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Molecular-Modelling-Untersuchungen

enzymkatalysierter

Ring¨

offnungspolymerisationen der

Candida antarctica Lipase B

Von der Fakult¨

at f¨

ur Naturwissenschaften

Department Chemie

der Universit¨

at Paderborn

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

genehmigte Dissertation

von

Iris Sch¨

onen

geb. Baum

Paderborn, Oktober 2011

Eingereicht am: 24.10.2011

M¨

undliche Pr¨

ufung am: 18.11.2011

Referent: Prof. Dr. Gregor Fels

Korreferent: Prof. Dr. Katja Loos

Vorwort

Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Oktober 2008 bis Oktober 2011 an der

Universit¨

at Paderborn im Fachbereich Organische Chemie im Arbeitskreis von Prof. Dr.

Gregor Fels angefertigt.

Herrn Prof. Dr. Gregor Fels danke ich f¨

ur die interessante Themenstellung, die her-

vorragende Betreuung meiner Arbeit, seine Diskussionsbereitschaft und sein stets offenes

Ohr.

Frau Prof. Dr. Katja Loos danke ich sowohl f¨

ur die langj¨

ahrige fruchtbare Zusammen-

arbeit als auch f¨

ur die ¨

Ubernahme des Korreferats.

Herrn Dr. Leendert Schwab und Frau Erythrina Stavila vom Zernike Institute for Ad-

vanced Materials der Universit¨

at Groningen danke ich f¨

ur die vielen Diskussionen, die

durch die Synergie ihrer pr¨

aparativen Arbeiten und meiner Modellierungen viele neue

L¨

osungsans¨

atze geliefert haben. Den Mitarbeitern des PC2(Paderborn Center for Parallel

Computing) danke ich f¨

ur den schnellen und zuverl¨

assigen Support. Herrn Prof. Dr. Jordis

(Universit¨

at Wien) danke ich f¨

ur die Berechnung der pKa-Werte der β-Alaninoligomere

im w¨

assrigen Medium.

Den Mitarbeitern meines Arbeitskreises, Herrn Dr. Markus Tusch, Frau Dr. Brigitta

Els¨

asser, Herrn Lars Haller, Herrn Dr. Jens Kr¨

uger und Frau Dr. Silvia Dohmeier-Fischer

danke ich f¨

ur den fachlichen Austausch und das angenehme Arbeitsklima. Des Weiteren

bedanke ich mich ganz herzlich bei den Freunden und Kollegen, die mich w¨

ahrend meiner

Zeit in Paderborn begleitet haben und diese unvergesslich machen.

Ganz besonderer Dank gilt meinem Mann und Wegbegleiter Stephan f¨

ur seine Un-

terst¨

utzung in den letzten Jahren und seine F¨

ursorge in den letzten Wochen, sowie auch

meiner restlichen Familie daf¨

ur, dass sie f¨

ur mich da sind.

meiner Familie

Kurzfassung I

Kurzfassung

In der vorliegenden Arbeit erfolgte die mechanistische Aufkl¨

arung der durch Candida

antarctica Lipase B (CALB) katalysierten Ring¨

offnungspolymerisationen von β-Lactam

und ε-Caprolacton mittels Molecular-Modelling-Techniken. Im Gegensatz zu Polyestern

sind Polyamide bisher nicht durch lipasekatalysierte Polymerisationsreaktionen zug¨

ang-

lich. Eine Ausnahme bildet hier die Polymerisation von β-Lactam mit CALB als erstes

Beispiel einer enzymkatalysierten Polyamidbildung, wobei das resultierende unverzweig-

te Nylon 3 (Poly(β-Alanin)) allerdings nur eine maximale Kettenl¨

ange von 18 und eine

durchschnittliche L¨

ange von acht Monomereinheiten aufweist. Gr¨

unde f¨

ur diese, trotz

der großen strukturellen ¨

Ahnlichkeit zwischen Lactonen und Lactamen, sehr unterschied-

lich ausgepr¨

agte Polymerisierbarkeit waren in der Vergangenheit nicht ersichtlich, zumal

die molekularen Abl¨

aufe dieser Polymerisationen g¨

anzlich unerforscht waren. Ziel dieser

Arbeit war daher die vergleichende Untersuchung der Polymerisationsmechanismen von

Lactamen und Lactonen am Beispiel der β-Lactam-Polymerisation als einzig bekannter

Polyamidbildung und der ε-Caprolacton-Polymerisation als Paradebeispiel einer in Poly-

meren mit hohen Molekulargewichten resultierenden Lactonpolymerisation.

Durch Anwendung von molekularen Simulationsverfahren wie Docking, Molekulardy-

namik und QM/MM-Berechnungen konnten die grundlegenden Schritte der CALB-ka-

talysierten Polymerisationen von β-Lactam und ε-Caprolacton auf molekularer Ebene

gekl¨

art werden. Zun¨

achst tritt ein Monomer in die Bindungstasche der CALB ein und

wird durch nucleophilen Angriff des Serins der katalytischen Triade (Ser105) an das En-

zym gebunden. Die im n¨

achsten Schritt erforderliche Ring¨

offnung des resultierenden ers-

ten tetraedrischen Intermediates TI1 (s. Schema 0.1B) erfordert einen Protonentransfer

vom katalytischen Histidin (His224), das nun das Serinproton tr¨

agt, zum Ringhetero-

atom des gebundenen Liganden. Im TI1 der Lactonpolymerisation liegt der Ringsauer-

stoff des ehemaligen ε-Caprolactons auf der sogenannten Alkoholseite des Enzyms und

ubernimmt das Histidinproton in einem direkten Protonentransfer. Im Gegensatz dazu

II Kurzfassung

bildet β-Lactam mit CALB einen inversen TI1, dessen Ringstickstoff auf der Acylseite

angeordnet ist, und der Protonentransfer kann einzig unter Verwendung eines Wassermo-

lek¨

uls als Protonenshuttle stattfinden, was ein Hemmnis der Polymerisation darstellt. Die

in beiden Polymerisationen gebildeten Acyl-Enzym-Komplexe (s. Schema 0.1C) sind da-

gegen komplett analog zueinander. Eine Hydrolyse des Acyl-Enzym-Komplexes, die eine

st¨

andige Konkurrenz zur Kettenverl¨

angerung darstellt, bewirkt die Freisetzung der ent-

sprechenden S¨

auren β-Alanin (pKa3,6) bzw. 6-Hydroxyhexans¨

aure (pKa4,75). W¨

ahrend

6-Hydroxyhexans¨

aure jedoch keinen Einfluss auf das Enzym hat, ist β-Alanin bedingt

durch seine h¨

ohere Azidit¨

at in der Lage das Histidin der katalytischen Triade irreversi-

bel zu protonieren. Das betreffende Enzym wird auf diesem Wege inaktiviert und nimmt

nicht weiter an der Polymerisationsreaktion teil. Dies f¨

uhrt zu den bei der β-Lactam-

Polymerisation beobachteten kurzen Kettenl¨

angen.

Die Kettenverl¨

angerung des Acyl-Enzym-Komplexes verl¨

auft ¨

uber ein aktiviertes Mo-

nomer (s. Schema 0.1E), das durch Addition eines katalytisch genutzten kristallographi-

schen Wassermolek¨

uls an das Monomer (s. Schema 0.1D) gebildet wird. Auch hier un-

terscheiden sich die gefundenen Mechanismen der Lactam- und Lactonpolymerisation

deutlich. Bei der Polymerisation von β-Lactam erfolgt die Kettenverl¨

angerung durch ein

in situ generiertes β-Alanin, das bei Hydrolyse von β-Lactam gebildet wird. Einzig auf-

grund der guten Stabilisierung dieses β-Alanins in der Bindungstasche der CALB und

nur wenn diese gegeben ist, ist die Nutzung eines solchen aziden Monomers und somit

die gesamte Polymerisation ¨

uberhaupt erst m¨

oglich. Der kettenverl¨

angernde Schritt der

ε-Caprolacton-Polymerisation verl¨

auft hingegen problemlos ¨

uber ein neutrales cyclisches

geminales Diol.

Das durch sofortige Abl¨

osung der verl¨

angerten Kette resultierende freie Dimer bzw.

Oligomer wird im darauffolgenden Schritt durch nucleophilen Angriff des Ser105 an

der terminalen Carboxylgruppe neu angebunden und ergibt nach Abspaltung des kata-

lytischen Wassermolek¨

uls einen verl¨

angerten Acyl-Enzym-Komplex.

Kurzfassung III

Schema 0.1:Wichtige Zwischenstufen im Katalysezyklus der Candida antarctica Lipase B ka-

talysierten Ring¨

offnungspolymerisationen von β-Lactam und ε-Caprolacton im Vergleich (ox:

oxyanion hole). Die entscheidenden Unterschiede beider Polymerisationen liegen in der zuein-

ander inversen Anbindung des tetraedrischen Intermediates TI1 und den mechanistischen Details

bei der Kettenverl¨

angerung der Acyl-Enzym-Komplexe.

Abstract V

Abstract

The present thesis describes the mechanism of the Candida antarctica lipase B (CALB)

catalyzed ring-opening polymerization of β-lactam and ε-caprolactone which has been

elucidated by molecular modelling techniques. In contrast to polyesters, polyamides are

not yet accessible via lipase catalyzed polymerization. As the only exception β-lactam

can enzymatically be polymerized by CALB resulting in unbranched nylon 3 (poly(β-

alanine)), with, however, a maximum chain length of only 18 and an average length of

8 monomer units. Reasons for this different polymerizability of lactones and lactams

were unapparent in the past despite of their great structural similarity, especially as the

molecular basis of these polymerizations was completely uninvestigated. With this back-

ground, the aim of this thesis was a comparative study of mechanistic details of the CALB-

catalyzed polymerization of lactams and lactones particularly using β-lactam as the mo-

nomer of the only known polyamide formation and ε-caprolactone as the most prominent

example of a lactone polymerization yielding a polymer of high molecular weights.

The basic steps of the CALB-catalyzed polymerization of β-lactam and ε-caprolactone

were investigated with atomistic details based on experimental data by applying mole-

cular modelling techniques like docking, molecular dynamics and QM/MM-procedures.

The reaction sequence starts with a monomer entering the CALB active site, where it is

covalently bound by nucleophilic attack of serine Ser105 which is part of the enzyme’s

catalytic triade. The subsequent step requires a ring-opening of the resulting tetrahedral

intermediate TI1 (see scheme 0.2B) involving a proton transfer from the catalytic histidine

(His224), which transfers the serine-proton to the ring heteroatom of the bound ligand. In

the TI1 of the lactone reaction sequence the ring-oxygen of the former ε-caprolactone

is oriented towards the so called alcohol side of the binding pocket and takes up the

histidine-proton by a direct proton transfer. In contrast, β-lactam forms an inverse TI1,

whose ring-nitrogen is oriented on the acyl side and in which the proton transfer can on-

ly occur by help of a crystallographic water molecule of the enzyme as proton shuttle.

VI Abstract

The resulting acyl enzyme complexes from β-lactam and ε-caprolactone are completely

analogous (see scheme 0.2C). Release of the acyl chain from the enzyme by hydrolytic

cleavage, which permanently competes with chain elongation, and which causes libera-

tion of the corresponding acids β-alanine (pKa3.6) and 6-hydroxyhexanoic acid (pKa

4.75), respectively. However, while 6-hydroxyhexanoic acid does not affect the enzyme’s

activity, β-alanine featuring a higher acidity is able to protonate the histidine residue of

the catalytic triade irreversibly. This leads to an inactivation of the enzyme and termi-

nates for this particular enzyme molecule the polymerization process. As a result only

short polymer chains are accessible as it is observed in the CALB-catalyzed β-lactam

polymerization.

Chain elongation of the acyl enzyme complex proceeds via an activated monomer (see

scheme 0.2E), which is formed by addition of a catalytic water molecule to the mono-

mer (see scheme 0.2D). Again, the proposed mechanisms of the lactam- and lactone-

polymerization differ significantly in this step. Chain elongation of β-lactam polymeri-

zation proceeds via an in situ generated β-alanine, which is formed by hydrolysis of a

β-lactam molecule inside the binding site. The good stabilization of this β-alanine inside

the CALB active site is the important feature that enables utilization of this molecule de-

spite of its comparatively strong acidity and prevents inhibition of the enzyme. In contrast,

the chain elongating step of the ε-caprolactone polymerization takes place via a neutral

cyclic geminal diol.

After chain elongation the dimer or oligomer, respectively, is released from the enzyme

and is rebound with its terminal carboxyl group by nucleophilic attack of Ser105 which

yields an elongated acyl enzyme complex while the catalytic water molecule is liberated

and can be used for the next elongation step.

Abstract VII

Schema 0.2:Comparison of important intermediates of the catalytic cycle of the Candida antarc-

tica lipase B catalyzed ring-opening polymerization of β-lactam and ε-caprolactone, respectively

(ox: oxyanion hole). The crucial differences of the two reaction sequences are the inverse binding

of the tetrahedral intermediates TI1 and the mechanistic details concerning the chain elongation of

the acyl enzyme complexes.

VIII Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis IX

Inhaltsverzeichnis

Kurzfassung I

Abstract V

Publikationen XI

Abk¨

urzungen XIII

1 Einleitung 1

1.1 Biokatalyse ................................. 2

1.2 Enzyme ................................... 6

1.3 Lipasen ................................... 13

1.4 Candida antarctica LipaseB........................ 18

1.4.1 Struktur und Mechanismus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

1.4.2 Selektivit¨

at der Candida antarctica Lipase B . . . . . . . . . . . 22

1.4.3 L¨

osungsmitteleinfluss auf Candida antarctica Lipase B . . . . . . 27

1.4.4 pH-Abh¨

angigkeit der Candida antarctica Lipase B . . . . . . . . 29

1.5 Lipase-katalysierte Polymerisationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2 Aufgabenstellung 39

3 Ergebnisse 41

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.1.1 Katalyseschritte der CALB-katalysierten Polyamidbildung . . . . 46

3.2 CALB-katalysierte ε-Caprolacton-Polymerisation . . . . . . . . . . . . . 65

3.2.1 Katalyseschritte der CALB-katalysierten Polyesterbildung . . . . 65

XInhaltsverzeichnis

4 Diskussion und Ausblick 79

4.1 Vergleich der β-Lactam- und ε-Caprolacton-Polymerisation . . . . . . . 79

4.2 Ausblick................................... 88

5 Strukturen und Methoden 91

5.1 Workflow .................................. 91

5.2 Verwendete Strukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

5.3 pKa-Berechnungen ............................. 92

5.4 Docking-Studien mit QXP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

5.4.1 QuickeXPlore ........................... 92

5.4.2 Definition des Dockingvolumens . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

5.4.3 Rescoring der Dockingergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

5.4.4 Aufbereitung der Dockingstrukturen und Berechnung der Proto-

nierungszust¨

ande.......................... 98

5.5 Energieminimierungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

5.5.1 Grundlagen............................. 99

5.5.2 Durchf¨

uhrung............................101

5.6 Molekulardynamische Untersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

5.6.1 Grundlagen.............................102

5.6.2 Durchf¨

uhrung............................103

5.7 QM/MM-Geometrieoptimierungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

5.7.1 Grundlagen.............................103

5.7.2 Durchf¨

uhrung............................105

Literaturverzeichnis XV

Publikationen XI

Publikationen

Aus der vorliegenden Arbeit sind folgende Ver¨

offentlichungen erschienen:

Baum I., Els¨

asser B., Schwab L.W., Loos K., Fels G., Atomistic model for the poly-

amide formation from β-lactam by Candida antarctica Lipase B., ACS Catalysis 2011,

1:323-336

Fels G., Baum I., Molecular Modeling Approach to Enzymatic Polymerization. in “Bio-

catalysis in Polymer Chemistry”, Loos K. (Herausgeber), Wiley-VCH (978-3-527-32618-

1), 2010, Kapitel 14, 349-368

Schwab L.W., Baum I., Fels G., Loos K., Mechanistic Insight in the Enzymatic Ring-

Opening Polymerization of β-Propiolactam. in “Green Polymer Chemistry: Biocatalysis

and Biomaterials”, Cheng H. N., Gross R. A. (Herausgeber), ACS Symposium Series,

American Chemical Society, 2010, Kapitel 19, 265-278

Verwendete Abk¨

urzungen XIII

Verwendete Abk¨

urzungen

Aminos¨

auren

Aminos¨

aure Code

Alanin Ala

Arginin Arg

Asparagin Asn

Asparagins¨

aure Asp

Cystein Cys

Glutamins¨

aure Glu

Glutamin Gln

Glycin Gly

Histidin His

Isoleucin Ile

Leucin Leu

Lysin Lys

Methionin Met

Phenylalanin Phe

Prolin Pro

Serin Ser

Threonin Thr

Tryptophan Trp

Tyrosin Tyr

Valin Val

XIV Verwendete Abk¨

urzungen

Abk¨

urzungen

Abk¨

urzung Bedeutung

ATP Adenosintriphosphat

CALB Candida antarctica Lipase B

CL Caprolacton

DFT Dichtefunktionaltheorie

DNA Desoxyribonucleins¨

aure

LMCS local Monte Carlo search algorithm

MC Monte Carlo

MD Molekulardynamik

MM Molekularmechanik

MOE Molecular Operating Environment

N435 Novozyme435

NAD Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid

PCA Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis)

PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

PDB Protein Data Base

PDL 15-Pentadecanolid

QM Quantenmechanik

QXP Quick eXPlore

VL Valerolacton

1 Einleitung

Polymere sind in unserer heutigen Technologiegesellschaft in nahezu allen Lebensberei-

chen vertreten und aus dem Alltag nicht mehr wegzudenken. Seit Begr¨

undung der Poly-

merchemie durch den Chemiker Hermann Staudinger, der seine Theorien zum struktu-

rellen Aufbau von Polymerketten im Jahr 1920 ver¨

offentlichte[1] und f¨

ur seine Arbeiten

auf diesem Gebiet im Jahr 1953 den Nobelpreis f¨

ur Chemie erhielt,[2] entstand ein ei-

genst¨

andiger Industriezweig mit rasantem Aufschwung.

Unter dem Handelsnamen Nylon kam kurz vor dem zweiten Weltkrieg die erste vollsyn-

thetische Faser auf den Markt: Polyamid 6.6, ein Polykondensat aus Hexamethylendiamin

und Adipins¨

aure. Diese Erfindung des US-amerikanischen Chemikers Wallace H. Caro-

thers, 1938 von DuPont patentiert,[3],[4] wurde zun¨

achst f¨

ur zivile Zwecke, wie Zahnb¨

urs-

ten und Damenstrumpfhosen, eingesetzt, entwickelte sich allerdings zusammen mit dem

deutschen Konkurrenzprodukt Perlon (Polyamid 6 aus ε-Caprolactam)[5], [6] zum kriegs-

wichtigen Rohstoff zur Herstellung von Fallschirmen. Seit 1950 ist ein kontinuierliches

Wachstum der Weltproduktion von Kunststoffen von 1,5 Mio. t (1950), ¨

uber bereits 50

Mio. t im Jahr 1976 bis hin zu 230 Mio. t (2009) zu verzeichnen, was einem durchschnitt-

lichen Wachstum von 9,0 % entspricht.[7] Die großtechnische Herstellung von Polyamid

6.6 erfolgt in der Schmelze durch Bulkpolymerisation eines Salzes aus Adipins¨

aure und

Hexamethylendiamin (AH-Salz) bei ca. 290◦C und 2,7 MPa im kontinuierlichen R¨

ohren-

reaktor.[5] Polyamid 6 wird haupts¨

achlich ¨

uber die hydrolytische Polymerisation einer 80-

90 %igen w¨

assrigen L¨

osung von ε-Caprolactam unter Zusatz kleiner Mengen Essigs¨

aure

gewonnen, wobei die Polymerisation chargenweise bei 260◦C abl¨

auft.[5]

Die meisten klassischen Polymerisationsverfahren sind energie- und somit auch kos-

tenintensiv, sowie aus ¨

okologischen Gesichtspunkten problematisch. In den letzten Jah-

ren geht der Trend hin zur Entwicklung ¨

okologisch und ¨

okonomisch sinnvollerer Verfah-

ren, wie dem Einsatz enzymkatalysierter Synthesen. Enzymkatalysierte Polymerisationen

21 Einleitung

k¨

onnen unter milderen Bedingungen und somit kostensparend durchgef¨

uhrt werden, tra-

gen durch die Wiederverwendung des Katalysators zu einer besseren ¨

okologischen Bilanz

bei, bieten durch ihrer hohe Regio- und Stereoselektivit¨

at neue Synthesem¨

oglichkeiten

und sind auch in organischen L¨

osungsmitteln m¨

oglich. Des Weiteren k¨

onnen hochreine

Produkte, die frei von R¨

uckst¨

anden der sonst ¨

ublichen organometallischen Polymerisati-

onsinitiatoren sind, hergestellt werden. Durch ihre gesundheitliche Unbedenklichkeit sind

diese auch f¨

ur biomedizinische Anwendungen geeignet.[8] Der Mechanismus enzymka-

talysierter Polymerisationen ist auf molekularer Ebene kaum erforscht, was eine Opti-

mierung der Prozesse schwierig macht. Mit Methoden des Molecular Modelling ist das

Studium dieser molekularen Abl¨

aufe m¨

oglich, wodurch auf langfristige Sicht eine Op-

timierung der Prozesse durch gezielte Mutation des Enzymkatalysators erreicht werden

kann.

1.1 Biokatalyse

Biokatalytische Verfahren werden bereits seit Jahrtausenden zur Herstellung von Lebens-

mitteln wie K¨

ase, Sojasauce, Wein oder Bier eingesetzt. Bei diesen zun¨

achst zuf¨

allig ent-

deckten und sp¨

ater technisierten Verfahren handelt es sich um Fermentationen, in denen

mehrstufige Synthesen unter Verwendung von biokatalytisch aktiven lebenden Zellen ab-

laufen. Im letzten Jahrhundert kamen zahlreiche neue biotechnologische Synthesen hinzu,

beispielsweise fermentative Verfahren zur Herstellung von Antibiotika wie Penicillin, Vi-

taminen und Amminos¨

auren, sowie großtechnische Prozesse zur Gewinnung von Glycerin

und Herstellung von L¨

osungsmitteln ¨

uber die Aceton-Butanol-G¨

arung.[9]–[11]

Neben der Fermentation ist als zweite bedeutsame Gruppe biokatalytischer Verfahren

die Biotransformation zu nennen, bei der keine lebenden Organismen, sondern isolierte

Enzyme eingesetzt werden, die dem Reaktionsgemisch entweder in l¨

oslicher Form oder

auf einem Tr¨

ager immobilisiert zugesetzt werden.[9] Die Verwendung freier Enzyme in

L¨

osung erweist sich aufgrund ihrer eingeschr¨

ankten Aktivit¨

at und Stabilit¨

at als problema-

1.1 Biokatalyse 3

tisch. Ferner ist eine Zur¨

uckgewinnung des Katalysators nicht m¨

oglich, was den entschei-

denden Vorteil eines immobilisierten Enzyms gegen¨

uber dem freien Enzym darstellt.[12]

Erste Versuche zur Immobilisierung von Enzymen erfolgten zwar bereits Anfang des letz-

ten Jahrhunderts, der Erfolg dieses Vorhabens ließ allerdings weitere 40 Jahre auf sich

warten bis in den 50er- und 60er-Jahren eine hinreichende Stabilit¨

at des immobilisierten

Enzyms auf seinem Tr¨

ager gew¨

ahrleistet werden konnte.[12],[13] Die Wahl des Tr¨

agerma-

terials und des Verfahrens zur Immobilisierung ist entscheidend um eine hohe Aktivit¨

und Stabilit¨

at des Enzympr¨

aparates zu erreichen. Die gebr¨

auchlichste Methode zur Im-

mobilisierung bildet die physikalische Adsorption, bei der das Enzym nur ¨

uber Van-der-

Waals-Kr¨

afte, ionische und hydrophobe Wechselwirkungen gebunden ist. Vorteil dieser

Methode ist die kosteng¨

unstige Durchf¨

uhrbarkeit und der geringe Einfluss auf die Akti-

vit¨

at des Enzyms. Diese Anbindung von Enzymen durch relativ schwache physikalische

Wechselwirkungen hat jedoch im Vergleich zur zweith¨

aufigsten Immobilisierungsmetho-

de, der kovalenten Anbindung, den Nachteil, dass mit der Zeit eine Desorption des Prote-

ins erfolgt. Durch kovalente Anbindung kann dieser st¨

andige Katalysatorverlust behoben

werden, wobei allerdings eine Verringerung der Enzymaktivit¨

at auftritt, da die erh¨

ohte

Bindungsst¨

arke eine sich meist nachteilig auswirkende Konformations¨

anderung des Pro-

teins hervorruft. Als Tr¨

agermaterialien f¨

ur die physikalische Adsorption von Enzymen

werden h¨

aufig Polymere, aber auch Kohlenstoffnanofasern, Silica und Celite verwendet,

w¨

ahrend die kovalente Anbindung auf Tr¨

agermaterialien erfolgt, deren reaktive Gruppen,

wie zum Beipiel Epoxidringe, mit den Aminogruppen des Proteins reagieren.[12]

Obwohl in der Vergangenheit vor allem fermentative Prozesse industriell genutzt wur-

den, gewinnen auch Biotransformationen immer mehr an Bedeutung. Diese lassen sich,

im Vergleich zur Verwendung ganzer Zellen bei Fermentationen, wesentlich komforta-

bler in kontinuierlichen Prozessen umsetzen. Das immobilisierte Enzym ist dabei wie ein

klassischer heterogener Katalysator verwendbar.[14] Tabelle1.1 zeigt beispielhaft einige

großtechnisch angewandte Biotransformationen unter Verwendung immobilisierter En-

zyme.[11],[15]–[18] Hier f¨

allt als besonders umsatzstarker Bereich die Lebensmittelindus-

41 Einleitung

trie ins Auge, w¨

ahrend die Bereiche Pharma und Feinchemikalien eher eine Nebenrolle

spielen. Als weiteres bedeutendendes Einsatzgebiet von Enzymen sind Wasch- und Rei-

nigungsmittel zu nennen, gefolgt von wesentlich geringeren Anteilen in der Textil- und

Lederindustrie.[14]

In den letzten Jahren wurde das enorme Potential der Biokatalyse bez¨

uglich der Her-

stellung enantiomerenreiner Produkte jedoch auch von der chemischen Industrie und der

Pharmaindustrie erkannt, weshalb auch in diesem Sektor immer h¨

aufiger enzymkataly-

sierte Synthesen zur Anwendung kommen.[18],[19] Letztlich entscheidet jedoch der Kos-

tendruck, ob eine Synthese auf klassischem chemischen oder biokatalytischem Weg er-

folgt. Somit ist die kosteng¨

unstige Verf¨

ugbarkeit von Enzymen besonders wichtig f¨

ur die

industrielle Anwendbarkeit der Biokatalyse. Dies kann durch Herstellung rekombinan-

ter Proteine mittels Klonierung gew¨

ahrleistet werden.[19] Dabei wird zun¨

achst die DNA

eines Organismus, der ein katalytisch interessantes Enzym herstellt, isoliert und aufgerei-

nigt, woraufhin das f¨

ur diese Enzymsynthese verantwortliche Gen identifiziert und mit-

tels der PCR-Methode (polymerase chain reaction) kloniert wird. ¨

Uber einen sogenannten

Vektor, ein Plasmid bestehend aus einem DNA-Doppelstrang, kann das klonierte Gen in

einen Wirt (z.B. das Bakterium Escherichia coli) eingebaut werden. Nach Vermehrung des

Wirtsorganismus tragen die Tochterzellen das auf diesem Wege eingeschleuste Gen und

k¨

onnen durch induzierte ¨

Uberexpression das gew¨

unschte Enzym in hinreichend großer

Menge produzieren.[11],[20]

Weitere Kriterien f¨

ur den industriellen Einsatz eines Biokatalysators sind ausreichend

hohe Aktivit¨

at und Stabilit¨

at sowie Substratspezifit¨

at des Enzyms.[19] W¨

ahrend Aktivit¨

und Stabilit¨

at des Enzyms sich, wie bereits beprochen, maßgeblich durch die Art der Im-

mobilisierung beeinflussen lassen, m¨

ussen zur Erh¨

ohung der Substratspezifit¨

at gezielte

Ver¨

anderungen am Enzym selbst vorgenommen oder andere geeignetere Biokatalysato-

ren gefunden werden. Die Suche nach neuen Biokatalysatoren erfolgt heutzutage meist

uber das Screening (high-throughput screening) kommerziell erh¨

altlicher Enzymdaten-

banken, wobei mittels eines entsprechenden Assays Enzyme gefunden werden k¨

onnen,

1.1 Biokatalyse 5

Tabelle 1.1: Industriell angewandte Biotransformationen

Produkt Edukt Reaktion Enzym Enzymklasse Produktions-

maßstab (pro Jahr)[11]

Maissirup[15] D-Glucose Isomerisierung Glucoseisomerase Isomerase (EC5) >1 Mio. t

(High-fructose corn syrup)

Lactose-freie Milch[16] D-Lactose Hydrolyse Lactase Hydrolase (EC3) >100.000 t

(D-Glucose und D-Galactose)

Kakaobutter[17] a1,3-Dipalmitoyl- Umesterung Candida rugosa Lipase Hydrolase (EC3) >10.000 t

2-monoolein (POP)

6-Aminopenicillans¨

aure[11] Penicillin G Hydrolyse Penicillinamidase Hydrolase (EC3) >1.000 t

L-Asparagins¨

aure[11] Fumars¨

aure Addition von Ammoniak Aspartase Lyase (EC4) >1.000 t

Ampicillin[11] 6-Aminopenicillans¨

aure Acylierung Penicillinamidase Hydrolase (EC3) >100 t

und D-Phenylglycinamid

L-Maleins¨

aure[18] Fumars¨

aure Addition von Wasser Fumarase Lyase (EC4) >100 t

L-Alanin[18] L-Asparagins¨

aure Decarboxylierung L-Aspartat-β-Decarboxylase Lyase (EC4) >100 t

abestehend aus 1(3)-Palmitoyl-3(1)-Stearoyl-2-monoolein (POSt) und 1,3-Distearoyl-2-monoolein (StOSt)

61 Einleitung

die eine hohe Aktivit¨

at f¨

ur bestimmte Reaktionen aufweisen.[21] Allerdings r¨

uckt auch

das aufw¨

andigere Protein Engineering, das gezielte Design von Biokatalysatoren, immer

mehr in den Fokus der Forschung.[22] Man unterscheidet dabei einerseits zwischen der

zielgerichteten Mutagenese (site-directed mutagenesis), bei der Aminos¨

auren des Enzyms

gezielt ausgetauscht werden, was zwangsl¨

aufig eine tiefgehende Kenntnis des Enzyms

erfordert und trotzdem nicht immer zum Erfolg f¨

uhrt,[22] und andererseits der gerichte-

ten Evolution (directed evolution), die sich in den meisten F¨

allen als die Methode der

Wahl erwiesen hat. Die gerichtete Evolution nutzt eine iterative Herangehensweise, bei

der zun¨

achst eine zuf¨

allige oder zielgerichtete Mutagenese durchgef¨

uhrt wird, die Mu-

tanten im Hinblick auf die gew¨

unschten katalytischen Eigenschaften untersucht und die

erfolgsversprechensten Mutanten weiter optimiert werden.[23] Ein prominentes Beispiel

f¨

ur den Einsatz genetisch ver¨

anderter Organismen ist die Produktion von Riboflavin (Vit-

amin B2) durch Hefen und Bakterien. So konnte die gegen zu hohe Eisenkonzentrationen

empfindliche Rivoflavin-Produktion der Hefe Candida famatata durch Auswahl von ent-

sprechenden eisenresistenten Mutanten wesentlich verbessert werden.[24]

1.2 Enzyme

Enzyme sind hochmolekulare katalytisch aktive Proteine, in der Regel bestehend aus li-

nearen Ketten proteinogener Aminos¨

auren, die durch Peptidbindungen miteinander ver-

kn¨

upft sind. Die katalytische Aktivit¨

at von Enzymen beruht auf der besonderen r¨

aum-

lichen Anordnung der Peptidketten, die nicht in langgestreckter Form, sondern als ge-

faltete Kette, in der sogenannten Sekund¨

arstruktur, vorliegen. Je nach Anordnung unter-

scheidet man dabei zwischen α-Helix und β-Faltblatt. Der Wechsel zwischen verschie-

denen Strukturabschnitten eines Enzyms erfolgt ¨

uber sogenannte β-Schleifen. Besonders

bei globul¨

aren Proteinen, zu denen die meisten Enzyme geh¨

oren, k¨

onnen nicht alle Ket-

tenabschnitte eine Sekund¨

arstruktur aufweisen, da sonst die f¨

ur diese Proteine typische

sph¨

arische Form nicht realisierbar w¨

are. Aus der r¨

aumlichen Anordnung der einzelnen

1.2 Enzyme 7

Substrat

Enzym

Substrat

Enzym

Substrat

Enzym

induced fit

Enzym

Abbildung 1.1: Bindung eines

Substrats an ein Enzym nach

dem Induced-fit-Modell

Strukturabschnitte des Proteins ergibt sich die Ter-

ti¨

arstruktur, deren Stabilisierung ¨

uber Wasserstoffbr¨

ucken-

bindungen, Disulfid-Br¨

ucken, ionische und hydrophobe

Wechselwirkungen erfolgt.[25],[26] Der Erhalt dieser Ter-

ti¨

arstruktur ist von elementarer Bedeutung f¨

ur die kataly-

tische Aktivit¨

at eines Enzyms.

Durch Visualisierung der Oberfl¨

ache eines Proteins

wird deutlich, dass diese nicht glatt ist, sondern viele Un-

regelm¨

aßigkeiten und Vertiefungen aufweist. Eine spezi-

elle Vertiefung ist die Bindungstasche (auch: active site),

in der die Umsetzung des Substrats stattfindet. Bei Ab-

lauf einer Enzymkatalyse tritt zun¨

achst das Substrat in

einem diffusionskontrollierten Schritt in die Bindungs-

tasche des Enzyms ein (s. Abb. 1.1). Enzymkatalysierte

Reaktionen sind substratspezifisch, d.h. von einem En-

zym werden nur bestimmte Substrate bzw. Substratgrup-

pen umgesetzt, die den sterischen und elektronischen Ge-

gebenheiten des Enzyms entsprechen. Vereinfacht kann

hier von einem Schl¨

ussel-Schloss-Prinzip,[26] bei dem das

Substrat (Schl¨

ussel) genau zum Schloss (Enzym) passen

muss, sprechen. Enzyme verf¨

ugen jedoch ¨

uber eine ge-

wisse Flexibilit¨

at, die durch das sogenannte Induced-fit-

Modell[27] wesentlich besser beschrieben wird.

Demnach ist das Enzym in der Lage bei Bindung eines

Substrats strukturelle ¨

Anderungen zu vollziehen und sich so dem Liganden anzupassen,

es bildet sich ein Enzym-Substrat-Komplex, der in einer enzymkatalysierten Reaktion

zu einem Enzym-Produkt-Komplex weiterreagiert. In einem letzten Schritt verlassen ein

oder mehrere Produkte die active site. Auch dieser letzte Schritt unterliegt der Diffusi-

81 Einleitung

onskontrolle (s. Abb. 1.1). Das Enzym bleibt als Katalysator im gleichen Zustand wie

vor der Reaktion zur¨

uck. Das Prinzip der Enzymkatalyse ist f¨

ur alle Lebewesen von enor-

mer Bedeutung, eine Vielzahl von Stoffwechselprozessen, die unkatalysiert nicht m¨

oglich

w¨

aren, l¨

auft dank der Enzymkatalyse bei niedrigen Temperaturen ab. Dies ist m¨

oglich, da

Enzyme die Aktivierungsenergie von Reaktionen durch Ver¨

anderung des Reaktionswe-

ges herabsenken. Abbildung 1.2 zeigt den Verlauf der Gibbs’schen freien Enthalpie einer

unkatalysierten und einer katalysierten Reaktion in Abh¨

angkeit von der Reaktionskoordi-

nate.[11] Zun¨

achst liegen Enzym und Substrat im Grundzustand (E + S) vor ohne miteinan-

der in Wechselwirkung zu treten. ¨

Uberwindung einer relativ kleinen Energiebarriere f¨

uhrt

zur reversiblen Bindung des Substrats an das Enzym und Bildung des Enzym-Substrat-

Komplexes (E-S), wobei die Gibbs’sche freie Bindungsenthalpie (∆Gb) gewonnen wird.

Durch Zufuhr weiterer Aktivierungsenergie (∆G∗

kat) wird der Enzym-Substrat-Komplex

uber einen wesentlich h¨

oher gelegenen ¨

Ubergangszustand direkt zu einem Produkt (P)

und dem freien Enzym (E) umgesetzt. Der Enzym-Produkt-Komplex (EP) wird dabei

unter der Annahme, dass die Abl¨

osung sehr schnell erfolgt, vernachl¨

assigt. Bei einer di-

rekten Umsetzung des Substrats zum Produkt ohne die Hilfe eines Katalysators muss die

Aktivierungsenergie (∆G∗

unkat) in einem Schritt zugef¨

ugt werden. Je h¨

oher die Energiebar-

riere einer Reaktion desto mehr Energie muss sich im System befinden und desto h¨

ohere

Reaktionstemperaturen sind notwendig. Die erste Energiebarriere der katalysierten Re-

aktion (s. Abb. 1.2) kann somit als unkritisch angenommen werden, interessanter ist der

Vergleich der maximalen Energiebarrieren der katalysierten und unkatalysierten Reakti-

on. Nach Gleichung 1.1 ergibt sich die Ersparnis der aufzuwendenden Aktivierungsener-

gie bei Einsatz eines Enzymkatalysators aus der Gibbs’sche freie Bindungsenthalpie bei

Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes und den Aktivierungsenergien von katalysierter

und unkatalysierter Reaktion.

∆∆G∗=∆G∗

unkat +∆Gb−∆G∗

kat (1.1)

1.2 Enzyme 9

ΔG

unkat

ΔG

E + S

E + P

E-S

Reaktionskoordinate

ΔG

kat

Δ Δ G

Abbildung 1.2: Energiediagramm einer enzymkatalysierten (rot) und der analogen unkatalysier-

ten (blau) Reaktion (in Anlehnung an Bommarius et al.[11]). ∆Gb: Gibbs’sche freie Bindungs-

enthalpie, ∆G∗

unkat: Gibbs’sche freie Enthalpie der Aktivierung (unkatalysierte Reaktion), ∆G∗

kat:

Gibbs’sche freie Enthalpie der Aktivierung (enzymkatalysierte Reaktion), ∆∆G∗: Differenz der

Aktivierungsenergien von katalysierter und unkatalysierter Reaktion

Die Kinetik enzymkatalysierter Reaktionen l¨

asst sich durch die von Michaelis und

Menten im Jahr 1913 postulierten Geschwindigkeitsgesetze beschreiben.[11] Auch Mi-

chaelis und Menten vernachl¨

assigten dabei die Bildung des Enzym-Produkt-Komplexes

(EP), da die Abl¨

osung des Produktes sehr schnell erfolgt. Die Reaktion des Enzym-

Substrat-Komplexes (ES) zum Produkt und freien Enzym wird als irreversibel angenom-

men, was f¨

ur die Betrachtung am Reaktionsbeginn auch zutreffend ist, da zu diesem Zeit-

punkt hohe Substratkonzentrationen herrschen und die Produktkonzentration sehr klein

ist. Nach Michaelis und Menten lautet die zu beschreibende Reaktionsgleichung folglich:

E+S k1

GGGGGB

FGGGGG

k−1

GGGGGGA E+P

Die nach ihnen benannte Michaelis-Menten-Gleichung (s. Gl. 1.2-1.4) beschreibt die

Reaktionsgeschwindindigkeit veiner enzymatischen Reaktion als zeitliche Zunahme der

Produktkonzentration [P]in Abh¨

angigkeit von der Substratkonzentration [S], der m¨

ogli-

chen Maximalgeschwindigkeit vmax und der Michaelis-Konstanten KM, bestehend aus

10 1 Einleitung

den Geschwindigkeitskonstanten der Einzelreaktionen. Die Konzentration des Enzym-

Substrat-Komplexes (ES) wird nach dem Bodenstein’schen Quasistationarit¨

atsprinzip als

zeitlich konstant angenommen (d[ES]/dt ≈0) und die Gesamtkonzentration des Enzyms

setzt sich aus den Konzentrationen des freien Enzyms und des Enzym-Substrat-Komplexes

zusammen ([E]ges = [E]+[ES]).[11]

v=d[P]

dt =vmax·[S]

[S]+KM

(1.2)

mit

vmax =k2·[E]ges (1.3)

und

KM=k−1+k2

(1.4)

Ist die Substratkonzentration klein ([S]KM), so verh¨

alt sich die Reaktionsgeschwin-

digkeit direkt proportional zu dieser, w¨

ahrend bei hohen Substratkonzentrationen ([S]

KM), also einer S¨

attigung des Enzyms mit Substrat, die Umsetzung mit Maximalgeschwin-

digkeit abl¨

auft. Die Michaelis-Konstante ist ein Maß der Bindungsaffinit¨

at des Enzyms,

je kleiner KMdesto h¨

oher die Affinit¨

at des Enzyms f¨

ur ein bestimmtes Substrat.[11] Die

Reaktionsgeschwindigkeit h¨

angt neben Faktoren wie Substrat- und Enzymkonzentrati-

on auch von ¨

außeren Einfl¨

ussen wie pH-Wert, Temperatur und Zusatz anderer Substan-

zen, die aktivierend oder inhibierend wirken k¨

onnen, ab. Sogenannte Aktivatoren, die die

enzymkatalysierte Reaktion beschleunigen, sind h¨

aufig Ionen, beispielsweise bei Akti-

vierung des Enzyms Amylase durch Chlorid-Ionen.[28] Inhibitoren senken hingegen die

Reaktionsgeschwindigkeit der Enzymkatalyse. Dabei ist zwischen verschiedenen Mecha-

nismen der Inhibierung zu unterscheiden. Kompetitive Inhibitoren, die die am h¨

aufigs-

ten auftretende Gruppe der Inhibitoren darstellen, binden in der gleichen active site wie

das Substrat und stehen somit zu diesem in Konkurrenz. Experimentell ist bei kompetiti-

ver Inhibierung eine Erh¨

ohung der Michaelis-Konstanten KMfeststellbar. Zusatz weiterer

Mengen Substrat f¨

uhrt allerdings zur Verschiebung des Gleichgewichts und es kann die

1.2 Enzyme 11

gleiche Maximalgeschwindigkeit vmax erreicht werden wie bei der ungehemmten Reakti-

on. Eine nicht-kompetitive (allosterische) Hemmung bewirkt durch Wechselwirkung des

Inhibitors mit einer anderen Bindungsstelle des Enzyms eine konformelle ¨

Anderung der

Bindungstasche des Substrats, die eine Bindung des Substrats erschwert oder verhindert.

Dabei bleibt die Michaelis-Konstante KMunbeeinflusst, w¨

ahrend die Maximalgeschwin-

digkeit Vmax absinkt. Eine Erh¨

ohung der Substratkonzentration hat keinerlei Effekt auf die

nicht-kompetitive Hemmung. Bei beiden vorgestellten Inhibierungsmechanismen handelt

es sich um reversible Inhibierungen. Des Weitern ist auch eine irreversible Inhibierung

durch kovalente Anbindung des Inhibitors an das Enzym m¨

oglich.

Der Mechanismus der Inhibierung ist von enormer Bedeutung zur Regulierung enzy-

matischer Prozesse in Organismen, die ebenfalls ¨

uber k¨

orpereigene Inhibitoren erfolgt.

Auch viele Medikamente oder toxische Substanzen entfalten ihre Wirkung durch die In-

hibierung von Enzymen, so hemmt zum Beispiel das Antibiotikum Penicillin ein f¨

ur die

Zellwandsynthese in Bakterien verantwortliches Enzym.[26] Ein mehr oder minder unspe-

zifischer, da auf alle Enzyme wirkender, Inhibitor sind Protonen.

Die Aktivit¨

at von Enzymen h¨

angt sehr stark vom pH-Wert der Umgebung ab, da die

sauren und basischen Aminos¨

auren des Proteins je nach pH-Wert in einem anderen Pro-

tonierungszustand vorliegen und die Umsetzung nicht m¨

oglich ist, wenn dieser nicht dem

zur Katalyse ben¨

otigten Protonierungszustand entspricht. Die meisten Enzyme besitzen

ein pH-Optimum im neutralen Bereich, es sind jedoch auch solche bekannt, die unter

extremen Bedingungen arbeiten, wie zum Beipiel das Enzym Pepsin im Magensaft mit

einem Optimum von pH 2.[26],[28]

Enzyme haben nicht nur spezifische Anforderungen an ihre Umgebung und Reakti-

onsbedingungen, sondern auch an die umzusetzenden Substrate. Diese Substratspezifit¨

macht man sich auch bei der Einteilung von Enzymen in ihre verschiedenen Gruppen zu-

nutze, die nach der vom Enzym katalysierten Reaktion bzw. dem umgesetzten Substrat

erfolgt. Tabelle 1.2 zeigt die sechs bekannten Enzymklassen, einige ihrer Untergruppen

und Beispiele der von ihnen katalysierten Reaktionen.[26],[28] Von besonderem industriel-

12 1 Einleitung

len Interesse sind die Enzymklassen der Hydrolasen (44% der biokatalytischen Anwen-

dungen) und Oxidoreduktasen (33%).[29] Zu den Hydrolasen geh¨

ort unter anderem die

Untergruppe der Lipasen, deren nat¨

urliche Substrate Triglyceride sind, die jedoch auch

eine Vielzahl anderer Substrate akzeptieren und dadurch bedingt h¨

aufig in der organi-

schen Synthesechemie eingesetzt werden.[30]

Einige Enzyme ben¨

otigen zur Umsetzung von Substraten weitere nichtproteinogene

Bestandteile, sogenannte Cofaktoren. Ein in biologischen Systemen bedeutsamer Cofak-

tor ist Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD), das in den Dehydrogenasen der Mito-

chondrien als Wasserstoff¨

ubertr¨

ager fungiert, indem es ein Hydrid aufnimmt (NAD++

H2→NADH +H+). Andere h¨

aufig vorkommende Cofaktoren sind Metallionen wie Fe2+,

Fe3+oder Mg2+.[26],[28]

Tabelle 1.2: Klassifizierung von Enzymen[26], [28], [31]

Enzymklasse Untergruppen Aufgaben (Bsp.)

Oxidoreduktasen Dehydrogenasen Oxidation von Substraten unter NADHa-Verbrauch

(EC1) Oxidasen Elektronentransfer bei Photosynthese

Transferasen Kinasen Transfer von Phosphatgruppen von ATPbauf Substrate

(EC2) Polymerasen Polymerisation von Nukleotiden

Hydrolasen Lipasen Spaltung von Lipiden in Glycerin und Fetts¨

auren

(EC3) im menschlichen Verdauungstrakt

Esterasen hydrolytische Spaltung von Estern

Lyasen Decarboxylasen Decarboxylierung von Substraten

(EC4) Synthasen Kondensationsreaktionen ohne ATP als Energiequelle

Isomerasen Racemasen Racemisierung von chiralen Aminos¨

auren

(EC5)

Ligasen Synthetasen Kondensationsreaktionen unter Nutzung von ATP

(EC6) als Energiequelle

aCofaktor Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) fungiert als Wasserstoff¨

ubertr¨

ager

bAdenosintriphosphat (ATP) wird dabei unter Energiefreisetzung zu Adenosindiphosphat umgesetzt

1.3 Lipasen 13

1.3 Lipasen

Lipasen, die zur Gruppe der Serin-Hydrolasen geh¨

oren, sind ubiquit¨

ar vorkommende En-

zyme, die z.B. bei S¨

augetieren f¨

ur die Spaltung von Nahrungsfetten im D¨

unndarm ver-

antwortlich sind und in den Samen h¨

oherer Pflanzen die Mobilisierung von Speicherli-

piden w¨

ahrend des Keimvorgangs bewerkstelligen.[25],[32] Durch ihre stark hydrophobe

Tasche sind Lipasen besonders zur Hydrolyse von Triglyceriden geeignet und setzen be-

vorzugt wasserunl¨

osliche Substrate um, w¨

ahrend sie in rein w¨

assrigen L¨

osungen eine sehr

niedrige Aktivit¨

at zeigen. Dieses Ph¨

anomen tritt durch die, f¨

ur eine katalytische Aktivit¨

ben¨

otigte, Grenzfl¨

achenaktivierung der Lipasen zutage. In Anwesenheit einer hydropho-

ben Grenzschicht, wie zum Beispiel in zweiphasigen Wasser/Fett-Gemischen, steigt die

Hydrolyseaktivit¨

at mit ¨

Uberschreiten der L¨

oslichkeit des Fetts sprunghaft an. Verantwort-

lich daf¨

ur ist die lid-Struktur der Lipasen, in der der Eingang zur Bindungstasche in w¨

ass-

rigen L¨

osungen von einem aus α-Helices bestehenden Deckel (lid) verschlossen wird.

In Anwesenheit einer hydrophoben Substratschicht vollzieht die Lipase jedoch eine Kon-

formations¨

anderung, wobei der lid zur Seite schwenkt und den Eingang zur active site

freigibt.[32],[33] Erst diese Konformations¨

anderung f¨

uhrt zur Bildung des bei Stabilisie-

rung des ¨

Ubergangszustands katalytisch wichtigen oxyanion holes und erh¨

oht gleichzeitig

durch Exposition hydrophober Reste den hydrophoben Charakter der Bindungstasche in

der offenen Form. Die restliche Oberfl¨

ache von Lipasen ist, wie typisch f¨

ur wasserl¨

osliche

Enzyme, hydrophil. Auch der lid der geschlossenen Form besitzt eine hydrophile Ober-

fl¨

ache, w¨

ahrend seine hydrophobe nach Innen gewandte Oberfl¨

ache erst bei Kontakt mit

einer ebenfalls hydrophoben Phasengrenzfl¨

ache nach außen gekehrt wird.[34] Die meisten

Lipasen weisen diese Grenzfl¨

achenaktivierung auf, eine seltene Ausnahme ist hier Can-

dida antarctica Lipase B.

Auch im Aufbau ihrer zentralen katalytischen Dom¨

ane besitzen Lipasen große ¨

Ahn-

lichkeit, sie alle weisen das f¨

ur Serin-Hydrolasen typische Strukturelement der α/β-Hy-

drolasefaltung (s. Abb. 1.3) auf.[35] Hierbei handelt es sich um ein α/β-Sheet aus acht

14 1 Einleitung

β-Faltbl¨

attern, die ¨

uber α-Helices miteinander verbunden sind. F¨

ur die katalytische Akti-

vit¨

at der Serin-Hydrolasen unerl¨

asslich sind die sogenannte katalytische Triade, die direkt

an der Anbindung des Substrats beteiligt ist, und das oxyanion hole zur Stabilisierung der

tetraedrischen Zwischenstufen. Die katalytische Triade[36] besteht aus einem Nucleophil

(z.B. Serin, Cystein), das das Substrat nucleophil angreift und einem Histidin, das ein Pro-

ton des Nucleophils ¨

ubernimmt und an das Carboxylat des Acylrestes (Asparagins¨

aure

oder Glutamins¨

aure) weitergibt. Dabei entsteht ein negativ geladenes Intermediat, das

vom oxyanion hole stabilisiert wird, indem dessen Aminos¨

aurereste Wasserstoffbr¨

ucken-

bindungen zum Substratsauerstoff, der die negative Ladung tr¨

agt, ausbilden.[14],[32]

NH2

COOH

Acyl

His

Abbildung 1.3: α/β-Hydrolasefaltung von Serin-Hydrolasen (in Anlehnung an Ollis et al.[35] und

Baumann[14]). β-Faltbl¨

atter (1-8) und α-Helices (A-F) sind als Pfeile bzw. Zylinder dargestellt.

Der Acylrest (Acyl), das Nucleophil (Nu) und das Histidin (His) der katalytischen Triade sowie das

oxyanion hole (ox) sind auf den entsprechenden Abschnitten eingezeichnet. Die zentrale Topologie

ist bei allen Serin-Hydrolasen gleich, obwohl in einigen Abschnitten eine gewisse Variabilit¨

vorliegt, hier angedeutet durch gestrichelte Linien.

Ein f¨

ur Serin-Hydrolasen allgemein g¨

ultiger Mechanismus zur Spaltung von Peptid-

und Esterbindungen wurde bereits 1988 von Carter et al.[37] anhand von Untersuchun-

gen an Serin-Proteasen aufgekl¨

art. Bei einer hydrolasekatalysierten Esterspaltung tritt

zun¨

achst der Ester (R1COOR) in die Bindungstasche des freien Enzym ein und wird dort

vom Nucleophil der katalytischen Triade (Serin) nucleophil angegriffen (s. Abb. 1.4).

W¨

ahrend der Serinsauerstoff eine Bindung zum Carbonylkohlenstoff des Esters eingeht

1.3 Lipasen 15

wird das Proton des Serins vom Histidinstickstoff abstrahiert, w¨

ahrend ein Histidinpro-

ton auf das Carboxylat des Acylrestes (Asparagins¨

aure oder Glutamins¨

aure) ¨

ubertragen

wird. Die Reversibilit¨

at dieses Protonen¨

ubertrags innerhalb der katalytischen Triade ist

von elementarer Bedeutung f¨

ur die Funktionsf¨

ahigkeit des Enzyms. Es bildet sich ein

tetraedrisches Intermediat, dessen negativ geladener Sauerstoff im oxyanion hole stabi-

lisiert ist, und das durch Abspaltung eines Alkoholrestes (ROH) unter R¨

uckbildung der

Carbonylgruppe in einen Acyl-Enzym-Komplex ¨

ubergeht. Das Proton des gebildeten Al-

kohols stammt dabei vom Histidin, das selbst wiederum ein Proton des Acylrestes abstra-

hiert. Der ¨

uber Wechselwirkungen zum oxyanion hole stabilisierte Acyl-Enzym-Komplex

kann im darauffolgenden Schritt von einem Wassermolek¨

ul gespalten werden, das sich im

Wasserstoffbr¨

uckenbindungsabstand zum Histidin aufh¨

alt und im Zuge eines nucleophi-

len Angriffs auf den Carbonylkohlenstoff des Acyl-Enzym-Komplexes ein Proton an den

Histidinstickstoff abgibt. Es bildet sich ein durch Wechselwirkungen zum oxyanion hole

stabilisiertes zweites tetraedrisches Intermediat, das durch Protonen¨

ubertrag vom Histidin

zum Serinsauerstoff abgel¨

ost wird, wobei eine Carbons¨

aure als Produkt entsteht. Nach

Durchlaufen eines Katalysezyklus liegt das Enzym wieder in seiner nativen Form vor und

kann die n¨

achste Umsetzung im darauffolgenden Zyklus katalysieren.

Vertreter aus der Enzymgruppe der Lipasen (EC3.1.1.3) werden aufgrund ihrer guten

Eigenschaften h¨

aufig als Biokatalysatoren eingesetzt. Im Allgemeinen verf¨

ugen Lipasen

uber eine hohe Temperatur- und Lagerstabilit¨

at, hohe Regio- und Enantioselektivit¨

at, to-

lerieren auch organische L¨

osungsmittel und sind meist cofaktorunabh¨

angig. Ein direk-

ter Vergleich der verschiedenen Lipasen ist aufgrund der großen strukturellen Vielfalt

schwierig. Schon relativ geringe ¨

Anderungen, wie die Mutation einer einzelnen Ami-

nos¨

aure, k¨

onnen weitreichende Auswirkungen auf die Aktivit¨

at und Selektivit¨

at eines En-

zyms haben, eine konkrete Voraussage dieser Eigenschaften anhand der Enzymstruktur

ist somit schwierig bis unm¨

oglich. Allein in Bezug auf die Gr¨

oße der active sites f¨

allt

die enorme Bandbreite der Taschenvolumina verschiedener Lipasen ins Auge. Tabelle 1.3

zeigt die mittels Q-SiteFinder[38] berechneten Volumina der Bindungstaschen einiger Li-

16 1 Einleitung

NHN

HIS

SER

ASP/GLU

+ R1COOR

NHN

HIS

SER

ASP/GLU

NHN

HIS

ASP/GLU

SER

NHN

HIS

SER

ASP/GLU

- ROH

+ H2O

NHN

HIS

SER

ASP/GLU H O

NHN

HIS

ASP/GLU

SER

freies Enzym

- R1COOH

Acyl-Enzym-Komplex

Abbildung 1.4: Katalysezyklus der Esterhydrolyse von Serin-Hydrolasen (ox: oxyanion hole).

1.3 Lipasen 17

pasen und (sofern vorhanden) Umsatz und Molekulargewicht bei Polymerisation diverser

Lactone. Ein direkter Zusammenhang zwischen Taschenvolumen und Polymerisierbar-

keit großer Lactone besteht nicht. Sowohl Burkholderia cepacia mit einem Volumen von

364 ˚

A3als auch Pseudomonas fluorescens mit einer halb so großen Tasche (162 ˚

A3) poly-

merisieren das 16-gliedrige Lacton PDL mit ¨

ahnlichen Ums¨

atzen und Molekulargewich-

ten, w¨

ahrend die wesentlich gr¨

oßere Porcine pancreas Lipase (429 ˚

A3) eine klare Bevor-

zugung des kleineren ε-Caprolactons zeigt. Candida antarctica Lipase B hat sich mit der

Zeit als effektiver Katalysator f¨

ur eine Vielzahl von Polymerisationsreaktionen erwiesen

und zeigte in vergleichenden Studien von Sivalingam et al.[39] die h¨

ochste Aktivit¨

at der

untersuchten Lipasen bei Polymerisation von ε-Caprolacton.

Tabelle 1.3: Bindungstaschenvolumina ausgew¨

ahlter Lipasen

Enzym PDB-Code Volumen MonomeraUmsatz ¯

in ˚

A3in % in 103g

mol

Burkholderia cepaciab2NW6 364 PDL[40] 90 2,4

Candida antarctica 3GUU 599 k.A. k.A. k.A.

Lipase A

Candida antarctica 1LBS 301 ε-CL[41] 99 25

Lipase B

Candida cylindracea 1LLF 270 ε-CL[40] 75 3,3

PDL[40] 54 5,8

Candida rugosa 3RAR 403 PDL[40] 21 2,5

Pseudomonas fluorescens 3IA2 162 δ-VL[40] 95 1,9

ε-CL[40] 85 7

PDL[40] 97 2,8

Porcine pancreas Lipase 1ETH 429 ε-CL[40] 69 2,5

PDL[40] 27 1,8

aδ-VL: δ-Valerolacton, ε-CL: ε-Caprolacton, PDL: 15-Pentadecanolid

bfr¨

uher: Pseudomonas cepacia

18 1 Einleitung

1.4 Candida antarctica Lipase B

1.4.1 Struktur und Mechanismus

Aus der Hefe Candida antarctica, benannt nach ihrem Fundort in der Antarktis,[42] konn-

ten die beiden Lipasen Candida antarctica Lipase A und B isoliert werden. Durch Ex-

pression in Aspergillus oryzae sind diese in großtechnischem Maßstab f¨

ur industrielle

Anwendungen verf¨

ugbar.[32] Lipase A weist bei sehr hoher Thermostabilit¨

at ein nur ge-

ringes Substratspektrum auf, weshalb bevorzugt Lipase B eingesetzt wird, die zwar eine

etwas geringere Thermostabilit¨

at aufweist, aber ein breites Spektrum von Substraten ak-

zeptiert und cofaktorunabh¨

angig ist.[42] Die lang gehegte Vermutung, dass Lipase A von

Ca2+als Cofaktor abh¨

angig ist konnte durch Strukturaufkl¨

arung von Ericsson et al.[43]

widerlegt werden. Candida antarctica Lipase A ist vor allem zur Umsetzung sterisch

stark gehinderter Substrate geeignet, beispielsweise Spaltung der mittleren Estergruppe

von Triglyceriden, f¨

ur die Candida antarctica Lipase B (CALB) keinerlei Aktivit¨

at auf-

weist.[42] Diese hohe Spezifit¨

at f¨

ur sterisch stark gehinderte Substrate ist durch die un-

gef¨

ahr doppelt so große Bindungstasche der Lipase A im Vergleich zu Lipase B gegeben

(s. Tab. 1.3). CALB ist immobilisiert auf einer makropor¨

osen Polymermatrix aus Polyme-

thylmethacrylat unter dem Namen Novozym 435 (N435) kommerziell erh¨

altlich.[44] Die

Strukturaufkl¨

arung von Lipase B erfolgte durch Uppenberg et al., sowohl f¨

ur das native

Enzym (PDB ID: 1TCA, 1TCB)[45] als auch komplexiert mit einem kovalent gebunden

Phosphonat-Inhibitor (PDB ID: 1LBS)[46] bzw. mit dem Detergenz Tween 80 (PDB ID:

1LBT).[46] Im Gegensatz zur Mehrzahl der Lipasen zeigt CALB nicht die f¨

ur diese En-

zymgruppe typische Grenzfl¨

achenaktivierung, da sie ¨

uber keine lid-Struktur, sondern nur

einen großen hydrophoben Bereich am Tascheneingang verf¨

ugt.[42],[45] Aus diesem Grund

kann sie auch als Zwischenstufe zur Gruppe der Esterasen gesehen werden.[14] In neueren

Untersuchungen konnten Skjøt et al.[47] zwei Enzymregionen sehr hoher Mobilit¨

at iden-

tifizieren: die α5-Helix (Aminos¨

auren 142-146), die schon Uppenberg als m¨

oglichen lid

erkannte, und die α10-Helix (Aminos¨

auren 268-287). Es handelt sich bei der α5-Helix

1.4 Candida antarctica Lipase B 19

jedoch eher um einen verk¨

ummerten lid, eine geschlossene Form der CALB ist nicht be-

kannt. Candida antarctica Lipase B geh¨

ort zu dem globul¨

aren Proteinen und weist die

f¨

ur Serin-Hydrolasen typische α/β-Hydrolasefaltung auf, wobei die zentrale β-Faltblatt-

Struktur aus sieben Str¨

angen besteht, von denen sechs parallel verlaufen und einer an-

tiparallel. F¨

unf der benachbarten β-Faltbl¨

atter werden miteinander durch vier der zehn

vorhandenen α-Helices verbunden. Die Bindungstasche von CALB besteht gr¨

oßtenteils

aus den Helices α5, α6 und α10 mit der α5-Helix als nicht funktionsf¨

ahigem lid (s. Abb.

1.5).

Abbildung 1.5: Terti¨

arstruktur von Candida antarctica Lipase B. Die zentrale β-Faltblatt-Struktur

aus sechs parallelen und einem antiparallelen β-Faltblatt (gelb) ist von mehreren α-Helices (rot)

umgeben, die f¨

unf der β-Faltbl¨

atter miteinander verkn¨

upfen. Die α5-Helix (gr¨

un) bildet den lid

der Lipase, wobei allerdings keine geschlossene Form vorhanden ist. Die Lage der katalytischen

Triade (Ser105, His224, Asp187) und des oxyanion holes (ox) ist angedeutet.

Die hydrophobe active site ist relativ eng, ca. 12 ˚

Atief und wird auf der einen Sei-

te von Leu140 und Leu144 und auf der anderen Seite von Leu278 begrenzt. Die untere

Begrenzung der Tasche bildet Trp104, das sich in direkter N¨

ahe zum aktiven Zentrum

am Boden der Bindungstasche befindet. Die katalytische Triade, bestehend aus Ser105,

His224 und Asp187, war nach Aufkl¨

arung der Enzymstruktur leicht identifizierbar, da sie

das einzig vorhandene Histidin der Struktur enth¨

alt.[45] Zur kovalenten Anbindung eines

20 1 Einleitung

Substrats greift der Sauerstoff der Serinhydroxygruppe den Carbonylkohlenstoff des Sub-

strats nucleophil an, w¨

ahrend gleichzeitig ein Proton vom Serin auf den basischen Histi-

dinstickstoff ¨

ubergeht, was wiederum einen Protonen¨

ubertrag von His224 auf Asp187 zur

Folge hat. Der daraus resultierende negativ geladene Substratsauerstoff wird im oxyanion

hole durch Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zu Gln106-NH (backbone), Thr40-NH (back-

bone) und Thr40-OH (Seitenkette) stabilisiert. Die direkte Umgebung des katalytischen

Serins (Ser105) ist ¨

außerst polar. Neben His224 sind Thr40, Asp134 und Gln157 als

weitere polare Reste vorhanden, die ¨

uber Wasserstoffbr¨

uckenbindungen miteinander ver-

kn¨

upft sind.[45] Die protonierte Carboxylgruppe des Asp134 weist eine Wechselwirkung

zur Seitenketten-Amidgruppe des Gln157 auf, dessen Aminogruppenproton die Position

der Thr40-Hydroxygruppe des oxyanion holes stabilisiert. Die in der Mitte der Tasche

befindlichen hydrophoben Seitenketten der Reste Ile189 und Ile285 unterteilen diese in

die sogenannte Alkohol- und Acylseite. Die Acylseite der Tasche ist gr¨

oßer und weniger

spezifisch als die Alkoholseite und hat somit keinen Einfluss auf die Stereoselektivit¨

des Enzyms. Nach Uppenberg et al.[46] muss ein an Ser105 gebundener Ester bei seiner

Hydrolyse so in der Tasche liegen, dass der Alkoholsauerstoff ein Proton des His224 auf-

nehmen kann (s. Abb. 1.6). Diese Seite (Leu278) wurde als Alkoholseite benannt. Die bei

der Esterspaltung entstehende S¨

aure kommt in der Acylseite der Tasche (Leu140, Leu144)

zu liegen. Bei anderer Anordnung kann der zur Spaltung ben¨

otigte Protonen¨

ubertrag vom

Histidin zum Substratsauerstoff nicht auf direktem Wege stattfinden. Im Falle einer ge-

nau inversen Positionierung des Substrats konnte allerdings in verschiedensten Untersu-

chungen ein durch Alkohole oder Wasser vermittelter Protonen¨

ubertrag von His224 zum

Substrat gezeigt werden. Park et al.[48] schließen aus Molecular-Modelling-Studien phos-

phoranaloger β-Lactame auf eine substrat-assistierte Ring¨

offnung bei Umesterung von

β-Lactamen. Der zur Umesterung eingesetzte Alkohol nimmt dabei das Histidinproton

auf und ¨

ubertr¨

agt dieses auf den in der Alkoholseite befindlichen Ringstickstoff des phos-

phoranalogen β-Lactams. In einer aus dem Jahr 2005 stammenden Studie von Lavandera

et al.,[49] einer Zusammenarbeit der Gruppen um Gotor und Kazlauskas, wird anhand

1.4 Candida antarctica Lipase B 21

Abbildung 1.6: Kristallstruktur von Candida antarctica Lipase B mit dem Ester Tween 80 (PDB

ID: 1LBT[46]). Der Ester (ball and stick) liegt so in der Bindungstasche (violett), dass sich seine

Acylkette in die Acylseite (Leu140) der active site erstreckt, w¨

ahrend der Alkoholsauerstoff des

Esters auf der Alkoholseite (Leu278) vor His224 angeordnet ist. Der Carbonylsauerstoff des Esters

ist durch Wasserstoffbr¨

uckenbindungen (gelb) zum oxyanion hole (Thr40, Gln106) stabilisiert.

Das Serin der katalytischen Triade liegt an der Grenze der Seiten zueinander, w¨

ahrend sich die

beiden anderen Reste der Triade (His224 u.Asp178) auf der Alkoholseite befinden. Asp134 und

Gln157 bilden auf der Acylseite ein Wasserstoffbr¨

uckenbindungsnetzwerk zur Stabilisierung der

am oxyanion hole beteiligten Thr40-Hydroxygruppe.

22 1 Einleitung

von Untersuchungen zur regioselektiven Acylierung von 3’,5’-Diaminonucleosiden ein

inverser Mechanismus f¨

ur die CALB-katalysierte Aminolyse postuliert, der jedoch, wie

von Lavandera ausdr¨

ucklich erw¨

ahnt, nicht bewiesen ist. Bei Aminolyse nach dem inver-

sen Mechanismus liegt die Acylkette des Acyl-Enzym-Komplexes auf der Alkoholseite

der Tasche, w¨

ahrend das Amin in die Acylseite eintritt und den Carbonylkohlenstoff des

Acyl-Enzym-Komplexes nucleophil angreift. Der anschließende Protonen¨

ubertrag vom

Aminstickstoff zum Histidinstickstoff erfolgt ¨

uber ein Wassermolek¨

ul als Protonenshut-

tle. Ein solcher inverser Mechanismus kann die h¨

ohere Regioselektivit¨

at der Aminolyse

von Nucleosiden im Vergleich zur Umesterung erkl¨

aren, jedoch ist eine einzelne Studie

unter Verwendung sehr großer Nucleophile nicht unbedingt repr¨

asentativ f¨

ur alle Amino-

lysen. So wurde aus der Gruppe um Gotor ein Jahr sp¨

ater eine Studie von Gonz´

alez-Sab´

ın

et al. nach klassischem Mechanismus ver¨

offentlicht. Gonz´

alez-Sab´

ın et al.[50] positioniert

in Studien der lipasekatalysierten Aminolyse von Estern den Stickstoff der modellierten

phosphonamid-analogen CALB-Komplexe wieder in der Alkoholseite der active site und

verwendet ebenfalls ein Wassermolek¨

ul als Protonen¨

ubertr¨

ager vom Aminstickstoff auf

His224. Unabh¨

angig vom genauen Mechanismus gibt es somit verschiedenste Beispiele

f¨

ur einen assistierten Protonen¨

ubertrag.

1.4.2 Selektivit¨

at der Candida antarctica Lipase B

Candida antarctica Lipase B akzeptiert nicht nur eine Vielzahl von Substraten, sondern

zeigt oft auch hohe Enantioselektivit¨

at bei der Umsetzung chiraler Substrate, eine Ei-

genschaft, die besonders in der organischen Chemie zur selektiven Umsetzung einzel-

ner Enantiomere eines racemischen Gemisches gefragt ist. Die genauen Mechanismen

nach denen die selektive Umsetzung erfolgt, sind von Substrat zu Substrat verschieden,

jedoch treten im Allgemeinen nur zwei entscheidende Einfl¨

usse auf, die zur Bevorzu-

gung eines Enantiomers f¨

uhren: zum einen sterische Hinderung und zum anderen der

Verlust von Wasserstoffbr¨

uckenbindungen. Die ersten Studien zur Vorhersage von En-

zymselektivit¨

aten stammen von Prelog,[51] der bereits 1964 empirische Regeln f¨

ur die

1.4 Candida antarctica Lipase B 23

Addition von Wasserstoff an Ketone durch die Hefe Culvaria lunata aufstellte. 1991 folg-

te die ebenfalls auf empirischen Untersuchungen basierende Regel von Kazlauskas[52] zur

Vorhersage der Enantioselektivit¨

at von Cholesterolesterase, Pseudomonas cepacia Lipase

und Candida rugosa Lipase bez¨

uglich der Hydrolyse von Acetaten sekund¨

arer Alkohole.

Abbildung 1.7: Substitutions-

muster des chiralen Alkohols

nach Kazlauskas.[53] M: mittel-

großer Rest, L: großer Rest

Nach Kazlauskas Regel, die f¨

ur eine Vielzahl von Enzy-

men, unter anderem auch CALB, anwendbar ist erfolgt

die Spaltung von Estern, deren Alkohole ein bestimmtes

Substitutionsmuster am Stereozentrum (s. Abb. 1.7) auf-

weisen, schneller als die des anderen Enantiomers. Dem-

nach f¨

uhren zwei unterschiedlich große Alkylreste am

chiralen Zentrum des Alkohols zu einer Erh¨

ohung der En-

antioselektivit¨

at, wobei ein großer und ein mittelgroßer

Substituent vertreten sein sollten. Bei Austausch einer Methylgruppe am Stereozentrum

des sekund¨

aren Alkohols durch eine tert-Butylgruppe findet die Hydrolyse des entspre-

chenden Esters somit mit wesentlich h¨

oherer Enantioselektivit¨

at statt. Die Gr¨

unde f¨

diese Bevorzugung eines Enantiomers der Ester sekund¨

arer Alkohole k¨

onnen ¨

uber empi-

rische Untersuchungen allerdings nicht gekl¨

art werden. Einen Ansatz zur mechanistischen

Kl¨

arung der Enantioselektivit¨

at von Enzymen bieten Molecular-Modelling-Techniken,

wie auch anhand der in den letzten Jahren steigenden Zahl der Ver¨

offentlichungen auf die-

sem Gebiet erkennbar. Ein Beipiel daf¨

ur ist die Erweiterung der Kazlauskas-Regel f¨

ur die

selektive Spaltung von Aziridin-2-Carboxylaten in CALB.[54] Ein Vergleich der tetraedri-

schen Zwischenstufen der serin-gebundenen Liganden (s. Abb. 1.8) mittels computerba-

sierter Methoden liefert hier die Erkl¨

arung f¨

ur die Bevorzugung eines Diastereomers. Das

langsam umgesetzte Diastereomer (2R,1’R) weist eine ung¨

unstige sterische Hinderung zu

Thr40 auf, wodurch dessen Wasserstoffbr¨

uckenbindung zum negativ geladenen Substrat-

sauerstoff im oxyanion hole verloren geht, w¨

ahrend das bevorzugte (2S,1’R)-Diastereomer

sterisch wesentlich passender ist und besser in der active site stabilisiert wird.

24 1 Einleitung

Abbildung 1.8: Tetraedrische Zwischenstufen der Aziridin-2-Carboxylate in CALB.[53] Das be-

vorzugt umgesetzte (2S, 1’R)-Diastereomer (a) passt sterisch gut in die active site und wird

durch einige Wasserstoffbr¨

uckenbindungen (lila) stabilisiert. Das langsam umgesetzte (2R,1’R)-

Diastereomer (b) muss zur Bildung des tetraedrischen Intermediats in Bezug auf die Konfiguration

des (2S,1’R)-Diastereomers eine schirmartige Inversion der Substituenten durchlaufen. Dadurch

kommt es zu einer ung¨

unstigen Wechselwirkung des Wasserstoffs am 2R-Stereozentrum mit der

Hydroxygruppe von Thr40 (orange), wobei eine Wasserstoffbr¨

uckenbindung zum oxyanion hole

verloren geht, wie hier als blaue Linie angedeutet.

1.4 Candida antarctica Lipase B 25

Der Verlust von Wasserstoffbr¨

uckenbindungen als Ursache der Selektivit¨

at muss nicht

unbedingt zwischen Ligand und Enzym erfolgen, sondern kann auch intramolekular im

Enzym oder zu konservierten Wassermolek¨

ulen stattfinden. So konnten L´

eonard et al.[55]

die Enantioselektivit¨

at von CALB gegen¨

uber Pentan-2-ol durch Destabilisierung eines

Wassermolek¨

uls in der stereoselektiven Seitentasche des Enzyms erkl¨

aren. Die Amino-

s¨

auren Gly39, Thr42, und Ser47 bilden diese stereoselektive Seitentasche, in der ein

Wassermolek¨

ul durch f¨

unf Wasserstoffbr¨

uckenbindungen stabilisiert wird und wie ein

nicht-kompetitiver Inhibitor wirkt. Im vorliegenden Fall h¨

angt somit die Enantioselek-

tivit¨

at der Reaktion vom Wassergehalt des Systems ab. Ist die stereoselektive Tasche

mit einem Wassermolek¨

ul besetzt, so tritt eine hohe Enantioselektivit¨

at auf, wohinge-

gen bei kleinen Wasseranteilen die Tasche eher unbesetzt und die Selektivit¨

at gering ist.

L´

eonard et al. untersuchten die Umesterung von Propans¨

auremethylester mit einem race-

mischen Gemisch von 2-Pentanol im Gasphasenreaktor und stellten fest, dass (R)-Pentan-

2-ol bevorzugt umgesetzt wird. In einem ersten Reaktionsschritt bindet der Propans¨

aure-

methylester an Ser105, Methanol wird abgespalten und 2-Pentanol greift den gebildeten

Acyl-Enzym-Komplex nucleophil an, woraus ein tetraedrischer ¨

Ubergangszustand resul-

tiert, der in Molecular-Modelling-Studien n¨

aher untersucht wurde. Abbildung 1.9 zeigt

die enzymgebundenen tetraedrischen Intermediate von (R)-2-Pentylpropanolat und (S)-

2-Pentylpropanolat in Anwesenheit eines Wassermolek¨

uls in der stereoselektiven Tasche.

Die beiden Zwischenstufen unterscheiden sich vor allem dadurch, dass im (S)-Enantiomer

ein Propylrest und im (R)-Enantiomer ein Methylrest auf die stereoselektive Tasche ge-

richtet ist. Damit die Umsetzung des (S)-Enantiomers ¨

uberhaupt m¨

oglich ist durchl¨

auft

das Enzym eine Konformations¨

anderung um Raum f¨

ur den sterisch anspruchsvolleren

Propylrest zu schaffen, wobei jedoch eine Wasserstoffbr¨

uckenbindung zwischen Thr40

und Thr42 verloren geht und die Zahl der Wasserstoffbr¨

uckenbindungen des Wassermo-

lek¨

uls in der stereoselektiven Tasche von f¨

unf auf drei sinkt. Da eine derartige konfor-

melle ¨

Anderung bei Umsetzung des (R)-Enantiomers nicht notwendig ist, wird dieses

thermodynamisch bevorzugt. In neueren Arbeiten von Marton et al.,[56] ebenfalls aus der

26 1 Einleitung

Abbildung 1.9: Molecular-Modelling-Untersuchungen der tetreadrischen Intermediate von (R)-2-

Pentylpropanolat (a) und (S)-2-Pentylpropanolat (b) in Anwesenheit eines Wassermolek¨

uls in der

stereoselektiven Tasche.[53] Bei Anbindung des (R)-Enantiomers bildet das Wassermolek¨

ul f¨

unf

Wasserstoffbr¨

uckenbindungen (lila) aus, wovon zwei im Fall des (S)-Enantiomers verloren gehen,

was zu einer thermodynamischen Bevorzugung des (R)-Enantiomers f¨

uhrt.

1.4 Candida antarctica Lipase B 27

Gruppe um Hult, konnte die Enantioselektivit¨

at von CALB gegen¨

uber sekund¨

aren Alko-

holen durch gerichtete Mutation der stereoselektiven Seitentasche (Ser47Ala, Thr42Val

und Ser47Ala–Thr42Val) weiter verbessert werden.

Ein Beispiel f¨

ur klassische sterische Limitationen der Enzymtasche als Ursache der Se-

lektivit¨

at bietet die Arbeit von Magnusson et al.,[57] der durch Austausch von Trp104, das

den Boden der Alkoholseite von CALB bildet, gegen kleinere Aminos¨

auren wie Histidin,

Glutamin oder Alanin die Akzeptanz des Enzyms gegen¨

uber sekund¨

aren Alkoholen mit

zwei großen Resten am Stereozentrum wesentlich erh¨

ohen konnte. Des Weiteren spielen

nicht nur die sterischen Gegebenheiten des Enzyms selbst eine Rolle, sondern auch der

Einfluss des Acyldonors auf ein angreifendes Nucleophil, wie von Rotticci[58] berichtet.

Da die Acyl- und die Alkoholseite von CALB r¨

aumlich nahe beieinander liegen, k¨

onnen

große Acylreste auch die Enantioselektivit¨

at bei Umesterung mit racemischen Alkohol-

gemischen beeinflussen. Diese steigt mit zunehmender Gr¨

oße oder L¨

ange des Acylrestes,

w¨

ahrend gleichzeitig allerdings die Reaktionsgeschwindigkeit sinkt.

1.4.3 L¨

osungsmitteleinfluss auf Candida antarctica Lipase B

Enzyme zeigen bez¨

uglich Aktivit¨

at und Enantioselektivit¨

at eine Abh¨

angigkeit von ihrem

Wasserhaushalt und vom verwendeten L¨

osungsmittel. Wasser ist von elementarer Bedeu-

tung f¨

ur Proteine, da bei zu geringen Wasseranteilen eine Destabilisierung der Struktur

eintritt. In hohen Konzentrationen reagiert Wasser jedoch vermehrt als Nucleophil, das

den Acyl-Enzym-Komplex angreifen kann und somit zu seiner Abl¨

osung f¨

uhrt. Dieser

Prozess findet in biologischen Systemen statt, in denen Enzyme oft die Aufgabe haben

Bindungen durch Hydrolyse zu spalten. F¨

ur die Synthese von Verbindungen ist eine solche

Hydrolyse nat¨

urlich unerw¨

unscht, weshalb diese in organischen wasserfreien L¨

osungs-

mitteln unter Verwendung getrockneter Enzympr¨

aparationen erfolgt. F¨

ur CALB (N435)

wurde eine optimale Trocknungszeit von 24 Stunden bei 46◦C im Vakuum ¨

uber Phos-

phorpentoxid ermittelt.[59] Die Unterdr¨

uckung der Hydrolyse kann neben der Verwendung

wasserfreier Reagenzien auch durch Modifikationen des Enzymkatalysators selbst erfol-

28 1 Einleitung

gen. Larsen et al.[60] entdeckte einen m¨

oglichen Wassertunnel in CALB (s. Abb. 1.10)

durch den die active site auch dann mit Wasser zur Hydrolyse von Substraten versorgt

werden kann wenn der Tascheneingang durch eine hydrophobe Substratphase blockiert

ist. Durch Austausch der hydrophilen Aminos¨

aurereste entlang des Tunnels gegen hydro-

phobe Reste l¨

asst sich der Wassertunnel blockieren. So zeigt der Mutant Ser47Leu eine

wesentlich geringere Hydrolyseaktivit¨

at, w¨

ahrend die Mutation Gln46Ala in einer weite-

ren ¨

Offnung des Tunnels und einer h¨

oheren Hydrolyseaktivit¨

at resultiert.

Eingang

Bindungstasche

Wassertunnel

Ser47

Gln46

Abbildung 1.10: Seitenansicht von CALB komplexiert mit dem Ester Tween 80 (PDB ID: 1LBT).

Der Ligand (violett) ragt nach oben aus der Bindungstasche heraus. Der Wassertunnel f¨

uhrt seitlich

an Ser46 und Gln47 (gelb) vorbei bis in die active site des Enzyms. Durch den Wassertunnel ist

die Carbonylgruppe des Liganden mit Wasserstoffbr¨

uckenbindungen (rot) zum oxyanion hole zu

erkennen.

Bei der Wahl eines L¨

osungsmittels f¨

ur die enzymkatalysierte Katalyse ist zu beach-

ten, dass das L¨

osungsmittel selbst kein Substrat f¨

ur das Enzym sein darf, sondern sich

m¨

oglichst inert verh¨

alt und die L¨

oslichkeit des Substrats im verwendeten L¨

osungsmittel

hoch genug ist. Ferner sind hydrophobe L¨

osungsmittel besser geeignet, da sie das Kristall-

wasser des Enzyms nicht aufnehmen und dieses in der Enzymstruktur konserviert bleibt.

Auch in L¨

osungsmitteln, die diese Voraussetzungen erf¨

ullen treten jedoch unterschied-

liche Enzymaktivit¨

aten auf. Nicht nur Wasser kann als nicht-kompetitiver Inhibitor auf

1.4 Candida antarctica Lipase B 29

CALB (s. Abschnitt 1.4.2) wirken, sondern auch durch organische L¨

osungsmittel ist eine

kompetitive Inhibierung der Lipase B bekannt. Besonders Ketone ¨

uben diesen Effekt aus,

w¨

ahrend terti¨

are Alkohole und Kohlenwasserstoffe die Enzymaktivit¨

at nicht beeinflussen.

Eine v¨

ollig andere Gruppe der L¨

osungsmittel, die ebenfalls gut f¨

ur biokatalytische

Anwendungen geeignet ist, stellen ionische Fl¨

ussigkeiten dar, bestehend aus Salzen mit

Schmelzpunkten von unter 100◦C bis hin zu Raumtemperatur.[61] Diese niedrigen Schmelz-

punkte werden durch Auswahl großer organischer Kationen mit delokalisierter Ladung

(z. B. Methylimidazolium oder Pyridinium) und schwach koordinierender Anionen (z.

B. Tetrafluoroborat oder Hexafluorophosphat) erreicht, da bei diesen Kombinationen kein

stabiles Kristallgitter gebildet wird und eine geringe Energiezufuhr ausreicht um die Git-

terenergie zu ¨

uberwinden. Ionische Fl¨

ussigkeiten bieten diverse Eigenschaften, die in der

Biokatalyse von Vorteil sind: sie besitzen eine mittelm¨

aßige Polarit¨

at (vergleichbar mit

Ethanol), sind hochgradig inert, meist hydrophob und weisen durch die Delokalisierung

ihrer Ladungen kaum Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zum Protein auf, wodurch eine De-

naturierung des Proteins quasi ausgeschlossen ist. Besonders durch die h¨

ohere Polarit¨

ist oft eine bessere L¨

oslichkeit des Substrats im Vergleich zu den f¨

ur die Biokatalyse

geeigneten organischen L¨

osungsmitteln feststellbar. Ionische Fl¨

ussigkeiten der neuesten

Generation bestehen beispielsweise aus einem Trimethylethanolammonium-Kation und

Anionen wie Zuckern, Aminos¨

auren oder Alkylphosphaten und zeigen die bereits ge-

nannten Vorteile der Verbindungsgruppe bei geringerer Toxizit¨

at der Anionen.[61] F¨

ur die

CALB-katalysierte Synthese von Polyestern aus ε-Caprolacton wurden ionische Fl¨

ussig-

keiten erstmals 2002 in der Gruppe um Kobayashi eingesetzt,[62] weitere Verwendung in

lipasekatalysierten Synthesen anderer Gruppen folgten.[63]–[66]

1.4.4 pH-Abh¨

angigkeit der Candida antarctica Lipase B

Enzyme zeigen nur in einem beschr¨

ankten pH-Bereich katalytische Aktivit¨

at, da der pH-

Wert der Umgebung direkten Einfluss auf den Protonierungszustand der Aminos¨

auren

hat. Wie die meisten Enzyme weist auch Candida antarctica Lipase B ein pH-Optimum

30 1 Einleitung

von 7 auf, ist aber ¨

uber den gesamten Bereich von pH 3,5 bis 9,5 stabil.[42] Neben dem

pH-Wert der Umgebung ist jedoch auch der pKa-Wert des Substrats zu beachten. Untersu-

chungen von Hollmann et al.[67] haben gezeigt, dass CALB in Gegenwart starker S¨

auren

irreversibel inhibiert wird, weshalb eine lipasekatalysierte Veresterung vieler essbarer or-

ganischer S¨

auren wie Weins¨

aure und Maleins¨

aure nicht m¨

oglich ist. Abbildung 1.11 zeigt

die von Hollmann et al. bestimmten Aktivit¨

aten in Anwesenheit verschiedener S¨

auren,

wobei die entsprechende S¨

aure mit der jeweils ¨

aquimolaren Menge 1-Oktanol bei 65◦C

mit 5 Massenprozent N435 inkubiert wurde.

Wein-

säure

Malein-

säure

Acryl-

säure

3-Methyl-

pentansäure

2-Methyl-

pentansäure

4-Methylpentansäure (pka4,9 / A = 3900 Ug-1)

Pentansäure (pka4,84 / A > 5000 Ug-1)

Abbildung 1.11: Aktivit¨

at der CALB in Anwesenheit verschiedener S¨

auren (Diagramm modifi-

ziert aus Untersuchungen von Hollmann et al.[67]). Einige S¨

auren sind exemplarisch aufgef¨

uhrt,

wobei 4-Methylpentans¨

aure und Pentans¨

aure eine Aktivit¨

at außerhalb der Diagrammskala aufwei-

sen. ¨

Aquimolare Mengen S¨

aure und 1-Oktanol wurden mit 5% (w/w) Novozyme 435 bei 65◦C

inkubiert. Einzig Weins¨

aure und Maleins¨

aure wurden statt dessen als 0,1 molare L¨

osung in 1-

Oktanol eingesetzt. Die Analyse erfolgte mittels GPC.

Alle untersuchten S¨

auren mit einem pKa-Wert unter 4,26 f¨

uhren ausnahmslos zu einer

rapiden Abnahme der Aktivit¨

at und in fast allen F¨

allen zu einem v¨

olligen Erliegen der

Reaktion. Im pKa-Bereich zwischen 4,3 und 4,7 liegen aus dieser Studie keine Daten vor,

wohingegen oberhalb dieses Bereiches eine Vielzahl von Verbindungen untersucht wur-

den. Bei pKa∼4,8 sind S¨

auren mit starkem, schwachem und keinem Inhibierungseffekt

vertreten. Hier ist eine Strukturabh¨

angigkeit der Inhibierung erkennbar, wobei Verzwei-

1.5 Lipase-katalysierte Polymerisationen 31

gungen der S¨

aure in α- oder β-Position ein Absinken der Aktivit¨

at verursachen. Dies

wird darauf zur¨

uckgef¨

uhrt, dass sterisch anspruchsvolle Substituenten in N¨

ahe der Car-

boxylgruppe eine Anbindung des Substrats verhindern. Hollmann et al. schließt aus die-

sem f¨

ur die Inaktivierung kritischen Schwellenwert von pKa∼4,8 auf die Protonierung

eines katalytisch oder strukturell wichtigen Aminos¨

aurerestes und nennt unter anderem

als m¨

oglichen Kandidaten die Asparagins¨

aure der katalytischen Triade (Asp187). Eine

Protonierung des Asp187 k¨

onnte indirekt ¨

uber Protonierung von His224 erfolgen, das

daraufhin ein Proton zu Asp187 transferiert. Dadurch kommt es zu einer irreversibelen

Inaktivierung des Enzyms, da bei nucleophilem Angriff des katalytischen Serins (Ser105)

am Carboxylkohlenstoff des Substrats das Serinproton von His224 aufgenommen werden

muss. Ist bereits im Vorfeld eine derartige Protonierung des Histidins erfolgt, kann es diese

Aufgabe nicht mehr erf¨

ullen, und eine Anbindung des Substrats am Enzym ist unm¨

oglich.

Des Weiteren liegt nach Deprotonierung der S¨

aure ein Carboxylat in der Bindungstasche

vor, das nicht mehr nucleophil angegriffen werden kann.

Außerdem ist anzumerken, dass in einigen Arbeiten von einer Erh¨

ohung der Enan-

tioselektivit¨

at und Reaktionsgeschwindigkeit bei Umsetzung sekund¨

arer Alkohole durch

Zusatz organischer Basen wie Triethylamin berichtet wird.[64],[68] Wodurch dieser Effekt

auftritt und ob es sich dabei um eine S¨

aure-Base-Reaktion oder einen eher unspezifischen

Einfluss, z. B. auf die Polarit¨

at des Systems, handelt ist nicht bekannt. Ferner wird Tri-

ethylamin in Arbeiten von Husson et al.[69] auch bei CALB-katalysierter Umsetzung von

Aminos¨

aureoligomeren in ionischen Fl¨

ussigkeiten mit dem Ziel der Deprotonierung der

Aminogruppen zugesetzt.

1.5 Lipase-katalysierte Polymerisationen

Enzymkatalysierte Polymerisationen spielen in vielen Organismen eine wichtige Rolle

beim Aufbau von Makromolek¨

ulen wie Polysacchariden, Proteinen und Polyestern. Die

Synthese erfolgt dabei ¨

uber enzymkatalysierte Kettenwachstumsreaktionen.[70] Bereits in

32 1 Einleitung

den 80er- und 90er-Jahren des letzten Jahrhunderts wurde festgestellt, dass Enzyme nicht

nur nat¨

urliche Substrate katalysieren, sondern auch f¨

ur synthetische Zwecke zu nutzen

sind. Eine Vielzahl von Enzymen ist in der Lage Polymerisationen zu katalysieren, darun-

ter Vertreter aus vier der sechs bekannten Enzymklassen: Oxidoreduktasen (EC1), Trans-

ferasen (EC2), Hydrolasen (EC3) und Ligasen (EC6) wurden bereits verwendet. Als Pro-

dukte sind Polyester, Polyphenole, Polycarbonate, Polyaniline, Vinylpolymere, aber auch

Polysaccharide und Polyaminos¨

auren bekannt.[40],[42],[70]–[75] Einen guten ¨

Uberblick gibt

das Buch “Biocatalysis in Polymer Chemistry”.[76]

Lipasen haben sich als besonders geeignet f¨

ur die enzymkatalysierte Synthese erwie-

sen, da sie auch in organischen L¨

osungsmitteln stabil sind und eine Vielzahl von Substra-

ten akzeptieren. W¨

ahrend in w¨

assrigen L¨

osungen die Hydrolyse des Polymers ¨

uberwiegt,

bieten wasserfreie Reaktionsmedien die M¨

oglichkeit des lipasekatalysierten Aufbaus der

Polymerkette. Wege zur enzymkatalysierten Polyestersynthese unter Verwendung von Li-

pasen sind bereits seit Jahren bekannt,[75],[77],[78] wohingegen die enzymkatalysierte Po-

lyamidsynthese noch weitgehend erfolglos blieb. Die Polyestersynthese kann dabei ¨

uber

Polykondensation von Dis¨

auren und Diolen[77],[78] oder auch durch Ring¨

offnungspolyme-

risation von Lactonen[44],[75], [79]–[81] erfolgen. Der Mechanismus der CALB-katalysierten

Polykondensation von Adipins¨

aure und Butan-1,4-diol ist bereits von Binns et al.[78]

eingehend behandelt worden. Laut seiner Hypothese bindet zun¨

achst die S¨

aure (A) un-

ter Bildung einer acylierten Zwischenstufe an das Enzym (vgl. Abb. 1.12). Diese wird

durch nucleophilen Angriff des Alkohols (B) zu einem Dimer (AB) verl¨

angert, das sich

vom Enzym abl¨

ost, neu anbindet und durch Addition einer weiteren Alkoholeinheit ei-

ne BAB-Spezies ergibt. Da keine terminale Anbindung dieses Trimer ¨

uber seine Hydro-

xyendgruppen (B) m¨

oglich ist, muss die wachsende Kette im oder außerhalb des Enzyms

auf die Acylierung des katalytischen Serins durch ein Dimer (AB) warten um den ge-

bildeten Acyl-Enzym-Komplex durch nucleophilen Angriff am Carbonylkohlenstoff zu

verl¨

angern. Die kettenverl¨

angernde Spezies ist nach Binns et al. somit immer ein AB-

Dimer, das das Enzym acyliert und von einem wartenden hydroxy-terminierten Oligomer

1.5 Lipase-katalysierte Polymerisationen 33

(B(AB)n) angegriffen wird. Binns st¨

utzt seine Schlussfolgerungen bez¨

uglich des Mecha-

nismus der Reaktion vor allem auf die Tatsache, dass gr¨

oßtenteils hydroxy-terminierte

Oligomere auftreten. Der von Binns et al. postulierte Mechanismus erfordert allerdings,

dass zu Beginn der Reaktion entweder große Mengen AB auf Vorrat gebildet werden, oder

die wachsende Kette die active site w¨

ahrend der Reaktion verl¨

asst, damit das zur Ketten-

verl¨

angerung ben¨

otigte Dimer AB gebildet werden kann. Beide Wege erscheinen relativ

umst¨

andlich und das Auftreten von vorwiegend hydroxy-terminierten Oligomeren ist viel-

leicht auch auf anderem Wege erkl¨

arbar: so ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein carboxyl-

terminiertes Oligomer die Tasche verl¨

asst ohne wieder angebunden zu werden wesentlich

kleiner als die Wahrscheinlichkeit, dass zu einem wartenden hydroxy-terminierten Oli-

gomer ein Dimer hinzudiffundiert, das Enzym acyliert und verl¨

angert wird. Nach dieser

Uberlegung w¨

are ebenfalls die Quote der hydroxy-terminierten Oligomere, die die Tasche

verlassen gr¨

oßer als die der carboxyl-terminierten.

Enz

Enz-AB

(Adipinsäure)

Enz-A

(Butandiol)

Enz

B(AB)

n+1

B(AB)

Abbildung 1.12: Mechanismus der Polyestersynthese aus Adipins¨

aure und Butandiol (nach Binns

et al.[78])

Obwohl mechanistisch bisher wenig erforscht, gibt es bereits vielf¨

altige Anwendun-

gen der Ring¨

offnungspolymerisation von Lactonen. Neben der in der vorliegenden Ar-

beit eingesetzten Lipase B aus Candida antarctica werden beispielsweise auch Lipase P

aus Pseudomonas fluorescens (Polymerisation von ε-Caprolacton[82]), Porcine pancreas

Lipase (Polymerisation von ε-Caprolacton[83]) und Candida cylindracea Lipase B (Po-

lymerisation von 11-Undecanolid[84]) verwendet. Unter den enzymkatalysierten Ring¨

off-

nungspolymerisationen ist die Polymerisation von ε-Caprolacton wohl eine der bestun-

34 1 Einleitung

tersuchten Reaktionen. Einen guten ¨

Uberblick ¨

uber die dabei verwendeten Lipasen, ihre

Aktivit¨

at und die resultierenden Polymereigenschaften gibt Sivalingam et al.,[39] in dessen

Untersuchungen Lipase B aus Candida antarctica die h¨

ochste Aktivit¨

at zeigte. Die Kine-

tik von Lactonpolymerisationen entspricht einer Michaelis-Menten-Kinetik,[73] wobei die

erreichten Ausbeuten sowohl von der Ringgr¨

oße als auch von der Wahl der verwendeten

Lipase abh¨

angen (s. auch Tab. 1.3).[73],[75] Kleine Ringsysteme weisen eine h¨

ohere Ring-

spannung auf, was sie zwar chemisch reaktiver macht, jedoch ist f¨

ur sogenannte Macrolide

(10- bis 17-gliedrige Lactonringe) eine noch h¨

ohere Reaktivit¨

at in lipasekatalysierten Po-

lymerisationen festzustellen als f¨

ur kleine Ringe.[73],[75],[84] In Untersuchungen von Veld

et al.[85] konnte dies auf die unterschiedliche Ringkonformation zur¨

uckgef¨

uhrt werden.

Kleine Lactone wie δ-Valerolacton und ε-Caprolacton weisen eine cisoide Konformati-

on der Esterbindung auf, w¨

ahrend bei Macroliden (z.B. Heptanolacton) eine transoide

Konformation vorliegt. In Docking- und Molekulardynamik-Studien von Lactonen ver-

schiedener Gr¨

oße in CALB zeigen cisoide Lactone (VL u. CL) katalytisch unproduktive

Bindungsmodi als bevorzugte Konformation, wohingegen transoide Lactone (HL) vor-

wiegend im produktiven Bindungsmodus vorliegen. Bei Ablauf einer enzymkatalysierten

Reaktion m¨

ussen somit cisoide Lactone zun¨

achst durch Einbringen einer Aktivierungs-

energie vom unproduktiven in einen produktiven Bindungsmodus ¨

uberf¨

uhrt werden.[85]

Der Mechanismus der enzymkatalysierten Ring¨

offnungspolymerisation wurde, wie in

Schema 1.1 gezeigt, von Uyama et al.[84] postuliert. In einem Startschritt erfolgt zun¨

achst

die Ring¨

offnung eines ersten Lactonmonomers unter Bildung des Acyl-Enzym-Interme-

diates, von Uyama als enzymaktiviertes Monomer (EM) bezeichnet. Dieses kann in einem

Initiationsschritt mit Wasser gespalten werden, wobei die entsprechende Hydroxycarbon-

s¨

aure und das native Enzym freigesetzt werden. Der Initiationsschritt der Polymerisation

stellt die Verf¨

ugbarkeit von Hydroxycarbons¨

auren als kettenverl¨

angerndes Monomer si-

cher, w¨

ahrend das Kettenwachstum in einen Propagationsschritt durch Addition freier

Hydroxycarbons¨

aureeinheiten oder Oligomere an das Acyl-Enzym-Intermediat erfolgt.

Dieser Mechanismus wird auch als monomer-aktivierter Mechanismus bezeichnet.[73], [84]

1.5 Lipase-katalysierte Polymerisationen 35

Schema 1.1:Mechanismus der lipasekatalysierten Ring¨

offnungspolymerisation von Lactonen

nach dem monomer-aktivierten Mechanismus von Uyama et al.,[84] aus einem Beitrag von Koba-

yashi in Macromolecular Symposia (2006).[73] Das Lacton bindet unter Ring¨

offnung an den En-

zymkatalysator und es entsteht ein enzymaktiviertes Monomer (enzyme activated monomer EM),

das durch Wasser abgel¨

ost wird und eine Hydroxycarbons¨

aure als kettenverl¨

angernde Spezies er-

gibt. Das Kettenwachstum erfolgt durch nucleophilen Angriff der Hydroxyendgruppe eines Mo-

nomers oder Oligomers am Acyl-Enzym-Komplex (enzymaktiviertes Monomer).

Auch hier wird das kettenverl¨

angernde Monomer zun¨

achst in einem Startschritt erzeugt

und im L¨

osungsmittel oder Enzym gespeichert um w¨

ahrend des Kettenwachstums in aus-

reichenden Mengen zur Verf¨

ugung zu stehen. Ist dies nicht der Fall, so erfolgt nach jeder

Kettenverl¨

angerung eine Abl¨

osung, wobei die wachsende Kette die active site zumindest

so weit verlassen muss, dass ein neues Lactonmonomer aktiviert werden kann. Insge-

samt beinhaltet ein derartiger Mechanismus einen enormen zeitlichen Aufwand f¨

ur die

Diffusion der Monomere und Oligomere. Bei Speicherung des aktivierten Monomers im

L¨

osungsmittel tritt jedes Monomer zwei Mal in die Tasche ein, zur Aktivierung und zur

Kettenverl¨

angerung. Sollte die Erzeugung des kettenverl¨

angernden Monomers erst bei

Bedarf erfolgen, so muss sogar die wachsende Kette vom Enzym abgel¨

ost werden und

ganz oder teilweise die Tasche verlassen. Das freie Oligomer liegt je nach L¨

osungsmittel

nicht in einer gestreckten Konformation vor, sondern entweder als Polymerkn¨

auel oder in

Wechselwirkung mit der Enzymoberfl¨

ache. Diese intra- oder intermolekularen Wechsel-

wirkungen m¨

ussen vor Diffusion des Oligomers zur¨

uck in die Bindungstasche gebrochen

werden. Der von Uyama et al. postulierte Mechanismus beinhaltet zwar die typischen

Schritte enzymkatalysierter Reaktionen, wie die Bildung und Verl¨

angerung eines Acyl-

36 1 Einleitung

Enzym-Komplexes, ist aber in Bezug auf die Aktivierung des Monomers eher unwahr-

scheinlich.

In bisherigen Arbeiten ist nicht nur die Umsetzung unsubstituierter Lactone gelungen,

sondern auch die enantioselektive Umsetzung racemischer Gemische substituierter Lac-

tone. Sowohl Caprolacton als auch Propriolacton werden auch in substituierter Form als

Substrat anerkannt. In der Regel werden beide Enantiomere umgesetzt, wobei sich al-

lerdings die Reaktionsgeschwindigkeiten so stark unterscheiden, dass man ein stark an-

gereichertes Polymer eines Enantiomers erh¨

alt. Die Ursachen der Enantioselektivit¨

at der

lipase-katalysierten Ring¨

offnungspolymerisation sind bis jetzt noch nicht gekl¨

art.[75],[86]

Wie bereits erw¨

ahnt gibt es recht wenige Beispiele f¨

ur die enzymkatalysierte Syn-

these von Polyamiden. Gu et al.[87] beschreibt die Polykondensation von Dis¨

auren wie

Adipins¨

aure, Malons¨

aure und Fumars¨

aure mit Diaminen wie Diethylentriamin oder Tri-

ethylentetramin, wobei allerdings einfache Diamine wie 1,6-Hexamethylendiamin nicht

eingesetzt wurden, obwohl das analoge Diol 1,6-Dihydroxyhexan mit Adipins¨

auredime-

thylester lipasekatalysiert polymerisierbar ist.[40] Die erste bekannte enzymkatalysierte

Polymerisation eines Lactams ist die von Schwab et al.[88] untersuchte Polymerisation

von β-Lactam (2-Azetidinon) zu unverzweigtem Poly(β-Alanin) unter Verwendung von

Candida antarctica Lipase B, wobei allerdings nur Oligomere mit einer maximalen Ket-

tenl¨

ange von 18 Einheiten gebildet werden. Andere enzymkatalysierte Ring¨

offnungsreak-

tionen substituierter β-Lactame sind zwar vielfach bekannt, jedoch handelt es sich dabei

nicht um Polymerisationsreaktionen.[48],[89]–[91]

Der Mechanismus enzymkatalysierter Ring¨

offnungspolymerisationen ist bisher kaum

verstanden und auch die Auswahl des richtigen Enzymkatalysators f¨

ur ein bestimmtes

Substrat erfolgt eher durch empirische Studien. Keine der enzymatischen Polymerisa-

tionen wurde bisher mit Methoden der Computerchemie untersucht, obwohl auf diesem

Wege die molekularen Vorg¨

ange im Enzym weit besser verstanden werden k¨

onnen und

sich so ganz neue Ans¨

atze zur Optimierung des Systems ergeben k¨

onnten. Der direkte

Beweis eines postulierten Mechanismus kann mittels computerbasierter Untersuchungen

1.5 Lipase-katalysierte Polymerisationen 37

zwar nicht erbracht werden, jedoch k¨

onnen m¨

ogliche Reaktionspfade und Zwischenstu-

fen vorgeschlagen und sterische Hindernisse der active site erkannt werden. Diese Er-

gebnisse sollten nachfolgend in experimentellen Studien ¨

uberpr¨

uft werden. Ein solche

synergetische Herangehensweise gestaltet sich wesentlich langwieriger als das Screening

nach geeigneten Enzymen oder deren Mutanten, erm¨

oglicht aber langfristig ein besseres

Verst¨

andnis und somit auch die gezielte Optimierung der Reaktionen.

38 1 Einleitung

2 Aufgabenstellung

Ziel dieser Arbeit ist die vergleichende Untersuchung der Candida antarctica Lipase B

(CALB) katalysierten Ring¨

offnungspolymerisation von β-Lactam und ε-Caprolacton auf

molekularer Ebene mittels Molecular-Modelling-Techniken auf QM-Niveau. Aus den Ar-

beiten von Schwab et al.[88] ist bekannt, dass β-Lactam mit kurzen Kettenl¨

angen von

durchschnittlich acht und maximal 18 Einheiten polymerisiert. Dabei handelt es sich um

die erste erfolgreiche CALB-katalysierte Polyamidsynthese. Im Gegensatz dazu sind di-

verse Studien zur Polymerisation von Lactonen in der Literatur bekannt,[39],[44], [75],[79]–[81]

wobei besonders ε-Caprolacton, das mit hohen Ausbeuten und Molekulargewichten CALB-

katalysiert polymerisierbar ist, eingehend experimentell untersucht wurde.[39],[80], [81]

Durch Molecular-Modelling-Studien der β-Lactam-Polymerisation, als bislang einzig

erfolgreiches Beispiel einer Lactampolymerisation, und der ε-Caprolacton-Polymerisation,

als bestuntersuchte und optimierte Lactonpolymerisation, sollen diese bisher nicht er-

kl¨

arbaren gravierenden Unterschiede der Polymerisierbarkeit von Lactamen und Lactonen

auf molekularer Ebene gekl¨

art werden um so neue Optimierungsvorschl¨

age f¨

ur die Poly-

merisation von β-Lactam, sowie langfristig auch anderen Lactamen wie ε-Caprolactam

zu erlangen.

40 2 Aufgabenstellung

3 Ergebnisse

3.1 Molecular Modelling der Candida antarctica Lipase B

katalysierten Polyamidbildung aus β-Lactam

Der Mechanismus der Candida antarctica Lipase B katalysierten Ring¨

offnungspolyme-

risation von β-Lactam konnte mittels kraftfeldbasierter Dockingmethoden und QM/MM-

Studien aufgekl¨

art werden, wobei der QM-Bereich mit DFT/B3LYP und das umgebende

Protein und L¨

osungsmittel mit dem Kraftfeld Amber[92] beschrieben wurde. Der gefunde-

ne Mechanismus entspricht dabei im Wesentlichen dem der klassischen lipasekatalysier-

ten Veresterung, wobei der initiale Schritt die Acylierung von Ser105 durch ein geeignetes

Nucleophil ist, w¨

ahrend in einem zweiten Schritt die Kettenverl¨

angerung durch Angriff ei-

nes Alkohols am Carbonylkohlenstoff des Acyl-Enzym-Komplexes erfolgt. Beide Schrit-

te verlaufen dabei ¨

uber Intermediate mit tetraedrischer Geometrie am seringebundenen

Kohlenstoff. ¨

Ubertragen auf die β-Lactam-Polymerisation bedeutet dies, dass zun¨

achst

ein Angriff des Ser105-Sauerstoffs auf β-Lactam (1) stattfindet und ein Acyl-Enzym-

Komplex (2) gebildet wird, der in Anwesenheit von Wasser unter Bildung von β-Alanin

(3) gespalten werden kann (s. Schema 3.1).

Schema 3.1:M¨

ogliche Reaktionspfade der lipasekatalysierten β-Lactam-Polymerisation.[93]

Ein entscheidender Unterschied der lipasekatalysierten Veresterung ausgehend von zwei

Edukten im Vergleich zur Amidbildung aus einem Edukt ist die kettenverl¨

angernde Spe-

42 3 Ergebnisse

zies. Als diese fungiert bei der klassischen Adipins¨

aure/Oktandiol-Polymerisation[94] im-

mer der Alkohol, w¨

ahrend bei der Ring¨

offnungspolymerisation nur β-Lactam verf¨

ugbar

ist, das sowohl selbst (Pfad A, Schema 3.1) als auch in offenkettiger Form nach Hy-

drolyse zu β-Alanin (Pfad B, Schema 3.1) als Monomer in Frage kommt. Im letzteren

Fall muss zun¨

achst gen¨

ugend β-Alanin durch enzymkatalysierte Hydrolyse des Lactams

erzeugt und anschließend in der active site oder im L¨

osungsmittel gespeichert werden.

Dabei w¨

urde pro ringge¨

offnetem Monomer ein Molek¨

ul Wasser aus dem Wasserreservoir

des getrockneten Enzyms ben¨

otigt, das im weiteren Verlauf der Reaktion wieder freige-

setzt wird. Eine Speicherung von β-Alanin im umgebenden organischen Medium w¨

urde

sich als limitierender Faktor auf die Reaktionsgeschwindigkeit auswirken, da jedes Mono-

mer zwei Mal, zur Hydrolyse und zur Kettenverl¨

angerung, in richtiger Orientierung in die

Bindungstasche diffundieren muss. Ein solches Szenario l¨

asst sich allerdings aufgrund der

geringen L¨

oslichkeit des β-Alanins in Toluol (wie in Experimenten von Schwab et al.[88]

verwendet) ausschließen, w¨

ahrend eine Speicherung in der active site prinzipiell denkbar

ist. Dabei ist jedoch zu bedenken, dass β-Alanin mit einem pKa-Wert von 3,6[95] weit un-

terhalb der von Hollmann et al.[67] gefundenen Inaktivierungsschwelle (pKa<4,8) liegt

und somit in einer geeigneten Position, mit ausreichendem Abstand der S¨

auregruppe zum

Histidin der katalytischen Triade, in der Tasche vorliegen muss, damit es nicht zu einer

Blockade des Enzyms durch Protonierung des Histidins kommt. Die Protonierung von

His224 verhindert die ¨

Ubernahme des Ser105-Protons, die bei Anbindung eines Ligan-

den erforderlich ist, und w¨

urde so zur Inaktivierung des Enzyms f¨

uhren. Eine Speiche-

rung gr¨

oßerer Mengen β-Alanin in der active site der Lipase ist demnach undenkbar. Des

Weiteren wurde von Schwab et al.[88] bewiesen, dass β-Alanin selbst kein Substrat f¨

die CALB-katalysierte Polyamidbildung ist. Eine L¨

osungsmittelabh¨

angigkeit dieses Re-

sultats konnte durch umfangreiche Experimente in verschiedenen L¨

osungsmitteln ausge-

schlossen werden.[59] Ein Mechanismus der lipasekatalysierten β-Lactam-Polymerisation

muss somit ¨

uber β-Lactam als kettenverl¨

angerndes Monomer verlaufen (Pfad A, Sche-

ma 3.1) und gleichzeitig auch die geringere Nucleophilie des Amidstickstoffs im Lactam

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation 43

gegen¨

uber einem Amin wie dem β-Alanin ber¨

ucksichtigen. In jedem durchlaufenen Ka-

talysezyklus entsteht ein Acyl-Enzym-Komplex (4, Schema 3.1), der entweder durch ein

weiteres Monomer verl¨

angert oder durch Wasser gespalten werden kann, wobei die Acyl-

kette als β-Alaninoligomer freigesetzt wird. Jede Kettenabl¨

osung verbraucht dabei ein

Wassermolek¨

ul, das aus dem Wasserreservoir des immobilisierten Enzyms bereitgestellt

werden muss. Dies ist jedoch kein limitierender Faktor der Reaktion. Selbst die allgemein

gebr¨

auchlichen getrockneten Enzymzubereitungen verf¨

ugen ¨

uber einen gen¨

ugend hohen

Wassergehalt f¨

ur die Kettenabl¨

osung, wie anhand der lipasekatalysierten Lactonpolyme-

risationen erkennbar.[73],[80],[96],[97]

Neben dem Wasserhaushalt des Systems sind auch die S¨

aure-Base-Eigenschaften der

Liganden und der umgebenden Aminos¨

auren von entscheidender Bedeutung f¨

ur den Ab-

lauf der Polymerisation. Dabei ist nicht nur der pKa-Wert des β-Alanins sondern auch

die Azidit¨

at der abgel¨

osten Oligomere in Betracht zu ziehen. Da hierzu keine experimen-

tellen Werte vorliegen erfolgte die Berechnung der pKa-Werte1der β-Alaninoligomere

mithilfe der ACDLab[98] Software. Um den Vergleich mit der von Hollmann et al.[67] ge-

fundenen Inaktivierungsschwelle zu erm¨

oglichen erfolgte die Berechnung im w¨

assrigen

Medium (Tabelle 3.1). Dabei konnte der experimentelle pKa-Wert von β-Alanin (3,6)[95]

hinreichend genau reproduziert werden. Dimerisierung und Trimerisierung des β-Alanins

bewirken einen leichten Abfall der S¨

aure- bzw. Basenst¨

arke des Liganden. Eine weitere

Kettenverl¨

angerung hat keinen Einfluss auf den pKa-Wert der endst¨

andigen Gruppen.

Tabelle 3.1: Berechnete pKa-Werte der β-Alaninoligomere

β-Alanineinheiten 1 2 >3

pKa(S¨

aure) 3,7±0,4 4,0±0,4 4,2±0,4

pKa(Base) 10,3±0,4 9,4±0,4 9,3±0,4

Beim Vergleich der berechneten pKa-Werte der Oligomere mit der Inaktivierungsschwel-

le der CALB ist zu beachten, dass Hollmann et al.[67] keine Liganden im pKa-Bereich von

4,3 bis 4,7 untersucht und selbst beim Schwellenwert von 4,8 eine Abh¨

angigkeit der En-

1Berechnung von Prof. Dr. Ulrich Jordis (Technische Universit¨

at Wien)

44 3 Ergebnisse

zymaktivit¨

at von der Ligandenstruktur festzustellen ist. Des Weiteren ist Adipins¨

aure, mit

einem pKa-Wert von 4,42,[99] mit Oktandiol in hohen Ausbeuten lipasekatalysiert poly-

merisierbar.[94] Es l¨

asst sich also annehmen, dass auch im pKa-Bereich von 4,3 bis 4,7

eine Strukturabh¨

angigkeit der Enzymaktivit¨

at besteht. Im Hinblick auf die Ungenauigkeit

der berechneten pKa-Werte (s. Tabelle 3.1) kann nicht mit Sicherheit festgestellt werden

ob β-Alaninoligomere eine Inaktivierung der Lipase bewirken, jedoch wird die Wahr-

scheinlichkeit einer Inaktivierung mit steigender Kettenl¨

ange vom β-Alanin zum Trimer

hin geringer.

Die bisher im w¨

assrigen Medium berechneten pKa-Werte erlauben zwar einen Ver-

gleich mit experimentellen Daten, lassen allerdings keine R¨

uckschl¨

usse auf die Verh¨

alt-

nisse in der Tasche zu. Die Proteinumgebung kann die Azidit¨

at eines Liganden stark be-

einflussen abh¨

angig davon ob dieser in unmittelbarer N¨

ahe eines Protonenakzeptors liegt

und somit leichter deprotonierbar ist. Das von Jensen et al.[100],[101] entwickelte PRO-

PKA Web Interface erm¨

oglicht die Berechnung von Liganden-pKa-Werten in der active

site eines Enzyms. Dies erlaubt einen Vergleich der Polyamidbildung aus β-Lactam mit

der Polyesterbildung aus Adipins¨

aure und Oktandiol im Hinblick auf eine m¨

ogliche Inak-

tivierung. Eine S¨

aure, die als Monomer der lipasekatalysierten Polymerisation fungieren

soll, muss in die active site des Enzyms mit der Carboxylgruppe nach unten eintreten

um dort Ser105 zu acylieren, w¨

ahrend das Serinproton auf das Histidin der katalytischen

Triade (His224) ¨

ubertragen wird. Durch die r¨

aumliche N¨

ahe von Ser105 zu His224 ist

eine Protonierung des Histidinstickstoffs anstelle einer Acylierung des Serins durch die

S¨

aure denkbar. Dies f¨

uhrt zu einer Inaktivierung des Enzyms, da kein anderer Akzeptor

f¨

ur das Serinproton verf¨

ugbar ist und das entstehende Carboxylatanion nicht nucleophil

angegriffen werden kann.

Zur Berechnung der pKa-Werte der beiden S¨

auren β-Alanin und Adipins¨

aure wurden

diese manuell in der Bindungstasche positioniert, wobei die Position der Carboxylgrup-

pen exakt identisch zueinander ist und das S¨

aureproton im Wasserstoffbr¨

uckenbindungs-

abstand zum Histidinstickstoff liegt. Nach sukzessiver Energieminimierung dieser Start-

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation 45

strukturen ergaben sich lokale Energieminima der Liganden, in denen eine Protonierung

von His224 m¨

oglich w¨

are.

Eine Inaktivierung muss nicht zwangsl¨

aufig im nativen Enzym erfolgen, sondern ist

auch nach Bildung des Acyl-Enzym-Komplexes m¨

oglich, wenn eine S¨

aure anstelle des f¨

den Propagationsschritt n¨

otigen Nucleophils in die Tasche eintritt. Zum Vergleich der β-

Lactam- mit der Adipins¨

aure-Oktandiol-Polymerisation wurden die S¨

auren in eine serin-

acylierte CALB eingebracht und die Strukturen, wie f¨

ur das freie Enzym beschrieben,

verfeinert. Die Acylierung erfolgte dabei durch die entsprechende S¨

aure.

Die ermittelten Ligandpositionen stellen zwar keine globalen Minima dar, aber ange-

sichts der freien Beweglichkeit der Liganden in der Tasche k¨

onnen diese auftreten und

beinhalten dabei ein gewisses Risiko f¨

ur eine Protonierung des His224. Aus der Berech-

nung der Ligand- und Histidin-pKa-Werte dieser Konformationen (s. Tabelle 3.2) l¨

asst

sich die Wahrscheinlichkeit f¨

ur einen Protonen¨

ubergang ableiten. Im nativen Enzym ist

die pKa-Differenz, und somit auch die Triebkraft eines Protonen¨

ubergangs, zwischen β-

Alanin und Histidin (7,35 pKa-Einheiten) wesentlich gr¨

oßer als zwischen Adipins¨

aure

und Histidin (5,58 pKa-Einheiten), w¨

ahrend in der serin-acylierten CALB kaum ein Un-

terschied besteht. Ein direkter Vergleich dieser Ergebnisse mit experimentellen Werten

ist nicht m¨

oglich, allerdings wird deutlich, dass die polymerisierbare Adipins¨

aure in der

Bindungstasche bedeutend weniger sauer reagiert als β-Alanin.

Tabelle 3.2: Berechnete pKa-Werte von β-Alanin und Adipins¨

aure in CALB

S¨

aure native CALB serin-acylierte CALB

pKa(S¨

aure) pKa(His224) pKa(S¨

aure) pKa(His224)

β-Alanin 2,68 10,03 4,37 8,55

Adipins¨

aure 3,10 8,68 5,50 9,60

46 3 Ergebnisse

3.1.1 Katalyseschritte der CALB-katalysierten Polyamidbildung

Die Ergebnisse der Molecular-Modelling-Studien der CALB-katalysierten β-Lactam-Po-

lymerisation lassen sich in einem Katalysezyklus (s. Schema 3.2) bestehend aus zwei

Startschritten (I und II), die den Acyl-Enzym-Komplex ergeben, sechs Propagationsschrit-

ten zur Kettenverl¨

angerung durch ein in situ generiertes β-Alanin (III-VIII) und einem

Terminierungsschritt zur Abl¨

osung der Polymerkette zusammenfassen.

W¨

ahrend die QM/MM-Berechnungen in einer Wasserbox erfolgten, ist in den expe-

rimentellen Arbeiten[88] Toluol als L¨

osungsmitlel verwendet worden. In vergleichenden

Berechnungen von Els¨

asser2wurden jedoch die ersten drei Schritte des Katalysezyklus in

einer COSMO-Berechnung mit Toluol als implizitem L¨

osungsmittel wiederholt. Dabei er-

gab sich f¨

ur beide L¨

osungsmittelmodelle, explizites Wasser und implizites Toluol, exakt

der gleiche Reaktionspfad, wobei in Toluol ein geringer Energiegewinn von 2 kcal/mol

auftritt.

Schritt I

Docking-Studien von β-Lactam in die Bindungstasche von CALB zeigen, dass das erste

Monomer in die Alkoholseite der Tasche eintritt und dort ¨

uber vier Wasserstoffbr¨

ucken-

bindungen stabilisiert wird (s. Abb. 3.1A). Diese Position ist durch Wechselwirkungen zu

Ser105 und Thr40 (OH- und NH-Gruppe) sowie His224 (jeweils 2,52 ˚

A, 3,02 ˚

A, 2,72 ˚

und 2,71 ˚

A) energetisch stark beg¨

unstigt. Dabei ist zu beachten, dass ein im Docking

uberwiegender und energetisch bevorzugter Bindungsmodus nicht zwangsl¨

aufig eine ka-

talytisch produktive Konformation darstellt, sondern, dass m¨

oglicherweise eine weitere

Energiebarriere ¨

uberwunden werden muss um diese zu erreichen. Eine derartige Ener-

giebarriere wurde auch in Studien der Bindungsmodi cisoider und transoider Lactone von

Veld et al.[85] beobachtet. Molekulardynamische Untersuchungen belegen, dass β-Lactam

sich dauerhaft nahe Ser105 aufh¨

alt und somit ein nucleophiler Angriff des Serinsauer-

stoffs auf den Carbonylkohlenstoff des β-Lactams wahrscheinlich ist, wobei zeitgleich

2Berechnung von Dr. Brigitta Els¨

asser, Universit¨

at Paderborn

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation 47

NHN

224HIS

NHHN

O H

NHN

224HIS

NHR

III

tetraedrisches

Intermediat (TI1)

NHN

224HIS

NHR

224HIS

NHR

NHN

224HIS

NHN

NHR

tetraedrischer

Übergangszustand (TS)

224HIS

NHN

VII

105SER

Polymerkette + freies Enzym

Acyl-Enzym-Komplex

+ H2O

+HOH

+ -lactam

R = H oder Polymerkette

105SER

in situ generiertes -Alanin

105SER

RHN

224HIS

NHN

HN O

NHR

tetraedrisches

Intermediat (TI2)

VIII

105SER

-HOH

105SER

GLY

THR

Schema 3.2:Katalysezyklus der Candida antarctica Lipase B katalysierten Ring¨

offnungspoly-

merisation von β-Lactam (ox: oxyanion hole).[93]

48 3 Ergebnisse

ein Protonen¨

ubertrag vom angreifenden Serinsauerstoff zum Histidinstickstoff (His224)

stattfindet. Es resultiert das tetraedrische Intermediat TI1, das je nach Position des an-

gegriffenen β-Lactams eine (S)- oder (R)-Konfiguration am ehemaligen Carbonylkohlen-

stoff tragen kann. In MD-Studien konnten Monomer-Konformationen gefunden werden,

die zur Bildung beider Enantiomere f¨

uhren. Tabelle 3.3 fasst die geometrischen Daten

zweier repr¨

asentativer Konformationen eines 1 ns MD-Laufes von β-Lactam in CALB

zusammen. Sowohl ein Angriff des Serinsauerstoffs am β-Lactam-Carbonylkohlenstoff

als auch ein Protonen¨

ubergang vom Ser105-O zum Histidinstickstoff ist in beiden Kon-

formationen m¨

oglich. In der zu einer (R)-Konfiguration f¨

uhrenden Konformation ist die

Geometrie allerdings geringf¨

ugig g¨

unstiger.

Tabelle 3.3: Repr¨

asentative Konformationen eines MD-Laufes (1 ns) von β-Lactam in CALB und

daraus resultierendes TI1-Enantiomer

Konformationen

MD-Lauf

O(Ser105)- O(Ser105)- Konfigura-

tion TI1

N(His224) C=O(β-Lactam)

Abstand ( ˚

A) Winkel (◦) Abstand ( ˚

A) Winkel (◦)

1 2,85 166,4 3,70 78,7(S)

2 3,07 129,3 3,39 71,9(R)

Schritt II

Ein nucleophiler Angriff des Serinsauerstoffs am β-Lactamcarbonyl ergibt ein erstes te-

traedrisches Intermediat TI1, das eine (R)- oder (S)-Konfiguration am ehemaligen Car-

bonylkohlenstoff des β-Lactams und eine cis- oder trans-Konfiguration des NH-Protons

bez¨

uglich des negativ geladenen Sauerstoffs aufweist. Eine Ring¨

offnung dieses tetraedri-

schen Intermediats erfordert den Transfer eines Protons von His224-N zum Ringstickstoff

des ehemaligen β-Lactams. Dazu muss das NH-Proton im ehemaligen Lactamring in der

cis-Konfiguration vorliegen und es m¨

ussen die geometrischen Voraussetzungen bez¨

uglich

Abstand und Winkel zwischen besagtem Ringstickstoff und His224-N gegeben sein. Geo-

metrieoptimierungen ergaben sowohl im (R)- als auch im (S)-Enantiomer von TI1 eine

cis-St¨

andigkeit des NH-Protons zum negativ geladenen Sauerstoff, wobei bei Raumtem-

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation 49

Abbildung 3.1: Stabilisierung von β-Lactam in der Alkholseite von CALB: (A). Anbindung des

β-Lactams durch Angriff des Serinsauerstoffs am β-Lactamcarbonyl ergibt ein erstes tetraedri-

sches Intermediat TI1 (Schritt I). Kovalentes Docking und QM/MM-Optimierung von TI1 in Ge-

genwart eines Wassermolek¨

uls als Protonenshuttle (B). Ring¨

offnung von TI1 (Schritt II) resultiert

in einer seringebundenen β-Amino-Acylseitenkette (Acyl-Enzym-Komplex), die nach QM/MM-

Geometrieoptimierung auf der Acylseite der Tasche liegt (C).[93]

50 3 Ergebnisse

peratur beide Konfigurationen im Gleichgewicht vorliegen sollten, da der Ring eine In-

versionsschwingung aufweist. Docking- und QM/MM-Studien des (S)-Enantiomers von

TI1 haben jedoch gezeigt, dass sich His224 in Richtung von Ser105-O orientiert, wo-

durch kein direkter Protonen¨

ubertrag stattfinden kann und stattdessen eine Abl¨

osung des

Monomers bevorzugt wird (Daten nicht gezeigt). Aber auch bei analogen Studien des

(R)-Enantiomers ergab sich eine Struktur, in der der Abstand zwischen His224-N und der

NH-Gruppe des ehemaligen Lactams f¨

ur eine Protonierung des Ringstickstoffs zu groß

und eine Ring¨

offnung somit nicht m¨

oglich ist. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass

unter Einbeziehung der Kristallwasser des nativen Enzyms ein wasservermittelter Pro-

tonentransfer stattfinden kann, wie bereits f¨

ur andere CALB-katalysierte Reaktionen be-

schrieben, in denen ein Molek¨

ul Alkohol oder Wasser als Protonenshuttle fungiert.[48]–[50]

In der Kristallstruktur der nativen CALB (PDB ID: 1TCA und 1TCB)[45] befinden sich

mehrere kristallographisch konservierte Wassermolek¨

ule, woraus sich bestimmte Posi-

tionen, die bevorzugt von Wasser besetzt sind, ableiten lassen. Eine dieser Wasserposi-

tionen liegt auf der Alkoholseite der Tasche im Wasserstoffbr¨

uckenbindungsabstand zu

His224-N (Position 1, Abb. 3.2), eine Weitere vor Thr40 mit Wechselwirkung zum back-

bone-Carbonyl (Position 2, Abb. 3.2) und eine Dritte oberhalb des oxyanion holes mit

Wasserstoffbr¨

uckenbindung zur Hydroxygruppe des Thr40 (Position 3, Abb. 3.2). Diese

kristallographischen Wassermolek¨

ule wurden in Dockingstudien der Strukturen B und D

(s. Schema 3.2) und in allen nachfolgenden QM/MM-Berechnungen des Katalysezyklus

ber¨

ucksichtigt.

Das vor His224 gefundene kristallographische Wassermolek¨

ul wurde in beiden Enan-

tiomeren der tetraedrischen Zwischenstufe TI1 manuell vor His224-N eingef¨

ugt und ener-

gieminimiert. Im Falle einer (R)-Konfiguration am ehemaligen Carbonylkohlenstoff des

tetraedrischen Intermediates verblieb dieses Wassermolek¨

ul im Verlauf von kovalenten

Dockingstudien des TI1, nachfolgender Energieminimierung und QM/MM-Optimierung

an seiner Position nahe His224-N. Aufgrund der sehr guten Stabilisierung dieses Wasser-

molek¨

uls durch Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zu His224-N, Asp134-O und zum Ring-

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation 51

Abbildung 3.2: Kristallwasser in der Bindungstasche der nativen CALB (rot: 1TCA.A, gr¨

un:

1TCB.A, blau: 1TCB.B)[93]

stickstoff des ehemaligen Lactams ist diese Position stark beg¨

unstigt. Der negativ gela-

dene Sauerstoff des teraedrischen Intermediats erf¨

ahrt weiterhin eine Stabilisierung durch

Wechselwirkungen zum oxyanion hole (s. Abb. 3.1B). Tabelle 3.4 fasst die Wasserstoff-

br¨

uckenbindungen des tetraedrischen Intermediats der (R)-Konfiguration zum umgeben-

den Protein und die das Wassermolek¨

ul stabilisierenden Wechselwirkungen zusammen.

Die geometrischen Voraussetzungen f¨

ur eine Verwendung dieses Wassermolek¨

uls als Pro-

tonenshuttle sind ideal, da eine starke Wasserstoffbr¨

uckenbindung sowohl zu His224-NH

als auch zum Ringstickstoff des ehemaligen Lactams besteht und die zu transferierenden

Protonen fast perfekt ausgerichtet sind.

Tabelle 3.4: Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zwischen a) tetraedrischem Intermediat TI1 und

oxyanion hole und b) katalytischem Wassermolek¨

ul und umgebendem Protein nach QM/MM-

Optimierung

a) TI1 - oxyanion hole

O(TI1)-NH(Gln106) O(TI1)-OH(Thr40) O(TI1)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,84 2,71 2,71

Winkel (◦) 164,9 176,7 176,0

b) H2O

O(H2O)-NH(TI1) O(H2O)-NH(His224) O(H2O)-O(Asp134)

Abstand ( ˚

A) 2,67 2,55 3,12

Winkel (◦) 168,2 162,5 161,4

52 3 Ergebnisse

Analoge Studies des (S)-Enantiomers von TI1 ergaben, dass hier eine derartige Stabi-

lisierung des Wassermolek¨

uls nahe Histidin (His224) vollkommen fehlt. Anstelle dessen

war w¨

ahrend der Energieminimierung eine Migration des Wassers in Richtung der Acyl-

seite der Tasche zu beobachten. Folglich kann die Ring¨

offnung des ersten tetraedrischen

Intermediates nur in der (R)-Konfiguration erfolgen, w¨

ahrend das katalytisch unprodukti-

ve (S)-Enantiomer zwar gebildet werden k¨

onnte, aber mangels Alternativen durch R¨

uck-

reaktion wieder abgel¨

ost wird.

Die Ring¨

offnung des (R)-Enantiomers von TI1 verl¨

auft unter Zuhilfenahme des erw¨

ahn-

ten Wassermolek¨

uls als Protonenshuttle. Das Programm NWChem[102],[103] erm¨

oglicht

die Simulation dieses Prozesses in einer QM/MM-Berechnung, wobei zun¨

achst das zu

ubertragende Proton des Wassers mit einer bestimmten Kraftkonstante zum Ringstickstoff

des TI1 gezogen wurde (spring method), gefolgt von einer QM/MM-Geometrieoptimie-

rung des Systems. Dabei ergab sich eine Struktur, in der ein Proton des katalytischen Was-

sermolek¨

uls zum Ringstickstoff des ehemaligen Lactams ¨

ubergeben wird, w¨

ahrend das

Wassermolek¨

ul das Histidinproton aufnimmt. Das entstandene Zwitterion ist nicht stabil

und reagiert unter sofortiger Ring¨

offnung des Lactamrings zum Acyl-Enzym-Komplex,

wobei die Acylkette auf die Acylseite der Tasche verlagert und die Alkoholseite f¨

ur den

Eintritt eines neuen Monomers frei wird (s. Abb. 3.1C). Kovalente Docking-Studien des

Acyl-Enzym-Komplexes in CALB ergaben eine fast identische Position der Acylkette (s.

Abb. 3.3C). Die Wechselwirkungen des Acyl-Enzym-Komplexes in QM/MM- und Dock-

ingstudien sind in Tabelle 3.5 zusammengefasst. In QM/MM-Berechnungen zeigte sich

eine zus¨

atzliche Stabilisierung des Acyl-Enzym-Komplexes durch Wasserstoffbr¨

ucken-

bindungen zum katalytischen Wassermolek¨

ul, das in Schritt II als Protonenshuttle ein-

gesetzt wurde und nun zwischen der Aminogruppe der β-Amino-Acylseitenkette und

Asp134 liegt (s. Abb. 3.1C). Der Carbonylsauerstoff des Acyl-Enzym-Komplexes verliert

eine Wasserstoffbr¨

uckenbindung zum oxyanion hole (Thr40-NH) zugunsten einer Wech-

selwirkung zur Aminogruppe des kovalent gebundenen Liganden (s. Tab. 3.5). In den

nachfolgenden Schritten des Katalysezyklus wird erneut ein Wassermolek¨

ul in der Alko-

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation 53

holseite der Tasche ben¨

otigt. Somit muss das katalytische Wassermolek¨

ul wieder von der

Acyl- zur¨

uck auf die Alkoholseite wandern oder aus dem Wasserreservoir des Enzyms

ersetzt werden.

Tabelle 3.5: Wechselwirkungen des Acyl-Enzym-Komplexes (aec) zum oxyanion hole und zum

katalytischen Wassermolek¨

ul nach a) Docking bzw. b) QM/MM-Optimierung

a) Acyl-Enzym-Komplex - oxyanion hole (Docking)

O(aec)-NH(Gln106) O(aec)-OH(Thr40) O(aec)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 3,17 2,86 2,62

Winkel (◦) 133,0 163,5 161,7

b) Acyl-Enzym-Komplex - oxyanion hole bzw. H2O (QM/MM)

O(aec)-NH(Gln106) O(aec)-OH(Thr40) O(aec)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,77 3,37 2,70

Winkel (◦) 165,0 94,5 155,2

NH2(aec)-OH(Thr40) NH2(aec)-H2O H2O-O(Asp134)

Abstand ( ˚

A) 2,74 2,91 2,76

Winkel (◦) 163,3 136,6 166,9

Schritt III

Wie bereits ausf¨

uhrlich diskutiert kann die Kettenverl¨

angerung des Acyl-Enzym-Kom-

plexes nur durch β-Lactam als kettenverl¨

angerndes Monomer erfolgen. Die Elektronen-

dichte am Ringstickstoff des β-Lactams ist jedoch, bedingt durch den partiellen Dop-

pelbindungscharakter der Amidbindung, zu klein f¨

ur einen direkten Angriff der Ser105-

gebundenen Carbonylgruppe. Anstelle dessen muss das β-Lactammonomer zun¨

achst un-

ter Aufhebung dieses Doppelbindungscharakters aktiviert werden. Dies kann durch nucleo-

philen Angriff eines katalytischen Wassermolek¨

uls am β-Lactamcarbonyl erreicht wer-

den. Diese Reaktion ist neutral bez¨

uglich des Wasserreservoirs des Enzyms, da das ka-

talytische Wassermolek¨

ul an einer anderen Stelle des Zyklus wieder freigesetzt wird und

somit der Prozess der Kettenverl¨

angerung kein Wasser konsumiert. Die Alkoholseite der

CALB weist mehrere kristallographische Wassermolek¨

ule auf, wobei das Wassermolek¨

vor His224-N bereits in Schritt II als Protonenshuttle eingesetzt wurde. Die beiden Po-

54 3 Ergebnisse

sitionen vor His224 und Thr40 sind recht nah zueinander, so dass ein schneller Wechsel

zwischen beiden Zust¨

anden m¨

oglich ist. Bei dem zur Aktivierung verwendeten Wasser

k¨

onnte es sich daher um dasselbe Molek¨

ul handeln, das schon in Schritt II als Protonen-

shuttle eingesetzt wurde.

Docking-Studien von β-Lactam in die acylierte Lipase in Anwesenheit eines Wasser-

molek¨

uls vor Thr40 (Position 2, Abb. 3.2) und nachfolgende QM/MM-Optimierungen

ergaben die in Abb. 3.3D gezeigte Struktur. Das zweite β-Lactammonomer wird durch ei-

ne starke Wasserstoffbr¨

uckenbindung zu einem weiteren L¨

osungsmittelmolek¨

ul (2,77 ˚

163,6◦) und eine schwache Wechselwirkung zu His224-N (3,36 ˚

A, 144,9◦) stabilisiert,

w¨

ahrend das katalytische Wassermolek¨

ul zwei starke H-Br¨

ucken zu den Carbonylgrup-

pen von Gly39 (2,62 ˚

A, 155,8◦) und Thr40 (2,60 ˚

A, 161,0◦) aufweist. Der Acyl-Enzym-

Komplex wird von zwei der urspr¨

unglich drei Wasserstoffbr¨

uckenbindungen des oxyanion

holes stabilisiert (s. Tab. 3.6). Die H-Br¨

ucke zu Thr40-NH geht zugunsten der Reorien-

tierung der Peptidbindung verloren, wodurch eine zus¨

atzliche Stabilisierung des kataly-

tischen Wassermolek¨

uls durch die Gly39-Carbonylgruppe erm¨

oglicht wird. In der resul-

tierenden Struktur (s. Abb. 3.3D) sind Abstand und Winkel zwischen dem Sauerstoff des

Wassers und dem Carbonylkohlenstoff des Lactams ideal f¨

ur eine in situ Ring¨

offnung

des β-Lactamrings (2,90 ˚

A, 109,4◦), die in einer QM/MM-Berechnung mittels der spring

method simuliert wird.

Tabelle 3.6: Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zwischen Acyl-Enzym-Komplex und oxyanion hole

nach Dockingstudien des zweiten β-Lactammonomers und anschließender QM/MM-Optimierung

(s. Abb. 3.3D)

Acyl-Enzym-Komplex (aec) - oxyanion hole

O(aec)-NH(Gln106) O(aec)-OH(Thr40) O(aec)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,77 2,60 3,74

Winkel (◦) 158,2 166,4 49,1

Das durch Angriff des katalytischen Wassermolek¨

uls am β-Lactam entstandene, in si-

tu generierte β-Alanin weist im Vergleich zu β-Lactam eine wesentlich h¨

ohere Elektro-

nendichte am Stickstoff auf und ist somit f¨

ur eine Kettenverl¨

angerung des Acyl-Enzym-

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation 55

Komplexes geeignet. Das katalytische Wassermolek¨

ul wird bei dieser Aktivierung des β-

Lactammonomers nicht verbraucht, sondern in Schritt VIII wieder freigesetzt und steht f¨

die n¨

achste Ring¨

offnung im nachfolgenden Zyklus zur Verf¨

ugung. In Konkurrenz zur Ket-

tenverl¨

angerung des Acyl-Enzym-Komplexes ist alternativ eine Abl¨

osung der Oligo(β-

Alanin)-Kette (Schritt IX) m¨

oglich. Da ein Wassermolek¨

ul nahe His224 oder Thr40 sich

gleichzeitig auch in der N¨

ahe von Ser105 befindet, kann der Acyl-Enzym-Komplex durch

nucleophilen Angriff des Wassers am Carbonylkohlenstoff leicht gespalten werden. Die-

se st¨

andige Konkurrenz von Kettenverl¨

angerung und Kettenabl¨

osung hat in Verbindung

mit der kritischen Azidit¨

at des β-Alanins eine vermehrte Bildung kurzer Ketten zur Folge

und erkl¨

art die in Experimenten von Schwab et al.[59] gefundenen kleinen Molmassen des

Polymers.

Schritt IV

Schritt IV der CALB-katalysierten Polyamidbildung beschreibt die zur Kettenverl¨

ange-

rung der seringebundenen β-Amino-Acylseitenkette notwendige Aktivierung eines β-

Lactammonomers. Ausgehend von einem β-Lactam nahe des katalytischen Wassermo-

lek¨

uls vor Thr40 (s. Abb. 3.3D) erfolgt die Aktivierung durch Angriff des katalytischen

Wassermolek¨

uls am β-Lactamcarbonylkohlenstoff. Dieser Prozess konnte in einer mehr-

stufigen QM/MM-Simulation nachvollzogen werden. Dabei wurde zuerst eine spring zwi-

schen dem Sauerstoff des Wassers und dem Lactamcarbonylkohlenstoff und, nach Op-

timierung dieser Struktur, eine spring zwischen dem Wasserproton und dem Lactam-

stickstoff angewandt, gefolgt von einer abschließenden Optimierung. Das in situ gene-

rierte β-Alanin wird durch Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zu Thr40-CO (2,55 ˚

A, 176,3◦),

Gly39-CO (3,00 ˚

A, 161,2◦), einem kristallographischen Wassermolek¨

ul (2,88 ˚

A, 169,6◦)

und einer schwachen Wechselwirkung zu His224-N (3,27 ˚

A, 156,2◦) stabilisiert (s. Abb.

3.3E). Das azide Proton des β-Alanins, das vorher der Hydroxygruppe des katalytischen

Wassers entsprach, befindet sich w¨

ahrend des gesamten Aktivierungsprozesses im Was-

serstoffbr¨

uckenbindungsabstand zur backbone-Carbonylgruppe des Thr40, was eine Pro-

56 3 Ergebnisse

Abbildung 3.3: Die seringebundene β-Amino-Acylseitenkette liegt nach kovalentem Docking auf

der Acylseite der Tasche (C), ¨

ahnlich der in QM/MM-Studien gefundenen Struktur (Abb. 3.1C).

Docking des zweiten β-Lactammonomers in das acylierte Enzym in Gegenwart eines kristallogra-

phischen Wassermolek¨

uls und nachfolgende QM/MM-Studien der Struktur (Schritt III, Struktur

D) zeigen eine Aktivierung von β-Lactam durch Angriff des Wassermolek¨

uls auf den Carbonyl-

kohlenstoff und Bildung eines in situ generierten β-Alanins (Schritt IV, Struktur E).[93]

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation 57

tonierung des Histidins (His224) und eine Inaktivierung des Enzyms unm¨

oglich macht.

Berechnung der pKa-Werte in dieser Konformation ergab, unter Verwendung des PRO-

PKA Web Interfaces, einen Wert von 8,54 f¨

ur die S¨

auregruppe des β-Alanins, w¨

ahrend

der pKa-Wert des Histidins bei 5,08 liegt. Durch Wasserstoffbr¨

uckenbindung des His224

zur Aminogruppe des β-Alanins und dadurch bedingten Anteil am Ligandenproton wird

die Basizit¨

at des Histidins herabgesetzt. Im Falle des β-Alanins f¨

uhrt der gleiche Ef-

fekt zu einer Erh¨

ohung des pKa-Wertes, da das S¨

aureproton eine starke Wechselwirkung

zur Proteinumgebung zeigt, die die Azidit¨

at des β-Alanins herabsetzt. Der Acyl-Enzym-

Komplex bleibt auch weiterhin durch zwei von drei H-Br¨

ucken des oxyanion holes sta-

bilisiert (s. Tab. 3.7), wobei die Wasserstoffbr¨

uckenbindung zu Thr40-NH zugunsten der

Stabilisierung des β-Alaninmonomers durch Gly39-CO verloren geht. Das in situ gebilde-

te β-Alanin ist ein geeignetes Monomer zur Kettenverl¨

angerung, da die Elektronendich-

te der Aminogruppe im Vergleich zu β-Lactam signifikant erh¨

oht ist und die passende

Ausrichtung des β-Alanins f¨

ur einen Angriff am Carbonylkohlenstoff des Acyl-Enzym-

Komplexes vorliegt (3,28 ˚

A, 95,0◦). Ausgehend von einer in situ Bildung eines β-Alanins

vor Thr40 kann eine sofortige Kettenverl¨

angerung ohne Reorientierung des Monomers,

die zur Protonierung von His224 f¨

uhren k¨

onnte, erfolgen.

Tabelle 3.7: Wechselwirkungen des Acyl-Enzym-Komplex zum oxyanion hole nach QM/MM-

Studien des in situ generierten β-Alanins (s. Abb. 3.3E)

Acyl-Enzym-Komplex (aec) - oxyanion hole

O(aec)-NH(Gln106) O(aec)-OH(Thr40) O(aec)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,77 2,63 3,52

Winkel (◦) 158,9 169,8 55,8

Schritt V

Die hinreichende Elektronendichte des Aminstickstoffs und die geeignete Lage des in

situ generierten β-Alanins zum Acyl-Enzym-Komplex (3,28 ˚

A, 95,0◦) f¨

uhren zu einem

nucleophilen Angriff des β-Alanin an der seringebundenen Carbonylgruppe. Dieser Re-

58 3 Ergebnisse

aktionsschritt wurde mithilfe einer spring zwischen dem Alaninstickstoff und dem Car-

bonylkohlenstoff des Acyl-Enzym-Komplex simuliert, wobei sich ein protonierter tetra-

edrischer ¨

Ubergangszustand TS ergibt, der durch Anlegen einer zweiten spring zwischen

dem positiv geladenen ehemaligen Alaninstickstoff und His224-N in den instabilen te-

traedrischen ¨

Ubergangszustand TS ¨

ubergeht (s. Abb. 3.4F). Tabelle 3.8 fasst die geome-

trischen Daten des ¨

Ubergangszustands TS nach QM/MM-Optimierung zusammen. Die

S¨

auregruppe des TS zeigt noch immer starke Wechselwirkung zu Thr40, w¨

ahrend die

NH-Gruppe in Richtung der Gly39-Carbonylgruppe orientiert ist. Des Weiteren wird der

negativ geladene Sauerstoff des TS im oxyanion hole von zwei Wasserstoffbr¨

uckenbin-

dungen stabilisiert, wobei der Ladungsausgleich durch die positive Ladung am protonier-

ten Histidinstickstoff erfolgt. Der dimere ¨

Ubergangszustand TS verh¨

alt sich instabil und

spaltet nach Entfernung der constraints in einer anschließenden QM/MM-Optimierung

das neu gebildete β-Alanindimer ab (s. Abb. 3.4F1).

Tabelle 3.8: Wechselwirkungen des dimeren tetraedrischen ¨

Ubergangszustands TS zum oxyanion

hole und zum umgebenden Protein nach QM/MM-Optimierung

O(TS)-NH(Gln106) O(TS)-OH(Thr40) O(TS)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,70 2,58 3,44

Winkel (◦) 173,2 171,9 66,1

OH(TS)-O(Thr40) NH(TS)-O(Gly39)

Abstand ( ˚

A) 2,55 2,78

Winkel (◦) 168,0 169,2

Schritt VI

Optimierung des dimeren tetraedrischen ¨

Ubergangszustands TS f¨

uhrt zur Abl¨

osung des

Dimers, wobei das Histidinproton zur¨

uck zum Ser105-Sauerstoff ¨

ubertragen wird. Das

abgel¨

oste Dimer (Abb. 3.4F1) bleibt w¨

ahrend einer weiteren QM/MM-Optimierung in

der N¨

ahe seiner vorherigen angebundenen Position, wobei sich die Wechselwirkungen

zum Protein nur marginal ver¨

andern (s. Tab. 3.9). Eine Neuanbindung des Dimers an

seiner terminalen Carboxylgruppe war in dieser Konformation nicht m¨

oglich, sondern

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation 59

Abbildung 3.4: Angriff des in situ generierten β-Alanins am seringebundenen Carbonylkohlen-

stoff f¨

uhrt zur Bildung eines instabilen dimeren ¨

Ubergangszustands (F), aus dem augenblicklich

ein Dimer (F1) freigesetzt wird.[93]

60 3 Ergebnisse

erfordert eine Wanderung der Oligomerkette in Richtung der Acylseite der Tasche. Ein

besonderes Merkmal des gefundenen Mechanismus ist, dass das Dimer die Tasche zur

terminalen Anbindung nicht verlassen muss und ein einfaches Rearrangement der Kette

zur Neuanbindung ausreicht. Nach Verlassen der Bindungstasche ist die Wahrscheinlich-

keit, dass die Polymerkette in genau der richtigen Orientierung in die Tasche zur¨

uckkehrt

verschwindend gering. Sollte ein Oligomer mit der S¨

auregruppe nach unten eintreten und

anstelle von Thr40 eine Wechselwirkung zu His224 eingehen, erfolgt m¨

oglicherweise ei-

ne Protonierung von His224 und somit eine Inaktivierung des Enzyms.

Docking-Studien des abgel¨

osten Dimers in CALB ergaben eine leicht ver¨

anderte Kon-

formation des Dimers, in der ein weiteres Kettenwachstum durch terminale Anbindung

des Liganden m¨

oglich ist. Obwohl die gedockte Dimerkonformation ein globales Mi-

nimum darstellt, also gegen¨

uber dem Dimer nach Abl¨

osung energetisch beg¨

unstigt ist,

konnte die Umorientierung des Dimers aufgrund der starken Wechselwirkungen des Di-

mers und der begrenzten Zeitskala in einem 1ns MD-Lauf leider nicht simuliert werden.

Abbildung 3.5G zeigt die im Docking gefundene Struktur nach QM/MM-Optimierung.

Das Proton der S¨

auregruppe weist noch immer eine starke Wasserstoffbr¨

uckenbindung

zu Thr40-O auf (2,6 ˚

A, 150,2◦), was drauf hindeutet, dass diese Wasserstoffbr¨

uckenbin-

dung auch w¨

ahrend der Migration des Dimers bestehen bleibt und dadurch eine Inak-

tivierung des Enzyms, ausgel¨

ost durch Protonierung des His224, verhindert wird. pKa-

Berechnungen dieser Dimer-Konformation ergaben einen pKavon 6,35 f¨

ur die S¨

aure-

gruppe, w¨

ahrend His224 in dieser Struktur einen Wert von 6,43 zeigt, wodurch ein Proto-

nen¨

ubertrag in dieser Struktur vollkommen ausgeschlossen ist. Der ausgesprochen nied-

rige pKa-Wert des His224 wird dabei durch eine starke Wasserstoffbr¨

uckenbindung zu

Ser105 verursacht (s. Abb. 3.5G). Zus¨

atzliche Stabilisierung erf¨

ahrt das gedockte Di-

mer durch Wechselwirkungen des terminalen Carboxylsauerstoffs zu Thr40-NH (2,87 ˚

124,9◦) und des Peptidsauerstoffs zu Thr40-OH (2,82 ˚

A, 166,7◦).

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation 61

Abbildung 3.5: Nach der ersten Kettenverl¨

angerung wird das gebildete Dimer von Ser105 ab-

gel¨

ost und durchwandert die Tasche Richtung Acylseite, wobei die H-Br¨

uckenbindung zu Thr40

erhalten bleibt, und eine leicht ver¨

anderte Konformation (G) eingenommen wird, die f¨

ur die Neu-

anbindung am Carboxylterminus des Dimers, unter Bildung des tetraedrischen Intermediats TI2

(H), geeignet ist. Protonen¨

ubertrag des Histidinprotons zur terminalen Hydroxygruppe des TI2

ergibt den um eine Monomereinheit verl¨

angerten Acyl-Enzym-Komplex C1.[93]

62 3 Ergebnisse

Tabelle 3.9: Wechselwirkungen des abgel¨

osten Dimers F1 zum oxyanion hole und zum umgeben-

den Protein nach QM/MM-Optimierung

O(Dimer)-NH(Gln106) O(Dimer)-OH(Thr40) O(Dimer)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,96 2,57 3,40

Winkel (◦) 169,8 163,7 61,6

OH(Dimer)-O(Thr40) NH(Dimer)-O(Gly39)

Abstand ( ˚

A) 2,55 2,71

Winkel (◦) 166,3 163,3

Schritt VII

Das abgel¨

oste Dimer durchquert die Alkoholseite der Tasche in Richtung Acylseite, bleibt

dabei aber mit der Carboxylgruppe am Thr40-O verankert (s. Abb. 3.4F1 und 3.5G). Der

terminale Carboxylsauerstoff zeigt bereits eine erste Wechselwirkung zum oxyanion hole

(Thr40-NH) und wird durch nucleophilen Angriff des Serinsauerstoffs am Carboxylkoh-

lenstoff vollst¨

andig ins oxyanion hole gezogen. Die Orientierung des Carboxylkohlen-

stoffs bez¨

uglich Ser105 ist nicht ideal f¨

ur einen Angriff des Serinssauerstoffs (3,60 ˚

64,4◦); dieser konnte allerdings mittels der spring method von NWChem simuliert wer-

den. Durch Anbringen einer spring zwischen Ser105-O und dem Carboxylkohlenstoff

des Dimers erfolgte die terminale Neuanbindung unter Bildung des tetraedrischen Inter-

mediates TI2 (s. Abb. 3.5H). Alternativ konnte das Dimer zun¨

achst mit einem constrain

an Ser105 angen¨

ahert werden und verblieb auch nach L¨

osen des constrain in einem Ab-

stand von 2,86 ˚

Azu Ser105 um von dieser Position ausgehend mithilfe einer spring an-

gebunden zu werden. Beide Verfahrensweisen liefern exakt das gleiche Ergebnis. Beim

nucleophilen Angriff des Serins erfolgt gleichzeitig ein Transfer des Serinprotons zum

Histidinstickstoff (2,80 ˚

A, 169,0◦), der dadurch eine positive Ladung erh¨

alt. Der negativ

geladene Sauerstoff des tetraedrischen Intermediates TI2 wird durch Wechselwirkungen

zum oxyanion hole stabilisiert, w¨

ahrend die terminale Aminogruppe eine Wasserstoff-

br¨

uckenbindung zum backbone-Carbonyl von Gln157 eingeht und die Hydroxygruppe

des TI2 eine starke Wechselwirkung zu His224-NH aufweist (s. Tabelle 3.10).

3.1 CALB-katalysierte β-Lactam-Polymerisation 63

Tabelle 3.10: Stabilisierung des terminal gebunden tetraedrischen Intermediates TI2 nach

QM/MM-Geometrieoptimierung

O(TI2)-NH(Gln106) O(TI2)-OH(Thr40) O(TI2)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,89 2,92 2,90

Winkel (◦) 171,9 173,8 174,1

NH2(TI2)-CO(Gln157) OH(TI2)-NH(His224)

Abstand ( ˚

A) 2,96 2,89

Winkel (◦) 171,1 168,3

Schritt VIII

Das Dimer reagiert durch terminale Anbindung an Ser105 zum tetraedrischen Intermediat

TI2, dessen Hydroxygruppe eine starke Wasserstoffbr¨

uckenbindung (2,89 ˚

A, 168,3◦) zu

His224-NH zeigt, die in Schritt VIII in einem via QM/MM-Berechnung mit spring simu-

lierten Protonen¨

ubertrag resultiert. Protonierung der terminalen OH-Gruppe f¨

uhrt unter

R¨

uckbildung der seringebundenen Carbonyl-Doppelbindung zur Abspaltung von Wasser

und es entsteht ein um eine Monomereinheit verl¨

angerter Acyl-Enzym-Komplex (s. Abb.

3.5C1, vgl. Abb. 3.1C). Bei dem freigesetzten Wassermolek¨

ul handelt es sich um das in

Schritt IV zur Aktivierung des β-Lactams verwendete katalytische Wassermolek¨

ul, das

nun wieder im n¨

achsten Zyklus f¨

ur eine weitere Aktivierung zur Verf¨

ugung steht. Die

Kettenverl¨

angerung ist demnach bez¨

uglich des Wasserreservoirs des Enzyms neutral.

Schritt IX

Mit der Bildung eines elongierten Acyl-Enzym-Komplexes ist der Katalysezyklus voll-

st¨

andig und es kann entweder eine weitere Kettenverl¨

angerung ¨

uber Schritt III erfolgen

oder eine Kettenabl¨

osung ¨

uber Schritt IX. Beide Prozesse stehen in st¨

andiger Konkurrenz

zueinander. Im Fall einer Kettenabl¨

osung greift das in Schritt VIII abgespaltene kataly-

tische Wassermolek¨

ul den Carbonylkohlenstoff des Acyl-Enzym-Komplexes nucleophil

an. Ein Proton des Wassermolek¨

uls wird dabei an His224-N abgegeben und es entsteht

erneut das tetraedrische Intermediat TI2, aus dem durch ¨

Ubertragung des Histidinprotons

64 3 Ergebnisse

auf Ser105 ein Oligomer abgespalten wird. Dieses kann, wenn es nicht sofort wieder ange-

bunden wird, m¨

oglicherweise den Histidinstickstoff protonieren und so zur Inaktivierung

des Enzyms f¨

uhren oder die Tasche verlassen und ins L¨

osungsmittel diffundieren, von

wo aus es f¨

ur eine Kettenverl¨

angerung in der richtigen Orientierung zur¨

uck in die Tasche

finden m¨

usste.

3.2 CALB-katalysierte ε-Caprolacton-Polymerisation 65

3.2 Molecular Modelling der Candida antarctica Lipase B

katalysierten Polyesterbildung aus ε-Caprolacton

Der Mechanismus der Candida antarctica Lipase B katalysierten Ring¨

offnungspolymeri-

sation von ε-Caprolacton verl¨

auft ¨

ahnlich der β-Lactam-Polymerisation ¨

uber einen nucleo-

philen Angriff des Ser105 am Ringcarbonyl, die Bildung eines Acyl-Enzym-Komplexes

unter Ring¨

offnung, die Verl¨

angerung durch ein aktiviertes Monomer und die anschlie-

ßende terminale Anbindung und Bildung eines verl¨

angerten Acyl-Enzym-Komplexes.

Trotz dieser mechanistischen Gemeinsamkeiten zeigen β-Lactam und ε-Caprolacton ein

grundlegend unterschiedliches Polymerisationsverhalten. W¨

ahrend ε-Caprolacton mit ho-

hen Molekulargewichten lipasekatalysiert polymerisierbar ist, bilden sich bei Verwendung

von β-Lactam als Monomer nur Oligomere. Die Untersuchung des Mechanismus der lipa-

sekatalysierten ε-Caprolacton-Polymerisation mittels kraftfeldbasierter Dockingmetho-

den und QM/MM-Studien liefert jedoch einige Anhaltspunkte f¨

ur dieses unterschiedliche

Polymerisationsverhalten. Im Nachfolgenden werden die Schritte der CALB-katalysierten

ε-Caprolacton-Polymerisation im Einzelnen beschrieben.

3.2.1 Katalyseschritte der CALB-katalysierten Polyesterbildung

Schema 3.3 zeigt den Katalysezyklus der CALB-katalysierten ε-Caprolacton-Polymeri-

sation als Ergebnis von Molecular-Modelling-Studien. Dieser besteht aus einer initialen

Acylierung des Enzyms in zwei Startschritten (I und II), sechs Propagationsschritten zur

Kettenverl¨

angerung (III-VIII) unter Verwendung eines aktivierten Monomers und einem

Terminierungsschritt zur Abl¨

osung des Polymers durch Wasser (IX).

Schritt I

Ein erstes ε-Caprolacton-Monomer wurde mittels Docking- und QM/MM-Methoden auf

der Alkoholseite der active site von CALB positioniert, wo das Monomer ¨

uber Was-

serstoffbr¨

uckenbindungen des Carbonylsauerstoffs zu Thr40-OH (2,81 ˚

A, 151,0◦) und

66 3 Ergebnisse

NHN

224HIS

NHHN

NHN

224HIS

III

tetraedrisches

Intermediat (TI1)

NHN

224HIS

NHN

224HIS

NHN

VII

105SER

Polymerkette + freies Enzym

Acyl-Enzym-Komplex

+ H2O

+HOH

+ -Caprolacton

R = H oder Polymerkette

105SER

cyclisches geminales Diol

105SER

VIII

-HOH

105SER

THR

terminale Neuanbindung

tetraedrisches

Intermediat (TI2)

Schema 3.3:Katalysezyklus der Candida antarctica Lipase B katalysierten Ring¨

offnungspoly-

merisation von ε-Caprolacton (ox: oxyanion hole).

3.2 CALB-katalysierte ε-Caprolacton-Polymerisation 67

Gln157-NH2(2,97 ˚

A, 174,2◦) stabilisiert wird. Das Proton der Serinhydroxygruppe weist

in Richtung des basischen Stickstoffs des Histidins (2,74 ˚

A, 156,3◦), wodurch zwar ei-

ne geeignete Geometrie f¨

ur einen Protonen¨

ubertrag zwischen diesen beiden Aminos¨

auren

der katalytischen Triade gegeben ist, jedoch ist der Carbonylkohlenstoff des Lactons f¨

einen nucleophilen Angriff des Serins zu weit entfernt (3,74 ˚

A, 62,5◦). In einer nachfol-

genden QM/MM-Optimierung konnte dieser Abstand unter Anwendung von constraints

auf 3,37 ˚

A(bei 57,9◦) nach erneuter Relaxation verringert werden, wobei die Wasserstoff-

br¨

uckenbindung zu Gln157 verloren geht (s. Abb. 3.6A). Das Monomer wird immer noch

durch Wechselwirkung zur Hydroxygruppe des Thr40 stabilisiert (2,68 ˚

A, 149,9◦) und es

liegt weiterhin eine passende Geometrie f¨

ur den Protonen¨

ubertrag zwischen Ser105 und

His224 vor (2,65 ˚

A, 157,1◦). Da ε-Caprolacton somit ¨

uber mehrere lokale Minima in der

N¨

ahe des katayltischen Serins verf¨

ugt, kann angenommen werden, dass ein nucleophiler

Angriff des Serinsauerstoffs am Carbonylkohlenstoff des Lactons erfolgen kann, wobei

das Serinproton zu His224 ¨

ubertragen wird. Dieser Angriff konnte mittels der spring me-

thod von NWChem simuliert werden, indem eine spring zwischen dem Serinsauerstoff

und dem Carbonylkohlenstoff des Lactons zur Erzwingung einer Bindung eingebracht

wurde. Gleichzeitig erfolgte der Transfer des Serinprotons zum His224.

In der daraus resultierenden tetraedrischen Zwischenstufe TI1 (s. Abb. 3.6B) liegt der

Ringsauerstoff des Lactons auf der Alkoholseite der Tasche vor His224 und der ehemalige

Carbonylkohlenstoff des gebundenen Monomers besitzt eine (R)-Konfiguration. Der ne-

gativ geladene Sauerstoff des TI1 ist durch drei Wasserstoffbr¨

uckenbindungen im oxyan-

ion hole stabilisiert, wie in Tabelle 3.11 gezeigt. Der Ladungsausgleich findet dabei durch

den positiv geladenen Histidinstickstoff statt, der nun das Serinproton tr¨

agt.

Tabelle 3.11: Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zwischen tetraedrischem Intermediat TI1 und oxyan-

ion hole nach QM/MM-Optimierung

TI1 - oxyanion hole

O(TI1)-NH(Gln106) O(TI1)-OH(Thr40) O(TI1)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,73 2,66 3,11

Winkel (◦) 176,4 176,0 162,9

68 3 Ergebnisse

Abbildung 3.6: ε-Caprolacton in der Alkoholseite von CALB (A) nach Docking und QM/MM-

Optimierung mit constraint und anschließender Relaxierung. Anbindung des ε-Caprolactons

durch Angriff des Serinsauerstoffs am Lactoncarbonyl (Schritt I) resultiert in einem ersten te-

traedrischen Intermediat TI1 (B). Ring¨

offnung von TI1 (Schritt II) durch Protonen¨

ubertragung

des Histidinprotons zum Ringsauerstoff des ehemaligen Lactonrings ergibt eine seringebunde-

ne ε-Hydroxy-Acylseitenkette (Acyl-Enzym-Komplex), deren Hydroxygruppe nach QM/MM-

Geometrieoptimierung noch auf der Alkoholseite der Tasche liegt (C).

3.2 CALB-katalysierte ε-Caprolacton-Polymerisation 69

F¨

ur die Bildung des entsprechenden (S)-Enantiomers, in dem der Ringsauerstoff auf

der Acylseite liegt, muss das ungebundene ε-Caprolacton eine andere Konformation ein-

nehmen. Veld et al.[85] unterscheidet in seinen Untersuchungen zur Reaktivit¨

at verschie-

dener Lactone zwischen einem produktiven und einem unproduktiven Bindungsmodus.

Der produktive Bindungsmodus nach Veld et al. f¨

uhrt im vorliegenden Fall zu einem (R)-

Enantiomer, w¨

ahrend aus dem unproduktiven Bindungsmodus ein (S)-Enantiomer resul-

tiert. Docking-Experimente von ε-Caprolacton in der Bindungstasche von CALB ergaben

im ersten Dockinglauf (mcdock) beide Bindungsmodi zu fast gleichen Anteilen, wobei

der unproduktive Bindungsmodus leicht ¨

uberwiegt. Das Rescoring-Verfahren nach Alisa-

raie et al.[104] und Haller[105] (s. auch Abschnitt 5.4.3) verweist jedoch auf drei Struktu-

ren mit produktivem Bindungsmodus, die in weiteren verfeinernden Dockingl¨

aufen (mcl-

dock) eingesetzt wurden. Auch in diesen befinden sich unproduktive Bindungsmodi unter

den ausgegebenen Strukturen. Die im Rescoring ermittelten Docking-Ergebnisse liegen

jedoch erneut im produktiven Bindungsmodus vor. Aus diesem Grund wurden die un-

produktiven Ligand-Enzym-Komplexe nicht weiter untersucht, sondern nur die als Tref-

fer des Rescorings erhaltenen produktiven Bindungsmodi in Energieminimierungen und

QM/MM-Optimierungen weiter verfeinert. Die Bildung eines (S)-Enantiomers durch An-

bindung eines im unproduktiven Bindungsmodus vorliegenden ε-Caprolacton-Monomers

ist allerdings nicht auszuschließen.

Schritt II

Ein nucleophiler Angriff des Serinsauerstoffs am Lactoncarbonyl resultiert in einer te-

traedrischen Zwischenstufe TI1, die entweder eine (R)- oder (S)-Konfiguration am ehe-

maligen Carbonylkohlenstoff aufweist. Im n¨

achsten Katalyseschritt erfolgt eine Ring¨

off-

nung des Lactonrings durch Transfer des Histidinprotons zum Ringsauerstoff. Im (S)-

Enantiomer des TI1, dessen Ringsauerstoff auf der Acylseite der Tasche liegt, ist ein

solcher Protonen¨

ubertrag h¨

ochstwahrscheinlich nicht auf direktem Wege m¨

oglich, ein

wasserassistierter Protonen¨

ubertrag analog zur Ring¨

offnung des β-Lactams (s. Abschnitt

70 3 Ergebnisse

3.1.1 Schritt II) aber durchaus denkbar. Dieser Reaktionsweg wurde nicht weiter verfolgt,

da Docking-Studien auf eine Konformation des ungebundenen Monomers verweisen, die

bei Anbindung das (R)-Enantiomer des ersten tetraedrischen Intermediats TI1 (s. Abb.

3.6B) ergibt, dessen Ringsauerstoff auf der Alkoholseite angeordnet ist. In dieser Struk-

tur ist der Abstand zwischen His224-NH und dem Ringsauerstoff des Lactons f¨

ur den

zur Ring¨

offnung notwendigen Protonen¨

ubertrag noch zu groß (3,50 ˚

A), da das Histidin

in Richtung Ser105 orientiert ist. Die hohe Beweglichkeit des His224 erm¨

oglicht jedoch

ein Umschwenken der Histidin-Seitenkette zur Alkoholseite und somit den erforderlichen

Transfer eines Protons vom Histidinstickstoff zum Ringsauerstoff des Lactons. Die Si-

mulation dieses Protonentransfers erfolgte durch Anbringen einer spring zwischen Histi-

dinproton und Ringsauerstoff, wodurch das Proton ¨

ubertragen und der ehemalige Lacton-

ring unter R¨

uckbildung der Carbonylgruppe ge¨

offnet wird. Nach QM/MM-Optimierung

verblieb die Alkoholfunktion des gebildeten Acyl-Enzym-Komplexes zun¨

achst in einem

lokalen Energieminimum auf der Alkoholseite der Tasche, wie in Abbildung 3.6C ge-

zeigt. Kovalentes Docking der enzymgebundenen Acylkette platzierte diese vollst¨

andig

auf der Acylseite der Tasche (s. Abb 3.7C). Diese Konformation, in der die Acylkette auf

der Acylseite angeordnet ist, stellt ein globales Minimum dar. Zur Entfaltung der Kette

und ¨

Ubergang vom lokalen ins globale Minimum muss eine Energiebarriere ¨

uberwunden

werden, wof¨

ur sich Docking-Studien ausgesprochen gut eignen.

In beiden Strukturen erfolgt eine Stabilisierung der serin-gebundenen Carbonylgruppe

des Acyl-Enzym-Komplexes durch das oxyanion hole, wobei in der gedockten Struktur

zwei starke Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zu Thr40 aufzufinden sind, w¨

ahrend die Wech-

selwirkung zu Gln106 fast verloren geht (s. Tabelle 3.12).

Die Generierung eines ersten Acyl-Enzym-Komplexes (C) bildet den Einstieg in den

Katalysezyklus (vgl. Schema 3.3). Von Struktur C ausgehend kann nun entweder die

Verl¨

angerung der Kette ¨

uber Schritt III ablaufen oder eine Abl¨

osung durch Wasser in

Schritt IX stattfinden.

3.2 CALB-katalysierte ε-Caprolacton-Polymerisation 71

Abbildung 3.7: Die seringebundene ε-Hydroxy-Acylseitenkette liegt nach kovalentem Docking

auf der Acylseite der Tasche (C), w¨

ahrend sie in QM/MM-Studien zun¨

achst auf der Alkoholseite

verbleibt (Abb. 3.6C). Docking des zweiten Monomers in das acylierte Enzym und nachfolgende

QM/MM-Studien zeigen eine Positionierung des Monomers im Wasserstoffbr¨

uckenbindungsab-

stand zum katalytischen Wassermolek¨

ul vor Thr40 (Schritt III, Strukur D). Ein Angriff des Wasser-

sauerstoffs am Lactoncarbonyl resultiert in einem geminalen cyclischen Diol (Schritt IV, Struktur

E), das als aktiviertes Monomer in der Lage ist den Acyl-Enzym-Komplex zu verl¨

angern.

72 3 Ergebnisse

Tabelle 3.12: Wechselwirkungen des Acyl-Enzym-Komplexes (aec) zum oxyanion hole nach a)

Docking bzw. b) QM/MM-Optimierung

a) Acyl-Enzym-Komplex - oxyanion hole (Docking)

O(aec)-NH(Gln106) O(aec)-OH(Thr40) O(aec)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 3,38 2,66 2,57

Winkel (◦) 138,1 166,0 153,8

b) Acyl-Enzym-Komplex - oxyanion hole (QM/MM)

O(aec)-NH(Gln106) O(aec)-OH(Thr40) O(aec)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,81 2,68 3,04

Winkel (◦) 168,8 164,5 167,1

Schritt III

Nach Anbindung des ersten Monomers und Bildung eines Acyl-Enzym-Komplexes muss

zur Kettenverl¨

angerung ein neues Monomer in die Tasche eintreten. Dieser Vorgang wur-

de mittels Dockingstudien von ε-Caprolacton in die Bindungstasche des acylierten En-

zyms, dessen Acylkette in der Acylseite der active site liegt, simuliert. Die Docking-

Experimente wurden sowohl in Ab- als auch in Anwesenheit von Kristallwasser (vgl. Abb.

3.2 in Abschnitt 3.1.1 Schritt II) durchgef¨

uhrt. Im Gegensatz zu Lactamen, die durch den

Doppelbindungscharakter der Peptidbindung bedingt nur ¨

uber eine niedrige Elektronen-

dichte am Ringstickstoff verf¨

ugen, weisen Lactone eine wesentlich h¨

ohere Elektronen-

dichte am Ringsauerstoff auf. Somit ist hier auch die M¨

oglichkeit einer direkten Verl¨

ange-

rung ohne vorherige Aktivierung des Monomers zu ¨

uberpr¨

ufen, wobei sich in QM/MM-

Studien jedoch zeigte, dass auch die ε-Caprolacton-Polymerisation eines Wassermolek¨

uls

zur Aktivierung bedarf. Eine direkte Verl¨

angerung ist ausgehend von den verschiedens-

ten Ligandpositionen weder mit noch ohne Kristallwasser m¨

oglich. Docking-Studien und

nachfolgende QM/MM-Optimierungen in Anwesenheit von Kristallwasser ergaben eine

fast senkrechte Positionierung des zweiten ε-Caprolactonmonomers in der Alkoholseite

der active site, wo es eine Wasserstoffbr¨

uckenbindung zu dem vor Thr40 befindlichen

Wassermolek¨

ul aufweist. Die freien Elektronenpaare des Wassersauerstoffs zeigen dabei

in Richtung des Trp104, das den Boden der Tasche bildet. Durch Anwenden eines cons-

3.2 CALB-katalysierte ε-Caprolacton-Polymerisation 73

traints und nachfolgende QM/MM-Optimierung konnte eine Drehung des Wassermo-

lek¨

uls erreicht werden, wobei die Position des Lactons fast identisch bleibt und auch die

Wasserstoffbr¨

uckenbindungen des Wassermolek¨

uls Bestand haben. Abbildung 3.7D zeigt

die auf diese Weise erlangte Platzierung des Monomers in der active site des acylierten En-

zyms. Das konservierte Wassermolek¨

ul vor Thr40 befindet sich im Wasserstoffbr¨

ucken-

bindungsabstand zum backbone-Carbonylsauerstoff dieser Aminos¨

aure (2,63 ˚

A, 168,6◦)

und bildet gleichzeitig eine Wasserstoffbr¨

uckenbindung zum Carbonylsauerstoff des Lac-

tons (2,94 ˚

A, 144,6◦). Abstand und Winkel des Wassersauerstoffs zum Lactoncarbonyl

(3,01 ˚

A, 74,9◦) sind dabei gut f¨

ur eine Aktivierung des Monomers durch das katalytisch

genutzte Wasser geeignet. Der Acyl-Enzym-Komplex, dessen Wechselwirkungen in Ta-

belle 3.13 zusammengefasst sind, bleibt weiterhin im oxyanion hole stabilisiert, w¨

ahrend

seine Hydroxygruppe eine Wasserstoffbr¨

uckenbindung zu einem Solvensmolek¨

ul ausbil-

det.

Tabelle 3.13: Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zwischen Acyl-Enzym-Komplex und oxyanion hole

bzw. Solvensmolek¨

ul nach Dockingstudien des zweiten ε-Caprolactonmonomers und anschlie-

ßender QM/MM-Optimierung (s. Abb. 3.7D)

Acyl-Enzym-Komplex (aec) - oxyanion hole

O(aec)-NH(Gln106) O(aec)-OH(Thr40) O(aec)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,84 2,75 2,84

Winkel (◦) 155,6 170,8 160,0

Acyl-Enzym-Komplex (aec) - H2O

OH(aec)-OH(H2O)

Abstand ( ˚

A) 2,78

Winkel (◦) 168,9

Schritt IV

Die Aktivierung des ε-Caprolactons erfolgt durch einen nucleophilen Angriff des Sau-

erstoffs des katalytischen Wassermolek¨

uls am Carbonylkohlenstoff des ε-Caprolactons,

der mittels einer QM-spring simuliert wurde. Dabei ist eine ¨

Ubertragung des Wasser-

protons, das vorher eine Wasserstoffbr¨

uckenbindung zum Carbonylsauerstoff des Lactons

74 3 Ergebnisse

ausbildete, auf eben diesen Carbonylsauerstoff zu beobachten. Es resultiert ein cyclisches

geminales Diol, das auch in der nachfolgenden QM/MM-Optimierung stabil blieb. Die-

ses ist durch Wasserstoffbr¨

uckenbindung der Hydroxygruppe des Diols zu Thr40 (2,71 ˚

172,9◦) stabilisiert (s. Abb. 3.7E), wobei es sich um dieselbe OH-Gruppe handelt, die

auch vorher im katalytischen Wassermolek¨

ul auf Thr40 gerichtet ist. Das kristallogra-

phische Wassermolek¨

ul vor Thr40 wird in diesem Schritt nicht verbraucht, sondern nur

als Katalysator verwendet, der in Schritt VIII wieder freigesetzt wird. Der Acyl-Enzym-

Komplex ist weiterhin durch das oxyanion hole und ein Wassermolek¨

ul stabilisiert, wie

in Tabelle 3.14 gezeigt. Der Ringsauerstoff dieses aktivierten Monomers befindet sich in

einem Abstand von 3,34 ˚

Azum Carbonylkohlenstoff des Acyl-Enzym-Komplexes und

ist senkrecht zu diesem ausgerichtet (90,4◦), wodurch ein sofortiger nucleophiler Angriff

des Diols am Acyl-Enzym-Komplex m¨

oglich wird. Alternativ w¨

are auch ein vorheriger

Zerfall des Diols in die entsprechende Hydroxycarbons¨

aure denkbar, der allerdings in

entsprechenden QM/MM-Rechnungen unter Anwendung der spring method nicht zu be-

obachten war und deshalb nicht weiter ber¨

ucksichtigt wurde.

Tabelle 3.14: Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zwischen Acyl-Enzym-Komplex und oxyanion hole

bzw. Solvensmolek¨

ul nach QM/MM-Optimierung des aktivierten Monomers (s. Abb. 3.7E)

Acyl-Enzym-Komplex (aec) - oxyanion hole

O(aec)-NH(Gln106) O(aec)-OH(Thr40) O(aec)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,76 2,75 2,89

Winkel (◦) 155,2 170,3 154,7

Acyl-Enzym-Komplex (aec) - H2O

OH(aec)-OH(H2O)

Abstand ( ˚

A) 2,77

Winkel (◦) 168,6

Schritt V

Das in Schritt IV gebildete aktivierte Monomer kann zur Kettenverl¨

angerung eingesetzt

werden, wobei der senkrecht zum Carbonylkohlenstoff des Acyl-Enzym-Komplexes po-

3.2 CALB-katalysierte ε-Caprolacton-Polymerisation 75

sitionierte Ringsauerstoff des cyclischen Diols (3,34 ˚

A, 90,4◦) diesen nucleophil angreift.

Dieser Vorgang wurde durch eine QM-spring simuliert, wobei nach Verl¨

angerung eine so-

fortige Abl¨

osung des Dimers erfolgt. Ein stabiles zweites tetraedrisches Intermediat wur-

de nicht gefunden. Der nucleophile Angriff des Ringsauerstoffs an der seringebundenen

Carbonylgruppe der ε-Hydroxy-Acylseitenkette bewirkt eine Ring¨

offnung des aktivierten

Monomers, wodurch ein Proton des geminalen Diols unter Bildung einer terminalen Car-

boxylgruppe abgespalten wird. Ob dieses Proton zun¨

achst unter Bildung eines tetraedri-

schen instabilen ¨

Ubergangszustands an His224 ¨

ubertragen wird, um von dort zu Ser105

transferiert zu werden, oder ob aufgrund der r¨

aumlichen N¨

ahe w¨

ahrend des nucleophi-

len Angriffs der Protonentransfer direkt vom Diol zum Serinsauerstoff erfolgt, ist nicht

klar. Die Abl¨

osung des Dimers fand bereits w¨

ahrend der ersten QM/MM-Optimierung

unter Anwendung der spring statt und nicht erst bei der anschließenden Relaxation, so

dass keine R¨

uckschl¨

usse zu ziehen sind ¨

uber welchen ¨

Ubergangszustand die Reaktion

verl¨

auft. Die Estercarbonylgruppe des abgel¨

osten Dimers (s. Abb. 3.8F) zeigt noch im-

mer zwei Wechselwirkungen zu den am oxyanion hole beteiligten Gruppen des Thr40,

w¨

ahrend das Proton der terminalen Carboxylgruppe eine starke Wasserstoffbr¨

uckenbin-

dung zum backbone-Carbonyl des Thr40 aufweist und die Hydroxygruppe des Serins auf

den Carbonylsauerstoff der S¨

auregruppe gerichtet ist (s. Tab. 3.15).

Tabelle 3.15: Wasserstoffbr¨

uckenbindungen der Estercarbonylgruppe und Carboxylgruppe des ab-

gel¨

osten Dimers zum oxyanion hole und umgebenden Protein nach QM/MM-Optimierung (s. Abb.

3.8F)

Estergruppe (Dimer) - oxyanion hole

CO(Ester)-OH(Thr40) CO(Ester)-NH(Thr40)

Abstand ( ˚

A) 2,70 3,20

Winkel (◦) 162,0 149,9

Carboxylgruppe (Dimer) - Enzym

H(COOH)-CO(Thr40) CO(COOH)-OH(Ser105)

Abstand ( ˚

A) 2,58 2,83

Winkel (◦) 169,1 150,4

76 3 Ergebnisse

Abbildung 3.8: Die Verl¨

angerung des Acyl-Enzym-Komplexes durch ein aktiviertes Monomer

f¨

uhrt zur sofortigen Abl¨

osung des Dimers (F), dessen Estergruppe noch zwei von drei Wasserstoff-

br¨

uckenbindungen zum oxyanion hole aufweist, w¨

ahrend seine Carboxylgruppe zwischen Ser105

und Thr40 stabilisiert ist.

Schritt VI bis VIII

Das abgel¨

oste Dimer wird durch Wechselwirkungen der Estergruppe zum Thr40 des oxy-

anion holes stabilisiert, w¨

ahrend das Proton der Carboxylgruppe auf Thr40 ausgerichtet

ist und die Serinhydroxygruppe eine Wasserstoffbr¨

uckenbindung zum Carbonylsauerstoff

der S¨

auregruppe eingeht (s. Abb. 3.8F, Tab. 3.15). Ausgehend von dieser Konformation

konnte eine direkte Neuanbindung des Dimers durch nucleophilen Angriff des Serinsau-

erstoffs am terminalen Carboxylkohlenstoff in entsprechenden QM/MM-Berechnungen

nicht gezeigt werden. Grund hierf¨

ur ist die Ausrichtung des Serinprotons auf den Car-

boxylsauerstoff, die einen Protonentransfer zum Histidinstickstoff (3,23 ˚

A, 29,1◦) un-

m¨

oglich macht. Des Weiteren erschwert der flache Winkel zwischen dem Serinsauerstoff

und der Carboxylgruppe des Dimers (3,56 ˚

A, 44,9◦) einen nucleophilen Angriff. Somit

muss auch w¨

ahrend der Caprolacton-Polymerisation zun¨

achst eine geringe Konformati-

ons¨

anderung (Schritt VI) erfolgen, damit die Neuanbindung m¨

oglich ist. Die nachfolgen-

den Schritte zur Bildung des elongierten Acyl-Enzym-Komplex k¨

onnen als analog zur

Lactampolymerisation angenommen werden. Durch nucleophilen Angriff des Serins auf

den Carboxylkohlenstoff des Dimers und Transfer des Serinprotons zum His224 (Schritt

VII) resultiert ein zweites tetreadrisches Intermediat TI2, dessen negativ geladener Sau-

3.2 CALB-katalysierte ε-Caprolacton-Polymerisation 77

erstoff im oxyanion hole stabilisiert ist. Die Hydroxygruppe des TI2 wird daraufhin in

Verbindung mit dem Histidinproton als Wassermolek¨

ul abgespalten, wobei sich unter

R¨

uckbildung der seringebundenen Carbonylgruppe ein elongierter Acyl-Enzym-Komplex

ergibt (Schritt VIII).

Schritt IX

Nach Durchlaufen jedes Katalysezyklus ergibt sich ein um eine Monomereinheit verl¨

anger-

ter Acyl-Enzym-Komplex, der entweder ¨

uber Schritt III weiter elongiert oder in Schritt

IX durch nucleophilen Angriff eines Wassermolek¨

uls am Carbonylkohlenstoff abgel¨

ost

werden kann, wobei zun¨

achst ein Proton des Wassermolek¨

uls an His224 ¨

ubergeht und das

tetraedrische Intermediat TI2 resultiert. Dieses spaltet durch Protonentransfer vom kata-

lytischen Histidin zu Ser105 ein Oligomer mit terminaler Carboxylgruppe ab. Die beiden

Reaktionswege der Kettenverl¨

angerung und -terminierung stehen in st¨

andiger Konkur-

renz zueinander. Die abgel¨

oste Polymerkette kann entweder die Tasche verlassen und ins

L¨

osungsmittel diffundieren, was ein weiteres Kettenwachstum unwahrscheinlich macht,

da dazu ein erneuter Eintritt in die Bindungstasche in geeigneter Orientierung erfolgen

muss, oder sofort neu angebunden werden. Das in diesem Schritt verwendete Wassermo-

lek¨

ul wird verbraucht, sofern keine Neuanbindung der Kette erfolgt. Somit muss das Was-

serreservoir des Enzyms pro abgel¨

oster Polymerkette ein Wassermolek¨

ul zur Verf¨

ugung

stellen. Die Gefahr einer Inaktivierung des Enzyms durch Protonierung des Histidins der

katalytischen Triade besteht bei der ε-Caprolacton-Polymerisation nicht, da das hydroly-

sierte Monomer (6-Hydroxyhexans¨

aure) einen hinreichend hohen pKa-Wert von 4,75 ±

0,1[98] aufweist und dieser bei Oligomerisierung noch weiter ansteigt.

78 3 Ergebnisse

4 Diskussion und Ausblick

4.1 Vergleich der CALB-katalysierten Polymerisationen von

β-Lactam und ε-Caprolacton

Obwohl die Candida antarctica Lipase B katalysierte Polymerisation von Lactonen Po-

lyester mit hohen Molekulargewichten liefert,[75] konnte die analoge Polyamidsynthese

bisher einzig mit β-Lactam als Monomer durchgef¨

uhrt werden, wobei nur eine Oligo-

merisierung mit der maximalen Kettenl¨

ange von 18 und einer durchschnittlichen L¨

ange

von 8 Monomereinheiten gelingt.[59],[88] Die zugrunde liegenden Reaktionsmechanismen

werden in der Literatur bislang als identisch angesehen, wobei sie nur spekulativ und bis-

her nicht experimentell oder theoretisch untersucht worden sind. An diesem Punkt setzt

die vorliegende Arbeit an, mit dem Ziel, die experimentellen Befunde mechanistisch zu

erkl¨

aren.

Die CALB-katalysierte Polymerisation von β-Lactam verl¨

auft ¨

uber die Anbindung

des ersten Monomers durch nucleophilen Angriff des Ser105-Sauerstoffs am β-Lactam-

Carbonyl und Ring¨

offnung des so gebildeten tetraedrischen Intermediats TI1 unter Zu-

hilfenahme eines katalytischen Wassermolek¨

uls als Protonenshuttle zur Protonen¨

ubertra-

gung von His224-NH zum auf der Acylseite liegenden Ringstickstoff des TI1. Der daraus

resultierende Acyl-Enzym-Komplex wird entweder in einem sechsschrittigen Katalyse-

zyklus um eine Monomereinheit verl¨

angert oder durch nucleophilen Angriff des katalyti-

schen Wassermolek¨

uls abgespalten.

Die Verl¨

angerung erfolgt dabei durch ein in situ gebildetes β-Alanin, das durch nucleo-

philen Angriff eines kristallographischen Wassermolek¨

uls auf den β-Lactam-Carbonyl-

kohlenstoff entsteht. Dieses katalytisch genutzte Wassermolek¨

ul befindet sich an einer

in der Kristallstruktur von CALB konservierten Wasserposition vor Thr40 und weist bei

Aktivierung Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zu den backbone-Carbonylgruppen von Gly39

80 4 Diskussion und Ausblick

und Thr40 auf, zu deren Gunsten eine Wasserstoffbr¨

uckenbindung des oxyanion holes

verloren geht. Das in situ gebildete β-Alanin stellt das kettenverl¨

angernde Monomer der

β-Lactam-Polymerisation dar und greift den Carbonylkohlenstoff der seringebundenen β-

Amino-Acylkette nucleophil an. Das resultierende Dimer wird sofort abgel¨

ost und muss

nach Konformations¨

anderung und Durchwanderung der Tasche in einem darauffolgenden

Schritt durch nucleophilen Angriff des Serinsauerstoffs an seiner terminalen Carboxyl-

gruppe neu angebunden werden. In einem letzten Schritt entsteht unter Freisetzung des

katalytischen Wassermolek¨

uls ein verl¨

angerter Acyl-Enzym-Komplex, der entweder in

einen neuen Zyklus eintreten oder durch nucleophilen Angriff eines Wassermolek¨

uls ab-

gel¨

ost werden kann.

Die CALB-katalysierte ε-Caprolacton-Polymerisation erfolgt ¨

ahnlich der β-Lactam-

Polymerisation ¨

uber die Bildung eines tetraedrischen Intermediats TI1, das nach Ring¨

off-

nung zum Acyl-Enzym-Komplex durch ein aktiviertes Monomer verl¨

angert wird. Die

Ring¨

offnung des ersten tetraedrischen Intermediats TI1 verl¨

auft dabei allerdings durch

einen direkten Protonentransfer vom basischen Histidinstickstoff des His224 zum in der

Alkoholseite befindlichen Ringsauerstoff des ehemaligen Caprolactons ohne Verwendung

eines Wassermolek¨

uls als Protonenshuttle. Abbildung 4.1 zeigt die ersten tetraedrischen

Intermediate der β-Lactam- und ε-Caprolacton-Polymerisation im direkten Vergleich.

Die Bildung des Acyl-Enzym-Komplexes der ε-Caprolacton-Polymerisation zeigt dem-

nach keine Wasserabh¨

angigkeit.

Nach Acylierung des Enzyms besteht sowohl bei der Polyester- als auch bei der Po-

lyamidsynthese eine st¨

andige Konkurrenz zwischen Kettenverl¨

angerung und Abl¨

osung.

Beide Reaktionen ben¨

otigen ein Wassermolek¨

ul vor Thr40 zur Erzeugung eines akti-

vierten Monomers, das aufgrund der r¨

aumlichen N¨

ahe alternativ auch den Acyl-Enzym-

Komplex abl¨

osen k¨

onnte. Dieses zur Kettenterminierung verwendete Wasser wird ver-

braucht und muss aus dem Wasserhaushalt des Enzyms ersetzt werden, was allerdings

kein limitierender Faktor der β-Lactam-Polymerisation ist, da dieses Wassermolek¨

ul auch

in Lactonpolymerisationen vom Enzym aufgebracht wird.[75] Als problematisch erwie-

4.1 Vergleich der β-Lactam- und ε-Caprolacton-Polymerisation 81

Abbildung 4.1: Erstes tetraedrisches Intermediat TI1 der β-Lactam- (oben) und ε-Caprolacton-

Polymerisation (unten). Durch die inverse Anordnung des Ringstickstoffs im ehemaligen β-

Lactam-Ring im Vergleich zum Ringsauerstoff des ε-Caprolactons kann kein direkter sondern

nur ein wasserassistierter Protonen¨

ubertrag zum Ringstickstoff erfolgen.

82 4 Diskussion und Ausblick

sen hat sich jedoch die S¨

aurest¨

arke der dabei freigesetzten S¨

auren. W¨

ahrend β-Alanin

im w¨

assrigen Medium einen pKa-Wert von 3,6[95] aufweist, der deutlich unter der von

Hollmann et al.[67] postulierten Inaktivierungsschwelle der CALB (pKa∼4,8) liegt, zeigt

6-Hydroxyhexans¨

aure einen pKavon 4,75[98] und verursacht keine Inhibierung. Protonie-

rung des katalytischen Histidins durch eine S¨

aure wie β-Alanin f¨

uhrt zu einer irreversi-

blen Inaktivierung des Enzyms, da der zur kovalenten Anbindung eines Substrats notwen-

dige Protonentransfer von Ser105 zu His224 nicht mehr m¨

oglich ist. β-Alaninoligomere

weisen ab einer Kettenl¨

ange von drei Einheiten einen im Vergleich zum Monomer erh¨

ohten

pKavon 4,2 auf, weshalb angenommen werden kann, dass die Wahrscheinlichkeit einer

Inaktivierung des Enzyms von β-Alanin zum β-Alanintrimer hin leicht abnimmt. Da in

den Studien von Hollmann et al.[67] keine S¨

auren mit pKa-Werten zwischen 4,3 und 4,7

eingesetzt wurden und nur eine S¨

aure bei pKa4,26 untersucht wurde, kann nicht mit Si-

cherheit gesagt werden in welchem Maße die Inaktivierung durch β-Alanintrimere und

h¨

ohere Oligomer stattfindet. Es wird jedoch in den vielen Polymerisationszyklen, die das

Enzym durchlaufen sollte, aufgrund der Konkurrenz von Kettenabl¨

osung und Wachstum

gelegentlich auch zu einer fr¨

uhzeitigen Abl¨

osung kommen. Im Falle des ε-Caprolactons

geht von der entstehenden Hydroxycarbons¨

aure dabei keine Gefahr aus und die Carbonyl-

gruppe kann durch nucleophilen Angriff des katalytischen Serins wieder angebunden wer-

den, w¨

ahrend die Hydrolyse von β-Lactam ein β-Alanin freisetzt, das zwar auch wieder

angebunden werden k¨

onnte, dazu allerdings mit der Carboxylgruppe in der N¨

ahe des Ser-

ins und somit auch des Histidins vorliegen muss und dort aufgrund seines niedrigen pKa-

Wertes das Histidin der katalytischen Triade protonieren kann.

Die Kettenverl¨

angerung beider Ring¨

offnungspolymerisationen verl¨

auft ¨

uber die Akti-

vierung des cyclischen Monomers unter Zuhilfenahme eines kristallographischen Was-

sermolek¨

uls, wobei β-Lactam zu einem in situ generierten β-Alanin ringge¨

offnet wird,

wohingegen ε-Caprolacton mit Wasser ein cyclisches geminales Diol bildet. In beiden

F¨

allen greift die Hydroxygruppe des Wassers am Carbonylkohlenstoff des Monomers

an. Die ¨

Ubertragung des Wasserprotons erfolgt im β-Lactam jedoch auf den Ringstick-

4.1 Vergleich der β-Lactam- und ε-Caprolacton-Polymerisation 83

stoff, w¨

ahrend beim ε-Caprolacton eine Protonierung des ehemaligen Carbonylsauerstoffs

erfolgt. Wie in Berechnungen auf QM/MM-Niveau ¨

uberpr¨

uft wurde, kann die Ketten-

verl¨

angerung der β-Lactam-Polymerisation nicht analog zur ε-Caprolacton-Polymerisa-

tion ¨

uber ein cyclisches geminales Diol erfolgen. Ebenso wurde der Zerfall des bei der

ε-Caprolacton-Polymerisation auftretenden cyclischen geminalen Diols in die entspre-

chende Hydroxycarbons¨

aure in QM/MM-Rechnungen nicht beobachtet.

Die verschiedenen Mechanismen der Monomeraktivierung ben¨

otigen auch leicht unter-

schiedliche Positionierung des katalytischen Wassermolek¨

uls, wie in Abbildung 4.2 ge-

zeigt. Im Fall des β-Lactams ist das katalytische Wassermolek¨

ul nicht nur am Thr40- son-

dern auch am Gly39-Carbonylsauerstoff verankert, wozu eine Rotation der Thr40/Gly39-

Peptidbindung erforderlich ist, die zum Verlust der Wasserstoffbr¨

uckenbindung des Thr40-

NH zum Acyl-Enzym-Komplex f¨

uhrt. Der Verlust dieser Wechselwirkung des oxyanion

holes und die Rotation der Bindung bedarf der ¨

Uberwindung einer Energiebarriere bei in

situ Generierung des β-Alanins, die zur Aktivierung des ε-Caprolactons nicht notwendig

ist. Abbildung 4.3 zeigt das in situ generierte β-Alanin und das zum cyclischen gemina-

len Diol umgesetzte ε-Caprolacton im Vergleich. Die Carboxylgruppe des β-Alanins ist

in Richtung der Thr40-backbone-Carbonylgruppe orientiert, w¨

ahrend seine Aminogrup-

pe zwischen His224 und Gly39 stabilisiert und optimal f¨

ur die Verl¨

angerung des Acyl-

Enzym-Komplexes ausgerichtet ist. Der im n¨

achsten Katalyseschritt folgende nucleophile

Angriff der Aminogruppe an der seringebundenen Carbonylgruppe muss schneller ablau-

fen als eine Konformations¨

anderung des kettenverl¨

angernden Monomers, was durch die

Fixierung des β-Alanins mittels Wasserstoffbr¨

uckenbindungen gew¨

ahrleistet ist. Auf die-

se Weise wird eine Protonierung des Histidins vorerst verhindert und die Kettenverl¨

ange-

rung durch ein eigentlich inhibierend wirkendes Monomer wie β-Alanin ¨

uberhaupt erst

m¨

oglich.

Im Vergleich dazu erfolgt bei der ε-Caprolacton-Polymerisation eine wesentlich schw¨

chere Stabilisierung des aktivierten Monomers. Dieses ist zwar ebenfalls ¨

uber eine Hy-

droxygruppe am Thr40-Carbonylsauerstoff verankert, verf¨

ugt aber ¨

uber keine weiteren

84 4 Diskussion und Ausblick

Wasserstoffbr¨

uckenbindungen, so dass das oxyanion hole bei der ε-Caprolacton- im Ge-

gensatz zur β-Lactam-Polymerisation intakt bleibt. Nach Kettenverl¨

angerung durch das

jeweilige Monomer erfolgt nach beiden Polymerisationsmechanismen die Abl¨

osung eines

Dimers, das durch Angriff des Serins an der terminalen Carboxylgruppe neu angebunden

werden muss.

Abbildung 4.2: Positionierung des zweiten Monomers der β-Lactam- (oben) und ε-Caprolacton-

Polymerisation (unten) in der jeweils durch das entsprechende Monomer acylierten CALB.

4.1 Vergleich der β-Lactam- und ε-Caprolacton-Polymerisation 85

Abbildung 4.3: Kettenverl¨

angernde aktivierte Monomere der β-Lactam- (oben) und ε-

Caprolacton-Polymerisation (unten) in der jeweils durch das entsprechende Monomer acylierten

CALB.

86 4 Diskussion und Ausblick

Zusammenfassend konnten drei grundlegende mechanistische Unterschiede der CALB-

katalysierten Ring¨

offnungspolymerisation von β-Lactam und ε-Caprolacton identifiziert

werden:

β-Lactam ε-Caprolacton

Ring¨

offnung TI1 Wasser als Protonenshuttle direkter Protonen¨

ubertrag

s. Abb. 4.4B

Aktivierung Stabilisierung des katalytischen Stabilisierung des katalyti-

s. Abb. 4.4D Wassers ¨

uber Thr40 und Gly39 schen Wassers ¨

uber Thr40

⇒Destabilisierung oxyanion hole

Kettenverl¨

angerung in situ generiertes β-Alanin cyclisches geminales Diol

s. Abb. 4.4E

Die Ring¨

offnung des ersten tetraedrischen Intermediates ist elementar, ohne sie kann

keinerlei enzymkatalysierte Umsetzung stattfinden, weder Polymerisation noch Hydroly-

se. Ein wasserassistierter Protonen¨

ubertrag, wie bei der β-Lactam-Polymerisation zu be-

obachten, verlangsamt m¨

oglicherweise die Polymerisationsgeschwindigkeit im Vergleich

zur ε-Caprolacton-Polymerisation, da die β-Lactam-Polymerisation so lange ruht bis ein

Wassermolek¨

ul an geeigneter Stelle vorliegt, w¨

ahrend der direkte Protonentransfer in der

Lactonpolymerisation unabh¨

angig davon vonstattengeht (s. Abb. 4.4B).

Der Verlust einer Wasserstoffbr¨

uckenbindung und die daraus hervorgehende Destabi-

lisierung des oxyanion holes zugunsten einer f¨

ur die Aktivierung des β-Lactams geeig-

neten Positionierung des katalytischen Wassermolek¨

uls zwischen Thr40 und Gly39 (s.

Abb. 4.4D) ist h¨

ochstwahrscheinlich nicht der die β-Lactam-Polymerisation limitierende

Faktor.

F¨

ur eine genauere Einsch¨

atzung dieser beiden ersten Effekte bedarf es der Berechnung

der Aktivierungsenergien der entsprechenden Katalyseschritte beider Polymerisationen

im Vergleich.

4.1 Vergleich der β-Lactam- und ε-Caprolacton-Polymerisation 87

β-Lactam

CALB

ε-Capro-

lacton

TI1

β-Lactam

ε-Caprolacton

Acyl-Enzym-Komplex

Asp134

His224

Ser105

Gln106

Thr40

His224

Ser105

Gln106

Thr40

+ Monomer

+ HOH

Aktivierung

β-Lactam

ε-Caprolacton

His224

Ser105

Gln106

Thr40

His224

Ser105

Gln106

Thr40

Kettenverlängerung

durch aktivierte Monomere

β-Lactam

ε-Caprolacton

in situ generiertes β-Alanin

cyclisches geminales Diol

abgelöstes Dimer

TI2

- HOH

+ H2O

Ablösung Polymerkette + freies Enzym

His224

Ser105

Gln106

Thr40

His224 Ser105

Gln106

Thr40

Abbildung 4.4: Wichtige Zwischenstufen im Katalysezyklus der Candida antarctica Lipase B

katalysierten Ring¨

offnungspolymerisationen von β-Lactam und ε-Caprolacton im Vergleich

88 4 Diskussion und Ausblick

Als der die Kettenl¨

ange limitierende Faktor der β-Lactam-Polymerisation ist vor allem

die Azidit¨

at des β-Alanins zu sehen. Dieses wird sowohl als in situ generiertes ketten-

verl¨

angerndes Monomer (s. Abb. 4.4E) verwendet als auch bei enzymkatalysierter Hy-

drolyse freigesetzt. Im Gegensatz dazu liegt der pKa-Wert von 6-Hydroxyhexans¨

aure, die

durch Hydrolyse von ε-Caprolacton entsteht, in einem unkritischen Bereich.

4.2 Ausblick

In der vorliegenden Arbeit konnten die wesentlichen mechanistischen Unterschiede der

CALB-katalysierten Ring¨

offnungspolymerisationen von β-Lactam und ε-Caprolacton und

die Gr¨

unde f¨

ur die nur eingeschr¨

ankte Polymerisierbarkeit des β-Lactams aufgezeigt wer-

den.

Die Optimierungsm¨

oglichkeiten der β-Lactam-Polymerisation erwiesen sich allerdings

als eher beschr¨

ankt, da die enzymkatalysierte Hydrolyse des β-Lactams die S¨

aure β-

Alanin freisetzt, deren Azidit¨

at ausreicht um das Histidin der katalytischen Triade zu pro-

tonieren, was zu einer Inaktivierung des Enzyms f¨

uhrt. Eine Mutation dieses f¨

ur Serin-

Hydrolasen typischen Histidinrestes gegen eine weniger basische Aminos¨

aure ist nicht

m¨

oglich, weil dadurch die katalytische Triade ihre Funktion einb¨

ußen w¨

urde. Eine Verrin-

gerung des Wassergehalts des Enzyms und somit auch der Hydrolyseaktivit¨

at ist ebenfalls

problematisch, da die Stabilit¨

at des Enzyms durch Entfernung des Kristallwassers in Mit-

leidenschaft gezogen wird und auch die Polymerisation selbst ein katalytisches Wasser-

molek¨

ul ben¨

otigt. Ein Optimierungsansatz der β-Lactam-Polymerisation best¨

unde aber in

der Verwendung von m¨

oglichst wasserfreien CALB-Mutanten mit blockiertem Wasser-

tunnel[60] in Verbindung mit einem geeigneten Alkohol, der sowohl als Protonenshuttle

als auch als aktivierendes Reagenz verwendet w¨

urde. Einerseits w¨

urde eine Blockierung

des Wassertunnels den Transport von Wassermolek¨

ulen aus dem Reservoir des Enzyms

in die Bindungstasche hemmen. Andererseits ist z.B. ein Alkohol wie Methanol geeignet

4.2 Ausblick 89

sowohl als Protonenshuttle zu fungieren als auch die Bildung eines in situ generierten

β-Alaninmethylester zu erm¨

oglichen.

Ein g¨

anzlich anderer Ansatz zur CALB-katalysierten Synthese von Nylon 3 w¨

are auf

der Basis der Untersuchungen von M¨

uller[106] denkbar, der Aminos¨

auren durch Bildung

von Kontaktionenpaaren mit nicht-nucleophilen Basen in unpolaren L¨

osungsmitteln lipa-

sekatalysiert umsetzt. Unter Umst¨

anden w¨

are die Erzeugung eines β-Alanin/Base-Kon-

taktionenpaars eine M¨

oglichkeit β-Alanin selbst direkt als Monomer einzusetzen.

Orientierende Modelling-Studien zur ¨

Ubertragung des hier postulierten Mechanismus

der ε-Caprolacton-Polymerisation auf die experimentell nicht m¨

ogliche Polymerisation

von ε-Caprolactam ergaben erste Anhaltspunkte, dass auch ε-Caprolactam analog zu β-

Lactam einen inversen TI1 ausbildet, dessen Ringstickstoff in der Acylseite liegt. Auf-

grund der unterschiedlichen Ringgr¨

oße und -konformation des Siebenrings im Vergleich

zum Vierring des β-Lactams unterscheidet sich auch die Lage des Ringstickstoffs beider

Intermediate, wobei das NH-Proton des ehemaligen Caprolactams eine starke Wechsel-

wirkung zu Gln157 bildet und ein TI1 resultiert, das aufgrund der ung¨

unstigen Geometrie

auch ¨

uber einen wasserassistierten Protonentransfer nicht ringge¨

offnet werden kann. Hier

w¨

are vermutlich eine Verhinderung dieser Wechselwirkung ¨

uber Mutation des Gln157

durch Aminos¨

auren mit k¨

urzeren Seitenketten ein potenzieller Weg, um auch die CALB-

katalysierte ε-Caprolactam-Polymerisation zu erm¨

oglichen. Diese und weitere Denkan-

s¨

atze zur Durchf¨

uhrbarkeit der Polymerisation von ε-Caprolactam werden zuk¨

unftig in

Molecular-Modelling-Studien von Els¨

asser1basierend auf den hier beschriebenen Er-

kenntnissen zur β-Lactam- und ε-Caprolactam-Polymerisation untersucht.

1Dr. Brigitta Els¨

asser, Universit¨

at Paderborn

90 4 Diskussion und Ausblick

5 Strukturen und Methoden

5.1 Workflow

Abbildung 5.1 zeigt den zur Modellierung lipasekatalysierter Reaktionen verwendeten

Workflow.

Kristallstruktur

Vorbereitung Ligand

D o c k i n g

Energieminimierung Protonate3D Kristallstruktur

Ligandenposition

Wasserpositionen

beschnittenes

Enzym

QM/MM MD

Abbildung 5.1: Workflow f¨

ur die Modellierung lipasekatalysierter Polymerisationen

5.2 Verwendete Strukturen

Alle Rechnungen basieren auf der Kristallstruktur von Candia antarctica Lipase B kom-

plexiert mit einem kovalent gebundenen Phosphonat-Inhibitor (PDB ID: 1LBS),[46] die

92 5 Strukturen und Methoden

aus der Brookhaven Protein Data Bank[107],[108] entnommen wurde. Zur Vorbereitung der

Strukturen wurde das Programm MOE (Molecular Operating Environment)[109] einge-

setzt. Bei Verwendung von kristallographischen Wassermolek¨

ulen wurden deren Positio-

nen aus den Kristallstrukturen der nativen Candida antarctica Lipase B (PDB ID: 1TCA,

1TCB)[45] entnommen und auf 1LBS ¨

ubertragen, gefolgt von einer Energieminimierung

(Kraftfeld MMFF94x). Alle anderen Wassermolek¨

ule, Liganden und nicht-proteinogene

Reste wurden entfernt.

5.3 pKa-Berechnungen

pKa-Berechnungen der Liganden in der active site von Candida antarctica Lipase B wur-

den mithilfe des PROPKA Web Interface (Version 2.0)[101] durchgef¨

uhrt. Da PROPKA

einen pKa-Wert von 4,50 f¨

ur alle S¨

auren in Wasser annimmt, wurden die Berechnungen

ein zweites Mal unter Verwendung der experimentellen pKa-Werte, bzw. im Fall des β-

Alanindimers des berechneten pKa-Werts in Wasser, wiederholt.

5.4 Docking-Studien mit QXP

5.4.1 Quick eXPlore

Die initiale Positionierung der Liganden in der Bindungstasche erfolgte mittels Quick eX-

Plore (QXP),[110] einem auf Monte-Carlo-Verfahren basierenden Dockingtool, das eine

modifizierte Variante des Kraftfelds AMBER[92] verwendet. Ziel des Docking-Verfahrens

ist es, die Konformation und Positionierung des Liganden im Enzym am globalen Mini-

mum der Energiehyperfl¨

ache vorauszusagen. Als Modellsystem wurde ein die Bindungs-

tasche umgebender Ausschnitt im Radius von 15 ˚

Averwendet, wobei das Dockingvolu-

men (s.a. Abschnitt 5.4.2) manuell durch Colorierung sogenannter guided atoms zu defi-

nieren ist. Aus der R¨

ontgenstruktur des Proteins sind nur die Positionen der Schweratome

bekannt, die Abs¨

attigung durch Wasserstoffatome erfolgt in QXP automatisiert, wobei

gleichzeitig auch die Protonierungszust¨

ande der Aminos¨

auren berechnet werden. Letz-

5.4 Docking-Studien mit QXP 93

tere sollten, besonders in der active site, noch einmal visuell ¨

uberpr¨

uft werden. Asp134

wird von QXP als protoniert angenommen, wie von Uppenberg et al.[45] vorausgesagt und

auch in Arbeiten von Garc´

ıa-Urdiales et al.[111] verwendet.

Im Gegensatz zu einer Energieminimierung, die als Ergebnis die Konformation am

n¨

achstliegenden lokalen Minimum der Energiehyperfl¨

ache liefert, k¨

onnen bei der Kon-

formationsgenerierung mittels Monte-Carlo-Verfahren auch globale Minima erreicht wer-

den, die von der Startkonformation ausgehend hinter einer Energiebarriere liegen. Die

Generierung von Konformationen verl¨

auft dabei nach einem Zufallsprinzip und im Ge-

gensatz zu molekulardynamischen Verfahren nur abh¨

angig von der letzten unmittelbar

vorher auftretenden Konformation. Jede neu generierte Struktur wird nachfolgendend ei-

ner energetischen Bewertung unterzogen. Ist die Energie der neu erzeugten geringer als

die der vorangegangenen Konformation, so wird die neue Konformation akzeptiert. An-

dernfalls erfolgt der Vergleich des Boltzmannfaktors der Energiedifferenz von alter und

neuer Konformation (exp{−(Eneu−Ealt )

kB·T}) mit einer Zufallszahl zwischen null und eins, wo-

bei die energiereichere Konformation akzeptiert wird wenn die Zufallszahl kleiner als der

Boltzmannfaktor ist. Ist diese Bedingung nicht erf¨

ullt, so wird im n¨

achsten Iterationschritt

die alte Konformation als Ausgangsstruktur verwendet. Dieses Prozedere erm¨

oglicht die

Generierung und Akzeptanz energetisch ung¨

unstigerer Konformationen und damit das

Uberwinden von Energiemaxima auf dem Weg zum globalen Minimum. Jedoch sinkt die

Wahrscheinlichkeit f¨

ur energetisch ung¨

unstige Konformationen mit steigender Energie-

differenz (Eneu −Ealt ) zwischen alter und neuer Konformation. Um die Reproduzierbar-

keit der Ergebnisse zu gew¨

ahrleisten handelt es sich bei den verwendeten Zufallszahlen

um sogenannte pseudo random numbers, d.h. unter gleichen Ausgangsbedingungen wer-

den auch die gleichen Zufallszahlen erzeugt, die allerdingd die gleichen statistischen Ei-

genschaften wie echte Zufallszahlen haben.[112]

Ein Docking-Lauf mit QXP besteht aus drei aufeinanderfolgenden Arbeitsschritten:

1. sdock

• initiale Platzierung des außerhalb der Tasche befindlichen Liganden

94 5 Strukturen und Methoden

• keine Konformationssuche

• erster Treffer wird f¨

ur full Monte Carlo Search eingesetzt

2. full Monte Carlo Search (mcdock)

• erster Dockinglauf mit uneingeschr¨

ankter Konformationssuche (360◦-Dreh-

barkeit aller Ligandbindungen)

• Auswahl von 1-4 Strukturen f¨

ur local Monte Carlo Search im Rescoring-

Verfahren

3. local Monte-Carlo-Search (mcldock)

• zweiter Dockinglauf mit eingeschr¨

ankten Freiheitsgraden (20-30◦-Drehbar-

keit der Ligandbindungen)

• Auswahl der Zielstruktur(en) im Rescoring-Verfahren

5.4.2 Definition des Dockingvolumens

Die Definition des Dockingvolumens erfolgte ¨

uber manuelle Colorierung sogenannter

guided atoms und anschließende visuelle Kontrolle des Dockingvolumens. Als guided

atoms wurden alle erwartungsgem¨

aß an der Stabilisierung des Liganden beteiligten He-

teroatome samt angebundener Protonen und die Seitenketten-C-Atome der Aminos¨

auren

Ile189 und Ile285 verwendet. Eventuell vorhandene kristallografische Wassermolek¨

ule

sowie funktionelle Gruppen einer seringebundenen Acylkette wurden ebenfalls coloriert.

Tabelle 5.1 zeigt eine ¨

Ubersicht der Colorierung im nativen und acylierten Enzym. Je nach

Colorierung k¨

onnen Atome das Dockingvolumen definieren (pink,lightblue), starr gehal-

ten werden (pink), sich eingeschr¨

ankt (purple) oder uneingeschr¨

ankt (lightblue,blue) be-

wegen. Bei eingeschr¨

ankter Beweglichkeit ist eine Positions¨

anderung im Umkreis von 2 ˚

erlaubt, wobei derartige Bewegungen in die Verformungsenergie der Tasche eingehen und

sich somit nachteilig auf die Gesamtenergie des System und die Platzierung der Struktur

in der Trefferliste auswirken. Kristallographische Wassermolek¨

ule wurden, sofern nicht

5.4 Docking-Studien mit QXP 95

explizit ben¨

otigt, vor dem Docking entfernt, da die Sauerstoffatome des Wassers nur einer

eingeschr¨

ankten Beweglichkeit (purple) unterliegen und folglich nicht beliebig auswei-

chen k¨

onnen um eine andere Position des Liganden zu erm¨

oglichen und ihre Bewegung

außerdem in die Verformungsenergie der Tasche eingeht. Beim Einsatz kristallographi-

scher Wassermolek¨

ule in Docking-Studien sollte deshalb gepr¨

uft werden inwiefern die

Wassermolek¨

ule die Positionierung des Liganden ver¨

andern.

Tabelle 5.1: Colorierung der guided atoms von CALB (PDB: 1LBS) in Docking-Studien mit

Quick eXPlore. Die Definition der Tasche erfolgt nur ¨

uber die entsprechend gekennzeichneten

(“X”) guided atoms.

Rest Atom(Gruppe) Farbe Beweglichkeit Definition

der Tasche

Thr40 N(NH, backbone)purple eingeschr¨

ankt

H(NH, backbone)lightblue uneingeschr¨

ankt X

O(Hydroxygruppe) purple eingeschr¨

ankt

H(Hydroxygruppe) lightblue uneingeschr¨

ankt X

Ser105 O(Hydroxygruppe) purple eingeschr¨

ankt

H(Hydroxygruppe) lightblue uneingeschr¨

ankt X

Gln106 N(NH, backbone)purple eingeschr¨

ankt

H(NH, backbone)lightblue uneingeschr¨

ankt X

His224 N(Imidazol) purple eingeschr¨

ankt

His224 (prot.) N(Imidazol) purple eingeschr¨

ankt

H(NH, protoniert) lightblue uneingeschr¨

ankt X

Ile189 C(CH2, Seitenkette) pink keine X

Ile285 C(CO, backbone)pink keine X

eventuell vorhandene Reste:

H2O O purple eingeschr¨

ankt

Hblue uneingeschr¨

ankt

Acylkette O(Carbonylgruppe) purple eingeschr¨

ankt

O(Ester) purple eingeschr¨

ankt

N(Aminogruppe) purple eingeschr¨

ankt

H(Aminogruppe) blue uneingeschr¨

ankt

N(Peptid) purple eingeschr¨

ankt

H(Peptid) blue uneingeschr¨

ankt

O(S¨

aure) purple eingeschr¨

ankt

H(S¨

aure) blue uneingeschr¨

ankt

96 5 Strukturen und Methoden

5.4.3 Rescoring der Dockingergebnisse

Das Rescoring der Docking-Ergebnisse erfolgte nach einer Kombination zweier verschie-

dener Verfahren:

• Punkte-Vergabe nach Alisaraie et al.[104]

• Hauptkomponentenanalyse (PCA, principal component analysis)[105]

Im Rescoring stehen 25 von QXP ausgegebene Strukturen, sortiert nach ihrer Gesamt-

bindungsenergie Eass, zur Verf¨

ugung, jede von ihnen mit einem entsprechenden Datensatz

der in Tabelle 5.2 gegebenen Energiewerte.

Tabelle 5.2: Energiewerte eines QXP-Docking-Laufes. Die Verwendung der Werte im Resco-

ring[113] ist entsprechend markiert (“X”).

Energie Beschreibung Rescoring

Eass Gesamtbindungsenergie

Elig

Ligandenenergie im Komplex abz¨

uglich Ligandenenergie

außerhalb der Bindungstasche im globalen Minimum

Eshe

Energie der Bindungstasche im Komplex abz¨

uglich Energie

der Bindungstasche nach lokaler Energieminimierung

Eslb Energie, die aus den bei Formierung neuer Bindungen

im Komplex auftretenden Spannungen resultiert

Enbd

Gesamtenergie der nichtbindenden Wechselwirkungen X

im Komplex

Evdw van-der-Waals-Energie der Komplexbildung X

Eest elektrostatische Energie der Komplexbildung X

Ecnt

abstandsabh¨

angige Kontaktenergie summiert ¨

uber X

alle Bindungstasche/Ligand-Atompaare

Evw+Summe aller van-der-Waals-Energien f¨

ur Bindungstasche/ X

Ligand-Atompaare mit positiven (abstoßenden) Energien

Nhph

Anzahl der hydrophoben Ligandatome, die in Kontakt X

zu hydrophoben Teilen der Bindungstasche stehen

Nhbd

Anzahl Wasserstoffbr¨

uckenbindungen zwischen

Ligand und Bindungstasche

5.4 Docking-Studien mit QXP 97

Die Gesamtbindungsenergie des Enzym-Ligand-Komplexes ergibt sich aus der Summe

der Ligandenenergie, Verformungsenergie und Energie der nichtbindenden Wechselwir-

kungen (s. Gl. 5.1 und 5.2).

Eass =Elig +Eshe +Eslb +Enbd (5.1)

Enbd =Evdw +Eest +Ecnt (5.2)

Im Scoring nach Punkte-Vergabe-Verfahren wird f¨

ur jede der zu bewertenden Gr¨

oßen

(s. Tab. 5.2) der beste Wert (Minimum bei Energien bzw. Maximum bei Kontakten) ge-

sucht und daraufhin f¨

ur alle Treffer mit einer Abweichung von ≤ ±2 ein Punkt verge-

ben. Insgesamt ergeben sich so zwischen null und sechs Punkte pro Trefferstruktur. Als

Rescoring-Ergebnis nach dem Punkte-Vergabe-Verfahren ergibt sich die Struktur mit den

meisten Punkten und, sofern mehrere Treffer dieses Kriterium erf¨

ullen, der niedrigsten

Gesamtbindungsenergie.[104] Im Rescoring mittels Hauptkomponentenanalyse wird das

vorliegende sechsdimensionale Problem (sechs zu bewertende Gr¨

oßen pro Treffer) auf

ein zweidimensionales Problem reduziert. Eine derartige Reduktion der Dimensionalit¨

ist immer dann m¨

oglich, wenn zwischen den Ausgangsvariablen eine Korrelation besteht,

die im vorliegenden Fall durch Abh¨

angigkeit der Energiewerte voneinander gegeben ist.

Diese Korellation l¨

asst sich mittels PCA eliminieren. Dabei ergibt sich pro Variable ei-

ne Hauptkomponente, die aus einer Linearkombination von Variablen besteht, und einer

Raumachse entspricht. D. h. f¨

ur ein System mit sechs Variablen ergibt sich ein sechs-

dimensionaler Raum. Die erste Hauptkomponente maximiert die Varianz, wodurch die

gr¨

oßte Streuung des Datensatzes entlang der ersten Hauptkomponente (PCA1) auftritt.

Nachfolgende Hauptkomponenten ber¨

ucksichtigen nur noch die Varianz, die nicht be-

reits in die vorherigen einbezogen wurde. Um die Gesamtvarianz zu erhalten werden

zwar genau so viele Hauptkomponenten wie Variablen ben¨

otigt, jedoch ist der Anteil der

h¨

oheren Hauptkomponenten so gering, dass diese zu vernachl¨

assigen sind.[112],[114] Im

98 5 Strukturen und Methoden

vorliegenden Fall bedeutet dies, dass nur die erste (PCA1) und zweite Hauptkomponente

(PCA2) ber¨

ucksichtigt wurden. Die zweite Hauptkomponente PCA2 wurde in Abh¨

angig-

keit von der ersten Hauptkomponente PCA1 in einem Diagramm aufgetragen, wobei sich

die Trefferstrukturen nach Hauptkomponentenanalyse im oberen linken Quadranten als

die Strukturen mit kleinster PCA1 und gr¨

oßter PCA2 ergeben.[105] Wenn beide Rescoring-

Methoden in einem lmcs-Dockinglauf auf die gleiche Struktur verwiesen, so wurde diese

als Endergebnis des Dockings angesehen.

5.4.4 Aufbereitung der Dockingstrukturen und Berechnung der

Protonierungszust¨

ande

Da f¨

ur die mit QXP durchgef¨

uhrten Dockingstudien nur ein Ausschnitt um die Bindungs-

tasche mit einem Radius von 15 ˚

Averwendet wird, muss die Proteinstruktur f¨

ur nach-

folgende Rechnungen wieder komplettiert werden. Dazu erfolgte zun¨

achst die Berech-

nung der Protonierungszust¨

ande der eingangs verwendeten Kristallstruktur nach Entfer-

nung des Liganden mithilfe der Protonate3D-Routine des Programms MOE, wobei die

energetisch optimale Protonierung der Aminos¨

auren resultieren sollte. Hier ist jedoch zu

beachten, dass die Option flip, die eine Drehung von Aminos¨

aureseitenketten erlaubt, de-

aktiviert wird. Andernfalls kommt es zu einer Drehung der Gln157-Seitenkette, Proto-

nierung von Asp134 und Zerst¨

orung des Wasserstoffbr¨

uckenbindungsnetzwerkes dieser

beiden Aminos¨

auren mit der Thr40-Hydroxygruppe des oxyanion holes. Die berechneten

Protonierungszust¨

ande sind visuell zu kontrollieren und die Reste der katalytischen Triade

m¨

ussen sich in einem katalytisch aktiven Protonierungszustand befinden (Asp187 depro-

toniert, His224 unprotoniert). In diese vorbereitete Enzymstruktur wurde die inkomplette

Dockingstruktur geladen, woraufhin man die Ligandenposition und - falls vorhanden - die

im Docking verwendeten Wassermolek¨

ule in die Orginalstruktur ¨

uberf¨

uhrte und das be-

schnittene Protein verwarf. Im Docking aufgetretene strukturelle ¨

Anderungen gehen auf

diese Weise zwar verloren, sind aber im Allgemeinen so gering, dass sie zu vernachl¨

assi-

gen sind, sofern die Struktur nachfolgend durch Energieminimierungen verfeinert wird.

5.5 Energieminimierungen 99

5.5 Energieminimierungen

5.5.1 Grundlagen

In kraftfeldbasierten Berechnungen, wie Energieminimierungen, erfolgt die Behandlung

eines Molek¨

ules nach einem rein mechanischen Modell als Ansammlung einzelner Mas-

senpunkte definierter Ausdehnung, die durch harmonische Kr¨

afte miteinander wechsel-

wirken, wobei die Gesamtenergie des Systems nur von den Positionen der Atome, die

es beinhaltet, abh¨

angt.[115] Ziel ist es das n¨

achstgelegene lokale oder globale Minimum

der Energiehyperfl¨

ache zu erreichen. Ausgehend von der Schr¨

odinger-Gleichung, die kei-

ne exakte L¨

osung f¨

ur Molek¨

ule besitzt, m¨

ussen zur Aufstellung einfacherer Modelle ver-

schiedene N¨

aherungen gelten, als wichtigste von ihnen die Born-Oppenheimer-N¨

aherung.

Nach der Born-Oppenheimer-N¨

aherung kann die Wellenfunktion des Gesamtsystems in

einen Elektronen- und einen Atomkernanteil aufgespalten werden (s. Gl. 5.3).

ψges(Kerne,Elektronen) = ψ(Elektronen)ψ(Kerne)(5.3)

Die Atomkerne verhalten sich nach dieser N¨

aherung adiabatisch und so k¨

onnen die

Elektronen sich dank ihrer wesentlich kleineren Masse und Tr¨

agheit jeglicher Positions-

anderung der Kerne sofort angleichen. Somit h¨

angt die Wellenfunktion der Elektronen nur

von der Position der Kerne ab und nicht von ihrem Impuls. Unter Anwendung der Born-

Oppenheimer-N¨

aherung ist die Schr¨

odinger-Gleichung auch f¨

ur Molek¨

ule l¨

osbar. Die Ge-

samtenergie Eges des Systems ergibt sich als Summe der durch elektrostatische Abstoßung

der Kerne bedingten Kernenergie EKerne und der Energie der Elektronen EElektronen, die

sich aus ihrer kinetischen und der potentiellen Energie im elektrostatischen Feld der Kerne

zusammensetzt (s. Gl. 5.4).[112]

Eges =EKerne +EElektronen (5.4)

100 5 Strukturen und Methoden

Unter der Annahme, dass die Atomkerne fixiert sind, ergibt sich die Gesamtenergie des

Systems nach Gleichung 5.5.

Eges =Estr +Ebend +Etors +Evdw +Eelec (5.5)

Die Gesamtenergie setzt sich demnach aus den kovalenten Energietermen f¨

ur Bin-

dungsstreckung (Estr), Winkelkr¨

ummung (Ebend) und Torsionsenergie (Etors), sowie den

nicht-kovalenten Energietermen f¨

ur van-der-Waals- (Evdw) und elektrostatische Wechsel-

wirkungen (Eelec) zusammen.[115] Nach Einsetzen dieser Terme in Gleichung 5.5 erh¨

alt

man Gleichung 5.6, die die potentielle Energie des Gesamtsystems in biomolekularen

Kraftfeldern beschreibt.[116]

Eges =∑

Bindungen

2kb(r−r0)2+∑

Winkel

2kθ(θ−θ0)2+∑

Torsion

2kϕ(1+cos(mϕ−ϕ0))

+∑

vdW

εikRmin,ik

rik 12

−2Rmin,ik

rik 6+∑

Coulomb

qiqk

εDrik

(5.6)

Die Energieterme f¨

ur bindende Wechselwirkungen werden, mit Ausnahme der Torsi-

onsenergie, durch harmonische Potentiale beschrieben, wobei man die Abweichung der

Bindungsl¨

angen rund Bindungswinkel θvon den entsprechenden Werten im Gleich-

gewicht (r0,θ0) betrachtet. Die Torsionsenergie ergibt sich aus einer Cosinusfunktion

mit Torsionswinkel ϕ, Nullphasenwinkel ϕ0und Periodizit¨

at m. Die jeweiligen Kraftkon-

stanten werden mit kr,kθund kϕbezeichnet. Elektrostatische Wechselwirkungen werden

durch das Coulomb-Potential und van-der-Waals-Wechselwirkungen durch das Lennard-

Jones-Potential ausgedr¨

uckt. Das Coulomb-Potential beschreibt die Wechselwirkung zwei-

er am Kern befindlicher Punktladungen (qiund qk), die im Abstand rik zueinander lie-

gen, wobei εDdie Dielektrizit¨

atskonstante ist. Das Lennard-Jones-Potential setzt sich aus

5.5 Energieminimierungen 101

dem Potentialminimum εik, dem Kollisionsradius Rmin,ik und dem Atomabstand rik zu-

sammen.[116]

Die Kraftfeldparameter (Kraftkonstanten und Gleichgewichtswerte) unterscheiden sich

von Kraftfeld zu Kraftfeld. Die Ermittlung dieser Werte kann beispielsweise auf empi-

rischem Wege erfolgen, wobei die im Kraftfeld auftretenden Torsionsprofile iterativ so

lange mit den aus quantenmechanischen Rechnungen resultierenden Profilen verglichen

werden bis eine gute ¨

Ubereinstimmung erreicht ist.[116] Da nicht f¨

ur alle Klassen von Mo-

lek¨

ulen die gleichen Energiefunktionen und Parameter angewendet werden k¨

onnen, gibt

es verschiedene Kraftfelder.

In der vorliegenden Arbeit werden die Kraftfelder MMFF94x, ein f¨

ur alle Atomsorten

parametrisiertes Kraftfeld, das vor allem f¨

ur kleine organische Molek¨

ule geeignet ist, und

AMBER99,[92] das ebenfalls f¨

ur alle Atomsorten parametrisiert ist, aber f¨

ur Proteine und

Nucleins¨

auren erstellt wurde und nur bedingt auf Liganden anwendbar ist, verwendet.[117]

5.5.2 Durchf¨

uhrung

Die aufbereiteten Dockingstrukturen wurden in einer Kaskade von Energieminimierungen

schrittweise verfeinert. Ein erster Minimierungslauf beinhaltet dabei verschiedene Rand-

bedingungen (constraints), die bewirken, dass der Ligand auf seiner Position verbleibt

und das Enzym sich in einer Art induced fit anpasst. So wurden im Fall des acylierten

Enzyms drei constraints (L¨

ange 2,6-3,2 ˚

A) vom Substratsauerstoff zu den an der Bildung

des oxyanion holes beteiligten Schweratomen gesetzt, w¨

ahrend bei einem ungebunden

Ligand der im Docking resultierende Abstand zum Serinsauerstoff (oder Carbonylkoh-

lenstoff des Acyl-Enzym-Komplexes) als maximal erlaubter Abstand eingesetzt wurde.

In einem zweiten Minimierungslauf wurden alle constraints entfernt. Jeder Lauf besteht

aus einer Abfolge von vier Energieminimierungen, die im Programm MOE durchgef¨

uhrt

werden:

1. Minimierung der Wasserstoffatome des Proteins

• Kraftfeld: Amber99

102 5 Strukturen und Methoden

• Ligand und kristallografische Wassermolek¨

ule fixiert

2. Minimierung der Proteinseitenketten

• Kraftfeld: Amber99

• Ligand und kristallografische Wassermolek¨

ule fixiert

3. Minimierung des Proteins

• Kraftfeld: Amber99

• Ligand und kristallografische Wassermolek¨

ule fixiert

4. Minimierung des Liganden und seiner Umgebung

• Kraftfeld: MMFF94x

• Ligand und kristallografische Wassermolek¨

ule beweglich

• Protein im Umkreis von 7 ˚

Aum den Liganden beweglich

• restliches Protein fixiert

Die energieminimierten Dockingstrukturen wurden nachfolgend in molekulardynami-

schen und quantenmechanischen Untersuchungen eingesetzt.

5.6 Molekulardynamische Untersuchungen

5.6.1 Grundlagen

In molekulardynamischen Untersuchungen erfolgt die Berechnung der zeitabh¨

angigen

Dynamik eines Systems durch numerisches L¨

osen der Newtonschen Bewegungsgleichun-

gen f¨

ur die Atomkoordinaten. Die Wechselwirkungsenergien der Partikel untereinander

werden dabei weiterhin durch Kraftfelder beschrieben. Der Zustand des Systems an jedem

beliebigen Zeitpunkt in der Zukunft kann aus dem gegenw¨

artigen Zustand vorhergesagt

werden, wobei jedoch die berechenbare Zeitspanne durch die heutige Rechnerleistung

sehr begrenzt ist (je nach Systemgr¨

oße im Bereich von Nanosekunden).[115],[117]

5.7 QM/MM-Geometrieoptimierungen 103

Molekulardynamische Simulationen erm¨

oglichen die ¨

Uberwindung von Energiebarrie-

ren, da dabei auch die thermische Bewegung ber¨

ucksichtigt wird, wodurch die Molek¨

ule

gen¨

ugend Energie besitzen um auch Energiebarrieren zu ¨

uberwinden und andere loka-

le Minima bzw. das globale Minimum zu erreichen. Dadurch sind molekulardynamische

Methoden besonders zur Konformationssuche großer Molek¨

ule (wie Proteine) geeignet.

Bei kleinen Molek¨

ulen k¨

onnen zum Beispiel Monte-Carlo-basierte Verfahren sinnvoller

sein.[115],[117]

5.6.2 Durchf¨

uhrung

Molekulardynamische Untersuchungen wurden mit MOE unter Verwendung der Nos´

Poincar´

e-Anderson (NPA) Gleichungen und eines NPT-Ensembles durchgef¨

uhrt. Die Si-

mulation erfolgte bei einer Temperatur von 300 K und einem Druck von 101 kPa f¨

ur eine

Zeitspanne von 1 ns.

5.7 QM/MM-Geometrieoptimierungen

5.7.1 Grundlagen

Kombinierte quantenmechanische und molekularmechanische Methoden (QM/MM-Me-

thoden) verbinden den Vorteil der großen Systemgr¨

oßen in molekularmechanischen Be-

rechnungen mit der Genauigkeit bei quantenmechanischer Beschreibung kleiner Syste-

me.[118] Bei diesen kombinierten Verfahren wird das Gesamtsystem in eine innere Region

(z.B. die active site eines Enzyms), die quantenmechanisch behandelt wird, und eine ¨

auße-

re Region, die mittels kraftfeldbasierter Methoden beschrieben wird, geteilt. Aufgrund der

Wechselwirkung von QM- und MM-Region ergibt sich die Gesamtenergie des Systems

nicht als Summe der Energien dieser Subsysteme, sondern es m¨

ussen weitere Kopplungs-

terme ber¨

ucksichtigt werden. Die Grenze zwischen QM- und MM-Region durchtrennt

zahlreiche kovalente Bindungen, deren Atome (sogenannte Grenzatome) mit Linkatomen

abges¨

attigt werden um eine vollst¨

andige QM-Region zu erhalten. Bei diesen nicht im real

104 5 Strukturen und Methoden

vorliegenden System vorhandenen Linkatomen handelt es sich meist um Wasserstoffato-

me. Die Grenze sollte so gew¨

ahlt werden, dass die zu durchtrennende Bindung m¨

oglichst

unpolar ist, so eignen sich besonders aliphatische C-C-Bindungen.[118]

Die Beschreibung der QM-Region kann anhand verschiedenster Methoden erfolgen, die

in diesem Zusammenhang meistverwendete ist die Dichtefunktionaltheorie (DFT). Die

Dichtefunktionaltheorie beschreibt die Energie des Grundzustand nach dem Hohenberg-

Kohn-Theorem als alleinig abh¨

angig von der Elektronendichte des Grundzustands.[119],[120]

Somit muss keine L¨

osung der Schr¨

odingergleichung f¨

ur ein Vielelektronensystem gefun-

den werden, sondern alle Eigenschaften stehen nur in Abh¨

angigkeit von der Elektronen-

dichte des Grundzustands. Die Schr¨

odingergleichung ergibt f¨

ur ein N-Elektronensystem

3N Koordinaten, je drei pro Elektron. Da die Elektronendichte durch das Quadrat der Wel-

lenfunktion integriert ¨

uber alle Elektronenkoordinaten beschrieben wird, ist diese von der

Anzahl der Elektronen unabh¨

angig und und h¨

angt nur von drei Koordinaten ab. Mittels

DFT sind so auch komplexe Vielelektronensysteme wie Molek¨

ule zu berechnen.[119],[120]

Die Energie des Systems ergibt sich aus drei verschiedenen Energietermen: der kineti-

schen Energie, der Anziehungsenergie zwischen Kernen und Elektronen und der Absto-

ßungsenergie zwischen den Elektronen, wobei sich die Energie der Elektronenabstoßung

aus dem Anteil der Coulomb-Wechselwirkung und einem Austauschkorrelationsterm zu-

sammensetzt. Es existieren verschiedene Methoden f¨

ur die Berechnung des Austausch-

korrelationsterms, zum einen die lokale Dichten¨

aherung (LDA), bei der ein uniformes

Elektronengas mit r¨

aumlich konstanter Dichte als Modell verwendet wird, und zum an-

deren die generalisierte Gradientenn¨

aherung (GGA), die eine ortsabh¨

angige Betrachtung

erlaubt. Daneben stehen diverse Hybridmethoden, die sich aus Linearkombinationen der

LDA und GAA zusammensetzen, zur Verf¨

ugung. Die in der Computerchemie gebr¨

auch-

lichste Hybridmethode ist B3LYP.[112],[120]

5.7 QM/MM-Geometrieoptimierungen 105

5.7.2 Durchf¨

uhrung

Alle QM/MM-Geometrieoptimierungen wurden unter Anwendung des Programms NW-

Chem (Version 6.0, Pacific Northwest National Laboratory, USA)[102], [103] durchgef¨

uhrt.

Die in direkte Wechselwirkung zum Liganden tretenden Aminos¨

auren der active site

(Thr40, Ser105, Gln106, His224) und die an der Stabilisierung des oxyanion holes be-

teiligten Reste (Asp134, Gln157) waren Teil der QM-Region, w¨

ahrend das restliche Pro-

tein und Wasser molekularmechanisch beschrieben wurde. Der Ligand, eine eventuell

gebundene Acylkette und die kristallographischen Wassermolek¨

ule befinden sich, sofern

vorhanden, ebenfalls in der QM-Region. Der ¨

Ubergang zwischen QM- und MM-Region

sollte stets zwischen zwei Kohlenstoffatomen erfolgen, diese Grenzatome wurden mit

Wasserstoffatomen abges¨

attigt und nach dem Pseudobindungsansatz[121],[122] behandelt.

Der QM-Bereich wurde mittels DFT unter Verwendung des B3LYP-Hybridfunktionals

mit dem Basissatz Ahldrichs-pVDZ berechnet, w¨

ahrend f¨

ur die Beschreibung der MM-

Region das Kraftfeld Amber99 verwendet wurde. Die Simulation von Reaktionen inner-

halb der QM-Region erfolgte in NWChem mittels der sogenannten spring method, bei

der eine harmonische Feder zwischen zwei Atomen deren Bindungsabstand im Produkt

definiert. Eine spring zwischen den Atomen iund jmit einer Federkonstante kund einem

Gleichgewichtsabstand r0bewirkt ein Ansteigen der Energie des Systems durch Beitrag

eines neuen Energieterms zur Gesamtenergie Eges (s. Gl. 5.7).[123]

Eges+spring =Eges +1

2k(ri j −r0)2(5.7)

Dieser zus¨

atzliche Energieterm erzwingt einen Abstand von ungef¨

ahr r0zwischen den

beiden Atomen, wobei nie der exakte Wert erreicht wird.[123] Die Kraftkonstante kbetrug

im Falle eines Protonen¨

ubertrags 0,5 au bei einem Abstand von r0=1,8au, wohingegen

f¨

ur eine Schweratombindung im Allgemeinen eine Kraftkonstante von 1,0 bis maximal

2,0 au und ein Bindungsabstand von 2,5 bis 3,0 au gew¨

ahlt wurde. Die Startkonfigura-

tion wird mittels der spring method m¨

oglichst nahe an den Produktzustand angen¨

ahert,

106 5 Strukturen und Methoden

w¨

ahrend die MM-Region sich den geometrischen Ver¨

anderungen anpasst. In einer nach-

folgenden Optimierung, f¨

ur die die spring entfernt wurde, relaxiert das System und man

erh¨

alt die Struktur im n¨

achstgelegenen Energieminimum.

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