Nachweis der geographischen Herkunft von Pistazien anhand der Stabilisotopenverhältnisse [original]

Nachweis der geographischen

Herkunft von Pistazien anhand der

Stabilisotopenverhältnisse

vorgelegt von

Diplom-Lebensmittelchemikerin

Anke Heier

aus Berlin

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktorin der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. W. Rotard

Berichterin: Prof. Dr. A. Hartwig

Berichter: Prof. Dr. R. Wittkowski

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 07. September 2006

Berlin 2006

D 83

Für meine Mutter

Danksagung

Ich möchte mich in erster Linie bei meinen Eltern für ihre langjährige Unterstützung bedanken,

denn ohne ihre Ermutigung zum Studium und der finanziellen Unterstützung wäre diese Arbeit

nicht zustande gekommen.

Herrn Professor Wittkowski danke ich ganz herzlich für die Bereitstellung des Themas und die

Beurteilung dieser Arbeit sowie auch für seine Unterstützung bei meinem einjährigen England-

aufenthalt über das Marie Curie Stipendium.

Frau Professor Hartwig möchte ich ebenfalls für die Übernahme der Betreuung und die Beurtei-

lung dieser Arbeit danken.

Herrn Professor Stan gilt mein besonderer Dank für die Unterstützung und das Beurteilungs-

schreiben, durch die ich das NaFöG-Stipendium erhalten habe.

Ganz besonders herzlich möchte ich mich auch bei meinem Arbeitskreis und den vielen lieben

Kollegen am Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) bedanken, in deren Mitte ich mich sehr

wohl gefühlt habe und die mir immer hilfreich zur Seite standen – moralisch, technisch, statis-

tisch, im Labor und bei der Auswertung und kritischen Beurteilung dieser Arbeit.

Meinen privaten Freunden gilt mein besonderer Dank, denn auch von dieser Seite habe ich viel

Hilfe und Ermutigung bekommen und die nötige Ablenkung von der Arbeit. Vielen Dank auch

an alle, die für mich fleißig Pistazienproben gesammelt haben.

iii

Für die Bereitstellung von kostenlosem, authentischem Probenmaterial möchte ich folgenden

Personen und Instituten recht herzlich danken:

Dr. F. Shojaee

Khatam Lab

Tehran, Iran

Dr. H. Yazdanpanah und Dr. M. Cheraghali

Ministry of Health and Medical Education

Food and Drug Control Labs

Tehran, Iran

B. Klein

California Pistachio Commission

Fresno, United States of America

L. Börs

Dr. Wierts – Dipl. Chem. Eggert – Dr. Jörissen GmbH

Handels- und Umweltschutzlaboratorium

Hamburg, Deutschland

Für den Einkauf und die Zusendung von Pistazien in/aus Kalifornien bedanke ich mich ebenfalls

ganz herzlich bei Herrn M. Kracht und Frau S. Freihammer.

Abstract

Previously there was no established analytical procedure to prove the origin and authenticity of

pistachio nuts. A simple, quick method is needed because every batch of Iranian and Turkish

pistachios have to be inspected by law for aflatoxin contamination before they are allowed to be

imported into the European Union (EU).

By contrast, US American pistachio nuts do not have to be checked. Therefore, Iranian pista-

chios are repeatedly labelled as being of US American origin to generate higher prices on the

world market and to avoid the analytical control at the EU borders.

This work presents a fast method to provenance pistachio nuts grown by the three main producer

countries: Iran, USA and Turkey. The δ-values of the elements oxygen, carbon and nitrogen

measured by stable isotope ratio mass spectrometry (IRMS) are used as variables for univariate

and multivariate statistics.

First, the IRMS method was validated in-house for each element and pistachio fraction. The re-

peatability (r) and reproducibility (R) for the EA methods are <0.6 ‰ whereas r and R for the

TC/EA methods are higher (≤1.5 ‰) due to the linearity problems of this instrument. Pistachio

oil was found to be the best fraction to analyse; its liquid matrix produces the lowest standard

deviations and best r- and R-values in comparison with the solid fractions (grinded nut and defat-

ted residue). The instruments were calibrated by reference materials prior to sample analysis and

the stability of the reference materials, working standards and pistachio nuts were observed by

control charts.

The dataset of the authentic pistachio samples was examined for outliers by cross-checking with

three different tests and then by univariate statistic tests (normality, homogeneity of variance,

post-hoc tests of observed means, analysis of correlation) and principal compound analysis be-

fore performing discriminant analysis.

25-30 authentic pistachio samples were collected for each country and used to set up the dis-

criminant analysis model. This model is able to separate the three countries with 100 % statisti-

cal probability (95 % confidence level). 63 further pistachio samples were used to test the

strengths and limits of the classification model.

Key words: pistachio nuts, origin, authenticity, isotopes, IRMS, EA, TC/EA, δ18O, δ13C, δ15N,

multivariate statistics, discriminant analysis

Inhaltsverzeichnis

ABSTRACT.......................................................................................... IV

INHALTSVERZEICHNIS ....................................................................... V

TABELLENVERZEICHNIS ................................................................... IX

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..............................................................XII

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS............................................................. XV

1. PROBLEMSTELLUNG........................................................................1

2. EINLEITUNG.....................................................................................2

3. ALLGEMEINER TEIL........................................................................5

3.1 Pistazien .......................................................................................................... 6

3.1.1 Ernte/Verarbeitung.................................................................................................7

3.1.2 Klima......................................................................................................................8

3.1.3 Wirtschaft............................................................................................................... 9

3.1.4 Aflatoxinproblematik ........................................................................................... 12

3.2 Stabilisotope.................................................................................................. 14

3.2.1 Kohlenstoff...........................................................................................................16

3.2.2 Stickstoff .............................................................................................................. 22

3.2.3 Sauerstoff ............................................................................................................. 25

3.2.3.1 Wasserkreislauf....................................................................................................... 25

3.2.3.2 Sauerstoffkreislauf in Pflanzen ............................................................................... 29

3.2.3.3 Weitere Einflussfaktoren auf das 18O/16O-Verhältnis von Pflanzen........................ 31

3.3 Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS) ................................... 32

3.3.1 IRMS-Basisgeräte ................................................................................................ 32

3.3.2 Elementaranalysator (EA)....................................................................................34

3.3.3 ConFlo IITM-Interface........................................................................................... 35

3.3.4 High Temperature Conversion / Elemental Analyzer (TC/EA)........................... 36

Inhaltsverzeichnis

3.4 Multivariate Datenanalyse...........................................................................38

3.4.1 Hauptkomponentenanalyse.................................................................................. 39

3.4.2 Diskriminanzanalyse............................................................................................ 40

4. ERGEBNISTEIL I: METHODENVALIDIERUNG............................... 41

4.1 Kalibrierung der Arbeitsstandards ............................................................44

4.2 Stabilitätsprüfung der Referenzgas-Kalibrierung ....................................47

4.3 Linearer Arbeitsbereich...............................................................................49

4.4 Voruntersuchungen von Pistazien ..............................................................50

4.4.1 Streubreite innerhalb einer Handelsverpackung .................................................. 50

4.4.2 δ-Wert-Beziehungen zwischen einzelnen Pistazienbestandteilen ....................... 52

4.5 In-House-Validierung der IRMS-Methode................................................54

4.5.1 Richtigkeit............................................................................................................ 54

4.5.2 Präzision............................................................................................................... 55

4.5.3 Prüfung der Laborpräzision ................................................................................. 58

4.5.4 Stabilität / Alterungsstudie................................................................................... 58

4.6 Prüfung der Öl-Extraktionsmethode..........................................................62

4.6.1 Diskriminierungsstudie anhand der Soxhletmethode .......................................... 62

4.6.2 Vergleich der Soxhlet-Methode mit der ASE...................................................... 63

4.6.3 Wiederholbarkeit der Extraktionsmethode .......................................................... 64

4.7 Einfluss von Röstung und Salzung auf den δ-Wert...................................66

5. ERGEBNISTEIL II: UNIVARIATE STATISTIK................................. 69

5.1 Übersicht über das Probenmaterial............................................................70

5.2 Box-Plot-Betrachtung des authentischen Datenmaterials........................71

5.3 Univariate statistische Vorbetrachtung des authentischen

Datenmaterials .............................................................................................74

5.3.1 Betrachtung der Ausreißer ................................................................................... 75

5.3.1.1 Box-Plots................................................................................................................. 75

5.3.1.2 Ausreißertest nach Grubbs und Nalimov................................................................ 77

5.3.2 Prüfung der Normalverteilung nach Kolmogorov-Smirnov................................ 80

5.3.3 Prüfung der Homogenität der Varianzen nach Levene........................................ 81

5.3.4 Prüfung auf Gruppenunterschiede mittels Post-Hoc-Mehrfachvergleichen........ 82

5.3.5 Korrelationsanalyse.............................................................................................. 84

Inhaltsverzeichnis

vii

6. ERGEBNISTEIL III: MULTIVARIATE STATISTIK ..........................87

6.1 Betrachtung des authentischen Datenmaterials in

x-y-Streudiagrammen ................................................................................. 90

6.2 Hauptkomponentenanalyse......................................................................... 93

6.2.1 Prüfung der Eignung der Korrelationsmatrix....................................................... 93

6.2.2 Extraktion der Faktoren (Komponenten) ............................................................. 95

6.2.3 Faktorinterpretation / Rotation............................................................................. 97

6.2.4 Grafische Darstellung der Faktorwerte ................................................................ 98

6.3 Diskriminanzanalyse.................................................................................. 100

6.3.1 Schrittweise Diskriminanzanalyse ..................................................................... 100

6.3.2 Erstellung des Diskriminanzmodells.................................................................. 103

6.3.2.1 Schätzung der Koeffizienten der Diskriminanzfunktionen.................................... 103

6.3.2.2 Beurteilung der Trennkraft/Güte der Diskriminanzfunktionen............................. 103

6.3.2.3 Ableitung des Erklärungsbeitrags der einzelnen Variablen ................................. 105

6.3.3 Prüfung des Klassifizierungsmodells................................................................. 107

6.3.4 Klassifizierungsfunktionen nach Fisher............................................................. 109

6.3.5 Grafische Darstellung der Funktionswerte......................................................... 111

6.3.6 Diskriminanzanalyse mit den Isotopenvariablen der Pistazien-Gesamtnuss..... 113

6.4 Anwendung der multivariaten Datenmodelle ......................................... 117

6.4.1 Klassifizierung von Handelsproben mit deklarierter Herkunft.......................... 117

6.4.2 Klassifizierung von Handelsproben unbekannter Herkunft............................... 119

6.4.3 Klassifizierung von Mischproben USA ↔ Iran.................................................120

6.4.4 Klassifizierung der Ausreißer aus Kapitel 5.3.1 ................................................123

6.4.5 Multivariate Betrachtung anderer Länder .......................................................... 127

7. ERGEBNISDISKUSSION.................................................................129

8. ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................145

9. MATERIAL UND METHODEN.......................................................149

9.1 Probenliste .................................................................................................. 150

9.2 Standards und Referenzmaterialien......................................................... 160

9.2.1 Referenzmaterialien der IAEA...........................................................................160

9.2.2 In-House kalibrierte Arbeitsstandards................................................................ 160

9.2.3 Gerätekontrollproben ......................................................................................... 161

Inhaltsverzeichnis

viii

9.3 Geräteeinstellungen und Probenvorbereitung ........................................162

9.3.1 Isotopenmassenspektrometer............................................................................. 162

9.3.2 Elementaranalysator (EA).................................................................................. 162

9.3.3 Pyrolyseeinheit (TC/EA).................................................................................... 164

9.3.4 Probenvorbereitung für die IRMS...................................................................... 165

9.3.5 Gewinnung des Pistazienöls............................................................................... 166

9.3.6 Röstung und Salzung im Laborversuch ............................................................. 167

10. LITERATURVERZEICHNIS ......................................................... 169

ANHANG ...............................................................................................I

Anhang I: Formelverzeichnis ..................................................................................II

Berechnung des δ-Werts....................................................................................................II

Statistische Grundformeln ............................................................................................... IV

Statistische Tests.............................................................................................................VII

Anhang II: Weiterführende Erläuterungen zur mulitvariaten Statistik .......... IX

Einteilung multivariater Analysenmethoden ................................................................... IX

Durchführung einer Hauptkomponentenanalyse ...............................................................X

Nähere Erläuterungen zur Diskriminanzanalyse.............................................................. XI

Anhang III: Probenliste mit δ-Wert-Messergebnissen .................................... XIV

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Exportmengen und Handelswerte von Pistazien aus den drei Hauptanbauländern ..13

Tabelle 2: Relative natürliche Häufigkeiten der stabilen Isotope der Bioelemente...................14

Tabelle 3: Internationalen Bezugsstandards, typische Messgase und Isotopenverhältnisse

der Bioelemente für die IRMS Messung..................................................................15

Tabelle 4: Ausmaß und Faktoren der Unterschiede im δ13C-Wert von C3-Pflanzen ................21

Tabelle 5: Jahresdurchschnittliche δ18O-Werte des Niederschlags in den Hauptanbau-

gebieten der Pistazien...............................................................................................27

Tabelle 6: Geografische Lage zentraler Städte in den Pistazienanbaugebieten der drei

Hauptproduzenten Iran, Türkei und USA................................................................28

Tabelle 7: Ergebnisse der Kalibrierung der Feststoff-Arbeitsstandards mittels IAEA-

Referenzmaterialien .................................................................................................45

Tabelle 8: Ergebnisse der Referenzgas-Kalibrierung (Mittelwerte aus verschiedenen

Standards und Sequenzen) .......................................................................................45

Tabelle 9: Ermittelte lineare Arbeitsbereiche für die 13C-, 15N- und 18O-Methode ...................49

Tabelle 10: δ13C-Ergebnisse des Vergleichs der Standardabweichung von 10 einzelnen

Pistaziennüssen und einer 20 g-Mischprobe derselben Tüte...................................50

Tabelle 11: δ15N-Ergebnisse des Vergleichs der Standardabweichung von 10 einzelnen

Pistaziennüssen und einer 20 g-Mischprobe derselben Tüte...................................51

Tabelle 12: δ18O-Ergebnisse des Vergleichs der Standardabweichung von 10 einzelnen

Pistaziennüssen und einer 20 g-Mischprobe derselben Tüte...................................51

Tabelle 13: Minimale, maximale und mittlere Differenz zwischen den δ-Werten von Haut ↔

Kern und Schale ↔ Kern aus der Untersuchung von einzelnen Pistaziennüssen ...52

Tabelle 14: Pearson-Korrelationsmatrix für δ13C von Schale, Haut und Kern............................52

Tabelle 15: Pearson-Korrelationsmatrix für δ15N von Haut und Kern ........................................53

Tabelle 16: Pearson-Korrelationsmatrix für δ18O von Schale, Haut und Kern............................53

Tabelle 17: Überprüfung der Methoden-Richtigkeit mittels der Arbeitsstandards und Proben

bekannten δ-Werts ...................................................................................................55

Tabelle 18: Ergebnisse der Ermittlung der Präzisionsdaten für die 13C-Methode .......................56

Tabelle 19: Ergebnisse der Ermittlung der Präzisionsdaten für die 15N-Methode.......................56

Tabelle 20: Ergebnisse der Ermittlung der Präzisionsdaten für die 18O-Methode.......................57

Tabelle 21: Daten für die Qualitätsregelkarten zur Kontrolle der Verfahrensstabilität aus der

Vorperiode ...............................................................................................................59

Tabelle 22: Ergebnisse der Alterungsstudie mit Pistazien...........................................................60

Tabelle 23: Vergleich der δ-Werte zweier Öle vor und nach Soxhlet-Extraktion.......................62

Tabellenverzeichnis

Tabelle 24: Vergleich der δ-Wert-Ergebnisse nach der Extraktion mit der Soxhlet- und

der ASE-Methode....................................................................................................63

Tabelle 25: Ergebnisse des Vergleichs der Mittelwerte (n = 5) von sechs ASE-Extraktionen

einer Pistazienprobe................................................................................................. 64

Tabelle 26: Einfluss des Röstens und Salzens auf den δ13CPDB-Wert..........................................66

Tabelle 27: Einfluss des Röstens und Salzens auf den δ15NAir-Wert........................................... 67

Tabelle 28: Einfluss des Röstens und Salzens auf den δ18OVSMOW-Wert .................................... 67

Tabelle 29: Zusammenfassung der Box-Plot-Ausreißer und -Extremwerte des authentischen

Datenmaterials der USA.......................................................................................... 75

Tabelle 30: Zusammenfassung der Box-Plot-Ausreißer und -Extremwerte des authentischen

Datenmaterials der Türkei ....................................................................................... 75

Tabelle 31: Zusammenfassung der Grubbs-/Nalimov-Test-Ausreißer des authentischen

Datenmaterials des Irans..........................................................................................77

Tabelle 32: Zusammenfassung der Grubbs-/ Nalimov-Test-Ausreißer des authentischen

Datenmaterials der USA.......................................................................................... 77

Tabelle 33: Zusammenfassung der Grubbs-/Nalimov-Test-Ausreißer des authentischen

Datenmaterials der Türkei ....................................................................................... 78

Tabelle 34: Signifikanzergebnisse (P = 95%) des K-S-Normalverteilungstests vom

authentischen Datenmaterial ohne Ausreißer..........................................................80

Tabelle 35: Signifikanzergebnisse des Levene-Tests auf Varianzhomogenität........................... 81

Tabelle 36: Signifikanz-Ergebnisse multipler Vergleichstests....................................................82

Tabelle 37: Korrelationskoeffizienten nach Pearson für die Variablen der authentischen

Proben...................................................................................................................... 84

Tabelle 38: Ergebnis des Bartlett-Tests und Wert des KMO-Kriteriums....................................94

Tabelle 39: Ergebnisse des MSA-Maßes..................................................................................... 94

Tabelle 40: Eigenwerte und prozentueller Beitrag der Komponenten zur Erklärung der

Gesamtvarianz ......................................................................................................... 95

Tabelle 41: Anfängliche und mit zwei Faktoren extrahierte Kommunalitäten............................ 96

Tabelle 42: Komponentenmatrix.................................................................................................. 97

Tabelle 43: Rotierte Komponentenmatrix....................................................................................97

Tabelle 44: Ergebnis der schrittweisen Diskriminanzanalyse mit allen Variablen des

authentischen Datensatzes der Pistazien................................................................ 101

Tabelle 45: Ergebnis der schrittweisen Diskriminanzanalyse mit sechs Variablen...................102

Tabelle 46: Maßzahlen zur Überprüfung der Modellgüte der Diskriminanzanalyse mit 3

und 2 Variablen......................................................................................................104

Tabelle 47: Wilks´ Lambda und χ²-Test zur Bewertung der Modellgüte .................................. 104

Tabelle 48: Struktur-Matrix der 3-Variablenkombination......................................................... 105

Tabellenverzeichnis

Tabelle 49: Struktur-Matrix der 2-Variablenkombination.........................................................105

Tabelle 50: Klassifikationsmatrix mit den Ergebnissen der 3- und 2-Variablenkombination

nach der R-, L- und H-Methode.............................................................................108

Tabelle 51: Fisher-Klassifikationsmatrix mit den Ergebnissen der 3- und 2-Variablen-

kombination nach der R- und H-Methode .............................................................110

Tabelle 52: Klassifikationsmatrix aus der Diskriminanzanalyse der 3- und 2-Variablen-

kombination der Pistazien-Gesamtnuss mit den Ergebnissen nach der R-, L-

und H-Methode ......................................................................................................114

Abbildungsverzeichnis

xii

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Separationsergebnis nach Ländern von Pistazienproben mit einer Auftragung

des C/N-Verhältnisses gegen den δ15N-Wert........................................................ 3

Abbildung 2: Nährstoffzusammensetzung [%] von Pistazien.....................................................6

Abbildung 3: Klimadiagramme der iranischen Städte Kerman, Shiraz und Yazd...................... 8

Abbildung 4: Klimadiagramme der amerikanischen Stadt Fresno (California Central Valley)

und der türkischen Stadt Urfa ............................................................................... 8

Abbildung 5: Pistazienweltproduktion 2003............................................................................... 9

Abbildung 6: Hauptexporteure (links) und -importeure (rechts) von Pistazien 2003................. 9

Abbildung 7: Irankarte und Hauptexportländer für iranische Pistazien 2003........................... 10

Abbildung 8: Türkeikarte und Hauptexportländer für türkische Pistazien 2003 ...................... 10

Abbildung 9: Kalifornienkarte und Hauptexportländer für amerikanische Pistazien 2003...... 11

Abbildung 10: Hauptimport- (links) und Exportländer (rechts) Deutschlands 2003.................. 11

Abbildung 11: Strukturformel Aflatoxin B1................................................................................12

Abbildung 12: δ13C-Verteilung des Kohlenstoffs in der Natur................................................... 16

Abbildung 13: Querschnitte durch Blätter von C3- und C4-Pflanzen mit schematischer Darstel-

lung der relevanten Schritte bei den unterschiedlichen Photosynthesewegen.... 17

Abbildung 14: δ13C-Werte verschiedener Kohlenstoffpools ...................................................... 18

Abbildung 15: δ15NAir-Werte verschiedener Stickstoffpools...................................................... 22

Abbildung 16: Stickstoffkreislauf der wichtigsten N-Verbindungen zwischen Atmosphäre,

Boden und Grundwasser..................................................................................... 23

Abbildung 17: Schematische Darstellung der verschiedenen, natürlichen Faktoren, die auf

das Sauerstoffisotopenverhältnis der Pflanzen Einfluss nehmen........................ 25

Abbildung 18: Schema des globalen Wasserkreislaufs............................................................... 26

Abbildung 20: Durchschnittliche δ18OVSMOW-Zusammensetzung des Niederschlags in Nord-

Amerika 2001......................................................................................................27

Abbildung 21: Zusammenhang zwischen den primären Sauerstoffquellen und den δ18O-

Werten organischer Komponenten und funktionellen Gruppen ......................... 30

Abbildung 22: δ18OVSMOW-Werte verschiedener Sauerstoffpools ..............................................30

Abbildung 23: δ15N- und δ18O-Werte verschiedener Düngernitrate...........................................31

Abbildung 24: Schema der Ionenoptik eines Finnigan Deltaplus-IRMS...................................... 33

Abbildung 25: Schema des Aufbaus und der Funktionsweise des EA.......................................34

Abbildung 26: Schema der Funktionsweise eines ConFlo IITM-Interfaces im Dualgasmode.....35

Abbildung 27: Schema des Aufbaus und der Funktionsweise des TC/EA................................. 36

Abbildung 28: Qualitätsregelkarte Acetanilid zur Überprüfung der CO2-Referenzgas-

kalibrierung......................................................................................................... 47

Abbildungsverzeichnis

xiii

Abbildung 29: Qualitätsregelkarte Acetanilid zur Überprüfung der N2-Referenzgas-

kalibrierung .........................................................................................................47

Abbildung 30: Qualitätsregelkarte Cellulose zur Überprüfung der CO-Referenzgas-

kalibrierung .........................................................................................................48

Abbildung 31: Lineare Regression zwischen δ13C von Haut und Kern......................................52

Abbildung 32: Lineare Regression zwischen δ15N von Haut und Kern......................................53

Abbildung 33: Lineare Regression zwischen δ18O von Haut und Kern......................................53

Abbildung 34: Qualitätsregelkarte von Atropin (GKP) zur Prüfung der Verfahrensstabilität

der 13C-Methode..................................................................................................59

Abbildung 35: Qualitätsregelkarte von Atropin (GKP) zur Prüfung der Verfahrensstabilität

der 15N-Methode..................................................................................................59

Abbildung 36: Qualitätsregelkarte von Benzoesäure (GKP) zur Prüfung der Verfahrens-

stabilität der 18O-Methode...................................................................................60

Abbildung 37: Überblick über das untersuchte Probenmaterial..................................................70

Abbildung 38: Box-Plot-Darstellung der δ13C-Messwerte des authentischen Datensatzes........71

Abbildung 39: Box-Plot-Darstellung der δ15N-Messwerte des authentischen Datensatzes........72

Abbildung 40: Box-Plot-Darstellung der δ18O-Messwerte des authentischen Datensatzes........72

Abbildung 41: Auftragung der δ13CPDB- gegen die δ15NAir-Messwerte der authentischen

Pistazien ..............................................................................................................90

Abbildung 42: Auftragung der δ15NAir- gegen die δ18OVSMOW-Messwerte der authentischen

Pistazien ..............................................................................................................90

Abbildung 43: Auftragung der δ13CPDB- gegen die δ18OVSMOW-Messwerte der authentischen

Pistazien ..............................................................................................................91

Abbildung 44: Wiederholung der Abbildung 1 zum Vergleich..................................................91

Abbildung 45: Grafische Darstellung der Varimax-rotierten Faktorwerte aus der

Hauptkomponentenanalyse mit dem authentischen Pistaziendatensatz..............98

Abbildung 46: Grafische Darstellung der Funktionswerte aus der Diskriminanzanalyse mit

3 Variablen........................................................................................................111

Abbildung 47: Grafische Darstellung der Funktionswerte und Trenngeraden aus der

Diskriminanzanalyse mit 2 Variablen...............................................................112

Abbildung 48: Grafische Darstellung der Funktionswerte aus der Diskriminanzanalyse mit

den 3 Pistazien-Gesamtnussvariablen...............................................................115

Abbildung 49: Grafische Darstellung der Funktionswerte und Trenngeraden aus der

Diskriminanzanalyse mit den 2 Pistazien-Gesamtnussvariablen......................115

Abbildung 50: Grafische Darstellung der Klassifizierung von Handelsproben mit deklarierter

Herkunft durch das 3-Variablen-Diskriminanzmodell aus Kapitel 6.3.2..........118

Abbildungsverzeichnis

xiv

Abbildung 51: Grafische Darstellung der Klassifizierung von Handelsproben unbekannter

Herkunft durch das 3-Variablen-Diskriminanzmodell aus Kapitel 6.3.2 ......... 119

Abbildung 52: Grafische Darstellung der Klassifizierung von USA-Iran-Mischproben

verschiedener Verhältnisse durch das 3-Variablen-Diskriminanzmodell aus

Kapitel 6.3.2...................................................................................................... 121

Abbildung 53: Grafische Darstellung der Klassifizierung von USA-Iran-Mischproben

verschiedener Verhältnisse durch ein 2-Länder-Diskriminanzmodell im

Vergleich mit der δ18OVSMOW-Messreihe des Öls............................................. 122

Abbildung 54: Klassifizierung der Ausreißer aus dem authentischen Pistaziendatensatz mit

dem 3-Variablenmodell..................................................................................... 123

Abbildung 55: Klassifizierung der Ausreißer aus dem authentischen Pistaziendatensatz mit

dem 2-Variablenmodell..................................................................................... 124

Abbildung 56: Wiederholung der Abb. 46 aus Kap. 6.3.5 (Darstellung der Diskriminanz-

funktionswerte) ................................................................................................. 138

Abbildung 57: Auftragung der δ13CPDB- gegen die δ18OVSMOW-Messwerte der authentischen

Pistazienöle ....................................................................................................... 138

Abkürzungsverzeichnis

$ Dollar

% Prozent

∅ Durchmesser

°C Grad Celsius

µg Mikrogramm

‰ Promille

AAS Atomabsorptionsspektrometrie

Abb. Abbildung

Abk. Abkürzung

AES Atomemissionsspektroskopie

Air Stickstoff der Luft: Bezugstandard für Stickstoffisotopenmessung

allg. allgemein

Anm. Anmerkung

ANOVA ANalysis Of VAriance

ASE Accelerated Solvent Extraction

BfR Bundesinstitut für Risikobewertung (ehemals BgVV)

BgVV Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin

C Kohlenstoff

ca. circa

CAM Crassulacean Acid Metabolism

CO Kohlenmonoxid

CO2 Kohlendioxid

DSC Differential Scanning Calorimeter

EA Elemental Analyser: Elementaranalysator

EG Europäische Gemeinschaft

et al. et alii: und andere

EU European Union

Forts. Fortsetzung

g Gramm

GC Gaschromatografie

GFS Gemeinsame Forschungsstelle

GISP Greenland Ice Sheet Precipitation: Referenzwasser der IAEA

GNIP Global Network of Isotopes in Precipitation

H Wasserstoff

H2O Wasser

Abkürzungsverzeichnis

xvi

ha Hektar

He Helium

HPLC High Pressure Liquid Chromatography: Hochdruckflüssigkeitschromatrografie

IAEA International Atomic Energy Agency: Internationale Atomenergiebehörde

ICP Inductive Coupled Plasma

int. international

IRMS Isotope Ratio Mass Spectrometry: Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie

Kap. Kapitel

kg Kilogramm

kJ Kilojoule

km² Quadratkilometer

LFGB Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch

LSD paarweiser multipler Vergleichstest auf geringste signifikante Differenz

m Meter

mg Milligramm

MHmV Mykotoxin-Höchstmengenverordnung

min. Minute

mm Millimeter

N Stickstoff

NMR Nuclear Magnetic Resonance

Nr. Nummer

O Sauerstoff

o.g. oben genannt

p Signifikanz

P Wahrscheinlichkeitsniveau

PDB Pee Dee Belemnite: Bezugsstandard für die Kohlenstoffisotopenmessung

r Wiederholbarkeit

R Vergleichbarkeit

r.F. relative Luftfeuchtigkeit

Ref.gas Referenzgas

s Sekunde

s Standardabweichung

S Spannweite

s. siehe

s.o. siehe oben

sog. so genannt

Std. Standard

Abkürzungsverzeichnis

xvii

t Tonne

Tab. Tabelle

TC/EA High Temperature Combustion Elemental Analyser: Pyrolyseeinheit

ü.d.M. über dem Meeresspiegel

vgl. vergleiche

VO Verordnung

VSMOW Vienna Standard Mean Ocean Water:

Bezugstandard für Sauerstoffisotopenmessung und Referenzwasser der IAEA

x Mittelwert

X Mittelwert der Mittelwerte (Gesamtmittelwert)

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

zw. zwischen

Σ Summe

1. Problemstellung

xviii

1. Problemstellung

Die Hauptanbaugebiete von Pistazien liegen im Iran und den USA. Diese beiden Länder teilen

sich fast den gesamten Pistazien-Weltmarkthandel, jedoch erzielen die USA aufgrund moderne-

rer Erntemethoden eine bessere Qualität hinsichtlich der Schimmelpilzbelastung. Daraus resul-

tiert ein etwas höherer Weltmarktpreis für amerikanische Pistazien. Bei iranischen Pistazien (wie

auch bei türkischen) wird häufiger eine Überschreitung des Mykotoxingrenzwerts (MHmV) ge-

funden und daher unterliegen diese einer Vorführpflicht in der Europäischen Union (EU), ameri-

kanische jedoch nicht. Aus diesem Grund kommt es immer wieder vor, dass iranische Ware um-

etikettiert und als teurere, amerikanische verkauft wird, so dass der Verbraucher gemäß §11 des

deutschen Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuches (LFGB) getäuscht wird.

Die EU zeigt an Methoden zur Feststellung der geografischen Herkunft von Lebensmitteln auch

ein großes Interesse, was die Inhalte der Forschungsthemen des 5. und 6. Rahmenprogramms

zeigen. Es wird nicht mehr nur der gesundheitliche Verbraucherschutz gefördert, sondern auch

der Schutz von Lebensmitteln, die sich durch die Produktion in einer bestimmten Region quali-

tätsmäßig und damit auch preislich hervorheben. Bei hochwertigen Lebensmitteln besteht somit

immer die Gefahr einer Nachahmung, Verfälschung oder falschen Deklaration von Lebensmit-

teln. Daher wird im Anhang 2 der Entscheidung des Rats vom 30. September 2002

(2002/836/EG) als ein Kernbereich die „öffentliche Sicherheit und Betrugsbekämpfung“ ge-

nannt. In der näheren Erklärung heißt es explizit: „Die GFS beabsichtigt, die Anwendung neuer

Technologien zu prüfen ... Korrelation der Isotopen-Analysen von Getränken und Lebensmitteln

zur Bestimmung von Bestandteilen und Herkunft ...“. Des Weiteren heißt es in der Entscheidung

des Rats vom 30. September 2002 (2002/834/EG) im Anhang 1 unter dem Ziel 1.1.5 „Lebens-

mittelqualität und -sicherheit“: „Im Mittelpunkt der Forschung werden folgende Themen stehen:

... Implementierung und Validierung von Methoden für die gesamte Lebensmittelkette; Sicher-

stellung der Unverfälschbarkeit; Echtheit von Kennzeichnungen ...“.

Aus diesen Gründen besteht hier (vor allem in der Lebensmittelüberwachung) der Bedarf an ei-

ner effizienten Methode, um die geografische Herkunft von Pistazien in Handelsware ermitteln

und ihre Kennzeichnung überprüfen zu können. Das Hauptziel dieser Arbeit soll daher die Ent-

wicklung einer Methode sein, mit der Pistazien der beiden Hauptanbauländer Iran und USA un-

terschieden werden können, sowie auch die der Türkei, da diese gleichermaßen einer Vorführ-

pflicht in der EU unterliegen und häufig auf dem deutschen Markt zu finden sind.

2. Einleitung

Pistazien werden in ihrem Ursprungsland Iran häufig noch traditionell per Hand durch Schütteln

des Baums und Aufsammeln der heruntergefallenen Nüsse von Matten geerntet. Dadurch kann

neben Schmutz und Mikroorganismen auch der Schimmelpilz Aspergillus flavus in die geöffne-

ten Schalen gelangen, der als Ausscheidungsprodukt die hoch krebserzeugenden Aflatoxine bil-

det. Feuchtigkeit und Wärme unterstützen zudem ein rasches Wachstum dieses Schimmelpilzes.

Dies stellt vor allem bei iranischen Pistazien ein Problem dar, da sie oftmals nicht ausreichend

getrocknet werden und noch lange in schlecht gelüfteten Silos lagern, bevor sie zur Weiterverar-

beitung (Rösten und Salzen) mit Containerschiffen in die Verbraucherländer transportiert wer-

den.

1997 wurden bis zu 70 % der iranischen Pistazienlieferungen aufgrund zu hoher Aflatoxinwerte

an den europäischen Grenzen abgelehnt und die EU reagierte darauf mit einem europaweiten

Einfuhrstopp. Eine Pistazienverordnung (97/830/EG) löste Ende 1997 das Einfuhrverbot durch

eine noch heute gültige Einfuhrbeschränkung ab. Seitdem müssen von allen iranischen Pistazien-

importen Proben genommen und auf ihre Unbedenklichkeit hin untersucht werden. Seit 2002 gilt

diese Vorführpflicht auch für Pistazien aus der Türkei (2002/80/EG). Im Gegensatz dazu werden

die Pistazien in den USA rein maschinell geerntet, gewaschen, getrocknet, sortiert und meist

noch auf der Ranch geröstet und gesalzen. Die Ware ist daher kaum aflatoxinkontaminiert, so

dass amerikanische Pistazien auf dem Weltmarkt einen höheren Preis erzielen und keinerlei Ein-

fuhrkontrollen unterliegen. USA-Pistazien sind daher aus Gewinngründen dazu geeignet, mit den

günstigeren iranischen verschnitten oder ganz ausgetauscht zu werden. Desgleichen können auch

die zwar kleinen, aber geschmacklich hochwertigen türkischen Pistazien mit iranischen ver-

schnitten oder ausgetauscht sein, da ihr Weltmarktpreis noch viel höher liegt. Eine Methode zur

Feststellung der geografischen Herkunft von Pistazien wäre daher für die Lebensmittelüberwa-

chung sehr hilfreich.

Eine Literaturstudie hinsichtlich Veröffentlichungen, die sich mit der geografischen Herkunft

von Pistazien befassen, erbrachte nur wenige Ergebnisse. 1989 und 1990 wurden von S.M.

Dyszel et al.[73,74] zwei Arbeiten herausgebracht, die aus der Datenkombination eines sehr hohen

Geräteaufwands (HPLC, DSC, AAS/ICP bzw. GC) iranische, kalifornische und türkische Pista-

zien unterscheiden konnten. Die untersuchte Probenanzahl wurde in den Artikeln nicht genannt.

R. Schwartz und L. Hecking[241] beschrieben 1991 eine weitere langwierige und komplizierte

Methode aus ICP-AES, AAS und mulivariater Statistik, mit der Pistazienproben aus sechs ver-

schiedenen Ländern richtig klassifiziert werden konnten. Es wurden jedoch insgesamt nur 33

Proben untersucht, was für eine aussagekräftige statistische Auswertung zu wenig ist und einen

sog. „Lasso-Effekt“ (näheres s. Kap. 3.4.2) erzeugt.

2. Einleitung

Ein weiterer Versuch, die Authentizität von Pistazien aus den drei Haupterzeugerländern Iran,

Kalifornien (USA) und Türkei nachzuweisen, wurde erst kürzlich von K. Anderson und B. Smith

(2005)[7] unternommen. Hier wurde die Trennung der drei Länder mit Hilfe der ICP-AES-

Technik und multivariater Methoden (u.a. Haupkomponenten- und Diskriminanzanalyse) ver-

sucht. Anders als bei dem Versuch von R. Schwartz und L. Hecking (1991)[241], wurden hier

knapp 380 Proben aus zwei aufeinander folgenden Erntejahren vermessen, jedoch sind die Pro-

benzahlen pro Land und Erntejahr sehr unterschiedlich. Es konnte eine grafisch sichtbare Auf-

trennung der ICP-MS-Daten in drei Punktwolken erreicht werden, jedoch kommen Überlappun-

gen vor (Klassifikationsmatrix gibt Zuordnungssicherheit zwischen 65-100 % aus). Bei der Tür-

kei treten hierbei die größten Fehlerraten auf. Als Erklärung dafür wurden von den Autoren die

vorher mit der ANOVA nachgewiesenen, saisonalen Unterschiede, eine breitere geografische

Streuung der gesammelten Proben aus dem Jahr 2001 und evtl. Sortenunterschiede postuliert.

Neben der ICP-AES-Messung wurde von K. Anderson und B. Smith[7] auch ein Teil (n=71) des

Gesamtdatensatzes aus 2001 auf δ13C- und δ15N-Isotopendaten sowie das gesamt C/N-Verhältnis

vermessen. Die von den ICP-MS-Daten separate, statistische Auswertung der δ-Werte blieb

univariat, da mit einer Auftragung des C/N-Verhältnisses gegen den δ15N-Wert die kaliforni-

schen Proben klar von den anderen abgetrennt sind. Die Punktwolken der türkischen und irani-

schen Pistazienproben liegen jedoch sehr nahe beieinander und eine klare Trennung ist hier nicht

zu erkennen. Außerdem können mit diesem Modell unbekannte Proben, die in diesen Schnitt-

mengenbereich fallen, nicht klar identifiziert werden. Die nachfolgende Abbildung 1 zeigt das

Ergebnisdiagramm von K. Anderson und B. Smith[7].

Abbildung 1:

Separationsergebnis nach Ländern von Pis-

tazienproben mit einer Auftragung des C/N-

Verhältnisses gegen den δ15N-Wert

Originalgrafik verändert nach Anderson et

al.[7]

Die Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS) hat sich schon häufig in der Lebensmittel-

analytik auf den Gebieten des Authentizitäts- und Verfälschungsnachweises als leistungsstark

bewährt. Die Methodik nutzt aus, dass in der Natur sog. Isotopeneffekte auftreten, durch die es

zu erheblichen globalen Unterschieden in der Isotopenzusammensetzung kommt, die sich wie-

derum in den Pflanzen und damit auch in den daraus hergestellten Lebensmitteln niederschlagen.

2. Einleitung

Daher können über einzelne Stabilisotopengehalte (Bioelemente H, O, C, N) oder deren Kombi-

nation z.B. die Herkunft hochwertiger Lebensmittel wie Wein[30,94,109,115,136,222], Vanillin[125,188],

Honig[188,218,301], Olivenöl[154,249,250], Kaffee[52,188,276] oder Tee[279,280] unterschieden werden.

Außerdem eignet sich diese Technik auch zur Unterscheidung von Pflanzenarten oder syntheti-

schen von natürlichen Produkten. So kann z.B. die Zuckerung von Honig[218,288,290,291], Frucht-

saft[68,104,161,169,219] und Wein[91,220,221], der Ersatz von natürlichen Aromen durch synthetisch her-

gestellte[20,27,29,33,225] oder die Rohstoffgrundlage von Whisky[188,195] oder Tequila[16] mit der Iso-

topenmassenspektrometrie festgestellt werden. Ein umfassender Übersichtsartikel über die An-

wendung der Stabilisotopenanalytik zur Bestimmung der Herkunft und Authentizität von Le-

bensmitteln wurde erst kürzlich von Schmidt et al. (2005)[233] veröffentlicht.

Nach den Ergebnissen von Anderson et al.[7] wird daher angenommen, dass die Frage nach der

geografischen Herkunft von amerikanischen, iranischen und türkischen Pistazien mit Hilfe einer

einfachen und schnellen IRMS-Methode eindeutiger gelöst werden könnte. Es stand in dieser

Arbeit neben dem Elementaranalysator (EA) zur Messung des Kohlenstoff- und Stickstoffisoto-

penverhältnisses auch eine Pyrolyseeinheit (TC/EA) zur Sauerstoffbestimmung bereit. Diese

Geräte erlauben schnelle Analysenzeiten (ca. 10 Minuten) und eine einfache Probenvorbereitung

(Einwaage der zermahlenen Probe). Da evtl. eine multivariate Datenanalyse zur Auswertung in

Frage kam, musste eine genügend große Anzahl authentischer Proben vermessen werden (min-

destens 30 authentische Proben pro Land). Außerdem sollten auch bestimmte Pistazieninhalts-

stoffe (z.B. Öl, Eiweiß, Zucker) vermessen werden, da in der Literatur eine Isotopendiskriminie-

rung in den Sekundärstoffwechseln der Pflanzen beschrieben wird, die zu einer Verschärfung der

Messwertunterschiede führen könnte.[216,228,293,294] Literaturveröffentlichungen auf dem Gebiet

der IRMS bezüglich der Frage nach Pistazien- oder allg. Nussauthentizität konnten zum Zeit-

punkt des Beginns dieser Arbeit nicht gefunden werden. Daher überschneiden sich die Untersu-

chungen und Ergebnisse teilweise mit der Arbeit von Anderson et al.[7], die nach den Angaben

der untersuchten Erntejahre (2000 und 2001) zur gleichen Zeit durchgeführt wurde.

Im Rahmen einer Diplomarbeit wurden zusätzlich von K. Zur (2004)[302] ein Großteil der ge-

wonnen Pistazienöle mittels 1H- and 13C-NMR-Spektroskopie vermessen, um die Frage nach der

Herkunft von Pistazien über ihre klimaabhängige Fettsäurezusammensetzung mit dieser Technik

zu testen. Mit Hilfe multivariater Statistik konnte hier eine 100 %ige Trennung in die drei

Hauptanbaugebiete Iran, USA und Türkei erreicht werden, allerdings dauert die Messung mit

dem NMR wesentlich länger als eine IRMS-Messung und ist kostenintensiver.

3. Allgemeiner Teil

Allgemeiner Teil

3. Allgemeiner Teil

3.1 Pistazien

Die Pistazie (Pistachia vera, „Grüne Man-

del“) kommt ursprünglich aus dem Mittleren

Osten und wurde bereits vor über 4000 Jah-

ren in Assyrien in Kultur genommen. Sie

gehört zur Familie der Anacardiaceae und ist

botanisch eine Steinfrucht und damit mit der

Cashewnuss und der Mango verwandt. Sie ist

sehr einweiß- und fettreich (Energiegehalt:

2405 kJ/100 g) und liefert unter allen Nüssen

den höchsten Gehalt an Eisen (7,3 mg/100 g)

und Kalium (1020 mg/100 g).[35,96,248,258]

Abbildung 2:

Nährstoffzusammensetzung [%] von Pistazien

Ein Pistazienbaum kann bis zu 10 m hoch und 200-300 Jahre alt werden und kommt in beiden

Geschlechtern vor (nur der weibliche trägt die Nüsse). Er wächst sehr langsam und hat wie viele

andere Nussbäume eine zweijährige Fruchtfolge (abwechselnd große und kleine Ernten), so dass

Spitzenerträge von bis zu 40 kg Früchten (1,8-3,4 t/ha) erst nach ca. 20 Jahren erzielt werden

können. Eine adäquate Düngung mit kommerziellen oder organischen Düngern ist außerdem

unerlässlich für ein gutes Wachstum und hohe Ernteerträge.[43,96,286]

Pistazien wachsen in traubenähnlichen Gruppen und während des Reifungsprozesses färbt sich

die äußere Haut des Fruchtfleisches rosa und die innere Schale wird durch den wachsenden grü-

nen Kern auf natürliche Weise am vorderen Teil gespalten. Sobald sich die äußere Fruchtfleisch-

hülle von der inneren Schale trennt und der grüne Kern in seiner rötlich-violetten Samenschale

offen liegt, sind Pistazien erntereif.

In der Farbe des Kerns spiegeln sich hierbei die Sorten- und Qualitätsunterschiede wider: gelbli-

che Kerne sind von geringer Qualität, grüne von der besten.[96,286] Im traditionellen Hauptanbau-

land Iran gibt es insgesamt 60 Sorten, davon sind die gängigsten Momtaz (klein, aber teuer),

Kalleghuchi (sehr groß), Akbari (länglich), Badami (mandelförmig) und Fandoghi (rundlich).[95]

Sie werden dort meist sonnengetrocknet, ungeröstet und ungesalzen verzehrt, wie es auch im

übrigen Orient und Südeuropa üblich ist. Eine wichtige, auch aus dem Iran stammende Sorte, ist

die Kerman, die fast ausschließlich in Kalifornien angebaut wird. Sie bildet eine besonders große

Nuss und eine weitgespaltene Schale.[1,286]

Fett

51%

Eiweiß

17%

Ballaststoffe

11%

Mineralien

Kohlen-

hydrate

12%

Wasser

3.1 Pistazien

3.1.1 Ernte/Verarbeitung

Die Erntezeit der Pistazien liegt je nach Anbauregion im September/Oktober und dauert nur

3-6 Wochen an. Der Erntezeitpunkt ist sehr wichtig, um eine möglichst große Menge an natür-

lich gespaltenen („lachenden“) Nüssen zu erzielen, die jedoch noch nicht von selbst zu Boden

gefallen sind. Zu Boden gefallene Pistazien würden eine sehr aufwändige Reinigung verursa-

chen, da der grüne Kern durch die natürlich geöffneten Schalen frei zugänglich für Schmutz und

Mikroorganismen ist.[1,286]

Pistazien werden entweder maschinell vom Baum geschüttelt und in eine Auffangeinreichung

geworfen („tree/trunk-shakers“), ohne den Boden zu berühren (pro Baum weniger als eine Minu-

te erforderlich) oder, vornehmlich im Iran, noch traditionell per Hand vom Baum gepflückt, ge-

klopft oder geschüttelt und in am Boden ausgelegten Netzen oder Matten gesammelt. Danach

müssen sie innerhalb von 12 bis 24 Stunden enthülst und getrocknet werden, da andernfalls die

Fruchtfleischhülle Feuchtigkeit aufnimmt und sich dadurch die Schalen verfärben.[1,44,79,96,286]

Schälmaschinen („hullers“) befreien die Pistazien von ihrer rosa Fruchtfleischhülle, bevor sie in

riesigen Tanks gewaschen und von den an der Oberfläche schwimmenden, leeren Früchte (ca.

1/3 der Ernte) abgetrennt werden. Durch die nachfolgende Trocknung bei relativ niedrigen Tem-

peraturen (60 °C) bis auf 5-7 % Restfeuchtigkeit wird der Pilzwuchs und Insektenbefall vermie-

den. Das Gewichtsverhältnis zwischen frischen und geschälten, getrockneten Pistazien liegt etwa

bei drei zu eins. Anschließend werden die geöffneten von den geschlossenen Pistazien durch

eine rotierenden Röhre („needle picker“) getrennt, deren Innenwand mit einer weichen Nadel-

matte ausgelegt ist, die nur die geöffneten Pistazien aufnimmt. Die geschlossenen Pistazien kön-

nen dann separat weiterverarbeitet werden (z.B. maschinelle Öffnung der Schalen oder Entfer-

nung der Schalen zum Verkauf der Kerne). Ein elektronisches Auge sortiert fleckige Pistazien

aus, bevor sie nach Größe und letztendlich auch noch einmal per Hand sortiert werden. Durch

diesen Sortierungsprozess werden >99 % der defekten Nüsse erkannt, die meistens auch für die

Aflatoxinkontamination verantwortlich sind.

Am Ende werden die Pistazien geröstet und gesalzen (häufig erst in den Verbraucherländern),

indem sie durch Sprühdüsen mit einer Salzlösung besprüht oder darin gebadet werden. Dann

folgt die Röstung für ca. 20 Minuten bei ~170 °C. Kühl und trocken gelagert halten sich Pista-

zien bis zu zwei Jahre, jedoch verlieren sie schneller als andere Nüsse an Qualität, da sie auf-

grund ihres hohen Ölanteils leicht ranzig werden.[1,43,44,95,101]

3. Allgemeiner Teil

3.1.2 Klima

Pistazienbäume bevorzugen wüstenähnliche Regionen, denn sie benötigen kühle Winter und

lange, heiße, trockene Sommer. Sie können Temperaturen zwischen -25 °C und +45 °C aushal-

ten, kommen mit 250-380 mm Niederschlag aus und sind bezüglich des Bodens sehr anspruchs-

los. Daher verdrängten Pistazien im Iran wegen zunehmender Wasserknappheit in den fünfziger

Jahren Kulturen wie Baumwolle, Gerste und Weizen. Das Hauptanbaugebiet des Irans liegt in

der Provinz Kerman und speziell um die Stadt Rafsanjan, wo ein mildes bis trockenes Klima

herrscht und der meiste Regen im Februar und März fällt (100 mm jährlicher Nieder-

schlag).[95,96,258,286] Das amerikanische Pistazienanbaugebiet liegt vornehmlich im südlichen San

Joaquin Valley (Kalifornien). Auch dort ist das Klima während der Wachstumsperiode heiß und

trocken (~ 38 °C) und es fällt praktisch kein Regen zwischen Mai und Oktober. Daher müssen

die Pistazienfelder bewässert werden.[43]

Aus den nachfolgend abgebildeten Klimadiagrammen[185] (s. Abbildung 3 und 4) der zentralen

Städte der drei Hauptanbauländer Iran, USA und Türkei ist abzulesen, dass die Pistazienanbau-

gebiete des Irans wesentlich höher liegen (>1000 m) und trockener sind als die der Türkei und

vor allem der USA. Die Stadt Fresno im „California Central Valley“ liegt fast auf Meeresspie-

gelhöhe. Im türkischen Pistazienanbaugebiet um die Stadt Urfa herum fällt dagegen der meiste

Regen und es werden mit 18 °C recht hohe Durchschnittstemperaturen erreicht.

Abbildung 3: Klimadiagramme der iranischen Städte Kerman, Shiraz und Yazd

Abbildung 4:

Klimadiagramme der amerika-

nischen Stadt Fresno (California

Central Valley) und der türki-

schen Stadt Urfa

3.1 Pistazien

3.1.3 Wirtschaft

Wild wachsend sind Pistazien von Syrien bis Irak,

vom Nordost-Iran bis Nord-Afghanistan und sogar

in Indien anzutreffen. Gewerbsmäßig kultiviert

werden sie dagegen vor allem im Iran, den USA

(Kalifornien), der Türkei, Syrien, Griechenland

(Ägina), Italien (Sizilien) und China. Die Welt-

produktion an Pistazien aus dem Jahr 2003[286] ist

in Abbildung 5 als Kreisdiagramm prozentual

dargestellt.

Abbildung 5: Pistazienweltproduktion 2003

Der Iran ist traditionsgemäß mit über 60 % Weltmarktanteil das mit Abstand größte Erzeuger-

land von Pistazien und auch der mit Abstand weltgrößte Exporteur (s. Abbildung 6[261]). Pistazien

stellen dort nach Erdöl und Perserteppichen das drittwichtigste Exportgut dar.

Abbildung 6: Hauptexporteure (links) und -importeure (rechts) von Pistazien 2003

Das Hauptanbaugebiet des Irans liegt bei der Stadt Rafsanjan in der Provinz Kerman, die sich in

den klimatisch und geologisch besonders günstig liegenden trockenen Hochebene (1200-

1600 m) im Südosten des Landes befindet, daneben Yazd und Shiraz (s. Abbildung 7[261]). 95 %

der iranischen Pistazienproduktion kommen aus dieser Region, dies entspricht ungefähr 50 % der

weltweit erzeugen Gesamternte. Die Hauptabnehmer iranischer Pistazien waren im Jahr 2003 die

Arabischen Emirate, Deutschland und Hong Kong (s. Abbildung 7[261]).[95,215,258]

Andere

Türkei

Hong Kong

Italien

Niederlande

Belgien

Deutschland

USA

10%

Iran

72%

Export Gesamtwert: $ 928.029.844

Kalifornien

11%

Türkei

11%

Syrien

11%

Iran

64%

Italien

Griechenland

Gesamternte: 474.276 t

2003

Italien

Frankreich

China,

Hong Kong

15%

Niederlande

Libanon

Andere

28%

England

Belgien

Canada

Deutschland

17%

Import Gesamtwert: $ 664.633.728

3. Allgemeiner Teil

Abbildung 7: Irankarte und Hauptexportländer für iranische Pistazien 2003

In der Türkei hat der Pistazienan-

bau auch eine große Tradition,

hier begann der kommerzielle

Anbau im 18. Jahrhundert. Sie ist

das drittgrößte Erzeugerland und

das Hauptanbaugebiet liegt hier in

Südostanatolien, an der Grenze zu

Syrien. Die Pistazie wird nach

ihrem berühmten Herkunftsgebiet, der Provinz

Gaziantep, auch „Antep-Nuss“ genannt. Die

Hauptabnehmer für türkische Pistazien waren 2003

Griechenland, Italien, Deutschland, Israel und die

USA (s. Abbildung 8[261]).

Türkische Pistazien sind im Allgemeinen klein,

nur wenig geöffnet und haben eine dunkle Schale

und stehen damit ganz im Gegensatz zu den ame-

rikanischen Ansprüchen. Viele Kenner schätzen

die türkische Pistazie jedoch wegen ihres

Abbildung 8:

Türkeikarte und Hauptexportländer für

türkische Pistazien 2003

besonderen Aromas. Die dunkle Farbe entsteht

durch die Lagerung „in Rot“, d.h. die getrocknete

Fruchthülle wird nicht binnen 24 Stunden nach der

Ernte entfernt, sondern bis zur Verarbeitung an der

Schale belassen.[215]

Deutschland

19%

Russische

Föderation

Asien

Andere

21%

China,

Hong Kong

ereinigte

Arabische

Emirate

41%

Gesamtexport: 184.946 t

Gesamtwert: $ 679.939.648

Italien

23%

USA

Andere

27%

Israel

Deutschland

Griechenland

28%

Gesamtexport: 1.039 t

Gesamtwert: $ 6.251.208

3.1 Pistazien

Pistazien sind in Amerika erst seit 1976

(erste Ernteerfolge) für kommerzielle Zwe-

cke gezüchtet worden. Seitdem erhöhen

sich die Anbauflächen und Erträge stetig,

so dass die USA heute nach dem Iran der

Hauptproduzent von Pistazien ist. 98 % der

amerikanischen Pistazien werden in Kali-

fornien (Central Valley) auf ca. 356 km²

produziert, wobei die Hauptproduktions-

stätte aufgrund des wüstenähnlichen

Klimas im San Joaquin Valley liegt; kleine

Anbauflächen finden sich aber auch in

Arizona, New Mexico und West-Texas.

50 % der kalifornischen Ernte wurde 2003

exportiert, die Hauptabnehmer waren die

EU, Kanada und Japan (s. Abbildung

9[261]).[42,215]

Abbildung 9:

Kalifornienkarte und Hauptexportländer

für amerikanische Pistazien 2003

In Abbildung 6 ist außerdem zu erkennen, dass Deutschland als einer der größten Pistazienhänd-

ler der Welt fungiert. Aus den Im- und Exportdaten Deutschlands von 2003 (s. Abbildung 10[261])

ist zu ersehen, dass große Mengen Pistazien vornehmlich aus dem Iran (71 %) und den USA

(25 %) nach Deutschland importiert wurden. Ca. die Hälfte davon wurde im gleichen Jahr wie-

der weiter in andere europäische Länder exportiert.

Abbildung 10: Hauptimport- (links) und Exportländer (rechts) Deutschlands 2003

Italien

12%

Frankreich

10%

Niederlande

Luxemburg

Ande re

17%

Spanien

29%

England

15%

Gesamtexport: 12.717 t

Gesamtwert: $ 47.855.000

USA

25%

Türkei

Niederlande

Luxemburg

Iran

71%

Ande re

Griechenland

Gesamtimport: 21.669 t

Gesamtwert: $ 89.308.000

Luxemburg

16%

Frankreich

Kanada

Italien

Japan

Deutschland

Andere

17% Belgien

18%

Niederlande

12%

Gesamtexport: 23.770 t

Gesamtwert: $ 91.430.84

3. Allgemeiner Teil

3.1.4 Aflatoxinproblematik

Die Schimmelpilzarten Aspergillus flavus und parasiticus sind auf Produkten aus warmen,

feuchten Regionen zu finden, wie z.B. Pistazien, Getreide und anderen Schalen- und Trocken-

früchten. Sie sind potentiell sehr gefährlich, da sie als Stoffwechselprodukte die hochgiftigen

und mutagen wirkenden Aflatoxine bilden können. Die Ursache für eine hohe Schimmelpilz-

und Aflatoxinbelastung bei Pistazien liegt meist in einer unsorgfältigen Ernte, einer zu langsa-

men Trocknung oder einer zu feuchten oder zu warmen Lagerung. Die günstigsten Wachstums-

bedingungen für Aflatoxinbildner sind Temperaturen zwischen 25 und 40 °C, daher erfolgt die

Kontamination der Lebensmittel mit Aflatoxinen meist in den tropischen und subtropischen An-

bauländern und weniger im europäischen Raum mit seinen gemäßigten Klimazonen.[50,192] Um

die Bildung von Aflatoxinen zu vermeiden oder vorzubeugen, sollten u.a. beschädigte und

fleckige Nüsse aussortiert, der Wassergehalt auf ca. 6 % während der Lagerung reduziert und

Stahlsilos mit hoher Luftzirkulation als Lagerbehältnis verwendet werden.[1,43]

Aflatoxine gehören zu den stärksten bisher bekann-

ten Leberkanzerogenen und das Aflatoxin B1 (s.

Abb. 11) gilt als einer der stärksten krebsauslösen-

den Naturstoffe überhaupt. Die Pilzgifte sind un-

sichtbar und gehen durch Erhitzen/Rösten oder

andere Verarbeitungsschritte nicht oder nur gering-

fügig verloren. Auch durch Bestrahlung werden

Aflatoxine weder eliminiert noch verringert.[50,192]

Abbildung 11: Strukturformel Aflatoxin B1

Schimmelpilze befallen nur einzelne Nüsse und sind deswegen in einer Pistazienpartie nicht ho-

mogen verteilt (Nesterbildung). Daher spielt die richtige Probennahme eine große Rolle, um eine

möglichst verlässliche Aussage über den Grad einer Aflatoxinkontamination treffen zu können.

Aus diesem Grund sind von der EU-Kommission für Lebensmittel detaillierte Probenahmever-

fahren und -mengen (EG-Richtlinie 98/53/EG) festgelegt worden. Sie sind als repräsentativ für

eine betreffende Partie anzusehen, jedoch kann dadurch trotzdem nicht mit hundertprozentiger

Sicherheit gewährleistet werden, dass in einer Partie die Aflatoxingehalte unterhalb der zulässi-

gen Höchstgrenze liegen.[50,130]

Die Höchstgrenzen für Mykotoxine sind von der Europäischen Gemeinschaft in der Kontami-

nanten-Höchstgehaltverordnung (VO (EG) 466/2001) für bestimmte Lebensmittel (Schalen-

früchte, Trockenfrüchte, Getreide, Gewürze) festgelegt worden, während in der Bundesrepublik

OCH3

3.1 Pistazien

Deutschland die Mykotoxin-Höchstmengenverordnung (MHmV) die Grenzwerte für alle Le-

bensmittel regelt[50] (Aflatoxin B1: 2 µg/kg, Summe Aflatoxine B1, B2, G1 und G2: 4 µg/kg).

Zu hohen Aflatoxinbelastungen kommt es in Ländern wie dem Iran oder der Türkei, in denen

häufig noch traditionelle Erntemethoden angewendet werden. Die Pistazien werden dort von den

Bäumen geschüttelt und liegen danach längere Zeit in Netzen oder Matten auf dem Boden, d.h.

frei zugänglich für Schmutz und Mikroorganismen. Sie werden dann zwar gewaschen, getrock-

net und sortiert, aber teilweise lagern die Nüsse noch monatelang in schlecht belüfteten Kühl-

häusern, bevor sie verkauft werden.[130]

Pistazien aus dem Iran fielen daher wegen erhöhter Gehalte an Aflatoxinen in der Vergangenheit

immer wieder auf und die EU reagierte darauf mit der noch heute gültige Pistazien-Verordnung

(s. auch Einleitung), die eine strenge Kontrolle der Pistazien vor der Einfuhr in ein EU-

Mitgliedsland verlangt (Vorführpflicht §55 Abs. 1 Nr. 3 LFBG)[39]. So müssen Importeure Un-

bedenklichkeitsbescheinigungen (Gutachten von amtlich zugelassenen Laboratorien) aus dem

Erzeugerland Iran und dem EU-Importland vorweisen, um Pistazien in der EU in den Handel

bringen zu dürfen. Dies bedeutet, dass von jeder Partie iranischer Pistazien eine Probe an den

gesetzlich festgelegten Eingangszollstellen (2004/429/EG) genommen wird. Im Jahr 2003 wur-

den in Schleswig-Holstein immer noch 34 % (359 Proben) der iranischen Pistazienpartien auf-

grund zu hoher Aflatoxinwerte abgelehnt, wobei sich vor allem Pistazien mit Schale als kritisch

erwiesen. Durch die verstärkten Untersuchungen auffälliger Erzeugnisse und Importeure musste

das für die amtlichen Untersuchungen in Hamburg zuständige Institut für Hygiene und Umwelt

jedoch beobachten, dass 2004 wesentlich weniger iranische Pistazien über Hamburg eingeführt

wurden.[214,252]

Da es auch bei Pistazien aus der Türkei immer wieder zu Überschreitungen der Mykotoxin-

höchstwerte kam, erließ die EU-Kommission im Februar 2002 eine gleichartige Sondervorschrift

(2002/80/EG) für türkische Pistazien.[50] Amerikanische Pistazien unterliegen dagegen keiner

gesetzlichen Vorführpflicht, da in den USA rein maschinell geerntet, getrocknet und sortiert

wird, was zu einer besseren Qualität hinsichtlich der Aflatoxinbelastung und dadurch auch zu

einem etwas höheren Weltmarktpreis führt (s. Tabelle 1).

Tabelle 1: Exportmengen und Handelswerte von Pistazien aus den drei Hauptanbauländern

2003 Exportmenge Handelswert Preis pro kg

Iran 184.946.224 kg $ 679.939.648 3,66 $/kg

USA 23.769.662 kg $ 91.430.848 3,85 $/kg

Türkei 1.039.321 kg $ 6.251.208 6,01 $/kg

Daten stammen von der Website www.unstats.un.org[261]

3. Allgemeiner Teil

3.2 Stabilisotope

Die meisten Bioelemente kommen in der Natur als Gemische mehrerer stabiler Isotope vor; da-

bei handelt es sich um Atome der gleichen Kernladungszahl, aber verschiedener Neutronenzahl.

Moleküle, die aus unterschiedlichen Isotopen aufgebaut sind, werden als Isotopomere bezeich-

net. In Tabelle 2 sind die wichtigsten stabilen Isotope der Bioelemente mit ihren relativen natür-

lichen Häufigkeiten aufgeführt. Es ist darin zu erkennen, dass im Allgemeinen bei weitem der

Anteil des “leichten” Hauptisotops überwiegt (>99 Atom-%).[40,159]

Tabelle 2: Relative natürliche Häufigkeiten der stabilen Isotope der Bioelemente

Element

Ordnungszahl

im PSE

stabile

Isotope

relative natürliche

Häufigkeit [Atom-%]

Wasserstoff 1 1H 99,985

2H 0,015

Kohlenstoff 6 12C 98,892

13C 1,108

Stickstoff 7 14N 99,634

15N 0,366

Sauerstoff 8 16O 99,759

17O 0,037

18O 0,204

Obwohl die Isotope eines Elements die gleiche Elektronenkonfiguration besitzen, bedingen die

geringfügigen Unterschiede in Kernmasse und -symmetrie ein unterschiedliches Verhalten bei

physikalischen und chemischen Prozessen. Dies wird als „Isotopeneffekt“ bezeichnet. Durch ihre

höhere Bindungsenergie reagieren z.B. Moleküle mit “schwereren Isotopen” im Allgemeinen

langsamer und reichern sich bei chemischen Umsetzungen im Ausgangspool an (Diskriminie-

rung). Die Auswirkungen dieses “kinetischer Isotopeneffekts” sind umso stärker, je größer die

relative Massendifferenz zweier Isotope ist, d.h. bei den Isotopen des Wasserstoffs ist der kineti-

sche Isotopeneffekt am stärksten ausgeprägt.[40,159,159,279]

Die physikalischen Eigenschaften von Molekülen wie chromatografisches Verhalten, Molvolu-

men oder Dampfdruck werden durch Isotope ebenfalls beeinflusst: Bei der Destillation verblei-

ben die schwereren Moleküle länger in der flüssigen Phase[93], bei der HPLC an Normalphasen

(z.B. Kieselgel) lösen sich die Kohlenstoffisotopomere mit höheren Massenzahlen langsamer

von der stationären Phase, während sie auf reversed-phase Säulen sowohl bei der HPLC als auch

3.2 Stabilisotope

bei der GC schneller eluieren.[28,106] Dieses Verhalten wird als “thermodynamischer Isotopenef-

fekt” bezeichnet.[40,279]

Kinetische und thermodynamische Isotopeneffekte finden auch bei der Biosynthese von Molekü-

len in Pflanzen und Tieren statt, so dass in der Natur nicht die mittleren Isotopenverteilungen der

Bioelemente (s. Tabelle 2) sondern unterschiedliche Isotopenverhältnisse vorkommen. Derzeit

sind schon viele biochemische Umsetzungen in der Natur aufgedeckt worden, bei denen eine

Fraktionierung der stabilen Isotope der Bioelemente stattfindet. Dies wird in den nachfolgenden

Kapiteln 3.2.1, 3.2.2 und 3.2.3 näher ausgeführt.

Für die Angabe des Isotopenverhältnisses einer Probe wird der sog. delta

(δ)

-Wert in Promille

(‰) verwendet. Der δ-Wert gibt an, wie stark die Isotopenzusammensetzung einer Probe von der

eines international festgelegten Standards abweicht. Das Verhältnis zwischen “schwerem” zu

“leichtem” Isotop in einer Probe kann mit

einem IRMS-Gerät sehr genau gemessen

werden. Nebenstehend ist die Formel für die

Berechnung des δ-Werts dargestellt.[159,294]

Aus der Formel für den δ-Wert folgt, dass der Anstieg des δ-Werts auch einen Anstieg des Ge-

halts an schwererem Isotop bedeutet und folglich eine reziproke Abnahme des leichteren

(Haupt-) Isotops.[199] Die internationalen Bezugsstandards für die einzelnen Bioelemente sind in

Tabelle 3 aufgeführt. Diese gibt zusätzlich die am häufigsten verwendeten Messgase und das in

der Regel gemessene Stabilisotopenverhältnis wieder. Die Standards sind fast nur von der inter-

nationalen Atomenergiebehörde (IAEA) in Wien zu beziehen, wegen Knappheit zum Teil sogar

nur in bestimmten Zeitabständen.

Tabelle 3: Internationalen Bezugsstandards, typische Messgase und Isotopenverhältnisse der Bio-

elemente für die IRMS Messung

Element Messgas Verhältnis internationaler Bezugsstandard Abk.

Wasserstoff H2 D/H Vienna Standard Mean Ocean Water VSMOW

Kohlenstoff CO2 13C/12C Pee Dee Belemnite* (fossiles CaCO3) PDB

Stickstoff N2 15N/14N Stickstoffgas der Luft Air

Sauerstoff CO

18O/16O Vienna Standard Mean Ocean Water VSMOW

Schwefel SO2 34S/32S Cañon Diablo Troilite (FeS-Meteorit) CDT

* Calcit-Fossil aus der PeeDee Formation in South Carolina

δX = [(RProbe / RStandard) - 1] × 10³

mit X = schweres Isotop (13C, 15N, 18O etc.)

R = Verhältnis schweres Isotop/Hauptisotop

(z.B.

13C/12C, 15N/14N, 18O/16O etc.)

3. Allgemeiner Teil

3.2.1 Kohlenstoff

Die primäre Quelle des Kohlenstoffs in biologischen Systemen ist das atmosphärische CO2, das

aufgrund eines thermodynamischen Isotopeneffekts gegenüber dem gelöstem HCO3- der Ozeane

(~0 ‰) um ca. 7 ‰ an 13C abgereichert ist.[152] Organisch gebundener Kohlenstoff weist wieder-

um ein Defizit an 13C gegenüber dem CO2 der Luft auf.

Kohlenstoff wird aus dem CO2 der Luft durch die Photosynthese der Pflanzen organisch gebun-

den. Da 13CO2 langsamer reagiert als 12CO2, tritt bei der primären CO2-Bindung ein erheblicher

Isotopeneffekt auf, wobei das schwerere 13C diskriminiert wird. Die dadurch auftretende 13C-

Abreicherung in organisch gebundenem Kohlenstoff ist jedoch nicht in jeder Pflanze gleich,

sondern das Ausmaß hängt von deren jeweiligen Photosynthesetyp ab. Es werden nach den Pho-

tosynthesewegen drei Pflanzengruppen unterschieden: C3-, C4- und CAM- (Crassulacean Acid

Metabolism) Pflanzen.[131,193,246] Abbildung 12 gibt einen Überblick über die δ13C-Verteilung des

Kohlenstoffs in der Natur.

Abbildung 12:

δ13C-Verteilung des Kohlen-

stoffs in der Natur

Originalgrafik verändert

nach einer Präsentation von

Oeßelmann et al.[188,199]

Die Gruppe der C3-Pflanzen bindet in den Chloroplasten atmosphärisches CO2 im sog. Calvin-

Cyclus durch die Ribulosediphosphat(RuBP)-Carboxylase zu dem C3-Primärprodukt

3-Phosphoglycerinsäure.[45] Die Mehrzahl der Kulturpflanzen wie die europäischen Getreidear-

ten, Reis, Zuckerrüben, Kartoffeln, Maniok, Weintrauben, Zitrusfrüchte und Sojabohnen sind

C3-Pflanzen, sowie viele andere überwiegend in der gemäßigten Klimazone wachsenden Pflan-

zen. Auch die in dieser Arbeit untersuchten Pistazien gehören der C3-Pflanzengattung an. Der

δ13C-Wert dieser Pflanzen liegt zwischen -32 und -24 ‰ („leichte Pflanzen“).[294]

C4-Pflanzen wachsen dagegen an wasserarmen, heißen Standorten und nehmen zur Vermeidung

von Transpirationsverlusten das CO2 vorwiegend nachts auf. Mit Hilfe der Phospho-

enolpyruvat(PEP)-Carboxylase wird das CO2 im sog. Hatch-Slack-Zyklus[123] zu dem C4-

Primärprodukt Oxalessigsäure in den Mesophyllzellen fixiert und als stabileres Malat zwischen-

3.2 Stabilisotope

gespeichert. Durch Dehydrierung und Carboxylierung wird tagsüber in den Gefäßbündelscheide-

zellen aus dem Malat wieder CO2 freigesetzt und die freigewordene 3-Phosphoglycerinsäure

dem Calvin-Zyklus zum Kohlenhydrataufbau zugeführt. Da die PEP-Carboxylase eine hohe Af-

finität zu ihrem Substrat (HCO3-) zeigt, wird praktisch das gesamte aufgenommene CO2 gebun-

den und dadurch aufkonzentriert, während die Photosynthese bei den C3-Pflanzen ausschließlich

auf Diffusion des atmosphärischen CO2 in die Photosynthesezellen beruht (s. Abbildung 13).

Abbildung 13:

Querschnitte durch Blätter von C3-

und C4-Pflanzen mit schematischer

Darstellung der relevanten Schritte

bei den unterschiedlichen Photosyn-

thesewegen

Originalgrafik aus der Veröffentli-

chung von J.R. Ehleringer[75]

Die Fixierung des CO2 aus der Luft mittels der PEP-Carboxylase ist somit der kürzere und

schnellere Weg verglichen mit dem Calvin-Zyklus und verläuft mit einem geringeren Isotopenef-

fekt als bei der RuBP-Carboxylase. Daher weist die Biomasse der C4-Pflanzen δ13C-Werte zwi-

schen -16 und -10 ‰ auf („schwere Pflanzen“). Zu dieser Gruppe gehören Kulturpflanzen wie

Hirse, Mais, Zuckerrohr und Sorghum, sowie viele tropische Gräser.

CAM-Pflanzen können das atmosphärische CO2 je nach äußeren Gegebenheiten sowohl auf dem

C3- als auch auf dem C4-Weg fixieren. Daher haben CAM-Pflanzen wie z.B. Ananas und Vanille

δ13C-Werte zwischen -30 und -12 ‰.[40,75,85,131,279,294]

Der δ13C-Wert gilt heute als zuverlässigstes Indiz für die Zuordnung der Arten zum C3- oder C4-

Pflanzentyp, da er sich als streng korreliert mit dem Photosynthesetypus erwiesen hat.[189] So

kann z.B. die Herkunft von Saccharose ermittelt werden, da die Zuckerrübe eine C3-Pflanze ist

und Rohrzucker sowie Maishydrolysate zu den C4-Pflanzen gehören.[294] Die Messung des δ13C-

Werts in Lebensmitteln (häufig auch in Kombination mit anderen Elementen) hat sich im Zu-

sammenhang mit Verfälschungsfragen vor allem bei Fruchtsäften[34,66,112,116,143-145], Honi-

gen[218,288-292,301] und alkoholischen Getränken (Zuckergrundlage des Gärungsalko-

hols[147,195,208,220,222,275] oder Kohlendioxids[23,71]) bewährt, aber auch bei Glycerol[41,99,100,274],

Essig[168,210] und Öl.[153,249,250,295]

Auch die Unterscheidung natürlicher Substanzen von synthetischen Analoga ist mit dem δ13C-

Wert möglich. Die meisten synthetischen Austauschstoffe werden nämlich aus fossilen Kohlen-

3. Allgemeiner Teil

stoffquellen (Erdöl, Kohle) hergestellt, die mit δ13C-Werte zwischen -22 und -35 ‰ grundsätz-

lich verschieden von C4-Pflanzen sind.[296] Es wurden hier vor allem Arbeiten auf dem Gebiet

der Aromen[20,27,29,46,126,148,278] geleistet, besonders zur Authentizitätsprüfung von natürlichem

Vanillin, das wesentlich teurer ist als industriell synthetisiertes.[33,135,151,170,171,225] Auch die Zuga-

be von synthetisch hergestellten Fruchtsäuren zu Fruchtsäften[67,105] oder die Unterscheidung von

synthetischem Essig und Gärungsessig[210,226] sind möglich.

Neben den großen Unterschieden aufgrund des Photosynthesetypus kommt es auch innerhalb der

einzelnen Teile und Substanzklassen einer Pflanze zu kleinen, aber signifikanten Unterschieden

in den δ13C-Werten. Diese hängen von einer Reihe exogener und endogener Faktoren ab, von

denen der Sekundärmetabolismus den größten Einfluss hat.

Die höchsten 13C-Gehalte in Pflanzenma-

terial finden sich in Kohlenhydraten (Zu-

cker, Cellulose, Stärke) und organischen

Säuren, den Primärprodukten der Photo-

synthese. Lipide und Phenole sind dem-

gegenüber bis zu 8 ‰ abgerei-

chert.[2,58,182,194,287] Aminosäuren und Pro-

teine weisen wiederum δ13C-Werte zwi-

schen denen der Zucker und Lipide auf

und sind um ca. 2-3 ‰ gegenüber den

Kohlenhydraten erniedrigt.[40,190,216,231]

Abbildung 14 zeigt die Unterschiede

des δ13C-Werts in den verschiedenen Koh-

lenstoffpools und innerhalb der verschie-

denen Substanzklassen der Pflanzen.

Abbildung 14:

δ13C-Werte verschiedener Kohlenstoffpools

Originalgrafik aus der Veröffentlichung von Butzen-

lechner[40]

Die Ursache für diese generellen Muster (intermolekulare Korrelation) liegt in Kohlenstoff-

Isotopenfraktionierungen bei Schlüsselreaktionen im Verlauf der Biosynthesen und Verzwei-

gungen im Stoffwechsel. So ist z.B. ein großer kinetischer 13C-Isotopeneffekt bei der Pyruvat-

Decarboxylase-Reaktion[58] und der Pyruvat-Dehydrogenase-Reaktion[182] zu beobachten, den

einleitenden Schritten zur Biosynthese von Lipiden und einigen Aminosäuren aus Kohlenhydra-

ten. Durch die bevorzugte Übertragung von 12C-haltigen Gruppen durch Enzyme sind die aus

Acetylresten aufgebauten Sekundärmetabolite gegenüber den primären an 13C verarmt. Dies er-

klärt auch die Beobachtung mehrerer Autoren[237], dass der Gesamt-δ13C-Wert einer Pflanze

einer zeitlichen Änderung über deren Entwicklungszeitraum unterliegt: Nach der Wachstums-

3.2 Stabilisotope

phase werden in verstärktem Maße Sekundärmetabolite (niedrigere δ13C-Werte) synthetisiert,

während gegen deren Ende Reservekohlenhydrate (Primärmetabolite = höhere δ13C-Werte) ein-

gelagert werden.[236]

Weitere Diskriminierungen des Kohlenstoff-Isotopenverhältnisses, die zu definierten Mustern in

bestimmten Substanzklassen beitragen, werden durch die Aldolase- und Transketolase-Reaktion

sowie enzymkatalysierten Esterkondensationen eingebracht und sind vor allem auch in Sekun-

därmetaboliten des Shikimisäurewegs (z.B. Lignin, Aromaten, Flavonoide) zu finden. Die Stärke

der Abreicherung hängt hier davon ab, wie weit die betrachteten Sekundärstoffe im biologischen

Kreislauf von den Primärsubstraten entfernt liegen.[104,110,231,260] Die konstanten Differenzen zwi-

schen den verschiedenen Fraktionen einer Pflanze, wie z.B. Zucker zu Lipiden, erlauben zudem

eine interne Standardisierung.[34,143,145,219,230,291] So können z.B. einem Lebensmittel hinzugefügte

Bestandteile leicht erkannt werden, da diese das 13C/12C-Verhältnis von bestimmten Fraktionen

zueinander verändern.[216,294]

Durch positionelle δ13C-Bestimmungen mittels IRMS konnte außerdem nachgewiesen werden,

dass auch die 13C-Verteilung in einzelnen Molekülen nicht statistisch ist, sondern An- und Ab-

reicherungen in bestimmten Positionen auftreten (intramolekulare Isotopenmuster).[229] Die Fruk-

tose-1,6-Bisphosphataldolase bewirkt z.B. eine 13C-Anreicherung in den Positionen C-3 und C-4

des Primärprodukts Glucose,[111,217,227] was sich natürlich auch in den Folgeprodukten bemerkbar

macht, so z.B. in Ethanol, organischen Säuren, funktionellen Gruppen an Aromaten, sowie Pyru-

vat, dem Ausgangsstoff vieler sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe. Auch die Isotopeneffekte be-

stimmter Schlüsselreaktionen (Enzymreaktionen) führen zu ganz spezifischen Verteilungsmus-

tern in den Produkten. So ist z.B. in der Carboxylgruppe von Acetyl-CoA eine starke 13C-

Abreicherung zu finden (und damit auch in den daraus synthetisierten Fettsäuren), genauso wie

in den Methoxylgruppen von Pektin und Lignin (δ-Werte bis zu -77 ‰).[103,155,159,216,294]

Die Überlagerung der bisher beschriebenen endogenen Faktoren erklärt weitestgehend die Varia-

tionsbreite der natürlich vorkommenden δ13C-Werte. Dazu kommen jedoch auch noch exogene

(ökologische) Faktoren, die zu kleinen, aber trotzdem signifikanten, regionalen Unterschiede im

13C/12C-Verhältnis der Pflanzen führen können.

Geringe Schwankungen des δ13C-Werts pflanzlichen Materials werden z.B. durch unterschiedli-

che Isotopengehalte des atmosphärischen CO2’s verursacht. In Gebieten mit geringer industriel-

ler Ansiedlung besitzt atmosphärisches CO2 δ13C-Werte zwischen -6,4 und -7,0 ‰, während

dieser Wert in Gebieten mit hoher industrieller Ansiedlung aufgrund der Verbrennung von Kohle

und Erdöl negativer ist (s. Abb. 14).[85,190,196,294]

3. Allgemeiner Teil

Das vorherrschende Klima (Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Niederschlag) an einem Ort ist ein

weiterer exogener Faktor, der zusätzlich auf das Isotopenverhältnis (2-3 ‰) einwirken kann, und

somit eine standortspezifische Größe darstellt. Die theoretische Basis, die den Umwelteinfluss

auf das δ13C-Verhältnis von C3-Pflanzen beschreibt, wurde bereits in den 80er Jahren von meh-

reren Autoren[80,83,190,191] untersucht und sogar in Form einer Gleichung ausgedrückt. Danach

erniedrigt sich der δ13C-Wert der Pflanze, wenn der partielle Druck des interzellulären CO2’s

erhöht wird, wie z.B. durch Umwelteinflüsse, die die Leitfähigkeit der Spaltöffnungen erhöhen

und/oder die Carboxylierungsrate senken. Eine derartige Beeinflussung der Spaltöffnungen und

der Carboxylierungsrate kann durch all diejenigen Faktoren ausgelöst werden, die mit der Photo-

synthese assoziiert sind: Lichtintensität, Nährstoffe, Temperatur und Wasserverfügbarkeit.

Die Temperatur beeinflusst z.B. alle thermodynamisch bedingten Isotopeneffekte, jedoch konnte

hier bisher kein einheitliches Bild in der Diskriminierungsrichtung festgestellt werden. Neuere

Untersuchungen (vor allem an Baumringen) zeigen häufig eine positive Korrelation zwischen

dem δ13C-Wert und der Temperatur.[124,131,175,247,266]

Eine dagegen klare Diskriminierungsrichtung kann beobachtet werden, wenn Pflanzen vermin-

derter Wasserverfügbarkeit (im Extremfall Dürrestress) ausgesetzt sind. In diesem Fall schließen

Pflanzen ihre Spaltöffnungen und die CO2-Konzentration in Blatt und somit auch die Diskrimi-

nierungsrate nehmen ab, so dass wesentlich höhere δ13C-Werte (weniger negativ) in solchen

Pflanzen zu finden sind. Einen gleichen Effekt löst ein erhöhter Salzgehalt oder Umweltver-

schmutzung (Ozon, SO2) aus.[10,80,83,124,213] Im Umkehrschluss konnte auch von mehreren Auto-

ren[175,184,207] nachgewiesen werden, dass das 13C/12C-Verhältnis signifikant vom regionalen Nie-

derschlag abhängt: vermehrter Regen bewirkt ein Absinken des δ13C-Werts in Pflanzen.

Desgleichen wurde auch eine starke Korrelation zwischen dem δ13C-Wert von C3-Pflanzen und

der Höhe über dem Meeresspiegel nachgewiesen. Messungen von mehreren Wissenschaftsgrup-

pen[158,175] ergaben, dass sich mit zunehmender Höhe die Carboxylierungseffizienz der Pflanzen

erhöht (Blätter von Bergpflanzen müssen die Photosynthese bei niedrigeren Partialdrücken

betreiben), was wiederum in erhöhten δ13C-Werten resultiert. Außerdem nehmen die Blattdicke

und der Stickstoffgehalt mit steigender Höhe zu, was außerdem zu einer Erhöhung der Photosyn-

thesekapazität beiträgt. Zudem konnte durch groß angelegte Versuche gezeigt werden, dass das

13C/12C-Verhältnis auch vom Breitengrad abhängt. Vom Äquator zu den Polen nimmt die Dis-

kriminierung gegenüber 13C ab, d.h. der δ-Wert wird positiver.[158,175]

Durch die Vielzahl der auf das 13C/12C-Verhältnis einwirkenden exogenen Faktoren kann die

resultierende Diskriminierungsrichtung nicht vorhergesagt werden, daher sind gegensätzliche

Messergebnisse nicht überraschend. Das Ausmaß eines umweltbedingten Faktors hängt davon

ab, inwieweit dieser die Photosynthese beeinflusst. Wirkt er sowohl auf die Spaltöffnungen als

auch auf die Carboxylierung, kann dies einen gegensätzlichen Effekt auf δ13C ausüben.

3.2 Stabilisotope

Die Schwankungsbreiten der einzelnen hier beschriebenen endogenen und exogenen Faktoren,

die auf das δ13C-Verhältnis von C3-Pflanzen wirken, sind von T.H.E. Heaton (1999)[124] in sei-

nem Artikel zusammengefasst worden (s. Tabelle 4).

Tabelle 4: Ausmaß und Faktoren der Unterschiede im δ13C-Wert von C3-Pflanzen

Grund für die Schwankungsbreite Ausmaß der Schwankungsbreite

Innerhalb eines Gebietes:

Unterschiede innerhalb einer Pflanze 1-2 ‰

Unterschiede innerhalb einer Art ± 1,5 ‰

Unterschiede zwischen Genotypen ≤ 4 ‰

Unterschiede zwischen verschiedenen Arten ≤ 4 ‰

Zwischen verschiedenen Gebieten:

Temperatureinfluss + 0,3 ‰ / °C

Unterschiede in der relativen Luftfeuchtigkeit - 0,1 ‰ / % r.F.

Höheneinfluss + 1 ‰ / 1000 m

Bodenunterschiede ≤ 0,5 ‰

Daten stammen aus der Veröffentlichung von T.H.E. Heaton[124]

Der δ13C-Wert eignet sich somit hervorragend zur Feststellung von Verschnitten zwischen C3-

und C4-Pflanzen sowie zur Erkennung synthetischer Austauschstoffe. Er kann auch zur Feststel-

lung der Herkunft von Lebensmitteln beitragen, da die umweltbedingten δ-Wert-Unterschiede

zwar klein aber signifikant sind. Das 13C/12C-Verhältnis hat sich in Kombination mit den δ-

Werten anderer Elemente oder in der multivariaten Datenauswertung schon als durchaus aussa-

gekräftig bewährt.

3. Allgemeiner Teil

3.2.2 Stickstoff

Obwohl die Atmosphäre die größte Stickstoffquelle der Erde ist (78 %), nutzen Pflanzen vor-

wiegend den Stickstoff des Bodens (NO3-, NH4+) und spiegeln dessen δ15N-Wert wie-

der.[199,242,268] Ausnahmen bilden

hier Pflanzen, die in Symbiose mit

N2-fixierenden Bakterien leben (Le-

guminosen) und daher auch einen

δ15N-Wert zwischen -2 und +2 ‰,

nahe dem des atmosphärischen N2

von 0 ‰ haben.[85]

Abbildung 15 zeigt die δ15N- Streu-

breiten verschiedener Stickstoff-

pools. Daraus ist zu ersehen, dass in

der Literatur für Pflanzenmaterial

im Allgemeinen δ15N-Werte

zwischen -5 und +10 ‰ beschrieben

werden.[133,199,242]

Abbildung 15: δ15NAir-Werte verschiedener Stickstoffpools

Diagrammdaten stammen aus den Veröffentlichungen von

B. Wagner[273] und F.J. Winkler[293]

Der organisch gebundene Stickstoff des Bodens wird von außen durch mehrere Quellen in den

Stickstoffkreislauf eingetragen:

1. gasförmige Verbindungen (Stickstofffixierung, Niederschlag, Industrieemissionen),

2. Pflanzen (Ernterückstände, Laub, Gründüngung) und

3. Dünger.

Durch die metabolische Umsetzung von standort- und bodenabhängigen Mikroorganismen wer-

den diese Stickstoffeinträge (Proteine, Nukleinsäuren, Aminozucker) den Pflanzen im Boden

wieder als Nitrat oder Ammonium zugänglich gemacht und zusätzlich durch topografische, geo-

grafische und klimatische Gegebenheiten beeinflusst.[159,273]

Mikroorganismen wandeln dazu den organischen Stickstoff zu Ammoniak um

(Ammonifikation), der sich wiederum mit Wasser zu Ammonium umsetzt. Im zweiten Schritt

wird daraus Nitrit gebildet (Nitrifikation) und dieses weiter zu Nitrat oxidiert. Durch

Denitrifikation können fakultativ anaerobe Bakterien das Nitrat auch wieder vollständig in

molekularen Stickstoff umsetzen.[273] In Abbildung 16 sind die hier wichtigsten Vorgänge im

biologischen Stickstoffkreislauf schematisch dargestellt.

-10 0 10 20 30

Luft

Ozeanwasser

Pflanzen (Land)

Pflanzen (Wasser)

Tiere (Land)

Tiere (Wasser)

Mineraldünger

Org. Dünger

Boden

Bodennitrat

Gesteine, Sedimente

Kohle, Öl

δ15NAir

3.2 Stabilisotope

Ammonifikation, Nitrifikation und

Denitrifikation sind Reaktionen, die

vom Boden und klimatischen Fakto-

ren abhängen und bei denen erhebli-

che Isotopeneffekte und damit Frakti-

onierungen auftreten. Während die

Denitrifikation zur Anreicherung des

schweren Isotops im verbleibenden

Bodennitrat führt, ergeben sich bei

der Nitrifikation aufgrund der bevor-

zugten Oxidation leichter N-Verbin-

Abbildung 16:

Stickstoffkreislauf der wichtigsten N-Verbindungen zwi-

schen Atmosphäre, Boden und Grundwasser

Originalgrafik verändert nach Schmidt et al.[234]

dungen ein 15N-abgereichertes Nitrat

und ein 15N-angereichertes Ammoni-

um im Boden.[4,21,57,85,138,159]

Lange und intensiv landwirtschaftlich genutzter Boden zeigt im Allgemeinen eine Anreicherung

von 15N, weil durch die Bodenbearbeitung die biologische Aktivität gefördert und somit die Um-

satzrate der isotopenrelevanten Prozesse erhöht wird.[174,273] Dürre, Salzgehalt oder Stickstoff-

mangel können den δ15N-Wert von Pflanzen dagegen bis zu 2 ‰ erniedrigen.[120,213]

Eine signifikante Abnahme des δ15N-Werts in den Pflanzen wurde außerdem mit fallender Jah-

resdurchschnittstemperatur und steigendem jahresdurchschnittlichen Niederschlag festgestellt.[5]

Eine eindeutige Erklärung für diese empirischen Beobachtungen konnte jedoch noch nicht gege-

ben werden, da noch zu wenig Forschung auf diesem Gebiet betrieben wurde. Es scheint, dass

Pflanzen mit steigender Feuchtigkeit effizienter am mineralischen Stickstoffzyklus teilhaben. In

dem Artikel von Amundson et al.[5] wurden außerdem Einflussfaktoren wie Höhe, Alter und Art

der Böden diskutiert. Zusammenfassend ist aus diesen Ergebnissen festzustellen, dass es zu glo-

balen Unterschieden aufgrund des Klimas im 15N/14N-Verhältnis kommen kann.

Einen relativ hohes 15N/14N-Verhältnis ist auch in küstennah wachsenden Pflanzen zu beobach-

ten, weil diese durch Windeinfluss mit dem relativ stark an 15N angereicherten Ozeanwasser in

Berührung kommen (s. Abbildung 15).[268] Außerdem sind auch innerhalb einer Pflanzenart, die

auf der gleichen Stickstoffquelle gezüchtet wurden, signifikante δ15N-Variationen von bis zu

1,3 ‰ zwischen verschiedenen Genotypen beobachtet worden. Da die Stickstoffaufnahme keine

Isotopendiskriminierungen verursacht[285], wurde von den Autoren der Verlust löslicher N-

Verbindungen durch die Wurzeln als Erklärung genannt.[213]

3. Allgemeiner Teil

Desgleichen diskriminieren wie beim Kohlenstoff nahezu alle Enzyme gegenüber 15N und es

kommt dadurch zu δ15Ν-Wert-Unterschieden zwischen einzelnen Substanzklassen und Pflanzen-

teilen.[119] Hier sind die Nitratreduktase[156,173,180,232], Glutaminsynthetase und vor allem die

Transaminase[176] als Fraktionierungsfaktoren zu nennen.[176,297,298] Werner und Schmidt[285] ha-

ben 2002 diesbezüglich einen sehr detaillierten Übersichtsartikel herausgebracht, in dem die 15N

An- und Abreicherungen in den einzelnen Molekülgruppen im Stickstoffkreislauf der Pflanzen

eingehend beschrieben werden.

Den zweiten großen Einfluss auf den δ15N-Wert des Bodens und damit auch auf den der Pflan-

zen bewirken neben den Mikroorganismen Dünger. In der Landwirtschaft werden vorwiegend

Mineraldünger, aber auch organische Dünger, eingesetzt. Die δ15N-Werte von Mineraldüngern

liegen aufgrund der Einbindung atmosphärischen Stickstoffs während ihrer Synthese mit -5 bis

+5 ‰ (s. Abbildung 15) recht niedrig.[49,97,244] Dabei haben Ammoniumdünger im Allgemeinen

niedrigere (negative) δ-Werte (14N wird kinetisch bei der Ammoniumsynthese bevorzugt), wäh-

rend Nitratdünger positive δ-Werte zeigen.[4,98,138,269]

Organische Stickstoffdünger wie Gülle oder Stallmist unterscheiden sich dagegen signifikant

von den synthetisch-anorganischen Mineraldüngern. Sie zeigen mit δ15N-Werten von 10-20 ‰

eine deutlich höhere Anreicherung mit 15N (s. Abb. 15), das vor allem aus einer Isotopenfraktio-

nierung bei der Ammoniak-Verdampfung aus tierischen Exkrementen resultiert.[49,231,244] Daher

wird beim Einsatz von organischen Düngern fast immer ein Anstieg des 15N-Gehalts im Boden

und damit auch im Pflanzenstickstoff beobachtet.[234,299] Bei steigender mineralischer Düngung

kann ein signifikanter Rückgang[15,149,157,243,299] des δ15N-Werts im Pflanzenstickstoff festgestellt

werden.[85,242,273] Konventionelle Farmer verwenden größtenteils synthetische Mineraldünger,

jedoch mischen sie teilweise auch organischen unter. Dagegen dürfen (Bio-) Bauern, die „ökolo-

gisch“ produzieren wollen, nach der Öko-Verordnung (VO (EWG) Nr. 2092/91)[270] nur aus-

schließlich zugelassene organische Dünger verwenden. Ähnlich werden in den USA Farmen und

deren Produkte, die das Label „organic“ tragen wollen, durch das „United States Department of

Agriculture“ reguliert und zertifiziert.[15]

Durch die vielen äußeren Einflussfaktoren kann die Schwankungsbreite der Stickstoff-

Isotopenverteilung des Bodens und damit der Pflanzen beträchtlich sein. Vor allem der mensch-

liche Einfluss durch die die Art der Düngung kann zu erheblichen saisonalen und lokalen Unter-

schieden führen. Daher können keine generellen Aussagen über bestimmte Gebiete gemacht

werden. Trotzdem kann der δ15N-Wert des Gesamtstickstoffs einer Pflanze Informationen über

ihre primäre Stickstoffquelle widerspiegeln und in Kombination mit anderen Elementen zur Her-

kunftsbestimmung herangezogen werden, um die Authentizität von z.B. Alkaloiden[52,278],

Milch[163], Käse[177], Fleisch[238] oder Fruchtsäften[161] zu kontrollieren.

3.2 Stabilisotope

3.2.3 Sauerstoff

Es gibt drei mögliche Quellen für den Sauerstoff in organischem Pflanzenmaterial: Wasser, CO2

und molekularen Sauerstoff. Diese Quellen weisen stark unterschiedliche 18O-Gehalte auf, wobei

Luftsauerstoff und CO2 mit standortunabhängigen δ18O-Werten von ca. +23,5 ‰ bzw. +41 ‰

relativ „schwer” sind,[24,65,167] während (Grund-) Wasser variable, aber meist deutlich niedrigere

δ18O-Werte zeigt (ca. -5 bis +5 ‰).[159,235] Abbildung 17 veranschaulicht diese verschiedenen

Einflüsse auf organisches Material in einem Schema.

Abbildung 17:

Schematische Darstellung der

verschiedenen, natürlichen Fak-

toren, die auf das Sauerstoffiso-

topenverhältnis der Pflanzen

Einfluss nehmen

Originalgrafik aus der Veröf-

fentlichung von Hillaire-

Marcel[131]

3.2.3.1 Wasserkreislauf

Das größte Wasserreservoir der Erde bilden mit 98 % die Ozeane, deren Isotopenverhältnis kon-

stant ist (0 ‰).[77] Der überwiegende Rest ist in den Polkappen als Eis gebunden und nur eine im

Verhältnis dazu sehr geringe Wassermenge wird durch Wetteraktivitäten als Wasserdampf in

Umlauf gebracht und innerhalb des Wasserkreislaufs stark diskriminiert.

Ausgangsort der großräumigen Bewegung der Luftmassen im weltweiten Maßstab ist der tro-

pische Bereich um den Äquator, von dem aus der Wasserdampf jeweils nach Norden und Süden

zu den Polen transportiert wird. Aufgrund der Fraktionierungen im weltweiten Wasserkreislauf

hat die isotopogene Zusammensetzung der Niederschläge ein bestimmtes geografisches Muster

und ist auch sehr eng mit der mittleren Lufttemperatur an einem Ort korreliert.[53,92,94] Eine

schematische Darstellung des Wasserkreislaufs ist in der nachfolgenden Abbildung 18 darge-

stellt.

3. Allgemeiner Teil

Abbildung 18:

Schema des globalen Wasser-

kreislaufs

Originalgrafik aus der Veröf-

fentlichung von Hoffman et

al.[134]

Bei der Verdunstung werden Wassermoleküle mit dem leichteren Isotop 16O bevorzugt, daher

sind Wolken und Niederschläge gegenüber der Verdunstungsquelle an 18O abgereichert. Durch

die Bewegung der Luftmassen vom Meer aus über das Land verarmt der Niederschlag immer

mehr an 18O (δ-Wert nimmt ab) und es können zwei damit einhergehende Effekte unterschieden

werden:[92]

1. die Abnahme des 18O-Gehalts im Niederschlag von der Küste zum Landesinneren mit zu-

nehmender Entfernung vom Meer („Kontinental-Effekt”),

2. die Abnahme des 18O-Gehalts im Niederschlag mit der Erhebung über das Meeresniveau

(„Höhen-Effekt”), der auf dem Abregnen an Hindernissen beruht.[94]

Die 18O-Gehalte von Nieder-

schlägen werden seit Jahren

von dem Global Network of

Isotopes in Precipitation

(GNIP) durch weltweit ver-

teilte Messstationen aufge-

zeichnet.[142] Der jahres-

durchschnittliche δ18O-Wert

der Niederschläge in den

drei Pistazienhauptanbauge-

bieten Iran, USA und Türkei

sind in den nachfolgenden

Abbildungen 19 und 20 he-

rauszulesen[142] und in Tabel-

le 5 zusammengefasst.

Türkei

Iran

Abbildung 19:

Durchschnittliche δ18OVSMOW-Zusammensetzung des Nieder-

schlags in Asien 2001

3.2 Stabilisotope

Abbildung 20:

Durchschnittliche δ18OVSMOW-

Zusammensetzung des Nieder-

schlags in Nord-Amerika 2001

Tabelle 5: Jahresdurchschnittliche δ18O-Werte des Niederschlags in den

Hauptanbaugebieten der Pistazien

Pistazienanbaugebiet

δ18OVSMOW-Bereich des Nieder-

schlags im Jahr 2001 [‰]

Iran (Zentraliran, Südwesten) 0 bis -6

Türkei (syrische Grenze) -6 bis -10

USA (Kalifornien) -2 bis -10

Der nachstehenden Tabelle 6 ist zu entnehmen, dass die drei Pistazienhauptanbauländer Iran,

USA und Türkei fast auf demselben Breitengrad liegen (Iran etwas näher am Äquator als die

beiden anderen Länder), sie sich jedoch stark in Längegrad und Höhe voneinander unterschei-

den. (In den Abbildungen 3 und 4 in Kapitel 3.1.2 sind die dazugehörigen Klimadaten schon

aufgeführt worden.) In Tabelle 5 ist dagegen zu sehen, dass trotz der unterschiedlichen Lage auf

zwei Kontinenten die δ18O-Wertbereiche des Niederschlags in der Türkei und Kalifornien

(Hauptanbaugebiet der USA) fast identisch sind. Der Regen im Iran zeigt im Durchschnitt die

höchsten δ18O-Werte von den drei betrachteten Ländern (s. Tabelle 5), obwohl die Entfernung

zur Türkei nur vergleichsweise gering ist. Hier scheint nicht die extreme Höhenlage der irani-

schen Pistazienanbaugebiete bzw. der o.g. „Höhen-Effekt“ Einfluss zu nehmen (der niedrige

δ18O-Werte gegenüber den beiden anderen Ländern erzeugen würde), sondern die weltweite

Bewegung der Luftmassen, durch die der Wasserdampf vom tropischen Bereich um den Äquator

herum jeweils nach Norden und Süden zu den Polen transportiert wird und dabei an 18O verarmt.

Da der Iran etwas näher am Äquator liegt als die Türkei und Kalifornien, sind hier höhere δ18O-

Werte im Niederschlag zu erwarten, was die Abbildungen 19 und 20 auch zeigen.

Kalifornien

3. Allgemeiner Teil

Tabelle 6: Geografische Lage zentraler Städte in den Pistazienanbaugebieten der drei Hauptpro-

duzenten Iran, Türkei und USA

Land Stadt Längengrad Breitengrad Höhe [m ü. M.]

Iran Shiraz 52° östl. 29° nördl. 1486

Yazd 54° östl. 32° nördl. 1238

Kerman 57° östl. 30° nördl. 1748

Türkei Gaziantep 37° östl. 37° nördl. 701

Urfa 39° östl. 37° nördl. 547

USA (Kalifornien) Stockton 121° westl. 38° nördl. 9

Fresno 119° westl. 37° nördl. 101

Daten stammen von der Website www.wetteronline.de[286]

Das Boden- und Grundwasser spiegelt letztendlich das längerfristige Mittel der örtlichen Nieder-

schläge wider, weil das Wasser in den unteren Bodenschichten nicht mehr umgesetzt wird. Die-

ses nimmt die Pflanze mit ihren Wurzeln auf und leitet es durch den Stamm bis in die Blätter.

Dabei findet weder bei der Aufnahme durch die Wurzeln noch während des Transports durch die

pflanzlichen Leitsysteme eine Isotopenfraktionierung des Wassers statt. Erst wenn der Wasser-

dampf aus Blättern und Früchten an die umgebene Luft abgegeben wird kommt es durch (Evapo-

) Transpiration zu einer Anreicherung von 18O im verbleibenden Blattwasser.[82,86] Das Ausmaß

dieser Anreicherung wird vom lokalen Klima (Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Niederschlag)

beeinflusst. So transpirieren Pflanzen bei höheren Temperaturen mehr und es kommt zu einer

erhöhten Anreicherung von 18O im Blattwasser. In niederschlagsreichen Gebieten nimmt die dort

im Allgemeinen herrschende hohe Luftfeuchte (stark an 18O abgereichert) Einfluss auf den Iso-

topenwert im Blattwasser, da sie sich mit diesem austauscht. Es herrscht hier ein signifikanter,

positiver Zusammenhang zwischen dem δ18O-Wert und der maximalen Temperatur und relativen

Luftfeuchtigkeit an einem Ort. Außerdem unterliegt die 18O-Anreicherung im Blattwasser zeitli-

chen Variationen, sowohl im Vegetationsverlauf (höhere Werte im Sommer) als auch im Tages-

verlauf (höchste Werte am frühen Abend).[92,94,159,207]

Die Anreicherung von 18O im Blattwasser hängt daher von drei generellen Parametern ab:

1. dem δ-Wert des Bodenwassers,

2. der Anreicherung während der Transpiration,

3. dem Austausch mit dem Wasserdampf der Luft.[14,86,91]

3.2 Stabilisotope

3.2.3.2 Sauerstoffkreislauf in Pflanzen

Der Sauerstoffkreislauf in Pflanzen ist im Gegensatz zum Kohlenstoffkreislauf sehr komplex.

Die Pflanzen nutzen für den Aufbau ihrer Primärprodukte (Kohlenhydrate) den Sauerstoff aus

dem CO2 der Luft (CO2-Fixierung durch die Photosynthese), jedoch spiegelt sich dessen hoher

δ18O-Wert (~ +41 ‰) nicht in dem Sauerstoff-Isotopenverhältnis des Pflanzenmaterials wieder.

Es konnte vielmehr in mehreren Studien gezeigt werden,[78,255] dass das 18O-Verhältnis der

Pflanzenprimärprodukte (erstmalig entdeckt bei Cellulose aus Bäumen) mit dem des (Blatt-)

Wassers am Standort korreliert.[59,235] Für verschiedene Pflanzen mit unterschiedlichen Photo-

synthesewegen wurde hier immer eine 18O-Anreicherung in den Kohlenhydraten von ca.

+27±4 ‰ gegenüber dem Blattwasser gefunden.[78,235,253-255] Diese generelle Sauerstoffisotopen-

Anreicherung wurde lange auf eine Äquilibrierungsreaktion zwischen dem Blattwasser und

hydratisierten Carbonylgruppen während der Kohlenhydrat-Biosynthese zurückgeführt.[51] Alle

Sauerstoffmoleküle, die in den Calvinzyklus gelangen, durchlaufen zwar ein Carbonylstadium

auf der Stufe der Triosen mit Phosphoglycerinaldehyd, jedoch ist zweifelhaft, ob eine vollständi-

ge Äquilibrierung mit Wasser in der Kürze der Reaktionszeit stattfinden kann.[159,216,255]

Neueren Theorien zufolge ist der generell gefundene Wert von ca. +27 ‰ in Cellulose eher zu-

fällig, denn Messungen an verschiedenen pflanzlichen Kohlenhydraten zeigten eine Spanne zwi-

schen +20,6 und +30,4 ‰. Es wird daher angenommen, dass der hohe δ-Wert des CO2-

Sauerstoffs der Luft in die Kohlenhydrate eingeführt wird, dieser jedoch durch nachfolgende

kinetische Isotopeneffekte und Äquilibrierungsreaktionen mit Wasser innerhalb der Pflanze ver-

loren geht. Der Isotopenwert der Primärprodukte (Kohlenhydrate) nähert sich dadurch dem des

Blattwassers an und liegt deshalb im Allgemeinen ca. +25 ‰ über dessen δ18O-Wert. Es wird

außerdem vermutet, dass das Sauerstoffatom des Wassers auch direkt auf organische Zwischen-

produkte übertragen wird und dass in Kohlenhydratmolekülen dadurch eine nicht-statistische

18O-Verteilung vorliegen muss (18O-An- und Abreicherungen in bestimmten Molekülpositionen).

Produkte aus dem Sekundärmetabolismus der Pflanzen weisen immer niedrigere 18O-Gehalte

gegenüber den Primärprodukten auf, da hier die Beteiligung des Wassers in den betreffenden

Biosynthesen zunimmt und die Reaktionen mit Isotopeneffekten einhergehen (z.B. enzymkataly-

sierte Hydrolysen, Wasseraddition an Doppelbindungen, weitere Sauerstoffaustauschreaktionen

von Carbonyl- und Carboxylgruppen mit Wasser).[216,228,235] So sind im Allgemeinen Proteine

um ca. 8 ‰ und Lipide um 12 ‰ gegenüber den primären Kohlenhydraten abgereichert.[293]

Beide korrelieren jedoch auch mit dem 18O-Gehalt des Niederschlagswassers. Abbildung 21

zeigt schematisch die Zusammenhänge zwischen den drei Primärquellen des pflanzlichen Sauer-

stoffs (CO2, H2O, O2) und die daraus zu erwartenden δ18O-Werte der verschieden Stoffklassen in

der Pflanze.[47,235,282]

3. Allgemeiner Teil

Abbildung 21: Zusammenhang zwischen den primären Sauerstoffquellen und den

δ18O-Werten organischer Komponenten und funktionellen Gruppen

Originalgrafik aus der Veröffentlichung von Schmidt et al.[235]

Luftsauerstoff kann von

Pflanzen auch direkt in Mo-

leküle durch enzymatische

Hydroxylierung eingebaut

werden, jedoch tritt hier

wiederum durch die bevor-

zugte Aufnahme und Abga-

be des leichteren Sauerstoff-

isotops durch die Enzyme

Oxygenase und Oxidase ein

kinetischer Isotopeneffekt

auf. Der Luftsauerstoff wird

dadurch gegenüber seinem

δ18O-Ausgangswert von ca.

Abbildung 22: δ18OVSMOW-Werte verschiedener Sauerstoffpools

Diagrammdaten stammen aus den Veröffentlichungen von A.

Roßmann[216] und F.J. Winkler[293]

23 ‰ auf Werte zwischen 0 und 10 ‰ abgereichert (aromatische Verbindungen wie z.B. Lignin,

Anethol, Estragol).[113,216,282] In Abbildung 22 sind die δ18OVSMOW-Werte verschiedener pflanzli-

cher Stoffklassen und deren Herkunftsquellen dargestellt.

Eine vollständige Klärung des Sauerstoffkreislaufs in den Pflanzen ist bislang noch nicht gelun-

gen. Aufgrund der unterschiedlichen Quellen des Sauerstoffs und der Isotopeneffekte innerhalb

der Pflanzen sind jedoch für die verschiedenen Stoffklassen deutlich unterscheidbare 18O-

Gehalte zu erwarten und z.T. auch nachgewiesen worden (s. Abbildung 21 und 22).

-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

Proteine

Lipide

pflanzl. Kohlenhydrate

Blattwasser

Regen/Grundwasser

atmosphärisches CO2

atmosphärisches O2

Ozeanwasser

δ18OVSMOW

3.2 Stabilisotope

3.2.3.3 Weitere Einflussfaktoren auf das 18O/16O-Verhältnis von Pflanzen

Eine weitere, weniger bedeutsame Sauerstoffquelle für Pflanzen ist das Nitrat (und Nitrit) aus

dem Boden. Hierbei stammt ein O-Atom im biologisch gebildeten NO3--Ion aus O2, die beiden

anderen aus H2O, da Stickstoff-Verbindungen niedrigerer Oxidationsstufen ihr O-Atom z.T.

schon mit Wasser ausgetauscht haben. Das durch Nitrifikation im Boden entstehende NO3- hat

daher einen δ18O-Wert, der weitgehend durch das

umgebende Wasser bestimmt wird. Die Denitrifi-

kation führt infolge kinetischer Isotopenfraktionie-

rung wie beim Stickstoff zu einem 18O angerei-

chertem NO3-. Bei technisch hergestelltem Nitrat,

wie es in Mineraldüngern vorkommt, stammen die

Sauerstoffatome vornehmlich aus dem O2 der

Luft. Aus diesem Grund weisen Nitrate aus indus-

trieller Produktion alle stark positive δ18O-Werte

auf und liegen nahe dem des Luftsauerstoffs

(+23,5 ‰). Die Aufbringung von Mineraldüngern

durch den Menschen kann daher den Sauerstoffiso-

topengehalt der Pflanzen beeinflussen.[4,234,269] Die

δ-Wert-Unterschiede in den verschiedenen Dün-

gerarten sind in Abbildung 23 grafisch dargestellt.

Abbildung 23:

δ15N- und δ18O-Werte verschiedener Dün-

gernitrate

Originalgrafik verändert nach Vitòria et

al.[269]

Während der molekulare Sauerstoff und das Kohlendioxid der Luft im Wesentlichen unabhängig

vom Standort sind, bildet das in der Pflanze enthaltene Wasser eine standortspezifische Größe,

da sein δ18O-Wert vom Grund- bzw. Niederschlagswasser und geografischen und klimatischen

Faktoren abhängt. Das standortspezifische Isotopenmuster des Wassers wird wiederum auf das

Pflanzenmaterial übertragen (starke Korrelationen), daher ist der δ18O-Wert sehr gut dazu geeig-

net, die Herkunft von Lebensmitteln zu bestimmen.[118] Vor allem zur Kontrolle der Herkunft

und Verfälschung von Fruchtsaft,[32,69,137,146,223,245] Wein[91,94,117,136] und alkoholhaltigen Geträn-

ken,[3,127,128] sowie für Aromen wie Koffein[72,211,276,277] und Vanille[19,125] hat sich das 18O/16O-

Verhältnis bereits als sehr aussagekräftig erwiesen, häufig auch in Kombination mit 2H- und 13C-

Messungen.[30,68,205,300]

3. Allgemeiner Teil

3.3 Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS)

Die instrumentelle Entwicklung von speziellen Isotopenverhältnis-Massenspektrometern

(IRMS – Isotope Ratio Mass Spectrometer) zur Isotopenverhältnisbestimmung bei Bioelementen

begann im Bereich der Geowissenschaften Mitte des 20. Jahrhunderts. IRMS-Geräte unterschei-

den sich deutlich von gewöhnlichen Massenspektrometern bezüglich des aufzulösenden Massen-

bereichs, der Stabilität der Ionenproduktion und auch in der Probenzufuhr. Ihre Entwicklung

wurde durch die Einführung multipler Kollektoren für die simultane Detektion der isotopomeren

Ionen und des Doppeleinlasssystems (Dual Inlet) bzw. des Changeover-Ventils ermöglicht,

durch dessen abwechselnden Einlass von Standard- und Probengas die Notwendigkeit langwieri-

ger Absolutmessungen von Isotopengehalten oder der statischen Messung von Standard- und

Probengas entfiel. Zur Bestimmung des Stabilisotopenverhältnisses der Bioelemente müssen die

organische Proben in einfache, reine Messgase (CO2, N2, H2, SO2, CO) überführt werden, und

zwar quantitativ oder zumindest frei von Isotopeneffekten.[179,186,281,283]

Für die vorliegende Arbeit zur Authentizitätsprüfung von Pistazien stand ein Deltaplus-IRMS der

Firma Finnigan als Basisgerät zur Verfügung. An dieses konnten wahlweise über das ConFlo

IITM-Interface die Peripheriegeräte EA (Elemental Analyzer = Elementaranalysator) zur gleich-

zeitigen Kohlenstoff- und Stickstoff-Isotopenverhältnisbestimmung[108,201,203,204] oder TC/EA

(High Temperatur Conversion / Elemental Analyzer = Pyrolyseeinheit) zur Sauerstoff-

Isotopenverhältnisbestimmung[17,81,165,284] angeschlossen werden. Die Funktionsweise und der

Aufbau des Basisgeräts und der beiden Peripheriegeräte werden in den folgenden Kapiteln erläu-

tert.

3.3.1 IRMS-Basisgeräte

Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (IRMS) sind hoch spezialisierte Sektorfeld-

Massenspektrometer, die nur für die Isotopenverhältnismessung einfacher Gasmoleküle wie

CO2, CO, N2, H2, SO2 einsetzbar sind. Die hohe Präzision und Genauigkeit der IRMS wird u.a.

durch die abwechselnde Messung des Analytengases und eines Standard- oder Referenzgases

erreicht. Diese Relativmethode bietet die größte Genauigkeit bei der Bestimmung und dem Ver-

gleich der Variation, denn Diskriminierungseffekte, wie sie z.B. über die Zeit oder zwischen

zwei Geräten auftreten können, werden kompensiert.[70,76,181,281,293]

Die Ionisation der Gasmoleküle erfolgt über Elektronenstoß, weil hiermit eine hohe Ionisations-

rate und gute Stabilität erreicht wird. Die entstehenden Kationen werden aufgrund ihres Mas-

se/Ladungsverhältnisses (m/z) in einem Magnetfeld (Permanent- bzw. Elektromagnet) getrennt

3.3 Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie

und die Isotopomere in parallelen Faraday-Kollektoren (im Falle des in dieser Arbeit verwende-

ten Finnigan Deltaplus ein Dreifach-Auffänger) quantifiziert. Ein Schema der Ionenoptik eines

Finnigan Deltaplus-IRMS ist in Abbildung 24 dargestellt.

Die hohe Präzision und Genauig-

keit der IRMS, die kleinen Mas-

senunterschiede bei zugleich gro-

ßen Konzentrationsunterschieden

zwischen den Isotopomeren emp-

findlich und präzise zu messen,

wurde u.a. erst durch Faraday-

Cups möglich. In diesen werden

die durch den Magneten

Abbildung 24:

Schema der Ionenoptik eines Finnigan Deltaplus-IRMS

Originalgrafik aus der Finnigan Deltaplus-Manual[88]

aufgetrennten Isotopomere aufge-

fangen und durch einen VFC (vol-

tage to frequency converter =

Spannungs-Frequenzwandler) verschieden hoch verstärkt. Im Falle der Kohlenstoff-

Isotopenverhältnismessung müssen z.B. die drei Massen m/z = 44, 45 und 46 des Kohlendioxids,

die aus den Isotopen-Kombination 12C16O2, 13C16O2 und 12C16O18O herrühren, voneinander ge-

trennt werden, wobei das leichtere Isotopomer 12C16O2 mit 99 % natürlichen Anteils im absolu-

ten Überschuss vorliegt (s. Tabelle 2 in Kapitel 3.2).[26,31,88,181,281]

Im Falle der Kohlenstoffmessung muss auch beachtet werden, dass der δ13C-Wert nicht unab-

hängig vom Sauerstoff bestimmt werden kann, da 13C16O2 die gleiche Masse hat wie das Mole-

kül aus der Isotopomerenkombination 12C17O16O (m/z = 45). Somit fallen beide Moleküle in den

gleichen Cup und die Berechnung der 13C-Konzentration würde durch das 17O verfälscht werden,

das einen Beitrag von ca. 7 % zur Masse m/z = 45 leistet. Daher muss der δ13C-Wert bzw. das

45/44-Verhältnis immer korrigiert werden, was meist nach der sog. 17O-Korrektur nach Craig[48]

erfolgt.[283]

3. Allgemeiner Teil

3.3.2 Elementaranalysator (EA)

Der Elementaranalysator (EA) dient zur Überführung von festen oder flüssigen organischen Pro-

ben in die Messgase CO2 und N2 zur simultanen Kohlenstoff- und Stickstoffbestimmung

(„Dumas Combustion“). Ein Schema des in dieser Arbeit verwendeten EA 1110 CHN von Carlo

Erba / Finnigan ist in Abbildung 25 dargestellt.

Die Probe wird für die Analyse in

Zinnkapseln eingewogen und in

den kontinuierlich mit Sauerstoff

gespülten Autosampler platziert.

Beim Öffnen des Autosamplers

fällt die Probe in die heißeste Zo-

ne (1040 °C) des Oxidationsofens

(Quarzrohr) und der Spül-

Sauerstoff verhindert den Eintritt

von Luft in den Reaktor. Durch

den mit gekörntem Chromoxid

gefüllten Reaktor fließt Helium

als Trägergas, dem gleichzeitig

mit dem Einwurf der Probe Sauer-

stoff zugesetzt wird, um die Probe

katalytisch in die Messgase CO2,

Abbildung 25:

Schema des Aufbaus und der Funktionsweise des EA

Originalgrafik aus Präsentation von Oeßelmann et al.[187]

N2 und H2O umzusetzen. Das gleichzeitig verbrennende Zinn unterstützt dabei die quantitative

Verbrennung, indem es die Temperatur durch einen sog. „Flash“ kurzzeitig auf über 1800 °C

erhöht. Störende Gase werden mit silberhaltigem Kobaltoxid entfernt. Die gasförmigen Analyten

werden durch das Trägergas aus dem Oxidationsofen in den etwas kühleren Reduktionsofen

(650 °C) gespült. Dieser ist mit Kupfer gefüllt und reduziert entstandene Stickstoffoxide (NOx)

zu elementarem Stickstoff und bindet den überschüssigen Sauerstoff. Das bei der Verbrennung

entstandene Wasser wird an einer einfachen Magnesiumperchlorat-Falle gebunden und an einer

GC-Säule (Porapak) werden die Messgase N2 und CO2 isotherm (50 °C) voneinander getrennt.

Ein Open-Split-Interface (ConFlo IITM) führt die Analytengase und die Referenzgaspulse dem

IRMS zu und reduziert den Trägergasstrom von ca. 90 ml/min. auf eine für das IRMS verträgli-

che Flussrate von ca. 0,3 ml/min. Dadurch erreichen nur noch ca. 0,3 % des Gases das

IRMS.[25,31,197,262]

3.3 Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie

3.3.3 ConFlo IITM-Interface

Das ConFlo IITM-Interface hat ein beson-

deres Open-Split-System, dass den großen

Trägergasstrom aus dem EA permanent

teilt. Es besteht aus zwei ineinander

gesteckten Glasröhrchen, zwischen denen

90 % des EA-Trägergasstroms als

„Waste“ vorbeifließen und nur ca. 10 % in

das innere Röhrchen gelangen. An dessen

Ende befindet sich die sog. „Schnüffel“-

Kapillare, die den reduzierten EA-

Trägergasstrom zum IRMS leitet. Das

Open-Split-System des ConFlo IITM ist

weiterhin so konzipiert, dass der EA-

Trägergasstrom mit Helium über eine

Abbildung 26:

Schema der Funktionsweise eines ConFlo IITM-

Interfaces im Dualgasmode

Originalgrafik aus dem ConFlo II-Interface Benut-

zerhandbuch[262]

bewegliche Kapillare noch weiter ver-

dünnt werden kann. Dies ist z.B. bei orga-

nischen Proben nötig, um das in hohen

Konzentrationen entstehende Kohlendi-

oxid gegenüber dem zumeist kleinen

Stickstoffsignal angleichen zu können. Dazu wird kurz vor dem Durchlauf des CO2-Peaks die

bewegliche Heliumkapillare unter das Niveau der MS-Schnüffelkapillare in das innere Röhrchen

abgesenkt und durch Gegenstromprinzip der ankommende EA-Trägergasstrom weiter verdünnt

(Dilution). Dabei ist jedoch zu beachten, dass die Zumischung des Heliums eine Isotopenfraktio-

nierung hervorruft, so dass Probe und Standard immer unter gleichen Bedingungen gemessen

werden müssen. Eine schematische Darstellung der Funktionsweise des ConFlo IITM während

einer N2-CO2-Dualgasmessung ist in Abbildung 26 wiedergegeben.

Außerdem können über die beweglichen Kapillaren dieses Open-Split-Systems auch die für die

interne Standardisierung benötigten Referenzgaspulse in den Helium-Trägergasstrom aus dem

EA zugegeben werden. Dadurch kann auch die externe Kalibrierung durch Messung von Ar-

beitsstandards entfallen, da die Steuerungssoftware (ISODAT NT) die Eingabe des δ-Werts der

Referenzgase erlaubt und somit der δ-Wert der Probe bezogen auf den internationalen Bezug-

standard ausgegeben wird. Nach Herstellerangaben liegt die Präzision einer N2-CO2-

Dualgasmessung für δ15N bei ±0,13 ‰ (5 µg N) und für δ13C bei ±0,11 ‰ (4 µg C).[12,262]

3. Allgemeiner Teil

3.3.4 High Temperature Conversion / Elemental Analyzer (TC/EA)

Ausgangspunkt vieler Entwicklungsversuche für eine Sauerstoffbestimmung waren die Metho-

den nach Unterzaucher (1952)[267] und Schütze (1939)[240] sowie Rittenberg und Ponticorvo

(1956)[212], bei denen der in der Probe enthaltene Sauerstoff quantitativ zu Kohlenmonoxid um-

gesetzt und dieses weiter zu Kohlendioxid zur Quantifizierung oxidiert wird.[18,206,259] Diese

Techniken sind jedoch mit hohen Zeitaufwand, Blindwerten, Memoryeffekten (Reaktionen mit

Reaktorwänden) und Einschränkungen bezüglich der zu analysierenden Proben (Fluoride reagie-

ren mit dem Quarzrohr, Sulfate mit Kohlenstoff) verbunden. Der Durchbruch auf dem Gebiet der

Sauerstoff-Isotopenverhältnismessung wurde daher durch die Entwicklung von memoryfreien

Pyrolyserohren aus glasartigem Kohlenstoff (Glassy Carbon) und die Umstellung auf eine direk-

te Messung der Kohlenmonoxidmassen m/z = 30 und 28 erreicht. Auch die online-Kopplung der

Pyrolyseeinheit an ein IRMS konnte durch die Verwendung von Helium als Trägergas erreicht

werden.[160,165,187,263,281,284]

Das in dieser Arbeit verwendete Pyrolysegerät der Firma ThermoQuest / Finnigan MAT ist der

sog. TC/EA (High Temperature Conversion / Elemental Analyzer), der für die (simultane) Was-

serstoff- und Sauerstoffbestimmung flüssiger oder fester, organischer oder anorganischer Proben

konzipiert ist. Im Falle der vorliegenden Arbeit war nur die Sauerstoffanalyse möglich, da das

IRMS-Basisgerät nicht mit H2-Faraday-Auffängern ausgestattet war. Der schematische Aufbau

und die Funktionsweise des TC/EA sind in Abbildung 27 dargestellt.

Abbildung 27:

Schema des Aufbaus und der

Funktionsweise des TC/EA

Originalgrafik aus der TC/EA-

Gerätebeschreibung[89]

3.3 Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie

Die in Zinn- oder Silberkapseln eingewogenen Proben werden hier anders als beim EA durch

einen heliumgespülten Autosampler in das Reaktorrohr eingeworfen und durch Pyrolyse, d.h.

einer Verbrennung bei sehr hohen Temperaturen unter Sauerstoffausschluss und mit einem Koh-

lenstoffdonator (Graphitcrucible), in die Messgase CO und elementaren H2 überführt

(s. Reaktionsgleichung in Abbildung 27). Die Probe fällt dabei in die heißeste Zone des Reaktor-

rohrs (1350 °C), das aus einem äußeren Keramikmantel (Aluminiumoxidrohr) und einem inneren

Glassy Carbon Rohr besteht. Der Zwischenraum zwischen diesen beiden Rohren wird permanent

mit Helium gespült, um unerwünschte Oxidationen zu vermeiden. Der Helium-Trägergasstrom

transportiert die entstehenden Probengase weiter, wobei Schwefel an Silberwolle gebunden wird,

die Bestandteil der Reaktorfüllung ist. Die im Trägergasstrom verbleibenden Analytengase H2,

N2 und CO werden isotherm (70 °C) an einer GC-Säule (Molsieve) voneinander getrennt und

dem IRMS via Open-Split-Interface (ConFlo IITM) zugeführt.[263] Nach Herstellerangaben liegt

die Präzision des TC/EA für δ18O-Messung von Feststoffen (Benzoesäure) bei ±0,4 ‰ (52 µg O)

und für δ2H bei ±3 ‰ (25 µg H).[89]

Es ist bei der Sauerstoffanalyse außerdem zu beachten, dass das aus stickstoffhaltigen Proben

entstehende Stickstoffgas die Messung stören kann. In der Ionenquelle entsteht aus dem Stick-

stoff in Verbindung mit Wasser Stickstoffmonooxid (NO), das einerseits schwer abzupumpen ist

und andererseits mit einer Masse von m/z = 30 die CO-Messwerte verfälscht. Abhilfe kann hier

das Zumischen eines sog. Auxiliary-Gases aus 1-2 % Wasserstoff in Helium zum Helium-

Trägergasstrom schaffen, um nach folgender Formel das Wasser in der IRMS-Quelle abzufangen

bzw. für eine Reaktion mit N2 zu inaktivieren: H2 + H2O → H3+ + OH-.

Ein weiteres, praktisches Problem während der Durchführung der vorliegenden Arbeit war das

Fehlen kommerziell erhältlicher, fester, organischer Referenzsubstanzen.[162] Kalibrierungen

mussten daher mit vorhandenen wässrigen Standards (VSMOW und einem Laborstandard der

Gasbench) durchgeführt werden, obwohl sich diese bei der Pyrolyse anders verhalten als ein

organischer Feststoff. Des Weiteren decken die kommerziell erhältlichen Referenzwässer nur

δ18O-Werte im negativen Bereich ab, jedoch liegen die von Pflanzen bzw. Lebensmitteln im All-

gemeinen mehr im Positiven. Seit Mitte 2004 sind bei der Internationalen Atomenergiebehörde

(IAEA)[139] zwei Benzoesäuren (+23,06 ‰ und +71,40 ‰) käuflich zu erwerben, die eine sichere

2-Punkt-Kalibrierung des TC/EA für die Messung von organischen Festproben ermöglichen,

jedoch kamen sie für diese Arbeit leider zu spät auf den Markt.

3. Allgemeiner Teil

3.4 Multivariate Datenanalyse

Der Literatur ist zu entnehmen, dass der Einsatz multivariater statistischer Datenanalysen in der

Lebensmittelchemie immer häufiger und notwendiger wird. Der Nachweis der Herkunft oder

Verfälschung von hochwertigen und damit teuren Lebensmitteln kann meist nicht nur anhand

eines Parameters geführt werden. Die multivariate Statistik stellt jedoch Methoden und Verfah-

ren zur Verfügung, die die gemeinsame, gleichzeitige Analyse mehrerer Merkmale bzw. deren

Ausprägungen erlauben und gegenüber einer univariaten Analyse die Abhängigkeiten zwischen

den beobachteten Merkmalen berücksichtigen.[121]

In den letzten Jahren wurden vor allem sechs spezielle Lebensmittel (Wein,[55,114,150,164,183,198,221]

kaltgepresstes Olivenöl,[84,178,249,250] Käse,[177,202] Fleisch,[22,200] Kaffee und Tee[6,52,87,172,276]) mit-

tels Stabilisotopendaten oder einer Kombination der Messungen von Stabilisotopen, 1H NMR,

Metallen oder Spurenelementen sehr intensiv unter Zuhilfenahme der multivariaten Datenanaly-

se untersucht. Hierbei wurden meistens die Hauptkomponentenanalyse und die Diskriminanz-

analyse, häufig auch in Kombination, verwendet.

Ein Datensatz wird im Allgemeinen über zwei Größen definiert: den Objekten (Untersuchungs-

gegenständen) und den Variablen (Messgrößen, Eigenschaften, Parametern).[129] Bei der vorlie-

genden Fragestellung nach der Herkunft (Gruppenvariable) der Pistazien werden an mehreren

Objekten (gesamte Nuss, Öl, entfetteter Rückstand) drei verschiedene Variablen (Isotopenda-

ten δ13C, δ15N, δ18O) gemessen. Ziel der multivariaten statistischen Untersuchung ist es nun, mit

Hilfe eines authentischen Datensatzes (Pistazienproben mit bekannter Herkunft/Gruppen-

zugehörigkeit) diejenige Variablen-Objekt-Kombination herauszufinden, die eine Herkunfts-

/Gruppenzuordnung der Proben nach Ländern zulässt. Mit Hilfe dieses Modells soll dann später

die Herkunft unbekannter Pistazienproben bestimmt/überprüft werden.

Es wird daher ein strukturen-prüfendes Verfahren zur Erstellung des statistischen Modells ge-

sucht, denn die abhängige (Gruppen-) Variable „Herkunft“ und die unabhängige Variable

„δ-Wert“ sind beim authentischen Datensatz bekannt. Ist wie in diesem Fall die abhängige Vari-

able nominal skaliert und die unabhängige Variable metrisch, so bietet sich die Diskriminanzana-

lyse zur Auswertung an. Sie ist ein Verfahren zur Analyse von Gruppenunterschieden und zur

Klassifizierung neuer Elemente.[13]

Es ist jedoch vorher ratsam, ein strukturen-entdeckendes Verfahren auf den Datensatz anzuwen-

den, um dessen wesentliche Struktur zu erkennen, d.h. ob sich die Pistaziendaten überhaupt nach

Ländern ordnen. Hierfür eignet sich die Hauptkomponentenanalyse, denn sie ermöglicht eine

klare grafische Veranschaulichung der wesentlichen Variablenstruktur eines Datensatzes und

kann auch zur Datenreduktion eingesetzt werden.[129]

3.4 Multivariate Datenanalyse

Eine nähere Erklärung zur Einteilung der multivariaten Analysenmethoden in primär strukturen-

entdeckende und strukturen-prüfende Verfahren ist in Anhang II gegeben.

3.4.1 Hauptkomponentenanalyse

Die Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis) ist ein Spezialgebiet der Fakto-

renanalyse und gehört zu den strukturen-entdeckenden Verfahren. Sie soll auf den authentischen

Pistaziendatensatz angewendet werden, um zu überprüfen und sicherzustellen, dass ein grund-

sätzlicher, statistischer Zusammenhang zwischen den δ-Werten und der Herkunft der Pistazien

besteht. Außerdem eignet sich die Hauptkomponentenanalyse aufgrund ihrer strukturen-

entdeckenden Eigenschaft hervorragend zur Erkennung multivariater Ausreißer, wenn sie auf

einen authentischen Datensatz angewendet wird, da hier die kausalen Zusammenhänge der Vari-

ablen schon bekannt sind (in diesem Falle die Herkunft der Pistazienproben).

Bei der Hauptkomponentenanalyse wird eine größere Anzahl von Variablen anhand der gegebe-

nen Fälle auf eine kleinere Anzahl unabhängiger Einflussgrößen (Hintergrundvariablen, künstli-

che Merkmale) zurückgeführt. Diese sog. Faktoren, die als „hinter den Variablen“ stehende Grö-

ßen angesehen werden, repräsentieren den Zusammenhang zwischen verschiedenen Ausgangsva-

riablen und machen diese handhabbar und oft auch erst interpretierbar. Der Vorteil dieser künst-

lichen Größen besteht darin, dass sie mehr Information übertragen als jede einzelne Ausgangsva-

riable. Dabei werden diejenigen Variablen, die untereinander stark korrelieren, zu einem Faktor

zusammengefasst. Ziel der Hauptkomponentenanalyse ist es somit, solche Faktoren zu ermitteln,

welche die beobachteten Zusammenhänge zwischen den gegebenen Variablen möglichst voll-

ständig erklären.[36,37,129] Üblicherweise wird diese Analyse in den folgenden vier Schritten

durchgeführt:

1. Berechnung der Korrelationsmatrizen,

2. Extraktion der Faktoren,

3. Rotation,

4. Berechnung der Faktorwerte.

Nähere Ausführungen zu den vier Schritten der Hauptkomponentenanalyse finden sich in An-

hang II.

3. Allgemeiner Teil

3.4.2 Diskriminanzanalyse

Die Diskriminanzanalyse ist eines der klassischen strukturen-prüfenden Verfahren unter der

Vielzahl multivariater Datenanalysen. Ihr primäres Ziel besteht in der optimalen, linearen Sepa-

ration gegebener Gruppen (Lernphase), um später neue Objekte in eine dieser Gruppen mit mög-

lichst großer Sicherheit einzuordnen/zu klassifizieren.[129] Im Mittelpunkt der Diskriminanzana-

lyse steht die Aufstellung der sog. Diskriminanzfunktion d, die auch als kanonische Diskrimi-

nanzfunktion bezeichnet wird, um die vorgenommene Linearkombination der Variablen zu

kennzeichnen:[13]

d = b1x1 + ... + bnxn + a

Dabei sind x1 bis xn die verschiedenen erklärenden Variablen und b1 bis bn sowie die Konstante a

die von der Analyse abzuschätzenden Koeffizienten, mit denen die Variablen in die Diskrimi-

nanzfunktion einfließen. Bei g Gruppen lassen sich maximal g-1 Diskriminanzfunktionen, die

jeweils orthogonal (rechtwinklig bzw. unkorreliert) zueinander sind, bilden. Ziel der Diskrimi-

nanzanalyse ist es nun, die Koeffizienten so zu ermitteln, dass die Werte der Diskriminanzfunk-

tionen die untersuchten Gruppen möglichst optimal trennen.

Es existiert jedoch keine definierte Regel bezüglich der minimal benötigen Größe eines

Lerndatensatzes zur Ermittlung der Diskriminanzfunktion, aber aus mathematisch-technischer

Sicht sollten pro Gruppe (wesentlich) mehr Proben als Variablen vorhanden sein. Ansonsten

besteht die Gefahr des sog. „Lasso-Effekts“ oder „overfittings“, d.h. bei Verwendung nur

weniger Proben wird eine scheinbar sehr gute Trennung der Gruppen erreicht, aber Testproben

danach falsch klassifiziert.[13,150]

Nach der Aufstellung eines Klassifizierungsmodells ist die abschließende Angabe einer Klassifi-

kationsfehlerrate als Gütemaß für die in der Lernphase aufgestellte Zuordnungsregel ein unver-

zichtbarer Bestandteil der Diskriminanzanalyse. Damit kann abgeschätzt werden, mit welcher

Sicherheit bzw. Irrtumswahrscheinlichkeit die Einordnung der Testobjekte in die vorgegebenen

Klassen behaftet ist und der schon erwähnte Lasso-Effekt wird ausgeschlossen.

Nähere Erläuterungen zur Durchführung einer Diskriminanzanalyse finden sich in Anhang II.

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

Ergebnisteil I:

Methodenvalidierung

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

Bevor Proben vermessen und ihre Messwertergebnisse diskutiert und interpretiert werden kön-

nen, müssen zuerst einige generelle Parameter überprüft werden, um sicherzustellen, dass das

Messgerät, die Proben und die Methode sichere, stabile und richtige Ergebnisse liefern und auch

die verwendeten Materialien und Aufarbeitungsschritte keine Fehler in die Ergebnisse eintragen.

Das einwandfreie Arbeiten und die Stabilität der Geräte kann am besten über darauf kalibrierte

Standards geprüft und verfolgt werden. Zertifizierte Referenzmaterialien sind im Bereich der

Stabilisotopenanalytik allerdings nur in geringen Mengen und sehr teuer bei der Internationalen

Atomenergiebehörde (IAEA) zu beziehen. Daher eignen sie sich nicht als täglicher Laborstan-

dard, sondern dienen nur zur Kontrolle des Geräts in größeren Abständen und zur Kalibrierung

eines Arbeitsstandards. Dieser kann dann aber hervorragend für die täglichen Messungen als

Bezugs-, Berechnungs- und Kontrollstandard eingesetzt werden. Außerdem sollte bei IRMS-

Geräten immer der lineare Arbeitsbereich kontrolliert werden, damit die Einwaagen richtig ge-

wählt sind. Zu hohe Einwaagen führen nämlich zu einer Überladung der Detektoren und zu nied-

rige können nicht mehr erfasst werden (Empfindlichkeit). Allerdings ist unter Linearität in der

IRMS nicht der klassische Zusammenhang zwischen Signal und Konzentration zu verstehen (aus

dessen Korrelation sich eine Kalibrierfunktion ergibt), sondern der Zusammenhang zwischen

Signalhöhe bzw. Probenmenge und Messwert (es werden keine Quantitäten sondern Verhältnisse

gemessen). Idealer Weise sollte bei der Auftragung der Signalhöhe gegen den Messwert eine

Parallele zur Achse resultieren, denn das Isotopenverhältnis einer Probe sollte immer gleich, also

unabhängig von der Einwaage und der Signalhöhe sein.

Im Zuge der Qualitätssicherung und des Qualitätsnachweises in einem analytischen Labor sollte

eine neue Messmethode außerdem validiert werden, um die Verwendbarkeit und Gültigkeit der

Analysenergebnisse zu gewährleisten. Die wichtigsten Kriterien für den Validierungsumfang

sind natürlich die Art der Probe, die Apparatur und das Ziel der Validierung.

Die Validierung eines Analysenverfahrens besteht im Wesentlichen aus der kritischen Untersu-

chung der einzelnen Analysenschritte auf systematische und statistische Fehler, jedoch erlaubt

die IRMS-Technik in diesem Zusammenhang nur die Prüfung von sehr wenigen der üblichen

Validierungsparameter, da hier Verhältnismessungen an einer bestimmten, charakteristischen

Eigenschaft der Probe durchgeführt werden. Die Auswahl an zertifizierten Referenzmaterialien

ist begrenzt und Standardmatrizes sind käuflich nicht zu erwerben, so dass sich die Validierung

in diesem Fall nur auf die Feststellung der Richtigkeit, Präzision und Stabilität beschränkt.[107,166]

Des Weiteren müssen neben der Messmethode auch die Probe an sich und ihre Aufarbeitung auf

Quellen von Fehlereinträgen und Diskriminierungen untersucht werden. Pistazien kommen z.B.

in unterschiedlichen Darreichungsformen in den Handel und werden als Snack-Artikel zumeist

geröstet und gesalzen angeboten (selten ohne Schale). Vor allem auf dem amerikanischen Markt

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

gibt es häufig auch ungesalzene oder rohe (nur getrocknete) Pistazien zu kaufen und im grünen

(frischen) Zustand sind sie zumeist bei den Backzutaten zu finden. Da die Methode daraufhin

abzielt, die geografische Herkunft in allgemeiner Handelsware zu erkennen, müssen die unter-

schiedlichen Darreichungsformen von Pistazien auf Unterschiedlichkeit in den Isotopenverhält-

nissen hin untersucht werden, um eine Vorstellung über ihre biologische Streubreite zu bekom-

men. Außerdem muss sichergestellt werden, dass die Stabilisotopenverhältnisse der Pistazien-

proben über den Untersuchungszeitraum hinweg stabil bleiben und nicht durch Alterung oder

Nebenreaktionen fraktionieren. Mögliche Reaktionen, die das Stabilisotopenverhältnis verändern

könnten, sind der Austausch oder die Reaktion mit der Umgebung (Luft, Lagerbehältnis) und

Bakterien- oder Schimmelpilzbefall (Mikroorganismen selber, Ausscheidungsprodukte).

Desgleichen müssen die Stabilität der Chemikalien und die Alterung von Materialien bei einem

Verfahren überprüft werden, sowie Faktoren wie Außentemperatur, -druck, Chargenwechsel von

Chemikalien, Austausch von Bauteilen etc. beachtet werden. Zur Prüfung der (Verfahrens-) Sta-

bilität eines Analysenverfahrens eignen sich sehr gut (Shewhart-) Mittelwert-Regelkarten, die die

zeitlichen Veränderungen der Qualitätsmerkmale realisieren. Eine gute Stabilität eines Verfah-

rens liegt vor, wenn die Gesamtstandardabweichung der zulässigen Präzision genügt und die

Standardabweichung zwischen den Serien maximal das Doppelte der Standardabweichung in der

Serie beträgt.[102,107]

Daher werden in diesem Kapitel Geräte, Methoden, Materialien und Aufarbeitungsverfahren auf

nachfolgende Punkte untersucht:

1. Kalibrierung der Arbeitsstandards,

2. Stabilitätsprüfung der Referenzgase,

3. Linearer Arbeitsbereich,

4. Voruntersuchungen von Pistazien,

5. In-House-Validierung der IRMS-Methode,

6. Prüfung der Öl-Extraktionsmethode,

7. Einfluss von Röstung und Salzung auf den δ-Wert.

Alle statistischen Auswertungen und Tests werden mit Hilfe der Software SPSS 12.0 auf dem

95 %-Wahrscheinlichkeitsniveau durchgeführt.

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

4.1 Kalibrierung der Arbeitsstandards

Die Grundvoraussetzungen eines Stoffes, der als Arbeitsstandard dienen soll, sind Homogenität

und Stabilität, zudem sollte er preisgünstig, in genügend großen Mengen verfügbar und nicht

giftig sein. Den praktischsten Arbeitsstandard stellen daher die Referenzgase dar. Außerdem

bietet die ISODAT-Software zur Steuerung der IRMS-Geräte der Firma Finnigan die Möglich-

keit, den δ-Wert für das Referenzgas vorzugeben, so dass bei jeder Messung gleich der δ-Wert

der Probe bezogen auf den internationalen Standard bestimmt wird. Da die Einsatzfähigkeit und

Stabilität der Referenzgase als Arbeitsstandards erst während dieser Arbeit geprüft wurde, wur-

den zur Sicherheit zusätzlich Feststoff-Arbeitsstandards (Acetanilid für die 13C- und 15N-

Analytik im Dualgasmodus, Cellulose für die 18O-Messungen) kalibriert und diese zusammen

mit Gerätekontrollproben (GKP) in jeder Sequenz mitgeführt.

Durchführung:

Die zu kalibrierenden organischen Feststoffe und die entsprechenden Referenzgase wurden ge-

gen zertifizierte Referenzmaterialen mehrfach in einer Sequenz vermessen und dies an verschie-

denen Tagen wiederholt. Die Vergleichbarkeit der an den verschiedenen Tagen gemessenen Mit-

telwerte wurde anhand der ANOVA überprüft, ebenso die Normalverteilung und die Homogeni-

tät der Messwerte. Am Elementaranalysator wurden diese Messungen sowohl im Single- als

auch im Dualgasmodus durchgeführt, um eventuelle Unterschiede zwischen diesen Einstellun-

gen feststellen zu können. Die Kalibrierung wurde am Anfang jeder Messperiode (nach Umbau

der Peripherien) erneut durchgeführt.

Die Kalibrierung der festen und gasförmigen Arbeitsstandards am Elementaranalysator erfolgte

über eine Ein-Punkt-Kalibrierung mittels der IAEA-Referenzmaterialien. Das CO-Referenzgas

des TC/EA’s wurde über den Arbeitsstandard Cellulose kalibriert, da dessen δ-Wert den Proben

am nächsten lag. Die Kalibrierung der Cellulose am TC/EA musste allerdings über eine Normie-

rung erfolgen, da dieses Gerät nicht über weite δ-Wertbereiche linear misst (s. Anhang I: Be-

rechnung des δ-Werts). Dazu wurden zwei Standards benötigt, jedoch existierten zu diesem

Zeitpunkt für die Sauerstoffanalyse noch keine zertifizierten organischen Feststoffe. Daher wur-

de die Cellulose über die zwei vom δ-Wert am nahe liegensten, verfügbaren Wasser-Standards

des Labors kalibriert, dem IAEA-Referenzmaterial VSMOW und einem Wasser-Arbeitsstandard

der Gasbench.

Eine Richtigkeitsprüfung erfolgte anschließend für die Kalibrierungsergebnisse der Feststoff-

Arbeitstandards mittels Proben bekannten δ-Werts (s. Kapitel 4.5.1).

4.1 Kalibrierung der Arbeitsstandards

Ergebnis:

Tabelle 7: Ergebnisse der Kalibrierung der Feststoff-Arbeitsstandards mittels IAEA-Referenz-

materialien

δ13CPDB Acetanilid δ15NAir Acetanilid δ18OSMOW Cellulose

IAEA-Referenzmaterial Polyethylenfolie Kaliumnitrat SMOW-Wasser

Arbeitsstd.-Wasser

Kalibrierverfahren Ein-Punkt-Kalibrierung Ein-Punkt-Kalibrierung Normierung

ermittelter δ-Wert -25,0 ‰ -8,6 ‰ 31,3 ‰

Standardabweichung s 0,10 ‰ 0,07 ‰ 0,43 ‰

Anzahl der Sequenzen 5 4 13

Anzahl der Messwerte n 49 39 63

Normalverteilungstest* 0,200 0,200 0,200

Varianzhomogenität* 0,330 0,567 0,934

ANOVA 0,994 0,051 0,101

* Test auf Normalverteilung nach Kolmogorov-Smirnov, Test auf Homogeniät der Varianzen nach Le-

vene

Tabelle 8: Ergebnisse der Referenzgas-Kalibrierung (Mittelwerte aus verschiedenen Standards

und Sequenzen)

Gas Mode Kalibrier-

standards

1. Messperiode

δ-Wert ± s [‰]

2. Messperiode

δ-Wert ± s [‰]

3. Messperiode*

δ-Wert ± s [‰]

CO2 Single Polyethylenfolie

NBS 22 -28,4 ± 0,06 -33,1 ± 0,07

CO2 Dual Polyethylenfolie

NBS 22 -28,3 ± 0,05 -28,5 ± 0,10 -33,0 ± 0,09

N2 Dual Kaliumnitrat

Ammoniumsulfat -5,7 ± 0,14 -5,7 ± 0,08 -13,7 ± 0,09

CO Single Cellulose -2,6 ± 0,40 -2,9 ± 0,29

* Gasflaschenwechsel bei den Referenzgasen CO2 und N2

Es konnte gezeigt werden, dass die zwei Feststoffe Acetanilid und Cellulose dazu geeignet sind,

als Arbeitsstandards für die δ13C-, δ15N- bzw. δ18O-Messung zu fungieren. Die Kalibrierung die-

ser Stoffe über mehrere Sequenzen an verschiedenen Tagen führt zu normalverteilten Werten

und der Vergleich der Varianzhomogenitäten und Mittelwerte zwischen den Sequenzen liefert

keine signifikanten Unterschiede auf dem 95 %-Signifikanzniveau (s. Tabelle 7). Zwischen den

Einstellungen „Single-“ und „Dualgasmode“ am Elementaranalysator konnten keine Unterschie-

de in den erhaltenen Messwerten festgestellt werden.

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

Auch die Ermittlung der δ-Werte der Referenzgase führt zu Mittelwerten mit befriedigenden

Standardabweichungen (s. Tabelle 8). Da die Eignung der Referenzgase als Arbeitsstandards

über den Zeitraum dieser Arbeit erst getestet wurde (siehe dazu die Stabilitätsprüfung in Kapitel

4.2), kann an dieser Stelle keine statistische Beurteilung erfolgen.

In Tabelle 8 ist auch abzulesen, dass zu Beginn jeder neuen Messperiode die Referenzgase ge-

ringfügig nachkalibriert werden mussten, was an den unterschiedlichen δ-Werten zwischen der

ersten und zweiten Messperiode zu erkennen ist. Dies kann nur durch eine Isotopendiskriminie-

rung aufgrund des Referenzgas-Druckventils am ConFlo-Interface erklärt werden, denn nur diese

Gasdruckventile wurden aufgrund des Peripheriegeräte- und damit Referenzgaswechsels ver-

stellt. Außerdem ist bei der Verwendung der Referenzgase als Standard darauf zu achten, dass

der ermittelte δ-Wert nur für die jeweilige Gasflasche gilt.

Anmerkung:

Die Richtigkeit des ermittelten δ-Werts der Cellulose muss mit Vorbehalt angesehen werden.

Um die Nicht-Linearität des Messsystems durch einen Korrekturfaktor auszugleichen, wurde

über eine Normierung kalibriert. Da jedoch zum Zeitpunkt der Kalibrierung noch keine zertifi-

zierten Standards in den δ-Wertbereichen der Cellulose und der Proben (20-40 ‰) existierten,

musste auf vorhandene Standards zurückgegriffen werden. Diese deckten aber nur einen Mess-

bereich ab, der ca. 20 ‰ unter dem Probenmessbereich lag, so dass hierdurch möglicherweise

ein Fehler eingetragen wurde. Eine weitere Fehlerquelle liegt wahrscheinlich auch in der Tatsa-

che, dass der Feststoff Cellulose gegen flüssige (Wasser-) Standards kalibriert werden musste.

Trotz dieser Unsicherheiten wurde der ermittelte δ18OVSMOW-Wert der Cellulose für die Proben-

vermessung verwendet, da dies die einzige Möglichkeit war, überhaupt zu kalibrieren und zu

messen.

4.2 Stabilitätsprüfung der Referenzgas-Kalibrierung

Die Prüfung der Richtigkeit und der Stabilität der Referenzgas-Kalibrierung erfolgte über Quali-

tätsregelkarten mit Hilfe der Arbeitsstandards, die zur Sicherheit in jeder Sequenz mitgeführt

wurden. Die Daten für den Sollwert und die Standardabweichung zur Berechnung der Kontroll-

und Warngrenzen (±2s, ±3s) stammen aus der Kalibrierung der Arbeitsstandards gegen die

IAEA-Referenzmaterialen (s. vorheriges Kapitel 4.1).

Ergebnis:

Qualitätsregelkarte: Acetanilid vs. CO

-Referenzgas

-25,4

-25,2

-25,0

-24,8

-24,6

Apr

´03

Jun

´03

Jul

´03

Jul

´03

Jul

´03

Okt

´03

Okt

´03

Feb

´04

Feb

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Sollwert

1./2. Mess

periode

3. Mess-

periode

+3s

+2s

-2s

-3s

Abbildung 28: Qualitätsregelkarte Acetanilid zur Überprüfung der CO2-Referenzgaskalibrierung

Qualitätsregelkarte: Acetanilid vs. N

-Referenzgas

-8,9

-8,7

-8,5

-8,3

Jun

´03

Jun

´03

Jun

´03

Jul

´03

Jul

´03

Jul

´03

Jul

´03

Okt

´03

Okt

´03

Okt

´03

Feb

´04

Feb

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Sollwert

1./2. Mess

periode

3. Mess-

periode

+3s

+2s

-2s

-3s

Abbildung 29: Qualitätsregelkarte Acetanilid zur Überprüfung der N2-Referenzgaskalibrierung

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

Qualitätsregelkarte: Cellulose vs. CO-Referenzgas

29,5

30,2

30,9

31,6

32,3

33,0

Aug

´03

Aug

´03

Sep

´03

Sep

´03

Sep

´03

Sep

´03

Sep

´03

Sep

´03

Okt

´03

Apr

´04

Mai

´04

Mai

´04

Mai

´04

Mai

´04

Mai

´04

Jun

´04

Jun

´04

Sollwert

1. Mess-

periode

2. Mess-

periode

+3s

+2s

-2s

-3s

Abbildung 30: Qualitätsregelkarte Cellulose zur Überprüfung der CO-Referenzgaskalibrierung

Die erwünschte Stabilität der Referenzgase ist an den Qualitätsregelkarten (s. Abbildung 28-30)

gut abzulesen: Die Messwerte der bei jeder Sequenz mitgeführten Arbeitsstandards streuen um

den Mittelwert (Sollwert), es sind keine Trends erkennbar und die Messwerte liegen meistens

innerhalb der Warngrenzen (±2s). Die Referenzgase eignen sich daher genauso gut als Bezugs-

standards wie die Feststoff-Arbeitsstandards. Dadurch wird die aufwändige nachträgliche

δ-Wertberechnung der Proben überflüssig, denn die IRMS-Gerätesoftware ISODAT kann die

δ-Werte direkt bezogen auf den internationalen Standard ausgegeben.

4.3 Linearer Arbeitsbereich

Der lineare Arbeitsbereich eines IRMS-Geräts soll sich über einen Bereich von 2-7 V erstrecken

und wird von der Firma Finnigan derart definiert, dass die bei steigender Konzentration resultie-

rende Signal-Messwert-Gerade um nicht mehr als 0,06 ‰/V steigen darf.[11]

Durchführung:

Der lineare Arbeitsbereich des EA’s und TC/EA’s wurde jeweils mit Pistazie, entfetteten Rück-

stand und Pistazienöl bestimmt, um eventuelle Matrix-Unterschiede zu erkennen. Dazu wurden

die Proben auf vier verschiedenen Konzentrationsniveaus jeweils fünffach vermessen.

Ergebnis:

Tabelle 9: Ermittelte lineare Arbeitsbereiche für die 13C-, 15N- und 18O-Methode

Pistazie Rückstand Öl

linearer Arbeitsbereich 5 – 8 V 2 – 6 V 3 – 8 V

13C Steigung 0,07 ‰/V 0,02 ‰/V 0,07 ‰/V

linearer Arbeitsbereich 3 – 4 V 3 – 8 V --

15N Steigung -0,06 ‰/V 0,00 ‰/V --

linearer Arbeitsbereich 3 – 6 V 3 – 5 V 2 – 8 V

18O Steigung -0,01 ‰/V 0,04 ‰/V 0,13 ‰/V

Die Ergebnistabelle 9 zeigt für den EA (13C- und 15N-Methode), dass in den angegebenen Sig-

nalhöhen- bzw. Arbeitsbereichen in allen drei untersuchten Pistazienfraktionen die Messungen

als linear zu bezeichnen sind. Die Spannweiten der Volt-Bereiche sind allerdings unterschied-

lich, weil mit einer Probeneinwaage gleichzeitig sowohl das 13C- als auch das 15N-Ergebnis er-

zeugt wurde (die Dualgasmessung ist zeit- und kostengünstiger).

Der TC/EA (18O-Methode) zeigt wesentlich engere lineare Arbeitsbereiche, weil es hier auf-

grund von Nebenreaktionen in der IRMS-Quelle zu starken Linearitätseinbußen kommt, die auch

das zugeführte Auxiliarygas (2 % H2 in He) nicht ausgleichen konnte (s. Kapitel 3.3.4). Beim

Pistazienöl zeigt sogar nur die nähere Umgebung einer Konzentration gleichartige δ-Werte. Hier

könnten die veränderten Bedingungen bei der Verbrennung aufgrund der flüssigen Konsistenz

des Öls und der stärkeren Zinnkapseln (Becher statt Folien) eine Rolle spielen. Da die Öle je-

doch alle per Mikroliterspritze abgemessen werden und dies sehr gut reproduzierbar ist, kann

davon ausgegangen werden, dass alle Proben auf dem gleichen Konzentrationsniveau und damit

unter gleichen Bedingungen vermessen wurden und der δ-Wert dadurch vergleichbar bleibt.

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

4.4 Voruntersuchungen von Pistazien

4.4.1 Streubreite innerhalb einer Handelsverpackung

Eine Pistazienprobe (z.B. eine Handelsverpackung) muss für die Untersuchung vermahlen wer-

den, um einen Durchschnittswert der Gesamtprobe zu erhalten. Es ist daher wichtig vorher fest-

zustellen, wie hoch die durch das Mischen mehrere Kerne erzeugte Streuung ist und wie viel

Kerne gebraucht werden, um eine homogene, repräsentative Probe zu erhalten. Zur Feststellung

der „biologischen Streubreite“ einer Pistazienprobe wurden daher einzelne Kerne einer Handels-

verpackung vermahlen und auf ihre 13C-, 15N- und 18O-Verhältnisse hin vermessen.

Durchführung:

Jeweils zehn einzelne Pistaziennüsse aus acht verschiedenen Handelsverpackungen unterschied-

licher Händler wurden auf ihr 13C-, 15N- und 18O-Stabilisotopenverhältnis hin vermessen. Die

daraus resultierende Gesamtstreuung der zehn Einzelnüsse einer Tüte wird jeweils mit einer

vermahlenen 20 g-Probe derselben Tüte verglichen.

Ergebnis:

Tabelle 10: δ13C-Ergebnisse des Vergleichs der Standardabweichung von 10 einzelnen Pistazien-

nüssen und einer 20 g-Mischprobe derselben Tüte

δ13C Tüte 1 Tüte 2 Tüte 3 Tüte 4 Tüte 5 Tüte 6 Tüte 7 Tüte 8

x in [‰] -26,59 -26,74 -27,25 -27,91 -27,20 -27,11 -28,11 -27,37

s in [‰] 1,17 0,96 0,89 1,03 1,01 0,91 0,74 1,25

Einzelnüsse

(n = 10)

S in [‰] 3,4 3,1 3,1 3,5 3,1 3,1 2,2 4,5

x in [‰] -26,48 -27,22 -26,36 -26,54 -26,62 -26,56 -27,41 -26,56

20 g

(n = 3)

s in [‰] 0,16 0,03 0,08 0,09 0,04 0,14 0,06 0,12

4.4 Voruntersuchungen von Pistazien

Tabelle 11: δ15N-Ergebnisse des Vergleichs der Standardabweichung von 10 einzelnen Pistazien-

nüssen und einer 20 g-Mischprobe derselben Tüte

δ15N Tüte 1 Tüte 2 Tüte 3 Tüte 4 Tüte 5 Tüte 6 Tüte 7 Tüte 8

x in [‰] 4,55 1,74 9,27 3,64 2,18 1,33 0,84 4,75

s in [‰] 2,26 2,52 1,75 2,36 1,96 2,17 0,91 1,98

Einzelnüsse

(n=10)

S in [‰] 6,5 6,4 5,7 7,1 5,7 7,6 2,6 5,3

x in [‰] 3,97 0,41 10,00 3,70 1,53 2,55 1,02 5,11

20 g

(n=3)

s in [‰] 0,13 0,03 0,11 0,26 0,08 0,15 0,13 0,35

Tabelle 12: δ18O-Ergebnisse des Vergleichs der Standardabweichung von 10 einzelnen Pistazien-

nüssen und einer 20 g-Mischprobe derselben Tüte

δ18O Tüte 1 Tüte 2 Tüte 3 Tüte 4 Tüte 5 Tüte 6 Tüte 7 Tüte 8

x in [‰] 37,26 29,77 36,60 36,50 29,24 28,83 27,16 35,23

s in [‰] 1,84 2,24 0,85 1,12 1,01 0,96 1,61 1,68

Einzelnüsse

(n = 10)

S in [‰] 5,0 6,2 2,5 4,2 3,1 2,9 5,4 5,0

x in [‰] 36,87 26,95 36,44 35,37 27,51 28,66 27,92 36,01

20 g

(n = 4)

s in [‰] 0,72 0,27 0,34 0,63 0,37 0,12 0,57 0,50

Die resultierenden Standardabweichungen s und Spannweiten S aus zehn einzelnen Pistazienüs-

sen einer Tüte sind mit bis zu 2 ‰ (s. Tabelle 10-12) bzw. 6 ‰ (s. Tabelle 12: δ18O-Reihe) recht

hoch im Vergleich zu denen der Arbeitsstandards (s. Kapitel 4.1). Diese hohe (biologische)

Streubreite ist jedoch nicht verwunderlich, denn bei Pistazien handelt es sich um ein natürlich

gewachsenes Produkt, bei dem viele verschiedene äußere Faktoren (z.B. Versorgung, Standort,

Reifungsgrad etc.) während des Wachstums auf die einzelnen Nüsse einwirken. Außerdem kön-

nen Handelsproben Mischungen verschiedenster Chargen sein, d.h. der Einfluss verschiedener

Gebiete (innerhalb eines Landes), unterschiedlicher Erntezeitpunkte, Sorten, Behandlungen etc.

fließt mit ein. Durch das Vermahlen der einzelnen Nüsse (= 20 g Kerne) wird die resultierende

Gesamtprobe so gut gemischt/homogenisiert, dass die Standardabweichungen weit unter 1 ‰

sinken und sich damit in den Größenordnungen der Arbeitsstandards bewegen. 20 g sind somit

eine repräsentative Menge für eine Probe, die auch noch aus der kleinsten auf dem Markt erhält-

lichen Verpackungseinheit (50 g Pistazien mit Schale) gewonnen werden kann und sich mit einer

normalen Labormühle zerkleinern lässt.

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

4.4.2 δ-Wert-Beziehungen zwischen einzelnen Pistazienbestandteilen

Bei Pistazien können drei Hauptbestandteile unterschieden werden: Schale, Haut und Kern. Für

die Wahl des für die Untersuchung zu analysierenden Teils ist es daher wichtig zu wissen, ob

sich diese drei Bestandteile in ihren Isotopenwerten signifikant voneinander unterscheiden.

Durchführung:

Schale, Haut und Kern einzelner Pistazien (geröstet und gesalzen, Iran und USA) wurden separat

auf ihr 13C-, 15N- und 18O-Isotopenverhältnis hin vermessen und die Differenzen zwischen Haut

↔ Kern und Schale ↔ Kern miteinander verglichen. Anschließend wurde eine Korrelationsana-

lyse nach Pearson durchgeführt.

Ergebnis:

Tabelle 13: Minimale, maximale und mittlere Differenz zwischen den δ-Werten von Haut ↔ Kern

und Schale ↔ Kern aus der Untersuchung von einzelnen Pistaziennüssen

δ13CPDB

n=15

δ15NAir

n=15 δ18OVSMOW

n=10

Min. Differenz Haut ↔ Kern |1,19 ‰| |1,01 ‰| |2,65 ‰|

Max. Differenz Haut ↔ Kern |1,61 ‰| |1,09 ‰| |7,30 ‰|

Mittelwert der Differenzen Haut ↔ Kern |0,16 ‰| |0,17 ‰| |4,68 ‰|

Min. Differenz Schale ↔ Kern |0,07 ‰| * |0,52 ‰|

Max. Differenz Schale ↔ Kern |2,68 ‰| * |7,30 ‰|

Mittelwert der Differenzen Schale ↔ Kern |1,34 ‰| * |4,25 ‰|

* Es ist kein N2 in der Schale detektierbar.

Tabelle 14: Pearson-Korrelationsmatrix für

δ13C von Schale, Haut und Kern

Abbildung 31: Lineare Regression zwischen

δ13C von Haut und Kern

13C Schale Haut Kern

Schale 1 0,857 0,628

Haut 0,857 1 0,775

Kern 0,628 0,775 1

Anzahl der Messungen: n=15

-29

-28

-27

-26

-25

-24

-29-28-27-26

C Kern

C Haut

4.4 Voruntersuchungen von Pistazien

Tabelle 15: Pearson-Korrelationsmatrix

für δ15N von Haut und Kern

Abbildung 32: Lineare Regression zwischen

δ15N von Haut und Kern

15N Haut Kern

Haut 1 0,986

Kern 0,986 1

Anzahl der Messungen: n=15

Tabelle 16: Pearson-Korrelationsmatrix für

δ18O von Schale, Haut und Kern

Abbildung 33: Lineare Regression zwischen

δ18O von Haut und Kern

18O Schale Haut Kern

Schale 1 0,925 0,967

Haut 0,925 1 0,949

Kern 0,967 0,949 1

Anzahl der Messungen: n=15

Die Untersuchung der Stabilisotopenverhältnisse im Kern, der Haut und der Schale von einzel-

nen Pistazienüssen hat ergeben, dass sich die drei Hauptbestandteile der Pistazie klar voneinan-

der unterschieden. Dies ist an den großen Unterschieden in den Differenzen (>1 ‰) zwischen

Haut ↔ Kern und Schale ↔ Kern zu erkennen (s. Tabelle 13) und daher dürften diese Bestand-

teile bei einer Messung nicht miteinander vermischt werden. Praktisch ist die vollständige Ab-

trennung der Pistazienhaut vom Kern einer gerösteten Pistazie jedoch nicht möglich und im

Handel werden Pistazien ohne Haut (außer in der Form „grün“) auch gar nicht angeboten.

Die Korrelationsanalysen nach Pearson (s. Tabelle 14-16 und Regressionsgraden in Abbildung

31-33) zeigen jedoch, dass Kern und Haut einer Pistaziennuss in allen drei untersuchten Stabil-

isotopenverhältnissen hoch bis sehr hoch (Korrelationskoeffizient >0,7) miteinander korrelieren,

d.h. der Isotopenwert des Kerns wird durch die Mischung mit der Haut nur proportional ver-

schoben. Da außerdem der Anteil der Haut gegenüber dem Kern sehr gering ist, wurde entschie-

den, die Pistazie mit der Haut zu vermahlen und als Gemisch zur Isotopenanalyse einzusetzen.

Die Verwendung der Schalen entfiel aufgrund des fehlenden Stickstoffvorkommens, großer

Probleme bei der Zerkleinerung durch ihre extreme Härte und weil im Handel Pistazien auch

ohne Schale dargereicht werden.

-2

-113579

N Kern

N Haut

26 30 34 38 42

O Kern

O Haut

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

4.5 In-House-Validierung der IRMS-Methode

4.5.1 Richtigkeit

Richtigkeit ist das Maß der Übereinstimmung zwischen einem ermittelten und einem als richtig

angesehenen Wert. Man bezieht sich dabei auf einen Wert, der konventionell als fehlerfrei und

somit als richtig gilt (z.B. zertifiziertes Referenzmaterial), da der wahre Wert prinzipiell nie be-

kannt sein kann. Hier bieten sich zur Überprüfung der 13C-, 15N- und 18O-Methode die IAEA-

Referenzmaterialien NBS22 (Öl), Ammoniumsulfat und der Wasserstandard der Gasbench an.

Zur Prüfung auf die Richtigkeit kann ein Soll/Ist-Vergleich (t- Test) oder der Doerffel-Test

durchgeführt werden.[107,122,166]

Durchführung:

Die Vergleichsmaterialien mit bekanntem δ-Wert werden in einer IRMS-Sequenz mehrmals wie

eine unbekannte Probe vermessen, ihr δ-Wert über die allgemeine Formel (s. Anhang I: Berech-

nung des δ-Werts) mit den zuvor kalibrierten Arbeitsstandards (s. Kapitel 4.1) bestimmt und das

Ergebnis mit ihrem Sollwert statistisch verglichen.

Sollwert-t-Test: Es wird überprüft, ob der Sollwert mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % inner-

halb des Vertrauensbereichs des Analysenergebnisses liegt (Formel s. Anhang I:

Statistische Tests).[166]

Doerffel-Test: Es wird überprüft, ob zwischen dem Sollwert und dem gefundenen Mittelwert

ein signifikanter Unterschied besteht. Ist die zu berechnende Ungleichung er-

füllt, besteht kein Grund zur Annahme eines systematischen Fehlers (Formel s.

Anhang I: Statistische Tests).[166]

4.5 In-House-Validierung der IRMS-Methode

Ergebnis:

Tabelle 17: Überprüfung der Methoden-Richtigkeit mittels der Arbeitsstandards und Proben be-

kannten δ-Werts

13C-Methode 15N-Methode 18O-Methode

Arbeitsstandard Acetanilid Acetanilid Cellulose

Vergleichsmaterial NBS 22 (NH4)2SO4 GKP-Wasser

Herkunft der Vergleiche IAEA IAEA Laborstandard

Sollwert µ -29,7 ‰ 0,4 ‰ -8,1 ‰

Mittelwert x -29,6 ‰ 0,4 ‰ -7,9 ‰

Standardabweichung s 0,21 ‰ 0,08 ‰ 0,50 ‰

Anzahl der Messwerte n 5 7 12

Sollwert-t-Test*

tMethode ≤ tTabelle 0,95 ≤ 2,78 0,95 ≤ 2,45 1,06 ≤ 2,20

Doerffel-Test*

|x-µ|<1,5×s/√n 0,09 < 0,14 0,03 < 0,05 0,15 < 0,22

* Zur Durchführung des Doerffel- und Sollwert-t-Tests siehe Anhang I: Statistische Tests

Die Ergebnistabelle 17 zeigt, dass mit allen drei Stabilisotopen-Messmethoden ein t-Wert er-

reicht wird, der kleiner als der zulässige Tabellenwert ist. Auch beim Doerffel-Test ist die Diffe-

renz zwischen dem Soll- und Ist-Wert kleiner als der zulässige Berechnungsterm. Somit wurden

bei beiden Tests richtige Ergebnisse erzielt und keine signifikanten Unterschiede auf dem 95 %-

Wahrscheinlichkeitsniveau zwischen dem Sollwert und dem gefundenem Mittelwert der Ver-

gleichsmaterialien bekannten δ-Werts festgestellt. Es ist somit bewiesen, dass die δ-Wert-

Bestimmung mit der 13C-, 15N- und 18O-Methode zu richtigen Ergebnissen führt.

4.5.2 Präzision

Präzision ist bei einem festgelegten Ermittlungsverfahren das Maß für die Übereinstimmung

unabhängiger Analysenergebnisse untereinander unter vorgegebenen Bedingungen. Erfolgt die

Ermittlung der Präzision unter Wiederholbedingungen (Wiederholbarkeit r / repeatability), so

wird dieselbe Probe in kurzen Zeitabständen, in einer statistisch ausreichend großen Zahl (n ≥ 5),

mit demselben Verfahren, in demselben Labor, durch denselben Bearbeiter und derselben Gerä-

teausrüstung vermessen. Werden die Ergebnisse durch dasselbe Verfahren und an identischem

Material, aber mit verschiedenen Beobachtern, in verschiedenen Labors, mit verschiedener Gerä-

teausrüstung gewonnen, so ermittelt man die Präzision unter Vergleichsbedingungen (Vergleich-

barkeit R / reproducibility).[107,140,141,166]

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

Aufgrund der Neuheit der IRMS-Technik in der Lebensmittelchemie und der erst allmählichen

Verbreitung der Geräte in der Routine sind auf dem Sektor der Isotopenanalytik Wiederhol- und

Vergleichbarkeitsdaten von nur wenigen Lebensmitteln vorhanden. Offiziell validierte Methoden

mit Ringversuchsabsicherung existieren bisher bei Wein,[271,272] Fruchtsaft,[8,60-63] Honig[9] und

Ahornsirup[8].

Durchführung:

Die Wiederhol- und Vergleichbarkeit für die 13C-, 15N- und 18O-Methode wurden jeweils an Pis-

tazie, entfettetem Rückstand und Pistazienöl ermittelt, um eventuelle Unterschiede der Präzision

zwischen den Fraktionen erkennen zu können. Dazu wurden die Proben jeweils sieben Mal an

drei verschiedenen Tagen vermessen. Da unter den gegebenen Umständen die Ermittlung einer

echten Vergleichspräzision nicht möglich war, wurde hier eine laborinterne Vergleichspräzision

gemessen, indem die Analyse an unterschiedlichen Tagen durchgeführt wurde. Die Schätzung

der Präzisionen erfolgte über die Wiederhol- bzw. Vergleichsstandardabweichungen (sr, sR), aus

denen dann die Wiederhol- und Vergleichbarkeit (r, R) errechnet wurde (s. Anhang I: Statisti-

sche Grundformeln).

Ergebnis:

Tabelle 18: Ergebnisse der Ermittlung der Präzisionsdaten für die 13C-Methode

13C-Methode Pistazie Rückstand Öl

x [‰] (n=3×7) -27,56 -24,48 -29,59

sr [‰] 0,126 0,213 0,081

sR [‰] 0,126 0,213 0,101

r [‰] 0,35 0,60 0,23

Rlaborintern [‰] 0,35 0,60 0,28

Vergleiche[60,63,271]

(direkte Verfahren)

Weinethanol:

r = 0,24

R = 0,60

Orangensaftzucker:

r = 0,26

R = 0,66

Orangensaftpulpe:

r = 0,32

R = 1,03

Tabelle 19: Ergebnisse der Ermittlung der Präzisionsdaten für die 15N-Methode

15N-Methode Pistazie Rückstand Öl

x [‰] (n=3×7) 2,02 2,09 --

sr [‰] 0,170 0,109 --

sR [‰] 0,176 0,113 --

r [‰] 0,48 0,31 --

Rlaborintern [‰] 0,49 0,32 --

4.5 In-House-Validierung der IRMS-Methode

Tabelle 20: Ergebnisse der Ermittlung der Präzisionsdaten für die 18O-Methode

18O-Methode Pistazie Rückstand Öl

x [‰] (n=3×7) 27,03 29,86 26,67

sr [‰] 0,513 0,537 0,397

sR [‰] 0,517 0,543 0,397

r [‰] 1,44 1,50 1,11

Rlaborintern [‰] 1,45 1,52 1,11

Vergleiche[61,272]

(indirekte Verfahren)

Weinwasser:

r = 0,24

R = 0,50

Apfelsaftwasser:

r = 0,45

R = 0,58

Bei allen drei Methoden ist zu erkennen, dass die laborinterne Vergleichsstandardabweichung sR

fast gleich der Wiederholstandardabweichung sr ist, d.h. die Streuung zwischen den Se-

rien/Tagen ist vernachlässigbar klein gegenüber der Streuung innerhalb einer Serie/eines Tages.

Des Weiteren ist die geringere Streuung bei den Ölen gegenüber den Feststoffen auffällig, was

sich auf die bessere Homogenität einer Flüssigkeit zurückführen lässt.

Beim Vergleich der Wiederholbarkeiten von Pistazie, Rückstand und Öl mit den angeführten

validierten 13C-Vergleichsmethoden (Weinethanol, Fruchtsaftzucker/-pulpe) ist zu erkennen,

dass sie alle in vergleichbaren Größenordnungen liegen. Die erreichte Präzision mit der IRMS-

13C-Methode ist somit akzeptabel.

Für Stickstoff gibt es noch keine validierten Methoden zum Vergleich, jedoch liegen die erziel-

ten Präzisionswerte in der Größenordnung der 13C-Methode und werden daher ebenfalls als gut

beurteilt.

Die 18O-Methode weist sowohl im Vergleich mit der 13C- und 15N-Methode als auch mit den

aufgeführten Vergleichsmethoden eine drei- bis fünffach höhere Wiederholbarkeit und laborin-

terne Vergleichbarkeit auf. Die erhöhte Streuung gegenüber den beiden anderen Methoden wird

durch den TC/EA selber verursacht, der aufgrund von Nebenreaktionen eine geringere Messsta-

bilität als der Elementaranalysator hat (s. Kapitel 3.3.4). Außerdem ist beim Vergleich mit den

offiziellen Ringversuchsmethoden in Betracht zu ziehen, dass die Verbrennung der Probe zu

Kohlenmonoxid mit dem TC/EA ein direktes Onlineverfahren ist, während der Sauerstoff bei

den angeführten Wein- und Fruchtsaftwasser-Methoden indirekt über eine Equilibrierung mit

Kohlendioxidgas gemessen wurde. Aufgrund des Fehlens einer validierten Vergleichsmethode

ist die Beurteilung der erzielten Präzisionsdaten für die 18O-Methode daher schwer. Da die Werte

gegenüber den EA-Methoden jedoch nicht übergroß sind, wird hier davon ausgegangen, dass

noch eine akzeptable Präzision vorliegt.

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

4.5.3 Prüfung der Laborpräzision

Für die Überprüfung der Laborpräzision standen weder ein zweites IRMS-Gerät noch ein ande-

rer Anwender zur Verfügung,[166] daher wurde an einer internationalen Laborvergleichsuntersu-

chung teilgenommen, die von dem „Joint Research Centre“ der Europäischen Kommission initi-

iert wurde. Innerhalb dieses „Proficiency Tests“ konnte 2004 anhand eines Proteins die Leis-

tungsfähigkeit der 13C-Methode überprüft werden.

Ergebnis des Laborvergleichstests:

Proficiency Test:

13C-Gehalt eines Proteins

„wahrer“ Wert: X = -23,31 ‰

Labormittelwert: xLabor = -23,38 ‰

Zielstandardabweichung:

= 0,25 ‰

Z-Score des Labors: zLabor = -0,29

Das mit der laborinternen IRMS-Methode erzielte Ergebnis der internationalen Laborvergleichs-

untersuchung liegt mit seinem Z-Score hervorragend am Mittelwert und innerhalb der Warn-

grenzen, d.h. mit der angewandten Analytik wurde den Anforderungen des Proficiency Tests

entsprochen und es konnte auf diesem Wege zumindest für die 13C-Methode eine gute Präzision /

Anwendbarkeit nachgewiesen werden.

4.5.4 Stabilität / Alterungsstudie

Die Messstabilität einer Methode / eines Verfahrens und natürlich auch die Stabilität des Analy-

ten selber müssen über den Zeitraum einer Analysenserie hinweg gewährleistet sein und sind

daher auch innerhalb einer Validierungsstudie zu überprüfen. Hierfür eignen sich am besten

Qualitätsregelkarten.

Durchführung:

Zur Erstellung der Qualitätsregelkarten wurden sog. Gerätekontrollproben in jeder IRMS-

Messsequenz über die gesamte Analysenzeit hinweg mitgeführt. Die Stabilität des 13C- und 15N-

Verfahrens wurden mit Hilfe von Atropin, die 18O-Messung mit Benzoesäure überprüft. Nach

zwanzig Messungen wurde jeweils der Mittelwert gebildet (Vorperiode) und dieser als Sollwert

für die weiteren Messungen angesehen. Als obere/untere Warngrenze wurde der ±2sr-Bereich

(95,5 %), als obere/untere Kontrollgrenze der ±3sr-Bereich (99,7 %) gewählt.

4.5 In-House-Validierung der IRMS-Methode

Zur Prüfung der Stabilität des Analyten über die Analysenzeit dieser Arbeit wurde eine Pista-

zienprobe frisch vermahlen auf ihre Stabilisotopenverhältnisse hin vermessen und diese Messun-

gen in verschiedenen Zeitabständen wiederholt. Die Lagerung der Probe erfolgte in einem

Plastikbehältnis im Kühlschrank.

Ergebnis „Verfahrensstabilität“:

Tabelle 21: Daten für die Qualitätsregelkarten zur Kontrolle der Verfahrensstabilität aus der

Vorperiode

13C 15N 18O

Gerätekontrollprobe Atropin Atropin Benzoesäure

Sollwert x (n = 20) -29,05 ‰ -17,97 ‰ 24,95 ‰

sr (GKP) 0,149 ‰ 0,119 ‰ 0,238 ‰

sr (Pistazie) aus Kap. 4.5.2 0,126 ‰ 0,176 ‰ 0,513 ‰

Abbildung 34:

Qualitätsregelkarte von

Atropin (GKP) zur Prü-

fung der Verfahrens-

stabilität der 13C-Methode

Abbildung 35:

Qualitätsregelkarte von

Atropin (GKP) zur Prü-

fung der Verfahrensstabi-

lität der 15N-Methode

Atropin-Qualitätsregelkarte: Stabilität der

C-Methode

-29,6

-29,3

-29,0

-28,7

Okt

´03

Okt

´03

Okt

´03

Feb

´04

Feb

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

δ13C

Messwerte Sollwert +2s -2s +3s -3s

Atropin-Qualitätsregelkarte: Stabilität der

N-Methode

-18,4

-18,2

-18,0

-17,8

-17,6

Okt

´03

Okt

´03

Okt

´03

Okt

´03

Feb

´04

Feb

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Mrz

´04

Messwerte Sollwert +2s -2s +3s -3s

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

Benzoesäure-Qualitätsregelkarte: Stabilität der

O-Methode

23,9

24,3

24,7

25,1

25,5

25,9

Sep

´03

Sep

´03

Sep

´03

Sep

´03

Sep

´03

Sep

´03

Okt

´03

Mai

´04

Mai

´04

Mai

´04

Mai

´04

Jun

´04

Jun

´04

Jun

´04

δ18O

Messwerte

Reaktor-

problem

Sollwert

+2s

-2s

+3s

-3s

Abbildung 36: Qualitätsregelkarte von Benzoesäure (GKP) zur Prüfung der Verfahrensstabilität

der 18O-Methode

Ergebnis „Alterungsstudie“:

Tabelle 22: Ergebnisse der Alterungsstudie mit Pistazien

δ13CPDB δ15NAir δ18OVSMOW

frisch (n=5) -26,8 ‰ 0,4 ‰ frisch (n=4) 27,2 ‰

7 Monate alt (n=5) -26,9 ‰ 0,6 ‰ 1 Monat alt (n=3) 27,2 ‰

18 Monate alt (n=5) -27,0 ‰ 0,7 ‰ 9 Monate alt (n=5) 27,1 ‰

X aus den 3 Alterungsstadien -26,88 ‰ 0,56 ‰ X aus den 3 Alterungsstadien 27,16 ‰

s 0,076 ‰ 0,150 ‰ s 0,056 ‰

sr (Pistazie) 0,126 ‰ 0,170 ‰ sr (Pistazie) 0,513 ‰

Signifikanzwert

ANOVA 0,943 0,882 Signifikanzwert

ANOVA 0,365

Die Qualitätsregelkarten für die 13C- und 15N-Methode (s. Abbildung 34 und 35) zeigen über

einen Zeitraum von ca. 1½ Jahren eine stabile Messung der Gerätekontrollproben an: Die Mess-

werte schwanken um den aus der Vorperiode errechneten Mittelwert (s. Tabelle 21) und treten

nicht über die Kontrollgrenzen hinaus. Die Wiederholstandardabweichungen sr des Atropins lie-

gen außerdem in der Größenordnung der zulässigen Methodenpräzision der Pistazien (s. Tabelle

21) und bestärken somit die gute Verfahrensstabilität dieser beiden Methoden.

Auch die 18O-Methode zeigt wie die beiden anderen Methoden alle Merkmale einer guten Ver-

fahrensstabilität. Allerdings musste hier eine Periode von Messdaten aus der Präzisionsdatenbe-

rechnung herausgenommen werden, da die Werte ganz offensichtlich geringere 18O/16O-

4.5 In-House-Validierung der IRMS-Methode

Verhältnisse aufweisen (s. Abbildung 36). Diese Messwerte wurden nach einer Reaktorreinigung

aufgenommen. Die δ-Werte verlagern sich wieder zu höheren Werten (Anfangswerte / Sollwer-

te), als der Reaktor erneut ausgebaut und gereinigt wurde. Daher hängen die niedrigen δ-Werte

(Sep. ’03 – Okt. ’03) ganz offensichtlich mit einem Fehler bei der Reaktorreinigung zusammen.

Die mit diesem Reaktor vermessenen Proben wurden allerdings nicht korrigiert, da dieses Phä-

nomen nur bei der Benzoesäure zu beobachten war und weder beim Arbeitsstandard Cellulose

(s. Kapitel 4.2, Abbildung 30) noch bei den zusätzlich mitgeführten Matrix-Gerätekontrollproben

(Pistazie, Rückstand und Öl) auftrat (nicht dargestellt). Offensichtlich hatte der durch die Reini-

gung des Reaktors eingeführte Fehler nur Auswirkungen auf die Verbrennung der Benzoesäure.

Es zeigt sich außerdem bei allen drei Stabilisotopenverhältnissen, dass zu keinem der untersuch-

ten Lagerzeitpunkte (18 bzw. 9 Monate) der Pistazienprobe ein signifikanter Mittelwertunter-

schied im δ-Wert auf dem 95 %-Signifikanzniveau auftritt, da p immer >0,05 ist (ANOVA-

Signifikanzwert). Außerdem ist die Standardabweichung s zwischen den δ-Werten der drei La-

gerzeitpunkte kleiner als die Wiederholstandardabweichung sr der Methode, d.h. sie genügt der

Methodenpräzision. Eine vermahlene Pistazienprobe ist somit über die betrachteten Zeiträume

hinweg stabil.

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

4.6 Prüfung der Öl-Extraktionsmethode

Neben der Untersuchung des Pistazienkerns im Ganzen, wurde auch von allen Proben das Pista-

zienöl und der nach der Extraktion verbleibende entfettete Rückstand auf die Isotopenverhältnis-

se hin untersucht. Hierdurch soll in der späteren statistischen Auswertung geklärt werden, ob

eine Verschärfung der Trennung der Herkunftsländer aufgrund von Sekundärstoffwechselvor-

gängen in der Pflanze in den Messwerten auftritt. Bei der Auswahl des Verfahrens zur Gewin-

nung des Öls und des entfetteten Rückstands wurde in erster Linie darauf geachtet, dass es dis-

kriminierungsfrei arbeitet, denn sonst wird das Stabilisotopenverhältnis stark verfälscht. Da sehr

viele Proben aufgearbeitet werden mussten, sollte die Aufarbeitungsmethode außerdem einfach,

schnell und automatisierbar sein.

4.6.1 Diskriminierungsstudie anhand der Soxhletmethode

Durchführung:

Zur Sicherstellung einer diskriminierungsfreien Extraktion des Pistazienöls wurden zwei Haus-

haltsöle einer Soxhlet-Extraktion mit Petrolbenzin[209] unterzogen und die Stabilisotopendaten

vor und nach der Extraktion gemessen.

Ergebnis:

Tabelle 23: Vergleich der δ-Werte zweier Öle vor und nach Soxhlet-Extraktion

δ13CPDB

Öl 1

δ18OVSMOW

Öl 1

δ13CPDB

Öl 2

δ18OVSMOW

Öl 2

xvor der Extraktion -27,5 ‰ 22,4 ‰ -13,3 ‰ 20,8 ‰

xnach der Extraktion -27,5 ‰ 22,9 ‰ -13,3 ‰ 21,2 ‰

Kritische Grenze CD*

|xvorher-xnachher| ≤ CD

Kein

Unterschied

nvor=4, nnach=6

0,5 ≤ 0,5 Kein

Unterschied

nvor=5, nnach=5

0,4 ≤ 0,5

* Zur Berechnung der kritischen Grenze CD zwischen zwei Werten s. Anhang I: Statistische Grundfor-

meln

Aus der Ergebnistabelle 23 ist zu entnehmen, dass keine Diskriminierung durch das Extraktions-

verfahren nach Soxhlet bei der 13C-Messung zu beobachten ist, denn die Mittelwerte vor und

nach der Extraktion beider Öle sind gleich.

Obwohl die Mittelwerte beim Sauerstoffisotop vor und nach der Extraktion differieren, konnte

auch hier statistisch keine Diskriminierung durch die Soxhlet-Extraktion festgestellt werden.

Hierzu wurde der Vergleich mit der kritischen Grenze herangezogen, der zeigt, dass die Mittel-

4.6 Prüfung der Öl-Extraktionsmethode

werte um einen von der Methodenpräzision her zulässigen Betrag differieren. Die Ölextrakti-

onsmethode nach Soxhlet arbeitet somit diskriminierungsfrei und ist für die Isotopenanalytik

geeignet. Dies war auch zu erwarten, da die Wirkungsweise einer Flüssig-Flüssig-Extraktionen

auf der Chemie der Moleküle beruht und nicht auf deren physikalischen Eigenschaften, die ver-

antwortlich für kinetische und thermodynamische Isotopeneffekte sind (siehe Kapitel 3.2). Auch

andere Autoren haben schon eine Diskriminierungsfreiheit für die Flüssig-Flüssig-Extraktion

festgestellt.[11,28,54]

4.6.2 Vergleich der Soxhlet-Methode mit der ASE

Die Extraktionsmethode nach Soxhlet ist eine traditionelle, validierte Methode, um Fett aus ver-

schiedensten Lebensmitteln diskriminierungsfrei (s. vorheriges Kapitel 4.6.1) zu extrahieren.[38]

Die Soxhlet-Extraktion war jedoch unter den gegebenen Laborbedingungen nicht automatisier-

bar, daher sollte die Ölextraktion aus den Pistazien auf die vollautomatische Extraktion mit der

ASE-Technik (Accelerated Solvent Extraction) umgestellt werden. Da dem Soxhletverfahren

schon Diskriminierungsfreiheit nachgewiesen wurde, musste eine ASE-Methode erstellt werden,

die quantitativ vollständig extrahiert und gleiche Ergebnisse wie das Soxhletverfahren liefert.

Durchführung:

Eine Pistazienprobe wurde parallel nach Soxhlet und mit einer optimierten ASE-Methode extra-

hiert und die gewonnenen Öle und entfetteten Rückstände auf ihre Gleichheit in den C-, N- und

O-Stabilisotopenverhältnissen hin überprüft.

Ergebnis:

Tabelle 24: Vergleich der δ-Wert-Ergebnisse nach der Extraktion mit der Soxhlet- und der ASE-

Methode

δ13CPDB

Rückstand δ15NAir

Rückstand δ18OVSMOW

Rückstand δ13CPDB

Öl

δ18OVSMOW

Öl

xSoxhletverfahren (n=2) -24,4 ‰ 8,5 ‰ 39,3 ‰ -29,0 ‰ 38,0 ‰

xASE-Methode (n=2) -24,3 ‰ 8,5 ‰ 39,2 ‰ -28,9 ‰ 37,7 ‰

Kritische Grenze CD*

|xSoxhlet-xASE| ≤ CD 0,1 < 0,4 0,0 < 0,2 0,1 < 1,1 0,1 < 0,2 0,3 < 0,8

* Zur Berechnung der kritischen Grenze CD zwischen zwei Werten s. Anhang I: Statistische Grundfor-

meln

Der Vergleich der Mittelwertdifferenzen mit der jeweiligen kritischen Grenze CD zeigt

(s. Tabelle 24), dass die Stabilisotopenverhältnisse der extrahierten Öle und entfetteten Rück-

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

stände nur um einen methodenpräzisionszulässigen Wert schwanken. Damit unterscheiden sich

die mit dem ASE-Verfahren ermittelten δ-Werte nicht von denen aus der Soxhletextraktion. Das

ASE-Verfahren zur Gewinnung von Pistazienöl und dem entfetteten Rückstand arbeitet somit

auch diskriminierungsfrei und ist als Probenaufarbeitungsmethode für die IRMS geeignet.

4.6.3 Wiederholbarkeit der Extraktionsmethode

Die Ölextraktionsmethode mit der ASE muss auf ihre Wiederholbarkeit hin überprüft werden,

um den Fehlerbeitrag der Aufarbeitung zur Gesamtmethode abschätzen zu können.

Durchführung:

Eine Pistazienprobe wurde sechsmal mit der ASE extrahiert und die gewonnenen Öle und entfet-

teten Rückstände auf ihr 13C-, 15N- und 18O-Isotopenverhältnis hin fünffach vermessen.

Ergebnis:

Tabelle 25: Ergebnisse des Vergleichs der Mittelwerte (n = 5) von sechs ASE-Extraktionen einer

Pistazienprobe

δ-Werte in [‰] δ13CPDB

Rückstand δ15NAir

Rückstand δ18OVSMOW

Rückstand δ13CPDB

Öl

δ18OVSMOW

Öl

Extraktion 1 -24,8 ± 0,13 2,1 ± 0,18 30,0 ± 0,38 -29,6 ± 0,06 26,4 ± 0,27

Extraktion 2 -24,7 ± 0,17 2,1 ± 0,03 30,3 ± 0,49 -29,6 ± 0,04 26,3 ± 0,18

Extraktion 3 -24,8 ± 0,22 2,0 ± 0,14 30,6 ± 0,46 -29,5 ± 0,02 26,2 ± 0,51

Extraktion 4 -25,0 ± 0,40 2,1 ± 0,21 30,0 ± 0,64 -29,3 ± 0,06 26,8 ± 0,11

Extraktion 5 -24,8 ± 0,31 2,1 ± 0,11 30,1 ± 0,21 -29,6 ± 0,06 26,3 ± 0,18

Extraktion 6 -24,6 ± 0,23 2,0 ± 0,15 30,4 ± 0,52 -29,5 ± 0,07 26,1 ± 0,30

Mittelwert -24,8 2,1 30,2 -29,5 26,3

sr (Versuch) 0,26 0,15 0,48 0,05 0,31

sr (Labor) 0,21 0,11 0,54 0,08 0,40

Levene-Test*

zw. Extraktion 1-6 0,556 0,246 0,397 0,137 0,299

ANOVA*

zw. Extraktion 1-6 0,457 0,777 0,420 0,246 0,793

Post-Hoc-Tests*

zw. Extraktion 1-6

kein signifikanter

Unterschied

kein signifikanter

Unterschied kein signifikanter

Unterschied

fett Ausreißer nach zweiseitigem Grubbs-Test (P = 95 %) und durch die Post-Hoc-Tests erkannter Ver-

ursacher eines signifikanten Mittelwertunterschieds (p < 0,05) bei der ANOVA ⇒ Werte wurden in

die weiteren Berechnungen nicht mit einbezogen.

* Test auf Homogenität der Varianzen nach Levene, Vergleich der Mittelwerte mittels einfaktorieller

ANOVA (P = 95 %) und Post-Hoc-Mehrfachvergleiche nach Scheffé, Tukey und LSD

4.6 Prüfung der Öl-Extraktionsmethode

Die Messwerte des Öls der Extraktion 4 wurden aus den statistischen Berechnungen herausge-

nommen, weil sie mit dem zweiseitigen Grubbs-Test (s. Anhang I: Statistische Tests) als Ausrei-

ßer erkannt wurden. Hier scheint ein Fehler nach der Extraktion gemacht worden zu sein, da nur

das Öl und nicht der Rückstand betroffen ist. Dies kann z.B. durch Eintrag einer Verunreinigung

beim Trocknen oder Umfüllen passiert sein.

Abgesehen von diesem Ausreißer beim Öl, ergibt sich aus den Mittelwerten der 13C-, 15N- und

18O-Messung der Rückstände wie auch der Öle, dass keine signifikanten Unterschiede zwischen

den sechs Extraktionen bestehen, d.h. mit 95 %iger Wahrscheinlichkeit gehören diese Werte zu

einer Grundgesamtheit.

Die Wiederholstandardabweichungen sr (Versuch) der Extraktionen liegen zudem in der gleichen

Größenordnung wie die im Rahmen der In-House-Validierung ermittelten Wiederholstandard-

abweichungen sr (Labor) (s. Kapitel 4.5.2). Die Abweichungen zwischen den sechs Extraktionen

sind somit nicht größer als die Methodenpräzision zulässt und die Reproduzierbarkeit der Ex-

traktion mit der ASE-Technik zur Gewinnung des Pistazienöls und des entfetteten Rückstands ist

daher gegeben.

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

4.7 Einfluss von Röstung und Salzung auf den δ-Wert

Pistazien durchlaufen viele Verarbeitungsschritte, bevor sie getrocknet, geröstet oder geröstet &

gesalzen in den Handel gelangen. Die beiden diskriminierungsverdächtigsten Schritte sind dabei

das Rösten und Salzen, daher wurde dies im Laborversuch nachgestellt und untersucht.

Durchführung:

Eine als „roh“ (getrocknet) gekaufte Ware wurde frisch, nach zwei verschieden langen Rös-

tungszeiten (Unterschied: ¼h, Spannweite laut verwendetem Rezept s. Kapitel 9.3.6) und nach

Salzung & Röstung auf ihr Isotopenverhältnis hin untersucht.

Ergebnis:

Tabelle 26: Einfluss des Röstens und Salzens auf den δ13CPDB-Wert

δ13CPDB Pistazie

(n = 3)

Rückstand

(n = 3)

Öl

(n = 2)

roh/getrocknet -27,8 ‰ -25,8 ‰ -29,8 ‰

Röstung 1½h -27,6 ‰ -24,5 ‰ -29,2 ‰

Röstung 1¾h -27,6 ‰ -24,9 ‰ -29,4 ‰

Salzung + Röstung 1½h -27,5 ‰ -24,4 ‰ -29,3 ‰

Salzung + Röstung 1¾h -28,5 ‰ -25,4 ‰ -30,2 ‰

Mittelwert X aus den 5 Verarbeitungsstadien -27,8 ‰ -25,0 ‰ -29,6 ‰

Standardabweichung s 0,41 ‰ 0,60 ‰ 0,41 ‰

sr (13C-Methode) 0,13 ‰ 0,21 ‰ 0,08 ‰

F-Test (s²/sr² < χ²(0,95;f)/f) 10,4 ≠< 2,4 7,8 ≠< 2,4 26,2 ≠< 2,4

Signifikanz ANOVA* < 0,001 < 0,001 < 0,001

* Voraussetzung der Varianzhomogenität (Levene-Test) ist gegeben

4.7 Einfluss von Röstung und Salzung

Tabelle 27: Einfluss des Röstens und Salzens auf den δ15NAir-Wert

δ15NAir Pistazie

(n = 3)

Rückstand

(n = 3)

roh/getrocknet 1,0 ‰ 1,2 ‰

Röstung 1½h 1,2 ‰ 1,4 ‰

Röstung 1¾h 0,6 ‰ 0,9 ‰

Salzung + Röstung 1½h 0,7 ‰ 0,6 ‰

Salzung + Röstung 1¾h 1,1 ‰ 1,0 ‰

Mittelwert X aus den 5 Verarbeitungsstadien 0,9 ‰ 1,0 ‰

Standardabweichung s 0,26 ‰ 0,30 ‰

sr (15N-Methode) 0,17 ‰ 0,11 ‰

F-Test (s²/sr² < χ²(0,95;f)/f) 2,3 < 2,4 7,7 ≠< 2,4

Signifikanz ANOVA* < 0,001 < 0,001

* Voraussetzung der Varianzhomogenität (Levene-Test) ist gegeben

Tabelle 28: Einfluss des Röstens und Salzens auf den δ18OVSMOW-Wert

δ18OSMOW Pistazie

(n = 4)

Rückstand

(n = 4)

Öl

(n = 3)

roh/getrocknet 27,8 ‰ 29,8 ‰ 27,6 ‰

Röstung 1½h 29,2 ‰ 30,6 ‰ 27,9 ‰

Röstung 1¾h 28,6 ‰ 30,1 ‰ 27,7 ‰

Salzung + Röstung 1½h 28,7 ‰ 30,4 ‰ 27,8 ‰

Salzung + Röstung 1¾h 27,8 ‰ 29,8 ‰ 27,5 ‰

Mittelwert X aus den 5 Verarbeitungsstadien 28,4 ‰ 30,1 ‰ 27,7 ‰

Standardabweichung s 0,61 ‰ 0,36 ‰ 0,16 ‰

sr (18O-Methode) 0,51 ‰ 0,54 ‰ 0,40 ‰

F-Test (s²/sr² < χ²(0,95;f)/f) 1,4 < 2,4 0,4 < 2,4 0,2 < 2,4

Signifikanz ANOVA* 0,206 0,062 0,014

* Voraussetzung der Varianzhomogenität (Levene-Test) ist gegeben

Die Ergebnistabellen 26 und 27 zeigen, dass bei gegebener Varianzhomogenität mit dem Mittel-

wertvergleichstest (ANOVA) ein deutlich signifikanter Unterschied zwischen den fünf Verarbei-

tungsstadien in den Messwerten des 13C- und 15N-Verhältnisses der Pistazie, des entfetteten

Rückstands und des Öls festzustellen ist. Dies bestätigt auch der F-Test, bei dem der Unterschied

der Standardabweichung s des Versuchs gegen die gegebene Wiederholstandardabweichung sr

der jeweiligen Methode getestet wird. Die Hypothese, dass s und sr aus einer Grundgesamtheit

4. Ergebnisteil I: Methodenvalidierung

stammen, muss immer abgelehnt werden (Ausnahme δ15N-Wert der Pistazie: er liegt knapp unter

der χ²-Prüfgröße).

Der signifikante Mittelwertunterschied besteht nicht nur zwischen allen fünf Verarbeitungssta-

dien, sondern auch beim Vergleich der einzelnen Stadien untereinander (Ergebnisdaten nicht

aufgeführt). Daraus ist abzuleiten, dass die Röstung an sich, die Röstungsdauer und auch die

Salzung das 13C- und 15N-Isotopenverhältnis beeinflussen. Die Änderungen in den Isotopenver-

hältnissen finden dabei stärker in den Bestandteilen des entfetteten Rückstands (Zucker, Protei-

ne) statt, denn die Spannweiten zwischen den Verarbeitungsschritten sind hier deutlich größer als

beim Öl.

Die Unterschiede zwischen den fünf Verarbeitungsstadien in den δ18O-Werten werden außer

beim Öl statistisch von der ANOVA nicht als signifikant angezeigt, gleichermaßen zeigt der

F-Test, dass die Standardabweichung s des Versuchs und die Wiederholstandardabweichung sr

der jeweiligen Methode nicht aus verschiedenen Gruppen stammen (s. Tabelle 28). Es können

jedoch gleiche Trends in den Messwertveränderungen (steigende/fallende Tendenzen) wie bei

den beiden anderen Elementen beobachtet werden. Daher ist anzunehmen, dass auch das Sauer-

stoffisotopenverhältnis von Röstung und Salzung beeinflusst wird, dies jedoch durch die geräte-

bedingte höhere Streuung des TC/EA’s statistisch nicht erkannt wird.

Mit diesem Laborversuch wurde somit nachgewiesen, dass die Röstung und Salzung das Isoto-

penverhältnis beeinflusst, und zwar schon aufgrund nur einer Rösttemperatur (160 °C) und zwei

verschiedenen Röstzeiten, die sich nur um eine Viertelstunde unterscheiden.

Bei Handelsware kann nun von vielen verschiedenen Herstellungs-/Verarbeitungsvarianten aus-

gegangen werden, die das Isotopenverhältnis nachhaltig verändern bzw. die Isotopen diskrimi-

nieren. Dieser Fehlerbeitrag ist jedoch gering (smax in diesem Laborversuch = 0,6 ‰) im Ver-

gleich mit der Standardabweichung, die zwischen Nüssen einer Tüte besteht (smax = 2,5 ‰,

s. Kapitel 4.4.1). Neben der hier untersuchten Verarbeitung fließen in die sog. „biologische

Streubreite“ noch viele andere, natürliche Faktoren (Sorte, Gebiet etc.) ein, die den Fehler erhö-

hen. Die „biologische Streubreite“ ist somit viel höher als der in diesem Versuch festgestellte

Fehler, der durch die Verarbeitung eingetragen wird. Daher sind die herstellungsbedingten Un-

terschiede im Isotopenverhältnis insgesamt gesehen vernachlässigbar klein und die Proben blei-

ben vergleichbar.

5. Ergebnisteil II: Univariate Statistik

Ergebnisteil II:

Univariate Statistik

5. Ergebnisteil II: Univariate Statistik

5.1 Übersicht über das Probenmaterial

Es wurden insgesamt 164 Pistazienproben untersucht, von denen 101 authentisch sind und 63 im

Handel gekauft wurden. Bei den authentischen Pistazien handelt es sich um Proben aus den bei-

den Hauptanbauländern USA und Iran, die direkt von Herstellern und Farmen bezogen oder im

Land selbst gekauft wurden. Türkische Pistazien wurden ebenfalls in die Untersuchung mit ein-

bezogen, da sie häufig auf dem deutschen Markt zu finden sind und bei ihnen, ebenso wie bei

den iranischen Pistazien, Einfuhrauflagen wegen der Aflatoxinproblematik bestehen. Eine

Direktverbindung in die Türkei für den Bezug authentischer Ware konnte leider nicht hergestellt

werden, daher wurden die Pistazien größtenteils in türkischen Läden in Berlin gekauft und diese

Handelsproben als authentisch angesehen. Zur besseren Übersicht veranschaulicht Abbildung 37

das in dieser Arbeit untersuchte Probenmaterial in einem Organigramm. Eine genaue Auflistung

der einzelnen Proben mit Angaben über ihre Herkunft, Verarbeitung und den δ-Mittelwerten sind

in Kapitel 9.1 und im Anhang III zu finden.

Abbildung 37: Überblick über das untersuchte Probenmaterial

Pistazienproben

n = 164

Handel

n = 63

authentisch

n = 101

ohne Deklaration

n = 26

mit Deklaration

n = 37

Iran

n = 32

USA

n = 38

Türkei

n = 31

5.2 Box-Plot-Betrachtung

5.2 Box-Plot-Betrachtung des authentischen Datenmaterials

Der Box-Plot ist eine zusammenfassende grafische Darstellung der Verteilung von Messwerten.

Die Länge der Box ist der Abstand zwischen dem 25. und 75. Perzentil und visualisiert gleich-

zeitig den Streubereich dieser Werte. 50 % der Proben haben Werte innerhalb der Box und die

innere Linie repräsentiert den Median. Der kleinste und größte beobachtete Wert, die keine Aus-

reißer sind, werden jeweils durch einen waagerechten auf einem senkrechten Strich gekenn-

zeichnet. Werte, die um mehr als anderthalb Kastenlängen außerhalb liegen, sind Ausreißer und

werden mit einem Kreis gekennzeichnet. Werte, die um mehr als drei Kastenlängen außerhalb

liegen, gelten als Extremwerte und werden im Box-Plot mit einem Stern markiert.[37,132]

Durchführung:

Die Box-Plots der δ-Messwerte des authentischen Pistaziendatensatzes (getrennt nach Herkunfts-

ländern und Isotopen) wurden mit Hilfe der Statistik-Software SPSS 12.0 erstellt. Die Proben-

nummern in den Grafiken korrespondieren mit denen der Probenlisten in Kapitel 9.1 und im An-

hang III.

Ergebnis:

USATürkeiIran

-22

-24

-26

-28

-30

Öl

Rückstand

Pistazie

Abbildung 38: Box-Plot-Darstellung der δ13C-Messwerte des authentischen Datensatzes

δ13CPDB

5. Ergebnisteil II: Univariate Statistik

USATürkeiIran

-2

Rückstand

Pistazie

Abbildung 39: Box-Plot-Darstellung der δ15N-Messwerte des authentischen Datensatzes

USATürkeiIran

Öl

Rückstand

Pistazie

Abbildung 40: Box-Plot-Darstellung der δ18O-Messwerte des authentischen Datensatzes

Die Box-Plot-Darstellungen der δ13CPDB-Werte des authentischen Datensatzes (s. Abbildung 38)

lässt erkennen, dass die Stabilisotopenverhältnisse der drei Länder in allen betrachteten Pista-

zienfraktionen (Gesamtnuss, entfetteter Rückstand, Öl) sehr eng beieinander liegen. Dennoch ist

hier ein Trend zu erkennen: Die δ13C-Werte der Türkei weisen in allen drei Fraktionen jeweils

die höchsten und die USA immer die niedrigsten Messwerte auf. Die amerikanischen Proben

sind zudem von den türkischen besser abgetrennt als von den iranischen.

Da die hier verglichenen Pistazienpflanzen denselben Photosyntheseweg haben, können die ge-

ringen, aber sichtbaren Unterschiede im δ13C-Verhältnis nur durch exogene Einflüsse hervorge-

rufen worden sein (s. Kapitel 3.2.1).

δ15NAir

δ18OVSMOW

5.2 Box-Plot-Betrachtung

Das δ15NAir-Verhältnis zeigt im Gegensatz zum δ13CPDB-Verhältnis in allen Fraktionen eine deut-

liche Trennung zwischen den Messwerten des Irans und der USA an (s. Abbildung 39), jedoch

überlappen sich die Werte der türkischen Proben mit denen der USA. Die Messwerte für die ira-

nischen Proben sind insgesamt höher als die der amerikanischen und türkischen Pistazien. Hier-

für können verschiedene exogene Faktoren verantwortlich sein: Dünger, Jahresdurchschnitts-

temperaturen, jahresdurchschnittliche Niederschlagsmenge, Bodenbeschaffenheit oder Sortenun-

terschiede (s. Kapitel 3.2.2).

Neben den δ15NAir-Wert-Unterschieden ist auch die stark unterschiedliche Streuung (Länge der

Boxen) zwischen den drei Ländern beim Stickstoffisotop sehr auffällig. Der Iran, als flächen-

und mengenmäßig größter Produzent, zeigt hierbei die größte Streuung, während die USA mit

einem recht abgegrenzten Anbaugebiet (Kalifornien) und wenigen, aber dafür sehr großen Far-

men, die kleinste Streuung in den Messwerten aufweist. Hieraus lässt sich schließen, dass durch

die größere Gesamtanbaufläche im Iran sich regionale Unterschiede (Klima, Boden, Mikroorga-

nismen) ergeben, die sich im Stickstoffisotopenverhältnis der Pistazien niederschlagen. Für eine

Herkunftsbestimmung von Pistazien innerhalb des Irans reichen diese Unterschiede allerdings

nicht aus bzw. war der Datensatz zu klein (Überprüfung dieser Aussage mit der Diskriminanz-

analyse, Ergebnisse nicht aufgeführt).

Eine vollständige Trennung zwischen den Pistazienproben der Hauptanbauländer Iran und USA

liefert das Sauerstoff-Isotopenverhältnis (s. Abbildung 40). Hier überschneiden sich weder die

äußersten Werte der Fraktion Pistazie, noch die des entfetteten Rückstands oder des Öls. An die-

ser Stelle ist das Hauptziel dieser Arbeit, nämlich Pistazien der beiden weltweit führenden Pro-

duzenten und Lieferanten Iran und USA zu unterscheiden, schon erreicht.

Die Messwerte des drittgrößten Pistazienproduzenten, der Türkei, ordnen sich allerdings genau

zwischen denen des Irans und der USA an und überschneiden sich mit beiden Ländern. Daher ist

eine Auswertung mit der multivariaten Datenanalyse unerlässlich (s. Kapitel 6), um zu versu-

chen, die türkischen Proben vollständig von den beiden anderen Ländern abzutrennen. Die voll-

ständige Abgrenzung der Türkei von den beiden anderen Ländern wurde in der Arbeit von An-

derson et al.[7] nämlich nicht erreicht. Nähere Ausführungen zu den Ursachen der Länderunter-

schiede zwischen den δ-Werten der Pistazien sind in Kapitel 7 gegeben.

Weiterhin ist bei der Betrachtung der Box-Plots aller Länder die sehr gleichmäßige Verschie-

bung der Messwertbereiche zwischen den Fraktionen Pistazie, entfettetem Rückstand und Öl in

den δ13CPDB- und δ18OVSMOW-Werten auffällig (s. Abbildung 38 und 40). Da diese sehr gleich-

mäßig bei den Proben aus allen Ländern auftreten, könnte hier ein statistischer Zusammenhang

wie eine Korrelation bestehen. Eine Korrelationsanalyse zur Überprüfung dieser Vermutung

wird an späterer Stelle durchgeführt (s. Kapitel 5.3.5).

5. Ergebnisteil II: Univariate Statistik

5.3 Univariate statistische Vorbetrachtung des authentischen

Datenmaterials

Der Datensatz der authentischen Pistazienproben muss zuerst sorgfältig auf nachfolgende Krite-

rien hin untersucht werden, da er sonst nicht zur multivariaten Datenanalyse eingesetzt werden

darf:

1. Ausreißer,

2. Normalverteilung,

3. Varianzhomogenität,

4. Gruppenunterschiede,

5. Korrelation.

Auf die Betrachtung der Ausreißer muss besondere Sorgfalt gelegt werden, da deren Entfernung

aus dem Datensatz die Ergebnisse der multivariaten Datenanalyse maßgeblich beeinflusst. Zu-

dem ist die Prüfung der Daten auf Normalverteilung entscheidend, da dies eine der Grundvor-

aussetzungen für die Anwendbarkeit der Diskriminanzanalyse ist.

Varianzhomogenität ist hilfreich für eine gute Separation der Gruppen und Voraussetzung für die

Anwendbarkeit der Fisher’schen Klassifizierungsfunktionen (Erläuterungen s. Kapitel 6.3.4 und

Anhang II). Auch für die Hauptkomponentenanalyse sind diese Voraussetzungen empfehlens-

wert, um eine gute Korrelationsmatrix erstellen zu können.

Die Durchführung eines Mehrstichprobentests zur Prüfung auf Mittelwertgleichheit zwischen

den Gruppen (Ländern) der einzelnen Variablen ist ratsam, um sicherzustellen, dass globale

Gruppenunterschiede vorhanden sind. Mit Hilfe von Post-Hoc-Mehrfachvergleichen können

dann paarweise Mittelwertvergleiche durchgeführt werden, um zu testen, ob zwischen allen

einzelnen Gruppen signifikante Unterschiede bestehen.[239]

Die Prüfung der Korrelation der Variablen ist wiederum für die Diskriminanzanalyse wichtig,

weil korrelierende Parameter nicht in den Lerndatensatz mit einbezogen werden dürfen, da sonst

die Gefahr eines instabilen Modells besteht (s. Kapitel 3.4.2).

Die oben genannten fünf Kriterien, die der authentische Pistaziendatensatz erfüllen muss, um zur

multivariaten Datenanalyse zugelassen zu werden, werden in den folgenden Kapiteln 5.3.1 bis

5.3.5 untersucht. Die statistischen Auswertungen und Tests wurden mit Hilfe der Statistik-

Software SPSS 12.0 auf dem 95 %-Wahrscheinlichkeitsniveau durchgeführt.

5.3 Univariate statistische Vorbetrachtung

5.3.1 Betrachtung der Ausreißer

Zur Überprüfung, ob es sich bei einem Wert, der von den anderen auffallend stark abweicht, um

einen Ausreißer oder um eine zufällige Abweichung handelt, existieren eine Vielzahl von Tests.

Prinzipiell überprüfen dabei alle die Hypothese, ob der verdächtigte Wert signifikant nicht mehr

zur Messreihe gehört, also ein Ausreißer ist. Werden Messwerte als Ausreißer identifiziert, so

dürfen sie in die Gesamtberechnung nicht mehr mit einbezogen werden.[122,166] Die vorliegenden

Messwerte werden daher zuerst grafisch mit Hilfe der Box-Plot-Darstellung betrachtet und da-

nach zur Bestätigung der visuell gefundenen Ausreißer dem Grubbs- und Nalimov-Ausreißertest

unterzogen.

5.3.1.1 Box-Plots

Durchführung:

→ siehe Kapitel 5.2, Abbildung 38-40

In den nachfolgenden Tabellen 29 und 30 sind die in den Box-Plots angezeigten Ausreißer und

Extremwerte (fett gedruckt) aufgelistet. Die aufgeführten Probennummern in den Tabellen und

im Text korrespondieren mit denen in der Probenliste des Kapitels 9.1 und des Anhangs III.

Ergebnis:

Tabelle 29:

Zusammenfassung der Box-Plot-Ausreißer

und -Extremwerte des authentischen Da-

tenmaterials der USA

USA Probennummern

Pistazie

δ13CPDB

δ15NAir 33 34 35 48

61 69

δ18OVSMOW 34 69

Rückstand

δ13CPDB

δ15NAir 33 34

61 69

δ18OVSMOW 38

Öl

δ13CPDB

δ18OVSMOW 33 69

Tabelle 30:

Zusammenfassung der Box-Plot-Ausreißer und

-Extremwerte des authentischen Datenmateri-

als der Türkei

Türkei Probennummern

Pistazie

δ13CPDB 75

δ15NAir 82 86 88

δ18OVSMOW 71 86 88

Rückstand

δ13CPDB 75 80

δ15NAir 82 86 88

δ18OVSMOW 82 86 88 90

Öl

δ13CPDB 75

δ18OVSMOW 82 86

88 90

5. Ergebnisteil II: Univariate Statistik

Der authentischen Datensatz der Proben des Irans zeigt in der Box-Plot-Darstellung weder

Ausreißer noch Extremwerte (s. Abbildung 38-40 in Kapitel 5.2).

Bei den authentischen Pistazienproben aus den USA sind Box-Plot-Ausreißer vor allem beim

Stickstoff- weniger im Sauerstoff-Isotopenverhältnis zu finden. Viele davon sind sogar als Ex-

tremwerte gekennzeichnet (s. fett gedruckte Werte in Tabelle 29 und vgl. Abb. 38-40 in Kap.

5.2). Auffällig sind hier die Proben mit den Nummern 33, 34, 35, 61 und 69. Die ersteren drei

sind direkt von kalifornischen Farmen bezogen worden (34/35 = gesalzene und ungesalzene Ver-

sion), während die letzteren beiden im amerikanischen Handel gekauft wurden (gleiche Firma

jedoch verschiedene Ernten) und den Vermerk „USDA organic“ tragen.

Mit dem Vermerk „organic“ dürfen in den USA nur Produkte gekennzeichnet werden, deren

Hersteller von dem United States Department of Agriculture (= Agrarministerium) begutachtet

und akkreditiert wurden und die nach deren Vorgaben produziert werden. Dazu gehören die

Vermeidung der meisten konventionellen Pestizide, Herbizide und kommerzieller Dünger, sowie

keine Klärschlammaufbringung beim Anbau und keine Benutzung von Bestrahlung oder gen-

technisch hergestellten Zutaten bei der Produktion. „Organic“ ist also vergleichbar mit dem deut-

schen Begriff „biologischer Anbau“.[265]

Die Box-Plot-Darstellung zeigt bei den authentisch-türkischen Messergebnissen sehr auffällige

Ausreißer in den δ15NAir- und δ18OVSMOW-Werten und zwar bei denselben Proben in allen drei

Fraktionen (s. Tabelle 30 und vgl. Abb. 38-40 in Kap. 5.2). Dies sind die Pistazienproben mit

den Nummern 82 (= lose Ware ohne Schale), 86 (= verpackte Ware ohne Schale), 88 (= verpack-

te Ware 5 Jahre alt mit Schale) und 90 (= lose Ware mit Schale).

Es scheint, als ob die Pistazien ohne Schale durch äußere Einflüsse (z.B. Luft, Verarbeitung,

Lagerung) in ihrem Stickstoff- und Sauerstoff-Isotopenverhältnis beeinflusst wurden bzw. mehr

isotopenrelevant beeinflusst wurden als Pistazien mit Schale. Die beiden auffälligen Proben Nr.

82 und 86 sind auch die einzigen ohne Schale im authentisch-türkischen Datensatz. Bei Probe

Nr. 88 könnte die Alterung (5 Jahre, keine Angaben über die Lagerungsbedingungen) zu einer

Veränderung der Isotopenverhältnisse geführt haben. Die authentisch-türkische Herkunft der

Probe Nr. 90 ist nicht mit Sicherheit anzunehmen, da sie als lose Ware in Berlin gekauft wurde.

Ein weiterer auffälliger Ausreißer im türkischen Datenmaterial ist die Probe Nr. 75, die nur im

δ13CPDB-Verhältnis aller Fraktionen ausreißt. Es handelt sich dabei ebenfalls um eine in Berlin

gekaufte, lose Ware mit Schale und ihre türkische Herkunft kann somit nicht mit Gewissheit

angenommen werden.

5.3 Univariate statistische Vorbetrachtung

5.3.1.2 Ausreißertest nach Grubbs und Nalimov

Zur Überprüfung, ob ein Wert mit einer starken Abweichung ein Ausreißer ist oder nicht, wird

beim Grubbs-Test die Prüfgröße Q und beim Nalimov-Test die Prüfgröße r berechnet

(s. Anhang I: Formelverzeichnis) und mit einem Tabellenwert verglichen. Der Wert gilt als Aus-

reißer, wenn die berechnete Prüfgröße Q bzw. r größer als der entsprechende Tabellenwert

ist.[122,166]

Durchführung:

Der zweiseitige Grubbs-Test wird zuerst auf die Messwerte der Mehrfachbestimmungen jeder

einzelnen Probe angewendet. So erkannte Ausreißer wurden nicht in die Berechnung des Mittel-

werts einbezogen. Danach wird der zweiseitige Grubbs-Test erneut auf die Mittelwerte aller Pro-

ben eines Landes angewendet (Signifikanzniveau P = 95 %). Die so ermittelten Grubbs-

Ausreißer sind in den Tabellen 31-33 fett gedruckt hervorgehoben.

Danach werden die durch den Grubbs-Test bereinigten Mittelwerte auf einem Signifikanzniveau

von P = 99 % dem Nalimov-Test unterzogen. Die aufgeführten Probennummern in den nachfol-

genden Tabellen 31-33 und im Text korrespondieren mit denen der Probenlisten in Kapitel 9.1

und im Anhang III.

Ergebnis:

Tabelle 31:

Zusammenfassung der Grubbs-/Nalimov-

Test-Ausreißer des authentischen Datenma-

terials des Irans

Iran Probennummern

Pistazie

δ13CPDB 22

δ15NAir

δ18OVSMOW

Rückstand

δ13CPDB

δ15NAir

δ18OVSMOW

Öl

δ13CPDB

δ18OVSMOW 7

Tabelle 32:

Zusammenfassung der Grubbs-/ Nalimov-Test-

Ausreißer des authentischen Datenmaterials

der USA

USA Probennummern

Pistazie

δ13CPDB

δ15NAir 34 61 69

δ18OVSMOW 34 69

Rückstand

δ13CPDB

δ15NAir 34 61 69

δ18OVSMOW

Öl

δ13CPDB

δ18OVSMOW 33 69

5. Ergebnisteil II: Univariate Statistik

Tabelle 33:

Zusammenfassung der Grubbs-/Nalimov-Test-Ausreißer

des authentischen Datenmaterials der Türkei

Türkei Probennummern

Pistazie

δ13CPDB 75

δ15NAir 71 82 86 88 90

δ18OVSMOW 88

Rückstand

δ13CPDB 75 80

δ15NAir 71 82 86 88 90

δ18OVSMOW

Öl

δ13CPDB 75

δ18OVSMOW 88

Der Grubbs-Test kennzeichnet auf dem 95 %-Signifikanzniveau nur vier Proben als Ausreißer

(fett gedruckte Nummern in den Tabellen 31-33) und urteilt damit im Vergleich wesentlich we-

niger scharf als die Box-Plots (s. Kapitel 5.3.1.1) und dem Nalimov-Test (alle aufgeführten Pro-

bennummern in den Tabellen 31-33). Der Nalimov-Test wurde entgegen dem Grubbs-Test auf

dem 99 %-Signifikanzniveau durchgeführt, da er bei P = 95 % zu scharf urteilt und fast alle Pro-

ben als Ausreißer kennzeichnet. Auf dem 99 %-Signifikanzniveau bestätigt der Nalimov-Test

jedoch fast alle Box-Plot-Ausreißerproben (vgl. Tabellen 29 und 30 in Kap. 5.3.1.1 mit Tabellen

31-33), allerdings nicht immer in den gleichen Stabilisotopenverhältnissen.

Bei den iranischen Proben werden praktisch keine Ausreißer gefunden, auch wenn der Nalimov-

Test (s. Tabelle 31) zwei anzeigt. Diese treten jedoch nicht wie die Ausreißerproben der anderen

Länder in mehreren Fraktionen auf und werden weder mit dem Grubbs-Test noch von den Box-

Plots bestätigt. Es kann hier keine plausible Erklärung für deren „Herausfallen“ gefunden wer-

den, da sie 100 % authentisch sind und keiner auffälligen Produktion oder Region entstammen.

Sie werden daher nicht aus dem Datensatz entfernt, sondern alle 32 authentisch-iranischen Pro-

ben werden in die multivariate Datenanalyse einfließen.

Der Nalimov- und Grubbs-Test bestätigen bei den USA-Proben die drei Extremwert-Proben Nr.

34, 61 und 69 der Box-Plots (s. Tabelle 32 und vgl. mit Tabelle 29 in Kap. 5.3.1.1). Die vier

Ausreißerproben Nr. 33, 35, 38 und 48, die bei der Box-Plot-Darstellung noch nah an der Box-

grenze liegen (s. Kapitel 5.2), werden von Nalimov allerdings nicht als Ausreißer angezeigt.

5.3 Univariate statistische Vorbetrachtung

Den Proben mit den Nummern 33, 34, 61 und 69 scheint der „biologische Anbau“ gemeinsam zu

sein, da es sich bei diesen Proben um diejenigen handelt, die den Aufdruck „organic“ tragen

bzw. direkt von kleinen Privatfarmen bezogen wurden. Es wird hier vermutet, dass sich eine be-

vorzugte oder ausschließliche Aufbringung von organischen Düngern auf das 15N- und 18O-

Stabilisotopenverhältnis ausgewirkt hat. Diese Proben sind dadurch jedoch nicht weniger authen-

tisch, sondern zeigen nur, dass die Düngung einen starken Einfluss hat (vor allem auf das Stick-

stoff-Isotopenverhältnis). Sie werden aber trotzdem aus dem authentischen Datenmaterial ent-

fernt und fließen nicht mit in die multivariate Datenanalyse ein. Ebenso Probe Nr. 35, die zwar

nur in der Box-Plot-Darstellung auffällig ist, jedoch stammt sie von der gleichen Farm wie die

Ausreißerprobe Nr. 34. Sie unterscheiden sich nur in der Verarbeitung gesalzen/ungesalzen.

Somit werden fünf Proben (Nr. 33, 34, 35, 61, 69) aus dem amerikanischen Pistaziendatensatz

entfernt und nur 33 von 38 authentischen USA-Proben zur multivariaten Datenanalyse zugelas-

sen. Die beiden Proben Nr. 38 und 48 verbleiben im Datensatz, da sie jeweils nur in einer Vari-

ablen in den Box-Plots auffällig sind.

Während die Box-Plots die Ausreißer bei den türkischen Proben mehr im Sauerstoffisotopenver-

hältnis (s. Tabelle 30) gekennzeichnet haben, reißen dieselben Proben (s. Tabelle 33, Probe Nr.

71, 82, 86, 88, 90) beim Nalimov-Test im 15N/14N-Verhältnis aus. Die Ausreißerprobe Nr. 71 ist

zwar eine in der Türkei gekaufte lose Ware, bei der die Authentizität schwer anzuzweifeln ist,

jedoch ist sie von zwei Tests eindeutig als Ausreißer erkannt worden. Außerdem wird auch die

türkische Probe Nr. 75 wie mit den beiden anderen Tests als Ausreißer beim δ13CPDB-Verhältnis

erkannt.

Es finden sich somit bei den authentisch-türkischen Proben die meisten Ausreißer, was zu erwar-

ten war, da die Proben nicht direkt aus dem Land sondern größtenteils in türkischen Läden in

Deutschland erworben wurden. Die o.g. Proben (Nr. 71, 75, 82, 86, 88, 90) werden daher aus

dem Datensatz genommen und nicht zur multivariaten Datenanalyse zugelassen. Somit fließen

nur 25 von 31 türkischen Ausgangsproben in die multivariate Auswertung ein. Probe Nr. 80 wird

im Datensatz belassen, da sie nur in der Variable „δ13C Rückstand“ ausreißt und nicht wie alle

anderen Ausreißerproben in mehreren Variablen und Elementen.

Insgesamt ist anzumerken, dass die meisten und deutlichsten Ausreißer im Stickstoff-

Isotopenverhältnis zu finden sind. In Kapitel 3.2.2 wurde hierzu schon angemerkt, dass durch die

Vielschichtigkeit der äußeren Einflussfaktoren die Schwankungsbreite des δ15N-Werts des Bo-

dens und damit der Pflanzen beträchtlich sein kann, was sich bei einer Herkunftsbestimmung

über dieses Element nachteilig auswirkt. Viele Zusammenhänge von Boden, Luft, Dünger und

Pflanze sind auch noch nicht eingehend wissenschaftlich untersucht worden. Die Verwendung

5. Ergebnisteil II: Univariate Statistik

des Stickstoffisotopenverhältnisses hat sich somit als nicht besonders geeignet für eine Her-

kunftsbestimmung herausgestellt.

Alle Ausreißerproben werden an späterer Stelle noch einmal mit der multivariaten Datenanalyse

(s. Kapitel 6.4.5) gesondert betrachtet und ihre Herausnahme aus dem authentischen Datensatz in

der Ergebnisdiskussion (s. Kapitel 7) eingehend diskutiert; vor allem die vier USA-Proben

(Nr. 33, 34, 61 und 69), bei denen ganz offensichtlich die Art der Düngung das Isotopenverhält-

nis beeinflusst hat.

5.3.2 Prüfung der Normalverteilung nach Kolmogorov-Smirnov

Der Test nach Kolmogorov (1941) und Smirnov (1948) ist dem Chi²-(χ²-) Anpassungstest ähn-

lich und vergleicht die empirische Verteilungsfunktion für eine Variable mit der Normalvertei-

lung. Dabei zeigt ein Testwertergebnis >0,05 an, dass die betrachtete Variable normalverteilt ist.

Eine Normalverteilung der Variablen ist Grundvoraussetzung für deren Verwendbarkeit in der

Diskriminanzanalyse und für die Aufstellung einer guten Korrelationsmatrix in der Hauptkom-

ponentenanalyse.[224,251,256]

Durchführung:

Der Test auf Normalverteilung nach Kolmogorov-Smirnov (K-S) wird mit dem um die Ausrei-

ßer verminderten authentischen Datensatz durchgeführt.

Ergebnis:

Tabelle 34: Signifikanzergebnisse (P = 95%) des K-S-Normalverteilungstests

vom authentischen Datenmaterial ohne Ausreißer

Kolmogorov-Smirnov-

Normalverteilungstest Iran USA Türkei

δ13CPDB Pistazie 0,972 1,000 0,783

δ15NAir Pistazie 0,422 0,706 0,903

δ18OVSMOV Pistazie 0,951 0,979 0,874

δ13CPDB Rückstand 0,910 0,952 0,692

δ15NAir Rückstand 0,460 0,830 0,863

δ18OVSMOV Rückstand 0,163 0,985 0,871

δ13CPDB Öl 0,408 0,872 0,774

δ18OVSMOV Öl 0,494 0,543 0,849

5.3 Univariate statistische Vorbetrachtung

Der Kolmogorov-Smirnov-Anpassungstest auf Normalverteilung zeigt für alle betrachteten Ele-

mente, Fraktionen und Länder eine zweiseitige Signifikanz >0,05, d.h. es kann für alle Messrei-

hen eine Normalverteilung nicht abgelehnt werden (s. Tabelle 34).

5.3.3 Prüfung der Homogenität der Varianzen nach Levene

Der Levene-Test dient zum Vergleich von Gruppenvarianzen und zum Testen derer Homogeni-

tät. Er ist relativ unempfindlich (robust) gegenüber Abweichungen von der Normalverteilung

und testet die Nullhypothese („alle Varianzen sind gleich“) gegen die F-Verteilung. Falls das

Signifikanzergebnis <0,05 ist, wird die Alternativhypothese angenommen, d.h. mindestens zwei

der betrachteten Varianzen sind ungleich. Voraussetzung für die Anwendbarkeit des Levene-

Tests sind Stichprobenumfänge pro Gruppe >10. Eine Varianzhomogenität zwischen den Grup-

pen wäre für die nachfolgenden multivariaten Datenanalysen wünschenswert und hilfreich, ist

jedoch keine zwingende Voraussetzung.[224,239,256]

Durchführung:

Der Test auf Varianzhomogenität nach Levene wird mit dem um die Ausreißer verminderten

authentischen Datensatz durchgeführt.

Ergebnis:

Tabelle 35: Signifikanzergebnisse des Levene-Tests

auf Varianzhomogenität

Levene-Homogenitätstest Signifikanz

δ13CPDB Pistazie 0,057

δ15NAir Pistazie <0,001

δ18OVSMOV Pistazie 0,020

δ13CPDB Rückstand 0,043

δ15NAir Rückstand <0,001

δ18OVSMOV Rückstand 0,052

δ13CPDB Öl 0,038

δ18OVSMOV Öl 0,006

Es wird nur für zwei der acht Variablen eine signifikante Varianzhomogenität der Gruppen vom

Levene-Test angezeigt (s. fett gedruckte Werte in Tabelle 35). Bei natürlichen Messwertreihen

ist dies jedoch zu erwarten und in der Box-Plot-Darstellung ist die Varianzheterogenität der Va-

riablen auch schon zu erkennen: Die Unterschiede in der Länge der Boxen, d.h. in der Streuung

5. Ergebnisteil II: Univariate Statistik

der Werte, sind zwischen den Ländern zum Teil erheblich. Daher kann zwischen den Ländern

innerhalb einer Fraktion keine Varianzhomogenität bestehen. Die möglichen Gründe dafür wer-

den in Kapitel 7 (Ergebnisdiskussion) eingehend diskutiert.

5.3.4 Prüfung auf Gruppenunterschiede über Post-Hoc-Mehrfachvergleiche

Zur Prüfung auf Gruppenunterschiede kann die weit verbreitete und bekannte einfaktorielle

ANOVA (analysis of variance, F-Test) mit dem vorliegenden Datenmaterial nicht durchgeführt

werden. Die Grundvoraussetzung für diesen Test, die Varianzhomogenität (Levene-Test, s. Ka-

pitel 5.3.3), wird von den meisten Variablen des authentischen Pistaziendatensatzes nicht er-

füllt.[239] Es gibt jedoch paarweise multiple Vergleichstests, bei denen Varianzheterogenität zu-

gelassen ist, so dass die einzelnen Gruppen innerhalb einer Variablen gegeneinander auf signifi-

kante Erwartungswertunterschiede (P = 95 %) getestet werden können.[251] Ein Wert <0,05 zeigt

an, dass ein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten der einzelnen Länder besteht.

Durchführung:

Der konservative, paarweise Vergleichstest T2 nach Tamhane, bei dem keine Varianzgleichheit

vorausgesetzt ist und auf der Grundlage eines T-Tests basiert, wird auf das um die Ausreißer

verminderte authentische Datenmaterial angewendet (P = 95 %). Ebenso wird zum Vergleich die

Scheffé-Prozedur als Vertreter eines F-Tests durchgeführt, bei dem Varianzhomogenität Voraus-

setzung ist. Hiermit soll überprüft werden, ob die vom Levene-Test angezeigte Varianzinhomo-

genität des Datensatzes groß oder klein ist.

Ergebnis:

Tabelle 36: Signifikanz-Ergebnisse multipler Vergleichstests

Post-Hoc-Mehrfachvergleiche Signifikanz

Tamhane-T2

Signifikanz

Scheffé-Prozedur

δ13CPDB Pistazie Iran ⇔ USA <0,001 <0,001

USA ⇔ Türkei <0,001 <0,001

Türkei ⇔ Iran 0,004 0,003

δ15NAir Pistazie Iran ⇔ USA <0,001 <0,001

USA ⇔ Türkei 0,001 0,197

Türkei ⇔ Iran <0,001 <0,001

δ18OVSMOV Pistazie Iran ⇔ USA <0,001 <0,001

USA ⇔ Türkei <0,001 <0,001

Türkei ⇔ Iran <0,001 <0,001

Fortsetzung der Tabelle auf der nächsten Seite!

5.3 Univariate statistische Vorbetrachtung

Fortsetzung der Tabelle 36:

Post-Hoc-Mehrfachvergleiche Signifikanz

Tamhane-T2

Signifikanz

Scheffé-Prozedur

δ13CPDB Öl Iran ⇔ USA <0,001 <0,001

USA ⇔ Türkei <0,001 <0,001

Türkei ⇔ Iran <0,001 <0,001

δ18OVSMOV Öl Iran ⇔ USA <0,001 <0,001

USA ⇔ Türkei <0,001 <0,001

Türkei ⇔ Iran <0,001 <0,001

δ13CPDB Rückstand Iran ⇔ USA <0,001 <0,001

USA ⇔ Türkei <0,001 <0,001

Türkei ⇔ Iran 0,002 0,001

δ15NAir Rückstand Iran ⇔ USA <0,001 <0,001

USA ⇔ Türkei 0,001 0,215

Türkei ⇔ Iran <0,001 <0,001

δ18OVSMOV Rückstand Iran ⇔ USA <0,001 <0,001

USA ⇔ Türkei <0,001 <0,001

Türkei ⇔ Iran <0,001 <0,001

Es konnte mit dem Post-Hoc-Mehrfachvergleichstest T2 nach Tamhane gezeigt werden, dass die

erwünschten signifikanten Unterschiede auf dem 95 %-Signifikanzniveau zwischen den einzel-

nen Gruppen (= Ländern) in allen Variablen bestehen. Alle Signifikanzwerte sind kleiner als

0,05 (s. Tabelle 36, linke Wertespalte), was bedeutet, dass die Mittelwerte der einzelnen Grup-

pen pro Variable nicht aus einer Grundgesamtheit stammen. Es bestehen damit signifikante Un-

terschiede zwischen den Ländern und die Voraussetzungen für eine multivariate Datenanalyse

zur Herkunftserkennung sind gegeben.

Zum Vergleich wurde auch die hier eigentlich unzulässige Scheffé-Prozedur durchgeführt, die

Varianzhomogenität voraussetzt. Auch mit diesem Test werden für fast alle Variablen signifi-

kante Gruppenunterschiede angezeigt (Ergebnisse <0,05). Die Mittelwerte liegen also trotz un-

terschiedlicher Varianzen weit genug auseinander (s. Tabelle 36, rechte Wertespalte). Nur für die

beiden Stickstoff-Parameter wird zwischen den Pistazien der USA und der Türkei kein signifi-

kanter Unterschied gefunden, während der Varianzheterogenität-tolerierende Tamhane-T2-Test

das Gegenteil anzeigt. Bei der Betrachtung der entsprechenden Box-Plot-Darstellungen (s. Ab-

bildung 39 in Kapitel 5.2) wird diese Diskrepanz visuell deutlich, denn die Mediane sind zwar

verschieden, jedoch hat der Pistazienprobendatensatz der Türkei eine wesentlich größere Spann-

weite und schließt damit alle amerikanischen Messwerte in seinem Intervall ein.

5. Ergebnisteil II: Univariate Statistik

5.3.5 Korrelationsanalyse

Bei der Betrachtung der Box-Plot-Darstellungen (s. Abbildung 38-40 in Kapitel 5.2) des authen-

tischen Datenmaterials wurde aufgrund der gleichmäßigen Verschiebungen zwischen den

δ-Werten der Pistazie, des entfetteten Rückstands und des Öls vermutet, dass die Fraktionen mit-

einander korrelieren. Zur Überprüfung dieser Vermutung wird eine Korrelationsanalyse durchge-

führt, die die Zusammenhänge zwischen gleichwertigen Zufallsvariablen anhand einer Stichpro-

be untersucht. Eine Maßzahl für die Stärke und Richtung eines linearen Zusammenhangs ist der

Korrelationskoeffizient ς. Er liegt zwischen –1 und +1, wobei ein Betrag nahe ±1 einen starken

und ein Betrag nahe Null einen schwachen Zusammenhang anzeigt.[37,224] Die Berechnung des

Korrelationskoeffizienten hängt vom Skalenniveau der betreffenden Variablen ab. Im vorliegen-

den Fall der Pistazienmesswerte sind alle Variablen intervallskaliert und normalverteilt, daher

wird die Produkt-Moment-Korrelation nach Pearson angewandt (s. Anhang I: Formelverzeich-

nis).[37]

Durchführung:

Die Korrelationsanalyse nach Pearson wird mit dem um die Ausreißer verminderten authenti-

schen Datensatz durchgeführt.

Ergebnis:

Tabelle 37: Korrelationskoeffizienten nach Pearson für die Variablen der authentischen Proben

Korrelations-

analyse

δ13C

Pistazie

δ13C

Rückst.

δ13C

Öl

δ15N

Pistazie

δ15N

Rückst.

δ18O

Pistazie

δ18O

Rückst.

δ18O

Öl

δ13C Pistazie 1 0,896 0,961 0,088 0,087 0,462 0,427 0,535

δ13C Rückstand 0,896 1 0,928 0,058 0,045 0,499 0,465 0,576

δ13C Pistazienöl 0,961 0,928 1 0,023 0,018 0,453 0,416 0,537

δ15N Pistazie 0,088 0,058 0,023 1 0,988 0,757 0,789 0,720

δ15N Rückstand 0,087 0,045 0,018 0,988 1 0,750 0,781 0,716

δ18O Pistazie 0,462 0,499 0,453 0,757 0,750 1 0,981 0,980

δ18O Rückstand 0,427 0,465 0,416 0,789 0,781 0,981 1 0,974

δ18O Pistazienöl 0,535 0,576 0,537 0,720 0,716 0,980 0,974 1

fettgedruckt: Korrelationen zwischen den Fraktionen eines Elements. Die Korrelationen sind alle auf

dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

unterstrichen: Korrelationen zwischen den Fraktionen verschiedener Elemente. Die Korrelation ist auf

dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

5.3 Univariate statistische Vorbetrachtung

Die Korrelationsanalyse nach Pearson (s. Tabelle 37) bestätigt statistisch den schon bei der Be-

trachtung der Box-Plots visuell erkannten Zusammenhang (s. Kapitel 5.2), dass die Fraktionen

Pistazie, entfetteter Rückstand und Öl innerhalb eines Elements miteinander korrelieren. Der

Korrelationszusammenhang ist fast immer, abgesehen von einer Ausnahme, „sehr hoch“

(ς > 0,9) und damit hoch signifikant. Dies war zu erwarten, denn wie schon in Kapitel 3.2 darge-

legt wurde, korrelieren die δ-Werte der Pflanzen mit ihren jeweiligen Kohlenstoff-, Stickstoff-

und Sauerstoffquellen der Umwelt. Im weiteren Stoffwechsel der Pflanzen kommt es zwar zu

diversen Isotopeneffekten, jedoch nach diesem Ergebnis scheinen die Isotopeneffekte immer in

einem Korrelationsgleichgewicht abzulaufen. Daher führt die Untersuchung der einzelnen Frak-

tionen „Öl“ und „entfetteter Rückstand“ nicht zu einer Verschärfung der Trennung zwischen den

Ländern.

Durch die hier festgestellten Korrelationen zwischen den Fraktionen eines Elements lässt sich

außerdem ableiten, dass für die Diskriminanzanalyse nur eine Fraktion pro Element zugelassen

werden darf, da sonst die Aussagekraft des Modells verschlechtert wird (s. Kapitel 3.4.2). Für die

Hauptkomponentenanalyse dagegen ist die Korrelation von Variablen gerade erstrebenswert, da

diese die korrelierenden Fraktionen zu Faktoren bündeln wird.

Außerdem ist zu beobachten, dass neben den sehr hohen Korrelationskoeffizienten zwischen

Pistazie, Rückstand und Öl innerhalb der Elemente, auch signifikante Korrelationen zwischen

verschiedenen Elementen bestehen. Die Variablen des Sauerstoffisotopenverhältnisses korreliert

sowohl „hoch“ (ς > 0,7) mit den Stickstoff-Variablen als auch noch „gering“ mit dem Kohlen-

stoff-Variablen (ς ~ 0,5). Diese Kreuzkorrelationen sind für die Hauptkomponentenanalyse er-

strebenswert, da dadurch eine weitere Bündelung der Variablen und eine Variablenreduktion zu

erwarten ist. Die Grundvoraussetzung für eine gute Eignung des Datensatzes für die Hauptkom-

ponentenanalyse ist damit hinreichend gegeben. Weitere Prüfkriterien dazu werden im nächsten

Kapitel untersucht.

Für die Diskriminanzanalyse ist die hohe Korrelation zwischen Sauerstoff und Stickstoff eher

kritisch zu betrachten. Es könnten dadurch Probleme bei der Modellbildung entstehen, da die

Diskriminanzanalyse sehr empfindlich auf zwischenelementare Korrelationen reagiert. Dies wird

sich jedoch erst beim Testen des Diskriminanzmodells zeigen.

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

Ergebnisteil III:

Multivariate Statistik

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

In diesem Kapitel werden die δ-Wertergebnisse der authentischen Pistazienproben zuerst in ein-

fachen Streudiagrammen zur visuellen Darstellung der Trennfähigkeit der Isotopenvariablen

betrachtet. Danach wird der authentische Datensatz mit multivariaten Datenanalysen untersucht,

um ein Modell zur Prüfung der Authentizität von Pistazien aus den drei Hauptanbauländern Iran,

USA und Türkei zu erstellen. Im Anschluss wird die Leistungsfähigkeit des erstellten Modells

mit Handelsproben überprüft und getestet.

In vorherigen Kapitel 5 wurde das authentische Pistaziendatenmaterial bereits univariat betrach-

tet und auf Ausreißer und seine Eignung für die Hauptkomponenten- und Diskriminanzanalyse

hin untersucht. Es hat sich dabei herausgestellt, dass die Isotopen-Messwerte der Pistazien alle

zwingend geforderten Kriterien (Normalverteilung, Gruppenunterschiede, Korrelation) erfüllen

und sich daher sehr gut für die multivariate Datenanalyse eignen. Es mussten zudem nur einige

Ausreißer aus dem Datensatz entfernt werden (genaue, sachlogische Erklärungen dazu sind in

der Ergebnisdiskussion in Kapitel 7 gegeben), so dass die Probenanzahl pro Gruppe (Land) noch

genügend groß für den Einsatz zur multivariaten Statistik ist.

Bei der multivariaten Datenanalyse wird der authentische Datensatz zuerst einer Hauptkompo-

nentenanalyse unterzogen. Hierbei werden nämlich keine Gruppen (Länder) vorgegeben, daher

eignet sich die Hauptkomponentenanalyse hervorragend zur Entdeckung der Strukturen des Da-

tensatzes und damit auch zur Prüfung, ob die Stabilisotopenvariablen dazu geeignet sind, nach

der Herkunft zu trennen (s. Kapitel 3.4.1). Sie wird in Kapitel 6.2 in folgenden Schritten durch-

geführt und die Ergebnisse jeweils diskutiert werden:

1. Prüfung der Eignung der Korrelationsmatrix,

2. Extraktion der Faktoren (Komponenten),

3. Faktorinterpretation,

4. grafische Darstellung.

Der Nachteil eines strukturen-entdeckenden Verfahrens wie der Hauptkomponentenanalyse ist es

allerdings, dass mit ihr keine neuen Proben ein- bzw. zugeordnet werden können. Das Ziel dieser

Arbeit ist es jedoch, Pistazienproben, deren Herkunft unbekannt oder zweifelhaft ist, den Erzeu-

gerländern Iran, USA oder Türkei anhand ihrer Stabilisotopenverhältnisdaten eindeutig zuordnen

zu können. Daher muss zusätzlich ein strukturen-prüfendes Verfahren wie die Diskriminanzana-

lyse auf den authentischen Datensatz angewendet werden, denn erst hiermit kann ein Klassifika-

tions-(Zuordnungs-)modell für Pistazien erstellt werden.

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

Die Diskriminanzanalyse wird in Kapitel 6.3 zuerst schrittweise durchgeführt, um die Gesamtan-

zahl der Variablen zu reduzieren und die aussagekräftigsten herauszufiltern. Danach wird mit

den „optimalen“ Variablen das Diskriminanzmodell erstellt. Dazu wird versucht, die Koeffizien-

ten der Diskriminanzfunktion so zu ermitteln, dass die untersuchten Gruppen möglichst optimal

getrennt werden, d.h. das Diskriminanzkriterium Γ1 maximal wird.[13,36,37] Eine neue (unbekann-

te) Probe wird dann nach der Bayes’schen Klassifikationsregel in diejenige Gruppe eingeordnet,

der sie am nächsten liegt, d.h. bezüglich derer die Distanz zwischen Element und Gruppenmittel

(Zentroid) minimal wird (s. Kapitel 3.4.1).

Die Klassifikationsfähigkeit des erstellten Diskriminanzmodells muss außerdem geprüft werden,

und zwar über die Häufigkeit von korrekt und falsch klassifizierten Elementen bekannter Her-

kunft. Da in der Regel aber alle authentischen Proben als Lerndatensatz für die Erstellung des

Klassifizierungsmodells verwendet werden, müssen diese zusätzlich als Quasi-Proben fungieren

(näheres zur Methodik siehe in Kapitel 6.3.3). Hierfür gibt das Statistik-Programm SPSS 12.0

eine sog. Klassifikationsmatrix aus, aus der sehr einfach die Klassifikationsfehlerrate für die auf-

gestellte Zuordnungsregel abgelesen werden kann.

Des Weiteren wird auch die Eignung der Isotopenvariablen zur Anwendung der linearen Klassi-

fizierungsfunktionen nach Fisher geprüft (s. Kapitel 6.3.4) und die Ergebnisse der Diskriminan-

zanalyse grafisch in Streudiagrammen veranschaulicht (s. Kapitel 6.3.5).

Im abschließenden Abschnitt 6.4 dieses Kapitels werden dann die Leistungsfähigkeit und die

Grenzen des erstellten Modells anhand von Handelsproben aufgezeigt und die Ausreißer des

authentischen Datensatzes noch einmal im Diskriminanzmodell betrachtet.

Die Durchführung und Auswertung der multivariaten Datenanalysen erfolgt in diesem Kapitel

unter Zuhilfenahme der Statistik-Software SPSS 12.0 auf dem 95 %-Wahrscheinlichkeitsniveau

und es wird ausschließlich der um die Ausreißer verminderte authentische Pistaziendatensatz für

die Berechnungen verwendet.

1 Diskriminanzkriterium Γ:

Γ = Streuung zwischen den Gruppen / Streuung in den Gruppen

Die Streuung zwischen den Gruppen wird durch die quadrierte Abweichung der Gruppenzentroide vom Gesamtmit-

tel gemessen. Die Streuung in den Gruppen wird durch die quadrierten Abweichungen der Gruppenelemente vom

jeweiligen Gruppenzentroid gemessen.[13] Die Separation wird umso besser, je homogener die Gruppen sind, je

kleiner also die Streuung der Objekte innerhalb der Gruppen verglichen mit der Streuung der Gruppenmittelpunkte

(Streuung zwischen den Gruppen) ist.[129]

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

6.1 Betrachtung des authentischen Datenmaterials in

x-y-Streudiagrammen

Das Verhalten der δ13CPDB-, δ15NAir- und δ18OVSMOW-Messwerte der authentischen Proben soll

vor der multivariaten Datenanalyse in einfachen, zweidimensionalen Streudiagrammen visuell

betrachtet werden. Hieraus lassen sich Rückschlüsse auf die zu erwartenden multivariaten Er-

gebnisse ziehen und die Trennkraft der einzelnen Variablen besser als in den Box-Plots

(s. Kapitel 5.2) visualisieren und mit dem Ergebnis von Anderson et al. (2005)[7] vergleichen.

Durchführung:

Es werden alle drei gemessenen Stabilisotopenvariablen des authentischen Datensatzes in einem

x-y-Streudiagramm jeweils gegeneinander aufgetragen. Es werden dafür beispielhaft nur die

Messwerte der Pistazien (Gesamtnuss) genommen, die des Öls und des entfetteten Rückstands

geben ähnliche visuelle Ergebnisse.

Ergebnis:

Abbildung 41:

Auftragung der δ13CPDB- gegen die

δ15NAir-Messwerte der authentischen

Pistazien

Abbildung 42:

Auftragung der δ15NAir- gegen die

δ18OVSMOW-Messwerte der authenti-

schen Pistazien

-29

-28

-27

-26

-25

-2 0 2 4 6 8 10

δ15NAir Pistazie

δ13CPDB Pistazie

-2

25 27 29 31 33 35 37 39

δ15NAir Pistazie

δ18OVSMOW Pistazie

6.1 Streudiagramme

Abbildung 43:

Auftragung der δ13CPDB- gegen die

δ18OVSMOW-Messwerte der authen-

tischen Pistazien

Abbildung 44:

Wiederholung der Abbildung 1

zum Vergleich

Originalgrafik verändert nach An-

derson et al.[7]

In der einfachen Auftragung des δ13CPDB-Werts der Pistazien gegen ihren δ15NAir-Wert

(s. Abbildung 41) kann durch die unterschiedliche Farbgebung schon eine Anordnung der Werte

in Punktwolken aber keine klare Trennung der Länder erkannt werden. Die Messwerte der USA

und der Türkei bilden kleine, mehr rundliche Punktwolken, während die Punktwolke der Iran-

proben durch die große Streubreite in deren δ15NAir-Werten (s. Kapitel 5.2) lang gestreckt ist.

Wird dagegen der δ18OVSMOW-Wert als eine der Variablen verwendet (s. Abbildung 42 und 43),

kann wie bei den Box-Plots in Kapitel 5.2 eine deutliche Abtrennung der iranischen Pistazien-

proben von denen der USA beobachtet werden. Die Punktwolke der türkischen Messwerte ord-

net sich jedoch immer zwischen der iranischen und amerikanischen an.

Dadurch stoßen z.B. in Abbildung 42 die Punktwolken der türkischen und der USA-Proben ohne

Zwischenraum aneinander. Da das Stickstoffisotop in diesem Fall gar keine Trennung leistet,

liegen diese beiden Punktwolken auch auf gleicher Höhe. Die iranischen Proben sind hier dage-

gen aufgrund differierender δ15NAir-Werte in y-Richtung verschoben. Es ist daher zu bemerken,

dass durch die Auftragung des δ15NAir-Werts gegen das Sauerstoff-Isotopenverhältnis eine Ab-

grenzung iranischer Pistazien von amerikanischer und türkischer Ware erreicht wird.

-29

-28

-27

-26

25 27 29 31 33 35 37 39

δ18OVSMOW Pistazie

δ13CPDB Pistazie

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

Bei der Auftragung des δ13CPDB-Werts gegen das δ18O-Verhältnis (s. Abbildung 43) sind die

amerikanische und iranische Punktwolke ebenfalls klar getrennt, jedoch ordnen sich die türki-

schen Pistazienproben ohne eindeutige Abgrenzung genau dazwischen an. Sie heben sich nur

aufgrund ihrer etwas höheren δ13CPDB-Werte optisch von der amerikanischen Punktwolke ab.

Auffällig ist hier außerdem die große Streubreite der iranischen Proben im 12C/13C-Verhältnis die

die gesamte Spannweite der amerikanischen und türkischen Proben einschließt.

Der Vergleich der drei Streudiagramme (s. Abbildung 41-43) mit dem ebenfalls grafisch zwei-

dimensionalen Ergebnis von Anderson et al.[7] (s. Abbildung 44, Auftragung des δ15N-Werts

gegen das C/N-Verhältnis) lässt nun erkennen, dass auch durch die Hinzunahme des Sauerstoff-

Isotopenverhältnisses keine bessere Trennung der drei Länder erreicht wurde. Die beiden Haupt-

pistazienproduzenten Iran und USA konnten in dieser Arbeit wie auch in der von Anderson et

al.[7] deutlich voneinander getrennt werden, jedoch überschneiden sich die türkischen Pistazien

mit denen der beiden Hauptproduzenten: In dieser Arbeit mehr mit den amerikanischen Proben,

bei Anderson et al.[7] mit den iranischen.

Es führt somit keine zweidimensionale Kombination der drei gemessenen Stabilisotopenverhält-

nisse (s. Abbildung 41-43) zu einer befriedigenden, klaren Trennung der drei Länder, jedoch

zeigen alle eine potenzielle Eignung, was für die anschließenden multivariaten Datenanalysen

von großem Vorteil ist. Multivariate Datenanalysen nutzten derartige Trends aus und verstärken

sie statistisch, was in diesem Fall auf eine vollständige Trennung der drei Länder hoffen lässt.

Das Sauerstoff-Isotopenverhältnis ist hierbei die wichtigste Variable, da sie schon alleinig die

iranischen und amerikanischen Pistazienproben voneinander trennt. Außerdem trennt sie auch

die türkischen Proben recht gut von den iranischen ab, aber nicht vollständig von den amerikani-

schen.

Der δ13CPDB-Wert ist die zweitwichtigste Variable, denn sie zeigt Stärken bei der Trennung der

amerikanischen Proben von den türkischen. Das Stickstoff-Isotopenverhältnis zeigt hier die we-

nigste Trennkraft, denn es kann nur die Sauerstoffvariable bei der Distanzierung der iranischen

Pistazien von den beiden anderen Ländern unterstützen.

6.2 Hauptkomponentenanalyse

6.2.1 Prüfung der Eignung der Korrelationsmatrix

Die Korrelationsmatrix des authentischen Pistaziendatensatzes wurde schon separat in Kapitel

5.3.5 eingehend untersucht. Die Matrix müsste danach sehr gut für die Hauptkomponentenanaly-

se geeignet sein, da sehr hohe Korrelationen zwischen den Variablen eines Elements sowie zwi-

schen den verschiedenen Elementen bestehen. Korrelationen zwischen den Variablen sind die

Grundvoraussetzung für die Eignung eines Datensatzes zur Hauptkomponentenanalyse.

Durchführung:

Als Maß für die Eignung einer Korrelationsmatrix für die Hauptkomponentenanalyse dienen

statistische Prüfkriterien wie z.B. der Bartlett-Test, das KMO-Kriterium oder das MSA-Maß.

Bartlett-Test:

Es wird mit einem χ²-Wert die Hypothese getestet, nach der alle Korrelationskoeffizienten zwi-

schen den Variablen in der Grundgesamtheit den Wert Null haben (Nullhypothese: Es besteht

keine Korrelation). Ist die Signifikanz <0,05 besteht mindestens zwischen zwei Variablen eine

Korrelation.[36]

KMO (Kaiser-Meyer-Olkin)-Kriterium / MSA (Measure of Sampling Adequacy)-Maß:

Diese Prüfgrößen zeigen an, in welchem Umfang die Ausgangsvariablen zusammengehören und

zeigen an, ob eine Hauptkomponentenanalyse sinnvoll erscheint oder nicht. Das KMO-Kriterium

erlaubt hierbei eine Beurteilung der Korrelationsmatrix insgesamt, während das MSA-Maß die

Beurteilung der einzelnen Variablen erlaubt. Die Wertebereiche liegen jeweils zwischen Null

und Eins, wobei Werte <0,5 anzeigen, dass die Korrelationsmatrix nicht für eine Hauptkompo-

nentenanalyse geeignet ist; Werte ≥0,8 sind wünschenswert.[13,36] Bei der Bewertung des KMO-

und MSA-Maßes sind folgende Wortlaute gebräuchlich:[36]

Wert Beurteilung

0,9 bis 1,0 fabelhaft (marvelous)

0,8 bis < 0,9 recht gut (meritorious)

0,7 bis < 0,8 mittelprächtig (middling)

0,6 bis < 0,7 mäßig (mediocre)

0,5 bis < 0,6 schlecht (miserable)

< 0,5 inakzeptabel (unacceptable)

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

Ergebnis:

Tabelle 38: Ergebnis des Bartlett-Tests und Wert des KMO-Kriteriums

Signifikanz des Bartlett-Tests auf Sphärizität: <0,001

Maß der Stichprobeneignung nach Kaiser-Meyer-Olkin: 0,807

Tabelle 39: Ergebnisse des MSA-Maßes

δ13C

Pistazie

δ13C

Rückst.

δ13C

Öl

δ15N

Pistazie

δ15N

Rückst.

δ18O

Pistazie

δ18O

Rückst.

δ18O

Öl

MSA-Maß 0,761 0,915 0,722 0,728 0,715 0,877 0,891 0,834

Das KMO-Maß zeigt mit einem Wert von ca. 0,8 (s. Tabelle 38) eine recht gute Eignung der

gesamten Korrelationsmatrix für die Hauptkomponentenanalyse an. Der Bartlett-Tests bestätigt

dies, denn durch das Ergebnis von p < 0,05 wird die Nullhypothese abgelehnt, d.h. die Variablen

der Erhebungsgesamtheit sind mit einer Wahrscheinlichkeit von nahe 100 % korreliert (s. Tabel-

le 38). Die MSA-Werte (s. Tabelle 39) werden an den Diagonalelementen der Anti-Image-

Matrize2 abgelesen und geben Aufschluss über die Eignung der einzelnen Variablen für die

Hauptkomponentenanalyse. Die Eignung der Variablen ist von „mittelprächtig“ (>0,7) über

„recht gut“ (>0,8) bis „fabelhaft“ (>0,9) zu bezeichnen. Es ist somit keine Variable von der

Hauptkomponentenanalyse auszuschließen.

2 Anti-Image-Matrix:

Das Image beschreibt den Anteil der Varianz, der durch die verbleibenden Variablen mit Hilfe einer multiplen Reg-

ressionsanalyse erklärt werden kann, während das Anti-Image denjenigen Teil darstellt, der von den übrigen Variab-

len unabhängig ist. Da die Faktorenanalyse unterstellt, dass den Variablen gemeinsame Faktoren zugrunde liegen,

ist es unmittelbar einsichtig, dass Variablen nur dann für eine Faktorenanalyse geeignet sind, wenn das Anti-Image

der Variablen möglichst gering ausfällt (⇒ Nicht-Diagonal-Elemente der Anti-Image-Kovarianz-Matrix müssen

nahe bei null liegen).[13,36]

6.2 Hauptkomponentenanalyse

6.2.2 Extraktion der Faktoren (Komponenten)

Um die den Variablen zugrunde liegenden Faktoren konkret zu bestimmen, müssen lineare

Kombinationen der Variablen gebildet und das Ergebnis der Faktorenextraktion mit geeigneten

Maßen beurteilt werden.

Durchführung:

Die erste Hauptkomponente wird so bestimmt, dass sie einen möglichst großen Teil der Gesamt-

streuung aller beobachteten Variablen im statistischen Sinne erklärt. Der zweite Komponente

wird anschließend so ermittelt, dass sie sich zur ersten orthogonal verhält (mit dieser also unkor-

reliert ist) und einen möglichst großen Teil der verbleibenden Streuung erklärt. Auf diese Weise

lassen sich immer weitere Komponenten bestimmen, bis im Extremfall so viele Komponenten

ermittelt wurden, wie Ausgangsvariablen im Faktorenmodell enthalten sind.[36]

Im Einzelnen werden zur gegebenen Korrelationsmatrix die sog. Eigenwerte und die dazugehö-

rigen Eigenvektoren bestimmt. Der Eigenwert einer Komponente zeigt an, welcher Betrag der

Gesamtstreuung aller beobachteten Variablen durch diese erklärt wird. Mit dem Eigenwert-Eins-

Kriterium nach Kaiser oder dem Scree-Test nach Cattell wird die signifikante Komponentenzahl

bestimmt. Üblicherweise werden so viele Komponenten „extrahiert“ wie Eigenwerte mit einem

Wert >1 vorliegen. Die zu diesen Eigenwerten gehörenden Eigenvektoren bilden die Komponen-

ten, die Elemente der Eigenvektoren nennt man die Faktorladungen. Diese können als Korrelati-

onskoeffizienten zwischen den betreffenden Variablen und den Komponenten verstanden wer-

den. Ebenfalls eine große Bedeutung für die Beurteilung der Faktorenextraktion hat die sog.

Kommunalität. Sie gibt - anders als der Eigenwert - an, welcher Teil der Streuung einer Variab-

len durch alle Komponenten erklärt wird.[13,36,37,121,129]

Ergebnis:

Tabelle 40: Eigenwerte und prozentueller Beitrag der Komponenten zur Erklärung der Gesamtva-

rianz

Komponente Eigenwerte % der erklärten Varianz Kumulierte Varianz-%

1 5,100 (4,208)* 63,745 (52,595)* 63,745 (52,595)*

2 2,427 (3,319)* 30,338 (41,489)* 94,084 (94,084)*

3 0,304 3,800 97,884

4 0,094 1,173 99,057

5 0,032 0,399 99,456

6 0,018 0,231 99,687

7 0,015 0,191 99,878

8 0,010 0,122 100,000

* Werte in Klammern ergeben sich mit der Varimax-Rotation.

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

Tabelle 41: Anfängliche und mit zwei Faktoren extrahierte Kommunalitäten

Kommunalitäten Anfänglich Extraktion

δ13CPDB Pistazie 1,000 0,924

δ13CPDB Rückstand 1,000 0,935

δ13CPDB Pistazienöl 1,000 0,967

δ15NAir Pistazie 1,000 0,930

δ15NAir Rückstand 1,000 0,926

δ18OVSMOW Pistazie 1,000 0,941

δ18OVSMOW Rückstand 1,000 0,950

δ18OVSMOW Pistazienöl 1,000 0,953

Tabelle 40 ist zu entnehmen, dass die erste Hauptkomponente schon über 60 % der Gesamtstreu-

ung der Variablen erklärt, die zweite steuert ca. 30 % bei und die dritte nur noch knapp 4 %. Da-

nach nimmt der Erklärungsbeitrag aller weiteren Komponenten rapide ab. Damit wird die Aus-

wahl der Faktorenzahl für die weiteren Schritte der Hauptkomponentenanalyse recht einfach: Da

Komponente 1 und 2 zusammen schon fast die gesamte Erklärung der Varianz (>90 %) liefern,

ist die Einbeziehung aller übrigen, weniger aussagekräftigen Faktoren nicht mehr nötig. Richtet

man sich nach dem Kaiser-Kriterium, sollten diejenigen Komponenten ins Modell aufgenommen

werden, die einen Eigenwert >1 haben. Dies sind in diesem Fall auch nur die ersten beiden

Komponenten, alle anderen haben Werte nahe Null.

Tabelle 41 enthält die Werte der Kommunalitäten. Sie gibt in der Spalte Anfänglich die Kommu-

nalitäten an, die sich ergeben, solange im ersten Schritt der Faktorextraktion insgesamt acht Fak-

toren (alle Stabilisotopenvariablen) unterschieden werden. Die Spalte Extraktion gibt nun die

Kommunalitäten für die abschließende Lösung der Faktorextraktion wieder. Sie sind kleiner als

Eins, da nur noch zwei Faktoren im Faktormodell verwendet werden, die nur einen Teil der

Streuung jeder Variablen erklären können.[36] Die Werte der Kommunalitäten liegen jedoch

trotzdem noch für alle Variablen nahe Eins. Dies bedeutet, dass durch die beiden ersten Haupt-

komponenten (Faktoren) fast die gesamte Streuung jeder einzelnen Variablen erklärt wird. Damit

hat sich die vorangegangene Auswahl von nur zwei Faktoren für die weitere Hauptkomponen-

tenanalyse als ausreichend für den Erklärungsgehalt erwiesen.

6.2 Hauptkomponentenanalyse

6.2.3 Faktorinterpretation / Rotation

Es soll nun versucht werden, die Faktoren mit Hilfe der Faktorladungen zu interpretieren.

Durchführung:

Die Faktorladung ist ein Maß für den Zusammenhang zwischen Variablen und Faktor und ist

somit ein Korrelationskoeffizient.[13] Große Faktorladungen zeigen daher eine große Bedeutung

eines Faktors für die entsprechende Variable an, kleine dagegen eine geringe. Ein Faktor ist dann

leicht zu interpretieren, wenn einige Variablen hoch auf ihn laden (Werte > |0,5|) und gleichzei-

tig die Landungen der anderen Variablen auf diesen Faktor gering sind.[36]

Ergebnis:

Tabelle 42: Komponentenmatrix

Faktor 1 Faktor 2

δ18O Pistazienöl 0,972

δ18O Pistazie 0,953

δ18O Rückstand 0,947

δ15N Pistazie 0,730 -0,629

δ15N Rückstand 0,724 -0,633

δ13C Pistazienöl 0,642 0,746

δ13C Rückstand 0,668 0,699

δ13C Pistazie 0,660 0,699

Werte <0,5 sind nicht aufgeführt.

Tabelle 43: Rotierte Komponentenmatrix

Varimax-Rotation Faktor 1 Faktor 2

δ15N Pistazie 0,960

δ15N Rückstand 0,957

δ18O Rückstand 0,907

δ18O Pistazie 0,884

δ18O Pistazienöl 0,848

δ13C Pistazienöl 0,979

δ13C Rückstand 0,957

δ13C Pistazie 0,952

Werte <0,5 sind nicht aufgeführt.

In Tabelle 42 sind die nach Größe sortierten Werte der Komponentenmatrix wiedergegeben und

es ist deutlich zu erkennen, dass alleinig das Sauerstoffverhältnis auf den ersten Faktor hoch lädt.

Die Stickstoff- und Kohlenstoffvariablen erweisen sich dagegen als heterogen, denn sie laden

jeweils auf beiden Faktoren ungefähr gleich hoch. Somit ist eine Interpretation der Faktoren erst

einmal nicht möglich.

Wird die Komponentenladungsmatrix allerdings durch orthogonale Drehung transformiert

(Varimax-Verfahren), ergibt sich eine neue Komponentenmatrix wie sie in Tabelle 43 dargestellt

ist. Durch die Rotation werden auch die Eigenwerte und der prozentuelle Beitrag der Komponen-

ten zur Erklärung der Gesamtvarianz beeinflusst (s. Werte in Klammern in Tabelle 40). Die Fak-

toren in der rotierten Form weisen eine viel klarere Beziehung zu den einzelnen Variablen auf.

Es ist nun deutlich zu erkennen, dass Komponente 1 vornehmlich von den Stickstoff- und Sauer-

stoffvariablen beschrieben wird, während auf Komponente 2 nur die Variablen der Kohlenstoff-

isotope laden.

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

6.2.4 Grafische Darstellung der Faktorwerte

Durchführung:

Die Schätzung der Faktorwerte erfolgte auf Basis einer multiplen Regressionsrechnung. Dies

führt zu standardisierten Faktorwerten mit einem Mittelwert von Null und einer Standardabwei-

chung von Eins, die bei zwei Komponenten, wie in diesem Fall, in einem Streudiagramm gra-

fisch dargestellt werden können. Für die inhaltliche Interpretation der Komponentenwerte ist

jedoch zu beachten, dass die Komponenten unter Verwendung aller Faktorladungen aus der ro-

tierten Komponentenmatrix berechnet werden; in Tabelle 43 wurden nur die Ladungen >0,5 auf-

geführt. Auch kleine Faktorladungen haben einen gewissen Einfluss auf die Größe der Faktor-

werte.

Ergebnis:

-2,5

-1,5

-0,5

0,5

1,5

-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5

Hauptkomponente 1 (53% Varianz = δ18O + δ15N)

Hauptkomponente 2 (41% Varianz = 013C)

Abbildung 45: Grafische Darstellung der Varimax-rotierten Faktorwerte aus der Hauptkomponen-

tenanalyse mit dem authentischen Pistaziendatensatz

Die grafische Darstellung der Faktorwerte in Abbildung 45 zeigt deutlich, dass sich der Daten-

satz der authentischen Pistazienmesswerte in drei separate Punktwolken gruppiert. Durch die

unterschiedliche Farbgebung der drei untersuchten Länder zeigt sich weiterhin, dass sich der

Datensatz auch genau in diese aufteilt. Somit ist die Trennfähigkeit der verwendeten Variablen,

d.h. der Stabilisotopenverhältnisse von Kohlenstoff, Stickstoff und Sauerstoff, in die drei Haupt-

anbaugebiete der Pistazien bewiesen. Dabei ist die Hauptkomponente 1 (δ18O- und δ15N-

6.2 Hauptkomponentenanalyse

Variablen) nur für die vollständige Abtrennung der iranischen Proben von denen der beiden an-

deren Ländern verantwortlich und erst durch die Hauptkomponente 2 (δ13C-Variablen) wird die

vollständige Trennung zwischen den amerikanischen und türkischen Pistazien erreicht.

Diese Aufteilung der Trennrichtungen zwischen den Elementen ist mit Hilfe der Box-Plot- und

Streudiagramm-Darstellungen zu erklären. In Kapitel 5.2 und 6.1 wurde bereits dargelegt, dass

das Sauerstoffisotop schon univariat die vollständige Trennung zwischen den beiden Pistazien-

hauptanbauländern leistet, während sich die türkischen Werte genau dazwischen anordnen. Uni-

variat wurde ebenfalls erkannt, dass das Stickstoffisotop eine fast vollständige Trennung der ira-

nischen und amerikanischen Proben schafft, sich aber türkische und amerikanische Proben in

diesem Element überschneiden. Aus diesem Grund sind die Sauerstoff- und Stickstoffvariablen

in der ersten Hauptkomponente gebündelt und dienen zur Abtrennung der iranischen Pistazien

von denen aus den USA und der Türkei.

Die vollständige Abtrennung der türkischen Messwerte von den amerikanischen wird erst durch

die Hauptkomponente 2 (y-Richtung) erreicht, deren Trennkraft hauptsächlich auf dem Kohlen-

stoffisotop beruht. Es fließen hier allerdings noch geringfügig die guten Trenneigenschaften des

Sauerstoffs mit ein. Die rotierten Faktoren der Sauerstoffisotopen-Variablen der zweiten Haupt-

komponente wurden in Tabelle 43 zwar nicht aufgeführt, weil die <0,5 und daher nicht als „hoch

ladend“ zu bezeichnen sind, doch liegen sie immerhin zwischen 0,3 und 0,5 und gehen somit

nicht unerheblich in die Berechnung der Faktorwerte mit ein. Aufgrund dessen ist auch die

Punktwolke der iranischen Messwerte ein wenig in y-Richtung verschoben. Die in Tabelle 43

nicht aufgeführten rotierten Faktoren für die Stickstoffisotopen-Variablen liegen dagegen unter

0,1, d.h. sie tragen nur sehr geringfügig zur Hauptkomponente 2 und damit zur Trennung der

USA-Proben von denen der Türkei bei.

Beim Vergleich der grafischen Darstellung der Ergebnisse der Hauptkomponentenanalyse mit

den einfachen x-y-Streudiagrammen der einzelnen Stabilisotopenvariablen aus Kapitel 6.1

(s. Abbildung 41-43) ist eine erhebliche Verbesserung in der Ländertrennung zu erkennen. Die

iranischen Proben sind deutlich von denen der beiden anderen Länder abgetrennt, was jedoch

schon teilweise mit den einfachen Streudiagrammen erreicht wurde. Durch die Hauptkomponen-

tenanalyse ist es nun aber gelungen, auch die türkischen Pistazien vollständig von den amerika-

nischen zu trennen. Hiermit ist auch eine erhebliche Verbesserung gegenüber den Ergebnissen

von Anderson et al.[7] (s. Kapitel 6.1, Abbildung 44) erreicht worden, die keine multivariate Da-

tenauswertung angewendet haben, sondern mit der alleinigen Abtrennung der amerikanischen

Proben von denen des Irans und der Türkei zufrieden waren.

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

100

6.3 Diskriminanzanalyse

Die im vorangegangenen Kapitel 6.2 durchgeführte Hauptkomponentenanalyse hat gezeigt, dass

die gemessenen Stabilisotopenverhältnisse grundsätzlich eine gute Trennkraft bezüglich der Pis-

tazienherkunftsländer besitzen. Der authentische Datensatz wurde grafisch in drei separate

Punktwolken aufgeteilt, die auch genau den drei Ländern Iran, USA und Türkei entsprechen.

Eine Diskriminanzanalyse wird nun durchgeführt, um über die vollständige Trennung des Daten-

satzes ein Klassifizierungsmodell zu erstellen, denn nur so können neue, unbekannte Proben ei-

nem Land zugeordnet werden.

6.3.1 Schrittweise Diskriminanzanalyse

Durchführung:

Bei der schrittweisen Diskriminanzanalyse werden die Variablen solange einzeln nacheinander

in das Modell einbezogen, bis von den noch nicht aufgenommenen kein signifikanter Erklä-

rungsbeitrag mehr zu erwarten ist. Das Selektionskriterium hierbei ist das Wilks´Lambda Güte-

maß, und zwar wird diejenige Variable zuerst in das Modell aufgenommen, für die sich der

kleinste Wilks´Lambda Wert ergibt. Nach der Aufnahme der zweiten Variable wird die erste

erneut daraufhin überprüft, ob sie auch noch in Kombination mit der zweiten Variable einen ge-

nügend großen Erklärungswert (Signifikanztest über partiellen F-Wert) für die Diskriminanz-

funktion liefert. Anschließend folgen analog weitere Schritte, bis keine der noch nicht aufge-

nommenen Variablen das Aufnahmekriterium mehr erfüllt. Als Signifikanzgrenzwert (minimaler

partieller F-Wert) für die Aufnahme einer Variablen in das Modell wird der in SPSS 12.0 vor-

eingestellte Wert 3,84 genommen, der Grenzwert (maximaler partieller F-Wert) für den erneuten

Ausschluss einer schon ins Modell aufgenommenen Variable ist 2,71.

Neben dem F-Wert und Wilks´Lambda wird auch die Toleranz als Kriterium für die Aufnahme

oder den Ausschluss einer Variablen in der schrittweisen Diskriminanzanalyse verwendet. Sie ist

ein Maß dafür, wie stark die unabhängigen Variablen untereinander korreliert sind und ist defi-

niert als 1-ς², wobei ς² der quadrierte multiple Korrelationskoeffizient zwischen der jeweils be-

trachteten Variablen und der Gesamtheit der anderen bereits im Modell aufgenommenen Variab-

len ist. Liegt eine starke Korrelation vor, ergibt sich ein hohes ς² und damit ein niedriger Tole-

ranzwert. Per Voreinstellung von SPSS 12.0 werden Variablen dann nicht in das Modell aufge-

nommen, wenn ihr Toleranzwert unter 0,001 liegt bzw. diese das Toleranzniveau einer bereits im

Modell enthaltenen Variable auf einen Werte unter 0,001 verringern würden.

6.3 Diskriminanzanalyse

101

Ergebnis 1:

Tabelle 44: Ergebnis der schrittweisen Diskriminanzanalyse mit allen Variablen des authentischen

Datensatzes der Pistazien

Schritt aufgenommeneVariable Toleranz F-Wert

für Ausschluss Wilks´ Lambda

1 δ18O Öl 1,000 815,904

2 δ18O Öl 0,999 561,817 0,266

δ13C Öl 0,999 71,930 0,051

3 δ18O Öl 0,449 15,169 0,019

δ13C Öl 0,984 36,687 0,026

δ18O Rückstand 0,448 15,784 0,019

4 δ18O Öl 0,439 15,977 0,016

δ13C Öl 0,952 20,911 0,018

δ18O Rückstand 0,446 11,578 0,015

δ15N Rückstand 0,895 6,853 0,014

5 δ18O Öl 0,292 18,134 0,016

δ13C Öl 0,951 19,235 0,016

δ18O Rückstand 0,395 6,014 0,012

δ15N Rückstand 0,883 7,403 0,013

δ18O Pistazie 0,312 3,944 0,012

Die schrittweise Diskriminanzanalyse hat aus den acht gemessenen unabhängigen Variablen fünf

in das Modell aufgenommen (s. Tabelle 44). Darunter sind alle drei Variablen des Sauerstoff-

Isotopenverhältnisses, von denen aus der Korrelationsanalyse (s. Kapitel 5.3.5) schon bekannt

ist, dass sie hoch miteinander korrelieren. Eine Grundvoraussetzung für ein aussagekräftiges

Diskriminanzmodell ist jedoch, dass die verwendeten Variablen unkorreliert sind. Daher dürfen

nicht alle drei Sauerstoffisotopenvariablen gleichzeitig in das Diskriminanzmodell aufgenommen

werden. Ihre Korrelation ist auch an den Toleranzwerten zu erkennen: Sobald die zweite Variab-

le des Sauerstoffs ins Modell aufgenommen wird (3. Schritt), sinken beide Toleranzwerte der

Sauerstoffvariablen stark ab, mit Aufnahme der dritten (5. Schritt) sogar auf <0,4. Die schritt-

weise Diskriminanzanalyse wurde daher nochmals durchgeführt, und zwar ohne die Variablen

„δ18O Rückstand“ und „δ18O Pistazie“. Die Variable “δ18O Öl“ wurde im Datensatz belassen, da

diese von der Diskriminanzanalyse als erstes ausgewählt wurde und somit die aussagekräftigste

ist.

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

102

Ergebnis 2:

Tabelle 45: Ergebnis der schrittweisen Diskriminanzanalyse mit sechs Variablen

Schritt aufgenommene Variable Toleranz F-Wert

für Ausschluss Wilks´ Lambda

1 δ18O Öl 1,000 815,904

2 δ18O Öl 0,999 561,817 0,266

δ13C Öl 0,999 71,930 0,051

3 δ18O Öl 0,915 148,911 0,067

δ13C Öl 0,971 28,833 0,025

δ15N Rückstand 0,896 11,639 0,019

Mit der zweiten schrittweisen Diskriminanzanalyse wurden neben der „δ18O Öl“-Variable nur

noch zwei weitere ausgewählt (s. Tabelle 45), und zwar genau die beiden, die auch schon in dem

ersten Versuch (s. Tabelle 44) als modellrelevant angezeigt wurden: „δ13C Öl“ und „δ15N Rück-

stand“. Die Auswahl gerade dieser Element-Fraktion-Kombinationen vom System ist leicht er-

klärlich, denn bei der Diskriminanzanalyse kommt es neben einer großen Streuung zwischen den

Gruppenmittelpunkten vor allem darauf an, dass die Streuung innerhalb der Gruppen möglichst

klein ist, d.h. die Gruppen homogen sind. Die geringste Streuung innerhalb der Gruppen ist bei

den Ölen zu finden, da sie flüssig und damit viel homogener als die Feststofffraktionen sind.

Die Stickstoffvariable wurde von der schrittweisen Diskriminanzanalyse als letztes ausgewählt.

Bei der Betrachtung der Box-Plots (s. Abb. 39 in Kap. 5.2) und den Streudiagrammdarstellungen

(s. Abb. 41 und 42 in Kap. 6.1) wurde schon erkannt, dass dieses Element die schwächste Trenn-

kraft hinsichtlich der Pistazienherkunft hat. Es wird daher vermutet, dass das 15N/14N-Verhältnis

nur sehr wenig zur Trennung beitragen wird und ggf. auch weggelassen werden kann. Das Dis-

kriminanzmodell wird daher einmal mit allen drei Variablen, die die schrittweise Diskriminan-

zanalyse als optimale Lösung ausgegeben hat, und als zweites nur mit den beiden ersten Variab-

len („δ18O Öl“ und „δ13C Öl“) erstellt.

6.3 Diskriminanzanalyse

103

6.3.2 Erstellung des Diskriminanzmodells

6.3.2.1 Schätzung der Koeffizienten der Diskriminanzfunktionen

Das Ziel der Diskriminanzanalyse besteht in der Schätzung der Koeffizienten für die Diskrimi-

nanzfunktionen, mit Hilfe derer die untersuchten Gruppen möglichst optimal/vollständig ge-

trennt werden. Im vorliegenden Fall sind zwei Diskriminanzfunktionen zu schätzen, da drei

Gruppen/Länder getrennt werden sollen. Das Statistikprogramm SPSS 12.0 gibt auf Grundlage

der zuvor mit der schrittweisen Diskriminanzanalyse ermittelten 3-Variablenkombination („δ18O

Öl“, „δ13C Öl“ und „δ15N Rückstand“) folgende Koeffizienten für die zwei Diskriminanzfunkti-

onen aus:

d1 = 0,891 × „δ18O Öl“ + 0,564 × „δ13C Öl“ + 0,061 × „δ15N Rückstand“ - 12,585

d2 = -0,017 × „δ18O Öl“ + 1,788 × „δ13C Öl“ - 0,370 × „δ15N Rückstand“ + 53,235

Für die 2-Variablenkombination („δ18O Öl“ und „δ13C Öl“) haben die Koeffizienten der Diskri-

minanzfunktionen nachstehende Werte:

d1 = 0,917 × „δ18O Öl“ + 0,536 × „δ13C Öl“ - 14,059

d2 = -0,244 × „δ18O Öl“ + 2,374 × „δ13C Öl“ + 76,480

Um nun die Werte der Diskriminanzfunktion für die einzelnen Proben zu berechnen, sind ledig-

lich die Ausprägungen der drei erklärenden Variablen in diese Funktionen einzusetzen.

6.3.2.2 Beurteilung der Trennkraft/Güte der Diskriminanzfunktionen

Im nächsten Schritt ist die Trennkraft (Güte) der ermittelten Diskriminanzfunktionen zu beurtei-

len, wofür mehrere Maßzahlen zur Verfügung stehen.

Durchführung:

Es wird zu jeder Diskriminanzfunktion der dazugehörige Eigenwert γ (Maximalwert des Diskri-

minanzkriteriums Γ) bestimmt, der sowohl in seiner Berechnung als auch in dem zugrunde lie-

genden Konzept weitgehend dem F-Wert einer Varianzanalyse entspricht. Er ergibt sich aus dem

Quotienten der Quadratsummen zwischen den Gruppen und innerhalb der Gruppen. Er ist somit

eine Kennzahl dafür, wie „sauber“ die Diskriminanzfunktion zwischen den verschiedenen Ob-

jekten der abhängigen Variablen zu trennen in der Lage ist. Er wird der Einfachheit halber meist

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

104

normiert, so dass er Werte zwischen Null und Eins annimmt. Bei der Diskriminanzanalyse wird

ein möglichst großer Eigenwert (nahe Eins) angestrebt, denn dann ist gewährleistet, dass sich die

Funktionswerte der einzelnen Gruppen deutlich voneinander unterscheiden, während die Werte

innerhalb einer Gruppe sehr ähnlich sind.[13,36]

Das im Zusammenhang mit der Diskriminanzanalyse häufiger betrachtete Kriterium ist Wilks´

Lambda Λ, welches den Anteil der Streuung innerhalb der Gruppen an der gesamten Streuung

(Λ = Π 1/(1+γ)) kennzeichnet. Auch dieser Wert ist normiert, jedoch zeigen hier kleine Werte

(nahe Null) eine gute Trennung zwischen den Gruppen an. Wilks´ Lambda lässt sich außerdem

in ein annähernd Chi(χ)²-verteiltes Maß transformieren, so dass ein Hypothesentest durchgeführt

werden kann. Hierbei wird getestet, ob zwischen den durchschnittlichen Funktionswerten in den

einzelnen Fallgruppen kein Unterschied besteht.

Der kanonische Korrelationskoeffizient misst wiederum den Anteil der Streuung zwischen den

Gruppen und der gesamten Streuung. Die Werte des Koeffizienten liegen zwischen Null und

Eins, wobei ein hoher kanonischer Korrelationskoeffizient auf eine gute Trennung zwischen den

Gruppen und damit auf einen hohen Erklärungsgehalt des Modells hinweist.[13,36]

Ergebnis:

Tabelle 46: Maßzahlen zur Überprüfung der Modellgüte der Diskriminanzanalyse mit 3 und 2

Variablen

Funktion Eigenwert % der Varianz Kanonische Korrelation

1 19,781 (19,633) 90,1 (92,6) 0,976 (0,975)

2 2,177 (1,559) 9,9 (7,4) 0,828 (0,781)

Die in Klammern stehenden Werte sind die Ergebnisse aus der 2-Variablenkombination.

Tabelle 47: Wilks´ Lambda und χ²-Test zur Bewertung der Modellgüte

Funktionen Wilks´s Lambda χ²-Signifikanz

1 und 2 0,015 (0,019) 0,000 (0,000)

nur 2 0,315 (0,391) 0,000 (0,000)

Die in Klammern stehenden Werte sind die Ergebnisse aus der 2-Variablenkombination.

Im vorliegenden Fall sind die Eigenwerte beider Funktionen beider Variablenkombinationen als

hoch zu bezeichnen, wobei der Wert der ersten Diskriminanzfunktion wesentlich größer als der

der zweiten ist (s. Tabelle 46). Dies kommt auch in der Spalte „% der Varianz“ zum Ausdruck,

in der angegeben wird, welcher Anteil der gesamten Streuung (berechnet als Summe der Quad-

ratsummen zwischen den Gruppen) auf die einzelnen Funktionen entfällt. Die erste Funktion

leistet hier mit über 90 % fast alleinig die Trennung der Gruppen. Des Weiteren zeigen die kano-

6.3 Diskriminanzanalyse

105

nischen Korrelationskoeffizienten mit den hier errechneten Werten von >0,7 an, dass sich beide

Funktionen beider Variablenkombinationen als erklärungsrelevant für das Modell erweisen, auch

wenn die zweite Funktion nur ca. 10 % zur Trennung beiträgt.

Tabelle 47 enthält die Maßzahlen zur Beurteilung der Modellgüte. Mit einem Wilks´ Lambda

Wert von <0,02 liefert die Kombination der beiden Funktionen eine hervorragende Trenngüte,

was der Signifikanztest mit der Ablehnung der Nullhypothese bestätigt. Diese Nullhypothese

wird ebenfalls abgelehnt, wenn nur noch die zweite Funktion betrachtet wird, d.h. auch diese

Funktion trägt signifikant zur Trennung bei.

6.3.2.3 Ableitung des Erklärungsbeitrags der einzelnen Variablen

Nachdem alle betrachteten Kennzahlen eine sehr gute Modellgüte sowohl für die 3- als auch für

die 2-Variablenkombination anzeigen, ist es als nächstes interessant, den Erklärungsbeitrag der

einzelnen Variablen abzuleiten.

Durchführung:

Es wird einer Korrelationsanalyse durchgeführt, bei der jedoch die gepoolten Korrelationskoeffi-

zienten zwischen den einzelnen unabhängigen Variablen und den Diskriminanzfunktionen be-

rechnet werden. Hierbei ergeben sich Koeffizienten für die gesamten Variablen, deren Werte

zwischen Null und Eins liegen und die aus allen Fällen des verwendeten Datensatzes gleichzeitig

und gleichberechtigt berechnet werden („Struktur-Matrix“). Für die Rückschlüsse von den Bei-

trägen der Koeffizienten auf den Erklärungsgehalt der Variablen gibt es jedoch Einschränkun-

gen: Sobald Korrelationen zwischen den Variablen vorliegen könnten die Koeffizienten verzerrt

sein und derartige Rückschlüsse sind dann nicht mehr uneingeschränkt möglich.[36]

Ergebnis:

Tabelle 48: Struktur-Matrix der

3-Variablenkombination

Funktion 1 Funktion 2

δ18O Öl 0,973 -0,137

δ13C Öl 0,252 0,831

δ15N Rückstand 0,299 -0,691

Tabelle 49: Struktur-Matrix der

2-Variablenkombination

Funktion 1 Funktion 2

δ18O Öl 0,975 -0,220

δ13C Öl 0,257 0,966

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

106

Die Korrelationsmatrix der gepoolten Koeffizienten der 3-Variablenkombination (s. Tabelle 48)

gibt ein recht eindeutiges Bild über den jeweiligen Erklärungsbeitrag der drei Variablen zu den

beiden Funktionen aus: Das Sauerstoffisotop des Öls korreliert sehr hoch (>0,9) mit der Diskri-

minanzfunktion 1, während die beiden anderen Variablen mit Werten <0,3 kaum einen Erklä-

rungsbeitrag zu dieser Funktion leisten. Das Kohlenstoff- und Stickstoffisotop korrelieren dafür

mit der 2. Diskriminanzfunktion sehr stark (>|0,7|) und erklären dort gemeinsam die Trenneigen-

schaften. Dafür leistet hier die Sauerstoffvariable praktisch keinen Beitrag. Anders als bei der

Hauptkomponentenanalyse lädt das Stickstoffisotop hier auf der 2. Diskriminanzfunktion, zu-

sammen mit dem Kohlenstoff. Dies ist jedoch nicht verwunderlich, da der Grundgedanke zur

Bündelung von Variablen bei diesen beiden multivariaten Analysen völlig verschieden ist. Die

Hauptkomponentenanalyse sucht nach Korrelationen zwischen Variablen (daher laden Sauerstoff

und Stickstoff auf der 1. Hauptkomponente), während bei der Diskriminanzanalyse die Gruppen

vorgegeben werden und über die Streuung in und zwischen den Gruppen nach der maximalen

Trennmöglichkeit gesucht wird.

Die Struktur-Matrix der 2-Variablenkombination (s. Tabelle 49) gibt eine analoge Beziehung der

Variablen zu den Funktionen aus: Die Sauerstoffvariable korreliert sehr hoch mit der ersten

Funktion und kaum mit der zweiten, während die Kohlenstoffvariable die Trennkraft der zweite

Funktion ausmacht und kaum einen Erklärungsbeitrag zur ersten liefert.

Das Sauerstoffisotop ist somit das Element, was den größten Beitrag zur Trennung der Pistazien

nach ihrer Herkunft leistet, denn es lädt fast alleinig auf der 1. Diskriminanzfunktion (Korrelati-

onskoeffizient >0,9, s. Tab. 48 und 49), die wiederum über 90 % der Varianz erklärt (s. Kapitel

6.3.2.2, Tabelle 46).

6.3 Diskriminanzanalyse

107

6.3.3 Prüfung des Klassifizierungsmodells

Nachdem das Klassifizierungsmodell mit Hilfe des authentischen Probenmaterials erstellt wurde,

muss nun die Güte der Klassifikation überprüft werden. Dies erfolgt aufgrund der gepoolten Va-

rianzen innerhalb der Gruppen und das Statistik-Programm SPSS 12.0 berechnet die Sicherheit

optional nach drei verschiedenen Methoden:[36]

1. Resubstitutionsmethode (R-Methode),

2. Leaving-one-out-Methode (L-Methode),

3. Hold-out-Methode (H-Methode).

Durchführung:

Die einfachste und am weitesten verbreitete Prozedur zur Prüfung der Klassifikationsgüte eines

Diskriminanzmodells ist die Resubstitutionsmethode, bei der es sich um bloßes Wiedereinsetzen

aller Lernobjekte selbst in das Klassifikationsmodell handelt. Da so die Fehlerrate auf Basis der-

selben Stichprobe berechnet wird, die auch für die Schätzung der Diskriminanzfunktion verwen-

det wurde (und diese so ermittelt wurde, dass die Fehlerrate in der verwendeten Stichprobe mi-

nimal wird), führt dies zwangsläufig zu einer Unterschätzung der Fehlerrate, vor allem bei klei-

nen Stichprobenumfängen.[13,56,129]

Die Leaving-one-out-Methode liefert dagegen einen im Mittel richtigen Schätzwert, denn hier

werden Lernobjekte getestet, die selbst nicht in das Klassifizierungsmodell eingegangen sind.

Dazu wird jedes der n Lernobjekte der Reihe nach genau einmal vom Datensatz isoliert. Die

Klassifikationsregel, die dann auf das isolierte Objekt angewendet wird, ergibt sich aus den je-

weils verbleibenden n-1 Lernobjekten. Da auch das isolierte Objekt zum ursprünglichen Lernda-

tensatz gehörte, ist seine Herkunft bekannt, und es können sukzessiv die Fehlentscheidungen

ausgezählt werden. Dadurch ergibt sich eine realistische und im Allgemeinen höhere Fehlerrate

als bei der R-Methode. Die R-Methode dient häufig nur dazu, die Verlässlichkeit der L-Methode

zu überprüfen. Sind beide Schätzwerte gleich, so deutet dies darauf hin, dass der gewählte Stich-

probenumfang groß genug für ein verlässliches Klassifikationsmodell und die Angabe einer Feh-

lerrate ist. Klaffen die beiden Schätzungen weit auseinander, deutet dies auf das Gegenteil hin:

der Stichprobenumfang ist zu klein.[56,129]

Bei der Hold-out-Methode wird der Datensatz in zwei Teile untergliedert, wobei der eine Teil als

Lernstichprobe zur Schätzung der Diskriminanzfunktionen dient, während der andere als Kon-

trollstichprobe zur Schätzung der Fehlerrate fungiert (prozentuale Unterteilung Lernstichpro-

be/Kontrollstichprobe: 50/50 oder 70/30). Die H-Methode ist nur dann zweckmäßig, wenn eine

hinreichend große Stichprobe zur Verfügung steht, da mit abnehmender Größe der Lernstichpro-

be die Zuverlässigkeit der geschätzten Diskriminanzkoeffizienten abnimmt.[13,129]

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

108

Ergebnis:

Tabelle 50: Klassifikationsmatrix mit den Ergebnissen der 3- und 2-Variablenkombination nach

der R-, L- und H-Methode

Vorhergesagte Gruppenzugehörigkeit

Prüfmethode Gruppe Iran USA Türkei Gesamt Fälle

R-Methode Iran 100 %

0 % 0 % 100 % 32

USA 0 % 100 % 0 % 100 % 33

Türkei 0 % 0 % 100 % 100 % 25

L-Methode Iran 100 %

0 % 0 % 100 % 32

USA 0 % 100 % 0 % 100 % 33

Türkei 0 % 0 % 100 % 100 % 25

H-Methode* Iran 100 %

0 % 0 % 100 % 16

USA 0 % 100 % 0 % 100 % 16

Türkei 0 % 0 % 100 % 100 % 12

* Für die Berechnung der H-Methode wurden die Gruppen per Zufallsgenerator in jeweils 50 % Lern-

und 50 % Kontrollstichprobe unterteilt.

Tabelle 50 zeigt die Klassifikationsmatrix mit dem Berechnungsergebnis der Fehlerraten nach

der R-, L- und H-Methode. Die 3- und 2-Variablenkombination liefern hierbei exakt die gleichen

Werte, daher ist nur eine Tabelle dargestellt. Das Ergebnis aller drei Methoden ist sehr eindeutig:

Alle authentischen Proben werden in ihre vorgegebene Gruppe richtig eingeordnet, was durch

die relative Häufigkeit von 100 % zum Ausdruck gebracht wird. Damit ist dieses Klassifizie-

rungsmodell hervorragend dazu geeignet, Pistazien unbekannter Herkunft den Ländern Iran,

USA oder Türkei zuzuordnen oder deren Etikettierung zu überprüfen.

6.3 Diskriminanzanalyse

109

6.3.4 Klassifizierungsfunktionen nach Fisher

Die Klassifizierung von Merkmalselementen kann auch über Fishers lineare Klassifizierungs-

funktionen erfolgen. Die Berechnung der Funktionen erfolgt zunächst mit SPSS 12.0, aber da-

nach kann die Gruppenzugehörigkeit einer unbekannten Probe ohne das kanonische Diskrimi-

nanzmodell bzw. ohne die Zuhilfenahme einer Statistik-Software ermittelt werden. Die

δ-Messwerte einer Probe werden einfach direkt in die Funktionen eingesetzt (z.B. unter Zuhilfe-

nahme eines Taschenrechners) und derjenigen Gruppe zugeordnet, für die der Funktionswert F

maximal wird.

Durchführung:

Nach Fisher wird für jedes der drei hier untersuchten Länder eine lineare Klassifizierungsfunkti-

on erstellt. Vorraussetzung für die Anwendbarkeit der Fisher´schen Klassifizierungsfunktionen

ist jedoch die Annahme gleicher Kovarianzmatrizen in den Gruppen (Box-M-Signifikanztest).

Zur Überprüfung der Güte des Klassifikationsmodells kann hier die R- und H-Methode einge-

setzt werden.

Ergebnis:

3-Variablenkombination:

FIran = 41,556 ×„δ18O Öl“ - 182,362 ×„δ13C Öl“ - 13,451 ×„δ15N Rückstand“ - 3359,922

FUSA = 32,395 ×„δ18O Öl“ - 187,859 ×„δ13C Öl“ - 14,142 ×„δ15N Rückstand“ - 3222,118

FTürkei = 37,272 ×„δ18O Öl“ - 179,101 ×„δ13C Öl“ - 14,969 ×„δ15N Rückstand“ - 3112,862

2-Variablenkombination:

FIran = 36,360 × „δ18O Öl“ - 173,343 × „δ13C Öl“ - 3173,467

FUSA = 26,932 × „δ18O Öl“ - 178,376 × „δ13C Öl“ - 3016,012

FTürkei = 31,490 × „δ18O Öl“ - 169,065 × „δ13C Öl“ - 2881,964

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

110

Tabelle 51: Fisher-Klassifikationsmatrix mit den Ergebnissen der 3- und 2-Variablenkombination

nach der R- und H-Methode

Vorhergesagte Gruppenzugehörigkeit

Prüfmethode Gruppe Iran USA Türkei Gesamt Fälle

R-Methode Iran 100 % 0 % 0 % 100 % 32

USA 0 % 100 % 0 % 100 % 33

Türkei 0 % 0 % 100 % 100 % 25

H-Methode* Iran 100 % 0 % 0 % 100 % 16

USA 0 % 100 % 0 % 100 % 16

Türkei 0 % 0 % 100 % 100 % 12

* Für die Berechnung der H-Methode wurden die Gruppen per Zufallsgenerator in jeweils 50 % Lern-

und 50 % Kontrollstichprobe unterteilt.

Nach dem Box-M-Signifikanztest (Ergebnisse nicht dargestellt) liegen keine gleichen Kovari-

anzmatrizen in den Gruppen des authentischen Pistaziendatensatzes vor und die linearen Klassi-

fizierungsfunktionen nach Fisher dürften nicht angewandt werden. Tabelle 51, die die Werte der

Fehlerrate zur Prüfung der Modellgüte nach der R- und H-Methode enthält, zeigt allerdings das

gleiche Ergebnis wie es mit den kanonischen Diskriminanzfunktionen (s. vorheriges Kap. 6.3.3)

erreicht wurde: Alle Proben beider Variablenkombinationen werden durch die Fisher´schen

Klassifizierungsfunktionen in ihre vorgegebene Gruppe richtig eingeordnet. Aus diesem eindeu-

tigen Ergebnis kann abgeleitet werden, dass die Fisher’schen Klassifizierungsfunktionen trotz

fehlender Voraussetzung hier anwendbar sind und als Alternative zum kanonischen Diskrimi-

nanzmodell zur „schnellen“ Bestimmung der Herkunft einer Pistazienprobe genutzt werden

kann.

6.3 Diskriminanzanalyse

111

6.3.5 Grafische Darstellung der Funktionswerte

Bei einer Diskriminanzanalyse mit nur zwei Diskriminanzfunktionen kann die Lage der Funkti-

onswerte sehr einfach grafisch in einem x-y-Streudiagramm dargestellt und dadurch die Trenn-

güte des Modells visualisiert werden.

Durchführung:

Es werden für sämtliche Fälle des authentischen Datensatzes mit Hilfe der beiden kanonischen

Diskriminanzfunktionen die Funktionswerte errechnet und in ein Streudiagramm eingetragen. Im

Falle der 2-Variablenkombination können zusätzlich mit den Fisher’schen Klassifizierungsfunk-

tionen auch die Trenngraden (Grenzen zwischen den Gruppen/Punktwolken) berechnet und gra-

fisch im Streudiagramm dargestellt werden.

Ergebnis:

-4

-2

-8 -4 0 4 8

1. kanonische Diskriminanzfunktion (90 % Varianz = δ

O Öl)

Gruppenzentroide

2. kanonische Diskriminanzfunktion

(10 % Varianz = δ

C Öl + δ

N Rückstand)

Abbildung 46: Grafische Darstellung der Funktionswerte aus der Diskriminanzanalyse mit 3 Vari-

ablen

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

112

-5

-3

-1

-8 -4 0 4 8

1. kanonische Diskriminanzfunktion (93 % Varianz = δ18O Öl)

Gruppenzentroide

2. kanonische Diskriminanzfunktion

(7 % Varianz = δ13C Öl)

Abbildung 47: Grafische Darstellung der Funktionswerte und Trenngeraden aus der Diskriminan-

zanalyse mit 2 Variablen

Die grafische Darstellung der Funktionswerte (s. Abbildung 46 und 47) verdeutlicht sehr klar die

hervorragende Trennleistung der beiden Klassifizierungsmodelle (3- und 2-Variablen-

kombination). Die Pistazienproben der Länder Iran, USA und Türkei bilden drei separate

Punktwolken, zwischen denen ein deutlicher Zwischenraum liegt.

Durch die grafische Darstellung wird nun auch ein kleiner Unterschied zwischen dem 3- und 2-

Variablen-Diskriminanzmodell erkennbar: Die Punktwolken der 2-Variablenkombination sind

etwas größer, d.h. sie streuen mehr, und die Punktwolke der türkischen Proben liegt etwas tiefer,

so dass der Abstand zwischen den Werten der türkischen und iranischen Pistazien etwas kleiner

ist als bei der 3-Variablenkombination. Hier wird der Informationsverlust durch die Herausnah-

me der Variable „δ15N Rückstand“ aus dem Diskriminanzmodell deutlich. Da jedoch beide Mo-

delle den authentischen Datensatz vollständig zu trennen vermögen, ist die Kombination aus nur

zwei Variablen als gleichwertig anzusehen. Zudem würde durch Verzicht der Vermessung des

Stickstoff-Isotopenverhältnisses Geld und Analysenzeit gespart werden.

In dem vorherigen Kapitel 6.3.2.3 wurde festgestellt, dass hinter der 1. kanonischen Diskrimi-

nanzfunktion bei beiden Variablenkombinationen vor allem das Sauerstoffisotop steht. In der

grafischen Darstellung der Funktionswerte (s. Abbildung 46 und 47) wird nun deutlich, dass die

1. kanonische Diskriminanzfunktion allein für die Trennung der beiden Pistazienhauptanbauge-

biete Iran und USA verantwortlich ist. Die große Trennkraft des Sauerstoffisotops, welche schon

6.3 Diskriminanzanalyse

113

bei der Betrachtung der Sauerstoffisotopen-Box-Plots (s. Kapitel 5.2) und den einfachen Streu-

diagrammen (s. Kapitel 6.1) auffiel, wird natürlich auch in der Diskriminanzanalyse ausgenutzt.

Die Gründe dafür liegen in der geografische Lage dieser beiden Länder und dem globalen Was-

serkreislauf. Dies wird näher in der Ergebnisdiskussion (s. Kapitel 7) ausgeführt.

Die δ-Messwerte der türkischen Pistazien liegen auch bei der Diskriminanzanalyse wieder genau

zwischen denen der USA und dem Iran. Jedoch wird die Punktwolke, die die Türkei repräsen-

tiert, durch die 2. kanonische Diskriminanzfunktion auf der y-Achse nach oben verschoben, so

dass sie wesentlich deutlicher von den beiden anderen Ländern abgetrennt wird als mit der

Hauptkomponentenanalyse (vgl. Abb. 46 und 47 mit Abb. 45 in Kap. 6.2.4).

Dies wird hauptsächlich durch das Kohlenstoffisotopenverhältnis bewirkt, welches tendenziell,

aber nicht vollständig, die drei Länder zu trennen vermag (s. Abb. 38 in Kap. 5.2).

An dieser Stelle sollte noch einmal erwähnt werden, dass wenn nur zwischen amerikanischen

und iranischen Pistazien unterschieden werden soll, schon eine univariate Betrachtung des Sau-

erstoff-Isotopenverhältnisses ausreichend ist. Die Betrachtung der Sauerstoffisotopenwerte in

den Box-Plots (s. Kapitel 5.2) hat sehr deutlich gezeigt, dass diese zwischen dem Iran und der

USA so stark verschieden sind, dass eine multivariate Datenanalyse zur Authentifizierung nicht

mehr nötig ist.

6.3.6 Diskriminanzanalyse mit den Isotopenvariablen der Pistazien-

Gesamtnuss

Mit Hilfe der schrittweisen Diskriminanzanalyse wurden aus den acht vorhandenen Variablen

die drei Isotopenverhältnis-Fraktion-Kombinationen ausgewählt, die den besten Erklärungsbei-

trag (die optimale Lösung) zur Trennung der Pistazien nach ihrer Herkunft liefern. Dabei stellten

sich die extrahierten Fraktionen (Öl und entfetteter Rückstand) wegen ihrer Matrixhomogenität

als die besseren Variablen heraus. Die Gewinnung des Öls und des entfetteten Rückstands kostet

jedoch Analysenzeit und -geld. Daher wird die Diskriminanzanalyse wiederholt, um zu prüfen,

ob mit nur den drei bzw. zwei Isotopenverhältnisvariablen der reinen, gemahlenen Pistazien die

gleiche Modellgüte erreicht werden kann wie mit der optimalen Lösung aus Kapitel 6.3.2.

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

114

Durchführung:

Die Erstellung des Diskriminanzmodells, die Prüfung des Klassifizierungsmodells mit der R-, L-

und H-Methode und die Berechnung der Funktionswerte zur grafischen Darstellung werden ana-

log zu den Kapiteln 6.3.2 bis 6.3.5 durchgeführt.

Ergebnis:

Diskriminanzfunktionen der 3-Pistazienvariablenkombination:

d1 = 0,900 × „δ18O Pistazie“ + 0,421 × „δ13C Pistazie“ + 0,148 × „δ15N Pistazie“ - 17,492

d2 = 0,088 × „δ18O Pistazie“ + 1,882 × „δ13C Pistazie“ - 0,402 × „δ15N Pistazie“ + 49,372

Diskriminanzfunktionen der 2-Pistazienvariablenkombination:

d1 = 0,965 × „δ18O Pistazie“ + 0,426 × „δ13C Pistazie“ - 19,020

d2 = -0,216 × „δ18O Pistazie“ + 2,423 × „δ13C Pistazie“ + 72,601

Klassifizierungsergebnisse:

Tabelle 52: Klassifikationsmatrix aus der Diskriminanzanalyse der 3- und 2-Variablen-

kombination der Pistazien-Gesamtnuss mit den Ergebnissen nach der R-, L- und H-

Methode

Vorhergesagte Gruppenzugehörigkeit

Prüfmethode Grup-

pe Iran USA Türkei Gesamt Fälle

R-Methode Iran 100 % 0 % 0 % 100 % 32

USA

0 % 100 % 0 % 100 % 33

Türkei 0 % 0 % 100 % 100 % 25

L-Methode Iran 100 % 0 % 0 % 100 % 32

USA

0 % 100 % 0 % 100 % 33

Türkei 0 % 0 % 100 % 100 % 25

H-Methode* Iran 100 % 0 % 0 % 100 % 12

USA 0 % 100 % 0 % 100 % 13

Türkei 0 % 0 % 100 % 100 % 9

* Für die Berechnung der H-Methode wurden die Gruppen per Zufallsgenerator in jeweils 70 % Lern-

und 30 % Kontrollstichprobe unterteilt.

6.3 Diskriminanzanalyse

115

Grafische Darstellung der Funktionswerte:

-4

-3

-2

-1

-8 -4 0 4 8

1. kanonische Diskriminanzfunktion (90 % Varianz = δ

O Pistazie)

Gruppenzentroide

2. kanonische Diskriminanzfunktion

(10 % Varianz = δ

C Pistazie + δ

N Pistazie)

Abbildung 48: Grafische Darstellung der Funktionswerte aus der Diskriminanzanalyse mit den 3

Pistazien-Gesamtnussvariablen

-4

-2

-8 -4 0 4 8

1. kanonische Diskriminanzfunktion (93 % Varianz = δ

O Pistazie)

Gruppenzentroide

kanonische Diskriminanzfunktion 2

(7 % Varianz = δ

C Pistazie)

Abbildung 49: Grafische Darstellung der Funktionswerte und Trenngeraden aus der Diskrimi-

nanzanalyse mit den 2 Pistazien-Gesamtnussvariablen

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

116

Die Diskriminanzanalyse mit nur den Stabilisotopenverhältnisvariablen der Pistazien-

Gesamtnuss ergibt ein gleich gutes Klassifizierungsergebnis für beide Variablenkombinationen

wie das Diskriminanzmodell der „optimalen Lösung“ (s. Kapitel 6.3.3). Auch hier werden mit

allen drei Klassifizierungsmethoden alle authentischen Proben richtig in ihre vorgegebenen

Gruppen eingeordnet, d.h. relative Häufigkeiten von 100 % erreicht. Die Trennleistung der Pis-

tazienvariablen reicht somit augenscheinlich schon aus, um ihre Herkunft zu bestimmen.

Bei der Betrachtung der grafischen Auftragung der Funktionswerte (s. Abbildungen 48 und 49)

zeigt sich jedoch der große Unterschied gegenüber den Diskriminanzmodellen mit den Variablen

der Pistazienfraktionen. Die Gruppen streuen wesentlich stärker und die Punktwolken sind daher

größer. Dadurch liegen die Punktwolken der drei Länder viel dichter zusammen und die ameri-

kanischen Pistazien sind von den türkischen nur knapp getrennt. Bei der 2-Variablenkombination

(s. Abbildung 49) liegen einige Datenpunkte sogar fast auf den Trenngeraden. Dies wird durch

die größere Streuung der δ-Messwerte der Pistazien-Gesamtnuss gegenüber der in den Fraktio-

nen bedingt. Die beiden Diskriminanzmodelle, die nur aus den Variablen Pistazien-Gesamtnuss

erstellt wurden, sind daher sehr bedingt zur Authentifizierung von unbekannten (Handels-) Pro-

ben geeignet. Die Wahrscheinlichkeit einer Fehleinordnung ist durch die schlechte Abgrenzung

der Messwerte der türkischen Proben recht hoch. Eine Extraktion des Pistazienöls und Verwen-

dung dieser Messdaten im Diskriminanzmodell ist daher anzuraten, auch wenn dies einen Zeit-

und Kostenfaktor darstellt.

Es wurde auch die Trenngüte von Diskriminanzmodellen getestet, die nur aus den Variablen der

Kohlenstoff- und Stickstoff-Isotopenverhältnisse bestanden, jedoch werden damit nur Klassifika-

tionsraten unter 90 % erreicht. Die Vermessung des Sauerstoff-Isotopenverhältnisses zur Fest-

stellung der Authentizität von Pistazien ist daher unerlässlich.

6.4 Anwendung der multivariaten Datenmodelle

117

6.4 Anwendung der multivariaten Datenmodelle

Die multivariate Datenanalyse wurde bisher nur zur grundsätzlichen Eignungsprüfung der Stabil-

isotopenvariablen zum Herkunftsnachweis (Hauptkomponentenanalyse) und zur Erstellung eines

Klassifizierungsmodells (Diskriminanzanalyse) eingesetzt. Dazu wurde ein Datensatz aus

authentischen Proben, d.h. Proben mit bekannter Herkunft, benutzt.

Ziel dieser Arbeit ist es jedoch, der Lebensmittelüberwachung eine effiziente Methode zur Auf-

deckung falsch deklarierter Handelspistazien oder zur Ermittlung der Herkunft unbekannter Pro-

ben zu liefern. Daher sollen der praktische Nutzen und die Grenzen der Diskriminanz- und

Hauptkomponentenanalyse anhand einiger nachfolgender Beispielanwendungen aufgezeigt wer-

den.

6.4.1 Klassifizierung von Handelsproben mit deklarierter Herkunft

Das Hauptanwendungsgebiet des in dieser Arbeit erstellten Diskriminanzmodells (s. Kapitel 6.3)

soll die Überprüfung der Herkunftsdeklaration von Pistazien sein. Da amerikanische Pistazien

auf dem Weltmarkt im Allgemeinen einen höheren Preis erzielen, besteht hier eine potenzielle

Gefahr der Täuschung des Verbrauchers durch eine falsche Deklaration. Es werden daher

iranisch und amerikanisch deklarierte Handelsproben in das im vorangegangenen Kapitel 6.3.2

erstellte 3-Variablen-Klassifikationsmodell eingesetzt, um die Richtigkeit ihrer Deklaration zu

überprüfen.

Durchführung:

Amerikanische und iranische Handelsproben mit deklarierter Herkunft (s. Kapitel 9.1 und An-

hang III) werden in das 3-Variablen-Diskriminanzmodell aus Kapitel 6.3.2 eingesetzt und klassi-

fiziert. Die Ergebnisse der Klassifikation werden farblich abgesetzt in einem Streudiagramm

visuell dargestellt und daher die Klassifikationsmatrix nicht mit aufgeführt. Die Probennummern

in der Grafik stimmen mit denen im Kapitel 9.1 und im Anhang III überein.

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

118

Ergebnis:

-5

-4

-3

-2

-1

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8

1. kanonische Diskriminanzfunktion (δ

O Öl)

authentisch Iran authentisch USA authentisch Türkei kommerziell Iran kommerziell USA

2. kanonische Diskriminanzfunktion

(δ

C Öl + δ

N Rückstand)

125

124

126

110

115

Abbildung 50: Grafische Darstellung der Klassifizierung von Handelsproben mit deklarierter Her-

kunft durch das 3-Variablen-Diskriminanzmodell aus Kapitel 6.3.2

Die grafische Darstellung des Klassifizierungsergebnisses (s. Abbildung 50) zeigt deutlich, dass

alle Handelsproben (als Dreiecke in ihrer deklarierten Gruppenfarbe dargestellt) durch das Dis-

kriminanzmodell eindeutig einem der drei Länder zugeordnet werden. Während alle getesteten

iranischen Handelspistazien auch innerhalb der iranischen Punktwolke wieder zu finden sind,

werden bei den amerikanischen nicht alle Handelsproben auch der USA-Gruppe zugeordnet.

Vier der vermeintlich amerikanischen Proben sind hier deutlich der iranischen Punktwolke zuge-

ordnet und eine liegt innerhalb der türkischen. Da diese fünf USA-deklarierten Proben so klar,

d.h. inmitten der Punktwolke, die die Proben aus dem Iran bzw. der Türkei repräsentieren, ein-

geordnet werden, kann hier von einer Falschdeklaration ausgegangen werden.

Die Klassifizierungsfunktionen von Fisher (s. Kapitel 6.3.4) sowie auch das kanonische Diskri-

minanzmodell aus nur 2-Variablen liefern die gleichen Klassifizierungsergebnisse wie es in Ab-

bildung 50 dargestellt ist, d.h. es werden die gleichen fünf amerikanisch-deklarierten Proben dem

Iran bzw. eine davon der Türkei zugeordnet.

6.4 Anwendung der multivariaten Datenmodelle

119

6.4.2 Klassifizierung von Handelsproben unbekannter Herkunft

Eine weitere praktische Anwendung des Diskriminanzmodells liegt in der Herkunftsbestimmung

von unbekannten Pistazienproben. Hierbei ist allerdings zu beachten, dass das hier aufgestellte

Diskriminanzmodell nur zwischen den drei Ländern Iran, USA und Türkei unterscheiden kann,

d.h. andere Anbauländer können nicht erkannt werden bzw. Proben anderer Anbauländer werden

grundsätzlich einem der drei Hauptanbauländer zugeordnet.

Durchführung:

Handelsproben ohne jegliche Herkunftsangaben (s. Kapitel 9.1 und Anhang III) werden in das

3-Variablen-Diskriminanzmodell aus Kapitel 6.3.2 eingesetzt und klassifiziert. Die Ergebnisse

der Klassifikation werden farblich abgesetzt in einem Streudiagramm visuell dargestellt und da-

her die Klassifikationsmatrix nicht mit aufgeführt.

Ergebnis:

-5

-4

-3

-2

-1

-8-6-4-202468

1. kanonische Diskriminanzfunktion (δ

O Öl)

authentisch Iran authentisch USA authentisch Türkei unbekannte Handelsware

2. kanonische Diskriminanzfunktion

(δ

C Öl + δ

N Rückstand)

Abbildung 51: Grafische Darstellung der Klassifizierung von Handelsproben unbekannter Her-

kunft durch das 3-Variablen-Diskriminanzmodell aus Kapitel 6.3.2

Die Handelsproben unbekannter Herkunft werden vom Diskriminanzmodell fast überwiegend in

die iranische Punktwolke eingeordnet (s. Abbildung 51). Die meisten Pistazien auf dem deut-

schen Markt stammen demnach aus dem Haupterzeugerland Iran, was den Importstatistiken zu-

folge (s. Kap. 3.1.3, Abb. 10)[90,261] auch die tatsächliche Marktsituation in Deutschland wider-

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

120

spiegelt. Der USA-Punktwolke werden 8 der 24 undeklarierten Proben zugeordnet. Eine weitere

Probe befindet sich in der Grafik genau zwischen der türkischen und iranischen Punktwolke. Sie

wird vom Klassifizierungsmodell statistisch der Türkei zugeordnet, jedoch könnte diese Probe

auch aus einem anderen, vierten Land stammen oder eine Mischprobe sein.

Auch in diesem Versuch führt die Klassifikation mit den Fisher´schen Klassifizierungsfunktio-

nen und der 2-Variablenkombination zu den gleichen Ergebnissen.

6.4.3 Klassifizierung von Mischproben USA ↔ Iran

Im vorherigen Kapitel 6.4.2 wurden die Grenzen des Diskriminanzmodells anhand der zwischen

den Punktwolken liegenden Probe angesprochen: Die Diskriminanzanalyse kann weder andere

Länder als die drei vorgegebenen (Iran, USA, Türkei) noch Mischungen erkennen, d.h. derartige

Fälle werden zwangsweise in eine der vorgegebenen Gruppen eingeordnet. Um das Modell da-

hingehend zu testen, wurden Mischproben aus authentisch iranischen und authentisch amerikani-

schen Pistazien in verschiedenen Verhältnissen hergestellt, vermessen und in das Diskriminanz-

modell eingeordnet.

Durchführung:

Es wurde die authentisch amerikanische Pistazienprobe Nr.36 mit der authentisch iranischen

Probe Nr. 12 (s. Kap. 9.1 und Anhang III) für diesen Versuch ausgewählt und in folgenden Ver-

hältnissen gemischt: 10:90, 30:70, 50:50, 70:30 und 90:10. Die Klassifikation dieser Mischungen

wird auf Grundlage der 3-Variablen-Diskriminanzmodells aus Kapitel 6.3.2 durchgeführt.

6.4 Anwendung der multivariaten Datenmodelle

121

Ergebnis 1:

-5

-4

-3

-2

-1

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8

1. kanonische Diskriminanzfunktion (δ

O Öl)

authentisch Iran

authentisch USA

authentisch Türkei

100 % USA

USA:Iran 90:10

USA:Iran 70:30

USA:Iran 50:50

USA:Iran 30:70

USA:Iran 10:90

100 % Iran

2. kanonische Diskriminanzfunktion

(δ

C Öl + δ

N Rückstand)

Abbildung 52: Grafische Darstellung der Klassifizierung von USA-Iran-Mischproben verschiede-

ner Verhältnisse durch das 3-Variablen-Diskriminanzmodell aus Kapitel 6.3.2

Die Klassifizierung der USA-Iran-Pistazienmischproben in das 3-Länder-Diskriminanzmodell

erweist sich wie vermutet als nicht sehr aussagekräftig. Von den fünf Mischungen sind grafisch

nur zwei auffällig, weil sie abseits der Punktwolken liegen (Quadrat und Kreuz in Abbildung

52). Dabei wird die 50:50-Mischung rein statistisch vom Diskriminanzmodell sogar der türki-

schen Punktwolke zugeordnet. Die Mischung mit einem Anteil von 70 % USA-Pistazien (Quad-

rat) liegt auffällig neben der amerikanischen Punktwolke, während die Mischung mit einem An-

teil von 70 % iranischen Pistazien (Punkt) sich zwar am Rand des iranischen Bereichs befindet,

jedoch nicht auffällig außerhalb.

Es wird daher eine weitere Diskriminanzanalyse durchgeführt, und zwar diesmal nur mit dem

authentischen Datensatz der USA und dem Iran, bei der nur diese beiden Länder als Gruppen

vorgegeben werden. Bei zwei Gruppen wird nur noch eine Diskriminanzfunktion extrahiert und

die grafische Darstellung ist daher eindimensional. Zum Vergleich ist die grafische Auftragung

der δ18OVSMOW-Messwerte der Öle dem Ergebnis der Diskriminanzanalyse gegenübergestellt.

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

122

Ergebnis 2:

-7

-5

-3

-1

VSMOW

Öl

authentisch Iran

authentisch USA

100 % Iran

USA:Iran 10:90

USA:Iran 30:70

USA:Iran 50:50

USA:Iran 70:30

USA:Iran 90:10

100 % USA

Diskriminanz-

analyse "δ

O Öl"

kanonische Diskriminanzfunktion

(δ

O Öl + δ

C Öl + δ

N Rückstand)

Abbildung 53: Grafische Darstellung der Klassifizierung von USA-Iran-Mischproben verschiede-

ner Verhältnisse durch ein 2-Länder-Diskriminanzmodell im Vergleich mit der

δ18OVSMOW-Messreihe des Öls

Die Klassifizierung der USA-Iran-Mischproben durch das 2-Länder-Diskriminanzmodell

(s. Abbildung 53) ergibt keine deutlichere Abtrennung von den authentischen Reinproben als mit

dem 3-Länder-Diskiminanzmodell (vgl. mit Abb. 52). Auch hier können nur die USA:Iran 50:50

und 70:30 Mischungen als visuell eindeutige „Ausreißer“ aus dem authentischen Datensatz er-

kannt werden. Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass bestenfalls ab einer Zumi-

schung von mehr als 10 % iranischen Pistazien zu amerikanischer Ware die Verfälschung er-

kannt werden kann. Durch die größere Streuung in den iranischen Daten und die dadurch größere

Punktwolke ist eine Zumischung von über 70 % iranischen zu amerikanischen Pistazien nicht

mehr auffällig.

6.4 Anwendung der multivariaten Datenmodelle

123

6.4.4 Klassifizierung der Ausreißer aus Kapitel 5.3.1

Die Ausreißer-Betrachtung des authentischen Datenmaterials in Kapitel 5.3.1 erbrachte vor al-

lem bei den amerikanischen Proben mehrere Ausreißer-Fälle, die zwar von allen Tests angezeigt

wurden, aber deren Authentizität aufgrund des Direktbezugs aus den USA schwer anzuzweifeln

ist. Es soll daher geprüft werden, wie sich die Ausreißer in der Diskriminanzanalyse verhalten,

d.h. ob sie grafisch auffällig sind oder inmitten einer der drei Punktwolken eingeordnet werden.

Da sie meistens aufgrund des Stickstoff-Isotopenverhältnises als Ausreißer erkannt wurden, sol-

len sie zusätzlich auch mit dem 2-Variablen-Diskriminanzmodell betrachtet werden, bei dem

keine Stickstoffvariable eingeht. Hierdurch soll getestet werden, ob die Ausreißer immer noch

grafisch auffällig oder in falsche Gruppen eingeordnet werden und ob das Stickstoff-

Isotopenverhältnis überhaupt zur Herkunftsbestimmung von Pistazien geeignet ist oder zu

Falsch-Klassifizierungen führt.

Durchführung:

Alle in Kapitel 5.3.1 erkannten Ausreißer werden mit dem 3- und 2-Variablen-

Diskriminanzmodell klassifiziert und die Ergebnisse grafisch dargestellt (Ausreißer: gefüllte

Symbole in jeweiligen Gruppefarbe). Die Probennummern in den Grafiken und im Text stimmen

mit denen in Kapitel 9.1 und im Anhang III überein.

Ergebnis:

-6

-4

-2

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

1. kanonische Diskriminanzfunktion (δ18OVSMOW Öl)

authentisch Iran

authentisch USA

authentisch Türkei

Ausreißer USA

Ausreißer Türkei

2. kanonische Diskriminanzfunktion

(δ13CPDB Öl + δ15NAir Rückstand)

86 82

Abbildung 54: Klassifizierung der Ausreißer aus dem authentischen Pistaziendatensatz mit dem 3-

Variablenmodell

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

124

-5

-4

-3

-2

-1

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

1. kanonische Diskriminanzfunktion (δ

VSMOW

Öl)

authentisch Iran

authentisch USA

authentisch Türkei

Ausreißer USA

Ausreißer Türkei

2. kanonische Diskriminanzfunktion (δ

PDB

Öl)

90 82

Abbildung 55: Klassifizierung der Ausreißer aus dem authentischen Pistaziendatensatz mit dem 2-

Variablenmodell

Rein mathematisch werden alle fünf Ausreißer (Nr. 33, 34, 35, 61, 69) des authentisch-

amerikanischen Datensatzes von beiden Diskriminanzmodellen (s. Abbildung 54 und 55) der

amerikanischen Gruppe zugeordnet. Allen fünf Ausreißern des authentischen Pistaziendatensat-

zes der USA ist gemein, dass sie Ausreißer und Extremwerte im Stickstoff-Isotopenverhältnis

zeigen und drei davon auch in den Sauerstoffvariablen. Ihre Lage in den grafischen Darstellun-

gen der Diskriminanzfunktionen (s. Abbildung 54 und 55) lässt erkennen, dass sie in der

3-Variablenkombination näher an der amerikanischen Gruppe liegen als bei der Diskriminanza-

nalyse mit nur 2-Variablen, bei der die Stickstoffvariable nicht eingeht. Diese bessere Zuordnung

der besagten Proben ist jedoch nur scheinbar, denn das Stickstoff- wie auch das Sauerstoff-

Isotopenverhältnis leisten einen negativen Erklärungsbeitrag auf der 2. kanonischen Diskrimi-

nanzfunktion (s. Kapitel 6.3.2.3). Je höher also der δ15NAir-Wert einer Probe ist desto mehr wird

der Funktionswert auf der y-Achse nach unten gedrückt, nämlich auf das Niveau der iranischen

Proben, deren δ15NAir-Werte allgemein deutlich höher sind als die der amerikanischen und türki-

schen (s. Abbildung 39 in Kapitel 5.2). Daher liegen die amerikanischen Ausreißerproben mit

ihren Extremwerten im Stickstoff-Isotopenverhältnis allgemein tiefer im 3- als im 2-

Variablenmodell und damit näher/besser in der amerikanischen Punktwolke.

6.4 Anwendung der multivariaten Datenmodelle

125

Optisch auffällig in Abbildung 54 und 55 sind bei den univariat erkannten Ausreißern des au-

thentisch-amerikanischen Datensatzes eigentlich nur zwei von den fünf Proben. Nur die Proben

mit den Nummern 33 und 69 liegen optisch auffällig rechts neben der amerikanischen Punktwol-

ke. Sie sind wegen ihrer hohen δ15NAir-Werte nicht nur nach unten, sondern aufgrund des zusätz-

lich erhöhten δ18OVSMOW-Werts auch noch nach links in Richtung der iranischen Punktwolke

verschoben. Probe Nr. 33 liegt in Abb. 54 allerdings höher als in Abb. 55, da ihr δ15NAir-Wert

niedriger als der amerikanische Durchschnitt ist.

Die Proben mit den Nummern 35 und 61 sind optisch keine auffälligen Ausreißer, denn sie lie-

gen noch am Rand der USA-Punktwolke. Desgleichen Probe Nr. 34, die nur im

2-Variablenmodell auffällig abgesetzt am linken Rand der Gruppe liegt, jedoch klar als amerika-

nische Probe klassifiziert werden muss, da es an dieser Stelle keine Schnittmenge mit anderen

Gruppen gibt.

Es ist somit zusammenfassend festzustellen, dass nur USA-Proben mit erhöhten (für iranische

Pistazien typischen bzw. ähnlichen) Sauerstoff-Isotopenverhältnissen im Streudiagramm visuell

auffällig rechts neben ihrer Punktwolke liegen. Da aber der Abstand zur iranischen Punktwolke

sehr groß ist, kommt es nicht zu einer Fehlklassifizierung.

Fehlklassifizierungen von amerikanischen Pistazien mit türkischen können ebenfalls nicht vor-

kommen, da die türkische Punktwolke oberhalb und nach rechts verschoben von der amerikani-

schen liegt. Nähere Erläuterungen zu den möglichen Gründen der erhöhten δ15NAir- und

δ18OVSMOW-Werte in den USA-Ausreißerproben sind im nachfolgenden Kapitel 7 (Ergebnisdis-

kussion) gegeben.

Im authentisch-türkischen Datensatz waren nach der univariaten Ausreißerbetrachtung sechs

Proben auffällig (s. Kapitel 5.3.1) und wurden aus dem Datensatz entfernt. Beide Diskriminanz-

modelle (s. Abbildung 54 und 55) ordnen die Proben mit den Nummern 71 und 75 mathematisch

der türkischen Gruppe zu, während die übrigen vier (Proben Nr. 82, 86, 88 und 90) der irani-

schen Punktwolke zugehörig sind.

Ausreißerprobe Nr. 71 wird vom Klassifizierungsmodell zwar als türkische Probe erkannt, je-

doch liegt sie optisch bei der iranischen Punktwolke (s. Abbildung 54 und 55)und scheint daher

ein echter Ausreißer zu sein. Probe Nr. 75 liegt in beiden Grafiken (s. Abbildung 54 und 55) auf-

fällig oberhalb der türkischen Punktwolke, da ihr δ13CPDB-Wert überdurchschnittlich hoch ist. An

dieser Stelle gibt es jedoch keinerlei Überschneidungen mit den beiden anderen Ländern, daher

ist die türkische Authentizität dieser Probe schwer anzuzweifeln.

Der optisch deutlichste Ausreißer im authentisch-türkischen Datensatz ist Probe Nr. 88, denn sie

liegt inmitten der iranischen Punktwolke. Ihre δ15NAir- und δ18OVSMOW-Werte sind in allen Frak-

6. Ergebnisteil III: Multivariate Statistik

126

tionen extrem hoch und liegen in der Spannweite des Irans. Es handelt sich hierbei um eine

5 Jahre alte, als türkisch deklarierte Handelsware, die entweder tatsächlich falsch deklariert ist

oder deren Stabilisotopenverhältnisse über die Jahre sehr stark fraktioniert sind. Letztere Mög-

lichkeit ist durch die Alterungsstudie in Kapitel 4.5.4 eher anzuzweifeln, da eine Fraktionierung

bzw. ein Austausch der Stabilisotopen mit der Umwelt zumindest über einen Zeitraum von ei-

nem Jahr nicht nachgewiesen werden konnte.

Die Proben mit den Nummern 82 und 86 haben ebenfalls überdurchschnittlich hohe δ15NAir- und

δ18OVSMOW-Werte und sind deshalb als Ausreißer markiert worden. Sie liegen beide im oberen

Teil der iranischen Punktwolke, da sie aufgrund ihres erhöhten Sauerstoff-Isotopenverhältnisses

vom Diskriminanzmodell dorthin (nach rechts, weg von der türkischen Punktwolke) verschoben

wurden. Im 2-Variablenmodell (s. Abbildung 55) liegen die beiden Proben immer noch auf der

Höhe der türkischen Werte während sie wegen ihres iranähnlichen Stickstoff-

Isotopenverhältnisses im 3-Variablenmodell (s. Abbildung 54) dagegen zusätzlich noch nach

unten gedrückt worden sind. Daher liegen Probe Nr. 82 und 86 im 3-Variablenmodell optisch

weiter von der türkischen Gruppe entfernt.

Ausreißerprobe Nr. 90 liegt in beiden Grafiken (s. Abbildung 54 und 55) am oberen Rand der

iranischen Punktwolke und würde im unteren Bereich der türkischen Punktwolke liegen, wenn

sie aufgrund ihres hohen δ18OVSMOW-Werts vom Klassifizierungsmodell nicht nach rechts ver-

schoben worden wäre. Ihre türkische Authentizität ist jedoch anzuzweifeln, da sie als lose Ware

auf einem Berliner Markt gekauft wurde.

Die Trennung zwischen Pistazien aus dem Iran und der Türkei ist somit schwierig. Im Gegensatz

zu den Ausreißern im authentisch amerikanischen Datensatz ist die Authentizität der univariat

erkannten türkischen Ausreißerproben tatsächlich anzuzweifeln, da die meisten Proben aufgrund

fehlender Direktkontakte in die Türkei auf dem deutschen Markt gekauft wurden. Türkische

Proben mit erhöhten δ18OVSMOW-Werten (und δ15NAir-Werten) werden wie die amerikanischen

Proben in der grafischen Darstellung nach rechts (und nach unten) verschoben, jedoch liegen sie

damit zwangsläufig in der iranischen Punktwolke bzw. werden auch als solche klassifiziert. Zwi-

schen der Türkei und dem Iran kann es daher sehr leicht zu Fehlklassifizierungen bei der Dis-

kriminanzanalyse kommen (s. dazu auch Kapitel 7: Ergebnisdiskussion).

6.4 Anwendung der multivariaten Datenmodelle

127

6.4.5 Multivariate Betrachtung anderer Länder

Neben den Pistazien aus den drei Hauptanbauländern Iran, USA und Türkei, konnten auch einige

Proben aus anderen Ländern gesammelt werden (1×Italien/Sizilien, 1×Marokko, 1×Usbekistan,

3×Syrien, 6×Griechenland). Da von der Diskriminanzanalyse fremde Gruppen nicht erkannt

werden können, sondern jede Probe in eins der vorgegebenen Länder eingeordnet wird, wurde

die Hauptkomponentenanalyse mit Varimax-Rotation nochmals angewendet. Sie ist im Gegen-

satz zur Diskriminanzanalyse eine strukturen-entdeckende Methode (s. Kapitel 3.4.1) und daher

geeignet, vorhandene Unterschiede in Messdaten aufzudecken und nachzuprüfen, ob sich andere

Länder von den drei Hauptanbaugebieten unterscheiden lassen.

Das Ergebnis der Hauptkomponentenanalyse mit den Daten des authentischen Pistaziendatensat-

zes und den Proben der fünf neuen Länder (Ergebnisgrafik nicht dargestellt) zeigt jedoch sehr

deutlich, dass sich alle Proben dieser fünf Länder innerhalb oder nahebei der Punktwolken vom

Iran, der USA und der Türkei einordnen. Die italienische (sizilianische) und marokkanische Pro-

be sind z.B. in der iranischen Punktwolke angesiedelt, während die Probe aus Usbekistan sich im

türkischen Bereich befindet. Die Proben aus Syrien sind sogar in zwei verschiedenen Punktwol-

ken (Türkei und USA) wieder zu finden, ebenso die sechs aus Griechenland (Türkei und Iran).

Keines dieser Länder bildet somit eine eigene Gruppe, d.h. sie können nicht eindeutig von den

drei Hauptanbaugebieten unterschieden werden. Dies bedeutet zum einen, dass die Fremdländer

keine eigenen Gruppen bilden bzw. bei einer größeren Probenanzahl würden sich überschnei-

dende Punktwolken ergeben, und zum anderen, dass sie nicht von den Hauptanbauländern unter-

schieden werden können.

7. Ergebnisdiskussion

128

7. Ergebnisdiskussion

129

Ergebnisdiskussion

7. Ergebnisdiskussion

130

In dieser Arbeit wird mit Hilfe der Stabilisotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS) der

Elemente Sauerstoff, Kohlenstoff und Stickstoff in Kombination mit multivariater Statistik

(Hauptkomponenten- und Diskriminanzanalyse) eine effiziente Methode zur Trennung von Pis-

tazien nach ihren drei Haupterzeugerländern Iran, USA und Türkei vorgestellt. Eine derartige

Methode fehlt zur Zeit in der Lebensmittelüberwachung, um die häufiger vorkommenden Ver-

fälschungen von amerikanischen Handelspistazien durch Umetikettierung oder Untermischung

iranischer Ware aufzudecken. Auch die EU wertet die Erstellung herkunftsnachweisender Me-

thoden als sehr wichtig (inhaltlicher Bestandteil des 5. und 6. Rahmenprogramms, s. Kap. 1), um

Verbraucher und Lebensmittel zu schützen.

Zu Beginn dieser Arbeit wurden mit dem Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (IRMS) Mes-

sungen durchgeführt, die der Absicherung und Überprüfung der 13C-, 15N- und 18O-Methode

galten. Es sollte sichergestellt werden, dass die Messmethoden zuverlässig, alle verwendeten

Materialien über den Messzeitraum von ca. einem Jahr stabil und die Auf- und Verarbeitungs-

schritte diskriminierungsfrei sind (s. Kapitel 4.1 und 4.2). Schwierigkeiten zeigten sich hier bei

der TC/EA-Messung (δ18O-Bestimmung), da zum Zeitpunkt der praktischen Arbeiten zu dieser

Dissertation noch kein zertifiziertes organisches Feststoff-Referenzmaterial zur Kalibrierung des

Geräts oder eines Arbeitsstandards käuflich zu erwerben war. Daher musste gegen Wasserstan-

dards kalibriert werden, die nicht den δ-Wertebereich des Arbeitsstandards und der Proben ein-

schlossen. Durch das unterschiedliche Verhalten von Flüssigkeiten und Feststoffen bei der

Verbrennung im TC/EA und die Extrapolation des δ-Werts wurde ein Fehler in die Kalibrierung

eingetragen. Dies war jedoch die einzige Möglichkeit der Kalibrierung eines Standards und Mes-

sung des δ18O-Werts in Pistazien überhaupt.

Die Ergebnisse innerhalb dieser Arbeit bleiben dadurch aber trotzdem vergleichbar und anwend-

bar, da bei der IRMS nur Verhältnisse und keine Absolutwerte gemessen werden. Mit einem

passenden Referenzmaterial (dies ist seit 2005 in Form von zwei Benzoesäuren bei der IAEA

erhältlich) könnte der Arbeitsstand nachkalibriert werden und bei Bedarf alle Ergebnisse durch

eine einfache Multiplikation mit einem Korrekturfaktor berichtigt werden.

Weitere Voraussetzungen, auf die bei der IRMS-Messung geachtet werden müssen um richtige

Ergebnisse zu erzeugen, sind die vorherige Feststellung der Diskriminierungsfreiheit sowie Wie-

derholbarkeit der Aufarbeitung der Proben (s. Kap. 4.6: Prüfung der Öl-Extraktionsmethode) und

die Überprüfung des linearen Arbeitsbereichs der Geräte (s. Kap. 4.3). Hier ergab sich eine Un-

stimmigkeit, weil die Signal-Messwert-Gerade entgegen der Herstellerdefinition um mehr als

0,06 ‰/V in dem Bereich von 2-7 Volt anstieg. Mit genauen Einwaagen und der Verwendung

von Mikroliterspritzen statt der Mikrowaage beim Öl konnte die Messung im linearen Arbeitsbe-

reich jedoch weitestgehend gewährleistet werden.

7. Ergebnisdiskussion

131

Außerdem hat sich gezeigt, dass eine Trocknung der Proben über Pentoxid für die δ18O-

Bestimmung unbedingt erforderlich ist, um die Standardabweichung zu verringern.

Alle weiteren Voruntersuchungen der Methodik und Materialien (Kalibrierungen, Stabilität der

Standards und Analyten) schlossen mit sehr zufrieden stellenden Ergebnissen ab, so dass die

IRMS-Messmethoden In-House validiert werden konnten, um die Verwendbarkeit und Gültig-

keit der Messergebnisse sicherzustellen (s. Kap. 4.5). Durch den Vergleich der erzielten Wieder-

hol- und Vergleichbarkeitsdaten (r, R) mit anderen, bereits validierten IRMS-Methoden in der

Lebensmittelanalytik zeigte sich, dass mit der 13C-, 15N- und 18O-Methode richtige, wiederholba-

re und vergleichbare Ergebnisse erzielt werden.

Die Validierung der drei Stabilisotopen-Methoden zur Vermessung von Pistazien ist sehr wich-

tig, da mit dieser Arbeit eine praktisch anwendbare Methodik erstellt werden sollte und sie erst

nach der Ermittlung der wichtigen Kenndaten wie r und R auch in einem Handels- oder Überwa-

chungslabor für z.B. Routineuntersuchungen etabliert werden kann.

Im Zuge der Validierung wurde eine weitere, wichtige Erkenntnis gewonnen, nämlich dass das

Pistazienöl die beste Fraktion für die δ-Wertbestimmung ist, da die Flüssigkeit eine wesentlich

homogenere Matrix darstellt. Gegenüber den Feststofffraktionen (Gesamtnuss, entfetteter Rück-

stand) konnte eine deutlich niedrigere Wiederhol- und Vergleichsstandardabweichung (sr, sR)

festgestellt und auch später bei den Probenmessungen eine allgemein niedrigere Streubreite in

den δ-Werten des Öls beobachtet werden. Diese Diskrepanz zwischen den Matrizes wird am

deutlichsten beim Vergleich der δ13CPDB-δ18OVSMOW-Auftragung in einfachen x-y-

Streudiagrammen: Mit den δ-Messwerten des Öls (s. Abb. 57 an späterer Stelle in diesem Kapi-

tel) wird eine viel deutlichere Trennung der Länder erreicht als mit denen der Gesamtnuss

(s. Abb. 43 in Kap. 6.1).

Entgegen Beschreibungen in der Literatur[216,228,293] kann jedoch keine Verschärfung der Mess-

wertunterschiede in den hier untersuchten Pistazienfraktionen beobachtet werden. Durch den

Sekundärstoffwechsel der Pflanzen kann derartiges hervorgerufen werden, jedoch ist dieses Phä-

nomen eher in Produkten zu finden, die in der Stoffwechselkette weit ab von den Primärproduk-

ten liegen oder zwischen Molekülen einer Stoffklasse, wie z.B. zwischen Fettsäuren.[302] In die-

ser Arbeit wurde nur eine grobe Fraktionierung der Pistazien in das Öl und den entfetteten Rück-

stand (Kohlenhydrate und Proteine) vorgenommen, welche nur die Primärverzweigungen der

Biosynthese darstellen und daher auch untereinander hoch korrelieren. Es kann aber die in der

Literatur[58,182,194] schon früh beschriebene Beobachtung bestätigt werden, dass der δ13C-Wert der

Lipide um ca. 8 ‰ gegenüber den Primärprodukten der Photosynthese, den Kohlenhydraten,

abgereichert ist. Die Kohlenhydrate befinden sich nach der Ölextraktion im entfetten Rückstand

und machen dort inhaltlich den größten Anteil aus. Der in dieser Arbeit durchschnittlich gefun-

7. Ergebnisdiskussion

132

dene Unterschied zwischen dem Öl und dem entfetteten Rückstand beträgt ca. 6 ‰ (s. Kap. 5.2,

Abb. 38). Er ist etwas niedriger, da im entfetten Rückstand auch noch die Proteine enthalten

sind, die etwa 2-3 ‰ gegenüber den Kohlenhydraten abgereichert sind und dadurch den δ13C-

Wertunterschied etwas erniedrigen.

Die sehr wichtige und unbedingt notwendige statistische Voruntersuchung des authentischen

Pistaziendatensatzes zeigte, dass die Kriterien Normalverteilung, Varianzhomogenität, Gruppen-

unterschiede und Korrelation von diesem erfüllt werden und er daher bestens zur multivariaten

Datenanalyse geeignet ist. Die Betrachtungen der δ-Werte in den Box-Plots und x-y-

Streudiagrammen untermauert dies, da hier schon eine Anordnung der Werte nach Ländern zu

erkennen ist (s. Abb. 38-40 in Kap. 5.2 und Abb. 41-43 in Kap. 6.1).

Der δ13CPDB-Wert zeigt Trenneigenschaften hinsichtlich der geografischen Herkunft von Pista-

zien, jedoch schafft er es nicht, eines der drei betrachteten Länder vollständig von den anderen

abzutrennen. Die am stärksten negativen Werte sind hier bei den Pistazienproben aus den USA

zu finden. Eine Erklärung hierfür könnte zum einen der höhere Grad an industriellen Ansiedlun-

gen und dem damit verbundenen vermehrten Ausstoß von Verbrennungsabgasen aus Kohle und

Erdöl (stark negative δ-Werte) sein (s. Kap. 3.2.1). Zum anderen wurde in Kapitel 3.2.1 bereits

erwähnt, dass vermehrter Regen das Absinken des δ13CPDB-Werts bewirkt. Die modernen Pista-

zienfarmen in den USA werden bekanntermaßen ausnahmslos bewässert.

Verminderte Wasserverfügbarkeit führt im Gegenzug zu einer Erhöhung des δ13CPDB-Werts

(mehr positiv). Dies könnte in der Türkei und dem Iran der Fall sein, da hier teilweise noch tradi-

tionell bzw. mit weniger modernen Mitteln Pistazien angebaut werden. Die riesige Pistazienkul-

tur im Iran ist u.a. auch aus Wasserknappheit in den fünfziger Jahren entstanden, weil andere

Kulturpflanzen (z.B. Weizen, Baumwolle) in diesen Regionen nicht mehr angebaut werden

konnten (s. Kap. 3.1.2).

Ein weiterer exogener Faktor, der sich auf das 13C/12C-Verhältnis auswirkt, ist die Temperatur.

Die Diskriminierungsrichtung wird zwar in der Literatur noch diskutiert, in neueren Artikeln

beschreiben die Autoren[124,175] jedoch häufiger einen positiven Zusammenhang (s. Kap. 3.2.1).

Laut den Klimatabellen der drei betrachteten Länder (s. Kap. 3.1.2, Abb. 3+4) sind die Jahres-

durchschnittstemperaturen im Iran und in der Türkei höher als in den USA, d.h. auch hier stimmt

die Theorie mit den in dieser Arbeit gefundenen δ13CPDB-Ergebnissen überein. Überdies spiegelt

sich auch der Höhenunterschied zwischen den Anbauflächen der beiden Pistazienhauptproduzen-

ten Iran (>1000 m ü.d.M.) und USA (~100 m ü.d.M.) in den Messwerten wieder. Laut Literatur

steigt mit zunehmender Höhe auch der δ13CPDB-Wert (s. Kap. 3.2.1). Die Messwerte der Türkei

folgen hier allerdings nicht der Theorie, da die δ13CPDB-Werte dort am höchsten sind, das An-

7. Ergebnisdiskussion

133

baugebiet aber höhenmäßig zwischen dem Iran und den USA liegt. Dies ist jedoch nicht ver-

wunderlich, denn der δ13CPDB-Wert wird durch das Zusammenspiel aller umweltbedingten Fak-

toren bestimmt und kann daher niemals mit Sicherheit vorhergesagt werden. Vielleicht spielt bei

den Werten der türkischen Pistazien noch die etwas nördlichere Lage eine Rolle, denn es wurde

auch eine positive Abhängigkeit des 13C/12C-Verhältnisses mit dem Breitengrad in der Litera-

tur[158,175] beschrieben (s. Kap. 3.2.1).

Der δ14NAir-Wert trennt dagegen sehr deutlich die Pistazienproben des Irans von denen der USA

und Türkei ab (stärker positive δ-Werte). Für höhere Stabilisotopen-Messwerte können beim

Element Stickstoff Faktoren wie verstärkter Einsatz von organischen Düngern, hohe Jahres-

durchschnittstemperaturen oder landwirtschaftlich lange und intensiv genutzte Böden verant-

wortlich sein (s. Kap. 3.2.2). All diese Punkte könnten auf das 15N/14N-Verhältnis der iranischen

Pistazien Einfluss genommen haben. Die heutigen Anbauflächen des Irans werden z.B. schon

seit den fünfziger Jahren intensiv landwirtschaftlich genutzt, während in den USA Pistazien erst

seit den siebziger Jahren angebaut werden. Die Jahresdurchschnittstemperaturen liegen im Iran

auch etwas höher als in den USA. Außerdem ist es in dem häufig noch traditionell bewirtschafte-

ten Iran auch eher wahrscheinlich, dass mehr organische Dünger (Gülle, Stallmist) anstelle teurer

Mineraldünger verwendet werden. Synthetische Dünger fördern das allmähliche Absinken des

δ15NAir-Werts im Pflanzenstickstoff und in den USA ist von einer derartigen Düngung auszuge-

hen. Von der Türkei sind die Düngergewohnheiten für Pistazien leider nicht bekannt.

Ein weiterer, exogener Faktor, der die allgemein niedrigeren δ15NAir-Werte in den amerikani-

schen und türkischen Pistazien bewirken könnte, ist die jahresdurchschnittliche Niederschlags-

menge. Zwar fällt im California Central Valley nicht unbedingt mehr Regen als im Iran, jedoch

ist bekannt, dass die amerikanischen Pistazienfelder regelmäßig und ausreichend bewässert wer-

den. In der Türkei fällt im Jahresdurchschnitt der meiste Regen, was die niedrigeren δ15NAir-

Werte gegenüber den iranischen Pistazien verursachen könnte (vgl. dazu die Klimadiagramme in

Kap. 3.1.2, Abb. 3+4).

Eine Erklärung für die zudem beobachteten stark unterschiedlichen Streubreiten zwischen den

15N/14N-Messwerten des Irans und der USA könnten Sortenunterschiede sein. In Kapitel 3.1

wurde bereits beschrieben, dass die Iraner eine breite Vielfalt von Pistaziensorten anbauen, wäh-

rend in den USA fast ausschließlich die Sorte Kerman kultiviert wird. Das Vorkommen signifi-

kanter δ15NAir-Variationen von bis zu 1,3 ‰ zwischen verschiedenen Genotypen wilder Gerste

wurde in der Literatur[213] schon beschrieben.

Der δ18OVSMOW-Wert zeigt die größte Trennkraft hinsichtlich der geografischen Herkunft von

Pistazien, was schon aus der Theorie zu erwarten gewesen ist (s. Kap. 3.2.3). Er trennt die beiden

Hauptanbauländer Iran und USA vollständig und sehr deutlich voneinander (s. Kapitel 5.2), die

7. Ergebnisdiskussion

134

türkischen Proben liegen allerdings genau dazwischen und überschneiden sich mit den Proben

der beiden anderen Ländern. Es lässt sich hier aber schon folgendes Ergebnis zur 100 %igen

Unterscheidung von (ausschließlich) iranischen und amerikanischen Pistazien formulieren:

Werden bei einer Pistazienprobe δ18OVSMOW-Werte unterhalb von 30 ‰ gefunden, handelt

es sich um eine amerikanische Pistazie; liegen die δ18OVSMOW-Werte dagegen oberhalb von

34 ‰, liegt eine iranische Ware vor. Beim Pistazienöl ist die Spannweite der δ18OVSMOW-

Werte zwischen den beiden Ländern sogar noch etwas größer und bewegt sich zwischen

28 ‰ und 35 ‰.

Dies ist ein großartiger Erfolg und eines der Hauptziele, die in dieser Arbeit erreicht werden soll-

te. Durch die einfache Messung nur eines Isotopenverhältnisses können Pistazien aus dem Iran

von denen der USA unterschieden werden und dadurch evtl. Umetikettierungen leicht und

schnell erkannt werden. Dies ist auch eine erhebliche Verbesserung gegenüber der Methode von

Anderson et al.[7] bei der zwei Parameter gemessen werden müssen (δ15N und C/N-Verhältnis),

um die beiden Haupterzeugerländer zu trennen. Außerdem ist die Herkunftsbestimmung von

Pistazienproben mit dem Anderson-Modell nur optisch möglich, da keine statistische Abgren-

zung der Punktwolken vorgenommen wurde. Es ist hier nicht klar, bei welchen Werten die

Grenze zwischen den USA und dem Iran zu ziehen ist.

Weiterhin ist bei der Betrachtung der durchschnittlichen δ18OVSMOW-Werte der Pistazienproben

der drei Länder zu erkennen, dass sie sich genau in der zu erwartenden Reihenfolge ihrer Nieder-

schlagswerte (Iran → Türkei → USA) anordnen (s. Kap. 3.2.3, Tab. 5). In Kapitel 3.2.3 wurde

bereits ausgeführt, dass das 18O/16O-Verhältnis der Pflanzen mit dem des Wassers am Standort

korreliert, welches als Boden- und Grundwasser das längerfristige Mittel der örtlichen Nieder-

schläge widerspiegelt. Aus den Global Networt of Isotopes in Precipitation (GNIP)-Karten[142]

Asiens und Nordamerikas (s. Kap. 3.2.3, Abb. 21+22) ist zu ersehen, dass von den drei Pista-

zienhauptproduzenten (Iran, USA, Türkei) im Iran der an 18O angereicherteste Regen fällt. Es

wurde dazu auch schon erklärt, dass dies von der etwas näheren Lage des Landes zum Äquator

herrührt. Die Messergebnisse der iranischen Pistazien zeigen damit übereinstimmend auch die

höchsten δ18OVSMOW-Werte von den drei betrachteten Ländern.

Weiterhin ist aus den GNIP-Karten abzulesen, dass die δ18OVSMOW-Werte der Türkei und Kali-

forniens ähnlich sind. Auch dies war zu erwarten, da beide Gebiete fast auf dem gleichen Brei-

tengrad liegen (s. Kap. 3.2.3, Tab. 6) und sich damit kein prinzipieller Unterschied in dem 18O-

Abreicherungsgrad der Wolken ergibt (der 18O-Gehalt der Luftmassen nimmt vom Äquator zu

den Polen hin ab). Es ist jedoch ein deutlicher Trend in den Messwerten der Pistazien zu erken-

7. Ergebnisdiskussion

135

nen: Die δ18OVSMOW-Werte der türkischen Pistazien sind höher als die amerikanischen und daher

überlappen sich die Messwerte dieser beiden Länder nur und sind nicht homogen vermischt.

Die sog. „Höhen“- und „Kontinental“-Effekte (vgl. Kap. 3.2.3) können für die stärker positiven

türkischen δ18OVSMOW-Werte nicht verantwortlich sein, denn hier besteht ein negativer Zusam-

menhang. Danach müsste das Verhältnis umgekehrt sein (türkische δ18OVSMOW-Werte niedriger

als die amerikanischen), denn das Pistazienanbaugebiet der Türkei liegt höher über dem Meeres-

spiegel und mehr im Landesinneren als das California Central Valley in den USA. Es besteht

aber ein signifikanter positiver Zusammenhang zwischen dem 18O/16O-Verhältnis und der maxi-

malen Temperatur und relativen Luftfeuchtigkeit an einem Ort (s. Kap. 3.2.3). Die Klimatabellen

aus den Pistazienanbaugebieten dieser beiden Länder zeigen (s. Kap. 3.1.2, Abb. 4), dass die

jahresdurchschnittliche Temperatur und Luftfeuchtigkeit tatsächlich in der Türkei höher ist als in

dem Hauptanbaugebiet der USA (Kalifornien). Dies könnte die Erklärung für die gefundenen

δ18OVSMOW-Werte in den Pistazien dieser beiden Herkunftsorte sein.

Weitergehend zur Arbeit von Anderson et al.[7] sollten auch die Pistazien aus der Türkei klar von

den beiden anderen Ländern abgetrennt werden. Es besteht hier zwar keine Verfälschungsgefahr

von amerikanischen mit türkischen Pistazien, aber türkische Pistazien können mit iranischen

verwechselt bzw. bewusst vertauscht werden. Im Iran werden im Gegensatz zur USA (dort wird

fast ausnahmslos nur die große, weitgespaltene Sorte Kerman kultiviert) sehr viele verschiedene

Sorten angebaut und u.a. auch sehr kleine wie sie in der Türkei üblich sind. Aufgrund ihrer ge-

schmacklichen Qualität und der Nachfrage vieler türkischer Konsumenten in Deutschland (in

türkischen Supermärkten werden fast ausschließlich nur landeseigene Pistazien geführt) werden

türkische Pistazien vermehrt importiert und auch sehr geschätzt. Sie sind sehr viel teurer als ame-

rikanische oder iranische Pistazien (s. Kap. 3.1.4), da in der Türkei nur wenig produziert und

noch weniger exportiert wird (~1 %, s. Kap. 3.1.3) und ihr Weltmarktanteil ist daher sehr gering.

Die (Um-) Etikettierung (günstigerer) iranischer Pistazien als türkische ist somit wie bei den

amerikanischen sehr lohnenswert und bei steigender Nachfrage nach türkischen Pistazien aber

geringen oder gleich bleibenden Ernten ein potentiell wachsendes Problem.

Die Abtrennung der türkischen Pistazien von den iranischen ist jedoch nicht so einfach wie die

der USA, da sich die beiden Länder in allen drei betrachteten Stabilisotopenverhältnissen über-

schneiden. Der δ18O-Wert ist auch hier wieder die stärkste Trennkomponente, jedoch erst im

Zusammenspiel mit dem δ13C- oder δ15N-Wert kann eine deutliche Abtrennung der Punktwolke

des Irans von der der Türkei in den x-y-Streudiagrammen erkannt werden (s. Kap. 6.1, Abb.

42+43). Aber wie bei der Darstellung von Anderson et al.[7] (hier wurde keine deutliche Tren-

nung zwischen iranischen und türkischen Pistazien erreicht) ist es bei dieser einfachen, zweidi-

7. Ergebnisdiskussion

136

mensionalen Auftragung sehr schwer, die Herkunft einer unbekannten Probe zu bestimmen, vor

allem wenn sie genau zwischen zwei Punktwolken liegt.

Dieses Problem und weitere Hauptziel dieser Arbeit wurde mit Hilfe der multivariaten Datenana-

lyse gelöst. Es konnte hier sowohl mit der Hauptkomponenten- als auch der Diskriminanzanalyse

eine vollständige Trennung der drei Länder voneinander erreicht werden (s. Abb. 45 in Kap.

6.2.4 und Abb. 46+47 in Kap. 6.3.5).

Die Hauptkomponentenanalyse diente in diesem Fall nur zur Überprüfung der grundlegenden

Fähigkeit der gemessenen Stabilisotopenvariablen nach Ländern zu trennen (s. Kap. 6.2). Bei der

Betrachtung der Komponentenmatrizes (s. Tab. 42+43 in Kap. 6.2.3) stellte sich heraus, dass

Komponente 1 die Variablen derjenigen beiden Bioelemente (O und N) vereinigt, die schon nach

Pearson hoch miteinander korrelieren (s. Korrelationskoeffizienten-Tabelle 37 in Kap.5.3.5). Die

Korrelation zwischen dem Stickstoff- und Sauerstoff-Isotopenverhältnis in den Pistazien könnte

damit zusammenhängen, dass beide Elemente durch gleichartige exogene Faktoren beeinflusst

werden. Hierfür würden nur zwei in Frage kommen: Niederschlag und Dünger (s. Kap. 3.2.2 und

3.2.3). Beide Faktoren können sowohl auf das 18O/16O- als auch auf das 15N/14N-Verhältnis dis-

kriminierend einwirken. Außerdem ist beiden gemeinsam, dass sie fraktionierend auf das Isoto-

penverhältnis der Nährstoffe im Boden (z.B. Wasser, Nitrat) wirken bzw. dieses verändern bevor

die Pflanze diese aufnimmt. Niederschlag und Dünger können standortspezifische Isotopenver-

hältnis-Unterschiede auf Pflanzen übertragen, die sich um mehrere ‰ unterscheiden.

Auf die Hauptkomponente 2 lädt dagegen dasjenige Bioelement hoch (C), welches die Pflanzen

aus einem weitgehend homogenen Pool (Luft) aufnehmen. Das Isotopenverhältnis des Kohlen-

stoffs aus CO2 wird vornehmlich nur durch den Primär- und Sekundärstoffwechsel der Pflanze

selber beeinflusst und verändert. Pflanzeninterne Kohlenstoff-Diskriminierungen, die zu Stand-

ortunterschieden führen, können nur durch exogene Faktoren, die auf diese Pflanzenmetabolis-

men wirken (z.B. Klima, Höhe, Druck), hervorgerufen werden. Sie besitzen allerdings nur gerin-

ge Diskriminierungskräfte (2-3 ‰, s. Kap. 3.2.1).

Obwohl die Hauptkomponentenanalyse den authentischen Pistaziendatensatz vollständig nach

Ländern zu trennen vermag, ist sie als strukturen-entdeckendes Verfahren nicht dazu geeignet,

die Herkunft neuer, unbekannter Proben zu ermitteln. Dies liefert jedoch die Diskriminanzanaly-

se (s. Kap. 6.3), so dass auf die Erstellung des Diskriminanzmodells und die Auswahl der ver-

wendeten Variablen die größte Sorgfalt gelegt und alle Prüfkriterien genaustes analysiert wur-

den. Die schrittweise Diskriminanzanalyse hat dabei eine nicht überraschende Elementauswahl

der Variablen in der Reihenfolge Sauerstoff (Öl) → Kohlenstoff (Öl) → Stickstoff (entfetteter

7. Ergebnisdiskussion

137

Rückstand) getroffen (s. Kap. 6.3.1). Anders als bei der Hauptkomponentenanalyse lädt hier al-

lerdings das Sauerstoffisotop alleinig auf der 1. kanonischen Diskriminanzfunktion und leistet

den Hauptanteil zur Gruppentrennung. Die große Trennkraft des Sauerstoff-Isotopen-

verhältnisses hinsichtlich der Herkunft von Pistazien fiel bereits bei der Betrachtung der Box-

Plots (s. Kap. 5.2) und der Darstellung der δ-Messwerte in einfachen x-y-Streudiagrammen

(s. Kap. 6.1) auf.

Das Kohlenstoff-Isotopenverhältnis lädt auf der 2. kanonischen Diskriminanzfunktion. Es ist wie

bei der Hauptkomponentenanalyse das zweitwichtigste Element für die Herkunftsbestimmung

von Pistazien und ist für die Trennung zwischen den amerikanischen und türkischen Pistazien

verantwortlich. Dies wurde auch bei den einfachen x-y-Streudiagrammen schon erkannt, denn

das grafische Ergebnis der Auftragung des δ13CPDB-Werts gegen das 18O/16O-Verhältnis ist bes-

ser als das der δ15NAir-δ18OVSMOW-Auftragung (vgl. Abb. 43 mit Abb. 42 in Kap. 6.1).

Der δ15NAir-Variable wurde von der schrittweisen Diskriminanzanalyse als letztes ausgewählt

und lädt zusammen mit dem Kohlenstoffisotop auf der 2. Diskriminanzfunktion. Anders als bei

der Hauptkomponentenanalyse, bei der das Stickstoffisotop aufgrund seiner Korrelation und dem

Beitrag zur Abtrennung der iranischen Proben mit dem Sauerstoffisotop zu einer Komponente

gebündelt wurde, hat die Diskriminanzanalyse das Stickstoffisotop hauptsächlich auf der gegen-

sätzlichen Achse vom Sauerstoffisotop wirken lassen. Zusammen mit dem δ13C-Wert verschiebt

das Stickstoff-Isotopenverhältnis die Punktwolke der Türkei in y-Richtung, also weiter weg von

den iranischen Pistazien. Damit ist die Diskriminanzanalyse ihrem Grundprinzip gefolgt, näm-

lich die vorgegebenen Gruppen bestmöglich voneinander zu trennen. Im Gegensatz zur Diskri-

minanzanalyse kann die Hauptkomponentenanalyse dies nicht leisten, da sie ein strukturen-

entdeckendes Verfahren ist und keine Gruppen vorgegeben sind.

Um zu testen, ob die Stickstoffvariable wirklich einen relevanten Trennbeitrag leistet, wurden

zwei Diskriminanzmodelle aufgestellt, einmal mit allen drei (den optimalen) Stabilisotopenvari-

ablen und zum anderen nur mit der Sauerstoff- und Kohlenstoffvariable. Es stellte sich heraus,

dass sowohl mit dem 3- als auch mit dem 2-Variablenmodell Klassifizierungsmodelle aufgestellt

werden konnten (s. Kap. 6.3.2), welche in der Überprüfung der Sicherheit mit den drei einschlä-

gigen Schätzverfahren (R-, L-, H-Methode) eine 100 %ig richtige Einordnung der Quasi-Proben

erreichen (s. Kap. 6.3.3). Der Beitrag, den die Stickstoff-Isotopenverhältnisvariable „δ15N Rück-

stand“ zur Trennung der drei Pistazienanbauländer leistet, ist daher nur sehr gering.

7. Ergebnisdiskussion

138

Der Vorteil der Diskriminanzanalyse gegenüber einer einfachen zweidimensionalen Auftragung

der δ-Werte wird beim Vergleich mit einer δ13CPDB-δ18OVSMOW-Auftragung der Pistazienöldaten

deutlich (vgl. nachfolgende Abb. 56+57).

-4

-2

-8 -4 0 4 8

1. kanonische Diskriminanzfunktion (90 % Varianz = δ18O Öl)

Gruppenzentroide

2. kanonische Diskriminanzfunktion

(10 % Varianz = 13C Öl + 15N Rückstand)

Abbildung 56:

Wiederholung der Abb. 46 aus Kap. 6.3.5

(Darstellung der Diskriminanzfunktionswerte)

Abbildung 57:

Auftragung der δ13CPDB- gegen die δ18OVSMOW-

Messwerte der authentischen Pistazienöle

Die grundsätzlichen Strukturen des Datensatzes und dessen grafische Darstellung, d.h. die Lage

und das Aussehen der Punktwolken, ähneln sich zwar sehr, aber bei genauerer Betrachtung der

Abbildungen 56 sind doch kleine Unterschiede zu dem in Abbildung 57 gezeigten einfachen

Vergleichsstreudiagramm festzustellen: Die Punktwolken der grafischen Darstellung der Dis-

kriminanzfunktionswerte (s. auch Abb. 46+47 in Kap. 6.3.5) sind in sich dichter und dazwischen

besser voneinander abgetrennt und vor allem die Punktwolke der türkischen Proben ist in y-

Richtung etwas weiter nach oben verschoben. Durch die Anwendung der Diskriminanzanalyse

auf das authentische Datenmaterial der Pistazien wurde das Ziel, eine 100 %ige Trennung der

Pistazien nach ihren Herkunftsländern, erreicht und vor allem durch das Klassifizierungsmodell

die Möglichkeit gegeben, unbekannte Proben statistisch abgesichert einem der drei Hauptanbau-

länder zuzuordnen. Dies ist mit einem einfachen x-y-Streudiagramm nicht möglich, denn wenn

sich unbekannte Proben genau in dem Bereich zwischen zwei Punktwolken anordnen (gekenn-

zeichnet durch Ellipsen in Abb. 57), kann nicht entschieden werden, zu welchem Land die Probe

gehört.

Hiermit ist der Lebensmittelüberwachung erstmals eine leistungsfähige und bei gegebener Gerä-

tevoraussetzung auch einfache und schnelle Methode an die Hand gegeben, die Herkunft von

Pistazien nachzuweisen. Da sich außerdem gezeigt hat, dass auch die linearen Klassifizierungs-

funktionen nach Fisher anwendbar sind (s. Kap. 6.3.4), ist dies wirklich eine praktikable Labor-

methode, mit der ganz ohne den authentischen Lerndatensatz und statistischer Computersoftware

die Prüfung der Herkunft einer Pistazienprobe mit Hilfe des Taschenrechners erfolgen kann.

-31

-30

-29

-28

24 26 28 30 32 34 36 38 40 42

δ18OVSMOW Öl

δ13CPDB Öl

7. Ergebnisdiskussion

139

Dem Klassifizierungsmodell sind jedoch auch deutliche Grenzen gesetzt, die bei der Anwendung

beachtet werden müssen. So können Pistazien anderer Länder generell mit der Diskriminanzana-

lyse nicht erkannt werden, da sie als strukturen-prüfendes Verfahren jede Probe in eine der vom

Lerndatensatz vorgegebenen Gruppen einordnen muss. Eine Überprüfung der Leistungsfähigkeit

der Stabilisotopenvariablen mit einigen „exotischen“ Pistazienproben aus kleineren Anbaulän-

dern durch eine erneute Hauptkomponentenanalyse hat gezeigt, dass diese anderen Länder keine

separaten Gruppen bilden (s. Kap. 6.4.5). In der Praxis stellen Pistazien aus anderen Ländern als

dem Iran, der USA und der Türkei auf dem deutschen und europäischen Markt kaum ein Prob-

lem dar, da nach den Importstatistiken der UN[261] zu über 95 % nur aus den drei Hauptanbau-

ländern importiert wird.

Eine weitere Grenze des hier erstellen Diskriminanzmodells liegt in der Erkennung von Pista-

zienmischungen aus verschiedenen Ländern (s. Kap. 6.4.3). Auch hier ist die zwangsweise Ein-

ordnung von allen Proben in eine der drei Gruppen durch das Klassifizierungsmodell hinderlich.

Im Versuch konnten Beimischungen von iranischen Pistazien zu amerikanischen ab ca. 30 %

optisch im Streudiagramm erkannt werden, jedoch wurde die USA-Iran-Mischung im Verhältnis

von 70:30 statistisch vom Modell noch zu den amerikanischen Proben geordnet und wäre damit

nicht auffällig. Hilfestellung kann das System hier nur durch die Abfrage der Wahrscheinlichkeit

der Gruppenzugehörigkeit geben, die in der Statistiksoftware SPSS 12.0 für jede Entschei-

dung/Probe abgerufen werden kann.

Eine weitere Schwierigkeit im Zusammenhang mit falschen Klassifizierungen wurde bei der

Betrachtung der Ausreißer im authentischen Pistaziendatensatz aufgedeckt. Fünf amerikanische

Proben sind wegen ihrer auffälligen δ15NAir- und δ18OVSMOW-Werte von drei verschiedenen Aus-

reißertests als solche identifiziert worden, obwohl ihre amerikanische Authentizität kaum anzu-

zweifeln ist. Auffällig war hier der Verpackungsvermerk „USDA organic“ (= biologischer An-

bau) bei den Proben Nr. 61 und 69. Durch diese besondere Produktion ist das Stickstoff- und

Sauerstoff-Isotopenverhältnis dieser Proben ganz offensichtlich gegenüber herkömmlich produ-

zierten Pistazien verändert worden, denn sieben weitere, in dieser Arbeit untersuchte Proben der

gleichen Herstellerfirma ohne diesen Vermerk sind unauffällig (Nr. 58-60, 65-68, vgl. Probenlis-

te in Kap. 9.1). Im biologischen Anbau dürfen nur organische Dünger anstelle von kommerziel-

len Mineraldüngern verwendet werden, was sich sicherlich auf den δ15NAir-Wert der Proben Nr.

61 und 69 ausgewirkt bzw. diesen erhöht (s. Kap. 3.2.2) hat.

Der Einfluss von Dünger wäre auch eine denkbare Erklärung für die Erhöhung im Stickstoff-

Isotopenverhältnis der beiden Ausreißerproben Nr. 34 und 35, bei denen es sich um Pistazien

handelt, die direkt von einer kleineren Farm bezogen wurden. Eventuell kultiviert und verarbeitet

7. Ergebnisdiskussion

140

diese Farm ihre Pistazien nicht großtechnisch bzw. baut „biologisch“ an, da sie nur für ihren di-

rekten Eigenverkauf produziert.

Der Einfluss von Dünger ist schon in mehreren Veröffentlichungen beschrieben wor-

den[49,234,244,299], denn organische Dünger wie Stallmist oder Gülle haben wesentlich höhere

δ15NAir-Werte als synthetische Mineraldünger (häufiger verwendete Düngerart in der Landwirt-

schaft) und erhöhen bei Aufbringung den 15N-Gehalt im Boden und somit auch in den Pflanzen.

Zudem scheint organischer Dünger auch Einfluss auf das δ18OVSMOW-Verhältnis zu nehmen, was

so noch nicht in der Literatur beschrieben wurde, jedoch an diesen Proben beobachtet werden

konnte, da sie häufig gleichzeitig in diesem Element als Ausreißer gekennzeichnet werden. Über

den δ18OVSMOW-Wert von organischen Düngern ist in der Literatur nur wenig zu finden, es wurde

nur das Sauerstoff-Isotopenverhältnis von Gülle als wesentlich niedriger als das von syntheti-

schen Mineraldüngern beschrieben (s. Abb. 25, Kap. 3.2.3).[4,269] Es gibt jedoch noch viele ande-

re organische Dünger (die auch nach der VO (EWG) Nr. 2092/91 im ökologischen Landbau zu-

gelassen sind),[270] denen zwar eine δ15NAir-erhöhende Wirkung in Pflanzen nachgewiesen wur-

de,[15,244] aber das 18O/16O-Verhältnis ist nicht bestimmt worden. Eventuell ist der prozentuale

Stickstoffanteil in organischen Düngern geringer und der Sauerstoffanteil höher als bei Mineral-

düngern und es wird dadurch insgesamt bei der Düngung mit z.B. Gülle mehr Sauerstoff auf die

Felder aufgebracht. Somit könnte auch mehr Fremdsauerstoff in die Pflanzen gelangen und auf

das Isotopenverhältnis in der Pflanze Einfluss nehmen.

Unter der hypothetischen Annahme, dass es organische Dünger mit hohen δ18OVSMOW-Werten

gibt, müsste sich der Sauerstoff des Düngers außerdem noch mit dem Bodenwasser equilibrieren

oder darin lösen, denn das 18O/16O-Verhältnis der Pflanzen ist streng mit dem lokalen Grundwas-

ser und daher nicht mit den Düngemitteln korreliert. Einen Hinweis, dass sich der Sauerstoff von

Düngemitteln tatsächlich mit dem Bodenwasser equilibriert, gibt die Korrelationsanalyse in Kap.

5.3.5. Hiermit wurde statistisch klar bewiesen, dass das 15N/14N-Verhältnis der Pistazien immer

hoch mit dem des Sauerstoffs korreliert, d.h. ungedüngte wie durch Dünger beeinflusste Pista-

zien korrelieren über das lokale Bodenwasser mit ihrer Sauerstoff- und Stickstoffquelle. Es ist

außerdem anzunehmen, dass Pistazienplantagen generell mit irgendeiner Art von Dünger behan-

delt werden, d.h. alle untersuchten Pistazienproben sind gedüngt. Diese Vermutungen sind je-

doch rein hypothetisch und da die genauen Umstände und Behandlungen der Pistazienpflanzen

im biologischen Anbau der USA nicht genau bekannt sind, könnten auch andere, äußere Fakto-

ren als die organische Düngung das 18O/16O-Verhältnis beeinflusst haben.

Wiedererwartend hat sich das erhöhte Stickstoff-Isotopenverhältnis bei den amerikanischen Aus-

reißerproben bei der Diskriminanzanalyse nicht als problematisch herausgestellt, denn sie wer-

7. Ergebnisdiskussion

141

den trotzdem ihrer Gruppe richtig zugeordnet. Nur die Erhöhung des δ18OVSMOW-Werts bewirkt

eine optisch auffällige Lage solcher Proben rechts neben der amerikanischen Punktwolke.

Der Versuch mit USA-Iran Mischproben (s. Kap. 6.4.3) hat außerdem gezeigt, dass erst ab einem

Mischungsverhältnis von 50 % amerikanischen und 50 % iranischen Pistazien die Probe in die

iranische Gruppe klassifiziert wurde. Da das 18O/16O-Verhältnis die ausschlaggebende Trennva-

riable im Pistazienklassifizierungsmodell ist, führen Erhöhungen in diesem Wert zu einer Ver-

schiebung in Richtung der iranischen Punktwolke, denn iranische Pistazien haben die höchsten

δ18O-Werte von allen drei untersuchten Ländern. Biologisch angebaute, amerikanische Pistazien

werden somit zwar nicht vom System falsch klassifiziert, können grafisch aber wie Mischproben

aussehen und daher im äußersten Fall zu einer falsch positiven Beanstandung führen.

Die Punktwolke der türkischen Proben hat in diesem Fall keine Probleme gemacht, da sie in der

grafischen Darstellung des Diskriminanzmodells (s. Kap. 6.3.5, Abb. 46+47) oberhalb der ame-

rikanischen und iranischen liegt, so dass keine Fehlklassifizierungen von amerikanischen Proben

in diese Gruppe vorkommen können. Es ist damit festzustellen, dass es mit der Diskriminanzana-

lyse zu keiner Verwechslung von Proben der USA mit denen aus dem Iran (und umgekehrt)

kommen kann. Diese beiden Gruppen sind aufgrund des Sauerstoff-Isotopenverhältnisses sehr

weit voneinander getrennt.

Die fünfte amerikanische Ausreißerprobe (Nr. 33), die ebenfalls direkt von einer kalifornischen

Farm bezogen wurde, hat dagegen ein erniedrigtes 15N/14N-Verhälnis und das 18O/16O-Verhältnis

ist alleinig beim Öl erhöht. Von dieser speziellen Farm ist bekannt, dass sie anders als der Groß-

teil der Pistazienbauern in Kalifornien nicht die übliche Pistaziensorte Kerman sondern Arya und

Kaleghuchi anbaut. Vielleicht ist der Sortenunterschied eine Erklärung für das Ausreißen dieser

Probe. Literaturstellen, die sich mit der Auswirkung der Sorte auf die Isotopenverhältnisse be-

schäftigen, konnten bisher nur für das 15N/14N-Verhältnis gefunden werden[213] (s. Kap. 3.2.2).

Fast alle Ausreißer des authentisch-türkischen Datensatzes finden sich (wie bei den amerikani-

schen Ausreißerproben) nur bei den δ15NAir- und δ18OVSMOW-Werten, welche auch hier immer

erhöht gegenüber den Durchschnittswerten sind. Hier könnte wie bei den organisch produzierten

Proben im amerikanischen Datensatz ein Zusammenhang mit der landwirtschaftlichen Produkti-

on bestehen.

Biologisch angebaute türkische Pistazien können jedoch nicht wie die amerikanischen von irani-

schen Pistazien unterschieden werden und Mischungen ebenfalls nicht. Eine Erhöhung des

δ15NAir- und/oder des δ18OVSMOW-Werts verschiebt die Proben zwangsläufig in die iranische

Punktwolke und daher würden türkische „Bio-“ Pistazien immer zu falsch positiven Beanstan-

dungen führen. Allerdings ist der ökologische Anbau etwas Besonderes und wird vom Konsu-

menten sogar mit höheren Preisen bezahlt, daher werden derartig angebaute Pistazien in der Pra-

7. Ergebnisdiskussion

142

xis sicherlich immer mit dieser Besonderheit beworben. So kann bei der Beurteilung einer tür-

kisch etikettierten Probe, welche vom Klassifizierungsmodell als iranische erkannt wird, dieser

Umstand in Betracht gezogen werden.

Die Messung des 15N/14N-Verhältnisses zur Herkunftsbestimmung von Pistazien hat sich somit

in dieser Arbeit als generell weniger wichtig erwiesen. Der δ15NAir-Wert wurde von der schritt-

weisen Diskriminanzanalyse zwar als dritte und letzte Variable ins System mit aufgenommen, er

leistet aber nur einen geringen Trennbeitrag und es konnte gezeigt werden, dass die Klassifika-

tion genauso gut ohne die Einbeziehung der Stickstoffvariable funktioniert. Das Stickstoffisotop

wird auch in der Literatur nicht häufig zur Herkunftsbestimmung herangezogen sondern eher zur

Bestimmung der primären Stickstoffquelle genutzt. Da das Stickstoff-Isotopenverhältnis von

Pflanzen direkt von dem des Bodens abhängt, schlagen sich exogene Einträge in den Boden wie

Düngemittel auch sofort in den Pflanzen nieder. Das Stickstoff-Isotopenverhältnis kann in der

Lebensmittelanalytik daher kaum lokale Gegebenheiten mit Sicherheit widerspiegeln und ist

somit wenig aussagekräftig bzw. kann schlimmsten Falls zu Falschaussagen bei Authentizitäts-

prüfungen wie im Falle der Düngung führen.

Die Aussagekraft einfacherer Modelle zur Herkunftsbestimmung von Pistazien, wie die zweidi-

mensionale Auftragung des δ15NAir-Werts gegen das C/N-Verhältnis von Anderson et al.[7], sind

durch die Anfälligkeit des Stickstoff-Isotopenverhältnisses gegenüber Fremdeinflüssen im Bo-

den noch gefährdeter. Eine biologisch angebaute amerikanische Pistazienprobe würde z.B. im

Anderson-Modell weit über der amerikanischen Punktwolke platziert werden, so dass sie zwar

sehr auffällig, jedoch überhaupt nicht mehr interpretierbar ist. Evtl. würde sie aufgrund des C/N-

Verhältnisses sogar zur iranischen Punktwolke hin verschoben und dann als „falsch deklariert“

beurteilt werden.

Die hier vorgestellte, validierte 13C-, 15N- und 18O-Methode zur IRMS-Vermessung von Pista-

zien und das mit Hilfe der Diskriminanzanalyse aufgestellte Modell zu ihrer Klassifizierung ist

trotz der zuvor diskutierten Limitierungen des Modells eine durchaus für die Praxis einsetzbare

und geeignete Methode, um die Authentizität von etikettierten Pistazien zu überprüfen oder die

geografische Herkunft von unbekannten Pistazienproben zu ermitteln. Die Wahl der IRMS als

Messtechnik ist eine wesentliche Verbesserung der bisher in der Literatur[7,73,74,241] beschriebe-

nen Versuche, die Herkunft von Pistazien nachzuweisen, da sie viel schneller, sicherer und ein-

facher zum Ergebnis führt. Durch den ausreichend groß gewählten authentischen Datensatz (>25

Proben pro Land) und die Überprüfung der Modellgüte mit der Resubstitutions-, Leaving-one-

out- und Hold-out-Methode, ist das erstellte Diskriminanzmodell auch so gut statistisch abgesi-

7. Ergebnisdiskussion

143

chert, dass dem Klassifizierungsergebnis vertraut und ein Lasso-Effekt ausgeschlossen werden

kann.

Natürlich ist die Methode noch verbesserungsfähig, da z.B. andere Länder als die drei Hauptpro-

duzenten nicht erkannt werden können. Zur Verbesserung müssten zum einen mehr authentische

Proben von anderen Ländern gesammelt und zum anderen noch andere herkunftsspezifische Va-

riablen gefunden werden. Erst dann könnte ein aussagekräftigeres Modell erstellt werden, denn

die hier gemachten Vorversuche mit der Hauptkomponentenanalyse haben gezeigt, dass mit den

drei Stabilisotopenvariablen allein keine neue Gruppe durch eines der „exotischen“ Länder ge-

bildet wird. Das D/Η-, 34S/32S-, oder 87Sr/86Sr-Verhältnis, NMR- oder ICP-MS-Daten könnten

hier z.B. hilfreiche Ergänzungen sein. Außerdem sollte auch der Jahrgangseinfluss untersucht

werden, um die evtl. dadurch eingebrachte höhere Streuung in den Werten berücksichtigen und

bewerten zu können.

Nähere Untersuchungen des Einflusses verschiedener organischer Dünger auf den δ15NAir- und

δ18OVSMOW-Wert der Pflanzen im Labor- oder Feldversuch würden mehr Klarheit über die Rich-

tung der Beeinflussung geben. Außerdem wäre es noch sehr interessant, das Pistazienöl mit einer

GC-IRMS-Kombination zu vermessen, um den δ13CPDB-, δ18OVSMOW- und δ2HVSMOW-Wert der

einzelnen Fettsäuren zu ermitteln, da hier eine Verschärfung der Trennung zu erwarten ist und

dadurch eine Erleichterung bei der Erweiterung des Klassifizierungsmodells auf mehr als die

drei Hauptanbauländer erreicht werden könnte.

8. Zusammenfassung

144

8. Zusammenfassung

145

Zusammenfassung

8. Zusammenfassung

146

Im weltweiten Pistazienhandel kommt es immer wieder zu Verfälschungen, weil iranische Pista-

zien umetikettiert und als teurere, amerikanische Ware verkauft oder amerikanischen Pistazien

beigemischt werden. Dadurch wird der Verbraucher nicht nur gemäß §17 des LFGB’s getäuscht,

sondern evtl. sogar gesundheitlich gefährdet. Iranische und auch türkische Pistazien müssen per

Gesetz vor dem Import in die EU auf ihre Aflatoxinbelastung hin untersucht werden, weil diese

häufig zu hoch ist, während amerikanische Pistazien keiner Vorführpflicht unterliegen. Es steht

der Lebensmittelüberwachung jedoch bisher noch keine Methode zur Verfügung, mit der die

Herkunft von Pistazien eindeutig bestimmt und die Etikettierung überprüft werden kann.

In dieser Arbeit wird nun ein Diskriminanzmodell vorgestellt, welches mit Hilfe der IRMS-

Messtechnik eine eindeutige Authentizitätsbestimmung von Pistazien aus den drei Hauptproduk-

tionsländern Iran, USA und Türkei leistet.

Zur Erstellung dieser Methode wurde zuerst die Messmethodik sehr genau überprüft, um die

Gültigkeit und Verwendbarkeit der Ergebnisse abzusichern. So sind Feststoffarbeitsstandards für

alle gemessenen Isotope und die Referenzgase gegen zertifizierte Referenzmaterialien kalibriert

und ihre Eignung und die Beherrschung der Messmethode durch den positiv ausgefallenen Ver-

gleich mit den Herstellerangaben der Gerätepräzisionen überprüft worden.

Durch die Führung von Qualitätsregelkarten mit in jeder Sequenz vermessene Gerätekontroll-

proben konnte jederzeit kontrolliert werden, dass die Stabilität der Referenzgase und aller ver-

wendeten Materialen und Chemikalien über den Messzeitraum hinweg (ca. ein Jahr) gegeben

war. Durch eine Alterungsstudie konnte außerdem der Beweis erbracht werden, dass sich auch

die Stabilisotopenverhältnisse des Analyten selber, der Pistazienproben, nicht veränderten son-

dern stabil blieben. Da mit der 13C-, 15N- und 18O-Methode richtige, wiederholbare und ver-

gleichbare Ergebnisse produziert wurden, konnten sie im Zuge dieser Untersuchung auch vali-

diert werden. Weitere Voruntersuchungen ergaben, dass eine Vermahlung von 20 g Pistazien-

kernen mit Haut pro Probe (Handelsverpackung) statistisch ausreichend ist und auch aus den

kleinsten Handelspackungen (50 g) noch gewonnen werden kann. Die Verwendung der Pista-

zienschale als Probenmaterial entfiel aufgrund fehlenden Stickstoffvorkommens, ihrer extremen

Härte und weil im Handel auch schalenlose Pistazien angeboten werden. Die biologische Streu-

breite einer Pistazienhandelsverpackung wurde zufrieden stellend zu <1 ‰ ermittelt.

Des Weiteren hat sich gezeigt, dass sowohl die Soxhlet-Extraktion als auch die ASE zur Gewin-

nung des Pistazienöls und des entfetteten Rückstands diskriminierungsfrei arbeiten und die Ver-

wendung des Pistazienöls für die IRMS-Messung sehr vorteilhaft ist, da die Flüssigkeit eine we-

sentlich homogenere Matrix darstellt und dadurch kleinere Standardabweichungen resultieren.

Auch für die Verarbeitungsschritte „Röstung“ und „Salzung“ kann Diskriminierungsfreiheit an-

8. Zusammenfassung

147

genommen werden, da der Betrag der Diskriminierung, der durch die Röstung und/oder Salzung

eingebracht wird, vernachlässigbar klein im Vergleich zur biologischen Streubreite ist.

Nach der Absicherung der Methodik wurden 101 authentischen Pistazienproben mit der IRMS

vermessen. Es wurde jeweils das 13C/12C-, 15N/14N- und 18O/16O-Verhältnis der vermahlenen

Probe, des daraus gewonnenen Pistazienöls und des verbleibenden entfetteten Rückstands be-

stimmt und die δ-Wertergebnisse danach eingehend statistisch untersucht. Ihre Betrachtung in

Box-Plot-Darstellungen und x-y-Streudiagrammen zeigte schon das sehr gute Potential der ge-

wählten Stabilisotopenvariablen, den authentischen Pistaziendatensatz nach Ländern zu trennen.

Mit Hilfe von drei verschiedenen Tests wurde dieser anschließend von Ausreißern bereinigt,

sowie die Daten auf ihre Normalverteilung, Varianzhomogenität, Gruppenunterschiede und Kor-

relation hin analysiert. Erst nachdem all diese Punkte zur Zufriedenheit überprüft wurden, ist der

authentische Datensatz zur multivariaten Datenanalyse zugelassen worden.

Zur multivariaten Untersuchung des authentischen Datensatzes wurde zuerst die Hauptkompo-

nentenanalyse herangezogen, um dessen Struktur zu überprüfen. Mit ihr kann getestet und si-

chergestellt werden, dass die gemessenen Variablen ohne jegliche Vorgabe der Herkunft das

Datenmaterial nach Ländern trennen und somit zur Herkunftsbestimmung geeignet sind. Das

Ergebnis war eine vollständige Trennung der drei Länder voneinander, so dass der authentische

Datensatz weiter mit einem strukturen-prüfenden Verfahren untersucht werden konnte. Aufgrund

der Art der Daten kam als Klassifikationsmodell nur die Diskriminanzanalyse in Frage. Auch

hier wurde eine vollständige Trennung der drei Länder erreicht und somit konnte ein Klassifizie-

rungsmodell erstellt werden, mit dem die Herkunft neuer, zweifelhafter oder unbekannter Pista-

zienproben festgestellt werden kann. Das System hat die Variablen „δ18O Öl“, „δ13C Öl“ und

„δ15N Rückstand“ als aussagekräftigste Variablen zur Erstellung des Diskriminanzmodells aus-

gewählt, jedoch zeigte die Prüfung der Sicherheit des Modells mit den drei einschlägigen

Schätzverfahren (R-, L- und H-Methode), dass die Stickstoffvariable nicht unbedingt mit einbe-

zogen werden muss. Eine echte Laboranwendbarkeit ist außerdem gegeben, da die linearen Klas-

sifikationsfunktionen nach Fisher anwendbar sind.

Mit 63 weiteren Proben wurden durch Anwendungsbeispiele die Stärken und Schwächen der

Methode aufgezeigt.

9. Material und Methoden

148

9. Material und Methoden

149

Material und

Methoden

9. Material und Methoden

150

9.1 Probenliste

authentisch iranische Pistazienproben

Proben-Nr.

grün

geröstet

gesalzen

Erntejahr

Bereitgestellt von:

1 9 2001 Gastgeschenk einer iranischen Delegation

2 9 2002

Ministry of Health & Medical Education

Food & Drug Control Labs / Tehran

3 9 2002

Ministry of Health & Medical Education

Food & Drug Control Labs / Tehran

4 9 2002

Ministry of Health & Medical Education

Food & Drug Control Labs / Tehran

5 9 2002

Ministry of Health & Medical Education

Food & Drug Control Labs / Tehran

6 9 2002

Ministry of Health & Medical Education

Food & Drug Control Labs / Tehran

7 9 2002

Ministry of Health & Medical Education

Food & Drug Control Labs / Tehran

8 9 2002

Ministry of Health & Medical Education

Food & Drug Control Labs / Tehran

9 9 2002

Ministry of Health & Medical Education

Food & Drug Control Labs / Tehran

10 9 2002

Ministry of Health & Medical Education

Food & Drug Control Labs / Tehran

11 9 2002

Ministry of Health & Medical Education

Food & Drug Control Labs / Tehran

12 9 2002

Wierts/Eggert/Jörissen GmbH Hamburg

Handels- und Umweltschutzlaboratorium

13 9 2002

Wierts/Eggert/Jörissen GmbH Hamburg

Handels- und Umweltschutzlaboratorium

14 9 2002

Wierts/Eggert/Jörissen GmbH Hamburg

Handels- und Umweltschutzlaboratorium

15 9 2002 Khatam Lab / Tehran

16 9 2002 Khatam Lab / Tehran

17 9 2002 Khatam Lab / Tehran

18 9 2002 Khatam Lab / Tehran

9.1 Probenliste

151

authentisch iranische Pistazienproben (Forts.)

Proben-Nr.

grün

geröstet

gesalzen

Erntejahr

Bereitgestellt von:

19 9 2002 Khatam Lab / Tehran

20 9 2002 Khatam Lab / Tehran

21 9 2002 Khatam Lab / Tehran

22 9 2002 Khatam Lab / Tehran

23 9 2002 Khatam Lab / Tehran

24 9 2002 Khatam Lab / Tehran

25 9 2002 Khatam Lab / Tehran

26 9 2002 Khatam Lab / Tehran

27 9 2002 Khatam Lab / Tehran

28 9 2002 Khatam Lab / Tehran

29 9 2002 Khatam Lab / Tehran

30 9 9 2002

Orlux Import-Export GmbH /

Frankfurt am Main

31 9 2002 KaDeWe / Berlin

32 9 9 2002 KaDeWe / Berlin

9. Material und Methoden

152

Proben-Nr.

roh

geröstet

gesalzen

lose Ware

ohne Schale

Erntejahr

Bereitgestellt / Bezogen von:

33 9 9 2002 Orandi Farms / Kalifornien

34 9 2002 Van Mourik Farms / Kalifornien

35 9 9 9 2002 Van Mourik Farms / Kalifornien

36 9 2002 Wierts/Eggert/Jörissen GmbH

37 9 2002 Wierts/Eggert/Jörissen GmbH

38 9 9 2002 California Pistachio Commission

39 9 9 2002 California Pistachio Commission

40 9 9 2002 California Pistachio Commission

41 9 9 2002 California Pistachio Commission

42 9 9 2002 California Pistachio Commission

43 9 9 2002 California Pistachio Commission

44 9 9 2002 California Pistachio Commission

45 9 9 2002 California Pistachio Commission

46 9 9 2002 California Pistachio Commission

47 9 9 2002 California Pistachio Commission

48 9 2002

Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

49 9 2002 Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

50 9 9 9 2002 Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

51 9 9 9 2002

Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

authentisch US amerikanische Pistazienproben

9.1 Probenliste

153

Proben-Nr.

roh

geröstet

gesalzen

lose Ware

ohne Schale

Erntejahr

Bereitgestellt / Bezogen von:

52 9 9 2002 Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

53 9 9 2002 Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

54 9 2002 Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

55 9 2002 Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

56 9 9 9 2002 Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

57 9 9 9 2002 Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

58 9 2002

Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

59 9 2002 Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

60 9 ½ 2002 Supermarkt in San Diego /

Kalifornien

61 9 9 2002 Supermarkt in San Diego /

Kalifornien → biologischer Anbau

62 9 9 2002 Supermarkt in Los Angeles /

Kalifornien

63 9 9 9 2002

Supermarkt in Los Angeles /

Kalifornien

64 9 2002

Supermarkt in Los Angeles /

Kalifornien

65 9 2002 Supermarkt in Los Angeles /

Kalifornien

66 9 ½ 2002 Supermarkt in Los Angeles /

Kalifornien

67 9 ½ 2002 Supermarkt in Los Angeles /

Kalifornien

68 9 9 2002 Supermarkt in Los Angeles /

Kalifornien

69 9 9 2002 Supermarkt in Los Angeles /

Kalifornien → biologischer Anbau

70 9 2002 Supermarkt in Los Angeles /

Kalifornien

authentisch US amerikanische Pistazienproben (Forts.)

9. Material und Methoden

154

Proben-Nr.

geröstet

gesalzen

lose Ware

ohne Schale

Erntejahr

Bereitgestellt / Bezogen von:

71 9 9 9 2001 Markt in der Türkei

72 9 9 2001 Naturkostladen, Berlin, biol. Anbau

73 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

74 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

75 9 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

76 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

77 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

78 9 9 9 2002 Großhandel

79 9 9 9 2002 Großhandel

80 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

81 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

82 9 9 9 2002 Türkischer Marktstand in Berlin

83 9 9 9 2002 Türkischer Marktstand in Berlin

84 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

85 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

86 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

87 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

88 9 9 1998 Türkischer Supermarkt, Berlin

89 9 9 1998 Türkischer Supermarkt, Berlin

authentisch türkische Pistazienproben

9.1 Probenliste

155

Proben-Nr.

geröstet

gesalzen

lose Ware

ohne Schale

Erntejahr

Bereitgestellt / Bezogen von:

90 9 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

91 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

92 9 9 2003 Türkischer Supermarkt, Berlin

93 9 9 2003 Türkischer Supermarkt, Berlin

94 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

95 9 9 9 2003 Türkischer Marktstand in Berlin

96 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

97 9 9 2002 Türkischer Supermarkt, Berlin

98 9 9 2003 Türkischer Supermarkt, Berlin

99 9 9 9 2003 Türkischer Supermarkt, Berlin

100 9 9 2003 Türkischer Supermarkt, Berlin

101 9 9 9 2003 Türkischer Supermarkt, Berlin

authentisch türkische Pistazienproben (Forts.)

9. Material und Methoden

156

Proben-Nr.

grün

geröstet

gesalzen

lose Ware

ohne Schale

Erntejahr

Deklarierte Herkunft: Bezogen aus / von:

102 9 9 2001 Iran Supermarkt, Berlin

103 9 9 9 2001 Iran Supermarkt, Wiesbaden

104 9 2001 Iran Supermarkt, Wiesbaden

105 9 9 2001 Iran Privatperson

106 9 9 2002 Iran Supermarkt, Berlin

107 9 9 2002 Iran Supermarkt, Spanien

108 9 9 2001 Iran Supermarkt, Berlin

109 9 9 1999 Kalifornien Supermarkt, Berlin

110 9 9 2001 Kalifornien Supermarkt, Berlin

111 9 9 2001 Kalifornien Supermarkt, Berlin

112 9 9 2001 Kalifornien Supermarkt, Berlin

113 9 9 2001 Kalifornien Supermarkt, Berlin

114 9 9 2001 Kalifornien Supermarkt, Berlin

115 9 9 2001 Kalifornien Privatperson

116 9 9 2001 Kalifornien Privatperson

117 9 9 2001 Kalifornien Privatperson

118 9 9 2002 Kalifornien Supermarkt, Berlin

119 9 9 1998 Kalifornien Restbestand FB 222

120 9 9 2001 Kalifornien Supermarkt, New York

Handelsproben mit Herkunftsdeklaration

9.1 Probenliste

157

Proben-Nr.

grün

geröstet

gesalzen

lose Ware

ohne Schale

Erntejahr

Deklarierte Herkunft: Bezogen aus / von:

121 9 9 2001 USA Supermarkt, New York

122 9 9 2001 USA Supermarkt, Berlin

123 9 9 9 2002 USA Supermarkt, Canada

124 9 9 2001 USA Supermarkt, Berlin

125 9 9 2002 USA Supermarkt, Berlin

126 9 9 2001 USA Supermarkt, Berlin

127 9 9 2000 Griechenland Supermarkt, Griechenland

128 9 9 2000 Griechenland Supermarkt, Griechenland

129 9 9 9 2001 Griechenland Markt in Griechenland

130 9 9 2001 Griechenland Supermarkt, Griechenland

131 9 9 9 2001 Griechenland Markt in Griechenland

132 9 9 9 2001 Griechenland Markt in Griechenland

133 9 9 9 2001 Syrien Markt in Syrien

134 9 2002 Syrien Grüne Woche, Berlin

135 9 9 9 2002 Syrien Grüne Woche, Berlin

136 9 9 9 2002 Marokko Grüne Woche, Berlin

137 9 2002 Usbekistan Grüne Woche, Berlin

138 9 2002 Italien Wierts/Eggert/Jörissen

GmbH

Handelsproben mit Herkunftsdeklaration (Forts.)

9. Material und Methoden

158

Proben-Nr.

grün

geröstet

gesalzen

lose Ware

ohne Schale

Erntejahr

Bezogen aus / von:

139 9 9 2001 Privatperson

140 9 9 2002 Supermarkt, Berlin

141 9 9 1999 Supermarkt, Berlin

142 9 2000 Supermarkt, Berlin

143 9 9 2001 Supermarkt, Berlin

144 9 9 2001 Supermarkt, Berlin (biologischer Anbau)

145 9 9 2001 Supermarkt, Berlin

146 9 9 2001 Supermarkt, Berlin

147 9 9 2001 Supermarkt, Berlin

148 9 9 2000 Supermarkt, Berlin

149 9 9 9 2001 Supermarkt, Berlin

150 9 9 2000 Supermarkt, Berlin

151 9 9 2001 Supermarkt, Berlin

152 9 9 9 2001 Supermarkt, Berlin

153 9 9 2001 Supermarkt, Berlin

154 9 2001 Supermarkt, Berlin

155 9 9 2001 Supermarkt, Kaarst

156 9 9 2001 Supermarkt, Kaarst

157 9 9 2002 Supermarkt, Wiesbaden

Handelsproben ohne Herkunftsdeklaration

9.1 Probenliste

159

Proben-Nr.

grün

geröstet

gesalzen

lose Ware

ohne Schale

Erntejahr

Bezogen aus / von:

158 9 9 2001 Supermarkt, Wiesbaden

159 9 9 2001 Supermarkt, Wiesbaden

160 9 9 2001 Supermarkt, Berlin

161 9 9 2002 Supermarkt, Berlin

162 9 9 2002 Supermarkt, Berlin

163 9 9 2002 Supermarkt, Spanien

164 9 9 1997 Supermarkt, Berlin (Restbestand FB222)

Handelsproben ohne Herkunftsdeklaration (Forts.)

9. Material und Methoden

160

9.2 Standards und Referenzmaterialien

9.2.1 Referenzmaterialien der IAEA

Folgende Referenzmaterialien der IAEA mit feststehenden δ-Werten standen zur Kalibrierung

der C-, N- und O-Messung während der Anfertigung dieser Arbeit im Labor zur Verfügung:

IAEA-Name Material Isotopenverhältnis Bezugsstd. δ-Wert

VSMOW Wasser 18O/16O VSMOW 0,0 ‰

GISP Wasser 18O/16O VSMOW -24,8 ‰

PE-Folie Polyethylenfolie 13C/12C PDB -31,8 ‰

NBS 22 Öl 13C/12C PDB -29,7 ‰

NO-3 Kaliumnitrat 15N/14N Air +4,7 ‰

N-1 Ammoniumsulfat

15N/14N Air +0,4 ‰

9.2.2 In-House kalibrierte Arbeitsstandards

Folgende Materialien wurden gegen die IAEA-Referenzmaterialien zum täglichen Gebrauch und

zur Qualitätskontrolle der C-, N- und O-Messungen als Arbeitsstandards kalibriert:

Labor-Name Material Isotopenverhältnis Bezugsstd. δ-Wert

Std. 4 Wasser 18O/16O VSMOW +14,5 ‰

Std. 9 Cellulose 18O/16O VSMOW +31,3 ‰

Std. 11 Acetanilid 13C/12C PDB -25,0 ‰

Std. 11 Acetanilid 15N/14N Air -8,6 ‰

9.2 Standards und Referenzmaterialien

161

Folgende Gase, die als Referenzgase bei der IRMS-Messung dienen und vor und nach jeder Pro-

be vermessen werden, wurden gegen die Arbeitsstandards zur Berechnung der Proben kalibriert:

Gas Zeitspanne Isotopenverhältnis Bezugsstd.

δ-Wert

CO Aug.-Okt. ´03 18O/16O VSMOW -2,6 ‰

CO Apr.-Jun. ´04 18O/16O VSMOW -3,0 ‰

CO2 Apr.-Jul. ´03 13C/12C PDB -28,3 ‰

CO2 Okt. ´03 13C/12C PDB -28,5 ‰

CO2 Feb.-Mrz. ´04 13C/12C PDB -33,0 ‰

N2 Apr.-Okt. ´03 15N/14N Air -5,7 ‰

N2 Feb.-Mrz. ´04 15N/14N Air -13,7 ‰

9.2.3 Gerätekontrollproben

Folgende Materialien wurden gegen die Arbeitsstandards kalibriert und zum täglichen Gebrauch

als Qualitätskontrollproben bei den C-, N- und O-Messungen verwendet:

Labor-Name Material Isotopenverhältnis Bezugsstd. δ-Wert

GKP-H2O Wasser 18O/16O VSMOW -8,1 ‰

GKP 2 Fruktose 13C/12C PDB -24,5 ‰

GKP 3 Atropin 13C/12C PDB -29,1 ‰

GKP 3 Atropin 15N/14N Air -18,0 ‰

GKP 4 Benzoesäure 18O/16O VSMOW +24,9 ‰

9. Material und Methoden

162

9.3 Geräteeinstellungen und Probenvorbereitung

9.3.1 Isotopenmassenspektrometer

Hersteller: ThermoQuest Finnigan

Gerätename: Deltaplus

Softwarepaket: ISODAT NT 1.5 mit ServicePack 1.6

Pumpen: Pfeiffer Duo 005M Drehschiebervakuumpumpe

Pfeiffer TMH 064 Turbomolekular-Drag-Pumpe

Pfeiffer TMH 260-005 Turbomolekular-Drag-Pumpe

Kollektor: 3-fach Faraday Cups

Ziehspannung: ~ 700 (EA)

~ 650 (TC/EA)

Interface: ConFlo II Finnigan MAT

Gasversorgung: Helium 5.0 mit Agilent Mass Spectrometer Gas Purifier

Kohlendioxid 4.5

Kohlenmonoxid

Sauerstoff 4.5

Stickstoff 6.0

2 % Wasserstoff in Helium 5.0 (Auxiliary Gas für TC/EA)

9.3.2 Elementaranalysator (EA)

Hersteller: CE Instruments, ThermoQuest Italia S.p.A.

Gerätename: EA 1110 CHN

Autosampler: AS 200 für 50 Proben

Eingangs-O2-druck: 150 kPa (~ 1,5 bar)

Eingangs-He-druck: 150 kPa (~ 1,5 bar)

Heliumfluß: 80 ml/min.

9.3 Geräteeinstellungen und Probenvorbereitung

163

Einstellungen am EA:

Zyklus Probenzufuhr (cycle time): 60 s

Sauerstoffzufuhr (oxy time): 59 s

Probeneinwurf (start sample): 17 s

Autosamplerdrehung (stop sample): 40 s

Druckeinstellungen am ConFlo II:

Helium-Dilution: ~ 1,30 bar

Kohlendioxid: ~ 1,15 bar

Stickstoff: ~ 1,60 bar

Oxidationsrohr (Quarz):

Temperatur: 1040 °C

Packung: Quarzwolle

Chrom(III)-oxid, gekörnt

versilbertes Kobaltoxid, Granulat

Reduktionsrohr (Quarz):

Temperatur: 650 °C

Packung: Quarzwolle

reduziertes Kupfer, 0,5mm

Kupfer(II)-oxid, 0,5mm

GC-Säule:

Temperatur: 50 °C

Material: Porapak

Wasserfalle:

Temperatur: Raumtemperatur, nicht beheizbar

Packung: Magnesiumperchlorat, Granulat

Verbrauchsmaterialienzulieferer: IVA Analysentechnik e.K.

Meerbusch, Deutschland

9. Material und Methoden

164

9.3.3 Pyrolyseeinheit (TC/EA)

Hersteller: ThermoQuest Finnigan

Gerätename: TC/EA

Autosampler: AS 200 für 50 Proben

He-druck (Purge): 1,0 bar

He-druck (Carrier): 0,7 bar

Auxiliarygasdruck: 0,8 bar (2 % H2 in He)

Heliumfluß: 90 ml/min.

Druckeinstellungen am ConFlo II:

Helium-Dilution: ~ 1,30 bar

Kohlendioxid: ~ 1,15 bar

Kohlenmonoxid: ~ 1,60 bar

Reaktor (Glassy Carbon Rohr in Aluminiumoxidrohr):

Temperatur: 1350 °C

Packung: Graphitcrucibles, rund

Glassy Carbon Granulat

Quarzwolle

Silberwolle

GC-Säule:

Temperatur: 70 °C

Material: Molecular Sieve 5a, 80-100 mesh

Verbrauchsmaterialienzulieferer: IVA Analysentechnik e.K.

Meerbusch, Deutschland

9.3 Geräteeinstellungen und Probenvorbereitung

165

9.3.4 Probenvorbereitung für die IRMS

Mühle:

Hersteller/Name: Retsch „Grindomix GM200“

Einwaage: ~ 20 g Pistazien (ohne Schale)

Mikrowaage:

Hersteller/Name: Mettler Toledo „Comparator“

Einwaagen für den EA: Acetanilid: 0,5 – 0,6 mg (Arbeitsstandard)

Atropin: 0,9 – 1,0 mg (Gerätekontrollprobe)

Pistazie: 1,0 – 1,1 mg

Pistazienhaut: 1,5 – 1,7 mg

Rückstand: 0,7 – 0,9 mg

Pistazienöl: 0,75 µl

Einwaagen für den TC/EA: Cellulose: 80 – 100 µg (Arbeitsstandard)

Benzoesäure: 140 – 160 µg (Gerätekontrollprobe)

Pistazie: 120 – 160 µg

Pistazienhaut: 110 – 140 µg

Rückstand: 100 – 130 µg

Pistazienöl: 0,40 µl

Einwaagegefäße:

Zinnkapseln für Feststoffe (0,02 ml): 3,2×4 mm, Zinnreinheit 97,5 %

Zinnkapseln für Flüssigkeiten (0,012 ml): ∅ 2,00 mm, Höhe 5,0 mm, Zinnreinheit 99,9 %

Zinnkapseln für Flüssigkeiten (0,003 ml): ∅ 1,06 mm, Höhe 5,5 mm, Zinnreinheit 99,9 %

Lagerung:

gemahlene Pistazien: Kühlschrank, Plastikgefäße (Naglene)

Pistazienöl: Kühlschrank, 1,5 ml-Glas-Vials (Wheaton)

entfetteter Pistazienrückstand: Raumtemperatur, Plastikgefäße in evakuiertem Exsikkator

Pistazien: Raumtemperatur, eingeschweißt in Tüten

Anmerkung:

Alle Proben für die TC/EA-Messungen wurden mindestens einen Tag lang über di-

Phosphorpentoxid p.A. (Merck) im evakuierten Exsikkator getrocknet.

Verbrauchsmaterialienzulieferer: IVA Analysentechnik e.K., Meerbusch, Deutschland

9. Material und Methoden

166

9.3.5 Gewinnung des Pistazienöls

Soxhlet-Extraktion:

Gerät: Soxhlet-Apparatur[209]

Einwaage: 5-10 g gemahlene Pistazien, ausgestrichen auf Faltenfilter

Extraktionsmittel: Petroleumbenzin p.A., Siedebereich 40-60 °C (Merck)

Extraktionsdauer: 4-6 Stunden

ASE-Extraktion:

Hersteller: Dionex

Gerätename: ASE 300

Kartuschengröße: 10 ml

Einwaage: ~ 1 g gemahlene Pistazien, ausgestrichen auf Faltenfilter ∅ 90 mm

(Schleicher & Schüll 595½)

Extraktionsmittel: Petroleumbenzin p.A., Siedebereich 40-60 °C (Merck)

Geräteeinstellungen: Preheating Time: 5 min.

Heating Time: 6 min.

Static Time: 5 min.

Flush Volume: 130 %

Purge Time: 100 s

Cycles: 1

Pressure: 140 bar

Temperature: 110 °C

Anzahl der Wiederholungen pro Kartusche: 3×

Vakuumrotationsverdampfer:

Hersteller: Büchi

Gerätenamen: Waterbath B-480

Rotavapor R-114

Vakuum System B-172

Vakuum/Destillation Controller B-168

Wasserbadtemperatur: 40 – 60 °C

Druck: 500 – 550 mbar

9.3 Geräteeinstellungen und Probenvorbereitung

167

Trockenschrank:

Hersteller: Heraeus

Temperatur: ~ 105 °C

Trocknungsdauer: ~ 6 Stunden

Trocknungsgefäße: Pistazienöl im Spitzkolben

entfetteter Pistazienrückstand auf Filterpapier und Uhrglas

9.3.6 Röstung und Salzung im Laborversuch

Im Laborversuch sollte der Einfluss der Röstung und Salzung auf das Isotopenverhältnis unter-

sucht werden. Dazu wurde eine vorhandene amerikanische Handelsware, die als „roh“ gekenn-

zeichnet war, als Probe gewählt und nach dem Rezeptvorschlag der „California Pistachio Com-

mission“, welcher auf deren Internetseite[42] abrufbar ist, zubereitet.

Versuch 1: Röstung

Menge: 1 Cup (~250 ml) Pistazien

Temperatur: 120 °C

Röstdauer: 1½ h und 1¾ h → alle 30 Minuten wenden

Versuch 2: Röstung und Salzung

Menge: 1 Cup (~250 ml) Pistazien

Salzlösung: 7 g NaCl (Merck) in 40 ml Wasser

→ Pistazien mit der Salzlösung vermengen und eindampfen, danach folgt die Röstung wie in

Versuch 1 beschrieben.

9.3.7 Statistik

Die statistischen Auswertungen und Tests in Kapitel 4, 5 und 6 wurden mit Hilfe der Statistik-

software SPSS 12.0 auf dem 95 %-Wahrscheinlichkeitsniveau durchgeführt. Abweichungen da-

von sind im Text erwähnt. Für die Berechnungen der Hauptkomponenten- und Diskriminanzana-

lyse wurde ausschließlich der um die Ausreißer verminderten Datensatz der authentischen Pista-

zien verwendet.

10. Literaturverzeichnis

168

10. Literaturverzeichnis

169

10.

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Anhang

Anhang I

Anhang I: Formelverzeichnis

Berechnung des δ-Werts

Allgemeine Formel:

1000 1-

)I / I (

eBezugsgröß int. pHauptisotoIsotop schweres

Probe pHauptisotoIsotop schweres

Probe

eBezugsgröß int. ⋅













mit: Probe

eBezugsgröß int.

= delta-Wert der Probe in [‰]; Abweichung des Isotopenverhältnisses der

Probe zur internationalen Bezugsgröße

schweres Isotop/IHauptisotop = Verhältnis der Ionenströme

Bestimmung des δ-Werts einer Probe mittels Ein-Punkt-Kalibrierung:

Die Probe und der jeweilige Standard (z.B. Referenzmaterial, Arbeitsstandard) werden gegen das

Referenzgas (Ref.gas) vermessen und somit ihre δ-Werte gegen dieses Referenzgas ermittelt.

Der δ-Wert des Standards gegenüber der internationalen Bezugsgröße ist bekannt. Für die Be-

rechnung des relativen Isotopenverhältnisses der Probe gegen die internationale Bezugsgröße

gelten dann nach Umstellen der allgemeinen Gleichung (s.o.) folgende Relationen:

1000

Ref.gas

eBezugsgröß int.

Probe

Ref.gas

eBezugsgröß int.

Probe

Ref.gas

Probe

eBezugsgröß int.

δδ

δδδ

⋅

++=

1000

Std

Ref.gas

Std.

Ref.gas

Std.

eBezugsgröß int.

Ref.gas

eBezugsgröß int.

δδ

mit: Probe

eBezugsgröß int.

= δ-Wert der Probe (gesuchte Größe)

Probe

Ref.gas

= δ-Wert der Probe gegenüber dem Referenzgas (Messwert)

Ref.gas

eBezugsgröß int.

= δ-Wert des Referenzgases gegenüber dem Standard (unbekannt)

Std.

Ref.gas

= δ-Wert des Standards gegenüber dem Referenzgas (Messwert)

Std.

eBezugsgröß int.

= δ-Wert des Standards gegenüber der int. Bezugsgröße (bekannt)

Formelverzeichnis

III

Kalibrierung der EA-Arbeitsstandards mittels Ein-Punkt-Kalibrierung:

Die Kalibrierung des Acetanilids als Arbeitsstandard für die 13C- und 15N-Messung erfolgte nach

obigen Formeln, wobei das Acetanilid wie eine Probe behandelt wurde und das IAEA-

Referenzmaterial als Standard diente.

Kalibrierung des TC/EA-Arbeitsstandards mittels Normierung:

Zur Ermittlung des Sauerstoffisotopenverhältnisses des Arbeitsstandards wird dessen δ-Wert

nach obigen Formeln mittels eines IAEA-Referenzmaterials berechnet und durch einen Korrek-

turfaktor F normiert. Dieser wird mit Hilfe von einem zweiten, mitgemessenen Standard bekann-

ten δ-Werts ermittelt. Dies ist nötig, da beim TC/EA eine Linearität über weite δ-Bereiche nicht

gegeben ist und die verfügbaren Standards für die Kalibrierung (SMOW-Wasser und Wasser-

Arbeitstandard der Gasbench) ca. 20‰ unter der zu kalibrierenden Cellulose lagen.

.Arbeitsstd

eBezugsgröß int.

.Arbeitsstd

eBezugsgröß int. (normiert)

δδ

⋅= F

und

(gemessen)

ch)(theoretis

Std.

eBezugsgröß int.

Std.

eBezugsgröß int.

mit: F = Korrekturfaktor

Std.

eBezugsgröß int.

= Wasser.Arbeitsstd

VSMOW

= 14,53 ‰

Arbeitsstd. Wasser: ausreichend geprüfter Arbeitsstandard aus dem IRMS-Labor

Std.-IAEA

eBezugsgröß int.

= Wasser-SMOW

VSMOW

= 0,00 ‰

Anhang I

Statistische Grundformeln

Mittelwert:[38]

∑

⋅= x

mit: n = Anzahl der Messwerte

x = Messwert

Standardabweichung einer Mehrfachbestimmung:[38,140]

∑−⋅

−

)(

1einzel

einzel xx

mit: xeinzel = Mittelwert

Standardabweichung innerhalb der Serien (Wiederholstandardabweichung sr):[38,140]

reinzelinnerhalb ssn

s=⋅−⋅

−

=∑

∑))1((

)1(

Standardabweichung zwischen den Serien:[38,140]

zwischen

innerhalb

gesamt

einzel

zwischen n

sXxn

)(

1−−⋅⋅

−

=∑ ∑

nzwischen 1

mit: N = Anzahl der Serien

Xgesamt = Mittelwert der Mittelwerte xeinzel

Gesamtstandardabweichung (Vergleichsstandardabweichung sR):[38,140]

sgesamt = sinnerhalb + szwischen = sR

Formelverzeichnis

Wiederholbarkeit r:[38,141]

r = 2,8 × sr

Vergleichbarkeit R:[38,141]

R = 2,8 × sR

Kritische Grenze CD (critical difference):[38,141]

Werden in einem Labor Mittelwerte(y1, y2) aus n1 bzw. n2 Mehrfachmessungen unter Wieder-

holbedingungen gemessen, gilt für die maximale Differenz zwischen den beiden Mittelwerten

nicht mehr r als Grenzwert, sondern die kritische Grenze CD auf dem 95%-Wahrscheinlich-

keitsniveau:[107]

|| 2

21 nn

rCD yy +⋅=

−

Korrelationskoeffizient nach Pearson:[37]

ssn

yyxx

⋅⋅−

−⋅−

=∑

)1(

)()(

mit: ς = Korrelationskoeffizient

xi,yi = Werte der Variablen

yx, = Mittelwerte der Variablen

sx,sy = Standardabweichungen der Variablen

n = Anzahl der Wertepaare

Anhang I

Z-score:[264]

z = (x-X)/σ

mit: z = Z-score

x = Messwert

X = wahrer Wert / Zielwert

σ = Ziel-Standardabweichung

Formelverzeichnis

VII

Statistische Tests

Sollwert-t-Test:[166]

t | |

−

mit: t = Prüfgröße

x = Mittelwert

= Sollwert: z.B. zertifiziertes IAEA-Referenzmaterial

−x = Messunsicherheit (systematischer Fehler)

s = Standardabweichung

n = Anzahl der Wiederholmessungen

Tabelle = Wert aus der t-Tabelle (P = 95%, f = n-1)

Doerffel-Test:[166]

x⋅

<− 5,1

mit: x = Mittelwert

= Sollwert: zertifiziertes IAEA-Referenzmaterial

−x = Messunsicherheit (systematischer Fehler)

s = Standardabweichung

n = Anzahl der Wiederholmessungen

Anhang II

VIII

F-Test:[64]

),(

mit: 2

s = Standardabweichung der Messung

s = Wiederholstandardabweichung der Methode

f = Freiheitsgrade (= n-1)

),(

2fP

= Wert aus der χ²-Tabelle (P = 95%, f = n-1)

Ausreißertest nach Grubbs:[38,166]

Q*−

mit: Q = Prüfgröße (P = 0,95)

x = Mittelwert

x* = ausreißerverdächtiger Wert

Ausreißertest nach Nalimov:[122]

1−

⋅

−

mit: r = Prüfgröße (P = 0,99)

xA = ausreißerverdächtiger Wert

x = Mittelwert der gesamten Messreihe

smA = Standardabweichung der gesamten Messreihe (inklusive xA)

n = Anzahl der Messwerte

Erläuterungen zur multivariaten Statistik

Anhang II: Weiterführende Erläuterungen zur mulitvariaten Sta-

tistik

Einteilung multivariater Analysenmethoden

Aufgrund der Vielzahl multivariater Analysenmethoden, werden sie oft nach ihren Fragestellun-

gen in primär „strukturen-entdeckende Verfahren“ und primär „strukturen-prüfende Verfahren“

eingeteilt. Diese beiden Kriterien werden folgendermaßen verstanden:

1. Strukturen-entdeckende Verfahren sind multivariate Verfahren, deren primäres Ziel die Ent-

deckung von Zusammenhängen zwischen Variablen oder zwischen Objekten ist. Der An-

wender besitzt zu Beginn der Analyse noch keine Vorstellungen darüber, welche Bezie-

hungszusammenhänge in einem Datensatz existieren. Derartige Verfahren sind z.B. die Fak-

torenanalyse oder die Clusteranalyse.

2. Strukturen-prüfende Verfahren sind multivariate Verfahren, deren primäres Ziel in der

Überprüfung von Zusammenhängen zwischen Variablen liegt. Der Anwender besitzt eine

auf sachlogischen oder theoretischen Überlegungen basierende Vorstellung über die Kausal-

zusammenhänge zwischen den Variablen und möchte diese mit Hilfe multivariater Verfah-

ren überprüfen, d.h. er weiß oder vermutet, welche der Variablen auf andere Variablen ein-

wirken. Er muss also in der Regel die von ihm betrachteten Variablen in abhängige und un-

abhängige Variablen einteilen können. Verfahren, die diesem Bereich der multivariaten Da-

tenanalyse zugeordnet werden können, sind z.B. die Regressions-, Diskriminanz- oder Vari-

anzanalyse.[13]

Anhang II

Durchführung einer Hauptkomponentenanalyse

Die Hauptkomponentenanalyse ist eine multivariate Analysenmethode und dient zur Entdeckung

der Strukturen eines Datensatzes. Sie wird üblicher Weise in folgenden vier Schritten durchge-

führt:

1. Berechnung der Korrelationsmatrizen

Zur Ermittlung der Faktoren ist es erforderlich, die Zusammenhänge zwischen den Ausgangsva-

riablen messbar zu machen. Als methodisches Hilfsmittel wird hierzu die Korrelationsanalyse

herangezogen. Durch die Berechnung der Korrelationen zwischen den beteiligten Variablen mit

Hilfe der Pearson-Korrelationskoeffizienten lässt sich erkennen, ob Zusammenhänge zwischen

Paaren von Variablen bestehen (Korrelationsmatrix). Besteht ein solcher Zusammenhang, kön-

nen diese Variablen als voneinander abhängig und damit als „bündelungsfähig“ angesehen wer-

den. An der so erstellten Korrelationsmatrix kann dann auch abgelesen werden, welche Variab-

len möglicherweise unberücksichtigt bleiben sollten, weil sie mit den übrigen Variablen nur sehr

geringe Korrelationen aufweisen.[13,37]

2. Extraktion der Faktoren

Die Hauptkomponentenanalyse ist das gebräuchlichste Verfahren zur Extraktion der Faktoren.

Wie bei anderen Verfahren auch (z.B. Maximum-Likelihood-Methode, kanonische Faktorenana-

lyse, Hauptachsen-Faktorenanalyse), wird zu diesem Zweck eine Ladungsmatrix konstruiert,

welche die Korrelationen der beobachteten Merkmale mit den künstlichen Faktoren enthält. Im

Speziellen geht die Hauptkomponentenanalyse davon aus, dass die Varianz einer Ausgangsvari-

ablen vollständig durch die Extraktion von Faktoren erklärt werden kann, d.h. sie unterstellt, dass

keine Einzelrestvarianz (= spezifische Varianz + Messfehlervarianz) in den Variablen existiert.

Es werden dazu lineare Kombinationen der Variablen gebildet. Das Ziel der Hauptkomponen-

tenanalyse liegt in der möglichst umfassenden Reproduktion der Datenstruktur durch möglichst

wenige Faktoren.[13,36,37,121,129]

3. Rotation

Die gefundenen Faktoren sind häufig zunächst schwierig zu interpretieren. Zur Erleichterung

macht man sich den Umstand zu nutze, dass die Faktoren Kunstgebilde sind, die verzerrungsfrei

unterschiedlichen Transformationen unterworfen werden können. Dadurch gelingt es häufig, die

Verbindung zu den Beobachtungsvariablen deutlicher aufzuzeigen und damit die Interpretation

der Faktoren zu erleichtern. Dieser Schritt wird als Rotation bezeichnet, da hierbei (wenn man

sich die Faktoren in einem Koordinatenkreuz angeordnet vorstellt) die Koordinatenachsen in

gewisser Weise gedreht werden. Es wird zwischen orthogonalen/rechtwinkligen (z.B. Variamx-,

Erläuterungen zur multivariaten Statistik

Quartimax-Methode) und schiefwinkligen (z.B. direkte Oblimin-, Promax-Rotation) Rotations-

verfahren unterschieden.[36] Speziell bei der Hauptkomponentenanalyse wird meistens von einer

Rotation abgesehen, da in der Regel nicht die Konstruktion interpretierbarer Komponenten im

Vordergrund steht, sondern die Reduzierung komplizierter Datenbeziehungen auf eine einfache

Form.[121]

4. Berechnung der Faktorwerte:

Für eine Vielzahl von Fragestellungen ist es von großem Interesse, nicht nur die Variablen auf

eine geringere Anzahl von Faktoren zu reduzieren, sondern danach zu erfahren, welche Werte

die Objekte hinsichtlich der extrahierten Faktoren annehmen, um sie z.B. als Variablen in weite-

ren Untersuchungen zu verwenden oder grafisch darstellen zu können. Im Gegensatz zu anderen

Extraktionsverfahren lassen sich die Faktorwerte im Falle der Hauptkomponentenanalyse recht

einfach anhand einer linearen Gleichung berechnen.[13,36]

Nähere Erläuterungen zur Diskriminanzanalyse

Die Diskriminanzanalyse ist eine der klassischen Techniken der mulitvariaten Datenanalyse und

dient zur Trennung gegebener Gruppen und zur Einordnung neuer, unbekannter Objekte. Dazu

wird zunächst in der sog. Lernphase das Klassifikationsmodell aufgestellt, wobei von den Vari-

ablenmustern einer bestimmten Menge von gruppierten (Lern-) Objekten ausgegangen wird.

Hinter dem Klassifikationsmodell verbergen sich bestimmte Rechengrößen (Vektoren), die spä-

ter die Klassifikation neuer Objekte erlauben.[129]

Im vorliegenden Fall der Zuordnung von Pistazien nach ihrer Herkunft liegen drei Gruppen

(Iran, USA, Türkei) vor, d.h. es werden zwei Diskriminanzfunktionen gebildet. Dies ist sehr vor-

teilhaft, da sich die Ergebnisse dann in einem zweidimensionalen Streudiagramm grafisch dar-

stellen und dadurch leichter interpretieren lassen. Es muss bei der Diskriminanzanalyse aller-

dings darauf geachtet werden, dass die Anzahl der Diskriminanzfunktionen nicht größer sein darf

als die Anzahl der Merkmalsvariablen, d.h. es dürfen nicht mehr Gruppen als gemessene Variab-

len vorliegen.[13,36,37]

Die Gruppengröße darf auch nicht zu klein gewählt werden, da sonst der sog. „Lasso-Effekt“

auftritt. Die Diskriminanzanalyse hat als strukturen-prüfendes Verfahren nämlich den großen

Nachteil, dass prinzipiell alle Proben in eine der vorgegebenen Gruppen eingeordnet werden

müssen. Daher werden auch Ausreißer und Proben mit einer Gruppenzugehörigkeit, die nicht im

Klassifikationsmodell enthalten ist, nicht erkannt. Aufgrund dessen muss auf die Auswahl der

Daten für den Lerndatensatz die größte Sorgfalt gelegt werden und Ausreißer sind vorher über

Anhang II

XII

angemessene Tests zu eliminieren. Die Diskriminanzanalyse liefert auch schlechte bzw. instabile

Ergebnisse, wenn miteinander hoch korrelierende Variablen in die Berechnung des Modells ein-

bezogen werden.[13,150,257]

Auch die Anzahl der zur Erstellung des Diskriminanzmodells verwendeten Variablen ist nicht

beliebig. Die Einbeziehung zahlreicher Variablen in das Klassifikationsmodell erhöht nur die

Gefahr, dass unnötige und eigentlich nichts zur Separation der Gruppen beitragende Variablen in

das Modell einbezogen werden, die die zu erwartende Fehlerrate sogar negativ beeinflussen kön-

nen. Die meisten Statistik-Programme bieten daher die schrittweise Diskriminanzanalyse an,

wobei der Algorithmus automatisch nur diejenigen Variablen auswählt, die signifikant zur Ver-

besserung der Diskriminanzanalyse beitragen und zu einer minimalen Fehlerrate führen. Aus der

Rangfolge, mit der die Variablen in die Diskriminanzfunktion(en) aufgenommen werden, lässt

sich deren relative Wichtigkeit erkennen.[13,36]

Das Endziel der Diskriminanzanalyse ist die Klassifizierung neuer, unbekannter Proben anhand

des mit dem Lerndatensatz erstellten Modells. Als Zuordnungsregel wird die Bayessche Klassi-

fikation verwendet, die eine Normalverteilung der Werte voraussetzt. Ein Element wird danach

in diejenige Gruppe eingeordnet, der es am nächsten liegt, d.h. bezüglich derer die Distanz zwi-

schen Element und Gruppenmittel (Zentroid) minimal wird. Üblicherweise werden die quadrier-

ten Mahalanobis-Distanzen verwendet, daher spricht man auch von quadratischer Diskriminanz-

funktion (QDF). Daraus ergeben sich daraus gekrümmte Trennflächen zwischen den Gruppen.

Liegen gleiche Streuungen in den Gruppen vor, d.h. sind die Kovarianzmatrizen der Gruppen

annähernd gleich (Prüfung mit dem Box´s M-Test), so minimiert sich die Bayessche Entschei-

dungsregel von quadratischen zu nur noch linearen Abhängigkeiten der Testobjekte. In diesem

Fall liegt dann nur noch eine lineare Diskriminanzfunktion (LDF) vor, bei der zwischen den

Gruppen lineare Trennflächen bzw. -linien erscheinen. Dies hat den Vorteil einer einfachen und

gut interpretierbaren grafische Darstellungsmöglichkeit der Ergebnisse, jedoch wird die Voraus-

setzung der Gleichheit der Kovarianzmatrizen in praktischen Anwendungen meist nie erfüllt.

R.A. Fisher hat 1936 aus den linearen Diskriminanzfunktionen die nach ihm benannten „Klassi-

fizierungsfunktionen“ entwickelt, die ein einfaches und praktisches Hilfsmittel zur Klassifizie-

rung von unbekannten Proben direkt auf Basis der Merkmalswerte bilden, d.h. ohne die Verwen-

dung von Diskriminanzfunktionen. Die Fisher´schen Klassifikationsfunktionen ähneln den Dis-

kriminanzfunktionen, jedoch wird hier für jede Gruppe eine gesonderte Klassifizierungsfunktion

F bestimmt:

Erläuterungen zur multivariaten Statistik

XIII

F1 = b01 + b11x1 + ... + bn1xn

F2 = b02 + b12x1 + ... + bn2xn

...

Ein unbekanntes Element ist hierbei derjenigen Gruppe g zuzuordnen, für die der Funktionswert

Fg maximal ist. Wenn die Koeffizienten der Fisher´schen Klassifizierungsfunktionen erst einmal

mit einem Computerprogramm bestimmt sind, wird die Zuordnung neuer Fälle relativ einfach

und ist sogar mit einem Taschenrechner möglich, was z.B. für die Anwendung in einem Labor

bei Routineuntersuchungen sehr vorteilhaft sein kann.[13,56,129]

Die bloße Einordnung von Testobjekten in vorgegebene Klassen ist jedoch relativ wertlos, so-

lange unbekannt ist, mit welcher Sicherheit bzw. Irrtumswahrscheinlichkeit die getroffenen Ent-

scheidungen (Klassifikationsfehlerrate) behaftet sind. Das Problem hierbei ist, dass zur Erpro-

bung des Erfolgs der Zuordnungsregel nur Objekte bekannter Herkunft, also keine echten Test-

objekte (unbekannte Proben) herangezogen werden können. Alle Objekte bekannter Herkunft

werden im Allgemeinen als Lernobjekte definiert, um das aufzustellende Klassifikationsmodell

mit möglichst viel Eingangsinformation zu versorgen. Als Konsequenz müssen daher die Lern-

objekte im Sinne von Pseudo-Testobjekten benutzt werden, um die Fehlerrate zu schätzen.[129]

Hier stehen mehrere Methoden zur Verfügung, auf die in Kapitel 6.2.3 näher eingegangen wird.

Wenn der Stichprobenumfang ausreichend groß ist, werden alle Methoden zur Schätzung der

Fehlerrate dasselbe Ergebnis hervorbringen. Je kleiner der Stichprobenumfang ist, desto größer

sind die Unterschiede zwischen den Schätzverfahren.[56]

Anhang III

XIV

Anhang III: Probenliste mit δ-Wert-Messergebnissen

authentisch iranische Pistazienproben

Mittelwerte der δ-Messung nach Grubbs-Ausreißertest

Probennr.

Verarbei-

tung

δ13CVPDB

Pistazie

δ15NAir

Pistazie

δ18OVSMOW

Pistazie

δ13CVPDB

Rückstand

δ15NAir

Rückstand

δ18OVSMOW

Rückstand

δ13CVPDB

Pistazienöl

δ18OVSMOW

Pistazienöl

1 R, S -26,36 10,00 36,44 -23,46 10,05 39,34 -28,28 38,79

2 R -26,22 7,76 37,20 -23,65 7,76 41,13 -28,34 37,92

3 R -27,07 10,58 36,43 -24,46 10,68 39,46 -28,94 37,11

4 R -26,64 8,96 35,39 -24,31 9,02 40,09 -28,36 36,75

5 R -27,03 7,91 37,57 -24,74 8,11 41,36 -28,72 38,35

6 R -27,22 8,60 37,41 -24,73 8,72 40,32 -29,06 39,88

7 R -27,35 8,78 38,18 -24,54 8,76 41,87 -29,22 41,09

8 R -26,94 6,77 36,90 -24,18 6,64 40,28 -28,84 36,68

9 R -26,46 8,47 36,42 -24,21 8,51 40,80 -28,14 38,06

10 R -27,22 9,95 37,19 -24,55 7,82 41,28 -28,83 38,75

11 R -27,15 6,73 37,35 -24,84 8,98 40,86 -29,04 38,63

12 R -26,38 3,77 35,65 -23,86 4,03 39,12 -28,35 36,75

13 R -26,52 4,26 35,72 -24,02 4,48 38,54 -28,32 36,68

14 G -26,24 5,12 34,06 -23,68 5,28 38,85 -28,01 37,28

15 R -26,91 5,57 38,41 -23,45 2,89 42,04 -28,50 38,65

16 R -27,33 2,37 36,50 -24,35 2,50 39,27 -29,07 37,25

17 R -26,50 4,21 36,38 -23,35 4,09 38,85 -28,08 37,06

18 R -27,08 5,48 35,55 -24,11 5,64 38,54 -28,69 37,40

19 R -27,37 5,67 35,77 -23,92 5,70 38,82 -28,82 37,62

20 R -27,01 5,22 36,06 -24,00 5,50 38,68 -28,68 37,60

21 R -26,74 4,16 34,36 -23,59 4,05 38,69 -28,31 35,18

22 R -28,19 3,65 34,68 -24,87 3,78 38,67 -29,70 35,78

23 R -26,36 3,31 38,37 -23,42 3,40 40,94 -28,15 40,38

24 R -26,76 3,23 34,55 -23,72 3,36 38,29 -28,12 35,74

25 R -27,39 4,31 34,95 -24,44 4,31 38,79 -29,31 35,89

26 R -26,88 3,41 35,07 -23,82 3,63 38,34 -28,76 37,58

27 R -27,60 9,47 36,14 -24,48 9,65 39,43 -29,86 37,49

28 R -26,47 5,15 35,50 -23,54 5,24 38,93 -28,21 36,60

29 R -28,03 8,49 38,78 -24,77 8,41 42,72 -29,84 40,15

30 R, S, Z -27,68 3,17 36,08 -24,78 3,24 39,41 -29,43 36,13

31 G -26,58 4,80 35,26 -24,11 4,79 38,18 -28,79 36,78

32 R, S -26,70 4,22 37,13 -23,42 4,61 38,30 -28,21 36,75

R: geröstet S: gesalzen G: grün Z: Zitronensaft

fett gedruckte Werte: nachgewiesene Ausreißer nach Kapitel 5.3.1

Probenliste mit δ-Werten

authentisch US amerikanische Pistazienproben

Mittelwerte der δ-Messung nach Grubbs-Ausreißertest

Probennr.

Verarbei-

tung

δ13CVPDB

Pistazie

δ15NAir

Pistazie

δ18OVSMOW

Pistazie

δ13CVPDB

Rückstand

δ15NAir

Rückstand

δ18OVSMOW

Rückstand

δ13CVPDB

Pistazienöl

δ18OVSMOW

Pistazienöl

33 R, S -27,51

-0,10 29,53 -24,51

-0,08 32,27 -29,65 29,59

34 R -26,88

3,33 24,82 -24,28 3,33 28,61 -29,02 25,06

35 R, S, O -26,97 2,10 27,29 -24,57 1,87 31,00 -28,97 27,74

36 R -27,53 1,85 27,02 -25,10 2,06 30,83 -29,65 26,53

37 R -28,35 0,63 27,77 -25,76 0,71 31,14 -30,40 27,02

38 R, S -27,39 1,33 27,93 -24,87 1,46 32,54 -29,54 27,01

39 R, S -27,39 1,21 28,28 -25,11 1,23 29,44 -29,32 27,66

40 R, S -27,70 1,35 28,07 -25,09 1,52 30,51 -29,56 27,92

41 R, S -27,89 1,05 27,83 -24,89 1,10 29,17 -29,64 26,59

42 R, S -27,57 1,23 28,34 -24,40 1,23 30,30 -29,18 27,84

43 R, S -27,91 1,27 27,56 -24,95 1,28 29,27 -29,56 26,75

44 R, S -27,95 1,40 27,75 -24,95 1,50 30,11 -29,54 26,93

45 R, S -27,76 0,93 27,86 -25,08 1,04 30,29 -29,51 27,61

46 R, S -27,73 0,90 27,72 -24,85 0,90 29,51 -29,25 27,18

47 R, S -28,42 0,99 27,23 -25,53 1,26 30,37 -30,01 27,45

48 roh -27,78

2,22 26,59 -25,23 2,17 29,03 -29,93 26,18

49 R -28,04 1,79 27,57 -25,56 1,82 29,84 -30,16 26,68

50 R, S -27,27 0,93 26,79 -24,89 0,94 28,75 -29,44 25,95

51 R, S, O -27,53 1,61 26,39 -25,21 1,59 28,46 -29,67 25,97

52 R, S -27,36 1,24 29,59 -24,86 1,33 30,21 -29,42 27,60

53 R, S -27,88 1,39 27,36 -25,31 1,34 28,80 -29,89 25,91

54 R -27,54 1,31 28,27 -25,32 1,32 29,22 -29,42 27,08

55 R -27,52 1,28 27,18 -25,38 1,42 29,23 -29,58 26,48

56 R, S -26,98 0,50 28,42 -25,02 0,37 30,03 -29,11 27,64

57 R, S -28,40 1,08 27,02 -25,87 1,33 28,16 -30,41 25,92

58 roh -27,84 1,03 27,77 -25,78 1,21 29,84 -29,79 27,55

59 R -27,71 1,64 28,08 -25,32 1,04 29,51 -29,62 26,87

60 R, ½S -27,66 1,30 28,24 -25,22 1,36 29,97 -29,81 27,53

61 R, S, B -27,32 5,27 27,74 -25,46

5,36 29,47 -29,49 26,42

62 R, S -28,22 0,74 27,40 -25,43 0,83 29,79 -30,28 26,50

63 R, S, O -28,01 1,19 27,28 -24,74 1,06 30,40 -29,96 27,22

64 roh -28,07 0,70 26,10 -25,14 0,68 29,16 -30,26 25,81

65 R -27,27 1,11 28,90 -24,37 1,31 30,76 -29,26 27,70

66 R, ½S -27,88 0,48 28,36 -24,93 0,65 30,91 -29,87 27,37

67 R, ½S -28,16 0,99 28,51 -25,14 1,12 30,37 -30,10 27,48

68 R, S -27,81 0,89 28,26 -25,36 0,93 30,90 -29,79 27,63

69 R, S, B -27,28 4,90 30,44 -24,42 5,03 32,33 -29,11 29,77

70 R -28,07 1,10 28,72 -24,67 1,12 30,28 -29,96 27,99

R: geröstet S: gesalzen O: ohne Schale B: biologischer Anbau

fett gedruckte Werte: nachgewiesene Ausreißer nach Kapitel 5.3.1

Anhang III

XVI

authentisch türkische Pistazienproben

Mittelwerte der δ-Messung nach Grubbs-Ausreißertest

Probennr.

Verarbei-

tung

δ13CVPDB

Pistazie

δ15NAir

Pistazie

δ18OVSMOW

Pistazie

δ13CVPDB

Rückstand

δ15NAir

Rückstand

δ18OVSMOW

Rückstand

δ13CVPDB

Pistazienöl

δ18OVSMOW

Pistazienöl

71 R, S -27,14 2,62 35,09 -24,57 2,63 36,43 -28,84 34,51

72 R, S, B -26,16 0,01 31,90 -23,33 -0,03 35,18 -27,74 32,97

73 R, S -26,37 0,64 29,65 -23,46 0,82 33,29 -27,98 31,80

74 R, S -26,39 0,71 31,64 -23,43 0,82 34,35 -27,82 33,32

75 R, S -25,28 -1,62 32,22 -22,31 -1,50 35,23 -26,82 33,38

76 R, S -27,14 0,00 30,92 -23,87 -0,20 33,39 -28,51 31,79

77 R, S -26,62 1,76 30,78 -23,72 1,70 33,03 -28,07 31,79

78 R, S -26,93 -0,46 30,43 -23,87 -0,34 33,05 -28,37 32,59

79 R, S -26,42 -0,49 30,11 -23,57 -0,36 33,44 -27,89 33,03

80 R, S -27,27 -0,38 31,47 -24,62 -0,09 33,21 -28,68 32,26

81 R -26,09 -0,14 31,43 -23,15 0,04 33,29 -27,69 32,73

82 R, S, O -26,49 4,30 34,59 -23,44

4,57 38,66 -28,15 36,47

83 R, S -26,01 -0,32 32,15 -23,33 -0,47 33,90 -27,63 33,22

84 R, S -26,92 0,79 29,65 -24,38 0,64 31,70 -28,55 31,44

85 R -26,58 0,47 30,44 -23,34 0,35 33,34 -28,03 32,14

86 R, S, O -26,27 4,49 35,17 -23,59 4,99 38,80 -28,01 36,20

87 R, S -26,92 0,95 30,90 -24,03 0,97 33,74 -28,57 31,77

88 R, S -27,38 5,28 36,77 -24,27 5,43 38,98 -28,91 38,05

89 R, S -26,79 0,19 31,72 -23,61 0,19 35,09 -28,13 33,79

90 R, S -26,75 3,23 34,92 -23,77

3,20 37,73 -28,18 36,34

91 R, S -26,21 -0,18 32,46 -23,20 -0,07 33,58 -27,79 33,17

92 R, S -26,65 -0,19 31,53 -23,71 -0,08 32,79 -28,39 32,44

93 R, S -26,23 1,53 29,92 -23,46 1,51 31,92 -27,81 31,12

94 R, S -26,41 -1,16 32,45 -23,84 -0,86 34,07 -27,99 33,28

95 R, S -26,78 0,88 30,94 -23,60 1,24 32,08 -28,32 31,62

96 R, S -26,22 0,04 32,30 -23,47 0,13 33,63 -27,76 33,03

97 R, S -26,82 1,21 30,36 -24,06 1,44 32,85 -28,24 31,39

98 R, S -26,48 0,32 32,21 -23,58 0,59 34,42 -28,01 33,13

99 R, S -26,80 1,48 29,37 -23,97 1,47 31,71 -28,30 30,50

100 R, S -26,29 0,64 29,09 -23,22 0,57 31,32 -27,79 30,05

101 R, S -26,25 0,71 31,41 -23,20 0,72 32,84 -27,85 31,62

R: geröstet S: gesalzen O: ohne Schale B: biologischer Anbau

fett gedruckte Werte: nachgewiesene Ausreißer nach Kapitel 5.3.1

Probenliste mit δ-Werten

XVII

Handelsproben mit Herkunftsdeklaration

Mittelwerte der δ-Messung nach Grubbs-Ausreißertest

Probennr.

Verarbei-

tung

δ13CVPDB

Pistazie

δ15NAir

Pistazie

δ18OVSMOW

Pistazie

δ13CVPDB

Rückstand

δ15NAir

Rückstand

δ18OVSMOW

Rückstand

δ13CVPDB

Pistazienöl

δ18OVSMOW

Pistazienöl

Iran

102 R, L, O -25,82 5,85 36,04 -23,08 5,81 39,72 -27,71 36,01

103 R, S, L -27,02 4,91 35,99 -23,54 4,89 39,23 -29,06 36,65

104 G -26,05 3,38 34,48 -22,85 3,66 38,19 -27,76 37,31

105 R, L -26,60 3,11 36,83 -23,82 2,98 38,70 -28,41 37,45

106 R, S -26,39 2,16 36,30 -23,48 2,19 39,04 -28,12 37,10

107 R, S -26,89 4,30 36,82 -23,95 4,40 39,37 -28,41 38,11

108 R, S -26,34 6,92 37,21 -23,41 7,09 39,95 -28,07 39,76

USA

109 R, S -27,22 0,41 26,95 -24,21 0,47 29,58 -29,28 26,68

110 R, S -26,54 3,70 35,37 -23,49 3,82 38,63 -28,36 38,29

111 R, S -27,92 0,74 26,28 -25,19 0,58 28,85 -29,93 26,44

112 R, S -27,16 1,64 27,87 -24,25 1,43 30,18 -29,23 27,74

113 R, S -27,41 1,59 28,16 -24,47 1,58 30,96 -29,53 27,90

114 R, S -27,42 0,96 26,23 -25,01 1,21 28,78 -29,51 26,12

115 R, S, L -26,84 2,88 36,95 -24,07 3,05 39,12 -28,62 37,69

116 R, S, L -27,69 1,81 27,87 -24,73 1,82 28,99 -29,47 26,95

117 R, S, L -28,41 1,33 27,64 -25,67 1,65 29,78 -30,24 26,73

118 R, S -27,76 0,97 28,10 -25,07 0,92 30,35 -29,83 27,48

119 R, S -28,15 1,63 24,77 -25,36 1,67 27,39 -30,21 24,59

120 R, S -27,56 1,47 26,55 -24,51 1,46 29,37 -29,59 26,16

121 R, S -27,23 0,33 25,95 -24,35 0,31 28,40 -29,31 26,61

122 R, S -27,22 1,39 26,26 -24,20 0,97 29,63 -29,20 29,35

123 R, S, L -27,77 0,74 25,98 -24,52 0,78 27,63 -29,50 24,79

124 R, S -26,41 3,60 35,62 -23,41 3,71 38,22 -27,94 40,78

125 R, S -26,26 1,24 30,71 -22,90 1,36 34,27 -27,76 32,29

126 R, S -27,08 7,11 36,04 -24,15 7,40 39,41 -28,84 36,97

R: geröstet S: gesalzen G: grün L: lose Ware O: ohne Schale

Anhang III

XVIII

Handelsproben mit Herkunftsdeklaration (Forts.)

Mittelwerte der δ-Messung nach Grubbs-Ausreißertest

Probennr.

Verarbei-

tung

δ13CVPDB

Pistazie

δ15NAir

Pistazie

δ18OVSMOW

Pistazie

δ13CVPDB

Rückstand

δ15NAir

Rückstand

δ18OVSMOW

Rückstand

δ13CVPDB

Pistazienöl

δ18OVSMOW

Pistazienöl

Griechenland

127 R, S -26,62 1,53 27,51 -24,22 1,58 29,72 -28,01 30,09

128 R, S -26,56 2,55 28,66 -24,22 2,62 29,47 -28,01 31,33

129 R, S, L -26,75 5,43 34,33 -23,67 5,77 37,40 -28,38 36,33

130 R, S -26,29 1,56 31,76 -23,44 1,86 33,03 -27,78 32,32

131 R, S, L -26,41 1,99 28,94 -23,51 2,08 30,91 -28,19 30,72

132 R, S, L -26,71 6,11 35,80 -23,84 6,05 37,80 -28,47 37,46

Syrien

133 R, S -26,13 -1,18 34,21 -22,97 -1,07 36,48 -27,89 35,88

134 roh -27,94 -0,23 29,43 -24,81 -0,30 33,28 -29,65 31,91

135 R, S -28,67 0,03 30,29 -25,53 0,03 33,31 -30,31 32,29

Marokko

136 R, S, L -26,94 5,34 34,76 -24,21 5,41 39,48 -28,61 37,69

Usbekistan

137 roh, L -26,29 5,01 27,09 -24,08 5,21 29,84 -27,53 30,70

Italien

138 G -25,95 4,14 34,73 -23,85 4,48 39,04 -27,72 37,21

R: geröstet S: gesalzen G: grün L: lose Ware O: ohne Schale

Probenliste mit δ-Werten

XIX

Handelsproben ohne Herkunftsdeklaration

Mittelwerte der δ-Messung nach Grubbs-Ausreißertest

Probennr.

Verarbei-

tung

δ13CVPDB

Pistazie

δ15NAir

Pistazie

δ18OVSMOW

Pistazie

δ13CVPDB

Rückstand

δ15NAir

Rückstand

δ18OVSMOW

Rückstand

δ13CVPDB

Pistazienöl

δ18OVSMOW

Pistazienöl

139 R, S -26,81 4,75 37,46 -24,02 4,83 39,24 -28,44 37,82

140 R, S -26,90 3,61 36,27 -23,71 3,55 39,15 -28,35 37,57

141 R, S -26,48 3,97 37,49 -23,47 3,74 38,94 -28,16 37,89

142 G -27,02 5,00 36,46 -23,75 5,13 38,32 -28,80 37,16

143 R, S -27,41 1,02 27,92 -24,24 1,09 29,84 -29,48 27,81

144 R, S -26,18 0,15 33,19 -23,07 0,37 36,28 -27,85 35,32

145 R, S -27,64 1,11 25,75 -24,54 1,12 28,76 -29,67 27,07

146 R, S -26,78 4,94 36,50 -24,04 4,77 38,94 -28,65 38,28

147 R, S -26,56 5,11 36,01 -23,61 5,45 38,87 -28,30 38,38

148 R, S -26,91 2,90 34,17 -23,89 2,91 36,41 -28,55 35,31

149 R, S -26,33 5,21 36,05 -23,18 5,30 38,67 -28,15 37,78

150 R, S -26,12 3,16 35,21 -23,19 3,53 38,22 -27,85 36,81

151 R, S -26,62 5,30 37,45 -23,97 5,05 39,34 -28,45 37,44

152 R, S -26,51 6,10 37,46 -23,50 6,19 39,56 -28,39 38,23

153 R, S -27,64 1,96 27,97 -24,58 1,79 28,69 -29,63 27,08

154 G -26,01 3,92 35,13 -23,05 4,20 38,70 -27,69 37,75

155 R, S -27,95 1,18 26,40 -24,89 1,29 29,72 -29,99 27,30

156 R, S -27,51 1,26 27,34 -24,55 1,35 29,89 -29,61 27,51

157 R, S -27,05 4,71 36,59 -23,94 4,71 39,75 -28,82 37,86

158 R, S -28,16 1,99 26,41 -25,01 1,75 30,07 -29,97 26,23

159 R, S -27,43 0,72 27,26 -24,53 0,79 30,94 -29,58 27,00

160 G -25,83 2,99 34,07 -23,50 3,40 38,08 -27,76 36,31

161 R, S -27,65 1,08 28,60 -24,97 1,27 30,72 -29,65 28,00

162 R, S -26,63 3,05 36,71 -23,62 3,47 39,52 -28,31 38,01

163 R, S -26,78 5,16 35,84 -24,03 5,32 38,28 -28,38 36,57

164 R, S -26,74 4,75 36,40 -24,21 5,10 38,66 -28,36 38,44

R: geröstet S: gesalzen G: grün