ach e ) P o . D . Bi gi a Wöh l (Zwei gu ach e in) P o . D . O win Meye (Vo si zende ) P o . D . F anz X. Schmid PD D . S e en Kolb „Das Leben wi d o wä s geleb und ückwä s e s anden!“ Sø en Kie kegaa d (1813 – 1855) Inhal s e zeichnis I Inhal s e zeichnis Inhal s e zeichnis ...................................................................................................................... I Zusammen assung .................................................................................................................... 1 Summa y ................................................................................................................................... 3 1 Einlei ung .......................................................................................................................... 5 1.1 Bak e ien im Allgemeinen und B. sub ilis im Speziellen ........................................... 5 1.2 Regula ion de Genexp ession in Bak e ien ............................................................... 6 1.3 Regula ion de T ansk ip ion ..................................................................................... 6 1.4 Ini ia ion de T ansk ip ion du ch Sigma ak o en ...................................................... 7 1.5 P imä e und sekundä e Sigma ak o en ...................................................................... 7 1.6 ECF-Sigma ak o en .................................................................................................... 8 1.6.1 Regula ion on ECF-Sigma ak o en ...................................................................... 9 1.6.1.1 Regula ion des ECF-Sigma ak o s E aus E. coli ....................................... 11 1.6.1.2 Regula ion des ECF-Sigma ak o s W aus B. sub ilis ................................ 12 1.6.2 De ECF-Sigma ak o X aus B. sub ilis .............................................................. 13 1.6.2.1 Das X-Regulon .......................................................................................... 14 1.6.2.2 Physiologische Rolle on X ...................................................................... 16 1.6.2.3 X-Regula ion du ch einen An i-Sigma ak o ............................................ 17 1.7 Te mina ion de T ansk ip ion ................................................................................. 19 1.7.1 Fak o unabhängige Te mina ion .......................................................................... 19 1.7.2 Fak o abhängige Te mina ion .............................................................................. 20 1.7.2.1 De Fak o Rho ........................................................................................... 21 1.7.2.2 Mechanismus de ak o abhängigen Te mina ion....................................... 22 1.7.2.3 Die Nus-Fak o en ........................................................................................ 24 1.8 Zielse zung diese A bei ......................................................................................... 25 Inhal s e zeichnis II 2 Ma e ial und Me hoden ................................................................................................. 26 2.1 Bak e iens ämme, Plasmide und Oligonukleo ide ................................................... 26 2.2 Ve wende e Pu e und Lösungen ............................................................................ 33 2.3 An ibio ika-Lösungen ............................................................................................... 43 2.4 An ikö pe ................................................................................................................ 43 2.5 Längens anda ds ....................................................................................................... 44 2.6 Mik obiologische Me hoden .................................................................................... 45 2.6.1 Näh medien .......................................................................................................... 45 2.6.2 Kul u e ah en .................................................................................................... 46 2.6.2.1 Au nehmen on Wachs umsku en ............................................................ 46 2.6.2.2 Anlegen on Glyce in-Daue kul u en ......................................................... 47 2.6.3 Fluo eszenzmik oskopie ....................................................................................... 47 2.6.3.1 Fluo eszenzmik oskopie und -quan i izie ung on GFP-Fusionen ............ 47 2.6.3.2 Fluo eszenzmik oskopie zu Bes immung de Zellmo phologie ................ 48 2.6.4 He s ellung kompe en e Zellen und T ans o ma ion .......................................... 48 2.6.4.1 Gene ische Manipula ion on E. coli-Zellen .............................................. 48 2.6.4.1.1 He s ellung chemisch kompe en e E. coli-Zellen ................................. 48 2.6.4.1.2 T ans o ma ion on Plasmid-DNA in chemisch kompe en e E. coli-Zellen .......................................................................................... 49 2.6.4.1.3 He s ellung on elek okompe en en E. coli-Zellen ü die Elek opo a ion ....................................................................................... 49 2.6.4.1.4 Elek opo a ion on E. coli-Zellen ......................................................... 50 2.6.4.2 Gene ische Manipula ion on B. sub ilis-Zellen ......................................... 50 2.6.4.2.1 He s ellung kompe en e B. sub ilis-Zellen ............................................ 50 2.6.4.2.2 T ans o ma ion on Plasmid- ode ch omosomale DNA in kompe en e B. sub ilis-Zellen ..................................................................................... 51 2.6.4.2.3 SPP1-Phagen T ansduk ion in B. sub ilis ............................................... 52 2.6.4.2.4 T ansposonmu agenese ........................................................................... 52 Inhal s e zeichnis III 2.7 Molekula biologische und gene ische Me hoden ..................................................... 52 2.7.1 Isolie ung on Nukleinsäu en .............................................................................. 52 2.7.1.1 Isolie ung on Gesam -DNA aus B. sub ilis ............................................... 52 2.7.1.2 Isolie ung on Plasmid-DNA aus E. coli .................................................... 53 2.7.1.2.1 Isolie ung on Plasmid-DNA du ch Mini-P äpa a ion (Boiling P äpa a ion) ............................................................................................ 53 2.7.1.2.2 Isolie ung on Plasmid-DNA du ch Midi-P äpa a ion .......................... 54 2.7.1.3 Isolie ung on Gesam -RNA aus B. sub ilis ............................................... 54 2.7.2 Pho ome ische Bes immung de DNA- und RNA-Konzen a ion ...................... 55 2.7.3 Ampli ika ion on DNA mi Hil e de Polyme ase Ke en eak ion (PCR) ......... 56 2.7.3.1 S anda d-PCR ............................................................................................. 56 2.7.3.2 Kolonie-PCR ............................................................................................... 57 2.7.4 Enzyma ische Modi ika ion on Nukleinsäu en .................................................. 58 2.7.4.1 Enzyma ische Hyd olyse on Nukleinsäu en ............................................. 58 2.7.4.2 Liga ion on Nukleinsäu en ........................................................................ 59 2.7.5 Reinigung on DNA-F agmen en nach de PCR bzw. nach ande en enzyma ischen Reak ionen ................................................................................... 60 2.7.6 Aga ose-Gelelek opho ese .................................................................................. 61 2.7.6.1 DNA-Aga ose-Gelelek opho ese ............................................................... 61 2.7.6.2 RNA-Aga ose-Gelelek opho ese ............................................................... 61 2.7.7 Isolie ung on Nukleinsäu en aus Aga osegelen (Gelex ak ion) ....................... 62 2.7.8 Sequenzie ung ...................................................................................................... 62 2.7.9 He s ellung eine DIG-ma kie en DNA-Sonde................................................... 62 2.7.10 Reinigung on DNA-/RNA-Sonden du ch P äadso p ion ................................. 62 2.7.11 Sou he n Blo ...................................................................................................... 63 2.7.12 Hyb idisie ung und Nachweis DIG-ma kie e Nukleinsäu e-Sonden du ch Chemolumineszenz ............................................................................................ 63 2.7.13 RNA-Analy ik .................................................................................................... 64 Einlei ung 5 1 Einlei ung 1.1 Bak e ien im Allgemeinen und B. sub ilis im Speziellen Das Vo kommen on Bak e ien kann als ubiqui ä bezeichne we den. Dies lieg auch in ih e eno men Anpassungs ähigkei beg ünde . Ex eme We e de Tempe a u , des pH-We es ode auch des Salzgehal es s ellen bei de Besiedelung eines Habi a s du ch Bak e ien kein P oblem da . Obwohl Bak e ien Eigenscha en besi zen, die sie auch ü den Menschen zum Pa hogen we den lassen, gib es seh iel meh nü zliche Funk ionen, wodu ch Bak e ien sowohl im Haushal als auch in de Indus ie zum Einsa z kommen (Schlegel 1992). Daneben we den Bak e ien auch in de G undlagen o schung als Modello ganismen e wende . Zwei de häu igs en Ve e e sind hie Esche ichia coli, ein G am-nega i es Bak e ium, und B. sub ilis, ein G am-posi i e O ganismus. Im Fokus diese A bei s eh das Bodenbak e ium B. sub ilis, welches auch un e dem Namen „Heubacillus“ bekann gewo den is , da man es leich aus einem Heuau guss isolie en kann. E s mals wu de dieses Bak e ium 1838 on Eh enbe g als Vib io sub ilis besch ieben und wenig spä e on Cohn in Bacillus sub ilis umbenann . Dieses s äbchen ö mige Bak e ium kann eine G öße on e wa 2-3 µm e eichen. B. sub ilis wu de abe nich nu im Boden ode Heuau güssen ge unden, sonde n auch in Milch (Law ence & Fo d 1916). Das zeig , dass B. sub ilis als nich -pa hogen gil . Es wu de dem Bak e ium soga de S a us eines GRAS- O ganismus (gene ally ecognized as sa e) e liehen (Kayse 2002). Eigenscha en wie die Apa hogeni ä , die leich e Kul i ie ba kei und auch die ku ze Gene a ionszei on nu 26 min bei 40 °C beg ünden u. a. die Ve wendung on B. sub ilis als Modello ganismus (Schlegel 1992). Fe ne gehö B. sub ilis mi zu den e s en Bak e ien, de en Genom olls ändig sequenzie wu de. Be ei s 2 Jah e nachdem das e s e olls ändig sequenzie e Genom eines Bak e iums e ö en lich wu de (Fleischmann e al. 1995), publizie en Kuns e al. die E gebnisse de Sequenzie ung des B. sub ilis Genoms. Demnach kodie dieses Bak e ium ü ca. 4100 P o eine (Kuns e al. 1997). In de Ve ügba kei de gesam en Sequenz des Genoms lieg ein wei e e wich ige G und ü den Einsa z on B. sub ilis in de G undlagen o schung übe Gen egula ion. Wich ige egula o ische G undp inzipien, z. B. die En deckung des e s en al e na i en Sigma ak o s (Fox & Pe o 1974; Haldenwang & Losick 1980), sind an B. sub ilis au geklä wo den. Einlei ung 6 Zusä zlich zu Ve wendung on B. sub ilis in de biologischen und medizinischen Fo schung komm das G am-posi i e Bak e ium auch in de Indus ie zum Einsa z. So benu z die Waschmi elindus ie den Vo eil, dass ex azellulä e Enzyme wie z. B. Sub ilisin E (Wong e al. 1984) on B. sub ilis in das umgebende Medium sek e ie we den (Simonen & Pal a 1993; An elmann e al. 2001). Des Wei e en wi d B. sub ilis in de Landwi scha als na ü liches Fungizid e wende (Leibinge e al. 1997). 1.2 Regula ion de Genexp ession in Bak e ien In jede Zelle muss die Exp ession de Gene in eine ge egel en A und Weise e olgen. Dies gil in besonde e Weise ü Bak e ien. Au g und ih e seh ge ingen G öße on nu wenigen Mik ome e n können nich zu jede Zei alle kodie en P o eine in g oße Menge in eine bak e iellen Zelle o ä ig sein. In Abhängigkei de äuße en Bedingungen muss die Zelle en scheiden, welche P o eine benö ig we den und die en sp echende Genexp ession egeln. Eine Vielzahl e schiedene Regula ionsmechanismen s eh da ü zu Ve ügung (Schlegel 1992). Eine Regula ion kann dabei schon au dem Le el de T ansk ip ion e olgen ode e s spä e wäh end de T ansla ion, sowie z. T. auch pos ansla ional. Das Haup augenme k diese A bei lieg jedoch au de Regula ion de T ansk ip ion. 1.3 Regula ion de T ansk ip ion Die T ansk ip ion bezeichne den P ozess de RNA-Syn hese anhand eine DNA-Ma ize (Jacob & Monod 1961). Essen iell ü diesen P ozess is das Vo handensein eine RNA- Polyme ase (Weiss 1960; Hu wi z e al. 1961; Chambe lin & Be g 1962). Im Gegensa z zu den Euka yo en e ügen die Bak e ien nu übe eine RNA-Polyme ase, welche ü die Syn hese de mRNA, RNA und auch de RNA (Hoagland 1960; B enne e al. 1961) e an wo lich is . Es wi d dabei zwischen zwei e schiedenen Fo men de RNA-Polyme ase un e schieden, dem Co e-Enzym und dem Holo-Enzym (Bu gess e al. 1969). Welche Fo m o lieg , wi d dabei on den einzelnen Un e einhei en bes imm , aus denen die RNA- Polyme ase zusammengese z is . Das RNA-Polyme ase Co e-Enzym wi d on ün Un e einhei en gebilde , welche die Bezeichnung ´ und  agen und zusammen das ka aly ische Zen um bilden (Haldenwang 1995; Ma hew & Cha e ji 2006). Sobald sich eine Einlei ung 7 wei e e Un e einhei , de Sigma ak o (), mi dem Co e-Enzym e binde , sp ich man on dem RNA-Polyme ase Holo-Enzym. 1.4 Ini ia ion de T ansk ip ion du ch Sigma ak o en Die P omo o -Spezi i ä , du ch welche das RNA-Polyme ase Holo-Enzym die T ansk ip ion on Genen spezi isch ini iie , wi d allein du ch die -Un e einhei he o ge u en (Dunn & Bau z 1969; T a e s & Bu gess 1969; Bu gess & T a e s 1970). Das Co e-Enzym weis im Gegensa z dazu eine seh unspezi ische Bindung de DNA au . Die -Un e einhei is in de Lage, geziel zwischen einzelnen DNA-Sequenzen zu un e scheiden und e kenn somi eine spezi ische P omo o egion (Domb oski e al. 1992; Bo ukho & Se e ino 2002). Sequenzanalysen un e ielen Sigma ak o en haben gezeig , dass man diese in zwei g oße G uppen ein eilen kann: e s ens in die G uppe mi Sequenzhomologien zu 70, dem p imä en Sigma ak o aus E. coli, und zwei ens in die G uppe mi Sequenzhomologien zu 54, dem ü die T ansk ip ion on S icks o - egulie en Genen benö ig en Sigma ak o aus E. coli (G oss e al. 1992). Beide G uppen zeigen zudem noch Un e schiede in de E kennung on P omo o egionen au . Sigma ak o en aus de 70-Familie e kennen DNA-Sequenzen, welche unge äh 10 bp und 35 bp s omau wä s on dem e s en Nukleo id des zu ansk ibie enden Genes liegen. Man sp ich auch on de -35 und de -10 Region (Rezniko e al. 1985; Doi & Wang 1986). Die P omo o egionen, die on de 54-Familie e kann we den, liegen hingegen 12 bp und 24 bp (-24 und -12 Region) s omau wä s om T ansk ip ionss a punk (Gussin e al. 1986). Die S ä ke eines P omo o s häng abe allein on de Länge de Sequenz zwischen den zwei Regionen ab und nich on de Nukleo idzusammense zung (S e ano & G alla 1982). Fü 70 aus E. coli wu de gezeig , dass diese Sigma ak o an die -35 und die -10 Region binde und dabei den Abs and zwischen beiden Regionen e kenn (Domb oski e al. 1996). 1.5 P imä e und sekundä e Sigma ak o en Neben de besch iebenen Un e scheidung on Sigma ak o en anhand on Sequenzhomologien kann man diese auch in p imä e und sekundä e Sigma ak o en ein eilen. Gene, die z. B. ü essen ielle Biosyn hesen exp imie we den müssen, we den mi Hil e de Einlei ung 8 p imä en Sigma ak o en ansk ibie (Hughes & Ma hee 1998). In B. sub ilis is de essen ielle, p imä e Sigma ak o A (P ice e al. 1983) und in E. coli is es 70 (Be g e al. 1971). Al e na i e (sekundä e) Sigma ak o en sind ü die T ansk ip ion on speziellen Regulons nö ig. Sie dienen de Exp ession on bes imm en Genen als Anpassung au e ände e Umwel bedingungen und Näh s o o kommen ode auch un e S essbedingungen (Helmann 2002). De e s e al e na i e Sigma ak o übe haup wu de in B. sub ilis du ch S udien mi dem Bak e iophagen SPO1 en deck . Hie bei handel es sich um B, welche ü die allgemeine S essan wo in B. sub ilis benö ig wi d (Fox & Pe o 1974; Haldenwang & Losick 1980). Au g und de Vielzahl an iden i izie en Sigma ak o en wu den die Sigma ak o en mi Sequenzhomologien zu 70 on Lone o e al. in d ei G uppen einge eil und spä e on Helmann um zwei wei e e G uppen e gänz (Lone o e al. 1992; Helmann 2002). In eine diese G uppen, G uppe 4, we den die ECF-Sigma ak o en zusammenge ass , welche im Folgenden nähe be ach e we den sollen. 1.6 ECF-Sigma ak o en Die ECF-Sigma ak o en wu den so benann , weil diese Sigma ak o en im Allgemeinen an de Regula ion on Genen be eilig sind, die ü P o eine mi ex acy oplasma ische Funk ion (ex a-cy oplasmic unc ion) kodie en. Die ECF-Sigma ak o en ungie en dabei als E ek o en nach ex acy oplasma ischem S imulus (Lone o e al. 1994). Beispielha ü die Vielzahl de mi ECF-Sigma ak o en e bundenen P ozesse sollen hie de Eisen-T anspo (FecI aus E. coli) (B aun 1997), die Algina -Sek e ion (AlgU/T in P. ae uginosa) (He shbe ge e al. 1995) und die Hi ze-Schock-An wo (E aus E. coli) (De Las Penas e al. 1997b) genann we den. Allgemein können diese P ozesse als T anspo , Sek e ion und ex acy oplasma ische S ess zusammenge ass we den (Helmann 2002). Wie be ei s im Kapi el 1.5 e wähn , zeigen alle ECF-Sigma ak o en Sequenzhomologien zu 70 aus E. coli. Alle dings un e scheiden sie sich on den Sequenzen de meis en ande en Sigma ak o en diese G uppe und bilden auch kleine e P o eine. Man ha es ges ell , dass die Sigma ak o en, welche zu 70-Familie gehö en, ie konse ie e Regionen in ih e Aminosäu esequenz besi zen. Lone o e al. zeig en anhand on sieben Beispielen ü ECF- Sigma ak o en aus e schiedenen O ganismen, da un e auch X aus B. sub ilis, dass sich die ECF-Sigma ak o en on ande en 70-Sigma ak o en da in un e scheiden, dass sie kü ze e Einlei ung 9 Pep ide bilden, da ihnen de g öß e Teil de konse ie en Region 3 ehl (Lone o e al. 1994). Auch phylogene ische Un e suchungen wu den on Lone o e al. du chge üh . Sie üh en zu dem Schluss, dass man die ECF-Sigma ak o en zusä zlich in zwei Un e g uppen au eilen kann (Lone o e al. 1994). Spä e e phylogene ische Un e suchungen deck en soga eine iel g öße e Di e si ä un e den ECF-Sigma ak o en au (Page & Helmann 2003; S a on e al. 2009). Wie schon im Kapi el 1.4 e läu e , wi d die P omo o spezi i ä de RNA-Polyme ase allein du ch die Sigma ak o en e mi el . Dabei haben besonde s die -35 und die -10 Region des P omo o s eine g oße Bedeu ung ü die 70-Familie. Fü ECF-Sigma ak o en wu den Konsensussequenzen ü diese Regionen ge unden. Es handel sich um das AAC-Mo i ü die -35 Region und das CGT-Mo i ü die -10 Region (Helmann 2002). Die ECF-Sigma ak o en inde man nich nu bei E. coli. Sie sind, o in g oße Anzahl, bei ielen wei e en O ganismen e e en. So besi z z. B. Mycobac e ium ube culosis gleich 10 (Cole e al. 1998) de ECF-Sigma ak o en und S ep omyces coelicolo soga 49 (Ben ley e al. 2002; Helmann 2002). De e s e ECF-Sigma ak o übe haup wu de eben alls in S. coelicolo en deck (Lone o e al. 1994). Von den 17 al e na i en Sigma ak o en, die das Genom on B. sub ilis kodie , konn en ebenso sieben in die G uppe de ECF-Sigma ak o en eingeo dne we den (Kuns e al. 1997; Helmann 2002; MacLellan e al. 2008). M, V, W, X, Y, Z und YlaC sind die ECF- Sigma ak o en aus B. sub ilis. 1.6.1 Regula ion on ECF-Sigma ak o en Die Regula ion de Genexp ession au de Ebene de T ansk ip ionsini ia ion e olg u. a. du ch die Sigma ak o en. Des Wei e en können auch Rep esso en und Ak i a o en die T ansk ip ion beein lussen. Zudem un e liegen die Sigma ak o en selbs auch eine Regula ion du ch An agonis en. Diese An agonis en we den als An i-Sigma ak o en bezeichne und ungie en als nega i e Regula o en. Au g und ih e Lokalisa ion, dem Cy oplasma, wi d eine G uppe on An i-Sigma ak o en als cy oplasma ische An i- Sigma ak o en bezeichne (Hughes & Ma hee 1998). Zu diese G uppe zählen z. B. FlgM, de nega i e Regula o on 28 (Chadsey e al. 1998) und DnaK, de nega i e Regula o on 32 (McCa y e al. 1996). Einlei ung 10 Die in Kapi el 1.6 besch iebenen ECF-Sigma ak o en we den im Gegensa z dazu o on memb angebundenen An i-Sigma ak o en egulie . Die Gene ü diese An i-Sigma ak o en liegen zumeis im gleichen Ope on wie die s omau wä s gelegenen Gene ü die en sp echenden ECF-Sigma ak o en (Hughes & Ma hee 1998). Die An i-Sigma ak o en sind meis ens T ansmemb anp o eine, de en N- e minale Domäne di ek mi den jeweiligen ECF- Sigma ak o en in e agie . De Ums and zeig , dass sich diese Domäne im Cy oplasma be inden muss. Yoshimu a e al. (2004) sp echen deshalb on eine in azellulä en inhibie enden Domäne und bezeichnen die C- e minale Domäne im Gegensa z dazu als ex acy oplasma ische senso ische Domäne. Das di ek e Zusammenspiel zwischen Sigma- und An i-Sigma ak o wu de u. a. in Yeas -Two-Hyb id-Expe imen en gezeig (Yoshimu a e al. 2004). Die inhibie ende Wi kung des An i-Sigma ak o s gegenübe dem ECF-Sigma ak o wi d au gehoben sobald diese einen ex acy oplasma ischen S imulus e häl . Im Anschluss kann die spezi ische T ansk ip ion e olgen. Helmann e gleich deshalb das Sys em aus An i- Sigma ak o und Sigma ak o soga mi dem Zwei-Komponen en-Sys em (S ock e al. 2000), bei welchem auch ex azellulä e P o eindomänen eine His idin-Kinase Signale wah nehmen und dami im Cy oplasma du ch DNA-bindende P o eine zu T ansk ip ion üh en (Helmann 2002). Bei eine allgemeinen Be ach ung de Regula ion on An i-Sigma ak o en nach einem zellulä en S imulus kann diese beispielsweise du ch ein wei e es P o ein, dem An i An i- Sigma ak o , ode du ch den T anspo des An i-Sigma ak o s aus de Zelle e olgen. Wei e hin spiel auch de p o eoly ische Abbau des An i-Sigma ak o s eine Rolle (B own & Hughes 1995). De nega i e Regula o on 28, FlgM, wi d z. B. aus de Zelle expo ie , wenn die 28–spezi ische T ansk ip ion beginnen soll (Hughes e al. 1993). RsbW, de nega i e Regula o on B aus B. sub ilis, wi d du ch den An i An i-Sigma ak o RsbV on eine In e ak ion mi dem Sigma ak o abgehal en (Du ou & Haldenwang 1994). Die Regula ion on ECF-Sigma ak o en konn e bislang nu ü seh wenige Beispiele de aillie au geklä we den. Dazu zählen E aus E. coli und W aus B. sub ilis (Hein ich & Wiege 2009). Es gib jedoch iele Hinweise, dass bei de Regula ion on ECF- Sigma ak o en de P ozess de egulie en in amemb anen P o eolyse (RIP) de jeweiligen An i-Sigma ak o en eine en scheidende Rolle spiel (Abbildung 1) (B own e al. 2000). Exempla isch sollen hie die F eise zung on E aus E. coli (Kapi el 1.6.1.1) sowie on W aus B. sub ilis (Kapi el 1.6.1.2) du ch RIP e läu e we den. Einlei ung 11 Zunehmende Bedeu ung gewinnen die ECF-Sigma ak o en und ih e Regula ion auch bei de Un e suchung de pa hogenen Wi kung on Mik oo ganismen (Bashyam & Hasnain 2004; U ban 2009). De ECF-Sigma ak o E aus M. ube culosis z. B. spiel auch eine Rolle beim Übe leben on M. ube culosis in Mak ophagen om Mensch und de Maus (Manganelli e al. 2001). Des Wei e en is die si e-2 P o ease R 2869c aus M. ube culosis ü die Pe sis enz on M. ube culosis in Mäuse-Lungen e an wo lich (Makinoshima & Glickman 2005) und beein luss die T ansk ip ion z. B. on Genen, die in die Lipid-Biosyn hese in ol ie sind, du ch die P o eolyse de d ei An i-Sigma ak o en An i-SigK, An i-SigL und An i-SigM (Skla e al. 2010). Si e-2 P o easen sind auch am P ozess de egulie en in amemb anen P o eolyse on ECF-Sigma ak o en be eilig (Weiho en & Ma oglio 2003). 1.6.1.1 Regula ion des ECF-Sigma ak o s E aus E. coli E. coli eagie au ex acy oplasma ischen S ess wie z. B. Hi ze u. a. du ch Ak i ie ung on E (E ickson & G oss 1989). De ECF-Sigma ak o E wi d abe auch du ch g oße Mengen alsch ge al e e P o eine de äuße en Memb an (ou e memb ane p o eins; OMPs) ak i ie (Mecsas e al. 1993) und is zusä zlich schon bei no malen Tempe a u en ü E. coli essen iell (De Las Penas e al. 1997a). Das Gen, welches ü E kodie , is mi d ei wei e en Genen, Abbildung 1: Modell de Regula ion on ECF-Sigma ak o en du ch egulie e in amemb ane P o eolyse (RIP) de en sp echenden An i-Sigma ak o en. De An i-Sigma ak o wi d nach einem spezi ischen S ess-S imulus on eine si e-1 P o ease (si e-1) und eine si e-2 P o ease (si e-2) p ozessie , be o e im Cy oplasma (CP) olls ändig on eine cy oplasma ischen P o ease abgebau wi d und den Sigma ak o ( en läss , welche dann zusammen mi de RNA-Polyme ase (RNAP) die T ansk ip ion spezi ische Gene ini iie en kann. CM: cy oplasma ische Memb an. Aus: Hein ich & Wiege (2009). Einlei ung 12 welche s omabwä s on diesem liegen, in einem Ope on lokalisie . Von diesen d ei Genen we den die P o eine RseABC ( egula o o sigma E, P o ein A, B, C) kodie (De Las Penas e al. 1997b). RseA is de An i-Sigma ak o on E. Diese is in de inne en Memb an lokalisie und inhibie E mi seine N- e minalen cy oplasma ischen Domäne (Missiakas e al. 1997; De Las Penas e al. 1997b). Du ch beispielsweise einen Hi zeschock dena u ie en die Po ine de äuße en Memb an. Dadu ch komm es zu Bindung zwischen den C- e minalen Enden de Po inen und de pe iplasma ischen PDZ-Domäne de Memb anp o ease DegS, wodu ch diese in einen ak i en Zus and übe geh und die si e-1 P o eolyse des An i- Sigma ak o s RseA ka alysie . Man kann diesen P ozess auch als allos e ische Ak i ie ung de P o ease DegS bezeichnen (Walsh e al. 2003; Sohn e al. 2007; Sohn & Saue 2009). Du ch die si e-1 P o eolyse wi d RseA in de pe iplasma ischen Domäne geschni en und wi d dami zum Subs a ü RseP ( egula o o sigma E P o ease), eine in amemb an- schneidenden Zink-abhängigen P o ease de si e-2 P o ease-Familie, welche den sogenann en iCliPs (in amemb ane clea ing p o eases) zugeo dne wi d (Alba e al. 2002; Kaneha a e al. 2002; Weiho en & Ma oglio 2003). In einem le z en Sch i nach de si e-2 P o eolyse wi d nun RseA mi dem imme noch gebundenen E ins Cy oplasma en lassen, wo mi Hil e des Adap e s SspB und de cy oplasma ischen P o ease ClpXP RseA olls ändig p ozessie wi d, was dann zu F eise zung on E und dami zu T ansk ip ionsini ia ion üh (Flynn e al. 2004; Chaba e al. 2007). 1.6.1.2 Regula ion des ECF-Sigma ak o s W aus B. sub ilis Neben E aus E. coli zähl auch de ECF-Sigma ak o W aus B. sub ilis zu den am bes en un e such en al e na i en Sigma ak o en de ECF-Familie. W wi d on dem Gen sigW kodie und is zusammen mi siW in einem Ope on lokalisie . siW kodie ü den memb angebundenen An i-Sigma ak o RsiW ( egula o o sigma W) (Huang e al. 1998). Auße seinem eigenen Ope on kon ollie W zusä zlich die Exp ession on ca. 60 Genen in 30 Ope ons (Helmann 2006). Helmann sp ich in diesem Zusammenhang on einem „An ibiosis“-Regulon, da das W-Regulon zum einen du ch Zellwandbiosyn hese- inhibie ende An ibio ika induzie wi d, und zum ande en spielen iele P o eine, de en Gene on W kon ollie we den, eine Rolle bei de De oxi ika ion bzw. de An ibio ika-Syn hese (Helmann 2002). So wi d beispielsweise die Syn hese eines Penicillin-bindenden P o eins, Einlei ung 13 PbpE, on W ebenso kon ollie wie die Bildung des Fos omycin-Resis enz P o eins FosB (Huang e al. 1999; Cao e al. 2001). Soga eine in insische Resis enz gegenübe an imik obiellen Subs anzen ande e Bacilli geh au W zu ück (Bu che & Helmann 2006). Das W-Regulon wi d du ch eine Vielzahl e schiedene Subs anzen induzie . Es wu den be ei s Alkali-S ess sowie die In ek ion mi Phagen (Wiege e al. 2001), Salz-S ess (Pe e sohn e al. 2001), an imik obielle Pep ide (Pie iainen e al. 2005) und zellwandspezi ische An ibio ika wie Vancomycin (Cao e al. 2002) als spezi ische S imuli iden i izie , die zu T ansk ip ionsini ia ion W-kon ollie e Gene üh en. Be o die T ansk ip ion eingelei e we den kann, muss de ECF-Sigma ak o W in ungebundene Fo m im Cy oplasma o liegen, was nu du ch P o eolyse seines An i- Sigma ak o s RsiW e olgen kann. RsiW is in de Memb an lokalisie , nimm die e schiedenen S imuli mi de C- e minalen Domäne wah und inhibie mi de N- e minalen cy oplasma ischen Domäne W (Schöbel e al. 2004). Die F eise zung des Sigma ak o s e olg du ch den P ozess de egulie en in amemb anen P o eolyse, wie e be ei s ü E aus E. coli (Kapi el 1.6.1.1) besch ieben wu de, wobei jedoch kleine Un e schiede o handen sind. Du ch einen de oben genann en S imuli wi d die si e-1 P o eolyse on RsiW eingelei e . Die si e-1 P o ease P sW (p o ease esponsible o ac i a ing sigma W) schneide RsiW in de ex acy oplasma ischen Domäne (Hein ich & Wiege 2006; Elle meie & Losick 2006). Die nun e kü z e Fo m on RsiW wi d nach olgend on eine noch unbekann en wei e en P o ease p ozessie , be o RsiW zum Subs a ü die si e-2 P o ease RasP we den kann (Hein ich e al. 2009). Die si e-2 P o ease RasP ( egula ing al e na i e sigma ac o p o ease), welche auch zu G uppe de iClip (in amemb ane clea ing p o ease) gehö (Weiho en & Ma oglio 2003), schneide im Anschluss den wei e e kü z en An i-Sigma ak o RsiW inne halb seine T ansmemb andomäne, sodass im Resul a de e kü z e An i-Sigma ak o mi gebundenem Sigma ak o ins Cy oplasma übe gehen kann (Schöbel e al. 2004). Hie wi d schließlich de e bliebene Teil on RsiW olls ändig du ch die Clp-P o ease p ozessie (Zellmeie e al. 2006) und W kann sich mi dem Co e-Enzym de RNA-Polyme ase e binden und die T ansk ip ion einlei en. 1.6.2 De ECF-Sigma ak o X aus B. sub ilis De e s e de sieben ECF-Sigma ak o en aus B. sub ilis, welche als solche iden i izie wu de, wa X (Lone o e al. 1994; Kuns e al. 1997). Das Gen des ECF-Sigma ak o s X, Einlei ung 14 sigX, wu de u sp ünglich als o X20 in de ch omosomalen Region on spoVA bis se A iden i izie . Es wu de dabei eine Sequenzübe eins immung on 25 % mi dem Gen des ECF- Sigma ak o s FecI, ecI, aus E. coli ge unden (So okin e al. 1993). FecI is an de Eisenci a - Ve we ung in E. coli be eilig . Als Sigma ak o ini iie es die T ansk ip ion de Eisen anspo -Gene ecABCDE (Van Ho e e al. 1990). B u sche & B aun e mu e en dahe auch eine Be eiligung on X an de Eisenci a -Ve we ung in B. sub ilis. In de Ta konn e eine Komplemen a ion eines ecI-Knockou s du ch sigX in E. coli gezeig we den. Jedoch üh en die Analysen in B. sub ilis zu dem E gebnis, dass X nich an eine Eisenci a - Ve we ung be eilig is , auch da Eisenci a on B. sub ilis nich als Eisen-Quelle benu z wi d. Des Wei e en konn e eine Be eiligung on X an de Regula ion des T anspo sys ems on Eisen-Side opho en ausgeschlossen we den (B u sche & B aun 1997). Demzu olge sind FecI und X keine O hologe, sonde n lediglich Homologe (Helmann 2002). 1.6.2.1 Das X-Regulon Fü X wu de eine Zugehö igkei zu G uppe 4 de 70-Familie, den ECF-Sigma ak o en, gezeig (Lone o e al. 1994; Helmann 2002). Als Sigma ak o e kenn X ganz spezi ische P omo o sequenzen und üh so zu T ansk ip ion des X-kon ollie en Regulons. Eine P omo o -Konsensus-Suche e möglich e die Iden i izie ung on 15 mu maßlichen Genen, die un e de Kon olle on X s ehen. Die hie ü e wende e Konsensussequenz ü die -35 Region lau e g AACnww, die ü die -10 Region lau e CGwCww. Dabei bedeu en g oße Buchs aben, dass diese Basen un e ände sind, w s eh ü en wede A ode T und n s eh ü eine beliebige Base (Huang & Helmann 1998). Als E gebnis diese Suche wu den als Mi gliede des X-Regulons u. a. csbB, das Gen ü eine memb angebundene Glykosyl ans e ase (Akba & P ice 1996), ly R, das Gen ü einen nega i en Regula o de Au olysin-Exp ession (Laza e ic e al. 1992), das pss-Ope on, welches in die Phospha idyle hanolamin-Syn hese in ol ie is (Okada e al. 1994; Ma sumo o e al. 1998), und auch das dl -Ope on, welches an de D-Alanylie ung on Teichonsäu en be eilig is (Pe ego e al. 1995), iden i izie (Huang & Helmann 1998; Helmann 2002). Daneben wu de on Huang & Helmann auch das sigX-Ope on als X-kon ollie ge unden. Alle dings wu de zu o be ei s on B u sche & B aun die Au o egula ion on sigX nachgewiesen (B u sche & B aun 1997; Huang & Helmann 1998). Einlei ung 21 Ande s als in insische Te mina ionssignale sind die Signale de Rho-abhängigen Te mina ion zweige eil und e s ecken sich übe e wa 200 bp in de DNA (Nudle & Go esman 2002). De s omau wä s liegende Teil wi d on de oben besch iebenen u -si e gebilde . De e wa 60-90 Nukleo ide s omabwä s on de u -si e liegende Teil wi d als Te mina ionszone bezeichne . In diese Zone inde die Te mina ion an e schiedenen S ellen s a , welche als Te mina ionss ellen bezeichne we den (Lau e al. 1982; Mo gan e al. 1983b; Bane jee e al. 2006). Am häu igs en handel es sich bei den Te mina ionss ellen um die S ellen, wo de T ansk ip ionselonga ion-Komplex pausie (pause si e), abe nich jede pause si e is gleichzei ig eine Rho-Te mina ionss elle (Kassa e is & Chambe lin 1981; Lau e al. 1983). 1.7.2.1 De Fak o Rho De ü die ak o abhängige Te mina ion zwingend nö ige Fak o Rho wu de be ei s 1969 en deck (Robe s 1969). Die meis en P oka yo en besi zen ein homologes P o ein zu Rho aus E. coli (Oppe man & Richa dson 1994; F ase e al. 1995). In Abhängigkei on de jeweiligen Spezies besi z Rho ein Molekula gewich on ca. 50 kDa (Qui k e al. 1993; Bane jee e al. 2006). In den P o eobak e ien E. coli und Rhodobac e sphae oides is Rho ein essen ielles P o ein (Das e al. 1976; Gomelsky & Kaplan 1996). Dagegen s ell Rho in den G am-posi i en O ganismen B. sub ilis und S aphylococcus au eus kein essen ielles P o ein da (Qui k e al. 1993; Washbu n e al. 2001). In diesem Ums and lieg auch die U sache ü die Annahme, dass die ak o abhängige Te mina ion in z. B. B. sub ilis nu eine un e geo dne e Rolle spiel , wohingegen in E. coli e wa die Häl e de Te mina ionen om Fak o Rho abhängen (de Hoon e al. 2005). Analysen haben gezeig , dass Rho aus E. coli und aus B. sub ilis o zdem ähnliche Eigenscha en z. B. hinsich lich de RNA-ak i ie en ATPase-Ak i i ä besi zen (Ingham e al. 1999). Rho is ein homohexame es P o ein (Sko dalakes & Be ge 2003). Das Enzym besi z sowohl eine ATPase-Ak i i ä als auch eine RNA/DNA-Helikase-Ak i i ä und binde an naszie ende mRNA (Ciampi 2006). Jedes Rho-Monome besi z eine N- e minale und eine C- e minale Domäne. Die kleine e, N- e minale Domäne bilde die p ime e RNA-bindende S elle. Sie kann sowohl einzels ängige DNA als auch einzels ängige RNA binden und is ü die Bindung on Rho an die u -si e e an wo lich (Galluppi & Richa dson 1980; Richa dson 1982; Sko dalakes & Be ge 2003). In de g öße en, C- e minalen Domäne be inde sich die sekundä e RNA-bindende S elle. Sie wi d ü die T ansloka ion on Rho en lang de mRNA Einlei ung 22 benö ig . Inne halb de C- e minalen Domäne wi d sie on dem Q- und dem R-Loop gebilde (Wei & Richa dson 2001; Bu gess & Richa dson 2001; Sko dalakes & Be ge 2003). Fe ne wi d auch de P-Loop on de C- e minalen Domäne ausgebilde . De P-Loop is ü die ATP- Bindung und die ATPase-Ak i i ä on Rho e an wo lich (Domb oski & Pla 1988; Dolan e al. 1990; Wei & Richa dson 2001; Sko dalakes & Be ge 2003). 1.7.2.2 Mechanismus de ak o abhängigen Te mina ion De Mechanismus de Rho-abhängigen Te mina ion wi d auch gegenwä ig seh in ensi un e such . Bishe sind noch nich alle in ol ie en P ozesse bis ins De ail au geklä . An diese S elle sollen dahe ku z die neues en E kenn nisse e wähn we den. K is allog aphische (Sko dalakes & Be ge 2003) und kine ische (Jeong e al. 2004) Un e suchungen konn en au klä en wie Rho die naszie ende mRNA binde . Das Modell on Jeong e al. (2004) weich e was on dem on Sko dalakes & Be ge (2003) ab. Wäh end Sko dalakes & Be ge (2003) on einem an eine S elle geö ne em Rho-Hexame ausgehen, welches sich nach de Bindung de mRNA schließ , hal en Jeong e al. (2004) es ü wah scheinliche , dass das Rho-Hexame ohne eine mRNA eine geschlossene Kon o ma ion einnimm , in welche die ATP-bindenden Domänen eingeeng we den. Nach dem Modell on Jeong e al. (2004) binde die p ime e RNA-bindende S elle on Rho an die u -si e wodu ch die ATP-bindenden Domänen ei nach außen exponie we den können. Dadu ch kann ATP seh schnell binden und induzie so eine Ände ung de Kon o ma ion des Hexame s. In olgedessen be inde sich die mRNA, an die sekundä e RNA-bindende S elle assoziie , im Zen um des Hexame s. Die ATP-bindenden Domänen sind wei e nach außen exponie , so dass die T ansloka ion des Rho-RNA-ATP-Komplexes beginnen kann. Fü die T ansloka ion des Rho-RNA-ATP-Komplexes en lang de mRNA is die Ene gie aus de ATP-Hyd olyse no wendig. Fü den P ozess de T ansloka ion wu den zwei Modelle au ges ell (Abbildung 2A). Das „pu e acking“-Modell besag , dass sich die Bindung zwischen Rho und de u -si e lös . Rho beweg sich dann in 5‘-3‘-Rich ung an de naszie enden mRNA en lang bis zum T ansk ip ionselonga ions-Komplex. Do angekommen, so g Rho du ch seine 5‘-3‘-RNA-DNA-Helikase-Ak i i ä da ü , dass die mRNA den Komplex e läss . Da au olg die Dissozia ion des gesam en T ansk ip ionselonga ions-Komplexes (Geiselmann e al. 1993). Das zwei e Modell is das „ e he ed acking“-Modell. In diesem Modell bleib die Bindung zwischen Rho und de u - Einlei ung 23 si e bes ehen. Rho beweg sich, an die u -si e gebunden, die mRNA in 5‘-3‘-Rich ung en lang bis zum T ansk ip ionselonga ions-Komplex, um do du ch seine 5‘-3‘-RNA-DNA-Helikase- Ak i i ä die Dissozia ion des gesam en T ansk ip ionselonga ions-Komplexes einzulei en (S einme z & Pla 1994). Alle dings is ü beide Modelle de genaue Mechanismus, nach welchem Rho die mRNA on de RNA-Polyme ase enn , noch nich bekann . Unabhängig on diesen beiden ela i ähnlichen Modellen schlagen Epsh ein e al. einen ganz ande en Mechanismus o (Abbildung 2B) (Epsh ein e al. 2010). Demnach is Rho mi Beginn de Ini ia ion de T ansk ip ion mi de RNA-Polyme ase in einem Komplex e ein . Sobald die naszie ende mRNA lang genug is , wi d sie on Rho gebunden. Rho so g dann ü eine schnelle Inak i ie ung de RNA-Polyme ase und eine e gleichsweise langsame Dissozia ion des T ansk ip ionselonga ions-Komplexes. Hie bei spielen Ve ände ungen in de Kon o ma ion des ka aly ischen Zen ums de RNA-Polyme ase du ch einen allos e ischen Mechanismus eine wich ige Rolle. A B Abbildung 2: Rho-abhängige Te mina ion. A: Modelle de T ansloka ion on Rho en lang de mRNA. De Fak o Rho binde an die u -si e. Die T ansloka ion on Rho en lang de mRNA bis zum T ansk ip ions- Elonga ionskomplex e olg nach dem „(pu e) acking“-Modell, nach welchem Rho die u -si e ü die T ansloka ion e läss , ode nach dem „ e he ed acking“-Modell, bei welchem Rho auch wäh end de T ansloka ion an die u -si e gebunden is . Aus: Bane jee e al. (2006). B: allos e ische Mechanismus de Rho-abhängigen Te mina ion. Rho is mi Beginn de T ansk ip ionsini ia ion mi de RNA-Polyme ase assoziie und binde bei aus eichende Länge des T ansk ip es an die u -si e. Es komm olglich zu Inak i ie ung de RNA-Polyme ase du ch einen allos e ischen Mechanismus und dami zu Dissozia ion des T ansk ip ions-Elonga ionskomplexes. Das An ibio ikum Tage i oxin (Tg ) inhibie die Te mina ion du ch Rho. Aus: Epsh ein e al. ( 2010). Einlei ung 24 1.7.2.3 Die Nus-Fak o en Wei e e wich ige Fak o en ü die ak o abhängige Te mina ion de T ansk ip ion sind die Nus-Fak o en. NusA und NusG in e agie en mi dem Fak o Rho und e höhen so die E izienz de Te mina ion in i o (Ciampi 2006; Bu mann & Rösch 2011). Fü NusG wu de gezeig , dass das P o ein di ek mi de RNA-Polyme ase und dem Fak o Rho in e agie (Pasman & on Hippel 2000). So is es möglich, dass NusG ü eine höhe e Ra e beim En lassen de naszie enden mRNA aus de RNA-Polyme ase und dami ü eine schnelle e Dissozia ion des T ansk ip ionselonga ions-Komplexes beim E eichen eine Te mina ionss elle so g (Bu ns e al. 1999). Des Wei e en wu de abe auch gezeig , dass NusG ü eine E höhung de Elonga ions a e de RNA-Polyme ase um 25 % e an wo lich is (Bu ns e al. 1998). Das P o ein NusA is , wie auch NusG, in de Lage, den Fak o Rho mi de RNA-Polyme ase zu e binden (Schmid & Chambe lin 1984). Auße dem is NusA in de Lage, du ch Fö de ung on Pausen de RNA-Polyme ase den P ozess de T ansk ip ionselonga ion zu e langsamen (A simo i ch & Landick 2000). Dadu ch gib es eine enge Kopplung zwischen de T ansk ip ion und de T ansla ion, was le z endlich zu eine Hemmung de o zei igen Te mina ion de T ansk ip ion üh (Zheng & F iedman 1994). In E. coli sind die P o eine NusG und NusA essen iell (Sulli an & Go esman 1992; Kainz & Gou se 1998; Ciampi 2006). Dagegen is in B. sub ilis de Fak o NusG nich essen iell, abe NusA is es auch ü diesen O ganismus (Ingham e al. 1999). Dies zeig , dass de P ozess de T ansk ip ions e mina ion du ch den Fak o Rho in beiden O ganismen Un e schiede au weisen muss (Ingham e al. 1999). Das Zusammenspiel zwischen den Fak o en Rho, NusA und NusG wu de auch schon in eine genomwei en Analyse in E. coli un e such . Dabei konn e gezeig we den, dass Rho als globale Regula o au i , dessen Ein luss au das T ansk ip om seh iel g öße is als au das P o eom. Diese S udie zeig e, dass besonde s P ophagen und ande e Gene, welche du ch ho izon alen Gen ans e e hal en wu den, eine Te mina ion du ch Rho un e liegen. In S ämmen, in welchen genau diese Gene dele ie wa en, wu de beobach e , dass die Fak o en NusA und NusG nich meh benö ig wu den. Des Wei e en wiesen diese S ämme mi einem nusA- ode einem nusG-Knockou ähnliche T ansk ip ionsp o ile au . Das is ein Hinweis, dass diese P o eine no male weise zusammena bei en. Ein E. coli-S amm, welche nu den Knockou des ac-P ophagen en hiel , e möglich e auch schon eine Dele ion des essen iellen Einlei ung 25 nusG. Das zeig , dass die en scheidende Funk ion on NusG in E. coli die Un e d ückung de ac-Exp ession is (Ca dinale e al. 2008). 1.8 Zielse zung diese A bei De ECF-Sigma ak o X aus B. sub ilis wu de hinsich lich seines Regulons schon in ensi analysie . Dabei wu den einige Gene, einschließlich des sigX- siX-Ope ons, ge unden, die un e de Kon olle dieses Sigma ak o s s ehen (Kapi el 1.6.2.1). Zusammenge ass kann demnach X eine Funk ion im Hinblick au die Zusammense zung und den Me abolismus de Zellhülle zugesp ochen we den (Helmann 2002). Des Wei e en is die Regula ion on X du ch den An i-Sigma ak o RsiX bekann (B u sche & B aun 1997). Jedoch sind noch keine E kenn nisse übe die Regula ion on RsiX o handen. RsiX is wie auch RsiW, de An i-Sigma ak o on dem ECF-Sigma ak o W (Kapi el 1.6.1.2), ein T ansmemb an-P o ein, welches ex azellulä e Signale übe die Memb an ins Cy oplasma lei en kann. Dami ex azellulä e In o ma ionen den ECF-Sigma ak o W e eichen, sind meh e e p o eoly ische Sch i e nö ig, die am Ende zum olls ändigen Abbau on RsiW üh en (Kapi el 1.6.1.2). Au g und on s uk u ellen Ähnlichkei en zwischen den An i-Sigma ak o en RsiX und RsiW wi d dahe eine ähnliche Regula ion e mu e , denn auch de An i-Sigma ak o RseA des ECF-Sigma ak o s E aus E. coli (Kapi el 1.6.1.1) wi d e gleichba wie RsiW p ozessie . Es könn e sich dabei um eine gene elle Regula ion ü ECF-Sigma ak o en handeln. Im Hinblick au den Ein luss on ECF-Sigma ak o en bei de Pa hogeni ä einige Mik oo ganismen (Kapi el 1.6.1) könn e dies einen seh wich igen Ansa z ü die Medikamen enen wicklung da s ellen. E s e Expe imen e zu egulie en P o eolyse on RsiX zeig en alle dings keine eindeu igen E gebnisse (Schä e 2007). Das Ziel diese A bei bes and deshalb da in, du ch einen genomwei en Sc een in B. sub ilis Fak o en mi Ein luss au die S abili ä des An i- Sigma ak o s RsiX zu iden i izie en und einen möglichen Mechanismus ü die RsiX- Regula ion au zus ellen. Fü diesen Sc een soll e die Me hode de T ansposonmu agenese angewand we den. De eindeu ige Ein luss on du ch den Sc een iden i izie en Fak o en soll e im Anschluss du ch die Kons uk ion de en sp echenden Knockou -S ämme e i izie we den. Schließlich soll e e such we den, einen möglichen Mechanismus de RsiX- Regula ion zu pos ulie en. Zusä zlich soll e übe p ü we den, inwiewei sich die ge undene Regula ion on RsiX mi de on RsiW deck . Ma e ial und Me hoden 26 2 Ma e ial und Me hoden 2.1 Bak e iens ämme, Plasmide und Oligonukleo ide Die in diese A bei e wende en Bak e iens ämme (Tabelle 1), Plasmide (Tabelle 2) und Oligonukleo ide (P ime ; Tabelle 3 und Tabelle 4) sind im Folgenden au ge üh . Tabelle 1: Bak e iens ämme Die in diese A bei e wende en Bak e iens ämme sind mi Bezeichnung, ele an em Geno yp sowie de Re e enz angegeben. Wu de s a eine Re e enz ein * angegeben, wu de de S amm in diese A bei kons uie . S ammbezeichnung ele an e Geno yp Re e enz E. coli DH10B F– mc A (m -hsdRMS-mc BC) 80dlacZM15 lacX74 deoR ecA1 endA1 a aD139 (a a, leu) 7697 galU galK – psL nupG (S ) G an e al. 1990 XL1-Blue F’::Tn10 p oA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15/ ecA1 endA1 gy A96(Nal ) hi hsdR17 ( K-mK+) glnV44 elA1 lac S a agene B. sub ilis 1012 leuA8 me B5 pC2 hs M1 Sai o e al. 1979 NCIB 3610 wild ypische B. sub ilis-S amm B anda e al. 2001 1012 amyE::ca 1012 amyE::ca (Cm ) Mogk e al. 1996 1012 lacA::spec 1012 lacA::spec (Spec ) Hä l e al. 2001 1012 siX::spec 1012 siX::spec (Spec ) Schä e 2007 1012 asP:: e 1012 yluC:: e (Te ) Schöbel e al. 2004 1012 p sW::bleo 1012 ypdC::bleo (Bleo ) Hein ich & Wiege 2006 1012 clpX 1012 clpX::ca (Cm ) Wiege & Schumann 2001 1012 ho::bleo 1012 ho::bleo (Bleo ) T. Wiege (un e ö en lich ) 1012 sigX siX::spec 1012 sigX siX::spec (Spec ) * WB800 Δ pC Δnp E Δap E Δep Δ p Δbp Δmp ::bleo Δnp B::bs Δwp A::hyg (Cm ) Mu ashima e al. 2002 KS4 1012 amyE::Pdl A-lacZ (Neo ) Schä e 2007 KS18 KS4 siX::spec (Neo , Spec ) Schä e 2007 KS11 1012 siX::spec amyE::Pdl A-lacZ lacA::pAL-FLAG- siX 71-368 (Spec , Neo , Em ) Schä e 2007 Ma e ial und Me hoden 27 S ammbezeichnung ele an e Geno yp Re e enz KS12 1012 siX::spec amyE::Pdl A-lacZ lacA::pAL-FLAG- siX (Spec , Neo , Em ) Schä e 2007 KS41 1012 amyE::Pg oE-g p- siX (Cm ) Schä e 2007 KS42 KS41 asP:: e (Cm , Te ) Schä e 2007 1012 pHTg p- siW 1012 amyE::PyuaF-lacZ pHTg p- siW (Neo , Cm ) T. Wiege (un e ö en lich ) 1012 pHTg p- siW  asP 1012 amyE::PyuaF-lacZ pHTg p- siW asP:: e (Neo , Cm , Te ) T. Wiege (un e ö en lich ) 1012 pHTg p- siW p sW 1012 amyE::PyuaF-lacZ pHTg p- siW p sW::bleo (Neo , Cm , Bleo ) T. Wiege (un e ö en lich ) KS82 1012 pHTg p- siX (Cm ) * KS83 1012 pHTg p- siX asP:: e (Cm , Te ) * KS94 1012 pHTg p- siX p sW::bleo (Cm , Bleo ) * KS115 1012 amyE::Pg oE-g p-bleo- siX (Cm ) * KS119 1012 amyE::Pg oE-g p-bleo- siX pIC333 (Cm , Spec ) * KS123 1012 amyE::Pg oE-g p-bleo- siX mini-Tn10 (Cm , Spec , Bleo ) * KS123a 1012 amyE::Pdl A-lacZ mini-Tn10 (Neo , Spec ) * KS149 1012 lacA::pALFsigX- siX (Em ) * KS155 1012 lacA::pALFsigX- siX ho::bleo (Em , Bleo ) * KS162 1012 lacA::pALFsigX- siX sigX siX::spec (Em , Spec ) * KS166 1012 lacA::pALFsigX- siX sigX siX::spec ho::bleo (Em , Spec , Bleo ) * KS148 1012 lacA::pALFsigX_s op- siX (Em ) * KS154 1012 lacA::pALFsigX_s op- siX ho::bleo (Em , Bleo ) * KS161 1012 lacA::pALFsigX_s op- siX sigX siX::spec (Em , Spec ) * KS165 1012 lacA::pALFsigX_s op- siX sigX siX::spec ho::bleo (Em , Spec , Bleo ) * 1012  asP  ho 1012 ho::bleo asP:: e (Bleo , Te ) * 1012-g p 1012 amyE::Pg oECIRCE-g p+ (Neo ) Zellmeie e al. 2006 1012-g p  ho 1012-g p ho::bleo (Bleo , Neo ) * 1012-g p  asP 1012-g p asP:: e (Te , Neo ) * 1012-g p  asP  ho 1012-g p ho::bleo asP:: e (Bleo , Te , Neo ) * Ma e ial und Me hoden 28 S ammbezeichnung ele an e Geno yp Re e enz KS187 - KS190 1012 amyE::Pg oE-g p- siX (KS187; Cm ) e knüp mi asP:: e (KS188; Cm , Te ), ho::bleo (KS189; Cm , Bleo ) ode beiden (KS190; Cm , Te , Bleo ) * KS191 - KS194 1012 amyE::Pg oE-g p- siX 71-368 (KS191; Cm ) e knüp mi asP:: e (KS192; Cm , Te ), ho::bleo (KS193; Cm , Bleo ) ode beiden (KS194; Cm , Te , Bleo ) * KS195 - KS198 1012 amyE::Pg oE-g p- siX 146-368 (KS195; Cm ) e knüp mi asP:: e (KS196; Cm , Te ), ho::bleo (KS197; Cm , Bleo ) ode beiden (KS198; Cm , Te , Bleo ) * KS201/KS203/KS231/KS232 1012 amyE::Pg oE-g p- siX 1-21 (KS201; Cm ) e knüp mi asP:: e (KS231; Cm , Te ), ho::bleo (KS203; Cm , Bleo ) ode beiden (KS232; Cm , Te , Bleo ) * KS202/KS204/KS233/KS234 1012 amyE::Pg oE-g p- siX 1-43 (KS202; Cm ) e knüp mi asP:: e (KS233; Cm , Te ), ho::bleo (KS204; Cm , Bleo ) ode beiden (KS234; Cm , Te , Bleo ) * KS207/KS209/KS227/KS228 1012 amyE::Pg oE-g p- siX 1-70 (KS207; Cm ) e knüp mi asP:: e (KS228; Cm , Te ), ho::bleo (KS209; Cm , Bleo ) ode beiden (KS227; Cm , Te , Bleo ) * KS208/KS210/KS229/KS230 1012 amyE::Pg oE-g p- siX 1-99 (KS208; Cm ) e knüp mi asP:: e (KS230; Cm , Te ), ho::bleo (KS210; Cm , Bleo ) ode beiden (KS229; Cm , Te , Bleo ) * 1012 g p-RBS_ siX 1012 amyE::Pg oE-g p-RBS_ siX (Cm ) T. Wiege (un e ö en lich ) 1012 g p-RBS_ siX  asP 1012 amyE::Pg oE-g p-RBS_ siX asP:: e (Cm , Te ) T. Wiege (un e ö en lich ) 1012 g p-RBS_ siX  ho 1012 amyE::Pg oE-g p-RBS_ siX ho::bleo (Cm , Bleo ) T. Wiege (un e ö en lich ) KS235 1012 amyE::Pg oE-g p-RBS_ siX asP:: e ho::bleo (Cm , Te , Bleo ) * 1012 g p-RBSmu _ siX 1012 amyE::Pg oE-g p-RBSmu _ siX (Cm ) T. Wiege (un e ö en lich ) 1012 g p-RBSmu _ siX  asP 1012 amyE::Pg oE-g p-RBSmu _ siX asP:: e (Cm , Te ) T. Wiege (un e ö en lich ) Ma e ial und Me hoden 29 S ammbezeichnung ele an e Geno yp Re e enz 1012 g p-RBSmu _ siX  ho 1012 amyE::Pg oE-g p-RBSmu _ siX ho::bleo (Cm , Bleo ) T. Wiege (un e ö en lich ) KS236 1012 amyE::Pg oE-g p-RBSmu _ siX asP:: e ho::bleo (Cm , Te , Bleo ) * KS157/KS172/KS173/KS174 1012 amyE::Pg oE-g p_S op- siX (KS157; Cm ) e knüp mi asP:: e (KS173; Cm , Te ), ho::bleo (KS172; Cm , Bleo ) ode beiden (KS174; Cm , Te , Bleo ) * 1012 g p- siX 53-69 1012 amyE::Pg oE-g p- siX 53-69 (Cm ) T. Wiege (un e ö en lich ) 1012 g p- siX 53-69  ho 1012 amyE::Pg oE-g p- siX 53-69 ho::bleo (Cm , Bleo ) T. Wiege (un e ö en lich ) 1012 g p- siX w * 1012 amyE::Pg oE-g p- siX_ es au ie (Cm ) T. Wiege (un e ö en lich ) 1012 g p- siX w *  ho 1012 amyE::Pg oE-g p- siX_ es au ie ho::bleo (Cm , Bleo ) T. Wiege (un e ö en lich ) 1012 g p- siX_ u 1012 amyE::Pg oE-g p- siX_ u (Cm ) T. Wiege (un e ö en lich ) 1012 g p- siX_ u  ho 1012 amyE::Pg oE-g p- siX_ u ho::bleo (Cm , Bleo ) T. Wiege (un e ö en lich ) KS245 1012 siX::spec amyE::Pdl A-lacZ lacA::pALF siX w * (Spec , Neo , Em ) T. Wiege (un e ö en lich ) KS242/KS249/KS253/KS257 KS245 e knüp mi asP:: e (KS242; Te , Spec , Neo , Em ), clpX::ca (KS249; Cm , Spec , Neo , Em ), p sW::bleo (KS253; Bleo , Spec , Neo , Em ) ode mi dem ach ach P o easen-Knockou on WB800 (KS257; Cm , Spec , Neo , Em ) * KS246 1012 siX::spec amyE::Pdl A-lacZ lacA::pALF siX_ u (Spec , Neo , Em ) T. Wiege (un e ö en lich ) KS243/KS250/KS254/KS258 KS246 e knüp mi asP:: e (KS243; Te , Spec , Neo , Em ), clpX::ca (KS250; Cm , Spec , Neo , Em ), p sW::bleo (KS254; Bleo , Spec , Neo , Em ) ode mi dem ach ach P o easen-Knockou on WB800 (KS258; Cm , Spec , Neo , Em ) * DS3290 [PY79] amyE::Physpank-ly F (Spec ) Chen e al. 2009 3610 ho::bleo 3610 ho::bleo (Bleo ) T. Wiege (un e ö en lich ) KS267 3610 ho::bleo amyE::Physpank-ly F (Bleo , Spec ) * Ma e ial und Me hoden 30 Tabelle 2: Plasmide Die in diese A bei e wende en Plasmide sind mi Bezeichnung, Besch eibung sowie de Re e enz angegeben. Wu de s a eine Re e enz ein * angegeben, wu de das Plasmid in diese A bei kons uie . Plasmidbezeichnung Besch eibung Re e enz pIC333 Shu le-Vek o ü T ansposonmu agenese in B. sub ilis, kodie das T ansposon mini-Tn10 (Spec , Em ) S einme z & Rich e 1994 pHTg p in B. sub ilis au onom eplizie endes Plasmid ü ansla ionelle g p-Fusionen, P omo o Pg ac is IPTG induzie ba (Amp , Cm ) Hein ich e al. 2009 pHTg p- siX in B. sub ilis au onom eplizie endes Plasmid ü ansla ionelle g p- siX-Fusion, P omo o Pg ac is IPTG induzie ba (Amp , Cm ) * pBRg p-bleo Plasmid ü ansla ionelle g p-bleo-Fusionen nach In eg a ion in B. sub ilis 1012-g p, kons i u i e P omo o Pg oE (Amp , Cm ) T. Wiege (un e ö en lich ) pBRg p-bleo- siX Plasmid ü ansla ionelle g p-bleo- siX-Fusion nach In eg a ion in B. sub ilis 1012-g p, kons i u i e P omo o Pg oE (Amp , Cm ) * pBR322 siX::spec Vek o ü siX::spec Knockou (Amp , Spec ) Schä e 2007 pBRsigX siX::spec Plasmid ü Knockou des sigX-Ope ons (Amp , Spec ) * pAL-FLAG siW siW N- e minal usionie mi 3x FLAG- ag, IPTG- induzie ba e P omo o Pspac (Amp , Em ) Schöbel e al. 2004 pALFsigX- siX Vek o ü die In eg a ion des IPTG-induzie ba en sigX- Ope ons in den lacA-Locus on B. sub ilis, dabei is sigX N- e minal usionie mi einem 3x FLAG- ag (Amp , Em ) * pALFsigX_s op- siX Vek o ü die In eg a ion des IPTG-induzie ba en sigX_s op- Ope ons in den lacA-Locus on B. sub ilis, dabei is sigX_s op N- e minal usionie mi einem 3x FLAG- ag, sigX_s op bedeu e ein S opp-Codon di ek nach dem S a -Codon on sigX (Amp , Em ) * pBRg p_amyE Plasmid ü ansla ionelle g p-Fusionen nach In eg a ion in B. sub ilis 1012-g p, kons i u i e P omo o Pg oE (Amp , Cm ) T. Wiege (un e ö en lich ) pBRg p- siX Plasmid ü ansla ionelle g p- siX-Fusion nach In eg a ion in B. sub ilis 1012-g p, kons i u i e P omo o Pg oE (Amp , Cm ) * pBRg p- siX 71-368 Plasmid ü ansla ionelle g p- siX 71-368-Fusion nach In eg a ion in B. sub ilis 1012-g p, kons i u i e P omo o Pg oE (Amp , Cm ) * pBRg p- siX 146-368 Plasmid ü ansla ionelle g p- siX 146-368-Fusion nach In eg a ion in B. sub ilis 1012-g p, kons i u i e P omo o Pg oE (Amp , Cm ) * Ma e ial und Me hoden 37 T B II: 10 mM MOPS 10 mM RbCl 75 mM CaCl2 15 % (w/ ) Glyce in pH 7,0 mi 1 M NaOH eins ellen s e il il ie en, lage n bei –20 °C No he n Blo : „Killing-Pu e “: 20 mM T is/HCl, pH 7,5 5 mM MgCl2 20 mM NaN3 Lysislösung I: 25 % Saccha ose 50 mM T is/HCl, pH 8,0 0,25 mM EDTA Lysozymlösung: 20 mg Lysozym/ml bides . H2O Lysislösung II: 3 mM EDTA 200 mM NaCl Sau es Phenol: Aqua-Phenol, Chlo o o m, Isoamylalkohol ( / / ; 25:24:1), zweimal ausgeschü el mi bides . H2O Chlo o o m/Isoamylalkohol: Chlo o o m, Isoamylalkohol ( / ; 24:1), mi 100 mM T is/HCl, pH 8,0 äquilib ie Na iumace a 3M Ma e ial und Me hoden 38 RNA-P obenpu e (2x): 6,5 ml Fo mamid 1,2 ml Fo maldehyd 2,0 ml 10x MOPS-Pu e 0,4 ml 50 % Saccha ose 20 mg B omphenolblau 20 mg Xylencyanol MOPS-Pu e (10x): 200 mM MOPS 50 mM Na iumace a 10 mM EDTA pH mi NaOH au 7,0 eins ellen, ad 1 l bides . H2O, au okla ie en Dena u ie ungslösung: 50 mM NaOH 10 mM NaCl Neu alisie ungslösung: 100 mM T is/HCl, pH 7,4 SSC-Pu e (20x): 3 M NaCl 0,3 M Na iumci a pH au 7,0 eins ellen, bei RT lage n Blocking Reagenz (10 %): 10 % Blocking Reagenz in Pu e P1 in Mik owelle au kochen lassen, au okla ie en, Lage ung bei 4 °C DEPC-H2O: 1 ml DEPC in 1 l bides . H2O lösen (0,1 %), gu schü eln, ÜN bei RT lage n, am nächs en Tag au okla ie en Ma e ial und Me hoden 39 P ähyb idisie ungslösung: 50 % ( / ) Fo mamid 5x SSC 2 % (w/ ) Blocking Reagenz 0,1 % (w/ ) N-Lau oylsa cosin 0,02 % (w/ ) SDS unmi elba o Geb auch anse zen, 30 min bei 37 °C o inkubie en Waschlösung I: 2x SSC 0,1 % SDS bei RT lage n Waschlösung II: 0,1x SSC 0,1 % SDS au 68 °C o empe ie en Pu e P1: 100 mM Maleinsäu e, pH 7,5 150 mM NaCl Pu e P2: 1 % (w/ ) Blocking Reagenz in Pu e P1 unmi elba o Geb auch anse zen, 30 min bei 37 °C o inkubie en De ek ionslösung: 0,1 M Die hanolamin 1 mM MgCl2 pH au 9,5 eins ellen, bei RT lage n Waschpu e : 0,3 % ( / ) Tween 20 in Pu e P1 Ma e ial und Me hoden 40 Sou he n Blo : Depu inie ungslösung: 0,25 M HCl Dena u ie ungslösung: 0,5 M NaOH 1,5 M NaCl Neu alisie ungslösung: 1,5 M NaCl 0,5 M T is/HCl, pH 7,4 SSC-Pu e (20x): 3 M NaCl 0,3 M Na iumci a pH au 7,0 eins ellen, bei RT lage n Blocking Reagenz (10 %): 10 % Blocking Reagenz in Pu e P1 in Mik owelle au kochen lassen, au okla ie en, Lage ung bei 4 °C P ähyb idisie ungslösung: 5x SSC 1 % (w/ ) Blocking Reagenz 0,1 % (w/ ) N-Lau oylsa cosin 0,02 % (w/ ) SDS unmi elba o Geb auch anse zen, 30 min bei 37 °C o inkubie en Waschlösung I: 2x SSC 0,1 % SDS bei RT lage n Ma e ial und Me hoden 41 Waschlösung II: 0,1x SSC 0,1 % SDS au 68 °C o empe ie en Pu e P1: 100 mM Maleinsäu e, pH 7,5 150 mM NaCl Pu e P2: 1 % (w/ ) Blocking Reagenz in Pu e P1 unmi elba o Geb auch anse zen, 30 min bei 37 °C o inkubie en De ek ionslösung: 0,1 M Die hanolamin 1 mM MgCl2 pH au 9,5 eins ellen, bei RT lage n Waschpu e : 0,3 % ( / ) Tween 20 in Pu e P1 Wes e n Blo : Au schlusspu e : 50 mM T is/HCl, pH 7,5 100 mM NaCl au okla ie en Ma e ial und Me hoden 42 Au agspu e (3x Lämmli): 3 ml Glyce in 0,3 ml -Me cap oe hanol 3 ml 20 % SDS 0,3 mg B omphenolblau (ode 60 µl eine 0,5%igen Lösung in bides . H2O) 1,825 ml bides . H2O (ode 1,765 ml bei Ve wendung eine 0,5%igen Lösung B omphenolblau) 1,875 ml 0,5 M T is/HCl pH 6,8 lage n bei –20 °C Elek opho esepu e (10x): 30 g T is 140 g Glycin 10 g SDS bides . H2O ad 1 l, lage n bei RT AP-Pu e (10x): 1 M T is/HCl pH 7,4 1 M NaCl 2,5 mM MgCl2 bides . H2O ad 1 l, lage n bei RT AP-T-Pu e : 100 ml AP-Pu e (10x) 0,05 % / Tween 20 (500 µl) ad 1 l bides . H2O, lage n bei RT Blo ing-Pu e : 3 g T is 14 g Glycin 1 g SDS 200 ml Me hanol bides . H2O ad 1 l, lage n bei RT Ma e ial und Me hoden 43 2.3 An ibio ika-Lösungen Alle e wende en An ibio ika-Lösungen sind in Tabelle 5 zusammenge ass . Wasse lösliche An ibio ika wu den s e il il ie . Alle Lösungen wu den bei –20 °C gelage . Tabelle 5: Zusammen assung de e wende en An ibio ika-Lösungen Angegeben sind jeweils Name, Konzen a ion de S ammlösung, Lösungsmi el sowie Endkonzen a ion des An ibio ikums in dem jeweils e wende en Medium. An ibio ikum Konzen a ion de S ammlösung [mg/ml] Lösungsmi el Endkonzen a ion [μg/ml] Ampicillin (Amp) 100 70 % ( / ) E OH 100 Bicyclomycin (BCM) 100 bides . H2O 100 Chlo amphenicol (Cm) 20 E OH abs. 10 E y h omycin (Em) 1 bzw. 50 E OH abs. 1 bzw. 100 Neomycin (Neo) 10 bides . H2O 10 Bleomycin (Bleo) 1 bides . H2O 1 Spec inomycin (Spec) 100 bides . H2O 100 Te acyclin (Te ) 2 50 % ( / ) E OH 10 2.4 An ikö pe Fü die in diese A bei du chge üh en Hyb idisie ungsexpe imen e sind die in Tabelle 6 und Tabelle 7 au gelis e en p imä en und sekundä en An ikö pe e wende wo den. Tabelle 6: P imä e An ikö pe Die Tabelle zeig die in diese A bei e wende en p imä en An ikö pe mi Ve dünnung und Re e enz au . Name Ve dünnung Re e enz An i-FLAG 1 : 1000 Sigma, F7425 An i-GFP 1 : 5000 S. Heidmann, un e ö en lich B. sub ilis An i-H pG 1 : 10000 Zellmeie e al. 2003 B. sub ilis An i-F sH 1 : 10000 Zellmeie e al. 2003 Ma e ial und Me hoden 44 Tabelle 7: Sekundä e An ikö pe Die Tabelle zeig die in diese A bei e wende en sekundä en An ikö pe mi Ve dünnung und Re e enz au . Name Ve dünnung Re e enz ECL™ An i-Rabbi IgG, Ho se adish Pe oxidase Conjuga e 1 : 5000 GE Heal hca e, NA934V An i-Digoxygenin-AP, Fab agmen s 1 : 10000 Roche, 11 093 274 910 2.5 Längens anda ds Die ü Aga ose-Gelelek opho esen benu z en Längens anda ds sowie de Molekula gewich ss anda d ü SDS-PAGEs, welche ü Wes e n Blo Analysen du chge üh wu den, sind in Tabelle 8 au gelis e . Tabelle 8: Längens anda ds ü Aga ose-Gelelek opho esen und Molekula gewich ss anda d ü SDS- PAGEs Angegeben sind zum einen de Name de Längens anda ds ü Aga ose-Gelelek opho esen mi Re e enz sowie G öße de DNA- bzw. RNA-F agmen e in bp bzw. Basen. Zum ande en is de Name des Molekula gewich ss anda ds ü SDS-PAGEs mi Re e enz und den G ößen de P o eine in kDa angegeben. S anda d ü DNA- Aga osegele Re e enz F agmen g ößen in bp Spp1 Roche 8576, 7425, 6106, 4899, 3639, 2799, 1953, 1882, 1515, 1482, 1164, 992, 710, 492, 359 O´RangeRule TM 200 bp DNA Ladde , eady- o-use Fe men as 3000, 2800, 2600, 2400, 2200, 2000, 1800, 1600, 1400, 1200, 1000, 800, 600, 400, 200 O´RangeRule TM 100+500 bp DNA Ladde , eady- o-use Fe men as 6000, 5500, 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 S anda d ü RNA- Aga osegele Re e enz F agmen g ößen in Basen RiboRule ™ RNA Ladde , High Range Fe men as 6000, 4000, 3000, 2000, 1500, 1000, 500, 200 S anda d ü SDS-PAGEs Re e enz Molekula gewich e in kDa PageRule ™ Plus P es ained P o ein Ladde Fe men as 250, 130, 100, 70, 55, 35, 25, 15, 10 Ma e ial und Me hoden 45 2.6 Mik obiologische Me hoden 2.6.1 Näh medien Die e wende en Näh medien wu den wie bei Samb ook besch ieben he ges ell (Samb ook & Russell 2001). Die nach olgend besch iebenen Zusammense zungen de einzelnen Medien beziehen sich au Flüssigkei en. Wu de das LB-Medium als es es Näh medium e wende , wu den diesem 15 g/l Aga -Aga bzw. 7 g/l Aga -Aga ü Weichaga o dem Au okla ie en zuge üg . Fü Selek ionen nö ige An ibio ika-Lösungen (Tabelle 5) wu den s e s nach dem Au okla ie en zugegeben. Das LB-Medium dien e zu Kul i ie ung on B. sub ilis- bzw. E. coli-Zellen, dagegen wu de das HS- und LS-Medium zu He s ellung kompe en e B. sub ilis-Zellen und de olgenden T ans o ma ion on DNA benö ig (2.6.4.2). LB-Medium 10 g Caseinhyd olysa (T yp on ode Pep on) 5 g He eex ak 5 g NaCl bides . H2O ad 1000 ml, au okla ie en LS-Medium 81,2 ml bides . H2O 10 ml 10x S-Base mi Mg2+ 2,5 ml 20 % Glucose 0,5 ml 1 mg/ml (0,1%) DL-T yp ophan 0,5 ml 2 % Caseinhyd olysa 5 ml 2 % He eex ak (Di co!) 0,25 ml 1 M MgCl2 0,05 ml 1 M CaCl2 Alle Komponen en we den nach dem Au okla ie en s e il zusammengegeben. Die T yp ophanlösung wu de nu s e il il ie . Ma e ial und Me hoden 46 HS-Medium 10 ml 10x S-Base mi Mg2+ 2,5 ml 20 % Glucose 5 ml 1 mg/ml (0,1%) DL-T yp ophan 1 ml 2 % Casein 5 ml 10 % He eex ak 10 ml 8 % A ginin, 0,4 % His idin 66,5 ml bides . H2O Alle Komponen en we den nach dem Au okla ie en s e il zusammengegeben. Die T yp ophanlösung wu de nu s e il il ie . 2.6.2 Kul u e ah en Um die Bak e ienkul u en in aus eichende Menge zu Ve ügung zu haben, wu den diese in lüssigem LB-Medium (gegebenen alls mi dem en sp echenden An ibio ikum) bei 37 °C und 200 pm un e aus eichende Lu zu uh inkubie . Bei de Ve wendung on es em Medium wu den die Bak e ienkul u en mi hil e eines D ygalski-Spa els ode eine Imp öse au LB-Pla en (gegebenen alls mi dem en sp echenden An ibio ikum) auspla ie und bei 37 °C übe Nach im B u sch ank angezogen. 2.6.2.1 Au nehmen on Wachs umsku en Fü die Au nahme on Wachs umsku en wu den 50 ml LB-Medium (gegebenen alls mi dem en sp echenden An ibio ikum) mi eine Übe nach kul u des en sp echenden Bak e iens ammes au eine OD578 on 0,05 angeimp . Die Kolben wu den im Wasse bad un e Schü eln und aus eichende Lu zu uh bei 37 °C inkubie . Das Bak e ienwachs um wu de du ch Messung de OD578 in de inie en Zei abs änden e olg . Bei Beda wu den P oben de Bak e iensuspension en nommen. Ma e ial und Me hoden 53 Es wu den 25 µl Lysozym-Lösung zugegeben. Anschließend wu de g ündlich gemisch und ü 30 min bei 37 °C inkubie . Im Anschluss wu den 30 µl SDS-Lösung und 3 µl P o einase K zuge üg und es wu de g ündlich gemisch . Fü 1 S unde wu de nun bei 37 °C inkubie . Als nächs es wu den 100 µl 5 M NaCl (nach Zugabe wu de g ündlich gemisch ) und 80 µl CTAB/NaCl zugegeben und du chmisch . Es olg e eine 10-minü ige Inkuba ion bei 65 °C. Im Anschluss e olg e die Ex ak ion mi 700 µl Chlo o o m/Isoamylalkohol (24:1) und eine Zen i uga ion ü 5 min bei 12000 pm. Es kam zu Phasen ennung. Fü die olgende Phenolisie ung wu de jeweils de wäss ige, nukleinsäu ehal ige iskose Übe s and inklusi e de weißlichen In e phase in ein neues 1,5 ml Sa s ed -Reak ionsge äß übe üh . Bei de Phenolisie ung wu de mi je 600 µl de olgenden Reagenzien ex ahie : 1x Phenol, 1x Phenol/Chlo o o m (1:1) und am Ende 2x mi Chlo o o m/Isoamylalkohol (24:1). Nach jede Ex ak ion wu de ü 5 min bei 12000 pm zen i ugie . Nach de le z en Ex ak ion wu de nu de Übe s and ohne die In e phase in ein neues Reak ionsge äß übe üh und mi 10 µl RNase e se z . Es wu de ü 30 min bei Raum empe a u inkubie . Dann e olg e die Zugabe on 0,6 Volumina Isop opanol, es wu de du chmisch und ü ca. 2 S unden bei -20 °C (ode übe Nach bei 4 °C) die DNA ge äll . Nun wu de ü 15 min bei 4 °C und 12000 pm zen i ugie , um die DNA zu pelle ie en. Das en s andene Pelle wu de mi 1 ml 70%igen E hanol gewaschen und ü 10 min bei 12000 pm zen i ugie . De Übe s and wu de e wo en und das Pelle wu de bei Raum empe a u ca. 15 min ge ockne . Anschließend wu de die DNA in 100 µl TE-Pu e esuspendie und zum Lösen ca. 1 S unde bei 65 °C inkubie . Danach wu de die DNA-Konzen a ion bes imm (2.7.2). 2.7.1.2 Isolie ung on Plasmid-DNA aus E. coli 2.7.1.2.1 Isolie ung on Plasmid-DNA du ch Mini-P äpa a ion (Boiling P äpa a ion) Mi de Mini-Plasmid-P äpa a ion nach de Boiling-P äp-Me hode (Holmes & Quigley 1981) wu den ge inge Mengen an Plasmid-DNA e hal en, wie sie z. B. ü Kon oll e daus nach eine Liga ion benö ig wu den. Dabei ging man wie olg o : Es wu de eine Übe nach kul u aus 2 ml LB mi dem en sp echenden An ibio ikum angeleg und bei 37 °C inkubie . 1,5 ml diese Kul u wu den in ein 1,5 ml Sa s ed -Reak ionsge äß übe üh . Bei de anschließenden Zen i uga ion (12000 pm, 3 min) wu den die Bak e ien pelle ie . De Übe s and wu de e wo en und das Pelle wu de in 110 µl STETL-Lösung Ma e ial und Me hoden 54 esuspendie . Es olg e eine 5-minü ige Inkuba ion bei Raum empe a u . Anschließend wu de 30 sec bei 100 °C im Heizblock inkubie und danach ü 15 min bei 4 °C und 12000 pm zen i ugie . Das schleimige Sedimen wu de mi einem s e ilen Zahns oche en e n und zu dem Übe s and wu den 110 µl Isop opanol gegeben. Es wu de ku z und g ündlich pe Hand gemisch und e neu ü 15 min bei 12000 pm und 4 °C zen i ugie . De Übe s and wu de e wo en und das e hal ene DNA-Pelle wu de mi 1 ml 70%igen E hanol gewaschen und eine Zen i uga ion ü 10 min und 12000 pm olg e. Das Pelle wu de ü ca. 5-10 min bei Raum empe a u ge ockne und in 30 µl TE-Pu e (en häl 1 µl RNase) esuspendie . Von diese isolie en DNA wu den Tes e daus (2.7.4.1) du chge üh . 2.7.1.2.2 Isolie ung on Plasmid-DNA du ch Midi-P äpa a ion Die Midi-Plasmid-P äpa a ion wu de e wende , um g öße e Mengen an Plasmid-DNA on hohe Reinhei zu gewinnen. Dabei wu de zu P äpa a ion de QIAGEN Plasmid Midi Ki 100 (Qiagen, Hilden) e wende . Es wu de nach dem om He s elle angegebenen P o okoll o gegangen. 2.7.1.3 Isolie ung on Gesam -RNA aus B. sub ilis Fü die Isolie ung on Gesam -RNA aus B. sub ilis wu de die sau e Phenol-Me hode on Völke (Völke e al. 1994) in eine leich modi izie en Weise (Homu h e al. 1997) angewand . Es wu de dabei wie olg e ah en: 10 ml de ele an en Bak e ienkul u wu den so o nach de P obenahme au 5 ml ge o enen ze s oßenen Killing-Pu e in Zen i ugen öh chen gegeben. Es olg e eine Zen i uga ion bei 4 °C und 3700 pm ü 30 min. Im Anschluss wu de das Pelle in 1 ml Killing-Pu e esuspendie , in ein 1,5 ml Reak ionsge äß übe üh und e neu zen i ugie (4 °C, 8800 pm, 5 min). Das e hal ene Pelle konn e gg . bei -20 °C gelage we den ode es wu de so o wei e e wende und in 1 ml Lysislösung I au Eis esuspendie . Es wu de anschließend mi 50 µl Lysozymlösung e se z und ü 5 min au Eis inkubie , dami sich P o oplas en ausbilden konn en. Gleichzei ig wu de die Lysislösung II o be ei e : p o RNA-P obe wu den in ein 2 ml Reak ionsge äß 270 µl Lysislösung II und 30 µl 10 % SDS gegeben. Nach dem Mischen wu de die Lösung bei 95 °C im Heizblock o gewä m . Die Suspension mi den P o oplas en wu de zen i ugie (4 °C, 4000 pm, 5 min). Das esul ie ende Pelle wu de in Ma e ial und Me hoden 55 300 µl Lysislösung II esuspendie und zu de o gewä m en Lysislösung II/SDS-Mischung gegeben. Zusammen wu de alles ü 5 min bei 95 °C inkubie . Dabei wu den die P o oplas en lysie . Danach wu den zu diese Lösung 600 µl sau e Phenol-Lösung gegeben. Es wu de ü 5 min bei RT geschü el und danach 5 min bei 12000 pm zen i ugie . 500 µl de Obe phase wu den e neu mi sau em Phenol (500 µl) e se z und das Schü eln bei RT sowie die Zen i uga ion wu den wiede hol . Danach wu den 400 µl de Obe phase abgenommen, mi 400 µl Chlo o o m/Isoamylalkohol (1:1) e se z , ü 5 min bei RT geschü el und 5 min bei 12000 pm zen i ugie . Die gesam e wäss ige Obe phase wu de danach in ein neues Reak ionsge äß gegeben und ü 10 min bei 65 °C inkubie . Im Anschluss wu de ü 30 min bei RT inkubie . Zu RNA-Fällung wu den zue s 40 µl 3 M Na iumace a (pH 5,2) und danach 1 ml 96%ige E hanol zuge üg . Die Fällung e olg e ÜN bei -20 °C. Anschließend wu de zen i ugie (4 °C, 12000 pm, 15 min), mi 1 ml 70%igem E hanol gewaschen und e neu zen i ugie (4 °C, 12000 pm, 15 min). Das e hal ene Pelle wu de 30 min an de B enne lamme ge ockne und in 100 µl DEPC-H2O gelös (3 S unden au Eis und 30 min bei RT ode ÜN au Eis). Mi diese Me hode wa en Ausbeu en on 1-3 µg RNA/µl möglich (2.7.2). Die Lage ung de isolie en RNA e olg e bei -20 °C. 2.7.2 Pho ome ische Bes immung de DNA- und RNA-Konzen a ion Die Konzen a ion on isolie e ch omosomale ode Plasmid-DNA sowie on RNA wu de mi dem Spek alpho ome e (Pha macia Bio ech, Ul ospec 2000) in 1 ml Qua zkü e en bei en sp echende Ve dünnung bes imm . Es wu de olgende De ini ion zug unde geleg : 1 A260 = 50 µg dsDNA/ml 1 A260 = 40 µg ssRNA/ml Das Ve häl nis A260/A280 gib die Reinhei de DNA im Ve häl nis zu P o ein e un einigungen an. Von eine DNA kann bei einem We on 1,8 bis 2,0 gesp ochen we den. Ma e ial und Me hoden 56 2.7.3 Ampli ika ion on DNA mi Hil e de Polyme ase Ke en eak ion (PCR) Die PCR is eine Me hode bei de bes imm e Be eiche eine Templa e DNA e iel äl ig we den können. Dazu we den spezi ische P ime (Oligonukleo ide), Desoxynukleosid iphospha e, he mos abile Polyme asen sowie die Templa e DNA benö ig . Die Ke en eak ion beginn mi de E höhung de Tempe a u , so dass es zum Au schmelzen de DNA komm . Im Anschluss wi d die Tempe a u bis einige G ad Celsius (ca. 10 °C) un e halb de Schmelz empe a u de P ime abgesenk (Annealing empe a u ), so dass die P ime an das Templa e hyb idisie en können. Danach wi d die Tempe a u wiede e höh und zwa bis zu de Tempe a u , bei welche die e wende e Polyme ase ih e höchs e Ak i i ä besi z , um einen neuen DNA-S ang zu syn he isie en. Wi d diese Zyklus meh ach wiede hol , komm es zu einem exponen iellen Ans ieg de Menge des gewünsch en DNA- F agmen s. Die PCR-Reak ionen ü diese A bei wu den mi dem The mal Cycle de Fi ma Bio-Rad (MyCycle ™) du chge üh . 2.7.3.1 S anda d-PCR Bei de ü diese A bei du chge üh en S anda d-PCR wu de die Taq-Polyme ase (5 U/µl) e wende . Wu den die ampli izie en F agmen e ü eine Klonie ung benö ig , wu de mi de P u-Polyme ase (2,5 U/µl) gea bei e , da diese im Gegensa z zu Taq-Polyme ase eine p oo eading-Funk ion besi z . Die benu z en P ime (2.1, Tabelle 3) besi zen meis zusä zlich zu den komplemen ä en Sequenzen zu de Templa e-DNA noch E kennungss ellen ü Res ik ionsenzyme. Au diese A wu den in das zu ampli izie ende DNA-F agmen noch Schni s ellen ü Res ik ionsenzyme einge üh . Auße dem be inden sich jensei s de Schni s ellen in de Sequenz de P ime meis noch so genann e GC-Klamme n. Dieses sind sechs Basen lange Sequenzen, so dass das DNA-F agmen jensei s de Schni s elle e länge wi d, was die spä e e Bindung de Res ik ionsenzyme e leich e . Ma e ial und Me hoden 57 Reak ionsansa z (100 µl) ü die S anda d-PCR: ad 100 µl bides . H2O 4 x 2 µl 10 mM dNTPs 10 µl 10x The mo Pol Pu e (mi MgCl2) 5 µl Templa e DNA (30-100 ng) 1 µl Fo wa d-P ime (100 pmol) 1 µl Re e sed-P ime (100 pmol) 1 µl Taq-Polyme ase bzw. 2 µl P u-Polyme ase Reak ionsbedingungen de S anda d-PCR: 8’ bei 95 °C 30 Zyklen: 1’ bei 95 °C 1’ bei Annealing empe a u 1’-4’ bei 72 °C 10’ bei 72 °C End empe a u 18 °C Ein Aliquo (5 µl) des PCR-P oduk es wu de zu Kon olle au Nebenp oduk e und zu Ausbeu eabschä zung au ein Aga osegel (2.7.6) au ge agen. Falls e o de lich wu de nach de PCR die DNA mi den en sp echenden Enzymen e dau (2.7.4.1) und ge einig (2.7.5). Die ampli izie e DNA wu de bei -20 °C gelage . 2.7.3.2 Kolonie-PCR Al e na i zu Mini-Plasmid-P äpa a ion (2.7.1.2.1) konn e auch eine Kolonie-PCR du chge üh we den. In diesem Fall wu de die Plasmid-DNA nich di ek in den PCR-Ansa z gegeben, sonde n es wu den mi s e ilen Zahns oche n Zellen on Einzelkolonien au Aga pla en di ek zum PCR-Ansa z gegeben. Du ch die hohen Tempe a u en bei de PCR wu den die Zellen lysie und die DNA lag olglich als Templa e o . Diese Me hode b ach e eine e hebliche Zei e spa nis. Die ge inge Reinhei de gewonnenen Ampli ika e eich e dabei aus, um Aussagen zu e en, ob es sich bei dem jeweiligen Plasmid um das gewünsch e P oduk handel e. Fü die Du ch üh ung wu den olgende Bedingungen gewähl : Ma e ial und Me hoden 58 Mas e mix-Ansa z ü 48 Klone: 812 µl bides . H2O 4 x 21 µl 10 mM dNTPs 104 µl 10x Pu e (mi MgCl2) 10 µl Fo wa d-P ime (100 pmol) 10 µl Re e sed-P ime (100 pmol) 20 µl Taq-Polyme ase Fü eine Kolonie/ein Klon wu den 20 µl Mas e mix e wende . PCR-P og amm: 8’ bei 95 °C 30 Zyklen: 1’ bei 95 °C 1’ bei Annealing empe a u 1’-4’ bei 72 °C 10’ bei 72 °C End empe a u 18 °C Eine sich anschließende Aga ose-Gelelek opho ese (2.7.6) dien e de Analyse de PCR- P oduk e und dem Sc eening nach posi i en Klonen. 2.7.4 Enzyma ische Modi ika ion on Nukleinsäu en 2.7.4.1 Enzyma ische Hyd olyse on Nukleinsäu en Fü die spezi ische enzyma ische Hyd olyse de DNA wu den Res ik ionsendonukleasen des Typs II e wende (A be 1978; A be 1993). Diese zeichnen sich dadu ch aus, dass sie spezi ische Nukleo idsequenzen (ku ze palind omische Sequenzen [4-8 bp] (Pingoud 2004)) e kennen und inne halb ode in unmi elba e Nähe diese Sequenzen die DNA spal en können. Die Res ik ionsenzyme wu den dem Hyd olyseansa z im Übe schuss zugegeben. Auße dem wu den Res ik ionspu e benö ig . Je nach e wende em Enzym wu den allgemeine Pu e ode enzymspezi ische Pu e e wende . Aus diesem G und wu de die Hyd olyse on DNA mi meh e en Enzymen mi un e nich gleichzei ig du chge üh . In diesem Fall wu de die Ma e ial und Me hoden 59 DNA sch i weise mi jedem Enzym einzeln e dau und zwischen den einzelnen Reak ionen ge einig (2.7.5). Fü das Ve dauen g oße Mengen an DNA (p äpa a i e Ve dau) wu den zum Hyd olyseansa z 10-15 µg diese DNA zugegeben. Dien e die Hyd olyse nu de Übe p ü ung de gewonnenen DNA (Tes e dau), eich e eine DNA-Menge on 200-500 ng aus. Die Hyd olyseansä ze wu den ü einen Tes e dau ca. 2 S unden, ü einen p äpa a i en Ve dau ca. 4 S unden beim Tempe a u op imum des jeweiligen Enzyms, meis 37 °C, inkubie . Nach e olg e Hyd olyse wu de das Enzym du ch s a ke Tempe a u e höhung (lau He s elle angabe) inak i ie . P äpa a i e Ve daus wu den nach dem Reak ionsende ge einig (2.7.5). Im Anschluss wu den die e hal enen DNA-F agmen e mi els Aga ose- Gelelek opho ese au ge enn und iden i izie (2.7.6). Soll en die Hyd olyseansä ze au bewah we den, wu den sie bei -20 °C gelage . Hyd olyseansä ze ü Tes e dau p äpa a i e Ve dau 1,5 µl 10x Pu e 10 µl 10x Pu e 0,5 µl Res ik ionsenzym 4 µl Res ik ionsenzym 200-500 ng DNA 10-15 µg DNA bides . H2O ad 15 µl bides . H2O ad 100 µl 2.7.4.2 Liga ion on Nukleinsäu en Zu Ve knüp ung on DNA mi kompa iblen Schni s ellen wu de diese enzyma isch ligie . Dazu wu de die T4-DNA-Ligase (Fe men as) e wende . Dabei e knüp das Enzym un e Ve b auch on ATP das eie 3’-Hyd oxyl- und 5’-Phospha -Ende de DNA-F agmen e zu eine Phosphodies e bindung. Fü die Liga ion wu de olgende Ansa z pipe ie : 1 µl 10x Liga ionspu e mi ATP 1 µl T4-DNA-Ligase DNA-F agmen e im Ve häl nis Vek o :Inse = 1:1 bis 1:5 HPLC-H2O ad 10 µl Ma e ial und Me hoden 60 Die Abschä zung de Menge an Inse und Vek o e olg e mi els eine Aga ose- Gelelek opho ese (2.7.6), bei de jeweils die gleichen Volumina an Vek o und Inse au ge agen wu den. De Liga ionsansa z wu de 1 S unde bei RT inkubie . Anschließend wu de das Enzym ü 10 min bei 65 °C inak i ie . Zu Kon olle wu de zu jedem Liga ionsansa z auch eine Liga ion ohne Inse du chge üh . Die ligie e DNA wu de im Anschluss in E. coli-Zellen ans o mie (2.6.4.1.2) ode bei Beda bei -20 °C gelage . 2.7.5 Reinigung on DNA-F agmen en nach de PCR bzw. nach ande en enzyma ischen Reak ionen Die Reinigung on DNA-F agmen en e olg e nach dem QIAquick PCR Pu i ica ion Ki P o okoll (bei Benu zung eine Mik ozen i uge) de Fi ma Qiagen GmbH (Ca . No. 28106). Nach diese Me hode konn en F agmen e on 100 bp bis zu 10 kb on P ime n, Nukleo iden, Enzymen und Salzen ge einig we den. Bei diese Me hode wu den alle Zen i uga ionssch i e mi de Tischzen i uge Mik o 12-24 de Fi ma He ich bei 13000 pm du chge üh . Dabei wu de wie olg o gegangen: Zu 1 Teil P obe wu den 5 Teile Bindungspu e PB gegeben, und die P obe wu de gemisch . Danach wu de de gesam e Ansa z au eine QIAquick spin Säule, welche sich au einem 2 ml Sammelge äß be and, au ge agen und ü 1 min zen i ugie . De Du ch luss wu de e wo en. Die Säule wu de dann zweimal (1. 700 µl, 2. 500 µl) mi dem Pu e PE gewaschen. Nach jedem Waschsch i wu de zen i ugie und de Du ch luss e wo en. Nach dem le z en Waschsch i wu de zusä zlich noch einmal 1 min zen i ugie , um das gesam e E hanol aus dem Pu e PE zu en e nen. Anschließend wu de die Säule in ein 1,5 ml Sa s ed -Reak ionsge äß gese z und in die Mi e de Memb an de Säule wu den 50 µl Elu ionspu e EB (10 mM T is-HCl, pH 8,5) gegeben. Es wu de ü 1 min zen i ugie , um alle DNA zu eluie en. Dabei wu den du chschni lich 46 µl DNA eluie . Ma e ial und Me hoden 61 2.7.6 Aga ose-Gelelek opho ese 2.7.6.1 DNA-Aga ose-Gelelek opho ese Um DNA-Moleküle nach ih e G öße au zu ennen, wu den 0,7%ige und 2,0%ige Aga osegele aus 0,7 % bzw. 2,0 % (w/ ) Aga ose in 1x TBE e wende . Die Gelelek opho ese wu de in ho izon alen Flachbe appa a u en du chge üh (Haywa d & Smi h 1972). Da ü wu de das Gel mi 1x TBE übe schich e und anschließend mi einem Längens anda d und den DNA-P oben, welche zu o mi 6x Loading Dye e misch wu den, beladen. Die Elek opho ese wu de bei RT mi eine Spannung on 120 V du chge üh . Die DNA is au g und des Pen ose-Phospha -Rückg ades nega i geladen und wande dahe wäh end de Elek opho ese zum Pluspol (Anode). Um die einzelnen DNA-F agmen e sich ba zu machen, wu de das Gel nach de Elek opho ese in E hidiumb omid-Lösung ü ca. 10 min ge ä b und danach ü ca. 10 min in bides . H2O en ä b . Dabei in e kalie E B zwischen die Basenpaa e de DNA. Au eine UV-Du chlich bank konn en so die DNA-Moleküle sich ba gemach und o og a ie we den. Das An egungsmaximum on DNA-gebundenem E B lieg bei 366 nm, das Emissionsmaximum lieg bei 605 nm (Ca l Ro h GmbH & Co. KG). Zu Abschä zung de G öße on DNA-Molekülen sowie de DNA- Menge wu den e schiedene Längens anda ds (Tabelle 8) he angezogen. 2.7.6.2 RNA-Aga ose-Gelelek opho ese RNA-Moleküle wu den ähnlich wie DNA-Moleküle du ch eine Gelelek opho ese in ho izon alen Flachbe appa a u en nach ih e G öße au ge enn . Hie ü wu den jedoch 1,2%ige dena u ie ende Aga osegele e wende . Dazu wu den ü die He s ellung on einem Gel 0,6 g Aga ose in 37 ml DEPC-H2O sowie 5 ml 10x MOPS du ch Au kochen im Mik owellenhe d gelös und danach ü 30 min bei 65 °C inkubie . Im Anschluss wu den 4,25 ml Fo maldehyd zuge üg und e neu ü 30 min bei 65 °C inkubie . 40 ml dieses Ansa zes wu den zum Gießen eines Gels e wende , welches eine S unde zum E s a en bei RT belassen wu de. Danach e olg e die Elek opho ese mi o gekühl em 1x MOPS als Lau pu e (siehe auch 2.7.13.2). Ma e ial und Me hoden 62 2.7.7 Isolie ung on Nukleinsäu en aus Aga osegelen (Gelex ak ion) Wu den DNA-Moleküle nach ih e Au ennung du ch Aga ose-Gelelek opho ese (2.7.6.1) wei e e wende (z. B. nach einem p äpa a i en Res ik ions e dau (2.7.4.1) ode eine PCR (2.7.3.1)), muss en die en sp echenden DNA-Moleküle aus dem Gel isolie we den. Dazu wu de die jeweilige Bande des DNA-Moleküls mi einem Skalpell un e UV-Lich aus dem Aga ose-Gel ausgeschni en. De Aga ose-Block wu de im Anschluss en wede mi dem QIAEX II Gel Ex ac ion Ki ode mi dem QIAquick Gel Ex ac ion Ki (jeweils on QIAGEN) nach den Anweisungen des He s elle s au gea bei e . 2.7.8 Sequenzie ung Sequenzie ungen on Plasmid-DNA wu den on de Fi ma Seqlab in Gö ingen du chge üh . Die P oben wu den olgende maßen o be ei e : Zu 0,6 µg Plasmid-DNA wu den 2 µl 10 pmol/µl Sequenzie p ime (Tabelle 4) zugegeben und au ein Gesam olumen on 7 µl mi bides . H2O au ge üll . 2.7.9 He s ellung eine DIG-ma kie en DNA-Sonde Die mi Digoxygenin ma kie e DNA wu de in den Hyb idisie ungsexpe imen en (Sou he n Blo ; 2.7.11) e wende , um spezi isch DNA nachzuweisen. Die Ma kie ung de Sonde e olg e mi DIG-dUTP wäh end eine PCR. Da ü wu de de PCR DIG Labeling Mix (Roche) benu z . Es wu de lau Vo sch i des He s elle s e ah en. Im Anschluss wu de die DIG-ma kie e DNA-Sonde ge einig (2.7.10). 2.7.10 Reinigung on DNA-/RNA-Sonden du ch P äadso p ion Be o die he ges ell en DIG-ma kie en DNA-/RNA-Sonden in den Hyb idisie ungs- expe imen en eingese z we den konn en, wu den diese ge einig . Dadu ch wu den unspezi ische Hin e g undsignale bei de De ek ion en e n (Sp enge e al. 1995). Fü die P äadso p ion wu de das P o okoll on Homu h (Homu h e al. 1997) angewand . Ma e ial und Me hoden 69 2.8.4 Ak i i ä s es s 2.8.4.1 Bes immung de P o einkonzen a ion mi dem B ad o d Assay Fü die Bes immung de P o einkonzen a ion wu de die Me hode nach B ad o d (B ad o d 1976) e wende . 2.8.4.2 Bes immung de β-Galak osidase-Ak i i ä Um β-Galak osidase-Ak i i ä en zu messen, wu den on de en sp echenden Kul u 50 ml LB-Medium mi eine Übe nach kul u au eine OD578 on 0,05 angeimp und bei 37 °C un e Schü eln inkubie . Beim Übe gang in die s a ionä e Wachs umsphase wu den 2 ml de Zellsuspension bei 12000 pm und 4 °C ü 10 min zen i ugie und die OD578 de Kul u zum Zei punk de P obenahme bes imm . Die Bes immung de β-Galak osidase-Ak i i ä e olg e dann wie bei Wiege e al. besch ieben (Wiege e al. 2001). Das P inzip de Ak i i ä smessung be uh e au dem Zellau schluss du ch Lysozym und dem anschließenden Umsa z des a blosen Subs a analogons ONPG zu dem gelblichen o ho- Ni ophenol du ch die β-Galak osidase. Diese Umsa z wu de pho ome isch bei 405 nm und 28 °C im VERSAmax™ (Molecula De ices, unable mic opla e eade ) e olg . Dabei wu de eine Einhei de β-Galak osidase-Ak i i ä de inie als E405 * min-1 * OD578-1 * 10-3 (Wiege e al. 2001). E405 bezeichne die Ände ung de Ex ink ion bei 405 nm. Die OD578 is die op ische Dich e de Kul u zum Zei punk de P obenahme. Die β-Galak osidase-Ak i i ä wu de auch g ob di ek au de Aga -Pla e bes imm . Dazu wu de das LB-Medium mi dem Subs a analogon X-Gal e se z und die Bak e ienkul u ÜN au diese Pla e inkubie . Du ch Au e en on blauen Kolonien wu de die β-Galak osidase- Ak i i ä nachgewiesen. Die Me hode be uh e au de Umse zung des a blosen X-Gal zu dem blauen 5-B om-4-chlo -indigo du ch die β-Galak osidase. Ma e ial und Me hoden 70 2.9 Kons uk ion on Plasmiden Die DNA-F agmen e, die in ein Plasmid klonie we den soll en, wu den zunächs mi els PCR (Kapi el 2.7.3; die e wende en Oligonukleo ide sind in Tabelle 3 au ge üh ) ampli izie , du ch Aga ose-Gelelek opho ese (Kapi el 2.7.6.1) übe p ü und anschließend au ge einig (Kapi el 2.7.5). Es olg e ein p äpa a i e Ve dau mi den en sp echenden Res ik ionsenzymen (Kapi el 2.7.4.1) und eine e neu e Au einigung sowie gegebenen alls eine p äpa a i e Aga ose-Gelelek opho ese. Das Plasmid, in welches das DNA-F agmen klonie we den soll e, wu de du ch eine Midi- P äpa a ion aus E. coli isolie (Kapi el 2.7.1.2.2) und du ch geeigne e Res ik ionsenzyme mi anschließende Aga ose-Gelelek opho ese au seine Rich igkei übe p ü . Danach e olg e auch ü das Plasmid ein p äpa a i e Ve dau mi den en sp echenden Res ik ionsenzymen sowie eine Au einigung. Anschließend wu den de geschni ene Vek o und das Inse , wie un e Kapi el 2.7.4.2 besch ieben, ligie und in E. coli ans o mie (Kapi el 2.6.4.1). Zu Selek ion konn en die e hal enen T ans o man en zusä zlich au LB-Selek i -Pla en übe pick we den. Um die kons uie en Plasmide au ih e Rich igkei zu kon ollie en, olg e on einigen T ans o man en en wede eine Mini-Plasmid-P äpa a ion (Kapi el 2.7.1.2.1) mi anschließendem Res ik ions e dau ode al e na i eine Kolonie-PCR und jeweils eine Aga ose-Gelelek opho ese. Von ein bis zwei Klonen mi ich igem Plasmid wu de dieses im Midi-Maßs ab isolie . Um zu gewäh leis en, dass ein ich ig kons uie es Plasmid isolie wu de, e dau e man dieses noch einmal mi meh e en e schiedenen Res ik ionsenzymen mi anschließende Aga ose-Gelelek opho ese. Die kons uie en Plasmide konn en zusä zlich du ch eine Sequenzie ung (Kapi el 2.7.8) übe p ü we den. In olgende Tabelle 10 sind die in diese A bei kons uie en Plasmide zusammenge ass . Ma e ial und Me hoden 71 Tabelle 10: Kons uk ion de Plasmide Die in diese A bei kons uie en Plasmide sind in olgende Tabelle zusammenge ass . Es sind auch die e wende en Ausgangsplasmide und die Enzyme, mi denen diese e dau wu den, angegeben. Auße dem sind die ü die Kons uk ion des Inse s nö igen P ime sowie die Res ik ionsenzyme, mi denen das PCR-P oduk geschni en wu de, au gelis e . Nachdem Inse und Vek o p äpa a i e dau wu den, olg en eine Liga ion und die T ans o ma ion in E. coli. Die Zellen wu den au Selek ionsmedium auspla ie . Es wu de auch jeweils eine Nega i kon olle, bei welche nu de geschni ene Vek o ohne Inse zu Liga ion benu z und danach ans o mie wu de, du chge üh . kons uie es Plasmid Ausgangsplasmid Res ik ionsenzyme ü Hyd olyse des Ausgangsplasmids P ime ü PCR- Ampli ika ion des Inse s Res ik ionsenzyme ü Hyd olyse des Inse s pHTg p- siX pHTg p BamHI / SmaI siX5´ FLAG / siX 3’ SmaI BamHI / SmaI pBRg p-bleo- siX pBRg p-bleo BglII / PaeI siX5´ FLAG / siX3´ FLAG BamHI / PaeI pBRsigX siX::spec pBR322 siX::spec EcoRI / Eco81I sigX5K-EcoRI / sigX3K-Eco81I EcoRI / Eco81I pALFsigX- siX pAL-FLAG siW BamHI / PaeI sigX5’ -BamHI / sigX3’ -PaeI BamHI / PaeI pALFsigX_s op- siX pAL-FLAG siW BamHI / PaeI sigX5’ -BamHI - S op / sigX3’ - PaeI BamHI / PaeI pBRg p- siX pBRg p_amyE BglII / PaeI siX 5’ BglII / siX3´ FLAG BglII / PaeI pBRg p- siX 71- 368 pBRg p_amyE BglII / PaeI siX 5’ BglII / siX70_3 BglII / PaeI pBRg p- siX 146- 368 pBRg p_amyE BglII / PaeI siX 5’ BglII / siX 145 BglII / PaeI pBRg p- siX 1-21 pBRg p_amyE BglII / PaeI siX-C1 / siX3´ FLAG BglII / PaeI pBRg p- siX 1-43 pBRg p_amyE BglII / PaeI siX-C2 / siX3´ FLAG BglII / PaeI pBRg p- siX 1-70 pBRg p_amyE BglII / PaeI siX 5’ ∆70 BglII / siX3´ FLAG BglII / PaeI pBRg p- siX 1-99 pBRg p_amyE BglII / PaeI siX 5’ ∆99 BglII / siX3´ FLAG BglII / PaeI pBRg p_S op- siX pBRg p_amyE BglII / PaeI siX 5’ BglII S op / siX3´ FLAG BglII / PaeI Ma e ial und Me hoden 72 2.10 Kons uk ion on B. sub ilis S ämmen Die kons uie en B. sub ilis S ämme wu den du ch T ans o ma ion on Plasmid- ode ch omosomale DNA in kompe en e Zellen, wie un e Kapi el 2.6.4.2 besch ieben, e hal en. Die S ämme wu den im Anschluss du ch Übe picken on T ans o man en au Pla en mi Selek i medium übe p ü . Des Wei e en wu de auch eine geeigne e PCR (Kapi el 2.7.3) als P ü ung de Rich igkei du chge üh . Wu den Knockou -S ämme kons uie , is zudem eine Sou he n Blo Analyse (Kapi el 2.7.11) du chge üh wu den. Von allen kons uie en S ämmen wu den Glyce in-Daue kul u en angeleg . In Tabelle 11 sind die in diese A bei kons uie en B. sub ilis S ämme mi dem jeweiligen U sp ungss amm sowie de ans o mie en DNA zusammenge ass . Tabelle 11: Kons uk ion on B. sub ilis S ämmen Angegeben sind jeweils de Name des kons uie en S ammes, de Ausgangss amm sowie die in ihn ans o mie e Plasmid-DNA bzw. die ans o mie e ch omosomale DNA. kons uie e B. sub ilis S amm B. sub ilis Ausgangss amm ans o mie e Plasmid- bzw. ch omosomale DNA KS82 1012 pHTg p- siX KS83 KS82 asP:: e KS94 KS82 p sW::bleo KS115 1012-g p pBRg p-bleo- siX KS119 KS115 pIC333 KS123 KS115 KS119 KS123a KS4 KS119 KS149 1012 lacA::spec pALFsigX- siX KS155 KS149 ho::bleo 1012 sigX siX::spec 1012 pBRsigX siX::spec KS162 KS149 sigX siX::spec KS166 KS155 sigX siX::spec KS148 1012 lacA::spec pALFsigX_s op- siX KS154 KS148 ho::bleo KS161 KS148 sigX siX::spec KS165 KS154 sigX siX::spec 1012  asP  ho 1012 ho::bleo asP:: e 1012-g p  ho 1012-g p ho::bleo Ma e ial und Me hoden 73 kons uie e B. sub ilis S amm B. sub ilis Ausgangss amm ans o mie e Plasmid- bzw. ch omosomale DNA 1012-g p  asP 1012-g p asP:: e 1012-g p  asP  ho 1012-g p  ho asP:: e KS187 1012-g p pBRg p- siX KS188 KS187 asP:: e KS189 KS187 ho::bleo KS190 KS187 ho::bleo asP:: e KS191 1012-g p pBRg p- siX 71-368 KS192 KS191 asP:: e KS193 KS191 ho::bleo KS194 KS191 ho::bleo asP:: e KS195 1012-g p pBRg p- siX 146-368 KS196 KS195 asP:: e KS197 KS195 ho::bleo KS198 KS195 ho::bleo asP:: e KS201 1012-g p pBRg p- siX 1-21 KS203 KS201 ho::bleo KS231 KS201 asP:: e KS232 KS201 ho::bleo asP:: e KS202 1012-g p pBRg p- siX 1-43 KS204 KS202 ho::bleo KS233 KS202 asP:: e KS234 KS202 ho::bleo asP:: e KS207 1012-g p pBRg p- siX 1-70 KS209 KS207 ho::bleo KS227 KS207 ho::bleo asP:: e KS228 KS207 asP:: e KS208 1012-g p pBRg p- siX 1-99 KS210 KS208 ho::bleo KS229 KS208 ho::bleo asP:: e KS230 KS208 asP:: e KS235 1012 g p-RBS_ siX ho::bleo asP:: e KS236 1012 g p-RBSmu _ siX ho::bleo asP:: e KS157 1012-g p pBRg p_S op- siX KS172 KS157 ho::bleo KS173 KS157 asP:: e KS174 KS157 ho::bleo asP:: e KS242 KS245 asP:: e Ma e ial und Me hoden 74 kons uie e B. sub ilis S amm B. sub ilis Ausgangss amm ans o mie e Plasmid- bzw. ch omosomale DNA KS249 KS245 clpX::ca KS253 KS245 p sW::bleo KS257 KS245 WB800 KS243 KS246 asP:: e KS250 KS246 clpX::ca KS254 KS246 p sW::bleo KS258 KS246 WB800 KS267 3610 ho::bleo amyE::Physpank-ly F E gebnisse 75 3 E gebnisse 3.1 Das sigX- siX-Ope on Das Gen des ECF-Sigma ak o s X, sigX, be inde sich zusammen mi dem Gen des en sp echenden An i-Sigma ak o s RsiX, siX, in einem bicis onischen Ope on (Huang e al. 1997; B u sche & B aun 1997). Dabei komm es zu Übe lappung des 3´-Endes on sigX mi dem 5´-Ende on siX. Diese Be eich ha eine G öße on 62 bp. Abbildung 3 zeig schema isch die Si ua ion im B. sub ilis Ch omosom. 3.2 RsiX ungie als nega i e Regula o on SigX In o angegangenen Expe imen en konn e gezeig we den, dass RsiX als nega i e Regula o on X ungie (B u sche & B aun 1997). Um dies du ch Messungen de -Galak osidase- Ak i i ä da zus ellen, wu den geeigne e Repo e s ämme benö ig . Es wu de das gleiche Repo e sys em e wende , welches be ei s wäh end eine Diploma bei (Schä e 2007) zu Anwendung kam. Dieses Sys em beinhal e eine dl A-lacZ-Fusion (Abbildung 4, oben). De ECF-Sigma ak o X kon ollie die T ansk ip ion des dl -Ope ons (Cao & Helmann 2004), dahe e olg auch die Exp ession des lacZ-Gens, welches ü die -Galak osidase kodie , sobald die T ansk ip ion du ch X ini iie wi d. Daneben is eine Dele ion des An i-Sigma ak o kodie enden Gens siX e o de lich (Abbildung 4, Mi e), so dass man un e schiedliche -Galak osidase-Ak i i ä en, in Abhängigkei des Vo handenseins de Dele ion on siX, e wa en kann. Wei e wa es nö ig, eine egulie e Exp ession on siX zu e möglichen. Dazu wu de eine T ansk ip ions usion aus dem IPTG- egulie ba en P omo o Pspac und siX Abbildung 3: Schema ische Da s ellung des sigX- siX-Ope ons aus B. sub ilis. Es handel sich hie bei um ein bicis onisches Ope on, in dem beide Gene on zwei möglichen P omo o en aus exp imie we den können ( PsigA, PsigX). Am Ende des Ope ons be inde sich ein in insische T ansk ip ions e mina o ( ). Nach: h p://genolis .pas eu . /Sub iLis / und Helmann (2002). E gebnisse 76 kons uie (Abbildung 4, un en), so dass eine geziel e Exp ession on siX ealisie ba sein soll e. Mi diesem Repo e sys em wu den nun Messungen de -Galak osidase-Ak i i ä en o genommen. Zue s wu den dabei die S ämme KS4 ( siX w ; gl. Abbildung 5, Mi e) und KS18 ( siX; gl. Abbildung 5, un en) be ach e . Au g und de Dele ion on siX wu de e wa e , dass die -Galak osidase-Ak i i ä ü den S amm KS18 ( siX) deu lich höhe aus äll . Das E gebnis de Messungen is in Abbildung 5 au gezeig . Wie zu e wa en, wu de ü den wild ypischen Hin e g und eine seh ge inge -Galak osidase-Ak i i ä e mi el . Im Gegensa z dazu s eh das e wa 10 ach höhe e Messe gebnis ü den S amm mi dem Knockou on siX, welches so e wa e wu de. Au g und de siX-Dele ion lieg de Sigma ak o X in eie ungebundene Fo m o und kann die T ansk ip ion de dl A-lacZ-Fusion einlei en. Dieses esul ie in eine hohen -Galak osidase-Ak i i ä . Es konn e mi diesem Repo e sys em das E gebnis on B u sche und B aun (B u sche & B aun 1997) bes ä ig we den. RsiX i als An i-Sigma ak o on X au . Abbildung 4: Schema ische Da s ellung de ele an en ch omosomalen Si ua ion im e wende en Repo e sys em zum Nachweis, dass RsiX als nega i e Regula o on X au i . Im amyE-Locus be inde sich die T ansk ip ions usion aus dem X-kon ollie en dl A-P omo o und lacZ (oben). siX is du ch eine spec- Kasse e dele ie (Mi e). Im lacA-Locus be inde sich das Gen siX, welches un e de Kon olle des IPTG- egulie ba en P omo o s Pspac s eh (un en). E gebnisse 77 In den olgenden -Galak osidase-Ak i i ä smessungen wu de de Ein luss de IPTG- egulie ba en T ansk ip ions usion on siX ( gl. Abbildung 4, un en) in dem besch iebenen Repo e sys em nähe be ach e . Du ch Zugabe on IPTG soll e de Knockou on siX komplemen ie we den. Es wu de e wa e , dass nach IPTG-Zugabe die -Galak osidase- Ak i i ä im Gegensa z zu Kul u ohne IPTG ähnlich nied ig aus äll wie im wild ypischen Hin e g und. En sp echend soll e die Enzymak i i ä de Kul u ohne IPTG analog wie ü die siX-Dele ion ela i hoch aus allen. Fü die Ak i i ä smessungen wu den die S ämme KS11 ( siX 71-368) und KS12 (Volllängen siX) be ach e . Bei dem S amm KS11 handel es sich um ein a i izielles Kons uk , bei dem de Teil des siX-Genes dele ie wu de, welche ü die ex acy oplasma ische Region kodie . Es we den nu die Aminosäu en 1 bis 70 exp imie . Es konn e be ei s gezeig we den, dass die F eise zung des Sigma ak o s W du ch p o eoly ischen Abbau des An i-Sigma ak o s RsiW e olg (Hein ich e al. 2009). Dabei en s eh eine in e mediä e Fo m des An i-Sigma ak o s, bei welche RsiW keine 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 1 2 -Galak osidase-Ak i i ä Abbildung 5: E gebnis des -Galak osidase-Ak i i ä s es s ü die S ämme B. sub ilis KS4 ( siX w ) und KS18 ( siX). Die P obenahme ü die Messung de Ak i i ä en e olg e beim Übe gang in die s a ionä e Wachs umsphase. Die Ak i i ä en beziehen sich jeweils au 1 OD578 zum Zei punk de P obenahme. Die Bes immung de β-Galak osidase-Ak i i ä e olg e wie bei Wiege e al. (2001) besch ieben. Die Fehle balken geben die be echne en We e de S anda dabweichung an (oben). Schema ische Da s ellung de ele an en ch omosomalen Si ua ion in den S ämmen B. sub ilis KS4 (Mi e) und B. sub ilis KS18 (un en). KS18 ( siX) KS4 ( siX w ) E gebnisse 78 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 1 2 3 4 IPTG 49,618 64,541 51,869 65,800 -Galak osidase-Ak i i ä ex acy oplasma ische Domäne meh besi z . Die hie e wende e e kü z e Fo m des siX wu de in Anlehnung an die in e mediä e Fo m des RsiW gewähl , um mögliche Rückschlüsse au einen ähnlichen p o eoly ischen Abbau on RsiX zu ziehen. Das E gebnis ü die Messungen diese -Galak osidase-Ak i i ä en is in Abbildung 6 da ges ell . Wie be ei s oben e wähn , wu den un e schiedliche Ak i i ä en in Abhängigkei des Vo handenseins on IPTG e wa e . Abe wie in Abbildung 6 zu e kennen, gib es nu ge inge Un e schiede bei den Ak i i ä smessungen nach Inkuba ion mi bzw. ohne IPTG. Fe ne sind keine Un e schiede zwischen dem Volllängen siX und seine e kü z en Fo m es s ellba . Alle Messwe e liegen e wa in de G ößeno dnung ü die Dele ion on siX ( gl. Abbildung 5). De siX-Knockou is in diesen Repo e s ämmen also nich olls ändig Abbildung 6: E gebnis des -Galak osidase-Ak i i ä s es s ü die S ämme B. sub ilis KS11 ( siX 71-368) und B. sub ilis KS12 (Volllängen siX) nach Inkuba ion bei 37 °C mi (+ IPTG; Endkonzen a ion: 1 mM) bzw. ohne IPTG (- IPTG). Die P obenahme ü die Messung de Ak i i ä en e olg e beim Übe gang in die s a ionä e Wachs umsphase. Die Ak i i ä en beziehen sich jeweils au 1 OD578 zum Zei punk de P obenahme. Die Bes immung de β-Galak osidase-Ak i i ä e olg e wie bei Wiege e al. (2001) besch ieben. Die Fehle balken geben die be echne en We e de S anda dabweichung an (oben). Schema ische Da s ellung de ele an en ch omosomalen Si ua ion in den S ämmen B. sub ilis KS11 (un en links) und B. sub ilis KS12 (un en ech s). KS11 ( siX 71-368) KS12 ( siX) + - + - E gebnisse 85 Alle Klone, die eine s a ke Fluo eszenz au wiesen, wu den im Anschluss au die Resis enz gegenübe bes imm e An ibio ika ge es e . Jene Klone soll en sensi i gegenübe E y h omycin sein. Eine Resis enz gegenübe diesem An ibio ikum wü de die In eg a ion des gesam en Plasmides ins Ch omosom bedeu en ( gl. Abbildung 10; die E y h omycin- Resis enz wi d auße halb des T ansposons im Plasmid pIC333 kodie ). Dies wa nich e wünsch . Au de ande en Sei e müssen all diese Klone esis en gegenübe Bleomycin (au g und de Selek ion au Vo handensein de Repo e usion, gl. Abbildung 9), Spec inomycin (da das T ansposon diese Resis enz kodie , gl. Abbildung 10) und auch Chlo amphenicol (weil de e wende e Repo e s amm dies kodie , gl. Abbildung 9) sein. Nu on Klonen, welche Ems, Bleo , Spec , Cm wa en und zudem noch eine s a ke Fluo eszenz zeig en, wu de die ch omosomale DNA ü wei e e Analysen isolie . Diese Phäno yp konn e bei insgesam 11 Klonen nachgewiesen we den (mi KS119 Klon 9, 13, 14, 18, 19, 22, 24, 25, 29, 39 bzw. 43 bezeichne ). 3.4.3 Re ans o ma ion de ch omosomalen DNA on scheinba posi i en Klonen nach de T ansposonmu agenese Die isolie e ch omosomale DNA on Klonen, welche Ems, Bleo , Spec , Cm wa en und eine s a ke Fluo eszenz zeig en, wu de im Anschluss in je zwei e schiedene Repo e s ämme ans o mie . Au diese A soll en alsch posi i e Klone iden i izie we den, um diese be ei s o den olgenden Analysen zu sepa ie en und zu e we en. Zum einen wa dies de Repo e s amm KS4, welche ü die T ansk ip ions usion aus dem X-kon ollie en dl A-P omo o und dem Gen lacZ kodie (Abbildung 4, oben). Nach Re ans o ma ion de ch omosomalen DNA eines Klons, bei welchem de An i-Sigma ak o RsiX du ch die In eg a ion des T ansposons an eine beliebigen S elle ins Ch omosom s abilisie wu de, e wa e e man, dass de Repo e eine seh ge inge bis ga keine -Galak osidase-Ak i i ä zeig e. Dies soll e du ch weiße Kolonien au eine LB-Pla e, welche X-Gal zugese z wa , e kennba sein. Wie be ei s un e 3.2 e läu e , kon ollie X die T ansk ip ion des dl -Ope ons (Cao & Helmann 2004). Dahe üh bei diesem Repo e s amm ein s abilisie e An i-Sigma ak o du ch die anhal ende Inhibie ung des Sigma ak o s nich zu Exp ession des lacZ-Gens und somi zu keinem Umsa z des Subs a es X-Gal zu einem blauen Indigo a bs o du ch die -Galak osidase. In de Ta konn en so d ei Klone iden i izie we den, welche nach T ans o ma ion ih e ch omosomalen DNA in den E gebnisse 86 Repo e KS4 weiße Kolonien bilde en sowie Spec (du ch T ansposon kodie ) und Neo (kodie on Repo e usion) zeig en. Die e bleibenden ach Klone wu den au g und ih e blauen Kolonie a be au X-Gal-Pla en als alsch posi i iden i izie . Zum ande en e olg e die Re ans o ma ion de isolie en ch omosomalen DNA in den Ausgangss amm ü die T ansposonmu agenese KS115 (Abbildung 9). Diese S amm wies o de Mu agenese keine Fluo eszenz au . Die T ans o ma ion dien e dem Nachweis, dass das T ansposon auch a sächlich in einen ü die S abili ä des An i-Sigma ak o s RsiX ele an en Abschni des Genoms in eg ie e. Somi soll en die Kolonien nach de Re ans o ma ion im Gegensa z zum Ausgangss amm KS115 eine in ensi e Fluo eszenz besi zen. Es wu den hie d ei Klone ge unden, welche eine s a ke Fluo eszenz zeig en und welche eine Spec (du ch T ansposon kodie ), Cm sowie Bleo (kodie om Repo e s amm KS115) o wiesen. In Abbildung 12 is zu e kennen, dass jene d ei Klone im Un e schied zum Ausgangss amm KS115 sowohl du ch die Resis enz gegen Spec inomycin als auch du ch eine ausgep äg e Fluo eszenz gekennzeichne sind. Dabei handel e es sich um die gleichen Klone, welche auch schon nach Re ans o ma ion ih e ch omosomalen DNA in den Repo e KS4 weiße Kolonien bilde en. Von den an änglich 11 Klonen, welche ein scheinba posi i es E gebnis nach de T ansposonmu agenese zeig en, d. h. bei welchen das T ansposon seh wah scheinlich in ein Abbildung 12: Fo og a ien on B. sub ilis Kolonien des S ammes 1012 amyE::g p-bleo- siX pIC333 (KS 123). Da ges ell sind Kolonien de Klone 9, 22 und 43 au LBCm10-Pla en (linke G a ik) bzw. LBSpec100-Pla en ( ech e G a ik) nach In eg a ion des T ansposons mini-Tn10 in de en Ch omosom. Die s a ke Fluo eszenz diese d ei Klone be uh au de In eg a ion des T ansposons in ein Gen mi Ein luss au die zellulä e Konzen a ion des An i-Sigma ak o s RsiX. Im Ve gleich dazu zeig KS 115 (Repo e s amm o de T ansposonmu agenese) keine Fluo eszenz. Die Kolonien wu den un e no malem weißem Lich (obe e Teil de G a iken) und bei An egung de GFP-Fluo eszenz bei eine Wellenlänge on 480 nm (un e e Teil de G a iken) o og a ie . Es wu den gleiche Au lösungen und Ve g öße ungen e wende . E gebnisse 87 Gen in eg ie e, das ü einen des abilisie enden Fak o hinsich lich des An i-Sigma ak o s RsiX kodie , wu den ach Klone als alsch posi i au g und de E gebnisse de Re ans o ma ionen ausgeschlossen. Seh wah scheinlich wu de die Fluo eszenzin ensi ä bei e schieden g oßen Kolonien als ähnlich in ensi eingeschä z , was dann zu einem alsch posi i en E gebnis üh e. Lediglich ü d ei Klone zeig en die E gebnisse eindeu ige Hinweise, dass es zu S abilisie ung on RsiX kam, da mögliche des abilisie ende Fak o en du ch das T ansposon dele ie wu den. Die en sp echenden d ei S ämme wu den mi KS123 Klon 9, 22 bzw. 43 (B. sub ilis 1012 amyE::g p-bleo- siX mini-Tn10) bezeichne . Die isolie e ch omosomale DNA diese d ei Klone wu de im Wei e en e wende , um einen Plasmid- escue du chzu üh en. Diese Sch i wi d im olgenden (3.4.4) e ö e . 3.4.4 Plasmid- escue Die ch omosomale DNA de d ei Klone 9, 22 und 43 des S ammes KS123 (B. sub ilis 1012 amyE::g p-bleo- siX mini-Tn10) wu de in nach olgenden Sch i en e wende , um die Gen egion zu iden i izie en, in welche das T ansposon mini-Tn10 in eg ie ha . Dazu e olg e ein p äpa a i e Res ik ions e dau diese DNA mi HindIII, da ü dieses Enzym inne halb de Sequenz des T ansposons keine Schni s elle o lieg (Abbildung 10). Somi wu den du ch den Ve dau F agmen e e hal en, welche zum einen das T ansposon en hiel en und zum ande en auch Teilsequenzen (bis zu eine HindIII-Schni s elle) des s omau wä s und s omabwä s liegenden Genes, in welches das T ansposon in eg ie e. Im Anschluss e olg e eine Liga ion de e hal enen F agmen e de ch omosomalen DNA, welche in olge de kompa iblen Enden de DNA nach dem HindIII-Ve dau zu zi kulä e (Plasmid-) DNA üh e. Du ch die anschließende T ans o ma ion mi els Elek opo a ion in E. coli DH10B-Zellen und de Selek ion bei 37 °C ü 48 S unden au LBSpec100-Pla en, konn en nu diejenigen Zellen wachsen, welche die Plasmid-DNA mi dem T ansposon, welches ü die Spec inomycin-Resis enz kodie sowie den o i pUC ü die Replika ion in E. coli besi z (Abbildung 10), en hiel en. Fü den E hal diese Plasmid-DNA e olg e nach de T ans o ma ion zunächs eine Mini- P äpa a ion. Zu Iden i ika ion de Plasmide, welche das T ansposon en hiel en, wu de im Anschluss eine Res ik ionsanalyse mi den Enzymen Ps I und BamHI du chge üh . Beide Enzyme haben inne halb des T ansposons Schni s ellen (Abbildung 10). Du ch den BamHI- Ve dau soll e ü jedes Plasmid ein 2,2 kb g oßes F agmen en s ehen, welches as E gebnisse 88 ausschließlich das T ansposon kodie (Abbildung 10). Im Anschluss wu de on eindeu ig iden i izie e Mini-Plasmid-DNA mi T ansposon eine Midi-P äpa a ion du chge üh . Die e hal ene Midi-Plasmid-DNA wu de e neu eine Res ik ionsanalyse mi den Enzymen Ps I und BamHI un e zogen. Die zu Beginn des Kapi els e wähn en Klone 9, 22 und 43 des S ammes KS123, on welchen de Plasmid- escue du chge üh wu de, zeig en dabei e schiedene Res ik ionsmus e beim Ve dau mi dem gleichen Enzym (Abbildung 13). Das deu e au un e schiedliche T ansposi ionse eignisse hin. Von diesen Klonen wu de jeweils die Midi-Plasmid-DNA ü eine e neu e Re ans o ma ion sowie eine Sequenzanalyse e wende . 3.4.5 Re ans o ma ion on Plasmid-DNA nach Plasmid- escue Die nach dem Plasmid- escue e hal ene Midi-Plasmid-DNA de en sp echenden Klone 9, 22 und 43 des S ammes KS123 wu de ü eine e neu e Re ans o ma ion in den Ausgangss amm ü die T ansposonmu agenese KS115 (Abbildung 9) e wende . Im Anschluss wu de wiede Abbildung 13: Fo og a ie eines E B -ge ä b en Aga osegels zu Dokumen a ion de Res ik ionsanalyse on Midi-Plasmid-DNA nach dem Plasmid- escue de Klone 9, 22 und 43 des S ammes KS123 (B. sub ilis 1012 amyE::g p-bleo- siX mini-Tn10). Es wu de eine Res ik ionsanalyse mi den Res ik ionsenzymen BamHI (Spu en 1-3) und Ps I (Spu en 5-7) du chge üh . Als Längens anda d wu de de Ma ke Spp1 e wende (Spu en 4 und 8). Die angegebenen G ößen (links bzw. ech s neben de Fo og aphie) beziehen sich au die en sp echenden F agmen e des Ma ke s. Die Spu en 1-3 zeigen alle ein 2,2 kb g oßes F agmen , welches das T ansposon mini-Tn10 en häl . E gebnisse 89 die Fluo eszenz de T ans o man en übe p ü . Man e hiel das gleiche E gebnis, welches man auch schon ü die Re ans o ma ion on ch omosomale DNA ( gl. Kapi el 3.4.3) e hiel . Du ch die In eg a ion des T ansposons in ein Gen mi Ein luss au die S abili ä des An i- Sigma ak o s RsiX konn e im Ve gleich zum Repo e s amm KS115 eine in ensi e Fluo eszenz es ges ell we den. Das GFP-BRP-RsiX-Fusionsp o ein lag in de Zelle s abil o . Ebenso wa en alle ele an en An ibio ika-Resis enzen o handen: eine Spec (du ch das T ansposon kodie ), eine Cm sowie eine Bleo (kodie om Repo e s amm KS115). Du ch die Re ans o ma ionen sowohl de Plasmid-DNA nach dem Plasmid- escue als auch de ch omosomalen DNA in die e schiedenen Repo e s ämme und du ch die Übe p ü ung alle ele an en An ibio ika-Resis enzen konn e das Vo liegen alsch posi i e Klone nach de T ansposonmu agenese ausgeschlossen we den. Es wu de da on ausgegangen, dass bei allen d ei Klonen eine In eg a ion des T ansposons in Gene s a and, welche eine Rolle bei de Des abilisie ung des An i-Sigma ak o s RsiX spielen. Da au hin wu den genau diese d ei Klone sequenzie . 3.4.6 Sequenzie ung de In eg a ionss elle des T ansposons mini-Tn10 Zu genauen Iden i izie ung de In eg a ionss elle des T ansposons ins Ch omosom des S ammes KS123 (B. sub ilis 1012 amyE::g p-bleo- siX mini-Tn10) e olg e eine Sequenzie ung de Midi-Plasmid-DNA de en sp echenden Klone 9, 22 und 43 ( gl. Kapi el 3.4.4). Diese wu de on de Fi ma Seqlab du chge üh . Fü die Sequenzie eak ion wu de de Sequenzie p ime pIC5 (Tabelle 4, Numme 5) eingese z . Diese P ime en sp ich dem ech en P ime in Abbildung 10, d. h. es wu de die Gen egion s omabwä s om T ansposon sequenzie . Die e hal enen Sequenzen wu den un e Zuhil enahme on Da enbanken aus dem In e ne (BSORF - Bacillus sub ilis Genome Da abase; Sub iLis - he GenoLis Wo ld Wide Web Se e ; BLASTN-P og amm des NCBI) analysie und iden i izie . Die Auswe ung de Sequenzie e gebnisse zeig ü alle d ei Klone ein eindeu iges E gebnis. Das T ansposon in eg ie e in allen d ei Fällen in das Gen ho, welches ü den T ansk ip ions e mina o Rho kodie . Dabei and das T ansposi ionse eignis ü die d ei Klone jeweils an e schiedenen S ellen in de Sequenz on ho s a (Abbildung 14). E gebnisse 90 Die be ei s oben besch iebenen Re ans o ma ionen on ch omosomale bzw. Plasmid-DNA de en sp echenden Klone 9, 22 und 43 zeig en eine s a k e höh e Fluo eszenz ( gl. Kapi el 3.4.3 und 3.4.5) bzw. weiße Kolonien ( gl. Kapi el 3.4.3), he o ge u en du ch das Vo handensein des An i-Sigma ak o s RsiX au g und des Funk ions e lus es on ho. In den olgenden Be ach ungen soll dahe de mögliche di ek e ode indi ek e Ein luss on Rho au RsiX nähe gep ü we den. 3.5 Analyse des Ein lusses on Rho bei de siX-Exp ession 3.5.1 Kons uk ion eines ho-Dele ionss ammes Zu Bes ä igung de E gebnisse de Sequenzanalyse nach de T ansposonmu agenese muss e als ein e s e Sch i de Knockou on ho kons uie we den. Das wa möglich, weil ho in B. sub ilis nich essen iell is (Qui k e al. 1993). De Knockou e olg e du ch die Inse ion eine Bleomycin-Resis enz-Kasse e in die Sequenz on ho (Abbildung 15, ech s). De esul ie ende S amm wu de mi B. sub ilis 1012 ho::bleo bezeichne . Zu Übe p ü ung des Knockou s wu de eine Sou he n Blo Analyse du chge üh . Dabei soll e nach de Res ik ion de ch omosomalen DNA on 1012 ho::bleo mi dem Abbildung 14: Volls ändige Sequenz des Gens ho aus B. sub ilis, welches ü den T ansk ip ions e mina o Rho kodie . Die o en P eile symbolisie en die S ellen im Ch omosom, in welche das T ansposon mini-Tn10 bei d ei un e schiedlichen Klonen nach eine T ansposonmu agenese mi dem Plasmid pIC333 in eg ie e. E gebnisse 91 Res ik ionsenzym EcoRV und de Hyb idisie ung mi eine DIG-ma kie en DNA-Sonde gegen ho in dem Luminog amm ein F agmen mi eine G öße on 1848 bp zu sehen sein. Als Kon olle wu de mi de DNA des Ausgangss ammes B. sub ilis 1012 genauso e ah en. Alle dings wu den ü diesen S amm F agmen e de G ößen 1414 bp sowie 424 bp e wa e . Das E gebnis de Sou he n Blo Analyse is in Abbildung 15 (links) da ges ell . Man kann deu lich den Un e schied zwischen dem Ausgangss amm und dem ho-Knockou e kennen. In beiden Fällen wu den die e wa e en F agmen g ößen e hal en. Es kann dahe on einem ko ek klonie en Knockou on ho ausgegangen we den. 3.5.2 Ein luss on  ho au die Konzen a ion des An i-Sigma ak o s RsiX De nächs e Sch i in de Übe p ü ung des E gebnisses de Sequenzanalyse nach de T ansposonmu agenese wa , die ch omosomale DNA on 1012 ho::bleo in S ämme zu ans o mie en, welche GFP-RsiX-Fusionen exp imie en. Hie ü wu den S ämme Abbildung 15: Links: Luminog amm de Sou he n Blo Analyse zu Übe p ü ung des ko ek en ho-Knockou s im S amm B. sub ilis 1012 ho::bleo (Spu 3). Als Re e enz wu de de Ausgangss amm B. sub ilis 1012 e wende (Spu 2). Die Res ik ion de jeweiligen ch omosomalen DNA e olg e mi EcoRV. Fü die Hyb idisie ung wu de eine DIG-ma kie e DNA-Sonde gegen ho e wende . Als Ma ke wu de DIG- ma kie e Spp1-Ma ke e wende (Spu 1). Die F agmen g ößen sind in bp angegeben (links neben dem Luminog amm). Rech s: Schema ische Da s ellung de ele an en ch omosomalen Si ua ion im S amm B. sub ilis 1012 ho::bleo. ho wu de du ch eine Bleomycin-Resis enz-Kasse e dele ie . E gebnisse 92 ausgewähl , welche die GFP-RsiX-Fusionen du ch den P omo o Pg oE kons i u i exp imie en soll en. Neben de Volllängen o m on RsiX wu de auch wiede eine e kü z e Fo m on RsiX be ach e . Diese e kü z e Fo m soll e nu die e s en 70 Aminosäu en, d. h. keine ex acy oplasma ische Domäne, exp imie en ( siX 71-368). Sowohl die Volllängen o m als auch die e kü z e Fo m on RsiX als GFP-Fusion wu de neben dem Wild yphin e g und (w ) und dem  ho-Hin e g und auch ü die Dele ion de Si e-2 P o ease RasP ( asP) und ü den Doppelknockou  ho  asP be ach e . Zue s e olg e die Übe p ü ung de Fluo eszenzin ensi ä en diese S ämme mi dem GFP- Scope. Eine Fo og a ie de jeweiligen Kolonien is in Abbildung 16 zu sehen. Hie bei is e kennba , dass man ü die Volllängen o m on RsiX (Spu 1) im  ho-Hin e g und im Ve gleich zum w eine e höh e Fluo eszenz es s ellen kann. Wie auch schon in Abbildung 7 gezeig , e häl sich de S amm im  asP-Hin e g und wie im w . Es is keine Fluo eszenz de Kolonien sich ba . Nu im Doppelknockou de Gene ü den T ansk ip ions e mina o Rho und de Si e-2 P o ease RasP is wiede eine Fluo eszenz nachweisba . Die E gebnisse ü die e kü z e Fo m on RsiX is in de zwei en Spu de Abbildung 16 da ges ell . Es is zu e kennen, dass lediglich im  asP-Hin e g und sowie im Doppelknockou on ho und asP eine Fluo eszenz o handen is . Fü den w und den Knockou on ho läss sich keine Fluo eszenz nachweisen. Abbildung 16: Fo og a ien on B. sub ilis Kolonien, welche GFP-RsiX exp imie en. Spu 1 zeig die E gebnisse ü die Volllängen o m on RsiX ( siX) und Spu 2 die ü die e kü z e Fo m on RsiX ohne die ex acy oplasma ische Domäne ( siX 71-368). Die Exp ession de Fusionsp o eine e olg e im Wild yphin e g und (w ), ho- ( ho) und asP- ( asP) Knockou sowie im Doppelknockou on ho und asP ( ho  asP). Du ch den P omo o Pg oE wa eine kons i u i e Exp ession de Fusionsp o eine möglich. Da ges ell sind die Kolonien bei An egung de GFP-Fluo eszenz bei eine Wellenlänge on 480 nm. E gebnisse 93 Danach wu den die gleichen S ämme Wes e n Blo Analysen un e zogen. Das en sp echende Luminog amm zeig Abbildung 17. In den Spu en 1 - 4 soll en die GFP-RsiX-Fusionen in den e schiedenen gene ischen Hin e g ünden de ek ie we den. Das Fusionsp o ein ha eine e wa e e G öße on 68 kDa. Das Resul a is iden isch mi Abbildung 16. De An i- Sigma ak o RsiX is wede im w noch im  asP-Hin e g und de ek ie ba . Sowohl im  ho- Hin e g und als auch im Doppelknockou on ho und asP konn e jedoch RsiX als Fusion mi GFP in de Memb an ak ion mi de e wa e en G öße de ek ie we den. Das E gebnis de Wes e n Blo Analyse ü die e kü z e Fo m on RsiX is in Abbildung 17 in den Spu en 5 – 6 da ges ell . Wie be ei s ü die Be ach ung de gleichen S ämme un e dem GFP-Scope (Abbildung 16) e läu e , kann nu im  asP-Hin e g und sowie im Doppelknockou on ho und asP ein Signal ü das Fusionsp o ein mi GFP de ek ie we den. Die Ladungskon olle lie e e wie zu e wa en in allen 8 Spu en kla e Signale bei 70 kDa ü die Me allop o ease F sH. Be ach e man die E gebnisse de Abbildung 16 und Abbildung 17 zusammen, kann eindeu ig es ges ell we den, dass de T ansk ip ions e mina o Rho einen Ein luss au die de ek ie ba e Menge des An i-Sigma ak o s RsiX ha . Sobald de Fak o Rho du ch Dele ion des en sp echenden Gens seine Funk ion e lo en ha , kann RsiX als Fusion mi GFP sowohl Abbildung 17: Luminog amm de Wes e n Blo Analyse on B. sub ilis S ämmen, welche GFP-RsiX zu Un e suchung de Konzen a ion des An i-Sigma ak o s RsiX exp imie en. Die Spu en 1-4 zeigen die E gebnisse ü die Volllängen o m on RsiX ( siX) und die Spu en 5-8 die ü die e kü z e Fo m on RsiX ohne die ex acy oplasma ische Domäne ( siX 71-368). Die Exp ession de Fusionsp o eine e olg e jeweils im Wild yphin e g und (w ), asP- ( asP) und ho- ( ho) Knockou sowie im Doppelknockou on ho und asP ( ho  asP). Du ch den P omo o Pg oE e olg e eine kons i u i e Exp ession de Fusionsp o eine. Die P o eine de Memb an ak ionen (10 µg/Spu ) wu den du ch SDS-PAGE au ge enn und anschließend au eine Ni ocellulosememb an geblo e . De immunologische Nachweis de GFP-RsiX-Fusionen e olg e mi An ikö pe n gegen GFP. Mi de Ladungskon olle (2 µg/Spu ) wu de in gleiche A e ah en, abe die En wicklung des Blo s e olg e mi An ikö pe n gegen die memb angebundene P o ease F sH. Die G ößen de de ek ie en P o eine sind ech s neben dem Luminog amm au gezeig . E gebnisse 94 im Immunoblo als auch anhand on s a ke Fluo eszenz un e dem GFP-Scope de ek ie we den. Dagegen schein die Si e-2 P o ease RasP ohne einen Ein luss au die Menge on RsiX zu sein. De Knockou on asP üh zu keine De ek ion on RsiX. De de ek ie ba e An i-Sigma ak o im Doppelknockou on ho und asP is lediglich die Folge du ch den Funk ions e lus on Rho. Ande s e häl es sich bei de Analyse de E gebnisse ü die e kü z e Fo m on RsiX in Abbildung 16 und Abbildung 17. Hie schein Rho ohne einen Ein luss au die Konzen a ion des An i-Sigma ak o s zu sein, denn wede mi dem Immunoblo noch du ch die Fluo eszenz- Analyse konn e de An i-Sigma ak o de ek ie we den. Alle dings üh hie de Funk ions e lus on RasP zu eine De ek ion on RsiX, sowohl im  asP-Hin e g und als auch im Doppelknockou on ho und asP. Es muss jedoch beach e we den, dass es sich hie um eine a i izielle Fo m des An i-Sigma ak o s handel , welche keine ex acy oplasma ische Domäne exp imie . Fü den An i-Sigma ak o RsiW wu de be ei s gezeig , dass RasP an seine P o eolyse be eilig is (Schöbel e al. 2004). Dabei is das Subs a ü RasP eine e kü z e Fo m on RsiW ohne die en sp echende ex acy oplasma ische Domäne. Es wi d dahe e mu e , dass RsiX 71-368 nu au g und seine s uk u ellen Ähnlichkei mi de e kü z en Fo m on RsiW zum Subs a on RasP gewo den is . Wa um Rho ü die zellulä e Konzen a ion on RsiX 71-368 keine Rolle zu spielen schein , kann an diese S elle noch nich genau beg ünde we den. Seh wah scheinlich abe is das im Zusammenhang mi dem Wi kmechanismus on Rho zu beg ünden (Mo gan e al. 1985; Bea e al. 1988; Ali ano e al. 1991). Möglich wä e, dass die ü die Te mina ion du ch Rho no wendige u -si e in de Region on siX lokalisie is , welche die ex acy oplasma ische Domäne kodie . Da diese Region ü siX 71-368 dele ie is , könn e Rho au g und eine ehlenden u -si e die T ansk ip ion nich e minie en. Im Kapi el 3.8 wi d dahe die Lage de u -si e im Gen siX bes imm . 3.6 Das sigX- siX-Ope on – egulie du ch T ansla ionskopplung? Im Kapi el 3.1 wu de e wähn , dass sich sigX und siX in einem bicis onischen Ope on be inden und sich ih e Sequenzen zum Teil übe lage n. Es liegen dami ähnliche Bedingungen wie ü das pEDCFBA-Ope on in B. sub ilis o , in welchem sich die Sequenzen ü pE und pD mi 29 Nukleo iden eben alls übe lage n. Im p-Ope on e olg genauso wie ü siX die Te mina ion de T ansk ip ion du ch den Fak o Rho. Auße dem konn e gezeig E gebnisse 101 T ansk ip ions e mina ion s a und GFP-RsiX wi d exp imie . Zusä zlich zeig dieses E gebnis, dass a sächlich Rho de Ang i spunk on BCM is . Die Ladungskon olle de Wes e n Blo Expe imen e lie e e in allen 6 Spu en kla e Signale bei 70 kDa ü das cy oplasma ische P o ein H pG (Abbildung 21B). Als Ladungskon olle ü die No he n Blo Analyse in Abbildung 21C e olg e die Hyb idisie ung mi eine DIG- ma kie en RNA-Sonde gegen gy A. Die Kon olle lie e e ü alle 6 Spu en kla e Signale bei 2500 Basen. Dami konn e gezeig we den, dass die Beein lussung de siX-Exp ession di ek au die Ak i i ä des T ansk ip ions e mina o s Rho zu ückzu üh en is . Es kam du ch die Zugabe on BCM zu keine T ansk ip ions e mina ion du ch Rho und somi s ieg die Menge an siX- T ansk ip . 3.8 Ka ie ung de u -si e im Gen siX Die o he gehenden Un e suchungen haben gezeig , dass die Exp ession on siX du ch den T ansk ip ions e mina o Rho nega i beein luss wi d. Um diesen E ek nähe zu un e suchen, wa es wich ig die Bindes elle on Rho im sigX- siX-T ansk ip zu ka ie en. Die Rho-Bindes elle wi d als u -si e (Rho u iliza ion) bezeichne und is ü die ak o abhängige Te mina ion essen iell. Rho binde dabei an diese spezi ischen Sequenzen au de mRNA und lei e so die Te mina ion de T ansk ip ion ein. Es is be ei s bekann , dass es sich dabei um e wa 70 bis 90 Basen lange Sequenzen mi einem ela i hohen An eil an dem Nukleo id Cy idin handel (Mo gan e al. 1985; Bea e al. 1988; Ali ano e al. 1991). Um die Region de u -si e ü siX Sch i ü Sch i einzug enzen, wu den zahl eiche GFP-RsiX-Repo e usionen kons uie , bei welchen en wede N- e minal ode C- e minal Dele ionen in de Aminosäu esequenz on RsiX einge üh wu den. Diese Repo e usionen s anden alle un e de Kon olle des P omo o s Pg oE, so dass eine kons i u i e Exp ession möglich wa . Die Zahlen in de Bezeichnung de GFP-RsiX-Repo e usionen bezeichnen die Aminosäu en, welche dele ie wu den. Zusä zlich wu den die olgenden d ei Repo e s ämme un e such : 1012 amyE::Pg oE-g p-RBS_ siX (eine Ribosomenbindes elle wu de zwischen das Repo e gen g p und siX einge üg ), 1012 amyE::Pg oE-g p-RBSmu _ siX (eine mu ie e E gebnisse 102 Ribosomenbindes elle wu de zwischen das Repo e gen g p und siX einge üg ) und 1012 amyE::Pg oE-g p_S op- siX (du ch ein einge üg es S opp-Codon nach de Sequenz des Repo e gens g p is dieses nich meh ansla ionell mi siX usionie ). 3.8.1 Fluo eszenzmessungen de GFP-Repo e s ämme Zue s wu den die im Kapi el 3.8 besch iebenen Repo e sys eme hinsich lich ih e Fluo eszenz analysie . Neben dem Wild yphin e g und wu de die Fluo eszenz ü alle Fusionen auch im  ho- und im  asP-Hin e g und sowie im Doppelknockou on ho und asP gep ü . Als Re e enz ü die Fluo eszenz wu de de S amm 1012 amyE::Pg oE-g p (Zellmeie e al. 2006) e wende , bei welchem de Repo e g p nich mi einem ande en Gen ansla ionell usionie wu de. Das Ziel bei diesen Expe imen en wa es, solche S ämme zu iden i izie en, welche be ei s im Wild yphin e g und eine s a ke Fluo eszenz zeigen. Da aus kann man au das Vo handensein g oße Mengen des An i-Sigma ak o s RsiX in Fusion mi GFP schließen, ohne dass das Gen des T ansk ip ions e mina o s Rho dele ie wu de. Nu die ehlende u -si e wä e in diesem Fall ü die hohe Konzen a ion des Fusionsp o eins e an wo lich. Die Fluo eszenzin ensi ä en wu den, wie im Kapi el 2.6.3.1 besch ieben, mi dem LAS4000 bes imm . Die ela i en In ensi ä en alle Repo e usionen im Ve gleich zum nich usionie en GFP (Zeile 11) sind im Diag amm in Abbildung 22 e anschaulich . Die Fluo eszenz ü den Re e enzs amm in Zeile 11, welche nu GFP exp imie , wu de in den e schiedenen gene ischen Hin e g ünden als 100 % es gese z . Dagegen wu de die Fluo eszenz ü den Wild yps amm 1012, in welchem keine g p- siX-Fusion kodie wi d (Zeile 12), in den en sp echenden gene ischen Hin e g ünden als 0 % de inie . Fü alle ande en Repo e s ämme (Zeilen 1 bis 10) wu den die Fluo eszenzin ensi ä en ela i zu GFP (Zeile 11) angegeben. In Abbildung 22 wi d deu lich, dass ü die meis en S ämme (Zeilen 3 bis 10) keine s a ke Fluo eszenz im Wild yphin e g und und auch nich in den ande en d ei gene ischen Hin e g ünden zu e kennen is . Die meis en Messwe e liegen e wa im Be eich on 30 - 40 %. Die zusä zliche Ribosomenbindes elle in de Repo e usion in Zeile 4 und auch die Ein üh ung eine mu ie en Ribosomenbindes elle in de Fusion in Zeile 3 üh en zu keine de ek ie ba en Menge des An i-Sigma ak o s RsiX. Die nega i en Fluo eszenzin ensi ä en kommen du ch die A de Be echnung de We e zu S ande. Die Eigen luo eszenz des E gebnisse 103 Abbildung 22: G a ische Da s ellung de ela i en Fluo eszenzin ensi ä en e schiedene B. sub ilis S ämme, welche GFP-RsiX in un e schiedlichen Va ian en exp imie en, um die u -si e on siX zu ka ie en. Die e ikale Achse gib die ele an en ch omosomalen Si ua ionen de einzelnen Repo e s ämme wiede . Au de ho izon alen Achse wu den die Fluo eszenzin ensi ä en in % abgebilde . Jede Zeile zeig die Fluo eszenzin ensi ä eines Repo e s in den olgenden ie gene ischen Hin e g ünden: Wild yphin e g und (w , blau),  asP-Hin e g und ( asP, o ),  ho-Hin e g und ( ho, g ün) sowie Doppelknockou on asP und ho ( asP / ho, iole ). Die Fluo eszenzin ensi ä en des Wild ypope ons (Zeile 12) wu den als 0% gewe e und die In ensi ä en ü den Repo e , welche nu GFP exp imie (Zeile 11) wu de als 100% angenommen und ü die Be echnung de ela i en Fluo eszenzin ensi ä en alle ande en S ämme he angezogen. Die Fehle balken geben die be echne en We e de S anda dabweichung an. E gebnisse 104 Wild yps ammes 1012 (Zeile 12) wu de o de Be echnung de ela i en Fluo eszenz on den Messwe en abgezogen. Das zusä zliche S opp-Codon de Fusion in Zeile 5 mach lediglich deu lich, dass Rho soga die Exp ession eines Gens beein luss , welches s omau wä s on dem Gen mi eine u -si e lieg . In diesem Fall lieg keine ansla ionelle Fusion o und g p soll e unabhängig on siX ansla ie we den, was eine s a ke Fluo eszenz zu Folge hä e. Jedoch läss nu die Dele ion on ho bzw. on ho und asP die Fluo eszenz dieses Repo e s au e wa den doppel en We ans eigen. Die N- e minale Dele ion on 43 Aminosäu en (Zeile 6) sowie die C- e minalen Dele ionen on 223 (Zeile 8) bzw. 298 Aminosäu en (Zeile 9) zeigen soga , dass Rho hie o enba keinen Ein luss ha . Beim Ve gleich de wild ypischen Fluo eszenz mi de ü den Knockou on ho is die Fluo eszenz im Knockou soga deu lich ge inge . Die GFP-Fusion mi de Volllängen o m on RsiX (Zeile 10) und die Fusion mi eine N- e minal e kü z en Fo m um 21 Aminosäu en (Zeile 7) zeigen ein ähnliches E gebnis. Es is im Wild yphin e g und eine seh ge inge Fluo eszenz zu e kennen, welche im  ho-Hin e g und deu lich höhe is . In Bezug au die Lokalisa ion de u -si e ha dies abe nu insowei eine Bedeu ung, dass sie nich in de Sequenz de e s en 21 Aminosäu en zu inden is . Einen deu lichen Hinweis au die Lokalisa ion de u -si e geben dagegen die Repo e usionen in den Zeilen 1 und 2. Es is e sich lich, dass bei Dele ion de e s en 70 (Zeile 2) bzw. 99 Aminosäu en (Zeile 1) die We e ü die Fluo eszenz im Wild yphin e g und be ei s höhe sind als bei einigen ande en Repo e n im  ho-Hin e g und. Die In ensi ä en de Fluo eszenz diese beiden S ämme im  ho-Hin e g und übe s eig soga die des Re e enzs ammes in Zeile 11. Die Analyse de Fluo eszenz diese Repo e s ämme zeig e, dass die u -si e ü siX in de Nukleo idsequenz ü die Aminosäu en 44 bis 70 liegen muss. Die Dele ion de e s en 43 Aminosäu en (Zeile 6) zeig e noch keine e höh e Fluo eszenz im Wild yphin e g und. Diese wu de e s mi de Dele ion de e s en 70 Aminosäu en beobach e . Dami konn e die u -si e eine bes imm en Region in de Sequenz on siX zugeo dne we den. Sie be inde sich unge äh in dem Be eich, welche ü die T ansmemb andomäne kodie . Die T ansmemb andomäne on RsiX wi d on den Aminosäu en 48 bis 64 gebilde (Abbildung 23). Abbildung 23: Schema ische Da s ellung des Gens siX aus B. sub ilis. Die Numme n im un e en Teil de Abbildung bezeichnen die en sp echenden Aminosäu en. Von den Aminosäu en 48 bis 64 wi d die T ansmemb andomäne (TM) gebilde . E gebnisse 105 3.8.2 Wes e n Blo Analysen zu Lokalisa ion de u -si e Im Folgenden wu den mi den S ämmen aus Abbildung 22 (Zeilen 1 – 2 und 6 – 10) Wes e n Blo Analysen du chge üh . Dabei wu den lediglich de Wild yphin e g und und de  ho-Hin e g und be ach e . Das en sp echende Luminog amm is in Abbildung 24 da ges ell . De immunologische Nachweis de GFP-RsiX-Fusionen e olg e mi An ikö pe n gegen GFP. Dabei wu de zu Analyse s e s das gesam e Zellex ak e wende . Fü die Volllängen o m on RsiX in Fusion mi GFP wu de eine P o eing öße on 68 kDa e wa e . Die du ch N- ode C- e minale Dele ionen en s andenen e kü z en Fo men des An i- Sigma ak o s in Fusion mi GFP besi zen eine en sp echend ge inge e P o eing öße. Das E gebnis de Wes e n Blo Analyse soll e iden isch mi den Messungen de Fluo eszenzin ensi ä en in Kapi el 3.8.1 sein. Es wi d e wa e , dass ü die S ämme g p- siX 1-70 sowie g p- siX 1-99 das Fusionsp o ein aus GFP und dem An i-Sigma ak o sowohl im Wild yphin e g und als im  ho-Hin e g und nachweisba is . Be ach e man die Spu en 11 und 12 sowie 13 und 14 in Abbildung 24 is dies auch e kennba . Das Fusionsp o ein gib in beiden Fällen ein kla es Signal bei e wa 60 kDa. Dies bedeu e , dass du ch die N- e minalen Dele ionen die u -si e en e n wu de und somi Rho keinen Ein luss meh ha . Das wiede um üh e zum Vo handensein des An i-Sigma ak o s RsiX in Fusion Abbildung 24: Luminog amm de Wes e n Blo Analyse e schiedene B. sub ilis S ämme zu Ka ie ung de u -si e in siX. Die Menge des An i-Sigma ak o s RsiX in Fusion mi GFP wu de im Wild yphin e g und (w ) und im  ho-Hin e g und be ach e . Es wu den sowohl die Volllängen o m on RsiX ( siX) als auch e schiedene Dele ionen () analysie . Die Zahlen bezeichnen dabei jeweils die dele ie en Aminosäu en. Die P o eine des Gesam zellex ak es (10 µg/Spu ) wu den du ch SDS-PAGE au ge enn und anschließend au eine Ni ocellulosememb an geblo e . De immunologische Nachweis on GFP-RsiX e olg e mi An ikö pe n gegen GFP. Mi de Ladungskon olle (2 µg/Spu ) wu de in gleiche A e ah en, abe die En wicklung des Blo s e olg e mi An ikö pe n gegen das cy oplasma ische P o ein H pG. Die G ößen de de ek ie en P o eine sind links neben dem Luminog amm au gezeig . E gebnisse 106 mi GFP. Bei den Signalen ü die P o eine, de en unge äh e G öße zwischen 35 und 50 kDa lieg , handel es sich um P o eolysep oduk e, welche beim Abbau de Repo e usion en s ehen. Das E gebnis ü die Volllängen o m on RsiX (Spu en 1 und 2) in Abbildung 24 zeig das be ei s bekann e E gebnis. De An i-Sigma ak o is im Wild yphin e g und nich nachweisba . Man e häl kein Signal ü das P o ein. Nu im  ho-Hin e g und konn e RsiX mi de e wa e en G öße on 68 kDa de ek ie we den. Zusä zlich sind auch hie P o eolysep oduk e e schiedene G ößen nachweisba . Fü die N- e minalen Dele ionen on 21 (Spu en 7 und 8) bzw. 43 Aminosäu en (Spu en 9 und 10) e hiel man im Wild yphin e g und ein nu seh schwaches Signal ü das Fusionsp o ein. Doch auch hie zeigen deu liche Signale im  ho-Hin e g und das Fusionsp o ein an, ähnlich wie es auch schon ü die Volllängen o m on RsiX zu beobach en wa (Spu en 1 und 2). Das Signal bei ca. 33 kDa in Spu 8 zeig wiede ein P o eolysep oduk an. Die u -si e is also nich in de Sequenz de e s en 43 Aminosäu en lokalisie . Fü die C- e minale Dele ion ab Aminosäu e 146 (Spu en 5 und 6) konn e wede im Wild yphin e g und noch im  ho-Hin e g und ein Signal de ek ie we den. Dies deu e da au hin, dass de An i-Sigma ak o unabhängig on Rho kein de ek ie ba es Fusionsp o ein bilde . Obwohl de T ansmemb andomäne-kodie ende Be eich (und dami e mu lich auch die u -si e) noch o handen is ( gl. Abbildung 23), scheinen die noch olgenden e wa 225 Nukleo ide nich auszu eichen, um die T ansk ip ion du ch die Ak i i ä on Rho zu e minie en. Das bes ä igen auch die E gebnisse de No he n Blo Expe imen e in Abbildung 25. Die e kü z e Fo m des An i-Sigma ak o s un e lieg wah scheinlich sowohl im Wild yphin e g und als auch im  ho-Hin e g und eine P o eolyse, denn kein Fusionsp o ein is nachweisba . Die E gebnisse de Fluo eszenzmessungen in Abbildung 22 weisen eben alls da au hin. Bei Be ach ung de Resul a e ü die C- e minale Dele ion ab Aminosäu e 71 (Spu en 3 und 4) e kenn man e neu keinen Ein luss on Rho, denn im Wild yphin e g und und auch im  ho-Hin e g und konn e das Fusionsp o ein aus GFP und RsiX de ek ie we den. Alle dings s eh dies im Wide sp uch zu den E gebnissen de Fluo eszenzmessungen in Abbildung 22. Hie wu de zwa auch kein Ein luss on Rho es ges ell , abe das Fusionsp o ein wa au g und de ehlenden Fluo eszenz nich nachweisba . Da abe auch in Kapi el 3.5.2 kein An i-Sigma ak o als e kü z e Fo m in den gleichen gene ischen Hin e g ünden bes immba wa , muss man in Abbildung 24 in den Spu en 3 und 4 on einem Fehle (z. B. eine zu langen Belich ungszei ) ausgehen. De ehlende Ein luss on Rho wi d auch in den olgenden No he n Blo Analysen bes ä ig (Abbildung 25). E gebnisse 107 Fass man die E gebnisse aus Abbildung 24 zusammen, e häl man das gleiche E gebnis, welches schon die Messungen de Fluo eszenzin ensi ä en in Abbildung 22 zeig en. Die u -si e on siX muss sich inne halb de Nukleo idsequenz be inden, welche ü die Aminosäu en 44 bis 70 kodie , also in de Region, welche ü die T ansmemb andomäne kodie . Die Ladungskon olle diese Wes e n Blo Expe imen e lie e e in allen 14 Spu en eindeu ige Signale bei 70 kDa ü das cy oplasma ische P o ein H pG. 3.8.3 No he n Blo Analysen und die Ein üh ung on Punk mu a ionen zu genauen Bes immung de u -si e in siX Im Anschluss soll en die bishe igen E gebnisse zu Lokalisa ion de u -si e zusä zlich in No he n Blo Analysen bes ä ig we den. Dazu wu den zunächs die gleichen S ämme un e such , welche auch schon ü die Wes e n Blo Expe imen e in Abbildung 24 e wende wu den. Das g p- siX-T ansk ip wu de du ch Ve wendung eine DIG-ma kie en RNA- Sonde gegen g p de ek ie . Fü diese Expe imen e soll en die g p- siX-T ansk ip e wiede um im Wild yphin e g und und auch im  ho-Hin e g und be ach e we den. Das Luminog amm diese Analyse is in Abbildung 25 zu sehen. Dabei wu de ü die Volllängen o m on siX in Fusion mi g p eine T ansk ip g öße on ca. 2200 Basen wie e wa e e hal en. Die du ch Dele ionen am 5´- bzw. 3´-Ende e kü z en Fo men on siX (Abbildung 25, Spu en 3 bis 14 sowie 17 und 18) zeig en ein en sp echend kü ze es T ansk ip au . Das Resul a diese Un e suchung s imm sowohl mi den E gebnissen ü die Wes e n Blo Expe imen e als auch ü die Messungen de Fluo eszenzin ensi ä en übe ein. Die De ek ion des g p- siX-T ansk ip es im Wild yphin e g und und im  ho-Hin e g und ü die beiden N- e minalen Dele ionen on 70 bzw. 99 Aminosäu en (Abbildung 25, Spu en 11 bis 14) bes ä ig das zu o e hal ene E gebnis, dass sich die u -si e im Be eich de T ansmemb andomäne-kodie enden Sequenz be inde . Wä e das nich de Fall, wü de man im Wild yphin e g und in beiden Fällen keine Signale e hal en. Nu du ch das Fehlen de u -si e konn e in den Spu en 11 und 13 o z des Vo handenseins on Rho nich e minie we den. Das E gebnis ü die N- e minalen Dele ionen on 21 bzw. 43 Aminosäu en in den Spu en 7 bis 10 zeig hingegen, dass in diesen Fällen die u -si e noch o handen is . Im Wild yphin e g und konn e Rho die T ansk ip ion noch e minie en, was im Fall des Knockou s on ho nich meh e olg e, weshalb die T ansk ip e de ek ie we den konn en. E gebnisse 108 So kann auch anhand de E gebnisse de No he n Blo Expe imen e de Be eich de u -si e au die Nukleo idsequenz es geleg we den, welche ü die Aminosäu en 44 bis 70 kodie . Fü die Volllängen o m on siX (Spu en 1 und 2 sowie 15 und 16 in Abbildung 25) wu de das bekann e E gebnis e hal en. Da die u -si e o handen is , e olg e die T ansk ip ions e mina ion du ch Rho im Wild yphin e g und und kein T ansk ip wa nachweisba . Sobald Rho nich meh unk ionell wa , and auch keine Te mina ion s a und das T ansk ip wu de im  ho-Hin e g und de ek ie . Fü die C- e minalen Dele ionen ab de 71. bzw. 146. Aminosäu e in den Spu en 3 bis 6 äll das E gebnis wie e wa e aus. Obwohl hie die u -si e den o genann en E gebnissen en sp echend noch in de Sequenz on siX o handen is , kann kein Ein luss des T ansk ip ions e mina o s Rho es ges ell we den. Fü den  ho-Hin e g und und auch ü den Wild yphin e g und, obgleich e was schwäche , konn e das g p- siX-T ansk ip de ek ie we den. Wie be ei s im o angegangenen Kapi el e läu e , schein die T ansk ip ion de e kü z en Fo men on siX, auch wenn die u -si e nich dele ie wu de, nich du ch Rho Abbildung 25: Luminog amm de No he n Blo Analyse e schiedene B. sub ilis S ämme zu Ka ie ung de u -si e in siX. Die S ämme wu den im Wild yphin e g und ( ho+) und im  ho-Hin e g und ( ho-) be ach e . Es wu den sowohl die Volllängen o m on siX (w ) als auch e schiedene Dele ionen () analysie . Die Zahlen bezeichnen dabei jeweils die dele ie en Aminosäu en. w * bezeichne eine es au ie e Fo m on siX mi zwei s illen Mu a ionen. Mi de Bezeichnung u wu de de S amm benann , bei welchem du ch Punk mu a ionen die u -si e ze s ö wu de. Die elek opho e ische Au ennung de Gesam -RNA e olg e im 1,2%igen dena u ie enden Aga osegel bei 80 V. Danach wu den die Ribonukleinsäu en au eine Nylonmemb an geblo e . Die Hyb idisie ung e olg e mi eine DIG-ma kie en RNA-Sonde gegen g p. Die G ößen de de ek ie en RNA-Moleküle sind ech s neben dem Luminog amm au gezeig . E gebnisse 109 e minie zu we den. Die e bleibenden wenigen Nukleo ide nach de u -si e in de Sequenz des am 3´-Ende e kü z en siX scheinen da ü nich auszu eichen. De Fak o Rho benö ig ü seine Ak i i ä als T ansk ip ions e mina o demnach noch wei e e Sequenzen on siX. Die u -si e is eine Region, welche eich an Cy idin und a m an Guanosin is (Bea e al. 1988; Ali ano e al. 1991). Inne halb de Nukleo idsequenz, welche ü die Aminosäu en 44 bis 70 kodie und wo die u -si e ü siX lokalisie is , gib es eine Region, au die diese Eigenscha en zu i . In de Nukleo idsequenz ü die Aminosäu en 53 bis 69 exis ie eine 26 bp lange Sequenz, die ga kein Guanosin en häl , da ü abe ach Cy idin (Abbildung 26, gelbe Rahmen). In nach olgenden Analysen wu de diese Sequenz genaue un e such . Die Spu en 17 und 18 de Abbildung 25 zeigen das Resul a de No he n Blo Expe imen e ü einen Repo e s amm, in welchem Teile de T ansmemb andomäne on RsiX (die Aminosäu en 53 bis 69) dele ie wu den. Es is zu e kennen, dass man sowohl im Wild yphin e g und als auch ü den Knockou on ho ein kla es Signal ü das g p- siX-T ansk ip in de e wa e en G öße e hiel . Dies bes ä ig die o he igen E kenn nisse, dass sich die u -si e inne halb de Sequenz ü die Aminosäu en 44 bis 70 be inde . Das Fehlen de u -si e üh hie dazu, dass de Fak o Rho im Wild yphin e g und nich e minie en kann und somi das T ansk ip de ek ie ba is . In den Spu en 19 und 20 de Abbildung 25 is das E gebnis de No he n Blo Analyse ü eine Volllängen o m on siX zu sehen. Sie un e scheide sich om wild ypischen siX lediglich in zwei Basen, welche du ch Klonie ungssch i e ausge ausch wu den und dann als s ille Mu a ionen au a en. Bei diesem es au ie en Wild yp (w *) wu de die wild ypische Nukleo idsequenz ü die Aminosäu en 53 bis 69 wiede in den Repo e s amm g p- siX 53-69 (Spu en 17 und 18) einge üg . Diese zwei s illen Mu a ionen wi k en sich alle dings au den Ein luss de Ak i i ä des T ansk ip ions e mina o s Rho nich aus. Es is zu e kennen, dass das T ansk ip wie ü den Wild yp (Spu en 1 und 2 sowie 15 und 16) nu bei einem Knockou on ho nachweisba is . Aus diesem G und konn e de Repo e s amm g p- siX 53-69 (Spu en 17 und 18) auch e wende we den, um eine du ch Punk mu a ionen leich e ände e Nukleo idsequenz ü die Aminosäu en 53 bis 69 einzu ügen. Die Sequenz wu de so geände , dass im Be eich de Aminosäu en 61 bis 68 ün Nukleo ide ausge ausch wu den ohne die Aminosäu esequenz zu ände n (Abbildung 26). Du ch diese s illen Mu a ionen wu den d ei Guanosin einge üh und die ma kie en Cy idin in Abbildung 26 sind e lo en gegangen. Au diese A wu den die Me kmale eine u -si e ze s ö . Fü diesen Be eich de u -si e on siX ha man so einen E gebnisse 110 Übe schuss an Guanosin e zeug . Die Sequenz mi diese mu ie en u -si e wu de anschließend in den Repo e s amm g p- siX 53-69 einge üh . De esul ie ende S amm g p- siX_ u (Abbildung 25, Spu en 21 und 22) zeig in den No he n Blo Expe imen en das e wa e e E gebnis. Die du ch s ille Mu a ionen leich e ände e Sequenz de u -si e üh e zu eine ähnlich s a ken De ek ion des g p- siX-T ansk ip es sowohl im Wild yphin e g und als auch im  ho-Hin e g und. Die ün Punk mu a ionen ze s ö en die Funk ionali ä de u -si e. Es kann dahe es geleg we den, dass sich ein unk ionelle Teil de u -si e inne halb de Nukleo idsequenz ü die Aminosäu en 44 bis 70 be inde . Dabei schein insbesonde e die Nukleo idsequenz ü die Aminosäu en 61 bis 69 eine wich ige Funk ion einzunehmen, da die Ein üh ung on s illen Mu a ionen in diese Sequenz die Wi kungsweise de u -si e ze s ö e. Zudem inde man in diese Sequenz as kein Guanosin, abe da ü e meh Cy idin, womi die E kenn nisse on Bea e al. sowie Ali ano e al. bes ä ig we den können. 3.9 P o eolyse on RsiX Fü den An i-Sigma ak o RsiW aus B. sub ilis konn e be ei s gezeig we den, dass RIP, die egulie e in amemb ane P o eolyse, s a inde , um RsiW bei bes imm en S essbedingungen abzubauen, dami de Sigma ak o W nich länge inhibie wi d (Hein ich & Wiege 2009). Bei diesem P ozess sind meh e e P o easen be eilig , u. a. P sW (Hein ich & Wiege 2006), RasP (Schöbel e al. 2004) und auch die cy oplasma ische P o ease ClpXP (Hein ich e al. 2009). In Kapi el 3.3 wu de zu o gezeig , dass die beiden P o easen P sW und RasP im Wild yphin e g und au die Konzen a ion on RsiX keinen Ein luss haben. Mi den neu Abbildung 26: Auszug aus de Sequenz ü das wild ypische Gen siX aus B. sub ilis. Oben: Nukleo idsequenz de dsDNA. De gelbe Rahmen kennzeichne den Be eich de u -si e, bei welchem in dem Repo e s amm 1012 amyE::Pg oE-g p- siX u du ch ün Punk mu a ionen ( o e P eile) s ille Mu a ionen als Nachweis de u -si e einge üg wu den. Un en: Die en sp echende Aminosäu esequenz des An i- Sigma ak o s RsiX. De schwa ze Rahmen kennzeichne den Be eich de T ansmemb andomäne on RsiX, die Zahlen bezeichnen die Posi ion de jeweiligen Aminosäu e in de P o einsequenz. E gebnisse 117 dem E gebnis de Wes e n Blo s keine Be eiligung an de P o eolyse on RsiX nachgewiesen we den. In dem Luminog amm on Abbildung 30 sind ü diese Fälle keine Signale ü P o eolysep oduk e on RsiX zu e kennen. Die ehlenden Signale ü die Volllängen o m on RsiX bei 60 kDa im clpX- und p sW-Hin e g und nach IPTG-Zugabe sind e mu lich die Folge eines Fehle s beim Übe agen de P o eine om Polyac ylamidgel au die Ni ocellulosememb an. Ve mu lich wa an diese S elle das Blo en nich e izien genug. Die Ladungskon olle ü diese Wes e n Blo Analyse lie e e wie zu e wa en in allen 20 Spu en kla e Signale bei 70 kDa ü die memb anassoziie e Me allop o ease F sH. Neben den Wes e n Blo Analysen wu den ü die oben besch iebenen S ämme, bei welchen die u -si e on siX mu ie wu de, auch Messungen de -Galak osidase-Ak i i ä en o genommen. Wie im Kapi el 3.9.1 be ei s angewand , wu den an diese S elle die Ak i i ä en auch übe einen Zei aum on 5 S unden bei eine IPTG-Konzen a ion on 250 µM gemessen. Abbildung 31 zeig das E gebnis diese Ak i i ä smessungen. Die We e ü die -Galak osidase-Ak i i ä en ohne Induk ion on siX du ch IPTG e hal en sich genauso wie es schon ü Abbildung 29 (oben) besch ieben wu de - sie sind alle ela i hoch. Nu die Ak i i ä en ü den Knockou on clpX weichen mi Beginn de s a ionä en Phase on den ande en Ak i i ä en ab. Sie sind ge inge als ü die ande en ie S ämme e mi el , abe imme noch deu lich höhe als die en sp echenden Ak i i ä en nach Induk ion mi IPTG. Sobald die T ansk ip ion on siX mi IPTG induzie wu de, e hal en sich de Wild yps amm und de  asP-S amm wie be ei s zu o besch ieben (Kapi el 3.9.1). Abbildung 31 (un en) zeig , dass sich de S amm mi dem Knockou ü p sW und auch de S amm mi dem ach ach P o easen-Knockou (WB800) ähnlich dem Wild yp e hal en. Dieses E gebnis bedeu e , dass diese P o easen nich an de P o eolyse on RsiX be eilig sind. Das en sp ich dem E gebnis de Wes e n Blo Analysen in Abbildung 30. An diese S elle kann man auße dem wiede die e s ä k e Ak i ie ung on X mi Beginn de s a ionä en Phase e kennen. Alle dings zeig de clpX-S amm genauso ge inge Messwe e ü die -Galak osidase-Ak i i ä wie de  asP-S amm und die Messwe e sind deu lich ge inge als die We e, die ü den Wild yps amm e mi el wu den. Diese Ums and is nu du ch eine S abilisie ung des An i-Sigma ak o s au g und des Knockou s on clpX und de dami e bundenen Inhibie ung on X zu e klä en. Dieses E gebnis läss au eine Be eiligung on ClpX an de RsiX P o eolyse schließen, obwohl die Resul a e de Wes e n Blo Analysen in Abbildung 30 einen ande en Schluss zuließen. Eindeu ige Aussagen bzgl. de Be eiligung E gebnisse 118 on ClpX an de RsiX P o eolyse können an diese S elle dahe nich ge o en we den. Es 0 2 4 6 8 10 12 14 0,5 5,0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 -Galak osidase-Ak i i ä OD578 Zei [min] 250 µM IPTG OD w OD asP OD p sW OD clpX OD WB800 w asP p sW clpX WB800 Abbildung 31: -Galak osidase-Ak i i ä en de B. sub ilis S ämme KS246 (pALF siX u ; w ), KS243 ( asP), KS254 (p sW), KS250 (clpX) und KS258 (WB800) zu Un e suchung de P o eolyse on RsiX. Sekundä achse: Die -Galak osidase-Ak i i ä en wu den im Wild yphin e g und (w ), im  asP-, p sW- und clpX-Hin e g und be ach e sowie ü den ach ach P o easen-Knockou , welche im S amm B. sub ilis WB800 (Wu e al. 2002) o lieg (WB800). Du ch Ve wendung des Plasmides pAL-FLAG konn e die T ansk ip ion on siX mi IPTG induzie we den (pALF siX). Die Bezeichnung u wu de gewähl , weil du ch Punk mu a ionen die u -si e on siX ze s ö wu de. Die dl A-lacZ-Repo e usion wi d du ch X-Ak i i ä induzie . Da ges ell sind jeweils die E gebnisse ohne IPTG (0 µM; oben) und mi IPTG (250 µM; un en) -Zugabe. De e wende e P omo o Pspac is du ch IPTG egulie ba . Die P obenahme ü die Messung de Ak i i ä en e olg e kon inuie lich alle 30 min. Die Ak i i ä en beziehen sich jeweils au 1 OD578 zum Zei punk de P obenahme. Die Bes immung de β-Galak osidase-Ak i i ä e olg e wie bei Wiege e al. (2001) besch ieben. Die Fehle balken geben die be echne en We e de S anda dabweichung an. P imä achse: Wachs umsku e de en sp echenden S ämme. Die OD578 wu de alle 30 min gemessen. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0,5 5,0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 -Galak osidase-Ak i i ä OD578 Zei [min] 0 µM IPTG OD w OD asP OD p sW OD clpX OD WB800 w asP p sW clpX WB800 E gebnisse 119 müss en zusä zliche Wes e n Blo Analysen mi de cy oplasma ischen F ak ion sowie gg . de Gesam zell ak ion du chge üh we den. Bei eine Be eiligung on ClpX an de RsiX P o eolyse soll en die seh kleinen Abbaup oduk e on RsiX im Cy oplasma de ek ie we den. Be ach e man die E gebnisse zu Analyse de P o eolyse des An i-Sigma ak o s RsiX zusammen, is es zus ellen, dass die si e-2 P o ease RasP an de P o eolyse on RsiX be eilig is . Des Wei e en is seh wah scheinlich auch die cy oplasma ische P o ease ClpX in ol ie . Da abe die si e-1 P o ease P sW nich an de P ozessie ung be eilig is , muss man da on ausgehen, dass die P o eolyse on RsiX ande s als ü RsiW be ei s bekann (Hein ich e al. 2009) e läu . 3.10 De Ein luss on  ho in i o Das Gen ü den T ansk ip ions e mina o Rho is in B. sub ilis nich essen iell (Qui k e al. 1993). Wu de das Wachs um eine B. sub ilis ho- Kul u du ch Messung de OD578 e olg , konn e es ges ell we den, dass das Wachs um ähnlich dem ü eine ho+ Kul u e lie . Zwischen beiden Kul u en wa en keine signi ikan en Un e schiede im Wachs ums e hal en e kennba . Bei nähe e Be ach ung einzelne Zellen un e dem Mik oskop wu den jedoch Un e schiede zwischen den S ämmen es ges ell . De wild ypische S amm besi z Zellen in S äbchen o m (Abbildung 32, Bilde 1 bis 3). Dagegen wachsen die Zellen in de ho- Kul u in langen Ke en (Abbildung 32, Bilde 4 bis 6). Diese Beobach ung wu de als Anlass ü wei e e Un e suchungen genommen. In eine aus üh lichen T ansk ip om-Analyse wu de das T ansk ip om on B. sub ilis 1012 mi dem T ansk ip om on B. sub ilis 1012  ho e glichen (U. Mäde , G. Homu h, un e ö en lich ). Dabei wu de ein g oße Un e schied zwischen beiden T ansk ip omen es ges ell . Eine Vielzahl e schiedene Gene wu de im ho-Knockou en wede hoch- ode he un e egulie . An diese S elle soll ein Beispiel ku z e wähn we den. Es wu de ge unden, dass Gene, welche du ch den al e na i en Sigma ak o D egulie we den, im  ho- Hin e g und eine deu lich ge inge e Exp ession e ah en als im Wild yphin e g und. Auße dem is be ei s bekann , dass B. sub ilis sigD Zellen ähnlich wie B. sub ilis  ho Zellen auch in langen, unbeweglichen Ke en wachsen (Ma quez e al. 1990). Chen e al. zeig en zudem, dass das Au olysin Ly F, welches du ch das Gen ly F kodie wi d und auch E gebnisse 120 D- egulie is , ü die T ennung de Zellen im Wesen lichen e an wo lich is (Chen e al. 2009). Die U sache, dass Zellen im ho-Knockou in Ke en wachsen, lieg also e mu lich da in, dass de Sigma ak o D und dami auch die Gene des D-Regulons s a k e minde exp imie we den. Dahe wu de in diese A bei ly F im S amm B. sub ilis 3610  ho ek opisch un e IPTG-Kon olle ges ell und e neu die Mo phologie de Zellen un e such . Zu genaue en Beu eilung wu den auße dem die Zellmemb anen mi dem Fluo eszenz a bs o FM4-64 ange ä b . Mi els Du chlich mik oskopie und zusä zlich du ch Fluo eszenzmik oskopie konn e die Wi kung on Ly F au die Zellmo phologie bes ä ig we den. In Abbildung 32, Bilde 7 bis 12, sieh man eindeu ig, dass die Zellen im ho- Knockou nu du ch Inkuba ion mi lediglich 30 µM IPTG ih e Fähigkei , sich in einzelne bewegliche Zellen zu eilen, zu ücke lang en. De T ansk ip ions e mina o Rho ha also nich nu Auswi kung au das sigX- siX-Ope on. Auch de al e na i e Sigma ak o D und sein Regulon we den du ch den Fak o Rho in de A beein luss , dass sich bei Dele ion des Fak o s Rho soga die Zellmo phologie e ände . Abbildung 32: Mik oskopie on B. sub ilis 3610 Zellen zu Beu eilung de Zellmo phologie im Wild yphin e g und (w ), im  ho-Hin e g und ( ho) bzw. im  ho-Hin e g und mi IPTG- induzie ba em ly F ( ho Physpank-ly F). Die Analyse e olg e anhand Du chlich mik oskopie (oben) und Fluo eszenzmik oskopie (Mi e). Die Übe lage ung de en sp echenden Du chlich - und Fluo eszenzau nahmen is un en da ges ell . Die Zellen wu den ü diese Au nahmen bei E eichen eine OD578 on 0,5 mi els Aga ose ixie . Das An ä ben de Memb anen e olg e mi FM4-64 (Molecula P obes). Diskussion 121 4 Diskussion Die Exp ession on Genen in P oka yo en is s eng egulie . Besonde s un e S essbedingungen muss eine solche Regula ion s a inden. Fü eine ge egel e Genexp ession bei bes imm en S ess ak o en so gen die sogenann en al e na i en Sigma ak o en. Die o liegende A bei beschä ig e sich mi dem ECF-Sigma ak o X aus B. sub ilis sowie seinem en sp echenden An i-Sigma ak o RsiX (Huang e al. 1997; B u sche & B aun 1997; Helmann 2002). Die An i-Sigma ak o en RsiX und RsiW sind beides T ansmemb anp o eine, die s uk u elle Ähnlichkei en e kennen lassen (Yoshimu a e al. 2004). Dahe wu de in diese A bei de F age nachgegangen, ob auch RsiX du ch eine egulie e in amemb ane P o eolyse p ozessie we den muss, dami X die T ansk ip ion seines Regulons ini iie en kann. 4.1 RsiX is de nega i e Regula o on X Um die X-Ak i i ä in e schiedenen Repo e s ämmen zu e anschaulichen, wu de eine Repo e usion e wende , bei welche de P omo o on dl A mi lacZ usionie is (Abbildung 4, oben). Sobald de Sigma ak o ak i ie wi d, soll e es zu T ansk ip ion de Repo e usion kommen und dies kann du ch Messung eine en sp echenden -Galak osidase- Ak i i ä gezeig we den. Die hie du chge üh en Messungen de -Galak osidase-Ak i i ä ü den wild ypischen Hin e g und und ü den Knockou on siX zeigen deu lich, dass RsiX als An i-Sigma ak o ungie , so dass in dessen Gegenwa X zu keine In e ak ion mi de RNA-Polyme ase ähig is . E s die Dele ion on RsiX üh zu Ak i ie ung on X. Die E gebnisse on B u sche und B aun sowie on Huang e al. sind ep oduzie ba . Demen sp echend müss e eine ek opische Inse ion eines IPTG-induzie ba en siX zu Komplemen a ion des Knockou s on siX üh en. Ein ähnliches Repo e sys em wu de be ei s mi E olg e wende , um den Ein luss on RsiW au die W-Ak i i ä zu un e suchen (Schöbel e al. 2004). Das Repo e sys em bei Schöbel e al. bes and aus dem siW-Knockou und einem IPTG- induzie ba en siW sowie aus eine Fusion zwischen dem P omo o des W- egulie en yuaF und lacZ. Alle dings konn e in de o liegenden A bei eine Komplemen a ion des siX- Knockou s nich e eich we den. In eine ühe en A bei wu de be ei s die ko ek e Diskussion 122 Kons uk ion de Repo e s ämme es ges ell (Schä e 2007), so dass Klonie ungs ehle als mögliche Fehle quelle ü die ehlende Komplemen a ion ausgeschlossen we den konn en. Neben de Volllängen o m ü siX wu de auch e such , mi eine e kü z en Fo m on siX eine Komplemen a ion des siX-Knockou s zu e eichen. Doch auch ü dieses Kons uk konn e die Komplemen a ion nich e ziel we den. Die U sache da ü lieg abe wah scheinlich genau in diese e kü z en Fo m on siX, denn siX 71-368 exp imie den An i-Sigma ak o ohne die ex acy oplasma ische Domäne. Schöbel e al. haben eine ähnlich e kü z e Fo m ü RsiW (RsiW1) be ei s e wende (Schöbel e al. 2004). Dabei wu de es ges ell , dass diese e kü z e Fo m on RsiW imme ein Subs a ü die P o ease RasP da s ell . Es lieg dahe nahe, dass auch hie RsiX 71-368 du ch RasP p ozessie wi d, was die T ansk ip ion des X-Regulons zu Folge hä e. Bes ä ig wi d diese Zusammenhang du ch die Be ach ung on GFP-RsiX 71-368 im  asP-Hin e g und (Abbildung 16). De in diese A bei ge undene Ein luss des T ansk ip ions e mina o s Rho au die siX- T ansk ip ion kann jedoch die ehlende Komplemen a ion des siX-Knockou s e klä en. Die ek opische siX-T ansk ip ion wi d demnach ini iie , üh abe du ch die o zei ige Te mina ion nu zu eine unzu eichenden T ansla ion on siX. Dami kann de Knockou nich komplemen ie we den und es wu de wei e hin das X-Regulon ansk ibie . Sobald abe die ü die Te mina ion wich ige u -si e on siX du ch Mu a ionen ze s ö wu de, konn e siX auch ansla ie und somi de Knockou komplemen ie we den (Abbildung 28). 4.2 De T ansk ip ions e mina o Rho beein luss die T ansk ip ion des sigX- siX-Ope ons Fü den genomwei en Sc een nach Fak o en, welche den An i-Sigma ak o RsiX in i gendeine Weise beein lussen, wu de die Me hode de T ansposonmu agenese mi dem Plasmid pIC333 e wende (S einme z & Rich e 1994). Das E gebnis de T ansposonmu agenese zeig e, dass de T ansk ip ions e mina o Rho die zellulä e Konzen a ion des siX-T ansk ip es bes imm . De Ums and, dass die un e schiedlichen T ansposi ionse eignisse in allen d ei Fällen zum gleichen E gebnis üh en, sp ach ü einen siche en Ein luss des Fak o s Rho au das siX-T ansk ip . Dieses Resul a wa abe seh une wa e , denn man ha e mi de Iden i izie ung eine ode meh e e P o easen ge echne . Genauso wie es ü RsiW bekann is (Hein ich e al. 2009), wu de ü RsiX angenommen, dass eine egulie e P o eolyse s a inde , um die X- egulie e T ansk ip ion zu ak i ie en. Diskussion 123 Ein seh ähnliche Sc een mi dem Plasmid pIC333 wu de e wende , um nach Fak o en zu suchen, die den An i-Sigma ak o RsiW egulie en (Hein ich & Wiege 2006). Alle dings wu den bei diesem Sc een deu lich meh T ansposi ionse eignisse mi Ein luss au den do e wende en GFP-RsiW-Repo e ge unden als in de hie o liegenden A bei . Die E izienz des gewähl en Mu agenese e ah ens is also in Abhängigkei des Repo e s seh un e schiedlich. Als Konsequenz des E gebnisses de T ansposonmu agenese wu de de Dele ionss amm ü ho kons uie . Das wa nu möglich, weil ho in B. sub ilis, im Gegensa z zu E. coli, nich essen iell is (Qui k e al. 1993). Die Kons uk ion des ho-Knockou s e olg e du ch Inse ion eine Bleomycin-Resis enz-Kasse e in die Sequenz ü ho. Au ähnliche Weise wu den auch schon Knockou s ü die P o easen RasP (Schöbel e al. 2004) ode P sW (Hein ich & Wiege 2006) e hal en. Den Ein luss des T ansk ip ions e mina o s Rho au die T ansk ip ion und dami auch au die T ansla ion on siX zeig en die E gebnisse de Fluo eszenzmik oskopie (Abbildung 16) und auch de Wes e n Blo Analysen (Abbildung 17) mi einem GFP-RsiX-Repo e . Sobald die ansla ionelle Fusion on g p und siX ansk ibie wu de, e minie e Rho im Wild yphin e g und, ande s als im ho-Knockou , die T ansk ip ion. Die Folge wa , dass die Kolonien keine Fluo eszenz zeig en und auch in Wes e n Blo Analysen konn e das Fusionsp o ein nich de ek ie we den. Die in diese A bei ge undene Te mina ion de sigX- siX-T ansk ip ion du ch den Fak o Rho wu de nich e wa e . Zum einen, weil, wie in Abbildung 3 zu sehen, das sigX- siX-Ope on zusä zlich am Ende des Ope ons einen in insischen Te mina o ü eine Fak o -unabhängige Te mina ion de sigX- siX-T ansk ip ion besi z (Huang e al. 1997). Zum ande en, weil die Regula ion de T ansk ip ion du ch den Te mina o Rho in B. sub ilis an sich ungewöhnlich is . Das sigX- siX-Ope on is e s das d i e bekann e Beispiel in B. sub ilis ü die Te mina ion du ch den Fak o Rho. Zu o wu de be ei s gezeig , dass das Gen des T ansk ip ions e mina o s Rho selbs eine Au o egula ion du ch Rho un e lieg (Ingham e al. 1999). Wei e is bekann , dass auch das p-Ope on om T ansk ip ions e mina o Rho beein luss wi d (Yakhnin e al. 2001). Ähnlich wie im sigX- siX-Ope on gib es im pEDCFBA-Ope on auch übe lappende Be eiche in de Nukleo idsequenz. Yakhnin e al. konn en eben alls zeigen, dass im  ho-Hin e g und meh T ansk ip ü pE und pD o handen wa als im Wild yphin e g und. Diskussion 124 Die Rho-abhängige Te mina ion schein au g und de Ta sache, dass bishe nu diese d ei Beispiele ü eine Fak o -abhängige Te mina ion ge unden wu den, in B. sub ilis nich wei e b ei e zu sein. Diese Ums and pass auch zu den Resul a en on Ingham e al., die wenige als 5 % de Menge des P o eins Rho, im Ve gleich zu E. coli, in B. sub ilis ge unden haben. De G und ü eine de a ige Regula ion ü einen Sigma ak o und seinen en sp echenden An i-Sigma ak o bleib abe mi den E gebnissen diese A bei ungeklä . Es können dahe hie nu Hypo hesen au ges ell we den. Ein mu maßliche G und ü diese A de Regula ion könn e die s öchiome ische P o einexp ession sein, dami de Sigma ak o X und sein en sp echende An i-Sigma ak o RsiX imme in gleichen Mengen o liegen. Oppenheim & Yano sky pos ulie en schon, dass die T ansla ionskopplung im p-Ope on aus E. coli auch nu de Siche s ellung eine äquimola en P oduk ion on Polypep iden dien (Oppenheim & Yano sky 1980). Alle dings wi das eine ande e F age au : Wann wi d die T ansk ip ion des Ope ons e minie ? Wenn man on eine pe manen en Te mina ion ausgeh , wü de das bedeu en, dass X und RsiX nie ansla ie wü den. Es muss also auch Bedingungen geben, bei denen Rho nich e minie . Möglich wä en dabei ähnliche Bedingungen wie sie ü das p-Ope on aus B. sub ilis ge unden wu den. Hie egulie ein wei e es P o ein, TRAP (Babi zke & Yano sky 1993), in Abhängigkei on de T yp ophan-Konzen a ion in de Zelle sowohl die T ansla ion als auch die T ansk ip ion des p-Ope ons (Me ino e al. 1995). Dabei binde T yp ophan bei eine hohen in azellulä en Konzen a ion an das P o ein TRAP, welches wiede um an das p-T ansk ip binde , was zu Bildung on Sekundä s uk u en üh , die schließlich dem Fak o Rho die T ansk ip ions e mina ion e möglichen (Yakhnin e al. 2001). Bei Übe agung dieses Szena ios au das sigX- siX-Ope on könn e nach olgend besch iebene Regula ion möglich sein. Du ch die schon bekann e Au o egula ion on sigX (B u sche & B aun 1997) könn e e s bei eine zu hohen in azellulä en X-Konzen a ion de Zugang ü Rho zum sigX- siX-T ansk ip ü die ak o abhängige Te mina ion e möglich we den. Abe an diese S elle sind noch seh iel wei e e Analysen nö ig. Das An ibio ikum Bicyclomycin (BCM) (Nishida e al. 1972) is ein spezi ische Inhibi o des T ansk ip ions e mina o s Rho (Zwie ka e al. 1993). Biochemische Analysen und auch Un e suchungen de S uk u des Fak o s Rho im Zusammenspiel mi BCM haben gezeig , dass BCM di ek die ATPase-Ak i i ä on Rho beein luss , indem die ATP-Hyd olyse un e bunden wi d, sodass Rho nich meh e minie en kann (Pa k e al. 1995; Magya e al. Diskussion 125 1996; Ca ano e al. 1998; Sko dalakes e al. 2005). Dami is die Zugabe on BCM in ein Medium eine e ek i e Maßnahme, um den Ein luss on Rho zu un e suchen, ohne eine Dele ion des Fak o s Rho zu benö igen. Dies se z abe o aus, dass ho in dem jeweiligen O ganismus nich essen iell is . Fü Analysen in E. coli kann diese Me hode dahe nich e wende we den, denn ü dieses Bak e ium is ho essen iell (Das e al. 1976; Bubunenko e al. 2007). Alle dings wu den schon suble ale Konzen a ionen on 20 µg/ml BCM benu z , um Expe imen e mi BCM in E. coli e olg eich du chzu üh en (Pe e s e al. 2009). In diese A bei wu de eben alls BCM e wende , um die Funk ion des T ansk ip ions e mina o s Rho zu inhibie en, ohne dass ein ho-Knockou nö ig wa , denn in B. sub ilis is ho nich essen iell (Qui k e al. 1993). Die hie du chge üh en Analysen dien en lediglich dazu, den di ek en Ein luss on Rho au das siX-T ansk ip noch einmal da zulegen. Die e ziel en E gebnisse e deu lichen, wie schon an ande e S elle besch ieben (Zwie ka e al. 1993; Ingham e al. 1999), dass die Ve wendung on BCM auch in B. sub ilis eine e ek i e Me hode da s ell , um den Ein luss des Fak o s Rho zu analysie en, ohne Rho zu dele ie en. 4.3 Mögliche T ansla ionskopplung im sigX- siX-Ope on Das Phänomen de T ansla ionskopplung und ih e Bedeu ung ü die s öchiome ische P oduk ion on Enzymen ü die Biosyn hesen sind schon sei langem bekann (Oppenheim & Yano sky 1980; McCa hy & Guale zi 1990). Schon 1980 wu de ü das p-Ope on aus E. coli nachgewiesen, dass das S opp-Codon on pE und das S a -Codon on pD übe lappen und die T ansla ion on pD di ek on de pE-T ansla ion abhäng . Dami wu de de Beg i de T ansla ionskopplung gep äg (Oppenheim & Yano sky 1980). Es wu de be ei s e wähn , dass es im p-Ope on on B. sub ilis auch zu Übe lage ungen de Nukleo idsequenzen ü die einzelnen Gene komm und dass dieses Ope on eben alls du ch den Fak o Rho egulie wi d (Yakhnin e al. 2001). Es s ell sich dahe die F age, ob auch das sigX- siX-Ope on au g und seine Regula ion du ch Rho und de übe lappenden Be eiche wie das p-Ope on aus B. sub ilis (Yakhnin e al. 2001) du ch T ansla ionskopplung egulie wi d. Wenn im sigX- siX-Ope on T ansla ionskopplung o lieg , hä e man im No he n Blo (Abbildung 20) ü das mu ie e Ope on schwäche e Signale e hal en müssen als ü das wild ypische Ope on, denn im Allgemeinen wi d da on ausgegangen, dass bei Inhibie ung Diskussion 126 de T ansla ion die mRNA an S abili ä e lie (Kushne 1996). Alle dings zeigen die E gebnisse de No he n Blo Analyse (Abbildung 20), dass die Menge an sigX- siX-T ansk ip nich eduzie wu de. Im Gegen eil, es schein , als ob die Menge an T ansk ip soga e was anges iegen is . Bei nähe e Be ach ung de E gebnisse ü das p-Ope on wu de es ges ell , dass sich hie o z Vo liegen eine T ansla ionskopplung die S abili ä de mRNA nich e ände ha , wenn die T ansla ion inhibie wa (Yakhnin e al. 2001). Diese Ums and läss dahe Zwei el au kommen, ob a sächlich keine T ansla ionskopplung zwischen sigX und siX he sch . Abe auch Kushne äum e ein, dass es manchmal bei eine ges ö en T ansla ion zu keine Ve ände ung de mRNA Halbwe szei komm und die S abili ä de mRNA soga zunehmen kann (Kushne 1996). Fü eindeu ige Aussagen bzgl. de T ansla ionskopplung im sigX- siX-Ope on müssen noch wei e e Analysen olgen. Hil eich wä e an diese S elle das Vo handensein on An ikö pe n gegen den An i-Sigma ak o RsiX. Dami wä en mi dem be ei s e wende en Repo e in wei e en Wes e n Blo Analysen schnelle Aussagen zu T ansla ion on siX bei nich s a indende T ansla ion on sigX möglich. Auch Fusionen mi dem lacZ-Gen als Repo e , wie sie bei Yakhnin e al. e wende wu den, wä en möglich. Zusä zlich könn en auch noch Ri ampicin-Expe imen e du chge üh we den, um die S abili ä de en sp echenden mRNA besse zu beu eilen, da Ri ampicin die T ansk ip ion schon au de Ebene de Ini ia ion blockie (Ha mann e al. 1967; Campbell e al. 2001). Eine Sache, die abe eindeu ig es ges ell we den konn e, is , dass o z de ehlenden sigX-T ansla ion wei e hin eine Te mina ion de T ansk ip ion du ch den Fak o Rho s a inde . Das is an deu lich s ä ke en Signalen ü das sigX- siX-T ansk ip im  ho-Hin e g und ü die mu ie e Fo m des Ope ons in Abbildung 20 zu e kennen. Ein ande es Phänomen, das noch nich geklä we den konn e, is , wa um man im Wes e n Blo in Abbildung 19 ü FLAG-SigX unge äh gleich iel P o ein im Wild yp- und  ho-Hin e g und ausmachen kann. Wohingegen man im No he n Blo in Abbildung 20 einen kla en Un e schied in de T ansk ip menge sieh . Es s ell sich dahe die F age, ob imme nu eine bes imm e Menge an sigX ansla ie wi d, obwohl es kla e Un e schiede in de T ansk ip menge gib . Soll e a sächlich keine e izien e T ansla ion on sigX e olgen, wü de die Te mina ion du ch Rho einen Weg da s ellen, dami in de Zelle s e s äquimola e Mengen an X und RsiX o liegen. Du ch den pola en E ek de Te mina ion wü de olglich die un ansla ie e naszie ende sigX- siX-mRNA e minie und abgebau we den, dami nich meh siX als sigX ansla ie we den kann. Das wü de abe auch bedeu en, dass man im Knockou on ho meh RsiX als X de ek ie en müss e, was dann zu keine bzw. eine Diskussion 133 Zudem e kenn man in Abbildung 29, dass die X beding e Induk ion des lacZ-Repo e s in Abhängigkei on de Wachs umsphase e olg e. Das Maximum de X-Ak i i ä is zu Beginn de s a ionä en Phase egis ie wo den. Diese E kenn nis deck sich jedoch nich mi den E gebnissen on Huang e al., die das Maximum de sigX-Exp ession sowie de Exp ession on X-kon ollie en Genen in de spä en loga i hmischen Wachs umsphase beobach e en (Huang e al. 1997; Huang & Helmann 1998). Abschließend kann o z de Ähnlichkei en in de S uk u de An i-Sigma ak o en RsiX und RsiW (Yoshimu a e al. 2004) es ges ell we den, dass die egulie e in amemb ane P o eolyse on RsiX einem e was ande em Mechanismus, als dem ü RsiW bekann en (Hein ich e al. 2009), olg . 4.6 De Ein luss on Rho au die Zellmo phologie Das Wachs um on Zellen im ho-Knockou in langen Ke en ähnel dem be ei s bekann en ü Zellen im clpP-Knockou (Msadek e al. 1998) bzw. im sigD-Knockou (Ma quez e al. 1990). In de Ta wu de in eine genomwei en T ansk ip om-Analyse (U. Mäde , G. Homu h, un e ö en lich ) ge unden, dass im Knockou on ho die T ansk ip ion des D-Regulons s a k e minde wa . Das auch zum D-Regulon gehö ende ly F kodie ü das Au olysin Ly F und is auch ü die Teilung de Zellen und dami ü das Wachs um in S äbchen e an wo lich (Ma go e al. 1999). Sobald eine ek opische ly F-Exp ession in eine ho-- Kul u e olg e, konn e das Wachs um in S äbchen wiede he ges ell we den (Abbildung 32), e gleichba mi Chen e al. (2009), die zeig en, dass ein sigD-Knockou -S amm nach ek opische ly F-Exp ession seine Fähigkei , in S äbchen zu wachsen, zu ücke lang e. Die U sache ü das ilamen öse Wachs um de Zellen im ho-Knockou schein also ielmeh an de e inge en sigD-Exp ession als am Knockou on ho selbs zu liegen. Das bes ä ig noch einmal den Ein luss on Rho auch au das D-Regulon. Ob es sich dabei um einen di ek en Ein luss on Rho au das D-Regulon handel , müssen wei e e Expe imen e zeigen. Abschließend kann es gehal en we den, dass de T ansk ip ions e mina o Rho in B. sub ilis an zahl eichen P ozessen be eilig zu sein schein , obwohl mi den E kenn nissen diese A bei e s d ei Fälle iden i izie we den konn en, bei welchen Rho di ek an de T ansk ip ions e mina ion be eilig is (Ingham e al. 1999; Yakhnin e al. 2001). Ausblick 134 5 Ausblick Die E gebnisse diese A bei haben gezeig , dass das sigX- siX-Ope on, welches ü den ECF- Sigma ak o X und seinen en sp echenden An i-Sigma ak o RsiX kodie , du ch den T ansk ip ions e mina o Rho be ei s au de T ansk ip ionsebene egulie wi d (Kapi el 3.5.2). Ein en scheidendes Elemen bei eine ak o abhängigen Te mina ion is dabei die u -si e, die Rho-Bindes elle in de naszie enden mRNA (Sals om e al. 1979). Obwohl in diese A bei die u -si e im Gen siX be ei s au die G öße on 81 Nukleo iden eingeg enz we den konn e (Kapi el 3.8.3), könn e in wei e üh enden Analysen e such we den, die Bindes elle ü den Fak o Rho au das Nukleo id genau zu bes immen. Des Wei e en haben die E gebnisse de o liegenden A bei gezeig , dass seh wah scheinlich eine zwei e Region in de Sequenz on siX en scheidend zu eine ak o abhängigen Te mina ion bei äg (Kapi el 4.4). In olgenden Expe imen en soll e dahe auch die These übe das Vo handensein eine Te mina ionszone (Lau e al. 1982; Mo gan e al. 1983b; Bane jee e al. 2006) un e such we den. Bei dem P ozess de T ansk ip ions e mina ion spielen die T ansk ip ions-Elonga ions- Fak o en NusA und NusG in E. coli eine wich ige Rolle. E s e Analysen in B. sub ilis bzgl. diese beiden Fak o en und ih e Rolle bei de T ansk ip ions e mina ion on ho und im p-Ope on haben abe gezeig , dass NusA und NusG übe un e schiedliche Eigenscha en in E. coli und B. sub ilis e ügen (Ingham e al. 1999; Yakhnin e al. 2008). Eine in e essan e F ages ellung wä e dahe , welchen Ein luss diese Fak o en au die Rho-abhängige Te mina ion on siX haben. Im Kapi el 4.2 wu de be ei s die F age disku ie , wa um die T ansk ip ion des sigX- siX-Ope ons du ch den Fak o Rho e minie we den muss. Es wu de es ges ell , dass es zwingend Bedingungen geben muss, un e denen keine Te mina ion s a inde , dami sigX und siX auch exp imie we den können. Dahe müssen auch Analysen e olgen, die de F age nachgehen, un e welchen Vo ausse zungen die T ansk ip ion ak o abhängig e minie wi d. Es muss un e such we den, ob die Konzen a ion on X in de Zelle, ähnlich wie es ü das p-Ope on ge unden wu de (Me ino e al. 1995; Yakhnin e al. 2001), dabei eine Rolle spiel . Fe ne wu de es ges ell , dass es au g und de Te mina ion du ch Rho im sigX- siX-Ope on zum Phänomen de T ansk ip ions-Pola i ä komm (Kapi el 4.4). Das bedeu e , dass nich nu die T ansk ip ion on siX, sonde n auch die Exp ession des s omau wä s liegenden sigX beein luss wi d. Die bishe einzige E klä ung da ü is die Ausblick 135 äquimola e Exp ession beide Gene. Alle dings ehlen an diese S elle ü diese E klä ung auch noch undie e Nachweise. Im Kapi el 3.9 diese A bei konn e gezeig we den, dass die si e-2 P o ease RasP an de P o eolyse on RsiX be eilig is . Es wu de abe auch deu lich, dass de P ozess de egulie en in amemb anen P o eolyse, wie e ü den An i-Sigma ak o RsiW nachgewiesen we den konn e (Hein ich e al. 2009), nich so ein ach au den An i-Sigma ak o RsiX übe agen we den kann. Hinsich lich de P o eolyse on RsiX sind noch iele F agen ungeklä , die in wei e en Expe imen en bean wo e we den müssen. So ehl z. B. ein Hinweis au die si e-1 P o ease, und man kenn auch nich die exak en S ellen in de Aminosäu esequenz, an denen z. B. RasP ang ei . De Ein luss de cy oplasma ischen P o ease ClpX bei de RsiX-P o eolyse muss auch noch abschließend geklä we den. Möglich wä en an diese S elle auch Analysen mi dem GFP-RsiX-Repo e sys em in E. coli, um z. B. einen möglichen Ein luss de P o ease Tsp an dem P ozess de RsiX-P o eolyse zu un e suchen (Hein ich e al. 2009). Zudem ha man bishe auch keinen eindeu igen S ess ak o ge unden, au g und dessen die P o eolyse on RsiX eingelei e wi d, dami de Sigma ak o X mi de RNA-Polyme ase in e agie en kann. E s e Un e suchungen dazu b ach en keine eindeu igen E gebnisse he o (Schä e 2007). Abkü zungs e zeichnis 136 Abkü zungs e zeichnis  Dele ion/Knockou eines Gens µl Mik oli e µg Mik og amm abs. absolu APS Ammoniumpe oxodisul a ATP Adenosin-5’-T iphospha B. sub ilis Bacillus sub ilis bides . H2O zwei ach des illie es Wasse bp Basenpaa (e) bzgl. bezüglich bzw. beziehungsweise ˚C G ad Celsius ca. ci ca ca Gen de Chlo amphenicol-Ace yl ans e ase CDP-S a Dina ium-2-chlo o-5-(4-me hoxyspi o[1,2-dioxe han-3,2’-(5’-chlo o) icyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)-1-phenylphospha c u colony o ming uni (koloniebildende Einhei ) CTAB Hexadecyl ime hylammoniumb omid DEPC Die hylpy oca bona d. h. das heiß DIG Digoxigenin DMF Dime hyl o mamid DNA Desoxy ibonukleinsäu e dNTPs Desoxynukleosid iphospha e dUTP Desoxyu idin iphospha dsDNA doppels ängige DNA ECF ex a-cy oplasmic unc ion (ex acy oplasma ische Funk ion) E. coli Esche ichia coli EDTA E hylendiamin e aace a EGTA E hylenglycol-bis-(b-amino-e hyle he )-N, N, N, N- e aace a e al. e al e i E B E hidiumb omid Abkü zungs e zeichnis 137 E OH E hanol GFP g een luo escen p o ein (G ün- luo eszie endes P o ein) gg . gegebenen alls H2O Wasse Hg Quecksilbe HPLC high pe o mance liquid ch oma og aphy HS high sal IPTG Isop opyl-β-D- hiogalac opy anosid kb Kilobase(n) kDa Kilodal on l Li e LB-Medium Lu ia-Be ani-Medium ode Lu ia B o h LBX LB-Medium mi dem An ibio ikum X LS low sal M mola min Minu e mm Millime e MOPS Mo pholinop opansul onsäu e mRNA messenge RNA nm Nanome e ODXXX Op ische Dich e bei eine Wellenlänge on λ= XXX nm ONPG o-Ni ophenyl-β-D-galac opy anose PCR Polyme ase-Ke en eak ion RNA Ribonukleinsäu e RNase Ribonuklease RP Ribo p obe (RNA-Sonde) pm Umd ehungen p o Minu e RNA ibosomale RNA RT Raum empe a u S S edbe g-Einhei en SDS Na iumdodecylsul a SDS-PAGE SDS-Polyac ylamidgelelek opho ese sec Sekunde ssRNA einzels ängige RNA Abkü zungs e zeichnis 138 TBE-Pu e T is-Bo säu e-EDTA-Pu e TE-Pu e T is-EDTA-Pu e TEMED N, N, N’, N’-Te ame hyle hylendiamin T is T is-(hyd oxyme hyl)-aminome han T i on-X-100 Polyoxyme hylene he U Uni s ÜN übe Nach UV Ul a iole V Vol gl. e gleiche / Volumen p o Volumen w Wild yp w/ weigh pe olume (Gewich p o Volumen) z. B. zum Beispiel X-Gal 5-B om-4-chlo -3-indolyl-β-D-galac osid X Resis enz gegen das An ibio ikum X Xs Sensi i i ä gegen das An ibio ikum X Xy An ibio ikum X mi de Konzen a ion on y µg/ml z. T. zum Teil Li e a u e zeichnis 139 Li e a u e zeichnis Abe, H., T. Abo, and H. Aiba, 1999 Regula ion o in insic e mina o by ansla ion in Esche ichia coli: ansc ip ion e mina ion a a dis ance downs eam. Genes Cells 4: 87-97. Akba , S., and C. W. P ice, 1996 Isola ion and cha ac e iza ion o csbB, a gene con olled by Bacillus sub ilis gene al s ess ansc ip ion ac o sigma B. Gene 177: 123-128. Alba, B. M., J. A. Leeds, C. Onu yk, C. Z. Lu, and C. A. G oss, 2002 DegS and YaeL pa icipa e sequen ially in he clea age o RseA o ac i a e he sigma(E)-dependen ex acy oplasmic s ess esponse. Genes De . 16: 2156-2168. Ali ano, P., F. Ri ellini, D. Limau o, C. B. B uni, and M. S. Ca lomagno, 1991 A consensus mo i common o all Rho-dependen p oka yo ic ansc ip ion e mina o s. Cell 64: 553-563. Al mann, C. R., D. E. 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