Charakterisierung und Stabilisierung der löslichen Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16 für den technischen Einsatz bei der reduktiven Cofaktorregenerierung [original]

Charakterisierung und Stabilisierung der löslichen Hydrogenase aus

Ralstonia eutropha H16 für den technischen Einsatz bei der reduktiven

Cofaktorregenerierung

vorgelegt von

Diplom-Chemikerin

Juliane Ratzka

aus Hennigsdorf

von der Fakultät II – Mathematik und Naturwissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktorin der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Professor Dr. rer. nat. Peter Hildebrandt (TU Berlin)

Berichter: Professor Dr. rer. nat. Marion B. Ansorge-Schumacher (TU Berlin)

Berichter: Professor Dr. rer. nat. Udo Kragl (Universität Rostock)

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 19.10.2011

Berlin 2011

D 83

Danksagung

Diese Arbeit entstand im Rahmen meiner Zeit als wissenschaftliche Mitarbeiterin an der TU

Berlin am Lehrstuhl für Technische Chemie in der AG Enzymtechnologie im Rahmen des

Excellenzclusters „Unifying Concepts in Catalysis“.

Zunächst danke ich Frau Prof. Dr. Marion Ansorge-Schumacher für die Überlassung des

interessanten Themas und die stete Diskussionsbereitschaft im Laufe der letzten Jahre. Herrn

Prof. Dr. Udo Kragl danke ich ganz herzlich für die Übernahme des Gutachtens und dem

Interesse an meiner Arbeit.

Ein ganz besonderer Dank gilt dem Arbeitskreis Friedrich/Lenz, insbesondere Lars

Lauterbach und Dr. Oliver Lenz, für die anfängliche Unterstützung bei der Zellkultivierung

und Proteinaufreinigung sowie für die stete Diskussionsbereitschaft während der Entstehung

dieser Arbeit.

Ganz besonders großer Dank gilt Nicole Herr und Jason Theobald, die im Rahmen ihrer

Diplom- bzw. Forschungsarbeiten maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beitrugen.

Meinen lieben Kollegen, insbesondere Valantina Yazbik und Nora Bieler, danke ich für die

immer sehr herzliche Arbeitsatmosphäre, die netten Feierabende sowie die stete Hilfsbereit-

schaft in allen Belangen.

Darüber hinaus bedanke ich mich bei Frau Astrid Müller-Klauke für ihre Unterstützung bei

NMR-Messungen.

Schließlich schulde ich meinen Eltern tiefen Dank für die fortwährende Unterstützung in allen

Belangen während meiner gesamten naturwissenschaftlichen Ausbildung. Auch meinen

Freunden und meinem Freund kann ich gar nicht genug für die stete moralische Unterstützung

in den letzten Jahren danken.

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift selbstständig verfasst und

keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Berlin, 09. September 2011

Inhalt I

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis............................................................................................................V

Tabellenverzeichnis.................................................................................................................X

1 Einleitung.........................................................................................................................1

1.1 Enzyme in der organischen Synthese.........................................................................1

1.2 Anforderungen an Enzyme für die technische Anwendung.......................................3

1.3 Strategien zur Enzymstabilisierung für die technische Anwendung..........................5

1.3.1 Chemische Modifizierung.................................................................................. 6

1.3.2 Immobilisierung ................................................................................................. 8

1.4 Die lösliche Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16...........................................10

1.4.1 Biochemische Eigenschaften............................................................................ 10

1.4.2 Reaktionsspektrum...........................................................................................12

1.4.3 Anwendungsfelder ...........................................................................................13

1.5 Reduktive Cofaktorregenerierung............................................................................15

1.5.1 Formiatdehydrogenasegekoppelte Cofaktorregenerierung .............................. 16

1.5.2 Hydrogenasegekoppelte Cofaktorregenerierung.............................................. 17

1.6 Zielsetzung ............................................................................................................... 20

2 Material und Methoden................................................................................................22

2.1 Materialien................................................................................................................22

2.1.1 Chemikalien .....................................................................................................22

2.1.2 Sonstige Materialien.........................................................................................23

2.1.3 Geräte ............................................................................................................... 24

2.1.4 Medien und Puffer............................................................................................ 25

2.2 Bereitstellung der Enzyme ....................................................................................... 26

2.2.1 Lösliche Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16........................................26

2.2.2 Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis..................................................27

2.3 Proteinmengenbestimmung nach Bradford.............................................................. 28

2.4 SDS-PAGE...............................................................................................................28

2.5 Charakterisierung der SH.........................................................................................29

2.5.1 Bestimmung der Enzymaktivität......................................................................29

Inhalt II

2.5.2 Untersuchung der Enzymaktivität in Abhängigkeit verschiedener isolierter

Einflüsse ...........................................................................................................30

2.5.3 Bestimmung der Enzymstabilität ..................................................................... 32

2.5.4 Untersuchung der Enzymstabilität in Abhängigkeit verschiedener isolierter

Einflüsse ...........................................................................................................33

2.5.5 Untersuchung der Enzymaktivität und -stabilität mittels Design of Experiments

..........................................................................................................................34

2.6 Bestimmung der Enzymaktivität der CPCR und FDH.............................................36

2.7 Chemische Modifizierung der SH mit Methoxypolyethylenglykol (mPEG)........... 37

2.7.1 Aktivierung von Methoxypolyethylenglycol ................................................... 37

2.7.2 Bestimmung des Aktivierungsgrades von p-Nitrophenyl-mPEG-carbonat durch

alkalische Hydrolyse......................................................................................... 38

2.7.3 Modifizierung des Enzyms............................................................................... 38

2.7.4 Charakterisierung des modifizierten Enzyms .................................................. 38

2.8 Immobilisierung der SH........................................................................................... 39

2.8.1 Adsorptive Immobilisierung der SH ................................................................ 39

2.8.2 Kovalente Immobilisierung der SH.................................................................. 39

2.8.3 Immobilisierung der chemisch modifizierten SH ............................................40

2.8.4 Bestimmung der Aktivität der Immobilisate....................................................40

2.8.5 Bestimmung der Stabilität der Immobilisate....................................................41

2.8.6 Bestimmung der Rezyklierbarkeit der Immobilisate ....................................... 41

2.8.7 Charakterisierung der Immobilisate.................................................................41

2.9 Reduktive Cofaktorregenerierung............................................................................ 42

2.9.1 Einsatz der chemisch modifizierten SH ...........................................................43

2.9.2 Einsatz der immobilisierten SH........................................................................ 44

3 Ergebnisse und Diskussion...........................................................................................45

3.1 Charakterisierung der Aktivität und Stabilität der SH in Abhängigkeit von

verschiedenen isolierten Einflüssen ......................................................................... 45

3.1.1 Abhängigkeit der Aktivität der SH von verschiedenen isolierten Einflüssen..45

3.1.2 Abhängigkeit der Stabilität der SH von verschiedenen isolierten Einflüssen.. 54

Inhalt III

3.1.3 Charakterisierung der Aktivität und Stabilität der SH unter Berücksichtigung

der gegenseitigen Beeinflussung von Temperatur und pH-Wert mittels Design

of Experiments..................................................................................................64

3.1.4 Zusammenfassung............................................................................................73

3.2 Stabilisierung der SH mittels der chemischen Modifizierung mit

Methoxypolyethylenglykol (mPEG)........................................................................74

3.2.1 Modifizierung der SH mit verschiedenen aktivierten

Methoxypolyethylenglykolen (mPEGs)...........................................................75

3.2.2 Stabilität der modifizierten SH.........................................................................81

3.2.3 Zusammenfassung............................................................................................85

3.3 Stabilisierung der SH durch adsorptive Immobilisierung........................................ 85

3.3.1 Optimierung des Immobilisierungsverfahrens.................................................86

3.3.2 Aktivität der Immobilisate ............................................................................... 91

3.3.3 Stabilität der Immobilisate...............................................................................93

3.3.4 Rezyklierung der Immobilisate........................................................................98

3.3.5 Zusammenfassung............................................................................................99

3.4 Stabilisierung der SH durch kovalente Immobilisierung.......................................100

3.4.1 Optimierung des Immobilisierungsverfahrens...............................................102

3.4.2 Aktivität der Immobilisate ............................................................................. 108

3.4.3 Stabilität der Immobilisate.............................................................................110

3.4.4 Rezyklierung der Immobilisate......................................................................114

3.4.5 Zusammenfassung..........................................................................................115

3.5 Einsatz der SH bei der reduktiven Cofaktorregenerierung ....................................116

3.5.1 Regenerierung von NADH mit nativer SH .................................................... 117

3.5.2 Regenerierung von NADH mit chemisch modifizierter SH ..........................119

3.5.3 Regenerierung von NADH mit adsorptiv immobilisierter SH.......................120

3.5.4 Regenerierung von NADH mit kovalent immobilisierter SH........................122

3.5.5 Zusammenfassung..........................................................................................123

4 Zusammenfassung.......................................................................................................124

5 Literatur.......................................................................................................................128

Veröffentlichungen IV

Liste der im Rahmen dieser Arbeit entstandenen Veröffentlichungen

J. Ratzka, L. Lauterbach, O. Lenz, M. B. Ansorge Schumacher, Systematic evaluation of the

dihydrogen-oxidising and NAD+-reducing soluble [NiFe]-hydrogenase from Ralstonia

eutropha H16 as a cofactor regeneration catalyst. Biocat. Biotrans. (2011) in Druck.

J. Ratzka, L. Lauterbach, O. Lenz, M. B. Ansorge Schumacher, Stabilisation of the soluble

[NiFe]-hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 through modification with

methoxypoly(ethylene) glycol. J. Mol. Catal. B: Enzym. (2011) akzeptiert.

Verzeichnisse V

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1 Methoden zur Immobilisierung von Enzymen. ............................................. 9

Abbildung 1.2 Schematische Darstellung der hexameren SH aus R.eutropha H16 nach

Burgdorf et al. 2005a.. ................................................................................. 11

Abbildung 1.3 Schematischer Aufbau der enzymatischen Brennstoffzelle......................... 13

Abbildung 1.4 Substratgekoppelte Cofaktorregenerierung. ................................................ 16

Abbildung 1.5 Reaktionsschema des L-tert-Leucinprozesses............................................. 17

Abbildung 1.6 Hydrogenasegekoppelte Cofaktorregenerierung. ........................................ 18

Abbildung 2.1 Die dreidimensionale Konfiguration eines Central-Composite-Designs..... 35

Abbildung 2.2 Der nach dem Central-Composite-Design erhaltene Versuchsplan für zwei

Faktoren (Temperatur, pH) mit der jeweiligen Faktorkombination, bei denen

die Enzymaktivität und -stabilität untersucht wurden.................................. 35

Abbildung 3.1 Abhängigkeit der SH-Aktivität von der Temperatur................................... 46

Abbildung 3.2 Abhängigkeit der SH-Aktivität vom pH-Wert............................................. 46

Abbildung 3.3 Einfluss verschiedener Salze auf die SH-Aktivität...................................... 47

Abbildung 3.4 Einfluss von 10 und 25 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol auf die SH-

Aktivität. ...................................................................................................... 48

Abbildung 3.5 Einfluss von MTBE, Toluol und n-Heptan auf die SH-Aktivität................ 50

Abbildung 3.6 Einfluss von 2,5, 5 und 10 % (v/v) verschiedener ILs auf die SH-Aktivität.52

Abbildung 3.7 Einfluss von verschiedenen Additiven auf die SH-Aktivität....................... 53

Abbildung 3.8 Abhängigkeit der Halbwertszeit der SH von der Temperatur. .................... 55

Abbildung 3.9 Abhängigkeit der Halbwertszeit der SH vom pH-Wert............................... 56

Abbildung 3.10 Einfluss verschiedener Salze auf die Halbwertszeit der SH........................ 57

Abbildung 3.11 Einfluss von 10 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol auf die

Halbwertszeit der SH. .................................................................................. 58

Abbildung 3.12 Einfluss von MTBE, Toluol und n-Heptan auf die Halbwertszeit der SH. . 59

Abbildung 3.13 Einfluss von 2,5, 5 und 10 % (v/v) verschiedener ILs auf die Halbwertszeit

der SH. ......................................................................................................... 61

Abbildung 3.14 Einfluss von verschiedenen Additiven auf die Halbwertszeit der SH......... 62

Abbildung 3.15 Einfluss von mechanischer Beanspruchung auf die Halbwertszeit der SH. 64

Verzeichnisse VI

Abbildung 3.16 Der nach central composite design erhaltene Versuchsplan mit den

Messergebnissen für die Aktivität [in U mL-1] und Halbwertszeit [in h] der

SH bei Variation des pH-Wertes [-] und der Temperatur [in °C]................ 66

Abbildung 3.17 Der mittels DOE erhaltene replicate index für die Aktivität [in U mL-1] und

Halbwertszeit [in h] der SH. ........................................................................ 67

Abbildung 3.18 Der mittels DOE erhaltene investigation plot für die Aktivität und

Halbwertszeit der SH. .................................................................................. 67

Abbildung 3.19 Der mittels DOE erhaltene deleted studentized residuals plot für die

Aktivität und Halbwertszeit der SH............................................................. 69

Abbildung 3.20 Der mittels DOE erhaltene interaction plot für die Aktivität [in U mL-1] und

Halbwertszeit [in h] der SH in Abhängigkeit vom pH-Wert [-] und der

Temperatur [in °C]....................................................................................... 69

Abbildung 3.21 Der mittels DOE erhaltene contour plot für die Aktivität [in U mL-1] (links)

und Halbwertszeit [in h] (rechts) der SH in Abhängigkeit vom pH-Wert [-]

und der Temperatur [in °C].......................................................................... 70

Abbildung 3.22 Der mittels DOE erhaltene surface plot für die Aktivität [in U mL-1] (links)

und Halbwertszeit [in h] der SH (rechts) in Abhängigkeit vom pH-Wert [-]

und der Temperatur [in °C].......................................................................... 71

Abbildung 3.23 Die sweet spot-Analyse für die Aktivität (links) und Halbwertszeit (rechts)

der SH in Abhängigkeit vom pH-Wert [-] und der Temperatur [in °C]. ..... 72

Abbildung 3.24 Die sweet spot Analyse für die Aktivität und Halbwertszeit der SH in

Abhängigkeit vom pH-Wert [-] und der Temperatur [in °C] bei einer

geforderten maximalen Enzymaktivität und -stabilität................................ 72

Abbildung 3.25 Aktivierung von mPEG mit p-Nitrophenylchloroformat............................. 75

Abbildung 3.26 Modifizierung primärer Aminogruppen mit aktiviertem mPEG. ................ 76

Abbildung 3.27 SDS-Gel der SH nach der Modifizierung mit mPEG2000 und mPEG5000 bei

einem Enzym-mPEG-Verhältnis von 1:500 und 1:1000. ............................ 77

Abbildung 3.28 Aktivität der SH nach der Modifizierung mit mPEG2000 und mPEG5000 bei

einem Enzym-mPEG-Verhältnis von 1:500 und 1:1000. ............................ 78

Abbildung 3.29 Aktivität der modifizierten SH in 10 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol

und Vergleich mit der nativen SH................................................................ 79

Verzeichnisse VII

Abbildung 3.30 Aktivität der modifizierten SH in 2,5 und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und

[MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit der nativen SH. .............................. 80

Abbildung 3.31 Stabilität der modifizierten SH in rein wässrigen Medien unter

mechanischer Beanspruchung und ohne und Vergleich mit der nativen SH...

...................................................................................................................... 82

Abbildung 3.32 Stabilität der modifizierten SH in 10 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol

und Vergleich mit der nativen SH................................................................ 83

Abbildung 3.33 Stabilität der modifizierten SH in 2,5 und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und

[MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit der nativen SH. .............................. 84

Abbildung 3.34 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

verschiedenen Trägern................................................................................. 88

Abbildung 3.35 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei pH 7,0 und 8,0. ..................................................... 89

Abbildung 3.36 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei verschiedenen Enzym-Träger-Verhältnissen........ 90

Abbildung 3.37 Aktivität der adsorptiv immobilisierten nativen und modifizierten SH in 10

% (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol und Vergleich mit der nativen SH.92

Abbildung 3.38 Aktivität der adsorptiv immobilisierten nativen und modifizierten SH in 2,5

und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit

der nativen SH.............................................................................................. 93

Abbildung 3.39 Stabilität der adsorptiv immobilisierten nativen und modifizierten SH in rein

wässrigen Medien unter mechanischer Beanspruchung und ohne und

Vergleich mit der nativen SH....................................................................... 94

Abbildung 3.40 Stabilität der adsorptiv immobilisierten nativen und modifizierten SH in 10

% (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol und Vergleich mit der nativen SH.96

Abbildung 3.41 Stabilität der adsorptiv immobilisierten nativen und modifizierten SH in 2,5

und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit

der nativen SH.............................................................................................. 97

Abbildung 3.42 Aktivität der adsorptiv immobilisierten nativen [A] und modifizierten [B]

SH während der Rezyklierung bei fünf Reaktionsdurchläufen. .................. 99

Abbildung 3.43 Reaktionschema der kovalenten Bindung eines Enzyms an einen festen

Träger......................................................................................................... 102

Verzeichnisse VIII

Abbildung 3.44 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei pH 7,0 und 8,0. ................................................... 103

Abbildung 3.45 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei verschiedenen Glutardialdehydkonzentrationen. 104

Abbildung 3.46 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei verschiedenen Inkubationszeiten des Trägers. ... 105

Abbildung 3.47 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei verschiedenen Inkubationszeiten des Enzyms.... 106

Abbildung 3.48 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei verschiedenen Enzym-Träger-Verhältnissen...... 107

Abbildung 3.49 Aktivität der kovalent immobilisierten nativen und modifizierten SH in 10

% (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol und Vergleich mit der nativen SH....

.................................................................................................................... 109

Abbildung 3.50 Aktivität der kovalent immobilisierten nativen und modifizierten SH in 2,5

und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit

der nativen SH............................................................................................ 110

Abbildung 3.51 Stabilität der kovalent immobilisierten nativen und modifizierten SH in rein

wässrigen Medien unter mechanischer Beanspruchung und ohne und

Vergleich mit der nativen SH..................................................................... 111

Abbildung 3.52 Stabilität der kovalent immobilisierten nativen und modifizierten SH in 10

% (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol und Vergleich mit der nativen SH....

.................................................................................................................... 113

Abbildung 3.53 Stabilität der kovalent immobilisierten nativen und modifizierten SH in 2,5

und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit

der nativen SH............................................................................................ 114

Abbildung 3.54 Aktivität der kovalent immobilisierten nativen [A] und modifizierten [B] SH

während der Rezyklierung bei fünf Reaktionsdurchläufen........................ 115

Abbildung 3.55 Reaktionsumsätze von Acetophenon bei variierenden SH- [A] und FDH-

Konzentrationen [B]................................................................................... 117

Abbildung 3.56 TTN [nProdukt/nEnzym] der SH und FDH nach Beendigung der Reaktion. ... 119

Abbildung 3.57 Reaktionsumsatz von Acetophenon unter Einsatz der chemisch

modifizierten SH........................................................................................ 120

Verzeichnisse IX

Abbildung 3.58 Reaktionsumsatz von Acetophenon beim Einsatz der adsorptiv

immobilisierten SH bei zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen............... 121

Abbildung 3.59 Reaktionsumsatz von Acetophenon beim Einsatz der kovalent

immobilisierten SH bei zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen............... 122

Verzeichnisse X

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.1 Methoden zur chemischen Modifizierung von Enzymen..............................7

Tabelle 1.2 Auswahl der möglichen Wasserstoffakzeptoren der SH und ihre

entsprechende Hydrogenaseaktivität............................................................ 12

Tabelle 2.1 Zusammensetzung von FN- und FGN-Medium pro Liter...........................25

Tabelle 2.2 Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel........................................... 29

Tabelle 2.3 Zusammensetzung der Reaktionsansätze bei der SH- bzw. FDH-

katalysierten Cofaktorregenerierung............................................................ 42

Tabelle 2.4 Gaschromatographische Analyse von Acetophenon und 1-Phenylethanol. 43

Tabelle 3.1 Referenzwerte für die vier Indikatoren des investigation plots. .................. 68

Tabelle 3.2 Auswahl verschiedener Träger für die adsorptive Immobilisierung der SH ...

......................................................................................................................87

Tabelle 3.3 Parameter für die Optimierung der kovalenten Immobilisierung der SH.. 103

Verzeichnisse XI

Abkürzungen

APS Ammoniumperoxodisulfat

[BMIM][BF4] 1-Butyl-3-methyl-imidazolium-tetrafluorborat

[BMIM][OTf] 1-Butyl-3-methyl-imidazolium-trifluormethansulfonat

BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)

CPCR Candida parapsilosis Carbonylreduktase

CSTR continuous stirred- tank reactor (kontinuierlicher Rührtankreaktor)

DMSO Dimethylsulfoxid

DMF N,N-Dimethylformamid

DOE design of experiments (statistische Versuchsplanung)

DTT Dithiothreitol

ee enantiomeric excess (Enantiomerenüberschuss)

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EC enzyme commission (Enzymkommission)

[EMIM][EtSO4] 1-Ethyl-3-methyl-imidazolium-ethylsulfat

FDH Formiatdehydrogenase (aus Candida Boidinii)

FGN Fructose-Glycerin-Nährmedium

FMN Flavin mononukleotid

FN Fructose-Nährmedium

FPLC fast protein liquid chromatography

GC Gaschromatograph/ Gaschromatographie

[HMIM][Cl] 1-Hexyl-3-methyl-imidazolium-chlorid

IL ionic liquid (ionische Flüssigkeit)

IP Isoelektrischer Punkt

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

LB Luria Bertani

Lys Lysin

logP Dekadische Logarittmus des Verteilungskoeffizienten

kDa Kilodalton

mPEG Methoxypolyethylenglykol

MTBE Methyl-tert-butylether

[MTEOA][MeSO4] Tris-(2-hydroxyethyl)-methyl-ammonium-methylsulfat

Verzeichnisse XII

n/n Mol pro Mol

NADH/ NAD+ Nikotinamid Adenin-Dinukleotid (reduzierte bzw. oxidierte Form)

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PEG Polyethylenglykol

pH pH-Wert

Q2 goodness of prediction (Güte der Vorhersagbarkeit)

R2 goodness of fit (Anpassungsgüte)

R.eutropha Ralstonia eutropha

RT Raumtemperatur

SDS Sodiumdodecylsulfat

SH soluble hydrogenase (lösliche Hydrogenase) (aus Ralstonia eutropha)

TCEP Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin

TEA Triethanolamin

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin

THF Tetrahydrofuran

Tris Trizma® Base

TTN total turnover number (Umsatzzahl)

U unit (Einheit)

Upm Umdrehungen pro Minute

UV Ultraviolet

v/v Volumen pro Volumen

w/v Masse pro Volumen

w/w Masse pro Masse

Formelzeichen

Av Volumetrische Aktivität U mL-1

c Molare Konzentration mM

d Schichtdicke cm

ε Molarer Extinktionskoeffizient mM-1 cm-1

Ext Extinktion -

∆E Extinktionsdifferenz -

k Inaktivierungskonstante -

Verzeichnisse XIII

nEnzym Stoffmenge Enzym mol

nProdukt Stoffmenge Produkt mol

t Zeit Min bzw. h

t1/2 Halbwertszeit Min bzw. h

VE Volumen des Enzyms mL

Vges Gesamtvolumen mL

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Enzyme in der organischen Synthese

Enzyme sind proteinogene Katalysatoren biologischen Ursprungs, die die Natur im Rahmen

evolutiver Prozesse fortwährend weiterentwickelt und optimiert hat. Aus diesem Grund

werden sie häufig als Biokatalysatoren bezeichnet. Ihre technische Nutzung umfasst den

Einsatz isolierter Enzyme und ganzer Zellen, die sowohl natürliche als auch nicht natürliche

Substanzen umsetzen. Ganze Zellen werden insbesondere bei synthetischen Reaktionen, die

die Gegenwart von Cofaktoren erfordern, angewandt. Diese häufig sehr teuren Cofaktoren,

bei denen es sich um für biokatalytische Prozesse essentielle, nicht-proteinogene

Komponenten handelt, lassen sich auf diesem Weg in vitro regenerieren. Zudem hat der

Einsatz ganzer Zellen den Vorteil, dass die Aufreinigung des Enzyms entfällt. Die Vorteile

der Nutzung isolierter Enzyme liegen dagegen in der Vermeidung von Nebenreaktionen durch

andere Enzyme sowie in höheren Enzym- und Produktkonzentrationen [Tyler et al., 2006,

Bommarius und Riebel, 2004, Faber, 2004, Schmid et al., 2001].

Biokatalysatoren zeichnen sich vor allem durch ihre hohe katalytische Effizienz aus, die es

ihnen ermöglicht, eine Reaktionsrate um Faktoren von 108 bis 1014 zu beschleunigen [Azerad,

1995]. In Folge dessen genügen oft bereits Enzymkonzentrationen zwischen 10-3 und 10-4

Mol-% im Reaktionsansatz, um hohe Produktausbeuten zu erzielen. Im Vergleich dazu

werden chemische Katalysatoren in Konzentrationen zwischen 0,1 bis 1 Mol-% eingesetzt

[Faber, 2004].

Eine herausragende Eigenschaft von Enzymen ist ihre Fähigkeit, ein weites Spektrum an

Reaktionen zu katalysieren und gleichzeitig eine hohe Chemo-, Regio- und Stereoselektivität

zu besitzen. Folglich treten Nebenreaktionen wie Isomerisierungen, Racemisierungen und

Epimerisierungen selten bis gar nicht auf, was zu einer deutlich höheren Reinheit des

Produktes führt und somit dessen Aufreinigung erleichtert. Als Konsequenz bedarf es keinem

oder einem verringerten Einsatz der Schutzgruppentechnik, die in der organischen Synthese

oft unerlässlich ist [Tyler et al., 2006, Bommarius und Riebel, 2004, Faber, 2004, Schmid et

al., 2001].

Einleitung 2

Enzyme sind unter milden Reaktionsbedingungen, normalerweise in einem Temperatur-

bereich zwischen 20 und 40 °C, in einem pH-Bereich zwischen 5 und 8 und unter atmosphäri-

schem Druck, aktiv, was zu einer höheren Prozessökonomie aufgrund der verringerten

Energieaufwendung führt. Darüber hinaus wirkt sich ihr Einsatz positiv auf die Prozessöko-

logie aus, da Biokatalysatoren vollständig biologisch abbaubar und somit umweltverträglich

sind [Tyler et al., 2006, Straathof et al., 2002].

Aufgrund der Vielzahl positiver Eigenschaften von Biokatalysatoren finden diese heutzutage

zahlreiche Verwendung im industriellen Sektor. Die Anwendungen umfassen die Katalyse

von Reaktionen, wie Synthesen, Umwandlungen oder Abbaureaktionen in der Pharma-,

Nahrungsmittel-, Textil-, Papier-, Agrar- und Waschmittelindustrie [Aehle, 2007, Straathof et

al., 2002, Liese et al., 2000].

Gegenwärtig existieren etwa 150 etablierte biokatalytische Prozesse, in den meisten Fällen für

die Produktion von komplexen Substanzen mit geringen Produktionsvolumina, sogenannten

Feinchemikalien [Osterath et al., 2007, Schulze und Wubbolts, 1999]. Diese sind meist chiral

und können mit Hilfe von Enzymen mit Enantiomerenüberschüssen (ee) von  99 % synthe-

tisiert werden [Hilterhaus und Liese, 2007]. Zu den industriell bedeutendsten enantiomeren-

reinen Verbindungen zählen chirale Alkohole, Diole oder Hydroxyketone, die beispielsweise

mittels Alkoholdehydrogenasen aus den jeweiligen prochiralen Ketonen hergestellt werden

können [Hummel und Kula, 1989]. Die auf diesem Weg gewonnenen Substanzen stellen

wichtige Bausteine für die Synthese von pharmazeutischen Wirkstoffen, Düngemitteln und

Duftstoffen dar.

Im Bereich der Produktion achiraler Bulkchemikalien können Enzyme, unter anderem

aufgrund ihres hohen Preises, selten gegenüber den etablierten chemischen Verfahren

bestehen. Eine bedeutende Ausnahme ist die biotechnologische Produktion von Acrylamid.

Dabei lassen sich aus der Ausgangssubstanz Acrylnitril mittels der Nitrilhydratase aus

Rhodococcus rhodochrous mittlerweile jährlich 30 000 Tonnen Acrylamid mit einer 99,9

%igen Ausbeute herstellen [Liese et al., 2000].

Einleitung 3

Die bislang etablierten biokatalytischen Prozesse sowie der Einsatz unkonventioneller Medien

zur Erweiterung des Reaktionsspektrums von Enzymen und somit derer Anwendungsbereiche

verdeutlichen das gegenwärtige und zukünftige Potential der Enzymkatalyse. Weiterhin

tragen Fortschritte im Bereich der Molekularbiologie und das wachsende Wissen im Bereich

der Strukturaufklärung von Proteinen zur weiteren Optimierung von Enzymen und somit zur

weiteren Erschließung neuer Anwendungsfelder bei.

1.2 Anforderungen an Enzyme für die technische Anwendung

Obwohl die Anzahl etablierter biokatalytischer Reaktionen in der Industrie stetig zunimmt

existieren noch immer zahlreiche Barrieren, die den technischen Einsatz von Enzymen limi-

tieren. Dazu zählt unter anderem, dass es einer hohen Effizienz des Biokatalysators bedarf,

dieser jedoch gleichzeitig preiswert und in ausreichenden Mengen verfügbar sein sollte. Zu-

dem erfordert der industrielle Einsatz von Enzymen eine hohe Aktivität und Stabilität des

Biokatalysators bei hohen Temperaturen, extremen pH-Bedingungen, hohen Salz-

konzentrationen, unter mechanischer Beanspruchung sowie in Gegenwart unkonventioneller

Lösungsmittel [Iyer und Ananthanarayan, 2008, Bommarius und Riebel, 2004, Faber, 2004,

Illanes, 1999].

Die genannten Anforderungen stellen in vielen Fällen noch immer Grenzen für die technische

Nutzung von Biokatalysatoren dar. So lassen sich zahlreiche Enzyme nur sehr aufwendig und

durch eine Vielzahl an Aufreinigungsschritten bereitstellen. In der Folge entstehen hohe

Kosten für die Isolierung eines Enzyms, was wiederum zu hohen Preisen von Biokatalysato-

ren führt [Faber, 2004].

Bei zahlreichen Reaktionen bedarf es Bedingungen, die außerhalb des Aktivitäts- und

Stabilitätsoptimums von Enzymen liegen. Dazu zählen extreme pH-Werte und hohe

Temperaturen, die zu höheren Reaktionsraten sowie einer besseren Löslichkeit zahlreicher

Reaktanden führen [Iyer und Ananthanarayan, 2008]. In der Folge kommt es in vielen Fällen

zu einer Inaktivierung der Enzyme aufgrund der Entfaltung ihrer Tertiärstruktur unter den

genannten Bedingungen, was eine weitere Begrenzung der technischen Umsetzung biokataly-

sierter Reaktionen darstellt.

Einleitung 4

Der Einsatz hoher Salzkonzentrationen in Gegenwart von Enzymen spielt insbesondere in der

Lebensmittelindustrie eine bedeutende Rolle. Mit Ausnahme halophiler Enzyme zeigen zahl-

reiche Biokatalysatoren unter solchen Bedingungen eine ausgeprägte Instabilität aufgrund der

starken Wechselwirkung der Salzionen mit schwachen ionischen Bindungen des Proteins, was

wiederum den technischen Einsatz von Proteinen beschränkt [Iyer und Ananthanarayan,

2008].

Für die industrielle Anwendung von Enzymen ist deren mechanische Stabilität von großer

Bedeutung, da unter Prozessbedingungen oft Scherkräfte zur Durchmischung der Reaktions-

lösung auf das Enzym einwirken, beispielsweise in einem kontinuierlichen Rührtankreaktor

(CSTR). Aus der mechanischen Beanspruchung des Biokatalysators resultiert oft dessen In-

aktivierung, was eine weitere Einschränkung der industriellen Nutzung von Enzymen dar-

stellt.

Der Einsatz unkonventioneller Lösungsmitteln bei biokatalysierten Reaktionen ist infolge der

begrenzten Löslichkeit vieler Substrate in rein wässrigen Medien oftmals unerlässlich. Zudem

lassen sich unerwünschte wasserabhängige Nebenreaktionen unterdrücken, mikrobielle

Verunreinigungen können eliminiert werden und die Produktisolierung wird aufgrund

niedriger Siedepunkte und hoher Dampfdrücke vereinfacht [Carrea und Riva, 2000,

Natarajan, 1991]. Die Nutzung unkonventioneller Medien umfasst unter anderem die Verwen-

dung wasserlöslicher und -unlöslicher organischer Lösungsmittel, sowie ionischer Flüssig-

keiten (ILs) [Castro und Knubovets, 2003, Carrea und Riva, 2000]. Der Einsatz von Enzymen

in diesen Medien stellt nach wie vor eine große Herausforderung dar, da die Proteinstabilität

in Gegenwart der genannten Medien oft drastisch reduziert wird und es zu einer Inaktivierung

des Enzyms kommt [Iyer und Ananthanarayan, 2008, Schiffer und Dötsch, 1996, Halling,

1990, Hahn-Hägerdal, 1986]. Dabei wird zwischen einer molekularen Toxizität und einer

Grenzflächentoxizität ausgehend vom Medium unterschieden [Carrea und Riva, 2008]. Die

molekulare Toxizität tritt in einem Einphasensystem auf, in dem die in der wässrigen Phase

gelösten Lösungsmittelmoleküle toxisch auf das Protein wirken. Dabei erfolgt die De-

hydratisierung des Enzyms, bei der Wassermoleküle an der Proteinoberfläche gegen Lösungs-

mittelmoleküle ausgetauscht werden, was zu einer Änderung der dreidimensionalen Protein-

struktur führt. Dadaurch kommt es zur Inaktivierung des Enzyms [Iyer und Ananthanarayan,

Einleitung 5

2008]. Zusätzlich hängt dieser Effekt von der Polarität des Lösungsmittels ab, wobei im

Allgemeinen gilt: Je polarer das Lösungsmittel ist, desto größer ist sein Einfluss auf den

Biokatalysator [Iyer und Ananthanarayan, 2008, Laane, et al. 1987]. Dieses Prinzip besitzt

jedoch keine Allgemeingültigkeit und ist somit nicht auf alle Reaktionssysteme übertragbar.

Im Fall der Grenzflächentoxizität, die neben der molekularen Toxizität in Zweiphasen-

systemen stattfindet, tritt das Enzym an der Phasengrenzfläche mit den Lösungsmittel-

molekülen in Kontakt und wird in Folge dessen inaktiviert.

Aufgrund der genannten Limitierungen besteht für die industrielle Nutzung eines Bio-

katalysators der Anspruch, ihn so zu optimieren, dass er unter den beschriebenen technischen

Anforderungen bestehen kann.

1.3 Strategien zur Enzymstabilisierung für die technische Anwendung

Zur Erhöhung der Stabilität von Enzymen für deren technische Nutzung existieren gegenwär-

tig verschiedene Strategien. Bei dem sogenannten medium engineering werden dem Enzym

Additive wie Salze, Kryoprotektantien, Polyole, Zucker, Antioxidantien, Polyethylenglykole

(PEG) und andere synthetische Polymere zugesetzt [Iyer und Ananthanarayan, 2008, Fágáin,

1995, Schmid, 1979]. Diese Methode beinhaltet zusätzlich die Veränderung des Reaktions-

mediums durch den Zusatz von Cosolventien wie organische Lösungsmittel oder ionische

Flüssigkeiten [Fágáin, 1995, Vermue und Tramper, 1995]. Darüber hinaus existieren Strate-

gien, die auf Basis der DNA- sowie auf der Proteinebene eine Erhöhung der Enzymstabilität

bewirken können. Ausgehend von der genetischen Ebene wird zwischen zwei Ansätzen unter-

schieden: dem rationalen Design und der gerichteten Evolution [Dalby, 2007]. Beim

rationalen Design erfolgt die selektive Veränderung der Primärstruktur des Proteins [Eijsink

et al., 2004]. Hierbei bedarf es jedoch einer intensiven Kenntnis von Struktur-Funktionsbezie-

hung des Enzyms. Im Unterschied dazu werden bei der gerichteten Evolution Veränderungen

auf Basis einer zufallsbasierten Mutation hervorgerufen [Rubin-Pitel und Zhao, 2006,

Bornscheuer und Pohl, 2001]. Weiterhin gelten die kovalente chemische Modifizierung von

Aminosäureresten des Proteins und die Immobilisierung des Enzyms durch Bindung an

verschiedenen Trägermaterialien als vielversprechende Methoden, um die Stabilität von Bio-

katalysatoren zu erhöhen [Brady und Jordaan, 2009, Hartmann und Jung, 2009, Sheldon,

Einleitung 6

2007, Davis, 2003, DeSantis und Jones, 1999, Roig und Kennedy, 1992]. Im Folgenden

werden die für diese Arbeit relevanten Methoden näher vorgestellt.

1.3.1 Chemische Modifizierung

Die chemische Modifizierung von Biokatalysatoren ist eine der ältesten Methoden zur ge-

zielten Veränderung der Proteineigenschaften infolge der kovalenten Bindung verschiedener

Reagenzien an bestimmte funktionelle Gruppen der Aminosäureseitenketten des Enzyms.

Prinzipiell stehen dazu alle Aminosäurereste zur Verfügung, wobei jedoch meist nur die pola-

ren Aminosäuren eine ausreichende Reaktivität besitzen, was auf deren ionisierbare Seiten-

ketten zurückzuführen ist. Die jeweils unprotonierten Spezies können als potente Nukleophile

in verschiedenen Additionsreaktionen agieren.

Ursprünglich diente die Modifizierung von Enzymen der Aufklärung von Struktur-Funktions-

Beziehungen [Means und Feeney, 1990]. Gegenwärtig wird sie hingegen bevorzugt zur Erhö-

hung der Enzymstabilität und -löslichkeit eingesetzt [DeSantis und Jones, 1999]. Dabei ist die

Auswahl der zur Verfügung stehenden Methoden und modifizierenden Reagenzien weit-

reichend. Hinsichtlich der Modifizierungsmethoden wird zwischen mono-, bi- und multi-

funktionalen Reagenzien unterschieden. Bi- und multifunktionale Reagenzien führen zur

intra- und intermolekularen Quervernetzung des Proteins, woraus die Bildung fester Enzym-

aggregate resultiert. Aus diesem Grund wird die Quervernetzung von Proteinen auch häufig

der Immobilisierung zugeordnet. Monofunktionale Reagenzien dagegen besitzen nur eine

reaktive Gruppe, die unter definierten Bedingungen mit bestimmten Aminosäureresten

reagiert. Dem entsprechend lassen sich monofunktionale Reagenzien nur nach dem Amino-

säurerest, mit dem sie spezifisch reagieren, oder nach der Art der durchgeführten Reaktion

unterteilen. Eine Auswahl der zur Verfügung stehenden Methoden zur chemischen Modifizie-

rung von Enzymen ist in Tabelle 1.1 zusammengefasst.

Einleitung 7

Tabelle 1.1 Methoden zur chemischen Modifizierung von Enzymen.

Funktionalität

(Aminosäureseitenkette) Reaktion Regenzien

Amidierung Imidoeste

Acetylierung Anhydride

Reduktive Aminierung NaBH4, NaBH3CN

Sulfonierung Trinitrobenzolsulfonat

Aminogruppe (





-Lys)

Cabamatbildung Carbonate

Carboxylgruppe (Asp, Glu) Urethanbildung Carbodiimide

Guanidingruppe (Arg) Alkylierung Dicarbonyl-Derivate

Imidazolgruppe (His) Alkylierung Anhydride

Indolgruppe (Trp) Oxidation N-Bromsuccinimid

Phenolgruppe (Tyr) Nitrierung Tetranitromethan

Alkylierung Halogenacetate

Thiolgruppe (Cys) Oxidation Dithiobis(2-nitrobenzolsäure)

Thioethergruppe (Met) Oxidation Radikalbildner (z.B. H2O2)

Ein Nachteil der chemischen Modifizierung von Enzymen ist die geringe Selektivität, mit der

die entsprechenden Reagenzien an die verfügbaren Aminosäurereste binden. In Folge dessen

kann das Modifizierungsreagenz neben der gewünschten auch an andere funktionelle Gruppen

kovalent binden. Eine Möglichkeit auf die Reaktivität der Aminosäurereste Einfluss zu

nehmen, ist die Veränderung des pH-Wertes während der Modifizierung, da eine Abhängig-

keit zwischen der Reaktivität der funktionellen Gruppen und deren Protonierungsgrad besteht.

Weitere Einflussparameter sind die Konzentration des Modifizierungsreagenzes sowie die

Reaktionsdauer. Trotz dieser Möglichkeiten lassen sich häufig nur heterogene Enzymlösun-

gen gewinnen, die wenig reproduzierbar sind [Means und Feeney, 1990].

Dennoch erfolgte die Etablierung der chemischen Modifizierung von Enzymen, um deren

Eigenschaften gezielt zu verändern. Dazu zählt unter anderem die Erhöhung der Löslichkeit

und Stabilität von Enzymen, beispielsweise durch eine Reaktion mit verschiedenen

Anhydriden [Sangeetha und Abraham, 2006, Khajeh, et al., 2001, Vinogradov et al., 2001],

Einleitung 8

Aldehyden [Vinogradov et al., 2001], Imidoestern [Ryan et al., 1994, Basri et al., 1992] oder

aktivierten Polymeren [Vandertol-Vanier et al., 2002, Hernáiz et al., 1999, Kazan et al.,

1997]. Ein häufig eingesetztes Polymer ist Polyethylenglycol (PEG). Die kovalente Bindung

von PEG an zugängliche Lysinreste an der Proteinoberfläche kann zu einer Erhöhung der

Temperaturstabilität von Enzymen führen [Garcia-Arellano et al., 2002, Yang et al., 1996,

Gaertner und Puigserver, 1992] sowie zu einer Stabilisierung gegenüber inaktivierenden Ein-

flüssen wie organischen Lösungsmitteln beitragen [Van den Wittenboer et al., 2010, Szabo et

al., 2009, Salleh et al., 2002, Vinogradov et al., 2001].

1.3.2 Immobilisierung

Bei der Immobilisierung von Enzymen werden diese per Definition durch chemische oder

physikalische Methoden in ihrer Beweglichkeit eingeschränkt, wobei ihre katalytischen

Fähigkeiten erhalten bleiben [Hartmeier, 1986]. Das bedeutet, dass ein immobilisierter Bio-

katalysator zum einen ausreichend katalytisch aktiv sein muss und zum anderen nicht mehr in

Lösung gehen darf, woraus die Möglichkeit für eine vereinfachte Abtrennung des Enzyms aus

der Produktlösung resultiert [Cao, 2005].

Durch die Immobilisierung von Enzymen ergibt sich für deren technische Anwendungen eine

Reihe von Vorteilen. So wird der Biokatalysator zum einen in eine handhabbarere Form über-

führt und folglich eine einfache Rezyklierbarkeit des Enzyms sowie eine kontinuierliche

Prozessführung ermöglicht. Zum anderen besitzen immobilisierte Enzyme hohe Katalysator-

dichten. Aufgrund dessen lassen sich die katalysierten Reaktionen wesentlich ökonomischer

gestalten, was für industrielle Anwendungen von großer Bedeutung ist [Sheldon, 2007].

Darüber hinaus weisen immobilisierte Enzyme oft auch verbesserte Eigenschaften auf. Dazu

zählen erhöhte Enzymaktivitäten [Mateo et al., 2007, Goto et al., 2005, Hsu et al., 2000,

Bastida et al., 1998] und sehr häufig verbesserte Stabilitäten, insbesondere unter denaturieren-

den Bedingungen [Bolivar et al., 2009, Mateo et al., 2007, Mateo et al., 2002, Fernandez-

Lafuente et al., 2000]. Dabei kann das Enzym beispielsweise gegenüber hohen Temperaturen

oder auch organischen Lösungsmitteln stabilisiert werden [Goto et al., 2005, Abian et al.,

2002, Klibanov, 1979]. Ferner kann die Immobilisierung eines Enzyms auch einen Einfluss

auf dessen Selektivität ausüben. In diesem Zusammenhang lässt sich diese sowohl verändern

[Cabrera et al., 2009, Palomo 2008, Palomo et al., 2002, Aoun und Baboulene 1998] als auch

Einleitung 9

erhöhen [Mateo et al., 2007, Suh et al., 2003, McIninch und Kantrowitz, 2001, Rotticci et al.,

2000].

Es existieren fünf grundsätzliche Methoden Enzyme zu immobilisieren. Dabei wird zwischen

der Immobilisierung des Enzyms infolge der Ausbildung einer Bindung untereinander oder

mit einem Träger und der Immobilisierung eines Biokatalysators durch dessen Einhüllung in

polymere Matrizes sowie seine Verkapselung in Membranen unterschieden, wie in Abbildung

1.1 dargestellt ist.

Immobilisierung

Bindung Einhüllung

Trägerlose Quervernetzung Verkapselung in Membran

Adsorption an Träger Kovalente Bindung an Träger Einbettung in Matrix

Immobilisierung

Bindung Einhüllung

Trägerlose Quervernetzung Verkapselung in Membran

Adsorption an Träger Kovalente Bindung an Träger Einbettung in Matrix

Abbildung 1.1 Methoden zur Immobilisierung von Enzymen.

Bei der Bindung an einen Träger kommen sehr viele anorganische und organische Stoffe

sowie synthetische Polymere in Betracht, wobei zwischen der adsorptiven und kovalenten

Bindung unterschieden wird. Die Adsorption ist die einfachste und älteste Methode, bei der

die Biokatalysatoren über hydrophobe, polare und elektrostatische Wechselwirkungen an der

Oberfläche des Trägers wie beispielsweise Holzschnitzel, Cellulose oder Silicate gebunden

werden. Diese Methode zeichnet sich durch ihre einfache Ausführbarkeit und den geringen

Einfluss auf die Konformation des Biokatalysators aus. Ihr Nachteil besteht jedoch in der

Freisetzung des Biokatalysators während des Prozesses aufgrund der geringen Bindungsstärke

[Cao, 2005, Faber, 2004, Hartmeier, 1986]. Im Gegensatz dazu tritt dieses Problem bei der

kovalenten Bindung des Enzyms an einem Träger nicht auf, da der Biokatalysator über die

funktionellen Gruppen seiner Aminosäuren kovalent gebunden ist, was zu einem stabileren

Einleitung 10

Biokatalysator-Träger-Komplex führt. Der wesentliche Nachteil dieser Methode liegt dagegen

in der bestehenden Möglichkeit, essentielle Aminosäurereste innerhalb oder in der Nähe des

aktiven Zentrums des Enzyms in diese Bindung zu involvieren, woraus ein drastischer Verlust

der katalytischen Aktivität resultiert [Hartmeier, 1986]. Bei der Quervernetzung (cross-

linking) werden die einzelnen Biokatalysatoren durch bi- oder mehrfunktionelle Reagenzien

wie z.B. Glutardialdehyd und Hexamethyldiisothiocyanate miteinander verbunden, was die

Bildung von sehr hochmolekularen unlöslichen Aggregaten zur Folge hat. Ein Nachteil dieser

Aggregate ist ihre meist gelatinöse Beschaffenheit, die ihren Einsatz in technischen Prozessen

erschwert. Weiterhin kann es bei der Quervernetzung von Enzymen zu einer Blockierung

derer aktiven Zentren innerhalb der entstehenden hochmolekularen Aggregate kommen, was

mit Aktivitätsverlusten einhergeht.

1.4 Die lösliche Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16

Ralstonia eutropha H16 ist ein gramnegatives lithoautotrophes Knallgasbakterium, das zur



-Subklasse der Proteobakterien zählt [Pohlmann et al., 2007]. Dieser Organismus verfügt

über drei aktive Hydrogenasen: eine membrangebundene, eine regulative und eine lösliche

[Burgdorf et al. 2005a, Löscher et al., 2005]. Letztere ist dabei in der Lage, neben der reversi-

blen Spaltung von molekularem Wasserstoff in Protonen und Elektronen gleichzeitig die

Reduktion von Elektronenakzeptoren wie Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) zu kataly-

sieren [Schneider und Schlegel, 1976].

1.4.1 Biochemische Eigenschaften

Die lösliche Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16 (SH, EC 1.12.1.2) zählt wie alle

Hydrogenasen zur Enzymklasse der Oxidoreduktasen. Aufgrund ihres heterodinuklearen Ni-

Fe-aktiven Zentrums ist sie innerhalb der Hydrogenasen der Subklasse der [NiFe]-Hydroge-

nasen zuzuordnen [Burgdorf et al., 2005a]. Bei der SH handelt es sich um ein heterohexame-

ren Proteinkomplex mit einer Molekularmasse von 208,2 kDa, der sich im Gegensatz zu einer

Vielzahl von Standardhydrogenasen durch seine Toleranz gegenüber Sauerstoff auszeichnet

und folglich eine aerobe Reaktionsführung erlaubt [Burgdorf et al., 2005a, Van der Linden et

al., 2004a, Lenz et al., 2002, Schneider und Schlegel, 1981]. Des Weiteren besitzt die SH eine

nur geringe Sensitivität gegenüber Kohlenstoffmonoxid [Van der Linden et al., 2004b].

Einleitung 11

Mittels Kristallographie ist es bereits gelungen detaillierte Informationen zur atomaren Struk-

tur von einigen Standardhydrogenasen aus der [NiFe]-Subklasse zu erlangen [Frey, 2002],

wohingegen die Kristallisation der sauerstofftoleranten Enzyme bislang noch nicht erreicht

werden konnte. Zur Aufklärung von Proteinstruktur-Funktionsbeziehungen der SH wurde sich

bis heute molekularbiologischer und spektroskopischer Techniken bedient, mit deren Hilfe

eine schematische Vorstellung der Struktur entwickelt werden konnte [Löscher et al., 2005,

Burgdorf et al., 2005a, Burgdorf et al., 2005c]. Abbildung 1.2 zeigt diesen strukturellen Auf-

bau der SH.

Ni Fe FMN-b

-a

HoxY HoxU HoxF

HoxH HoxI

NADH

NAD+

2H+

Ni Fe FMN-b

-a

HoxY HoxU HoxF

HoxH HoxI

NADH

NAD+

2H+

Abbildung 1.2 Schematische Darstellung der hexameren SH aus R.eutropha H16 nach

Burgdorf et al. 2005a. [mit freundlicher Genehmigung von S. Karger AG Basel]

Die SH besteht aus zwei funktional unterschiedlichen heterodimeren Komplexen, wobei es

sich um ein Hydrogenasemodul und ein NADH-dehydrogense bzw. -diaphorasemodul han-

delt. Diese beiden Komplexe konnten bereits getrennt voneinander isoliert und charakterisiert

werden [Lauterbach et al., 2011, Horch et al., 2010, Burgdorf et al., 2005b, Burgdorf et al.,

2005c, Löscher et al., 2005, Van der Linden et al. 2004a, Van der Linden et al. 2004b,

Massanz et al. 1998, Schneider et al., 1979, Schneider & Schlegel, 1978]. Demnach besitzt

die SH ein [2Fe-2S]-Cluster, mindestens 3 [4Fe-4S]-Cluster und zwei nicht kovalent gebun-

dene Flavinmononukleotidgruppen (FMN). Das Hydrogenasedimer, kodiert durch die Gene

HoxH (55 kDa) und HoxY (23 kDa), beherbergt unter anderem das Ni-Fe-aktive Zentrum so-

wie eine der beiden FMN-Gruppen (FMN-a) und ist für die Hydrogenaseaktivität verantwort-

lich. Das Diaphorasedimer, kodiert durch die Gene HoxF (67 kDa) und HoxU (26 kDa), regu-

liert hingegen die Bindung und Umsetzung von NAD(H) und stellt die zweite FMN-Gruppe

(FMN-b) sowie mehrere [Fe-S]-Cluster bereit.

Einleitung 12

Die wasserstoffabhängige Reduktion von NAD+ erfordert das tetramere Konstrukt der SH

(HoxHYUF). Die infolge der Wasserstoffspaltung bereitgestellten Elektronen werden dabei

von der Ni-Fe-Seite über FMN-a, die [4Fe-4S]-Cluster und den [2Fe-2S]-Cluster bis hin zum

FMN-b und schlussendlich auf NAD+ übertragen. Die zwei zusätzlichen Untereinheiten, die

vom HoxI-Gen (je 18,6 kDa) kodiert sind, wurden in dem höhergewichtigen hexameren

Komplex entdeckt, wobei deren Funktion bislang noch nicht eindeutig geklärt ist [Burgdorf et

al., 2005b].

1.4.2 Reaktionsspektrum

Die SH katalysiert wie alle Hydrogenasen die Spaltung von molekularem Wasserstoff in

Elektronen und Protonen. Zudem setzt sie aufgrund ihrer Bidirektionalität Elektronenakzepto-

ren wie NAD+ um. Neben ihrer Spezifität gegenüber NAD+ ist die SH ebenso in der Lage, ein

breites Spektrum weiterer Wasserstoffakzeptoren vollständig zu reduzieren [Schneider und

Schlegel, 1976]. Einige dieser möglichen Wasserstoffakzeptoren und die entsprechende

Hydrogenaseaktivität der SH sind in Tabelle 1.2 aufgelistet.

Tabelle 1.2 Auswahl der möglichen Wasserstoffakzeptoren der SH und ihre entsprechende

Hydrogenaseaktivität.

Wasserstoffakzeptor Aktivität [%]

NAD 100

Methylviologen 70

Benzylviologen 34

Menaquinon 307

Ubiquinon 85

Methylenblau 125

Phenazinmethosulfat 354

Diazingrün 108

Ferricyanid 503

FMN 85

Einleitung 13

Die SH kann demnach neben NAD Elektronenakzeptoren wie Methylviologen, Menaquinon,

Methylenblau bis hin zu Ferricyanid umsetzen. Dabei zeigt sie verglichen mit NAD+ 3-, 3,5-

und 5-fach höhere Reaktionsraten bei der Reduktion von Menaquinon, Phenazinmethosulfat

bzw. Ferricyanid. Des Weiteren setzt sie Methylviologen, Benzylviologen oder Ubiquinon

vollständig um, jedoch mit verminderten Hydrogenaseaktivitäten im Vergleich zu NAD+.

1.4.3 Anwendungsfelder

Für den technischen Einsatz der SH sind insbesondere ihre Hydrogenaseaktivität sowie ihre

Fähigkeit, NAD+ zu reduzieren von Bedeutung. In diesem Zusammenhang besteht einerseits

ein großes Interesse an der Verwendung der SH in einer enzymatischen Brennstoffzelle sowie

an ihrem Einsatz für eine lichtgetriebene Wasserstoffproduktion. Andererseits kann sie eben-

falls Anwendung bei der Regenerierung des Cofaktors NADH finden, welcher in einer Viel-

zahl enzymkatalysierter Reduktionen umgesetzt bzw. verbraucht wird.

Die Verwendung der SH in einer Brennstoffzelle beruht auf ihrer Fähigkeit, Wasserstoff in

Elektronen und Protonen zu zerlegen und auf diese Weise aus Wasserstoff und Sauerstoff

elektrischen Strom und Wasser zu produzieren, wie in Abbildung 1.3 in Anlehnung an

Ludwig et al., 2008 dargestellt ist [Ludwig et al., 2008, Cracknell et al., 2008, Vincent et al.,

2006, Vincent et al., 2005a].

Verbraucher

- +

Wasserstoff Sauerstoff

Wasser

Hydrogenase

Hydrogenase Laccase

Laccase

Elektrolyt

Laccase

Laccase-

-beschichtete

beschichtete

Graphit

Graphit-

-Kathode

Kathode

Hydrogenase

Hydrogenase-

-beschichtete

beschichtete

Graphit

Graphit-

-Anode

Anode

2 H

4 H

2 H

Verbraucher

- +

Wasserstoff Sauerstoff

Wasser

Hydrogenase

Hydrogenase Laccase

Laccase

Elektrolyt

Laccase

Laccase-

-beschichtete

beschichtete

Graphit

Graphit-

-Kathode

Kathode

Hydrogenase

Hydrogenase-

-beschichtete

beschichtete

Graphit

Graphit-

-Anode

Anode

2 H

4 H

2 H

Abbildung 1.3 Schematischer Aufbau der enzymatischen Brennstoffzelle.

Einleitung 14

Wie konventionelle Brennstoffzellen besteht die enzymatische Brennstoffzelle aus zwei

Elektroden, wobei diese nicht aus Platin sondern aus enzymbeschichtetem Graphit bestehen.

Die Graphit-Anode ist dabei mit einer Hydrogenase beschichtet, die Kathode hingegen mit

einer Sauerstoff-Reduktase, einer Laccase. Werden nun die entsprechenden Substrate, Was-

serstoff und Sauerstoff, hinzugefügt lässt sich ein kontinuierlicher Strom erzeugen [Ludwig et

al., 2008, Vincent et al., 2005b]. Im Vergleich zu konventionellen, Platin-basierten Brenn-

stoffzellen besitzt die biologische unter anderem den Vorteil, dass es aufgrund der hohen

Spezifität der Enzyme sowie der Sauerstofftoleranz der Hydrogenasen aus Ralstonia eutropha

H16 keiner Trennung der Elektroden durch eine Protonen-Austausch-Membran bedarf.

Zudem zeichnen sich die Hydrogenasen aus Ralstonia eutropha H16 durch ihre geringe

Sensitivität gegenüber Kohlenstoffmonoxid aus, welches in ungereinigtem, aus fossilen Roh-

stoffen gewonnenem Wasserstoffgas in Spuren vorhanden ist und Platin-basierte Katalysa-

toren vergiftet. Das enzymatische System wird dagegen davon folglich nicht beeinträchtigt

[Ludwig et al., 2008, Cracknell et al., 2008, Vincent et al., 2006, Vincent et al., 2005a,

Vincent et al., 2005b].

Des Weiteren konnte bereits gezeigt werden, dass sich die Hydrogenasen aus Ralstonia

eutropha H16 zur Produktion von reinem Wasserstoff aus Licht und Wasser eignen. Dabei

besteht das Ziel ein solches System in robusten Cyanobakterien zu etablieren, wodurch die

Wasserstoffgewinnung bei gleichzeitiger Sauerstofffreisetzung angestrebt wird [Ludwig et

al., 2008].

Unter Voraussetzung der Gewinnung von Wasserstoff aus der oxygenen Photosynthese und

der Erzeugung elektrischen Stroms aus diesem mittels der enzymatischen Brennstoffzelle

ließe sich ein Kreislauf schließen, bei dem aus Licht und Wasser elektrischer Strom aus-

schließlich durch den Einsatz von Biokatalysatoren erzeugt werden könnte. In diesem

Zusammenhang würde es zu keinem Anfall klimaschädlicher Abfallprodukte kommen, was

aus ökologischer Sicht einen bedeutenden Vorteil darstellt. Unter wirtschaftlichen Aspekten

gesehen stehen der Aufwand der Realisierung eines solchen Systems und die daraus gewon-

nenen Strom- bzw. Wasserstoffmengen bislang jedoch in keinem rentablen Verhältnis. Aus

diesem Grund bedarf es der weiteren Optimierung und Stabilisierung der entsprechenden En-

zyme unter den beschriebenen Bedingungen.

Einleitung 15

Der Einsatz der SH bei der reduktiven Cofaktorregenerierung wird im Folgenden näher

beschrieben.

1.5 Reduktive Cofaktorregenerierung

Die asymmetrische Synthese chiraler Substanzen wie Hydroxysäuren [Simon et al., 1989,

Vasic-Racki et al., 1989], Aminosäuren [Bommarius et al. 1998; Hummel & Kula 1989] oder

Alkohole [Itoh et al., 1999, Rissom et al., 1999, Itoh et al., 2002] aus den entsprechenden

prochiralen Ketonen mittels Oxidoreduktasen erfordert in zahlreichen Reaktionen den Einsatz

von Cofaktoren, am häufigsten NADH. Aufgrund der hohen Kosten der Cofaktoren ist deren

Regenerierung im Reaktionsansatz für eine wirtschaftliche Produktion unerlässlich.

Gegenwärtig existieren verschiedene Strategien zur Regenerierung von NADH, wobei

zwischen biologischen, elektrochemischen, chemischen und photochemischen Methoden zu

unterscheiden ist. Die biologische Methode nutzt ganze Zellen oder isolierte Enzyme zur

Wiedergewinnung des Cofaktors. Das elektrochemische Verfahren hingegen bedient sich

elektrischer Energie und das photochemische der entsprechenden Lichtenergie. Bei der

chemischen Regenerierung von NADH werden wiederum Reduktionsmittel eingesetzt

[Wichmann und Vasic-Racki, 2003, Chenault et al., 1988].

Ein industriell anwendbares Cofaktorregenerierungssystem sollte eine hohe Effizienz auf-

weisen, was sowohl hohe Reaktionsumsätze als auch hohe Reaktionsraten einschließt. In

diesem Zusammenhang wird sich der Ermittlung der total turnover number (TTN) bedient,

die diese Effizienz widerspiegelt. Hierbei gibt die TTN die Menge Produkt an, die mit Hilfe

von 1 Mol Cofaktor produziert wird. Somit gibt sie die Anzahl der Reaktionszyklen, wie häu-

fig ein Cofaktor oxidiert und reduziert werden kann, an [Chenault et al., 1988]. Ein wirt-

schaftliches System sollte dabei den Cofaktor 103 - 105mal regenerieren, was sowohl bei

chemischen als auch bei elektro- und photochemischen Methoden nicht der Fall ist [Chenault

und Whitesides, 1987]. Biologische Cofaktorregenerierungssysteme hingegen zeigen eine

hohe Effizienz. Hierbei wird die Arbeit mit ganzen Zellen durch das Auftreten von Neben-

reaktionen und Substrat- oder Produktinhibierungen begrenzt. Im Gegensatz dazu führt der

Einsatz von isolierten Enzymen sowohl zu hohen TTNs als auch zur Vermeidung von Neben-

Einleitung 16

reaktionen, vorausgesetzt das Enzym besitzt eine ausreichend hohe Stabilität [Wichmann und

Vasic-Racki, 2003, Chenault et al., 1988].

Zur Regenerierung von NADH mittels isolierter Enzyme haben sich gegenwärtig zwei

Strategien bewährt:

1. Bei der substratgekoppelten Regenerierung katalysiert die Oxidoreduktase, wobei es sich

im speziellen um eine Alkoholdehydrogenase handelt, sowohl die Reduktion des

Zielketons als auch die Cofaktorregenerierung (Abbildung 1.4). Dazu wird dem

Reaktionsansatz ein Alkohol, beispielsweise Isopropanol, im Überschuss hinzugegeben,

welcher im selben Maß oxidiert wird, wie das Keton reduziert wird.

NAD

NADH + H

Oxidoreduktase

Abbildung 1.4 Substratgekoppelte Cofaktorregenerierung.

2. Die enzymgekoppelte Cofaktorregenerierung nutzt ein zweites Enzym und sein Substrat.

1.5.1 Formiatdehydrogenasegekoppelte Cofaktorregenerierung

Die Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii (FDH, EC 1.2.1.2) mit Formiat als Substrat

stellt das meist eingesetzte enzymgekoppelte Cofaktorregenerierungssystem dar, da es gegen-

über dem substratgekoppelten System eine Reihe von Vorteilen besitzt [Orlich, 2000]:

 Erhöhung der Reduktionsrate, da Substrat und Cosubstrat nicht um dasselbe aktive Zen-

trum eines Enzyms konkurrieren.

Einleitung 17

 Formiat ist eine günstige Wasserstoffquelle und zudem in hohen Konzentrationen in

Lösung stabil.

 Aufgrund des Übergangs des entstehenden Kohlenstoffdioxids in die Gasphase liegt das

Reaktionsgleichgewicht stark auf der Produktseite (NADH + H+).

 Die FDH ist kommerziell und zu niedrigen Preisen erhältlich.

Aufgrund der beschriebenen Vorteile findet die FDH-katalysierte Cofaktorregenerierung

gegenwärtig industrielle Anwendung bei der Evonik Degussa GmbH, wo L-tert-Leucin aus

Trimethylpyruvat mit einer Leucin-Dehydrogenase hergestellt wird (Abbildung 1.5)

[Wöltinger et al., 2005].

HCOOH NAD

NADH + H

CO2

Leucindehydrogenase

EC 1.4.1.9

+ NH

- H

Formiatdehydrogenase

Abbildung 1.5 Reaktionsschema des L-tert-Leucinprozesses.

1.5.2 Hydrogenasegekoppelte Cofaktorregenerierung

Die Nutzung eines hydrogenasegekoppelten Systems zur Regenerierung von NADH stellt

eine bemerkenswerte Alternative zum konventionell genutzten FDH-katalysierten System dar,

vorausgesetzt die eingesetzte Hydrogenase besitzt neben einer Bindestelle zur Umsetzung von

molekularem Wasserstoff eine weitere für NAD+, wie es bei der SH der Fall ist. In einem

solchen System erfolgt die Regenerierung von NADH durch die Zugabe der Hydrogenase und

ihres Substrates Wasserstoff (Abbildung 1.6).

Einleitung 18

Oxidoreduktase

NAD

NADH + H

Hydrogenase

Abbildung 1.6 Hydrogenasegekoppelte Cofaktorregenerierung.

Aus dem Einsatz einer Hydrogenase zur Cofaktorregenerierung ergibt sich zunächst der Vor-

teil, eines der günstigsten zur Verfügung stehenden Reduktionsmittel nutzen zu können,

molekularen Wasserstoff. Des Weiteren wird eine maximale Atomökonomie erzielt und die

Entstehung von Nebenprodukten, wie es bei der FDH der Fall ist, vermieden. Zudem hat sich

das FDH-gekoppelte System zwar bislang für industrielle Anwendungen bewährt, jedoch

besitzt es noch immer eine Reihe von Nachteilen, die durch den Einsatz einer effizienten

Hydrogenase kompensiert werden könnten. So besitzt die FDH eine geringe spezifische

Aktivität, die zwischen 3 und 4 U mg-1 liegt und dazu führt, dass große Enzymmengen und

lange Reaktionszeiten benötigt werden, um ausreichend hohe Reaktionsumsätze zu erzielen

[Hummel, 1999]. In diesem Zusammenhang konnten bei der FDH-gekoppelten Regene-

rierung von NADH bislang nur TTNs zwischen 600 und 80000 erreicht werden [Chenault et

al., 1988, Kula und Wandrey, 1987], was die begrenzte Effizienz dieses Regenerierungs-

systems nochmals belegt. Zudem gilt die FDH in organischen Lösungsmitteln als wenig stabil

[Gröger et al., 2003, Kruse et al., 1996], was die technische Anwendbarkeit zusätzlich

limitiert. Der Einsatz von Formiat bei der FDH-gekoppelten Cofaktorregenerierung zieht

darüber hinaus den ständigen Bedarf einer starken Pufferung des Reaktionssystems nach sich.

Anderenfalls käme es zu einer starken Beeinträchtigung des pH-Wertes während der Reak-

tion, was die Inaktivierung der eingesetzten Enzyme zur Folge hätte.

Dass ein hydrogenasegekoppeltes Cofaktorregenerierungssystem grundsätzlich realisierbar

ist, wurde bislang mittels verschiedener Hydrogenasen demonstriert. So konnte bereits gezeigt

Einleitung 19

werden, dass sich mithilfe der löslichen Hydrogenase aus Pyrococcus furiosus NADPH mit

einer hohen Effizienz regenerieren lässt [Mertens et al., 2003]. Darüber hinaus wurde die

generelle Realisierbarkeit der NADH-Regenerierung unter anderem mit einer Hydrogenase

aus Desulfovibrio vulgaris [Hilhorst et al., 1993] sowie mit der SH gezeigt, wobei die Umset-

zung mit der SH ihren Einsatz in der isolierten Form [Andersson et al., 1998, Klibanov und

Puglisi, 1980] als auch den Einsatz der ganzen Zellen [Hasumi et al., 1992, Okura et al.,

1990, Otsuka et al., 1989, Payen et al., 1983] einschloss. Eine ausgiebige Bewertung und ein

Vergleich mit der konventionell genutzten FDH wurden jedoch bislang nicht vorgenommen,

wodurch noch keine Aussagen über die Effizienz des SH-katalysierten Cofaktorregenerie-

rungssystems getroffen werden konnten.

Einleitung 20

1.6 Zielsetzung

Die asymmetrische Synthese chiraler Substanzen wie Hydroxysäuren, Aminosäuren oder

Alkohole mittels Oxidoreduktasen erfordert häufig den Einsatz des Cofaktors NADH, wes-

halb eine Regenerierung dieses Cofaktors im Reaktionsansatz für eine ökonomische Prozess-

führung unerlässlich ist. Da das gegenwärtig etablierte Verfahren, das die Formiatdehydroge-

nase aus Candida boidinii (FDH) als Cofaktorregenerierungsenzym nutzt, noch immer eine

geringe Effizienz besitzt, besteht das Bestreben ein alternatives und effizienteres Regenerie-

rungssystem bereitzustellen. Ein besonderes Interesse wird in diesem Zusammenhang dem

Einsatz eines hydrogenasegekoppelten Regenerierungssystems beigemessen, vorausgesetzt es

handelt sich um eine bidirektionale Hydrogenase, die neben der Bindestelle zur Umsetzung

von molekularem Wasserstoff eine zweite für die Reduktion von NAD besitzt. Eine Hydroge-

nase, die diese Voraussetzung erfüllt und sich zudem durch eine geringe Sensitivität gegen-

über Sauerstoff auszeichnet, ist die lösliche Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16 (SH).

Für eine solche technische Anwendung der SH erfolgte jedoch bislang noch keine umfassende

Charakterisierung, Bewertung sowie eine gezielte Anpassung des Enzyms an die geforderten

Prozessbedingungen.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst eine umfassende Charakterisierung der überexpri-

mierten und mittels Strep-Tactin®-Affinitätschromatographie aufgereinigten, hexameren SH

erfolgen, da in diesem Bereich nur unzureichend Literaturdaten existieren. Dazu sollte der

Einfluss verschiedener isolierter und technisch relevanter Faktoren auf die Aktivität und

Lagerungsstabilität der SH analysiert werden. Bei den zu untersuchenden Parametern sollte es

sich um die Temperatur, den pH-Wert, verschiedene Salze, unterschiedliche wasserlösliche

und -unlösliche organische Lösungsmittel sowie ionische Flüssigkeiten, verschiedene Additi-

ve und die mechanische Beanspruchung handeln. Zudem sollte die gegenseitige Beeinflus-

sung des pH-Wertes und der Temperatur bezogen auf die Enzymaktivität und -stabilität mit-

tels design of experiments (DOE, statistische Versuchsplanung) analysiert und die optimalen

Bedingungen für eine maximale Aktivität und Stabilität sowie einer Balance zwischen den

beiden Größen ermittelt werden. Basierend auf der Kenntnis dieser technisch relevanten

Faktoren und deren Einfluss auf die Aktivität und Stabilität der SH sollte eine Bewertung der

SH hinsichtlich ihres Einsatzes bei der Regenerierung von NADH erfolgen.

Einleitung 21

Basierend auf den Resultaten der Enzymcharakterisierung sollte die gezielte Stabilisierung

der SH gegenüber deaktivierenden Einflüssen wie der Gegenwart organischer Lösungsmittel,

ionischer Flüssigkeiten und unter mechanische Beanspruchung erfolgen. Da sich die

Stabilisierung eines komplexen, heteromeren Enzyms wie der SH durch molekularbiologische

Methode sehr aufwändig gestaltet, sollte die Stabilisierung der SH über die chemische

Modifizierung der Proteinoberfläche und die adsorptive sowie kovalente Immobilisierung auf

einen geeigneten Träger erfolgen. Dazu sollte für beide Immobilisierungsformen eine Opti-

mierung des Immobilisierungsverfahrens durchgeführt und zudem eine Bewertung der er-

zielten Enzymstabilisierung vorgenommen werden. Durch die Immobilisierung der SH sollte

neben einer Stabilisierung der SH die Entwicklung eines handhabbareren, rezyklierbaren Bio-

katalysators, der eine kontinuierliche Prozessführung erlaubt, erreicht werden.

Schlussendlich sollte die SH in ihrer nativen sowie in ihrer stabilisierten Form bei der

reduktiven Regenerierung von NADH eingesetzt werden. Als Modellreaktion sollte dabei die

durch die Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis (CPCR) katalysierte Reduktion von

Acetophenon zu (S)-1-Phenylethanol dienen. Anhand der Bestimmung der Reaktionsumsätze

sowie der Berechnung der erreichten Umsatzzahlen (TTN) sollte die Effizienz dieses

Regenerierungssystems ermittelt und über den Vergleich mit dem gegenwärtig etablierten

FDH-gekoppelten System bewertet werden.

Material und Methoden 22

2 Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Chemikalien

Acetophenon Sigma Aldrich (Steinheim)

AmmoengTM 101 RWTH Aachen (AK Leitner)

Biorad Protein Assay Biorad (München)

[BMIM][BF4] Roth (Karlsruhe)

[BMIM][OTf] Roth (Karlsruhe)

D-Desthiobiotin Sigma Aldrich (Steinheim)

DTT Roth (Karlsruhe)

DMF Roth (Karlsruhe)

DMSO Roth (Karlsruhe)

[EMIM][EtSO4] Roth (Karlsruhe)

FMN Sigma Aldrich (Steinheim)

[HMIM][Cl] Roth (Karlsruhe)

IPTG Roth (Karlsruhe)

Isopropanol Roth (Karlsruhe)

MTBE Roth (Karlsruhe)

[MTEOA][MeSO4] RWTH Aachen (AK Leitner)

n-Heptan Roth (Karlsruhe)

NAD+ Roth (Karlsruhe)

NADH (Kaliumsalz) Sigma Aldrich (Steinheim)

NADH (Natriumsalz) Roth (Karlsruhe)

Rotiphorese® Gel 40 Roth (Karlsruhe)

Toluol Roth (Karlsruhe)

Material und Methoden 23

Alle nicht aufgeführten Chemikalien wurden von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck

(Darmstadt), Roth (Karlsruhe) oder Sigma-Aldrich (Steinheim) bezogen und waren mindes-

tens analysenrein (p.a.).

2.1.2 Sonstige Materialien

Durchfluss Strep-Tactin® Superflow® Säule IBA (Göttingen)

FDH (58,3 U mL-1) Sigma Aldrich (Steinheim)

Ni-NTA-Säule Qiagen (Hilden)

Page RulerTM Prestained Protein Ladder Fermentas (Leon-Rot)

Page BlueTM Protein Staining Solution Fermentas (Leon-Rot)

Roti®-Load (4 x) Roth (Karlsruhe)

Plasmide und Stämme

Ralstonia eutropha HF210(pHG1) (Humboldt Universität Berlin, AK

Friedrich/Lenz)

[Kortlücke und Friedrich, 1992]

pGE760 41.2kB, SH Operon (StrepHoxF)

∆hoxBCJ in pEDY309 TcR RK2 ori

Mob+ (Humboldt Universität Berlin, AK

Friedrich/Lenz)

[Josta Hamann, Oliver Lenz, Lars

Lauterbach, unveröffentlicht]

E. coli BL21(DE3) [F- ompT gal dcm lon hsdSB (rB- m

B-)

λ(DE3 [lacI lacUV5-T7gege 1 ind1 sam7

nin5])] (Novagen)

pET26b(+)CPCRhis 6.266 kb, PT7lac, KanR, lacI, ColE1-

Replikon

Träger für die Enzymimmobilisierung

AmberliteTM XAD 761 Rohm und Haas (Chauny, Frankreich)

AmberliteTM XAD 7HP Rohm und Haas (Chauny, Frankreich)

AmberliteTM FPA 54 Rohm und Haas (Chauny, Frankreich)

Material und Methoden 24

AmberliteTM FPC 3500 Rohm und Haas (Chauny, Frankreich)

CV-IB-A161 Chiralvision (Leiden, Niederlande)

CV-IB-C435 Chiralvision (Leiden, Niederlande)

Sepabeads® EC-EP Resindion S.R.L (Binasco, Italien)

2.1.3 Geräte

Elektrophorese (SDS-PAGE) Xcell SureLockTM Mini-Cell, Invitrogen

(Karlsruhe)

FPLC Amersham Bioscience Europa GmbH

(Freiburg)

Gaschromatograph GC-2010 Shimadzu (Kyoto, Japan)

Geldokumentation Alpha Innotech (Hessisch Oldendorf)

Inkubator Memmert (Schwabach)

Inkubationsschüttler Infors AG (Bottmingen, Schweiz)

Autoklav HSP Steriltechnik AG (Magdeburg)

Magnetrührer VWR (Darmstadt)

pH-Meter Metrohm (Filderstadt, Plattenhardt)

Rotationsverdampfer Büchi (Essen)

Thermoblock Peqlab (Erlangen)

Thermoschränke Aqualytic (Dortmund)

Überkopfschüttler 3025 GFL (Burgwedel)

Ultraschallgeräte:

Ultraschallbad Sonorex RK106 Bandelin (Berlin)

Ultraschallstab Labsonic M Satorius (Göttingen)

UV-Vis-Spektrometer Cary 50 Varian (Darmstadt)

Vortexer Genius 3 IKA (Staufen)

Waage Sartorius (Göttingen)

Zentrifugen:

Minispin Plus Eppendorf AG (Hamburg)

Biofuge Stratos Heraeus, Thermo Fisher Scientific (Bonn)

Material und Methoden 25

2.1.4 Medien und Puffer

FN-/FGN-Medium (SH)

Tabelle 2.1 Zusammensetzung von FN- und FGN-Medium pro Liter.

Komponenten FN-Medium

Masse [g]

FGN-Medium

Masse [g]

Na2HPO4 x 2 H2O 4,47 4,47

KH2PO4 1,5 1,5

MgSO4 x 7 H2O 0,02 0,02

FeCl3 0,0003 0,0003

CaCl2 x 2 H20 0,001 0,001

NiCl2 0,000013 0,000013

ZnCl2 0,000014 0,000014

NH4Cl 0,2 0,2

Fructose 0,4 0,2

Glycerin - 0,2

ZnSO4 x 7 H20 0,0001 0,0001

MnCl2 x 4 H20 0,00003 0,00003

H3BO3 0,0003 0,0003

CoCl2 x 6 H20 0,0002 0,0002

CuCl2 x 2 H20 0,00001 0,00001

Na2MoO4 x 2 H20 0,00003 0,00003

Die Selektion erfolgte durch Zusatz von 0,1 µg mL-1 Tetrazyclin.

LB-Medium (CPCR)

Zusammensetzung pro Liter: 10 g Bacto-Trypton; 10 g NaCl; 5 g Hefeextrakt.

Die Selektion erfolgte durch Zusatz von 25 µg mL-1 Kanamycin.

Laufpuffer für SDS-Gel (pH 8,3)

Zusammensetzung pro Liter: 14,4 g Glycerin; 3 g Tris; 1 g SDS.

Material und Methoden 26

Puffer zur Aufreinigung der SH:

Lysepuffer (pH 7,0)

0,05 M K2HPO4/KH2PO4; 0,05 M Dinatriumsuccinat; 0,5 mM NiCl2; 0,005 M MgCl2.

Waschpuffer (pH 7,1)

0,05 M K2HPO4/KH2PO4.

Elutionspuffer (pH 7,0)

0,05 M K2HPO4/KH2PO4; 0,005 M D-Desthiobiotin.

Puffer zur Aufreinigung der CPCR:

Lysepuffer (pH 8,0)

0,05 M NaH2PO4; 0,3 M NaCl; 0,02 M Imidazol.

Waschpuffer (pH 8,0)

0,05 M NaH2PO4; 0,3 M NaCl; 0,08 M Imidazol.

Elutionspuffer (pH 8,0)

0,05 M NaH2PO4; 0,3 M NaCl; 0,25 M Imidazol.

Entsalzungspuffer (pH 8,0)

0,05 M TEA/HCl; 0,15 M NaCl.

2.2 Bereitstellung der Enzyme

2.2.1 Lösliche Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16

Kultivierung von Ralstonia eutropha

Die Kultivierung von Ralstonia eutropha erfolgte in 1 L-Schüttelkolben. Als Medium diente

FGN, das mit dem Selektionsmarker Tetrazyklin versetzt wurde. Die FGN-Hauptkulturen

wurden 1:50 mit einer 3 Tage FN-Vorkultur beimpft und etwa 48 Stunden bei ebenfalls 30 °C

Material und Methoden 27

und 150 Upm bis zum Erreichen einer OD436 von 8-11 inkubiert. Die Zellernte erfolgte

mittels Zentrifugation (10 min, 7500 Upm, 4 °C) und anschließender Resuspension in 0,05 M

Kaliumphosphatpuffer (pH 7.0) sowie einer abschließenden Zentrifugation. Die Zellpellets

wurden bei mindestens -20 °C gelagert.

Proteinaufreinigung

Die Zellen wurden zunächst auf Eis aufgetaut und anschließend in Lysepuffer resuspendiert

(2 mL g-1 Zellfeuchtgewicht). Nach Zugabe von EDTA-freien Proteaseinhibitoren wurde der

Ansatz abermals für eine Zeitdauer von 10 Minuten auf Eis gehalten. Im Anschluss erfolgte

der Zellaufschluss mittels gepulsten Ultraschalls in 5 Zyklen über je 5 Minuten mit jeweils 1

Minute Pause auf Eis. Die Abtrennung der Trümmer erfolgte durch Zentrifugation unter

Argonatmosphäre (60 min, 15000 Upm, 4 °C). Im Anschluss wurde der gesamte Überstand

mit Sauerstoff begast und bei 4 °C etwa 15 Minuten lang gerührt.

Die Aufreinigung der SH erfolgte über den C-terminalen Strep-tag unter Verwendung einer

Durchfluss Strep-Tactin®-Säule mit einem Matrixvolumen von 5 mL und ebenfalls bei 4 °C.

Vor der Beladung der Strep-Tactin®-Säule wurde diese mit Waschpuffer equilibriert und der

Enzymrohextrakt filtriert. Im Anschluss wurden zunächst ungebundene und unspezifisch ge-

bundene Proteine von der Matrix mit 3-5 Säulenvolumen Waschpuffer gewaschen, bevor

selektiv das Zielprotein eluiert wurde. Dies erfolgte unter Verwendung von 6 x 0,5 Säulen-

volumen Elutionspuffer. Die SH wurde unter Zugabe von 5 % Glycerin bei -80 °C gelagert.

2.2.2 Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis

Kultivierung von Candida parapsilosis

Die Expression der rekombinanten CPCR mittels der entsprechenden E.coli Zellen erfolgte in

1 L-Schüttelkolben. Als Medium diente LB, das mit dem Selektionsmarker Kanamycin ver-

setzt wurde. Die Hauptkulturen wurden 1:50 mit einer Übernacht-Vorkultur beimpft und bei

37 °C und 250 Upm bis zum Erreichen einer OD600 von 0,8-1 inkubiert. Die Expression wur-

de durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert und erfolgte für etwa 6 Stunden ebenfalls bei

37 °C und 250 Upm. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation geerntet (30 min, 7500 Upm,

4 °C), in 0,02 M Tris/HCl-Puffer (pH 8.0) resuspendiert und erneut über eine Zeitdauer von

25 Minuten zentrifugiert. Die Zellpellets wurden bei mindestens -20 °C gelagert.

Material und Methoden 28

Proteinaufreinigung

Die Zellen wurden zunächst auf Eis aufgetaut und anschließend in Lysepuffer resuspendiert

(4 mL g-1 Zellfeuchtgewicht). Nach Zugabe von 1 mg mL-1 Lysozym erfolgte eine weitere

Inkubation unter Rühren über eine Zeitdauer von 30 Minuten auf Eis. Nach der darauffolgen-

den Zugabe von 5 µg mL-1 DNaseΙ und 1 % (v/v) TritonX100 wurde der Ansatz ebenfalls für

10 Minuten auf Eis gehalten. Der anschließende Zellaufschluss erfolgte mittels gepulsten

Ultraschalls in 6 Zyklen über je 30 Sekunden mit jeweils 1 Minute Pause auf Eis. Die

Zelltrümmer wurden schließlich durch Zentrifugation abgetrennt (30 min, 15000 Upm, 4 °C).

Die Aufreinigung der CPCR erfolgte über den N-terminalen His-tag unter Verwendung eines

FPLC-Systems mit einer Ni-NTA-Säule mit einem Matrixvolumen von 5 mL. Vor der Bela-

dung der Ni-NTA-Säule wurde diese mit Lysepuffer equilibriert und der gesamte Überstand

des Zellaufschlusses filtriert. Nach Auftragung des Enzymrohextraktes auf die Ni-NTA-Säule

wurden zunächst ungebundene und unspezifisch gebundene Proteine von der Matrix ge-

waschen, bevor im Anschluss selektiv das Zielprotein eluiert wurde. Dies erfolgte durch die

direkte Erhöhung der Imidazolkonzentration von 0,001 M auf 0,25 M. Die Flussrate entsprach

stets 5 mL min-1. Die CPCR wurde unter Zugabe von 50 % Glycerin bei -20 °C gelagert.

2.3 Proteinmengenbestimmung nach Bradford

Die Proteinkonzentrationen wurde nach der Methode von Bradford bestimmt [Bradford,

1976]. Die Quantifizierung des Proteins erfolgte dabei durch die Reaktion mit Coomassie

Brilliant Blue spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 595 nm. Unter Verwendung

von Rinderserumalbumin (BSA) wurde in einem Konzentrationsbereich von 5-25 μg

kalibriert. Jeweils 800 μL der entsprechenden Proben wurden mit 200 μL Bradfordreagenz

versetzt und nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) vermessen.

2.4 SDS-PAGE

Der Proteinnachweis erfolgte über Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

(SDS-PAGE). Die genaue Zusammensetzung des Sammel- bzw. Trenngels ist Tabelle 2.2 zu

entnehmen.

Material und Methoden 29

Tabelle 2.2 Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel.

Sammelgel (5 %) Trenngel (12 %)

Dest. Wasser 6,45 mL 4,35 mL

Acrylamid (40 %) 4,5 mL 0,5 mL

1 M Tris/HCl (pH 6,8) - 1,75 mL

1,5 M Tris/HCl (pH 8,8) 3,75 mL -

SDS 10 % (w/v) 0,15 mL 0,6 mL

APS 10 % (w/v) 0,15 mL 0,6 mL

TEMED 0,006 mL 0,006 mL

Die Proteinproben wurden 1:1 mit dem Probepuffer Roti®-Load (4x) versetzt und bei 95 °C 5

Minuten denaturiert. Im Anschluss wurde ein Probevolumen von jeweils 20 µL in die Probe-

tasche gegeben. Als Standard zur Bestimmung des Molekulargewichts der Proteine diente

Page RulerTM Prestained Protein Ladder, von dem 5 µL ebenfalls in eine der Probetaschen ge-

geben wurde. Die Gelelektrophorese erfolgte bei einer konstanten Spannung von 180 Volt für

1-1,5 Stunden. Anschließend wurde das Gel 30 Minuten in destilliertem Wasser gewaschen

und die Proteinbanden mit Page BlueTM Protein Staining Solution über Nacht angefärbt. Die

Entfärbung nicht proteinhaltiger Gelbereiche erfolgte wiederum mit destilliertem Wasser. Die

Dokumentation der Proteinbanden erfolgte mittels einer Geldokumentation.

2.5 Charakterisierung der SH

2.5.1 Bestimmung der Enzymaktivität

Die Aktivität der SH wurde spektralphotometrisch über die wasserstoffabhängige Bildung

von NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm ermittelt. Das Reaktionsvolumen betrug 1 mL

und setzte sich wie folgt zusammen:

Puffer 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0)

NAD+ 1 mM

FMN 1 µM

Material und Methoden 30

Die Reaktionslösung wurde in eine Küvette überführt und mit einem gasdichten Septum ver-

sehen. Im Anschluss wurde die gesamte Lösung mit Wasserstoff gesättigt und die Reaktion

durch die Zugabe von 1-10 µL Enzym gestartet. Die Zunahme der Absorption wurde für 1

Minute bei RT verfolgt, das Messintervall entsprach 1 Sekunde. Die molare Konzentration

von NADH wurde mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten aus der gemessenen Extinktion

unter Verwendung des Lambert- Beerschen Gesetzes (Gleichung 2.1) berechnet.

dcExt







Gleichung 2.1

wobei Ext der Extinktion [-],



dem Extinktionskoeffizienten [L mol-1 cm-1], c der Konzen-

tration [mol L-1] und d der Schichtdicke [cm] entspricht. Die Berechnung der volumetrischen

Enzymaktivität erfolgte demnach nach der folgenden Gleichung:

ges

v





340



Gleichung 2.2

wobei v

A der volumetrischen Aktivität [U mL-1],



der Extinktionsdifferenz über die Zeit

[-], ges

V dem Gesamtvolumen der Reaktion [mL], E

V dem Enzymvolumen [mL] und 340



dem Extinktionskoeffizienten von NADH bei 340 nm [6220 L mol-1 cm-1] entspricht. Die

Schichtdicke der Küvette beträgt 1 cm. Demnach ist eine Unit (U) der SH als die Enzym-

menge definiert, die die Reduktion von 1 µmol NAD+ pro Minute katalysiert.

2.5.2 Untersuchung der Enzymaktivität in Abhängigkeit verschiedener

isolierter Einflüsse

Die Untersuchung der Enzymaktivität erfolgte in Abhängigkeit von verschiedenen reaktions-

relevanten Parametern [Temperatur, pH, Salze, wasserlösliche und -unlösliche organische

Lösungsmittel, ionische Flüssigkeiten (ILs) und Additive], deren Einfluss nacheinander unab-

hängig von einander analysiert wurde. Hiebei wurde die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit,

wie in Kapitel 2.5.1 beschrieben, bestimmt. Die jeweiligen, für die verschiedenen Parameter

untersuchten Bedingungen sind nachfolgend beschrieben.

Material und Methoden 31

Temperatureinfluss

Der Temperatureinfluss wurde durch die Ermittlung der Enzymaktivität bei verschiedenen

Temperaturen (25, 30, 35, 40, 45 °C) in 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) untersucht.

pH-Einfluss

Die Untersuchung des pH-Einflusses erfolgte anhand der Bestimmung der Enzymaktivität bei

verschiedenen pH-Werten (7, 7,5, 8, 8,5, 9). Für die Einstellung des pH wurde stets ein

0,05 M Tris/HCl-Puffer verwendet, wobei die Reaktionstemperatur 35 °C betrug.

Einfluss verschiedener Salze

Für die Untersuchung der Enzymaktivität in Abhängigkeit von Salzen wurde diese in Gegen-

wart von NaCl, Na2SO4, Na2HPO4, KCl, K2SO4, K2HPO4, (NH4)Cl, (NH4)2SO4 und

(NH4)2HPO4 bestimmt. Die Salzkonzentration betrug 0,1 M. Die Reaktion wurde in einem

Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) bei 35 °C durchgeführt.

Einfluss von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln

Bei der Untersuchung des Einflusses von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln auf

die Enzymaktivität wurden mehrere funktionell unterschiedliche Lösungsmittel ausgewählt,

wobei es sich um DMF, DMSO und Isopropanol handelte. Die Lösungsmittel wurden zu

einem Anteil von jeweils 10 und 25 % (v/v) dem Reaktionssystem zugesetzt. Die Bestim-

mung der Enzymaktivität erfolgte bei 35 °C in einem Tris/HCl-Puffer (pH 8,0).

Einfluss von wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln

Die Untersuchung der Enzymaktivität in Gegenwart von wasserunlöslichen organischen

Lösungsmitteln erfolgte unter der Verwendung funktionell unterschiedlicher Lösungsmittel,

wobei es sich um MTBE, Toluol und n-Heptan handelte. Der für die Reaktion verwendete

Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) wurde hierbei mit dem jeweiligen Lösungsmittel gesättigt und die

Enzymaktivität bei 35 °C bestimmt.

Einfluss von ionischen Flüssigkeiten

Der Einfluss von ILs auf die Enzymaktivität wurde unter Verwendung verschiedener wasser-

löslicher ILs durchgeführt. Dabei handelte es sich um AmmoengTM 101, [BMIM][BF4],

Material und Methoden 32

[BMIM][OTf], [EMIM][EtSO4], [HMIM][Cl] und [MTEOA][MeSO4], die dem Reaktions-

system zu einem Anteil von jeweils 2,5, 5 und 10 % (v/v) zugesetzt wurden. Die Reaktion

wurde in einem Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) bei 35 °C durchgeführt.

Einfluss von Additiven

Die Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Additiven auf die Enzymaktivität erfolg-

te unter Verwendung von jeweils 1 und 3 µM FMN, 0,5 mM und 1 mM DTT, 0,5 mM TCEP,

0,2 M Ascorbinsäure, 0,05 M PEG400 und 0,05, 0,1 und 0,25 M Glycerin. Die Reaktion wurde

in einem Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) bei 35 °C durchgeführt.

Bei allen Messungen der Enzymaktivität unter den verschiedenen Reaktionsbedingungen

erfolgte eine Dreifachbestimmung der Aktivität zur statistischen Sicherung der Ergebnisse.

2.5.3 Bestimmung der Enzymstabilität

Die Stabilität der SH wurde über die zeitliche Abnahme der Enzymaktivität und der daraus

resultierenden Inaktivierungskonstante bestimmt. Dazu wurde das Enzym unter definierten

Bedingungen inkubiert und die Restaktivität in regelmäßigen Abständen bestimmt. Dazu

wurde dem Inkubationsansatz ein definiertes Volumen entnommen und die Enzymaktivität,

wie unter 2.5.1 beschrieben ist, ermittelt. Die Inkubation des Enzyms fand bei allen

Messungen unter aeroben Bedingungen statt.

Die Quantifizierung der Enzymstabilität erfolgte über die Halbwertszeit, die sich aus der

Inaktivierungskonstante berechnen lässt (Gleichung 2.3) und als diejenige Zeit definiert ist,

nach der das Enzym 50 % seiner Ausgangsaktivität zurückbehalten hat.

t2ln

2/1  Gleichung 2.3

wobei 2/1

t der Halbwertszeit [h] und k der Inaktivierungskonstante entspricht [h-1].

Material und Methoden 33

2.5.4 Untersuchung der Enzymstabilität in Abhängigkeit verschiedener isolier-

ter Einflüsse

Die Untersuchung der Enzymstabilität erfolgte analog zu den Untersuchungen der Enzym-

aktivität in Abhängigkeit von Temperatur, pH, Salzen, wasserlöslichen und -unlöslichen orga-

nischen Lösungsmitteln, ILs, sowie Additiven. Dabei wurden die verschiedenen Einfluss-

größen unabhängig von ihrer gegenseitigen Beeinflussung nacheinander untersucht.

Temperaturstabilität

Die Analyse der Temperaturstabilität wurde über die Inkubation des Enzyms in einem 0,05 M

Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) bei verschiedenen Temperaturen (4, 15, 25, 35, 45 °C) durchgeführt.

pH-Stabilität

Die pH-Stabilität wurde bei pH 7, 7,5, 8, 8,5 und 9 in 0,05 M Tris/HCl-Puffer untersucht. Die

Inkubationstemperatur betrug stets 35 °C.

Salzstabilität

Zur Untersuchung der Salzstabilität wurde das Enzym in Gegenwart verschiedener Salze

(NaCl, Na2SO4, Na2HPO4, KCl, K2SO4, K2HPO4, (NH4)Cl, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4) inku-

biert, die dem Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) in einer Konzentration von 0,1 M zugesetzt wurden.

Die Inkubation erfolgte bei 35 °C.

Lösungsmittelstabilität

Die Untersuchung der Lösungsmittelstabilität erfolgte zum einen unter Verwendung wasser-

löslicher und zum anderen unter Verwendung wasserunlöslicher organischer Lösungsmittel.

Dabei handelte es sich um funktionell unterschiedliche Lösungsmittel. Die Untersuchung des

Einflusses von wasserunlöslichen Lösungsmitteln umschloss den Einsatz von DMF, DMSO

und Isopropanol, die dem Inkubationsansatz zu einem Anteil von 10 % zugesetzt wurden. Der

verwendete Puffer war stets Tris/HCl-Puffer (pH 8,0). Bei der Untersuchung der

Enzymstabilität in Abhängigkeit von wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln wurden

MTBE, Toluol und n-Heptan eingesetzt. Hierbei wurde der verwendete Puffer mit dem jewei-

ligen Lösungsmittel gesättigt. Die Inkubation erfolgte bei 35 °C.

Material und Methoden 34

IL-Stabilität

Die Untersuchung der IL-Stabilität erfolgte unter Verwendung von AmmoengTM 101,

[BMIM][BF4], [BMIM][OTf], [EMIM][EtSO4], [HMIM][Cl] und [MTEOA][MeSO4], die

dem Reaktionssystem zu einem Anteil von jeweils 2,5, 5 und 10 % (v/v) zugesetzt wurden.

Die Inkubation erfolgte in einem Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) bei 35 °C.

Stabilität in Gegenwart verschiedener Additive

Bei der Untersuchung der Enzymstabilität in Gegenwart verschiedener Additive wurden je-

weils 1 µM FMN, 0,25 mM Kaliumhexacyanoferrat, 0,05 M PEG400 sowie 0,05, 0,1 und 0,25

M Glycerin dem Inkubationsansatz zugesetzt. Die Inkubation erfolgte in einem Tris/ HCl-

Puffer (pH 8,0) bei 35 °C.

Mechanische Stabilität

Bei der Untersuchung der mechanischen Enzymstabilität wurde der Einfluss von Scherkräften

in Form eines KPG-Rührers (400 Upm) und eines Magnetrührers (400 und 800 Upm) analy-

siert. Die Inkubation erfolgte in einem Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) bei 35 °C.

Bei allen Messungen der Enzymstabilität unter den verschiedenen Inkubationsbedingungen

erfolgte eine Dreifachbestimmung der Halbwertszeit zur statistischen Sicherung der Ergeb-

nisse.

2.5.5 Untersuchung der Enzymaktivität und -stabilität mittels Design of

Experiments

Durch den Einsatz von design of experiments (DOE, statistische Versuchsplanung) lassen sich

im Gegensatz zu klassischen Methoden Wechselwirkungen zwischen mehreren Einflussgrö-

ßen auf eine Zielgröße ermitteln, da über statistische Zusammenhänge alle Faktoren gleichzei-

tig variiert werden können [Siebertz et al., 2010]. Bei den untersuchten Zielgrößen handelte

es sich um die Enzymaktivität und -stabilität, die in Abhängigkeit von der Temperatur und

dem pH unter Berücksichtigung derer gegenseitigen Beeinflussung analysiert wurden. Die

Temperatur und der pH stellten hierbei quantitative Faktoren dar, die einfach variiert werden

konnten. Die beiden Einflussgrößen wurden in 2 Stufen festgelegt, wobei der Versuchsplan

nach dem Central-Composite-Design erstellt wurde. Hierbei entstehen ein Würfel und ein

Material und Methoden 35

Stern, wobei der Würfel dem zweistufigen Versuchsplan entspricht und der Stern aus der

Variation der einzelnen Faktoren, ausgehend von der Mittelstellung, dem sogenannten center

point, resultiert, wie in Abbildung 2.1 nach Siebertz et al., 2010 dargestellt ist. Der

Stufenabstand übersteigt dabei den des Würfels, wodurch letztlich jeder Faktor auf 5 Stufen

getestet wird und sich somit die Möglichkeit bietet, auch nichtlineare Zusammenhänge zu

analysieren.

Abbildung 2.1 Die dreidimensionale Konfiguration eines Central-Composite-Designs.

Die Anzahl der Versuche sowie die Faktorkombination des einzelnen Versuchs können dem

Versuchsplan entnommen werden, der in Abbildung 2.2 gezeigt ist.

Abbildung 2.2 Der nach dem Central-Composite-Design erhaltene Versuchsplan für zwei

Faktoren (Temperatur, pH) mit der jeweiligen Faktorkombination, bei denen die Enzym-

aktivität und -stabilität untersucht wurden.

Material und Methoden 36

Die Untersuchung der Enzymaktivität und -stabilität erfolgte unter den entsprechenden Tem-

peratur- und pH-Bedingungen in 0,05 M Tris/HCl-Puffer. Die Quantifizierung der Enzym-

stabilität erfolgte, wie bereits beschrieben, über die Halbwertszeit (Kapitel 2.5.3).

2.6 Bestimmung der Enzymaktivität der CPCR und FDH

CPCR

Die Bestimmung der Aktivität der CPCR erfolgte spektralphotometrisch über den Verbrauch

von NADH, welches bei der Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol stöchiometrisch

zu NAD+ oxidiert wird. Die Abnahme der Absorption wurde bei 340 nm für 1 Minute und bei

30 °C gemessen. Das Reaktionsvolumen betrug 1 mL und setzte sich wie folgt zusammen:

Puffer 0,1 M TEA/HCl-Puffer (pH 7,5)

Acetophenon 0,3 mM

NADH 0,3 mM

Die Reaktionslösung wurde zunächst vortemperiert und dann in eine Küvette überführt. Im

Anschluss wurde die Reaktion durch die Zugabe von 10 µL Enzym gestartet. Demnach ent-

spricht eine Unit CPCR der Enzymmenge, die die Reduktion von 1 µmol Acetophenon pro

Minute katalysiert.

FDH

Die Bestimmung der Aktivität der FDH erfolgte spektralphotometrisch über die Reduktion

von NAD+, wobei die Bildung von NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm über 1 Minute

und bei 30 °C verfolgt wurde. Als Substrat diente Natriumformiat. Das Reaktionsvolumen be-

trug 1 mL und setzte sich wie folgt zusammen:

Puffer 0,1 M TEA/HCl-Puffer (pH 7,5)

Natriumformiat 0,25 M

NAD+ 1,7 mM

Die Reaktionslösung wurde zunächst vortemperiert und dann in eine Küvette überführt. Im

Anschluss wurde die Reaktion durch die Zugabe von 5 µL Enzym gestartet. Demnach ent-

Material und Methoden 37

spricht eine Unit FDH der Enzymmenge, die die Umsetzung von 1 µmol Natriumformiat pro

Minute katalysiert.

Die Berechnung der Aktivität der CPCR und FDH erfolgte analog zu den Berechnungen der

Aktivität der SH.

2.7 Chemische Modifizierung der SH mit Methoxypolyethylenglykol

(mPEG)

2.7.1 Aktivierung von Methoxypolyethylenglycol

Die Aktivierung des verwendeten mPEG2000 und mPEG5000 erfolgte mittels p-Nitrophenyl-

chloroformat nach der Methode von Hernáiz et al., 1997. Jeweils 10 g mPEG wurden in

20 mL wasserfreiem Acetonitril gelöst. Im Anschluss wurde eine Lösung bestehend aus

0,7 mL Triethylamin und 1 g p-Nitrophenylchloroformat zugegeben. Das Gemisch wurde für

20 Stunden bei RT und unter einer Stickstoff-Schutzgasatmosphäre gerührt, wobei ein weißer

Niederschlag bestehend aus Triethylaminchlorid und mPEG entstand. Dieser wurde nach Ab-

lauf der Reaktion abfiltriert und anschließend verworfen. Im nächsten Schritt wurde das Fil-

trat mit 200 mL wasserfreiem Diethylether versetzt und auf 4°C gekühlt. Es entstand ein wie-

ßer Niederschlag bestehend aus dem Produkt und nicht aktiviertem PEG und eine gelbliche

zweite Phase bestehend aus überschüssigem Edukt. Zur Aufreinigung wurde der Niederschlag

abfiltriert, getrocknet und anschließend in 10 mL wasserfreiem Acetonitril resolviert. Zu

dieser Lösung wurden 200 mL wasserfreier Diethylether gegeben und auf 4°C gekühlt. Der

hierbei entstandene Niederschlag wurde erneut abfiltriert und getrocknet. Dieser Schritt wurde

insgesamt viermal wiederholt, bis kein p-Nitrophenylchloroformat mehr nachgewiesen wer-

den konnte. Anschließend wurden Proben entnommen und mittels 1H-NMR analysiert.

1H-NMR p-Nitrophenyl-mPEG-carbonat:

(CDCl3, 200 MHz, 20 °C): δ (ppm) = 8.53-8.63 (m, 2H), 8.28-8,35 (m, 2H), 3.69 (s, 4H), 3.37

(s, 3H)

Material und Methoden 38

2.7.2 Bestimmung des Aktivierungsgrades von p-Nitrophenyl-mPEG-carbonat

durch alkalische Hydrolyse

Die Bestimmung des Aktivierungsgrades des mPEG erfolgte über die spektralphotometrische

Quantifizierung von p-Nitrophenol, welches bei der Esterhydrolyse aus p-Nitrophenyl-

mPEG-carbonat freigesetzt wird. Hierbei wurden 0,16 g aktiviertes mPEG pro Liter destillier-

tes Wasser gelöst. Die Hydrolyse wurde durch die Zugabe von 1 M NaOH (1,2 μL mL-1) initi-

iert, wobei die Carbonatgruppen der aktivierten mPEG durch NaOH hydrolysiert und dabei

neben mPEG p-Nitrophenol und Kohlendioxid freigesetzt werden. Die Lösung wurde für 40

Minuten unter leichtem Rühren bei RT vermischt und die Freisetzung des p-Nitrophenols an-

schließend spektralphotometrisch bei 400 nm gemessen. Die Konzentration des p-Nitro-

phenols wurde dann mittels einer entsprechenden Kalibrierung (0 - 0,1725 mM) berechnet.

2.7.3 Modifizierung des Enzyms

Für die Modifizierung der SH wurde zunächst eine Enzymlösung (1 mg mL-1) in 0,05 M

Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) hergestellt. Zu dieser Lösung wurde aktiviertes mPEG2000 bzw.

mPEG5000 in molaren Überschüssen von 500- und 1000-fach gegeben. Die Modifizierung er-

folgte bei 4 °C unter Rühren für 1 Stunde. Im Anschluss wurde die Lösung dann mittels

Ultrazentrifugation über Zentrifugenfilter mit einer Ausschlussgröße von 10 kDa (8 Zentrifu-

gationsschritte) aufgereinigt [Hernáiz et al., 1997]. Die Filter dienten dabei der Entfernung

von freigesetztem p-Nitrophenol und nicht reagiertem mPEG, während modifiziertes Enzym

im Retentat zurückgehalten werden. Im Anschluss wurde das modifizierte Enzym mittels

SDS-PAGE und des Standardaktivitätstests analysiert und bei 4 °C gelagert.

2.7.4 Charakterisierung des modifizierten Enzyms

Die Untersuchung der Aktivität und Stabilität der modifizierten SH erfolgte anhand des Stan-

dardaktivitätstests (Kapitel 2.5.1). Die Enzymaktivität und -stabilität wurde zunächst in rein

wässrigen Medien (0,05 M Tris/HCl-Puffer) bei optimalen Reaktionsbedingungen (35 °C und

pH 8,0) sowohl unter mechanischer Beanspruchung in Form eines Magnetrührers (400 Upm)

als auch ohne analysiert. Im Anschluss wurde die Aktivität und Stabilität des modifizierten

Enzyms in Gegenwart von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln und ILs ebenfalls bei

Material und Methoden 39

35 °C und pH 8,0 untersucht. Hierbei handelte es sich zum einen um DMF, DMSO und Iso-

propanol, die dem Reaktions- bzw. Inkubationsansatz zu einem Anteil von jeweils 10 % (v/v)

zugesetzt wurden, und zum anderen um [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4], die den An-

sätzen zu einem Anteil von 2,5 und 5 % (v/v) zugesetzt wurden. Es erfolgten stets Dreifach-

bestimmungen der Aktivität und Stabilität des modifizierten Enzyms zur statistischen Siche-

rung der Ergebnisse. Die erhaltenen Resultate wurden direkt mit dem nativen Enzym ver-

glichen.

2.8 Immobilisierung der SH

2.8.1 Adsorptive Immobilisierung der SH

Die adsorptive Immobilisierung der SH wurde auf verschiedenen Träger getestet. Dazu wur-

den zunächst Lösungen, die jeweils 0,1 mg SH und 0,2 g des jeweiligen Trägers enthielten,

hergestellt. Bei dem verwendeten Puffer handelte es sich um 0,05 M Tris/HCl-Puffer

(pH 8,0). Die Immobilisierung erfolgte bei 4 °C in einem Überkopfschüttler über eine Zeit-

dauer von 1 Stunde. Im Anschluss wurden die Immobilisate mit 0,05 M Tris/HCl-Puffer

(pH 8,0) gewaschen und bei 4 °C gelagert. Nach Auswahl eines geeigneten Trägers, der zum

einen zu einer maximalen Restaktivität des Enzyms als auch zu einer maximalen trägergebun-

denen Proteinmenge führte, erfolgte die Optimierung der Immobilisierungsmethode. Dazu

wurde das Immobilisat sowohl hinsichtlich seiner Aktivität als auch der trägergebundenen

Proteinmenge bei verschiedenen pH-Werten (7,0 und 8,0) während der Immobilisierung, bei

verschiedenen Enzym-Träger-Verhältnissen (1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000) und in Ab-

hängigkeit von der Inkubationszeit des Enzyms (1 und 2 h) analysiert. Zur statistischen Siche-

rung der Ergebnisse wurden die Enzymaktivität sowie die trägergebundene Proteinmenge

stets dreifach bestimmt.

2.8.2 Kovalente Immobilisierung der SH

Für die kovalente Immobilisierung der SH wurde eine Anzahl verschiedener Träger getestet.

Im ersten Schritt erfolgte die Aktivierung des jeweiligen Trägers, indem jeweils 0,2 g Träger

mit 2,5 % (v/v) Glutardialdehyd über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei RT in einem Überkopf-

schüttler inkubiert wurden. Im Anschluss wurde der jeweilige Träger mit destilliertem Wasser

Material und Methoden 40

gewaschen und zu 1 mL 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), der 0,1 mg SH enthielt, gegeben.

Die Immobilisierung erfolgte für 1 Stunde bei RT im Überkopfschüttler. Im Anschluss wur-

den die Immobilisate mit 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) gewaschen und bei 4 °C gelagert.

Zur Optimierung der Immobilisierungsmethode wurden der pH-Wert während der Immobili-

sierung (7,0 und 8,0), die Glutardialdehydkonzentration (0,5, 1, 2,5, 5 % (v/v)), die

Inkubationszeit der Träger mit Glutardialdehyd (0,5, 1 und 2 h), die Inkubationszeit des

Enzyms (0,25, 0,5, 1 und 2 h) sowie das Enzym-Träger-Verhältnis (1:500, 1:1000, 1:2000,

1:4000, 1:8000) variiert. Dabei wurden die jeweiligen Immobilisate hinsichtlich ihrer Aktivi-

tät und der trägergebundenen Proteinmenge analysiert. Auch bei diesen Untersuchungen

erfolgte eine Dreifachbestimmung der Enzymaktivität und der trägergebundenen Proteinmen-

ge zur statistischen Sicherung der Ergebnisse.

2.8.3 Immobilisierung der chemisch modifizierten SH

Für die adsorptive sowie kovalente Immobilisierung der chemisch modifizierten SH erfolgte

zunächst die Modifizierung des Enzyms mit mPEG5000 unter optimierten Bedingungen

(Kapitel 2.7.3). Für die anschließende Immobilisierung des modifizierten Enzyms wurden

ebenfalls die in Kapitel 2.8.1 und 2.8.2 für das unmodifizierte Enzym ermittelten, optimalen

Bedingungen gewählt.

2.8.4 Bestimmung der Aktivität der Immobilisate

Die Aktivität der Immobilisate wurde über die wasserstoffabhängige Bildung von NADH er-

mittelt. Das Reaktionsvolumen betrug 2,5 mL und setzte sich genauso wie bei der Aktivitäts-

bestimmung des nativen Enzyms zusammen (Kapitel 2.5.1). Die Reaktionslösung und 0,2 g

Immobilisat wurden in ein 5 mL-Vial überführt, mit einem gasdichten Septum versehen und

mit Wasserstoff gesättigt. Anschließend wurde die Reaktion durch die Zugabe von NAD+ ge-

startet, wobei die Lösung während der Reaktion kontinuierlich mittels eines Magnetrührers

(400 Upm) durchmischt wurde. Die Zunahme der Absorption wurde über eine Zeitdauer von

3 Minuten durch regelmäßige Probeentnahme verfolgt. Zur Vermeidung einer Aufkonzentrie-

rung der Reaktionslösung wurden die Proben nach Messung der Absorption zur Reaktion zu-

rückgegeben. Die Reaktionstemperatur betrug, wenn nicht anders definiert, RT. Die Berech-

nung der Aktivität der Immobilisate erfolgte wie in Kapitel 2.5.1 bereits beschrieben wurde.

Material und Methoden 41

2.8.5 Bestimmung der Stabilität der Immobilisate

Die Untersuchung der Stabilität der Immobilisate erfolgte wie bei der nativen SH über die Er-

mittlung der Halbwertszeit (Kapitel 2.5.3). Dazu wurden 0,2 g Immobilisat unter definierten

Bedingungen über eine definierte Zeitdauer inkubiert und im Anschluss daran die Restaktivi-

tät anhand des Aktivitätstest (Kapitel 2.8.4) bestimmt. Die Inkubation der Immobilisate fand

bei allen Messungen unter aeroben Bedingungen statt.

2.8.6 Bestimmung der Rezyklierbarkeit der Immobilisate

Die Untersuchung der Rezyklierung der Immobilisate wurde anhand der Wiederholung der

Reduktion von NAD+ über 3 Minuten durchgeführt (Kapitel 2.8.4). Dazu wurden die Immobi-

lisate nach jeder Reaktion mit 0,05 M Tris/HCl-Puffer gewaschen und bei einer erneuten

Reaktion eingesetzt. Die Reaktionstemperatur betrug dabei 35 °C. Zur statistischen Sicherung

der Ergebnisse erfolgte eine Dreifachbestimmung der Rezyklierung der Immobilisate.

2.8.7 Charakterisierung der Immobilisate

Die Untersuchung der Aktivität und Stabilität der Immobilisate erfolgte anhand des beschrie-

benen Aktivitätstests (Kapitel 2.8.3). Die Aktivität und Stabilität des immobilisierten Enzyms

wurde zunächst in rein wässrigen Medien (0,05 M Tris/HCl-Puffer) bei optimalen Reaktions-

bedingungen (35 °C und pH 8,0) sowohl unter mechanischer Beanspruchung der Immobilisa-

te in Form eines Magnetrührers (400 Upm) als auch ohne analysiert. Anschließend wurde die

Aktivität und Stabilität des Immobilisats in Gegenwart von wasserlöslichen organischen Lö-

sungsmitteln und ILs ebenfalls bei 35 °C und pH 8,0 untersucht. Hierbei handelte es sich zum

einen um DMF, DMSO und Isopropanol, die dem Reaktions- bzw. Inkubationsansatz zu

einem Anteil von jeweils 10 % (v/v) zugesetzt wurden, und zum anderen um [EMIM][EtSO4]

und [MTEOA][MeSO4], die den Ansätzen zu einem Anteil von 2,5 und 5 % (v/v) zugesetzt

wurden. Zudem wurde auch das Ausbluten des Enzyms aus der Matrix in den verschiedenen

Systemen untersucht. Zur statistischen Sicherung der Ergebnisse erfolgte eine

Dreifachbestimmung der Aktivität und der Stabilität der Enzymimmobilisate. Alle Ergebnisse

wurden direkt mit dem nativen Enzym verglichen.

Material und Methoden 42

2.9 Reduktive Cofaktorregenerierung

Zur Untersuchung des Einsatzes der SH bei der reduktiven Cofaktorregenerierung diente die

CPCR-katalysierte Reduktion von Acetophenon zu (S)-1-Phenylethanol unter Verbrauch des

Cofaktors NADH als Modellreaktion. Zudem erfolgten Vergleichsmessungen mit der FDH.

Das Reaktionsvolumen betrug stets 3 mL, wobei sich die Ansätze wie folgt zusammensetzten.

Tabelle 2.3 Zusammensetzung der Reaktionsansätze bei der SH- bzw. FDH-katalysierten

Cofaktorregenerierung.

SH FDH

CPCR 0,35 U mL-1 0,35 U mL-1

Acetophenon 45 mM 45 mM

NADH 1 mM (als Kaliumsalz) 1 mM (als Natriumsalz)

DTT 1 mM 1 mM

Natriumformiat - 100 mM

Die Reaktionslösungen wurden in 5 mL-Vials überführt, wobei dieses im Fall der SH mit

einem gasdichten Septum verschlossen wurde. Zur Pufferung des Reaktionssystems diente

0,1 M TEA/HCl-Puffer (pH 7,5). Bei den eingesetzten SH- bzw. FDH-Konzentrationen

handelte es sich um jeweils 1, 2 und 4 U mL-1. Der Reaktionsstart erfolgte durch Zugabe der

CPCR und wurde bei 30 °C über eine Zeitdauer von 4 Stunden verfolgt, wobei die Reaktions-

lösung kontinuierlich mittels eines Magnetrührers (400 Upm) durchmischt wurde und im Fall

der SH-katalysierten Cofaktorregenerierung zusätzlich eine kontinuierliche Begasung mit

Wasserstoff erfolgte. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden dem Reaktionsansatz Proben ent-

nommen und im Verhältnis 1:6 mit Ethylacetat versetzt, wodurch Acetophenon und 1-Phenyl-

ethanol extrahiert wurden und deren Konzentration anschließend mittels eines Gaschromato-

graphen (GC) der Firma Shimadzu ermittelt werden konnte. Die Detektion erfolgte dabei über

einen Flammenionisationsdetektor. Als Säule wurde eine apolare Säule (BPX-5) der Firma

SGE verwendet. Weitere Einzelheiten der GC-Methode sind Tabelle 2.4 zu entnehmen. Zur

statistischen Sicherung der Ergebnisse erfolgte bei allen Messungen des Reaktionsumsatzes

über die Zeit eine Dreifachbestimmung.

Material und Methoden 43

Tabelle 2.4 Gaschromatographische Analyse von Acetophenon und 1-Phenylethanol.

Trägergas Stickstoff (70 kPa)

Split 50 mL min-1

Injektionsvolumen 2 µL

Injektor/Detektor 230 °C/ 290 °C

80 °C

98 °C (2 °C/ min)

Temperatur

200 °C (20 °C/ min)

Acetophenon 10,7 min

Retentionszeiten 1-Phenylethanol 10,4 min

Aus den bestimmten Acetophenon- und 1-Phenylethanolkonzentrationen wurden die Umsätze

ermittelt sowie die Umsatzzahl, die total turnover number (TTN), die sich nach Gleichung 2.4

berechnen lässt und als Maß für die Effizienz eines Katalysators gilt.

Enzym

odukt

TTN Pr

 Gleichung 2.4

wobei TT

der Umsatzzahl [-], odukt

nPr der Stoffmenge des gebildeten Produktes [mol] und

Enzym

n der Stoffmenge des eingesetzten Enzyms [mol] entspricht.

2.9.1 Einsatz der chemisch modifizierten SH

Die Untersuchung des Einsatzes der chemisch modifizierten SH erfolgte bei einer Acetophe-

nonkonzentration und NADH-Konzentration von 45 mM bzw. 1 mM unter Zusatz von 1 mM

DTT (Kapitel 2.9). Die CPCR-Aktivität betrug wie beim Einsatz der nativen SH 0,35 U mL-1.

Die native SH wurde unter optimierten Bedingungen mit mPEG5000 modifiziert und an-

schließend mit einer Aktivität von 4 U mL-1 eingesetzt. Die Bestimmung der Reaktionsumsät-

ze erfolgte wie in Kapitel 2.9 bereits beschrieben wurde.

Material und Methoden 44

2.9.2 Einsatz der immobilisierten SH

Die Untersuchung des Einsatzes der adsorptiv und kovalent immobiliserten SH erfolgte unter

den in Kapitel 2.9 und 2.9.2 beschriebenen Bedingungen, wobei die Immobilisierung unter

den jeweils optimierten Bedingungen stattfand. Die Aktivität der eingesetzten Immobilisate

betrug 4 U mL-1.

Rezyklierung der Immobilisate

Zur Untersuchung der Rezyklierbarkeit wurden die in Kapitel 2.9.3 verwendeten Immobilisa-

te nach Beendigung einer Reaktion gewaschen und bei einer weiteren CPCR-katalysierten

Reduktion von Acetophenon eingesetzt. Dabei erfolgte die Bestimmung der Reaktionsum-

sätze bei beiden Reaktionen über eine Zeit von 4 Stunden.

Ergebnisse und Diskussion 45

3 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Charakterisierung der Aktivität und Stabilität der SH in Abhängigkeit

von verschiedenen isolierten Einflüssen

Die industrielle Nutzung eines Biokatalysators setzt die hinreichende Kenntnis prozessrele-

vanter Parameter und deren Einfluss auf die Enzymaktivität und -stabilität voraus, da dadurch

erst eine Anpassung des technischen Verfahrens erfolgen kann. Zu diesen technisch entschei-

denden Faktoren zählen unter anderem die Temperatur, der pH-Wert, die Anwesenheit ver-

schiedener Salze, die Zugabe von Lösungsvermittlern und Additiven sowie die mechanische

Beanspruchung. Deren Einfluss auf die Aktivität und Lagerungsstabilität der rekombinanten

SH wurde erstmalig im Rahmen dieser Arbeit systematisch untersucht, da bislang nur Litera-

turdaten für die aus dem Wildtyp isolierte SH existieren. Die Einflussgrößen wurden dabei

anfangs isoliert voneinander betrachtet und nacheinander variiert. Die Charakterisierung der

SH-Aktivität und -Stabilität erfolgte stets bei optimalen Temperatur- und pH-Bedingungen,

die zu Beginn der Untersuchungen bestimmt wurden. Anschließend wurden die Wechsel-

wirkungen zwischen der Temperatur und dem pH-Wert, bezogen auf die SH-Aktivität und

-Stabilität, mittels design of experiments (DOE) analysiert und die optimalen Reaktionsbedin-

gungen für eine Balance zwischen diesen beiden Größen ermittelt. Anhand der Ergebnisse der

Enzymcharakterisierung erfolgte schließlich eine Bewertung der SH hinsichtlich ihres techni-

schen Einsatzes bei der Regenerierung des Cofaktors NADH.

3.1.1 Abhängigkeit der Aktivität der SH von verschiedenen isolierten Einflüssen

Temperatureinfluss

Die Bestimmung des Temperaturoptimums der SH erfolgte in einem Bereich zwischen 25 und

45 °C bei pH 8,0. Dabei wurde ein Aktivitätsmaximum von 30,2 (± 1,0) U mg-1 bei 35 °C er-

mittelt (Abbildung 3.1). Da keine Aktivitätsbestimmung zwischen den untersuchten Tempera-

turen stattfand, könnte das tatsächliche Temperaturmaximum wenige Grad über oder unter

dem ermittelten liegen. Das bei diesen Untersuchungen erhaltene Temperaturoptimum befin-

det sich in Übereinstimmung mit Literaturdaten des SH-Wildtyps, die ein Aktivitätsmaximum

zwischen 33 und 36 °C angeben [Schneider und Schlegel, 1976, Pfitzner et al., 1970].

Ergebnisse und Diskussion 46

25 30 35 40 45

Aktivität [U mg-1]

Temperatur [°C]

Abbildung 3.1 Abhängigkeit der SH-Aktivität von der Temperatur. [Temperatur wie angege-

ben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 1 mM NAD+, 1 µM FMN]

pH-Einfluss

Die Untersuchung des pH-Optimums der SH erfolgte in einem Bereich zwischen 7,0 und 9,0

unter Verwendung eines 0,05 M Tris/HCl-Puffer. Die Reaktionstemperatur entsprach dabei

stets dem ermittelten Temperaturoptimum von 35 °C. Die Ergebnisse dieser Messungen sind

in Abbildung 3.2 gezeigt.

7,07,58,08,59,0

Aktivität [U mg-1]

pH-Wert [-]

Abbildung 3.2 Abhängigkeit der SH-Aktivität vom pH-Wert. [pH-Wert wie angegeben,

0,05 M Tris/HCl-Puffer, 35 °C, 1 mM NAD+, 1 µM FMN]

Ergebnisse und Diskussion 47

Demnach besitzt die SH ihr Aktivitätsmaximum bei pH 8,0, wohingegen sie bei pH 7,5 und

8,5 bereits 21 bzw. 24 % ihrer maximalen Aktivität verliert. Das hierbei ermittelte pH-Opti-

mum korreliert mit Literaturdaten, die ebenfalls ein pH-Optimum von 8,0 wiedergeben

[Schneider und Schlegel, 1976, Pfitzner et al., 1970]. Aufgrund der geringen Pufferkapazität

von Tris/HCl außerhalb der betrachteten pH-Region wurde auf eine Untersuchung in diesem

Bereich verzichtet. Basierend auf den Ergebnissen des Temperatur- und pH-Optimums der

SH erfolgten alle weiteren Untersuchungen zur Charakterisierung der Aktivität und Stabilität

der SH bei den ermittelten optimalen Bedingungen.

Einfluss verschiedener Salze

Die Untersuchung der SH-Aktivität in Abhängigkeit von Salzionen erfolgte durch die Zugabe

von verschiedenen, in technischen Anwendungen häufig verwendeten Salzen zum Reaktions-

ansatz. Hierbei handelte es sich um NaCl, Na2SO4, Na2HPO4, KCl, K2SO4, K2HPO4, (NH4)Cl,

(NH4)2SO4, (NH4)2HPO4. In Gegenwart von Natriumionen konnte eine deutliche Abnahme

der SH-Aktivität um etwa 70 % beobachtet werden (Abbildung 3.3). Die gleiche Entdeckung

machten bereits Schneider und Schlegel und Keefe et al., wobei letztere von einer Inhibierung

der SH infolge der Zugabe von Natriumionen ausgingen [Keefe et al., 1995, Schneider und

Schlegel, 1976].

reiner Puffer

NaCl

Na2SO4

Na2HPO4KCl

K2SO4

K2HPO4

NH4Cl

(NH4)2SO4

(NH4)2HPO4

Aktivität [U mg-1]

Abbildung 3.3 Einfluss verschiedener Salze auf die SH-Aktivität. [0,1 M Salzkonzentration,

0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C, 1 mM NAD+, 1 µM FMN]

Ergebnisse und Diskussion 48

Des Weiteren führte die Gegenwart von Ammoniumionen zu einer Abnahme der Enzymakti-

vität um bis zu 30 %, was ebenso von Keefe et al. zuvor beschrieben wurde [Keefe et al.,

1995]. Salze, die Sulfat- oder Phosphationen beinhalteten, verringerten die SH-Aktivität eben-

falls um bis zu 10 %. Keinen Einfluss auf die Enzymaktivität hatten dagegen Kalium- und

Chloridionen. Basierend auf diesen Resultaten sollte in technischen Anwendungen der SH ein

Einsatz von Natriumsalzen vermieden werden und ein Austausch gegen Kaliumsalze erfol-

gen.

Einfluss von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln

Für die Bestimmung der Aktivität der SH in Gegenwart von wasserlöslichen organischen Lö-

sungsmitteln wurden drei häufig in enzymkatalysierten Reaktionen eingesetzte Lösungsmittel

ausgewählt, bei denen es sich um DMF (logP -1,0), DMSO (logP -1,3) und Isopropanol

(logP 0,3) handelte [Azevedo et al., 2001, Guagliardi et al., 1989]. Diese wurden in Konzen-

trationen von 10 und 25 % (v/v) zum Reaktionsansatz gegeben, wie es in einer Vielzahl von

Oxidoreduktase-katalysierten Reaktionen üblich ist, um eine Erhöhung der Substrat- bzw.

Produktlöslichkeit zu erzielen [Vermue und Tramper, 1995, Vazquez-Duhalt et al., 1993,

Mozhaev et al., 1989]. Dabei zeigten alle drei Lösungsmittel einen ausgeprägten inaktivieren-

den Einfluss auf die SH, wie in Abbildung 3.4 dargestellt ist.

DMF DMSO Isopropanol

Aktivität [U mg-1]

0 % Lösungsmittel

10 % Lösungsmittel

25 % Lösungsmittel

Abbildung 3.4 Einfluss von 10 und 25 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol auf die SH-

Aktivität. [Lösungsmittelkonzentration wie angegeben, 0,05 M Tris/ HCl-Puffer (pH 8,0),

35 °C, 1 mM NAD+, 1 µM FMN]

Ergebnisse und Diskussion 49

Bezogen auf die Aktivität der SH, die ohne den Einsatz eines Cosolvents in reinem Tris/HCl-

Puffer ermittelt wurde, war bei einer Lösungsmittelkonzentration von 25 % (v/v) nur noch in

DMSO eine Enzymaktivität von 4,7 (± 2,2) U mg-1 messbar, was einer Restaktivität von 15 %

entspricht. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis war bei einer Lösungsmittelkonzentra-

tion von 10 % (v/v) ebenfalls im Fall von DMSO die höchste SH-Aktivität von 15,4 (± 0,5)

U mg-1 zu beobachten, was etwa der Hälfte der Enzymaktivität in reinem Puffer entspricht. Im

Gegensatz dazu führte die Zugabe von DMF zur stärksten Inaktivierung der SH, wobei

lediglich 7 % der ursprünglichen Enzymaktivität noch bestimmt werden konnten. Die Zugabe

von 10 % (v/v) Isopropanol führte ebenfalls zu einem ausgeprägten Aktivitätsverlust um etwa

78 %, wobei eine Aktivität von 6,8 (± 1,3) U mg-1 gemessen wurde.

Die Inaktivierung von Enzymen in Gegenwart organischer Lösungsmittel ist allgemein

bekannt [Schmid et al., 2001]. Die dabei auftretenden Wechselwirkungen zwischen dem

Enzym und dem zugesetzten organischen Lösemittel sind vielfältig. So können wasserlösliche

Lösungsmittel Wassermoleküle von der Proteinoberfläche sowie aus dem katalytischen

Zentrum des Enzyms verdrängen, was die thermodynamische Stabilisierung der Tertiärstruk-

tur beeinflusst. In der Folge kann dies zu einer Inaktivierung aufgrund der Konformations-

änderung führen [Pazhang et al., 2006, Ogino und Ishikawa, 2001].

Dass Enzyme in Gegenwart von DMSO stabilisiert werden bzw. ein abweichendes Verhalten

verglichen mit dem in anderen wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln zeigen, wurde

bereits für eine Vielzahl von Enzymen beschrieben [Pazhang et al., 2006, Azevedo et al.,

2001]. Hierbei wurde von einem geringeren inhibierenden Potential von DMSO in Kombina-

tion mit Enzymen ausgegangen. Dieses wurde auf spezielle Interaktionen zwischen DMSO

und den proteinogenen Aminosäuren zurückgeführt, was in der Folge eine Konformations-

änderung des Enzyms hervorruft und so zu dessen erhöhter Flexibilität führt, die wiederum

eine erhöhte Aktivität bzw. einen geringeren Aktivitätsverlust in DMSO verursacht [Pazhang

et al., 2006]. Aufgrund unzureichender Strukturinformationen der SH bleiben genauere Aus-

sagen über mögliche Ursachen für die beobachteten geringen Aktivitäten in den untersuchten

Lösungsmitteln jedoch offen. Des Weiteren existieren keine Vergleichsdaten für die Aktivität

der SH in den analysierten Lösungsmitteln, da entsprechende Untersuchungen der SH bislang

nicht vorgenommen wurden.

Ergebnisse und Diskussion 50

Einfluss von wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln

Zur Bestimmung des Einflusses von wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln auf die

Aktivität der SH wurden MTBE (logP 1,0), Toluol (logP 2,5) und n-Heptan (logP 4,0) ausge-

wählt, wobei diese funktionelle Unterschiede aufweisen sowie verschiedene Wasserlöslich-

keiten besitzen (Wasserlöslichkeiten: MTBE 42 g L-1, Toluol 0,5 g L-1, n-Heptan 0,1 g L-1).

Die Untersuchungen berücksichtigten dabei einzig den Einfluss der molekularen Toxizität des

jeweiligen Lösungsmittels, nicht aber die Grenzflächentoxizität. Dazu genügte die alleinige

Sättigung des Puffers mit dem Lösungsmittel, wodurch ein monophasiges Reaktionssystem

erhalten blieb. Die SH zeigte in jedem der drei untersuchten Lösungsmittel eine Verringerung

ihrer maximalen, in reinem Puffer gemessenen Aktivität (Abbildung 3.5). Am deutlichsten

war dieser Effekt bei der Sättigung des verwendeten Puffers mit Toluol zu sehen. Hierbei

verlor die SH 45 % ihrer ursprünglichen Aktivität. In MTBE und n-Heptan hingegen betrug

der Aktivitätsverlust 19 bzw. 22 %.

reiner Puffer MTBE Toluol n-Heptan

Aktivität [U mg-1]

Abbildung 3.5 Einfluss von MTBE, Toluol und n-Heptan auf die SH-Aktivität. [Sättigung

des Puffers mit Lösungsmittel, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C, 1 mM NAD+, 1 µM

FMN]

Aufgrund dieser Resultate lässt sich schlussfolgern, dass der deaktivierende Einfluss der

untersuchten Lösungsmittel nicht auf die Stärke der Wasserlöslichkeit der gewählten Medien

zurückzuführen ist. Anderenfalls hätte die Enzymaktivität von MTBE hin zu n-Heptan

zunehmen müssen, da n-Heptan die geringste Wasserlöslichkeit besitzt. Vielmehr ließen sich

Ergebnisse und Diskussion 51

die erhaltenen Ergebnisse auf die Funktionalität der untersuchten Lösemittel zurückführen,

wobei auch in diesem Fall keine genauen Ursachen angegeben werden können, da nur

unzureichende Strukturinformationen der SH existieren. Im Weiteren kann kein Vergleich mit

Literaturdaten vorgenommen werden, da entsprechende Vergleichsinformationen für die SH

bislang nicht vorliegen.

Einfluss von ionischen Flüssigkeiten

Ionische Flüssigkeiten (ionic liquids (ILs)) sind sogenannte flüssige Salze, die genauso wie

organische Lösungsmittel löslichkeitsvermittelnde Eigenschaften besitzen, weshalb sie bereits

bei einer Vielzahl biokatalytischer Reaktionen zur Erhöhung der Substrat- bzw. Produktlös-

lichkeit Einsatz fanden [Roosen et al., 2008, Van Rantwijk und Sheldon, 2007, Kragl et al.,

2002, Sheldon et al., 2002]. Darüber hinaus gelten sie als umweltfreundliche Alternative ver-

glichen mit den herkömmlich eingesetzten organischen Lösungsmitteln. Bei den untersuchten

ILs handelte es sich um AmmoengTM 101, [BMIM][BF4], [BMIM][OTf], [EMIM][EtSO4],

[HMIM][Cl] und [MTEOA][MeSO4], die alle vollständig wasserlöslich sind. Die untersuch-

ten Konzentrationen im Reaktionsansatz betrugen 2,5, 5 und 10 % (v/v). Wie in Abbildung

3.6 gezeigt ist, gehen von den analysierten ILs unterschiedliche, deaktivierende Einflüsse auf

die SH aus. Demnach zeigte die SH in Gegenwart von 2,5 % (v/v) [BMIM][BF4] und

[EMIM][EtSO4] noch immer 92 bzw. 94 % ihrer maximalen, in reinem Puffer ermittelten

Aktivität. In 2,5 % (v/v) AmmoengTM 101 und [HMIM][Cl] betrug die Restaktivität der SH

dagegen lediglich 50 bzw. 43 % ihrer maximalen Aktivität. Eine Erhöhung der IL-Konzentra-

tion auf 5 und 10 % (v/v) führte folglich zu einer weiteren Inaktivierung der SH. So ließen

sich bei Zugabe von je 10 % (v/v) [BMIM][BF4], [BMIM][OTf] und [HMIM][Cl] nur noch

Restaktivitäten von 1, 1 bzw. 0,2 % bestimmen, wohingegen die SH in Gegenwart von 10 %

[MTEOA][MeSO4] immer noch 62 % ihrer ursprünglichen Aktivität besaß.

Ergebnisse und Diskussion 52

AmmoengTM 101

[BMIM][BF4]

[BMIM][OTf]

[EMIM][EtSO4]

[HMIM][Cl]

[MTEOA][MeSO4]

Aktivität [U mg-1]

0 % IL

2,5 % IL

5 % IL

10 % IL

Abbildung 3.6 Einfluss von 2,5, 5 und 10 % (v/v) verschiedener ILs auf die SH-Aktivität.

[IL-Konzentrationen wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C, 1 mM NAD+,

1 µM FMN]

Die erhaltenen Ergebnisse stimmen mit Literaturdaten überein, in denen die Deaktivierung

einer Vielzahl von Enzymen in Gegenwart von ILs beschrieben wurde [Nakashima et al.,

2006, Turner et al., 2003, Sheldon et al., 2002, Erbeldinger et al., 2000]. Dabei stellt die

Polarität der ILs einen häufig diskutierten Aspekt bei deren Einfluss auf die Enzymaktivität

dar. In diesem Zusammenhang werden ILs als moderat polar - analog zu kurzkettigen Alko-

holen - eingeordnet [Zhao, 2010]. Des Weiteren können ILs ähnlich wie polare organische

Lösungsmittel in Wechselwirkung mit der Tertiärstruktur des Enzyms treten und dadurch

schließlich zu einer Konformationsänderung, die mit einer Deaktivierung des Proteins

einhergeht, führen [Kragl et al., 2002]. Für einen direkten Vergleich der ermittelten SH-

Aktivitäten in den untersuchten ILs existieren bisher keine entsprechenden Literaturdaten.

Einfluss von Additiven

Basierend auf früheren Studien, in denen eine Aktivierung der SH in Gegenwart von

Reduktionsäquivalenten beschrieben wurde, erfolgte die Untersuchung der SH-Aktivität in

Abhängigkeit von verschiedenen Additiven [Schneider und Schlegel, 1976]. Dabei galt es,

Ergebnisse und Diskussion 53

mögliche enzymaktivierende bzw. -deaktivierende Effekte dieser Reagenzien zu ermitteln.

Bei den gewählten Zusätzen handelte es sich um den SH-Cofaktor FMN, Reduktionsäquiva-

lente wie DTT, TCEP und Ascorbinsäure, sowie Glycerin und PEG400. Die ausgewählten

Additive wurden in definierten Konzentrationen zum Reaktionsansatz gegeben. Die dabei

ermittelten Enzymaktivitäten sind in Abbildung 3.7 dargestellt.

00 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10

Aktivität [U mg-1]

Abbildung 3.7 Einfluss von verschiedenen Additiven auf die SH-Aktivität. [00- ohne

Additive, 01- 1 µM FMN, 02- 3 µM FMN, 03- 0,5 mM DTT, 04- 1 mM DTT, 05- 0,5 mM

TCEP, 06- 0,2 M Ascorbinsäure, 07- 0,05 M PEG400, 08- 0,05 M Glycerin, 09- 0,1 M

Glycerin, 10- 0,25 M Glycerin; 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C, 1 mM NAD+]

Es zeigte sich, dass die Zugabe von 1 und 3 µM FMN zu einer Aktivierung der SH um 20

bzw. 24 % führt, wie es auch von Schneider und Schlegel in früheren Untersuchungen gezeigt

wurde [Schneider und Schlegel, 1976]. Die beobachtete Enzymaktivierung durch die Zugabe

von FMN ist darauf zurückzuführen, dass die SH durch NADH, das während der Reaktion

entsteht, in ihren reduzierten Zustand überführt wird und dabei an der HoxY-Untereinheit

nicht kovalent gebundenes FMN-a verliert. In der Folge sinkt die Aktivität der SH, da es zu

einer Hinderung der Elektronenübertragung kommt [Lauterbach et al., 2011, Van der Linden

et al., 2004b]. Somit verhindert die Zugabe von FMN diese Inaktivierung der SH infolge der

Wiederherstellung der uneingeschränkten Elektronenübertragung zwischen dem Hydrogena-

se- und Diaphorasedimer. Die Anwesenheit von DTT führte genauso wie FMN zu einer

Aktivierung der SH. In diesem Fall betrug der Aktivitätsgewinn bei einer Konzentration von

Ergebnisse und Diskussion 54

0,5 mM 22 % und bei einer Konzentration von 1 mM lediglich 8 %, was zeigt, dass die

Zugabe höherer Konzentrationen von Reduktionsäquivalenten die Aktivierung der SH stören

kann. DTT ist in diesem Zusammenhang für die Überführung der SH in ihren reduzierten

Zustand verantwortlich, der laut Schneider und Schlegel die aktivierte Enzymform darstellt

[Schneider und Schlegel, 1976]. Dem entsprechend sollte TCEP einen vergleichbaren Effekt

nach sich ziehen, wie auch beobachtet wurde, da die SH in Gegenwart einer 0,5 mM

Konzentration eine um 15 % erhöhte Aktivität verglichen mit der in reinem Puffer zeigte. Die

Zugabe von 0,2 M Ascorbinsäure führte dagegen zu einer Abnahme der SH-Aktivität um 11

%, was nicht erwartet wurde, da dieses Reagenz ebenfalls dem Oxidationsschutz des Enzyms

dient und folglich ein ähnliches Resultat wie bei der Zugabe von DTT und TCEP erwartet

wurde. Dem gegenüber wurden in Anwesenheit des Polymers PEG400 sowie unterschiedlicher

Konzentrationen von Glycerin keine veränderten Enzymaktivitäten ermittelt.

3.1.2 Abhängigkeit der Stabilität der SH von verschiedenen isolierten

Einflüssen

Die Untersuchung der Stabilität der SH in Abhängigkeit von verschiedenen isolierten Ein-

flüssen erfolgte anhand der Bestimmung der Abnahme der Enzymaktivität über die Zeit bei

definierten Inkubationsbedingungen. Daraus ließ sich die Halbwertszeit des Enzyms

berechnen. Die Temperatur sowie der pH-Wert während der Inkubation der SH entsprachen

stets dem in Kapitel 3.1.1 ermittelten Temperatur- und pH-Optimum von 35 °C und pH 8,0

unter Verwendung eines 0,05 M Tris/HCl-Puffers.

Temperaturstabilität

Die Untersuchung der Stabilität der SH in Abhängigkeit von der Temperatur erfolgte

zwischen 4 und 45 °C. Hierbei zeigte sich eine hohe Temperatursensitivität des Enzyms (Ab-

bildung 3.8). So konnte eine maximale Halbwertszeit von 48,5 (± 4,4) h bei einer Inkuba-

tionstemperatur von 4 °C ermittelt werden. Bei ihrem Aktivitätsoptimum von 35 °C betrug

die Halbwertszeit der SH dagegen nur noch 5,3 (± 0,7) h. Die weitere Erhöhung der

Inkubationstemperatur um 10 °C auf 45 °C führte nochmals zu einem 5-fachen Stabilitäts-

verlust (t1/2: 1,0 (± 0,1) h). Da bisher keine entsprechenden Untersuchungen der Temperatur-

stabilität der SH erfolgten, ist ein Vergleich mit Literaturdaten nicht möglich.

Ergebnisse und Diskussion 55

4 15253545

Halbwertszeit [h]

Temperatur [°C]

Abbildung 3.8 Abhängigkeit der Halbwertszeit der SH von der Temperatur. [Temperatur wie

angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0)]

Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen sollte die hohe Sensitivität der SH gegenüber hohen

Temperaturen bei technischen Anwendungen Berücksichtigung finden bzw. gegebenenfalls

eine Anpassung des Enzyms mittels einer geeigneten Stabilisierungsmethode erfolgen.

pH-Stabilität

Die Untersuchung der pH-Stabilität der SH erfolgte in einem Bereich zwischen pH 7,0 und

9,0. Die Ergebnisse dieser Messungen ergaben eine starke Abhängigkeit der Halbwertszeit

der SH vom pH-Wert (Abbildung 3.9). So führte die Verringerung des pH-Wertes von 8,0 auf

7,0 zu einer deutlichen Erhöhung der Halbwertszeit von 5,3 (± 0,7) h auf 16,1 (± 0,5) h,

wohingegen das Enzym bei der Erhöhung des pH-Wertes auf 9,0 eine klare Abnahme seiner

Halbwertszeit auf 0,5 (± 0,0) h zeigte. Auch für diese Ergebnisse existieren bislang noch

keine entsprechenden Vergleichsdaten.

Ergebnisse und Diskussion 56

7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

Halbwertszeit [h]

pH-Wert [-]

Abbildung 3.9 Abhängigkeit der Halbwertszeit der SH vom pH-Wert. [pH-Wert wie

angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer, 35 °C]

Hinsichtlich eines technischen Einsatzes sollte demnach kein pH größer als 8,0 gewählt

werden, sondern ein pH im Bereich zwischen 7,0 und 8,0. Anderenfalls sollte eine Anpassung

des Enzyms durch eine geeignete Stabilisierungsstrategie erfolgen.

Salzstabilität

Die Untersuchung der SH-Stabilität in Gegenwart verschiedener Salzionen erfolgte über die

Zugabe einer je 0,1 M Konzentration der folgenden Salze zum Inkubationsansatz: NaCl,

Na2SO4, Na2HPO4, KCl, K2SO4, K2HPO4, (NH4)Cl, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4. Dabei zeigte

sich, dass die Stabilität der SH in Anwesenheit von Phosphationen sinkt, da die Zugabe aller

drei phosphathaltigen Salze zu verringerten Halbwertszeiten führte (Abbildung 3.10). Dem-

nach betrug die Halbwertszeit der SH 3,3 (± 0,3) h in 0,1 M Na2HPO4-Lösung, 4,5 (± 0,3) h

in 0,1 M K2HPO4-Lösung und 3,7 (± 0,4) h in 0,1 M (NH4)2HPO4-Lösung, was verglichen

mit der Halbwertszeit in reinem Puffer (5,3 (± 0,7) h) einem Stabilitätsverlust um bis zu 38 %

entspricht. Im Gegensatz dazu führte die Zugabe von Sulfatsalzen zu einer Stabilisierung des

Enzyms, da die Halbwertszeit der SH 6,5 (± 0,6) h in 0,1 M K2SO4-Lösung und 6,9 (± 0,2) h

in 0,1 M (NH4)2SO4-Lösung betrug, was einer Stabilitätserhöhung um 23 bzw. 30 % ent-

spricht. Diese Beobachtung korreliert mit früheren Untersuchungen von Schneider und

Schlegel, die ebenfalls eine 25 %-ige Stabilitätserhöhung der SH in Gegenwart von

Ergebnisse und Diskussion 57

(NH4)2SO4 beschrieben [Schneider und Schlegel, 1976]. Des Weiteren wurde der stabilisie-

rende Effekt von (NH4)2SO4 auch bei einer Reihe anderer Enzyme beobachtet [Schmid,

1979].

reiner Puffer

NaCl

Na2SO4

Na2HPO4

KCl

K2SO4

K2HPO4

NH4Cl

(NH4)2SO4

(NH4)2HPO4

Halbwertszeit [h]

Abbildung 3.10 Einfluss verschiedener Salze auf die Halbwertszeit der SH. [0,1 M

Salzkonzentration, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C]

Auf Basis der erhaltenen Resultate für die SH-Stabilität in Gegenwart von verschiedenen

Salzionen sollte bei technischen Anwendungen der SH der Zusatz von Phosphatsalzen ver-

mieden werden, wohingegen Sulfatsalze aufgrund der beobachteten stabilisierenden Effekte

bevorzugt Einsatz finden können.

Lösungsmittelstabilität (wasserlösliche Lösungsmittel)

Zur Analyse der SH-Stabilität in Gegenwart von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln

wurden je 10 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol zum Inkubationsansatz gegeben. Auf

eine Erhöhung der Lösungsmittelkonzentration auf 25 % (v/v) wurde hierbei verzichtet, da

die Untersuchung der SH-Aktivität in Gegenwart dieser Lösungsmittelkonzentration eine

starke Inaktivierung der SH ergab (Kapitel 3.1.1), so dass im Vorfeld bereits von einer zu

rapiden und nicht mehr erfassbaren Deaktivierung des Enzyms unter diesen Bedingungen aus-

gegangen werden konnte.

Ergebnisse und Diskussion 58

Die Messungen der Halbwertszeit der SH in Gegenwart der gewählten Lösungsmittel zeigten,

dass jedes der drei eingesetzten Lösungsmittel zu einer rapiden Deaktivierung der SH führt

(Abbildung 3.11).

reiner Puffer DMF DMSO Isopropanol

Halbwertszeit [h]

Abbildung 3.11 Einfluss von 10 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol auf die Halbwertszeit

der SH. [Lösungsmittelkonzentration wie angegeben, 0,05 M Tris/ HCl-Puffer (pH 8,0),

35 °C]

Die höchste Halbwertszeit von 1,0 (± 0,0) h wurde dabei in DMSO ermittelt, was verglichen

mit der Halbwertszeit ohne Zugabe eines Cosolvents (5,3 (± 0,7) h) einer Stabilitätsver-

ringerung um 81 % entspricht. Die Anwesenheit von 10 % (v/v) DMF und Isopropanol führte

in beiden Fällen zu einer Halbwertszeit von nur 0,1 (± 0,0) h und somit zu einer Destabilisie-

rung der SH um 98 %. Ein Vergleich der erhaltenen Resultate mit Literaturdaten ist nicht

möglich, da bisher keine entsprechenden Untersuchungen erfolgten.

Im Allgemeinen wurde die rapide Deaktivierung von Enzymen in Gegenwart von organischen

Lösungsmitteln bisher für eine Vielzahl von Enzymen beschrieben [Mattos und Ringe, 2001,

Halling, 1990, Hahn-Hägerdal, 1986]. Als Ursache dafür gilt häufig die Entfaltung der dreidi-

mensionalen Proteinstruktur in Folge der Veränderung der lokalen Umgebung des aktiven

Zentrums des Enzyms [Knubovets et al., 1999, Schiffer und Dötsch, 1996]. Im speziellen Fall

der SH könnte zudem eine Aufhebung der Quartärstruktur im Zuge des Proteinzerfalls in

seine einzelnen Untereinheiten die Inaktivierung des Enzyms hervorrufen. Genauere Aussa-

Ergebnisse und Diskussion 59

gen sind jedoch aufgrund der bislang unzureichenden Strukturinformationen der SH nicht zu

treffen. Hinsichtlich einer technischen Anwendung der SH in wässrigen Lösungsmittel-

systemen erwiesen sich die betrachteten Lösungsmittel als ungeeignet, woraus der Bedarf

einer Stabilisierung des Enzyms gegenüber den beobachteten deaktivierenden Einflüssen der

untersuchten Medien erwächst.

Lösungsmittelstabilität (wasserunlösliche Lösungsmittel)

Entsprechend der Aktivitätsuntersuchungen in Abhängigkeit von wasserunlöslichen organi-

schen Lösungsmitteln (Kapitel 3.1.1) erfolgte die Analyse der SH-Stabilität ebenfalls durch

die jeweilige Sättigung des verwendeten Inkubationspuffers mit MTBE, Toluol bzw. n-

Heptan. Hiebei verringerte sich die Halbwertszeit der SH von 5,3 (± 0,7) h in reinem Puffer

auf bis zu 0,4 (± 0,0) h in MTBE-gesättigtem Puffer, was einem Stabilitätsverlust von 92 %

entspricht (Abbildung 3.12).

reiner Puffer MTBE Toluol n-Heptan

Halbwertszeit [h]

Abbildung 3.12 Einfluss von MTBE, Toluol und n-Heptan auf die Halbwertszeit der SH.

[Sättigung des Puffers mit Lösungsmittel, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C]

In dem mit Toluol bzw. n-Heptan gesättigtem Puffer betrug die Halbwertszeit der SH dagegen

3,6 (± 0,3) bzw. sogar 4,5 (± 0,5) h, was einer Verringerung der Stabilität um nur 32 bzw. 15

% gleichkommt. Auch im Rahmen dieser Untersuchungen ist kein Vergleich mit früheren

Studien möglich, da diese für die SH bislang nicht durchgeführt wurden.

Ergebnisse und Diskussion 60

Im Allgemeinen deuten die beobachteten Tendenzen für den Einfluss von wasserunlöslichen

organischen Lösungsmitteln auf die Halbwertszeit der SH auf eine Abhängigkeit der Enzym-

stabilität von der Wasserlöslichkeit des eingesetzten Lösungsmittels hin. So handelt es sich

bei MTBE um das Lösungsmittel mit der höchsten Wasserlöslichkeit (42 g L-1), welches

infolge des stark ausgeprägten Kontaktes mit dem Enzym zu dessen rapider Deaktivierung

führt. Im Gegensatz dazu besitzt n-Heptan die geringste Wasserlöslichkeit (0,1 g L-1). Somit

kommt es im Fall von n-Heptan zur schwächsten Wechselwirkung mit der SH, was wiederum

die nur geringfügige Deaktivierung der SH in diesem Lösungsmittelsystem zur Folge hat.

Basierend auf diesen Resultaten gilt es für technische Anwendungen der SH in vergleichbaren

Lösungsmittelsystemen mittels einer geeigneten Stabilisierungsmethode die Stabilität der SH

in diesen Medien zu erhöhen.

IL-Stabilität

Die Untersuchung der SH-Stabilität in ILs erfolgte analog zu den Aktivitätsmessungen

(Kapitel 3.1.1) durch die Zugabe verschiedener Konzentrationen (2,5, 5 und 10 % (v/v)) der

folgenden ILs zum Inkubationspuffer: AmmoengTM 101, [BMIM][BF4], [BMIM][OTf],

[EMIM][EtSO4], [HMIM][Cl] und [MTEOA][MeSO4]. Dabei zeigte die SH in allen unter-

suchten ILs mit Ausnahme von [MTEOA][MeSO4] deutlich verringerte Halbwertszeiten ver-

glichen mit der in reinem Puffer (5,3 (± 0,7) h), wie in Abbildung 3.13 dargestellt ist. So ließ

sich bei einer IL-Konzentration von 10 % (v/v) nur noch in [MTEOA][MeSO4] eine Halb-

wertszeit der SH ermitteln. Diese betrug in diesem Fall 0,9 (± 0,2) h. Alle anderen untersuch-

ten ILs führten bei dieser Konzentration zu einer vollständigen und nicht mehr messbaren

Deaktivierung der SH. In Gegenwart von 5 % (v/v) der gewählten ILs zeigte die SH neben

[MTEOA][MeSO4] des Weiteren in [EMIM][EtSO4] eine noch erfassbare Halbwertszeit, die

in [MTEOA][MeSO4] 1,8 (± 0,7) h und in [EMIM][EtSO4] 0,5 (± 0,1) h betrug. Wurden

2,5 % (v/v) dieser beiden ILs zum Inkubationsansatz gegeben, besaß die SH eine Halbwerts-

zeit von 7,1 (± 0,8) bzw. 0,9 (± 0,1) h, was im Fall von [MTEOA][MeSO4] sogar einer

erhöhten Halbwertszeit der SH verglichen mit der in reinem Puffer entspricht. Somit führten

geringe Konzentrationen von [MTEOA][MeSO4] zu einer Stabilisierung der SH. Da auch im

Bereich der SH-Stabilität in ILs keine Literaturdaten vorhanden sind, kann kein Vergleich der

erhaltenen Ergebnisse vorgenommen werden.

Ergebnisse und Diskussion 61

AmmoengTM 101

[BMIM][BF4]

[BMIM][OTf]

[EMIM][EtSO4]

[HMIM][Cl]

[MTEOA][MeSO4]

Halbwertszeit [h]

0 % IL

2,5 % IL

5 % IL

10 % IL

Abbildung 3.13 Einfluss von 2,5, 5 und 10 % (v/v) verschiedener ILs auf die Halbwertszeit

der SH. [IL-Konzentrationen wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C]

Da die Untersuchung der SH-Stabilität in Abhängigkeit von Salzen einen stabilisierenden

Effekt für Sulfationen ergab (Kapitel 3.1.2), könnten die erhöhten Halbwertszeiten der SH im

Fall von [MTEOA][MeSO4] und [EMIM][EtSO4] ebenfalls auf die bei diesen ILs vorliegen-

den Sulfationen zurückzuführen sein. Aufgrund dessen sollten in technischen Anwendungen,

in denen Löslichkeitsvermittler wie ILs benötigt werden, bevorzugt sulfatenthaltende ILs wie

[MTEOA][MeSO4] in Kombination mit der SH eingesetzt werden. Weiterhin gilt diese IL als

gesundheitlich unbedenklich und umweltschonend, da sie biologisch abbaubar ist

[Wasserscheid und Welton, 2008].

Stabilität in Gegenwart von Additiven

In Analogie zu den Aktivitätsuntersuchungen für die SH in Abhängigkeit von verschiedenen

Additiven (Kapitel 3.1.1) erfolgte eine entsprechende Analyse der SH-Stabilität. In dieser galt

es, mögliche enzymdestabilisierende bzw. -stabilisierende Effekte durch den Zusatz verschie-

dener Additive zu ermitteln. Dazu wurden definierte Konzentrationen der folgenden Additive

zum Inkubationsansatz gegeben: FMN, Kaliumhexacyanoferrat, PEG400 und Glycerin. Von

PEG und Glycerin gingen hierbei bereits bei einer Reihe von Enzymen stabilisierende Effekte

Ergebnisse und Diskussion 62

aus [Iyer und Ananthanarayan, 2008, Schmid, 1979]. Bei Kaliumhexacyanoferrat handelt es

sich dagegen um ein schwaches Oxidationsmittel, welches die SH in ihre oxidierte und nach

Schneider und Schlegel stabilisierte Enzymform überführen sollte [Schneider und Schlegel,

1976].

Wie in Abbildung 3.14 dargestellt ist, zeigte die SH in Gegenwart von 1 µM FMN und

0,25 M Kaliumhexacyanoferrat eine Halbwertszeit von 4,8 (± 0,2) bzw. 1,6 (± 0,1) h, was

verglichen mit ihrer Halbwertszeit ohne den Zusatz eines Additivs (5,3 (± 0,7) h) einer

Stabilitätsabnahme um 9 bzw. 70 % entspricht. Im Gegensatz dazu führte die Zugabe von

PEG400 zu einer geringfügigen Erhöhung der Halbwertszeit um 25 % auf 6,6 (± 0,9) h. Ein

ähnliches Verhalten zeigte die SH in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Glyce-

rin, wobei bei einer Glycerinkonzentration von 0,1 M eine erhöhte Halbwertszeit von bis zu

7,4 (± 0,3) h bestimmt wurde. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit entsprechenden Literatur-

daten ist an dieser Stelle nicht möglich, da entsprechende Untersuchungen bislang noch nicht

durchgeführt wurden.

00 01 02 03 04 05 06

Halbwertszeit [h]

Abbildung 3.14 Einfluss von verschiedenen Additiven auf die Halbwertszeit der SH. [00-

ohne Additive, 01- 1 µM FMN, 02- 0,25 M Kaliumhexacyanoferrat, 03- 0,05 M PEG400, 04-

0,05 M Glycerin, 05- 0,1 M Glycerin, 06- 0,25 M Glycerin; 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0),

35 °C]

Ergebnisse und Diskussion 63

Basierend auf den ermittelten Ergebnissen konnte im Fall des Oxidationsmittels Kaliumhexa-

cyanoferrat keine zusätzliche Oxidation und somit Stabilisierung der SH erzielt werden. Die

Zugabe dieser oxidierenden Komponente führte vielmehr zu einer deutlichen Erhöhung der

Deaktivierungsrate der SH. Möglicherweise lag die SH vor der Zugabe von Kaliumhexa-

cyanoferrat schon weitestgehend oxidiert vor, so dass dessen Gegenwart zu einer divergenten

Deaktivierung der SH führte. Auch die Zugabe von FMN zeigte keinen stabilisierenden

Einfluss auf die SH. Lediglich der Zusatz des Polymers PEG400 sowie die Anwesenheit von

Glycerin stabilisierten die SH, was mit Literaturdaten korreliert, in denen der stabilisierende

Effekt durch die Zugabe von PEG und Glycerin für zahlreiche Enzyme beschrieben wurde

[Iyer und Ananthanarayan, 2008, Schmid, 1979].

Aufgrund der gezeigten Resultate erweist sich der Zusatz von PEG-Polymeren und Glycerin

in technischen Anwendungen der SH als geeignet. Auf die Zugabe von Oxidationsmittel wie

Kaliumhexacyanoferrat zum Reaktionssystem sollte dagegen verzichtet werden.

Mechanische Stabilität

Da in technischen Anwendungen von Enzymen eine Durchmischung des Reaktionssystems

unerlässlich ist, wurde die SH unter mechanischer Beanspruchung in Form von Scherkräften

untersucht. Die Stabilitätsmessungen erfolgten zum einen unter Verwendung verschiedener

Rührertypen und zum anderen bei variierenden Rührgeschwindigkeiten. Hierzu wurden ein

KPG-Rührer sowie ein Magnetrührer ausgewählt und deren Einfluss auf die Halbwertszeit der

SH bestimmt. Die Rührgeschwindigkeit betrug dabei zunächst 400 Upm bei beiden Rührer-

typen und wurde dann im Fall des Magnetrührers in einer zusätzlichen Messung auf 800 Upm

erhöht. Dabei zeigte die SH eine deutlich verringerte Stabilität, wenn der Inkubationsansatz

bei 400 Upm gerührt wurde (Abbildung 3.15). Die Rührerform hatte dagegen keinen Einfluss

auf die SH-Stabilität, da die Halbwertszeit der SH beim Einsatz eines KPG-Rührers bei einer

Rührgeschwindigkeit von 400 Upm 1,8 (± 0,1) h betrug und im Fall des Magnetrührers eine

vergleichbare Halbwertszeit von 1,9 (± 0,1) h erhalten wurde. Verglichen mit der Enzym-

stabilität ohne eine mechanische Beanspruchung in Form von Scherkräften (5,3 (± 0,7) h)

betrug die Verringerung der Stabilität in beiden Fällen etwa 65 %. Wurde die Rührgeschwin-

digkeit weiter auf 800 Upm erhöht, kam es wie erwartet zu einer weiteren Abnahme der

Halbwertszeit der SH auf nur 0,8 (± 0,1) h, was einem Stabilitätsverlust von insgesamt 85 %

Ergebnisse und Diskussion 64

entspricht. Auch im Bereich der SH-Stabilität in Abhängigkeit von mechanischer

Beanspruchung existieren bislang noch keine Literaturdaten, die einen Vergleich der

erhaltenen Ergebnisse erlauben.

00 01 02 03

Halbwertszeit [h]

Abbildung 3.15 Einfluss von mechanischer Beanspruchung auf die Halbwertszeit der SH.

[00- ohne Rühren, 01-KPG- Rührer (400 Upm), 02- Magnetrührer (400 Upm), 03- Magnet-

rührer (800 Upm); 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C]

Eine der möglichen Ursachen für den drastischen Stabilitätsverlust der SH unter Einwirkung

von Scherkräften stellt der Zerfall der SH in ihre einzelnen Untereinheiten dar. Aufgrund der

erhaltenen Ergebnisse ist eine Stabilisierung der SH gegenüber deaktivierender Einflüsse aus-

gehend von Scherkräften unerlässlich, insbesondere in Hinblick auf technische Anwendun-

gen, welche eine Durchmischung des Reaktionssystems erfordern.

3.1.3 Charakterisierung der Aktivität und Stabilität der SH unter

Berücksichtigung der gegenseitigen Beeinflussung von Temperatur und

pH-Wert mittels Design of Experiments

Bei der klassischen Methode zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Parameter auf

ein System wird lediglich ein Einflussfaktor variiert, während alle anderen Parameter konstant

gehalten werden, wie auch in Kapitel 3.1.1 und 3.1.2 vorgegangen wurde. Eine effiziente

Alternative für diese Methode stellt das mathematische Verfahren der Versuchsplanung dar,

Ergebnisse und Diskussion 65

welches unter dem Begriff design of experiments (DOE) zusammengefasst wird. Dadurch ist

es möglich, die gegenseitige Wechselwirkung der Einflussparameter des Systems zu unter-

suchen, da jegliche Parameter gleichzeitig variiert werden können. In der Folge werden zuver-

lässige Karten, die sogenannten contour plots und surface plots, erhalten, die die Mess-

ergebnisse präsentieren und zu einem verbesserten Verständnis des untersuchten Systems

führen [Eriksson et al., 2000].

Das allgemeine Vorgehen des DOEs beruht auf der Festlegung eines relevanten Standard-

experiments, das den sogenannten Nullpunkt center point darstellt und um welchen herum in

symmetrischer Weise weitere Experimente durchgeführt werden. Zudem gilt es, zu Beginn

der Untersuchungen das Problem zu formulieren. Dies umfasst die Auswahl der Zielsetzung,

der Einflussfaktoren und der Zielgrößen, sowie des anzuwendenden Modells und des Designs.

Im letzten Schritt erhält man den entsprechenden Versuchsplan, der die Kombinationen der

durchzuführenden Experimente wiedergibt. Abschließend erfolgt die Analyse der Messergeb-

nisse mittels des DOE [Eriksson et al., 2000].

Der zu Beginn festgelegte center point im Rahmen dieser Untersuchung stellte das in Kapitel

3.1.1 ermittelte Temperatur- und pH-Optimum der SH (35 °C, pH 8,0) dar. Bei den unter-

suchten Einflussfaktoren, deren gegenseitige Beeinflussung es zu analysieren galt, handelte es

sich um die Temperatur und den pH-Wert, wohingegen die Enzymaktivität und die Halb-

wertszeit die Zielgrößen darstellten. Beim anzuwendenden Modell wurde das quadratische

gewählt, so dass die Möglichkeit entstand, auch nichtlineare Zusammenhänge zu erfassen.

Der nach dem central composite design erhaltene Versuchsplan für einen Temperaturbereich

zwischen 25 und 45 °C und einem pH-Bereich zwischen 7,0 und 9,0 sowie die für die Aktivi-

täts- und Stabilitätsmessungen erhaltenen Ergebnisse sind in Abbildung 3.16 dargestellt.

Hierbei bestätigte sich nochmals das in Kapitel 3.1.1 erhaltene Aktivitätsoptimums der SH,

welches bei einer Reaktionstemperatur von 35 °C und einem pH-Wert von 8,0 zu finden ist.

Im Gegensatz dazu zeigte die SH ihre geringste Aktivität von 134 U mL-1 bei 25 °C und pH

7,0. Die niedrigste Stabilität der SH wurde dagegen bei 45 °C und pH 9,0 ermittelt, wobei die

Halbwertszeit der SH bei diesen Bedingungen 0,0 h betrug. Dem gegenüber zeigte die SH

ihre maximale Halbwertszeit von 13,9 h innerhalb des untersuchten Messbereichs bei 20,86

°C und pH 8,0.

Ergebnisse und Diskussion 66

Abbildung 3.16 Der nach central composite design erhaltene Versuchsplan mit den Messer-

gebnissen für die Aktivität [in U mL-1] und Halbwertszeit [in h] der SH bei Variation des pH-

Wertes [-] und der Temperatur [in °C]. [Temperatur und pH-Wert wie angegeben, 0,05 M

Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 1 mM NAD+ und 1 µM FMN bei der Reaktion]

Datenanalyse

Zur Analyse der erhaltenen Daten für die Aktivität und Stabilität der SH bei den untersuchten

Faktorkombinationen sowie für die Bewertung der statistischen Berechnungen existieren ver-

schiedene Methoden innerhalb des DOE.

Den ersten Schritt bei der Datenanalyse bildet die Bewertung der erhaltenen Daten in Form

des replicate index. Dabei erhält man einen Überblick über die Reproduzierbarkeit der

ermittelten Messergebnisse [Eriksson et al., 2000]. Der mittels DOE erhaltene replicate index

ist in Abbildung 3.17 dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die gemessenen Werte so-

wohl für die Aktivität als auch für die Halbwertszeit der SH bei den verschiedenen Faktor-

kombinationen eine hohe Reproduzierbarkeit aufwiesen, da die jeweiligen Werte für den

center point (Proben 9, 10 und 11) dicht beieinander lagen.

Ergebnisse und Diskussion 67

Abbildung 3.17 Der mittels DOE erhaltene replicate index für die Aktivität [in U mL-1] und

Halbwertszeit [in h] der SH.

Zudem gibt der investigation plot in Form eines Balkendiagramms einen zusammenfassenden

Überblick über die generelle Güte der durchgeführten Experimente und zeigt wesentliche

Kriterien der Anwendbarkeit des gewählten Modells auf (Abbildung 3.18). Dazu existieren

vier Indikatoren, die die vier verschiedenen Balken darstellen [Eriksson et al., 2000].

Abbildung 3.18 Der mittels DOE erhaltene investigation plot für die Aktivität und Halb-

wertszeit der SH.

R2 (goodness of fit), die sogenannte Anpassungsgüte, stellt das Maß für die Anpassbarkeit des

Regressionsmodells für die erhaltenen Daten dar. Dieser Wert wird in Kombination mit Q2

(goodness of prediction), der Güte der Vorhersagbarkeit, betrachtet, wobei eine Aussage über

Ergebnisse und Diskussion 68

die Zuverlässigkeit des Modells hinsichtlich der Vorhersage weiterer Experimente getroffen

werden soll. Die model validity, die Modellgültigkeit, weist das gewählte Modell als geeignet

oder ungeeignet aus, wohingegen die reproducibility, die Reproduzierbarkeit, die Güte der ex-

perimentellen Daten zusammenfasst [Eriksson et al., 2000]. Im Fall der Wahl eines zuverläs-

sigen Modells, sollten diese Indikatoren den folgenden Referenzwerten entsprechen:

Tabelle 3.1 Referenzwerte für die vier Indikatoren des investigation plots.

Indikator Referenzwert [-]

R2 – Q2 < 0,2-0,3

Q2 > 0,5

model validity > 0,25

reproducibility > 0,5

Der investigation plot für die Aktivität der SH zeigte, dass sich die experimentellen Ergebnis-

se mit einem Wert nahe 1 für die reproducibility als sehr reproduzierbar einstufen ließen.

Darüber hinaus wiesen sowohl R2 als auch Q2 mit einer Abweichung von 0,18 die statistische

Auswertung als sehr zuverlässig aus. Auch die model validity lag mit einem Wert von 0,51

weit über den mindestens geforderten 0,25. Der investigation plot für die experimentellen

Daten für die Halbwertszeit der SH wies diese ebenfalls als sehr reproduzierbar aus, da

ebenso ein Wert nahe 1 für die Gesamtreproduzierbarkeit erreicht wurde. Bei einem Wert von

0,45 für die model validity zeigte das gewählte Modell eine hohe Gültigkeit. Hinsichtlich der

zugrunde liegenden statistischen Auswertungsmethode für das Untersuchungsobjekt wiesen

sowohl R2 als auch Q2 unabhängig voneinander die Methode als aussagekräftig aus. Ihre

Differenz untereinander ist jedoch 20 % höher als der geforderte maximale Abstand von 0,3.

Betrachtet man die Messergebnisse hinsichtlich möglicher Datenausreißer, so belegt der

deleted studentized residuals plot, dass sich die Daten für die Aktivität der SH innerhalb der

statistischen Bandbreite bewegen, wohingegen sich die Probe 3 bei den Daten für die Halb-

wertszeit der SH als Ausreißer erwies (Abbildung 3.19).

Ergebnisse und Diskussion 69

Abbildung 3.19 Der mittels DOE erhaltene deleted studentized residuals plot für die

Aktivität und Halbwertszeit der SH.

Die Untersuchung der gegenseitigen Wechselwirkung der Einflussgrößen (Temperatur und

pH-Wert) erfolgte mittels des interaction plots, der in Abbildung 3.20 gezeigt ist.

Abbildung 3.20 Der mittels DOE erhaltene interaction plot für die Aktivität [in U mL-1] und

Halbwertszeit [in h] der SH in Abhängigkeit vom pH-Wert [-] und der Temperatur [in °C].

Hiebei wurde deutlich, dass die beiden Parameter Temperatur und pH-Wert bezüglich ihres

Einflusses auf die Enzymaktivität nur geringfügig miteinander wechselwirken bzw. eine sehr

schwach ausgeprägte gegenseitige Beeinflussung bei hohen Temperaturen erfolgt. Das bedeu-

Ergebnisse und Diskussion 70

tet, dass der pH-Wert während der Reaktion bei höheren Temperaturen einen stärkeren Ein-

fluss auf die Aktivität der SH ausübt, als es bei niedrigen Temperaturen der Fall ist. Für die

Stabilität der SH verdeutlichen die Ergebnisse, dass die untersuchten Parameter bei geringe-

ren Temperaturen stärker miteinander wechselwirken. Das heißt, dass der pH-Wert in diesem

Temperaturbereich einen entscheidenden Einfluss auf die Halbwertszeit der SH besitzt. Zu

hohen Temperaturen hin nimmt dieser Einfluss ab, da in diesem Bereich die Temperatur

selbst die bedeutende Relevanz für die Stabilität der SH besitzt.

Um ein verbessertes Verständnis des untersuchten Systems zu erhalten, kann man sich zwei-

bzw. dreidimensionalen Darstellungen der Messergebnisse bedienen, den sogenannte contour

bzw. surface plots. Diese beiden Darstellungsweisen nehmen eine optische Einordnung der

erhaltenen Messergebnisse mit einem Farbcode vor [Eriksson et al., 2000]. Die für die

Aktivität und Stabilität erhaltenen contour plots sind in Abbildung 3.21 dargestellt.

Abbildung 3.21 Der mittels DOE erhaltene contour plot für die Aktivität [in U mL-1] (links)

und Halbwertszeit [in h] (rechts) der SH in Abhängigkeit vom pH-Wert [-] und der Tempera-

tur [in °C].

Wie anhand der contour plots für die Aktivität und Stabilität der SH ersichtlich ist, zeigte die

SH auch im Rahmen der Untersuchungen mittels DOE eine maximale Aktivität in einem Be-

reich um das in Kapitel 3.1.1 bestimmte Aktivitätsoptimum von 35 °C und pH 8,0 herum. Ei-

ne maximale Stabilität der SH war dabei bei tiefen Temperaturen sowie niedrigen pH-Werten

innerhalb des untersuchten Messbereichs zu beobachten, was mit den in Kapitel 3.1.2 erhal-

Ergebnisse und Diskussion 71

tenen Erkenntnissen übereinstimmt. Der surface plot der Messergebnisse stellt diese Effekte

nochmals in dreidimensionaler Form grafisch dar (Abbildung 3.22). Zudem lassen sich an-

hand dieser Darstellung Aussagen über die Anpassung des Modells treffen [Eriksson et al.,

2000]. Diesbezüglich wird deutlich, dass das Verhältnis zwischen den Einflussfaktoren und

der Aktivität der SH dem quadratischen Modell entspricht. Im Gegensatz dazu ist ersichtlich,

dass die Abhängigkeit der Halbwertszeit der SH von den Einflussfaktoren mit dem quadra-

tischen Modell weniger übereinstimmt, da die Fläche eine nur schwache Krümmung aufweist.

Abbildung 3.22 Der mittels DOE erhaltene surface plot für die Aktivität [in U mL-1] (links)

und Halbwertszeit [in h] der SH (rechts) in Abhängigkeit vom pH-Wert [-] und der Tempera-

tur [in °C].

Da anhand des contour und surface plots nur eine grobe Abschätzung der optimalen Bedin-

gungen für eine maximale Enzymaktivität bzw. -stabilität vorgenommen werden kann, wird

sich der sweet spot-Analyse bedient, mit Hilfe welcher eine genaue Bestimmung dieser

Bedingungen erfolgen kann, wie in Abbildung 3.23 dargestellt ist [Eriksson et al., 2000].

Daraus ergab sich im Rahmen der Faktoreneinstellung ein optimaler Arbeitsbereich für eine

maximale Enzymaktivität bei einer Reaktionstemperatur von 35 °C und einem pH-Wert von

8,2. Eine maximale Enzymstabilität wurde hingegen bei einer Temperatur von 25 °C und

einem pH von 7,0 erreicht. Somit befinden sich die mittels des DOE ermittelten Bedingungen

für eine maximale Aktivität bzw. Stabilität der SH in guter Übereinstimmung mit den anhand

Ergebnisse und Diskussion 72

der klassischen Methode erhaltenen Ergebnissen, da diese ebenfalls ein Aktivitätsoptimum

bei 35 °C und pH 8,0 und ein Stabilitätsoptimum bei pH 7,0 sowie bei niedrigen Temperatu-

ren ergaben (Kapitel 3.1.1 und 3.1.2).

Abbildung 3.23 Die sweet spot-Analyse für die Aktivität (links) und Halbwertszeit (rechts)

der SH in Abhängigkeit vom pH-Wert [-] und der Temperatur [in °C].

Zur Ermittlung einer Faktoreneinstellung, die zu einer hohen Enzymaktivität bei einer

gleichzeitig hohen Stabilität der SH führt, wurde sich ebenfalls der sweet spot-Analyse be-

dient. Die dabei erhaltene Darstellung ist in Abbildung 3.24 zu sehen.

Abbildung 3.24 Die sweet spot Analyse für die Aktivität und Halbwertszeit der SH in Ab-

hängigkeit vom pH-Wert [-] und der Temperatur [in °C] bei einer geforderten maximalen

Enzymaktivität und -stabilität.

Ergebnisse und Diskussion 73

Bei einer geforderten Enzymaktivität zwischen 280 und 349,2 U mL-1 und einer Halbwerts-

zeit zwischen 8,5 und 13,9 h ergab sich der in Abbildung 3.24 rot unterlegte Arbeitsbereich,

welcher sich bei einer Temperatur zwischen 27 und 30 °C und einem pH-Wert zwischen 7,4

und 7,9 befindet. Auch die ermittelten Temperatur- und pH-Bereiche für eine geforderte

maximale Aktivität und Stabilität der SH befinden sich in Übereinstimmung mit den in

Kapitel 3.1.1 und 3.1.2 erhaltenen Resultaten, die ebenfalls die Vermeidung von zu hohen

Temperaturen ergaben und nach denen pH-Werte unter 7,0 und über 8,0 vermieden werden

sollten. Für technische Anwendungen der SH sollten demnach Reaktionstemperaturen von

30 °C nicht überschritten werden und pH-Werte in dem ermittelten Bereich zwischen 7,4 und

7,9 gewählt werden.

3.1.4 Zusammenfassung

Zusammenfassend besitzt die SH eine ausgeprägte Sensitivität gegenüber einer Vielzahl der

untersuchten, technisch relevanten Einflussgrößen. In diesem Zusammenhang wurde eine

rapide Deaktivierung der SH bei Temperaturen oberhalb ihres Optimums bei 35 °C sowie bei

pH-Werten über 8,0 beobachtet. Des Weiteren zeigte die SH eine ausgeprägte Inaktivierung

in Gegenwart von Natriumionen, wohingegen Phosphationen zu einer Verringerung der

Enzymstabilität führten. Die Anwesenheit von Sulfatsalzen lieferte hingegen eine geringfügi-

ge Erhöhung der SH-Stabilität. Ein besonders drastischer Aktivitäts- und Stabilitätsverlust der

Hydrogenase wurde in Gegenwart der untersuchten organischen Lösungsmittel DMF, DMSO

und Isopropanol, sowie beim Zusatz der untersuchten ionischen Flüssigkeiten bestimmt.

[MTEOA][MeSO4] bildete dabei eine Ausnahme, da die SH bei Zugabe dieser ionischen

Flüssigkeit bedingt stabilisiert werden konnte. Wurde die SH einer mechanischen Beanspru-

chung ausgesetzt, zeigte das Enzym dagegen abermals eine rapide Deaktivierung.

Aufgrund der erhaltenen Messresultate für die Untersuchung der SH-Aktivität und -Stabilität

unter den verschiedenen Reaktions- und Inkubationsbedingungen sollte dies in technischen

Anwendungen der SH entsprechend berücksichtigt werden. In diesem Zusammenhang sollte

die Reaktionstemperatur nicht oberhalb von 30 °C und der pH zwischen 7,4 und 7,9 liegen, da

in diesem Bereich eine maximal mögliche Enzymaktivität bei einer gleichzeitig maximalen

Enzymstabilität mittels DOE bestimmt wurde. Zudem sollte bei der Verwendung von Salzen

auf die Zugabe von natrium- und phospathaltigen Salzen verzichtet werden und diese durch

Ergebnisse und Diskussion 74

kalium- oder sulphatenthaltende Salze ersetzt werden. Da insbesondere die Zugabe von orga-

nischen Lösungsmitteln sowie von einer Vielzahl der untersuchten ILs zu einer drastischen

Deaktivierung der SH führte, viele technische Anwendungen die Gegenwart dieser Medien

jedoch erfordern, werden im weiteren Verlauf verschiedene Strategien zur Stabilisierung der

SH untersucht.

3.2 Stabilisierung der SH mittels der chemischen Modifizierung mit

Methoxypolyethylenglykol (mPEG)

Polyethylenglykol (PEG) und Derivate wie Methoxypolyethylenglykol (mPEG) zählen zu den

am häufigsten eingesetzten Polymeren für die chemische Modifizierung von Enzymen, da sie

aufgrund ihres amphiphilen Charakters in der Lage sind, sowohl die Löslichkeit von Protei-

nen als auch deren Stabilität in wässrigen und organischen Lösungen zu erhöhen [Ogino und

Ishikawa, 2001, DeSantis und Jones, 1999, Jene et al., 1997]. Die Enzymstabilisierung ist

dabei auf die Interaktion der PEG-Moleküle mit den Aminosäureresten an der Enzymober-

fläche zurückzuführen. Dadurch kommt es zu einer Verringerung der Flexibilität der Protein-

struktur und somit zu einer Stabilisierung der dreidimensionalen Struktur des Enzyms

[Rodriguez-Martinez et al., 2008]. Zudem handelt es sich bei der chemischen Modifizierung

der Proteinoberfläche um eine wenig zeitintensive Methode, bei der es keiner Kenntnis der

Enzymstruktur bedarf [Ó` Fágáin, 2003].

Die chemische Modifizierung mit mPEG sollte der Stabilisierung der SH dienen, insbe-

sondere gegenüber den in Kapitel 3.1 ermittelten Einflussgrößen, die zu einer ausgeprägten

Deaktivierung der SH führten und eine große technische Relevanz besitzen. Dazu zählten die

Gegenwart der untersuchten wassermischbaren organischen Lösungsmittel und zwei der ioni-

schen Flüssigkeiten sowie die mechanische Beanspruchung des Enzyms in Form von Rühren

in rein wässrigen Medien. Die Wahl des Modifizierungsreagenzes mPEG ist dabei mit dem

stabilisierenden Einfluss von PEG zu begründen, der bereits ohne eine Modifizierung der SH

eingeleitet werden konnte (Kapitel 3.1.2). Zudem wurde die chemische Modifizierung der SH

mit mPEG in der Literatur bislang noch nicht beschrieben. Die mPEGylierung der SH erfolgte

anhand der Verwendung von monofunktionalem mPEG, da somit eine unerwünschte Quer-

vernetzung der SH vermieden werden konnte. Bei dem eingesetzten mPEG handelte es sich

Ergebnisse und Diskussion 75

um mPEG2000 mit einer Molekularmasse von 2166 g mol-1 und mPEG5000 mit einer

Molekularmasse von 5166 g mol-1.

3.2.1 Modifizierung der SH mit verschiedenen aktivierten Methoxypolyethylen-

glykolen (mPEGs)

Um eine kovalente Bindung des mPEGs mit den Aminogruppen des Proteins hervorzurufen,

ist eine Aktivierung des mPEGs notwendig. Die Aktivierung beruht dabei auf der Bildung

einer reaktiven Carbonatbindung durch die Reaktion von p-Nitrophenylchloroformat mit der

Hydroxygruppe des mPEGs (Abbildung 3.25).

mPEG

n = 2000, 5000

-Nitophenylchloroformat

p-Nitrophenyl-mPEG-carbonat

[aktiviertes mPEG, n = 2000, 5000]

Abbildung 3.25 Aktivierung von mPEG mit p-Nitrophenylchloroformat.

Für die Aktivierungsgrade des eingesetzten mPEG2000 bzw. mPEG5000 wurden 70 bzw. 55 %

bestimmt. Das bedeutet, dass eine vollständige Aktivierung der mPEG-Moleküle nicht

erreicht werden konnte. Der erreichte Aktivierungsgrad sollte jedoch für die Modifizierung

der SH ausreichen.

Der aktivierte p-Nitrophenyl-mPEG-carbonat-Komplex bildet mit Nukleophilen wie den un-

protonierten -Aminofunktionen des Lysins stabile Carbamat-Komplexe unter Abspaltung

von p-Nitrophenol, wie in Abbildung 3.26 dargestellt ist. Als Nebenreaktion findet ebenso die

Hydrolyse der Carbonatbindung statt. Hierbei wird neben dem p-Nitrophenol das eingesetzte

Polymer frei.

Ergebnisse und Diskussion 76

-Nitrophenol mPEG

n = 2000, 5000

Enzym Enzym

-Nitrophenyl-mPEG-carbonat

[aktiviertes mPEG, n = 2000, 5000]

Enzym-mPEG-carbamatkomplex

NH2

OOH

O2NNO2

NH Me

Abbildung 3.26 Modifizierung primärer Aminogruppen mit aktiviertem mPEG.

Der Modifizierungsgrad sowie die verbleibende katalytische Aktivität des modifizierten En-

zyms hängen stark vom Verhältnis zwischen dem Modifizierungsreagenz und dem Enzym ab.

Da es stetig zur Hydrolyse der Carbonatbindung des aktivierten mPEGs kommt, sollte das

Modifizierungsreagenz immer im Überschuss eingesetzt werden [Means und Feeney, 1990].

Aus diesem Grund wurde die Modifizierung der SH bei zwei verschiedenen Enzym-mPEG-

Verhältnissen, 1:500 und 1:1000, getestet. Die Konzentration der SH betrug stets 1,0

mg mL-1. Zur Vermeidung einer unmittelbaren Inaktivierung der SH während der Modifizie-

rung erfolgte diese bei einem pH-Wert von 8,0 in 0,05 M Tris/HCl-Puffer und einer Modifi-

zierungstemperatur von 4 °C. Die Modifizierung wurde über eine Zeitdauer von einer Stunde

unter mäßigem Rühren durchgeführt. Da die Bindung der mPEG-Moleküle an das Enzym zur

Erhöhung des Molekulargewichts des Proteins führt, ließ sich der Erfolg der Modifizierung

mittels SDS-PAGE analysieren (Abbildung 3.27). Das dabei erhaltene SDS-Gel zeigte, dass

sowohl mPEG2000 als auch mPEG5000 an verfügbare Lysinreste an der Oberfläche der SH

gebunden werden konnte. Die Anzahl der kovalent gebundenen mPEG-Moleküle war dabei

nicht bestimmbar. Wie anhand des SDS-Gels jedoch zu sehen ist, scheinen die nieder-

molekulareren Untereinheiten der SH, HoxU (26 kDa), HoxY (23 kDa) und HoxI (18,6 kDa),

größtenteils unmodifiziert vorzuliegen, während an die höhermolekularen Untereinheiten,

HoxF (67 kDa) und HoxH (55 kDa), mPEG-Moleküle kovalent gebunden wurden. Dies

Ergebnisse und Diskussion 77

deutet darauf hin, dass die zahlreichen Lysinreste der drei niedermolekularen Untereinheiten

der SH einer kovalenten Bindung des Modifizierungsregenzes nicht zur Verfügung stehen, da

sie möglicherweise in einer tieferen Proteinregion verdeckt liegen. Zudem lässt sich anhand

der Banden im SDS-Gel erkennen, dass mittels mPEG5000 ein stärkerer Modifizierungsgrad

erreicht werden konnte.

M 01 02 03 04 05 [KDa]

-170

-130

-95

-70

-55

-40

-35

-25

-15

-10

M 00 01 02 03 04 [KDa]

-170

-130

-95

-70

-55

-40

-35

-25

-15

-10

M 01 02 03 04 05 [KDa]

-170

-130

-95

-70

-55

-40

-35

-25

-15

-10

M 00 01 02 03 04 [KDa]

-170

-130

-95

-70

-55

-40

-35

-25

-15

-10

Abbildung 3.27 SDS-Gel der SH nach der Modifizierung mit mPEG2000 und mPEG5000 bei ei-

nem Enzym-mPEG-Verhältnis von 1:500 und 1:1000. [00-native, unmodifizierte SH, 01-

modifizierte SH (mPEG2000, 1:500), 02-modifizierte SH (mPEG2000, 1:1000), 03-modifizierte

SH (mPEG5000, 1:500), 04-modifizierte SH (mPEG5000, 1:1000); 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH

8,0), 4 °C]

Die Untersuchung der Enzymaktivität mittels des Standardaktivitätstests zeigte, dass nach der

Modifizierung mit mPEG2000 bei einem Enzym-mPEG-Verhältnis von 1:500 und 1:1000 noch

86,7 (± 4,6) bzw. 84,0 (± 4,0) % der ursprünglichen Aktivität der SH erhalten blieben (Abbil-

dung 3.28). Im Vergleich dazu zeigte die SH nach der Modifizierung mit mPEG5000 bei einem

Enzym-mPEG-Verhältnis von 1:500 und 1:1000 noch 91,0 (± 13,4) bzw. 87,1 (± 2,5) % ihrer

Ausgangsaktivität. Somit scheint die Verwendung von mPEG5000 mit einem geringeren

Aktivitätsverlust während der Modifizierung einherzugehen. Aufgrund dieses Ergebnisses

und des scheinbar höheren Modifizierungsgrades bei dem Einsatz von mPEG5000 erfolgten die

Untersuchungen der Enzymaktivität und -stabilität der modifizierten SH unter Verwendung

von mPEG5000 bei einem Enzym-mPEG-Verhältnis von 1:500.

Ergebnisse und Diskussion 78

00 01 02 03 04

100

120

Relative Aktivität [%]

Abbildung 3.28 Aktivität der SH nach der Modifizierung mit mPEG2000 und mPEG5000 bei ei-

nem Enzym-mPEG-Verhältnis von 1:500 und 1:1000. [00- native, unmodifizierte SH, 01-

modifizierte SH (mPEG2000, 1:500), 02- modifizierte SH (mPEG2000, 1:1000), 03- modifizierte

SH (mPEG5000, 1:500), 04- modifizierte SH (mPEG5000, 1:1000)]

Neben der Bestimmung der Aktivität der modifizierten SH in rein wässrigen Medien (Kapitel

3.2.1) wurde die Enzymaktivität nach der Modifizierung mit mPEG in Lösungsmittel-Wasser-

Gemischen sowie in IL-Wasser-Gemischen untersucht. Bei den eingesetzten wassermisch-

baren Lösunsgmitteln handelte es sich um DMF, DMSO und Isopropanol, bei den IL-Wasser-

Gemischen um [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4], da diese beiden ILs die native SH

am wenigsten deaktivierten, wie in Kapitel 3.1.1 gezeigt wurde. Die Aktivitätsmessungen er-

folgten stets bei optimalen Reaktionsbedingungen von 35 °C und pH 8,0 unter Verwendung

eines 0,05 M Tris/HCl-Puffer. Die Lösungsmittelkonzentrationen und die Konzentrationen

der ILs betrugen dabei 10 bzw. 2,5 und 5 % (v/v). Somit konnten die Ergebnisse für die modi-

fizierte SH direkt mit den Resultaten des nativen, unmodifizierten Enzym aus Kapitel 3.1.1

verglichen und hinsichtlich einer Aktivitätserhöhung oder -abnahme bewertet werden.

Aktivität in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen

Die Ergebnisse für die Aktivität der modifizierten SH sowie die in Kapitel 3.1.1 ermittelten

Aktivitäten für die native, unmodifizierte SH in 10 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol

sind in Abbildung 3.29 dargestellt.

Ergebnisse und Diskussion 79

DMF DMSO Isopropanol

Relative Aktivität [%]

native SH

modifizierte SH

Abbildung 3.29 Aktivität der modifizierten SH in 10 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol

und Vergleich mit der nativen SH. [Lösungsmittelkonzentration wie angegeben, 0,05 M Tris/

HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C, 1 mM NAD+, 1 µM FMN]

Wie zu sehen ist, zeigte die modifizierte SH deutlich höhere relative Aktivitäten in den

untersuchten Lösungsmitteln als das native, unmodifizierte Enzym. Demnach betrug die

Aktivität der modifizierten SH in 10 % (v/v) DMF noch 22,9 (± 3,3) %. Verglichen mit der

nativen SH, die unter den gleichen Bedingungen nur noch 6,7 (± 1,4) % ihrer Aktivität ohne

den Zusatz von Lösungsmitteln zeigte, konnte somit eine 3,4-fache Aktivitätserhöhung erzielt

werden. In 10 % (v/v) DMSO führte die mPEGylierung der SH immerhin noch zu einer 1,4-

fachen Aktivitätserhöhung, da die gemessene Aktivität des modifizierten Enzyms 72,1 (±

2,8) % betrug. In Isopropanol ließ sich die relative Aktivität der SH durch die Modifizierung

mit mPEG von 22,5 (± 4,4) % auf 44,4 (± 6,6) % erhöhen, was einer Verdopplung der

Aktivität entspricht. Folglich scheint die kovalente Bindung des Modifizierungsreagenzes

mPEG an die Proteinoberfläche der SH diese vor einer Denaturierung durch die Gegenwart

von organischen Lösungsmitteln zu schützen. In Übereinstimmung mit diesen Resultaten

wurden vergleichbare Effekte in früheren Untersuchungen mit anderen Enzymen beobachtet.

Hierbei ließ sich die Lösungsmittelaktivität ebenfalls durch die Modifizierung mit PEG-

Derivaten erhöhen [Wu et al., 2001, Basri et al., 1995]. In diesem Zusammenhang wurde die

Erhöhung der Enzymaktivität darauf zurückgeführt, dass infolge der Proteinmodifizierung die

Ergebnisse und Diskussion 80

Entfernung von katalytisch essentiellem Wasser in der Enzymumgebung durch die anwesen-

den organischen Lösungsmittel verhindert wird [Basri et al., 1995].

Aktivität in IL-Wasser-Gemischen

Die Ergebnisse für die Aktivitäten der modifizierten und nativen, unmodifizierten SH zeigen,

dass auch in 2,5 und 5 % (v/v) von [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4] eine Erhöhung

der Enzymaktivität durch die Modifizierung mit mPEG erreicht werden konnte (Abbildung

3.30).

2,5% [EMIM][EtSO

]

5% [EMIM][EtSO

]

2,5% [MTEOA][MeSO

]

5% [MTEOA][MeSO

]

100

120

140

160

Relative Aktivität [%]

native SH

modifizierte SH

Abbildung 3.30 Aktivität der modifizierten SH in 2,5 und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und

[MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit der nativen SH. [IL-Konzentrationen wie angegeben,

0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C, 1 mM NAD+, 1 µM FMN]

Nach der Modifizierung mit mPEG betrug die Aktivität der SH 139,8 (± 14,9) % und 107,5 (±

9,4) % in 2,5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] bzw. [MTEOA][MeSO4]. Verglichen mit den Aktivitä-

ten des nativen, unmodifizierten Enzyms konnte somit eine Aktivitätserhöhung um 46 bzw.

34 % in 2,5 % (v/v) der untersuchten ILs erzielt werden. In 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] bzw.

[MTEOA][MeSO4] wurde dagegen eine deutlich geringere Aktivitätssteigerung durch die

mPEGylierung des Enzyms erhalten. So besaß die modifizierte SH eine innerhalb der

Ergebnisse und Diskussion 81

Standardabweichung des unmodifizierten Enzyms liegende Aktivität in Gegenwart von 5 %

(v/v) [EMIM][EtSO4]. In 5 % (v/v) [MTEOA][MeSO4] wurde hingegen eine deutlichere Er-

höhung der Enzymaktivität um 20 % ermittelt.

Die durch die chemische Modifizierung hervorgerufene Aktivitätserhöhung der SH lässt sich

mit Literaturdaten belegen. Dabei führte die chemische Modifizierung eines Enzyms mit PEG

ebenfalls zu einer Steigerung der Enzymaktivität in verschiedenen ILs [Nakashima et al.,

2006].

3.2.2 Stabilität der modifizierten SH

Analog zu den Messungen der Aktivität der chemisch modifizierten SH wurde die Stabilität

des mPEGylierten Enzyms in rein wässrigen Medien unter mechanischer Beanspruchung des

Enzyms sowie ohne und in Lösungsmittel- und IL-Wasser-Gemischen untersucht. Hierbei

betrug die Konzentration der wassermischbaren organischen Lösungsmittel DMF, DMSO und

Isopropanol immer 10 % (v/v). Die ILs [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4] wurden da-

gegen in Konzentrationen von 2,5 und 5 % (v/v) eingesetzt. Auch diese Messungen erfolgten

stets bei einer Inkubationstemperatur von 35 °C und einem pH von 8,0 unter Verwendung

eines 0,05 M Tris/HCl-Puffer. Somit ließen sich die Ergebnisse für die modifizierte SH eben-

falls direkt mit den Resultaten für das native, unmodifizierte Enzym aus Kapitel 3.1.2 verglei-

chen und hinsichtlich einer Enzymstabilisierung durch die chemische Modifizierung mit

mPEG bewerten.

Stabilität in rein wässrigen Medien

Im Zuge der chemischen Modifizierung mit mPEG konnte die Halbwertszeit der nativen SH

(5,3 (± 0,7) h) nur geringfügig um 11 % auf 5,9 (± 0,1) h erhöht werden (Abbildung 3.31).

Wurde der Inkubationsansatz zusätzlich bei 400 Upm mittels eines Magnetrührers gerührt und

somit das Enzym in Form von Scherkräften zusätzlich beansprucht, betrug die Halbwertszeit

der mPEGylierten SH 3,2 (± 0,3) h. Im Gegensatz dazu besaß die native SH unter vergleich-

baren Inkubationsbedingungen eine Halbwertszeit von nur 1,9 (± 0,1) h. Somit führte die che-

mische Modifizierung der SH zu einer deutlichen Erhöhung ihrer mechanischen Stabilität.

Hierbei betrug die Steigerung der Enzymstabilität 68 %.

Ergebnisse und Diskussion 82

00 01

Halbwertszeit [h]

native SH

modifizierte SH

Abbildung 3.31 Stabilität der modifizierten SH in rein wässrigen Medien unter mechanischer

Beanspruchung und ohne und Vergleich mit der nativen SH. [00- ohne Rühren, 01- Magnet-

rührer (400 Upm); 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C]

Stabilität in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen

Die Ergebnisse für die Stabilität der chemisch modifizierten SH und der Vergleich mit dem

nativen, unmodifizierten Enzym zeigen, dass in allen untersuchten Lösungsmitteln eine Erhö-

hung der Halbwertszeit im Zuge der mPEGylierung erzielt werden konnte (Abbildung 3.32).

In 10 % DMF (v/v) nahm die Halbwertszeit von 0,1 (± 0,0) h auf 0,3 (± 0,0) h zu, was einer

3-fachen Enzymstabilisierung entspricht. In 10 % DMSO betrug die Halbwertszeit der

mPEGylierten SH 2,0 (± 0,4) h, was verglichen mit der Halbwertszeit für das native Enzym

(1,0 (± 0,0) h) einer Verdopplung der Enzymstabilität entspricht. In 10 % (v/v) Isopropanol

zeigte sich der deutlichste stabilisierende Effekt, der von der chemischen Modifizierung mit

mPEG ausgeht. Hierbei ließ sich die Halbwertszeit des nativen Enzyms von 0,1 (± 0,0) h auf

0,5 (± 0,2) h erhöhen, was einer 5-fachen Stabilisierung entspricht. Folglich führt die

chemische Modifizierung mit mPEG neben einer Steigerung der Enzymaktivität zudem zu

einer Stabilisierung der SH in den betrachteten Lösungsmittel-Wasser-Gemischen. Auch für

andere modifizierte Enzyme wurden bislang vergleichbare Effekte in verschiedenen organi-

schen Lösemitteln beschrieben [Basri et al., 1995].

Ergebnisse und Diskussion 83

DMF DMSO Isopropanol

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Halbwertszeit [h]

native SH

modifizierte SH

Abbildung 3.32 Stabilität der modifizierten SH in 10 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol

und Vergleich mit der nativen SH. [Lösungsmittelkonzentration wie angegeben, 0,05 M Tris/

HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C]

Stabilität in IL-Wasser-Gemischen

Die chemische Modifizierung der SH mit mPEG zeigte keinen Einfluss auf die Stabilität der

SH in 2,5 und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4], da die modifizierte SH ver-

gleichbare Halbwertszeiten wie das native, unmodifizierte Enzym besaß (Abbildung 3.33).

Somit gingen keine stabilisierenden Effekte von der Enzymmodifizierung mit mPEG in den

untersuchten IL-Wasser-Gemischen aus. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass der

enzymdeaktivierende bzw. aktivierende Einfluss dieser Lösemittel einem anderen Mechanis-

mus als dem der untersuchten polaren organischen Lösungsmittel folgt. Vielmehr scheinen

die erhaltenen Ergebnisse im Zusammenhang mit den in Kapitel 3.1.1 und 3.1.2 beobachteten

Auswirkungen von gelösten Salzen auf die Aktivität und Stabilität der SH zu stehen. Dabei

zeigten Salze, die beispielsweise Sulfationen enthielten, enzymstabilisierende, phosphat-

haltige Salze hingegen destabilisierende Effekte. Genauere Aussagen sind aufgrund der

fehlenden Strukturinformation zur SH jedoch nicht zu treffen.

Ergebnisse und Diskussion 84

2,5% [EMIM][EtSO

]

5% [EMIM][EtSO

]

2,5% [MTEOA][MeSO

]

5% [MTEOA][MeSO

]

Halbwertszeit [h]

native SH

modifizierte SH

Abbildung 3.33 Stabilität der modifizierten SH in 2,5 und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und

[MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit der nativen SH. [IL-Konzentrationen wie angegeben,

0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C]

Für gewöhnlich wird der stabilisierende Effekt von mPEG durch den Grad der Hydratisierung

der Proteinoberfläche, basierend auf den hydrophilen Eigenschaften des PEGs, bestimmt.

Dabei kommt es zu einer Reduzierung der Enzymflexibilität aufgrund der gleichzeitigen

Wechselwirkung von hydrophoben Bereichen des PEGs mit hydrophoben Teilen an der Ober-

fläche des Proteins [Van den Wittenboer et al., 2010, Quintanilla-Guerrero et al., 2008,

Rodriguez-Martinez et al., 2008, Svergun et al., 2008, Lopez-Cruz et al., 2006, Garcia-

Arellano et al., 2002]. Infolge dessen kommt es zur Ausbildung eines rigiden Käfigs um das

Enzym herum. Dieser reduziert Anfälligkeiten des Enzyms gegenüber Einflüssen, die zu einer

Entfaltung der dreidimensionalen Proteinstruktur führen. Die Größe und Kraft dieses Käfigs

hängt dabei von der Anzahl von kovalent gebundenen PEG-Molekülen pro Enzymmolekül ab.

Demnach kann der Schutz vor denaturierenden Einflüssen durch die Enzymmodifizierung mit

PEG so lang aufrecht erhalten werden, wie ein intakter Käfig um das Protein herum existiert.

Die Ergebnisse für die modifizierte SH deuten somit daraufhin, dass bis zu einer bestimmten

Konzentration an polaren Molekülen, wie den untersuchten organischen Lösungsmitteln,

Ergebnisse und Diskussion 85

mPEG eine hinreichende Schutzfunktion besitzt. In Gegenwart von Molekülen, die eine

starke Wechselwirkung mit Wasser eingehen, kann die Hydratisierung durch mPEG dagegen

nicht mehr aufrechterhalten werden, auch bei niedrigen Konzentrationen dieser Substanzen.

Vermutlich ist ein dem entsprechendes Verhalten bei der modifizierten SH in Gegenwart der

untersuchten ILs zu beobachten.

3.2.3 Zusammenfassung

Es konnte gezeigt werden, dass die chemische Modifizierung der Oberfläche der SH mit

mPEG eine geeignete Methode zur Stabilisierung der SH ist, insbesondere gegenüber inakti-

vierenden Interaktionen mit Lösungsmitteln. Die Modifizierung der SH mit mPEG5000 führte

bei einem Enzym-mPEG-Verhältnis von 1:500 zu hohen Restaktivitäten von 91 %. Zudem

konnte die zuvor beobachtete ausgeprägte Sensitivität des Enzyms gegenüber polaren

organischen Lösungsmitteln deutlich verringert werden. Dabei konnte die Lösungsmittel-

aktivität der SH um ein bis zu 3,4-faches und die Lösunsgmittelstabilität um ein bis zu 5-

faches erhöht werden. Darüber hinaus konnte eine prägnante Aktivitätssteigerung um bis zu

46 % in IL-Wasser-Gemischen erzielt werden. Hinsichtlich der Halbwertszeit der SH in den

untersuchten IL-Wasser-Gemischen war dagegen keine Veränderung zu beobachten, was auf

einen alternativen Mechanismus der Deaktivierung der SH durch die Zugabe von ILs

verglichen mit dem in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen hindeutet. In rein wässrigen Medien

war ebenfalls nur die Erhöhung der Enzymstabilität unter Rühren zu beobachten.

3.3 Stabilisierung der SH durch adsorptive Immobilisierung

Die adsorptive Bindung von Proteinen an feste Träger zählt zu den ältesten Methoden inner-

halb der Enzymimmobilisierung, da sich auf diesem Weg die Proteinstabilität in wässrigen

sowie in organischen Lösungen erhöhen lässt [Mateo et al., 2007, Mateo et al., 2000, Pan-Soo

et al., 2000]. Die Enzymstabilisierung ist dabei im Wesentlichen auf die signifikante Verän-

derung der Mikroumgebung des Enzyms durch seine adsorptive Bindung an einen Träger

zurückzuführen. Das stark solvatisierte, von Wasser umgebene Enzym wird dabei desolvati-

siert. Dadurch können natürliche Kräfte, die die solvatisierte Struktur aufrecht erhalten,

gestört werden, weshalb eine Anpassung der Enzymkonformation erfolgt, die häufig mit einer

Veränderung der Enzymaktivität, -stabilität und -selektivität einhergeht [Cao, 2005]. Zusätz-

Ergebnisse und Diskussion 86

lich erhält man bei der adsorptiven Immobilisierung von Enzymen die Möglichkeit, den

Biokatalysator durch einfache Filtration wiederholt einsetzen zu können. Darüber hinaus ist

häufig eine hohe Retention der Enzymaktivität zu beobachten, da das Protein selbst während

der adsorptiven Immobilisierung nicht modifiziert wird, wie es bei der kovalenten Immobili-

sierung der Fall ist [Albayrak und Yang, 2002, Sharma und Yamazaki, 1984].

Die Adsorption der SH an einen geeigneten Träger sollte in erster Linie der Enzymstabilisie-

rung dienen, da diesbezüglich bislang keine Literaturdaten für die SH existieren. Wie schon in

Kapitel 3.2, galt es auch bei diesen Untersuchungen, die Stabilität der SH insbesondere

gegenüber den in Kapitel 3.1.2 beobachteten inaktivierenden Einflussparametern zu erhöhen.

Dies umfasste abermals die Stabilsierung gegenüber den Lösungsmitteln DMF, DMSO und

Isopropanol und den ILs [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4]. Zudem sollte im Zuge der

Immobilisierung die mechanische Stabilität der SH in rein wässrigen Medien erhöht werden.

Hierzu wurden die Aktivität und die Halbwertszeit der erhaltenen Immobilisate unter den ent-

sprechenden Bedingungen analysiert und durch einen direkten Vergleich mit dem nativen

Enzym hinsichtlich einer Stabilisierung bewertet. Des Weiteren wurde die Rezyklierbarkeit

der hergestellten Immobilisate sowie die mögliche Enzymdesorption von den Partikeln, die

bei der adsorptiven Immobilisierung häufig zu beobachten ist, untersucht [Mateo et al., 2007,

Cao, 2005]. Die Bestimmung der Aktivität und Stabilität erfolgte zum einen für die Immobili-

sate der nativen SH und zum anderen für die Immobilisate der zuvor chemisch modifizierten

SH. Dies sollte der Erfassung möglicher additiver Effekte der beiden Stabilisierungsmethoden

dienen.

3.3.1 Optimierung des Immobilisierungsverfahrens

Zu Beginn der Untersuchungen erfolgte eine Optimierung des Immobilisierungsverfahrens

unter Verwendung der nativen, unmodifizierten SH. Da das Trägermaterial, der pH-Wert

während der Immobilisierung, die Inkubationszeit sowie das Enzym-Träger-Verhältnis einen

maßgeblichen Einfluss auf die Aktivität der Immobilisate und die Proteinbeladung der Träger

besitzen, erfolgte die Optimierung in Abhängigkeit von diesen Parametern [Mateo et al.,

2007, Cao, 2005]. Dazu wurde für jede dieser Einflussgrößen die verbleibende Enzym-

aktivität und die Menge des trägergebundenen Proteins bestimmt. Die Immobilisierung der

SH erfolgte dabei zu Beginn bei pH 8,0, dem pH-Optimum der nativen SH, und einem

Ergebnisse und Diskussion 87

Enzym-Träger-Verhältnis von 1:2000. Die Temperatur betrug stets 4 °C, um eine maximale

Adsorption der SH zu erhalten, die bei niedrigen Temperaturen begünstigt ist. Bei dem

verwendeten Puffer handelte es sich um 0,05 M Tris/HCl-Puffer.

Zunächst wurde eine Auswahl verschiedener Immobilisierungsmatrizes getroffen, bei denen

es sich unter anderem um makroporöse Harze unterschiedlicher Ladung handelte (Tabelle

3.2).

Tabelle 3.2 Auswahl verschiedener Träger für die adsorptive Immobilisierung der SH.

Hersteller Name Matrix Partikelgröße

AmberliteTM XAD761 Divinylbenzol 0,56 – 0,76 mm

AmberliteTM XAD7HP Acryl 0,56 – 0,71 mm

AmberliteTM FPA54 Formophenol -

Rohm und Haas

AmberliteTM FPC3500 Methacryl/Divinylbenzol 0,45 – 0,65 mm

IB-A161 Polystyren 0,35 – 0,7 mm

Chiralvision IB-C435 Polyacryl 0,35 – 0,7 mm

Resindion S.R.L Sepabeads® EC-EP Polymethacryl -

Die Ergebnisse für die gemessene Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Enzym-

immobilisierung auf den verschiedenen Trägern sind in Abbildung 3.34 dargestellt. Hiebei

zeigte sich, dass die adsorptive Bindung der SH an jeden dieser Träger zu einem deutlichen

Aktivitätsverlust führte. Die Aktivitätsabnahme ist hierbei auf die eintretende Konformations-

änderung des Enzyms durch seine ionische Interaktion mit dem Trägermaterial zurück-

zuführen [Cao, 2005]. In der Folge kommt es zudem häufig zu einer Diffusionslimitierung der

beteiligten Reaktanden aufgrund der schlechteren Zugänglichkeit des aktiven Zentrums des

trägergebundenen Proteins. Wie ausgeprägt die Aktivitätsabnahme des Enzyms nach der

Immobilisierung ist, hängt folglich stark von dem eingesetzten Trägermaterial ab, woraus die

ermittelten Aktivitätsunterschiede für die verschiedenen Träger resultieren. Die erreichte

maximale Restaktivität der SH betrug 48,9 (± 0,4) % nach der Immobilisierung auf dem

anionischen Harz AmberliteTM FPA54. Die adsorptive Bindung der SH an den kationischen

Träger AmberliteTM FPC3500 führte hingegen zu einem vollständigen Aktivitätsverlust, da

nur 0,8 (± 0,4) % der ursprünglichen Aktivität der SH bestimmt werden konnten. Die Protein-

Ergebnisse und Diskussion 88

beladung betrug bei beiden Trägern 93,4 (± 0,8) % bzw. sogar 100 (± 0,0) %, was bedeutet,

dass im Fall von AmberliteTM FPC3500 alle Proteinmoleküle adsorptiv gebunden werden

konnten, die dadurch herbeigeführte Änderung der Enzymkonformation jedoch zu einer

vollständigen Inaktivierung der SH führte, möglicherweise durch die kationische

Funktionalität des Trägermaterials. Bei der Immobilisierung der SH auf AmberliteTM FPA54

konnte hingegen eine hoher Anteil der SH gebunden werden und dabei die Hälfte ihrer

ursprünglichen Aktivität erhalten bleiben, weshalb dieser Träger für die weiteren Unter-

suchungen ausgewählt wurde.

00 01 02 03 04 05 06

100

120

100

120

Enzymaktivität

Proteinbeladung

Proteinbeladung [%]

Relative Aktivität [%]

Abbildung 3.34 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

verschiedenen Trägern. [00- AmberliteTM XAD761, 01- AmberliteTM XAD7HP, 02-

AmberliteTM FPA54, 03- AmberliteTM FPC3500, 04- Chiralvision IB-A161, 05- Chiralvision

IB-C435, 06- Resindion S.R.L. Sepabeads® EC-EP; 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 4 °C,

Enzym-Träger-Verhältnis: 1:2000]

Die adsorptive Enzymimmobilisierung erfolgt unter anderem über ionische Interaktionen

zwischen dem Protein und dem Trägermaterial. Diese werden wiederum durch die

Protonierung der Aminosäureseitenketten des Enzyms sowie durch die Protonierung der

Funktionalitäten am Träger bestimmt [Whitesides et al., 2006, Cao, 2005]. Folglich übt der

pH-Wert während der Immobilisierung einen starken Einfluss auf die Quantität der Protein-

Träger-Bindung sowie auf die verbleibende Restaktivität des gebundenen Enzyms aus,

weshalb eine Optimierung des Immobilisierungsverfahrens in Abhängigkeit vom pH-Wert

Ergebnisse und Diskussion 89

erfolgte. Dazu wurde die Aktivität und Proteinbeladung der Immobilisate nach der Immobili-

sierung zusätzlich bei einem pH-Wert von 7,0 bestimmt. Auf die Optimierung in einem

weiteren pH-Bereich wurde dabei verzichtet, da in diesem Fall eine Inaktivierung der SH

während der Immobilisierung zu erwarten war. Es zeigte sich, dass der pH-Wert während der

Immobilisierung in dem betrachteten Bereich keinen signifikanten Einfluss auf die Aktivität

der Immobilisate sowie auf deren Proteinbeladung besitzt (Abbildung 3.35). So nahm sowohl

die Enzymaktivität als auch die Menge des gebundenen Proteins bei einer Verringerung des

pH-Wertes von 8,0 auf 7,0 nur geringfügig ab, da die ermittelte SH-Aktivität noch immer

44,4 (± 0,3) % und die Proteinbeladung 77,8 (± 7,3) % betrug. Somit erfolgte die weitere SH-

Immobilisierung bei einem pH-Wert von 8,0.

100

Proteinbeladung [%]

Relative Aktivität [%]

pH-Wert [-]

Enzymaktivität

Proteinbeladung

Abbildung 3.35 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei pH 7,0 und 8,0. [pH-Werte wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer,

4 °C, Enzym-Träger-Verhältnis: 1:2000]

Die Variation des Enzym-Träger-Verhältnisses zeigte einen nur geringen Einfluss auf die

Proteinbeladung der Träger (Abbildung 3.36). So wurden nach der Erhöhung der Enzym-

menge von 0,1 mg auf 0,2 mg noch immer 77,8 (± 7,3) % des eingesetzten Proteins am Träger

adsorbiert und bei einer Verringerung auf 0,05 mg SH ebenfalls noch 72,4 (± 0,8) % des

Enzyms am Träger gebunden. Demnach erfolgte eine Erhöhung der trägergebundenen

Enzymmenge, wenn die zur Immobilisierung eingesetzte Enzymmenge erhöht wurde. Im

Gegensatz dazu zeigte die Veränderung des Enzym-Träger-Verhältnisses einen deutlichen

Ergebnisse und Diskussion 90

Einfluss auf die relative Enzymaktivität nach der Immobilisierung. Demnach konnten bei

einem Enzym-Träger-Verhältnis von 1:500 nur noch 15,5 (± 0,0) % der Ausgangsaktivität

bestimmt werden. Bei einer Verdopplung der Enzymmenge, die zu einem Enzym-Träger-Ver-

hältnis von 1:1000 führte, verdoppelte sich gleichzeitig die Restaktivität der Immobilisate,

was mit der absolut höheren Enzymbeladung korreliert. Nur die Erhöhung des Enzym-Träger-

Verhältnisses von 1:2000 auf 1:4000 erzielte eine lediglich geringfügige Erhöhung der Rest-

aktivität um 10 %, die zudem innerhalb der Standardabweichung lag und somit für eine

Sättigung der Trägeroberfläche mit Enzym bei einem Enzym-Träger-Verhältnis von 1:2000

spricht. Zudem deuten die erhaltenen Resultate darauf hin, dass es bei hohen Proteinanteilen

zu einer Ausbildung von Polyenzymschichten kommt [Pareira et al., 2001, Al-Duri und Yong,

2000]. Dabei werden die innergebundenen Enzymmoleküle für einen Substratzugang

blockiert, was in der Folge zu einer Abnahme der Gesamtaktivität führt.

1:4000 1:2000 1:1000 1:500

100

Proteinbeladung [%]

Relative Aktivität [%]

Enzym-Träger-Verhältnis

Enzymaktivität

Proteinbeladung

Abbildung 3.36 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei verschiedenen Enzym-Träger-Verhältnissen. [Enzym-Träger-

Verhältnisse wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 4 °C]

Aufgrund der ermittelten hohen Proteinbeladung und der gleichzeitig hohen Aktivität der SH-

Immobilisate bei einem Enzym-Träger-Verhältnis von 1:2000 wurde die Immobilsierung

weiterhin bei diesem Verhältnis durchgeführt. Hierbei betrug die Proteinbeladungsdichte

0,47·10-3 mg SH pro mg Träger.

Ergebnisse und Diskussion 91

Die Erhöhung der Inkubationszeit während der Immobilisierung auf zwei Stunden übte

keinen Einfluss auf die Aktivität und Proteinbeladung der Träger aus, weshalb eine

Immobilisierungsdauer von einer Stunde beibehalten wurde. Die Untersuchung der Aktivität

und Stabilität der SH-Immobilisate erfolgte somit weiterhin bei 4 °C, pH 8,0, einem Enzym-

Träger-Verhältnis von 1:2000 und über eine Inkubationszeit von einer Stunde.

3.3.2 Aktivität der Immobilisate

Analog zu der Aktivitätsuntersuchung der mPEGylierten SH (Kapitel 3.2.2) erfolgte die Be-

stimmung der relativen Aktivität der SH-Immobilisate in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen

und IL-Wasser-Gemischen. Wie schon bei der nativen und modifizierten SH erfolgte die

Aktivitätsbestimmung der SH-Immobilisate ebenfalls stets bei 35 °C und pH 8,0 unter

Verwendung eines 0,05 M Tris/HCl-Puffer. Hiebei wurden sowohl die Aktivität der immobi-

lisierten nativen SH als auch die des immobilisierten und zuvor modifizierten Enzyms

ermittelt und hinsichtlich einer Aktivitätserhöhung bewertet.

Aktivität in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen

Die adsorptive Immobilisierung auf AmberliteTM FPA54 führte zu einer signifikanten

Erhöhung der Aktivität der SH in Gegenwart von polaren organischen Lösungsmitteln

(Abbildung 3.37). So konnte eine Erhöhung der relativen Enzymaktivität um ein bis zu 13-

faches beobachtet werden. Hierbei betrug die relative Aktivität der nativen SH nach ihrer

Immobilisierung noch 98,7 (± 0,4) %, 84,9 (± 4,5) % und 74,8 (± 5,4) % in 10 % (v/v) DMF,

DMSO bzw. Isopropanol. Die native, unimmobilisierte SH zeigte dem gegenüber eine deut-

lich geringere relative Aktivität unter vergleichbaren Bedingungen. Die Immobilisierung der

zuvor mit mPEG modifizierten SH führte zu ähnlichen bzw. sogar zu teilweise niedrigeren

Aktivitäten der Immobilisate in den untersuchten Lösungsmittel-Wasser-Gemischen. Somit

konnten keine additiven Effekte der beiden Stabilisierungsmethoden auf die Aktivität der SH

festgestellt werden.

Ergebnisse und Diskussion 92

DMF DMSO Isopropanol

100

Relative Aktivität [%]

native SH

adsorptiv immobilisierte SH

modifizierte und adsorptiv immobilisierte SH

Abbildung 3.37 Aktivität der adsorptiv immobilisierten nativen und modifizierten SH in

10 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol und Vergleich mit der nativen SH. [Lösungsmittel-

konzentration wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C, 1 mM NAD+, 1 µM

FMN]

Die Ergebnisse für die Aktivität der SH-Immobilisate verdeutlichen, dass die adsorptive

Immobilisierung der nativen sowie der chemisch modifizierten SH eine deutlich stabilere

Enzymkonformation hervorruft. In der Folge besitzt die SH eine verringerte Sensitivität

gegenüber den untersuchten organischen Lösungsmitteln, die zu einer geringeren Enzym-

deaktivierung führt.

Aktivität in IL-Wasser-Gemischen

Auch in IL-Wasser-Gemischen ließ sich die Aktivität der SH durch die adsorptive Immobili-

sierung auf AmberliteTM FPA54 deutlich erhöhen (Abbildung 3.38). So führte die Immobili-

sierung der nativen SH insbesondere in 5 % (v/v) [MTEOA][MeSO4] zu einer beachtlichen

Aktivitätszunahme um 294 %, wohingegen sich die Aktivität des immobilisierten und zuvor

chemisch modifizierten Enzyms nur um 127 % erhöhen ließ. Diese Beobachtung lässt auf

eine außergewöhnliche ionische Interaktion zwischen [MTEOA][MeSO4] und der adsorptiv

gebundenen SH schließen, insbesondere bei der gewählten IL-Konzentration. Die Aktivitäts-

zunahmen in 2,5 und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und in 2,5 % (v/v) [MTEOA][MeSO4] betru-

Ergebnisse und Diskussion 93

gen bis zu 60, 80 bzw. 75 %. Mit Ausnahme der Aktivität der Immobilisate in 5 % (v/v)

[MTEOA][MeSO4] waren keine signifikanten Unterschiede zwischen der Aktivität der Immo-

bilisate des nativen und des modifizierten Enzyms festzustellen. Somit konnten auch in den

untersuchten IL-Systemen keine deutlichen additiven Effekte bei der chemischen Modifizie-

rung der SH und ihrer zusätzlichen Immobilisierung beobachtet werden.

2,5% [EMIM][EtSO

]

5% [EMIM][EtSO

]

2,5% [MTEOA][MeSO

]

5% [MTEOA][MeSO

]

100

150

200

250

300

350

400

450

native SH

adsorptiv immobilisierte SH

modifizierte und adsorptiv immobilisierte SH

Relative Aktivität [%]

Abbildung 3.38 Aktivität der adsorptiv immobilisierten nativen und modifizierten SH in 2,5

und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit der nativen SH.

[IL-Konzentrationen wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C, 1 mM NAD+, 1

µM FMN]

3.3.3 Stabilität der Immobilisate

Wie bei der mPEGylierten SH in Kapitel 3.2.3 erfolgte die Untersuchung der Stabilität der

SH-Immobilisate ebenfalls in rein wässrigen Medien, in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen

und in IL-Wasser-Gemischen. Die Inkubationsbedingungen betrugen wie auch schon bei der

nativen und chemisch modifizierten SH stets 35 °C und pH 8,0 unter Verwendung eines 0,05

M Tris/HCl-Puffers. Die ermittelten Halbwertszeiten wurden sowohl für das immobilisierte

native als auch für das immobilisierte und zuvor modifizierte Enzym hinsichtlich einer Stabi-

lisierung in den verschiedenen Lösemittelsystemen bewertet.

Ergebnisse und Diskussion 94

Stabilität in rein wässrigen Medien

Die adsorptive Immobilisierung führte zu einer ausgeprägten Erhöhung der SH-Stabilität in

rein wässrigen Systemen (Abbildung 3.39).

00 01

native SH

adsorptiv immobilisierte SH

modifizierte und adsorptiv immobilisierte SH

Halbwertszeit [h]

Abbildung 3.39 Stabilität der adsorptiv immobilisierten nativen und modifizierten SH in rein

wässrigen Medien unter mechanischer Beanspruchung und ohne und Vergleich mit der

nativen SH. [00-ohne Rühren, 01- Magnetrührer (400 Upm); 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH

8,0), 35 °C]

In reinem Puffer und ohne eine zusätzliche Durchmischung des Inkubationsansatzes betrug

die Halbwertszeit der immobilisierten SH 12,8 (± 2,6) h, was einem Stabilisierungsfaktor von

2,4 entspricht. Die zusätzliche Modifizierung der SH mit mPEG führte zu einer ähnlich

hohen, innerhalb der Standardabweichung liegenden Halbwertszeit von 13,3 (± 0,6) h. Wurde

das rein wässrige Inkubationssystem zusätzlich gerührt, ergaben sich sowohl für die

Immobilisate der nativen als auch der mPEGylierten SH Enzymstabilitäten von 3,4 h. Unter

den gleichen Bedingungen betrug die Halbwertszeit der nativen SH nur 1,9 (± 0,1) h. Somit

konnte auch unter diesen Bedingungen eine 1,8-fache Stabilisierung erzielt werden. Erwar-

tungsgemäß ergaben sich für die chemische Modifizierung der SH mit mPEG und der zusätz-

lichen Immobilisierung keine additiven Effekte bezüglich einer Enzymstabilisierung, was mit

den Ergebnissen für die Stabilität der chemisch modifizierten SH in rein wässrigen Medien

(Kapitel 3.2.3), die keine Stabilisierung der SH ergaben, korreliert. Die gemessenen Halb-

Ergebnisse und Diskussion 95

wertszeiten für die SH-Immobilisate sind demzufolge allein auf die adsorptive Bindung an

AmberliteTM FPA54 und der dadurch stabilisierten Enzymkonformation bzw. der erhöhten

Rigidität des Proteins, die eine Entfaltung der dreidimensionalen Enzymstruktur verhindert,

zurückzuführen. Die Ergebnisse stimmen zudem mit Literaturdaten überein, die die Erhöhung

der Stabilität von verschiedenen Enzymen in rein wässrigen Medien durch deren adsorptive

Interaktionen mit einem festen Trägermaterial beschrieben [Mateo et al., 2007, Mateo et al.,

2000, Pan-Soo et al., 2000].

Zusätzlich zu den Stabilitätsmessungen erfolgte die Bestimmung des Proteingehalts in jedem

Inkubationssystem. Dabei war in beiden Fällen kein Protein nachweisbar. Somit kommt es

selbst unter dem Einfluss von Scherkräften zu keinem messbaren leaching des Enzyms unter

den betrachteten Bedingungen. Demzufolge wird kein Enzym von den Immobilisierungs-

partikeln ausgewaschen bzw. unter den gewählten Bedingungen tritt zunächst keine Desorp-

tion des Proteins ein. Das lässt darauf schließen, dass eine ausgeprägte Interaktion zwischen

der SH und der Immobilisierungsmatrix stattfindet, was für technische Anwendungen von

besonderem Interesse ist und nur selten bei der adsorptiven Bindung von Proteinen an ein

Trägermaterial zu beobachten ist [Brady und Jordaan, 2009, Mateo et al., 2007, Cao, 2005].

Stabilität in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen

Analog zu der Stabilität in rein wässrigen Medien ließ sich auch die Lösungsmittelstabilität

der SH durch ihre adsorptive Immobilisierung signifikant erhöhen (Abbildung 3.40). So

führte die Immobilisierung der nativen SH zu Halbwertszeiten von 0,6 (± 0,1) h, 2,8 (± 0,4) h

und 0,7 (± 0,1) h in 10 % (v/v) DMF, DMSO bzw. Isopropanol. Verglichen mit der nativen

SH konnten somit Stabilisierungsfaktoren von 6, 2,8, bzw. 7 erreicht werden. Vergleichbare

Effekte wurden ebenfalls für verschiedene andere adsorptiv immobilisierte Enzyme und deren

Stabilisierung gegenüber organischen Lösungsmitteln beschrieben [Mateo et al., 2007].

Hierbei lässt sich der stabilisierende Effekt abermals auf die Erhöhung der Rigidität des

Proteins durch dessen ionischer Interaktion mit einem festen Trägermaterial zurückführen.

Wurde die SH vor ihrer Immobilisierung zudem mit mPEG chemisch modifiziert konnten die

Halbwertszeiten nochmals deutlich erhöht werden. So betrugen die Halbwertszeiten in diesem

Fall 1,6 (± 0,4) h, 6,4 (± 0,0) h und 2,3 (± 0,0) h in Gegenwart von 10 % (v/v) DMF, DMSO

und Isopropanol, was signifikant höheren Stabilisierungsfaktoren von 16, 6,4 und 23

Ergebnisse und Diskussion 96

entspricht, wenn ein Vergleich mit den Immobilisaten der nativen SH erfolgt. Somit kommt

es zu einer Addition der stabilisierenden Effekte, die durch beide Methoden, der chemischen

Modifizierung und der adsorptiven Immobilisierung, eingeleitet werden können. Der be-

obachtete additive Effekt stützt sich zudem auf die Ergebnisse für die Stabilität der chemisch

modifizierten SH (Kapitel 3.2.3), da auch schon die alleinige Modifizierung der SH mit

mPEG zu einer ausgeprägten Stabilisierung gegenüber den untersuchten polaren organischen

Lösemitteln führte.

DMF DMSO Isopropanol

native SH

adsorptiv immobilisierte SH

modifizierte und adsorptiv immobilisierte SH

Halbwertszeit [h]

Abbildung 3.40 Stabilität der adsorptiv immobilisierten nativen und modifizierten SH in

10 % (v/v) DMF, DMSO und Isopropanol und Vergleich mit der nativen SH. [Lösungsmittel-

konzentration wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C]

Auch bei diesen Untersuchungen wurde für jedes Lösemittel der Proteingehalt in den

Inkubationsansätzen bestimmt. Wie schon in den rein wässrigen Systemen zeigte sich, dass

kein leaching des Enzyms während der Inkubation einsetzt. Somit kann auch in diesen Löse-

mittelsystemen auf eine ausgeprägte Interaktion zwischen der SH und dem Trägermaterial

geschlossen werden, die ein Auswaschen des Proteins verhindert.

Ergebnisse und Diskussion 97

Stabilität in IL-Wasser-Gemischen

Die Untersuchung der Stabilität der SH-Immobilisate in den ILs [EMIM][EtSO4] und

[MTEOA][MeSO4] lieferte diverse Ergebnisse (Abbildung 3.41).

2,5% [EMIM][EtSO

]

5% [EMIM][EtSO

]

2,5% [MTEOA][MeSO

]

5% [MTEOA][MeSO

]

native SH

adsorptiv immobilisierte SH

modifizierte und adsorptiv immobilisierte SH

Halbwertszeit [h]

Abbildung 3.41 Stabilität der adsorptiv immobilisierten nativen und modifizierten SH in 2,5

und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit der nativen SH.

[IL-Konzentrationen wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C]

Die alleinige Immobilisierung der nativen SH führte zwar zu einer Verdopplung der Halb-

wertszeit in 2,5 % (v/v) [EMIM][EtSO4], bei einer weiteren Konzentrationserhöhung dieser

IL auf 5 % (v/v) war dagegen keine Enzymstabilisierung mehr zu beobachten. Auch in 2,5

und 5 % (v/v) [MTEOA][MeSO4] konnte keine erhöhte Halbwertszeit der adsorptiv immobi-

lisierten SH bestimmt werden. Diese lag in 5 % (v/v) dieser IL sogar unter der des nativen

Enzyms. Wurde die SH vor ihrer Immobilisierung jedoch zusätzlich modifiziert, betrug die

Halbwertszeit der Immobilisate 6,8 (± 0,6) bzw. 1,5 (± 0,0) h in 2,5 und 5 % (v/v)

[EMIM][EtSO4] und 8,8 (± 1,5) bzw. 3 (± 0,3) h in 2,5 und 5 % (v/v) [MTEOA][MeSO4].

Somit ließ sich SH-Stabilität in 2,5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] um einen Faktor von 7,6 und

somit beachtlich erhöhen, wohingegen dieser Faktor in den anderen IL-Systemen wesentlich

Ergebnisse und Diskussion 98

kleiner ausfiel. Auch in den IL-Systemen konnte kein Protein bestimmt werden, weshalb es

auch in diesen Medien zu keinem leaching der SH kommt.

Die gezeigten Ergebnisse deuten auf eine ungewöhnliche Interaktion zwischen dem kovalent

gebundenen mPEG, der Immobilisierungsmatrix, den umgebenden ILs und dem Protein selbst

hin, da keine eindeutigen Tendenzen bei Betrachtung der Halbwertszeiten der immobilisierten

SH in den untersuchten IL-Systemen festgestellt werden konnten. Diese Wechselwirkungen

sind mit hoher Wahrscheinlichkeit vorrangig ionischer Natur. Zudem war der beobachtete

Stabilisierungseffekt, der durch die chemische Modifizierung mit mPEG und der zusätzlichen

Immobilisierung auf AmberliteTM FPA54 eingeleitet wurde, so nicht zu erwarten, da sowohl

die alleinige chemische Modifizierung als auch ihre adsorptive Immobilisierung keinen

stabilisierenden Einfluss auf die SH ausübten, eine Kombination aus beidem, wie gezeigt

wurde, aber durchaus.

3.3.4 Rezyklierung der Immobilisate

Neben der Analyse der Aktivität und Stabilität der Immobilisate erfolgte darüber hinaus die

Untersuchung der Rezyklierbarkeit der hergestellten SH-Immobilisate. Dazu wurden sowohl

die immobilisierte native SH als auch die immobilsierte und zuvor chemisch modifizierte SH

wiederholt bei der Reduktion von 1 mM NAD+ eingesetzt. Die jeweilige Reaktionsdauer

betrug dabei drei Minuten, wobei die Immobilisate nach jeder Reaktion zunächst filtriert und

gewaschen und dann bei einer erneuten Reaktion eingesetzt wurden. Zudem wurde der

Reaktionsansatz kontinuierlich mittels Rühren bei 400 Upm durchmischt. Die ermittelten

relativen Aktivitäten der immobilisierten SH nach jeder der insgesamt fünf durchgeführten

Reaktionen sind in Abbildung 3.42 dargestellt. Dabei ließ sich zeigen, dass durch die

adsorptive Immobilisierung der SH ein wiederholt einsetzbarer aktiver Katalysator bereitge-

stellt wird, es trotz dessen aber zu einer Deaktivierung des Enzyms unter Prozessbedingungen

kommt. So verloren sowohl die Immobilisate der nativen SH als auch die Immobilisate der

chemisch modifizierten SH nach jedem Reaktionsdurchlauf kontinuierlich ihre Aktivität. Die

Aktivität der nativen immobilisierten SH bzw. des mPEGylierten immobilisierten Enzyms

betrug nach der ersten Reaktion noch 97,7 (± 8,7) bzw. 98,5 (± 4,2) %, nach der zweiten

Reaktion dann bereits nur noch 88,3 (± 3,5) bzw. 90,6 (± 3,3) %. Nach insgesamt vier

Reaktionsdurchläufen besaßen beide Immobilisate dann nur noch 56,7 (± 8,5) % der ur-

Ergebnisse und Diskussion 99

sprünglichen Aktivität der nativen immobilisierten SH bzw. 62,7 (± 5,5) % der ursprünglichen

Aktivität der immobilisierten mPEGylierten SH.

Da eine zunehmende mechanische Instabilität der Partikel infolge der wirkenden Scherkräfte

zu beobachten war, kann nicht ausgeschlossen werden, dass daraus ein inaktivierender Ein-

fluss auf die immobilisierte SH resultierte. Des Weiteren könnte der beobachtete Aktivitäts-

verlust durch das vorgenommene Waschen der Immobilisate zwischen den einzelnen

Reaktionsdurchläufen und einem damit einhergehenden Enzymverlust hervorgerufen worden

sein.

12345

100

120

[A]

Relative Aktivität [%]

Anzahl der Reaktionen

12345

100

120

[B]

Relative Aktivität [%]

Anzahl der Reaktionen

12345

100

120

[A]

Relative Aktivität [%]

Anzahl der Reaktionen

12345

100

120

[B]

Relative Aktivität [%]

Anzahl der Reaktionen

Abbildung 3.42 Aktivität der adsorptiv immobilisierten nativen [A] und modifizierten [B] SH

während der Rezyklierung bei fünf Reaktionsdurchläufen. [0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0),

35 °C, 1 mM NAD+, 1 µM FMN]

3.3.5 Zusammenfassung

Anhand der adsorptiven Immobilisierung wurde die SH über verschiedene nicht-kovalente

Wechselwirkungen, die unter anderem ionischer, hydrophiler oder hydrophober Natur sein

Ergebnisse und Diskussion 100

können, an einen geeigneten Träger (Amberlite TM FPA54) gebunden. Dadurch sollte die

Proteinrigidität erhöht werden, um in der Folge eine Stabilisierung gegenüber deaktivierenden

Einflüssen zu erreichen. Zugleich sollte auf diesem Weg ein rezyklierbares Enzympräparat

bereitgestellt werden, welches eine ökonomischere Prozessführung bei möglichen technischen

Anwendungen ermöglicht. Optimierungsuntersuchungen ergaben zunächst eine maximale

Restaktivität von 48,9 % und eine Proteinbeladung von 93,4 % bei einem Enzym-Träger-

Verhältnis von 1:2000 und einem pH-Wert von 8. Darüber hinaus kam es in keinem der

untersuchten Medien zu einem leaching der SH, was in technischen Anwendungen von

Vorteil ist. In rein wässrigen Medien und in jedem der untersuchten organischen

Lösungsmittel zeigten die Immobilisate eine signifikant höhere Halbwertszeit als die native

SH. Dabei wurden in rein wässrigen Medien Stabilisierungsfaktoren von bis zu 2,4 und in

organischen Lösemitteln bis zu 7-fach erhöhte Halbwertszeiten bestimmt. Für die

Immobilisierung der zuvor chemisch modifizierten SH ergaben sich vor allem in DMF,

DMSO und Isopropanol additive Effekte, die zu einer weiteren Erhöhung der Enzymstabilität

führten. In diesem Zusammenhang konnten beachtliche Stabilisierungsfaktoren von bis zu 23

erzielt werden. In den analysierten IL-Wasser-Gemischen konnten zwar verbesserte Enzym-

aktivitäten erhalten werden, jedoch lieferte die Untersuchung der Stabilität der SH-Immobili-

sate in diesen Medien diverse Resultate, die auf keine eindeutige Enzymstabilisierung

schließen ließen. Im Vergleich zur reinen chemischen Modifizierung der SH mit mPEG

(Kapitel 3.2) kann durch die zusätzliche adsorptive Immobilisierung des Enzyms eine

wesentlich stärkere Stabilisierung der SH erzielt werden.

3.4 Stabilisierung der SH durch kovalente Immobilisierung

Die kovalente Bindung von Enzymen an geeignete Träger ist eine weitere bedeutende

Methode innerhalb der Immobilisierung. Im Gegensatz zur adsorptiven Enzymimmobili-

sierung erfolgt hierbei die Ausbildung einer kovalenten und somit stabileren Bindung

zwischen der Immobilisierungsmatrix und dem Protein, die zwar die direkte chemische

Modifizierung des Enzyms zur Folge hat, dafür aber häufig ein leaching des Proteins

verhindert und zudem zu einer stärkeren Enzymstabilisierung führt [Brady und Jordaan, 2009,

Sheldon, 2007, Cao, 2005]. Der stabilisierende Effekt beruht dabei im Allgemeinen auf der

Erhöhung der Enzymrigidität [Iyer und Ananthanarayan, 2008, Fernández-Lafuente et al.,

1999].

Ergebnisse und Diskussion 101

Auch die kovalente Immobilisierung der SH sollte in erster Linie ihrer Stabilisierung gegen-

über deaktivierenden Einflüssen dienen. Diese Einflüsse umfassten, wie auch zuvor, die

mechanische Beanspruchung in rein wässrigen Medien und die Zugabe der organischen Löse-

mittel DMF, DMSO und Isopropanol, sowie der ILs [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4].

Wie auch schon bei der adsorptiven Immobilisierung der SH erfolgte die Untersuchung der

Aktivität und Stabilität der erhaltenen Immobilisate in den verschiedenen Reaktionsmedien,

wobei es sich zum einen um die immobilisierte native SH handelte und zum anderen um das

immobilisierte und zvor chemisch modifizierte Enzym. Dies sollte, wie schon zuvor, der

Erfassung möglicher additiver Effekte beider Stabilisierungsmethoden dienen. Zudem wurde

ebenfalls die Rezyklierbarkeit der Immobilisate analysiert. Zwar wurde die native SH bereits

auf verschiedenen Trägermaterialien kovalent immobilisiert, jedoch erfolgte bislang noch

keine systematische Studie, in der eine Bewertung der Enzymstabilisierung unter den in

dieser Arbeit untersuchten Inkubationsbedingungen vorgenommen wurde [Deloggio und

Graves, 1988, Popov et al., 1986, Payen et al., 1983, Danielson et al., 1982, Egerer und

Simon, 1982].

Da die Eignung von Amberlite-Trägern zur kovalenten Immobilsierung bislang für eine Viel-

zahl verschiedener Proteine beschrieben wurde, erfolgte die kovalente Bindung der SH an das

bereits bei der adsorptiven SH-Immobilisierung verwendete makroporöse Harz AmberliteTM

FPA54 [Kumari und Kayastha, 2011, Dwevedi und Kayastha, 2009, Fazlena et al., 2006,

Anita et al., 1997]. Dieses verfügt über aktivierbare Aminofuktionen an seiner Oberfläche.

Die kovalente Bindung der SH erfolgte in einer zweistufigen Reaktion, die mechanistisch wie

in Abbildung 3.43 dargestellt abläuft. Hierbei werden zunächst die Funktionalitäten an der

Trägeroberfläche aktiviert, wozu im Fall der Immobilisierung der SH das häufig eingesetzte

hochreaktive Glutardialdehyd diente. Dabei kommt es zur Bildung eines Enamins zwischen

den sekundären Aminogruppen des Trägers und einer der beiden Aldehydfunktionen des

bifunktionalen Aktivirieungsreagenzes. Im zweiten Schritt erfolgt dann die Iminbildung

zwischen der zweiten Aldehydfunktion des Glutarddialdehyds und den verfügbaren



-Lysin-

Aminosäuren des Proteins.

Ergebnisse und Diskussion 102

Abbildung 3.43 Reaktionschema der kovalenten Bindung eines Enzyms an einen festen

Träger.

3.4.1 Optimierung des Immobilisierungsverfahrens

Zunächst erfolgte eine Optimierung der kovalenten Immobilisierung der nativen SH in

Abhängigkeit von den in Tabelle 3.3 aufgeführten Parametern, da diese einen maßgeblichen

Einfluss auf die Aktivität und Proteinbeladung von Immobilisaten ausüben [Mateo et al.,

2007 Cao, 2005]. Dazu wurde jeder der Parameter in einem definierten Bereich, der ebenfalls

in Tabelle 3.3 angegeben ist, variiert und die verbliebene Aktivität der SH sowie die Menge

des kovalent gebundenen Proteins bestimmt. Die Immobilisierung erfolgte stets bei Raum-

temperatur unter Verwendung eines 0,05 M Tris/HCl-Puffers. Der pH-Wert während der

Immobilisierung betrug zu Beginn 8,0, die Glutardialdehydkonzentration 2,5 % (v/v), die

Inkubationszeit für die Trägeraktivierung sowie die Inkubationszeit des Enzyms jeweils 1

Stunde und das Enzym-Träger-Verhältnis 1:2000. Zur Optimierung des Immobilisierungsver-

fahrens wurden dann die jeweiligen Parameter nacheinander variiert.

Ergebnisse und Diskussion 103

Tabelle 3.3 Parameter für die Optimierung der kovalenten Immobilisierung der SH.

Parameter Variationsbereich

pH-Wert 7,0 und 8,0

Glutardialdehydkonzentration 0,5 - 5 % (v/v)

Aktivierungszeit der Träger 0,5 - 2 h

Inkubationszeit des Enzyms 0,25 - 2 h

Enzym-Träger-Verhältnis 1:500 - 1:4000

Da der während der Immobilisierung vorherrschende pH-Wert Einfluss auf die für eine

kovalente Bindung notwendige Nukleophilie der Trägerfunktionalitäten und des Protonie-

rungsgrades der Aminosäureseitenketten ausübt, wurde dieser Parameter zunächst variiert

[Whitesides et al., 2006, Cao, 2005]. Dazu wurden jeweils die Proteinbeladung und Aktivität

der Immobilisate nach der Immobilisierung bei pH 7,0 und 8,0 bestimmt (Abbildung 3.44).

Aufgrund der hohen Instabilität der SH bei pH-Werten über 8 wurde auf eine Untersuchung in

diesem Bereich verzichtet.

100

120

100

120

Proteinbeladung [%]

Relative Aktivität [%]

pH-Wert [-]

Enzymaktivität

Proteinbeladung

Abbildung 3.44 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei pH 7,0 und 8,0. [pH-Werte wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer,

RT, 2,5 % (v/v) Glutardialdehyd, Enzym-Träger-Verhältnis: 1:2000]

Ergebnisse und Diskussion 104

Es zeigte sich, dass die Menge der trägergebundenen SH bei beiden pH-Werten 100 % betrug.

Im Gegensatz dazu, übte der pH-Wert während der Immobilisierung aber einen deutlichen

Einfluss auf die Aktivität der SH aus, wobei die Immobilisate bei einem pH-Wert von 7,0

11,5 (± 0,0) % und bei einem pH-Wert von 8,0 28,2 (± 0,1) % der ursprünglichen Aktivität

der nativen SH besaßen. Aufgrund der in Kapitel 3.1.2 ermittelten höheren Stabilität der SH

bei einem pH von 7,0, ist auszuschließen, dass die geringere Aktivität der Immobilisate nach

der Immobilisierung bei diesem pH-Wert durch eine Deaktivierung der SH verursacht wurde.

Vielmehr scheint die Immobilisierung bei pH 8,0 zu einer aktivieren Konformation der träger-

gebundenen SH geführt zu haben, weshalb die Enzymimmobilisierung im Weiteren auch bei

diesem pH-Wert durchgeführt wurde.

Da die Konzentration des Aktivierungsreagenzes Glutardialdehyd die Anzahl der verfügbaren

Bindestellen für die Trägerbindung des Enzyms bestimmt, wurde dieser Einflussparameter im

nächsten Schritt der Optimierungsanalyse untersucht [Singh et al., 2011]. Die dabei erhalte-

nen Ergebnisse der Aktivität sowie der Proteinbeladung der Immobilisate sind in Abbildung

3.45 dargestellt.

0,5 1 2,5 5

100

120

100

120

Enzymaktivität

Proteinbeladung

Proteinbeladung [%]

Relative Aktivität [%]

Konzentration Glutardialdehyd [%(v/v)]

Abbildung 3.45 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei verschiedenen Glutardialdehydkonzentrationen. [Glutardialdehyd-

konzentrationen wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), RT, Enzym-Träger-

Verhältnis: 1:2000]

Ergebnisse und Diskussion 105

Die Variation der Glutardiadehydkonzentration zeigte keinen messbaren Einfluss auf die

Proteinbeladung, da stets 100 % der eingesetzten SH kovalent am Träger gebunden wurden.

Im Gegensatz dazu nahm die Aktivität der Immobilisate bei einer Verringerung der Glutardi-

aldehydkonzentration von 2,5 auf 1 % (v/v) zunächst zu (34,1 (± 0,1) %), wobei ein weiteres

Herabsetzten auf 0,5 % (v/v) dann zu einem langsamen Aktivitätsverlust führte. Die geringste

Aktivität von nur 14,7 (± 0,0) % besaßen die SH-Immobilisate jedoch bei einer Glutardialde-

hydkonzentration von 5 % (v/v). Dieser Aktivitätsverlust kann auf die Bildung von Enzym-

agglomeraten und der daraus resultierenden Verzerrung der Enzymstruktur bei hohen Glutar-

dialdehydkonzentrationen zurückgeführt werden [Dwevedi und Kayastha, 2009]. Die weitere

Aktivierung der Träger erfolgte somit bei einer Glutardialdehydkonzentration 1 % (v/v).

Die Veränderung der Inkubationszeit für die Aktivierung des Trägers zeigte weder einen

Einfluss auf die Proteinbeladung noch auf die Aktivität der SH-Immobilisate (Abbildung

3.46).

0,5 1 2

100

120

100

120

Enzymaktivität

Proteinbeladung

Proteinbeladung [%]

Relative Aktivitt [%]

Inkubationszeit der Träger [h]

Abbildung 3.46 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei verschiedenen Inkubationszeiten des Trägers. [Inkubationszeiten des

Trägers wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), RT, 2,5 % (v/v) Glutardialdehyd,

Enzym-Träger-Verhältnis: 1:2000]

So genügte bereits eine Aktivierungszeit von einer halben Stunde um eine vergleichbar hohe

Aktivität der SH-Immobilisate von 35,7 (± 0,0) % sowie eine 100 %-ige Proteinbeladung wie

Ergebnisse und Diskussion 106

nach 1 oder 2 Stunden zu erzielen. Somit erfolgte die Trägeraktivierung weiterhin nur noch

über eine Zeitdauer von 30 Minuten.

Ähnliche Tendenzen wie bei der Dauer der Trägeraktivierung ergaben sich für den Einfluss

der Inkubationszeit des Enzyms auf die Proteinbeladung und die Aktivität der Immobilisate

(Abbildung 3.47). So zeigte sowohl die Erhöhung auf 2 Stunden als auch die Verringerung

der Inkubationszeit auf nur 15 Minuten keinen merklichen Effekt auf die beiden Größen.

Infolgedessen kann eine kurze Inkubationszeit für den Enzymbindungsschritt abgeleitet

werden, was eine zeiteffiziente Immobilisierung der SH ermöglicht. Darauf basierend wurde

für die weiteren Untersuchungen die Inkubationszeit der SH auf 15 Minuten reduziert. Dabei

besaßen die Immobilisate eine relative Aktivität von 39,3 (± 0,0) %.

0,25 0,5 1 2

100

120

100

120

Enzymaktivität

Proteinbeladung

Proteinbeladung [%]

Relative Aktivität [%]

Inkubationszeit des Enzyms [h]

Abbildung 3.47 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei verschiedenen Inkubationszeiten des Enzyms. [Inkubationszeiten des

Enzyms wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), RT, 2,5 % (v/v) Glutardialdehyd,

Enzym-Träger-Verhältnis: 1:2000]

Wie erwartet, beeinflusste die Variation des Enzym-Träger-Verhältnisses sowohl die Protein-

beladung als auch die Aktivität der SH-Immobilisate (Abbildung 3.48). Dabei sank die

Enzymaktivität sowie die Menge gebundenen Proteins bei einer Erhöhung der Enzymmenge.

Bei einem Enzym-Träger-Verhältnis von 1:500 konnten somit nur noch 47,7 (± 1,4) % der

eingesetzten SH am Träger gebunden werden, wobei die relative Aktivität der Immobilisate

Ergebnisse und Diskussion 107

nur noch 9,6 (± 0,0) % betrug. Eine Verringerung der Enzymmenge von 0,1 auf 0,05 mg

(Enzym-Träger-Verhältnis: 1:4000) führte hingegen zu einer geringfügigen Abnahme der

Enzymaktivität von 39,3 (± 0,0) % auf 34,3 (± 0,0) %. Anhand dieser Ergebnisse lässt sich

daraus schließen, dass bei einem Enzym-Träger-Verhältnis von 1:2000 die gesamte Träger-

oberfläche mit gebundener SH gesättigt ist. Somit kann bei einer weiteren Erhöhung der

Enzymmenge dieses nicht mehr an der Matrix gebunden werden. Demnach ergibt sich ein

optimales Enzym-Träger-Verhältnis von 1:2000, wobei die Proteinbeladungsdichte 0,5·10-3

mg SH pro mg AmberliteTM FPA54 beträgt. Dieser Wert entspricht jenem, der bereits bei der

adsorptiven Immobilisierung ermittelt wurde. Die erfolgreiche kovalente Immobilisierung

lässt sich an dieser Stelle jedoch durch die Variation der Glutardialdehydkonzentration sicher-

stellen, da dieser Parameter einen deutlichen Einfluss auf die Aktivität der erhaltenen Immo-

bilisate zeigte. Im Fall einer vorrangig adsorptiven Trägerbindung der SH hätte dieser

Parameter anderenfalls zu keiner Veränderung der Aktivität der Immobilisate führen dürfen.

1:4000 1:2000 1:1000 1:500

100

Proteinbeladung [%]

Relative Aktivität [%]

Enzym-Träger-Verhältnis

Enzymaktivität

Proteinbeladung

Abbildung 3.48 Enzymaktivität und Proteinbeladung nach der Immobilisierung der SH auf

AmberliteTM FPA54 bei verschiedenen Enzym-Träger-Verhältnissen. [Enzym-Träger-

Verhältnisse wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), RT, 2,5 % (v/v) Glutardi-

aldehyd]

Letztlich betrug die maximale Aktivität der SH-Immobilisate 39,3 (± 0,0) %, wobei die

Gesamtmenge der eingesetzten SH am Träger gebunden wurde. Der optimale pH-Wert

während der Immobilisierung betrug dabei 8,0, die Glutardialdehydkonzentration 1 % (v/v)

Ergebnisse und Diskussion 108

und das Enzym-Träger-Verhältnis 1:2000. Zudem konnte gezeigt werden, dass es lediglich

einer Inkubationszeit von 30 Minuten bedarf, um eine vollständige Aktivierung der

Immobilisierungsmatrix zu erreichen. Die anschließende kovalente Bindung der SH an

AmberliteTM FPA54 beanspruchte zudem nur 15 Minuten.

3.4.2 Aktivität der Immobilisate

In Analogie zu den Untersuchungen der Aktivität der chemisch modifizierten SH (Kapitel

3.2.2) sowie des adsorptiv immobilisierten Enzyms (Kapitel 3.3.2) erfolgte die Bestimmung

der Aktivität der kovalent immobilisierten SH in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen und in

IL-Wasser-Gemischen. Dabei wurde die relative Aktivität für das native kovalent immobili-

sierte Enzym sowie für die immobilisierte und zuvor chemisch modifizierte SH ebenfalls bei

35 °C und pH 8,0 unter Verwendung eines 0,05 M Tris/HCl-Puffers ermittelt und hinsichtlich

einer Aktivitätserhöhung bewertet.

Aktivität in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen

Die kovalente Immobilisierung auf AmberliteTM FPA54 führte zu einer deutlichen Erhöhung

der Aktivität der SH in Gegenwart von polaren organischen Lösungsmitteln (Abbildung

3.49). So betrugen die relativen Aktivitäten der kovalent immobilisierten nativen SH 98,9 (±

2,2) %, 109,6 (± 5,0) % und 82,4 (± 3,0) % in 10 % (v/v) DMF, DMSO bzw. Isopropanol.

Verglichen mit der nativen SH entspricht dies einer Aktivitätserhöhung um 92, 59 bzw. 60 %.

Somit verursachten die drei betrachteten Lösemittel nur noch eine geringe Enzymdeaktivie-

rung bzw. im Fall von DMSO sogar eine Aktivierung der SH, wenn diese kovalent immobili-

siert im Reaktionsansatz vorlag. Diese verringerte Sensitivität der SH gegenüber polaren

organischen Lösungsmitteln ist auf die erhöhte Enzymrigidität zurückzuführen, die aus der

kovalenten Bindung des Proteins an einen festen Träger resultiert und auch schon für andere

Enzyme beschrieben wurde [Wan et al., 2010, Qigang et al., 2004]. Der beobachtete aktivie-

rende Einfluss von DMSO auf die trägergebundene SH kann im Zusammanhang mit

Wechselwirkungen des polaren Lösemittels mit den geladenen Aminosäuren des Enzyms

stehen, die in der Folge zu erhöhten Reaktivitäten führen [Azevedo et al., 2001].

Ergebnisse und Diskussion 109

DMF DMSO Isopropanol

100

120

native SH

kovalent immobilisierte SH

modifizierte und kovalent immobilisierte SH

Relative Aktivität [%]

Abbildung 3.49 Aktivität der kovalent immobilisierten nativen und modifizierten SH in 10 %

(v/v) DMF, DMSO und Isopropanol und Vergleich mit der nativen SH. [Lösungsmittel-

konzentration wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C, 1 mM NAD+, 1 µM

FMN]

Wurde die native SH vor ihrer kovalenten Bindung an AmberliteTM FPA54 zusätzlich

chemisch modifiziert besaßen die dabei entstandenen Immobilisate geringere Aktivitäten von

90,1 (± 5,1) %, 80,1 (± 2,4) % und nur 35,3 (± 2,2) % in 10 % (v/v) DMF, DMSO bzw. Iso-

propanol. Die verringerte Aktivität der immobilisierten und zuvor modifizierten SH lässt sich

auf eine Abnahme der Enzymrigidität und der daraus resultierenden erhöhten Sensitivität der

SH-Immobilisate gegenüber deaktivierenden Einflüssen zurückführen. Als Ursache dafür

kann die verringerte Anzahl der zur Verfügung stehenden Bindestellen für die Bildung des

Enzym-Träger-Komplexes angenommen werden, da die dafür erforderlichen Aminofunktio-

nen von Lysin durch bereits kovalent gebundene mPEG-Moleküle blockiert sind.

Aktivität in IL-Wasser-Gemischen

Mittels der kovalenten Bindung der SH an AmberliteTM FPA54 ließen sich auch in den

untersuchten IL-Wasser-Gemischen wesentlich höhere Aktivitäten erzielen (Abbildung 3.50).

Hierbei besaßen die Immobilisate der nativen SH Aktivitäten von 162,6 (± 5,8) %, 163,2 (±

5,6) %, 134,1 (± 0,4) % und 142,9 (± 5,7) % in 2,5 und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] bzw. 2,5

Ergebnisse und Diskussion 110

und 5 % (v/v) [MTEOA][MeSO4]. Verglichen mit der Aktivität der nativen SH in den beiden

ILs entspricht dies einer deutlichen Aktivitätszunahme. Somit führte die erhöhte Rigidität der

SH infolge ihrer Immobilisierung auch in diesen Lösemittelsystemen zu einer Verringerung

der Enzymsensitivität gegenüber der Gegenwart der untersuchten ILs und stimmt damit mit

Resultaten anderer Enzyme überein [Persson und Bornscheuer, 2003]. Zudem zeigten die

Immobilisate der zuvor chemisch modifizierten SH wiederholt geringere Aktivitäten als die

Immobilisate des nativen Enzyms in den IL-Wasser-Gemischen. Auch in diesem Fall ist

dieser Effekt auf die geringere Enzymrigidität infolge der Bindung von mPEG an der Protein-

oberfläche und dem damit einhergehenden verringerten Anteil der Enzym-Träger-Bindungen

zurückzuführen.

2,5% [EMIM][EtSO

]

5% [EMIM][EtSO

]

2,5% [MTEOA][MeSO

]

5% [MTEOA][MeSO

]

100

150

200

native SH

kovalent immobilisierte SH

modifizierte und kovalent immobilisierte SH

Relative Aktivität [%]

Abbildung 3.50 Aktivität der kovalent immobilisierten nativen und modifizierten SH in 2,5

und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit der nativen SH.

[IL-Konzentrationen wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C, 1 mM NAD+, 1

µM FMN]

3.4.3 Stabilität der Immobilisate

Die Untersuchung der Stabilität der SH-Immobilisate erfolgte ebenfalls in rein wässrigen

Medien, in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen und in IL-Wasser-Gemischen. Die Inkubations-

Ergebnisse und Diskussion 111

bedingungen betrugen wie auch schon bei der nativen, chemisch modifizierten und adsorptiv

immobilisierten SH stets 35 °C und pH 8,0 unter Verwendung eines 0,05 M Tris/HCl-Puffers.

Die ermittelten Halbwertszeiten wurden sowohl für das immobilisierte native als auch für das

immobilisierte und zuvor modifizierte Enzym hinsichtlich einer Stabilisierung in den ver-

schiedenen Lösemittelsystemen bewertet.

Stabilität in rein wässrigen Medien

Die kovalente Bindung an AmberliteTM FPA54 führte zu einer signifikanten Erhöhung der

SH-Stabilität in rein wässrigen Systemen (Abbildung 3.51).

00 01

native SH

kovalent immobilisierte SH

modifizierte und kovalent immobilisierte SH

Halbwertszeit [h]

Abbildung 3.51 Stabilität der kovalent immobilisierten nativen und modifizierten SH in rein

wässrigen Medien unter mechanischer Beanspruchung und ohne und Vergleich mit der

nativen SH. [00-ohne Rühren, 01-Magnetrührer (400 Upm); 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0),

35 °C]

Die Halbwertszeit der immobilisierten nativen SH und die der immobilisierten und zuvor

chemisch modifizierten SH betrugen 19,1 (± 2,5) bzw. 22,1 (± 4,2) h in reinem Puffer, ohne

dass die Immobilisate einer mechanischen Beanspruchung ausgesetzt wurden. Bei einem

Vergleich der gemessenen Halbwertszeiten mit denen der nativen SH ergaben sich Stabilisie-

rungsfaktoren von 3,6 bzw. 4,2 für die immobilisierte native bzw. die immobilisierte

mPEGylierte SH. Wurde das Inkubationssystem zusätzlich gerührt und somit eine mechani-

Ergebnisse und Diskussion 112

sche Beanspruchung der Immobilisate herbeigeführt, ließen sich Stabilisierungsfaktoren von 6

bzw. 4,8 für die immobilisierte native bzw. die immobilisierte mPEGylierte SH erzielen. So-

mit konnte die mechanische Stabilität der SH im Zuge der kovalenten Immobilisierung bedeu-

tend erhöht werden, wie es auch schon für andere Enzyme beschrieben wurde [Kumari und

Kayastha, 2011, Bolivar et al., 2006]. Der beobachtete stabilisierende Effekt lässt sich dabei

ebenfalls auf die allgemeine Erhöhung der Enzymrigidität infolge der Immobilisierung

zurückführen [Iyer und Ananthanarayan, 2008, Fernández-Lafuente et al., 1999]. Des Weite-

ren zeigte die zusätzliche chemische Modifizierung keinen Einfluss auf die Stabilität der SH-

Immobilisate. Ein Vergleich dieser Resultate mit früheren Ergebnissen für die Immobilisie-

rung der SH gestaltet sich an dieser Stelle schwierig, da die damaligen Stabilitätsuntersuchun-

gen unter abweichenden Bedingungen durchgeführt wurden und zudem keine Quantifizierung

der Enzymstabilität über die Halbwertszeit erfolgte [Deloggio und Graves, 1988, Popov et al.,

1986, Payen et al., 1983, Danielson et al., 1982, Egerer und Simon, 1982].

Stabilität in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen

Die kovalente Immobilisierung führte zu einer beachtlichen Erhöhung der Lösungsmittelsta-

bilität der SH (Abbildung 3.52). Die Halbwertszeiten der Immobilisate der nativen SH betru-

gen 13,9 (± 0,5) h, 28,7 (± 4,9) h und 15,9 (± 1,0) h in 10 % (v/v) DMF, DMSO bzw. Isopro-

panol, was verglichen mit dem nativen Enzym beachtlichen Stabilisierungsfaktoren von 139,

28,7, bzw. 159 entspricht. Ähnliche stabilisierende Effekte der kovalenten Immobilisierung

wurden bislang auch für verschiedene andere Enzyme in Gegenwart von organischen

Lösungsmitteln beschrieben [Betancor et al., 2006, Bolivar et al., 2006, Hidalgo et al., 2003,

Sheffield et al., 1994]. Wurde die SH vor ihrer kovalenten Immobilisierung zusätzlich mit

mPEG modifiziert, besaßen die Immobilisate geringere Halbwertszeiten von 9,9 (± 0,1) h,

17,1 (± 0,3) h und 14,9 (± 1,4) h in 10 % (v/v) DMF, DMSO bzw. Isopropanol. Die in diesem

Fall beobachtete verminderte Stabilität der SH-Immobilisate lässt sich wiederholt darauf

zurückführen, dass das immobilisierte und zuvor chemisch modifizierte Enzym eine geringere

Enzymrigidität aufweist als das immobilisierte native Enzym. Da in dem untersuchten

Bereich der Lösungsmittelstabilität der SH bislang noch keine Studien durchgeführt wurden,

ist ein Vergleich der gezeigten Ergebnisse mit entsprechenden Literaturdaten nicht möglich.

Ergebnisse und Diskussion 113

DMF DMSO Isopropanol

native SH

kovalent immobilisierte SH

modifizierte und kovalent immobilisierte SH

Halbwertszeit [h]

Abbildung 3.52 Stabilität der kovalent immobilisierten nativen und modifizierten SH in 10 %

(v/v) DMF, DMSO und Isopropanol und Vergleich mit der nativen SH. [Lösungsmittel-

konzentration wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C]

Stabilität in IL-Wasser-Gemischen

Auch in den gewählten IL-Wasser-Gemischen wies die kovalent immobilisierte SH bedeutend

höhere Halbwertszeiten als das native Enzym auf (Abbildung 3.53). Hiebei konnten für das

immobilisierte native Enzym beachtlich hohe Halbwertszeiten von 15,5 (± 0,9) h und 4,4 (±

0,5) h bzw. 17,5 (± 0,4) h und 16,9 (± 1,5) h ermittelt werden, wenn jeweils 2,5 und 5 % (v/v)

[EMIM][EtSO4] bzw. 2,5 und 5 % (v/v) [MTEOA][MeSO4] zum Inkubationsansatz gegeben

wurden. Die dabei erhaltenen Stabilisierungsfaktoren betrugen 17,2 und 8,8 bzw. 2,5 und 9,4.

Die zusätzliche chemische Modifizierung der SH-Immobilisate führte wiederholt zu einer

Abnahme der Halbwertszeiten der rein kovalent immobilisierten SH. Folglich betrugen die

Stabilisierungsfaktoren nur noch 13,2 und 11,8 bzw. 1,7 und 5,3 in 2,5 und 5 % (v/v)

[EMIM][EtSO4] bzw. 2,5 und 5 % (v/v) [MTEOA][MeSO4]. Auch diese Ergebnisse lassen

auf die Abnahme der Rigidität der immobilisierten SH infolge der zusätzlichen chemischen

Modifizierung schließen.

Ergebnisse und Diskussion 114

2,5% [EMIM][EtSO

]

5% [EMIM][EtSO

]

2,5% [MTEOA][MeSO

]

5% [MTEOA][MeSO

]

native SH

kovalent immobilisierte SH

modifizierte und kovalent immobilisierte SH

Halbwertszeit [h]

Abbildung 3.53 Stabilität der kovalent immobilisierten nativen und modifizierten SH in 2,5

und 5 % (v/v) [EMIM][EtSO4] und [MTEOA][MeSO4] und Vergleich mit der nativen SH.

[IL-Konzentrationen wie angegeben, 0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 35 °C]

3.4.4 Rezyklierung der Immobilisate

Im Anschluss an die Untersuchung der Aktivität und Stabilität der kovalent immobilisierten

SH erfolgte die Bestimmung der Rezyklierbarkeit der Immobilisate. Dazu wurden sowohl die

immobilisierte native SH als auch die immobilsierte und zuvor chemisch modifizierte SH

wiederholt bei der Reduktion von 1 mM NAD+ eingesetzt. Die dabei ermittelten relativen

Aktivitäten der immobilisierten SH nach jeder der insgesamt fünf durchgeführten Reaktionen

sind in Abbildung 3.54 dargestellt. Hierbei zeigte sich, dass die Aktivität beider Immobilisate

nach jedem Reaktionsdurchlauf kontinuierlich abnimmt. So betrug die relative Aktivität der

immobilisierten nativen SH bzw. des immobilisierten und mPEGylierten Enzyms nach der

ersten Reaktion zwar noch 100,3 (± 3,9) bzw. 99,3 (± 4,2) %. Während der fünften Reaktion

betrug die relative Aktivität dann aber nur noch 60,2 (± 5,3) bzw. 63,7 (± 5,4) %. Somit kam

es auch im Rahmen der Rezyklierung der kovalent immobilisierten SH zu einer Deaktivierung

der Immobilisate. Da auch bei der Untersuchung der Rezyklierbarkeit der kovalent

immobilisierten SH eine zunehmende mechanische Instabilität der AmberliteTM FPA54-

Ergebnisse und Diskussion 115

Partikel infolge der permanent wirkenden Scherkräfte zu beobachten war, kann nicht

ausgeschlossen werden, dass daraus ein inaktivierender Einfluss auf die immobilisierte SH

resultierte. Des Weiteren könnte der beobachtete Aktivitätsverlust ebenfalls durch das

vorgenommene Waschen der Immobilisate zwischen den einzelnen Reaktionsdurchläufen und

einem damit einhergehenden Enzymverlust hervorgerufen worden sein.

12345

100

120

[A]

Relative Aktivität [%]

Anzahl der Reaktionen

12345

100

120

[B]

Relative Aktivität [%]

Anzahl der Reaktionen

12345

100

120

[A]

Relative Aktivität [%]

Anzahl der Reaktionen

12345

100

120

[B]

Relative Aktivität [%]

Anzahl der Reaktionen

Abbildung 3.54 Aktivität der kovalent immobilisierten nativen [A] und modifizierten [B] SH

während der Rezyklierung bei fünf Reaktionsdurchläufen. [0,05 M Tris/HCl-Puffer (pH 8,0),

35 °C, 1 mM NAD+, 1 µM FMN]

3.4.5 Zusammenfassung

Durch die kovalente Immobilisierung der SH sollte eine weitere Erhöhung ihrer Stabilität

gegenüber inaktivierenden Einflüssen erreicht werden, da die kovalente Bindung an einen

geeigneten Träger (AmberliteTM FPA54) gewöhnlich zu einer weiteren Zunahme der Protein-

rigidität führt. Optimierungsuntersuchungen ergaben eine maximale Restaktivität von 39,3 %

und eine vollständige Proteinbeladung der Träger bei einem pH-Wert von 8, einer Glutar-

dialdehydkonzentration von 1 % (v/v) und einem Enzym-Träger-Verhältnis von 1:2000.

Ergebnisse und Diskussion 116

Zudem genügte eine sehr kurze Inkubationszeit der Träger mit Glutardialdehyd (0,5 h) als

auch des Enzyms (0,25 h) während seiner Immobilisierung um diese maximale Enzym-

aktivität und Proteinbeladung zu erzielen. Verglichen mit der chemischen Modifizierung mit

mPEG (Kapitel 3.2) und der adsorptiven Immobilisierung (Kapitel 3.3) führte die kovalente

Immobilisierung in allen betrachteten Lösemittelsystemen zu einer deutlich stärkeren

Stabilisierung der SH. In diesem Zusammenhang konnten beachtliche Stabilisierungsfaktoren

von bis zu 159 in 10 % (v/v) Isopropanol ermittelt werden. Die zusätzliche chemische Modifi-

zierung der SH erzielte hingegen keine weitere Enzymstabilisierung, sondern bewirkte

vielmehr eine Abnahme dieser infolge einer möglicherweise verringerten Enzymrigidität.

Schlussendlich wurde durch die kovalente Immobilisierung der SH ein äußerst stabiles sowie

rezyklierbares Enzympräparat bereitgestellt, das verglichen mit dem nativen Protein eine

ökonomischere Reaktionsführung erlaubt, insbesondere wenn polare organische Lösemittel

aber auch ILs eingesetzt werden.

3.5 Einsatz der SH bei der reduktiven Cofaktorregenerierung

Im Anschluss an die Charakterisierung und der daraufhin folgenden Stabilisierung der SH

wurde diese als Regenerierungsenzym für den Cofaktor NADH in Kombination mit der

CPCR eingesetzt. Als Modellreaktion diente die asymmetrische Reduktion von Acetophenon

zu (S)-1-Phenylethanol, wobei die Kapazität der SH anhand des direkten Vergleichs mit dem

derzeit bedeutendsten Cofaktorregenerierungssystem bewertet wurde, der Formiat-

dehydrogenase aus Candida boidinii (FDH) [Patel, 2003, Shaked und Whitesides, 1980, Kula

und Wandrey, 1987]. Zwar existieren gegenwärtig Studien, die die Anwendung der SH bei

der Regenerierung von NADH beschreiben, jedoch erfolgte bislang nie eine Bewertung der

Effizienz dieses Systems und ein Vergleich mit dem etablierten FDH-katalysierten Prozess

[Andersson et al., 1998, Hasumi et al., 1992, Okura et al., 1990, Otsuka et al., 1987, Payen et

al., 1983].

Bei der Wahl der Reaktionsbedingungen der CPCR-katalysierten Reduktion von Aceto-

phenon sollten die in Kapitel 3.1.3 ermittelten pH- und Temperaturverhältnisse, die zu einer

möglichst hohen Aktivität bei einer gleichzeitig maximalen Stabilität der SH führten,

Berücksichtigung finden, weshalb die Reaktion bei 30 °C und pH 7,5 erfolgte. Diese

Ergebnisse und Diskussion 117

Bedingungen gewährleisteten zudem eine hohe katalytische Aktivität der anderen beteiligten

bzw. betrachteten Enzyme, der CPCR und der FDH [Steinsiek, 2006, Bhattacharjee, 2005].

Alle weiteren Reaktionsbedingungen wurden in Anlehnung an die Arbeiten von Steinsiek

gewählt [Steinsiek, 2006], wobei die Reaktionsumsätze über eine Zeit von 4 Stunden

bestimmt wurden. Neben der Untersuchung der NADH-Regenerierung mit der nativen SH

erfolgte zudem der Einsatz der chemisch modifizierten, der adsorptiv immobilisierten sowie

der kovalent immobilisierten SH unter analogen Reaktionsbedingungen.

3.5.1 Regenerierung von NADH mit nativer SH

Die Untersuchung der Reaktionsumsätze von Acetophenon erfolgte in Abhängigkeit von der

Konzentration des jeweiligen Cofaktorregenerierungsenzyms, wobei je 1, 2 und 4 U mL-1 der

SH bzw. der FDH eingesetzt wurden (Abbildung 3.55).

01234

100

[A]

1 U mL

-1

2 U mL

-1

4 U mL

-1

Reaktionsumsatz [%]

Zeit [h]

01234

100

[B]

1 U mL

-1

FDH

2 U mL

-1

FDH

4 U mL

-1

FDH

Reaktionsumsatz [%]

Zeit [h]

01234

100

[A]

1 U mL

-1

2 U mL

-1

4 U mL

-1

Reaktionsumsatz [%]

Zeit [h]

01234

100

[B]

1 U mL

-1

FDH

2 U mL

-1

FDH

4 U mL

-1

FDH

Reaktionsumsatz [%]

Zeit [h]

Abbildung 3.55 Reaktionsumsätze von Acetophenon bei variierenden SH- [A] und FDH-

Konzentrationen [B]. [SH/FDH: 1, 2, 4 U mL-1, 0,35 U mL-1 CPCR, 0,1 M TEA/HCl-Puffer

(pH 7,5), 30 °C, 45 mM Acetophenon, 1 mM NADH, 1 mM DTT]

Ergebnisse und Diskussion 118

Wie erwartet, ergab sich für beide Cofaktorregenerierungsenzyme eine Abhängigkeit

zwischen deren Konzentration und der Acetophenonumsätze in definierten Zeiträumen. So

nahm die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit im Zuge der Erhöhung der SH- bzw. FDH-

Konzentration ebenfalls zu. Für das FDH-katalysierte Cofaktorregenerierungssystem befinden

sich diese Resultate in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Steinsiek [Steinsiek,

2006]. Nach einer Reaktionszeit von 0,5 Stunden betrug der Umsatz bei der höchsten

Cofaktorregenerierungsenzymkonzentration von 4 U mL-1 60,2 (± 3,3) % für das CPCR/SH-

System und 58 (± 2,2) % für das CPCR/FDH-System. Das verdeutlicht, dass die Kapazität der

SH zur Regenerierung von NADH vergleichbar hoch ist wie die der üblich eingesetzten FDH.

Der Endumsatz der Reaktion erreichte in dem CPCR/SH-System 88,8 (± 0,3) % und in dem

CPCR/FDH-System 95,4 (± 4) %, was im Fall der FDH ebenfalls mit den Ergebnissen von

Steinsiek korreliert [Steinsiek, 2006]. Innerhalb der ersten 1,5 Stunden waren bei beiden

betrachteten Regenerierungssystemen vergleichbare Reaktionsumsätze zu beobachten. Diese

stagnierten jedoch im Fall des CPCR/SH-Systems während des weiteren Reaktionsverlaufs,

was sich auf die begrenzte Stabilität der SH unter den gewählten Bedingungen zurückführen

lässt. Dabei kann angenommen werden, dass es insbesondere infolge der kontinuierlichen

Durchmischung des Reaktionssystems durch den eingesetzten Magnetrührer zu einer Deakti-

vierung der SH kommt, so wie es beobachtet wurde.

Nach Beendigung der Reaktion nach einer Zeit von 4 Stunden wurden für beide Regenerie-

rungssysteme die TTNs bei den verschiedenen Konzentrationen der SH und FDH berechnet

(Abbildung 3.56). Hiebei zeigte sich, dass das SH-katalysierte Regenerierungssystem eine

deutliche höhere TTN erzielt als das FDH-System. So betrug die TTN bei der geringsten

Cofaktorregenerierungsenzymkonzentration von 1 U mL-1 143666 (± 5450) im Fall der SH

und nur 1685 (± 14), wenn die FDH zur Regenerierung von NADH eingesetzt wurde. Bei

einer Cofaktorregenerierungsenzymkonzentration von 4 U mL-1 erreichte das SH-System eine

TTN von 50199 (± 180), die 100-fach höher ist als die der FDH (494 (± 21)). Aufgrund dieser

Ergebnisse, kann das SH-Regenerierungssystem als das deutlich effizientere ausgewiesen

werden, was auf die deutlich höhere spezifische Aktivität der SH im Vergleich zur FDH

zurückzuführen ist. In diesem Zusammenhang besaß die SH eine spezifische Aktivität von

24,2 U mg-1, wohingegen die der FDH lediglich 0,4 U mg-1 betrug. Für technische Anwen-

Ergebnisse und Diskussion 119

dungen stellt dieses Ergebnis einen beachtlichen Vorteil dar, da es im Fall der SH deutlich

geringeren Enzymmengen bedarf, um vergleichbare Reaktionsumsätze zu erzielen.

124

1000

2000

3000

40000

80000

120000

160000

TTN [%]

Coenzymaktivität [U mL

-1

]

FDH

Abbildung 3.56 TTN [nProdukt/nEnzym] der SH und FDH nach Beendigung der Reaktion.

[SH/FDH: 1, 2, 4 U mL-1, 0,35 U mL-1 CPCR, 0,1 M TEA/HCl-Puffer (pH 7,5), 30 °C,

45 mM Acetophenon, 1 mM NADH, 1 mM DTT]

3.5.2 Regenerierung von NADH mit chemisch modifizierter SH

Die Reaktionsumsätze, die bei der Regenerierung von NADH mit der chemisch modifizierten

SH bestimmt wurden, sind in Abbildung 3.57 dargestellt. Die Regenerierung erfolgte dabei

unter Verwendung einer Cofaktorregenerierungsenzymkonzentration von 4 U mL-1. Wie sich

zeigte, wurden mit der chemisch modifizierten SH zu Beginn der Reaktion vergleichbare

Reaktionsumsätze wie mit der äquivalenten Konzentration des nativen Enzyms erzielt. So

betrug der Umsatz von Acetophenon nach einer Reaktionszeit von 0,5 Stunden 60,5 (± 8,4) %

bei der Verwendung der mPEGylierten SH und im Vergleich dazu 60,2 (± 3,3) %, wenn die

NADH-Regenerierung mit 4 U mL-1 des nativen Enzyms erfolgte (Kapitel 3.5.1). Im

Gegensatz dazu war der Endumsatz von Acetophenon bei der chemisch modifizierten SH mit

98,4 (± 1,4) % um 9,6 % höher als bei der nativen SH (88,8 (± 0,3) %). Diese

Umsatzerhöhung kann auf die erhöhte Stabilität der chemisch modifizierten SH gegenüber

Scherkräften in rein wässrigen Systemen zurückgeführt werden, wie in Kapitel 3.2.3 bestimmt

wurde.

Ergebnisse und Diskussion 120

01234

100

Reaktionsumsatz [%]

Zeit [h]

Abbildung 3.57 Reaktionsumsatz von Acetophenon unter Einsatz der chemisch modifizierten

SH. [SH 4 U mL-1, 0,35 U mL-1 CPCR, 0,1 M TEA/HCl-Puffer (pH 7,5), 30 °C, 45 mM

Acetophenon, 1 mM NADH, 1 mM DTT]

3.5.3 Regenerierung von NADH mit adsorptiv immobilisierter SH

Für den Einsatz der adsorptiv immobilisierten SH bei der Reduktion von Acetophenon

wurden die gleichen Reaktionsbedingungen gewählt wie bereits bei der Verwendung der

nativen und auch chemisch modifizierten SH. Demnach wurde diejenige Menge an SH-

Immobilisaten eingesetzt, die nach der Immobilisierung eine Restaktivität von 4 U mL-1 auf-

wiesen. Zudem wurden die Immobilisate nach Beendigung der Reaktion nach 4 Stunden

filtriert, gewaschen und bei einer erneuten Reduktion von Acetophenon eingesetzt. Die dabei

erhaltenen Ergebnisse für die Reaktionsumsätze sind in Abbildung 3.58 dargestellt. Anhand

der ermittelten Reaktionsumsätze des ersten Reaktionsdurchlaufs zeigte sich, dass der Einsatz

der immobilisierten SH im Vergleich zur nativen SH zu deutlich geringeren Acetophenonum-

sätzen führte. So betrug die Menge des umgesetzten Substrats nach einer Reaktionszeit von

0,5 Stunden nur 42,4 (± 3,9) %, was verglichen mit der nativen SH einem um etwa 20 %

geringerem Umsatz entspricht. Auch nach 2 Stunden erreichte der Umsatz nur einen Wert von

62,2 (± 0,4) %. Beim Einsatz der nativen SH betrug der Reaktionsumsatz zu diesem Zeitpunkt

dagegen schon 87,7 (± 0,8) % und somit ca. 25 % mehr als im Fall der SH-Immobilisate.

Schlussendlich konnte bis zum Abbruch der Reaktion nach 4 Stunden ein Umsatz von 74,7 (±

Ergebnisse und Diskussion 121

1,0) % erreicht werden. Aufgrund der unerwarteten geringeren Umsätze beim Einsatz der

immobilsierten SH wurden des Weiteren Messungen durchgeführt, die zeigen sollten, ob es

während der Reduktion von Acetophenon zu Adsorptionserscheinungen der beteiligten

Reaktanden an den eingesetzten Träger AmberliteTM FPA54 kommt. Hiebei ergab sich, dass

sowohl Acetophenon als auch 1-Phenylethanol ungleichmäßig am Träger adsorbierten, wobei

stetig etwa doppelt so hohe Konzentrationen des entstehenden Produktes adsorbierten im Ver-

gleich zu Acetophenon. Somit können die ermittelten geringeren Umsätze auf Adsorptions-

vorgänge während der Reaktion zurückgeführt werden. Bei der Durchführung der zweiten

Reaktion mit den filtrierten und gewaschenen Immobilisaten wurde nach einer Reaktionszeit

von 0,5 Stunden noch immer ein Umsatz von 36,7 (± 2,3) % erhalten. Auch zu den darauf-

folgenden Zeiten nahm der Reaktionsumsatz stetig zu und erreichte nach 4 Stunden einen

Wert von 62,2 (± 2,6) %. Somit konnte gezeigt werden, dass das immobilisierte Enzym ver-

glichen mit der nativen SH eine deutlich höhere Stabilität aufweist, um bei einer wiederholten

Anwendung zu nur geringfügig verringerten Umsätzen zu führen. Aus ökonomischer Sicht

stellt das einen bedeutenden Vorteil für technische Anwendungen der SH dar. Die ermittelten

geringeren Umsätze während der Reduktion von Acetophenon wurden zuvor schon

begründet.

01234

100

1. Reaktion

2. Reaktion

Reaktionsumsatz [%]

Zeit [h]

Abbildung 3.58 Reaktionsumsatz von Acetophenon beim Einsatz der adsorptiv immobilisier-

ten SH bei zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen. [SH 4 U mL-1, 0,35 U mL-1 CPCR, 0,1 M

TEA/HCl-Puffer (pH 7,5), 30 °C, 45 mM Acetophenon, 1 mM NADH, 1 mM DTT]

Ergebnisse und Diskussion 122

3.5.4 Regenerierung von NADH mit kovalent immobilisierter SH

Analog zu den Untersuchungen des Einsatzes der adsorptiv immobilisierten SH bei der

Regenerierung von NADH (Kapitel 3.5.3) erfolgte die Verwendung der kovalent

immobilisierten SH bei der Reduktion von Acetophenon. Im Rahmen dessen zeigte sich, dass

anhand der kovalent immobilisierten SH vergleichbare Umsätzen erzielt werden können wie

mit dem adsorptiv immobilisierten Enzym (Abbildung 3.59).

01234

100

1. Reaktion

2. Reaktion

Reaktionsumsatz [%]

Zeit [h]

Abbildung 3.59 Reaktionsumsatz von Acetophenon beim Einsatz der kovalent

immobilisierten SH bei zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen. [SH 4 U mL-1, 0,35 U mL-1

CPCR, 0,1 M TEA/HCl-Puffer (pH 7,5), 30 °C, 45 mM Acetophenon, 1 mM NADH, 1 mM

DTT]

Während des ersten Reaktionsdurchlaufs wurden Umsätze von 49,4 (± 1,5) %, 70,9 (± 0,3) %

und 76,8 (± 1,8) % nach einer Reaktionszeit von 0,5, 2 bzw. 4 Stunden bestimmt. Im

Vergleich dazu lieferte der Einsatz der SH-Immobilisate während des zweiten Durchlaufs

etwas niedrigere Umsätze von 42,2 (± 2,8) %, 62 (± 4,7) % und 74,9 (± 4,5) % nach den

entsprechenden Reaktionszeiten. Als Ursache für die beobachteten geringen Reaktions-

umsätze, die im Vergleich zur nativen SH bestimmt wurden, sind ebenfalls die in Kapitel

3.5.3 beobachteten unsteten Adsorptionserscheiungen der beteiligten Reaktanden zu nennen.

Schlussendlich konnte auch anhand dieser Resultate gezeigt werden, dass die eingesetzte

kovalent immobilisierte SH ebenfalls eine deutlich erhöhte Stabilität aufweist. Im Zuge

Ergebnisse und Diskussion 123

dessen ließen sich bei einem wiederholten Einsatz der SH-Immobilisate erneut hohe

Reaktionsumsätze erzielen, was aus ökonomischer Sicht einen beachtlichen Vorteil gegenüber

des Einsatzes des gelösten nativen Enzyms darstellt, da dadurch eine wirtschaftlichere

Prozessführung erlaubt wird.

3.5.5 Zusammenfassung

Es konnte gezeigt werden, dass die native SH ein erfolgversprechender Biokatalysator zur

Regeneration von NADH in asymmetrischen Reduktionen ist, da sie verglichen mit der

konventionell eingesetzten FDH bei nur geringfügig niedrigeren Endumsätzen bedeutend

höhere TTNs infolge ihrer höheren spezifischen Aktivität erreicht. Für technische Anwendun-

gen stellt dieses Ergebnis einen bedeutenden Vorteil dar, da im Fall der SH geringere Protein-

mengen nötig sind, um vergleichbar hohe Reaktionsumsätze zu erzielen. Wurde die SH in

ihrer chemisch modifizierten Form eingesetzt, gelang es, die Endumsätze um weitere 10 %

auf etwa 98 % zu erhöhen, was den mittels der FDH erzielten Reaktionsumsätzen entspricht.

Die adsorptiv sowie die kovalent immobilisierte SH führte zwar aufgrund von unsteten

Adsorptionsvorgängen der beteiligten Reaktanden am eingesetzten Immobilisierungsträger zu

scheinbar geringeren Umsätzen, jedoch konnte bei deren wiederholtem Einsatz ein vergleich-

bar hoher Endumsatz erzielt werden, was nochmals die erhöhte Stabilität des immobilisierten

Enzyms demonstriert. Es wurde somit ein den industriellen Anforderungen entsprechender

Biokatalysator zur NADH-Regenerierung bereitgestellt, der eine effiziente und somit

ökonomischere Prozessführung erlaubt. Basierend auf diesen Ergebnissen kann ein

technischer Einsatz der SH in industriell bedeutenden Synthesen wie der Produktion von (L)-

tert-Leucin angestrebt werden.

Zusammenfassung 124

4 Zusammenfassung

Die lösliche Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16 (SH) ist aufgrund ihrer Bidirektionali-

tät und ihrer Toleranz gegenüber Sauerstoff ein vielversprechender Biokatalysator zur Rege-

nerierung des Cofaktors NADH. Dieser wird in zahlreichen asymmetrischen Synthesen zur

Herstellung chiraler Hydroxysäuren, Aminosäuren oder Alkohole durch Oxidoreduktasen

benötigt. Aufgrund des Bestrebens einer ökonomischen Prozessführung in industriellen

Anwendungen bedarf es der Regenerierung von NADH im Reaktionsansatz. Da das gegen-

wärtig etablierte Verfahren, das die Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii (FDH) als

Cofaktorregenerierungsenzym nutzt, noch immer eine geringe Effizienz besitzt, besteht das

Bestreben ein alternatives Regenerierungssystem bereitzustellen. Ein hydrogenasegekoppeltes

System, welches die SH nutzt, stellt in diesem Zusammenhang eine interessante Alternative

dar. Für eine solche Anwendung wurde jedoch bislang noch keine umfassende

Charakterisierung, Bewertung sowie eine gezielte Anpassung der SH an die geforderten

Prozessbedingungen vorgenommen. Aus diesem Grund erfolgte in der vorliegenden Arbeit

eine systematische Analyse der SH unter prozessrelevanten Bedingungen sowie die

Untersuchung verschiedener Stabilisierungsstrategien.

Zunächst wurde der Einfluss verschiedener technisch relevanter Parameter auf die Aktivität

und Stabilität der SH ermittelt. Dazu zählten die Temperatur, der pH-Wert, verschiedene

Salzionen, organische Lösungsmittel, sowie ionische Flüssigkeiten und die mechanische

Beanspruchung in Form von Scherkräften. Dabei zeigte sich, dass die SH eine ausgeprägte

Sensitivität gegenüber einer Vielzahl der untersuchten Einflussgrößen aufweist. So resultierte

aus der Erhöhung der Temperatur über 35 °C sowie des pH-Wertes über 8,0 eine starke

Inaktivierung der SH. Die Gegenwart von Natriumionen führte wiederum zu einer 70 %-igen

Inhibierung des Enzyms, wohingegen Phosphationen eine Verringerung der Stabilität

bewirkten. Dem gegenüber besaßen Sulfationen einen enzymstabilisierenden Einfluss. Ein

besonders drastischer Aktivitäts- und Stabilitätsverlust der SH wurde in Gegenwart der

verschiedener organischen Lösungsmittel, bei denen es sich um DMF, DMSO und Iso-

propanol handelte, sowie beim Zusatz verschiedener ionischen Flüssigkeiten (ILs) ermittelt.

[MTEOA][MeSO4] bildete dabei eine Ausnahme, da die SH bei Zugabe dieser ionischen

Flüssigkeit bedingt stabilisiert werden konnte. Wurde die SH einer mechanischen Beanspru-

Zusammenfassung 125

chung ausgesetzt, zeigte das Enzym dagegen abermals eine rapide Deaktivierung. Im

Weiteren wurde anhand des design of experiments (DOE) die gegenseitige Beeinflussung der

Temperatur und des pH-Wertes hinsichtlich derer Effekte auf die Aktivität und Stabilität der

SH untersucht. Dies sollte vorrangig der Bestimmung geeigneter Tempartur- und pH-

Bedingungen dienen, die zu einer möglichst maximalen Enzymaktivität bei einer gleichzeitig

hohen Stabilität der SH führen. Hierbei zeigte sich, dass die Reaktionstemperatur nicht ober-

halb von 30 °C und der pH zwischen 7,4 und 7,9 liegen sollte. Da die Zugabe von organi-

schen Lösungsmitteln sowie von ILs zu einer drastischen Deaktivierung der SH führte, viele

technische Anwendungen die Gegenwart dieser Medien jedoch erfordern, wurden im weiteren

Verlauf verschiedene Strategien zur Stabilisierung des Enzyms untersucht.

Durch chemische Modifizierung der freien Aminogruppen der SH wurden zunächst die

chemischen Funktionalitäten auf der Proteinoberfläche verändert, um diese gegenüber Inter-

aktionen mit Lösungsmitteln abzuschirmen. Die Modifizierung der SH mit mPEG5000 führte

bei einem Enzym-mPEG-Verhältnis von 1:500 zu hohen Restaktivitäten von 91 %. Zudem

konnte die zuvor beobachtete ausgeprägte Sensitivität des Enzyms gegenüber polaren

organischen Lösungsmitteln deutlich verringert werden. Dabei konnte die Aktivität der SH

um ein bis zu 3,4-faches und die Enzymstabilität um ein bis zu 5-faches in den untersuchten

LM-Wasser-Gemischen erhöht werden. Darüber hinaus konnte eine signifikante Aktivitäts-

steigerung um bis zu 46 % in IL-Wasser-Gemischen erzielt werden. Hinsichtlich der Halb-

wertszeit der SH in den untersuchten IL-Wasser-Gemischen war dagegen keine Veränderung

zu beobachten, was auf einen alternativen Mechanismus der Deaktivierung der SH durch die

Zugabe von ILs verglichen mit dem in Lösungsmittel-Wasser-Gemischen hindeutet. In rein

wässrigen Medien war ebenfalls nur die Erhöhung der mechanischen Stabilität des Enzyms zu

beobachten.

Anhand der adsorptiven Immobilisierung wurde die SH über verschiedene nicht-kovalente

Wechselwirkungen an einen geeigneten Träger, bei dem es sich um das anionische Harz

AmberliteTM FPA54 handelte, gebunden. Dadurch sollte die Proteinrigidität erhöht werden,

um in der Folge eine Stabilisierung gegenüber deaktivierenden Einflüssen zu erreichen und

zugleich ein rezyklierbares Enzympräparat bereitzustellen, was wiederum einer ökonomische-

ren Prozessführung bei möglichen technischen Anwendungen der SH dient. Optimierungs-

Zusammenfassung 126

untersuchungen ergaben eine maximale Restaktivität von 48,9 % und eine Proteinbeladung

von 93,4 % bei einem Enzym-Träger-Verhältnis von 1:2000 und einem pH-Wert von 8.

Darüber hinaus kam es in keinem der untersuchten Medien zu einem leaching der SH, was in

technischen Anwendungen von Vorteil ist. In rein wässrigen Medien und in jedem der

untersuchten organischen Lösungsmittel zeigten die Immobilisate eine signifikant höhere

Halbwertszeit als die native SH. Dabei wurden in rein wässrigen Medien Stabilisierungs-

faktoren von bis zu 2,4 und in organischen Lösemitteln bis zu 7-fach erhöhte Halbwertszeiten

bestimmt. Für die Immobilisierung der zuvor chemisch modifizierten SH ergaben sich vor

allem in DMF, DMSO und Isopropanol additive Effekte, die zu einer weiteren Erhöhung der

Enzymstabilität führten. In diesem Zusammenhang konnten beachtliche Stabilisierungsfakto-

ren von bis zu 23 erreicht werden. In den analysierten IL-Wasser-Gemischen konnten zwar

verbesserte Enzymaktivitäten erreicht werden, jedoch lieferte die Untersuchung der Stabilität

der SH-Immobilisate in diesen Medien diverse Resultate, die auf keine eindeutige Enzym-

stabilisierung schließen ließen.

Mittels kovalenter Immobilisierung der SH sollte eine weitere Erhöhung ihrer Stabilität

gegenüber inaktivierenden Einflüssen erreicht werden, da die kovalente Bindung an einen

geeigneten Träger (AmberliteTM FPA54) zu einer weiteren Zunahme der Proteinrigidität führt.

Optimierungsuntersuchungen ergaben eine maximale Restaktivität von 39,3 % und eine

vollständige Proteinbeladung der Immobilisate bei einem pH-Wert von 8, einer Glutardialde-

hydkonzentration von 1 % (v/v) und einem Enzym-Träger-Verhältnis von 1:2000. Die kova-

lente Immobilisierung der SH führte in jedem der untersuchten Medien zu einer beachtlichen

Stabilisierung der SH. Dabei konnten Stabilisierungsfaktoren von bis zu 159 erreicht werden.

Die zusätzliche chemische Modifizierung der SH erzielte hingegen keine weitere Enzym-

stabilisierung, sondern bewirkte vielmehr eine Abnahme dieser infolge einer verringerten

Enzymrigidität.

Abschließend wurde die SH als Cofaktorregenerierungsenzym bei der durch die Carbonyl-

reduktase aus Candida parapsilosis (CPCR) katalysierten Reduktion von Acetophenon einge-

setzt, um die Regenerierung von NADH zu katalysieren. Die Effizienz des hydrogenase-

gekoppelten Regenerierungssystems wurde anhand des direkten Vergleichs mit der FDH

ermittelt. Dabei zeigte sich, dass mittels der SH zwar geringfügig niedrige Endumsätze jedoch

Zusammenfassung 127

bis zu 100-fach höhere TTNs erzielt werden. Für technische Anwendungen stellt das einen

bedeutenden Vorteil dar, da im Fall der SH geringere Proteinmengen nötig sind, um

vergleichbar hohe Reaktionsumsätze zu erzielen. Mithilfe der stabilisierten mPEGylierten SH

gelang es, die Endumsätze um weitere 10 % auf etwa 98 % zu erhöhen. Die adsorptiv sowie

die kovalent immobilisierte SH führte zwar aufgrund von Adsorptionsvorgängen der

beteiligten Reaktanden am eingesetzten Immobilisierungsträger zu scheinbar geringeren

Umsätzen, jedoch konnten bei deren wiederholtem Einsatz vergleichbar hohe Endumsätze

erzielt werden. Somit wurde ein, den industriellen Anforderungen entsprechendes

Enzympräparat bereitgestellt, dessen hohe Effizienz sowie Stabilität einen ökonomischeren

Prozess der NADH-Regenerierung ermöglicht.

Literatur 128

5 Literatur

Abian, O., Mateo, C., Fernandez-Lorente, G., Palomo, J. M., Fernandez-Lafuente, R., Guisan,

J. M., Stabilization of immobilized enzymes against water-soluble organic cosolvents

and generation of hyperhydrophilic microenvironments surrounding enzyme

molecules. Biocatal. Biotransform. 2001, 19, 489-503.

Aehle, W., Enzymes in Industry: production and Application, 2007. Weinheim: VCH-Wiley.

Albayrak, N. und Yang, S. T., Immobilisation of Aspergillus oryzae



-galactosidase on

tosylated cotton cloth. Enzyme Microb. Technol. 2002, 31, 371-383.

Al-Duri, B. und Yong, Y. P., Lipase immobilisation: an equilibrium study of lipases

immobilised on hydrophobic and hydrophilic/hydrophobic supports. Biochem. Eng. J.

2000, 4, 207-215.

Andersson, M., Holmberg, H., Adlercreutz, P. Evaluation of Alcaligenes eutrophus cells as

an NADH regenerating catalyst in organic-aqueous two-phase system. Biotechnol.

Bioeng. 1998, 57, 79-86.

Anita, C. A., Sastry, M. A., Hashim, M. A., Immobilization of urease using Amberlite MB-1.

Bioprocess Biosyst. Eng. 1997, 17, 355-359.

Aoun, S. und Baboulene, M., Regioselectivity bromohydroxylation of alkenes catalysed by

chloroperoxidase: advantages of the immobilisation of enzyme on taic. J. Mol. Catal.

B: Enzym. 1998, 4, 101-109.

Azerad, R., Application of biocatalysts in organic synthesis. Bull. Soc. Chim. Fr. 1995, 132,

17-51.

Azevedo, A. M., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S., Fonseca, L. P. Stability of free and

immobilised peroxidase in aqueous mixtures of organic solvents. J. Mol. Catal. B:

Enzym. 2001, 15, 147-153.

Basri, M., Ampon, K., Yunus, W. M. Z., Razak, C. N. A., Salleh, A. B., Synthesis of fatty

esters by polyethylene glycol-modified lipase. J . Chem. Tech. Biotechnol. 1995, 64,

10-16.

Basri, M., Ampon, K., Yunus, W. M. Z., Razak, C.N.A., Salleh, A. B., Amidination of lipase

with hydrophobic imidoesters. J. Am. Oil Chem. Soc. 1992, 69, 579-583.

Literatur 129

Bastida, A., Sabuquillo, P., Armisen, P., Fernandez-Lafuente, R., Huguet, J., Guisan, J. M., A

single step purification, immobilization, and hyperactivation of lipases via interfacial

adsorption on strongly hydrophobic supports. Biotechnol. Bioeng. 1998, 58, 486-493.

Bhattacharjee, M., Cloning, expression, characterization and immobilization of carbonyl

reductase from Candida parapsilosis. 2005, Dissertation RWTH Aachen.

Bolivar, J. M., Mateo, C., Rocha-Martin, J., Cava, F., Berenguer, J., Fernandez-Lafuente, R.,

Guisan, J. M., The adsorption of multimeric enzymes on very lowly activated supports

involves more enzyme subunits: stabilization of a glutamate dehydrogenase from

Thermus thermophilus by immobilization on heterofunctional supports. Enzyme

Microb. Technol. 2009, 44, 139-144.

Bommarius, A. S. und Riebel, B. R., Biocatalysis: Fundamentals and Applications, 2004.

Weinheim: VCH-Wiley.

Bommarius, A. S., Schwarm, M., Drauz, K., Biocatalysis to amino acid-based chiral

pharmaceuticals - examples and perspectives. J. Mol. Catal. B: Enzym. 1998, 5, 1-11.

Bornscheuer, U. T. und Pohl, M., Improved biocatalysts by directed evolution and rational

protein design. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 137-143.

Bradford, M. M., Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of

protein utilizing principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254.

Brady, D. und Jordaan, J., Advances in enzyme immobilisation. Biotechnol. Lett. 2009, 31,

1639-1650.

Burgdorf, T., Lenz, O., Buhrke, T., Van der Linden, E., Jones, A. K., Albracht, S. P. J.,

Friedrich, B., [NiFe]-Hydrogenases of Ralstonia eutropha H16: Modular enzymes for

oxygen-tolerant biological hydrogen oxidation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2005a,

10, 181-196.

Burgdorf, T., Van der Linden, E., Bernhard, M., Yin, Q. Y., Back, J. W., Hartog, A. F.,

Muijsers, A. O., De Koster, C. G., Albracht, S. P. J., Friedrich, B., The soluble NAD+-

reducing [NiFe]-hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 consists of six subunits

and can be specifically activated by NADPH. J. Bacteriol. 2005b, 187, 3122-3132.

Burgdorf, T., Löscher, S., Liebisch, P., Van der Linden, E., Galander, M., Lendzian, F.,

Meyer-Klaucke, W., Albracht, S. P. J., Friedrich, B., Dau, H., Haumann, M.,

Structural and oxidation-state changes at its nonstandard Ni-Fe site during activation

Literatur 130

of the NAD-reducing hydrogenase from Ralstonia eutropha detected by x-ray

absorption, EPR, and FTIR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 2005c, 127, 576-592.

Cabrera, Z., Fernandez-Lorente, G., Fernandez-Lafuente, R., Palomo, J. M., Guisan, J. M.,

Novozym 435 displays very different selectivity compared to lipase from Candida

antarctica B adsorbed on other hydrophobic supports. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2009,

57, 171-176.

Cao, L., Carrier-bound immobiliezed enzymes: principles, applications and design, 2005.

Weinheim: VCH-Wiley.

Carrea, G. und Riva, S., Properties and synthetic applications of enzymes in organic solvents.

Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 2226-2254.

Castro, G. R. und Knubovets, T., Homogeneous biocatalysis in organic solvents and water-

organic mixtures. Crit. Rev. Biotechnol. 2003, 23, 195-231.

Chenault, H. K., Simon, E. S., Whitesides, G. M., Cofactor regeneration for enzyme-catalysed

synthesis. Biotechnol. Genetic Engineering Reviews 1988, 6, 221-270.

Chenault, H. K. und Whitesides, G. M., Regeneration of nicotinamide cofactors for use in

organic synthesis. Appl. Biochem. Biotechnol. 1987, 14, 147-197.

Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A., Enzymes as working or inspirational

electrocatalysts for fuel cells and electrolysis. Chem. Rev. 2008, 108, 2439-2461.

Dalby, P. A., Engineering enzymes for biocatalysis. Recent Pat. Biotechnol. 2007, 1, 1-9.

Danielsson, B., Winqvist, F., Malpote, J. Y., Mosbach, K., Regeneration of NADH with

immobilized systems of alanine dehydrogenase and hydrogen dehydrogenase.

Biotechnol. Lett. 1982, 14, 673-678.

Davis, B. G., Chemical modification of biocatalysts. Curr. Opin. Biotechnol. 2003, 14, 379-

386.

Deloggio, T. J. und Graves, D. J., An immobilized hydrogenase from Alcaligenes eutrophus

H-16. Biotechnol. Bioeng. 1988, 32, 295-300.

DeSantis, G. und Jones, J. B., Chemical modification of enzymes for enhanced functionality.

Curr. Opin. Biotechnol. 1999, 10, 324-330.

Dwevedi, A. und Kayastha, A. M., Stabilization of



-galactosidase (from peas) by

immobilization onto Amberlite MB-150 beads and its application in lactose

hydrolysis. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 682-688.

Literatur 131

Egerer, P. und Simon, H., Immobilization and stability of the NAD-dependent hydrogenase

from Alcaligenes eutrophus and of whole cells. Biotechnol. Lett. 1982, 4, 489-494.

Eijsink, V. G. H., Bjork, A., Gaseidnes, S., Sirevag, R., Synstad, B., Van den Burg, B.,

Vriend, G., Rational engineering of enzyme stability. J. Biotechnol. 2004, 113, 105-

120.

Erbeldinger, M., Mesiano, A. J., Russell, A. J. Enzymatic catalysis of formation of Z-

aspartame in ionic liquid - an alternative to enzymatic catalysis in organic solvents.

Biotechnol. Prog. 2000, 16, 1129-1131.

Eriksson, L., Johansson, E., Kettaneh-Wold, N., Wikström, C., Wold, S., Design of

Experiments: Principles and Applications, 2000 Umetrics Academy.

Faber, K., Biotransformations in organic chemistry. 2004. Springer Verlag, Berlin/

Heidelberg.

Fágáin, C. O., Understanding and increasing protein stability. Biochim. Biophys. Acta 1995,

1252, 1-14.

Fazlena, H., Kamaruddin, A. H., Zulkali, M. M. D., Dynamic kinetic resolution: alternative

approach in optimizing S-ibuprofen production. Bioprocess Biosyst. Eng. 2006, 28,

227-233.

Fernández-Lafuente, R., Guisan, J. M., Ali, S., Cowan, D., Immobilization of functionally

unstable catechol-2,3-dioxygenase greatly improves operational stability. Enzyme

Microb. Technol. 2000, 26, 568-573.

Fernández-Lafuente, R., Rodríguez, V., Mateo, C., Penzol, G., Hernández-Justiz, O., Irazoqui,

G., Villarino, A., Ovsejevi, K., Batista, F., Guisán, J. M., Stabilization of multimeric

enzymes via immobilization and post-immobilization techniques. J. Mol. Catal. B:

Enzym. 1999, 7, 181-189.

Frey, M., Hydrogenases: hydrogen-activating enzymes. ChemBioChem 2002, 3, 153-160.

Gaertner, H. F., Puigserver, A. J., Increased activity and stability of poly (ethylene glycol)-

modified trypsin. Enzyme Microb. Technol. 1992, 14, 150-155.

Garcia-Arellano, H., Valderrama, B., Saab-Rincon, G., Vazquez-Duhalt, R., High temperature

biocatalysis by chemically modified cytochrome C. Bioconjug. Chem. 2002, 13, 1336-

1344.

Literatur 132

Garcia-Arellano, H., Valderrama, B., Saab-Rincón, G., Vazquez-Duhalt, R., High temperature

biocatalysis by chemically modified cytochrome c. Bioconjug. Chem. 2002, 13, 1336-

1344.

Goto, M., Hatanakaa, C., Masahiro, G., Immobilization of surfactant-lipase complexes and

their high heat resistance in organic media. Biochem. Eng. J. 2005, 24, 91-94.

Gröger, H., Hummel, W., Buchholz, S., Drauz, K., Nguyen, T. V., Rollmann, C., Husken, H.,

Abokitse, K., Practical Asymmetric Enzymatic Reduction through discovery of a

dehydrogenase-compatible biphasic reaction media. Org. Lett. 2003, 5, 173-176.

Guagliardi, A., Manco, G., Rossi, M., Bartolucci, S. Stability and activity of a thermostable

malic enzyme in denaturants and water-miscible organic solvents. Eur. J. Biochem.

1989, 183, 25-30.

Hahn-Hägerdal, B. Water activity: A possible external regulator in biotechnical processes.

Enzyme Microb. Technol. 1986, 8, 322-327.

Halling, P. J., High-affinity binding of water by proteins is similar in air and in organic

solvents. Biochim. Biophys. Acta 1990, 1040, 225-228.

Hartmann, M. und Jung, D., Biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts:

the status quo and future trends. J. Mater. Chem. 2010, 20, 844-857.

Hartmeier, W., Immobilisierte Biokatalysatoren. 1986. Springer Verlag, Berlin/Heidelberg.

Hasumi, F., Adachi, S., Fukuoka, K., Miyamoto, Y., Yamamoto, T., Nakada, N. Synthesis of

leucine by a combination of hydrogenase and leucine dehydrogenase. Numazu College

of Technology Research Annual 1992, 26, 103-105.

Hernáiz, M. J., Sánchez-Montero, J. M. und Sinisterra, J. V., Influence of the nature of

modifier in the enzymatic activity of chemical modified semipurified lipase from

Candida rugosa. Biotechnol. Bioeng. 1997, 55, 252-260.

Hilhorst, R., Laane, C., Veeger, C., Enzymatic conversion of apolar compounds in organic

media using a NADH-regenerating system and dihydrogen as reductant. FEBS Letters

1983, 159, 225-228.

Hilterhaus, L. und Liese, A., Building blocks. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2007, 105,

133-173.

Horch, M., Lauterbach, L., Saggu, M., Hildebrandt, P., Lendzian, F., Bittl, R., Lenz, O.,

Zebger, I., Probing the active site of an O2-tolerant NAD+-reducing [NiFe]-

Literatur 133

hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 by in situ EPR and FTIR spectroscopy.

Angew. Chem., Int. Ed. 2010, 49, 8026-8029.

Hsu, A. F., Foglia, T. A., Shen, S., Immobilization of Pseudomonas cepacia lipase in a

phyllosilicate sol-gel matrix. Effectiveness as a biocatalyst. Biotechnol. Appl.

Biochem. 2000, 31, 179-183.

Hummel, W. Large-scale applications of NAD(P)-dependent oxidoreductases: recent

developments. Tibtech December 1999, 17, 487-492.

Hummel, W. und Kula, M. R., Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. Eur. J.

Biochem. 1989, 184, 1-13.

Illanes, A., Stability of Biocatalyst. Electr. J. Biotechnol. (online) 1999, 2, 7-15.

Itoh, N., Matsuda, M., Mabuchi, M., Dairi, T., Wang, J., Chiral alcohol production by

NADH-dependent phenylacetaldehyde reductase coupled with in situ regeneration of

NADH. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 2394-2402.

Itoh, N., Mizuguchi, N., Mabuchi, M., Production of chiral alcohols by enantioselective

reduction with NADH-dependent phenylacetaldehyde reductase from

Corynebacterium strain, ST-10. J. Mol. Catal. B: Enzym. 1999, 6, 41-50.

Iyer, P. V. und Ananthanarayan, L., Enzyme stability and stabilization - aqueous and non-

aqueous environment. Process Biochem. 2008, 43, 1019-1032.

Jene, Q., Pearson, J. C. und Lowe, C. R., Surfactant modified enzymes: solubility and activity

of surfactant-modified catalase in organic solvents. Enzyme Microb. Technol. 1997,

20, 69-74.

Kazan, D., Ertan, H., Erarslan, A., Stabilization of Escherichia coli penicillin G acylase

against thermal inactivation by cross-linking with dextran dialdehyde polymers. Appl.

Microbiol. Biotechnol. 1997, 48, 191-197.

Keefe, R. G., Axley, M. J., Harabin, A. L., Kinetic mechanism studies of the soluble

hydrogenase from Alcaligenes eutrophus H16. Arch. Biochem. Biophys. 1995, 317,

449-456.

Khajeh, K., Naderi-Manesh, H., Ranjbar, B., Moosavi-Movahedi, A., Nemat-Gorgani, M.

Chemical modification of lysine residues in Bacillus α-amylase: effect on activity and

stability. Enzyme and Microb. Technol. 2001, 28, 543-549.

Klibanov, A. M. und Puglisi, A. V. The regeneration of coenzymes using immobilized

hydrogenase. Biotechnol. Lett. 1980, 2, 445-50.

Literatur 134

Klibanov, A. M., Enzyme stabilization by immobilization. Anal. Biochem. 1979, 93, 1-25.

Knubovets, T., Osterhout, J. J., Klibanov, A. M. Structure of lysozyme dissolved in neat

organic solvents as assessed by NMR and CD spectroscopies. Biotechnol. Bioeng.

1999, 63, 242-248.

Kortlücke, C. und Friedrich, B., Maturation of membrane-bound hydrogenase of Alcaligenes

eutrophus H16. J. Bacteriol. 1992, 174, 6290-6293.

Kragl, U., Eckstein, M., Kaftzik, N. Enzyme catalysis in ionic liquids. Curr. Opin.

Biotechnol. 2002, 13, 565-571.

Kruse, W., Kragl, U., Wandrey, C., Verfahren zur kontinuierlichen enzymkatalysierten

Gewinnung hydrophober Produkte. Forschungszentrum Jülich GmbH, DE 4436149

A1 1996.

Kula, M. R. und Wandrey, C. Continuous enzymatic transformation in an enzyme-membrane

reactor with simultaneous NAD regeneration. Method. Enzymol. 1987, 136, 9-21.

Kumari, A. und Kayastha, A. M., Immobilization of soybean (glycine max)



-amylase onto

Chitosan and Amberlite MB-150 beads: optimization and characterization. J. Mol.

Catal. B: Enzym. 2011, 69, 8-14.

Laane, C., Boeren, S., Vos, K. und Veeger, C., Rules for optimization of biocatalysis in

organic solvents. Biotechnol. Bioeng. 1987, 30, 81-87.

Lauterbach, L., Liu, J., Horch, M., Hummel, P., Schwarze, A., Haumann, M., Vincent, K. A.,

Lenz, O., Zebger, I., The hydrogenase subcomplex of the NAD+-reducing [NiFe]-

hydrogenase from Ralstonia eutropha: insights into catalysis and redox

interconversions. Eur. J. Inorg. Chem. 2011, 7, 1067-1079.

Lenz, O., Bernhard, M., Buhrke, T., Schwartz, E., Friedrich, B., The hydrogen-sensing

apparatus in Ralstonia eutropha. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2002, 4, 255-262.

Liese, A., Seelbach, K. und Wandrey, C., Industrial Biotransformations, 2000. Weinheim:

VCH-Wiley.

Lopez-Cruz, J. I., Viniegra-Gonzalez, G., Hernandez-Arana, A., Thermostability of native and

pegylated Myceliophthora thermophila laccase in aqueous and mixed solvents.

Bioconjug. Chem. 2006, 17, 1093-1098.

Löscher, S., Burgdorf, T., Buhrke, T., Friedrich, B., Dau, H., Haumann, M., Non-standard

structures of the Ni-Fe cofactor in the regulatory and the NAD-reducing hydrogenases

from Ralstonia eutropha. Biochemical Society Transactions 2005, 33, 25-27.

Literatur 135

Ludwig, M., Schwarze, A., Lenz, O., Knallgas unter Kontrolle: O2-tolerante Hydrogenasen

und ihre Anwendung. BIOspektrum 2008, 14, 477-479.

Massanz, C., Schmidt, S., Friedrich, B., Subforms and in vitro reconstitution of the NAD-

reducing hydrogenase of Alcaligenes eutrophus. J. Bacteriol. 1998, 180, 1023-1029.

Mateo, C., Palomo, J. M., Fernandez-Lorente, G., Guisan, J. M., ,Fernandez-Lafuente, R.,

Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization

techniques. Enzyme Microb. Technol. 2007, 40, 1451-1463.

Mateo, C., Abian, O., Fernandez-Lorente, G., Pedroche, J., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J.

M., Epoxy Sepabeads: A novel epoxy support for stabilization of industrial enzymes

via very intense multipoint covalent attachment. Biotechnol. Prog. 2002, 18, 629-634.

Mateo, C., Abian, O., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J. M., Reversible enzyme

immobilization via a very strong and nondistorting ionic adsorption on support-

polyethylenimine composites. Biotechnol. Bioeng. 2000, 68, 98-105.

Mattos, C. und Ringe, D., Proteins in organic solvents. Curr. Opin. Struct. Biol. 2001, 11,

761-764.

McIninch, J. K. und Kantrowitz, E. R., Use of silicate sol-gels to trap the R and T quaternary

conformational states of pig kidney fructose-1,6-bisphosphatase. Biochim. Biophys.

Acta 2001, 1547, 320-328.

Means, G. E. und Feeney, R. E., Chemical modifications of proteins: history and applications.

Bioconjug. Chem. 1990, 1, 2-12.

Mertens, R., Greiner, L., Van den Ban, E. C. D., Haaker, H. B. C. M., Liese, A., Practical

applications of hydrogenase I from Pyrococcus furiosus for NADPH generation and

regeneration. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2003, 24-25, 39-52.

Mozhaev, V. V., Khmelnitsky, Y. L., Sergeeva, M. V., Belova, A. B., Klyachko, N. L.,

Levashov, A. V., Martinek, K. Catalytic activity and denaturation of enzymes in

water/organic cosolvent mixtures: a-Chymotrypsin and laccase in mixed

water/alcohol, water/glycol and water/formamide solvents. Eur. J. Biochem. 1989,

184, 597-602.

Nakashima, K., Maruyama, T., Kamiya, N., Goto, M. Homogeneous enzymatic reactions in

ionic liquids with poly(ethylene glycol)-modified subtilisin. Org. Biomol. Chem. 2006,

4, 3462-3467.

Natarajan, K. R., Biocatalysis in organic solvents. J. Chem. Educ. 1991, 68, 13-16.

Literatur 136

Ó` Fágáin, C., Enzyme stabilization - recent experimental progress. Enzyme Microb. Technol.

2003, 33, 137-149.

Ogino, H. und Ishikawa, H., Enzymes which are stable in the presence of organic solvents. J.

Biosci. Bioeng. 2001, 91, 109-116.

Okura, I., Otsuka, K., Nakada, N., Hasumi, F. Regeneration of NADH and ketone

hydrogenation by hydrogen with the combination of hydrogenase and alcohol

dehydrogenase. Appl. Biochem. Biotechnol. 1990, 24-25, 425-30.

Orlich, B., Biokatalyse an hydrophoben Substraten mit Tensiden und Membranen als

reaktionstechnische Werkzeuge. 2000, Dissertation TU-Berlin.

Osterath, B., Rao, N., Luetz, S., Liese, A. Technische Anwendung von Enzymen. Chemie in

unserer Zeit 2007, 41, 324-333.

Otsuka, K., Aono, S., Okura, I. Regeneration of NADH and hydrogenation of ketones to

alcohols with the combination of hydrogenase and alcohol dehydrogenase. Chem. Lett.

1987, 10, 2089-90.

Pan-Soo, K., Hyun-Dong, S., Joong-Kon, P., Yong-Hyun, L., Immobilization of cyclodextrin

glucanotransferase on Amberlite IRA-900 for biosynthesis of transglycosylated

xylitol. Biotechnol. Bioprocess. Eng. 2000, 5, 174-180.

Palomo, J. M., Lipases enantioselectivity alteration by immobilization techniques. Curr.

Bioact. Compd. 2008, 4, 126-138.

Palomo, J. M., Fernandez-Lorente, G., Mateo, C., Ortiz, C., Fernandez-Lafuente, R., Guisan,

J. M., Modulation of the enantioselectivity of lipases via controlled immobilization

and medium engineering: hydrolytic resolution of mandelic acid esters. Enzyme

Microb. Technol. 2002, 31, 775-783.

Pareira, E. B., De Castro, H. F., De Moraes, F. F., Zanin, G. M., Kinetic Studies of Lipase

from Candida rugosa: A comparative study between free and immobilized enzyme

onto porous chitosan beads. Appl. Biochem. Biotechnol. 2001, 91-93, 739-748.

Patel, R. N., Microbial/enzymatic synthesis of chiral pharmaceutical intermediates. Curr.

Opin. Drug Discov. Dev. 2003, 6, 902-920.

Payen, B., Segui, M., Monsan, P., Schneider, K., Friedrich, C. G., Schlegel, H. G. Use of

cytoplasmic hydrogenase from Alcaligenes eutrophus for NADH regeneration.

Biotechnol. Lett. 1983, 5, 463-468.

Literatur 137

Pazhang, M., Khajeh, K., Ranjbar, B. und Hosseinkhani, S., Effects of water-miscible

solvents and polyhydroxy compounds on the structure and enzymatic activity of

thermolysin. J. Biotechnol. 2006, 127, 45-53.

Persson, M. und Bornscheuer, U. T., Increased stability of an esterase from Bacillus

stearothermophilus in ionic liquids as compared to organic solvents. J. Mol. Catal. B:

Enzym. 2003, 22, 21-27.

Pfitzner, J., Linke, H. A. B., Schlegel, H. G., Eigenschaften der NAD-spezifischen

Hydrogenase aus Hydrogenomonas H16. Arch. Mikrobiol. 1970, 71, 67-78.

Pohlmann, A., Fricke, W. F., Reinecke, F., Kusian, Liesegang, H., Cramm, R., Eitinger, T.,

Ewering, C., Pötter, Schwartz, E., Strittmatter, A., Voß, I., Gottschalk, G.,

Steinbüchel, A., Friedrich, B., Bowien, B., Genome sequence of the bioplastic-

producing ‘‘Knallgas’’ bacterium Ralstonia eutropha H16. Nat. Biotechnol. 2007, 25,

1-6.

Popov, V. O., Oychinnikoy, A. N., Egoroy, A. M., Berezin, I. Y., NAD+-dependent

hydrogenase from the hydrogen oxidizing bacterium Alcaligenes eutrophus Zl.

Stabilization against temperature and urea induced inactivation. Biochimie 1986, 68,

63-68.

Qigang, W., Gao, Q., Shi, J., Enhanced catalytic activity of hemoglobin in organic solvents by

layered titanate immobilization. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 14346-14347.

Quintanilla-Guerrero, F., Duarte-Vázquez, M.A., Tinoco, R., Gómez-Suárez, M., Garciá-

Almendárez, B.E., Vázquez-Duhalt, R., Regalado, C., Chemical modification of turnip

peroxidase with methoxypolyethylene glycol enhances activity and stability for phenol

removal using the immobilized enzyme. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 8058-8065.

Rissom, S., Beliczey, J., Giffels, G., Kragl, U., Wandrey, C.,

Asymmetric reduction of acetophenone in membrane reactors: comparison of

oxazaborolidine and alcohol dehydrogenase catalysed processes. Tetrahedron:

Asymmetry 1999, 10, 923-928.

Roig, M. G. und Kennedy, J. F., Perspectives for chemical modifications of enzymes. Crit.

Rev. Biotechnol. 1992, 12, 391-412.

Rodriguez-Martinez, J. A., Sola, R. J., Castillo, B., Cintron-Colon, H. R., Rivera-Rivera, I.,

Barletta, G. und Griebenow, K., Stabilization of alpha-chymotrypsin upon PEGylation

Literatur 138

correlates with reduced structural dynamics. Biotechnol. Bioeng. 2008, 101, 1142-

1149.

Roosen, C., Müller, P., Greiner, L. Ionic liquids in biotechnology: applications and

perspectives for biotransformations. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008, 81, 607-614.

Rotticci, D., Norin, T., Hult, K., Mass transport limitations reduce the effective

stereospecificity in enzyme-catalyzed kinetic resolution. Org. Lett. 2000, 2, 1373-

1376.

Rubin-Pitel, S. B. und Zhao, H., Recent advances in biocatalysis by directed enzyme

evolution. Comb. Chem. High Throughput Screening 2006, 9, 247-257.

Ryan, O., Smyth, M. R. und Fagain, C. O., Thermostabilized chemical derivatives of

horseradish peroxidase. Enzyme Microb. Technol. 1994, 16, 501-505.

Salleh, A. B., Basri, M., Taib, M., Jasmani, H., Rahman, R. N. Z. A., Rahman M. B. A.,

Razak, C. n. A., Modified enzymes for reactions in organic solvents. Appl. Biochem.

Biotechnol. 2002 , 102-103, 349-357.

Schiffer C. A., Dötsh, V., The role of protein-solvent interactions in protein unfolding. Curr.

Op. Biotechnol. 1996, 7, 428-432.

Schmid, A., Dordick, J. S., Hauer, B., Kiener, A., Wubbolts, M., Witholt, B., Industrial

biocatalysis today and tomorrow. Nature 2001, 409, 258-268.

Schmid, R., Stabilized soluble enzymes. Adv. Biochem. Eng. 1979, 12, 41-118.

Schneider, K. und Schlegel, H. G., Production of superoxide radicals by soluble hydrogenase

from Alcaligenes eutrophus H16. Biochem. J. 1981,193, 99-107.

Schneider, K., Cammack, R., Schlegel, H. G., Hall, D. O., The ironsulphur centres of soluble

hydrogenase from Alcaligenes eutrophus. Biochim. Biophys. Acta 1979, 578, 445-461.

Schneider, K., Schlegel, H. G., Identification and quantitative determination of the flavin

component of soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus. Biochem. Biophys.

Res. Commun. 1978, 84, 564-571.

Schneider, K., Schlegel, H. G., Purification and properties of soluble hydrogenase from

Alcaligenes eutrophus H16. Biochim. Biophys. Acta 1976, 425, 66-80.

Schulze, B. und Wubbolts, M. G., Biocatalysis for industrial production of fine chemicals.

Curr. Opin. Biotechnol. 1999, 10, 609-615.

Shaked, Z. und Whitesides, G. M., Enzyme-catalyzed organic synthesis: NADH regeneration

by using formate dehydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 7104-7105.

Literatur 139

Sharma, S. und Yamazaki, H., Preparation of hydrophobic cotton cloth. Biotechnol. Lett.

1984, 6, 301-306.

Sheldon, R. A., Enzyme immobilization: the quest for optimum performance. Adv. Synth.

Catal. 2007, 349, 1289-1307.

Sheldon, R. A., Lau, R. M., Sorgedrager, M. J., Van Rantwijk, F., Seddon, K. R. Biocatalysis

in ionic liquids. Green Chem. 2002, 4, 147-151.

Siebertz, K., Van Bebber, D., Hochkirchen, T., Statistische Versuchsplanung: Design of

Experiments (DoE), 2010. Springer.

Simon, E. S., Plante, R., Whitesides, G. M., D-lactate dehydrogenase: substrate specificity

and use as a catalyst in the synthesis of homochiral 2-hydroxy acids. Appl. Biochem.

Biotechnol. 1989, 22,169-179.

Singh, A. N., Singh, S., Suthar, N., Dubey, V. K., Glutaraldehyde-activated chitosan matrix

for immobilization of a novel cysteine protease, Procerain B. J. Agric. Food Chem.

2011, 59, 6256-6262.

Steinsiek, S., Charakterisierung und Optimierung gel-stabilisierter Zwei-Phasen-Systeme zur

stereospezifischen Reduktion hydrophober Verbindungen mit der Carbonyl-Reduktase

aus Candida parapsilosis. 2006, Dissertation RWTH Aachen.

Straathof, A. J., Panke, S. und Schmid, A., The production of fine chemicals by

biotransformations. Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13, 548-556.

Suh, C. W., Choi, G. S., Lee, E. K., Enzymic cleavage of fusion protein using immobilized

urokinase covalently conjugated to glyoxyl-agarose. Biotechnol. Appl. Biochem. 2003,

37, 149-155.

Svergun, D. I., Ekstrom, F., Vandegriff, K. D., Malavalli, A., Baker, D. A., Nilsson, C.,

Winslow, R. M., Solution structure of poly(ethylene) glycol-conjugated hemoglobin

revealed by small-angle X-ray scattering: implications for a new oxygen therapeutic.

Biophys. J. 2008, 94, 173-181.

Szabo, A., Kotormán, M., Laczkó, I., Simon, L. M., Improved stability and catalytic activity

of chemically modified papain in aqueous organic solvents. Process Biochem. 2009,

44, 199-204.

Turner, M. B., Spear, S. K., Huddleston, J. G., Holbrey, J. D., Rogers, R. D. Ionic liquid salt-

induced inactivation and unfolding of cellulase from Trichoderma reseei. Green

Chem. 2003, 5, 443-447.

Literatur 140

Tyler, J., Simurdiak, R. S., Zhao, H., Biocatalysis. Encyclopedia of Chemical Processing

2006, DOI: 10.1081/ E-ECHP-120017565, 101-110.

Van den Wittenboer, A., Niemeijer, B., Kumar Karmee, S., Ansorge-Schumacher, M. B.,

Systematic assessment of the stability of benzaldehyde lyase in aqueous-organic

biphasic systems and its stabilization by modification with methoxy-poly(ethylene)

glycol. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2010, 67, 208-213.

Van der Linden, E., Burgdorf, T., Bernhard, M., Bleijlevens, B., Friedrich, B., Albracht, S. P.

J., The soluble [NiFe]-hydrogenase from Ralstonia eutropha contains four cyanides in

its active site, one of which is responsible for the insensitivity towards oxygen. J. Biol.

Inorg. Chem. 2004a, 9, 616–626.

Van der Linden, E., Bart, W., Faber, B., Bleijlevens, B., Burgdorf, T., Bernhard, M.,

Friedrich, B., Albracht, S. P. J., Selective release and function of one of the two FMN

groups in the cytoplasmic NAD+-reducing [NiFe]-hydrogenase from Ralstonia

eutropha. Eur. J. Biochem. 2004b, 271, 801-808.

Van Rantwijk, F. und Sheldon, R.A. Biocatalysis in ionic liquids. Chem. Rev. 2007, 107,

2757-2785.

Vasic-Racki, D., Jonas, M., Wandrey, C., Hummel, W., Kula, M. R., Continuous (R)-

mandelic acid production in an enzyme membrane reactor. Appl. Microbiol.

Biotechnol. 1989, 3, 215-222.

Vazquez-Duhalt, R., Semple, K. M., Westlake, D. W. S., Fedorak, P. M. Effect of water-

miscible organic solvents on the catalytic activity of cytochrome c. Enzyme Microb.

Technol. 1993, 15, 936-943.

Vermue, M. H. und Tramper, J., Biocatalysis in nonconventional media - medium engineering

aspects. Pure Appl. Chem. 1995, 67, 345-373.

Vinogradov, A. A., Kudryashova, E. V., Grinberg, V. Y., Grinberg, N. V., Burova, T. V.,

Levashov, A. V., The chemical modification of α-chymotrypsin with both

hydrophobic and hydrophilic compounds stabilizes the enzyme against denaturation in

water-organic media. Protein Eng. 2001, 14, 683-689.

Vincent, K. A., Cracknell, J. A., Clark, J. R., Ludwig, M., Lenz, O., Friedrich, B., Armstrong,

F. A., Electricity from low-level H2 in still air - an ultimate test for an oxygen tolerant

hydrogenase. Chem. Commun. 2006, 48, 5033-5035.

Literatur 141

Vincent, K. A., Cracknell, J. A., Parkin, A., Armstrong, F. A., Hydrogen cycling by enzymes:

electrocatalysis and implications for future energy technology. Dalton Trans. 2005a,

3397-3404.

Vincent, K. A., Cracknell, J. A., Lenz, O., Zebger, I., Friedrich, B., Armstrong, F. A.,

Electrocatalytic hydrogen oxidation by an enzyme at high carbon monoxide or oxygen

levels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005b, 102, 16951-16954.

Wan, Y.-Y., Lu, R., Xiao, L., Du, Y.-M., Miyakoshi, T., Chen, C.-L., Knill, C. J., Kennedy, J.

F., Effects of organic solvents on the activity of free and immobilised laccase from

Rhus vernicifera. Int. J. Biol. Macromol. 2010, 47, 488-495.

Wasserscheid, P. und Welton, T., Ionic liquids in organic synthesis, 2008, Weinheim: VCH-

Wiley.

Whitesides, G. M., Gitlin, I., Carbeck, J. D., Warum sind Proteine geladen? Netzwerke aus

Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen in Proteinen, analysiert über Ladungsleitern und

Kapillarelektrophorese. Angew. Chem. 2006, 118, 3090-3131.

Wichmann, R. und Vasic-Racki, D., Cofactor regeneration at the lab scale. Adv. Biochem.

Eng. Biotechnol. 2005, 92, 225-260.

Wöltinger, J., Karau, A., Leuchtenberger, W., Drauz, K., Membrane reactors at Degussa. Adv.

Biochem. Eng. Biotechnol. 2005, 92, 289-316.

Wu, J. C., Zhang, G. F., He, Z. M., Enhanced activity of Candida rugosa lipase modified by

polyethylene glycol derivatives. Biotechnol. Lett. 2001, 23, 211-214.

Yang, Z., Domach, M., Auger, R., Yang, F. X., Russell, A. J., Polyethylene glycol-induced

stabilization of subtilisin." Enzyme Microb. Technol. 1996, 18, 82-89.

Zhao, H., Methods for stabilizing and activating enzymes in ionic liquids - a review. J. Chem.

Tech. Biotechnol. 2010, 85, 891-907.

Lebenslauf

Persönliche Angaben

Name: Juliane Ratzka

Anschrift: Rheinsberger Straße 62,

10115 Berlin

Geburtsdatum: 22.03.1984

Geburtsort: Hennigsdorf

Familienstand: ledig

Ausbildung und Berufstätigkeit

08/1990 – 06/1996 Grundschule Velten-Süd

08/1996 – 06/2003 A.S.-Puschkin-Gymnasium; Abschluss: Abitur

10/2003 – 09/2008 Studium der Chemie (Diplom) an der Universität Rostock

Hauptfach: Umweltchemie, Diplomarbeit am Institut für Technische

Chemie der Universität Rostock

Thema: Einflussgrößen auf die Aktivität der Lipase B aus Candida

antarctica in binären Systemen

10/2008 – 10/2011 Promotion an der TU Berlin im Rahmen des Excellenzclusters

„Unifying Concepts in Catalysis“