Charakterisierung der autoimmun-vermittelten Signaltransduktion über Angiotensin II Typ 1-und Endothelin-1 Typ A Rezeptoren in systemischer Sklerose [original]

Charakterisierung der autoimmun-vermittelten Signaltransduktion

über Angiotensin II Typ 1-und Endothelin-1 Typ A Rezeptoren in

systemischer Sklerose

vorgelegt von

Diplom-Chemikerin

Melanie Näther

geboren in Wolmirstedt

Von der Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

Dr.rer.nat.

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. Thomas Friedrich

Berichter/Gutachter: Prof. Dr. Duska Dragun

Berichter/Gutachter: Prof. Dr. Roderich Süssmuth

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 05.03.2010

Berlin 2010

D 83

Inhaltsverzeichnis 2

1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ........................................................................... 5

2 ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................... 8

3 EINLEITUNG ....................................................................................................... 9

3.1 Sklerodermie 9

3.1.1 Systemische Sklerose 10

3.2 Angiotensin II 12

3.2.1 Biosynthese von Angiotensin II 13

3.3 Das Endothelin-System 14

3.4 G-Protein gekoppelte Rezeptoren 16

3.4.1 Die Angiotensin II- und Endothelin-1 Rezeptoren 17

3.5 Hypertonie 18

3.5.1 Autoimmune Pathomechanismen kardiovaskulärer Veränderungen 20

3.6 Fragestellung 23

4 MATERIAL ........................................................................................................ 24

4.1 Zelllinie 24

4.2 Material 24

4.3 Stimulanzien (Agonisten/Antagonisten/Inhibitoren) 24

3.4 Kommerzielle Kits 25

4.5 Chemikalien 25

4.6 Lösungen und Puffer 26

4.7 Geräte 28

5 METHODEN ...................................................................................................... 29

5.1 Zellkultur 29

5.1.1 Kultivierung 29

5.1.2 Lagerung der Zellen 29

5.2 IgG-Isolation 29

5.2.1 Patientenmaterial 30

5.2.2 Probenvorbereitung 30

5.2.3 Säulenvorbereitung und IgG-Isolation 30

5.2.4 Lagerung und Reinigung der Säulen 31

5.3 Genexpressionsanalyse 31

5.3.1 RNA-Isolation 31

5.3.2 Messung der Extinktion der RNA 32

Inhaltsverzeichnis 3

5.3.3 Qualitätsprüfung der RNA durch Gelelektrophorese 32

5.3.4 Reverse Transkription 32

5.3.5 Konventionelle PCR 33

5.3.6 Quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR) 33

5.4 Zytotoxizitätstest 34

5.4.1 MTT-Test 34

5.5 Proteinanalysen 35

5.5.1 Proteinextraktionen 35

5.5.2 Proteinbestimmung 36

5.5.3 Western Blot Analyse 37

5.5.4 Gelretardationsexperiment (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA) 38

5.6 Funktionelle Tests 40

5.6.1 BrdU-ELISA 40

5.6.2 Konfokale Mikroskopie/Fluoreszensmikroskopie 41

5.7 Statistik 41

6 ERGEBNISSE ................................................................................................... 42

6.1 Versuchsübersicht 42

6.2 Vorversuche 43

6.2.1 Angiotensin- und Endothelin-Rezeptorexpression 43

6.2.2 Vitalität der HMEC-1 43

6.3 ERK1/2-Signaltransduktionsweg 45

6.3.1 Untersuchung von Mitogen- aktiviertem Proteinkinase Signalwegen (MAPK) 45

6.3.2 Dosis- und Zeitverläufe 45

6.3.3 Einfluss der natürlichen Liganden (Ang II, ET-1) und Patienten-IgG auf ERK1/2-

Phosphorylierung 47

6.3.4 Einfluss eines MEK1/2-Inhibitors auf die AT1-und ETAR-induzierte ERK1/2-

Phosphorylierung 49

6.4 Untersuchung des Transkriptionsfaktors Ets-1 und Tissue Factor 50

6.4.1 Tissue Factor 50

6.4.2 Genexpressionsanalyse 51

6.4.3 Lokalisation von Ets-1 und phosphoryliertem Ets-1 51

6.4.4 Einfluss der natürlichen Liganden (Ang II und ET-1) und Patienten-IgG auf die

Phosphorylierung von Ets-1 54

6.4.5 Nachweis von Tissue Factor in Proteinextrakten 56

6.4.6 Aktivierung des TF-Promotors durch Ets-1 Expression 57

6.5 Proliferationsexperimente mittels BrdU-Einbau 58

7 DISKUSSION .................................................................................................... 62

8 LITERATURVERZEICHNIS .............................................................................. 68

9 ANHANG ........................................................................................................... 73

9.1 Angiotensin II Rezeptorblocker 73

9.2 Endothelin-1 Rezeptorblocker 74

9.3 Raf-Inhibitor 75

Inhaltsverzeichnis 4

9.4 MEK1/2-Inhibitor 76

10 DANKSAGUNG ............................................................................................. 76

11 VERÖFFENTLICHUNGEN ............................................................................ 77

11.1 Publikation 77

11.2 Kongressbeiträge 77

Abkürzungsverzeichnis 5

1 Abkürzungsverzeichnis

APS Ammoniumperoxodisulfat

Ang II Angiotensin II

Ang III Angiotensin 2-8

Ang IV Angiotensin 1-7, Angiotensin 3-8

ACE Angiotensin Converting Enzyme

AT1R Angiotensin II Typ 1 Rezeptor

AT2R Angiotensin II Typ 2 Rezeptor

AT1RAA Angiotensin II Typ 1-Rezeptor Autoantikörper

ADCC Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytoxität

AECA anti-Endothelzell-Antikörper

BrdU 5-Brom-2`-desoxy-uridin

BSA Bovines Serumalbumin

c konstant

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

(complementary deoxyribonucleic acid)

CTP C-terminalen Peptids

DAPI 4’,6-Diamidin-2’-phenylindoldihydrochlorid

DEPC Diethylpyrocarbonat

dATP Desoxyadenosintriphosphat

dCTP Deoxycytidintriphosphat

dGTP Desoxyguanosintriphosphat

dTTP Desoxythymidintriphosphat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid)

DTT Dithiothreitol

Ets-1 E26 Erythroblastomavirus transformationsspezifisch

ET-1 Endothelin-1

ET-2 Endothelin-2

ET-3 Endothelin-3

ETAR Endothelin-1 Typ A Rezeptor

ETBR Endothelin-1 Typ B Rezeptor

E. coli Escherichia coli

ECE-1 Endothelin-converting-enzymes-1

EDRF Endothelin-derived relaxing factor

Abkürzungsverzeichnis 6

EGF epidermal-growth-factor

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGTA Ethylendioxy-bis(ethylennitrilo)-tetraessigsäure

ERK1/2 extracellular regulated kinase

EL extrazelluläre Schleife

FACS-Puffer fluorescence activated cell sorting-Puffer

FCS Fötales Kälberserum

GapdH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

GPCR G-Protein gekoppelter Rezeptor

GW5074 3-(3,5-Dibrom-4-hydroxybenzyliden)-5-iod-1,3-dihydroindol-2-on

h heavy

HMEC-1 human microvascular endothelial cell

l light

Ig Immunglobulin

IgG Immunglobulin G

IgM Immunglobulin M

IL intrazelluläre Schleife

IL-1 Interleukin-1

kDa Kilodalton

MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase

MEK1/2 MAPK/ERK-Kinase

mRNA messenger RNA

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

NaCl Natriumchlorid

Na2HPO4 Natriumdihydrogenphosphat

NaH2PO4 Natriumhydrogendiphosphat

PFA Paraformaldehyd

PBS phosphate buffered saline

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PD98059 2´-Amino-3´-methoxyflavon

PD184352 2-(2-Chlor-4-iod-phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4-

difluor-benzamid

PD123319 S-(+)-1-[(4-(Dimethylamino)-3-methylphenyl)methyl]-5

(diphenylacetyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-imidazo[4,5-c]pyridine-6-

carbonsäure

PI Propidiumiodid

25xcomplets Protease Inhibitor Cocktail

Abkürzungsverzeichnis 7

PAH pulmonaler arterieller Hypertonie

qRT-PCR quantitative Echtzeit-PCR

Raf-1 rapidly growing fibrosarcoma

RT Raumtemperatur

RT reverse Transkription

RAS Renin Angiotensin System

HCl Salzsäure

Scl-70 Antikörper gegen Topoisomerase I

SLE systemischer Lupus erythematodes

Ssc systemische Sklerose

dc Ssc diffuse systemische Sklerose

lc Ssc limitierte systemische Sklerose

TdT terminale Desoxyribonukleotidyltransferase

TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethan-1,2-diamin

TF Tissue Factor

TGF- Transforming Growth Factor beta

TM Transmembrandomainen

TBE-Puffer TRIS-Borat-EDTA-Puffer

TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung (tris buffered saline)

TNFα Tumornekrosefaktor-α

v variabel

Zusammenfassung 8

2 Zusammenfassung

Die systemische Sklerose ist eine seltene und komplexe Multisystemerkrankung,

charakterisiert durch Vaskulopathie (Gefäßveränderungen), Gewebefibrose und der Bildung

von Autoantikörpern gegen verschiedene Antigene. Im fortschreitenden Verlauf der

Erkrankung können Dysfunktionen und Ausfälle verschiedener Organe auftreten.

Pathogenetisch stehen funktionelle Veränderungen der Endothelzellen im Vordergrund.

Durch gestörte Vasodilatation (verminderte NO-Produktion) und gesteigerte Vasokonstriktion

(vermehrte Bildung von Endothelin-1 (ET-1) und Angiotensin II (Ang II) kommt es zu

Störungen in der Gewebeperfusion. Ang II und ET-1 vermitteln ihre physiologischen und

pathophysiologischen Wirkungen über vier Rezeptoren (AT1,-AT2,-ETA-und ETB-Rezeptor).

Die direkte pharmakologische Blockade der Rezeptoren mit spezifischen Anatagonisten wird

teilweise erfolgreich bei der Behandlung der systemischen Sklerose eingesetzt.

Ziel dieser Arbeit war es autoimmun-vermittelte Änderungen an Rezeptoren über die

Signaltransduktion an einer mikrovaskulären endothelialen Zelllinie der Haut (HMEC-1) zu

untersuchen. Es wurden die Effekte der natürlichen Liganden Ang II und ET-1 mit

immunologisch bedingten Mechanismen durch isoliertes IgG von Patienten mit systemischer

Sklerose auf die Aktivierung des Signaltransduktionsweges ERK1/2/Ets-1 verglichen. Sowohl

die Liganden als auch IgG von erkrankten Patienten führten zu einer gesteigerten

Phosphorylierung. Darüber hinaus wurde ausschließlich durch Stimulation mit Patienten-IgG

eine Zunahme der Endothelzellproliferation beobachtet. Spezifische Blockade von AT1R und

ETAR reduzierte die ERK1/2/Ets-1 Aktivierung deutlich. AT2R- und ETBR-Antagonisten

zeigten dagegen keinen inhibierbaren Effekt. In weiteren Experimenten konnte gezeigt

werden, dass durch Inhibition der ERK1/2-Vorläuferkinasen Raf-1 und MEK1/2 die

aktivierenden Effekte durch Patienten-IgG sowie die natürlichen Liganden verhindert wurden.

Ein häufiges pathomorphologisches Korrelat der Gefäßveränderungen bei Patienten mit

systemischer Sklerose sind Mikrothrombosen. Deshalb wurden Unterschiede in der

Regulation und Expression des prokoagulatorischen und prothrombotischen Proteins Tissue

Factor untersucht. Auf Ebene der Gen- und der Proteinexpression konnte eine gesteigerte

Aktivierung von Tissue Factor nach Stimulation mit Patienten-IgG nachgewiesen werden.

Zudem wurde eine Bindung zwischen Ets-1 und dem Tissue Factor Promotor observiert.

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass das IgG von Patienten mit systemischer

Sklerose proliferationssteigernde Signalwege in Endothelzellen aktiviert. Damit konnte eine

immunologisch bedingte Rezeptoraktivierung als möglicher Pathomechanismus identifiziert

werden. Hieraus ergeben sich neue therapeutische Optionen durch Immunmodulation und

Rezeptorblockade in der Behandlung von Patienten mit systemischer Sklerose.

Einleitung 9

3 Einleitung

Die systemische Sklerose ist eine verheerende Multiorgankrankheit, die charakterisiert ist

durch Autoimmunität, Fibrosierung der Haut und innerer Organe, durch vermehrte

Ablagerung von Matrixproteinen wie Kollagen, sowie eine schwere obliterative Vaskulopathie

(verengende Gefäßerkrankung). Der Verlauf ist häufig sehr schwer mit einer 10-Jahres-

Überlebensrate von 54-66%.1

Diagnose und Behandlung der systemischen Sklerose (SSc) sind anspruchsvoll, nicht zuletzt

aufgrund der Vielzahl der betroffenen Organsysteme wie Gastrointestinaltrakt, Lunge, Herz

und Nieren, die abhängig vom Subtyp der Erkrankung sehr unterschiedlich sein können.

Pharmakologische Strategien zielen einerseits auf eine Unterdrückung der Autoimmunität

durch Immunsuppressiva und andererseits auf eine Inhibierung vasokonstriktiver Systeme

ab. Durch direkte Blockade spezifischer Rezeptoren der zwei hauptverantwortlichen

Systeme, nämlich des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) und des Endothelin-Systems, kann

eine Vasodilatation (Gefäßerweiterung) und damit eine Verringerung der Folgen der

Vaskulopathie erreicht werden.2, 3

Bis heute gibt es aber noch keine zugelassene spezifische Therapie, die das Fortschreiten

der Krankheit verhindern oder auch nur verlangsamen kann. Insbesondere sind

immunsuppressive Strategien trotz der immer vorhandenen Autoimmunität häufig

wirkungslos. Dies zeigt, dass die pathophysiologischen Zusammenhänge von Immunsystem

und Gefäßsystem noch immer nicht verstanden sind.

3.1 Sklerodermie

Der Begriff Sklerodermie wurde aus dem Griechischen hergeleitet und bedeutet übersetzt

„harte Haut“. Maßgebliche Faktoren für die Erkrankung sind: Vaskulopathie (Veränderungen

im Gefäßsystem), Autoantikörper gegen verschiedenste zelluläre Antigene und großflächige

Fibrosierung. Die Prävalenz (Häufigkeit) der Krankheit liegt bei 50-300 Fällen pro einer

Millionen Menschen und die Anzahl der Inzidenz (Neuerkrankungen) liegt bei 2.3-22.8 Fällen

pro eine Millionen Menschen.4

Unterteilt wird die Sklerodermie in zirkumskripte (lokalisierte) Sklerodermie, systemische

Sklerose sowie das Overlap-Syndrom, wobei die zikumskripte Sklerodermie unterschieden

werden kann in: herdförmige zirkumskripte Sklerodermie, Morphea und lineare Sklerodermie.

(Abbildung 1) Im Vergleich zur systemischen Sklerose handelt es sich bei der zirkumskripten

Einleitung 10

Variante um eine rein kutane Verlaufsform ohne Beteiligung innerer Organe, die auf Gesicht

und Akren beschränkt ist und nicht lebensbedrohlich ist. Beim Overlap-Syndrom handelt es

sich um eine Überlappung von verschiedenen Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Lupus

erythematodes, Rheumatoider Arthritis, Dermatomyositis und Polymyositis. Hierzu gehört

auch die sogenannte Mischkollagenose (SHARP-Syndrom). Im Folgenden wird lediglich auf

die systemische Sklerose näher eingegangen.5

Abbildung 1: Einteilung der verschiedenen Sklerodermieerkrankungen mit lokalisierter

Sklerodermie, Overlap-Syndrom und systemischer Sklerose, die unterteilt ist in: diffuse

systemische Sklerose und limitierte systemische Sklerose.

3.1.1 Systemische Sklerose

Die systemische Sklerose (SSc) ist eine generalisierte Erkrankung aus dem Gebiet der

Kollagenosen, bei der neben der Haut verschiedene innere Organe wie z.B. Lunge, Herz,

Nieren und Gastrointestinaltrakt betroffen sind.

Durch das Ausmaß der Organbeteiligung wird die Schwere der Krankheit bestimmt. Wenn

z.B. die Nieren involviert sind, wird eine erhöhte Eiweißausscheidung, Hypertonie

(Bluthochdruck), sowie eine zunehmende Nierenfunktionsstörung verzeichnet, die in

Nierenversagen und Dialysepflichtigkeit enden kann.6 Bei einer Lungenbeteiligung kommt es

durch die fortschreitende Fibrose (Vermehrung des Bindegewebes) des Lungengewebes zu

Atemnot.7

Als erstes zeigen sich morphologische Veränderungen an den Blutgefäßen, noch bevor es

zu klinischen Symptomen der Krankheit kommt. Die Krankheit ist durch

Autoantikörperproduktion und Inflammation (Entzündung) aber auch durch ein

Einleitung 11

pathologisches Zusammenspiel von Endothelzellen, Epithelzellen und Fibroblasten

gekennzeichnet, was in Gefäßobliteration und Gewebsfibrosierung resultiert.8

Man unterteilt die systemische Sklerose in eine diffuse und eine limitierte Form.

(Abbildung 1) Der limitierten SSc geht meist ein langjähriges Raynaud-Phänomen voraus.

Hierbei handelt es sich um eine Dysfunktion der Vasomotorik (Fehlregulation der

Gefäßmuskulatur), bei dem plötzliche Vasospasmen (Gefäßkrämpfe) der kleinen arteriellen

Gefäße vorwiegend an Händen und/oder Füßen auftreten und zu einem Abblassen der

Akren (Finger, Zehen) führen, gefolgt von Zyanose (bläuliche Verfärbung der Haut) und

schmerzhaft reaktiver Hyperämie (überschießende Durchblutung). Häufige Auslöser sind

Kältereize, aber auch emotionale Anspannung und Stress. Das Raynaud-Phänomen ist nicht

spezifisch für die SSc, lediglich das sekundäre Raynaud-Phänomen wird mit Kollagenosen

wie der SSc assoziiert und tritt hier in ca. 90% der Fälle auf.

Die Vaskulopathie tritt in der SSc bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt auf und ist mit einer

Endothelzellschädigung assoziiert. Es kommt zu einer Hochregulierung von

vasokonstriktiven, thrombogenen und proinflammatorischen Faktoren einerseits und zu einer

Herunterregulierung von vasodilatatorischen (gefäßerweiternden) und anti-thrombotischen

Faktoren andererseits. Durch dieses Ungleichgewicht kommt es zu Vasokonstriktion,

intimaler Proliferation und Thrombose. Die Gefäße verlieren an Elastizität, werden enger und

können schließlich vollständig obliteriert (verschlossen) sein. In Abbildung 2 ist schematisch

die Entwicklung der Vaskulopathie (Obliteration und Thrombose) dargestellt. Die Obliteration

beginnt in der Media (Gefäßmitte mit glatten Muskelzellen) und dehnt sich auf die Intima

(Gefäßinnenschicht mit Endothelzellen) und die Adventitia (Gefäßaußenschicht) aus,

wodurch die Gefäße ihre Elastizität verlieren.9

Abbildung 2: Vaskulopathie in der SSc: dargestellt sind Aufnahmen von Gefäßen auf der

linken Seite (gesund bis zur Vaskulopathie), schematische Darstellung der Erkrankung auf

der rechten Seite 100

Einleitung 12

Wichtige Mediatoren für die systemische Sklerose sind Wachstumsfaktoren und Zytokine

(Regulatoren von Wachstum und Differenzierung von Zellen), sowie Autoantikörper. Ein

potentes profibrotisches Zytokin ist Transforming Growth Factor beta (TGF-ß). In einer

Studie von Whitfield et al. wurde eine erhöhte Expression von TGF-β in Hautproben von

SSc-Patienten gefunden.10 Shephard et al. veröffentlichten 2004, dass TGF-ß in Verbund

mit der biologisch aktiven Substanz Endothelin-1 (ET-1) Fibroblasten in Myofibroblasten

umwandeln kann. Myofibroblasten sind eine spezielle Untergruppe von Fibroblasten, die

unter anderem an der Wundheilung beteiligt sind.11 Die Inhibierung von Endothelin-1-

Rezeptoren hatte einen positiven Einfluss auf die pulmonale Hypertonie bei SSc-Patienten.

Eine Überexpression von TGF-ß kann in Lungenfibroblasten durch ET-1 Inhibierung

unterbunden werden.12 Durch diese Daten wird deutlich, dass ET-1 eine bedeutende Rolle in

der Pathogenese der SSc spielt.

Die SSc wird des Weiteren mit verschiedenen Autoantikörpern assoziiert. Deren Detektion

kann nicht nur für die Diagnose der Krankheit hilfreich sein, sondern auch für die

Abschätzung der Schwere und des Risikos von Organkomplikationen und für eine Prognose

herangezogen werden. Zu den bisher nachgewiesenen Autoantikörpern zählen unter

anderem Antikörper gegen Topoisomerase I (Scl-70) und Zentromer-assoziierte Proteine.

Anti-Scl-70-Antikörper treten vor allem bei der diffusen Form und anti-Zentromer-Antikörper

bei der limitierten Form der SSc auf.5

3.2 Angiotensin II

1940 berichtete Braun-Menendez erstmalig von einer vasokonstriktorischen

(gefäßverengenden) Substanz, die aus Nierenblut eines hypertensiven Hundes isoliert

wurde.13 Diese Substanz wurde „Hypertensin“ in Argentinien und „Angiotonin“ in den USA

genannt, noch bevor sie isoliert und charakterisiert wurde.14, 15 Später stellte sich heraus,

dass es um ein und dasselbe Peptid handelte. 1958 bekam das Peptid dann seinen

endgültigen Namen von Braun-Menedez und Page: „Angiotensin“. Die Sequenz von

Angiotensin II in Mensch, Pferd und Schwein ist: H2N-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-

OH.16 1987 bekam Angiotensin die Abkürzung Ang von der American Heart Association und

wurde als Kürzel für alle Angiotensin-Peptide benutzt.17

Angiotensin II (Ang II) spielt eine Schlüsselrolle in der Regulation der kardiovaskulären

Homöostase. Es kann als Peptidhormon angesehen werden, das den Gefäßwiderstand und

somit den Blutdruck reguliert. Das Spektrum von Ang II umfasst unterschiedliche

Zielgewebe. Hierzu zählen neben glatten Gefäßmuskelzellen unter anderem auch Niere und

Einleitung 13

Gehirn. Angiotensin wird nicht nur im Blutkreislauf gebildet, sondern kann auch lokal in

zahlreichen Geweben wie dem Gehirn, den Nieren, aber auch in den Gefäßwänden selbst

synthetisiert werden. Somit zählt Angiotensin II zu den autokrinen und parakrinen Hormonen,

die Zellwachstum und Proliferation induzieren, aber auch extrazelluläre Matrixformation

kontrollieren.18 Andere Angiotensin-Metabolite mit biologischer Aktivität sind Angiotensin 2-8

(Ang III), Angiotensin 1-7 und Angiotensin 3-8 (Ang IV).19, 20

3.2.1 Biosynthese von Angiotensin II

Angiotensin II wird nicht nur systemisch gebildet und wirksam, sondern auch lokal. Somit

wird zwischen systemischem und lokalem Renin-Angiotensin-System unterschieden

(Abbildung 3).

Angiotensin II entsteht in mehreren Schritten aus Angiotensinogen, welches aus der Leber

stammt. In einer ersten Reaktion wird Angiotensinogen von Renin zu Angiotensin I

umgesetzt. Renin ist ein Glykoprotein und wird in den juxtaglomerulären Zellen der Niere

gebildet. Im Blut hat es die Funktion einer Protease, die von Angiotensinogen das aktivierte

Dekapeptid Angiotensin I abspaltet. Durch das Angiotensin Converting Enzyme (ACE) wird

ein Dipeptid von Ang I abgespalten, wodurch aus diesem Ang II entsteht.

Beim lokalen RAS werden die biochemischen Komponenten, die zur Bildung von Ang II

erforderlich sind, von ortständigen Zellen gebildet. Diese Systeme sind daher unabhängig

von den zirkulienden Faktoren und können sehr effektiv in einzelnen

Gewebskompartimenten Ang II bereitstellen, das ausgeprägte lokale Effekte hervorruft, ohne

systemisch zu wirken. Die Existenz lokaler RAS wurde in vielen Organen belegt, mit

besonders starkem Auftreten in Blutgefäßen, Herz, Niere und Immunsystem.21, 22

Einleitung 14

Abbildung 3: Renin-Angiotensin-System (RAS) mit Unterteilung in lokales und

systemisches RAS und Struktur des Octapeptids Angiotensin II

3.3 Das Endothelin-System

1980 berichteten erstmalig Furchgott und Zwadzki von einer Endothel-abhängigen

Vasodilatation. Das Endothel ist eine wichtige Einheit bei der Regulation des Tonus der

glatten Muskulatur.23 Es wurde beschrieben, dass bei Stimulation von Endothelzellen mit

vasoaktiven Substanzen, wie z.B. Acetylcholin, kurzlebige Produkte exprimiert werden, die

Endothelin-derived relaxing factor (EDRF) genannt wurden. Einer dieser Faktoren wurde als

Stickstoffmonoxid identifiziert.24 Hickey, Gillespie und O’Brien berichteten von einer

vasokonstriktiven Aktivität in Überständen von Endothelzellkulturen.25-27 Yanagisawa et al.

isolierten 1988 aus Überständen von Schweineaortenendothelzellen ein Peptid von 21

Aminosäuren, welches Endothelin genannt wurde und starke vasokonstriktorische

Fähigkeiten aufwies.28 Später wurde gefunden, dass Endothelin ein Spektrum an

biologischen Aktivitäten zeigt, wie z.B. regionale vasodilatatorische Effekte in vivo oder auch

Einleitung 15

Stimulation und Proliferation glatter Muskelzellen und Fibroblasten.29,30, 31 Endothelin existiert

in drei Isoformen, das „klassische“ Endothelin-1 (ET-1), Endothelin-2 (ET-2) und

Endothelin-3 (ET-3). Alle Isoformen besitzen zwei Disulfidbrücken, die durch 4 Cysteinreste

gebildet werden und eine carboxyterminale Sequenz, die für die Aktivität verantwortlich ist.32

Die dominierende Form der Endothelin-Peptide ist Endothelin-1. Die Regulation der

Endothelin-1 Synthese ist ein sehr komplexer Prozess, der nicht nur das Endothel und

andere Zellen als Ort einschließt, sondern auch z.B. Wachstumsfaktoren beinhaltet.33,34 In

Abbildung 4 ist schematisch die Synthese von Endothelin-1 dargestellt. Vorrangig wird ET-1

in den Endothelzellen der Blutgefäße und in vitro in glatten Muskelzellen gebildet. 28,35 ET-2

wird in den Epithelzellen der Niere, Kardiomyozyten und Endothelzellen gebildet. ET-3 wurde

im endokrinen System, im ZNS und im Gastrointestinaltrakt nachgewiesen.33

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Biosynthese von Endothelin-1 aus prepro-

Endothelin 101

Die Biosynthese von Endothelin-1 beinhaltet eine Reihe proteolytischer Schritte. Abgeleitet

ist ET-1 von einem 212 Aminosäuren großem Precursorprotein, dem prepro-Endothelin-1.

Durch eine neutrale Endopeptidase wird das prepro-Endothelin-1 in das aktive big-

Endothelin-1 (pro-Endothelin-1) umgewandelt. In einem nächsten Schritt, einer weiteren

Proteolyse, wird das pro-Endothelin durch Abspaltung eines C-terminalen Peptids (CTP),

mittels substratspezifischen Endothelin-converting-enzymes-1 (ECE-1), in Endothelin-1

umgewandelt. Die ECEs gehören zur Familie der Zinkfinger-Metalloproteinasen

Einleitung 16

(Matrix-Metalloproteinasen). Durch alternatives Splicing entstehen drei ECE-1 Isoformen,

wobei ECE-1 a und c auf der Zelloberfläche und ECE-1 b intrazellulär lokalisiert sind. Die

extrazellulären Formen von ECE-1 können das big-ET-1 außerhalb der Zelle spalten.

Endogen produziertes big-ET-1 wird durch das intrazellulär lokalisierte ECE-1 b zum aktiven

Peptid ET-1 umgewandelt. 36

3.4 G-Protein gekoppelte Rezeptoren

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (G-Protein coupled receptors, GPCR) stellen mit ca. 2000

verschiedenen Formen die größte Familie membranständiger Rezeptoren im Genom dar. Sie

vermitteln physiologische Antworten auf eine Vielzahl von Stimulantien, wie z. B. Hormone,

Peptide oder auch Proteine.

Abbildung 5: G-Protein gekoppelter Rezeptor (-NH2 = Aminoterminus, -COOH =

Carboxyterminus, EL1-3 = extrazelluläre Schleifen und IL1-4 = intrazelluläre Schleifen)

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bestehen aus sieben hydrophoben -helikalen

Transmembrandomainen (7-TM-Rezeptoren), die alternierend durch drei intrazelluläre

(IL1-IL3) und drei extrazelluläre (EL1-EL3) Schleifen miteinander verbunden sind. Sie

besitzen extrazelluläre oder transmembrane Bindungsdomäne für Liganden, sowie einen

intrazellulären C-Terminus. Die sieben Transmembrandomainen sind für die Verankerung

des Rezeptors in der Zellmembran verantwortlich. Der NH2-Terminus und die extrazellulären

Domänen des Rezeptors sind häufig glykosyliert. In der zweiten extrazellulären Schleife

Einleitung 17

(EL 2) und am Anfang der dritten transmembranären Domäne des Rezeptors befinden sich

zwei konservierte, zur Disulfidbrückenbildung befähigte Cysteine, welche die Struktur des

Rezeptors stabilisieren, indem sie die Transmembrandomänen III bis V aneinander binden.

Die intrazelluläre Seite des Rezeptors ist mit Bindungsstellen für G-Proteine und andere

Signalmoleküle ausgestattet. An der Bindung von G-Proteinen sind insbesondere die

Transmembrandomänen nahen Aminosäuren der zweiten (IL2) und dritten intrazellulären

Schleife (IL 3) sowie der sich an die 7. Transmembrandomäne anschließende COOH-

terminale Rest, beteiligt. Der intrazelluläre COOH-terminale Anteil ist in der Regel sehr kurz

(meist unter 50 Aminosäuren). In Abbildung 6 ist der Mechanismus der Aktivierung von

G-Protein schematisch dargestellt.

Abbildung 6: Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Der Mechanismus der

Rezeptoraktivierung unterliegt drei Schritten: 1. Signalinduzierung, 2. transmembranäre

Signalweiterleitung und Bindung des G-Proteins, 3. Signaltransfer zu zytoplasmatischen

Signalmolekülen.37

Wird der Rezeptor durch Ligandenbindung aktiviert, so führt dies zu Änderungen in der

relativen Orientierung der Transmembranhelices, wodurch Bindungsstellen für G-Proteine

freigelegt werden. Alle G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten, einem größeren -Teil

mit variablem Molekulargewicht und aus je einem -und einem -Teil, die zwei kleinere

aneinander gekoppelte Untereinheiten darstellen.38, 39

3.4.1 Die Angiotensin II- und Endothelin-1 Rezeptoren

Angiotensin II vermittelt seine Effekte über zwei G-Protein gekoppelte Rezeptoren, den

Angiotensin II Typ 1 (AT1R) und den Angiotensin II Typ 2 (AT2R) Rezeptor. Des Weiteren

Einleitung 18

existieren zwei andere Rezeptoren, der AT3R, exprimiert in Zelllinien und AT4R, exprimiert in

Herz, Lunge, Niere, Gehirn und Leber. Da aber beide Rezeptoren nicht komplett

charakterisiert sind, sind sie nicht in der definierten Klassifizierung der „Säugetier“-AT

Rezeptoren enthalten.40 Der AT1-Rezeptor besitzt im kardiovaskulären System die größte

Bedeutung, denn über ihn werden die weithin bekannten Angiotensin II-Wirkungen wie

Vasokonstriktion, Produktion von Wachstumsfaktoren, Hypertrophie der glatten Muskulatur

und der Kardiomyozyten sowie Proliferationsreize vermittelt.16

Der AT2-Rezeptor zeigt am Ende der Embryonalentwicklung seine stärkste Expression, was

den Schluss nahe legt, dass er an embryonalen Entwicklungsprozessen maßgeblich beteiligt

ist.41 Im adulten Organismus wird er dagegen z.B. im Uterus, in bestimmten Hirnarealen, im

Herz, in den Nieren, im Gefäßsystem, aber auch bei Reparaturprozessen der Haut

exprimiert.42 Im Gefäßsystem wurde der AT2R in der Adventitia und in der Media gefunden,

wohingegen der AT1R stark in glatten Muskelzellen exprimiert ist.43 In einigen Fällen scheint

dem AT2R die Rolle eines Gegenspielers zum AT1R zuzukommen, denn AT2-Rezeptoren

können in vitro die proliferativen Effekte von AT1-Rezeptoren antagonisieren.44 Der AT2-

Rezeptor weist nur eine Homologie zu 34 % zum AT1-Rezeptor auf.

Endothelin-1 vermittelt seine Effekte ebenfalls über zwei G-Protein gekoppelte Rezeptoren

den Endothelin-1 Typ A und Endothelin-1 Typ B-Rezeptor (ETAR und ETBR). Die strukturelle

Analogie der beiden Endothelin-Rezeptoren auf Proteinebene ist sehr hoch, aber doch

gehen sie unterschiedliche physiologische Reaktionen ein, resultierend in intrazelluläre

Signalwege nach Agoniststimulation.45

Der ETAR ist voranging auf glatten Muskelzellen exprimiert, wo er für eine lang anhaltende

Vasokonstriktion nach Stimulation sorgt, wohingegen der ETB-Rezeptor vermehrt auf

vaskulären Endothelzellen lokalisiert ist und nach Aktivierung für eine kurze Vasodilatation

verantwortlich ist.46, 47 Es existiert aber auch eine Subpopulation von ETBR mit

vasokonstriktorischen Eigenschaften, die ebenfalls auf glatten Muskelzellen exprimiert

sind.48-50

3.5 Hypertonie

Als manifeste Hypertonie gilt ein Blutdruck von >140 mmHg systolisch und/oder >90 mmHg

diastolisch bei mindestens zwei Messungen an unterschiedlichen Tagen. Eingeteilt wird die

Hypertonie in primär und sekundär, wobei Systemerkrankungen mit renaler Beteiligung zu

den sekundären Ursachen zählen. 102

Einleitung 19

Erstmalig wurde der Blutdruck 1733 von Strephen Hales bei einem Pferd bestimmt. Die

Technik der modernen Messung mit einem Stethoskop und einer Druckmanschette wurde

durch Nicolai Korotkov 1905 eingeführt.

Auslöser für einen erhöhten Blutdruck, können unter anderem ein erhöhter arterieller

Gefäßtonus oder Umbauvorgänge in der Gefäßwand sein. Die arterielle Hypertonie ist ein

unabhängiger Risikofaktor für Myokardinfarkt und Schlaganfall sowie für die Entstehung der

linksventrikulären Hypertrophie.51 Durch seine vasokonstriktorischen Eigenschaften könnte

Endothelin-1 (ET-1) an der Entstehung sekundärer Hypertonieformen, die mit erhöhtem

Gefäßtonus einhergehen, beteiligt sein.52 Bei in vitro Experimenten mit glatten Muskelzellen

von Bluthochdruckpatienten konnten Rossi et al. erhöhte ET-1 mRNA und

Proteinkonzentrationen detektieren.53

Das Renin-Angiotensin-System (RAS) nimmt eine zentrale Stellung bei physiologischen und

pathologischen Adaptionsmechanismen im kardiovaskulären und renalen System ein. Dabei

hat Angiotensin II als potenter Vasokonstriktor oftmals eine Schlüsselrolle bei der

Blutdruckregulation. Die blutdrucksteigernden Effekte von Angiotensin II werden über den

Angiotensin II Typ 1-Rezeptor (AT1R) vermittelt. Deshalb wurden spezifische AT1-

Rezeptorblocker entwickelt, um die Wirkung von Angiotensin II zu hemmen. Einige Beispiele

für spezifische Antagonisten ohne agonistische Aktivität am AT1R sind Valsartan, Losartan

oder auch Irbesartan.

Einen bedeutenden Einflussfaktor bei der Entstehung und dem Schweregrad auf pulmonale

arterielle Hypertonie, eine Bluthochdruckform, hat Endothelin-1. In Patienten mit idopatischer

pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) konnten erhöhte Plasma ET-1 Spiegel

nachgewiesen werden.54 PAH findet sich in Assoziation mit pulmonalem Gefäßumbau und

Thrombosen mit konsekutiver Gefäßverengung und ist einer der wichtigsten

Mortalitätsgründe in der systemischen Sklerose.55 10-12 % der SSc-Patienten entwickeln

eine PAH, die im Verläuf einen unabhängigen Risikofaktor für eine erhöhte Mortalität

darstellt.56 Pathogenetisch ist unter anderem eine verstärkte Aktivierung von

ETA-und ETB-Rezeptoren bedeutend. Durch rezeptorvermittelte Wirkung von Endothelin-1

kommt es zu erhöhter Vasokonstriktion und gesteigerter Proliferation von Gefäßzellen.57 Um

diese Mechanismen zu unterdrücken, wurden pharmakologische Rezeptorblocker entwickelt.

Das Vorläufermolekül eines selektiven ETAR-Antagonisten wurde aus Streptomyces

Misakiensis, einer Mikrobenart, gewonnen. Daraus abgeleitet ergab sich das cyclische

Pentapeptid BQ123.58 ETBR-Blocker, wie BQ788 wurden erstmalig durch Ishikawa et al 1994

publiziert.59 Ein Beispiel für einen unselektiven ETA/ETB-Rezeptorblocker stellt Bosentan dar.

Bosentan ist einer von drei zugelassenen ET-Rezeptor-Antagonisten in der Behandlung von

pulmonaler arterieller Hypertonie. Bei oraler Gabe von Bosentan wurde jedoch als

pathogenetisch ungünstige Nebenwirkung eine Erhöhung der ET-1 Plasmaspiegel

Einleitung 20

beobachtet.60 Besser ist hier der neue hochselektive ETA-Rezeptor Antagonist Sitaxsentan,

der den ET-1 Spiegel nicht beeinflusst.61

3.5.1 Autoimmune Pathomechanismen kardiovaskulärer Veränderungen

3.5.1.1 Immunglobuline (Ig)

Der Oberbegriff Immunglobuline (Ig) umfasst sämtliche Subklassen von Antikörpern

(IgA, IgE, IgG, IgM). Die einzelnen Ig-Subklassen sind bei verschiedenen spezifischen

humoralen und Effektormolekül-vermittelten Immunantworten teilweise gewebespezifisch

beteiligt. Die Erkennung von Fremdantigenen durch Ig wird dabei über den Amino-terminalen

Anteil (FAB) vermittelt. Dabei erkennt und bindet beispielsweise ein Molekül IgG jeweils zwei

identische Antigene über seinen FAB-Teil. Über den carboxy-terminalen Teil (FC) wird die

Immunantwort des Organismus durch Interaktion mit weiteren Molekülen und Zellen des

Immunsystems vermittelt.

Die Grundstruktur der IgG-Subklasse entspricht einem Tetramer aus je zwei identischen

Paaren von schweren (H; heavy) und leichten (L; light) Polypeptidketten. Die einzelnen

Ketten werden durch kovalente und nichtkovalente Bindungen (Disulfid-Brücken)

zusammengehalten. Jede einzelne Kette besteht aus einem variablen (V) und einem

konstanten (C)- bzw. einem polymorphen Abschnitt. Die beiden Amino-terminalen Enden,

der vollständigen Immunglobuline werden von V-Regionen der L- und H-Ketten gemeinsam

gebildet und erkennen identische Antigenstrukturen.

Durch Pepsin oder Papain (Enzyme) können Immunglobuline in die einzelnen Abschnitte

gespalten werden. Dabei bildet der Amino-terminale Abschnitt das Fab-Fragment

(antigenbindenes Fragment). Der übrige Anteil des Immunglobulins, wird auf Grund seiner

leichten Kristallisierbarkeit, als Fc-Fragment bezeichnet wird. (Abbildung 7)

Immunglobuline der Klasse G (IgG) entsprechen dem Hauptteil der zirkulierenden

Immunglobuline (70-75 %). IgG’s haben die Möglichkeit über ihren Fc-Teil an Rezeptoren auf

verschiedenen Zellen (z.B. T-und B-Lymphozyten) zu binden. Durch diese Interaktion tragen

sie zur Phagozytose und zur Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytoxität (ADCC) bei.

Einleitung 21

Abbildung 7: Strukur eines Immunglobulins Klasse G mit Fc = carboxyterminaler Teil,

Fab = aminoterminaler Teil, H = schwere Kette, L = leichte Kette, V = variable Region, C =

konstante Region .[modifiziert nach 62]

3.5.1.2 Bedeutung von Autoantikörpern bei Vaskulopathien

Autoimmune Aktivierungen innerhalb des Immunsystems werden über Bildung von

Autoantikörpern vermittelt. Auch bei der Entstehung von Vaskulopathien können

Autoantikörper involviert sein. Hierzu publizierten erstmalig Wallukat et al. 1999. In einem

neonatalen Rattenkardiomyzyten-Modell konnten die Untersucher Angiotensin II Typ 1-

Rezeptor Autoantikörper (AT1RAA) über eine Steigerung der Kontraktionsfrequenz

detektieren. Hierbei wurden die Kardiomyzyten mit isoliertem IgG aus dem Serum von

präeklamptischen und gesunden Frauen stimuliert. Lediglich IgG aus dem Serum von

Präeklampsie-Patientinnen führte zu einer Steigerung der Kontraktionsrate. Dieser Effekt

konnte durch spezifische AT1-Rezeptorblockage inhibiert werden.63

Die Präeklampsie ist eine spezielle Hypertonieform in der Schwangerschaft, die nach der

20.-sten Schwangerschaftswoche auftreten kann und neben einem erhöhten Blutdruck

(>140/90 mmHg) mit Proteinurie und vaskulären Veränderungen in der Plazenta assoziiert

ist.64, 65

Im Jahr 2000 berichteten Mellor et al. von immunologischen Parallelen zwischen dem Verlust

von transplantatierten Organen und dem fetalen Überleben bei Schwangeren in

Präeklampsie.66

Einleitung 22

Dragun et al. veröffentlichten im Jahr 2005 einen direkten Zusammenhang zwischen dem

Auftreten von AT1R-Autoantikörpern und dem Verlust von Nierentransplantaten durch eine

akute, therapierefraktäre, vaskuläre Abstoßung. Für den Nachweis der Autoantikörper

dienten auch hier neonatale Rattenkardiomyozyten, die den AT1-Rezeptor expremieren.

Durch Zugabe von IgG betroffener Patienten erhöhte sich die Kontraktionsrate der

Kardiomyozyten, welche sich selektiv durch AT1-Rezeptorblockade inhibieren ließ.67

Die Forschung nach Autoantikörpern, die an die Endothelin-Rezeptoren binden können, ist

bis zum heutigen Zeitpunkt wenig fortgeschritten. Es wurden natürliche anti-Endothelzell-

Antikörper (AECA) nachgewiesen, die auch basal bei gesunden Menschen exprimiert

werden. In Endothelzellen konnte gezeigt werden, dass bei Stimulation mit IgG-AECA

Endothelin-1 freigesetzt wird. Dieser Effekt wurde auch im Zusammenhang mit renalen

Begleiterkrankungen bei Präeklampsie gesehen.68 Yoshio et al. konnten bei Patienten mit

systemischen Lupus erythematodes (SLE) in einer weiteren Studie zeigen, dass das Serum

von SLE-Patienten im Vergleich zum Kontrollserum eine erhöhte Freisetzung von ET-1 aus

humanen Nabelschnurendothelzellen bewirkt. Die ET-1 Freisetzung korreliert dabei mit dem

TiterfürIgM-AECA.69

Fragestellung 23

3.6 Fragestellung

Die klinischen Veränderungen der systemischen Sklerose sind gekennzeichnet von

fortschreitender Haut- und Viszeralfibrose, welche den Krankheitsverlauf und die Mortalität

entscheidend bestimmen. Pathogenetisch lassen sich diese Veränderungen in erster Linie

auf obliterative Gefäßveränderungen zurückführen gefolgt von endothelialer Dysfunktion und

progredienter Organfibrose. Im Erkrankungsverlauf wurden Ungleichgewichte im Verhältnis

zwischen Vasokonstriktion und Dilatation, vermittelt durch physiologische und

pathophysiologische Effekte von Angiotensin II und Endothelin-1, beobachtet. So konnte

gezeigt werden, dass eine endotheliale Dysfunktion zu einer Aktivierung des RAS-Systems

verbunden mit erhöhten Angiotensin II Plasmaspiegeln führt. Parallel wurden außerdem

steigende Plasmaspiegel des vasokonstriktorischen Peptids Endothelin-1 mit Zunahme der

endothelialen Dysfunktion gemessen. Beschrieben wurden zudem auch humorale und

zelluläre immunologische Veränderungen in Zusammenhang mit der systemischen Sklerose,

deren pathogenetische Relevanz bisher jedoch nicht eindeutig geklärt ist. So konnten

Autoantikörper gegen verschiedene Zielepitope im Serum erkrankter Patienten festgestellt

werden. Unter anderem fanden sich in Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe an

Patientenkohorten mit systemischer Sklerose Autoantikörper gegen den Angiotensin II Typ 1

Rezeptor (AT1R-AA) und gegen den Endothelin-1 Typ A Rezeptor (ETAR-AA).

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollen autoimmun-vermittelte Effekte auf Änderungen in

der Signaltransduktion an einer humanen mikrovaskulären Endothelzelllinie der Haut

(HMEC-1) untersucht werden. Verglichen werden Auswirkungen der natürlichen Liganden

Endothelin-1 und Angiotensin II mit isoliertem IgG von Patienten mit systemischer Sklerose

und Kontroll-IgG von Gesunden. Es soll getestet werden, welche Änderungen im

ERK1/2/Ets-1-Signaltransduktionsweg auftreten. Als direkte funktionelle Folge der alterierten

Signaltransduktion wird die Endothelzellproliferation bestimmt. Durch spezifische

pharmakologische Rezeptorblockade soll überprüft werden, welcher Anteil der beobachteten

Effekte über Angiotensin II- und Endothelin-1-Rezeptoren vermittelt wird. Im nächsten Schritt

sollen die Kinasen Raf-1 und MEK1/2 oberhalb von ERK1/2 spezifisch blockiert werden.

Ein zusätzliches zentrales Problem der systemischen Sklerose stellen mikrothrombotische

Gefäßverschlüsse dar. Da für Tissue Factor (TF) sowohl prothrombotische als auch

proinflammatorische Effekte beschrieben wurden, soll in weiteren Experimenten die

Expression und Regulation von diesem Faktor untersucht werden.

Material 24

4 Material

4.1 Zelllinie

Alle Experimente erfolgten mit einer immortalisierten humanen Endothelzelllinie (HMEC-1).70

4.2 Material

Material Bezugsquelle

Neubauer-Zählkammer Optik Labor

Zellkulturschalen (100x20 mm; 60x15 mm) TPP/BD Falcon

Zellkulturflaschen BD Falcon

Falcons (50 ml, 15 ml) BD Falcon

Pipetten, steril (25 ml; 10 ml; 5 ml) BD Falcon

Mikropipetten-Tips (2 – 200 µl; 0.5 – 20 µl; 100 – 5000 µl) Eppendorf

Tips (100–1000 µL) Sarstedt

Safe Lock Tubes (2 ml; 1.5 ml; 0.5 ml) Eppendorf

96-Well-Platten BD Falcon

Zellschaber Corning Incorporated

Insulinspritze Becton Dickinson S.A.

Clear Blue X-Ray Film Kodak

Protein G Sepharose 4 fast flow Säule GE Healthcare

Filterflasche Nalgene Nunc

Dialyseschläuche Roth

Chamber Slides Nunc

Microtitereinsätze Nunc

Biodyne®Precut Nylon Membranes Pierce

4.3 Stimulanzien (Agonisten/Antagonisten/Inhibitoren)

1. Agonisten

Material Bezugsquelle

humanes Angiotensin II Sigma-Aldrich

humanes Endothelin-1 Sigma-Aldrich

humanes IgG Sigma-Aldrich

Material 25

2. Antagonisten

Material Bezugsquelle

Valsartan Novartis

PD 123,319 Sigma-Aldrich

Sitaxsentan Encysive Pharma. Inc.

BQ788 Alexis Biochemicals

Bosentan Actelion

3. Inhibitoren

Material Bezugsquelle

GW5074 Sigma-Aldrich

PD98059 Sigma-Aldrich

PD 184,352 axon MEDCHEM

3.4 Kommerzielle Kits

Material Bezugsquelle

Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Roche

DC-Protein-Assay Bio-Rad

RNA PCR Core Kit Roche

In situ Cell Death Detection Kit, TMR red Roche

Biotin 3´End DNA Labeling Kit Thermo Scientific

Light Shift™ EMSA Optimization Kit Thermo Scientific

NE-PER® Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Pierce

GeneAmp RNA PCR Core Kit Applied Biosystem

Pow Sybr® Green PCR Master Mix Applied Biosystem

4.5 Chemikalien

Material Bezugsquelle

Dimethylsulfoxid Appli Chem

Endothelial Basal Medium PAA

Fetales Kälberserum PAA

L-Glutamin Biochrom AG

Penicillin/Streptomycin Biochrom AG

Hydrocortison Sigma-Aldrich

EGF Sigma-Aldrich

Trypsin/EDTA Biochrom AG

PBS, steril (ohne Mg2+ und Ca2+) PAA

Trypanblau Sigma-Aldrich

3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl- Sigma-Aldrich

tetrazoliumbromid (MTT)

Gel Blotting Papier Schleicher&Schell

Material 26

Blotmembran PeqLab

Methanol Merck

Detektionslösung 1+2 Thermo Science

Entwicklerlösung Kodak

Fixierer Kodak

Diethylpyrocarbonat (DEPC) Sigma

Agarose Serva

Ethidiumbromid Roth

Trizol Invitrogen

Chloroform Merck

Ethanol J.T. Baker

Na2HPO4 Roth

Glycin-HCl Sigma-Aldrich

Tris-HCl Sigma-Aldrich

NaH2PO4 Roth

NaCl Merck

EDTA Roth

Propidiumiodid Fluka

Paraformaldehyd Sigma-Aldrich

Kaliumhydroxid Roth

DAPI Roche

Aqua Poly Mount Polyscience

DNase I Stratagene

Protease Inhibitoren Complets Roche

BSA Serva

Acrylamid Bio RAD Laboratories AG

TEMED Sigma-Aldrich

APS Roth

DTT Roth

Magermilchpulver AppliChem

Ponceau S Sigma-Aldrich

Gelatine AppliChem

4.6 Lösungen und Puffer

Couting-Lösung

2 % Gelatine in dd H2O lösen

autoklavieren

1:10 mit PBS vor Verwendung verdünnen

Endothel Basal 5% FCS-Kulturmedium:

500 ml Endothel Basal Medium

5% FCS

10 mmol/l L-Glutamin

1% Penicillin/Streptomycin

100 μl Hydrocortison (50 μmol/l)

50 μl EGF (100 μg/ml)

Material 27

Endothel Basal 1% FCS-Kulturmedium:

500 ml Endothel Basal Medium

1% FCS

10 mmol/l L-Glutamin

1% Penicillin/Streptomycin

Endothel Basal 0% FCS-Kulturmedium:

500 ml Endothel Basal Medium

10 mmol/l L-Glutamin

1% Penicillin/Streptomycin

Bindungspuffer (pH 7.0)

0.02 mol/l Na2HPO4

Elutionspuffer (pH 2.7)

0.1 mol/l Glycin-HCl

Neutralisationspuffer (pH 9.0)

1 mol/l Tris-HCl

Dialysepuffer (10fach)

Lösung1: 8.9 g Na2HPO4x2H2O in 500 ml H2O lösen

Lösung2: 3.45 g NaH2PO4x2H2O in 250 ml H2O lösen

Lösung3: Lösung2 zu Lösung1 geben, bis pH 7.2 erreicht ist

Lösung4: 45.0 g NaCl in 500 ml Lösung3 lösen

FACS-Puffer

5 mmol/l EDTA in PBS

5 % FCS

MTT-Lösung

5 mg/ml MTT in PBS

Fixierlösung

4 % PFA in PBS

Blocklösung

1xTBS

0.2 % Triton X-100

5 % BSA

Permeabilitätslösung

0.1 % Natrium-Citrat

0.1 % Triton X-100

Lysis-Puffer (pH 7.4)

50 mmol/l Tris-HCl

0.1 % SDS

0.5 % Triton X-100

auf 100 ml mit dd. H2O auffüllen

Material 28

50/O/5/2-Puffer (pH 7.4)

1 mol/l Tris (100 ml)

200 mmol/l EDTA (50 ml)

200 mmol/l EGTA (20 ml)

4.7 Geräte

Material Bezugsquelle

Sterilbank Thermo Scientific

Inkubator Thermo Scientific

Mikroskop Carl Zeiss AG

Fluoreszenzmikroskop Carl Zeiss AG

Waage (5 g-6100 g; 10 mg-220 g) Sartorius AG

Zentrifuge Eppendorf

Megafuge Thermo Scientific

Vortexer VWR International

Heizblock VWR International

Elektrophorese Mini Proten Tetra Cell Bio RAD Laboratories AG

Western Blot Modul Invitrogen

Rolltisch Marienfeld

Schütteltisch Heidolph

Peltier Thermal Cycler Biozyme

Thermalcycler Px2 Thermo Scientific

Elisa-Reader Thermo Scientific

Nano Drop PeqLab

Konfokales Mikroskop Biorad/Nikon

7500 Fast Real-Time PCR Applied Biosystem

Methoden 29

5 Methoden

5.1 Zellkultur

5.1.1 Kultivierung

Die Kultivierung erfolgte auf adhäsiven, zuvor mit 0.5 % Gelatine beschichteten

Zellkulturflaschen, -platten, bzw. -schalen bei CO2 Begasung (5 %) und 100 %

Luftfeuchtigkeit bei 37 °C. Die verwendeten Medien und Lösungen wurden vor Gebrauch auf

37 °C im Wasserbad temperiert.

Zum Passagieren der Zellen wurde nach Mediumabnahme und einmaligem Waschen mit

PBS eine Ablösung der Zellen durch Trypsinierung (5 ml Trypsin für 4 min bei 37 °C)

durchgeführt. Danach wurden die Zellen in 5 ml Medium aufgenommen, für 3 min bei

1200 min-1 zentrifugiert und in 10 ml neuem Medium resuspendiert. Für die

Weiterkultivierung wurden x Zellen/ cm2 ausgesät.

5.1.2 Lagerung der Zellen

Zum Einfrieren kultivierter Zellen wurde zunächst, wie bei der Passagierung, nach Abnahme

von Medium einmal mit PBS gewaschen, trypsiniert, in 5 ml Medium aufgenommen und

pellettiert. Nach Resuspendierung in Vollmedium, wurden die Zellen gezählt und mit 10 %

DMSO in einem 1 ml Schraubdeckelröhrchen versetzt, schrittweise um 10 °C auf -80 °C

abgekühlt und in flüssigen Stickstoff überführt.

5.2 IgG-Isolation

Immunglobuline wurden mittels Affinitätschromatographie über Protein G HiTrap Säulen

gewonnen. Die Säulen sind gepackt mit 5 ml Sepharose gekoppelt mit einem rekombinant

hergestelltem Protein G., welches in E. coli gezüchtet wurde. Dieses ist ein bakterielles

Protein mit hoher Affinität zum Fc-Teil der IgG-Isotypen (IgG1, 2, 3, 4). Die Bindungsaffinität des

Methoden 30

Fc-Teils zu Protein G nimmt mit sinkendem pH ab, d.h. gebundene Antikörper werden bei

geringem pH eluiert.

5.2.1 Patientenmaterial

Die Isolation der Immunglobuline Klasse G erfolgte aus Serum oder Plasma von Patienten

mit systemischer Sklerose. Die Patienten hatten verschiedene Organbeteiligungen, wobei

hauptsächlich die Lunge in Form einer pulmonal arteriellen Hypertonie, betroffen war. Es

wurden keine Einschränkungen aufgrund des Alters oder des Geschlechts gemacht.

5.2.2 Probenvorbereitung

Die Proben müssen sauber und frei von Rückständen sein, d.h. Serum und /oder Plasma

wurden für 20 min bei 3000 min-1 zentrifugiert und danach filtriert mit einer Filtereinheit von

0.45 µm. Um Überladungen der Säulen zu vermeiden, wurden 20 ml Serum und/oder

Plasma mit 20 ml Bindungspuffer verdünnt, denn die Bindungskapazität liegt bei 25 mg

human IgG/ml.

5.2.3 Säulenvorbereitung und IgG-Isolation

Die 5 ml-Säule wurde mit 25 ml Bindungspuffer und einer Flußrate von 20 ml/min äquilibriert.

Dann wurden 20 ml verdünntes Serum und/oder Plasma auf die Säule gegeben. Dieser

Schritt wurde zwei-bis dreimal wiederholt, damit sich die Ausbeute an IgG vergrößert. Die

ungebundenen Bestandteile wurden dann mit 25 ml Bindungspuffer von der Säule

gewaschen. Eluiert wurde bei pH = 2.7 mit 20 ml Elutionspuffer, wobei in vier Fraktionen a’

5 ml unterteilt wurde und Fraktion 1 und 4 auf Grund der geringen IgG-Konzentration

verworfen wurde. Die Fraktionen zwei und drei wurden nach jedem Schritt gepoolt und

anschließend über 24-48 h dialysiert.

Nach Dialyse erfolgte die Konzentrationsbestimmung mittels Immunturbidimetrie im

Zentrallabor der Charite Berlin (CVK) und die Bestimmung der Titer der Angiotensin II Typ 1

Rezeptor Autoantikörper und der Endothelin-1 Typ A Rezeptor Autoantikörper (AT1RAA,

ETARAA) von der Firma Celltrend in Luckenwalde.

Methoden 31

5.2.4 Lagerung und Reinigung der Säulen

Nach dem Elutionsschritt wurde mit 25 ml Bindungspuffer erneut äquilibriert. Die Säulen

wurden bei +4 °C in 20 % Ethanol gelagert. Nach drei bis viermaliger Anwendung wurden die

Säulen mit 5 mol/l Guanidin-Hydrochlorid gereinigt werden, um letzte Spuren von nicht

eluierten Partikeln zu entfernen.

5.3 Genexpressionsanalyse

5.3.1 RNA-Isolation

In 60 mm Petrischalen wurden 250.000 Zellen gegeben und bis zum Erreichen der

Konfluenz in 5 % FCS-haltigem Medium kultiviert. Nach einer Inkubationszeit von 24 h der

Zellen mit 1 % FCS-haltigem Medium erfolgte die Inkubation mit unterschiedlichen

Stimulanzien für verschiedene Zeitpunkte.

Am Ende der Stimulationen wurde das Medium abgenommen, die Zellen einmal mit PBS

gewaschen, in 1 ml Trizol lysiert, von der Platte gekratzt und das Lysat in Eppendorftubes

überführt. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur (RT) wurden 200 µl Chloroform

zugegen, 30 s kräftig am Vortexer geschüttelt, 10 min bei RT inkubiert und anschließend bei

11200 min-1 für 15 min bei 4 °C zentrifugiert. Die wässrige Phase (ca. 400 µl) wurde in ein

neues Eppendorftube überführt und mit 500 µl Isopropanol versetzt, ca. 10 s vorgetext,

10 min bei RT inkubieren lassen und bei 11200 min-1 bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand

wurde abdekantiert und das entstandene Pelltet in 1 ml Ethanol geschwenkt, 5 min bei

8900 min-1 zentrifugiert, der Überstand wieder abgenommen, nochmals in 1 ml Ethanol

geschwenkt und wieder bei 8900 min-1 zentrifugiert.

Das gereinigte Pellet wurde dann bei 60 °C im Heizblock getrocknet und in 10-20 µl

DEPC-Wasser aufgenommen und bei -80 °C weggefroren.

Methoden 32

5.3.2 Messung der Extinktion der RNA

Die Bestimmung der RNA erfolgte mittels photometrischer Messung am NanoDrop™. Die

Reinheit der RNA wurde durch das Verhältnis von OD260/OD280 ermittelt. Reine DNA sollte

ein Extinktionsverhältnis von r = 1.5-2.0 aufweisen.

Anschließend wurde die Konzentration der RNA rechnerisch auf 100 ng/µl eingestellt.

5.3.3 Qualitätsprüfung der RNA durch Gelelektrophorese

Zur Kontrolle der Qualität der RNA wurden 500 ng gesamt RNA [RNA-Gel: 14 µl = 500 ng,

V(RNA) = 4.5 µl, V(DEPC) = 7.2 µl, V(Ladepuffer) = 2.3 µl] in einem 1 %-igen Agarose-Gel mit

Ethidiumbromid (50 ng/ml) in 1 x TBE-Puffer für 55 min bei 80 V elektrophoretisch

aufgetrennt. Die RNA wurde bei -80 °C gelagert.

5.3.4 Reverse Transkription

Die Reverse Transkription (RT), d.h. das Umschreiben von RNA in cDNA mittels reverser

Transkriptase wurde nach folgendem Ansatz durchgeführt:

RT-Ansatz:

25 mM MgCL2 (25 mmol/l) 4 µl

10x PCR Buffer II 2.5 µl

dGTP (100 mmol/l) 2 µl

dATP (100 mmol/l) 2 µl

dTTP (100 mmol/l) 2 µl

dCTP (100 mmol/l) 2 µl

RNase OUT™ Inhibitor (40U/µl) 1 µl

MuLV Reverse Transcriptase (50 U/µl) 1 µl

Random Hexamers/Oligo d(T)16 (50 µmol/l) 1 µl

500 ng RNA 7.5 µl

V (Gesamt): 25 µl

Die RT wurde wie folgt durchgeführt:

25 °C 10 min

42 °C 45 min

95 °C 5 min

Die auf 10 ng/µl verdünnte cDNA wurde für die anschließende PCR eingesetzt.

Methoden 33

5.3.5 Konventionelle PCR

Die Amplifikation der cDNA erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Der PCR-

Prozess besteht aus einer bestimmten Anzahl von Zyklen die in einem sogenannten

Thermocycler durchgeführt werden. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten, wobei im ersten

Schritt, der Denaturierung, die DNA-Doppelstränge des Templats erhitzt werden, um sie zu

trennen. Im zweiten Schritt erfolgt die Anlagerung der sogenannten Primer an das Templat,

das die Zielsequenz enthält. Länge und Sequenz der Primer bestimmen die genaue

Temperatur, die im Thermocycler vorherrschen muss, damit sich die Primer an die

komplementären DNA-Abschnitte des Templats anlagern können. Im dritten Schritt findet die

Elongation statt, d.h. die DNA-Polymerase verlängert am angelagerten Primer den

Einzelstrang und führt somit zur Bildung eines komplementären DNA-Stranges. Dieser

Vorgang wird in Zyklen wiederholt, was zur Amplifikation der Einzelstränge führt. Die

elektrophoretische Auftrennung der amplifizierten DNA erfolgte in einem 1 %-igen

Agarosegel mit Ethidiumbromid (50 ng/ml) in 1xTBE-Puffer. Anhand parallel aufgetrennter

DNA-Längenstandards, wurde die DNA-Fragmentgröße ermittelt. Es wurde abhängig von

der Gelgröße, 90 V bis 130 V Spannung angelegt.

PCR-Ansatz:

10xPCR-Puffer II 2.5 µl

dNTP (100 µmol/l) 5 µl

vorwärts-Primer(10 pmol/l) 0.5 µl

rückwärts-Primer (10 pmol/l) 0.5 µl

Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl) 0.3 µl

cDNA (10 ng/µl) 2 µl

ad 25 µl H2O

PCR-Protokoll:

Denaturierung 95 °C 1 min

Denaturierung 95 °C 30 s

Annealing (Primerspez.) T 30 s /xZyklen

Elongation 72 °C 30 s

Finale Elongation 72 °C 3 min

Pause 4 °C

5.3.6 Quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR)

Die Echtzeit quantitative-PCR ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren die auf

dem Prinzip der PCR beruht. Sie gestattet mit Hilfe von Fluoreszenzmessungen die

Quantifizierung der gewonnen DNA während der PCR-Zyklen. Die Fluoreszenz nimmt

proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Die Quantifizierung wird in der

exponentiellen Phase der PCR vorgenommen, da hier die optimalen Reaktionsbedingungen

Methoden 34

vorliegen. Die real-time PCR wurde mit dem Power SYBR® Green PCR Master Mix von

Applied Biosystems durchgeführt. Die qRT-PCR erfolgte mit Reaktionsvolumen von 20 µl,

das je 2 µl cDNA und 0,5 µmol/l vorwärts und rückwärts primer und 10 µl des Power SYBR®

Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) enthielt.

qRT-PCR-Protokoll:

Initalisierungsschritt 50 °C 2 min

Denaturierung 95 °C 10 min

Annealing (Primerspez.) T 15 s /xZyklen

Elongation 60 °C 1 min

Denaturierungskurven wurde nach jeder Serie von Proben angelegt, um die Spezifität der

Reaktion nachzuprüfen. Die relative Menge Kopien wurde nach der cycle threshold methode

(Applied Biosystems) mit der 7500 System Software (Version 1.2.3; Applied Biosystems)

beschrieben, normalisiert und zur endogenen Referenz (GAPDH) berechnet.

Tabelle 1: Genspezifische Primersequenzen mit fw = forward (vorwärts) und rv = reverse

(rückwärts)

Gen

Primer

5’-3’-Primersequenzen

Annealing-

T in °C

Zyklen

Fragment

(Basenpaare)

AT1R

AGTCGGCACCAGGTGTATTT

ATCACCACCAAGCTGTTTCC

211

AT2R

TTCCCTTCCATGTTCTGACC

AAACACACTGCGGAGCTTCT

191

ETAR

GATAGCCAGTCTTGCCCTTG

CAGAGGTTGAGGACGGTGAT

177

ETBR

GCGAAACGGTCCCAATATC

CCACGGAGGCTTTCTGTATG

161

Ets-1

ACCCAGCCTATCCAGAATCC

ATGAAGCTGGGCTCTGAGAA

106

TGAAGGATGTGAAGCAGACG

TTCTCCTGGCCCATACACTC

451

GAPDH

CATCACCATCTTCCAGGAGCG

TGACCTTGCCCACAGCCTTG

443

5.4 Zytotoxizitätstest

5.4.1 MTT-Test

In einer 96-Well-Platte wurden 7000 Zellen/well bis zur Konfluenz zunächst in 5 %-FCS-

Medium und danach für 24 h in 0 % oder 1 %-FCS Medium wachsen gelassen. Nach der

Inkubation mit dem Stimulans wurden 10 µl der gelben Tetrazoliumsalz-Lösung (MTT) in

jedes Well gegeben und für 1 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Stoffwechselaktive Zellen

Methoden 35

reduzieren mit ihrer NADH-abhängigen Succinatdehydrogenase der Mitrochondrien den

MTT-Farbstoff zu Formazon. Die violetten Formazonkristalle wurden in 100 µl

2-Propanol/0.04 N HCl gelöst. Die Quantifizierung erfolgte im ELISA-Reader bei einer

Wellenlänge von  = 570 nm.

5.5 Proteinanalysen

5.5.1 Proteinextraktionen

5.5.1.1 Gesamtprotein

In 60 mm Petrischalen oder 6-Loch-Platten wurden 250000 bzw. 200000 Zellen in 5 % FCS-

Medium bis zur Konfluenz kultiviert, 24 h auf 1 % FCS gesetzt und teilweise mit

Antagonisten, Blockern und Agonisten stimuliert. Am Ende wurde das Medium

abgenommen, einmal mit PBS gewaschen und die Zellen mit Lysispuffer (mit Protease-und

Phosphataseinhibitoren) lysiert, mittels eines Zellschabers abgeschabt, in ein Eppendorftube

überführt und für 10 min bei 14000 min-1 zentrifugiert. Der Überstand (Gesamtprotein) wurde

in neues Eppendorftube überführt.

5.5.1.2 Kernprotein

In 100 mm Petrischalen wurden 1 Mio. Zellen in 5 % FCS-Medium bis zur Konfluenz

kultiviert, dann für 24 h auf 1 % FCS-Medium gesetzt und mit unterschiedlichen Agonisten

für 24 h stimuliert. Danach wurde das Medium abgenommen, einmal mit PBS gewaschen,

die Zellen mittels eines Zellschabers abgekratzt, in ein 1.5 ml Eppendorftube überführt und

3 min bei 800 min-1 zentrifugiert. Die Isolation der Kernproteine erfolgte mit dem NE-PER®

Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Kit von Pierce. Für die verschiedenen

Reagenzien im Kit wurde nach folgendem Schema gearbeitet:

Methoden 36

Tabelle 2: Pipettierschema für Kernproteinisolation

Zellen

CER I [µl]

CER II [µl]

NER [µl]

10 µL (20 mg)

100

5.5

20 µL (40 mg)

200

100

50 µL (100 mg)

500

27.5

250

100 µL (200 mg)

1000

500

Der Überstand wurde vorsichtig aus dem Eppendorftube entfernt und das Zellpellet in 200 µl

CER I Lösung, mit Protease Inhibitor Cocktail (25xcomplets) resuspendiert, 15 s am Vortexer

geschüttelt und 10 min auf Eis inkubiert. Danach wurden 11 µl CERII Lösung zugegeben, die

Lösung für 5 s kräftig vorgetext, für 1 min auf Eis inkubiert, wieder für 5 s am Vortexer

geschüttelt und 5 min bei 14000 min-1 zentrifugiert. Der Überstand (zytoplasmatische

Fraktion) wurde in vorgekühlte Eppendorftubes überführt und bei -80 °C gelagert. Das

verbleibende Zellpellet wurde in 50 µl NER-Lösung resuspendiert, für 15 s kräftig am

Vortexer geschüttelt und 10 min auf Eis inkubiert. Dieser Vorgang wurde viermal wiederholt

und dann bei 14000 min-1 für 10 min zentrifugiert. Der Überstand (Kernproteine) wurde in

vorgekühlte Eppendorftubes überführt und bei -80 °C gelagert.

5.5.1.3 Membranproteine

In 100 mm Petrischalen wurden 1 Mio. Zellen in 5 % FCS-Medium bis zur Konfluenz

kultiviert, für 24 h unter Serumarrest in 1 %-FCS-Medium kultiviert und dann stimuliert. Im

nächsten Schritt wurde das Medium abgenommen, die Zellen mit PBS gewaschen, 150 µl

5/O2-Puffer auf die Platten gegeben, mittels einem Zellschaber abgeschabt und in ein 1 ml

Eppendorftube überführt. Die Tubes wurden dann zum Zellaufschluss abwechselnd in

flüssigem Stickstoff eingefroren und bei 37 °C im Heizblock aufgetaut. Dieser Vorgang wurde

dreimal wiederholt, dann 5 min bei 14000 min-1 zentrifugiert, der Überstand (zytosolische

Fraktion) abgenommen und/oder verworfen und das Pellet in ca. 100 µl 5/O2-Puffer mit

(1 % SDS, Protese-und Phosphatase-Inhibitoren) resuspendiert, bei 14000 min-1 für 5 min

zentrifugiert und der Überstand (Membranproteine) in ein neues Eppendorftube überführt.

5.5.2 Proteinbestimmung

Zur Ermittlung der Proteinkonzentration für die nachfolgende Gelelektrophorese wurde eine

Proteinbestimmung nach Lowry mit dem DC Protein Assay Kit durchgeführt. Die

Methoden 37

entstehenden Farbtöne sowie die Farbintensität sind von der Proteinkonzentration abhängig

und lassen sich photometrisch bestimmen.

Der Test wurde in einer 96-Well-Platte durchgeführt. Hierzu wurden als Hintergrundkontrolle

5 µl Lysispuffer, sowie jeweils 5 µl einer Standardreihe aus BSA-Lösung in den

Konzentrationen 0.25; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 µg/ml und 5 μl Probe vorgelegt. In jedes Well wurden

25 µl Reagenz A’, bestehend aus 1 ml Reagenz A und 20 µl Reagenz S, sowie 200 µl

Reagenz B zugegeben. Nach ca. 15 min Schütteln erfolgte die Auswertung im ELISA-

Reader bei einer Wellenlänge von  = 690 nm.

5.5.3 Western Blot Analyse

Die Proteine wurden mit 1x Lämmli-Puffer und 20 mmol/l DTT versetzt und für 5 min bei

95°C gekocht. Der Größenmarker Prestained Protein Marker wurde mitgekocht. Pro Gel

wurden 5 μl Marker eingesetzt.

Die Auftrennung der Proteine erfolgte in 10 %-igen und 1.5 mm breiten SDS-PAGE Gelen.

Die Geltaschen wurden mit einer Proteinmenge von 20-30 μg beladen. Die Proteine liefen

mit 90 V in das 5%-ige Sammelgel, während die Auftrennung der Proteine im 10%-igem

Trenngel bei 150 V erfolgte. Im nächsten Schritt erfolgte der Transfer bei einer Spannung

von 30 V innerhalb von 2 h auf eine Nitrozellulose-Membran. Nach dem Transfer wurden die

Membranen für 1 h in 5 % Milchpulverlösung geblockt, um unspezifische Bindungen

abzusättigen. Im Anschluss wurde über Nacht bei 4 °C mit den Primärantikörpern inkubiert,

dann die Membran mit TBST drei Mal 5 min gewaschen und mit dem Sekundärantikörper in

TBST 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert und abschließend erneut drei Mal mit TBST

10 min gewaschen. Die Entwicklung des Western-Blots erfolgte auf Röntgenfilmen per

Chemilumineszensverfahren (ECL-System).

Tabelle 3: Verwendete Antikörper im Western Blot

Antikörper Spezies Firma

phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) Rabbit mAb Cell Signaling

p44/42 MAPK (Erk1/2) Rabbit mAb Cell Signaling

-Tubulin Sigma-Aldrich

Ets-1 [pT38] Rabbit pAb Invitrogen

Ets-1 Rabbit pAb Santa Cruz

Ets-1 antibody Rabbit pAb Abcam

Tissue Factor Mouse American

Diagnostica

donkey-anti rabbit Sekundärantikörper Dianowa

Methoden 38

5.5.4 Gelretardationsexperiment (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)

Durch die EMSA-Methode können Protein-DNA Interaktionen nachgewiesen werden. Hierzu

wird eine biotynilierte Promotersequenz, die ein spezifisches Kernmotiv für einen

Transkriptionsfaktor aufweist, mit einem Kernproteinextrakt, welches den

Transkriptionsfaktor exprimiert, inkubiert. Die gebildeten Protein-DNA Komplexe werden

anschließend in einem nativen Polyacrylamidgel auf Grund ihrer verminderten Mobilität von

ungebundener DNA abgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und auf einem

Röntgenfilm sichtbar gemacht.

5.5.4.1 In silico Analyse der DNA-Bindesequenz von Ets-1

Die Analyse erfolgte mit dem Softwareprogramm TESS. Im ersten Schritt wurde die gesamte

Promotor-Sequenz in das Programm eingespeist, aus dem dann alle DNA-

Nukleotidsequenzen (Kernmotiv) für Transkriptionsfaktoren angezeigt wurden. Anschließend

wurde die DNA-Nukleotidsequenzen des entsprechenden Transkriptionsfaktors bestimmt.

Diese besteht immer aus vier Nukleotiden. Für die Bindung zwischen Transkriptionsfaktor

und Promotor sind auch die Nachbarsequenzen des Kernmotivs sehr wichtig. Wieviele

Nukleotide dafür gewählt werden, ist subjektiv. Hinweise dafür sind aber in der Literatur

gegeben. In dieser Arbeit wurde eine Sequenz von 24 Nukleotiden gewählt, d.h. die DNA-

Bindesequenz in dieser Arbeit setzt sich zusammen aus: 10 Nukleotide-Kernmotiv-10

Nukleotide.

5.5.4.2 Biotin-Markierung von DNA

Für die Biotynilierung wurde das Biotin 3´End Labeling Kit von Pierce verwendet. Im ersten

Schritt wurden die DNA der verwendeten Sequenzen auf eine Konzentration von 100 pmol/µl

eingestellt und dann 1:100 auf 1 pmol/µl verdünnt. Für die Reaktion wurde folgendes

Pipettierschema verwendet:

Methoden 39

Tabelle 4: Pipettierschema für Biotynilierung

Komponente

Forward [µl]

Reverse [µl]

dd H2O

5xTdT reaction buffer

Oligo [1 µmol/l]

Biotin-11-dUTP [5 µmol/l]

diluted TdT [2 U/µl]

gesamtes Volumen

Die Ansätze wurden bei 37 °C inkubiert und nach 30 min mit 2.5 µl EDTA abgestoppt. In

einem nächsten Schritt wurden 50 µl Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) zugegeben, kurz im

Vortexer geschüttelt, 2 min bei 14000 min-1 zentrifugiert und der Überstand (wässrige Phase)

in ein neues Eppendorftube überführt. Dann fand das „Oligoannealing“ statt. Hierfür wurde

folgendes Pipettierschema verwendet:

Tabelle 5: Pipettierschema für „Oligoannealing“

Komponente

Forward Primer

22.5 µl

Reverse Primer

22.5 µl

dd H2O

2.5 µl

20xSSC

2.5 µl

Nach dem Zusammenpipettieren wurden die Eppendorftubes in den Thermocycler gestellt

und unter folgendem Programm „oligoannealiert“:

90 °C Pause

90 °C 5 min

80 °C 1 min zu Schritt 3 bis 55 °C um jeweils 1 °C abkühlen

25 °C 1 h

4 °C Pause

Tabelle 6: Oligonukleotide für EMSA-Experimente mit fw = forward und rv = reverse

Oligonukleotid

Primer

5’-3’-Primersequenzen

Mutiertes Bindemotiv TF-

Promotor

TGGGCAAAGCATCCGGGAAATGCC

GGCATTTCCCGGATGCTTTGCCCA

Bindemotiv TF-Promotor

TGGGCAAAATGGAATTGAAATGCC

GGCATTTCAATTCCATTTTGCCCA

5.5.4.2 LightShift™Chemiluminescent EMSA Kit (Pierce)

Für die Auftrennung des Protein-DNA Komplexes wurde ein 5 % Polyacrylamidgel (0.75 mm)

nach folgendem Schema gegossen:

Methoden 40

5xTBE-Puffer 1.2 ml

Polyacrylamid 2 ml

dest. H2O 8.8 ml

APS (10 %) 60 µl

TEMED 10 µl

Proben und Biotin-markierte DNA wurden in einem gepufferten Reaktionsansatz (100 mmol/l

Tris, 500 mmol/l KCl, 10 mmol/l DTT) mit 1 µg/µl Poly (dI:dC) und dd. H2O, von 20 µl für

20 min bei RT inkubiert. Im nächsten Schritt wurden die Proben auf das 5 %

Polyacrylamidgel aufgetragen und bei 100 V in 0.5xTBE-Puffer aufgetrennt. Währenddessen

wurde die Nylonmembran in 0.5xTBE-Puffer inkubiert, worauf im nächsten Schritt die

Proteine bei 380 mA für 1 h transferiert wurden. Dem Transfer folgte ein UV-Crosslink, um

die DNA auf der Membran zu fixieren. Danach wurde die Membran für 20 min in Blocking

Puffer inkubiert und dann nochmal 15 min mit Streptavidin-Horseradish-Peroxidase in 20 ml

neuem Blocking Puffer. Nach verschiedenen Wasch- und Äquilibrierungsschritten wurden die

DNA/bzw. DNA-Protein-Komplexe durch Auflegen und Entwickeln eines Röntgenfilmes

sichtbar gemacht.

5.6 Funktionelle Tests

5.6.1 BrdU-ELISA

In eine 96-Well-Platte wurden 7000 Zellen pro Well gegeben und bis zur Konfluenz bei 37 °C

und 5 % CO2 mit 5 % FCS Medium zum Adhärieren kultiviert. Danach wurden die Zellen für

24 h in 1 % FCS-Medium unter gleichen Bedingungen kultiviert. Darauf erfolgte die Zugabe

der Antagonisten bzw. der Stimulantien in verschiedenen Konzentrationen und Zeiten. Nach

der jeweiligen Zeit wurde BrdU (5-Brom-2`-desoxy-uridin) in einer 1:100 Verdünnung/100 µl

in 1 % FCS-Medium auf die Zellen gegeben und 2 h inkubiert. BrdU wird an Stelle von

Thymidin in die DNA eingebaut, und kann mit einem Peroxidase-gekoppelten Antikörper

detektiert werden. Anti-BrdU wird ebenfalls in einer Verdünnung von 1:100 eingesetzt. Die

Quantifizierung von eingebautem BrdU erfolgte durch eine nachgeschaltete Peroxidase-

Farbreaktion im ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von  = 450 nm und einer

Referenzwellenlänge von Ref = 690 nm.

Methoden 41

5.6.2 Konfokale Mikroskopie/Fluoreszensmikroskopie

In einem 8-Well Chamber Slide wurden 8000 Zellen/Well bis zur Konfluenz in

5 % FCS-Medium wachsen gelassen, 24 h in 1 % FCS-Medium kultiviert und für 24 h mit

verschiedenen Agonisten stimuliert. Im nächsten Schritt wurde das Medium abgenommen,

einmal mit PBS gewaschen und mit eiskaltem Methanol für mindestens 24 h fixiert. Danach

wurde in 5 % BSA für 30 min geblockt und der erste Antikörper in einer Verdünnung von

1:200 in 1xTBS/5 % BSA für 1 h inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit 1xTBS wurde der

Zweitantikörper in einer Verdünnung von 1:200 in 1xTBS/5 % BSA für 45 min inkubiert,

wieder dreimal mit 1xTBS gewaschen und mit Aqua-Poly/Mount eingedeckt. Die Lagerung

erfolgte bei 4 °C im Dunkeln. Die nachfolgende konfokale Mikroskopie erfolgte an einem

Biorad MRC 1024 /Nikon DIAPHOT 300 Mikroskop, welches mit einem Argon/Krypton Laser

versehen war.

5.7 Statistik

Die Ergebnisse der Experimente sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM)

dargestellt. Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mittels Mann-Whitney- Test. Ab

einem Wert von p<0,05 wurden die zu vergleichenden Werte als statistisch signifikant

angesehen.

Ergebnisse 42

6 Ergebnisse

6.1 Versuchsübersicht

In Abbildung 7 sind die durchgeführten Experimente in einer Übersicht zusammengefasst.

Abbildung 7: Darstellung des zu untersuchenden Signaltransduktionsweges.

Es wurde mit verschiedenen Rezeptoragonisten und mit Kontroll-IgG stimuliert. Desweiteren

wurde mit Antagonisten (Strukturen siehe Anhang) gearbeitet, die sich aus einer

pharmakologischen Inhibierung zum einen auf die Rezeptoren und zum anderen auf die

ERK1/2-Vorläuferkinasen bezogen. Eine Folge der ERK1/2-Aktivierung ist die

Phosphorylierung von Ets-1. Diese Aktivierung wurde im Hinblick auf die Stimulation mit den

Agonisten und Kontroll-IgG, sowie nach Präinkubation mit Rezeptorantagonisten untersucht.

Desweiteren wurde die Aktivierung und Inhibierung auf die funktionelle Aktivität der

Ergebnisse 43

Agonisten und Antagonisten, resultierend in Proliferation überprüft. Zusätzlich wurde die

Bindung des Transkriptionsfaktors Ets-1 an den Tissue Factor Promotor überprüft.

6.2 Vorversuche

6.2.1 Angiotensin- und Endothelin-Rezeptorexpression

Im ersten Teil der Arbeit wurde die Expression der Rezeptoren von Angiotensin II und

Endothelin-1 in humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC-1) untersucht. Hierfür

wurden die HMEC-1 in 60 mm mit 0.2 % Gelatine beschichteten Petrischalen ausgesät. Am

dritten Tag wurden die RNA isoliert. Die Expression der einzelnen Rezeptoren wurde durch

konventionelle PCR bestimmt. Die Zellen exprimieren sowohl den AT1-, AT2- als auch

ETA- und ETB-Rezeptor.

Auf Proteinebene wurden die AT1R und ETAR untersucht. Hier konnte ebenfalls ein positives

Ergebnis bezüglich der Rezeptoren gefunden werden.

6.2.2 Vitalität der HMEC-1

In einem nächsten Experiment wurde die Vitalität der HMEC-1 nach Stimulation mit Ang II,

ET-1 und Patienten-IgG in Abhängigkeit der Konzentration untersucht. Hierzu wurden die

Zellen in 96-Well-Platten ausgesät und am dritten Tag mit den Stimulantien

konzentrationsabhängig für 24 h versetzt. In Abbildung 8 sind die Konzentrationsreihen für

Ang II, ET-1 und P-IgG dargestellt.

Die Untersuchung ergab, dass sowohl Angiotensin II und Endothelin-1 als auch Patienten-

IgG in dem verwendeten Konzentrationsprofil keinen Einfluss auf die Vitalität der Zellen hat.

Ergebnisse 44

Abbildung 8: Zellvitalität Stimulation mit Angiotensin II, Endothelin-1 und Patienten-

IgG in HMEC-1. Dargestellt ist der Einfluß von Ang II, ET-1 und P-IgG in einer

Konzentrationsreihe auf das Überleben der HMEC-1. Es ist kein Einfluss der Stimulantien

erkennbar.

Ergebnisse 45

6.3 ERK1/2-Signaltransduktionsweg

6.3.1 Untersuchung von Mitogen- aktiviertem Proteinkinase Signalwegen (MAPK)

Als MAP-Kinasen wird eine Familie von Serin/Threonin-Proteinkinasen bezeichnet, die an

der Regulation von intrazellulären Signalwegen beteiligt sind.

Der ERK1/2-Signalweg wird, wie die MAPK-Signalwege, in eine Dreikomponenten Kaskade

unterteilt. Der initiierende Schritt für die Aktivierung der Signaltransduktionskaskade ist die

Ligandenbindung an den jeweiligen Rezeptor, gefolgt von Rezeptoraktivierung und Bindung

von weiteren Proteinen. Mit diesem Schritt wird Raf-1, eine Vorläuferkinase, aktiviert und

phosphoryliert und aktiviert wiederum eine bilokal wirkende Proteinkinase (MEK1/2), welche

in einem dritten Schritt ERK1/2 phosphoryliert und aktiviert wird.

ERK1/2 sind Serin/Threonin-Kinasen, die Signale durch Phosphorylierung von Proteinen an

ihren Serin- oder Threoninresten, im Zellkern oder im Zytoplasma weiterleiten. Zu diesen

Proteinen (Substraten) zählen unter anderem Transkriptionsfaktoren.71

Ein entscheidender Transkriptionsfaktor hinsichtlich der Bildung neuer Gefäße bzw. der

Proliferation ist Ets-1, ein Mitglied der ETS-Transkriptionsfaktorenfamilie

(E26 Erythroblastomavirus transformationsspezifisch). ETS-Faktoren können mit ihrer Ets-

Domäne an eine hoch konservative Purin-reiche 5´-GGAA-3´-DNA-Bindungsstelle binden.

Desweiteren besitzt das Ets-1 Protein zwei -helikale inhibitorische Domainen. Die

inhibitorische Aktivität kann durch Phosphorylierung oder Protein/Protein-Wechselwirkungen

aufgehoben werden. Zwei weitere Domainen beinhalten die Transaktivierungsdomaine und

die sogenannte „Pointed Domain“ (PNT), in der sich eine MAP-Kinase Phosphoakzeptorseite

(T38) befindet. Die Phosphorylierung an Threonin 38 (Phosphorakzeptorseite) durch ERK2

erhöht die transkriptionelle Aktivität von Ets-1. 72

6.3.2 Dosis- und Zeitverläufe

In initialen Dosis-und Zeitexperimenten wurde die Aktivität der natürlichen Liganden auf den

ERK1/2-Signalweg untersucht. In Abbildung 9 sind die Dosis-und Zeitverläufe dargestellt.

Für die stärkste Phosphorylierung von ERK1/2 wurde für Angiotensin II eine

Stimulationsdauer von 10 min bei einer Konzentration von 1 µmol/l und für Endothelin-1 eine

Stimulationsdauer von 10 min bei einer Konzentration von 100 nmol/l ermittelt.

Ergebnisse 46

Abbildung 9: Dosis-und Zeitverlauf von Ang II (A) , ET-1 (B) auf ERK1/2

Phosphorylierung. Die Konzentrationen von Ang II sind 1 µmol/l und 100 nmol/l, 10 nmol/l,

von Endothelin-1 100 nmol/l, 10 nmol/l und 1 pmol/l. Die Zeitreihe zu den Zeitpunkten

0, 5, 10, 30 und 60 min wurden mit einer Konzentration von 1 µmol/l für Ang II und 100

nmol/l für ET-1 generiert. Die höchsten Phosphorylierungsgrade sind sowohl für ET-1 und

Ang II nach 10 min bei einer Ang II Konzentration von 1 mmol/l und einer Endothelin-1

Konzentration von 100 nmol/l.

Um den Einfluss auf die Phosphorylierung von ERK1/2 bezüglich der Dosis und Zeit für

isoliertes Patienten-IgG zu ermitteln, wurde die Zeitreihe an die natürlichen Liganden

angepasst. In Abbildung 10 ist erkennbar, dass auch Patienten-IgG nach einer Zeit von 10

min ERK1/2 am stärksten phosphoryliert. Die Dosisreihe wurde mit Konzentrationen von 0.1-

2.5 mg/ml durchgeführt. Das Maximum für die stärkste Aktivierung liegt bei 1.0 bzw. 2.5

mg/ml.

Ergebnisse 47

Abbildung 10: Dosis-und Zeitverlauf von Patienten-IgG (P-IgG) auf ERK1/2

Phosphorylierung. Die gewählten Konzentrationen sind von 0.1-2.5 mg/ml P-IgG. Die

Zeitreihe zu den Zeitpunkten 0, 10, 15, 30 und 60 min wurden mit einer Konzentration von

2.5 mg/ml generiert. Höchste Phosphorylierungsgrade sind bei einer Konzentration von

2.5 mg/ml nach 10 min erkennbar.

Sowohl mit den natürlichen Liganden, als auch mit Patienten-IgG wurden Zeit- und

Dosisreihen mit den Rezeptorblockern (Valsartan = AT1R-Blocker, PD 123,319 = AT2R-

Blocker, Bosentan = ETA/ETBR-Blocker, Sitaxsentan = ETAR-Blocker, BQ788 = ETBR-

Blocker) durchgeführt. Die effektivste und stärkste Blockade konnte mit allen Blockern bei

einer Konzentration von 10 µmol/l bei einer Präinkubationsdauer von 2 h gezeigt werden.

6.3.3 Einfluss der natürlichen Liganden (Ang II, ET-1) und Patienten-IgG auf ERK1/2-

Phosphorylierung

Im finalen Experiment wurden die Einflüsse der natürlichen Liganden und des Patienten-

IgG’s, bzw. die Blockade der Rezeptoren, auf den ERK1/2 Signalweg überprüft. Hierfür

wurden HMEC-1 in 60 mm mit Gelatine beschichteten Petrischalen ausgesät und am dritten

Tag stimuliert bzw. 2 h präinkubiert mit den spezifischen Rezeptorblockern.

In Abbildung 11 ist erkennbar, dass die Aktivierung von ERK1/2 nach Stimulation mit

Patienten-IgG steigt um den Faktor 2 bei Stimulation mit Angiotensin II und mit Patienten-IgG

an. Durch Präinkubation mit dem spezifischen AT1R-Blocker Valsartan (V) kann die

Phosphorylierung um mehr als die Hälfte reduziert werden. Der AT2R-Blocker PD 123,319

(PD) hat keinen inhibierenden Einfluss auf die Aktivierung von ERK1/2. Es zeigt sich mit PD

ein leichter aktivierender Einfluss auf die Phosphorylierung von ERK1/2.

Ergebnisse 48

Abbildung 11: Induzierte ERK1/2 -Phosphorylierung durch Angiotensin II (Ang II) und

Patienten-IgG. Konfluente HMEC-1 wurden stimuliert mit Ang II (1 µmol/l), Kontroll-IgG

(2.5 mg/ml) und Patient-IgG (2.5 mg/ml) für 10 min, bzw. präinkubiert mit AT1R-Blocker

(V = Valsartan) (10 µmol/l) und AT2R-Blocker (PD = PD 123,319) (10 µmol/l) für 2 h. Es ist

eine deutliche Aktivierung von ERK1/2 mit P-IgG und Ang II erkennbar, die partiell inhibierbar

ist mit einem spezifischen AT1R-Blocker.

In Abbildung 12 ist die Aktivierung von ERK1/2 über die Endothelin-Rezeptoren dargestellt.

Es ist eine deutliche Aktivierung von ERK1/2 mit Patienten-IgG und ET-1 erkennbar.Diese

Phosphorylierung ist um die Hälfte reduzierbar bei Präinkubation mit dem ETAR-

Antagonisten Sitaxsentan aber auch mit dem ETAR/ETBR-Antagonisten Bosentan. Der ETBR-

Blocker BQ788 hat keinen reduzierenden Effekt auf die ERK1/2 Phosphorylierung.

Ergebnisse 49

Abbildung 12: Induzierte ERK1/2 -Phosphorylierung durch Endothelin-1 (ET-1) und

Patienten-IgG. Konfluente HMEC-1 wurden stimuliert mit ET-1 (100 nmol/l), Kontroll-IgG

(2.5 mg/ml) und Patienten-IgG (2.5 mg/ml) für 10 min, bzw. präinkubiert mit ETAR/ETBR-

Blocker (Bos = Bosentan) (10 µmol/l), ETAR-Blocker (Sitax = Sitaxsentan) (10 µmol/l) und

ETBR-Blocker (BQ788) (10 µmol/l) für 2 h. Es ist eine deutliche Aktivierung von ERK1/2 mit

P-IgG und ET-1 erkennbar, die partiell inhibierbar ist mit einem spezifischen ETAR-Blocker

(Sitaxsentan), bzw. ETAR/ETBR-Blocker (Bosentan).

6.3.4 Einfluss eines MEK1/2-Inhibitors auf die AT1-und ETAR-induzierte ERK1/2-

Phosphorylierung

MEK1/2 sind die Vorläuferkinasen für die Aktivierung von ERK1/2. Um MEK1/2 zu inhibieren,

wurde in dieser Arbeit PD184,352 verwendet. In den meisten veröffentlichten Studien über

pharmakologische Inhibierung von MEK1/2 wird von PD98059, als potenter Blocker,

berichtet. In dieser Arbeit lag in Vorversuchen die Inhibierung von ERK1/2 mit PD98059 bei

ca. 20 %. PD184,352, ein neuer MEK1/2-Inhibitor wurde in dieser Arbeit verwendet. In

Vorversuchen auf Zeit und Dosis zeigte sich, dass die beste Inhibierung mit 500 nmol/l bei

einer Präinkubationszeit von 1 h erzielt werden kann.

Ergebnisse 50

In Abbildung 13 ist das finale Experiment dargestellt. Es ist erkennbar, dass die observierte

Aktivierung durch Patienten-IgG mit PD184352 zu fast 100 % inhibierbar ist. Die gleiche

Inhibierung ist auch für die natürlichen Liganden Ang II und ET-1 ersichtlich.

Abbildung 13: Inhibierung der ERK1/2-induzierten Phosphorylierung durch MEK1/2-

Inhibitor PD184,352. Präinkubation von PD184,352 [500 nmol/l] für 1 h mit anschließender

Stimulation von Ang II [1 µmol/l], ET-1 [100 nmol/l], Patienten-IgG [2.5 mg/ml] für 10 min. Es

ist eine signifikante Reduktion von phospho-ERK1/2 nach Präinkubation mit PD184,352

erkennbar. (*p<0.05)

6.4 Untersuchung des Transkriptionsfaktors Ets-1 und Tissue Factor

6.4.1 Tissue Factor

Tissue Factor (Gewebe-Thromboplastin), ein transmembranes Glycoprotein, bestehend aus

263 Aminosäuren, fungiert als Oberflächenrezeptor und Kofaktor für den

Blutgerinnungsfaktor VII und den im Blut bereits aktiviert vorliegenden Faktor VIIa. Es initiiert

die extrinsiche Blutkoagulationskaskade.73 Aber auch in anderen Zellen des Gefäßsystems

(z.B. Endothelzellen) kann Tissue Factor durch Stimulation mit Entzündungsmediatoren

induziert werden.74

Ergebnisse 51

6.4.2 Genexpressionsanalyse

Voraussetzung für die Untersuchung von Tissue Factor (TF) und des Transkriptionsfaktors

Ets-1 war die Expression in HMEC-1. Hierzu wurde auf mRNA Ebene die Genexpression

überprüft. Es zeigte sich eine deutliche Expression von beiden Genen bei Überprüfung

mittels konventioneller PCR.

6.4.3 Lokalisation von Ets-1 und phosphoryliertem Ets-1

Um die Lokalisation von Ets-1 bzw. seiner aktivierten Form [pT38] Ets-1 zu überprüfen,

wurden die Zellen Fluoreszenz gefärbt und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Hierfür

wurden die HMEC-1 für 24 h mit Angiotensin II bzw. Patienten-IgG stimuliert und auf Ets-1,

bzw. Ets-1 [pT38] gefärbt.

Wie in Abbildung 14 und 15 erkennbar ist, ist Ets-1 und Ets-1 [pT38] basal (A) im Kern

lokalisiert. Durch die Stimulantien Ang II (B) und Patient-IgG (C) verteilt sich die Detektion

diffus auf das Zytoplasma bzw. im Kern. Am stärksten ist dieser Effekt in Abbildung 14 (C)

visualisiert.

In Abbildung 15 (C) ist eine schwächere Expression im Kern von Ets-1 [pT38] erkennbar.

Ergebnisse 52

Abbildung 14: Nachweis von Ets-1 mittels konfokaler Mikroskopie. Dargestellt sind

mikroskopische Aufnahmen mit Kontrolle (A), Stimulation mit Angiotensin II (B) [1 µmol/l],

Patienten-IgG (C) [2.5 mg/ml] für 24 h. Es ist eine Veränderung der Lokalisation von Ets-1

nach Stimulation mit P-IgG im Vergleich zur Kontrolle erkennbar. Die Lokalisation ist diffus in

der Zelle verteilt.

Ergebnisse 53

Abbildung 15: Nachweis von P-Ets-1 mittels konfokaler Mikroskopie. Dargestellt sind

mikroskopische Aufnahmen mit Kontrolle (A), Stimulation mit Angiotensin II (B) [1 µmol/l],

Patienten-IgG (C) [2.5 mg/ml] für 24 h. Es ist eine Abnahme der Ets-1 Expression im Kern

nach Stimulation mit P-IgG erkennbar.

Ergebnisse 54

6.4.4 Einfluss der natürlichen Liganden (Ang II und ET-1) und Patienten-IgG auf die

Phosphorylierung von Ets-1

Als Folge der Aktivierung von ERK1/2 wurde die Phosphorylierung von Ets-1 mittels Western

Blot observiert. Hierfür wurden die Zellen nach dem gleichen Muster wie für die P-Erk1/2

Experimente durchgeführt. Stimuliert wurden die HMEC-1 am dritten Tag mit den natürlichen

Liganden Ang II und ET-1 bzw. mit Kontroll-IgG und Patienten-IgG. Wie in Abbildung 16 und

17 erkennbar, wurde selektiv mit dem AT1R-Blocker Valsartan (V), mit dem AT2R-Blocker

PD 123,319 (PD), dem ETAR/ETBR-Blocker Bosentan (Bos), dem ETAR-Blocker Sitaxsentan

(Sitax) und dem ETBR-Blocker BQ788 (BQ) gearbeitet. In beiden Abbildungen ist der

aktivierende Effekt von Patienten-IgG auf Ets-1 erkennbar. Sowohl Kontroll-IgG als auch

Angiotensin II haben keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von Ets-1, wohingegen der

natürliche Ligand Endothelin-1, wie in Abbildung 17 erkennbar, die Phosphorylierung deutlich

erhöht.

Abbildung 16: Phosphorylierung von Ets-1 an Threonin 38 über Angiotensin II Typ

1 Rezeptor in HMEC-1. Stimulation mit Angiotensin II (1 µmol/l), Kontroll-IgG (2.5 mg/ml)

und Patienten-IgG (2.5 mg/ml) für 10 min, bzw. Präinkubation mit selektiven

AT1R-Blocker (V = Valsartan) und AT2R-Blocker (PD = PD123,319) in einer

Konzentration von 10 µmol/l. Es ist eine deutliche Phosphorylierung von Ets-1 durch P-

IgG erkennbar, die eindeutig durch den AT1R-Blocker (Valsartan) inhibiert ist.

Ergebnisse 55

Die Inhibierungseffekte der Blocker für AT1R, ETAR und ETAR/ETBR sind in beiden

Abbildungen erkennbar. Bosentan inhibiert die Phosphorylierung um die Hälfte im Vergleich

zu Patienten-IgG. BQ788, als ETBR-Blocker ist im Vergleich kein bedeutender Effekt

zuzuschreiben. Das Gleiche gilt auch für PD123,319, als AT2R-Blocker.

Abbildung 17: Phosphorylierung von Ets-1 an Threonin 38 über Endothelin-1 Typ A

Rezeptor in HMEC-1. Stimulation mit Endothelin-1 (100 nmol/l), Kontroll-IgG (2.5 mg/ml)

und Patienten-IgG (2.5 mg/ml) für 10 min , bzw. Präinkubation mit selektiven ETAR-Blocker

(Sitax = Sitaxsentan), ETBR-Blocker (BQ = BQ788) und ETA/ETBR-Blocker

(Bos = Bosentan) in einer Konzentration von 10 µmol/l. Es ist eine deutliche

Phosphorylierung von Ets-1 durch P-IgG erkennbar, die eindeutig durch den ETAR-Blocker

(Sitaxsentan), bzw. durch den ETAR/ETBR-Blocker (Bosentan) inhibiert ist.

Ergebnisse 56

6.4.5 Nachweis von Tissue Factor in Proteinextrakten

Um die Proteinexpression von Tissue Factor zu untersuchen, wurden membran-und

zytosolische Proteinlysate generiert. Dafür wurden die Zellen für 24 h mit Angiotensin II,

Endothelin-1, Kontroll-IgG und Patienten-IgG stimuliert. Tissue Factor setzt sich zusammen

aus einer extrazellulären Domäne von 219 Aminosäuren Länge, eine einfach

transmembranäre Domäne mit einer Länge von 23 Aminosäuren sowie eine

zytoplasmatische Domäne mit 21 Aminosäuren Länge.75

In Abbildung 18 sind die Auswirkungen der Stimulationen auf Membranproteinextrakte

dargestellt. Es ist keine Regulation erkennbar. Die Expression von Tissue Factor geht nicht

über Basalniveua (ohne) hinaus.

Abbildung 18: Expression von Tissue Factor in Membranproteinextrakten aus HMEC-

1. Stimulation der HMEC-1 mit ET-1 (100 nmol/l), Ang II (1 µmol/l), Kontroll-IgG (2.5 mg/ml)

und Patienten-IgG (2.5 mg/ml) für 24 h. Es ist keine Regulation der Tissue Factor Epression

erkennbar.

Ergebnisse 57

Im nächsten Schritt wurde die Expression in zytosolische Proteinextrakten untersucht. In

Abbildung 19 ist erkennbar, dass die Expression von TF nach Stimulation mit Patienten-IgG

im Vergleich zu allen Stimulantien und zur Kontrolle (ohne) signifikant erhöht ist. Die

natürlichen Liganden Endothelin-1 und Angiotensin II haben keinen Einfluss auf die

Expression von TF im Zytosol.

Abbildung 19: Expression von Tissue Factor in zytosolischer Fraktion aus HMEC-1.

Stimulation der HMEC-1 mit ET-1 (100 nmol/l), Ang II (1 µmol/l), Kontroll-IgG (2.5 mg/ml) und

Patient-IgG (2.5 mg/ml) für 24 h. Es ist ein signifikanter Anstieg von Tissue Factor nach

Stimulation mit Patienten-IgG im Bezug auf Ang II, ET-1 und Kontroll-IgG erkennbar.

(*p<0.05)

6.4.6 Aktivierung des TF-Promotors durch Ets-1 Expression

In diesem Experiment wurde die transkriptionelle Aktivität von Ets-1 zum Tissue Factor

Promotor untersucht. Hierzu wurden HMEC-1 mit unterschiedlichen Stimulantien versetzt,

Kernextrakte generiert und mittels Gel-Retardierungsexperimenten (EMSA) die

transkriptionelle Aktivierung von TF durch Ets-1 untersucht. Es zeigte sich ein sehr

einheitliches Muster. Wie in Abbildung 20 erkennbar, ist ein deutlicher Shift von Bande A-E

vorhanden, die in Bande E (Stimulation mit P-IgG) am stärksten ist. In den Banden G-H ist

Ergebnisse 58

der Shift nicht vorhanden, denn hier wurde eine mutierte Sequenz von Tissue Factor, auf das

Kernmotiv von Ets-1 bezogen, eingesetzt. In Bande F wurde zusätzlich zum Kernextrakt,

inkubiert mit der TF-Promotorsequenz, noch der Ets-1 Antikörper zugesetzt.

Abbildung 20: Transkriptionelle Aktivität von Ets-1. Dargestellt sind Kernextrakt-TF-

Promotor-Bindungen aus HMEC-1, die durch Stimulation mit (A = ohne, B = ET-1, C = Ang II,

D = Kontroll-IgG, E = Patienten-IgG, F = Patienten-IgG+Ab., G = ohne (mutierte TF),

H = ET-1 (mutierte TF), I = Patienten-IgG (mutierte TF) gewonnen wurden. Erkennbar ist

eine starker Shift in E nach Stimulation mit P-IgG. Die Banden G-H weisen keinen TF-Shift

auf, denn hier wurde eine mutierte Kernnukleotidsequenz des TF-Promotors verwendet.

6.5 Proliferationsexperimente mittels BrdU-Einbau

Als Folge der ERK1/2-Aktivierung wurde, als funktioneller Parameter, die Proliferation der

HMEC-1 in Bezug auf verschiedene Aspekte untersucht.

In Abbildung 21 und 22 wurde die Proliferation auf Angiotensin II-und Endothelin-1-

Rezeptoren untersucht. Es ist erkennbar, dass Angiotensin II keinen Effekt auf die

Proliferation ausübt. Durch Stimulation mit Patienten-IgG wird die Teilungsrate der Zellen um

den Faktor 1.5 in Bezug auf die Kontrolle erhöht. Die verursachte Proliferationssteigerung

durch Patienten-IgG ist durch den AT1R-Blocker Valsartan inhibierbar. Auch der AT2R-

Blocker PD 123,319 übt in diesem Experiment einen reduzierenden Einfluss aus, der aber

deutlich schwächer ist, als der reuzierende Effekt von Valsartan.

TF-Shift

Ergebnisse 59

Abbildung 21: Blockade der Proliferation durch Inhibierung des AT1-Rezeptors.

Behandlung mit den Stimulantien Ang II [1 µmol/l] Kontroll-IgG und Patienten-IgG

[2.5 mg/ml] für 24 h, mit und ohne Präinkubation (2 h) von AT1R-Blocker (Valsartan)

[10 µmol/l] und AT2R-Blocker (PD 123,319) [10 µmol/l]. Erkennbar ist ein Anstieg der

Proliferation nach Stimulation mit P-IgG um den Faktor 1.5 bezogen auf die unstimulierte

Kontrolle (ohne), sowie eine Inhibierung der nach Präinkubation mit dem AT1R-Blocker um

den Faktor 1.7 bezogen auf P-IgG. (*p<0.05; **p<0.001)

In Abbildung 22 wurde ist Proliferation in Bezug auf die Endothelin-Rezeptoren dargestellt.

Endothelin-1 und Kontroll-IgG erhöhen in geringem Masse die Proliferation. Patienten-IgG

erhöht die Teilungsrate um den Faktor 1.5. Sowohl der ETAR/ETBR-Blocker Bosentan und

der ETAR-Antagonist Sitaxsentan reduzieren die ausgelöste Patienten-IgG Proliferation um

mehr als die Hälfte. Der selektive ETBR-Blocker BQ788 übt ebenfalls einen deutlich

reduzierenden Effekt auf die durch Patienten-IgG ausgelöste Proliferation aus.

Ergebnisse 60

Abbildung 22: Blockade der Proliferation durch Inhibierung der ET-Rezeptoren.

Behandlung mit den Stimulantien ET-1 und Patienten-IgG in den Konzentrationen von

100 nmol/l und 2.5 mg/ml für 24 h, mit und ohne Präinkubation (2 h) mit ETAR-Blocker

(Sitaxsentan) [10 µmol/l], ETBR-Blocker (BQ788) [10 µmol/l] und ETAR/ETBR-Blocker

(Bosentan) [10 µmol/l]. Es ist nach Stimulation mit P-IgG eine Zunahme der Proliferation um

den Faktor 1.5 in Bezug zur Kontrolle (ohne) ersichtlich, mit nachfolgender signifikanter

Inhibierung mit den Rezepotrblockern um den Faktor 3 in Bezug zu P-IgG.

(*p<0.05; **p<0.001)

In den nächsten beiden Abbildungen sind die Auswirkungen auf die Inhibierungen von Raf-1

und MEK1/2, als Vorläuferkinasen des ERK1/2-Signalweges, auf die Zellteilung dargestellt.

In Abbildung 23 wird Raf-1 selektiv blockiert durch GW5074 in einer Konzentrationsreihe. Die

Effekte von GW5074 wurden in Bezug auf den natürlichen Liganden Angiotensin II und

Patienten-IgG getestet.

Die durch Stimulation mit Angiotensin II ausgelöste Proliferation lässt sich durch

Präinkubation mit GW5074 auf Basalniveau blocken. Die verwendete Konzentration von

GW5074 ist für diese Reduktion 1 mmol/l. Nach Präinkubation mit der Konzentration

500 nmol/l zeigte sich ebenfalls eine Inhibierung der Proliferation. Allerdings konnte bei einer

Konzentration von 100 nmol/l ein leicht aktivierender Effekt festgestellt werden.

Durch Stimulation mit Patienten-IgG konnte wie in den vorherigen Experimenten eine

Zunahme der Proliferation festgestellt werden, die durch Präinkubation mittels eines

Konzentrationsgefälles von 100 nmol/l über 500 nmol/l zu 1 µmol/l von GW5074 in einer

Abnahme der Proliferation resultiert.

Ergebnisse 61

Abbildung 23: Blockade der Proliferation durch Inhibierung von Raf-1. Dargestellt sind

die Proliferationsdaten mit/ohne Blockade der Raf-1 Kinase mittels GW5074 in Bezug auf

Stimulation mit Ang II (1 mmol/l) und P-IgG (2.5 mg/ml). Die Reduktion der Proliferation mit

GW5074 ist statistisch signifikant, wobei die höchste Reduktion bei einer Konzentration von

GW5074 bei 1 µmol/l erkennbar ist. (*p<0.001, **p<0.05)

In den nächsten Abbildungen sind die Experimente mit dem selektiven MEK1/2-Inhibitors

PD184,352 dargestellt. Hierfür wurden die HMEC-1 mit verschiedenen Konzentrationen von

PD184,352 versetzt und danach mit Angiotensin II bzw. mit Patienten-IgG stimuliert. In

Abbildung 24 ist erkennbar, dass durch Stimulation mit Patienten-IgG die Zellteilung im

Vergleich zur Kontrolle erhöht wird. Die durch Patienten-IgG erhöhte Proliferation kann bei

Ergebnisse 62

einer PD184,352-Konzentration von 500 nmol/l am stärksten um ca. 80 % reduziert werden.

Aber auch mit den höheren MEK1/2-Inhibitorkonzentrationen ist eine Reduktion der

Proliferation erkennbar.

Angiotensin II übt in diesem Experiment keinen Einfluß auf die Proliferation aus. In diesem

Graph ist aber ein inhibitorischer Effekt von PD184,352 auf die Kontrolle (ohne) visualisiert.

Abbildung 24: Blockade der Proliferation durch Inhibierung von MEK1/2 in HMEC-1.

Dargestellt sind die Proliferationsdaten mit/ohne Blockade der MEK1/2 Kinase mittels

PD184,352 in Bezug auf Stimulation mit Ang II (1 mmol/l) und P-IgG (2.5 mg/ml). Die

Reduktion der Proliferation mit PD184352 ist statistisch signifikant, wobei die höchste

Reduktion bei einer Konzentration von PD184352 bei 500 nmol/l erkennbar ist.

(*p<0.05; **p<0.001)

Diskussion 62

7 Diskussion

Die systemische Sklerose ist eine Multiorgankrankheit mit autoimmunen Einflüssen. Da ein

möglicher Zusammenhang zwischen immunologischen und vaskulären Veränderungen noch

weitgehend ungeklärt ist, sollte in dieser Arbeit eine Verbindung zwischen

Gefäßschädigungsmechanismen und Immunglobulinen von Patienten mit systemischer

Sklerose überprüft werden. Hierzu wurde der ERK1/2/Ets-1-Signaltransduktionsweg in einer

humanen mikrovaskulären Endothelzelllinie der Haut (HMEC-1) untersucht. Die Ergebnisse

nach Stimulation mit Patienten-IgG, Kontroll-IgG bzw. den natürlichen Liganden Angiotensin

II und Endothelin-1 zeigten eindeutige aktivierende Effekte in Bezug auf ERK1/2, Ets-1 und

eine Zunahme der Zellproliferation. Diese Effekte konnten durch spezifische AT1-und

ETA-Rezeptorantagonisten inhibiert werden. Blockade der Kinasen Raf-1 und MEK1/2

oberhalb von ERK1/2 bewirkte ebenfalls eine Inhibition des Signalweges gefolgt von

verminderter Proliferation der Endothelzellen.

Zur Klärung möglicher relevanter Pathomechanismen der Gefäßschädigung wurde in

weiteren Untersuchungen die Regulation und Expression des proinflammatorischen und

prokoagulatorischen Proteins Tissue Factor untersucht. Isoliertes Patienten-IgG führte zu

einer gesteigerten Expression von Tissue Factor im Zytosol der Endothelzellen. Außerdem

konnte als eine mögliche Verbindung zum ERK1/2-Signalweg eine Bindung der

Kernnukleotidsequenz von Ets-1 an den Tissue Factor Promotor nachgewiesen werden.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten zeigen, dass die durch SSc-IgG

ausgelösten Effekte rezeptorabhängig sind und über den AT1R und den ETAR vermittelt

werden. Sie erklären damit einen möglichen pathogenetischen Zusammenhang zwischen

immunologischen Mechanismen und gefäßschädigenden Prozessen. Durch die Aufdeckung

dieses Pathomechanismus eröffnen sich zudem neue spezifische Therapiemöglichkeiten für

Patienten mit systemischer Sklerose.

In einer initialen Versuchsreihe wurde der Phosphorylierungsstatus von ERK1/2 nach

Stimulation mit den natürlichen Liganden (Ang II, ET-1) oder Patienten-IgG untersucht. Der

stärkste Aktivierungsgrad trat bei allen eingesetzten Substanzen 10 min nach der Stimulation

auf. Diese Kinetik entspricht Beobachtungen von anderen Untersuchern an glatten

Muskelzellen. Dabei wurde eine maximale Aktivierung von ERK1/2 durch Ang II nach

10±5 min bei einer eingesetzen Konzentration von 100 nmol/l beschrieben.76, 77 Zur

Stimulation von Endothelzellen und anderen Zelllinien wurden häufig höhere Ang II-

Konzentrationen im Bereich 1 µmol/l eingesetzt.77, 78 Chen et al. fanden in einer aktuellen

Diskussion 63

Studie zum Zeitverlauf der ERK1/2-Aktivierung nach ET-1 Stimulation in humanen glatten

Muskelzellen eine vergleichbare Kinetik wie in der vorliegenden Arbeit.79

Die höchste Aktivität der ERK1/2-Kinase konnte mit einer IgG-Konzentration zwischen

2.0 und 2.5 mg/ml erzielt werden. Erstmalig wurde in dieser Arbeit mit IgG-Dosen und nicht

mit IgG-Verdünnungen gearbeitet, denn die IgG-Konzentrationen zeigten nach Isolation

Variationen zwischen 4 und 9 mg/ml. Ähnliche Ergebnisse konnten Dechend et al. mit

aufgereinigtem IgG aus dem Serum von Patientinnen mit Präeklampsie auf die ERK1/2

Phosphorylierung in Endothelzellen und glatten Gefäßmuskelzellen finden. Vorarbeiten aus

unserer Arbeitsgruppe konnten ebenfalls mit isoliertem IgG von Patienten mit refraktärer

vaskulärer Nierentransplantatrejektion eine ERK1/2-Aktivierung in glatten Gefäßmuskelzellen

nachweisen.67, 80 Allerdings wurde in diesen Arbeiten mit einheitlichen IgG-Verdünnungen

gearbeitet.

In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals eine Aktivierung des ERK1/2-Signalweges durch

IgG von Patienten mit systemischer Sklerose in humanen Endothelzellen nachgewiesen

werden. Mittels eines ELISA-Tests konnten in den isolierten IgG-Fraktionen hohe Titer von

aktivierenden Autoantikörpern gegen den AT1R und ETAR nachgewiesen werden. Sowohl

Dragun et al. als auch Dechend et al. konnten mit Hilfe eines Bioassays hohe

Autoantikörpertiter aus isolierten IgG-Fraktionen von Patienten mit Präeklampsie und

refraktärer vaskulärer Nierentransplantatrejektion gegen den AT1R feststellen. 67, 80

In den finalen Experimenten konnte eine Aktivierung durch das IgG von Patienten mit

systemischer Sklerose mittels dem AT1R-Blocker Valsartan eindeutig reduziert werden.

Dagegen beinflusste die Präinkubation mit dem AT2R-Blocker PD123,319 die

Phosphorylierung von ERK1/2 nicht, sondern führte stattdessen sogar zu einer gesteigerten

Phosphorylierung. Ähnliche Ergebnisse konnten auch andere Arbeitsgruppen finden. In

humanen Hautfibroblasten beobachteten Liu et al., dass eine Aktivierung des AT2-Rezeptors

zu einer Antagonisierung der über die AT1R-vermittelten Aktivierungskaskade von PI3/Akt

führt. Stimulation der Fibroblasten mit PD123,319 führte zu einer deutlichen Zunahme der

Akt Phosphorylierung.81 In mit dem AT2R transfizierten, adulten, vaskulären glatten

Gefäßmuskelzellen aus der Ratte konnten die Funktionen des AT1R eindeutig durch

Überexpression des AT2Rezeptors reduziert werden.44 Die gefundenen Effekte könnten in

dieser Arbeit und auch durch andere Studien auf einen „Crosstalk“ zwischen dem AT1R und

AT2R hindeuten.

Auch Dragun et al. und Dechend et al. konnten durch anschließende spezifische

Rezeptorblockade des AT1R, die durch Patienten-IgG ausgelöste Aktivierung von ERK1/2

inhibieren. Der AT2R-Blocker zeigte in diesem Modell ebenfalls keine inhibierenden Effekte

auf die Phosphorylierung von ERK1/2.67, 80

Diskussion 64

Erstmalig konnte in Vorstudien unserer Arbeitsgruppe an Material von Patienten mit

systemischer Sklerose, hohe Titer von aktivierenden Autoantikörpern gegen den ETAR

mittels ELISA-Test nachgewiesen werden. Die Inhibierung der ERK1/2-Aktivierung durch

Einsatz des spezifischen ETAR-Blockers Sitaxsentan deutet darauf hin, dass die

beobachteten Effekte zumindest teilweise über den ETAR vermittelt werden. Der

ETBR-Blocker BQ788 zeigte dagegen keine Auswirkung auf den Phosphorylierungsgrad.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen erstmalig eine mögliche Beteiligung des ETAR an der

ERK1/2-Aktivierung in Endothelzellen. Der Nachweis von aktivierenden Autoantikörpern

gegen den AT1R und den ETAR im Serum von Patienten mit systemischer Sklerose deutet

auf eine Beteiligung beider Rezeptoren bei der ERK1/2-Aktivierung hin.

In weiteren Experimenten dieser Arbeit wurde die pharmakologische Inhibierung des

ERK1/2-Signalweges mittels eines Blockers der Vorläuferkinase MEK1/2 untersucht. Es ist

bekannt, dass diese Proteinkinase für die Aktivierung des Signalweges oberhalb von ERK1/2

verantwortlich ist. Servant et al. zeigten, dass durch Blockade von MEK1/2 in glatten

Gefäßmuskelzellen die Phosphorylierung von ERK1/2 verhindert werden kann. 82 83 In der

vorliegenden Arbeit zeigte sich eine ERK1/2-Inaktivierung von ca. 80-90 % durch

Präinkubation von PD184352 bei einer Konzentration von 500 nmol/ nach Stimulation mit

den natürlichen Liganden oder Patienten-IgG. Aus diesen Ergebnissen lässt sich zeigen,

dass nach der Aktivierung der Angiotensin II- und Endothelin-1 Rezeptoren, der ERK1/2-

Signaltransduktionsweg stark beteiligt ist.

Der Transkriptionsfaktor Ets-1 wird durch Phosphorylierung von ERK2 an Threonin 38

phosphoryliert. Nach der Aktivierung erhöht sich die transkriptionelle Aktivität von Ets-1.72 Die

Phosphorylierung von Ets-1 erfolgt an der Phosphoakzeptorseite über die MAP-Kinase

ERK2.84 ERK1/2-Kinasen vermitteln Signale von Plasmamembran-ständigen Rezeptoren in

den Zellkern. Kommt es zur Aktivierung von ERK1/2 durch Phosphorylierung können Teile

von ERK2 in den Kern wandern, während Proteinreste der Kinase im Zytoplasma

zurückbleiben.85

In der vorliegenden Arbeit wurde mittels konfokaler Mikroskopie die Lokalisation der aktiven

und der inaktiven Form von Ets-1 in Endothelzellen überprüft. Es konnte gezeigt werden,

dass sowohl Ets-1 als auch seine phosphorylierte Form basal im Kern exprimiert werden. Die

unphosphorylierte Form von Ets-1 konnte im Kern und Zytoplasma sowohl vor als auch nach

Stimulation nachgewiesen werden. Vergleichbare Lokalisationen wurden auch von Valter et

al. beschrieben.86 Nach Stimulation mit IgG von Patienten mit systemischer Sklerose liess

sich die aktive Form Phospho-Ets-1 nicht nur im Zellkern sondern auch im Zytoplasma

nachweisen.

Diskussion 65

In weitern Untersuchungen wurde die Aktivierung von Ets-1 mittels Western Blot über

phosphoryliertes Threonin 38 ([pT38] Ets-1) überprüft. Callaway et al. berichteten, dass die

Phosphorylierung von Ets-1 auch über Serin 26 verlaufen kann. Dies tritt jedoch nur nach

sehr langen Stimulationszeiten auf oder wenn ERK2 nicht die komplette Phosphorylierung

katalysiert.84

In der vorliegenden Arbeit wurde die Stimulationsdauer mit den natürlichen Liganden,

Patienten-IgG, Kontroll-IgG und den Rezeptoranatagonisten den Phosphorylierungszeiten

von ERK1/2 angepasst und lag bei 10 min. Innerhalb dieser Zeitspanne wurden von anderen

Untersuchern bisher keine Phosphorylierungen an Serin 26 beobachtet. Das Ausmaß der

[pT38] Ets-1-Phosphorylierung korrelierte eng mit dem Grad der ERK1/2 Phosphorylierung.

Stimulation mit Patienten-IgG führte zu einer deutlich erhöhten Aktivität von [pT38] Ets-1,

welche mittels spezifischer Rezeptorblockade durch Valsartan (AT1R-Blocker) und

Sitaxentan (ETAR-Blocker) gehemmt werden konnte. Die AT2R- und ETBR-Blocker hatten

dagegen keinen inhibitorischen Einfluß.

Auch der natürliche ETAR-Ligand ET-1 verursachte eine Aktivierung von Ets-1, welche durch

Stimulation mit Ang II nicht ausgelöst werden konnte.

Über eine Aktivierung von Ets-1 in glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC) durch ET-1 wurde

auch von Naito et al. berichtet.87 Eine Aktivierung von Ets-1 durch Ang II wurde bisher

lediglich auf mRNA Basis detektiert.88

Die sowohl durch den natürlichen Agonisten ET-1 als auch durch Patienten-IgG auslösbare

Aktivierung von Ets-1 ist ein zusätzlicher Hinweis auf einer rezeptoraktivierende Wirkung der

im Patientenserum detektierten AT1RAA und ETARAA.

Tissue Factor (TF) ist ein transmembranäres Glykoprotein, welches als essentieller Kofaktor

vom Gerinnungsfaktor VII an der Initiierung des extrinsischen Weges der

Blutgerinnungskaskade beteiligt ist. TF setzt sich aus drei verschiedenen Domänen

zusammen. Neben einer extrazellulären Domäne von 219 Aminosäuren Länge existiert eine

einfach transmembranäre Domäne mit einer Länge von 23 Aminosäuren sowie eine

zytoplasmatische Domäne mit 21 Aminosäuren Länge.75 Sowohl die natürlichen Liganden

Angiotensin II und Endothelin-1 als auch Patienten-IgG sind in der Lage, Tissue Factor zu

aktivieren. Die Aktivierung erfolgt an unterschiedlichen Stellen innerhalb der Zelle. In

Membranextrakten konnte eine Expression mit allen Stimulantien nachgewiesen werden.

Dagegen war im Zytoplasma eine Aktivierung nur nach Stimulation mit Patienten-IgG

vorhanden. Mody et al. konnten zeigen, dass die Mehrzahl der Modifizierungen und

potentiellen regulatorischen Mechanismen die zytoplasmatische Domäne von TF betrifft.75

Somit deutet die verstärkte Expression des zytoplasmatischen Anteils nach Stimulation mit

Patienten-IgG auf eine gesteigerte Aktivierung hin.

Diskussion 66

TF wird basal nicht von Endothelzellen exprimiert. Allerdings kann die Expression in

Endothelzellen durch verschiedene Zytokine oder Immunkomplexe wie z.B. IL-6 oder TNF-

induziert werden.89 In Studien mit Serum von SSc-Patienten konnte eine Aktivierung von TF

nachgewiesen werden. Dabei wurden wiederum die Zytokine IL-6 und TNF-  als auslösende

und regulatorische Faktoren vermutet, da deren Serumspiegel bei Patienten mit SSc stark

erhöht sind.90, 91 Zudem korrelierten die erhöhten Zytokinspiegel mit dem Grad der

systmischen Fibrosierung. So wurden beispielsweise von anderen Untersuchern erhöhte

TNF- -Spiegel im Serum von SSc-Patienten mit dem Auftreten von Lungenfibrose

assoziiert.92 In weiteren in vitro Studien konnte außerdem eine gesteigerte TF-Expression

nach Stimulation durch aufgereinigtes IgG von Patienten mit verschiedenen

Krankheitsentitäten festgestellt werden. So fanden Dechend et al. in glatten Muskelzellen

eine erhöhte TF-Expression nach Stimulation mit IgG von präeklamptischen Frauen.80 Dörfel

et al. berichteten über die Aktivierung von TF in Monozyten durch IgG von hypertensiven

Patienten.93

In weiteren Versuchen wurden Bindungsstudien von Ets-1 mit dem Tissue Factor Promotor

durchgeführt. Mit dem Phosphorylierungsgrad von Ets-1 steigt dessen transkriptionelle

Aktivität. Alle ETS-Faktoren binden mit ihrer Ets-Domäne an eine Kernnukleotidsequenz

„GGAA/T“ eines Promotors. 72 Diese Bindung wurde erstmalig in einer THP-1 Zelllinie nach

LPS Stimulation nachgewiesen.94

In der vorliegenden Arbeit konnte eine Bindung (Shift) zwischen der Kernnukleotidsequenz

der Tissue Factor Promotor Region und Ets-1 beobachtet werden. Allerdings wurde bis zu

diesem Zeitpunkt kein Supershift (Bindung zwischen Ets-1, Kernnukleotidsequenz und

Antikörper) mit dem Ets-1 Antikörper erzielt. Es ist aber eindeutig eine schwächere TF-

Bande zwischen Kernprotein, Kernnukleotidsequenz und Ets-1 Antikörper erkennbar, was

auf einen möglichen Supershift hindeuten könnte. Ein weiteres Indiz einer eindeutigen

Kernnukleotidsequenz-Promotor-Bindung stellen in Abbildung 20 die Banden G-H dar. Hier

wurde mit einer mutierten Sequenz des TF Promotors gearbeitet und es konnte keine TF-

Shiftbande detektiert werden.

Vergleichbare Beobachtungen wurden mit Patienten-IgG von präeklamptischen Patientinnen

sowie von Patienten mit refraktärer vaskulärer Nierentransplantatabstoßung gemacht. Durch

in vitro Stimulation von Endothelzellen und glatten Gefäßmuskelzellen konnte bei

Gelretardationsexperimenten eine Aktivierung von Activator Protein-1 (AP-1) festgestellt

werden. 67, 80

Anhand der erzielten Ergebnisse, werden erste Hinweise auf das Vorhandensein einer

Bindung zwischen Kernukleotidsequenz des Transkriptionsfaktors Ets-1 und der

Promotorregion des Transmembranen Proteins Tissue Factor gegeben. Aufgrund der

Diskussion 67

Aktivierung der ERK1/2/Ets-1 Signaltransduktionskaskade kann ein weiterer Hinweis auf die

Aktivierung von Tissue Factor durch Patienten-IgG gegeben werden.

In den abschließenden Experimenten wurde die Funktionalität nach Stimulation mit

Patienten-IgG auf die Endothelzellproliferation untersucht. Während die natürlichen Liganden

die Proliferation nicht beeinflussten, führte Inkubation mit Patienten-IgG zu einer deutlichen

Steigerung der Teilungsrate. Diese Wirkung ließ sich durch Präinkubationen mit spezifischen

Rezeptorantagonisten oder den Inhibitoren der Vorläuferkinasen Raf-1 und MEK1/2 partiell

inhibieren. Ein möglicher Grund für die geringe proliferative Antwort nach Stimulation mit den

natürlichen Agonisten könnte die Verwendung einer immortalisierten Zelllinie sein.

Verschiedene frühere Studien konnten proliferationssteigernde Effekte durch Angiotensin II

und Endothelin-1 bei Zellkulturexperimenten zeigen. Allerdings wurde die Mehrzahl der

Expermiente an Primärkulturen und vorrangig an glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC)

durchgeführt. Mehrere Untersuchungen konnten zeigen, dass VSMC den AT1-Rezeptor und

die Endothelin-Rezeptoren exprimieren.95, 96,79 In Endothelzellen konnten ebenfalls

Proliferationssteigerungen nach Stimulation mit Endothelin-1 observiert werden.97, 98 Auch

der Einfluss von AT1- und AT2-Rezeptorblockern auf die Ang II-induzierte Proliferation wurde

an Mesangial,- Epithel- und Endothelzellen getestet. Mit Hilfe der eingesetzten Antagonisten

konnte eine Reduktion der Proliferationsrate um bis zu 50 % erzielt werden.99 Über den

Einfluss der ETR-Blocker auf die Zellproliferation existieren nur wenige Daten. Der Raf-1

Inhibitor GW5074 zeigte in den Experimenten ebenfalls eine deutliche Reduktion um ca.

50 % der durch Patienten-IgG ausgelösten Proliferationssteigerung.

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass IgG von Patienten mit systemischer

Sklerose proliferationssteigernde Signalwege in Endothelzellen aktiviert und dieser durch

spezifische Rezeptorantagonisten inhibiert werden können. Damit konnte eine

immunologisch bedingte Rezeptoraktivierung als möglicher Pathomechanismus identifiziert

werden. Um diese Ergebnisse zu verstärken, könnten in weiterführenden Studien

Bindungsexperimente zwischen Ets-1 und dem Tissue Factor Promotor durchgeführt

werden, mit Blick auf Rezeptorinhibierungen und die Auswirkungen dieser.

Da die Signale durch Blockierung der ERK1/2 Vorläuferkinasen nicht vollständig inhibierbar

sind, wäre es wichtig auch andere Signalwege, die für das Zellüberleben stehen, zu

überprüfen.

Literaturverzeichnis 68

8 Literaturverzeichnis

1. Maurer B, Walder M, Gay RE, Gay S, Distler O. [Systemic sclerosis. Objectives for

the treatment]. Z Rheumatol 2009;68:37-43.

2. Steen VD, Costantino JP, Shapiro AP, Medsger TA, Jr. Outcome of renal crisis in

systemic sclerosis: relation to availability of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors.

Ann Intern Med 1990;113:352-7.

3. Denton CP, Humbert M, Rubin L, Black CM. Bosentan treatment for pulmonary

arterial hypertension related to connective tissue disease: a subgroup analysis of the pivotal

clinical trials and their open-label extensions. Ann Rheum Dis 2006;65:1336-40.

4. Chifflot H, Fautrel B, Sordet C, Chatelus E, Sibilia J. Incidence and prevalence of

systemic sclerosis: a systematic literature review. Semin Arthritis Rheum 2008;37:223-35.

5. Gabrielli A, Avvedimento EV, Krieg T. Scleroderma. N Engl J Med 2009;360:1989-

2003.

6. Denton CP, Lapadula G, Mouthon L, Muller-Ladner U. Renal complications and

scleroderma renal crisis. Rheumatology (Oxford) 2009;48 Suppl 3:iii32-5.

7. Shahin AA. Pulmonary involvement in systemic sclerosis. Treat Respir Med

2006;5:429-36.

8. Abraham D, Distler O. How does endothelial cell injury start? The role of endothelin in

systemic sclerosis. Arthritis Res Ther 2007;9 Suppl 2:S2.

9. Guillevin L. Vasculopathy and pulmonary arterial hypertension. Rheumatology

(Oxford) 2009;48 Suppl 3:iii54-7.

10. Whitfield ML, Finlay DR, Murray JI, et al. Systemic and cell type-specific gene

expression patterns in scleroderma skin. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:12319-24.

11. Shephard P, Hinz B, Smola-Hess S, Meister JJ, Krieg T, Smola H. Dissecting the

roles of endothelin, TGF-beta and GM-CSF on myofibroblast differentiation by keratinocytes.

Thromb Haemost 2004;92:262-74.

12. Shi-wen X, Kennedy L, Renzoni EA, et al. Endothelin is a downstream mediator of

profibrotic responses to transforming growth factor beta in human lung fibroblasts. Arthritis

Rheum 2007;56:4189-94.

13. Braun-Menendez E, Fasciolo JC, Leloir LF, Munoz JM. The substance causing renal

hypertension. J Physiol 1940;98:283-98.

14. Skeggs LT, Jr., Lentz KE, Kahn JR, Shumway NP, Woods KR. The amino acid

sequence of hypertensin. II. J Exp Med 1956;104:193-7.

15. Page IH, Mc CJ, Schwarz H, Bumpus FM. Pharmacologic aspects of synthetic

angiotonin. Circ Res 1957;5:552-5.

16. de Gasparo M, Catt KJ, Inagami T, Wright JW, Unger T. International union of

pharmacology. XXIII. The angiotensin II receptors. Pharmacol Rev 2000;52:415-72.

17. Dzau VJ, Baxter JA, Cantin M, et al. Report of the Joint Nomenclature and

Standardization Committee of the International Society of Hypertension, American Heart

Association and the World Health Organization. J Hypertens 1987;5:507-11.

18. Dzau VJ, Gibbons GH. Autocrine-paracrine mechanisms of vascular myocytes in

systemic hypertension. Am J Cardiol 1987;60:99I-103I.

19. Tsai BS, Peach MJ. Angiotensin homologs and analogs as inhibitors of rabbit

pulmonary angiotensin-converting enzyme. J Biol Chem 1977;252:4674-81.

20. Schiavone MT, Khosla MC, Ferrario CM. Angiotensin-[1-7]: evidence for novel actions

in the brain. J Cardiovasc Pharmacol 1990;16 Suppl 4:S19-24.

21. Ganten D, Schelling P, Vecsei P, Ganten U. Iso-renin of extrarenal origin. "The tissue

angiotensinogenase systems". Am J Med 1976;60:760-72.

22. Rosenthal JH, Pfeifle B, Michailov ML, Pschorr J, Jacob IC, Dahlheim H.

Investigations of components of the renin-angiotensin system in rat vascular tissue.

Hypertension 1984;6:383-90.

Literaturverzeichnis 69

23. Furchgott RF, Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of

arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature 1980;288:373-6.

24. Palmer RM, Ferrige AG, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological

activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 1987;327:524-6.

25. Hickey KA, Rubanyi G, Paul RJ, Highsmith RF. Characterization of a coronary

vasoconstrictor produced by cultured endothelial cells. Am J Physiol 1985;248:C550-6.

26. Gillespie MN, Owasoyo JO, McMurtry IF, O'Brien RF. Sustained coronary

vasoconstriction provoked by a peptidergic substance released from endothelial cells in

culture. J Pharmacol Exp Ther 1986;236:339-43.

27. O'Brien RF, Robbins RJ, McMurtry IF. Endothelial cells in culture produce a

vasoconstrictor substance. J Cell Physiol 1987;132:263-70.

28. Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide

produced by vascular endothelial cells. Nature 1988;332:411-5.

29. Wright CE, Fozard JR. Regional vasodilation is a prominent feature of the

haemodynamic response to endothelin in anaesthetized, spontaneously hypertensive rats.

Eur J Pharmacol 1988;155:201-3.

30. Komuro I, Kurihara H, Sugiyama T, Yoshizumi M, Takaku F, Yazaki Y. Endothelin

stimulates c-fos and c-myc expression and proliferation of vascular smooth muscle cells.

FEBS Lett 1988;238:249-52.

31. Takuwa N, Takuwa Y, Yanagisawa M, Yamashita K, Masaki T. A novel vasoactive

peptide endothelin stimulates mitogenesis through inositol lipid turnover in Swiss 3T3

fibroblasts. J Biol Chem 1989;264:7856-61.

32. Inoue A, Yanagisawa M, Kimura S, et al. The human endothelin family: three

structurally and pharmacologically distinct isopeptides predicted by three separate genes.

Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86:2863-7.

33. Levin ER. Endothelins. N Engl J Med 1995;333:356-63.

34. Matsuura A, Yamochi W, Hirata K, Kawashima S, Yokoyama M. Stimulatory

interaction between vascular endothelial growth factor and endothelin-1 on each gene

expression. Hypertension 1998;32:89-95.

35. Yu JC, Pickard JD, Davenport AP. Endothelin ETA receptor expression in human

cerebrovascular smooth muscle cells. Br J Pharmacol 1995;116:2441-6.

36. Remuzzi G, Perico N, Benigni A. New therapeutics that antagonize endothelin:

promises and frustrations. Nat Rev Drug Discov 2002;1:986-1001.

37. Ji TH, Grossmann M, Ji I. G protein-coupled receptors. I. Diversity of receptor-ligand

interactions. J Biol Chem 1998;273:17299-302.

38. Coleman DE, Berghuis AM, Lee E, Linder ME, Gilman AG, Sprang SR. Structures of

active conformations of Gi alpha 1 and the mechanism of GTP hydrolysis. Science

1994;265:1405-12.

39. Sondek J, Bohm A, Lambright DG, Hamm HE, Sigler PB. Crystal structure of a G-

protein beta gamma dimer at 2.1A resolution. Nature 1996;379:369-74.

40. Touyz RM, Schiffrin EL. Signal transduction mechanisms mediating the physiological

and pathophysiological actions of angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Pharmacol

Rev 2000;52:639-72.

41. Grady EF, Sechi LA, Griffin CA, Schambelan M, Kalinyak JE. Expression of AT2

receptors in the developing rat fetus. J Clin Invest 1991;88:921-33.

42. Unger T, Chung O, Csikos T, et al. Angiotensin receptors. J Hypertens Suppl

1996;14:S95-103.

43. Zhuo J, Moeller I, Jenkins T, et al. Mapping tissue angiotensin-converting enzyme

and angiotensin AT1, AT2 and AT4 receptors. J Hypertens 1998;16:2027-37.

44. Nakajima M, Hutchinson HG, Fujinaga M, et al. The angiotensin II type 2 (AT2)

receptor antagonizes the growth effects of the AT1 receptor: gain-of-function study using

gene transfer. Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92:10663-7.

45. Sakurai T, Yanagisawa M, Masaki T. Molecular characterization of endothelin

receptors. Trends Pharmacol Sci 1992;13:103-8.

Literaturverzeichnis 70

46. Seo B, Oemar BS, Siebenmann R, von Segesser L, Luscher TF. Both ETA and ETB

receptors mediate contraction to endothelin-1 in human blood vessels. Circulation

1994;89:1203-8.

47. de Nucci G, Thomas R, D'Orleans-Juste P, et al. Pressor effects of circulating

endothelin are limited by its removal in the pulmonary circulation and by the release of

prostacyclin and endothelium-derived relaxing factor. Proc Natl Acad Sci U S A

1988;85:9797-800.

48. Masaki T. Historical review: Endothelin. Trends Pharmacol Sci 2004;25:219-24.

49. Adner M, Uddman E, Cardell LO, Edvinsson L. Regional variation in appearance of

vascular contractile endothelin-B receptors following organ culture. Cardiovasc Res

1998;37:254-62.

50. Verhaar MC, Strachan FE, Newby DE, et al. Endothelin-A receptor antagonist-

mediated vasodilatation is attenuated by inhibition of nitric oxide synthesis and by endothelin-

B receptor blockade. Circulation 1998;97:752-6.

51. Dhaun N, Pollock DM, Goddard J, Webb DJ. Selective and mixed endothelin receptor

antagonism in cardiovascular disease. Trends Pharmacol Sci 2007;28:573-9.

52. Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, Goto K, Masaki T. A novel peptide

vasoconstrictor, endothelin, is produced by vascular endothelium and modulates smooth

muscle Ca2+ channels. J Hypertens Suppl 1988;6:S188-91.

53. Rossi GP, Colonna S, Pavan E, et al. Endothelin-1 and its mRNA in the wall layers of

human arteries ex vivo. Circulation 1999;99:1147-55.

54. Rubens C, Ewert R, Halank M, et al. Big endothelin-1 and endothelin-1 plasma levels

are correlated with the severity of primary pulmonary hypertension. Chest 2001;120:1562-9.

55. Kabunga P, Coghlan G. Endothelin receptor antagonism: role in the treatment of

pulmonary arterial hypertension related to scleroderma. Drugs 2008;68:1635-45.

56. Koh ET, Lee P, Gladman DD, Abu-Shakra M. Pulmonary hypertension in systemic

sclerosis: an analysis of 17 patients. Br J Rheumatol 1996;35:989-93.

57. Schneider MP, Boesen EI, Pollock DM. Contrasting actions of endothelin ET(A) and

ET(B) receptors in cardiovascular disease. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007;47:731-59.

58. Ihara M, Noguchi K, Saeki T, et al. Biological profiles of highly potent novel endothelin

antagonists selective for the ETA receptor. Life Sci 1992;50:247-55.

59. Ishikawa K, Ihara M, Noguchi K, et al. Biochemical and pharmacological profile of a

potent and selective endothelin B-receptor antagonist, BQ-788. Proc Natl Acad Sci U S A

1994;91:4892-6.

60. Williamson DJ, Wallman LL, Jones R, et al. Hemodynamic effects of Bosentan, an

endothelin receptor antagonist, in patients with pulmonary hypertension. Circulation

2000;102:411-8.

61. Givertz MM, Colucci WS, LeJemtel TH, et al. Acute endothelin A receptor blockade

causes selective pulmonary vasodilation in patients with chronic heart failure. Circulation

2000;101:2922-7.

62. Papadea C, Check IJ. Human immunoglobulin G and immunoglobulin G subclasses:

biochemical, genetic, and clinical aspects. Crit Rev Clin Lab Sci 1989;27:27-58.

63. Wallukat G, Homuth V, Fischer T, et al. Patients with preeclampsia develop agonistic

autoantibodies against the angiotensin AT1 receptor. J Clin Invest 1999;103:945-52.

64. Redman CW, Sargent IL. Latest advances in understanding preeclampsia. Science

2005;308:1592-4.

65. Granger JP, Alexander BT, Llinas MT, Bennett WA, Khalil RA. Pathophysiology of

hypertension during preeclampsia linking placental ischemia with endothelial dysfunction.

Hypertension 2001;38:718-22.

66. Mellor AL, Munn DH. Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell

tolerance and suppression. Annu Rev Immunol 2000;18:367-91.

67. Dragun D, Muller DN, Brasen JH, et al. Angiotensin II type 1-receptor activating

antibodies in renal-allograft rejection. N Engl J Med 2005;352:558-69.

68. Yamamoto T, Takahashi Y, Kuno S, Geshi Y, Sasamori Y, Mori H. Effects of anti-

endothelial cell antibody in pre-eclampsia on endothelin-1 release from cultured endothelial

cells. Immunol Cell Biol 1997;75:340-4.

Literaturverzeichnis 71

69. Yoshio T, Masuyama J, Mimori A, Takeda A, Minota S, Kano S. Endothelin-1 release

from cultured endothelial cells induced by sera from patients with systemic lupus

erythematosus. Ann Rheum Dis 1995;54:361-5.

70. Ades EW, Candal FJ, Swerlick RA, et al. HMEC-1: establishment of an immortalized

human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol 1992;99:683-90.

71. Cohen P. The search for physiological substrates of MAP and SAP kinases in

mammalian cells. Trends Cell Biol 1997;7:353-61.

72. Oettgen P. Regulation of vascular inflammation and remodeling by ETS factors. Circ

Res 2006;99:1159-66.

73. Bach RR. Initiation of coagulation by tissue factor. CRC Crit Rev Biochem

1988;23:339-68.

74. Bloem LJ, Chen L, Konigsberg WH, Bach R. Serum stimulation of quiescent human

fibroblasts induces the synthesis of tissue factor mRNA followed by the appearance of tissue

factor antigen and procoagulant activity. J Cell Physiol 1989;139:418-23.

75. Mody RS, Carson SD. Tissue factor cytoplasmic domain peptide is multiply

phosphorylated in vitro. Biochemistry 1997;36:7869-75.

76. Anandanadesan R, Gong Q, Chipitsyna G, Witkiewicz A, Yeo CJ, Arafat HA.

Angiotensin II induces vascular endothelial growth factor in pancreatic cancer cells through

an angiotensin II type 1 receptor and ERK1/2 signaling. J Gastrointest Surg 2008;12:57-66.

77. Nie W, Yan H, Li S, et al. Angiotensin-(1-7) enhances angiotensin II induced

phosphorylation of ERK1/2 in mouse bone marrow-derived dendritic cells. Mol Immunol

2009;46:355-61.

78. Sampaio WO, Henrique de Castro C, Santos RA, Schiffrin EL, Touyz RM.

Angiotensin-(1-7) counterregulates angiotensin II signaling in human endothelial cells.

Hypertension 2007;50:1093-8.

79. Chen QW, Edvinsson L, Xu CB. Role of ERK/MAPK in endothelin receptor signaling

in human aortic smooth muscle cells. BMC Cell Biol 2009;10:52.

80. Dechend R, Homuth V, Wallukat G, et al. AT(1) receptor agonistic antibodies from

preeclamptic patients cause vascular cells to express tissue factor. Circulation

2000;101:2382-7.

81. Liu HW, Cheng B, Yu WL, et al. Angiotensin II regulates phosphoinositide 3

kinase/Akt cascade via a negative crosstalk between AT1 and AT2 receptors in skin

fibroblasts of human hypertrophic scars. Life Sci 2006;79:475-83.

82. Servant MJ, Giasson E, Meloche S. Inhibition of growth factor-induced protein

synthesis by a selective MEK inhibitor in aortic smooth muscle cells. J Biol Chem

1996;271:16047-52.

83. Davies SP, Reddy H, Caivano M, Cohen P. Specificity and mechanism of action of

some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J 2000;351:95-105.

84. Callaway KA, Rainey MA, Riggs AF, Abramczyk O, Dalby KN. Properties and

regulation of a transiently assembled ERK2.Ets-1 signaling complex. Biochemistry

2006;45:13719-33.

85. Fukuda M, Gotoh Y, Nishida E. Interaction of MAP kinase with MAP kinase kinase: its

possible role in the control of nucleocytoplasmic transport of MAP kinase. EMBO J

1997;16:1901-8.

86. Valter MM, Hugel A, Huang HJ, et al. Expression of the Ets-1 transcription factor in

human astrocytomas is associated with Fms-like tyrosine kinase-1 (Flt-1)/vascular

endothelial growth factor receptor-1 synthesis and neoangiogenesis. Cancer Res

1999;59:5608-14.

87. Naito S, Shimizu S, Maeda S, Wang J, Paul R, Fagin JA. Ets-1 is an early response

gene activated by ET-1 and PDGF-BB in vascular smooth muscle cells. Am J Physiol

1998;274:C472-80.

88. Hultgardh-Nilsson A, Cercek B, Wang JW, et al. Regulated expression of the ets-1

transcription factor in vascular smooth muscle cells in vivo and in vitro. Circ Res

1996;78:589-95.

Literaturverzeichnis 72

89. Drake TA, Morrissey JH, Edgington TS. Selective cellular expression of tissue factor

in human tissues. Implications for disorders of hemostasis and thrombosis. Am J Pathol

1989;134:1087-97.

90. Gourh P, Arnett FC, Assassi S, et al. Plasma cytokine profiles in systemic sclerosis:

associations with autoantibody subsets and clinical manifestations. Arthritis Res Ther

2009;11:R147.

91. Sfrent-Cornateanu R, Mihai C, Balan S, Ionescu R, Moldoveanu E. The IL-6 promoter

polymorphism is associated with disease activity and disability in systemic sclerosis. J Cell

Mol Med 2006;10:955-9.

92. Hasegawa M, Sato S, Nagaoka T, Fujimoto M, Takehara K. Serum levels of tumor

necrosis factor and interleukin-13 are elevated in patients with localized scleroderma.

Dermatology 2003;207:141-7.

93. Dorffel Y, Wallukat G, Bochnig N, et al. Agonistic AT(1) receptor autoantibodies and

monocyte stimulation in hypertensive patients. Am J Hypertens 2003;16:827-33.

94. Groupp ER, Donovan-Peluso M. Lipopolysaccharide induction of THP-1 cells

activates binding of c-Jun, Ets, and Egr-1 to the tissue factor promoter. J Biol Chem

1996;271:12423-30.

95. Allen AM, Zhuo J, Mendelsohn FA. Localization and function of angiotensin AT1

receptors. Am J Hypertens 2000;13:31S-8S.

96. Marrero MB, Schieffer B, Li B, Sun J, Harp JB, Ling BN. Role of Janus kinase/signal

transducer and activator of transcription and mitogen-activated protein kinase cascades in

angiotensin II- and platelet-derived growth factor-induced vascular smooth muscle cell

proliferation. J Biol Chem 1997;272:24684-90.

97. Dong F, Zhang X, Wold LE, Ren Q, Zhang Z, Ren J. Endothelin-1 enhances oxidative

stress, cell proliferation and reduces apoptosis in human umbilical vein endothelial cells: role

of ETB receptor, NADPH oxidase and caveolin-1. Br J Pharmacol 2005;145:323-33.

98. Kuhlmann CR, Most AK, Li F, et al. Endothelin-1-induced proliferation of human

endothelial cells depends on activation of K+ channels and Ca+ influx. Acta Physiol Scand

2005;183:161-9.

99. Efrati S, Berman S, Goldfinger N, et al. Enhanced angiotensin II production by renal

mesangium is responsible for apoptosis/proliferation of endothelial and epithelial cells in a

model of malignant hypertension. J Hypertens 2007;25:1041-52.

Anhang 73

9 Anhang

9.1 Angiotensin II Rezeptorblocker

Angiotensin II Typ 1 Rezeptorblocker = Valsartan

Angiotensin II Typ 2 Rezeptorblocker = PD123,319

Anhang 74

9.2 Endothelin-1 Rezeptorblocker

Endothelin-1 Typ A/Typ B Rezeptor = Bosentan

Endothelin-1 Typ A Rezeptor = Sitaxsentan

Anhang 75

Endothelin-1 Typ B Rezeptor = BQ788

9.3 Raf-Inhibitor

GW5074

Anhang 76

9.4 MEK1/2-Inhibitor

PD184,352

Danksagung 76

10 Danksagung

Mein besonderer Dank geht an Frau Prof. Dr. Duska Dragun für die Bereitstellung des

Themas, ihrer fachlichen Diskussionsbereitschaft und ihr Vertrauen, welches sie in mich

gesetzt hat. Prof. Dr. Roderich Süßmuth danke ich für die Berichterstattung an die

Technische Universität Berlin und das offene Ohr für diverse Fragen.

Carsten Lindschau danke ich für die mikroskopischen Aufnahmen und die Unterstützung in

der Auswertung. Der Firma Celltrend und besonders Dr. rer. nat. Harald Heidecke danke ich

für die schnelle Bestimmung der Patiententiter.

Meinen Kollegen, die mich in allen Situationen hilfreich unterstützt haben, möchte ich

danken. Besonders PhD Aurélie Philippe möchte ich für ihre ständige Mühe und

Unterstützung danken, aber auch Dr. med. Uwe Hoff und Dr. med. Björn Hegner bin für

jegliche medizinische Fachfragen und auch allem anderen, was uns so verbunden hat in den

letzten fünf Jahren, dankbar. Dennis Gürgen, mein längster Bekannter aus dieser

Arbeitsgruppe möchte ich für die stete Diskussionsbereitschaft und auch die oft lustigen

Gespräche danken. Ein großer Dank gilt selbstverständlich auch Dr. rer. nat. Rusan Catar,

der immer ein offenes Ohr hatte und mir in jeder Fragestellung Hilfe geben konnte. Dr. med.

Angelika Kusch möchte ich für den Rat und Beistand danken, sowie Marc Eigen und Chantel

Spencer-Hänsch für die Übernahme diverser experimentelle Hilfestellungen und ohne die ich

manchmal nicht mehr weiter gewusst hätte.

Ein besonderer Dank gilt aber meinen Freunden. Und jeder Einzelne weiß sich an dieser

Stelle angesprochen! Besonders zu erwähnen sind aber meine beiden Sabine-Freundinnen,

die mich schon durchs Studium begleitet haben und mit denen ich so manch prikäre

Situation durchgestanden hab. Aber auch Katarina und Kati sind immer für mich dagewesen,

egal, wie meine Lage gerade war. Es ist so schön, dass es Euch gibt!

Mein besonderer Dank gilt meiner Mama und Jürgen, die mich in allen Situationen

unterstützt haben und immer, auch wenn es manchmal nicht leicht war, an mich glaubten.

Mein Papa ist nicht zu vergessen, der auch aus der Ferne nie aufhören wird an mich zu

glauben!

Ohne die unendliche Energie eines Menschen wäre dieses Schriftstück nicht in dieser Zeit

entstanden und auch dafür möchte ich mich bei Dir, Florian, bedanken! Es ist das Beste,

Dich an meiner Seite zu haben!

Veröffentlichungen 77

11 Veröffentlichungen

11.1 Publikation

T. Florian Fuller, Uwe Hoff, Linghua Kong, Melanie Naether, Philine Wagner, Melina

Nieminen-Kelhä, Jochen Nolting , Friedrich C. Luft, Björn Hegner, Duska Dragun

CYTOPROTECTIVE ACTIONS OF FTY720 MODULATE SEVERE PRESERVATION

REPERFUSION INJURY IN RAT RENAL TRANSPLANTS

Transplantation (in press)

11.2 Kongressbeiträge

Philippe Aurélie, Naether Melanie, Catar Rusan, Riemekasten Gabriela and Dragun Duska

Synergy of agonistic autoantibodies targeting ETA- and AT1 receptors in systemic sclerosis

patients.

Keystone, G Protein-Coupled Receptors, 07.–12.04.2010, Breckenridge, Colorado

Melanie Naether, Aurélie Philippe, Rusan Catar, Ivo Lukitsch, Gabriela Riemekasten, Duska

Dragun

Signaling induced by endogenous ligand independent autoimmune activation of Angiotensin

type 1- and Endothelin Type A-receptor in microvascular endothelial cells

1st systemic sclerosis world congress, 11.-13.02.10 Florenz, Italien

Catar R, Kretzschmar T, Naether M, Philippe A, Wagner P, Luft FC, Riemekasten G,

Dragun D (2010)

Agonistic autoantibodies targeting ETA- and AT1 receptors act synergistically in systemic

sclerosis patients

1st systemic sclerosis world congress, 11.-13.02.10 Florenz, Italien

Hegner B, Catar R, Kusch A, Essin K, Naether M, Gollasch M, Riemekasten G, Dragun D

Differentation responses of bone marrow derived mesenchymal stem cells from systemic

sclerosis patients to pro-fibrotic cytokines

1st systemic sclerosis world congress, 11.-13.02.10 Florenz, Italien

Catar R, Kretzschmar T, Naether M, Philippe A, Wagner P, Luft FC, Riemekasten G, Dragun

Agonistic Autoantibodies Targeting ETA- and AT1 Receptors Act Synergistically in Systemic

Sclerosis Patients

Renal Week 2009: American Society of Nephrology (ASN) 2009 Annual Meeting, San Diego,

USA

Anhang 78

Melanie Naether, Aurélie Philippe, Rusan Catar, Ivo Lukitsch, Gabriela Riemekasten, Duska

Dragun

Signaling induced by endogenous ligand independent autoimmune activation of Angiotensin

type 1- and Endothelin Type A-receptor in microvascular endothelial cells

Signal Transduction and Disease, Trinational Fall Meeting of the Biochemical Societies, 27.-

30.09.2009 Aachen, Deutschland

Duska Dragun, Melanie Naether, Dominik N. Müller, Ulrich Frei, Harald Heidecke,

FriedrichC. Luft, Maik Gollasch, Gabriela Riemekasten

Activating AT1R and ETAR autoantibodies serve as biomarkers and link autoimmunity and

vasculopathy in systemic sclerosis

ET-11: APS International Conference on Endothelin, 9.-12.09.09 Montreal, Canada

Catar R, Kretzschmar T, Naether M, Philippe A, Wagner P, Luft FC, Riemekasten G, Dragun

Synergy of agonistic autoantibodies targeting ETA- and AT1 receptors increases sensitivity

to natural ligands

APS Conference ET-11: APS International Conference on Endothelin Montréal, Canada

R. Catar; T. Kretzschmar ; M. Näther; A. Philippe; P. Wagner; F. C. Luft; G. Riemekasten; D.

Dragun

Agonistic autoantibodies targeting ETA- and AT1-receptors act synergistically in systemic

sclerosis patients

Kongress für Nephrologie 2009, 26.-29.09 Göttingen, Deutschland

R. Catar; T. Kretzschmar ; M. Näther; A. Philippe; P. Wagner; F. C. Luft; G. Riemekasten; D.

Dragun

Agonistic autoantibodies targeting ETA- and AT1-receptors act synergistically in systemic

sclerosis patients

Jahrestagung der Gesellschaft für Kinder- und Jugendrheumatologie e.V. 2009, 23.-26.09.09

Köln, Deutschland