Analyse der Hyperinflammation im Verlauf der murinen Pneumokokken-Pneumonie unter besonderer Berücksichtigung des Neutrophile-rekrutierenden Chemokins CXCL5 [original]

vorgelegt von

M.Sc.

SARAH BERGER

geb. in Görlitz

von der Fakultät III - Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

- Dr. rer.nat. -

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. Jens Kurreck

Gutachter: Prof. Dr. Roland Lauster

Gutachter: Prof. Dr. Bastian Opitz

Gutachterin: Dr. Ing. Geraldine Nouailles-Kursar

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 25. Juli 2018

Berlin 2019

Analyse der Hyperinflammation im Verlauf der murinen

Pneumokokken-Pneumonie unter besonderer Berücksichtigung

des Neutrophile-rekrutierenden Chemokins CXCL5

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................... V

1 Zusammenfassung ..................................................................................................... VIII

2 Summary ...................................................................................................................... IX

3 Einleitung ....................................................................................................................... 1

3.1 Die ambulant erworbene Pneumonie ...................................................................... 1

3.2 Streptococcus pneumoniae ..................................................................................... 2

3.3 Therapie einer Lungenentzündung .......................................................................... 3

3.3.1 Mechanische Beatmung und die beatmungsassoziierte Lungenschädigung .... 4

3.4 Die alveolokapilläre Barriere .................................................................................... 5

3.4.1 Das Endothel.................................................................................................... 6

3.4.2 Das alveoläre Epithel ....................................................................................... 7

3.5 Die Zellen des angeborenen Immunsystems ........................................................... 8

3.5.1 Alveoläre Makrophagen ................................................................................... 9

3.5.2 Monozyten ......................................................................................................10

3.5.3 Dendritische Zellen .........................................................................................11

3.5.4 Neutrophile Granulozyten ................................................................................11

3.6 Chemokine und ihre Rezeptoren ............................................................................14

3.6.1 Chemokingruppen ...........................................................................................14

3.6.2 Vom Stimulus zur Chemokinausschüttung ......................................................15

3.6.3 Die Rolle des Chemokinrezeptors CXCR2 und seiner Liganden .....................17

4 Zielsetzung ...................................................................................................................19

5 Material und Methoden .................................................................................................21

5.1 Material ..................................................................................................................21

5.1.1 Geräte .............................................................................................................21

5.1.2 Verbrauchsmaterialien ....................................................................................22

5.1.3 Reagenzien .....................................................................................................24

5.1.4 Antikörper ........................................................................................................25

5.1.5 Enzyme ...........................................................................................................25

5.1.6 Narkose und Heparin ......................................................................................26

5.1.7 Medien und Puffer ...........................................................................................26

5.1.8 Bakterienstämme ............................................................................................29

5.1.9 Zelllinien ..........................................................................................................29

5.1.10 Kits ..................................................................................................................29

5.1.11 Software ..........................................................................................................30

5.2 Methoden ...............................................................................................................30

5.2.1 Anzucht von Streptococcus pneumoniae .........................................................30

5.2.2 Tierexperimentelle Untersuchungen ................................................................31

5.2.3 Analyse der Tiere und Probenentnahme .........................................................34

5.2.4 Mechanische Ventilationsversuche .................................................................36

5.2.5 Färbung der BAL-Zellen für durchflusszytometrische Untersuchungen ...........37

5.2.6 Histologische Untersuchungen ........................................................................39

5.2.7 Ermittlung der vaskulären Permeabilität ..........................................................39

5.2.8 Quantifizierung von Chemokinen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren ............40

5.2.9 In vitro Versuche .............................................................................................40

5.2.10 Auswertung und Darstellung der Ergebnisse ...................................................45

6 Ergebnisse ...................................................................................................................47

6.1 Der Einfluss früher und später antimikrobieller Therapie auf die Resolution einer

Streptokokken-induzierten Pneumonie in der Maus ..........................................................47

6.1.1 Eine retardierte Antibiotika-Therapie schützt nicht vor einem fatalen Pneumonie-

Verlauf in Mäusen .........................................................................................................47

6.1.2 Der Zeitpunkt der Antibiotika-Gabe hat keinen Einfluss auf die antibakterielle

Wirkung ........................................................................................................................48

6.1.3 Die Ampicillin-Therapie hat keinen Einfluss auf die Kinetik der Leukozyten im

Alveolarraum ................................................................................................................50

6.1.4 Frühzeitige und späte Antibiotika-Therapie reduzieren lokale Zytokin-Level ....52

6.1.5 Eine antibakterielle Therapie vermindert unabhängig vom Startzeitpunkt lokale

Konzentrationen einzelner ............................................................................................54

6.1.6 Zirkulierende Immunzell-Populationen werden weder von früher noch von später

antibakterieller Therapie beeinflusst .............................................................................56

III

6.1.7 Frühe, aber nicht späte antibakterielle Therapie verhindert den systemischen

Anstieg inflammatorischer Mediatoren ..........................................................................58

6.1.8 Eine frühzeitige antibakterielle Therapie schützt vor Entwicklung von Pleuritis,

Steatitis und Leberschädigung ......................................................................................60

6.1.9 Nur eine frühe Therapie zeigt einen protektiven Effekt auf die Entwicklung eines

perivaskulären Ödems ..................................................................................................62

6.1.10 Ein frühzeitiger Therapiebeginn verhindert die Schädigung der alveolokapillären

Barriere ........................................................................................................................64

6.2 Der Einfluss des Chemokins CXCL5 auf Neutrophile-Rekrutierung und

Lungenschädigung in der Streptokokken-induzierten Pneumonie .....................................66

6.2.1 Die CXCR2 Liganden werden in vivo nach S. pn-Infektion sekretiert ...............66

6.2.2 Epithelzellen sind die Hauptquelle der CXCL5 Sekretion in der Mauslunge ....67

6.2.3 Die Sekretion der CXCR2 Liganden von Epithelzellen ist TLR2-abhängig .......69

6.2.4 Die Abwesenheit von CXCL5 resultiert in einer stark verminderten Neutrophile-

Rekrutierung .................................................................................................................70

6.2.5 Trotz erhöhter bakterieller Last ist die Mortalität nicht beeinflusst ....................71

6.2.6 Die Abwesenheit von CXCL5 beeinflusst neben Neutrophilen auch alveoläre

Makrophagen im Alveolarraum .....................................................................................72

6.2.7 CXCL5 beeinflusst keine weiteren inflammatorischen Mediatoren in

Alveolarraum und Blut ..................................................................................................73

6.2.8 Im Zuge einer Serotyp 2-Infektion schützt die Abwesenheit von CXCL5 nicht vor

Ödem-Entwicklung oder der bakteriellen Ausbreitung in die Peripherie ........................74

6.2.9 Die Abwesenheit von CXCL5 vermindert die Schädigung der alveolokapillären

Barriere ........................................................................................................................76

6.3 Der Einfluss des Chemokins CXCL5 auf Neutrophile-Rekrutierung und

Lungenschädigung in einem Modell mechanischer Beatmung ..........................................76

6.3.1 Mechanische Beatmung induziert die Sekretion von CXC-Chemokinen und

Neutrophile-Infiltration in vivo ........................................................................................77

6.3.2 Mechanische zyklische Dehnung induziert die Ausschüttung von CXC-

Chemokinen und VEGF in vitro.....................................................................................77

6.3.3 In Abwesenheit von CXCL5 ist die Rekrutierung von Neutrophilen im Zuge der

mechanischen Ventilation vermindert ...........................................................................78

6.3.4 CXCL5 beeinflusst keine weitere Rekrutierung von Immunzellen in den

Alveolarraum bei einer mechanischen Beatmung .........................................................80

6.3.5 Die Abwesenheit von CXCL5 ist die Lungenfunktion unter mechanischer

Beatmung verbessert ....................................................................................................81

6.3.6 Histopathologische Untersuchungen der Lunge ventilierter Mäuse weisen auf

eine erhöhte Schädigung der Alveolarwand in Anwesenheit von CXCL5 hin ................83

6.3.7 In Abwesenheit von CXCL5 ist die alveolokapilläre Barriere unter mechanischer

Beatmung geschützt .....................................................................................................85

7 Diskussion ....................................................................................................................86

7.1 Etablierung eines Modells der frühzeitigen und späten Antibiotikatherapie bei

Pneumokokken-induzierter Pneumonie ............................................................................86

7.2 Mögliche Mechanismen hinter dem Therapieversagen einer späten antibakteriellen

Behandlung ......................................................................................................................89

7.3 Die Rolle von VEGF bei der der Erhöhung der alveolokapillären Permeabilität ......94

7.4 Die alveolokapilläre Barriere in Abhängigkeit von CXCL5 ......................................96

7.4.1 Alveoläre Epithelzellen sind die Hauptquelle von CXCL5 in der Lunge ...........96

7.4.2 CXCL5 ist notwendig für eine vollständige Rekrutierung der Neutrophilen ......98

7.4.3 CXCL5-unabhängige Wege der Neutrophilen-Rekrutierung ............................99

7.4.4 Folgen einer reduzierten Neutrophile-Rekrutierung ....................................... 100

7.4.5 Möglicher therapeutischer Effekt von CXCL5 und einer verminderten oder

inhibierten Neutrophile-Rekrutierung .......................................................................... 104

7.4.6 Mechanismen hinter dem Schutz der alveolokapillären Barriere in Abwesenheit

von CXCL5 ................................................................................................................. 105

8 Literaturverzeichnis ..................................................................................................... 107

9 Anhang ....................................................................................................................... 123

9.1 Tabellenverzeichnis .............................................................................................. 123

9.2 Abbildungsverzeichnis .......................................................................................... 124

9.3 Publikationen ........................................................................................................ 126

9.4 Danksagung ......................................................................................................... 128

Abkürzungsverzeichnis

anti

alvMs

alveoläre Makrophagen

AST

Aspartat-Aminotransferase

BAL

Bronchoalveoläre Lavage

BALC

BAL Cells, Zellen der bronchoalveolären Lavage

BALF

BAL Fluid, Nicht-zellulärer Anteil der bronchoalveolären Lavage

BSA

Bovines Serumalbumin

CAP

community-acquired pneumonia, ambulant erworbene Pneumonie

CCL

Ligand mit C-C Motiv

CCR

Rezeptor eines Liganden mit C-C Motiv

Cluster of Differentiation, System zur Bezeichnung von

Differenzierungsantigenen

CFU

colony forming units, Kolonie-bildende Einheiten

Cre

Cre-Rekombinase

CXCL

Ligand mit C-X-C Motiv

CXCR

Rezeptor eines Liganden mit C-X-C Motiv

DCs

Dendritische Zellen

DNA

deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure

E. coli

Escherichia coli

ELISA

Enzyme-linked Immunosorbent Assay, enzymgekoppelter

Immunadsorptionstest

Eos

Eosinophile

EpiCs

Epithelzellen

FACS

fluorescence-activated cell sorting, Durchflusszytometrie

FCS

fetal calf serum, Fetales Kälberserum

Gauge

G-CSF

Granulocyte-Colony Stimulating Factor, Granulozyten-Kolonie-

stimulierender Faktor

GM-CSF

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, Granulozyten-

Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor

H & E

Hematoxylin & Eosin

HBSS

Hank’s Balanced Salt Solution

HMGB1

high mobility group box 1

HSA

Humanes Serumalbumin

HVT

high tidal volume ventilation, Beatmung mit hohem Tidalvolumen

i.p.

intraperitoneal

i.v.

intravenös

IFN

Interferon

Interleukin

iMs

inflammatorische Monozyten / Makrophagen

LPS

Lipopolysaccharide

LVT

high tidal volume ventilation, Beatmung mit niedrigem Tidalvolumen

M. tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis

MACS

Magnetic cell separation, Magnetische Zellseparation

M-CSF

Macrophage colony-stimulating factor, Monozyten-Kolonien-

stimulierender Faktor

MHC

major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex

MOI

multiplicity of infection, Multiplizität der Infektion

MSA

Murines Serumalbumin

MyD88

myeloid differentiation factor 88

n.n.

nicht nachweisbar

NETs

neutrophil extracellular traps, neutrophile extrazelluläre Fallen

NF-κB

nuclear factor „kappa-light-chain-enhancer“ of activated B-cells

reaktive Stickstoffspezies

Nicht ventiliert

optische Dichte

P. aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa

p.i.

post infectionem, nach der Infektion

PAMPs

Pathogen-associated molecular patterns, Pathogen-assoziierte

molekulare Muster

PAS

periodic acid-Schiff, Perjodsäure-Schiff Reaktion

PBS

phosphate buffered saline, Phosphatgepufferte Salzlösung

PIP

peak inspiratory pressure, inspiratorischer Spitzendruck

PLY

Pneumolysin

PMNs

Polymorphkernige neutrophile Granulozyten

PRRs

Pattern recognition receptors, Mustererkennungs-Rezeptoren

RNA

ribonucleic acid, Ribonukleinsäure

ROS

reaktive Sauerstoffspezies

Raumtemperatur

S. pn.

Streptococcus pneumoniae

siRNA

Small interfering RNA, kleine eingreifende RNA

ssRNA

single-stranded ribonucleic acid, Einzelsträngige RNA

VII

Serotyp

STAT3

signal transducer and activator of transcription 3

tACE

Angiotensin-konvertierendes Enzym

TIR

Toll/Interleukin-1 Rezeptor

TIRAP

TIR domain-containing adapter protein, Adapterprotein, welches eine

TIR Domäne aufweist

TLR

Toll-like Receptor, toll-ähnlicher Rezeptor

TNF

Tumornekrosefaktor

TRIF

TIR-domain-containing adaptor protein-inducing IFN-β, TIRAP, welches

IFN-β induzieren kann

ü.N.

über Nacht

VE-Cadherin

vascular endothelial cadherin, vaskuläres endotheliales Cadherin

VEGF

Vascular Endothelial Growth Factor, vaskulärer endothelialer

Wachstumsfaktor

VE-PTP

vascular endothelial protein tyrosine phosphatase, vaskuläre

endotheliale Protein Tyrosin Phosphatase

VILI

ventilator-induced lung injury, Ventilations-assoziierte

Lungenschädigung

Wildtyp

VIII

1 Zusammenfassung

Die ambulant erworbene Pneumonie ist mit ihrer hohen Inzidenz und Mortalität eine der

bedeutendsten Infektionskrankheiten weltweit. Streptococcus pneumoniae (S. pn.) ist der

häufigste Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie. Eine wichtige Ursache für die hohe

Sterblichkeit trotz wirksamer antibiotischer Therapie stellt die umgreifende Schädigung eines

inadäquat aktivierten Immunsystems während der Infektion dar. Vor allem neutrophile

Granulozyten (PMNs) können im Zuge der Pathogen-Eliminierung das Lungengewebe und die

alveolokapilläre Barriere schädigen, weshalb es zur Entstehung von Lungenödemen kommen

kann. Ferner kann sich die Inflammation in die Peripherie ausbreiten, wodurch sich eine lokale

Infektion der unteren Atemwege oftmals zu einer lebensbedrohlichen Sepsis entwickelt. Die

detaillierten Mechanismen hinter dem Therapieversagen trotz antibakterieller Behandlung sind

bisher unbekannt, könnten aber wertvolle Ansatzpunkte für neue adjuvante Therapien

darstellen. In dieser Doktorarbeit wurde deshalb der Fokus auf die Hyperinflammation gelegt,

welche trotz Eliminierung der Erreger unter antibiotischer Therapie auftritt.

Dazu wurden S. pn.-infizierte Mäuse, die eine Pneumonie ausgebildet hatten, beginnend früh

(24 h p.i.) oder spät (48 h p.i.) nach der Infektion in 12 h-Intervallen mit Ampicillin therapiert.

S. pn-infizierte Kontrollgruppen wurden analog mit Lösungsmittel behandelt. Detaillierte

Analysen von Immunantwort und klinischen Parametern zu mehreren Zeitpunkten

ermöglichten die Verfolgung des Infektionsverlaufs während der gesamten Therapie. Nach

beiden Behandlungsstarts verliefen Pathogen-Eliminierung und Reduktion der lokalen

inflammatorischen Mediatoren zeitlich analog ab. Dennoch konnte nur eine frühe Therapie

infizierte Tiere retten. Faktoren, die mit dem Therapieversagen assoziiert werden konnten,

waren eine erhöhte vaskuläre Permeabilität sowie das Auftreten einer systemischen

Inflammation. Diese Prozesse konnten durch eine frühe Therapie verhindert werden, während

eine späte Behandlung bereits etablierte Schädigungen weder verringern, noch eine

systemische Inflammation eindämmen konnte.

Weiterhin wurde der Einfluss des PMN-rekrutierenden Chemokins CXCL5 untersucht. In vivo

und in vitro zeigte sich eine vermehrte CXCL5-Sekretion sowohl nach S. pn.-Infektion als auch

im Anschluss an invasive Beatmung bzw. zyklischer Dehnung von Epithelzellen. Alveoläre

Epithelzellen konnten als Hauptquelle des Chemokins identifiziert werden. In vivo führte eine

Deletion von Cxcl5 zu einer reduzierten PMN-Migration in den Alveolarraum, was im

Infektionsmodell mit einer Erhöhung der bakteriellen Last einherging. In beiden Modellen

schützte die Abwesenheit von CXCL5 vor einer Schädigung der alveolokapilläre Barriere.

Es konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion von PMNs, die Stärkung der alveolokapillären

Barriere oder eine Verminderung der systemischen Inflammation Ansatzpunkte für die

Entwicklung neuer adjuvanter Therapien sein könnten. In Verbindung mit einer adäquaten

antibiotischen Therapie könnte so zukünftig eine Herabsetzung der Mortalität erreicht werden.

2 Summary

Community-acquired pneumonia, due to its high incidence and morbidity rates, is one of the

most clinically relevant infectious diseases worldwide. While the reasoning behind poor

survival rates are complex, one major driving factor seems to be the overwhelming activation

of the host immune system during infection with Streptococcus pneumoniae (S. pn.), the main

pathogen of pneumonia. Especially polymorphonuclear neutrophils (PMNs) may cause

damage to the lung and alveolar-capillary barrier during tissue infiltration and exertion of

effector functions. Thus, common consequences are alveolar flooding. Further, the

inflammation can spread into the circulation, whereby a local infection of the lower respiratory

tract can develop into life-threatening sepsis. The underlying mechanisms behind therapeutic

failure despite appropriate antibiotic treatment are still unknown, albeit important for the

development of new adjunctive therapies. Therefore, the focus of this doctoral thesis was to

examine host-specific hyperinflammation, which occurs despite pathogen-elimination.

S. pn.-infected mice were treated every 12 h with Ampicillin, starting early (24 h p.i.) and late

(48 h p.i.) following infection. Respective S. pn.-infected control groups were treated with

solvent. At both starting points, infected animals showed characteristics of pneumonia together

with bacteremia. Detailed analysis of local and systemic inflammatory processes and

pneumonia symptoms at multiple experimental time points allowed for comprehensive

monitoring of the course of infection during therapy. Following both therapeutic starting points,

the degree of bacterial elimination accompanied by reduction of local inflammatory mediators

were comparatively effective. However, only early antibiotic therapy commencement rescued

S. pn.-infected mice. The main events causative for therapy failure are believed to be the

breakdown of the alveolar-capillary barrier and development of a systemic inflammation. These

processes were prevented by early therapy only while late therapy neither reversed

established barrier damage nor reduced inflammatory mediators in the blood.

Furthermore, the impact of the PMN-attracting chemokine CXCL5 was examined in models of

murine pneumonia and mechanical ventilation. S. pn.-infection and mechanical ventilation

evoked increased CXCL5 secretion in vivo, while in vitro experiments helped confirm epithelial

cells as main source of CXCL5 in both models. Cxcl5-deficiency caused a strong decrease in

PMN-migration into the alveolar space, accompanied by elevated bacterial burden in the

S. pn.-infection model. However, in mice lacking CXCL5, the alveolar-capillary barrier was

shown to be protected compared to the respective wild-type mice.

A reduction of PMN infiltration, intactness of the alveolar-capillary barrier and diminishing of

systemic inflammation were hereby indicated to be crucial for the development of new

adjunctive therapies. With the aid of ongoing research accompanied by appropriate antibiotic

regimen, these strategies may help to decrease the mortality of community-acquired

pneumonia.

3 Einleitung

3.1 Die ambulant erworbene Pneumonie

Die ambulant erworbene Pneumonie (community-acquired pneumonia (CAP)) gehört aufgrund

ihrer hohen Morbidität und Mortalität zu den bedeutendsten Infektionskrankheiten weltweit.

Nach Informationen der Weltgesundheitsorganisation war im Jahr 2015 eine Infektion der

unteren Atemwege weltweit die dritthäufigste Todesursache [1]. Dabei war allein die

Pneumonie für 16 % aller Todesfälle von Kindern unter fünf Jahren verantwortlich [2].

In Deutschland sind laut Angaben des statistischen Bundesamtes im Jahr 2015 19.368

Personen an einer Pneumonie verstorben, womit die Pneumonie an achter Stelle der

häufigsten Todesursachen rangierte [3]. Die Inzidenz der Pneumonie lag hier in den Jahren

2010 / 2011 bei 9,7 von 1.000 Einwohnern pro Jahr, wovon 46,3 % hospitalisiert werden

mussten [4]. Die Sterblichkeitsrate unterscheidet sich abhängig von der nach Art der

Lungenentzündung: Nicht-invasive Formen, bei denen es zu keiner Ausbreitung der

Infektionserreger ins Blut des Patienten kam, verlaufen nachweislich milder und werden mit

einer hohen Überlebenschance assoziiert [5]. Allerdings kann sich aus einer nicht-invasiven

Form eine invasive Pneumonie entwickeln, wenn die Erreger aus dem Respirationstrakt in das

Blutsystem übertreten. Dies erfordert oft eine Hospitalisierung des Patienten und steht mit

einem erhöhten Risiko für Atemversagen oder einem Sepsis-assoziierten Organversagen in

Verbindung [6]. Im Jahre 1937, bevor die flächendeckende Behandlung mit Antibiotika

eingeführt wurde, lag die Sterblichkeit der Pneumonie zwischen 8 und 100 %, wobei vor allem

eine invasive Form und zunehmendes Alter des Patienten mit einer ansteigenden Mortalität in

Verbindung gebracht werden konnten (siehe Abbildung 1) [7].

Auch heute müssen noch 21 % der hospitalisierten CAP-Patienten in den USA auf der

Intensivstation behandelt werden, von denen 26 % eine mechanische Beatmung benötigen

([8], siehe 3.3.1). Daten des AQUA-Instituts bestätigen, dass zunehmendes Alter der Patienten

mit einer erhöhten Sterblichkeit einhergeht: Während die Mortalität hospitalisierter Patienten

zwischen 20 und 29 Jahren bei lediglich 1,2 % liegt, steigt sie auf 12,3 % in der Gruppe der 70

bis 79-Jährigen. Patienten, die älter als 90 Jahre sind, haben die höchste Sterblichkeitsrate

mit 22,5 % [9]. Obwohl es mit der Einführung der Antibiotikatherapie zu einem starken

Rückgang der Mortalität gekommen ist, liegt diese in Deutschland immer noch bei 12 - 13 %

[5, 6].

Abbildung 1: Mortalität der Pneumonie.

Die Mortalität der Pneumonie ist abhängig vom Alter der Patienten und

der Ausbreitung der Infektion in das Blutsystem. Basierend auf [7].

3.2 Streptococcus pneumoniae

Obwohl die ambulant erworbene Pneumonie von einer Vielzahl von Infektionserregern

ausgelöst werden kann, sind meist bakterielle Pathogene für eine Erkrankung verantwortlich.

Am häufigsten wird dabei das grampositive Bakterium Streptococcus pneumoniae (S. pn.) als

kausales Pathogen identifiziert [10]. S. pn. wurde 1881 parallel von Louis Pasteur und Georg

Miller Sternberg isoliert, kultiviert und beschrieben. Albert Fränkel arbeitete von 1884 bis 1886

an dem Nachweis, dass dieses Bakterium der Erreger der humanen Pneumonie ist, was 1886

von Anton Weichselbaum in Wien bestätigt werden konnte. Auch in Deutschland findet sich

bei über 40 % der Patienten, die an einer bakteriellen Pneumonie erkrankt sind, S. pn. als

nachweisbarer Erreger [11]. S. pn., auch als „Pneumokokkus“ bezeichnet, kolonialisiert den

Nasopharynx von Kindern (53 %) und Erwachsenen (4 %), von wo sich das Bakterium in die

unteren Atemwege oder ins Blutsystem ausbreiten kann [12]. Es konnte gezeigt werden, dass

eine vorherige Kolonialisierung des Nasopharynx mit diesen Bakterien die Voraussetzung für

eine spätere Erkrankung ist [13].

Anhand des Aufbaus der Polysaccharidhülle (Kapsel) lassen sich innerhalb der Art der

Pneumokokken über 90 verschiedene Serotypen unterscheiden. Diese Kapsel-Saccharide

zählen zu den potentesten Virulenzfaktoren, da sie das Bakterium umhüllen und vor einer

Phagozytose schützen können [14]. Aufgrund der unterschiedlichen Strukturen der Hülle

unterscheidet sich je nach Serotyp die Immunantwort des Wirtes auf die Infektion [15]. Auch

die Mortalität variiert zwischen den verschiedenen Serotypen. Während beispielsweise eine

nicht antibiotisch behandelte invasive Infektion mit Serotyp 2-Pneumokokken altersabhängig

zu einer Sterblichkeit zwischen 50 % und 89 % führt (Abbildung 2 A), haben Patienten aller

Altersgruppen bei einer unbehandelten Serotyp 3-Bakteriämie eine Mortalität von 96 bis 100 %

12-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70+

2 0

4 0

6 0

8 0

100

A lte r [in Ja h ren]

M ortalität [% ]

B a k te riä m ie

ke in e B a kte riä m ie

(Abbildung 2 B). Basierend auf den Polysacchariden der verschiedenen Kapsel-Typen wurden

Impfungen gegen die 23 bzw. 13 am häufigsten nachgewiesenen Serotypen entwickelt [16].

Eine Immunisierung schützt vor einer pulmonalen und systemischen Infektion und beugt der

Besiedlung des Nasopharynx und der damit verbundenen Verbreitung in der Gesellschaft vor.

Abbildung 2: Mortalität einer nicht antibiotisch behandelten Streptococcus

pneumoniae Pneumonie in Abhängigkeit von Alter und Nachweis der Erreger im Blut.

A) Serotyp 2. B) Serotyp 3. Modifiziert nach [7].

3.3 Therapie einer Lungenentzündung

In den letzten Jahren wurden diverse Studien und Übersichtsarbeiten veröffentlicht, die die

Lungenentzündung als Notfall beschreiben und die Bedeutung einer umgehenden Therapie

unterstreichen [5, 17, 18]. Daniel et al. konnten zeigen, dass hospitalisierte Patienten, die

innerhalb von vier Stunden eine antibiotische Behandlung erfahren hatten, eine signifikant

niedrigere Mortalität zeigten als diejenigen, die später therapiert worden waren [19]. Auch

Phua et al. beschrieben einen Zusammenhang zwischen einer frühen und aggressiven

medikamentösen Betreuung der Patienten und einer verminderten Sterblichkeitsrate [20]. Bei

bakteriellen Pneumonien wird in erster Linie mit antibiotischen Substanzen therapiert, um eine

schnelle Eliminierung der Pathogene zu ermöglichen. Die Wahl und Konzentration des

Antibiotikums richtet sich dabei nach der Schwere der Infektion, möglichen

Nebenerkrankungen und dem Alter des Patienten. Des Weiteren werden unkomplizierte

Lungenentzündungen, die keiner Hospitalisierung bedürfen, meist oral therapiert, während bei

schweren Verläufen intravenös behandelt wird. Das Mittel der Wahl sind dabei

Aminopenicillinpräparate, auch als β-Laktame bekannt [21]. Dabei handelt es sich um

Antibiotika, bei denen eine Aminogruppe an den Benzylrest des Penicillins angefügt wurde,

wodurch das Wirkspektrum dieser Therapeutika erweitert wird. Zur Gruppe der

Aminopenicilline gehören beispielsweise Ampicillin und Amoxicillin. Diese Antibiotika sind

bakteriolytisch und greifen bei der Teilung der Bakterien ein, indem sie die Ausbildung einer

12-29 30-49 50+

2 0

4 0

6 0

8 0

100

A lte r [Jah re ]

M ortalität [% ]

B a k te riä m ie ke in e B a kte riä m ie

12-29 30-49 50+

2 0

4 0

6 0

8 0

100

A lte r [Jah re ]

M ortalität [% ]

B a k te riä m ie ke in e B a kte riä m ie

A BSerotyp 2 Serotyp 3

neuen Mureinschicht durch die Blockierung des Enzyms D-Alanin-Transpeptidase inhibieren

[22]. Bei mittelgradigen bis schweren Verläufen oder Penicillin-Resistenzen werden häufig

zusätzlich Beta-Laktamase-Inhibitoren eingesetzt. Diese Präparate verhindern, dass das

bakterieneigene Enzym Beta-Laktamase das molekulare Grundgerüst des Penicillins auflöst

und somit die Wirkung des Antibiotikums hemmt. Bei schweren Verläufen wird empfohlen,

zusätzlich zum β-Laktam mit einem Makrolid zu behandeln [21]. Diese Antibiotikagruppe hat

neben ihrer bakteriostatischen Wirkung auch einen immunsupprimierenden Effekt [23, 24], der

bei Patienten mit einer inadäquat aktivierten Immunreaktion (Hyperinflammation) oftmals

hilfreich ist. Um eine zu unkontrollierte und damit schädigende Immunantwort einzudämmen,

wurde in den letzten Jahren an weiteren adjuvanten Therapiemöglichkeiten geforscht. So

wurde in einigen klinischen Studien an Patienten mit schwerer Pneumonie die Behandlung mit

Kortikosteroiden, in der Nebenniere gebildeten Steroidhormonen, untersucht und mit einer

niedrigeren Mortalität, einem geringeren Risiko für mechanische Beatmung (siehe 3.3.1) und

einem verkürzten Krankenhausaufenthalt in Verbindung gebracht [25, 26]. Bei Patienten mit

leichten bis mittelgradigen Pneumonien konnte dieser Effekt allerdings nicht beobachtet

werden, weshalb die Verwendung von Kortikosteroiden sich nicht als adjuvante Therapie, die

bei allen Patienten eingesetzt wird, durchsetzen konnte. Auch auf dem Schutz der

alveolokapillären Barriere (siehe 3.4) liegt ein Fokus der aktuellen Forschung. Beispielsweise

wird dem körpereigenen Peptid Adrenomedullin eine protektive Funktion zugeschrieben,

indem es die zellulären Verbindungen stärkt und somit der Bildung inter-endothelialer Spalten

entgegenwirkt [27-29]. In einigen Studien wurde auch eine immunmodulatorische Wirkung von

Adrenomedullin beschrieben [29, 30]. Andere Studien konnten diesen Effekt jedoch nicht

reproduzieren [31, 32]. Bisher wurden mit Adrenomedullin noch keine klinischen Studien an

Pneumonie-Patienten durchgeführt, weshalb eine Aussage über die Wirksamkeit im humanen

System zu diesem Zeitpunkt noch nicht getroffen werden kann.

3.3.1 Mechanische Beatmung und die beatmungsassoziierte Lungenschädigung

Eine weitere Behandlung, die bei vielen Patienten mit schwerer CAP und damit

einhergehender respiratorischer Insuffizienz eingesetzt wird, ist die invasive mechanische

Beatmung [33, 34]. Allerdings lässt sich beobachten, dass mit Einsatz einer mechanischen

Beatmung auch die Sterblichkeitsrate der Patienten ansteigt [35, 36]. Diese gesteigerte

Mortalität kann mit einer Schädigung des Lungengewebes in Verbindung gebracht werden, die

als ventilator-induced lung injury (VILI) bezeichnet wird. Aus diesem Grund wird heutzutage

nur mit einem Tidalvolumen von 6 mg/kg statt 10 – 15 mg/kg, einem Plateaudruck von unter

30 cmH2O und mit einem positiven endexspiratorischen Druck beatmet, um eine mechanische

Schädigung des Lungengewebes zu vermeiden. Allein durch diese Maßnahmen konnte die

Mortalität von Patienten mit einer akuten Lungenschädigung um 22 % gesenkt werden [37].

Die Grundlage dieser Untersuchung war, dass der starke mechanische Stimulus im Zuge der

Beatmung beim umliegenden Gewebe eine Umwandlung des Signals, verbunden mit einer

Ausschüttung inflammatorischer Mediatoren bewirkt – ein Vorgang, der Mechanotransduktion

genannt wird [38-40]. Obwohl durch die Vermeidung hoher Tidalvolumina VILI reduziert wird,

kann es doch nicht komplett vermieden werden. So sorgt auch eine protektive

Ventilationsstrategie für einen Anstieg inflammatorischer Mediatoren und einen Einstrom von

Neutrophilen (siehe 3.5.4). Auch ein systemischer Anstieg der Zytokinlevel, eine Schädigung

der alveolokapillären Barriere (siehe 3.4) und die Entwicklung von Lungenödemen kann im

Zusammenhang mit VILI beobachtet werden [41-43]. Häufig tritt bei Patienten, die eine

mechanische Beatmung erfahren, eine Schädigung sekundärer Organe, verbunden mit einem

erhöhten Risiko für die Entwicklung einer Sepsis auf [32, 44, 45]. Vor allem bereits

geschädigtes Lungengewebe im Zusammenhang mit einer Sepsis oder Pneumonie ist

besonders gefährdet, VILI zu entwickeln [46, 47].

3.4 Die alveolokapilläre Barriere

Im Zuge einer Pneumonie kann sich auch unabhängig von einer mechanischen Beatmung

eine lokale Infektion zu einer systemischen Inflammation entwickeln. Grundlage dafür ist

einerseits der aktive Übertritt der Bakterien in das Blutsystem des Wirts, andererseits eine

Schädigung der Barriere, die die Alveolen von den Kapillaren der Lunge trennt. Physiologisch

ermöglicht diese mechanische Barriere einen effizienten Gasaustausch und trennt das

Lungen- und Luftkompartiment vom Blut- bzw. Flüssigkeitskompartiment. Zellulär setzt sich

die alveolokapilläre Barriere aus Epithelzellen der Lungen und Endothelzellen der Kapillare

zusammen. Zwischen diesen Zellschichten befindet sich eine Basalmembran und interstitielles

Gewebe, das von einer alveolären Basalmembran flankiert wird (Abbildung 3). Dieses

Interstitium hat die Aufgabe, bei der Bildung eines pulmonalen Ödems die entstehende

Flüssigkeit zu sammeln. Dadurch bleibt die freiliegende Seite der Barriere trocken und es kann

weiterhin ein ungehinderter Gasaustausch erfolgen [48]. Die Endothelzellen auf der

vaskulären Seite der Barriere kontrollieren die Passage von zirkulierenden Zellen und

Proteinen in das angrenzende Gewebe.

Diese semipermeable Barriere sorgt dadurch für den Aufbau von osmotisch wirksamen

Protein-Gradienten, die für die Regulierung der Gewebsflüssigkeit essentiell ist.

Die alveolokapilläre Barriere ist auch von immunologischer Bedeutung, da durch sie das

unkontrollierte Übertreten von Pathogenen oder Immunzellen ins Blutsystem verhindert wird.

[49, 50]. Des Weiteren wird die Exsudation von Wasser oder wasserlöslichen Bestandteilen

von den Kapillaren in die Alveolen verhindert und der Abtransport von Flüssigkeiten aus dem

Alveolarraum von den Zellen der Barriere gefördert.

3.4.1 Das Endothel

Die endotheliale Permeabilität wird durch zwei Transport-Mechanismen ermöglicht: Gelöste

Stoffe oder Zellen können einerseits auf direktem Weg durch die Zelle hindurch (transzellulär),

andererseits zwischen den Zellen entlang (parazellulär) befördert werden. Die transzelluläre

Route erfordert entweder Poren oder ein komplexes System aus Vesikeln, die zu Kanälen

fusionieren können und so den Transport von Zellen oder Molekülen ermöglichen [51, 52]. Im

Gegensatz dazu wird der parazelluläre Weg durch koordiniertes Öffnen und Schließen der

Zell-Zell-Verbindungen zwischen den einzelnen Endothelzellen ermöglicht. Diese Funktion

verläuft streng reguliert, um die endotheliale Integrität zu bewahren [53, 54]. Biophysikalische

Prozesse (wie eine Dehnung des Gewebes) aber auch diverse Moleküle, zum Beispiel

Histamin, Thrombin oder vascular endothelial growth factor (VEGF) können zu einer

reversiblen Bildung parazellulärer Spalten führen [55, 56], die durch kontraktile Mechanismen

des Actin-Myosin-Komplexes entstehen [57]. Diese zeitweilige Permeabilität ermöglicht einen

schnellen Übertritt von Nährstoffen, verhilft Leukozyten zum Ort der Entzündung zu migrieren

und führt zur Akkumulierung von Fibrinogen an den Blutgefäßen für eine verbesserte Gewebe-

Reparatur. Histamin, VEGF und Thrombin haben einen unmittelbaren Effekt auf die

Permeabilität [55, 58], wohingegen inflammatorische Zytokine längere Zeit benötigen, um eine

Erhöhung der Permeabilität herbei zu führen. Dieser Effekt ist aber langlebiger und dauert bis

zu 48 h an [59].

Abbildung 3: Schematischer Aufbau der alveolokapillären Barriere.

Alveolarepithel

Basalmembran

Interstitium

Endothel

Blutkapillare

3.4.2 Das alveoläre Epithel

Das alveoläre Epithel dient als erste mechanische Barriere der unteren Atemwege gegen

Pathogene und kleidet alle der bis zu 400 Millionen Alveolen der Lunge aus, was einer Fläche

von 220.000 µm2 entspricht [60]. Man kann zwei alveoläre Epithelzellen-Arten unterscheiden:

Jede Alveole ist durchschnittlich von 40 Typ I Epithelzellen und 77 Typ II Epithelzellen

ausgekleidet, allerdings machen Typ I Zellen bis zu 95 % der zellulären Oberfläche aus [60].

Über ihre großflächige Struktur sorgen sie für den Gasaustausch zwischen Epithel und

Kapillaren. In Abbildung 4 ist die humane alveoläre Oberfläche dargestellt. In Gelb koloriert ist

in der Abbildung eine Typ I Epithelzelle zu erkennen, die über einem Netz von Kapillaren liegt

und deutlich großflächiger ist als die daneben liegenden Typ II Epithelzellen. Letztere sind

durch einen Ring an Mikrovilli gekennzeichnet, Strukturen, die der Oberflächenvergrößerung

der Zelle dienen. Die kubisch geformten Typ II Epithelzellen sind für die Sekretion von

Surfactant zuständig [61], einer oberflächenaktiven Substanz, die für eine Herabsetzung der

Oberflächenspannung zwischen Luft und Alveole sorgt und so das Zusammenfallen der

Lungen verhindert [62]. Typ II Epithelzellen spielen auch eine große Rolle bei

Reparaturprozessen in der Lunge, da sich aus ihnen neue Typ I Epithelzellen differenzieren

können [63, 64].

Neben ihrer Funktion als mechanische Barriere bei Infektionen haben Epithelzellen auch eine

tragende Rolle bei der Rekrutierung und Aktivierung von Immunzellen, indem sie Zytokine und

Chemokine (siehe 3.6) sekretieren [65-67]. Der Verbund der Epithelzellen wird, wie auch bei

Endothelzellen, durch tight- und adherens junctions vernetzt [68-71]. Durch diese engen

Verbindungen wird verhindert, dass Substanzen oder Zellen unkontrolliert die alveolokapilläre

Barriere übertreten [72]. Diese inter-endothelialen und -epithelialen Verbindungen öffnen sich

durch die Remodellierung von Molekülen wie VE-Cadherin (vascular endothelial cadherin)

[73]. Für eine optimale VE-Cadherin Funktion muss das Cadherin mit VE-PTP (vascular

endothelial protein tyrosine phosphatase) assoziiert sein, einem Protein der Endothel-

Membran. Die Separation von VE-PTP und VE-Cadherin kann beispielsweise durch die

Bindung von Leukozyten oder durch eine Stimulation mit VEGF initiiert werden [74]. Auch

während einer Infektion mit S. pn kommt es aufgrund von Dissoziationen der tight- und

adherens-junctions zu einer Erhöhung der vaskulären Permeabilität. Die erste Phase, die vor

allem der Rekrutierung von Leukozyten dient, ist reversibel. Allerdings folgen auf diese initiale

Phase oft irreversible Schädigungsprozesse am Epithel, die eine folgenschwere

Beeinträchtigung der alveolokapillären Barriere mit sich bringen [75]. Diese Prozesse sind

einerseits auf Pathogen-assoziierte Faktoren zurück zu führen, können aber auch durch eine

unkontrollierte Immunantwort des Wirts herbeigeführt werden. Diese Schädigung der Barriere

ist vor allem durch die Flutung der Alveolen mit proteinreicher Ödem-Flüssigkeit charakterisiert

[76]. Trotz effektiver antibiotischer Therapie (siehe 3.3) kommt es bei CAP-Patienten häufig zu

einer akuten Schädigung der alveolokapillären Barriere, dem Übertritt proteinreicher

Flüssigkeit in den Alveolarbereich, Ödembildung und schlussendlich zu einer mitunter

lebensbedrohlichen Lungenschädigung [77].

Abbildung 4: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der alveolären Oberfläche

einer humanen Lunge.

Zu sehen sind Kapillaren unter Typ I und Typ II Epithelzellen (Ep1 bzw. Ep2). Die Pfeile

markieren die gelb gefärbte Typ I Epithelzelle. Zwei Typ II Epithelzellen befinden sich in den

Nischen der Kapillaren und sind gekennzeichnet durch Mikrovilli. Entlang der Zellen sind

interzelluläre Zell-Zell-Verbindungen zu sehen. Reprinted with permission of the American

Thoracic Society. Copyright

make a good lung. Am J Respir Crit Care Med 2015, 191(5):504-513. [78]

3.5 Die Zellen des angeborenen Immunsystems

Wie gravierend sich eine Pneumonie nach einer Infektion mit S. pn. entwickelt, ist von zwei

Prozessen abhängig: der Resistenz des Immunsystems gegen den Erreger und der

Widerstandsfähigkeit der Gewebe des Wirts gegenüber Pathogen und wirtseigenen Faktoren

[79]. Eine Resistenz wird über die Reduktion der Pathogene bewirkt, bei Patienten in ärztlicher

Betreuung kann dies beispielsweise durch eine Antibiotika-Therapie geschehen. Diese

Aufgabe können auch die weißen Blutkörperchen (Leukozyten) erfüllen, Zellen des

Immunsystems, die im Zuge der Blutbildung (Hämatopoese) im Knochenmark gebildet werden

(siehe Abbildung 5). Dort bilden sich aus einer pluripotenten Vorläuferzelle zwei

Stammzellpopulationen: die myeloischen Vorläuferzellen, aus denen sich im Zuge der

Hämatopoese die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) und Blutplättchen (Thrombozyten,

siehe 3.5.4.3), aber auch Leukozyten entwickeln. B- und T-Lymphozyten entstehen aus

lymphoiden Vorläuferzellen. In welche Richtung sich die entsprechenden Vorläuferzellen

entwickeln, wird von den umgebenden Zytokinen bestimmt, die beispielsweise von

Endothelzellen und Makrophagen sekretiert werden. So bewirkt die Anwesenheit des

Granulocyte-Colony Stimulating Factors, (G-CSF) die Entwicklung von Neutrophilen (siehe

3.5.4), während der Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) eine Differenzierung zu

Monozyten (siehe 3.5.2) begünstigt.

Abbildung 5: Vereinfachtes Schema der Entwicklung von Blutzellen aus Stammzellen im

Knochenmark.

Aus einer pluripotenten Stammzelle entwickeln sich zwei Stammzelllinien (lymphatische und

myeloische Vorläuferzellen). Durch eine Vielzahl an Zytokinen werden die weiteren

Entwicklungsschritte bestimmt. Modifiziert nach [80]. Abkürzungen: IL= Interleukin, G-CSF=

Granulocyte-Colony Stimulating Factor, M-CSF= Macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF=

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

3.5.1 Alveoläre Makrophagen

Die ersten Zellen, auf die eindringende Pathogene in der Lunge treffen, sind Epithelzellen und

alveoläre Makrophagen (alvMs). Obwohl sie unter basalen Bedingungen etwa 90-95 % der

zellulären Bestandteile des Alveolarraums ausmachen, befindet sich nur in jeder dritten

Alveole ein alveolärer Makrophage [81].

Durch ihre phagozytotischen Eigenschaften können Makrophagen für die Abtötung erster

eindringender Pneumokokken sorgen [82]. Bei einer Pneumonie scheint aber die wichtigere

IL-17

IL-2, IL-4, IL-7

IL-11

IL-5

IL-3

G-CSF

GM-CSF

IL-3

G-CSF

M-CSF

IL-3

Aufgabe der alvMs in der Beseitigung zellulärer Überreste körpereigener Zellen, wie

apoptotischer Neutrophiler (siehe 3.5.4) zu liegen [83, 84]. Durch diese Phagozytose, dem

Umfließen und Verdauen von Partikeln oder Zellen, kann eine Schädigung des umliegenden

Gewebes durch teilweise toxische Zellbestandteile vermindert werden.

Alveoläre Makrophagen entstehen während der Embryogenese aus fetalen Monozyten [85].

Die Entwicklung von alvMs bei Erwachsenen wird seit Jahrzehnten in der Wissenschaft

diskutiert. Während einige Ergebnisse auf zirkulierende Monozyten aus dem Knochenmark als

Vorläufer für die residenten Makrophagen schließen lassen [86, 87], legen weitere Studien

nahe, dass sich alvMs selbst erneuern und Knochenmark-Zellen keinen Einfluss auf die

Entwicklung neuer AlvMs haben [85, 88-90].

Alveoläre Makrophagen, genauso wie die die Alveole auskleidenden Epithelzellen, werden

durch Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) aktiviert, was zu einer Stimulation

des Immunsystems über die Ausschüttung von Zytokinen wie IL-1 und IL-6 und anderen

inflammatorischen Mediatoren führt [91-93].

Alveoläre Makrophagen befinden sich über gap junctions in engem Kontakt mit den sie

umgebenden Epithelzellen. Eine Stimulation der Makrophagen über toll-like Rezeptoren

(TLRs) führt zu zyklischen und synchronisierten Ausschüttungen von in Makrophagen und

Epithelzellen gespeicherten Calcium-Ionen. Dadurch wird eine schnelle und weitreichende

Weiterleitung des Signals über viele Alveolen hinweg zu anderen alvMs ermöglicht [81].

3.5.2 Monozyten

Monozyten sind mononukleare myeloide Zellen, entwickeln sich also aus myeloischen

Stammzellen im Knochenmark. Sie zirkulieren in Blut und Knochenmark sowie in der Milz.

Monozyten können anhand der Expression des C-C-Chemokin Rezeptors Typ 2 (CCR2) und

des Oberflächenmarkers Ly6C unterschieden werden [94]. Die CCR2low und Ly6Clow

Monozyten werden in nicht-infizierte Gewebe rekrutiert, wo sie sich zu Makrophagen

differenzieren können. CCR2+ und Ly6Chigh Monozyten werden auch als inflammatorische

Monozyten oder inflammatorische Makrophagen (iMs) bezeichnet, da sie infolge einer

Infektion zum Ort der Entzündung migrieren.

Die Rekrutierung inflammatorischer Monozyten / Makrophagen bezeichnet wird durch CCR2

und seinen Liganden CCL2 koordiniert [95, 96]. IMs werden im Zuge einer Inflammation mit

Hilfe eines Chemokin-Gradienten aus dem Blut zum Entzündungsort rekrutiert, wo sie eine

wichtige Rolle in der Bekämpfung eingedrungener Pathogene spielen. Experimentell konnte

gezeigt werden, dass vermehrte Rekrutierung von Monozyten nach einer S. pn. Infektion durch

eine CCL2 Überexpression in alveolären Epithelzellen zu einer Verringerung der bakteriellen

Last und einer niedrigeren Mortalität führt. Allerdings entwickelten diese Versuchstiere eine

Entzündung der Bronchiolen, was auch auf eine starke gewebeschädigende Wirkung der

damit im Zusammenhang stehenden inflammatorischen Prozesse schließen lässt [96].

Rekrutierte Monozyten produzieren inflammatorische Mediatoren wir VEGF,

Tumornekrosefaktor (TNF) und reaktive Stickstoffspezies (NO) [97-99], phagozytieren aber

auch apoptotische Zellen oder toxische Moleküle [100]. Des Weiteren können sie zu Subtypen

von Dendritischen Zellen differenzieren [101].

3.5.3 Dendritische Zellen

Dendritische Zellen (DCs) sind eine heterogene Zellpopulation, entwickeln sich teilweise aus

Monozyten und haben als phagozytierende Zellen ebenfalls die Aufgabe der Beseitigung von

körperfremden Materialien, abgestorbenen Zellen und Pathogenen. Anschließend werden,

z. B. bei bakteriellen Infektionen, Moleküle der phagozytierten Bakterien zu Peptiden

prozessiert, auf den Haupthistokompatibilitätskomplex II (major histocompatibility complex,

MHCII) geladen und anschließend auf der Oberfläche der DCs präsentiert [102]. Nachdem die

aktivierten DCs in die drainierenden Lymphknoten gewandert sind, präsentieren sie dort

spezifischen T Zellen ihr Antigen und initiieren somit die adaptive Immunantwort [103]. DCs

fungieren somit als Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität.

3.5.4 Neutrophile Granulozyten

Polymorphkernige neutrophile Leukozyten (PMNs) sind die häufigsten Vertreter der weißen

Blutkörperchen (Leukozyten) in Säugetieren. Sie entwickeln sich aus Stammzellen im

Knochenmark, aus dem sie ins Blutsystem gelangen und dort zirkulieren, um schnell zum Ort

einer Infektion migrieren zu können.

3.5.4.1 Die Migration von Neutrophilen zur Entzündungsstelle

PMNs werden, wie alle Leukozyten mittels ihrer Oberflächenrezeptoren zur Entzündung

gelockt, indem sie auf Stimuli wie Chemokine und Komplement-Komponenten reagieren und

einem chemotaktischen Gradienten folgen. In der Maus dient vor allem der CXC-Motiv-

Chemokinrezeptor 2 (CXCR2, siehe 3.6.3) der Erkennung von rekrutierenden Chemokinen.

Nach der Bindung eines Liganden werden Integrine des Neutrophilen aktiviert, wodurch sich

das Zytoskelett verändert. Beim Übertritt der Neutrophilen vom Blutsystem in die Alveole

müssen sie Endothel und Epithel durchqueren. Dafür erfolgt zunächst über die Interaktion von

Selektinen und Integrinen die Adhäsion der Neutrophilen an das vaskuläre Endothel [104] und

anschließend eine trans- oder parazelluläre Migration der PMNs durch das Endothel (siehe

Abbildung 6).

Nach der darauffolgenden Wanderung durch das interstitielle Gewebe müssen die

Neutrophilen das Epithel überqueren. Dies erfolgt in den meisten Schritten analog zu der

Migration durch das Endothel, allerdings haben die Neutrophilen durch diese vorherigen

Aktionen und den Kontakt zu den Chemokinen bereits eine erste Aktivierung (Priming)

erfahren [105, 106]. Für die Migration adhärieren die PMNs an der basolateralen Oberfläche

der Epithelzellen, wobei hier im Gegensatz zur transendothelialen Überquerung keine

Selektine am Adhäsionsprozess beteiligt sind. Es wurde lange davon ausgegangen, dass die

Überquerung des Epithels nur über die parazelluläre Route erfolgt. Allerdings konnten neuere

Studien auch die transzelluläre Migration zeigen [107]. Nach der Migration adhärieren

Neutrophile auf der apikalen Seite der Epithelzellen [108]. Dadurch vermeiden sie, weggespült

zu werden und können mit der Phagozytose eingedrungener Pathogene beginnen.

Dieser Ablauf der einzelnen Migrationsschritte kann ohne eine Beeinträchtigung der

alveolokapillären Barriere erfolgen [109], allerdings scheinen stark aktivierte Neutrophile über

die Sekretion zytotoxischer Moleküle das Epithel bei der Durchquerung zu schädigen, indem

sie zur Beeinträchtigung der junction Proteine sowie zur Induktion von epithelialer Apoptose

führen [110-112]. PMNs scheinen mit der Entwicklung einer irreversiblen Barriere-Dysfunktion

in Verbindung zu stehen, beispielsweise indem sie und ihre Produkte die parazelluläre

Permeabilität erhöhen [113]. Da sie ebenfalls Chemokine und Zytokine sekretieren, sind sie

aktiv an der Rekrutierung und Aktivierung weiterer Immunzellen beteiligt (siehe Abbildung 6)

[114, 115].

Eine andere Studie zeigte, dass PMNs von einem inflammatorischen Status in einen anti-

inflammatorischen Status wechseln können, indem sie beispielsweise Lipide sekretieren, die

bei der Resolution der Inflammation helfen [116] (siehe Abbildung 6). Darüber hinaus ist über

diesen anti-inflammatorischen Einfluss von Neutrophilen in Entzündungen jedoch wenig

bekannt.

3.5.4.2 Phagozytose, Apoptose, NETose

Neutrophile beseitigen körpereigene apoptotische Zellen mittels Phagozytose (siehe 3.5.1,

alvMs). Pathogene können zusätzlich mittels reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS;

NO) oder über proteolytische Prozesse wie der Generation von neutrophil extracellular traps

(NETs) bekämpft werden (siehe Abbildung 6). Diese netzartigen Strukturen bestehen aus

adhäsiver Neutrophilen-DNA, Histonen und aktiven Proteasen, wodurch sie einen essentiellen

Beitrag bei der Bekämpfung diverser Mikroben leisten [117]. Neutrophile haben eine kurze

Lebensspanne, von meist nur wenigen Stunden [118], obwohl auch gezeigt werden konnte,

dass sie bis zu fünf Tage lang zirkulieren können [119]. PMNs sterben entweder durch

unkontrollierte Nekrose und Lyse oder durch programmierten Zelltod (Apoptose), der im Zuge

der NETose (NETs Produktion) geschehen kann. Die Apoptose ist stark reguliert und kann

durch intrinsische (mitochondriale) und extrinsische (über Stimuli von außen) Signalwege oder

aufgrund von vorheriger Pathogen-Phagozytose initiiert werden [120-122]. Während im Zuge

der Nekrose unkontrolliert pro-inflammatorische Moleküle wie beispielsweise HMGB1 (high

mobility group box 1) ausgeschüttet werden, wird dies im Zuge der Apoptose verhindert, da

hierbei die Zellmembran intakt bleibt. Neutrophile verändern während des Sterbeprozesses

ihre Oberflächenmarker, um von anderen Zellen (z. B. alvMs, siehe 3.5.1) effektiver gefunden

und phagozytiert werden zu können [123]. Das Entfernen von abgestorbenen Zellen ist dabei

essentiell für die Resolution einer Entzündung, da sterbende Neutrophile zu einer länger

anhaltenden Inflammation und Schädigung des umliegenden Gewebes führen können [124].

Abbildung 6: Funktionen der

Neutrophilen.

Nach der Migration phagozytieren

Neutrophile (PMNs) eingedrungene

Bakterien, produzieren NETs

(NETose), um Bakterien zu fangen

oder sekretieren Zytokine, um weitere

Immunzellen anzulocken. Nach der

Beseitigung der Bakterien können

PMNs in Apoptose gehen. Modifiziert

nach [125].

Journal of Experimental Medicine,

https://doi.org/10.1084/jem.20122220.

3.5.4.3 Neutrophil-Thrombozyt Interaktion

Blutblättchen (Thrombozyten) scheinen eine tragende Rolle bei der durch Neutrophile

verursachten Lungenschädigung zu spielen. PMNs und Thrombozyten interagieren im

Blutsystem, aber auch am Inflammationsort. Neutrophile formen über das Thrombozyten-

Oberflächenprotein P-Selektin Aggregate mit Blutblättchen [126], wodurch sich die

Aktivierungsgrade von beiden Zelltypen erhöhen und die inflammatorischen und

antibakteriellen Effekte verstärkt werden [127]. Diese Interaktion ist für das Immunsystem von

großer Wichtigkeit, beispielsweise indem Thrombozyten die vaskuläre Oberfläche absuchen,

Pathogene aufnehmen und darüber Neutrophile stimulieren. Dieser Prozess initiiert eine

verstärkte inflammatorische Reaktion der PMNs, was allerdings eine Gewebeschädigung

begünstigen kann [128]. ]. Der Prozess der NETose scheint durch die PMN-Thrombozyten

Interaktion verstärkt zu werden, wodurch die Ausbreitung bakterieller Infektionen verringert

werden kann [129]. Es konnte aber ebenfalls gezeigt werden, dass eine Thrombozyten-

Depletion eine Säure- oder Transfusions-induzierte Lungenschädigung vermindert [130].

3.6 Chemokine und ihre Rezeptoren

Auf der Oberfläche von Neutrophilen und anderen Immunzellen befinden sich eine Vielzahl

von Rezeptoren, die der Wahrnehmung der direkten Umgebung dienen. Damit Zellen des

Immunsystems zum Ort der Inflammation rekrutiert werden können, müssen Chemokine

erkannt werden. Dies geschieht über spezielle Chemokinrezeptoren. Bei Chemokinen handelt

es sich um chemotaktisch wirksame Zytokine, die Zielzellen zu einer gerichteten Bewegung

aus dem Blut zum Ort der Inflammation führen (Chemotaxis). Dabei orientieren sich die

rekrutierten Zellen entlang eines chemischen Chemokingradienten. Chemokinrezeptoren sind

G-Protein-gekoppelte Oberflächenrezeptoren mit sieben Transmembrandomänen, die nach

Bindung eines Liganden phosphoryliert werden [131]. Dadurch wird ein Einstrom von Calcium-

Ionen in die Zelle angeregt, wodurch intrazellulare Signalwege bis zur Aktivierung von

Integrinen und einer Veränderung des Zytoskeletts initiiert werden, die notwendig sind für die

Chemotaxis [132]. Chemokinrezeptoren werden je nach Art der Liganden in unterschiedliche

Subgruppen eingeteilt.

3.6.1 Chemokingruppen

Es sind etwa 50 unterschiedliche Chemokine bekannt, die in vier Chemokingruppen unterteilt

werden können. Die Gruppen haben eine stark konservierte Faltung (Tertiärstruktur),

unterscheiden sich aber am Amino-Terminus, wo Cysteinreste in verschiedenen Mengen und

Positionen vorkommen und ein oder zwei Disulfidbrücken ausbilden können (siehe Abbildung

7). Anhand dieser Cysteine lässt sich zwischen den vier Gruppen unterscheiden. Die Gruppe

der C-Chemokine (Abbildung 7 A) trägt nur ein Cystein am Amino-Terminus, welches nur eine

Disulfidbrücke ausbildet. Kommen zwei Cysteine direkt hintereinander vor, gehört das

Chemokin zu den CC-Chemokinen (Abbildung 7 B). Wenn sich zwischen den beiden

Cysteinen eine Aminosäure befindet, wird das Chemokin zur Gruppe der CXC-Chemokine

zugeordnet (Abbildung 7 C), bei drei Aminosäuren gehört es den CX3C-Chemokinen

(Abbildung 7 D). Diese letzten drei Gruppen zeichnen sich durch zwei Disulfidbrücken an den

Cysteinen aus [133]. Zur Nomenklatur der Chemokine dient die Zugehörigkeit zur

Chemokingruppe, verbunden mit einem L (Ligand) und einer fortlaufenden Nummerierung. Im

Zuge dieser Arbeit wird ein spezieller Fokus auf Chemokine der CXC-Chemokingruppe gelegt,

weshalb auf diese Familie und einen ihrer Rezeptoren in Kapitel 3.6.3 spezieller eingegangen

wird.

Abbildung 7: Einteilung der Chemokingruppen anhand von Cysteinresten und

Disulfidbrücken.

A. C-Chemokine tragen ein Cystein am Amino-Terminus, das eine Disulfidbrücke ausbildet. B.

CC-Chemokine haben zwei aufeinanderfolgende Cysteine. C. CXC-Chemokine weisen zwischen

den Cysteinen eine Aminosäure (X) auf. D. CX3C-Chemokine weisen drei Aminosäuren zwischen

den Cysteinen auf. Die Gruppen der CC-, CXC- sowie CX3C-Chemokine (B-D) bilden zwei

Disulfidbrücken aus. Modifiziert nach L. Kohidai, 2008.

3.6.2 Vom Stimulus zur Chemokinausschüttung

Damit das Immunsystem auf körperfremde Stoffe reagieren kann, müssen die Immunzellen

mittels Oberflächenrezeptoren durch externe Stimuli wie z. B. PAMPs aktiviert werden. PAMPs

sind Moleküle, die von Pathogenen exprimiert oder sekretiert werden und vom Immunsystem

des Wirts über Mustererkennungs-Rezeptoren (Pattern recognition receptors (PRRs)), wie

z. B. TLRs spezifisch erkannt werden können. Klassische PAMPs sind beispielsweise

Lipopolysaccharide (LPS) oder Endotoxine, die auf der Oberfläche gramnegativer Bakterien

vorkommen. Bei grampositiven Bakterien, wie S. pn. können Lipoproteine der Zellwand als

PAMPs wirken, indem sie an TLR-2 binden [134]. Auch das intrazellulare Toxin Pneumolysin

(PLY) ist ein potenter Immunstimulus, der von Pneumokokken produziert wird. PLY scheint

einerseits aktiv von S. pn. sekretiert zu werden, andererseits auch durch lytische Prozesse

(z. B. bei Therapie mit einem lytischen Antibiotikum) aus den Zellen zu gelangen [135, 136].

Hoch konzentriertes PLY lysiert Wirtszellen, während es niedriger dosiert die Expression vieler

immunmodulatorischer Gene initiiert [136-139]. PLY scheint von den Rezeptoren TLR-2 und -

4 erkannt zu werden [140], die unter anderem auf Makrophagen und Epithelzellen (siehe 3.4.2)

A B C

C-Chemokine CC-Chemokine CXC-Chemokine

CX3C-Chemokine

Mucinartige

Domäne

Peptidkette

Disulfidbrücke

zu finden sind. Die Aktivierung dieser Rezeptoren sorgt für eine Weiterleitung des Signals über

eine Signalkaskade ins Zellinnere (siehe Abbildung 8), wodurch schließlich eine Ausschüttung

inflammatorischer Mediatoren initiiert wird [141, 142]. In Abb. Abbildung 8 ist der Signalweg

nach TLR-Liganden-Bindung dargestellt: Bestandteile extrazellulärer Bakterien (z. B.

Lipoproteine) binden an den TLRs auf der Zelloberfläche von Immunzellen, wohingegen

einzelsträngige RNA / DNA oder doppelsträngige RNA intrazellulär von den TLRs 3, 7 / 8 oder

9 detektiert wird. Die zytosolischen Domänen der Rezeptoren rekrutieren im Anschluss an die

Liganden-Bindung Adapterproteine, beispielsweise den myeloid differentiation factor 88

(MyD88). Nur TLR3 scheint unabhängig von MyD88 zu agieren. Der MyD88-assoziierte

Signalweg führt zu einer Aktivierung von nuclear factor „kappa-light-chain-enhancer“ of

activated B-cells (NF-κB), einem Transkriptionsfaktor, dessen Proteine p65 (RelA) und p50 in

Folge einer Phosphorylierungsreaktion in den Zellkern wandern, um die Transkription und

Translation inflammatorischer Zytokine und Chemokine anzuregen [143]. Es konnte gezeigt

werden, dass NF-κB bzw. RelA in Epithelzellen essentiell ist für eine wirkungsvolle

Immunantwort nach Pneumokokken-Infektion [65, 144]. Dahingegen scheint in Makrophagen

vor allem die direkte und frühzeitige Immunreaktion RelA-abhängig zu sein, da in einzelnen

Infektionsexperimenten ein konditioneller RelA-Knockout in Makrophagen zu frühen

Zeitpunkten eine retardierte Rekrutierung der Neutrophilen und verminderte Zytokinlevel mit

sich brachte, zu späteren Zeitpunkten aber keine Unterschiede mehr zu sehen waren [145].

In einem geringeren Maße scheinen auch TLR- und MyD88-unabhängige Prozesse zu einer

Sekretion von Zytokinen oder Chemokinen wie CXCL5 zu führen. So konnte beispielsweise

eine Beteiligung des Transkriptionsfaktors STAT3 (signal transducer and activator of

transcription 3) an der IL-6 induzierten Sekretion von CXCL5 gezeigt werden [146].

Die tragende Rolle von TLRs in Infektionen zeigt sich bei Patienten mit genetischer Defizienz

von MyD88. Diese Patienten zeigen eine abgeschwächte Immunreaktion mit geringeren

Zytokin-Konzentrationen und einer erhöhten Rate invasiver Pneumonien [147, 148].

Abbildung 8: Signalkaskade nach toll-like Rezeptor (TLR) Aktivierung.

Abkürzungen: dsDNA: double-stranded deoxyribonucleic acid; dsRNA: double-stranded ribonucleic

acid; IRF: IFN regulatory factor; LPS: Lipopolysaccharid; MyD88: myeloid differentiation factor 88;

IFN: Interferon; NF-κB: nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B-cells; ssRNA:

single-stranded ribonucleic acid; TIR: Toll/interleukin-1 receptor; TIRAP: TIR domain-containing

adapter protein; TRAM: TRIF-related adaptor molecule; TRIF: TIR-domain-containing adaptor

protein-inducing IFN-β. Modifiziert nach [149].

nephrology and renovascular disease 2014, 7:241-251.

3.6.3 Die Rolle des Chemokinrezeptors CXCR2 und seiner Liganden

Auf der Oberfläche von Neutrophilen werden verschiedene Chemokinrezeptoren exprimiert,

unter anderem die CXC-Motiv-Chemokinrezeptoren 2 (CXCR2, auch als IL-8 Rezeptor

bekannt) und -4 (CXCR4) [150, 151]. Das Zusammenspiel dieser Rezeptoren reguliert die

Freisetzung von Neutrophilen aus dem Knochenmark. Während CXCR4 und sein Ligand

CXCL12 für einen Rückhalt der PMNs im Knochenmark sorgen, fungiert eine CXCR2-

Aktivierung durch die im Knochenmark produzierten Chemokine CXCL1 und CXCL2 für die

Freisetzung der Zellen ins Blut [151]. Diese Liganden, wie auch CXCL5, sind gekennzeichnet

durch die Anwesenheit des aus den Aminosäuren Glutamyl, Leucyl, Arginin bestehenden ELR-

Motivs (ELR+ Chemokine) und werden in der Maus nur von CXCR2 detektiert. Auf humanen

Neutrophilen wird zusätzlich CXCR1 exprimiert, an den ebenfalls ERL+ Chemokine binden

können. Dieser Rezeptor ist strukturell sehr ähnlich zu CXCR2 und scheint ebenfalls der

Neutrophile-Rekrutierung und -Aktivierung zu dienen [152].

Funktionell konnte in den letzten Jahren gezeigt werden, dass CXCR2 und seine Liganden,

z. B. CXCL1, CXCL2 und CXCL5, eine tragende Rolle bei der Rekrutierung von Neutrophilen

Lipoproteine Flagellin

Endosom Endosom

Zytoplasma

Zellkern

Inflammatorische

Zytokine und

Chemokine

IFN-β,

IFN-induzierte

Gene

IFN-α/IFN-β,

IFN-induzierte

Gene

und mesenchymalen Stammzellen in Tumorgewebe haben [153-155], wobei eine starke

Expression von CXCR2 oder CXCL5 in tumorösen Bereichen mit verringerten

Überlebenschancen assoziiert werden kann [156, 157].

Zu der Rolle von CXCR2 und seinen Liganden in Infektionen ist beispielsweise bekannt, dass

CXCL5 aufgrund vermehrter Infiltration von Neutrophilen zu einer Schädigung der Blut-Hirn-

Schranke nach einer LPS Stimulation im Gehirn beiträgt [158]. Des Weiteren konnte gezeigt

werden, dass ein Knockout von CXCR2 oder CXCL5 in einem Tuberkulose-Model vor einem

schadhaften Neutrophile-Influx und einer hohen Letalität schützt [67]. Allerdings wurde auch

vermehrt von einem protektiven Einfluss der ELR+ Chemokine berichtet: Bei einer Bakterien-

induzierten Darminfektion schützt der mittels CXCR2 eingeleitete Einstrom von Neutrophilen

vor der Ausbreitung der Bakterien und Diarrhö [159]. In einer murinen virusinduzierten

Enzephalomyelitis, einer entzündlichen Erkrankung des Zentralnervensystems, sorgt die

Infiltration von PMNs zwar für eine Schädigung der Blut-Hirn-Schranke, ermöglicht so aber

auch die Rekrutierung von virusspezifischen T-Zellen zum Ort der Infektion, sodass eine

Inhibition von CXCR2 in einer unkontrollierten Virusvermehrung und einer 100 %-igen

Mortalität resultiert [160]. Auch in einer Pseudomonas aeruginosa Pneumonie tragen CXCR2

und seine Liganden essentiell zur Rekrutierung von PMNs und Bakterienbekämpfung bei,

weshalb eine Neutralisierung von CXCR2 dazu führt, dass die Überlebenssrate der infizierten

Tiere stark sinkt [161].

Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die Neutrophile-rekrutierende Wirkung von CXCR2

und ELR+ Chemokinen entweder positiv oder negativ für die Bekämpfung und Resolution der

Erkrankung ist, was abhängig vom Pathogen zu sein scheint. Vor allem bei Infektionen, die

eine starke Reaktion des Immunsystems mit irreversibler Gewebeschädigung verursachen,

scheint eine Verminderung der Neutrophilenzahl durch Neutralisierung von Rezeptor oder

Liganden tendenziell eine verminderte Mortalität mit sich zu bringen [67].

4 Zielsetzung

Die Pneumonie ist mit ihrer unverändert hohen Morbidität und Mortalität immer noch eine der

der wichtigsten Infektionskrankheiten. Obwohl die vielen Forschungsergebnisse der letzten

Jahrzehnte zu einer Anpassung der Therapie geführt haben, sterben trotz adäquater

antimikrobieller Betreuung und Behandlung von Ko-Morbiditäten immer noch zu viele

Patienten.

Bei einer Pneumonie scheint oftmals eine lokale Hyperinflammation mit der Entwicklung einer

schädlichen systemischen Entzündung und Organschädigung assoziiert werden zu können.

Aus diesem Grund wird empfohlen, innerhalb von höchstens vier Stunden nach Einweisung

mit einer antibakteriellen Therapie zu beginnen. Die Bedeutung und die Auswirkungen der

frühen Intervention sollen im Zuge dieser Dissertation detailliert untersucht werden. Dazu

sollen S. pn.-infizierte Mäuse frühzeitig oder erst zu einem späten Zeitpunkt der Infektion mit

Ampicillin therapiert werden. Eine umfangreiche Analyse klinischer Parameter, der lokalen und

systemischen Immunantwort, der Integrität der alveolokapillären Barriere sowie

histopathologische Untersuchungen sollen vor Therapiebeginn und zu ausgewählten

Zeitpunkten während der Therapie durchgeführt werden. Dies ermöglicht die Untersuchung

des Verlaufs der Pneumonie in Abhängigkeit vom Zeitpunkt des Therapiebeginns. Durch

diesen Ansatz kann des Weiteren analysiert werden, welche Prozesse der Pneumokokken-

induzierten Inflammation durch eine antibiotische Therapie reversibel sind. Ebenso könnten

Hinweise darauf gefunden werden, welche irreversiblen Schädigungen vor Einsatz einer

antibakteriellen Therapie entstehen, die durch die Eliminierung des Pathogens nicht verringert

werden können.

Ferner soll in der vorliegenden Arbeit der Einfluss des Neutrophile-rekrutierenden Chemokins

CXCL5 auf die Schädigung der Lunge untersucht werden, und zwar sowohl bei einer

infektiösen Inflammation der Lunge nach S. pn. Infektion, als auch nach steriler Inflammation

im Zuge einer invasiven Beatmung mit hohem Tidalvolumen. Eine Reduktion der neutrophilen

Granulozyten, die bei diesen Modellen früh und in hoher Zahl in den Alveolarraum migrieren,

könnte zu einer Verminderung der Neutrophilen-assoziierten Schädigung des

Lungengewebes führen. Um diese Hypothese zu überprüfen, sollen Cxcl5-defiziente Mäuse

mit Pneumokokken infiziert oder mechanisch ventiliert werden. Da Neutrophile essentiell sind

für die Eliminierung von Pneumokokken, könnten verringerte PMN-Zahlen in der Lunge

infizierter Tiere zu einer erhöhten bakteriellen Last führen. Ob dies die Mortalität erhöht oder

die verminderte Gewebs- und Barriereschädigung zu einer Verbesserung des klinischen

Zustandes der infizierten Tiere führt, ist bisher noch unklar. Die Analyse klinischer Parameter,

der Immunantwort, der vaskulären Permeabilität sowie histopathologischer Merkmale einer

Lungenschädigung sollen bei beiden Formen der pulmonalen Inflammation Aufschluss

darüber geben, inwieweit die Abwesenheit von CXCL5 vorteilhaft oder von Nachteil ist.

Basierend auf den Ergebnissen, die im Zuge dieser Arbeit generiert werden, könnten Ansätze

für adjuvante Therapien gefunden werden. Diese könnten aufbauend auf einer antibakteriellen

Behandlung langfristig eine Verbesserung der Überlebensrate von Pneumonie-Patienten

herbeiführen.

5 Material und Methoden

5.1 Material

5.1.1 Geräte

Tabelle 1: Übersicht der verwendeten Geräte

Gerät

Bezeichnung

Hersteller

Analysewaage

Sartorius, MC 5(-OCE)

Sartorius AG (Göttingen)

Autoklav

Tuttnauer Systec 2540 EL

Systec GmbH (Wettenberg)

Beatmungspumpe Maus

flexiVent™

SCIREQ Scientific

Respiratory Equipment Inc.

(Kanada)

Brutschrank

Heraeus Typ BB 6220 O2

Kendro Laboratory Products

(Osterode)

Durchflusszytometer

BD FACSCanto™

BD (Heidelberg)

Hämatologiegerät

scil Vet abc

scil animal care company

GmbH (Viernheim)

Homogenisierer

gentleMACS™ Dissociator

Miltenyi Biotec (Bergisch

Gladbach)

Kaltlichtquelle

Flexilux 600 longlife

Hugo Sachs Elektronik

(March-Hugstetten)

Magnet für magnetische

Säulen

MidiMACS Separator

Miltenyi Biotec (Bergisch

Gladbach)

Magnet für Zellisolation

DynaMag - Spin magnet

Thermo Fisher Scientific

(USA)

Magnethalter

MACS MultiStand

Miltenyi Biotec (Bergisch

Gladbach)

Magnetrührer

Thermo Scientific™

Variomag Mono Direkt

Thermo Fisher Scientific

(USA)

Oximeter

MouseOX Plus

Hugo Sachs Elektronik

(March-Hugstetten)

pH-Meter

FiveEasy™ pH/mV-

Messgerät

Mettler-Toledo

Photometer

Multiskan™

Mikrotiterplatten-Photometer

Thermo Fisher Scientific

(USA)

Photometer

Scanning

Spectrophotometer, Uvikon

BioTek Instruments (USA)

Präparationsbesteck

Fine Science Tools GmbH

(Heidelberg)

Pumpe für gleichmäßige

Entleerung von Spritzen

Pump 11 Elite Infusion

Hugo Sachs Elektronik

(March-Hugstetten)

Säulen für magnetische

Zellisolierung

LS Columns

Miltenyi Biotec (Bergisch

Gladbach)

Sicherheitswerkbank

Hera Safe Typ HS 12

Kendro Laboratory Products

(Osterode)

Tension System

Flexcell® FX-5000TM

Tension Systems

Flexcell® International

Corporation (USA)

Thermometer

BAT-12 Microprobe

Thermometer

Physitemp Instruments, Inc.

(USA)

Trachealkanüle für Mäuse

Hugo Sachs Elektronik

(March-Hugstetten)

Vakuumpumpe

Vacusafe comfort

Integra Biosciences AG

(Schweiz)

Vortexer

Vortex-Genie 2® Model G-

560E

Scientific Industries, Inc.

(USA)

Wärmematten System

Homeothermic Blanket

Systems

Harvard Apparatus (USA)

Wärmematten System

Homeothermic Blanket

Systems

Harvard Apparatus (USA)

Wasserbad

SW23 Schüttelwasserbad

Julabo GmbH (Seelbach)

Zählkammer

Neubauer-Zählkammer

bright-line

LO-Laboroptik GmbH

(Friedrichsdorf)

Zellfilter für magnetische

Zellisolierung

Pre-Separation Filters

(30 µm)

Miltenyi Biotec (Bergisch

Gladbach)

5.1.2 Verbrauchsmaterialien

Tabelle 2: Übersicht der verwendeten Materialien

Material

Spezifikation

Hersteller

Dispenser-Spitzen (5/10 ml)

Combitips advanced®

Eppendorf AG (Hamburg)

Dynabeads für Endothelzell-

Isolation

Dynabeads Sheep anti-Rat

IgG

Thermo Fisher Scientific

(USA)

Dynabeads für Epithelzell-

Isolation

MagniSort™ Streptavidin

Negative Selection Beads

Thermo Fisher Scientific

(USA)

Einbettkassetten

Rotilabo, Carl Roth GmbH +

CO. KG (Karlsruhe)

Handschuhe

B. Braun (Melsungen)

Homogenisier Gefäße

gentleMACS™ M Tubes

Miltenyi Biotec (Bergisch

Gladbach)

Impfschlingen (1/10 µl)

Einmal-Impfschlingen

Sarstedt (Nümbrecht)

Kanüle 18 G

Sterican® G 18 × 1/2"

B. Braun (Melsungen)

Kanüle 20 G

Sterican® G 20 × 1/2"

B. Braun (Melsungen)

Kanüle 26 G

Sterican® G 26 × 1/2"

B. Braun (Melsungen)

Kanüle 27 G

BD Microlance™ 3

BD (Heidelberg)

Kapillarblutentnahmesystem

(für Serum)

BD Microtainer® SST™

Tubes

BD (Heidelberg)

Kapillarblutentnahmesystem

(mit EDTA)

Microvette® 500 µl

Sarstedt (Nümbrecht)

Kryo-Röhrchen (1 ml)

Thermo Fisher Scientific

(USA)

Küvetten

Halb-Mikro-Küvette, PS

Sarstedt (Nümbrecht)

Mikrotestplatte (96 Well)

Mikrotestplatte 96 Well, F

Sarstedt (Nümbrecht)

Reagenzgefäß

(0,5/1,5/2,0 ml)

Reagiergefäß SafeSeal

Sarstedt (Nümbrecht)

Reagenzgefäß (15/50 ml)

Falcon® konische

Zentrifugenröhrchen

Corning (USA)

Reagenzgefäß für FACS

Falcon® 5mL Round Bottom

High Clarity PP Test Tube

Corning (USA)

Serologische Pipetten

(2/5/10/25 ml)

Falcon® serologische

Einwegpipetten aus

Polystyrol

Corning (USA)

Spritzen (1 ml)

Omnifix® F Solo, 1 ml

B. Braun (Melsungen)

Spritzen (2/5/10 ml)

BD Discardit™ II

BD (Heidelberg)

Vakuum Filter System

Filtropur V50 500ml 0.22µm

Sarstedt (Nümbrecht)

Zellkulturflasche, 75 cm2

TC-Flasche T75,Standard

Sarstedt (Nümbrecht)

Zellkulturplatte

(6/12/24/48/96 Well)

Falcon® Multiwell-

Zellkulturplatten

Corning (USA)

Zellkulturschale, 8 cm2

TC-Schale 35, Standard

Sarstedt (Nümbrecht)

Zellsiebe (40/70/100 µm)

EASYstrainer™ Zellsiebe

Greiner Bio-One

(Österreich)

5.1.3 Reagenzien

Tabelle 3: Übersicht der verwendeten Reagenzien

Reagenz

Hersteller

Ampicillin

Ratiopharm (Ulm)

Bovines Serumalbumin (BSA)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen)

cOmplete™, Mini Protease Inhibitor Cocktail

Roche Diagnostics GmbH (Mannheim)

CountBright™ Absolute Counting Beads

Thermo Fisher Scientific (USA)

Dulbecco’s Phosphatgepufferte Salzlösung

(1 × PBS)

Thermo Fisher Scientific (USA)

Ethanol, absolut reinst

Merck (Darmstadt)

FACSFlow™

BD (Heidelberg)

FACS™ Shutdown Solution

BD (Heidelberg)

Formaldehyd-Lösung, gepuffert (4 %)

AppliChem (Darmstadt)

Hämalaunlösung, sauer nach Mayer

Carl Roth (Karlsruhe)

Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS),

ohne CaCl2 und MgCl2 (HBSS-/-)

Thermo Fisher Scientific (USA)

Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS),

versetzt mit CaCl2 und MgCl2 (HBSS+/+)

Thermo Fisher Scientific (USA)

Heparin 25000 I.E., 5 ml

Ratiopharm (Ulm)

Humanes Serumalbumin (20 %), HSA

CSL Behring (USA)

Isotonische Kochsalzlösung 0,9 %

Fresenius Kabi (Langenhagen)

Kanadabalsam

Carl Roth (Karlsruhe)

Opti-MEM®

Thermo Fisher Scientific (USA)

Perjodsäure, ≥ 99 %

Carl Roth (Karlsruhe)

Prostaglandin I2 Natriumsalz (PGI2)

Merck (Darmstadt)

Schiffs Reagenz

Carl Roth (Karlsruhe)

Thilo Tears Augengel

Alcon Pharma GmbH(Freiburg im Breisgau)

Tween® 20

Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen)

Xylol

Carl Roth (Karlsruhe)

5.1.4 Antikörper

Tabelle 4: Übersicht der verwendeten Antikörper

Spezifität

Klon

Fluorochrom

Konzentration

Hersteller

CD11b

M1/70

PE-Cy7

0,2 mg/ml

BD (Heidelberg)

CD11c

N418

Cy5

1 mg/ml

ATCC (USA)

CD11c

HL3

APC

0,2 mg/ml

BD (Heidelberg)

CD144

11D4.1

unkonjugiert

125 µg/ml

BD (Heidelberg)

CD16/32

2.4G2

biotinyliert

0,5 mg/ml

BD (Heidelberg)

CD31

MEC13.3

biotinyliert

15,6 mg/ml

BD (Heidelberg)

CD45

30-F11

FITC

0,5 mg/ml

BD (Heidelberg)

CD45

30-F11

biotinyliert

0,5 mg/ml

BD (Heidelberg)

F4/80

BM8

0,2 mg/ml

Thermo Fisher

Scientific (USA)

Ly6C

AL-21

V450

0,2 mg/ml

BD (Heidelberg)

Ly6C

HK1.4

BV510

0,1 mg/ml

BioLegend (USA)

Ly6G

1A8

PerCP-Cy5.5

0,2 mg/ml

BD (Heidelberg)

MHCII

M5/114.15.2

AF700

0,2 mg/ml

Thermo Fisher

Scientific (USA)

Siglec F

E50-2440

BV421

0,5 mg/ml

BD (Heidelberg)

TLR2

T2.5

unkonjugiert

0,2 µg/ml

Thermo Fisher

Scientific (USA)

5.1.5 Enzyme

Tabelle 5: Übersicht der verwendeten Enzyme

Enzym

Hersteller

Apyrase

Merck (Darmstadt)

Dispase

Corning (USA)

DNase I

AppliChem (Darmstadt)

Kollagenase II

Biochrom (Berlin)

5.1.6 Narkose und Heparin

Tabelle 6: Übersicht und Zusammensetzung der verwendeten Narkotika und Heparin

Narkose-Mix für Analyse

9 ml

NaCl 0,9 %

B. Braun (Melsungen)

2 ml

Ketamin (100 mg/ml)

Bela-pharm (Vechta)

1 ml

Xylazin 2 %

CP-Pharma (Burgdorf)

Ulmer-Mix für Infektion

3 ml

NaCl 0,9 %

B. Braun (Melsungen)

3 ml

Ketamin (100 mg/ml)

Bela-pharm (Vechta)

2,4 ml

Xylyzin 2 %

CP-Pharma (Burgdorf)

Narkose-Mix für Ventilierung

1 ml

NaCl 0,9 %

B. Braun (Melsungen)

2 ml

Fentanyl (0,5 g/ml)

Ratiopharm (Ulm)

1 ml

Medetomidin (1 mg/ml)

CP-Pharma (Burgdorf)

2 ml

Midazolam (5 mg/ml)

Ratiopharm (Ulm)

Heparin-Gemisch

2 ml

NaCl 0,9 %

B. Braun (Melsungen)

2 ml

Heparin (5.000 U/ml)

Ratiopharm (Ulm)

5.1.7 Medien und Puffer

Tabelle 7: Übersicht und Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer

RPMI-10 Complete Medium (cRPMI)

RPMI 1640

PAA Laboratories GmbH

(Österreich)

10 %

FCS, Hitzeinaktiviert

CAPRICORN Scientific

(Ebsdorfergrund)

1 %

HEPES Puffer (1 M)

Life Technology (USA)

1 %

L-Glutamin (200 mM, 100 ×)

Life Technology (USA)

1 %

Penicillin/Streptomycin

10.000 U/ml

Life Technology (USA)

FACS Puffer

1 × PBS

Thermo Fisher Scientific

(USA)

0,2 %

BSA

Sigma-Aldrich Chemie

GmbH (Taufkirchen)

Wachstumsmedium für Bakterien (THY+Yeast)

0,5 %

Bacto™ Technischer Hefeextrakt

BD (Heidelberg)

3 %

Bacto™ Todd Hewitt Bouillon

BD (Heidelberg)

H2O (destilliert)

B. Braun (Melsungen)

Einfriermedium für Bakterien

20 %

Glycerin

Merck (Darmstadt

80 %

THY+Yeast

Eigene Herstellung

Red Blood Cell Lysis buffer

1000 ml

H2O (destilliert)

B. Braun (Melsungen)

1 g

KHCO3 (10 mM)

Merck (Darmstadt

8.29 g

NH4Cl (0.15 M)

Merck (Darmstadt

1%-ige Paraformaldehyd (4% PFA) Lösung, methanolfrei

36 ml

1 × PBS

Thermo Fisher Scientific

(USA)

1 ml

Formaldehyd, methanolfrei,

37 %

Carl Roth (Karlsruhe)

T7 Wachstumsmedium

DMEM

Life Technology (USA)

10 %

FCS, Hitzeinaktiviert

CAPRICORN Scientific

(Ebsdorfergrund)

1 %

HEPES, 1 M

Life Technology (USA)

1 %

Insulin-Transferrin-Selenium

Supplements

Thermo Fisher Scientific

(USA)

1 %

L-Glutamin, 209 mM

Life Technology (USA)

DMEM-10 Complete Medium (cDMEM)

DMEM

Life Technology (USA)

10 %

FCS, Hitzeinaktiviert

CAPRICORN Scientific

(Ebsdorfergrund)

1 %

HEPES, 1 M

Life Technology (USA)

1 %

L-Glutamin, 209 mM

Life Technology (USA)

Endothelzell-Wachstumsmedium

Endothelial Cell Growth Medium

MV2

PromoCell

10 %

FCS, Hitzeinaktiviert

CAPRICORN Scientific

(Ebsdorfergrund)

1 %

Penicillin/Streptomycin

10.000 U/ml

Life Technology (USA)

MACS Puffer

1 × PBS

Thermo Fisher Scientific

(USA)

0,5 %

BSA

Sigma-Aldrich Chemie

GmbH (Taufkirchen)

2 mM

EDTA

Thermo Fisher Scientific

(USA)

ACD Puffer

111 mM

D-Glukose

Sigma-Aldrich Chemie

GmbH (Taufkirchen)

85 mM

tri-Natriumcitrat-Dihydrat,

C6H5Na3O7 × 2 H2O

Merck (Darmstadt)

67 mM

Zitronensäuremonohydrat,

HOC(COOH)(CH2COOH)2 × H2O

Merck (Darmstadt)

CGS Puffer

0,033 M

M-Glukose

Sigma-Aldrich Chemie

GmbH (Taufkirchen)

0,123 M

Natriumchlorid, NaCl

Carl Roth (Karlsruhe)

0,013 M

tri-Natriumcitrat-Dihydrat,

C6H5Na3O7 × 2 H2O

Merck (Darmstadt)

Auf einen pH von 6,5 einstellen

Tyrodes Puffer

0,35 %

BSA

Sigma-Aldrich Chemie

GmbH (Taufkirchen)

2 mM

Calciumchlorid Dihydrat,

CaCl2×2H2O

Merck (Darmstadt)

5,5 mM

D-Glukose

Sigma-Aldrich Chemie

GmbH (Taufkirchen)

10 mM

HEPES

Life Technology (USA)

2,7 mM

Kaliumchlorid, KCl

Merck (Darmstadt)

1 mM

Magnesiumchlorid Hexahydrat;

MgCl2×6 H2O

AppliChem (Darmstadt)

137 mM

Natriumchlorid, NaCl

Carl Roth (Karlsruhe)

0,3 mM

Natriumdihydrogenphosphat-

Monohydrat, NaH2PO4×H2O

Merck (Darmstadt)

11,9 mM

Natriumhydrogencarbonat,

NaHCO3

Merck (Darmstadt)

VILI Puffer

487,5 ml

Jonosteril®

Fresenius Kabi (Bad

Homburg vor der Höhe)

12,5 ml

Tham Köhler

Köhler Pharma (Alsbach-

Hähnlein)

5.1.8 Bakterienstämme

Tabelle 8: Übersicht der verwendeten Bakterienstämme

Bezeichnung

Serotyp

NTCC

D39

NCTC 7466

PN36

NCTC 7978

5.1.9 Zelllinien

Tabelle 9: Übersicht der verwendeten Zelllinien

Bezeichnung

Herkunft

Hersteller

T7 (ECACC

07021402)

Typ II alveoläre

Epithelzellen aus

H 2Kb-tsA58 Mäusen

ECACC (UK)

5.1.10 Kits

Tabelle 10: Übersicht der verwendeten Kits

Bezeichnung

Hersteller

Anti-Ly-6G MicroBead Kit, mouse

Miltenyi Biotec (Bergisch

Gladbach)

Foxp3/Transcription Factor

Staining Buffer Set

Thermo Fisher Scientific (USA)

Human Albumin ELISA Kit

Bethyl Laboratories (USA)

Mouse Albumin ELISA Kit

Bethyl Laboratories (USA)

Mouse CXCL1/KC DuoSet ELISA

R&D Systems (USA)

Mouse CXCL2/MIP-2 DuoSet

ELISA

R&D Systems (USA)

Mouse LIX DuoSet ELISA

R&D Systems (USA)

Mouse VEGF DuoSet ELISA

R&D Systems (USA)

ProcartaPlex® Multiplex

Immunoassay

Thermo Fisher Scientific (USA)

5.1.11 Software

Tabelle 11: Übersicht der verwendeten Software

Bezeichnung

Hersteller

GraphPad Prism, V7

Graphpad Software

FACS Diva

BD (Heidelberg)

FlowJo, V10

FlowJo, LLC

FX-5000TM software

Flexcell® International

Corporation (USA)

scil vIP Manager, V2.0

scil animal care company GmbH

(Viernheim)

SkanIt, 4.1

Thermo Fisher Scientific (USA)

5.2 Methoden

5.2.1 Anzucht von Streptococcus pneumoniae

5.2.1.1 Kryokonservierung von Streptococcus pneumoniae

Es wurden Kryostocks der Stämme D39 und PN36 angelegt. Dafür wurden die Pneumokokken

mit Hilfe einer 1 µl Impfschlinge auf Blutagarplatten aufgebracht und über Nacht (ü.N.) bei

37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Einzelne Kolonien wurden auf neue Blutagarplatten übertragen

und für 8 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Alle Kolonien einer Platte wurden in ein 1 ml

Kryoröhrchen mit 1 ml Gefriermedium überimpft und bei -80 °C bis zur Verwendung gelagert

5.2.1.2 Zucht von Streptococcus pneumoniae für Infektionsversuche

Mit einer 1 µl Impfschlinge wurde Bakterienmaterial aus dem gefrorenen Stock auf fünf

Blutagarplatten ausgestrichen und bei 37 °C und 5 % CO2 für 8 h inkubiert. Anschließend

wurden Einzelkolonien in 18 ml THY + Yeast, versetzt mit 2 ml hitzeinaktiviertem FCS,

übertragen, bis eine optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge (OD600nm) von 0,03 - 0,04 erreicht

wurde. Die anschließende Inkubation im Wasserbad erfolgte bei 37 °C, bis die Bakterien die

exponentielle Wachstumsphase erreichten (OD600nm = 0,3 - 0,4). Anschließend wurde die

Flüssigkultur bei 2000 × g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert, der Überstand

verworfen und das Bakterienpellet in 20 ml warmen 1 × PBS aufgenommen. Nach erneuter

Zentrifugation wurden die Bakterien in 1 ml 1 × PBS resuspendiert und durch Bestimmung der

OD die Anzahl Kolonie bildender Einheiten (colony forming units, CFUs) bestimmt, wobei eine

OD600nm von 0,1 einer Konzentration von 1 × 108 CFU/ml entspricht. Die Bakteriensuspension

wurde mit 1 × PBS auf die für den jeweiligen Versuch gewünschte Konzentration verdünnt und

zur Kontrolle in 1:10 Verdünnungsschritten auf Blutagarplatten aufgetragen. Die Auszählung

der Kontrollplatten erfolgte am nächsten Tag.

5.2.2 Tierexperimentelle Untersuchungen

5.2.2.1 Versuchstiere

Für die Untersuchung der Pneumokokken-Pneumonie in Abhängigkeit von unterschiedlichen

Zeitpunkten der Antibiotikagabe wurden 8 Wochen alte weibliche Mäuse des Stammes

C57BL/6N von Charles River Laboratories (Sulzfeld) bezogen.

Zur Untersuchung der Entwicklung eines Lungenschadens in Abhängigkeit von CXCL5 in der

Pneumokokken-Pneumonie und unter mechanischer Beatmung wurden neben Wildtyp (WT)

Mäusen des Stammes C57BL/6J auch Cxcl5 Knockout (Cxcl5−/−) Tiere mit diesem Stamm als

Hintergrund verwendet. Der Cxcl5−/− Stamm wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Stefan

H.E. Kaufmann am Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie (Berlin) generiert und uns

freundlicherweise zur Verfügung gestellt [67].

5.2.2.2 Tierhaltung

Für unsere tierexperimentellen Arbeiten wurde die Zucht der Cxcl5 Wildtyp (WT) und Cxcl5−/−

Stämme in der Forschungseinrichtung für Experimentelle Medizin der Charité

Universitätsmedizin Berlin verlegt.

Der Transport der Mäuse erfolgte 5 – 7 Tage vor Versuchsstart, um den Tieren eine Adaption

an den Tierstall im Labor zu ermöglichen. Bis zu fünf Mäuse wurden nach ihrer Ankunft

gemeinsam in individuell ventilierte, mit Filterhauben ausgestattete Käfige gesetzt, wo ihnen

Wasser und Futter ad libitum zur Verfügung stand. Ein Wechsel zwischen Hell- und

Dunkelphasen erfolgte im 12-Stunden Rhythmus. Tiere unterschiedlicher experimenteller

Gruppen wurden in getrennten Käfigen gehalten.

5.2.2.3 Versuchsgruppen

Für das Modell der retardierten Ampicillin-Therapie wurden die in Tabelle 12 dargestellten

Versuchsgruppen zu den angegebenen Zeitpunkten untersucht. Ein Schema des Ablaufes von

Infektion und antibakterieller Therapie ist in Abbildung 9 dargestellt.

Tabelle 12: Versuchsgruppen Pneumokokken-Pneumonie und Ampicillin-Therapie

Infektion

Behandlung

Behandlungsstart

(h p.i.)

Analyse Zeitpunkt

(h p.i.)

PBS

24, 48

5 × 106 S. pn ST3

24, 48

5 × 106 S. pn ST3

0,9 % NaCl

36, 48, 60, 72

5 × 106 S. pn ST3

0,4 mg Ampicillin

36, 48, 60, 72, 96, 120

5 × 106 S. pn ST3

0,9 % NaCl

60, 72

5 × 106 S. pn ST3

0,4 mg Ampicillin

60, 72, 96, 120

Für das Modell der Pneumokokken-Pneumonie in Abhängigkeit von CXCL5 wurden die in

Tabelle 13 dargestellten Gruppen untersucht.

Tabelle 13: Versuchsgruppen Pneumokokken-Pneumonie in Abhändigkeit von CXCL5

Genotyp

Infektion

Analyse Zeitpunkt (h p.i.)

Cxcl5 WT

PBS

Cxcl5 WT

5 × 106 S. pn ST2

Cxcl5−/−

PBS

Cxcl5−/−

5 × 106 S. pn ST2

Zur Untersuchung der akuten Lungenschädigung unter mechanischer Beatmung in

Abhängigkeit von CXCL5 und Neutrophilen wurden die in Tabelle 14 gelisteten

Versuchsgruppen analysiert.

Tabelle 14: Versuchsgruppen mechanische Beatmung in Abhängigkeit von CXCL5 und Neutrophilen

Genotyp

Behandlung

Beatmungsmodus

Cxcl5 WT

NV (10 min)

Cxcl5 WT

HVT (4 h)

Cxcl5−/−

NV (10 min)

Cxcl5−/−

HVT (4 h)

NV = nicht ventiliert, HVT = ventiliert mit hohem Tidalvolumen

5.2.2.4 Infektion der Tiere

Vor der Infektion wurden Körpertemperatur und Gewicht bestimmt. Anschließend erfolgte die

Einleitung der Narkose entsprechend des Gewichtes durch Verabreichung des Ulmer-Mixes

mit 80 mg/kg Ketamin und 25 mg/kg Xylazin, welcher intraperitoneal (i.p.) appliziert wurde.

Nach Feststellung der ausreichenden Narkose-Tiefe durch Überprüfung des Zwischenzeh-

Reflexes wurde den Tieren zum Schutz der Kornea Augensalbe aufgetragen, bevor sie an den

oberen Schneidezähnen hängend in einer Infektionsbox fixiert wurden. Es folgte eine

tropfenweise Verabreichung von 10 µl Bakteriensuspension (2,5 × 108 CFU/ml) pro

Nasenloch. Die Infektion der Kontrollgruppen verlief analog mit 10 µl 1 × PBS pro Nasenloch.

Anschließend wurden die Mäuse in den Käfigen bis zum Erwachen unter Rotlicht gestellt und

regelmäßig überwacht.

5.2.2.5 Behandlung mit Ampicillin

Die Therapie der S. pn.-infizierten Tiere mit 0,4 mg Ampicillin in 150 µl 0,9 % NaCl startete

24 h bzw. 48 h nach der Infektion (post infectionem, p.i.). Sie erfolgte intraperitoneal (i.p.) und

in 12 h-Intervallen. Kontrollgruppen wurden analog mit 0,9 % NaCl behandelt (Abbildung 9).

Abbildung 9: Infektion und Therapie mit Ampicilin.

Beginn der Ampicillin-Therapie erfolgte 24 h bzw. 48 h nach der Infektion mit 5 × 106 CFU S. pn. oder

der Kontrollinfektion mit 1 × PBS. Zur Kontrolle wurden S. pn.-infizierte Tiere mit 150 µl 0,9 % NaCl

i.p. behandelt. Die Analyse der Gruppen, die keine oder nur Lösungsmittel-Therapien erhielten,

erfolgte bis 72 h p.i. Mit Ampicillin behandelte Tiere wurden bis zum Zeitpunkt 120 h p.i. analysiert.

Abkürzung: S. pn. – Streptococcus pneumoniae; p.i. - post infectionem

5.2.2.6 Überwachung des Infektionsverlaufs

Beginnend 24 h p.i. wurden alle Gruppen der Experimentreihe für frühzeitige und verspätete

antibakterielle Therpie im 12 h Intervall über den gesamten Versuchszeitraum überwacht.

Dafür wurde neben Gewichts- und Temperaturmessung das äußere Erscheinungsbild und das

Verhalten der Mäuse beobachtet und die Atmung kontrolliert. Wenn dabei festgestellt wurde,

dass die Krankheit bei einzelnen Tiere weit fortgeschritten und das Leiden nicht mehr ethisch

vertretbar war, erfolgte umgehend eine Euthanasie mittels Narkotisierung und anschließender

zervikalen Dislokation. Zur Beurteilung dieses Zeitpunktes wurde nach Empfehlung des

Arbeitskreises Berliner Tierschutzbeauftragter ein Score Sheet erstellt, mit dessen Hilfe die

Belastung dokumentiert und Abbruchkriterien festgelegt wurden. Eine Übersicht dieses

Scoring Systems ist Tabelle 15 zu entnehmen. Folgende Handlungsanweisungen wurden

beachtet: Erfüllt das Tier Symptome der Kategorie A oder B wird es weiter beobachtet. Sobald

das Tier ein Symptom der Kategorie C aufweist, muss es unverzüglich schmerzlos

euthanasiert werden.

Infektion

5 × 106 CFU

S. pn. / PBS

+/- Ampicillin / 0,9 % NaCl (alle 12 Stunden)

Analyse-Zeitpunkte in Stunden p.i.

120

Tabelle 15: Handlungsanweisung zur klinischen Beurteilung infizierter Tiere

Symptom

Kategorie

Tier isoliert sich

Struppiges / ungepflegtes Fell

Verhaltens-/ und Haltungsauffälligkeiten

Augen (krustige Belege, Augenausfluss)

Atmung n/t/s *

/ B/ C

Krämpfe, Torkeln, Apathie

Schmerzen (gekrümmte Haltung oder Leib aufgezogen, Laufen auf

Zehenspitzen)

Tier vermeidet Bewegung / Reaktionsminderung auf äußeren Reiz

Fehlstellung der Zähne

Äußere Veränderungen:

Verletzungen Hautveränderungen (A)

Abszesse, äußerlich sichtbare Infektionen, Ödeme, Automutilation (B)

A/ B

Hautfalten bleiben stehen

Leib hart und aufgetrieben

Körpertemperatur-Bestimmung [°C]

Hypothermie (Körperkerntemperatur < 35 °C)

Körpermasse-Bestimmung [g]

Körpermasseabnahme ab 10 %

Körpermasseabnahme ab 20 %

Körpermasseabnahme ≥ 25 %

Legende: * Atmung: n = normal; t = beschleunigt oder flach (Kategorie B); s = schwerfällige

oder stark pumpende Atmung (Kategorie C)

5.2.3 Analyse der Tiere und Probenentnahme

5.2.3.1 Vorbereitung der Tiere

Zum festgelegten Analyse Zeitpunkt wurden die Mäuse ein letztes Mal auf die in Tabelle 15

aufgelisteten Symptome untersucht und anschließend durch intraperitoneale Verabreichung

des Narkose-Mixes (160 mg/kg Ketamin, 75 mg/kg Xylazin, verdünnt in 0,9 % NaCl)

entsprechend ihres Körpergewichtes narkotisiert. Nach Feststellung einer ausreichenden

Narkosetiefe durch Testung des Zwischenzeh-Reflexes wurden die Tiere auf einer

Styroporunterlage fixiert und mit 70 %-igem EtOH benetzt. Die Bauchhöhle wurde vorsichtig

geöffnet, wonach aus der Vena cava caudalis und mit Hilfe einer 27 G Kanüle Blut entnommen

wurde. Durch diese finale Blutabnahme wurde ein sofortiger Herz- und Kreislaufstillstand

gewährleistet.

5.2.3.2 Verarbeitung des Blutes

50 µl des entnommenen Blutes wurden in ein mit EDTA behandeltes Blutentnahmesystem

gegeben, das restliche Volumen zur Gewinnung von Serum in ein Serum separator tube

gefüllt. Dieses wurde für 30 min bei RT inkubiert und bei 13.000 × g für 2 min bei RT

zentrifugiert, bevor das Serum in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und bis zur weiteren

Analyse bei -80 °C gelagert wurde. In dem mit EDTA versetzten Blut wurde mit Hilfe eines

Hämatologiegerätes Leukozyten, Monozyten und Granulozyten im Blut gemessen und der

Hämatokrit bestimmt. Des Weiteren wurde zur Bestimmung der bakteriellen Last das Blut pur

und in 1:10 Verdünnungen auf Blutagarplatten gebracht und über Nacht bei 37 °C und 5 %

CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurden die gewachsenen Kolonien ausgezählt. Für die

Untersuchung des akuten Lungenschadens in Abhängigkeit von CXCL5 wurde kein Serum

gewonnen, sondern das Plasma aus dem mit EDTA versetzten Blut untersucht. Dafür wurden

die EDTA-Röhrchen bei 2.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und das Plasma bis zur

weiteren Analyse bei -80 °C gelagert.

5.2.3.3 Durchführung der bronchoalveoären Lavage

Zur Freilegung der Trachea wurde ein medianer Hautschnitt bis zum Kopf der Maus

durchgeführt und das Gewebe oberhalb der Trachea entfernt. Zwei 1 ml Spritzen wurden mit

jeweils 800 µl 1 × PBS, versetzt mit Protease-Inhibitor, befüllt. Eine 18 G Kanüle wurde die

Trachea eingeführt, eine Spritze aufgesetzt und die Lunge vorsichtig gespült. Nach dem

Wechsel der Spritzen erfolgte eine erneute Spülung. Die Lavageflüssigkeit (BAL) wurde pur

und in 1:10 Verdünnungen auf Blutagarplatten gebracht und über Nacht bei 37 °C und 5 %

CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurden die gewachsenen Kolonien ausgezählt. Die BAL

wurde für 5 min bei 400 × g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand (BAL fluid, BALF) wurde bei

-80 °C bis zur weiteren Analyse gelagert, das Zellpellet (BAL cells, BALC) in 100 µl FACS

Puffer resuspendiert und bis zur Antikörper-Färbung (siehe 5.2.5) in einem Reaktionsgefäß für

FACS auf Eis gelagert.

5.2.3.4 Verarbeitung der Lunge

Die Lunge wurde mit Hilfe einer 10 ml Spritze und einer 27 G Kanüle über das Herz mit 5 ml

1 × PBS perfundiert, woraufhin alle Lungenlappen bis auf den linken Lungenlappen (Pulmo

sinister) und den rechten mittleren Lappen (Lobus medius) in 1 ml 1 × PBS mit Hilfe des

gentleMACS™ Dissociators homogenisiert wurden. Die Suspension wurde pur und in 1:10

Verdünnungen auf Blutagarplatten gebracht und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

Am folgenden Tag wurden die gewachsenen Kolonien ausgezählt.

5.2.3.5 Verarbeitung der Milz

Die Milz wurde in 1 ml 1 × PBS mit Hilfe des gentleMACS™ Dissociators homogenisiert. Die

Suspension wurde pur und in 1:10 Verdünnungen auf Blutagarplatten gebracht und über Nacht

bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurden die gewachsenen Kolonien

ausgezählt.

5.2.4 Mechanische Ventilationsversuche

5.2.4.1 Anfangs-Präparation

Nach einer Gewichtsbestimmung der Maus wurden entsprechend ihres Gewichtes das

Narkosegemisch für die Ventilierung (siehe Tabelle 6) verabreicht (Fentanyl (0,05 mg/kg),

Midazolam (5 mg/kg) und Medetomidin (0,5 mg/kg)). Nach Feststellung der ausreichenden

Narkose-Tiefe durch Überprüfung des Zwischenzeh-Reflexes wurde die Maus unterhalb des

Beatmungsgerätes fixiert. Zur durchgängigen Bestimmung der Körpertemperatur wurde rektal

eine Temperatursonde eingeführt. Anschließende Schritte der Anfangs-Präparation wurden

von Dr. med. vet. Sandra-Maria Wienhold durchgeführt. Um im Laufe des

Ventilationsexperimentes weiterhin Narkose verabreichen zu können, wurde ein

intraperitonealer Narkose-Katheter gelegt. Die Trachea wurde freigelegt und vorsichtig

geöffnet. Anschließend wurde eine Trachealkanüle in die generierte Öffnung eingeführt und

fixiert, woraufhin eine Beatmung mit einem niedrigen Tidalvolumen (LVT, 9 ml/kg) gestartet

wurde. In die anschließend freigelegte Halsschlagader (Arteria carotis) wurde ein Katheter zur

fortlaufenden Versorgung mit VILI-Puffer (siehe Tabelle 7) gelegt. Ein Blasenkatheter diente

dem Auffangen von Urin.

5.2.4.2 Ventilation

Die Ventilation erfolgte unter gleichbleibenden Bedingungen für 10 min (Gruppe: NV) oder mit

einem hohen Tidalvolumen (33 ml/kg) für 240 min (Gruppe: HVT). Der positive

endexspiratorische Druck (PEEP) betrug 2 cm/H2O, der Anteil am inspiratorischen Sauerstoff

(fraction of inspired oxygen (FiO2)) 0,5. VILI-Puffer wurde über einen Katheter zur

Halsschlagader mittels einer elektrischen Pumpe mit einer Flussrate von 350 µl/h konstant

zugeführt. Alle 10 min wurden Blutdruck (gemessen durch einen Druckaufnehmer über den

Katheter in der Halsschlagader), Atem- und Herzfrequenz notiert. Über das FlexiVent® wurden

der peak inspiratory pressure (PIP) und die Compliance im 10 min Intervall gemessen. Um

eine ausreichende Narkosetiefe über den Versuchszeitraum gewährleisten zu können, wurde

im weiteren Verlauf abhängig von der Narkosetiefe über den i.p. Katheter Narkosegemisch

verabreicht (30 % der Ausgangsdosis). Um die Integrität der alveolokapillären Barriere mittels

ELISA bestimmen zu können, wurden 90 min vor Versuchsende 1 mg humanes

Serumalbumin (HSA) in 75 µl 0,9 % NaCl intraarteriell über den Carotiskatheter bzw.

intravenös über die laterale Schwanzvene (i.v., NV-Gruppe) appliziert.

5.2.4.3 Beendigung der Ventilation und Probenentnahme

Nach 4-stündiger Beatmung wurden 50 µl des Narkosegemisches für die Ventilierung über

den i.p. Katheter appliziert. Nach weiteren 5 min erfolgte eine Verabreichung von 50 µl

Heparin-Gemisch (siehe Tabelle 6) über den Carotiskatheter. Über den selben Katheter wurde

nach einer 5-minütigen Wartezeit mit Hilfe einer 1 ml Spritze, die ein halbes EDTA-Plättchen

enthielt, Blut entnommen, bis ein Herz- und Kreislaufstillstand gewährleistet war. Das Blut

wurde in ein EDTA-Gefäß überführt um mit Hilfe eines Hämatologiegerätes Immunzellen zu

bestimmen. Im Anschluss wurde das Blut zentrifugiert (2.000 × g, 10 min, 4 °C) und das

Plasma für weitere Analysen bei -80 °C gelagert. Die Maus wurde vom FlexiVent® entfernt,

woraufhin eine eine bronchoalveoläre Lavage durchgeführt wurde. Diese wurde zentrifugiert

(400 × g, 5 min, 4 °C), der Überstand bei -80 °C eingefroren und die Zellen für die Analyse der

Immunzellen in 100 µl FACS-Puffer aufgenommen (siehe 5.2.5).

5.2.5 Färbung der BAL-Zellen für durchflusszytometrische Untersuchungen

Die Zellen der BAL wurden mit 10 µl aCD16/CD32 Antikörper für 5 min auf Eis inkubiert, um

unspezifische Bindungsstellen abzudecken. Die Färbung der Oberfläche erfolgte mit den

Antikörpern antiCD11c-Cy5 (aCD11c; 1:250), aCD11b-PE-Cy7 (1:200), aF4/80-PE (1:125),

aLy6G-PerCP-Cy5.5 (1:200), aLy6C-V450 (1:125) und aMHCII-Alexa Fluor 700 (1:666) für

20 min bei 4 °C. Bei Versuchen mit Cxcl5−/− und Cxcl5 WT erfolgte eine Oberflächenfärbung

nach analogen Bedingungen mit den Antikörpern aCD11c-APC (1:250), aCD11b-PE-Cy7

(1:200), aF4/80-PE (1:125), aCD45-FITC (1:400), aLy6G-PerCP-Cy5.5 (1:200), aLy6C-BV510

(1:200), aMHCII-Alexa Fluor (1:666) und aSiglec F-BV421 (1:125). Im Anschluss erfolgte eine

Zentrifugation der Proben mit 1 ml 1 × PBS (400 × g, 5 min, 4 °C). Der Überstand wurde

verworfen und die Zellen in 300 µl 1 %-igem PFA aufgenommen. Nach einer Inkubation ü.N.

bei 4 °C wurde 2 ml FACS Puffer zu den Zellen gegeben, woraufhin sie erneut zentrifugiert

wurden (400 × g, 5 min, 4 °C). Nach einem erneuten Waschen der Zellen mit 2 ml FACS Puffer

wurden die Zellen in 100 µl FACS Puffer aufgenommen. Zur Bestimmung der Zellzahl wurden

50 µl CountBright™ Absolute Counting Beads, welche zuvor 1:10 verdünnt wurden, zu den

Zellen gegeben. Die einzelnen Zellpopulationen wurden wie in Abbildung 10 dargestellt

anhand ihrer Oberflächenmarker charakterisiert.

Abbildung 10: Gating Strategien zur Untersuchung bronchoalveolären Lavage.

Charakterisierung der einzelnen Leukozyten-Populationen anhand ihrer Oberflächenmarker im A. Modell

einer frühen und späten antibakteriellen Therapie und B. nach S. pn.-Infektion oder mechanischer

Ventilation von Cxcl5─/─ und WT Tieren..

SSC

FSC

CD11c

CD11b

Ly6G

F4/80

Ly6C

F4/80 CD11b

CD11b MHCII

Von 1

Von 2 Von 3

Von 6 Von 7

1 –Leukozyten

4–Alveoläre Makrophagen

5–Neutrophile

8 –inflammatorische Monozyten / Makrophagen

FSC-A

SSC-A

FSC-A

FSC-H

CD45

CD11c

CD11b

Siglec F

F4/80

CD11b

MHCII

Ly6G

CD11b

Siglec F

CD11b

F4/80

CD11b

Ly6C

MHCII

Von 1 Von 2

Von 3

Von 4

Von 7

Von 5

Von 10

Von 11

12 13

Von 12

1 –Leukozyten

3 –CD45+ Leukozyten

6 –Alveoläre Makrophagen

8 –Dendritische Zellen

9 –Neutrophile

13 –inflammatorische Monozyten / Makrophagen

Von 2 Von 3

5.2.6 Histologische Untersuchungen

Für die histopathologischen Untersuchgen der Mauslungen wurden die infizierten bzw.

beatmeten Tiere wie in 5.2.3.1 beschrieben mittels finaler Blutabnahme euthanasiert. Die

Trachea wurde abgebunden, um einen Lungenkollaps zu vermeiden. Nach dem Öffnen des

Thorax wurden die Lungen ohne vorherige Lavage oder Perfusion vorsichtig entnommen und

in Einbettkassetten für 24 h bei RT in 4 %-igem Formalin fixiert. Nachfolgende Schritte wurden

in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Gruber an der Freien Universität Berlin durchgeführt. Die

Lungen wurden in Paraffin eingebettet und in 2 µm dünne Schnitte zerteilt. Die Schnitte wurden

mit Hematoxylin & Eosin (H & E) gefärbt, wie bereits in [162] und [163] beschrieben. Pro Lunge

wurden drei Abschnitte mikroskopisch von den Veterinärmedizinerinnen Dr. Corinne Gunther

oder Dr. Kristina Dietert ausgewertet, um die Ausbreitung und Stärke pathologischer

Veränderungen zu bewerten. Dazu wurden folgende spezifische Inflammationsparameter für

die Lunge ausgewertet: Bereich der betroffenen Lunge; Verteilungen der Läsionen;

peribronchiale, interstitielle und intra-alveoläre Inflammation; alveoläre Nekrose; perivaskuläre

Inflammation und Ödembildung; Infiltration von Immunzellen; alveoläres Ödem; Pleuritis und

Steatitis, wie bereits in [164] beschrieben. Ein Lungen-Inflammationsscore wurde aus dem

Durchschnitte der folgenden Parameter, die je nach Ausprägung auf einer Skala von 0 (nicht

betroffen) bis 4 (hochgradig) eingestuft worden sind, erstellt: Ausprägung der Inflammation,

Immunzellinfiltration, Pleuritis und Steatitis. Alveoläres und perivaskuläres Ödem wurden auf

einer Skala bis 5 (massiv) bewertet.

Bei mechanisch ventilierten Tieren wurde neben einer H & E Färbung zur verbesserten

Darstellung von Bindegewebe, Basalmembran und Zellwänden zusätzlich eine PAS (periodic

acid-Schiff) Reaktion durchgeführt. Dazu wurden die Lungenschnitte entparaffiniert, wozu sie

für jeweils 15 min bei 70 °C zunächst dreimal in Xylol und anschließend in einer absteigenden

Alkoholreihe (100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 0 %) inkubiert wurden. Anschließend erfolgte eine

5-minütige Inkubation der Schnitte in 1 %-iger Perjodsäure bei RT, woraufhin sie in

destilliertem Wasser gespült und für anschließend für jeweils 5 min in Schiffs Reagenz, H2O

und Hämalaun gelagert wurden. Daraufhin erfolgte das Bläuen der Schnitte in H2O. Nach einer

aufsteigenden Alkoholreihe zur Entwässerung (jeweils für 15 min bei 70 °C in 70 %, 80 %,

96 % und 100 % Alkohol) wurden die Schnitte in Xylol aufgehellt und in Kanadabalsam

eingebettet.

5.2.7 Ermittlung der vaskulären Permeabilität

Murines Serumalbumin (MSA) wurde im Plasma bzw. Serum sowie in der bronchoalveolären

Lavageflüssigkeit der Mäuse mittels Mouse Albumin ELISA Kit nach Herstellerangaben

quantifiziert. Bei Versuchen mit mechanischer Ventilierung wurde 90 min vor Beendigung des

Beatmungsversuchs 1 mg Humanes Serumalbumin (HSA) in 75 µl 0,9 %-igem NaCl i.v.

verabreicht. Die HSA Konzentration wurde mit Hilfe des Human Albumin ELISA Quantitation

Set nach Herstellerangaben bestimmt.

Zur Ermittlung der vaskulären Permeabilität wurde folgende Formel genutzt:

𝑃𝑒𝑟𝑚𝑒𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡ä𝑡 = 𝑐 (𝑀𝑆𝐴 ⁄ 𝐻𝑆𝐴)𝐵𝐴𝐿𝐹

𝑐 (𝑀𝑆𝐴 ⁄ 𝐻𝑆𝐴)𝑆𝑒𝑟𝑢𝑚 ⁄ 𝑃𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎

5.2.8 Quantifizierung von Chemokinen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren

Chemokine, Zytokine und Wachstumsfaktoren wurden in der BALF und dem Plasma bzw.

Serum der Versuchstiere oder im Zellkultur-Überstand nach Herstellerangaben folgender Kits

quantifiziert:

Tabelle 16: Übersicht der verwendeten ELISA Kits

Analyt

Kit (Hersteller)

CXCL1

Mouse CXCL1/KC DuoSet ELISA (R&D Systems)

CXCL2

Mouse CXCL2/MIP-2 DuoSet ELISA (R&D Systems)

CXCL5

Mouse LIX DuoSet ELISA (R&D Systems)

VEGF

Mouse VEGF DuoSet ELISA (R&D Systems)

IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p40, TNF-α,

IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, CCL2,

CCL3

ProcartaPlex® Multiplex Immunoassay (Thermo

Fisher Scientific)

5.2.9 In vitro Versuche

5.2.9.1 Kultivierung von T7 Zellen

Die gefrorenen Zellen wurden in einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut und in ein 50 ml

Reaktionsgefäß mit 15 ml T7 Wachstumsmedium überführt. Nach einer 5-minütigen

Zentrifugation (400 x g, RT) wurde der Überstand verworfen, die Zellen erneut in 10 ml T7

Wachstumsmedium aufgenommen und wiederholt zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 20 ml

T7 Wachstumsmedium aufgenommen und in einer 75 cm2 Zellkulturflasche bei 37 °C und 5 %

CO2 inkubiert. Zum Aufteilen in neue Zellkulturflaschen oder Zellkulturplatten wurden die

Zellen mit 37 °C warmen 1 × PBS gewaschen und anschließend mit 2 ml Trypsin / EDTA

versetzt. Nach einer 2minütigen Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion mit T7

Wachstumsmedium gestoppt und die Zellsuspension in ein 50 ml Reaktionsgefäß überführt.

Nach der Zentrifugation (400 x g, 5 min, RT) wurde der Überstand entfernt, die Zellen in 1 ml

T7 Wachstumsmedium aufgenommen und nach einer 1:50-Verdünnung in eine neue 75 cm2

Zellkulturflasche überführt. Für weiterführende Experimente wurden die Zellen in Opti-MEM®

aufgenommen, mit Hilfe von Tryptanblau ausgezählt und in Zellkulturplatten eingebracht.

5.2.9.2 Stimulation oder Infektion von T7 Zellen

Für Infektionsversuche wurden die Zellen in einer Konzentration von 2 × 105/ml in

Zellkulturplatten eingebracht und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, bis sie einen konfluenten

Zellrasen gebildet hatten. Die Bakterien für eine Infektion der Zelllinie wurden analog zu den

in vivo Infektionsversuchen ohne Zugabe von FCS gezüchtet (siehe 5.2.1.2) und in einer

Konzentration von 1 × 107/ml in Opti-MEM® aufgenommen. Für eine Multiplizität der Infektion

(MOI) von 1 wurden 10 µl der Bakteriensuspension pro Well einer 24-Well Zellkulturplatte auf

die Zellen gegeben und für 24 h bei 37 °C und 5 % CO2 stimuliert. Die Überstände wurden

abgenommen und bis zur Quantifizierung der sekretierten Proteine (siehe 5.2.8) bei -20 °C

gelagert.

Für eine Blockierung des toll-like Rezeptors 2 (TLR2) vor der Infektion wurden nach

Erneuerung des Kulturmediums 0,05 µg aTLR2 (T2.5) Antikörper pro Well einer 24-Well

Zellkulturplatte eingebracht und für 30 min unter gleichbleibenden Bedingungen vor der S. pn.-

Infektion inkubiert. Zur Kontrolle der Infektionsdosis wurde die Bakteriensuspension pur und

in 1:10 Verdünnungen auf Blutagarplatten gebracht und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2

inkubiert. Am folgenden Tag wurden die gewachsenen Kolonien ausgezählt.

Zur Simulation einer mechanischen Ventilation in vitro wurden T7 Zellen in einer Konzentration

von 1 × 105/ml in Opti-MEM®, versetzt mit 1 % Penicillin / Streptomycin aufgenommen. 2 ml

der Zellsuspension wurden in jedes Well einer Kollagen IV-beschichteten flexiblen Membranen

einer BioFlex® Zellkulturplatte gebracht und bis zur Bildung eines konfluenten Zellrasens bei

37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach der Erneuerung des Mediums wurden die Zellen bei 37 °C

und 5 % CO2 mit Hilfe des Flexcell® FX-5000TM Tension Systems mit einer Frequenz von

0,25 Hertz (Hz) und einer Elongation von 18 % zyklisch gedehnt. Als Kontrolle dienten analog

behandelte, unter statischen Konditionen inkubierte T7 Zellen. Die Überstände wurden

abgenommen und bis zur Quantifizierung der sekretierten Proteine (siehe 5.2.8) bei -20 °C

gelagert.

5.2.9.3 Isolation und Infektion muriner vaskulärer Endothelzellen

Die Mäuse wurden wie in 5.2.3.1 beschrieben narkotisiert und durch eine finale Blutabnahme

aus der Vena Cava euthanasiert. Die Lunge wurde freigelegt, nach Entfernung von

umgebendem Fettgewebe, Herz und Thymus vollständig entnommen und in HBSS-/-

gewaschen. Das Lungengewebe wurde in 1 – 2 mm3 große Stücke zerschnitten, in 10 ml

Verdau-Lösung überführt und für 60 min im 37 °C warmen Wasserbad inkubiert. In der

Inkubationszeit wurden 35 mm2 Zellkulturschalen bei RT für 60 min mit 1 ml Fibronektin

beschichtet und die magnetischen Beads vorbereitet. Dazu wurden pro Mauslunge 3 µl

Dynabeads in 1000 µl HBSS+/+ + 0,5 % BSA in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und am

Magneten platziert, sodass sich die Beads an der Rückwand des Reaktionsgefäßes

anlagerten. Der Überstand wurde verworfen, das Reaktionsgefäß vom Magneten entfernt und

erneut 1000 µl HBSS+/+ + 0,5 % BSA zu den Beads gegeben. Dieser Waschvorgang wurde

dreimal durchgeführt, bevor die Beads im ursprünglichen Volumen (4 µl / Maus) aufgenommen

und mit 2,5 µl aCD144 Antikörper pro Lunge versetzt wurden. Die Suspension wurde für

60 min bei RT in einem Schüttler inkubiert, anschließend wie bereits beschrieben dreimal am

Magneten gewaschen in 100 µl HBSS+/+ + 0,5 % BSA aufgenommen.

Im Anschluss an die Inkubation der Lunge im Wasserbad wurden die Gewebestücke mit einer

10 ml Pipette für 5 min auf- und abpipettiert, um die Zellen aus dem Gewebe zu lösen.

Anschließend wurde die Zellsuspension durch ein 70 µm in ein 50 ml Reaktionsgefäß mit

10 ml Endothelzell-Wachstumsmedium überführt und bei 400 × g für 5 min bei 4 °C

zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet in 10 ml HBSS+/+ + 0,5 % BSA

aufgenommen und erneut zentrifugiert. Die Zellen wurden in 700 µl HBSS+/+ + 0,5 % BSA

resuspendiert und mit den zuvor gewaschenen und mit Antikörpern inkubierten Dynabeads

vermengt. Nach einer 30minütigen Inkubation bei RT wurde die Suspension auf vier 1,5 ml

Reaktionsgefäße überführt und in jeweils 1 ml HBSS+/+ + 0,5 % BSA aufgenommen. Die Zellen

wurden wie bereits beschrieben dreimal gewaschen, bevor die Zellen in 1 ml HBSS+/+ + 0,5 %

BSA aufgenommen und in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß zusammengeführt wurden. Nach

einem letzten Waschvorgang mit Hilfe des Magneten wurden die Zellen in 1 ml Endothelzell-

Wachstumsmedium aufgenommen und in die mit Fibronektin beschichtete 35 mm2

Zellkulturschale eingesäht. Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 wurde

das Medium erneuert. Dies erfolgte alle 48 h, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht

hatten. Für Infektionsversuche wurden die Zellen mit Hilfe von Trypsin / EDTA analog zum

Protokoll für T7 Zellen auf 24-Well Zellkulturplatten aufgeteilt (siehe 5.2.9.1). Wenn die

Endothelzellen einen konfluenten Zellrasen gebildet hatten, wurden sie mit 1 × PBS

gewaschen und mit 500 µl Opti-MEM® versetzt. Nach einer 3-stündigen Inkubation wurden

die Endothelzellen analog zu den T7 Zellen für 24 h mit S. pn. stimuliert, bevor der Überstand

abgenommen und bis zur Messung der Proteine bei -20 °C aufbewahrt wurde.

5.2.9.4 Isolation und Infektion alveolärer Epithelzellen

Die Mäuse wurden wie in 5.2.3.1beschrieben narkotisiert und durch eine finale Blutabnahme

aus der Vena Cava euthanasiert. Zur Freilegung der Trachea wurde ein medianer Hautschnitt

bis zum Kopf der Maus durchgeführt und das Gewebe oberhalb der Trachea entfernt. Die

Lunge wurde über das Herz mit 5 ml HBSS-/- gespült. Mit Hilfe einer 18 G Kanüle wurden über

die Trachea vorsichtig 1,5 ml Dispase-Lösung (500 U) in die Lunge eingebracht, woraufhin die

Spritze schnell gewechselt wurde, um anschließend 500 µl einer flüssigen 1 %-igen

Agaroselösung zu applizieren. Nachdem sich diese verfestigt hatte, wurden Herz und Thymus

entfernt, die mit Dispase und Agarose gefüllte Lunge herauspräpariert, dreimal in HBSS-/- auf

Eis geschwenkt und in einem 15 ml Reaktionsgefäß mit 1 ml Dispaselösung bedeckt bei RT

für 40 min inkubiert. 24,5 ml cDMEM wurden mit 2,5 mg DNase versetzt. Im Anschluss an die

Inkubation wurde die Lunge in eine 60 mm Petrischale mit 5 ml dieser Verdaulösung überführt.

Mit Hilfe von zwei Pipetten wurden die Zellen aus dem Lungengewebe geklopft. Anschließend

wurde die Zellsuspension mit einer 10 ml Pipette auf- und abpipettiert und durch ein 100 µm

Zellsieb gegeben, um die Zellen zu vereinzeln. Nach einer 5-minütigen Zentrifugation (200 × g,

4 °C) wurde das Pellet in 1,5 ml cDMEM + 10 % FCS aufgenommen. Der Überstand wurde

erneut zentrifugiert und das Pellet mit den Zellen der vorherigen Zentrifugation

zusammengeführt. Die Zellen wurden mit Hilfe von Tryptanblau quantifiziert, woraufhin pro

1 × 107 Zellen für die spätere Negativselektion jeweils 10 µl unkonjugiertes aCD45, aCD16/32

und aCD31 zu der Zellsuspension gegeben und für 30 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert

wurden. In dieser Zeit wurden 10 µl der magnetischen Beads pro 1 × 107 Zellen wie in 5.2.9.3

beschrieben dreimal mit jeweils 1 ml 1 × PBS am Magneten gewaschen und anschließend in

100 µl 1 × PBS aufgenommen. Im Anschluss an die Inkubation wurde die Zellsuspension mit

20 ml cDMEM versetzt und zentrifugiert (5 min, 200 × g, 4 °C). Der Überstand wurde

verworfen, das Pellet in 25 ml cDMEM aufgenommen, erneut zentrifugiert und in 1,5 ml

cDMEM resuspendiert. Zusammen mit den vorbereiteten Beads wurden die Zellen für 15 min

bei RT inkubiert, auf zwei 1,5 ml Reaktionsgefäße aufgeteilt und an einen Magneten platziert.

Da hier eine Negativselektion angewendet wurde, wurden die Zellsuspension mit den Zellen,

die nicht am Magneten gebunden waren in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Zellen am

Magneten wurden erneut in 1 ml cDMEM aufgenommen und am Magneten platziert. Der

Überstand wurde ebenfalls in das 15 ml Reaktionsgefäß gegeben, mit 10 ml cDMEM + 10 %

FCS versetzt und bei 200 × g und 4 °C für 5 min zentrifugiert. Die Zellen wurden in 1 ml

cDMEM + 10 % FCS aufgenommen und mit Hilfe von Tryptanblau ausgezählt. Die Zellen

wurden auf eine Konzentration von 1 × 106 / ml eingestellt und 500 µl der Epithelzell-

Suspension pro Well in eine 24-Well Zellkulturplatte eingebracht. Die Epithelzellen wurden bei

37 °C und 5 % CO2 inkubiert, woraufhin alle 48 h das Medium erneuert wurde. Wenn die Zellen

konfluent waren, wurden sie dreimal mit warmen 1 × PBS gewaschen und 500 µl DMEM + 2 %

FCS + 1 % L-Glutamin + 1 % HEPES pro Well zu den Zellen gegeben. Nach einer Inkubation

ü.N. wurden das Infektionsmedium erneuert und die Zellen analog zu den T7 Zellen für 24 h

mit S. pn. stimuliert, bevor der Überstand abgenommen und bis zur Messung der Proteine bei

-20 °C aufbewahrt wurde.

5.2.9.5 Isolation und Infektion alveolärer Makrophagen

Die Mäuse wurden wie in 5.2.3.1 beschrieben narkotisiert und durch eine finale Blutabnahme

aus der Vena Cava euthanasiert. Zur Freilegung der Trachea wurde ein medianer Hautschnitt

bis zum Kopf der Maus durchgeführt und das Gewebe oberhalb der Trachea entfernt. Fünf

1 ml Spritzen wurden mit jeweils 800 µl 1 × PBS befüllt. Eine 18 G Kanüle wurde die Trachea

eingeführt, die Spritzen nacheinander aufgesetzt und die die Lunge fünfmal vorsichtig gespült.

Die Lavageflüssigkeit wurde in einem 15 ml Reaktionsgefäß gesammelt und bei 400 × g und

4 °C für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen in 100 µl DMEM + 10 %

FCS aufgenommen und mit Hilfe von Tryptanblau ausgezählt. 5 × 104 Zellen in 200 µl DMEM

+ 10 % FCS wurden pro Well in eine 96-Well Zellkulturplatte eingebracht und für 2 h bei 37 °C

und 5 % CO2 inkubiert. Das Medium mit den nicht-adhärenten Zellen wurde entfernt und 200 µl

frisches Medium zu den Zellen gegeben. Die Infektion erfolgte am kommenden Tag analog zu

den T7 Zellen für 24 h mit S. pn., bevor der Überstand abgenommen und bis zur Messung der

Proteine bei -20 °C aufbewahrt wurde.

5.2.9.6 Isolation und Infektion muriner Knochenmarks-Neutrophiler

Die Mäuse wurden wie in 5.2.3.1 beschrieben narkotisiert und durch eine finale Blutabnahme

aus der Vena Cava euthanasiert. Das Fell und Fleisch wurde vorsichtig von Femur und Tibia

entfernt und das Bein vom Hüftknochen gelöst. Femur und Tibia wurden voneinander getrennt

und die Fußknochen vorsichtig entfernt, ohne die Knochen zu beschädigen. Die Enden der

Knochen wurden entfernt und das Knochenmark mit Hilfe einer 27 G Kanüle und 10 ml

1 × PBS herausgespült. Die Suspension wurde in ein 50 ml Reaktionsgefäß mit 15 ml MACS

Puffer übertragen und bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde

verworfen, die Zellen in 5 ml MACS Puffer pro Maus aufgenommen und mit Hilfe von

Tryptanblau ausgezählt. Nach einer erneuten Zentrifugation unter gleichen Bedingungen

wurden die Konzentration der Zellen in MACS Puffer auf 5 × 108/ml eingestellt und pro 1 × 108

Zellen 50 µl aLy6G-Biotin zu den Zellen gegeben. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 4 °C

wurden pro 1 × 108 Zellen 150 µl MACS Puffer sowie 100 µl aBiotin-Microbeads

hinzugegeben, woraufhin eine erneute Inkubation für 15 min bei 4 °C erfolgte. Die Zell-

Antikörper-Microbead Suspension wurde mit 10 ml MACS Puffer versetzt, zentrifugiert

(300 × g, 5 min, 4 °C) und in 500 µl MACS Puffer pro 1 × 108 Zellen resuspendiert.

Anschießend erfolgte die Isolierung der Ly6G-positiven Zellen mit Hilfe eines Magnet-

Systems. Dazu wurde eine Säule (LS Column) in das magnetische Feld eines MidiMACS

Separators eingebracht und mit 3 ml MACS Puffer versetzt. Die Zellsuspension wurde durch

einen 30 µm Filter auf die Säule gegeben, wodurch Zellen, die an einen aLy6G Antikörper und

die Microbeads gekoppelt waren, an dem Magneten hängen blieben. Die Zellen, die durch die

Säule hindurchgingen, wurden verworfen. Anschließend wurden zum Waschen der Zellen und

zum Entfernen unspezifisch gebundener Zellen dreimal 3 ml MACS Puffer auf die Säule

gegeben. Die Säule wurde vom Magneten entfernt, woraufhin sie zum Herauslösen der Zellen

mit 5 ml MACS Puffer versetzt wurde. Die isolierten Neutrophilen wurden in einem 15 ml

Reaktionsgefäß aufgefangen und mit Hilfe von Tryptanblau ausgezählt. Für anschließende

Infektionsversuche wurden die Neutrophilen zentrifugiert (300 × g, 5 min, 4 °C) und zu

5 × 105/ml in Opti-MEM® resuspendiert. Pro Well einer 48-Well Zellkulturplatte wurden 250 µl

der Zellsuspension eingebracht. Die S. pn.-Infektion der Neutrophilen erfolgte am selben Tag

analog zu den T7 Zellen für 24 h, bevor der Überstand abgenommen und bis zur Messung der

Proteine bei -20 °C aufbewahrt wurde.

5.2.9.7 Isolation und Infektion muriner Thrombozyten

Die Mäuse wurden wie in 5.2.3.1 beschrieben narkotisiert.150 µl des ACD-Puffers wurden in

eine 1 ml Spritze gefüllt, in welche das Blut entnommen wurde. Durch diese finale

Blutabnahme aus der Vena Cava wurden die Mäuse euthanasiert. Das mit ACD-Puffer

versetzte Blut wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Eine Apyrase-Lösung (0,02 U/ml)

wurde 1:1000 in CGS-Puffer verdünnt, wovon 200 µl zum Blut gegeben wurden. Nach einer

Zentrifugation (200 × g, 10 min, 37 °C) wurden die oberste Schicht mit Zwischenphase und

25 % der untersten Sicht in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zu den übrigen 75 % der

erythrozytenhaltigen untersten Schicht wurden erneut 200 µl Apyrase-haltiger CGS-Puffer

hinzugegeben. Beide Reaktionsgefäße wurden bei gleichbleibenden Bedingungen

zentrifugiert, die obersten Schichten vorsichtig abgenommen und in einem neuen

Reaktionsgefäß vereint. In diese Lösung wurde entsprechend des Volumens PGI2

hinzugegeben, sodass eine Verdünnung von 1:1.000 erreicht wurde. Nach sanftem Mischen

der Suspension und einer anschließenden Zentrifugation (1.000 × g, 6 min, 37 °C) wurde der

Überstand verworfen, das Thrombozyten-Pellet in 1 ml CGS-Puffer (versetzt mit PGI2 und

Apyrase) aufgenommen und erneut bei gleichbleibenden Bedingungen zentrifugiert. Das

Pellet wurde in 400 µl Tyrodes Puffer + 0,1 % Apyrase resuspendiert und die Zellen für eine

Stunde bei RT ruhen lassen. Die Thrombozyten wurden mit Hilfe von Druchflusszytometrie

ausgezählt, die Zellen erneut bei gleichen Bedingungen zentrifugiert und in Tyrodes Puffer

ohne Apyrase resuspendiert. Anschließend erfolgte eine S. pn.-Infektion analog zu den T7

Zellen, allerdings nicht für 24 h, sondern nur für eine Stunde.

5.2.10 Auswertung und Darstellung der Ergebnisse

GraphPad Prism (Version 7.0) wurde für die statistische Auswertung der Ergebnisse und die

Erstellung der Graphen verwendet. Die Kurven zur Darstellung der Überlebensraten wurden

mit Hilfe der Kaplan-Meier Methode dargestellt und einem log-rank (Mantel-Cox) Test

ausgewertet. Zur statistischen Auswertung parametrischer Daten zweier Gruppen wurde ein

ungepaarter t-Test verwendet. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des

Mittelwertes (SEM) dargestellt. Nicht-parametrischen Daten wurden als Median mit 25 – 75 %

Interquartilabstand dargestellt und mit Hilfe eines Mann Whitney Tests statistisch ausgewertet.

In der Experimentreihe zur Untersuchung frühzeitiger und später antibakterieller Therapie

wurden mehrerer Zeitpunkte der S. pn.-infizierten, lösunsmittelbehandelen Kontrollgruppe mit

Hilfe eines 1-way ANOVAs (Kruskal-Wallis-Test) zu den Werten des Behandlungsstarts

verglichen. Parametrische wie auch nicht-parametrische Daten von mehr als zwei Gruppen

wurden mit einem 2-way ANOVA statistisch ausgewertet. P Werte kleiner als 0,05 wurden als

statistisch signifikant gewertet.

6 Ergebnisse

6.1 Der Einfluss früher und später antimikrobieller Therapie auf die Resolution

einer Streptokokken-induzierten Pneumonie in der Maus

Der Effekt frühzeitiger und verspäteter Ampicillin-Therapie auf den Krankheitsverlauf und die

Immunantwort des Wirts sollte detailliert erforscht werden, um die Wichtigkeit einer

frühzeitigen antibakteriellen Therapie zu verstehen. Dazu wurden C57BL/6J-Mäuse transnasal

mit S. pn. infiziert und ab 24 h p.i. bzw. 48 h p.i. in 12-Stunden Intervallen mit Ampicillin

therapiert. S. pn.-infizierte Kontrolltiere wurden mit 0,9 % NaCl behandelt.

6.1.1 Eine retardierte Antibiotika-Therapie schützt nicht vor einem fatalen

Pneumonie-Verlauf in Mäusen

Tiere, die frühzeitig (24 h p.i.) behandelt wurden, konnten vor einem fatalen Pneumonie-

Verlauf geschützt werden und zeigten eine Mortalität von lediglich 2,9 %, wohingegen ein

später Therapiestart (48 h p.i.) in einer signifikant erhöhten Sterblichkeit von 79,6 % resultierte

(Abbildung 11 A). Von außen sichtbare Anzeichen einer murinen Pneumonie, wie

schwerfällige Atmung, eitrige Augen oder ungepflegtes Fell, wurden in einem klinischen Score

zusammengefasst und über den Infektionsverlauf hinweg dokumentiert. 24 h nach Infektion

wiesen die Tiere einen signifikant erhöhten klinischen Score im Vergleich zur scheininfizierten

Kontrollgruppe auf. Mit Hilfe einer frühzeitigen Therapie konnten diese klinische Symptome

bereits 12 h nach initialer Ampicillin-Gabe signifikant reduziert werden und blieben im weiteren

Verlauf auf basalem Niveau. 48 h nach Infektion, zum Startpunkt der späten Therapie, zeigten

sich vermehrt äußere Pneumonie-Symptome, wodurch es zu einem Anstieg des klinischen

Scores kam. Dieser konnte durch eine späte Therapie nicht reduziert werden (Abbildung 11

B). Auch die Fähigkeit, die Körpertemperatur aufrecht zu erhalten (Abbildung 11 C) und das

Gewicht (Abbildung 11 D) der infizierten Tiere waren 24 h p.i. bereits signifikant vermindert,

konnten aber durch die frühzeitige Antibiotikagabe innerhalb von 12 bis 24 erhöht werden.

Abbildung 11: Späte Antibiotika-Therapie schützt S. pn.-infizierte Mäuse nicht vor fataler

Pneumonie.

Die Mäuse wurden mit S. pn. infiziert (n = 9). Beginnend 24 h (blau) bzw. 48 h (rot) nach Infektion

wurden Behandlungsgruppen mit Ampicillin therapiert (n = 9). Kontrollgruppen wurden mit

Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 7) bzw. mit Lösungsmittel behandelt (0,9 % NaCl, n = 9). A.

Kaplan-Meier Kurven der Überlebensrate der einzelnen Gruppen, Log-rank Test. B. Klinischer Score,

Median und 25 – 75 % Interquartilsabstand, 2-way ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test für den

Vergleich von Ampicillin- versus Lösungsmittel-Behandlung. Kruskal-Wallis Test/Dunn’s multiple

comparison Test für den Vergleich zu unbehandelten, S. pn.-infizierten Tieren zu Therapiebeginn. C.

Körpertemperatur und D. Körpergewicht der jeweiligen Gruppen. C, D: Mittelwert ± SEM, 2-way

ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test. * zeigt einen Unterschied zwischen Gruppen zum selben

Zeitpunkt an, # zeigt den Unterschied zum Therapiestart an. A – D: :*/# p < 0,05 und ****/#### p < 0,0001.

6.1.2 Der Zeitpunkt der Antibiotika-Gabe hat keinen Einfluss auf die antibakterielle

Wirkung

Um den Verlauf der bakteriellen Eliminierung zu messen und die Wirksamkeit der frühen und

späten Therapie zu kontrollieren, wurden Lavage-Flüssigkeit (BAL), Lungen-Homogenat und

Blut der infizierten Tiere auf Kolonie-bildende Einheiten (CFUs) untersucht. Es zeigte sich,

dass die Kinetik der Bakterien-Abtötung in allen untersuchten Organen nach frühem und

spätem Therapiebeginn vergleichbar ablief: 48 h nach Therapiebeginn war die bakterielle Last

im Alveolarraum auf ~ 104 CFUs reduziert, unabhängig vom Start der Behandlung (Abbildung

12 A). Zum Zeitpunkt 48 h p.i. war in der Lunge eine höhere bakterielle Last zu finden als 24 h

Z eit p.i. [h]

Ü b e rle b e n [% ]

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

2 0

4 0

6 0

8 0

100 ****

Z eit p.i. [h]

K örp e rte m pe ra tu r [°C ]

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

2 4

2 7

3 0

3 3

3 6

3 9

**** **** ****

****

Z eit p.i. [h]

K lin isch e r S co re

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

****

**** ****

####

Z eit p.i. [h]

48 60 72 96 120

####

Z eit p.i. [h]

G ew icht

[% G e w ic h t v or In fe k tio n ]

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

100

105

****

Überlebensrate

Körpertemperatur

A B

Klinischer Score

GewichtD

T im e p .i. [h ]

b o d y te m p e ra tu re [°C ]

0 24 3 6 4 8 60 7 2

P B S K o n tro lle

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + Lö su n g sm itte l 2 4 h p .i.

S . p n . + Lö su n g sm itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

h o u rs p .i.

C lin ical S c o re

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g sm itte l 2 4 h p .i.

P B S K o n tro lle

S . p n .

S . p n . + L ö s u n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

T im e p .i. [h ]

b o d y te m p e ra tu re [°C ]

0 24 3 6 4 8 60 7 2

P B S K o n tro lle

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + Lö su n g sm itte l 2 4 h p .i.

S . p n . + Lö su n g sm itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

h o u rs p .i.

C lin ical S c o re

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g sm itte l 2 4 h p .i.

P B S K o n tro lle

S . p n .

S . p n . + L ö s u n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

T im e p .i. [h ]

b o d y te m p e ra tu re [°C ]

0 24 3 6 4 8 60 7 2

P B S K o n tro lle

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + Lö su n g sm itte l 2 4 h p .i.

S . p n . + Lö su n g sm itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

p.i. (Abbildung 12 B). Infolge der frühzeitigen Therapie konnten in der Ampicillin-Gruppe

niedrigere Werte gemessen werden als in der kontrollbehandelten Gruppe, aber nur eine

geringe Reduktion im Vergleich zum Therapiestart. Durch die späte Behandlung konnte keine

signifikante Verminderung erreicht werden, jedoch waren Tendenzen sichtbar. Im Blut

(Abbildung 12 C) konnten bereits 24 h p.i. Erreger detektiert werden. Hier war ebenfalls eine

Eliminierung zu beobachten: 12 h nach Therapiebeginn war nach beiden Behandlungsstarts

eine Reduktion um mehr als 99 % erreicht und im Laufe von 48 h Therapie konnte die

Erreberlast auf 0 – 10 CFU/µl Blut reduziert werden.

Abbildung 12: Die Kinetik der Bakterien-Eliminierung mittels Antibiotika-Therapie ist nicht

abhängig vom Therapiebeginn.

Die Mäuse wurden mit S. pn. infiziert (n = 9). Beginnend 24 h (blau) bzw. 48 h (rot) nach Infektion

wurden Behandlungsgruppen mit Ampicillin therapiert (n = 9). Kontrollgruppen wurden mit

Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 7) bzw. mit Lösungsmittel behandelt (0,9 % NaCl, n = 9).

Bakterielle Last in A. bronchoalveolärer Lavage (BAL), B. Homogenisierter Lunge und C. Blut. A - C:

Median ± Interquartilsabstand, 2-way ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test für den Vergleich von

Ampicillin- versus Lösungsmittel-Behandlung. Kruskal-Wallis Test/Dunn’s multiple comparison Test

für den Vergleich zu unbehandelten, S. pn.-infizierten Tieren zu Therapiebeginn. * zeigt einen

Unterschied zwischen Gruppen zum selben Zeitpunkt an, # zeigt den Unterschied zum Therapiestart

an. A – C: */# p < 0,05, **/## p < 0,01, ***/### p < 0,001 und ****/#### p < 0,0001. CFU= Kolonie-bildende

Einheiten

Z e it p .i. [h ]

C F U [lo g 1 0]

48 60 72 96 120

C F U [log 1 0 ]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

####

# #

C F U / µ l [lo g 1 0 ]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

# #

*** * ***

Z e it p .i. [h ]

C F U / µ l [lo g 1 0 ]

48 60 72 96 120

###

# #

** *

CFU BAL CFU BlutA

C F U [log 1 0 ]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

1 0

1 2 *** * * *

# #

Z e it p .i. [h ]

C F U [log 1 0 ]

48 60 72 96 120

1 0

1 2

B CCFU Lunge

h o u rs p .i.

C linical S c ore

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g s m itte l 2 4 h p.i.

P B S K o n tro lle

S . p n .

S . p n . + L ö su n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

h o u rs p .i.

C linical S c ore

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g s m itte l 2 4 h p.i.

P B S K o n tro lle

S . p n .

S . p n . + L ö su n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

6.1.3 Die Ampicillin-Therapie hat keinen Einfluss auf die Kinetik der Leukozyten im

Alveolarraum

Residente und rekrutierte Immunzellen sind an der Bekämpfung eindringender Pathogene

beteiligt [79]. Um zu untersuchen, ob die Unterschiede in der Überlebensrate infolge

beeinflusster Zellrekrutierung stattfanden, wurden mittels Durchflusszytometrie diverse

Leukozyten-Populationen ausgewertet. Die Mehrzahl der rekrutierten Leukozyten waren

PMNs, die zum Zeitpunkt 24 h p.i. allein 60 % der Leukozyten darstellten (Abbildung 13 A). Im

Verlauf der Pneumonie verminderte sich die Neutrophilen-Population, allerdings unabhängig

von der Ampicillin-Therapie, da keine Unterschiede zu den kontrolltherapierten Gruppen

erkennbar waren. Die residenten AlvMs zeigten nach frühzeitigem Therapiebeginn keine

signifikanten Unterschiede, weder zum Infektionsstart noch zu den Kontrollgruppen (Abbildung

13 B). Bei spätem Therapiebeginn war im weiteren Infektionsverlauf ein prozentualer, aber

nicht in totalen Zellzahlen widergespiegelter Anstieg der Makrophagen erkennbar. Allerdings

können die erhöhten prozentualen Anteile an AlvMs durch den Rückgang der PMNs erklärt

werden. Die Anzahl an iMs stieg im Zuge der Infektion signifikant an (Abbildung 13 C), blieb

aber von der Antibiotika-Therapie unbeeinflusst.

Abbildung 13: Ampicillin hat keinen Einfluss auf Leukozyten-Populationen im Alveolarraum.

Die Mäuse wurden mit S. pn. infiziert (n = 9). Beginnend 24 h (blau) bzw. 48 h (rot) nach Infektion wurden

Behandlungsgruppen mit Ampicillin therapiert (n = 9). Kontrollgruppen wurden mit Lösungsmittel scheininfiziert

(1 × PBS, n = 7) bzw. mit Lösungsmittel behandelt (0,9 % NaCl, n = 9). Totale Anzahl und Frequenzen von A.

Neutrophilen (PMNs), B. Alveolären Makrophagen (AlvMs) und C. Inflammatorischen Monozyten / Makrophagen

(iMs), gemessen in der bronchoalveolären Lavage (BAL) zum Analysezeitpunkt. D. Repräsentative Dot Blots zur

Illustration der Analyse der Populationen. A – C: Mittelwert ± SEM; 2-way ANOVA/Sidak’s multiple comparison

Test für den Vergleich von Ampicillin- versus Lösungsmittel-Behandlung. 1-way ANOVA/Dunnett’s multiple

comparison Test für den Vergleich zu unbehandelten, S. pn.-infizierten Tieren zu Therapiebeginn. # zeigt den

Unterschied zum Therapiestart an. # p < 0,05, *## p < 0,01, ### p < 0,001 und #### p < 0,0001.

P M N s in B A L

[10 5]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

# #

48 60 72 96 120

# #

Z e it p .i. [h ]

48 60 72 96 120

2 5

5 0

7 5

# #

####

# #

Z e it p .i. [h ]

% d e r Le u k oz yten

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

2 0

4 0

6 0

8 0

###

####

BAL PMNs

iM s in B A L

[10 4]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

###

48 60 72 96 120

# #

Z e it p .i. [h ]

% d e r Le u k oz yten

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

1 0

1 5

2 0

####

Z e it p .i. [h ]

48 60 72 96 120

1 0

1 5

2 0

###

BAL iMs

A lv M in B A L

[10 4]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

1 0

1 2

1 4

48 60 72 96 120

1 0

1 2

1 4

# #

Z e it p .i. [h ]

48 60 72 96 120

2 0

4 0

6 0

8 0

100

# #

Z e it p .i. [h ]

% d e r Le u k oz yten

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

2 0

4 0

6 0

8 0

100

# #

BAL AlvMs

CD11b

CD11c

24 h 48 h

23 % 23 %

24 h 48 h

MHCII

Ly6C

24 h 48 h

0.1 % 5 %

24 h 48 h

CD11b

Ly6G

68 % 50 %

24 h 48 h

BAL

PMNs

BAL

AlvMs

BAL

iMs

D Dot Blots

h o u rs p .i.

C lin ical S c ore

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g s m itte l 2 4 h p .i.

P B S K o n tro lle

S . p n .

S . p n . + L ö su n g sm itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

CD11b

CD11c

MCHII

Ly6C

6.1.4 Frühzeitige und späte Antibiotika-Therapie reduzieren lokale Zytokin-Level

Residente und rekrutierte Zellen der Lunge produzieren nach direkter oder indirekter

Stimulation von Pathogenen inflammatorische Mediatoren. Infolge früher und später

Ampicillin-Therapie konnten die lokalen inflammatorischen Zytokine IL-6, IL-1β, TNF-α und

IFN-γ im Alveolarraum reduziert werden (Abbildung 14 A). Auch die Konzentration des anti-

inflammatorischen Zytokins IL-10 sank nach frühzeitiger Therapie. Im Gegensatz dazu konnte

im Verlauf einer frühen antibakteriellen Behandlung vermehrt IL-12p40, der geteilten

Untereinheit von IL-12 und IL-23, nachgewiesen werden. Nach einem späten Therapiebeginn

sank die Konzentration von IL-12p40. Das Ausmaß der Inflammation in der Lunge sollte auch

auf histologischer Basis untersucht werden. Dazu wurden von Dr. Kristina Dietert, PhD, aus

der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Achim Gruber an der Freien Universität Berlin die

histopathologisch darstellbare Ausbreitung und Schwere der S. pn.-Infektion, Inflammation

und induzierten Läsionen des Gewebes einzeln bewertet und zu einem Gesamtscore

zusammenfasst (Inflammationsscore, Abbildung 14 B). Für diese Bewertung wurden die

fixierte Lunge geschnitten und anschließend mittels Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H & E)

beurteilt (Abbildung 14 C). Infolge einer frühen Therapie zeigten die antibiotisch behandelten

Tiere pathologisch deutlich geringere Anzeichen von Läsionen und Entzündungen, wodurch

der Inflammationsscore der antibiotisch behandelten Tiere signifikant niedriger blieb als der

der kontrollbehandelten Gruppen. Dies konnte nach später Therapie nicht beobachtet werden,

hier gab es weder Unterschiede zum Therapiestart, noch zur entsprechenden Kontrollgruppe.

Abbildung 14: Verminderte Zytokin-Level im Alveolarraum nach antibakterieller Therapie und

histologische Analysen.

Die Mäuse wurden mit S. pn. infiziert (A: n = 9, B: n = 4). Beginnend 24 h (blau) bzw. 48 h (rot) nach Infektion

wurden Behandlungsgruppen mit Ampicillin therapiert (n = 9 bzw. 4). Kontrollgruppen wurden mit

Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 7 bzw. 4) bzw. mit Lösungsmittel behandelt (0,9 % NaCl, n = 9

bzw. 4). A. Zytokin-Konzentrationen, in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit, Mittelwert ± SEM, B.

Inflammationsscore, zusammengestellt aus histologischen Inflammationsparametern der Lunge, Median ±

Interquartilsabstand, Score-Einteilung: 0: nicht betroffen, 1: vereinzelt, 2: geringgradig, 3: mittelgradig, 4:

hochgradig, 5: massiv. C: Repräsentative H & E Färbung ganzer Lungenschnitte. A, B: 2-way ANOVA/Sidak’s

multiple comparison Test für den Vergleich von Ampicillin- versus Lösungsmittel-Behandlung. A. 1-way

ANOVA/Dunnett’s multiple comparison Test und B. Kruskal-Wallis Test/Dunn’s multiple comparison Test für

den Vergleich zu unbehandelten, S. pn.-infizierten Tieren zu Therapiebeginn. * zeigt einen Unterschied

zwischen Gruppen zum selben Zeitpunkt an, # zeigt den Unterschied zum Therapiestart an. */# p < 0,05, **/##

p < 0,01, ***/### p < 0,001 und ****/#### p < 0,0001.

Z e it p .i. [h]

pg /m l [10 2]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

1 0 ** *

Z e it p .i. [h]

pg /m l [1 0 ]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

####

Z e it p .i. [h]

pg /m l [10 4]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

2*** *

IL-6

IL-1β

IL-10

Z e it p .i. [h]

48 60 72 96 120

Z e it p .i. [h]

4 8 6 0 7 2 9 6 1 2 0

# #

###

Z e it p .i. [h]

48 60 72 96 120

1 0

Z e it p .i. [h]

In fla m m a tio n s s c o re

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

Z e it p .i. [h]

4 8 6 0 7 2

InflammationsscoreB

60 h p.i.

72 h p.i.

S. pn. +

Amp 48 h p.i.

S. pn. +

0,9% NaCl 48 h p.i.

36 h p.i.

S. pn. +

Amp 24 h p.i.

48 h p.i.

S. pn. +

0,9% NaCl 24 h p.i.

2 mm

Z e it p .i. [h]

pg /m l [10 3]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

####

TNF-α

Z e it p .i. [h]

48 60 72 96 120

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

# #

Z e it p .i. [h]

pg /m l [10 3]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

# #

IFN-γ

Z e it p .i. [h]

48 60 72 96 120

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

# #

Z e it p .i. [h]

pg /m l [10 2]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

###

####

IL-12p40

Z e it p .i. [h]

48 60 72 96 120

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

####

A Zytokinlevel im Alveolarraum

h o u rs p .i.

C lin ical S c o re

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö su n g s m itte l 2 4 h p .i.

P B S K o n tro lle

S . p n .

S . p n . + L ö s u n g sm itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

6.1.5 Eine antibakterielle Therapie vermindert unabhängig vom Startzeitpunkt lokale

Konzentrationen einzelner

Lokale alveoläre Chemokine sorgen für die Rekrutierung von Leukozyten. In 6.1.3 konnte

gezeigt werden, dass lokale Leukozyten-Populationen unbeeinflusst waren von einer

antibakteriellen Therapie. Gleichbleibende Chemokin-Konzentrationen könnten dafür

ursächlich gewesen sein und wurden aus diesem Grund ebenfalls analysiert. Der alveoläre

Proteingehalt an CCL3 und CCL2, beides Monozyten-rekrutierende Chemokine, war nach

einer frühen Behandlung deutlich niedriger als zu Therapiestart oder in den Kontrolltieren

(Abbildung 15). Nach spätem Therapiebeginn zeigte sich 60 h p.i. ebenfalls eine tendenzielle

Reduktion dieser Chemokine, welche im späteren Verlauf auch in den kontrollbehandelten

Tieren nachgewiesen wurde. Der Wachstumsfaktor G-CSF scheint die Mobilisierung von

Neutrophilen in einer Infektion zu regulieren [165], während GM-CSF beispielsweise die anti-

inflammatorische Immunantwort von AlvMs beeinflusst [166]. Die Kinetik von G-CSF spiegelte

die von CCL2 wieder, während es nach frühzeitiger Therapie zu einem kurzfristigen Anstieg

von GM-CSF kam. Auch hier sanken die Konzentrationen im Zuge der S. pn.-Infektion in den

Ampicillin-therapierten Tieren in gleichem Maße wie in der Kontrollgruppe. Die CXCR2-

Liganden CXCL1, CXCL2 und CXCL5 sind für die Neutrophilen Rekrutierung wichtig [167]. Im

Laufe der Infektion stiegen die Konzentrationen dieser drei Chemokine in den infizierten,

kontrollbehandelten Tieren an. Im Anschluss an eine Antibiotika-Therapie sanken die CXCL1

und CXCL2-Level, während CXCL5 erhöht blieb. Analog zu GM-CSF zeigte sich auch hier ein

kurzfristiger Anstieg nach frühzeitigem Therapiebeginn.

Abbildung 15: Regulierte Konzentrationen von Chemokinen und Wachstumsfaktoren im

Alveolarraum nach antibakterieller Therapie

Die Mäuse wurden mit S. pn. infiziert (n = 9). Beginnend 24 h (blau) bzw. 48 h (rot) nach Infektion wurden

Behandlungsgruppen mit Ampicillin therapiert (n = 9). Kontrollgruppen wurden mit Lösungsmittel

scheininfiziert (1 × PBS, n = 7) bzw. mit Lösungsmittel behandelt (0,9 % NaCl, n = 9). Die Chemokine

und Wachstumsfaktoren wurden in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit bestimmt. Mittelwert ± SEM;

2-way ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test für den Vergleich von Ampicillin- versus Lösungsmittel-

Behandlung. 1-way ANOVA/Dunnett’s multiple comparison Test für den Vergleich zu unbehandelten,

S. pn.-infizierten Tieren zu Therapiebeginn. * zeigt einen Unterschied zwischen Gruppen zum selben

Zeitpunkt an, # zeigt den Unterschied zum Therapiestart an. */# p < 0,05, **/## p < 0,01 und ***/### p < 0,001.

Z e it p .i. [h ]

pg/m l [10 3]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

###

Z e it p .i. [h ]

pg/m l

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

Z e it p .i. [h ]

pg/m l [10 2]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

** *

Z e it p .i. [h ]

pg/m l [10 2]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

# #

Z e it p .i. [h ]

48 60 72 96 120

Z e it p .i. [h ]

pg/m l [x10 3]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

8** *

Z e it p .i. [h ]

48 60 72 96 120

# #

Z e it p .i. [h ]

48 60 72 96 120

###

Z e it p .i. [h ]

48 60 72 96 120

Z e it p .i. [h ]

48 60 72 96 120

# #

Z e it p .i. [h ]

pg/m l [10 2]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

# #

Z e it p .i. [h ]

48 60 72 96 120

# #

Z e it p .i. [h ]

pg/m l [10 2]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

1 0

** *

Z e it p .i. [h ]

48 60 72 96 120

1 0

# #

CCL3

CCL2

G-CSF

GM-CSF

CXCL1

CXCL2

CXCL5

h o u rs p .i.

C lin ical S co re

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö su n g sm itte l 2 4 h p .i.

P B S K o n tro lle

S . p n .

S . p n . + L ö s u n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

6.1.6 Zirkulierende Immunzell-Populationen werden weder von früher noch von

später antibakterieller Therapie beeinflusst

Um auch über die systemische Immunantwort infolge der frühzeitigen und verspäteten

antimikrobiellen Behandlung Aussagen treffen zu können, wurden mit Hilfe eines

Hämatologiegerätes im Blut der Tiere Neutrophile, Monozyten, Eosinophile und Thrombozyten

bestimmt. Die Frequenzen, aber nicht die totalen Zellzahlen an PMNs waren im Anschluss an

eine frühe Ampicillin-Therapie reduziert (Abbildung 16 A). 24 h p.i., zu Beginn des frühen

Behandlungsstarts, war ein signifikanter Anstieg an Monozyten im Vergleich zur

kontrollinfizierten Gruppe zu vermerken (Abbildung 16 B). Im Laufe der Infektion sank dieser

Wert, allerdings unabhängig von Ampicillin. Eosinophile waren ebenfalls nicht von einer

Therapie beeinflusst, allerdings zeigten sich analog zu den PMNs auch hier verminderte

Frequenzen infolge eines frühzeitigen Therapiestarts (Abbildung 16 C). Die Konzentration an

Thrombozyten schien weder durch eine Infektion noch durch die nachfolgende Behandlung

beeinflusst zu werden (Abbildung 16 D). Allerdings schien der Gesamtanteil an festen

Bestandteilen im Blut, auch als Hämatokrit bezeichnet, durch die S. pn.-Infektion anzusteigen

(Abbildung 16 E). Im Zuge einer frühen Ampicillin-Therapie sank der Wert im Vergleich zum

Therapiestart, aber auch zu den kontrollbehandelten Tieren. Im Anschluss an eine späte

Therapie ließ sich dieser Effekt nicht beobachten.

Abbildung 16: Eine antibakterielle Therapie hat keinen Einfluss auf Leukozyten- und

Thrombozyten-Konzentrationen im Blut, jedoch auf den Hämatokrit.

Die Mäuse wurden mit S. pn. infiziert (n = 9). Beginnend 24 h (blau) bzw. 48 h (rot) nach Infektion

wurden Behandlungsgruppen mit Ampicillin therapiert (n = 9). Kontrollgruppen wurden mit

Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 7) bzw. mit Lösungsmittel behandelt (0,9 % NaCl, n = 9).

Die Bestimmung von A. Neutrophilen (PMNs), B. Monozyten, C. Eosinophilen (Eos), D. Thrombozyten

und E. Hämatokrit (HCT) erfolgte mit einem Hämatologiegerät. A – E: Mittelwert ± SEM; 2-way

ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test für den Vergleich von Ampicillin- versus Lösungsmittel-

Behandlung. 1-way ANOVA/Dunnett’s multiple comparison Test für den Vergleich zu unbehandelten,

S. pn.-infizierten Tieren zu Therapiebeginn. * zeigt einen Unterschied zwischen Gruppen zum selben

Zeitpunkt an, # zeigt den Unterschied zum Therapiestart an. */# p < 0,05, **/## p < 0,01, ***/### p < 0,001

und #### p < 0,0001.

48 60 72 96 120

P M N s/µ l [10 3]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

Z e it p.i. [h ]

% de r Le u k oz yte n

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

2 0

4 0

6 0

* *

Z e it p.i. [h ]

48 60 72 96 120

2 0

4 0

6 0

Blut PMNsA

E o s/µ l [10 3]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

Z e it p.i. [h ]

T h rom bo z yte n /µ l [10 6]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

Z e it p.i. [h ]

48 60 72 96 120

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

Z e it p.i. [h ]

% de r Le u ko z yten

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

1 0

1 5 *

Z e it p.i. [h ]

4 8 6 0 7 2 9 6

1 0

1 5

Blut Thrombozyten

Blut Eosinophile

48 60 72 96 120

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

48 60 72 96 120

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

M o no z yte n /µ l [10 3]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

####

# #

Z e it p.i. [h ]

% de r Le u k oz yte n

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

1 0

1 5

2 0

####

###

####

Z e it p.i. [h ]

48 60 72 96 120

1 0

1 5

Blut Monozyten

Z e it p.i. [h ]

H C T [% ]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5 ***

###

# #

###

Z e it p.i. [h ]

48 60 72 96 120

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

Hämatokrit

h o u rs p .i.

C lin ical S core

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g sm itte l 2 4 h p .i.

P B S K o n tro lle

S . p n .

S . p n . + L ö su n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

h o u rs p .i.

C lin ical S core

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g sm itte l 2 4 h p .i.

P B S K o n tro lle

S . p n .

S . p n . + L ö su n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

6.1.7 Frühe, aber nicht späte antibakterielle Therapie verhindert den systemischen

Anstieg inflammatorischer Mediatoren

Infolge einer lokalen Inflammation in der Lunge kommt es oftmals zur systemischen

Ausbreitung von Bakterien und Entzündung. Dies kann einerseits durch den aktiven Übertritt

der Bakterien ins Blutsystem geschehen, wo es zu einer sekundären Entzündungsreaktion

kommt oder als Folge einer geschädigten alveolokapillären Barriere eintreten, wodurch ein

unkontrollierter Übertritt inflammatorischer Mediatoren aus der Alveole ins Blutsystem möglich

ist. Zum Zeitpunkt 24 h p.i. konnten im Serum im Vergleich zu scheininfizierten Kontrolltieren

keine erhöhten Proteinkonzentrationen der Zytokine (z.B. IL-6, TNF-α oder IFN-γ; Abbildung

17 A) und Chemokine (z.B. CCL2 und CXCL1) sowie G-CSF (Abbildung 17 B) festgestellt

werden. Eine frühe Ampicillin-Therapie, begonnen 24 h p.i., beugte dem Anstieg dieser Werte

vor, wohingegen S. pn.-infizierte, kontrollbehandelte Tiere stark erhöhte

Serumkonzentrationen dieser inflammatorischen Mediatoren aufwiesen. Zum Zeitpunkt 48 h

p.i., bevor mit der späten Therapie begonnen wurde, waren die systemischen Zytokinwerte im

Vergleich zu 24 h p.i. um das 10- bis 12-fache erhöht (IL-6 bzw. TNF-α). Auch bei den

systemischen Chemokinen (Abbildung 17 B) zeigte sich, dass zum Zeitpunkt 48 h p.i. 5- bis

90-fach (CXCL1 bzw. CCL3) erhöhte Konzentrationen im Vergleich zu 24 h p.i. messbar

waren. Im Vergleich zu den kontrollbehandelten Tieren konnte im Anschluss an diese späte

antibakterielle Therapie keine signifikante Reduktion der Zytokin- oder Chemokin-

Konzentrationen beobachtet werden. Lediglich bei TNF-α zeigten sich tendenzielle

Unterschiede zwischen den Gruppen, diese waren aber nicht signifikant. Eine Reduktion der

systemischen Inflammation konnte nach später Therapie erst zwei bis drei Tage nach

Behandlungsstart und im späten Verlauf der Pneumonie beobachtet werden.

Systemische IL-10-Konzentrationen waren nur vereinzelt messbar. Es konnten keine

Unterschiede zwischen den Gruppen oder in Abhängigkeit vom Therapiestart beobachtet

werden. IL-1β ließ sich im Serum nicht nachweisen (Daten nicht gezeigt).

Systemische CXCL5-Konzentrationen ließen sich nicht auswerten, weil der Vorgang der

Serum-Aufbereitung eine unkontrollierte CXCL5-Ausschüttung durch aktivierte Thrombozyten

induziert.

Abbildung 17: Frühzeitige, jedoch nicht späte antibakterielle Therapie verhindert systemische

Inflammation.

Die Mäuse wurden mit S. pn. infiziert (n = 9). Beginnend 24 h (blau) bzw. 48 h (rot) nach Infektion wurden

Behandlungsgruppen mit Ampicillin therapiert (n = 9). Kontrollgruppen wurden mit Lösungsmittel

scheininfiziert (1 × PBS, n = 7) bzw. mit Lösungsmittel behandelt (0,9 % NaCl, n = 9). Im Serum der

analysierten Tiere wurden A. Zytokine, B. Chemokine und G-CSF gemessen. A, B: Mittelwert ± SEM; 2-

way ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test für den Vergleich von Ampicillin- versus Lösungsmittel-

Behandlung. 1-way ANOVA/Dunnett’s multiple comparison Test für den Vergleich zu unbehandelten,

S. pn.-infizierten Tieren zu Therapiebeginn. * zeigt einen Unterschied zwischen Gruppen zum selben

Zeitpunkt an, # zeigt den Unterschied zum Therapiestart an. */# p < 0,05, **/## p < 0,01, ***/### p < 0,001

und ****p < 0,0001.

Z e it p .i. [h]

pg/m l [10 2]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

** *

Z e it p.i. [h]

48 60 72 96 120

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

n .n .

Z e it p.i. [h]

48 60 72 96 120

Z e it p .i. [h]

pg/m l [10 3]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

Z e it p .i. [h]

48 60 72 96 120

TNF-α

IFN-γ

IL-6

Z e it p .i. [h]

pg/m l

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

1 0

1 5

Z e it p .i. [h]

48 60 72 96 120

1 0

1 5

Z e it p .i. [h]

pg/m l

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

Z e it p .i. [h]

48 60 72 96 120

IL-12p40

IL-10

Z e it p.i. [h]

pg/m l [10 2]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

Z e it p .i. [h]

pg/m l [10 2]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

8*** *

*** *

Z e it p .i. [h]

pg/m l [10 3]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

*** *

Z e it p .i. [h]

pg/m l

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

1 0

1 5

2 0

2 5

Z e it p .i. [h]

48 60 72 96 120

1 0

1 5

2 0

2 5

Z e it p.i. [h]

48 60 72 96 120

Z e it p.i. [h]

48 60 72 96 120

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

CCL3

G-CSF

CCL2

CXCL1

Z e it p.i. [h]

48 60 72 96 120

Z e it p.i. [h]

pg/m l [1 0 ]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

*** * *** *

h o u rs p .i.

C linical S co re

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g s m itte l 2 4 h p .i.

P B S K on tro lle

S . p n .

S . p n . + L ö s u n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

6.1.8 Eine frühzeitige antibakterielle Therapie schützt vor Entwicklung von Pleuritis,

Steatitis und Leberschädigung

Im Laufe einer Pneumonie kann es zu einer Schädigung sekundärer Organe und einer

Entzündung des Brustfells oder des die Lunge umgebenden Fettgewebes kommen. Vor allem

die Entzündung des Brustfells (Pleuritis) ist bei Patienten oftmals mit symptomatischen

Atemschmerzen verbunden.

Die histologischen Analysen zur Untersuchung der Ausprägung der Entzündung von Brustfell

und Fettgewebe wurden erneut von Dr. Kristina Dietert, PhD durchgeführt. Zum Zeitpunkt 24 h

p.i. war noch kein signifikanter Unterschied zu den kontrollinfizierten Tieren sichtbar. Eine

frühzeitige Therapie schützte vor der Entstehung einer Pleuritis (Abbildung 18 A), wohingegen

diese 48 h p.i. bereits hochgradig ausgeprägt war und anschließend an einen späten

Behandlungsstart nicht therapiert werden konnte. Analoge Ergebnisse zeigten sich für die

Entwicklung einer Steatitis, einer Entzündung des die Lunge umgebenden Fettgewebes

(Abbildung 18 B). Zur Analyse von Laborwerten wurden in den Serumproben im Labor von

LABOklin (Bad Kissingen) die Konzentrationen der Aspartat-Aminotransferase (AST), einem

Marker für Leberschädigung gemessen (Abbildung 18 C). Erhöhte AST-Werte zeigten sich

48 h p.i., aber nicht 24 h p.i. Ein früher Therapiestart verhinderte auch hier den Anstieg der

AST-Werte, wohingegen ein später Start keine Reduktion der bereits erhöhten Werte bewirken

konnte.

Abbildung 18: Frühzeitige, jedoch nicht späte antibakterielle Therapie schützt vor der

Entwicklung von Pleuritis, Steatitis und Leberschädigung.

Die Mäuse wurden mit S. pn. infiziert (A, B: n = 4, C: n = 9). Beginnend 24 h (blau) bzw. 48 h

(rot) nach Infektion wurden Behandlungsgruppen mit Ampicillin therapiert (n = 4 bzw. 9).

Kontrollgruppen wurden mit Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 4 bzw. 7) bzw. mit

Lösungsmittel behandelt (0,9 % NaCl, n = 4 bzw. 9). Histologische Analysen zur Ermittlung

des Schweregrades von A. Pleuritis und B. Steatitis. C. Zur Untersuchung der

Lungenschädigung wurde im Serum der Tiere Aspartat-Aminotransferase (AST) bestimmt.

A, B: Score-Einteilung: 0: nicht betroffen, 1: vereinzelt, 2: geringgradig, 3: mittelgradig, 4:

hochgradig, 5: massiv. Median ± Interquartilsabstand, C: Mittelwert ± SEM; 2-way

ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test oder A, B. Kruskal-Wallis Test/Dunn’s multiple

comparison Test für den Vergleich von Ampicillin- versus Lösungsmittel-Behandlung. und C.

1-way ANOVA/Dunnett’s multiple comparison Test für den Vergleich zu unbehandelten,

S. pn.-infizierten Tieren zu Therapiebeginn. * zeigt einen Unterschied zwischen Gruppen zum

selben Zeitpunkt an, # zeigt den Unterschied zum Therapiestart an. * p < 0,05, ** p < 0,01, ***

p < 0,001 und ****/#### p < 0,0001.

Z eit p.i. [h ]

P le u ritis S co re

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

** *

Z eit p.i. [h ]

S te a titis S c o re

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

***

Z eit p.i. [h ]

U /l [10 2]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5 *** *

Z eit p.i. [h ]

48 60 72 96 120

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

AST

Z eit p.i. [h ]

4 8 6 0 7 2

####

Z eit p.i. [h ]

4 8 6 0 7 2

####

A Pleuritis Score

B Steatitis Score

h o u rs p .i.

C lin ical S co re

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g sm itte l 2 4 h p .i.

P B S K on trolle

S . p n .

S . p n . + L ö su n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

h o u rs p .i.

C lin ical S co re

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g sm itte l 2 4 h p .i.

P B S K on trolle

S . p n .

S . p n . + L ö su n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

6.1.9 Nur eine frühe Therapie zeigt einen protektiven Effekt auf die Entwicklung eines

perivaskulären Ödems

Die Erfassung der Ödembildung in der Lunge ist in der Pneumonie von besonderer Bedeutung,

da es infolge dieser Flüssigkeitsansammlungen in Alveole und Interstitium zur Atemnot kommt

und der Patient nur noch beeinträchtigt Sauerstoff aufnehmen kann [168].

Bei der Bildung von Ödemen kommt es zum Übertritt von Flüssigkeit aus dem Blut in das

Interstitium (perivaskuläres Ödem) oder später in die Alveolen (alveoläres Ödem) der Lunge.

Grundlage dafür ist eine erhöhte vaskuläre Permeabilität. Die histopathologische Auswertung

zur Ausprägung der Ödeme wurde an H & E gefärbten Lungenschnitten mit Hilfe von Scores

evaluiert. Bereits 24 h nach einer S. pn.-Infektion zeigte sich ein perivaskuläres Ödem

(Abbildung 19 A, repräsentative Bilder in Abbildung 19 C). Innerhalb von 48 h konnte auch ein

alveoläres Ödem nachgewiesen werden (Abbildung 19 B, repräsentative Bilder in Abbildung

19 D). Das perivaskuläre Ödem konnte nach frühem Therapiestart im Vergleich zur

lösungsmittelbehandelten Kontrollgruppe zunächst reduziert werden, nahm allerdings im

Laufe der Infektion erneut tendenziell zu (Abbildung 19 A und C). Eine späte Therapie hatte

dahingegen keine Auswirkung auf die Ausbreitung des perivaskulären Ödems. Das Ausmaß

des alveolären Ödems zeigte sich tendenziell geringer als das des perivaskulären Ödems.

Eine frühzeitige antibakterielle Behandlung bewirkte eine tendenzielle, aber nicht signifikante

Reduktion der Ausbreitung des alveolären Ödems im Vergleich zur Kontrollgruppe,

wohingegen eine späte Behandlung keinen Therapieeffekt zeigte.

Abbildung 19: Die frühe antibakterielle Behandlung hat einen therapeutischen Effekt auf die

Ödemausprägung.

Die Mäuse wurden mit S. pn. infiziert (n = 4). Beginnend 24 h (blau) bzw. 48 h (rot) nach Infektion wurden

Behandlungsgruppen mit Ampicillin therapiert (n = 4). Kontrollgruppen wurden mit Lösungsmittel

scheininfiziert (1 × PBS, n = 4) bzw. mit Lösungsmittel behandelt (0,9 % NaCl, n = 4). Histologische Scores

zur Quantifizierung des Schweregrades an A. perivaskulärem und B. alveolärem Ödem. Score-Einteilung:

0: nicht betroffen, 1: vereinzelt, 2: geringgradig, 3: mittelgradig, 4: hochgradig, 5: massiv. A, B: Median ±

Interquartilsabstand; 2-way ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test für den Vergleich von Ampicillin-

versus Lösungsmittel-Behandlung. Kruskal-Wallis Test/Dunn’s multiple comparison Test für den Vergleich

zu unbehandelten, S. pn.-infizierten Tieren zu Therapiebeginn. * zeigt einen Unterschied zwischen Gruppen

zum selben Zeitpunkt an, # zeigt den Unterschied zum Therapiestart an. */# p < 0,05, ** p < 0,01 und #### p <

0,0001. Repräsentative H & E Färbung zur Darstellung von alveolärem (*) und Perivaskulärem (#) Ödem

nach C. frühzeitiger und D. später Therapie mit Ampicillin oder Lösungsmittel (0,9 % NaCl).

Maßstabsbalken: 100 µm.

Z e it p .i. [h ]

4 8 6 0 7 2

Z e it p .i. [h ]

A lve o lä re s Ö d e m

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

Z e it p .i. [h ]

P e rivask u lares Ö d e m

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

** *

Z e it p .i. [h ]

4 8 6 0 7 2

####

A B Alveoläres ÖdemPerivaskuläres Ödem

C Ödembildung nach früher Antibiose ab 24 h p.i.

Ampicillin 0,9 % NaCl.

36 h p.i.

Alveolär Perivaskulär

48 h p.i.

60 h p.i.

D Ödembildung nach später Antibiose ab 48 h p.i.

60 h p.i.

Ampicillin 0,9 % NaCl. 72 h p.i.

h o u rs p .i.

C lin ical S c o re

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g s m itte l 2 4 h p .i.

P B S K on tro lle

S . p n .

S . p n . + L ö s u n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

Ampicillin 0,9 % NaCl.

Ampicillin 0,9 % NaCl. Ampicillin 0,9 % NaCl.

Alveolär Perivaskulär

6.1.10 Ein frühzeitiger Therapiebeginn verhindert die Schädigung der alveolokapillären

Barriere

Eine weitere Möglichkeit, die Integrität der alveolokapillären Barriere zu untersuchen, ist neben

der histologischen Analyse der Ödemausprägung eine Quantifizierung von Makromolekülen

in Blut und Alveolarraum. Dazu wurden die Konzentrationen an murinem Serumalbumin (MSA)

in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) und Serum der analysierten Tiere mittels ELISA

bestimmt. MSA ist ein Protein mit einem molekularen Gewicht von 67 kDa, welches im Blut zu

finden ist und unter physiologischen Bedingungen nicht die alveolokapilläre Barriere übertritt.

Bei einem Integritätsverlust der Barriere kann man dieses Protein aber auch im Alveolarraum

nachweisen. Je höher das Verhältnis von MSA in BALF zu Serum, desto ausgeprägter ist

demnach die Schädigung der alveolokapillären Barriere. 24 h p.i. konnte noch keine vermehrte

Schädigung im Vergleich zur Lösungsmittel-infizierten Kontrollgruppe nachgewiesen werden

(Abbildung 20 A). Der frühe Beginn der Ampicillin-Therapie verhinderte einen weiteren

Anstieg, wodurch signifikante niedrigere Werte als bei den infizierten,

lösungsmittelbehandelten Kontrolltieren gemessen werden konnten. 48 h nach der S. pn.-

Infektion war eine signifikante Erhöhung der vaskulären Permeabilität im Vergleich zur

Kontrollgruppe messbar. Ein später Therapiebeginn konnte diese entstandene Schädigung

nicht beheben.

VEGF ist ein Wachstumsfaktor, der die Zellen der alveolokapillären Barriere beeinflussen und

somit die Permeabilität erhöhen kann und beispielsweise von Neutrophilen nach S. pn.-

Stimulation sekretiert wird [56, 169]. Analog zur Permeabilität zeigte sich, dass ein frühzeitiger

Therapiestart einen signifikanten Rückgang der VEGF-Konzentration im Alveolarraum

bewirkte, während dies nach einer verzögerten Behandlung nicht der Fall war (Abbildung

20 B).

Abbildung 20: Nur ein frühzeitiger Therapiestart erhält die Integrität der

alveolokapillären Barriere und reduziert lokale VEGF-Level.

Die Mäuse wurden mit S. pn. infiziert (n = 9). Beginnend 24 h (blau) bzw. 48 h (rot) nach

Infektion wurden Behandlungsgruppen mit Ampicillin therapiert (n = 9). Kontrollgruppen

wurden mit Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 7) bzw. mit Lösungsmittel

behandelt (0,9 % NaCl, n = 9). A. Quantifizierung der Permeabilität der alveolokapillären

Barriere mittels Messung von murinem Serumalbumin (MSA) in bronchoalveolärer

Lavageflüssigkeit (BALF) und Serum. B. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in

BALF. A, B: Mittelwert ± SEM; 2-way ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test für den

Vergleich von Ampicillin- versus Lösungsmittel-Behandlung. 1-way ANOVA/Dunnett’s

multiple comparison Test für den Vergleich zu unbehandelten, S. pn.-infizierten Tieren

zu Therapiebeginn. */# p < 0,05 und **/## p < 0,01.

Z e it p.i. [h ]

M S A B A L F /

M S A S e ru m [1 0 -2 ]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

Z e it p.i. [h ]

48 60 72 96 120

# #

Permeabilität

Z e it p.i. [h ]

pg/m l [10 2]

2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

# #

Z e it p.i. [h ]

48 60 72 96 120

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

VEGF

h o u rs p .i.

C lin ical S co re

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g sm itte l 2 4 h p .i.

P B S K on trolle

S . p n .

S . p n . + L ö su n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

h o u rs p .i.

C lin ical S co re

48 60 72 96 120

# # # #

S . p n . + A m p ic illin 2 4 h p .i.

S . p n . + L ö s u n g sm itte l 2 4 h p .i.

P B S K on trolle

S . p n .

S . p n . + L ö su n g s m itte l 4 8 h p .i.

S . p n . + A m p ic illin 4 8 h p .i.

6.2 Der Einfluss des Chemokins CXCL5 auf Neutrophile-Rekrutierung und

Lungenschädigung in der Streptokokken-induzierten Pneumonie

Neutrophile gehören in vielen Inflammationsmodellen zu den ersten Zellen, die zum Ort der

Infektion rekrutiert werden. Dies konnte im Zuge dieser Arbeit auch für die Pneumokokken-

induzierte Pneumonie in der Maus festgestellt werden (siehe 6.1.3). Für die Migration von

PMNs in den Alveolarraum scheinen der Oberflächenrezeptor CXCR2 und seine Liganden bei

vielen Erkrankungen eine tragende Rolle zu spielen, was beispielsweise in einem murinen

Tuberkulose-Modell gezeigt werden konnte [67]. Ebenfalls wurde in jener Arbeit dargestellt,

dass von den drei für die PMN-Rekrutierung wichtigen CXCR2 Liganden (CXCL1, CXCL2 und

CXCL5) CXCL5 als erstes in der Lavageflüssigkeit infizierter Tiere nachweisebar und allein für

mehr als 50 % der rekrutierten Neutrophilen zuständig war. Daten von Yamamoto et al.

zeigten, dass nach LPS- oder Pneumokokken-Stimulation CXCL5 von Epithelzellen sekretiert

wird und in diesem Modell ebenfalls eine Rolle bei der Neutrophile-Rekrutierung zu haben

scheint [65, 170]. Im weiteren Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde deshalb untersucht,

welche detaillierten Funktionen CXCL5 in der Pneumonie hat und ob eine mögliche Reduktion

der PMNs einen therapeutischen oder nachteiligen Effekt auf den Verlauf der Infektion mit sich

bringt.

6.2.1 Die CXCR2 Liganden werden in vivo nach S. pn-Infektion sekretiert

Verschiedene Pneumokokken Stämme unterscheiden sich durch den Aufbau der Kapsel, die

die Bakterien umkleidet (siehe 0). Zunächst sollte untersucht werden, ob neben dem bereits

untersuchten S. pn. Serotyp 3 (Abbildung 21 A) auch Serotyp 2 zur Sekretion der CXCR2

Liganden CXCL1, CXCL2 und CXCL5 führt (Abbildung 21 B). Ein signifikanter Anstieg der

Chemokin-Konzentrationen im Alveolarraum gegenüber kontrollinfizierter Tiere konnte für

beide untersuchten Serotypen gemessen werden. Beide Serotypen waren demnach in der

Lage, die Sekretion der untersuchten Chemokine zu induzieren. CXCL5 zeigte dabei im

Vergleich zu CXCL1 und CXCL2 bei beiden untersuchten Serotypen den höchsten Anstieg

zum Zeitpunkt zwei Stunden nach Infektion. Während die Konzentration von CXCL5 im

Anschluss an die Serotyp 3-Infektion im weiteren Verlauf tendenziell absank, nahm sie

während der Serotyp 2-Infektion weiter zu. Zum Zeitpunkt 48 h p.i. waren die Proteinlevel nach

Serotyp 3- (Mittelwert: 0,46 ng/ml) und Serotyp 2-Infektion (Mittelwert: 0,42 ng/ml) vergleichbar

hoch. Im Gegensatz dazu stiegen die Proteinkonzentrationen der Chemokine CXCL1 und

CXCL2 im Verlauf einer Serotyp 3-Infektion stärker an als infolge einer Serotyp 2-Infektion.

Abbildung 21: Sekretion von CXCL1, CXCL2 und CXCL5 nach S. pn.-Infektion in vivo.

WT Mäuse wurden mit S. pn. A. Serotyp 3 oder B. Serotyp 2 infiziert (n = 9 - 25). Kontrollgruppen

wurden mit Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 6 - 14). Die Chemokine CXCL1, CXCL2 und

CXCL5 wurden in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit mittels ELISA bestimmt. A, B: Mittelwert

± SEM; 2-way ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test zum Vergleich S. pn.-infiziert zu 1 × PBS. *

p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 und **** p < 0,0001.

6.2.2 Epithelzellen sind die Hauptquelle der CXCL5 Sekretion in der Mauslunge

Yamamoto et al. beschreiben in einem in vivo Modell, dass Epithelzellen (EpiCs) die

Hauptquelle für CXCL5 nach einer S. pn.-Infektion in der Lunge sind [170]. Um diese

Hypothese zu bestätigen und zusätzlich zu untersuchen, welche Zelltypen der Lunge CXCL1

und CXCL2 sekretieren, wurden verschiedene Lungen-residente oder -rekrutierte

Zellpopulationen isoliert und mit S. pn. stimuliert. CXCL1 wurde infolge einer Pneumokokken-

Infektion hauptsächlich von AlvMs (Abbildung 22 A), Epithelzellen (Abbildung 22 B) und

Endothelzellen (Abbildung 22 C) sekretiert. AlvMs sekretieren neben CXCL1 auch CXCL2,

ebenso wie PMNs (Abbildung 22 D). Auch EpiCs und Endothelzellen scheinen infolge einer

S. pn.-Stimulation geringe Mengen CXCL2 zu sekretieren. CXCL5 wird von EpiCs und

Thrombozyten (Abbildung 22 E) sekretiert. Da in den anschließenden in vitro Experimenten

auf eine EpiC Zelllinie zurückgegriffen werden sollte, wurde diese wie die Primärzellen infiziert.

Es zeigten sich weitestgehend analoge Sekretionsmuster (Abbildung 22 F), denn auch im

Überstand der Zelllinie waren die Chemokine CXCL1 und CXCL5 nach S. pn.-Infektion in

hohen Konzentrationen nachweisbar, allerdings konnte hier keine CXCL2 Sekretion

nachgewiesen werden.

Z e it p .i. [h]

C X C L 1 [n g /m l]

0 2 6 1 2 2 4 4 8 7 2

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

* *

* * *

Z e it p .i. [h]

C X C L 1 [n g /m l]

2 2 4 4 8 7 2 1 2 0

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

****

Z e it p .i. [h]

C X C L 2 [n g /m l]

2 2 4 4 8 7 2 1 2 0

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

***

Z e it p .i. [h]

C X C L 5 [n g /m l]

2 2 4 4 8 7 2 1 2 0

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

****

***

Z e it p .i. [h]

C X C L 2 [n g /m l]

0 2 6 1 2 2 4 4 8 7 2

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

*****

* *

Z e it p .i. [h]

C X C L 5 [n g /m l]

0 2 6 1 2 2 4 4 8 7 2

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

* * *

* * * ****

Z e it p .i. [h ]

C X C L 1 [n g /m l]

0 2 6 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

* *

* * *

S . p n .

1 P B S

S. pn. Serotyp 3

S. pn. Serotyp 2

Abbildung 22: Sekretion der Chemokine CXCL1, CXCL2 und CXCL5 nach S. pn.-Infektion

in vitro.

A. Alveoläre Makrophagen, B. Lungen Epithelzellen, C. Lungen Endothelzellen, D. Neutrophile

aus Knochenmark (PMNs), E. Thrombozyten aus dem Blut, und F. eine Epithel Zelllinie (T7)

wurden mit S. pn. Serotyp 2 infiziert. Als Kontrolle wurde mit Lösungsmittel (1 × PBS) infiziert.

Die Chemokine CXCL1, CXCL2 und CXCL5 wurden im Zellüberstand mittels ELISA bestimmt.

Die Versuche wurden 2 bis 3-mal unabhängig durchgeführt, repräsentative Experimente wurden

für diese Darstellung ausgewählt. A – F: Mittelwert ± SEM; 2-way ANOVA/Sidak’s multiple

comparison Test. * p < 0,05, **p < 0,01, *** p < 0,001 und ****p < 0,0001. n.n. = nicht nachweisbar.

EndothelzellenEpithelzellenAlveoläre

Makrophagen

PMNs Epithel ZelllinieThrombozyten

A B C

D E F

CXCL 1

CX C L 2

CX C L 5

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

2 ,5

****

C X C L [n g /m l]

CXCL 1

CX C L 2

CX C L 5

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

n.n.

****

C X C L [n g /m l]

CXCL 1

CX C L 2

CX C L 5

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

1 ,2 ****

n .n . n .n .

CXCL 1

CX C L 2

CX C L 5

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0 * *

n .n . n .n .

CXCL 1

CX C L 2

CX C L 5

1 0

1 5

2 0

2 5

n.n.

****

Z eit p.i. [h ]

C X C L 1 [n g /m l]

0 2 6 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

* *

* * *

S . p n .

1 P B S

CX C L 1

CXCL 2

CX C L 5

0 ,0 0

0 ,2 5

0 ,5 0

0 ,7 5

1 ,0 0

1 ,2 5

* * *

Z eit p.i. [h ]

C X C L 1 [n g /m l]

0 2 6 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

* *

* * *

S . p n .

1 P B S

6.2.3 Die Sekretion der CXCR2 Liganden von Epithelzellen ist TLR2-abhängig

Es ist bekannt, dass Oberflächenproteine von S. pn. von toll-like Rezeptoren (TLRs) erkannt

werden. Lipoproteine können an die Rezeptoren TLR1, TRL2 und TLR6 binden. In einem

Reportergen-Assay konnte bereits demonstriert werden, dass für eine S. pn.-induzierte

Immunantwort TLR2 notwendig ist [134]. Dies sollte nun auch für Epithelzellen nachgewiesen

werden. CXCL1 und CXCL5 wurden von T7 Zellen nach S. pn.-Infektion vermehrt sekretiert.

Dies konnte durch eine vorherige Inkubation mit einem anti-TLR2 Antikörper inhibiert werden

(Abbildung 23). Kein Einfluss konnte auf die CXCL2-Sekretion beobachtet werden. Hier waren

nur vereinzelt Werte messbar, die meisten befanden sich unter dem Detektionslimit des

ELISAs.

Abbildung 23: Die epitheliale Sekretion von CXCL1 und CXCL5 geschieht in Abhängigkeit vom

toll-like Rezeptor 2 (TLR2).

T7 Zellen wurden mit einem anti-TLR2 Antikörper bzw. Lösungsmittel (1 × PBS) inkubiert und

anschließend mit S. pn. Serotyp 2 infiziert. Zur Kontrolle wurden die Zellen analog mit Lösungsmittel

infiziert. Die Chemokine CXCL1, CXCL2 und CXCL5 wurden im Zellüberstand mittels ELISA

bestimmt. Die Versuche wurden 2-mal unabhängig durchgeführt, repräsentative Ergebnisse wurden

für diese Darstellung ausgewählt. Mittelwert + SEM; 2-way ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test.

**** p < 0,0001. n.n. = nicht nachweisbar.

CXCL5

1  P B S S T2

1 0

2 0

3 0 ****

C h e m o kin e [n g /m l]

1  P B S S T2

2 0

4 0

6 0

****

CXCL1 CXCL2

1  P B S S T2

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

n .n . n .n .

1  P B S S T2

30 **** K ontrolle

anti T LR 2

1  P B S S T2

30 **** K ontrolle

anti T LR 2

6.2.4 Die Abwesenheit von CXCL5 resultiert in einer stark verminderten Neutrophile-

Rekrutierung

Während in einem Tuberkulose-Modell CXCL5 für eine verstärkte Neutrophile-Rekrutierung

sorgt [67], scheint nach einer E. coli Infektion CXCL5 eine eher hemmende Wirkung zu

besitzen und andere Chemokine oder Zytokine für die Migration der PMNs essentiell zu sein

[171]. Infolge einer S. pn.-Infektion von WT und Cxcl5-Knockout Mäusen (Cxcl5−/−) zeigte sich

zum Zeitpunkt 24 h p.i. eine Verminderung der Neutrophile-Rekrutierung im Alveolarraum um

67 %, während keine Unterschiede zwischen den kontrollinfizierten Tieren zu beobachten

waren (Abbildung 24 A). Im Blut zeigte sich zum selben Zeitpunkt keine signifikant veränderte

Größe der Granulozyten Population (Abbildung 24 B).

Abbildung 24: Verminderte Neutrophile-Rekrutierung in den Alveolarraum S. pn.-

infizierter Mäuse in Abwesenheit von CXCL5.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden mit S. pn. Serotyp 2 infiziert (n = 14). Kontrollgruppen

wurden mit Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 8). Neutrophile wurden in A.

bronchoalveolären Lavage (BAL) mittels FACS und B. Blut mit Hilfe eines Hämatologie-

Gerätes bestimmt. A, B: Mittelwert ± SEM; 2-way ANOVA/Tukey’s multiple comparison Test.

**** p < 0,0001.

% d e r L e u ko zyte n

2 0

4 0

6 0

8 0 ****

S . p n .

1 P B S

P M N s in B A L [1 0 4]

1 0

1 5

2 0

2 5 ***

S . p n .1 P B S

P M N s / µ l B lut [1 0 3]

S . p n .1 P B S

% d e r L e u ko zyte n

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

S . p n .1 P B S

ANeutrophile im Alveolarraum

BNeutrophile im Blut

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a nd-

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T

C x c l5 -/-

Cxcl5−/−

6.2.5 Trotz erhöhter bakterieller Last ist die Mortalität nicht beeinflusst

Neutrophile scheinen einen essentiellen Beitrag bei der Eliminierung von Pathogenen zu

leisten [117], wurden in Cxcl5−/− Mäusen aber vermindert in den Alveolarraum rekrutiert. Die

bakterielle Last der infizierten Tiere wurde zum Zeitpunkt 24 h p.i. untersucht. Es zeigte sich,

dass im Alveolarraum (Abbildung 25 A) und im Lungengewebe (Abbildung 25 B) in

Abwesenheit von CXCL5 signifikant erhöhte Mengen des Erregers nachweisbar waren. In Blut

(Abbildung 25 C) und Milz (Abbildung 25 D) zeigten sich keine Unterschiede zwischen der WT

und der Cxcl5−/− Gruppe. Trotz erhöhter bakterieller Last konnte kein nachteiliger Effekt auf die

Überlebensrate der Tiere nachgewiesen werden: Die Mortalität der Cxcl5−/− Tiere unterschied

sich nicht signifikant von der Mortalität der WT Gruppe (Abbildung 25 E).

Abbildung 25: Eine erhöhte bakterielle Last in Alveolarraum und Lunge hat keinen nachteiligen

Effekt auf die Mortalität S. pn.-infizierter Mäuse.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden mit S. pn. Serotyp 2 infiziert (n = 14). Kontrollgruppen wurden mit

Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 8). Colony Forming Units (CFU) in A. bronchoalveolärer

Lavage (BAL), B. Lunge, C. Blut und D. Milz. A – D: Zur verbesserten Darstellung und statistischen

Auswertung nach der Formel Y=Y+1 modifiziert und anschließend logarithmiert. Median ±

Interquartilsabstand; Mann Whitney Test. ** p < 0,01 und **** p < 0,0001. E. Kaplan-Meier Test der

Überlebensrate der einzelnen Gruppen, Log-rank Test.

C F U / M ilz [lo g 1 0 ]

W T C x c l5 -/-

C F U / L u n g e [lo g 1 0 ]

* *

W T C x c l5 -/-

C F U /µ l B lu t [lo g 1 0 ]

W T C x c l5 -/-

C F U /µ l B A L [lo g 1 0 ]

****

W T C x c l5 -/-

A CFU BAL B CFU Lunge C CFU Blut

D CFU Milz E Mortalität

Z e it p.i. [h]

Ü b e rle b e n [% ]

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108120

2 0

4 0

6 0

8 0

100

Cxcl5−/−

6.2.6 Die Abwesenheit von CXCL5 beeinflusst neben Neutrophilen auch alveoläre

Makrophagen im Alveolarraum

Alveoläre Makrophagen haben eine wichtige Aufgabe in der Beseitigung von Pathogenen,

aber auch Überresten körpereigener Zellen wie apoptotischer PMNs [83, 84]. Durch diese

Phagozytose-Prozesse kann eine Schädigung des umliegenden Gewebes vermindert werden.

Dabei kommt es allerdings in vielen Infektionen auch zu einem Rückgang dieses Zelltyps, was

wiederum zu einer länger anhaltenden Inflammation führen kann. In Cxcl5−/− Tieren waren

nach einer S. pn.-Infektion trotz erhöhter bakterieller Last (siehe 6.2.5) signifikant mehr AlvMs

im Alveolarraum nachweisbar als in der WT Gruppe (Abbildung 26 A). Die Rekrutierung

anderer Immunzellen wie iMs (Abbildung 26 B) und DCs (Abbildung 26 C) war durch die

Abwesenheit von CXCL5 und der damit verbundenen verminderten Migration von

Neutrophilen nicht beeinflusst.

Abbildung 26: In S. pn.-infizierten Tieren sind alveoläre Makrophagen, aber nicht

inflammatorische Monozyten / Makrophagen oder dendritische Zellen, durch eine Cxcl5

Deletion beeinflusst.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden mit S. pn. Serotyp 2 infiziert (n = 14). Kontrollgruppen wurden mit

Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 8). A. Alveoläre Makrophagen (AlvMs), B.

Inflammatorische Monozyten / Makrophagen (iMs) und C. Dendritische Zellen (DCs) wurden in der

bronchoalveolären Lavage mittels FACS gemessen. A – C: Mittelwert ± SEM; 2-way ANOVA/Tukey’s

multiple comparison Test. ** p < 0,01 und **** p < 0,0001.

% d e r L e u ko zyte n

2 0

4 0

6 0

8 0

100 ****

S . p n .1 P B S

A lv M s in B A L [1 0 4]

1 0

1 5

2 0

S . p n .1 P B S

% d e r L e u ko zyte n

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

S . p n .1 P B S

D C s in B A L [1 0 2]

1 0

1 5

S . p n .1 P B S

% d e r L e u ko zyte n

S . p n .1 P B S

iM s in B A L [1 0 2]

1 0

2 0

3 0

4 0

S . p n .1 P B S

Alveoläre

Makrophagen

B Inflammatorische

Monozyten / Makropagen

C Dendritische

Zellen

WT Cxcl5−/−

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a n d-

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T

C x c l5 -/-

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a n d-

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T

C x c l5 -/-

6.2.7 CXCL5 beeinflusst keine weiteren inflammatorischen Mediatoren in

Alveolarraum und Blut

Da Neutrophile selbst inflammatorische Mediatoren sekretieren oder andere Zelltypen zur

Expression entsprechender Gene stimulieren können, wurden im Alveolarraum (Abbildung

27 A) und im Blut (Abbildung 27 B) eine Vielzahl an Zytokinen, Chemokinen und

Wachstumsfaktoren mit einem Multiplex-Assay gemessen. Es zeigten sich keine

unterschiedlichen Konzentrationen der Zytokine IL-1β, IL-6, TNF-α oder IFN-γ. Auch die

Wachstumsfaktoren G-CSF und GM-CSF blieben durch die Cxcl5 Deletion unverändert. Die

Chemokine CCL2, CCL3 und CXCL1 waren ebenfalls gleichbleibend zwischen den Gruppen

und es konnten keine signifikanten Unterschiede in Lavageflüssigkeit oder Plasma detektiert

werden. Erwartungsgemäß führte die Deletion des Cxcl5 Gens dazu, dass in den WT Tieren

signifikant mehr CXCL5 gemessen wurden als in der Knockout Gruppe.

Abbildung 27: Inflammatorische Mediatoren in einer S. pn.-Infektion werden durch eine Cxcl5

Deletion nicht beeinflusst.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden mit S. pn. Serotyp 2 infiziert (n = 14). Kontrollgruppen wurden mit

Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 8). Die Konzentrationen inflammatorischer Mediatoren

wurden in A. Alveolarraum und B. Plasma der Tiere mittels Multiplex bestimmt. Abkürzungen: BAL:

Bronchoalveoläre Lavage, IL: Interleukin, TNF: Tumornekrosefaktor, IFN: Interferon, G-CSF:

Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, GM-CSF: Granulozyten-Monozyten-Kolonie-

stimulierender Faktor. A, B: Mittelwert + SEM; 2-way ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test. ****

p < 0,0001.

A Konzentration inflammatorischer Mediatoren im Alveolarraum

M e d ia toren im

P la s m a [p g /m l]

IL -1

IL -6

T N F -

IF N -

G -C S F

G M -C S F

CCL 2

CC L 3

C X C L 1

CX C L 5

200

400

600

800

****

M e diatore n in

B A L F [p g /m l]

IL -1

IL -6

T N F -

IF N -

G -C S F

G M -C S F

CCL 2

CC L 3

C X C L 1

CX C L 5

100

200

300

400

500

****

Konzentration inflammatorischer Mediatoren im Plasma

K on ze n tra tion im

P la s m a [p g /m l]

IL -1

IL -6

T N F

IF N

G -C S F

GM -C S F

CCL2

CC L 3

C X C L 1

C X C L 5

200

400

600

800

**** W T

C x c l5 -/-

Cxcl5−/−

K on ze n tra tion im

P la s m a [p g /m l]

IL -1

IL -6

T N F

IF N

G -C S F

GM -C S F

CCL2

CC L 3

C X C L 1

C X C L 5

200

400

600

800

**** W T

C x c l5 -/-

Cxcl5−/−

6.2.8 Im Zuge einer Serotyp 2-Infektion schützt die Abwesenheit von CXCL5 nicht vor

Ödem-Entwicklung oder der bakteriellen Ausbreitung in die Peripherie

Analog zu einer Infektion mit Serotyp 3 Pneumokokken konnte bei mit Serotyp 2-infizierten WT

Mäusen zum Zeitpunkt 24 h p.i. ein tendenzieller Anstieg der histopathologischen Anzeichen

einer Pneumonie, zusammengefasst als Inflammationsscore, beobachtet werden (Abbildung

28 A und vergleiche Abbildung 14 B). Bei den Cxcl5-defizienten Tieren wurden zum WT

vergleichbare Scores ermittelt. Im analysierten Zeitraum von 24 h nach einer S. pn.-Infektion

wurde in keinem der Genotypen eine Entwicklung von alveolären Ödemen beobachtet (nicht

dargestellt), allerdings konnten bereits minimal bis mittelgradig ausgebildete perivaskuläre

Ödeme histologisch dargestellt werden (Abbildung 28 B). Auch hier wurde kein signifikanter

Unterschied zwischen WT und Cxcl5−/− Tieren festgestellt. Die Ausbreitung der

Pneumokokken und eine damit zusammenhängende leichte Entzündung des die Lunge

umgebenden Fettgewebes (Steatitis, Abbildung 28 C) konnte bei zwei von fünf Tieren 24 h p.i.

in beiden Gruppen beobachtet werden. Anzeichen einer Entzündung des Brustfells (Abbildung

28 D) waren ebenfalls bei einzelnen Tieren beider Gruppen feststellbar. Beide S. pn.-infizierte

Gruppen zeigten Anzeichen einer eitrigen Entzündung im Zuge der Pneumonie, die bei den

mit 1 × PBS scheininfizierten Kontrolltieren nicht darstellbar waren (Abbildung 28 E).

Abbildung 28: Histopathologische Analysen zeigen keine Unterschiede bei der Entwicklung

einer entzündlichen Pneumonie zwischen WT und Cxcl5─/─ auf.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden mit S. pn. Serotyp 2 (ST2) infiziert (n = 5). Kontrollgruppen wurden mit

Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 3). A. Inflammationsscore, zusammengestellt aus

histologischen Inflammationsparametern der Lunge. Histologische Scores zur Quantifizierung des

Schweregrades an B. Perivaskulärem Ödem, C. Steatitis und D. Pleuritis. A – D: Median ±

Interquartilsabstand. Score-Einteilung: 0: nicht betroffen, 1: vereinzelt, 2: geringgradig, 3: mittelgradig.

2-way ANOVA/Tukey’s multiple comparison Test. * p < 0,05. E. Repräsentative H & E Färbung

scheininfizierter (oben) und S. pn.-infizierter (unten) WT (links) und Cxcl5-KO (rechts) Tiere zur

Darstellung der eitrigen Pneumonie (*).

A Inflammationsscore B

Pleuritis Score

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

In fla m m a tio n s sc o re

S . p n .

1 P B S

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

P le u ritis S co re

S . p n .

1 P B S

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

S te a titis S co re

S . p n .

1 P B S

P e riv ask u lä re s

Ö d e m (S c o re )

S . p n .

1 P B S

Steatitis Score

Perivaskuläres Ödem

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a nd-

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T

C x c l5 -/-

Cxcl5−/−

S. pn. ST 2 1 PBS

E Histopathologische Darstellung

Cxcl5−/−

= 100 µm

*= eitrige Pneumonie

6.2.9 Die Abwesenheit von CXCL5 vermindert die Schädigung der alveolokapillären

Barriere

Durch die Endothel- und Epithelschicht der alveolokapillären Barriere eindringende, aktivierte

Neutrophile können zu einer Schädigung dieser schützenden Zellschicht zwischen Alveole und

Blutgefäß führen [110-112]. Die Quantifizierung der Schrankenstörung zeigte, dass Cxcl5-

defiziente Tiere zum Zeitpunkt 24 h p.i. niedrige Permeabilitätswerte aufwiesen, wohingegen

WT Tiere bereits eine Störung der alveolokapillären Barriere zeigten (Abbildung 29 A). Ein

Wachstumsfaktor, der zu einer Dissoziation der inter-endothelialen und -epithelialen Zell-Zell-

Verbindungen führen kann, ist VEGF [74]. Dieser Wachstumsfaktor wird unter anderem von

Neutrophilen, aber auch von inflammatorischen Monozyten / Makrophagen produziert und

scheint neben seinem schädigenden Effekt und seiner Neutrophile-rekrutierenden Wirkung

auch wichtig zu sein für die Gewebe-Reparatur [172]. Analog zu den reduzierten

Permeabilitätswerten zeigten Cxcl5−/− Tiere ebenfalls niedrige VEGF-Konzentrationen im

Alveolarraum.

Abbildung 29: Die Abwesenheit von CXCL5 schützt vor Barriereschädigung nach S. pn.-

Infektion.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden mit S. pn. Serotyp 2 infiziert (n = 14). Kontrollgruppen wurden mit

Lösungsmittel scheininfiziert (1 × PBS, n = 8). A. Die Bestimmung der Permeabilität der

alveolokapillären Barriere erfolgte mittels Quantifizierung von murinem Serumalbumin (MSA) in

bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) und Plasma. B. Die Bestimmung von Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF) aus der BALF erfolgte mittels ELISA. A, B: Mittelwert ± SEM; 2-

way ANOVA/Tukey’s multiple comparison Test. * p < 0,05 und *** p < 0,001.

6.3 Der Einfluss des Chemokins CXCL5 auf Neutrophile-Rekrutierung und

Lungenschädigung in einem Modell mechanischer Beatmung

Die Rolle von CXCL5 auf die alveolokapillären Barriere sollte auch unabhängig von einer

bakteriellen Infektion untersucht werden, weshalb ein Modell einer sterilen Lungenschädigung

eingesetzt wurde. Dazu wurden Mäuse mit einem Beatmungsgerät unter Einsatz hoch- und

niedrigvolumiger Tidalvolumina ventiliert. Mit diesem Modell kann die Situation von Patienten

A Permeabilität B VEGF

V E G F in B A L F [n g /m l]

0 ,0 0

0 ,0 2

0 ,0 4

0 ,0 6

0 ,0 8

0 ,1 0

0 ,1 2 * * *

S . p n .

1 P B S

M S A B A L F /

M S A P la s m a 1 0 - 3

1 0

1 5

2 0

2 5

S . p n .

1 P B S

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a nd-

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T

C x c l5 -/-

Cxcl5−/−

auf der Intensivstation simuliert und der Effekt einer mechanischen Beatmung auf Zell-

Rekrutierung, Lungenfunktion und Barriereschädigung untersucht werden.

6.3.1 Mechanische Beatmung induziert die Sekretion von CXC-Chemokinen und

Neutrophile-Infiltration in vivo

Auch im Zuge einer sterilen Inflammation kommt es zu einer Rekrutierung von Neutrophilen.

Dies kann beispielsweise durch Signale nekrotisierender Zellen eingeleitet werden [173, 174].

Im Zuge einer Ventilation mit hohem Tidalvolumen (HVT) über 240 min kam es in WT Tieren

zur vermehrten Sekretion der CXCR2-Liganden CXCL1 und CXCL5 im Vergleich zur nicht-

ventilierten (NV) WT Kontrollgruppe (Abbildung 30 A - C). Kein Einfluss konnte auf die

Sekretion von CXCL2 gemessen werden. Zwischen nicht-ventilierten WT und Cxcl5−/− Tieren

konnte kein Unterschied der Sekretion der CXC-Chemokine beobachtet werden. Infolge der

vierstündigen Beatmung mit hohem Tidalvolumen zeigte sich jedoch eine verminderte CXCL1-

Sekretion in der Cxcl5−/− Gruppe im Vergleich zu den WT Tieren.

Abbildung 30: Induktion der Ausschüttung von CXCL1 und CXCL5 nach hochvolumiger

mechanischer Beatmung in vivo.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden für 10 min mit einem Tidalvolumen von 9 mg/kg (NV: nicht ventiliert,

n = 8-9) oder für 240 min (HVT: hochvolumige Ventilation, n = 8-15) mit einem Tidalvolumen von

33 ml/kg beatmet. A. CXCL1, B. CXCL2 und C. CXCL5 in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit,

bestimmt mittels ELISA. A – C: Mittelwert + SEM. 2-way ANOVA/Tukey’s multiple comparison Test.

* p < 0,05 und **** p < 0,0001.

6.3.2 Mechanische zyklische Dehnung induziert die Ausschüttung von CXC-

Chemokinen und VEGF in vitro

Um zu überprüfen, ob die mechanische Belastung der Epithelzellen ursächlich war für die

erhöhten Chemokinlevel im Alveolarraum, wurde in vitro untersucht, ob eine zyklische

Dehnung von Epithelzellen die Sekretion der CXC-Chemokine induziert. Nach periodischer,

18 %-iger Dehnung eines einschichtigen Epithelzellrasens zeigte sich im Vergleich zur analog

behandelten statischen Kontrolle eine signifikante Erhöhung der CXCL1- und CXCL5-

0 ,0

0 ,1

0 ,2

0 ,3

0 ,4

C X C L 1 [n g /m l]

**** *

NV H VT

CXCL 1

C X C L 2

CX C L 5

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

C X C L [n g /m l]

W T H V T

* *

W T N V

0 ,0

0 ,1

0 ,2

0 ,3

0 ,4

0 ,5

C X C L 2 [n g /m l]

NV H VT

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

C X C L 5 [n g /m l]

NV H VT

WT Cxcl5−/−

CXCL 1

C X C L 2

CX C L 5

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

C X C L [n g /m l]

W T H V T

* *

W T N V

A CXCL1 B CXCL2 C CXCL5

Sekretion (Abbildung 31 A). CXCL2 konnte analog zur S. pn.-Infektion in vitro (siehe Abbildung

22 F) nicht im Zellüberstand detektiert werden. Die Sekretion von VEGF wurde nach

periodischer Dehnung der Zellen ebenfalls vermehrt induziert, allerdings auf einem niedrigeren

Niveau als die Chemokin-Konzentrationen (Abbildung 31 B).

Abbildung 31: Mechanische Dehnung von Epithelzellen induziert die Ausschüttung von

CXCL1, CXCL5 und VEGF.

T7 Zellen wurden auf Kollagen IV-beschichteten flexiblen Zellkultur-Membranen für 24 h mit einer

Frequenz von 0,25 Hz zyklisch um 18 % gedehnt. Statische Kontrollen (0 %) wurden auf analogen

Membranen im selben Inkubator parallel inkubiert. A. Die Chemokine CXCL1, CXCL2 und CXCL5

und B. der Wachstumsfaktor VEGF wurden im Zellüberstand mittels ELISA bestimmt. Die Versuche

wurden 2-mal unabhängig durchgeführt, ein repräsentatives Experiment wurden für diese Darstellung

ausgewählt. A, B: Mittelwert + SEM; A. 2-way ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test, B:

ungepaarter t-Test. ** p < 0,01 und **** p < 0,0001. n.n. =nicht nachweisbar.

6.3.3 In Abwesenheit von CXCL5 ist die Rekrutierung von Neutrophilen im Zuge der

mechanischen Ventilation vermindert

Im Anschluss an hochvolumige mechanische Beatmung war eine Infiltration von Neutrophilen

in den Alveolarraum zu beobachten, dabei war diese nach 240 min Ventilation bei den Cxcl5−/−

Tieren im Vergleich zur HVT WT Gruppe im Mittel um 53 % vermindert (Abbildung 32 A, B).

Bei den nicht-ventilierten Gruppen (Präparation und 10-minütige Ventilation mit niedrigem

Tidalvolumen) zeigten sich keine Unterschiede in der Infiltration von Neutrophilen in den

Alveolarraum. Im Blut wiesen die Cxcl5−/− Mäuse im Vergleich zum WT vor und nach einer

HVT-Beatmung tendenziell erhöhte Granulozyten-Konzentrationen auf. Anteilig an den

Gesamtleukozyten war dieser Unterschied signifikant (Abbildung 32 C).

A CXC-Chemokine B VEGF

C X C L 1 C X C L 2 C X C L 5

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

C X C L [n g /m l]

****

n .n .

0 ,0 0

0 ,0 5

0 ,1 0

0 ,1 5

V E G F [n g /m l]

* *

0 .0 0

0 .0 5

0 .1 0

0 .1 5

V E G F [n g /m l]

* *

18 %

0 %

Abbildung 32: Induktion der Neutrophile-Rekrutierung in den Alveolarraum durch

mechanische Beatmung.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden für 10 min mit einem Tidalvolumen von 9 mg/kg (NV: nicht ventiliert,

n = 8-9) oder für 240 min (HVT: hochvolumige Ventilation, n = 8-15) mit einem Tidalvolumen von

33 ml/kg beatmet. A. Neutrophile (PMNs) wurden in der bronchoalveolären Lavage mittels

Durchflusszytometrie bestimmt. B. Repräsentative Dot Blots der Neutrophilen-Populationen im

Alveolarraum. C. Neutrophile im Blut wurden mit Hilfe eines Hämatologie-Gerätes bestimmt. A, C:

Mittelwert + SEM. 2-way ANOVA/Tukey’s multiple comparison Test. ** p < 0,01, *** p < 0,001 und ****

p < 0,0001.

1 0

1 5

P M N s in B A L [1 0 3]

NV HVT

1 0

1 5

2 0

2 5

% d e r L e u ko zyte n

**** * *

NV HVT

A Neutrophile im Alveolarraum

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

2 ,5

G ranulo zyte n / µl

B lu t [1 0 3]

NV HVT

1 0

2 0

3 0

4 0

% d e r L e u ko zyte n

* * *

NV HVT

* *

Neutrophile im Blut

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a n d-

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T

C x c l5 -/-

Cxcl5−/−

HVT

Cxcl5−/−

Neutrophile im Alveolarraum –Dot Blots

CD11b

Ly6G

6.3.4 CXCL5 beeinflusst keine weitere Rekrutierung von Immunzellen in den

Alveolarraum bei einer mechanischen Beatmung

Auch im Zuge einer sterilen Inflammation werden AlvMs benötigt, um apoptotische oder

nekrotische PMNs zu beseitigen und eine weitere Schädigung des Gewebes zu reduzieren

[175]. Zu Beginn sowie nach der vierstündigen HVT Ventilation war die Zahl der AlvMs im

Alveolarraum durch eine Cxcl5 Deletion nicht beeinflusst (Abbildung 33 A). Allerdings zeigte

sich eine Verminderung der AlvM-Frequenzen im Mittel von 87 auf 73 % im Anschluss an eine

HVT Beatmung in der WT Gruppe, wohingegen bei der Cxcl5−/− Gruppe kein Rückgang

gemessen werden konnte, was mit einem Einstrom an Neutrophilen zusammenhing (siehe

Abbildung 32). Des Weiteren zeigten sich in keiner Gruppe eine Veränderung der totalen

Zellzahlen oder Frequenzen der iMs (Abbildung 33 B) und DC-Populationen (Abbildung 33 C)

in den Alveolen.

Abbildung 33: CXCL5 beeinflusst neben der PMN-Rekrutierung keine weiteren Immunzellen im

Alveolarraum nach mechanischer Beatmung.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden für 10 min mit einem Tidalvolumen von 9 mg/kg (NV: nicht ventiliert,

n = 8-9) oder für 240 min (HVT: hochvolumige Ventilation, n = 8-15) mit einem Tidalvolumen von

33 ml/kg beatmet. Totale Zellzahlen und Prozente an Leukozyten von A. Alveolären Makrophagen

(AlvMs), B. Inflammatorischen Monozyten / Makrophagen (iMs) und C. Dendritischen Zellen (DCs)

wurden mittels FACS in der bronchoalveolären Lavage (BAL) bestimmt. A – C: Mittelwert + SEM. 2-

way ANOVA/Tukey’s multiple comparison Test. * p < 0,05 und ** p < 0,01.

1 0

A lv M s in B A L [1 0 4]

NV HVT

2 5

5 0

7 5

100

% d e r Le u ko zyten

* *

NV HVT

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

2 ,5

% d e r Le u ko zyte n

NV HVT

iM s in B A L [10]

NV HVT

D C s in B A L [10]

NV HVT

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

% d e r Le u ko zyte n

NV HVT

A Alveoläre

Makrophagen

B Inflammatorische

Monozyten / Makrophagen

C Dendritische

Zellen

WT Cxcl5−/−

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a nd-

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T

C x c l5 -/-

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a nd-

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T

C x c l5 -/-

6.3.5 Die Abwesenheit von CXCL5 ist die Lungenfunktion unter mechanischer

Beatmung verbessert

Mit Hilfe des maximalen inspiratorischen Drucks (peak inspiratory pressure, PIP) ist eine

Aussage darüber möglich, wie viel Widerstand in der relativ steifen Trachea während der

Einatmung gemessen wird. Je höher dieser Wert, desto mehr Druck muss ausgeübt werden,

um die Lunge zu ventilieren. Auch die Dehnbarkeit der Lunge kann bestimmt werden, und

zwar mit Hilfe der „Compliance“. Diese ist definiert als der Quotient aus Volumenänderung pro

Druckänderung (C = ΔV × ΔP-1) und gibt Aufschluss darüber, wie viel Druck ausgeübt werden

muss, um die im Gegensatz zur steifen Trachea relativ elastische Lunge selbst zu dehnen.

Mehr Kraft muss beispielsweise aufgewendet werden, wenn die Lunge im Zuge einer

Schädigung des Gewebes steifer wird. Die Anwendung eines erhöhten Drucks wiederum kann

zu einer stärkeren Entwicklung von Ödemen führen als eine Beatmung mit geringerem Druck.

Zusammenfassend lässt sich demnach sagen, dass eine niedrige Compliance sowie erhöhte

PIP-Werte auf eine verschlechterte Lungenfunktion hinweisen. In Abwesenheit des

Chemokins CXCL5 zeigten die Tiere im Verlauf der vierstündigen mechanischen HVT-

Beatmung niedrigere PIP-Werte auf als in der WT Gruppe (Abbildung 34 A). Die Cxcl5-

defizienten Mäusen zeigten zwar im Vergleich zu den WT Tieren mit niedrigeren PIP Werten

in das Experiment ein, der Unterschied war zum Zeitpunkt 0 h aber statistisch nicht signifikant.

Nach 240 min Beatmung, zum Ende des Experiments, zeigten WT Tiere statistisch höhere

PIP-Werte im Vergleich zu den Cxcl5-defizienten Mäusen (Abbildung 34 A rechts). Für erhöhte

PIP-Werte können das Alter und das Gewicht der Tiere ursächlich sein, allerdings waren auch

hier keine signifikanten Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen messbar (Abbildung

34 B). Die Compliance der Cxcl5─/─ Tiere war tendenziell niedriger als in der WT-Gruppe

(Abbildung 34 C). Die Cxcl5-defizienten Mäuse zeigten bereits zu Beginn des Versuchs

tendenziell niedrigere Werte, die Unterschiede waren allerdings nicht statistisch signifikant.

Der Abfall in der Dehnbarkeit über die Beatmungszeit war bei den WT Tieren stärker

ausgeprägt. Dies zeigte sich deutlich nach Normalisierung der Messwerte der Compliance auf

den Anfangszeitpunkt t = 30 min. Der relative Complianceverlust war in den WT Tieren

demnach signifikant stärker als in der Cxcl5─/─ Gruppe. Über den Verlauf der Beatmung

entstanden in den Lungen der Cxcl5─/─ Tiere folglich signifikant weniger Versteifungen als in

den Lungen der WT Tiere.

Abbildung 34: Die Lungenfunktion ist in Abwesenheit von CXCL5 nach mechanischer

Beatmung verbessert.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden für 240 min (HVT: hochvolumige Ventilation, n = 11-15) mit einem

Tidalvolumen von 33 ml/kg beatmet. A. Maximaler inspiratorischer Druck (peak inspiratory pressure,

PIP), gemessen alle 10 min (links) und zu Beginn und Ende (rechts). B. Alter und Gewicht der

untersuchten Tiere. C. Dehnbarkeit der Lunge (Compliance), in absoluten Messwerten (oben) und

normalisiert zu t = 30 min (unten). A - C: Mittelwert ± SEM. A. 2-way ANOVA mit aufeinander

folgenden Messungen (links), 2-way ANOVA/Sidak’s multiple comparison Test (rechts), B.

ungepaarter t-Test. C. 2-way ANOVA mit aufeinander folgenden Messungen. *p < 0,05, ** p < 0,01

und **** p < 0,0001.

APeak Inspiratory Pressure (PIP)

B Alter und Gewicht

0 h 4 h

1 0

1 2

1 4

1 6

1 8

2 0 *

n .s .

A lte r [T a g e ]

W T C x c l5 -/-

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

G e w ich t [g ]

W T C x c l5 -/-

1 6

1 8

2 0

2 2

2 4

0 60 120 180 240

1 3

1 4

1 5

1 6

Z e it [m in ]

P IP [cm H 2O ]

****

0 60 120 180 240

0,020

0,025

0,030

0,035

Z e it [m in ]

c o m p lia n c e

C [m l/cm H 2O ]

C Dehnbarkeit der Lunge

60 120 180 240

0 ,8

0 ,9

1 ,0

1 ,1

1 ,2

Z e it [m in ]

re la tive C o m p lia n ce

* *

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a n d-

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T

C x c l5 -/-

Cxcl5−/−

WT HVT

Cxcl5−/− HVT

6.3.6 Histopathologische Untersuchungen der Lunge ventilierter Mäuse weisen auf

eine erhöhte Schädigung der Alveolarwand in Anwesenheit von CXCL5 hin

Zur Beurteilung der Entstehung von Ödemen und Emphysemen, der Schädigung der die

Alveole auskleidenden Epithelzellen und der Bildung hyaliner Membranen, erfolgten

histopathologische Untersuchungen der Lungen von WT und Cxcl5−/− Tieren. Hyaline

Membranen weisen auf einen diffusen alveolären Schaden hin. Sie entstehen, wenn

Plasmaproteine aufgrund einer Permeabilitätserhöhung aus dem vaskulären Kompartiment in

den Alveolarraum übertreten und gemeinsam mit nekrotischen Alveolarzellen

charakteristische transparente (hyaline) Membranen bilden. Die Auswertung der einzelnen

Tiere ergab, dass in allen Tieren der Cxcl5-defizienten Gruppe nach HVT Beatmung nur

vereinzelt Hyalin-Membranen in den Alveolen vorkamen, während bei drei von vier WT Tieren

tendenziell mehr dieser Strukturen gefunden werden konnten (Abbildung 35 A und F). Bei der

Entwicklung von alveolären und perivaskulären Ödemen konnten keine Unterschiede

zwischen den Genotypen beobachtet werden, ebenso nicht beim Auftreten alveolärer

Emphyseme (Abbildung 35 B - D). Diese Überblähung der alveolaren Strukturen entsteht

beispielsweise, wenn durch Inflammation und der damit verbundenen Leukozyten-

Rekrutierung Proteasen freigesetzt werden, die die Struktur der Alveolen schädigen. Dadurch

können die Alveolen kollabieren und die darin enthaltene Luft bleibt in diesen Blasen gefangen

[176]. Unterschiede zeigten sich aber in der Schädigung der Alveolarwand, welche

beispielsweise durch Nekrose von Epithelzellen versursacht werden kann. Während in

Abwesenheit von CXCL5 die Tiere nur minimale bis geringgradige Schädigungen aufwiesen,

konnte in der WT Gruppe eine gering- bis mittelgradige Ausprägung charakterisiert werden

(Abbildung 35 E und F).

Abbildung 35: Histopathologische Auswertung der ventilierten WT und Cxcl5─/─ Tiere.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden für 240 min (HVT: hochvolumige Ventilation, n = 4) mit einem

Tidalvolumen von 33 ml/kg beatmet. Histopathologische Scores der Ausbreitung von A. hyalinen

Membranen, B. alveolären Ödemen, C. perivaskulären Ödemen, D. alveolären Emphysemen und E.

der Schädigung der Alveolarwand. A – E: Score-Einteilung: 0: nicht betroffen, 1: vereinzelt, 2:

geringgradig, 3: mittelgradig, 4: hochgradig. Mittelwert ± SEM, Mann Whitney Test. F. Repräsentative

H & E Färbung (oben) und PAS (periodic acid-Schiff) Reaktion zur Darstellung von hyalinen

Membranen (Pfeil) und Alveolarwand-Schädigung (Pfeilkopf) in WT (links) und Cxcl5─/─ (rechts)

Tieren.

A Hyaline Membran B Alveoläres Ödem

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a n d-

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T C x c l5 -/-

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

2 ,5

H yaline

M em b ra n (S c o re )

W T C x c l5 -/-

P e riv ask u lä re s

Ö d e m (S c o re )

W T C x c l5 -/-

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

2 ,5

A lv e o lä re s

Ö d e m (S c o re )

W T C x c l5 -/-

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

2 ,5

A lv e o lä re s

E m p h y se m (S c o re )

C Perivaskuläres Ödem

D Alveoläres

Emphysem

E Schädigung der

Alveolarwand

H&E

PAS

F Histophatologische Darstellung

= Hyaline Membran = Alveolarwand-Schädigung = 100 µm

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a nd -

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T

C x c l5 -/-

Cxcl5−/−

6.3.7 In Abwesenheit von CXCL5 ist die alveolokapilläre Barriere unter mechanischer

Beatmung geschützt

Im Laufe der vierstündigen HVT Beatmung erhöhte sich die Permeabilität der alveolokapillären

Barriere bei den WT Tieren im Vergleich zu den nicht-beatmeten Kontrolltieren signifikant

(Abbildung 36 A). In Abwesenheit von CXCL5 zeigte sich nach hochvolumiger Ventilation eine

signifikant geringere vaskuläre Permeabilität im Vergleich zu den WT Tieren, jedoch nicht zur

nicht-ventilierten Kontrollgruppe (Abbildung 36 A). Beide Genotypen zeigten im Anschluss an

die Beatmung signifikant erhöhte VEGF Werte, wobei im Gegensatz zum Infektionsmodell (vgl

Abbildung 29 B) kein Unterschied zwischen der WT und der Cxcl5−/− Gruppe detektiert werden

konnte (Abbildung 36 B).

Abbildung 36: Bei einer mechanische Beatmung schützt die Abwesenheit von CXCL5 vor einer

Schädigung der alveolokapilläre Barriere.

WT und Cxcl5─/─ Mäuse wurden für 10 min mit einem Tidalvolumen von 9 mg/kg (NV: nicht ventiliert,

n = 8-9) oder für 240 min (HVT: hochvolumige Ventilation, n = 8-15) mit einem Tidalvolumen von

33 ml/kg beatmet. A. Die Bestimmung der Permeabilität der alveolokapillären Barriere mittels

Quantifizierung von humanem Serumalbumin (HSA, 90 min vor Versuchsende appliziert) in

bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) und Plasma. B. Die Bestimmung von Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF) aus der BALF erfolgte mittels ELISA. A, B: Mittelwert ± SEM; 2-

way ANOVA/Tukey’s multiple comparison Test. * p < 0,05, ** p < 0,01 und **** p < 0,0001.

A Permeabilität B VEGF

H S A B A L F /

H S A P la s m a 1 0 - 3

NV HVT

* *

0 ,0 0

0 ,0 5

0 ,1 0

0 ,1 5

0 ,2 0

0 ,2 5

V E G F in B A L F [n g /m l]

* *

****

NV HVT

W T C x c l5 -/-

A lve o la rw a nd-

S c h ä d ig u n g (S co re )

W T

C x c l5 -/-

Cxcl5−/−

7 Diskussion

7.1 Etablierung eines Modells der frühzeitigen und späten Antibiotikatherapie

bei Pneumokokken-induzierter Pneumonie

Bei einer Lungenentzündung handelt es sich um eine schwerwiegende Infektion der unteren

Atemwege. Vor allem die Ausbreitung des Pathogens (S. pneumoniae gilt dabei als der

häufigste Erreger [10]) von der Lunge in die Peripherie wird mit einer erhöhten Sterblichkeit

assoziiert, während nicht-invasive Formen oftmals milder verlaufen [5, 7]. Die Mortalität der

Pneumonie liegt trotz antibakterieller Therapie bei 12 - 13 % [5, 6], wobei sie bei Patienten, die

wegen einer schwerwiegenden Infektion auf die Intensivstation eingewiesen werden müssen,

deutlich höher ist [9, 34, 177, 178]. In den letzten Jahren konnte in diversen Studien gezeigt

werden, dass eine umgehende antibakterielle Therapie innerhalb von vier Stunden nach

Vorstellung des Patienten beim Arzt mit einer verbesserten Überlebensrate assoziiert ist [19,

20].

Die im Zuge der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente zum Vergleich zwischen

frühzeitigem und spätem Behandlungsstart hatten die Ziele, diese Aussagen zu bestätigen,

zugrundeliegende Mechanismen zu untersuchen sowie Ansatzpunkte für adjuvante Therapien

herauszustellen.

Zum frühzeitigen Behandlungsstart zum Zeitpunkt 24 h p.i. zeigten die infizierten Tiere bereits

äußerlich sichtbare Krankheitssymptome wie ungepflegtes Fell oder ruhigeres Verhalten, was

eine Verschlechterung des allgemeinen Befindens der Tiere implizierte. Auch

Körpertemperatur und -gewicht waren 24 h p.i. signifikant reduziert. Des Weiteren konnten

Pneumokokken in Lunge, Alveolarraum und Blut nachgewiesen werden. Die Infektion hatte

sich demnach bereits von einer lokalen Infektion in die Peripherie ausgebreitet. In den

histopathologischen Untersuchungen der Lunge zeigten sich bereits perivaskuläre Ödeme,

jedoch keine Hinweise auf ein alveoläres Ödem oder eine Schädigung der alveolokapillären

Barriere. In unserem Modell hatten die Tiere demnach bereits zum Zeitpunkt 24 h p.i., dem

Start der frühen Therapie, eine Pneumonie und Bakteriämie ausgebildet. Die frühe

Behandlung zeigte dennoch einen protektiven Effekt, weshalb 97 % der S. pn.-infizierten Tiere

die Infektion überlebten.

Problematisch bei der Therapie einer Pneumonie ist wie bei anderen Erkrankungen unter

anderem auch, dass viele Patienten erst bei einer weit fortgeschrittenen Erkrankung in

medizinische Betreuung kommen oder dass Komorbiditäten den Krankheitsverlauf

beschleunigen. Aus diesem Grund ist eine frühzeitige Behandlung (analog zu dem im Modell

gewählten frühem Therapiebeginn) nicht mehr möglich, was eine der Ursachen für die hohe

Mortalität der Pneumonie ist. Weitere Gründe für das Versterben von Patienten trotz

antimikrobieller Therapie sind vielseitig. Resistenzen gegenüber verwendeten Antibiotika

werden als eine Ursache genannt. Auch die falsche Dosierung des Antibiotikums kann ein

Grund für das Versterben von Patienten sein [179]. Generell werden beispielsweise hohes

Alter und männliches Geschlecht als Risikofaktoren genannt, die in dem für die vorliegende

Arbeit gewählten Modell aber nicht dargestellt wurden [34].

Eine stark fortgeschrittene Pneumonie sollte in dem experimentellen Tiermodell mit Hilfe eines

späteren Behandlungsstarts zum Zeitpunkt 48 h p.i., also nur 24 h nach Beginn der

frühzeitigen Therapie, repräsentiert werden. Zu diesem Zeitpunkt waren Körpergewicht- und

Temperatur der Versuchstiere weiter gesunken und die äußerlich erkennbaren Symptome

einer Pneumonie hatten sich noch verstärkt. Neben einem perivaskulärem Ödem konnten

auch ausgeprägte alveoläre Ödeme nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigte sich eine

deutliche Schädigung der alveolokapillären Barriere und eine ausgeprägte systemische

Inflammation hatte sich bereits ausgebildet. Im Gegensatz zu einer frühen Therapie war ein

Behandlungsstart zu diesem Zeitpunkt nicht mehr protektiv, weshalb nur etwa 20 % der

therapierten Versuchstiere diese Erkrankung überlebten.

Die im Infektionsmodell beobachtete Mortalität ist damit höher als die bei Patienten

dokumentierte Sterblichkeit, obwohl einige beim Menschen bestehende Risikofaktoren wie

hohes Alter oder Komorbiditäten bei den Tieren nicht vorlagen. Allerdings werden schwer

erkrankte Patienten im Krankenhaus intensiver und umfangreicher therapiert als die Mäuse in

dem für diese Arbeit verwendeten Modell. Sie erhalten beispielsweise, wenn die Monotherapie

mit einem einzelnen Antibiotikum nicht mehr ausreichend sein könnte, Makrolide, die

entzündungshemmend wirken und so zu einer verbesserten Überlebenschance beitragen

können [21, 180]. Auch eine zusätzliche Flüssigkeitszufuhr gegen die Dehydrierung wird

gewährleistet. Solch eine intensive Betreuung stellt das in dieser Arbeit verwendete Modell

nicht bereit, was ein zusätzlicher Grund für die hohe Mortalität der spät therapierten Tiere sein

könnte.

Es muss des Weiteren angebracht werden, dass sich die Immunreaktion von Mensch und

Maus in vielen Punkten unterscheidet. Mäuse, die abgeschirmt von vorherigen Infektionen in

einer Tierhaltung geboren wurden, zeigen beispielsweise eine andere Reaktion auf Pathogene

als Menschen, deren Immunsystem durch vorherige Infektionen besser adaptiert ist. Da naive

Labormäuse beispielsweise keine T-Gedächtniszellen aufweisen, ähnelt ihre Immunantwort

eher der Neugeborener als der Erwachsener. Mäuse, die unter Exposition von Mikroben leben,

wie freilebende Tiere oder solche aus einem Zoofachgeschäft, weisen dagegen diese

Lymphozyten-Population auf [181]. Bereits die gemeinsame Haltung von Labor- und

Fachgeschäft-Mäusen genügt, um eine Immunreaktion hervorzurufen, die der Erwachsener

ähnlicher ist. Weiterführende Experimente könnten diesen Ansatz des „Co-Housings“ nutzen,

um die Immunreaktion der Tiere ähnlicher der von Patienten zu gestalten.

Auch der Aufbau der Lunge unterscheidet sich zwischen Maus und Mensch. Während die

Maus nur einen linken Lungenlappen hat, sind beim Menschen zwei linke Lappen ausgeprägt.

Die Zellen der alveolokapillären Barriere sind dünner bei der Maus (0,32 µm) als beim

Menschen (0,62 µm), was möglicherweise Einfluss auf Gasaustausch und Lungenmechanik

hat [182]. Des Weiteren werden für tierexperimentelle Untersuchungen Inzuchtlinien

verwendet, um die genetische Varianz zwischen den Tieren zu minimieren. Auch dies steht im

Gegensatz zu humanen Patienten, die eine hohe genetische Streuung aufweisen. Trotz all der

Unterschiede, die zwischen einem murinen Modell und humanen Patienten herrschen, zeigen

die Versuchstiere der für die vorliegende Arbeit durchgeführten Experimente im Verlauf der

Pneumonie sehr viele Überschneidungen zum Menschen. So zeigten Rodriguez et al., dass

die Mortalität immunkompetenter Pneumonie-Patienten trotz adäquater antibakterieller

Therapie und Behandlung von Komorbiditäten bei 20,7 % liegen kann [178]. Vor allem das

Voranschreiten der Infektion mit der Ausbreitung in die Peripherie, einer messbaren Erhöhung

inflammatorischer Mediatoren in Alveolarraum und Blutsystem und der Schädigung

sekundärer Organe spiegelt den Infektionsverlauf im Menschen wider.

In dieser Arbeit sollte der Fokus nicht auf die Therapie- oder Resistenz-assoziierten [179],

sondern auf die wirtsspezifischen Probleme bei der Behandlung einer Pneumonie gelegt

werden. Diese umfassen beispielsweise die häufig auftretende unkontrollierte

Hyperinflammation, die im Zuge einer Infektion zu einer Schädigung des Lungengewebes,

Multiorganversagen und Sepsis führen kann [179]. Auch bereits bestehende eitrige

Entzündungen, beispielsweise der Lunge, zählen zu den wirtsspezifischen Problemen, werden

aber in dieser Arbeit nicht adressiert. Der Fokus auf wirtsspezifische Probleme bei der

Therapie konnte erzielt werden, indem die Faktoren falsche Dosierung und Resistenzen durch

die kontrollierte Durchführung der Experimente und die Wahl eines nicht resistenten S. pn.-

Stammes ausgeschlossen wurden. Für die Entwicklung neuer adjuvanter Therapien, die

wirtsspezifische Probleme bei der Infektionsresolution adressieren, ist eine detaillierte

Untersuchung der genauen Abläufe der Immunreaktion essentiell. Der Fokus richtete sich

hierbei vor allem auf die Frage, welche potentiell schädigenden Prozesse der Immunantwort

durch eine antimikrobielle Therapie reversibel sind und an welchen Stellen die alleinige

Eliminierung der Pathogene nicht ausreicht, um dem Patienten zu helfen. Um diese Frage

genauer zu untersuchen, bietet sich das für diese Arbeit gewählte Modell der frühzeitigen,

protektiven im Vergleich zur verspäteten, unzureichenden Therapie mit Ampicillin sehr gut an.

Mit Hilfe des Versuchsaufbaus konnten detaillierte Mechanismen hinter dem

Therapieversagen untersucht und Ansätze für die Entwicklung neuer adjuvanter

Behandlungsmöglichkeiten herausgestellt werden.

7.2 Mögliche Mechanismen hinter dem Therapieversagen einer späten

antibakteriellen Behandlung

In der Klinik stehen Mediziner vor der schweren Aufgabe, die Therapie eines Pneumonie-

Patienten zu modifizieren, sollte sich dessen Verfassung trotz antibakterieller Behandlung

nicht verbessern. Neben den Fragen, ob eventuelle Resistenzen ursächlich sind [183] oder die

richtige Antibiotika-Klasse und -Dosis [184-186] eingesetzt wurde, müssen hierbei auch

wirtsspezifische Probleme in Betracht gezogen werden. Denn trotz adäquat eingesetzter

antimikrobieller Behandlung verschlechtert sich der Zustand vieler Patienten im Zuge der

Behandlung [178]. Die Autoren dieser und weiterer Studien nehmen an, dass bei der

Entwicklung einer schweren invasiven Pneumonie und einer damit assoziierten Sepsis eine

Hyperinflammation zu einer schweren Schädigung der Organe führt [34, 178, 187].

Um diese Annahme zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit exploriert, welche

Prozesse ursächlich für die unterschiedlichen Überlebensraten der frühzeitig und verspätet

behandelten Tiere sind. Dafür wurden lokale und systemische inflammatorische Reaktionen

detailliert ausgewertet. Auffällig war, dass viele Prozesse in den S. pn.-infizierten Mäusen zu

beiden Behandlungsstarts analog verliefen. Die Eliminierung der Pneumokokken erfolgte nach

frühzeitigem und spätem Therapiebeginn in vergleichbarem Umfang und schien demnach

nicht ursächlich zu sein für die unterschiedliche Mortalität der Versuchsgruppen. Des Weiteren

schien die Anwesenheit von Immunzellen im Alveolarraum generell nicht durch die eingesetzte

Therapie beeinflusst zu werden, da keine Unterschiede zu den infizierten, Lösungsmittel-

therapierten Tieren gemessen werden konnten. Es konnte allerdings nicht gezeigt werden, ob

Unterschiede in der Apoptose- bzw. Nekroserate der Leukozyten zwischen den Gruppen

vorzufinden waren, da entsprechende Marker (z. B. 7-AAD und Annexin V zur Unterscheidung

apoptotischer von nekrotisierenden Zellen [188]) nicht untersucht wurden. Wie im

Alveolarraum war auch im Blut kein Effekt von Ampicillin auf die zirkulierenden Neutrophilen

und Monozyten messbar.

Die gleichbleibende Anzahl an Neutrophilen in der Lunge könnte in der von der antibakteriellen

Therapie unbeeinflussten Konzentration des Neutrophile-rekrutierenden Chemokins CXCL5

im Alveolarraum der Tiere begründet liegen [67]. Diese unveränderten CXCL5-Level scheinen

nicht in der Methodik der Aufbereitung der Lavage und einer damit verbundenen

unkontrollierten Ausschüttung des Chemokins begründet zu sein, da signifikante Unterschiede

zur kontroll-infizierten Gruppe nachweisbar waren. Möglicherweise kann die CXCL5-Sekretion

von Epithelzellen durch die zellulären Bestandteile der antibakteriell lysierten Pneumokokken

vermehrt induziert werden. Dies wurde bereits von Baumgartner et al. in vitro für einen

Serotyp 3 S. pn. Stamm an humanen Epithelzellen des Nasopharynx gezeigt. Hier induzierten

antibiotisch lysierte Bakterien eine stärkere Sekretion des Neutrophile-rekrutierenden

Chemokins CXCL8 [189], einem humanen Analog von CXCL5, als intakte Pneumokokken

[190]. Ein weiterer Mechanismus hinter der unveränderten CXCL5-Konzentration könnten die

erhöhten IL-12p40 Werte sein. IL-12p40 ist eine Untereinheit der beiden Interleukine IL-12 und

IL-23. Die Sekretion von IL-12 wird beispielsweise durch freigesetzte Pneumokokken-RNA

induziert [191] und scheint ebenfalls die Rekrutierung von Neutrophilen zu begünstigen [192].

IL-23 kann die IL-17 Sekretion einiger T-Zell Populationen induzieren [193, 194]. In einem

Klebsiella pneumoniae-Infektionsmodell wurde gezeigt, dass IL-17 zu einer stärkeren CXCL5-

Sekretion alveolärer Epithelzellen führt, welche wiederum eine vermehrte Neutrophile-

Rekrutierung induziert [195]. Im Laufe der Resolution der Pneumonie kam es in allen

überlebenden Tieren zum Rückgang der Neutrophilen im Alveolarraum. Im Menschen konnte

gezeigt werden, dass Patienten, bei denen die Resolution verzögert abläuft, auch zwei

Wochen nach einer antibakteriellen Therapie mehr Neutrophile im Alveolarraum aufwiesen als

Patienten mit einer unkomplizierten Pneumonie [196]. Die Autoren dieser Studie konnten auch

beobachten, dass inflammatorische Mediatoren im Blut der Patienten zu diesem Zeitpunkt

nicht mehr nachweisbar waren, die lokalen Zellpopulation der Patienten aber längere Zeit

erhöht waren. Die in der vorliegenden Arbeit erhobenen Ergebnisse zeigten keinen

Unterschied an Neutrophilen zwischen früher und später Therapie. Allerdings muss angemerkt

werden, dass nach spätem Behandlungsbeginn zu den Zeitpunkten 72 h, 96 h und 120 h p.i.

nur 20 % der zu Experimentstart infizierten Tiere überlebt hatten, welche in die Analyse

einfließen konnten. Diese Tiere zeigten zwar zu Beginn des Versuchs eine vergleichbare

Ausprägung der messbaren Symptomatik und wurden deshalb nicht aus dem Experiment

ausgeschlossen, möglicherweise waren sie dennoch in der Lage, die Infektion mit eigenen

Kräften besser zu bekämpfen als die Mehrzahl der übrigen Tiere. Dadurch könnte es zu einer

Verschiebung der Ergebnisse gekommen sein, da nur die Mäuse, die zu diesen späten

Zeitpunkten noch am Leben waren, analysiert wurden und die schweren Verläufe, die im Zuge

des Versuches euthanasiert werden mussten, nicht mit in die Analysen aufgenommen werden

konnten.

Im Gegensatz zu den Ergebnissen in dieser Arbeit wurde in anderen Studien an S. pn.-

infizierten, Ampicillin-behandelten Mäusen festgestellt, dass eine Ampicillin-Therapie zu einer

zumindest tendenziellen Reduktion von Neutrophilen im Alveolarraum führen kann [197, 198].

Direkte immunomodulatorische Effekte von β-Laktamen auf die Leukozyten-Rekrutierung sind

nicht bekannt, es konnte aber gezeigt werden, dass Ampicillin möglicherweise die

Differenzierung humaner T-Zellen einleiten kann [199]. Dennoch scheint die in anderen

Studien beobachtete Reduktion der Leukozyten im Alveolarraum eher indirekt und im

Zusammenhang mit der Eliminierung der Bakterien durch das Antibiotikum induziert worden

zu sein. Die oben diskutierten Chemokine und Interleukine wurden in den genannten Arbeiten

nicht quantifiziert, weshalb keine Aussage darüber getroffen werden kann, inwieweit diese

ebenfalls beeinflusst waren.

Obwohl die Anzahl der im Alveolarraum vorgefundenen Immunzellpopulationen in den

Versuchen der vorliegenden Arbeit nicht durch Ampicillin beeinflusst wurde, schienen sich ihre

Aktivierungsgrade im Anschluss an eine Therapie signifikant zu vermindern. Dies wurde

indirekt anhand der sekretierten inflammatorischen Mediatoren gemessen, deren Level mit

Ausnahme von CXCL5, GM-CSF und IL-12 / -23 nach beiden Behandlungsstarts absanken.

Der Wachstumsfaktor GM-CSF wird beispielsweise von alveolären Epithelzellen sekretiert

[200] und ist essentiell für die Funktionalität alveolärer Makrophagen und der damit

einhergehenden Elimination von Pathogenen [166, 201]. Das Absinken der anderen

Mediatoren-Konzentrationen war vor allem nach frühzeitiger Behandlung deutlich erkennbar.

Auch nach später Behandlung kam es zu einer signifikanten Reduktion vieler Zytokin- und

Chemokin-Level, allerdings muss an dieser Stelle erneut auf den geringen Gruppenumfang ab

dem Zeitpunkt 72 h p.i. hingewiesen werden, weshalb diese Daten nur unter Vorbehalt

interpretiert werden können.

Bei den Mediatoren IL-1β, TNF-α und IFN-γ konnte eine tendenzielle Zunahme der

Konzentrationen 12 h nach frühzeitigem Therapiestart im Alveolarraum gemessen werden.

Diese kurzfristige Erhöhung der Sekretion könnte auf den lytischen Eigenschaften von

Ampicillin basieren. Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Verwendung eines

lytischen Antibiotikums zu einer stärkeren TNF-α-Sekretion in Makrophagen führt als die

Verwendung eines nicht-lytischen Antibiotikums [202] und dass die Zellwand grampositiver

Bakterien die Sekretion von TNF-α und IL-6 in humanen Monozyten induzieren kann [203].

Da dieser Anstieg der Zytokin-Konzentrationen nur kurzfristig war und die früh therapierten

Tiere zu diesem Zeitpunkt bereits eine verbesserte äußerlich erkennbare Symptomatik und

eine normalisierte Körpertemperatur aufwiesen, kann davon ausgegangen werden, dass

dieser Anstieg zu keiner Benachteiligung der Versuchstiere führte. Die frühzeitige Therapie

verhinderte erfolgreich das Voranschreiten der Infektion und die Ausbildung von

bakterieninduzierten Läsionen, bereits entwickelte Gewebeschädigungen konnten jedoch

nicht vermindert werden. Diese Läsionen spiegelten sich jedoch in dieser Versuchsgruppe

nicht in weiteren Symptomen wider. Zu Beginn der späten Therapie war es bereits zu einer

stärkeren Schädigung des Lungengewebes gekommen, vermutlich aufgrund der längeren

Exposition mit einer hohen bakteriellen Last und Inflammation. Auch hier bewirkte die

antibakterielle Behandlung keinen Rückgang der bereits ausgebildeten Läsionen.

Zum späten Therapiebeginn hatten sich Infektion und damit einhergehende entzündliche

Reaktionen im Körper der Tiere bereits in die Peripherie ausgebreitet, was pathologisch

beispielsweise an der hochgradig entwickelten Pleuritis sowie Steatitis erkennbar war. Die

bakterielle Last im Blut der Versuchstiere zum Zeitpunkt 48 h p.i. lag auf einem ähnlichen

Niveau wie beim frühen Behandlungsstart und beide Therapien führten zu einer umgehenden

Reduktion der bakteriellen Last im Blut. Zum Zeitpunkt 24 h p.i. konnte trotz hoher Erregerlast

im Blut der Versuchstiere noch kein signifikanter Anstieg der inflammatorischen Mediatoren im

Serum im Vergleich zu den kontroll-infizierten Tieren nachgewiesen werden. Im Gegensatz

dazu waren die Werte zum Zeitpunkt 48 h p.i. stark erhöht und es zeigten sich vermehrt

leberspezifische Entzündungswerte. Bei Pneumonie-Patienten werden die lokal produzierten

Zytokine im Alveolarraum stärker sekretiert und sind deshalb besser quantifizierbar als im Blut

[204, 205]. Es konnte allerdings gezeigt werden, dass die systemischen Konzentrationen von

beispielsweise IL-6 und IFN-γ in Pneumonie-Patienten ebenfalls erhöht sind und mit der

Schwere der Erkrankung korrelieren. Im Gegensatz dazu können die inflammatorischen

Mediatoren in der BAL nicht mit dem aktuellen Krankheitsverlauf assoziiert werden [204-206].

Diese Beobachtungen decken sich mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, in der die

lokale Inflammation unabhängig von der weiteren Entwicklung der Pneumonie im Zuge der

antibakteriellen Behandlung abnimmt, wohingegen die systemischen Konzentrationen mit der

Schwere der Pneumonie korrelierten. Des Weiteren konnten Endeman et al. keinen

Unterschied in den systemischen Zytokin-Leveln zwischen adäquat und inadäquat

antibakteriell therapierten Patienten messen. Allerdings wurde dieses Ergebnis nicht in

Abhängigkeit der Schwere der Pneumonie untersucht. Deshalb ist keine Aussage darüber

möglich, ob es, wie in dieser Dissertation, Abhängigkeiten zwischen systemischer

Inflammation und Krankheitsverlauf gab [207].

Mehrere Ursachen könnten der Beobachtung zugrunde liegen, dass zum Zeitpunkt des

späteren Behandlungsstarts signifikant erhöhte systemische Konzentrationen

inflammatorischer Mediatoren gemessen wurden, während dies zu 24 h p.i. trotz

vergleichbarer bakterieller Last noch nicht der Fall war. Zum einen hatte das Blutsystem eine

um 24 Stunden verlängerte bakterielle Expositionszeit, wodurch die vaskulären Endothelzellen

und zirkulierenden Immunzellen vermehrt Zytokine und Chemokine produzieren konnten.

Achouiti et al. konnten ebenfalls eine Zunahme der gemessenen inflammatorischen

Mediatoren im Blut S. pn.-infizierter Mäuse über die Zeit messen, allerdings stieg hier auch die

bakterielle Last im gleichen Zeitraum an, weshalb nicht gesagt werden kann, ob die vermehrte

Inflammation eine direkte Folge der erhöhten bakteriellen Last war oder die verlängerte

Inkubationszeit der Bakterien im Blut zu diesem Ergebnis führte [208]. Neben dem bekannten

Vorgang des aktiven Übertritts der Bakterien aus dem Lungenkompartiment in die Peripherie

[209-211] und der darauffolgenden sekundären systemischen Entzündungsreaktion, könnte

es auch zu einem unkontrollierten Übergang der lokalen inflammatorischen Mediatoren über

die zum Zeitpunkt 48 h p.i. geschädigte alveolokapilläre Barriere gekommen sein. Die

Schädigung der alveolokapillären Barriere wird in vielen Studien und Übersichtsarbeiten als

ein zentraler Schritt bei der Pathogenese einer Pneumonie beschrieben, der im

Zusammenhang mit der Entwicklung von Atemversagen, Sepsis und der Schädigung weiterer

Organe stehen kann [113, 212, 213].

Die Schädigung dieser zellulären Barriere wurde in dieser Arbeit nur durch die frühzeitige

Therapie verhindert. Gracia et al. zeigten in einer Studie mit S. pn.-infizierten Ratten ebenfalls,

dass eine frühzeitige Therapie einer Schädigung des Lungengewebes vorbeugen kann und

das Versterben infizierter Tiere verhindert. Allerdings wurde in dieser Studie bereits eine

Stunde nach Infektion mit der frühen Behandlung gestartet, weshalb im Gegensatz zu der

vorliegenden Arbeit in jener Studie nicht davon ausgegangen werden kann, dass die Tiere

bereits eine Pneumonie entwickelt hatten oder eine irreversible Schädigung des

Lungengewebes vorlag [214]. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und der von Gracia et

al. zeigen des Weiteren, dass die antibiotische Lyse der Bakterien, die eine Freisetzung

intrazellulärer, teilweise gewebeschädigender Substanzen wie Pneumolysin mit sich zieht

[215, 216], nicht in jedem Fall zu einer messbaren Erhöhung der vaskulären Permeabilität

führt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine frühzeitige, aber auch eine späte antibakterielle

Therpie die Bakterien effektiv eliminierten. Weder der frühe noch der späte Start führte zu einer

Verringerung der Leukozyten in Blut und Alveolarraum, reduzierten aber die lokalen

Konzentrationen inflammatorischer Mediatoren. Während eine frühzeitige Behandlung die

Schädigung der alveolokapillären Barriere, eine systemische Inflammation und

Leberschädigung verhinderte, verfehlte die späte Therapie diese Effekte, was wahrscheinlich

ursächlich war für die stark erhöhte Mortalität dieser Tiere. Als Schlussfolgerung sollte

demnach die antibakterielle Therapie unverzüglich nach Vorstellung des Patienten erfolgen,

worauf beispielsweise auch Daniel et al. und Phua et al. im Jahr 2016 hinwiesen [19, 20]. Des

Weiteren sollten als Ergebnis dieser Doktorarbeit die Verminderung der systemischen

Inflammation und der Schutz der alveolokapillären Barriere im Fokus der Entwicklung neuer

adjuvanter Therapien stehen. So konnte beispielsweise in weiteren Forschungen dieser

Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass die Peptide Adrenomedullin und Vasculotide eine

Barrierestörung in der Maus vermindern können [31, 212]. Weiterführende Studien sollten

allerdings noch durchgeführt werden, um die Wirksamkeit im Menschen zu untersuchen. Den

Weg in die Klinik schaffen leider nur wenige der in der Präklinik als vielversprechend geltenden

Agenzien (z.B. GM-CSF [217, 218]). Daher besteht die Aufgabe der Grundlagenforscher und

Präklinker weiterhin darin, mögliche Wirkmechanismen und Angriffspunkte für adjuvante

Therapien zu identifizieren. Das Ziel ist dabei, die Mortalität der Pneumonie, die seit der

Einführung der antibakteriellen Behandlung bei 12 - 13 % stagniert, weiter zu senken.

7.3 Die Rolle von VEGF bei der der Erhöhung der alveolokapillären

Permeabilität

Die Konzentration des lokal gemessenen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF)

zeigte in dem gewählten Modell früher und später antibakterieller Behandlung einen zur

vaskulären Permeabilität analogen Verlauf. Dies weist darauf hin, dass VEGF eine potentielle

Ansatzstelle für adjuvante Therapien sein könnte. Nach einer Serotyp 2 S. pn.-Infektion sowie

im Anschluss an die in dieser Arbeit durchgeführte mechanische Ventilation von WT und

Cxcl5-defizienten Versuchstieren konnte ebenfalls ein Anstieg von VEGF festgestellt werden.

Deshalb soll an dieser Stelle genauer auf den möglichen Einfluss dieses Mediators auf die

alveolokapilläre Barriere eingegangen werden. Auch andere Arbeitsgruppen beschrieben

bereits eine vermehrte VEGF Sekretion nach mechanischer Beatmung [97, 219]. Es konnte

ebenfalls gezeigt werden, dass VEGF einen direkten Einfluss auf die Erhöhung der vaskulären

Permeabilität hat, beispielsweise indem es zur Bildung parazellulärer Spalten führt [56]. Eine

Inhibition von VEGF mit Hilfe von siRNA kann im Ventilations-Modell dazu führen, dass sich

die induzierte Lungenschädigung vermindert und die Infiltration von Neutrophilen reduziert

wird. Ob dies ein direkter Effekt von VEGF ist, oder indirekt als Folge der geringeren

Gewebeschädigung auftritt, wurde jedoch nicht untersucht [219].

Allerdings ist VEGF auch essentiell für die Bildung neuer Blutgefäße, die Regeneration des

Lungengewebes und kann das Überleben von Endothelzellen verlängern [172, 220]. Des

Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Verabreichung von VEGF dazu führen kann, dass

eine LPS-induzierte Schädigung der alveolokapillären Barriere vermindert wird [221]. Das

Wirkspektrum von VEGF ist demnach umfangreich und reicht von Barriere-destabilisierend bis

–regenerierend. Verschiedene Studien beschreiben gegensätzliche Ergebnisse und die Rolle

von VEGF bei der bakteriellen und sterilen Inflammation ist immer noch nicht im Detail

verstanden.

In Beatmungsmodellen mit mechanischer Ventilation wurde bereits gezeigt, dass neben

Epithelzellen auch inflammatorische Monozyten / Makrophagen in der Lage sind, VEGF zu

sekretieren und damit die Permeabilität von Endothelzellen zu erhöhen [97]. In den für die

vorliegende Arbeit durchgeführten Ventilationsversuchen mit WT und Cxcl5-defizienten

Versuchstieren konnte nach vierstündiger invasiver Beatmung noch keine Rekrutierung dieser

Zellpopulationen in den Alveolarraum festgestellt werden. Dies legt nahe, dass

inflammatorische Monozyten / Makrophagen in diesen Experimenten nicht die Hauptquelle für

VEGF sind. In vielen Studien wurde beschrieben, dass Typ II Epithelzellen VEGF speichern

und nach Stimulation abgeben können [222-224]. Dass für eine erhöhte VEGF Sekretion allein

ein mechanischer Stimulus hinreichend ist, konnte in der vorliegenden Arbeit in vitro nach

zyklischer Dehnung von Epithelzellen beobachtet werden. Allerdings könnte dies auch ein

indirekter Effekt gewesen sein und die VEGF Sekretion nicht unmittelbar als Ergebnis der

mechanischen Belastung, sondern als Folge der vermehrten Ausschüttung inflammatorischer

Mediatoren ausgelöst worden sein. Es ist bekannt, dass Zytokine wie IL-6 und TNF-α eine

VEGF-Ausschüttung induzieren können [225, 226]. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit

wurde die Rolle des Neutrophile-rekrutierenden Chemokins CXCL5 bei der Schädigung der

vaskulären Permeabilität untersucht. Über den Einfluss der CXCR2-Liganden CXCL5, CXCL1

und CXCL2 auf die VEGF Sekretion wurden bisher noch keine Studien veröffentlicht. Diese

Chemokine wurden infolge der für diese Arbeit durchgeführten zyklischen Dehnung der

Epithelzellen ebenfalls vermehrt sekretiert und könnten eine VEGF Sekretion induziert haben.

Die ebenfalls durchgeführten in vivo Versuche lassen allerdings darauf schließen, dass CXCL5

die VEGF Sekretion nicht beeinflusst, da die Konzentration dieses Wachstumsfaktors in WT

und Cxcl5−/− Tieren nach hochvolumiger Ventilation vergleichbar war. Dennoch könnte die

zyklischen Dehnungsversuche in weiterführenden Experimenten analog an Epithelzellen,

isoliert aus Cxcl5−/− Mäusen durchgeführt werden, um einen Einfluss von CXCL5 auf die

VEGF Sekretion von Epithelzellen zu explorieren. Auch Neutrophile speichern VEGF in ihren

Granula [227], welches sie nach Stimulation freisetzen können. In den in der vorliegenden

Arbeit verwendeten Modellen korrelierten die Menge an Neutrophilen im Alveolarraum nicht

mit den VEGF-Konzentrationen, da bei ventilierten Cxcl5−/− Tieren vergleichbare Mengen des

Proteins gemessen wurden wie bei analog behandelten WT Tieren trotz unterschiedlich

starker Neutrophile-Rekrutierung. In diesem Modell scheinen Neutrophile also keinen Einfluss

auf die Gesamtmenge an VEGF zu haben. Dennoch unterschieden sich die Gruppen in der

messbaren Schädigung der alveolokapillären Barriere. Im Zuge einer mechanischen

Ventilation, die eine sterile Inflammation auslöst, zeigte sich demnach keine Assoziation

zwischen dem in der Lavageflüssigkeit messbaren VEGF und der Zunahme der vaskulären

Permeabilität. Es gibt in diesem Modell also keinen Hinweis darauf, dass VEGF für die

Induktion einer Schrankenstörung verantwortlich ist.

Im Gegenzug dazu zeigte sich in den Modellen der S. pn.-induzierten Lungenschädigung ein

Zusammenhang zwischen VEGF-Menge und vaskulärer Permeabilität. So entwickelte sich die

Proteinkonzentration an VEGF nach einer Serotyp 2- wie auch Serotyp 3-Infektion parallel zur

Schädigung der alveolokapillären Barriere und war bei einer Cxcl5-Defizienz sowie nach

frühzeitiger Therapie signifikant reduziert. Möglicherweise unterscheidet sich die Rolle von

VEGF bei Entstehung der vaskulären Permeabilität zwischen steriler und bakterieller

Inflammation. Weiterführende Experimente sollten untersuchen, inwieweit sich eine Inhibition

von VEGF, beispielsweise mit Hilfe von siRNA oder Rezeptor-Blockade, auf die Entwicklung

der vaskulären Permeabilität in einer S. pn.-Infektion und bei einer invasiven Beatmung

auswirkt. Anschließend könnte in Betracht gezogen werden, ob ein Eingreifen in eine VEGF-

vermittelte Permeabilität ein möglicher Ansatz für eine adjuvante Therapie sein könnte.

7.4 Die alveolokapilläre Barriere in Abhängigkeit von CXCL5

Wie im Voraus diskutiert, scheint die Intaktheit der alveolokapillären Barriere von zentraler

Wichtigkeit für den Gasaustausch und die Verhinderung einer unkontrollierten Ausbreitung der

Inflammation von der Lunge in die Peripherie zu sein. Im ersten Teil wurde untersucht,

inwieweit der Zeitpunkt des Therapiebeginns ausschlaggebend war für diese Vorgänge nach

einer S. pn.-Infektion. Im weiteren Verlauf wurde analysiert, inwieweit das Neutrophile-

rekrutierende Chemokin CXCL5 Einfluss auf die Entwicklung einer Schrankenstörung haben

kann. Neben der Beeinträchtigung der alveolokapillären Barriere im Zuge einer

Pneumokokken-induzierten Pneumonie wurde in dieser Arbeit des Weiteren untersucht, wie

eine mechanische Ventilation, die bei Pneumonie-erkrankten Patienten häufig eingesetzt wird,

die vaskuläre Permeabilität erhöhen kann. Die mechanische Ventilation induziert einen

Lungenschaden, der im Gegenzug zu einer bakteriellen Infektion eine sterile Inflammation

hervorruft.

7.4.1 Alveoläre Epithelzellen sind die Hauptquelle von CXCL5 in der Lunge

Die Sekretion der CXCR2-Liganden CXCL1 und CXCL5 im Alveolarraum erfolgte frühzeitig

nach einer Pneumokokken-Infektion sowie nach einer vierstündigen Ventilation mit hohem

Tidalvolumen. Eine erhöhte CXCL2-Konzentration konnte dagegen nur nach einer Serotyp 3-

Infektion, nicht nach einer in vivo Serotyp 2-Infektion oder im Anschluss an eine Ventilation

gemessen werden. In vitro dagegen war zu beobachten, dass eine Serotyp 3-Infektion zu einer

Sekretion aller drei analysierten CXCR2-Liganden in rekrutierten und residenten Zellen der

Lunge führte. Dabei wurde nicht jedes dieser Chemokine von allen Zelltypen sekretiert.

Stattdessen wiesen die verschiedenen Zellen unterschiedliche Sekretionsmuster der

einzelnen Liganden auf. Primäre alveoläre Epithelzellen wie auch eine Typ II Epithel Zelllinie

waren in der Lage, infolge einer S. pn.-Infektion CXCL5 zu sekretieren. Wie bereits im

M. tuberculosis-Modell gezeigt [67], war dies in Epithelzellen auch nach einer S. pn.-Infektion

abhängig von TLR2. Auch infolge einer simulierten mechanischen Ventilation in vitro, bei der

T7 Zellen zyklisch gedehnt wurden, zeigte sich eine vermehrte CXCL1 und CXCL5 Sekretion.

Dieser Vorgang der Umwandlung einer mechanischen Stimulation in die Ausschüttung

inflammatorischer Mediatoren wird als Mechanotransduktion bezeichnet und konnte im

Tiermodell wie auch bei invasiv beatmeten Patienten beobachtet werden. Auf Grundlage

dieser früheren Studien wurden die Beatmungsparameter in der Klinik angepasst, um eine

durch die mechanische Beatmung induzierte schädigende Immunantwort zu reduzieren. In

Folge der Herabsetzung des eingesetzten Plateaudrucks und Tidalvolumens [37] konnte im

Patienten eine verringerte Mortalität und im Tiermodell ein Rückgang der Lungenschädigung

festgestellt werden [40, 228]. Allerdings kann auch eine niedrigvolumige Ventilation in

gesunden Versuchstieren eine Schädigung des Lungengewebes hervorrufen [41].

Nouailles et al. und Jeyaseelan et al. beschrieben bereits, dass Epithelzellen die Hauptquelle

für CXCL5 infolge einer M. tuberculosis-Infektion oder LPS-Stimulation sind [67, 229]. Auch

Yamamoto et al. konnten zeigen, dass eine Epithelzell-spezifische Deletion von RelA, einem

Bestandteil von NF-κB, zu einer signifikanten Reduktion der messbaren CXCL5-Menge in der

Lunge und im Alveolarraum infolge einer LPS-Stimulation bzw. zu Beginn einer S. pn.-Infektion

führte [65, 170]. Aus diesen Ergebnissen schlussfolgerten sie ebenfalls, dass Epithelzellen

(Typ II wie auch Typ I) eine wichtige Quelle für CXCL5 sind, wobei die Sekretion von CXCL1

und CXCL2 vom Knockout unbeeinflusst war und demnach von andere Zelltypen übernommen

wurde. Dies konnte in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden, da CXCL2 nur in sehr

geringem Maße von Epithelzellen sekretiert und CXCL1 beispielsweise auch von AlvMs in den

Überstand abgegeben wurde. Der Knockout von RelA führte in den S. pn.-

Infektionsexperimenten von Yamamoto et al. allerdings zu keiner kompletten Blockierung der

CXCL5-Sekretion. Außerdem war bereits nach 24-stündiger Infektion kein Unterschied zu den

WT Tieren mehr sichtbar. Daraus lässt sich entweder schließen, dass epitheliales RelA nur zu

Beginn einer Infektion essentiell für eine CXCL5-Sekretion ist und weitere, NF-κB-

unabhängige Prozesse zur Ausschüttung von CXCL5 führen, oder aber dass auch andere

Zellen neben Epithelzellen in der Lage sind, dieses Chemokin zu produzieren. Traber et al.

konnten beispielsweise zeigen, dass die Expression von Cxcl5 auch durch STAT3, also ohne

Einbeziehung von NF-κB, mit Hilfe von Oncostatin-M, einem Zytokin der IL-6 Familie, induziert

werden kann [146]. Auch andere inflammatorische Mediatoren, wie IL-17, TNF-α oder IL-1β

können die CXCL5-Sekretion von Epithelzellen induzieren [230, 231]. Dies könnte die zeitliche

Verzögerung der CXCL5-Sekretion in den RelA-Knockouts erklären, da die genannten

Zytokine erst im Verlauf der Infektion ansteigen.

Weiterführende in vitro Experimente könnten zeigen, ob eine S.pn.-abhängige Induktion der

CXCL5-Sekretion trotz Inhibition von TLR2 und damit NF-κB, beispielsweise durch IL-6, IL-1β,

TNF-α oder IL-17 in Epithelzellen möglich ist. Die Zytokine könnten von den Epithelzellen

selbst produziert werden und die Sekretion von CXCL5 initiieren (autokriner Mechanismus)

oder von anderen Zellen, um anschließend auf die Epithelzellen zu wirken (z. B. alveoläre

Makrophagen oder PMNs, parakriner Mechanismus). Diese Zellen könnten sich entweder in

Ko-Kultur mit den Epithelzellen befinden oder in einem separaten Experiment infiziert werden,

um anschließend die Überstände auf die unstimulierten Epithelzellen zu geben.

Des Weiteren konnte in der vorliegenden Arbeit auch bei Thrombozyten nach einer Stimulation

mit Pneumokokken eine vermehrte CXCL5-Ausschüttung beobachtet werden. Thrombozyten

speichern CXCL5 in Vesikeln, wodurch sie unmittelbar auf eine Stimulation reagieren können

[171, 232]. Das von Yamamoto et al. quantifizierte CXCL5 in Lungengewebe und Alveolarraum

könnte demnach auch durch Thrombozyten bedingt gewesen sein, die entweder durch die

Erreger oder durch die verwendete Präparationstechnik zu einer Ausschüttung von CXCL5

stimuliert worden sind.

7.4.2 CXCL5 ist notwendig für eine vollständige Rekrutierung der Neutrophilen

Die Rekrutierung von Neutrophilen zum Ort der Infektion erfolgt häufig über die Stimulation

des Chemokin-Rezeptors CXCR2. Nach M. tuberculosis-Infektion oder LPS-Stimulation von

Cxcr2−/− Tieren konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Migration von PMNs in den

Alveolarraum vollständig inhibiert war [67, 233]. Der Chemokin-Rezeptor ist demnach

essentiell für die Neutrophilen-Rekrutierung in diesen Infektionsmodellen. Oft werden

Chemokine, die an einen gemeinsamen Rezeptor binden, als redundant angesehen. Dass

dies für die CXCR2 Liganden CXCL1, CXCL2 und CXCL5 nicht der Fall zu sein scheint, wurde

bereits im murinen Tuberkulose-Modell dargestellt [67] und konnte in der vorliegenden Arbeit

bestätigt werden: Im Zuge einer S. pn.-Infektion und nach mechanischer Beatmung resultierte

der Knockout von Cxcl5 in einer um 67 bzw. 53 % reduzierten Infiltration von Neutrophilen in

den Alveolarraum, ein Prozess welcher durch andere Neutrophile-rekrutierende Vorgänge

nicht kompensiert werden konnte. Diese Ergebnisse decken sich mit den von Nouailles et al.

dargestellten Beobachtungen und widersprechen damit denen von Mei et al., die eine

Migrations-hemmende Wirkung von CXCL5 im Zuge einer E. coli-Infektion beschrieben hatten

[67, 171]. Die Rekrutierung der Neutrophilen von der Zirkulation ins Lungengewebe konnte in

der vorliegenden Arbeit an den im Blut gemessenen Zellzahlen nicht beobachtet werden:

Weder nach einer S. pn.-Infektion noch infolge einer Ventilation konnte ein signifikanter

Rückgang der gemessenen Neutrophilen im Blut von WT oder Cxcl5-defizienten Tieren

beobachtet werden. Dies könnte in einer schnellen Rekrutierung neuer PMNs aus dem

Knochenmark begründet liegen, wo bis zu 120 Millionen Neutrophile gespeichert werden.

Dadurch kann sich die Menge an Blut-Neutrophilen innerhalb von Stunden um das zehnfache

steigern [234]. Im Blut, aber nicht im Alveolarraum, wiesen Cxcl5-defiziente Mäuse bereits vor

einer mechanischen Ventilation tendenziell mehr Neutrophile auf als die WT Tiere. Nouailles

et al., die den gleichen Knockout-Stamm nutzten, der auch für die vorliegenden Arbeit

verwendet wurde, konnten bereits nachweisen, dass naive Cxcl5-defiziente Tiere mehr

Neutrophile im Knochenmark aufweisen als WT Mäuse. Bisher ist kein direkter Einfluss von

CXCL5 auf die Rekrutierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark bekannt. Stattdessen

konnte bisher gezeigt werden, dass PMNs über den Rezeptor CXCR4 und seinen Liganden

CXCL12 im Knochenmark zurückgehalten werden, während CXCR2 mit den Liganden CXCL1

und CXCL2 die Freisetzung der PMNs ins Blut initiiert [151]. Da aber auch CXCL5 an CXCR2

bindet, wäre ein Effekt des Chemokins auch auf die Abgabe der Neutrophilen aus dem

Knochenmark denkbar. Möglicherweise kommt es zu einer Ansammlung dieser Zellen in

Knochenmark und Blut, da sie auch unter basalen Bedingungen in Abwesenheit von CXCL5

nur vermindert in die Gewebe rekrutieren können. In weiterführenden Experimenten sollten

mittels Durchflusszytometrie die Immunzellen im Blut naiver Tiere erneut überprüft werden,

um eine endgültige Aussage darüber treffen zu können, ob naive Cxcl5−/− Mäuse neben der

erhöhten Anzahl von Neutrophilen im Knochenmark auch mehr PMNs im Blut aufweisen.

7.4.3 CXCL5-unabhängige Wege der Neutrophilen-Rekrutierung

Da eine Deletion von Cxcl5 nicht zu einer vollständigen Inhibition der PMN-Migration führt,

scheinen weitere, CXCL5-unabhängige Mechanismen bei einer S. pn.-Infektion und dem

Modell der mechanischen Ventilation dazu führen zu können, dass diese Immunzellen zum

Ort der Inflammation wandern. Weitere CXCR2-abhängige Wege wirken über CXCL1 und

möglicherweise auch über CXCL2. Wenn die Liganden von CXCR2 inhibiert oder deletiert

werden, kommt es bei vielen Infektionsmodellen, analog zu dem hier vorliegenden, zu einer

Reduktion der Neutrophilen-Infiltration ins Gewebe [235, 236]. So scheint beispielsweise eine

Neutralisierung des Chemokins CXCL2 in einer Klebsiella pneumoniae-Pneumonie zu einer

stark verminderten Migration von PMNs zu führen [237]. Allerdings ist für ein murines Modell

einer pulmonalen Nocardia asteroides-Infektion beschrieben, dass CXCL2 keinen Effekt bei

der Neutrophile-Rekrutierung aufweist [238]. In einem Kombinationsmodell aus i.p.-

verabreichtem Alkohol und S. pn.-Infektion konnte rekombinantes CXCL1, nicht aber CXCL2

zu einer Eliminierung der Pathogene führen. Ursächlich dafür könnte eine mit Hilfe des

Chemokins induzierte Migration von Neutrophilen gewesen sein. Diese Zellen wurden in dieser

Studie von den Autoren allerdings nicht quantifiziert [239]. Die Liganden von CXCR2 scheinen

demnach in den genannten Studien wie auch in der vorliegenden Arbeit keine redundanten,

sondern additive Effekte auf die Rekrutierung von Neutrophilen in den Alveolarraum

auszuüben. Welche prozentualen Anteile CXCL1 und CXCL2 an der Rekrutierung von

Neutrophilen in Folge einer S. pn.-Infektion besitzen, sollte in weiterführenden Experimenten

untersucht werden.

Eine Blockade des geteilten Rezeptors CXCR2 in Infektionsexperimenten oder nach LPS-

Stimulation führt häufig zur kompletten Inhibierung der PMN-Rekrutierung [67, 233, 240]. Dies

ist auch in Modellen einer sterilen Inflammation, wie einer chronisch-entzündlichen

Darmerkrankung zu beobachten. Auch hier kann eine Blockierung von CXCR2 zur

vollständigen Inhibition der PMN-Infiltrierung ins entzündliche Gewebe führen [241].

Aber auch CXCR2-unabhängige Signalwege können eine Migration von Neutrophilen ins

Lungengewebe bewirken. Dies zeigte sich in einigen Infektionsexperimenten, unter anderem

mit S. pn.-infizierten Cxcr2-defizienten Tieren [242]. In diesen Experimenten oder nach

100

Blockierung des Rezeptors mit Hilfe eines anti-CXCR2 Antikörpers und anschließender

Infektion mit Legionella pneumophila, zeigte sich jeweils eine starke Verminderung, jedoch

keine vollständige Inhibition der Neutrophilen-Migration in den Alveolarraum [242, 243].

Weitere Veröffentlichungen zeigen ebenfalls lediglich eine Reduktion der Neutrophilen-

Infiltration, allerdings wurde bei nicht die Migration in den Alveolarraum, sondern die

Neutrophilen im Lungengewebe quantifiziert [161, 238]. Reutershan et al. konnten zeigen,

dass Cxcr2-defiziente Neutrophile nach LPS-Stimulation nicht in den Alveolarraum wanderten,

jedoch im Lungengewebe zu finden waren. Mit Hilfe einer separaten Färbung systemischer

und lokaler Neutrophiler und einer Perfusion der Lunge konnten die Autoren des Weiteren

zeigen, dass sich die Zellen im vaskulären Kompartiment und in Adhärenz zu den

Gefäßwänden befanden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine klassische Analyse des

gesamten lavagierten Lungengewebes auch die vaskulär adhärenten Neutrophile erfasst und

somit nicht spezifisch jene Neutrophile identifizieren kann, die ins interstitielle Gewebe migriert

sind [233].

Eine Inhibition der Signalweiterleitung des CXCR2 Rezeptors in einem sterilen

Inflammationsmodell mit Zigarettenrauch führte ebenfalls zu einer Reduktion, aber keiner

vollständigen Blockierung des Einstroms an Neutrophilen [244]. Es konnte beispielsweise in

einem Arthritis-Modell gezeigt werden, dass Leukotrin B4, ein Lipid Metabolit, dass in

Leukozyten vorkommt, über die Bindung an den Rezeptor BLT1 auf der Oberfläche von

Neutrophilen ebenfalls eine Migration der Zellen zum Inflammationsort induziert [231]. Ein

weiterer Chemokin-Rezeptor auf der Oberfläche von PMNs ist CCR1, der beispielsweise die

Liganden CCL3, CCL4 und CCL5 bindet. Bei einer Candida-Infektion hatte dieser Rezeptor

einen positiven Einfluss auf die Rekrutierung der Neutrophilen in die Nieren der Versuchstiere

[245]. Auch eine Überexpression von CCL5 im Lungengewebe führte zu einer verstärken

Migration von PMNs [246].

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CXCL5 nicht der einzige Ligand des Rezeptors

CXCR2 ist, der in sterilen und infektiösen Inflammationsmodellen die Rekrutierung von

Neutrophilen herbeiführen kann. Des Weiteren sind auch CXCR2-unabhängige Wege

bekannt, die die Migration dieser Immunzellen initiieren können. Dennoch muss

hervorgehoben werden, dass eine Deletion von Cxcl5 eine starke Reduktion der PMN-

Rekrutierung bewirkt und CXCL5 in den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Modellen

demnach das wichtigste Chemokin für die Migration von Neutrophilen ist.

7.4.4 Folgen einer reduzierten Neutrophile-Rekrutierung

Vielfach wurde gezeigt, dass Neutrophile essentiell sind für die Elimination der Pneumokokken

in der Lunge [192, 242, 247]. Aus diesem Grund kann geschlussfolgert werden, dass die in

101

der vorliegenden Arbeit beobachtete erhöhte bakterielle Last in den Cxcl5-defizienten Tieren

in der verminderten Anzahl an Neutrophilen im Alveolarraum begründet liegt. Dagegen zeigte

sich die Zahl der alveolären Makrophagen im Vergleich zum WT erhöht. Alveoläre

Makrophagen, wie bereits von Knapp et al. und Morimoto et al. beschrieben, spielen in einer

S. pn.-Infektion eine tragende Rolle bei der Beseitigung körpereigener Zellreste wie

apoptotischer Neutrophiler und tragen weniger zur Eliminierung des Pathogens bei [83, 84].

Die Phagozytose der toxischen Zellbestandteile ist dabei essentiell für die Resolution der

Inflammation [83]. Es ist bekannt, dass die Phagozytose zellulärer Bestandteile alveoläre

Makrophagen zur Sekretion von Zytokinen anregt [248, 249]. Durch intratracheale

Verabreichung des Pneumokokken-eigenen Virulenzfaktors Pneumolysin wurde gezeigt, dass

dieser eine Reduktion der alveolären Makrophagen bewirkt [250]. Auch im Zuge viraler

Infektionen oder bei Erkrankungen mit intrazellulären Bakterien kommt es zu einer

Verminderung alveolärer Makrophagen [251-253]. Ursächlich hierfür ist, dass diese

Pathogene Makrophagen als Wirtszellen einnehmen und die Immunzellen über eine induzierte

Apoptose die Elimination der Erreger herbeiführen können [254]. Bei aus inflammatorischen

Monozyten differenzierten Makrophagen, die selbst Bakterien eliminieren, wurde der Vorgang

der induzierten Apoptose nach einer S. pn.-Infektion ebenfalls bereits beschrieben [255].

In dem in der vorliegenden Arbeit gewählten Modell der mechanischen Beatmung konnte kein

Unterschied in der Menge alveolärer Makrophagen im Alveolarraum zwischen WT und

Cxcl5─/─ Mäusen festgestellt werden. Möglicherweise war hier die Menge apoptotischer

Neutrophiler geringer, da diese nicht die Aufgabe der Pathogen-Eliminierung übernahmen. Es

sollte demnach in weiterführenden Experimenten zum einen untersucht werden, wie viele der

gemessenen Neutrophilen Apoptose-Marker tragen (z. B. 7-AAD und Annexin V [256]). Des

Weiteren könnte überprüft werden, ob eine reduzierte Anzahl apoptotischer Neutrophiler dazu

führt, dass alveoläre Makrophagen vermindert diese zellulären Bestandteile beseitigen und ob

dies vor dem Verlust dieser anti-inflammatorisch agierenden Zellen im Alveolarraum schützen

könnte.

Im vorherigen Teil der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion der

bakteriellen Last mittels (verspäteter) antibakterieller Therapie nicht unmittelbar die

Schädigung des umliegenden Gewebes vermindert. In Cxcl5-defizienten und S. pn.-infizierten

Versuchstieren war die Zahl an Pneumokokken erhöht. Dies schien ebenfalls nicht direkt zu

einer Entwicklung von Ödemen oder einer vermehrten Schädigung der alveolokapillären

Barriere zu führen. Die Mortalität der Tiere war nicht beeinflusst, was möglicherweise im

Zusammenhang mit dem Schutz der zellulären Barriere stand. Der Virulenzfaktor PLY hat

einen direkten negativen Einfluss auf die alveolokapilläre Barriere und kann zur Schädigung

des Lungengewebes führen, weshalb eine erhöhte bakterielle Last stets mit einer gesteigerten

vaskulären Permeabilität assoziiert wurde [250, 257]. Diese Beobachtung konnte basierend

102

auf den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit nicht unterstützt werden. Vielmehr ließ sich ein

protektiver Effekt einer verminderten Neutrophile-Rekrutierung, trotz vermehrter

Pneumokokken, beobachteten. Die Menge an freigesetztem PLY in Alveolarraum und Lunge

wurde allerdings nicht quantifiziert, dies könnte in weiterführenden Experimenten untersucht

werden. Zusätzlich könnte die Analyse weiterer Zeitpunkte nach der Infektion zeigen, ob die

erhöhte bakterielle Last im weiteren Verlauf der Infektion eine Erhöhung der vaskulären

Permeabilität mit sich bringt.

Im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit zeigten Versuche anderer

Arbeitsgruppen mit unterschiedlichen pulmonalen Infektionserregern, dass die CXCR2-

vermittelte vollständige Rekrutierung von Neutrophilen die Versuchstiere schützt und eine

verminderte oder inhibierte PMN-Migration die Mortalität erhöht [161, 235, 238]. Eine stark

reduzierte Neutrophile-Infiltration bei S. pn.-infizierten Cxcr2-Knockout Mäusen führte zu einer

signifikant erhöhten bakteriellen Last und einer Mortalität von 100 % innerhalb von vier Tagen

p.i. [242]. Die Autoren dieser Studie zeigten des Weiteren, dass ein prozentualer Knockout

von Cxcr2 von 10 - 75 % die bakterielle Last stufenweise erhöht, was mit einer sinkenden

Überlebensrate der Tiere assoziiert war. Die zusammenfassende Aussage der Studie war,

dass bereits eine Reduktion der lokalen Neutrophilen um 10 bis 25 % zu einer gesteigerten

Mortalität S. pn.-infizierter Mäuse führt. Dagegen zeigten die Analysen der vorliegenden

Arbeit, dass eine um mehr als die Hälfte reduzierte Neutrophilen-Infiltration, die mit einer

erhöhten bakteriellen Last assoziiert war, keine verschlechterte Überlebensrate mit sich

brachte. Mögliche Gründe für diese Abweichungen könnte die Verwendung unterschiedlicher

Maus- und Bakterienstämme sein. Die von Herbold et al. genutzten BALB/c Mäuse scheinen

beispielsweise weniger resistent gegenüber einer S. pn.-Infektion zu sein als der für die

vorliegende Arbeit verwendete C57BL/6J Stamm [258]. Des Weiteren wiesen die infizierten

WT Tiere eine höhere bakterielle Last und eine stärkere Rekrutierung von Neutrophilen zum

Zeitpunkt 24 h p.i. auf als die Mäuse in den Experimenten für diese Doktorarbeit, was ebenfalls

ursächlich für die beobachteten Unterschiede in den Überlebensraten sein könnte.

Weiterführende Experimente mit einer höheren Infektionsdosis könnten Hinweise darauf

geben, ab welchem Umfang eine vermehrte und unkontrollierte Pneumokokkenlast zu

irreversiblen Schädigungen des umliegenden Gewebes und einer signifikanten Erhöhung der

Mortalität führt.

Wie sich eine vollständige Depletion von Neutrophilen auf die bakterielle Last bei einer S. pn.-

Infektion auswirkt, wurde von Garvy und Harmsen [247] untersucht: Bei einer Infektion mit

einer geringen Infektionsdosis scheint die Depletion von Neutrophilen keinen Einfluss auf die

bakterielle Last zu haben. Im Gegensatz dazu führte eine vorherige Eliminierung der PMNs

nach Infektion mit einer hohen Infektionsdosis zu einer unkontrollierten Vermehrung der

Bakterien in der Lunge. Allerdings muss angemerkt werden, dass in diesen Versuchen ein

103

anti-GR-1 Antikörper für die Depletion verwendet wurde. GR-1 bindet jedoch an Ly6G auf

Neutrophilen wie auch an Ly6C auf Monozyten, weshalb in dieser Studie wahrscheinlich nicht

nur Neutrophile, sondern auch Monozyten depletiert wurden und somit keine Aussage darüber

getroffen werden kann, inwieweit sich eine alleinige Neutrophilen-Depletion auf die bakterielle

Last auswirkt. Aussagen über die Beschaffenheit der alveolokapillären Barriere oder die

Mortalität der untersuchten Tiere wurden in dieser Studie leider nicht getroffen.

In Cxcl5−/− Mäusen konnte in der vorliegenden Arbeit auch im Anschluss an eine mechanische

Beatmung eine geschützte alveolokapilläre Barriere und eine verbesserte Dehnbarkeit der

Lunge beobachtet werden. Die untersuchten WT Tiere wiesen im Vergleich zur Cxcl5−/−-

Gruppe eine erhöhte vaskuläre Permeabilität auf. Thatcher et al. konnten in einem anderen

murinen Modell steriler Inflammation, induziert durch Zigarettenrauch, beobachten, dass eine

reduzierte Anzahl von Neutrophilen ebenfalls zu einer verminderten Schädigung des

Lungengewebes führt [244]. Eine Inhibition der PMN-Infiltration wie auch eine Depletion von

Neutrophilen führte ebenfalls zu einer Verminderung der Gewebeschädigung in einem

Reperfusionsschaden-Modell in Kaninchen, bei dem eine induzierte Durchblutung eines

vorher minderdurchbluteten Gewebes eine Schädigung induzieren kann [259]. Es lässt sich

aus den in der vorliegenden Arbeit generierten Ergebnissen schlussfolgern, dass nicht primär

die Pneumokokken für die Schädigung der alveolokapillären Barriere verantwortlich sind.

Vielmehr weisen die Analysen darauf hin, dass die Reaktionen des Immunsystems des Wirtes

vermehrt zur Erhöhung der vaskulären Permeabilität beitragen. Zur Validierung dieser

Ergebnisse sollten diese Versuche mit einer höheren Infektionsdosis oder einem anderen

Mausstamm wiederholt werden, um das Modell robuster zu gestalten. Die reine Anwesenheit

von Neutrophilen scheint in dem gewählten S. pn.-Infektionsmodell nicht zu einer Schädigung

der alveolokapillären Barriere zu führen, wie nach früher und später antimikrobieller Therapie

beobachtet wurde. Ob in den untersuchten Inflammationsmodellen die von aktivierten PMNs

am Ort der Inflammation sekretierten zytotoxischen Moleküle alleine oder bereits der Vorgang

der Migration der Neutrophilen durch die Zellen der alveolokapillären Membran die

Schädigung herbeiführt, sollte in weiterführenden Experimenten näher betrachtet werden.

Studien anderer Arbeitsgruppen zeigten einerseits, dass die Rekrutierung von Neutrophilen

durch die zelluläre Barriere ohne eine Schädigung ablaufen kann [109], allerdings

widersprechen andere Studien dieser Beobachtung und zeigen, dass durch den Vorgang der

Migration PMNs die Apoptose von Epithelzellen bewirken können [110-112].

104

7.4.5 Möglicher therapeutischer Effekt von CXCL5 und einer verminderten oder

inhibierten Neutrophile-Rekrutierung

Eine vollständige Inhibierung der Neutrophile-Rekrutierung ist beim Menschen nicht

praktikabel, da der Patient sich erst mit etablierter Infektion beim Arzt vorstellt. Dennoch könnte

eine Verminderung zusätzlich infiltrierender PMNs als adjuvante Therapie bei einer

Pneumonie oder anderen Erkrankungen mit starker Neutrophile-Migration vorteilhaft sein. Bei

erfolgreicher Eliminierung der Infektionserreger mit Hilfe einer antibakteriellen Therapie wäre

eine Reduktion der infiltrierenden Neutrophilen möglicherweise sinnvoll, um eine mit

Neutrophilen assoziierte Schädigung des infizierten Gewebes zu vermindern. Bei Infektionen

mit antibiotikaresistenten Bakterien sollte eine solche Therapie allerdings nicht angewendet

werden, da Neutrophile einen großen Beitrag bei der Beseitigung von Bakterien leisten und

eine unkontrollierte Vermehrung der Pathogene zusätzlich schädlich für die Infizierten wäre.

Eine Übersichtsarbeit von Boppana et al. fasst eine große Anzahl von CXCR1- und CXCR2-

Inhibitoren zusammen, die bei den untersuchten Krankheitsmodellen die Neutrophile-

Rekrutierung vermindern oder vollständig blockieren können [260]. Es gibt mehrere Ansätze

zur Unterbindung der Wirksamkeit eines Rezeptors. Antagonisten, auch Inhibitoren genannt,

binden an einen Rezeptor (an oder außerhalb der Bindungsstelle des Liganden) und

verhindern durch die induzierte Konformationsänderung des Proteins die Bindung und

Signalinduktion der eigentlichen Liganden. So konnten beispielsweise die CXCR2-Inhibitoren

Antileukinate und Reparixin in vivo eine Bleomycin- bzw. LPS-induzierte Neutrophilen-

Rekrutierung in die Lunge reduzieren [261, 262]. In beiden Modellen konnte einhergehend mit

der verminderten PMN-Migration ebenfalls eine geringere vaskuläre Permeabilität gemessen

werden. Ein anderer therapeutischer Ansatz umfasst Chemokin-Analoga, die im Gegensatz

zu Antagonisten dem eigentlichen Liganden strukturell sehr ähnlich sind und an dessen Stelle

am Rezeptor binden, aber keine Signalweiterleitung induzieren. So konnte in dem bereits

genannten Modell der Zigarettenrauch-induzierten sterilen Inflammation das Chemokin-

Analogon SCH-N die Migration von Neutrophilen in die Bronchien inhibieren und damit

einhergehend die Inflammation in der Lunge im Vergleich zur Kontrollgruppe vermindern [244].

Weiterführende Experimente, die eine verspätete antibakterielle Behandlung mit einer

Blockade von CXCR2 oder einer Deletion von Cxcl5 kombinieren, könnten hilfreich sein, um

einen möglichen Ansatz für eine adjuvante Therapie in der Pneumonie zu untersuchen. Auch

eine Reduktion der Neutrophilen-Infiltration bei der mechanischen Ventilation kann von Vorteil

sein, um eine Schädigung des Lungengewebes und eine Verschlechterung der

Lungenfunktion zu vermindern. Um zu untersuchen, ob mechanisch beatmete Patienten von

solch einer Therapie profitieren würden, könnten Antikörper zur Neutralisierung von CXCL5

oder zur Blockierung von CXCR2 in weiteren Experimenten mit WT Tieren mit Beginn der

105

Beatmung zum Einsatz kommen. Dies wäre ein therapeutischer Ansatz, der im Gegensatz zu

einer Cxcl5 Deletion auch im Patienten anwendbar wäre.

7.4.6 Mechanismen hinter dem Schutz der alveolokapillären Barriere in Abwesenheit

von CXCL5

Die Experimente dieser Arbeit zeigen, dass die Deletion von Cxcl5 zu einer verringerten

Schädigung des Lungengewebes und einem Schutz der alveolokapillären Barriere führt. Dies

könnte damit erklärt werden, dass weniger Neutrophile zum Ort der Inflammation rekrutiert

werden, was mit einer verminderten Schädigung des umliegenden Gewebes assoziiert werden

kann. Neben Neutrophilen exprimieren aber auch Endothelzellen und Bronchialepithelzellen

den Chemokin-Rezeptor CXCR2, an welchen CXCL5 bindet [233]. Es könnte demnach auch

einen direkten Einfluss von CXCL5 auf die Endothelzellen der alveolokapillären Barriere

geben, der bei WT Tieren zu einer Erhöhung der vaskulären Permeabilität führen kann. So

konnte beispielsweise gezeigt werden, dass in Cxcr2−/− Mäusen nach einer LPS-Injektion in

das Gehirn neben einer verminderten Neutrophile-Rekrutierung die zerebralen Endothelzellen

auch eine reduzierte Expression von Adhäsions-Molekülen im Vergleich zur WT Gruppe

aufwiesen, was die Infiltration von Leukozyten vermindern könnte. Des Weiteren scheint

CXCR2 für eine Aktivierung der Endothelzellen essentiell zu sein [263]. Diese Aktivierung ließ

sich aber auch durch CXCL1 induzieren, weshalb nicht gesagt werden kann, dass CXCL5 für

diese CXCR2-induzierte Endothel-Aktivierung essentiell ist. Für die Lunge konnte gezeigt

werden, dass CXCR2 auf Zellen nicht-hämatopoetischen Ursprungs benötigt wird, um nach

einer LPS-Stimulation die vaskuläre Permeabilität zu erhöhen [233]. Es kann neben der

reduzierten Migration von Neutrophilen aufgrund der Abwesenheit eines CXCL5-

Chemokingradienten also auch der direkte Effekt von CXCL5 auf die Zellen der

alveolokapillären Barriere ausschlaggebend für den Schutz vor einer erhöhten vaskulären

Permeabilität sein.

Weiterführende Experimente sollten durchgeführt werden, um die zugrundeliegenden

Mechanismen zu untersuchen. Eine Antikörper-vermittelte Depletion von Neutrophilen mit

anschließender mechanischer Beatmung könnte zeigen, ob Unterschiede in der induzierten

Permeabilität zwischen WT und Cxcl5−/− Mäusen auch unabhängig von rekrutierten

Neutrophilen auftreten. Ein weiterer Ansatz könnte in der Generation von Maus-Chimären

liegen, wie es bereits von Reutershan et al. untersucht wurde [233]. Die Autoren dieser Studie

konnten beobachten, dass die CXCR2-Expression auf Zellen hämatopoetischen Ursprungs

zwar essentiell ist für eine LPS-induzierte PMN-Rekrutierung in den Alveolarraum, aber keine

Veränderung der vaskulären Permeabilität mit sich bringt. Wenn andererseits lediglich Zellen

nicht-hämatopoetischen Ursprungs (wie beispielsweise Endothelzellen) Cxcr2-defizient waren

106

und Neutrophile ungehindert dem Chemokingradienten in der Lunge folgen konnten, war die

alveolokapilläre Barriere geschützt. Reutershan et al. schlussfolgerten aus diesen

Ergebnissen, dass allein die Expression des Chemokin-Rezeptors auf nicht-

hämatopoetischen Zellen ausschlaggebend ist für die Schädigung der zellulären Barriere.

Allerdings nutzte diese Arbeitsgruppe kleine Versuchsgruppen, bestehend aus vier Tieren und

LPS als Stimulanz. LPS ist auf gramnegativen Bakterien zu finden und ruft damit

möglicherweise eine andere Immunreaktion hervor als ein grampositiver Infektionserreger

oder eine im Zuge einer mechanischen Beatmung hervorgerufene sterile Inflammation. Aber

auch nach einer LPS-Stimulation kommt es zum Einstrom von Neutrophilen, welche in

Apoptose und Nekrose gehen und von alveolären Makrophagen eliminiert werden [264].

Dennoch könnte die Verwendung von Chimären aus WT und Cxcr2−/− Aufschluss darüber

geben, ob auch im Falle einer mechanischen Beatmung oder einer S. pn.-Infektion die CXCR2

Expression auf Endothelzellen essentiell für die Schädigung der alveolokapillären Barriere ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine intakte alveolokapilläre Barriere neben ihrer

Aufgabe des Gasaustauschs essentiell ist, um eine unkontrollierte Ausbreitung einer

Inflammation aus der Lunge in die Peripherie zu verhindern und der Bildung von Ödemen

entgegenzuwirken. Eine umgehende antimikrobielle Behandlung und die Reduktion der

infiltrierenden Neutrophilen in den Alveolarraum sind Wege, die vor eine Erhöhung der

vaskulären Permeabilität schützen können. In weiterführenden Experimenten sollte untersucht

werden, inwiefern eine Kombination beider Modelle als möglicher Ansatz für die Therapie von

Pneumonie-Patienten dienen kann, um die seit Jahrzehnten gleichbleibende Mortalität dieser

Infektionskrankheit zu senken.

107

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123

9 Anhang

9.1 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Übersicht der verwendeten Geräte ......................................................................21

Tabelle 2: Übersicht der verwendeten Materialien ................................................................22

Tabelle 3: Übersicht der verwendeten Reagenzien ..............................................................24

Tabelle 4: Übersicht der verwendeten Antikörper .................................................................25

Tabelle 5: Übersicht der verwendeten Enzyme ....................................................................25

Tabelle 6: Übersicht und Zusammensetzung der verwendeten Narkotika und Heparin ........26

Tabelle 7: Übersicht und Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer ...............26

Tabelle 8: Übersicht der verwendeten Bakterienstämme ......................................................29

Tabelle 9: Übersicht der verwendeten Zelllinien ...................................................................29

Tabelle 10: Übersicht der verwendeten Kits .........................................................................29

Tabelle 11: Übersicht der verwendeten Software .................................................................30

Tabelle 12: Versuchsgruppen Pneumokokken-Pneumonie und Ampicillin-Therapie .............31

Tabelle 13: Versuchsgruppen Pneumokokken-Pneumonie in Abhändigkeit von CXCL5 ......32

Tabelle 14: Versuchsgruppen mechanische Beatmung in Abhängigkeit von CXCL5 und

Neutrophilen .........................................................................................................................32

Tabelle 15: Handlungsanweisung zur klinischen Beurteilung infizierter Tiere .......................34

Tabelle 16: Übersicht der verwendeten ELISA Kits ..............................................................40

124

9.2 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Mortalität der Pneumonie. ................................................................................. 2

Abbildung 2: Mortalität einer nicht antibiotisch behandelten Streptococcus pneumoniae

Pneumonie in Abhängigkeit von Alter und Nachweis der Erreger im Blut. ............................. 3

Abbildung 3: Schematischer Aufbau der alveolokapillären Barriere. ...................................... 6

Abbildung 4: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der alveolären Oberfläche einer

humanen Lunge. ................................................................................................................... 8

Abbildung 5: Vereinfachtes Schema der Entwicklung von Blutzellen aus Stammzellen im

Knochenmark. ....................................................................................................................... 9

Abbildung 6: Funktionen der Neutrophilen. ...........................................................................13

Abbildung 7: Einteilung der Chemokingruppen anhand von Cysteinresten und Disulfidbrücken.

.............................................................................................................................................15

Abbildung 8: Signalkaskade nach toll-like Rezeptor (TLR) Aktivierung. ................................17

Abbildung 9: Infektion und Therapie mit Ampicilin. ...............................................................33

Abbildung 10: Gating Strategien zur Untersuchung bronchoalveolären Lavage....................38

Abbildung 11: Späte Antibiotika-Therapie schützt S. pn.-infizierte Mäuse nicht vor fataler

Pneumonie. ..........................................................................................................................48

Abbildung 12: Die Kinetik der Bakterien-Eliminierung mittels Antibiotika-Therapie ist nicht

abhängig vom Therapiebeginn. ............................................................................................49

Abbildung 13: Ampicillin hat keinen Einfluss auf Leukozyten-Populationen im Alveolarraum.

.............................................................................................................................................51

Abbildung 14: Verminderte Zytokin-Level im Alveolarraum nach antibakterieller Therapie und

histologische Analysen. ........................................................................................................53

Abbildung 15: Regulierte Konzentrationen von Chemokinen und Wachstumsfaktoren im

Alveolarraum nach antibakterieller Therapie .........................................................................55

Abbildung 16: Eine antibakterielle Therapie hat keinen Einfluss auf Leukozyten- und

Thrombozyten-Konzentrationen im Blut, jedoch auf den Hämatokrit. ....................................57

Abbildung 17: Frühzeitige, jedoch nicht späte antibakterielle Therapie verhindert systemische

Inflammation. ........................................................................................................................59

Abbildung 18: Frühzeitige, jedoch nicht späte antibakterielle Therapie schützt vor der

Entwicklung von Pleuritis, Steatitis und Leberschädigung. ...................................................61

Abbildung 19: Die frühe antibakterielle Behandlung hat einen therapeutischen Effekt auf die

Ödemausprägung. ................................................................................................................63

Abbildung 20: Nur ein frühzeitiger Therapiestart erhält die Integrität der alveolokapillären

Barriere und reduziert lokale VEGF-Level. ...........................................................................65

Abbildung 21: Sekretion von CXCL1, CXCL2 und CXCL5 nach S. pn.-Infektion in vivo. .......67

125

Abbildung 22: Sekretion der Chemokine CXCL1, CXCL2 und CXCL5 nach S. pn.-Infektion in

vitro. .....................................................................................................................................68

Abbildung 23: Die epitheliale Sekretion von CXCL1 und CXCL5 geschieht in Abhängigkeit vom

toll-like Rezeptor 2 (TLR2). ...................................................................................................69

Abbildung 24: Verminderte Neutrophile-Rekrutierung in den Alveolarraum S. pn.-infizierter

Mäuse in Abwesenheit von CXCL5. .....................................................................................70

Abbildung 25: Eine erhöhte bakterielle Last in Alveolarraum und Lunge hat keinen nachteiligen

Effekt auf die Mortalität S. pn.-infizierter Mäuse. ...................................................................71

Abbildung 26: In S. pn.-infizierten Tieren sind alveoläre Makrophagen, aber nicht

inflammatorische Monozyten / Makrophagen oder dendritische Zellen, durch eine Cxcl5

Deletion beeinflusst. .............................................................................................................72

Abbildung 27: Inflammatorische Mediatoren in einer S. pn.-Infektion werden durch eine Cxcl5

Deletion nicht beeinflusst. .....................................................................................................73

Abbildung 28: Histopathologische Analysen zeigen keine Unterschiede bei der Entwicklung

einer entzündlichen Pneumonie zwischen WT und Cxcl5─/─ auf. ..........................................75

Abbildung 29: Die Abwesenheit von CXCL5 schützt vor Barriereschädigung nach S. pn.-

Infektion................................................................................................................................76

Abbildung 30: Induktion der Ausschüttung von CXCL1 und CXCL5 nach hochvolumiger

mechanischer Beatmung in vivo. ..........................................................................................77

Abbildung 31: Mechanische Dehnung von Epithelzellen induziert die Ausschüttung von

CXCL1, CXCL5 und VEGF. ..................................................................................................78

Abbildung 32: Induktion der Neutrophile-Rekrutierung in den Alveolarraum durch mechanische

Beatmung. ............................................................................................................................79

Abbildung 33: CXCL5 beeinflusst neben der PMN-Rekrutierung keine weiteren Immunzellen

im Alveolarraum nach mechanischer Beatmung. ..................................................................80

Abbildung 34: Die Lungenfunktion ist in Abwesenheit von CXCL5 nach mechanischer

Beatmung verbessert. ..........................................................................................................82

Abbildung 35: Histopathologische Auswertung der ventilierten WT und Cxcl5─/─ Tiere. ........84

Abbildung 36: Bei einer mechanische Beatmung schützt die Abwesenheit von CXCL5 vor einer

Schädigung der alveolokapilläre Barriere. ............................................................................85

126

9.3 Publikationen

In der vorliegenden Arbeit enthaltene Daten wurden publiziert:

Berger S, Gökeri C, Gupta SK, Vera J, Dietert K, Behrendt U, Lienau J, Wienhold SM, Gruber

AD, Suttorp N, Witzenrath M, Nouailles G. Delay in Antibiotic Therapy Results in Fatal

Disease Outcome in Murine Pneumococcal Pneumonia. Crit Care. 2018, 22(1):287.

Dietert K, Nouailles G, Gutbier B, Reppe K, Berger S, Jiang X, Schauer AE, Hoche AC, Herold

S, Slevogt H, Witzenrath M, Suttorp N, Gruber AD. Digital Image Analyses on Whole Lung

Slides in Mouse Models of Acute Pneumonia. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2018, 58(4):440-

448.

Konferenzbeiträge:

Poster: 2nd International Conference “Innate immunity of the lung – Improving pneumonia

outcome”.15. – 17.09.2016, Berlin. Berger S, Gökeri C, Behrendt U, Lienau J, Suttorp N,

Nouailles G, Witzenrath G: In vivo Analysis of Murine Pneumococcal Pneumonia for

Mathematical Modelling of Community Acquired Pneumonia.

Poster und Vortrag: Herbsttreffen der Sektion Zellbiologie und der Sektion Infektiologie und

Tuberkulose der DGP. 11. – 12.11.2016, Hannover. Berger S, Gökeri C, Behrendt U, Lienau

J, Suttorp N, Nouailles G, Witzenrath G: In vivo Analysis of Murine Pneumococcal

Pneumonia for Mathematical Modelling of Community Acquired Pneumonia.

Poster: 58. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Pneumologie und Beatmungsmedizin

(DGP). 22. – 25.03.2017, Stuttgart. Berger S, Gökeri C, Behrendt U, Lienau J, Suttorp N,

Nouailles G, Witzenrath G: In vivo Analysis of Murine Pneumococcal Pneumonia for

Mathematical Modelling of Community Acquired Pneumonia.

Poster: 58. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Pneumologie und Beatmungsmedizin

(DGP). 22. – 25.03.2017, Stuttgart. Berger S, Wienhold SM, Gökeri C, Behrendt U, Fatykhova

D, Zscheppang K, Berg J, Gisch N, Dietert K, Doehn JM, Hocke AC, Witzenrath M, Nouailles

G: Spatial and temporal regulation of neutrophil-attractant CXCL5/LIX in acute

streptococcal pneumonia.

Poster: Gemeinsame Jahrestagung DGI und des DZIF 2017. 28. – 30.09.2017, Hamburg.

Berger S, Gökeri C, Behrendt U, Lienau J, Suttorp N, Witzenrath M, Nouailles G: Delay in

127

Adequate Antibiotic Therapy Results in Fatal Disease Outcome in a Mouse Model of

CAP.

Poster: Herbsttagung der Sektionen Zellbiologie und Infektiologie und Tuberkulose der

Deutschen Gesellschaft für Pneumologie und Beatmungsmedizin e.V. 10. – 11.11.2017,

Gießen. Berger S, Gökeri C, Behrendt U, Lienau J, Suttorp N, Witzenrath M, Nouailles G:

Delay in Adequate Antibiotic Therapy Results in Fatal Disease Outcome in a Mouse

Model of CAP.

Poster: Herbsttagung der Sektionen Zellbiologie und Infektiologie und Tuberkulose der

Deutschen Gesellschaft für Pneumologie und Beatmungsmedizin e.V. 10. – 11.11.2017,

Gießen. Berger S, Wienhold SM, Gökeri C, Behrendt U, Müller-Redetzky H, Dietert K, Gruber

AD, Witzenrath M, Nouailles G: Role of neutrophil-attractant CXCL5/LIX in barrier damage

in ventilator-induced lung injury and pneumococcal pneumonia.

Poster: 59. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Pneumologie und Beatmungsmedizin

(DGP). 14. – 17.03.2018, Dresden. Berger S, Gökeri C, Behrendt U, Lienau J, Suttorp N,

Witzenrath M, Nouailles G: Delay in Adequate Antibiotic Therapy Results in Fatal Disease

Outcome in a Mouse Model of CAP.

128

9.4 Danksagung

Ich möchte allen Personen danken, die mich in den letzten Jahren dabei unterstützt haben,

das Projekt „Doktorarbeit“ zu meistern. Einzelnen und sehr wichtigen Wegbegleitern soll an

dieser Stelle separat gedankt werden:

Dr. Geraldine Nouailles-Kursar, der besten Betreuerin, die ich mir vorstellen kann. Neben der

Übermittlung eines großen Anteils ihres umfangreichen immunologischen Wissensschatzes

hat sie vor allem einen unglaublichen Beitrag dabei geleistet, kritisches Denken und

wissenschaftliche Eigenständigkeit zu fördern. Sie hat es geschafft, gleichzeitig meine

Selbstständigkeit zu unterstützen wie auch Rückhalt zu geben. Durch einfaches Zuhören oder

strukturiertes Angehen von Problemen war sie stets eine riesige Stütze und ein großes Vorbild.

Prof. Dr. Martin Witzenrath, der mich mit großer Herzlichkeit in seine Arbeitsgruppe

aufgenommen hat, mir einen umfangreichen Einblick in die Medizin ermöglichte und der trotz

seiner knapp bemessenen Zeit immer Wege fand, auftretende Anliegen zu besprechen.

Prof. Dr. Roland Lauster und Prof. Dr. Bastian Opitz, welche mir als Gutachter dieser

Dissertation eine unkomplizierte und reibungsfreie Promotion an der TU Berlin ermöglichten.

Prof. Dr. Jens Kurreck möchte ich dafür danken, dass er die Leitung der Prüfungskommission

übernommen hat.

Allen Mitgliedern der AG Witzenrath. Die unglaublich hilfsbereite, freundliche und kollegiale

Atmosphäre hat einen Großteil dazu beigetragen, dass ich jeden Tag gerne zur Arbeit

gekommen bin, unglaublich viel gelernt habe und daran auch große Freunde hatte. Besonders

möchte ich Ulrike und Cengiz danken: Ulrike war die größte Hilfe der Welt. Die letzten Monate

wären so ohne sie nicht möglich gewesen. Cengiz, I can’t imagine how night preps would have

been without his help and friendship! Jasmin danke ich fürs Korrektur lesen, das war eine

riesige Hilfe. Sandra, die fachlich wie auch privat immer für mich da war. Danke!

Dr. Kristina Dietert aus der AG Gruber, die die histopathologischen Auswertungen

durchgeführt und mir darüber hinaus immer ihr großes Fachwissen zur Verfügung gestellt hat.

Meiner Familie und Roberto. Vor allem meiner Mama möchte ich danken, bei ihr konnte ich

immer darauf vertrauen, ein offenes Ohr für alle Sorgen zu finden. Meinen Schwestern Conny

und Claudia, die es für mich sogar mit dieser Arbeit aufgenommen haben. Ein riesiges

Dankeschön auch an Roberto, der war immer für mich da und mich unterstützt hat, wo er nur

konnte. Du bist der Beste.