Die Bedeutung des lokalen und zirkulierenden
Renin-Angiotensin Systems in der Präeklampsie
vorgelegt von
Diplom-Ingenieur
Florian Herse
aus Berlin
von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
-Dr. rer. nat.-
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. rer.nat. Lothar Kroh
Berichter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. Ulf Stahl
Berichter: PD Dr. med. Ralf Dechend
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 18. Dezember 2007
Berlin, 2007
D 83
Inhaltsverzeichnis 2
1
ZUSAMMENFASSUNG 4
2
EINLEITUNG 5
2.1
P
RÄEKLAMPSIE
5
2.2
R
ENIN
-A
NGIOTENSIN
S
YTEM
8
2.3
P
ROBLEMSTELLUNG
13
3
MATERIAL 15
3.1
C
HEMIKALIEN
15
3.2
R
EAKTIONSPUFFER
,
A
NTIBIOTIKA
,
RT-PCR 15
3.3
A
LLGEMEIN VERWENDETE
L
ÖSUNGEN UND
P
UFFER
15
3.4
P
RIMER UND
O
LIGONUCLEOTIDE
16
3.5
M
ARKER
17
3.6
A
NTIKÖRPER
17
3.7
Z
ELLKULTURMEDIUM
17
3.8
K
ITS
17
3.9
G
ERÄTE
18
3.10
S
OFTWARE
18
4
METHODEN 19
4.1
P
ATIENTEN
19
4.2
P
ROBENGEWINNUNG
19
4.3
RNA-I
SOLIERUNG
20
4.4
RNA-Q
UANTIFIZIERUNG
/Q
UALIFIZIERUNG
21
4.5
S
YNTHESE VON C
DNA 21
4.6
M
ICROARRAY
22
4.6.1
D
ATENANALYSE
22
4.6.2
D
URCHFÜHRUNG
22
4.7
R
EALTIME
-RT-PCR 22
4.8
I
MMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
25
4.9
P
LASMA
R
ENIN
A
KTIVITÄT
25
4.10
A
UFREINIGUNG DER
AT1-AA
AUS
S
ERUM
(I
G
G-A
UFREINIGUNG
) 26
4.10.1
C
APRYLSÄURE
26
4.10.2
A
MMONIUMSULFAT
-F
ÄLLUNG
(AS-F
ÄLLUNG
) 26
4.10.3
G
LOBAFFIN
27
4.11
K
ARDIOMYOZYTEN
-K
ONTRAKTIONS
-B
IOASSAY
27
4.12
Z
ELLKULTUR
27
4.13
P
ROTEINISOLATION
27
4.14
P
ROTEINBESTIMMUNG NACH
B
RADFORD
28
4.15
W
ESTERNBLOTANALYSE
28
4.15.1
SDS-P
AGE
28
4.15.2
B
LOTTEN
29
4.15.3
B
LOCKEN
29
4.15.4
A
NTIKÖRPER
29
4.15.5
D
ETEKTIERUNG DES
A
NTIKÖRPERS
30
4.16
Q
UANTIFIZIERUNG
W
ESTERN
B
LOT
30
4.17
S
TATISTIK
30
Inhaltsverzeichnis 3
5
ERGEBNISSE 31
5.1
P
ATIENTENCHARAKTERISTIK
31
5.2
M
ICROARRAY
32
5.3
L
OKALES
R
ENIN
-A
NGIOTENSIN
S
YSTEM
35
5.4
Z
IRKULIERENDES
R
ENIN
-A
NGIOTENSIN
S
YSTEM
48
6
DISKUSSION 51
7
LITERATUR 57
8
PUBLIKATIONSLISTE 64
8.1
B
EITRÄGE
65
10
DANKSAGUNG 67
Zusammenfassung 4
1 Zusammenfassung
Präeklampsie ist verheerend für Mutter und Kind. Der Ursprung der Krankheit liegt in
der utero-plazentären Einheit (upE). Auswirkungen sind bis in die Zirkulation der
Mutter messbar. Das Renin-Angiotensin System (RAS) ist in die Präeklampsie
involviert, obwohl nicht geklärt ist, wie das zirkulatorische und das
gewebespezifische utero-plazentäre RAS miteinander interagieren. Diese Arbeit
sollte die Dysregulation in der upE und der maternalen und fetalen Zirkulation,
insbesondere des RAS, zeigen. Es wurden Expressionsanalysen der Decidua,
Plazenta (als upE), Fett- und Muskelgewebe von 10 Kontroll-Schwangeren und 10
präeklamptischen Schwangeren durchgeführt und auf Proteinebene verifiziert.
Außerdem wurden die Plasma-Renin Aktivität (PRA) und der Angiotensin II-Rezeptor
Typ 1-Autoantikörper (AT1-AA) in der Zirkulation untersucht und die Aktivität des
AT1-AA charakterisiert. Die meisten Gene waren in der Decidua dysreguliert. Der
Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 (AT1-R) war um den Faktor 5,0 in der
präeklamptischen Decidua hochreguliert, der AT2-R in der präeklamptischen
Plazenta runterreguliert. Der AT1-AA wurde in maternalem Serum und im
transplazentaren Transfer detektiert und zeigte sich befähigt den MAPK-Weg
spezifisch zu aktivieren. Die PRA war in der Präeklampsie um den Faktor 3 reduziert.
Die RAS-Komponenten Renin (35-fach), Angiotensin converting enzyme (2,8-fach)
und Angiotensinogen (9-fach) waren unabhängig der Präeklampsie in der Decidua
höher expremiert als in der Plazenta, wohingegen der AT1-R in der Plazenta höher
expremiert wurde. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Dysregulation des lokalen und
zirkulierenden RAS während der Präeklampsie und beschreiben das RAS in der upE.
Diese neuen Faktoren könnten zum besseren Verständnis der Pathologie von
Präeklampsie beitragen.
Einleitung 5
2 Einleitung
2.1 Präeklampsie
Die Schwangerschaftserkrankung Präeklampsie manifestiert sich durch schlagartigen
Anstieg des Bluthochdrucks, einhergehend mit einer Proteinurie und wurde das erste
mal 2000 v. Chr. in dem Kahun-Papyrus im alten Ägypten beschrieben (Stevens,
1975). Die Auswirkungen für Mutter und Fötus sind verheerend (Sibai et al., 2005).
So ist die Präeklampsie die Hauptursache für mütterliche und kindliche Morbidität
und Mortalität (Norwitz und Repke, 2000). Das American College of Obstetricians
and Gynecologists (ACOG) hat Kriterien aufgestellt, wonach eine Präeklampsie
deutlich charakterisiert wird und von anderen schwangerschaftsinduzierten
Bluthochdruckerkrankungen unterschieden werden kann. So ist der Blutdruck einer
vormals nicht an Bluthochdruck leidenden Patientin mit >140/90 mm Hg definiert und
die Proteinurie mit >300 mg/l Protein in einem 24h-Sammelurin angegeben (2002).
Eine schwere Verlaufsform der Präeklampsie ist das HELLP-Syndrom, was für
Haemolyse, Elevated Liver enzymes (erhöhte Leberwerte) und Low Platelets
(verminderte Thrombozyten) steht, sowie die Eklampsie (Auftreten von schweren
Krämpfen bei der Mutter) (Davison et al., 2004). Leidet die Mutter bereits vor der
Schwangerschaft an Bluthochdruck, so addieren sich die Pathologien auf und man
spricht von einer Pfropfgestose.
Insgesamt 5-10 % aller Schwangerschaften weltweit entwickeln eine Präeklampsie.
Die Unterschiede sind aber regional sehr unterschiedlich und variieren von 2-5% in
Europa und den USA, bis maximal 19% in Entwicklungsländer (Roberts et al., 2003).
Die kindliche Morbidität oder sogar Mortalität ist bedingt durch eine mögliche
Mangelversorgung des Kindes, hervorgerufen durch eine eingeschränkte Funktion
der Plazenta. Hierbei kann es zu Wachstumsretardierung, mangelnde
Sauerstoffversorgung oder sogar zum Kindstod kommen (Fayyad und Harrington,
2005). Liegt diese Mangelversorgung nicht vor, so verbleibt das Risiko eines zu
geringen Geburtsgewichtes, IUGR (intrauterine growth restriction) genannt,
resultierend aus dem vorzeitigen Schwangerschaftsabbruch. Kinder mit IUGR haben
im weiteren Leben ein erhöhtes Risiko kardiovaskuläre Krankheiten zu erleiden
(Barker, 1997; Barker, 1999). Ebenfalls bei Frauen, die unter einer Präeklampsie
Einleitung 6
entbunden haben, ist ein erhöhtes Risiko für kardiovaskulären Erkrankungen
erkennbar (Anderson, 2007).
Zurzeit steht keine geeignete Therapie zur Verfügung, welche sowohl die Gesundheit
des Kindes wie die der Mutter berücksichtigt. Dies beruht auf der Tatsache, dass der
genaue Hintergrund der Krankheit nicht geklärt ist. Die herkömmlichen
Therapieansätze bei Bluthochdruckerkrankungen wie ACE-Hemmer und AT-Blocker
sind eher kontraindizierend für die fetale Entwicklung. Es bleibt nur eine vorzeitige
Entbindung, um schwere Schädigungen der Mutter wie Hirnblutungen oder
Nierenschädigung zu verhindern (Wolf et al., 2001). Es wurde bei Risikopatientinnen
versucht, mit verschiedenen Medikamenten und Diäten, wie z.B. Magnesium-, Zink-
Verabreichung oder einer Proteindiät, die Entwicklung einer Präeklampsie/Eklampsie
zu verhindern. Meist haben diese Studien nur eine sehr geringe Fallzahl und zeigen
widersprüchliche Ergebnisse (Witlin und Sibai, 1997).
Für Präeklampsie ist eine Vielzahl an Risikofaktoren bekannt, die mehr oder weniger
alle auf statistischen Erhebungen beruhen. So nimmt das Risiko, an Präeklampsie zu
erkranken mit jeder folgenden Schwangerschaft um das etwa 6 bis 8-fache ab.
Dieser relative Schutz in den folgenden Schwangerschaften ist nicht mehr vorhanden,
wenn die Kinder mit verschiedenen Vätern gezeugt werden, was eine deutliche
immunologische Komponente erkennen lässt (Trupin et al., 1996). Ein weiterer
Hinweis auf eine immunologische Komponente liefert die Tatsache, dass Frauen, die
längere Zeit vor der Befruchtung mit dem Vater sexuellen Kontakt hatten, ein
geringeres Risiko für Präeklampsie aufweisen (Einarsson et al., 2003). Es gibt
ebenfalls einige Faktoren, die auf eine genetische Komponente schließen lassen,
welche sowohl den mütterlichen wie den väterlichen Ursprung berücksichtigen. So
haben Töchter und Schwestern von präeklamptischen Frauen ein 30%iges Risiko, an
Präeklampsie zu erkranken (Chesley, 1980). Die Inzidenz von Präeklampsie ist
erhöht bei jungen Schwangeren, Mehrlingsschwangerschaften, Diabetes mellitus,
Übergewicht und anderen Erkrankungen, die mit einer Autoimmunkrankheit
assoziiert sind (wie Anti-Cardiolipin Antikörper Syndrom) (Roberts und Cooper, 2001).
Eine breite Akzeptanz findet die 2-stage-disorder theory. Hiernach entwickelt sich
eine Präeklampsie in zwei Stufen, wobei sich die erste Stufe durch eine verminderte
Perfusion der Plazenta und die zweite Stufe als Translation der ersten Stufe auf das
gesamte System der Mutter verstanden wird (Roberts und Gammill, 2005).
Einleitung 7
Dass die Plazenta die ausschlaggebende Einheit in der Entstehung der
Präeklampsie ist, begründet sich schon in der Tatsache, dass ihr Auftreten an das
Vorhandensein der Plazenta gebunden ist. Die Plazenta fängt an sich auszubilden,
sobald sich der Blastozyste (befruchtete Eizelle) im Endometrium der Mutter einnistet.
Aus der Blastozyste entwickelt sich der Embryoblast und eine umgebene Zellschicht,
aus der sich die Trophoblasten bilden, welche wiederum die Plazenta aufbauen. Die
Plazenta besteht somit aus fetalem Gewebe. Sie kann im ausgereiften Stadium etwa
500-600g wiegen, mit einem Durchmesser von 15-20cm. Das Endometrium bildet
sich nach Einnistung des Blastozysten in die Decidua um. Hier sind die Spiralarterien
lokalisiert, welche einen enorm hohen Nährstoff- und Sauerstoffaustausch
gewährleisten. Dieser Teil ist mütterliches Gewebe und wird durch einwandernde
Trophoblasten mit fetalen Zellen infiltriert. Dieser Teil verbleibt normalerweise bei der
Geburt im Uterus, währenddessen die Plazenta mit der Nachgeburt ausgestoßen
wird. In einer normalen Schwangerschaft muss dem Fötus ein ausreichendes
Nährstoffangebot zur Verfügung gestellt werden, d.h. die Arterien in der Plazenta
werden umgebaut. Dies geschieht, indem Trophoblasten gegen den Blutstrom in die
Arterien einwandern, die Gefäßwand ausbetten und so zu einer Umgestaltung der
Spiralarterien durch Ersetzen der Endothelzellen und glatte Gefäßmuskelzellen
führen (Kam et al., 1999). Diese endovaskulären Trophoblasten erfahren einen
Differenzierungsprozess, an dessen Ende sie endotheliale Marker wie
angiogenetische Faktoren und Rezeptoren expremieren. Dieser Prozess wird durch
Hypoxie gesteuert (Red-Horse et al., 2004). Durch diesen Umbau der Arterien (engl.
artery-remodeling) ist sicher gestellt, dass in Stresssituationen freigesetzte
vasokonstriktorische Stimuli, wie z.B. Angiotensin II, kein Verengen der Arterien und
damit einhergehende Mangelversorgung des Kindes vermitteln können und die
uneingeschränkte Blutversorgung des Fötus gesichert ist. Neben den
endovaskulären Trophoblasten tritt auch eine weitere invasive Art auf, die
interstinalen Trophoblasten, welche nicht durch die Gefäße wandern, sondern direkt
durch das mütterliche Gewebe. In der präeklamptischen Plazenta kommt es zu
einem stark hypoxischen Zustand und einem gestörten Level an angiogenetischen
wie antiangiogenetischen Faktoren. Die Trophoblasteninvasion ist inhibiert, der
Umbau der Spiralarterien vermindert und es kommt zu einer gestörten Zirkulation in
der Plazenta (Redman, 1991). Dieser Vorgang wird auch als abnormale Plazentation
bezeichnet.
Einleitung 8
Abb.1: Veränderte Plazentation während der Präeklampsie (nach Redman und Sargent, 2005).
A) Der Aufbau und das Umgestallten der Spiralarterienwand durch einwandernde Trophoblasten führt
zu einer nicht-kontraktionsfähigen Spiralarterie und einem hohen Blutfluß. B) Während der
Präeklampsie kommt es zu einer verminderten Trophoblasteninvasion, gestörten Umgestaltung der
Spiralarterien und dadurch zu einer abnormalen Plazentation. Durch eine mögliche Kontraktion kommt
es zu einer Mangelversorgung des Fetus.
2.2 Renin-Angiotensin Sytem
Das Renin-Angiotensin System (RAS) ist eine gut charakterisierte Hormon-Enzym-
Kaskade, welche die Salz- und Wasserretention sowie das Blutdrucksystem steuert.
Am bekanntesten ist die Wirkungsweise über die Zirkulation (zirkulierendes RAS).
Hier kommt es zum Zusammenspiel aus in der Niere expremiertem Enzym Renin
und in der Leber freigesetztem Hormon Angiotensinogen. Neben diesem
zirkulierenden RAS gibt es auch ein lokales RAS. Hier sind alle Komponenten des
RAS mit gewebespezifischer Lokalisierung expremiert. Das final aktive Peptidhormon
der Kaskade ist das Angiotensin II (AngII). Es ist ein Octapeptid und wurde zuerst
unter dem Namen Angiotonin 1957 beschrieben (Bumpus et al., 1957). Es wird über
die Vorstufe Angiotensin I (AngI) aus dem nicht-bioaktiven Peptidhormon
Angiotensinogen gebildet. Die Protease Renin spaltet und aktiviert das
Angiotensinogen (AGT) zu dem AngI. Durch das Angiotensin Converting Enzyme
Einleitung 9
(ACE) werden zwei Aminosäuren von AngI abgespalten und somit in AngII
umgewandelt. AngII hat die Sequenz Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe und wurde in
der Vergangenheit lediglich als Hormon angesehen, welches regulatorischen Einfluß
auf den Blutdruck, die Natrium-Resorption und die Aldosteron-Freisetzung nahm.
Mittlerweile ist jedoch bekannt, dass AngII auch die Expression von
Wachstumsfaktoren, Zytokinen, Chemokinen und Adhesionsmolekülen reguliert.
Diese sind in das Zellwachstum, Apoptose, Fibrose (Vermehrung des Bindegewebes)
und inflammatorische Prozesse involviert (Ruiz-Ortega et al., 2001). Aufgrund eines
erhöhten Gehaltes an ACE, AngII und deren Rezeptor in arteriosklerotischen
Herzkranzgefäßen konnte gezeigt werden, dass das RAS in inflammatorischen
Prozessen der Gefäßwand mitwirkt (Schieffer et al., 2000). Ebenfalls in
Sauerstoffradikalbildung ist das AngII involviert, da es durch Regulierung der
NADH/NADPH-Oxidase vermehrt die Bildung von reaktiven Sauerstoffmolekülen
induziert (Griendling et al., 1997). Diese reaktiven Sauerstoffmoleküle beeinflussen
das Zellwachstum, die Herzhypertrophie, die Lipidoxidation und inflammatorische
Prozesse (Luft, 2000). Die Wirkung von AngII wird über zwei Rezeptoren vermittelt.
Bei dem Menschen sind zwei Subtypen von Angiotensinrezeptoren bekannt: Der
Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 (AT1-R) und der Angiotensin II-Rezeptor Typ 2 (AT2-
R). Der AT1-R wurde das erste Mal 1970 beschrieben und 1991 kloniert (Goodfriend
und Lin, 1970; Sasaki et al., 1991).
Der menschliche AT1-Rezeptor besteht aus 359 Aminosäuren (41 kDa) und weist
sieben hydrophobe, transmembrane Segmente in α-Helixstruktur auf (Murphy et al.,
1991). Der AT1-R gehört zu der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (engl.
G protein-coupled receptors, GPCR). Über ein Pertussistoxin-sensitives G-Protein
kommt es zur Aktivierung der Phospholipase C und dadurch wiederum zur
Aktivierung von Calziumkanälen und der Protein-Kinase C (PKC). Diese G-Protein-
gekoppelten Signaltransduktion, welche unter anderem die Kontraktion von glatten
Muskelzellen, Sekretion von Aldosteron, Aktivierung von Nerven, Transport von
Ionen und die Proliferation von Zellen und deren Wachstum steuert, setzt sich über
die MAP-Kinase/ERK-Signalkaskade fort. Hierdurch kommt es zur Regulation der
Transkription und Expression von Proteinen, die das Wachstum und die Proliferation
von AngII-Zielgewebe kontrollieren (de Gasparo et al., 2000).
Es gibt viele Hinweise, dass das RAS in der Entstehung der Präeklampsie beteiligt ist
(Shah, 2005). Das zirkulierende RAS wird bereits durch die Schwangerschaft
Einleitung 10
aktiviert, was sich dadurch äußert, dass Renin- und Angiotensinogen-Spiegel erhöht
sind (Hsueh et al., 1982). In der Präeklampsie sind AngII Spiegel, Plasma-Renin
Aktivität und Alodosteronspiegel gegenüber einer unkomplizierten Schwangerschaft
reduziert. Neben den „normalen“ RAS (zirkulierendes und lokales RAS) kommt es bei
schwangeren Frauen zu einem weiteren Auftreten eines RAS, das uteroplazentare
RAS (Shah, 2005).
Präeklamptische Patientinnen zeigen eine höhere Sensitivität gegenüber AngII (Shah,
2006). Studien, bei denen schwangeren Patientinnen AngII in geringen Dosierungen
infundiert wurde, zeigten, dass die Patientinnen, welche später eine Präeklampsie
entwickelten eine geringere Dosis an AngII benötigten, um einen Blutdruckanstieg zu
erreichen (Gant et al., 1973). Mögliche Erklärungen könnten eine vermehrte
Aktivierung durch Autoantikörper gegen den AT1-R, eine erhöhte Expression des
AT1-R, bzw eine Heterodimerisierung des AT1-R mit dem Bradykinin Rezeptor
(BDKRB2) sein (Shah, 2006). Viele dieser G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zeigen
im heterodimerisierten Zustand veränderte Eigenschaften, wie Bindungsaffinität oder
Signalvermittlung (Barki-Harrington, 2004). In der Präeklampsie kommt es durch
diese Rezeptor-Dimerisierung zwischen dem AT1-R und dem BDKRB2 oder auch
dem AT1-R mit sich selber bei gleicher AngII Konzentration zu einer verstärkten
Signaltransduktion. Zudem ist der heterodimerisierte AT1-R vor einer Inaktivierung
geschützt (AbdAlla et al., 2001). Der AT1-R ist ebenfalls in die Aktivität von
Wachstumsfaktor-Rezeptoren (engl. Growth factor receptors) involviert. So kommt es
durch den AT1-R zu einer Transaktivierung des Epidermal Growth factor- Rezeptors
(EGF-R) (Higuchi et al., 2007). Als Erweiterung des RAS kann man das Renin-
Angiotensin-Aldosteron System (RAAS) auffassen, da die Bildung von Aldosteron
(Ald) und AngII eng verknüpft ist. Aldosteron wird durch die Aldosteronsynthase
(Cyp11B2) in der Nebennierenrinde gebildet und interagiert über den
Mineralocorticoid Rezeptor (MR). Die durch AngII und Ald vermittelte
Signaltransduktion ist eng gekoppelt. So aktivieren AngII und Ald beide die
Phosphorylierung der MAP-Kinase (ERK) und wirken in Kombination additiv. Die
induzierte Phosphorylierung lässt sich durch einen spezifischen MR Blocker sowie
EGF-R Blocker hemmen (Mazak et al., 2004). Hieraus ergibt sich ein enges
Zusammenspiel zwischen den einzelnen Rezeptoren und deren Agonisten.
In der Zirkulation schwangerer Frauen sind gegenüber nicht-schwangeren Frauen
einige Faktoren verändert. Neben einem veränderten Hormonhaushalt sind auch
Einleitung 11
Trophoblasten-Trümmer und angiogenetisch-assozierte Faktoren detektierbar.
Gerade diesen Faktoren widerfährt eine Dysregulation in der Präeklampsie (Redman
und Sargent, 2005). Ein weiterer Faktor, der in der Zirkulation präeklamptischer
Frauen detektierbar ist, ist ein agonistischer Autoantikörper, der gegen den AT1-R
gerichtet ist (AT1-AA) (Wallukat et al., 1999). Dieser AT1-AA ist nicht spezifisch für
die Präeklampsie, da er auch in weiteren schwangerschaftsinduzierten
Bluthochdruckerkrankungen sowie IUGR anzutreffen ist (Walther et al., 2005). Da er
auch in der Zirkulation eines präeklamptischen Rattenmodel´s gefunden wurde,
scheint er auch nicht speziesgebunden zu sein (Dechend et al., 2005). Ebenfalls in
Patienten mit Nieren-Transplantat-Abstoßungs-Reaktion ist der AT1-AA detektierbar
(Dragun et al., 2005). Das Epitop gegen welches der AT1-AA reaktiv ist, wurde als
Sequenz (sieben Aminosäuren) aus dem zweiten extrazellulären Loop des AT1-R
charakterisiert (Wallukat et al., 1999). Die Signaltransduktion ist nur in Teilen
charakterisiert, zeigen jedoch immer einen deutlichen Hintergrund zu der
präeklamptischen Erkrankung auf. So führen die Autoantikörper zu einer
intrazellulären Freisetzung von Sauerstoffradikalen. Dieser Prozess wird durch die
Aktivierung der NADPH-Oxidase vermittelt. Als Redox-sensitive
Transkriptionsfaktoren werden im folgendem die Transkriptionsfaktoren AP-1 und
NF-kB durch AT1-AA aktiviert (Dechend et al., 2003). Durch isolierte Zellen aus
Knock-out Tieren konnte gezeigt werden, dass die NADPH Oxidase für die AT1-AA
induzierte Aktivierung von NF-kB notwendig ist. Als Folge dieser Aktivierung kommt
es zu einer vermehrten Expression und Aktivität des Tissue Faktors, eines der
wichtigsten pro-koagulatorischen Proteine (Dechend et al., 2000). In humanen
Mesangialzellen (Ursprung: Niere) führen die AT1-AA in Vitro zur erhöhten
Expression von Interleukin-6 und dem Plasminogen activator inhibitor-1 (Bobst et al.,
2005). Diese beiden Faktoren deuten auf einen inflammatorischen Prozeß und einen
pathologischen Zustand der Niere hin, welches beides in einer Präeklampsie
gegeben ist. Eine weitere Signalkaskade welche durch den AT1-AA aktiviert wird, ist
die intrazelluläre Calziumfreisetzung und die damit verbundene Aktivierung des
Transkriptionsfaktors NFAT (Thway et al., 2004). Erhöhte intrazelluläre
Calziumspiegel in Thrombozyten sind ebenfalls in Patienten mit Präeklampsie
beschrieben worden (Haller et al., 1989).
Einleitung 12
Abb.2: Renin-Angiotensin System (RAS). Das RAS besteht aus dem Hormon Angiotensinogen
welches durch die Enzyme Renin und Angiotensin-Converting-Enzyme (ACE) in das aktive
Peptidhormon Angiotensin II gespallten wird. Dieses vermittelt Signaltransduktion über die Angiotensin
II-Rezeptoren Typ 1 (AT1-R) und Typ 2 (AT2-R) und ist in die Blutdruckregulation involviert.
Einleitung 13
2.3 Problemstellung
Einige in dieser Arbeit untersuchten Aspekte waren im Einzelnen schon aus anderen
Arbeiten bekannt. Dieser Arbeit liegt zu Grunde, dass ein gut charakterisiertes
Patientenkollektiv von Kontroll-Schwangeren (n=10) und präeklamptischen
Schwangeren (n=10) genutzt wurde, um das komplexe Bild der Präeklampsie besser
im Ganzen zu betrachten. So sollte von jeder Patientin das Genexpressionsverhalten
der uteroplazentaren Einheit (Plazenta und Decidua) in der Gesamtheit und im
Einzelnen sowie des Fettgewebes charakterisiert werden. Insbesondere sollten in
diesen Geweben und zusätzlich in Muskelgewebe die Komponenten des RAS sowie
deren Cofaktoren näher untersucht werden. Da die Präeklampsie auch als 2 stage
disorder bezeichnet wird, die Entstehung der uteroplazentaren Einheit zugesprochen
wird und die Auswirkung oder die gebildeten Faktoren über die Zirkulation der
Patientin vermittelt werden, sollten neben dem lokalen RAS auch das zirkulierende
RAS untersucht werden. Ein sehr wichtiger Faktor im zirkulierenden System
präeklamptischer Frauen ist der AT1-AA, dessen vermittelnde Signaltransduktion im
Vordergrund stehen sollte.
Durch die in dieser Arbeit gewählten Methoden und ausgehend von dem
umfangreichen und sehr gut klinisch charakterisierten Patientenmaterial, sollte die
ausgesprochen komplexe Pathologie der Präeklampsie untersucht werden.
Einleitung 14
Abb.3: Studiendesign.
Material 15
3 Material
3.1 Chemikalien
Chemikalien wurden, soweit nicht anders angegeben, von den Firmen Roth
(Karlsruhe), Roche (Mannheim), Sigma (Deisenhofen), Merck (Darmstadt), Gibco
Life Technologies (Karlsruhe) und Fluka (Neu-Ulm) in reinst oder p.A. Qualität
verwendet.
3.2 Reaktionspuffer, Antibiotika, RT-PCR
Rnase, dNTPs stammten von Promega (Mannheim) und AmpliTaq DNA Polymerase
von Applied Biosystems (Weiterstadt), Advantage II Polymerasemix und 10 x
Reaktionspuffer von BD-Biosciences (Heidelberg).
3.3 Allgemein verwendete Lösungen und Puffer
10 x PBS 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 7,4 mM Na
2
HPO
4
10 x PAGE 0,25 M Tris; 1,92 M Glycin
10 x TBE Puffer 0,9 M Tris-HCl; 0,9 M Borsäure; 20 mM EDTA; pH 7,8
DNA Probenpuffer Bromphenolblau 0,25% (w/V); Glyzerin 30% (w/V)
TE Puffer 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 7,6
Auftragepuffer
(Proteingel)
310 mM Tris-HCL pH 6,8; SDS 10%; Glyzerin 50%;
Bromphenolblau 0,01%; 2-Mercaptoethanol 25%
TBS-T (Blotten) NaCl 0,8%; 20 mM Tris-HCL pH 7,5; Tween 20 0,2%
Elektrophoresepuffer 1x PAGE; SDS 10%
Coomassie-Färbung G 250 0,1%; Essigsäure 10%; Methanol 50%
Coomassie-Entfärbung Essigsäure 10%; Methanol 20%
Lysispuffer 20mM HEPES pH 7,9 ; 350mM NaCl ; 20% Glycerol ;
1mM MgCl2 ; 0,5mM EDTA 0,1mM EGTA ; 1% NP40;
Complete (Roche) (1 Tablette auf 30 ml) ; 1%
Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 1 (SIGMA)
Vectashild-Mounting
Medium
Vector-Laboratories, Burlingame, USA
Material 16
3.4 Primer und Oligonucleotide
Gen Primer fw Primer rv Amplikon-
länge
[Basen]
Primer
5´-CACCCAGGCCAGGAAGTTT-3´ 5´-TGCCCGTTCTAGGTCCTGAA-3´
ACE Sonde 5´FAM-CCAGTTGCAGAACACCACTATCAAGCGG-TAMRA3´ 88
Primer
5´-CTTCACTGAGAGCGCCTGC-3´ 5´-AGACCCTCCACCTTGTCCA-3´
AGT Sonde 5´FAM-CTGATCCAGCCTCACTATGCCTCTAACC-TAMRA3´ 73
Primer
5´-ACCCAATGAAGTCCCGCCT-3´ 5´-AGCAGCCAAATGATGATGCAG-3´
AT1-R Sonde 5´FAM-CGACGCACAATGCTTGTAGCCAAAGTCA-TAMRA3´ 70
AT2-R Applied Biosystems Assay on Demand Hs 00169126_m1 113
Primer
5´-CCCACCACGGCCTCTTT-3´ 5´-GTTAAGAGTGGGCCCTTGCA-3´
BDKRB2 Sonde 5´FAM-AGCGCCGACATGCTCAATGTCACC-TAMRA3´ 63
Primer
5´-CTTGGTGCTTCAGAACTACCACAT-3´ 5´-CATTGCGACCCAGCGAGTA-3´
Cyp11B2 Sonde 5´FAM-CCAGCTGGGACATTGGTACAGGTTTTCC-TAMRA3´ 74
Primer
5´-GACAGCATAGACGACACCTTCCT-3´ 5´-GCCAGCGGGCCTTTTG-3´
EGFR Sonde 5´FAM-CCAGTGCCTGAATACATAAACCAGTCCGTTC-TAMRA3´ 72
Primer
5´-CCCAGAGGAAGGGACAACGT-3´ 5´-GCTGAGGAACCAGTGCTGTGT-3´
M-R Sonde 5´FAM-TCGCTCCTGCAAAAGAACCCTCGG-TAMRA3´ 72
Renin Applied Biosystems Assay on Demand Hs 00166915_m1 71
Primer
5´-CCAGGACTCGCAGTGGGTAA-3´ 5´-ACTCCCTTCACCATCACCATG-3´
Renin-R Sonde 5´FAM-TGTTTCATCGTCCTCGGGCTACCGA-TAMRA3´ 67
Primer
5´-GACCTAAAGACCATTGCACTTCGT-3´ 5´-CCTCATGATTACCGCAGCAAA-3´
TBP Sonde 5´FAM-CCGAAACGCCGAATATAATCCCAAGC-TAMRA3´ 75
Primer
5´-AGCAGATGCAGCAGATCCG-3´ 5´-TCTTGCCCATCAGCACCAC-3´
36B4 SYBR 59
Tab.1: Primerliste. In dieser Liste sind die Sequenzen der Primer und Sonden und deren
Amplikonlängen für die Realtime RT-PCR aufgeführt.
Material 17
3.5 Marker
Kaleidoscope
Prestained Standards
Bio-Rad Laboratories, München
3.6 Antikörper
Anti-hu Cytokeratin 7 Santa Cruz
Anti-hu AT1-Rezeptor Santa Cruz
Anti-hu Renin Roche, Mannheim
Anti-rabbit-Cy3 Jackson Immunoresearch Laboratories
Anti-pERK Cell Signaling Technologies
Anti-ERK Cell Signaling Technologies
Anti-rabbit-HRP Jackson Immunoresearch Laboratories
*tragen Horseradish Peroxidase (HRP) –Label
3.7 Zellkulturmedium
D-MEM:F-12 (1:1) Gibco/Invitrogen, Karlsruhe
Penicillin/Streptamycin Gibco/Invitrogen, Karlsruhe
Glutamin Gibco/Invitrogen, Karlsruhe
Fetal Calf Serum (FCS) Biochrom, Berlin
3.8 Kits
RNeasy Kit Qiagen, Hilden
ECL Western blotting
detection reagents and
analysis system
Amersham Biosciences, Freiburg
Globaffin Affina Immuntechnik GmbH (heute Fresenius)
RNA 6000 Assay Agilent Technologies, Santa Clara, USA
Primer Random Roche, Mannheim
M-MLV RT Promega, USA
Megascript T7 Ambion, USA
qPCR MasterMix Plus Eurogentec, Köln
Material 18
3.9 Geräte
Kühlzentrifuge Beckmann, München
PCR Maschinen Applied Biosystems, Weiterstadt
Tischzentrifugen Eppendorf, Hamburg
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, USA
NanoDrop PeqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen
SpectraFluor Plus TECAN, Crailsheim
Elektrophorese-System Bio-Rad Laboratories, München
Power Pac 200 Bio-Rad Laboratories, München
Trans-Blot SD Semi-Dry
Transfer Cell
Bio-Rad Laboratories, München
Zellkulturzentrifuge Beckmann, München
Entwickler (Optimax) Protec, Oberstenfeld
Cryostat CM3050S Leica,
Axioplan 2 mit SensiCam Zeiss, Jena
Ultra-Turrax T25 basic IKA-Werke
3.10 Software
GeneWorks Oxford Molecular Group
Primer Express 2.0 Applied Biosystems, Weiterstadt
AxioVision 3.0 Zeiss, Jena
MAS 5.0 Affymetrix, United Kingdom
RMAexpress 0.5 B.M. Bolstad, USA (http://rmaexpress.bmbolstad.com/)
Cluster 3.0 Michael Eisen, USA (http://rana.lbl.gov/)
TreeView Michael Eisen, USA (http://rana.lbl.gov/)
Magellan TECAN, Crailsheim
GeneAmp 5700 SDS Applied Biosystems, Weiterstadt
SPSS 14.0 SPSS, USA (http://www.spss.com/)
Methoden 19
4 Methoden
4.1 Patienten
Die in dieser Arbeit verwendeten Proben waren Plazenta, Decidua, Fett- und
Muskelgewebe, Serum und Plasma der Mutter und Serum aus der Umbilikalvene.
Sie wurden alle am Institut für Geburtshilfe und Gynäkologie am Ulleval Universitäts-
Krankenhaus in Oslo, Norwegen gesammelt. Die schwangeren Frauen waren alle
Nichtraucher, Kaukasen, gesund und mit einer unauffälligen Schwangerschaft. Es
gab keinen chronischen Bluthochdruck und keine Nierenerkrankung oder Diabetes in
der Vorgeschichte. Beide eingeschlossene Gruppen, präeklamptische Gruppe und
normal-schwangerschafts Gruppe (Kontrollgruppe), wurden mit einem Kaiserschnitt
entbunden und hatten zur Zeit der Entbindung keine infektiöse Erkrankung. Die
Kaiserschnittgeburt in der Kontrollgruppe wurde nach freiem Wunsch durchgeführt
und nicht aufgrund von Komplikationen. Eine Präeklampsie wurde diagnostiziert,
wenn der Blutdruck bei einer ehemals normotensiven Schwangeren ab der 20.
Schwangerschaftswoche (SSW) >140/90 mmHg an zwei zeitlich getrennten
Messungen war und eine Proteinurie im 24 h Sammelurin (>0,3 g Protein) oder über
Proteinstick (bei mindestens zwei unabhängigen Messungen >1+) detektiert wurde.
Hierbei durfte keine Harnwegsinfektion vorliegen. Alle Patientinnen haben eine
Einwilligung unterschrieben und die Studie wurde von dem Committee of Medical
Research Ethics in Eastern Norway kontrolliert.
4.2 Probengewinnung
Während des Kaiserschnittes wurde abdominales Fettgewebe, Muskelgewebe, sowie
Plazentagewebe durch eine Biopsie entnommen. Das Deciduagewebe wurde durch
eine besondere Technik, der sogenannten „decidual suction method (DSM)“, nach
der Entfernung der Plazenta gewonnen. Hierbei wurde durch eine
Vakuumabsaugung die Decidua aus dem Myometrium herausgetrennt und das
Gewebe in einem Nylonnetz aufgefangen. Dort wurde es unmittelbar mit 500ml
sterile NaCl-Lösung gewaschen, um Verunreinigungen durch Blut zu entfernen. Alle
Proben wurden unmittelbar nach ihrer Gewinnung in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei -80°C gelagert. Ein kleiner Teil der Decidua wurde direkt
histologisch untersucht, um den decidualen Ursprung zu verifizieren.
Methoden 20
Das maternale Blut wurde aus der Armvene entnommen. Das Blut aus der Umbilical
Vene wurde direkt nach der Abnabelung des Kindes entnommen. Das Blut wurde in
entsprechenden Monovetten (für Serum oder Plasma) gesammelt und nach einer
halben Stunde bei RT für 10 min bei 1600g abzentrifugiert. Das Serum/Plasma
wurde entnommen, portioniert und bei -80°C gelagert.
4.3 RNA-Isolierung
Die Isolierung erfolgte unter Verwendung des RNeasy Mini Kits von Qiagen, welches
eine rasche Aufreinigung von RNA-Molekülen (>200 Nukleotide) verspricht.
Ca. 500mg Gewebe wurden mit ca. 2 ml Lysepuffer RLT (der Lysepuffer muss 1% ß-
Mercaptoethanol enthalten; dieses Gemisch ist nur ca. 30 Tage stabil) in einem 8 ml
Rundbodenröhrchen gemischt und für 1 min bei 24000 Umdrehungen/min mit einem
Stabhomogenisator homogenisiert (Ultra-Turrax T25 basic, IKA-Werke). Es wurden
1 ml in ein 2 ml-Eppendorfgefäß überführt und für 2 min bei 8600 g zentrifugiert. Der
Überstand wurde in ein neues Gefäß überführt. Um eine Scherung der vorhandenen
DNA zu erreichen, wurde die wässrige Phase sieben mal durch eine Kanüle (20 G)
und einer 5 ml Spritze aufgesogen. Die weiteren Schritte folgten der Vorschrift von
Qiagen.
Für die RNA-Isolierung aus Fettgewebe steht ein leicht modifiziertes Protokoll des
RNeasy Mini Kit von Qiagen zur Verfügung:
Nach der Entnahme des Fettgewebes aus der Lagerung (-80°C) musste es sofort auf
Eis gelagert und langsam aufgetaut werden. Das Fettgewebe wurde nun im
Mengenverhältnis 1:2 mit dem Lysepuffer RLT (1% ß-Mercaptoethanol. Dieses
Gemisch ist nur ca. 30 Tage stabil) gemischt und im Wasserbad bei 37°C unter
mehrmaligem Vortexen erwärmt und lysiert. Das Lysat lag nun als ölige Emulsion vor
und wurde zentrifugiert (5 min, 2500 g, 25°C). Nach erfolgter Zentrifugation war
deutlich eine Phasentrennung zu erkennen (wässrige Phase, ölige Phase). Mit einer
5 ml Spritze und einer langen Kanüle (20 G) wurde die wässrige Phase in ein neues
Zentrifugenröhrchen überführt. Ab diesem Schritt wurde wie bei der herkömmlichen
RNA-Isolierung verfahren (beginnend mit der DNA-Scherung).
Methoden 21
4.4 RNA-Quantifizierung/Qualifizierung
Die RNA wurde mit Hilfe des NanoDrop quantifiziert. Hierzu wurden 1,5 µl auf die
Probenhalterung aufgetragen und gegen einen Leerwert gemessen. In dieser Arbeit
wurde darauf geachtet, dass folgende Richtwerte eingehalten wurden:
• Quotient 260/280: 1,8-2,0
• Quotient 260/230: 1,8-2,2
• RNA-Konzentration: >500 ng/µl
Zur Qualifizierung (und erneuten Quantifizierung) wurde eine RNA
Konzentrationsmessung mit dem RNA 6000 Assay unter Verwendung des 2100
Bioanalyzer und nach Herstellerangaben durchgeführt.
4.5 Synthese von cDNA
Um aus einer RNA-Matrize einzelsträngige cDNA zu erhalten, musste eine reverse
Transkription durchgeführt werden. Da die Gesamt-RNA umgeschrieben werden
sollte, wurde als Primer der aus vielen kurzen Oligonukleotiden bestehende Random-
Primer (Randomhexamere) ausgewählt, so dass mehrfache, unspezifische
Bindungen über die gesamte RNA erfolgte (anders als bei dem Poly-(dT) Primer,
welcher lediglich an den Polyadenylierungssequenzen bindet). Zur Anwendung kam
das M-MLV RT-Kit. Es wurde wie in Tab.2 dargestellt vorgegangen:
Probe 2 µg RNA
Random Primer 1,8 µl
Wasser Auf 14 µl auffüllen
65°C, 10 min, danach sofort auf Eis
5x M-MLV RT-buffer 4 µl
dNTPs(10 mM each) 1 µl
M-MLV RT 1 µl
Ges.-Vol. 20 µl
Mixen (Pipette), 60 min 37°C, 10 min 95°C
Tab.2: Pipettierschema cDNA Synthese.
Methoden 22
4.6 Microarray
Mit der Arraytechnologie ist es möglich, viele tausend Transkripte in einem
Experiment zu untersuchen. Die gleichzeitige Analyse dieser Transkripte eröffnet ein
Potenzial, neue Zusammenhänge zwischen Genen aufzudecken. Isolierte mRNA
wird mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase zu cDNA umgeschrieben, daraus
wiederum cRNA synthetisiert. Bei diesem letzten Schritt werden markierte Nukleotide
verwendet. Die synthetisierte, einzelsträngige cRNA kann nun an speziellen Sonden
auf einer Trägersubstanz hybridisieren. Findet eine sequenzspezifische
Hybridisierung statt, so kann sie durch die Markierung der cRNA detektiert werden.
Somit ist es möglich, eine Aussage darüber zu treffen, welche Gene in dem Gewebe
exprimiert werden. In dieser Arbeit wurden die Human Genom U133 Plus 2 Arrays
von Affymetrix verwendet. Alle Arbeitsschritte wurden nach den MIAME-Kriterien
(Minimum information about a microarray experiment) durchgeführt (Brazma und Vilo,
2001; Stoeckert et al., 2002).
4.6.1 Datenanalyse
In dieser Arbeit wurden die Programme MAS 5.0 (Affymetrix Software), RMAexpress
0.5 (B.M. Bolstad), Cluster 3.0, TreeView (Michael Eisen), sowie die Internetseite
http://david.abcc.ncifcrf.gov des National Institute of Allergy and Infectious Diseases
(NIAID), NIH in Maryland, USA, für die Auswertung des Microarray genutzt.
4.6.2 Durchführung
Für die Microarrayanalysen wurde die RNA der Patientinnen innerhalb der Gruppen
(Kontrolle und Präeklampsie) und innerhalb der Gewebegruppen (Fettgewebe,
Plazenta, Decidua) gepoolt. So ist jedes Microarrayergebnis das Resultat aus n=10
Patientinnen. Nach dem Poolen der RNA wurden je 5 µg RNA zu cDNA
umgeschrieben und einem früheren Protokoll gefolgt (Wellner et al., 2005).
Die Qualität wie Quantität wurden mit dem NanoDrop Spectralphotometer kontrolliert.
Nach dem Umschreiben zu cDNA wurde eine Test-PCR durchgeführt.
4.7 Realtime-RT-PCR
Die Realtime-RT-PCR wurde mit dem Gene Amp 5700 Sequence Detector von ABI
durchgeführt. Es wurde der qPCR Mastermix Plus von Eurogentec und ein Primer-
Sonden-System verwendet. Die Sonden waren FAM und TAMRA markiert. Neben
Methoden 23
der genspezifischen Primer/Sonden-Paarung wurde ein zweiter Ansatz erstellt, der
eine Primer/Sonden-Paarung enthielt, welche spezifisch an ein sogenanntes
„housekeeping-Gen“ hybridisiert. Somit konnte die Expression des Zielgens auf die
Expression des houskeeping-Gens normalisiert werden.
Das Primer/Sonden-Design wurde mit Hilfe des Primer Express 2.0-
Computerprogramms ausgewählt.
Ein charakteristisches Pipettierschema ist in Abb.4 dargestellt.
Um die Ergebnisse entsprechend darstellen zu können, mussten die Daten aus dem
Realtime-Report in die relative Expression umgerechnet werden. Hierzu wurde die
gemittelte Menge (Mean Qty) der Probe durch die Mean Qty des houskeeping-Gens
dividiert.
Methoden 24
Abb.4: Realtime RT-PCR Pipettierschema. Hier ist ein Beispiel eines Pipettierschemas dargestellt,
wie es in dieser Arbeit verwendet wurde.
Methoden 25
4.8 Immunfluoreszenzmikroskopie
Für die Immunfluoreszenz wurden die tiefgefrorenen Gewebe (Plazenta und Decidua)
mit dem Cryostaten (Leica, CM3050S) in 6 µm dünne Scheiben geschnitten. Diese
wurden auf Objektträger aufgezogen und wie folgt behandelt:
Fixierung:
• Aceton (10min, -20°C)
• Lagerung bei -20°C
Färbung:
• Erneute Fixierung mit Aceton (10 min, -20°C)
• Trocknen lassen und Gewebe mit PAP-Pen umranden
• In PBS 10 min quellen lassen
• Blocken mit 10% Eselserum in TBS (45min, RT)
• 1. Antikörper (60 min, RT) (Anti-hu Cytokeratin 7, 1:500 verdünnt; oder Anti-hu
Renin, 1:200 verdünnt; oder Anti-hu AT1-Rezeptor, 1:500
verdünnt)
• Waschen (3 x 10 min TBS)
• 2. Antikörper (60 min, RT) (Anti-rabbit-Cy3, 1:500 verdünnt)
• Waschen (3 x 10 min TBS)
• Einbetten mit Vectashild-Mounting Medium
Mikroskopisch untersucht wurden die markierten Schnitte mit dem Axioplan 2 mit
SensiCam (40 fache Vergrößerung) (Zeiss) sowie der Software AxioVision 3.0.
(Zeiss)
4.9 Plasma Renin Aktivität
Bei der Bestimmung der Plasma Renin Aktivität wird die Menge an gebildeten
Angiotensin I aus Angiotensinogen gemessen. Hierbei wurden 50 µl Plasma mit 47 µl
Tris Puffer (pH 7,4) gemischt und zusammen mit 3 µl PMSF (Proteaseinhibitor) für 2h
bei 37°C inkubiert. Zum Stoppen der Reaktion wurden 5 µl Ro 42 (2x10
-6
M)
hinzupipettiert. Die Durchführung folgt dem früher beschriebenen Protokoll (Poulsen
und Jorgensen, 1974).
Methoden 26
4.10 Aufreinigung der AT1-AA aus Serum (IgG-Aufreinigung)
4.10.1 Caprylsäure
Die Caprylsäuere ist eine gesättigte Fettsäure, mit deren Hilfe sich viele Bestandteile
aus dem Serum herausfällen lassen. Die IgGs bleiben jedoch in Lösung. Somit ist es
eine geeignete Wahl um IgGs besonders schonend aufzureinigen.
• Serumvolumen messen
• 2x Volumen 60 mM Na-Acetat (pH 4,0) unter Schütteln hinzufügen
• pH auf 4,8 einstellen
• Caprylsäure unter Schütteln langsam tröpfchenweise hinzufügen (auf 10 ml
Serum kommen 700 µl Caprylsäure)
• 30 min bei RT schütteln
• Zentrifugation: 15 min, 5000 g (4°C)
• Überstand vorsichtig abnehmen und über Nacht gegen PBS dialysieren
4.10.2 Ammoniumsulfat-Fällung (AS-Fällung)
• Auf 1 ml Serum 660 µl gesättigte Ammoniumsulfatlsg. tropfenweise auf
Vortexmixer zugeben
• Über Nacht bei 4°C stehen lassen
• Am nächsten Tag 1x vortexen
• Zentrifugation (7 min bei 5000 g, 4°C)
• Überstand verwerfen
• Sediment in 500 µl PBS lösen, dann 500 µl gesättigte Ammoniumsulfatlsg. auf
einmal (nicht tropfenweise) zugeben, mischen und dann kurz fällen lassen (ca.
1 min)
• Zentrifugation (7 min bei 5000 g, 4°C)
• Erneut Fällung und Zentrifugation (wie oben)
• Sediment in 660 µl PBS lösen
• Lösung in Dialyseschlauch (MWCO: 6-8.000) überführen
• Dialyse gegen PBS 24 h lang, alle 8 h PBS wechseln (3 Proben in 1 l Volumen
dialysiert)
Methoden 27
4.10.3 Globaffin
Globaffin (Affina Immuntechnik) basiert auf dem Prinzip der IgG-Auffreinigung mit
Hilfe von Protein G. Hierbei wird das Serum über eine Säule gegeben, gewaschen
und das IgG eluiert. Globaffin wird bei bestimmten Immunerkrankungen am
Menschen angewandt. Das Säulenmaterial besitzt eine IgG-Bindungskapazität von
20mg IgG/ml Säulenvolumen. Es wurde nach Herstellerangaben vorgegangen.
4.11 Kardiomyozyten-Kontraktions-Bioassay
Es wurden neonatale Rattenkardiomyozyten aus Rattenherzen isoliert (Wallukat et
al., 1995) und als einzelne Schicht in einer Dichte von 800 Zellen/mm
2
für wenige
Tage kultiviert. Die Basal-Schlagfrequenz und die Schlagfrequenz nach Inkubation
mit IgG´s (gegebenenfalls Inhibitoren) wurden bei 37°C via Mikroskopie ermittelt.
4.12 Zellkultur
1x10
6
CHO- und CHO-AT1-Zellen wurden in einer 150 cm
2
Zellkulturflasche in 25 ml
D-MEM:F-12 (1:1) (1% Penicillin/Streptamycin, 1% Glutamin, 10% FCS) -Medium mit
kultiviert und jeweils Montag, Mittwoch und Freitag nach diesem Protokoll neu
ausgesät. Zum Ablösen der adhärenten Zellen wurden diese mit PBS gewaschen (3x)
und anschließend mit 4 ml Trypsin für ca. 1-2 min inkubiert (37°C) und mit Medium
abgestoppt (Zugabe von ca. 10 ml).
Für Stimulationsversuche wurden 2x10
5
–Zellen in 6 cm-Schälchen (3 ml Medium)
ausgesät und nach 48 h Inkubation (37°C) Medium gewechselt (Medium ohne FCS).
Die Stimulantien wurden nach 6 h hinzugegeben.
4.13
Proteinisolation
Nach entsprechender Inkubation mit den Stimulantien wurde das Medium abgesaugt
und die Zellen mit eiskaltem PBS gewaschen. Danach wurden 100 µl Bäuerle-Puffer
(1% Phosphatase-Inhibitor-Cocktail, 1:25 Complete Protease-Inhibitor-Cocktail) auf
dem Schälchen verteilt und auf Eis gestellt. Das Zellen-Lysispuffer-Gemisch wurde
mit einem Schaber von dem Schälchen geschabt und in ein 0,5 ml Eppendorfgefäß
überführt. Nach ca. 15 min Inkubation auf Eis wurde bei 20.000 g und 4°C
zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt.
Methoden 28
4.14 Proteinbestimmung nach Bradford
Die Proteinkonzentration in den Proben wurde durch die Bradfordmethode in einer
96-Well-Platte mit dem SpectraFluor Plus und der dazugehörigen Software (Magellan)
gemessen (Bradford, 1976). Hierzu wurden die Proben entsprechend verdünnt, um in
den Bereich der Standardkurve zu gelangen (0-40 µg BSA) und in einer
Dreifachbestimmung gemessen.
4.15 Westernblotanalyse
4.15.1 SDS-Page
Um Proteine in einem Gemisch zu identifizieren und deren Massengewicht zu
bestimmen, wurde die Gel-Elektrophorese angewandt. Es wurden Polyacrylamidgele
mit einer Konzentration von 10% eingesetzt.
Die Herstellung der Polyacrylamidgele wurde mit Hilfe des Mini-PROTEAN 3
Electrophoresis System von Bio-Rad Laboratories durchgeführt.
10%
H
2
O 4,0
30% Acrylamidmix 3,3
1,5 M Tris (pH 8,8) 2,5
10% SDS 0,1
10% APS 0,1
TEMED 0,004
Gesamtvolumen (ml) 10
Tab.3: Pipettierschema Polyacrylamid-Trenngel. In dieser Tabelle ist das Pipettierschema für ein
10% iges Polyacrylamid-Trenngel aufgeführt. 10 ml entsprechen der Menge für ein Trenngel.
Methoden 29
H
2
O 1,4
30% Acrylamidmix 0,33
1 M Tris (pH 6,8) 0,25
10% SDS 0,2
10% APS 0,2
TEMED 0,002
Gesamtvolumen (ml) 2
Tab.4: Pipettierschema Polyacrylamid-Sammelgel. In dieser Tabelle ist das Pipettierschema
Polyacrylamid-Sammelgel aufgeführt. 2 ml entsprechen der Menge für ein Trenngel.
4.15.2 Blotten
Beim Blotten wurden die Proteine aus dem Gel mittels elektrischen Feldes auf eine
Membran (Nylon- oder Nitrozellulosemembranen) übertragen, welche später mit
entsprechenden Antikörpern inkubiert werden konnten. Es wurde die Blottaparatur
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell von Biorad verwand und pro Membran mit 110
mA 1 h inkubiert.
4.15.3 Blocken
Um unspezifisches Anlagern des Antikörpers an die Membran zu verhindern, wurde
die Membran in TBS-T + Magermilch (5%) inkubiert (2 h, auch über Nacht möglich).
Das in der Magermilch enthaltene BSA blockiert die freie Membranfläche für den
Antikörper.
4.15.4 Antikörper
Der gegen das pERK gerichtete Antikörper (Anti-pERK) wurde in TBS-T +
Magermilch (5%) verdünnt (1:1000) und für 2 h zur Inkubation auf die Membran
gegeben. Ebenso wurde mit dem Anti-ERK–Antikörper verfahren. Nach der
Inkubation wurde 5 x mit TBS-T gewaschen. Danach Inkubation mit 2. Antikörper
(1 h). Beide polyklonale Antikörper haben den Ursprung Kaninchen, weshalb als
zweite Antikörper Anti-rabbit-HRP (1:6000) genutzt wurden. Danach 5x mit TBS-T
waschen.
Methoden 30
4.15.5 Detektierung des Antikörpers
Da die Antikörper einen Horseradish Peroxidase (HRP) –Label trugen, wurde das
ECL Western Blotting Detection Reagents and Analysis System von Amersham
Bioscience verwendet und nach dem Protokoll verfahren. Der Hyperfilm wurde nach
einer Belichtungszeit von etwa 1 min im Entwickler (Optimax) entwickelt.
4.16 Quantifizierung Western Blot
Um mehrere Western Blot Ergebnisse zusammenfassen zu können, wurden die
entwickelten Filme eingescannt und mit dem ImageJ 1.32j vom National Institut of
Health, USA, densitometrisch erfasst.
4.17 Statistik
Die statistische Auswertung wurde mit der Software SPSS 14.0 durchgeführt. Es
wurde mit dem Kolmogorov-Smirnov Test die Normalverteilung überprüft. Normal
verteilte Daten wurden mit dem t-Test analysiert, nicht-normal verteilte Daten mit
dem Mann-Whitney Test. P<0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Ergebnisse 31
5 Ergebnisse
5.1 Patientencharakteristik
Die klinische Patientencharakteristik ist in Tab.5 gezeigt. Die Kontrollgruppe und die
Präeklampsiegruppe unterscheiden sich im Blutdruck, Proteinurie (nicht gezeigt) und
dem Geburtsgewicht der Feten. Im Schnitt wurde in der Präeklampsiegruppe die
Schwangerschaft 6 Wochen vor der normalen Entbindungswoche beendet. Aufgrund
der vorzeitigen Entbindung war auch das Geburtsgewicht signifikant niedriger als das
der Feten aus der Kontrollgruppe. Auch wenn die Neugeborenen Gewichts-Perzentil
in der Präeklampsiegruppe geringer war, so wurde lediglich bei einem Neugeborenen
ein Gewicht unter der 10. Gewichts-Perzentil und damit zu niedrigen Geburtsgewicht
protokolliert.
Charakteristik Kontrolle (n=10) Präeklampsie (n=10) p-Wert
Patientenalter bei Entbindung (Jahre) 28 (21-37) 29 (19-38) 0,8
BMI vor Schwangerschaft (kg/m
2
) 21,3 (17,4-25,0) 23,6 (19,8-30,4) 0,1
BMI während Schwangerschaft (kg/m
2
) 28,2 (20,3-32,4) 30,9 (24,2-35,7) 0,2
Parität 0 (0-0) 0 (0-0) 1
Schwangerschaftswoche bei Geburt 39,0 (34,4-39,6) 33,1 (26,4-36,0) <0,001
Geburtsgewicht Fetus (g) 3433 (2575-3695) 1735 (879-2764) <0,001
Neugeborenen Gewichts-Perzentil 51 (10-64) 37 (2-54) <0,04
Systolischer BD bei Geburt (mmHg) 120 (90-130) 158 (147-171) <0,001
Diastolischer BD bei Geburt (mmHg) 78 (70-85) 105 (95-110) <0,001
Tab.5: Patientencharakteristik. Für die Präeklampsie bedeutsame Charakteristika der Patienten.
BMI = body-mass index; BD = Blutdruck
Die statistische Auswertung der Genexpressionsunterschiede zwischen den beiden
Gruppen (Tab.6) zeigt eindeutig ein unterschiedliches Muster zwischen den
Ergebnisse 32
Geweben. So sind die meisten Gene während des präeklamptischen Verlaufs in der
Decidua dysreguliert und auch das fast ausnahmslos in positiver Weise.
Dysregulierte Gene in der Plazenta oder im Fettgewebe haben im Vergleich zur
Decidua ein ca. 88% geringeres Vorkommen. Die Anzahl der Gene, welche in zwei
verschiedenen Geweben dysreguliert sind, ist sehr gering und lediglich zwei Gene
sind gleichzeitig in allen Geweben dysreguliert: Pentraxin-related gene, PTX3;
(Accessionnr.: NM_002852) ist in allen Geweben hochreguliert während der
Präeklampsie und splicing factor, arginine/serine-rich 6, SFRS6 (Accessionnr.:
NM_006275) ist in Decidua und Plazenta hoch und im Fettgewebe runter reguliert.
5.2 Microarray
Tab.6: Statistische Auswertung der Genexpressionsdaten aus den Microarrayanalysen. Es ist
die Anzahl der durch die Präeklampsie dysregulierten Gene in verschiedenen Gruppierungen
dargestellt. A) gibt die Anzahl der Gene an, welche außschließlich in einem Gewebe dysreguliert sind,
B) in zwei oder in allen Geweben dysreguliert sind und C) differenziell zwischen Plazenta und Decidua
der Kontrollpatienten expremiert sind (nicht Präeklampsieabhängig). Jedes der drei Gewebe (Plazenta,
Decidua, Fettgewebe) gilt als dysreguliert, wenn sich die Präeklampsiegruppe von der Kontrollgruppe
unterscheidet und den Vorselektionierungskriterien (>2-fache Regulierung; Expressionslevel >100)
entspricht. Jede der sechs Gruppen repräsentiert einen Pool von n=10 Patienten.
A Dysregulation
(Kontrolle vs. Präeklampsie hochregulierte
Gene runterreguliert
Gene
Nur Decidua 347
11
Nur Plazenta 42
32
Nur Fettgewebe 59
42
B Dysregulation
(Kontrolle vs. Präeklampsie Gene Gesamt
Nur Decidua und Plazenta 7
Nur Decidua und Fettgewebe 30
Nur Plazenta und Fettgewebe 4
Decidua, Plazenta, Fettgewebe 2
C
Differenzielle Genexpression Plazenta höher
expremiert Decidua höher
expremiert
Plazenta vs. Decidua 3200
3439
Ergebnisse 33
Abb.5: Analyse der mRNA Expression (Microarray)
durch A) hierarchische Gruppierung und B)
Anreicherungsanalysen. A) Die Ergebnisse aus dem
Microarray wurden nach einer Vorselektionierung (>2-fache
Regulierung; Expressionslevel >100) hierarchisch gruppiert
(Cluster 3.0; Treeview). Jedes der drei Gewebe (Plazenta,
Decidua, Fettgewebe) ist als Kontrolle (K) und
Präeklampsie (PEK) vertreten. Jede der sechs Gruppen
repräsentiert einen Pool von n=10 Patienten. Die Farbskala
reicht von gesättigtem Grün (log Quotient ≤-3) bis
gesättigtem rot (log Quotient ≥3). B) Unter Verwendung
einer Vielzahl von Datenbanken, sind fünf Felder in der
hierarchischen Gruppierung hervorgetreten, welche hier
coloriert hervorgehoben sind. In den Diagrammen ist die
Prozentzahl der Gene dargestellt, die in der jeweiligen
Kategorie angereichert sind (bezogen auf die
Gesamtmenge der in dem Feld enthaltenen Gene).
Ergebnisse 34
Um die Vielzahl der dysregulierten Gene in den drei Geweben besser
charakterisieren zu können, wurde eine hierarchische Gruppierungsanalyse der
Genexpressionsdaten, die aus dem Microarray hervorgingen, durchgeführt (Abb.5A).
Hier traten 5 Gruppierungen hervor, die in der anschließenden Anreicherungsanalyse
Informationen zur weiteren Selektionierung der Daten ergaben (Abb.5B). Besonderes
Interesse wurde an der Gruppe 3 gezeigt, welche eine Anreicherung von 42% in dem
Bereich der Membranproteine aufzeigte. Diese während der Präeklampsie
dysregulierten Gene sind mit ihrem Grad der Regulation in der Decidua in Abb.2
gezeigt. Hier findet sich der Complement-Faktor C7 mit einer 5,4-fachen
Hochregulierung wieder. C7 ist Teil des Membranangriffskomplexes, welcher nach
Aktivierung der Complement-Kaskade im Rahmen der Deaktivierung von
Krankheitserregern wirkt, im Verlauf einiger Krankheiten aber auch
Gewebeschädigung vermitteln kann.
Accessionnummer Genname; Genabkürzung Dysregulation in Decidua
(x-fach Änderung)
NM_000587 complement component 7; C7 5,4
NM_000300 phospholipase A2, group IIA (platelets, synovial fluid);
PLA2G2A 3,6
NM_000685 angiotensin II receptor, type 1; AGTR1 4,5
NM_012302 latrophilin 2; LPHN2 2,2
NM_018286 transmembrane protein 100; TMEM100 2,2
NM_004961 gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, epsilon;
GABRE 2,2
NM_005233 EPH receptor A3; EPHA3 2,5
NM_005161 angiotensin II receptor-like 1; AGTRL1 3,7
Abb.6: Membrangene aus der Anreicherungsanalyse (s.Abb.1B). Aus der Anreicherungsanalyse
sind die Gene einzeln aufgeführt, welche zu 42% in der Kategorie „Membrane“ angereichert sind. Alle
Gene sind lediglich in der Decidua dysreguliert. Besonders hervorgehoben ist das Gen für den
Angiotensin II-Rezeptor Typ 1.
Ergebnisse 35
Ebenso findet sich hier die Phospholipase A2-Gruppe IIA (PLA2G2) mit einer 3,6-
fachen Hochregulierung. Die PLA2G2A ist dafür verantwortlich, dass Arachidonsäure
aus der Membran freigesetzt wird und somit dem Cytochrom P450 (CYP) als
Substrat zur Verfügung steht. Die entstehenden Metabolite sind abhängig von der
Cytochrom P450-Subfamilie und haben ein breites Wirkungsspektrum. So wurde das
Cytochrom P450 CYP2J2 aus der Epoxygenasefamilie in der präeklamptischen
Decidua als hochreguliert detektiert (Daten nicht gezeigt). Besonders hervorgehoben
ist in der Abb.2 der AT1-R. Hier wurde eine Hochregulation von 4,5 detektiert.
5.3 Lokales Renin-Angiotensin System
Um das Expressionsprofil des AT1-R und der anderen RAS-Komponenten, sowie die
Cofaktoren des AT1-R auf mRNA-Ebene zu verifizieren, wurden Realtime RT-PCR´s
für die einzelnen Gewebe durchgeführt. Die Tab.7 zeigt, dass in der Plazenta keine
Komponente signifikant dysreguliert war. In der Decidua konnte die Hochregulation
des AT1-R in der Präeklampsiegruppe mit dem Faktor 5,0 verifiziert werden (siehe
Tab.8 und Abb.7). Ebenfalls im Fettgewebe wurde eine signifikante Hochregulation
des AT1-R detektiert (siehe Tab.9 und Abb.10). Da es aufgrund des
Krankheitsverlaufs zu einer frühzeitigen Entbindung des Kindes kommt und damit die
SSW bei Entbindung im Durchschnitt 6 Wochen vor der bei der Kontrollgruppe lag,
wurde durch eine Korrelation geprüft, ob die Regulierung des AT1-R mit der SSW
gekoppelt ist. Wie Abb.8-9 zeigt besteht in der Decidua keine Korrelation zwischen
der SSW bei der Entbindung und der Expression des AT1-R. Ein gleichgesinntes
Ergebnis zeigt Abb.11-12 für das Fettgewebe. Keine Expression konnte für die
Aldosteronsynthase (Cyp 11b2) in den untersuchten Geweben detektiert werden.
Ergebnisse 36
Plazenta
Kontrolle
(n=10)
[A.U. ± SEM]
Präeklampsie
(n=10)
[A.U. ± SEM] p-Wert
Angiotensinogen 25,0 ± 4,8 26,7 ± 6,1 0,824
Angiotensin-converting enzyme 78,6 ± 18,8 119,1 ± 23,2 0,192
Renin 3,8 ± 0,7 10,5 ± 5,2 0,28
Renin-Rezeptor 77,7 ± 10,8 91,9 ± 12,9 0,41
Angiotensin II-Rezeptor 1 195,9 ± 34,3 218,9 ± 34,2 0,642
Angiotensin II-Rezeptor 2 8,4 ± 5,2 0,1 ± 0,1 0,133
Epidermal-growth-factor Rezptor 162,2 ± 27,0 182,7 ± 26,9 0,598
Bradykininrezeptor-B2 29,1 ± 6,4 20,8 ± 3,7 0,275
Mineralocorticoidrezeptor 183,1 ± 28,1 169,3 ± 24,8 0,725
Cyp-11b2 n.d. n.d. -
Tab.7: mRNA Expression der RAS-Komponenten und deren Cofaktoren in der Plazenta.
(Resultate der Realtime RT-PCR)
Decidua
Kontrolle
(n=8)
[A.U. ± SEM]
Präeklampsie
(n=10)
[A.U. ± SEM] p-Wert
Angiotensinogen 275,9 ± 73,5 197,4 ± 49,3 0,372
Angiotensin-converting enzyme 246,6 ± 31,3 309,2 ± 37,2 0,231
Renin 264,9 ± 75,7 236,9 ± 44,6 0,742
Renin-Rezeptor 99,7 ± 11,5 124,1 ± 18,0 0,297
Angiotensin II-Rezeptor 1 4,6 ± 0,7 23,4 ± 8,6 0,016
Angiotensin II-Rezeptor 2 760,0 ± 747,0 35,0 ± 21,9 0,291
Epidermal-growth-factor Rezptor 25,5 ± 3,7 37,9 ± 4,2 0,047
Bradykininrezeptor-B2 141,0 ± 15,5 152,0 ± 23,2 0,713
Mineralocorticoidrezeptor 31,1 ± 2,4 41,9 ± 3,5 0,027
Cyp-11b2 n.d. n.d. -
Tab.8: mRNA Expression der RAS-Komponenten und deren Cofaktoren in der Decidua.
(Resultate der Realtime RT-PCR)
Ergebnisse 37
Fettgewebe
Kontrolle
(n=10)
[A.U. ± SEM]
Präeklampsie
(n=10)
[A.U. ± SEM] p-Wert
Angiotensinogen 84,7 ± 9,6 75,5 ± 8,9 0,491
Angiotensin-converting enzyme 180,1 ± 23,9 194,4 ± 19,5 0,648
Renin 651,5 ± 330,0 403,2 ± 184,3 0,519
Renin-Rezeptor 45,0 ± 3,6 54,0 ± 4,0 0,096
Angiotensin II-Rezeptor 1 44,9 ± 3,6 73,2 ± 9,6 0,013
Angiotensin II-Rezeptor 2 1013,4 ± 310 1021,8 ± 287,4 0,984
Epidermal-growth-factor Rezptor 34,4 ± 3,5 51,7 ± 8,2 0,067
Bradykininrezeptor-B2 91,8 ± 20,4 105,7 ± 20,5 0,637
Mineralocorticoidrezeptor 34,0 ± 2,4 43,0 ± 4,7 0,105
Cyp-11b2 n.d. n.d. -
Tab.9: mRNA Expression der RAS-Komponenten und deren Cofaktoren in Fettgewebe.
(Resultate der Realtime RT-PCR)
Muskelgewebe
Kontrolle
(n=9)
[A.U. ± SEM]
Präeklampsie
(n=9)
[A.U. ± SEM] p-Wert
Angiotensinogen 1197,25 ± 8,56 1344,46 ± 12,12 0,287
Angiotensin-converting enzyme 486,88 ± 2,38 297,75 ± 6,07 0,005
Renin n.d. n.d. -
Renin-Rezeptor 798,4 ± 8,86 646,91 ± 2,49 0,086
Angiotensin II-Rezeptor 1 721,4 ± 7,05 676,13 ± 4,21 0,549
Angiotensin II-Rezeptor 2 695,43 ± 34,65 329,77 ± 11,19 0,281
Epidermal-growth-factor Rezptor 562,45 ± 2,4 491,86 ± 3,17 0,066
Bradykininrezeptor-B2 960,08 ± 24,74 642,25 ± 9,97 0,204
Mineralocorticoidrezeptor 582,09 ± 7,23 419,94 ± 6,62 0,085
Cyp-11b2 n.d. n.d. -
Tab.10: mRNA Expression der RAS-Komponenten und deren Cofaktoren in Muskelgewebe.
(Resultate der Realtime RT-PCR)
Ergebnisse 38
Kontrolle Präeklampsie
0
10
20
30
40
*
AT1-R mRNA [A.U.]
34 35 36 37 38 39 40
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
r = -0,050
p = 0,906
SSW
AT1-R mRNA [A.U.]
Abb.7: Dysregulation des Angiotensin II Rezeptor Typ 1 (AT1-R) in präeklamptischer Decidua.
Der AT1-R ist auf mRNA-Ebene in der Präeklampsiegruppe signifikant um den Faktor 5 hochreguliert.
(* p=0,016)
Abb.8: Korrelation zwischen Schwangerschaftswoche (SSW) und Angiotensin II Rezeptor Typ 1
(AT1-R)-Expression in Decidua der Kontrollgruppe. Es ist keine signifikante Korrelation erkennbar.
Ergebnisse 39
Kontrolle Präeklampsie
0
25
50
75
100
*
AT1-R mRNA [A.U.]
25 30 35 40
0
20
40
60
80
SSW
AT1-R mRNA [A.U.]
r = 0,450
p = 0,192
Abb.9: Korrelation zwischen Schwangerschaftswoche (SSW) und Angiotensin II Rezeptor Typ 1
(AT1-R)-Expression in präeklamptischer Decidua. Es ist keine signifikante Korrelation erkennbar.
Abb.10: Dysregulation des Angiotensin II Rezeptor Typ 1 (AT1-R) in präeklamptischen
Fettgewebe. Der AT1-R ist auf mRNA-Ebene in der Präeklampsiegruppe signifikant um den Faktor
1,6 hochreguliert. (* p=0,013)
Ergebnisse 40
34 35 36 37 38 39 40
25
40
55
70
85
r = 0,092
p = 0,800
SSW
AT1-R mRNA [A.U.]
25 30 35 40
0
50
100
150
r = 0,006
p = 0,987
SSW
AT1-R mRNA [A.U.]
Abb.11: Korrelation zwischen Schwangerschaftswoche (SSW) und Angiotensin II Rezeptor Typ
1 (AT1-R)-Expression in Fettgewebe der Kontrollgruppe. Es ist keine signifikante Korrelation
erkennbar.
Abb.12: Korrelation zwischen Schwangerschaftswoche (SSW) und Angiotensin II Rezeptor Typ
1 (AT1-R)-Expression in präeklamptischem Fettgewebe. Es ist keine signifikante Korrelation
erkennbar.
In Tab.7 fällt auf, dass der AT2-R um den Faktor 84,0 in der präeklamptischen
Plazenta runterreguliert wurde. Dieses Ergebnis ist nicht signifikant, da das
Expressionslevel für alle Proben (Kontrolle und Präeklampsie) so gering war, dass es
Ergebnisse 41
zu sehr hohen Schwankungen in den Einzelbestimmungen kam. Um den AT2-R
näher zu charakterisieren, wurde hier von jeder Probe 7 Realtime RT-PCR-Ansätze
durchgeführt. Wenn wenigstens ein Ansatz eine typische PCR-Kurve ergab, so
konnte davon ausgegangen werden, dass in der Probe wenigstens eine Kopie des
AT2-R-Genes vorlag. In der Kontrollgruppe waren 80% der Replikate positiv,
wohingegen nur 20% der Replikate in der Präeklampsiegruppe positiv waren (siehe
Abb.13).
Betrachtet man die Expressionsprofile zwischen Plazenta und Decidua, so fällt auf,
dass es zu großen Unterschieden zwischen den beiden Geweben kommt. So ist die
Reninexpression in der Decidua signifikant um den Faktor 35 höher als in der
Plazenta. Auch die RAS-Komponenten ACE und AGT, sowie der Cofaktor des AT1-R,
der BDKRB2 sind signifikant höher in der Decidua expremiert (siehe Abb.14 und 16).
Der AT1-R selber sowie seine Cofaktoren EGF-R und M-R sind signifikant höher in
der Plazenta expremiert (siehe Abb.15 und 16).
Ergebnisse 42
Abb.13: Dysregulation des Angiotensin II Rezeptor Typ 2 (AT2-R) in Plazenta. In den
Plazentaproben der Präeklampsiegruppe waren lediglich 20% der Replikate (7 PCR-Ansätze pro
Patientin) durch eine PCR-Kurve positiv detektierbar, im Gegensatz zu 80% in der Kontrollgruppe. Es
sind repräsentative Realtime RT-PCR Realtime-Kurven der positive Detektierung (Kontrollgruppe) und
der negativen Detektierung (Präeklamspiegruppe) gezeigt.
Ergebnisse 43
Präeklampsie Plazenta
Kontrolle Plazenta
**
*
Plazenta Decidua
AGT
ACE
Renin
1
10
100
1000
AGT mRNA [A.U.]
1
10
100
1000
ACE mRNA [A.U.]
1
10
100
1000
Renin m
RN
A
[
A
.
U
.
]
Plazenta Decidua
Plazenta Decidua
Kontrolle Decidua Präeklampsie Decidua
AT
1-R
1
10
100
1000
AT1-R mRNA [A.U.]
*
*
Plazenta Decidua
Präeklampsie Plazenta
Kontrolle Plazenta
Kontrolle Decidua Präeklampsie Decidua
.
Abb.14: Differenzielle Genexpression der Renin-Angiotensin System (RAS) Komponenten
(Renin, ACE, AGT) in der Plazenta vs. Decidua. Die RAS Enzyme Renin und ACE, sowie das
Protein AGT sind in der Decidua signifikant höher expremiert (Renin: Faktor 35; ACE: Faktor 2,8; AGT:
Faktor 9) als in der Plazenta (* p<0,001).
Abb.15: Differenzielle Genexpression des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 (AT1-R) in der
Plazenta vs. Decidua. Der AT1-R ist in der Plazenta (Kontrolle) signifikant höher expremiert (Faktor
42) als in der Decidua. Die Dysregulation des AT1-R in der präeklamptischen Decidua ist erkennbar
(Faktor 5) (* p<0,01).
Ergebnisse 44
E
G
F
-
R
1
10
100
1000
E
G
F
-
R
m
RNA
[
A
.
U
.
]
Plazenta Decidua
*
BDK
R
B
2
1
10
100
1000
BDKRB2 mRNA [A.U.]
Plazenta Decidua
*
M
-
R
1
10
100
1000
M-R mRNA [A.U.]
Plazenta Decidua
*
Präeklampsie Plazenta
Kontrolle Plazenta
Kontrolle Decidua Präeklampsie Decidua
Abb.16: Differenzielle Genexpression der Coaktivatoren des Angiotensin II Rezeptor Typ 1
(Epidermal-Growths-Factor-Rezeptor (EGF-R), Bradikinin-Rezeptor B2 (BDKRB2),
Mineralocorticoid-Rezeptor (M-R)) in der Plazenta vs. Decidua. Der EGF-R und der M-R sind in
der Plazenta signifikant höher expremiert (EGF-R: Faktor 5,3; M-R: Faktor 4,7). Der BDKRB2 ist in der
Decidua signifikant höher expremiert (Faktor 5,9) (* p<0,001).
Die Expression des AT1-R wurde ebenfalls auf Proteinebene durch
Immunfluoreszenz-Mikroskopie verifiziert. Hierzu sieht man in Abb.17 deutlich, dass
es in der präeklamptischen Decidua zu einer stärkeren AT1-R-Expression kommt als
in der Kontroll-Decidua. Diese markierten Rezeptoren sind, wie aus Abb.18
ersichtlich wird, hauptsächlich am Trophoblasten lokalisiert. Auch die höhere Renin-
Expression in der Decidua im Vergleich zu der dazugehörigen Plazenta ist eindeutig
verifiziert worden. Dieses Ergebnis ist nicht durch den Krankheitsstatus
(Präeklampsie) beeinflusst (siehe Abb.19). Neben den lokalen Phänomenen der
Präeklampsie kommt es zu Veränderungen im zirkulierenden RAS. Die Plasma-
Renin Aktivität war im Serum präeklamptischer Frauen signifikant um den Faktor 3
reduziert (siehe Abb.20). Ebenso wurde der AT1-AA in ihrem Serum detektiert (siehe
Abb.21). Im Kardiomyozyten-Kontraktions- Bioassay kam es nur nach Inkubation mit
den aus präeklamptischen Frauen isolierten IgGs zu einer Erhöhung der
Schlagfrequenz, welche sich AT1-R-spezifisch durch Losartan blocken ließ. 83% der
präeklamptischen Patientinnen waren AT1-AA-Positiv im Gegensatz zu 0% der
Kontroll-Schwangeren. Derselbe Effekt wurde nach Inkubation mit isolierten IgGs aus
Ergebnisse 45
Serum, welches aus der Umbilikalvene stammte, detektiert (siehe Abb.22). Der AT1-
AA vermittelt seine Aktivität über den MAPK-Weg. Hierbei kam es nach Inkubation zu
einer verstärkten Phosphorylierung des ERK1/2. Dieser Effekt war nicht abhängig
von der Isolationsmethode, wohl aber von dem Vorhandensein des AT1-R auf der
Abb.17: Dysregulation des Angiotensin II Rezeptor Typ 1 (AT1-R) in Decidua
(Immunfluoreszenz-Mikroskopie). Die spezifische Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass der AT1-R
auf Protein-Ebene in der Präeklampsiegruppe deutlich hochreguliert ist. Da das Deciduagewebe ein
sehr inhomogenes Gewebe ist, sind hier zwei repräsentative Beispiele gewählt.
Ergebnisse 46
Zelloberfläche. Nach Inkubation mit 100nM AngII kam es ebenfalls zur
Phosphorylierung (siehe Abb.23). Insgesamt war die Signaltransduktion des AT1-AA
signifikant und spezifisch, da sie nur Zellen, die den AT1-R präsentierten, aktiviert
haben und war nur gering schwächer als die Aktivierung durch das AngII (siehe
Abb.24).
Abb.18: Immunfluoreszenzfärbung von Deciduagewebe zur Charakterisierung von
Trophoblasten. Es sind Trophoblasten im Deciduagewebe spezifisch durch Cytokeratin 7 angefärbt.
Es ist derselbe Zelltyp erkennbar wie unter Abb.13. Da das Deciduagewebe ein sehr inhomogenes
Gewebe ist, sind hier zwei repräsentative Beispiele gewählt.
Ergebnisse 47
Abb.19: Differenzielle Genexpression des Renin in der Plazenta vs. Decidua
(Immunfluoreszenz-Mikroskopie). Die spezifische Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass das
Enzyme Renin in der Decidua deutlich höher expremiert ist als in der dazugehörigen Plazenta.
Aufgrund der Inhomogenität beider Gewebe sind drei verschiedene Plazenten im Vergleich zu ihren
entsprechenden Deciduen dargestellt. Zur Verdeutlichung, dass keine Dysregulation durch die
Präeklampsie stattfindet, ist neben zwei Kontrollen auch das Gewebe einer Präeklampsie aufgeführt.
Ergebnisse 48
Kontrolle
Präeklampsie
Präeklampsie
+Losartan
0
5
10
15
20
/
m
i
nu
t
e
*
*
5.4 Zirkulierendes Renin-Angiotensin System
Abb.20: Dysregulation der Plasma-Renin Aktivität (PRA) in der Präeklampsie. Die PRA ist in der
Präeklampsiegruppe signifikant um den Faktor 3 geringer (* p=0,015)
Abb.21: Der Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 (AT1-R)-Autoantikörpers (AT1-AA) in
präeklamptischen maternalem Serum. Im Kardiomyozyten-Kontraktions-Bioassay ist ein
signifikanter Anstieg der Schlagfrequenz nach Inkubation mit maternalem Serum aus der
Präeklampsiegruppe erkennbar. Dieser Effekt ist spezifisch blockbar durch Vorinkubation mit dem
AT1-R Blocker Losartan (* p<0,001).
Plasma-Renin Aktivität
Kontrolle Präeklampsie
0
500
1000
1500
2000
*
pg/ml/1h
Ergebnisse 49
0
5
10
15
20
ea
t
s
/
m
i
nu
t
e
*
*
Kontrolle
Präeklampsie
Präeklampsie
+Losartan
Abb.22: Der Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 (AT1-R) -Autoantikörpers (AT1-AA) in
präeklamptischen Serum der Umbilikalvene (UV). Im Kardiomyozyten-Kontraktions-Bioassay ist ein
signifikanter Anstieg der Schlagfrequenz nach Inkubation mit Serum aus der UV (Repräsentiert den
Blutstrom von der Mutter zum Fötus) der Präeklampsiegruppe erkennbar. Dieser Effekt ist spezifisch
blockbar durch Vorinkubation mit dem AT1-R Blocker Losartan (* p<0,001).
Abb.23: Signaltransduktion des Angiotensin II Rezeptor (AT1-R) Typ 1-Autoantikörpers (AT1-
AA). Es ist eine repräsentative Phosphorylierung der p44/42-MAP Kinase (ERK2/1) in Chinese
Hamster ovary (CHO) Zellen und AT1-R überexpremierenden CHO Zellen (CHO-AT1) im Westernblot
dargestellt. In CHO-AT1 Zellen ist eine deutliche Phosphorylierung nach Stimulation mit Angiotensin II
(Ang II) (100 nM, 15 min) und den AT1-AA (aus verschiedenen Aufreinigungsmethoden) (Verdünnung
1/40, 30 min) erkennbar. In CHO Zellen ist dieser Effekt nicht ersichtlich. Es wurden jeweils die
gleichen Proteinmengen aufgetragen. Als Normalisierung ist die unphosphorylierte Variante von
ERK1/2 dargestellt.
Ergebnisse 50
Kontrolle
AT1-AA
Ang II
Kontrolle
AT1-AA
Ang II
0
4
8
12
1
CHO-AT1 CHO
***
x-fach
Abb.24: Densitometrische Auswertung der Signaltransduktion des Angiotensin II Rezeptor
(AT1-R) Typ 1-Autoantikörpers (AT1-AA). Die Westernblot Ergebnisse zur Signaltransduktion des
AT1-AA sind hier zusammenfassend dargestellt. In Chinese Hamster ovary (CHO) Zellen, die den
AT1-R überexpremieren (CHO-AT1), ist ein signifikanter Anstieg der Signalintensität nach Inkubation
mit dem AT1-AA (nach AS-Fällung) zu erkennen (Faktor 7). Einen ähnlichen Effekt erzielte
Angiotensin II (Faktor 10). In CHO Zellen ist keine relevante Veränderung erkennbar. (*p=0,004;
**p=0,001)
Diskussion 51
6 Diskussion
Die Microarraydaten zeigten, dass es durch die Präeklampsie zu einer Dysregulation
des Expressionsprofiles in den untersuchten Geweben kam, mit dem häufigsten
Auftreten in der Decidua. Das RAS ist insbesondere an der Pathologie der
Präeklampsie beteiligt. So war der AT1-R in der präeklamptischen Decidua
hochreguliert was sich im Microarray zeigte und via Realtime RT-PCR und
Immunofluoreszenzmikroskopie verifiziert werden konnte. Ebenso kam es zu einer
leichten Dysregulation im Fettgewebe. Der AT2-R wurde in der präeklamptischen
Plazenta runterreguliert. Das zirkulatorische RAS war durch die reduzierte PRA und
das Vorhandensein des AT1-AA im Serum der Mutter und im transplazentaren
Transfer dysreguliert. Der AT1-AA ist eindeutig befähigt, die MAPK/ERK-Kaskade zu
aktivieren. Unabhängig der Dysregulation durch die Präeklampsie kam es zu einer
differenziellen Genexpression von RAS-Komponenten und den AT1-R-Cofaktoren.
So war Renin wesentlich höher in der Decidua expremiert als in der Plazenta,
ebenso ACE, AGT und der BDKRB2. Konträr dazu verhielt sich der EGF-R, M-R und
der AT1-R. Eine Expression der Aldosterone-Synthase konnte in keinem der
untersuchten Gewebe nachgewiesen werden.
Präeklampsie ist eine Krankheit, die bei schwangeren Frauen seit Beginn der
menschlichen Aufzeichnungen bekannt ist und mit einem relativ hohen Prozentsatz
von 3-5% in den Industrieländern vertreten ist. Dennoch ist trotz intensiver
Bemühungen bislang keine adäquate Therapie oder Frühdiagnostik gefunden
worden (Mutter und Karumanchi, 2007). Der Grund hierfür dürfte in der besonderen
Komplexität der Pathologie zu finden sein, welche nicht nur auf die utero-plazentare
Einheit beschränkt ist, sondern auch die Mutter sowie den Fetus beinhaltet. Mit den
in dieser Arbeit bereitgestellten Proben wurde diese Komplexität bedient. So wurde
Plazenta und Decidua für die utero-plazentare Einheit, Muskel- sowie Fettgewebe für
mütterliches Gewebe, Serum und Plasma der Mutter für das zirkulatorische System
der Mutter und Serum aus der Umbilikalvene für den transplazentaren Transfer von
Mutter zu Kind für Expressionsstudien und weitere Analysen verwand. Die gute
klinische Charakterisierung der in dieser Studie einbezogenen Frauen muss
ebenfalls als begünstigend angesehen werden. Das Fettgewebe lässt weiteren
Spielraum zur näheren Untersuchung des Risikofaktors Übergewicht. Der gesamte
Aufbau der Studie zielte darauf hinaus, das Zusammenspiel von utero-plazentarer
Diskussion 52
Einheit und dem zirkulatorischen System der Mutter zu untersuchen. Hierbei wurde
der akzeptierten Theorie gefolgt, dass die Präeklampsie eine 2-stage disorder ist
(Roberts, 2000). Diese Theorie wird durch das Microarrayergebnis gestützt, nachdem
in der Decidua ca. 7x mehr Gene dysreguliert sind, als in den anderen untersuchten
Geweben. Hier ist der Ort, wo es zur abnormalen Plazentation und zur gestörten
Spiralaterienumgestalltung kommt (Robertson et al., 1985).
Es wurde in dieser Studie darauf geachtet, dass die Auswahl der Patientinnen ihren
Gruppen entsprechend eindeutige Befunde zeigten, um die späteren Ergebnisse
auch sicher interpretieren zu können. Es gab zwischen den Gruppen keine
signifikanten Unterschiede, außer den präeklampsiebedingten, wie Blutdruck,
Schwangerschaftswoche und Geburtsgewicht. Das Geburtsgewicht war nicht nur
aufgrund der geringeren Schwangerschaftswoche niedriger, sondern auch
krankheitsbedingt, wie die neonatale Gewichtspercentile zeigt. Dies deutet eindeutig
auf die mangelnde Versorgung des Fetus hin, was hervorgerufen wird durch einen
reduzierten plazentaren Blutfluss (Friedman et al., 1991; 2000).
Das RAS ist ein sehr wichtiger Faktor, der bei der Pathologie von
Bluthochdruckerkrankungen eine entscheidende Rolle spielt und auch in
Präeklampsie involviert ist (Luft, 2004). So gibt es viele Publikationen, die sich auf
einen genetischen Aspekt bei RAS-abhängigen Genen beziehen (Chappell und
Morgan, 2006). Einen entscheidenden Hinweis brachte ebenfalls Gant et al mit
seinen, nach heutigen Maßstäben nicht zu verantwortbaren, Infusionsstudien mit
AngII (Gant et al., 1973). Frauen mit schwangerschafts-induzierten Bluthochdruck
reagierten sensitiver auf AngII, was ähnliche Beobachtungen bei präeklamptischen
Frauen bekräftigen (Talledo, 1968). Dies deutet darauf hin, das eine erhöhte Anzahl
von AngII-Rezeptoren bereit steht, was Baker et al anhand vom hochregulierten AT1-
R auf Blutplättchen präeklamptischer Frauen bestätigen konnte (Baker et al., 1992).
Die Hochregulation von dem AT1-R in der Decidua konnte anhand dieser Arbeit
somit in einem weiteren Gewebe gezeigt werden, was ein Schwerpunkt dieser Arbeit
ist und auf mRNA- und Proteinebene gezeigt werden konnte. Ebenfalls kam es zur
Hochregulation des AT1-R im Fettgewebe. Eine weitere interessante Entdeckung
war die differenzielle Genexpression von den RAS-Komponenten. So war Renin ca.
35-fach höher in der Decidua expremiert als in der Plazenta. Ebenfalls AGT und ACE
waren in der Decidua höher expremiert, was unabhängig vom Krankheitsbild
Präeklampsie gezeigt werden konnte. Diese Entdeckung bestätigen die Studien von
Diskussion 53
Shaw et al, die das Deciduagewebe als eine Hauptquelle für die Reninproduktion
beschreiben (Shaw et al., 1989). Der AT1-R war im Gegensatz dazu höher in der
Plazenta expremiert als in der Decidua. Aus diesen Ergebnissen lässt sich eine
erhöhte physiologische AngII-Produktion in der Decidua spekulieren mit einem
geringen AT1-R-Vorkommen. Plazenta und Decidua sind verschieden im Hinblick auf
ihren zellularen Ursprung. Die Plazenta besteht aus Gewebe, welches den Ursprung
Fetus hat, wohingegen die Decidua aus dem uterinen Endometrium (maternale
Zellen, wie Deciduazellen und auch Immunzellen), aber auch aus eingedrungenen
fetalen Trophoblasten aufgebaut ist. Wie dieses komplizierte und auch sehr
inhomogen aufgebaute utero-plazentare Gewebe interagiert in Hinsicht auf AngII-
Produktion kann mit dieser Arbeit nicht geklärt werden. Einen möglichen Hinweis
bietet die Arbeit von Hunton et al, die chemotaxische Interaktion von AngII und dem
AT1-R untersuchte (Hunton et al., 2005). Eine vorstellbare Möglichkeit könnte sein,
dass die Decidua der Ort der AngII-Produktion ist und die Plazenta das Zielorgan
darstellt. Eine hochregulierte AT1-R-Expression in der präeklamptischen Decidua
mag dieses komplexe utero-plazentare RAS initial stören.
Shah et al konnten in früheren Studien zeigen, dass die Reninexpression in
präeklamptischen Frauen in der Decidua 3-fach höher war als in den Deciduen der
Kontrollgruppe (Shah et al., 2000). Dieses Ergebnis konnten in der Arbeit nur bedingt
verifiziert werden. Es wurde zwar auf mRNA-Ebene eine Hochregulation detektiert,
jedoch war diese nicht signifikant. Dies mag an der unterschiedlichen Art der
Gewinnung des Materials liegen. Für diese Arbeit wurde das Decidua-Gewebe durch
eine spezielle Vakuumabsaugung des Plazentabettes aus der Uterina gewonnen.
Dieser Teil der Plazenta verbleibt für gewöhnlich bei der Geburt (auch bei
herkömmlichen Kaiserschnitten) in der Gebärmutter. Bei Shah et al wurde eine
Microdissektion der entbundenen Plazenta durchgeführt. Dies führt auch einen
weiteren Unterschied auf. In dieser Arbeit wurde darauf geachtet, dass nur Proben
aus Kaiserschnitten verwand wurden, die, bevor die Wehen eingesetzt hatten,
gewonnen wurden. Dadurch wurde vermieden, dass das Gewebe (oder auch
Serum/Plasma) dem unkontrollierbaren und damit schwer kalkulierbaren oxidativen
Stress der unterschiedlich langen und starken Wehenzeit unterlag (Rogers et al.,
1998). Dass Renin auch außerhalb der Niere expremiert wird, konnten schon Hodari
et al und Symonds et al zeigen und wurde auch durch die vorliegende Arbeit wie
oben beschrieben verifiziert (Hodari et al., 1967; Symonds et al., 1968). Die
Diskussion 54
Verbindung von Präeklampsie und Renin in der Zirkulation wurde anhand der PRA
belegt. So ist die PRA in normalen Schwangeren gesteigert, was auf ein höheres
Reninsubstrat zurückgeführt wurde (Ganten et al., 1971; Weinberger et al., 1977).
Während der Präeklampsie kommt es allerdings zu einer Erniedrigung der PRA
(Gordon et al., 1969). In dieser Arbeit wurde eine 3-fach höhere PRA im Plasma von
normalschwangeren Frauen im Gegensatz zu präeklamptischen Frauen detektiert.
Diese Ergebnis passt zu den Studien von Langer et al, welche zeigen, dass AngII in
der Zirkulation von präeklamptischen Frauen reduziert ist (Langer et al., 1998). Ein
weiterer dysregulierter Faktor in der Zirkulation von präeklamptischen Frauen ist der
AT1-AA. Dieser Autoantikörper wurde eindeutig im Serum detektiert, hingegen im
Serum von Schwangeren aus der Kontrollgruppe nicht. In dieser Arbeit konnte
erstmals gezeigt werden, dass der AT1-AA auch zum Fetus transportiert wird. Die
Auswirkungen dieses Transfers wurden hier zwar nicht untersucht, aber es ist
denkbar, dass dieser Faktor eine Erklärung für die Tatsache ist, dass Mutter und
Kind im späteren Leben ein erhöhtes Risiko haben, kardiovaskulären Krankheiten zu
erleiden (Roberts und Gammill, 2005). Ein Hinweis in diese Richtung wurde auch
schon von Khan et al diskutiert, welche das RAS für eine mögliche Quelle für
kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen in der Mutter, hervorgerufen durch
„fetal programming“, ansehen (Khan et al., 2003). Dass der AT1-AA Aktivität besitzt
und diese via AT1-R vermittelt, konnte in dieser Arbeit ebenfalls deutlich gezeigt
werden. So ist der Kardiomyozyten-Kontraktions-Bioassay an sich schon ein
Aktivitätsnachweis, da er auf der Kontraktion der neonatalen Rattenkardiomyozyten
beruht und diese durch Losartan spezifisch für den AT1-R blockbar waren. Dieser
Effekt wurde bei den AT1-AA, isoliert aus Serum der Mutter und Serum aus der
Umbilikalvene, detektiert. Dies wird auch durch vorangegangene Ergebnisse
bestätigt, wo gezeigt werden konnte, dass der Autoantikörper befähigt ist, NADPH-
Oxidase und die Expression von tissue factor zu aktivieren (Dechend et al., 2000;
Dechend et al., 2003). Auch wurde beschrieben, dass eine Aktivierung des AT1-R
durch den AT1-AA zu einer erhöhten intrazellulären freien Ca2+ Konzentration führt
(Thway et al., 2004). In dieser Arbeit wurde nun eine weiterere Signaltransduktion
beschrieben, die durch den AT1-AA vermittelt wird. Der MAPK-Weg ist eindeutig
aktiviert, was durch die Phosphorylierung von ERK gezeigt werden konnte. Durch
den MAPK-Weg kommt es zur Aktivierung des AP-1-Promoters. Dass AP-1 durch
AT1-AA aktiviert wird, konnten schon Dechend et al zeigen (Dechend et al., 2000).
Diskussion 55
AT1-AA spielen eine entscheidende Rolle in Herzerkrankungen, indem sie die
Eigenschaften der Mastzellen verändern (Okruhlicova et al., 2007). Außerdem treten
sie in weiteren Erkrankungen auf, die alle das Bild einer Abstoßungsreaktion zeigen.
2001 wurden die AT1-AA in einer HELLP-Patientin detektiert, deren einer Fetus
(Mehrlingsschwangerschaft) in der Gebärmutter verstorben war (Fischer et al., 2001).
Außerdem wurden die Autoantikörper bei Schwangeren mit IUGR detektiert (Walther
et al., 2005). Eine Nicht-Schwangerschaftserkrankung, bei der die Autoantikörper
auftreten, stellt die Transplantatabstoßung nach Nierentransplantation dar (Dragun et
al., 2005). Präeklampsie muss auch als eine solche Krankheit angesehen werden, da
sie die Anzeichen von Entzündungsreaktionen trägt und nach Entbindung des Kindes,
bzw. der Plazenta die Abwehrreaktionen abbrechen. So wurden lediglich in 17,2%
der Frauen mit ehemals Präeklampsie der AT1-AA 18 Monate postpartum noch
detektiert (Hubel et al., 2007). In dieser Arbeit konnten zur Zeit der Entbindung 83%
der präeklamptischen Frauen als AT1-AA-positiv detektiert werden. Ob das Auftreten
des AT1-AA die Präeklampsie fördert oder sogar bedingt oder in Folge der
Präeklampsie auftritt, zum Beispiel als Abwehrreaktion gegen eine pathologische
utero-plazentare Einheit, kann abschließend nicht geklärt werden.
Die in letzter Zeit als mögliche Präeklampsiemarker diskutierten Faktoren konnten
anhand dieser Arbeit größtenteils bestätigt werden (Daten nicht gezeigt). So wurde in
der präeklamptischen Plazenta der lösliche Vaskular Endothelien Wachstumsfaktor
Rezeptor 1 (soluble VEGFR1, oder sFLT1) und Endoglin als hochreguliert detektiert.
Beide Faktoren sind in der Zirkulation von präeklamptischen Frauen erhöht (Maynard
et al., 2003; Venkatesha et al., 2006). Auch das Gen für Leptin ist in der Decidua und
in der Plazenta der Präeklampsiegruppe hochreguliert, was für die Plazenta schon
gezeigt wurde und mit dieser Arbeit für die Decidua bestätigt wurde (Haugen et al.,
2006). Laivuori et al konnten weiterhin zeigen, dass Leptin im präeklamptischen,
maternalem Plasma erhöht ist (Laivuori et al., 2006). Eine enge Korrelation zwischen
dem AT1-R und dem Epoxyeicosatriensäurebildner Cytochrom P450 CYP2J2 wurde
in der Decidua detektiert. CYP2J2 ist neben anderen Cytochrom P450 in einem
Rattenmodell für Präeklampsie dysreguliert (Kaergel et al., 2002). Angiotensin II
stimuliert die Expression von Cytochrom P450 Isoformen, welche in engen Kontakt
zu Albuminurie und Bluthochdruck stehen (Muller und Oertle, 1993). Eine Inhibition
von Cytochrom P450 führte in einem weiteren Rattenmodell für Präeklampsie, dem
RUPP-Modell, zu einer Senkung des Blutdruckes (Llinas et al., 2004).
Diskussion 56
Ein Schwachpunkt dieser Studie ist die geringe Patientenanzahl in den Gruppen. Da
unterschiedliche Individuen generell ein relativ verschiedenes Expressionsprofil
aufweisen, kann es zu großen Schwankungen kommen, welche Signifikanzen
beeinträchtigen können. Abhilfe schafft hier nur eine kostenaufwendige Erhöhung der
n-Zahl. Außerdem war es nicht möglich, die Resultate gegen die
Schwangerschaftslänge zu korrigieren. Allerdings ergaben die Analysen der
Expressionsdaten gegen die Schwangerschaftswoche in den Gruppen keine
signifikante Korrelation, was auf eine Unabhängigkeit hindeutet.
Das RAS ist während der Präeklampsie eindeutig dysreguliert und zwar als lokale
Komponente in der utero-plazentaren Einheit, und zirkulatorische Komponente. Auch
andere Systeme, die eng mit dem RAS gekoppelt sind oder sogar durch dieses
gesteuert werden, sind in der Präeklampsie dysreguliert. Dies weist darauf hin, dass
ein Eingreifen in dieses System als therapeutisches Mittel eine enorme Bedeutung
hat. ACE-Inhibition und AT1-R-Blockade können aufgrund der
reproduktionstoxischen Wirkung nicht eingesetzt werden (Paternoster et al., 2006).
Gegenwärtig sind Faktoren zur Neutralisation der Präeklampsiemarker sFLT1 und
sEndoglin in der Entwicklung. Dieses Interesse sollte ebenfalls dem AT1-AA
beigemessen werden und weitere Möglichkeiten zur Intervention des inflammatorisch
aktivierten RAS durchdacht werden. Denkbar wäre eine spezifische Plasmaphorese,
durch die der Autoantikörper aus der Zirkulation der Mutter genommen werden würde,
was bei anderen Autoimmunerkrankungen bereits als Therapieform Anwendung
findet (Mutasim, 2004). Diese Anstrengungen könnten zu einer unbedingt
notwendigen Verlängerung der Schwangerschaft bei präeklamptischen Frauen
führen und die Auswirkungen des enormen Bluthochdrucks, wie Nierenschäden und
spätere kardiovaskuläre Erkrankungen bei Mutter und Kind, lindern.
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Literatur 63
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Publikationen 64
8 Publikationsliste
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N, Micheel B, Schlag PM, Osterziel KJ, Ozcelik C, Scherneck S, Jandrig B.
Expression of the protein phosphatase 1 inhibitor KEPI is downregulated in breast
cancer cell lines and tissues and involved in the regulation of the tumor suppressor
EGR1 via the MEK-ERK pathway.
Biol Chem. 2007 May;388(5):489-95.
PMID: 17516844
- Herse F, Dechend R, Harsem NK, Wallukat G, Janke J, Qadri F, Hering L, Muller DN,
Luft FC, Staff AC.
Dysregulation of the circulating and tissue-based renin-angiotensin system in
preeclampsia.
Hypertension. 2007 Mar;49(3):604-11. Epub 2007 Jan 29.
PMID: 17261642
- Hubel CA, Wallukat G, Wolf M, Herse F, Rajakumar A, Roberts JM, Markovic N,
Thadhani R, Luft FC, Dechend R.
Agonistic angiotensin II type 1 receptor autoantibodies in postpartum women with a
history of preeclampsia.
Hypertension. 2007 Mar;49(3):612-7. Epub 2007 Jan 8.
PMID: 17210828
- Janke J, Engeli S, Gorzelniak K, Feldpausch M, Heintze U, Bohnke J, Wellner M,
Herse F, Lassalle P, Luft FC, Sharma AM.
Adipose tissue and circulating endothelial cell specific molecule-1 in human obesity.
Horm Metab Res. 2006 Jan;38(1):28-33.
PMID: 16477537
- Wellner M, Herse F, Janke J, Gorzelniak K, Engeli S, Bechart D, Lasalle P, Luft FC,
Sharma AM.
Endothelial cell specific molecule-1--a newly identified protein in adipocytes.
Horm Metab Res. 2003 Apr;35(4):217-21.
PMID: 12778364
Publikationen 65
8.1 Beiträge
- Herse F, Wellner M, Engeli S, Gorzelniak K, Janke J, Luft FC, Sharma AM
Regulation und zelluläre Lokalisation von ESM-1, einem neuen Adipocytären Protein.
18. Jahrestagung der Deutschen Adipositas-Gesellschaft; 2002; Dresden,
Deutschland
- Herse F, Dechend R, Harsem NK, Wallukat G, Janke J, Qadri F, Hering L, Muller DN,
Luft FC, Staff AC.
Dysregulation of the circulating and tissue-based renin-angiotensin system in
preeclampsia.
The 15
th
World Congress Of The International Society For The Study Of Hypertension
In Pregnancy; 2006; Lisbon, Portugal
- Herse F, Dechend R, Harsem NK, Wallukat G, Janke J, Qadri F, Hering L, Muller DN,
Luft FC, Staff AC.
Dysregulation of the circulating and tissue-based renin-angiotensin system in
preeclampsia.
56.Kongress der Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe; 2006;
Berlin, Deutschland
- Herse F, Dechend R, Harsem NK, Wallukat G, Janke J, Qadri F, Hering L, Muller DN,
Luft FC, Staff AC.
Dysregulation des zirkulären und lokalen Renin-Angiotensin System in Präeklampsie.
30. Wissenschaftlicher Kongress Hypertonie 2006, Deutsche Hochdruckliga; 2006;
München, Deutschland
- Herse F, Dechend R, Harsem NK, Wallukat G, Janke J, Qadri F, Hering L, Muller DN,
Luft FC, Staff AC.
Dysregulation des zirkulären und lokalen Renin-Angiotensin System in Präeklampsie.
73. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie; 2007; Mannheim,
Deutschland
- Herse F, Hering L, Janke J, Engeli S, Gorzcelniak K, Kittelsen Harsem
N, Jordan J,
Luft FC, Staff AC, Muller DN, Dechend R
Adipocytes produce the angiogenesis inhibitor, soluble fms-like tyrosine kinase (sFlt-
1).
61st Annual High Blood Pressure Research Conference; 2007; Tuscon, USA
- Herse F, Hering L, Janke J, Engeli S, Gorzcelniak K, Kittelsen Harsem
N, Jordan J,
Luft FC, Staff AC, Muller DN, Dechend R
Adipocytes produce the angiogenesis inhibitor, soluble fms-like tyrosine kinase (sFlt1).
Scientific Sessions 2007, American Heart Association; 2007; Orlando, USA
Abkürzungen 66
9 Abkürzungen
µg Mikrogramm
ACE Angiotensin converting enzyme
AGT Angiotensinogen
Ald Aldosteron
AngI Angiotensin I
AngII Angiotensin II
AP-1 Activator protein 1
Arg Arginin
Asp Asparagin
AT1-AA Angiotensin II-Rezeptor 1-Autoantikörper
AT1-R Angiotensin II-Rezeptor 1
AT2-R Angiotensin II-Rezeptor 2
BDKRB2 Bradykinin-Rezeptor B2
BMI Body-Mass-Index
Cyp11B2 Aldosteron-Synthase
DNA Desoxyribonukleinsäure
EGF-R Epidermal growth factor-Rezeptor
ERK Extracellular-signal Regulated Kinasen
g Gramm
GPCR G-protein coupled receptor
His Histidin
Ile Isoleucin
IUGR Intrauterine growth restriction
kDa kilo Dalton
kg kilo Gramm
MAPKinase mitogen-activated protein-Kinase
mmHg Millimeter Quecksilbersäule
MR Mineralocorticoid-Rezeptor
mRNA Messenger Ribonukleinsäure
NADH Nicotinamidadenindinukleotid
NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
NFAT Nuclear factor of activated T-cells
NF-kB Nuclear factor-kB
Phe Phenylalanin
PKC Protein-Kinase C
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
Pro Prolin
RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron System
RAS Renin-Angiotensin System
Renin-R Renin-Rezeptor
RNA Ribonukleinsäure
Ro 42 Remikirin
Tyr Tyrosin
Val Valin
Danksagung 67
10 Danksagung
Ich bedanke mich bei Herrn Prof. Dipl.-Ing. Dr. Ulf Stahl für seine Bereitschaft, die
Betreuung dieser Doktorarbeit am Institut für Biotechnologie an der TU Berlin zu
übernehmen. Zudem hat er mir mit seinem Rat bei der Zusammenstellung der
Ergebnisse zur Seite gestanden.
Mein besonderer Dank gilt PD Dr. Ralf Dechend und MD PhD Anne Cathrine Staff,
die dieses Projekt erst ermöglicht haben, mir jederzeit eine große Hilfe waren und mit
Anregungen und viel Spaß zur Seite standen. Egal ob in Oslo, Berlin oder auf
Kongressen, sie waren mir immer eine große Unterstützung.
Herrn Prof. Dr. Friedrich C. Luft und PD Dr. Dominik N. Müller danke ich für die
freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe und für die jahrelange Betreuung.
Ebenfalls seit vielen Jahren eine große Hilfe ist mir das gesamte Team der Firma
CellTrend, wo ich mich vor allem bei Melanie Soosten für die tatkräftige
Unterstützung bedanken möchte.
Weiterhin gilt mein Dank der Arbeitsgruppe von Dr. Gerd Wallukat am MDC-Berlin für
die Unterstützung bei dem Bioassay.
Eine große Hilfe im Alltag war mir natürlich die ganze Arbeitsgruppe mit ihrer
Unterstützung, Gabi N´Diaye, May-Britt Köhler, Mathilde Schmidt, Anette Fiebeler,
Fatimunnisa Qadri, Jürgen Janke, Henning Damm, Maren Wellner, Ute Gerhard,
Jana Czychi und besonders der täglich erfrischende Gedankenaustausch mit Lydia
Hering, Sandra Feldt, Ulrike Maschke und Petra Gratze.
Außerdem danken möchte ich MD Gergö Molnar für seine Hilfe bei der Statistik und
MD Nina Kittelsen Harsem für die tatkräftige Unterstützung bei den Patientenproben.
An allererster Stelle möchte ich jedoch meiner Familie danken, die immer für mich da
ist und die ich in allen Lebenssituationen an meiner Seite weiß. Danke!
