Charakterisierung Migräne-relevanter Mutationen anhand
Struktur-Funktions-Untersuchungen der Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit
vorgelegt von
Diplom-Biologin
Nedime Neslihan Tavraz
aus Mainz
von der Fakultät II – Mathematik und Naturwissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzende: Prof. Dr. Marga Lensen
Gutachter: Prof. Dr. Thomas Friedrich
Gutachter: Prof. Dr. Peter Hildebrandt
Gutachter: Prof. Dr. Ernst Bamberg
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 17. Dezember 2010
Berlin 2010
D 83
„Forschung ist immer das Weiterforschen, wo andere aufgehört haben, das Weiterbauen
auf Grundsteinen und Gerüsten, die andere vorbereitet haben, und damit allerdings leider
zugleich auch mitunter das Weitergehen auf Irrwegen, die andere eingeschlagen haben.”
Hubert S. Markl (*1938), dt. Biologe und Hochschullehrer, 1986-91 Präsident der DFG, 1996-2002 Präsident der Max-Planck-Gesellschaft
Für Robert Schumann
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis III
Publikationen, Vorträge, Posterbeiträge V
1 Einleitung 01
1.1 Die ATPasen-Superfamilie 03
1.1.1 Die Na+/K+-ATPase: Untereinheiten und Isoformen 05
1.1.1.1 α-Untereinheit 05
1.1.1.2 β-Untereinheit 08
1.1.1.3 γ-Untereinheit 10
1.1.2 Weitere funktionell wichtige Bereiche der Na+/K+-ATPase 13
1.1.2.1 Inhibitoren der Na+/K+-ATPase und ihre Bindungsstellen 13
1.1.2.2 Kationen-Bindungsstellen 15
1.1.3 Aktiver Transport und katalytischer Zyklus 17
1.1.4 Elektrogenizität 18
1.2 Na+/K+-ATPase-assoziierte Erkrankungen 19
1.2.1 Die klassische Migräne 23
1.2.2 Pathophysiologie der Migräneaura 24
1.2.3 Cortical Spreading Depression 25
1.2.4 Familiäre Hemiplegische Migräne Typ 2, FHM-2 29
1.3 Zielsetzung der Arbeit 33
2 Materialien & Methoden 35
2.1 Molekularbiologische Methoden und Xenopus laevis-Ooyzten-Präparation 36
2.1.1 Herstellung der cDNA-Konstrukte 36
2.1.2 Partielle Ovarektomie und Oozytenbehandlung 36
2.1.3 cRNA-Synthese und -Injektion 38
2.2 Proteinbiochemische und zellbiologische Methoden 38
2.2.1 Isolierung von Plasmamembranfragmenten 38
2.2.2 Präparation der Totalmembranfraktion 39
2.2.3 HEK293FT-Zellen: Transfektion und Gewinnung von Ganzzell-Lysaten 39
2.2.4 SDS-Gel-Elektrophorese und Western Blots 39
2.3 Transportmessungen der humanen Na+/K+-ATPase 40
2.3.1 Vorbereitung der Oozyten 40
2.3.2 Rubidium-Transport-Messungen mittels Atom-Absorptions-Spektroskopie 40
2.4 Elektrophysiologische Messungen und Auswertung der Messdaten 41
2.4.1 Verwendete Lösungen und Geräte 41
2.4.2 Spannungsprotokoll 42
2.4.3 Messung und Untersuchung der stationären und transienten Ströme 43
2.4.4 Bestimmung der Aktivierungsenergie EA 45
Inhaltsverzeichnis
II
3 Resultate 46
3.1 Kalium-induzierte Pumpströme 48
3.2 Untersuchung der Rubidium-Aufnahme 49
3.3 Expression der ATP1A2-Konstrukte in Xenopus laevis-Oozyten 50
3.4 [K+]ext- und Spannungsabhängigkeit der K+-induzierten Pumpströme 51
3.5 Transiente Ströme: Kinetiken und Spannungsabhängigkeiten 55
3.6 Wechselzahlen 58
3.7 Proteinstabilität 60
4 Diskussion 64
4.1 Auswirkung auf die katalytische Aktivität und die Plasmamembran-Expression 67
4.1.1 Elektrophysiologisch nicht charakterisierbare Konstrukte 71
4.2 Vernetzung via R1-X1-H•••X2-R2 zwischen der Schleife L6/7, der P- & TM-Domäne 74
4.2.1 Mutation in der Region des Gelenkstücks zwischen der P- und N-Domäne 77
4.3 Temperaturabhängige Instabilität des Na+/K+-ATPase-Proteins 78
4.4 Expansion des C-Terminus durch Mutation des Stopp-Codons TGA 81
4.5 Zusammenhang zwischen Funktionsstörungen der Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit und Migräne 84
5 Zusammenfassung 88
6 Literaturverzeichnis 90
7 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 114
8 Danksagung 118
Abkürzungsverzeichnis
III
Abkürzungen
Abb. Abbildung
ABC-ATPasen ATP-bindende Kassette (enthaltene) ATPasen (“ATP binding cassette“)
ADP Adenosindiphosphat
Ag Silber
APS Ammoniumpersulfat
ATP Adenosintriphosphat
ATPase ATP-hydrolysierendes Enzym
AS Aminosäure
BFIC benigne familiäre infantile Krampfanfälle (“benign familial infantile convulsions”)
BFNC benigne familiäre neonatale Krampfanfälle (”benign familial neonatal convulsions“)
BOLD “blood oxygen level dependency”
bp Basenpaar
°C Grad Celsius
CaCl2 Calciumchlorid
CADASIL (”Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy”)
Cd Cadmium
Cl Chlorid
CFTR “Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator”
cRNA komplementäre Ribonukleinsäure (“complementary ribonucleic acid”)
CSD kortikale Streudepolarisierung (“cortical spreading depression”)
Cu Kupfer
DNA Desoxyribonukleinsäure (“desoxyribonucleic acid”)
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
EA-2 episodische Ataxie Typ 2
ENaC epithelialer Natriumkanal
et al. “und andere“ (“et alii“)
F Faraday-Konstante (9,64853•104 C•mol−1)
FHM Familiäre Hemiplegische Migräne
fMRT, fMRI funktionelle Magnetresonanztomographie (“functional magnetic resonance imaging“)
g Gramm
GLAST Glutamat-Transporter in Astrozyten (“glutamate aspartate transporter“)
HbA Homogenisierungspuffer A (homogenisation buffer A)
HEPES N-2-Hydroxethylpiperazin-N-Ethansulfonsäure
I Strom
K Kalium
kb Kilo-Basenpaare
K0.5 Konzentration der halbmaximalen Aktivität
KCl Kaliumchlorid
kDa Kilodalton
l bzw. L Liter
M Molar
MA Migräne mit Aura
MBS Modified Barth Solution
MBSS MES-gepufferte Salzlösung
MES 2(-N-Morpholino)-Ethansulfonsäure
mg Milligramm
Mg Magnesium
MgCl2 Magnesiumchlorid
Abkürzungsverzeichnis
IV
min Minuten
mM Millimolar
ml Milliliter
MOPS 3(-N-Morpholino)-propansulfonsäure
MRS Magnet Resonanz Spektroskopie (”magnetic resonance spectroscopy”)
n nano
Na Natrium
NaCl Natriumchlorid
NCX Natrium-Kalzium-Austauscher (”sodium calcium exchanger“)
NMDA-Rezeptoren Glutamat-Rezeptor (“N-methyl-D-aspartate receptor“)
NMR Kernspinresonanzspektroskopie (“nuclear nagnetic resonance”)
ORI Oozyten-Ringerlösung
p pico
PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Pb Blei
PBST Phosphat gepufferte Salzlösung mit Tween 20
PC Phosphatidylcholin
PE Phosphatidylethanolamin
PLB Post-Ladelösung (“post loading buffer”)
PMCA Plasmamembran Kalzium-ATPase
PS Phosphatidylserin
R molare Gaskonstante (8,314472 J mol−1 K−1)
rCBF regionaler zerebraler Blutfluss (”regional cerebral blood flow”)
RNA Ribonukleinsäure (“ribonucleic acid”)
Rb Rubidium
RDP “Rapid-Onset Dystonia-Parkinsonism”
Q Ladung
s Sekunde
SCA-6 Spinozerebelläre Ataxie Typ 6 (“spinocerebral ataxie type 6”)
SDS Natriumdodecylsulfat (“sodium dodecyl sulfate“)
SERCA Kalzium-ATPase im Sarkoplasmatischem Retikulum
sf9 Insekten-Zelllinie aus Ovar-Zellen von Spodoptera frugiperda
SHM Sporadische Hemiplegische Migräne
T Temperatur
TEMED N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin
TEVC Zwei-Elekroden-Spannungsklemme (“two electrode voltage clamp“)
TM Transmembran
TRIS Tris(-hydroxylmethyl-)aminomethan
V Volt, Einheit für Spannung
V0.5 Spannung des halbmaximalen Ladungswertes
WHO Weltgesundheitsorganisation (”world health organization”)
WT Wildtyp
xg x 9,81 m/s2
Q Ladung
Zn Zink
µ mikro
Ω Ohm
Aminosäuren-Kodierung erfolgt nach der IUPAC-Nomenklatur (Ein- bzw. Drei-Buchstaben-Code)
V
Publikationen
Diese Arbeit ist teilweise in folgenden Publikationen bereits veröffentlicht worden:
* TAVRAZ, N. N., FRIEDRICH, T., DÜRR, K. L., KOENDERINK, J. B., BAMBERG, E., FREILINGER, T., DICHGANS, M. (2008)
“Diverse functional consequences of mutations in the Na+/K+-ATPase α2-subunit causing familial hemiplegic
migraine type 2.”
J. Biol. Chem. 283, 31097-31106
* TAVRAZ, N. N., DÜRR, K. L., KOENDERINK, J. B., FREILINGER, T., BAMBERG, E., DICHGANS, M., FRIEDRICH, T. (2009)
“Impaired plasma membrane targeting or protein stability by certain ATP1A2 mutations identified in sporadic or
familial hemiplegic migraine.”
Channels (Austin) 3, 82-87
Vorträge
Teile dieser Arbeit wurden auf folgenden Tagungen/Konferenzen vorgetragen:
* Göttinger Transporttage, 03. Dezember 2005, Universität Göttingen, Göttingen, Deutschland
[von Prof. Dr. Thomas Friedrich]
* 12th International ATPase Conference, 05.-10. August 2008, Universität Århus, Århus, Dänemark
[von Prof. Dr. Thomas Friedrich]
* 18th Annual Computational Neuroscience Meeting CNS*2009, Workshop vom 22.-23. Juli 2009, Berlin-
Brandenburgische Akademie der Wissenschaften, Berlin
[von Prof. Dr. Thomas Friedrich]
Poster
Teile dieser Arbeit wurden auf folgenden Tagungen/Konferenzen präsentiert:
* 11th International ATPase Conference and 59th Annual Meeting and Symposium of the Society of General
Physiologists, 06. - 11. September 2005, Woods Hole, Massachusetts, (USA)
* Joint Meeting of The German Society of Physiology and The Federation of European Physiological Societies,
26. - 29. März 2006, München, Deutschland
* 12th International ATPase Conference, 05. - 10. August 2008, Universität Århus, Århus, Dänemark
VI
Weitere Publikationen
1. DÜRR, K. L., TAVRAZ, N. N., ZIMMERMANN, D., BAMBERG, E., and FRIEDRICH, T. (2008)
“Characterization of Na,K-ATPase and H,K-ATPase enzymes with glycosylation-deficient β-subunit
variants by voltage-clamp fluorometry in Xenopus oocytes.”
Biochemistry 47, 4288-4297
2. DÜRR, K. L., TAVRAZ, N. N., DEMPSKI, R. E., BAMBERG, E., and FRIEDRICH, T. (2009)
“Functional significance of E2 state stabilization by specific α/β-subunit interactions of Na,K- and
H,K-ATPase.”
J. Biol. Chem. 284, 3842-3854
3. DÜRR, K. L., ABE, K., TAVRAZ, N. N., and FRIEDRICH, T. (2009)
„E2P-state stabilization by the N-terminal tail of the H,K-ATPase β-subunit is critical for efficient
proton pumping under in vivo conditions.”
J. Biol. Chem. 284, 20147-20154
4. MEIER, S., TAVRAZ, N. N., DÜRR, K. L., and FRIEDRICH, T. (2010)
„Hyperpolarization-activated inward Na+ leakage currents caused by deletion or mutation of
carboxy-terminal tyrosines of the Na+/K+-ATPase α-subunit.”
J. Gen. Physiol. 135, 115-134
1
Einleitung
Einleitung
2
1 Einleitung
Noch bevor die DNA als „Nuclein“ in Zellkernen von Lymphoyzten entdeckt [MIESCHER, 1871] und viel
später auch ihre molekulare Struktur aufgeklärt wurde [WATSON und CRICK, 1953], war die Existenz von
Enzymen bekannt [PAYEN und PERSOZ, 1833]. Der Begriff Enzym stammt ursprünglich aus dem
Lateinischen (fermentum), steht für „Ferment“ und bedeutet „Gärungsmittel“ oder „Sauerteig“. Erst im
Jahre 1878 erhielt die heute in der Wissenschaft gebräuchliche Bezeichnung „Enzym“ seinen
eigentlichen Namen [KÜHNE, 1878]. Dieses Wort entstammt dem Griechischen (ένζυμον, ’enzymon’) von
en (έν) ’in’ und zýmē (ζύμη), dem ebenfalls die Bedeutung „Sauerteig“ zugewiesen wird.
Zu einem der bekanntesten Lehrbuch-Enzyme gehört die Na+/K+-ATPase. Sie wurde 1957 vom
dänischen Mediziner Jens Christian Skou entdeckt [SKOU, 1957], wofür er im Jahre 1997 gemeinsam
mit John Ernest Walker und Paul Delos Boyer den Nobelpreis für Chemie erhielt. Die Na+/K+-ATPase
bzw. die Na+/K+-Pumpe, wie sie teilweise auch bezeichnet wird, ist für den Aufbau und die
Aufrechterhaltung des Konzentrationsunterschieds der Ionen Natrium und Kalium zwischen dem
Zytoplasma und dem extrazellulären Raum verantwortlich. Im Inneren der Zelle liegt eine
Natriumkonzentration ([Na+]) von etwa 10-20 mM vor, während sie im Außenmedium eine [Na+] von
ca. 120 mM aufweist. Im Falle des Kaliums verhält sich die Konzentrationsverteilung genau umgekehrt,
hier herrscht im zytoplasmatischen Raum eine hohe [K+] von ca. 130 mM und eine niedrige
extrazelluläre [K+] von lediglich etwa 5-10 mM. Dies bewerkstelligt das Enzym unter ATP-Hydrolyse und
katalysiert pro ATP-Molekül den Transport von zwei Kalium-Ionen ins Zellinnere und drei Natrium-Ionen
aus der Zelle heraus (siehe Abbildung 1.1) [POST und JOLLY, 1957, GARRAHAN und GLYNN, 1967].
Abbildung 1.1
In die Plasmamembran integrierte Na+/K+-ATPase. Die beiden Prozesse ATP-Spaltung und Ionentransport sind bei ATPasen
strikt gekoppelt und finden unter physiologischen Bedingungen gegen den elektrochemischen Gradienten statt.
Na
+
K
+
ATP ADP
P
i
extrazellulär
intrazellulär
+
Einleitung
3
1.1 Die ATPasen-Superfamilie
ATPasen kommen sowohl in Membranen von Pro- als auch Eukaryoten vor und haben die gemeinsame
Eigenschaft, dass sie die Hydrolyse von ATP in ADP katalysieren und die dabei frei werdende Energie
für den Transport von Ionen nutzen. Sie lassen sich in membrangebundene und nicht-
membrangebundene ATPasen einteilen. Membran-assoziierte Transport-ATPasen werden kategorisiert
in F-, P-, V- und ABC-ATPasen [PEDERSEN und CARAFOLI, 1987, PEDERSEN 2002, 2005].
ABC-ATPasen sind eher unter der Bezeichnung ABC-Transporter bekannt [HIGGINS, 2001,
DAVIDSON und CHEN, 2004, DEAN und ANNILO, 2005, HOLLENSTEIN, et al., 2007]. Die Namensgebung ist
darauf zurückzuführen, dass sie alle eine ATP-bindende Kassette (ATP Binding Cassette) besitzen.
Neben der ATPase-Untereinheit gibt es noch die Permease-Domäne, die für Substrat-Spezifität und
-Transport verantwortlich ist. Die ABC-Transporter repräsentieren die größte Familie der ATPasen, da
sie in fast allen Organismen zu finden sind. Allein im menschlichen Organismus existieren etwa
50 ABC-Transporter [GOTTESMAN und AMBUDKAR, 2001, AMBUDKAR et al., 2003, DEAN und ANNILO, 2005].
Zu den bekanntesten ABC-ATPasen gehören der MDR1-Transporter (Multi Drug Resistent Transporter)
und der Chloridkanal CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Häufig führen
Mutationen in ABC-Transportern zu erblichen Erkrankungen, wie z. B. Adrenoleukodystrophie (ABCD-
Transporter, Substrat: relativ langkettige Fettsäuren) [BLAW, 1970, GRIFFIN et al., 1977, MIGEON et al.,
1981, MOSSER et al., 1993, BEZMAN et al., 2001], Mukoviszidose auch genannt Zystische Fibrose (CFTR,
Substrat: Chlorid) [FARBER, 1945, KEREM et al., 1989, BEAR et al., 1992, NAGEL et al., 1992] und
Lipoproteinämie, die Tangier-Krankheit (ABCA 1-Transporter, Substrat: Cholesterol) [FREDRICKSON et al.,
1961, REMALEY et al., 1999, BROOKS et al., 1999, ZARUBICA et al., 2007].
Dem F-Typ zugehörige ATPasen sind vertreten in prokaryotischen Plasmamembranen,
eukaryotischen Mitochondrienmembranen und in Thylakoidmembranen von Chloroplasten. Sie
bestehen aus zwei funktionell verschiedenen Komponenten, die jeweils aus mehreren unterschiedlichen
Untereinheiten aufgebaut sind, dem katalytischen Kopfteil F1 und dem Protonen-transportierenden
Fo-Komplex. Hinsichtlich ihrer physiologischen Funktion sind F-Typ-ATPasen eigentlich
ATP-Synthasen, weil sie nicht (wie die ATPasen im engeren Sinne) ATP hydrolysieren, sondern ATP
synthetisieren.
Der Name V-Typ-ATPase geht auf die Besonderheit zurück, dass diese Enzyme in Vakuolen und in
Vesikeln der Endo- und Exozytose zu finden sind. Sie kommen aber auch in Endo- und Lysosomen
sowie im Golgi-Apparat vor. Aufgebaut sind sie teilweise aus mehr als 20 Untereinheiten [XU et al.,
2007] und weisen eine gewisse strukturelle Ähnlichkeit zu den F-Typ-ATPasen auf, da sich ihr V1-
Komplex wie der F1-Komplex der F-Typ-ATPase auf der zytosolischen Membranseite befindet und der
Vo-Teil kanalartig die Membran durchzieht, wie es auch bei dem Fo-Teil der F-Typ-ATPase der Fall ist.
Einleitung
4
Enzyme, die während des Transportzyklus ein phosphoryliertes Zwischenprodukt bilden, werden
der Familie der P-Typ-ATPasen zugeordnet [PEDERSEN und CARAFOLI, 1987]. Im Laufe der
ATP-Hydrolyse wird das terminale Phosphat (das γ-Phosphat) des ATPs an einen Aspartatrest der
katalytischen Untereinheit übertragen [POST und KUME, 1973]. Dieses Aspartat befindet sich innerhalb
des für P-Typ-ATPasen charakteristischen Motivs DKTGTLT (Abbildung 1.2), wobei die letzten drei
Aminosäuren eine Variabilität aufweisen [JØRGENSEN und ANDERSEN, 1988]. Neben diesem Motiv gibt es
noch zwei weitere ebenfalls hochkonservierte Bereiche: das TGES-Motiv (vor der DKTG-Sequenz)
[MØLLER et al., 1996] und das GDGXNDXP-Motiv (kurz hinter der DKTG-Sequenz). Das TGES-Motiv ist
an der hydrolytischen Abspaltung des Phosphatrestes beteiligt und greift während der Phosphorylierung
die Phosphatgruppe an [CLAUSEN et al., 2004, MØLLER et al., 2005]. Eine Vermutung ist, dass Kalium die
Wechselwirkung der Aktuator- (A) und Phosphorylierungs-Domäne (P) beschleunigt und auf diese
Weise die von der A-Domäne katalysierte Abspaltung des in der P-Domäne vorhandenen Pi begünstigt
[PEDERSEN et al., 2006]. Die Domänen werden unter 1.1.1.1 näher beschrieben (siehe auch Abb. 1.3).
Abhängig von der Substratspezifität unterscheidet man fünf Gruppen innerhalb der
P-Typ-Superfamilie, nämlich Typ I-V (Tabelle 1.1) [SACHS und MUNSON, 1991, FAGAN und SAIER, 1994,
LUTSENKO und KAPLAN, 1995, PALMGREN und AXELSEN, 1998, AXELSEN und PALMGREN, 1998, KÜHLBRANDT,
2004]. Die bislang am besten charakterisierten P-Typ-ATPasen sind zwei aus der Gruppe des PII-Typs:
die Ca2+-ATPase [HASSELBACH und MAKINOSE, 1961, EBASHI und LIPMANN, 1962, HASSELBACH, 1979,
SCOFANO und de MEIS, 1981, HASSELBACH und OETLIKER, 1983, TANFORD, 1984, INESI, 1985, ANDERSEN,
1989, SCHATZMANN, 1989, JENCKS, 1989, INESI et al., 1990, TOYOSHIMA und INESI, 2004, TOYOSHIMA, 2007]
und die Na+/K+-ATPase [SKOU, 1975, ROBINSON und FLASHNER, 1979, CANTLEY, 1981, SCHUURMANNS-
STEKHOVEN und BONTING, 1981, JØRGENSEN, 1982, GLYNN, 1985, JØRGENSEN und ANDERSEN, 1988, SKOU,
1988, ANDERSEN und VILSEN, 1995, MORTH et al., 2007]. Ca2+-ATPasen werden nach ihrer zellulären
Lokalisation in die Subtypen SERCA (im Sarkoendoplasmatischen Retikulum, SarcoEndoplasmatic
Reticulum Ca2+-ATPase) und PMCA (in der Plasmamembran, Plasma Membrane Ca2+-ATPase)
unterschieden. Die SERCA zählt zu den PIIA-Typ-ATPasen [LEE, 2002, STOKES und GREEN, 2003],
während die Plasmamembran-gebundene Ca2+-ATPase dem PIIB-Typ zugeordnet wird.
Die meisten P-Typ-ATPasen sind als Monomere aus einer einzigen Untereinheit aufgebaut. Zu den
Ausnahmen gehört die bakterielle Kdp-ATPase des PIA-Typs [HESSE et al., 1984, BUURMAN et al., 1995,
ALTENDORF et al., 1998], die aus vier verschiedenen Einheiten aufgebaut ist (A, B, C und F), mit der
KdpB-Untereinheit als katalytische Komponente [ALTENDORF et al., 1998]. Weiterhin gehören die Na+/K+-
und die H+/K+-ATPase (TypIIC) mit ihren katalytischen alpha- (α) und akzessorischen beta- (β)
Untereinheiten zu den oligomeren Ionenpumpen, wobei im Falle der Na+/K+-ATPase gewebsspezifisch
eine weitere Untereinheit, die gamma- (γ) im funktionellen Komplex vorhanden sein kann. Einige
Phospholipid-transportierenden PIV-ATPasen [TANG et al., 1996, KÜHLBRANDT, 2004, LENOIR et al., 2007,]
Einleitung
5
besitzen ebenfalls mehr als eine Untereinheit. Neben der α- gibt es eine zweite Untereinheit, die einer
Kombination der β- und γ-Untereinheit der Na+/K+-ATPasen ähnelt [POULSEN et al., 2008].
ATPase
Typ Trivial-Name Vorkommen Anzahl TM Anzahl UE Transportiertes
Kation/Substrat
Typ I A
Typ I B
Typ II A
Typ II B
Typ II C
Typ II D
Typ III A
Typ III B
Typ IV
Typ V A
Typ V B
Kdp-ATPase
CopA, ZntA, CadA
SERCA
PMCA
Na+/K+- & H+/K+-ATPase
Na+- & Ca+-ATPase
H+-ATPase
Mg2+-ATPasen
Lipid-Flippasen
Prokaryoten
Pro- & Eukaryoten
Pro- & Eukaryoten; SR
Pro- & Eukaryotren; PM
Pro- & Eukaryoten
Eukaryoten
Pflanzen, Pilze; PM
Prokaryoten
Eukaryoten
Eukaryoten; ER, cis-Golgi
Eukaryoten; Lysosom
6
8
10
10
10
10
10
10
10
10
10
4
1
1
1
2 bzw. 3
1
1
1
2
1
1
K+
Cu+, Ag+, Zn2+, Cd2+, Pb2+
Ca+
Ca+
Na+/K+, H+/K+
Na+*, Ca+
H+
Mg2+
Phospholipide (PC, PE, PS)
ohne Zuordnung
ohne Zuordnung
Tabelle 1.1
Übersicht über die P-Typ-ATPasen (PC = Phosphatidylcholin, PE = Phosphatidylethanolamin, PS = Phosphatidylserin).
1.1.1 Die Na+/K+-ATPase: Untereinheiten und Isoformen
Die kleinste funktionelle Einheit, aus der die oligomere Na+/K+-ATPase (und auch die H+/K+-ATPase)
aufgebaut ist, besteht aus einer α- und einer β-Untereinheit [JØRGENSEN et al., 1988, BLANCO und
MERCER, 1998]. Im Jahre 1978 entdeckten Forbush und Kollegen eine weitere Untereinheit der Na+/K+-
ATPase, die sogenannte γ-Untereinheit [FORBUSH et al., 1978].
1.1.1.1 α-Untereinheit
Insgesamt sind vier Isoformen der α-Untereinheit bekannt, welche mit α1-α4 bezeichnet werden. Alle
α-Isoformen haben ein Molekulargewicht von ca. 110 kDa und bestehen aus etwas mehr als 1000
Aminosäuren (AS). Die Sequenzidentität liegt bei ~85 % und variiert selbst innerhalb einer Spezies,
insbesondere in der Anzahl der Aminosäuren, wie beispielsweise an den α-Isoformen der Ratte
veranschaulicht werden kann: Hier ist die α1-Isoform aus 1024 AS, die α2-Isoform aus 1021 AS, die α3-
als kürzeste Isoform aus 1014 AS, und die α4-Isoform als längste aus 1028 AS aufgebaut [SCHNEIDER et
al., 1985, SHULL et al., 1986, HERRERA et al., 1987]. Neben der unterschiedlichen Aminosäureanzahl ist
zudem die Anwesenheit von verschiedenartigen regulatorischen Proteinen, die je nach Gewebe und
Organismus variieren (sogenannte FXYD-Proteine, siehe auch “γ-Untereinheit“) und deren
unterschiedliche Interaktionen an der zytoplasmatischen Seite [CORNELIUS et al., 2005] für die
Feinregulierung funktioneller Parameter verantwortlich.
Einleitung
6
Ein weiterer gravierender Unterschied der vier α-Isoformen liegt in ihrem Vorkommen in
verschiedenen Gewebearten [SHULL et al., 1986, SWEADNER, 1989, LINGREL et al., 1990, SHAMRAJ und
LINGREL, 1994]. Während die α1-Isoform ubiquitär ist und in fast allen Geweben vorliegt, werden die
anderen Isoformen zell- und gewebsspezifischer exprimiert. Die α2-Isoform wird bevorzugt im Herzen
und im Gehirn (insbesondere in Gliazellen) exprimiert, die α3-Isoform ist in größeren Mengen in
neuronalem Gewebe lokalisiert und die α4-Isoform ist ausschließlich in testinalem Gewebe vorzufinden
[BLANCO et al., 1999, WOO et al., 2000].
Bei allen α-Isoformen befinden sich die C- (carboxyl, C00H) und N- (amino, NH2) Termini auf der
zytosolischen Seite (Abbildung 1.2). In der M-Domäne (membrane domain), dem transmembranären
Bereich, sind zehn helikale Transmembrandomänen (TM1-TM10) integriert.
Abbildung 1.2 Topologische Anordnung der drei Untereinheiten (α, β, γ) der Na+/K+-ATPase.
Von den fünf extrazellulären und vier intrazellulären Schleifen wird der großen intrazellulären Schleife
zwischen dem vierten und fünften Segment (M4/M5) eine bedeutende Rolle zugeschrieben. In diesem
Bereich befindet sich das für P-Typ-ATPasen charakteristische DKTG-Motiv mit dem hochkonservierten
Aspartat - im Falle der humanen α2-Untereinheit an Position 374 (Asp374 bzw. D374) - das reversibel
phosphoryliert wird und daher maßgeblich an der Namensgebung der P-Domäne (phosphorylation
domain) beteiligt ist. Die N-Domäne (nucleotide binding domain) enthält die bindende Struktur für das
Adenosin-Triphosphat-Molekül (ATP) - das Rossmann-Motiv [KÜHLBRANDT, 2004]. Durch die Bindung
des ATP-Moleküls wird eine beachtliche Konformationsänderung der Bindungstasche und der
Aminosäurereste im „Gelenkstück“ (hinge region), das die N- und P-Domänen miteinander verbindet,
bewerkstelligt [HILGE et al., 2003]. Bereits seit über 30 Jahren ist bekannt, dass P-Typ-ATPasen
während des katalytischen Zyklus’ umfangreiche Konformationsänderungen durchführen [JØRGENSEN,
1975]. Es werden dabei zwei prinzipielle Konformationszustände E1 und E2 unterschieden, welche sich
Einleitung
7
durch jeweils eigene Affinitäten für Nukleotide und transportierte Ionen auszeichnen. Detaillierte
Ausführungen zum Pumpzyklus und den darin involvierten Intermediärzuständen sind unter „Aktiver
Transport und katalytischer Zyklus“ (Kapitel 1.1.3) nachzulesen.
E1-Zustand E2-Zustand
Abbildung 1.3
P-Typ-ATPase-Struktur. (A) Na+/K+-ATPase ist farblich in ihre eindeutig definierten Domänen unterteilt: A- (gelb), N- (rot),
P- (blau), TM-Domäne (grau) und die Switch-Region (violett) [basierend auf MORTH et al., 2009]. (B) und (C) Ca2+-ATPase
(SERCA) in den beiden Prinzipalkonformationen E1 (B) und E2 (C) [basierend auf KÜHLBRANDT, 2004].
Die A-Domäne (actuator domain) ist die kleinste zytoplasmatische Domäne der α-Untereinheit. Sie
enthält neben dem bereits erwähnten TGES-Motiv den stark hydrophilen N-terminalen Bereich und die
Schleife zwischen dem M2- und M3-Segment. Der N-Terminus bildet zusammen mit der M2-M3-
Schleife eine regulatorische Einheit, die mit der M4-M5-Schleife interagiert [SEGALL et al., 2002]. Am
N-Terminus ist eine bedeutsame Sequenzabweichung festzustellen [DALY et al., 1994].
Interessanterweise ist die Sequenz im N-Terminus der Na+/K+-ATPase um ca. 35 AS länger als in der
AS-Sequenz der Ca2+-ATPase; die H+/K+-ATPase enthält in diesem zytosolischen Bereich sogar 10-20
weitere Aminosäuren. Trunkationen des Lysin-reichen N-Terminus führen zu veränderten ATPase-
Eigenschaften, da dieser Bereich möglicherweise die Zugänglichkeit der Kationen-Bindungsstellen
reguliert (ohne direkt die Ionenbindung zu beeinflussen). Zu den Auswirkungen N-terminaler
Trunkationen gehören veränderte K+-Affinitäten an der extrazellulären Seite [VASILETS et al., 1993] und
erhöhte K+-Deokklusionsraten (occlusion, okkludieren = vom Protein eingeschlossen werden) [WIERBICKI
und BLOSTEIN, 1993]. Die Verkürzung wirkt sich nicht nur auf die K+-Eigenschaften aus, sondern betrifft
auch die ATP- und Natrium-Bindungseigenschaften [ISHII et al., 1994]. Mit Hilfe zahlreicher
Untersuchungen konnten einzelne Aminosäuren im N-Terminus identifiziert werden, die einen
Einleitung
8
gravierenden Einfluss auf die Enzymfunktion haben [VASILETS et al, 1991, DALY et al., 1994, DALY, et al.,
1996, BOXENBAUM, 1998]. Eine weitere Rolle, welche dem N-Terminus der Na+/K+-ATPase
zugeschrieben wird, ist die eines Signaltranducers, die durch die Interaktion mit dem N-Terminus des
Inositol-1,4,5-Triphosphat-Rezeptors (InsP3R) zustande kommt [ZHANG et al., 2006]. Dieser Rezeptor
besitzt eine Vielzahl an Funktionen, welche die Zellproliferation, die Zelldifferenzierung und die
Apoptose beeinflussen [FURUICHI und MIKOSHIBA, 1995, BOEHNING et al., 2003]. Letzteres wird über die
Ca2+-Regulation bewerkstelligt, auf die sich die Interaktion der beiden N-Termini auswirkt [LI et al.,
2006].
Bisher gibt es nur wenige Studien darüber, inwieweit sich die verschiedenen α-Isoformen in ihren
Eigenschaften voneinander unterscheiden. Die Experimente konzentrieren sich hauptsächlich auf die
apparenten Affinitäten für Kalium, Natrium und das Cardenolidglykosid Ouabain. Die Ergebnisse der
Studien differieren, je nachdem welches Expressionssystem eingesetzt wird. Während in Experimenten
mit HeLa-Zellen (menschliche Epithelzellen eines Zervixkarzinoms) die α3-Isoform der Ratte eine
höhere apparente K+-Affinität als die α1- und α2-Isoform aufweist [JEWELL und LINGREL, 1991, MUNZER et
al., 1994, THERIEN at al., 1996], zeigt die α3-Isoform in Sf9-Zellen (Insekten-Zelllinie aus Ovar-Zellen von
Spodoptera frugiperda) im Vergleich zur α1-Isoform eine geringere apparente Affinität für Kalium
[BLANCO und MERCER, 1998]. In Xenopus laevis-Oozyten verhalten sich die α-Isoformen der humanen
Na+/K+-ATPase unter identischen experimentellen Bedingungen ebenfalls voneinander abweichend. Bei
der Betrachtung der Ouabain-Sensitivität der einzelnen α-Isoformen zeigte sich, dass alle eine ähnlich
hohe Affinität zu diesem Inhibitor haben [WANG et al., 2001], die α2-Isoform jedoch im Vergleich zur α1-
und α3-Isoform schnellere Assoziations- und Dissoziations-Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten hat
[CRAMBERT et al., 2000]. Diese Unterschiede scheinen nicht nur auf die menschlichen Isozyme
beschränkt, sondern eher ein generelles Phänomen zu sein [CRAMBERT et al., 2004]. Der Aspekt der
inotropischen Wirkung von Cardenolidglykosiden und dem damit korrelierten Ca2+-Transport wird unter
dem Punkt „Inhibitoren der Na+/K+-ATPase und ihre Bindungsstellen“ genauer erläutert.
1.1.1.2 β-Untereinheit
Die β-Untereinheit ist aus etwa 370 Aminosäuren aufgebaut und existiert in vier verschiedenen
Isoformen: β1, β2, β3 und βm (muscle β) [GEERING et al., 2001, BLANCO et al., 2005, PESTOV et al., 2007].
Im Gegensatz zur α-Untereinheit enthält die β-Untereinheit (β1 und β3) drei konservierte, extrazelluläre
Konsensusmotive für die N-Glykosylierung, an denen eine intensive Glykosylierung stattfindet. Dadurch
kommt es zu Variationen ihres Molekulargewichts zwischen 35-55 kDa. Allgemein dienen
Glykosylierungen an Proteinen der Qualitätskontrolle, dem Plasmamembran-Targeting, der Erhöhung
ihrer Stabilität und somit ihrem Schutz vor proteolytischem Abbau. Darüber hinaus können sie die
Affinitäten ihrer Bindungsspartner verändern. Im Falle der Na+/K+-ATPase β-Untereinheit hat die
Einleitung
9
Glykosylierung zudem noch eine wichtige Funktion bei der Ausbildung der Zellpolarität, sowie der
Bildung von Desmosomen und Tight Junctions, die die Zellbeweglichkeit einschränken und somit die
Polarität aufrechterhalten [VAGIN et al., 2005, 2006, 2009, RAJASEKARAN et al., 2001, 2001].
Eine der bisher ausführlich erforschten Hauptfunktionen der β-Untereinheit besteht darin, als eine
Art Chaperon die strukturelle und funktionelle Entwicklung und Stabilisierung der α-Untereinheit zu
unterstützen, indem sie u. a. dazu beiträgt, die α-Untereinheit fehlerfrei in die Membran zu integrieren
[GEERING et al., 1989, MØLLER et al., 1996, HASLER et al. 1998]. Außerdem moduliert sie die
Transporteigenschaften und beeinflusst in geringem Maße die apparenten K+- und Na+-Affinitäten der
gereiften Na+/K+-ATPase [GEERING, 2001]. Während die diversen β-Isoformen die apparenten
K+-Affinitäten beeinflussen, sind gewisse Regionen der β-Untereinheit für die apparenten Na+-Affinitäten
verantwortlich [EAKLE et al., 1992, SCHMALZING et al., 1992, JAUNIN et al., 1993, JAISSER et al., 1994,
BLANCO und MERCER, 1998, HASLER et al., 1998, KOENDERINK et al., 1999, CRAMBERT et al., 2000, GEERING,
2001].
Mit Hilfe der Kristallstruktur der Na+/K+-ATPase, die im Dezember 2007 veröffentlicht wurde [MORTH
et al., 2007], konnten die α/β-Interaktionsstellen teilweise identifiziert und mit den bisherigen
elektrophysiologischen und biochemischen Studien in Einklang gebracht werden. Involviert sind die
beiden Segmente M7 und M10 sowie die M7-M8-Schleife der α-Untereinheit, inklusive des in dieser
Schleife enthaltenen hochkonservierten SYGQ-Motivs [COLONNA et al., 1997, WANG et al., 1997, BÉGUIN
et al., 2000, LEMAS et al., 2004, MORTH et al., 2007]. Die extrazellulären Schleifen der Domänen M5-M6
und M7-M8 werden in der Kristallstruktur vollständig von der β-Untereinheit bedeckt. Es wird daher
davon ausgegangen, dass die β-Untereinheit wesentlich an der K+-Okklusion beteiligt ist [LUTSENKO und
KAPLAN, 1993, MORTH et al., 2007].
Als Interaktionsstelle seitens der β-Untereinheit sind die beiden hochkonservierten Tyrosine Y39
und Y43 sowie F42 in der unmittelbaren Umgebung des G848 (auf TM7 der α-Untereinheit) beteiligt (die
Positionen der Aminosäuren richten sich nach der β1-und α1-Sequenz der Na+/K+-ATPase aus der
Schweineniere). Anhand von Mutagenesestudien konnte gezeigt werden, dass Mutationen dieser
beiden hochkonservierten Tyrosine die apparenten Kalium-Affinitäten signifikant herabsetzen und eine
Verschiebung des Gleichgewichts der beiden möglichen Konformationszustände (E1 und E2) zugunsten
des E2-Zustands bei physiologischen Membranpotentialen begünstigen [DÜRR et al., 2009]. Durch die
kürzlich von Shinoda und Kollegen veröffentlichte Kristallstruktur lässt sich die Interaktion zwischen der
α- und β-Untereinheit eingehender charakterisieren [SHINODA et al., 2009]. Die Bindung der beiden
Untereinheiten erfolgt über viele Wasserstoffbrücken und zahlreiche weitere Kontakte zwischen
aromatischen Resten der β-Untereinheit zu zwei Transmembrandomänen der α-Untereinheit (TM7 und
TM10). Ein Teil dieser aromatischen Reste stammt von den Aminosäuren F39-Y44 (β-Untereinheit), die
mit TM10 (Y1001) der α-Untereinheit interagieren bzw. Y40 und Y44 mit TM7 und einem Cholesterol-
Einleitung
10
Molekül (Abbildung 1.4). Wie bereits in der Arbeit von Colonna und Kollegen beschrieben [COLONNA et
al., 1997], ist auch in der aktuellen Kristallstruktur zu erkennen, dass der Bereich um die Konsensus-
Sequenz SYGQ, die Schleife zwischen TM7/TM8 - genauer genommen D892 bis Q910 - eine
Schlüsselrolle in der α/β-Interaktion spielt. T247 der β-Untereinheit fixiert R183 (ebenfalls in der
β-Untereinheit), um eine Wechselwirkung mit E899 der α-Untereinheit zu vermitteln, welches wiederum
mit K250 (β-Untereinheit) interagiert.
Abbildung 1.4
Interaktionsschnittstelle zwischen α- und β-Untereinheit. a) und c) Zwischen der Transmembrandomäne 7 (TM7) und der
β-Untereinheit ist das Cholesterol-Molekül (C) dargestellt. b) rot eingerahmt sind sowohl die beiden Domänen TM7 und
TM10 als auch die Aminosäuren, die zur β-Untereinheit gehören. Rote Kugeln entsprechen Wassermolekülen. Die
Abbildungen sind angelehnt an die Publikation von [SHINODA et al., 2009].
Da die Na+/K+-ATPase-Kristallstruktur bisher lediglich im E2P•2K+-Zustand vorliegt, bietet die Voltage-
Clamp-Fluorometrie-Technik (VCF) die Möglichkeit, die relative Orientierung der beiden Untereinheiten
während der Konformationsänderung beobachten und zuordnen zu können [GEIBEL et al., 2003, DEMPSKI
et al., 2005].
Weitere Interaktionspartner der β-Untereinheit sind die Proteine MONaKA (modulates Na+/K+-
ATPase) [MAO et al., 2005] und NKAIN1 (Na+/K+-ATPase interacting, β1) [GOROKHOVA et al., 2007], die
ebenfalls Einfluss auf die Transportaktivität der Na+/K+-ATPase haben. Jedoch ist der regulatorische
Einfluss dieser beiden Proteine in Bezug auf die Na+/K+-ATPase noch weitestgehend unbekannt.
1.1.1.3 γ-Untereinheit
Die kleinste Untereinheit der Na+/K+-ATPase ist die γ-Untereinheit. Wie auch die β-Untereinheit weist
sie lediglich eine einzelne Transmembrandomäne auf und hat mit etwa 65 Aminosäuren ein
Molekulargewicht von ca. 7 kDa. Die erste Aufreinigung und die primären Informationen über die
Aminosäuresequenz wurden im Jahre 1980 von Reeves und Kollegen erbracht [REEVES et al, 1980].
Von Mercer und Kollegen konnte gezeigt werden, dass dieses kleine Protein ein Bestandteil der
abc
Einleitung
11
Na+/K+-ATPase ist und dass das Auftreten mit der α-Untereinheit korreliert [MERCER et al., 1993]. Die
γ-Untereinheit bindet ausschließlich an einen α/β-Komplex und nicht an einzeln vorkommende α- bzw.
β-Untereinheiten [BÉGUIN et al., 1997]. Isoliert vorkommende γ-Untereinheiten gelangen nicht an die
Plasmamembran, sondern werden zügig abgebaut [BÉGUIN et al., 1997]. Während die β-Untereinheit für
die Stabilität und die Faltung der Na+/K+-ATPase unerlässlich ist, ist das Mitwirken der γ-Untereinheit
bei der strukturellen und funktionellen Reifung der Na+/K+-ATPase nicht essentiell, sondern hat vielmehr
eine regulatorische Funktion und ist für die gewebsspezifische Feinabstimmung der Transportfunktion
zuständig.
Die γ-Untereinheit der Na+/K+-ATPase wird auch als FXYD2 bezeichnet und gehört aufgrund ihrer
im Namen enthaltenen hochkonservierten Sequenzregion zur FXYD-Proteinfamilie [SWEADNER und
RAEL, 2000]. Die Homologie zwischen den bisher bekannten sieben FXYD-Familienmitgliedern
(Tabelle 1.2) liegt im Sequenzvergleich verschiedener Arten untereinander bei etwa 75 % und im
Vergleich innerhalb der Säugetiere sogar bei ~93 % [THERIEN und BLOSTEIN, 2000]. Béguin und seine
Kollegen erbrachten die ersten Hinweise darauf, dass die Na+/K+-ATPase-Aktivität durch die
γ-Untereinheit beeinflusst wird [BÉGUIN et al., 1997].
Neben FXYD2 werden auch die anderen FXYD-Familienmitglieder mit der Na+/K+-ATPase assoziiert, da
sie ebenfalls die Fähigkeit haben die Na+/K+-ATPase-Aktivität modulieren und/oder regulieren zu
können [GEERING, 2006]. Hiervon betroffen sind die apparenten ATP-, K+- und die Na+-Affinitäten
[BÉGUIN et al., 1997, ARYSTARKHOVA et al., 1999, THERIEN et al., 1999, BÉGUIN et al., 2001].
Das FXYD2-Protein, die γ-Untereinheit der Na+/K+-ATPase, existiert in zwei Spleißvarianten γa und
γb, die sich strukturell lediglich in ihrem N-Terminus voneinander unterscheiden [KÜSTER et al., 2000,
SWEADNER et al., 2000]. FXYD2a und FXYD2b werden in separaten Bereichen des Nierenmarks
exprimiert [PIHAKASKI-MAUNSBACH et al., 2006]. Nennenswert ist eine erbliche Erkrankung, die mit der
Mutation G41R der γ-Untereinheit einhergeht [MEIJ et al., 2000]. Das Glycin an Position 41 ist für das
Oligomerisieren des FXYD2-Proteins notwendig [THERIEN und DEBER, 2002, CAIRO et al, 2008] und führt
zu einer autosomal vererbbaren Form der Hypomagnesiämie (erhöhte Mg2+-Ausscheidung in der Niere)
[MEIJ et al., 2000]. Dieses Glycin befindet sich in einer Region der γ-Untereinheit, die mit dem
TM9-Segment der α-Untereinheit interagiert [MORTH et al., 2007]. In der Arbeit von Morth und Kollegen
konnten die an der α/γ-Interaktion involvierten Aminosäuren seitens der α-Untereinheit identifiziert
werden, wie es bereits in Mutagenesestudien aus dem Jahr 2004 beschrieben wurde [LI et al., 2004,
MORTH et al, 2007]. Hierzu gehört das Phenylalanin an Position 949 (F949), die Glutaminsäure E953,
das Leucin L957 und das Phenylalanin F960 im TM9-Segment der renalen α1-Untereinheit vom
Hausschwein (sus scrofa domestica) bzw. äquivalent dazu die Aminosäuren F953, E957, L961 und
F964 der humanen α2-Untereinheit. Nach neuesten Erkenntnissen lässt sich dies auch anhand des
Einleitung
12
FXYD-Proteins der Rektaldrüse vom Hai weitestgehend miteinander in Einklang bringen [SHINODA et al.,
2009].
Typ Bezeichnung Vorkommen Referenz
FXYD1 Phospholemman Herz, Leber, Skelettmuskulatur PALMER et al., 1991
BOGAEV et al., 2001
FXYD2 γ-Untereinheit der Na+/K+-ATPase Niere
FORBUSH et al., 1978
MERCER et al., 1993
BÉGUIN et al., 1997
THERIEN et al., 1997
PU et al., 2001
FXYD3 Mat-8 (mammary tumor marker) Uterus, Magen, Darm, Haut MORRISON et al., 1995
RUNKEL et al., 2003
FXYD4 CHIF
(corticosteroid hormone-induced factor)
Sammelrohr und Papillen des
Nierenmarks
CAPURRO et al., 1996
SHI et al., 2001
FXYD5 Dysadherin bzw. RIC
(related to ion channel)
versch. Gewebearten, meist in
Karzinomgewebe
FU & KAMPS, 1997
INO et al., 2002
FXYD6 Phosphohippolin diverse Gewebearten SWEADNER & RAEL, 2000
YAMAGUCHI et al., 2001
FXYD7 ausschließlich im Gehirn BÉGUIN et al., 2002
Tabelle 1.2
Die bisher charakterisierten sieben Proteine der FXYD-Familie und ihre Verteilung im Gewebe.
Die verschiedenen Untereinheiten der Na+/K+-ATPase (α, β, γ) und ihre Isoformen (α1, α2, α3, α4, β1, β2,
β3) lassen sich in vielen Expressionssystemen unter physiologisch relevanten Bedingungen sehr gut
miteinander kombinieren, während die in vivo am häufigsten vorkommende Kombination die
α1/β1-Variante ist. Mit Hilfe diverser Studien konnte gezeigt werden, dass sich Na+/K+-ATPase-
Oligomere (α-β-γ) zu höhermolekularen Einheiten zusammenschließen können. In der Na+/K+-ATPase-
Kristallstruktur sind zwei Na+/K+-ATPase-Oligomere zu erkennen, die im leichten Kontakt über ihre
A-Domänen in Verbindung stehen, jedoch kaum über Interaktionen im Transmembranbereich. Während
Morth und seine Kollegen indes von einem einzelnen Na+/K+-ATPase-Oligomer ausgehen, postulieren
andere Arbeitsgruppen eine Dimerisierung (2α-2β-2γ) oder aber auch eine Tetramerisierung (4α-4β-4γ)
[KOBAYASHI et al., 2007, MORTH et al. 2007, MIMURA et al., 2008].
Einleitung
13
1.1.2 Weitere funktionell wichtige Bereiche der Na+/K+-ATPase
Um ihrer Funktion als Transportprotein nachkommen und die von der Zelle benötigten Ionengradienten
aufrechterhalten zu können, besitzt die Na+/K+-ATPase spezifische Bindungsstellen für die
transportierten Kationen, Na+ und K+. Ebenso ist es von essentieller Bedeutung, dass die
Na+/K+-ATPase Bindungsstellen für selektive Inhibitoren aufweist.
1.1.2.1 Inhibitoren der Na+/K+-ATPase und ihre Bindungsstellen
Einer der natürlich vorkommenden Inhibitoren der Na+/K+-ATPase ist das g-Strophanthin. Es stammt
aus dem Samen afrikanischer Schlinggewächse der Gattung Strophanthus, dessen Aussehen sich in
der Namensgebung wieder findet (’Strophe’: στροφος = Band, Strick, Seil. στροφας = sich drehend).
Das g-Strophanthin wird auch als Ouabain bezeichnet. Dieser Name ist auf den afrikanischen Ouabaio-
Baum (ostafrikanische Aussprache ’Wabayo’) zurückzuführen, dessen Samen ebenfalls das
g-Strophanthin enthält. Bereits Ende des 19. Jahrhunderts hat das Extrakt des bis heute
pharmakologisch genutzten Präparats einen Eintrag im deutschen Arzneibuch erhalten. Das bis Ende
des 20. Jahrhunderts bei akuter Herzinsuffizienz eingesetzte Herzglykosid [ALLEN et al., 1985] findet
auch in der Erforschung der Na+/K+-ATPase Verwendung. Herzglykoside besitzen die zunächst einmal
paradox erscheinende Eigenschaft die Herzkontraktilität zu steigern, was auch als positiv inotroper
Effekt bezeichnet wird. Durch die Inhibition der Na+/K+-ATPase steigt die Konzentration des
intrazellulären Natriums. Das Angleichen der intra- und extrazellulären [Na+] wiederum bewirkt, dass
durch das verringerte Konzentrationsgefälle die Aktivität des Na+/Ca+-Austauschers (NCX) herabgesetzt
wird und dies schließlich zu einer Anreicherung der intrazellulären [Ca+] führt. Das angereicherte
Calcium wird über Ca2+-ATPasen ins sarkoplasmatische Retikulum, einem Calciumspeicher,
transportiert und bei der Erregung der Muskulatur vermehrt ausgeschüttet, was letztendlich zu einer
erhöhten Kontraktilität führt [BLAUSTEIN et al., 1998, 2002]. Die eng begrenzten funktionellen
Kompartimente der neuronalen Zellen, in denen die beiden Ouabain-sensitiven Isoformen α2 und α3
gemeinsam mit dem Na+/Ca+-Austauscher und der Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums
eine Mikrodomäne bilden, werden als „PlasmERosom“ bezeichnet (Abbildung 1.5). Die α1-Isoform ist
allerdings in diesem diffusionsbegrenzten Bereich zwischen Plasmamembran und sarkoplasmatischem
Retikulum nicht vorzufinden. Auch in Bezug auf ihre Ouabain-Affinität stellt die α1-Isoform eine
Sonderform dar. In Nagetieren, wie beispielsweise Ratten und Mäusen, ist sie nahezu Ouabain-
resistent (1000fach geringere Ouabain-Affinität im Vergleich zur α2- und α3-Isoform); bei den anderen
Spezies jedoch nicht [CRAMBERT et al., 2000, WANG et al., 2001]. Die Ouabain-Affinität wird von
Aminosäuren diverser Regionen beeinflusst, wobei zwei Aminosäuren von besonderer Bedeutung sind,
die sich an den Rändern der ersten extrazellulären Schleife (H1-H2) zwischen den Segmenten M1 und
M2 befinden. Die Ouabain-sensitiven α-Isoformen verfügen an den entsprechenden Positionen über
Einleitung
14
Zytosol
sarkoplasmatisches
bzw.
endoplasmatisches
Retikulum
K+
Na+/K+-
ATPase
ATP
Na
+
Ca+
2
ATP
SERCA
Na
+
Na+/Ca+-
Austauscher
2
ATP
Ca+
2
Lumen
K
+
Na+/K+-
ATPase
ATP
Na
+
α
1
α/α
23
Ca+
2
ATP
PMCA
ungeladene Aminosäuren, während die nahezu resistente Isoform geladene Aminosäuren aufweist
(α1 Schaf: Gln-111 und Asn-122, α1 Ratte: Arg-113 und Asp-124) [PRICE und LINGREL, 1990]. Eine
Ouabain-Resistenz der Ouabain-sensitiven α-Isoformen kann durch Substitution der beiden
Aminosäuren Glutamin und Asparagin erzielt werden (Q111R und N122D) [PRICE und LINGREL, 1988].
Abbildung 1.5
Schematische Darstellung der PLasmERosom-Region. Die beiden besonders Ouabain-sensitiven α-Untereinheiten (α2 und
α3) der Na+/K+-ATPase befinden sich gemeinsam mit dem Na+/Ca2+-Austauscher in unmittelbarer Nähe des endo- bzw.
sarkoplasmatischen Retikulums (ER, SR) und bilden auf diese Weise das „PLasmERosom“. Sie wurden sowohl in
Nervenzellen als auch in arteriellen Muskelzellen nachgewiesen [BLAUSTEIN et al., 1998 und 2002] und sind vermutlich auch
in Skelett- und Herzmuskelzellen existent [JAMES et al. 1999]. Die nahezu Ouabain-resistente α1-Untereinheit hingegen ist
gleichmäßig in der Plasmamembran vorhanden und ist nicht in direkter Umgebung zur Plasmamembran-Mikrodomäne.
Im Juli 2009 wurde durch Veröffentlichung die Kristallstruktur der Na+/K+-ATPase mit gebundenem
Ouabain und K+-Ionen (E2•2K+•Pi) bekannt [OGAWA et al., 2009]. Aufgrund des Antagonismus zwischen
Ouabain und Kalium repräsentiert die Struktur einen niederaffinen Ouabain-gebundenen Zustand.
Ouabain besitzt eine dreiteilige Struktur, bestehend aus einem γ-Lacton (Fünfring), einem Steroidgerüst
und dem Monosaccharid Rhamnose. Jeder einzelne Bestandteil scheint eine andersartige Funktion zu
realisieren. Allgemein lässt sich festhalten, dass unter Beteiligung der Transmembranhelices M1, M2,
M4, M5 und M6 eine Vertiefung geformt wird, in der das Ouabain-Molekül gebunden werden kann.
Diese Kavität befindet sich in unmittelbarer Nähe der K+-Bindungsstellen, die unter anderem eine
Einleitung
15
partielle Entwindung der Helix M4 beinhalten. Diese Entwindung könnte eine mögliche Erklärung sein,
weshalb die Ouabain-Bindung relativ langsam stattfindet [WALLICK und SCHWARTZ, 1988].
Weitere Na+/K+-ATPase-Inhibitoren sind (ortho)-Vanadat VO3-4 („transition state analogue“), welches
eine Ähnlichkeit mit dem Phosphat-Anion PO3-4 aufweist, sowie Oligomycin [GLYNN, 1985, SKOU, 1988]. In
dieser Arbeit wird ausschließlich auf den Inhibitor Ouabain eingegangen.
1.1.2.2 Kationen-Bindungsstellen
Als Ausgangspunkt für Struktur-Funktions-Analysen der Na+/K+-ATPase musste bis vor kurzer Zeit auf
die Struktur der SERCA zurückgegriffen werden [TOYOSHIMA et al., 2000], wobei nur eine 30%ige
Identität und eine 65%ige Sequenzähnlichkeit zwischen diesen beiden P-Typ-ATPasen vorliegt
[SWEADNER und DONNET, 2001]. Gegenwärtig existieren mehrere hoch aufgelöste (2,6 Å)
Kristallstrukturen der SERCA, die sowohl in den beiden Konformationszuständen E1 und E2 als auch mit
verschiedenen Fluorid-Salzen (Aluminium-, Beryllium- oder Magnesiumfluorid) stabilisiert gebunden
vorliegen, die die unterschiedlichen Phasen des E2P-Zustandes widerspiegeln [TOYOSHIMA et al., 2000,
TOYOSHIMA und NOMURA, 2002, TOYOSHIMA und MIZUTANI, 2004, SØRENSEN et al., 2004, OLESEN et al.,
2004, OLESEN et al., 2007]. Die Kationen-Bindungsstellen der SERCA sind genau identifiziert und
definiert [TOYOSHIMA et al., 2000, TOYOSHIMA und INESI, 2004] und Homologiestudien weisen darauf hin,
dass diese beiden Kationen-Bindungsstellen mit denen in der Na+/K+-ATPase übereinstimmen und hier
sowohl von Natrium- als auch von Kalium-Ionen besetzt werden können [OGAWA und TOYOSHIMA, 2002].
Mit Hilfe von zahlreichen Mutagenese- und Homologiestudien konnten ferner die an der
Ionenkoordination beteiligten Transmembranregionen der Na+/K+-ATPase lokalisiert und auf die
Segmente M4, M5 und M6 eingegrenzt werden [FENG und LINGREL, 1995, ANDERSEN, 1995, VILSEN, 1995,
KUNTZWEILER et al., 1996, BLOSTEIN et al., 1997, VILSEN und ANDERSEN, 1998, NIELSEN et al., 1998,
PEDERSEN et al., 1998, ARGÜELLO et al., 1999, TOYOSHIMA et al., 2000, JØRGENSEN und PEDERSEN, 2001,
JØRGENSEN et al., 2003]. Genau 50 Jahre nach Entdeckung der Na+/K+-ATPase wurde ihre
Kristallstruktur mit einer Auflösung von 3,5 Å veröffentlicht [MORTH et al., 2007]. In der Struktur sind zwei
Rubidium-Ionen erkennbar (E2P-Zustand), die verglichen mit K+-Ionen aufgrund ihres sehr ähnlichen
Ionenradius (Rb+ = 2,35 Å, K+ = 2,2 Å) wie ebensolche von der Na+/K+-ATPase transportiert werden
können. Die beiden Rb+-Ionen umgebenden Aminosäurereste sind an folgenden Positionen vorzufinden
(α1-Untereinheit der Schweineniere): E327 (M4), S775 (M5), N776 (M5), E779 (M5), D804 (M6) und
D808 (M6). Diese stimmen mit den Resten überein, die an der Ca2+-Bindung der SERCA beteiligt sind
und denen die die Sauerstoff-Liganden hierfür zur Verfügung stellen [MORTH et al., 2007]. Aufgrund der
Tatsache, dass die Na+/K+-ATPase drei Na+-Ionen im Vergleich zur SERCA, die zwei Ca2+-Ionen bindet
und okkludiert, resultiert eine Abweichung des Kationentransports, insbesondere bezüglich der dritten
Bindungsstelle für Natrium-Ionen.
Einleitung
16
Erst kürzlich wurde eine weitere Kristallstruktur der Na+/K+-ATPase mit einer höheren Auflösung von
2.4 Å veröffentlicht, in der zwei der drei Kationen-Bindungstellen einzelnen Aminosäureresten
zugeordnet werden können [SHINODA et al., 2009]. Diese Struktur, die unter dem PDB-Dateinamen
2ZXE zu finden ist, zeigt im Vergleich zu der vorhergehenden einen größeren Anteil der β- und enthält
zusätzlich die γ-Untereinheit, das FXYD10. Die aus der Rektaldrüse von Haien erhaltene Kristallstruktur
ist ebenso in einem E2-P•2K+-analogen Zustand kristallisiert wie die auf dem Schweinenierenenzym
basierende erste Struktur der Na+/K+-ATPase.
Die drei Kationen-Bindungsstellen, wovon zwei sich ungefähr in der Mitte der Transmembran-
Region (I und II) befinden und die dritte zur zytosolischen Seite (C) hin orientiert ist, werden von
Sauerstoffatomen des Proteinrückgrats koordiniert. Im Falle der Bindungsstelle I sind fünf
Sauerstoffatome beteiligt, die einem Wassermolekül und folgenden Aminosäuren zugeordnet sind: T779
(Sauerstoff stammt aus der Hauptkette), S782, N783 und D811 (aus den Seitenketten). Bei der
Bindungsstelle II sind drei Carbonylgruppen aus der Hauptkette beteiligt (V329, A330 und V332) und
drei bis vier Sauerstoffatome der Seitenketten von N783, E786, D811 und möglicherweise von E334,
jedoch kein Wassermolekül (Abbildung 1.6). Weiterhin spielt das Q930 eine indirekte Rolle bei der
Regulierung der K+-Affinität, da diese Aminosäure aus der Transmembrandomäne TM8 - gemeinsam
mit der Hydroxylgruppe von Y778 - die Seitenkette von D815 stabilisiert [SHINODA et al., 2009].
Interessanterweise interagieren die beiden zusammenstehenden K+-Ionen nicht direkt miteinander,
obwohl sie von zwei gleichen Aminosäuren jeweils ein Sauerstoffatom zur Verfügung gestellt
bekommen. Bemerkenswert ist auch das Vorhandensein des P785 in der TM5-Helix (äquivalent zu
G770 der SERCA), wodurch eine Entwindung und ein leichter Knick der Helix verursacht wird, so dass
das T779 seinen Sauerstoff für die K+-Koordination bereitstellen kann. Diese Entwindung der TM7 wird
zusätzlich von Wasserstoffbrücken über Y44 der β-Untereinheit zum G855 der α-Untereinheit
stabilisiert. Das Vorhandensein eines Cholesterol-Moleküls scheint diese entwundene Stelle der TM7 zu
schützen, indem es die umgebenden Lipide fernhält, so dass dem Cholesterin-Molekül eine wichtige
Struktur-stabilisierende Funktion zukommt. Wie bereits zuvor vorgeschlagen [LUTSENKO und KAPLAN,
1993, HASLER et al., 2001, GEERING, 2001], wird somit aus der neuen Struktur besonders deutlich, dass
die β-Untereinheit einen weitreichenden Einfluss auf die K+-Bindung hat.
Partielle Bestätigungen und Ergänzungen zu bisherigen Spekulationen über die Lokalisation der
dritten Natrium-Bindungsstelle [JØRGENSEN et al., 2003, LI et al., 2005] erbrachte bereits die 2007
veröffentlichte Kristallstruktur der Na+/K+-ATPase [MORTH et al., 2007]. Fünf Aminosäurereste in den
Segmenten M5 (Y771), M6 (Y807, D808), M8 (Q923) und M9 (E954) werden näher in Betracht
gezogen, in der Na+-Bindung involviert zu sein. Des Weiteren wird vorgeschlagen, dass der C-Terminus
an der Optimierung der Bindung des dritten Natrium-Ions einen Beitrag leistet, in dem er mit dem M5-
Segment und der Schleife zwischen M8 und M9 interagiert [MORTH et al., 2007]. Über die Beteiligung
Einleitung
17
des C-Terminus an der Kationen-Okklusion wurde bereits im Jahr 1992 spekuliert [CAPASSO et al.,
1992].
Abbildung 1.6
Parallele Ansicht auf die Membran mit Einblick auf zwei Kationen-Bindungsstellen. Die Darstellung basiert auf der
Kristallstruktur, die unter dem PDB-File 2ZXE zu finden ist, und der Veröffentlichung von [SHINODA et al., 2009]. Die Präsenz
von P785 entwindet die TM7, was dazu führt, dass ein Sauerstoffatom von T779 für die K+-Koordination zur Verfügung
gestellt werden kann (violette Kugeln = K+-Ionen, rote Kugeln = Wassermoleküle, cyan-farbige Kugeln = gebundenes Ca2+ im
E1•2Ca2+-Zustand der SERCA).
1.1.3 Aktiver Transport und katalytischer Zyklus
Im katalytischen Zyklus unterscheidet man zwei Prinzipalkonformationen: den E1- und E2-Zustand.
Diese beiden Konformationen unterscheiden sich hinsichtlich Orientierung und Spezifität ihrer
Bindungsstellen für Na+ und K+. Während die E1-Konformation nach innen gerichtete Kationen-
Bindungsstellen besitzt und eine hohe Affinität für Na+ und ATP hat, sind in der E2-Konformation die
Bindungsstellen nach außen gerichtet und es wird K+ und Pi präferiert gebunden (Abbildung 1.7).
Aufgrund des reversiblen Phosphorylierungsschrittes existieren zudem phosphorylierte
Intermediärformen.
Der Reaktionszyklus wird häufig in Form eines Mechanismus dargestellt, der auf Arbeiten von
R. L. Post und W. R. Albers zurückgeht [ALBERS, 1967, POST et al., 1972]. In Anwesenheit von
intrazellulärem Natrium wird das Enzym im E1-Zustand durch ATP phosphoryliert, wobei ADP
freigesetzt wird und die Na+-Ionen okkludiert werden. Das Enzym geht in den E2P-Zustand über, die
Bindungsstellen reorientieren sich zur extrazellulären Seite und die Na+-Ionen werden entlassen.
TM7
a
I
II
TM4 TM5
TM7
TM4 TM5
TM7
T779 Y778
D815
D811
N783
E786
E334
A330
P785
S782
Y854
Einleitung
18
Zytoplasma
Extrazellulärer Raum
Membran
3 Na • E • ATP
+1
(3 Na )E -P • ADP
+
1
3 Na E -P
+
•
2
-3 Na
+
+2 K
+
E-P
2
E-P • 2 K
2
+
E(2 K
2
+)
-ADP -P
i
-2 K
+
+ATP
E • 2 K
1
+
E
1
• ATP
Phosphorylierung
Dephosphorylierung
+3 Na
+
Daraufhin folgt die K+-Bindung, Okklusion der beiden K+-Ionen und die Dephosphorylierung. Das Post-
Albers-Schema mitsamt den einzelnen Reaktionsschritten ist in Abbildung 1.7 dargestellt.
Abbildung 1.7
Reaktionszyklus der Na+/K+-ATPase dargestellt im modifizierten Post-Albers-Schema. Ausgehend von der
zytoplasmatischen Seite binden drei Na+-Ionen im E1-Zustand an die intrazellulär orientierten Kationen-Bindungsstellen (E1).
Durch den Phosphorylierungsschritt kommt es zur Okklusion der drei Na+-Ionen und die Na+/K+-ATPase wechselt ihre
Konformation in den E2-Zustand, wobei ADP freigesetzt wird (E2P). An der extrazellulären Seite werden nun die Na+-Ionen
deokkludiert und freigesetzt, woraufhin die beiden hochaffinen K+-Ionen gebunden und okkludiert werden. Dies geht mit der
Dephosphorylierung einher (E2). Das Enzym ändert seine Konformation erneut in den E1-Zustand und es kommt zur
Freisetzung der K+-Ionen an der intrazellulären Seite. Blau = ATP, ADP und Pi, gelb = Na+-Ionen, rot = Ka+-Ionen.
1.1.4 Elektrogenizität
Die 3:2-Stöchiometrie der Na+/K+-ATPase ist unabhängig von der [Na+]int [GADSBY und CRANEFIELD, 1979,
EISNER et al., 1981, GLITSCH et al., 1982], der [Na+]ext, der [K+]ext [ABERCROMBIE und DE WEER, 1978,
GADSBY, 1980, EISNER et al. 1981], vom Membranpotential [RAKOWSKI et al., 1989] und von der ATP-
Konzentration [GOLDSCHLEGER et al., 1987]. Aufgrund der 3Na+/2K+-Stöchiometrie entsteht indes ein
Netto-Transport einer elektrischen Ladung [THOMAS, 1969]. Der maßgebende elektrogene Vorgang
findet während des Natrium-Transportschritts statt, genauer formuliert erfolgt der Großteil der
Ladungsverschiebung während der extrazellulären Freisetzung bzw. der Rückbindung von Natrium.
Dies konnte 1985 mittels BLM-Experimenten (BLM, Black Lipid Membrane) von Fendler und seinen
Einleitung
19
Mitarbeitern [FENDLER et al., 1985] bzw. ein Jahr später von Nakao und Gadsby anhand
elektrophysiologischer Messungen nachgewiesen werden [NAKAO und GADSBY, 1986]. Mittels
Spannungssprungexperimenten (VC, Voltage Clamp technique bzw. TEVC, Two Electrode Voltage
Clamp), die in Abwesenheit von extrazellulärem Kalium und in Gegenwart von hohem intra- und
extrazellulären Natrium durchgeführt werden (unter so genannten Na+/Na+-Austausch-Bedingungen),
können die Na+-abhängigen Transportschritte gezielt untersucht werden. Diese Spannungssprünge, die
ATP-abhängig sind und Ouabain-sensitive transiente Ströme erzeugen, werden als „pre-steady-state-
Ströme“ bezeichnet. Die extrazelluläre Freisetzung von Natrium-Ionen wird durch Spannungssprünge
zu positiven Potentialen hervorgerufen, was zu positiven transienten Strömen und zu einer
Verschiebung des E1P-E2P-Gleichgewichts in Richtung E2P führt. Pulse zu negativen Potentialen
fördern die Na+-Rückbindung und verschieben somit das Gleichgewicht in Richtung E1P [RAKOWSKI,
1993, HOLMGREN und RAKOWSKI, 1994, FRIEDRICH und NAGEL, 1997]. Folglich sind die Na+-Bindungs- und
die Na+-Freisetzungsschritte unmittelbar mit der E1P-E2P-Gleichgewichtsreaktion assoziiert. Überdies
konnte nachgewiesen werden, dass die Na+-Bindungs- und die Na+-Freisetzungsschritte in drei
unabhängige und reversible Ladungsverschiebungsschritte unterteilt sind und strikt sequentiell
verlaufen [HOLMGREN et al., 2000]:
(3 Na+)E1P ↔ (3 Na+)E2P ↔ E2P + 3 Na+
Der Zeitverlauf der Natrium-abhängigen Reaktionsschritte (transiente Ströme), welcher durch apparente
Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten bestimmt werden kann, ist in der Vorwärtsreaktion
(Na+-Freisetzung) spannungsunabhängig und in der Rückwärtsreaktion (Bindung von extrazellulärem
Natrium) spannungsabhängig [DE WEER et al., 1992].
1.2 Na+/K+-ATPase-assoziierte Erkrankungen
Die Na+/K+-ATPase, die als essentielles „Haushaltsenzym“ konstitutiv exprimiert wird, weckt seit einigen
Jahren bei Humangenetikern und Neurologen ein immer größer werdendes Interesse. Bei der
Erforschung diverser Krankheiten sind einige Defekte bekannt geworden, die auf Genen lokalisiert sind,
die für α-Isoformen der Na+/K+-ATPase kodieren. Hierzu gehören die beiden Gene ATP1A2 (lokalisiert
auf Chromosom 1q21-1q23, 1q31) [DUCROS et al., 1997, GARDNER et al., 1997] und ATP1A3 (lokalisiert
auf Chromosom 19p13) [SHULL und LINGREL, 1987, YANG-FENG et al., 1988, DE CARVALHO AGUIAR et al.,
2004]. Mutationen auf dem letztgenannten Gen (kodiert die α3-Untereinheit der Na+/K+-ATPase) führen
zu einer seltenen autosomal-dominanten Erbkrankheit, die als Dystonie-Parkinsonismus-Syndrom
mit raschem Erkrankungsbild (DYT12, Rapid-Onset Dystonia-Parkinsonism, RDP) bezeichnet wird
[DOBYNS et al., 1993, BRASHEAR et al., 1997, PITTOCK et al., 2000, LINAZASORO et al., 2002]. Die ersten
Einleitung
20
Beobachtungen machte der Mediziner William B. Dobyns im Jahre 1992 an einer 15-Jährigen und
benannte die Krankheit nach den schnell auftretenden Anfällen von dystonischen Krämpfen, die mit
Anzeichen von Parkinson einhergingen, wie beispielsweise Rigor (Muskelstarre), Tremor (Muskelzittern)
und Bradykinese (verlangsamte Bewegungen) sowie posturale Instabilität (Haltungsinstabilität). Nach
über 15 Jahren sind inzwischen mehr als 50 Patienten aus 20 Familien registriert worden.
Bisher gibt es noch keine Erkenntnisse darüber, ob Mutationen in den beiden Na+/K+-ATPase-
Untereinheiten α1 und α4 ebenfalls mit Krankheiten assoziiert sind. Indessen werden Veränderungen
auf dem oben erwähnten Gen ATP1A2, das die α2-Untereinheit der Na+/K+-ATPase kodiert, mit einer
vererbbaren Form der Migräne in Verbindung gebracht [MAY et al., 1995, GARDNER et al., 1997, DUCROS
et al., 1997]. Hierbei handelt es sich um eine autosomal-dominante Erbkrankheit, die als „Familiäre
Hemiplegische Migräne“ (FHM, Familial Hemiplegic Migraine) bezeichnet wird. Die ersten
Beschreibungen der familiären hemiplegischen Migräne gehen auf J. Michell Clarke zurück [CLARKE,
1910]. Der Ausdruck „hemiplegisch“ leitet sich her vom (symptomatischen) Auftreten einer halbseitigen
Lähmung, welche dem eigentlichen Kopfschmerz vorausgeht.
Die Internationale Kopfschmerzgesellschaft (IHS, International Headache Society) kategorisiert die
verschiedenartigsten Kopfschmerzen und untergliedert die Migräne in „Migräne ohne Aura“ und
„Migräne mit Aura“ (Tabelle 1.3). Die familiäre und auch die „Sporadische Hemiplegische Migräne“
werden der Klassifizierung „mit Aura“ zugeordnet. Diese neurologischen Symptome, die entweder als
„Vorboten“ oder als „Begleiter“ des eigentlichen Kopfschmerzes einhergehen, sind unter dem Abschnitt
„Die klassische Migräne“ (1.2.1) näher erläutert.
Die sporadische hemiplegische Migräne ähnelt symptomatisch betrachtet der familiären hemiplegischen
Migräne, unterscheidet sich jedoch darin, dass innerhalb der Familie - Verwandtschaft ersten und
zweiten Grades - keine äquivalente Diagnose vorliegt. Die Krankheitshäufigkeit (Prävalenz) beider
Migräne-Formen ist vergleichbar selten (1:10000) [THOMSEN et al., 2002, THOMSEN und OLESEN, 2004].
Als weitere Ursache für eine Erkrankung an familiärer hemiplegischer Migräne seien noch zusätzlich die
beiden Gene CACNA1A (frühere Bezeichnung CACNL1A4, auf Chromosom 19p13, FHM-1) [OPHOFF et
al., 1996] und SCN1A (auf Chromosom 2q24, FHM-3) erwähnt [DICHGANS et al., 2005, GARGUS und
TOURNAY, 2007]: SCN1A kodiert die α1-Untereinheit eines spannungsabhängigen neuronalen
Natriumkanals (Nav1.1), während das CACNA1A-Gen für die α1-Untereinheit des
spannungsabhängigen P/Q-Typ-Calciumkanals (Cav2.1) kodiert. Interessanterweise wurden auf dem
gleichen Genlocus (Chromosom 19p) und damit einhergehend in der α1-Untereinheit des
spannungsabhängigen Calciumkanals Mutationen entdeckt, die neben der FHM noch mit weiteren
dominant vererbbaren neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden: Spinozerebelläre
Ataxie Typ 6 (SCA-6) [ZHUCHENKO et al., 1997] und episodische Ataxie Typ 2 (EA-2) [OPHOFF et al.,
1996]. Einige klinische Merkmale der EA-2 und der FHM sind überlappend, wie beispielsweise das
Einleitung
21
Auftreten von Schwindelgefühlen [HAAN et al., 1995, DENIER et al., 1999]. Außerdem weisen etwa 50 %
der an EA-2 Erkrankten die Symptome einer Migräne auf, insbesondere der Migräne vom Basilaris-Typ
(Tabelle 1.3) [BALOH et al., 1997].
1 Migräne ohne Aura (gewöhnliche Migräne)
2 Migräne mit Aura (klassische Migräne)
2.1 Migräne mit typischer Aura
2.2 typische Aura mit untypischen Kopfschmerzen
2.3 typische Aura ohne Kopfschmerzen
2.4 familiäre hemiplegische Migräne (FHM)
2.5 sporadische hemiplegische Migräne (SHM)
2.6 Migräne vom Basilaristyp
3 periodische Syndrome in der Kindheit (die im Allg. Vorläufer einer Migräne sind)
3.1 zyklisches Erbrechen
3.2 abdominelle Migräne
3.3 benigner paroxysmaler Schwindel
4 retinale Migräne
5 wahrscheinliche Migräne
5.1 wahrscheinliche Migräne ohne Aura
5.2 wahrscheinliche Migräne mit Aura
5.3 wahrscheinliche chronische Migräne
6 Migränekomplikationen
6.1 chronische Migräne
6.2 Status migränosus
6.3 migränöser Infarkt
6.4 persistierende Aura ohne Infarkt
6.5 migränegetriggerte epileptische Anfälle
Tabelle 1.3
Übersicht über die Klassifikation der Migräne einschließlich ihrer Subtypen aus der Ende 2003 erschienenen überarbeiteten
Auflage der Internationalen Kopfschmerzgesellschaft (IHS, International Headache Society). Die zweite Auflage der IHS-
Kriterien (ICHD-II) ist vollständig in den Zeitschriften „Nervenheilkunde“ (2003, 22: 531-610) und „Cephalalgia“ (2004,
24: Suppl. 1: 1-160) aufgeführt.
Migräne-Symptome weisen Ähnlichkeiten zu weiteren neurologischen Erkrankungen auf, wie
beispielsweise Hirnschlag, Depressionen und Epilepsie. FHM wird auch häufig irrtümlich als Epilepsie
diagnostiziert und dementsprechend falsch behandelt [JOUVENCEAU et al., 2001, VANMOLKOT et al., 2003,
KORS et al., 2004, BEAUVAIS et al., 2004]. Es gibt aber auch Epilepsie-Formen, die mit der familiären
hemiplegischen Migräne teilweise kosegregieren (Tabelle 1.4), wie zum Beispiel „benigne familiäre
infantile Krampfanfälle“ (BFIC, Benign Familial Infantile Convulsions, autosomal-dominant, Genort:
19q13, Gen: CHRNA4) und „benigne familiäre neonatale Krampfanfälle“ (BFNC, Benign Familial
Neonatale Convulsions, autosomal-dominant, Genort: 20q und 8q24, Gen: KCNQ2 und KCNQ3)
Einleitung
22
[TERWINDT et al., 1997, CHARLIER et al., 1998, SINGH et al., 1998, VANMOLKOT et al., 2003, BONESCHI et al.,
2005]. Das Gen ATP1A2 ist wahrscheinlich auch in anderen Epilepsie-Formen involviert, da auch Fälle
mit BFIC-freien Epilepsien in Familien mit FHM existieren, die in direktem Zusammenhang mit dem
Chromosom 1q21-1q23 stehen [DUCROS et al., 1997, CEVOLI et al., 2002, MARCONI et al., 2003,
VANMOLKOT et al., 2003].
Krankheit
Abkürzung
Gen
Chromosom
Familiäre Hemiplegische Migräne Typ 1 FHM-1 CACNA1A 19p13
Familiäre Hemiplegische Migräne Typ 2 FHM-2 ATP1A2 1q21-1q23
Familiäre Hemiplegische Migräne Typ 3 FHM-3 SCN1A 2q24
Familiäre Hemiplegische Migräne Typ 4 FHM-4 ? 14q32
Sporadische Hemiplegische Migräne SHM
CACNA1A, SCN1A,
ATP1A2
19p13, 2q24,
1q21-1q23
Benigne Familiäre Infantile Krampfanfälle BFIC ATP1A2 19q13
Benigne Familiäre Neonatale Krampfanfälle BNIC SCN1A 20q, 8q24
Zerebral autosomal-dominante Arteriopathie mit
subkortikalen Infarkten und Leukenzephalopathie
CADASIL Notch3 19p13.2-p13.1
Episodische Ataxie Typ 2 EA-2 CACNA1A 19p13
Spinozerebelläre Ataxie Typ 6 SCA-6 CACNA1A 19p13
Tabelle 1.4
Vier Gene, die entweder direkt oder indirekt mit hemiplegischer Migräne in Verbindung stehen, einschließlich ihrer
Lokalisation auf den entsprechenden Chromosomen.
Die klassische Migräne („Migräne mit Aura“) tritt ebenfalls in Verbindung mit anderen neurologischen
Erkrankungen auf. Die zerebral autosomal-dominante Arteriopathie mit subkortikalen Infarkten
und Leukenzephalopathie (CADASIL, Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical
Infarcts and Leukoencephalopathy) weist in ihrer frühen Symptomatik migräneartige Kopfschmerzen auf
[DICHGANS et al., 1998], was in den meisten Fällen dazu führt, dass diese seltene genetische Erkrankung
relativ spät als solche erkannt wird. Die entsprechenden Mutationen kommen auf dem Chromosom 19p
Einleitung
23
(Notch3-Gen) vor, auf dem auch die Gene CACNA1A und SCA-6 lokalisiert sind (Tabelle 1.4) [DUCROS
et al., 1996].
Im Januar 2009 wurde ein Genlocus auf Chromosom 14q32 mit FHM assoziiert [CUENCA-LEÓN et al.,
2009]. Das deutet auf eine noch größere genetische Heterogenität der hemiplegischen Migräne hin, als
bisher angenommen wurde. In dieser Arbeit wird jedoch im Weiteren hauptsächlich auf die sporadische
und familiäre hemiplegische Migräne des Typs 2 (SHM und FHM-2) eingegangen.
1.2.1 Die klassische Migräne
Die Weltgesundheitsorganisation (WHO, World Health Organization) hat Migräne unter den chronischen
Erkrankungen weltweit auf Platz 19 der Hauptursachen für Arbeitsunfähigkeit eingeordnet und auf
Platz 4 der neurologischen Erkrankungen, die innerhalb Europas mit einer Höhe von >27 Mrd. Euro pro
Jahr am kostspieligsten sind [MENKEN et al., 2000, ANDLIN-SOBOCKI et al., 2005, GOADSBY, 2005 und 2006,
DODICK und GARGUS, 2008]. Es leiden schätzungsweise 15 % der Weltbevölkerung an Migräne, darunter
dreimal mehr Frauen als Männer [STEWART et al., 1994, LAUNER et al., 1999, STOVNER et al., 2006].
Migräne zeichnet sich dadurch aus, dass anfallartige, pulsierende Kopfschmerzen auftreten, die meist
auf eine Kopfhälfte begrenzt sind und periodisch wiederkehren. Ein Migräneanfall kann in fünf Phasen
unterteilt werden: (1) interiktale Phase, (2) Prodromalphase, (3) Auraphase, (4) Schmerzphase und
(5) Rückbildungsphase [BLAU, 1992]. Die erste Phase ist beschwerdefrei und zeigt neben veränderten
Gehirnaktivitäten eine niedrige Serotoninkonzentration. Jedoch ist noch weitestgehend unklar, in
welchem Ausmaß der Serotoninstoffwechsel bei einem Migräneanfall eine Rolle spielt. In der zweiten
Phase, der Prodromalphase, treten Symptome wie Konzentrationsmangel, Stimmungsschwankungen,
Appetitsteigerung sowie Übelkeit und Erbrechen auf, die über mehrere Stunden andauern und der Aura
vorausgehen [RUSSELL und OLESEN, 1996]. Zu den häufigsten vor der Kopfschmerzphase (Auraphase)
auftretenden vegetativen Begleiterscheinungen gehören neben den visuellen, motorischen,
sensorischen und sensiblen Störungen die Sprachstörungen. Etwa 30 % der Migränepatienten erfahren
eine Auraphase, jedoch treten nicht immer alle Auraformen auf [RASMUSSEN und OLESEN, 1992,
SILBERSTEIN, 2004]. Die diversen neurologischen Reiz- und Ausfallsymptome sind in Tabelle 1.5
detaillierter aufgelistet. Binnen einer Stunde nach Beginn der Aura setzt die Kopfschmerzphase ein. Die
Schmerzphase lässt sich mit dem pathophysiologischen Korrelat der Migräne-Aura, der „kortikalen
Streudepolarisierung“ (CSD, Cortical Spreading Depression), anschaulich darstellen und mittels
bildgebender Verfahren (fMRI) raum-zeitlich darstellen. Die Rückbildungsphase dauert im Durchschnitt
etwa einen bis zu drei Tage, in denen begünstigt durch Schlaf der Normalzustand und damit auch das
Wohlbefinden des Erkrankten regeneriert werden können.
Einleitung
24
Art der Symptomatik Art der Störung
visuell
Augenflimmern, helle und dunkle Flecken an bestimmten Stellen des
Gesichtsfeldes in wechselnder Kombination und Bewegung,
Doppelbilder, Augenbewegungsstörungen, Sehen gezackter Linien
motorisch
Gang- und Standunsicherheit, Gleichgewichtsstörungen,
Lähmungserscheinungen
sensorisch & sensibel
Gefühlsstörungen oder Missempfindungen an versch. Körperregionen
(Mund, Zunge, Wange, Hand, Fuß) wie Kribbeln, Ameisenlaufen,
Stechen, Spinnwebgefühl, Jucken, Schwellungsgefühl, gestörte Kälte-
und/oder Warmempfindung, Licht- und Geräuschempfindlichkeit,
Geruchs- und Geschmacksstörungen
artikulatorisch
Allgemeine Sprach- und Sprechstörungen, wie Stottern, Lallen,
Stammeln und Wortfindungsstörungen
Begleitsymptome
Erbrechen, Übelkeit, Schwindel, Unwohlsein, Krämpfe in inneren
Organen der Bauchhöhle, Hyperaktivität, Appetitlosigkeit,
Gesichtsblässe
Tabelle 1.5
Während der Aura- bzw. Kopfschmerzphase auftretende Symptome.
1.2.2 Pathophysiologie der Migräneaura
Bisher war umstritten, ob die Entstehung des Migräneschmerzes vaskulären oder neurogenen
Ursprungs ist, da es für beide Ursachearten haltbare Theorien gibt. Die neurogene Annahme geht
davon aus, dass die Migräne-Aura durch eine Störung der Nervenzellaktivität im zentralen
Nervensystem hervorgerufen wird, während die vaskuläre eine zentrale Rolle der Gefäßpathologie in
Betracht zieht [BOES und DALESSIO, 2008]. Mittlerweile wird von einer Kombination aus beiden denkbaren
Ursachen ausgegangen, die als „neurovaskuläre Theorie“ bezeichnet wird und derzeit allgemein
akzeptiert ist. Das Phänomen der „Cortical Spreading Depression“ ist Bestandteil der neurogenen
Komponente der Migräne. Die ersten Beobachtungen diesbezüglich machte Karl Spencer Lashley an
sich selbst. Er konnte während einer Migräne-Aura die Ausbreitungsgeschwindigkeit des Flimmerns in
seinem Gesichtsfeld mit 2-5 mm/min bestimmen [LASHLEY, 1941]. Drei Jahre später wurde die gleiche
Geschwindigkeit in unabhängigen Experimenten (an Kaninchenhirnarealen) von Aristides A. P. Leão
ebenfalls gemessen [LEÃO, 1944]. Der Ausdruck „spreading depression“, den der brasilianische
Einleitung
25
Neurophysiologe Leão damals prägte, wurde im Jahr 1958 zum ersten Mal in Verbindung mit
Migräneaura verwendet [MILNER, 1958].
1.2.3 Cortical Spreading Depression
Die Cortical Spreading Depression ist eine transiente (1-2 min) Depolarisation (negative
Potentialverschiebung um ~20-35 mV) der Nerven- und Gliazellen der Hirnrinde (Cortex), die sich
wellenartig mit einer Geschwindigkeit von 2-5 mm/min über die Hirnoberfläche ausbreitet [SANCHEZ DEL
RIO und REUTER, 2004]. Hierbei kommt es zur massiven Umverteilung der Ionen Na+, K+, Cl- und Ca2+
[HANSEN et al., 1990, HANSEN und ZEUTHEN, 1981] und verschiedener Neurotransmitter [DAVIES et al.,
1995] zwischen dem intra- und extrazellulären Raum. Es ist nachgewiesen, dass die extrazelluläre
Glutamatkonzentration um etwa das 20-fache ansteigt [SCHELLER et al., 1991] und über die NMDA-
Rezeptoren (Glutamat-Rezeptor, NMDA, N-Methyl-D-Aspartat) zur Weiterleitung der CSD beiträgt.
Zudem erhöht sich die Kaliumkonzentration im Extrazellulärraum kurzzeitig von ~3 mM auf bis zu
60 mM [HANSEN und ZEUTHEN, 1981]. Parallel kommt es zu einer Reduktion der extrazellulären Na+- (von
~130 mM auf 70 mM) und Ca2+-Konzentration (von ~1,5 auf 0,15 mM). Dies führt dazu, dass ebenso Cl-
-Ionen und in der Folge auch Wasser auf osmotischem Wege ins Zellinnere gelangt. Die Größe des
Extrazellulärraums reduziert sich dabei vorübergehend fast um die Hälfte. Der pH-Wert erfährt während
der Depolarisation ebenfalls eine Verschiebung: zunächst in den alkalischen (um ~0,3 Einheiten) und
dann in den aziden Bereich (um ~0,05-0,1 Einheiten im Vergleich zum Ausgangswert). Auf die
transiente neuronale Übererregung folgt schließlich eine länger anhaltende neuronale Inhibition.
Parallel zur Depolarisationsphase kommt es zu einem Anstieg bzw. unmittelbar im Anschluss an die
elektrophysiologischen Veränderungen zur Reduktion des regionalen zerebralen Blutflusses (rCBF,
regional Cerebral Blood Flow) [OLESEN et al., 1981, OLESEN, 1991]. Durch die Cortical Spreading
Depression wird das „trigemino-vaskuläre System“ (periphere trigeminale Verbindungen mit zerebralen
Blutgefässen) aktiviert. In den Endothelien der zerebralen Blutgefäße induzieren Astrozyten die
Funktion der Blut-Hirn-Schranke. Diese sternförmigen Zellen des Nervengewebes unterscheiden sich
strukturell und funktionell von den typischen Neuronen und stehen ungeachtet dessen in direktem
Kontakt zu ihnen. In ihrer Zellmembran befinden sich verschiedene Transporter, Rezeptoren und
spannungsabhängige Kanäle, die an der Regulation und Aufrechterhaltung insbesondere des Glutamat-
und Kalium-Haushalts beteiligt sind (Abbildung 1.8). In diesem Zusammenhang sei der Glutamat-
Transporter GLAST (GLutamate ASpartate Transporter, auch als EAAT1 Excitatory Amino Acid
Transporter 1 bezeichnet) erwähnt, der nach Erregung von Neuronen freigesetztes Glutamat aus dem
synaptischen Spalt im Co-Transport zu drei Na+-Ionen, einem H+-Ion (Symport) und einem K+-Ion
(Antiport) befördert [DANBOLT, 2001, BALCAR, 2002]. Das Glutamat wird in Astrozyten über die Glutamin-
Einleitung
26
Synthetase in Glutamin umgewandelt und kann nach der Ausscheidung in den extrazellulären Raum
erneut von Neuronen aufgenommen und nach Umwandlung über die Glutaminase wieder als Glutamat
in synaptische Vesikel verpackt werden (Abbildung 1.8).
Die exzitatorische Aminosäure Glutamat und das extrazelluläre Kalium tragen - neben den hohen
intrazellulären Na+- und Ca2+-Konzentrationen - ebenfalls einen wesentlichen Beitrag zur Erzeugung
einer Cortical Spreading Depression und zum parallel stattfindenden gefäßverengenden bzw.
-erweiternden Effekt. Der vaskuläre Anteil der Migräne-Aura, die Gefäßdysfunktion, kann heutzutage
sehr erfolgreich mit Hilfe von sogenannten „Neuroimaging-Techniken“ untersucht werden [SCHWEDT
und DODICK, 2009]. Neurologen verwenden diverse Verfahren zur in vivo-Untersuchung der sich in den
entsprechenden Hirnarealen pathologisch ereignenden Prozesse. Einige der häufig angewendeten
Verfahren, die zur Charakterisierung der CSD herangezogen werden, seien an dieser Stelle kurz
erwähnt. Die Magnetresonanzspektroskopie (MRS, Magnetic Resonance Spectroscopy) basiert
beispielsweise auf dem Verfahren der Kernspinresonanz (NMR, Nuclear Magnetic Resonance) und
kann hervorragend in vivo durchgeführt werden. Diese Methode bietet die Möglichkeit die
biochemischen Informationen des Gewebes zu erforschen und somit die Unterschiede zu den
physiologischen Gegebenheiten zu erhalten. In Kombination mit der Magnetresonanztomographie (MRT
bzw. MRI, Magnetic Resonance Imaging) kann die MRS sehr gut dazu eingesetzt werden, um
Informationen zur metabolischen Funktion der Neuronen zur Verfügung zu stellen. Um detaillierte
Struktur-Funktions-Beziehungen innerhalb des Gehirns messen zu können, wurde das gegenüber der
Computer-Tomographie kontrastreichere MRT-Verfahren verbessert. Zu den speziellen
Weiterentwicklungen gehören die funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT oder fMRI, functional
Magnetic Resonance Imaging) und die „BOLD“-Methode (Blood Oxygen Level Dependency) [HADJIKHANI
et al., 2001, CAO et al., 2002]. Wie die Bezeichnung „blood oxygen“ bereits andeutet, ist es mit dieser
Methode möglich die Durchblutung von Organen und Geweben gezielt zu betrachten, indem die
magnetischen Eigenschaften vom Hämoglobin und dessen Sauerstoffbeladung kernspintomografisch
erfasst werden. Während mit Sauerstoff beladenes Hämoglobin sich diamagnetisch verhält, zeigt die
ungeladene Form ein paramagnetisches Verhalten. Mithilfe dieser Methode können durch die
Bestimmung der veränderten Diffusionsverhalten, die bei Erkrankungen im Gehirn vorliegen,
Rückschlüsse auf die Neuronenaktivität gezogen werden. Lokale Änderungen der Gehirnaktivität lassen
sich somit millimetergenau messen.
Für die dynamischen Regulationen des Blutflusses innerhalb des Gehirns wurde der medizinische
Ausdruck „Hämodynamik“ eingeführt. Das Prinzip der fMRT bzw. des BOLD-Verfahrens beruht auf
diesen hämodynamischen Reaktionen. Hierunter fallen, wie bereits oben erläutert, die Erregung von
Neuronen, die Freisetzung von Glutamat, dessen Bindung an den NMDA-Rezeptor, den
Calciumeinstrom in die Zelle und schließlich die über mehrere Kaskaden ablaufenden Ca2+-aktivierten
Einleitung
27
Prozesse bis hin zur Blutgefässerweiterung und dem dadurch bedingten gesteigerten Blutfluss
(„Hyperämie“) [ROSSI, 2006, TAKANO et al., 2006].
Abbildung 1.8 a
Schematische Darstellung zweier Neuronen (prä- und postsynaptisch), dem dazwischen liegenden synaptischen Spalt und
einer angrenzenden Astrozyte. Eingezeichnet sind unter anderem die drei FHM-verursachenden Proteine Cav2.1
(α1-Untereinheit des spannungsabhängigen P/Q-Typ-Calciumkanals, FHM-1), Nav1.1 (α1-Untereinheit des
spannungsabhängigen Natriumkanals, FHM-3) und die Na+/K+-ATPase (α2-Untereinheit, FHM-2). Mutationen in allen drei
Proteinen scheinen zu einer erhöhten neuronalen Hypererregbarkeit (Exzitabilität) zu führen und dadurch an der Entstehung
und Fortleitung der kortikalen Streudepolarisation beteiligt zu sein. Die funktionellen Folgen aller FHM-Mutationen sind im
Einzelnen recht komplex, doch allgemein werden FHM-1- und FHM-3-Mutationen zu „gain-of-function“-Mutationen gezählt
und FHM-2-Mutationen zu „loss-of-function“-Mutationen. Bei einem „Funktionsgewinn“ wird die erhöhte neuronale
Exzitabilität durch veränderte Kanalkinetik erreicht, was die Absenkung des Schwellenpotentials zu negativeren Spannungen
und/oder die Erhöhung der Leitfähigkeit für Na+- (FHM-3, SCN1A) bzw. Ca2+-Ionen (FHM-1, CACNA) zur Folge hat. Die
gesteigerte Ca2+- bzw. Na+-Aktivierung bewirkt über eine verlängerte Depolarisation die erhöhte Erregbarkeit.
FHM-2-Mutationen hingegen weisen einheitlich auf einen Funktionsverlust der Na+/K+-ATPase hin. Aufgrund der
eingeschränkten bzw. dem völligen Verlust der Funktion kommt es intrazellulär zur K+- und extrazellulär zur
Na+-Anreicherung. Hier wird die kortikale Streudepolarisation zum einen über die direkte Depolarisation der Neuronen
(erhöhte [K+]int) oder durch die Beteiligung des Glutamat-Transporters und/oder des Na+/Ca2+-Austauschers (erhöhte
[Glutamat]int bzw. [Ca2+]int) begünstigt.
Einleitung
28
Abbildung 1.8 b
Schematische Darstellung zweier Neuronen (prä- und postsynaptisch), dem dazwischen liegenden synaptischen Spalt und
einer angrenzenden Astrozyte. Bei Eintreffen eines Aktionspotentials im präsynaptischen Neuron kommt es zur Aktivierung
der spannungsgesteuerten Ca2+-Kanäle. Durch den dadurch veranlassten Ca2+-Einstrom wird die Freisetzung der
Aminosäure Glutamat aus synaptischen Vesikeln bewirkt. Das Glutamat wird entweder über den NMDA-Rezeptor
postsynaptisch oder über den Glutamat-Transpoter GLAST in Astrozyten aufgenommen. Dieser Transporter ist vom
Natriumgradienten der Astrozytenmembran abhängig, der von der Na+/K+-ATPase aufgebaut und aufrechterhalten wird
(rote Sterne = ATP-getrieben).
In Zusammenhang mit der CSD wurden zwei Proteine entdeckt, die während bzw. im Anschluss an die
Depolarisation vermehrt im Kortex anzutreffen sind: das Galanin (LIU und HOKFELT, 2002), das imstande
ist diverse Neurotransmitter freizusetzen, und das Matrixmetalloproteinase-9 (GURSOY-OZDEMIR et al.,
2004), dessen überhöhte Produktion zu Schädigungen der Blut-Hirn-Schranke führt. Diese beiden
Proteine leiten einen entzündungsfördernden Prozess ein, wobei unklar ist, wie dies zu einer
Aktivierung des trigeminalen Systems führt [SANCHEZ DEL RIO und REUTER, 2004].
Einleitung
29
Ferner existiert eine überschaubare Anzahl weiterer Erkrankungen, die mit der CSD in Beziehung
gebracht werden. Dazu gehören das Schädelhirntrauma [MAYEVSKY, 1996], der ischämische
Schlaganfall (Hirninfarkt) [NEDERGAARD und ASTRUP, 1986], die Hypoglykämie (niedriger
Blutzuckerspiegel) [ASTRUP und NORBERG, 1976] und die Epilepsie [LEÃO, 1944]. In dieser Arbeit liegt der
Fokus auf der CSD in Verbindung mit der familiären hemiplegischen Migräne, insbesondere des Typs 2.
1.2.4 Familiäre Hemiplegische Migräne Typ 2, FHM-2
Die ersten Mutationen, die mit FHM-2 assoziiert wurden, sind im Jahr 2003 veröffentlicht worden
(DE FUSCO et al., 2003). Mittlerweile ist die Existenz von etwa 50 Mutationen im Gen ATP1A2 bekannt
(Tabelle 1.6, Abbildung 1.9). Die meisten von ihnen sind Missense-Mutationen, die durch die
Substitution einer einzelnen – fast ausschließlich hochkonservierten – Aminosäure hervorgerufen
werden. Auffallend bevorzugt werden Arginine ausgetauscht (besonders häufig gegen Histidin,
Glutamat und Tyrosin). Arginin tritt aber auch vermehrt als Substituent auf, gefolgt von Histidin, Lysin
und Glutamin (Tabelle 1.6). Der Argininanteil der α2-Untereinheit der Na+/K+-ATPase liegt bei knapp
5 % des Aminosäurebestands.
Die Mehrzahl der Aminosäureaustausche ist in der großen intrazellulären Schleife L4/5 (L = loop)
vorzufinden, in der sich das DKTG-Motiv befindet, und in der extrazellulären Schleife L7/8, die an der
Bindung der akzessorischen β-Untereinheit beteiligt ist. Betroffen sind aber auch der N- und der
C-Terminus (Abbildung 1.9 und 1.10). Spätestens seit der Veröffentlichung von Morth und Kollegen wird
dem C-Terminus der α-Untereinheit bei der Bildung der dritten Kationen-Bindungsstelle eine wichtige
Rolle zugeschrieben. Es wird vorgeschlagen, dass die dritte Bindungsstelle durch Wechselwirkungen
des C-Terminus mit der Transmembrandomäne TM5 und der Schleife zwischen TM8 und TM9 gebildet
wird [MORTH et al., 2007]. Die letzten beiden hochkonservierten Tyrosine im KETYY-Motiv (das exakt vor
dem Stopp-Signal lokalisiert ist) interagieren mit positiv geladenen Resten: K766 (α1TM5) und R933
(Schleife in 8-9). Dieses Arginin an Position 933 entspricht in der α2-Isoform R937, das
interessanterweise als Locus für eine FHM2-Mutation bekannt ist (R937P).
Einleitung
30
extrazellulär
intrazellulär
R383H
D718N
E700K
P796R/S
W887R E902K
P979L
I883L
X1021R
R548H
M731T
1234 5678 910
V628M
T345A
T415M
E174K
I286T
R51H
T263M
T378N
V362E
A606T
S966X
R937P
(K935-S940)insI
R834Q
M829R
Y9N
R65W
E120A
V138A
R202Q
G301R
T376M
C515Y
E492K
R510S R593W
G615R
R689Q
R763H/C
C702Y
N717K
G900R
R908Q
D999H
R1002Q
Y1009X
P786L
L764P
M745I
R879Q/W
G855R
Abbildung 1.9
Schematische Darstellung der Na+/K+-ATPase und den bisher im Gen ATP1A2 humangenetisch identifizierten Mutationen
(Stand April 2010). Bläuliche Zylinder stellen die zehn Transmembrandomänen der Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit dar, die
in der Plasmamembran integriert vorliegen. Bislang entdeckte Mutationen sind als graue Kreise dargestellt. Die Mutation
X1021R, die das Stopp-Codon betrifft (graue Wabe) enthält 28 zusätzlich angefügte Aminosäuren (weiße Waben). Die
beiden Polymorphismen (nicht krankheitsbedingte Sequenzvariationen) R510S und I883L sind in dunklem Grau abgebildet.
Mediziner und Humangenetiker sprechen im Falle der FHM-2 von einer Haploinsuffizienz, was zum
Ausdruck bringt, dass die Mutation zwar auf einem Allel vorliegt, es aber dennoch zu einer Dominanz
dieses genetisch veränderten Allels führt. Mittels so genannter “Cell Survival Assays“, die auf dem
Expressionssystem menschlicher Epithelzellen eines Zervixkarzinoms (HeLa-Zellen, Henrietta Lacks)
basieren, wurden einige der entdeckten Mutationen hinsichtlich der Überlebensfähigkeit in Anwesenheit
von Ouabain charakterisiert. Bei Behandlung von transient transfizierten Zellen mit Ouabain zeigt die
Ouabain-insensitive Form (Oua-R) normales Wachstum, wohingegen die Ouabain-sensitive (Oua-S)
Form eine beachtlich reduzierte Lebenszeit aufweist. Wenn nun eine Ouabain-insensitive Mutation in
Gegenwart des Inhibitors kultiviert wird, so wird die endogene Pumpe vollständig inhibiert und das
Überleben der Zellen hängt von der Funktionalität des exogen exprimierten Enzyms ab. Auf diese
Weise lassen sich Aussagen darüber treffen, wie stark die Enzymfunktion durch die Mutation
beeinträchtigt wird. Weitergehende funktionelle Untersuchungen wurden hingegen lediglich an einer
unbeträchtlichen Anzahl an ATP1A2-Mutationen durchgeführt.
Einleitung
31
Mutation Mutationsart Phänotyp Lokalisation Referenz
Y9N Punktmutation SHM A-Domäne THOMSEN et al., 2008
R51H Punktmutation MO A-Domäne CASTRO et al., 2004
R65W Punktmutation FHM A-Domäne TONELLI et al., 2007
E120A Punktmutation SHM Loop zw. TM1-2 DE VRIES et al., 2007
V138A Punktmutation FHM TM2 THOMSEN et al., 2007
E174K Punktmutation MA/MO A-Domäne TODT et al., 2005
R202Q Punktmutation FHM A-Domäne HANSEN et al., 2008
T263M Punktmutation FHM A-Domäne RIANT et al., 2005
I286T Punktmutation FHM TM3 VANMOLKOT et al., 2007
G301R Punktmutation FHM TM3 SPADARO et al., 2004
T345A Punktmutation FHM P-Domäne KAUNISTO et al., 2004,
SEGALL et al., 2004
V362E Punktmutation FHM P-Domäne CASTRO et al., 2008
T376M Punktmutation FHM P-Domäne RIANT et al., 2005
T378N Punktmutation FHM
AHC P-Domäne BASSI et al., 2004,
SWOBODA et al., 2004
R383H Punktmutation SHM N-Domäne JURKATT-ROTT et al., 2004
T415M Punktmutation FHM N-Domäne VANMOLKOT et al., 2007
E492K Punktmutation SHM N-Domäne DE VRIES et al., 2007
R510S Polymorphismus - N-Domäne THOMSEN et al., 2007
C515Y Punktmutation MA/MO N-Domäne TODT et al., 2005
R548H Punktmutation BM/MA N-Domäne AMBROSINI et al., 2005
R593W Punktmutation FHM P-Domäne VANMOLKOT et al., 2006a
A606T Punktmutation FHM P-Domäne RIANT et al., 2005,
JEN et al., 2007
G615R Punktmutation FHM & MR P-Domäne VANMOLKOT et al., 2006b
V628M Punktmutation FHM P-Domäne VANMOLKOT et al., 2006a
R689Q Punktmutation FHM & BFIC P-Domäne VANMOLKOT et al., 2003,
SEGALL et al., 2005
E700K Punktmutation FHM P-Domäne PIERELLI et al., 2006
C702Y Punktmutation MA/MO & Epilepsie P-Domäne DEPREZ et al., 2007
N717K Punktmutation SHM P-Domäne JEN et al., 2007
D718N Punktmutation FHM P-Domäne JURKATT-ROTT et al., 2004
M731T Punktmutation FHM, BFIC P-Domäne VANMOLKOT et al., 2003, SEGALL
et al., 2005, CASTRO et al., 2007
M745I Punktmutation SHM P-Domäne THOMSEN et al., 2008
R763H/C Punktmutation FHM TM5 JURKATT-ROTT et al., 2004,
THOMSEN et al., 2007
L764P Punktmutation FHM TM5 DE FUSCO et al., 2003,
KOENDERINK et al., 2005
P786L Punktmutation SHM TM5 DE VRIES et al., 2007
P796R/S Punktmutation FHM Loop zw. TM5-6 JURKATT-ROTT et al., 2004,
CASTRO et al., 2008
M829R Punktmutation FHM Loop zw. TM6-7 RIANT et al., 2005
R834Q/X Punktmutation FHM/SHM Loop zw. TM6-7 RIANT et al., 2005,
DE VRIES et al., 2007
G855R Punktmutation FHM & Fieberkrämpfe TM 7 DE VRIES et al, 2009
R879Q/W Punktmutation SHM Loop zw. TM7-8 THOMSEN et al., 2008
I883L Polymorphismus - Loop zw. TM7-8 JURKATT-ROTT et al., 2004
W887R Punktmutation FHM Loop zw. TM7-8 DE FUSCO et al., 2003,
KOENDERINK et al., 2005
G900R Punktmutation FHM & Epilepsie Loop zw. TM7-8 DEPREZ et al., 2007
E902K Punktmutation FHM Loop zw. TM7-8 JURKATT-ROTT et al., 2004
R908Q Punktmutation SHM Loop zw. TM7-8 DE VRIES et al., 2007
del(K935-S940)insI Deletion & Insertion FHM TM8-9 RIANT et al., 2005
R937P Punktmutation FHM TM8-9 RIANT et al., 2005
S966X Frameshift FHM Loop zw. TM9-10 RIANT et al., 2005
P979L Punktmutation FHM Loop zw. TM9-10 JURKATT-ROTT et al., 2004
D999H Punktmutation FHM C-Terminus FERNANDEZ et al., 2008
R1002Q Punktmutation FHM C-Terminus JEN et al., 2007
Y1009X Punktmutation SHM C-Terminus MORTH et al., 2007,
GALLANTI et al., 2008
X1021R Elongation FHM Stopp-Codon JURKATT-ROTT et al., 2004
Tabelle 1.6 Bisher entdeckte FHM2- und SHM-Mutationen und ihre topologische Lokalisation (April 2010).
Einleitung
32
In ersten funktionellen Untersuchungen von FHM2-Mutanten (L764P und W887R) an Xenopus laevis-
Oozyten konnte ein kompletter Funktionsverlust nachgewiesen werden, obwohl die charakteristische
Expression in der Plasmamembran nicht beeinträchtigt war [DE FUSCO et al., 2003, KOENDERINK et al.,
2005]. Segall und Kollegen zeigten anhand drei weiteren Mutationen, dass die heterolog exprimierten
Na+/K+-ATPase-Mutanten zwar enzymatisch aktiv waren, jedoch teilweise mit veränderten
Eigenschaften. Beispielsweise hatte T345M eine geringere, während R689Q und M731T eine höhere
apparente Affinität für K+-Ionen aufwiesen [SEGALL et al., 2004, 2005]. Im Vergleich zum Wildtyp-Enzym
zeigten die beiden letztgenannten Mutationen reduzierte katalytische Wechselzahlen (turnover number,
Einheit in s-1), was bedeutet, dass die Anzahl der Pumpzyklen pro Zeiteinheit herabgesetzt ist.
Bislang fehlt noch das Verständnis für die pathophysiologischen Konsequenzen von FHM2-
Mutationen im ATP1A2-Gen. Um die miteinander verzahnten Mechanismen und Zusammenhänge
verstehen zu können, bedarf es weiterer intensiver Untersuchungen der Ursachen auf molekularer
Ebene.
Abbildung 1.10
Strukturelle Darstellung der Na+/K+-ATPase
α2-Untereinheit inklusive der FHM2- und SHM-
Mutationen. Die Farbgebung spiegelt die einzelnen
Regionen wider: gelb markierte Mutationen befinden
sich in der A-Domäne, rote in der N-Domäne und blaue
in der P-Domäne, grüne in der Übergangsstelle
zwischen der Transmembran-Region und der
P-Domäne. Violett dargestellt ist die sogenannte
„Switch-Region“, in der sich auch der C-Terminus
befindet. Weiß eingezeichnete Mutationen kommen in
der Transmembran-Region vor und die beigefarbenen
befinden sich im extrazellulären Bereich. Die
Kristallstruktur ist in der Protein-Datenbank RCSB
(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics)
als PDB-Datei mit der Bezeichnung 3B8E hinterlegt.
Die hier abgebildete Na+/K+-ATPase-Kristallstruktur
basiert auf der Veröffentlichung von Morth und
Kollegen aus dem Jahr 2009 [Philosophical
Transactions of The Royal Society 364, 217-227,
2009].
R65
E174
T263
R689
E492
C515
T415
N717
D718
E700
T376
T378
R593
V628
M731
A606
M829
L764
R834
R937
D999
R1002
V362
T345
I286
V138
E120
W887E902
R908
P796
P979
S966
P786
G301
R51
Y9
Y1009
X1021
N
A
P
extrazellulärer
Bereich
M745
R879
Einleitung
33
1.3 Zielsetzung der Arbeit
Die Antriebskraft des Menschen, das Wissen durch Forschung zu erweitern, ist ihm von Anbeginn der
Menschheitsentwicklung gegeben, genauso wie der Drang, Krankheiten verstehen und heilen zu
können. Mit Hilfe von neu erworbenen medizinischen Erkenntnissen und technischen Erneuerungen
kann der Mensch in immer tiefere Bereiche des täglichen Lebens eindringen. Herausragende Projekte,
wie das Humangenomprojekt, erlauben es Humangenetikern, Erbkrankheiten zu erforschen und
molekulare Mechanismen der Entstehung besser zu verstehen.
Seit Entdeckung verschiedener Gendefekte, die für gewisse Migräneformen verantwortlich sind, wie
beispielsweise die familiäre hemiplegische Migräne, ist es von großem Interesse die komplexen
Vorgänge im menschlichen Körper zu erfassen. Mutationen, die sich im Gen ATP1A2 befinden, das die
Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit kodiert, führen zur Erkrankung an der familiären hemiplegischen
Migräne des Typs II (FHM2). In diesem Zusammenhang ist auch die Na+/K+-ATPase wieder näher in
den Fokus der Forscher gerückt. Bisher ist von den bislang entdeckten FHM2-Mutationen lediglich ein
kleiner Anteil funktionell im Detail untersucht worden.
Ziel dieser Arbeit ist es, Mutationen aus funktionell und strukturell relevanten Domänen der Na+/K+-
ATPase α2-Untereinheit mittels verschiedener Methoden zu charakterisieren. Zu diesem Zweck
kommen neben der elektrophysiologischen Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Technik außerdem
biochemische Verfahren sowie Transportmessungen zum Einsatz. Von der Mutation bis hin zum
Abbildung 1.11
Schematisierte Darstellung der Na+/K+-ATPase und der im entsprechenden Gen ATP1A2 vorkommenden Mutationen. Die
blauen Zylinder stellen die zehn Transmembrandomänen der Na+/K+-ATPase dar, die in die Plasmamembran integriert sind.
Von den bisher entdeckten ~50 Mutationen (magentafarbene und graue Kreise) sind diejenigen in Magenta unterlegt, die in
dieser Arbeit näher betrachtet werden. Die Mutation, die das Stopp-Codon betrifft (magentafarbene Raute) enthält 28
zusätzlich angefügte Aminosäuren (weiße Rauten). Die Polymorphismen R510S und I883L sind in dunklem Grau dargestellt.
R65W
E120A
V138A
E492K
R510S R593W
G615R
C702Y
N717K
R908Q
R1002Q
Y1009X
P786L
G855R
R879Q/W
Einleitung
34
Kopfschmerz gibt es zahlreiche, bislang unbekannte Kaskaden. Mittels Struktur-Funktions-
Untersuchungen soll ein tieferer Einblick in die Zusammenhänge gewonnen werden. In Abbildung 1.11
sind die für diesen Zweck selektierten 14 FHM2-Mutationen aufgeführt. Neben gewöhnlichen
Punktmutationen, sind ebenso Mutationen ausgewählt, die nicht nur einzelne Basen bzw. Aminosäuren
betreffen, sondern auch größere Abschnitte, die durch Deletionen bzw. Additionen auftreten. Seit der
vor kurzem veröffentlichten Na+/K+-ATPase-Kristallstruktur ist es nun auch möglich, eine ausführlichere
Einsicht in die strukturellen Eigentümlichkeiten des ionentransportierenden Enzyms zu erlangen.
35
Materialien & Methoden
Materialien & Methoden
36
2 Materialien & Methoden
2.1 Molekularbiologische Methoden und Xenopus laevis-Oozyten-Präparation
2.1.1 Herstellung der cDNA-Konstrukte
Die cDNA-Konstrukte der beiden Untereinheiten α2 und β1 der humanen Na+/K+-ATPase sowie
Mutanten wurden durch rekombinante Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction)
und in besonders schwierigen Fällen mittels des QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kits
(Stratagene, La Jolla, CA, USA) erhalten. Die PCR-Fragmente wurden in den für die Oozytenexpression
optimierten Vektor pCDNA3.1 kloniert (IonGate Biosciences, Frankfurt am Main). Nach der Ligation des
Vektors mit dem Insert im Verhältnis 3:1 (Rapid DNA Ligation Kit, Roche, Mannheim) erfolgte die
Transformation in chemisch-kompetente E. coli-Zellen (rekombinante PCR: „XL1-Blue Competent
Cells“, „QuikChange: XL10-Gold Ultracompent Cells“ von Stratagene, La Jolla, CA, USA). Im Anschluss
an die Gewinnung der Plasmid-DNA wurden die Konstrukte per Sequenzierung (Eurofins MWG Operon
in Ebersberg) verifiziert.
Um die endogene von der heterolog-exprimierten Na+/K+-ATPase unterscheiden zu können, wurden
die Mutationen Q116R und N127D in die α2-Untereinheit eingefügt, wodurch eine Ouabain-resistente
Form (IC50 im mM Bereich) erzeugt wurde [PRICE und LINGREL, 1988]. Dieses Konstrukt wird als (hum.
Na/Kα2-) WT bezeichnet und für die entsprechenden Mutagenesen verwendet, sofern nicht anders
angegeben. Die untersuchten Konstrukte wurden nach ihrer Aminosäure-Substitution benannt, wie zum
Beispiel T263M.
2.1.2 Partielle Ovarektomie und Oozytenbehandlung
Weibliche Tiere der Spezies Xenopus laevis (Abbildung 2.1) wurden mit 0,2 %igem Tricain pH 7,0
(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) anästhesiert, und durch einen 10 – 15 mm langen Schnitt am
ventralen Abdominalbereich wurde jeweils ein Teil des Ovargewebes (einige cm3) entnommen.
Um die Oozyten zu vereinzeln (Abbildung 2.2), wurde das ovarielle Gewebe einer Kollagenase-
Behandlung unterzogen. Hierfür wurden die mit Bindegewebe umhüllten Oozyten in 1 ml Kollagenase
Typ 1A aus Clostridium histolyticum [20 mg/ml], 1 ml Trypsin-Inhibitor Typ III-O aus Hühnereiweiß
[10 mg/ml] und 8 ml Ca2+-freie Oozyten-Ringer-Lösung ORI-Ca2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM
MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH7,4) eingelegt und für 3 - 4 Stunden bei ca. 18°C sehr vorsichtig
geschwenkt.
Materialien & Methoden
37
Abbildung 2.1
Weibliches Individuum der Spezies Xenopus laevis (afrikanischer Krallenfrosch). Die adulten Tiere können eine Kopf-/Steiß-
Länge von bis zu 13 cm erlangen und erreichen in freier Natur ein Alter von etwa 15 bis 25 Jahren. Trotz ihrer aquatischen
Lebensweise (seichte Gewässer und Tümpel) handelt es sich bei dieser Amphibien-Klasse um Lungenatmer, die regelmäßig
an der Wasseroberfläche durch Schluckatmung Luft holen.
Abbildung 2.2
Oozyten eines weiblichen Krallenfrosches im Stadium V mit einem Durchmesser von etwa 1 bis 1,2 mm. Die helle Hälfte ist
der schwere, dotterhaltige Anteil der Oozyte, die als „vegetaler Pol“ bezeichnet wird, während die dunkle Hälfte leicht
zytoplasma- und ribosomenreich ist und den „animalen Pol“ darstellt.
Materialien & Methoden
38
2.1.3 cRNA-Synthese und -Injektion
Nach Linearisieren der Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym Xba I wurde die Synthese der zu
injizierenden cRNA (kodierende Ribonukleinsäure, complementary ribonucleic acid) mit dem
mMESSAGE mMACHINE® T7 Kit (Ambion, Austin, TX, USA) durchgeführt. Pro Oozyte der Stadien V
und VI [DUMONT, 1972] mit einem Durchmesser von ca. 1 - 1,2 mm (Follikelschicht-frei) wurden 25 ng
der α2-Untereinheit- und 2,5 ng der β1-Untereinheit-cRNA injiziert. Die Oozyten wurden in einer
Gentamycin-haltigen (50 mg/l) ORI+Ca2+-Lösung für 3 - 5 Tage bei 18°C aufbewahrt.
2.2 Proteinbiochemische und zellbiologische Methoden
2.2.1 Isolierung von Plasmamembranfragmenten
Die Durchführung der Plasmamembran-Präparation erfolgte bis auf kleine Modifikationen nach der
Methode von Kamsteeg und Deen [KAMSTEEG und DEEN, 2001]. In einer MBSS-Lösung (20 mM MES,
80 mM NaCl, pH 6,0) inklusive 1 %iger kolloidaler Quarz-Kügelchen (beads, Sigma Aldrich, St. Louis,
MO, USA) wurden 8 -12 Oozyten für 30 Minuten bei 4°C rotiert. Nach zweimaligem Waschen mit
MBSS-Lösung wurden die Oozyten erneut für 30 Minuten rotiert. Die MBSS-Lösung für den zweiten
Rotationsschritt enthielt außerdem 0,1 %ige Polyacrylsäure (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Nach
zwei weiteren Waschschritten mit einer MBS-Lösung (Modified Barth’s Solution, 88 mM NaCl,
1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4, 0,33 mM Ca(NO3)2, 0,41 mM CaCl2,
pH 7,4) [BARTH und BARTH, 1959] wurden die noch intakten Oozyten in je 1,5 ml HbA-Lösung
homogenisiert, die mit Complete® Protease-Inhibitoren (1 Tablette/50 ml, Roche Applied Science,
Mannheim) versetzt war. Anschließend wurde insgesamt viermal zentrifugiert, wobei die
Beschleunigung von 10xg (die ersten beiden Zentrifugationen) über 20xg (dritte Zentrifugation) bis zu
40xg erhöht wurde. Nach dem ersten Zentrifugationsschritt enthielt der Überstand den Großteil des
zellulären Membrananteils, weshalb der Überstand (1,3 ml) auch zur Weiterverwendung für eine
Totalmembran-Präparation aufbewahrt wurde (siehe unten). Bei den darauffolgenden drei
Zentrifugationsschritten wurde je 1 ml des Überstandes verworfen und mit 1 ml HbA-Puffer aufgefüllt.
Die nach der letzten Zentrifugation in den verbliebenen 200 µl enthaltenen Beads wurden bei 4°C
mindestens für 30 Minuten bei 16000xg pelletiert. Das Pellet wurde mit 4 µl Laemmli-Puffer [LAEMMLI,
1970] für jede in die Präparation eingegangene Oozyte resuspendiert.
Materialien & Methoden
39
2.2.2 Präparation der Totalmembranfraktion
Die aufbewahrten 1,3 ml des Überstandes (nach der allerersten Zentrifugation bei 10xg aus der
Plasmamembran-Präparation) wurden für die Analyse des zellulären Proteinanteils verwendet. Einer
dreiminütigen Zentrifugation bei 2000xg und 4°C folgte eine weitere für 30 Minuten bei 16000xg. Die
resultierenden Pellets wurden ebenfalls in je 4 µl Laemmli-Puffer pro Oozyte gelöst.
2.2.3 HEK293FT-Zellen: Transfektion und Gewinnung von Ganzzell-Lysaten
Für die Zellkultur wurde eine α2-Untereinheit der humanen Na+/K+-ATPase eingesetzt, die am
N-Terminus mit einem HA-Tag markiert war. Diese neun Aminosäure lange Sequenz “YPYDVPDYA“
wurde ebenfalls durch die rekombinante Polymerase-Kettenreaktion zwischen dem Start-Methionin und
dem offenen Leserahmen (ORF, open reading frame) eingefügt. Die beiden humanen Na+/K+-ATPase
α2- und β1-Untereinheiten wurden mit Hilfe von Lipofectamine™ 2000-Reagenzien (Invitrogen,
Carlsbad, CA) in einem Verhältnis 1:1 in HEK293FT-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden in einem
DMEM/Glutamax-Medium in 10 cm-Petrischalen unter Zusatz von 10 % fetalem Kälberserum und
10 µM Ouabain bis zu einer 70 %igen Konfluenz kultiviert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in zwei
Fraktionen unterteilt. Eine der beiden Fraktionen wurde bei einer Temperatur von 28°C und die andere
bei 37°C inkubiert. Nach weiteren 24 Stunden wurden die Zellen zweimal mit kaltem PBS gewaschen
und mit einem Zellschaber (in PBS) abgeerntet. Nach einer dreiminütigen Zentrifugation bei 2000xg
wurde der Überstand vorsichtig verworfen, das Pellet in 1 ml PBS resuspendiert und in ein
1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Das nach einer zweiten Zentrifugation erhaltene Pellet wurde mit
einem äquivalenten Volumen Lyse-Puffer (30 mM TRIS-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 % Triton X,
10 % Glyzerol, 2 mM DDT, 200 µM PMSF, inklusive Protease-Inhibitor) resuspendiert. Die
Gesamtproteinmenge in dem Ganzzell-Lysat wurde mittels eines BCA-Reagenz (Bicinchoninsäure,
bicinchoninic acid, Perbio, Bonn) spektroskopisch bestimmt. Für die anstehenden SDS-Gele wurde
jeweils eine Menge von 15 µg Gesamtprotein eingesetzt.
2.2.4 SDS-Gel-Elektrophorese und Western Blots
Die 10 %igen SDS-Gele wurden nach dem Protokoll von Maniatis gegossen, das jedoch leicht
modifiziert war [HARLOW und LANE, 1988] (Trenngel: 6,7 ml Bis-/Acrylamid (30 %), 7,9 ml H20, 5 ml TRIS
pH 8.8 (1,5 M), 0,2 ml SDS (10 %), 0,2 ml APS (10 %), 0,02 ml TEMED und Sammelgel:
1,7 ml Bis-/Acrylamid (30 %), 6,8 ml H20, 1,25 ml TRIS pH 6.8 (1 M), 0,1 ml SDS (10 %), 0,1 ml APS
(10 %), 0,01 ml TEMED). Je Konstrukt wurde eine Probenmenge äquivalent zum Proteingehalt einer
bzw. zweier Oozyten aufgetragen. Nach dem Transfer der Proteine aus dem SDS-Gel auf die
Nitrozellulose-Membran wurde diese mehrmals mit PBST (Phosphat-gepufferte Salzlösung, phosphate
Materialien & Methoden
40
buffered saline, inklusive 0,1 % Tween) gewaschen. Zur spezifischen Detektion der humanen
Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit (~100 kD) kam der polyklonale Antikörper AB9094 (Milipore, Bedford,
MA, USA) zum Einsatz [LENCESOVA et al., 2004]. Im Falle der HA-getaggten α2-Untereinheit wurde ein
monoklonaler anti-HA-Antikörper (hergestellt in Ratten) 3F10 (Roche Diagnostics, Mannheim)
verwendet. Das endogen exprimierte β-Aktin ließ sich mit einem monoklonalen anti-β-Aktin-Antikörper
(hergestellt in Mäusen) AC-15 (Sigma, Taufkirchen) detektieren. Als sekundärer Antikörper dienten
gegen Ratte bzw. Maus gerichtete Meerrettichperoxidase-Konjugate (Promega, Mannheim) durch
welche die anschließenden Chemilumineszenzreaktionen (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) zur
Detektion auf Kodak BioMax Light Filmen (Sigma Aldrich) katalysiert werden konnten.
2.3 Transportmessungen der humanen Na+/K+-ATPase
2.3.1 Vorbereitung der Oozyten
Um die intrazelluläre Natrium-Konzentration zu erhöhen, wurden die Oozyten für 60 Minuten in einer
Natrium-Ladelösung (110 mM NaCl, 2,5 mM Natrium-Citrat, 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH7,4) und
danach zur Äquilibrierung für mindestens 30 Minuten in einer Post-Ladelösung (100 mM NaCl, 1 mM
CaCl2, 5 mM BaCl2, 5 mM NiCl2, 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4) inkubiert [RAKOWSKI, 1993].
2.3.2 Rubidium-Transport-Messungen mittels Atom-Absorptions-Spektroskopie
Die in Na+-Ladelösung und anschließender Post-Ladelösung inkubierten Xenopus laevis-Oozyten
wurden für 3 Minuten in einer 1 mM bzw. 5 mM Rubidium-Lösung (1 bzw. 5 mM RbCl, 1 mM CaCl2,
5 mM BaCl2, 5 mM NiCl2, 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS) bei einer Raumtemperatur von 21 - 22°C
inkubiert. In der Rb+-Lösung waren außerdem entweder 10 µM oder 10 mM Ouabain enthalten, um die
Aktivität der endogenen Na+/K+-ATPase von der heterolog-exprimierten unterscheiden zu können.
Anschließend erfolgten drei Waschschritte mit der Post-Ladelösung (ohne Rb+) und ein Waschschritt
mit Milipore-Wasser. Jede Oozyte wurde einzeln in 1 ml Milipore-Wasser homogenisiert und für die
AAS-Messung wurden davon 20 µl Probenvolumen eingesetzt. Die über die Na+/K+-ATPase in die
Oozyte aufgenommene Rubidium-Menge wurde mit dem Atom-Absorptions-Spektrometer
AAnalyst800TM (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) bestimmt, welches mit einer Rb+-
Hohlkathodenlampe (Photron, Melbourne, Australien) und einem transversal geheizten Graphitrohr
(THGA) ausgestattet war. Das Zeit- und Temperatur-Protokoll folgte den Angaben des Herstellers
(siehe Tabelle 2.1) und die Absorption erfolgte bei einer Wellenlänge von 780 nm. Zur Berechnung der
Materialien & Methoden
41
aufgenommenen Rb+-Menge wurde jeweils vor der Messung eine Standard-Eichkurve in einem Bereich
von 0 - 50 µg/l Rb+ aufgenommen. Die noch detektierbare Rb+-Menge beträgt etwa 10 pg und wird als
charakteristische Masse bezeichnet.
Schritt Temperatur
(°C)
Anstiegszeit
(s)
Haltezeit
(s)
Acetylenverbrauch
(ml/min)
Trocknung 1
Trocknung 2
Pyrolyse
Atomisierung
Ausheizen
110
130
300-600
1700-1800
2400
1
5
10
0
1
20
30
20
5
2
250
250
250
0
250
Tabelle 2.1
Vom Hersteller empfohlenes Zeit- und Temperaturprotokoll für ein transversal geheiztes Graphitrohr.
2.4 Elektrophysiologische Messungen und Auswertung der Messdaten
2.4.1 Verwendete Lösungen und Geräte
Auch hierfür wurden die überexprimierenden Oozyten mit Natrium beladen (siehe ’Vorbereitung der
Oozyten’), um die intrazelluläre [Na+] zu erhöhen. Strommessungen wurden mit der Zwei-Elektroden-
Spannungsklemme (TEVC, two electrode voltage clamp) durchgeführt. Eine einzelne Oozyte wurde in
die Perfusionskammer überführt und konnte auf diese Weise mit verschiedenen Lösungen perfundiert
werden. Die Na+-haltige Lösung (siehe unter 2.3.1) enthielt zusätzlich entweder 10 µM oder 10 mM
Ouabain, um die endogene Na+/K+-Pumpe von der heterolog-exprimierten unterscheiden bzw. letztere
vollständig inhibieren zu können. Die K+-haltige Lösung (100 mM KCl, 5 mM BaCl2, 5 mM NiCl2, 1 mM
CaCl2, 2,5 mM TRIS, 2,5 MOPS, pH 7,4) wurde in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt: 0,2 mM,
0,5 mM, 2 mM, 5 mM und 10 mM (entsprechend mit der Na+-haltigen Lösung verdünnt).
Die Messungen wurden zum einen mit einem Flachbettschreiber BD 11 aufgezeichnet (Kipp & Zonen,
Delft, Niederlande) und zum anderen über einen Computer, an den ein Turbo Tec10CX Verstärker (NPI
Electronic GmbH, Tamm), eine Digidata 1200 Schnittstelle (Axon, Instruments Inc., Union City, CA,
USA) und die Software pClamp 9.2 (Axon, Instruments Inc., Union City, CA, USA), die zur Erzeugung
von Spannungspulsen sowie Haltepotentialen und zur Aufzeichnung der Stromsignale angeschlossen
bzw. integriert war (Abbildung 2.3). Für die Datenverarbeitung (Auswertung und Präsentation) wurden
die Programme Clampfit 9.2 Axon, Instruments Inc., Union City, CA, USA) und Origin 7.5G (OriginLab
Corporation, Northampton and Wellesley Hills, MA, USA) verwendet.
Materialien & Methoden
42
Abbildung 2.3 Schaltplan für eine Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC).
Die elektrophysiologischen Experimente wurden bei einer Raumtemperatur von 22-23°C durchgeführt.
Die Mikropipetten wurden mit einem Pipettenziehgerät PC-10 (puller, Narishige, Japan) mit
Spitzendurchmessern von etwa 20 – 30 µm gezogen und mit einer hochkonzentrierten Elektrolytlösung
(3 M KCl) befüllt. Für die Messungen wurden Ag/AgCl-Elektroden verwendet. Die Pipetten-Widerstände
lagen zwischen 0,7 - 2 MΩ.
2.4.2 Spannungsprotokoll
Es wurden lediglich Zellen gemessen, die bei einem Haltepotential von -30 mV einen Haltestrom von bis
zu -300 nA aufwiesen. Ausgehend von -30 mV wurden die Oozyten für eine Dauer von 200 ms auf
Potentiale von +60 mV bis -180 mV in 20 mV-Schritten geklemmt, wobei nach jedem Spannungssprung
wieder zum Haltepotential von -30 mV zurückgekehrt wurde.
Abbildung 2.4
Angewendetes Spannungsprotokoll. Ausgehend von einem Haltepotential von -30 mV werden die Oozyten
Spannungssprüngen in 20 mV-Schritten von positiven (+60 mV) zu negativen (-180 mV) Potentialen ausgesetzt.
200 ms
-30 mV
-180 mV
60 mV
40 mV
20 mV
0 mV
-20 mV
-40 mV
-60 mV
-80 mV
-100 mV
-120 mV
-140 mV
-160 mV
Haltepotential
Materialien & Methoden
43
2.4.3 Messung und Untersuchung der stationären und transienten Ströme
Als „stationärer Strom“ werden die K+-stimulierten Pumpströme bei einem konstanten Haltepotential (in
diesem Fall bei -30 mV) bezeichnet. Hierzu wurden Oozyten vor und nach der Perfusion mit
verschiedenen [K+] mit der oben genannten Na+-haltigen Lösung perfundiert (Abbildung 2.5). Alle
Lösungen enthielten zudem 10 µM Ouabain, um die Pumpströme der endogenen Na+/K+-ATPase zu
unterdrücken.
Abbildung 2.5
Mit verschiedenen Kalium-Konzentrationen stimulierte Pumpströme bei einem Haltepotential von -30 mV.
Bei der Ermittlung der Kalium-Affinitäten (K0.5) wurde mittels der Schreiberaufzeichnungen, falls
erforderlich, eine rundown-Korrektur durchgeführt. Die Korrektur bestand darin, die zeitliche Abnahme
der maximalen Pumpstromamplitude (bei 10 mM [K+]ext) durch eine lineare Interpolation zu
berücksichtigen.
Mit Hilfe des oben angegebenen Spannungsprotokolls kann auch die Spannungsabhängigkeit der
stationären Ströme untersucht werden. Hierfür wurden die Zellen sowohl vor und nach der Zugabe von
K+ext als auch währenddessen diesem Spannungsprotokoll ausgesetzt (Abbildung 2.6, graue
Markierung).
Abbildung 2.6
Sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Kalium wurde ein Spannungsprotokoll mit Pulsen von +60 mV bis
-180 mV (in 20 mV-Schritten) durchlaufen.
_
_
_
_
_
_
_
__
_
_
__
Materialien & Methoden
44
Um die Abhängigkeit der Pumpströme vom Membranpotential (Strom-/Spannungs-Diagramme) und von
extrazellulärem Kalium (K+ext) zu bestimmen, wurden die digital aufgezeichneten kaliumfreien Vorher-
und Nachher-Messungen gemittelt und von den kaliumhaltigen Messungen abgezogen und falls
notwendig ebenfalls rundown-korrigiert. Die Stromantworten wurden auf den Wert normiert, der in
Gegenwart von 10 mM K+ bei einer angelegten Spannung von 0 mV gemessen wurde. Die Bestimmung
der spannungsabhängigen Kalium-Affinitäten (K0.5) erfolgte unter Verwendung folgender Hill-Gleichung:
(Gleichung 2.1)
(Imax: maximaler Strom, [K+]: Kaliumkonzentration, K0.5: Konzentration der halbmaximalen Aktivität, nH: Hill-Koeffizient)
Das gleiche Spannungsprotokoll wurde auch verwendet, um transiente („vorstationäre“, pre-steady-
state) Ströme in Gegenwart von hohen [Na+]ext und in Abwesenheit von K+ext zu messen. Die
extrazelluläre Natriumlösung enthielt entweder 10 µM (zur Inhibition der endogenen Na+/K+-ATPase)
oder 10 mM Ouabain (zusätzlich zur Inhibition der heterologen Na+/K+-ATPase). Die Daten wurden
voneinander subtrahiert (10 µM-Messung – 10 mM-Messung) und die Differenzstromsignale durch eine
monoexponentielle Funktion angepasst. Hierbei wurden die ersten drei bis fünf Sekunden nicht
einbezogen, um kapazitive Artefakte weitestgehend auszuschließen. Dies wurde sowohl bei den so
genannten „on-Pulsen“ als auch „off-Pulsen“ berücksichtigt.
Abbildung 2.7
Mit dem Programm pClamp aufgezeichnete Stromantworten, die auf die entsprechenden Spannungspulse (13 Sprünge)
folgten. Die Aufnahme zeigt eine Differenzstrommessung (WT), bei der die 10 µM-Ouabain-haltige Lösung von der 10 mM-
haltigen (hohe [Na+] und K+-frei) abgezogen wurde.
H
n
K
K
I
I
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
+
=
+][
15.0
max
5004003002001000
Time (ms) Sweep:1 Visible:13 of 13
Im em b
(µA)
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
I
memb(µA)
Zeit (ms)
“”
on -Pulse
“”
off -Pulse
Materialien & Methoden
45
Aus den transienten Strömen direkt nach einem Spannungssprung („on-Pulse“) wurden die apparenten
Geschwindigkeitskonstanten bestimmt (Abbildung 2.5). Aus den transienten Strömen unmittelbar nach
Rückkehr zum Haltepotential bei -30 mV („off-Pulse“) konnten die transportierten Ladungen (Q), die
V0.5-Werte (Spannung des halbmaximalen Q-Wertes), die zq-Werte (Anteil der Ladung, die die gesamte
Membran passiert) und die Wechselzahlen (turnover number) bestimmt werden. Hierfür wurde die
transportierte Ladung Q als Zeitintegral der mittels einer monoexponentiellen Funktion angepassten
transienten Ströme bestimmt. Die Q/V-Kurven wurden mithilfe einer Boltzmann-Funktion des folgenden
Typs angepasst:
(Gleichung 2.2)
Qmax und Qmin sind die jeweiligen Sättigungswerte der verschobenen Ladung, zq ist die Äquivalentladung, F ist die Faraday-
Konstante, R ist die molare Gaskonstante, T ist die Temperatur in Kelvin, V0.5 ist die Spannung des halbmaximalen
Q-Wertes und V ist das Membranpotential.
Die Berechnung der molekularen Aktivität (Wechselzahl, turnover number) erfolgte durch Division des
stationären Stroms, der in Gegenwart von 10 mM Kalium bei einem Haltepotential von -30 mV
gemessen wurde, durch die Summe der transportierten Ladung (Qtot = Qmax - Qmin), die aus der
Anpassung der Q/V-Kurven erhalten wurde. Da pro Pumpzyklus eine Nettoladung verschoben wird,
stellt die Differenz Qmax-Qmin eine Abschätzung für die Anzahl der Na+/K+-ATPase-Moleküle dar, die den
jeweiligen Strom in der Oozyte verursachen.
2.4.4 Bestimmung der Aktivierungsenergie EA
An den Analog-Digital-Wandlereingang des Digidata 1200-Interfaces des Voltage-Clamp-Setups wurde
ein zusätzliches Präzisions-Labormessgerät (T900 series, Dostmann electronic GmbH, Wertheim)
angeschlossen, mit dessen Hilfe die jeweils herrschende Temperatur digital aufgezeichnet werden
konnte. Der Temperaturfühler wurde in der Messkammer in unmittelbarer Nähe der Oozyte platziert.
Der untersuchte Temperaturbereich lag zwischen 18 bis 34°C und aufgetragen wurde der logarithmierte
Pumpstrom (bei 10 mM [K+]ext) gegen den Reziprokwert der Temperatur 1000/T (T in Kelvin). Aus der
Steigung m der Geraden in dieser Arrhenius-Auftragung konnte die Aktivierungsenergie EA nach
EA = -m • R (R = molare Gaskonstante) bestimmt werden.
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛−
⋅
⋅
+
−
+=
)(exp1
)(
5.0
minmax
max
VV
TR
Fz
QQ
QVQ
q
46
Resultate
Resultate
47
WT IICKTRRNSVFQQGMKNKILIFGLLEETALAAFLSYCPGPMGVALRMYPLKVTWWFCAFPYSLLIFIYDEVRKLILRRYPGGWVEKETYYX 1020
del(K935-S940)insI IIC IVFQQGMKNKILIFGLLEETALAAFLSYCPGPMGVALRMYPLKVTWWFCAFPYSLLIFIYDEVRKLILRRYPGGWVEKETYYX 1015
S966X IICKTRRNSVFQQGMKNKILIFGLLEETALAAFLLLPRHGCSPPVPAQSHLVVVRLPLQPPHLHLX 997
X1021R IICKTRRNSVFQQGMKNKILIFGLLEETALAAFLSYCPGPMGVALRMYPLKVTWWFCAFPYSLLIFIYDEVRKLILRRYPGGWVEKETYYRPHWKKNQAWKDGELWRCCGDGDGEGWKX 1049
3 Resultate
Alle in der α2-Untereinheit der humanen Na+/K+-ATPase nachgewiesenen FHM- und SHM-assoziierten
Mutationen sind in hochkonservierten Regionen lokalisiert, die für jegliche PII-Typ-ATPasen (Na+/K+-,
H+/K+- und Ca2+-ATPasen) kennzeichnend sind [AXELSEN und PALMGREN, 1998]. Die in dieser Arbeit
untersuchten Mutationen wurden entsprechend ihrer Lokalisation in strukturell wichtigen Domänen der
Na+/K+-ATPase selektiert. Eine der näher betrachteten FHM2-Mutationen, T263M, befindet sich in der
Aktuator-Domäne (A) innerhalb der intrazellulären Schleife zwischen den Transmembran-Segmenten
TM2 und TM3. Zwei der Migräne-verursachenden Mutationen, T376M und R383H, sind in der
Nukleotid-Domäne (N) vorzufinden. Während T376M ein Bestandteil des SDKTGT-Motivs ist, liegt
R383H zwischen zwei β-Faltblättern in einer Scharnier-Region („hinge region“) zwischen den beiden
Domänen N und P. Von den zwischen der P-Domäne und dem transmembranären Teil des Proteins
gelegenen Mutationen wurden vier für die funktionellen Untersuchungen ausgewählt: A606T, R763H,
M829R und R834Q. Daneben wurden vier weitere Mutationen untersucht, die den extrazellulären Teil
der Na+/K+-ATPase betreffen (R908Q, P979L, del(K935-S940)insI, S966X). R908Q und P979L sind
klassische Punktmutationen. S966X hingegen stellt eine Frameshift-Mutation dar, die durch die Deletion
von zwei Basen, die Serin in Position 966 kodieren, entsteht und zu einer Verschiebung des
Leserasters führt, so dass das Protein nach weiteren 31 Aminosäuren abbricht (Abbildung 3.1). Bei
del(K935-S940)insI handelt es sich um eine Deletion von fünf Aminosäuren mit einer simultanen
Insertion einer einzelnen Aminosäure, einem Isoleucin, so dass diese beiden Sequenzänderungen zu
einem mehr oder minder verkürzten Protein führen (statt 1020 lediglich 1015 Aminosäuren). Ebenso
wurde die in der Transmembrandomäne TM4 gelegene Mutation G301R in die Struktur-Funktions-
Analyse einbezogen. Ein überaus interessanter Bereich stellt außerdem die sogenannte “Switch-
Region“ dar, in der auch der C-Terminus vorliegt. Auch hier wurden zwei FHM2-Mutationen ausgewählt,
um aufschlussreiche Informationen auf strukturelle und funktionelle Veränderungen der Na+/K+-ATPase
durch Migräne-assoziierte Mutationen zu erlangen. R937P und die das Stopp-Codon an Position 1021
betreffende Mutation mit der Bezeichnung X1021R (R = Arginin, insgesamt eine Addition von 28
zusätzlichen Aminosäuren, RPHWKKNQAWKDGELWRCCGDGDGEGWK), sind ebenfalls mit diversen
Methoden charakterisiert worden.
bp
Abbildung 3.1
Sequenzvergleich zwischen dem Wildtyp-Protein und den ATP1A2-Mutationen del(K935-S940)insI, S966X und X1021R.
Resultate
48
3.1 Kalium-induzierte Pumpströme
Etwa drei bis fünf Tage nach simultaner Injektion der α2- und β1-Untereinheit cRNAs der humanen
Na+/K+-ATPase (α2 = 25 ng, β1 = 2,5 ng) wurden die Xenopus laevis-Oozyten elektrophysiologisch
untersucht. Eine erfolgreiche Expression konnte anhand der Pumpströme mittels einer 10 mM
K+-Lösung nachgewiesen werden. Die als Wildtyp (WT) bezeichnete unveränderte Na+/K+-ATPase wies
einen durchschnittlichen stationären Strom von 184 nA auf (Abbildung 3.2). Während die Mutationen
P979L und M829R mit 67 % bzw. 73 % etwa zwei Drittel des WT-Pumpstroms erreichten, lagen sechs
Konstrukte mit 27 – 43 % unter der Hälfte des Wildtypwertes. Weitere sechs der vierzehn untersuchten
Mutationen zeigten entweder absolut keinen Pumpstrom oder weniger als 10 nA. Hierzu gehören neben
der S966X Frameshift- und del(K935-S940)insI Deletionsmutation die Konstrukte T263M, G301R,
T376M und R937P.
Abbildung 3.2
Durch Zugabe von 10 mM Kalium induzierte stationäre Pumpströme. Dargestellt sind gemittelte Werte verschiedener
ATP1A2-Konstrukte im Vergleich zum Wildtyp (WT) mit einem durchschnittlichen Pumpstrom von etwa 184 nA. Gemessen
wurden lediglich Zellen, die bei einem angelegten Haltepotential von -30 mV einen stationären Pumpstrom von mehr als
10 nA aufwiesen. Für die Auftragung der Fehlerbalken wurden die entsprechenden Standardfehler (± S.E.) verwendet. In
weißer Schrift ist die Anzahl der gemessenen Zellen pro Konstrukt unterlegt.
WT
T263M
G301R
T376M
R383H
A606T
R763H
M829R
R834Q
R908Q
R937P
S966X
del(K935-940)insI
P979L
X1021R
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
139
139
gemittelter stationärer Pumpstrom / nA
139 12 41 111 69 33 39 31 417 12
Resultate
49
3.2 Untersuchung der Rubidium-Aufnahme
Die Na+/K+-ATPase ist dazu befähigt, anstelle von K+ auch Rb+ in die Zelle zu transportieren, da beide
Ionen sehr ähnliche Radien besitzen. Nachgewiesen werden kann die Rb+-Aufnahme unter anderem
mit Hilfe der Atom-Absorptions-Spektroskopie. Diese Art der nicht-radioaktiven Analyse ist eine sehr
sensitive Methode, um selbst geringe Ionentransport-Aktivitäten messen zu können. Die Rb+-Aufnahme-
Messung an Xenopus laevis-Oozyten kann bereits am dritten Expressionstag durchgeführt werden.
Untersucht wurden neben dem Wildtyp in erster Linie die Konstrukte, die absolut keinen oder lediglich
einen sehr kleinen (< 10 nA) stationären Pumpstrom zeigten. Zusätzlich wurde das Konstrukt X1021R
mit dieser Methode näher betrachtet, da bei der Untersuchung der stationären Pumpströme (mit
10 mM K+) sehr große Schwankungen beobachtet wurden. Dabei zeigte sich, dass die funktionelle
Aktivität dieses Konstrukts von der Dauer der Expressionszeit abhängig war. Dies ließ sich anhand der
Transportmessungen mit der Atom-Absorptions-Spektroskopie nachweisen (Abbildung 3.3). Während
nach drei Tagen weniger als 50 % (~ 42 %) des Pumpstroms des Wildtyps erreicht wurde, war nach vier
Tagen bereits ¾ der Wildtyp-Aktivität (~ 75 %) zu beobachten. Bei den restlichen Konstrukten konnte
diese Abhängigkeit (Expressionszeit ↔ Expressionslevel) jedoch nicht beobachtet werden, was darauf
schließen lässt, dass Proteinexpression, -faltung und -transport zur Plasmamembran bei einer
Elongation des C-Terminus mit zeitlicher Verzögerung ablaufen.
Abbildung 3.3
Normierte Rubidium-Aufnahme vom Wildtyp und dem Konstrukt X1021R. Vergleichend dargestellt sind Messungen nach
einer Expressionszeit von drei Tagen (linkes Panel) und nach vier Tagen (Panel rechts). Die Zellen wurden in Gegenwart
von 10 µM (WT bzw. X1021R) bzw. 10 mM Ouabain (WT+Oua bzw. X1021R+Oua) gemessen.
Im Vergleich zu uninjizierten Kontrollzellen zeigten G301R, T376M und S966X keine signifikant
erhöhten Rb+-Aufnahmeraten, wohingegen T263M und R937P etwa 20 % der Rb+-Aufnahme des
Wildtyps aufwiesen, wodurch ebenfalls eine drastische Reduktion der Pump-Aktivität nachgewiesen
werden konnte (Abbildung 3.4).
WT
WT+Oua
X1021R
X1021R+Oua
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Rb+-Aufnahme
WT
WT+Oua
X1021R
X1021R+Oua
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Rb+-Aufnahme
Resultate
50
Abbildung 3.4
Ouabain-sensitive Differenzströme der Messungen in Gegenwart von 10 µM und 10 mM Ouabain. Die Messungen stammen
aus vier verschiedenen Experimenten und beinhalten etwa 14-30 Zellen pro Konstrukt. Die Daten wurden auf die
Wildtyp-Messung in Gegenwart von 10 µM Oubain normiert (Experiment 1: 49 pmol/Oozyte/min; Experiment 2:
130 pmol/Oozyte/min; Experiment 3: 38 pmol/Oozyte/min; Experiment 4: 61 pmol/Oozyte/min). k. A. = keine Angabe.
3.3 Expression der ATP1A2-Konstrukte in Xenopus laevis-Oozyten
Um die Unterschiede im Expressionsverhalten der einzelnen Konstrukte beurteilen zu können, wurden
Western Blots von Plasmamembran- und Totalmembran-Präparationen durchgeführt. Hierdurch sollten
Aussagen darüber gewonnen werden, ob die Reduktion bzw. das völlige Ausbleiben der Transport-
Aktivität darauf zurück zu führen ist, dass weniger Protein in die Plasmamembran gelangt oder ob das
Enzym in gleicher Menge wie der WT in der Membran vorliegt, aber völlig inaktiv ist. Für eine korrekte
Faltung und das daran anschließende Targeting der Na+/K+-ATPase ist die β-Untereinheit von
essentieller Bedeutung, weshalb bei der cRNA-Injektion auch stets ein exaktes Verhältnis zwischen den
beiden Untereinheiten α und β eingehalten werden muss. Grundsätzliche Information über eine intakte
α/β-Interaktion, lässt sich der Abbildung 3.5 entnehmen: Alle Konstrukte waren in der Totalmembran-
Präparation (Ganzzell-Lysate) in annähernd gleichen Mengen vertreten (Abbildung 3.5, unten). In den
Plasmamembran-Präparationen (Abbildung 3.5, oben) hingegen ließ sich erkennen, dass die beiden
Konstrukte del(K935-S940)insI und R908Q in geringer Menge und die Frameshift-Mutation S966X so
gut wie gar nicht in die Plasmamembran integriert wurden.
uninj
WT
T263M
G301R
T376M
R383H
A606T
R763H
R908Q
M829R
R834Q
R937P
S966X
del(K935-S940)insI
P979L
X1021R
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
Rubidium-Aufnahme
(normiert)
k. A.
Resultate
51
Abbildung 3.5
Repräsentativer Western Blot mit Proteinproben aus Plasmamembran- (PM) bzw. Totalmembran-Präparationen (TM). Im
linken Teil der Abbildung wurde ein Probenvolumen äquivalent zu einer Oozyte und im rechten das Äquivalent von zwei
Oozyten aufgetragen. Eingesetzt wurde ein polyklonaler Antikörper, der an die α2-spezifische HERED-Region bindet
(Aminosäureposition 491 bis 495). Dies dient der Unterscheidung von der Xenopus α1-Form.
3.4 [K+]ext- und Spannungsabhängigkeit der K+-induzierten Pumpströme
In Gegenwart von extrazellulärem K+ ist die Na+/K+-ATPase dazu fähig zwei K+-Ionen ins Zellinnere und
drei Na+-Ionen nach außen zu transportieren. Mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC)
kann unter Zugabe von Lösungen mit unterschiedlichen K+-Konzentrationen ([K+]ext = 0,2 - 10 mM)
neben der K+-Abhängigkeit der Strom-Spannungs-Kennlinien (I/V-Kurven) auch die
Spannungsabhängigkeit der Km-Werte der stationären Pumpströmen bestimmt werden. Diese
Untersuchungen konnten lediglich an Na+/K+-ATPase-exprimierenden Oozyten durchgeführt werden,
die bei einem Haltepotential von -30 mV ausreichenden Pumpstrom aufwiesen (>30 nA, Abbildung 3.2).
Die Konstrukte T263M, G301R, T376M, R937P, S966X und del(K935-S940)insI ließen sich aufgrund zu
geringer stationärer Pumpströme auf diese Weise nicht eingehender untersuchen. Die beiden
Konstrukte R763H und X1021R zeigten mit K0.5-Werten von 0,72 ± 0,05 mM bzw. 0,37 ± 0,05 mM eine
leichte bzw. drastische Erhöhung der K+-Affinität im Vergleich zum WT (0,95 ± 0,04 mM), wohingegen
die Mutation A606T mit einem K0.5-Wert von 1,42 ± 0,12 mM eine insgesamt niedrigere Affinität für K+
aufwies (Tabelle 3.1). Verglichen mit dem Wildtyp lagen die K0.5-Werte der restlichen Konstrukte im
Bereich des angegebenen Fehlers und zeigten keine signifikanten Veränderungen.
Die spannungsabhängigen Stromantworten auf die verschiedenen extrazellulären [K+] sind für alle mit
dieser Methodik analysierbaren Konstrukte in Abbildung 3.6 dargestellt. Am Beispiel des Wildtyps lässt
uninjiziert
WT
T263M
G301R
T376M
A606T
M829R
R834Q
R908Q
R937P
S966X
del(K935-S940)ins
I
98 kDa
98 kDa
uninjiziert
WT
R383H
R763H
P979L
X1021R
PM
TM
Resultate
52
sich erkennen, dass in Gegenwart von 10 mM K+ eine Sättigung einsetzt. Mit zunehmender
Hyperpolarisierung kommt es bei allen K+-Konzentrationen zur Abnahme der normierten Pumpströme.
Diese Abnahme spiegelt die Inhibition der Vorwärtsreaktion durch die spannungsabhängige
extrazelluläre Rückbindung von extrazellulären Na+-Ionen wider (Abbildung 3.6) [RAKOWSKI et al., 1997].
Unter nicht sättigenden K+-Konzentrationen (< 5 mM) deutet sich eine glockenförmige I/V-Kurve mit
einem Maximum bei etwa 20 mV an, die bei positiven Potentialen eine charakteristische Abnahme
aufweist. Dies kommt dadurch zustande, dass unter diesen Bedingungen die spannungsabhängige
K+-Bindung für den Vorwärtstransport geschwindigkeitsbegrenzend ist [LAFAIRE und SCHWARZ, 1986,
NAKAO und GADSBY, 1989, RAKOWSKI et al., 1991]. In der vergleichbaren I/V-Kurve für das Konstrukt
A606T erscheint das Maximum zu positiveren Potentialen verschoben (≥50 mV). Hier ist allerdings
generell keine Glockenform zu sehen, da das Maximum der I/V-Kurven bei den angelegten positiven
Potentialen (bis +60 mV) selbst in Gegenwart von 10 mM extrazellulärem Kalium nicht erreicht werden
konnte.
Tabelle 3.1
Mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme ermittelte K0.5-Werte für die [K+]-Abhängigkeit der stationären Pumpströme
in Gegenwart von 100 mM [Na+]ext.
In den I/V-Kurven von R763H und R834Q sind selbst bei höheren Konzentrationen (≥ 5 mM)
glockenförmige Kurven zu erkennen. Andeutungsweise ist dieses Verhalten auch bei dem Konstrukt
R383H zu beobachten. Die verbleibenden auswertbaren Konstrukte (M829R, R908Q und P979L)
zeigten in den aufgezeichneten Strom-Spannungs-Kennlinien keine nennenswerten Abweichungen
bezüglich ihrer K+-Abhängigkeit. Das Konstrukt X1021R ließ sich aufgrund von erhöhten Hintergrund-
Leitfähigkeiten der exprimierenden Oozyten und den daraus resultierenden Schwankungen der
Nullstrom-Amplituden nicht mit ausreichender Genauigkeit charakterisieren.
K0.5 (K+) [mM] Anzahl Zellen
WT 0,95 ± 0,04 41
R383H 0,98 ± 0,06 14
A606T 1,42 ± 0,12 32
R763H 0,72 ± 0,05 25
M829R 0,85 ± 0,02 16
R834Q 0,87 ± 0,06 10
R908Q 1,03 ± 0,03 10
P979L 1,06 ± 0,07 11
X1021R 0,37 ± 0,05 9
Resultate
53
-200 -150 -100 -50 0 50 100
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
normierter Pumpstrom
Potential in mV
WT
-200 -150 -100 -50 0 50 100
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
normierter Pumpstrom
Potential in mV
A606T
-200 -150 -100 -50 0 50 100
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
normierter Pumpstrom
Potential in mV
M829R
-200 -150 -100 -50 0 50 100
0. 2
0. 4
0. 6
0. 8
1. 0
1. 2
1. 4
normierter Pumpstrom
Potential in mV
R834Q
-200 -150 -100 -50 0 50 100
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
normierter Pumpstrom
Potential in mV
R908Q
-200 -150 -100 -50 0 50 100
0. 2
0. 4
0. 6
0. 8
1. 0
1. 2
1. 4
normierter Pumpstrom
Potential in mV
P979L
-200 -150 -100 -50 0 50 100
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
normierter Pumpstrom
Potential in mV
R383H
-200 -150 -100 -50 0 50 100
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
normierter Pumpstrom
Potential in mV
R763H
Abbildung 3.6
[K+]ext-abhängige Strom-Spannungs-Kennlinien der verschiedenen ATP1A2-Konstrukte und des WT-Proteins. Die Zellen
(≥ 3 pro Konstrukt, aus ≥ 3 Chargen) wurden Spannungssprüngen von +60 bis -180 mV in 20 mV-Schritten ausgesetzt.
Normiert wurde auf den Pumpstromwert, der bei einem Potential von 0 mV in Gegenwart von 10 mM K+ aufgezeichnet
wurde. Farbgebung für die unterschiedlichen [K+]-Werte: schwarz = 0,2 mM, rot = 0,5 mM, grün = 2 mM, dunkelblau = 5 mM
und cyan = 10 mM K+. Anzahl Zellen/Anzahl Charge: WT=10/6, R383H=10/3, A606T=20/10, R763H=5/3, M829R=12/5,
R834Q=6/3, R908Q=3/3, P979L=10/3.
Resultate
54
-100 -50 0 50
0
1
2
3
WT
K0.5
(
K+
)
/mM
Potential / mV
-100 -50 0 50
0
1
2
3
M829R
K0.5
(
K+
)
/mM
Potential / mV
-100 -50 0 50
0
1
2
3R908Q
K0.5
(
K+
)
/mM
Potential / mV
-100 -50 0 50
0
1
2
3R383H
K0.5
(
K+
)
/mM
Potential / mV
-100 -50 0 50
0
1
2
3A606T
K0.5
(
K+
)
/mM
Potential / mV
-100 -50 0 50
0
1
2
3
R834Q
K0.5
(
K
+
)
/mM
Potential / mV
-100 -50 0 50
0
1
2
3
R763H
K0.5
(
K+
)
/mM
Potential / mV
-100 -50 0 50
0
1
2
3P979L
K0.5
(
K+
)
/mM
Potential / mV
Die spannungsabhängigen K0.5-Werte des Wildtyps folgen einer charakteristischen parabelförmigen
Kurve mit einem Minimum von 0.86 mM bei etwa +10 mV (Abbildung 3.7). Das Minimum ist bei R383H
und A606T deutlich in Richtung positiver Potentiale verschoben und liegt etwa bei +50 mV. Eine leichte
Verringerung bzw. Erhöhung der apparenten K+-Affinität (Verschiebung der K0.5(K+)-Kurven nach oben
bzw. unten) ist bei fast allen Konstrukten zu sehen. Jedoch sind diese K0.5-Werte nicht wesentlich
größer bzw. kleiner als die für den Wildtyp ermittelten Werte. Eine signifikante Veränderung ist
allerdings im Falle der ATP1A2-Mutation R763H zu beobachten. Die K0.5-Werte fallen im Vergleich zum
Wildtyp über den gesamten untersuchten Spannungsbereich niedriger aus. Der bei einem Haltepotential
von -30 mV ermittelte K0.5-Wert von 0,72 ± 0,05 stimmt mit dieser Beobachtung sehr gut überein und ist
ein weiterer Beleg für die erkennbar erhöhte apparente K+-Affinität. Im gänzlichen Gegensatz zum WT
ist hier außerdem keine Parabelform sondern vielmehr eine lineare Abnahme von -120 mV bis zu
+60 mV erkennbar. Das Minimum ist, wie bei den Mutationen R383H und A606T, nach rechts
verschoben und liegt im positiven Spannungsbereich bei ca. +60 mV. Bei R908Q fiel auf, dass die
Spannungsabhängigkeit der K0.5-Werte deutlich schwächer ausgeprägt war als beim Wildtyp-Protein.
Abbildung 3.7
Spannungsabhängige K0.5-Werte von K+-stimulierten Pumpströmen, die aus Anpassungen einer Hill-Funktion an die in
Abbildung 3.6 dargestellten Daten bestimmt wurden. Die Wildtyp-Kurve ist in gepunkteter Form in die Diagramme der
jeweiligen ATP1A2-Mutanten eingefügt (polynomiale Anpassung). Anzahl Zellen/Anzahl Chargen: WT=10/6, R383H=10/3,
A606T=20/10, R763H=5/3, M829R=12/5, R834Q=6/3, R908Q=3/3, P979L=10/3 (± S.D.).
Resultate
55
3.5 Transiente Ströme: Kinetiken und Spannungsabhängigkeiten
Zur Untersuchung der Na+-transportierenden Schritte innerhalb des Post-Albers-Reaktionsschemas
eignen sich Messungen, die in Abwesenheit von extrazellulärem Kalium und in Gegenwart von hohen
extrazellulären Na+-Konzentrationen durchgeführt werden. Unter diesen Umständen ist die Na+/K+-
ATPase nicht in der Lage die vorwärtsgerichtete „normale“ Transportreaktion durchzuführen. Es kann
jedoch durch Anlegen von Spannungssprüngen eine vorübergehende (transiente)
Ladungsverschiebung im Natriumzweig des Reaktionszyklus’ hervorgerufen werden, die beim Verlauf
der Teilreaktionssequenz
(3Na+)E1-P ↔ E2-P • 3Na+ ↔ E2-P + 3Na+
erfolgt. Das bedeutet, es findet eine vom vorliegenden Potential abhängige extrazelluläre Na+-
Freigesetzung bzw. eine Na+-Rückbindungsreaktion statt. Spannungspulse zu positiven Potentialen
begünstigen die extrazelluläre Na+-Freisetzung, was zu positiven transienten Strömen und zur
Verschiebung des E1P-E2P-Gleichgewichts in Richtung E2P führt. Negative Potentiale hingegen fördern
die extrazelluläre Na+-Rückbindung und verursachen negative transiente Ströme: Das Gleichgewicht
wird in Richtung E1P verschoben. Spannungssprungexperimente unter solchen Na+/Na+-Austausch-
Bedingungen werden in An- und Abwesenheit von 10 mM Ouabain durchgeführt. Anhand der daraus
resultierenden Differenzströme lassen sich Aussagen über die Reaktionskinetik des elektrogenen
Na+-Transports treffen. Die Spannungsabhängigkeiten der apparenten Reaktionsgeschwindigkeits-
konstanten und der translozierten Ladung sind in den Abbildungen 3.8 und 3.9 dargestellt. Mit
zunehmender Hyperpolarisation steigen die reziproken Zeitkonstanten stetig an, während sie bei
positiven Potentialen einen limitierenden Wert von etwa 55-60 s-1 erreichen. Der Anstieg bei negativen
Potentialen ist auf die elektrogene Rückbindung extrazellulärer Natrium-Ionen zurückzuführen und das
gleich bleibende Niveau im positiven Spannungsbereich spiegelt den nicht bzw. kaum elektrogenen
Vorwärtsreaktionsschritt wider. Dieses Verhalten ließ sich bei fast allen untersuchten Konstrukten
beobachten, die auf diese Weise elektrophysiologisch charakterisiert werden konnten. Eine leichte
Erhöhung bzw. Verminderung der reziproken Zeitkonstanten konnte bei den Konstrukten R383H,
A606T, R763H, M829R, R834Q, R908Q und P979L beobachtet werden (Abbildung 3.8 A,C,E,G,J,L,N).
R383H zeigte prinzipiell etwas langsamere apparente Ratenkonstanten mit einem Sättigungswert von
etwa 250 s-1 bei Potentialen unterhalb von -120 mV. Die Konstrukte A606T und P979L zeigten bei
negativen Potentialen eine Verschiebung in Richtung positiver Potentiale, während R763H, M829R und
R834Q über den gesamten untersuchten Spannungsbereich eine Verschiebung aufwiesen (Abbildung
3.8).
Resultate
56
-200 -150 -100 -50 0 50 100
-20
-15
-10
-5
0
5
Ladung
/nC
Potential / mV
-200 -150 -100 -50 0 50 100
-10
-5
0
5
Ladung
/nC
Potential / mV
-200 -150 -100 -50 0 50 100
-30
-20
-10
0
10
Ladung
/nC
Potential / mV
-150 -100 -50 0 50
0
200
400
600
reziproke Zeitkonstante / s
-1
Potential / mV
-150 -100 -50 0 50
0
200
400
600
reziproke Zeitkonstante / s
-1
Potential / mV
-150 -100 -50 0 50
0
200
400
600
reziproke Zeitkonstante / s
-1
Potential / mV
AB
CD
-150 -100 -50 0 50
0
200
400
600
Potential / mV
reziproke Zeitkonstante / s-1
-200 -150 -100 -50 0 50 100
-20
-15
-10
-5
0
5
Ladung / nC
Potential / mV
E
G
F
H
-200 -150 -100 -50 0 50 100
-20
-15
-10
-5
0
5
Ladung / nC
Potential / mV
R834Q
M829R
A606T
R383H
-150 -100 -50 0 50
0
200
400
600
reziproke Zeitkonstante / s-1
Potential / mV
R763H
JK
-150 -100 -50 0 50
0
200
400
600
reziproke Zeitkonstante / s
-1
Potential / mV
-150 -100 -50 0 50
0
200
400
600
reziproke Zeitkonstante / s
-1
Potential / mV
-200 -150 -100 -50 0 50 100
-3
-2
-1
0
1
Ladung / nC
Potential / mV
-200 -150 -100 -50 0 50 100
-10
-5
0
5
Ladung / nC
Potential / mV
R908Q
P979L
LM
NO
Abbildung 3.8
Aus transienten Strömen bestimmte apparente Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten (links) und Q/V-Kurven (rechts)
gemessen in Abwesenheit von Kalium und in Gegenwart hoher Na+-Konzentrationen (100 mM).
Resultate
57
-450 -300 -150 0 150 300
-5
0
5
10
translozierte Ladung / nC
Potential / mV
-200 -150 -100 -50 0 50 100
-15
-10
-5
0
5
10
translozierte Ladung / nC
Potential / mV
0 102030
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
Strom / µA
Zeit/ms
+60 mV
-180 mV
0 102030
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
-180 mV
Strom / µA
Zeit/ms
+60 mV
BD
EG
C
WT
X1021R
X1021R
WT
-150 -100 -50 0 50
200
400
600
reziproke Zeitkonstante / s
-1
Potential / mV
-150 -100 -50 0 50
200
400
600
reziproke Zeitkonstante / s
-1
Potential / mV
WT
X1021R
F
ATP1A2 WT 1000-EVRKLILRRYPGGWVEKETYY*
ATP1A2 X1021R 1000-EVRKLILRRYPGGWVEKETYYRPHWKKNQAWKDGELWRCCGDGDGEGWK*
A
Abbildung 3.9
Das Konstrukt X1021R im Vergleich zum Wildtyp. (A) Sequenzen des Wildtyp-Proteins und dem um 28 Aminosäuren
elongierten C-Terminus von X1021R. (B) und (E) Repräsentative transiente Ströme aufgezeichnet an je einer einzelnen
ATP1A2 WT bzw. X1021R exprimierenden Oozyte, die Spannungssprüngen von +60 mV bis -180 mV ausgesetzt wurde.
(C) und (F) Unter hohen [Na+] und in Abwesenheit von K+ gemessene und gegen die Spannung aufgetragenen reziproken
Zeitkonstanten für WT (C) und X1021R (F). (D) und (G) Q/V-Kurven, die durch Integration der transienten Ströme
(dargestellt in (B) und (E)) ermittelt wurden. Gestrichelte Linien geben zum Vergleich den Kurvenverlauf des WT-Proteins an.
Eine interessante Ausnahme bezüglich der reziproken Zeitkonstanten stellte das Konstrukt X1021R dar,
welches einen um 28 Aminosäuren verlängerten C-Terminus aufweist. Im drastischen Gegensatz zum
Wildtyp zeigte sich hier mit zunehmender Depolarisierung ein Anstieg der reziproken Zeitkonstanten.
Während beim Wildtyp die niedrigsten apparenten Ratenkonstanten bei positiven Potentialen erreicht
wurden, wies X1021R bei stark hyperpolarisierenden Potentialen die niedrigsten Geschwindigkeits-
Konstanten auf. Bei negativen Potentialen unterhalb von -100 mV erreichten die Zeitkonstanten einen
limitierenden Wert von ~ 200 s-1 (Abbildung 3.9). Dieses Verhalten deutet darauf hin, dass einer der
Reaktionsschritte in der Vorwärtsrichtung des Natrium-Transportzweiges elektrogen sein könnte.
Durch Integration der transienten Ströme kann die während des Transportvorgangs auftretende
Ladungsverschiebung errechnet werden. Die Auftragung der infolge eines Spannungssprungs über die
Membran verschobenen Ladung gegen das angelegte Membranpotential ergibt sogenannte
Q/V-Kurven, die die Spannungsabhängigkeit der translozierten Ladung widerspiegeln. Diese Kurven
folgen dem Verlauf einer Boltzmann-Funktion (siehe Material & Methoden, Gleichung 2.2). In Q/V-
Resultate
58
Kurven nähern sich die Zahlenwerte sowohl bei positiven als auch bei negativen Potentialen einem
Sättigungswert. Dies ergibt sich daraus, dass durch die begrenzte Anzahl der Na+/K+-ATPase-Moleküle
in der Membran schließlich alle Moleküle entsprechend des gegenwärtigen Membranpotentials
entweder vollständig im E1- oder E2-Zustand vorliegen (E1 : bei negativen Potentialen, E2 : bei positiven
Potentialen). Die Messung transienter Ströme erfolgte bei Spannungssprüngen von -180 mV bis
+60 mV, wohingegen für die Extrapolation der Q/V-Kurven in der Anpassung an die Boltzmann-Funktion
ein Potentialbereich von -200 mV bis +100 mV ausgewählt wurde.
Die Q/V-Kurven der drei ATP1A2-Mutationen R383H, A606T und R834Q waren zu depolarisierenden
Potentialen verschoben und deuteten somit auf eine erhöhte apparente Affinität für extrazelluläre
Natrium-Ionen an (Abbildung 3.8 B,D,K). Unter hohen extrazellulären Na+-Konzentrationen erfolgt bei
diesen Konstrukten die extrazelluläre Na+-Freisetzung offenbar weniger effizient. Eine zu
hyperpolarisierenden Potentialen verschobene Q/V-Kurve war lediglich bei einem einzigen Konstrukt,
der M829R-Mutante, zu beobachten, was im Gegenteil auf eine reduzierte apparente Na+-Affinität
hindeutet (Abbildung 3.8 H).
Insgesamt war die höchste Verschiebung der Q/V-Kurve zu positiven Potentialen bei A606T mit einem
V0.5-Wert von 43,2 ± 8,6 mV zu beobachten (Tabelle 3.2), was im Vergleich zum Wildtyp einer Differenz
von etwa 39 mV entspricht. Dieser als „halbmaximaler Spannungswert“ bezeichnete Parameter V0.5 ist
der Spannungswert, bei dem die Hälfte alle in der Membran vorliegenden Na+/K+-ATPase-Moleküle im
E1- bzw. E2-Zustand anzutreffen sind. Besonders auffällig bei diesem Konstrukt war auch die Tatsache,
dass selbst bei +100 mV noch keine Sättigung der Ladungswerte erkennbar war. Noch ausgeprägter
waren die Veränderungen der I/V-Kurve bei der Mutation X1021R. Über den gesamten untersuchten
Spannungsbereich hinweg war der Q/V-Kurvenverlauf der X1021R-exprimierenden Zellen linear. Beim
Versuch der Extrapolation der Boltzmann-Funktion über einen erweiterten Spannungsbereich von
-500 mV bis +300 mV wird die drastische Verringerung der Spannungsabhängigkeit der
Na+-Translokation im Vergleich zum Wildtyp-Protein deutlich (Abbildung 3.9 G).
3.6 Wechselzahlen
Weitere Parameter, die unter Na+/Na+-Austausch-Bedingungen mit elektrophysiologischen Methoden
ermittelt werden können, sind die Turnover-Zahl und der Steigungsfaktor zq der Q/V-Kurven, der die
verschobene Ladung während eines Elementarereignisses darstellt. Der zq-Wert liegt nach einer
Veröffentlichung im Jahre 1994 von Holmgren und Rakowski bei ~ 0,8, was den Transfer einer
Elementarladung über 80 % des Membranpotentials indiziert [HOLMGREN und RAKOWSKI, 1994]. Die
Resultate
59
Mutante X1021R wies jedoch einen stark reduzierten zq-Wert von 0,29 ± 0,03 s-1, was vermutlich sogar
eher der oberen Grenze entspricht. Auch die berechneten Turnover-Werte für dieses Konstrukt sind im
Vergleich zum Wildtyp (12,8 ± 3,0 s-1) relativ gering mit 3,5 ± 1,2 s-1. Das dürfte wahrscheinlich
ebenfalls eine Obergrenze darstellen, da bei einer Ausweitung des Spannungsbereichs die lineare
Entwicklung der Q/V-Kurve noch kleinere Werte liefern würde. Die ATP1A2-Mutanten R383H, R763H
und R834Q zeigten ebenso signifikant reduzierte Turnover-Zahlen (p > 0.005), jedoch nicht in einem
solchen Ausmaß wie X1021R (Tabelle 3.2). A606T weist mit einem Wert von 8,9 ± 2,5 eine relativ
geringfügige Reduktion der Transportkapazität auf.
V0.5
mV zq Turnover
s-1 n
WT 4,3 ± 3,5 0,82 ± 0,03 12,8 ± 3,0 18
T263M nicht bestimmbar -
T376M nicht bestimmbar -
R383H 30,4 ± 6,4 0,80 ± 0,07 6,1 ± 1,2 12
A606T 43,2 ± 8,6 0,85 ± 0,07 8,9 ± 2,5 15
R763H 6,2 ± 6,9 0,81 ± 0,02 4,2 ± 1,8 18
M829R -12,0 ± 6,4 0,77 ± 0,04 11,6 ± 3,7 15
R834Q 25,6 ± 8,6 0,93 ± 0,20 3,6 ± 1,0 6
R908Q 11,7 ± 9,3 0,79 ± 0,08 13,0 ± 4,7 8
R937P nicht bestimmbar -
P979L 4,0 ± 7,1 0,79 ± 0,04 18,6 ± 5,4 21
S966X nicht bestimmbar -
del(K935-S940)insI nicht bestimmbar -
X1021R 30 ± 20 0,29 ± 0,03 3,5 ± 1,2 11
Tabelle 3.2
Aus transienten Strömen unter Na+/Na+-Austausch-Bedingungen ermittelte Eigenschaften der ATP1A2-Mutanten. Aufgelistet
sind der Spannungswert für die halbmaximale Ladungsverschiebung V0.5, die Äquivalentladungen und die Turnover-Zahlen,
die in Spannungssprungexperimenten unter hohen Na+-Konzentrationen und K+-freien Bedingungen für messbare
Konstrukte bestimmt wurden.
Resultate
60
3.7 Proteinstabilität
Insgesamt zeigten zwei ATP1A2-Mutanten, die mit den verwendeten Methoden eingehend untersucht
werden konnten, trotz der eindeutigen humangenetischen Klassifikation als FHM2/SHM-Mutationen
keine funktionellen Veränderungen. Hierzu gehören die Konstrukte R908Q und P979L.
Der Austausch von Arginin zu Glutamat an Position 908 führt zu einer auffällig verminderten
Proteinexpression in der Plasmamembran (Abbildung 3.5), was auch der Grund dafür sein könnte,
weshalb diese SHM-Mutation im Mittel geringere stationäre Pumpströme aufweist, obwohl weder
Turnover-Zahl noch V0.5, und auch keine Veränderungen der Q/V-Kurve beobachtet werden konnten.
Gleichermaßen waren die reziproken Zeitkonstanten identisch im Vergleich zu den Konstanten des
Wildtyps. Die R908Q-Punktmutation befindet sich in der Schleife zwischen den beiden
Transmembrandomänen TM8 und TM9 und ruft offenbar eine Beeinträchtigung im Targeting bzw. in der
Integration in die Plasmamembran oder in der mittleren Verweildauer des Proteins in der
Plasmamembran hervor, wobei die Proteinmenge in Ganzzell-Lysaten gegenüber dem WT-Protein nicht
verringert war (Abbildung 3.5). Auf eine verringerte Plasmamembran-Expression lässt sich auch
unabhängig von den Western Blots schließen. Die Ladungswerte (Qmax – Qmin) des Wildtyp-Proteins
lagen im Durchschnitt bei ~19 nC, während R908Q einen durchschnittlichen Wert von 4.35 nC aufwies.
Die P979L-Mutante hingegen zeigte mit allen verwendeten Methoden zur Charakterisierung der
Funktionalität in keiner Weise eine nennenswerte Abweichung der Enzymeigenschaften im Vergleich
zur unmutierten Na+/K+-ATPase. Da in Oozyten-Experimenten, die bei einer Raumtemperatur von etwa
20-22°C durchgeführt wurden, absolut keine funktionellen Veränderungen zu erkennen waren, sind die
Untersuchungen auf höhere Temperaturen ausgedehnt worden. Hierbei wurde die Möglichkeit in
Betracht gezogen, dass bei verschiedenen Temperaturen unterschiedliche Schritte im Reaktionszyklus
temperaturabhängig werden, so dass dadurch Unterschiede in der Temperaturabhängigkeit der
Turnover-Rate verursacht werden könnten. Die Pumpströme des Konstrukts P979L und des Wildtyps
wurden in einem Temperaturbereich von 18 bis 34°C untersucht und jeweils in Form einer Arrhenius-
Auftragung dargestellt (Abbildung 3.10). Die Analyse ergab, dass die Pumpströme beider Konstrukte
identische Aktivierungsenergien (EA) besitzen. In einem Temperaturbereich von 18-26°C weisen der
WT eine Aktivierungsenergie von 132 ± 14 kJ/mol und P979L eine EA von 124 ± 6 kJ/mol auf. Bei
Temperaturen zwischen 26 - 34°C zeigten die beiden Enzyme ebenfalls keinen signifikanten
Unterschied bezüglich ihrer Aktivierungsenergien: 87 ± 15 kJ/mol (WT) versus 80 ± 2 (P979L). Die
Unterteilung in zwei Temperaturbereiche bzw. das Auftreten solcher „Knickstellen“ in Arrhenius-
Diagrammen ist gemäß früherer Publikationen charakteristisch für natürliche Membransysteme und
resultiert aus der Gegebenheit, dass es in der Lipid-haltigen Zellmembran zu Phasenübergängen
zwischen einer flüssig-kristallinen und einer Gelphase kommt [FRIEDRICH et al., 1996].
Resultate
61
Abbildung 3.10
Repräsentative Arrhenius-Diagramme für das WT-Protein und die ATP1A2-Mutante P979L. Entsprechend exprimierende
Xenopus laevis-Zellen wurden bei verschiedenen Temperaturen (18-34°C) untersucht. Die Aktivierungsenergien wurden
durch lineare Anpassungen ermittelt.
Des Weiteren wurden Experimente mit Säugerzellen der Zelllinie „HEK293FT“ anstelle des
Expressionssystems „Oozyte“ durchgeführt. Dies war erforderlich, um die Auswirkungen der
physiologischen Körpertemperatur von 37°C untersuchen zu können. In diesem Zusammenhang wurde
vermutet, dass faltungsbedingt eine temperaturabhängige Proteindegradierung auftreten könnte.
HEK293FT-Zellen, die bei zwei verschiedenen Temperaturen (28°C und 37°C) kultiviert wurden,
zeigten in Western Blots von Ganzzell-Lysaten tatsächlich unterschiedliche Bandenintensitäten
(Abbildung 3.11). Während die Proteinmenge des Konstrukts P979L bei einer Kultivierungstemperatur
von 28°C identisch zur WT-Proteinexpression war, zeigte sie bei 37°C eine schwächere Bande. Die
Ergebnisse von insgesamt fünf unabhängigen Experimenten ließen sehr deutlich erkennen, dass die
Proteinmenge der ATP1A2-Mutante P979L bei einer Temperatur von 37°C im Vergleich zum Wildtyp
stets bedeutend geringer ausfiel. Ein repräsentativer Western Blot ist in Abbildung 3.11 dargestellt. Als
Kontrolle diente einerseits das WT-ähnlich exprimierende ATP1A2-Konstrukt I883L (ein sich nicht
pathologisch auswirkender Polymorphismus), und das β-Aktin, ein endogen zytosolisch exprimiertes
Strukturprotein, welches als Ladekontrolle für die aufgetragene Gesamtproteinmenge fungierte.
3.25 3.30 3.35 3.40 3.45
0.1
1
10
log10(normierter Strom)
1000 / T (K-1)
WT
3.25 3.30 3.35 3.40 3.45
0.1
1
10
log10(normierter Strom)
1000 / T (K-1)
P979L
Resultate
62
MOCK
WT
P979L
I838L
MOCK
WT
P979L
I838L
28°C 37°C
a2-Untereinheit
b-Aktin
Abbildung 3.11
Repräsentativer Western Blot mit Proben aus Ganzzell-Lysaten (je 15 µg Protein), die aus transient transfizierten
HEK293FT-Zellen stammen und bei Temperaturen von 28°C bzw. 37°C kultiviert wurden. Untersucht wurden mit Wasser
(= MOCK), mit WT, P979L und I883L transfizierte Zellen. Die β-Aktin-Bande diente als Kontrolle der äquivalenten Beladung
der Geltaschen. I883L ist ein nicht Krankheit verursachender Polymorphismus, der ebenfalls zur internen Kontrolle
aufgetragen wurde.
Es ist weitestgehend bekannt, dass in sämtlichen Expressionssystemen die α-Untereinheit der Na+/K+-
ATPase das Endoplasmatische Retikulum nicht ohne die Assemblierung mit der β-Untereinheit
verlassen kann [NOGUCHI et al., 1987]. Die Degradierung hingegen geschieht bei diesen beiden Na+/K+-
ATPase-Untereinheiten separat: Die β-Untereinheit wird schneller abgebaut als die α-Untereinheit
[YOSHIMURA et al., 2008]. Auch wenn die molekulare Natur der Faktoren, die die Degradierung von nicht
intakten Proteinen vermitteln, im Falle der oligomeren Membranproteine nicht vollständig verstanden ist,
wird davon ausgegangen, dass der Abbau sowohl auf proteasomalem/lysosomalen als auch über den
endozytotischen Weg stattfindet. Der proteasomale bzw. lysosomale Abbau ist eine Degradierungsform,
der über mehrere Schritte verläuft und mit Anhängen des als Signalsequenz dienenden 8,5 kDa
schweren Proteins Ubiquitin initiiert wird. Je nach Anzahl der angehängten Ubiquitinmoleküle wird
zwischen verschiedenen Ubiquitinierungsarten unterschieden: Mono-, Oligo-, Multi- und Poly-
Ubiquitinierung [MUKHOPADHYAY und RIEZMAN, 2007]. Abhängig davon, über welches Lysin die Moleküle
verknüpft sind, wird der Zielort festgelegt. Bei der Verkettung über das Lysin 48 wird das ubiquitinierte
Protein zum Proteasom und bei der Verkettung über das Lysin 63 zum Lysosom transportiert [HERSHKO
und CIECHANOVER, 1992, BARRIERE er al, 2007]. Die beiden Abbauwege können mit entsprechenden
Inhibitoren untersucht werden. Während der lysosomale Abbau über Inhibitoren wie beispielsweise
Resultate
63
28 °C
37 °C
37 °C + Lactacysti
n
mock
WT
P979L
I883L
Chloroquin und Ammoniumchlorid gehemmt werden kann, sind MG-132 und Lactacystin zwei Beispiele
als Inhibitoren für das Proteasom.
In der vorliegenden Arbeit kamen sowohl MG-132 als auch Lactacystin zum Einsatz. Leider ließen sich
Xenopus laevis-Oozyten nicht über einen längeren Zeitraum bei Temperaturen um 37°C lagern, so
dass bei diesem Expressionssystem keine temperaturabhängige Degradierung der Na+/K+-ATPase
untersucht werden konnte. In HEK293FT-Zellen führte die Zugabe von MG-132 und Lactacystin zu
keiner erhöhten Anreicherung des mutierten Proteins (Abbildung 3.12). Daher scheint der proteasomale
Abbauweg unwahrscheinlich zu sein, so dass für künftige Experimente andere Möglichkeiten, wie
beispielsweise die lysosomale und die endozytotische Inhibition, noch offen bleiben.
Abbildung 3.12
Western Blots vorläufiger Untersuchungen der proteasomalen Inhibition mittels Lactacystin. HEK293FT-Zellen, die mit dem
Konstrukt P979L transfiziert wurden, zeigten bei Temperaturen von 28 °C keine Degradierung, während das bei 37 °C
inkubierte Protein eine schwächere Bandenintensität aufwies. Diese jedoch ließ sich nach der dreistündigen Behandlung mit
Lactacystin (10 µM) keine Anreicherung des mutierten Proteins erkennen. Aufgetragen wurden je 15 µg Gesamtprotein
(quantitative Bestimmung nach Bradford). I883L wurde als nicht krankheitsverursachende FHM2-Mutation zur internen
Kontrolle eingesetzt. Verwendete Antikörper: anti-HA (monoklonal, Klon 3F10) als Erst-Antikörper, anti-Ratte (Peroxidase-
konjugiert) als zweiter Antikörper.
64
Diskussion
Diskussion
65
4 Diskussion
Seit der Entdeckung und Veröffentlichung der ersten Mutationen im Gen ATP1A2 hat die Na+/K+-
ATPase aus humangenetischer Sicht ein verstärktes Interesse an ihrer Erforschung erlangt. Die mit
Familiärer Hemiplegischer Migräne des Typs 2 assoziierten Mutationen sind in unterschiedlichen
Domänen der humanen Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit lokalisiert. Im Rahmen der Struktur-Funktions-
Untersuchungen wurden insgesamt 14 ATP1A2-Mutationen aus diversen Regionen des Enzyms
ausgewählt. Die Selektion konzentrierte sich dabei auf Mutationen in hochkonservierten Kernregionen,
die für alle P-Typ-ATPasen charakteristisch sind bzw. in allen PII-Typ-ATPasen vorkommen (Na+/K+-,
H+/K+-, Ca2+-ATPase).
A-DOMÄNE: Bislang sind in der Aktuator-Domäne nicht viele FHM2-Mutationen bekannt geworden.
T263M beispielsweise ist in der intrazellulären L2/3-Schleife lokalisiert. Diese Region ist deswegen
interessant, weil sich die Positionierung der A-Domänenschleife auf die ATPase-Aktivität auswirkt. Die
L2/3-Schleife bildet mit dem N-Terminus eine regulatorische Einheit, die wiederum mit der L4/5-Schleife
interagiert [SEGALL et al., 2002].
N-DOMÄNE: Eine direkt an der Scharnierstelle zwischen der N- und P-Domäne lokalisierte Mutation
ist R383H. Neben der Tatsache, dass diese Mutation eine Art “Gelenkstück“ zwischen diesen beiden
Domänen bildet, liegt sie zudem nur neun Aminosäuren von der Phosphorylierungsstelle D374 entfernt.
Hier ist es überaus aufschlussreich, inwieweit sich der Aminosäureaustausch auf die Dynamik von
Konformationsänderungen auswirkt.
P-DOMÄNE: Die FHM2-Mutation T376M betrifft das Threonin im DKTG-Motiv und ist lediglich zwei
Aminosäuren vom Aspartat (D374) entfernt, das während der ATP-Hydrolyse phosphoryliert wird. Da es
sehr wahrscheinlich ist, dass Mutationen in diesem hochkonservierten Motiv die enzymatische Funktion
beeinflussen, ist es von fundamentaler Bedeutung, die strukturellen und funktionellen Auswirkungen des
Aminosäureaustauschs (Threonin→Methionin) an dieser Position zu untersuchen.
TRANSMEMBRAN-REGION: G301R befindet sich im Transmembran-Segment TM3. Der Austausch von
einem Glycin gegen ein Arginin könnte aufgrund der langen Seitenkette des Arginins sterische
Probleme hervorrufen. Die Position der Mutante G301R ist hinsichtlich ihrer regionalen Lokalisation
zunächst unauffällig. Phänotypisch hingegen stellt diese Mutation eine besonders schwere Form der
FHM2-Erkrankung dar. Neben der hemiplegischen Migräne kommt es außerdem zu starken
Diskussion
66
sensorischen Defiziten und transienten oder permanenten zerebellären Anzeichen, wie Ataxie
(Störungen der Bewegungskoordination), Nystagmus (Augenzittern) und Dysarthrie (Sprechstörungen).
ÜBERGANGSREGION TRANSMEMBRAN-BEREICH UND P-DOMÄNE: Die Mehrheit der näher betrachteten
FHM2- und SHM-Mutationen liegt in dieser Region. Insgesamt sind hier vier Mutationen ausgewählt
worden, die einer funktionellen Charakterisierung unterzogen wurden: A606T, R763H, M829R und
R834Q. R763 liegt unmittelbar benachbart zur Aminosäure L764, die bei einer Mutation zu Prolin zu
einem völlig inaktiven Protein führt [KOENDERINK et al., 2005]. M829R und R834Q sind die einzigen
FHM2-Mutationen, die in der intrazellulären Schleife L6/7 zwischen den Transmembrandomänen TM6
und TM7 lokalisiert sind. Diese Schleife ist während der Bindung der Kationen maßgeblich an der
Konformationsänderung des TM6-Segments beteiligt. A606 wird ebenfalls eine essentielle Funktion in
der Stabilisierung der P-Domäne mit der L6/7-Scheife zugeschrieben.
EXTRAZELLULÄRER BEREICH: Bisher ist nur eine kleine Anzahl an Mutationen im extrazellulären
Bereich bekannt. Hier sind aus zwei unterschiedlichen Schleifen drei Mutationen untersucht worden:
R908Q (SHM) in L7/8, P979L (FHM) und S966X (FHM) in L9/10. R908Q ist eine in der extrazellulären
Schleife zwischen TM7 und TM8 lokalisierte Mutation. Diese Schleife ist von essentieller Bedeutung für
die Interaktion der α- und β-Untereinheit. Im Falle der S966X-Mutation handelt es sich um eine
Frameshift-Mutation, die aufgrund eines frühzeitigen Stopp-Codons anstelle der aus den üblichen
1020 Aminosäuren aufgebauten zu einem lediglich aus 997 Aminosäuren bestehenden Enzym führt.
Daher stellt sich die Frage, wie sich in diesem Fall die veränderte Aminosäuresequenz auf die
nachfolgenden Transmembrandomänen auswirkt. P979L ist eine zu Beginn des TM10-Segments
extrazellulär gelegene Mutation, die relativ nahe am C-Terminus lokalisiert ist und einen Einfluss auf die
Proteinstruktur mit möglichen funktionellen Konsequenzen haben könnte.
SWITCH-REGION UND C-TERMINUS: Bei den drei zytoplasmatisch positionierten Mutationen in der
sogenannten Switch-Region bzw. am äußersten Ende des C-Terminus handelt es sich einerseits um
eine typische Punktmutation (R937P), des Weiteren um eine Deletion (Deletion von fünf Aminosäuren)
mit simultaner Insertion einer einzelnen Aminosäure (Δ(K935-S940)insI, insgesamt 1015 AS) und
außerdem um eine Mutation, die für die Addition 28 zusätzlicher Aminosäuren am C-terminalen Ende
des Proteins verantwortlich ist (X1021R). Im Falle dieser drei Mutationen sind strukturelle
Veränderungen und somit auch funktionelle Abweichungen zu erwarten. Der Austausch des Arginins
gegen ein Prolin (R937P), einem potentiellen Helixbrecher, lässt vermuten, dass eine Störung der
ATPase-Sekundär- und Tertiär-Struktur auftritt. Außerdem ist zu erwarten, dass die amino-
aromatischen Wechselwirkungen zu den Tyrosinen am C-Terminus beeinträchtigt werden.
Diskussion
67
Diese mit besonderem Augenmerk ausgewählten ATP1A2-Mutanten wurden mit Hilfe von
elektrophysiologischen, spektroskopischen und biochemischen Methoden eingehend auf ihre
Funktionalität untersucht. Vorweg lassen sich die Auswirkungen der Mutationen anhand der Resultate
zahlreicher Untersuchungen in zwei Gruppen zusammenfassen. Zur ersten Gruppe gehören
Mutationen, die entweder eine verschwindend geringe katalytische Aktivität oder sogar den
vollständigen Verlust jeglicher Funktion aufwiesen, aber auch die, die einen beeinträchtigten Transport
zur Plasmamembran zeigten. Als Diskussionsgrundlage wird für diese Gruppe von Mutationen ihre
strukturelle Bedeutung mit Hilfe von Grafikprogrammen zur Darstellung von Makromolekülen betrachtet
und hinsichtlich ihrer mutmaßlichen Auswirkungen erörtert. Der zweiten Gruppe werden Mutationen
zugeordnet, die mit den angewendeten Methoden als leicht bis relativ stark in ihrer Funktionalität
beeinträchtigt oder verändert beurteilt wurden. Zu diesen Aberrationen gehören Veränderungen in
apparenten Affinitäten für die transportierten Kationen (Rb+, Na+, K+) und Abweichungen hinsichtlich
ihrer Kinetik und Spannungsabhängigkeit. In diesem Fall ist eine detaillierte Diskussion bezüglich
Struktur-Funktions-Beziehungen durchführbar.
4.1 Auswirkung auf die katalytische Aktivität und die Plasmamembran-Expression
Verschwindend geringen bzw. keinen stationären Pumpstrom zeigten die Mutationen T263M, G301R,
T376M, Δ(K935-S940)insI, R937P und S966X, und auch in Experimenten zur Untersuchung der
Rubidiumaufnahme wiesen sie teilweise eine ausgeprägt reduzierte Pumpaktivität auf. Im Falle der
Mutanten T263M, G301R, T376M und R937P war die Menge an Total- und Plasmamembranprotein
gegenüber dem Wildtyp unverändert, so dass hier der beobachtete Funktionsverlust mit größter
Wahrscheinlichkeit auf einen stark reduzierten oder gar völlig aufgehobenen katalytischen Umsatz bei
unbeeinträchtigter Proteinfaltung und Plasmamembran-Expression zurückzuführen ist (siehe 4.1.1).
Sowohl die beiden verbleibenden Mutationen, die Deletions- und Frameshift-Mutante, als auch R908Q
hatten hingegen eine beeinträchtige Plasmamembran-Expression. Bei Δ(K935-S940)insI und S966X
sind diese Effekte sehr wahrscheinlich durch die verkürzte bzw. stark veränderte Sequenz bedingt.
Untersuchungen der durch diese beiden Mutationen bewirkten Aminosäuresequenzen mit Hilfe des
Transmembran-Vorhersageprogramms TMMOD zeigten, dass bei S966X die zehnte Transmembran-
Domäne vollständig fehlt (Abbildung 4.1). Durch das Wegfallen von zwei Basen des Serin kodierenden
Tripletts an Position 966 kommt es zu folgender Aminosäuresequenz:
LLPRHGCSPPVPAQSHLVVVRLPLQPPHLHL. Die hier vorkommenden sieben Proline haben
erheblichen Einfluss auf die Proteinfaltung, da es durch das Vorhandensein der cis-Amidbindung zu
Diskussion
68
Unterbrechungen der lokalen Sekundärstruktur (α-Helices und β-Faltblätter) kommt. Die zentrale
Bedeutung des C-Terminus wird im Zusammenhang mit der Mutante X1021R eingehend diskutiert.
Abbildung 4.1
Mit Hilfe von im Internet verfügbarer Software (TMMOD: Hidden Markov Model for Transmembrane Protein Topology
Prediction http://liao.cis.udel.edu/website/servers/TMMOD/scripts/frame.php?p=submit) erstellte Vorhersagen über
transmembranäre Helices (rot) und ihre Topologie. In blau dargestellt ist der intrazelluläre und in grün der extrazelluläre
Bereich. Untersucht wurden der Wildtyp und die Mutanten Δ(K935-S940)insI und S966X.
Auch bei der Mutanten Δ(K935-S940)insI kann in der Vorhersage beobachtet werden, dass die
bereits recht kurze intrazelluläre Schleife zwischen TM8 und TM9 noch kürzer wird (Abbildung 4.1). Das
Fehlen der sechs Aminosäuren KTRRNS scheint einen gewichtigen Einfluss auf die korrekte
Proteinfaltung und die Plasmamembran-Expression und wahrscheinlich ebenso auf die katalytische
Aktivität zu haben. Da in dieser Region auch die FHM-Mutation R937P (KTRRNS) gelegen ist, wird auf
die Bedeutung von diesem Sequenzabschnitt in einem späteren Teil der Diskussion näher
eingegangen.
R908Q hingegen zeigte in den untersuchten Plasmamembran-Präparationen zwar ebenfalls keine
WT-äquivalente Proteinmenge, doch konnten außer den reduzierten Pumpströmen keine weiteren
Veränderungen der funktionellen Eigenschaften beobachtet werden. Demnach ist das fehlerhafte
Plasmamembran-Targeting sehr wahrscheinlich der Grund für die verminderte Ionentransport-Aktivität.
Das Arginin in Position 908 befindet sich in der extrazellulären Schleife zwischen den beiden
WT
ΔK935-S940ins
I
S966X
III III IV VVI VII VIII IX X
I II III IV VVI VII IX X
I II III IV VVI VII IX
VIII
VIII
Diskussion
69
Transmembrandomänen TM7 und TM8, welche sich lediglich acht Aminosäuren entfernt von dem hoch
konservierten 898SYGQ901-Motiv befindet (Positionen entsprechen der humanen α2-Isoform,
Abbildung 4.2). Wie bereits eingangs erwähnt, ist dieses Motiv für die einwandfreie Faltung der
α-Untereinheit und die effiziente α/β-Interaktion notwendig. In einer Studie von Béguin und Kollegen
wurde beschrieben, dass dieses Motiv zwar wichtig aber nicht alleinig ausreichend für das korrekte
Aneinanderfügen der beiden Untereinheiten ist [BÉGUIN et al., 2000]. Möglicherweise dient das SYGQ-
Motiv als primäre Interaktionsstelle für die β-Untereinheit und gewährleistet das Eintreten von
nachfolgenden sekundären Interaktionsabläufen.
Abbildung 4.2
Schematische Darstellung (oben) und Sequenz-Vergleich (unten) der Region TM7/TM8 der humanen Na+/K+-ATPase
α2-Untereinheit. In diesem Bereich befindet sich sowohl das SYGQ-Motiv als auch dieses umgebend weitere Aminosäuren,
die ebenfalls unmittelbar an der Bindung der β- an die α-Untereinheit beteiligt sind. Grün abgesetzt ist die Sequenz, welche
sich stabilisierend auf die α-Untereinheit auswirkt. In rot dargestellte Aminosäuren sind an darauf folgenden
Faltungsprozessen beteiligt. Die untersuchte Mutation R908Q befindet sich genau in dieser bedeutsamen Region.
Eine wichtige funktionelle Bedeutung wird der Verbindungsschleife zwischen den Transmembran-
Domänen TM7 und TM8 zugeschrieben: hierbei handelt es sich um einen Abschnitt von etwas mehr als
20 Aminosäuren. Es wird vorgeschlagen, dass die Assemblierung der β-Untereinheit an einen
Teilbereich von insgesamt neun Aminosäuren (α2: D897-Y905, Abbildung 4.2, grüne Banden) bereits
während der Proteinsynthese wichtig für die Stabilisierung der α-Untereinheit ist. Die um wenige
Aminosäuren längere Sequenz (α2 D888-R908 in Abbildung 4.2, rote Banden) ist an weiteren
SY
GQ
extrazellulär
intrazellulär
TM7 TM8
908
901
898
888
α
2
DDRT
M
N
D
LED
E
W
T
YE
Q
Diskussion
70
Faltungsereignissen beteiligt, die erst nach der Interaktion mit der β-Untereinheit stattfinden. Solche
sekundären intramolekularen Interaktionen könnten (a) die korrekte Verpackung der C-terminalen
Membrandomäne und (b) eventuell auch deren Integration in die Lipiddoppelschicht sein [BÉGUIN et al.,
2000]. Wie bereits erwähnt, wird dieser vormals eingehend unter Punkt 4.4 beschriebenen C-terminalen
Membrandomäne eine zentrale Rolle beim Ionentransport zugeschrieben.
Interessanterweise wurde von Béguin und Kollegen dem in Abbildung 4.2 dargestellten
hochkonservierten Sequenzabschnitt die Funktion eines Degradierungssignals zugesprochen, das von
der luminalen Seite im Endoplasmatischen Retikulum erkannt wird [BÉGUIN et al., 2000]. Das bedeutet,
dass die Sequenz unmittelbar nach Anlagerung der β-Untereinheit an die extrazelluläre Schleife L7/8
„verdeckt“ wird und so die α-Untereinheit vor einer vorzeitigen Degradierung schützt. Die Anwesenheit
der Mutation R908Q in diesem Sequenzbereich rechtfertigt die Annahme, dass der Austausch des
basischen Arginins durch ein saures Glutamin in dieser hochkonservierten Region zu einem verfrühten
Abbau der Na+/K+-ATPase beiträgt.
Eine weitere Möglichkeit zur Erklärung der Integritätsstörungen der α-Untereinheit im Falle der
Mutation R908Q könnte das Ausbleiben einer eventuell vorhandenen Wasserstoffbrücke zwischen der
Guanidingruppe des Arginins und dem Sauerstoff des L797-Rückgrats (extrazelluläre Schleife zwischen
TM5 und TM6) sein (Abbildung 4.3).
Abbildung 4.3
Strukturelle Darstellung der beiden über eine potentielle Wasserstoffbrücke (rot gestrichelt) miteinander wechselwirkenden
extrazellulären Schleifen der Transmembrandomänen TM5/TM6 und TM7/TM8. Die Carboxylgruppe des Leucin-Rückgrats
und eine der terminalen Guanidingruppe des Arginins bilden die einzig mögliche Wasserstoffbrücke zwischen den beiden
genannten extrazellulären Schleifen (dunkel eingezeichneter Pfeil). Zugrunde liegt die PDB-Datei 3B8E, wobei die
Beschriftung der homologen Aminosäurepositionen der humanen α2-Unteinheit entspricht. In der PDB-Datenbank
hinterlegten Na+/K+-ATPase-Struktur liegen zwei Rb+-Ionen (rot) in der Kationen-Bindungsstelle gebunden vor. Zur
anschaulichen Darstellung wurde das Grafikprogramm PyMOL verwendet.
Diskussion
71
4.1.1 Elektrophysiologisch nicht charakterisierbare Konstrukte
Wie zuvor erwähnt, gibt es auch FHM2-Mutationen, die trotz ihrer einwandfreien Integration in die
Plasmamembran absolut keine stationären Pumpströme aufwiesen. Die Mutationen G301R und T376M
zeigten selbst in den hochsensitiven Atom-Absorptions-Spektroskopiemessungen keine bzw. nur eine
sehr niedrige Rb+-Aufnahme, die der von uninjizierten Oozyten entsprach. Dieser Effekt, dass
uninjizierte Zellen ebenfalls eine geringe Menge an Rb+ aufnehmen, ist auf unspezifische Aufnahme
zurückzuführen. Für die Mutanten T263M und R937P liegt die gemessene Rb+-Aufnahme lediglich
geringfügig über dem Hintergrund der uninjizierten Oozyten. Demnach sind diese vier Mutanten
strukturell derart beeinträchtigt, dass sie zwar richtig gefaltet und in die Plasmamembran eingebaut
werden, es sich aber dabei um nichtfunktionsfähige Proteine handelt. Dieser völlige Funktionsverlust
lässt sich gut mit einer durch die entsprechende Punktmutation beeinträchtigten Struktur erklären.
T263M: Der Austausch von einem Threonin zu einem Methionin führt zu einem Wegfall der
terminalen Hydroxyl-Gruppe und somit auch zum Verlust einer möglichen Ausbildung einer
Wasserstoffbrückenbindung. Das Threonin an der Position 263 befindet sich unmittelbar vor einem
Glycin (G264), welches in allen P-Typ-ATPasen vorkommt. Anscheinend duldet die hochkonservierte
Kernsequenz in dieser Region nicht die kleinste Veränderung. Obwohl die Seitenkette des Methionins
im Vergleich zu der des Threonins nur geringfügig größer ist, wird durch den Austausch die lokale
Struktur offenbar so stark beeinträchtigt, dass die Interaktion zwischen den Anteilen der A-Domäne, die
aus der L2/3-Schleife und dem N-Terminus zusammengesetzt ist, gestört wird und keine regulatorische
Einheit (A-Domäne) gebildet werden kann. Daher könnte zusätzlich auch die Interaktion mit der
N-Domäne (L4/5-Schleife) betroffen sein [SEGALL et al., 2002]. Im Falle der homologen Ca2+-ATPase
SERCA existieren bereits diverse Kristallstrukturen beider Konformationszustände E1 und E2, aus
denen sich schließen lässt, dass sich im Bereich des T263-Äquivalents T230 das α-helikale Muster im
Verlauf der E1-E2-Konformationsänderung teilweise entwunden bzw. unterbrochen wird [TOYOSHIMA et
al., 2000, TOYOSHIMA und NOMURA, 2002]. Womöglich ist dies auch bei der Na+/K+-ATPase der Fall,
weshalb es folglich zur Beeinträchtigung bzw. zum Ausbleiben der notwendigen Interaktionsschritte
kommt.
G301R: Durch den Austausch der kurzkettigen Aminosäure Glycin gegen die positiv-geladene
Aminosäure Arginin mit relativ langer Seitenkette treten zwei Wasserstoffatome auf (Guanidingruppe
des Arginins), die potentiell zur Ausbildung von weiteren Wasserstoffbrücken beitragen können. Glycin
G301 könnte lediglich Wasserstoffbrücken-Bindungen zu Aminosäuren innerhalb der Transmembran-
domäne TM3 ausbilden. Die Mutante G301R hingegen wäre imstande weitere Bindungen auszubauen,
Diskussion
72
wie beispielsweise zur nahe gelegenen Helix M5. Ein Glycin in einer Transmembran kann entweder
einen leichten Knick bewirken oder ist dort anzutreffen, wo es räumlich beengt ist. Im Falle dieser
Mutation dürfte die Störung der lokalen Struktur und somit des Kationen-Transports durch eine sterische
Hinderung hervorgerufen sein.
T376M: Wie bei T263M handelt es sich hierbei ebenfalls um einen Austausch von einem Threonin
zu einem Methionin, wodurch die Wasserstoffbrücken-bildende OH-Gruppe verloren geht. Thr-376
befindet sich inmitten des DKTGT-Motivs und trägt entscheidend zur Mg2+-Koordination und somit zur
ATP-Spaltung bei. T376 bildet über den Stickstoff der Hauptkette eine Wasserstoffbrücke zum
terminalen Sauerstoff des D374 - der Aminosäure, auf die das γ-Phosphat des Adenosintriphosphats
über eine Phosphoanhydrid-Bindung übertragen wird. Mit Hilfe des Grafikprogramms Swiss-PDBViewer
und dem PDB-File 3B8E kann dargestellt werden, dass das in der Kristallstruktur der Na+/K+-ATPase
befindliche Magnesium von insgesamt drei Aminosäuren koordiniert wird: T374, T376 und D714
(AS-Position entspricht der α2-Isoform). Der Abbildung 4.4 kann entnommen werden, dass T376 eine
Wasserstoffbrücken-Bindung mit E219 eingeht. Durch die Mutation zu einem Methionin entfällt die
Wasserstoffbrücken-Bindung von der terminalen OH-Gruppe des T376 und es wird stattdessen eine
Bindung vom Schwefel des Methionins zum Sauerstoff des E219 ausgebildet (Abbildung 4.4 B). Die mit
dem Swiss-PDBViewer simulierte Mutation von Threonin zu Methionin deutet auf keine Beeinflussung
der Magnesium-Koordination hin. Jedoch muss hierbei der Verzicht auf Optimierungen wie
beispielsweise Energie-Minimierungen berücksichtigt werden.
Es ist auch durchaus denkbar, dass die endständige Methyl-Gruppe des Methionins einen großen
Beitrag zum Funktionsverlust der Na+/K+-ATPase leistet. Bonn und Kollegen haben herausgefunden,
dass die Reorientierung von Wassermolekülen, die eine Methyl-Gruppe umgeben, von 2.5 ps bis mehr
als 10 ps verlangsamt wird [BONN et al., 2009]. Eine einzige Methyl-Gruppe kann die
Reorientierungsdynamik von bis zu fünf Hydroxylgruppen in ihrer Umgebung beeinflussen [HAUPTS et
al., 1999]. Zwar handelt es sich bei den Untersuchungen von Bonn und Kollegen nicht explizit um
Protonen, deren Mobilität durch die Anwesenheit einer Methyl-Gruppe verringert wird. Dennoch ist die
Möglichkeit einer Beeinträchtigung der Orientierung bzw. Koordination des Magnesium-Ions und des
Phosphats durch die neu erworbene CH3-Gruppe und des daraus resultierenden vollständigen Verlusts
der ATPase-Aktivität nicht auszuschließen. Bedauerlicherweise konnte die Kristallstruktur der Na+/K+-
ATPase im E1-Zustand noch nicht aufgeklärt werden. Denn möglicherweise sind Wasserstoffbrücken-
Bindungen bzw. andere molekulare Wechselwirkungen, die im E2P-Zustand vorliegen, erst gar nicht in
der E1-Konformation vorhanden bzw. umgekehrt.
Diskussion
73
A
B
D714
D374 MgF
2-
4
Mg
2+
E219
T376
D374
D714
Mg
2+
MgF
2-
4
T376M
E219
Abbildung 4.4
(A) T376 und die in einem Umkreis von 5 Å lokalisierten Aminosäuren mit den zugehörigen Wasserstoffbrücken-Bindungen.
In (B) ist Threonin an Position 376 mit Hilfe des Programms Swiss-PDBViewers zu Methionin mutiert worden, wodurch neue
Wechselwirkungen entstehen. T376 koordiniert mit D374 und D714 das Magnesium-Ion, das zur ATP-Hydrolyse benötigt
wird. Türkis = Phosphatanalogon (Magnesiumtetrafluorid), magenta = Magnesium, rot = Sauerstoff, blau = Stickstoff, gelb =
Schwefel, anthrazit = Kohlenstoff.
Diskussion
74
R937P: Seit der Veröffentlichung der Na+/K+-ATPase-Struktur im Dezember 2007 wird Arg-937 eine
elementare Rolle in der korrekten Positionierung des C-Terminus zugeschrieben. Das sich in der
intrazellulären Schleife L8/9 befindliche Arginin bildet zu den beiden terminalen Tyrosinen Y1019
(OH-Gruppe der aromatischen Seitenkette) und Y1020 (Sauerstoff der terminalen COOH-Gruppe des
Rückgrats) Wasserstoffbrücken aus (Abbildung 4.5) und ist unter Beteiligung einer weiteren
Wasserstoffbrücke (Y1020 ↔ K770) darin involviert, die dritte Natrium-Bindungsstelle zu bilden [MORTH
et al., 2007]. Sowohl Toustrup-Jensen und Kollegen als auch Meier und Kollegen fanden heraus, dass
die Hydroxylgruppen der Tyrosine einen geringeren Einfluss auf die strukturelle und funktionelle
Verbindung zwischen dem C-Terminus und der dritten Na+-Bindungsstelle haben als die aromatischen
Ringe der Tyrosine [TOUSTRUP-JENSEN et al., 2009, MEIER et al., 2010]. Die amino-aromatischen
Wechselwirkungen werden durch den Austausch des Arginins durch Prolin eliminiert, so dass auch hier
ein völliger Funktionsverlust die Folge ist.
Abbildung 4.5
Strukturelle Detail-Darstellung des Arg-937 und der entsprechenden Wasserstoffbrücken-Bindungen zu den beiden
Tyrosinen Y1019 und Y1020. In orange ist die Helix M5 dargestellt und in rot die Sequenz kurz vor dem C-Terminus,
inklusive des C-Terminus (Grafikprogramm = PyMOL, Protein-Datenbank-Eintrag = 3B8E).
4.2 Vernetzung via R1-X1-H•••X2-R2 zwischen der Schleife L6/7, der P- & TM-Domäne
Neben der Tatsache, dass die ATP1A2-Mutationen A606T, R763H, M829R und R834Q allesamt
reduzierte Turnover-Zahlen aufwiesen, gehören zu weiteren Gemeinsamkeiten erhöhte apparente
Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten der transienten Ströme und diverse Veränderungen
spannungsabhängiger Eigenschaften bzw. der Kationen-Affinitäten. Die genannten vier Mutationen
betreffen ausnahmslos hoch konservierte Aminosäuren, die vermutlich sehr stark in einem Netzwerk
aus Wasserstoffbrücken-Bindungen (R1-X1-H•••X2-R2) eingebunden sind. In Abbildung 4.6 ist zu
erkennen, welche Transmembrandomänen bzw. Schleifen hierbei involviert sind. R763 (Helix M5) bildet
Y1019
R937
Y1020
Diskussion
75
die zentrale Aminosäure, die über Wasserstoffbrücken mit A606 (P-Domäne), M829 (Schleife L6/7) und
G365 (P-Domäne) in Verbindung steht (Abbildung 4.6 A). Durch diese Anordnung wird die relative
Position der L6/7-Schleife, der P-Domäne und der M5-Helix stabilisiert. Die ATP1A2-Aminosäuren
A606, R763 und M829 entsprechen den SERCA-Aminosäuren A617, R751 und M817, bei denen
ebenfalls das Auftreten eines solchen Netzwerks von Wasserstoffbrücken-Bindungen beschrieben
wurde [TOYOSHIMA et al., 2000, TOYOSHIMA und NOMURA, 2002]. Während der Konformationsänderung der
SERCA von der E1- (Protein-Datenbank Eintrag 1SU4, [TOYOSHIMA et al., 2000]) zur E2-Struktur (Protein-
Datenbank Eintrag 1IWO, [TOYOSHIMA und NOMURA, 2002]) werden die Wasserstoffbrücken zwar neu
angeordnet, jedoch bleiben sie dabei zwischen R751 und A617 oder M817 im Wesentlichen intakt. Dies
deutet auf die Notwendigkeit einer sehr strikt stabilisierten lokalen Struktur während des katalytischen
Zyklus hin.
Abbildung 4.6
In Netzwerken von Wasserstoffbrücken-Bindungen im Zentralbereich des Proteins involvierte ATP1A2-Aminosäuren.
(A) R763 bildet die Verknüpfungsstelle zwischen der Schleife L6/7 (M829) und der P-Domäne (A606 und G365).
(B) Wasserstoffbrücken-Bindungen (rot gestrichelt) von R834 zu D839 (L67/) und S366 (P-Domäne). Potentielle
Wasserstoffbrücken sind bis zu einer Länge von 3,3 Å berücksichtigt.
In Abbildung 4.6 B ist zu erkennen, dass R834 sowohl zur Aminosäure D839 (Schleife L6/7) als auch zu
S366 (P-Domäne) Wasserstoffbrücken ausbilden kann. Die hierzu entsprechende SERCA-Aminosäure
R822 ist unter Vermittlung eines Wassermoleküls über Wasserstoffbrücken mit einem
hochkonservierten Glutamat verknüpft, das sich innerhalb der ersten α-Helix der P-Domäne befindet
[TOYOSHIMA et al., 2000]. Anhand von Vergleichen mit der Ca2+-ATPase ist davon auszugehen, dass im
Falle der Na+/K+-ATPase die entsprechenden Aminosäuren A606, R763, M829 und R834 während des
Diskussion
76
katalytischen Zyklus ebenfalls für die komplexe strukturelle Stabilisierung der Verknüpfungsstellen
zwischen den verschiedenen Domänen verantwortlich sind. Die vier FHM2-Mutationen A606T, R763H,
M829R und R834Q scheinen das Netzwerk aus Wasserstoffbrücken-Bindungen so stark zu stören,
dass eine abnorme Flexibilität während der Konformationsänderung des E1P- in den E2P-Zustand
erreicht wird.
Ein bedeutender Befund dieser Untersuchung ist, dass die unterschiedlichen Mutationen innerhalb
der Wasserstoffbrücken-Netzwerke, die die diversen Domänen des Enzyms miteinander verbinden,
nicht zu einer vollständigen Inaktivierung der Na+/K+-ATPase führen, es aber zu Veränderungen der
Kinetiken des E1P/E2P-Konformationsübergangs und/oder der spannungsabhängigen Eigenschaften
kommt, die von komplexen Effekten auf die Wechselwirkung mit den transportierten Kationen begleitet
werden. Da sich die Kationen-Bindungsstellen nicht in unmittelbarer Nachbarschaft zur „Netzwerk-
Region“ befinden, kann die Veränderung der Kationen-Affinität nicht durch eine direkte Störung der
Struktur der Kationen-Bindungsstellen begründet werden. Vielmehr kann das Gleichgewicht der
spannungsabhängigen Verteilung zwischen den beiden Zuständen E1P und E2P durch
außergewöhnlich hohe apparente Ratenkonstanten der Vorwärts- und/oder Rückwärtsreaktion
beeinflusst sein. In der Tat weisen die verschobenen Q/V-Kurven auf Veränderungen der
spannungsabhängigen Verteilung zwischen den Zuständen E1P und E2P hin. Deshalb kann in
Anlehnung an die von Jørgensen und Kollegen angestellten Überlegungen [JØRGENSEN et al., 2001]
davon ausgegangen werden, dass die beobachteten Veränderungen der apparenten Kationen-
Affinitäten lediglich eine sekundäre Konsequenz der Verschiebung des Konformationsgleichgewichts
sind. Allerdings sind die beobachteten langreichweitigen Effekte auf die Kationen-Bindungsstellen sehr
komplex, da die Verschiebungen des dynamischen E1P-E2P-Gleichgewichts scheinbar nicht konsistent
mit den Veränderungen der apparenten Kationen-Affinitäten korrelieren. Das bedeutet, dass sich keine
„vorzugsweise Richtung“ der Effekte erkennen lässt, da sowohl negativ als auch positiv verschobene
Q/V-Kurven und neben erhöhten auch reduzierte Kationen-Affinitäten vorzufinden sind. Obwohl die
Mutationen räumlich eng benachbarte Aminosäuren betreffen, beeinflussen sie in differenzieller Weise
die apparenten Affinitäten an den Kationen-Bindungsstellen. In diesem Zusammenhang ist die
unterschiedliche Benennung der drei Bindungsstellen zu erwähnen. Die beiden Kationen-
Bindungsstellen, die sowohl K+- als auch Na+-Ionen binden, werden in der Literatur meist als „common
cation binding sites“ (manchmal auch „shared sites“) und die dritte Bindestelle als „unique Na+ binding
site“ bezeichnet. In Anlehnung an kürzlich publizierte Arbeiten [YARAGATUPALLI et al., 2009, MEIER et al.,
2010], die den Einfluss von diversen Deletionen und Mutationen am C-Terminus der Na+/K+-ATPase
α2-Untereinheit auf die entsprechenden Bindungsstellen beschreiben, können die hier beobachteten
Effekte ebenfalls mit den Auswirkungen auf die ungleichen Bindungsstellen erklärt werden. A606T wies
Diskussion
77
Q/V-Kurven auf, die relativ stark zu positiven Potentialen verschoben waren, was auf eine erhöhte
Na+-Affinität hindeutet. In Kombination mit einer niedrigeren Affinität für K+ lässt sich schließen, dass die
„common sites“ betroffen sind. Wenn an diesen Bindungsstellen die Na+-Affinität höher ist, wird die
K+-Affinität geringer und umgekehrt. Denn positivere Potentiale als der halbmaximale Spannungswert
V0.5 begünstigen die Na+-Freisetzung von der dritten Bindungsstelle, was wiederum die
Na+-Freisetzung an den beiden anderen Bindungsstellen ermöglicht. Bei R763H hingegen ist die
K+-Affinität erhöht, ohne dass eine Verschiebung der Q/V-Kurve beobachtet werden kann. Dies könnte
den Schluss zulassen, die „common sites“ wären betroffen, nicht aber die „unique site“. Die beiden
FHM-Mutationen M829R und R834Q zeigten keine veränderten Affinitäten für K+, jedoch für Na+
(M829R = Reduktion der apparenten Affinitäten für extrazelluläres Na+, R834Q = Erhöhung der
apparenten Affinitäten für extrazelluläres Na+). Hier scheint sich die jeweilige Mutation nicht auf die
beiden Na+- und K+-transportierenden Bindungsstellen („common sites“), sondern ausschließlich auf die
dritte Na+-Bindungsstelle auszuwirken.
Höchstwahrscheinlich sind die ermittelten Affinitätsveränderungen eine Kombination aus komplexen
Überlagerungen der langreichweitigen strukturellen Auswirkungen der Beeinträchtigung von Kationen
koordinierenden Aminosäureresten einerseits und anderseits der veränderten Kinetik, mit denen der
E1P-E2P-Konformationsübergang stattfindet. Die konsistent beobachtete Erhöhung der apparenten
Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten der transienten Ströme sind ein Hinweis darauf, dass die
Mutanten A606T, R763H, M829R und R834Q eine abnorm hohe Flexibilität während der E1P-E2P-
Konformationsänderung aufweisen. Obwohl all diese Veränderungen die Beeinträchtigung der
Na+/K+-ATPase-Funktion unter physiologischen Bedingungen begründen können, wird es in Zukunft
immer wieder eine Herausforderung sein, die beobachteten Funktionsabnormitäten mit strukturellen
Überlegungen konsistent zu vereinbaren.
4.2.1 Mutation in der Region des Gelenkstücks zwischen der P- und N-Domäne
Das hochkonservierte Arginin R383 (SERCA-Homolog: Q360 im TNQMS-Motiv) befindet sich im fünften
Kernmotiv [AXELSEN und PALMGREN, 1998] der P-Typ-ATPasen und ist Bestandteil des Gelenkstücks,
das die N-Domäne flexibel mit der P-Domäne verbindet (Abbildung 4.7). Da die N-Domäne während
des katalytischen Zyklus beachtliche Bewegungen relativ zur P-Domäne vollzieht, könnte die Mutation
R383H die Flexibilität der Konformationsänderung behindern. Aufgrund der Histidin-Substitution sind
sowohl die apparenten Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten während der Spannungssprung-
induzierten E1P↔E2P-Konformationsänderung als auch die Turnover-Zahl sehr stark reduziert. Die
außerdem beobachtete Verschiebung der Q/V-Kurve um ca. +26 mV weist auf eine Beeinflussung des
Diskussion
78
Konformationsgleichgewichts hin, wobei bei physiologischen Potentialen die E1P-Konformation
stabilisiert zu sein scheint. Eine ebenfalls in dem zweiten Gelenkstück zwischen der N- und P-Domäne
lokalisierte FHM2-Mutation (R593W) ist zwar funktionell nicht im Detail charakterisiert worden, aber es
konnte immerhin gezeigt werden, dass in sogenannten „cell survival assays“ mit diesem Konstrukt das
Überleben der Zellen stark beeinträchtigt war, was ebenfalls die kritische Rolle dieser Gelenkstücke für
die Pump-Aktivität und die Flexibilität der Konformation hervorhebt. Der Funktionsverlust lässt sich
durch die beobachtete Reduktion der Wechselzahl hervorragend erklären.
Abbildung 4.7
Lokalisation von R383 in der Na+/K+-ATPase-Struktur. Das hochkonservierte Arginin an Position 383 (α2-Untereinheit) liegt
exakt im Gelenkstück zwischen der N- und P-Domäne.
4.3 Temperaturabhängige Instabilität des Na+/K+-ATPase-Proteins
Die ATP1A2-Mutation P979L zeigte in elektrophysiologischen Experimenten keinerlei Abweichungen im
Vergleich zum Wildtyp, weshalb für dieses Konstrukt eine Erweiterung des Methodenspektrums
notwendig wurde. Hierfür kamen ein weiteres Expressionssystem und höhere Temperaturen zum
Einsatz. Es ist durchaus bekannt, dass die Temperatur die Proteinfaltung, die Proteinstabilität und die
zellulären Qualitätskontrollmechanismen beeinflusst. Erst kürzlich wurde in einem Artikel veröffentlicht,
dass unterschiedliche Temperaturen bei dem Polyglutamin-reichen Protein Huntingtin (huntingtin-
exon1, thtt), welches für die Erkrankung an Chorea Huntington verantwortlich ist, zu unterschiedlichen
Strukturen des Polypeptids führen. Während es bei 4°C zu einer etwas lockereren Form der Fibrillen-
R383
N-Domäne
A
-Domäne
P-Domäne
Diskussion
79
Anordnung kommt, (β-Fibrillen: unlösliche Ablagerungen in Form kleiner Fasern, so genannter Fibrillen,
die als Amyloid bezeichnet werden), wird die Polypeptid-Sequenz bei 37°C in eine Amyloid-Form
gefaltet, die weniger auffällig und toxisch ist (Abbildung 4.8) [NEBOOKI-MACHIDA et al., 2009]. Die bei
niedriger Temperatur gebildeten Amyloide weisen neben ihrer Detergens-Empfindlichkeit und der
signifikant höheren Zelltodrate eine höhere Affinität zu Marker-Farbstoffen auf. Demnach kann ein und
dasselbe Protein, in Abhängigkeit der vorliegenden Temperatur, in zwei verschiedene Strukturen mit
völlig unterschiedlichen Eigenschaften gefaltet werden.
Abbildung 4.8
Die Faltung des Proteins Huntingtin in zwei verschiedene Amyloid-Konformationen. Bei 4°C entsteht eine toxische, fragile
Struktur, während in Gegenwart von Temperaturen um 37°C stabilere und weniger toxische Fibrillen gebildet werden.
Abbildung entstammt der Veröffentlichung von [NEBOOKI-MACHIDA et al., 2009].
Ein weiteres, sehr gründlich erforschtes Beispiel für den Einfluss der Temperatur auf die
Proteinexpression und das Targeting zur Plasmamembran ist die ΔF508-Mutation im CFTR-
Chloridkanal (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Üblicherweise werden während
der Faltung zelluläre Qualitätskontrollmerkmale an das naszierende CFTR-Protein angefügt. Im Falle
der ΔF508-Mutation wurde in Zellkulturversuchen gezeigt, dass das Protein rasch und effizient
abgebaut wird, noch bevor es das Endoplasmatische Retikulum der Säugerzellen verlässt [SHARMA et
al., 2001]. Es konnte ebenfalls die Temperaturempfindlichkeit dieses Effekts gezeigt werden [DENNING et
al., 1992], was auch erklärt, weshalb CFTR-ΔF508 in Xenopus-Zellen (18°C) aufgrund des Erreichens
der Plasmamembran funktionell exprimiert werden kann, aber nicht in Zellkultur (37°C), da das Protein
vor Erreichen der Plasmamembran abgebaut wird [DRUMM et al., 1991].
Diskussion
80
Die ATP1A2-Mutante P979L gelangt in Xenopus laevis-Zellen ebenfalls erfolgreich in die
Plasmamembran und wird dort auch völlig funktionsfähig eingebaut. Temperaturen von 37°C jedoch,
wie sie in der Zellkultur vorzufinden sind, führen offensichtlich zu einer reduzierten Proteinmenge in der
Plasmamembran. Es ist wahrscheinlich, dass es bei P979L ebenfalls zu einer vorzeitigen Degradation
kommt. Solch eine temperaturabhängige Degradation scheint in der Tat bei P979L vorzuliegen.
Während es bei HEK293FT-Zellen, die bei 28°C kultiviert wurden, zu äquivalenten Proteinmengen der
Mutante und des Wildtyps führt, ist die Gesamtproteinmenge von P979L bei 37°C sehr stark reduziert.
Im Allgemeinen werden Proteine auf unterschiedliche Weise abgebaut; entweder über die
Lysosom- oder die Proteasom-vermittelte Proteolyse. Exogene Proteine gelangen über Endozytose
(aber auch über Phagozytose) in die Zelle und werden durch lysosomale Proteasen (Cathepsine) im
Inneren der Lysosomen zerlegt. Diese Zellorganellen haben einen Durchmesser von 0,2 – 0,5 µm und
enthalten eine Vielzahl (>50 Typen) an sauren Hydrolasen (Nukleasen, Proteasen, Lipasen,
Phosphatasen, u.v.m.), die unter aziden Bedingungen (pH~5,0) aktiv sind. Der niedrige pH-Wert wird
über eine ATP-getriebene Protonen-Pumpe (V-Typ-ATPase) aufgebaut und aufrechterhalten. Auch
endogene Proteine werden auf lysosomalem Weg verdaut, was als „Autophagie“ bezeichnet wird. Im
Vergleich zum proteasomalen Abbau wird hier dem zu degradierenden Protein ein einziges Ubiquitin-
Molekül angeheftet (Ubiquitinierung über Lys-63). Je mehr Ubiquitin-Moleküle angehängt werden, umso
schneller wird das zu degradierende Protein abgebaut. Beim proteasomalen Abbau handelt es sich um
eine Multi-Ubiquitinylierung (ubiquitiniert wird über Lys-48) - das impliziert auch, dass dieser
Proteolyseweg schneller stattfindet als der lysosomale. Die Entdeckung der Ubiquitin-vermittelten
Proteindegradation und die entsprechende Grundlagenforschung in den 80er Jahren erbrachten Aaron
Ciechanover, Avram Hershko und Irwin Rose den Nobelpreis für Chemie [NANDI et al., 2006]. Durch die
schnelle Degradation von geschwindigkeitsbestimmenden Enzymen ist die ATP-abhängige Protease,
das Proteasom, in der Lage, regulatorisch auf eine Vielzahl zellulärer Prozesse einzuwirken. 1997
wurde an COS-7-Zellen erstmals gezeigt, dass die Na+/K+-ATPase α1- und α2-Untereinheit ubiquitiniert
wird [COPPI und GUIDOTTI, 1997]. In der Plasmamembran werden die beiden Untereinheiten α und β
unterschiedlich abgebaut: lysosomale Degradation der α-Untereinheit und proteosomale der β-
Untereinheit [YOSHIMURA und TAKEYASU, 2003]. Es gibt aber auch den Ubiquitin-unabhängigen
proteasomalen Proteinabbau. Fehlgefaltete Proteine werden umgehend transloziert, d. h. zurück ins
Zytosol transportiert, und durch das Proteasom degradiert.
Die Behandlung von Zellen mit Proteasom-Inhibitoren führt zur Verlängerung der Halbwertszeit der
Proteine und somit zu deren Akkumulation in den entsprechenden Zellkompartimenten. In der
vorliegenden Arbeit sollte mit Hilfe der beiden Proteasom-Inhibitoren MG-132 und Lactacystin gezeigt
werden, ob und inwieweit das Konstrukt P979L vom proteasomalen Abbau betroffen ist, wenn es bei
Diskussion
81
Temperaturen von 37°C inkubiert wird. Der Abbau von P979L in Gegenwart hoher Temperaturen
scheint entweder keiner Ubiquitinylierung zu bedürfen, da auch unter Verwendung des anti-Ubiquitin-
Antikörpers keine Akkumulation des Na+/K+-ATPase-Proteins zu sehen war, oder er geschieht nicht
über den proteasomalen Weg (nicht gezeigt). Die nicht signifikanten Ergebnisse dieser Arbeit deuteten
darauf hin, dass im Falle der P979L vermutlich der Abbau über den endosomal/lysosomalen Weg
stattfindet. Um den Mechanismus der FHM2-Mutation P979L einzugrenzen, könnten die diversen
Proteolyse-Varianten mit entsprechenden Inhibitoren beeinflusst werden. Brefeldin A beispielsweise
hemmt den Proteintransport vom Golgi-Apparat zum ER, so dass das Protein innerhalb des
Endoplasmatischen Retikulums akkumuliert wird. Eine ganze Reihe von verschiedenartigen
Hemmstoffen, wie zum Beispiel Bafilomycin A1, Amantadin, Concanamycin A, Concanamycin B,
Chloroquin, Ammoniumchlorid und N-Acetylcystein, u.v.m., kann den endo-/lysosomalen Abbauweg
gänzlich inhibieren. Auf diese Weise könnte ein Hinweis darauf erlangt werden, in welchem
Kompartiment die temperatursensitive Mutation P979L zur Degradation führt. Möglicherweise könnte
das Protein bereits im Golgi-Apparat oder im ER zurückgehalten werden oder aber auch erst kurz vor
oder nachdem sie in die Plasmamembran eingebaut wird. Die Ergebnisse von Untersuchungen der
posttranslationellen Regulation der Na+/K+-ATPase-Mutation P979L in Gegenwart verschiedener
Temperaturen würden einen wichtigen Beitrag dazu leisten, einen bedeutsamen Zusammenhang
zwischen der Proteindegradation/Temperatursensitivität von ATP1A2-Mutationen und der Erkrankung
an Familiärer Hemiplegischer Migräne des Typs II aufzuzeigen.
4.4 Expansion des C-Terminus durch Mutation des Stopp-Codons TGA
Spätestens seit Veröffentlichung der ersten Na+/K+-ATPase-Struktur im Jahr 2007 wird dem Carboxy-
Terminus eine äußerst gewichtige Bedeutung für die Spannungsabhängigkeit der Bindungsstellen für
die transportierten Kationen zugeschrieben [MORTH et al., 2007]. Diese Vermutungen wurden in jüngster
Vergangenheit von Toustrup-Jensen und Kollegen gestützt, die darlegen konnten, dass der C-Terminus
einen wesentlichen Beitrag zur Ausbildung und Stabilisierung der dritten Na+-Bindungsstelle leistet
[TOUSTRUP-JENSEN et al., 2009]. Deletionen und Mutationen im C-terminalen WVEKETYY-Motiv führten
zu einer enormen Herabsetzung der apparenten Na+-Affinitäten (Na+außen und Na+innen). Je länger die
deletierte Sequenz, umso geringer war die Na+-Affinität der Na+-abhängigen E1-Phosphorylierung
(ΔY = 2,3-fach, ΔYY = 9-fach, ΔTYY= 17-fach, ΔKETYY = 26-fach, α1-Untereinheit der Ratte)
[TOUSTRUP-JENSEN et al., 2009]. Zu ähnlichen Resultaten kamen auch Meier und Kollegen, die zeigen
Diskussion
82
konnten, dass die humane α2-Untereinheit bei Trunkation der beiden terminalen Tyrosine (ΔYY) eine
12 - 14-fach reduzierte apparente Na+-Affinität aufweist [MEIER et al., 2010].
In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass nicht nur Verkürzungen des intrazellulären
C-Terminus die Spannungssensitivität und die Kationen-Interaktion beeinflussen, sondern auch dessen
Elongation. Die Auswirkungen der Addition von 28 Aminosäuren an den C-Terminus der Na+/K+-
ATPase, wie es bei der FHM2-Mutation X1021R zum Ausdruck kommt, sind sehr ähnlich zu den mit
biochemischen Methoden untersuchten Deletionskonstrukten: die Natrium-Affinität sinkt ebenfalls.
Ferner sind auch die Turnover-Zahl und die apparente intrazelluläre K+-Affinität sehr stark reduziert.
Außerdem verhalten sich die Spannungsabhängigkeiten und die Kinetiken der transienten Ströme
vollkommen anders als beim Wildtyp-Protein, da die apparenten Ratenkonstanten mit depolarisierenden
Potentialen ansteigen, anstelle zu sinken. Solch ein invertiertes Verhalten wurde bereits für die Mutation
D808E beschrieben, welche explizit eine Aminosäure betrifft, die sich in der Kationen-Bindungsstelle
befindet und für die Kationen-Koordination relevant ist [OGAWA und TOYOSHIMA, 2002, KOENDERINK et al.,
2003]. Während beim Wildtyp die extrazelluläre Na+-Rückbindung spannungsabhängig ist, scheint hier
einer der vorwärtsgerichteten Reaktionsschritte des Natrium-Zweiges (die intrazelluläre Na+-Bindung,
der E1P-E2P-Konformationswechsel, die extrazelluläre Na+-Freisetzung) spannungsabhängig zu sein
(Abbildung 4.9). Die Elektrogenizität des Na+-Transports ist bei der X1021R-Mutante drastisch reduziert,
ebenso die Spannungsabhängigkeit der Ladungsverschiebung (der zq-Wert entspricht ~0,29 im
Vergleich zu ~0,82).
Abbildung 4.9
Reaktionszyklus der Na+/K+-ATPase. In grau unterlegt sind die vorwärtsgerichteten Reaktionsschritte des Natrium-Zweiges:
(1) intrazelluläre Na+-Bindung, (2) Konformationsübergang vom E1P- in den E2P-Zustand und (3) extrazelluläre
Na+-Freisetzung. Die mit dem roten Pfeil markierte Rückwärtsreaktion stellt die elektrogene Na+-Rückbindung dar, die unter
hohen [Na+]ext- und K+-freien Bedingungen elektrophysiologisch untersucht werden kann. Beim WT-Protein ist diese
Rückwärtsreaktion maßgebend spannungsabhängig, wohingegen die X1021R-Mutante in einer der Vorwärtsreaktionen des
Na+-Zweiges elektrogen zu sein scheint.
EP + 3Na
2
+
2K
+
E·(2
1
K)
+
intrazellulär
vorwärtsgerichtete Reaktion
extrazellulär
3Na ·E ·ATP
+
1
3Na
+
E·ATP
1
2K
+
2K ·E
+
1
(3Na )·E -P
+
1
E P·3Na
2
+
EP·(2K)
2
+
1
2
3
Diskussion
83
Ein ähnliches Verhalten hinsichtlich der Spannungsabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten aus
den transienten Strömen zeigten auch die beiden Deletionsmutanten ΔYY und ΔKETYY am C-Terminus
der humanen α2-Unterinheit [MEIER et al., 2010]. Hier konnte ebenfalls ein invertiertes Verhalten
beobachtet werden, d. h. ein Ansteigen der Geschwindigkeitskonstanten bei hyperpolarisierenden
Potentialen. Bei einem weiteren Vergleich dieser beiden Konstrukte mit der hier untersuchten
FHM2-Mutante X1021 scheinen die Veränderungen der apparenten Affinitäten an den Kationen-
Bindungsstellen unterschiedlich zu sein. ΔYY wies eine veränderte Na+-Affinität an der dritten
Na+-Bindungsstelle („unique Na+ binding site“) auf, während die Deletion der letzten fünf Aminosäuren
(ΔKETYY) sowohl die „common sites“ als auch die „unique site“ beeinträchtigt [MEIER et al., 2010]. Die
Elongation des C-Terminus führt zu einer erhöhten apparenten K+-Affinität und minimal veränderten
Reduktion der apparenten Na+-Affinitäten (1,1 - 1,9-fach), was darauf schließen lässt, dass lediglich die
„common sites“ betroffen zu sein scheinen, aber nicht die „unique Na+ binding site“. Trotz allem zeigt
X1021R nicht die für die Deletionsmutanten typischen stationären Einwärtsströme, was auf eine noch
im Wesentlichen intakt zu sein scheinende Kationen-Okklusion hindeutet. Die YY-Deletion hingegen
setzt die Energiebarriere für die intrazelluläre Na+-Okklusionsreaktion herab und destabilisiert somit den
Na+-okkludierten Zustand, was einen stationären Na+-Einwärtsstrom zur Folge hat [MEIER et al., 2010].
R937 K770
Y1020
Y1019
R1002
TM5
Rb
+
Rb
+
AS-Rückgrat
des C-Terminus’
Abbildung 4.10
Wechselwirkungen des C-Terminus’ der humanen Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit (terminale Tyrosine Y1019 und Y1020)
mit den umliegenden Aminosäuren R937 und K770.
Diskussion
84
Die ATP1A2-Mutante X1021R ist jedoch nicht die einzige FHM2-verursachende Mutation, die sich
in der sogennanten Switch-Region befindet. Neben der bereits erwähnten Aminosäure R937P
(4.1.1 Elektrophysiologisch nicht charakterisierbare Konstrukte, Abbildung 4.5) befinden sich auch die
Mutationen D999H, R1002Q und Y1009X in dieser Region. Bei Betrachtung der strukturellen
Anordnung des Carboxy-Terminus ist erkennbar, dass die Aminosäure Arg-937 eine strategisch
wichtige Position einnimmt und für die strukturelle Stabilisierung des C-Terminus und die durch ihn
kontrollierte Natrium-Bindung an der dritten Kationen-Bindungsstelle verantwortlich ist (Abbildung 4.10).
Toustrup-Jensen und Kollegen konnten durch Mutagenese-Studien zeigen, dass der Austausch des
positiv geladenen Arginins gegen ein Alanin (R937→R937A) zu einer 5-fachen Reduktion der
apparenten Na+-Affinität führt [TOUSTRUP-JENSEN et al., 2009]. Ähnliches tritt auf, wenn das endständige
Tyrosin gegen ein Alanin ausgetauscht (5-fache Reduktion) bzw. es vollständig entfernt wird (2,3-fache
Reduktion).
Gleichermaßen interessant ist die Tatsache, dass die Aminosäure Lys-770, die mit dem terminalen
Tyr-1020 potentiell eine Wasserstoffbrücken-Bindung eingeht und somit auch an der Ausbildung der
dritten Na+-Bindungsstelle beteiligt ist (Abbildung 4.10), bei einem Austausch zu einem Alanin (K770A)
eine fünffache Reduktion der apparenten Na+-Affinität bewirkt [TOUSTRUP-JENSEN et al., 2009]. Die
Reduktion der Na+-Affinitäten sowohl durch Deletionen bzw. Elongation als auch durch die Störung der
ausgebildeten Quervernetzungen zum C-Terminus beschränkt sich nicht nur auf die α2-Untereinheit,
sondern betrifft auch andere Na+/K+-ATPase α-Isoformen. Blanco-Arias und Kollegen konnten sogar
eine 50-fache Reduktion der Na+-Affinität verursacht durch die Duplikation des terminalen Tyrosins der
α3-Untereinheit (WVEKETYYY) zeigen [BLANCO-ARIAS et al., 2009]. Diese Mutation wird mit der
vererbbaren Form der Parkinson-Krankheit assoziiert (RDP, rapid-onset dystonia-parkinsonism).
Durch Untersuchungen von Struktur-Funktions-Beziehungen und Kausalzusammenhängen wird
etwas deutlicher, weshalb Veränderungen in der Switch-Region und direkt am C-Terminus zu
pathophysiologischen Auswirkungen führen können. Die Erforschung der Ätiologie der erblichen
Migräneformen bleibt weiterhin von großer Relevanz.
4.5 Zusammenhang zwischen Funktionsstörungen der Na+/K+-ATPase
α2-Untereinheit und Migräne
Nahezu alle untersuchten ATP1A2-Mutationen führten entweder zu partiellem oder gar vollständigem
Funktionsverlust. Die funktionellen Veränderungen sind hierbei recht vielfältig und reichen von leichten
Abweichungen der Kationen-Affinitäten bis hin zu völlig entgegengesetzter Spannungsabhängigkeiten
Diskussion
85
und Kinetiken der transienten Ströme. Nun stellt sich die Frage, wie sich die FHM2-Mutationen unter
physiologischen Bedingungen auswirken? Was passiert in der Zelle und wie kann ein funktionell
beeinträchtigtes Enzym zum Auftreten von Migräne führen? Diese und weitere Fragen lassen sich
einerseits anhand des einleitend beschriebenen Phänomens der Cortical Spreading Depression und
andererseits durch die Betrachtung der in vivo stattfindenden Prozesse eingehend erläutern. Die
Natrium-Kalium-Pumpe ist in zahlreichen zellulären Vorgängen sowohl im Gehirn als auch in anderen
Organen involviert. Viele sekundäre Transporter, wie beispielsweise die astrozytischen Glutamat-
Transporter GLAST und GLT-1, nutzen als Energiequelle den elektrochemischen Na+-Gradienten, der
durch die Na+/K+-ATPase aufgebaut und aufrechterhalten wird. Unter pathologischen Bedingungen ist
der gekoppelte Mechanismus zwischen der neuronalen Aktivität und dem Energie-Metabolismus in der
Astrozyte und somit zwischen der Na+/K+-ATPase und Glutamat-Transportern GLAST und GLT-1
enorm beeinträchtigt. Chatton und Kollegen konnten bereits im Jahr 2000 durch eine quantitative
Analyse aufzeigen, dass die intrazelluläre Natrium-Konzentration sowohl durch die Glutamat-Aufnahme
als auch durch die Na+/K+-ATPase-Aktivität in Astrozyten beeinflusst wird [CHATTON et al., 2000]. Die
rasche Entfernung von Glutamat aus dem synaptischen Spalt ist eine Voraussetzung für die neuronale
Informationsübertragung. Sie verhindert die Desensitivierung neuronaler Glutamat-Rezeptoren und die
Übererregung umgebender Neuronen. Wenn nun die Na+/K+-ATPase einen durch eine Mutation
bedingten Funktionsdefekt aufweist, so kommt es zum Zusammenbruch des Na+-Gradienten und die
dadurch erhöhte Glutamat-Konzentration führt schließlich ebenfalls zur Übererregbarkeit der
Nervenzellen und folglich zur Streudepolarisation.
Weiterhin sei die Bedeutung der α2-Untereinheit genauer betrachtet. Diese α-Isoform besitzt eine
geringfügig höhere Affinität für intrazelluläres Natrium (möglicherweise bedingt durch die Verschiebung
in Richtung der E1-Konformation), was bei niedrigen Na+-Konzentrationen in nicht-erregbaren Gliazellen
enorm von Vorteil ist [SEGALL et al., 2001]. Dies ist ebenso äußerst bedeutsam für das effiziente
Entfernen von extrazellulärem Kalium, um weitere Depolarisationen der umgebenden Zellen zu
vermeiden. ATP1A2-Knockout-Mäuse ohne die α2-Untereinheit sterben sofort nach der Geburt aufgrund
ihrer Unfähigkeit mit der Atmung beginnen zu können [JAMES et al., 1999, IKEDA et al., 2003]. Die
α2-Untereinheit wird, wie bereits erwähnt, hauptsächlich in neuronalem Gewebe exprimiert, genauer in
Gliazellen (Astrogliazellen oder Astrozyten). Ihr Anteil an der gesamten Na+/K+-ATPase-Aktivität im
Gehirn beträgt weniger als 10 %, weshalb es relativ unwahrscheinlich ist, dass der dominante
Krankheitsphänotyp durch die globale Veränderungen der Konzentrationen von monovalenten Kationen
im Zytosol oder im extrazellulären Raum herbeigeführt wird [GARGUS, 2009]. Vielmehr beeinflusst die
reduzierte Pumpaktivität über den Natrium-Gradienten und den funktionell gekoppelten Na+/Ca2+-
Austauscher NCX (der sowohl in Neuronen als auch in Gliazellen vorkommt) die Ca2+-Homöostase.
Diskussion
86
NCX kann abhängig von dem vorliegenden Natrium-Gradienten Ca2+ entweder in die Zelle hinein oder
aus der Zelle heraus transportieren. Wie in Abbildung 1.5 dargestellt ist, wird in den als
PlasmERosomen bezeichneten Mikrodomänen neben dem NCX auch die PMCA (in der
Plasmamembran vorkommende Ca2+-ATPase) exprimiert. Die beiden Transporterarten unterscheiden
sich hinsichtlich ihrer Eigenschaften. Während PMCA eine hohe Ca2+-Affinität und eine geringe
Turnoverzahl besitzt, hat NCX eine niedrigere Affinität für Ca2+ und eine um einiges höhere
Turnoverrate, was darauf hindeutet, dass NCX durch nicht-transportiertes intrazelluläres Ca2+ aktiviert
wird [BLAUSTEIN et al., 2002]. Als Folge einer stark verringerten Na+/K+-ATPase-Aktivität wird intrazellulär
angereichertes Ca2+ in speziellen Depots gespeichert. Sofern in den PlasmERosomen auch
Inositoltriphosphat-Rezeptoren (IP3-Rezeptor = Liganden-aktivierter Ca2+-Kanal) vorhanden sind, kann
die erhöhte intrazelluläre Ca2+-Konzentration den IP3-Rezeptor für Inositioltriphosphat sensibilisieren
[ARNON et al., 2000]. Das wiederum bewirkt die verstärkte Freisetzung von Ca2+-Ionen aus dem
Endoplasmatischen Retikulum. Eine Dysfunktion der Na+/K+-ATPase hat somit einen sehr
weitreichenden Einfluss auf zahlreiche physiologische Prozesse. Im Folgenden ist anhand des
Zytoskelett-Proteins Ankyrin B ein Beispiel für phänotypische Modifikationen aufgeführt. Ankyrin B
interagiert über nicht-kovalente Bindungen mit diversen Ionen-Pumpen und Ionen-Kanälen (Na+/K+-
ATPase, Na+/Ca2+-Austauscher, IP3-Rezeptor) und ist an ihrer Verankerung in der Plasmamembran und
in speziellen Mikrodomänen in Membranen von Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) beteiligt, die am
Ca2+-Signaling mitwirken [MOHLER et al., 2003, MOHLER et al., 2005]. Mutationen im LQT4-Gen, welches
das Protein Ankyrin B kodiert, führen zur Long-QT-Krankheit, bei der es zu lebensbedrohlichen
Herzrhythmusstörungen kommen kann. Ein charakteristisches Merkmal ist die namensgebende
Verlängerung der QT-Zeit im Elektrokardiogramm (EKG). Die QT-Zeit ist die Zeitspanne des EKGs,
währenddessen der Herzmuskel elektrisch repolarisiert und in Vorbereitung für die nächste
Depolarisation relaxiert, was zur Kontraktion und zum Ausströmen des Blutes in die Hauptarterien führt.
Dieser Prozess beinhaltet die Inaktivierung der depolarisierenden Na+- und Ca2+-Kanalströme und die
Aktivierung der K+-Kanalströme. Mutationen in diesem Gerüst stören ebenfalls in extremer Weise das
Zusammenspiel der verschiedenen Ionen-Arten. Diese Fehlfunktion verursacht eine Verlängerung der
Repolarisationsphase des Aktionspotentials in Herzmuskelzellen und dadurch die Verlängerung der
QT-Zeit im Elektrokardiogramm. Die Ca2+-Homöostase unterliegt einer sorgfältigen Feinregulierung:
Durch das Ausströmen von Ca2+ kommt es zur Kontraktion der Zelle. Das eingeströmte Ca2+ wird durch
den Na+/Ca2+-Austauscher aus der Zelle befördert und im Antiport werden Na+-Ionen in die Zelle
transportiert. Na+-Ionen können dann wiederum über die Na+/K+-ATPase wieder aus der Zelle befördert
werden. Ankyrin B, der Na+/Ca2+-Austauscher, die Na+/K+-ATPase und der IP3-Rezeptor bilden einen
Multienzym-Komplex und sorgen auf diese Weise für ein exaktes Zusammenspiel, um elektrische
Diskussion
87
Erregungen von der Zelloberfläche ins Zellinnere weiterzuleiten. Hierbei wird deutlich, wie es zur
englischen Begriffsentstehung „Channelopathy“ bzw. „Calciumopathy“ kommt und welche Bedeutung
sie haben. Mutationen in allen bisher bekannten FHM-Genen zeigen solch einen prototypischen
neuronalen „Channelopathy-Phänotyp“. Da die Na+/K+-ATPase den Interaktionspartner einer Vielzahl
von Proteinen darstellt, können bereits sehr leichte Veränderungen an den beteiligten
Interaktionsstellen zu enormen pathologischen Ereignissen und Prozessen führen. Die nähere
Betrachtung diverser genetischer Modifikationen im ATP1A2-Gen und die hier dargelegten Kausalitäten
zwischen Mutationsart, elektrophysiologischer und struktureller Charakterisierung verdeutlichen die
Notwendigkeit weiterer systematischer Untersuchungen von Struktur-Funktions-Beziehungen. Das
Verständnis dieser Zusammenhänge steht an einem viel versprechenden Anfang.
Zusammenfassung
88
5 Zusammenfassung
Die aus drei verschiedenen Untereinheiten (α-, β-, γ-) aufgebaute Na+/K+-ATPase ist ein ubiquitäres
Membranprotein, das zu den P-Typ-ATPasen gehört und maßgeblich an der Bildung und Erhaltung des
Transmembranpotentials beteiligt ist. Als omnipräsente Ionenpumpe transportiert sie unter Verbrauch
eines ATP-Moleküls drei Natrium-Ionen aus der Zelle und im selben Zyklus zwei Kalium-Ionen ins
Zellinnere. Durch diesen aktiven Transport wird auch das Ruhepotential in Neuronen aufrechterhalten,
das kritisch für die Erregbarkeit ist. Mutationen in der Na+/K+-ATPase α-Untereinheit können
wesentliche Proteinfunktionen massiv beeinträchtigen. Von den bisher bekannten vier humanen
α-Untereinheiten sind die beiden Isoformen α2 und α3 mit neurologischen Erkrankungen assoziiert.
Während Mutationen in der Na+/K+-ATPase α3-Untereinheit zu der seltenen Erbkrankheit “Dystonie-
Parkinsonismus-Syndrom“ führen, kommt es bei genetischen Veränderungen in der α2-Untereinheit zu
einer autosomal-dominant vererbbaren Form der Migräne mit Aura, der “Familiären Hemiplegischen
Migräne“ des Typs II (FHM-2).
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss 14 migräne-relevanter Mutationen auf Struktur-Funktions-
Beziehungen der Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit untersucht. Überwiegend handelte es sich hierbei um
typische Punktmutationen, wobei auch je eine Deletions- und eine Frameshift-Mutation näher betrachtet
wurden. Die Auswahl der ATP1A2-Mutanten erfolgte nach ihrer Lokalisation in funktionell wichtigen
bzw. hochkonservierten Regionen der Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit.
Mit Hilfe des Expressionssystems der Xenopus laevis-Oozyten konnten die Konsequenzen der
unterschiedlichen Aminosäure-Austausche eingehend charakterisiert werden. Hierfür standen neben
elektrophysiologischen auch biochemische und spektroskopische Methoden zur Verfügung.
Ausgenommen von zwei ATP1A2-Mutationen konnten die übrigen erfolgreich in der Plasmamembran
nachgewiesen werden. Die beiden Mutationen S966X (Frameshift) und del(K935-S940)insI (Deletion)
befinden sich unmittelbar in der Nähe der C-terminal gelegenen Transmembrandomäne TM9 und
verursachen starke strukturelle Veränderungen, die dazu führen, dass ein verkürztes und nicht korrekt
in die Plasmamembran integrierbares Protein entsteht. Vier weitere FHM2-Mutationen (T263M, G301R,
T376M und R937P) wiesen ebenfalls keine stationären Pumpströme auf, trotz ihrer fehlerfreien
Integration in die Plasmamembran. Durch die strukturelle Veränderung in den hochkonservierten
Regionen ist die Na+/K+-ATPase-Funktion dieser Mutanten schwerwiegend beeinträchtigt. Anhand der
Na+/K+-ATPase-Kristallstruktur konnte gezeigt werden, dass hier essentielle Wasserstoffbrücken-
Netzwerke destabilisiert werden, die die Transportaktivität massiv beeinträchtigen.
Bei acht der untersuchten FHM2-Mutationen ließen sich diverse Parameter, wie Spannungswerte für
halbmaximale Ladungsverschiebungen, Wechselzahlen, sowie Na+- und K+-Affinitäten im Detail
Zusammenfassung
89
bestimmen. Nennenswert sind hierbei insbesondere die zwei Mutanten: P979L und X1021R. Die
Charakterisierung der P979L-Mutation führte zu der Erkenntnis, dass sie sich funktionell wie das
Wildtyp-Enzym verhält und keinerlei Abweichungen aufweist. Allerdings lässt sich diese Beobachtung
lediglich bei Xenopus laevis-Oozyten machen, die bei etwa 18°C kultiviert und analysiert werden. In
Säugerzellen, die bei einer Temperatur von 37°C wachsen und untersucht werden, zeigte sich, dass die
Mutation bei Körpertemperatur offensichtlich zu einem degradierten Protein führt.
Durch die FHM2-Mutation X1021R ist der C-Terminus um 28 Aminosäuren elongiert.
Elektrophysiologische Messungen ergaben ein vollkommen kontroverses Verhalten des veränderten
Proteins gegenüber dem Wildtyp. Die Addition von zusätzlichen Aminosäuren an den C-Terminus führt
zu gravierenden Veränderungen in der Natrium-Interaktion und der Spannungssensitivität. Strukturell
betrachtet leisten der C-Terminus und die zugehörige Switch-Region einen erheblichen Beitrag zur
Bildung der dritten Natrium-Bindungsstelle.
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114
Abbildungs- & Tabellenverzeichnis
Abbildungs- und Tabellenverzeichnisverzeichnis
115
7 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildungen
1.1 In die Plasmamembran integrierte Na+/K+-ATPase 02
1.2 Topologische Anordnung der drei Unreinheiten (α, β, γ) der Na+/K+-ATPase 06
1.3 P-Typ-ATPase-Struktur 07
1.4 Interaktionsschnittstelle zwischen der α- und β-Untereinheit 10
1.5 Schematische Darstellung der PlasmERosom-Region 14
1.6 Parallele Ansicht auf die Membran mit Einblick auf zwei Kationen-Bindungsstellen 17
1.7 Reaktionszyklus der Na+/K+-ATPase dargestellt im modifizierten Post-Albers-Schema 18
1.8 a Schematische Darstellung zweier Neuronen (prä- und postsynaptisch), dem dazwischen liegenden
Synaptischen Spalt und einer angrenzenden Astrozyte 27
1.8 b Schematische Darstellung zweier Neuronen (prä- und postsynaptisch), dem dazwischen liegenden
Synaptischen Spalt und einer angrenzenden Astrozyte 28
1.9 Schematische Darstellung der Na+/K+-ATPase und den bisher im Gen ATP1A2 humangenetisch
identifizierten Mutationen
30
1.10 Strukturelle Darstellung de Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit inklusive der FHM2- und SHM-
Mutationen 32
1.11 Schematisierte Darstellung der Na+/K+-ATPase und der im entsprechenden Gen ATP1A2
vorkommenden Mutationen
33
_______________________________________________________________________________
2.1 Weibliches Individuum der Spezies Xenopus laevis 37
2.2 Oozyten eines weiblichen Krallenfrosches im Stadium V 37
2.3 Schaltplan für eine Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC) 42
2.4 Angewendetes Spannungsprotokoll 42
2.5 Mit verschiedenen Kalium-Konzentrationen stimulierte Pumpströme bei einem Haltepotential 42
von -30 mV 43
2.6 Sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Kalium wurde ein Spannungsprotokoll mit 42
Pulsen von +60 mV bis -180 mV (in 20 mV-Schritten) durchlaufen 43
2.7 Mit dem Programm pClamp aufgezeichnete Stromantworten, die auf die entsprechenden 43
Spannungspulse folgten 44
_______________________________________________________________________________
Abbildungs- und Tabellenverzeichnisverzeichnis
116
3.1 Sequenzvergleich zwischen dem Wildtyp-Protein und den ATP1A2-Mutationen
del(K935-S940)insI, S966X und X1021R 47
3.2 Durch Zugabe von 10 mM Kalium induzierte stationäre Pumpströme 48
3.3 Normierte Rubidium-Aufnahme vom Wildtyp und dem Konstrukt X1021R 49
3.4 Ouabain-sensitive Differenzströme der Messungen in Gegenwart von 10 µM und 10 mM Ouabain 50
3.5 Repräsentativer Western Blot mit Proteinproben aus Plasmamembran- (PM) bzw. Totalmembran- 50
Präparationen (TM) 51
3.6 [K+]ext-abhängige Strom-Spannungs-Kennlinien der verschiedenen ATP1A2-Konstrukte und des 53
WT-Proteins 53
3.7 Spannungsabhängige K0.5-Werte von K+-stimulierten Pumpströmen 54
3.8 Aus transienten Strömen bestimmte apparente Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten und 54
Q/V-Kurven 56
3.9 Das Konstrukt X1021R im Vergleich zum Wildtyp 57
3.10 Repräsentative Arrhenius-Diagramme für das WT-Protein und die ATP1A2-Mutante P979L 61
3.11 Repräsentativer Western Blot mit Proben aus Ganzzell-Lysaten 62
3.12 Western Blots vorläufiger Untersuchungen der proteasomalen Inhibition mittels Lactacystin 63
_______________________________________________________________________________
4.1 Mit Hilfe von im Internet verfügbarer Software erstellte Vorhersagen über transmembranäre
Helices und ihre Topologie 68
4.2 Schematische Darstellung (oben) und Sequenz-Vergleich (unten) der Region TM7/TM8 der
humanen Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit 69
4.3 Strukturelle Darstellung der beiden über eine potentielle Wasserstoffbrücke (rot gestrichelt)
miteinander wechselwirkenden extrazellulären Schleifen der Transmembrandomänen 73
TM5/TM6 und TM7/TM8 70
4.4 T376 und die in einem Umkreis von 5 Å lokalisierten Aminosäuren mit den zugehörigen
Wasserstoffbrücken-Bindungen 73
4.5 Strukturelle Detail-Darstellung des Arg-937 und der entsprechenden Wasserstoffbrücken-
Bindungen zu den beiden Tyrosinen Y1019 und Y1020 74
4.6 In Netzwerken von Wasserstoffbrücken-Bindungen im Zentralbereich des Proteins involvierte 74
ATP1A2-Aminosäuren 75
4.7 Lokalisation von R383 in der Na+/K+-ATPase-Struktur 78
4.8 Die Faltung des Proteins Huntingtin in zwei verschiedene Amyloid-Konformationen 79
4.9 Reaktionszyklus der Na+/K+-ATPase 82
4.10 Wechselwirkungen des C-Terminus’ der humanen Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit (terminale 82
Tyrosine Y1019 und Y1020) mit den umliegenden Aminosäuren R937 und K770 83
_______________________________________________________________________________
Abbildungs- und Tabellenverzeichnisverzeichnis
117
Tabellen
1.1 Übersicht über die P-Typ-ATPasen 02
1.2 Die bisher charakterisierten sieben Proteine der FXYD-Familie und ihre Verteilung im Gewebe 12
1.3 Übersicht über die Klassifikation der Migräne einschließlich ihrer Subtypen aus der Ende 2003
erschienenen überarbeiteten Auflage der Internationalen Kopfschmerzgesellschaft (IHS) 21
1.4 Vier Gene, die entweder direkt oder indirekt mit hemiplegischer Migräne in Verbindung stehen,
einschließlich ihrer Lokalisation auf den entsprechenden Chromosomen 22
1.5 Während der Aura- bzw. Kopfschmerzphase auftretende Symptome 24
1.6 Bisher entdeckte FHM2- und SHM-Mutationen und ihre topologische Lokalisation 31
_______________________________________________________________________________
2.1 Vom Hersteller empfohlenes Zeit- und Temperaturprotokoll für ein transversal geheiztes 31
Graphitrohr 41
_______________________________________________________________________________
3.1 Mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme ermittelte K0.5-Werte für die 41
[K+]-Abhängigkeit der stationären Pumpströme in Gegenwart von 100 mM [Na+]ext 52
3.2 Aus transienten Strömen unter Na+/Na+-Austausch-Bedingungen ermittelte Eigenschaften 52
der ATP1A2-Mutanten 59
118
Danksagung
Danksagung
119
8 Danksagung
Ja, ja, Neslie und ihre Promotion!
Nach Abschluss meiner Diplomarbeit, damals an der Johannes Gutenberg-Universität in Mainz, nahm
ich mir vor, einen riesigen Bogen um die Promotion zu machen. Die Arbeit im Labor machte mir jedoch
so viel Spaß, dass ich mir vorstellen konnte anstelle dessen als Technische Assistentin zu arbeiten.
Gesagt, getan. So landete ich in der Arbeitsgruppe von Thomas Friedrich, die zur Abteilung
„Biophysikalische Chemie“ am Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt am Main gehörte. Die
Arbeit bereitete mir sehr viel Freude und recht bald bekam ich auch ein eigenes Projekt. So vergingen
die Tage, Wochen und Monate. Doch während dieser Zeit summierten sich die Anfragen von Herrn
Professor Ernst Bamberg, unserem Abteilungsleiter, und meines direkten Vorgesetzen Thomas
Friedrich. Sie deuteten immer wieder an, dass sie es mir durchaus zutrauen, eine Promotion in Angriff
zu nehmen und zu bewältigen. Und nun bin ich am Ende meiner Dissertation angelangt und stehe kurz
vor dem Abschluss des Promotionsverfahrens… Allerdings gab es zwischendurch eine Phase, in der
ich sehr stark an mir zweifelte und mich fragte, ob ich jemals den Doktortitel erlangen würde. Doch
Thomas Friedrich als „der beste Chef der Welt“ stand stets hinter mir und hat mir zu jeder Zeit
unterstützend zur Seite gestanden. Ich danke ihm für den unerschütterlichen Glauben an mich und
seine Unterstützung in allen Lebenslagen.
Charlie Chaplin (1889–1977) sagte einst: „An den Scheidewegen des Lebens stehen keine
Wegweiser“, doch das stimmt so nicht ganz. Denn es ist immer ein aufmerksamer Mensch da, der
einem mit seinen eigenen Erfahrungen hilft, eine Entscheidung zu treffen, die einem wieder auf den
richtigen Weg verhilft. Ein besonderer Dank gebührt an dieser Stelle ebenso Herrn Professor Bamberg,
der mich 2004 herzlich in seiner Arbeitsgruppe aufgenommen und mir ebenfalls auf den Promotionsweg
verholfen hat und nun als Gutachter das Promotionsabschlussverfahren miterleben wird..
Auf dem bisher steinigen Weg haben mich sehr viele Menschen sowohl in wissenschaftlicher
Hinsicht als auch in zwischenmenschlichen Aspekten begleitet und unterstützt. Um in chronologischer
Reihenfolge zu bleiben, sei zunächst meinen Frankfurter Kollegen gedankt: hierzu gehören Heidi
Bergemann, die gute Seele der Abteilung „Biophysikalische Chemie“. Sie hatte stets ein offenes Ohr
und stand mir jederzeit zu allen erdenklichen Themen mit Rat und Tat zur Seite: danke schön. Verena
Pintschovius danke ich für die liebevolle Einarbeitung in die Tätigkeiten einer TA. Rosemarie Schmidtell
und Solveigh McCormack danke ich für ihre gelegentliche Unterstützung in der Literatur-Recherche,
insbesondere der medizinischen Artikel, die ich ohne die Hilfe der beiden nicht hätte erhalten können.
Helga Volk danke ich herzlich für ihre kreative und farbige Unterstützung in Sachen Postergestaltung.
Herr Kussius und Herr Löhmann belieferten mich stets mit Paketen, die sie für mich angenommen
haben. Die Gruppenleiter Klaus Hartung, Klaus Fendler, Jürgen Rettinger, Phil Wood und die
Danksagung
120
Doktoranden, insbesondere meine roommates Eva Bongartz (Büro I), Taryn Kirsch (Büro I), Julia Spitz
(Büro II) und Christian Bamann (Büro II) verhalfen mir zu anregenden und aufschlussreichen
Gesprächen, sei es in wissenschaftlicher oder aber auch in persönlicher Hinsicht. Miriam Dörr danke ich
für die unzähligen leckeren Tees, die sie uns gekocht hat.
Vom ersten Satz der Rohfassung bis zum Ende der fertigen Dissertation war es ein langer Weg und
ich bin zutiefst dankbar, dass ich ihn nicht allein gehen musste, sondern mich in so wunderbarer
Gesellschaft befunden habe. Aber auch die Jahre zuvor begleitete mich Katharina Dürr, die sich ebenso
wie ich von Frankfurt/Main nach Berlin begeben hat, um ihre Doktorarbeit weiterzuführen. Mit ihr fühle
ich mich weit über das Wissenschaftliche hinaus verbunden und unsere gemeinsamen Aktivitäten in
beiden Städten sowie die gemütlichen Bürostunden in Berlin haben unsere Zeit während des
Promovierens ordentlich versüßt. Dazu gehören auch die unzähligen Überraschungs-Eier und auch
sonstigen Süßwaren in allen möglichen Variationen.
Neben meiner Bürofreundin Luise, gab es und gibt es nach wie vor zahlreiche liebe Menschen, die
mich während meiner Promotionsphase in Berlin begleiteten. Hierzu gehören Jennifer Langbein (meine
Konzertfreundin, die mich stets mit guter Musik belieferte), Jan Geißendörfer (unser Hahn im Korb und
mein Seelentröster während unserer Kaffee-Sessions), Kirstin Hobiger (der größten Frau, die ich
persönlich kenne, die es gut gemeistert bekommt Familie & Beruf zu vereinbaren), Wienke Lange
(meine Rock’n’roll-Queen, mit der ich am liebsten das Tanzbein schwinge), Susan Meier (die
„Sockenspitzenstopferin“ und meine ehemalige Diplomandin, der das Thema so gut gefiel, dass sie bei
uns geblieben ist, um auch zu promovieren), Ina Seuffert (meine Nachbarin, von der ich nur einen
Katzensprung entfernt bin, um unzählige gemeinsame Aktionen zu starten) Monika Weß und Sabine
Kussin (die beiden unermüdlichen TA’s), Herr Renger (mein persönlicher Updater bezüglich meines
Lieblingsvereins Mainz 05 und meinem „Baby“ der Na+/K+-ATPase), Steffen Sarstedt (der einen mit
allem versorgt hat, sei es Büromaterial, wie Toner und Hefter, oder News über die TU Berlin). Des
Weiteren danke ich den „Hildebrandt-Jungs“ David von Stetten, Steve Kaminski, Tillmann Utesch,
Miguel Saggu, Khoa Ly, Fransisco Escobar und der guten Seele von Peter Hildebrandt, nämlich Marina
Böttcher für die wunderbare Zeit hier im Max-Volmer-Laboratorium: DANKE! Zu dieser bunten Truppe
gehören natürlich zudem Dörte Di Fiore, Heidemarie Pannier, Athina Zouni, Peter Richter und Lars
Paasche.
Klemens Raithel danke ich für die erlebnisreichen sieben Jahre, die wir gemeinsam verbracht
haben, und für die unterstützende Entscheidung mit mir nach Berlin zu gehen.
Zu guter Letzt gilt mein tief empfundener Dank Prof. Peter Hildebrandt dafür, dass er sich als
Gutachter bereit erklärt hat und sich hierfür ein weiteres Mal mit dem „Friedrich’schen Protein“, der
Na+/K+-ATPase, auseinander setzen „muss“.
