Inter- und intramolekulare Assoziationsreaktionen als zentrale Prozesse im Verlauf der Faltung und Stabilisierung von Proteinen
Full text
In e - und in amolekula e Assozia ions eak ionen
als zen ale P ozesse im Ve lau de Fal ung und
S abilisie ung on P o einen
DISSERTATION
zu E langung des G ades
- Dok o de Na u wissenscha en -
de Fakul ä ü Biologie, Chemie
und Geowissenscha en
de Uni e si ä Bay eu h
o geleg on
Diplom-Biochemike in
S ephanie Ho mann-Thoms
Bay eu h 2012
Die o liegende A bei wu de on Mai 2007 bis Feb ua 2012 am Leh s uhl ü Biochemie
de Uni e si ä Bay eu h un e de Anlei ung on P o . D . F anz X. Schmid ange e ig .
Volls ändige Abd uck de on de Fakul ä ü Biologie, Chemie und Geowissenscha en de
Uni e si ä Bay eu h genehmig en Disse a ion zu E langung des akademischen G ades eines
Dok o s de Na u wissenscha en (D . e . na .).
Am ie ende Dekan: P o . D . Bea e Lohne
P omo ionsgesuch einge eich am: 29. Feb ua 2012
Zulassung du ch die P ü ungskommission: 14. Mä z 2012
Tag des wissenscha lichen Kolloquiums: 15. Juni 2012
P ü ungsausschuss:
P o . D . F anz-Xa e Schmid (E s gu ach e )
P o . D . Wul Blanken eld (Zwei gu ach e )
P o . D . And eas Fe y (Vo si zende )
P o . D . Benedik Wes e mann
Inhal s e zeichnis
i
Inhal s e zeichnis
1Einlei ung ........................................................................................................................................ 1
1.1 Au bau und Ve meh ung de F -Phagen ................................................................................... 1
1.2 Phage display zu Selek ion au e höh e Bindungsa ini ä ...................................................... 2
1.3Selek ion au e höh e S abili ä – das P oside-Ve ah en ......................................................... 3
1.4Die Rolle des G3P des d Phagen bei de In ek ion on E. coli Zellen .................................... 5
1.5 P olylisome isie ung als limi ie ende Sch i de Phagenin ek ion ......................................... 9
1.6 Die Fal ung des G3P* ko elie mi dem In ek ionsmechanismus des d Phagen ................. 10
1.7P oblems ellung ...................................................................................................................... 12
2Ma e ial und Me hoden ..................................................................................................................15
2.1Ma e ial ................................................................................................................................... 15
2.1.1Bak e iens ämme und Plasmide ...................................................................................... 15
2.1.2Näh medien ..................................................................................................................... 15
2.1.3Enzyme, P o eine und Pep ide ........................................................................................ 15
2.1.4Oligodesoxy ibonukleo ide ............................................................................................. 16
2.1.5Chemikalien .................................................................................................................... 16
2.1.6Ve b auchsma e ialien .................................................................................................... 16
2.1.7Ge ä e .............................................................................................................................. 17
2.1.8Compu e p og amme ...................................................................................................... 17
2.2Gelelek opho e ische Me hoden ............................................................................................ 18
2.2.1Aga ose-Gelelek opho ese ............................................................................................. 18
2.2.2Diskon inuie liche Polyac ylamid-Gelelek opho ese (SDS-PAGE) ............................. 18
2.3Isolie ung und Reinigung on DNA ....................................................................................... 19
2.3.1P äpa a ion doppels ängige DNA ................................................................................. 19
2.3.2P äpa a ion einzels ängige DNA .................................................................................. 19
2.3.3Elu ion on DNA aus Aga ose-Gelen ............................................................................. 19
2.4Polyme ase-Ke en eak ion (PCR) ......................................................................................... 20
2.4.1Kolonie-PCR ................................................................................................................... 20
2.4.2Ein üh ung on Mu a ionen mi els blun -end Mu agenese ............................................ 20
2.4.3Ampli ika ion on DNA-F agmen en ............................................................................. 21
2.4.4E zeugung on Gen agmen en anhand on o e lap ex ension PCR ............................. 21
2.5Klonie ung e schiedene P o ein a ian en ............................................................................ 21
2.5.1Res ik ion de DNA-F agmen e und des Vek o s pET11a ............................................ 21
2.5.2Liga ion ........................................................................................................................... 22
2.6He s ellung und T ans o ma ion on E. coli Zellen ............................................................... 22
2.6.1He s ellung und T ans o ma ion elek okompe en e E. coli XL1 Blue Zellen .............. 22
2.6.2He s ellung und T ans o ma ion CaCl2-kompe en e E. coli BL21 (DE3)-Zellen .......... 22
2.7A bei en mi Phagen ............................................................................................................... 23
2.7.1P opaga ion und Isolie ung on d Phagen ..................................................................... 23
2.7.2In ek ion pilushal ige E. coli XL1 Blue bzw. E. coli TG1 Zellen ................................. 23
2.7.3In ek ion des pilus eien E. coli HB2156 S ammes ........................................................ 23
2.7.4Ve gleich de In ek iosi ä en e schiedene d Phagen ................................................... 24
2.7.5Kompe i ionsexpe imen e ............................................................................................... 24
2.8Exp ession de P o ein-Va ian en ........................................................................................... 25
2.8.1Tes au die Übe exp ession eines P o eins ..................................................................... 25
2.8.2Fe men a ion und Zellau schluss .................................................................................... 25
Inhal s e zeichnis
ii
2.9Reinigung de P o eine ........................................................................................................... 25
2.9.1Reinigung de G1-Va ian en ........................................................................................ 25
2.9.2Isolie ung de G3P*-Va ian en und de isolie en N1-Domäne aus inclusion bodies .... 26
2.9.3Reinigung de isolie en N1-Domäne des G3P des IF1 Phagen als SUMO-Fusion ....... 27
2.9.4Reinigung de C- e minalen Domäne des TolA-P o eins ............................................... 28
2.9.5Ma kie ung des Rezep o p o eins TolAC mi IAEDANS .............................................. 29
2.10P oben o be ei ung und Konzen a ionsbes immung ............................................................ 30
2.11Un e suchung de kon o ma ionellen S abili ä de P o eine ................................................. 30
2.11.1The misch-induzie e Dena u ie ung .............................................................................. 30
2.11.2Dena u ie ungsmi el-induzie e En al ungsübe gänge ................................................. 35
2.12Analyse des Fal ungsmechanismus de P o eine ................................................................... 37
2.12.1Kine ische Messungen zu Fal ung de G3P*-Va ian en bzw. isolie en Domänen ...... 37
2.12.3Auswe ung de kine ischen Messungen ........................................................................ 40
2.12.2Analyse de Fal ung de G1-Va ian en ........................................................................ 41
2.13Cha ak e isie ung de In e ak ion de N1-Domäne des G3P* mi TolAC-AEDANS ........... 44
2.13.1Messung on Fluo eszenzspek en ................................................................................. 44
2.13.2Kine ik de Bindung de N1-Domäne des G3P* an TolAC-AEDANS .......................... 44
2.13.3Rück al ung des G3P* in Gegenwa on TolAC-AEDANS ......................................... 46
3E gebnisse und Diskussion ............................................................................................................ 47
3.1Die Fal ung des Gen-3-P o eins des ilamen ösen Phagen d ................................................ 47
3.1.1Die Fal ung des globulä en Teils de N2-Domäne e olg in de To zei de
manuellen Mischung ...................................................................................................... 49
3.1.2 Die anscis-Isome isie ung on P o213 is de kon o ma ionellen En al ung on
N2 aus dem gedock en Zus and nachgelage ................................................................ 52
3.1.3 Anhand on Doppelmischexpe imen en kann die Rück al ung des G3P* di ek in
die na i e Fo m e olg we den .................................................................................... 55
3.1.4 Die Subs i u ion des P o161 gegen Alanin ha keine Auswi kung au den
gedock en Zus and .......................................................................................................... 59
3.1.5 Du ch den Aus ausch des P o213 gegen Glycin lieg das WT d G3P* eilweise in
nich assoziie e Fo m o ............................................................................................. 65
3.1.6 Die Geschwindigkei de Assozia ion de Domänen im d G3P* P213G is
gegenübe de anscis-Isome isie ung on P o213 deu lich beschleunig ................ 67
3.1.7 Die Assemblie ung des d G3P* P213G kann du ch den Fal ungshel e
hFKBP12+IF beschleunig we den ................................................................................ 69
3.1.8 Die Rück al ung de N2-Domäne in de s abilisie en Va ian e d G3P* IIHY
e olg unmi elba in den lose-assoziie en Zus and ...................................................... 74
3.2 Ak i ie ung des d Phagen G3P* du ch P olin-gekoppel e En al ung ................................. 82
3.2.1 Die Popula ion des ak i en In e media es e höh die A ini ä de N1-Domäne des
G3P* ü TolAC ............................................................................................................. 82
3.2.2 Im ak i en In e media des WT d G3P* liegen die beiden Domänen N1 und N2
unabhängig oneinande o .......................................................................................... 86
3.2.3 Sequenz a ia ionen um den P olinschal e üh en zu Dissozia ion de
N- e minalen Domänen .................................................................................................. 90
3.2.4 Die Subs i u ion de Schal e sequenz ha g a ie ende Auswi kungen au die
In e ak ion mi TolAC-AEDANS................................................................................... 94
3.2.5 Du ch den Aus ausch de zu P o213 benachba en Res e lieg de en sp echende
Phage pe manen in de geö ne en Fo m o ................................................................ 97
3.3 De Ein luss de e s en Schlei e on N1 au die Assemblie ung de N- e minalen
Domänen des d G3P* .................................................................................................. 100
Inhal s e zeichnis
iii
3.3.1 De Aus ausch de e s en Schlei e in N1 s abilisie diese Domäne, üh abe
gleichzei ig auch zu s a ken Des abilisie ung de N2-Domäne ................................... 102
3.3.2 Im d G3P* EGDS sind die Wechselwi kungen zwischen den N- e minalen
Domänen d as isch e minde ..................................................................................... 107
3.3.3 Du ch die Subs i u ion de Schlei en egion wi d das ak i e In e media populie ...... 111
3.3.4 De d Phage geh du ch den Aus ausch de Schlei en egion und den dami
e bundenen Ve lus de Domänenin e ak ionen in den ak i en Zus and übe ........... 114
3.3.5 De Aus ausch de e s en Schlei e on N1 kompensie die Ve besse ung de
Domänenin e ak ion du ch die zusä zlichen Subs i u ionen des d G3P* IIHY ........... 116
3.4Aus ausch de TolAC-Bindedomäne im d G3P* du ch die homologe N1-Domäne des
ilamen ösen Phagen IF1 ............................................................................................... 121
3.4.1 Du ch den Einbau on IF1-N1 in die s abilisie e Va ian e d G3P* IIHY we den
beide Domänen des abilisie ........................................................................................ 122
3.4.2 In de Chimä e d G3P* IF1-N1DDKTLD IHY liegen die Domänen IF1-N1DDKTLD und
N2 in nich assoziie e Fo m o .................................................................................. 125
3.4.3 Du ch die Gegenwa de N2-Domäne wi d die A ini ä de IF1-N1-Domäne in
de Chimä e ü TolAC-AEDANS nich beein luss .................................................... 128
3.5 Die Bedeu ung des dis alen Se in-Glycin- eichen Linke s ü die S abili ä und
Funk ionali ä des d G3P ............................................................................................. 134
3.5.1 Die Ve kü zung des dis alen Linke be eiches ha keinen Ein luss au die S abili ä
und Fal ung de N- e minalen Domänen des WT d G3P* ........................................... 135
3.5.2 Die A ini ä de N1-Domäne ü TolAC is unabhängig on de Länge des dis alen
Linke s des G3P* .......................................................................................................... 139
3.5.3 d Phagen mi e kü z em dis alem Linke haben bei de P opaga ion gegenübe
dem Wild yp-Phagen keinen Nach eil .......................................................................... 142
3.6 S uk u elle und ene ge ische G undlagen de Dime isie ung des G1-P o eins ................. 145
3.6.1 Die hohe S abili ä de Va ian e G1-M2 wi d zum Teil beding du ch die
Ausbildung on Dime en .............................................................................................. 146
3.6.2 Leucin es e an den Posi ionen 16 und 37 üh en zu Dime isie ung des
G1-P o eins ................................................................................................................. 149
3.6.3 Die Assozia ion de Monome e des G1-M2 wi d e mi el übe hyd ophobe
Wechselwi kungen und die Ausbildung eines in e molekula en -Fal bla es ............. 152
3.6.4 Die Na u des Res es an Posi ion 33 ha keinen Ein luss au die Tendenz des G1-
M2 zu Dime isie ung ................................................................................................... 156
3.6.5 Analyse des Fal ungsmechanismus de hype s abilen Va ian e G1-M2 ..................... 157
3.6.6 Übe Doppelmischexpe imen e kann die En al ungs eak ion de monome en Fo m
des G1-M2 sich ba gemach we den .......................................................................... 161
3.6.7 Die Dissozia ionskons an e des G1-M2-Dime s lieg im nanomola en Be eich ........ 165
4.Zusammen assende Diskussion ....................................................................................................169
4.1 Die S abili ä de Gelenk egion beein luss die Funk ionali ä des G3P .............................. 170
4.1.1Die ak i e Fo m des WT d G3P* lieg nich im lose-assoziie en Zus and o ........... 170
4.1.2 Im langlebigen In e media is die A ini ä de N1-Domäne des G3P* gegenübe
TolAC deu lich e höh .................................................................................................. 171
4.2Die Sequenz um P o213 egulie den Übe gang in den gedock en Zus and des G3P ......... 172
4.2.1 Du ch die Subs i u ion des P o213 gegen Glycin lieg das Wild yp-G3P zum Teil in
geö ne e Fo m o ...................................................................................................... 172
4.2.2 Die Auswi kung de Aus ausche Q212A und P214A is abhängig on de Na u des
Res es an Posi ion 213 .................................................................................................. 173
4.3Die In e ak ion de e s en Schlei e on N1 mi dem globulä en Teil on N2 s abilisie
den assoziie en Zus and ............................................................................................... 175
i
4.4Die N1-Domäne des IF1 Phagen kann o z de s uk u ellen Ähnlichkei zu d-N1 diese
unk ionell nich olls ändig e se zen ........................................................................... 177
4.5 De dis ale Linke zwischen den N- e minalen Domänen ha keinen Ein luss au die
In ek ion und Ve meh ung des d Phagen .................................................................... 178
4.6 G1 kann du ch zwei Aus ausche in ein Dime umgewandel we den ............................... 179
4.6.1 Die hype s abile Va ian e G1-M2 wi d du ch die Ausbildung on Dime en
zusä zlich s a k s abilisie ............................................................................................ 179
4.6.2 S abilisie ung on G1 mi els P oside – Selek ion au dime e Va ian en? ................ 180
4.6.3 Übe die Analyse des Fal ungsmechanismus kann sowohl die S abili ä de
monome en Spezies als auch die des Komplexes e mi el we den ............................. 180
5.Publika ionslis e ........................................................................................................................... 183
6.Zusammen assung ....................................................................................................................... 185
7.Summa y ...................................................................................................................................... 189
8.Abkü zungs e zeichnis ................................................................................................................ 193
9.Li e a u e zeichnis ..................................................................................................................... 197
10.Anhang ......................................................................................................................................... 205
Einlei ung
1
1 Einlei ung
Die Diskussion um umwel schonende Ene giegewinnung und de en e izien e e Nu zung sind
ak uelle denn je, o allem o dem Hin e g und, dass ossile B enns o e wie Kohle ode
E döl die Umwel belas en und zudem nu beg enz e ügba sind. De Geb auch de
Ke nene gie s eh eben alls in de K i ik, nich zule z angesich s de bislang ungeklä en
F age de Endlage ung de adioak i en Ke nb enns äbe. Aus diesem G und wi d mi le weile
e s ä k die Nu zung on Wind-, Wasse - und Sonnenene gie ge ö de .
Ge ade die En wicklung on Pho o ol aikanlagen mi hohem Wi kungsg ad ha sich
jedoch als schwie ig e wiesen, weshalb mi le weile auch ungewöhnliche Ansä ze e olg
we den. So konn e die A bei sg uppe um Angela Belche du ch die Ve wendung on
gene isch e ände en M13 Bak e iophagen zum einen als Ge üs ma e ial ü kohlens o -
hal ige Nano öh en, zum ande en als Obe läche zu Anlage ung on TiO2, einem wich igen
Bes and eil ih e a bs o sensibilisie en Sola zellen, de en E izienz um as ein D i el on
8 au 10,6 % s eige n.1
Neben de G öße diese ü den Menschen unge äh lichen Phagen we den ih e einhei liche
d eidimensionale S uk u und die übe gene ische Manipula ion s eue ba en Eigenscha en
ih e Obe lächenp o eine genu z , um un e ande em e izien e Li hium-Ba e ien,
Ka alysa o en und halblei ende Nanod äh e zu en wickeln.2-5 Ein wei e e Vo eil des
ilamen ösen M13 Phagen lieg in de e häl nismäßig ein achen He s ellung g oße Mengen
du ch die Anzuch en sp echend in izie e Bak e iens ämme.6; 7 Die Kenn nis de s uk u-
ellen und he modynamischen Eigenscha en de Vi usp o eine sowie de en Funk ion bei de
Ve meh ung diese ilamen ösen Bak e iophagen is dahe eine wich ige G undlage ü die
En wicklung und He s ellung i us-basie e Nano echnologiep oduk e.
1.1 Au bau und Ve meh ung de F -Phagen
De ilamen öse Phage M13 gehö inne halb de Familie de Ino i idae zu Ga ung de
Ino i en.8 Die Ino i en, de en 6-7 kb g oße, zi kulä e Einzels ang-DNA (ssDNA) on einem
zylind ischen, jedoch lexiblen Filamen umgeben is , sind zwischen 1 und 2 µm lang .6; 9 Die
meis en de bekann en Ino i en nu zen G am-nega i e Bak e ien e schiedene Ga ungen
wie z.B. Esche ichia, Pseudomonas ode Salmonella als Wi so ganismen, wobei sie zu
In ek ion die au de Obe läche de Zellen be indlichen, einziehba en Pili als p imä e
Rezep o en e wenden.6 Im Gegensa z zu den nich ilamen ösen T4 ode -Phagen
e meh en sie sich jedoch ohne die Bak e ienzellen zu lysie en.8; 9 Die Phagenpa ikel we den
ielmeh übe eine in de Memb an de Wi szelle gebilde e Po e eigese z .6 Vom
ilamen ösen Phagen P 4 aus Pseudomonas ae uginosa is soga bekann , dass e eine
wich ige Rolle ü die Dynamik des Bio ilms de Wi szelle und de en Vi ulenz spiel .10
Inne halb de Ga ung de Ino i en bilde de Bak e iophage M13 gemeinsam mi dem
1 Phagen und dem in diese A bei nähe un e such en d Phagen die G uppe de F Phagen
(F-Pili, ilamen ös), welche E. coli Zellen übe de en F-Pilus in izie en.8; 11 Die d ei Phagen-
Einlei ung
2
spezies 1, d und M13 weisen eine Iden i ä ih e ssDNA on 98,5 % au , wobei die neun
en hal enen Gene ü el P o eine codie en.6
Im Anschluss an die In ek ion du ch einen de F -Phagen, nachdem dessen ssDNA im
Cy osol du ch die DNA Polyme ase III de E. coli Zelle zu einem Doppels ang
e olls ändig wu de, komm es un e Einsa z des Gen-2-P o eins (G2P) des Phagen zu
Replika ion de DNA nach dem olling ci cle P inzip.6; 8 Die neu syn he isie e ssDNA wi d
zunächs du ch das G10P s abilisie und dami akkumulie , be o sie bis au eine spezi ische
Packungssequenz olls ändig on G5P-Molekülen bedeck wi d. Die Zusammense zung des
Phagen wi d ini iie du ch die Wechselwi kung des s ab ö migen ssDNA-G5P-Komplexes
mi dem aus G1P, G4P und G11P bes ehenden Expo komplex sowie den memb ans ändigen
G7P und G9P.6; 9; 12 Nachdem sich d ei bis ün Kopien diese beiden Hüllp o eine an die
Spi ze de Phagen-DNA gelage haben, komm es zu Elonga ion des Phagenpa ikels.
Gemäß dem gegenwä igen Modell bilden das G1P und G11P einen ATP-abhängigen Kanal
du ch die Cy oplasmamemb an, übe den mi Hil e des wi seigenen Thio edoxin die ssDNA
in das Pe iplasma anspo ie wi d.9; 13; 14 Das G5P wi d dabei du ch das in de
Cy oplasmamemb an lokalisie e G8P e se z , welches mi ca. 2700 Kopien den G oß eil de
Phagenhülle ausmach . Sobald die Phagen-DNA olls ändig on G8P umgeben is , lage n
sich d ei bis ün Kopien des G6P bzw. G3P an das un e e Ende, wodu ch de Phage
gleichzei ig on de inne en Memb an gelös wi d.15-17 Die abschließende F eise zung in das
Medium e olg übe die aus 14 Molekülen des G4P o mie e, ass ö mige Po e in de
äuße en Memb an.18
Anzahl und Posi ion de ün Obe lächenp o eine sind zwa bekann , alle dings besi z
jedes P o ein in Abhängigkei seine exponie en Sei eng uppen de inie e Bindungs-
eigenscha en. Dami ilamen öse Phagen als Ge üs z.B. zu spezi ischen Anlage ung on
TiO2 e wende we den können, muss olglich zunächs die A ini ä mindes ens eines ih e
Hüllp o eine gegenübe dem gewünsch en Ma e ial e höh we den. Bei den en sp echend
modi izie en Vi en e olg die Wechselwi kung mi dem In e ak ionspa ne nich di ek übe
die Res e des Hüllp o eins, sonde n wi d du ch ku ze Pep ide e mi el , die an einem Ende
des Phagenp o eines ange üg we den.2; 19; 20 Zu Iden i izie ung de am bes en geeigne en
Pep idsequenzen we den Selek ions e ah en au G undlage des sogenann en phage display
angewand .2; 7; 19; 20
1.2 Phage display zu Selek ion au e höh e Bindungsa ini ä
Die Me hode des phage display, welche 1985 on Geo ge P. Smi h un e Ve wendung des
ilamen ösen Phagen M13 en wo en wu de21, is mi le weile ein seh wei e b ei e es
bio echnologisches Ve ah en zu En wicklung he apeu ische ekombinan e An ikö pe , die
an de inie e Zielmoleküle binden.22-24 Da übe hinaus bie e das Ve ah en die Möglichkei
zu Iden i izie ung spezi ische Inhibi o en de ak i en bzw. allos e ischen Zen en on
Enzymen.25; 26
Einlei ung
3
Das P inzip des phage display basie au dem Sc eening on Phagenbiblio heken nach
Va ian en mi e höh e A ini ä gegenübe einem spezi ischen Bindungspa ne .21 Dazu
we den andomisie e Gensequenzen ku ze Pep ide ode auch P o eine so in das Gen eines
de Obe lächenp o eine des Phagen in eg ie , dass das esul ie ende Fusionsp oduk nach de
Assemblie ung an de Obe läche des Phagen p äsen ie wi d. Dami is die Ve knüp ung on
Geno- und Phäno yp gewäh leis e . Solche Biblio heken en hal en bis zu 1011 e schiedene
Phagen a ian en und we den anhand des sogenann en panning (engl. „Schwenken“) nach
hocha inen Va ian en du chsuch , indem nach de Inkuba ion mi dem an eine es en Phase
immobilisie en Zielp o ein du ch einen ode meh e e Waschsch i e ungebundene bzw.
schwach bindende Phagen en e n we den.25 Die anschließend eluie en Phagen mi hohe
A ini ä gegenübe dem Bindungspa ne we den eilweise du ch die In ek ion on
Wi szellen e iel äl ig und gegebenen alls eine wei e en Selek ions unde un e wo en.21; 25
Die Sequenz des selek ie en Polypep ids e gib sich du ch Sequenzie ung des en sp echenden
Be eiches de ssDNA des Phagen.
Die Me hode des phage display wi d haup sächlich zu Cha ak e isie ung bzw.
Ve besse ung on P o ein–P o ein–In e ak ionen e wende .26-28 Fü indus ielle Anwen-
dungen spielen jedoch neben den Bindungs- o allem auch die enzyma ischen Eigenscha en
on P o einen eine wich ige Rolle, da sie in de Regel eine hohe Selek i i ä besi zen.29; 30 Die
na ü liche E olu ion de P o eine is alle dings au ein ausgewogenes Ve häl nis zwischen
kon o ma ionelle S abili ä und de ü die Funk ion wich igen Flexibili ä ausge ich e ,
weshalb in ielen Indus iezweigen zu bio echnologischen He s ellung on P oduk en
Enzyme he mophile bzw. hype he mophile O ganismen e wende we den.31-33 Dies ha
den Vo eil, dass echnische Ve ah en bei höhe en Tempe a u en du chge üh we den
können, wodu ch die Löslichkei de Reak an en sowie die Reak ions a en ges eige und
gleichzei ig mik obiologische Kon amina ionen eduzie we den.34; 35 Zudem beschä ig sich
de Fo schungsbe eich des sogenann en p o ein enginee ing mi de En wicklung
maßgeschneide e P o eine mi op imie en ode ollkommen neuen Eigenscha en. Neben
de a ionalen Mu agenese 36-38 und dem compu e ges ü z en Design39-41 we den dabei auch
(Phagen-)Display e ah en zu ge ich e en E olu ion e wende , um nich nu Enzyme mi
ges eige e Ak i i ä sonde n auch hohe he mische S abili ä zu e hal en.42-46
1.3 Selek ion au e höh e S abili ä – das P oside-Ve ah en
Das phage display au e höh e S abili ä basie au de selek i en Bindung s abilisie e
Va ian en eines P o eins an immobilisie e Liganden und is dahe abhängig on dessen
Bindungseigenscha en.44; 47 Eine Al e na i e dazu s ell das Selek ionssys em P oside
(P o ein s abili y inc eased by di ec ed e olu ion) da .48; 49 Es e knüp die In ek iosi ä des
ilamen ösen Phagen d mi de p o eoly ischen S abili ä des in das phageneigene G3P
eingebau en Gas p o eins (Abbildung 1.1a). Dabei wi d die Ta sache ausgenu z , dass
P o eine im na i en, ge al e en Zus and übliche weise wenige emp indlich gegenübe
Einlei ung
10
lokal en al e e Umgebung des P olin es es, wodu ch au g und de höhe en Flexibili ä de
isome e Zus and nich ixie we den kann.111; 112 Es gib jedoch auch Hinweise da au , dass
die Isome isie ung zwischen den beiden Kon o ma ionen als molekula e Schal e eingese z
wi d. So zeig die SH2-Domäne de Ty osinkinase I k in Abhängigkei on de Kon o ma ion
des P olin es es 287 eine un e schiedlich s a ke A ini ä zu seinen al e na i en Subs a en,
de I k-SH3-Domäne und einem phospho y osinhal igen Pep id.113; 114
En gegen ühe e Ve mu ungen is in de Regel de Übe gang om en al e en Zus and in
ein eilweise ge al e es In e media auch dann möglich, wenn einige de P olin es e noch in
ih e nich -na i en Kon igu a ion o liegen. Die anschließende Einnahme de na i en
Kon o ma ion wi d limi ie du ch die Isome isie ung de unko ek en Pep idylp olylbindung.
Au g und des pa iellen Doppelbindungscha ak e s de Bindung is die Ene gieba ie e
zwischen den Isome en alle dings seh hoch (e wa 80 kJ mol-1) und dahe läu die Reak ion
mi Zei kons an en zwischen 10 und 100 s (bei 25 °C) langsam ab.106; 115 Sie is jedoch du ch
sogenann e P olylisome asen wie Cyclophilin, den T igge ak o ode SlyD ka alysie -
ba . 116-119
Ta sächlich konn e gezeig we den, dass auch die Zei kons an e de Inak i ie ung des
d Phagen, dessen N2-Domäne des G3P mi P o161 im globulä en Teil und P o213 in de
Gelenk egion gleich zwei cis-P olin es e en häl (Abbildung 1.2), du ch Cyclophilin18
deu lich beschleunig wi d.96; 120 Da zudem de d Phage, in dessen G3P P o213 gegen Glycin
ausge ausch wu de, deu lich schnelle in die assoziie e Fo m übe geh als de Wild yp-
Phage, konn e diese in de Gelenk egion gelegene P olin es eindeu ig als Zei gebe de
Lebensdaue des ak i en, geö ne en Zus andes iden i izie we den.96 Die auch im Ve gleich
zu bekann en P olylisome isie ungen in Pep iden und P o einen e häl nismäßig langsame
Ra e on 5700 s wi d dabei e u sach du ch die lokale Sequenz um P o213. De Aus ausch
eines de beiden lankie enden Res e Gln212 bzw. P o214 (Abbildung 1.2) üh eben alls zu
eine beschleunig en Einnahme de inak i en Fo m des Phagen. Die lokale Sequenz um
P o213 des G3P ungie demnach als Schal e de In ek ion on E. coli Zellen du ch den
d Phagen.96
1.6 Die Fal ung des G3P* ko elie mi dem In ek ionsmechanismus des
d Phagen
Die Eins ellung des cis/ ans-Gleichgewich es an P o213 is nich nu de Zei gebe ü den
In ek ionsp ozess sonde n auch de a enlimi ie ende Sch i wäh end de Einnahme des
na i en Zus andes des G3P. Dies konn e un e ande em anhand des Fal ungsmechanismus des
N1N2-F agmen es de übe die P oside-Me hode s abilisie en Va ian e d G3P* IIHY
gezeig we den, in de eilge al e e In e media e besse cha ak e isie we den konn en, da sie
s abile sind.121; 122 Dieses P o ein, in dem o allem die N2-Domäne s a k s abilisie is ,
beinhal e mi T101I und Q129H zwei Subs i u ionen in de Gelenk egion. Die ande en
beiden Aus ausche T13I und D209Y sind in de N1-Domäne bzw. dem globulä en Teil de
N2-Domäne lokalisie (Abbildung 1.4a).
Einlei ung
11
Abbildung 1.4: De Fal ungsmechanismus de s abilisie en Va ian e d G3P* IIHY.
a) Te iä s uk u des N1N2-F agmen s on WT d G3P*. Die Res e P o161, Gln212, P o213 und P o214 sowie
die Posi ionen de s abilisie enden Subs i u ionen im d G3P* IIHY sind als S äbchen-Modelle gezeig . Die N1-
Domäne is in o , de globulä e Teil on N2 in blau und die Gelenk egion in g ün da ges ell . Die Abbildung
wu de anhand de PDB-S uk u 2G3P60 mi dem P og amm Pymol123 e s ell . b) Modell des
Fal ungsmechanismus on d G3P* IIHY. Angegeben sind die Zei kons an en de En al ungs eak ionen de
beiden N- e minalen Domänen bei 3,0 bzw. 4,5 M GdmCl sowie die Rück al ungs eak ionen in 0,5 M GdmCl.
Zu Beginn de Rück al ung geh zunächs die N1-Domäne in den na i en Zus and übe ( o es Quad a ). Die
Fal ung de N2-Domäne (blaues Quad a ) e olg in zwei sequenziellen Sch i en. Nach de kon o ma ionellen
Fal ung des globulä en Teils komm es nach dem Modell zu losen Assozia ion de Domänen. Die Einnahme de
na i en Kon o ma ion wi d du ch die anscis-Isome isie ung on P o213 e u sach , wodu ch die
Gelenk egion (g ünes Rech eck) ge al e wi d. Au g und de Assozia ion de Domänen is ih e En al ung nich
nu deu lich e langsam , sonde n auch gekoppel . Die Abbildung wu de nach Re e enz 122 modi izie .
Nach dem gegenwä igen Modell um ass die Fal ung des G3P* einen Zei be eich on
wenigen Millisekunden bis zu meh e en S unden, wobei de le z e Sch i du ch die
Isome isie ung on P o213 in die cis-Kon o ma ion limi ie wi d (Abbildung 1.4b).122
Wäh end de ühen Phase de Rück al ung ausgehend on olls ändig dena u ie em
P o ein (U) al e zunächs die s abile e N1-Domäne ( = 9,4 ms in 0,5 M GdmCl). Die
Zei kons an e en sp ich dabei de de isolie en N1-Domäne, was zeig , dass die
S uk u ie ung on N1 im G3P* unabhängig on de noch imme en al e en N2-Domäne
e olg . Diese al e mi deu liche Ve zöge ung in zwei sequenziellen Sch i en. Die
schnelle e de beiden Phasen mi eine Zei kons an e on 7 s spiegel dabei die
kon o ma ionelle Fal ung ih es globulä en Teils wide . De zwei e Sch i ( = 42 s in
0,5 M GdmCl) wi d de losen Assozia ion de beiden ge al e en Domänen zugesch ieben.122
Anhand on NMR-Expe imen en konn e zeig we den, dass in diesem Zus and ein g oße Teil
de Res e de Gelenk egion noch nich in de na i en Kon o ma ion o lieg .62 Die
Th 13
P o161
P o213
Asp209Th 101
Gln129 P o214
Gln212
a)
b)
Einlei ung
12
Bindungss elle ü den Memb an ezep o TolA au de N1-Domäne is in diese Fo m olglich
zugänglich. Da das In e media zudem langlebig is , wi d da on ausgegangen, dass es de
ak i en Fo m des G3P des d Phagen en sp ich . Die abschließende Einnahme des na i en
Zus andes (N) e olg du ch die anscis-Isome isie ung des P o213, wodu ch die
Gelenk egion in den na i en Zus and übe geh . Mi eine Zei kons an e on 6200 s lieg die
Geschwindigkei de Reak ion im Zei be eich de Inak i ie ung des d Phagen ( = 5700 s).96
Auch die En al ung des d G3P* IIHY wi d du ch die Kon o ma ion seines P o213
beein luss . Ausgehend on na i em P o ein mi cis-P o213 en al en die assemblie en
Domänen in einphasigen P ozessen mi de gleichen langsamen Geschwindigkei ( = 2500 s
in 3 M GdmCl, Abbildung 1.4).122 Die Isome isie ung des P olin es es in de Gelenk egion is
un e diesen Bedingungen demnach de a enlimi ie ende Sch i de En al ung beide
Domänen. Wäh end de In ek ion we den dagegen du ch die In e ak ion de N2-Domäne mi
dem Pilus die cis ans-Isome isie ung des P o213 und dami Dissozia ion de Domänen
ini iie . Aus dem en sp echenden In e media szus and des G3P* mi ans-P o213 is die
En al ung de beiden Domänen nich nu deu lich beschleunig sonde n auch oneinande
en koppel .122
1.7 P oblems ellung
De Fal ungsmechanismus des d G3P* IIHY bes ä ig , dass das G3P des Phagen ü die
In ek ion de E. coli Zellen zunächs ak i ie we den muss. Die da ü no wendige
Dissozia ion on N1 und N2 wi d he o ge u en du ch die cis ans-Isome isie ung des
P o213, in Folge de es zu pa iellen En al ung de Gelenk egion und dami de
Des abilisie ung de N2-Domäne komm . Bei de Un e suchung de Auswi kungen
zusä zliche des abilisie ende Aus ausche in de N2-Domäne au die S abili ä und den
Fal ungsmechanismus des G3P* ha sich jedoch gezeig , dass diese seh s a k om jeweiligen
Subs i u ionshin e g und abhängen. Wäh end einige Aus ausche im Wild yp-G3P*
(WT d G3P*) zu eine d as ischen Abnahme de S abili ä de N2-Domäne und de
En kopplung de En al ung de Domänen üh e, wu de ih E ek du ch die in de
s abilisie en Va ian e en hal enen Subs i u ionen as olls ändig kompensie . Aus diesem
G und soll e in Rahmen de o liegenden A bei zunächs die on Roman Jakob begonnene
Un e suchung de Fal ung des na ü lichen G3P* abgeschlossen we den.
Anhand de Analyse wu de deu lich, dass das na ü liche G3P* im Gegensa z zu
s abilisie en Va ian e wäh end de Rück al ung keine lose-assoziie e Kon o ma ion
einnimm . Die N2-Domäne in WT d G3P* wi d analog zu ih e isolie en Fo m lediglich
du ch die Isome isie ung des P olin es es 161 in seine na i e cis-Kon o ma ion s abilisie . Es
s ell e sich dahe die F age, inwiewei die En - und Rück al ungs eak ionen des WT d G3P*
nich nu du ch die Isome isie ung des P o213 sonde n auch des P o161 beein luss we den.
Um dies zu klä en, wu den zusä zlich die Fal ung de G3P*-Va ian en mi den Subs i u ionen
P161A bzw. P213G un e such .
Einlei ung
13
Von de Wechselwi kung zwischen den beiden N- e minalen Domänen häng nich nu die
S abili ä de N2-Domäne, sonde n auch die Zugänglichkei de Bindungs läche ü TolAC
au de N1-Domäne ab. Dahe wa zu e wa en, dass die geö ne e Fo m des WT d G3P*
deu lich besse mi TolAC in e agie en kann als die des d G3P* IIHY. Die Schal e sequenz
Gln212-P o213-P o214 beein luss eben alls die Popula ion des ak i en Zus andes, da sie
übe die Geschwindigkei de P olylisome isie ung die Ö nungs- und Schließ a e de
Domänen o gib . Du ch die Kombina ion on in i o und in i o Expe imen en soll e dahe
analysie we den, wie sich de Fal ungszus and des G3P* und die Va ia ion de lokalen
Sequenz um P o213 au die A ini ä des G3P ü TolAC auswi k .
Wäh end de In ek ion we den die no wendige Isome isie ung on P o213 und die da an
gekoppel e Dissozia ion de Domänen du ch die Bindung de N2-Domäne an die Spi ze des
Pilus ausgelös . Welche s uk u ellen Ve ände ungen du ch diese In e ak ion he o ge u en
we den und welche Be eiche des G3P an de Wei e lei ung des Signals zu Gelenk egion
be eilig sind, is jedoch nich bekann . Anhand de Subs i u ion eine Schlei ensequenz in de
In e ak ions läche de beiden Domänen, die Dele ion des dis alen Glycin-Se in- eichen
Linke s sowie den Aus ausch de N1-Domäne du ch die homologe N1-Domäne des Phagen
IF1 soll e de Ein luss diese S uk u elemen e au die Assozia ions ähigkei de N- e minalen
Domänen analysie we den. Diese In o ma ion e möglich Rückschlüsse au wei e e, ü die
S abilisie ung des gedock en Zus andes essen ielle, In e ak ionen im G3P, die olglich
wäh end de Dissozia ion de Domänen au gehoben we den müssen.
Mi Hil e des Selek ionssys ems P oside, das die In ek iosi ä des d Phagen an die
p o eoly ische S abili ä des eingebau en Gas p o eins koppel , konn en ü das G1-P o ein
meh e e s abilisie ende Subs i u ionen iden i izie we den. Die Kombina ion de bes en
Aus ausche e gab die Va ian e G1-M2, die im Ve gleich zum Wild yp-P o ein einen
deu lich höhe en Schmelzpunk besi z . Im zwei en Teil de A bei soll en die ene ge ischen
und s uk u ellen G undlagen diese S abilisie ung analysie we den. Dabei zeig e sich, dass
diese un e ande em du ch die Ausbildung on Dime en e u sach wi d, die auch du ch die
Va ia ion de Lösungsmi elbedingungen nich un e bunden we den konn e. Da die S abili ä
de monome en Fo m übe Gleichgewich sen al ung nich zugänglich wa , soll e anhand de
Fal ungskine iken de Va ian e e such we den, die kon o ma ionelle Fal ung des Monome s
on de Assozia ions- bzw. Dissozia ions eak ion de Moleküle zu ennen. Aus dem Ve lau
de En - und Rück al ungs a en könn e dann un e ande em die eie En halpie de En al ung
des Monome s bes imm und dami eine Aussage übe den s abilisie enden E ek de ie
en hal enen Subs i u ionen ge o en we den.
14
Ma e ialien und Me hoden
15
2 Ma e ial und Me hoden
2.1 Ma e ial
2.1.1 Bak e iens ämme und Plasmide
In de o liegenden A bei wu den olgende Bak e iens ämme e wende :
De E. coli S amm XL1 Blue wu de zu P oduk ion on Plasmid-DNA und zu P opaga ion des
d Phagen e wende . De S amm wu de genauso wie die E. coli TG1 Zellen und de pilus eie E. coli
HB2156 S amm ü In ek ionsexpe imen e benu z . De in diese A bei nähe un e such e d Phage
basie au dem Phagemid CKCBS.48; 125
Die Exp ession on P o einen e olg e in E. coli BL21 (DE3) Zellen. Als Vek o ü die Klonie ung
und Exp ession de P o ein-Va ian en wu de das Plasmid pET11a (AmpR, NOVAGEN, Madison,
USA) e wende . Das in diesen Vek o klonie e Gen wu de dabei un e Kon olle eines T7-P omo o s
geb ach .
2.1.2 Näh medien
dYT-Medium: 5 g l-1 NaCl; 10 g l-1 He eex ak ; 16 g l-1 Pep on aus Casein
Näh böden: dYT-Medium mi 1,5 % (w/ ) Aga -Aga
Die Näh medien wu den du ch Au okla ie en (120 °C; 20 min; 2 ba ) s e ilisie . An ibio ika zu
Selek ion au Resis enzen wu den nach dem Au okla ie en als s e il il ie e S ammlösungen zu den
Näh medien gegeben (Amp: 300 µg ml-1, Cm: 25 µg ml-1).
2.1.3 Enzyme, P o eine und Pep ide
Taq-DNA-Polyme ase (6 U/µl) S. Ho mann-Thoms (Bay eu h)
P u-DNA-Polyme ase (3 U/µl) MBI Fe men as (Vilnius, LT)
T4-DNA-Ligase (1 Weiss U/µl)
T4-Polynukleo idkinase (10 U/µl)
Res ik ionsenzyme:
BamHI, NdeI (20 U/µl)
BenchMa kTM P o eins anda d
bo ines Se umalbumin (BSA 100x, 100 mg/ml) NEB (F ank u a. Main)
Abz-Ala-Ala-P o-Ala-Ala-pNa D . G. Jah eis (MPI, Halle)
Die im Rahmen de A bei ü Messungen e wende en P o eine d G3P* G153D, d G3P* Q212A,
d G3P* P212A, d G3P* P213G, sowie d G3P* IIHY P213G und d G3P* IIHY P161A wu den on
E. coli XL1 Blue ecA1 endA1 gy A96 hi-1 hsdR17 ( K-mK+) supE44 elA1
lac [F`p oAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Te R)]
S a agene
(La Jolla, USA)
E. coli BL21 (DE3) B F- dcm ompT hsdS ( B– mB–) gal λ(DE3)
E. coli TG1 F´ aD36 lacIq Δ(lacZ)M15 p oA+B+/supE Δ(hsdM-mc B)
5 ( k-, mk+Mc B-), hiΔ (lac-p oAB)
E. coli HB 2156 supE hi-1 (lac-p o-AB)
(mc B-hsdSM)5 ( k-, mk+) Re e enz 124
Ma e ialien und Me hoden
16
Ba ba a Ecke zu Ve ügung ges ell .79 Vo de Ve wendung wu den diese Va ian en, wie un e
2.9.2.3 besch ieben, eine Gel il a ionsch oma og aphie un e zogen. Die Va ian en d G3P* AGA
und isolie e N2-Domäne bzw. d G3P* APA wu den on Roman Jakob bzw. Johanna Koch
he ges ell . Die P o eine d G3P* IIHY 6 und d G3P* IIHY APA wu den on S e an Lo enz bzw.
Ch is ian Wunschel e hal en.80; 126 Von Anna Schneide wu de im Rahmen eines on mi be eu en
P ak ikums die Va ian e d G3P* EGDS ge einig . Die P olylisome ase hFKBP12+IF127 wu de on
Anne-Juliane Gei ne zu Ve ügung ges ell . Einige de G1-P o eine wu den on Michael
Wunde lich e hal en.128
2.1.4 Oligodesoxy ibonukleo ide
Die zu Klonie ung de jeweiligen P o ein-Va ian en bzw. zu He s ellung on Phagen a ian en
e wende en Oligodesoxy ibonukleo ide wu den on de Fi ma INVITROGEN (Ka ls uhe, D)
bezogen und sind in Tabelle 10.5 im Anhang au ge üh .
DNA-Längens anda ds:
λ-DNA/Eco 130 I: 421-19329 bp MBI Fe men as (Vilnius; LT)
bp-Lei e : 100-1500 bp Johanna Koch (Bay eu h)
2.1.5 Chemikalien
Imidazol, Chlo o o m/Isoamylalkohol, PEG-8000 Fluka (Neu-Ulm)
Isop opyl-β-D- hiogalac osid (IPTG), Ha ns o Ge bu (Gaibe g)
1,5-IAEDANS ( > 90%)
Guanidiniumchlo id (ul a pu e) MP (Biomedicals, I ine, USA)
Adenosin-5’-T iphospha , Ampicillin, Ac ylamid/ N,N’- Ro h (Ka ls uhe)
Me hylenbisac ylamidlösung (37,5:1 “Ro ipho ese 30”),
Desoxy ibonukleo ide, EDTA, E hidiumb omid,
Glu a hion ox. (GSSG), Glu a hion ed. (GSH),
N,N,N´,N´-Te ame hylene hylendiamin (TEMED),
N-(T i(hyd oxyme hyl)me hyl)glycin (T icin),
T is-(hyd oxyme hyl)-aminome han (T is),
T is-(2-ca boxye hyl)-phosphinhyd ochlo id (TCEP)
Aga ose, APS, SDS Se a (Heidelbe g)
Coomassie B illina Blue G-250, Silica (S-5631), Sigma Ald ich (Deisenho en)
B omphenolblau
Alle wei e en Chemikalien wu den im Reinhei sg ad p.A. on de Fi ma VWR (Da ms ad ) bezogen.
Das ü Pu e und Lösungen e wende e Wasse wu de mi eine Se alpu -Reins wasse anlage
deionisie (ddH2O, Lei ähigkei < 0,1 μS cm-1). Pu e ü spek oskopische Messungen wu den
du ch 0,45 μm-Nylon il e il ie und o Geb auch mindes ens 30 min lang en gas .
2.1.6 Ve b auchsma e ialien
Ni-NTA-Supe low-Aga ose-Säule Qiagen (Hilden)
NAP-5 und -10 Säulen (Sephadex G-25 DNA-g ade), GE Heal hca e (F eibu g, D)
Ma e ialien und Me hoden
17
Gel il a ionssäule HiLoad Supe dex 75
(16/60 und 26/60 p ep g ade)
F ac ogel EMI TMAE-650 Anionenaus ausche säule
Konzen a o en Amicon Ul a-15(3,5 kDa Ausschluss), Millipo e (Bille ica, USA)
Millipo e Fil e Typ VS 0,025 µm
Spec opo Dialyseschläuch (>3,5 kDa) Spec um (Los Angeles, USA)
Ro ilabo Sp i zen il e (0,45; 0,2 µm) Sa s ed (Nü nb ech )
Memb an il e (0,2 µm) Schleiche & Schuell (Dassel)
2.1.7 Ge ä e
DX.17MV sequen ial Applied Pho ophysics,
s opped- low-Fluo eszenzspek ome e (Lea he head, GB)
T ansillumina o 302 nm Bachho e (Reu lingen)
Kühlzen i uge So all RC-5Bplus Du Pon (Bad Hombu g)
Ro o en GS-3 und SS-34
Zen i uge 5415 R, Mas e cycle G adien , Eppendo (Hambu g)
The momixe 5436
FPLC-Anlage, ÄKTA-FPLC (academic edi ion), GE Heal hca e (F eibu g)
Ve ikalelek opho esekamme 2050 MIDGET
und Ne zge a 2301 Mac o
P äzisionskü e en aus Qua zglas Sup asil Hellma (Mühlheim)
Labo uge 400 R He aeus (Hanau)
Zen i uge Z 216 MK He mle (Wehingen)
Zen i uge 5415 R Eppendo (Hambu g)
Re ak ome e K üss (Hambu g)
Bio-P in Da k oom CN-UV/Vis LTF-Labo echnik (Wasse bu g)
Mic o luidize M-110L Mic o luidics (New on, USA)
The mocycle PTC 100 MJ Resea ch (Wa e own, USA)
en i onmen al incuba o shake G24, New B unswick Scien i ic
Inno a 3000, incuba o shake C24 (Edison, USA)
Easyjec P ima Elek opo a ionsappa a u Peqlab (E langen)
Labo waage L610D, Analysenwaage R200D Sa o ius (Gö ingen)
Wasse au be ei ung: Se alpu p o 90 CN Se al (Ransbach)
UV/VIS-Dioden-A ay Spec ome e 8452A Hewle -Packa d (Waldb onn)
Hi achi-Fluo eszenzspek opho ome e F-4010 Hi achi (Tokio, J)
Spek opola ime e Jasco J-600, Pel ie elemen PTC-348 Jasco (G oß-Ums ad )
Jasco-Fluo eszenzpek opho ome e FP-6500
VP-DSC Mik okalo ime e Mic oCal (No hamp on, USA)
UV/Vis-Spek opho ome e : Ca y 100 Bio Va ian (Da ms ad )
Memb an-Vakuumpumpe Vakuub and (We heim)
Mik op ozesso pH-Me e : WTW pH 537 WTW (Weilheim)
2.1.8 Compu e p og amme
Biocap LTF-Labo echnik (Wasse bu g)
BioEdi Hall, T. (Ibis The apeu ics, USA)
Ma e ialien und Me hoden
18
Ch omas 1.4.5 Technelysium (Helens ale, AUS)
G a i 3.0 / 5.0 E i hacus (Middlesex, UK)
ImageJ 1.30 Rasband, W. (NIH, Be hesda, USA)
O igin 5.0 O iginLab Co po a ion (USA)
Pymol DeLanoScien i ic (San F ancisco, USA)
Scien is 2.01 Mic oma h (S . Louis, USA)
Swiss-Pdb Viewe Ve sion 3.7 GlaxoSmi hKline (München, D)129
DynaFi Re e enz
130; 131
2.2 Gelelek opho e ische Me hoden
2.2.1 Aga ose-Gelelek opho ese
TAE-Pu e (1x): 40 mM T is/HCl, pHRT 8,0; 20 mM Eisessig; 1 mM EDTA
P obenpu e (6x): 4 M Ha ns o ; 10 mM EDTA; 0,1 % (w/ ) B omphenolblau; 50 % ( / )
Glyce in
Zu p äpa a i en Reinigung on DNA-F agmen en und Plasmide sowie de Au ennung und
Iden i izie ung on DNA-F agmen en wu de die Me hode de ho izon alen Aga ose-
Gelelek opho ese e wende . Je nach G öße de zu analysie enden F agmen e wu de die
Konzen a ion an Aga ose zwischen 0,6 und 3,0 % (w/ ) a iie . Die P oben wu den mi 16
Volumen
an P obenpu e gemisch und au das Gel au ge agen. Die Gelelek opho ese e olg e 30 min lang in
eine ho izon alen Elek opho esekamme mi 0,5x TAE-Pu e und eine angeleg en Spannung on
6 V p o cm Elek odenabs and. Zu Fä bung de DNA-Banden wu de das Gel in E hidiumb omid-
Fä belösung (ca. 2 µg ml-1) 5 min lang geleg . Nach ku ze En ä bung in 0,5x TAE-Pu e wu den die
DNA-Banden un e UV-Lich ( = 302 nm) iden i izie .
2.2.2 Diskon inuie liche Polyac ylamid-Gelelek opho ese (SDS-PAGE)
Sammelgel: 4,2 % (w/ ) Ac ylamid (S ammlösung mi 37,5:1 Ac ylamid/N,N’-
Me hylenbisac ylamid); 0,75 M T is/HCl, pHRT 8,45; 0,07 % (w/ ) SDS
T enngel: 2,5 % (w/ ) Ac ylamid (S ammlösung s.o.); 1 M T is/HCl, pHRT 8,45;
0,1 % (w/ ) SDS
P obenpu e (4x): 0,2 M T is/HCl pHRT 7,0; 0,12 M DTE; 40 mM EDTA; 48 % ( / )
Glyce in; 15 % (w/ ) SDS; 0,04 % (w/ ) B omphenolblau
Anoden-Pu e : 0,2 M T is/HCl pHRT 8,9
Ka hoden-Pu e : 0,1 M T is/HCl pHRT 8,2; 0,1 M T icin; 0,1 % (w/ ) SDS
Fä belösung: 25 % ( / ) Isop opanol; 10 % ( / ) Essigsäu e; 0,05 % (w/ ) Coomassie-
B illian Blue G
En ä belösung: 10 % ( / ) Essigsäu e
Die Me hode de Gelelek opho ese nach Schägge und on Jagow132 wi d e wende , um dena u ie e
P o eine nach ih e ela i en G öße zwischen ün und 100 kDa au zu ennen, wobei T icin als
Folgeion eingese z wi d. Zu Vo be ei ung de P oben wu den die P o einlösungen (e wa 2,5 µg)
jeweils mi 14
P obenpu e e se z und zu Dena u ie ung ü 10 min in einem Wasse bad e hi z .
Die Gelelek opho ese wu de in eine gekühl en MIDGET-Ve ikalelek opho esekamme bei 7 °C
du chge üh . Fü den Lau de P oben du ch das Sammelgel wu de eine Spannung on 20 mA
angeleg , welche zum Au ennen de P o eine im T enngel au 45 mA e höh wu de. Nach
Ma e ialien und Me hoden
19
Beendigung de Gelelek opho ese wu den die P o einbanden im Gel du ch ku zes E hi zen und
10-minü ige Inkuba ion mi Fä belösung ange ä b . Die En ä bung in En ä belösung e olg e du ch
E hi zen und anschließende Inkuba ion des Gels ü meh e e S unden bei RT.
2.3 Isolie ung und Reinigung on DNA
2.3.1 P äpa a ion doppels ängige DNA
Um doppels ängige Plasmid- bzw. Phagen-DNA zu p äpa ie en wu den Kul u en de jeweiligen
E. coli Zellen übe Nach bei 37 °C inkubie . Von diese Übe nach kul u wu den 1,5 ml en nommen,
abzen i ugie und aus dem esul ie enden Zellpelle mi Hil e des Pha macia-FlexiP ep-Ki
(GE Heal hca e, F eibu g, D) gemäß den He s elle angaben die DNA p äpa ie . Die Elu ion de DNA
on de Anionenaus ausche ma ix e olg e mi 50 µl ddH2O.
2.3.2 P äpa a ion einzels ängige DNA
TE-Pu e : 10 mM T is/HCl, pHRT 8,0; 1 mM EDTA
Zu Isolie ung einzels ängige Phagen-DNA wu de das nach 2.7.1 e hal ene Phagenpelle in 100 μl
TE-Pu e esuspendie . Um die P o einhülle des Phagen zu en e nen, wu den 50 μl Phenol/T is
zugegeben, de Ansa z 30 s lang geschü el und anschließend zu Phasen ennung zen i ugie
(13000 pm, 4 °C, 1 min). Die ssDNA-hal ige Obe phase wu de abgenommen und un e den gleichen
Bedingungen eine Chlo o o m/Isoamylalkohol-Fällung (Ve häl nis 24:1) du chge üh . De Übe s and
wu de mi 300 µl E hanol/ 3 M Na-Ace a (25:1), pH 5,2 e se z und 15 min lang bei RT zu
P äzipi a ion de ssDNA inkubie . Nach 10-minü ige Zen i uga ion (13000 pm, 4 °C) wu de das
ssDNA-Pelle mi 200 μl 70 % E hanol gewaschen, 10 min bei RT ge ockne und in 30 μl ddH2O
esuspendie .
2.3.3 Elu ion on DNA aus Aga ose-Gelen
Waschpu e : 50 mM NaCl; 10 mM T is/HCl pHRT 7,5; 2,5 mM EDTA; 50 % ( / )
E hanol
Silica-Suspension: 1 g Silica in 10 ml 3 M NaI
Zu Reinigung und Ab ennung on DNA-F agmen en on solchen ande e Länge nach einem
Res ik ionsschni ode eine PCR wu de die DNA im Aga osegel au ge enn (2.2.1), das gewünsch e
F agmen ausgeschni en und in ein Reak ionsge äß übe üh . Zu dem F agmen wu den zwei
Volumina 6 M NaI zugegeben und de Ansa z bei 55 °C 5 min lang geschü el , um das Gels ück
olls ändig zu lösen. Anschließend wu de ein geeigne es Volumen Silica-Suspension (10 µl en hal en
1 mg Silica, an das bei genügend hohe Ionens ä ke ca. 3 µg DNA binden) hinzuge üg und de Ansa z
5 min au Eis inkubie . Nach ku zem Zen i ugie en wu de das esul ie ende Pelle d eimal mi je
500 µl Waschpu e gewaschen. Nach olls ändige En e nung des Pu e s wu de das in 30 µl ddH2O
au genommene Pelle zu Elu ion de DNA bei 45 °C 5 min lang un e Schü eln eluie . Nach e neu e
Zen i uga ion wu de de Übe s and in ein neues Reak ionsge äß übe üh und bei -20 °C gelage .
Das gleiche Ve ah en wu de in leich abgewandel e Fo m auch zu En salzung on DNA z.B. nach
Ma e ialien und Me hoden
26
2.9.1.2 Anionenaus auschch oma og aphie
Au agspu e : 20 mM T is/HCl, pHRT 8,0
Elu ionspu e : 20 mM T is/HCl, pHRT 8,0; 1 M NaCl
Nach dem Hi zesch i wu de de Zellex ak zunächs in Au agspu e ein ach e dünn und dann
mi Hil e eine P1-Pumpe (GE Heal hca e, F eibu g, D) mi eine Flussgeschwindigkei on
5 ml min-1 au eine mi Au agspu e äquilib ie e F ac ogel EMI TMAE-650 Anionen-
aus ausche säule au ge agen. Nach Waschen mi Au agspu e ü 70 min wu de du ch einen
gleichmäßig ans eigenden G adien en an Elu ionspu e mi de Elu ion begonnen, wobei das Elua in
5 ml F ak ionen (Elu ionsgeschwindigkei : 5 ml min-1) gesammel wu de. Das Vo handensein on
P o ein in den einzelnen F ak ionen wu de de ek ie du ch die gleichzei ige Messung de Abso p ion
bei 280 nm. Die F ak ionen, in denen das G1-P o ein en hal en wa , wu den e einig und mi Hil e
on Konzen a o en mi einem Ausschlussgewich on ün kDa (Amicon Ul a, Millipo e)
konzen ie .
2.9.1.3 Gel il a ionsch oma og aphie
Gel il a ionspu e : 20 mM T is/HCl, pHRT 8,0
Die au ein Volumen on 5 ml konzen ie e P o einlösung wu de au eine in Gel il a ionspu e
äquilib ie e Hiload-Supe dexTM 75 26/60 p ep g ade-Gel il a ionssäule (GE Heal hca e, F eibu g,
D) au gesp i z und au ge enn . Dazu wu de die beladene Säule zunächs 70 min lang mi
Gel il a ionspu e gewaschen (Fluss a e 2,5 ml min-1) und danach mi de Sammlung on 80 2,5 ml
F ak ionen begonnen. Die De ek ion des P o eins e olg e wiede um du ch Messung de Abso p ion
bei 280 nm. Fü die anschließenden Messungen wu den die F ak ionen, in denen das G1-P o ein
en hal en wa , e einig , au ein Volumen on 2 ml konzen ie und bei -20 °C gelage .
2.9.2 Isolie ung de G3P*-Va ian en und de isolie en N1-Domäne aus inclusion
bodies
2.9.2.1 Reinigung de inclusion bodies
Waschpu e 1: 1 mM EDTA; 1 mg ml-1 Desoxychola ; 20 mM DTT; pHRT 8,0
Lyse-Pu e : 50 mM T is/HCl pHRT 8,0; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA; 20 mM DTT
Waschpu e 2: 0,1 M T is/HCl, pHRT 8,5; 1 mM EDTA; 50 mM GSH
Die G3P*-Va ian en und die isolie e N1-Domäne des d Phagen wu den nach dem Zellau schluss und
de anschließenden Zen i uga ion (2.8.2) aus dem esul ie enden Pelle ge einig . Dazu wu de dieses
in 15 ml Waschpu e mi zusä zlich 0,2 mg ml-1 Lysozym g ündlich esuspendie und e neu
zen i ugie (20 min, 12000 pm, 4 °C, SS-34-Ro o ). Um die Zell ümme olls ändig zu en e nen,
wu den diese Waschsch i noch d eimal mi je 10 ml Waschpu e ohne Lysozym und d eimal mi je
10 ml Lysepu e wiede hol . Abschließend wu den die inclusion bodies mi Waschpu e 2
gewaschen, um das DTT zu en e nen.
Ma e ialien und Me hoden
27
2.9.2.2 Reduk i e En al ung und oxida i e Rück al ung
En al ungspu e : 0,1 M T is/HCl, pHRT 8,0; 1 mM EDTA; 6 M GdmCl; 50 mM GSH
Rück al ungspu e : 0,1 M T is/HCl, pHRT 8,5; 1 mM EDTA; 0,5 mM GSSG
Die in 2.9.2.1 ge einig en inclusion bodies wu den in 15 ml En al ungspu e esuspendie und un e
s ändigem Rüh en 2 h lang bei RT inkubie , um sie un e eduk i en Bedingungen zu en al en. Die
oxida i e Rück al ung de P o eine wu de du ch sch i weise Übe üh ung des En al ungsansa zes in
Rück al ungspu e ini iie , wodu ch die P o einlösung zehn ach e dünn wu de. Im Fall de G3P*-
Va ian en wu de de Ansa z mindes ens 6 h lang bei RT inkubie , um die Einnahme des na i en
Zus andes zu e möglichen. Die bei de Rück al ung au e enden Agg ega e wu den du ch
Zen i uga ion en e n (SS34-Ro o , 15000 pm, 20 min, 4 °C).
2.9.2.3 A ini ä sch oma og aphie und Gel il a ion
Pu e A: 50 mM T is/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl, 10 mM Imidazol
Pu e B: 50 mM T is/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 0,5 M Imidazol
Gel il a ionspu e : 0,1 M Kaliumphospha (KP), pH 7,0
De nach de Zen i uga ion in 2.9.2.2 e hal ene Übe s and wu de zu Komplexie ung des EDTA mi
50 mM MgCl2 e se z und mi Hil e eines Memb an il e s (Po eng öße 0,45 µm) il ie . De Ansa z
wu de anschließend in 10 mM Imidazol mi eine Fluss a e on 4 ml min-1 au eine mi Pu e A
äquilib ie e Ni-NTA-Säule au ge agen. Schwach bindende P o eine wu den du ch Waschen mi
Pu e A bei eine Fluss a e on 4 ml min-1 en e n . Die Elu ion des P o eins e olg e du ch die
E höhung de Imidazolkonzen a ion au 250 mM. Das To olumen de Säule (5 ml) wu de e wo en
und anschließend 25 ml als Elua gesammel . Zu Reinigung de Säule wu de diese mi 30 ml Pu e B
und abschließend mi ddH2O gewaschen.
Das p o einhal ige Elua wu de au 5 ml konzen ie und au eine mi Gel il a ionspu e
äquilib ie e HiLoad Supe dex 75 (16/60) p ep g ade-Säule au ge agen und das gewünsch e P o ein
mi eine Fluss a e on 1,7 ml min-1 eluie . Die e einig en F ak ionen aus de Gel il a ion wu den
au ein Volumen on 1,5 ml konzen ie und bei -20 °C gelage .
2.9.3 Reinigung de isolie en N1-Domäne des G3P des IF1 Phagen als SUMO-Fusion
2.9.3.1 A ini ä sch oma og aphie zu Reinigung de SUMO-Fusionsp o eine
En al ungspu e : 50 mM T is/HCl, pHRT 8,0; 0,1 M KCl; 50 mM -Me cap oe hanol;
6 M GdmCl
Waschpu e : 50 mM T is/HCl, pHRT 8,0; 0,1 M KCl; 6 M GdmCl
Rück al ungspu e : 50 mM T is/HCl, pHRT 8,0; 0,1 M KCl; 6 M GdmCl; 5 mM GSH;
1 mM GSSG
Pu e A: 50 mM T is/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 10 mM Imidazol
Pu e B: 50 mM T is/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 0,5 M Imidazol
Ma e ialien und Me hoden
28
Die N1-Domäne des G3P des Phagen IF1 wu de als SUMO-Fusionsp o ein isolie . In diesem
Kons uk be inde sich de zu Reinigung e wende e (His)6- ag am N- e minalen Ende des SUMO-
P o eins wodu ch nach de Reinigung und P o eolyse ag- eie IF1-N1-Domäne e hal en wu de.
T o z des zusä zlichen SUMO-P o eins bilde auch die IF1-N1-Domäne bei Übe exp ession
inclusion bodies. Diese wu den, wie un e 2.9.2.1 ü das G3P besch ieben, ge einig und in 50 ml
En al ungspu e gelös . Nach 2 h wu den e bliebene Zell agmen e du ch Zen i uga ion en e n
(SS34-Ro o , 15000 pm, 20 min, 4 °C) und de Übe s and übe einen Memb an il e (Po eng öße
0,45 µm) il ie . De Ansa z wu de mi eine Fluss a e on 4 ml min-1 au eine in En al ungspu e
äquilib ie e Ni-NTA-Säule au ge agen und mi 30 ml Waschpu e gewaschen, um nich bindende
P o eine zu en e nen. Die Rück al ung wu de induzie du ch das Spülen de Säule mi
50 ml Rück al ungspu e (Fluss a e: 2,5 ml min-1). Nach einem wei e en Waschsch i (30 ml Pu e
A) wu de das Fusionsp o ein in 250 mM Imidazol on de Säule eluie . Die Konzen a ion des
P o eins wu de übe die Messung de Abso p ion bei 280 nm bes imm .
2.9.3.2 Abspal ung des SUMO-P o eins und wei e e Reinigung de IF1-N1-Domäne
Dialysepu e : 50 mM T is/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl
Pu e A: 50 mM T is/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 10 mM Imidazol
Pu e B: 50 mM T is/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 0,5 M Imidazol
Gel il a ionspu e : 0,1 M Kaliumphospha (KP), pH 7,0
Das in 2.9.3.1 eluie e Fusionsp o ein wu de in einen Dialyseschlauch gegeben (Auschlussg öße
3,5 kDa) und übe Nach bei 4 °C in Gegenwa eine aus eichenden Menge de SUMO-P o ease
SenP2 (1 g P o ease spal e 150 g Fusionsp o ein) gegen 1,5 l Dialysepu e dialysie . Dadu ch wu de
zum einen die IF1-N1-Domäne hyd oly isch om SUMO-P o ein abgespal en und gleichzei ig die
Imidazolkonzen a ion e inge .
Wäh end de anschließenden A ini ä sch oma og aphie de dialysie en Lösung blieben sowohl
das SUMO-P o ein als auch die mi einem (His)6- ag e sehene SUMO-P o ease an de Säule
gebunden, das gewünsch e P o ein be and sich dagegen im Du chb uch. Diese wu de au ein
Volumen on 5 ml konzen ie und, wie un e 2.9.2.3 besch ieben, eine Gelpe mea ions-
ch oma og aphie un e zogen. Die e einig en F ak ionen aus de Gel il a ion wu den wiede um au
ein Volumen on 1,5 ml konzen ie und bei -20 °C gelage .
2.9.4 Reinigung de C- e minalen Domäne des TolA-P o eins
2.9.4.1 A ini ä sch oma og aphie
Pu e A: 50 mM T is/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 10 mM Imidazol
Pu e B: 50 mM T is/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 0,5 M Imidazol
Das TolAC-P o ein (TolA AS 295-421+Cys-(Ala)3-(His)6) besi z neben dem ü die Ma kie ung mi
dem Fluo eszenz a bs o IAEDANS zusä zlich einge üg en Cys ein es am C-Te minus einen (His)6-
ag, de e wende wu de, um das P o ein aus de nach 2.8.2 e hal enen, cy osolischen F ak ion zu
isolie en. Dazu wu de diese mi 50 mM MgCl2 e se z und anschließend mi Hil e eines
Memb an il e s (Po eng öße 0,45 µm) il ie . Nach dem Au ag des Ansa zes au eine mi Pu e A
Ma e ialien und Me hoden
29
äquilib ie e Ni-NTA-Säule (Fluss a e 4 ml min-1) wu de diese zunächs mi 40 ml Pu e A
gewaschen. Die Elu ion e olg analog zu 2.9.2.3 du ch E höhung de Imidazolkonzen a ion au
250 mM in einem Volumen on 25 ml, das du ch Konzen a ion au 1 ml e inge wu de.
2.9.4.2 Reduk i e En al ung und oxida i e Rück al ung des TolAC-P o eins
En al ungspu e : 0,1 M T is/HCl, pHRT 8,0; 1 mM EDTA; 6 M GdmCl; 50 mM GSH
Rück al ungspu e : 0,1 M T is/HCl, pHRT 8,5; 1 mM EDTA; 0,5 mM GSSG
Gel il a ionspu e : 0,1 M Kaliumphospha (KP), pH 7,0
Neben dem zusä zlichen C- e minalen Cys ein en häl TolAC zwei wei e e Cys ein es e. Um e en uell
wäh end de He s ellung ausgebilde e Fehl e b ückungen in den TolAC-Molekülen zu beheben,
wu de das P o ein zunächs un e eduk i en Bedingungen in 15 ml En al ungspu e ü 2 h en al e .
Die Rück al ung wu de analog zum G3P* (2.9.2.2) du ch zehn ache Ve dünnung in Rück al ungs-
pu e ini iie . Nach eins ündige Inkuba ion und anschließende Zugabe on 50 mM MgCl2 wu de
de Ansa z zen i ugie , um e en uell en s andene Agg ega e zu en e nen. Die wei e e Reinigung des
TolAC-P o eins e olg e, wie un e 2.9.2.3 ü das G3P* besch ieben, mi els A ini ä s- und
Gel il a ionsch oma og aphie. Die P o ein ak ionen de Gel il a ion wu den e einig und bis au
ein Volumen on 1,5 ml konzen ie . Das ge einig e TolAC-P o ein wu de bei -20 °C gelage .
2.9.5 Ma kie ung des Rezep o p o eins TolAC mi IAEDANS
Ma kie ungspu e : 0,1 M T is/HCl, pH15 °C 8,0; 10 mM EDTA
TolAC-S ammlösung: 500 µM TolAC in 0,1 M Kaliumphospha (KP), pH 7,0
Gel il a ionspu e : 0,1 M Kaliumphospha (KP), pH 7,0
Im Gegensa z zu d-N1- bzw. IF1-N1-Domäne en häl de Bindungspa ne TolAC keine
T yp ophan es e, weshalb die Wechselwi kung de P o eine anhand on Fö s e -Resonanz-Ene gie-
T ans e -(FRET)-Expe imen en analysie we den konn e. Dazu wu de das ge einig e TolAC mi dem
Fluo eszenz a bs o IAEDANS (5-(((2-Iodace yl)amino)e hyl)amino)-naph halin-1-sul onsäu e)
ma kie , de ko alen mi dem am C-Te minus be indlichen, zusä zlichen Cys ein es e knüp
wu de. Wäh end de nukleophilen Subs i u ions eak ion e se z dabei das Thiola anion des Cys eins
das Ioda om, wodu ch ein s abile Thioe he en s eh .
Zu Modi ika ion wu de die TolAC-S ammlösung mi 450 µl Ma kie ungspu e e dünn und
zunächs zu Reduk ion des e en uell oxidie en Cys eins am C-Te minus 0,2 M TCEP zugegeben.
Nach 20 min wu den 50 µl IADEDANS-Lösung (2 mg gelös in 50 μl N,N-Dime hyl o mamid)
zugegeben und in einem abgedunkel en Reak ionsge äß 3 h lang bei 15 °C inkubie . Um die Reak ion
zu s oppen und übe schüssiges IAEDANS bzw. niede molekula e Subs anzen zu en e nen, wu den
hin e einande zwei Gel il a ionssch i e an eine mi Gel il a ionspu e äquilib ie en NAPTM-10-
Säule du chge üh . Die Konzen a ion an TolAC-AEDANS sowie die Ma kie ungse izienz wu den
übe die Messung de Abso p ion des P o eins bei 280 und 336 nm bes imm .
Ma e ialien und Me hoden
30
2.10 P oben o be ei ung und Konzen a ionsbes immung
Zu Vo be ei ung de P o eine ü die spek oskopischen Un e suchungen wu den diese, alls nö ig,
zunächs mi els Gel il a ionsch oma og aphie an eine im en sp echenden Messpu e äquilib ie en
NAPTM-10- bzw. NAPTM-5-Säule in die gewünsch en Pu e bedingungen übe üh . Um e en uell
o handene Agg ega e abzu ennen wu den alle P o einp oben 30 min lang bei 4 °C zen i ugie
(13000 pm).
Zu Bes immung de Konzen a ion wu de on eine geeigne en Ve dünnung de P o einlösungen
mi einem Ca y 100 Bio UV-VIS-Spek opho ome e ein UV-Abso p ionsspek um im Be eich on
240 bis 350 nm (TolAC-AEDANS: 240 - 450 nm) au genommen. Als Re e enz dien e de
en sp echende Messpu e . Fü die Messungen wu den Qua zkü e en mi eine Schich dicke on
1 cm e wende . Die Au nahmegeschwindigkei de Abso p ionsspek en be ug 100 nm min-1 bei
eine Bandb ei e on 2 nm und eine Au lösung on 0,5 nm. Anhand de Abso p ion bei 280 nm
konn e mi Hil e des Lambe -Bee schen Gese zes die P o einkonzen a ion be echne we den. Die
da ü no wendigen Ex ink ionskoe izien en wu den nach de Me hode on Gill & . Hippel133
bes imm bzw. mi els des P og amms P o Pa am134 be echne :
d G3P* 280 = 41900 M-1 cm-1
G3P*-Va ian en mi de Subs i u ion D209Y 280 = 43400 M-1 cm-1
isolie e N1-Domäne des d G3P 280 = 21000 M-1 cm-1
isolie e N2-Domäne des d G3P 280 = 19700 M-1 cm-1
AEDANS 336 = 5700 M-1 cm-1
AEDANS 280 = 880 M-1 cm-1
TolAC 280 = 5480 M-1 cm-1
Chimä e d G3P* IF1-N1DDKTLD IHY 280 = 43400 M-1 cm-1
isolie e N1-Domäne des IF1 G3P 280 = 21095 M-1 cm-1
G1-Va ian en 280 = 9970 M-1 cm-1
G1-Va ian en mi Y33X Subs i u ion 280 = 8480 M-1 cm-1
2.11 Un e suchung de kon o ma ionellen S abili ä de P o eine
2.11.1 The misch-induzie e Dena u ie ung
2.11.1.1 Messung he misch-induzie e En al ungsübe gänge
Die he misch-induzie e En al ung de G3P*-Va ian en, ih e isolie en Domänen, on TolAC sowie
de e schiedenen G1-Va ian en wu de mi els Ci cula dich oismus an einem Jasco J-600
Spek opola ime e mi PTC-348 WI Pel ie -Elemen un e such . Als Signal dien e jeweils die
Ände ung de Ellip izi ä bei eine de inie en Wellenlänge. Die En al ungsübe gänge wu den bei
eine Bandb ei e on 1 nm in Qua zkü e en mi eine Schich dicke on 1 cm gemessen.
De Übe gang de isolie en N2-Domäne bzw. N2 in den G3P*-Va ian en konn e selek i anhand
de Abnahme des CD-Signals on 1 µM P o ein bei 210 nm gemessen we den. Die En al ung de
isolie en N1-Domäne und N1 in den G3P*-Va ian en wu de übe die Ände ung de Ellip izi ä on
4 µM P o ein bei 230 nm e olg . Im zwei en Fall e gaben sich bis au den Übe gang de Chimä e
d G3P* IF1-N1DDKTLD IHY biphasische Ve läu e, die die Dena u ie ung beide Domänen wide -
spiegeln. Die Messungen e olg en jeweils in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi eine Heiz a e on
Ma e ialien und Me hoden
31
60 °C h-1 und eine Dämp ung on 8 s. Die he mischen Übe gänge de isolie en N1-Domänen des
G3P des IF1-Phagen sowie TolAC wu den un e den gleichen Bedingungen, jedoch bei eine
Wellenlänge on 222 nm und mi eine Dämp ung on 1 s de ek ie .
Um die Abhängigkei de S abili ä e schiedene G1-Va ian en on de P o einkonzen a ion zu
bes immen, wu den de en he mische Übe gänge mi 1, 4 bzw. 10 µM P o einlösungen anhand de
Zunahme des CD-Signals bei 222,6 nm gemessen. Die Heiz a e wäh end de Messungen in 0,1 M Na-
Cacodyla pu e , pH 7,0 und zusä zlich 1,5 M GdmCl be ug 90 °C h-1.
2.11.1.2 Auswe ung de En al ungsübe gänge nach einem Zweizus andsmodell
Die he mischen Übe gänge de isolie en Domänen N1 und N2, TolAC sowie die selek i bei 210 nm
gemessene En al ung de N2-Domäne im G3P* des d Phagen zeigen einen einphasigen Ve lau .
Un e de Annahme des Zweizus andsmodells in Gleichung 1 s eh dabei de na i e Zus and de
P o eine im Gleichgewich mi dem dena u ie en Zus and. De Quo ien aus de Konzen a ion des
en al e en bzw. na i en P o eins e gib dabei die Gleichgewich skons an e KU de En al ung
(Gleichung 2), aus de sich die eie En halpie de En al ung G be echnen läss (Gleichung 3).
KU selbs kann aus eine physikalischen Eigenscha yobs, wie z.B. de empe a u abhängigen
Ellip izi ä eines P o eins bei eine de inie en Wellenlänge, bes imm we den (Gleichung 2).
NU Gl. 1
KU =
Uobs
obsN )(
N
U
yy
yy
Gl. 2
G = -RT lnKU Gl. 3
KU: Gleichgewich skons an e de En al ung; yN, yU: physikalische Eigenscha des na i en bzw. dena u ie en
P o eins; yobs: Messg öße bei Vo liegen eine Mischung on N und U; G: eie En halpie de En al ung (in
J mol-1); R: allgemeine Gaskons an e (in J mol-1 K-1); T: Tempe a u (in K)
Un e den zwei Annahmen, dass die Ände ung de mola en Wä mekapazi ä Cp kons an und die
G undlinien ü na i es und dena u ie es P o ein linea e lau en, läss sich aus de Kombina ion on
Gleichung 3 mi de Gibbs-Helmhol z-Gleichung du ch In eg a ion des En halpie- und des
En opie e ms zwischen TM und T die eie En halpie de En halpie be echnen (Gleichung 4).135; 136
Gleichungen 5a und 5b geben dabei die linea e Ände ung de Messg öße des na i en bzw. des
en al e en P o eins in Abhängigkei de Tempe a u wiede .
G (T) = H (TM)
M
Mp
M
Mln T
T
TTTC
T
TT Gl. 4
yN = 0
N
y + mN T Gl. 5a
yU = 0
U
y + mU T Gl. 5b
G(T): eie En halpie des he mischen Übe gangs (in J mol-1); T: Tempe a u (in K); TM: Tempe a u am
Mi elpunk des Übe gangs (in K); H: an’ Ho En halpie de En al ung bei TM (in J mol-1); Cp: Ände ung
de mola en Wä mekapazi ä bei En al ung des P o eins bei kons an em D uck (in J mol-1 K-1); yN, yU:
physikalische Eigenscha des na i en (N) bzw. dena u ie en (U) P o eins; mN, mU: S eigungen de G undlinien
des na i en und des dena u ie en P o eins; 0
U
0
N,yy : au T = 0 K ex apolie We e ü yN und yU
Ma e ialien und Me hoden
32
Die Kombina ion de Gleichungen 2-5 e gib Gleichung 6, wo übe du ch nich -linea e Reg ession
mi dem P og amm G a i 3.0 bzw. G a i 5.0 de Schmelzpunk (TM) des he mischen Übe gangs und
die an’ Ho -En halpie HD e mi el wu den.
y (T) =
T
T
T
T
R
C
TTR
TH
T
T
T
T
R
C
TTR
TH
TmyTmy
MM
p
M
M
MM
p
M
M
U
0
UN
0
N
ln1
11
)(
exp1
ln1
11
)(
exp)(
Gl. 6
y(T): Messg öße, hie gemessene Ellip izi ä (in G ad); yN, yU: physikalische Eigenscha des na i en (N) bzw.
dena u ie en (U) P o eins, wobei y0 jeweils die au T = 0 K ex apolie en We e angib ; mN, mU: S eigungen de
G undlinien des na i en und des dena u ie en P o eins; TM: Tempe a u am Mi elpunk des Übe gangs (in K);
H: an’ Ho -En halpie de En al ung bei TM (in J mol-1);
Cp: Ände ung de mola en Wä mekapazi ä bei
En al ung des P o eins bei kons an em D uck (in J mol-1 K-1); T: Tempe a u (in K); R: allgemeine Gaskons an e
(in J mol-1 K-1)
Zu Auswe ung de En al ungsübe gänge wu de ü die G3P*-Va ian en eine kons an e Ände ung
de Wä mekapazi ä Cp on 10000 J mol-1 K-1 ü N2 und 1000 J mol-1 K-1 ü N1 angenommen.121
Fü die isolie en N2-Domänen wu den Cp-We e on 8000 J mol-1 K-1 und ü TolAC ein We on
6000 J mol-1 K-1 e wende .79; 121 Übe die aus de Auswe ung e hal enen We e ü den
Übe gangsmi elpunk TM und die an’ Ho -En halpie HD kann die kon o ma ionelle S abili ä des
P o eins in Abhängigkei de Tempe a u be echne we den (Gleichung 4).
2.11.1.3 Auswe ung de En al ungsübe gänge nach einem D eizus andsmodell
Fü die he mische En al ung des G3P* bei 230 nm e gaben sich biphasische Übe gänge. Wäh end
de Dena u ie ung wi d demnach ein In e media gebilde (Gleichung 7). Die Auswe ung diese
he mischen Übe gänge e olg e dahe gemäß dem D eizus andsmodell137, wobei die beiden
Gleichgewich skons an en de En al ung K1 und K2 be ücksich ig we den muss en (Gleichung 8).
NIU Gl. 7
K1 =
N
I ; K2 =
I
U Gl. 8
K1: Gleichgewich skons an e des Übe gangs on N nach I; K2: Gleichgewich skons an e des Übe gangs on I
nach U; N: na i es P o ein; I: In e media ; U: en al e es P o ein
Die Gesam p o einmenge (P) be echne sich aus de Summe de Konzen a ionen an na i em
P o ein [N], In e media [I] und dena u ie em P o ein [U] (Gleichung 9). Du ch Kombina ion de
Gleichungen 8 und 9 e gib sich nach Um o mung Gleichung 10, übe die die Konzen a ion an
dena u ie em P o ein in Abhängigkei de Gesam konzen a ion be echne we den kann.
[P] = [N] + [I] + [U] Gl. 9
[U] =
1
P
121
21
KKK
KK Gl. 10
Ma e ialien und Me hoden
33
Aus de Summe de An eile des dena u ie en P o eins (XU) und des In e media s (XI) e gib sich
de appa en e An eil des dena u ie en P o eins yapp (Gleichung 11). De Pa ame e z en sp ich dabei
de op ischen Ähnlichkei des In e media s mi dem en al e en Zus and.
yapp = [XU] + z [XI]; [XU] =
P
U; [XI] =
P
U
2K Gl. 11
Die Kombina ion de Gleichungen 8-11 e gib Gleichung 12, welche die übe die Messg öße y(T)
beobach e e En al ung in Abhängigkei on de Tempe a u besch eib . Die Be echnung de
Schmelz empe a u en ü die beiden Domänen N1 und N2, sowie de en an` Ho En halpien aus den
he mischen Übe gängen des G3P* bei 230 nm, e olg e anhand on Gleichung 12 wiede um du ch
nich -linea e Reg ession un e Ve wendung de P og amme G a i 3.0 und G a i 5.0.
y(T) =
TmyTmyK
K
K
Tmy N
0
NU
0
N2
1
2
N
0
N)z(
1
1
1
Gl. 12
K1 =
T
T
T
T
R
C
T
T
TR
H1,M1,M
1,p
1,M
1ln1
1
exp
K2 =
T
T
T
T
R
C
T
T
TR
H2,M2,M
2,p
2,M
2ln1
1
exp
y(T): Messg öße, gemessene Ellip izi ä (in G ad); yN, yU: Signal des ge al e en (N) und en al e en (U) P o eins;
0
U
0
N,yy : We e ü yN und yU au T = 0 K ex apolie ; mN, mU: S eigungen de G undlinien des na i en und des
dena u ie en P o eins; TM,1,TM,2: Tempe a u am Mi elpunk des Übe gangs de 1. Domäne (TM,1) bzw. des
Übe gangs de 2. Domäne (TM,2) (in K); ∆H1, ∆H2: an´ Ho En halpie de En al ung bei TM,1 bzw. TM,2 (in
J mol-1); ∆Cp,1, ∆Cp,2: Di e enz de mola en Wä mekapazi ä en des dena u ie en und na i en P o eins de bei
TM,1 bzw. TM,2 en al enden Domäne (in J mol-1 K-1); z: op ische Ähnlichkei des In e media s mi dem en al e en
Zus and; T: Tempe a u (in K); R: allgemeine Gaskons an e (in J mol-1 K-1)
Zu Auswe ung de En al ungsübe gänge wu de ü die G3P*-Va ian en eine kons an e Ände ung
de Wä mekapazi ä Cp on 10000 J mol-1 K-1 ü N2 und 1000 J mol-1 K-1 ü N1 angenommen. Die
op ische Ähnlichkei wu de au 0,2 es geleg .79; 121 Übe die aus dem Angleich e mi el en We e ü
HD und die Schmelzpunk e konn e ü jede de Domänen des G3P* nach Gleichung 4 die eie
En halpie be echne we den.
2.11.1.4 Auswe ung de he misch-induzie en En al ungsübe gänge de G1-P o eine
Da die G1-P o eine in einem einphasigen Übe gang en al en, wu den de Ve lau ih e he mischen
En al ung eben alls nach dem ein achen Zweizus andsmodell NU aus 2.11.1.2 ausgewe e . Bei
wei e en Un e suchungen s ell e sich jedoch he aus, dass einige de Va ian en eine deu lich e höh e
Tendenz zu Dime isie ung haben. Die Dissozia ionskons an e de hype s abilen Va ian e G1-M2
be inde sich im Be eich on 30 nM, weshalb de G oß eil de Moleküle be ei s bei eine
P o einkonzen a ion on 1 µM als Dime o lieg . Die En al ung des P o eins is olglich an die
Dissozia ion des Dime s gekoppel . Im ein achen Fall en al e das Dime di ek in den dena u ie en,
Ma e ialien und Me hoden
34
jedoch monome en Zus and (Gleichung 13). Die Gleichgewich skons an e KU diese
En al ungs eak ion e gib sich nach dem Massenwi kungsgese z aus dem Quo ien en des Quad a es
de Konzen a ion an dena u ie em P o ein und de Konzen a ion des Dime s (Gleichung 14).
N2U Gl. 13
KU =
U
2
2
2
1
2
N
U
C U
Gl. 14
KU: Gleichgewich skons an e de En al ung (in µM); [N2]: Konzen a ion an na i em Dime (in µM);
[U]: Konzen a ion an en al e em P o ein (in µM); C : Gesam konzen a ion an monome em P o ein (in µM);
: An eil des en al e en P o eins
Un e de Annahme on Gleichung 13 is KU di ek p opo ional zu Gesam konzen a ion an
monome em P o ein und läss sich aus dem An eil an en al e em P o ein e mi eln (Gleichung
14).138 Diese wiede um e gib sich in Abhängigkei de Tempe a u aus de Messg öße des
he mischen Übe gangs (yobs) und den en sp echenden Signalen des ge al e en (N) und en al e en (U)
P o eins (Gleichung 15).
)()(
)()(
)( TyTy
TyTy
T
UN
obsN
U
Gl. 15
: An eil des en al e en P o eins; yobs: Messg öße bei Vo liegen eine Mischung on N2 und U; yN, yU: Signal
des ge al e en (N) und en al e en (U) P o eins, T: Tempe a u (in K)
Du ch e neu e Analyse de he mischen Übe gänge on 1, 4 bzw. 10 µM G1-M2 wu de de An eil
an en al e em P o ein und dami anhand on Gleichung 14 die jeweilige Gleichgewich skons an e in
Abhängigkei on de Tempe a u be echne . Du ch die Au agung des na ü lichen Loga i hmus on
KU gegen das In e se de Tempe a u ( an` Ho -Au agung) konn e nach Gleichung 16 du ch
linea e Reg ession de We e im Übe gangsbe eich die appa en e En halpie de En al ung des Dime s
H H(app) ü die e schiedenen Konzen a ionen an G1-M2 be echne we den.
R
H
T
K HU )app(
)
1
(
ln
Gl. 16
KU: Gleichgewich skons an e de En al ung (µM); H H(app): appa en e En halpie de En al ung des Dime s
(in J mol-1); T: Tempe a u (in K); R: allgemeine Gaskons an e (in J mol-1 K-1)
Die Abhängigkei de Schmelz empe a u on de Konzen a ion des G1-M2 is zwa o handen,
jedoch e häl nismäßig ge ing. In e s e Nähe ung sind dami sowohl die En halpie de En al ung des
Dime s, H H(Dime ), als auch die En opie S H(Dime ) unabhängig on de Tempe a u . Un e
diese Vo ausse zung e gib sich nach Gleichung 17 die an die Dissozia ion des Dime s gekoppel e
En halpie de En al ung auße dem aus de S eigung de Au agung on 1/TM gegen den na ü lichen
Loga i hmus de Konzen a ion an Monome en (C ).138
)Dime (
)Dime (
ln
)Dime (
1
H
H
HM H
S
C
H
R
T
Gl. 17
Ma e ialien und Me hoden
35
2.11.1.5 Kalo ime ische Messungen (DSC)
Zu Bes immung de he mischen S abili ä und des Oligome isie ungsg ades on WT-G1 und de
hype s abilen Va ian e G1-M2 bei höhe en Konzen a ionen wu den die P o eine zunächs in
0,1 M Na-Cacodyla pu e , pH 7,0, 1,5 M GdmCl übe Nach dialysie . Nach de Kalib ie ung des
VP-DSC Mik okalo ime e s (Zell olumen 0,532 ml) mi dem jeweiligen Dialysepu e wu den die
zu o en gas en P o einp oben mi Konzen a ionen zwischen 62 und 140 µM gemessen. Die Heiz a e
wäh end de Tempe a u läu e be ug 90 °C h-1. Nach Ko ek u de Da en um den Pu e we ,
Um echnung in die mola e Wä mekapazi ä und Ko ek u de Basislinien wu den die mola en
Wä mekapazi ä en de Va ian en mi den Gleichungen 18 und 19 un e de Annahme eines Nich -
Zweizus andsmodells ausgewe e . De We ü Cp wu de dabei au null es gese z . Die Analyse
wu de mi dem P og amm O igin 5.0 du chge üh .
...
))(1(
)(
)( 22
,,
RTTK
HHTK
TC
A
HAcalAA
p Gl. 18
)1(exp)( ,
M
HA
AT
T
RT
H
TK Gl. 19
Cp(T): mola e Wä mekapazi ä (kJ mol-1 K-1); T: Tempe a u (in K); TM: Tempe a u am Übe gangsmi elpunk
on Domäne A (in K); HA, H: an’ Ho En halpie de En al ung on Domäne A; HA,cal: kalo ime ische
En halpie de En al ung on Domäne A; R: allgemeine Gaskons an e (in J mol-1 K-1)
2.11.2 Dena u ie ungsmi el-induzie e En al ungsübe gänge
2.11.2.1 Messung Dena u ie ungsmi el-induzie e En al ungsübe gänge
Die S abili ä de P o eine gegenübe GdmCl bzw. Ha ns o wu de anhand de Ände ung des
Fluo eszenzsignals de P o einlösung bei eine de inie en Wellenlänge nach An egung bei 280 ode
295 nm an einem Jasco-Fluo eszenzspek opho ome e FP-6500 un e such . Die genaue
Dena u ie ungsmi elkonzen a ion wu de nach e ak ome ische Bes immung de B echungsindices
de einzelnen P oben e mi el . Die jeweilige Konzen a ion e gib sich dabei aus de Di e enz de
B echungsindices des Pu e s in Gegenwa und Abwesenhei on GdmCl bzw. Ha ns o
(Gleichungen 20 und 21).139
[GdmCl] = 57,147 ∆n + 38,68 (∆n)2 - 91,6 (∆n)3 Gl. 20
[Ha ns o ] = 117,66 ∆n + 29,753 (∆n)2 + 185,56 (∆n)3 Gl. 21
[GdmCl]: GdmCl-Konzen a ion (in M); [Ha ns o ]: Ha ns o -Konzen a ion (in M); ∆n: Di e enz de
B echungsindices de Lösungen mi und ohne Dena u ie ungsmi el
Die En al ung sowohl de Va ian en de isolie en N1-Domäne, als auch on N1 im d G3P* du ch
GdmCl bei 25 °C wu de anhand de Ände ung de T p-Fluo eszenz de P o eine bei 360 nm nach
An egung bei 295 nm e olg . De Übe gang de N2-Domäne wu de selek i übe die Ände ung de
Ty -Fluo eszenz bei 310 nm (An egung 280 nm) de ek ie . Die S abili ä de isolie en IF1-N1-
Va ian en gegenübe GdmCl wu de bei 325 nm (An egung 280 nm) analysie . Die Messungen mi
1 µM P o ein e olg en nach Inkuba ion de P oben ü mindes ens 1 h bei 25 °C. Fü den GdmCl-
Ma e ialien und Me hoden
42
2U 2N N2
k
RF
k
EF
k
on
k
o
2.12.2.2 Doppelmischexpe imen e zu Analyse de Kine ik de Dime isie ung
Die Assozia ion de Monome e des G1-M2-P o eins inde nich wäh end de kon o ma ionellen
Fal ung de Monome e s a , sonde n e olg in eine nachgelage en Reak ion, die lediglich im
Übe gangsbe eich on 4 bis 6 M GdmCl du ch die da an gekoppel e Fal ung de monome en Spezies
spek oskopisch sich ba is . Die Geschwindigkei de Assozia ions eak ion un e na i en
Bedingungen wu de analog zu Kapi el 2.12.1.4 übe einen Zweisch i -En al ungs es e mi el . Die
en sp echenden Doppelmischexpe imen e in 0,1 M Na-Cacodyla pu e , pH 7,0 bei 25 °C wu den
wiede um an einem DX.17MV Sequen ial s opped- low-Spek o luo ime e (Applied Pho ophysics)
du chge üh .
In 7,4 M GdmCl dena u ie es P o ein (11 µM bzw. 66 µM) wu de du ch el ache Ve dünnung ü
a iable Zei spannen in 2, 3 bzw. 3,5 M GdmCl ückge al e . Du ch wei e e sechs ache Ve dünnung in
7,0 M GdmCl konn e die schnelle En al ungs eak ion de monome en Spezies des G1-M2 anhand
de Fluo eszenzände ung obe halb on 320 nm nach An egung bei 280 nm de ek ie we den. Die
Ku en e läu e wu den, wie un e 2.12.3 besch ieben, anhand des Angleiches exponen ielle
Funk ionen ausgewe e und die e hal enen Ampli uden gegen die Rück al ungsdaue au ge agen. De
Angleich an die Da en e olg e un e de Annahme, dass die Fal ung des Monome s und die
Eins ellung des Monome -Dime -Gleichgewich es sequenzielle Reak ionen sind (Gleichung 30):
Gl. 30
N: ge al e es Monome ; N2: dime e Spezies; U: en al e es P o ein; kEF, kRF: Geschwindigkei skons an en de
En - bzw. Rück al ung (in s-1); kon, ko : mik oskopischen Ra en de Assozia ion und Dissozia ion (in µM-1s-1
bzw. s-1)
Au G undlage dieses Modells e geben sich ü die Ände ung de Konzen a ionen de d ei Spezies
U, N und N2 die olgenden Di e enzialgleichungen (Gleichung 31-33).
]N[]U[
]U[
EFRF kk
Gl. 31
]N[2]N[2]N[]U[
]N[
2
2
o onEFRF kkkk
Gl. 32
]N[]N[
]N[
2
2
2
o on kk
Gl. 33
[N]: Konzen a ion an ge al e em Monome (in µM); [N2]: Konzen a ion de dime en Spezies (in µM);
[U]: Konzen a ion an en al e em P o ein (in µM); kEF, kRF: Geschwindigkei skons an en de En - bzw.
Rück al ung (in s-1); kon, ko : mik oskopischen Ra en de Assozia ion und Dissozia ion (in µM-1s-1 bzw. s-1)
Die Auswe ung de Ve läu e un e Ve wendung de Gleichungen 31-33 und de
P o einkonzen a ionen wäh end de Rück al ung (1 bzw. 6 µM) e olg e du ch nich -linea en leas
squa es Angleich des pos ulie en heo e ischen Modells (Gleichung 30) mi dem P og amm DynaFi .
Zu Ve inge ung de Anzahl an Va iablen wu den die In o ma ionen übe die
Geschwindigkei skons an en kEF und kRF, die dem Ve lau des Rück al ungsas es de monome en
Spezies en nommen wo den wa en, kons an gese z . Im be ach e en Dena u ie ungsmi elbe eich on
2-3,5 M GdmCl geh monome es G1-M2 zudem olls ändig in den na i en Zus and übe . Aus de
Ma e ialien und Me hoden
43
Bes immung de Dissozia ionskons an en des Dime s (KD) in Übe gangsbe eich (2.12.2.3) ging
he o , dass bei 1 µM de hype s abilen Va ian e das Gleichgewich deu lich au de Sei e des Dime s
lieg . Aus diesem G und wu de die Dissozia ionskons an e ko bei den Angleichen an die
Ampli uden e läu e bei 2, 3 bzw. 3,5 M GdmCl e nachlässig . Bei de e neu en Analyse de
Rück al ungskine iken im Übe gangsbe eich (2.12.2.3) zu Bes immung des KD-We es wu de ko
jedoch als eie Pa ame e in die Analyse einbezogen.
2.12.2.3 Bes immung de Dissozia ionskons an e des G1-M2-Dime s
Die Analyse de Fal ungskine iken ha gezeig , dass die langsame e de beiden Rück al ungsphasen im
Übe gangsbe eich zwischen 4 und 6 M GdmCl die du ch die Assozia ion de Moleküle limi ie e
Fal ung de Monome e wide spiegel . Die en sp echenden Ku en e läu e on 1 µM G1-M2 wu den
dahe un e de Annahme des sequenziellen Modells in Gleichung 30 noch einmal neu ausgewe e
(2.12.2.2), um die mik oskopischen Ra en de Assozia ion und Dissozia ion, kon und ko , bei de
en sp echenden GdmCl-Konzen a ion zu e mi eln. Aus dem Quo ien on ko und kon läss sich die
Dissozia ionskons an e KD des Dime s be echnen (Gleichung 34).
on
o
Dk
k
K Gl. 34
KD: Dissozia ionskons an e (in µM); kon, ko : mik oskopische Ra en de Assozia ion und Dissozia ion (in µM-1s-1
bzw. s-1)
Neben de Auswe ung de Kine iken wu de die Dissozia ionskons an e zu Ve gleichszwecken
zusä zlich übe die Analyse de Gleichgewich sübe gänge on G1-M2 bei e schiedenen
P o einkonzen a ionen e mi el . Da sich die monome e Spezies und das Dime in ih en
Fluo eszenzeigenscha en nich un e scheiden, zeigen die Gleichgewich sübe gänge mi 0,25, 1 bzw.
10 µM P o ein einen einphasigen Ve lau . Die Gleichgewich sen al ung kann olglich nach dem
Modell in Gleichung 30 übe die appa en e Gesam gleichgewich skons an e Kapp besch ieben we den
(Gleichung 35).
]N[2]N[
]U[
2
app
K Gl. 35
Kapp: appa en e Gesam gleichgewich skons an e; [N]: Konzen a ion an ge al e em Monome (in µM);
[N2]: Konzen a ion de dime en Spezies (in µM); [U]: Konzen a ion an en al e em P o ein (in µM)
Die Konzen a ion an dena u ie em P o ein [U] is p opo ional zu Gleichgewich skons an e KU
de En al ung und e gib sich dahe du ch Ums ellung de Gleichung 36a. Die Konzen a ion des
Dime s [N2] läss sich übe die Dissozia ionskons an e e mi eln (Gleichung 36b).
]N[
]U[
U
K Gl. 36a
D
K
2
2
]N[
][N Gl. 36b
Ma e ialien und Me hoden
44
Die Kombina ion de Gleichungen 35, 36a und 36b esul ie in Gleichung 37, die die d ei
Gleichgewich skons an en in Bezug zu Konzen a ion des ge al e en Monome s se z . Im Folgenden
wi d diese Ausd uck du ch die Va iable a subs i uie .
a
K
K
Kapp
U
D
1
2
1]N[ Gl. 37
Die Konzen a ionen an na i em P o ein [N] e gib sich aus Gleichung 38 übe die
Gesam p o einkonzen a ion [N0] und de Konzen a ion des Dime s [N2] bzw. des dena u ie en
P o eins [U] (Gleichung 38).
]N[2]U[]N[]N[ 20 Gl. 38
Aus den Gleichungen 36-38 esul ie Gleichung 39, übe welche die Dissozia ionskons an e des
Dime s in Abhängigkei on de appa en en Gesam gleichgewich skons an e und de Gleichgewich s-
kons an e de En al ung des Monome s be echne we den kann.
2
0
2)1(
][N
aKa
K
U
D
Gl. 39
Die Kapp-We e wu den als Funk ion de GdmCl-Konzen a ion aus de Zweizus andsanalyse (Vgl.
Gleichung 6) de Gleichgewich sübe gänge on 0,25, 1 bzw. 10 µM G1-M2 e mi el . Die
Gleichgewich skons an e de En al ung (KU) bei e schiedenen GdmCl-Konzen a ionen wu de aus
dem Quo ien en de en sp echenden Geschwindigkei skons an en de En - bzw. Rück al ung de
monome en Spezies, kEF und kRF, e hal en (Gleichung 28).
2.13 Cha ak e isie ung de In e ak ion de N1-Domäne des G3P* mi
TolAC-AEDANS
2.13.1 Messung on Fluo eszenzspek en
Die Fluo eszenzemissionsspek en on je 1 µM de Bindungspa ne TolAC-AEDANS und isolie e
N1-Domäne bzw. WT d G3P* sowie de en sp echenden Mischungen wu den in empe ie ba en
Qua zkü e en (Schich dicke 1 cm) an einem Jasco FP-6500 Spek o luo ime e bei 25 °C in
0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 gemessen. Die Au nahme de Emissionsspek en im Be eich on 300 bis
550 nm nach An egung bei 280 nm e olg e mi eine Geschwindigkei on 120 nm min-1 und eine
Dämp ung on 0,5 s. Die Bandb ei e de An egungswellenlänge be ug 3 nm, die de Emissions-
wellenlänge 5 nm. Die Spek en wu den jeweils um die Fluo eszenz des Pu e s ko igie .
2.13.2 Kine ik de Bindung de N1-Domäne des G3P* an TolAC-AEDANS
Die Bindung des Akzep o s TolAC-AEDANS an die isolie e N1-Domäne bzw. an N1 in den
e schiedenen G3P*-Va ian en wu de nach schnelle Mischung an einem DX.17MV Sequen ial
s opped- low-Spek o luo ime e (Applied Pho ophysics) e olg . Die Assozia ions eak ion des
jeweiligen Bindungspa ne s (Konzen a ionsbe eich: 0 - 16 µM) mi 0,2 µM TolAC-AEDANS wu de
du ch 1:1 Mischung in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 und gegebenen alls 0,1 M GdmCl bei 25 °C ini iie .
Als Messsignal de Assozia ion de P o eine dien e die Ände ung de in eg alen Fluo eszenz obe halb
Ma e ialien und Me hoden
45
on 460 nm, wobei S eu- und Fluo eszenzlich du ch eine mi p-Ni oanilin-Lösung (2 mg ml-1 in
E hanol) ge üll e Kü e e (Schich dicke 5 mm) o dem Pho omul iplie abso bie wu de. Die
An egung e olg e bei 280 nm mi eine Bandb ei e on 10 nm. Es wu den jeweils mindes ens sechs
Einzelmessungen du chge üh , gemi el und de esul ie ende Ve lau nach Kapi el 2.12.3 du ch
Angleich eine monoexponen iellen Funk ion ausgewe e .
Die da übe e hal enen appa en en Ra en und Ampli uden wu den gegen die Dono konzen a ion
au ge agen. Du ch linea e Reg ession des Ve lau es de Ra en e gib sich aus dem O dina enabschni
die mik oskopische Ra e de Dissozia ion (ko ) und aus de S eigung de Ge ade die mik oskopische
Ra e de Assozia ion (kon). Nach Gleichung 34 wu de die Dissozia ionskons an e KD aus dem
Quo ien en on ko und kon be echne . Um den KD-We aus dem Ve lau de Ampli uden zu e mi eln,
wu de diese analog zu eine Gleichgewich s i a ion analysie (Gleichung 43).
De In e ak ion on N1 mi TolAC-AEDANS e olg nach dem nachs ehenden Reak ionsschema:
N1 + TolAC*N1·TolAC*
Die Dissozia ionskons an e KD be echne sich nach Gleichung 40 zu:
KD =
*TolACN1
*TolACN1
=
on
o
k
k Gl.40
KD: Dissozia ionskons an e (in µM); [N1]: Konzen a ion an eiem N1 (in µM), [TolAC*]: Konzen a ion an
eiem TolAC-AEDANS (in µM); [N1TolAC*]: Konzen a ion des N1-TolAC-AEDANS-Komplexes (in µM);
kon: Geschwindigkei skons an e de Assozia ion (in µM-1 s-1); ko : Geschwindigkei skons an e de Dissozia ion
(in s-1)
Die Konzen a ionen an ungebundene N1-Domäne [N1] bzw. eiem TolAC-AEDANS [TolAC*]
e geben sich un e Be ücksich igung de Massene hal ung zu [N1] = [N1]0 - [N1TolAC*] und
[TolAC*] = [TolAC*]0 - [N1TolAC*] (mi [N1]0 und [TolAC*]0 als den Gesam konzen a ionen an
N1 bzw. TolAC-AEDANS). Du ch Einse zen diese Gleichungen in Gleichung 40 e gib sich die
Konzen a ion des N1-TolAC-AEDANS-Komplexes (Gleichung 41).
[N1TolAC*] =
2
*TolACN1 D00 K 00
D00 ]TolAC*[]N1[
4
2
)]TolAC*[]N1([
K Gl. 41
Die Assozia ions eak ion wi d übe die Ände ung de Fluo eszenz de ko alen an TolAC gebundenen
AEDANS-Einhei e olg . Die gemessene Fluo eszenz is dabei abhängig on den Konzen a ionen
an eiem und gebundenem TolAC-AEDANS (Gleichung 42).
F = F0 + F
0
]TolAC*[
]TolAC*N1[ Gl. 42
F: gemessene Fluo eszenz; F0: Fluo eszenz des eien TolAC-AEDANS; F: maximale Fluo eszenzände ung bei
olls ändige Bindung; [N1TolAC*]: Konzen a ion des N1-TolAC-AEDANS-Komplexes (in µM);
[TolAC*]: Konzen a ion an eiem TolAC-AEDANS (in µM)
Die Kombina ion de Gleichungen 41 und 42 esul ie in Gleichung 43, die die Abhängigkei de
gemessenen Fluo eszenz on den Gesam konzen a ionen de Bindungspa ne und dem KD-We des
Komplexes aus N1 und TolAC-AEDANS wiede gib . Du ch Angleich diese Gleichung an den
Ve lau de Fluo eszenzampli ude in Abhängigkei on de P o einkonzen a ion e gib sich die
Dissozia ionskons an e KD.
Ma e ialien und Me hoden
46
F = F0 +
0
[TolAC*]
ΔF (
2
*TolACN1 D
00 K - 00
D00 ]TolAC*[]N1[
4
2
)]TolAC*[]N1([
K) Gl. 43
Um die A ini ä de ak i en Zus ände des WT d G3P* und de s abilisie en Va ian e d G3P* IIHY
zu bes immen, wu den diese als langlebige Fal ungsin e media e populie . Dazu wu den die in
5,0 M GdmCl dena u ie en P o eine 25 ach in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 e dünn und die Rück al ung
übe einen Zei aum on 450 s e möglich. Anschließend wu den die Ansä ze bis zu Messung au Eis
ges ell , um die du ch die Isome isie ung on P o213 limi ie e Einnahme des gedock en Zus andes zu
e langsamen. Vo de Messung wu den die P o eine ü 2 min in den Vo schubsp i zen de
o empe ie en Messappa a u bei 25 °C inkubie . Die Au nahme und Analyse de Assozia ions-
kine iken nach 1:1 Mischung mi 0,4 µM TolAC-AEDANS in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 e olg e
analog zu den na i en P o einen.
2.13.3 Rück al ung des G3P* in Gegenwa on TolAC-AEDANS
Die Rück al ung e schiedene G3P*-Va ian en und de isolie en N1-Domäne bei 25 °C wu de
zusä zlich in Gegenwa on TolAC-AEDANS un e such , das im nich assoziie en Zus and des G3P*
mi dessen N1-Domäne in e agie en kann. In GdmCl en al e es G3P* wu de du ch zehn- bzw.
el ache Ve dünnung (Endkonzen a ion: 1 µM) in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 und zusä zlich
1 µM TolAC-AEDANS in Rück al ungsbedingungen übe üh . Dadu ch kann die schnell al ende
N1-Domäne mi TolAC-AEDANS in e agie en. Die Ve d ängung on TolAC du ch die Rück al ung
des G3P* wu de anhand de Ände ung de Fluo eszenz bei 490 nm nach An egung bei 280 nm in
Qua zkü e en (Schich dicke 1 cm) an einem Jasco FP-6500 Spek o luo ime e e olg . Die
Bandb ei e de An egungswellenlänge be ug 3 nm, die de Emissionswellenlänge 5 nm. Die
Kine iken wu den um die Fluo eszenz des Pu e s ko igie und du ch Angleich exponen ielle
Funk ionen (2.12.3) ausgewe e .
E gebnisse und Diskussion
47
3 E gebnisse und Diskussion
3.1 Die Fal ung des Gen-3-P o eins des ilamen ösen Phagen d
Eine wich ige Vo ausse zung, um den Wi kungsmechanismus und dami die Funk ion eines
P o eins au klä en zu können, is die Kenn nis übe dessen S abili ä und
Fal ungsmechanismus. Le z e e is jedoch ge ade ü die in de Zelle übe wiegend
o kommenden Meh domänenp o eine deu lich komplizie e als ü kleine Eindomänen-
p o eine, welche meis nach einem ein achen Zweizus andsmodell inne halb wenige
Sekunden al en.56; 144-148 G und da ü sind un e ande em Wechselwi kungen zwischen den
Domänen, die, wie im Fall de beiden N- e minalen Domänen (N1 und N2) des
Gen-3-P o eins (G3P) des ilamen ösen d Phagen, zu ih e S abilisie ung und gleichzei ig zu
Inak i ie ung des P o eins üh en können.96; 97; 122; 149
Die In e ak ion de genann en Domänen N1 und N2 des G3P, die ü die In ek ion on
E. coli Zellen du ch den d Phagen essen iell sind, wi d zum g oßen Teil übe die
Gelenk egion de N2-Domäne e mi el (Abbildung 3.1.1).59; 62; 96 Eine wich ige Rolle spiel
dabei P olin es 213 in diese Gelenk egion, das im geschlossenen Zus and in cis-
Kon o ma ion o lieg und dadu ch die Fal ung de Gelenk egion und die Assozia ion de
Domänen e möglich .120 Ba ba a Ecke konn e zudem zeigen, dass die au g und de
benachba en Res e Gln212 und P o214 seh langsame Isome isie ung de Gln212-P o213-
Pep idbindung die In ek iosi ä des Phagen d egulie .96
Abbildung 3.1.1: Te iä s uk u des N1N2-F agmen s on WT d G3P*.
Die Res e P o161, Gln212, P o213 und P o214 sowie die Posi ionen de s abilisie enden Subs i u ionen in
d G3P* IIHY sind als S äbchen-Modelle gezeig . Die N1-Domäne is in o , de globulä e Teil on N2 in blau
und die Gelenk egion in g ün da ges ell . Die Abbildung wu de anhand de PDB-S uk u 2G3P60 mi dem
P og amm Pymol123 e s ell .
De Fal ungsmechanismus des F agmen s, das die beiden N- e minalen Domänen um ass ,
wu de, wie be ei s e wähn , on And eas Ma in anhand de s a k s abilisie en Va ian e
d G3P* IIHY un e such (Abbildung 3.1.2a), um eilge al e e und dami wenige s abile
In e media e besse analysie en zu können.120; 122 Dieses P o ein en häl neben den
Aus auschen T13I und Q129H mi T101I und D209Y auch zwei Subs i u ionen in de
Gelenk egion (Abbildung 3.1.1), welche zusammen mi Q129H die S abili ä de labile en
N2-Domäne deu lich e höhen.121
Th 13
P o161
P o213
Asp209Th 101
Gln129 P o214
Gln212
E gebnisse und Diskussion
48
Es ha sich jedoch gezeig , dass diese Subs i u ionshin e g und die Auswi kungen
des abilisie ende AS-Aus ausche au die S abili ä und den Fal ungsmechanismus des
jeweiligen G3P* s a k beein luss . Wäh end zum Beispiel die En al ung de beiden N-
e minalen Domänen im d G3P* IIHY o z des Aus ausches de beiden zu P o213
benachba en AS zu Alanin noch imme gekoppel is 126, bewi ken die gleichen
Subs i u ionen im WT d G3P*, dass die Domänen as olls ändig unabhängig oneinande
o liegen (Johanna Koch, un e ö en lich e Da en). Um olglich Aussagen übe den E ek
on AS-Aus auschen au die Fal ungseigenscha en de beiden N- e minalen Domänen des
WT d G3P* e en zu können, muss auch de Fal ungsmechanismus des na ü lich
o kommenden G3P* bekann sein.
En sp echende Un e suchungen wu den be ei s on Roman Jakob un e ande em im
Rahmen seine Diploma bei begonnen. E konn e zeigen, dass analog zu d G3P* IIHY die
En al ung beide Domänen ausgehend on na i em WT d G3P* kine isch gekoppel und,
wie die Einnahme des gedock en Zus andes, du ch die no wendige Isome isie ung on P o213
deu lich e langsam is (;●;●, Abbildung 3.1.2a).150 Die En al ung de N1-Domäne aus dem
nich assoziie en Zus and sowie de en Rück al ung lau en dagegen wiede um im gleichen
schnellen Zei be eich ab wie die de N1-Domäne de s abilisie en Va ian e.
Abbildung 3.1.2: Au agung de En - und Rück al ungs a en on WT d G3P*, d G3P* IIHY und isolie e N2.
a) Au ge agen sind die appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en
(o ene Symbole)
on WT d G3P* (schwa ze Symbole) bzw. d G3P* IIHY (g aue Symbole) in Abhängigkei on de GdmCl-
Konzen a ion bei 25 °C. Die Reak ionen de N1-Domäne wu den anhand de T p-Fluo eszenz nach An egung
bei 295 nm e olg . Nach An egung bei 280 nm wu den die Fal ungs a en de N2-Domäne in
Handmischexpe imen en übe die Messung de Fluo eszenz bei 310 nm und nach s opped- low-Mischung
anhand de Fluo eszenzände ung obe halb on 340 nm e hal en. Gezeig sind die Rück al ung (;) de N1-
Domäne und de en En al ung aus dem nich assoziie en Zus and (;) e hal en du ch Doppelmisch-
expe imen e, die gekoppel e En al ung on N1 und N2 ausgehend on na i em P o ein (;●;●), sowie die
Rück al ung de N2-Domäne (; und ;). Die En al ungs a en de N2-Domäne im ungedock en Zus and
(;) wu den übe Doppelmischexpe imen e e mi el . Die gezeig en Da en wu den de Diploma bei on
Roman Jakob150 und Re e enz 151 en nommen. b) En al ungs- (o ene Symbole) und Rück al ungskine iken
(ausge üll e Symbole) de isolie en N2-Domäne Q129H in Abhängigkei on de Ha ns o -Konzen a ion bei
15 °C. Gezeig sind die kon o ma ionelle Rück al ung de cis- bzw. ans-Spezies de N2 (;), de en
En al ung (●) und die du ch die Isome isie ung on P o161 limi ie en En - und Rück al ungs a en (;). Die
Da en wu den de Dok o a bei on Roman Jakob94 en nommen, wobei die en sp echende Abbildung modi izie
wu de. Alle Messungen sind in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi 0,5 bzw. 1 µM P o ein du chge üh wo den.
76543210
10
2
10
1
10
0
10
-1
10
-2
10
-3
[Ha
ns o ] (M)
(s
-1
)
a) b)
[GdmCl] (M)
0123456
(s
-1
)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
3
10
E gebnisse und Diskussion
49
Die monophasische En al ung de N2-Domäne ausgehend on nich assoziie em
WT d G3P* is au g und ehlende güns ige Wechselwi kungen zwischen den Domänen
eben alls deu lich beschleunig (, Abbildung 3.1.2a). Wäh end de Rück al ung de N2-
Domäne wu den dagegen zwei Phasen de ek ie , wobei die schnelle e de beiden ( = 37 s in
0,5 M GdmCl; , Abbildung 3.1.2a) analog zu d G3P* IIHY de kon o ma ionellen Fal ung
des globulä en Teils on N2, die zwei e de losen Domänenassozia ion zugeo dne wu de
(, Abbildung 3.1.2a; = 195 s in 0,5 M GdmCl).150
Wäh end seine Dok o a bei konn e R. Jakob jedoch du ch die eingehende Analyse des
Fal ungsmechanismus on isolie e N2 im Dena u ie ungsmi el Ha ns o zeigen, dass die
Rück al ung diese Domäne nich in zwei sonde n d ei Phasen abläu , wobei de in de N2-
Domäne des na i en G3P* eben alls in cis-Kon o ma ion o kommende P olin es 161 eine
wich ige Rolle spiel (Abbildung 3.1.1).151 In eine schnellen Reak ion al e dabei zunächs
die ge inge Popula ion dena u ie e N2 mi cis-P o161 ( = 33 ms in 1 M Ha ns o ), danach
e olg die 30 ach langsame e Fal ung de Spezies mi P o161 in ans-Kon o ma ion
(;, Abbildung 3.1.2b). Im le z en Sch i komm es zu anscis-Isome isie ung des
P olin- Res es, wodu ch N2 s abilisie wi d (, Abbildung 3.1.2b). Die En al ungs a en de
beiden na i en Fo men und sind dagegen gleich und olgen dahe dem gleichen
Che onas (●, Abbildung 3.1.2b). Zu besse en Zuo dnung de isome en Spezies de
P olin es e 161 und 213 gil im Folgenden die Fes legung, dass Kon o me e, die sich au
P o161 beziehen, übe hochges ell e Bezeichnungen gekennzeichne we den, diejenigen on
P o213 sind en sp echend ie ges ell (/P o
P o).
Du ch den Ve gleich de Rück al ungskine iken de isolie en N2-Domäne mi denen de
N2-Domäne im WT d G3P* in Ha ns o konn e abgelei e we den, dass die Fal ung diese
Domäne im N1N2-F agmen eben alls in diesen d ei Phasen abläu . Die S uk u ie ung des
globulä en Teils on N2 e olg dami nich nu unabhängig on N1 und de e en uell
gleichzei ig s a indenden Fal ung de Gelenk egion, sonde n is o allem auch schnelle , als
aus den Da en de Rück al ung in GdmCl zunächs geschluss olge wo den wa .94
3.1.1 Die Fal ung des globulä en Teils de N2-Domäne e olg in de To zei de
manuellen Mischung
Die Analyse de Fal ung de N2-Domäne im du ch Ha ns o en al e en WT d G3P* and in
Gegenwa on na i e N1 s a , da diese seh s abil is und in Ha ns o nu zu einem
ge ingen Teil en al e wi d. Einige de in diese A bei un e such en Subs i u ionen sind
jedoch in de N1-Domäne lokalisie , weshalb zu Analyse de Fal ung beide Domänen
diese Va ian en wiede au das s ä ke e Dena u ie ungsmi el GdmCl zu ückgeg i en
we den muss e. Um die E ek e de Aus ausche au die Fal ung des WT d G3P* e aluie en
zu können, wu de zunächs un e such , inwiewei sich de oben besch iebene Fal ungs-
mechanismus on N2 in Gegenwa on Ha ns o und bei 15 °C au die Fal ung de isolie en
Fo m und des Gesam p o eins in GdmCl bei 25 °C übe agen läss . Im Folgenden we den in
E gebnisse und Diskussion
50
den Au agungen die be ei s bekann en Che onda en in g au da ges ell . Fa blich
he o gehoben we den jeweils die en sp echend disku ie en Da en.
Die isolie e N2-Domäne besi z nu eine seh ge inge S abili ä (TM = 34,6 °C), weshalb
de Ve lau de Rück al ungs a en nich gu au gelös we den konn e (, Abbildung 3.1.3).
Die nach s opped- low-Mischung au genommenen Kine iken zeigen jedoch, dass die Fal ung
on N2 schnell abläu ( = 0,42 s in 0,2 M GdmCl). Obe halb on 0,3 M GdmCl kann die
gebilde e Spezies au g und ih e ge ingen S abili ä nich meh al en. S a dessen sind
Fal ungs eak ionen mi noch schnelle en Ra en de ek ie ba (, Abbildung 3.1.3).
Abbildung 3.1.3: Che on-Au agung de Fal ungs- und En al ungs a en on WT d G3P*.
Au ge agen sind die appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en (o ene Symbole) on
WT d G3P* (g aue Symbole) aus Abbildung 3.1.2 und isolie e N2 (schwa ze Symbole) in Abhängigkei on
de GdmCl-Konzen a ion bei 25 °C. Die Ra en de Rück al ung de N2-Domäne ausgehend on olls ändig
en al e em WT d G3P* () bzw. in 2 M GdmCl eilweise dena u ie em P o ein () wu den nach Doppel- bzw.
Einzelmischexpe imen en e hal en, die En al ungs a en on N2 aus dem nich assoziie en Zus and übe
Doppelmischexpe imen e nach Rück al ung ü 0,5 s () bzw. 150 s () in 0,5 M GdmCl. Die En - und
Rück al ungs a en de isolie en N2-Domäne (;;) wu den anhand on Einzelmischexpe imen en e hal en.
Gezeig sind auße dem die Rück al ung () de N1-Domäne des WT d G3P* und de en En al ung aus dem
nich assoziie en Zus and () e hal en du ch Doppelmischexpe imen e, die gekoppel e En al ung on N1 und
N2 ausgehend on na i em P o ein (;●), sowie die Rück al ung de N2-Domäne (;). Die En al ungs a en
de N2-Domäne im ungedock en Zus and nach 20 s Rück al ungsdaue () wu den eben alls übe
Doppelmischexpe imen e e mi el . Einige de Da en wu den, wie in Abbildung 3.1.2 besch ieben, de
Diploma bei on Roman Jakob150 en nommen. Nach s opped- low-Mischung wu den die Fal ungs a en de N2-
Domäne anhand de Ände ung de Fluo eszenz obe halb on 320 nm (An egung bei 280 nm) e hal en. Die
Messungen wu den in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi 0,5 bzw. 1 µM P o ein du chge üh .
Nach dem on Roman Jakob au ges ell en Modell is au g und des ge ingen -An eils
wäh end de Rück al ung de N2-Domäne as ausschließlich die Fal ung de -Spezies
beobach ba , die e s du ch die langsame Isome isie ung des P o161 in die s abile e cis-Fo m
umgewandel wi d.151 Die wäh end de langsame en Fal ungs eak ion gebilde e ins abile
Spezies en sp ich demnach isolie e N2 mi ans-P o161 (). Im ge al e en Zus and is
de An eil an deu lich gegenübe e höh , wodu ch die Ampli ude de
En al ungskine iken ausgehend on ge al e e N2 du ch die Reak ion on
dominie wi d.
[GdmCl] (M)
0123456
(s
-1
)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
3
10
E gebnisse und Diskussion
51
De nied ige TM-We de isolie en N2-Domäne ließ e mu en, dass N2 im nich
assoziie en WT d G3P* gegenübe GdmCl eben alls nu eine ma ginale S abili ä besi z . Im
na i en, gedock en WT d G3P* is die N2-Domäne dagegen du ch die In e ak ion mi N1
s a k s abilisie . De Übe gangsmi elpunk ih es Gleichgewich sübe ganges lieg bei
1,4 M GdmCl, de de N1-Domäne bei 2,6 M GdmCl.121 Au g und de Limi ie ung du ch die
maximal mögliche Ve dünnung wäh end de s opped- low-Mischung wu de die Fal ung de
N2-Domäne zunächs ausgehend on (in 2 M GdmCl) eilweise en al e em G3P* un e such .
Un e diesen Bedingungen is die labile e N2 be ei s en al e , N1 be inde sich dagegen noch
as olls ändig im na i en Zus and. Gemäß de e hal enen Rück al ungs eak ionen läu die
Fal ung des globulä en Teils de N2-Domäne im eilge al e en WT d G3P* deu lich schnelle
ab als au g und ühe e Da en150 angenommen. Die Zei kons an e is on 37 s au 2,8 s in
0,5 M GdmCl e inge (, Abbildung 3.1.3).
Um auch die Rück al ung de N2-Domäne ausgehend on olls ändig dena u ie em
WT d G3P* un e suchen zu können, wu den zusä zlich Doppelmischexpe imen e
du chge üh . Du ch el ache Ve dünnung des en al e en P o eins on 5,5 M nach
0,5 M GdmCl ü 0,55 s wu de zunächs die Fal ung de N1-Domäne e möglich ( = 83 ms).
Die Rück al ung de N2-Domäne wu de nach einem wei e en Sp ung in GdmCl-
Konzen a ionen on 0,1 bis 0,5 M e olg . Die Ra en de esul ie enden monophasischen
Kine iken (, Abbildung 3.1.3) sind dabei iden isch mi denen de Rück al ung ausgehend
on in 2 M GdmCl eilweise ge al e em G3P*. Im Ve gleich zu isolie e N2 is die
Rück al ung jeweils ge ing ügig e langsam . Eine Aussage da übe , ob die Rück al ungs-
geschwindigkei de N2-Domäne du ch die Anwesenhei de ge al e en N1-Domäne, mi de
sie übe die Gelenk egion e knüp is , beein luss wi d, kann jedoch nich ge o en we den,
da dazu die In o ma ionen übe die isolie e N2-Domäne ehlen.
Die En al ung de N2-Domäne aus dem nich assoziie en Zus and kann eben alls anhand
on Doppelmischexpe imen en un e such we den. Be ei s nach ku ze Rück al ungsdaue
on 0,5 s in 0,5 M GdmCl und e neu em Sp ung diesmal in En al ungsbedingungen e geben
sich En al ungskine iken, de en Zei kons an en (0,125 s in 1,6 M GdmCl) im Be eich de on
Roman Jakob nach eine Rück al ungszei on 20 s gemessenen Ra en liegen
(;, Abbildung 3.1.3).150 Auch nach Ve länge ung de Rück al ungsdaue au 150 s in
0,5 M GdmCl en al e obe halb on 1,2 M GdmCl zumindes ein Teil de N2-Moleküle des
WT d G3P* mi de gleichen Geschwindigkei (, Abbildung 3.1.3). Dies s imm mi de
Beobach ung übe ein, dass die beiden N2-Spezies ( und ) gleich schnell
en al en.151 Un e halb on 1,2 M GdmCl deu e sich nach länge e Rück al ung ein
Abknicken des En al ungsas es an. Das is ein Hinweis da au , dass hie im Gegensa z zu
En al ung nach ku ze Rück al ung wiede die Dena u ie ung de s abile en -Spezies das
Fluo eszenzsignal dominie . Die anscis-Isome isie ung des P olin161 inde demnach
e mu lich in diesem Zei ens e s a .
E gebnisse und Diskussion
58
Abbildung 3.1.6. Analyse de En al ung de N2-Domäne ausgehend on nich assoziie em WT d G3P*.
a) En al ungskine ik on 1 µM de N2-Domäne im WT d G3P* in 1,4 M GdmCl nach Rück al ung des
olls ändig en al e en P o eins ü 300 s in 0,5 M GdmCl. Die schwa ze du chgezogene Linie s ell den
Angleich eine iexponen iellen Funk ion an die Da en mi Zei kons an en on = 13,2 s, 2 = 102 s und
3 = 1667 s da . b) Au agung de Ampli uden de schnellen () und in e mediä en En al ungsphase (●) und
des Be ages de Ampli ude de langsams en Rück al ungs eak ion () de N2-Domäne im WT d G3P* als
Funk ion de GdmCl-Konzen a ion nach Rück al ung des en al e en P o eins ü 300 s in 0,5 M GdmCl und
e neu em Sp ung in En al ungsbedingungen. Die in a) und b) gezeig en Da en wu de bei 310 nm nach An egung
bei 280 nm e hal en. c) Au ge agen sind die appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en
(o ene Symbole) on WT d G3P* in Abhängigkei on de GdmCl-Konzen a ion. Die Ra en de schnellen ()
und in e mediä en En al ungs eak ion (●) sowie de langsamen Rück al ungsphase () des WT d G3P* aus
dem nich assoziie en Zus and wu den, wie in a) besch ieben, übe Doppelmischexpe imen e bes imm .
Au ge agen sind zudem die übe Einzelsp ünge nach manuelle Mischung e hal enen En al ungs- (●;●) und
Rück al ungs a en (;) ausgehend on olls ändig na i em bzw. en al e em P o ein sowie die Ra en de
langsamen () und in e mediä en Rück al ungsphase () de N2-Domäne aus dem en al e en Zus and mi
cis-P o213. Gezeig sind auße dem die Ra en de Rück al ung de N2-Domäne ausgehend on en al e em
WT d G3P* (), die En al ungs a en on N2 aus dem nich assoziie en Zus and nach Rück al ung ü 150 s
() bzw. 20 s () in 0,5 M GdmCl, die Rück al ung de N1-Domäne des WT d G3P* () und de en En al ung
aus dem ungedock en Zus and () e hal en du ch Doppelmischexpe imen e, die gekoppel e En al ung on N1
und N2 ausgehend on na i em P o ein (, e olg nach s opped- low-Mischung). Zu Ve gleichszwecken
au ge agen sind zusä zlich die En - und Rück al ungs a en de isolie en N2-Domäne (;;). Wie in
Abbildung 3.1.2 besch ieben, wu de ein Teil de Da en de Diploma bei on Roman Jakob en nommen.150 Alle
Messungen wu den in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi 0,5 bzw. 1 µM P o ein bei 25 °C du chge üh .
a) b)
c)
(s)
060120180240
ela i e Fluo eszenz
150
155
160
165
170
2000 4000 6000
[GdmCl] (M)
0123456
(s
-1
)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
3
10
[GdmCl] (M)
1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
ela i e Fluo eszenz
0
10
20
30
E gebnisse und Diskussion
59
Nach 300 s Rück al ungsdaue is sowohl die N1- als auch die N2-Domäne ge al e . Die
Gelenk egion is dagegen noch nich s uk u ie , da P o213 noch wei gehend in ans-
Kon o ma ion o lieg . Wäh end de En al ung dieses In e media es sind d ei Phasen
de ek ie ba , wobei die schnelle ( = 13,3 s) und die mi le e ( = 102 s) ein ab allendes Signal
zeigen, die langsame ( = 1667 s; jeweils in 1,4 M GdmCl) dagegen mi einem Ans ieg de
Fluo eszenz e bunden is (Abbildung 3.1.6a). G und ü le z e en is , wie auch schon in den
Rück al ungsexpe imen en beobach e , die Kopplung de Fal ung on N2 an die
Isome isie ung on P o213 und die Einnahme des gedock en Zus andes. Obe halb on
1,5 M GdmCl is diese Rück al ungs eak ion nich meh de ek ie ba , da das Gleichgewich
zu s a k au de Sei e de En al ung lieg (, Abbildung 3.1.6b,c).
Die in e mediä e Phase olg in ih en Ra en de kon o ma ionellen En al ung ausgehend
on na i em P o ein. Ih e Ampli ude is jedoch im Ve gleich zu den Da en aus den
Einzelmischexpe imen en deu lich e inge (●, Abbildung 3.1.6b,c). Das Au e en diese
Reak ion deu e an, dass im en al e en Zus and analog zu P o161 auch P o213 sowohl in
ans- als auch cis-Kon o ma ion o komm , wobei das Gleichgewich au de Sei e de
-Spezies lieg . Bei ge ingen GdmCl-Konzen a ionen wi d die g öß e Signalände ung
du ch die zusä zliche schnelle Phase e u sach (, Abbildung 3.1.6). De Ve lau ih e Ra en
geh in den Che onas de schnellen Rück al ungs eak ion übe (, Abbildung 3.1.6b). Dies
deu e an, dass hie analog zum Fal ungsmechanismus de isolie en N2-Domäne in Ha ns o
die du ch die cis ans-Isome isie ung on P o161 limi ie e En al ung de -Spezies
beobach e wi d.
3.1.4 Die Subs i u ion des P o161 gegen Alanin ha keine Auswi kung au den
gedock en Zus and
Nach den gezeig en E gebnissen kann ü WT d G3P* keine de kon o ma ionellen Fal ung
de einzelnen Domänen nachgelage e lose Assozia ions eak ion beobach e we den. Die N2-
Domäne wi d s a dessen sowohl wäh end de kon o ma ionellen Fal ung als auch im nich
assoziie en Zus and du ch die Isome isie ung on P o161 in die cis-Kon o ma ion
s abilisie , be o de gedock e Zus and, limi ie du ch die anscis-Isome isie ung on
P o213, eingenommen wi d. Du ch diese abschließende Kopplung de beiden Domänen wi d
die S abili ä on N2 im na i en G3P* deu lich e höh . Die Subs i u ion des P o161 du ch
Alanin, das ausschließlich in ans-Kon o ma ion o lieg , soll e sich demnach lediglich au
die Rück al ung, jedoch kaum au die S abili ä des Wild yp-G3P* im Gleichgewich bzw.
dessen En al ung aus dem na i en Zus and auswi ken.
Die S abili ä de en sp echenden Va ian e d G3P* P161A wu de du ch he misch-
induzie e En al ung un e such , wobei die Ände ung des CD-Signals bei 230 nm als Sonde
dien e.121 Genau wie zu o ü WT d G3P* und die Va ian e d G3P* P213G beobach e ,
en al e d G3P* P161A bei diese Wellenlänge in einem zweiphasigen Übe gang. Wäh end
de e s en Phase komm es zu En al ung de labile en N2-Domäne, die gleichzei ig auch die
E gebnisse und Diskussion
60
Dissozia ion de Domänen und die En al ung de Gelenk egion wide spiegel . De zwei e
Übe gang kann de Dena u ie ung de s abile en N1-Domäne zugeo dne we den
(Abbildung 3.1.7). Die nach Angleich gemäß eines D eizus andsmodells e hal enen
he modynamischen Pa ame e sind in Tabelle 3.1.1 au gelis e .
Abbildung 3.1.7: The misch-induzie e En al ung on WT d G3P* und den beiden subs i uie en Va ian en.
Au agung de ela i en Ände ung des CD-Signals bei a) 230 nm und b) 210 nm on WT d G3P* (●),
d G3P* P213G (○) und d G3P* P161A () in Abhängigkei on de Tempe a u . Die du chgezogenen Linien
S ellen den Angleich an die Da en gemäß eines a) D eizus ands- bzw. b) Zweizus andsmodells da . Die
Übe gänge on 4 µM P o ein (1 µM bei 210 nm) wu den in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi eine Schich dicke on
1 cm, eine Heiz a e on 60 °C h-1 und eine Dämp ung on 8 s gemessen. Die aus de Da enanalyse e hal enen
he modynamischen Pa ame e sind in Tabelle 3.1.1 au gelis e .
Tabelle 3.1.1: S abili ä sda en aus de he misch-induzie e En al ung on WT d G3P* und den Va ian en
d G3P* P161A bzw. d G3P* P213G
Domänendissozia ion und En al ung
de N2-Domäne En al ung de N1-Domäne
Va ian e TM (°C) H
(kJ mol-1)
G45°C
(kJ mol-1) TM (°C) H
(kJ mol-1)
G60°C
(kJ mol-1)
WT d G3P* 48,5 591 6,2 60,2 230 0,1
48,0 612 5,6 - - -
d G3P* P161A 47,1 636 4,1 60,5 211 0,3
46,6 560 2,7 - - -
d G3P* P213G 44,9 279 -0,1 60,2 225 0,1
37,8 442 -11,0 - - -
isolie e N2-Domäne 34,6 304 -11,7 - - -
Angegeben sind ü die G3P*-Va ian en d G3P* P161A, d G3P* P213G und WT d G3P* sowie die isolie e
N2-Domäne die Schmelz empe a u en TM, die En halpie de jeweiligen En al ungs eak ion am TM (H) und die
eien En halpien de En al ung G45°C und G60°C bei 45 °C bzw. 60 °C. Die S abili ä sda en de beiden
Domänen im G3P* wu den nach Auswe ung des biphasischen En al ungsübe gangs, de anhand des CD-
Signals bei 230 nm gemessen wu de, gemäß eines D eizus andsmodells e hal en (Abbildung 3.1.7a). De e s e
Übe gang spiegel die En al ung de N2-Domäne sowie die Dissozia ion de Domänen wide , de zwei e
Übe gang die Dena u ie ung de N1-Domäne. Da un e jeweils au gelis e sind die S abili ä sda en on N2 im
jeweiligen G3P*, welche, wie die de isolie en N2-Domäne, übe die Ände ung des CD-Signals bei 210 nm
e mi el wu den (Abbildung 3.1.7b). Die en sp echenden he mischen Übe gänge wu den gemäß eines
Zweizus andsmodells ausgewe e . Fü die Analyse wu de eine kons an e Ände ung de Wä mekapazi ä Cp
on 10000 J mol-1 K-1 ü N2 bzw. ü N1 1000 J mol-1 K-1 angenommen. Fü die isolie e N2-Domäne wu de ein
We on 8000 J mol-1 K-1 e wende . Die Da en ü WT d G3P* wu den de A bei 121 en nommen; die We e
ü d G3P* P213G bei 230 nm de Re e enz 79. Die Da en zu isolie e N2-Domäne sind eine pe sönliche
Mi eilung on Roman Jakob. Die Messungen wu den un e den in Abbildung 3.1.7 besch iebenen Bedingungen
du chge üh .
10080604020
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
T (°C)
ela i e Signalände ung
6050403020
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
T (°C)
ela i e Signalände ung
a) b)
E gebnisse und Diskussion
61
Im Gegensa z zu Va ian e d G3P* P213G, in de de Aus ausch des P o213 zu eine
Abnahme des TM-We es de N2-Domäne um ca. 3 °C üh , is die S abili ä on N2 in
d G3P* P161A e wa ungsgemäß nu ge ing ügig gegenübe WT d G3P* e inge . Die
ähnlich hohe En halpie deu e da au hin, dass in diesem P o ein die s abilisie ende
Assozia ion zwischen den Domänen noch bes eh . Die Koope a i i ä de En al ung on N2
in de Va ian e mi Glycin an Posi ion 213 is dagegen deu lich kleine , was zumindes au
eine Schwächung de Wechselwi kungen schließen läss . Die S abili ä de N1-Domäne is
du ch die Subs i u ion im globulä en Teil on N2 bzw. in de Gelenk egion, die zusammen
mi N2 en al e , nich beein luss .
Die du ch die Dena u ie ung de N2-Domäne e u sach e Signalände ung bei 230 nm is
seh ge ing. Wenn die Übe gänge de beiden Domänen nu schwach oneinande ge enn und
zudem die En halpien de Übe gänge klein sind, wi d die Bes immung des
Übe gangsmi elpunk es de N2-Domäne seh ungenau. Aus diesem G und wu de die
En al ung de labile en -Fal bla dominie en N2-Domäne zusä zlich selek i übe die
Ände ung des CD-Signals bei 210 nm e olg (Abbildung 3.1.7b, Tabelle 3.1.1). Dabei
zeig e sich, dass zwa ü WT d G3P* bzw. d G3P* P161A die S abili ä sda en mi den
zu o bei 230 nm e hal enen We en gu übe eins immen, de Übe gangsmi elpunk de
Va ian e mi P213G-Subs i u ion is jedoch um 7 °C e inge . Dami is die N2-Domäne des
d G3P* P213G nu ge ing ügig s abile als die isolie e N2-Domäne (TM = 34,6 °C,
Tabelle 3.1.1). Die gleichzei ig deu lich e höh e En halpie zeig alle dings an, dass im na i en
d G3P* P213G zwischen den Domänen o z de e inge en S abili ä Wechselwi kungen
o handen sind, die e mu lich auch übe die s uk u ie e Gelenk egion e mi el we den
(Tabelle 3.1.1).
Da die Fal ungskine iken in Abhängigkei on de GdmCl-Konzen a ion analysie
we den, wu de zu Ve gleichszwecken zusä zlich die S abili ä de P o eine gegenübe diesem
Dena u ie ungsmi el un e such (Abbildung 3.1.8). Hie dien e die Ände ung de Fluo eszenz
bei 310 nm nach An egung bei 280 nm als spezi ische Sonde de En al ung de N2-Domäne,
an die wiede um die En al ung de Gelenk egion und die Dissozia ion de Domänen
gekoppel sind. Die Dena u ie ung de N1-Domäne wu de anhand de Zunahme de
Fluo eszenz de d ei en hal enen T yp ophan es e bei 360 nm e olg . Die N2-Domäne
besi z eben alls ein T yp ophan, weshalb diese Sonde nich olls ändig selek i ü N1 is .
Die du ch T p181 in N2 e u sach e schwache Signalände ung is e mu lich de G und
da ü , dass das Fluo eszenzsignal o allem des na i en d G3P* P161A in diesem Be eich
nich linea e läu (Abbildung 3.1.8a). Die nach Angleich an die Da en un e Fes legung de
Basislinie e hal enen he modynamischen Pa ame e de N1-Domäne de Va ian e sind im
Ve gleich zu WT d G3P* leich e inge , was jedoch wah scheinlich au die ungenaue e
Auswe ung zu ückzu üh en is (Tabelle 3.1.2). Wie auch schon bei de he misch-induzie en
En al ung beobach e , is de Übe gangsmi elpunk de N1-Domäne du ch die Subs i u ion
P213G eben alls nich beein luss .
E gebnisse und Diskussion
62
Abbildung 3.1.8: GdmCl-induzie e En al ung de P161A- bzw. P213G-subs i uie en G3P*-Va ian e.
Au ge agen is die ela i e Fluo eszenzände ung on WT d G3P* (●), d G3P* P213G (○) bzw.
d G3P* P161A () als Funk ion de GdmCl-Konzen a ion bei (a) 360 nm nach An egung bei 295 nm zu
De ek ion de En al ung de N1-Domäne anhand de T p-Fluo eszenz und bei (b) 310 nm nach An egung bei
280 nm zu Beobach ung de N2-Domäne anhand de Ty -Fluo eszenz. Die du chgezogenen Linien s ellen
Ku enangleiche an die Messwe e un e Annahme eines Zweizus andsmodells da . Die Da en ü WT d G3P
wu den de A bei 121 en nommen. Die Übe gänge wu den bei 25 °C mi 0,5 µM WT d G3P bzw. 1 µM
d G3P P213G und d G3P P161A in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 bei eine Schich dicke on 1cm gemessen. Die
aus de Da enanalyse e hal enen he modynamischen Pa ame e sind in Tabelle 3.1.2 au gelis e .
Tabelle 3.1.2: S abili ä sda en on WT d G3P* bzw. den Va ian en d G3P* P161A und d G3P* P213G aus
GdmCl-induzie e En al ung
Domänendissozia ion und En al ung
de N2-Domäne En al ung de N1-Domäne
Va ian e [GdmCl]m
(M)
m
(kJ mol-1 M-1)
G25 °C
(kJ mol-1)
[GdmCl]m
(M)
m
(kJ mol-1 M-1)
G25 °C
(kJ mol-1)
WT d G3P* 1,4 18,8 26,6 2,6 8,6 22,2
d G3P* P161A 1,1 19,7 22,1 2,4 6,7 15,9
d G3P* P213G 0,7 18,7 12,3 2,6 6,5 16,5
Angegeben sind die Übe gangsmi elpunk e [GdmCl]m, die Koope a i i ä spa ame e m sowie die au
0 M GdmCl ex apolie en eien En halpien de En al ung (G) bei 25 °C. De Übe gang de N2-Domäne
wu de nach An egung bei 280 nm anhand de Fluo eszenz bei 310 nm gemessen, de de N1-Domäne bei
360 nm nach An egung bei 295 nm e olg . Fü beide Domänen e olg e die Analyse de Da en nach einem
Zweizus andsmodell. Die Da en ü WT d G3P* wu den de A bei 121 en nommen. Die Messungen wu den
un e den in Abbildung 3.1.8 besch iebenen Bedingungen du chge üh .
Die N2-Domänen de beiden Subs i u ions a ian en sind wiede im Ve gleich zum
Wild yp-G3P* des abilisie , insbesonde e nach Aus ausch on P o213 du ch Glycin. Die
Subs i u ion P161A in de N2-Domäne wi k sich wenige s a k des abilisie end aus. Die
un e ände hohen m-We e de En al ung de N2-Domäne zeigen jedoch an, dass diese in
beiden Va ian en an die En al ung de Gelenk egion und die Domänenö nung gekoppel is
(Tabelle 3.1.2).
Im Folgenden wu de un e such , inwiewei sich die P161A-Subs i u ion in de N2-Domäne
au den Fal ungsmechanismus des G3P* auswi k . Dazu wu den zunächs die Rück al ung
on N1 und des globulä en Teils de N2-Domäne diese Va ian e nach schnelle Mischung
analysie . Die Ra en beide Reak ionen s immen mi denen des WT d G3P*
32,521,510,50
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
[GdmCl] (M)
ela i e Signalände ung
a) b)
543210
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
[GdmCl] (M)
ela i e Signalände ung
E gebnisse und Diskussion
63
übe ein (;, Abbildung 3.1.9). Auch in diese Va ian e al en demnach beide Domänen
unabhängig oneinande in schnellen Reak ionen. Die Fal ungs a en on N2 mi P161A
olgen dabei in ih em Ve lau denen de N2-Domäne mi ans-P o161 im geö ne en Zus and
des G3P*. Obe halb on 0,5 M GdmCl is jedoch keine zusä zliche Phase de ek ie ba , die de
Fal ung de N2-Spezies mi cis-P o161 im WT d G3P* en sp ich .
Abbildung 3.1.9. Che onau agung de Fal ungs- und En al ungs a en de Va ian e d G3P* P161A.
Au ge agen sind die appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en (o ene Symbole) on
WT d G3P* (g aue Symbole) bzw. d G3P* P161A ( a bige Symbole) in Abhängigkei on de GdmCl-
Konzen a ion. Die langsamen En al ungs- (●;●;●;●) und Rück al ungs a en (;;;;) de N2-Domäne des
jeweiligen G3P* nach manuelle Mischung wu den anhand de Ände ung de Ty osin luo eszenz bei 310 nm
nach An egung bei 280 nm gemessen. Gezeig sind auße dem die schnelle Rück al ung de N1-Domänen (;),
die anhand de T p-Fluo eszenz obe halb on 340 nm nach An egung bei 295 nm e olg wu de. Die
kon o ma ionelle Fal ung de jeweiligen -Spezies (;) ausgehend on en al e em P o ein sowie die
gekoppel e En al ung on N1 und N2 aus dem na i en Zus and (;) nach s opped- low-Mischung wu den
anhand de Fluo eszenz obe halb on 320 nm nach An egung bei 280 nm gemessen. Die Rück al ung on N2
(;) und de N1-Domäne () ausgehend on dena u ie em P o ein mi cis-P o213 wu de nach En al ung ü
1,5 s in 3,5 M GdmCl und e neu em Sp ung in na i e Bedingungen übe die gleiche Sonde de ek ie . Zu
Ve gleichszwecken au ge agen sind auße dem die En al ungs a en de N2-Domäne nach 20 bzw. 150 s
Rück al ungsdaue in 0,5 M GdmCl (;), die En al ungs a en de N1-Domäne () im ungedock en
WT d G3P* sowie die En - und Rück al ungs a en de isolie en N2-Domäne (;). Einige de Da en des
WT d G3P* wu den, wie in Abbildung 3.1.2 besch ieben, de Diploma bei on Roman Jakob en nommen.150
Alle Messungen wu den in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi 1 µM P o ein bei 25 °C du chge üh .
Auch nach Aus ausch on P o161 gegen Alanin e olg die langsame, nach manuelle
Mischung de ek ie e Rück al ung im meh e en Phasen (;;, Abbildung 3.1.10). Bei
nied igen GdmCl-Konzen a ionen is lediglich eine Reak ion (, = 19,2 s in
0,25 M GdmCl) mi eine ge ingen Ampli ude de ek ie ba (Abbildung 3.1.10a), da die
kon o ma ionelle Fal ung de N2-Domäne zum g oßen Teil be ei s in de To zei de
manuellen Mischung abläu (Abbildung 3.1.9). Diese Fal ungsphase wa auch ü die
isolie e N2-Domäne mi de P161A-Subs i u ion beobach e wo den. Es wu de e mu e ,
dass sie die du ch die cis ans-Isome isie ung de zusä zlich in N2 en hal enen P olin es e
limi ie e Fal ung de N2-Domäne e lek ie . Diese Reak ion wi d im WT d G3P* du ch die
Isome isie ung des P o161 übe deck , die im gleichen Zei be eich abläu .151
[GdmCl] (M)
0123456
(s
-1
)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
3
10
E gebnisse und Diskussion
64
Obe halb on 0,5 M GdmCl kann nu noch ein kleine Teil de N2-Domäne o de
Assozia ion mi N1 in die na i e Fo m übe gehen. Die Fal ung wi d ielmeh du ch die
langsame anscis-Isome isie ung des P o213 bes imm , wodu ch de assoziie e Zus and
eingenommen und die N2-Domäne aus eichend s abilisie wi d (Abbildung 3.1.10c,b). Diese
langsame Reak ion zeig demnach auch die g öß e Ampli ude (, Abbildung 3.1.10d).
Zusä zlich is eine in e mediä e Phase mi eine Zei kons an e on e wa 100 s de ek ie ba ,
de en ge inge Ampli ude jedoch in e essan e weise in die en gegengese z e Rich ung zeig
(, Abbildung 3.1.10b-d). Die genaue U sache de Signalände ung is nich bekann . Es kann
jedoch nich ausgeschlossen we den, dass sie lediglich du ch Bleiche ek e e u sach wi d,
da die P obe wäh end de e s en 240 s pe manen e Lich eins ahlung ausgese z wa .
Abbildung 3.1.10. Rück al ungskine iken on d G3P* P161A in Abhängigkei de GdmCl-Konzen a ion.
Gezeig sind die Fal ungs eak ionen on 1 µM en al e em d G3P* P161A nach Ve dünnung in a) 0,25 M,
b) 0,55 M bzw. c) 0,7 M GdmCl. Die schwa zen du chgezogenen Linien s ellen Angleiche an die Da en mi
mono-, bi- bzw. iexponen iellen Gleichungen da. Die da aus e hal enen Zei kons an en e geben sich zu
a) = 19,2 s, b) = 29 s, = 94 s und = 2564 s, c) = 127 s und = 3300 s. d) Au agung de
Ampli uden de schnelle en (●) und langsams en En al ungsphase (●) sowie de schnellen (), in e mediä en
() und langsams en () Rück al ungs eak ionen de N2-Domäne im d G3P* P161A als Funk ion de GdmCl-
Konzen a ion. Die Da en wu den nach manuelle Mischung bei 310 nm anhand de Ty -Fluo eszenz (An egung
280 nm) in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 bei 25 °C gemessen.
Wie be ei s e mu e wi d die En al ung des P o eins du ch die Alanin-Subs i u ion nich
e ände . Die Zei kons an en de monophasischen En al ungskine iken on na i em
(s)
0 20406080100
ela i e Fluo eszenz
210
212
214
216
(s)
0 50 100 150 200
ela i e Fluo eszenz
195
200
205
210
2500 5000 7500
a) b)
d)c)
(s)
0 50 100 150 200
ela i e Fluo eszenz
190
195
200
205
210
3000 6000 9000
[GdmCl] (M)
0,5 1 1,5 2
ela i e Fluo eszenz
0
10
20
30
40
50
E gebnisse und Diskussion
65
d G3P* P161A bei hohen GdmCl-Konzen a ionen en sp echen denen des WT d G3P*
(, Abbildung 3.1.9). Im Be eich on 1 bis 2 M GdmCl e olg die En al ung de N2-
Domäne in einem zweiphasigen P ozess (●;●, Abbildung 3.1.9, Abbildung 3.1.10). Dem
Ra en- bzw. Ampli uden e lau nach kann die schnelle Reak ion de kon o ma ionellen
En al ung de N2-Domäne aus dem assoziie en Zus and (●), die langsame e (●) de
Isome isie ung des P o213 zugeo dne we den. Dass du ch den AS-Aus ausch die S abili ä
de N2-Domäne im Ve gleich zu N2 im Wild yp-P o ein leich e inge is , zeig sich in de
ge ing ügigen Ve schiebung des Che onas es zu nied ige en GdmCl-Konzen a ionen
(●;●, Abbildung 3.1.9).
Die Rück al ung de N2-Domäne in den gedock en Zus and wu de wiede um übe
Doppelmischexpe imen e e mi el , indem na i es d G3P* P161A zunächs ku z ü 1,5 s in
3,5 M GdmCl zu Popula ion de -Spezies en al e wu de. Wie be ei s ausge üh , is
diese En al ungspuls aus eichend, um das P o ein kon o ma ionell zu en al en, alle dings
behäl P o213 in de Gelenk egion wei gehend seine cis-Kon o ma ion, so dass sich bei de
Rück al ung unmi elba de geschlossene Zus and ausbilden kann. Im Gegensa z zu
WT d G3P* sind wäh end de Rück al ung lediglich zwei Phasen de ek ie ba , wobei die
schnelle e de beiden die Fal ung de N1-Domäne wide spiegel (, Abbildung 3.1.9). Die
langsame Phase (, Abbildung 3.1.9) e lek ie die Fal ung de N2-Domäne. Ih e Ra e
en sp ich de Ra e de Bildung de
-Spezies in WT d G3P* (, Abbildung 3.1.9). Die
Analyse des en sp echenden Che ons zeig , dass die N2-Domäne bei de Fal ung in die
gedock e Fo m wiede um deu lich s abile is als bei Rück al ung on olls ändig
dena u ie em G3P* in den nich assoziie en Zus and. Bei nied igen GdmCl-Konzen a ionen
s immen die jeweiligen Fal ungs a en jedoch wiede gu übe ein ((
) = 2,7 s;
(
) = 2,1 s, jeweils in 0,5 M GdmCl, Abbildung 3.1.9, ;). De Ablau de
Fal ung de N2-Domäne wi d demnach auch in d G3P* P161A nich du ch die Kon o ma ion
des P o213 beein luss . Die deu liche S abilisie ung de N2-Domäne in Gegenwa on cis-
P o213 wi d ielmeh übe die dann mögliche Assozia ion mi de ge al e en N1-Domäne
e eich . Das Fehlen de Rück al ungsphase mi eine Zei kons an e on 0,134 s (in
0,64 M GdmCl), die im Ausgangsp o ein die Bildung de
-Fo m e lek ie
(, Abbildung 3.1.5), bes ä ig , dass die Fal ung on d G3P* P161A im Wesen lichen de
Fal ung de Fo m des WT d G3P mi ans-P o161 olg .
3.1.5 Du ch den Aus ausch des P o213 gegen Glycin lieg das WT d G3P* eilweise
in nich assoziie e Fo m o
Ande s als die P161A-Subs i u ion ha de Aus ausch on P o213 gegen Glycin einen deu lich
nega i en Ein luss au die S abili ä de N2-Domäne des WT d G3P, was sich auch in de
Rück al ungskine ik de Va ian e d G3P* P213G wide spiegel . Wäh end de Fal ung
ausgehend on olls ändig dena u ie em d G3P* P213G sind d ei Reak ionen
spek oskopisch sich ba (Abbildung 3.1.11). Die Ve läu e de Fal ungs a en de N1-Domäne
E gebnisse und Diskussion
66
(, Abbildung 3.1.11) und des globulä en Teils de N2-Domäne mi P o161 in ans-
Kon o ma ion (, Abbildung 3.1.11) s immen dabei mi den en sp echenden Ra en übe ein,
die ü das Wild yp-P o ein e hal en wo den wa en. Die S abili ä des globulä en Teils de
N2-Domäne im nich assoziie en Zus and is also o z des Aus ausches in de Gelenk egion
un e ände . Nach manuelle Mischung konn e dagegen nu eine Fal ungs eak ion de ek ie
we den, de en Ra e de Isome isie ung on P o161 in seine cis-Kon o ma ion en sp ich
(, Abbildung 3.1.11). Die langsams e Reak ion, die de Bildung de assoziie en Fo m beim
WT d G3P en sp ich , konn e bei d G3P* P213G nich nachgewiesen we den.
Abbildung 3.1.11. Che onau agung de Fal ungs- und En al ungs a en des d G3P* P213G.
Au agung de appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en (o ene Symbole) on
WT d G3P* (g aue Symbole) bzw. d G3P* P213G ( a bige Symbole) in Abhängigkei on de GdmCl-
Konzen a ion. Die En al ungs- (●;;●;●) und Rück al ungs a en (;;) de N2-Domäne des jeweiligen
G3P* nach manuelle Mischung wu den anhand de Ände ung de Ty osin luo eszenz bei 310 nm nach
An egung bei 280 nm gemessen. Gezeig sind auße dem die schnelle Rück al ung de N1-Domänen (;), die
anhand de T p-Fluo eszenz obe halb on 340 nm nach An egung bei 295 nm e olg wu de. Die
kon o ma ionelle Fal ung de jeweiligen -Spezies (;) ausgehend on en al e em P o ein sowie die
En al ung on N1 und N2 aus dem na i en Zus and (;;) wu den nach s opped- low-Mischung anhand de
Ände ung de Fluo eszenz obe halb on 320 nm (An egung 280 nm; bzw. N1: An egung bei 295 nm, Emission
obe halb on 340 nm) beobach e . Die En al ung de -Spezies aus dem nich assoziie en Zus and ()
konn e be ei s in Einzelsp ungexpe imen en nach schnelle Mischung anhand de gleichen Sonde de ek ie
we den. Im WT d G3P* sind diese Ra en dagegen e s nach Rück al ung ü 20 bzw. 150 s in 0,5 M GdmCl und
e neu e Übe üh ung in En al ungsbedingungen beobach ba (;). Zu Ve gleichszwecken au ge agen sind
auße dem die En al ungs a en de N1-Domäne () im ungedock en WT d G3P* sowie die En - und
Rück al ungs a en de isolie en N2-Domäne (;). Einige de Da en des WT d G3P* wu den, wie in
Abbildung 3.1.3 besch ieben, de Diploma bei on Roman Jakob en nommen.150 Die Messungen wu den in
0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi 0,5 bzw. 1 µM P o ein bei 25 °C du chge üh .
De Ve lau de Rück al ung deu e da au hin, dass du ch den Aus ausch des P o213
gegen Glycin die Einnahme des gedock en Zus andes und dami die S abilisie ung de N2-
Domäne e hinde we den und deshalb ein g oße Teil de P o eine in geö ne e Fo m
o lieg . Ta sächlich e geben sich bei de En al ung ausgehend on na i em P o ein im
Be eich on 1 bis 2 M GdmCl d ei Phasen (●;;, Abbildung 3.1.11). Die Ra en de
schnells en En al ungs eak ion, die nach s opped-Flow-Mischung de ek ie wu de, s immen
[GdmCl] (M)
0123456
(s
-1
)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
3
10
E gebnisse und Diskussion
67
mi denen de Dena u ie ung on nich assoziie e -Spezies im WT d G3P* übe ein
(;, Abbildung 3.1.11), die in le z e em Fall jedoch e s übe Doppelmischexpe imen e
zugänglich is . Im Gegensa z zum Wild yp-P o ein is olglich die En al ung zumindes eines
Teils de Moleküle des d G3P* P213G a sächlich nich du ch die Dissozia ion de Domänen
limi ie .
Die in e mediä e Phase (, Abbildung 3.1.11), die nach manuelle Mischung e hal en
wu de, en sp ich mi eine Zei kons an e on
= 29 s (in 1,1 M GdmCl) de du ch die
cis ans-Isome isie ung on P o161 limi ie en Dena u ie ung on N2 im WT d G3P*
(
= 27 s in 1,1 M GdmCl). Die Ra en de langsamen En al ungs eak ion de N2-Domäne
(;●, Abbildung 3.1.11) gehen dem Ve lau nach in den En al ungsas on N1 ausgehend
on na i em P o ein übe (, Abbildung 3.1.11). Obe halb on 3,5 M GdmCl s immen die
übe beide Sonden e hal enen En al ungskine iken übe ein. Die Zei kons an e diese
Reak ion (
= 25 ms in 3,7 M GdmCl) is dabei zehnmal ge inge als im WT d G3P*
(
= 230 ms in 3,7 M GdmCl) und en sp ich dami de Zei kons an e de En al ung de
isolie en N1-Domäne. Dies bedeu e zum einen, dass o z des Fehlens on P o213 ein Teil
de Popula ion einen Zus and einnehmen kann, in dem du ch die Assozia ion de beiden
Domänen die En al ung on N1 an die de N2-Domäne gekoppel is . Zum ande en weis die
e höh e En al ungsgeschwindigkei de Domänen da au hin, dass ih e Kopplung in diesem
Zus and und dami die S abilisie ung on N2 deu lich schwäche is als im Wild yp-P o ein.
Ta sächlich is de En al ungsas diese assoziie en Spezies zu nied ige en GdmCl-
Konzen a ionen e schoben. Dabei liegen die un e halb on 1,6 M GdmCl nach manuelle
Mischung e hal enen Ra en de En al ung on N2 aus diese assoziie en Fo m
(●, Abbildung 3.1.11) im Zei be eich de Ra en de kon o ma ionellen En al ung de
-Fo m on WT d G3P* (●, Abbildung 3.1.11).
Die Va ian e d G3P* P213G lieg olglich als Mischung aus geschlossene und o ene
Fo m o . Dies e klä auch die on Ba ba a Ecke beobach e e hohe In ek iosi ä des
en sp echenden Phagen gegenübe pilus eien E. coli HB2156 Zellen, bei de en In ek ion die
Zugänglichkei de N1-Domäne ü ih en Rezep o , die C- e minale Domäne des
Memb anp o eins TolA, on en scheidende Bedeu ung is .96 Im Ve gleich zum
Ausgangsphagen is de Phage mi P213G-Subs i u ion hunde ach in ek iöse , was au die
du ch die Domänendissozia ion deu lich besse e Exposi ion de Bindungs läche au de N1-
Domäne zu ückge üh we den kann.
3.1.6 Die Geschwindigkei de Assozia ion de Domänen im d G3P* P213G is gegen-
übe de anscis-Isome isie ung on P o213 deu lich beschleunig
Die Assemblie ung on N1 und N2 im d G3P* P213G is spek oskopisch nich sich ba . Um
In o ma ionen übe die Geschwindigkei de Bildung des assoziie en Zus andes zu e hal en,
wu de dahe ein Zweisch i -En al ungs es ü na i e Moleküle du chge üh .142; 143 Dazu
wu de en al e es d G3P* P213G analog zu den be ei s besch iebenen
E gebnisse und Diskussion
74
Fü die s abilisie e Va ian e d G3P* IIHY P213G konn e keine Beschleunigung de
Assozia ions eak ion du ch die P olylisome ase Cyclophilin 18 beobach e we den.120 Von
Cyclophilin 18 is jedoch bekann , dass es die Isome isie ung on P o213 beschleunigen kann
und gene ell eine ge inge Spezi i ä gegenübe de AS on und nach dem P olin es besi z .160
Die U sache ü den Un e schied in de Ka alysie ba kei de beiden P213G-Va ian en is
nich bekann , ein mögliche G und kann jedoch die Zugänglichkei de be o enen
Pep idbindung in de Gelenk egion sein. Wäh end im lose-assoziie en Zus and de
s abilisie en Va ian e die Gelenk egion be ei s eilweise ge al e o lieg 62, is sie im
langlebigen Fal ungsin e media on WT d G3P* uns uk u ie (siehe auch Kapi el 3.2.2).
Dies is wah scheinlich auch die U sache ü die un e schiedlich s a ke Beschleunigung de
beiden Rück al ungsphasen in d G3P* P213G, denn P o161 in Schlei e 3 de N2-Domäne is
seh s a k lösungsmi elexponie und dami gu zugänglich ü P olylisome asen.
3.1.8 Die Rück al ung de N2-Domäne in de s abilisie en Va ian e d G3P* IIHY
e olg unmi elba in den lose-assoziie en Zus and
Nach den o handenen Da en e geben sich signi ikan e Un e schiede in den
Fal ungsmechanismen des Wild yp-P o eins und de s abilisie en Va ian e d G3P* IIHY.
Die En al ung des na i en WT d G3P* e olg in zwei spek oskopisch sich ba en Sch i en,
wobei die kon o ma ionelle En al ung de N2-Domäne deu lich schnelle is als die
cis ans-Isome isie ung on P o213. Fü die s abilisie e G3P*-Va ian e is lediglich eine
En al ungsphase de ek ie ba , de en Ra e im Übe gangsbe eich de N2-Domäne de de
langsamen P olylisome isie ungs eak ion on P o213 en sp ich (●, Abbildung 3.1.16).122 De
En al ungsas de Va ian e d G3P* IIHY P213G is zwa zu nied ige en GdmCl-
Konzen a ionen e schoben, jedoch sind im Gegensa z zu d G3P* P213G neben de
En al ung aus dem assoziie en Zus and keine wei e en Reak ionen de ek ie ba
(●, Abbildung 3.1.16).120 Das bedeu e , dass d G3P* IIHY im na i en Zus and o z des
Fehlens on P o213 olls ändig in de geschlossenen Kon o ma ion o lieg .
Wäh end de Rück al ung de s abilisie en G3P*-Va ian e bei nied igen GdmCl-
Konzen a ionen sind d ei Phasen beobach ba (;;, Abbildung 3.1.16), be o de na i e
Zus and in eine spek oskopisch unsich ba en Reak ion du ch die Isome isie ung on P o213
( = 6200 s in 0,5 M GdmCl) e eich wi d. Die S uk u ie ung de N1-Domäne is dabei
wiede inne halb wenige Millisekunden abgeschlossen. Die N2-Domäne al e dagegen mi
deu liche Ve zöge ung in zwei sequenziellen Sch i en. Die schnelle e de beiden Phasen mi
eine Zei kons an e on 7 s spiegel dabei die kon o ma ionelle Fal ung ih es globulä en Teils
wide . De zwei e Sch i ( = 42 s in 0,5 M GdmCl) wu de hie jedoch nich de
Isome isie ung on P o161, sonde n de losen Assozia ion de beiden ge al e en Domänen
zugeo dne (, Abbildung 3.1.16).122 Du ch Doppelmischexpe imen e ließ sich analog zum
WT d G3P* die En al ungsgeschwindigkei on N2 aus diesem lose assoziie en Zus and
bes immen (, Abbildung 3.1.16).122 Sie is zwa deu lich schnelle als die En al ung de
Domäne aus dem gedock en Zus and, jedoch gleichzei ig e heblich langsame als die
E gebnisse und Diskussion
75
Dena u ie ung de en sp echenden isolie en N2-Domäne (, Abbildung 3.1.16). Dies zeig
an, dass N2 du ch die e s ä k e In e ak ion mi de N1-Domäne deu lich gegenübe de nich
assoziie en Fo m s abilisie is .
Abbildung 3.1.16. Fal ungs- und En al ungs a en de Va ian en d G3P* IIHY und d G3P* IIHY P213G.
Au ge agen sind die appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en (o ene Symbole) on
d G3P* IIHY (g aue Symbole) bzw. d G3P* IIHY P213G (blaue Symbole) in Abhängigkei on de GdmCl-
Konzen a ion. Bis au die Ra en de isolie en N2 wu den alle Da en den Publika ionen 120 und 122 en nommen.
Die En al ungs- (●;●) und Rück al ungs a en (;;;) on N2 des jeweiligen G3P* nach manuelle
Mischung wu den anhand de Ände ung de Ty osin luo eszenz bei 310 nm nach An egung bei 280 nm
gemessen. Gezeig is auße dem die schnelle Rück al ung de N1-Domäne des d G3P* IIHY () sowie de en
En al ung aus dem ungedock en Zus and (), die übe Doppelmischexpe imen e e mi el wu de. Die En al ung
de N2-Domäne des d G3P* IIHY aus dem lose-assoziie en Zus and wu de nach Rück al ung übe einen
Zei aum on 180 s in 0,5 M GdmCl und e neu em Sp ung in En al ungsbedingungen () nach manuelle
Mischung e mi el . Die kon o ma ionelle Fal ung on N2 e gab sich übe die Rück al ung ü 0,5 s in
0,5 GdmCl und wei e e Ve dünnung in nied igen GdmCl-Konzen a ionen () nach schnelle Mischung. Die
Bildung on na i em d G3P* IIHY und dami die Ra e de Domänenassozia ion wu de wie Re e enz 122
besch ieben anhand eines Zweisch i -En al ungs es s ü na i e Moleküle e mi el (). Zu Ve gleichszwecken
au ge agen sind auße dem die En - und Rück al ungs a en de isolie en N2-Domäne Q129H (;).
Dass die Rück al ung und o allem die Einnahme des lose-assoziie en Zus andes des
s abilisie en G3P* a sächlich nich meh on de Ände ung de Kon o ma ion des P o161
abhängig is , e gib sich auch aus den Rück al ungsexpe imen en de d ei Va ian en
d G3P* IIHY, d G3P* IIHY P213G und d G3P* IIHY P161A in Gegenwa on TolAC-
AEDANS (Abbildung 3.1.17). De Angleich an die Da en is zwa au g und ehlende
In o ma ionen übe den Reak ions e lau zu Beginn de Messung s a k ehle beha e , abe
dennoch zeig sich, dass nach manuelle Mischung die e s e de ek ie ba e Rück al ungsphase
auch des d G3P* IIHY P161A übe 80 % de Gesam ampli ude besi z . Die Zei kons an en
diese Reak ion im d G3P* IIHY bzw. d G3P* IIHY P213G en sp echen mi 27 bzw. 25 s
nich nu denen de jeweiligen langsamen Rück al ungs eak ionen (Abbildung 3.1.16),
sonde n be inden sich genau wie die Zei kons an e on d G3P* IIHY P161A ( = 24 s) im
Zei be eich de Isome isie ung on Pep idylp olylbindungen.106 Die nachgelage e Reak ion
spiegel die Einnahme des gedock en Zus andes wide , die du ch den Aus ausch on P o213
gegen Glycin deu lich beschleunig wi d. Die Zei kons an e on 168 s en sp ich dabei ela i
[GdmCl] (M)
0123456
(s-1)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
E gebnisse und Diskussion
76
gu de Zei kons an e de Domänenassozia ion, die mi Hil e eines Zweisch i -
En al ungs es es ü na i e Moleküle bes imm wo den wa ( = 240 s).120
Abbildung 3.1.17: F eise zung on TolAC-AEDANS du ch Fal ung de s abilisie en G3P*-Va ian en.
Gezeig sind die no mie en Kine iken de Ve d ängung on TolAC-AEDANS wäh end de Rück al ung on
d G3P* IIHY (g ün), d G3P* IIHY P161A ( o ) bzw. d G3P* IIHY P213G (blau). Die Reak ionen wu den
nach el ache Ve dünnung des jeweiligen dena u ie en P o eins (11 µM in 5,5 M GdmCl) in Gegenwa on
1 µM TolAC-AEDANS anhand de AEDANS-Fluo eszenz bei 490 nm nach An egung bei 280 nm e olg . Die
schwa zen Linien s ellen den Angleich biexponen ielle Funk ionen an die Da en mi olgenden Zei kons an en
da: 1(IIHY) = 27 s, 2(IIHY) = 1357 s; 1(P161A) = 24 s, 2(P161A) = 1263 s und 1(P213G) = 25 s,
2(P213G) = 168 s. Die Messungen wu den bei 25 °C in 0,1 M KP-Pu e , 0,5 M GdmCl, pH 7,0 mi eine
Schich dicke on 1 cm du chge üh .
Es s ell e sich dahe die F age, inwiewei sich die Isome isie ung des P o161 in de
s abilisie en Va ian e au den Fal ungsmechanismus und die S abili ä auswi k . De
Übe gangsmi elpunk des he mischen Übe ganges de N2-Domäne is ähnlich wie im
WT d G3P* du ch die Alaninsubs i u ion an Posi ion 161 nu ge ing ügig on 61,4 au
59,6 °C e inge , wäh end die S abili ä de N1-Domäne 65,7 °C un e ände is .79 Dies
deck sich auch mi den Da en aus de GdmCl-induzie en En al ung (Tabelle 3.1.4).
Wäh end sich du ch den Aus ausch des P o213 gegen Glycin eine deu liche Ve schiebung des
Übe gangsmi elpunk es de N2-Domäne zu nied ige en Dena u ie ungsmi elkonzen a ionen
e gib 79, is die N2-Domäne in d G3P* IIHY P161A nu leich gegenübe d G3P* IIHY
des abilisie .
Tabelle 3.1.4: S abili ä sda en on d G3P* IIHY und de Va ian en d G3P* IIHY P161A und d G3P* IIHY
P213G aus GdmCl-induzie e En al ung
Domänendissozia ion und En al ung
de N2-Domäne En al ung de N1-Domäne
Va ian e [GdmCl]m
(M)
m
(kJ mol-1 M-1)
G25 °C
(kJ mol-1)
[GdmCl]m
(M)
m
(kJ mol-1 M-1) G25 °C
(kJ mol-1)
d G3P* IIHY 2,5 15,9 39,3 3,2 8,9 28,6
d G3P* IIHY P161A 2,3 16,9 38,8 3,3 8,1 26,7
d G3P* IIHY P213G 1,7 19,8 34,3 3,2 8,1 26,3
Angegeben sind die Übe gangsmi elpunk e [GdmCl]m, die Koope a i i ä spa ame e m sowie die au
0 M GdmCl ex apolie en eien En halpien de En al ung G bei 25 °C. De Übe gang de N2-Domäne wu de
nach An egung bei 280 nm anhand de Fluo eszenz bei 310 nm gemessen, de de N1-Domäne bei 360 nm nach
An egung bei 295 nm e olg . Fü beide Domänen e olg e die Analyse de Da en nach einem
Zweizus andsmodell. Die Messungen wu den bei 25 °C in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi eine Schich dicke on
1 cm du chge üh . Die Da en ü d G3P* IIHY und d G3P* IIHY P213G wu den de A bei 79 en nommen.
(s)
0 100 200 300
ela i e Fluo eszenz
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
5000 10000
E gebnisse und Diskussion
77
E wa ungsgemäß s immen dahe die En al ungs a en de N2-Domäne ausgehend on
na i em d G3P* IIHY P161A (●, Abbildung 3.1.18a) mi denen on d G3P* IIHY übe ein
(●, Abbildung 3.1.18a). Die schnelle Rück al ung de N1-Domäne is eben alls iden isch mi
de on d G3P* IIHY (;, Abbildung 3.1.18a).
Abbildung 3.1.18: De Fal ungsmechanismus des d G3P* IIHY P161A.
a) Au ge agen sind die appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en (o ene Symbole)
on d G3P* IIHY (g aue Symbole) bzw. d G3P* IIHY P161A ( a bige Symbole) in Abhängigkei on de
GdmCl-Konzen a ion. Die En al ungs- (●;●) und Rück al ungs a en (;;;) on N2 des jeweiligen G3P*
nach manuelle Mischung gemessen. Die schnelle Rück al ung de N2-Domäne ausgehend on olls ändig
en al e em d G3P* IIHY P161A wu de zusä zlich an eine s opped- low-Appa a u un e such (). Gezeig is
auße dem die Rück al ung de N1-Domänen (;) sowie de en En al ung aus dem ungedock en Zus and des
d G3P* IIHY (), die übe Doppelmischexpe imen e e mi el wu de. Die kon o ma ionelle Fal ung on N2 des
d G3P* IIHY wu de nach Rück al ung ü 0,5 s in 0,5 M GdmCl du ch Ve dünnung in nied ige GdmCl-
Konzen a ionen () gemessen. Die En al ung de N2-Domäne aus dem nich assoziie en Zus and on
d G3P* IIHY e gab sich du ch einen zwei en Sp ung in En al ungsbedingungen (). Die En al ung de N2-
Domäne aus dem lose-assoziie en Zus and wu de nach eine Rück al ungsdaue on 180 s in 0,5 M GdmCl und
e neu em Sp ung in En al ungsbedingungen übe manuelle Mischung e hal en (;). Die Ra e de
Domänenassozia ion on d G3P* IIHY wu de, wie in Re e enz 122 besch ieben, anhand eines Zweisch i -
En al ungs es s ü na i e Moleküle e mi el (). Zu Ve gleichszwecken au ge agen sind auße dem die En -
und Rück al ungs a en de isolie en N2-Domäne Q129H (;). Bis au die En al ungs a en on N2 aus dem
nich assoziie en Zus and wu den die Da en on d G3P* IIHY de Publika ion 122 en nommen. Die Reak ionen
de N1-Domäne wu den anhand de T p-Fluo eszenz obe halb on 340 nm nach An egung bei 295 nm e olg ,
die de N2-Domäne obe halb on 320 nm nach An egung bei 280 nm. Die Fal ungs a en de N2-Domäne nach
manuelle Mischung wu den übe die Messung de Fluo eszenz bei 310 nm e hal en. b) Rück al ungskine ik de
N2-Domäne in 0,5 M GdmCl ausgehend on olls ändig en al e em d G3P* IIHY P161A. Die Reak ion wu de
bei 310 nm (An egung 280 nm) gemessen. Die o e Linie s ell den Angleich eine iexponen iellen Funk ion an
die Da en mi Zei kons an en on = 2,4 s, 2 = 24,7 s und 3 = 5640 s da. c) Au agung de
Fluo eszenzampli uden de Ty osin luo eszenz de schnellen (), in e mediä en () und langsamen Rück al ung
() de N2-Domäne in d G3P* IIHY P161A als Funk ion de GdmCl-Konzen a ion. Die Messungen wu den in
0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi 1 µM P o ein bei 25 °C du chge üh .
b) c)
[GdmCl] (M)
0,5 1 1,5 2
ela i e Fluo eszenz
5
10
15
20
25
(s)
0 50 100 150 200
ela i e Fluo eszenz
115
120
125
130
135
140
7000 14000
a)
[GdmCl] (M)
0123456
(s
-1
)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
E gebnisse und Diskussion
78
Wäh end de Rück al ung nach manuelle Mischung sind d ei Phasen de ek ie ba
(;;, Abbildung 3.1.18). Mi eine Zei kons an e on 5640 s (in 0,5 M GdmCl) spiegel die
langsame Phase die Fal ung on N2 du ch die P o213-limi ie e Einnahme des gedock en
Zus andes wide (, Abbildung 3.1.18b). Im Gegensa z zu d G3P* IIHY is diese Reak ion
jedoch auch bei nied igen GdmCl-Konzen a ionen beobach ba , alle dings nu mi eine
ge ingen Ampli ude (, Abbildung 3.1.18c). Dies zeig , dass hie ein kleine Teil de -
Spezies wäh end de Fal ung nich die na i e Kon o ma ion einnehmen kann. Ab
1,5 M GdmCl e gib sich eine deu liche Zunahme de Ampli ude, da die N2-Domäne bei
diesen Dena u ie ungskonzen a ionen nu noch du ch die Einnahme des gedock en Zus andes
aus eichend s abilisie wi d (, Abbildung 3.1.18c). Au ällig is zudem, dass die Ra en übe
den gesam en un e such en Be eich unabhängig on de GdmCl-Konzen a ion sind. Die
scheinba e Beschleunigung de langsamen Rück al ung on d G3P* IIHY bei ge ingen
GdmCl-Konzen a ionen kann demnach zum Teil au die Isome isie ung on P o161 und die
dami e bundene Bildung de s abile en cis-Spezies zu ückge üh we den.
Wäh end de Rück al ung des d G3P* IIHY P161A is noch eine wei e e GdmCl-
unabhängige Phase beobach ba , de en Zei kons an e mi 24,7 s in 0,5 M GdmCl de
schnellen Ve d ängung on TolAC-AEDANS aus dem Komplex mi N1 wäh end de
Rück al ung des P o eins en sp ich ( = 24 s, Abbildung 3.1.17, ). Wie be ei s e wähn is
die Dena u ie ungsmi elunabhängigkei ein Anzeichen da ü , dass die Geschwindigkei de
en sp echenden Reak ion du ch P olylisome isie ungen limi ie is .106; 153 Um dies zu
übe p ü en wu de die Ka alysie ba kei de Phase du ch die P olylisome ase hFKBP12+IF
un e such (Abbildung 3.1.19).
Abbildung 3.1.19: Ka alyse de Rück al ung on d G3P* IIHY P161A du ch den Fal ungshel e hFKBP12+IF.
Gezeig sind die Rück al ungskine iken on 1 µM en al e em d G3P* IIHY P161A in 0,6 M GdmCl in
Abwesenhei (blau) bzw. Anwesenhei on 50 nM ( o ), 200 nM (g ün), 300 nM (o ange) bzw. 1 µM (schwa z)
des Fal ungshel e s hFKBP12+IF. Die du chgezogenen Linien s ellen den Angleich on biexponen iellen
Gleichungen an die Da en mi olgenden Zei kons an en da : (ohne) = 8,0 s, (ohne) = 38,5 s;
(50 nM) = 6,5 s, (50 nM) = 34,8 s; (200 nM) = 4,4 s, (200 nM) = 30,8 s; (300 nM) = 3,7 s,
(300 nM) = 23,5 s; (1 µM) = 2,0 s, (1 µM) = 8,0 s. Die Reak ionen wu den bei 310 nm nach An egung bei
280 nm in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 bei 25 °C gemessen.
(s)
0 50 100 150 200
ela i e Fluo eszenz
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
E gebnisse und Diskussion
79
Ta sächlich wi d nich nu die in e mediä e Phase ( = 38,5 s) du ch die P olylisome ase
beschleunig sonde n auch die e was schnelle e Reak ion ( = 8,0 s). Le z e e spiegel einen
Teil de kon o ma ionellen Fal ung de N2-Domäne wide , welche eben alls meh e e
P olin es e beinhal e (, Abbildung 3.1.18). Da P o161 du ch Alanin e se z wu de, s ell
sich die F age, welche P oline die langsame Reak ion e u sachen. Be ei s wäh end de
Rück al ung on d G3P* P161A wa bei nied igen GdmCl-Konzen a ionen eine Reak ion
mi ähnliche Zei kons an e und e gleichba ge inge Ampli ude beobach e wo den
(Abbildung 3.1.18), welche de be ei s e wähn en, nachgelage en cis ans-Isome isie ung
on P olin es en in de N2-Domäne zugeo dne wu de. Im Gegensa z zu s abilisie en
Va ian e wi d dadu ch die Bindungs ähigkei on TolAC-AEDANS an N1 kaum beein luss
(Abbildung 3.1.14), da in diesem P o ein de lose-assoziie e Zus and nich populie wi d.
Mögliche weise is ü die Einnahme de lose-assoziie en Fo m in den s abilisie en
G3P*-Va ian en die Kon o ma ionsände ung on einem ode meh e en P olin es en in de
Gelenk egion no wendig. Diese Be eich des G3P* en häl neben P o213 sechs wei e e
P oline. Die Analyse de K is alls uk u en des WT d G3P* und de hype s abilen Va ian e
0SS-G3P*-s ab161, die neben wei e en Subs i u ionen auch die ie s abilisie enden
Aus ausche en häl , zeig , dass im gedock en Zus and des G3P* nu die P olin es e 161 und
213 in cis-Kon o ma ion o liegen. Au g und des pa iellen Doppelbindungscha ak e s is die
Ak i ie ungsene gie ü die Ro a ion um die Pep idbindung seh hoch.162 Es is dahe seh
unwah scheinlich, dass wäh end de Bildung des lose-assoziie en In e media es zunächs ein
P olin es in die cis-Fo m isome isie , um bei de abschließenden Assozia ions eak ion
e neu die Kon o ma ion zu wechseln. Denkba is jedoch, dass die in e mediä e Phase die
nachgelage e Isome isie ung on P olin es en in de Gelenk egion wide spiegel , die im
en al e en Zus and eilweise auch in de nich na i en cis-Fo m o kommen.153
In diesem Fall is jedoch, en gegen ühe e Ve mu ungen122, die Einnahme des
langlebigen In e media es keine sequenziell au die Fal ung des globulä en Teils de N2-
Domäne olgende Reak ion. Vielmeh geh be ei s wäh end de schnellen Rück al ungsphase
ein g oße Teil de -Spezies du ch die gleichzei ig s a indende pa ielle S uk u ie ung
de Gelenk egion di ek in den lose-assoziie en Zus and übe . Bek ä ig wi d diese Annahme
du ch den Ve lau de en sp echenden Fal ungs a en im s abilisie en Hin e g und. Bei allen
d ei hie gezeig en Va ian en geh de Rück al ungsas in den En al ungsas de lose-
assoziie en Spezies übe , de nach Rück al ung ü 180 s in 0,5 M GdmCl und e neu em
Sp ung in En al ungsbedingungen e mi el wu de (Abbildung 3.1.17 bzw. 3.1.18). Im
Ve gleich zu isolie en N2-Domäne Q129H is in den P o einen dadu ch nich nu de
Übe gangsmi elpunk on N2 um meh als 1 M zu höhe en GdmCl-Konzen a ionen
e schoben sonde n auch die En al ung de Domäne as ausend ach e langsam
(Abbildung 3.1.18). Zwa is die N2-Domäne im geö ne en WT d G3P* eben alls leich
gegenübe de isolie en Domäne s abilisie , de Un e schied äll jedoch deu lich ge inge
aus (Abbildung 3.1.3).
E gebnisse und Diskussion
80
Um den Zei e lau de Bildung des lose-assoziie en Zus andes zu e mi eln, wu den
analog zu d G3P* P213G Doppelmischexpe imen e du chge üh , indem zunächs du ch
Ve dünnung on en al e em d G3P* IIHY bzw. d G3P* IIHY P161A die Rück al ung in
0,5 M GdmCl ini iie wu de. Nach a iablen Zei spannen wu de du ch einen wei e en Sp ung
in 2,45 M GdmCl die En al ung de Moleküle anhand de Fluo eszenzände ung obe halb on
320 nm nach An egung bei 280 nm an eine s opped- low-Appa a u e olg . Fü beide
P o eine wu den biexponen ielle Kine iken mi Zei kons an en on (IIHY) = 0,18 s und
(IIHY) = 1,1 s bzw. (P161A) = 0,25 s und (P161A) = 1 s e hal en, de en Ampli uden in
Abbildung 3.1.20 in Abhängigkei on de Rück al ungsdaue au ge agen sind (;). Die
schnelle e de beiden Phasen spiegel e mu lich die En al ung de N2-Domäne aus dem
nich assoziie en In e media wide . Die Zei kons an en de zwei en En al ungs eak ionen
s immen mi denen de jeweiligen N2-Domäne aus dem lose-assoziie en Zus and übe ein, die
aus Doppelmischexpe imen en nach eine Rück al ungsdaue on 180 s e hal en wu den
(;, Abbildung 3.1.18)
Abbildung 3.1.20: Zei e lau de Rück al ung on N2 im d G3P* IIHY bzw. d G3P* IIHY P161A.
Au ge agen sind die Ampli uden de schnellen () und langsamen () En al ungsphase on a) d G3P* IIHY
und b) d G3P* IIHY P161A in 2,45 M GdmCl nach s opped- low-Mischung in Abhängigkei de
Rück al ungsdaue in 0,5 M GdmCl. Die Reak ionen wu den anhand de Fluo eszenz obe halb on 320 nm nach
An egung bei 280 nm mi 1 µM P o ein in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 bei 25 °C e olg . In 5,5 M GdmCl
dena u ie es G3P* wu de dazu du ch el ache Ve dünnung in 0,5 M GdmCl übe e schiedene Zei en
ückge al e und danach in 2,45 M GdmCl e neu en al e . Die du chgezogenen Linien s ellen den Angleich
biexponen ielle Funk ionen an die Da en da . Fü die Ve läu e de Ampli uden e geben sich Zei kons an en on
(IIHY) = 2,8 s und (IIHY) = 3,9 s bzw. (P161A) = 1,3 s, (P161A) = 1,6 s.
Die schnelle e Phase ha zwa nu eine seh ge inge Ampli ude (, Abbildung 3.1.20), sie
zeig jedoch an, dass, analog zum WT d G3P*, auch in beiden s abilisie en Va ian en im
ge ingen Maße ein nich assoziie e Zus and populie wi d. Zumindes ü d G3P* IIHY
e gaben sich nach ku ze Rück al ung in 0,5 M GdmCl und e neu em Sp ung in
En al ungsbedingungen die Ra en des en sp echenden En al ungsas es
(, Abbildung 3.1.18). Im d G3P* IIHY P161A konn e dagegen diese Ve lau au g und de
ge ingen Signalände ung nich au gelös we den.
a) b)
Rück al ungsdaue (s)
0 5 10 15 20 25
Ampli ude de En al ung
0
0,1
0,2
0,3
Rück al ungsdaue (s)
0 5 10 15 20 25
Ampli ude de En al ung
0
0,1
0,2
0,3
E gebnisse und Diskussion
81
De Ve lau de in Abbildung 3.1.20 gezeig en Ampli uden mach deu lich, dass sowohl die
nich assoziie e als auch die lose-assoziie e Fo m mi e wa de gleichen Zei kons an e
gebilde wi d. Die Zei kons an en liegen mi (IIHY) = 2,8 s und (IIHY) = 3,9 s bzw.
(P161A) = 1,3 s, (P161A) = 1,6 s jeweils im Be eich de en sp echenden schnellen
Rück al ungs eak ionen de N2-Domänen on d G3P* IIHY und d G3P* IIHY P161A. Wie
be ei s in den Rück al ungsexpe imen en ausgehend on na i em P o ein beobach e , is auch
hie die Fal ung on N2 in d G3P* IIHY P161A leich beschleunig . Die U sache de im
Ve gleich zum d G3P* IIHY e inge en Signalände ung de schnell en al enden Fo m im
Zweisch i -En al ungs es (Abbildung 3.1.20) lieg e mu lich am Fehlen de s abile en cis-
Spezies, die im Gegensa z zu ans-Fo m in 0,5 M GdmCl olls ändig in den na i en Zus and
übe geh . Die Ra en und Ampli uden de schnellen En al ungsphase on
d G3P* IIHY P161A sind dahe seh s a k ehle beha e und können lediglich als
Anhal punk e be ach e we den.
Das Au e en de nich assoziie en Spezies deck sich mi de Beobach ung, dass ein
kleine Teil de Moleküle des d G3P* IIHY P161A in 0,5 M GdmCl e s du ch die
nachgelage e Isome isie ung on P olin es en in de Gelenk egion in den s abile en lose-
assoziie en Zus and übe gehen und dami TolAC-AEDANS e d ängen kann. Die S abili ä
de isolie en N2 Q129H zeig dabei an, dass die Domäne un e diesen Bedingungen auch
ohne zusä zliche güns ige Wechselwi kungen mi N1 zumindes eilweise al en kann. Ob die
lose-assoziie e Fo m in Ve lau des wei e en Fal ungs o ganges olls ändig eingenommen
wi d, konn e anhand des Doppelmischexpe imen es nich au gelös we den. Sowohl die auch
bei ge ingen Dena u ie ungsmi elkonzen a ionen de ek ie ba e P o213-limi ie e Fal ungs-
eak ion de P161A-subs i u ie en Va ian e als auch de Ve lau de langsamen Rück al ung
on d G3P* IIHY lassen jedoch schluss olge n, dass zumindes ein ge inge An eil de
Popula ion nich als s abilisie es In e media o lieg .
E gebnisse und Diskussion
82
3.2 Ak i ie ung des d Phagen G3P* du ch P olin-gekoppel e En al ung
Die Rück al ungsexpe imen e de e schiedenen G3P*-Va ian en in Gegenwa on TolAC-
AEDANS haben deu lich gemach , dass die Wechselwi kung de N1-Domäne mi dem
sekundä en Rezep o TolAC seh s a k om Fal ungszus and und dami on de S abili ä de
N2-Domäne abhäng . Ta sächlich konn e be ei s Ba ba a Ecke un e ande em anhand de
In ek ion on sowohl pilushal igen als auch pilus eien E. coli Zellen du ch Phagen mi
un e schiedlich s abilen G3P*-Va ian en zeigen, dass die Fal ung und S abili ä des P o eins
au die Funk ion in i o abges imm is .79; 96; 97 Sie schluss olge e, dass s abilisie e Phagen
gegenübe dem Wild yp-Phagen im Nach eil sind, da in ih em G3P* die Ak i ie ung du ch
Domänendissozia ion und En al ung de Gelenk egion au g und de s abilisie enden
Subs i u ionen e schwe is . Die E gebnisse des o angegangenen Kapi els bek ä igen diese
Ve mu ungen. En gegen ühe e Annahmen lieg das langlebige In e media on
WT d G3P* mi ans-P o213 nämlich o en, und nich wie die s abilisie e Va ian e be ei s
in lose-assoziie e Fo m o , wodu ch die In e ak ions läche ü TolAC au de N1-Domäne
des Wild yp-P o ein in diesem Zus and besse zugänglich is .
Im Ve gleich zu o enen Fo m is die In e ak ions ähigkei de gedock en Fo m des G3P*
gegenübe TolAC deu lich he abgese z . Im Folgenden soll e zunächs du ch Bes immung de
Dissozia ionskons an e (KD) quan i izie we den, wie sich die e schiedenen Fal ungs-
zus ände des G3P* in ih e A ini ä ü die C- e minale Domäne on TolA un e scheiden und
welchen Ein luss dabei die ie s abilisie enden Subs i u ionen des d G3P* IIHY in de
Gelenk egion bzw. in den beiden Domänen au die Wechselwi kung zwischen dem G3P* und
TolAC haben.
3.2.1 Die Popula ion des ak i en In e media es e höh die A ini ä de N1-Domäne
des G3P* ü TolAC
Zu E mi lung de KD-We e de Komplexe aus TolAC und WT d G3P*, d G3P* IIHY,
ih en Fal ungsin e media en sowie de jeweiligen isolie en N1-Domäne wu de das in
Kapi el 3.1.7 besch iebene Ene gie ans e sys em e wende . Nach An egung de Ty osin-
bzw. T yp ophan es e des G3P* bei 280 nm dien e die Ände ung de Fluo eszenz de
AEDANS-G uppe als Sonde de In e ak ion. En sp echende Gleichgewich s i a ionen, bei
denen die Konzen a ion des Dono s a iie wo den wa , ha en be ei s e deu lich , dass die
isolie e N1-Domäne mi de s abilisie enden Subs i u ion T13I eine seh hohe A ini ä zu
TolAC-AEDANS ha (KD = 0,49 µM). De zunächs ü das na i e WT d G3P* e hal ene
We wa mi 3,9 µM ach ach schlech e .79 Anhand eine Ve d ängungs i a ion mi
unma kie em TolAC zu F eise zung on TolAC-AEDANS aus dem Komplex mi N1
konn e zudem nachgewiesen we den, dass die Modi ika ion mi dem Fluo opho AEDANS
die A ini ä on TolAC gegenübe de N1-Domäne nu ge ing ügig beein luss .79
In wei e üh enden Expe imen en s ell e sich he aus, dass ge inge Ve un einigungen mi
eiem AEDANS das Fluo eszenzsignal s a k beein lussen (Da en nich au ge üh ). Die
E gebnisse und Diskussion
83
Komplexbildung zwischen 0,2 µM TolAC-AEDANS und zunehmenden Dono -
konzen a ionen in Be eich on 0 bis 15 µM wu de deshalb nach s opped- low-Mischung in
ih em Zei e lau analysie . Wie be ei s ü die isolie e Domäne N1 T13I und die
Dele ions a ian e G3P* IIHY 6 gezeig , e geben sich dabei nach geeigne e Mischung de
Bindungspa ne ü die Fluo eszenz obe halb on 460 nm nach An egung bei 280 nm
Reak ions e läu e pseudo-e s e O dnung.79; 80
Da die Bindung des TolAC-P o eins an die N1-Domäne on de en Zugänglichkei und
dami de spon anen Dissozia ion de Domänen des G3P* abhäng , können be ei s mi
ge ingen Konzen a ionen an isolie e und dami ei zugängliche N1- bzw. N1 T13I-
Domäne Assozia ionskine iken de ek ie we den (Abbildung 3.2.1). Na i es WT d G3P*
lieg dagegen as ausschließlich im gedock en Zus and o , weshalb deu lich höhe e
P o einkonzen a ionen benö ig we den, um die Bindung an TolAC-AEDANS e olgen zu
können (Abbildung 3.2.1b). In d G3P* IIHY is de TM-We de N2-Domäne, de
gleichzei ig auch die Domänendissozia ion und die En al ung de Gelenk egion e lek ie ,
deu lich on 48,0 au 61,2 °C e höh .121 Die S abilisie ung des assoziie en Zus andes üh
dazu, dass selbs in Gegenwa on 15 µM d G3P* IIHY keine Bindungskine ik beobach ba
is (Abbildung 3.2.1b).
Abbildung 3.2.1: In e ak ion on TolAC-AEDANS mi de N1-Domäne e schiedenen G3P*-Va ian en.
Assozia ions eak ionen on 0,2 µM TolAC-AEDANS mi a) ans eigenden Konzen a ionen (0; 0,2; 0,8; 1,5 bzw.
3 µM) an isolie e N1 T13I und b) 2,5; 7,5 µM bzw. 15 µM WT d G3P* (schwa z) sowie 15 µM d G3P* IIHY
( o ). Die Bindung wu de jeweils nach Fö s e -Resonanz-Ene gie-T ans e on den in N1 en hal enen T p-
Res en au TolAC-AEDANS anhand de AEDANS-Fluo eszenz obe halb on 460 nm nach An egung bei
280 nm e olg . Die Messungen e olg en bei 25 °C nach schnelle Mischung an eine s opped- low-Appa a u
in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0, 0,1 M GdmCl.
Du ch Angleich monoexponen ielle Funk ionen an die Kine iken lassen sich die jeweilige
Ampli ude und Ra e in Abhängigkei de Dono konzen a ion bes immen (Abbildung 3.2.2).
Übe den Ve lau de un e Bedingungen pseudo-e s e O dnung e hal enen appa en en Ra en
kann nach linea e Reg ession die Dissozia ionskons an e e mi el we den. De
Achsenabschni de aus dem Ve lau de Ra en esul ie enden Ge ade en sp ich de
mik oskopischen Ra e de Dissozia ion (ko ), die S eigung de Assozia ions a e (kon). De
Quo ien on ko und kon e gib KD (Gleichung 34). Diese kann zudem unabhängig da on aus
a) b)
(s)
02468
ela i e Fluo eszenz
4
5
6
7
(s)
00,511,52
ela i e Fluo eszenz
4
5
6
7
E gebnisse und Diskussion
90
Die Schu z ak o en de Res e im ak i en Zus and wu den anhand de Kompe i ion
zwischen Fal ung und H/D-Aus ausch e mi el , indem en al e es WT d G3P* zunächs in
1 M GdmCl und 100 % H2O ü 5 min ückge al e wu de. Nach de Übe üh ung in D2O-
hal igen Pu e wu de nach 10 S unden ein 15N TROSY-HSQC-Spek um au genommen. Als
Re e enz dien e ein un e den gleichen Bedingungen gemessenes Spek um des na i en G3P*.
Übe den Ve gleich de In ensi ä en de e bleibenden NH-K euzsignale wu den, wie in
Re e enz 62 besch ieben, die Schu z ak o en be echne (Abbildung 3.2.4b).
In de olls ändig ge al e en und dami gedock en Fo m bilden die Domänen eine
koope a i e Einhei , weshalb N1 und N2 e gleichba hohe Schu z ak o en au weisen
(Abbildung 3.2.4a). Im Gegensa z zu s abilisie en Va ian e d G3P* IIHY62 sind jedoch die
We e ü die am s ä ks en geschü z en Amidp o onen um eine G ößeno dnung e inge ,
was eine Abnahme de eien En halpie um 5,7 kJ mol-1 en sp ich . Zudem wi d im
WT d G3P* die Gelenk egion du ch die cis-P o213 beding e In e ak ion de N- e minalen
Domänen nich so deu lich s abilisie wie in d G3P* IIHY.
De S abili ä sun e schied de Res e im ak i en In e media szus and äll noch deu liche
aus. Wäh end in de s abilisie en Va ian e du ch die lose Assozia ion on N1 und N2 ein
g oße Teil de AS beide Domänen noch imme ähnlich gu geschü z is , sind im
Ausgangsp o ein o allem die Schu z ak o en de Amidp o onen on N2 deu lich eduzie
(Abbildung 3.2.4b). Die We e ü den globulä en Teil sind dabei um Fak o zehn e inge ,
übe die Schu z ak o en de Res e de Gelenk egion liegen au g und de s a k e inge en
S abili ä keine In o ma ionen o .62
Ein ähnliches E gebnis e gib sich ü WT d G3P* in Gegenwa eines ie achen
Übe schusses an TolAC (Abbildung 3.2.4c). Die In e ak ion on N1 mi TolAC üh zu
Dissozia ion de Domänen und dami zu Popula ion des geö ne en Zus andes, weshalb die
AS de Gelenk egion wiede um ollkommen ungeschü z sind. Die Schu z ak o en on N2
be inden sich mi We en un e 100 eben alls im Be eich de e de nich assoziie en Fo m.
Einzig die Res e de N1-Domäne weisen zum Teil e höh e We e au , was e mu lich indi ek
beding wi d du ch die Wechselwi kung mi TolAC.
3.2.3 Sequenz a ia ionen um den P olinschal e üh en zu Dissozia ion de
N- e minalen Domänen
Die Übe eins immung de Schu z ak o en des langlebigen Rück al ungsin e media es on
WT d G3P* mi denen seine na i en Fo m in Gegenwa on TolAC zeig , dass du ch die
Bindung on TolAC die s a k s abilisie ende Domänenassemblie ung au gelös we den kann.
Die un e schiedlichen A ini ä en des WT d G3P* und de s abilisie en Va ian e in diesem
Zus and (Tabelle 3.2.1) weisen gleichzei ig da au hin, dass un e ande em auch die S abili ä
de Gelenk egion übe die In e ak ions ähigkei en scheide . Um zu un e suchen, wie sich die
Ve ände ung de S abili ä und des Fal ungsmechanismus au die Funk ionali ä des G3P
auswi ken, wu de die lokale Sequenz um P o213 a iie (Abbildung 3.2.5). In de Va ian e
d G3P* APA wu den dazu on Johanna Koch die zu P o213 benachba en Res e Gln212 und
E gebnisse und Diskussion
91
P o213
Th 13
Gln129
Th 101 Asp209
P o214
Gln212
6
P o214 gegen Alanin es e ausge ausch . Die Va ian e d G3P* AGA, die on Roman Jakob
he ges ell wu de, en häl zusä zlich dazu die P213G-Subs i u ion.
Abbildung 3.2.5: Te iä s uk u des N1N2-F agmen s on WT d G3P*.
Die Res e de Schal e egion Gln212, P o213 und P o214 sowie die Posi ionen de s abilisie enden
Subs i u ionen im d G3P* IIHY sind als S äbchen-Modelle gezeig . Die N1-Domäne is in o , de globulä e
Teil on N2 in dunkelblau und die Gelenk egion in g ün da ges ell . De in de Va ian e d G3P* IIHY 6
dele ie e Fal bla s ang de Gelenk egion is in hellblau gezeig . Die Abbildung wu de anhand de PDB-
S uk u 2G3P60 mi dem P og amm Pymol123 e s ell .
De Aus ausch on Gln212 bzw. P o214 gegen Alanin üh jeweils zu eine zwei- bzw.
d ei achen Beschleunigung de Isome isie ungs eak ion an P o213. Du ch die Q212A-
Subs i u ion wi d auße dem das im assoziie en Zus and gebilde e Wasse s o b ücken-
ne zwe k zwischen de Gelenk egion und de N1-Domäne geschwäch , da die Sei eng uppe
des Gln212 gleich zwei Wasse s o b ücken zu Gln52 in de N1-Domäne ausbilde , wenn
P o213 in cis-Kon o ma ion o lieg .120
Die Kombina ion de beiden Subs i u ionen ha au WT d G3P* und d G3P* IIHY seh
un e schiedliche Auswi kungen. Wäh end in d G3P* IIHY APA o z de s a ken
Des abilisie ung on N2 beide Domänen wei e hin in gedock e Kon o ma ion o liegen
(Tabelle 3.2.2)126, en al e die N1-Domäne im d G3P* APA unabhängig on N2 (Johanna
Koch, pe sönliche Mi eilung). In le z e em Fall is nich nu de Übe gangsmi elpunk de
labile en Domäne deu lich on 48,0 °C au 36,8 °C e inge sonde n auch die En halpie de
En al ung. Mi 331 kJ mol-1 lieg H im Be eich de En halpie de isolie en N2-Domäne
(304 kJ mol-1), was bes ä ig , dass zwischen den N- e minalen Domänen des na i en
d G3P* APA kaum noch In e ak ionen o handen sind. Eine olls ändige En kopplung de
Domänen wie bei de Va ian e d G3P* IIHY 6, in de du ch die Dele ion des in de
Gelenk egion gelegenen sechs en -Fal bla s anges (Abbildung 3.2.5) die S abili ä de N2-
Domäne au das Ni eau on isolie e N2 Q129H he abgese z is (Tabelle 3.2.2), lieg
jedoch nich o .151 Gegenübe de isolie en N2-Domäne is de TM-We de N2-Domäne
des d G3P* APA jedoch nu um 2 °C e höh .
E gebnisse und Diskussion
92
Die zusä zliche Subs i u ion des P o213 du ch Glycin in d G3P* AGA wi k sich im
Ve gleich dazu leich s abilisie end aus, wobei auch die En halpie mi 470 kJ mol-1 deu lich
e höh is . De TM-We on d G3P* AGA ähnel mi 37,9 °C dem TM-We de Va ian e
d G3P* P213G (Tabelle 3.2.2), die eilweise in geö ne e Fo m o komm . Dies is deshalb
beme kenswe , da du ch die d ei Subs i u ionen die gesam e Schal e sequenz en e n is . Die
des abilisie enden E ek e de d ei Aus ausche an den Posi ionen Gln212-P o214 sind
demnach nich addi i . Die P213G-Subs i u ion alleine üh e zu eine deu lichen
Ve inge ung de S abili ä , nich nu im Wild yp-P o ein sonde n auch in de s abilisie en
Va ian e IIHY.79 Die Auswi kung de Subs i u ion de zu P o213 benachba en Res e is
demnach eno m om Kon ex abhängig.
Tabelle 3.2.2: The mische S abili ä sda en on WT d G3P* und e schiedenen G3P*-Va ian en
Domänendissozia ion und
En al ung de N2-Domäne En al ung de N1-Domäne
Va ian e TM
(°C)
H
(kJ mol-1)
G55°C
(kJ mol-1)
TM
(°C) H
(kJ mol-1)
G65°C
(kJ mol-1)
isolie e N1 - - - 62,3 234 -1,9
isolie e N1 T13I - - - 67,5 235 1,7
isolie e N2 34,6 304 -25,4 - - -
isolie e N2 Q129H 38,8 344 -21,2 - - -
WT d G3P* 48,0 612 -14,1 60,2 230 -3,3
d G3P* APA 36,8 331 -24,6 59,9 227 -3,5
d G3P* AGA 37,9 470 -30,4 58,6 189 -3,7
d G3P* P213G 37,8 442 -29,1 60,2 225 -3,3
d G3P* IIHY 61,2 644 11,4 66,0 228 0,7
d G3P* IIHY APA 53,5 453 -2,1 67,0 228 1,3
d G3P* IIHY 6 36,7 285 -21,1 64,1 202 -0,5
Angegeben sind ü die G3P*-Va ian en bzw. isolie en Domänen die Schmelz empe a u en TM, die En halpien
de jeweiligen En al ungs eak ion am TM (H) und die eien En halpien de En al ung G55°C und G65°C bei
55 °C bzw. 65 °C. Die Übe gänge de N2-Domänen (isolie ode im G3P*), welche übe die Ände ung des CD-
Signals bei 210 nm e olg wu den, wu den gemäß eines Zweizus andsmodells analysie . Die Da en ü die
N1-Domänen in den G3P*-Va ian en wu den nach Auswe ung des biphasischen En al ungsübe gangs, de
anhand des CD-Signals bei 230 nm gemessen wu de, gemäß eines D eizus andsmodells e hal en. De e s e
Übe gang spiegel die En al ung de N2-Domäne sowie die Dissozia ion de Domänen wide , de zwei e
Übe gang die Dena u ie ung de N1-Domäne. De Übe gang de isolie en N1-Domänen wu de übe die
Ände ung des CD-Signals bei 230 nm gemessen und gemäß eines Zweizus andsmodells ausgewe e . Zu
Auswe ung de En al ungsübe gänge wu de ü die G3P*-Va ian en eine kons an e Ände ung de
Wä mekapazi ä Cp on 10000 J mol-1 K-1 ü N2 und ü N1 1000 J mol-1 K-1 angenommen, ü die isolie en
N2-Domänen wu den Cp-We e on 8000 J mol-1 K-1 und ü die isolie en N1-Domänen 1000 J mol-1 K-1
e wende . Die Da en ü WT d G3P*, isolie e N1 T13I und d G3P* IIHY wu den de Re e enz 121
en nommen. Die S abili ä spa ame e on d G3P* IIHY 6 bzw. isolie e N1-Domäne wu den aus den
A bei en 80 bzw. 152 e hal en. Die We e ü die Domänen des d G3P* IIHY APA bzw. N1 de Va ian e
d G3P* P213G en s ammen den Re e enzen 126 und 79. Die Da en on isolie e N2 Q129H wu den de Re e enz
151 en nommen, die We e ü die Va ian en d G3P* APA und d G3P* AGA sind pe sönliche Mi eilungen on
Johanna Koch bzw. Roman Jakob. Die Übe gänge on 4 µM P o ein (1 µM bei 210 nm) wu den in 0,1 M KP-
Pu e , pH 7,0 mi eine Schich dicke on 1 cm, eine Heiz a e on 60 °C h-1 und eine Dämp ung on 8 s
gemessen.
Die wäh end de Rück al ung de Va ian e d G3P* P213G beobach e e
Domänenassozia ions eak ion wa de Isome isie ung on P olin es en wie P o214 in de
E gebnisse und Diskussion
93
Gelenk egion zugesch ieben wo den. Ob o z des E sa zes dieses Res es eine en sp echende
Assozia ions eak ion wäh end de S uk u ie ung on d G3P* AGA de ek ie ba is , wu de
anhand de En - und Rück al ungskine iken diese Va ian e nähe un e such
(Abbildung 3.2.6a). Die schnelle Rück al ung on N1 und des globulä en Teils on N2 sind
du ch den Aus ausch de Schal e sequenz nich beein luss (;;, Abbildung 3.2.6a). Wie
jedoch schon ü die Va ian e d G3P* P213G beobach e , is nach manuelle Mischung die
du ch die Isome isie ung on P o161 limi ie e En al ung auch ausgehend on na i em
P o ein de ek ie ba (, Abbildung 3.2.6a). Die diese Reak ion nachgelage e Phase mi
ge inge Ampli ude besi z eine GdmCl-unabhängige Zei kons an e im Be eich on 1000 s
(●, Abbildung 3.2.6a). Ih e Ra en gehen demnach bei höhe en Dena u ie ungsmi el-
konzen a ionen nich in den En al ungsas de N1-Domäne übe (, Abbildung 3.2.6a). Die
En al ung de N2-Domäne im d G3P* AGA obe halb on 1 M GdmCl is ielmeh be ei s
nach schnelle Mischung au lösba , wobei de en sp echende As ge ing ügig zu höhe en
GdmCl-Konzen a ionen e schoben is (, Abbildung 3.2.6a). Dies deck sich mi dem
Be und, dass die En al ungs a en on N1 im d G3P* AGA mi denen de isolie en N1-
Domäne übe eins immen und N1 dami on N2 en koppel is (, Abbildung 3.2.6a).
Abbildung 3.2.6: Analyse de Fal ungs- und En al ungs a en des d G3P* AGA und d G3P* APA.
Au agung de appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en (o ene Symbole) on
a) d G3P* AGA bzw. b) d G3P* APA (jeweils a bige Symbole) sowie jeweils de en sp echenden Ra en des
WT d G3P* (g aue Symbole) in Abhängigkei on de GdmCl-Konzen a ion. Die En al ungs- (●;;●;●) und
Rück al ungs a en (;;;) de N2-Domäne des jeweiligen G3P* wu den nach manuelle Mischung
gemessen. Gezeig sind auße dem die schnelle Rück al ung de N1-Domänen (;), die kon o ma ionelle
Fal ung de jeweiligen -Spezies (;) ausgehend on en al e em P o ein sowie die En al ung on N1 aus
dem na i en Zus and (;) nach s opped- low-Mischung. Die En al ung de -Spezies aus dem nich
assoziie en Zus and () konn e be ei s in Einzelmischexpe imen en nach schnelle Mischung de ek ie we den.
Im WT d G3P* sind diese Ra en dagegen e s nach Rück al ung ü 20 bzw. 150 s in 0,5 M GdmCl und e neu e
Übe üh ung in En al ungsbedingungen beobach ba (;). Zu Ve gleichszwecken au ge agen sind auße dem
die En al ungs a en de N1-Domäne () im ungedock en WT d G3P* sowie die En - und Rück al ungs a en
de isolie en N2-Domäne (;). Einige de Da en des WT d G3P* wu den, wie in Abbildung 3.1.2
besch ieben, de Diploma bei on Roman Jakob150 en nommen. Die Reak ionen de N1-Domäne nach schnelle
Mischung wu den anhand de T p-Fluo eszenz obe halb on 340 nm nach An egung bei 295 nm e olg , die de
N2-Domäne obe halb on 320 nm nach An egung bei 280 nm. Die Fal ungs a en de N2-Domäne nach
manuelle Mischung wu den übe die Messung de Fluo eszenz bei 310 nm e hal en. Die Messungen wu den in
0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi 1 µM P o ein bei 25 °C du chge üh .
a)
b
)
[GdmCl] (M)
012345
(s
-1
)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
3
10
[GdmCl] (M)
012345
(s
-1
)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
3
10
E gebnisse und Diskussion
94
Du ch die nach manuelle Mischung zusä zlich de ek ie ba e Fal ungs eak ion on
d G3P* AGA wi d N2 nu leich s abilisie . Im Gegensa z zu d G3P* P213G lieg hie
jedoch keine Mischung aus o ene und s abilisie e , gedock e Spezies o . Demnach
beein luss P o214 in Abwesenhei des u sp ünglichen Schal e s P o213 a sächlich die
Fal ung hin zum assoziie en Zus and. Du ch die zusä zliche Subs i u ion de Res e, die
P o213 lankie en, wi d auch P o214 en e n . Dadu ch e höh sich die Flexibili ä de
Gelenk egion, und d G3P* AGA kann eine gegenübe de o enen Spezies des WT d G3P*
s abilisie e Kon o ma ion einnehmen.
Die Kombina ion de Subs i u ionen Q212A und P214A ha einen noch g a ie ende en
E ek au den Fal ungsmechanismus des WT d G3P*. Die wäh end de Rück al ung
ansien gebilde e ans-P o213-Spezies is deu lich ins abile als die des d G3P* AGA bzw.
WT d G3P* (, Abbildung 3.2.6b). Das bedeu e , dass wäh end de Fal ung güns ige
In e ak ionen zu N1 bzw. Res en de Gelenk egion nich ausgebilde we den können. U sache
is e mu lich die Kombina ion aus beschleunig e Einnahme de cis-Kon o ma ion des
P o213 und dessen S a hei , wodu ch die ü Ums uk u ie ungen wie im d G3P* AGA
wäh end de ühen Fal ungsphase no wendige Flexibili ä nich gegeben is .
Wie bei d G3P* AGA sind im d G3P* APA nach manuelle Mischung wiede die
Isome isie ungs eak ion on P o161 und die nachgelage e Rück al ungsphase mi eine
Zei kons an e im Be eich on 1000 s de ek ie ba (;, Abbildung 3.2.6b). Beide üh en zu
eine S abilisie ung de N2-Domäne, alle dings nich so s a k wie bei de N2-Domäne im
d G3P* AGA. Die En al ungs a en on N2 s immen ielmeh mi denen des cis-Kon o me s
des Wild yp-P o eins übe ein (, Abbildung 3.2.6b). Wie anhand de NMR-Expe imen e
gezeig , sind die Domänen in diesem Zus and as olls ändig unabhängig oneinande . Die
molekula e U sache ü die langsame Rück al ungs eak ion mi eine Zei kons an e on
1000 s is ü beide P o eine nich bekann (, Abbildung 3.2.6). Mögliche weise sind
P olin es e in de Gelenk egion da ü e an wo lich.
3.2.4 Die Subs i u ion de Schal e sequenz ha g a ie ende Auswi kungen au die
In e ak ion mi TolAC-AEDANS
Die Un e schiede in den Fal ungsmechanismen on d G3P* APA und d G3P* AGA
spiegeln sich auch in ih e Rück al ung in Gegenwa on TolAC-AEDANS wide
(Abbildung 3.2.7). Da die Subs i u ionen in de Gelenk egion lokalisie sind, is ih Ein luss
au die S abili ä on N1 seh ge ing (Tabelle 3.2.2). Die A ini ä de P o eine zu TolAC-
AEDANS is demzu olge auch hie abhängig on de Popula ion an nich assoziie en
Molekülen, in denen die In e ak ions läche au N1 ü TolAC exponie is .
In olls ändig ge al e em d G3P* APA sind zwischen den Domänen as keine In e ak ionen
o handen. Wäh end de S uk u ie ung diese Va ian e komm es dahe lediglich zu eine
ge ing ügigen Ve d ängung on TolAC-AEDANS inne halb de e s en 300 s
(Abbildung 3.2.7). Wede die S uk u ie ung on N2 du ch die Bildung de s abile en Spezies
mi cis-P o161 noch die Kon o ma ionsände ung wäh end de nachgelage en
E gebnisse und Diskussion
95
Fal ungs eak ion üh en demnach zu eine signi ikan en Ve d ängung on TolAC und dami
de Abnahme des Fluo eszenzsignals de AEDANS-G uppe.
Abbildung 3.2.7: F eise zung on TolAC-AEDANS bei de Fal ung on d G3P* AGA bzw. d G3P* APA.
Gezeig sind die Kine iken de Ve d ängung on TolAC-AEDANS wäh end de Rück al ung on d G3P* AGA
(schwa z) und d G3P* APA (blau). Die Reak ionen wu den nach el ache Ve dünnung des jeweiligen
dena u ie en P o eins (11 µM in 5,5 M GdmCl) in Gegenwa on 1 µM TolAC-AEDANS anhand de
AEDANS-Fluo eszenz bei 490 nm nach An egung bei 280 nm e olg . Die o e Linie s ell den Angleich
biexponen ielle Funk ionen an die Da en des d G3P* AGA mi Zei kons an en on 1 = 96 s und 2 = 1250 s
da . Die Messungen wu den bei 25 °C in 0,1 M KP-Pu e , 0,5 M GdmCl, pH 7,0 mi eine Schich dicke on
1 cm du chge üh .
Die F eise zung on TolAC-AEDANS aus dem Komplex mi N1 de Va ian e
d G3P* AGA e olg dagegen in zwei Phasen, wobei die e s e Reak ion die Haup ampli ude
besi z (Abbildung 3.2.7). Die Zei kons an e diese schnellen Phase en sp ich mi 96 s de
Isome isie ungs eak ion on P o161. Die nachgelage e Signalände ung is zwa deu lich
ge inge , sie bes ä ig jedoch, dass die Moleküle des d G3P* AGA in einen s ä ke
assoziie en Zus and übe gehen, wodu ch TolAC-AEDANS e d äng wi d. Die
Zei kons an e de Reak ion lieg mi 1250 s (in 0,5 M GdmCl) im Be eich de
Assozia ions eak ion on d G3P* P213G (752 s; Kapi el 3.1.7, Tabelle 3.1.3). Dies weis
da au hin, dass in den P213G-subs i uie en Va ian en nich ausschließlich P o214 ü die
Einnahme zumindes eine leich assoziie en Fo m e an wo lich is .
Wie in Kapi el 3.1.7 angedeu e , können aus den Ampli uden de Reak ions e läu e keine
di ek en Rückschlüsse au die A ini ä en de Va ian en ü TolAC gezogen we den, da zum
Teil be ei s du ch die S uk u ie ung on N2 in de To zei des Expe imen es die Bindung on
TolAC-AEDANS an N1 beein äch ig wi d. Aus diesem G und wu den analog zum
WT d G3P* und d G3P* IIHY übe die Messung de Assozia ionskine iken die KD-We e
de im Be eich des P o213 subs i uie en P o eine bes imm (Tabelle 3.2.3).
(s)
0 100 200
ela i e Fluo eszenz
20
40
60
80
2500 5000 7500
E gebnisse und Diskussion
96
Tabelle 3.2.3: In e ak ion on TolAC-AEDANS mi den e schiedenen G3P*-Va ian en.
Va ian e kon (µM-1s-1) ko (s-1) ko /kon (µM) KD (µM)
isolie e N1 0,86 ± 0,01 0,26 ± 0,03 0,30 0,31 ± 0,02
isolie e N1 T13I 1,21 ± 0,02 0,16 ± 0,03 0,13 0,19 ± 0,01
WT d G3P* 0,003 ± 0,001 0,51 ± 0,01 171 22,1 ± 6,6
d G3P* APA 0,65 ± 0,01 0,37± 0,01 0,57 0,44 ± 0,02
d G3P* AGA 0,19 ± 0,01 0,31 ± 0,01 1,68 1,26 ± 0,05
d G3P* IIHY APA n. d. n. d. n. d. 31 ± 21
WT d G3P* - In e media 0,19 ± 0,01 0,29 ± 0,01 1,54 1,85 ± 0,12
d G3P* IIHY - In e media 0,006 ± 0,001 0,28 ± 0,01 48 13,6 ± 1,8
d G3P* IIHY keine Assozia ionskine iken de ek ie ba
Angegeben is jeweils de aus de Analyse de Ampli uden nach Gleichung 43 e hal ene KD-We sowie die
mik oskopischen Ra en ko und kon aus de Auswe ung de Au agung de appa en en Assozia ions a en. De en
Quo ien e gib eben alls die Dissozia ionskons an e des Komplexes aus dem jeweiligen G3P* und 0,2 µM
TolAC-AEDANS. Die en sp echenden Assozia ionskine iken wu den nach An egung bei 280 nm anhand de
Ände ung de AEDANS-Fluo eszenz obe halb on 460 nm in s opped- low-Mischexpe imen en e olg . (n. d.:
keine Auswe ung möglich). Alle Messungen wu den bei 25 °C in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0, 0,1 M GdmCl
du chge üh .
Beide P o eine, d G3P* AGA und d G3P* APA, besi zen ela i zu na i em WT d G3P*
eine deu lich höhe e A ini ä ü TolAC-AEDANS, was haup sächlich au höhe e
Assozia ions a en zu ückge üh we den kann. Die Dissozia ionskons an e de
d ei achsubs i uie en Va ian e d G3P* AGA lieg dabei mi 1,68 µM im Be eich des KD-
We es des lose assoziie en WT d G3P* (1,85 µM). Rela i zu isolie en N1-Domäne is die
Bindungs ähigkei de Va ian e nu sechs ach e inge . Demnach sind die zusä zlichen
s abilisie enden Wechselwi kungen im d G3P* AGA übe den nich assoziie en Zus and
hinaus ela i schwach. Die Va ian e d G3P* APA binde noch besse an TolAC-AEDANS.
Im Ve gleich zu isolie en N1-Domäne is die Dissozia ionskons an e nu unwesen lich on
0,31 µM au 0,44 µM e höh (Tabelle 3.2.3), was noch einmal bes ä ig , dass die Domänen in
diese Va ian e im Wesen lichen unabhängig oneinande o liegen.
Im d G3P* IIHY üh en die Subs i u ionen de beiden zu P o213 benachba en Res e
dazu, dass im un e such en Konzen a ionsbe eich zumindes Kine iken de Assozia ion on
TolAC-AEDANS und d G3P* IIHY APA de ek ie we den können. De aus den
Ampli uden e mi el e KD-We on 31 µM is zwa seh s a k ehle beha e , e bek ä ig
jedoch, dass auch in diese Va ian e die S ä ke de Domänenassozia ion du ch die beiden
Alanin-Subs i u ionen s a k he abgese z wi d. Im Gegensa z zum WT d G3P* können die
eben alls en hal enen Subs i u ionen T101I und D209Y in de Gelenk egion die
des abilisie ende Wi kung de Aus ausche Q212A und P214A jedoch zumindes sowei
kompensie en, dass de gedock e Zus and eingenommen wi d.
E gebnisse und Diskussion
97
3.2.5 Du ch den Aus ausch de zu P o213 benachba en Res e lieg de
en sp echende Phage pe manen in de geö ne en Fo m o
Die Modula ion des P olinschal e s ha in i o einen g oßen Ein luss au die S abili ä und
dami auch die A ini ä des G3P* ü TolAC. Übe in i o Expe imen e soll e im Folgenden
un e such we den, wie sich die Subs i u ionen um P o213 au die In ek iosi ä des d Phagen
auswi ken. Im e s en Sch i de In ek ion pilushal ige (F+) E. coli Zellen in e agie die N2-
Domäne des G3P* mi de Spi ze des F-Pilus, wodu ch e mu lich de Pilus zu ückgezogen
wi d und so de Phage an die Zellobe läche gelang .11; 69 Ob N2 wäh end de olgenden
In ek ionssch i e am Pilus gebunden bleib is nich bekann . Die Wechselwi kung mi dem
Pilus üh jedoch zu Isome isie ung on P o213 in die ans-Kon o ma ion und die
Dissozia ion de Domänen, wodu ch die In e ak ions läche ü TolAC au de N1-Domäne
exponie wi d.60; 72 Ve ein ach be ach e spiegel demnach die In ek iosi ä des d Phagen
gegenübe F+-Zellen die A ini ä seines G3P* im ak i en In e media szus and gegenübe
TolAC wide .
Anhand on In ek ionss udien mi pilushal igen E. coli Zellen konn e be ei s gezeig
we den, dass Phagen mi s abilisie enden Subs i u ionen in de Gelenk egion des G3P einen
leich en Nach eil gegenübe dem na ü lichen d Phagen haben.79 U sache da ü sind
e mu lich die zusä zlichen güns igen In e ak ionen zwischen de Gelenk egion und N1,
welche zu Ausbildung de lose-assoziie en Fo m üh en, in de die Bindung on TolAC
beein äch ig is . Die in diese A bei nähe un e such en Aus ausche de zu P o213
benachba en AS haben dagegen zum Teil eine d as ische Ve inge ung de
Domänenin e ak ionen und dami Des abilisie ung on N2 zu Folge. Ein en sp echend
posi i e E ek au die Funk ionali ä de Phagen mi ak i ie em G3P is jedoch nich
beobach ba . Rela i zum Phagen d G3P IIHY is die In ek iosi ä des Phagen
d G3P IIHY APA gegenübe F+-Zellen un e ände (Abbildung 3.2.8). Dass sich die
Subs i u ionen Q212A und P214A selek i nu au das assoziie e G3P auswi ken, is
unwah scheinlich. Vielmeh geh un e ande em aus den Fal ungskine iken des
d G3P* IIHY APA126 sowie dessen Rück al ung in Gegenwa on TolAC-AEDANS he o ,
dass zwa de In e media szus and deu lich des abilisie und dami N1 besse exponie is ,
da ü jedoch das P o ein iel schnelle seine na i e, gedock e Fo m einnimm (Da en nich
gezeig ). Die Beschleunigung de Ö nungs- und Schließ eak ion des P o213 üh e mu lich
zu S ö ung de In e ak ion zwischen N1 und TolAC.
In e essan e weise ha auch de Phage d G3P APA bei de In ek ion on pilushal igen
Zellen keinen Vo eil gegenübe dem WT d Phagen (Abbildung 3.2.8), obwohl sein G3P
selbs in de na i en Fo m as olls ändig geö ne o lieg . Ein mögliche G und ü die
e inge e In ek iosi ä diese Va ian e und auch d G3P IIHY 6 is die ge inge S abili ä
ih e N2-Domänen. Die In ek ionsexpe imen e selbs wu den un e Bedingungen
du chge üh , bei denen N2 jeweils ge al e o lag. Die zu Isolie ung de Phagen
e wende en Übe nach kul u en (ÜNK) wu den jedoch bei 37 °C inkubie , was im Be eich
E gebnisse und Diskussion
98
des Übe gangsmi elpunk es de N2-Domäne de Va ian en lieg . Es is dahe nich
auszuschließen, dass au g und de Agg ega ion eines Teils de pa iell en al e en P o eine die
Anzahl an in ek iösen Phagenpa ikeln e inge wu de.
Abbildung 3.2.8: In ek ion on pilus eien bzw. pilushal igen E. coli Zellen du ch die d Phagen a ian en.
Au ge agen sind die In ek iosi ä en e schiedene d Phagen gegenübe a) F+ E. coli TG1 Zellen und
b) F- E. coli HB2156 Zellen in Gegenwa on 50 mM CaCl2 in a) ela i zu WT d Phagen bzw. in b) ela i zu
d G3P N2 Phagen. Die koloniebildenden Einhei en (c. .u.) de in izie en Zellen wu den nach Inkuba ion ü
30 min bei 25 °C anhand on Ve dünnungs eihen au Chlo amphenicol- (Cm-)hal igen dYT-Näh böden
bes imm .
Fü die In ek ion on F+-Zellen is die Anwesenhei de N2-Domäne essen iell, da du ch
de en In e ak ion mi dem Pilus de geö ne e, ak i e Zus and e zeug wi d. Pilus eie
F- E. coli Zellen können in Gegenwa on 50 mM CaCl2 eben alls in izie we den.124 Die
E izienz is alle dings um meh als d ei Zehne po enzen he abgese z , da du ch die ehlende
Wechselwi kung mi dem Pilus keine An eiche ung de Phagen au de Obe läche s a inde .
Es wi d ielmeh e mu e , dass die zusä zlich en hal enen Calciumionen en wede du ch
P äzipi a ion de Phagen au de Obe läche ode übe die S ö ung de Memb anin eg i ä de
Zelle und dami Ve besse ung de Zugänglichkei on TolAC die In ek iosi ä e höhen.
Die Gegenwa de N2-Domäne wi k sich demnach hie hinde lich au den
In ek ionsp ozess aus, da sie du ch die Wechselwi kung mi de N1-Domäne die
In e ak ions läche ü TolAC blockie . Die Phagen a ian en, de en G3P* au g und
zusä zliche Subs i u ionen en wede deu lich schwäche ode ga nich in assoziie e Fo m
o lieg , haben demnach einen deu lichen Vo eil. E wa ungsgemäß zeigen de Dele ions-
phage d G3P N2 und de Phage d G3P* IIHY 6, in dessen G3P die beiden Domänen
unabhängig oneinande agie en, die höchs e In ek iosi ä (Abbildung 3.2.8b). Die
In ek iosi ä des Phagen d G3P APA is dem gegenübe jedoch nu zwei ach e inge . Dies
deck sich mi den aus den Bindungsexpe imen en e hal enen KD-We en und zeig
gleichzei ig an, dass de Ve lus an ak i en d G3P APA Phagenpa ikeln du ch
Agg ega ionsp ozesse wäh end de Inkuba ion de ÜNK bei 37 °C ge ing is .
a) b)
ela i e In ek iosi ä (%)
0.1
1
10
100
d G3P N2
WT d Phage
d G3P IIHY
d G3P APA
d G3P IIHY APA
d G3P IIHY 6
ela i e In ek iosi ä (%)
0.1
1
10
100
d G3P N2
WT d Phage
d G3P IIHY
d G3P APA
d G3P IIHY APA
d G3P IIHY 6
E gebnisse und Diskussion
99
Dass die In ek iosi ä on de spon anen Dissozia ion de Domänen und dami auch de
S abili ä de N2-Domäne abhäng , zeig sich in den We en de d ei üb igen Va ian en.
Wäh end analog zum in i o Expe imen die Anzahl an du ch den Phagen d G3P IIHY
in izie en Zellen un e halb de De ek ionsg enze lieg , üh die beschleunigende
Modi ika ion des P olinschal e s zu eine sich ba en Ve besse ung de In ek iosi ä gegenübe
F--Zellen. Sowohl de Übe gangsmi elpunk on N2 als auch de KD-We des
d G3P* IIHY APA sind nu leich im Ve gleich zu denen des WT d G3P* e höh , weshalb
die In ek iosi ä en de en sp echenden Phagen seh ähnlich sind. Gegenübe dem Phagen
d G3P N2 mi olls ändig zugängliche N1-Domäne e gib sich alle dings noch imme ein
hunde ache Un e schied, de mi den Di e enzen in den Dissozia ionskons an en gu
übe eins imm . Die übe den Ene gie ans e zwischen den ge einig en P o einen e hal enen
Bindungsa ini ä en e lek ie en demnach seh gu die S ä ke de Wechselwi kung de N1-
Domäne des Phagen-G3P wäh end de In ek ion.
E gebnisse und Diskussion
106
Abbildung 3.3.4: Che on-Au agung de Rück- und En al ungs a en de isolie en N1-Domänen.
Gezeig sind die appa en en Rück al ungs- (o ene Symbole) und En al ungs a en (geschlossene Symbole) on
isolie e N1 (,), N1 T13I (,), N1 EGDS (,) und N1 T13I EGDS (,●) in Abhängigkei on de GdmCl-
Konzen a ion. Die du chgezogenen Linien ep äsen ie en den Angleich gemäß eines Zweizus andsmodells an
die Da enpunk e. Die da aus e hal enen he modynamischen Pa ame e sind in Tabelle 3.3.3 au gelis e . Die
en sp echenden Kine iken wu den nach s opped- low-Mischung anhand de Ände ung de T p-Fluo eszenz
obe halb on 330 nm nach An egung bei 295 nm mi 1 µM P o ein e olg . Alle Messungen wu den in
0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 bei 25 °C du chge üh . Die Da en ü isolie e N1 T13I wu den de Re e enz 122
en nommen, die de isolie en N1-Domäne de A bei 95.
Tabelle 3.3.3: Pa ame e de Analyse de Fal ungs eak ionen de isolie en N1-Domänen.
Va ian e mRF
(M-1) kRF
(s-1)
mEF
(M-1) kEF
(s-1) [GdmCl]m
(M) m
(kJ mol-1 M-1) G
(kJ mol-1)
Isolie e N1 -1,205 302 1,062 1,421 2,4 5,6 13,3
N1 EGDS -1,086 373 0,962 0,367 3,4 5,1 17,2
N1 T13I -1,017 281 1,02 0,357 3,3 5,0 16,5
N1 T13I EGDS -1,033 416 0,941 0,111 4,1 4,9 20,4
Au gelis e sind die mik oskopischen En al ungs- (kEF) und Rück al ungs a en (kRF) ex apolie au
0 M GdmCl sowie die en sp echenden kine ischen m-We e nach Auswe ung de in Abbildung 3.3.4 gezeig en
Da en gemäß eines Zweizus andsmodells (Gleichung 28). De Übe gangsmi elpunk [GdmCl]m, die eie
En halpie de En al ung G sowie Koope a i i ä m wu den übe die Gleichung 29 bzw. 30 be echne . Die
kine ischen Da en wu den wie in Abbildung 3.3.4 besch ieben gemessen. Die Da en ü isolie e N1 T13I
wu den de Re e enz 122 en nommen, die de isolie en N1-Domäne de A bei 95.
Die kine ischen m-We e de En - und Rück al ung sind im Gegensa z zu den
Ra enkons an en kaum e ände . Die da übe e mi elba en Koope a i i ä spa ame e liegen
dahe alle im Be eich on ca. 5 kJ mol-1 M-1. De m-We de isolie en N1 T13I is dami
deu lich ge inge als de übe den Gleichgewich sübe gang bes imm e We on
8,9 kJ mol-1 M-1. Ein e gleichba e Un e schied in den Koope a i i ä en e gib sich auch ü
N1 T13I in d G3P* IIHY (Tabelle 3.3.3). Bei diese Va ian e wu de au g und des
Abknickens des Rück al ungsas es e mu e , dass wäh end de S uk u ie ung in ge ingen
GdmCl-Konzen a ionen ein schnell al endes N1-In e media populie wi d.122 Die eben alls
gu e Übe s immung de aus den kine ischen Pa ame e n e hal enen [GdmCl]m-We e mi
denen de Gleichgewich sübe gänge zeig jedoch an, dass die Auswe ung de kine ischen
Da en anhand eines Zweizus andsmodells insgesam ge ech e ig is .
[GdmCl] (M)
0123456
(s-1)
1
10
2
10
3
10
E gebnisse und Diskussion
107
3.3.2 Im d G3P* EGDS sind die Wechselwi kungen zwischen den N- e minalen
Domänen d as isch e minde
Die im Ve gleich zu WT d G3P* deu lich e inge e S abili ä de N2-Domäne de Va ian e
d G3P* EGDS läss e mu en, dass hie de gedock e Zus and nich meh olls ändig
eingenommen we den kann. In diesem Fall soll e die En al ung de N1-Domäne ausgehend
on na i em P o ein deu lich beschleunig sein, da hie die Dena u ie ung nich du ch die
Domänenö nung limi ie wi d. Ta sächlich olgen die En al ungs a en on N1 in
d G3P* EGDS dem Ve lau de En al ung de isolie en N1 EGDS (;, Abbildung 3.3.5).
De sich aus den En - und Rück al ungs a en de N1-Domäne des d G3P* EGDS e gebende
Übe gangsmi elpunk und de m-We s immen dabei mi den Da en des
Gleichgewich sübe ganges übe ein (Tabelle 10.1 im Anhang).
Bei hohen GdmCl-Konzen a ionen e geben sich monoexponen ielle Kine iken, die de
olls ändig on N2 en koppel en En al ung de N1-Domäne zugeo dne we den können.
Zwischen 3 und 4,4 M GdmCl is eine zusä zliche schnelle e Phase mi en gegengese z e
Ampli ude de ek ie ba , welche die En al ung de N2-Domäne wide spiegel . Un e halb on
2,8 M GdmCl wi d die Signalände ung on de Dena u ie ung de N2-Domäne dominie
(Abbildung 3.3.5b). Die Ra en olgen jedoch nich dem Ve lau de En al ung on N2 im
nich assoziie en Zus and des WT d G3P*. De Che onas is ielmeh leich zu höhe en
GdmCl-Konzen a ionen e schoben (, Abbildung 3.3.5). Die N2-Domäne wi d demnach
übe zusä zliche Wechselwi kungen leich s abilisie .
De Ve lau de Rück al ung de -Spezies des d G3P* EGDS kann nich au gelös
we den (, Abbildung 3.3.5). Die nach s opped- low-Mischung gemessenen Kine iken sind
mi Zei kons an en on 0,67 s (in 0,2 M GdmCl) e wa d ei ach gegenübe de Rück al ung
on N2 im WT d G3P* (1,82 s in 0,2 M GdmCl) beschleunig , wobei das Che onminimum
zu nied ige en GdmCl-Konzen a ionen e schoben is (, Abbildung 3.3.5). Im
Umkeh schluss bedeu e dies, dass im Wild yp-P o ein be ei s wäh end de S uk u ie ung
on N2 zu Schlei en egion hin In e ak ionen ausgebilde we den. De Be und deck sich auch
mi den E gebnissen de -We -Analyse de isolie en N2-Domäne on Roman Jakob und
Maximilian on Delb ück.157; 166 Aus -We en können anhand des Ve gleiches de
Fal ungsmechanismen des Ausgangsp o eins und eine subs i uie en Va ian e Rückschlüsse
au die ene ge ischen Wechselwi kungen de u sp ünglichen AS in den e schiedenen
Zus änden gezogen we den.167; 168 De mi Asp24 in de N1-Domäne in e agie ende Res
Gly153 on N2 be inde sich danach be ei s im Übe gangszus and in eine na i ähnlichen
Umgebung.157; 166 E kann also im G3P* wäh end de Fal ung on N2 mi de schon ge al e en
N1-Domäne In e ak ionen eingehen, wodu ch wiede um die Rück al ung on N2 beein luss
wi d.
E gebnisse und Diskussion
108
Abbildung 3.3.5: Analyse de Fal ungs- und En al ungs a en des d G3P* EGDS.
a) Au agung de appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en (o ene Symbole) on
WT d G3P* (g aue Symbole) bzw. d G3P* EGDS ( a bige Symbole) in Abhängigkei on de GdmCl-
Konzen a ion. Die langsamen En al ungs- (●;;;●;●) und Rück al ungs eak ionen (;;;) de N2-
Domäne des jeweiligen G3P* wu den nach manuelle Mischung gemessen. Gezeig sind auße dem die schnellen
Rück al ungs a en (;) de N1-Domänen sowie de isolie en N1 EGDS () nach s opped- low-Mischung.
Au ge agen sind zusä zlich die Ra en de kon o ma ionellen Fal ung de jeweiligen -Spezies (;)
ausgehend on en al e em P o ein sowie die En al ung on N1 aus dem na i en Zus and (;;) nach s opped-
low-Mischung. Die En al ung on N2 aus dem nich assoziie en Zus and () konn e be ei s in
Einzelmischexpe imen en nach schnelle Mischung de ek ie we den. Im WT d G3P* sind diese Ra en dagegen
e s nach Rück al ung ü 20 bzw. 150 s in 0,5 M GdmCl und e neu e Übe üh ung in En al ungsbedingungen
beobach ba (;). Zu Ve gleichszwecken au ge agen sind auße dem die En al ungs a en de N1-Domäne ()
im ungedock en WT d G3P* sowie die En - und Rück al ungs a en de isolie en N2-Domäne (;). Einige de
Da en des WT d G3P* wu den de Diploma bei on Roman Jakob en nommen (siehe Abbildung 3.1.2).150 Die
Kine iken des d G3P* EGDS wu den bis au die mi den Symbolen ●; und gekennzeichne en Da en on
Anna Schneide gemessen, jedoch on mi noch einmal sepa a ausgewe e . Die Reak ionen de N1-Domäne
nach schnelle Mischung wu den anhand de T p-Fluo eszenz obe halb on 340 nm nach An egung bei 295 nm
e olg , die de N2-Domäne obe halb on 320 nm nach An egung bei 280 nm. Die Fal ungs a en de N2-
Domäne nach manuelle Mischung wu den übe die Messung de Fluo eszenz bei 310 nm e hal en. b) Gezeig
sind die En al ungskine iken on na i em d G3P* EGDS nach schnelle Mischung in 2,7 M GdmCl (blau) und
3,3 M GdmCl (schwa z, ech e O dina e) mi Zei kons an en on M GdmCl) = 43 ms bzw.
M GdmCl) = 23 ms und M GdmCl) = 50 ms. Die Reak ionen wu den obe halb on 340 nm nach
An egung bei 280 nm gemessen. c) Au agung de Fluo eszenzampli uden de schnellen () Rück al ungsphase
sowie de schnelle en () und langsamen En al ungsphase (●) de N2-Domäne im d G3P* EGDS als Funk ion
de GdmCl-Konzen a ion. Die Da en wu den nach manuelle Mischung anhand de Ty osin luo eszenz bei
310 nm nach An egung bei 280 nm au genommen. Die Messungen wu den in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi
1 µM P o ein bei 25 °C du chge üh .
[GdmCl] (M)
0123456
(s
-1
)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
3
10
[GdmCl] (M)
00,511,52
ela i e Fluo eszenz
0
20
40
60
(s)
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
ela i e Fluo eszenz
5,6
5,7
5,8
5,9
ela i e Fluo eszenz
5,8
5,9
6
6,1
6,2
a)
b) c)
E gebnisse und Diskussion
109
Sowohl die En al ung de isolie en N2-Domäne als auch on N2 in nich assoziie em
G3P* sind no male weise unabhängig on de Kon o ma ion des P o161 (Kapi el 3.1.1).151
In e essan e weise ha jedoch de Aus ausch de Schlei en egion einen Ein luss au die
En al ungsgeschwindigkei de cis- bzw. ans-Fo m de N2-Domäne. De En al ungsas de
-Spezies des d G3P* EGDS, de sich nach Rück al ung in 0,5 M GdmCl ü 2 s und
e neu em Sp ung in En al ungsbedingungen e gib (, Abbildung 3.3.6), is im Ve gleich zu
dem de isolie en N2-Domäne is zu höhe en GdmCl-Konzen a ionen e schoben
(, Abbildung 3.3.6). Dies zeig an, dass de globulä e Teil on N2 wäh end de Fal ung
du ch schwache In e ak ionen z.B. du ch den Zusammenhal de Enden on N2 s abilisie
wi d. Die En al ungsgeschwindigkei de -Spezies is alle dings ge ing ügig
gegenübe de de s abile en N2-Domäne mi cis-P o161 e höh , die nach Rück al ung in
0,5 M GdmCl ü 600 s populie wi d. Die En al ungs a en de -Fo m liegen im Be eich
de e on N2 des nich assoziie en WT d G3P* (;, Abbildung 3.3.6). Ve mu lich haben
die AS de uns uk u ie en Gelenk egion einen ungüns igen Ein luss au die Ano dnung de
Res e des globulä en Teils on N2 mi ans-P o161, de e s du ch die nachgelage e
anscis-Isome isie ung on P o161 und dami S abilisie ung on N2 kompensie wi d. Im
WT d G3P* wi d diese ungüns ige Ano dnung du ch die be ei s im ühen S adium de
Fal ung de labile en N2-Domäne ausgebilde e In e ak ion mi de Schlei en egion e hinde .
Abbildung 3.3.6: Analyse de Fal ungs- und En al ungskine iken de N2-Domäne d G3P* EGDS.
Au agung de appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en (o ene Symbole) de N2-
Domäne on WT d G3P* (g aue Symbole) bzw. d G3P* EGDS ( a bige Symbole) nach schnelle Mischung in
Abhängigkei on de GdmCl-Konzen a ion. Gezeig is de Ve lau de Rück al ung ausgehend on en al e em
P o ein (;) sowie die En al ung on na i em d G3P* EGDS (), die on Anna Schneide gemessen wu de
(Da en pe sönliche Mi eilung). Die En al ungs a en aus dem nich assoziie en Zus and wu den übe
Doppelmischexpe imen e e hal en. En al e es P o ein wu de ü 2 () bzw. 600 s () in 0,5 M GdmCl
ückge al e und danach du ch e neu en Sp ung in höhe e Dena u ie ungsmi elkonzen a ionen en al e . Im
WT d G3P* wu den en sp echende Ra en nach Rück al ung ü 20 () bzw. 150 s () in 0,5 M GdmCl und
e neu e Übe üh ung in En al ungsbedingungen beobach e . Zu Ve gleichszwecken au ge agen sind die En -
und Rück al ungs a en de isolie en N2-Domäne (;). Einige de Da en des WT d G3P* wu den, wie in
Abbildung 3.1.2 besch ieben, de Diploma bei on Roman Jakob en nommen.150 Die Reak ionen de N2-
Domäne nach schnelle Mischung wu den anhand de Fluo eszenz obe halb on 320 nm nach An egung bei
280 nm e olg . Die Messungen wu den in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi 1 µM P o ein bei 25 °C du chge üh .
[GdmCl] (M)
00,511,522,53
(s
-1
)
-1
10
1
1
10
2
10
E gebnisse und Diskussion
110
Die En al ung de subs i uie en Va ian e nach manuelle Mischung olg einem
biexponen iellen Ve lau . Mi eine Zei kons an e on 51 s en sp ich dabei die schnelle e de
beiden Phasen de Isome isie ung on P o161 in die ans-Kon o ma ion
(, Abbildung 3.3.5a). Demnach lieg im na i en d G3P* EGDS genau wie in
d G3P* P213G ein Teil de Moleküle im nich assoziie en Zus and o . Die Zei kons an e
de langsame en Reak ion e inge sich zwischen 0,6 und 1,6 M GdmCl on 1430 au
196 s, bleib obe halb diese Dena u ie ungsmi elkonzen a ion jedoch kons an
(●, Abbildung 3.3.5a). Die Ra en be inden sich unge äh im Be eich de Isome isie ung des
P o213, ih Ve lau is jedoch zu nied ige en GdmCl-Konzen a ionen e schoben, was die
deu liche Des abilisie ung on N2 im assoziie en Zus and des d G3P* EGDS e lek ie . Die
Ampli uden de beiden Phasen nehmen eben alls zu höhe en GdmCl-Konzen a ionen hin ab
(●;, Abbildung 3.3.5c). Die mi de g öß en Signalände ung e bundene kon o ma ionelle
En al ung aus dem o enen bzw. assoziie en Zus and inde , wie in den s opped- low-
Expe imen en gezeig , be ei s in de To zei de Handmischung s a . Die de ek ie en
En al ungs eak ionen s ellen olglich die da an gekoppel en langsame en Isome isie ungen
on P o161 bzw. P o213 da , welche be ei s ü WT d G3P* beobach e wo den wa en
(Kapi el 3.1.2, Gleichung 44).
Wäh end de Rück al ung is nach manuelle Mischung lediglich eine Phase de ek ie ba ,
de en Zei kons an e mi 122 s (in 0,5 M GdmCl) de de anscis-Isome isie ung des
P olin161 en sp ich (, Abbildung 3.3.5a). Ta sächlich läss sich die Geschwindigkei diese
Rück al ungs eak ion du ch den Fal ungshel e hFKBP12+IF beschleunigen (Da en nich
gezeig ). Eine nachgelage e Reak ion, die de Einnahme des assoziie en Zus andes du ch die
anscis-Isome isie ung on P o213 en sp ich , is dagegen spek oskopisch nich sich ba .
Dies kann au dessen ge inge S abili ä im Ve gleich zum WT d G3P* zu ückge üh we den,
denn anhand de F eise zung on TolAC-AEDANS aus dem Komplex mi de N1-Domäne
des d G3P* EGDS wäh end de Rück al ung in 0,5 M GdmCl läss sich die Zei kons an e de
Assozia ions eak ion bes immen (Abbildung 3.3.7). Sie lieg , wie be ei s e mu e , mi 3390 s
e wa im Zei be eich de langsamen Isome isie ungs eak ion des P o213. De P olinschal e is
demnach noch in ak . Die E höhung de In e ak ionen zwischen den Domänen und dami die
S abilisie ung de N2-Domäne sind jedoch du ch die Ve kü zung de Schlei en egion deu lich
behinde . Ob dadu ch auch die Ausbildung des Wasse s o b ückenne zwe kes zwischen de
N1-Domäne und de Gelenk egion beein luss is , kann an diese S elle nich eindeu ig geklä
we den.
Wäh end de Fal ung on d G3P* EGDS wi d deu lich wenige TolAC-AEDANS
e d äng als bei de Rück al ung des Wild yp-P o eins bzw. d G3P* P161A
(Abbildung 3.3.7). Wie be ei s anhand des Fal ungsmechanismus de Va ian e mi
subs i uie e Schlei e 1 geschluss olge , lieg ein G oß eil de Moleküle au g und de nu
schwach ausgep äg en Domänenin e ak ionen in geö ne e Fo m o . Au ällig is zudem,
dass die Ampli ude de e s en Phase de F eise zung on TolAC-AEDANS wäh end de
Rück al ung on d G3P* EGDS wie in d G3P* P161A deu lich ge inge is als die de
E gebnisse und Diskussion
111
zwei en Reak ion. Du ch die Isome isie ung on P o161, mi de in 0,5 M GdmCl
haup sächlich auch die S uk u ie ung des globulä en Teils de N2-Domäne einhe geh , kann
TolAC olglich nu zu einem seh ge ingen An eil e d äng we den. Dies bes ä ig noch
einmal, dass die beiden Domänen im nich assoziie en Zus and des d G3P* EGDS as
olls ändig unabhängig oneinande sind und die N2-Domäne im Gegensa z zu WT d G3P*
wäh end ih e Fal ung nich mi TolAC um die Wechselwi kung mi N1 kompe ie en kann.
Abbildung 3.3.7: Ve d ängung on TolAC aus dem Komplex mi N1 du ch Fal ung des d G3P* EGDS.
Gezeig sind die um den Pu e we ko igie en Kine iken de F eise zung on TolAC-AEDANS wäh end de
Rück al ung on WT d G3P* (schwa z), d G3P* P161A ( o ) und d G3P* EGDS (g ün). Die Reak ionen
wu den nach zehn ache Ve dünnung des jeweiligen dena u ie en P o eins (10 µM in 5 M GdmCl) in
Gegenwa on 1 µM TolAC-AEDANS anhand de AEDANS-Fluo eszenz bei 490 nm nach An egung bei
280 nm e olg . Die schwa zen Linien s ellen den Angleich biexponen ielle Funk ionen an die Da en mi
olgenden Zei kons an en da : 1(WT) = 82 s, 2(WT) = 5260 s; 1(P161A) = 60 s, 2(P161A) = 7190 s;
1(EGDS) = 122 s, 2(EGDS) = 3390 s. Die Messungen wu den bei 25 °C in 0,1 M KP-Pu e , 0,5 M GdmCl,
pH 7,0 mi eine Schich dicke on 1 cm du chge üh .
3.3.3 Du ch die Subs i u ion de Schlei en egion wi d das ak i e In e media
populie
Eine Aussage da übe , wie g oß de An eil an geö ne en d G3P* EGDS Molekülen ela i
zum Ausgangsp o ein is , kann nich ge o en we den, da ein Ve gleich de
Gesam ampli uden aus den TolAC-Ve d ängungsexpe imen en de e schiedenen Va ian en
unzulässig is . Die In e ak ion zwischen N1 und TolAC wi d haup sächlich übe
Wasse s o b ücken und Coulombwechselwi kungen e mi el .81; 83 Un e ande em bilde
auch die Sei enke e des Asp28 de u sp ünglichen Schlei ensequenz on d-N1 (DDKTLD28)
mi dem am C-Te minus on TolAC lokalisie en Lys212 eine Salzb ücke aus. Die
Bindungs ähigkei de N1-Domäne on d G3P* EGDS is dahe e mu lich he abgese z .
Um he auszu inden, wie g oß de E ek de Subs i u ion au die A ini ä is , wu den
analog zu Kapi el 3.2.1 anhand de Assozia ionskine iken die Dissozia ionskons an en de
Komplexe aus TolAC-AEDANS und den e schiedenen Va ian en in Abwesenhei on
GdmCl bes imm . Neben den appa en en Ra en de Reak ionen wu de wiede de Ve lau de
Ampli uden ausgewe e (Abbildung 3.3.8). Die e hal enen We e sind in Tabelle 3.3.4
au gelis e .
(s)
0 100 200 300
ela i e Fluo eszenz
0
20
40
60
10000 20000 30000
E gebnisse und Diskussion
112
Wie e wa e üh de Aus ausch de Schlei en egion unabhängig om zusä zlichen
Subs i u ionshin e g und zu eine ie achen Ve inge ung de A ini ä de isolie en
N1-Domäne. In e essan e weise sind Assozia ion und Dissozia ion gleiche maßen nega i
beein luss . Das bedeu e , dass zwa be ei s die o allem au elek os a ische Anziehung
basie ende Bindung e schwe wi d, gleichzei ig jedoch auch ungüns ige In e ak ionen den
Komplex des abilisie en. Im Komplex on TolAC mi de N1-Domäne des Phagen IF1, nach
de en Vo bild die Va ian e d G3P* EGDS kons uie wo den wa , wi d eben alls eine
Salzb ücke ausgehend on Lys212 des TolAC-P o eins gebilde . De ko espondie ende
Wechselwi kungspa ne de IF1-N1-Domäne is jedoch nich Asp28 in de Schlei en egion
sonde n Glu37, welches im übe nächs en Fal bla s ang lokalisie is .91 In d-N1 be inde
sich an diese Posi ion Asn39 (Abbildung 3.3.1), das un e den Pu e bedingungen (pH 7,0)
keine Salz- sonde n lediglich Wasse s o b ücken zu Lys212 ausbilden kann. De Ve lus des
u sp ünglichen In e ak ionspa ne s Asp28 kann demnach nich olls ändig kompensie
we den.
Aus dem Ve gleich de Dissozia ionskons an en on isolie e N1 EGDS und
N1 T13I EGDS geh alle dings he o , dass die Subs i u ion T13I die Ve inge ung de
A ini ä du ch die Ve ände ung de e s en Schlei e eilweise ausgleich (Tabelle 3.3.4). Im
Hin e g und de s abilisie enden Subs i u ion T13I wi ken sich demnach de Aus ausch de
Schlei en egion und de dami e bundene Ve lus des ü die In e ak ion mi TolAC
wich igen Asp28 nu ge ing ügig au die A ini ä de N1-Domäne ü TolAC aus.
Abbildung 3.3.8: Bindung de G3P*-Va ian en mi e ände e Schlei e an den Rezep o TolAC-AEDANS.
Au agung de no mie en Fluo eszenzampli uden (a) bzw. appa en en Assozia ions a en (b) in Abhängigkei
on de Konzen a ion an isolie e N1 (), N1 T13I (), N1 EGDS (), N1 T13I EGDS (●), WT d G3P* (●),
d G3P* EGDS () bzw. d G3P* IIHY EGDS (). Sowohl die Ra en als auch die Ampli uden wu den aus dem
Angleich monoexponen ielle Gleichungen an die Assozia ionskine iken e hal en. Die in a) gezeig en Linien
s ellen einen Angleich an die Ampli uden gemäß Gleichung 43 da . Die mik oskopischen Ra en de Dissozia ion
(ko ) und Assozia ion (kon) e gaben sich nach linea e Reg ession de in b) au ge agenen Da en aus dem
Schni punk mi de y-Achse bzw. de Ge adens eigung. Die Dissozia ionskons an e KD wu de aus dem
Quo ien en de beiden mik oskopischen Ra en be echne (Gleichung 34). Die Assozia ionskine iken wu den
nach An egung bei 280 nm anhand de Ände ung de AEDANS-Fluo eszenz obe halb on 460 nm in s opped-
low-Mischexpe imen en e olg . Alle Messungen wu den bei 25 °C in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 du chge üh .
Die e hal enen KD-We e und mik oskopische Ra en sind in Tabelle 3.3.4 au gelis e .
[P o ein] (µM)
0 4 8 121620
k
app
(s
-1
)
0
2
4
6
8
10
a) b)
[P o ein] (µM)
0 4 8 121620
ela i e Ampli ude
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
E gebnisse und Diskussion
113
Tabelle 3.3.4: Pa ame e de In e ak ion on TolAC-AEDANS mi den e schiedenen G3P*-Va ian en.
Va ian e kon
(µM-1s-1)
ko
(s-1)
ko /kon
(µM)
KD
(µM)
Isolie e N1 0,97 ± 0,01 0,25 ± 0,01 0,26 0,28 ± 0,02
Isolie e N1 EGDS 0,41 ± 0,01 0,53 ± 0,02 1,3 1,07 ± 0,05
Isolie e N1 T13I 1,24 ± 0,02 0,16 ± 0,04 0,13 0,15 ± 0,01
Isolie e N1 T13I EGDS 0,61 ± 0,01 0,4 ± 0,02 0,65 0,56 ± 0,02
WT d G3P* n.d. n.d. n.d. 82 ± 30
d G3P* EGDS 0,11 ± 0,01 0,6 ± 0,01 5,62 3,45 ± 0,16
d G3P* APA 0,81 ± 0,01 0,36 ± 0,01 0,44 0,34 ± 0,01
d G3P* G153D 0,26 ± 0,01 0,4 ± 0,02 1,51 1,08 ± 0,07
d G3P* IIHY n.d. n.d. n.d. n.d.
d G3P* IIHY EGDS n.d. n.d. n.d. 107 ± 40
Angegeben is de aus de Analyse de Ampli uden e hal ene KD-We sowie die mik oskopischen Ra en ko und
kon aus de Auswe ung de appa en en Assozia ions a en. De en Quo ien e gib eben alls die
Dissozia ionskons an e des Komplexes aus dem jeweiligen G3P* und 0,2 µM TolAC-AEDANS. (n. d.: keine
Auswe ung möglich). Die Messungen e olg en un e den in Abbildung 3.3.8 besch iebenen Bedingungen.
Die A ini ä on d G3P* EGDS is au g und des hohen An eils an nich assoziie e
Spezies nich nu deu lich gegenübe WT d G3P* e höh , sonde n auße dem nu ie ach
gegenübe de A ini ä de ko espondie enden isolie en N1 EGDS e inge .
Ve an wo lich ü diesen e bleibenden Un e schied is die nied ige e Assozia ions a e des
G3P* (Tabelle 3.3.4). Die TolAC-Bindungsdomäne de Va ian e is demnach e was
schlech e zugänglich, was au die Mischung aus geö ne em und assoziie em Zus and
zu ückge üh we den kann. Un e de Annahme, dass im nich assoziie en d G3P* EGDS
zwischen N1 und N2 kaum Wechselwi kungen bes ehen und N1 in de geschlossenen Fo m
des G3P* nich an TolAC binden kann, läss sich abschä zen, dass maximal 75 % des na i en
P o eins im gedock en Zus and o liegen.
De Aus ausch G153D in N2 ha nich nu einen zu Subs i u ion de Schlei en egion
ähnlichen E ek au die S abili ä de N2-Domäne sonde n auch au die
Dissozia ionskons an e (Tabelle 3.3.4). Die Bindung on d G3P* G153D an TolAC-
AEDANS is genau wie bei d G3P* EGDS nu ie ach schlech e als die Wechselwi kung
zwischen TolAC und de ko espondie enden isolie en N1-Domäne. G und da ü is
eben alls die e langsam e Assozia ions eak ion. Die A ini ä de gegenübe d G3P* EGDS
leich des abilisie en Va ian e d G3P* APA is auch ohne das Dena u ie ungsmi el GdmCl
as so hoch wie die A ini ä de isolie en N1-Domäne (Tabelle 3.3.4). Im na i en Zus and
sind hie In e ak ionen zwischen den Domänen nu seh schwach ausgep äg , weshalb die N1-
und N2- Domäne as olls ändig unabhängig oneinande o liegen.
In de Va ian e d G3P* IIHY EGDS gehen du ch die zusä zlichen s abilisie enden
Subs i u ionen in de Gelenk egion as alle Moleküle in den gedock en Zus and übe . De
KD-We is dahe e wa ungsgemäß seh hoch. Die N2-Domäne des d G3P* IIHY EGDS is
jedoch e mu lich au g und ehlende In e ak ionen leich des abilisie , weshalb im
E gebnisse und Diskussion
114
Ve gleich zu d G3P* IIHY die Assozia ion de ek ie we den kann, auch wenn sie seh
schwach is und nu eine ge inge Ampli ude zeig .
3.3.4 De d Phage geh du ch den Aus ausch de Schlei en egion und den dami
e bundenen Ve lus de Domänenin e ak ionen in den ak i en Zus and übe
Die A ini ä des jeweiligen G3P* in i o wu de wiede um übe die In ek iosi ä de
en sp echenden Phagen gegenübe pilus eien Zellen un e such . Die Anzahl de du ch den
Phagen d G3P IIHY EGDS in izie en F- HB2156 E. coli Zellen lieg o z de leich
e besse en Bindungs ähigkei un e halb de De ek ionsg enze (Abbildung 3.3.9a). Die
In ek iosi ä des Phagen d G3P* EGDS is dagegen um as eine Zehne po enz gegenübe de
des Wild yp-Phagen e höh , da die In ek ion diese F--Zellen on de Popula ion an Phagen
mi G3P im nich assoziie en Zus and abhäng (Abbildung 3.3.9a). Wie in Kapi el 3.2.5
gezeig , wi d de F- HB2156 E. coli S amm in Gegenwa on 50 mM CaCl2 am e izien es en
om d G3P N2 Phagen in izie , dessen G3P* lediglich N1 und die C- e minale Domäne
en häl , und dahe die Bindungss ellen ü TolAC pe manen zugänglich sind. Die
In ek iosi ä des d G3P N2 Phagen mi N1 EGDS is dabei leich gegenübe dem Phagen
mi de u sp ünglichen N1-Domäne he abgese z (Abbildung 3.3.9a), was im Rahmen des
Fehle s dem Un e schied de übe die in i o Expe imen e e mi el en A ini ä en de
isolie en N1-Domänen ü TolAC-AEDANS en sp ich (Tabelle 3.3.4).
Abbildung 3.3.9: In ek ion on pilus eien bzw. pilushal igen E. coli Zellen du ch d Phagen a ian en.
Au ge agen sind die In ek iosi ä en e schiedene d Phagen gegenübe a) F- HB2156 E. coli Zellen in
Gegenwa on 50 mM CaCl2 und b) E. coli XL1 Blue Zellen in a) ela i zu d G3P N2 bzw. in b) ela i zu
WT d Phagen. Die koloniebildenden Einhei en (c. .u.) de in izie en Zellen wu den nach Inkuba ion ü 30 min
bei 25 °C anhand on Ve dünnungs eihen au Cm-hal igen dYT-Näh böden bes imm .
Pilushal ige E. coli Zellen we den du ch die beiden Phagen a ian en ohne N2-Domäne
nich in izie (Abbildung 3.3.9b). E s du ch die Bindung on N2 an den Pilus gelang de
Phage an die Zellobe läche, wobei die In e ak ion gleichzei ig ü die Dissozia ion de
ela i e In ek iosi ä (%)
0,1
1
10
100
d G3P N2
WT d Phage
d G3P IIHY
d G3P EGDS
d G3P IIHY EGDS
d G3P N2 EGDS
ela i e In ek iosi ä (%)
0,1
1
10
100
d G3P N2
WT d Phage
d G3P IIHY
d G3P EGDS
d G3P IIHY EGDS
d G3P N2 EGDS
a) b)
E gebnisse und Diskussion
115
Domänen so g . Dadu ch wi d die Bindungss elle ü TolAC au de N1-Domäne exponie ,
de en A ini ä wäh end de olgenden In ek ionssch i e on en scheidende Bedeu ung is .
Aus diesem G und is die In ek iosi ä de d G3P EGDS Phagen im Ve gleich zum Wild yp-
Phagen e minde . De Un e schied is mi Fak o zehn seh g oß und wie bei den Phagen
d G3P IIHY 6 und d G3P APA (Kapi el 3.2.5) e mu lich du ch die e inge e S abili ä
de N2-Domäne beding . Die hie eben alls hohe In ek iosi ä gegenübe pilus eien Zellen
zeig jedoch wiede um an, dass de Ve lus an ak i en d G3P EGDS Phagen e häl nismäßig
ge ing is .
De Phage d G3P IIHY EGDS in izie F+-Zellen as so gu wie de WT d Phage. Neben
de deu lich höhe en S abili ä on N2 wi d hie die du ch die Subs i u ion de Schlei e
beding e Ve inge ung de A ini ä au g und de zusä zlichen Subs i u ion T13I eilweise
ausgeglichen. Die In ek iosi ä dieses Phagen is jedoch auch leich gegenübe de seines
Ausgangsphagen d G3P IIHY e höh . Im geö ne en Zus and, de du ch die Wechselwi kung
mi dem Pilus populie wi d, is demnach die Zugänglichkei de TolAC-In e ak ions läche
de N1-Domäne im G3P IIHY EGDS deu lich besse als im G3P IIHY. Dies zeig sich auch
in den Rück al ungsexpe imen en mi den en sp echenden P o ein a ian en in Gegenwa on
TolAC-AEDANS (Abbildung 3.3.10).
Abbildung 3.3.10: F eise zung on TolAC-AEDANS im Ve lau de Fal ung s abilisie e G3P*-Va ian en.
Gezeig sind die no mie en Kine iken de Ve d ängung on TolAC-AEDANS wäh end de Rück al ung on
d G3P* IIHY (blau), d G3P* IIHY P161A ( o ), d G3P* P161A (schwa z) bzw. d G3P* IIHY EGDS (g ün).
Die Reak ionen wu den nach el ache Ve dünnung des jeweiligen dena u ie en P o eins (11 µM in
5,5 M GdmCl) in Gegenwa on 1 µM TolAC-AEDANS anhand de AEDANS-Fluo eszenz bei 490 nm nach
An egung bei 280 nm e olg . Die schwa zen Linien s ellen den Angleich biexponen ielle Funk ionen an die
Da en mi olgenden Zei kons an en da : 1(IIHY) = 27 s, 2(IIHY) = 1357 s; 1(IIHY P161A) = 24 s,
2(IIHY P161A) = 1263 s; 1(EGDS) = 99 s, 2(EGDS) = 5670 s und 1(P161A) = 60 s, 2(P161A) = 7190 s. Die
Messungen wu den bei 25 °C in 0,1 M KP-Pu e , 0,5 M GdmCl, pH 7,0 mi eine Schich dicke on 1 cm
du chge üh .
In allen bishe un e such en G3P* IIHY Va ian en wi d TolAC-AEDANS be ei s wäh end
de Einnahme des lose-assoziie en Zus andes aus dem Komplex mi de N1-Domäne
eigese z (Abbildung 3.3.10). Wäh end de Fal ung on d G3P* IIHY EGDS is dagegen,
ähnlich wie im d G3P* P161A, ü die Ve d ängung des Bindungspa ne s haup sächlich die
(s)
0 100 200
ela i e Fluo eszenz
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
10000 20000 30000
E gebnisse und Diskussion
122
Abbildung 3.4.1: Ve gleich de S uk u en und Sequenzen de N1-Domänen des d G3P* und IF1 G3P*.
a) Übe lage ung de K is alls uk u de N1-Domäne des G3P des Phagen IF1 (g au) mi de N1-Domäne des
WT d G3P* ( o ), de en Rückg a a ome eine Abweichung on 0,623 Å zeigen. Die homologe Schlei ens uk u
is o ange ( d-N1) bzw. hellblau (IF1-N1) einge ä b . Als S äbchen-Modelle da ges ell sind die im d G3P*
en hal enen Res e Asp49 und Glu50 sowie die AS Asp48 und Asp46 de IF1-N1-Domäne. Die Abbildung wu de
anhand de PDB-S uk u en 1G3P61 und 2X9B91 mi dem P og amm Pymol123 e s ell . b) AS-Sequenz e gleich
de N1-Domänen des d G3P und IF1 G3P* sowie IF1-N1DDKTLD. Iden ische Res e sind in o , ähnliche AS in
blau da ges ell . Die Abbildung wu de mi dem P og amm BioEdi 165 e s ell .
3.4.1 Du ch den Einbau on IF1-N1 in die s abilisie e Va ian e d G3P* IIHY
we den beide Domänen des abilisie
Die esul ie ende Va ian e d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY und die ko espondie ende isolie e
N1-Domäne mi e ände e Schlei ensequenz (IF1-N1DDKTLD) wu den zunächs hinsich lich
au ih e S abili ä cha ak e isie . Die he mische En al ung de isolie en N1-Domäne wu de
dabei anhand des CD-Signals bei 222 nm gemessen. Im Ve gleich zu na ü lich
o kommende IF1-N1 e gab sich eine s a ke Des abilisie ung du ch die Ve ände ung de
Schlei e (Tabelle 3.4.1). Die Abnahme des TM-We es um übe 10 °C äll dabei noch
deu liche aus als die S abilisie ung on d N1 du ch die ezip oke Subs i u ion seine langen
Schlei e du ch die homologe Schlei e EGDS aus IF1-N1 (TM = 8 °C, Kapi el 3.3.1). Wie
be ei s bei de Va ian e d G3P* EGDS beobach e , ha de Aus ausch de Region jedoch
keinen Ein luss au die Koope a i i ä des Übe ganges. Das bedeu e , dass die
Des abilisie ung nich du ch eine wenige kompak e Fal ung e u sach wi d. Zwa bleib die
Ne oladung de Schlei e gleich, du ch die Ve länge ung wi d jedoch an ih em N- e minalen
Ende ein zusä zliche Aspa a es einge üg . Da sich analog zu N1-Domäne des Phagen d
mi den AS Asp46 und Asp48 zwei nega i geladene Res e in unmi elba e Umgebung
be inden (Abbildung 3.4.1b), wi d die ungüns ige nega i e Obe lächenladungsdich e in
diese Region zusä zlich e g öße .
De des abilisie ende E ek au die N1-Domäne in de Chimä e is noch g a ie ende . De
Übe gangsmi elpunk de Domäne is nochmals um meh als 4 °C e inge (Tabelle 3.4.1).
De S abili ä sun e schied zeig an, dass sich die Ve knüp ung mi N2 übe die Gelenk egion
10 20 30 40 50 60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|..
N1 T13I d G3P AETVESCLAKPHIENSFTNVWKDDKTLDRYANYEGCLWNATGVVVCTGDETQCYGTWVPIGLAIPEN
N1 IF1 G3P ATTDAECLSKPAFDGTLSNVWKEGDS--RYANFENCIYELSGIGIGYDNDTSCNGHWTPVRAAD---
IF1-N1DDKTLD ATTDAECLSKPAFDGTLSNVWKDDKTLDRYANFENCIYELSGIGIGYDNDTSCNGHWTPVRAAD---
Glu50
Asp49
Asp46
Asp48
a)
b)
E gebnisse und Diskussion
123
ungüns ig au N1 auswi k . Auch im WT d G3P* is die N1-Domäne ela i zu isolie en
N1-Domäne leich des abilisie , jedoch is hie de Un e schied mi 2,1 °C nich so s a k
ausgep äg .
Tabelle 3.4.1: The mische S abili ä sda en on IF1-N1DDKTLD und de Chimä e d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY.
Domänendissozia ion und
En al ung de N2-Domäne En al ung de N1-Domäne
Va ian e TM
(°C) H
(kJ mol-1)
G45°C
(kJ mol-1) TM
(°C) H
(kJ mol-1) G55°C
(kJ mol-1)
Isolie e IF1-N1 - - - 67,2 232 8,1
Isolie e IF1-N1DDKTLD - - - 56,8 238 1,3
d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY 46,3 341 1,4 52,7 222 -1,6
isolie e N1 - - - 62,3 234 5,0
isolie e N1 T13I - - - 67,5 235 8,4
isolie e N2 Q129H 38,8 344 -7,4 - - -
WT d G3P* 48,0 612 5,6 60,2 230 3,5
d G3P* T101I 56,2 626 19,4 62,7 262 5,9
d G3P* IIHY 61,2 644 27,2 66,0 228 7,2
d G3P* IIHY 6 36,7 285 -8,7 64,1 202 5,3
Angegeben sind ü die Va ian en die Schmelz empe a u en TM, die En halpien de jeweiligen En al ungs-
eak ion am TM (H) und die eien En halpien de En al ung G45°C und G55°C bei 45 °C bzw. 55 °C. Die
Übe gänge de N2-Domänen im G3P, welche übe die Ände ung des CD-Signals bei 210 nm e olg wu den,
wu den gemäß eines Zweizus andsmodells analysie . Die Da en ü N1 im G3P* und de wu den nach
Auswe ung des biphasischen En al ungsübe gangs, de anhand des CD-Signals bei 230 nm gemessen wu de,
gemäß eines D eizus andsmodells e hal en. De e s e Übe gang spiegel die En al ung de N2-Domäne sowie
die Dissozia ion de Domänen wide , de zwei e Übe gang die Dena u ie ung de N1-Domäne. Die he misch-
induzie en Übe gänge de isolie en N1-Domänen des Phagen IF1 wu den anhand de CD-Signalände ung bei
222 nm gemessen. De Übe gang de isolie en d-N1-Domänen wu de übe die Ände ung des CD-Signals bei
230 nm gemessen und gemäß eines Zweizus andsmodells ausgewe e . Zu Auswe ung de
En al ungsübe gänge wu de ü die G3P*-Va ian en eine kons an e Ände ung de Wä mekapazi ä Cp on
10000 J mol-1 K-1 ü N2 und ü N1 1000 J mol-1 K-1 angenommen, ü die isolie en N2-Domänen wu den Cp-
We e on 8000 J mol-1 K-1 und ü die isolie en N1-Domänen 1000 J mol-1 K-1 e wende . Die Da en ü
WT d G3P*, isolie e N1 T13I und d G3P* IIHY wu den de Re e enz 121 en nommen. Die
S abili ä spa ame e on d G3P* IIHY G153D bzw. isolie e N1-Domäne wu den aus den A bei en 150 bzw. 152
e hal en. Die Da en on isolie e N2 Q129H wu den de Re e enz 151 en nommen. Die Da en de isolie en d-
N1-Domäne bzw. isolie en IF1-N1-Domäne wu de den A bei en 152 und 91. Die We e ü die Domänen des
d G3P* T101I en s ammen de Re e enz 79, die Da en de Va ian e d G3P* IIHY 6 wu den Re e enz 80
en nommen. Die Übe gänge on 4 µM P o ein (1 µM bei 210 nm) wu den in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi eine
Schich dicke on 1 cm, eine Heiz a e on 60 °C h-1 und eine Dämp ung on 8 s gemessen.
Wäh end de Dena u ie ung de N2-Domäne des Wild yp-P o eins sind die En al ung de
Gelenk egion und die Dissozia ion de Domänen N1 und N2 mi einande gekoppel . Die
S abili ä on N2 is demen sp echend ein Maß ü die S ä ke de Domänenassozia ion. In de
Va ian e d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY sind güns ige In e ak ionen zwischen den Domänen nu
schwach ausgebilde . Zwa lieg de Übe gangsmi elpunk mi 46,3 °C deu lich übe denen
de isolie en N2 Q129H (38,8 °C) bzw. N2 aus de Dele ions a ian e d G3P* IIHY
6
(36,7 °C), die En halpie de En al ung be inde sich jedoch mi 341 kJ mol-1 im gleichen
Be eich (Tabelle 3.4.1). Die ela i zu isolie e N2-Domäne e höh e S abili ä de Chimä e is
olglich nich au die e s ä k e Wechselwi kung zwischen den Domänen zu ückzu üh en. Im
Gegensa z zu d G3P* IIHY
6 is in d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY mi dem
E gebnisse und Diskussion
124
6-Fal bla s ang auch de Aus ausch T101I en hal en. Im na i en G3P* üh diese in de
Gelenk egion lokalisie e Subs i u ion zu eine E höhung des TM-We es um meh als 8 °C
(Tabelle 3.4.1), wobei au g und des ge ingen Abs andes zu N1-Domäne on 4 Å e mu e
wu de, dass hyd ophobe Wechselwi kungen zu N1 da ü e an wo lich sind.121 Zwa wi d in
de Chimä e de gedock e Zus and nich eingenommen, es is jedoch möglich, dass du ch
In e ak ionen de Res e de lankie enden Gelenk egion die Enden des globulä en Teils on
N2 zusammengehal en und die Domäne dadu ch en opisch s abilisie wi d.
Zusä zlich wu de wiede um die S abili ä gegenübe dem Dena u ie ungsmi el GdmCl
un e such . Dabei zeig e sich, dass in d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY die Ände ung de
Fluo eszenz sowohl nach An egung bei 280 nm als auch 295 nm nich selek i ü die
En al ung de N2- bzw. N1-Domäne is , obwohl in diese Va ian e die gleiche Anzahl an
Fluo opho en en hal en is wie im d G3P* IIHY. De Ve lau des Signals bei 310 nm nach
An egung bei 280 nm konn e nich ausgewe e we den. Die Da en aus dem biphasischen
Übe gang bei 325 nm nach An egung bei 295 nm (Abbildung 10.1 im Anhang) sind in
Tabelle 3.4.2 au gelis e . Au g und de ge ingen S abili ä sun e schiede sind die beiden
Phasen nich seh gu oneinande ge enn . Da zusä zlich N2 im Ve gleich zu
Ausgangs a ian e deu lich des abilisie und dahe die Basislinie des na i en P o eins schlech
de inie is , sind die e hal enen Pa ame e s a k ehle beha e . Wie be ei s bei de
he mischen En al ung beobach e , is die N2-Domäne in de Chimä e o zdem leich
gegenübe de isolie en N2-Domäne s abilisie .
De [GdmCl]m-We on isolie e IF1-N1DDKTLD is ela i zu isolie en IF1-N1-Domäne
eben alls deu lich um 1,2 M GdmCl e inge (Tabelle 3.4.2). De Übe gangsmi elpunk de
N1-Domäne des d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY im Ve gleich dazu wiede um ge ing ügig zu
nied ige en Dena u ie ungsmi elkonzen a ionen e schoben, was sich mi den E gebnissen
de he mischen En al ung deck .
Tabelle 3.4.2: S abili ä sda en on IF1-N1DDKTLD und de Chimä e d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY aus GdmCl-
induzie e En al ung.
Domänendissozia ion und En al ung
de N2-Domäne En al ung de N1-Domäne
Va ian e [GdmCl]m
(M) m
(kJ mol-1 M-1)
G
(kJ mol-1)
[GdmCl]m
(M) m
(kJ mol-1 M-1) G
(kJ mol-1)
isolie e IF1-N1 - - - 3,6 7,8 29,0
isolie e IF1-N1DDKTLD - - - 2,4 6,5 15,0
d G3P* IF1-
N1DDKTLDIHY 0,9 23,0 19,8 2,2 6,1 13,6
isolie e N2 Q129H 0,7 15,9 10,9 - - -
d G3P* IIHY 2,5 14,9 37,2 3,2 8,9 28,6
Angegeben sind die Übe gangsmi elpunk e [GdmCl]m, die Koope a i i ä spa ame e m sowie die au
0 M GdmCl ex apolie en eien En halpien de En al ung G bei 25 °C. De Übe gang on N2 im d G3P*
bzw. isolie e N2 Q129H wu de anhand de Fluo eszenz bei 310 nm bzw. 340 nm (An egung 280 nm)
gemessen, de de N1-Domäne im d G3P* IIHY bei 360 nm (An egung 295 nm) e olg . De Ve lau de
En al ung de isolie en N1-Domänen des Phagen IF1 wu de bei 325 nm (An egung bei 280 nm) au genommen.
Fü beide Domänen e olg e die Analyse de Da en nach einem Zweizus andsmodell. Die GdmCl-induzie e
En al ung de Domänen de Chimä e wu de übe die Fluo eszenz bei 325 nm (An egung bei 295 nm) e olg .
De en sp echende Übe gang wu de gemäß eines D eizus andsmodells ausgewe e . Die Da en ü die isolie e
E gebnisse und Diskussion
125
IF1-N1-Domäne wu de Re e enz 91 und die Pa ame e ü d G3P* IIHY de Re e enz 121 en nommen. Die Da en
isolie e N2 Q129H sind eine pe sönliche Mi eilung on Roman Jakob.
Um zu un e suchen, wie sich de Aus ausch de Schlei e in IF1-N1 au die Fal ung des
P o eins auswi k , wu den die en sp echenden En - und Rück al ungskine iken gemessen
(Abbildung 3.4.2). Aus dem Ve lau de en sp echenden Ra en geh he o , dass sich de
Aus ausch de Schlei en egion au beide Geschwindigkei skons an en kEF und kRF ungüns ig
auswi k . Die En al ung on IF1-N1DDKTLD is gegenübe IF1-N1 ach ach beschleunig , die
Rück al ung dagegen 2,7 ach e langsam . Demnach wi d nich nu de en al e e Zus and
s abilisie sonde n gleichzei ig auch die ge al e e Fo m des abilisie . Zusammen mi den
un e ände en Koope a i i ä en (Tabelle 10.2 im Anhang) bes ä ig dies, dass in de ge al e en
IF1-N1-Domäne du ch die Subs i u ion de Schlei ensequenz lokal ungüns ige
Wechselwi kungen ausgebilde we den.
Abbildung 3.4.2: Che on-Au agung de Fal ungs- und En al ungs a en on IF1-N1 und IF1-N1DDKTLD.
Gezeig sind die appa en en Rück al ungs- (o ene Symbole) und En al ungs a en (geschlossene Symbole) on
isolie e IF1-N1 (;) und IF1-N1DDKTLD (;●) in Abhängigkei on de GdmCl-Konzen a ion. Die
du chgezogenen Linien ep äsen ie en den Angleich an die Da enpunk e gemäß eines Zweizus andsmodells. Die
da aus e hal enen he modynamischen Pa ame e sind im Anhang in Tabelle 10.2 au gelis e . Die
en sp echenden Kine iken wu den nach s opped- low-Mischung anhand de Ände ung de T p-Fluo eszenz
obe halb on 330 nm nach An egung bei 295 nm mi 1 µM P o ein e olg . Alle Messungen wu den in
0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 bei 25 °C du chge üh . Da en de isolie en IF1-N1-Domäne wu den de Re e enz 91
en nommen.
3.4.2 In de Chimä e d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY liegen die Domänen IF1-N1DDKTLD
und N2 in nich assoziie e Fo m o
Zu Analyse, wie s a k die Wechselwi kungen du ch den Aus ausch de modi izie en
N1-Domäne e inge sind, wu de de Fal ungsmechanismus de Va ian e
d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY un e such . Sowohl die Rück al ungs- als auch die
En al ungs a en on N1 de Chimä e (;, Abbildung 3.4.3) sind iden isch zu denen de
ko espondie enden isolie en N1-Domäne (;, Abbildung 3.4.3, Tabelle 10.2 im Anhang).
Im Gegensa z zu s abilisie en Ausgangs a ian e d G3P* IIHY is demnach die En al ung
on N1 deu lich beschleunig . Die Rück al ung de N2-Domäne de Chimä e in die -
Fo m is ge ing ügig gegenübe de de isolie en N2-Domäne e langsam
(;, Abbildung 3.4.3). Die N2-Domäne wi d olglich nu leich du ch das Zusammenhal en
[GdmCl] (M)
0123456
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10
E gebnisse und Diskussion
126
de Enden s abilisie und nich wie im d G3P* IIHY du ch die Einnahme des lose-
assoziie en Zus andes (;, Abbildung 3.4.3). Die In e ak ionen zwischen den Domänen
wäh end de Fal ung sind olglich nu seh schwach ausgep äg .
Abbildung 3.4.3: Analyse de Fal ungs- und En al ungs a en de Chimä e d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY.
Au agung de appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en (o ene Symbole) on
d G3P* IIHY (g aue Symbole) und d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY ( a bige Symbole) in Abhängigkei on de
GdmCl-Konzen a ion. Die langsamen En al ungs- () und Rück al ungs a en () de N2-Domäne de Chimä e
wu den nach manuelle Mischung gemessen. Gezeig sind auße dem die schnellen Rück- und En al ungs a en
de N1-Domäne in de Chimä e (;), die en sp echenden Ra en de isolie en IF1-N1DDKTLD (;) und die
kon o ma ionelle Fal ung de jeweiligen -Spezies (;), ausgehend on en al e em P o ein. Die
En al ung de -Spezies aus dem nich assoziie en Zus and () konn e be ei s in Einzelmischexpe imen en
nach schnelle Mischung de ek ie we den. Die en sp echenden Ra en wu den zusä zlich auch An egung bei
295 nm anhand de Ände ung de Fluo eszenz obe halb on 340 nm e hal en (). Die En al ung de N2-
Domäne aus dem lose-assoziie en Zus and des d G3P* IIHY wu de ausgehend on olls ändig en al e em
P o ein nach Rück al ung ü 180 s () in 0,5 M GdmCl und Sp ung in En al ungsbedingungen gemessen. Die
En al ungs- (●) und Rück al ungs a en () des d G3P* IIHY nach manuelle Mischung gemessen. Zu
Ve gleichszwecken au ge agen sind auße dem die En al ungs a en de N1-Domäne im ungedock en
d G3P* IIHY (), de en Rück al ung aus dem en al e en Zus and () und die En - und Rück al ungs a en de
isolie en N2-Domäne Q129H (;).Die Reak ionen de N1-Domänen nach schnelle Mischung wu den anhand
de T p-Fluo eszenz obe halb on 340 nm nach An egung bei 295 nm e olg , die de N2-Domänen obe halb
on 320 nm nach An egung bei 280 nm. Die Fal ungs a en de N2-Domänen nach manuelle Mischung wu den
übe die Messung de Fluo eszenz bei 310 nm e hal en. Die Da en on d G3P* IIHY wu den de Publika ion 122
en nommen. Die Messungen wu den in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi 0,5 bzw. 1 µM P o ein bei 25 °C
du chge üh .
Nach manuelle Mischung is lediglich eine Rück al ungs eak ion de ek ie ba , de en Ra e
unabhängig on de GdmCl-Konzen a ion is (, Abbildung 3.4.3). Mi eine Zei kons an e
on 37 s (in 0,6 M GdmCl) lieg sie im Be eich de Isome isie ung on P o161
(Abbildung 3.1.6, Kapi el 3.1.3). Wäh end de En al ung kann nach manuelle Mischung
eben alls nu eine Reak ion de ek ie we den, de en Zei kons an e bei e wa 40 s lieg
(, Abbildung 3.4.3). Dem Ve lau nach gehen die Ra en de Phase in die langsame, on
P o161 limi ie e Rück al ungs eak ion übe . Obe halb on 2,0 M GdmCl e lie die
En al ungs eak ion ih e Ampli ude. Ab diese GdmCl-Konzen a ion inde demnach die
kon o ma ionelle En al ung de N2-Domäne olls ändig in de To zei de manuellen
Mischung s a .
[GdmCl] (M)
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10
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10
E gebnisse und Diskussion
127
Nach s opped- low-Mischung e geben sich un e halb on 3,0 M GdmCl biexponen ielle
Kine iken, de en schnelle Reak ion die En al ung de N1-Domäne wide spiegel
(, Abbildung 3.4.3). De Ve lau de esul ie enden Ra en s imm , wie schon e wähn , mi
dem de isolie en IF1-N1DDTKLD übe ein (, Abbildung 3.4.3). Die langsame Phase e lek ie
die En al ung de N2-Domäne. Sie wi d sowohl nach An egung bei 280 nm als auch bei
295 nm beobach e (;, Abbildung 3.4.3). Eine Kopplung zwischen den Domänen, die z.B.
du ch die Dena u ie ung de N1-Domäne e langsam wi d, is demnach nich beobach ba .
T o z de s abilisie enden Subs i u ionen T101I und D209Y in de Gelenk egion gehen die
beiden Domänen de Chimä e wäh end de Fal ung wede in den gedock en noch in den lose-
assoziie en Zus and übe . N1 und N2 liegen ielmeh in eine nich assoziie en Fo m o ,
die dem langlebigen Fal ungsin e media des Wild yp-P o eins en sp ich . Die Ve mu ung
lieg dahe nahe, dass sich IF1-N1DDKTLD in de Chimä e au g und lokale Sequenzun e schiede
nich in de Weise ano dnen kann wie die d-N1-Domäne und dadu ch die Einnahme de
gedock en Fo m nich möglich is .
In G3P des d Phagen wi d de assoziie e Zus and mi cis-P o213 du ch die Ausbildung
eines Wasse s o b ückenne zwe kes zwischen Res en de Gelenk egion und dem un e en Teil
de N1-Domäne s a k s abilisie .62 Da an be eilig is , wie be ei s e wähn , un e ande em
Gln52 in de N1-Domäne, das zu Gln212 zwei Wasse s o b ücken ausbilde .120 In de
S uk u de isolie en IF1-N1-Domäne be inde sich an diese Posi ion ein Se in es , de
olglich die Wechselwi kungen nich im gleichen Maße au ech e hal en kann. Deswei e en
äg Se in es 16 zu S abilisie ung de assoziie en Fo m des d G3P* bei. De Res bilde
übe sein Ca bonylsaue s o a om mi Val215 und seine Hyd oxylg uppe mi P o211 jeweils
eine Wasse s o b ücke aus. In IF1-N1 is an de en sp echenden Posi ion ein Th eonin es
lokalisie , de sich e en uell au g und de zusä zlichen Me hylg uppe nich op imal
posi ionie en kann. T o z de gu en Übe eins immung des P o ein ückg a es de S uk u en
de beiden N1-Domänen gib es demnach lokale Un e schiede, die e mu lich eine g oße
Auswi kung au die S abili ä des gedock en Zus andes haben. Diese E ek wi d
wah scheinlich noch e s ä k du ch die Anhäu ung on P olin es en in de Gelenk egion
(P o211, P o213, P o214, P o96, P o98), die die Flexibili ä de Gelenk egion he abse zen,
weshalb al e na i e In e ak ionspa ne in de N1-Domäne wenige gu ole ie we den.
Im Folgenden s ell e sich die F age, ob zumindes die In e ak ion de e länge en
Schlei e 1 de N1-Domäne de Chimä e zu S abilisie ung de N2-Domäne bei äg . Anhand
de Va ian e d G3P* EGDS konn e gezeig we den, dass die In e ak ion mi de
Schlei en egion wich ig is ü S abilisie ung des ans-Kon o me s on N2, das dadu ch mi
de gleichen Geschwindigkei en al e wie die cis-Fo m (Kapi el 3.3.2). Um zu un e suchen,
ob sich die En al ungsäs e de cis- und ans-Spezies de N2-Domäne de Chimä e
un e scheiden, wu de die En al ung de Domäne mi ans-P o161 nach ku ze Rück al ung
ü 1 s in 0,35 M GdmCl e olg (, Abbildung 3.4.4).
E gebnisse und Diskussion
128
Abbildung 3.4.4: Fal ungs- und En al ungs a en des d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY nach schnelle Mischung.
Au agung de appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en (o ene Symbole) de
Domänen des d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY in Abhängigkei on de GdmCl-Konzen a ion. Gezeig sind die
schnellen Rück- und En al ungs a en de N1-Domäne in de Chimä e (;) und die kon o ma ionelle Fal ung
de -Spezies () ausgehend on en al e em P o ein. Die En al ung de N2-Domäne aus dem na i en
Zus and () wu de in Einzelmischexpe imen en nach schnelle Mischung de ek ie . Die Dena u ie ung de
-Fo m de Chimä e wu den nach Rück al ung ü 1 s in 0,35 M GdmCl und e neu e Übe üh ung in
En al ungsbedingungen beobach e (). Zu Ve gleichszwecken au ge agen sind auße dem die En - und
Rück al ungs a en de isolie en N2-Domäne Q129H (;). Die Reak ionen de N1-Domäne nach schnelle
Mischung wu den anhand de T p-Fluo eszenz obe halb on 340 nm nach An egung bei 295 nm e olg , die de
N2-Domäne obe halb on 320 nm nach An egung bei 280 nm. Die Messungen wu den in 0,1 M KP-Pu e ,
pH 7,0 mi 0,5 bzw. 1 µM P o ein bei 25 °C du chge üh .
Ta sächlich is die Geschwindigkei de En al ung de -Fo m (, Abbildung 3.4.4)
gegenübe dem En al ungsas de N2-Domäne ausgehend on na i em
d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY leich beschleunig (, Abbildung 3.4.4). Dies zeig , dass analog
zu Va ian e d G3P* EGDS wäh end de Fal ung des globulä en Teils on N2 keine
güns igen Wechselwi kungen zu de e länge en Schlei en egion in de N1-Domäne
ausgebilde we den. De Aus ausch de Schlei e und die Anwesenhei de Gelenk egion
eichen demnach nich aus, dami IF1-N1 und die N2-Domäne des d G3P mi einande
assoziie en können.
3.4.3 Du ch die Gegenwa de N2-Domäne wi d die A ini ä de IF1-N1-Domäne in
de Chimä e ü TolAC-AEDANS nich beein luss
Du ch die Subs i u ion de N1-Domäne kann wede de gedock e noch de lose-assoziie e
Zus and eingenommen we den. In diesem Fall soll e die A ini ä de N1-Domäne de
Chimä e ela i zu isolie en Fo m un e ände sein. Ta sächlich is de KD-We on
d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY mi 4,7 µM nu unwesen lich gegenübe IF1-N1DDKTLD
(KD = 3,7 µM) e höh (Tabelle 3.4.3). De Un e schied äll bei den übe die Au agung de
Ra en e hal enen Dissozia ionskons an en g öße aus (6,5 µM und 4,4 µM), was au die
ge ing ügig e inge e Assozia ions a e und dami e mu lich e was schlech e e
Zugänglichkei on N1 in de Chimä e zu ückge üh we den kann.
[GdmCl] (M)
01234
(s
-1
)
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E gebnisse und Diskussion
129
De Komplex aus d N1 bzw. IF1-N1 und TolAC wi d un e ande em du ch d ei
Salzb ücken s abilisie . Zwei de d ei wechselwi kenden Res e on TolAC, A g158 und
Asp210, besi zen mi A g29 ( d-N1) bzw. A g27 (IF1-N1) und Glu50 bzw. Asp48 homologe
In e ak ionspa ne au N1 (Abbildung 3.4.5). Die Salzb ücke ausgehend on Lys212 wi d
dagegen, wie be ei s e wähn , in IF1-N1 zu Glu37 ausgebilde , wäh end in de N1-Domäne
des d Phagen mi Asp28 de le z e Res de Schlei en egion an de In e ak ion be eilig is .91
Tabelle 3.4.3: Pa ame e de In e ak ion on TolAC-AEDANS mi e schiedenen IF1-G3P*-Va ian en.
Va ian e [NaCl]
(M)
kon
(µM-1s-1)
ko
(s-1)
ko /kon
(µM)
KD
(µM)
Isolie e IF1-N1 0 0,24 ± 0,01 1,06 ± 0,01 4,4 3,3 ± 0,1
1 0,22 ± 0,01 1,23 ± 0,02 5,6 4,5 ± 0,1
Isolie e IF1-N1 E37N 0 0,23 ± 0,01 1,91 ± 0,01 8,4 7,2 ± 0,7
Isolie e IF1-N1DDKTLD E37N 0 0,32 ± 0,01 1,96 ± 0,02 6,3 5,3 ± 0,2
Isolie e IF1-N1DDKTLD 0 0,4 ± 0,01 1,74 ± 0,01 4,4 3,7 ± 0,1
0,5 0,37 ± 0,01 1,71 ± 0,01 4,6 3,0 ± 0,3
1 0,39 ± 0,01 1,55 ± 0,01 4,0 3,6 ± 0,2
d G3P* IF1-N1DDKTLD IHY 0 0,26 ± 0,01 1,68 ± 0,04 6,5 4,7 ± 0,2
0,5 0,15 ± 0,01 1,57 ± 0,01 10,5 7,7 ± 0,3
1 0,11 ± 0,01 1,44 ± 0,01 13,1 11,4 ± 0,2
Angegeben sind die aus de Analyse de Ampli uden mi els Gleichung 43 e hal enen KD-We e sowie die
mik oskopischen Ra en ko und kon aus de Auswe ung de appa en en Assozia ions a en. De en Quo ien e gib
eben alls die Dissozia ionskons an e des Komplexes aus de jeweiligen N1-Domäne und 0,2 µM TolAC-
AEDANS. Die Da en on IF1-N1 in Abwesenhei bzw. in 1 M NaCl wu den de Mas e a bei on S e anie
Ho mann en nommen.169 Die Messungen e olg en in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 und den angegebenen
Salzkonzen a ionen bei 25 °C.
Abbildung 3.4.5: Übe lage ung de S uk u en de Komplexe aus IF1-N1 und TolAC bzw. d-N1 und TolAC.
Gezeig sind die S uk u en on TolAC (g ün) im Komplex mi d-N1 ( o , PDB-Ein ag 1TOL81) und TolAC im
Komplex mi IF1-N1 ( iole bzw. g au; PDB-Ein ag 2X9A91). Als S äbchen-Modelle da ges ell sind die in de
d-N1-Domäne en hal enen Res e Asp28, A g29 und Leu27, die Res e A g27, Glu37 und Asp48 de IF1-N1-
Domäne sowie die Res e A g158, Asp210 und Lys212 on TolAC. Die die Res e 23 bis 26 bzw. 28 um assende
homologe Schlei ens uk u is in de linken Abbildung hellblau (IF1-N1) bzw. o ange ( d G3P*) einge ä b . Die
Abbildung wu de mi dem P og amm Pymol63 e s ell .
Lys212
Glu37
Asp28
Asp210
A g29/A g27
Glu50/Asp48
A g158
E gebnisse und Diskussion
130
Du ch die Subs i u ion de Schlei ensequenz en häl IF1-N1DDKTLD mi Asp28 neben Glu37
einen zusä zlichen po enziellen In e ak ionspa ne ü Lys212 im TolAC, o zdem is die
A ini ä diese Va ian e ü TolAC im Ve gleich zu IF1-N1 nich e besse (Tabelle 3.4.3).
Un e schiede e geben sich alle dings bei den We en ü kon und ko , die ü IF1-N1DDKTLD
jeweils leich e höh sind. Demnach wi d de Komplex zwa schnelle gebilde , is jedoch
gleichzei ig wenige s abil.
De Aus ausch des Glu37 gegen Glu amin in de isolie en IF1-N1 üh zu eine
zwei achen E höhung des KD-We es, was haup sächlich in de Beschleunigung de
Dissozia ion beg ünde lieg (Tabelle 3.4.3). Diese E ek kann jedoch zumindes eilweise
du ch die wei e e Subs i u ion de Schlei en egion kompensie we den. Im Ve gleich zu
isolie e IF1-N1 E37N (KD = 7,2 µM) is die Dissozia ionskons an e de Va ian e
IF1-N1DDTKLD E37N nu leich au 5,3 µM e inge (Tabelle 3.4.3). Glu37 ha olglich
keinen g oßen Ein luss au die A ini ä de N1-Domäne ü TolAC.
Wie zusä zlich die Analyse de Bindungsa ini ä eine TolAC-Va ian e, in de un e
ande em Lys212 gegen Aspa a ausge ausch wu de, gegenübe d-N1 bzw. IF1-N1 gezeig
ha , schein de Ein luss de einzelnen Salzb ücken au die S abili ä des Komplexes ela i
ge ing zu sein. In beiden Fällen wa en die KD-We e zwa e höh , lagen jedoch jeweils in de
gleichen G ößeno dnung (Da en nich gezeig ). G und da ü is e mu lich das zusä zlich übe
Wasse s o b ücken zusammengehal ene, in e molekula e -Fal bla zwischen den
In e ak ionspa ne n, welches du ch hyd ophobe Wechselwi kungen s abilisie wi d
(Abbildung 3.4.5). Folglich ha auch die E höhung de Salzkonzen a ion bis au 1 M NaCl
kaum eine Auswi kung au die A ini ä de isolie en IF1-N1DDTKLD bzw. IF1-N1 ü TolAC
(Tabelle 3.4.3).
In e essan e weise nimm dagegen in 1 M NaCl die Dissozia ionskons an e de Chimä e
deu lich on 3,6 au meh als 11 µM zu, was ausschließlich an de deu lich schlech e en
Assozia ions a e lieg (Tabelle 3.4.3). Mögliche weise is die Bindungs ähigkei he abgese z ,
da die In e ak ionen zwischen den Domänen de Chimä e in 1 M Salz e besse sind und das
P o ein dadu ch s ä ke geschlossen o lieg . In diesem Fall müss e sich die Ve besse ung de
Wechselwi kungen zwischen IF1-N1DDKTLD und N2 auch in ih em TM-We und o allem de
En halpie beme kba machen. Ta sächlich e gib sich mi s eigende NaCl-Konzen a ion eine
Zunahme des H-We es, alle dings is diese Salzabhängigkei auch ü die isolie e
N2 Q129H beobach ba (Tabelle 3.4.4). Wäh end in 1 M NaCl de Übe gangsmi elpunk
dieses P o eins ge ing ügig zu höhe en We en e schoben is , sind die TM-We e beide
Domänen im d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY soga leich e inge , was gegen eine s ä ke e
Assemblie ung de Domänen in diesem Kons uk sp ich .
E gebnisse und Diskussion
131
Tabelle 3.4.4: The mische S abili ä sda en de isolie en N2-Domäne Q129H bzw. N1 und N2 in de Chimä e.
Domänendissozia ion und
En al
ung de N2-Domäne En al ung de N1-Domäne
Va ian e [NaCl]
(M) TM
(°C)
H
(kJ mol-1) G45°C
(kJ mol-1)
TM
(°C) H
(kJ mol-1) G55°C
(kJ mol-1)
isolie e N2 Q129H 0 38,8 344 -7,4 - - -
0,5 38,0 346 -8,7 - - -
1 39,6 392 -7,2 - - -
d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY 0 46,3 341 1,4 52,7 222 -1,6
0,5 43,2 345 -2,0 51,0 193 -2,4
1 44,8 391 -0,2 50,5 192 -2,7
Angegeben sind ü die beiden P o eine die Schmelz empe a u en TM, die En halpien de jeweiligen
En al ungs eak ion am TM (H) und die eien En halpien de En al ung G45°C und G55°C bei 45 °C bzw.
55 °C. Die Übe gänge de N2-Domänen, welche übe die Ände ung des CD-Signals bei 210 nm e olg
wu den, wu den gemäß eines Zweizus andsmodells analysie . De Ve lau de En al ung de N1-Domäne
wu de anhand de Ände ung des CD-Signals bei 230 nm e olg und eben alls anhand eines
Zweizus andsmodells analysie . Zu Auswe ung de En al ungsübe gänge wu de ü N2 in de Chimä e
d G3P* IF1-N1DDKTLDIHY eine kons an e Ände ung de Wä mekapazi ä Cp on 10000 J mol-1 K-1 ü N2 und
ü N1 1000 J mol-1 K-1 angenommen, ü die isolie e N2-Domäne Q129H wu de ein Cp-We on
8000 J mol-1 K-1 e wende . Die Da en on isolie e N2 Q129H in Abwesenhei on NaCl wu den de Re e enz
151 en nommen. Die Messungen e olg en in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi eine Schich dicke on 1 cm und eine
Heiz a e on 60 °C h-1.
Da das Dena u ie ungsmi el GdmCl ein Salz is , inden die En - und Rück al ung on
P o einen in GdmCl imme un e Hochsalzbedingungen s a . Um zu übe p ü en, ob die
Ionenkonzen a ion einen Ein luss au den Fal ungsmechanismus de Chimä e ha , wu den
dahe de en En - und Rück al ungskine iken zusä zlich im unpola en Dena u ie ungsmi el
Ha ns o bei 15 °C un e such . Un e diesen Bedingungen e geben sich sowohl nach
An egung bei 280 als auch bei 295 nm monophasische Gleichgewich sübe gänge, die die
Dena u ie ung de N2-Domäne e lek ie en. Die N1-Domäne lieg o z ih e nu ge ing ügig
höhe en S abili ä pe manen in ge al e e Fo m o . Wie auch schon bei de En al ung du ch
GdmCl beobach e , is de Übe gangsmi elpunk de N2-Domäne des d G3P* IF1-
N1DDKTLDIHY mi 4,1 M Ha ns o deu lich gegenübe isolie e N2-Domäne Q129H e höh
([Ha ns o ]m = 2,6 M; Tabelle 10.3 im Anhang).
Die Kombina ion aus e inge e Mess empe a u und dem im Ve gleich zu GdmCl
schwäche en Dena u ie ungsmi el Ha ns o mach es möglich, die Fal ungskine iken de
N2-Domäne selek i zu messen und so sowohl den Che on de cis-P o161-Spezies als auch
den de labile en ans-Fo m de N2-Domäne Q129H au zulösen (Abbildung 3.4.6). Wie
be ei s e wähn un e scheiden sich bei de isolie en N2-Domäne die beiden Kon o me e mi
cis- bzw. ans-P o161 lediglich in ih e Rück al ungsgeschwindigkei , ih e En al ungs a en
olgen dagegen dem gleichen Che onas .
E gebnisse und Diskussion
138
Die S abili ä en de Dele ions a ian en sind jedoch ähnlich hoch, dahe is anzunehmen, dass
de g öße e Teil die gedock e Kon o ma ion einnimm .
Abbildung 3.5.2: Che on-Au agung de En al ungs- und Rück al ungs a en de Dele ions a ian en.
Au ge agen sind die appa en en En al ungs- (ge üll e Symbole) und Rück al ungs a en (o ene Symbole) on
a) d G3P* GG und b) d G3P* GSEG in Abhängigkei on de GdmCl-Konzen a ion. In o sind die
Reak ionen de N1-Domäne da ges ell , welche obe halb on 340 nm anhand de T p-Fluo eszenz nach
An egung bei 295 nm gemessen wu den. Nach An egung bei 280 nm wu den die Fal ungs a en de N2-Domäne
(blaue Symbole) in Handmischexpe imen en übe die Messung de Fluo eszenz bei 310 nm und nach schnelle
Mischung übe die Ve olgung de Fluo eszenz obe halb on 320 nm e hal en. Die Rück al ung de N1-Domäne
(), die En al ung des na i en P o eins obe halb on 2,3 M GdmCl (;) und de N2-Domäne im nich
assoziie en Zus and () wu den nach schnelle Mischung an eine s opped- low-Appa a u gemessen. Die
schnelle e () und langsams e () Rück al ungs eak ion on N2 und die zwei bzw. d ei En al ungs eak ionen
de N2-Domäne aus dem na i en Zus and (;●;●) wu den nach manuelle Mischung au genommen. In g au
sind jeweils zum Ve gleich analogen die Da en des WT d G3P* au ge agen. Die en sp echenden Ra en wu den
de Abbildung 3.1.6 (Kapi el 3.1.3) en nommen. Gezeig sind dabei die aus Doppelsp ungexpe imen en
e hal enen Ra en de du ch die Isome isie ung on P o161 limi ie en En al ung on N2 (), die Rück al ung
de ungedock en N2-Domäne () sowie die En al ung de N1-Domäne im nich assoziie en Zus and (). Alle
Messungen wu den bei 25 °C in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 mi 1 µM P o ein du chge üh .
Im Gegensa z zu ku zen Dele ions a ian e lieg na i es d G3P* GSEG wie die
Ausgangs a ian e as ausschließlich im assoziie en Zus and o . Die En al ungs- und
a)
[GdmCl] (M)
0123456
(s
-1
)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
3
10
[GdmCl] (M)
0123456
(s-1)
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
1
10
2
10
3
10
b)
E gebnisse und Diskussion
139
Rück al ungs a en en sp echen denen on WT d G3P* und es sind wede in den Handmisch-
noch in den s opped- low-Mischexpe imen en zusä zliche Phasen de ek ie ba
(Abbildung 3.5.2b). De einzige Un e schied e gib sich ü die Ra en de En al ung aus dem
gedock en Zus and obe halb on 3 M GdmCl, die ela i zum WT d G3P* ge ing ügig
e langsam sind (;, Abbildung 3.5.2b). Die Abweichung i e s un e
Dena u ie ungsbedingungen au , bei denen die En al ung on de Dena u ie ung de N1-
Domäne abhäng . Die Rück al ung de N1-Domäne is wie in d G3P* GG du ch die Dele ion
des Linke s nich beein luss .
T o z de Ta sache, dass sich die Länge de Linke be eiche in den Dele ions a ian en um
lediglich zwei AS un e scheide , is nu in d G3P* GG de geö ne e Zus and signi ikan
populie . Es is dahe unwah scheinlich, dass de dis ale Glycin-Se in- eiche Linke im
WT d G3P* di ek an de Ve mi lung on s abilisie enden Wechselwi kungen zwischen den
beiden N- e minalen Domänen be eilig is , denn sons wä e ein ähnlich des abilisie ende
E ek auch ü d G3P* GSEG beobach e wo den.
De Fal ungsmechanismus de Popula ion an assoziie en Molekülen in de ku zen
Dele ions a ian e is im Ve gleich zu WT d G3P* un e ände . Denkba is dahe , dass die
e knüp ende Linke sequenz in d G3P* GG aus eich , um den Abs and zwischen N1 und
dem e s en Fal bla de Gelenk egion im olls ändig ge al e en P o ein zu übe b ücken.
Dami jedoch de gedock e Zus and übe haup eingenommen we den kann, sind neben de
Isome isie ung on P o213 zusä zlich s uk u elle Umlage ungen de AS de Gelenk egion
no wendig, die un e ande em zu Ausbildung de beiden -Fal blä e üh en (Kapi el 3.2).
Die zu s a ke Ve kü zung des Linke be eiches e hinde also e mu lich eine op imale
O ien ie ung de Res e, wodu ch die au g und de no wendigen P olylisome isie ung ohnehin
hohe Ene gieba ie e noch e g öße und das Gleichgewich leich in Rich ung de nich
assoziie en Spezies e schoben wi d.
3.5.2 Die A ini ä de N1-Domäne ü TolAC is unabhängig on de Länge des
dis alen Linke s des G3P*
Die S abili ä und de Fal ungsmechanismus des gedock en d G3P* sind du ch die Dele ion
des dis alen Linke s nu ge ing ügig bzw. ga nich beein luss . Es s ell sich dahe die F age,
ob diese Be eich e en uell eine Rolle ü die In e ak ion on N1 mi dem Rezep o TolAC
spiel . Denkba is , dass du ch seine Länge und Flexibili ä de Abs and de N1-Domäne zu
N2 und de Gelenk egion e g öße und somi die Bindungs läche besse exponie wi d. Im
nächs en Sch i soll e dahe un e such we den, wie sich die Ve kü zung des e s en
Linke be eiches au die A ini ä des G3P* ü TolAC auswi k . Dazu wu den, wie in
Kapi el 3.2.1 gezeig , die Kine iken de Bindung on TolAC-AEDANS an d G3P* GG bzw.
d G3P* GSEG in Abhängigkei on de en Konzen a ion gemessen. Anhand de Zunahme
de Ampli uden und de appa en en Ra en (kapp) konn en die Dissozia ionskons an en
bes imm we den (Abbildung 3.5.3, Tabelle 3.5.3).
E gebnisse und Diskussion
140
Abbildung 3.5.3: Bindung de G3P*-Dele ions a ian en an den Rezep o TolAC-AEDANS.
a) Abhängigkei de no mie en Fluo eszenzampli uden aus den Assozia ionskine iken on de Konzen a ion an
isolie e N1 (●), WT d G3P* (●), d G3P* GG (●) bzw. d G3P* GSEG (●). Die Linien s ellen den Angleich
an die Da en gemäß Gleichung 43 da . b) Au agung de appa en en Assozia ions a en de Bindung on
a iie enden Konzen a ionen isolie e N1 (●), WT d G3P* (●), d G3P* GG (●) bzw. d G3P* GSEG (●) an
0,2 µM TolAC-AEDANS. Die Ra en und Ampli uden wu den aus dem Angleich monoexponen ielle
Funk ionen an die Assozia ionskine iken e hal en. Du ch linea e Reg ession (du chgezogene Linien) e gab sich
aus dem Schni punk mi de y-Achse die mik oskopische Ra e de Dissozia ion ko , aus de S eigung die
mik oskopische Ra e de Assozia ion kon. Die Dissozia ionskons an e KD wu de aus den Quo ien en de beiden
be echne . Die Assozia ionskine iken wu den nach An egung bei 280 nm anhand de Ände ung de AEDANS-
Fluo eszenz obe halb on 460 nm in s opped- low-Mischexpe imen en e olg . Alle Messungen wu den bei
25 °C in 0,1 M KP-Pu e , pH 7,0 du chge üh . Die e hal enen KD-We e und mik oskopischen Ra en sind in
Tabelle 3.5.3 au gelis e .
Tabelle 3.5.3: Bindungspa ame e de In e ak ion on TolAC-AEDANS mi den G3P*-Dele ions a ian en.
Va ian e kon (µM-1s-1) ko
(s-1)ko /kon (µM) KD (µM)
Isolie e N1 0,97 ± 0,01 0,25 ± 0,01 0,26 0,28 ± 0,02
WT d G3P* n.d. n.d. n.d. 82 ± 30
d G3P* GG 0,014 ± 0,001 0,453 ± 0,002 32 13 ± 2
d G3P* GSEG n.d. n.d. n.d. 59 ± 10
Angegeben is de aus de Analyse de Ampli uden e hal ene KD-We sowie die mik oskopischen Ra e ko und
kon aus de Auswe ung de appa en en Assozia ions a en. De en Quo ien e gib eben alls die
Dissozia ionskons an e des Komplexes aus dem jeweiligen G3P* und 0,2 µM TolAC-AEDANS. (n. d.: keine
Auswe ung möglich). Die Messungen e olg en un e den in Abbildung 3.5.3 besch iebenen Bedingungen.
Im na i en, gedock en Zus and des G3P is die Bindungss elle ü TolAC g öß en eils in
de In e ak ions läche zwischen N1 und N2 e bo gen. E s nach Dissozia ion de beiden
Domänen wi d die Bindungss elle zugänglich. Volls ändig ge al e es WT d G3P* ha dahe
z.B. im Ve gleich zu isolie e N1 eine seh ge inge A ini ä gegenübe TolAC-AEDANS.
De aus de Auswe ung de Ampli uden e hal ene K
D-We de länge en de beiden
Dele ions a ian en, d G3P* GSEG, is mi 59 µM e gleichba hoch. Eine e lässliche
Auswe ung de appa en en Ra en wa hie , wie auch schon beim WT d G3P*, nich möglich
(Abbildung 3.5.3, Tabelle 3.5.3). Zwischen den beiden Va ian en exis ie en also wede
signi ikan e Un e schiede in de he modynamischen S abili ä noch im Fal ungsmechanismus
und d G3P* GSEG lieg wie das Wild yp-P o ein eben alls as olls ändig im gedock en
a)
[P o ein] (µM)
0481216
k
app
(s
-1
)
0
1
2
3
4
5
6
b)
[P o ein] (µM)
0481216
ela i e Ampli ude
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
E gebnisse und Diskussion
141
Zus and o . In diesem ha die Ve kü zung des dis alen Linke s au die Sequenz GSEG
demnach keinen E ek au die Wechselwi kung mi TolAC.
Die A ini ä on d G3P* GG gegenübe TolAC-AEDANS is im Ve gleich zu isolie en
N1-Domäne o allem au g und de deu lich ge inge en Assozia ions a e noch imme seh
ge ing. Rela i zu WT d G3P* bzw. d G3P* GSEG is jedoch de KD zumindes nach de
Analyse des Ampli uden e lau es signi ikan e inge . Aus dem Quo ien en de
mik oskopischen Ra en ko und kon e gib sich ein höhe e KD-We , de jedoch auch un e
denen de ande en beiden G3P*-Va ian en lieg . Ve an wo lich da ü is wah scheinlich die
im Ve gleich zu den ande en P o einen e höh e Popula ion an nich assoziie en Molekülen, in
denen die In e ak ions läche au N1 ü TolAC-AEDANS besse zugänglich is . De An eil an
ungedock em d G3P* GG lieg danach bei maximal 10 %, wie de Ve gleich mi de
Dissozia ionskons an e des langlebigen, nich assoziie en In e media es des WT d G3P*
zeig (KD = 1,54 µM in zusä zlich 0,1 M GdmCl; Kapi el 3.2.1).
Um die Bindungs ähigkei de Dele ions a ian en im ungedock en Zus and zu un e suchen,
wu de, wie un e Kapi el 3.1.7 besch ieben, ih e Rück al ung in Gegenwa on TolAC-
AEDANS anhand de Ände ung de Akzep o luo eszenz de ek ie . Bei allen d ei Va ian en
e olg die F eise zung on TolAC-AEDANS aus dem Komplex mi N1 übe eine
biexponen ielle Reak ion, de en Ra en die Fal ung de N2-Domäne und die es e
Domänenassozia ion du ch die Isome isie ung on P o161 bzw. P o213 in die cis-
Kon o ma ion wide spiegeln (Abbildung 3.5.4, Tabelle 3.5.4).
Abbildung 3.5.4: Ve d ängung on TolAC aus dem Komplex mi N1 du ch Fal ung des jeweiligen G3P*.
Gezeig sind die um den Pu e we ko igie en Kine iken de F eise zung on TolAC-AEDANS bei de
Rück al ung on (●) WT d G3P*, (●) d G3P* GG bzw. (●) d G3P* GSEG. Die Reak ionen wu de nach
zehn ache Ve dünnung des jeweiligen dena u ie en P o eins (10 µM in 5 M GdmCl) in Gegenwa on
1 µM TolAC-AEDANS anhand de AEDANS-Fluo eszenz bei 490 nm nach An egung bei 280 nm e olg . Die
Messungen wu den bei 25 °C in 0,1 M KP-Pu e , 0,5 M GdmCl, pH 7,0 mi eine Schich dicke on 1 cm
du chge üh . Die schwa zen Linien s ellen den Angleich biexponen ielle Funk ionen an die Da en da. Die
da aus e hal enen Ra en und Ampli uden sind in Tabelle 3.5.4 au gelis e .
(s)
0100200
ela i e Fluo eszenz
0
20
40
60
7500 15000 22500
E gebnisse und Diskussion
142
Tabelle 3.5.4: Ra en und Ampli uden de F eise zung on TolAC-AEDANS aus dem Komplex mi N1 du ch
Fal ung de e schiedenen G3P*-Dele ions a ian en.
Va ian e A1 A2Ages
1(s-
1
)2 (s-
1
)
WT d G3P* 23,9 37,4 61,3 82 5260
d G3P* GSEG 25,6 28,9 54,5 78 5435
d G3P* GG 18,9 27,7 46,5 84 4762
Au gelis e sind die Ra en und Ampli uden aus dem Angleich biexponen ielle Funk ionen an die Kine iken de
TolAC-AEDANS-Ve d ängung du ch die Fal ung de jeweiligen G3P*-Dele ions a ian e. Die Messungen
wu den un e den in Abbildung 3.5.6 besch iebenen Bedingungen du chge üh .
Die Zei kons an en de beiden Phasen s immen jeweils übe ein, was wiede um bes ä ig ,
dass die Linke egion keinen Ein luss au die Fal ungskine ik des Wild yp-G3P* ha . Die
An angswe e de Dele ions a ian en sind jedoch im Ve gleich zum WT d G3P* leich
he abgese z . Das bedeu e , dass die Zugänglichkei de Bindungs läche au de N1-Domäne
im geö ne en Zus and diese beiden P o eine schlech e is . Haup u sache da ü is
e mu lich die e inge e Flexibili ä de N1-Domäne im nich assoziie en Zus and, welche
beding wi d du ch die Ve kü zung des Linke s. Abweichungen e geben sich auße dem bei
den Ampli uden de Reak ionen. E wa ungsgemäß is die Gesam ampli ude de TolAC-
Ve d ängung du ch die Fal ung on d G3P* GG am kleins en, da hie ein Teil de Moleküle
nich in die assoziie e Fo m übe geh . De Fluo eszenzendwe diese Ve d ängungskine ik
lieg demen sp echend deu lich übe denen de ande en.
3.5.3 d Phagen mi e kü z em dis alem Linke haben bei de P opaga ion gegen-
übe dem Wild yp-Phagen keinen Nach eil
De Ve gleich de e kü z en P o eine mi WT d G3P* zeig , dass de dis ale Linke , wenn
übe haup , nu einen ge ingen Ein luss au die S abili ä und Fal ung des G3P* bzw. die
A ini ä de N1-Domäne gegenübe TolAC ha . Das leg die Ve mu ung nahe, dass diese
Be eich e en uell eine wich ige Funk ion wäh end eines de ande en Sch i e de
Phagenp opaga ion ha , denn das G3P is un e ande em auch an de Fe igs ellung de
Assemblie ung des Phagen be eilig .15-17
Zu Übe p ü ung wu den im Gen-3 des Wild yp-Phagen die en sp echenden Dele ionen
einge üg und die DNA in E. coli Zellen eingeb ach . Nach Inkuba ion de Zellen konn en aus
de en Kul u medium die en sp echenden Phagen d G3P GG bzw. d G3P GSEG isolie
we den. Die Assemblie ung und F eise zung de Phagen a ian en sind demnach du ch die
Ve kü zung des e s en Se in-Glycin- eichen Linke s nich beein luss .
Die isolie en Phagen wu den zunächs ü In ek ionsexpe imen e mi pilus eien
E. coli HB2156 Zellen e wende . Die In ek iosi ä de Phagen is hie lediglich abhängig on
de Popula ion de Phagen mi geö ne em G3P*, denn e s du ch die Dissozia ion de beiden
N- e minalen Domänen wi d die Bindungss elle au N1 ü den Rezep o TolAC zugänglich.
T o z de leich e höh en A ini ä des d G3P* GG gegenübe TolAC-AEDANS in i o
besi z de en sp echende Phage ela i zu den d WT Phagen und dem Phagen
d G3P* GSEG keine höhe e In ek iosi ä gegenübe den F--Zellen (Da en nich gezeig ). De
E gebnisse und Diskussion
143
An eil de Phagen mi nich assoziie em G3P is demnach zumindes ge inge als die
Au lösungsg enze des In ek ionsexpe imen es, das eine Genauigkei on 10 % ha .
Beim Ve gleich de In ek iosi ä en de Phagen a ian en gegenübe pilushal igen
E. coli Zellen wa eben alls kein Un e schied zum Wild yp-Phagen de ek ie ba (Da en nich
gezeig ). Das bedeu e zum einen, dass auch ü das Einb ingen de ssDNA des Phagen in die
Zelle nach de In e ak ion on N1 mi TolAC die Länge des e s en Linke s nich
ausschlaggebend is . Zum ande en inde sich kein Hinweis da au , dass die on Nilsson e al.
beobach e e In e ak ion des Se in-Glycin- eichen Be eiches mi dem Pilus170 einen
signi ikan en Ein luss au den In ek ionsmechanismus ha . Die Genauigkei des Ve gleiches
de In ek ion e schiedene pilushal ige E. coli Kul u en du ch die Phagen a ian en is
jedoch e häl nismäßig ge ing, da die Konzen a ion an F-Pili s a k on den
Wachs umsbedingungen de Zellen abhäng .
Wie be ei s e wähn wa es bis zum je zigen Zei punk nich möglich, die monome e
Einhei des Pilus, das F-Pilin, in s abile Fo m he zus ellen. Ob es zwischen dem F-Pilus und
dem dis alen Linke zu Wechselwi kungen komm , wodu ch die Bindungsa ini ä des G3P*
gegenübe dem Pilus zusä zlich e höh wi d, konn e deshalb in i o nich un e such we den.
Soll e jedoch de Wild yp-Phage du ch die e mein liche zwei e Bindungss elle bei de
In e ak ion mi dem Pilus einen Vo eil gegenübe den e kü z en Phagen a ian en haben,
müss e e sich in einem en sp echenden Kompe i ionsexpe imen gegen diese Konku enz
du chse zen. Um dies zu un e suchen wu de eine E. coli TG1 Zellkul u mi gleichen
Konzen a ionen an d WT Phagen und d G3P GSEG bzw. d G3P GG Phagen in izie .
Nach eine Runde bes ehend aus In ek ion, Phagenp opaga ion und -isola ion wu den mi de
e hal enen Phagensuspension hin e einande d ei wei e e Zyklen du chge üh , um e en uell
o handene ge inge Un e schiede in den In ek iosi ä en de Phagen zu ampli izie en. Nach
jede In ek ions unde wu de on eine ep äsen a i en Anzahl an Zellen mi els PCR
bes imm , du ch welche Phagen a ian e sie in izie wo den wa en. Dabei wu de ausgenu z ,
dass die Gene des G3P de Dele ionsphagen im Be eich des dis alen Linke s deu lich kü ze
sind als das u sp üngliche Gen-3. In Abbildung 3.5.5 sind die E gebnisse de Kompe i ion
zwischen dem d WT Phagen und d G3P GSEG bzw. d G3P GG gezeig .
Auch nach ie In ek ionszyklen wa de An eil de Phagen mi e kü z em G3P an de
Gesam menge de koloniebildenden Einhei en (c. .u.) un e ände , sie können sich also gegen
den Wild yp-Phagen behaup en. Die in den Kine iken de TolAC-Ve d ängung beobach e e,
leich e inge e A ini ä on d G3P* GSEG ü TolAC im nich assoziie en Zus and ha
eben alls keine Auswi kung au die Fi ness des en sp echenden Phagen. Es is alle dings nich
geklä , ob das G3P de Phagen du ch die Wechselwi kung on N2 mi dem Pilus lediglich in
den nich assoziie en Zus and übe geh ode N2 e en uell soga olls ändig en al e wi d. In
diesem Fall wä e die Bindungss elle ü TolAC au de N1-Domäne au g und ehlende
In e ak ionen mi N2 auch im d G3P* GSEG Phagen pe manen zugänglich.
E gebnisse und Diskussion
144
Abbildung 3.5.5: Kompe i ion de Dele ionsphagen mi dem Wild yp-Phagen um die In ek ion on F+-Zellen.
Au ge agen is de jeweilige An eil an a) Phagen d G3P GSEG (g au) bzw. d WT Phagen (schwa z) und
b) Phagen d G3P GG (g au) bzw. d WT Phagen (schwa z) an de Gesam menge an c. .u. nach jedem
In ek ionszyklus. Vo de e s en In ek ions unde wu den die jeweiligen Phagensuspensionen im Ve häl nis on
1:1 gemisch und dami bei 25 °C E. coli TG1 Zellen (m.o.i. (mul iplici y o in ec ion) > 1) in izie . Nach jedem
de ie au einande olgenden Zyklen bes ehend aus In ek ion, Phagenp opaga ion und de en P äpa a ion wu de
on mindes ens 48 Zellen mi els PCR bes imm , du ch welche Phagen sie in izie wo den wa en.
Dass die on Nilsson e al.170 besch iebene In e ak ion zwischen dem dis alen Linke und
dem Pilus aus eich , dami ein Phage mi G3P, bes ehend aus N1, e s em Se in-Glycin-
eichem Linke und C- e minale Domäne, pilushal ige Zellen ähnlich gu in izie en kann wie
de d WT Phage, is nach den e hal enen E gebnissen unwah scheinlich. De Wild yp-Phage
ha bei de gleichzei igen In ek ion on F+-Zellen keinen Vo eil gegenübe den
Dele ionsphagen, de en A ini ä en ü den Pilus du ch das Fehlen des Linke s signi ikan
e inge sein soll en. Die Wechselwi kung de N2-Domäne mi de Spi ze des F-Pilus wi d
zudem haup sächlich übe de en hyd ophobe Res e T p181, Phe190 und Phe194 e mi el .68
Ein Aus ausch diese AS gegen Alanin-Res e im G3P üh dazu, dass die en sp echende
Phagen a ian e F+-Zellen nich meh in izie en kann.68; 97 De in diesem Phagen eben alls
en hal ene dis ale Linke kann olglich den Ve lus de Wechselwi kung on N2 mi dem
Pilus nich kompensie en.
In ek ionszyklus
1234
ela i e An eil an c. .u. (%)
0
20
40
60
80
100
a) b)
In ek ionszyklus
1234
ela i e An eil an c. .u. (%)
0
20
40
60
80
100
E gebnisse und Diskussion
145
3.6 S uk u elle und ene ge ische G undlagen de Dime isie ung des
G1-P o eins
Wie das Beispiel des G3P des d Phagen zeig , is die na ü liche E olu ion so ausge ich e ,
dass P o eine zum einen un e den he schenden Bedingungen ih e na i e S uk u
au ech e hal en und zum ande en ih e biologische Funk ion op imal e üllen können.31; 32 Die
ge inge S abili ä , o allem gegenübe he mische Dena u ie ung beein äch ig jedoch die
indus ielle Anwendba kei iele P o eine, weshalb un e ande em Selek ions e ah en zu
ge ich e en e olu i en S abilisie ung imme s ä ke e Bedeu ung e langen.35
Mi Hil e des in diese A bei sg uppe en wickel en Selek ionssys ems P oside konn en
be ei s das Käl eschockp o ein CspB aus B. sub ilis und die TEM-1 β-Lac amase aus E. coli
e heblich s abilisie we den.54; 172 Die P oside-Me hode basie au de Kopplung de
In ek iosi ä des d Phagen an die P o ease esis enz und dami S abili ä des zwischen de C-
e minalen und den beiden N- e minalen Domänen des G3P eingebau en Gas p o eins.48; 49
Die S abilisie ung de Immunoglobulinbindungsdomäne 1 des P o eins G aus
S ep ococcus (G1) e olg e in meh e en Sch i en. Zunächs wu de dessen Gen mi els
e o -p one PCR andomisie und die e hal enen Phagenbiblio heken du ch P oside-
Selek ion ge ich e e E olu ion un e wo en. Dadu ch konn en on Michael Wunde lich mi
Glu15, Th 16, Th 18, Ala24 und Asn37 ün Res e iden i izie we den, welche anscheinend
ein hohes S abilisie ungspo en ial au weisen (Abbildung 3.6.1).57
Abbildung 3.6.1: Te iä s uk u des G1-P o eins aus S ep ococcus sp.
Die ün Res e mi S abilisie ungspo en ial Glu15, Th 16, Th 18, Ala24 und Asn37 sowie Ty 33 sind als
S äbchen-Modelle da ges ell . Die Abbildung wu de mi dem P og amm Pymol63 e s ell und basie au den
Koo dina en de PDB-Da ei 1PGA173.
Du ch Sä igungsmu agenese an diesen Posi ionen und anschließende P oside-Selek ion
e gaben sich un e ande em in jede de selek ie en Va ian en an den Posi ionen 16 und 37
Leucin-Subs i u ionen, die das P o ein deu lich s abilisie en. Die Kombina ion de bes en,
allesam hyd ophoben Aus ausche E15V, T16L, T18I und N37L e höh den TM-We de
esul ie enden Va ian e G1-M2 gegenübe WT-G1 um 35 °C.57
Eine he modynamische Analyse de einzelnen Aus ausche sowohl im WT-G1- als auch
G1-M2-Hin e g und zeig e, dass o allem die In e ak ion zwischen den Leucin es en an den
Ala24
Th 18 Th 16 Glu15
Asn37
Ty 33
3
E gebnisse und Diskussion
146
Posi ionen 16 und 37 einen seh hohen Bei ag zu S abilisie ung des G1-M2-P o eins
lie e , wobei dessen En halpie de En al ung signi ikan e höh is . Eine di ek e
Wechselwi kung zwischen den Res en konn e jedoch au g und des g oßen Abs andes de
beiden AS on übe 10 Å ausgeschlossen we den. Vielmeh wu de e mu e , dass die
In e ak ion übe die a oma ische Sei enke e des Ty 33 e mi el wi d
(Abbildung 3.6.1).128; 174
Im Rahmen des Ve ie ungsp ak ikums und de anschließenden Diploma bei wu de on
mi die Funk ion des Ty 33 ü die S abili ä on G1 anhand wei e e P oside-Selek ionen
mi an den Posi ionen 16, 33 und 37 bzw. 16, 18, 33 und 37 andomisie en G1-
Phagenbiblio heken un e such . Da aus esul ie en sechs Va ian en, on denen zwei an
Posi ion 33 den u sp ünglichen Ty osin es besi zen. Diese Va ian en G1-16L,18I,Y33,37L
und G1-16L,18I,Y33,D36A,37L en hiel en auße dem an den Posi ionen 16, 18 und 37 die
gleichen AS wie G1-M2. Ansons en wa en an den a iie en Posi ionen as ausschließlich
a oma ische und alipha ische Subs i u ionen zu inden (Tabelle 10.4 im Anhang).175
Alle P o eine wiesen deu lich e höh e En halpien und TM-We e au , die zum Teil noch
übe denen des hype s abilen G1-M2 lagen. Bei allen Va ian en zeig e sich zudem, dass ih e
S abili ä abhängig on de eingese z en P o einkonzen a ion is . Im Be eich on 1 bis 10 µM
e gab sich jeweils ein Ans ieg des TM-We es zwischen 0,7 °C (G1-16F,33M,37L) und
3,9 °C (G1-16L,33L,37I, Tabelle 10.4 im Anhang), was die Ve mu ung naheleg e, dass die
P o eine un e schiedlich s a k zu Ausbildung on Oligome en neigen. Bei ühe en übe
P oside-Selek ionen s abilisie en G1-Va ian en und WT-G1 konn e dagegen in diesem
Konzen a ionsbe eich keine Tendenz zu Oligome isie ung beobach e we den (Da en nich
gezeig ).
Bei de En al ung on Oligome en müssen zunächs die in e molekula en
Wechselwi kungen zwischen den Molekülen gelös we den dami die Monome e en al en
können. Die he mischen En al ungsku en de Va ian en konn en jedoch gemäß eines
ein achen Zweizus andsmodells ausgewe e we den. Eine Signalände ung, e u sach du ch
die Dissozia ion de Oligome e, wa demnach nich di ek beobach ba . Wenn ein Dime
en al e , äg neben den einzelnen s abilisie enden Subs i u ionen jedoch olglich auch die
Ve g öße ung de koope a i en Einhei zu E höhung de appa en en Gesam en halpie de
En al ung ΔH H(Monome ) bei. Die Koope a i i ä en de Übe gänge de Va ian en sind
e mu lich deshalb deu lich um bis zu 230 kJ mol-1 gegenübe de des WT-G1 e höh , das
als monome es P o ein a sächlich in einem Zweizus andsübe gang en al e .175
3.6.1 Die hohe S abili ä de Va ian e G1-M2 wi d zum Teil beding du ch die
Ausbildung on Dime en
De Übe gangsmi elpunk und die En halpie de kombinie en Va ian e G1-M2 liegen im
Be eich de We e, die ü die selek ie en Va ian en e hal en wo den wa en. Aus diesem
G und wu de die he mische En al ung on G1-M2 eben alls im Konzen a ionsbe eich on
E gebnisse und Diskussion
147
1 bis 10 µM un e such (Abbildung 3.6.2). Die e hal enen he misch-induzie en
En al ungsübe gänge wa en wiede einphasig, so dass de Angleich an die Da en un e de
Annahme eines Zweizus andsmodells e olg e.
Abbildung 3.6.2: Konzen a ionsabhängigkei de he misch-induzie en En al ung on WT-G1 und G1-M2.
a) Au agung de ela i en Ände ung des CD-Signals bei 222,6 nm on 1 () und 10 µM (●) WT-G1 bzw.
1 (), 4 () und 10 µM () G1-M2 in Abhängigkei on de Tempe a u . Die du chgezogenen Linien s ellen
den Angleich an die Messwe e nach Auswe ung un e de Annahme des Zweizus andsmodells NU da . Die
Übe gänge wu den in 0,1 M Na-Cacodyla pu e , pH 7,0 in Gegenwa on 1,5 M GdmCl mi eine Schich dicke
on 1 cm, eine Heiz a e on 90 °C h-1 und eine Dämp ung on 8 s gemessen. Die aus de Da enanalyse
e hal enen he modynamischen Pa ame e sind in Tabelle 3.6.1 au gelis e . b) Abhängigkei de
Schmelz empe a u TM on de Konzen a ion C an monome em G1-M2. Die au ge agenen
Übe gangsmi elpunk e esul ie en aus de Analyse de CD- () und DSC-Messungen (, Tabelle 3.6.1). Nach
Gleichung 17 läss sich du ch linea e Reg ession aus de S eigung die Gesam en halpie de En al ung
H H(Dime ) ausgehend on olls ändig dime em G1-M2 zu 615 ± 17 kJ mol-1 be echnen.
Im Gegensa z zu WT-G1 is auch die En al ung on G1-M2 konzen a ionsabhängig
(Tabelle 3.6.1). Zwischen 1 und 10 µM s eig de Schmelzpunk um 3,6 °C und die En halpie
on 360 au 391 kJ mol-1, was andeu e , dass die hype s abile Va ian e im angegebenen
Konzen a ionsbe eich eben alls eine Tendenz zu Oligome isie ung ha . Um eine Aussage
übe den Oligome isie ungsg ad e en zu können, wu den die S abili ä en on WT-G1 und
G1-M2 bei hohen Konzen a ionen mi els DSC (Di e encial Scanning Calo ime y)
analysie . Neben dem TM-We we den hie In o ma ionen übe die an’ Ho und
kalo ime ische En halpie e hal en, aus de en Quo ien sich de Zweizus andscha ak e eines
En al ungsübe ganges abschä zen läss .176
De Übe gangsmi elpunk on WT-G1 is bis zu eine Konzen a ion on 100 µM
kons an und das Ve häl nis H H/Hcal nahe 1, was bes ä ig , dass das P o ein in Lösung als
Monome o lieg und gemäß des Zweizus andsmodells NU en al e (Tabelle 3.6.1). Im
Ve gleich dazu sind die Schmelzpunk e on G1-M2 bei 62 bzw. 139 µM genau wie die
H H-We e signi ikan e höh . Die kalo ime ische En halpie Hcal wi d dagegen au
G undlage de Monome konzen a ion be echne . Da sich ü G1-M2 ein Quo ien
H H/Hcal on e wa 2 e gib , lieg dieses bei den un e such en Konzen a ionen olglich als
Dime o .
10080604020
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
T (°C)
ela i e Signalände ung
-8-9-10-11-12-13-14
2,82
2,8
2,78
2,76
2,74
2,72
ln C
1/T
M
(1000/K)