Stammesspezifische Unterschiede in der
analgetischen Wirkung von Buprenorphin bei der Maus
vorgelegt von
Master of Science
Juliane Rudeck
geb. in Berlin
von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktorin der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Roland Lauster
Erster Gutachter: Prof. Dr. Jens Kurreck
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Gilbert Schönfelder
Dritter Gutachter: Prof. Dr. Lars Lewejohann
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 08.10.2018
Berlin 2018
I
Eidesstattliche Erklärung
„Ich erkläre an Eides Statt, dass die vorliegende Dissertation in allen Teilen von mir
selbstständig angefertigt wurde und die benutzten Hilfsmittel vollständig angegeben worden
sind.“
Berlin, den
(Juliane Rudeck)
II
Aus dieser Arbeit hervorgegangene Publikationen
Die Arbeit wurde am Bundesinstitut für Risikobewertung in der Abteilung Experimentelle
Toxikologie und ZEBET angefertigt und gefördert vom BMBF (Grant No. 031A262D).
Die Inhalte der hier vorliegenden Dissertation wurden teilweise bereits in wissenschaftlichen
Journalen veröffentlicht bzw. Eingereicht zur Veröffentlichung. Diese sind im Folgenden
aufgelistet.
J. Rudeck, B. Bert, P. Marx-Stoelting, G. Schönfelder, S. Vogl, Liver lobe and strain
differences in the activity of murine cytochrome P450 enzymes. Toxicology, (2018). Jul 1;
404-405:76-85. https://doi.org/10.1016/j.tox.2018.06.001.
J. Rudeck, S. Vogl, C. Heinl, M. Steinfath, B. Bert, G. Schönfelder, Analgesic efficacy of
buprenorphine depends on the mouse strain. Submitted for publication, (2018).
J. Rudeck, B. Bert, S. Vogl, G. Schönfelder, L. Lewejohann, The effectiveness of habituation
on experimental design: A retrospective analysis. In progress, (2018).
III
Zusammenfassung
Die Verwendung einer optimalen Analgesie sollte oberste Priorität in der Versuchstierkunde
haben und ist nicht nur aus ethischen, sondern auch aus rechtlichen Gründen verpflichtend.
Laut nationalen und internationalen Versuchstierstatistiken ist die Maus mit ca. 70 % die am
häufigsten verwendete Spezies. Opioide werden gewöhnlich zur perioperativen Behandlung
von moderaten bis schweren Schmerzen eingesetzt. Aufgrund der langanhaltenden Wirkung
und geringen unerwünschten Nebenwirkungen wird für die Spezies Maus bevorzugt das
Opioid Buprenorphin verwendet. Unterschiedliche Empfehlungen bzgl. Dosierung,
Applikationsart und -intervall führen jedoch zu Unstimmigkeiten in dessen Anwendung.
Obwohl mausstammspezifische Unterschiede in der Wirkung von Opioiden bekannt sind,
sind diese bisher für die analgetische Wirkung von Buprenorphin noch nicht eindeutig geklärt
und finden daher keine Berücksichtigung in den Empfehlungen. Das Ziel der hier
vorliegenden Arbeit war es daher, den analgetischen Effekt von Buprenorphin in drei häufig
verwendeten Maus-Inzuchtstämmen (C57BL/6J, Balb/cJ, 129S1/SvImJ) zu untersuchen und
zu prüfen, ob eventuelle Unterschiede in der Wirkung auf eine veränderte Metabolisierung
zurückzuführen sind. Hierfür wurden die basale Schmerzempfindlichkeit sowie der
analgetische Effekt von Buprenorphin (0,42 mg/kg, 4,0 mg/kg) unter Verwendung der
Incremental Hot Plate in vivo getestet. Serum- und Gehirnkonzentrationen von Buprenorphin
und seiner Metaboliten wurden bestimmt, um ggf. pharmakokinetisch-bedingte
Veränderungen aufzudecken. Darüber hinaus wurden in vitro die für die Metabolisierung von
Buprenorphin relevanten CYP3A Isozyme hinsichtlich der mRNA Expression, des
Proteingehalts und der Aktivität, untersucht.
Die verwendeten Mausstämme unterschieden sich deutlich in ihrer basalen
Schmerzempfindlichkeit, wobei Balb/cJ Mäuse am sensitivsten und 129S1/SvImJ Mäuse am
wenigsten sensitiv waren. Die Applikation von Buprenorphin führte zu einem dosis- und
stammesabhängigen analgetischen Effekt. Die Dosiserhöhung von Buprenorphin steigerte
die Antinozizeption beim C57BL/6J und Balb/cJ Stamm, wohingegen der analgetische Effekt
beim 129S1/SvImJ Stamm stagnierte. Serum- und Gehirnkonzentrationen von Buprenorphin
und seiner Metaboliten waren dosisabhängig und unterschieden sich bei einer Dosis von
4,0 mg/kg Buprenorphin zwischen den Stämmen. Das Verhältnis von Buprenorphin und
seinen Metaboliten im Blut sowie die Verteilung zwischen Gehirn und Blut zeigten keine
Dosis- und nur geringe Stammesunterschiede, die aber nicht mit der analgetischen Wirkung
korrelierten. Darüber hinaus wurden keine Stammesunterschiede in der Aktivität und im
Proteingehalt der CYP3A Isozyme detektiert. Auf mRNA Ebene wurden
Stammesunterschiede bei einigen CYP3A Isozymen detektiert. Jedoch konnte kein
Zusammenhang zwischen mRNA und Aktivitätsdaten nachgewiesen werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass die Applikation von Buprenorphin
mausstammspezifisch gestaltet werden sollte. Nur so kann Schmerzen optimal vorgebeugt
IV
und unerwünschte Nebenwirkungen vermieden werden. Die beobachteten Unterschiede auf
pharmakokinetischer Ebene können den unterschiedlichen analgetischen Effekt von
Buprenorphin in den drei Mausstämmen nicht ausreichend erklären. Möglicherweise spielen
pharmakodynamische Mechanismen eine übergeordnete Rolle, welche in weiterführenden
Studien untersucht werden sollen. Die Ergebnisse sollen die wissenschaftliche Gemeinschaft
für die Verwendung einer optimierten Analgesie sensibilisieren und somit aktiv zum
Tierschutz in der Versuchstierkunde beitragen.
V
Abstract
The optimal dosage of analgesics should be state-of-the-art in laboratory animal sciences
and is not only a question of animal welfare but also a legal provision. According to current
national and international statistics on laboratory animals, the mouse is the most commonly
used species with approximately 70 %. Opioid analgesics are commonly used for
perioperative care of moderate to severe pain in mice. Among the numerous opioid drugs
available, buprenorphine is the preferred analgesic due to its long-lasting effect and little
adverse side effects. Vast differences in recommendations for dosage, application route and
application intervals lead to uncertainties for appropriate administration and counteract
optimal pain management. Although strain differences in the analgesic efficacy for opioids in
mice are known, they have not been sufficiently investigated for buprenorphine, and
consequently have not been taken into account in current recommendations. Therefore, the
present study aimed to elucidate the influence of strain differences on the analgesic effect of
buprenorphine. Hence, basal pain sensitivity and the analgesic effect of buprenorphine
(0.42 mg/kg, 4.0 mg/kg) were tested in vivo using three popular mouse strains (male
C57BL/6J, Balb/cJ, 129S1/SvImJ) on the Incremental Hot Plate. As pharmacokinetic
mechanisms might play a crucial role influencing the analgesic outcome, phase-I and -II
metabolism were assessed. Thus, the metabolically relevant CYP3A isozymes were
investigated in vitro in regard to mRNA expression, protein content and activity. Moreover,
serum and brain concentrations of buprenorphine and its metabolites were analyzed in order
to investigate alterations in the metabolism.
Basal pain sensitivity differed considerably between the mouse strains with Balb/cJ mice
being the most and 129S1/SvImJ mice the least sensitive strain. The application of
buprenorphine led to dose and strain dependent analgesic differences. While the analgesic
effect of buprenorphine increased in C57BL/6J and Balb/cJ mice with the higher
administered dose, the analgesic effect remained stable in 129S1/SvImJ mice. Serum and
blood concentrations of buprenorphine and its metabolites were dose and partly strain
dependent (4.0 mg/kg dose group). The metabolic ratio in blood and distribution between
brain and blood showed no dose and only slight strain dependent variations, which did not
correspond with the analgesic effect of buprenorphine. Additionally, no strain dependent
differences for CYP3A activity and protein content could be detected in vitro, whereas at
mRNA expression level slight strain differences were present. However, the mRNA
expression differences of some CYP3A isozymes were not in accordance with activity data.
Thus, administration of buprenorphine for optimal pain management should be adapted to
the respective mouse strain to avoid pain or adverse side effects. However, strain differences
in the analgesic effect of buprenorphine could not be explained by differences in
pharmacokinetics. Hence, differences in pharmacodynamic parameters are more likely and
should be investigated in further studies. In summary, the results of this study should
sensitize the scientific community to optimize pain management in order to contribute to
laboratory animal welfare in life sciences.
VI
Inhaltsverzeichnis
Eidesstattliche Erklärung ........................................................................................................ I
Aus dieser Arbeit hervorgegangene Publikationen ................................................................. II
Zusammenfassung ............................................................................................................... III
Abstract ................................................................................................................................. V
1 Einleitung ........................................................................................................................ 1
1.1 Nozizeption und Schmerz ........................................................................................ 3
1.2 Das Opioidrezeptor System ..................................................................................... 6
1.3 Schmerztestung in der Versuchstierkunde ............................................................... 9
1.3.1 Thermischer Stimulus ..................................................................................... 10
1.3.2 Mechanischer Stimulus ................................................................................... 11
1.3.3 Chemische und elektrische Stimuli ................................................................. 11
1.4 Schmerzmanagement bei der Maus ...................................................................... 12
1.5 Buprenorphin ......................................................................................................... 14
1.5.1 Pharmakokinetik und -dynamik von Buprenorphin und seiner Metaboliten ..... 15
1.6 Stammesunterschiede bei der Spezies Maus ........................................................ 19
1.6.1 Nozizeption und Analgesie ............................................................................. 20
1.6.2 Pharmakokinetik und Pharmakodynamik ........................................................ 21
1.7 Zielstellung ............................................................................................................ 22
2 Material und Methoden ................................................................................................. 24
2.1 Material .................................................................................................................. 24
2.1.1 Tiere ............................................................................................................... 29
2.1.1.1 Ethische Stellungnahme .......................................................................... 29
2.1.1.2 Haltung .................................................................................................... 30
2.1.2 Substanzen .................................................................................................... 30
2.2 Methoden .............................................................................................................. 30
2.2.1 Stammesvergleich analgetische Wirkung von Buprenorphin ........................... 31
2.2.1.1 Incremental Hot Plate .............................................................................. 31
2.2.1.2 Open Field ............................................................................................... 31
2.2.1.3 Habituation .............................................................................................. 32
VII
2.2.1.4 Vorversuch: Buprenorphin Dosis-Wirkungskurve ..................................... 32
2.2.1.5 Hauptversuch: Stammesvergleich zur analgetischen Wirkung von
Buprenorphin............................................................................................................. 33
2.2.1.6 Statistische Planung des Vor- und Hauptversuches ................................ 33
2.2.2 Stammesvergleich zur Veränderung im Phase-I Metabolismus ...................... 34
2.2.2.1 Probenentnahme ..................................................................................... 34
2.2.2.2 Analyse von Buprenorphin und seiner Metaboliten .................................. 35
2.2.2.3 SNP Identifizierung .................................................................................. 35
2.2.2.3.1 Primerdesign ........................................................................................ 36
2.2.2.3.2 DNA-Isolation und Fragmentherstellung mittels PCR ........................... 37
2.2.2.3.3 RFLP und Sanger Sequenzierung ........................................................ 38
2.2.2.4 Aktivitätsanalysen .................................................................................... 39
2.2.2.4.1 MeSH Term Analyse Lebermikrosomenisolation .................................. 39
2.2.2.4.2 Lebermikrosomenisolation .................................................................... 40
2.2.2.4.3 CYP Aktivitäts-Assay ............................................................................ 41
2.2.2.4.4 CPR Aktivitäts-Assay ............................................................................ 42
2.2.2.5 Expressionsmessungen metabolisch relevanter Enzyme ........................ 42
2.2.2.5.1 RNA Isolation und cDNA Synthese ....................................................... 42
2.2.2.5.2 Quantitative real-time PCR und Auswertestrategie ............................... 42
2.2.2.5.3 CYP Proteinbestimmung ...................................................................... 43
2.2.3 Statistische Auswertung der Ergebnisse ......................................................... 43
3 Ergebnisse .................................................................................................................... 45
3.1 Stammesvergleich zur analgetischen Wirkung von Buprenorphin .......................... 45
3.1.1 Buprenorphin Dosis-Wirkungskurve ................................................................ 45
3.1.2 Stammesabhängige Wirksamkeit von Buprenorphin ....................................... 47
3.1.2.1 Wirksamkeit von Buprenorphin in verschiedenen Maus-Inzuchtstämmen 47
3.1.2.2 Stammesabhängiges Schmerzverhalten.................................................. 49
3.1.2.3 Lokomotorische Aktivitätsanalyse ............................................................ 49
3.2 Stammesvergleich zur Veränderung im Phase-I Metabolismus ............................. 52
3.2.1 Metabolisierung von Buprenorphin ................................................................. 52
VIII
3.2.1.1 Buprenorphin Dosis-Wirkungskurve ......................................................... 52
3.2.1.2 Stammesvergleich Buprenorphin ............................................................. 53
3.2.2 SNP Verifizierung in stoffwechselrelevanten Enzymen ................................... 58
3.2.3 Methodenetablierung zur Aktivitäts- und Expressionsanalyse ......................... 60
3.2.3.1 MeSH-Term Analyse zur Lebermikrosomenisolation ............................... 60
3.2.3.2 Lobuläre CYP Aktivitäts- und Expressionsanalyse ................................... 61
3.2.4 Stammesabhängige CYP Aktivitäts- und Expressionsanalyse ........................ 65
4 Diskussion .................................................................................................................... 68
4.1 Stammesabhängiges Schmerzverhalten ................................................................ 68
4.1.1 Basale Schmerzsensitivität ............................................................................. 68
4.1.2 Stammesabhängige Abbruchkriterien ............................................................. 70
4.1.3 Analgetische Wirkung von Buprenorphin ........................................................ 71
4.2 Stammesabhängige Metabolisierung von Buprenorphin ........................................ 74
4.2.1 Stammesspezifische CYP3A Aktivitätsuntersuchungen an Mikrosomen ......... 74
4.2.2 Metabolismus von Buprenorphin in vivo .......................................................... 76
4.3 Pharmakodynamik von Buprenorphin .................................................................... 78
4.3.1 Spinale und supraspinale Wirkung von Buprenorphin ..................................... 79
4.3.2 Phosphorylierungsmuster und Splicing Varianten des MOR ........................... 80
4.3.3 Einfluss endogener Neurotransmitter .............................................................. 80
4.4 Abgeleitete Empfehlungen ..................................................................................... 81
4.4.1 Bewertung von Schmerzen ............................................................................. 81
4.4.2 Verwendung von Buprenorphin ...................................................................... 82
5 Schlussfolgerung und Ausblick ..................................................................................... 85
Literaturverzeichnis .............................................................................................................. 87
Anhang ................................................................................................................................ 98
Abbildungsverzeichnis ....................................................................................................... 136
Tabellenverzeichnis ........................................................................................................... 137
Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................... 138
Danksagung ...................................................................................................................... 140
Einleitung
1
1 Einleitung
In der Versuchstierkunde sollte die Verwendung von Analgetika zur Behandlung von
schmerzhaften Eingriffen während eines Experimentes, beispielsweise bei einem
chirurgischen Eingriff, Induktion einer Inflammation oder Tumorwachstum, der Goldstandard
sein. Diese Forderung spiegelt sich in der im Jahre 2010 in Kraft getretenen Europäischen
Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere
wider. Die Richtlinie greift das sogenannte 3R-Prinzip auf, welches somit in das nationale
Recht aller EU-Mitgliedsstaaten implementiert werden muss (1). Das 3R-Prinzip wurde
erstmals im Jahre 1959 von den britischen Wissenschaftlern William Russel und Rex Burch
in ihrem Buch „The Principles of Humane Experimental Technique“, beschrieben (2). Die 3R
beziehen sich im Kontext der Versuchstierkunde auf die Begriffe Replacement (Vermeidung),
Reduction (Verringerung) und Refinement (Verbesserung), das bedeutet Tierversuche sollen
wenn möglich durch Alternativen ersetzt (Replacement) und die Anzahl der Tiere auf das
notwendige Mindestmaß reduziert werden (Reduction). Des Weiteren sollen die
Bedingungen der Versuchstiere während Zucht, Haltung oder im Versuch verbessert
werden, so dass Schmerzen, Leiden oder Schäden auf das unerlässliche Maß reduziert
werden (Refinement). Auch wenn das übergeordnete Ziel der Richtlinie 2010/63/EU der
vollständige Ersatz von Tierversuchen durch Alternativmethoden ist, so erkennt sie auch an,
dass derzeit noch nicht gänzlich auf Tierversuche verzichtet werden kann, um die
Gesundheit von Mensch und Tier sowie die Umwelt zu schützen. Bis zur Erreichung des
Ziels, sollen Maßnahmen ergriffen werden, um den Versuchstieren einen besseren Schutz
zu gewährleisten. So schreibt Artikel 14 der Richtlinie explizit die Verwendung von
Analgetika zur Schmerzreduktion vor.
Der Einsatz von Analgetika ist nicht nur aus ethischen und rechtlichen Gründen zwingend
erforderlich, sondern trägt auch zu einer verbesserten Qualität von wissenschaftlichen Daten
z.B. deren Reproduzierbarkeit bei. Schmerz ist eine subjektive Wahrnehmung (3) und kann
unterschiedliche physiologische Parameter des Versuchstieres ungewollt und individuell
beeinflussen (4). Beispielsweise wurde gezeigt, dass postoperative Schmerzen nach einer
Laparotomie zu Veränderungen in der Herzfrequenz und zu Herzfrequenzvariabilität in
Mäusen führen (5). Des Weiteren kann sich Schmerz negativ auf die Heilung von Geweben,
beispielsweise von Knochen auswirken (6). Zusätzlich kann unbehandelter Schmerz das
Immunsystem beeinflussen. Page und Kollegen zeigten, dass unbehandelte Schmerzen
nach einem operativen Eingriff zu einer Reduktion der Aktivität der natürlichen Killerzellen
und zu einer erhöhten Metastasenbildung in einem Ratten-Lungenkarzinom-Modell führte (7-
9). Durch die Behandlung von Schmerzen durch Gabe von Buprenorphin konnte das
Wohlbefinden von Mäuse in einem Tumor-Modell verbessert und ein nachhaltiges
Einleitung
2
erwünschtes Tumorwachstum induziert werden (10). Die genaue Beschreibung des
durchgeführten Schmerzmanagements bei einer Veröffentlichung der Versuchsergebnisse
ermöglicht Dritten einzuschätzen, ob unbehandelte Schmerzen oder das eingesetzte
Analgetikum einen möglichen Störfaktor im Experiment darstellen. Dies würde zu einer
besseren Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit der Daten von tierexperimentellen Studien
führen. Obwohl ein Anstieg in der Berichterstattung bzgl. der Verwendung von Analgetika bei
Nagetieren von 10 % (2000/2001) auf 20 % (2005/2006) beobachtet wurde, ist diese bis
heute bzgl. der perioperative Versorgung von Versuchstieren nicht zufriedenstellend (11).
Carbone und Austin veröffentlichten im Jahr 2016 einen Review, indem sie die publizierten
Angaben zur Analgesie und Anästhesie bei Versuchstieren analysierten. Hierfür
untersuchten sie 400 Publikationen (250 Publikationen vor 2011 und 150 zwischen 2014 bis
2015), auf die Vollständigkeit der Angaben. In den Publikationen wurden Thorakotomien,
Kraniotomien, Gonadenektomien, Organtransplantationen, periphere Nervenschädigungen,
spinale Laminektomien und orthopädische Eingriffe an verschiedenen Spezies durchgeführt,
die gemäß versuchstierkundlicher Empfehlungen einer postoperativen Schmerzbehandlung
bedürfen. 70 % der Publikationen beschrieben lediglich die Anästhesie und ggf. die
intraoperative Analgesie, aber erwähnten keine postoperative Analgesie (12). Diese
Tatsache verdeutlicht, dass die Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler vermehrt dafür
sensibilisiert werden sollten, Analgetika zur Schmerzreduktion bei Versuchstieren zu
verwenden und deren Einsatz bei der Publikation der Ergebnisse zu beschreiben.
Da die Spezies Maus laut aktuellen nationalen und internationalen Tierversuchsstatistiken
mit 1.959.169 (in Deutschland) und 6.999.312 (in Europa) verwendeten Individuen die am
häufigsten verwendete Tierart ist, würde eine hohe Anzahl an Versuchstieren von einer
effektiven Schmerzbehandlung profitieren (13, 14).
Einleitung
3
1.1 Nozizeption und Schmerz
Nozizeption und Schmerz sind zwei verschiedene Mechanismen, die klar voneinander
abgegrenzt werden sollten (Abbildung 1.1). Schmerz ist ein Produkt komplexerer
Verarbeitungsprozesse in höheren Hirnregionen, wohingegen Nozizeption auch ohne die
Wahrnehmung von Schmerz auftreten kann (15). Die „International Association for the study
of pain“ (IASP) definiert Schmerz wie folgt: “Schmerz ist eine unangenehme sensorische und
emotionale Erfahrung verbunden mit tatsächlicher oder potentieller Schädigung eines
Gewebes und ist immer subjektiv“ (3).
Die Modulierung und Entstehung der Schmerzwahrnehmung ist noch nicht vollständig
aufgeklärt. Es wird angenommen, dass unterschiedliche Gehirnregionen an der Verarbeitung
von Schmerz beteiligt sind (15). Dahingegen bezieht sich die Nozizeption auf das periphere
und zentrale Nervensystem (ZNS), welches über die Aktivierung von Nozizeptoren interne
oder externe Umwelteinflüsse registriert und weiterleitet. Insgesamt sind drei verschiedene
Gruppen von Nozizeptoren bekannt: Aβ-, Aδ- und C-Faser Nozizeptoren. Die Nozizeptoren
sind prinzipiell in allen Strukturen des Körpers lokalisiert, die an der Nozizeption beteiligt
sind, einschließlich der Haut, Muskeln und Viszera (innere Organe) (16). Die myelinisierten
und schnell leitenden Aβ-Fasern sind primär an der Weiterleitung von nicht schmerzhaften
Reizen der Haut, Muskeln oder Gelenke beteiligt. Dahingegen kann die Weiterleitung von
äußeren Reizen über Aδ- und C-Faser zu einer Schmerzempfindung führen. Die dünn
myelinisierten polymodalen (thermisch, mechanisch, chemisch) Aδ-Fasern sind schnell
leitende mechanosensitive Rezeptoren (primärer Schmerz). Die nicht myelinisierten C-
Fasern hingegen sind langsam leitende polymodale Nozizeptoren (sekundärer Schmerz).
Eine weitere schwer zu identifizierende Gruppe an Nozizeptoren sind die sogenannten
„stillen oder schlafenden“ Nozizeptoren, die nur durch eine Gewebsschädigung aktiviert
werden (17-19). Je nach Qualität des noxischen Reizes werden die jeweiligen Nozizeptoren
Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der anatomischen Bereiche, die an der Nozizeption-
und Schmerzwahrnehmung beteiligt sind
Einleitung
4
angesprochen, die zu verschiedenen Qualitäten von Schmerz, wie beispielsweise
stechendem, dumpfem oder brennendem Schmerz, führen (16, 18).
Schmerzen können nicht nur durch äußere Reize wie Hitze, Kälte, Druck oder chemische
Stimuli wie Capsaicin oder Senföl induziert werden, sondern auch durch endogene
Entzündungsmediatoren wie Serotonin, Acetylcholin, Histamin oder H+- und K+-Ionen, die
infolge einer Gewebsschädigung ausgeschüttet werden (Abbildung 1.2).
Gleichzeitig kommt es bei einer traumatischen oder entzündlichen Gewebsschädigung zur
Bildung von Prostaglandinen, Leukotrienen und Kininen, die zu einer Sensibilisierung und
erhöhten Ansprechbarkeit der Nozizeptoren auf endogene Schmerzmediatoren führen. Die
an der Reizweiterleitung beteiligten Transmitter der Nozizeptoren sind unter anderem
Substanz P, Calcitonin gene-related peptide (CGRP), Somatostatin, vasoaktives intestinales
Abbildung 1.2: Schematische Darstellung der Nozizeption
Noxische Reize werden durch spezifische Nozizeptoren wahrgenommen und über das aufsteigende
Nervensystem (blau) und das dorsale Horn im Rückenmark zum Gehirn weitergeleitet (Darstellung murines
Gehirn). Gewebsschädigungen führen zur Ausschüttung von endogenen Entzündungsmediatoren, die ebenfalls
eine Reizweiterleitung zum Gehirn induzieren. Die Reize werden über den Thalamus zum zerebralen Cortex
weitergeleitet, wo die eigentliche Schmerzwahrnehmung stattfindet. Über das absteigende Nervensystem (rot)
können inhibitorische oder Flexor-Motorneuronen stimuliert werden. Abkürzungen: Nozizeptor (N), Hippocampus
(HC), Substantia nigra (SN), Ventrales Striatum (VS), Histamin (His), Serotonin (5-HT), Acetylcholin (Ach),
Calcitonin gene-related peptide (CGRP). Abbildung wurden unter Verwendung von Science Slide, Microsoft
erstellt.
Einleitung
5
Peptid und Glutamat (16). Molekulare Detektoren der Nozizeptoren sind vor allem
signalgesteuerte Ionenkanäle. Die prominentesten Vertreter sind die transient receptor
potential-Kanäle (TRP) (20). Beispielsweise wird der TRPV1 Kanal durch thermische Reize
aktiviert und ist für Calcium- und Natriumionen, die zu einer Depolarisation und Öffnung
weiterer spannungsabhängiger Natriumkanäle führen, durchlässig. Typischerweise werden
schmerzhafte Reize in Form von Aktionspotenzialen über die peripheren primären afferenten
Neuronen an das dorsale Horn des Rückenmarks und oder dem Nucleus spinalis nervi
trigemini übermittelt. Das neuronale Netzwerk des dorsalen Horns ist nicht nur für die
Reizweiterleitung zum Gehirn zuständig, sondern ist zusätzlich an der Modulierung der
Reizinformationen zu anderen Neuronen des Rückenmarks beteiligt. Je nach
Stimulationsmuster werden Flexor-Motorneuronen oder inhibitorische Neuronen stimuliert.
Dieses System, welches die absteigenden inhibitorischen Prozesse steuert, wird auch als
„diffuse noxious inhibitory controls (DNIC)“ bezeichnet (18, 21, 22). Zusätzlich wird vom
dorsalen Horn oder Nucleus spinalis trigemini der Reiz an den Hirnstamm und über den
Thalamus zum zerebralen Cortex weitergeleitet, wo die eigentliche Schmerzwahrnehmung
prozessiert wird. Die am besten erforschten Bahnen der Schmerzweiterleitung sind die
spinothalamische Bahn (projiziert in den Thalamus), die spinomencephalicus Bahn (projiziert
in das Mittelhirn) und die spinolimbische Bahn (projiziert zum medialen Thalamus) (16). Vom
Thalamus aus bestehen Verbindungen zum limbischen System, welches die Ausschüttung
von unter anderem Serotonin und Dopamin steuert, welche die Hauptakteure des
Belohnungssystems darstellen. Zusätzlich bestehen über die Hypophyse Verbindungen zum
endokrinen System. Bei der Wahrnehmung von Schmerzen wird unter anderem das
endogene Amin β-Endorphin ausgeschüttet, welches Einfluss auf die Schmerzwahrnehmung
nimmt (23). In der Modulierung der Schmerzwahrnehmung im Thalamus und zerebralen
Cortex, beispielsweise durch endogene Substanzen, ist vor allem das Opioidrezeptor
System involviert, welches im Folgenden näher erläutert wird.
Einleitung
6
1.2 Das Opioidrezeptor System
Das endogene Opioid System besteht zum einem aus den vier verschiedene
Opioidrezeptoren: MOR, DOR, KOR und ORL1 und zum anderen aus den endogene
Opioidpeptiden β-Endorphin, Enkephaline und Dynorphine und ist maßgeblich an der
Ausprägung von Schmerzverhalten und Antinozizeption (gegen die Schmerzwahrnehmung
wirkend) beteiligt (24, 25). Die Opioidpeptide und die entsprechenden Rezeptoren sind im
zentralen Nervensystem, in kritischen emotional-verknüpften Gehirnstrukturen sowie in
peripheren Organen, wie Herz, Lunge, Leber, Gastrointestinaltrakt und Reproduktionstrakt,
lokalisiert (26-28). Opioidrezeptoren können prä- und postsynaptisch vorkommen.
Präsynaptisch führen sie zu einer Inhibierung der Neurotransmitterfreisetzung und
postsynaptisch zu einer Abnahme der neuronalen Erregbarkeit (29).
Bislang wurden vier verschiedene Opioidrezeptoren charakterisiert: µ- (MOR), δ- (DOR) und
κ-Opioidrezeptor (KOR) sowie der Opioid receptor like-1 (ORL1) Rezeptor (24). Zusätzlich
gibt es Hinweise in der Literatur, dass weitere Opioidrezeptoren existieren, wie
beispielswiese der ε-, ζ- und der λ-Opioidrezeptor. Jedoch befasst sich die aktuelle
Forschung hauptsächlich mit MOR, DOR, KOR und ORL1 (Tabelle 1.1). Zusätzlich existiert
die Meinung, dass vor allem der ε-Opioidrezeptor möglicherweise ein Subtyp vom MOR oder
KOR ist (24). Jeder Opioidrezeptor ist hinsichtlich seiner Funktion subklassifizier (z.B. MOR1
und MOR2), obwohl bisher nur ein Gen je Opioidrezeptor identifiziert und isoliert wurde (23,
30).
Tabelle 1.1: Übersicht zur Verteilung und wichtigsten Eigenschaften der µ- (MOR), δ- (DOR), κ-
(KOR) und Opioid receptor like-1 (ORL1) Opioidrezeptoren
MOR
DOR
KOR
ORL1
Primäres
Vorkommen
caudate Putamen
Bulbus olfactorius,
caudate Putamen
Hypothalamus,
Nucleus
accumbens
Thalamus
Liganden
Alle klinisch
relevanten Opioide,
Endorphine
Enkephaline
Dynorphine
Nozizeptin/
OrphaninFQ
Primäre
Eigenschaft
Analgesie
Anxiolyse
z.T. spinale
Analgesie
Hemmung der
MOR, DOR und
KOR vermittelte
Analgesie
Vermittelte
Nebenwirkung
Atemdepression,
hohes
Suchtpotenzial
Atemdepression
Suchtpotenzial
Einleitung
7
Der MOR wird in drei funktionelle Subtypen gegliedert, die auf unterschiedliche
Bindungsaffinitäten und -selektivitäten von Agonisten und Antagonisten begründet sind (31).
MOR1 weist eine hohe Sensitivität gegenüber dem Antagonisten Naloxonazin auf,
wohingegen MOR2 Naloxonazin insensitiv ist, welches eine Unterscheidung von MOR1 und
MOR2 Agonisten in vitro und in vivo ermöglicht (30, 32). Der MOR3 Subtyp wurde erst
später identifiziert und zeichnet sich durch eine Opioid-Alkaloid-Selektivität bei gleichzeitiger
Opioidpeptid-Insensitivität aus (33). Die MOR Subtypen sind über das gesamte ZNS
inklusive des Rückenmarks verteilt, wobei die höchste Dichte im caudate Putamen (Teil des
Großhirns) gemessen wurde (24, 34). MOR wird zudem stark im Magen-Darm-Trakt und der
Blase exprimiert (35). Der MOR wird vor allem auf Grund seiner analgetischen Wirkung aktiv
beforscht (23, 30). In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass alle klinisch relevanten
Opioide Agonisten am MOR sind (36). Jedoch wurden zahlreiche weitere Funktionen dem
MOR zugeordnet wie beispielsweise Anxiolyse, Sedierung, Euphorie, Atemdepression,
Miosis, Antidiurese, Obstipation sowie ein großes Suchtpotenzial (23, 29, 37). Vor allem der
MOR1 wurde mit der Vermittlung der analgetischen Wirkung (30, 31), aber auch mit der
Ausbildung einer Abhängigkeits- und Toleranzentwicklung in Verbindung gebracht (37).
Dahingegen scheint die Atemdepression vorrangig durch MOR2 vermittelt zu sein (31).
Der DOR ist vor allem im bulbus olfactorius, Neocortex, caudate Putamen und Nucleus
accumbens (Kernstruktur im unteren Vorderhirn) lokalisiert. Im Thalamus, Hypothalamus und
Hirnstamm kommt er nur vereinzelt vor (24, 38). Die spinal vermittelte Analgesie des DOR
spielt nur eine untergeordnete Rolle (39). Jedoch können DOR Agonisten die Potenz und
Wirksamkeit von MOR Agonisten positiv unterstützen und DOR Antagonisten die
Toleranzausbildung, die gleichzeitig MOR Agonisten sind, reduzieren (23). In Ratten führte
die Stimulation des DOR zu einem antidepressiven Effekt, weshalb dem DOR vor allem eine
anxiolytische Wirkung zugesprochen wird (40). Zusätzlich besitzt der DOR eine
atemdepressive Wirkung (41).
Die Verteilung des KOR ist speziesspezifisch (24). Beispielsweise wurde im Schwein die
höchste Dichte an KOR in der inneren Schicht des zerebralen Cortex, der Substantia nigra
(Kernkomplex im Mittelhirn) und dem Nucleus interpeduncular (Kernkomplex im Mittelhirn)
gefunden. Dahingegen ist der KOR in Maus und Ratte hauptsächlich im Nucleus
accumbens, Claustrum (Teil des Endhirns), dorsaler endopiriformer Nucleus (Teil des
olfaktorischen Cortex), Nucleus interpeduncular und Hypothalamus lokalisiert und nur im
geringen Maße im zerebralen Cortex (24, 38, 42). Ähnlich wie DOR spielt KOR nur eine
untergeordnete Rolle bei der Vermittlung eines analgetischen Effektes (23). Jedoch konnte
für KOR knock-out Mäuse eine erhöhte Schmerzantwort bzgl. peritonealer Injektion von
Essigsäure beobachtet werden (43). Zusätzlich wird der KOR mit der Ausbildung einer
Abhängigkeits- und Toleranzentwicklung in Verbindung gebracht (23).
Einleitung
8
Der ORL1 ist vor allem in schmerzassoziierten Gehirnstrukturen und dem ZNS lokalisiert,
wie das periaquäduktale Grau (Kernkomplex im Mittelhirn), der Thalamus, der
somatosensorischer Cortex, das Rückenmark und das Spinalganglion (Nervenknoten im
Wirbelkanal) (44). Die Stimulation des ORL1 führt zu einer Blockierung des MOR, DOR und
KOR vermittelten antinozizeptiven Effektes (44, 45). Des Weiteren führt die Stimulierung des
ORL1 weder zu einer Belohnung noch zu einem aversiven Effekt (44).
Die Liganden-gesteuerte Aktivierung der Opioidrezeptoren inhibiert post- und vor allem
präsynaptisch direkt Neuronen, die wiederum die Transmission des Schmerzreizes entlang
des Rückenmarks inhibieren, welches für die Analgesie von größter Bedeutung ist (46). Zu
den endogenen Opioidpeptiden zählen die Enkephaline (DOR-selektiv), Endorphine (MOR-
selektiv) und Dynorphine (KOR-selektiv), die strukturell dem Opiumalkaloid Morphin ähneln
(23). Sie sind an einer Vielzahl von biologischen Prozessen als Transmitter involviert und
werden im Gegensatz zu den exogenen Opioiden nach ihrer Synthese sofort von
Aminopeptidasen abgebaut. Hierdurch werden Toleranz und Abhängigkeitsentwicklung
verhindert (47). Die Opioidrezeptoren sind G-Protein gekoppelte Rezeptoren, die sieben
transmembran-Domänen besitzen (Abbildung 1.3).
Nach der Bindung eines spezifischen agonistisch-wirkenden Liganden dissoziieren die Gαi
und Gβγ Untereinheiten und interagieren mit verschiedenen Signalwegen (37, 48). Die
wichtigste intrazelluläre Antwort besteht in der Modulation von Calcium- und Kaliumkanälen
in post- und präsynaptischen Neuronen, welche zu einer Hyperpolarisation sowie Blockade
Abbildung 1.3: Schematische Übersicht möglicher Signalwege von Opioidrezeptoren
1. Bindung eines Agonisten am Opioidrezeptor und Dissoziation der Gαi und Gβγ-Untereinheiten;
2. Gαi interagiert mit Kaliumkanälen und Adenylatcyclase (AC); 3. Gβγ inhibiert Calciumeinstrom
(Ca2+); 4. G-Protein gekoppelte Rezeptorkinase (GRK) vermittelte Phosphorylierung (P) und Arrestin
Rekrutierung; 5. Opioidrezeptor Internalisierung und Wiederherstellung in den aktiven Zustand; 6.
Weitere mögliche Signalwege: MAPK (mitogen-activated protein Kinase); ERK: (extracellular-signal
regulated Kinase); JNK (c-Jun N-terminale Kinasen). Die Abbildung wurde in Anlehnung an Al-Hasani
und Burchas 2011 (37) unter Verwendung von Science Slide, Microsoft erstellt.
Einleitung
9
der Transmitterfreisetzung führt und die neuronale Aktivität inhibiert (48-50). Hierbei
interagiert die Gαi oder Gβγ Untereinheit mit Kaliumkanälen und fördert den Efflux von
Kaliumionen (48, 50). Die Gβγ Untereinheit bindet direkt an Calciumkanälen und inhibiert
den Influx (49). Des Weiteren wird durch die Aktivierung der Opioidrezeptoren die
Adenylatcyclase Aktivität inhibiert und der cAMP-abhängige Calcium Influx prä- und
postsynaptisch reduziert (37). Die Aktivierung von Opioidrezeptoren führt gleichzeitig zu
einer G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinase (GRK) - vermittelten Phosphorylierung am
Carboxyl-Terminus und intrazellulären Loops, welches eine Arrestin2/3-vermittelte
Desensibilisierung und Internalisierung initiiert (37, 51). Die Rezeptorinternalisierung sowie
deren Wiederherstellung in den aktiven Zustand scheinen Liganden-abhängig zu sein (52-
54). Unterschiedliche Liganden führen zu unterschiedlichen Phosphorylierungsmustern an
Serinen, Threoninen oder Tyrosinen der intrazellulären Loops und des C-Terminus (55).
Schulz und Kollegen zeigten, dass Morphin und DAMGO (synthetisches Opioidpeptid) einen
unterschiedlichen Grad der Phosphorylierung am MOR induzieren. DAMGO desensibilisierte
MOR werden sofort dephosphoryliert, wohingegen Morphin desensibilisierte MOR an der
Plasmamembran verweilen und die Phosphorylierung einen persistenten Zustand aufweist
(52). Des Weiteren wurden Unterschiede in der Schnelligkeit der Internalisierung festgestellt.
Für den ORL1 wurde beispielsweise beschrieben, dass dessen Internalisierung deutlich
schneller im Vergleich zu anderen Opioidrezeptoren, verläuft (56).
Die Bildung von Homo- und Heterodimeren zwischen verschiedenen Opioid- und Nicht-
Opioidrezeptoren moduliert die Rezeptorantwort, die durch einen Liganden induziert wird.
Das bedeutet, dass die Wirkung eines endogenen oder exogenen Opioids, das Resultat
eines komplexen Zusammenspiels verschiedener Opioidrezeptoren sein kann (23, 37). Pan
und Kollegen konnten beispielsweise zeigen, dass MOR mit ORL1 Heterodimere ausbilden
kann, welches zu einer gesteigerten Affinität von Liganden des ORL1 führte. Diese
gesteigerte Affinität beschränkte sich jedoch auf Liganden, die schon eine hohe Affinität
gegenüber MOR aufwiesen (57). Gomes und Kollegen wiesen die Existenz von MOR-DOR
Heterodimeren nach und zeigten, dass ein DOR Antagonist die Potenz und Effektivität des
MOR Signals steigert (58).
Trotz fortwährend neuer Erkenntnisse ist der durch das Opioidrezeptor System gesteuerte
exakte Prozess (Signalweiterleitung), d.h. die analgetische Wirkung verschiedener Opioide,
weiterhin nicht ausreichend verstanden und bedarf weiterer Forschung (37).
1.3 Schmerztestung in der Versuchstierkunde
In der Schmerzforschung ist die Unterscheidung zwischen Nozizeption und Schmerz für die
Interpretation von Verhaltenstests an Tieren bedeutend, da sie vorwiegend auf Reflexen,
hervorgerufen durch noxische Stimuli, beruhen. Prinzipiell werden die Schmerztestungen
Einleitung
10
nach Art des eingesetzten noxischen Stimulus in thermische, mechanische, chemische und
elektrische Schmerztestungen unterschieden (59, 60). Abhängig vom Einsatz eines
konstanten oder ansteigenden (inkrementellen) Stimulus wird die Latenzzeit bzw. die
Intensität des Stimulus bis zur ersten Schmerzreaktion detektiert. Zusätzlich zu den
Schmerztestungen die einen akuten definierten Stimulus verwenden sind Schmerzmodelle
etabliert, die durch einen chirurgischen Eingriff oder Applikation von chemischen Substanzen
chronische Schmerzen induzieren. Beispiele hierfür sind neuropathische Schmerzen durch
eine Kompression bestimmter Nerven oder aber Entzündungsschmerz durch Applikation von
Freund-Adjuvans in die Pfote (60). Der Testung chronischer Schmerzen wird in der Regel
eine höhere klinische Relevanz als der Testung akuter Schmerzen zugeschrieben. Allerdings
ist der induzierte Stimulus nicht skalierbar und langanhaltend und geht damit mit einer
deutlich erhöhten Belastung für das Versuchstier einher (59). Auf die Testung von
chronischen Schmerzen wird in der folgenden Übersicht nicht eingegangen.
1.3.1 Thermischer Stimulus
Bei thermischen Schmerzmodellen werden konstante oder inkrementelle Hitze- oder
Kältestimuli angewendet. Die Verwendung von Kältestimuli ist schwierig und wird
vergleichsweise selten angewendet, beispielsweise um neuropathische Schmerzen zu
evaluieren (60).
Wesentlich verbreiteter ist der Einsatz von Hitzestimuli. Der Tail-Flick Assay ist einer der
ältesten nozizeptiven Tests, bei dem der Schwanz der Maus oder Ratte einem thermischen
Reiz z.B. Infrarot-Strahlungsquelle oder temperiertes Wasserbad ausgesetzt wird.
Gemessen wird die Latenzzeit bis zum Reflex des Rückzucks des Schwanzes. Diese
Reaktion wird als spinale Reflexreaktion bewertet und somit der Nozizeption zugeordnet (60,
61). Der Tail-Flick Assay wird vor allem zur Testung von Analgetika eingesetzt und soll hoch
sensitiv gegenüber der Aktivitätstestung von Opioiden sein, jedoch nicht bei partiellen
Opioid-Agonisten (59).
Der Hot Plate Test ist ein weiterer klassischer Test, bei dem die Ratte oder Maus auf eine
Heizplatte mit definierter Temperatur gesetzt wird und die Latenzzeit bis zum Heben und
Schütteln oder Lecken einer der beiden Hinterpfoten gemessen wird. Dieses komplexe
Verhalten, soll supraspinale Strukturen mit einbeziehen und somit nicht nur Nozizeption,
sondern auch Schmerz testen (15, 60, 61). Der Hot Plate Test wird ebenfalls zur Testung
von Analgetika eingesetzt und eignet sich für volle und partielle Opioid-Agonisten (59).
Der Incremental Hot Plate (IHP) Test stellt eine Variation des klassischen Hot Plate Tests
dar. Er bezieht ebenfalls supraspinale Strukturen ein und wird zur Testung von Analgetika
verwendet (Abbildung 1.4). Beim IHP Test wird die Heizplatte von einer definierten nicht
schmerzhaften bis zu einer schmerzhaften Temperatur aufgeheizt. Die Vorteile des IHP Test
Einleitung
11
gegenüber des klassischen Hot Plate Tests sind eine höhere Sensitivität und
Reproduzierbarkeit (62, 63). Hunskaar und Kollegen detektierten mit Hilfe des IHP Test nach
Verabreichung von Paracetamol und Acetylsalicylsäure einen dosisabhängigen Anstieg der
Abbruchtemperatur, welcher mit dem klassischen Hot Plate Test nicht dargestellt werden
konnte (62). Des Weiteren wurden im Gegensatz zum klassischen Hot Plate Test (64-66) bei
Mäusen und Ratten keine Habituationseffekte beobachtet, die sich in einer verkürzten
Reaktionszeit und somit einer niedrigeren Abbruch-Temperatur widerspiegeln (62, 63).
Aufgrund der Vorteile wird der IHP Test zusätzlich zur Differenzierung thermaler Allodynie
(verstärkte Schmerzempfindlichkeit auf eigentlich nicht schmerzhafte Reize) und
Hyperalgesie (gesteigerte Schmerzantwort auf schmerzhaften Reiz) verwendet (60).
1.3.2 Mechanischer Stimulus
Bei der mechanischen Stimulation wird fast ausschließlich der von Frey Test verwendet.
Hierbei werden sogenannte von Frey Filamente (5 cm lange Plastikfilamente, die
Durchmesser variieren) mit einer kalibrierten Kraft gegen die Unterseite der Hinterpfote
gedrückt. Es wird die Schwelle in Gramm bis zum Rückzug der Pfote detektiert, welches
lediglich einen spinalen Reflex darstellt und somit der Nozizeption zugeordnet wird (59).
Jedoch ist nicht auszuschließen, dass auch supraspinale Komponenten beteiligt sind. Dieser
Test wird vorrangig zur Untersuchung von Allodynie (verstärkte Schmerzempfindlichkeit auf
eigentlich nicht schmerzhafte Reize), vor allem bei Patienten und Tieren mit chronischen
Schmerzen, eingesetzt (60).
1.3.3 Chemische und elektrische Stimuli
Die Stimulation mit exogen aufgebrachten chemischen Stimuli spielt eher eine
untergeordnete Rolle in der Versuchstierkunde. Beispiele für chemische Stimuli sind die
Substanzen Capsaicin oder Senföl, die zu einer Stimulation am TRPV1 bzw. TRPA1
Rezeptor führen (67, 68).
Abbildung 1.4: A) Incremental Hot Plate Apparatur und B) Abbruchkriterium
Die Testung wurde durch einen Experimentator beobachtet und zusätzlich durch zwei Kameras frontal
und lateral dokumentiert. Ein definiertes Abbruchkriterium war unter anderem Lecken einer der beiden
Hinterpfoten.
B
A
Einleitung
12
Die elektrische Stimulation ist ein unnatürlicher und unspezifischer Reiz, der nur selten in der
Schmerzforschung eingesetzt wird. In der Regel wird die elektrische Stimulation als
Kontrollparameter für andere Verhaltensexperimente (z.B. Lernmodelle) bestimmt, in denen
Elektrostimuli appliziert werden (60). Der elektrische Reiz induziert hierarchisch angeordnete
Reaktionen, die den Reflex des Vermeidens, die Vokalisation während der Stimulation und
ggf. eine andauernde Vokalisation einbeziehen und somit spinale sowie supraspinale
Strukturen bedient (59).
1.4 Schmerzmanagement bei der Maus
Die Ziele eines optimalen Schmerzmanagements variieren zwischen der totalen
Ausschaltung von Schmerz (beispielsweise während einer Operation) und der Reduktion auf
einen minimalen Schmerz, der vom Tier toleriert wird, ohne dessen Wohlbefinden zu
beeinflussen. Analgesie wird definiert als das Fehlen von Schmerz. Jedoch ist die totale
Schmerzausschaltung in wachen Tieren zum einen nicht realisierbar und zum anderen nicht
erstrebenswert, da der Schmerz eine Schutzfunktion hat, die vor weiteren Verletzungen
schützen soll. Zu den grundsätzlichen Voraussetzungen einer adäquaten Analgesie zählen
folgende Punkte: Eine Sedierung ist nicht gleichbedeutend mit einem analgetischen Effekt
und maskiert unter Umständen die Schmerzäußerungen. Analgetika sollten in der
entsprechenden Dosierung verwendet werden, die effektive Plasma- und
Gewebekonzentrationen hervorrufen. Hierbei sollte der Einsatz einer multimodalen
Analgesie (Verwendung von mehreren Analgetika mit verschiedenen Wirkmechanismen) in
Betracht gezogen werden. Die Überprüfung der Wirksamkeit des Analgetikums ist zwingend
notwendig, um einen (wiederkehrenden) Abfall des analgetischen Effektes zu vermeiden
(15).
Zu den gängigen Analgetika zählen die Klassen der Lokalanästhetika, nichtsteroidale
Antiphlogistika (NSAID) und Opioide (Tabelle 1.2). Lokalanästhetika blockieren
spannungsabhängige Natriumkanäle und sind in ihrer Wirkung lokal und zeitlich stark
begrenzt. Der Einsatz von Lokalanästhetika bei der Spezies Maus ist meist nur auf den
Gebrauch während einer Operation begrenzt. Die NSAID wirken durch Hemmung der
Cyclooxygenase-1 und/ oder -2, wodurch die Synthese von Prostaglandinen und der
hierdurch vermittelte Schmerz gehemmt wird. Opioide wirken wie bereits erläutert an
Opioidrezeptoren (MOR, DOR, KOR, ORL1) im zentralen Nervensystem sowie peripheren
Organen und hemmen dort die Entstehung und Weiterleitung noxischer Stimuli.
Einleitung
13
Tabelle 1.2: Pharmakologische Vorgehensweise in der Schmerztherapie in Abhängigkeit der
prognostizierten Schmerzintensität bei der Maus (modifiziert nach (15, 69))
Schmerzintensität
Analgesie
gering
Monotherapie akzeptabel: NSAID (z.B. Carprofen, Meloxicam,
Metamizol)
moderat
Multimodale Therapie sollte berücksichtigt werden: NSAID und/
oder Opioiden (z.B. Butorphanol, Buprenorphin, Tramadol)
schwer
Multimodale Therapie empfohlen: starke Opioide (z.B.
Buprenorphin, Fentanyl, Tramadol) in Kombination mit NSAID,
Lokalanästhetika
Nicht nur die Auswahl des adäquaten Analgetikums ist herausfordernd, zusätzlich existieren
unterschiedliche Empfehlungen zur Applikationsroute (oral, transdermal, intraperitoneal (i.p.),
subkutan (s.c.), intravenös, intramuskulär), zum Applikationsintervall und zur Dosierung. Die
Empfehlungen zur Dosierung beschränken sich hierbei auf die Spezies Maus und weisen
eine breite Dosierungsspanne auf. Im Fall des häufig verwendeten Opioidanalgetikum
Buprenorphin werden Empfehlungen von 0,006 bis 10 mg/kg Körpergewicht angegeben
(Tabelle 1.3) (69-75).
Tabelle 1.3: Verschiedene Dosierungsempfehlungen für Buprenorphin zur Anwendung bei der
Maus
Dosis
Applikationsart
Applikationsintervall
Literatur
0,01 – 0,05 mg/kg
s.c.
mind. 2h
(73)
0,05 – 0,1 mg/kg
s.c. oder i.p.
8 h
(69)
0,1 mg/kg
s.c.
6-12 h
(70)
2 mg/kg
s.c.
12 h
(71)
2 mg/kg
s.c.
3-5 h
(72)
2,5 mg/kg
i.p.
6-8 h
(71)
Gades und Kollegen empfehlen beispielsweise bei der Maus die Verwendung von 2,0 mg/kg
Buprenorphin zur Behandlung milder Schmerzen über einen Zeitraum von 3 bis 5 Stunden
(72). Dahingegen kamen Matsumiya und Kollegen zu dem Schluss, dass Dosen von 0,01 bis
0,05 mg/kg Buprenorphin ausreichend sind, um postoperative Schmerzen nach einer
Laparotomie bei der Maus zu behandeln (73). Diese stark variierenden Angaben führen zu
Unsicherheiten in deren Umsetzung, da unnötiges Leiden der Tiere durch Unterdosierung,
aber auch unerwünschte Nebenwirkungen durch Überdosierung vermieden werden sollten.
Einleitung
14
1.5 Buprenorphin
Das Opioid Buprenorphin ist das mit am häufigsten verwendete Analgetikum zur Behandlung
von moderaten bis starken postoperativen Schmerzen (11, 69, 70, 73, 76). Es weist ein
breites analgetisches Spektrum auf und bietet die Möglichkeit verschiedene Qualitäten von
Schmerz zu behandeln (76). Die deutsche Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-SOLAS)
berichtet, dass erfahrungsgemäß in 95 % der Fälle Versuchstiere mit Buprenorphin bei
richtiger Dosierung ausreichend analgetisch behandelt werden können (69).
Buprenorphin besitzt eine schnell einsetzende (15 bis 30 Min nach Applikation(45, 76, 77))
und langanhaltende analgestische Wirkung von vier bis zwölf Stunden in Abhängigkeit von
der Dosis (72-75). Die analgetische Wirkung von Buprenorphin ist bedingt durch ein
komplexes pharmakologisches Profil. Buprenorphin ist ein partieller MOR Agonist, ein voller
DOR und KOR Antagonist und ein ORL1 Agonist, mit einer geringen intrinsischen Aktivität
und einer hohen Rezeptor Affinität, einhergehend mit einer langsamen Dissoziation vom
Rezeptor (siehe als Review (78)). Aufgrund seines geringen sucht- und
abhängigkeitserzeugenden Potenzials (MOR Agonist, DOR Antagonist), wird Buprenorphin
vorzugsweise zur Behandlung von z.B. Morphin-abhängigen Suchtpatienten (Suchttherapie)
eingesetzt (siehe als Review (79)). Bei Partialagonisten können sogenannte Ceiling- oder
auch Sättigungseffekte auftreten, die in der Pharmakologie als eine fehlende Zunahme der
Wirkung eines Pharmakons trotz Dosissteigerung beschrieben sind. Buprenorphin weist
einen Ceiling-Effekt bzgl. der respiratorischen Depression auf, welches das Sicherheitsprofil
von Buprenorphin positiv unterstützt (80-82). Jedoch tritt bei höheren Dosierungen von
Buprenorphin ebenfalls ein Ceiling-Effekt bezogen auf den analgetischen Effekt, auf (80, 81,
83, 84). Darüber hinaus wurden in Nager-Modellen sogar glockenförmige Dosis-
Wirkungsbeziehungen detektiert, die bei hohen Dosierungen von Buprenorphin eine
Abnahme des analgetischen Effektes beschreiben (45, 76). Lutfy und Kollegen konnten
zeigen, dass der analgetische Effekt von Buprenorphin MOR vermittelt ist. Zeitgleich wirkt
Buprenorphin agonistisch am ORL1, wodurch der analgetische Effekt von Buprenorphin
reduziert wird (glockenförmige Dosis-Wirkungsbeziehung). Durch Blockierung mit J-113397
(ORL1 Antagonist) oder knock-out des ORL1 wird die glockenförmige Dosis-
Wirkungsbeziehung aufgehoben (45). Die genauen Mechanismen, die das komplexe
pharmakologische Profil bedingen, sind jedoch weitestgehend noch nicht aufgeklärt.
Zusätzliche bekannte Nebenwirkungen des Opioid Analgetikum Buprenorphin sind
Sedierung, reduzierte Futteraufnahme und damit verbundene Gewichtsreduktion, erhöhte
Aktivität (Verschiebungen im Tag/ Nacht Rhythmus), Obstipation, Übelkeit und ein daraus
bei Nagetieren resultierendes Pica-Verhalten (unkontrolliertes Fressverhalten) (85-90).
Einleitung
15
Nicht nur Buprenorphin sondern auch seine Metaboliten sind pharmakologisch aktiv, so dass
zusätzlich die Pharmakokinetik eine entscheidende Rolle auf die analgetische Wirkung von
Buprenorphin hat.
1.5.1 Pharmakokinetik und -dynamik von Buprenorphin und seiner
Metaboliten
Die Pharmakokinetik befasst sich mit den Wirkungen des Organismus auf das Pharmakon.
Hierbei beschreibt das ADME-Modell den Verlauf eines Wirkstoffs im Organismus. Das
Akronym ADME steht für Resorption, Verteilung, Metabolismus und Exkretion. Je nach
Applikationsroute erfolgt zunächst die Resorption des Pharmakons in das Blutplasma und
verteilt sich hierüber im gesamten Körper bis es den spezifischen Wirkungsort (z.B.
Opioidrezeptoren) erreicht. Schon während der Verteilung kann die Metabolisierung und
oder Elimination des Pharmakons einsetzten. Die Metabolisierung findet hauptsächlich in der
Leber statt und im geringen Maße im Darmepithel sowie im Kapillarendothel. An der
Exkretion sind im Wesentlichen Leber, Darm, Niere und z.T. Lunge beteiligt. In der Leber
werden die vorwiegend lipophilen Pharmaka durch Konjugationsreaktionen in eine
wasserlösliche Form gebracht und über den Fäzes und oder Urin ausgeschieden (29).
Die Metabolisierung von Pharmaka erfolgt analog zu endogenen Substraten und wird in zwei
enzymatisch katalysierte Phasen, Phase-I und Phase-II, eingeteilt. Die Phase-I-Reaktion ist
eine Funktionalisierungsreaktion und wird vor allem durch membranständige Cytochrom-
P450 (CYP) Enzyme vermittelt, die im glatten endoplasmatischen Retikulum von
hepatischen Zellen lokalisiert sind. Durch Übertragung eines Sauerstoffmoleküls katalysieren
CYP Enzyme die Oxidation, Hydroxylierung, Desalkylierung, Desaminierung oder
Dehalogenierung von Pharmaka (29). Der Katalysemechanismus ist komplex und noch nicht
vollständig aufgeklärt (Abbildung 1.5)
Einleitung
16
Zu Beginn bindet das Substrat an den oxidierten Eisen-Kofaktor des Eisen-Protoporphyrin ix
(Häm). Anschließend erfolgt eine NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase (CPR)
vermittelte Reduktion des Eisen-Kofaktors, wodurch die Anlagerung eines
Sauerstoffmoleküls an das CYP Enzym ermöglicht wird. Durch erneuten Elektronentransfer
durch die CPR erfolgt die Übertragung des atomaren Sauerstoffs auf das Substrat (91). Die
entstehenden Metaboliten sind z.T. wasserlöslicher und z.T. wirksam. Derzeit sind 102
funktionale murine CYP Enzyme identifiziert, die in 18 Familien eingeteilt werden und eine
sehr breite Substratspezifität aufweisen (92). Pharmaka werden vor allem von den
Subfamilien CYP1A, CYP2C, CYP2D und CYP3A metabolisiert (93). Die Regulation der
Genexpression der CYP Enzyme ist komplex und kann durch Aktivierung vielerlei
Rezeptoren moduliert werden. Prominente Vertreter sind beispielsweise der Aryl-
Hydrocarbon Rezeptor (AHR), Constitutiv androstan Rezeptor (CAR) und der Pregnan-X-
Rezeptor (PXR). AHR ist ein Liganden-aktivierbarer Transkriptionsfaktor, der die Expression
von CYP1A Isozymen reguliert. CAR und PXR sind Transkriptionsfaktoren, die unter
anderem die Expression von CYP3A Isozymen regulieren (94). Des Weiteren unterliegen die
Expression sowie die Aktivität der CYP Enzyme dem zirkadianen Rhythmus. Zhang und
Kollegen zeigten für verschiedene CYP Enzyme, die CPR sowie diverser
Transkriptionsfaktoren zirkadiane Expressionsprofile (95).
Abbildung 1.5: Schematische Übersicht des Katalysemechanismus von CYP Enzymen
Abkürzungen: Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP), reduzierte Form des NADP (NADPH),
Eisen-(II/III)-Ionen (Fe2+/3+), Rest (R), NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase (CPR), Cytochrom-
P450 (CYP). Abbildung wurden unter Verwendung von Science Slide, Microsoft erstellt.
Einleitung
17
Buprenorphin zeichnet sich durch eine hohe Bioverfügbarkeit nach s.c. und intramuskulärer
Applikation aus (77, 96, 97). Die Bioverfügbarkeit nach intravenöse Applikation ist laut
Definition bei 100 %. Nur nach oraler Gabe ist die Bioverfügbarkeit deutlich reduziert, auf
Grund des signifikanten First-Pass Metabolismus in Magen und Leber (98). Zusätzlich
verfügt Buprenorphin über ein großes Verteilungsvolumen, bei gleichzeitiger hoher
Plasmaproteinbindung von 96 % (96, 97, 99-101). Buprenorphin ist nach s.c. Gabe vor allem
im Gehirn, Fettgewebe, Niere und Muskelgewebe zu finden (102, 103).
Im Menschen wird Buprenorphin primär durch eine CYP3A4/5-vermittelte N-Desalkylierung
zu Norbuprenorphin umgesetzt (Abbildung 1.6). Diese Reaktion kann z.T. von CYP2C8/9
unterstützt werden (104, 105).
Norbuprenorphin ist ein voller MOR und DOR sowie ein partieller KOR Agonist und ist damit
ein aktiver Metabolit von Buprenorphin (106). Über die Affinität von Norbuprenorphin zum
ORL1 sind kontroverse Ansichten in der Literatur zu finden (ORL1 Agonist (106), keine
Affinität zum ORL1 (86)). Im Gegensatz zu Buprenorphin verursacht Norbuprenorphin eine
beträchtliche Atemdepression und induziert nur eine geringe analgetische Wirkung (86).
Brown und Kollegen zeigten, dass Norbuprenorphin im Gegensatz zu Buprenorphin ein
Substrat des P-Glykoproteins (ein ABC-Transporter an der luminalen Membran von Gehirn
Kapillarendothelzellen in der Blut-Hirn-Schranke) ist (103, 107, 108), das bedeutet, dass
Norbuprenorphin zu einem großen Teil wieder aus dem Gehirn ausgeschleust wird. Der
Efflux von Norbuprenorphin aus dem Gehirn geht mit einem geringen analgetischen Effekt
einher (107). Zusätzlich fanden Alhaddad und Kollegen heraus, dass die pharmakologische
Abbildung 1.6: Metabolisierung von Buprenorphin
Abkürzungen: Cytochrom-P450 (CYP), UDP-Glukuronosyltransferasen (UGT)
Einleitung
18
Inhibition des P-Glykoproteins zu einer Blockade des Effluxes von Norbuprenorphin führt, die
mit einer verstärkten Buprenorphin-bedingten Atemdepression einher geht (85).
Im Zuge der Phase-II-Reaktion, der Konjugationsreaktion, finden durch Transferasen
katalysierte Glukuronidierungen, Sulfatierungen, Methylierungen, Acetylierungen und
Konjugationen mit Aminosäuren oder Glutathion statt. Die durch UDP-
Glukuronosyltransferase (UGT) vermittelte Glukuronidierung stellt hierbei eine häufige
Phase-II-Reaktion bei lipophilen Pharmaka dar (109). Ähnlich wie die CYP Enzyme unterliegt
auch die Expression der UGT Enzyme dem zirkadianem Rhythmus (95). Buprenorphin sowie
Norbuprenorphin werden beide in einer Phase-II-Reaktion durch UGT glukuronidiert
(Abbildung 1.6) (110). Die Bildung von Buprenorphin-3-Glukuronid wird vor allem durch
UGT1A1 mit Unterstützung von UGT1A3 und UGT2B17 katalysiert. Dahingegen wird die
Bildung von Norbuprenorphin-3-Glukuronid primär durch UGT1A3 unter Unterstützung von
UGT1A1 katalysiert (111). Hierbei wurden häufig gleiche oder höhere
Plasmakonzentrationen der Glukuronide im Vergleich zu Buprenorphin detektiert (112, 113).
In der Regel wird die Phase-II-Reaktion als Inaktivierungsreaktion zur Eliminierung von
Metaboliten angesehen. Jedoch zeigten Brown und Kollegen, dass die Glukuronide von
Buprenorphin und Norbuprenorphin ebenfalls eine biologische Aktivität aufweisen (86).
Buprenorphin-3-Glukuronid weist eine hohe Affinität zum MOR, DOR und ORL1, nicht jedoch
zum KOR auf. Dahingegen ist Norbuprenorphin hoch affin dem KOR und ORL1, nicht jedoch
dem MOR und DOR gegenüber. Buprenorphin-3-Glukuronid zeigt einen geringen
analgetischen Effekt, wohingegen Norbuprenorphin-3-Glukuronid das Tidalvolumen reduziert
und eine Sedierung verursacht (86).
Das Opioid Buprenorphin wird vorrangig über die Galle und nach intensiver
enterohepatischer Zirkulation über den Fäzes ausgeschieden und nur zu 10 – 30 % über den
Urin (97, 102). Die Glukuronide Buprenorphin- und Norbuprenorphin-3-Glukuronid sind vor
allem im Urin und Buprenorphin und Norbuprenorphin im Fäzes zu finden (114, 115).
Einleitung
19
Abbildung 1.7: Häufig verwendete Maus Inzuchtstämme
Von links nach rechts: C57BL/6J, Balb/cJ, 129S1/SvImJ (6 Wochen alte männliche Mäuse).
1.6 Stammesunterschiede bei der Spezies Maus
Die unterschiedlichen Dosierungsempfehlungen für Buprenorphin können nicht nur durch
variierende noxische Stimuli, sondern auch in der Verwendung unterschiedlicher
Mausstämme begründet sein. Generell wird bei der Spezies Maus zwischen Auszucht- und
Inzuchtstämmen unterschieden. Ein Auszuchtstamm ist definiert, als eine geschlossene
Population mit definierter genetischer Heterogenität unter Einhaltung bestimmter
Variationsgrenzen im Verlauf der Generationen (116). Ein Inzuchtstamm ist ein über
mindestens 20 Generationen, durch Bruder-Schwester Verpaarung, gezüchteter Stamm, mit
einem klar definierten genetischen Hintergrund. Nach 20 Generationen wird ein
Inzuchtkoeffizient (d.h. die Wahrscheinlichkeit eines einzelnen Genlokus, in homozygoter
Form vorzuliegen) von 98,63 % und nach 40 Generationen von 99,98 % erreicht (117). Auf
Grund des gut definierten genetischen Hintergrundes, werden Inzuchtstämme vermehrt für
wissenschaftliche Fragestellungen genutzt. Im Jahre 2009 wurde vom Sanger Institut das
„Mouse-Genome“ Projekt initiiert (118). In der Datenbank werden vollständig sequenzierte
Genome einzelner Inzucht-Mausstämme gesammelt und veröffentlicht. Zusätzliche
Funktionen ermöglichen einen einfachen Sequenzvergleich spezifischer Zielgene in
unterschiedlichen Mausstämmen, sodass beispielsweise die Identifizierung von single
nucleotide polymorphism (SNP), Insertionen, Deletionen und Strukturvarianten möglich ist.
Hierdurch wird ermöglicht, genetische Varianten mit einer biologischen oder klinischen
Relevanz in Zusammenhang zu bringen.
Häufig verwendete Inzuchtstämme sind C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ (119)
(Abbildung 1.7). C57BL/6J ist der am weitesten verbreitete Inzuchtstamm, dessen Genom
als erstes sequenziert wurde. Er wird in der Regel als Hintergrundstamm zur Generierung
von kongenen Stämmen verwendet (120). Balb/cJ wird häufig zur Generierung von
Plasmozytomen verwendet, die die Basis der Produktion von monoklonalen Antikörpern
darstellen (121). Historisch gesehen, wurden 129S1/SvImJ Mäuse verwendet, auf Grund
ihrer hohen Inzidenz zur Ausbildung von testikulärer Teratomen. Mittlerweile werden sie
weitaus häufiger zur Produktion gezielter Mutationen verwendet, auf Grund der großen
Verfügbarkeit von verschiedenen embryonalen Stammzelllinien, die von ihnen abgeleitet
wurden (122).
Einleitung
20
1.6.1 Nozizeption und Analgesie
Stammesbedingte Unterschiede sind bei der Maus für die basalen Nozizeption bezogen auf
unterschiedliche Schmerzreize bereits gut charakterisiert (123-129). Beispielsweise
untersuchten Mogil und Kollegen elf Inzuchtstämme hinsichtlich ihrer basalen Nozizeption
mit zwölf verschiedenen Schmerztestungen, die thermische, mechanische und chemische
Stimuli sowie neuropathischen Schmerz beinhaltete (124). Die verschiedenen
Inzuchtstämme wiesen Unterschiede in ihrer basalen Schmerzempfindlichkeit auf, die
zusätzlich von der Qualität des Schmerzreizes abhing (124). Zusätzlich charakterisierte die
Forschungsgruppe die genetische Variabilität der Nozizeption und identifizierte durch
Clusteranalysen fünf verschiedene Typen der Nozizeption und Hypersensitivität: basale
thermale Nozizeption, spontane Antwort auf noxische chemische Stimuli, thermische
Hypersensitivität, mechanische Hypersensitivität und afferente Eingangs-abhängige
Hypersensitivität (124, 130, 131). Jedoch wurden bisher keine konkreten Zielgene
identifiziert. Des Weiteren wurden sogar innerhalb verschiedener Substämme von C57BL/6
Unterschiede in der basalen Nozizeption detektiert (132). Die genauen Mechanismen sind
derzeit noch nicht aufgeklärt.
Stammesbedingte Unterschiede bezogen auf den analgetischen Effekt von Opioiden wurden
für die Spezies Maus bisher nur für Fentanyl, Morphin und Tramadol eindeutig
nachgewiesen (133-136). Der volle MOR Agonist Fentanyl zeigte eine 7-fach höhere Potenz
bei männlichen C57BL/6J Mäusen, verglichen mit dem Inzuchtstamm 129/SvJ, bei gleicher
basaler Schmerzsensitivität ohne Medikation (134). Mogil und Kollegen detektierten
ebenfalls Stammesunterschiede hinsichtlich des analgetischen Effektes des vollen MOR
Agonisten Morphin (135). Im Fall des partiellen MOR Agonisten Buprenorphin, wurden für
die Spezies Ratte stammesbedingte Unterschiede festgestellt (137-139). Für die Spezies
Maus sind nach dem bisherigen Wissensstand kontroverse Daten bzgl. eines
Stammesvergleichs für den analgetischen Effekt von Buprenorphin vorhanden. Carbone und
Kollegen verglichen zwei Maus-Inzuchtstämme Balb/cJ und SWR/J hinsichtlich der
Wirkdauer von Buprenorphin miteinander und konnten zwei Stunden nach Applikation keine
Stammesunterschiede feststellen (74). Dahingegen untersuchten Wright-Williams und
Kollegen die Effektivität von zwei Dosen an Buprenorphin nach einer Vasektomie in
männlichen C57BL/6Crl und C3H/HeNCrl Mäusen. Durch Beurteilung von
schmerzbezogenen Verhaltensweisen schlussfolgerten sie, dass Buprenorphin in
männlichen C57BL/6Crl Mäusen effektiver war (140).
Einleitung
21
1.6.2 Pharmakokinetik und Pharmakodynamik
Unterschiede im analgetischen Effekt von Buprenorphin können in der genetischen
Disposition durch eine unterschiedliche Pharmakokinetik und/ oder Pharmakodynamik
begründet werden. Wie bereits beschrieben, wird Buprenorphin in einer Phase-I-Reaktion zu
Norbuprenoprhin umgesetzt, welches eine weitaus geringere analgetische Wirkung als
Buprenorphin aufweist (86). Der analgetische Effekt hängt daher unter anderem von der
Stoffwechsel-Aktivität der CYP3A Isozyme ab. Stammesunterschiede in der Aktivität von
CYP Enzyme sind bekannt. Lofgren und Kollegen untersuchten die Aktivität von CYP
Enzymen in fünf unterschiedlichen Mausstämmen. Hierfür verwendeten sie dreizehn
verschiedene humanspezifische CYP Substrate, die sie in Lebermikrosomen von männlichen
und weiblichen Tieren testeten. Stammesbedingte Unterschiede konnten für die CYP3A-
vermittelte Testosteron 6β-Hydroxylierung detektiert werden (141). Stammesvergleichende
Studien bzgl. der Stoffwechselaktivität der Phase-II-vermittelnden UGT Enzyme sind nur
vereinzelt vorhanden. Guo und Kollegen untersuchten in zehn Mausstämmen die
Glukuronidierungsrate der UGT1A Isozyme (unter anderem relevant für die Bildung von
Buprenorphin- und Norbuprenorphin-3-Glukuronid) in Lebermikrosomen und konnten hierbei
stammesbedingte Unterschiede feststellen (142). Inwieweit Stammesunterschiede für die
Metabolisierung von Buprenorphin eine Rolle spielt, ist nur wenig bekannt. Für zwei
Mausstämme (Auszuchtstamm Swiss und Inzuchtstamm FvB) wurde bereits gezeigt, dass
sich ihre metabolische Kapazität in der Umsetzung von Buprenorphin zu Norbuprenorphin
statistisch signifikant unterscheidet (143). Die Studie untersuchte zwar den stammes- und
geschlechtsspezifischen Einfluss des P-Glykoproteins auf die Buprenorphin-vermittelte
respiratorische Depression, jedoch nicht die analgetische Wirkung von Buprenorphin oder
Unterschiede innerhalb der CYP3A Isozyme.
Die analgetische Wirkung von Buprenorphin wird vor allem über den MOR vermittelt (45). Xu
und Kollegen untersuchten die Expression unterschiedlicher Splicing-Varianten des MOR in
vier verschiedenen Mausstämmen (144). Sie detektierten stammesabhängige Unterschiede
auf Expressionsebene des MOR Gens in verschiedenen Regionen des Gehirns und zeigten
eine wahrscheinliche Korrelation mit der stammesbedingten Effektivität gegenüber Morphin
auf. Die Gesamtexpression des MOR im Gehirn wies dabei keine stammesspezifischen
Unterschiede auf.
Die bisherigen Erkenntnisse aus der Literatur bzgl. einer stammesabhängigen Nozizeption
und Analgesie bei der Maus verdeutlichen, dass auch im Fall von Buprenorphin eine
stammesabhängige Wirkung wahrscheinlich ist. Aus diesem Grund wurde folgende
Zielstellung entwickelt.
Einleitung
22
1.7 Zielstellung
Die Etablierung einer geeigneten Analgesie ist eine wichtige Refinement-Maßnahme in der
Versuchstierkunde, um Schmerzen, Leiden und Schäden auf das unerlässliche Maß zu
reduzieren. Jedoch wird aus der Literatur deutlich, dass die perioperative
Schmerzbehandlung bisher nicht zufriedenstellend ist (12). Für die Spezies Maus, die mit
70 % das am häufigsten verwendete Versuchstier ist (13, 14), wird das Opioidanalgetikum
Buprenorphin zur Behandlung von moderaten bis schweren postoperativen Schmerzen
empfohlen (11, 69, 70, 73, 76). Extreme Spannbreiten von Dosierungsempfehlungen
(0,006 – 10 mg/kg) führen jedoch zu großen Unstimmigkeiten in der Anwendung (69-75).
Zusätzlich werden wichtige Parameter, wie beispielsweise die Verwendung von
unterschiedlichen Mausstämmen, bisher nicht in den Empfehlungen berücksichtigt.
Folgende Fragestellungen sollten im Rahmen dieser Promotionsarbeit untersucht werden
(Abbildung 1.8):
1. Unterscheidet sich die analgetische Wirkung von Buprenorphin in verschiedenen
Maus-Inzuchtstämmen?
2. Ist dieser mutmaßliche stammesabhängige analgetische Effekt von Buprenorphin, auf
Veränderungen im Phase-I Stoffwechsel zurück zu führen?
Zur Bearbeitung der beiden Fragestellungen wurden männliche C57BL/6J, Balb/cJ und
129S1/SvImJ Mäuse verwendet und folgende Parameter untersucht (Abbildung 1.9):
Fragestellung 1: Stammesvergleich zur analgetischen Wirkung von Buprenorphin
Identifizierung einer geeigneten Buprenorphin-Dosis zum Vergleich dreier Maus-
Inzuchtstämme durch Erstellung einer Dosis-Wirkungskurve für den
Referenzstamm C57BL/6J, unter Verwendung des IHP Tests.
Identifizierung der basalen Schmerzempfindlichkeit sowie der analgetischen
Wirkung von Buprenorphin in zwei Dosen (0,42 mg/kg; 4,0 mg/kg) in C57BL/6J,
Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäusen mittels IHP Test.
Abbildung 1.8: Illustrierung der wissenschaftlichen Fragestellung
Einleitung
23
Fragestellung 2: Stammesvergleich zu Veränderungen im Phase-I Metabolismus
Konzentrationsbestimmung von Buprenorphin und seiner Metaboliten in
Blutserum und Gehirn mittels HPLC-MS/MS Analyse.
Identifizierung und Verifizierung von potentiell relevanten SNP in
stoffwechselrelevanten Enzymen mittels Datenbank-Analyse sowie Restriktions-
Fragmentlängen Polymorphismus–Analyse (RFLP) und Sanger Sequenzierung.
Aktivitätsanalyse von relevanten Enzymen des Phase-I Metabolismus in
Lebermikrosomen durch Verwendung eines Luciferin-basierten Aktivitäts-Assay.
Expressionsmessung von relevanten Enzymen des Phase-I Metabolismus auf
mRNA und Protein Ebene mittels qPCR im SYBR Green Format und ELISA.
Die Ergebnisse sollen zu einer Verbesserung der aktuellen Dosierungsempfehlungen von
Buprenorphin beitragen, indem auf Stammesunterschiede aufmerksam gemacht wird und
diese vorzugsweise in bestehende Empfehlungen berücksichtigt werden.
Abbildung 1.9: Übersicht der Arbeitspakete sowie angestrebtes Ziel
Abkürzungen: Cytochrom-P450 (CYP), Incremental Hot Plate (IHP)
Material und Methoden
24
2 Material und Methoden
2.1 Material
Standardmäßig verwendetes Verbrauchsmaterial und sowie gängige Laborausstattung
werden nicht gesondert aufgelistet.
Tabelle 2.1: Verbrauchsmaterial
Material
Hersteller
1 ml Einwegspritze
Dispomed Witt oHG, Gelnhausen (D)
384-well Fast PCR
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (D)
50 Venofix® Venenpunktionsbesteck 23G, 24G, 25G
Braun, Melsungen (D)
50 ml Einwegspritzen
Braun, Melsungen (D)
Black/White Isoplate-96 Black frame White Well
Perkin Elmer, Rodgau (D)
Einweg Skalpell
Braun, Melsungen (D)
Neoject® Einmal-Kanüle 26Gx1/2”
Dispomed Witt oHG, Gelnhausen (D)
OptiSeal Ultracentrifugationsröhrchen 10 ml
Beckmann Coulter, Krefeld (D)
Tabelle 2.2: Chemikalien/ Biochemikalien und Reagenzien
Name
Hersteller
6x DNA Loading Dye & SDS Solution (6x)
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (D)
Agarose, TopVision
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (D)
Di-Kaliumphosphat-Trihydrat
Roth, Karlsruhe (D)
D-Luciferin Firefly, Potassium salt
Biosynth®, Staad (CHE)
EDTA
Roth, Karlsruhe (D)
Eisessig
Roth, Karlsruhe (D)
Ethanol
Roth, Karlsruhe (D)
GelGreenTM 10000-fach konzentriert in Wasser
Biotium, Fremont (USA)
Helipur selbstreinigendes Desinfektionsmittel
Braun, Melsungen (D)
Kaliumphosphat
Roth, Karlsruhe (D)
ortho-Phosphorsäure 85 %
Merck, Darmstadt (D)
Saccharose
Merck, Darmstadt (D)
TRIS base
Roth, Karlsruhe (D)
β-Mercaptoethanol
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
(D)
Material und Methoden
25
Tabelle 2.3: Puffer und Lösungen
Name
Hersteller
DPBS
PANTM Biotech GmbH, Aidenbach (D)
NaCl 0,9 %, steril
G-Bioscience, St. Louis (USA)
TE Puffer
AmbionTM, Thermo Fisher Scientific,
Schwerte (D)
Puffer
Zusammensetzung
10x TAE Buffer (1 l)
48,4 g Tris base;
11,44 ml Eisessig;
20 ml 0,5M EDTA
Tabelle 2.4: Kommerzielle biologische Kits
Name
Hersteller
AccuPrime Taq DNA Polymerase System
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (D)
Cytochrome P450 Reductase (CPR) Activity kit
BioVision Inc., Milpitas (USA)
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (D)
Mouse Cytochrome P450 3A4 (CAP3A4) ELISA kit
(SED299Mu)
Cloud-Clone Corp., Huston (USA)
NADPH Regeneration System
Promega GmbH, Mannheim (D)
P450-GloTM CYP3A4 Assay (Luciferin-IPA)
Promega GmbH, Mannheim (D)
PierceTM BCA Protein Assay Kit
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (D)
QIAamp® DNA Mini Kit
QIAGEN®, Hilden (D)
QIAquick® PCR Purification Kit
QIAGEN®, Hilden (D)
QuantiFast® SYBR Green PCR Kit
QIAGEN®, Hilden (D)
RNase-free® DNase Set
QIAGEN®, Hilden (D)
RNeasy® Mini Kit
QIAGEN®, Hilden (D)
Material und Methoden
26
Tabelle 2.5: Enzyme
Enzyme
Hersteller
AvrII
New England BioLabs Inc., Frankfurt (D)
BsaHI
New England BioLabs Inc., Frankfurt (D)
BstNI
New England BioLabs Inc., Frankfurt (D)
CviKI-1
New England BioLabs Inc., Frankfurt (D)
DraI
New England BioLabs Inc., Frankfurt (D)
NlaIII
New England BioLabs Inc., Frankfurt (D)
Tabelle 2.6: DNA/ RNA Ladder
Ladder
Hersteller
GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (D)
GeneRuler 50bp DNA Ladder
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (D)
RiboRuler HR RNA Ladder
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (D)
Tabelle 2.7: Kommerzielle Primer
Kommerzielle Primer
Hersteller
Mm_Actb_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp3a11_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp3a13_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp3a16_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp3a25_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp3a41a_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp3a44_va.1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp3a57_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp3a59_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Nr1i2_1_SG (PXR) QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Nr1i3_1_SG (CAR) QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Por_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Rn18s_3_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Material und Methoden
27
Tabelle 2.8: Designte Primer zur SNP Validierung mittels RFLP oder Sanger Sequenzierung
Gen
SNP-ID
Methode
Orientierung
Sequenz (5‘ zu 3‘)
Cyp3a16
rs33543287
RFLP
FORWARD
CTTGGGTACATGCCCGTGAT
REVERSE
ACATGTAGGCTGTGTGCCAA
Cyp3a16
rs33166435
Sanger
FORWARD
GCAATCAGGAAAACACACAATGCC
REVERSE
GCCATAAAGCAGATCAAGCCAG
FORWARD
GAGGACCACTGGACATTGA
REVERSE
GGAAGGAGCCCAGTTGTT
Cyp3a44
rs239851337
Sanger
FORWARD
TGCCATTGAGCCTACTGACC
REVERSE
TACTGCCTGTACATTTGTAGACTCC
FORWARD
ACCATTGCAAGTGACCAAAT
REVERSE
TCTGGATGTGTCATTTGCTG
Cyp3a44
rs583385430
RFLP
FORWARD
CCTTTACTGCTCACTGAATGACAA
REVERSE
GAGGGAGCCCAGTTGTTGAT
Cyp3a57
rs29684215
RFLP
FORWARD
AAAGATGTGAAGCTGTGCCAGA
REVERSE
AAGCTAAATGTGGAATTTCGGGTC
Cyp3a59
rs29510048
Sanger
FORWARD
AAGACCCAGACAATTAACAGTGAT
REVERSE
CCAGTCATGAGACAATGAGTTGC
Cyp3a59
rs49207862
RFLP
FORWARD
AGAAAGGGGAGCCCATCAAC
REVERSE
GTTAGAGGAGGATAGAAGGGATGGA
Cyp3a59
rs36827986
Sanger
FORWARD
TTTTGAGTCCAACACTGTAGGGAA
REVERSE
GCATCTACCATGAAGCCCTTGG
FORWARD
TGGGTTTAGGGCTTGAATTG
REVERSE
TGTTTTGAAGCAAGGCGT
Cyp3a59
rs38952718
RFLP
FORWARD
CCGGGAAATCCACTGTCACTC
REVERSE
ATCATGACCAGCCAGACTGTG
Cyp3a59
rs51611659
RFLP
FORWARD
TCCATCAATTGAGTTAGACCT
REVERSE
ATCTCTTTACAGCATGGAAC
Cyp3a59
rs33429092
Sanger
FORWARD
GCCAGACAAGTATTTCCCTACA
REVERSE
CACTCCCCATTAACTCCGGT
FORWARD
AAGGATTCAGCTACAAGTCC
REVERSE
ACAGCAATAGAAAAGAGCCA
Cyp3a59
rs33260411
RFLP
FORWARD
TTTCCCTACATGAGAAGTCTCCCAG
REVERSE
TGTGCACAATCACTCCCCATT
Material und Methoden
28
Tabelle 2.9: Geräte
Gerät
Hersteller
Geldokumentation, Fusion Solo S
Vilber Lourmat, Eberhardzell (D)
GloMax VeritasTM Microplate Luminometer
Promega GmbH, Mannheim (D)
Incremental Hot Cold Plate Analgesia Meter
IITC Inc. Life Science, Woodland Hills (USA)
Kamera Axis M1125; Objektiv 3-10.5 mm
Axis Communications, Ismaning (D)
Kamera: DFK 33GR0134, Objektiv: AU-
VT02812N (F1.4, 2.8-12mm)
The Imaging Source, Bremen (D) , VIDO.AT,
Wien (AUT)
Mastercycler® nexus gradient
Eppendorf, Hamburg (D)
Mikroplattenlesegerät
Tecan Reader GENios, Männedorf (CHE)
Mithras LB940
Berthold Technologies, Wien (AUT)
Multifuge X1R
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (D)
Mikrovolumen-Spektralphotometer,
Nanodrop
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (D)
Oberflächenfühler (88105K-IEC)
Omega Engineering GmbH, Deckenpfronn (D)
Optima LE-80K Ultracentrifuge (NVT 65
Rotor)
Beckmann Coulter, Krefeld (D)
pH Meter 765
Knick, Berlin (DE)
Präzisionswaage L420P
Sartorius AG, Göttingen (DE)
Quant Studio7 Cycler
Thermo Fisher Scientific, Schwerte (DE)
Thermometer (HH802U)
Omega Engineering GmbH, Deckenpfronn (DE)
Tabelle 2.10: Software
Software
Hersteller
GraphPad Prism6.0
GraphPad Software, San Diego (USA)
ImageJ
Wayne Rasband (public domain)
Mediarecorder
Biobserve GmbH,Bonn (D)
MEGA7
Kumar, Stecher und Tamura (public domain)
NEBCutter2.0
New England BioLabs Inc (public domain)
R software Version3.4.0
Prozess und Statistik (public domain)
ScienceSlides Add-Ins
Microsoft, Redmond (USA)
Spectator
Biobserve GmbH,Bonn (D)
Viewer IV
Biobserve GmbH,Bonn (D)
Material und Methoden
29
2.1.1 Tiere
Anhand der Literatur wurden die drei Maus-Inzuchtstämme C57BL/6J, Balb/cJ und
129S1/SvImJ, auf Grund ihrer Häufigkeit der Verwendung (119) und der nicht engen
Verwandtschaft hinsichtlich ihrer Genealogie (145), für die folgenden Untersuchungen
ausgewählt.
2.1.1.1 Ethische Stellungnahme
Die Haltungsbedingungen der Versuchstiere, die angewendete Tötungsmethode sowie das
Studiendesign wurden von der zuständigen Genehmigungsbehörde in Berlin, Landesamt für
Gesundheit und Soziales, begutachtet und genehmigt (T 0205/2014, T 0252/2015,
G 0309/15, G 0194/16) und sind konform mit dem Deutschen Tierschutzgesetz und der
Tierschutzversuchstierverordnung. Die einzelnen verwendeten Mausgruppen sind zur
besseren Verständlichkeit in Tabelle 2.11 aufgeführt.
Tabelle 2.11: Übersicht der verwendeten Mausgruppen zugeordnet zum jeweiligen Versuch
Versuch
Stamm
Anzahl
Substanz
Test
Proben
Buprenorphin
Dosisfindung (G 0309/15)
C57BL/6J
23
Buprenorphin
(0,05, 0,25,
0,5, 1,0, 2,0,
4,0 mg/kg),
Fentanyl
(0,3 mg/kg)
Habituation
, OF, IHP
Blut,
Gesamtleber,
Gehirn
Stammesvergleich
Buprenorphin (G 0194/16)
C57BL/6J,
Balb/cJ,
129S1/SvImJ
15 je
Stamm
Buprenorphin
(0,42,
4,0 mg/kg)
Habituation
, OF, IHP
Blut,
Gesamtleber,
Gehirn,
Schwanzspitze
Methodenetablierung
Lebermikrosomenisolation
T 0205/2014
C57BL/6J
10
/
/
Leberlappen
Stammvergleich naiver
Tiere bzgl. CYP3A
Aktivität und Expression
T 0252/2015
C57BL/6J,
Balb/cJ,
129S1/SvImJ
8 je
Stamm
/
/
Gesamtleber,
Gehirn
Abkürzungen: Open Field (OF), Incremental Hot Plate (IHP)
Material und Methoden
30
2.1.1.2 Haltung
Männliche C57BL/6J Mäuse wurden von Charles River (Sulzfeld, D, züchtet den Original
Jackson Stamm aus den USA) und männliche Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäuse von
Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA, Import durch Charles River) nach dem Absetzen
bezogen. Die Mäuse waren, bezogen auf die gelisteten viralen, bakteriellen und parasitären
Pathogene, der „Federation of European Laboratory Animal Science Association“ (FELASA)
ohne Befund. Die Mäuse wurden in Gruppen von 5 bis 8 Tieren in Eurostandard Typ III
Polycarbonat Käfigen (Tecniplast, Hohenpeissenberg, D) mit Filtertop gehalten. Diese waren
mit autoklaviertem Einstreu (LASbeddingTMPG2, LASvendi, Soest, D) und Nistmaterial,
einem Maushaus aus Pappe und einem Nageholz ausgestattet. Die Tiere hatten
unbegrenzten Zugang zu autoklaviertem Futterpellets (LASQCdietTM Rod16, LASvendi,
Soest, D) und Wasser. Dieses war mit Salzsäure angesäuert (pH-Wert = 3), um das
Wachstum von pathogenen Keimen zu verhindern. Die Raumtemperatur betrug 21 ± 1 °C,
mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 ± 10 %. Der Tag/Nacht Rhythmus wurde durch
artifizielles Licht im 12/12 h Rhythmus simuliert, mit Licht von 5:00 bis 17:00 während der
Winterzeit und 6:00 bis 18:00 während der Sommerzeit.
2.1.2 Substanzen
Die verwendeten Analgetika wurden mit steriler 0,9 % Natriumchlorid Lösung entsprechend
verdünnt. Folgende Konzentrationen wurden verwendet: 0,05, 0,25, 0,42, 0,5, 1,0, 2,0 und
4,0 mg/kg Buprenorphin (Charge: H012, H007) und 0,3mg/kg Fentanyl (Charge 5010). Das
Injektionsvolumen betrug 13,5 ml/kg Körpergewicht und wurde s.c. in die Nackenfalte
injiziert. Als Kontrolle diente 0,9 % Natriumchlorid Lösung. Applikationsvolumen und –art
waren analog zu den applizierten Testsubstanzen.
Tabelle 2.12: Verwendete Analgetika
Analgetikum
Hersteller
Buprenovet® 0,3 mg/ml
Bayer Animal Health Care, Leverkusen (D)
Fentanyl 0,05 mg/ml
Janssen-Cilag GmbH, Neuss (D)
2.2 Methoden
Die Expression und die Aktivität der CYP3A Isozyme, die maßgeblich für die Metabolisierung
von Buprenorphin verantwortlich sind, werden durch den zirkadianen Rhythmus beeinflusst.
Aus diesem Grund fanden sowohl die Verhaltensuntersuchungen als auch die
Probenentnahme von 9:00 bis 11:00 während der Winterzeit und 10:00 bis 12:00 während
der Sommerzeit statt. Zusätzliche Einflussfaktoren sind das Alter und das Geschlecht,
weshalb sich entschieden wurden ausschließlich männliche Mäuse im Alter von sieben bis
acht Wochen zu verwenden (146-149).
Material und Methoden
31
2.2.1 Stammesvergleich analgetische Wirkung von Buprenorphin
2.2.1.1 Incremental Hot Plate
Zur Testung der Schmerzreaktion wurde die Incremental Hot Plate (IHP) verwendet (IITC
Inc. Life Science, Los Angeles, USA, Plattengröße 10 cm x 20 cm umgeben von
durchsichtigen Plexiglas-Wänden, Abbildung 1.4). Da alle in der Literatur beschriebenen
Schmerztestungen artifiziell sind und nicht die reale Situation eines chirurgischen Eingriffs
widerspiegeln, wurde in der vorliegenden Arbeit bewusst nur ein Schmerztest ausgewählt,
dessen definierter Schmerzreiz so wenig belastend wie möglich ist. Hierbei wurde die
Heizplatte linear erwärmt. Gemessen wurde die Temperatur, die eine schmerzhafte Reaktion
bei dem Tier auslöste. In Anlehnung an Carbone und Kollegen (74) wurde als schmerzhafte
Reaktion Heben und Schütteln oder Lecken einer der beiden Hinterpfoten sowie Springen
gewertet. Folgendes Protokoll wurde entsprechend Alshahrani und Kollegen (63) mit leichten
Modifikationen verwendet: 35 °C Starttemperatur, eine Heizrate von 6 °C/ min und 55 °C
Abbruchtemperatur (T2). Zu Beginn wurde die Maus auf die 35 °C warme Heizplatte gesetzt
und eine Minute gewartet, damit sich die Maus auf der Platte orientieren konnte. Der Test
wurde durch Betätigen des entsprechenden Knopfes gestartet. Bei Auftreten einer
Schmerzreaktion wurde der Test manuell über Betätigung der Taste beendet und die
Heizplatte innerhalb von 25 bis 30 Sekunden automatisch auf die Starttemperatur herunter
gekühlt. Wenn keine Schmerzreaktion auftrat, wurde der Test automatisch bei Erreichen der
definierten Abbruchtemperatur (55 °C) beendet. Die Testung wurde frontal und lateral per
Videoaufzeichnung dokumentiert und verblindet ausgewertet, um die Abbruchtemperatur zu
ermitteln. Die analysierten Daten der IHP Testung wurden verwendet, um zum einen die
Temperaturdifferenz ΔT = T1(x) – T0 zu berechnen (T1(x): Abbruchtemperatur nach
Analgetikum Applikation der Dosis x, T0: basale Abbruchtemperatur). Zum anderen wurde
der maximal mögliche Effekt MPE(x) = 100 % x [(T1(x) – T0) / (T2 – T0)] berechnet (T2:
55°C maximale Abbruchtemperatur). Zwischen den Testungen der einzelnen Mäuse wurden
die Platte sowie die Plexiglasbegrenzung mit alkoholfreien Desinfektionstüchern gereinigt.
2.2.1.2 Open Field
Da laut Literatur Buprenorphin eine Steigerung der Lokomotion verursacht (75, 90, 150) und
nicht auszuschließen ist, dass eine gesteigerte Lokomotion einen Einfluss auf den IHP Test
hat, sollte die Lokomotion vor der IHP Testung untersucht werden. Hierfür wurden die Tiere
unmittelbar nach s.c. Injektion von Buprenorphin in eine kreisrunde mit Einstreu gefüllte
Open Field (OF) Arena (grünes Plastik, ø 30 cm, 40 cm Höhe, 109 Lux) gesetzt und bis zur
IHP Testung von oben per Videoaufnahme dokumentiert. Hierbei wurde die zurückgelegte
Strecke (cm) sowie die durchschnittliche Geschwindigkeit (cm/s) mit Hilfe der Software
Viewer, Version IV von Biobserve GmbH, analysiert. Um die Lokomotion während der IHP
Testung abschätzen zu können, wurden die zurückgelegte Strecke sowie die
Material und Methoden
32
durchschnittliche Geschwindigkeit der letzten drei Minuten vor der IHP Testung beurteilt und
diese mit der individuellen basalen Lokomotion ohne Injektion verglichen. Zwischen den
Testungen der einzelnen Mäuse wurde das Einstreu gewechselt sowie die Arena mit
alkoholfreien Desinfektionstüchern gereinigt.
2.2.1.3 Habituation
Um vertrauenswürdige Daten zu erzeugen sowie die Belastung des Versuchstieres während
des eigentlichen Experiments so gering wie möglich zu halten, ist eine Habituation an die
Versuchsapparaturen notwendig. Zwei Wochen nach Akklimatisierung an die
Haltungsbedingungen wurden die männlichen Mäuse in Einzelhaltung überführt. Die
folgenden sechs Tage wurde täglich jede Maus in einer randomisierten Reihenfolge an die
experimentellen Gegebenheiten habituiert. Zunächst erfolgte eine Fixation, um die s.c.
Injektion in die Nackenfalte zu simulieren. Anschließend erfolgte eine dreiminütige
Habituation an die kreisrunde OF Arena, die von oben per Videoaufnahme dokumentiert
wurde. Im Folgenden wurde die Maus auf die warme (35 °C Starttemperatur) Heizplatte der
IHP Apparatur für 4 min gesetzt und ebenfalls frontal und lateral per Videoaufnahme
dokumentiert.
2.2.1.4 Vorversuch: Buprenorphin Dosis-Wirkungskurve
Zur Erstellung der Buprenorphin Dosis-Wirkungskurve wurden männliche C57BL/6J Mäuse
in einer randomisierten Reihenfolge getestet. Im Folgenden wird der Versuchsablauf
exemplarisch für ein Tier beschrieben (Abbildung 2.1 ).
Nach der Habituation erfolgte die einmalige Bestimmung der basalen Schmerzempfindung
(T0) mittels IHP. Zunächst wurde die Maus fixiert, um eine s.c. Injektion zu simulieren.
Anschließend wurde sie für drei Minuten in die kreisrunde Arena gesetzt und die Lokomotion
von oben per Videoaufnahme dokumentiert (Basalwert). Anschließend wurde die
Schmerzreaktion mittels IHP getestet. Ein Tag nach Testung der basalen
Schmerzempfindung wurde die analgetische Wirkung einer definierten Dosis von
Abbildung 2.1: Zeitlicher Ablauf des Tierversuches
Abkürzung: Incremental Hot Plate (IHP)
Material und Methoden
33
Buprenorphin (T1(x)) getestet. Folgende Dosen von Buprenorphin wurden eingesetzt: 0,00;
0,05; 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00 mg/kg mit n = 3 Mäusen pro Dosisgruppe. Nach s.c.
Injektion einer der aufgelisteten Dosen von Buprenorphin wurde die Maus in die kreisrunde
Arena zur Erfassung der Lokomotion gesetzt. 30 Minuten nach s.c. Injektion wurde die
Schmerzempfindung auf der IHP getestet. Zusätzlich zu den Buprenorphin Dosisgruppen
wurden zwei Tiere mit einer Dosis von 0,3 mg/kg Fentanyl behandelt und analog im OF und
IHP getestet. Im Anschluss an die IHP Testung wurde die Maus sofort zur Probenentnahme
getötet, die im Abschnitt 2.2.2.1 beschrieben wird.
2.2.1.5 Hauptversuch: Stammesvergleich zur analgetischen Wirkung von
Buprenorphin
Zur Testung der analgetischen Wirkung von Buprenorphin in verschiedenen Mausstämmen
wurden männliche Mäuse der Inzuchtstämme C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ
verwendet. Die Durchführung des Versuches erfolgte analog zum Vorversuch (2.2.1.4).
Jedoch wurden hier lediglich zwei verschiedene Buprenorphin Dosen s.c. in die Nackenfalte
appliziert: 0,42 mg/kg (n = 10 je Stamm) und 4,00 mg/kg (n = 5 je Stamm), die nach
Auswertung des Vorversuches festgelegt wurden.
2.2.1.6 Statistische Planung des Vor- und Hauptversuches
Zur Berechnung der Versuchstierzahlen, die im Vor- und Hauptversuch verwendet wurden,
wurde ein Simulationsmodell mit Hilfe der Software R (Version 3.3.1) erstellt und berechnet.
Im Vorversuch sollte eine Dosis-Wirkungskurve erstellt werden, um die Effektive Dosis 50 %
(ED50) zu ermitteln. Die Genauigkeit der Abschätzung des ED50 ist abhängig von der
Präzision der gemessenen Dosis-Wirkungskurve, die wiederum von den verwendeten Dosen
und der Tierzahl pro Dosisgruppe abhängt. Der ermittelte ED50 Wert sollte so genau
bestimmt werden, um im Hauptversuch, mit einer Power von 80 % drei verschiedene Maus-
Inzuchtstämme an einer Stelle ihrer Dosis-Wirkungskurve unterscheiden zu können, wenn
sie sich mindestens um den Faktor 1,5 in ihrer Buprenorphin-Effektivität variieren.
Zur Erstellung einer Dosis-Wirkungskurve wurde die applizierte Dosis gegen den
MPE(x) = 100% x [(T1(x) – T0) / (T2 – T0)] aufgetragen. Die Werte für das Simulationsmodell
wurden zum einen definiert mit T2 = 55 °C Abbruchtemperatur und zum anderen aus der
Literatur geschätzt (T0 = 47,5 °C ± 2,5 °C (MW ± SD) (63)). T1 ist abhängig von der
applizierten Dosis x und wurde durch eine loglogistische Funktion modelliert:
)))ln()(ln(exp(1
5.7
01 exb
TT
.
Der Anstieg der loglogistischen Funktion wurde als gleich für alle drei verwendeten Maus-
Inzuchtstämme angenommen und mit b = -2 aus der Literatur geschätzt (151). Der ED50
Wert wurde als e = 0,61 mg/kg Buprenorphin für den Inzuchtstamm C57BL/6J angenommen
Material und Methoden
34
(151) und für Balb/cJ und 129S1/SvImJ wie folgt definiert: e(Balb/cJ) = 2/3*e(C57BL/6J);
e(129S1/SvImJ) = 3/2*e(C57BL/6J), um einen Unterschied, der mindestens um den Faktor
1,5 variiert, detektieren zu können. Die Varianz des normalverteilten Störfaktors ε wurde so
gewählt, dass die Varianz zwischen T1(x) und T0 pro Dosis r² beträgt, mit 0,25, 0,49 und
0,81 als mögliche Werte. Folgende Dosispunkte wurden verwendet: 0,00, 0,05, 0,25, 0,50,
1,00, 2,00 und 4,00 mg/kg. Für jeden Parametersatz wurden 5000 Dosis-Wirkungskurven
simuliert und eine Kurvenanpassung mit der R-Funktion drm durchgeführt, sodass e und b
geschätzt werden konnten. Die Simulation ergab, dass eine Gruppengröße mit n = 3 Tieren
je Dosis verwendet werden sollte (α = 0,05, β = 0,2, r² = 0,81).
Die realen Daten des Vorversuches wurden verwendet (T0 = 48 ± 0,87 °C,
ED50 = 0,42 mg/kg, b = -1,4, r² = 0,89), um das Simulationsmodell zu optimieren und die
Gruppengröße für den Hauptversuch zu berechnen. Die Gruppengröße je Stamm wurde
durch Bootstrap-Analyse und Kruskal-Wallis Testungen mit einer Stichprobengröße von
n = 1000 durchgeführt. Diese Analyse ergab, dass die optimal zu prüfende Dosis 0,42 mg/kg
ist, mit einer Gruppengröße von n =10 Tiere (α = 0,05, β = 0,2). Zusätzlich wurde eine zweite
Dosis (4,0 mg/kg) implementiert, um mögliche Unterschiede in der Effektivität von
Buprenorphin zu ermitteln. Hierfür wurde dasselbe Simulationsmodell verwendet, unter der
Annahme, dass die obere Asymptote um den Faktor 3/2 oder 1/2 verschoben wird. Die
Analyse ergab eine Gruppengröße von n = 5 Tiere pro Stamm (α = 0,05, β = 0,2).
2.2.2 Stammesvergleich zur Veränderung im Phase-I Metabolismus
2.2.2.1 Probenentnahme
Im Alter von 7 bis 8 Wochen wurden die Mäuse durch graduelle Kohlenstoffdioxid (CO2)
Begasung getötet und sofort Blut durch Herzpunktion gewonnen. Anschließend wurde die
Bauchhöhle eröffnet und die Leber mit eiskalter steriler Phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS) über die Portalvene perfundiert. Die perfundierte Leber sowie das Gehirn wurden
entnommen, gewogen und sofort mittels flüssigen Stickstoffs eingefroren und bei -80 °C
gelagert. Das koagulierte Blut wurde für 15 min bei 5.500 relativer Zentrifugalkraft (rcf) und
Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Das gewonnene Serum wurde bei -20 °C gelagert.
Für die Methodenetablierung der Lebermikrosomenisolation wurden die einzelnen
Leberlappen sowie der Processus papillaris (Proc. p.) präpariert und separat eingefroren
(Abbildung 2.2). Für alle weiteren Versuche wurde die gesamte Leber eingefroren.
Zusätzlich zur Entnahme von Blut, Leber und Gehirn, wurde von den Mäusen, die für den
Buprenorphin Stammesvergleich eingesetzt wurden, eine Schwanzspitzenbiopsie für die
SNP Analyse entnommen, mittels flüssigen Stickstoffs eingefroren und bei -80 °C gelagert.
Material und Methoden
35
2.2.2.2 Analyse von Buprenorphin und seiner Metaboliten
Zur Methodenetablierung bzw. -optimierung, wurden vorab Serum und Gehirn von
unbehandelten Tieren an die Firma MVZ Labor Dessau GmbH versendet. Anhand der
Proben des Vorversuches wurde die Funktionalität der Analyse überprüft.
Nach Proteinpräzipitation wurde der Gesamtgehalt an Buprenorphin und seiner Metaboliten
im Serum und Gehirn mittels Flüssigchromatographie gekoppelt an Tandem-
Massenspektrometrie (LC-MS/MS) durch die Firma MVZ Labor Dessau GmbH analysiert
(Nachweisgrenze: 0,1 ng/ml für jeden Analyten). Die Quantifizierung erfolgte über
Buprenorphin und Norbuprenorphin Isotopenstandards mit einer Quantifizierungsgrenze von
0,13 ng/ml für Buprenorphin, 0,16 ng/ml für Norbuprenorphin, 0,15 ng/ml für Buprenorphin-3-
Glucuronid und 0,2 ng/ml für Norbuprenorphin-3-Glucuronid. Die Analyse wurde mit Hilfe der
Proben des Vorversuches etabliert und analog für die Proben des Hauptversuches
durchgeführt.
2.2.2.3 SNP Identifizierung
Das „Welcome Trust Sanger Institute“ hat im Zuge seines „Mouse Genome“ Projektes eine
Datenbank entwickelt, in der mittlerweile die Genome von 36 verschieden Maus-
Inzuchtstämmen vollständig sequenziert vorliegen
(http://www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1505, Datum: 15.12.2015) (118). Mit
Hilfe dieser Datenbank kann gezielt nach SNP, Insertionen, Deletionen oder
Strukturvarianten in ausgewählten Genen und Mausstämmen gesucht werden, die laut
Datenbankbetreibern jedoch bei den eigens verwendeten Tieren verifiziert werden sollten.
Abbildung 2.2: Schematische Darstellung der Leberlappen der Maus und entsprechende
Nassgewichte
Dargestellt sind Lobus sinister lateralis (Lobus s. l.), Lobus medialis (Lobus m.), Lobus dexter lateralis
(Lobus d. l.), Lobus caudatus (Lobus c.) und Processus papillaris (Proc. p.) und die in Rot
gekennzeichneten Schnittlinien. Die Tabelle stellt eine Übersicht der Nassgewichte nach
Leberperfusion als Mittelwert ± Standardabweichung (MW ± SD) dar (n = 10, C57BL/6J, männlich).
Material und Methoden
36
Die Datenbank nutzt den Inzuchtstamm C57BL/6J als Referenzstamm. In der vorliegenden
Arbeit wurde die Datenbank verwendet, um „missense Varianten“ im kodierenden Bereich
aller Cyp3a Gene bei den Maus-Inzuchtstämmen C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ zu
identifizieren. Unter Verwendung der Veröffentlichung RL1505-GRCm38, wurden insgesamt
12 SNP in 5 Cyp3a Genen identifiziert, in denen die drei Maus-Inzuchtstämme einen
Unterschied aufweisen: rs33543287, rs33166435, rs239851337, rs583385430, rs29684215,
rs29510048, rs49207862, rs36827986, rs38952718, rs51611659, rs33429092, rs33260411.
Diese identifizierten SNP sollten in den verwendeten Mäusen, mit Hilfe von RFLP
(Restriktions-Fragmentlängen Polymorphismus) oder Sanger Sequenzierung verifiziert
werden, um sicherzustellen, dass unsere drei Mausstämme keinen genetischen Drift
aufweisen. Hierfür wurden zunächst Primer designt.
2.2.2.3.1 Primerdesign
Die identifizierten SNP wurden anhand ihrer SNP ID in der Datenbank „dbSNP“ von National
Center for Biotechnology Information (NCBI) aufgerufen. Ein Sequenzbereich von etwa 3,3
bis 3,8 Kilobasen um den SNP herum wurde extrahiert im FASTA Format. Mit Hilfe der
Anwendung „PrimerBlast“ von NCBI wurden SNP umspannende Primerpaare designt. Dabei
wurde darauf geachtet, dass keine unspezifischen Nebenprodukte entstehen, dass das
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Produkt genügend groß ist (ca. 1000 Basenpaare (bp))
und der SNP möglichst mittig im PCR-Produkt lokalisiert ist. Anschließend wurde die
Anwendung NEBCutter2.0 genutzt, um ein geeignetes Restriktionsenzym zu identifizieren.
Dieses sollte beim Vorhanden- oder Nichtvorhandensein des SNPs spezifisch schneiden.
Zusätzlich Schnittstellen im Gesamt-PCR-Produkt wurden akzeptiert, solange die
resultierenden Fragmentlängen mittels Gelelektrophorese noch aufzutrennen und der
entsprechenden SNP nachzuweisen war. Insgesamt konnten für 7 SNP spezifische
Restriktionsenzyme identifiziert werden, sodass eine Analyse mittels RFLP möglich war
(Tabelle 2.8). Für die verbleibenden fünf SNP wurden zusätzliche unspezifische Primer auf
das vorhandene PCR-Produkt designt, so dass ein kleineres PCR-Produkt (max. 500 bp) für
eine Sanger Sequenzierung generiert werden konnte.
Material und Methoden
37
2.2.2.3.2 DNA-Isolation und Fragmentherstellung mittels PCR
Die DNA aus den Schwanzspitzenbiopsien, wurde mit dem kommerziell erhältliche Kit
QIAamp DNA Mini Kit von der Firma QIAGEN entsprechend des Herstellerprotokolls isoliert.
Die DNA Konzentration wurde am Spektralphotometer (Nanodrop) bestimmt. Die Proben der
15 Mäuse je Inzuchtstamm wurden jeweils in drei 5-er Gruppen eingeteilt und entsprechend
zu gleichen Teilen gepoolt.
Die DNA Fragmente wurden mittels konventioneller PCR unter Verwendung des AccuPrime
Taq DNA Polymerase System, hergestellt. Das dafür verwendete PCR-Programm ist in
Tabelle 2.13 dargestellt.
Tabelle 2.13: PCR-Programm zur DNA-Fragmentherstellung
Temperatur
Dauer
Zyklenanzahl
Hot Start
94 °C
2 min
Denaturieren
94 °C
30 sec
35
Annealing
Siehe
Tabelle 2.14
30 sec
Verlängern
68 °C
2 min
Auffüllen
68 °C
10 min
Hold
4 °C
unendlich
Hierfür wurden zunächst die Annealing Temperaturen der designten Primerpaare optimiert
sowie verschiedene Reaktionsbedingungen ausgetestet (verschiedene Volumina an
AccuPrimeTM PCR Buffer). Die optimierten Bedingungen sind in Tabelle 2.14 dargestellt.
Zusätzlich ist die final verwendete Zusammensetzung des Reaktionsmix in Tabelle 2.15
aufgelistet. Die PCR-Produkte wurden im Anschluss an die PCR mit dem QIAquick PCR
Purification Kit von QIAGEN aufgereinigt. Zur Herstellung der DNA Fragmente in zwei
aufeinander folgenden PCR mit unterschiedlichen Primerpaaren (Tabelle 2.13), wurde als
DNA Template für die zweite PCR 1 µl des aufgereinigten PCR-Produktes aus der ersten
PCR verwendet. Die DNA Konzentration des PCR-Produktes wurde am Spektralphotometer
(Nanodrop) bestimmt.
Material und Methoden
38
Tabelle 2.14: Optimierte Reaktionsbedingungen der designten Primerpaare
Gen
SNP ID
Primerpaar
Annealing T
[°C]
Produktgröße
[bp]
Reaktionsmix [µl]
Cyp3a16
rs33543287
1
54,6
1216
2,5
Cyp3a16
rs33166435
2
53,4
1445
2,5
3
50,4
340
2,5
Cyp3a44
rs239851337
4
53,4
1285
2,5
5
50,4
393
2,5
Cyp3a44
rs583385430
6
50,8
1108
2,5
Cyp3a57
rs29684215
7
54,6
546
5,0
Cyp3a59
rs29510048
8
52,1
500
2,5
Cyp3a59
rs49207862
9
53,4
1238
2,5
Cyp3a59
rs36827986
10
52,1
1992
3,5
11
50,4
216
2,5
Cyp3a59
rs38952718
12
46,8
309
2,5
Cyp3a59
rs51611659
13
54,7
400
2,5
Cyp3a59
rs33429092
14
53,4
1835
2,5
15
50,4
399
2,5
Cyp3a59
rs33260411
16
54,6
1833
5,0
Tabelle 2.15: Zusammensetzung des PCR Reaktionsmix
Komponenten
50 µl Reaktion
10x AccuPrimeTM PCR Buffer II
Siehe
Tabelle 2.14
Primer Mix (jeweils 10 µM)
2,5 µl
DNA Template
100 ng
AccuPrimeTM Taq DNA Polymerase
1 µl
PCR Wasser
Auffüllen auf 50 µl
2.2.2.3.3 RFLP und Sanger Sequenzierung
Die identifizierten SNPs wurden mittels RFLP oder Sanger Sequenzierung verifiziert (Tabelle
2.8). Tabelle 2.16 zeigt eine Übersicht der verwendeten Restriktionsenzyme (RE) und das
resultierende spezifische Fragmentmuster der eingesetzten DNA Fragmente. DNA
Material und Methoden
39
Fragmente, die eine spezifische Unterscheidung zwischen der Wildtyp-Sequenz (C57BL/6J)
und dem Vorhandensein des SNP zulassen, sind rot markiert. Die Restriktion wurde nach
Herstellerangeben durchgeführt. Anschließend wurden die Proben mittels Gelelektrophorese
aufgetrennt und die DNA Banden durch GelGreen visualisiert und dokumentiert (2 %
Agarosegel, TAE Puffer, 130 V, 120 min, anschließendes Färben mit 3xGelGreen in ddH2O
für 30 min, Entfärben in ddH2O für 10 min).
Tabelle 2.16: Übersicht verwendeter Restriktionsenzyme (RE) und resultierender DNA-
Fragmente
SNP ID
RE
Ref-Sequenz1 [bp]
SNP-Sequenz2 [bp]
Stamm3
rs33543287
BstNI
100, 197, 78, 721, 119
100, 197, 800, 119
129S1/SvImJ
rs583385430
NlaIII
180, 185, 168, 40,
408,126
180, 185, 168, 40, 335,
74, 126
129S1/SvImJ,
Balb/cJ
rs29684215
DraI
546
236, 310
Balb/cJ
rs49207862
CviKI-1
11, 113, 25, 40, 16,14,
56, 741, 222
11, 113, 25, 40, 16,14,
56, 87, 654, 222
Balb/cJ
rs38952718
BsaHI
309
158, 151
Balb/cJ
rs51611659
BstNI
120, 181, 98
120, 280
Balb/cJ
rs33260411
AvrII
1833
1002, 831
Balb/cJ
1DNA-Fragmente bei Referenzsequenz, 2DNA-Fragmente bei SNP-Sequenz, 3SNP enthaltender
Stamm
Abkürzungen: single nucleotide polymorphism (SNP), Identifikationsnummer (ID), Restriktionsenzym
(RE), Referenz (Ref), Basenpaar (bp)
Rot markiert: Fragmentlängen, die Unterscheidung zwischen Ref- und WT-Sequenz ermöglichen
Die SNP rs33166435, rs239851337, rs29510048, rs36827986, rs33429092 wurden mittels
Sanger Sequenzierung verifiziert. Zusätzlich wurden die Ergebnisse der RFLP Analyse der
SNP rs33543287, rs583385430 nochmals mittels Sanger Sequenzierung überprüft. Die
Sequenzierung wurde durch die Firma eurofins Genomics (Ebersberg, D) durchgeführt.
Hierfür wurden voreingestellte Proben (15 µl PCR Produkt (5 ng/µl: 300 – 1000 bp; 10 ng/µl:
1000 – 3000 bp) und 2 µl Primer (10µM)) versendet. Anschließend wurden die
Sequenzdaten mit der Software MEGA7 ausgewertet.
2.2.2.4 Aktivitätsanalysen
2.2.2.4.1 MeSH Term Analyse Lebermikrosomenisolation
Für die Etablierung der Methoden der Lebermikrosomenisolation wurde eine systematische
Recherche in der Literaturdatenbank PubMed des NCBI, unter Verwendung der MeSH-
Terme „liver microsomes“ (38.429 Publikationen), „mouse“ (eingegrenzt auf 5.217
Publikationen) und „cytochrome p450“ (eingegrenzt auf 1.804 Publikationen), durchgeführt.
MeSH-Terme sind Schlagwörter, die den Inhalt von Fachartikeln beschreiben und im Fall von
Material und Methoden
40
PubMed manuell zugeordnet werden. Die Suche wurde auf einen Zeitraum von 2011 bis
2015 beschränkt (Suchbegriff: (((liver microsomes[MeSH Terms]) AND mouse[MeSH
Terms]) AND cytochrome p450[MeSH Terms]) AND ("2011/01/01"[Date - Publication] :
"2015/12/31"[Date - Publication]). Auf Grund der Unsicherheit, bis zu welchem Zeitpunkt
PubMed die MeSH-Terme für eine Publikation vergibt, wurden die Publikationen von 2016
nicht mit berücksichtigt. Die zeitliche Einschränkung reduzierte die Anzahl der Publikationen
auf 168. Diese 168 Publikationen wurden nach Angaben zum verwendeten Lebergewebe für
eine Mikrosomenisolation (Teilstück oder Gesamte Leber) durchsucht (Anhang: Tabelle S1
und ergänzende Literatur PubMed Analyse). 127 der 168 untersuchten Publikationen
verwendeten tatsächlich Maus-Lebermikrosomen. Diese 127 Publikationen wurden unter
folgende Kategorien sortiert: „Leber“ (Autoren erwähnten lediglich das verwendete Gewebe
Leber), „gepoolte Leber“ (Autoren beschreiben ein Zusammenfassen mehrerer Lebern von
unterschiedlichen Tieren) und „Teilstück der Leber“ (Autoren nennen ein Teilstück der Leber
verwendet zu haben). Zusätzlich wurde analysiert, welches Geschlecht und welcher
Hintergrundstamm am häufigsten für eine Mikrosomenisolation verwendet wurden. Auf
Grundlage der Recherche wurde zunächst ein Versuch durchgeführt, bei dem die einzelnen
Leberlappen im Vergleich zur Gesamtleber hinsichtlich der Aktivität und Expression der
CYP3A Isozyme untersucht wurden.
2.2.2.4.2 Lebermikrosomenisolation
Die im folgendem beschriebenen Schritte der Lebermikrosomenisolation wurden bei 4 °C
durchgeführt. Die einzelnen Leberlappen (Methodenetablierung) bzw. die gesamte Leber
(Stammesvergleich) wurden auf Eis aufgetaut, mit einem Skalpell zerkleinert und in einen
8 ml Potter, gefüllt mit 5 ml Homogenisationsmedium (250 mM Saccharose, 1mM EDTA),
überführt. Die zerkleinerte Leber wurde mechanisch durch sieben auf und ab Bewegungen
des Potters homogenisiert. Für die RNA-Isolation wurden 100 µl des Homogenats in 600 µl
RNeasy Lysis Buffer (RLT), versetzt mit β-Mercaptoethanol (β-ME), überführt und bei -80 °C
gelagert. Das verbleibende Homogenat wurde in ein 15 ml Zentrifugations-Röhrchen
überführt und auf 10 ml mit Homogenisationsmedium aufgefüllt. Das Homogenat bzw. der
Überstand wurde zweimal zentrifugiert: 15 min, 12.000 g, 4 °C (Multifuge, Hereaus). Der
Überstand wurde in ein 10 ml Ultrazentrifugations-Röhrchen transferiert und
ultrazentrifugiert: 1 h 10 min, 100.000 g, 4 °C (Beckmann Ultrazentrifuge, NVT65 Rotor). Das
mikrosomale Pellet wurde in 200 bis 250 µl Suspensionsmedium (250 mM Saccharose)
resuspendiert, aliquotiert und bei -80 °C gelagert. Der Gesamtproteingehalt der isolierten
Mikrosomen wurde mit Hilfe des PierceTM BCA Protein Assay Kit bestimmt. Hierfür wurde
eine BSA Standardreihe mit folgenden Konzentrationen verwendet: 25, 125, 250, 500, 700
und 1000 µg/ml.
Material und Methoden
41
2.2.2.4.3 CYP Aktivitäts-Assay
Da mausspezifische CYP3A-Substrate bisher nicht existieren, wurde die CYP3A Aktivität mit
dem kommerziell erhältlichen Luciferin-basierten Assay von Promega analysiert. Dieser
Assay wurde ursprünglich für die Analyse humaner Proben entwickelt. Es wurde jedoch
zusätzlich gezeigt, dass auch die murine CYP Aktivität analysierbar ist (152, 153). Der Assay
wurde nach Herstellerprotokoll durchgeführt. Laut Herstellerangaben besteht eine
Produktbildung erster Ordnung in Bezug auf die angegebene Proteinkonzentration und
Inkubationszeit. Dieses wurde exemplarisch mit einer Probe überprüft und bestätigt. Für jede
Reaktion wurden 3 µg Mikrosomen in einem Volumen von 5 µl verwendet. Die vorherige
Verdünnung erfolgte in Suspensionsmedium. Zur Quantifizierung wurde eine D-Luciferin
Standardkurve, verdünnt in sterilem ddH2O, mit folgenden Konzentrationen verwendet:
0,008, 0,016, 0,08, 0,20, 0,40, 1,00 und 2,00 µM D-Luciferin. Der Assay wurde in einer 96-
Well Platte mit weißen Wells und Schwarzen Rand durchgeführt, um eine gegenseitige
Beeinflussung benachbarter Wells zu minimieren. Die Reaktion wurde durch Hinzugabe des
NADPH Regenerationssystems (Promega GmbH, Mannheim, D) gestartet. Die Reaktionszeit
des CYP3A Assay betrug 10 min bei 37 °C. Die Reaktion wurde durch Hinzugabe des
Luciferin Detektion Reagenz gestoppt und für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur
inkubiert, um das Lumineszenzsignal zu stabilisieren. Die relative Lumineszenz wurde
fünfmal hintereinander in einem Luminometer (GloMax, Promega GmbH, Mannheim, D)
gemessen. Die resultierenden relativen Lumineszenzeinheiten (RLU) der fünf Messungen
wurden gemittelt und in D-Luciferin Konzentrationen durch Interpolation mit der
Standardkurve umgerechnet. Anschließend wurden die D-Luciferin Konzentrationen in CYP
Reaktionsraten umgerechnet und auf den Gesamtgehalt an Protein normalisiert. Da nicht
genau bekannt ist, welche murinen CYP3A Isozyme maßgeblich an der Verstoffwechslung
des produktspezifischen Substrats beteiligt sind, wird im folgendem der Begriff CYP3A
Reaktionsrate verwendet. Um die Spezifität des CYP3A Assay zu testen, wurden zwei von
der U.S. Food and Drug Administration (FDA) als CYP3A-spezifisch empfohlene Inhibitoren
(Ketoconazol und Troleandomycin) in unterschiedlichen Konzentrationen verwendet (1, 1,0,
10, 100 und150 µM Ketoconazol und 1,0 und 10 µM Troleandomycin). Die Inhibitoren
wurden in der entsprechenden Konzentration zum Reaktionsansatz hinzugefügt und für
10 Minuten bei 37 °C vor inkubiert. Im Anschluss wurde die Reaktion durch Hinzugabe von
NADPH gestartet. Die weitere Durchführung erfolgte analog. Die Daten sind im Anhang
dargestellt (Anhang: Abbildung S1).
Für die Methodenentwicklung zur Mikrosomenisolation, wurde die CYP Aktivität in den
einzelnen Leberlappen und dem Proc. p. der Maus analysiert. Um die theoretische CYP
Reaktionsrate der gesamten Leber zu illustrieren, wurde ein gewichteter Mittelwert (WA) aller
Material und Methoden
42
Leberlappen und des Proc. p. berechnet. Dieser basiert auf der individuellen CYP Aktivität
und dem entsprechenden Gewicht des spezifischen Leberlappens.
2.2.2.4.4 CPR Aktivitäts-Assay
Die CPR Aktivität in isolierten Maus-Lebermikrosomen wurde mit einem kommerziell
erhältlichen Kit nach Herstellerangaben analysiert. Hierbei ist die Reduktion eines farblosen
Substrats in ein farbiges Produkt (Absorptionsmaximum 460 nm) an die CPR vermittelte
Oxidation von NADPH gekoppelt. Die Reduktion ist direkt proportional zur CPR Aktivität. Die
Quantifizierung erfolgte in Duplikaten und für jede Reaktion wurden 25 µg Mikrosomen
eingesetzt. Als Positivkontrolle wurden im Kit enthaltende humane CPR Enzyme verwendet.
Die Absorption wurde direkt nach Starten der Reaktion im kinetischen Modus in einem
Messintervall von 1 min für eine Dauer von 30 min bei 25 °C gemessen, um eine Reaktion
Erster Ordnung zu gewährleisten. Zunächst wurde ΔOD460 berechnet mit: ΔOD460=A2-A1 (A1
Probenwert zum Zeitpunkt T1, A2 Probenwert zum Zeitpunkt T2). Die Berechnung der in einer
bestimmten Reaktionszeit (T1 – T2) gebildeten Substratmenge in nmol (B), wurde durch
Interpolation des ΔOD460 Wertes mit der korrespondierenden Glucose-6-Phosphat
Standardkurve erreicht. Die CPR Aktivität wird als 𝐵
∆𝑇×𝑃 =𝑛𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑖𝑛×𝑚𝑔 =𝑚𝑈/𝑚𝑔 dargestellt, mit P
als Gesamtproteingehalt der Probe.
2.2.2.5 Expressionsmessungen metabolisch relevanter Enzyme
2.2.2.5.1 RNA Isolation und cDNA Synthese
Die gelagerten Aliquots, bestehend aus 100 µl Leberhomogenat und 600 µl RLT versetzt mit
β-ME, wurden aufgetaut und auf Raumtemperatur gebracht. Zur RNA Isolation wurde das
kommerziell erhältliche RNeasy® Mini Kit von QIAGEN, mit direktem DNase I Verdau auf der
Säule, nach Herstellerangaben verwendet. Die RNA Konzentration wurde am
Spektralphotometer (Nanodrop) bestimmt. Die Integrität der RNA wurde durch Visualisierung
der ribosomalen Banden 18S und 28S auf einem nativen 1 % Agarose Gel (TAE Puffer,
130 V, 1 h) kontrolliert. 1 µg der Gesamt-RNA wurde in cDNA mittels High-Capacity cDNA
Reverse Transkription Kit, unter Verwendung des Herstellerprotokolls, transkribiert.
2.2.2.5.2 Quantitative real-time PCR und Auswertestrategie
Quantitative real-time PCR (qPCR) Expressionsprofile wurden im SYBR Green Format, unter
Verwendung des QuantiFast SYBR Green PCR Kit und QuantiTect Primer von QIAGEN,
durchgeführt. Dabei wurden folgende Gene analysiert: Cyp3a11, Cyp3a13, Cyp3a16,
Cyp3a25, Cyp3a41, Cyp3a44, Cyp3a57, Cyp3a59, NADPH-Cytocrome-P450-
Oxidoreductase (CPR), Pregnan-X-Rezeptor (PXR), Constitutiv androstan Rezeptor (CAR).
Für jede Reaktion wurden 6 ng cDNA in einem Reaktionsvolumen von 10 µl im 384-Well
Plattenformat eingesetzt. Die Quantifizierung erfolgte in Triplikaten und in Echtzeit mit dem
Material und Methoden
43
Applied Biosystems Quant Studio7 unter folgenden Bedingungen: 95°C für 5 min, (95°C für
10 s, 60°C für 30 sec) x 40 Zyklen. Im Anschluss wurde eine Schmelzkurvenanalyse
durchgeführt. β-Actin, Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (GAPDH) und 18S
ribosomal RNA (Rn18s) wurden als Referenzgene verwendet. Zur Berechnung des ΔCt-
Wertes wurde das arithmetische Mittel der drei Referenzgene gebildet und vom gemittelten
Ct-Wert der jeweiligen Probe subtrahiert. Die errechneten ΔCt-Werte wurden in relative
Genexpressionen transformiert: 2 ^ (- ΔCt)*10^7.
2.2.2.5.3 CYP Proteinbestimmung
Murine CYP3A Isozyme wurden auf Proteinebene mittels kommerziell erhältlichen
mausspezifischen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit, entsprechend der
Herstellerangaben, quantifiziert. Hierbei wurden Mikrosomen in PBS verdünnt und 1 µg in
einem Volumen von 100 µl pro Well hinzugegeben. Der spezifische CYP Proteingehalt
wurde indirekt spektrophotometrisch (450 nm) detektiert und durch Interpolation mit der
Standardkurve quantifiziert. Da zum jetzigen Zeitpunkt nicht für alle murinen CYP3A Isozyme
Antikörper kommerziell erhältlich sind wurde ein Assay ausgewählt, der gegen die humane
CYP3A4 Sequenz gerichtet ist, um konsistent zum ausgewählten CYP3A4 Aktivitäts-Assay
zu sein. Die Reaktivität gegen die Zielspezies Maus wurde durch den Hersteller getestet.
2.2.3 Statistische Auswertung der Ergebnisse
Zur statistischen Auswertung und graphischen Darstellung der erhobenen Ergebnisse wurde
die Software GraphPad Prism, Version 6 verwendet. Alle Daten wurden als nicht
normalverteilt angenommen. Die jeweiligen exakt verwendeten statistischen Testungen
werden im Zusammenhang mit der Ergebnisdarstellung genannt. Daten die hinsichtlich des
Faktors Stamm miteinander verglichen wurden, wurden mittels Kruskal-Wallis Test
(einfaktorielle Varianzanalyse) und anschließendem Dunn’s multiple comparison Test
analysiert. Zum Vergleich einer Dosisgruppe mit dem entsprechenden Basal-Wert innerhalb
eines Stammes wurde ein einseitiger Wilcoxon matched-pairs signed rank Test verwendet,
da es sich hier um abhängige Daten handelt. Der Test wurde auf Einseitigkeit beschränkt, da
die Applikation eines Schmerzmittels nur eine Veränderung in eine Seite zulässt. Zum
Vergleich beider Dosisgruppen innerhalb eines Stammes wurde ein zweiseitiger Mann-
Whitney Test durchgeführt, da es sich um unabhängige Daten handelt. Dieser Test wurde
zweiseitig durchgeführt, da sich die beiden Dosisgruppen theoretisch in beide Richtungen
unterscheiden können. Ab einem P-Wert < 0,05 wurden Unterschiede als statistisch
signifikant bewertet. Um eine Übersichtlichkeit der Abbildungen zu gewährleisten, wurde nur
ein Stern zur Visualisierung der statistischen Signifikanz eingefügt. Die exakten P-Werte
sowie Mittelwerte ± Standardabweichung, bzw. Median mit [5./ 95. Perzentile] sind in Tabelle
S2 bis S36 im Anhang aufgeführt. Da es sich bei GraphPad Prism um eine amerikanische
Software handelt, sind die Dezimalstellen in den Abbildungen durch einen Punkt getrennt.
Material und Methoden
44
Fehlende Messwerte sind im Zusammenhang mit den Ergebnissen kommentiert und werden
hier der Vollständigkeit halber gelistet:
Die Analyse der Videodaten ergab, dass der IHP Test für eine 129S1/SvImJ Maus
aus der 4,00 mg/kg Buprenorphin Dosisgruppe zu früh gestoppt wurde
(Hauptversuch). Aus diesem Grund fehlt für dieses Tier die exakte T1(x).
Fehlende Messwerte in der Analytik von Buprenorphin und seiner Metaboliten sind
durch das nicht Erreichen der Quantifizierungsgrenze bedingt.
Zusätzlich wurde mit der Software R (Version 3.3.1) eine Faktorenanalyse bzgl. der
detektierten Varianz durchgeführt. Unter Verwendung eines linearen Korrelationsmodells
(lmres) wurden nacheinander die Faktoren Stamm, durchschnittliche Geschwindigkeit,
Buprenorphinkonzentration in Serum und Gehirn, metabolische Kapazität von Buprenorphin
zu Norbuprenorphin sowie die Verteilung von Buprenorphin zwischen Gehirn und Blut als
mögliche Erklärung für die vorhandene Varianz der Abbruchtemperaturen bzgl. beider
Dosisgruppen im IHP Test getestet und der Korrelationskoeffizient R² ermittelt. Zusätzlich
wurde R² nach Subtraktion des Stammeffektes für alle aufgezählten Faktoren berechnet. Die
statistische Signifikanz wurde mittels Kruskal-Wallis Test berechnet.
Ergebnisse
45
3 Ergebnisse
1
3.1 Stammesvergleich zur analgetischen Wirkung von
Buprenorphin
3.1.1 Buprenorphin Dosis-Wirkungskurve
Um eine geeignete Buprenorphin-Dosis für den Vergleich von drei Maus-Inzuchtstämmen zu
identifizieren, wurde zunächst eine Dosisfindungsstudie durchgeführt. Zur Durchführung
wurden männliche C57BL/6J Mäuse verwendet.
Die Funktionalität des IHP Testes wurde zusätzlich durch die Modellsubstanz Fentanyl
evaluiert. Fentanyl ist ein voller MOR Agonist, der bei einer ausreichend hohen Dosis zu
einem maximalen Effekt im IHP Test führen sollte. Hierfür wurden zwei männliche C57BL/6J
Mäuse 30 Min nach s.c. Injektion mit 0,3 mg/kg Fentanyl auf der IHP getestet, wobei eine
MPE von 100 % erreicht wurde (Daten nicht gesondert dargestellt). Die Gabe von
Buprenorphin führte zu einem dosisabhängigen analgetischen Effekt mit einer halbmaximal
effektiven Dosis (ED50) von 0,42 mg/kg (Kruskal-Wallis Test: p = 0,01) (Abbildung 3.1).
Die maximale Wirksamkeit wurde im IHP Test mit einem durchschnittlichen maximal
möglichen Effekt (MPE) von 38,71 % erreicht. Dabei wies die Dosis-Wirkungskurve eine
Steigung von 1,4 auf. Als durchschnittliche basale Schmerzempfindlichkeit wurden
1
Ergebnisse, die in diesem Abschnitt gezeigt werden, sind zum Teil adaptiert worden aus Rudeck et
al. (2018). Die Verwendung von ähnlichen Abbildungen und wörtlichen Passagen wird nicht zusätzlich
als Selbstzitation kenntlich gemacht (siehe Abschnitt: Aus dieser Arbeit hervorgegangene
Publikationen).
Abbildung 3.1: Buprenorphin Dosis-Wirkungskurve
Effekt von Buprenorphin in männlichen C57BL/6J Mäusen auf dem IHP Test 30 min nach s.c.
Applikation (MW ± SD, n = 3 je Dosisgruppe, P-Wert < 0,05: *vs. Vehikel Kontrolle, Kruskal-Wallis
Test mit Dunn’s multiple comparison Test). Die Dosiswirkungskurve wurde mit einem 4-
parametrischen loglogistischen Modell erstellt (exakte Werte im Anhang: Tabelle S2, S3).
Ergebnisse
46
48 ± 0,87 °C (MW ± SD) ermittelt. Hierbei zeigte sich eine hohe Korrelation von 0,89
zwischen der basalen Schmerztemperatur T0 und der Schmerztemperatur T1 nach Gabe
einer definierten Dosis x. Die ermittelten Daten wurden verwendet, um das im Methodenteil
beschriebene Simulationsmodell (2.2.1.6) zu optimieren und die Dosis zu evaluieren, bei der
die Durchführung eines Stammesvergleichs am sinnvollsten ist. Hierbei wurde eine Dosis
von 0,42 mg/kg berechnet.
Zur Evaluation des Einflusses einer potentiellen Lokomotionssteigerung durch Applikation
von Buprenorphin wurde die durchschnittliche Geschwindigkeit drei Minuten vor IHP Testung
ermittelt. Die durchschnittliche Geschwindigkeit scheint durch die Gabe von Buprenorphin
dosisabhängig gesteigert worden zu sein (Abbildung 3.2). Jedoch wurden keine eindeutigen
statistisch signifikanten Unterschiede ermittelt (Kruskal-Wallis Test: p = 0,576; basale
Lokomotion ohne Injektion ausgeschlossen).
Abbildung 3.2: Dosisabhängige Geschwindigkeit 30 min nach Gabe von Buprenorphin
Dargestellt ist die durchschnittliche (ø) zurückgelegte Strecke [cm], der letzten drei Minuten vor der
IHP Testung, 27 bis 30 min nach s.c. Applikation von Buprenorphin (MW ± SD, Basal: n = 15; Vehikel
(VH)-Gruppe und Dosisgruppen: n = 3; männliche C57BL/6J, Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s multiple
comparison Test vs. VH; basal Gruppe ausgeschlossen) (exakte Werte im Anhang: Tabelle S2, S3).
Ergebniszusammenfassung: Dosisfindung Buprenorphin
Buprenorphin war analgetisch wirksam im IHP Test.
Eine Buprenorphin Dosis-Wirkungskurve konnte für den Stamm C57BL/6J
ermittelt werden.
Als optimale Dosis für den Stammesvergleich wurden 0,42 mg/kg Buprenorphin
berechnet.
Buprenorphin scheint zu einer Steigerung der Lokomotion zu führen.
Ergebnisse
47
3.1.2 Stammesabhängige Wirksamkeit von Buprenorphin
Die Wirksamkeit von Buprenorphin wurde in den drei häufig verwendeten Maus-
Inzuchtstämmen C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ untersucht. Auf Grundlage der
Ergebnisse des Vorversuches wurde die als optimal berechnete Dosis von 0,42 mg/kg
Buprenorphin verwendet. Der Stamm C57BL/6J wies bei der Dosisfindungsstudie nur eine
maximale Wirksamkeit von 38,71 % auf. Um zu evaluieren, ob bei Balb/cJ und 129S1/SvImJ
Mäusen eine abweichende maximale Wirksamkeit auftritt, wurde zusätzlich die Dosis von
4,0 mg/kg Buprenorphin untersucht.
3.1.2.1 Wirksamkeit von Buprenorphin in verschiedenen Maus-Inzuchtstämmen
Die drei verwendeten Maus Inzuchtstämme zeigten deutliche Unterschiede in ihrer basalen
Schmerzsensitivität im IHP Test (Kruskal-Wallis Test: p < 0,0001; Abbildung 3.3). Hierbei
war der Inzuchtstamm Balb/cJ, mit einer Abbruchtemperatur von 44,42 °C [40,5/ 46,4 °C]
(Median [5./ 95. Perzentile]) am sensitivsten und der Inzuchtstamm 129S1/SvImJ mit einer
Abbruchtemperatur von 50,65 °C [48,0/ 52,68 °C] (Median [5./ 95. Perzentile]) am wenigsten
sensitiv. Für den Inzuchtstamm C57BL/6J wurde eine Abbruchtemperatur von 48,39 °C
[47,0/ 49,34 °C] (Median [5./ 95. Perzentile]) ermittelt.
Die Gabe von Buprenorphin führte zu einer Steigerung der Abbruchtemperatur im Vergleich
zur basalen Abbruchtemperatur bei allen Inzuchtstämmen, ausgenommen bei 129S1/SvImJ
Mäuse nach s.c. Injektion von 4,0 mg/kg Buprenorphin (Wilcoxon matched-pairs signed rank
Test (Basal vs. 0,42 mg/kg, Basal vs. 4,0 mg/kg): C57BL/6J: p = 0,001, p = 0,0313; Balb/cJ:
p = 0,001, p = 0,313; 129S1/SvImJ: p = 0,001, p = 0,0625) (Abbildung 3.4 A). Eine
dosisabhängige Verringerung der Schmerzsensitivität wurde bei den Inzuchtstämmen
C57BL/6J und Balb/cJ ermittelt, welches sich in einer Erhöhung der Abbruchtemperatur
Abbildung 3.3: Basale Schmerzsensitivität
Basale Abbruchtemperatur männlicher C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäuse, unter
Verwendung des IHP Test (n = 15 pro Stamm; Kruskal-Wallis Test mit Dunn‘s multiple comparison
Test; P-Wert < 0,05: * vs. C57BL/6J; # 129S1/SvImJ vs. Balb/cJ). Die Daten sind als Box Plots mit
Median [5./ 95. Perzentile] dargestellt (exakte Werte im Anhang: Tabelle S4 – S5).
Ergebnisse
48
widerspiegelte (Mann-Whitney Test (0,42 mg/kg vs. 4,0 mg/kg): C57BL/6J: p = 0,0193,
Balb/cJ: p = 0,0007). Jedoch führte eine Erhöhung der verabreichten Dosis von
Buprenorphin zu keiner Steigerung in der analgetischen Wirkung bei 129S1/SvImJ Mäusen
(Mann-Whitney Test (0,42 mg/kg vs. 4,0 mg/kg): p = 0,1059). Zusätzlich zur
Dosisabhängigkeit wies Buprenorphin eine stammesabhängige Wirksamkeit auf (Kruskal-
Wallis Test: 0,42 mg/kg: p < 0,0001; 4,0 mg/kg: p = 0,0003) (Abbildung 3.4 B). Die
Verabreichung von 0,42 mg/kg Buprenorphin führte zu einer Erhöhung der
Abbruchtemperatur um 1,35 °C [1,1/ 1,81 °C] (Median [5./ 95. Perzentile]) in C57BL/6J,
4,05 °C [2,9/ 5,5 °C] in Balb/cJ und 2,87 °C [1,8/ 5,12 °C] in 129S1/SvImJ. Die Applikation
von 4,0 mg/kg Buprenorphin führte zu einer zweifach höheren Abbruchtemperatur mit
2,69 °C [2,21/ 3,3 °C] (Median [5./ 95. Perzentile]) in C57BL/6J und zu einer 2,4-fachen
höheren Abbruchtemperatur mit 9,68 °C [6,27/ 10,62 °C] in Balb/cJ Mäusen (Mann-Whitney
Test (0,42 mg/kg vs. 4,0 mg/kg): beide Stämme p = 0,0007). Der Stamm 129S1/SvImJ wies
nur eine Erhöhung der Abbruchtemperatur von 1,85 °C [1,42/ 3,12 °C]
(Median [5./ 95. Perzentile]) auf (Mann-Whitney Test (0,42 mg/kg vs. 4,0 mg/kg):
p = 0,1059).
Durch eine Korrelationsanalyse konnte untermauert werden, dass die beobachteten
Unterschiede in der Schmerzwahrnehmung auf den Stamm zurück zu führen sind bzgl.
beider Dosisgruppen (0,42 mg/kg: R² = 0,67, p = 3,2 x 10-7; 4,0 mg/kg: R2 = 0,85,
p = 2,76 x 10-5).
Abbildung 3.4: Dosis- und stammesabhängige Wirksamkeit von Buprenorphin
A) Abbruchtemperatur der basalen Schmerzsensitivität sowie 30 min nach s.c. Applikation von
Buprenorphin unter Verwendung des IHP Test (einseitiger Wilcoxon matched-pairs signed rank Test;
P-Wert < 0,05: * vs. individuelle basale Sensitivität). B) Temperaturdifferenz der Schmerzsensitivität
30 min nach Gabe von Buprenorphin und der basalen Schmerzsensitivität (Kruskal-Wallis Test mit
Dunn’s multiple comparison; P-Wert < 0,05: * vs. C57BL/6J; # 129S1/SvImJ vs. Balb/cJ). Die Daten
sind als Box Plots mit Median und [5./ 95. Perzentile] dargestellt (basal: n = 15, 0,42 mg/kg: n = 10;
4,0 mg/kg: n = 5 ausgenommen 129S1/SvImJ mit n = 4) (exakte Werte im Anhang: Tabelle S4 - S6).
A)
B)
Ergebnisse
49
3.1.2.2 Stammesabhängiges Schmerzverhalten
Als Abbruchkriterien wurden das Schütteln und/ oder Lecken einer der beiden Hinterpfoten
sowie Springen definiert. Hierbei war auffällig, dass der Inzuchtstamm 129S1/SvImJ bei der
Erfassung der basalen Schmerztemperatur fast ausschließlich das Schütteln einer der
beiden Hinterpfoten zeigte (Abbildung 3.5 A). Dahingegen wiesen die Hälfte der
verwendeten Mäuse des Stammes C57BL/6J das Lecken einer der beiden Hinterpfoten als
Abbruchkriterium auf (Abbildung 3.5 A). Mäuse des Inzuchtstammes Balb/cJ zeigten vor
allem ein Schütteln der Hinterpfote, welches oft mit einem nachfolgenden Lecken der
entsprechenden Hinterpfote einherging. Nach Gabe von Buprenorphin zeigten fast alle
Mäuse der verwendeten Stämme, als erstes Abbruchkriterium das Schütteln einer der
beiden Hinterpfoten an. Vor allem männliche C57BL/6J Mäuse, die mit 4,0 mg/kg
Buprenorphin behandelt wurden zeigten jedoch weiterhin ein Lecken der Hinterpfote als
Abbruchkriterium an (Abbildung 3.5 B, C). Weder bei der Evaluation der basalen
Schmerzsensitivität noch nach Gabe von Buprenorphin wurde der IHP Test durch Springen
der Maus abgebrochen.
3.1.2.3 Lokomotorische Aktivitätsanalyse
Basal und ohne vorherige Injektion zeigten die drei Inzuchtstämme keine statistisch
signifikanten Unterschiede in ihrer Lokomotion (Kruskal-Wallis Test: p = 0,05). Die
Applikation von Buprenorphin führte zu einer Steigerung der durchschnittlichen
Geschwindigkeit in allen drei Inzuchtstämmen, wobei der Grad der Steigerung vom
Abbildung 3.5: Häufigkeit der definierten Abbruchkriterien im IHP Test
Dargestellt ist die Häufigkeit der ersten sich darstellenden definierten Abbruchkriterien bei den
verwendeten Maus-Inzuchtstämmen im IHP Test, basal oder nach 30-minütiger s.c. Applikation von
Buprenorphin.
A)
B)
C)
Ergebnisse
50
jeweiligen Stamm abhing (Wilcoxon matched-pairs signed rank Test (Basal vs. 0,42 mg/kg,
Basal vs. 4,0 mg/kg): C57BL/6J: p = 0,001, p = 0,0313; Balb/cJ: p = 0,001, p = 0,0313;
129S1/SvImJ: p = 0,001, p = 0,0625) (Abbildung 3.6, Anhang: Tabelle S4 – S6). Hierbei
konnte beim Inzuchtstamm 129S1/SvImJ eine signifikant verminderte Lokomotion, verglichen
mit den Stämmen C57BL/6J und Balb/cJ, in beiden Dosisgruppen detektiert werden
(Kruskal-Wallis Test: 0,42 mg/kg: p = 0,0043; 4,0 mg/kg: p = 0,0113).
Die Ergebnisse der lokomotorischen Aktivitätsanalyse erklären jedoch nicht die vorhandenen
Unterschiede in der Schmerzwahrnehmung (0,42 mg/kg: R2 = 0,01, p = 0,61; 4,0 mg/kg:
R2 = 0,3, p = 0,04). Auch die Subtraktion des ermittelten Stammeffektes führte zu keiner
Korrelation der Parameter Temperaturdifferenz und durchschnittliche Geschwindigkeit
(0,42 mg/kg: R2 = 0,008, p = 0,62; 4,0 mg/kg: R2 = 0,01, p = 0,73).
Abbildung 3.6: Aktivitätssteigerung durch Applikation von Buprenorphin
Dargestellt ist die durchschnittliche (ø) Geschwindigkeit [cm/s] in den letzten drei Minuten vor der
IHP Testung, 27 bis 30 min nach s.c. Applikation von Buprenorphin (Box Plot mit Median und
[5./ 95. Perzentile]; Basal: n = 15; 0,42: n = 10; 4,0: n = 5; einseitiger Wilcoxon matched-pairs signed
rank Test: *p < 0,05 vs. basal) (exakte Werte im Anhang: Tabelle S4 – S6).
Ergebnisse
51
Ergebniszusammenfassung:
Stammesabhängige Wirksamkeit von Buprenorphin
C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ wiesen unterschiedliche basale
Schmerzempfindlichkeiten auf.
Buprenorphin zeigte in allen verwendeten Inzuchtstämmen eine analgestische
Wirksamkeit im IHP Test.
Der analgetische Effekt von Buprenorphin konnte in den Stämmen C57BL/6J und
Balb/cJ dosisabhängig gesteigert werden.
Eine Erhöhung der Buprenorphindosis führte beim Stamm 129S1/SvImJ zu
keinem gesteigerten analgetischen Effekt.
Buprenorphin steigerte die Lokomotion stammesabhängig, jedoch unabhängig von
der analgetischen Wirkung.
Ergebnisse
52
3.2 Stammesvergleich zur Veränderung im Phase-I Metabolismus
3.2.1 Metabolisierung von Buprenorphin
3.2.1.1 Buprenorphin Dosis-Wirkungskurve
Die Konzentration von Buprenorphin und seiner Metaboliten wurde in Serum und Gehirn der
im Vorversuch verwendeten Mäuse untersucht (Abbildung 3.7). Hierbei stiegen die
Konzentrationen im Serum sowie im Gehirn dosisabhängig an. Im Serum waren vor allem
Buprenorphin und dessen glukuronidierte Form Buprenorphin-3-Glukuronid vorhanden,
deren Konzentrationen vergleichbar waren, außer nach Applikation von 0,5 mg/kg
Buprenorphin (Abbildung 3.7 A). Im Gehirn konnten nur Buprenorphin sowie
Norbuprenorphin quantifiziert werden (Abbildung 3.7 B). Hierbei waren die
Buprenorphinkonzentrationen im Gehirn um das 25- bis 85-fache höher als die von
Norbuprenorphin.
Abbildung 3.7: Konzentration von Buprenorphin und seiner Metaboliten in Serum und Gehirn
Analytik von Buprenorphin und seiner Metaboliten 30 min nach s.c. Applikation in A) Serum und B)
Gehirn (MW ± SD, n = 3, männliche C57BL/6J Mäuse; Datenpunkte unterhalb der
Quantifizierungsgrenze sind nicht dargestellt).
Auf Grund der geringen Tierzahl und z.T. fehlender Messwerte wurde keine Statistik durchgeführt
(exakte Werte im Anhang: Tabelle S2, S7).
A)
B)
Ergebnisse
53
Abbildung 3.8: Dosis- und stammesabhängige Serumkonzentration von Buprenorphin und
seiner Metaboliten
Serumkonzentrationen wurden in männlichen C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäusen 30 min
nach s.c. Applikation von Buprenorphin mittels LC-MS/MS analysiert und sind als Box Plots mit Median
und [5./ 95. Perzentile] dargestellt (0,42 mg/kg: n = 10, 4,0 mg/kg: n = 5, Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s
multiple comparison; P-Wert < 0,05: * vs. C57BL/6J, # 129S1/SvImJ vs. Balb/cJ). Messwerte unterhalb
der Quantifizierungsgrenze sind nicht dargestellt. Cave: Unterschiedliche Skalierung zur besseren
Visualisierung (exakte Werte im Anhang: Tabelle S4 – S6).
A)
B)
C)
D)
3.2.1.2 Stammesvergleich Buprenorphin
Die Serumkonzentration von Buprenorphin und seiner Metaboliten stieg dosisabhängig in
allen drei Stämmen an (Abbildung 3.8, Mann-Whitney Test pro Stamm pro Stamm
0,42 mg/kg vs. 4,0 mg/kg siehe Anhang: Tabelle S6). Stammesabhängige Unterschiede
zeigten sich nur nach Gabe von 4,0 mg/kg Buprenorphin hinsichtlich der Buprenorphin und
Norburpenorphin-3-Glukuronid Serumkonzentration (Kruskal-Wallis Test: p = 0,0142
Buprenorphin; p = 0,0204 Norbuprenorphin-3-Glukuronid). Dabei wies der Stamm Balb/cJ für
beide Substanzen eine höhere Serumkonzentration auf als die Stämme C57BL/6J und
129S1/SvImJ (Abbildung 3.8 A, D). Jedoch konnte durch die detektierten Unterschiede in
der Buprenorphinkonzentration nicht die vorhandene stammesbedingte
Schmerzwahrnehmung erklärt werden (0,42 mg/kg: R2 = 0,0027, p = 0,78; 4,0 mg/kg:
R2 = 0,38, p = 0,02). Auch die Subtraktion des Stammeffektes führt zu keiner Korrelation der
beiden Parameter (0,42 mg/kg: R2 = 0,07, p = 0,15; 4,0 mg/kg: R2 = 0,03, p = 0,58).
Ergebnisse
54
Das metabolische Verhältnis (MR) von Norbuprenorphin zu Buprenorphin und Buprenorphin-
3-Glukuronid zu Buprenorphin zeigte weder dosis- noch stammesabhängige Unterschiede
(Abbildung 3.9 A, B, Mann-Whitney Test pro Stamm pro Stamm 0,42 mg/kg vs. 4,0 mg/kg
siehe Anhang: Tabelle S5, S6). Dahingegen war das metabolische Verhältnis von
Norbuprenorphin-3-Glukuronid zu Norbuprenorphin stammes- (Kruskal-Wallis Test:
0,42 mg/kg: p = 0,0004; 4,0 mg/kg: p = 0,001), jedoch nicht dosisabhängig. Der Stamm
129S1/SvImJ zeigte ein statistisch signifikant geringeres MR als der Stamm Balb/cJ
(Abbildung 3.9 C). Jedoch wurde keine Korrelation zwischen der MR und der
stammesbedingten Schmerzwahrnehmung weder vor (0,42 mg/kg: R2 = 0,06, p = 0,18;
4,0 mg/kg: R2 = 0,12, p = 0,21) noch nach der Berücksichtigung des Stammeffektes
festgestellt (0,42 mg/kg: R2 = 0,04, p = 0,27; 4,0 mg/kg: R2 = 0,04, p = 0,48).
Abbildung 3.9: Metabolisches Verhältnis (MR) im Serum
Dargestellt ist das logarithmierte MR von A) Norbuprenorphin (NBup) zu Buprenorphin (Bup),
B) Buprenorphin-3-Glukuronid (B3G) zu Bup und C) Norbuprenorphin-3-Glukuronid (N3G) zu NBup
als Box Plots mit Median [5./ 95. Perzentile] (0,42 mg/kg: n = 10; 4,0 mg/kg: n = 5; Kruskal-Wallis Test
mit Dunn’s multiple comparison; P-Wert < 0,05: # 129S1/SvImJ vs. Balb/cJ). Die Konzentrationen
wurden in männlichen C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäusen 30 min nach s.c. Applikation von
Buprenorphin ermittelt. Messwerte unterhalb der Quantifizierungsgrenze sind nicht dargestellt (exakte
Werte im Anhang: Tabelle S4 – S6).
A)
B)
C)
Ergebnisse
55
Vergleichbar zu den Ergebnissen aus der Serumanalytik, wies die Konzentration von
Buprenorphin und seiner Metaboliten eine dosisabhängige Erhöhung im Gehirn auf
(Abbildung 3.10, Mann-Whitney Test pro Stamm pro Stamm 0,42 mg/kg vs. 4,0 mg/kg siehe
Anhang: Tabelle S6). Stammesabhängige Konzentrationsunterschiede bzgl. Buprenorphin
und Norbuprenorphin wurden in beiden Dosisgruppen gemessen. Im Vergleich zu
C57BL/6JMäusen wurde bei 129S1/SvImJ Mäusen eine niedrigere Konzentration von
Buprenorphin und Norbuprenorphin im Gehirn nachgewiesen (Kruskal-Wallis Test:
Buprenorphin: p = 0,0018 (0,42 mg/kg), p = 0,0081 (4,0 mg/kg); Norbuprenorphin: p = 0,0096
(0,42 mg/kg), p = 0,0014 (4,0 mg/kg)) (Abbildung 3.10 A, B).
Dahingegen waren Stammesunterschiede hinsichtlich der entsprechenden Glukuronide nur
in der hohen Dosisgruppe feststellbar. Hierbei wurden im Vergleich zu C57BL/6J Mäusen bei
129S1/SvImJ Mäusen geringere Glukuronidkonzentrationen im Gehirn gemessen (Kruskal-
Wallis Test: Buprenorphin-3-Glukuronid: p = 0,0002; Norbuprenorphin-3-Glukuronid:
p = 0,0001) (Abbildung 3.10 C, D). Weder vor (0,42 mg/kg: R2 = 0,08, p = 0,12; 4,0 mg/kg:
R2 = 0,02, p = 0,65) noch nach der Berücksichtigung des stammesbedingten Effektes
Abbildung 3.10: Dosis- und stammesabhängige Konzentration von Buprenorphin und seiner
Metaboliten im Gehirn
Gehirnkonzentrationen wurden in männlichen C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäusen 30 min
nach s.c. Applikation von Buprenorphin mittels LC-MS/MS analysiert und sind als Box Plots mit Median
und [5./ 95. Perzentile] dargestellt (0,42 mg/kg: n = 10, 4,0 mg/kg: n = 5, Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s
multiple comparison; P-Wert < 0,05: * vs. C57BL/6J, # 129S1/SvImJ vs. Balb/cJ). Messwerte unterhalb
der Quantifizierungsgrenze sind nicht dargestellt. Cave: Unterschiedliche Skalierung zur besseren
Visualisierung (exakte Werte im Anhang: Tabelle S4 – S6).
A)
B)
C)
D)
Ergebnisse
56
(0,42 mg/kg: R2 = 0,01, p = 0,54; 4,0 mg/kg: R2 = 0,09, p = 0,28) konnte ein Zusammenhang
zwischen der Schmerzwahrnehmung und der Buprenorphinkonzentration im Gehirn
nachgewiesen werden, auch nach Subtraktion des detektierten Stammeffektes.
Bezüglich der Verteilung von Buprenorphin und seiner Metaboliten konnte festgestellt
werden, dass Buprenorphin in höheren Konzentrationen im Gehirn vorkommt, während die
Glukuronide vermehrt im Blut nachzuweisen sind (Abbildung 3.11 A, C, D).
Norbuprenorphin zeigte eine gleichmäßige Verteilung zwischen Gehirn und Blut (Abbildung
3.11 B).
Abbildung 3.11: Dosis- und stammesabhängige Verteilung von Buprenorphin und seiner
Metaboliten zwischen Gehirn und Blut
Dargestellt ist das logarithmierte Verteilungsverhältnis zwischen Gehirn und Blut als Box Plot mit
Median und [5./ 95. Perzentile] (0,42 mg/kg: n = 10, 4,0 mg/kg: n = 5, Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s
multiple comparison; P-Wert < 0,05: * vs. C57BL/6J). Die Konzentrationen wurden in männlichen
C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäusen 30 min nach s.c. Applikation von Buprenorphin
ermittelt. Messwerte unterhalb der Quantifizierungsgrenze sind nicht dargestellt (exakte Werte im
Anhang: Tabelle S4 – S6).
A)
B)
C)
D)
Ergebnisse
57
Die Verteilung von Buprenorphin und seiner Metaboliten war nicht dosisabhängig
(Abbildung 3.11, Mann-Whitney Test pro Stamm pro Stamm 0,42 mg/kg vs. 4,0 mg/kg siehe
Anhang: Tabelle S6). Geringe stammesabhängige Unterschiede waren nur bzgl.
Buprenorphin in beiden Dosisgruppen festzustellen (Abbildung 3.11 A). Bezogen auf die
0,42 mg/kg Dosisgruppe wurde beim Inzuchtstamm C57BL/6J ein höherer
Verteilungskoeffizient von Buprenorphin im Gehirn im Vergleich zu den beiden anderen
Stämmen, detektiert (Kruskal-Wallis Test: p = 0,0042). In der 4,0 mg/kg Dosisgruppe war die
Verteilung von Buprenorphin zwischen Gehirn und Blut bei C57BL/6J Mäusen nur gegenüber
129S1/SvImJ Mäusen signifikant erhöht (Kruskal-Wallis Test: p = 0,0012). Die vorhandene
Varianz der Schmerzwahrnehmung aller getesteter Mäuse (Abbildung 3.4 B) kann nicht
durch die Verteilung von Buprenorphin zwischen Gehirn und Blut erklärt werden (0,42 mg/kg:
R2 = 0,13, p = 0,05; 4,0 mg/kg: R2=0,17, p = 0,14). Auch die Subtraktion des Stammeffektes
führt zu keiner verbesserten Korrelation (0,42 mg/kg: R2 = 0,05, p = 0,25; 4,0 mg/kg:
R2 = 0,12, p = 0,22).
Ergebniszusammenfassung: Metabolisierung von Buprenorphin
Buprenorphin und seine Metaboliten konnten dosisabhängig im Blut und Gehirn
nachgewiesen werden.
Die Metabolisierung von Buprenorphin und die Verteilung von Buprenorphin und
seiner Metaboliten zwischen Gehirn und Blut zeigten bei den drei verwendeten
Mausstämmen keine dosisabhängigen und nur teilweise stammesabhängige
Unterschiede.
Ein Zusammenhang zwischen analgetischer Wirksamkeit und der Metabolisierung
von Buprenorphin war nicht festzustellen.
Ergebnisse
58
3.2.2 SNP Verifizierung in stoffwechselrelevanten Enzymen
Wie in der Einleitung ausführlich beschrieben, erfolgt im Menschen der Phase-I
Metabolismus von Buprenorphin über Isozyme der Subfamilie CYP3A. Aus diesem Grund
lag der Fokus der folgenden Untersuchungen auf dieser Enzym-Subfamilie.
Unterschiede im Metabolismus von Substanzen können beispielsweise auf das
Vorhandensein stammspezifischer SNP zurückgeführt werden. Mit Hilfe der „Mouse
Genome“ Datenbank wurden zwölf stammesspezifische SNP in der kodierenden Sequenz
der Cyp3a Isozyme identifiziert. Um den genetischen Status der von uns verwendeten
Mausstämme zu überprüfen, wurden die zwölf identifizierten SNP verifiziert. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 3.1 dargestellt. Als Referenzsequenz verwendet die Datenbank den
Inzuchtstamm C57BL/6J. Dementsprechend ist der jeweilige Stamm bei einem
Nichtvorhandensein eines SNP unter der Spalte „Referenzsequenz“ einsortiert. Konnte der
untersuchte SNP nachgewiesen werden, ist der entsprechende Stamm in der Spalte „SNP
vorhanden“ einsortiert. Die hochgestellte Zahl „1“ weist darauf hin, dass das Ergebnis mit
den Angaben der Datenbank übereinstimmt, wohingegen die hochgestellte Zahl „2“ eine
Abweichung anzeigt.
Tabelle 3.1: Ergebnisse der SNP Verifizierung bei verwendeten C57BL/6J, Balb/cJ und
129S1/SvImJ Mäusen (n = 15 pro Stamm).
SNP ID
Gen
Methode
Referenzsequenz
SNP vorhanden
rs33543287
Cyp3a16
Sanger
C57BL/6J1, Balb/cJ1
129S1/SvImJ1
rs33166435
Cyp3a16
Sanger
C57BL/6J1, 129S1/SvImJ1
Balb/cJ1
rs239851337
Cyp3a44
Sanger
C57BL/6J1, Balb/cJ1
129S1/SvImJ1
rs583385430
Cyp3a44
Sanger
C57BL/6J1, Balb/cJ2,
129S1/SvImJ2
rs29684215
Cyp3a57
RFLP
C57BL/6J1, 129S1/SvImJ1
Balb/cJ1
rs29510048
Cyp3a59
Sanger
C57BL/6J1, 129S1/SvImJ1
Balb/cJ1
rs49207862
Cyp3a59
RFLP
C57BL/6J1, 129S1/SvImJ1
Balb/cJ1
rs36827986
Cyp3a59
Sanger
C57BL/6J1, 129S1/SvImJ1
Balb/cJ1
rs38952718
Cyp3a59
RFLP
C57BL/6J1, 129S1/SvImJ1
Balb/cJ1
rs51611659
Cyp3a59
RFLP
C57BL/6J1, 129S1/SvImJ1
Balb/cJ1
rs33429092
Cyp3a59
Sanger#
C57BL/6J1, 129S1/SvImJ1
rs33260411
Cyp3a59
RFLP
C57BL/6J1, 129S1/SvImJ1
Balb/cJ1
1 Stamm weist die in der „Mouse Genome“ Datenbank angegebene Sequenz auf
2 Stamm weist eine zur „Mouse Genome“ Datenbank abweichende angegebene Sequenz auf
# Die Sequenzen des Stammes Balb/cJ waren nicht auswertbar
Ergebnisse
59
Mittels RFLP bzw. Sanger Sequenzierung konnten alle identifizierten SNP für den
betreffenden Mausstamm verifiziert werden, mit Ausnahme von rs583385430 und
rs33429092. Der SNP rs583385430 war in keinem der von uns verwendeten Stämme
nachweisbar. Jedoch ist dieser SNP mit einer geringen Vertrauenswürdigkeit in der „Mouse
Genome“ Datenbank angegeben und befindet sich noch im Validierungsprozess. Aus
diesem Grund ist es möglich, dass dieser SNP im Laufe des Validierungsprozesses wieder
aus der Datenbank entfernt wird. Bezogen auf den SNP rs33429092 waren die Sequenzen
des Stammes Balb/cJ nicht auswertbar, sodass eine Verifizierung in diesem Stamm nicht
möglich war. Für die Stämme C57BL/6J und 129S1/SvImJ hingegen wurde das
Nichtvorhandensein des SNP rs33429092 in Übereinstimmung mit den Angaben der
Datenbank nachgewiesen. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass die verwendeten
Mausstämme einen stabilen genetischen Status, bezogen auf die untersuchten Cyp3a
Isozyme, aufweisen.
Ergebniszusammenfassung: SNP Verifizierung
Identifizierte SNP in der Cyp3a Subfamilie konnten analog zur „Mouse Genome“
Datenbank in den Stämmen C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ nachgewiesen
werden.
Das genetische Profil war bei den von uns verwendeten Stämmen mit der „Mouse
Genome“ Datenbank vergleichbar.
Ergebnisse
60
3.2.3 Methodenetablierung zur Aktivitäts- und Expressionsanalyse
3.2.3.1 MeSH-Term Analyse zur Lebermikrosomenisolation
Zur weiteren Untersuchung der CYP Subfamilien sollten Mikrosomen aus Lebergewebe
isoliert werden. Jedoch stellte sich bei der Methodenetablierung heraus, dass sich die
Protokolle zur Lebermikrosomenisolation stark in der Angabe des zu verwendenden
Ausgangsmaterials (Gesamtleber vs. Teilstück der Leber) unterscheiden. Aus diesem Grund
wurde eine systematische PubMed Literaturrecherche durchgeführt, um zu evaluieren,
welches das geeignetste Ausgangsmaterial für die Lebermikrosomenisolation bei der Maus
ist.
Die systematisch durchgeführte PubMed Literaturrecherche (n = 127 Publikationen,
Anhang: Tabelle S1) ergab, dass 30 % der untersuchten Publikationen nur den Term
„Leber“, ohne weitere Spezifikationen im Material und Methodenteil, als verwendetes
Material zur Lebermikrosomenisolation nannten. 35 % beschrieben die Verwendung von
gepoolten Lebern mehrerer Maus-Individuen. Die verbleibenden 35 % gaben an, Teilstücke
der Leber zu verwenden. 95 % der Publikationen, die ein Teilstück der Leber verwendeten,
gaben keine genaueren Angaben, welcher Leberlappen verarbeitet wurde. Des Weiteren
nutzten 48 % aller analysierten Publikationen männliche Mäuse, 11,8 % weibliche und 4,7 %
beide Geschlechter. Die verbleibenden 35,5 % benannten das Geschlecht nicht. Am
häufigsten wurde der Inzuchtstamm C57BL/6 (33,9 % der Publikationen) von verschiedenen
Züchtern verwendet. Die Inzuchtstämme Balb/cJ und 129/Sv wurden nur zu jeweils 4,7 %
genutzt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Frage nach dem geeignetsten
Ausgangsmaterial für eine Lebermikrosomenisolation und welche Bedeutung dieses für
darauffolgende CYP Analysen hat, nicht eindeutig geklärt ist. Aus diesem Grund wurden
zunächst für den Inzuchtstamm C57BL/6J Aktivitäts- und Expressionsanalysen zu relevanten
CYP Enzym-Subfamilien durchgeführt in den verschiedenen Leberlappen und dem Proc. p.
der Maus im Vergleich zur Gesamtleber durchgeführt.
Ergebniszusammenfassung: MeSH Term Analyse Lebermikrosomenisolation
In der Literatur konnte keine einheitliche Empfehlung aufgefunden werden,
welches Ausgangsmaterial für eine Lebermikrosomenisolation verwendet werden
soll.
Von den analysierten Publikationen verwendeten jeweils ein Drittel entweder die
gesamte Leber, gepoolte Lebern oder Teilstücke der Leber.
Die Mehrzahl der Publikationen definierte nicht, welche Teile der Leber verwendet
wurden.
Ergebnisse
61
3.2.3.2 Lobuläre CYP Aktivitäts- und Expressionsanalyse
In männlichen C57BL/6J Mäusen wurde die CYP3A Subfamilie in den einzelnen
Leberlappen und dem Proc. p. hinsichtlich ihrer Aktivität und Expression untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass die gemessene lobuläre Aktivität von CYP3A im Lobus s. l. und
Lobus m. am größten ist. Im Vergleich zum Lobus s. l. war die CYP Reaktionsrate im Lobus
d. l., Lobus c. und dem Proc. p. durchschnittlich um das 1,2-, 1,7- und 2,6-fache niedriger
(Friedman Test: p = 0,0006) (Abbildung 3.12 A). Der theoretisch berechnete gewichtete
Mittelwert (WA) war mit der gemessenen CYP Aktivität im Lobus d. l. vergleichbar. Um den
errechneten WA beurteilen zu können, wurde ebenfalls die CYP Aktivität in der Gesamtleber
von männlichen C57BL/6J Mäusen analysiert. Diese zeigte eine gute Übereinstimmung zum
theoretischen berechneten WA (Abbildung 3.12 A und Abbildung 3.14 A).
Abbildung 3.12: CYP Aktivität und Proteingehalt in den Leberlappen männlicher C57BL/6J
Mäuse
A) Lobuläre Aktivität und B) lobulärer Proteingehalt der CYP3A Isozyme in den vier Leberlappen und
dem Proc. p. (MW ± SD, n = 10; P-Wert < 0,05; * vs. Lobus s. l., # vs Lobus m., Friedman Test mit
Dunn’s multiple comparison). Die schwarz gestrichelte Linie repräsentiert den theoretisch errechneten
gewichteten Mittelwert (WA) (exakte Werte im Anhang: Tabelle S8– S11). Abkürzungen: Lobus
sinister lateralis (Lobus s. l.), Lobus medialis (Lobus m.), Lobus dexter lateralis (Lobus d. l.), Lobus
caudatus (Lobus c.) und Processus papillaris (Proc. p.).
A)
B)
Ergebnisse
62
Der Gesamtproteingehalt an CYP3A wurde mittels ELISA analysiert, wobei keine
signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Leberlappen und dem Proc. p.
festgestellt werden konnten (Friedman Test: p = 0,6771) (Abbildung 3.12 B).
Tabelle 3.2 stellt die lobuläre mRNA Expression der Cyp3a Isozymen mit den
entsprechenden P-Werten dar. Alle Cyp Transkripte konnten in den entsprechenden Proben
analysiert werden. Insgesamt wiesen die Gene Cyp3a11 und 3a25 ein hohes und die Gene
3a41 und 3a44 ein sehr geringes mRNA Expressionslevel auf. Interlobuläre Unterschiede
wurden bezüglich der Cyp3a13, 3a16 und 3a25 mRNA Expression festgestellt (Tabelle 3.2)
Zusätzlich wurden die Aktivität, Protein- und Genexpression der Enzym-Subfamilien CYP1A,
CYP2C und CYP2D analysiert. Diese Subfamilien sind neben CYP3A von besonderer
Bedeutung für den Phase-I Stoffwechsel verschiedener Pharmaka (93). Da sie jedoch keinen
bekannten Beitrag zur Verstoffwechslung von Buprenorphin leisten, sind diese Ergebnisse
nur im Anhang aufgeführt (Anhang: Abbildung S2, Tabelle S8, S10, S12 – S20).
Ergebnisse
63
Tabelle 3.2: Relative Genexpression der Cyp3a Isozyme in den vier Leberlappen und dem Processus papillaris männlicher C57BL/ 6J
Mäuse (n = 10; E = Exponent).
Lobus sinister
lateralis
Lobus medialis Lobus dexter
lateralis
Lobus caudatus Processus papillaris
Gen MW1± SD2MW1± SD2MW1± SD2MW1± SD2MW1± SD2P-Wert3
Cyp3a11 2,06E+06 7,44E+05 2,07E+06 7,20E+05 2,12E+06 7,02E+05 2,23E+06 6,47E+05 2,04E+06 7,19E+05 0,100
Cyp3a13 1,63E+05 3,73E+04 1,57E+05 3,64E+04 1,65E+05 3,67E+04 1,42E+05 3,55E+04 1,52E+05 2,67E+04 0,035
Cyp3a16 1,78E+04 6,60E+03 1,42E+04 4,32E+03 1,27E+04 3,65E+03 1,30E+04 4,79E+03 1,65E+04 6,91E+03 0,0004
Cyp3a25 8,57E+05 1,92E+05 8,08E+05 1,42E+05 8,77E+05 1,50E+05 7,51E+05 9,93E+04 7,90E+05 1,54E+05 0,018
Cyp3a41 3,73E+02 1,64E+02 3,73E+02 1,68E+02 3,74E+02 1,66E+02 3,56E+02 1,50E+02 3,99E+02 1,93E+02 0,648
Cyp3a44 1,48E+02 1,06E+02 1,31E+02 8,25E+01 1,15E+02 9,92E+01 1,28E+02 8,13E+01 1,19E+02 1,00E+02 0,238
Cyp3a57 2,85E+05 5,76E+04 2,78E+05 4,82E+04 2,30E+05 8,19E+04 2,74E+05 3,32E+04 2,79E+05 4,46E+04 0,765
Cyp3a59 3,77E+05 6,31E+04 3,65E+05 5,58E+04 3,79E+05 5,28E+04 3,74E+05 4,06E+04 3,58E+05 5,21E+04 0,440
1 Mittelwert (MW) 2 Standardabweichung (SD) 3 Friedman Test
Ergebnisse
64
Die Aktivität von CYP Enzymen ist unter anderem abhängig von der Elektronenzufuhr. Der
bekannteste Elektronendonator für CYP Enzyme ist die CPR. Die Aktivität der CPR kann
somit indirekt Einfluss auf die Aktivität von CYP Enzymen haben (154).
Untersuchungen der CPR Aktivität zeigten signifikante Unterschiede zwischen den
verschiedenen Leberlappen und dem Proc. p. (Friedman Test: p = 0,0001) (Abbildung
3.13 A). Hierbei wurde die höchste CPR Aktivität im Lobus s. l. und Lobus m. und die
geringste im Proc. p. gemessen. Der theoretisch berechnete WA (schwarz gestrichelte Linie)
ist vergleichbar mit der CPR Aktivität in der gesamten Leber von männlichen C57BL/6J
Mäusen (Abbildung 3.15). Bei der Analyse der relativen Genexpression der CPR wurde
lediglich eine geringe Erhöhung im Lobus c. im Vergleich zum Lobus m. detektiert (Friedman
Test: p = 0,0228) (Abbildung 3.13 B).
Abbildung 3.13: Lobuläre CPR Aktivität und Genexpression
A) Lobuläre CPR Aktivität und B) lobuläre CPR Genexpression in den vier Leberlappen und dem
Proc. p. männlicher C57BL/6J Mäuse (n = 10, MW ± SD; P-Wert < 0,05: * vs. Lobus. s. l., # vs.
Lobus m., Friedman Test mit Dunn’s multiple comparison) (exakte Werte im Anhang: Tabelle S8,
S19, S21, S22). Abkürzungen: Lobus sinister lateralis (Lobus s. l.), Lobus medialis (Lobus m.),
Lobus dexter lateralis (Lobus d. l.), Lobus caudatus (Lobus c.) und Processus papillaris (Proc. p.).
A)
B)
Ergebniszusammenfassung: Interlobuläre CYP Analyse
Die CYP3A Enzyme wiesen eine unterschiedliche Aktivität und zum Teil mRNA
Expressionsunterschiede in den verschiedenen Leberlappen und dem Processus
papillaris auf (männliche C57BL/6J Mäuse).
Lobuläre Unterschiede in der CPR Aktivität weisen Ähnlichkeiten zu lobulären
Unterschieden in der CYP Aktivität auf.
Ergebnisse
65
3.2.4 Stammesabhängige CYP Aktivitäts- und Expressionsanalyse
Da die vorher genannten Ergebnisse gezeigt haben, dass die Auswahl eines bestimmten
Teilstücks der Leber zu signifikanten Unterschieden in der Aktivität und Expression von CYP
Enzymen führen kann, wurden für den Vergleich der drei Maus-Inzuchtstämme die
Mikrosomen aus der Gesamt-Leber isoliert. Die Untersuchungen ergaben, dass keine
signifikanten stammesbedingte Unterschiede in der CYP3A Aktivität vorliegen (Kruskal-
Wallis Test: p = 0,2248) (Abbildung 3.14).
Für den Gesamtproteingehalt an CYP3A Isozymen konnten ebenfalls keine signifikanten
Unterschiede zwischen den drei Inzuchtstämmen festgestellt werden (Kruskal-Wallis Test:
p = 0,208) (Abbildung 3.14 B).
Stammesbedingte mRNA Expressionsunterschiede wurden bei allen Genen der Cyp3a
Isozymen, mit Ausnahme von Cyp3a44, detektiert. Hierbei waren die Gene Cyp3a11, 3a16,
3a25, 3a57 und 3a59 am stärksten im Inzuchtstamm Balb/cJ exprimiert. Im Vergleich dazu
wiesen die Inzuchtstämme C57BL/6J und 129S1/SvImJ eine geringere Expression dieser
Gene auf. Die Genexpression von Cyp3a13 und 3a41 war in den Inzuchtstämmen C57BL/6J
und Balb/cJ deutlich erniedrigt (Tabelle 3.3). Zusätzlich wurde die Genexpression zweier
CYP Regulatoren ermittelt. Der Transkriptionsfaktor Constitutiv androstan Rezeptor (CAR)
induziert vor allem die Expression von Cyp3a11 und 3a44, wies jedoch keinen Unterschied
in seiner Genexpression in den drei Stämmen auf. Der Transkriptionsfaktor Pregnan-X-
Rezeptor (PXR) induziert ebenfalls die Expression von Cyp3a11 und 3a44 und wies eine
geringere Expression im Stamm Balb/cJ auf, verglichen mit C57BL/6J (Tabelle 3.3).
Abbildung 3.14: Stammesabhängige CYP3A Aktivität und Proteingehalt
A) Stammesabhängige Aktivität und B) stammesabhängiger Proteingehalt der CYP3A Isozyme in der
gesamten Leber männlicher Mäuse (MW ± SD, n = 8, P-Wert < 0,05: * vs. C57BL/6J, # 129S1/SvImJ
vs. Balb/cJ, Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s multiple comparison) (exakte Werte im Anhang: Tabelle
S23 – S26).
A)
B)
A
Ergebnisse
66
Tabelle 3.3: Relative Genexpression der Cyp3a Isozyme und CYP Regulatoren in der gesamten
Leber von männlichen C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäusen (n = 8, E = Exponent)
Stamm
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
Gen
MW1
± SD2
MW1
± SD2
MW1
± SD2
P-Wert3
Cyp3a11
2,31E+06
6,56E+05
5,55E+06
1,59E+06
1,73E+06
3,03E+05
0,0002
Cyp3a13
1,48E+05
2,35E+04
1,54E+04
3,81E+03
1,76E+05
1,91E+04
0,0002
Cyp3a16
2,08E+04
5,75E+03
3,63E+04
7,01E+03
1,29E+04
2,95E+03
0,0001
Cyp3a25
9,28E+05
2,28E+05
1,80E+06
4,88E+05
1,03E+06
3,03E+05
0,0016
Cyp3a41
5,06E+02
1,22E+02
1,18E+03
3,05E+02
1,13E+03
6,47E+02
0,0018
Cyp3a44
1,98E+02
7,90E+01
3,11E+02
1,63E+02
5,03E+02
4,15E+02
0,1013
Cyp3a57
3,97E+05
7,45E+04
1,11E+06
3,27E+05
3,77E+05
9,74E+04
0,0004
Cyp3a59
5,04E+05
1,02E+05
1,38E+06
3,49E+05
5,04E+05
1,39E+05
0,0005
CAR
4,50E+04
7,87E+03
4,35E+04
1,00E+04
5,75E+04
1,70E+04
0,1433
PXR
3,02E+04
2,63E+03
2,25E+04
2,71E+03
2,90E+04
7,38E+03
0,0032
1 Mittelwert (MW) 2 Standardabweichung (SD) 3 Kruskal-Wallis Test
Des Weiteren wurde die stammesabhängige CPR Aktivität in den drei Inzuchtstämmen
bestimmt (Abbildung 3.15). Die CPR Aktivität in Balb/cJ Mäusen war deutlich erniedrigt
verglichen mit C57BL/6J und 129S1/SvImJ Mäusen (Kruskal-Wallis Test: p = 0,013). Bei der
Analyse der relativen Genexpression der CPR, konnten keine stammesabhängigen
Unterschiede festgestellt werden (Kruskal-Wallis Test: p = 0,3491).
Es ist nicht bekannt inwieweit die Applikation von Buprenorphin einen Einfluss auf die in vitro
gemessene CYP Aktivität und Expression hat. Daher wurden sowohl bei den verwendeten
Tieren für die Buprenorphin Dosis-Wirkungskurve als auch bei den Tieren für den
Stammesvergleich zur analgetischen Wirksamkeit von Buprenorphin die Aktivität und
Abbildung 3.15: Stammesbedingte CPR Aktivität und Genexpression
A) Stammesabhängige CPR Aktivität und B) Genexpression in der gesamten Leber männlicher
C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäuse (n = 8, MW ± SD; P-Wert < 0,05: * vs. C57BL/6J,
# 129S1/SvImJ vs. Balb/cJ, Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s multiple comparison) (exakte Werte im
Anhang: Tabelle S23, S27 – S29).
A)
B)
Ergebnisse
67
Expression der CYP3A Enzyme ex vivo analysiert (Anhang: Abbildung S3 – S6). Hierbei
konnten keine wesentlichen Unterschiede zu den bereits untersuchten unbehandelten Tieren
(Abbildung 3.14, Tabelle 3.3) festgestellt werden. Des Weiteren wurden keine
dosisabhängigen Unterschiede detektiert (Anhang: Abbildung S3, S4). Lediglich in der
mRNA Expression von Cyp3a16 wurde eine Erniedrigung (Mann-Whitney Test: p < 0,0001
(C57BL/6J), p = 0,0008 (Balb/cJ), p = 0,0003 (129S1/SvImJ)) und von CPR eine Erhöhung
(Mann-Whitney Test: p < 0,0001 (C57BL/6J, Balb/cJ), p = 0,0025 (129S1/SvImJ)) in allen
drei Inzuchtstämmen beobachtet (Anhang: Abbildung S6).
Wie in der Einleitung bereits dargestellt, werden Buprenorphin und Norbuprenorphin durch
eine UGT-vermittelte Phase-II Reaktion glukuronidiert. Aus diesem Grund wurde die relative
Genexpression der Ugt1a und 2b Isozyme in den drei Inzuchtstämmen untersucht. Da sich
die vorliegende Promotionsarbeit vorwiegend auf den Phase-I Stoffwechsel fokussiert, sind
diese Ergebnisse nur im Anhang aufgeführt (Anhang: Abbildung S7, S8).
Zusätzlich wurden die Aktivität, der Proteingehalt und die Genexpression der CYP1A,
CYP2C und CYP2D Isozyme in den drei Inzuchtstämmen analysiert (Anhang: Abbildung S9,
Tabelle S23, S25, S28, S30 – S36).
Ergebniszusammenfassung: Stammesabhängige CYP Analyse
Die CYP3A Aktivität sowie der Proteingehalt wiesen in den drei untersuchten
Maus-Inzuchtstämmen keinen signifikanten Unterschied auf.
Stammesbedingte Unterschiede in der Cyp3a Genexpression stehen in keinem
Zusammenhang mit dem CYP3A Proteingehalt und der Aktivität.
Die CYP3A Aktivität scheint unabhängig von stammesbedingten Unterschieden in
der CPR Aktivität zu sein.
Die Applikation von Buprenorphin führt nicht zu wesentlichen Veränderungen in der
CYP3A Aktivität, Proteingehalt und Genexpression.
Diskussion
68
4 Diskussion
4.1 Stammesabhängiges Schmerzverhalten
Opioide werden häufig perioperativ zur Behandlung von moderaten bis schweren Schmerzen
bei der Maus eingesetzt (11, 69, 70, 73, 76). Unter den zahlreich verfügbaren Opioiden wird
Buprenorphin auf Grund seines langanhaltenden analgetischen Effektes und der geringen
unerwünschten Nebeneffekte bevorzugt verwendet (78, 79, 86). Um das
Schmerzmanagement möglichst optimal zu gestalten, sind Kenntnisse über eine
angemessene Dosierung zwingend erforderlich. Bisher waren Stammesunterschiede bei
Mäusen bezüglich des analgetischen Effekts von Buprenorphin nicht eindeutig geklärt und
wurde daher auch nicht in Empfehlungen berücksichtigt.
4.1.1 Basale Schmerzsensitivität
Stammesunterschiede in der basalen Nozizeption sind gut in der Literatur dokumentiert (74,
124, 127, 135). Variationen in der Schmerzsensitivität von verschiedenen Mausstämmen
sind abhängig von verschiedenen Faktoren. Zum einen sind Stammesunterschiede in der
basalen Nozizeption abhängig von der Qualität und Intensität des angewendeten
Schmerzreizes, z.B. thermischer, mechanischer oder chemischer Schmerzreiz (124). Zum
anderen sind die Stammesunterschiede abhängig vom Ort des angewandten Schmerzreizes.
So führt beispielsweise die Induktion eines Schmerzreizes durch einen thermischen Stimulus
an den Pfoten im Vergleich zum Schwanz zu einem unterschiedlichen Ergebnis (124).
Zusätzlich sind die Stammesunterschiede in der basalen Nozizeption abhängig vom Züchter
von dem ein Mausstamm bezogen wurde und selbst die Verwendung von Substämmen kann
zu unterschiedlichen Ergebnissen führen (124, 132).
In der vorliegenden Arbeit wurden stammesspezifische Unterschiede in der basalen
Nozizeption unter Verwendung des IHP Test ermittelt. Hierbei war der Inzuchtstamm Balb/cJ
am sensitivsten und der Inzuchtstamm 129S1/SvImJ am wenigsten empfindlich. Der IHP
Test stellt eine Variation des klassischen Hot Plate Tests dar, sodass diese beiden
Schmerztestungen am ehesten vergleichbar sind. Mogil und Kollegen untersuchten die
basale Nozizeption der Inzuchtstämme C57BL/6J und Balb/cJ auf dem klassischen Hot Plate
Test. Diese Mausstämme wurden vom selben Züchter (Jackson Laboratory, USA) wie die in
der vorliegenden Arbeit verwendeten Mausstämme bezogen. Im Gegensatz zu unseren
Ergebnissen beobachteten Mogil und Kollegen eine geringere Schmerzsensitivität beim
Inzuchtstamm C57BL/6J im Vergleich zum Inzuchtstamm Balb/cJ unter Verwendung des
klassischen Hot Plate Test (124). Jedoch konnten die in der hier vorliegenden Arbeit,
während der Dosisfindungsstudie erhobenen basalen Schmerzsensitivitäten bzgl. des
Inzuchtstammes C57BL/6J (48 ± 0,87 °C) während der Stammesvergleichsstudie wiederholt
Diskussion
69
werden (48,2 ± 0,58 °C). Dieses trägt zu einer gesteigerten Vertrauenswürdigkeit der in
dieser Arbeit erhobenen Daten bei. Daher sind die kontroversen Ergebnisse der
Stammesunterschiede in der basalen Nozizeption zwischen IHP Test bezogen auf die
Ergebnisse der hier vorliegende Arbeit und klassischem Hot Plate Test bezogen auf Daten
aus der Literatur eher der Methodik geschuldet.
Eine Erklärung für die kontroversen Ergebnisse könnten die unterschiedlichen Endpunkte
beim klassischen Hot Plate Test und dem IHP sein. Der klassischen Hot Plate Test basiert
auf der Messung der Zeit, wann die Tiere bei einer fixen Temperatur zum ersten Mal ein
Schmerzverhalten in Form von Lecken der Hinterpfoten zeigen. Dabei hängt die Abbruchzeit
erheblich von der definierten Temperatur ab, die in der Regel zwischen 53 und 58 °C liegt
(74, 124). Der IHP Test basiert dahingegen auf einer linearen Temperatursteigerung, bei
dem die Temperatur bestimmt wird, bei der die Tiere erstmals eine Schmerzreaktion zeigen.
In der hier vorliegenden Arbeit wurden für alle getesteten C57BL/6J und Balb/cJ Mäuse
Abbruchtemperaturen kleiner als 50 °C detektiert. Yeasomans und Kollegen fanden heraus,
dass unterschiedliche nozizeptive Fasern durch niedrige und hohe Hitzestimuli aktiviert
werden (155, 156). Hierbei wurden durch eine niedrige Hitzerate C-Fasern (0,9 °C/s)
aktiviert, wohingegen hohe Hitzeraten (6,5 °C/s) vorzugsweise Aδ-Fasern aktiviert haben.
Daher ist zu vermuten, dass beim klassischen Hot Plate Test mit hohen fixen Temperaturen,
primär Aδ-Fasern angesprochen werden, wohingegen der hier eingesetzte IHP Test eher C-
Fasern aktiviert. Die Aktivierung unterschiedlicher Schmerzfasern könnte zu unterschiedlich
starken Schmerzempfindlichkeiten bei demselben Mausstamm führen und daher einen
Vergleich zwischen IHP und klassischem Hot Plate Test erschweren.
Trotz fehlender Vergleichbarkeit zum klassischen Hot Plate Test wurde die Entscheidung zur
Verwendung des IHP Test in der hier vorliegenden Arbeit bewusst getroffen. Der IHP Test
wird in der Literatur im Vergleich zum klassischen Hot Plate Test bei Maus und Ratte als
sensitiver beschrieben (62, 63). Hunskaar und Kollegen detektierten mit Hilfe des IHP Test
einen dosisabhängigen Anstieg der Abbruchtemperatur, nach Verabreichung von
Paracetamol und Acetylsalicylsäure. Dieser Effekt konnte mit dem klassischen Hot Plate
Test nicht dargestellt werden (62). Dieser Aspekt macht deutlich, dass der IHP Test die
Möglichkeit besitzt, auch geringe Unterschiede im analgetischen Effekt (z.B. schwach
wirksamer Substanzen) zu detektieren. Zusätzlich erlaubt der IHP Test im Gegensatz zum
klassischen Hot Plate Test (64-66) auch die wiederholte Verwendung der Tiere für einen
Versuch (62, 63). Auch wenn die Testdauer beim IHP Test im Vergleich zum Hot Plate Test
deutlich länger ist (ca. 3 Minuten vs. 30 Sekunden (63, 74, 75)), überwiegen klar die Vorteile
einer gesteigerten Sensitivität und Reproduzierbarkeit unter Einsatz eines geringeren
thermischen Stimulus. Es bleibt jedoch ganz klar festzuhalten, dass sowohl der IHP Test als
auch der klassische Hot Plate Test nur eine Qualität von Schmerz, nämlich akuten
Diskussion
70
thermisch-ausgelösten Schmerz, betrachten. Der klassische Hot Plate und IHP Test sollen
supraspinale Schmerzweiterleitung widerspiegeln, bei der auch komplexere Strukturen der
Schmerzwahrnehmung eine Rolle spielen. Im Gegensatz dazu testet beispielsweise der Tail-
Flick Test nur den reinen Reflex, der auf spinale Strukturen zurück zu führen ist (61). Durch
Auswahl des IHP Testes sollte in der hier vorliegenden Arbeit sichergestellt werden, dass
nicht nur spinal, sondern auch supraspinal vermittelte Analgesie detektiert werden kann (39,
157).
4.1.2 Stammesabhängige Abbruchkriterien
Um das Schmerzmanagement überprüfen zu können, ist die richtige Einschätzung des
Schmerzverhaltens von großer Bedeutung. Jedoch besteht weiterhin das größte Problem
darin Schmerzen richtig zu erkennen (15, 73). Da bisher kein optimales System existiert
Schmerzen richtig einzuschätzen, gibt es eine Vielzahl an Möglichkeiten zur Evaluierung von
Schmerzen.
Die Evaluierung von postoperativen und Krankheitsmodell bedingten Schmerzen muss im
Voraus durchdacht sein, um das Schmerzmanagement zu überprüfen. Hierbei sollten
modellspezifische Parameter definiert werden, die für jede Studie individuell anzupassen
sind. Beispielsweise wird bei neuropathischen Schmerzen eine spontane schmerz-
assoziierte Beinbewegung als Indikator verwendet (158). Abdominale Schmerzen nach
chirurgischen Eingriffen werden durch Strecken und/ oder Aufwölben des Rückens angezeigt
(159). Eine relativ neue Methode zur Evaluation postoperativer Schmerzen ist die
sogenannte „Grimace Scale“, die anhand der Position bzw. Status der Ohren, Augen, Nase,
Schnurrhaare und Wangen, den Schmerz einschätzt (73, 160). Dieses setzt jedoch eine gute
Dokumentation des Gesichtsausdruckes und eine schnelle Auswertung voraus. Zusätzlich
können weitere Parameter herangezogen werden, um das Wohlbefinden zu beurteilen, wie
beispielsweise der Nestbau oder das Putzverhalten. Mäuse bauen sich in der Regel sofort
ein Nest, um einen Unterschlupf vor Prädatoren zu haben und sich ein Mikroklima zu
schaffen. Anhand der Schnelligkeit und Komplexität, können Rückschlüsse auf das
Wohlbefinden gezogen werden (161). Fehlendes Putzverhalten, welches sich in verklebten
oder struppigen Fell widerspiegelt können Anzeichen von länger anhaltenden Schmerzen
sein (159).
Bei artifiziellen Schmerztests ist die Definition der Abbruchkriterien ebenfalls äußerst wichtig
und kann zu signifikant unterschiedlichen Ergebnissen führen. Belknap und Kollegen
untersuchten unterschiedliche Abbruchkriterien bzgl. der Morphinsensitivität im Hot Plate
Test und konnten nur beim Lecken der Vorderpfote Stammesunterschiede detektieren (162).
Jedoch ist das Lecken der Vorderpfoten Teil des normalen Putzverhaltens von Mäusen und
somit eher als ungeeignetes Abbruchkriterium einzuordnen. Bannon und Kollegen empfehlen
Diskussion
71
daher als einziges Abbruchkriterium das Lecken einer der beiden Hinterpfoten zu definieren,
da es ein eindeutiges schmerzhaftes Verhalten darstellt (163). Carbone und Kollegen
mussten jedoch feststellen, dass der Inzuchtstamm Balb/cJ nur bedingt als schmerzhaftes
Verhalten das Lecken einer der beiden Hinterpfoten zeigte. Daher wurde zusätzlich das
Heben und Schütteln einer der beiden Hinterpfoten definiert (74). Auf Grundlage der
publizierten Erkenntnisse wurde in der hier vorliegenden Arbeit das Lecken sowie das Heben
und Schütteln einer der beiden Hinterpfoten als Abbruchkriterium gewertet.
Stammesabhängiges schmerzhaftes Verhalten wurde auch in der vorliegenden Arbeit
beobachtet. Vor allem die Stämme Balb/cJ und 129S1/SvImJ wiesen fast ausschließlich das
Schütteln als Abbruchkriterium auf. Der Stamm C57BL/6J zeigte Schmerzen vor allem durch
das Lecken einer der beiden Hinterpfoten an. Zusätzlich zeigte die Nachauswertung des
Videomaterials bei C57BL/6J Mäusen, dass unmittelbar vor dem Lecken, die entsprechende
Hinterpfote geschüttelt wurde. Der Stamm 129S1/SvImJ speichelte und urinierte sich zudem
den Bauch ein, bevor er eine der beiden Hinterpfoten hob und schüttelte. Diese Erkenntnisse
machen deutlich, wie wichtig die Auswertung der Videoaufnahmen für die hier vorgestellten
Ergebnisse war. Zusätzlich zeigen diese Umstände, dass die Definition der Abbruchkriterien
einen erheblichen Einfluss auf den Ausgang der Ergebnisse haben kann und sorgfältig
hinterfragt werden sollte.
4.1.3 Analgetische Wirkung von Buprenorphin
Die analgetische Wirkung von Buprenorphin wurde in zahlreichen human- und tierbasierten
Studien untersucht und ist gut in der Literatur dokumentiert (76, 78, 84). Für die Spezies
Maus gibt es ebenfalls viele Untersuchungen bzgl. der analgetischen Wirkung von
Buprenorphin, die jedoch einen anderen Fokus als Stammesunterschiede haben.
Ein Großteil dieser Studien untersuchten schwerpunktmäßig die pharmakokinetischen
sowie -dynamischen Eigenschaften von Buprenorphin in einem einzigen Mausstamm. Dabei
variieren diese Studien stark in der Verwendung der Applikationsrouten, des Zeitpunktes der
Testung nach Applikation, des Schmerztests oder chirurgischen Eingriffs sowie des
Bewertungssystems der Schmerzen, sodass ein Vergleich nur bedingt möglich ist (5, 73-76,
151, 159, 161, 164). Ein weiterer Teil der Studien, die die analgetische Wirkung von
Buprenorphin untersuchten, verwendeten zwar mehrere Mausstämme, jedoch zu einem
anderen Zweck. Carbone und Kollegen verglichen beispielsweise die analgetische Wirkung
von Buprenorphin mit einem Buprenorphin-Präparat mit nachhaltiger Freisetzung in zwei
unterschiedlichen Mausinzuchtstämmen (Balb/cJ, SWR/J) unter Verwendung des
klassischen Hot Plate Tests (74). Lediglich Wright-Williams und Kollegen untersuchten die
analgetische Wirkung von Buprenorphin nach einer Vasektomie in C57BL/6Crl und
C3H/HeNCrl Mäusen und beobachteten Stammesunterschiede im Schmerzverhaltens (z.B.
Diskussion
72
kratzen oder Lecken der Wunde, abnormaler Gang) (140). Diese Publikation ist eine der
wenigen die anmerkt, dass Buprenorphin stammesspezifisch analgetisch wirksam ist.
Auf Grundlage der existierenden Datenlage ist ein systematischer Stammesvergleich nicht
möglich und fehlt bisher für die Spezies Maus. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein
systematischer Vergleich der analgetischen Wirkung von Buprenorphin in den drei häufig
verwendeten Inzuchtstämme C57BL76J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ unter Verwendung des
IHP Testes durchgeführt. Hierbei wurde gezeigt, dass sowohl in der basalen
Schmerzsensitivität, als auch in der analgetischen Wirkung von Buprenorphin
Stammesunterschiede existieren.
Neben der analgetischen Wirkung kann Buprenorphin die Lokomotion beeinflussen. Niedrige
Buprenorphin-Dosen führen zu einer erhöhten lokomotorischen Aktivität (87), wohingegen
hohe Dosen sedativ wirken (143). Daher können lokomotorische Effekte von Buprenorphin
die Ergebnisse des IHP beeinflussen, da komplexe Abbruchkriterien wie Heben und
Schütteln bzw. Lecken einer der beiden Hinterpfoten, abgeprüft werden. Aus diesem Grund
wurde die Lokomotion unmittelbar vor der IHP Testung ermittelt, um diese als möglichen
Störfaktor ausschließen zu können. Der Stamm 129S1/SvImJ zeigte bei beiden
Buprenorphindosen vergleichbar hohe Abbruchtemperaturen ermittelt als verzögertes Heben
und Schütteln/Lecken einer der beiden Hinterpfoten, die auf einen sedativen Effekt
zurückgeführt werden könnten. Jedoch zeigten die Ergebnisse des Lokomotionstests im
Open Field für beide applizierten Buprenorphindosen eine im Vergleich zum Basalwert
ähnlich erhöhte lokomotorische Aktivität, was einem sedativen Effekt widerspricht. Für den
Inzuchtstamm Balb/cJ zeigte Buprenorphin die höchste analgetische Wirkung, welches sich
in einer hohen Abbruchtemperatur widerspiegelte. Daher könnte argumentiert werden, dass
die gute analgetische Wirkung von Buprenorphin auf eine Erhöhung der Lokomotion zurück
zu führen ist, die zu einem reduzierten Kontakt der Pfoten mit der Heizplatte und damit einer
verzögerten Reaktion führen könnte. Allerdings war die Steigerung der Lokomotion auch bei
diesem Mausstamm nicht abhängig von der applizierten Buprenorphindosis und vergleichbar
mit dem Stamm C57BL/6J, der geringere Abbruchtemperaturen im IHP Test aufwies. Aus
diesen Gründen ist der Einfluss von Buprenorphin auf die Lokomotion als möglicher
Störfaktor für die IHP Testung unwahrscheinlich.
Die in der vorliegenden Arbeit beobachteten Stammesunterschiede in der
Schmerzsensitivität sind auf eine unterschiedliche analgetische Wirkung von Buprenorphin
zurück zu führen. Hierbei führte die Applikation von 0,42 mg/kg Buprenorphin im
Inzuchtstamm Balb/cJ zur höchsten und im Inzuchtstamm C57BL/6J zur niedrigsten
analgetischen Wirkung. Die Ergebnisse zeigten darüber hinaus, dass eine hohe basale
Schmerzsensitivität nicht zwingendermaßen einer erhöhten Buprenorphindosis bedarf, um
Diskussion
73
eine vergleichbare analgetische Wirkung herbeizuführen. So wies der Stamm Balb/cJ die
höchste basale Sensitivität gegenüber dem thermischen Schmerzreiz auf. Gleichzeitig hatte
Buprenorphin im Vergleich zu den anderen beiden Stämmen die höchste Effektivität.
Dahingegen zeigte der Stamm C57BL/6J im Vergleich zum Balb/cJ Stamm eine moderate
basale Schmerzsensitivität und eine vergleichbar geringere analgetische Wirkung von
Buprenorphin. Um beide Stämme auf ein vergleichbares analgetisches Niveau zu bringen,
wäre für den Balb/cJ Stamm eine weitaus geringere Dosis an Buprenorphin ausreichend als
für den C57BL/6J Stamm. Im Gegensatz dazu hatte Buprenorphin beim Stamm
129S1/SvImJ eine moderate analgetische Wirkung.
Die Untersuchung eines mutmaßlichen Zusammenhanges zwischen basaler
Schmerzsensitivität und analgetischer Wirkung von Buprenorphin ist daher interessant, da
eine Abschätzung der Dosis erheblich erleichtert wäre. In der Literatur finden sich Beispiele
für andere Opioide. Im Fall des Opioids Fentanyl detektierten Varnado-Rhodes und Kollegen
eine siebenfach erhöhte Potenz im 129/svJ Stamm im Vergleich zum C57BL/6J Stamm,
obwohl sich diese in ihrer basalen Schmerzsensitivität nicht unterschieden haben (134).
Symeon und Kollegen zeigten für das Opioid Tramadol eine deutlich höhere Effektivität für
den Balb/cJ Stamm im Vergleich zu C57BL/6J Mäusen, bei einer vergleichbaren basalen
Schmerzsensitivität (136). Auch in der hier durchgeführten Arbeit konnte kein
Zusammenhang zwischen basaler Schmerzsensitivität und analgetischer Wirkung von
Buprenorphin festgestellt werden. Folglich kann der analgetische Effekt von Buprenorphin in
verschiedenen Mausstämmen nicht anhand der basalen Schmerzsensitivität abgeleitet
werden.
Die Applikation einer höheren Dosis von Buprenorphin (4,0 mg/kg) führte in der hier
vorliegenden Arbeit zu einer gesteigerten analgetischen Wirkung bei den Inzuchtstämmen
C57BL/6J und Balb/cJ. Dahingegen konnte durch die Applikation von 4,0 mg/kg
Buprenorphin keine Steigerung der analgetischen Wirkung von Buprenorphin bei dem
Inzuchtstamm 129S1/SvImJ erreicht werden. Das Abflachen der analgetischen Wirkung bei
diesem Stamm bei einer höheren Dosis von Buprenorphin deutet auf eine glockenförmige
Dosis-Wirkungskurve hin. Glockenförmige Dosis-Wirkungskurven von Buprenorphin sind
häufig bei Schmerztests in Maus und Ratte beobachtet worden, die eine sehr hohe
Schmerztemperatur verwenden (45, 76). Während der sogenannte Ceiling-Effekt von
Buprenorphin durch die partiell agonistische Aktivität am MOR erklärt werden kann, kann
diese Eigenschaft als Argument bezogen auf die glockenförmige Dosis-Wirkungsbeziehung
nicht dienen (78). Lutfy und Kollegen nehmen an, dass die Aktivierung des ORL1 Rezeptors
zu der Ausbildung einer glockenförmigen Dosis-Wirkungsbeziehung beiträgt (45). Dieses
Ergebnis einer wahrscheinlich glockenförmig verlaufenden Dosis-Wirkungskurve von
Buprenorphin beim Stamm 129S1/SvImJ ist von großer Bedeutung, da eine zu hohe
Diskussion
74
Dosierung nicht nur mit unerwünschten Nebenwirkungen wie respiratorischer Depression
assoziiert sein kann, sondern auch mit einem Abfall der analgetischen Wirkung.
4.2 Stammesabhängige Metabolisierung von Buprenorphin
Von besonderer Bedeutung für den Phase-I Stoffwechsel von Buprenorphin ist im Menschen
die Enzym-Subfamilien CYP3A, die vor allem in Leber und Darm lokalisiert ist (93, 148). Da
es sehr wahrscheinlich ist, dass auch in der Spezies Maus Buprenorphin über die orthologe
Enzym-Subfamilie CYP3A verstoffwechselt wird, wurde diese in der hier vorliegenden Arbeit
untersucht. Hierbei wurden bereits bei der Planung und Durchführung mögliche Faktoren, die
die Expression und Aktivität der CYP Enzyme beeinflussen, wie beispielsweise der
zirkadiane Rhythmus, das Alter und Geschlecht (95, 146-148), mit berücksichtigt und im
Material und Methoden Teil begründend dargelegt.
Zur Untersuchung der Metabolisierung von verschiedenen Substanzen existieren zwei sich
ergänzende Ansätze, die ex vivo und in vivo durchgeführt werden. Beide Ansätze wurden in
der hier vorliegenden Arbeit angewendet und werden in den beiden folgenden Abschnitten
diskutiert.
4.2.1 Stammesspezifische CYP3A Aktivitätsuntersuchungen an Mikrosomen
Die Verwendung von murinen Lebermikrosomen oder Leberschnitten ist der Goldstandard,
um grundlegende pharmako- bzw. toxikokinetische Profile der Biotransformation von
Substanzen ex vivo darzustellen (165-169). Darüber hinaus eignet sich diese Methode auch,
um stammesspezifische Aktivitätsunterschiede zu untersuchen. Jedoch stellte sich im
Rahmen der Methodenetablierung und einer systematischen PubMed Literaturrecherche
heraus, dass sich die Protokolle zur Lebermikrosomenisolation erheblich in der Angabe des
zu verwendenden Ausgangsmaterials (Gesamtleber vs. Teilstück der Leber) unterscheiden.
Hinsichtlich der Konsequenzen, die durch die Verwendung von einzelnen Leberlappen- oder
Gesamtleber-Homogenaten für die Mikrosomenisolation resultieren, sind bisher nur sehr
limitierte Informationen vorhanden. Uehara und Kollegen untersuchten die CYP2E und
CYP2B Aktivität in den verschiedenen Leberlappen der Ratte und konnten signifikante
Unterschiede, im Zusammenhang mit einer gesteigerten Empfindlichkeit der
Tetrachlormethan-induzierten Hepatotoxizität feststellen (170). Für die Spezies Maus sind
solche Daten bisher nicht erhoben worden.
Daher wurde im Rahmen der Methodenentwicklung zur Mikrosomenisolation untersucht, ob
lobuläre Unterschiede in der CYP3A Aktivität existieren. Hierbei konnte gezeigt werden, dass
die CYP3A Aktivität erhebliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Leberlappen und
dem Proc. p. aufweisen. Die höchste CYP3A Aktivität wurde im Lobus s.l. und Lobus m.
detektiert, welches auf einen erhöhten Metabolismus in diesen zwei Leberlappen hinweist.
Diskussion
75
Mögliche Erklärungen für die Variation der enzymatischen Aktivität sind eine erhöhte Gen-
und/ oder Proteinexpression (171), verminderte Aktivität von assoziierten Enzymen (154,
172, 173) sowie weitere nicht genetische Faktoren, wie beispielsweise der Blutfluss und
damit verbundene Sauerstoffpartialdruck (93, 168, 174-180). In der hier vorliegenden Arbeit
konnte ein Zusammenhang zwischen einer erhöhten Aktivität und Gen- bzw.
Proteinexpression nicht bestätigt werden. In der Literatur existieren mehrere Beispiele, die
eine Diskrepanz zwischen mRNA bzw. Proteinexpression und der CYP Aktivität beschreiben
und somit im Einklang mit dem vorliegenden Ergebnis dieser Arbeit sind (146, 154). Die
Zufuhr von Elektronen durch die CPR ist maßgeblich für die Funktionalität und auch Aktivität
von CYP Enzymen (154, 172). Aus diesem Grund wurden zusätzlich in der hier vorliegenden
Arbeit die mRNA Expression und die Aktivität der CPR untersucht. Hierbei konnte gezeigt
werden, dass im Gegensatz zur CPR Genexpression die CPR Aktivität lobuläre
Unterschiede aufweist. Eine gesteigerte CPR Aktivität in einem bestimmten Leberlappen
ging dabei mit einer erhöhten CYP3A Aktivität einher.
Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Wahl des Leberlappens einen entscheidenden
Einfluss auf das Resultat einer pharmakologischen bzw. toxikologischen Metabolismusstudie
haben kann und unter Umständen zu falsch negativen oder positiven Ergebnissen führ.
Wenn möglich sollte daher die gesamte Leber zur Mikrosomenherstellung verwendet
werden, welches für die in der hier vorliegenden Arbeit durchgeführte Untersuchung der
CYP3A Aktivität in verschiedenen Mausstämmen umgesetzt wurde. Hierbei konnten keine
Unterschiede in der CYP3A Aktivität zwischen den drei Inzuchtstämmen C57BL/6J, Balb/cJ
und 129S1/SvImJ detektiert werden. Des Weiteren wurden eine vergleichbare CYP3A
Proteinexpression zwischen den drei Inzuchtstämmen festgestellt. Auch Lofgren und
Kollegen führten eine systematische Untersuchung der CYP3A-vermittelten
Testosteron-6β-Hydroxylierung und CYP3A Proteinexpression in Lebermikrosomen von fünf
verschiedenen Mausstämmen durch und stellten ebenfalls keine Unterschiede fest (141).
In der hier vorliegenden Arbeit wurden im Gegensatz zur CYP3A Aktivität
Stammesunterschiede in der Genexpression der CYP3A Enzyme ermittelt. In der Literatur
finden sich meist nur Genexpressionsdaten bezogen auf einen Stamm (148), sodass diese
systematisch erhobenen Daten eine Ergänzung zur existierenden Literatur darstellen.
Jedoch liefern diese Ergebnisse keine weitere Erkenntnis bzgl. einer stammesbedingten
CYP3A Aktivität.
Analog zu der in der hier vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchung bzgl. lobulärer
Unterschiede in der CYP3A Aktivität bei männlichen C57BL/6J Mäusen wurde auch die CPR
Aktivität in den drei verwendeten Mausstämmen untersucht. Überraschenderweise wurden
im Gegensatz zur CYP3A Aktivität Stammesunterschiede in der CPR Aktivität gemessen.
Diskussion
76
Die lobuläre und stammesbedingte CYP3A Aktivität scheinen demnach durch
unterschiedliche Faktoren bzw. Mechanismen beeinflusst. Genetische Polymorphismen und/
oder epigenetische Modifikationen der CPR oder CYP Enzyme könnten eine Erklärung für
den fehlenden Zusammenhang zwischen CPR und CYP Aktivität in den drei verwendeten
Mausstämmen sein (93). Im Menschen wurden in den letzten 60 Jahren vererbbare
genetische Variationen in Pharmaka-verstoffwechselnden Enzymen ausgiebig untersucht
(93). Häufig führen Polymorphismen zu einem Funktionsverlust, indem sie das Splicen oder
die mRNA Expression beeinflussen und weniger die Transkription oder Proteinstruktur (181).
Überraschenderweise gibt es nur wenige Polymorphismen, die einen klaren Einfluss auf die
Substratselektivität oder Umsetzung des Substrates haben (93). Für die Spezies Maus sind
solche Untersuchungen bisher nicht bekannt, da eine personalisierte Therapie lange Zeit nur
auf die Humanmedizin beschränkt war. Bisher wurden die verschiedenen genetischen
Varianten bzgl. der CYP Enzyme, die zwischen den unterschiedlichen Maus-
Inzuchtstämmen auftreten nur in einer Datenbank dokumentiert, jedoch noch nicht mit einer
klinischen Relevanz in Zusammenhang gebracht (118). In dieser Arbeit wurden zwölf SNP in
der codierenden Sequenz unterschiedlicher CYP3A Isozyme verifiziert. Damit konnte der
genetische Status der verwendeten Mäuse charakterisiert werden und ein genetischer Drift
bezogen auf die in der Datenbank hinterlegten Sequenzen ausgeschlossen werden. Eine
Verknüpfung mit einem relevanten Effekt konnte an dieser Stelle jedoch nicht hergestellt
werden.
Da nicht sicher ist, ob das in der hier vorliegenden Arbeit im ex vivo Test verwendete
Substrat durch vergleichbare Enzyme verstoffwechselt wird wie Buprenorphin in der Maus,
ist die in vivo Testung eine erforderliche Überprüfung und Ergänzung der bisherigen
Ergebnisse.
4.2.2 Metabolismus von Buprenorphin in vivo
Buprenorphin ist maßgeblich für den analgetischen Effekt verantwortlich (86), sodass dessen
Metabolisierungsrate ein Grund für Stammesunterschiede in der analgetischen Wirkung
darstellen kann. Alhaddad und Kollegen konnten für männliche Fvb und Swiss Mäuse eine
signifikant unterschiedliche Metabolisierung von Buprenorphin zu Norbuprenorphin
nachweisen (143). Jedoch untersuchten sie nicht gleichzeitig den analgetischen Effekt von
Buprenorphin, sondern die durch Norbuprenorphin verursachte respiratorische Depression.
Im pharmakologischen Kontext betrachtet, führt ein Funktionsverlust von
stoffwechselrelevanten Enzymen zu einer verringerten Clearance und erhöhten
Plasmakonzentration der jeweiligen Substanz, während eine gesteigerte Enzymfunktion mit
einer erhöhten Clearance und geringen Plasmakonzentration einhergeht (93).
Diskussion
77
In der hier vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die gemessene
Serumkonzentration von Buprenorphin 30 Minuten nach Applikation in allen Proben über
0,5 ng/ml betrug, welches als effektive analgetische Serumkonzentration in der
Humanmedizin angesehen wird (182). Zusätzlich wurde Buprenorphin extensiv in seine drei
bekannten Metaboliten Norbuprenorphin, Buprenorphin-3-Glukuronid und Norbuprenorphin-
3-Glukuronid umgesetzt. Die höchste Umsetzungsrate war hierbei von Buprenorphin zu
Buprenorphin-3-Glukuronid, welches sich in einer vergleichbar hohen Serumkonzentration
widerspiegelte. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit Daten aus der Literatur, die 100 bis
600 % höhere Buprenorphin-3-Glukuronid Konzentrationen im Vergleich zu Buprenorphin
beschreiben und die Metabolisierung zu Norbuprenorphin als weniger bedeutende
Umwandlung ansehen (86, 112, 113). Da in der hier vorliegenden Arbeit die
Probenentnahme bereits 30 Minuten nach Applikation stattgefunden hat, kann eine spätere
Verschiebung des Verhältnisses von Buprenorphin zu seinen Metaboliten nicht
ausgeschlossen werden.
Obwohl geringe Stammesunterschiede in der Serumkonzentration von Buprenorphin in der
4,0 mg/kg Dosisgruppe detektiert wurden, konnten weder Stammesunterschiede in der
metabolischen Kapazität von Buprenorphin zu Norbuprenorphin noch von Buprenorphin zu
Buprenorphin-3-Glukuronid festgestellt werden. Alle drei bekannten Metaboliten von
Buprenorphin sind pharmakologisch aktiv, wobei nur Norbuprenorphin und Buprenorphin-3-
Glukuronid analgetisch wirksam sind (86). Jedoch konnten auch hier keine
stammesbedingten Unterschiede in der Serumkonzentration festgestellt werden.
Buprenorphin weist eine periphere und zentral Wirkung am Opioidrezeptor sowie eine
langsame Dissoziation auf (78). Daher könnte die Verteilung von Buprenorphin und seinen
Metaboliten sowie deren Gehirnkonzentrationen eine größere Relevanz als die
Plasmakonzentrationen für den analgetischen Effekt von Buprenorphin haben. Die
Verarbeitung des noxischen Stimulus und die Schmerzwahrnehmung bzw. Modulierung wird
vor allem über das Opioidrezeptor System gesteuert, welches im ZNS lokalisiert ist (37).
Dabei sind für die Prozessierung des Schmerzes vor allem höhere Cortex Strukturen
notwendig (15). Aus diesem Grund sollte die Konzentration im Gehirn einen größeren
Einfluss auf den analgetischen Effekt von Buprenorphin haben. Buprenorphin, welches vor
allem für den analgetischen Effekt verantwortlich ist (86), wurde in weitaus höheren
Konzentrationen im Gehirn der drei Inzuchtstämme detektiert, als die Metaboliten. Es wurden
jedoch nur geringe Stammesunterschiede in der Gehirnkonzentration von Buprenorphin
gemessen, die nicht im Zusammenhang mit einem erhöhten analgetischen Effekt im IHP
Test stehen. Auch die Verteilung der Metaboliten von Buprenorphin zwischen Blut und
Gehirn zeigte keine signifikanten Stammesunterschiede.
Diskussion
78
Darüber hinaus konnte beim Stamm 129S1/SvImJ kein dosisabhängiger Zusammenhang
zwischen analgetischer Wirkung und applizierter Dosis nachgewiesen werden. Beobachtet
wurde ein vergleichbarer analgetischer Effekt bei den beiden applizierten Dosen von
Buprenorphin, obwohl die Gehirnkonzentration um das 8-fache zwischen der 0,42 und
4,0 Dosisgruppe variierte. Dieses Phänomen könnte auf eine gleichzeitige Aktivierung des
MOR und ORL1 zurück zu führen sein und wurde bereits im Abschnitt 4.1.3 ausgeführt (45).
In dieser vorliegenden Arbeit wurde ausschließlich die Gesamtkonzentration von
Buprenorphin und seiner Metaboliten, nach Proteinpräzipitation, analysiert. Eine Aussage
über die Verfügbarkeit der ungebundenen Form von Buprenorphin kann daher nicht getroffen
werden. Buprenorphin weist eine hohe Plasmaproteinbindung von 95 – 98 % im Hund auf
und bindet vor allem an α- und β-Globulin Fraktionen im Blut (99-101). Dieser Wert wird auch
als Richtwert für den Menschen angenommen (183). Eine höhere Proteinplasmabindung
kann unter Umständen zu einer geringeren Verteilung ins Gewebe führen und beeinträchtigt
somit auch die Effektstärke des Pharmakons (29, 184). Bei lipophilen Pharmaka wie
Buprenorphin ermöglicht die Proteinplasmabindung die Transportfähigkeit im Blut (99, 185).
Darüber hinaus ist deren Anreicherung in Geweben, wie beispielsweise dem Gehirn im
Vergleich zur Verteilung im Blutkreislauf begünstigt (102, 103). Dieses konnte in der hier
vorliegenden Arbeit bestätigt werden, da höhere Buprenorphinkonzentrationen im Gehirn als
im Serum gemessen wurden. Durch eine erhöhte Plasmaproteinbindung wird gleichzeitig die
Elimination des Pharmakons verzögert (29, 184). KuKanich und Kollegen stellten dar, dass
die unterschiedliche Plasmaproteinbindung von Fentanyl (84 %) und Buprenorphin (95 -
98 %) ein Grund für die Unterschiede in deren pharmakokinetischen Parametern sein
könnte (184). Daher scheint die Plasmaproteinbindung vorrangig interessant für die
Untersuchung verschiedener Opioide zu sein und weniger für die Untersuchung von
Stammesunterschieden bei einer Substanz.
Insgesamt weisen die Ergebnisse darauf hin, dass für die hier untersuchten Stämme
pharmakokinetische Parameter als mögliche Gründe für Stammesunterschiede im
analgetischen Effekt von Buprenorphin, eine untergeordnete Rolle spielen. Daher werden im
folgenden Abschnitt mögliche Gründe für Stammesunterschiede in der analgetischen
Wirkung von Buprenorphin auf pharmakodynamischer Ebene diskutiert.
4.3 Pharmakodynamik von Buprenorphin
Unterschiede in der analgetischen Wirkung von Opioiden werden vielfältig auf
pharmakodynamischer Ebene diskutiert. Mögliche Faktoren, die zum Teil auch schon mit
stammesbedingten Unterschieden in der analgetischen Wirkung von Buprenorphin diskutiert
wurden, sind die spinale und supraspinale Wirkung von Buprenorphin durch verschiedene
Opioidrezeptoren, Phosphorylierungsmuster und Splicing Varianten des MOR und eine
Diskussion
79
durch das endogene Opioid System bedingte veränderte Ausschüttung von endogenen
Neurotransmittern. Diese werden in den folgenden Abschnitten kurz vorgestellt.
4.3.1 Spinale und supraspinale Wirkung von Buprenorphin
Schmerzinhibierende Mechanismen schließen vor allem spinale (zum Rückenmark
gehörend) und supraspinale (oberhalb des Rückenmarks) Reizweiterleitung mit ein (39, 157,
186-189). Die Applikation von Buprenorphin führt in MOR „knock-out“ Mäusen zu keinem
analgetischen Effekt (45, 190, 191). Dies ist ein starkes Indiz dafür, dass die analgetische
Wirkung von Buprenorphin primär über MOR vermittelt ist. Lutfy und Kollegen fanden
heraus, dass die MOR vermittelte Analgesie von Buprenorphin maßgeblich durch
gleichzeitige Aktivierung des ORL1 beeinflusst wurde. Die Blockierung des ORL1 führte zu
einer Steigerung des analgetischen Effektes von Buprenorphin (45). Veränderte
Eigenschaften des MOR und oder ORL1 könnten relevant für den stammesabhängigen
analgetischen Effekt von Buprenorphin sein.
Ob Buprenorphin vorrangig spinal oder supraspinal analgetisch wirksam ist wird kontrovers
diskutiert (188, 189, 192, 193). Jedoch wurden unterschiedliche Kombinationen an
Opioidrezeptoren als Hauptakteure für die spinal und supraspinal vermittelte Analgesie
identifiziert. Lange Zeit wurde geglaubt, dass MOR1 supraspinale Analgesie, wohingegen
MOR2 spinale Analgesie induzieren soll (194-196). Jedoch zeigten Moskowitz und Goodman
mit einer autoradiographischen Verteilungsstudie, dass sowohl MOR1 als auch MOR2 spinal
und supraspinal exprimiert sind (197). Zusätzlich zeigten verschiedene Studien, dass die
intrazerebralventrikuläre und intrathekale Applikation von Fentanyl und Morphin in MOR1-
defizienten Mäusen keine analgetische Wirkung hervorruft (198).
Die spinale Analgesie soll laut Porreca und Kollegen vor allem DOR vermittelt sein (39).
Dahingegen zeigten Gerhold und Kollegen, dass die spinale Analgesie vorrangig MOR1
vermittelt ist (188). Die supraspinale Analgesie ist laut verschiedene Forschungsgruppen
MOR1 vermittelte und durch einen intensiven cross-talk mit DOR verknüpft (39, 157, 189,
199). Darüber hinaus zeigten Ballesta und Kollegen bei zwei Rattenstämmen, das ein
verstärkter cross-talk zwischen MOR und DOR mit einer erhöhten analgetischen Wirkung,
induziert durch MOR Agonisten, assoziiert ist (189). Ding und Kollegen identifizierten eine
zusätzliche supraspinale Komponente bei der Buprenorphin vermittelten Analgesie, die keine
Sensitivität gegenüber dem Opioidrezeptor Antagonisten Naloxon, Pertussis Toxin und
Nociceptin/Orphanin-FQ aufweist (200). Dahingegen führte spinal appliziertes Naloxon zu
einem verringerten und JTC-801 (ORL1-Antagonist) zu einem erhöhten analgetischen Effekt
von Buprenorphin (200).
Diskussion
80
4.3.2 Phosphorylierungsmuster und Splicing Varianten des MOR
Phosphorylierungsmuster und alternative Splicing Varianten des MOR werden bezogen auf
die Sensitivität unterschiedlicher Opioide diskutiert.
Posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierungen an Serin-, Threonin- und oder
Tyrosin-Resten an intrazellulären Loops induzieren eine Arrestin 2/3 Rekrutierung, welches
zur Internalisierung des Rezeptors führt (37, 55). In der Literatur sind bereits Liganden-
abhängige Phosphorylierungsmuster identifiziert worden, die zu unterschiedlichen Effekten
führen können. Beispielsweise zeigten Schulz und Kollegen, dass Morphin und DAMGO
(synthetisches Opioidpeptid) einen unterschiedlichen Grad der Phosphorylierung am MOR
induzieren. DAMGO desensibilisierte MOR werden sofort dephosphoryliert, wohingegen
Morphin desensibilisierte MOR an der Plasmamembran verweilen und die Phosphorylierung
einen persistenten Zustand aufweist (52). Jedoch wurde bisher nicht untersucht, ob es auch
stammesbedingte Phosphorylierungsmuster gibt, die die Internalisierung beeinflussen und so
zu relevanten Unterschieden im analgetischen Effekt von Opioiden, wie beispielsweise
Buprenorphin führen können.
Alternative Splicing Varianten des MOR werden häufig im Zusammenhang mit dem
Opioidrezeptor System diskutiert. Xu und Kollegen untersuchten die bekannten 29 Splicing
Varianten des MOR in vier verschiedenen Mausstämmen und fanden im gesamten Gehirn
keine Unterschiede. Jedoch identifizierten sie stammesbedingte Unterschiede in einigen
Splicing Varianten in bestimmten Hirnregionen, die im Zusammenhang mit der
Morphinsensitivität der Mausstämme stehen sollen (144). Diese Vermutung wird durch
verschiedene Studien unter Verwendung von unterschiedlichen MOR Splicing Varianten
knock-out Mäusen unterstützt (191, 201).
4.3.3 Einfluss endogener Neurotransmitter
Veränderungen im endogenen Opioid System gehen sehr wahrscheinlich mit einer
veränderten Ausschüttung endogenen Neurotransmitters wie beispielsweise Serotonin und
Dopamin einher, die den analgetischen Effekt von Opioiden beeinflussen können.
Der Zusammenhang zwischen Serotonin und Schmerz ist sehr komplex (202). Zum einen
zeigen unterschiedliche Arbeiten, dass die Ausschüttung von Serotonin auf spinaler und
peripherer Ebene einen positiven Einfluss auf die induzierte Analgesie hat (203-205). Zum
anderen kann Serotonin auch pro-nozizeptiv wirken (206, 207). Im Zusammenhang mit
chronischen Schmerzen beschäftigen sich Wijnvoord und Kollegen mit dem inhibitorischen
serotonergen System. Hierbei konnten sie zeigen, dass naive Balb/cCrl Mäuse im Vergleich
zu C57BL/6J und 129/SvCrl einen höheren Anteil an Serotonin-immunreaktiven Fasern im
dorsalen Horn des Rückenmarks sowie eine erhöhte Serotoninkonzentration aufwiesen.
Zusätzlich weist der Stamm 129/SvCrl im Vergleich zum Stamm C57BL/6J eine erhöhte
Diskussion
81
Serotoninkonzentration im dorsalen Horn des Rückenmarks auf (128). Denkbar wäre, dass
die vorhandene Konzentration an Serotonin die analgetische Wirksamkeit von Buprenorphin
positiv oder auch negativ unterstützt. In der Literatur ist bereits beschrieben, dass die
Applikation von Opioide das seretonerge System beeinflusst (208-210). Im Fall von
Buprenorphin wird vermutet, dass die Applikation zu einer Erhöhung des intrasynaptischen
Serotonin Levels führt (210). Jedoch bleibt ein Zusammenhang mit einer veränderten
analgetischen Wirkung offen.
Eine weitere Möglichkeit für die stammesbedingten Unterschiede in der analgetischen
Wirkung von Buprenorphin sind genetische Variationen, die den KOR und oder den Dopamin
Transporter betreffen. Svingos und Kollegen zeigten in der Spezies Ratte, dass der KOR und
der Dopamin Transporter in den neuronalen Endigungen des Nucleus accumbens
koexistieren (211). Ergebnisse von Gerra und Kollegen stellten dar, dass Buprenorphin bei
Opioid-abhängigen humanen Patienten effektiver war, wenn sie an Depressionen litten (212,
213). Dieses Ergebnis könnte auf der antagonistischen Wirkung von Buprenorphin auf den
KOR beruhen. In einer weiterführenden Studie identifizierten sie mögliche Genvarianten im
Dopamin Transporter, die mit Nicht-Respondern bzw. Respondern bzgl. Buprenorphin in
Zusammenhang gebracht werden konnten (214). Bei Nicht-Respondern wurde eine erhöhte
Frequenz des Dopamin Transporters Gen-Polymorphismus im Allel 10 gefunden und bei
Respondern im Allel 6,7 und 11 (214). Entsprechende Untersuchungen in der Spezies Maus
fehlen bisher.
4.4 Abgeleitete Empfehlungen
Diese Arbeit ist als erster Schritt zur Entwicklung Mausstamm-spezifischer Empfehlungen zu
verstehen. Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, dass stammesbedingte Unterschiede bzgl. des
Schmerzverhaltens, der basalen Nozizeption sowie der analgetischen Wirksamkeit von
Buprenorphin existieren. Die wissenschaftliche Gemeinschaft sollte dafür sensibilisiert
werden, dass verschiedene Mausstämme auch einer unterschiedlichen Behandlung mit
Analgetika bedürfen und nicht generell als Spezies Maus anzusehen sind.
Zum einen lassen sich allgemeine Empfehlungen bzgl. der Erfassung von Schmerzen und
der Etablierung eines optimierten Schmerzmanagements ableiten. Zum anderen konnten
wichtige Erkenntnisse bzgl. der Verwendung von Buprenorphin gewonnen werden, die einen
ersten Schritt zu einer stammesspezifischen Analgesie darstellen.
4.4.1 Bewertung von Schmerzen
Die Erfassung und Bewertung von Schmerzen stellt bis heute eines der größten Probleme in
der Versuchstierkunde dar. Da Mäuse zu den Beutetieren zählen, vermeiden sie es in der
Regel Schmerzen zu zeigen, aus Angst vor dem Prädator und zusätzlich, um den sozialen
Diskussion
82
Status aufrechtzuerhalten. Durch automatisierte Erfassungssysteme kann dieses Problem
umgangen werden und Schmerzen meist noch präziser und eher identifiziert werden, um
entsprechend die Medikation zu optimieren oder den Versuch ggf. abzubrechen (158). Auch
in der hier vorliegenden Arbeit war die manuelle Auswertung der automatisch erfassten
Videoaufnahmen von großer Bedeutung. Hierdurch konnte sichergestellt werden, dass
zuverlässig das erste Schmerzverhalten während der IHP Testung gewertet wurde.
Nichtsdestotrotz bedarf es weiterer Forschung, um das „Normalverhalten“ von Mäusen vom
schmerzhaften Verhalten klar abzugrenzen und skalierbar zu machen. Daher ist es
notwendig, sich vor Beginn des Versuches adäquate Parameter zu definieren und diese ggf.
während des Versuches anzupassen. Grundlegend das angewendete Schmerzmanagement
nur so gut ist, wie die Fähigkeit, die Schmerzen auch richtig einzuschätzen und zu bewerten.
Die Notwendigkeit der Behandlung von Schmerzen bei Versuchstieren sollte unumstritten
sein. Jedoch bleibt zu diskutieren, ob die Applikation der höchsten nicht toxischen Dosis eine
ausreichende Refinement-Maßnahme darstellt. Dieses kann klar verneint werden. In der hier
vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Applikation hoher Dosen von
Buprenorphin zu keiner gesteigerten analgetischen Wirkung führen kann und ein weiterer
Abfall der analgetischen Wirkung nicht ausgeschlossen werden kann. Daher sollte zusätzlich
zur Etablierung eines neuen Mausstammes in einer Forschungseinrichtung, auch die
stammesspezifische Analgesie etabliert werden. Hierbei können institutsinterne etablierte
Dosierungen von anderen Mausstämmen als Richtwert herangezogen werden. Jedoch sollte
die Wirksamkeit kritisch überprüft und für den entsprechenden Eingriff optimiert werden.
4.4.2 Verwendung von Buprenorphin
Die hier vorliegenden Ergebnisse können nur als Orientierungshilfe zur Dosierung von
Buprenorphin herangezogen werden, da Dosierungen verwendet wurden, die um das 4- bis
40-fache über den üblicherweise verwendeten Dosierungen von Buprenorphin liegen. Des
Weiteren ist es absolut notwendig, dass die Analgesie auf den entsprechenden Eingriff
angepasst wird. Außerdem wurde nur ein Zeitpunkt während der Hellphase, nämlich 30
Minuten nach Applikation von Buprenorphin untersucht. Folgendes lässt sich jedoch
trotzdem ableiten. Es ist zu vermuten, dass der Stamm Balb/cJ eine geringere Dosis von
Buprenorphin benötigt als der C57BL/6J Stamm. Zusätzlich ist anzunehmen, dass der
Stamm Balb/cJ ein breiteres Dosierungsspektrum besitzt. Dahingegen sollte die Dosierung
mit Buprenorphin beim Stamm 129S1/SvImJ vorsichtig etabliert werden. Die Daten zeigen,
dass eine hohe Dosis zu einem gleichbleibenden analgetischen Effekt führt, sodass das
Wirkspektrum als deutlich kleiner anzunehmen ist, als beim Balb/cJ Stamm. Es ist sehr
wahrscheinlich, dass weitere Mausstämme existieren, die ebenfalls einen glockenförmigen
Verlauf der analgetischen Wirkung von Buprenorphin aufweisen. Zusätzlich lässt die
Tatsache, dass selbst durch Verwendung eines vergleichsweise milden artifiziellen
Diskussion
83
thermischen Stimulus zu signifikanten Unterschieden in der analgetischen Wirkung von
Buprenorphin führt vermuten, dass auch bei anderen noxischen Stimuli
Stammesunterschiede auftreten, die auch weitere hier nicht untersuchte Stämme betreffen.
Aus diesem Grund wird eine stammesspezifische Anwendung von Buprenorphin empfohlen.
Neben den zahlreichen positiven Eigenschaften, die Buprenorphin als anzuwendendes
Analgetikum attraktiv machen, sind auch einige unerwünschte Nebenwirkungen beschrieben.
Eine der am häufigsten beschriebenen unerwünschten Nebenwirkungen ist die durch
Buprenorphin und Norbuprenorphin ausgelöste Atemdepression (86, 143). Signifikante
Erniedrigungen im Tidalvolumen wurden bei männlichen FvB Mäusen ab einer Konzentration
von 30 mg/kg Buprenorphin über einen Zeitraum von 120 Minuten detektiert (143). Allerdings
liegen diese Konzentrationen nicht im empfohlenen Dosisbereich von Buprenorphin (69-73,
75). Jedoch werden Analgetika in der Regel perioperativ, also vor, während und nach einem
chirurgischen Eingriff, eingesetzt. Ein chirurgischer Eingriff bedarf einer Anästhesie, die
zusätzlich zur Schwächung des Kreislaufes und Erniedrigung des Tidalvolumens führt. Das
bedeutet, dass der vermeintlich unbedenklich Effekt von Buprenorphin auf das Tidalvolumen
bei niedriger Dosis, in Kombination mit einer Anästhesie zu einer lebensbedrohlichen
Situation führen kann (69). Zusätzlich kann je nach Zeitpunkt der Applikation die Tiefe der
Anästhesie falsch eingeschätzt werden. Daher wird bei der Spezies Hund und Katze bei
präoperativer Anwendung von Buprenorphin, eine Wartezeit von 30 Minuten empfohlen (215,
216).
Des Weiteren kann bereits die Applikation von geringen Dosen an Buprenorphin (z.B.
0,1 mg/kg) zu einer reduzierten Futteraufnahme und Gewichtsverlust führen (75). Je nach
Gewichtsverlust kann und muss hierdurch der Versuch frühzeitig beendet werden.
Vermutlich verursacht Buprenorphin, ähnlich wie beim Menschen, Übelkeit, die eine Ursache
für die reduzierte Futteraufnahme sein kann (84). Bei der Spezies Ratte wurde häufig das
sogenannte Pica Verhalten beobachtet (88, 89). Da Nagetiere nicht die Fähigkeit besitzen
sich zu übergeben, wird ein unkontrolliertes Fressverhalten von Nest- und Einstraumaterial
ausgelöst, um wahrscheinlich die Übelkeit zu minimieren (217). Dieses unkontrollierte
Fressverhalten führt in der Regel zum Darmverschluss der betroffenen Tiere und
unumgänglich zum Tod. Die Konsequenz hieraus ist, dass die Tiere eine Zeit lang ohne Nist-
oder Einstreumaterial gehalten werden müssen. Im Gegensatz zur Spezies Ratte ist für die
Maus dieses Phänomen bisher nicht ausreichend untersucht worden (4, 88, 89).
Um mögliche Nebenwirkungen zu umgehen, könnte die Applikation von sehr niedrigen
Dosen eine Lösung sein, die jedoch engere Applikationsintervalle mit sich führen würde, um
einen konstanten analgetisch wirksamen Plasmaspiegel zu gewährleisten. Obwohl
Buprenorphin eine geschätzte Halbwertszeit von ca. drei Stunden bei der Maus aufweist, gibt
Diskussion
84
es dennoch eine längere Wirkdauer von bis zu zwölf Stunden in Abhängigkeit von der Dosis
auf Grund der hohen Rezeptoraffinität (74, 77, 78). Daher wäre darauf zu achten, die
Applikationsintervalle nicht zu kurz zu wählen, um eine ungewollte hohe Akkumulation von
Buprenorphin auf den vorhandenen Plasmaspiegel zu vermeiden, der unerwünschte
Nebenwirkungen hervorrufen könnte. Generell bedarf jede Applikation eines Analgetikums
einer Fixierung des Tieres, die mit erheblichem Stress verbunden ist (218-220). Stress kann
sich ähnlich wie Schmerzen negativ auf den Heilungsprozess auswirken und womöglich die
Ergebnisse des Experimentes beeinflussen (5, 6). Zusätzlich zeigten Gerhold und Kollegen,
dass die Applikation einer subanalgetischen Dosis von Buprenorphin zu einem pro-
nozizeptiven Effekt führen kann, der sich in einer thermischen und mechanischen
Hyperalgesie widerspiegelte (188). Um tägliche Mehrfachdosierungen zu umgehen, gibt es
eine in den USA zugelassene Formulierung von Buprenorphin mit Depot Wirkung.
Untersuchungen verschiedener Forschungsgruppen zeigen dabei vielversprechende
Ergebnisse auf, mit einer Langzeitwirkung von mindestens 12 bis 24 Stunden (74, 75).
Dieses Präparat ist jedoch bisher nicht in der Europäischen Union zugelassen.
Als Fazit lässt sich festhalten, dass die Etablierung stammesspezifischer Dosierungen einer
gerechtfertigten Notwendigkeit unterliegt. Nur hierdurch wird ermöglicht, Schmerzen und
Leiden der Versuchstiere auf das unerlässliche Maß zu reduzieren.
Schlussfolgerung und Ausblick
85
5 Schlussfolgerung und Ausblick
Zusammengefasst ist nicht nur die basale Nozizeption sondern auch der analgetische Effekt
von Buprenorphin unter Verwendung des IHP Test stammesabhängig:
1. Balb/cJ weist die höchste Sensitivität gegenüber Buprenorphin auf, sowie ein breites
Dosierungsspektrum.
2. 129S1/SvImJ zeigt die geringste Sensitivität gegenüber Buprenorphin und eine
fehlende Steigerung des analgetischen Effektes, bei höherer Dosis.
3. C57BL/6J weist eine moderate Sensitivität gegenüber Buprenorphin, mit moderatem
Dosierungsspektrum auf.
Der stammesabhängige analgetische Effekt von Buprenorphin konnte weder durch die
Aktivität der stoffwechselrelevanten Enzyme in vitro, noch durch die Analyse der
Konzentration von Buprenorphin und seiner Metaboliten in vivo erklärt werden. Die
Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der stammesabhängige analgetische Effekt von
Buprenorphin bei einem festen Zeitpunkt nicht vorrangig auf pharmakokinetischen
Unterschieden basiert. Zusätzliche Untersuchungen sind notwendig, um weitere
Einflussfaktoren wie pharmakodynamische Parameter zu untersuchen (Abbildung 5.1):
1. Ist der stammesbedingte analgetische Effekt von Buprenorphin auf ein verändertes
Phosphorylierungsmuster des MOR zurück zu führen?
2. Ist der stammesbedingte analgetische Effekt von Buprenorphin auf eine veränderte
Ausschüttung von Serotonin und endogenen Opioidpeptiden zurück zu führen?
Schlussfolgerung und Ausblick
86
Ein optimales Schmerzmanagement ist nicht nur aus ethischen und rechtlichen Gründen
gefordert, sondern trägt gleichzeitig zu einer verbesserten Qualität von wissenschaftlichen
Daten bei. Bisher ist nicht abzuschätzen, wann der komplette Ersatz durch alternative
Methoden und somit der vollständige Verzicht auf Tierversuche realisiert werden kann. Bis
zu diesem Zeitpunkt sollten unerlässliche Tierversuche so optimiert werden, dass
Schmerzen, Leiden und Schäden auf ein Minimum reduziert werden, um aktiv zum
Tierschutz in der Versuchstierkunde beizutragen. Die Erkenntnis, dass auch beim häufig
verwendeten Opioid Buprenorphin stammesabhängige analgetische Effekte bei der Spezies
Maus auftreten sollte genutzt werden, um eine stammesspezifische Analgesie zu entwickeln.
Um dies zu realisieren, sollten in Publikationen folgende Parameter konsequent veröffentlicht
werden: Stamm, Geschlecht, Alter, Art und Zeitpunkt des Eingriffes, Analgetikum, Dosis,
Applikationsart und -intervall sowie Evaluationsmodell zur Überprüfung der Analgesie.
Zusätzlich ist die Betrachtung beider Geschlechter anzustreben, da sowohl in der
Humanmedizin, als auch bei Maus und Ratte geschlechtsbedingte Unterschiede in der
Schmerzwahrnehmung existieren (221-223).
Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zu einer Sensibilisierung der wissenschaftlichen
Gemeinschaft zu einer stammesspezifischen Schmerzmedikation bei. Darüber hinaus stellen
sie eine Grundlage für zukünftige Untersuchungen dar, um stammesspezifische
Empfehlungen für definierte Eingriffe zu etablieren.
Abbildung 5.1: Übersicht der neu formulierten Hypothesen
Veränderungen im Phosphorylierungsmuster der µ-Rezeptoren oder der Serotoninausschüttung
könnten Gründe für den nachgewiesenen stammesbedingten Unterschiede der analgetischen Wirkung
von Buprenorphin sein.
Literaturverzeichnis
87
Literaturverzeichnis
1. Richtlinie 2010/63/EU Des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22.
September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere
(2010).
2. W. M. S. Russel, R. L. Burch, The Principles of Humane Experimental Technique.
(Methuen, London, 1959).
3. IASP, Classification of Chronic Pain. H. Merskey, N. Bogduk, Eds., (Seattle, ed. 2,
1994).
4. P. Jirkof, Side effects of pain and analgesia in animal experimentation. Lab animal 46,
123-128 (2017).
5. M. Arras, A. Rettich, P. Cinelli, H. P. Kasermann, K. Burki, Assessment of post-
laparotomy pain in laboratory mice by telemetric recording of heart rate and heart rate
variability. BMC veterinary research 3, 16 (2007).
6. C. Schwarz et al., Mechanical load modulates the stimulatory effect of BMP2 in a rat
nonunion model. Tissue engineering. Part A 19, 247-254 (2013).
7. G. G. Page, S. Ben-Eliyahu, R. Yirmiya, J. C. Liebeskind, Morphine attenuates
surgery-induced enhancement of metastatic colonization in rats. Pain 54, 21-28
(1993).
8. G. G. Page, W. P. Blakely, S. Ben-Eliyahu, Evidence that postoperative pain is a
mediator of the tumor-promoting effects of surgery in rats. Pain 90, 191-199 (2001).
9. G. G. Page, Immunologic effects of opioids in the presence or absence of pain.
Journal of pain and symptom management 29, S25-31 (2005).
10. J. Lofgren et al., Analgesics promote welfare and sustain tumour growth in orthotopic
4T1 and B16 mouse cancer models. Laboratory animals, 23677217739934 (2017).
11. E. L. Stokes, P. A. Flecknell, C. A. Richardson, Reported analgesic and anaesthetic
administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Laboratory
animals 43, 149-154 (2009).
12. L. Carbone, J. Austin, Pain and Laboratory Animals: Publication Practices for Better
Data Reproducibility and Better Animal Welfare. PloS one 11, e0155001 (2016).
13. EU Commission. (2013).
14. BMEL, Versuchstierdaten 2016. (2017).
15. National Research Council (US), Committee on Recognition and Alleviation of Pain in
Laboratory Animals, Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals. (
National Academies Press (US), Washington (DC), 2009).
16. W. D. Willis, K. N. Westlund, Neuroanatomy of the pain system and of the pathways
that modulate pain. Journal of clinical neurophysiology : official publication of the
American Electroencephalographic Society 14, 2-31 (1997).
17. M. S. Gold, G. F. Gebhart, Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med 16,
1248-1257 (2010).
18. A. I. Basbaum, D. M. Bautista, G. Scherrer, D. Julius, Cellular and molecular
mechanisms of pain. Cell 139, 267-284 (2009).
19. D. Julius, A. I. Basbaum, Molecular mechanisms of nociception. Nature 413, 203-210
(2001).
20. D. Julius, TRP channels and pain. Annual review of cell and developmental biology
29, 355-384 (2013).
21. D. Le Bars, A. Dickenson, J. Besson, Diffuse noxious inhibitory controls (DNIC). I.
Effects on dorsal horn convergent neurons in the rat. Pain 6, 283-304 (1979).
22. D. Le Bars, A. Dickenson, J. Besson, Diffuse noxious inhibitory controls (DNIC). II.
Lack of effect on non-convergent neurons, supraspinal involvement and theoretical
implications Pain 6, 305-327 (1979).
23. Y. Feng et al., Current Research on Opioid Receptor Function. Current drug targets
13, 230-246 (2012).
24. B. N. Dhawan et al., International Union of Pharmacology. XII. Classification of opioid
receptors. Pharmacological reviews 48, 567-592 (1996).
Literaturverzeichnis
88
25. E. E. Benarroch, Endogenous opioid systems: current concepts and clinical
correlations. Neurology 79, 807-814 (2012).
26. A. Mansour, C. A. Fox, H. Akil, S. J. Watson, Opioid-receptor mRNA expression in
the rat CNS: anatomical and functional implications. Trends in neurosciences 18, 22-
29 (1995).
27. Y. Xia, G. G. Haddad, Ontogeny and distribution of opioid receptors in the rat
brainstem. Brain research 549, 181-193 (1991).
28. G. Wittert, P. Hope, D. Pyle, Tissue distribution of opioid receptor gene expression in
the rat. Biochem Biophys Res Commun 218, 877-881 (1996).
29. K. H. Greaefe, W. Lutz, H. Bönisch, Pharmakologie und Toxikologie. (Georg Thieme
Verlag KG, Würzburg, 2011).
30. G. W. Pasternak, Insights into mu opioid pharmacology the role of mu opioid receptor
subtypes. Life sciences 68, 2213-2219 (2001).
31. G. S. Ling, K. Spiegel, S. H. Lockhart, G. W. Pasternak, Separation of opioid
analgesia from respiratory depression: evidence for different receptor mechanisms.
The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 232, 149-155 (1985).
32. R. M. Eisenberg, TRIMU-5, a mu 2-opioid receptor agonist, stimulates the
hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Pharmacology, biochemistry, and behavior 47,
943-946 (1994).
33. P. Cadet, K. J. Mantione, G. B. Stefano, Molecular identification and functional
expression of mu 3, a novel alternatively spliced variant of the human mu opiate
receptor gene. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 170, 5118-5123 (2003).
34. U. Arvidsson et al., Distribution and targeting of a mu-opioid receptor (MOR1) in brain
and spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for
Neuroscience 15, 3328-3341 (1995).
35. M. Sobczak, M. Sałaga, M. A. Storr, J. Fichna, Physiology, signaling, and
pharmacology of opioid receptors and their ligands in the gastrointestinal tract:
current concepts and future perspectives. Journal of Gastroenterology 49, 24-45
(2014).
36. H. Pathan, J. Williams, Basic opioid pharmacology: an update. British journal of pain
6, 11-16 (2012).
37. R. Al-Hasani, M. R. Bruchas, Molecular mechanisms of opioid receptor-dependent
signaling and behavior. Anesthesiology 115, 1363-1381 (2011).
38. P. E. Lutz, B. L. Kieffer, Opioid receptors: distinct roles in mood disorders. Trends in
neurosciences 36, 195-206 (2013).
39. F. Porreca, H. I. Mosberg, R. Hurst, V. J. Hruby, T. F. Burks, Roles of mu, delta and
kappa opioid receptors in spinal and supraspinal mediation of gastrointestinal transit
effects and hot-plate analgesia in the mouse. The Journal of pharmacology and
experimental therapeutics 230, 341-348 (1984).
40. A. Baamonde et al., Antidepressant-type effects of endogenous enkephalins
protected by systemic RB 101 are mediated by opioid delta and dopamine D1
receptor stimulation. European journal of pharmacology 216, 157-166 (1992).
41. G. G. Haddad, J. I. Schaeffer, K. J. Chang, Opposite effects of the delta- and mu-
opioid receptor agonists on ventilation in conscious adult dogs. Brain research 323,
73-82 (1984).
42. J. C. Hunter et al., CI-977, a novel and selective agonist for the kappa-opioid
receptor. British journal of pharmacology 101, 183-189 (1990).
43. C. Gaveriaux-Ruff, B. L. Kieffer, Opioid receptor genes inactivated in mice: the
highlights. Neuropeptides 36, 62-71 (2002).
44. L. Toll, M. R. Bruchas, G. Calo, B. M. Cox, N. T. Zaveri, Nociceptin/Orphanin FQ
Receptor Structure, Signaling, Ligands, Functions, and Interactions with Opioid
Systems. Pharmacological reviews 68, 419-457 (2016).
45. K. Lutfy et al., Buprenorphine-induced antinociception is mediated by mu-opioid
receptors and compromised by concomitant activation of opioid receptor-like
receptors. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for
Neuroscience 23, 10331-10337 (2003).
Literaturverzeichnis
89
46. K. Ahlbeck, Opioids: a two-faced Janus. Current medical research and opinion 27,
439-448 (2011).
47. E. Freye, Opioide in der Medizin. (Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2010), vol. 8.
48. K. Wickman, D. E. Clapham, Ion channel regulation by G proteins. Physiol Rev 75,
865-885 (1995).
49. G. W. Zamponi, T. P. Snutch, Modulating modulation: crosstalk between regulatory
pathways of presynaptic calcium channels. Molecular interventions 2, 476-478
(2002).
50. R. Sadja, N. Alagem, E. Reuveny, Gating of GIRK channels: details of an intricate,
membrane-delimited signaling complex. Neuron 39, 9-12 (2003).
51. C. P. Bailey, M. Connor, Opioids: cellular mechanisms of tolerance and physical
dependence. Current opinion in pharmacology 5, 60-68 (2005).
52. S. Schulz et al., Morphine induces terminal micro-opioid receptor desensitization by
sustained phosphorylation of serine-375. The EMBO journal 23, 3282-3289 (2004).
53. E. J. Melief et al., Duration of action of a broad range of selective kappa-opioid
receptor antagonists is positively correlated with c-Jun N-terminal kinase-1 activation.
Molecular pharmacology 80, 920-929 (2011).
54. A. A. Pradhan et al., Ligand-directed trafficking of the delta-opioid receptor in vivo:
two paths toward analgesic tolerance. The Journal of neuroscience : the official
journal of the Society for Neuroscience 30, 16459-16468 (2010).
55. C. Chavkin, J. P. McLaughlin, J. P. Celver, Regulation of opioid receptor function by
chronic agonist exposure: constitutive activity and desensitization. Molecular
pharmacology 60, 20-25 (2001).
56. S. Spampinato, M. Baiula, M. Calienni, Agonist-regulated internalization and
desensitization of the human nociceptin receptor expressed in CHO cells. Current
drug targets 8, 137-146 (2007).
57. Y. X. Pan, E. Bolan, G. W. Pasternak, Dimerization of morphine and orphanin
FQ/nociceptin receptors: generation of a novel opioid receptor subtype. Biochem
Biophys Res Commun 297, 659-663 (2002).
58. I. Gomes et al., Heterodimerization of mu and delta opioid receptors: A role in opiate
synergy. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for
Neuroscience 20, Rc110 (2000).
59. D. Le Bars, M. Gozariu, S. W. Cadden, Animal models of nociception.
Pharmacological reviews 53, 597-652 (2001).
60. M. Barrot, Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience 211,
39-50 (2012).
61. N. S. Gregory et al., An overview of animal models of pain: disease models and
outcome measures. The journal of pain : official journal of the American Pain Society
14, 1255-1269 (2013).
62. S. Hunskaar, O. G. Berge, K. Hole, A modified hot-plate test sensitive to mild
analgesics. Behavioural brain research 21, 101-108 (1986).
63. S. Alshahrani, F. Fernandez-Conti, A. Araujo, M. DiFulvio, Rapid determination of the
thermal nociceptive threshold in diabetic rats. Journal of visualized experiments :
JoVE, e3785 (2012).
64. R. L. Collins, G. Whitney, Genotype and test experience determine responsiveness to
morphine. Psychopharmacology 56, 57-60 (1978).
65. G. D. Gamble, R. J. Milne, Repeated exposure to sham testing procedures reduces
reflex withdrawal and hot-plate latencies: attenuation of tonic descending inhibition?
Neuroscience letters 96, 312-317 (1989).
66. M. A. Plone, D. F. Emerich, M. D. Lindner, Individual differences in the hotplate test
and effects of habituation on sensitivity to morphine. Pain 66, 265-270 (1996).
67. A. E. Dubin, A. Patapoutian, Nociceptors: the sensors of the pain pathway. The
Journal of clinical investigation 120, 3760-3772 (2010).
68. K. Y. Kwan et al., TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception
but is not essential for hair-cell transduction. Neuron 50, 277-289 (2006).
Literaturverzeichnis
90
69. Committee on Anaesthesia of GV-SOLAS, Expert Information: Pain management for
laboratory animals. GV-SOLAS, 1-69 (2015).
70. C. A. Richardson, P. A. Flecknell, Anaesthesia and post-operative analgesia following
experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Alternatives to
laboratory animals : ATLA 33, 119-127 (2005).
71. C. T. Hawk, S. L. Leary, T. H. Morris, Formulary for Lab Animals. (Blackwell
Publishing, ed. Third Edition, 2005, pp 19).
72. N. M. Gades, P. J. Danneman, S. K. Wixson, E. A. Tolley, The magnitude and
duration of the analgesic effect of morphine, butorphanol, and buprenorphine in rats
and mice. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science 39, 8-13 (2000).
73. L. C. Matsumiya et al., Using the Mouse Grimace Scale to reevaluate the efficacy of
postoperative analgesics in laboratory mice. Journal of the American Association for
Laboratory Animal Science : JAALAS 51, 42-49 (2012).
74. E. T. Carbone, K. E. Lindstrom, S. Diep, L. Carbone, Duration of action of sustained-
release buprenorphine in 2 strains of mice. Journal of the American Association for
Laboratory Animal Science : JAALAS 51, 815-819 (2012).
75. P. Jirkof, A. Tourvieille, P. Cinelli, M. Arras, Buprenorphine for pain relief in mice:
repeated injections vs sustained-release depot formulation. Laboratory animals 49(3),
177-187 (2015).
76. T. Christoph et al., Broad analgesic profile of buprenorphine in rodent models of acute
and chronic pain. European journal of pharmacology 507, 87-98 (2005).
77. S. Yu et al., Pharmacokinetics of buprenorphine after intravenous administration in
the mouse. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science :
JAALAS 45, 12-16 (2006).
78. K. Lutfy, A. Cowan, Buprenorphine: a unique drug with complex pharmacology.
Current neuropharmacology 2, 395-402 (2004).
79. T. M. Tzschentke, Behavioral pharmacology of buprenorphine, with a focus on
preclinical models of reward and addiction. Psychopharmacology 161, 1-16 (2002).
80. A. Cowan, J. W. Lewis, I. R. Macfarlane, Agonist and antagonist properties of
buprenorphine, a new antinociceptive agent. British journal of pharmacology 60, 537-
545 (1977).
81. S. L. Walsh, K. L. Preston, M. L. Stitzer, E. J. Cone, G. E. Bigelow, Clinical
pharmacology of buprenorphine: ceiling effects at high doses. Clinical pharmacology
and therapeutics 55, 569-580 (1994).
82. A. Dahan et al., Buprenorphine induces ceiling in respiratory depression but not in
analgesia. British journal of anaesthesia 96, 627-632 (2006).
83. A. Cowan, J. C. Doxey, E. J. Harry, The animal pharmacology of buprenorphine, an
oripavine analgesic agent. British journal of pharmacology 60, 547-554 (1977).
84. S. L. Walsh, T. Eissenberg, The clinical pharmacology of buprenorphine:
extrapolating from the laboratory to the clinic. Drug and alcohol dependence 70, S13-
27 (2003).
85. H. Alhaddad et al., Respiratory toxicity of buprenorphine results from the blockage of
P-glycoprotein-mediated efflux of norbuprenorphine at the blood-brain barrier in mice.
Critical care medicine 40, 3215-3223 (2012).
86. S. M. Brown, M. Holtzman, T. Kim, E. D. Kharasch, Buprenorphine metabolites,
buprenorphine-3-glucuronide and norbuprenorphine-3-glucuronide, are biologically
active. Anesthesiology 115, 1251-1260 (2011).
87. P. Jirkof, A. Tourvieille, P. Cinelli, M. Arras, Buprenorphine for pain relief in mice:
repeated injections vs sustained-release depot formulation. Laboratory animals 49,
177-187 (2015).
88. J. A. Clark, Jr., P. H. Myers, M. F. Goelz, J. E. Thigpen, D. B. Forsythe, Pica behavior
associated with buprenorphine administration in the rat. Laboratory animal science
47, 300-303 (1997).
89. R. Sarabia-Estrada, A. Cowan, B. M. Tyler, M. Guarnieri, Association of nausea with
buprenorphine analgesia for rats. Lab animal 46, 242-244 (2017).
Literaturverzeichnis
91
90. H. C. Jackson, I. J. Griffin, D. J. Nutt, Buprenorphine-cocaine interactions in mice:
effect on locomotor activity and hole-dipping behaviour. The Journal of pharmacy and
pharmacology 45, 636-640 (1993).
91. F. P. Guengerich, Rate-limiting steps in cytochrome P450 catalysis. Biol Chem 383,
1553-1564 (2002).
92. D. R. Nelson et al., Comparison of cytochrome P450 (CYP) genes from the mouse
and human genomes, including nomenclature recommendations for genes,
pseudogenes and alternative-splice variants. Pharmacogenetics 14, 1-18 (2004).
93. U. M. Zanger, M. Schwab, Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism: regulation
of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation. Pharmacol
Ther 138, 103-141 (2013).
94. E. G. Hrycay, S. M. Bandiera, Expression, function and regulation of mouse
cytochrome P450 enzymes: comparison with human P450 enzymes. Current drug
metabolism 10, 1151-1183 (2009).
95. Y. K. Zhang, R. L. Yeager, C. D. Klaassen, Circadian expression profiles of drug-
processing genes and transcription factors in mouse liver. Drug metabolism and
disposition: the biological fate of chemicals 37, 106-115 (2009).
96. D. Brewster, M. J. Humphrey, M. A. McLeavy, The systemic bioavailability of
buprenorphine by various routes of administration. The Journal of pharmacy and
pharmacology 33, 500-506 (1981).
97. A. Elkader, B. Sproule, Buprenorphine: clinical pharmacokinetics in the treatment of
opioid dependence. Clinical pharmacokinetics 44, 661-680 (2005).
98. S. E. Robinson, Buprenorphine: an analgesic with an expanding role in the treatment
of opioid addiction. CNS drug reviews 8, 377-390 (2002).
99. E. R. Garrett, V. R. Chandran, Pharmacokinetics of morphine and its surrogates VI:
Bioanalysis, solvolysis kinetics, solubility, pK'a values, and protein binding of
buprenorphine. Journal of pharmaceutical sciences 74, 515-524 (1985).
100. E. R. Garrett, V. R. Chandran, Pharmacokinetics of morphine and its surrogates. X:
Analyses and pharmacokinetics of buprenorphine in dogs. Biopharmaceutics & drug
disposition 11, 311-350 (1990).
101. R. C. Heel, R. N. Brogden, T. M. Speight, G. S. Avery, Buprenorphine: a review of its
pharmacological properties and therapeutic efficacy. Drugs 17, 81-110 (1979).
102. R. B. Pontani, N. L. Vadlamani, A. L. Misra, Disposition in the rat of buprenorphine
administered parenterally and as a subcutaneous implant. Xenobiotica; the fate of
foreign compounds in biological systems 15, 287-297 (1985).
103. H. E. Hassan, A. L. Myers, A. Coop, N. D. Eddington, Differential involvement of P-
glycoprotein (ABCB1) in permeability, tissue distribution, and antinociceptive activity
of methadone, buprenorphine, and diprenorphine: in vitro and in vivo evaluation.
Journal of pharmaceutical sciences 98, 4928-4940 (2009).
104. N. Picard, T. Cresteil, N. Djebli, P. Marquet, In vitro metabolism study of
buprenorphine: evidence for new metabolic pathways. Drug metabolism and
disposition: the biological fate of chemicals 33, 689-695 (2005).
105. K. Kobayashi et al., Human buprenorphine N-dealkylation is catalyzed by cytochrome
P450 3A4. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 26, 818-
821 (1998).
106. P. Huang, G. B. Kehner, A. Cowan, L. Y. Liu-Chen, Comparison of pharmacological
activities of buprenorphine and norbuprenorphine: norbuprenorphine is a potent
opioid agonist. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 297, 688-
695 (2001).
107. S. M. Brown et al., P-glycoprotein is a major determinant of norbuprenorphine brain
exposure and antinociception. The Journal of pharmacology and experimental
therapeutics 343, 53-61 (2012).
108. N. Tournier et al., Interaction of drugs of abuse and maintenance treatments with
human P-glycoprotein (ABCB1) and breast cancer resistance protein (ABCG2). The
international journal of neuropsychopharmacology 13, 905-915 (2010).
Literaturverzeichnis
92
109. H. L. Liston, J. S. Markowitz, C. L. DeVane, Drug glucuronidation in clinical
psychopharmacology. Journal of clinical psychopharmacology 21, 500-515 (2001).
110. R. D. Bruce, E. McCance-Katz, E. D. Kharasch, D. E. Moody, G. D. Morse,
Pharmacokinetic interactions between buprenorphine and antiretroviral medications.
Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society
of America 43 Suppl 4, S216-223 (2006).
111. K. Rouguieg, N. Picard, F. L. Sauvage, J. M. Gaulier, P. Marquet, Contribution of the
different UDP-glucuronosyltransferase (UGT) isoforms to buprenorphine and
norbuprenorphine metabolism and relationship with the main UGT polymorphisms in
a bank of human liver microsomes. Drug metabolism and disposition: the biological
fate of chemicals 38, 40-45 (2010).
112. D. E. Moody et al., A liquid chromatographic-electrospray ionization-tandem mass
spectrometric method for determination of buprenorphine, its metabolite,
norbuprenorphine, and a coformulant, naloxone, that is suitable for in vivo and in vitro
metabolism studies. Analytical biochemistry 306, 31-39 (2002).
113. E. F. McCance-Katz et al., Interaction between buprenorphine and atazanavir or
atazanavir/ritonavir. Drug and alcohol dependence 91, 269-278 (2007).
114. Y. Blom, U. Bondesson, E. Anggard, Analysis of buprenorphine and its N-dealkylated
metabolite in plasma and urine by selected-ion monitoring. Journal of
chromatography 338, 89-98 (1985).
115. E. J. Cone, C. W. Gorodetzky, D. Yousefnejad, W. F. Buchwald, R. E. Johnson, The
metabolism and excretion of buprenorphine in humans. Drug metabolism and
disposition: the biological fate of chemicals 12, 577-581 (1984).
116. J. Weiss, C. Becker, E. Bernsmann, H. Dietrich, K. Nebendahl, Tierpflege in
Forschung und Klinik. (Enke Verlag, Stuttgart, 2009), vol. 3. Auflage.
117. GV-SOLAS Ausschuss für Genetik und Labortierzucht, Substämme von
Inzuchtstämmen. (2013).
118. D. J. Adams, A. G. Doran, J. Lilue, T. M. Keane, The Mouse Genomes Project: a
repository of inbred laboratory mouse strain genomes. Mammalian genome : official
journal of the International Mammalian Genome Society 26, 403-412 (2015).
119. M. Johnson, Laboratory Mice and Rats. Materials and Methods 2, (2012).
120. The Jackson Laboratory, C57BL/6J Mouse Strain Datasheet - 000664. (2017).
121. The Jackson Laboratory, Balb/cJ Mouse Strain Datasheet - 000651. (2017).
122. The Jackson Laboratory, 129S1/SvImJ Mouse Strain Datasheet - 002448. (2017).
123. K. Bon, C. A. Lichtensteiger, S. G. Wilson, J. Mogil, Characterization of
cyclophosphamide cystitis, a model of visceral and referred pain, in the mouse:
species and strain differences. The Journal of urology 170, 1008-1012 (2003).
124. J. S. Mogil et al., Heritability of nociception I: responses of 11 inbred mouse strains on
12 measures of nociception. Pain 80, 67-82 (1999).
125. S. Leo, R. Straetemans, R. D'Hooge, T. Meert, Differences in nociceptive behavioral
performance between C57BL/6J, 129S6/SvEv, B6 129 F1 and NMRI mice.
Behavioural brain research 190, 233-242 (2008).
126. J. S. Mogil, S. M. Adhikari, Hot and cold nociception are genetically correlated. The
Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 19, RC25
(1999).
127. E. Nesher, V. Peskov, A. Rylova, O. Raz, A. Pinhasov, Comparative analysis of the
behavioral and biomolecular parameters of four mouse strains. Journal of molecular
neuroscience : MN 46, 276-284 (2012).
128. N. Wijnvoord et al., Inter-strain differences of serotonergic inhibitory pain control in
inbred mice. Molecular pain 6, 70 (2010).
129. S. L. Wright-Williams, J. P. Courade, C. A. Richardson, J. V. Roughan, P. A.
Flecknell, Effects of vasectomy surgery and meloxicam treatment on faecal
corticosterone levels and behaviour in two strains of laboratory mouse. Pain 130,
108-118 (2007).
130. W. R. Lariviere et al., Heritability of nociception. III. Genetic relationships among
commonly used assays of nociception and hypersensitivity. Pain 97, 75-86 (2002).
Literaturverzeichnis
93
131. J. S. Mogil et al., Heritability of nociception II. 'Types' of nociception revealed by
genetic correlation analysis. Pain 80, 83-93 (1999).
132. C. D. Bryant et al., Behavioral differences among C57BL/6 substrains: implications for
transgenic and knockout studies. Journal of neurogenetics 22, 315-331 (2008).
133. A. Oliverio, C. Castellano, B. E. Eleftheriou, Morphine sensitivity and tolerance: a
genetic investigation in the mouse. Psychopharmacologia 42, 219-224 (1975).
134. Y. Varnado-Rhodes, J. Gunther, G. W. Terman, C. Chavkin, Mu opioid analgesia and
analgesic tolerance in two mouse strains: C57BL/6 and 129/SvJ. Proceedings of the
Western Pharmacology Society 43, 15-17 (2000).
135. J. S. Mogil, B. Kest, B. Sadowski, J. K. Belknap, Differential genetic mediation of
sensitivity to morphine in genetic models of opiate antinociception: influence of
nociceptive assay. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 276,
532-544 (1996).
136. I. Symeon et al., Evaluation of the effects of tramadol on analgesic response and
locomotor activity on two different strains of laboratory mice. J HELLENIC VET MED
SOC 68(1), 089-096 (2017).
137. H. Avsaroglu, A. S. van der Sar, H. A. van Lith, L. F. van Zutphen, L. J. Hellebrekers,
Differences in response to anaesthetics and analgesics between inbred rat strains.
Laboratory animals 41, 337-344 (2007).
138. D. Morgan, C. D. Cook, M. J. Picker, Sensitivity to the discriminative stimulus and
antinociceptive effects of mu opioids: role of strain of rat, stimulus intensity, and
intrinsic efficacy at the mu opioid receptor. The Journal of pharmacology and
experimental therapeutics 289, 965-975 (1999).
139. J. M. Terner, L. M. Lomas, E. S. Smith, A. C. Barrett, M. J. Picker, Pharmacogenetic
analysis of sex differences in opioid antinociception in rats. Pain 106, 381-391 (2003).
140. S. Wright-Williams, P. A. Flecknell, J. V. Roughan, Comparative effects of vasectomy
surgery and buprenorphine treatment on faecal corticosterone concentrations and
behaviour assessed by manual and automated analysis methods in C57 and C3H
mice. PloS one 8, e75948 (2013).
141. S. Lofgren, A. L. Hagbjork, S. Ekman, R. Fransson-Steen, Y. Terelius, Metabolism of
human cytochrome P450 marker substrates in mouse: a strain and gender
comparison. Xenobiotica; the fate of foreign compounds in biological systems 34,
811-834 (2004).
142. Y. Guo et al., In silico and in vitro pharmacogenetic analysis in mice. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 17735-17740
(2007).
143. H. Alhaddad et al., Gender and strain contributions to the variability of buprenorphine-
related respiratory toxicity in mice. Toxicology 305, 99-108 (2013).
144. J. Xu et al., Differential expressions of the alternatively spliced variant mRNAs of the
micro opioid receptor gene, OPRM1, in brain regions of four inbred mouse strains.
PloS one 9, e111267 (2014).
145. J. A. Beck et al., Genealogies of mouse inbred strains. Nature genetics 24, 23-25
(2000).
146. H. C. Kwak, H. C. Kim, S. J. Oh, S. K. Kim, Effects of age increase on hepatic
expression and activity of cytochrome P450 in male C57BL/6 mice. Archives of
pharmacal research, (2014).
147. T. Sakuma et al., Regulation of the expression of two female-predominant CYP3A
mRNAs (CYP3A41 and CYP3A44) in mouse liver by sex and growth hormones. Arch
Biochem Biophys 404, 234-242 (2002).
148. H. J. Renaud, J. Y. Cui, M. Khan, C. D. Klaassen, Tissue distribution and gender-
divergent expression of 78 cytochrome P450 mRNAs in mice. Toxicol Sci 124, 261-
277 (2011).
149. J. S. Mogil, Perspective: Equality need not be painful. Nature 535, S7 (2016).
150. P. Marquez, R. Baliram, B. L. Kieffer, K. Lutfy, The mu opioid receptor is involved in
buprenorphine-induced locomotor stimulation and conditioned place preference.
Neuropharmacology 52, 1336-1341 (2007).
Literaturverzeichnis
94
151. U. K. Ozdogan, J. Lahdesmaki, M. Scheinin, The analgesic efficacy of partial opioid
agonists is increased in mice with targeted inactivation of the alpha2A-adrenoceptor
gene. European journal of pharmacology 529, 105-113 (2006).
152. J. Y. Chung et al., Cellular defense mechanisms against benzo[a]pyrene in testicular
Leydig cells: implications of p53, aryl-hydrocarbon receptor, and cytochrome P450
1A1 status. Endocrinology 148, 6134-6144 (2007).
153. U. Emmenegger et al., Pharmacodynamic and pharmacokinetic study of chronic low-
dose metronomic cyclophosphamide therapy in mice. Molecular cancer therapeutics
6, 2280-2289 (2007).
154. C. Lee, X. Ding, D. S. Riddick, Downregulation of mouse hepatic CYP3A protein by 3-
methylcholanthrene does not require cytochrome P450-dependent metabolism. Drug
metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 41, 1782-1786 (2013).
155. D. C. Yeomans, V. Pirec, H. K. Proudfit, Nociceptive responses to high and low rates
of noxious cutaneous heating are mediated by different nociceptors in the rat:
behavioral evidence. Pain 68, 133-140 (1996).
156. D. C. Yeomans, H. K. Proudfit, Nociceptive responses to high and low rates of
noxious cutaneous heating are mediated by different nociceptors in the rat:
electrophysiological evidence. Pain 68, 141-150 (1996).
157. G. S. Ling, G. W. Pasternak, Spinal and supraspinal opioid analgesia in the mouse:
the role of subpopulations of opioid binding sites. Brain research 271, 152-156
(1983).
158. S. Kawasaki-Yatsugi et al., Automated measurement of spontaneous pain-associated
limb movement and drug efficacy evaluation in a rat model of neuropathic pain.
European journal of pain (London, England) 16, 1426-1436 (2012).
159. T. W. Adamson et al., Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of
mice after surgical removal of the mammary fat pad. Journal of the American
Association for Laboratory Animal Science : JAALAS 49, 610-616 (2010).
160. D. J. Langford et al., Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat
Methods 7, 447-449 (2010).
161. P. Jirkof et al., Assessment of postsurgical distress and pain in laboratory mice by
nest complexity scoring. Laboratory animals 47, 153-161 (2013).
162. J. K. Belknap, M. Lame, P. W. Danielson, Inbred strain differences in morphine-
induced analgesia with the hot plate assay: a reassessment. Behavior genetics 20,
333-338 (1990).
163. A. W. Bannon, A. B. Malmberg, Models of nociception: hot-plate, tail-flick, and
formalin tests in rodents. Current protocols in neuroscience / editorial board,
Jacqueline N. Crawley ... [et al.] Chapter 8, Unit 8 9 (2007).
164. K. M. Faller, D. J. McAndrew, J. E. Schneider, C. A. Lygate, Refinement of analgesia
following thoracotomy and experimental myocardial infarction using the Mouse
Grimace Scale. Experimental physiology 100, 164-172 (2015).
165. L. Jia, X. Liu, The conduct of drug metabolism studies considered good practice (II):
in vitro experiments. Current drug metabolism 8, 822-829 (2007).
166. D. Zhang, G. Luo, X. Ding, C. Lu, Preclinical experimental models of drug metabolism
and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B 2,
549-561 (2012).
167. S. Muruganandan, C. J. Sinal, Mice as clinically relevant models for the study of
cytochrome P450-dependent metabolism. Clin Pharmacol Ther 83, 818-828 (2008).
168. P. Godoy et al., Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary
hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and
their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME.
Archives of toxicology 87, 1315-1530 (2013).
169. OECD, OECD Guideline for the testing of chemicals, Toxicokinetics No. 417. (2010).
170. T. Uehara et al., Heterogeneous Liver Lobe Responses of Carbon Tetrachloride-
Induced Hepatotoxicity in Male Rats Pretreated with Hepatic Enzyme-Inducing
Agents. J Toxicol Pathol 17, 223–230 (2004).
Literaturverzeichnis
95
171. M. Martignoni, G. M. Groothuis, R. de Kanter, Species differences between mouse,
rat, dog, monkey and human CYP-mediated drug metabolism, inhibition and
induction. Expert opinion on drug metabolism & toxicology 2, 875-894 (2006).
172. L. Gong, C. M. Zhang, J. F. Lv, H. H. Zhou, L. Fan, Polymorphisms in cytochrome
P450 oxidoreductase and its effect on drug metabolism and efficacy.
Pharmacogenetics and genomics 27, 337-346 (2017).
173. H. F. Zhang et al., Correlation of Cytochrome P450 Oxidoreductase Expression with
the Expression of 10 Isoforms of Cytochrome P450 in Human Liver. Drug Metab
Dispos 44, 1193-1200 (2016).
174. T. Kashiwagi, T. Kamada, H. Abe, Dynamic studies on the portal hemodynamics of
scintiphotosplenoportography. Streamline flow in the human portal vein.
Gastroenterology 69, 1292-1296 (1975).
175. Y. Shirai et al., Colorectal carcinoma metastases to the liver. Does primary tumor
location affect its lobar distribution? Cancer 77, 2213-2216 (1996).
176. G. H. Copher, B. M. Dick, "stream line" phenomena in the portal vein and the
selective distribution of portal blood in the liver. Archives of Surgery 17, 408-419
(1928).
177. T. Oinonen, K. O. Lindros, Zonation of hepatic cytochrome P-450 expression and
regulation. The Biochemical journal 329 ( Pt 1), 17-35 (1998).
178. D. E. Malarkey, K. Johnson, L. Ryan, G. Boorman, R. R. Maronpot, New insights into
functional aspects of liver morphology. Toxicol Pathol 33, 27-34 (2005).
179. J. W. Allen, S. N. Bhatia, Formation of steady-state oxygen gradients in vitro:
application to liver zonation. Biotechnology and bioengineering 82, 253-262 (2003).
180. P. Maier, B. Saad, H. P. Schawalder, Effect of periportal- and centrilobular-equivalent
oxygen tension on liver specific functions in long-term rat hepatocyte cultures.
Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA 8,
423-435 (1994).
181. W. Sadee et al., Pharmacogenomics of the RNA world: structural RNA
polymorphisms in drug therapy. Clin Pharmacol Ther 89, 355-365 (2011).
182. H. C. Evans, S. E. Easthope, Transdermal buprenorphine. Drugs 63, 1999-2010;
discussion 2011-1992 (2003).
183. H. Hoja et al., Determination of buprenorphine and norbuprenorphine in whole blood
by liquid chromatography-mass spectrometry. J Anal Toxicol 21, 160-165 (1997).
184. B. KuKanich, P. Allen, Comparative pharmacokinetics of intravenous fentanyl and
buprenorphine in healthy greyhound dogs. Journal of veterinary pharmacology and
therapeutics 37, 595-597 (2014).
185. S. D. Roy, E. Roos, K. Sharma, Transdermal delivery of buprenorphine through
cadaver skin. Journal of pharmaceutical sciences 83, 126-130 (1994).
186. M. J. Millan, Multiple opioid systems and pain. Pain 27, 303-347 (1986).
187. J. McDonald, D. G. Lambert, Opioid receptors. BJA Education 15, 219-224 (2015).
188. K. J. Gerhold, R. Drdla-Schutting, S. D. Honsek, L. Forsthuber, J. Sandkuhler,
Pronociceptive and Antinociceptive Effects of Buprenorphine in the Spinal Cord
Dorsal Horn Cover a Dose Range of Four Orders of Magnitude. The Journal of
neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 35, 9580-9594
(2015).
189. J. J. Ballesta, J. Cremades, M. Rodriguez-Munoz, J. Garzon, C. C. Faura, Sensitivity
to mu-opioid receptor-mediated anti-nociception is determined by cross-regulation
between mu- and delta-opioid receptors at supraspinal level. British journal of
pharmacology 166, 309-326 (2012).
190. S. Ide et al., Buprenorphine antinociception is abolished, but naloxone-sensitive
reward is retained, in mu-opioid receptor knockout mice. Neuropsychopharmacology :
official publication of the American College of Neuropsychopharmacology 29, 1656-
1663 (2004).
191. S. G. Grinnell et al., Mediation of buprenorphine analgesia by a combination of
traditional and truncated mu opioid receptor splice variants. Synapse (New York,
N.Y.) 70, 395-407 (2016).
Literaturverzeichnis
96
192. R. M. Bryant, J. E. Olley, M. B. Tyers, Antinociceptive actions of morphine and
buprenorphine given intrathecally in the conscious rat. British journal of pharmacology
78, 659-663 (1983).
193. T. Yamamoto, K. Shono, S. Tanabe, Buprenorphine activates mu and opioid receptor
like-1 receptors simultaneously, but the analgesic effect is mainly mediated by mu
receptor activation in the rat formalin test. The Journal of pharmacology and
experimental therapeutics 318, 206-213 (2006).
194. K. A. Gergen, J. E. Zadina, A. J. Kastin, D. Paul, Intrathecal Tyr-W-MIF-1 produces
potent, naloxone-reversible analgesia modulated by alpha 2-adrenoceptors.
European journal of pharmacology 298, 235-239 (1996).
195. D. Paul, R. J. Bodnar, M. A. Gistrak, G. W. Pasternak, Different mu receptor subtypes
mediate spinal and supraspinal analgesia in mice. European journal of pharmacology
168, 307-314 (1989).
196. C. G. Pick, R. J. Nejat, G. W. Pasternak, Independent expression of two
pharmacologically distinct supraspinal mu analgesic systems in genetically different
mouse strains. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 265, 166-
171 (1993).
197. A. S. Moskowitz, R. R. Goodman, Autoradiographic analysis of mu1, mu2, and delta
opioid binding in the central nervous system of C57BL/6BY and CXBK (opioid
receptor-deficient) mice. Brain research 360, 108-116 (1985).
198. M. Narita, S. Imai, Y. Itou, Y. Yajima, T. Suzuki, Possible involvement of mu1-opioid
receptors in the fentanyl- or morphine-induced antinociception at supraspinal and
spinal sites. Life sciences 70, 2341-2354 (2002).
199. D. Wang et al., Functional Divergence of Delta and Mu Opioid Receptor Organization
in CNS Pain Circuits. Neuron 98, 90-108.e105 (2018).
200. Z. Ding, R. B. Raffa, Identification of an additional supraspinal component to the
analgesic mechanism of action of buprenorphine. British journal of pharmacology
157, 831-843 (2009).
201. J. Xu et al., Alternatively spliced mu opioid receptor C termini impact the diverse
actions of morphine. The Journal of clinical investigation 127, 1561-1573 (2017).
202. F. Viguier, B. Michot, M. Hamon, S. Bourgoin, Multiple roles of serotonin in pain
control mechanisms--implications of 5-HT(7) and other 5-HT receptor types.
European journal of pharmacology 716, 8-16 (2013).
203. Y. B. Peng, Q. Lin, W. D. Willis, The role of 5-HT3 receptors in periaqueductal gray-
induced inhibition of nociceptive dorsal horn neurons in rats. The Journal of
pharmacology and experimental therapeutics 276, 116-124 (1996).
204. R. I. Taber, M. B. Latranyi, Antagonism of the analgesic effect of opioid and non-
opioid agents by p-chlorophenylalanine (PCPA). European journal of pharmacology
75, 215-222 (1981).
205. D. A. Diniz et al., Serotonin induces peripheral antinociception via the opioidergic
system. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie 97,
1434-1437 (2017).
206. C. Heinl, R. Drdla-Schutting, D. N. Xanthos, J. Sandkuhler, Distinct mechanisms
underlying pronociceptive effects of opioids. The Journal of neuroscience : the official
journal of the Society for Neuroscience 31, 16748-16756 (2011).
207. L. L. Tan et al., A pathway from midcingulate cortex to posterior insula gates
nociceptive hypersensitivity. Nature neuroscience 20, 1591-1601 (2017).
208. P. K. Gillman, Monoamine oxidase inhibitors, opioid analgesics and serotonin toxicity.
British journal of anaesthesia 95, 434-441 (2005).
209. G. G. Graham, M. J. Davies, R. O. Day, A. Mohamudally, K. F. Scott, The modern
pharmacology of paracetamol: therapeutic actions, mechanism of action, metabolism,
toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology 21, 201-232
(2013).
210. R. Rastogi, R. A. Swarm, T. A. Patel, Case scenario: opioid association with serotonin
syndrome: implications to the practitioners. Anesthesiology 115, 1291-1298 (2011).
Literaturverzeichnis
97
211. A. L. Svingos, C. Chavkin, E. E. Colago, V. M. Pickel, Major coexpression of kappa-
opioid receptors and the dopamine transporter in nucleus accumbens axonal profiles.
Synapse (New York, N.Y.) 42, 185-192 (2001).
212. G. Gerra et al., Buprenorphine treatment outcome in dually diagnosed heroin
dependent patients: A retrospective study. Progress in neuro-psychopharmacology &
biological psychiatry 30, 265-272 (2006).
213. G. Gerra et al., Buprenorphine versus methadone for opioid dependence: predictor
variables for treatment outcome. Drug and alcohol dependence 75, 37-45 (2004).
214. G. Gerra et al., Association between gene variants and response to buprenorphine
maintenance treatment. Psychiatry research 215, 202-207 (2014).
215. J. Henke, W. Erhardt, S. Tacke, Analgesieprotokoll vor, während und nach der
Anästhesie von Hunden und Katzen mit schmerzhaften Zuständen. Tierärztl Prax 36,
27-34 (2008).
216. W. Erhardt, J. Henk, J. Haberstroh, Anästhesie und Analgesie beim Klein- und
Heimtier sowie bei Vögeln, Reptilien, Amphibien und Fischen. (Schattauer GmbH,
Stuttgart, 2004).
217. N. Takeda, S. Hasegawa, M. Morita, T. Matsunaga, Pica in rats is analogous to
emesis: an animal model in emesis research. Pharmacology, biochemistry, and
behavior 45, 817-821 (1993).
218. P. Cinelli, A. Rettich, B. Seifert, K. Burki, M. Arras, Comparative analysis and
physiological impact of different tissue biopsy methodologies used for the genotyping
of laboratory mice. Laboratory animals 41, 174-184 (2007).
219. M. K. Meijer, A. G. Lemmens, B. F. Van Zutphen, V. Baumans, Urinary corticosterone
levels in mice in response to intraperitoneal injections with saline. Journal of applied
animal welfare science : JAAWS 8, 279-283 (2005).
220. M. K. Meijer, B. M. Spruijt, L. F. van Zutphen, V. Baumans, Effect of restraint and
injection methods on heart rate and body temperature in mice. Laboratory animals 40,
382-391 (2006).
221. I. Belfer et al., Pain modality- and sex-specific effects of COMT genetic functional
variants. Pain 154, 1368-1376 (2013).
222. J. S. Mogil, Sex differences in pain and pain inhibition: multiple explanations of a
controversial phenomenon. Nature reviews. Neuroscience 13, 859-866 (2012).
223. J. S. Mogil, E. J. Chesler, S. G. Wilson, J. M. Juraska, W. F. Sternberg, Sex
differences in thermal nociception and morphine antinociception in rodents depend on
genotype. Neuroscience and biobehavioral reviews 24, 375-389 (2000).
Anhang
98
Anhang
Abbildung S1: Spezifische Inhibierung der CYP3A Aktivität
Spezifische Inhibierung der CYP3A Aktivität mittels Ketoconazol und Troleandomycin in pmol D-Luciferin
pro µg Protein und Minute in der gesamten Leber von männlichen C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ
Mäusen (gepoolte Proben aus n = 8 Individuen pro Stamm). Die Werte sind dargestellt als
Mittelwert ± Standardabweichung (technische Triplikate).
Anhang
99
Die in Abbildung S2 dargestellten Ergebnisse wurden nach den unter 2.2.2.4 und 2.2.2.5
beschriebenen Methoden erstellt. Für die Analyse der Aktivitäten wurden die kommerziell
erhältlichen Kits P450-GloTM CYP1A1 Assay (Luciferin-CEE), P450-GloTM CYP1A2 Induction/
Inhibition Assay (Luciferin-1A2), P450-GloTM CYP2D6 Assay (Luciferin-ME EGE) der Firma
Promega GmbH (Mannheim, D) und für die Analyse des Proteingehaltes die kommerziell
erhältlichen Kits Mouse Cytochrome P450 1A1(CYP1A1) ELISA kit (EIab®, Wuhan (CHN)),
Mouse Cytochrome P450 1A2 (CYP1A2) ELISA kit (SED294Mu) (Cloud-Clone Corp., Huston
(USA)) und Mouse Cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) ELISA kit (BlueGene Biotech,
Shanghai (CHN)) verwendet.
Abbildung S2: CYP Aktivität und Proteingehalt in den Leberlappen männlicher C57BL/6J
Mäuse
Lobuläre Aktivität der A) CYP1A1, B) CYP1A2 und C) CYP2D Enzyme und lobulärer Proteingehalt der
D) CYP1A1, E) CYP1A2 und F) CYP2D Isozyme in den vier Leberlappen und dem Proc. p.
(MW ± SD, n = 10; P-Wert < 0,05; * vs. Lobus s. l., # vs Lobus m., Friedman Test mit Dunn’s multiple
comparison). Die schwarz gestrichelte Linie repräsentiert den theoretisch errechneten gewichteten
Mittelwert (WA) (Tabelle S12 - S17). Abkürzungen: Lobus sinister lateralis (Lobus s. l.), Lobus
medialis (Lobus m.), Lobus dexter lateralis (Lobus d. l.), Lobus caudatus (Lobus c.) und Processus
papillaris (Proc. p.).
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Anhang
100
Die in Abbildung S3 – S6 dargestellten Ergebnisse wurden nach den unter 2.2.2.4 und
2.2.2.5 beschriebenen Methoden erstellt. Die entsprechenden verwendeten Materialien sind
im Material- und Methodenteil aufgelistet.
Abbildung S3: Effekt von Buprenorphin auf die Aktivität und den Proteingehalt von CYP3A
A) CYP3A Aktivität und B) Proteingehalt in Lebermikrosomen männlicher C57BL/6J Mäuse, die
30 min vor der Tötung mit unterschiedlichen Dosen an Buprenorphin behandelt wurden (MW ± SD,
n = 3, Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s multiple comparison).
A
B
Anhang
101
Abbildung S4: Effekt von Buprenorphin auf die Genexpression der Cyp3a Enzyme und CPR
Dargestellt ist der fold change der relativen hepatischen Genexpression männlicher C57BL/6J
Mäuse, die mit unterschiedlichen Dosen an Buprenorphin behandelt wurden, bezogen auf die
0,00 mg/kg Kontrollgruppe (MW ± SD, n = 3, Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s multiple comparison
auf log transformierten Daten).
Anhang
102
Abbildung S5: Dosis- und stammabhängige Aktivität und Expression von CYP3A
A) Aktivität und B) Proteingehalt von CYP3A Enzymen in Lebermikrosomen männlicher Mäuse, die
30 min vor der Tötung mit verschiedenen Dosen an Buprenorphin behandelt wurden (Box Plot mit
Median und [5./ 95. Perzentile]; 0,42 mg/kg n = 10; 4,0 mg/kg n = 5; Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s
multiple comparison).
A
B
Abbildung S6: Effekt von Buprenorphin auf die relative Genexpression von CYP3A Isozymen
und CPR in unterschiedlichen Inzuchtstämmen
Dargestellt ist die durchschnittliche relative hepatische Genexpression + SD in männlichen Mäusen, mit
(hellgrau) und ohne (dunkelgrau) vorherige Behandlung von Buprenorphin (naive Tiere n = 8,
Buprenorphin Tiere n = 15; zweiseitiger Mann-Whitney Test, P-Wert < 0,05: * vs. Naive Tiere). Da die
mit Buprenorphin behandelten Tiere keinen dosisabhängigen Effekt aufwiesen, wurden diese
zusammengefasst dargestellt.
Anhang
103
Abbildung S8: Stammesabhängige Ugt2b Enzym Genexpression
Dargestellt ist die durchschnittliche hepatische Genexpression in männlichen Mäusen (MW + SD,
n = 8, Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s multiple comparison; P-Wert < 0,05, # Balb/cJ vs.
129S1/SvImJ).
Die in Abbildung S7 und S8 dargestellten Ergebnisse wurden nach den unter 2.2.2.5
beschriebenen Methoden erstellt. Die zur Analyse verwendeten Primer sind in Tabelle S32
im Anhang aufgeführt.
Abbildung S7: Stammesabhängige Ugt1a Enzym Genexpression
Dargestellt ist die durchschnittliche hepatische Genexpression in männlichen Mäusen (MW + SD,
n = 8, Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s multiple comparison; P-Wert < 0,05, # Balb/cJ vs.
129S1/SvImJ).
Anhang
104
Die in Abbildung S9 dargestellten Ergebnisse wurden nach den unter 2.2.2.4 und 2.2.2.5
beschriebenen Methoden erstellt. Für die Analyse der Aktivitäten wurden die kommerziell
erhältlichen Kits P450-GloTM CYP1A1 Assay (Luciferin-CEE), P450-GloTM CYP1A2 Induction/
Inhibition Assay (Luciferin-1A2), P450-GloTM CYP2D6 Assay (Luciferin-ME EGE) der Firma
Promega GmbH (Mannheim, D) und für die Analyse des Proteingehaltes die kommerziell
erhältlichen Kits Mouse Cytochrome P450 1A1(CYP1A1) ELISA kit (EIab®, Wuhan (CHN)),
Mouse Cytochrome P450 1A2 (CYP1A2) ELISA kit (SED294Mu) (Cloud-Clone Corp., Huston
(USA)) und Mouse Cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) ELISA kit (BlueGene Biotech,
Shanghai (CHN)) verwendet.
Abbildung S9: Stammesabhängige CYP Aktivität und Proteingehalt
Stammesabhängige Aktivität der A) CYP1A1, B) CYP1A2 und C) CYP2D und stammesabhängiger
Proteingehalt der D) CYP1A1, E) CYP1A2 und F) CYP2D Enzyme in der gesamten Leber männlicher
Mäuse (MW + SD, n = 8, P-Wert < 0,05: * vs. C57BL/6J, # 129S1/SvImJ vs. Balb/cJ, Kruskal-Wallis
Test mit Dunn’s multiple comparison) (exakte Werte im Anhang: Tabelle S29 – S34).
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Anhang
105
Nr.1 Spezies Mausstamm2 Geschlecht Mikrosomen
verwendet
Leber gepoolte
Leber
kommerzielle
Mikrosomen
Teilstück
der Leber
1 Human keine Angaben
2 Maus other Männl. Ja Ja Ja
3 Ratte other keine Angaben Ja Ja Ja
4 Maus Sv/129 keine Angaben Ja Ja
5 Maus Sv/129 keine Angaben Ja Ja
6 Maus C57BL/6 Männl./ Weibl. Ja Ja
7 Maus keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
8 Maus C57BL/6 keine Angaben Ja Ja
9 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
10 Maus keine Angaben Ja Ja Ja
11 Maus Männl. Ja Ja
12 Maus
CD-1
C57BL/6
DBA Männl. Ja Ja
13 Ratte, Hund,
Human, Affe Ja Ja
Maus C57BL/6 Männl. Nein
15 Human, Ratte Ja Ja Ja
16 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
17 Maus other keine Angaben Ja Ja
18 Maus, Ratte,
Human Balb/c keine Angaben Ja Ja Ja
19 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
20 Maus keine Angaben keine Angaben Ja Ja
21 Maus ICR Männl. Ja Ja
22 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
23 Maus keine Angaben keine Angaben Ja
24 Human Ja Ja
25 Maus other keine Angaben Ja Ja
26 Maus ICR Männl. Ja Ja
27 Maus keine Angaben keine Angaben Ja Ja
14
1 Nummerierung Literatur in Übereinstimmung mit dem folgenden Literaturverzeichnis, 2 bzw. Hintergrundstamm,
Tabelle S1: Übersicht der verwendeten Literatur aus PubMed zur systematischen Analyse des durchschnittlich verwendeten
Ausgnagsmaterials zur Leber Mikrosomenisolation
Anhang
106
Nr.1 Spezies Mausstamm2 Geschlecht Mikrosomen
verwendet
Leber gepoolte
Leber
kommerzielle
Mikrosomen
Teilstück
der Leber
28 Maus weitere keine Angaben Ja Ja
29 Maus keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
30 Human keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
31 Maus DBA Weibl. Ja Ja
32 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
33 Maus FVB Weibl. Ja Ja
34 Maus keine Angaben Ja Ja
35 Maus
CD-1
keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
36 Maus Männl. Ja Ja Ja
37 Maus keine Angaben Ja
38 Maus Männl. Ja Ja
39 Ratte Männl. Ja Ja
40 Maus Weibl. Ja Ja
41 Maus Männl. Ja Ja
42 Maus Männl. Ja Ja
43 Maus Männl. Nein
44 Maus keine Angaben Nein
45 Maus Männl. Ja Ja
46 Maus Männl. Ja Ja Ja
47 Maus Männl. Ja Ja
48 Maus keine Angaben Ja Ja Ja
49 Maus Männl./ Weibl. Ja Ja Ja
50 Human Ja Ja Ja
51 Maus Männl. Ja Ja
52 Maus Weibl. Ja Ja
53 Maus Männl. Ja Ja
54 Maus Weibl. Ja Ja
55 Maus Männl. Ja Ja
56 Maus Männl. Ja Ja Ja
57 Maus keine Angaben Ja
58 Maus
CD-1
keine Angaben
weitere weitere
C57BL/6
Sv/129 weitere
ICR
ICR
Balb/c
FVB
weitere
keine Angaben
C57BL/6
weitere
ICR
C57BL/6
C57BL/6
C57BL/6
ICR
C57BL/6 keine
Angaben keine
Angaben
keine Angaben Ja Ja Ja
59 Ratte, Humane keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
60 Maus weitere Männl. Ja Ja
Fortsetzung Tabelle S1
1 Nummerierung Literatur in Übereinstimmung mit dem folgenden Literaturverzeichnis, 2 bzw. Hintergrundstamm,
Anhang
107
Nr.1 Spezies Mausstamm2 Geschlecht Mikrosomen
verwendet
Leber gepoolte
Leber
kommerzielle
Mikrosomen
Teilstück
der Leber
61 Maus C57BL/6 Männl./ Weibl. Ja Ja Ja
62 Maus CD-1 keine Angaben Ja
63
64 Maus C57BL/6 Weibl. Nein
65 Maus Männl. Ja Ja
66 Maus Weibl. Ja Ja
67 Maus
CD-1
Balb/c
C57BL/6 keine Angaben Ja Ja
68 Maus Männl. Ja Ja Ja
69 Maus Männl. Ja Ja
70 Maus, Ratte,
Human
CD-1
ICR
keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
71 Maus Sv/129 keine Angaben Ja Ja
72 Human Männl./Weibl. Ja Ja Ja
73 Maus C57BL/6 keine Angaben Ja Ja Ja
74 Maus keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
75 Maus ICR Männl. Ja Ja
76 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja Ja Ja
77 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja Ja
78 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja 2
79 Maus keine Angaben keine Angaben Ja Ja
80 Maus C57BL/6 Männl. Ja
81 Nein
82 Maus weitere Männl. Nein
83 Maus Balb/c Männl. Ja Ja
84 Human Ja Ja Ja
85 Maus C57BL/6 keine Angaben Ja Ja
86 Ratte, Humane keine Angaben keine Angaben Ja
87 Maus Männl. Ja Ja Ja
88 Maus
CD-1
keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
89 Maus keine Angaben Ja Ja Ja
90 Maus Männl. Ja Ja Ja
91 Maus
CD-1
keine Angaben
C57BL/6 Weibl. Ja
Fortsetzung Tabelle S1
1 Nummerierung Literatur in Übereinstimmung mit dem folgenden Literaturverzeichnis, 2 bzw. Hintergrundstamm,
Anhang
108
Nr.1 Spezies Mausstamm2 Geschlecht Mikrosomen
verwendet
Leber gepoolte
Leber
kommerzielle
Mikrosomen
Teilstück
der Leber
92 Maus keine Angaben keine Angaben Ja Ja
93 Maus weitere keine Angaben Ja Ja
94 Maus ICR Männl. Ja Ja
95 Maus weitere Männl. Ja Ja
96 Maus ICR Männl. Ja Ja
97 Maus Sv/129 Männl./ Weibl. Ja Ja
98 Maus C57BL/6 Weibl. Ja Ja
99 Ratte, Human keine Angaben keine Angaben Ja
100 Maus ICR Männl. Ja Ja
101 Maus C57BL/6 keine Angaben Ja
102 Maus weitere keine Angaben Ja Ja Ja
103 Maus weitere Weibl. Nein
104 Maus Balb/c Männl. Ja Ja
105 Maus Nein
106 Maus keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
107 Maus weitere keine Angaben Ja
108 Maus C57BL/6 Weibl. Ja Ja
109 Maus keine Angaben Männl. Ja Ja
110 Maus keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
111 Nicht auswertbar da russisch
112 Maus Sv/129 keine Angaben Ja Ja
113 Maus weitere Weibl. Ja Ja Ja
114 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
115 Maus keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
116 Maus Männl. Ja Ja Ja
117 Maus Weibl. Ja Ja
118 Maus
CD-1
FVB
C57BL/6 keine Angaben Ja Ja
119 Nicht auswertbar da russisch
120 Maus Keine Angaben Keine Angaben Ja Ja
121 Maus weitere Männl. Ja Ja
122 Maus keine Angaben keine Angaben Ja Ja Ja
123 Human Ja
Fortsetzung Tabelle S1
1 Nummerierung Literatur in Übereinstimmung mit dem folgenden Literaturverzeichnis, 2 bzw. Hintergrundstamm,
Anhang
109
Nr.1 Spezies Mausstamm2 Geschlecht Mikrosomen
verwendet
Leber gepoolte
Leber
kommerzielle
Mikrosomen
Teilstück
der Leber
124 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
125 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
126 Maus CD-1 Männl. Ja Ja
127 Human Ja
128 Maus ICR Männl. Ja Ja
129 Maus C57BL/6 keine Angaben Ja
130 Maus C57BL/6 keine Angaben Ja Ja
131 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja Ja
132 Nicht auswertbar da chinesisch
133 Maus CD-1 Männl. Ja Ja
134 Human Ja
135 Maus weitere keine Angaben Ja Ja
136 Nicht auswertbar da chinesisch
137 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
138 Maus Weibl. Nein
139 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
140 Human Ja
141 Human Ja
142 Maus weitere Männl. Ja Ja
143 Maus weitere Weibl. Nein
144 Ratte, Human Ja Ja Ja
145 Maus C57BL/6 Weibl. Ja Ja
146 Maus weitere Männl./ Weibl. Ja Ja
147 Maus CD-1 Männl. Ja Ja
148 Nicht auswertbar da russisch
149 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
150 Maus ICR Männl. Ja Ja
151 Maus Sv/129 Weibl. Ja Ja
152 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
153 Human Ja
154 Human Ja
155 Maus Balb/c Männl. Nein
Fortsetzung Tabelle S1
1 Nummerierung Literatur in Übereinstimmung mit dem folgenden Literaturverzeichnis, 2 bzw. Hintergrundstamm,
Anhang
110
Nr.1 Spezies Mausstamm2 Geschlecht Mikrosomen
verwendet
Leber gepoolte
Leber
kommerzielle
Mikrosomen
Teilstück
der Leber
156 Maus DBA keine Angaben Ja Ja
157 Maus C57BL/6 Männl. Ja Ja
158 Maus CD-1 Männl. Nein
159 Maus Männl. Ja Ja Ja
160 Maus keine Angaben Ja Ja
161 Maus Weibl. Ja Ja Ja
162 Maus Männl. Ja Ja Ja
163 Maus Weibl. Ja Ja
164 Maus
CD-1
C57BL/6
DBA
C57BL/6
other
C57BL/6 keine Angaben Ja Ja
165 Maus Männl. Ja Ja
166 Maus Männl. Ja Ja
167 Maus
CD-1
Balb/c
C57BL/6 Männl. Ja
168 Maus CD-1 Männl./ Weibl. Ja Ja Ja
1Nummerierun 2bzw. Hintergrundstamm,
g Literatur in Übereinstimmung mit dem folgenden Literaturverzeichnis, 1
Fortsetzung Tabelle S1
Anhang
111
Ergänzung: Literatur PubMed Analyse von Tabelle S1
1. J. Zhang et al., Cytochrome P450 Isoforms in the Metabolism of Decursin and Decursinol
Angelate from Korean Angelica. The American journal of Chinese medicine 43, 1211-1230
(2015).
2. J. D. Xie et al., Fentanyl Enhances Hepatotoxicity of Paclitaxel via Inhibition of CYP3A4 and
ABCB1 Transport Activity in Mice. PloS one 10, e0143701 (2015).
3. S. Wei et al., Impact of chrysosplenetin on the pharmacokinetics and anti-malarial efficacy of
artemisinin against Plasmodium berghei as well as in vitro CYP450 enzymatic activities in rat
liver microsome. Malaria journal 14, 432 (2015).
4. S. Wang, D. Bott, A. Tung, K. S. Sugamori, D. M. Grant, Relative Contributions of CYP1A2
and CYP2E1 to the Bioactivation and Clearance of 4-Aminobiphenyl in Adult Mice. Drug
metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 43, 916-921 (2015).
5. S. Wang, K. S. Sugamori, A. Tung, J. P. McPherson, D. M. Grant, N-hydroxylation of 4-
aminobiphenyl by CYP2E1 produces oxidative stress in a mouse model of chemically induced
liver cancer. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology 144, 393-
405 (2015).
6. Y. C. Tien et al., Dose of Phenobarbital and Age of Treatment at Early Life are Two Key
Factors for the Persistent Induction of Cytochrome P450 Enzymes in Adult Mouse Liver. Drug
metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 43, 1938-1945 (2015).
7. J. Sun et al., Guanfu base A, an antiarrhythmic alkaloid of Aconitum coreanum, Is a CYP2D6
inhibitor of human, monkey, and dog isoforms. Drug metabolism and disposition: the biological
fate of chemicals 43, 713-724 (2015).
8. N. Scheer et al., Defining Human Pathways of Drug Metabolism In Vivo through the
Development of a Multiple Humanized Mouse Model. Drug metabolism and disposition: the
biological fate of chemicals 43, 1679-1690 (2015).
9. C. Z. Qin et al., Mechanism-based inhibition of Alantolactone on human cytochrome P450 3A4
in vitro and activity of hepatic cytochrome P450 in mice. Journal of ethnopharmacology 168,
146-149 (2015).
10. J. Ning et al., Characterization of phase I metabolism of resibufogenin and evaluation of the
metabolic effects on its antitumor activity and toxicity. Drug metabolism and disposition: the
biological fate of chemicals 43, 299-308 (2015).
11. K. Muta, T. Fukami, M. Nakajima, A proposed mechanism for the adverse effects of
acebutolol: CES2 and CYP2C19-mediated metabolism and antinuclear antibody production.
Biochemical pharmacology 98, 659-670 (2015).
12. S. N. Muhsain, M. A. Lang, A. Abu-Bakar, Mitochondrial targeting of bilirubin regulatory
enzymes: An adaptive response to oxidative stress. Toxicology and applied pharmacology
282, 77-89 (2015).
13. K. W. Mosure et al., Preclinical Pharmacokinetics and In Vitro Metabolism of Asunaprevir
(BMS-650032), a Potent Hepatitis C Virus NS3 Protease Inhibitor. Journal of pharmaceutical
sciences 104, 2813-2823 (2015).
14. N. Moskaleva et al., Spaceflight Effects on Cytochrome P450 Content in Mouse Liver. PloS
one 10, e0142374 (2015).
15. Y. Ma et al., Design and optimization of a series of 1-sulfonylpyrazolo[4,3-b]pyridines as
selective c-Met inhibitors. Journal of medicinal chemistry 58, 2513-2529 (2015).
16. Q. L. Lv et al., In Vitro and in Vivo Inhibitory Effects of Glycyrrhetinic Acid in Mice and Human
Cytochrome P450 3A4. International journal of environmental research and public health 13,
84 (2015).
17. X. Liu et al., Metabolomics reveals the formation of aldehydes and iminium in gefitinib
metabolism. Biochemical pharmacology 97, 111-121 (2015).
18. G. I. Lepesheva et al., VFV as a New Effective CYP51 Structure-Derived Drug Candidate for
Chagas Disease and Visceral Leishmaniasis. The Journal of infectious diseases 212, 1439-
1448 (2015).
19. S. Y. Lee, J. Y. Lee, Y. M. Kim, S. K. Kim, S. J. Oh, Expression of hepatic cytochrome P450s
and UDP-glucuronosyltransferases in PXR and CAR double humanized mice treated with
rifampicin. Toxicology letters 235, 107-115 (2015).
20. J. Y. Lee, S. Y. Lee, K. Lee, S. J. Oh, S. K. Kim, Determination of species-difference in
microsomal metabolism of amitriptyline using a predictive MRM-IDA-EPI method. Chemico-
biological interactions 229, 109-118 (2015).
21. O. K. Kwon et al., Comprehensive Analysis of in Vivo Phosphoproteome of Mouse Liver
Microsomes. Journal of proteome research 14, 5215-5224 (2015).
Anhang
112
22. H. C. Kwak, H. C. Kim, S. J. Oh, S. K. Kim, Effects of age increase on hepatic expression and
activity of cytochrome P450 in male C57BL/6 mice. Archives of pharmacal research 38, 857-
864 (2015).
23. T. M. Keck et al., Using click chemistry toward novel 1,2,3-triazole-linked dopamine D3
receptor ligands. Bioorganic & medicinal chemistry 23, 4000-4012 (2015).
24. F. Kazmi, J. E. Barbara, P. Yerino, A. Parkinson, A long-standing mystery solved: the
formation of 3-hydroxydesloratadine is catalyzed by CYP2C8 but prior glucuronidation of
desloratadine by UDP-glucuronosyltransferase 2B10 is an obligatory requirement. Drug
metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 43, 523-533 (2015).
25. K. Kato et al., Development of Murine Cyp3a Knockout Chimeric Mice with Humanized Liver.
Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 43, 1208-1217 (2015).
26. J. S. Jeon et al., Metabolic characterization of meso-dihydroguaiaretic acid in liver
microsomes and in mice. Food and chemical toxicology : an international journal published for
the British Industrial Biological Research Association 76, 94-102 (2015).
27. R. Jayaraman, M. K. Pasha, A. Williams, K. C. Goh, K. Ethirajulu, Metabolism and Disposition
of Pacritinib (SB1518), an Orally Active Janus Kinase 2 Inhibitor in Preclinical Species and
Humans. Drug metabolism letters 9, 28-47 (2015).
28. C. J. Henderson, L. A. McLaughlin, N. Scheer, L. A. Stanley, C. R. Wolf, Cytochrome b5 is a
major determinant of human cytochrome P450 CYP2D6 and CYP3A4 activity in vivo.
Molecular pharmacology 87, 733-739 (2015).
29. H. Hashimoto et al., Identification of a major radiometabolite of [11C]PBB3. Nuclear medicine
and biology 42, 905-910 (2015).
30. W. Hamaguchi et al., Synthesis, SAR study, and biological evaluation of novel quinoline
derivatives as phosphodiesterase 10A inhibitors with reduced CYP3A4 inhibition. Bioorganic &
medicinal chemistry 23, 297-313 (2015).
31. M. M. Fashe, R. O. Juvonen, A. Petsalo, J. Rasanen, M. Pasanen, Species-Specific
Differences in the in Vitro Metabolism of Lasiocarpine. Chemical research in toxicology 28,
2034-2044 (2015).
32. O. H. Elshenawy, A. O. El-Kadi, Modulation of aryl hydrocarbon receptor-regulated enzymes
by trimethylarsine oxide in C57BL/6 mice: In vivo and in vitro studies. Toxicology letters 238,
17-31 (2015).
33. E. F. Choo et al., Use of transgenic mouse models to understand the oral disposition and
drug-drug interaction potential of cobimetinib, a MEK inhibitor. Drug metabolism and
disposition: the biological fate of chemicals 43, 864-869 (2015).
34. J. Cheng et al., Optimization of 2-phenylcyclopropylmethylamines as selective serotonin 2C
receptor agonists and their evaluation as potential antipsychotic agents. Journal of medicinal
chemistry 58, 1992-2002 (2015).
35. A. L. Blobaum et al., A Screen of Approved Drugs Identifies the Androgen Receptor
Antagonist Flutamide and Its Pharmacologically Active Metabolite 2-Hydroxy-Flutamide as
Heterotropic Activators of Cytochrome P450 3A In Vitro and In Vivo. Drug metabolism and
disposition: the biological fate of chemicals 43, 1718-1726 (2015).
36. T. Yu, X. Chen, Y. Wang, R. Zhao, S. Mao, Modulatory effects of extracts of vinegar-baked
Radix Bupleuri and saikosaponins on the activity of cytochrome P450 enzymes in vitro.
Xenobiotica; the fate of foreign compounds in biological systems 44, 861-867 (2014).
37. B. Yang, W. Liu, K. Chen, Z. Wang, C. Wang, Metabolism of diosbulbin B in vitro and in vivo in
rats: formation of reactive metabolites and human enzymes involved. Drug metabolism and
disposition: the biological fate of chemicals 42, 1737-1750 (2014).
38. T. Sueyoshi et al., Flame retardant BDE-47 effectively activates nuclear receptor CAR in
human primary hepatocytes. Toxicological sciences : an official journal of the Society of
Toxicology 137, 292-302 (2014).
39. M. Stiborova et al., The influence of dicoumarol on the bioactivation of the carcinogen
aristolochic acid I in rats. Mutagenesis 29, 189-200 (2014).
40. M. Stiborova et al., Cytochrome b5 and epoxide hydrolase contribute to benzo[a]pyrene-DNA
adduct formation catalyzed by cytochrome P450 1A1 under low NADPH:P450 oxidoreductase
conditions. Toxicology 318, 1-12 (2014).
41. S. Shen, L. Li, X. Ding, J. Zheng, Metabolism of styrene to styrene oxide and vinylphenols in
cytochrome P450 2F2- and P450 2E1-knockout mouse liver and lung microsomes. Chemical
research in toxicology 27, 27-33 (2014).
42. N. Scheer et al., Deletion of 30 murine cytochrome p450 genes results in viable mice with
compromised drug metabolism. Drug metabolism and disposition: the biological fate of
chemicals 42, 1022-1030 (2014).
Anhang
113
43. J. Ruan, M. Yang, P. Fu, Y. Ye, G. Lin, Metabolic activation of pyrrolizidine alkaloids: insights
into the structural and enzymatic basis. Chemical research in toxicology 27, 1030-1039
(2014).
44. E. J. Park et al., Discovery of novel pyrimidine and malonamide derivatives as TGR5 agonists.
Bioorganic & medicinal chemistry letters 24, 4271-4275 (2014).
45. N. Moriya, H. Kataoka, H. Fujino, J. Nishikawa, F. Kugawa, Different expression patterns of
hepatic cytochrome P450 s during anaphylactic or lipopolysaccharide-induced inflammation.
Die Pharmazie 69, 142-147 (2014).
46. T. Mitsui et al., A useful model capable of predicting the clearance of cytochrome 3A4
(CYP3A4) substrates in humans: validity of CYP3A4 transgenic mice lacking their own Cyp3a
enzymes. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 42, 1540-1547
(2014).
47. K. Liu et al., Role of CYP3A in isoniazid metabolism in vivo. Drug metabolism and
pharmacokinetics 29, 219-222 (2014).
48. Y. Li, L. Wu, Y. Gu, D. Si, C. Liu, Metabolism of aildenafil in vivo in rats and in vitro in mouse,
rat, dog, and human liver microsomes. Drug testing and analysis 6, 552-562 (2014).
49. L. Li, V. Megaraj, Y. Wei, X. Ding, Identification of cytochrome P450 enzymes critical for lung
tumorigenesis by the tobacco-specific carcinogen 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-
butanone (NNK): insights from a novel Cyp2abfgs-null mouse. Carcinogenesis 35, 2584-2591
(2014).
50. B. Lee et al., Potential of decursin to inhibit the human cytochrome P450 2J2 isoform. Food
and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological
Research Association 70, 94-99 (2014).
51. Y. Kusunoki et al., Hepatic early inflammation induces downregulation of hepatic cytochrome
P450 expression and metabolic activity in the dextran sulfate sodium-induced murine colitis.
European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for
Pharmaceutical Sciences 54, 17-27 (2014).
52. S. Kuno et al., Development of mice exhibiting hepatic microsomal activity of human CYP3A4
comparable to that in human liver microsomes by intravenous administration of an adenovirus
vector expressing human CYP3A4. Drug metabolism and pharmacokinetics 29, 296-304
(2014).
53. Y. A. Kazantseva, A. A. Yarushkin, V. O. Pustylnyak, CAR-mediated repression of Foxo1
transcriptional activity regulates the cell cycle inhibitor p21 in mouse livers. Toxicology 321,
73-79 (2014).
54. H. Kakutani et al., In vitro and in vivo induction of cytochrome P450 by coplanar
polychlorinated/brominated biphenyls (Co-PXBs) providing high TEQ in mother's milk in
Japan. Toxicology 324, 68-75 (2014).
55. M. Ishii et al., Total gastrectomy may result in reduced drug effectiveness due to an increase
in the expression of the drug-metabolizing enzyme Cytochrome P450, in the liver. European
journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for
Pharmaceutical Sciences 51, 180-188 (2014).
56. C. J. Henderson et al., A role for cytochrome b5 in the In vivo disposition of anticancer and
cytochrome P450 probe drugs in mice. Drug metabolism and disposition: the biological fate of
chemicals 42, 70-77 (2014).
57. V. S. Gopinath et al., Design, synthesis, ADME characterization and antileishmanial
evaluation of novel substituted quinoline analogs. Bioorganic & medicinal chemistry letters 24,
2046-2052 (2014).
58. F. Du, Z. Liu, X. Li, J. Xing, Metabolic pathways leading to detoxification of triptolide, a major
active component of the herbal medicine Tripterygium wilfordii. Journal of applied toxicology :
JAT 34, 878-884 (2014).
59. I. H. Baek et al., Development of a pharmacokinetic/pharmacodynamic/disease progression
model in NC/Nga mice for development of novel anti-atopic dermatitis drugs. Xenobiotica; the
fate of foreign compounds in biological systems 44, 975-987 (2014).
60. T. Ashino, K. Hakukawa, Y. Itoh, S. Numazawa, Inhibitory effect of synthetic cannabinoids on
CYP1A activity in mouse liver microsomes. The Journal of toxicological sciences 39, 815-820
(2014).
61. P. Zhang et al., Dietary regulation of mouse intestinal P450 expression and drug metabolism.
Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 41, 529-535 (2013).
62. H. K. Zhang et al., Chemistry, pharmacology, and behavioral studies identify chiral
cyclopropanes as selective alpha4beta2-nicotinic acetylcholine receptor partial agonists
Anhang
114
exhibiting an antidepressant profile. Part II. Journal of medicinal chemistry 56, 5495-5504
(2013).
63. K. Yokotani et al., [Effect of three herbal extracts on cytochrome P450 and possibility of
interaction with drugs]. Shokuhin eiseigaku zasshi. Journal of the Food Hygienic Society of
Japan 54, 56-64 (2013).
64. X. Wu, M. Duffel, H. J. Lehmler, Oxidation of polychlorinated biphenyls by liver tissue slices
from phenobarbital-pretreated mice is congener-specific and atropselective. Chemical
research in toxicology 26, 1642-1651 (2013).
65. T. L. Swenson, J. E. Casida, Neonicotinoid formaldehyde generators: possible mechanism of
mouse-specific hepatotoxicity/hepatocarcinogenicity of thiamethoxam. Toxicology letters 216,
139-145 (2013).
66. M. Sutherland et al., Antitumor activity of a duocarmycin analogue rationalized to be
metabolically activated by cytochrome P450 1A1 in human transitional cell carcinoma of the
bladder. Molecular cancer therapeutics 12, 27-37 (2013).
67. M. Stiborova, V. Cerna, M. Moserova, V. M. Arlt, E. Frei, The effect of benzo[a]pyrene on
metabolic activation of anticancer drug ellipticine in mice. Neuro endocrinology letters 34
Suppl 2, 43-54 (2013).
68. S. Smith et al., The pre-clinical absorption, distribution, metabolism and excretion properties of
IPI-926, an orally bioavailable antagonist of the hedgehog signal transduction pathway.
Xenobiotica; the fate of foreign compounds in biological systems 43, 875-885 (2013).
69. W. Sirisangtragul, B. Sripanidkulchai, Moduratory effect of Thai traditional medicine (Yahom
Tultavai) on hepatic cytochrome P450 enzymes and pentobarbital-induced sleeping in mice.
African journal of traditional, complementary, and alternative medicines : AJTCAM 10, 128-
136 (2013).
70. B. M. Silber et al., Pharmacokinetics and metabolism of 2-aminothiazoles with antiprion
activity in mice. Pharmaceutical research 30, 932-950 (2013).
71. T. Y. Shih, T. H. Young, H. S. Lee, C. B. Hsieh, O. Y. Hu, Protective effects of kaempferol on
isoniazid- and rifampicin-induced hepatotoxicity. The AAPS journal 15, 753-762 (2013).
72. P. Pimkaew et al., Interactions of sesquiterpenes zederone and germacrone with the human
cytochrome P450 system. Toxicology in vitro : an international journal published in association
with BIBRA 27, 2005-2012 (2013).
73. K. M. Pianalto, J. H. Hartman, G. Boysen, G. P. Miller, Differences in butadiene adduct
formation between rats and mice not due to selective inhibition of CYP2E1 by butadiene
metabolites. Toxicology letters 223, 221-227 (2013).
74. T. Nishimura et al., Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug
metabolism and a drug-drug interaction. The Journal of pharmacology and experimental
therapeutics 344, 388-396 (2013).
75. L. Li, W. Li, Y. H. Kim, Y. W. Lee, Chlorella vulgaris extract ameliorates carbon tetrachloride-
induced acute hepatic injury in mice. Experimental and toxicologic pathology : official journal
of the Gesellschaft fur Toxikologische Pathologie 65, 73-80 (2013).
76. C. Lee, X. Ding, D. S. Riddick, The role of cytochrome P450-dependent metabolism in the
regulation of mouse hepatic growth hormone signaling components and target genes by 3-
methylcholanthrene. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 41,
457-465 (2013).
77. C. Lee, X. Ding, D. S. Riddick, Downregulation of mouse hepatic CYP3A protein by 3-
methylcholanthrene does not require cytochrome P450-dependent metabolism. Drug
metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 41, 1782-1786 (2013).
78. M. J. LeBaron et al., An integrated approach for prospectively investigating a mode-of-action
for rodent liver effects. Toxicology and applied pharmacology 270, 164-173 (2013).
79. M. Kot et al., Gender-dependent activity of CYP3A is indirectly modified by GR in the
noradrenergic system. Pharmacological reports : PR 65, 1431-1434 (2013).
80. S. D. Kim, M. Antenos, E. J. Squires, G. M. Kirby, Cytochrome P450 2A5 and bilirubin:
mechanisms of gene regulation and cytoprotection. Toxicology and applied pharmacology
270, 129-138 (2013).
81. K. Kaminski, J. Obniska, I. Chlebek, B. Wiklik, S. Rzepka, Design, synthesis and
anticonvulsant properties of new N-Mannich bases derived from 3-phenylpyrrolidine-2,5-
diones. Bioorganic & medicinal chemistry 21, 6821-6830 (2013).
82. Z. Y. Hu et al., Pharmacokinetic evaluation of the anticancer prodrug simmitecan in different
experimental animals. Acta pharmacologica Sinica 34, 1437-1448 (2013).
Anhang
115
83. V. Hosagrahara et al., Effect of repeated dosing on rifampin exposure in BALB/c mice.
European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for
Pharmaceutical Sciences 49, 33-38 (2013).
84. R. Higuchi, T. Fukami, M. Nakajima, T. Yokoi, Prilocaine- and lidocaine-induced
methemoglobinemia is caused by human carboxylesterase-, CYP2E1-, and CYP3A4-
mediated metabolic activation. Drug metabolism and disposition: the biological fate of
chemicals 41, 1220-1230 (2013).
85. C. J. Henderson, L. A. McLaughlin, C. R. Wolf, Evidence that cytochrome b5 and cytochrome
b5 reductase can act as sole electron donors to the hepatic cytochrome P450 system.
Molecular pharmacology 83, 1209-1217 (2013).
86. K. Fukunaga et al., 2-(2-Phenylmorpholin-4-yl)pyrimidin-4(3H)-ones; a new class of potent,
selective and orally active glycogen synthase kinase-3beta inhibitors. Bioorganic & medicinal
chemistry letters 23, 6933-6937 (2013).
87. J. C. Erve et al., Bioactivation of sitaxentan in liver microsomes, hepatocytes, and expressed
human P450s with characterization of the glutathione conjugate by liquid chromatography
tandem mass spectrometry. Chemical research in toxicology 26, 926-936 (2013).
88. J. Y. Choi et al., Rational development of 4-aminopyridyl-based inhibitors targeting
Trypanosoma cruzi CYP51 as anti-chagas agents. Journal of medicinal chemistry 56, 7651-
7668 (2013).
89. H. Chen, D. Soroka, Y. Zhu, S. Sang, Metabolism of ginger component [6]-shogaol in liver
microsomes from mouse, rat, dog, monkey, and human. Molecular nutrition & food research
57, 865-876 (2013).
90. A. L. Blobaum et al., Heterotropic activation of the midazolam hydroxylase activity of CYP3A
by a positive allosteric modulator of mGlu5: in vitro to in vivo translation and potential impact
on clinically relevant drug-drug interactions. Drug metabolism and disposition: the biological
fate of chemicals 41, 2066-2075 (2013).
91. X. Zhou, J. D'Agostino, F. Xie, X. Ding, Role of CYP2A5 in the bioactivation of the lung
carcinogen 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone in mice. The Journal of
pharmacology and experimental therapeutics 341, 233-241 (2012).
92. M. Zhao et al., Stereoselective metabolism of tetrahydropalmatine enantiomers in rat liver
microsomes. Chirality 24, 368-373 (2012).
93. M. F. Yueh, T. Li, R. M. Evans, B. Hammock, R. H. Tukey, Triclocarban mediates induction of
xenobiotic metabolism through activation of the constitutive androstane receptor and the
estrogen receptor alpha. PloS one 7, e37705 (2012).
94. K. Yokotani et al., Hepatic cytochrome P450 mediates interaction between warfarin and
Coleus forskohlii extract in vivo and in vitro. The Journal of pharmacy and pharmacology 64,
1793-1801 (2012).
95. X. Wang et al., Furocoumarins affect hepatic cytochrome P450 and renal organic ion
transporters in mice. Toxicology letters 209, 67-77 (2012).
96. N. Virgona et al., Coleus forskohlii extract induces hepatic cytochrome P450 enzymes in mice.
Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial
Biological Research Association 50, 750-755 (2012).
97. K. Vanhees et al., Maternal intake of quercetin during gestation alters ex vivo benzo[a]pyrene
metabolism and DNA adduct formation in adult offspring. Mutagenesis 27, 445-451 (2012).
98. R. J. Turesky, E. E. Bessette, D. Dunbar, R. G. Liberman, P. L. Skipper, Cytochrome P450-
mediated metabolism and DNA binding of 2-amino-1,7-dimethylimidazo[4,5-g]quinoxaline and
its carcinogenic isomer 2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline in mice. Chemical
research in toxicology 25, 410-421 (2012).
99. Y. Tamura et al., Design, synthesis and identification of novel benzimidazole derivatives as
highly potent NPY Y5 receptor antagonists with attractive in vitro ADME profiles. Bioorganic &
medicinal chemistry letters 22, 5498-5502 (2012).
100. M. Tajima et al., Consumption of a high-fat diet during pregnancy decreases the activity of
cytochrome P450 3a in the livers of offspring. European journal of pharmaceutical sciences :
official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences 47, 108-116 (2012).
101. M. Stiborova et al., Bioactivation versus detoxication of the urothelial carcinogen aristolochic
acid I by human cytochrome P450 1A1 and 1A2. Toxicological sciences : an official journal of
the Society of Toxicology 125, 345-358 (2012).
102. M. Stiborova et al., Activation and detoxification metabolism of urban air pollutants 2-
nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone by rat and mouse hepatic
microsomes. Neuro endocrinology letters 33 Suppl 3, 8-15 (2012).
Anhang
116
103. M. I. Shukoor et al., Tolfenamic acid suppresses cytochrome P450 2E1 expression in mouse
liver. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro 4, 1122-1129 (2012).
104. A. M. Sharma, Y. Li, M. Novalen, M. A. Hayes, J. Uetrecht, Bioactivation of nevirapine to a
reactive quinone methide: implications for liver injury. Chemical research in toxicology 25,
1708-1719 (2012).
105. S. Sanoh et al., Predictability of metabolism of ibuprofen and naproxen using chimeric mice
with human hepatocytes. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 40,
2267-2272 (2012).
106. M. K. Pasha et al., Preclinical metabolism and pharmacokinetics of SB1317 (TG02), a potent
CDK/JAK2/FLT3 inhibitor. Drug metabolism letters 6, 33-42 (2012).
107. X. Y. Pang et al., Expression and regulation of human fetal-specific CYP3A7 in mice.
Endocrinology 153, 1453-1463 (2012).
108. M. Murtomaa-Hautala et al., Significant interspecies differences in induction profiles of hepatic
CYP enzymes by TCDD in bank and field voles. Environmental toxicology and chemistry 31,
663-671 (2012).
109. C. Mekjaruskul, M. Jay, B. Sripanidkulchai, Modulatory effects of Kaempferia parviflora extract
on mouse hepatic cytochrome P450 enzymes. Journal of ethnopharmacology 141, 831-839
(2012).
110. M. E. McDonnell et al., Riluzole prodrugs for melanoma and ALS: design, synthesis, and in
vitro metabolic profiling. Bioorganic & medicinal chemistry 20, 5642-5648 (2012).
111. M. M. Marchenko, H. P. Kopyl'chuk, I. O. Shmarakov, I. M. Buchkovs'ka, [Activity of enzymatic
detoxification systems in the mice liver under conditions of different retinoid provision].
Ukrains'kyi biokhimichnyi zhurnal (1999 ) 84, 42-47 (2012).
112. Y. Lu, X. H. Zhang, A. I. Cederbaum, Ethanol induction of CYP2A5: role of CYP2E1-ROS-Nrf2
pathway. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology 128, 427-438
(2012).
113. D. Lowes et al., Lead optimization of antimalarial propafenone analogues. Journal of medicinal
chemistry 55, 6087-6093 (2012).
114. W. S. Lo et al., A dual function of the furanocoumarin chalepensin in inhibiting Cyp2a and
inducing Cyp2b in mice: the protein stabilization and receptor-mediated activation. Archives of
toxicology 86, 1927-1938 (2012).
115. Y. Li et al., In vitro bioactivation of a selective estrogen receptor modulator (2S,3R)-(+)-3-(3-
hydroxyphenyl)-2-[4-(2-pyrrolidin-1-ylethoxy)phenyl]-2,3-dihydro -1,4-benzoxathiin-6-ol (I) in
liver microsomes: formation of adenine adducts. Chemical research in toxicology 25, 2368-
2377 (2012).
116. L. Li, X. Chen, J. Zhou, D. Zhong, In vitro studies on the oxidative metabolism of 20(s)-
ginsenoside Rh2 in human, monkey, dog, rat, and mouse liver microsomes, and human liver
s9. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 40, 2041-2053 (2012).
117. J. S. Lagas et al., P-glycoprotein, multidrug-resistance associated protein 2, Cyp3a, and
carboxylesterase affect the oral availability and metabolism of vinorelbine. Molecular
pharmacology 82, 636-644 (2012).
118. Y. Kobayashi, T. Fukami, R. Higuchi, M. Nakajima, T. Yokoi, Metabolic activation by human
arylacetamide deacetylase, CYP2E1, and CYP1A2 causes phenacetin-induced
methemoglobinemia. Biochemical pharmacology 84, 1196-1206 (2012).
119. V. I. Kaledin, N. V. Baginskaia, E. A. Vasiunina, S. I. Il'nitskaia, L. P. Ovchinnikova, [Increase
of general toxic effects and decrease of hepatocarcinogenic effects of diethylnitrosamine
administered to mice in conjunction with isopropanol]. Voprosy onkologii 58, 658-662 (2012).
120. J. Hou et al., Discovery and extensive in vitro evaluations of NK-HDAC-1: a chiral histone
deacetylase inhibitor as a promising lead. Journal of medicinal chemistry 55, 3066-3075
(2012).
121. M. Hasegawa et al., Investigation of drug-drug interactions caused by human pregnane X
receptor-mediated induction of CYP3A4 and CYP2C subfamilies in chimeric mice with a
humanized liver. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 40, 474-
480 (2012).
122. L. A. Gates, D. Lu, L. A. Peterson, Trapping of cis-2-butene-1,4-dial to measure furan
metabolism in human liver microsomes by cytochrome P450 enzymes. Drug metabolism and
disposition: the biological fate of chemicals 40, 596-601 (2012).
123. S. S. Gao et al., Dual effects of phloretin on aflatoxin B1 metabolism: activation and
detoxification of aflatoxin B1. BioFactors (Oxford, England) 38, 34-43 (2012).
124. A. S. Gandhi et al., CYP3A-dependent drug metabolism is reduced in bacterial inflammation in
mice. British journal of pharmacology 166, 2176-2187 (2012).
Anhang
117
125. Z. Z. Fang et al., Metabolic map and bioactivation of the anti-tumour drug noscapine. British
journal of pharmacology 167, 1271-1286 (2012).
126. S. Deb, M. Pandey, H. Adomat, E. S. Guns, Cytochrome P450 3A-mediated microsomal
biotransformation of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 in mouse and human liver: drug-related
induction and inhibition of catabolism. Drug metabolism and disposition: the biological fate of
chemicals 40, 907-918 (2012).
127. K. C. Chimalakonda et al., Cytochrome P450-mediated oxidative metabolism of abused
synthetic cannabinoids found in K2/Spice: identification of novel cannabinoid receptor ligands.
Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 40, 2174-2184 (2012).
128. W. Chatuphonprasert, K. Jarukamjorn, Impact of six fruits--banana, guava, mangosteen,
pineapple, ripe mango and ripe papaya--on murine hepatic cytochrome P450 activities.
Journal of applied toxicology : JAT 32, 994-1001 (2012).
129. S. A. Bardowell, F. Duan, D. Manor, J. E. Swanson, R. S. Parker, Disruption of mouse
cytochrome p450 4f14 (Cyp4f14 gene) causes severe perturbations in vitamin E metabolism.
The Journal of biological chemistry 287, 26077-26086 (2012).
130. V. M. Arlt et al., Exposure to benzo[a]pyrene of Hepatic Cytochrome P450 Reductase Null
(HRN) and P450 Reductase Conditional Null (RCN) mice: Detection of benzo[a]pyrene diol
epoxide-DNA adducts by immunohistochemistry and 32P-postlabelling. Toxicology letters 213,
160-166 (2012).
131. J. L. Zheng et al., Assessment of subclinical, toxicant-induced hepatic gene expression
profiles after low-dose, short-term exposures in mice. Regulatory toxicology and
pharmacology : RTP 60, 54-72 (2011).
132. M. Zhao, L. P. Li, J. Shen, H. D. Jiang, [Inhibitory and inductive effects of (-)- and (+)-
tetrahydropalmatine on CYP450 in mice]. Zhejiang da xue xue bao. Yi xue ban = Journal of
Zhejiang University. Medical sciences 40, 33-39 (2011).
133. F. Zhang et al., In vitro metabolism, glutathione conjugation, and CYP isoform specificity of
epoxidation of 4-vinylphenol. Xenobiotica; the fate of foreign compounds in biological systems
41, 6-23 (2011).
134. D. Yang, J. Yang, D. Shi, R. Deng, B. Yan, Scoparone potentiates transactivation of the bile
salt export pump gene and this effect is enhanced by cytochrome P450 metabolism but
abolished by a PKC inhibitor. British journal of pharmacology 164, 1547-1557 (2011).
135. H. Yamazaki et al., In vivo formation of a glutathione conjugate derived from thalidomide in
humanized uPA-NOG mice. Chemical research in toxicology 24, 287-289 (2011).
136. M. Wang et al., Comparative pharmacokinetics and metabolism studies in lean and diet-
induced obese mice: an animal efficacy model for 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type
1 (11beta-HSD1) inhibitors. Drug metabolism letters 5, 55-63 (2011).
137. Y. F. Ueng et al., Mechanism-based inhibition of cytochrome P450 (CYP)2A6 by chalepensin
in recombinant systems, in human liver microsomes and in mice in vivo. British journal of
pharmacology 163, 1250-1262 (2011).
138. L. Udomsuk et al., Modified expression of aryl hydrocarbon receptor-related genes by
deoxymiroestrol, a phytoestrogen, in mouse hepatocytes in primary culture. Journal of
ethnopharmacology 137, 902-908 (2011).
139. K. N. Theken et al., Activation of the acute inflammatory response alters cytochrome P450
expression and eicosanoid metabolism. Drug metabolism and disposition: the biological fate of
chemicals 39, 22-29 (2011).
140. X. Su et al., Discovery of adamantyl heterocyclic ketones as potent 11beta-hydroxysteroid
dehydrogenase type 1 inhibitors. ChemMedChem 6, 1439-1451 (2011).
141. K. Samuelsson, M. A. Bergstrom, C. A. Jonsson, G. Westman, A. T. Karlberg,
Diphenylthiourea, a common rubber chemical, is bioactivated to potent skin sensitizers.
Chemical research in toxicology 24, 35-44 (2011).
142. S. A. Saghir, B. I. Ghanayem, I. R. Schultz, Kinetics of trihalogenated acetic acid metabolism
and isoform specificity in liver microsomes. International journal of toxicology 30, 551-561
(2011).
143. J. J. Raybon et al., Pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling of rifampicin-mediated
Cyp3a11 induction in steroid and xenobiotic X receptor humanized mice. The Journal of
pharmacology and experimental therapeutics 337, 75-82 (2011).
144. A. Potega et al., The imidazoacridinone antitumor drug, C-1311, is metabolized by flavin
monooxygenases but not by cytochrome P450s. Drug metabolism and disposition: the
biological fate of chemicals 39, 1423-1432 (2011).
145. M. H. Pham et al., Identification and induction of cytochrome P450s involved in the
metabolism of flavone-8-acetic acid in mice. Drug metabolism letters 5, 73-84 (2011).
Anhang
118
146. A. Pal et al., Influence of Moringa oleifera on pharmacokinetic disposition of rifampicin using
HPLC-PDA method: a pre-clinical study. Biomedical chromatography : BMC 25, 641-645
(2011).
147. S. Nesnow et al., Propiconazole increases reactive oxygen species levels in mouse hepatic
cells in culture and in mouse liver by a cytochrome P450 enzyme mediated process. Chemico-
biological interactions 194, 79-89 (2011).
148. N. E. Moskaleva, V. G. Zgoda, A. I. Archakov, [Mass-spectrometric measurements of P450
isoform specific content and corresponding enzyme activities]. Bioorganicheskaia khimiia 37,
149-164 (2011).
149. M. S. Moon et al., 3,5,5-trimethyl-hexanoyl-ferrocene diet protects mice from moderate
transient acetaminophen-induced hepatotoxicity. Toxicological sciences : an official journal of
the Society of Toxicology 124, 348-358 (2011).
150. X. C. Ma et al., Comparative metabolism of cinobufagin in liver microsomes from mouse, rat,
dog, minipig, monkey, and human. Drug metabolism and disposition: the biological fate of
chemicals 39, 675-682 (2011).
151. Y. Lu, J. Zhuge, D. Wu, A. I. Cederbaum, Ethanol induction of CYP2A5: permissive role for
CYP2E1. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 39, 330-336
(2011).
152. Q. Li et al., Kinetics of ethylene and ethylene oxide in subcellular fractions of lungs and livers
of male B6C3F1 mice and male fischer 344 rats and of human livers. Toxicological sciences :
an official journal of the Society of Toxicology 123, 384-398 (2011).
153. F. Li, J. Lu, X. Ma, Metabolomic screening and identification of the bioactivation pathways of
ritonavir. Chemical research in toxicology 24, 2109-2114 (2011).
154. F. Li, J. Lu, L. Wang, X. Ma, CYP3A-mediated generation of aldehyde and hydrazine in
atazanavir metabolism. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 39,
394-401 (2011).
155. B. Li, P. Yau, B. Kemper, Identification of cytochrome P450 2C2 protein complexes in mouse
liver. Proteomics 11, 3359-3368 (2011).
156. J. E. Laine, S. Auriola, M. Pasanen, R. O. Juvonen, D-Isomer of gly-tyr-pro-cys-pro-his-pro
peptide: a novel and sensitive in vitro trapping agent to detect reactive metabolites by
electrospray mass spectrometry. Toxicology in vitro : an international journal published in
association with BIBRA 25, 411-425 (2011).
157. Y. Kato et al., A possible mechanism for 2,2',4,4',5,5'-hexachlorobiphenyl-mediated decrease
in serum thyroxine level in mice. Toxicology and applied pharmacology 254, 48-55 (2011).
158. H. Jin et al., Pulmonary toxicity and metabolic activation of tetrandrine in CD-1 mice. Chemical
research in toxicology 24, 2142-2152 (2011).
159. R. Jayaraman et al., Preclinical metabolism and disposition of SB939 (Pracinostat), an orally
active histone deacetylase inhibitor, and prediction of human pharmacokinetics. Drug
metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 39, 2219-2232 (2011).
160. M. C. Hollander et al., A Cyp2a polymorphism predicts susceptibility to NNK-induced lung
tumorigenesis in mice. Carcinogenesis 32, 1279-1284 (2011).
161. M. R. Hakkinen et al., 2'-Deoxyguanosine as a surrogate trapping agent for DNA reactive drug
metabolites. Toxicology letters 207, 34-41 (2011).
162. Y. Guo et al., CYP2D plays a major role in berberine metabolism in liver of mice and humans.
Xenobiotica; the fate of foreign compounds in biological systems 41, 996-1005 (2011).
163. M. A. Crampsie et al., Phenylbutyl isoselenocyanate modulates phase I and II enzymes and
inhibits 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)- 1-butanone-induced DNA adducts in mice. Cancer
prevention research (Philadelphia, Pa.) 4, 1884-1894 (2011).
164. N. N. Bumpus, E. F. Johnson, 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide-ribonucleoside (AICAR)-
stimulated hepatic expression of Cyp4a10, Cyp4a14, Cyp4a31, and other peroxisome
proliferator-activated receptor alpha-responsive mouse genes is AICAR 5'-monophosphate-
dependent and AMP-activated protein kinase-independent. The Journal of pharmacology and
experimental therapeutics 339, 886-895 (2011).
165. S. Botros, N. El-Lakkany, S. H. Seif el-Din, A. N. Sabra, M. Ibrahim, Comparative efficacy and
bioavailability of different praziquantel brands. Experimental parasitology 127, 515-521 (2011).
166. T. Ashino et al., Auranofin protects against cocaine-induced hepatic injury through induction of
heme oxygenase-1. The Journal of toxicological sciences 36, 635-643 (2011).
167. I. Amunom et al., Cytochromes P450 catalyze the reduction of alpha,beta-unsaturated
aldehydes. Chemical research in toxicology 24, 1223-1230 (2011).
Anhang
119
168. J. J. Alberti, S. Sentellas, M. Salva, In vitro liver metabolism of aclidinium bromide in
preclinical animal species and humans: identification of the human enzymes involved in its
oxidative metabolism. Biochemical pharmacology 81, 761-776 (2011).
Anhang
120
Tabelle S2: Übersicht der durchschnittlichen Geschwindigkeit (Geschw.), des maximal möglichen Effektes (MPE(x)) sowie der
Konzentrationen von Buprenorphin und seiner Metaboliten in Serum und Gehirn (männl. C57BL/6J Mäuse, basal: n=21, pro
Dosisgruppe: n=3; G 0309/15)
Bup [mg/kg] Basal 0,00/ VH 0,05 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0
MW ±SD MW ±SD MW ±SD MW ±SD MW ±SD MW ±SD MW ±SD MW ±SD
Geschw.
[cm/s]
2,48 ± 0,82 6,49 ± 5,81 5,74 ± 4,84 10,24 ± 4,65 5,73 ± 1,07 8,43 ± 4,22 9,0 ± 3,47 10,14 ± 1,71
MPE(x) [%] - -1,65 ± 2,59 1,91 ± 1,64 10,76 ± 6,24 28,83 ± 2,17 31,46 ± 10,42 38,71 ± 16,14
Bup-Serum
[ng/ml]
- - 3,8 ± 0,68 16,27 ± 5,02
23,91 ± 9,1
13,41 ± 14,09 71,32 ± 27,57 192,9 ± 24,8 418,7 ± 59,01
NBup-
Serum
[ng/ml]
- - - 0,11 0,13 0,52 ± 0,5 0,41 ± 0,12 1,23 ± 0,63
B3G-Serum
[ng/ml]
- - 8,45 ± 9,85 21,78 ± 17,3 115,6 ± 106,7 57,03 ± 30
N3G-Serum
[ng/ml]
- - 0,24 ± 0,17 0,58 ± 0,36 6,54 ± 4,86 4,59 ± 1,73
318,7 ± 249
19,24 ± 12,57
Bup-Gehirn
[pg/mg]
- - 2,25 ± 0,07 11,5 ± 2,86 14,53 ± 2,01 74,07 ± 26,98 193,3 ± 74,66
NBup-
Gehirn
[pg/mg]
- - - 0,35 ± 0,07
49,43 ± 80,59
2,04 ± 2,51
10,03 ± 6,64
0,4 0,6 ± 0,14 1,83 ± 0,84 3,3 ± 1,02
B3G-Gehirn
[pg/mg]
- - - - - - - -
N3G-Gehirn
[pg/mg]
- - - - - - - -
Bup: Buprenorphin; NBup: Norbuprenorphin; B3G: Buprenorphin-3-Glukuronid, N3G: Norbuprenorphin-3-Glukuronid
MW ± SD: Mittelwert ± Standardabweichung; VH: Vehikelgruppe
Anhang
121
Tabelle S3: Übersicht der berechneten P-Werte unter Durchführung des Kruskal-Wallis Test mit
Dunn’s multiple comparison bezogen auf die basalen Werte (männl. C57BL/6J Mäuse, n=3 pro
Dosisgruppe, G 0309/15)
Bup [mg/kg]
0,05
0,25
0,5
1,0
2,0
4,0
Geschw.
> 0,9999
> 0,9999
> 0,9999
> 0,9999
> 0,9999
> 0,9999
MPE(x)
> 0,9999
> 0,9999
0,2115
0,0617
0,028
0,0119
Geschw.: durchschnittliche Geschwindigkeit; MPE(x): Maximal möglicher Effekt
Anhang
122
Tabelle S4: Übersichtstabelle der Daten des Stammesvergleiches (männl. C57BL/6J, Balb/cJ, 129S1/SvImJ Mäuse, n=15 pro Stamm, G 0194/ 16)
C57BL/6J [Median [5./ 95.] Perzentile] Balb/cJ [Median [5./ 95.] Perzentile] 129S1/SvImJ [Median [5./ 95.] Perzentile]
Dosisgruppe Basal 0.42 mg/kg 4.0 mg/kg Basal 0.42 mg/kg 4.0 mg/kg Basal 0.42 mg/kg 4.0 mg/kg
Temperatur [°C] 48,39 [47/ 49,39] 49,67 [48,81/ 50,48] 50,7 [49,6/ 51,65] 44,42 [40,5/ 46,4] 47,91 [46/ 49,3] 51,82 [50,7/ 55] 50,65 [48/ 52,68] 53,97 [51,6/ 55] 52,6 [51,12/ 54,1]
ΔT [°C]
a- 1,35 [1,1/ 1,81] 2,69 [2,21/ 3,3] -9,68 [6,27/ 10,62] -1,85 [1,42/ 3,12]
Geschw. [cm/s] 2,7 [1,1/ 3,93] 8,7 [7,8/ 11,5] 10,87 [8,33/ 12,73] 2,77 [0,33/ 5,5]
4,05 [2,9/ 5,5]
9,28 [6,13/ 17,7]10,83 [8,9/ 17,7] 1,63 [0,47/ 3,07]
2,87 [1,8/ 5,12]
5,04 [2/ 11,07] 7 [1,47/ 8,9]
Bup Serum
[ng/ml] - 44 [18,1/ 67,5] 459 [370/ 495] - 52,25 [31,8/ 72,9] 538 [468/ 560] - 41,5 [31,1/ 84,3] 468 [415/ 501]
NBup Serum
[ng/ml] - 0,6 [0,2/ 9,9] 6,3 [3,6/ 9,3] - 0,5 [0,2/ 1,8] 5,8 [2,4/ 9,5] - 0,6 [0,2/ 7,5] 5,6 [3,9/38,7]
B3G Serum
[ng/ml] - 101,6 [6,7/ 332] 277 [134/ 370] - 28,85 [10,5/ 271] 250 [185/ 426] - 90,1 [15/ 288] 205 [185/ 342]
N3G Serum
[ng/ml] - 9,6 [2,5/ 22,8] 100 [40,5/ 188] - 9,6 [5,1/ 38,9] 162 [45,8/289] - 5,65 [1,6/ 13,9] 33,6 [25,3/ 98,2]
Bup Gehirn
[pg/mg] - 1530 [1157/ 1959] 12268 [9345/ 14803] - 1329 [879,6/ 12785] 11957 [9635/ 12785] - 1171 [860,2/ 1407] 8896 [7752/ 10203]
NBup Gehirn
[pg/mg] - 4,35 [2,2/ 6,8] 38 [30,4/ 50,3] - 2,85 [1,8/ 5,1] 31,5 [20,4/ 37] - 2,35 [1,3/ 4] 15,5 [13,5/ 26,9]
B3G Gehirn
[pg/mg] - 0,8 [0,6/ 2,8] 9,8 [4,7/ 15,9] - 1,6 [0,8/ 4,4] 20,4 [10,2/ 31,1] - 0,85 [0,6/ 1,4] 4,5 [4,1/ 6,7]
N3G Gehirn
[pg/mg] - 1,93 [1,37/ 2,84] 9,84 [4,68/ 15,89] - 2,56 [1,52/ 4,41] 20,41 [10,22/ 31,11] - 1,4 [1,4/ 1,4] 4,48 [4,05/ 6,67]
Log10
(NBup/Bup)
Serum - -1,78 [-2,45/ -0,65] - -2,07 [-2,3/ -1,46] - -1,84 [-2,2/ -0,75] -1,07]
Log10
(B3G/Bup)
Serum - 0,53 [-0,93/ 0,88]
-1,82 [-2,11/ -1,73]
-0,13 [-0,54/ -0,07] - -0,31 [-0,58 / 0,93]
-1,97 [-2-29/ -1,74]
-0,35 [-0,46/ -0,08] - 0,29 [-0,41/ 0,83]
-1,92 [-2,03/
-0,31 [-0,4/ -0,12]
Log10
(N3G/NBup)
Serum - 1,15 [0,35/ 1,6] 1,23 [0,81/ 1,31] - 1,34 [1,14/ 1,56] 1,45 [1,16/ 1,54] - 0,79 [0,23/ 1,09] 0,74 [0,41/ 0,81]
Log10
(Gehirn/Blut)
Bup - 0,79 [0,57/ 1,28] 0,69 [0,632/ 0,76] - 0,54 [0,48/ 0,87] 0,53 [0,37/ 0,61] - 0,57 [0,27/ 0,71] 0,5 [0,39/ 0,55]
Log10
(Gehirn/Blut)
NBup - 0,06 [-1,32/ 0,6] 0,02 [-0,15/ 0,4] - -0,06 [-0,39/ 0,09] - -0,24/ [-1,57/ 0,1] -0,02]
Log10
(Gehirn/Blut)
B3G - -1,69 [-2,43/ -0,75] - -1,5 [-2,34/ -0,76] - -2,16 [-2,85/ -1,33] -1,51]
Log10(Gehirn/Blut)
N3G - -1,64 [-1,69/ -1,2]
-0,95 [-1,88/ -0,81]
-1,9 [-2,1/ -1,3] - -1,44 [-2,2/ -1,2]
-0,9 [-0,27/ 0,16]
-1,24 [-1,67/ -0,96]
-1,71 [-1,93/ -1,36] - -1,42 [-1,42/ -1,42]
-0,26 [-1,18/
-1,59 [-1,89/
-1,6 [-2,15/ -1,53]
Bup: Buprenorphin, NBup: Norbuprenorphin, B3G: Buprenorphin-3-Glukuronid, N3G: Norbuprenorphin-3-Glukuronid
Anhang
123
Tabelle S5: Übersicht der berechneten P-Werte der Daten des Stammesvergleiches (Kruskal-Wallis Test mit Dunn’s multiple comparison, männl., n=15
pro Stamm, G0194/16)
Basal 0,42 mg/kg Bup 4,0 mg/kg Bup
C57BL/6J vs.
Balb/cJ
C57BL/6J vs.
129S1/SvImJ
Balb/cJ vs.
129S1/SvImJ
C57BL/6J vs.
Balb/cJ
C57BL/6J vs.
129S1/SvImJ
Balb/cJ vs.
129S1/SvImJ
C57BL/6J vs.
Balb/cJ
C57BL/6J vs.
129S1/SvImJ
Balb/cJ vs.
129S1/SvImJ
Temperatur 0,0033 0,0131 < 0,0001 0,0668 0,0230 < 0,0001 0,1231 0,0584 > 0,9999
ΔT - - - < 0,0001 0,0038 0,8242 0,1029 0,7850 0,0055
Geschw. 0,1474 0,0742 0,0144 0,0144 0,0926 0,0265
Bup-Serum
> 0,9999
- - - 0,8575 0,1681
NBup-Serum - - - > 0,9999
B3G-Serum - - - > 0,9999
N3G-Serum - - -
> 0,9999
0,4425
> 0,9999
0,7591
> 0,9999
> 0,9999
0,5106
0,2195
> 0,9999
0,0239
> 0,9999
> 0,9999
> 0,9999 0,0327
Log10(NBup/Bup)
Serum - - - 0,6977 0,5597 0,7737 > 0,9999
Log10(B3G/Bup)
Serum - - - 0,443
> 0,9999
> 0,9999
> 0,9999
0,5848
> 0,9999
> 0,9999 0,5106 > 0,999
9
> 0,9999
> 0,9999
0,9144
0,1687
> 0,9999
> 0,9999 > 0,9999
Log10(N3G/NBup)
Serum - - - 0,2022 0,0986 0,0002 0,7737 0,1431 0,0056
Bup-Gehirn - - - 0,2262 0,0011 0,2262 0,0216 0,0851
NBup- Gehirn - - - 0,0893 > 0,0056 0,2313
B3G- Gehirn - - -
0,01
0,1172 > 0,9999
0,9999
0,0611 0,2682 0,0030
N3G- Gehirn - - - Nicht möglich auf Grund fehlender Werte
> 0,9999
0,5373
0,3339
0,3594 0,2313 0,0027
Log10(Gehirn /Blut)
Bup - - - 0,0197 0,0082 > 0,9999 0,0589 0,0089 > 0,9999
Log10(Gehirn /Blut)
NBup - - - 0,9289 0,1265 0,9289 0,8665 0,0589 0,6093
Log10(Gehirn /Blut)
B3G - - - > 0,9999 0,5597 0,1265 0,1017 0,4127
Log10(Gehirn /Blut)
N3G - - - Nicht möglich auf Grund fehlender Werte
> 0,9999
> 0,9999 > 0,9999 > 0,9999
Bup: Buprenorphin, NBup: Norbuprenorphin, B3G: Buprenorphin-3-Glukuronid, N3G: Norbuprenorphin-3-Glukuronid
Anhang
124
Tabelle S6: Übersicht der berechneten P-Werte nach Vergleich der Dosisgruppen pro Stamm (männl., n=15 pro Stamm, G0194/16)
C57BL/6J Balb/cJ 129S1/SvImJ
Basal vs,
0,42 mg/kg
basal vs,
4,0 mg/kg
0,42 mg/kg vs,
4,0 mg/kg
Basal vs,
0,42 mg/kg
basal vs,
4,0 mg/kg
0,42 mg/kg vs,
4,0 mg/kg
Basal vs,
0,42 mg/kg
basal vs,
4,0 mg/kg
0,42 mg/kg vs,
4,0 mg/kg
Temperatur a0,001 a0,0313 b0,0193 a0,001 a0,0313 b0,0007 a0,001 a0,0625 b0,1059
Geschw. a
0,001 a
0,0313 b
0,1645 a
0,001 a
0,0313 b
0,2158 a
0,001 a
0,0625 b
0,7003
bBup-Serum - - 0,0007 - - 0,0007 - - 0,0007
bNBup-Serum - - 0,0113 - - 0,0003 - - 0,0077
bB3G-Serum - - 0,04 - - 0,0127 - - 0,1645
bN3G-Serum - - 0,0007 - - 0,0007 - - 0,0007
bLog10(NBup/Bup)
Serum - - 0,5135 - - 0,4396 - - 0,8591
bLog10(B3G/Bup)
Serum - - 0,0753 - - > 0,9999 - - 0,0193
bLog10(N3G/NBup)
Serum - - 0,7679 - - 0,3553 - - 0,3097
- - 0,0007 - - 0,0007 - - 0,0007
bBup-Gehirn
bNBup- Gehirn - - 0,0007 - - 0,0007 - - 0,0007
- - 0,0003 - - 0,0007 - - 0,0007
- - 0,0159 - - 0,0043 - - Nicht möglich
bB3G- Gehirn
bN3G- Gehirn
bLog10(Gehirn /
Blut)
Bup - - 0,2065 - - 0,6787 - - 0,3097
bLog10(Gehirn /Blut)
NBup - - 0,8591 - - 0,953 - - 0,7679
bLog10(Gehirn /Blut)
B3G - - 0,0753 - - 0,4396 - - 0,028
bLog10(Gehirn /Blut)
N3G - - 0,4127 - - 0,6623 - - Nicht möglich
a Wilcoxon matched pairs signed rank Test,
einseitig bMann-Whitney Test, zweiseitig
Bup: Buprenorphin, NBup: Norbuprenorphin, B3G: Buprenorphin-3-Glukuronid, N3G: Norbuprenorphin-3-Glukuronid
Anhang
125
Tabelle S7: Log10 des metabolischen Verhältnisses von Buprenorphin und seiner Metaboliten
sowie deren Verteilung zwischen Gehirn und Blut (männl. C57BL/6J Mäuse, n=21, G 0309/15)
Median [5./ 95. Perzentile]
Log10(NBup/Bup)
-2,49 [-2,83/ -1,95]
Log10(B3G/Bup)
-0,05 [-0,91/ 0,68]
Log10(N3G/NBup)
1,07 [0,79/ 1,47]
Log10(Gehirn/Blut) Bup
0,66 [0,19/ 17,88]
Log10(Gehirn/Blut) NBup
3,47 [0,51/ 4,74]
Buprenorphin; NBup: Norbuprenorphin; B3G: Buprenorphin-3-Glukuronid, N3G: Norbuprenorphin-3-Glukuronid
Tabelle S8: CYP1A1, 1A2, 2C, 2D und 3A Aktivität (pmol D-Luciferin/ µg Protein/ Min) und CPR
Aktivität (mU/ mg) in den verschiedenen Leberlappen und dem Processus papillaris von
männlichen C57BL/6J Mäusen (Mittelwert (MW) ± Standardabweichung (SD), n=10, P-Wert:
Friedman Test).
Lobus sinister
lateralis
Lobus
medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Aktivität
MW
± SD
MW
± SD
MW
± SD
MW
± SD
MW
± SD
P-Wert
CYP1A1
0,040
0,018
0,041
0,015
0,028
0,012
0,022
0,007
0,015
0,009
< 0,0001
CYP1A2
0,550
0,175
0,576
0,145
0,425
0,110
0,335
0,061
0,255
0,081
< 0,0001
CYP2C
0,008
0,002
0,009
0,003
0,005
0,002
0,003
0,001
0,003
0,001
< 0,0001
CYP2D
0,081
0,037
0,094
0,039
0,078
0,061
0,052
0,040
0,035
0,025
< 0,0001
CYP3A
0,085
0,029
0,080
0,036
0,068
0,040
0,051
0,036
0,028
0,031
0,0006
CPR
69,61
7,250
67,26
11,01
58,14
13,79
58,15
14,37
45,88
14,10
0,0001
Tabelle S9: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Friedman Test), mit Dunn’s
multiple comparison der CYP3A Aktivitätsdaten in den verschiedenen Leberlappen und dem
Processus papillaris (männl. C57BL/6J Mäuse, n = 10).
P-Wert
Lobus sinister
lateralis
Lobus medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Lobus sinister
lateralis
1
> 0,999
0,897
0,109
0,004
Lobus medialis
> 0,999
1
0,897
0,109
0,004
Lobus dexter
lateralis
0,897
0,897
1
> 0,999
0,66
Lobus caudatus
0,109
0,109
> 0,999
1
> 0,999
Processus
papillaris
0,004
0,004
0,66
> 0,999
1
Anhang
126
Tabelle S10: CYP1A1, 1A2, 2D und 3A Proteingehalt (ng CYP/ µg Protein) in den verschiedenen
Leberlappen und dem Processus papillaris von männlichen C57BL/6J Mäusen (Mittelwert (MW)
± Standardabweichung (SD), n=10, P-Wert: Friedman Test).
Lobus
sinister
lateralis
Lobus
medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Proteingehalt
MW
± SD
MW
± SD
MW
± SD
MW
± SD
MW
± SD
P-Wert
CYP1A1
0,408
0,2
0,43
0,184
0,416
0,191
0,351
0,132
0,34
0,163
0,4395
CYP1A2
0,543
0,142
0,527
0,092
0,534
0,193
0,482
0,17
0,554
0,225
0,4628
CYP2D
0,313
0,025
0,299
0,04
0,33
0,0435
0,324
0,065
0,318
0,047
0,4395
CYP3A
0,987
0,254
0,905
0,123
0,835
0,263
0,793
0,349
0,734
0,415
0,6771
Tabelle S11: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Friedman Test), mit Dunn’s
multiple comparison der CYP3A Proteindaten in den verschiedenen Leberlappen und dem
Processus papillaris (männl. C57BL/6J Mäuse, n = 10).
P-Wert
Lobus sinister
lateralis
Lobus medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Lobus sinister
lateralis
1
> 0,999
> 0,999
>0,999
> 0,999
Lobus medialis
> 0,999
1
> 0,999
> 0,999
> 0,999
Lobus dexter
lateralis
> 0,999
> 0,999
1
> 0,999
> 0,999
Lobus caudatus
> 0,999
> 0,999
> 0,999
1
> 0,999
Processus
papillaris
> 0,999
> 0,999
> 0,999
> 0,999
1
Tabelle S12: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Friedman Test) mit Dunn’s
multiple comparison der CYP1A1 Aktivitätsdaten in den verschiedenen Leberlappen und dem
Processus papillaris (männl. C57BL/6J Mäuse, n = 10).
P-Wert
Lobus sinister
lateralis
Lobus medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Lobus sinister
lateralis
1
> 0,999
0,477
0,072
0,0002
Lobus medialis
> 0,999
1
0,162
0,019
< 0,0001
Lobus dexter
lateralis
0,477
0,162
1
> 0,999
0,237
Lobus caudatus
0,072
0,019
> 0,999
1
> 0,999
Processus
papillaris
0,0002
< 0,0001
0,237
> 0,999
1
Anhang
127
Tabelle S13: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Friedman Test) mit Dunn’s
multiple comparison der CYP1A2 Aktivitätsdaten in den verschiedenen Leberlappen und dem
Processus papillaris (männl. C57BL/6J Mäuse, n = 10).
P-Wert
Lobus sinister
lateralis
Lobus medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Lobus sinister
lateralis
1
> 0,999
0,897
0,019
0,0004
Lobus medialis
> 0,999
1
0,339
0,004
< 0,0001
Lobus dexter
lateralis
0,897
0,339
1
> 0,999
0,162
Lobus caudatus
0,019
0,004
> 0,999
1
> 0,999
Processus
papillaris
0,0004
< 0,0001
0,162
> 0,999
1
Tabelle S14: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Friedman Test) mit Dunn’s
multiple comparison der CYP2C Aktivitätsdaten in den verschiedenen Leberlappen und dem
Processus papillaris (männl. C57BL/6J Mäuse, n = 10).
P-Wert
Lobus sinister
lateralis
Lobus medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Lobus sinister
lateralis
1
> 0.999
0.4771
0.0069
< 0.0001
Lobus medialis
> 0.999
1
0.3389
0.0041
< 0.0001
Lobus dexter
lateralis
0.4771
0.3389
1
> 0.999
0.0721
Lobus caudatus
0.0069
0.0041
> 0.999
1
> 0.999
Processus
papillaris
< 0.0001
< 0.0001
0.0721
> 0.999
1
Tabelle S15: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Friedman Test) mit Dunn’s
multiple comparison der CYP2D Aktivitätsdaten in den verschiedenen Leberlappen und dem
Processus papillaris (männl. C57BL/6J Mäuse, n = 10).
P-Wert
Lobus sinister
lateralis
Lobus medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Lobus sinister
lateralis
1
> 0,999
> 0,999
0,047
0,004
Lobus medialis
> 0,999
1
0,477
0,001
< 0,0001
Lobus dexter
lateralis
> 0,999
0,477
1
0,660
0,109
Lobus caudatus
0,047
0,001
0,660
1
> 0,999
Processus
papillaris
0,004
< 0,0001
0,109
> 0,999
1
Anhang
128
Tabelle S16: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Friedman Test) mit Dunn’s
multiple comparison der CYP1A1 Proteindaten in den verschiedenen Leberlappen und dem
Processus papillaris (männl. C57BL/6J Mäuse, n = 10).
P-Wert
Lobus sinister
lateralis
Lobus medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Lobus sinister
lateralis
1
> 0,999
> 0,999
> 0,999
> 0,999
Lobus medialis
> 0,999
1
> 0,999
> 0,999
> 0,999
Lobus dexter
lateralis
> 0,999
> 0,999
1
> 0,999
> 0,999
Lobus caudatus
> 0,999
> 0,999
> 0,999
1
> 0,999
Processus
papillaris
> 0,999
> 0,999
> 0,999
> 0,999
1
Tabelle S17: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Friedman Test) mit Dunn’s
multiple comparison der CYP1A2 Proteindaten in den verschiedenen Leberlappen und dem
Processus papillaris (männl. C57BL/6J Mäuse, n = 10).
P-Wert
Lobus sinister
lateralis
Lobus medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Lobus sinister
lateralis
1
> 0,999
> 0,999
0,897
> 0,999
Lobus medialis
> 0,999
1
> 0,999
> 0,999
> 0,999
Lobus dexter
lateralis
> 0,999
> 0,999
1
> 0,999
> 0,999
Lobus caudatus
0,897
> 0,999
> 0,999
1
> 0,999
Processus
papillaris
> 0,999
> 0,999
> 0,999
> 0,999
1
Tabelle S18: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Friedman Test) mit Dunn’s
multiple comparison der CYP2D Proteindaten in den verschiedenen Leberlappen und dem
Processus papillaris (männl. C57BL/6J Mäuse, n = 10).
P-Wert
Lobus sinister
lateralis
Lobus medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Lobus sinister
lateralis
1
> 0,999
> 0,999
> 0,999
> 0,999
Lobus medialis
> 0,999
1
0,219
> 0,999
> 0,999
Lobus dexter
lateralis
> 0,999
0,219
1
> 0,999
> 0,999
Lobus caudatus
> 0,999
> 0,999
> 0,999
1
> 0,999
Processus
papillaris
> 0,999
> 0,999
> 0,999
> 0,999
1
Anhang
129
Tabelle S19: Relative Genexpression der Cyp1a, Cyp2c und 2d Enzyme in den vier Leberlappen und dem Processus papillaris
männlicher C57BL/6J Mäuse (n = 10, Ausnahme Cyp2d9 und Cyp2d34 n = 6; E = Exponent). Die zur Analyse verwendeten Primer sind
in Tabelle S19 im Anhang aufgeführt.
Lobus sinister
lateralis
Lobus medialis Lobus dexter
lateralis
Lobus caudatus Processus papillaris
Gen MW1± SD2MW1± SD2MW1± SD2MW1± SD2MW1± SD2P-Wert3
Cyp1a1 1,14E+03 8,63E+02 8,53E+02 3,78E+02 5,78E+02 2,64E+02 6,23E+02 3,29E+02 5,25E+02 1,63E+02 0,151
Cyp1a2 8,14E+05 3,23E+05 8,41E+05 3,46E+05 7,96E+05 3,17E+05 7,86E+05 3,06E+05 7,29E+05 2,26E+05 0,538
Cyp2c29 2,20E+06 3,31E+05 2,09E+06 2,36E+05 2,08E+06 3,35E+05 2,24E+06 2,80E+05 2,09E+06 2,23E+05 0,122
Cyp2c37 1,73E+06 6,12E+05 1,75E+06 6,65E+05 1,75E+06 5,91E+05 1,74E+06 5,80E+05 1,54E+06 5,25E+05 0,016
Cyp2c44 4,81E+05 7,20E+04 5,01E+05 5,08E+04 5,06E+05 6,35E+04 5,20E+05 4,26E+04 4,73E+05 5,57E+04 0,101
Cyp2c50 3,13E+06 7,46E+05 2,97E+06 6,97E+05 2,94E+06 5,48E+05 3,18E+06 5,69E+05 2,88E+06 4,82E+05 0,247
Cyp2c67 2,91E+05 5,65E+04 2,91E+05 4,74E+04 2,89E+05 5,30E+04 3,20E+05 4,81E+04 3,08E+05 5,86E+04 0,033
Cyp2c70 4,67E+10 1,48E+11 4,09E+10 1,29E+11 4,95E+10 1,57E+11 5,61E+10 1,77E+11 5,53E+10 1,75E+11 0,130
Cyp2d9 1,43E+06 6,56E+05 1,24E+06 6,43E+05 1,30E+06 6,06E+05 1,39E+06 5,84E+05 1,43E+06 5,42E+05 0,424
Cyp2d10 2,10E+06 6,89E+05 2,03E+06 6,22E+05 1,99E+06 6,14E+05 2,01E+06 5,96E+05 2,05E+06 5,90E+05 0,138
Cyp2d11 1,13E+05 3,48E+04 1,13E+05 2,70E+04 1,11E+05 2,30E+04 1,04E+05 2,04E+04 1,63E+05 7,13E+04 0,019
Cyp2d12 2,98E+02 7,83E+01 2,65E+02 1,10E+02 2,65E+02 8,66E+01 2,88E+02 7,30E+01 3,05E+02 8,45E+01 0,252
Cyp2d13 4,81E+05 1,01E+05 4,98E+05 1,00E+05 5,08E+05 8,24E+04 5,11E+05 7,74E+04 4,68E+05 1,11E+05 0,024
Cyp2d22 2,17E+05 2,93E+04 2,11E+05 2,88E+04 2,11E+05 2,76E+04 2,08E+05 3,06E+04 2,14E+05 3,39E+04 0,648
Cyp2d26 1,05E+06 1,04E+05 1,07E+06 1,15E+05 1,08E+06 1,40E+05 1,06E+06 1,58E+05 1,05E+06 1,64E+05 0,308
Cyp2d34 1,69E+01 7,59E+00 1,49E+01 8,72E+00 2,18E+01 1,62E+01 2,80E+01 1,90E+01 2,70E+01 1,81E+01 0,424
Cyp2d40 1,64E+05 3,95E+04 1,64E+05 4,07E+04 1,78E+05 4,25E+04 1,79E+05 3,70E+04 1,91E+05 4,78E+04 0,0003
CPR 2,10E+05 3,19E+04 1,97E+05 3,52E+04 2,05E+05 3,56E+04 2,18E+05 3,81E+04 1,99E+05 4,83E+04 0,0228
1 Mittelwert (MW) 2 Standardabweichung (SD) 3 Friedman Test
Anhang
130
Tabelle S20: Verwendete Primer zur Genexpression der Cyp1a, Cyp2c, Cyp2d, Ugt1a, Ugt2b
Enzyme und AHR
Kommerzielle Primer
Hersteller
Mm_0610033E06Rik_1_SG QuantiTect Primer Assay (Ugt2b37)
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_1300012D20Rik_1_SG QuantiTect Primer Assay (Ugt2b1)
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_9430041C03Rik_1_SG QuantiTect Primer Assay (Ugt2b38)
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_AHR_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_AI788959_1_SG QuantiTect Primer Assay (Ugt2b34)
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_C730031G17_1_SG QuantiTect Primer Assay (Ugt2b35)
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp1a1_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp1a2_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2c29_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2c37_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2c44_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2c50_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2c67_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2c70_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2d10_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2d11_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2d12_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2d13_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2d22_2_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2d26_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2d34_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2d40_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Cyp2d9_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Ugt1a12_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Ugt1a2_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Ugt1a5_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Ugt1a6_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Ugt1a7c_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Ugt2b36_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Mm_Ugt2b5_1_SG QuantiTect Primer Assay
QIAGEN®, Hilden (D)
Anhang
131
Tabelle S21: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Friedman Test), mit Dunn’s
multiple comparison der CPR Aktivitätsdaten in den verschiedenen Leberlappen und dem
Processus papillaris (männl. C57BL/6J Mäuse, n = 10).
P-Wert
Lobus
sinister
lateralis
Lobus
medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Lobus sinister
lateralis
1
> 0,999
0,0374
0,1333
0,0003
Lobus medialis
> 0,999
1
0,2838
0,7710
0,0053
Lobus dexter
lateralis
0,0374
0,2838
1
> 0,999
> 0,999
Lobus caudatus
0,1333
0,7710
> 0,999
1
0,8969
Processus
papillaris
0,0003
0,0053
> 0,999
0,8969
1
Tabelle S22: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Friedman Test), mit Dunn’s
multiple comparison der CPR Genexpressionsdaten in den verschiedenen Leberlappen und
dem Processus papillaris (männl. C57BL/6J Mäuse, n = 10).
P-Wert
Lobus
sinister
lateralis
Lobus
medialis
Lobus dexter
lateralis
Lobus
caudatus
Processus
papillaris
Lobus sinister
lateralis
1
0,8969
> 0,999
> 0,999
> 0,999
Lobus medialis
0,8969
1
> 0,999
0,0186
> 0,999
Lobus dexter
lateralis
> 0,999
> 0,999
1
0,2365
> 0,999
Lobus caudatus
> 0,999
0,0186
0,2365
1
0,1621
Processus
papillaris
> 0,999
> 0,999
> 0,999
0,1621
1
Tabelle S23: CYP1A1, 1A2, 2C, 2D und 3A Aktivität (pmol D-Luciferin/ µg Protein/ Min) und CPR
Aktivität (mU/ mg) in männl. C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäusen (Mittelwert (MW) ±
Standardabweichung (SD), n=8, P-Wert: Kruskal-Wallis).
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
Aktivität
MW
± SD
MW
± SD
MW
± SD
P-Wert
CYP1A1
0,0196
0,0066
0,0103
0,0025
0,0393
0,0073
0,0001
CYP1A2
0,478
0,098
0,335
0,0635
0,6355
0,0436
0,0002
CYP2C
0,0103
0,003
0,003
5,8E-5
0,009
0,001
0,0003
CYP2D
0,0707
0,021
0,002
0,0007
0,0562
0,0513
0,0002
CYP3A
0,0698
0,014
0,06075
0,0079
0,0732
0,0146
0,2248
CPR
55,06
6,961
36,72
2,899
52,63
15,07
0,0130
Anhang
132
Tabelle S24: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Kruskal-Wallis Test) mit
Dunn’s multiple comparison der CYP3A Aktivitätsdaten (männl. C57BL/6J, Balb/cJ,
129S1/SvImJ Mäuse, n = 8).
P-Wert
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
C57BL/6J
1
0,5038
> 0,999
Balb/cJ
0,5038
1
0,3348
129S1/SvImJ
> 0,999
0,3348
1
Tabelle S25: CYP1A1, 1A2, 2D und 3A Proteingehalt (ng CYP/ µg Protein) in männl. C57BL/6J,
Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäusen (Mittelwert (MW) ± Standardabweichung (SD), n=8).
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
Proteingehalt
MS
± SD
MW
± SD
MW
± SD
P-Wert
CYP1A1
0,305
0,134
0,294
0,148
0,284
0,144
0,9254
CYP1A2
0,578
0,304
0,472
0,164
0,354
0,084
0,0935
CYP2D
0,31
0,02
0,314
0,028
0,328
0,027
0,2299
CYP3A
0,645
0,268
0,505
1,11
0,475
0,178
0,2080
Tabelle S26: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Kruskal-Wallis Test) mit
Dunn’s multiple comparison der CYP3A Proteindaten (männl. C57BL/6J, Balb/cJ, 129S1/SvImJ
Mäuse, n = 8).
P-Wert
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
C57BL/6J
1
0,9666
0,2313
Balb/cJ
0,9666
1
> 0,9999
129S1/SvImJ
0,2313
> 0,9999
1
Tabelle S27: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Kruskal-Wallis Test) mit
Dunn’s multiple comparison der CPR Aktivitätsdaten (männl. C57BL/6J, Balb/cJ, 129S1/SvImJ
Mäuse, n = 8).
P-Wert
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
C57BL/6J
1
0,0240
> 0,999
Balb/cJ
0,0240
1
0,0441
129S1/SvImJ
> 0,999
0,0441
1
Anhang
133
Tabelle S28: Relative Genexpression der Cyp Enzyme und CYP Regulatoren in der gesamten
Leber von männlichen C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäusen (n = 8, Ausnahme
Cyp2d34: n = 7 (C57BL/6J) und n = 5 (129S1/SvImJ), E = Exponent). Die zur Analyse
verwendeten Primer sind in Tabelle S19 im Anhang aufgeführt.
Stamm
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
Gen
MW1
± SD2
MW1
± SD2
MW1
± SD2
P-Wert3
Cyp1a1
7,99E+02
1,63E+02
1,10E+03
2,84E+02
8,69E+02
2,21E+02
0,0568
Cyp1a2
1,26E+06
2,14E+05
1,26E+06
2,01E+05
1,68E+06
9,25E+04
0,0005
Cyp2c29
3,53E+05
6,97E+04
6,06E+05
2,00E+05
5,52E+05
2,08E+05
0,0087
Cyp2c37
3,14E+06
3,37E+05
2,59E+06
2,95E+05
2,51E+06
4,20E+05
0,0061
Cyp2c44
7,87E+05
9,27E+04
7,75E+04
1,85E+04
6,04E+05
1,26E+05
< 0,0001
Cyp2c50
4,64E+06
7,03E+05
9,75E+06
7,56E+05
6,25E+06
1,16E+06
< 0,0001
Cyp2c67
4,25E+05
6,14E+04
8,64E+05
9,48E+04
6,10E+05
4,03E+04
< 0,0001
Cyp2c70
3,53E+05
6,97E+04
6,06E+05
2,00E+05
5,52E+05
2,08E+05
0,0087
Cyp2d9
1,93E+06
6,73E+05
2,54E+06
3,09E+05
1,98E+06
1,78E+05
0,0075
Cyp2d10
3,27E+06
4,24E+05
3,66E+06
3,94E+05
2,99E+06
2,40E+05
0,0079
Cyp2d11
1,29E+05
3,33E+04
1,52E+05
4,16E+04
1,20E+05
1,78E+04
0,1083
Cyp2d12
5,80E+02
1,66E+02
5,36E+02
1,20E+02
1,10E+03
1,47E+02
0,0006
Cyp2d13
6,56E+05
9,13E+04
5,77E+05
7,97E+04
6,36E+05
1,06E+05
0,2894
Cyp2d22
2,94E+05
5,70E+04
2,60E+05
5,31E+04
2,55E+05
3,41E+04
0,2363
Cyp2d26
1,44E+06
2,52E+05
1,32E+06
3,39E+05
1,26E+06
1,36E+05
0,2815
Cyp2d34
2,77E+02
3,73E+02
1,52E+02
2,75E+02
1,11E+02
1,64E+02
0,5144
Cyp2d40
2,10E+05
2,30E+04
1,77E+05
2,44E+04
2,04E+05
3,20E+04
0,0583
AHR
3,61E+04
7,85E+03
2,93E+03
7,18E+02
3,08E+04
7,43E+03
0,0004
CAR
4,50E+04
7,87E+03
4,35E+04
1,00E+04
5,75E+04
1,70E+04
0,1433
PXR
3,02E+04
2,63E+03
2,25E+04
2,71E+03
2,90E+04
7,38E+03
0,0032
CPR
1,44E+05
3,31E+04
1,20E+05
4,22E+04
1,36E+05
2,20E+04
0,3491
1 Mittelwert (MW) 2 Standardabweichung (SD) 3 Kruskal-Wallis Test
Tabelle S29: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Kruskal-Wallis Test) mit
Dunn’s multiple comparison der CPR Genexpressionsdaten (männl. C57BL/6J, Balb/cJ,
129S1/SvImJ Mäuse, n = 8).
P-Wert
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
C57BL/6J
1
0,4415
> 0,9999
Balb/cJ
0,4415
1
> 0,9999
129S1/SvImJ
> 0,9999
> 0,9999
1
Anhang
134
Tabelle S30: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Kruskal-Wallis Test) mit
Dunn’s multiple comparison der CYP1A1 Aktivitätsdaten (männl. C57BL/6J, Balb/cJ,
129S1/SvImJ Mäuse, n = 8).
P-Wert
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
C57BL/6J
1
0,2141
0,0441
Balb/cJ
0,2141
1
<0,0001
129S1/SvImJ
0,0441
<0,0001
1
Tabelle S31: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Kruskal-Wallis Test) mit
Dunn’s multiple comparison der CYP1A2 Aktivitätsdaten (männl. C57BL/6J, Balb/cJ,
129S1/SvImJ Mäuse, n = 8).
P-Wert
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
C57BL/6J
1
0,2691
0,0441
Balb/cJ
0,2691
1
0,0001
129S1/SvImJ
0,0441
0,0001
1
Tabelle S32: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Kruskal-Wallis Test) mit
Dunn’s multiple comparison der CYP2C Aktivitätsdaten (männl. C57BL/6J, Balb/cJ,
129S1/SvImJ Mäuse, n = 8).
P-Wert
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
C57BL/6J
1
0,0005
> 0,999
Balb/cJ
0,0005
1
0,0080
129S1/SvImJ
> 0,999
0,0080
1
Tabelle S33: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Kruskal-Wallis Test) mit
Dunn’s multiple comparison der CYP2D Aktivitätsdaten (männl. C57BL/6J, Balb/cJ,
129S1/SvImJ Mäuse, n = 8).
P-Wert
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
C57BL/6J
1
0,0002
0,7737
Balb/cJ
0,0002
1
0,0140
129S1/SvImJ
0,7737
0,0140
1
Anhang
135
Tabelle S34: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Kruskal-Wallis Test) mit
Dunn’s multiple comparison der CYP1A1 Proteindaten (männl. C57BL/6J, Balb/cJ, 129S1/SvImJ
Mäuse, n = 8).
P-Wert
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
C57BL/6J
1
>0,9999
>0,9999
Balb/cJ
>0,9999
1
>0,9999
129S1/SvImJ
>0,9999
>0,9999
1
Tabelle S35: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Kruskal-Wallis Test) mit
Dunn’s multiple comparison der CYP1A2 Proteindaten (männl. C57BL/6J, Balb/cJ, 129S1/SvImJ
Mäuse, n = 8).
P-Wert
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
C57BL/6J
1
>0,9999
0,1017
Balb/cJ
>0,9999
1
0,4127
129S1/SvImJ
0,1017
0,4127
1
Tabelle S36: Berechnete P-Werte der nichtparametrischen ANOVA (Kruskal-Wallis Test) mit
Dunn’s multiple comparison der CYP2D Proteindaten (männl. C57BL/6J, Balb/cJ, 129S1/SvImJ
Mäuse, n = 8).
P-Wert
C57BL/6J
Balb/cJ
129S1/SvImJ
C57BL/6J
1
>0,9999
0,2691
Balb/cJ
>0,9999
1
0,8665
129S1/SvImJ
0,2691
0,8665
1
Abbildungsverzeichnis
136
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der anatomischen Bereiche, die an der
Nozizeption- und Schmerzwahrnehmung beteiligt sind.......................................................... 3
Abbildung 1.2: Schematische Darstellung der Nozizeption .................................................... 4
Abbildung 1.3: Schematische Übersicht möglicher Signalwege von Opioidrezeptoren .......... 8
Abbildung 1.4: A) Incremental Hot Plate Apparatur und B) Abbruchkriterium .......................11
Abbildung 1.5: Schematische Übersicht des Katalysemechanismus von CYP Enzymen ......16
Abbildung 1.6: Metabolisierung von Buprenorphin ................................................................17
Abbildung 1.7: Häufig verwendete Maus Inzuchtstämme .....................................................19
Abbildung 1.8: Illustrierung der wissenschaftlichen Fragestellung ........................................22
Abbildung 1.9: Übersicht der Arbeitspakete sowie angestrebtes Ziel ....................................23
Abbildung 2.1: Zeitlicher Ablauf des Tierversuches ..............................................................32
Abbildung 2.2: Schematische Darstellung der Leberlappen der Maus und entsprechende
Nassgewichte .......................................................................................................................35
Abbildung 3.1: Buprenorphin Dosis-Wirkungskurve ..............................................................45
Abbildung 3.2: Dosisabhängige Geschwindigkeit 30 min nach Gabe von Buprenorphin .......46
Abbildung 3.3: Basale Schmerzsensitivität ...........................................................................47
Abbildung 3.4: Dosis- und stammesabhängige Wirksamkeit von Buprenorphin ....................48
Abbildung 3.5: Häufigkeit der definierten Abbruchkriterien im IHP Test ................................49
Abbildung 3.6: Aktivitätssteigerung durch Applikation von Buprenorphin ..............................50
Abbildung 3.7: Konzentration von Buprenorphin und seiner Metaboliten in Serum und Gehirn
.............................................................................................................................................52
Abbildung 3.8: Dosis- und stammesabhängige Serumkonzentration von Buprenorphin und
seiner Metaboliten ................................................................................................................53
Abbildung 3.9: Metabolisches Verhältnis (MR) im Serum .....................................................54
Abbildung 3.10: Dosis- und stammesabhängige Konzentration von Buprenorphin und seiner
Metaboliten im Gehirn ..........................................................................................................55
Abbildung 3.11: Dosis- und stammesabhängige Verteilung von Buprenorphin und seiner
Metaboliten zwischen Gehirn und Blut ..................................................................................56
Abbildung 3.12: CYP Aktivität und Proteingehalt in den Leberlappen männlicher C57BL/6J
Mäuse ..................................................................................................................................61
Abbildung 3.13: Lobuläre CPR Aktivität und Genexpression ................................................64
Abbildung 3.14: Stammesabhängige CYP3A Aktivität und Proteingehalt..............................65
Abbildung 3.15: Stammesbedingte CPR Aktivität und Genexpression ..................................66
Abbildung 5.1: Übersicht der neu formulierten Hypothesen ..................................................86
Tabellenverzeichnis
137
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1.1: Übersicht zur Verteilung und wichtigsten Eigenschaften der µ- (MOR), δ- (DOR),
κ- (KOR) und Opioid receptor like-1 (ORL1) Opioidrezeptoren .............................................. 6
Tabelle 1.2: Pharmakologische Vorgehensweise in der Schmerztherapie in Abhängigkeit der
prognostizierten Schmerzintensität bei der Maus (modifiziert nach (15, 69)) ........................13
Tabelle 1.3: Verschiedene Dosierungsempfehlungen für Buprenorphin zur Anwendung bei
der Maus ..............................................................................................................................13
Tabelle 2.1: Verbrauchsmaterial ...........................................................................................24
Tabelle 2.2: Chemikalien/ Biochemikalien und Reagenzien ..................................................24
Tabelle 2.3: Puffer und Lösungen .........................................................................................25
Tabelle 2.4: Kommerzielle biologische Kits ...........................................................................25
Tabelle 2.5: Enzyme .............................................................................................................26
Tabelle 2.6: DNA/ RNA Ladder .............................................................................................26
Tabelle 2.7: Kommerzielle Primer .........................................................................................26
Tabelle 2.8: Designte Primer zur SNP Validierung mittels RFLP oder Sanger Sequenzierung
.............................................................................................................................................27
Tabelle 2.9: Geräte ...............................................................................................................28
Tabelle 2.10: Software ..........................................................................................................28
Tabelle 2.11: Übersicht der verwendeten Mausgruppen zugeordnet zum jeweiligen Versuch
.............................................................................................................................................29
Tabelle 2.12: Verwendete Analgetika ...................................................................................30
Tabelle 2.13: PCR-Programm zur DNA-Fragmentherstellung ...............................................37
Tabelle 2.14: Optimierte Reaktionsbedingungen der designten Primerpaare .......................38
Tabelle 2.15: Zusammensetzung des PCR Reaktionsmix ....................................................38
Tabelle 2.16: Übersicht verwendeter Restriktionsenzyme (RE) und resultierender DNA-
Fragmente ............................................................................................................................39
Tabelle 3.1: Ergebnisse der SNP Verifizierung bei verwendeten C57BL/6J, Balb/cJ und
129S1/SvImJ Mäusen (n = 15 pro Stamm). ..........................................................................58
Tabelle 3.2: Relative Genexpression der Cyp3a Isozyme in den vier Leberlappen und dem
Processus papillaris männlicher C57BL/6J Mäuse (n = 10; E = Exponent). ..........................63
Tabelle 3.3: Relative Genexpression der Cyp3a Isozyme und CYP Regulatoren in der
gesamten Leber von männlichen C57BL/6J, Balb/cJ und 129S1/SvImJ Mäusen (n = 8,
E = Exponent) ......................................................................................................................66
Abkürzungsverzeichnis
138
Abkürzungsverzeichnis
AC
Adenylatcyclase
AHR
Aryl-Hydrocarbon Rezeptor
Alas1
δ-Aminolaevulinat Synthase 1
bp
Basenpaare
bp
Basenpaare
cAMP
Zyklische Adenosinmonophosphat
CAR
Constitutiv androstan Rezeptor
CGRP
calcitonin gene-related peptide
CHE
Schweiz
CHN
China
CO2
Kohlenstoffdioxid
CPR
NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase
CYP
Cytochrom-P450
D
Deutschland
DOR
δ-Opioidrezeptor
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
ERK
extracellular-signal regulated Kinase
FELASA
Federation of European Laboratory Animal Science Association
GRK
G-Protein gekoppelte Rezeptorkinase
GV-SOLAS
Gesellschaft für Versuchstierkunde
i.p.
intraperitoneal
IASP
International Association for the study of pain“
IHP
Incremental Hot Plate
JNK
c-Jun N-terminale Kinasen
KOR
κ-Opioidrezeptor
Lobus c.
Lobus caudatus
Lobus d. l.
Lobus dexter lateralis
Lobus m.
Lobus medialis
Lobus s. l.
Lobus sinister lateralis
MAPK
mitogen-activated protein kinase
MOR
µ-Opioidrezeptor
MPE
Maximal möglicher Effekt
MR
metabolisches Verhältnis
MW
Mittelwert
NCBI
National Center for Biotechnology Information
NSAID
Nichtsteroidale Antiphlogistika
Abkürzungsverzeichnis
139
ORL1
Opioid receptor like-1
PBS
Phosphatgepufferte Salzlösung
PCPA
P-Chlorphenylalanin
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
Proc. p.
Processus papillaris
PXR
Pregnan-X-Rezeptor
qPCR
Quantitative Polymerase-Kettenreaktion
rcf
relativer Zentrifugalkraft
RE
Restriktionsenzym
Ref
Referenz
RFLP
Restriktions-Fragmentlängen Polymorphismus
RLT
RNeasy Lysis Buffer
RLU
relativen Lumineszenzeinheiten
s.c.
subkutan
SD
Standardabweichung
SNP
single nucleotide polymorphism
TRP
transient receptor potential -Kanäle
UGT
UDP-Glucuronosyltransferase
USA
Vereinigte Staaten von Amerika
vs.
versus
WA
Gewichteter Mittelwert
ZNS
Zentral Nervensystem
β-ME
β-Mercaptoethanol
Danksagung
140
Danksagung
Mein besonderer Dank geht an Herrn Prof. Dr. Gilbert Schönfelder, der mir ermöglicht hat
auf diesem interessanten und interdisziplinären Gebiet zu promovieren. Vielen Dank für die
Unterstützung, aber auch für das entgegengebrachte Vertrauen dieses Projekt so frei
durchzuführen. Darüber hinaus möchte ich Herrn Prof. Dr. Jens Kurreck für die überaus
konstruktive universitäre Betreuung meiner Promotion danken. Ein weiterer Dank geht an
Herrn Prof. Dr. Lars Lewejohann, der mich mit seiner Expertise in der Verhaltensbiologie
unterstützt hat.
Ein herzlicher Dank geht an meine beiden wissenschaftlichen Betreuerinnen Dr. Silvia Vogl
und PD Dr. Bettina Bert, die immer ein offenes Ohr für mich hatten und mich in meiner
wissenschaftlichen Karriere gefördert haben. Des Weiteren möchte ich der Fachgruppe 95
am BfR für die freundliche Aufnahme danken und dabei besonders meiner
Fachgruppenleiterin Frau Dr. Stefanie Banneke, die sich immer Zeit für meine Anliegen
genommen hat. Darüber hinaus möchte ich den Tierpflegern herzlich danken, die mich in
den professionellen Umgang mit Versuchstieren eingeführt und unterstützt haben. Hierbei
möchte ich besonders Frau Carola Schwarck danken, die selbst manches Wochenende mit
mir im Tierraum verbracht hat. Des Weiteren möchte ich meiner Bürokollegin Dr. Annalena
Riedasch danken, die mich nicht nur fachlich unterstützt hat sondern mit der Zeit eine sehr
gute Freundin geworden ist, mit der ich immer herzlich lachen konnte. Natürlich möchte ich
auch allen anderen Kollegen und Doktoranden der Abteilung 9 des BfR für ihre
Unterstützung, die freundliche Zusammenarbeit und die konstruktiven Kommentare in den
Laborseminaren danken. In diesem Zusammenhang möchte ich Dr. Céline Heinl und Dr.
Philip Marx-Stoelting für ihre fachliche Expertise danken und Julia Scheinpflug, die mich
während der Verifizierung der SNP tatkräftig beim pipettieren unterstützt hat. Ein herzlicher
Dank geht auch an Dr. Matthias Steinfath, der sich in den komplexen biologischen
Sachverhalt eingedacht und das Simulationsmodell zur Berechnung der zu verwendenden
Tierzahl in den Versuchen erstellt hat.
Zum Schluss möchte ich vor allem meinen Freunden und meiner Familie danken, die mich in
allem unterstützt haben, immer ein offenes Ohr für mich hatten und mich zu der Person
gemacht haben die ich heute bin. Darin inbegriffen ist mein Freund Philip Preikschat der
mich in allem unterstützt und immer wieder aufgebaut hat. Außerdem möchte ich besonders
Marica Grossegesse und „unserem“ Pferd Avalon für die gemeinsamen entspannten Ausritte
am Wochenende danken.
