Struktur-Wirkungsbeziehungen bei der enzymatischen
Hydrolyse von Carbonsäureestern
vorgelegt von
Diplom-Lebensmittelchemikerin
Verena Arnold
Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzende: Prof. Dr. rer. nat. Andrea Hartwig
Berichter: Prof. Dr. rer. nat. Lothar W. Kroh
Berichter: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Platzek
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 11.07.2005
Berlin 2005
D 83
Danksagung
Die vorliegende Arbeit entstand am Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), früher BgVV,
Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, Fachbereich
Toxikologie der Lebensmittel und Bedarfsgegenstände.
Ich danke Prof. Dr. rer. nat. Thomas Platzek vom BfR für die Bereitschaft, sich als Betreuer zur
Verfügung zustellen, das entgegengebrachte Vertrauen, die wertvollen Hinweise und seine
Diskussionsbereitschaft.
Prof. Dr. rer. nat. Lothar W. Kroh von der Technischen Universität Berlin danke ich herzlich für
die Übernahme der Begutachtung der Arbeit und seine konstruktiven, pragmatischen
Anregungen.
Den Kolleginnen und Kollegen aus dem gesamten Fachbereich 1 des BfR sei an dieser Stelle
für die freundliche Aufnahme und die stets angenehme, hilfsbereite Arbeitsatmosphäre gedankt.
Für das Zustandekommen dieser Arbeit danke ich Herrn Dr. Werner Grunow sowie Herrn Dr.
Christhard Böhme. Herrn Dr. Hans-Jürgen Altmann und Herrn Dr. Rainer Gürtler danke ich für
die Überlassung des Themas, ihre fachliche Diskussionsbereitschaft sowie die großzügige
Unterstützung in allen wissenschaftlichen und organisatorischen Fragen. Danke auch für die
finanzielle Unterstützung, ohne die diese Arbeit so nicht zustande gekommen wäre.
Ein besonderer Dank richtet sich an Regina Zimmermann für ihre unermüdliche Hilfe bei der
Bewältigung der zahlreichen Analysen und für ihre Kompetenz und Unterstützung in allen
praktischen Laborangelegenheiten. Regina Al-Hamwi danke ich für die Weiterführung der
praktischen Arbeiten und ihre kompetenten Literaturrecherchen. Ich danke Marlis Sagmeister
und Elisabeth Hering für ihren stets hilfsbereiten Einsatz bei der Plasmagewinnung. Jörg Herre
danke ich für seine permanente und schnelle Hilfe in allen Computerangelegenheiten. Dank
auch an Gitti Finke und Dora Wittke für die Hilfsbereitschaft und die aufmunternden Gespräche
über den Laboralltag hinaus.
Herzlichen Dank an alle Institutsangehörigen, die sich als Blutspender zur Verfügung gestellt
haben. Den Mitarbeitern des Betriebsärztlichen Dienstes sei herzlich für die kooperative
Unterstützung bei der Durchführung der zahlreichen Blutspenden gedankt.
Bei Herrn Dipl.-Ing. Scharna vom IVT der Universitätsbibliothek an der Technischen Universität
Berlin möchte ich mich für die umfangreichen Literaturrecherchen bedanken.
Ein besonders herzlicher Dank richtet sich an meine Eltern, die mich stets großzügig unterstützt
haben sowie an meinen Ehemann Andreas, der mit seinen Anregungen stets Motivation und
eine große moralische Stütze war.
I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................................V
Symbolverzeichnis .....................................................................................................................VII
Definitionen ...............................................................................................................................VIII
Abbildungsverzeichnis..................................................................................................................X
Tabellenverzeichnis..................................................................................................................XVII
Zusammenfassung....................................................................................................................XIX
1 Einleitung ....................................................................................................................... 1
2 Theoretische Grundlagen .............................................................................................. 3
2.1 Struktur und Reaktivität von Carbonsäureestern........................................................... 3
2.1.1 Allgemeines ................................................................................................................... 3
2.1.2 Qualitative Parameter .................................................................................................... 3
2.1.3 Quantitative Parameter.................................................................................................. 4
2.2 Klassifizierung esterspaltender Enzyme........................................................................ 5
2.3 Zum Metabolismus von Carbonsäureestern.................................................................. 6
2.4 Verlauf der enzymatisch katalysierten Esterhydrolyse ................................................ 10
2.4.1 Mikroskopische Betrachtung........................................................................................ 10
2.4.2 Phänomenologischer Ansatz ....................................................................................... 12
2.5 Pharmakokinetische Parameter................................................................................... 16
2.5.1 Spezifische Hydrolyseaktivität ..................................................................................... 16
2.5.2 Halbwertzeit ................................................................................................................. 17
2.5.3 Reaktionskinetik nach der Theorie von Michaelis-Menten........................................... 18
3 Aromastoffe in Lebensmitteln ...................................................................................... 23
3.1 Allgemeines ................................................................................................................. 23
3.1.1 Begriffsbestimmung ..................................................................................................... 23
3.1.2 Lebensmittelrechtliche Einordnung.............................................................................. 24
3.2 Toxikologische Bewertung........................................................................................... 24
3.2.1 Allgemeines ................................................................................................................. 24
3.2.2 Bewertungsprogramm der Europäischen Kommission................................................ 25
3.3 Literaturübersicht zu Hydrolysestudien........................................................................ 27
4 Problemstellung und Lösungsansätze......................................................................... 35
5 Ergebnisse................................................................................................................... 37
5.1 Zur Auswahl der Carbonsäureester und Herangehensweise ...................................... 37
5.2 Löslichkeit der Carbonsäureester im wässrigen Medium ............................................ 38
II
5.3 Plasmagewinnung ........................................................................................................44
5.4 Validierung der Methode ..............................................................................................48
5.4.1 Versuchsaufbau und Reagenzien ................................................................................48
5.4.2 Substratkonzentration...................................................................................................49
5.4.3 Clean up .......................................................................................................................50
5.4.4 Plasmapool und Lagerdauer ........................................................................................52
5.4.5 Generieren der Rohdaten.............................................................................................56
5.5 Pharmakokinetische Parameter ...................................................................................57
5.5.1 Allgemeines..................................................................................................................57
5.5.2 Berechnung der spezifischen Hydrolyseaktivität..........................................................57
5.5.3 Berechnung der Halbwertzeit .......................................................................................58
5.5.4 Berechnung der kinetischen Parameter nach Michaelis-Menten .................................58
5.5.5 Phenylacetat als Referenz mit schnellster Hydrolysierbarkeit......................................64
5.6 Vergleich verschiedener physiologischer Medien ........................................................65
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma................................................................67
5.7.1 Ethylester mit aliphatisch linear unverzweigtem Acylrest.............................................67
5.7.2 Ethyl- und Benzylester mit verzweigtem oder aromatischem Acylrest .........................75
5.7.3 Ester mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer Struktur ............86
6 Diskussion ....................................................................................................................93
6.1 Metabolismus und Risikobewertung.............................................................................93
6.2 Validierung und Methodik.............................................................................................94
6.3 Esterhydrolyse in verschiedenen biologischen Medien................................................97
6.4 Hydrolyse in Humanplasma..........................................................................................99
6.4.1 Ethylester mit aliphatisch linear verzweigtem und verzweigtem Acylrest.....................99
6.4.2 Ethyl- und Benzylester mit verzweigtem oder aromatischem Acylrest .......................101
6.4.3 Ester mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer Struktur ..........103
6.4.4 Bewertung der Hydrolysierbarkeit ..............................................................................104
6.4.5 Struktur-Wirkungsbeziehungen ..................................................................................109
6.4.6 Bewertung der Hydrolyseergebnisse..........................................................................111
6.5 Fehlerbetrachtung ......................................................................................................112
7 Ausblick ......................................................................................................................115
8 Experimenteller Teil....................................................................................................117
8.1 Allgemeines................................................................................................................117
8.2 Geräte.........................................................................................................................117
8.2.1 Tierhaltung..................................................................................................................117
8.2.2 Narkose ......................................................................................................................117
8.2.3 Gaschromatographie..................................................................................................118
III
8.2.4 Geräte zur Probenvorbereitung und Analyse............................................................. 118
8.2.5 Spektralphotometrie................................................................................................... 118
8.2.6 Probenarchivierung.................................................................................................... 119
8.3 Chemikalien und Materialien...................................................................................... 119
8.4 Prüfvorschriften.......................................................................................................... 121
8.4.1 Gewinnung von Rattenplasma................................................................................... 121
8.4.2 Gewinnung von Humanplasma.................................................................................. 121
8.4.3 Zum Umgang mit Blutplasma..................................................................................... 122
8.4.4 Allgemeine Durchführung eines Hydrolyseexperimentes .......................................... 123
8.4.5 Probenahme .............................................................................................................. 124
8.4.6 Probenaufarbeitung zur Analyse von Carbonsäureestern......................................... 124
8.4.7 Probenaufarbeitung zur Analyse von Esterhydrolyseprodukten................................ 124
8.4.8 Gaschromatographische Analyse.............................................................................. 125
8.4.9 Validierung................................................................................................................. 126
8.4.10 Proteinbestimmung.................................................................................................... 127
8.4.11 Bestimmung der Löslichkeit von Carbonsäureestern ................................................ 128
Literaturverzeichnis .................................................................................................................. 131
Anhang..................................................................................................................................... 149
I Eigenschaften und Verwendung von ausgewählten Carbonsäureestern .................. 149
II Messdaten und Validierungsparameter GC-Analytik................................................. 155
III Methodenvalidierung.................................................................................................. 161
IV Biologisches Material und pharmakokinetische Parameter ....................................... 163
Lebenslauf................................................................................................................................ 189
V
Abkürzungsverzeichnis
Ac Acetat
AC Allylcaproat
Acry acrylat (propenoat)
All Allyl (2-propen)
Am Amyl (n-pentyl)
BA Butylacetat
Benz Benzyl
BG Bestimmungsgrenze
BiB Benzylisobutyrat
BlutVol Blutvolumen
BPA Benzylphenylacetat
BS Benzylsalicylat
BT Benzyltiglat
But Butyl
Butyr butyrat
BW Blindwert
Cap caproat (hexanoat)
CEFS (engl.) Committee of Experts on Flavouring Substances
Cinn cinnamat (trans-3-phenylpropenoat)
COE (engl.) Council of Europe
Cyt Cytosol
Dec decanoat
EB Ethylbutyrat
EC Ethylcinnamat
EH Ethylheptanoat
EiV Ethylisovalerat
EM Ethylmyristat
EP Ethylpropionat
EPA Ethylphenylacetat
Erythr Erythrozyten
ES Ethylsalicylat
Et Ethyl
ET Ethyltiglat
EtPhen Ethylphenyl
EU Ethylundecanoat
EV Ethylvalerat
FAEE (engl.) fatty acid ethyl ester
FEMA (engl.) Flavoring Extract Manufacturer´s Association
FAO (engl.) Food and Agriculture Organization of the United Nations
FurylProp furylpropionat
HA Heptylacetat
Hep heptanoat
Hex hexanoat
i.v. (lat.) intravenous
VI
IAB Isoamylbutyrat
IAC Isoamylcaproat
IAiV Isoamylisovalerat
iAm iso-Amyl
iBut iso-Butyrat
IOFI (engl.) International Organisation of the Flavour Industry
iProp iso-Propyl
iVal isovalerat (isopentanoat)
JECFA (engl.) Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives
k. A. keine Angaben vorhanden
KHP Krebs-Henseleit-Puffer
KMF künstliche Magenflüssigkeit
Lau laurat (dodecanoat)
LDL (engl.) low density lipoprotein
Lin linoleat
LMKV Lebensmittel-Kennzeichnungsverordnung
MA Methylanthranilat
Me Methyl
MeAcry methylacrylat (methylpropenoat)
Mikr Mikrosomen
MO Methyloctanoat
MPA Methylphenylacetat
NWG Nachweisgrenze
PA Phenylacetat
Pel pelargonat (nonanoat)
Phen Phenyl
PhenAc Phenylacetyl
PhenEt Phenylethyl
PhenProp phenylpropionat
PL Plasma
PLE (engl.) pig liver esterase (Schweineleberesterase)
Prop propionat
Sali salicylat (2-hydroxybenzoat)
SCF (engl.) Scientific Committee on Food
SCOOP (engl.) Scientific Cooperation Working Group on Chemically Defined Flavouring
Substances of the Scientific Committee on Food of the EC
secBut sec-Butyl
tertBut tert-Butyl
Tigl tiglat (trans-2-methyl-2-butenoat)
ÜZ Übergangszustand
vgl. vergleiche
VO Verordnung
WHO (engl.) World Health Organisation
VII
Symbolverzeichnis
Fth [µm] Film Thickness (Filmdicke)
Ha [mol /min⋅g Protein] spezifische Hydrolyseaktivität
ID [mm] (engl.) Inner Diameter – Innendurchmesser
Km [mol /L] Michaelis-Menten-Konstante
lg - Logarithmus zur Basis 10
ln - Logarithmus zur Basis 2
log - Logarithmus
log PO/W Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient
mg 10-3 g Milligramm
mM 10-3 mol /L Millimol je Liter
mmol 10-3 mol Millimol
nmol 10-9 mol Nanomol
µmol 10-6 mol Mikromol
n
x
x
n
1i
i
∑
=
= arithmetisches Mittel, Mittelwert
n - Anzahl der Parallelexperimente
pKm - negativer dekadischer Logarithmus der Michaelis-Menten-
Konstante
ρ [g /cm³] Spezifische Dichte (bei einer Temperatur von 20°C)
R2 oder r2 Quadrat des Pearsonschen Korrelationskoeffizienten r Maß
für die lineare Abhängigkeit zwischen zwei Datensätzen,
dimensionslos und mit dem Wertebereich -1,0 ≤ r ≤ 1,0
(maximale Korrelation)
()
()
1n
xx
s
n
1i
2
i
−
−
=∑
= (engl.) standard deviation, empirische Standardabweichung
n
s
SEM = (engl.) standard error of the mean
S0 [mmol /L] Substratanfangskonzentration (Initialkonzentration)
sv [mg /L] Verfahrenstandardabweichung
vi [mol /min⋅g Protein] Initialgeschwindigkeit
Vmax [mol /min⋅g Protein] Maximalgeschwindigkeit
VK [%] Variationskoeffizient, relative Standardabweichung
i
x - einzelner Messwert
VIII
Definitionen
Halbwertzeit (t1/2) Die Halbwertzeit ist ein wichtiger pharmakokinetischer Parameter für
die Eliminationsgeschwindigkeit einer Substanz aus dem Körper und
definiert als die Zeit, innerhalb der die Hälfte des Substrats umgesetzt
ist.
Hydrolyseaktivität,
spezifische (Ha)
Die spezifische Hydrolyseaktivität ist definiert als die Steigerung der
Umsatzgeschwindigkeit des Substrates, die von einer bestimmten
Enzymmenge im Vergleich zur unkatalysierten Reaktion bewirkt wird
(Umsatzrate je Zeiteinheit und Proteinkonzentration).
hydrophil (griechisch) wasserliebend oder wasserlöslich;
Eine Eigenschaft von Molekülen, Wechselwirkungen mit polaren
Lösemitteln einzugehen. Die Löslichkeit hydrophiler Moleküle in
Wasser beeinflusst indirekt deren Verfügbarkeit in Lebensmitteln
sowie deren Ausscheidung über die Niere. Die Anordnung hydrophiler
Moleküle an Membranlipide bewirkt die Zusammenlagerung zu Lipid-
Doppelmembranen in wässriger Umgebung.
hydrophob (griechisch) lipophil oder fettlöslich,
Eine Eigenschaft von Molekülen, Wechselwirkungen mit unpolaren
Lösemitteln einzugehen. Hydrophobe Substanzen könne sich im
Körperfett anreichern und werden nach Metabolisierung über die
Niere ausgeschieden.
in vitro Hier enzymatische Reaktion im geschlossenen Reaktionssystem.
Experimente am isolierten Zellorgan oder in biologischen Flüssig-
keiten unter definierten Reaktionsbedingungen im Reagenzglas. Die
in vitro Reaktionen laufen ohne dynamische Wechselspiel zwischen
Zelle, Zellorganellen, Gewebe, Organ und Gesamtorganismus ab. Die
Enzyme sind frei in Lösung. Teilweise Inaktivierung der Enzyme
während des Reaktionsverlaufs. Die Substratkonzentration [S] ist
gegenüber physiologischen Bedingungen relativ hoch: [S] >> Ks
(Substratsättigung). Es kann in Abhängigkeit von der Versuchsdauer
zu einer Anhäufung der Reaktionsprodukte kommen.
in vivo Hier enzymatische Reaktion im offenen Reaktionssystem oder
Reaktionsbedingungen der lebenden Zelle. Experimente am
Gesamtorganismus, seinen Organen oder Zellen. Die Enzyme sind in
Kompartimenten und an Strukturen gebunden. Der Enzymbestand
wird ständig erneuert oder angepasst (Induktion oder Repression).
Das Substrate liegt in geringer Konzentration vor: [S] klein; [S] ≈ Ks
(beschränktes Substratangebot). Während des Substratumsatzes
erfolgt eine laufende Beseitigung der Reaktionsprodukte durch
andere Enzyme oder deren Abtransport.
IX
Km Michaelis-Menten-Konstante; wichtiges Maß für die Affinität eines
Enzyms oder Enzymsystems zu einem Substrat. Je höher Km , um so
höher muss die Substratkonzentration sein, damit die Reaktion mit
halbmaximaler Geschwindigkeit abläuft und desto geringer ist demzu-
folge die Substrataffinität.
Median Der Median oder Zentralwert ist definiert als der Wert, der die nach
der Größe geordnete Wertereihe in zwei gleich große Teile zerlegt.
Vmax Die Maximalgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion ist definiert
als eine nur theoretische erreichbare Maximalgeschwindigkeit nach
der Theorie von Michaelis-Menten.
X
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Metabolismus der kurz- und mittelkettigen Fettsäuren im Vergleich zu dem
der langkettigen (nach Jahreis & Bochmann, 1998) ...................................................7
Abb. 2: Oxidativer und nicht-oxidativer Ethanolmetabolismus beim Menschen (nach
Laposata, 1997) ..........................................................................................................8
Abb. 3: FAEE-Synthaseaktivität bei der Bildung von Ethylestern (nach Riley et
al., 1990) .....................................................................................................................9
Abb. 4: Schematische Darstellung der esterasekatalysierten Hydrolyse von
Carbonsäureestern (nach Quinn et al., 1999)...........................................................10
Abb. 5: Mechanismus der Esterhydrolyse durch Carboxylesterase EC 3.1.1.1 (nach
Satoh & Hosokawa, 1998).........................................................................................11
Abb. 6: Phänomenologische Betrachtung einer esterasekatalysierten
Esterhydrolyse...........................................................................................................13
Abb. 7: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit [v] von der
Substratanfangskonzentration [S] (nach Drauz & Waldmann, 1995)........................14
Abb. 8: Schema für die Ein-Substrat-Reaktion nach Michaelis-Menten................................14
Abb. 9: Heterogene Esterhydrolyse durch Lipasen nach Michaelis-Menten
(Quinn et al., 1999)....................................................................................................16
Abb. 10: Verlauf einer enzymkatalysierten Reaktion bei Substraten mit
unterschiedlicher Affinität (nach Drauz et al., 1995)..................................................20
Abb. 11: Procedure for the safety evaluation of flavouring agents (nach JECFA,
1996) .........................................................................................................................26
Abb. 12: in vivo und in vitro-Hydrolyse von Ethylacetat bei der Ratte (nach Gallaher &
Loomis, 1975)............................................................................................................29
Abb. 13: Einfluss der Acylkettenlänge auf pKm (•) und Vmax (▲) bei der Hydrolyse von
Methylestern durch Carboxylesterase aus Rattenlebermikrosomen (nach
Arndt & Krisch, 1973) ................................................................................................33
Abb. 14: Abhängigkeit von Vmax und Km von PLE Isoenzymen I und V von der
Acylkettenlänge bei der Hydrolyse von Methylestern (nach Junge &
Heymann, 1979)........................................................................................................33
Abb. 15: Einfluss der Alkylkettenlänge auf pKm (•) und Vmax (▲) bei der Hydrolyse von
Acetaten durch Carboxylesterase aus Rattenlebermikrosomen (nach Arndt
& Krisch, 1973)..........................................................................................................34
Abb. 16: Abhängigkeit von Vmax und Km von PLE Isoenzymen I und V von der
Alkylkettenlänge bei der Hydrolyse von Acetaten (nach Junge & Heymann,
1979) .........................................................................................................................34
Abb. 17: Substratübersicht für die enzymatische Hydrolyse in Humanplasma .......................37
Abb. 18: Referenzsubstanz Phenylacetat................................................................................38
XI
Abb. 19: Zusammensetzung von Krebs-Henseleit-Puffer im Vergleich mit Ratten- und
Humanplasma........................................................................................................... 39
Abb. 20: Löslichkeit von Ethylestern mit aliphatisch linear gesättigtem Acylrest sowie
Ethylisovalerat in Krebs-Henseleit-Puffer bei 37°C im Vergleich mit
Longland et al. (1977)............................................................................................... 41
Abb. 21: Löslichkeit von Ethyl- und Benzylestern in Krebs-Henseleit-Puffer bei 37°C
im Vergleich mit Longland et al. (1977) .................................................................... 41
Abb. 22: Löslichkeit von Estern mit identischer Summenformel und unterschiedlicher
chemischer Struktur sowie Isoamylcaproat (IACap) in Krebs-Henseleit-
Puffer bei 37°C (Messwerte) im Vergleich mit Longland et al. (1977) in
Wasser bei 37°C....................................................................................................... 42
Abb. 23: Schematische Darstellung der negativen Korrelation von Löslichkeit in
Krebs-Henseleit-Puffer (37 °C) und Hydrophobizität von Carbonsäureestern
log PO/W ..................................................................................................................... 43
Abb. 24: Löslichkeit in Krebs-Henseleit-Puffer (37 °C) und Hydrophobizität log PO/W
von Carbonsäureestern ............................................................................................ 44
Abb. 25: Proteingehalt von Rattenplasma verschiedener Pools............................................. 47
Abb. 26: Proteingehalt von Humanplasma verschiedener Pools............................................ 47
Abb. 27: Schematische Darstellung der säulenchromatographische Reinigung der
Probe aus biologischem Material.............................................................................. 48
Abb. 28: GC-Chromatogramm mit MN permabond FFAP-DF-0.25 (30m x 0,32 mm)
für Tiglinsäure und Benzylalkohol aus der Hydrolyse von Benzyltiglat in
Humanplasma (Plasmacharge: (h)020.504; S0 = 1,00 mM; ti = 30 min,
Interner Standard Pentansäure 12,58 ng/µl; Extraktionsmittel: Ethylacetat) ............ 51
Abb. 29: GC-Chromatogramme mit MN permabond SE-52-DF-0.25 (25m x 0,32
mm) für Undecan- und Phenylessigsäure aus der Hydrolyse von
Ethylundecanoat und Ethylphenylacetat in Humanplasma (Plasmacharge:
(h)020.504; S0 = 1,00 mM; ti = 30 min und 20 min, Interner Standard
Decansäure: 18,33 und 16,56 ng/µl; Extraktionsmittel: Ethylacetat) ........................ 52
Abb. 30: Substratumsatz von Phenylacetat in Rattenplasma Pool (r) 015.004,
1:100 verdünnt.......................................................................................................... 53
Abb. 31: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei Phenylacetat in
Abhängigkeit von der Lagerdauer bei –84°C............................................................ 54
Abb. 32: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma in Abhängigkeit von der
Lagerdauer ............................................................................................................... 54
Abb. 33: Spezifische Hydrolyseaktivität von Rattenplasma in Abhängigkeit von der
Lagerdauer ............................................................................................................... 55
Abb. 34: Hydrolyse von Ethylheptanoat in künstlicher Magenflüssigkeit und 1:100
verdünntem Rattenplasma........................................................................................ 56
XII
Abb. 35: Hydrolyseverlauf von Isoamylbutyrat in Humanplasma in Abhängigkeit von
der Initialkonzentration des Esters ............................................................................57
Abb. 36: Ableitung der Geschwindigkeitskonstanten aus der enzymatischen
Hydrolyse von Ethylvalerat in Humanplasma in Abhängigkeit von der
Initialkonzentration ....................................................................................................58
Abb. 37: Ableitung der Initialgeschwindigkeit für die Hydrolyse von Phenylacetat in
Humanplasma ...........................................................................................................59
Abb. 38: Lineweaver-Burk-Plot für die Hydrolyse von Phenylacetat in Humanplasma
als Funktion der Initialzeit..........................................................................................60
Abb. 39: Michaelis-Menten-Parameter für die Hydrolyse von Phenylacetat in
Humanplasma als Funktion der Initialzeit nach Lineweaver-Burk.............................60
Abb. 40: Linearisierungsverfahren für die Hydrolyse von Phenylacetat in
Humanplasma ...........................................................................................................61
Abb. 41: Cornish-Bowen-Plot für die Hydrolyse in Humanplasma ..........................................61
Abb. 42: Kinetische Parameter in Abhängigkeit von der Darstellungsform für die
Hydrolyse von Phenylacetat und Ethylphenylacetat in Humanplasma .....................62
Abb. 43: Lineweaver-Burk-Plot für die Hydrolyse von Ethylvalerat und Ethylisovalerat
in Rattenplasma in Abhängigkeit von der Plasma-Verdünnung................................63
Abb. 44: Michaelis-Menten-Parameter für die Hydrolyse von Ethylvalerat und
Ethylisovalerat in Rattenplasma in Abhängigkeit von der Plasma-
Verdünnung (nach Lineweaver-Burk)........................................................................64
Abb. 45: Hydrolyseaktivität künstlicher und physiologischer Körperflüssigkeiten bei
Ethyltiglat und Benzyltiglat ........................................................................................66
Abb. 46: Hydrolyseverlauf von Ethylestern mit aliphatisch linear unverzeigtem
Acylrest in Humanplasma..........................................................................................68
Abb. 47: Bildung von Valeriansäure bei der Hydrolyse von Ethylvalerat in
Humanplasma ...........................................................................................................68
Abb. 48: Bildung von Myristinsäure bei der enzymatischen Hydrolyse von
Ethylmyristat in Humanplasma..................................................................................69
Abb. 49: Spezifische Hydrolyseaktivität bei Ethylestern mit aliphatisch linear
unverzeigtem Acylrest in Humanplasma...................................................................70
Abb. 50: Bestimmung von Geschwindigkeitskonstanten aus der Hydrolyse von
Ethylestern in Humanplasma ....................................................................................71
Abb. 51: Halbwertzeit von Ethylestern mit aliphatisch linear unverzeigtem Acylrest
sowie Ethylvalerat in Humanplasma .........................................................................71
Abb. 52: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von Ethylestern in Humanplasma ........................72
Abb. 53: Maximalgeschwindigkeit und Vmax/Km der enzymatischen Hydrolyse von
Ethylestern in Humanplasma ....................................................................................73
Abb. 54: Michaelis-Menten-Konstante Km der enzymatischen Hydrolyse von
Ethylestern in Humanplasma ....................................................................................74
XIII
Abb. 55: Verlauf der Maximalgeschwindigkeit und dem negativen dekadischen
Logarithmus von Km (pKm) in Abhängigkeit von der Kettenlänge des
Acylrests von Ethylestern bei der Hydrolyse in Humanplasma ................................ 75
Abb. 56: Hydrolyseverlauf von Ethyl- und Benzylestern bei der Hydrolyse in
Humanplasma........................................................................................................... 76
Abb. 57: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei Ethyl- und
Benzylestern mit verzweigten oder aromatischem Acylrest ..................................... 76
Abb. 58: Bildung von Benzylalkohol bei der enzymatischen Hydrolyse von
Benzyltiglat in Humanplasma ................................................................................... 77
Abb. 59: Bildung von Tiglinsäure bei der enzymatischen Hydrolyse von Benzyltiglat in
Humanplasma........................................................................................................... 77
Abb. 60: Spezifische Hydrolyseaktivität von Ethyl- und Benzylestern mit verzweigtem
und/oder aromatischem Acylrest in Humanplasma .................................................. 78
Abb. 61: Halbwertzeit von Ethyl- und Benzylestern bei der Hydrolyse in
Humanplasma........................................................................................................... 79
Abb. 62: Halbwertzeit von Ethyl- und Benzylestern mit verzweigtem oder
aromatischem Acylrest in Humanplasma ................................................................. 79
Abb. 63: Halbwertzeit von Ethyl- und Benzylestern mit verzweigtem und/oder
aromatischem Acylrest in Humanplasma ................................................................. 80
Abb. 64: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von verschiedenen Ethyl- und
Benzylestern in Humanplasma................................................................................. 81
Abb. 65: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von Ethylvalerat und –isovalerat in
Humanplasma........................................................................................................... 82
Abb. 66: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von Ethyl- und Benzylphenylacetat in
Humanplasma........................................................................................................... 83
Abb. 67: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von Ethyl- und Benzyltiglat in
Humanplasma........................................................................................................... 83
Abb. 68: Maximalgeschwindigkeit und Vmax/Km bei der enzymatischen Hydrolyse von
Ethyl- und Benzylestern in Humanplasma................................................................ 84
Abb. 69: Michaelis-Menten-Konstante Km der enzymatischen Hydrolyse von Ethyl-
und Benzylestern in Humanplasma.......................................................................... 85
Abb. 70: Hydrolyseverlauf von Carbonsäureestern mit identischer Summenformel
und verschiedener chemischer Struktur in Humanplasma ....................................... 86
Abb. 71: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei Carbonsäureestern
mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer Struktur in
Humanplasma........................................................................................................... 87
Abb. 72: Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten k aus Hydrolyse von Estern
mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer Struktur in
Humanplasma........................................................................................................... 88
XIV
Abb. 73: Halbwertzeit von Carbonsäureestern mit identischer Summenformel und
verschiedener chemischer Struktur in Humanplasma...............................................89
Abb. 74: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von Estern mit identischer Summenformel
und verschiedener chemischer Struktur in Humanplasma........................................90
Abb. 75: Maximalgeschwindigkeit und Vmax/Km der enzymatischen Hydrolyse von
Estern mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer
Struktur in Humanplasma..........................................................................................90
Abb. 76: Maximalgeschwindigkeit und Vmax/Km bei der enzymatischen Hydrolyse von
Ethyl- und Benzylestern in Humanplasma ................................................................91
Abb. 77: Michaelis-Menten-Konstante der Hydrolyse von Estern mit identischer
Summenformel und verschiedener chemischer Struktur in Humanplasma ..............91
Abb. 78: Michaelis-Menten-Konstante Km für die enzymatische Hydrolyse von
Carbonsäureestern in Humanplasma......................................................................105
Abb. 79: Maximalgeschwindigkeit Vmax der enzymatischen Hydrolyse von
Carbonsäureestern in Humanplasma......................................................................105
Abb. 80: Vmax /Km für die enzymatische Hydrolyse von Carbonsäureestern in
Humanplasma .........................................................................................................105
Abb. 81: Hydrolysierbarkeit der untersuchten Carbonsäureester anhand der
Halbwertzeit in Humanplasma.................................................................................107
Abb. 82: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei der enzymatischen
Hydrolyse von Carbonsäureestern in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration im Vergleich zu Vmax ...............................................165
Abb. 83: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei der enzymatischen
Hydrolyse von Ethylestern in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration.................................................................................167
Abb. 84: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei der enzymatischen
Hydrolyse von Ethyl- und Benzylestern in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration.................................................................................168
Abb. 85: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei der enzymatischen
Hydrolyse von Carbonsäureestern mit identischer Summenformel und
verschiedener chemischer Struktur in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration.................................................................................169
Abb. 86: Halbwertzeit von Carbonsäureestern bei der enzymatischen Hydrolyse in
Humanplasma in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration..................171
Abb. 87: Halbwertzeit von Ethylestern bei der enzymatischen Hydrolyse in
Humanplasma in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration..................173
Abb. 88: Halbwertzeit von Ethyl- und Benzylestern bei der enzymatischen Hydrolyse
in Humanplasma in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration..............174
Abb. 89: Halbwertzeit von Estern mit identischer Summenformel und verschiedener
chemischer Struktur bei der enzymatischen Hydrolyse in Humanplasma in
Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration..............................................175
XV
Abb. 90: Spezifische Initialgeschwindigkeit vi, spez. in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration und Maximalgeschwindigkeit Vmax bei der
Hydrolyse von Carbonsäureestern in Humanplasma ............................................. 177
Abb. 91: Spezifische Initialgeschwindigkeit vi, spez. spezifische Hydrolyseaktivität Ha
sowie Maximalgeschwindigkeit Vmax bei der Hydrolyse von
Carbonsäureestern in Humanplasma..................................................................... 179
Abb. 92: Spezifische Hydrolyseaktivität Ha, spezifische Initialgeschwindigkeit vi,spez.
sowie Maximalgeschwindigkeit Vmax von Humanplasma bei der
enzymatischen Hydrolyse von Ethylestern in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration................................................................................ 181
Abb. 93: Spezifische Hydrolyseaktivität Ha, Spezifische Initialgeschwindigkeit vi,spez.
sowie Maximalgeschwindigkeit Vmax von Humanplasma bei der
enzymatischen Hydrolyse von Ethyl- und Benzylestern in Abhängigkeit von
der Substratanfangskonzentration.......................................................................... 182
Abb. 94: Spezifische Hydrolyseaktivität Ha , Spezifische Initialgeschwindigkeit vi, spez.
sowie Maximalgeschwindigkeit Vmax von Humanplasma bei der
enzymatischen Hydrolyse von Carbonsäureestern mit identischer
Summenformel und verschiedener chemischer Struktur in Abhängigkeit von
der Substratanfangskonzentration.......................................................................... 183
Abb. 95: Kinetische Parameter von Ethylestern bei der enzymatischen Hydrolyse in
Humanplasma......................................................................................................... 184
Abb. 96: Kinetische Parameter von Ethyl- und Benzylestern bei der enzymatischen
Hydrolyse in Humanplasma.................................................................................... 184
Abb. 97: Kinetische Parameter von Estern mit identischer Summenformel und
verschiedener chemischer Struktur bei der enzymatischen Hydrolyse in
Humanplasma......................................................................................................... 184
Abb. 98: Spezifische Hydrolyseaktivität Ha von Humanplasma bei der enzymatischen
Hydrolyse von Carbonsäureestern in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration................................................................................ 185
Abb. 99: Halbwertzeit t1/2 von Carbonsäureestern bei der enzymatischen Hydrolyse in
Humanplasma in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration ................. 186
Abb. 100: Spezifische Initialgeschwindigkeit vi, spez. von Carbonsäureestern bei der
enzymatischen Hydrolyse in Humanplasma........................................................... 187
XVII
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Auswahl der wichtigsten esterspaltenden Hydrolasen ............................................... 5
Tab. 2: Darstellungsformen zur grafischen Bestimmung von Km und Vmax ........................... 20
Tab. 3: Einteilung der Aromastoffe gemäß Anlage 1 Aromenverordnung ............................ 23
Tab. 4: Halbwertzeit von Carbonsäureestern und spezifische Hydrolyseaktivität von
künstlicher Magen- und Pankreasflüssigkeit sowie Rattenleber- und
Rattendünndarmmucosa-Homogenat bei 37°C (Longland et al., 1997)................... 28
Tab. 5: Spezifische Hydrolyseaktivität von Lungen- und Leber-Homogenat von
Phenylacetat und Amylacetat (nach Dahl, 1987)...................................................... 30
Tab. 6: Studien zur Hydrolysierbarkeit von Carbonsäureestern ........................................... 31
Tab. 7: Michaelis-Menten Parameter von Carbonsäureestern ............................................. 32
Tab. 8: Studien zur Hydrolysierbarkeit beim Menschen ....................................................... 33
Tab. 9: Löslichkeit von Carbonsäureestern in Krebs-Henseleit-Puffer (Messwerte)
im Vergleich mit Longland et al. (1977) in aqua dest. bei 37°C sowie dem
Octanol/Wasser- Verteilungskoeffizienten (log PO/W)................................................ 40
Tab. 10: Löslichkeit der untersuchten Carbonsäureester in Krebs-Henseleit-Puffer.............. 43
Tab. 11: Parameter zur Gewinnung von Humanplasma......................................................... 46
Tab. 12: Parameter zur Gewinnung von Rattenplasma.......................................................... 46
Tab. 13: Literaturangaben zum Proteingehalt von Ratte und Mensch.................................... 46
Tab. 14: Gegenüberstellung verschiedener Lösemittel für die Substratdotierung.................. 49
Tab. 15: Pharmakokinetische Parameter für Phenylacetat in Humanplasma......................... 65
Tab. 16: Reihenfolge der untersuchten Ethylester mit zunehmender
Hydrolysierbarkeit und Substrataffinität in Humanplasma...................................... 100
Tab. 17: Reihenfolge der untersuchten Ethyl- und Benzylester mit zunehmender
Hydrolysierbarkeit und Substrataffinität in Humanplasma...................................... 102
Tab. 18: Reihenfolge der zunehmenden Hydrolysierbarkeit und Substrataffinität bei
Estern mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer
Struktur ................................................................................................................... 103
Tab. 19: Kinetische Parameter nach Michaelis-Menten von Carbonsäureestern bei
der enzymatischen Hydrolyse in Humanplasma..................................................... 106
Tab. 20: Chemikalien............................................................................................................ 119
Tab. 21: Lösungen................................................................................................................ 120
Tab. 22: Verbrauchsmaterial................................................................................................. 121
Tab. 23: Substratzusatz für den Hydrolyseansatz ................................................................ 124
Tab. 24: Zeitpunkte der Probenahme nach Reaktionsstart .................................................. 124
Tab. 25: Temperaturprogramm für Carbonsäureester.......................................................... 125
XVIII
Tab. 26: Temperaturprogramm für Esterhydrolyseprodukte .................................................126
Tab. 27: Organoleptische Eigenschaften, Vorkommen und Verwendung von
Carbonsäureestern in Lebensmitteln ......................................................................149
Tab. 28: Verwendung von ausgewählten Carbonsäureestern in kosmetischen Mitteln........154
Tab. 29: Messdaten - Ethylester............................................................................................155
Tab. 30: Messdaten - Benzylester.........................................................................................157
Tab. 31: Messdaten – Methyloctanoat, Isoamylbutyrat, Phenylacetat ..................................158
Tab. 32: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der gaschromatographischen Analyse .......159
Tab. 33: Wiederfindungsrate der Analyten in Humanplasma und Krebs-Henseleit-
Puffer in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration ...............................160
Tab. 34: Zusammensetzung von Krebs-Henseleit-Puffer im Vergleich mit Ratten- und
Humanplasma .........................................................................................................161
Tab. 35: Hydrolyse von Ethylheptanoat in künstlicher Magenflüssigkeit...............................161
Tab. 36: Hydrolyse von Ethylheptanoat in 1:100 verdünntem Rattenplasma........................161
Tab. 37: Kinetische Parameter in Abhängigkeit von der Darstellungsform für
Phenylacetat in Humanplasma................................................................................162
Tab. 38: Kinetische Parameter in Abhängigkeit von der Darstellungsform für
Ethylphenylacetat in Humanplasma........................................................................162
Tab. 39: Kinetische Parameter für Phenylacetat in Humanplasma in Abhängigkeit
vom Tangentenanstieg............................................................................................162
Tab. 40: Initialgeschwindigkeit der enzymatischen Hydrolyse von Ethylvalerat und -
isovalerat in Rattenplasma in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration..............162
Tab. 41: Hydrolyseaktivität von Rattenplasma in Abhängigkeit von der Lagerdauer ............163
Tab. 42: Hydrolyseaktivität von Humanplasma in Abhängigkeit von der Lagerdauer ...........163
Tab. 43: Substratumsatz von Phenylacetat in Rattenplasma („frisch“; 1:100 verdünnt)
in Abhängigkeit von der Lagerdauer .......................................................................163
Tab. 44: Spezifische Hydrolyseaktivität künstlicher und physiologischer
Körperflüssigkeiten anhand von Ethyltiglat, Benzyltiglat und Phenylacetat ............163
Tab. 45: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei der enzymatischen
Hydrolyse von Carbonsäureestern in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration.................................................................................164
Tab. 46: Halbwertzeit von Carbonsäureestern bei der enzymatischen Hydrolyse in
Humanplasma in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration..................170
Tab. 47: Spezifische Initialgeschwindigkeit vi, spez. von Humanplasma bei der
enzymatischen Hydrolyse von Carbonsäureestern in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration.................................................................................176
XIX
Zusammenfassung
Die Hydrolysierbarkeit von Carbonsäureestern, die als Aromastoffe und als Bestandteile von
Lebensmittelverpackungsmaterial Bedeutung haben, spielt bei der toxikologischen Bewertung
dieser Substanzen eine wichtige Rolle. Das Ziel vorliegender Studie war es, allgemeine
Struktur-Wirkungsbeziehungen der enzymatischen Hydrolyse von Carbonsäureestern
abzuleiten.
Es wurden 15 Ester aus der ständig aktualisierten JECFA Flavouring Agents Database
(JECFA, 2002) mit charakteristischen und für Aromastoffe relevanten Strukturmerkmalen
ausgewählt: Ethylester mit linear unverzweigtem Acylrest verschiedener Kettenlänge (Ethyl-
propionat, -valerat, -heptanoat, -undecanoat und –myristat), Ethyl- und Benzylester mit
verzweigtem und aromatischem Acyl- oder Alkylrest (Ethylisovalerat, Ethyl- und Benzyltiglat,
Ethyl- und Benzylphenylacetat, Benzylsalicylat sowie Ethylcinnamat) sowie Ester mit identischer
Summenformel und verschiedener chemischer Struktur (Methyloctanoat, Ethylheptanoat und
Isoamylbutyrat).
Voraussetzung für die Metabolisierung eines Stoffes ist seine Verteilung im Körper. Daher
wurden in der ersten Projektphase die Löslichkeitseigenschaften der Ester beurteilt. Anhand der
Löslichkeit in Verbindung mit dem errechneten Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten
(log PO/W) konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Subtanzen hydrophobe Eigenschaften
besitzen.
In künstlicher Magenflüssigkeit, Rattenleberhomogenat sowie Ratten- und Humanplasma
wurden in vitro Experimente durchgeführt. Aus der Geschwindigkeit von Substratabbau und
Produktbildung wurden die pharmakokinetischen Kennzahlen spezifische Hydrolysierbarkeit,
Halbwertzeit und Michaelis-Menten-Parameter abgeleitet. Die Validierung zur Bestimmung der
Hydrolyseparameter erfolgte mittels Hydrolyse von Benzyltiglat, Ethyltiglat und Ethylheptanoat
sowie der Referenzsubstanz Phenylacetat in Rattenplasma. Dem wurde die Hydrolysierbarkeit
in Humanplasma, künstlicher Magenflüssigkeit und Leberhomogenat gegenübergestellt.
Erwartungsgemäß wurde in künstlicher Magenflüssigkeit die geringste Hydrolyseaktivität
bestimmt.
Rattenplasma hydrolysierte die Ester im Vergleich zu Humanplasma um den Faktor 7 bis 10
(Ethyltiglat) und 34 bis 51 (Benzyltiglat) schneller. Die höchste Hydrolyseaktivität besaß
Rattenleberhomogenat, welches Ethyl- und Benzyltiglat 600-mal und 350-mal schneller als
Rattenplasma hydrolysierte. Die speziesspezifischen Hydrolyseeigenschaften bei Mensch und
Ratte beruhen auf deren unterschiedlicher Carboxylesterase-Konstitution. Die Ratte besitzt im
Vergleich zum Menschen ein hohes Carboxylesteraselevel. Die beim Menschen höhere
Cholinesteraseaktivität trägt dagegen nur in einem geringen Maße zur hydrolytischen Spaltung
bei. Für die Einteilung der Substanzen nach ihrer Hydrolysierbarkeit wurden nur die Ergebnisse
der Studien mit Humanplasma herangezogen.
Ethylundecanoat-, –myristat und –cinnamat sowie Benzylsalicylat und –tiglat wurden in
Humanplasma langsam hydrolysiert. Die Elimination war nach ca. 4 bis 5 Halbwertzeiten
weitestgehend abgeschlossen. In Verbindung mit den hydrophoben Eigenschaften
(log PO/W > 2) muss jedoch davon ausgegangen werden, dass diese Substanzen längere Zeit im
Körper zirkulieren. Damit ist besonders im Fettgewebe eine Tendenz zur Anreicherung
gegeben.
XX
Die untersuchten Ester wurden bezüglich ihrer Hydrolysierbarkeit in drei Klassen eingeteilt,
wobei die Halbwertzeit (t1/2) und der Quotient aus Maximalgeschwindigkeit und Michaelis-
Menten-Konstante (Vmax/Km) als Kriterien herangezogen wurden. Dabei ergaben sich folgende
Klassen:
Klasse I: schnelle Hydrolysierbarkeit
Ethylvalerat
Isoamylbutyrat
Benzylphenylacetat
Phenylacetat (Referenzsubstanz)
Klasse II: mäßige Hydrolysierbarkeit
Ethylpropionat
Ethylheptanoat
Ethylisovalerat
Ethylphenylacetat
Klasse III: langsame Hydrolysierbarkeit
Ethylundecanoat und Ethylmyristat
Ethyltiglat
Benzyltiglat
Ethylcinnamat
Benzylsalicylat
In jeder Gruppe befinden sich Substanzen mit verschiedenen Struktureigenschaften, wie
aliphatische Ketten mit und ohne Verzweigungen, aromatische Ringe sowie Doppelbindungen
im Acylrest- und/oder Alkylrest.
Die Verlängerung des Acylrestes um ein oder zwei Methylgruppen führte zu einem signifikanten
Abfall der Hydrolysegeschwindigkeit und beeinflusst damit die Maximalgeschwindigkeit Vmax.
Nach einem mit zunehmender Acylkettenlänge verzeichneten Anstieg wurde der Maximalwert
für Vmax bei C5 (Ethylvalerat) ermittelt. Die weitere Verlängerung der Acylkettenlänge geht mit
einem Abfall von Vmax einher. Bei mehr als sieben Kohlenstoffatomen wurde die enzymatische
Umsatzrate primär von der steigenden Hydrophobizität und damit verringerten
Substratverfügbarkeit am reaktiven Zentrum behindert.
Die Kettenlänge des Alkylrestes beeinflusst die Michaelis-Menten-Konstante Km.
Carbonsäureester mit kurzkettigen Alkylresten (Cn < 6) besaßen im Vergleich zu längerkettigen
einen höheren Km-Wert. Eine Veränderung der Kettenlänge mit kurzkettigem Alkylrest bewirkte
eine signifikante Änderung der Initialgeschwindigkeit, da der geschwindigkeitsbestimmende
Schritt des SN2-Mechanismus, Bildung und Zerfall des tetrahedralen Intermediats, besonders
durch dessen Struktur beeinflusst wird.
Verzeigungen bei kurzkettigen Acylresten bewirkten keine signifikante Veränderung der
Hydrophobizität. Sie wirkten sich besonders sterisch hemmend auf die Hydrolysierbarkeit aus,
wenn sie sich in der Nähe des sp2-hybridisierten Carbonylsauerstoffatoms befinden. Dieser
Effekt wurde vornehmlich bei voluminösen Substituenten in α–Position beobachtet. Die
Abschirmung des reaktiven Zentrums ruft eine Verringerung der Geschwindigkeitskonstante
hervor.
XXI
Die intermolekulare Beweglichkeit der reagierenden funktionellen Gruppen ist somit
herabgesetzt und führt zu Spannungen bei der Bildung des Übergangszustandes. Die
Einführung von Verzweigungen in Estermoleküle wird als Parameter für eine erhöhte Toxizität
angesehen.
Die Einführung eines aromatischen Rings in Estermoleküle mit kurzkettigen Substitutenten
ohne Verzweigungen im Molekül beeinträchtigt die Hydrolysierbarkeit nicht. Arylester wurden
rasch durch im Plasma befindliche Arylesterase umgesetzt und daher im Vergleich zu Estern
mit kurzen Acyl- und Alkylresten vergleichsweise schnell abgebaut. Dieser Effekt überwog
deutlich die hervorgerufene Steigerung der Hydrophobizität durch aromatische Substituenten
gegenüber kurzkettig verzweigten oder kurzkettig unverzweigten.
Polare Gruppen, wie 2-Hydroxygruppen an aromatischen Ringen, setzten die Carbonylaktivität
der funktionellen Gruppe herab. Die erhöhte Polarität der Carbonylgruppe begünstigt eine
verstärkte Ausbildung einer Solvathülle, wodurch der Substratangriff allgemein erschwert wird.
Dieser Einfluss ist besonders stark in der Nähe des sp2-hybridisierten Carbonylsauerstoffatoms
ausgeprägt. Weiterhin setzten Sauerstoffatome im Substratmolekül durch Erhöhung der
Polarität des Substrates die Hydrolyseaktivität von Lipasen herab.
Der trans-2- oder trans-3-Doppelbindungen im Acylrest des Esters verringerten die
Hydrolyserate des Substrats signifikant. Sie bewirken eine voluminösere Ausdehnung des
Molekülrests und reduzieren dadurch die Bindungsbereitschaft bei der Bildung des Über-
gangszustandes. Zusätzlich wurde eine erhöhte Hydrophobizität hervorgerufen, die eine im
Wässrigen verringerte Substratkonzentration bewirkt.
Die untersuchten Ester mit identischer Summenformel und verschiedener chemische Struktur
unterschieden sich in der Hydrophobizität nicht. Die unterschiedlichen polaren Eigenschaften
von Acyl- und Alkylrest hoben sich bei inversen Estern auf. Die Verzweigung in C3-Position
befand sich im Alkylrest und damit an der carbonylfunktion-abgewandten Seite, sodass eine
Verringerung der Hydrolysierbarkeit nicht festgestellt wurde. Der gleichzeitig kurzkettige und
unverzweigte Acylrest (C4) bewirkte eine gegenüber den Vergleichssubstanzen (C7 und C8)
erhöhte Abbaurate.
Die unterschiedlichen strukturellen Eigenschaften zeigen, dass grundsätzlich eine schnelle
Hydrolyse von Carbonsäureestern in Blutplasma des Menschen nicht unterstellt werden kann.
Mit der Möglichkeit einer langsamen Hydrolyse muss gerechnet werden, wenn Substanzen mit
voluminösen Substituenten in der Nähe des sp2-hybridisierten Carbonylsauerstoffatoms (α–
Position) zu finden sind. Dazu zählen insbesondere Acylkettenlängen > 4 Kohlenstoffatome,
iso-, sec- oder tert-Funktionen, aromatische Ringe mit polaren Gruppen wie 2-Hydroxy-Gruppen
sowie trans-Doppelbindungen.
Die Extrapolation von Ergebnissen von der Ratte auf den Menschen in Bezug auf Blutplasma
insoweit möglich, als dass aufgrund der verschiedenen Enzymkonstitution bei der Ratte
grundsätzlich mit einer schnelleren Hydrolyse von Carbonsäureestern zu rechnen ist. Die am
schnellsten ablaufende Hydrolyse in Rattenleberhomogenat lässt den Schluss zu, dass auch
beim Menschen unhydrolysierter Ester über die Blutbahn in die Leber gelangt und dort rasch
abgebaut wird. Somit kann die toxikologische Bewertung der Substanzklasse Carbonsäureester
auch anhand der Hydrolyseprodukte vorgenommen werden.
1
1 Einleitung
Carbonsäureester finden als Aromastoffe und Bestandteile von Lebensmittelverpackungs-
material seit vielen Jahren breite Anwendung. Die toxikologische Bewertung dieser Substanzen
wird seit Jahrzehnten durch verschiedene internationale Gremien diskutiert. Hierbei stehen jene
Substanzen im Vordergrund, die bei der Herstellung von Lebensmitteln als Aromastoffe
verwendet werden. Bei der toxikologischen Beurteilung dieser Verbindungen spielt die
Hydrolysierbarkeit eine bedeutende Rolle.
Die Kriterien für die toxikologische Bewertung werden von verschiedenen internationalen
Komitees erarbeitet. Darunter sind Expertengremien wie das Joint FAO/WHO Expert Committee
on Food Additives (JECFA), das Committee of Experts on Flavouring Substances of the Council
of Europe (CE), das Scientific Committee for Food (SCF) der EU sowie internationale
Organisationen der Aromenindustrie wie die International Organisation of the Flavour Industry
(IOFI) in Europa und das Expert Panel of the Flavour and Extract Manufacturers Association of
the United States (FEXPAN).
Ein Ansatzpunkt ist die Fragestellung, ob a) grundsätzlich eine schnelle Hydrolyse von
Carbonsäureestern unterstellt werden kann oder ob b) auch mit der Möglichkeit einer
langsamen Hydrolyse gerechnet werden muss und ob c) die Hydrolysegeschwindigkeit anhand
der chemischen Struktur vorausgesagt werden kann oder ob dies im Einzelfall zu prüfen ist.
Bei vielen Estern ist nach der oralen Aufnahme in den Organismus mit einer schnellen
Hydrolyse im Verdauungstrakt zu rechnen, so dass die Bewertung auch anhand der
Hydrolyseprodukte möglich ist. Bisherige Untersuchungen haben allerdings gezeigt, dass die
hydrolytische Spaltung in einzelnen Fällen nur langsam verläuft und somit eine teilweise
Resorption der unveränderten Ester im Magen-Darm-Trakt nicht ausgeschlossen werden kann.
Dies wäre toxikologisch nur dann zu vernachlässigen, wenn in der Folge beim Durchtritt durch
die Schleimhaut, im Blut oder in der Leber eine rasche Hydrolyse erfolgen würde und die
gebildeten Alkohole und Carbonsäuren toxikologisch unproblematisch sind. Die
Geschwindigkeit der Hydrolyse durch in Geweben vorkommende Carboxylesterasen ist jedoch
bei den einzelnen Estern unterschiedlich und wird von deren chemischer Struktur beeinflusst
(Basak et al., 1997; Dahl et al., 1987; Grundschober, 1977; Longland et al., 1977; McCracken,
1993a; Savary & Constantin, 1970; Savary, 1972).
Im Fachbereich „Toxikologie der Lebensmittel und Bedarfgegenstände“ des Bundesinstituts für
Risikobewertung (früher BgVV, Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und
Veterinärmedizin) in Berlin werden seit 1998 Grundlagen zur Methodenentwicklung verschie-
dener in vitro Hydrolysestudien erarbeitet. Der Schwerpunkt dieser Dissertation liegt in der
Bewertung der enzymatischen Hydrolysierbarkeit verschiedener Carbonsäureester in Human-
und Rattenplasma durch Nachweis von Struktur-Wirkungsbeziehungen.
Es werden 15 Carbonsäureester aus 3 Strukturklassen ausgewählt: Ethylester mit linear unver-
zweigtem Acylrest verschiedener Kettenlänge, Ethyl- und Benzylester mit verzweigtem und/oder
aromatischem Acyl- und/oder Alkylrest sowie Ester mit identischer Summenformel und unter-
schiedlicher chemischer Struktur. Anhand der pharmakokinetischen Variablen spezifische
Hydrolyseaktivität, Halbwertzeit und Michaelis-Menten-Parametern sollen allgemeine Aussagen
zu chemischer Struktur und Hydrolysierbarkeit abgeleitet werden.
3
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Struktur und Reaktivität von Carbonsäureestern
2.1.1 Allgemeines
Carbonsäureester sind Carbonylverbindungen, deren Reaktivität auf der leichten Polarität ihrer
Carbonylgruppe beruht. Sie wird hervorgerufen durch den negativen induktiven Effekt des
Sauerstoffatoms. Die Carbonylgruppe besitzt am Kohlenstoffatom elektrophile und am
Sauerstoff nucleophile Eigenschaften. Die an die Carbonylfunktion gebundenen Acyl- und
Alkylgruppen bestimmen die Polarität (Carbonylaktivität) und damit die Reaktivität des Esters.
Im Vergleich zu anderen Carbonylverbindungen weisen Ester eine mittlere Carbonylaktivität auf.
Bei Abwesenheit eines Katalysators (Säure, Base oder Enzyme) zeigen sie im Wässrigen eine
träge Reaktionsbereitschaft. Die Nucleophilie des Wassers ist so gering, dass der erste Schritt
einer Solvolyse, die Addition des Nucleophils an des Carbonylkohlenstoffatoms, mit kaum
messbarer Geschwindigkeit abläuft.
Sauer oder alkalisch katalysierte Hydrolysen verlaufen dagegen rasch. Der Mechanismus
beider Solvolysearten ist in der Vergangenheit umfangreich untersucht worden (Loudon, 1988;
Streitwieser, 1994). March gibt eine anschauliche Klassifikation der acht möglichen
Mechanismen bei der alkalischen und sauren Esterhydrolyse. Es werden, in Abhängigkeit von
der Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur des Alkoholrestes, die Alkylspaltung (SN1- oder SN2-
Mechanismus) und Acylspaltung (SN1-Mechanismus oder Bildung eines tetraedrischen
Intermediats) unterschieden (March, 1985).
2.1.2 Qualitative Parameter
Polare Substituenteneinflüsse werden durch Elektronegativitätsunterschiede zwischen den Ele-
menten hervorgerufen und bestimmen so die Polarität der Bindung zwischen Substituent und
Carbonylkohlenstoffatom. Induktive (I-) Effekte treten zwischen Bindungen mit sp3-hybridisierten
Kohlenstoffatomen auf. Substituenten, die das Bindungselektronenpaar stärker anziehen als
das Wasserstoffatom, entfalten einen -I-Effekt, umgekehrt einen +I-Effekt. Faktoren wie Ladung,
Elektronegativität, Sättigungsgrad des Substituenten bestimmen die Stärke des Effektes.
Sind die Substituenten an sp²- oder sp-hybridisierte Kohlenstoffatome gebunden, so sind neben
σ- auch π–Bindungen betroffen. Hier treten zusätzlich Resonanzeffekte (M-Effekt) auf. Ihre
Größe wird neben Ladung und Elektronegativität vor allem durch die Fähigkeit des Substitu-
enten zur inneren Mesomerie bzw. Resonanz bestimmt. Elektronenakzeptor-Substituenten (-I-
und –M-Effekt) positivieren das Reaktionszentrum, stabilisieren Anionen und vergrößern die
Reaktionsgeschwindigkeit, wenn im geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Reaktion ein
Anion entsteht. Damit ist die Bereitschaft eines Angriffs durch nucleophile Reagenzien erhöht.
Sterische Effekte werden durch voluminöse Substituenten hervorgerufen und beeinflussen
vorwiegend in α–Position die Reaktivität der Carbonylfunktion (Barton et al. 1994). Mesome-
riehinderung tritt auf, wenn die an der Konjugation beteiligten Atome gehindert werden, in einer
Ebene zu liegen und damit der M-Effekt gemindert ist.
4 2 Theoretische Grundlagen
Wird das Reaktionszentrum durch benachbarte Substituenten sterisch abgeschirmt, verringert
sich die Geschwindigkeitskonstante (F-strain-Effekt). Der B-strain-Effekt beschreibt mit der
Beschleunigung bzw. die Vergrößerung der Geschwindigkeitskonstante durch sterische
Spannungen im Edukt einen entgegengesetzten Effekt, der vor allem auf der dem
Reaktionszentrum abgewandten Seite wirksam ist. Ein Maß für die ausgeübte Abschirmung ist
die sterische Substituentenkonstante Es. Je raumfüllender die Substituenten sind, um so
negativer wird Es und desto langsamer verläuft die Hydrolyse des entsprechenden Esters.
Damit steigt der Wert für die Freie Reaktionsenthalpie ∆H#, da Abstoßungskräfte auf dem Weg
zum Übergangszustand überwunden werden müssen; die freie Aktivierungsenthalpie ∆S# wird
negativer. Beide Parameter bewirken über die Gibbs-Helmholtz-Gleichung eine Erhöhung der
Freien Aktivierungsenthalpie ∆G#.
Der Einfluss des van der Waals Volumens wurde anhand der Hydrolyse von Ethylestern
diskutiert (DeTar, 1976 und 1976a; Moriguchi, 1977).
Nachbargruppeneffekte werden bei nucleophilen Substitutionsreaktionen, besonders bei Sol-
volysen, beobachtet. β-ständige Gruppen erhöhen im Vergleich zu unsubstituierten Verbind-
ungen die Reaktionsgeschwindigkeit (anchimere Beschleunigung), die bei Reaktionen am
Chiralitätszentrum häufig mit der Retention der Konfiguration einhergeht.
Stereo-elektronische Effekte treten insbesondere beim SN2-Mechanismus auf. Diese synchron
ablaufende Hydrolyse ist gekennzeichnet durch einen acyclisch aktivierten Komplex. Die Freie
Aktivierungsenthalpie ∆G# ist gering, wenn sich die Elektronen, die an der Produktbildung
beteiligt sind, von der austretenden Gruppe abgewandten Seite nähern.
Die Ausbildung von polaren oder ionischen Übergangszuständen kann bei nucleophilen Substi-
tutionsreaktionen durch Solvatation behindern werden. Die Struktur des Lösungsmittels
korreliert mit den Geschwindigkeitskonstanten von nach dem SN1-Mechanismus verlaufenden
nucleophilen Substitutionsreaktionen am gesättigten Kohlenstoff (Grunwald & Winstein, 1948).
2.1.3 Quantitative Parameter
Im Vordergrund der Betrachtungen steht die Theorie des Übergangszustandes. Der reaktivitäts-
bestimmende Parameter ist die Freie Aktivierungsenthalpie ∆G#. Sie bestimmt die Geschwindig-
keitskonstante einer chemischen Reaktion. Die Gesetze der chemischen Kinetik, wie Arrhenius-
und Eyring-Gleichung, beschreiben den Zusammenhang zwischen ∆G#, Freier Reaktions-
enthalpie ∆RH#, Aktivierungsenergie Ea und -entropie ∆S# sowie dem präexponentiellen Faktor
der Arrhenius-Gleichung (A). A steht dabei für sterische Anforderungen beim Aufbau des
Übergangszustandes (Ghanayem et al., 1985; Hansch & Leo, 1979; Wilson & Famini, 1991).
Der M-Effekt kann quantitativ mit Hilfe der Hammett-Gleichung beschrieben werden. Sie
beschreibt die lineare Abhängigkeit zwischen logarithmierter Geschwindigkeitskonstante und
Dissoziationskonstante einer chemischen Reaktion von para- oder meta-substituierten
Benzderivaten in bezug auf die unsubstituierte Verbindung (Hammett, 1937). Induktive Substitu-
entenkonstanten sind ein quantitatives Maß für den induktiven Effekt.
2.2 Klassifizierung esterspaltender Enzyme 5
Gemäß der Taft-Gleichung gilt, dass Reaktionen mit positiven Reaktionskonstanten durch
Substituenten mit -I-Effekt beschleunigt und mit +I-Effekt verlangsamt werden und
kennzeichnen den Einfluss α-ständiger Substituenten auf die Reaktivität aliphatischer
Verbindungen (Taft, 1952).
2.2 Klassifizierung esterspaltender Enzyme
Carboxylester spaltende Enzyme werden den Hydrolasen zugeordnet und werden gemäß dem
Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-
IUBMB, 2002) in der Enzym-Klasse EC 3.1 „Esterbindungen spaltende Enzyme“
zusammengefasst. Hydrolasen kommen beim Menschen und Säugetier ubiquitär in
verschiedenen Geweben und Körperflüssigkeiten vor. Sie weisen eine breite, sich oftmals
überschneidende Substratspezifität und hydrolytische Aktivität auf (Mentlein & Heymann, 1984;
Indou et al., 1980). Eine hohe Aktivität besitzen Leber, Niere, Blut, Gastrointestinaltrakt, Lunge,
Gehirn und Pankreas (Buchwald & Bodor, 2000; Satoh & Hosokawa, 1998; Silverman, 1999).
Wichtige Vertreter dieser Enzymklasse sind in Tab. 1 zusammengefasst.
Tab. 1: Auswahl der wichtigsten esterspaltenden Hydrolasen
Gruppe EC Nr. Systematischer Name
gemäß NC-IUBMB (2002)
Trivialnamen
(Auswahl)
Vorkommen Typische Substrate
Esterasen 3.1.1.1 Carboxylesterase unspezifische
Carboxylesterase,
Aliesterase,
B-Esterase
menschliche und
tierische Gewebe,
überwiegend in
Leber und Blut
aliphatische Ester mit
geringem Molekulargewicht;
xenobiotische Ester
3.1.1.2 Arylesterase Arylesterhydrolase,
A-Esterase
Plasma und
Erythrozyten
aromatische Ester
3.1.1.6 Acetylesterase Acetylesterase,
C-Esterase
menschliche und
tierische Gewebe
Acetylester
Lipasen 3.1.1.3 Triacylglycerollipase Lipase,
Triglyceridlipase
menschliche und
tierische Gewebe,
überwiegend in
Pankreas
Ester mit höherem Molekular-
gewicht; wasserunlösliche und
an Supramoleküle1
gebundene Fettsäureester;
Triglyceride; Lipidmobilisation
in Säugetierzellen; Hydrolyse
und Resorption von Fettsäu-
reestern aus der Nahrung in
den Blutkreislauf
3.1.1.13 Sterolesterase Cholesterylesterase,
Acetylcholinlipase
Pankreas und Leber Hydrolyse und Resorption von
Fettsäureestern aus der
Nahrung in den Blutkreislauf;
Lipoproteinmetabolismus;
Sterolester
3.1.1.34 Lipoproteinlipase Diglyceridlipase,
Clearingfaktor
menschliche und
tierische Gewebe,
Herz und adipöses
Gewebe
adipöse Aufnahme von
Fettsäuren; an Proteine
gebundene neutrale
Triglyceride
Cholin-
esterasen
3.1.1.7 Acetylcholinesterase Echte
Cholinesterase,
Cholinesterase I
menschliche und
tierische Gewebe,
neuronales Gewebe
und Erythrozyten
Acetylcholin; Acetyl-α-methyl-
cholin und andere Acetylester
3.1.1.8 Butyrylcholinesterase Pseudo- oder
unspezifische
Cholinesterase,
Cholinesterase II
menschliche und
tierische Gewebe,
Blutplasma
xenobiotische Ester im Blut,
Cholinester
Quelle: Quinn (1999), Schomburg & Salzmann (1991), Walker (1985), Williams (1985)
1 z.B. Lipoproteine, Eiweiße, Micellen, Membranen, intrazellulare Lipideinschlüsse
6 2 Theoretische Grundlagen
Die Esteraseaktivität von Proteinen am Beispiel von Albumin in Humanplasma gegenüber
Phenylestern beschreiben Means & Bender (1975), Ohta et al. (1983) sowie Rainsford et al.
(1980). Neben der Esterspaltung katalysieren Hydrolasen auch den enzymatischen Abbau von
Peptiden, Amiden und Halogeniden. Die Tatsache, dass diese Enzyme sowohl Ester- als auch
Nicht-Esterbindungen spalten können, weist auf die Problematik einer systematischen
Klassifikation hin.
Als veraltet gelten daher die von Aldridge (1953) und Augustinsson (1963) beschriebenen
Klassifizierungen. Sie werden der breiten und sich überlappenden Substratspezifität der
Esterasen nicht gerecht. Die Klassifikation nach Aldridge basiert auf der Interaktion von Enzym
und Organophosphaten. Dieser einfache Ansatz teilt die Esterasen in A-Esterasen (hydroly-
sieren Organophosphate), B-Esterasen (Inhibierung durch irreversible Phosphorylierung der
Serin-Hydroxyl-Gruppe im aktiven Zentrum) und C-Esterasen (keine Wechselwirkung) ein.
Augustinsson unterteilte die Hydrolasen in Aliesterasen (aliphatische Substrate), Arylesterasen
(aromatische Substrate) und Cholinesterasen (Cholinester).
Junge zeigte bereits 1973, dass eine eindeutige Unterscheidung zwischen Ali- und
Arylesterasen nicht möglich ist. Walker & Mackness (1989) diskutierten die Fragestellung, wie
aktiv die hydrolytische Aktivität eines Proteins sein muss, um als Esterase bezeichnet zu
werden. Sie empfehlen eine neuartige Einordnung, die auf den Eigenschaften der
aufgereinigten Enzyme in Verbindung mit ihrem Vorkommen in verschiedenen Spezies basiert.
Williams (1985) klassifizierte die Esterasen in Cholin-, Carboxyl- und Arylesterasen. Darüber
hinaus wird zwischen der Hydrolyse durch Carboxylesterasen (Arylesterasen und
Cholinesterasen) und Lipasen (Acetylesterasen und Acetylcholinesterasen) unterschieden. Eine
der jüngsten Esterase-Klassifizierungen stammt von Satoh & Hosokawa (1998). Sie legen drei
„Hauptfamilien“ für esterspaltende Enzyme fest: Phospholipasen (maximale Aktivität bei
neutralem pH-Wert sowie Aktivierung durch Calciumionen und Lewis-Säuren),
α
/
β
-Hydrolasen
(Serin-Esterase mit Serin, Histidin, Asparaginsäure oder Glutaminsäure im aktivem Zentrum)
sowie Säure-Lipasen (Lysosome der Zellen in Magenflüssigkeit, Maximalaktivität bei pH 2 bis 5,
Thiolfunktion von Cystein im reaktiven Zentrum). Die weiterführende Differenzierung anhand
von Unterfamilien basiert auf der Identifizierung der Aminosäuresequenz von Isoenzymen sowie
auf einer speziesabhängigen Unterteilung.
In den letzten Jahren hat sich in der Literatur die NC-IUBMB -Nomenklatur (2002) zu Recht
durchgesetzt. Sie verbindet eine numerische Systematik mit einer der Substratstruktur
entlehnten Bezeichnung und wird entsprechend in dieser Arbeit angewendet.
2.3 Zum Metabolismus von Carbonsäureestern
Der Metabolismus von exogenen Verbindungen hängt vom Aufnahmeweg der Substanzen ab.
Neben der Verwendung in Lebensmitteln werden Ester in kosmetischen Mitteln als duftgebende
Komponenten eingesetzt. Vorkommen und Verwendung der für diese Studie relevanten
Verbindungen zeigt Anhang I (Tab. 27 und Tab. 28). Carbonsäureester, die über kosmetische
Mittel auf die Haut gelangen, können durch die Epidermis diffundieren oder durch Schweiß-
drüsen und Haarbälge in den Organismus eindringen.
2.3 Zum Metabolismus von Carbonsäureestern 7
Das Haupthindernis dabei ist die Hornschicht der Oberhaut (Stratum corneum), die nur einen
geringen Wasseranteil besitzt und so vornehmlich für lipophile Verbindungen, wie etwa
Carbonsäureester, durchlässig ist. Wegen der Dicke der Hornhaut (ca. 10 µm) werden diese
Stoffe nur sehr langsam aufgenommen (Dekant & Vamvakas, 1994). Wir setzen in unserer
Studie voraus, dass die relevanten Verbindungen im wesentlichen über Nahrungsmittel, also
über den Magen-Darm-Trakt aufgenommen werden.
Carbonsäureester werden wie alle lipophilen Substanzen schlecht ausgeschieden. Nach der
Aufnahme werden sie größtenteils mit dem Blut über die Pfortader direkt zur Leber transportiert.
Die Epithelzellen der Darmwand und der Leber besitzen in hohem Maße die Fähigkeit,
Fremdstoffe umzuwandeln und abzubauen (first pass effect). Erst nach dem Passieren der
Leber gelangen die Stoffe oder ihre Stoffwechselprodukte über den Blutkreislauf zu den
verschiedenen Organen. Im Magen-Darm-Trakt erfolgt die Resorption über Membranen, die
primär für lipophile Substanzen passierbar sind. Der Transport in Blutkapillaren und Membranen
geschieht passiv entlang eines Konzentrationsgefälles und wird zusätzlich durch Poren und
Carriermoleküle erleichtert. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von Carbonsäureestern erfolgt
die Interaktion an Membranen hauptsächlich durch Serumalbumine und Lipoproteine (Bird et
al., 1996). Verschiedene enzymatische Systeme katalysieren die metabolische Umwandlung in
wasserlösliche Verbindungen, wodurch die Ausscheidung über den Harn beschleunigt wird.
Enzymatisch katalysierte Hydrolysereaktionen setzen den korrespondierenden Alkohol und die
Carbonsäure frei. Die wichtigsten freisetzenden Gewebe dabei sind Leber, Niere, Blut,
Gastrointestinaltrakt, Lunge, Gehirn und Pankreas (Buchwald & Bodor, 2000;
Satoh & Hosokawa, 1998; Silverman, 1999).
Abb. 1: Metabolismus der kurz- und mittelkettigen Fettsäuren im Vergleich zu dem der
langkettigen (nach Jahreis & Bochmann, 1998)
Hydrolasen werden der Phase I des Fremdstoffmetabolismus zugerechnet (Dekant &
Vamvakas, 1994; Schäfer & Marquardt, 2004). Die Esterhydrolyseprodukte werden nach dem
Durchlaufen des Phase II - Metabolismus ausgeschieden. Der Metabolismus des Acylrests ist
8 2 Theoretische Grundlagen
abhängig von der chemischen Struktur der jeweiligen Carbonsäure. Jahreis und
Bochmann (1998) beschreiben Transport und Resorption hydrophober, langkettiger Fettsäuren
(> 10 C-Atome) sowie kurz und mittelkettiger Fettsäuren (Abb. 1).
Im ersten Schritt werden Carbonsäuren von den freisetzenden Geweben an das Blut abge-
geben und an Serumalbumin gebunden. Nach der enzymatischen Aktivierung im Cytoplasma
werden die Fettsäuren der β–Oxidation in den Mitochondrien zugeführt. Linear geradkettig
unverzeigt gesättigte Fettsäuren werden dabei durch sukzessive Acetyl-CoA-Abspaltung
abgebaut, das anschließend dem Tricarbonsäurecyclus zugeführt wird. Bei ungeradkettigen
Fettsäuren verbleibt ein Propionyl-CoA, das in freies Succinat überführt wird und ein Intermediat
der Tricarbonsäurecyclus darstellt. Die Metabolisierung von ungesättigten Fettsäuren mit cis-
Konfiguration erfordert die reversible Umlagerung durch Enoyl-CoA-Isomerase.
Kurz- und mittelkettige Fettsäuren werden unverestert zur Leber transportiert und dort Carnitin-
unabhängig oxidiert, woraus eine schnelle Plasmaclearance resultiert. Langkettige Fettsäuren
werden dagegen in Darmzellen zu Triglyceriden umgesetzt. Sie gelangen durch Assoziation mit
Chylomikronen über die Lymphe in die Leber. Nach partieller Oxidation wird der Hauptteil in
Lipoproteinen reassimiliert und zwecks Deposition im Fettgewebe gespeichert (Abb. 1).
Ein Schwerpunkt unserer Studie ist die Bewertung der Hydrolysierbarkeit verschiedener
Fettsäureethylestern (FAEE), die als Aromastoffe eingesetzt werden. Sie stellen wichtige
endogene Stoffwechselprodukte des oxidativen und non-oxidativen Ethanolstoffwechsels dar
(Abb. 2). In der Regel findet der oxidative Weg über die Acetat- und weiter Acetyl-CoA-Bildung
statt. Letzteres wird anschließend zur Energiegewinnung in den Tricarbonsäurecyclus
eingeschleust. Die Phosphatidylethanol-Bildung über den beschriebenen nicht-oxidativen Weg
ist als Alkoholismus-Marker bei übermäßigem Alkoholkonsum von Bedeutung und wird an
dieser Stelle nur der Vollständigkeit halber erwähnt (Aleryani, 1996; Gorski, 1996; Haber, 1993).
Heute werden FAEE als Ursache alkoholinduzierter Organschäden vor allem an Pankreas,
Leber und Herz angesehen. Schädigungen können durch Einlagerung von FAEE in biologische
Doppelmembranen eine Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung auslösen, zur Erhöhung
der Lysosomenfragilität beitragen sowie die Hemmung der Proteinsynthese und
Zellwucherungen bewirken (Lange, 1981; Hungund et al., 1988; Gorski, 1996; Haber, 1993;
Hungund, 1988; Laposata, 1999).
Abb. 2: Oxidativer und nicht-oxidativer Ethanolmetabolismus beim Menschen (nach Laposata,
1997)
2.3 Zum Metabolismus von Carbonsäureestern 9
Als Acylrest für endogen gebildete Ethylester wurden überwiegend Öl-, Palmitin- und Stearin-
säure, in geringerer Konzentration Linol- und Arachidonsäure nachgewiesen (Bernhardt et al.,
1996; Bird et al., 1999; Dan & Laposata, 1997; Doyle et al., 1994 und 1996). Die Präferenz zur
Synthese von Ethylestern mit Öl- und Linolsäure im Acylrest wurde von Hungund et al. (1988)
beschrieben. Besonders nach erhöhtem Alkoholkonsum werden FAEE durch Wirkung spezifi-
scher Synthasen und unspezifischer Esterasen aus Ethanol, freien Fettsäuren, Phospholipiden
und Triglyceriden gebildet (Saghir et al., 1999).
FAEE sind stark lipophile Verbindungen, die eine geringe Löslichkeit im wässrigen Medium
besitzen. Sie zirkulieren überwiegend an Phospholipide (LDL), Triglyceride, Cholesterinester
oder in geringerem Maße an Albumin gebunden im Blutkreislauf (Doyle et al., 1994; Laposata et
al., 1995; Szczepiorkowski et al., 1995; Teruya et al., 1995). Auf zellulärer Ebene wurden
Wechselwirkungen zwischen Ethylestern und Zellmembranen nachgewiesen. Die dabei stattfin-
dende Ausrichtung des polaren Alkylrestes hin zum wässrigen Medium gewährleistet eine
Orientierung der Estercarbonylfunktion in die für Esterasen favorisierte Position, so dass die
esterasekatalysierte Hydrolyse an der Lipid-Wasser-Grenzfläche stattfinden kann (Bird et al.,
1999). Neben den Isoformen der cytosolischen und mikrosomalen FAEE-Synthase besitzen die
unspezifische Lipoprotein-Lipase, Carboxylesterase, Carboxylester-Lipase und Cholesterin-
Lipase Synthaseaktivität. Sie sind überwiegend in Leber, Pankreas, Fettgewebe, verschiedenen
Hirnregionen und Leucozyten lokalisiert (Aleryani et al., 1996; Gorski, 1996; Laposata, 1999;
Manautou & Carlson, 1991). Für hochgereinigte FAEE-Synthase beim Menschen wurde eine
spezifische Aktivität von 40 ± 2,5 µmol /min.g Protein nachgewiesen (Riley et al., 1990). Abb. 3
zeigt eine mit zunehmender Carbonsäure-Konzentration zunehmende FAEE-Synthaseaktivität
des hochgereinigten Enzyms. Ein Abfall der Enzymaktivität wurde nach dem Erreichen der
optimalen Substratkonzentration für Linolen- und Ölsäure ab ca. 1 mM beobachtet.
Abb. 3: FAEE-Synthaseaktivität bei der Bildung von Ethylestern (nach Riley et al., 1990)
(●) Linolensäure; (Ο) Ölsäure, (■) Arachidonsäure, (∆) Palmitinsäure, (▲) Stearinsäure; Reaktionsbedingungen: 37°C, 1.5 M
Ethanol in Phosphat-Puffer (60 mM; pH 7,2)
Weibliche Probanden zeigten gegenüber männlichen bei identischer Ethanol-Aufnahme eine
signifikant höhere endogene FAEE-Konzentration (Soderberg, 1999). Diese geschlechts-
spezifischen Unterschiede beruhen auf dem bei Frauen verminderten first-pass-Metabolismus,
woraus ein erhöhter Transport von Ethanol vom Gastrointestinaltrakt ins Blut resultiert. Die
10 2 Theoretische Grundlagen
Wiederveresterung der freien Fettsäuren (FFA) zu Phospholipiden und Triglyceriden erfolgt im
Körper für gewöhnlich rasch; nach ca. 3 Stunden waren 90 % der FFA umgesetzt
(Szczepiorkowski et al., 1995). Hungund et al. (1995) ermittelten in Rattenplasma für
Ethyllineoat nach 10 min eine in vivo und in vitro Umsatzrate von 75 % und 99 %. FAEE werden
auch im adipösen Gewebe gespeichert und schrittweise in den Blutkreislauf abgegeben. Auf
diese Weise können Fettsäureethylester längere Zeit im Körper zirkulieren (Saghir et al., 1997).
Laposata et al. (1989) bestimmten im Fettgewebe von Ratten eine Halbwertzeit von 16 ± 1,6
Stunden.
Verschiedene Studien zeigen eine Korrelation von Ethanolaufnahme und FAEE-Synthese. Die
in vivo Studie von Dan & Laposata 1997 illustriert die FAEE-Bildung beim Menschen. Die
Ethanolaufnahme bis zu einer Konzentration im Vollblut von 0,12-0,15 g% (26-33 mM) führte zu
einer mittleren FAEE-Konzentration von 1,8 µM FAEE im Serum. Doyle et al. (1994 und 1996)
stellten 2 Stunden nach der Ethanolaufnahme (0,07 - 0,10 g% Vollblut) eine FAEE-Konzentra-
tion von durchschnittlich 0,30 µM im Blut fest. Die Ethanolaufnahme durch Probanden bis zu
einer Konzentration von 26-32 mmol/L Vollblut führte nach 100 min zu einer maximalen Serum-
FAEE-Konzentration zwischen 1,25 und 3 µM. In Humanserum wurde in vivo für FAEE eine
Eliminations-Halbwertzeit von 173 min sowie eine terminale Halbwertzeit von 693 min bestimmt.
2.4 Verlauf der enzymatisch katalysierten Esterhydrolyse
2.4.1 Mikroskopische Betrachtung
Der mikroskopische Ansatz befasst sich mit der Beschreibung von mechanistischen und
intermolekularen Aspekten beim Ablauf einer enzymkatalysierten Reaktion. Die nichtenzy-
matische und säurekatalysierte Esterspaltung verläuft in Abhängigkeit von der Molekülstruktur
als nucleophile Substitutionsreaktion unter Acyl- oder Alkylspaltung (Abb. 4). Die chemische
Struktur der Acyl(R1)- und Alkyl(R2)-Reste des Esters bestimmen den Ablauf der Hydrolyse als
mono- (SN1) oder bimolekulare (SN2) nucleophile Substitution.
Abb. 4: Schematische Darstellung der esterasekatalysierten Hydrolyse von Carbonsäureestern
(nach Quinn et al., 1999)
2.4 Verlauf der enzymatisch katalysierten Esterhydrolyse 11
Vom Methyl- zum tert-Butylsystem im Alkyl-Rest wächst die Tendenz zur SN1-Reaktion unter
Spaltung der Alkyl-Sauerstoff-Bindung. Im Übergangszustand (ÜZ) erfolgt hier die Bildung eines
Acylium-Ions. In entgegengesetzter Richtung steigt die Tendenz zur Spaltung der Acyl-
Sauerstoff-Bindung unter Bildung eines tetrahedralen Intermediats. Dieser SN2-Mechanismus
läuft bevorzugt bei primären oder sekundären Alkyl-Resten ab. Unabhängig von strukturellen
Eigenschaften der Substituenten muss berücksichtigt werden, dass beim natürlichen
Metabolismus exogener oder endogener Estermoleküle tertiäre Alkyl-Reste nur von
untergeordneter Bedeutung sind (Baton & Ollis, 1979; Beyer & Walter, 1984; March, 1985;
Trotta, 1995).
Mechanistische Aspekte der esterasekatalysierten Hydrolyse wurden anhand verschiedener
Modelle interpretiert, die im Zusammenhang mit der nichtenzymatischen Säurekatalyse zu
betrachten sind und Grenzfälle darstellen. In der Zelle findet ein Mechanismus statt, der als
Mischform der beschriebenen Reaktionsverläufe anzusehen ist. Intermolekulare Aspekte der
Hydrolyse wurden nach Quinn et al. (1999) als Acyl-Enzym-Mechanismus dargestellt. Die
Reaktion verläuft gemäß Abb. 5 in drei aufeinander folgenden Stufen: nichtkovalente Enzym-
Substrat-Bindung, Acylation und Deacylation (Williams, 1989; Greenzaid, 1971).
Abb. 5: Mechanismus der Esterhydrolyse durch Carboxylesterase EC 3.1.1.1 (nach Satoh &
Hosokawa, 1998)
12 2 Theoretische Grundlagen
Der substantielle Nachweis von Acylierung und Deacylierung wurde erstmals durch Froede und
Wilson (1984) geführt. Beide Reaktionsstufen durchlaufen den energiereichen Über-
gangszustand des tetrahedralen Intermediats, der in der Regel mit gleichen Anteilen am
geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Gesamtreaktion beteiligt ist (McClelland, 1983;
Niyaz Khan, 1982). Das reaktive Zentrum der Esterasen stellt eine hydrophobe Tasche dar,
deren Aminosäuren in einer stark apolaren Umgebung eingebettet sind, so dass die Reaktion
praktisch im wasserfreien Milieu abläuft.
Abb. 5 zeigt, dass die katalytische Wirksamkeit auf der Funktion der Aminosäuren Serin-
Glutaminsäure-Histidin in Verbindung mit vier Cystein-Resten, welche die spezifischen Disulfid-
Brücken ausbilden, beruht (Buchwald & Bodor, 1999; Provencher et al., 1994 und 1994a;
Toone et al., 1990). Bildungs- und Zerfallsgeschwindigkeit werden durch induktive und sterische
Effekte sowie durch die Hydrophobizität der Abgangsgruppe bestimmt (Järv et al., 1976). Im
ersten Reaktionsschritt des konzertiert ablaufende Mechanismus findet eine
Protonenübertragung vom Serin (Ser203) auf den Histidinrest (His448) statt. Der damit
verbundene nucleophile Angriff am Carbonylkohlenstoff des Esters führt zur Ausbildung des
tetrahedralen Intermediats. Der Übergangszustand wird dabei durch die elektrostatische
Wechselwirkung zwischen dem Carboxylat-Anion und dem Imidazol-Kation am Histidin-Rest, in
Verbindung mit Wasserstoffrückenbindung zu peptidischen Glycinresten (Gly123 und Gly124)
stabilisiert. Aus dem tetrahedralen Intermediat bildet sich der Acyl-Enzym-Komplex, indem der
protonierte Histidinrest ein Wasserstoffatom abgibt und im Anschluss der Alkohol als erstes
Hydrolyseprodukt abgespalten wird (Acylation). Die Deacylation führt unter dem Einfluss eines
Wassermoleküls über einen inversen Weg zur Abspaltung der Carbonsäure.
Starke Abgangsgruppen bedingen den konzertierten Verlauf des Protonentransfers sowie die
Bildung der neuen Carbonylfunktion (Lensink, 1999). Serin und Histidin fungieren als nucleo-
philes säure-base-katalysierendes Element. Wasser kann als Reaktionsmedium Substrat und
Produkt gleichermaßen sein. Es ist an der Ausbildung aller nicht-kovalenten Bindungen
beteiligt. Sein pH-Wert stabilisiert die charakteristische Proteinstruktur des Enzyms. Wasser
stört gleichermaßen die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen, garantiert die
Reagenzdiffusion und ist beteiligt an der Einstellung der Gleichgewichtskonstanten der
chemischen Reaktion (Goldberg, 1990).
2.4.2 Phänomenologischer Ansatz
Die phänomenologische oder auch makroskopische Betrachtung des Reaktionsverlaufes lässt
mechanistische Aspekte während des Reaktionsablaufs außer acht. In Abhängigkeit von der
Molekularität und Reaktionsordnung der enzymatischen Reaktion werden theoretische Größen
zur Beschreibung der Reaktionsgeschwindigkeit abgeleitet.
Die Molekularität beschreibt die Anzahl der Moleküle, die an der Bildung des aktivierten
Komplexes beteiligt sind bzw. die Anzahl der Moleküle, die miteinander reagieren müssen,
damit das Reaktionsprodukt entsteht. Die Reaktionsordnung leitet sich aus der Stöchiometrie
der Gesamtreaktion in Verbindung mit dem Zeitgesetz ab, welches die beste Näherung des
Konzentrations-Zeit-Verlaufs beschreibt. Aus der Stöchiometrie gemäß Abb. 4 geht hervor, dass
Wasser als Lösemittel an der Gesamtreaktion und an der Ausbildung der Solvathülle des akti-
2.4 Verlauf der enzymatisch katalysierten Esterhydrolyse 13
vierten Komplexes beteiligt ist. Wasser liegt in großem Überschuss vor; seine Konzentration
bleibt während des gesamten Reaktionsverlaufs praktisch konstant.
Die esterasekatalysierte Esterspaltung ist somit eine Einsubstrat-Reaktion pseudomono-
molekulare Reaktion erster Ordnung, bei der aus einem Substrat zwei Produkte entstehen
(Buddecke, 1994; Holzhauer, 1995). Reaktionen erster Ordnung sind gekennzeichnet durch die
direkte Proportionalität der Reaktionsgeschwindigkeit (dS/dt) zur Konzentration der
Ausgangsstoffe (S).
tk
dt
dS ⋅−= S(t) Substratkonzentration zu einer beliebigen Zeit t
k Geschwindigkeitskonstante der Reaktion
t Reaktionszeit
Durch Integration lässt sich bei bekannter Ausgangskonzentration (S0) zum Zeitpunkt t = 0
(Startzeitpunkt) die Konzentration zu einem beliebigen Zeitpunkt (t) ermitteln.
∫∫ =−
t
t
S
S0
0
dtk
S
dS
kt
S
S
ln
0
=−
S0 Substratkonzentration zum Zeitpunkt t0
t0 t = 0 (Startzeit der Reaktion)
Die Delogarithmierung des Integrationsergebnisses führt letztlich zur bekannten Form des
Konzentrations-Zeit-Gesetzes 1. Ordnung:
kt
eSS −
⋅= 0 S0 Substratanfangskonzentration (Gleichung 1)
Die Reaktionsgeschwindigkeit der Substratumsetzung wird als Abnahme der
Substratkonzentration dargestellt und hat allgemeine Bedeutung für die Ausscheidung von
endogenen und exogenen Substanzen. Die phänomenologische Darstellung der homogenen
Esterhydrolyse als Gesamtreaktion leitet sich in Anlehnung an Abb. 5 wie folgt ab:
Ksk+2
P1
k+3
P2
E
E + S ES ES`
Acylierung Deacylierung
E (Enzym), S (Substrat), P1 (Produkt 1, Alkohol), P2 (Produkt 2, Säure), ES (Enzym-Substrat-Komplex), ES` (Acyl-Enzym-
Komplex), k2:´(Geschwindigkeitskonstante Acylierung), k3 (Geschwindigkeitskonstante Deacylierung). Ks (Dissoziationskonstante)
Abb. 6: Phänomenologische Betrachtung einer esterasekatalysierten Esterhydrolyse
Die Geschwindigkeitskonstanten für Acylierung und Deacylierung (k+2 und k+3) sind annähernd
gleich groß und damit gleichermaßen geschwindigkeitsbestimmend. Enzyme mit Histidin im
14 2 Theoretische Grundlagen
aktiven Zentrum zeigen Konzentrationsabstufungen für die Reaktionsgeschwindigkeit. Für
verschiedene Substratanfangskonzentrationen wurden unterschiedliche Geschwindigkeits-
konstanten bestimmt, da jedes Enzym für ein umzusetzendes Substrat eine spezifische Affinität
besitzt (Buddecke, 1994; Kleber & Schlee, 1987; Lehninger, 2001). Der Einfluss der Substrat-
sättigung auf die Geschwindigkeit von Reaktionen erster Ordnung zeigt Abb. 7.
Abb. 7: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit [v] von der Substratanfangskonzentration [S]
(nach Drauz & Waldmann, 1995)
Im Bereich einer geringen Substratanfangskonzentration S0 verhält sich die Reaktions-
geschwindigkeit v0 proportional zu S0. Im weiteren Verlauf geht die Hydrolyse in eine „Reaktion
gemischter Ordnung“ über (v0 steigt langsamer als S0). Bei weiterem Konzentrationsanstieg
nähert sich v0 schließlich asymptotisch einem konstanten Wert und ist damit
konzentrationsunabhängig. Das Enzym ist nun substratgesättigt. In Bezug auf das Substrat
spricht man von einer Reaktion nullter Ordnung. Alle Enzyme weisen diesen Saturierungseffekt
auf. Die Konzentration, ab der bei einem Enzym Substratsättigung oder -hemmung einsetzt, ist
eine substratspezifische Kenngröße, die von anderen Reaktionsparametern wie Temperatur
und pH-Wert beeinflusst wird. Zerfällt der Enzym-Substrat-Komplex sehr schnell, ist dieser
Schritt nicht mehr geschwindigkeitsbestimmend und Substratsättigung wird nicht beobachtet.
1902 beschrieben Brown und Henri diesen Effekt unabhängig voneinander und postulierten die
Enzym-Substrat-Wechselwirkung als reversible Reaktion, die unter Bildung eines Enzym-
Substrat-Komplexes stattfindet. Michaelis und Menten erweiterten diese Theorie 1913 mit der
Formulierung einer Gleichgewichtsreaktion für die enzymatische Katalyse einer Ein-Substrat-
Reaktion und leiteten folgenden einfachen Ausdruck für die Reaktionsgeschwindigkeit ab:
k1k2
k-1
P + E
k-2
E + S ES
Reaktanten: E (Enzym), S (Substrat), ES (Enzym-Substrat-Komplex), P (Produkt), Geschwindigkeitskonstanten: k1 (Bildung von
ES), k-1 (Zerfall von ES), k2 (Bildung von P); k-2 (Rückbildung von ES aus E und P)
Abb. 8: Schema für die Ein-Substrat-Reaktion nach Michaelis-Menten
2.4 Verlauf der enzymatisch katalysierten Esterhydrolyse 15
Als geschwindigkeitsbestimmender Schritt wird der Zerfall des Enzym-Substrat-Komplexes und
damit die Produktbildung angesehen. Auf dieser Grundlage gaben Briggs und Haldane 1925
eine allgemeine Formulierung für die Geschwindigkeitsgleichung mit der Annahme eines
stationären Zustandes (steady-state) an, in dem die Konzentration des Enzym-Substrat-
Komplexes [ES] konstant ist bzw. die Änderung seiner Konzentration mit Null angenommen
wird. Als Voraussetzung für die Einstellung des steady-state muss die Anfangssubstrat-
konzentration S0 deutlich größer sein als die des Enzyms (S0 >> E), so dass der Anteil des
enzymgebundenen Substrats vernachlässigbar klein ist.
Die enzymkatalysierte Reaktion verläuft wie folgt in drei Phasen: pre-steady-state, steady-state
sowie post-steady-state (Belitz et al., 2001): Das Enzym E reagiert intermediär mit dem Substrat
S zu [ES]. Der Zerfall des Enzym-Substrat-Komplexes unter Freisetzung des
Reaktionsprodukts [P] stellt dabei den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt dar. Die
Geschwindigkeitsgleichung nach Michaelis-Menten beschreibt eine mathematische Beziehung
zwischen Initialgeschwindigkeit vi [Änderung der Konzentration je Zeiteinheit] und
Substratkonzentration S0 [mol /L] für die enzymkatalysierte Einsubstratreaktion auf Basis des
Massenwirkungsgesetzes. Die kinetische Betrachtung von Rohpräparaten oder biologischem
Material haben Michaelis und Menten durch eine Grenzwertbetrachtung das
Geschwindigkeitsgesetz relativiert:
0
0max
SK
SV
v
m
i+
⋅
= Michaelis-Menten-Gleichung (Gleichung 2)
Ist S0 so hoch, dass das Enzym gesättigt ist, das heißt im wesentlichen in [ES] gebunden
vorliegt, so wird die maximale Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion erreicht:
02max EkV ⋅= +
Für den speziellen Fall vi = ½ Vmax gilt Km = S. Die Michaelis-Menten-Konstante Km entspricht
somit jener Substratkonzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit halbmaximal ist. Der
Km -Wert hat die Dimension einer Konzentration [mol /L] und ist unabhängig von der
Enzymkonzentration. Aus der hyperbelförmigen Korrelation zwischen vi und S0 gemäß Abb. 7
(E0 = konstant) resultiert, dass nur für sehr geringe Substratkonzentrationen (vi
≈
S0) eine
Reaktion erster Ordnung vorliegt. Eine Erhöhung der Substratkonzentration führt zu der
beschriebenen asymptotischen Annäherung von vi → Vmax. Der Übergang in eine Reaktion
nullter Ordnung setzt erfahrungsgemäß bei Konzentrationen > 5.Km ein (Rapoport, 1987).
Der hier beschriebene homogene Reaktionsablauf gilt nicht für Substrate, die sehr schwer oder
nicht wasserlöslich sind. Die heterogene Esterhydrolyse ist typisch für durch Lipasen
katalysierte Reaktionen. Lipasen sind Esterasen, die eine Spaltung von Estern mit hoher Hydro-
phobizität katalysieren (Goto, 2000). Das Substrat wird an die Lipid-Wasser-Grenzfläche
sogenannter Supramoleküle gebunden. Abb. 9 zeigt die dafür erforderliche Erweiterung des
Michaelis-Menten-Modells.
16 2 Theoretische Grundlagen
Abb. 9: Heterogene Esterhydrolyse durch Lipasen nach Michaelis-Menten (Quinn et al., 1999)
Dazu müssen die Parameter Oberfläche der Enzym-Interface-Wechselwirkung, Substratkon-
zentration je Oberfläche sowie Reaktionsvolumen berücksichtigt werden. Das Interface sym-
bolisiert hier das Supramolekül, an das der Ester gebunden wird. Das Enzym bindet spezifisch
an Trägermolekül und Substrat. Diese Wechselwirkung optimiert die katalytische Funktion und
Umsatzrate des Enzyms. Enzym-Substrat-Bindung und der Substratabbau laufen im Vergleich
zur Interface-Substrat-Bindung und Substratnachlieferung schneller ab, so dass
Substratsättigung bei diesem Reaktionsmodell nicht erreicht werden kann (k1 > k2).
2.5 Pharmakokinetische Parameter
Die Kinetik beschreibt den zeitlichen Ablauf der Umsetzung eines Substrates. Durch Anwen-
dung von mathematischen Methoden auf beobachtete Messwerte lassen sich charakteristische
Größen der Umsetzung bestimmen. Messwerte sind in Abhängigkeit von der Zeit ermittelte
Konzentrationen einer durch die Reaktion gebildeten oder umgesetzten Komponente.
2.5.1 Spezifische Hydrolyseaktivität
Die Umsatzrate der enzymkatalysierten Carbonsäureesterhydrolyse im biologischem Medien
wie Blutplasma, Magenflüssigkeit oder Leberhomogenat ist auf eine Vielzahl von Hydrolasen
2.5 Pharmakokinetische Parameter 17
zurückzuführen. Der quantitative Parameter Hydrolyseaktivität beschreibt die Gesamtheit der
hydrolytischen Aktivität eines enzymatischen Hydrolysemediums.
Die spezifische Hydrolyseaktivität ist die umgesetzte Substratmenge pro Zeiteinheit und
Enzymmenge unter definierten Bedingungen (optimale Substratanfangskonzentration,
pH- und Temperaturoptimum, Aktivatoren). Die maximale Substratkonzentration ist dann
erreicht, wenn ein maximaler Substratumsatz je Zeiteinheit besteht. Kann aus methodischen
Gründen eine Sättigungskonzentration nicht eingestellt werden, so kann die Festsetzung einer
definierten Substratsanfangskonzentration als ausreichend angesehen werden (Hess, 1966).
Bedingung für die experimentelle Durchführung ist, dass sich Enzym- und Substratkonzen-
tration während des Messzeitraumes kaum ändern. Der Messzeitraum soll einerseits
hinreichend groß sein, um einen über der Bestimmungsgrenze detektierbaren Substratumsatz
zu erhalten. Andererseits soll er so kurz als sein, um den unerwünschten Einfluss der
Denaturierung mit fortschreitender Reaktionszeit zu minimieren. Das Substrat liegt gegenüber
dem Enzym in großem molarem Überschuss vor (Faktor mindestens 1.10+3, Kleber et al., 1997)
und seine Konzentration bleibt so während des Messzeitraums praktisch konstant.
Die Maßeinheit der Hydrolyseaktivität ist die Zunahme der Umsatzgeschwindigkeit des
Substrates, die von einer bestimmten Enzymmenge im Vergleich zur unkatalysierten Reaktion
bewirkt wird (Lottspeich & Zorbas, 1998). Bei der Angabe der spezifischen Hydrolaseaktivität
bezieht man die molare Aktivität auf die Proteinkonzentration in der Hydrolysenlösung, die als
Maß für die Enzymmenge im biologischen System angesehen werden kann.
2.5.2 Halbwertzeit
Die Halbwertzeit (t1/2) ist ein wichtiger Kennwert chemischer Reaktionen und hat für die
quantitative Beschreibung von physiologischen Abbauraten in der toxikologischen Bewertung
einen hohen Stellenwert. Sie ist definiert als jener Zeitraum, in dem eine zu Beginn
herrschende Substratkonzentration auf die Hälfte abgesunken ist.
Nach Umformung und Integration von Gleichung 1 (Abschnitt 2.4.2) wird ein Term erhalten, der
für die Reaktion erster Ordnung einen exponentiellen Abfall der Substratkonzentration mit der
Zeit beschreibt. Für die Halbwertzeit gilt definitionsgemäß S = S0 /2 und damit:
k
)2ln(
t2/1 = k: Geschwindigkeitskonstante der Reaktion 1. Ordnung (Gleichung 3)
Für die Berechnung ist es notwendig, den Wert für die Geschwindigkeitskonstante experimentell
zu ermitteln. Dazu wird der Abfall der Konzentration des Substrats oder die Zunahme an Edukt
während des Hydrolyseverlaufs experimentell bestimmt. Die Logarithmierung der Messwerte
führt zu einem linearen Plot, aus dessen Anstieg die Geschwindigkeitskonstante berechnet
werden kann (Chandler, 1992; Holtzhauer, 1995; Rappoport, 1987). Die Ableitung der Halbwert-
zeit erfolgt in unserer Studie in Anlehnung an die im Amtsblatt der EG Nr. L251/216 vom
19.09.1984 beschriebenen Methode. Wird der Term ln (S0 /Si) gegen die Reaktionszeit ti
18 2 Theoretische Grundlagen
graphisch aufgetragen, so ergibt sich aus dem Anstieg der linearen Trendlinie der Wert für die
Geschwindigkeitskonstante k [min-1].
Im klinisch-pharmakologischen Bereich werden zur Beschreibung des vollständigen
Substratabbaus die Eliminationshalbwertzeit, dominierende sowie terminale Halbwertzeit
unterschieden. Man geht davon aus, dass nach etwa 4 bis 5 Halbwertzeiten die Elimination
eines Pharmacons weitgehend abgeschlossen ist (Forth & Henschler, 1992).
2.5.3 Reaktionskinetik nach der Theorie von Michaelis-Menten
Beim exponentiellen Konzentrations-Zeit-Verlauf der Reaktion erster Ordnung ist die
Reaktionsgeschwindigkeit dS/dt abhängig von der Lage des Messintervalls. Meist wird dS/dt mit
fortschreitender Zeit kleiner. Je stärker gekrümmt die Kurve ist, um so schwieriger wird es, die
Initialgeschwindigkeit exakt zu ermitteln. Näherungswerte erhält man abgeleitet vom Hydrolyse-
verlauf aus dem Anstieg der Tangente am Zeitpunkt ti „kurz nach dem Start der Reaktion“. Es
sind für jedes Substrat [n] Wertpaare [Si; ti] als Substratkonzentration zum Zeitpunkt ti
experimentell zu ermitteln. Die Reaktionsgeschwindigkeit zu einem beliebigen Zeitpunkt ti
entspricht der ersten Ableitung der Funktion der Konzentrationsmenge S´(ti). Die Bildung der
ersten Ableitung erfordert zunächst, den Verlauf der Konzentrationsmenge als Funktion auf der
Basis der Messwerte darzustellen. Dies erfolgt nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate
nach Gauß (Hartmann et al., 1974; Rösch, 1993):
Aus [n] Wertpaaren [Si; ti] wird eine Funktion S(t) gesucht, deren Wertepaare [S(ti), ti] möglichst
wenig von den gemessenen Werten abweichen, so dass der Ausdruck
∑−= n
1
2
ii ]S)t(S[Q
zum Minimum wird. Der Verlauf der enzymatischen Hydrolyse lässt sich in guter Näherung als
Exponentialfunktion darstellen:
ta
eatS ⋅
⋅= 1
0
)( mit 0a1
≤
Nach dem Logarithmieren der Messwerte [ ii SlnS →] wird die Ausgleichfunktion als ganz-
rationale Funktion ersten Grades bestimmt:
taa)t(Stalnaln)t(Sln 1010
+
=→+=
Die Koeffizienten ak werden so bestimmt, dass die Minimalbedingung [dQ /dak = 0] erfüllt wird.
Die Gleichungen für die Koeffizienten, sogenannte Normalengleichungen, lauten:
]tS[]t[a]t[a
]S[]t[ana
2
10
10
⋅=+
=+
2.5 Pharmakokinetische Parameter 19
Hierbei bedeuten:
∑
=n
1
2
i
2t]t[
∑⋅=⋅ n
1
ii St]tS[
∑
=n
1
i
S]S[
n Anzahl der gemessenen Wertepaare
Si i-ter Wert der im Versuch ermittelte Konzentration
ti Zeitpunkt der Konzentrationsbestimmung
Die Bestimmung der Koeffizienten erfolgt durch Lösen des oben dargestellten
Gleichungssystems. Die Ausgleichfunktion ist somit bekannt. Da die Messwerte in einem ersten
Schritt logarithmiert wurden, lautet die Funktion in mathematisch exakter Schreibweise:
talnaln)t(Sln 10
+
=.
Diese Funktion kann entsprechend der Logarithmusgesetze wie folgt umgeschrieben werden:
()
taaln)t(Sln 10
⋅
=
Das Rückgängigmachen der Logarithmierung ergibt:
ta
a1
0ee)t(S ⋅=
Die Ableitung der Funktion an der Stelle t liefert die Geschwindigkeit zum Zeitpunkt t.
ta
10
1
eaa)t(V)t(S ⋅⋅==
′
Die Initialgeschwindigkeit wird in unserer Studie als Reaktionsgeschwindigkeit zum Zeitpunkt
ti = 0,10 min definiert. Für die Initialgeschwindigkeit gilt somit:
1
1,0
10,
a
spezi eaaV ⋅
⋅⋅=
Die Berechnungen und grafischen Auswertungen für die untersuchten Substanzen erfolgen mit
dem Computerprogramm MicrosoftEXCEL. Es gelten folgende Konventionen bei der
Variablenbezeichnung:
ytS →)(
x
t→
Zusammenfassend kann der Anstieg der Tangente zum Zeitpunkt ti aus der Hydrolysefunktion
(Gleichung 1) wie folgt berechnet werden (Brunner, 1996):
)ax()a(f)a(f)x(T −⋅
′
+
= (Gleichung 4)
Zur Bestimmung der Michaelis-Menten-Parameter Km und Vmax wurden verschiedene Line-
arisierungsverfahren entwickelt (Tab. 2). Das in der Literatur am häufigsten genutzte Verfahren
ist die doppelt reziproke Darstellung nach Lineweaver & Burk (1934). Die Vorteile der
Darstellung resultieren aus der leichten Ableitung von Inhibitoreffekten, wie der Substrat-
inhibition. Von Nachteil ist die erschwerte Wichtung der Messergebnisse sowie die
20 2 Theoretische Grundlagen
Beschränkung auf die Auswertung von Initialgeschwindigkeitsmessungen. Messwerte im
Sättigungsbereich häufen sich und bei geringen Substratkonzentrationen erfolgt eine ent-
sprechende Dehnung. Messwerte, die bei niedriger Substratkonzentration erhalten werden, sind
mit größerem Fehler behaftet und werden im Lineweaver-Burk-Plot bei der Festlegung der
Geraden leicht überbewertet (Britt, 1992; Dixon, 1953 und 1972; Markus, 1976).
Tab. 2: Darstellungsformen zur grafischen Bestimmung von Km und Vmax
Auftrag auf der Schnittpunkt mit der Darstellungsform nach
x-Achse y-Achse x-Achse y-Achse
Steigung
Lineweaver-Burk
0
1
S
iv
1
m
K
1
−
max
1
V
maxV
Km
Hanes-Woolf 0
S
iv
S0 m
K
−
maxV
Km
max
1
V
Eadie-Hofstee
0
S
vi i
v
mK
Vmax max
V
m
K−
Cornish-Bowen 0
S i
v - - -
Quelle: Holtzhauer (1997)
Die Verfahren nach Eadie & Hofstee (1932) und Hanes & Woolf (1922) versuchen diese
Nachteile durch Multiplikation der linearisierten Gleichung mit einem Korrekturfaktor auszu-
gleichen. Der direct plot nach Cornish & Bowen (1976) verhindert durch eine direkte Auftragung
der Parameter eine Verzerrung der Messfehlerverteilung. Dagegen ist die Bestimmung von Km
und Vmax nur durch eine grafische Abschätzung möglich und entsprechend ungenau. Die
Korrelation von Vmax und Km nach Michaelis-Menten zeigt Abb. 10.
Abb. 10: Verlauf einer enzymkatalysierten Reaktion bei Substraten mit unterschiedlicher Affinität
(nach Drauz et al., 1995)
2.5 Pharmakokinetische Parameter 21
Km ist ein Maß für die Affinität eines Enzyms zu einem Substrat. Je höher Km, desto
größer muss die Substratkonzentration sein, damit die Reaktion mit halbmaximaler
Geschwindigkeit abläuft. Dabei verringert sich die Substrataffinität (Lottspeich, 1998).
Der Quotient aus Vmax /Km gilt als Indikator für die Substratempfindlichkeit gegenüber der
enzymatischen Reaktion unter substratgesättigten Bedingungen. Je höher der
Verhältnis, desto größer ist die Empfänglichkeit des Substrats gegenüber dem Enzym
(McCarthy, 1997).
Für Phenylacetat wurden die Michealis-Menten-Parameter u.a. in Rattenlebermikrosomen (LM)
und Rattenlebercytosol (LC) bestimmt (McCracken et al., 1993). Im Konzentrationsbereich von
0,5 bis 4,0 mM wurde Km mit 1430 µM und 900 µM (LM und LC) bestimmt. Die Vmax–Werte
betrugen 800 und 31 µmol /min⋅g(mL) Gewebe (LM und LC). Daraus wurde der Quotient
[Vmax/Km] mit 559⋅10-3 L/ g⋅min (LM) und 34⋅10-3 L /mL⋅min (LC) berechnet. Die Hydrolysier-
barkeit von Phenylacetat in Lebermikrosomen ist somit mehr als 16-mal größer als im Leber-
cytosol. Diese und andere Ergebnisse werden ausführlich in Abschnitt 3.3 (Tab. 7) dargestellt.
23
3 Aromastoffe in Lebensmitteln
3.1 Allgemeines
In den letzten Jahrzehnten hat der Anteil aromatisierter Lebensmittel stark zugenommen. Er
liegt in Deutschland bei 15 bis 20 % des gesamten Lebensmittelverbrauchs (Beelitz et al.,
2001). Eine Ursache ist der Anstieg industriell gefertigter Lebensmittel, die teilweise einer
Aromatisierung bedürfen, weil bestimmte Rohstoffe nur begrenzt zur Verfügung stehen und
deshalb teuer sind, oder, weil beim Herstellungsprozess und der Lagerung Aromaverluste
auftreten, die auf diesem Wege ausgeglichen werden sollen.
Aromen werden überwiegend hochverarbeiteten Lebensmitteln zugesetzt und sollen durch
ihren anregenden Einfluss auf das Nervensystem des Konsumenten Speisen und Getränken
einen speziellen Genusswert verleihen. Dazu werden Aromakonzentrate oder Essenzen
verwendet, die aus einzelnen chemischen Substanzen „komponiert“ werden. Hierbei spielen
organische Verbindungen wie Alkohole, Aldehyde, Acetale, Ketone, Phenole und Phenolether,
Säuren und Ester, Lactone sowie Kohlenwasserstoffe eine bedeutende Rolle.
3.1.1 Begriffsbestimmung
Aromen sind Zubereitungen von Geruchs- und Geschmacksstoffen (Aromastoffe), die dazu
bestimmt sind, Lebensmitteln einen besonderen Geruch oder Geschmack zu verleihen
(§ 1 Abs. 1 AromenVO). Sie sind nicht zum direkten Verzehr bestimmt und enthalten als
Hauptbestandteile Aromaextrakte (konzentrierte natürliche Aromakomplexe), Aromastoffe,
Lebensmittel als Trägerstoffe oder Lösemittel sowie Zusatzstoffe.
Bei Aromastoffen handelt es sich um flüchtige Verbindungen, die mit Geruchsrezeptoren
wahrgenommen werden. Sie erreichen die Rezeptoren durch nasale Wahrnehmung und über
den Rachenraum, nachdem sie beim Kauen freigesetzt worden sind (retronasale
Wahrnehmung). Von der Definition ausgenommen sind somit Verbindungen, die ausschließlich
süßen, sauren oder salzigen Geschmack verleihen.
Es werden verschiedene Arten von Aromen unterschieden (Anlage 1 Aromenverordnung):
• natürliche, naturidentische oder künstliche Aromastoffe (Tab. 3),
• Aromaextrakte pflanzlichen und tierischen Ursprungs,
• Reaktionsaromen, die nach Erhitzen Aroma entwickeln sowie
• Raucharomen.
Tab. 3: Einteilung der Aromastoffe gemäß Anlage 1 Aromenverordnung
Natürliche Aromastoffe Naturidentische Aromastoffe Künstliche Aromastoffe
Zubereitungen oder einzelne Stoffe, die für den
menschlichen Verzehr geeignet sind und ausschließlich
durch physikalische, mikrobiologische oder enzymati-
sche Prozesse aus pflanzlichem oder tierischem Aus-
gangsmaterial gewonnen werden, und die sich entwe-
der im Rohzustand oder im Zustand nach Verarbeitung
durch herkömmliche Lebensmittelverarbeitungs-
prozesse (einschließlich Rösten, Trocknen, Gären) im
Hinblick auf den Verzehr durch Menschen befinden.
Stoffe, die mit chemischen Methoden aus
aromatischen Rohstoffen isoliert oder
synthetisch hergestellt werden;
sie sind chemisch identisch mit Stoffen,
die in natürlichen, für den menschlichen
Verzehr bestimmten Produkten (zuberei-
tet oder nicht zubereitet) vorkommen.
Stoffe, die bisher nicht in
natürlichen, für den mensch-
lichen Verzehr bestimmten
Produkten (zubereitet oder
nicht zubereitet) identifiziert
worden sind.
24 3 Aromastoffe in Lebensmitteln
3.1.2 Lebensmittelrechtliche Einordnung
Lebensmittelrechtlich werden Aromen entweder als Lebensmittel oder als Zusatzstoffe ange-
sehen. Lebensmittel sind generell frei verwendbar, nur bestimmte Stoffe oder Zubereitungen
können aus gesundheitlichen Gründen verboten sein oder einer beschränkten Verwendung
unterliegen (Negativ-System). Zusatzstoffe unterliegen hingegen der generellen Zulassung
durch ein bestimmtes Verfahren (Positiv-System). Beide Systeme werden miteinander
kombiniert angewendet.
Im Zutatenverzeichnis ist die Verwendung von Aromastoffen mit dem Hinweis „Aroma“ oder
einer Beschreibung des Aromas anzugeben. Bestehen die aromatisierenden Bestandteile
ausschließlich aus natürlichen Aromastoffen oder Aromaextrakten, so darf das Wort „natürlich“
gebraucht werden (§ 6 Abs. 5 Lebensmittel-Kennzeichnungsverordnung).
Die Richtlinie des Rates 88/388/EWG vom 22.06.1988 legt Kriterien fest, die eine Verwendung
von Aromastoffen in Lebensmitteln sowie deren Ausgangsstoffen für ihre Herstellung betreffen.
In der Verordnung (EG) Nr. 2232/96 des Europäischen Parlaments und des Rates wurde die
Schaffung einer EU-einheitlichen Positivliste von Aromastoffen, die in oder auf Lebensmitteln
verwendet werden sollen, beschlossen. Die Verordnung legt grundlegende Verwendungs-
bedingungen für diese Stoffe fest:
• Aromastoffe dürfen nur zugelassen werden, wenn sie nach wissenschaftlicher Bewer-
tung die Gesundheit des Verbrauchers nicht gefährden sowie der Verbraucher durch
sie nicht irregeführt wird.
• Zur Bewertung möglicher schädlicher Auswirkungen eines Aromastoffs ist dieser einer
toxikologischen Bewertung zu unterziehen. Alle Aromastoffe müssen ständig über-
wacht und erforderlichenfalls neu bewertet werden.
3.2 Toxikologische Bewertung
3.2.1 Allgemeines
Toxikologische Fragestellungen werden im Hinblick auf die Verwendung von Aromastoffen bei
der Lebensmittelzubereitung seit Jahrzehnten diskutiert (Bär & Griepentrog, 1967; Taylor,
1998). Die Kriterien für die toxikologische Bewertung werden von verschiedenen internationalen
Expertenkomitees erarbeitet. Darunter sind Gremien wie das Joint FAO/WHO Expert
Committee on Food Additives (JECFA), das Committee of Experts on Flavouring Substances of
the Council of Europe (CE), das Scientific Committee for Food (SCF) der EU sowie
internationale Organisationen der Aromenindustrie wie die International Organisation of the
Flavour Industry (IOFI) in Europa und das Expert Panel of the Flavour and Extract
Manufacturers Association of the United States (FEXPAN).
JECFA hat weltweit bei der Bewertung von Lebensmittelzusatzstoffen den größten Einfluss auf
deren Zulassung. Seit mehr als 30 Jahren werden kontinuierlich Bewertungskriterien für die
Evaluierung von Lebensmittelzusatzstoffen veröffentlicht. 1987 wurde erstmals in einem
JECFA-Report (WHO, 1987) die Evaluierung von Aromastoffen beschrieben. Diese weicht in
3.2 Toxikologische Bewertung 25
wesentlichen Punkten von der Bewertung sonstiger Zusatzstoffe ab. Die Verordnung (EG) Nr.
2232/96 legt ein Verfahren zur Schaffung einer EU-einheitlichen „Positivliste von Aromastoffen
zur Verwendung in Lebensmitteln“ fest. Nach Artikel 3 hatten die Mitgliedstaaten der
Kommission bis zum 22.11.1997 eine Liste der auf ihrem Territorium vermarkteten Aromastoffe
zu melden.
3.2.2 Bewertungsprogramm der Europäischen Kommission
Von der Europäischen Kommission wurde ein „Verzeichnis 1999/217/EG der EG-Kommission
der in oder auf Lebensmitteln verwendeten Aromastoffe“ zusammengestellt und am 04.03.1999
veröffentlicht. Es enthält ca. 2800 Stoffe und lässt Ergänzungen zu. Die Informationen, die für
die Bewertung benötigt werden, müssen von den Aromastoffherstellern zu bestimmten Fristen
geliefert werden. Diese Fristen sind in der Verordnung (EG) Nr. 622/2002 der Kommission
festgelegt. Die gelisteten Aromastoffe werden durch ein wissenschaftliches Komitee gemäß der
Verordnung (EG) Nr. 1565/2000 der Kommission bewertet. Die Bewertung läuft in mehreren
Phasen ab:
Zunächst werden den Substanzen ihren chemischen Eigenschaften entsprechend so genannte
FL-Nummern zugewiesen. Es werden Gruppen strukturverwandter Verbindungen geschaffen,
bei denen gewisse Gemeinsamkeiten im metabolischen Verhalten zu erwarten sind. Bei der
toxikologischen Bewertung soll auf vorliegende Daten der Expertenkomitees zurück gegriffen
werden:
• Daten aus Sicherheitsevaluierungen des Sachverständigenausschusses für
Aromastoffe des Europarates (CEFS),
• Daten des Wissenschaftlichen Lebensmittelausschusses der Europäischen
Kommission (SCF) sowie
• Daten des Gemeinsamen FAO/WHO-Sachverständigenausschusses für Lebensmittel-
zusatzstoffe (JECFA).
Die Stoffgruppen werden zur Evaluierung zwischen JECFA und SCF aufgeteilt. Die Anzahl der
zu bewertenden Substanzen ist beträchtlich, so dass gruppenweise vorangegangen wird.
Stoffe, bei denen Gemeinsamkeiten im metabolischen und biologischen Verhalten zu erwarten
sind, werden gemeinsam bewertet.
„Chemisch definierte Aromastoffe“ werden im Rahmen der Mitwirkung der Mitgliedstaaten bei
der wissenschaftlichen Prüfung von Lebensmittelfragen (SCOOP) behandelt. Diese
Arbeitsgruppe erstellt eine Datenbank (FLAVIS), in der Informationen für die wissenschaftliche
Prüfung von Aromastoffen zusammengestellt werden.
JECFA evaluiert Aromastoffe nach dem Munro-Prinzip (Munro et al., 1998). Es beruht auf der
gemeinsamen Verwendung von Struktur-Wirkungsbeziehungen, Metabolismus und Toxizität. In
Abb. 11 ist die systematische Vorgehensweise für die toxikologische Bewertung nach Munro
dargestellt (JECFA, 1999).
26 3 Aromastoffe in Lebensmitteln
Abb. 11: Procedure for the safety evaluation of flavouring agents (nach JECFA, 1996)
Das Schlüsselelement des Verfahrens ist die Unterteilung der zu evaluierenden Verbindungen
in drei Strukturklassen (Schritt 1 aus Abb. 11).
Klasse 1: Substanzen mit einfacher chemischer Struktur, die schnell metabolisiert
werden, was einen geringen Toxizitätsgrad bei oraler Gabe erwarten lässt.
Klasse 2: Substanzen, deren strukturelle Eigenschaften weniger unschädlich als die der
Substanzen in Klasse 1 sind, aber nicht auf Toxizität hindeuten.
Klasse 3: Substanzen, deren strukturelle Eigenschaften keine Annahme der Sicherheit
erlauben oder sogar auf Toxizität hindeuten.
Schritt 2 aus Abb. 11 beschreibt die Herangehensweise zur Abschätzung der Metabolisierung.
Die Kernaussage der Munro-Bewertung ist, dass entweder der Aromastoff oder die Metaboliten
toxikologisch unbedenklich sind oder als endogene Substanzen ausgeschieden werden.
Endogene Substanzen sollten keine Störung physiologischer Vorgänge hervorrufen. Die
Aufnahmemenge hängt vom Gehalt im Lebensmittel und dessen Verzehrsmenge ab. Unter
Bezugnahme auf das 46. JECFA-Meeting (JECFA, 1997) wurden definiert :
• toxikologisch unbedenkliche Metaboliten
sind definiert als Substanzen, die für den Menschen als harmlos bekannt sind
oder deren toxikologische Bewertung keinen anderen Schluss zulässt
• endogene Substanzen
sind Zwischenmetabolite, die natürlicherweise im menschlichen Gewebe oder
in Körperflüssigkeiten frei oder konjugiert vorkommen, ausgenommen
Hormone und andere Substanzen mit biochemischer oder physiologisch
regulativer Funktion.
3.3 Literaturübersicht zu Hydrolysestudien 27
Die Bewertung nach Munro erfolgt anhand a) der chemischen Struktur, b) der geschätzten
täglichen Aufnahmemenge sowie c) anhand vorhandener Daten zur Hydrolysierbarkeit. Es
wurden 15 Ethylester mit geradkettigem, gesättigtem Acyl-Rest und einer Kettenlänge von 1 bis
12, 14, 16 sowie 18 Kohlenstoffatome bewertet (Semino, 1997). Alle Substanzen werden von
der Lebensmittelindustrie zur Aromatisierung von Lebensmitteln eingesetzt.
zu a) Augrund ihrer einfachen Struktur wurden die Ester gemäß dem Munro-Prinzip der
Struktur-Klasse 1 zugeordnet.
zu b) Die maximale tägliche Aufnahmemenge für Substanzen mit der Acyl-Kettenlänge C1,
C
5, C7 bis C12, C14, C16, C18 liegt mit ca. 1,5 µg /Tag unterhalb der Schwellenkonzen
tration von 1800 µg /Tag für Substanz-Klasse 1 (JECFA, 1996).
zu c) Alle Ester werden im Körper vollständig in ihre endogenen Intermediate Ethanol und
Carbonsäure gespalten. Die Metaboliten der Ester mit einer Kettenlänge von 2, 3, 4
und 6 C-Atomen sind endogen und erfordern damit keine toxikologische Bewertung.
Für die genannte Ethylester ist damit eine toxikologische Bewertung nicht erforderlich.
3.3 Literaturübersicht zu Hydrolysestudien
Carbonsäureester können über verschiedene Wege in den menschlichen Körper gelangen. Sie
kommen ubiquitär in Lebensmitteln als natürliche Aromabestandteile vor. Darüber hinaus
entstehen Carbonsäureester bei der Zubereitung von Lebensmitteln und tragen auf diesem
Wege zur Aromabildung bei (Salter et al., 1988).
Die pharmazeutische Industrie verwendet Carbonsäureester als Vorstufen von therapeutisch
aktiven Agenzien, sogenannte prodrugs (Bruchhausen, 1991; Hosokawa et al., 1990). Carbon-
säureester werden im Körper als endogene Verbindungen im Verlauf des allgemeinen Metabo-
lismus gebildet (Bernhardt et al., 1996; Bird et al., 1999; Dan & Laposata, 1997; Doyle et al.,
1996). Sie sind als Additive in Bedarfsgegenständen mit Lebensmittelkontakt zu finden und
können durch Sorption und Migration in das Lebensmittel übergehen. Wechselwirkung und
Einflussfaktoren der Migration wurden anhand von Lebensmitteln oder deren Simulantien
untersucht (Gnanasekharan, 1997; Koszinowski, 1987; Landois-Garza, 1988; Shmunes, 1990).
Zur Metabolisierung von Carbonsäureestern werden seit Jahren Studien veröffentlicht. Sie
beinhalten Methoden zur Strukturaufklärung von Metaboliten oder beschreiben die
Abbaubarkeit der Ester in Abhängigkeit von Spezies, biologischem Material (Organe, Blut,
Gastrointestinaltrakt) oder Simulantien (künstliche Magenflüssigkeit oder Darminhalt).
Überwiegend wurde das in vitro Hydrolyseverhalten von Estern bei der Ratte beschrieben.
Grundlegende Arbeiten dazu legten 1977 Longland et al. und Grundschober vor. Sie untersuch-
ten die Hydrolyserate und Esteraseaktivität von Carbonsäureestern in künstlicher Gastrointesti-
nalflüssigkeit und Rattenleberpräparationen bei 37 °C (Tab. 4).
28 3 Aromastoffe in Lebensmitteln
Tab. 4: Halbwertzeit von Carbonsäureestern und spezifische Hydrolyseaktivität von künstlicher
Magen- und Pankreasflüssigkeit sowie Rattenleber- und Rattendünndarmmucosa-
Homogenat bei 37°C (Longland et al., 1997)
Substanz Summen-
formel S0 [mM]2 künstliche
Magenflüssigkeit
künstliche
Pankreasflüssigkeit
Leber-
Homogenat
Dünndarmmucosa-
Homogenat
E
a [µmol /L je min] / t1/2 [min] Ea [µmol /g Gewebe je min] / t1/2 [s]
Et But C6 H12 O2 < 58,8 75,8 / 490 6543 / 5,67 k. A. / k. A. k. A. / k. A.
Et Cap C8 H16 O2 < 3,19 6,73 / 293 578 / 3,47 832 / 0,145 240 / 0,501
Et Hep C9 H18 O2 < 1,07 1,14 / 770 87,8 / 9,78 314 / 0,164 94,2 / 0,550
Et Pelar C11 H22 O2 < 0,06 0,21 / 177 7,14 / 5,92 k. A. / k. A. k. A. / k. A.
Et Lau C14 H28 O2 < 0,12 0,13 / 640 12,7 / 6,10 k. A. / k. A. k. A. / k. A.
All Cap C9 H16 O2 < 0,25 0,13 / 1120 73,6 / 1,98 2,24 / 3,96 91,5 / 0,0960
iAm But C9 H18 O2 < 1,52 1,52 / 660 90,4 / 11,3 125 / 0,492 859 / 0,0713
iAm iVal C10 H20 O2 < 0,29 0,70 / 295 19,4 / 10,2 k. A. / k. A. k. A. / k. A.
iAm Cap C11 H22 O2 < 0,08 0,38 / 146 1,45 / 37,8 k. A. / k. A. k. A. / k. A.
PhenEt Ac C10 H12 O2 < 7,67 17,5 / 300 177 / 29,7 k. A. / k. A. k. A. / k. A.
Benz iBut C11 H14 O2 < 0,45 0,50 / 577 17,1 / 17,8 434 / 0,0422 259 / 0,0707
But Ac C6 H12 O2 < 56,8 124 / 318 597 / 66,0 4,82 / 491 21,9 / 108
Et iVal C7 H14 O2 < 17,7 8,07 / 1390 55,8 / 198 66,6 / 23,5 4,99 / 133
Me PhenAc C9 H10 O2 < 0,60 0,33 / 905 2,93 / 96,7 k. A. / k. A. k. A. / k. A.
Et PhenAc C10 H12 O2 < 0,43 0,37 / 640 2,25 / 110 k. A. / k. A. k. A. / k. A.
Ausgangspunkt der Studie von Longland et al. (1997) war die Löslichkeitsbestimmung der Ester
in destilliertem Wasser. Die Substratanfangskonzentration S0 des Hydrolyseansatzes wurde mit
einem Wert unterhalb der ermittelten Löslichkeit festgelegt. Daraus resultierte für jedes Substrat
ein unterschiedlicher Wert für S0. Für die Ableitung von Geschwindigkeitskonstanten und der
Halbwertzeiten wurde eine Kinetik 1. Ordnung zugrunde gelegt. Die Berechnung basierte auf
dem gaschromatographisch bestimmten Abfall der Esterkonzentration während des
Hydrolyseverlaufs.
Tab. 4 zeigt den signifikanten Abfall der Halbwertzeit in der Reihenfolge künstliche Magenflüs-
sigkeit >> künstliche Pankreasflüssigkeit >> Leber- und Dünndarmmucosahomogenat. Damit
wurde belegt, dass die Esteraseaktivität in Geweben und Körperflüssigkeiten sehr verschieden
sein kann. In Abhängigkeit von der Halbwertzeit wurde eine Einteilung gemäß folgender
Kategorien vorgenommen (Longland et al., 1977; Grundschober, 1977):
• schnelle Hydrolysierbarkeit: t1/2 < 10 min
• mäßige Hydrolysierbarkeit: 10 min ≤ t1/2 ≤ 45 min
• langsame Hydrolysierbarkeit: t1/2 > 45 min.
Die Kategorie „schnell hydrolysierbar“ ist ohne die Festlegung von Grenzen unspezifisch
(Child et al., 1971, Ghittori et al., 1984). Die Esteraseaktivität in unterschiedlichen Geweben
führt zu keiner konsistenten Einteilung. So wird Ethylpelargonat mit der Halbwertzeit von
5,92 min in künstlicher Pankreasflüssigkeit als schnell hydrolysierbar eingestuft. Die
korrespondierende spezifische Esteraseaktivität ist mit 7,14 µM /min im Vergleich zu
Substraten mit ähnlicher Halbwertzeit (Et But, Et Cap, Et Hep, Et Lau) vergleichsweise
gering (siehe Tab. 4).
2 Substratkonzentration "less than that reqiured to give an saturated solution“
3.3 Literaturübersicht zu Hydrolysestudien 29
Die Interpretation der Hydrolyseparameter kann somit nur in ihrer Gesamtheit erfolgen. Als
Ursache können verschiedene Substratanfangskonzentrationen (S0) des Hydrolyseansatzes
angenommen werden. Ein Vergleich kinetischer Messgrößen setzt voraus, dass für jedes
Substrat identische Parameter in Bezug auf Enzymkonstitution, Temperatur, pH-Wert und S0
vorliegen.
Adamczyk & Grote (1999) untersuchten den Einfluss von oxidierten Acylresten (α-Alkoxy- und
α-Hydroxy-Gruppen) auf die Hydrolyse- und Amidolyseaktivität von Lipasen. Im Vergleich zu
Benzylphenylacetat war die Hydrolysierbarkeit durch die erhöhte Anzahl von Sauerstoffatomen
im Substrat (Benzylphenoxyacetat) herab gesetzt. Dieser Effekt trat verstärkt in benachbarten
Regionen der Carbonylfunktion auf. Das zusätzliche Sauerstoffatom erhöht die Elektophilie der
Carbonylgruppe, die Polarität des Moleküls wird verstärkt, die Hydratation begünstigt und damit
eine Substratbindungswahrscheinlichkeit am hydrophoben reaktiven Zentrum herabgesetzt.
Ein wichtiger Aspekt ist der Vergleich von in vitro mit in vivo Studien. Gallaher & Loomis (1975)
stellten die Hydrolysierbarkeit von Ethylacetat in vitro in Rattenvollblut mit der in vivo Metaboli-
sierung bei der Ratte gegenüber. Abb. 12 die beim in vivo Umsatz um den Faktor 7 bis 13
erhöhte Umsatzrate im Vergleich zur in-vitro-Reaktion. Die Verifizierung der in vitro Ergebnisse
konnte durch die synchrone Quantifizierung von Substrat und freigesetzten Hydrolyseprodukten
erzielt werden (rechte Seite in Abb. 12). Die in vivo Reaktion zeigt 5 min nach der Ethylacetat-
Injektion einen Anstieg der Ethanolkonzentration im Blut. Nach ca. 15 min erreichte die
Ethanolkonzentration ein Maximum; danach überwogt der Einfluss der ethanolabbauenden
Enzyme. Die Halbwertzeit von Ethylacetat wurde hier mit 5-10 min bestimmt. Vollblut wies im
Vergleich zu Niere oder Leber eine geringere in vivo Hydrolyseaktivität auf
(Buchwald, 2000 und 2002; Mutch et al., 1992; Quinn et al., 1999, Satoh & Hosokawa, 1998).
Hungund et al. (1995) stellten eine um 25 % erhöhte in vivo Abbaurate von Linolsäureethylester
(t1/2 < 1 min) in Rattenplasma gegenüber dem in vitro Experiment fest.
in vivo-Hydrolyse in vitro Hydrolyse
Abb. 12: in vivo und in vitro-Hydrolyse von Ethylacetat bei der Ratte (nach Gallaher & Loomis,
1975)
30 3 Aromastoffe in Lebensmitteln
Tab. 5: Spezifische Hydrolyseaktivität von Lungen- und Leber-Homogenat von Phenylacetat und
Amylacetat (nach Dahl, 1987)
Ha, spez. [mol /min⋅g Protein]
Spezies Testsystem S0 [mM] Hydrolysedauer
Phenylacetat Amylacetat
Hamster Lunge 50 - 125 10 min 520 ± 30⋅10-6 180 ± 4⋅10-6
Leber 1500 ± 10⋅10-6 1100 ± 81⋅10-6
Kaninchen Lunge 390 ± 50⋅10-6 47 ± 2⋅10-6
Leber 610 ± 30⋅10-6 380 ± 14⋅10-6
Ratte Lunge 110 ± 6⋅10-6 75 ± 4⋅10-6
Leber 510 ± 10⋅10-6 250 ± 6⋅10-6
Dahl et al. (1987) untersuchten an Hamster, Kaninchen und Ratte die spezifische Hydrolyse-
aktivität (Ha, spez.) in S9-Homogenat von Leber und Lunge gegenüber Amyl- und Phenylacetat
(Tab. 5). Die freigesetzte Carbonsäure wurde quantifiziert und daraus Ha, spez. berechnet.
Grundsätzlich erwies sich Leberhomogenat hydrolyseaktiver als die Lungenpräparation.
Hamstergewebehomogenat hydrolysierte beide Ester mit höchster Aktivität. Phenylacetat wurde
stets schneller als Amylacetat hydrolysiert, da beim Abbau neben der unspezifischen Carboxyl-
esterase (EC 3.1.1.1) zusätzlich die Arylesterase (EC 3.1.1.2) beteiligt ist (McCracken, 1993a).
Die Hydrophobizität der Alkylrestes beeinflusst wesentlich die Hydrolyserate. Mit ansteigender
Hydrophobizitätskonstante von Methylacetat (C1) → Octylacetat (C8) nimmt die Hydrolyserate
bis Pentylacetat (C5) zu. Ab C6 (Hexylacetat) wurde eine fallende Hydrolyserate beobachtet.
Ebenso korrelierte die ansteigende Hydrophobizität von n-, iso-, sec- und tert-Butylacetat
negativ mit der Hydrolyserate in Rattengewebehomogenat.
Der Einfluss sterischer Faktoren, wie Verzweigungen, verringert sich mit zunehmendem Ab-
stand zum Carbonylkohlenstoffatom. Grundschober (1977) definierte die Hydrolyserate als
Substratabbau zwei Stunden nach Reaktionsstart und ermittelte diese in Schweinegewebe-
Homogenaten von Pankreas, Jejunum (mittlerer Dünndarmabschnitt) sowie Leber. Neben dem
Abfall der Esterkonzentration wurde zusätzlich die Menge an freigesetzter Alkoholkomponente
gemessen. Unter den gegebenen Redaktionsbedingungen (0,5 M Phosphatpuffer; pH 7,5 und
37 °C) war die Konzentration der untersuchten Ester um 50 bis 100 % reduziert.
Eine Gegenüberstellung der schnellen Hydrolysierbarkeit von aliphatischen und verzweigten
Acetatestern im Vergleich zum vergleichsweise langsamen Abbau von Estern mit aromatischer
Substituenten ist in Abb. 14 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen unterschiedliche Herangehens-
weisen der Autoren bei der Bestimmung von Hydrolyseraten. Verschiedene Untersuchungs-
bedingungen erschweren einheitliche Schlussfolgerungen.
Methylcinnamat wird in Vollblut und Serum sehr langsam hydrolysiert; daher ist vor allem im
Magen mit der Resorption von nicht-hydrolysiertem Ester zu rechnen. Eine hohe
Hydrolyseaktivität wurde im Gastrointestinaltrakt und in der Leberpräparation nachgewiesen.
Propylanthranilat und Anthranilsäure werden hauptsächlich über den Magen aufgenommen. Da
Propylanthranilat auch im peripheren Blut nachgewiesen wurde, kann auf eine langsamere
Hydrolyse des Esters geschlossen werden (Fahelbum & James, 1977).
Kakkar & Mayersohn (1998) studierten die in vivo Hydrolyse von Methylsalicylat an der Ratte
und wiesen eine vergleichsweise langsame Hydrolyse in Plasma nach (t1/2 36 min; Systemische
Clearance 14 ml/min kg).
3.3 Literaturübersicht zu Hydrolysestudien 31
Doppelbindungen oder Ringe in der Nähe der Carbonylfunktion lösen sterische Hinderungen
bei der Esterspaltung aus. Ein Vergleich der relativen Hydrolyseraten von Methylestern in
Schweineleberesterase ergab folgende Reihenfolge der Hydrolyseraten: -phenyloxy-
propanoat : -phenylpropanoat : -phenylcyclopropanoat : -trans-3-phenylpropenoat (cinnamat) =
85:70:2:1 (Basak et al., 1997).
Tab. 6: Studien zur Hydrolysierbarkeit von Carbonsäureestern
Substanz Summen-
formel
Spezies Testsystem S0 [mM] Hydrolysedauer / -rate Referenz
All Hex C9 H16 O2 Schwein Pankreas 0,34 2 h / 100%
All PhenAc C11 H12 O2 Pankreas 0,25 2 h / 100%
All Tigl C8 H12 O2 Darm 2,54 2 h / 100%
Grundschober, 1977
Am PhenAc C13 H18 O2 Pankreas < 0,11 2 h / 100%
iAm Ac C7 H14 O2 Pankreas 0,67 2 h / 20%
Darm 3,34 2 h / 100%
iProp But C7 H14 O2 Pankreas 1,23 2 h / 40%
iProp PheAc C11 H14 O2 Pankreas 0,45 2 h / 50%
Me Cinn C10 H10 O2 Kaninchen Blut 12,5 3 h / 0,59 mM
Serum 12,5 1 h / 0,25 mM
Ratte Blut 15,5 3 h / 0,54 mM
Serum 15,5 1 h / 0,29 mM
Gastroint. 12,5
10 ± 80⋅10-3 mol /min⋅gProt
Leber 12,5
20,3±1,7⋅10-6 mol/min⋅gProt
Fahelbum & James, 1977
Schwein LeberCE 7 - 40 kcat = 1 /min
Me PhenProp C10 H12 O2 Schwein LeberCE 7 - 40 kcat = 12,4 /min
Basak et al., 1997
Me Sali C8 H8 O3 Ratte, in vivo Plasma 0,85 t1/2 = 36 min Kakkar & Mayersohn, 1998
Kinetische Parameter nach Michaelis-Menten sind in Tab. 7 zusammengefasst. McCarthy &
Witz (1997) interpretierten den Quotienten Vmax/Km als Maß für die „Anfälligkeit“ von
Acrylatestern gegenüber der Hydrolyse durch Schweinelebercarboxylesterase (PLE). PLE hat
sich daher wegen ähnlicher katalytischer Eigenschaften seiner Isoenzyme als Modell für die
enzymatische Hydrolyse beim Menschen bewährt (Hosokawa et al., 1990).
Butylacrylat und Butylmethacrylat zeigen aufgrund annähernd gleich großer kinetischer
Parameter eine ähnliche Hydrolysierbarkeit durch Schweineleber-Cholinesterase. Ebenso
wurden Methylcinnamat (Methyl-trans-3-phenylpropenoat) und Methylphenylpropionat
untersucht und fast identische Km-Werte bestimmt. Die trans-Doppelbindung beeinflusst hier die
Enzymaffinität kaum. Generell werden Unterschiede bei kinetischen Parametern als signifikant
interpretiert, wenn sich diese um mindestens zwei Zehnerpotenzen unterscheiden.
Die
α
–Methylsubstitution hat einen geringen Einfluss auf Km und Vmax. Unter Berücksichtigung
der Vertrauensbereiche beider Parameter konnte keine signifikante Veränderung nachgewiesen
werden. Butylacrylat und Butylmethacrylat werden mit annähernd gleich großer Hydrolyse-
geschwindigkeit (Vmax) abgebaut. Ebenso kann von einer ähnlichen Affinität (Km) gegenüber
methylierten und unmethylierten Substraten ausgegangen werden (McCarthy, 1999).
32 3 Aromastoffe in Lebensmitteln
Tab. 7: Michaelis-Menten Parameter von Carbonsäureestern
Michaelis-Menten-Parameter Substanz Spezies Test-
system
S0 [mM]
Km
[mol /L]
Vmax
[mol /min⋅g Prot]
Vmax /Km
[L /g (mL)⋅min]
Referenz
iAm Ac AcChE (EC 3.1.1.7) 1 - 5 3,6⋅10-3 k. A. k. A. Cohen et al., 1984
But Acry Schwein LeberCE 0,005-0,25 33,3 ± 8,5⋅10-6 1,49 ± 0,83⋅10-9 45⋅10-6 McCarthy, 1999
But But Ratte LeberCE 0,2 - 2 0,11⋅10-3 470⋅10-6 k. A. Arndt & Krisch,
1973
But MeAcry Schwein LeberCE 0,005-0,25 72 ± 28⋅10-6 1,84 ± 0,64⋅10-9 26⋅10-6 McCarthy, 1999
Et Acry Schwein LeberCE 0,025-2,5 134 ± 16⋅10-6 8,9 ± 2,0⋅10-9 6,64⋅10-5 McCarthy & Witz,
1997
Et But Schwein LeberCE 0,1-12,7 0,44⋅10-3 11,7⋅10-6 /U - Adler et al., 1962
Et Methacry Schwein LeberCE 0,025-2,5 159 ± 90⋅10-6 5,2 ± 2,5⋅10-9 3,30⋅10-5 McCarthy & Witz,
1997
EtPhen Prop Rind LeberCE. k. A. 1,3⋅10-3 k. A. k. A. Wynne et al., 1973
Me But Schwein LeberCE 0,12 - 44,2 0,439⋅10-3 11,7⋅10-6 /U k. A. Adler et al., 1962
Me Cinn Ratte Leber 0,25 - 8,17 0,39 ± 0,05⋅10-3 53 ± 15⋅10-6 k. A. Fahelbum &
James, 1977
Schwein LeberCE 7 - 40 33,3⋅10-3 k. A. k. A. Basak et al., 1997
Me PhenProp Schwein LeberCE 7 - 40 5,9⋅10-3 k. A. k. A. Basak et al., 1997
Phen Ac Ratte LebMicr 0,5-4,0 1430 ± 140⋅10-6 800 ± 75⋅10-6 559⋅10-3
LebCyt
900 ± 500⋅10-6 30,7 ± 3,0⋅10-6 34⋅10-3
LungMicr
1460 ± 580⋅10-6 4,9 ± 3,1⋅10-6 3,3⋅10-3
LungCyt
1330 ± 550⋅10-6 14,2 ± 5,5⋅10-6 11⋅10-3
HautMicr
950 ± 100⋅10-6 1,13 ± 0,02⋅10-6 1,2⋅10-3
HautCyt
340 ± 50⋅10-6 3,4 ± 1,4⋅10-6 10⋅10-3
BlutPl/Cyt
2340 ± 40⋅10-6 290 ± 40⋅10-6 124⋅10-3
McCracken et al.,
1993
Die Länge des Alkylrestes beeinflusst die Michaelis-Menten-Konstante. Ethylacrylat besitzt im
Vergleich zu Butylacrylat einen vierfach höheren Km–Wert. Der mittlere Km-Wert für
Ethylmethacrylat wurde als annähernd doppelt so hoch bestimmt wie für Butylmethacrylat. Vmax
von Butylacrylat /-methacrylat war gegenüber Ethylacrylat /-methacrylat auf ein Sechstel /Drittel
verringert (McCarthy & Witz, 1997). Ghanayem et al. (1985) untersuchten den Einfluss von α-
Methylsubstituenten auf die Toxizität von Acrylaten. In einer Studie mit PLE konnte der Einfluss
auf kinetische Parameter nicht belegt werden (Adler et al., 1962).
Hydrolysestudien mit biologischem Material des Menschen wurden bisher nur vereinzelt
publiziert. Eine Übersicht dazu liefert Tab. 8. Im Vordergrund standen die vergleichende
Bewertung der Hydrolysierbarkeit von Phenylacetat sowie die Untersuchung der endogenen
Synthese von Fettsäureethylestern und deren Metabolismus (Doyle, 1994). McCracken et al.
(1993) untersuchten die in vitro Hydrolyseaktivität der Ratte mit Phenylacetat und etablierten die
Substanz als Marker für die Arylesteraseaktivität in biologischen Systemen.
Die Ratte verfügt in Blut, Plasma und Serum über höhere Esteraseaktivitäten als der Mensch
(Aldridge, 1953; Buchwald & Bodor, 1999 und 2000; McCracken et al., 1993 und 1993a;
Minagawa et al., 1995; Saghir et al., 1999). Human- und Rattenblut enthalten hohe Aktivitäten
an Cholinesterase (EC 3.1.1.7 und 3.1.1.8), dagegen ist die Aktivität der Carboxylesterase (EC
3.1.1.1, EC 3.1.1.2 und EC 3.1.16) bei der Ratte gegenüber der des Menschen deutlich erhöht.
3.3 Literaturübersicht zu Hydrolysestudien 33
Tab. 8: Studien zur Hydrolysierbarkeit beim Menschen
Michaelis-Menten-Parameter Substanz Testsystem S0
[mM]
Hydrolyse-
parameter Km
[mol /L]
Vmax
[mol/min]
Vmax /Km
[l/min⋅g]
Referenz
Phen Ac LeberMicr 0,5 - 4 k. A. 280 ± 93⋅10-6 57 ± 21⋅10-6
/g Gewebe
0,204 McCracken et al.,
1993a
LeberCyt 0,5 - 4 k. A. 190 ± 66⋅10-6 37 ± 8⋅10-6
/g Gewebe
0,195
BlutPl 0,5 - 4 k. A. 1480 ± 285⋅10-6 250 ± 54⋅10-6
/ml Plasma
0,168
Serum 3,0
38-126⋅10-6 mol /ml
Serum⋅min
k. A. k. A. k. A. Mutch et al., 1992
FAEE Fettgewebe k. A. t1/2 = 16 – 24 h k. A. k. A. k. A. Doyle, 1994
Arndt & Krisch (1973) sowie Junge & Heymann (1979) stellten den Einfluss der Kettenlänge von
Acyl- und Alkylresten auf kinetische Parameter bei der enzymatischen Hydrolyse von Methyl-
estern und Acetaten dar (Abb. 13 bis Abb. 16).
Substratinhibition setzte bei der Hydrolyse von Methylestern in Rattenlebercarboxylesterase bei
S0 > 0,01 mol/L ein. Ein scharfer Maximalwert für Vmax wurde bei der Acylkettenlänge C4
(Methylbutyrat) ermittelt, wogegen der Verlauf von pKm keine Abhängigkeit von der
Acylkettenlänge zeigte. Bei der Hydrolyse von Alkylacetaten stieg Vmax von C1 bis C3
kontinuierlich an und erreichte ein Maximum für Propylacetat (Arndt & Krisch, 1973).
() pKm Isoenzym V; () Vmax Isoenzym V;
() pKm Isoenzym I, (▲) Vmax Isoenzym I
Abb. 13: Einfluss der Acylkettenlänge auf
pKm (•) und Vmax (▲) bei der
Hydrolyse von Methylestern durch
Carboxylesterase aus Ratten-
lebermikrosomen (nach Arndt &
Krisch, 1973)
Abb. 14: Abhängigkeit von Vmax und Km
von PLE Isoenzymen I und V von
der Acylkettenlänge bei der
Hydrolyse von Methylestern
(nach Junge & Heymann, 1979)
34 3 Aromastoffe in Lebensmitteln
Abb. 15: Einfluss der Alkylkettenlänge auf
pKm (•) und Vmax (▲) bei der
Hydrolyse von Acetaten durch
Carboxylesterase aus Ratten-
lebermikrosomen (nach Arndt &
Krisch, 1973)
Abb. 16: Abhängigkeit von Vmax und Km von
PLE Isoenzymen I und V von der
Alkylkettenlänge bei der
Hydrolyse von Acetaten (nach
Junge & Heymann, 1979)
Der Vergleich von Abb. 13 und Abb. 15 lässt den Schluss zu, dass der stärkere Einfluss auf
Vmax von der Kettenlänge des Acylrestes ausgeht. Die zunehmende Alkylkettenlänge von
Acetatestern ergibt ansteigende Werte für pKm, die sich, ohne ein Maximum zu erreichen, bis zu
einer Acylkettenlänge von C7 plateauförmig annähern. Der Mechanismus verläuft wie bei allen
Serinesterasen über die Bildung eines Acyl-Enzym-Intermediats, dessen Zerfall als
geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Gesamtreaktion angesehen wird. Der Einfluss der
Rückreaktion der Intermediat-Bildung ohne Substratumsatz, nimmt mit zunehmender
Hydrophobizität des Alkylrestes zu, was letztlich zu einem Abfall der Gesamtumsatzrate (Vmax)
bei Alkylkettenlängen von C3 bis C7 führt.
Bei der Hydrolyse von Acetatestern zeigt das Isoenzym V ein Minimum für die Maximalge-
schwindigkeit bei den Alkylkettenlängen von Butyl-(C4) und Pentyl-(C5)acetat (Abb. 16).
Isoenzym I zeigt dagegen die deutliche Präferenz für den Umsatz von Acetaten mit längeren
Alkylresten. Der pKm–Wert beider Isoenzyme zeigt annähernd gleich große Werte und steigt mit
zunehmender Alkylkettenlänge leicht an. Die Tendenz von Isoenzyme I, bevorzugt
Monoacylester mittlerer Kettenlänge zu hydrolysieren, deckt sich mit seiner Cholinesterase-
eigenschaft. Für Isoenzym V wurde eine höhere Substratspezifität nachgewiesen, was
besonders in der schnellen Transacylationskatalyse zum Ausdruck kommt. Für die inversen
Ester Butylacetat und Methylpentanoat, die eine identische Summenformel und Molekülgröße
aufweisen, wurden ähnliche Km-Werte, aber deutlich verschiedene Vmax–Werte bestimmt.
Ursache dafür kann eine „unproduktive“ Enzym-Substrat-Bindung [ES] sein: [ES] ist zu stabil, zu
instabil oder eine unvorteilhafte geometrische Anordnung des Substrates verhindert deren
Umsetzung (Savary, 1972).
35
4 Problemstellung und Lösungsansätze
Wie einleitend beschrieben, spielt die Hydrolysierbarkeit von Carbonsäureestern, die als
Aromastoffe und als Bestandteile von Lebensmittelverpackungsmaterial Bedeutung haben, bei
der toxikologischen Bewertung dieser Stoffe eine wichtige Rolle.
Seit der ersten Beschreibung enzymatisch katalysierter Reaktionen anhand von kinetischen
Parameter durch Michaelis und Menten (1928) werden kontinuierlich Studien veröffentlicht, die
Hydrolyseeigenschaften von Carbonsäureestern beschreiben. Castle et al. (1993), Dahl (1987),
Fahelbum & James (1977 und 1979), Hagan et al. (1967), Longland et al. (1977), McCarthy &
Witz (1997) sowie McCracken et al. (1993a) untersuchten verschiedene Carbonsäureester hin-
sichtlich ihrer Hydrolysierbarkeit in biologischem Material von Ratte, Kaninchen, Schwein und
Hamster sowie künstlicher Magenflüssigkeit und Darminhalt. Studien auf der Grundlage von
biologischem Material des Menschen existieren hingegen nur in geringer Anzahl. Überwiegend
wurden Hydrolysestudien mit Phenylacetat veröffentlicht (McCracken et al., 1993; Mutch, 1992).
Auf diesen Grundlagen aufbauend sollen in unserer Studie mit Humanplasma die Hydrolyse-
eigenschaften von Carbonsäureestern näher untersucht werden. Dazu ist es zunächst
erforderlich, eine geeignete Methode zu quantitativen Beschreibung der Hydrolysierbarkeit zu
validieren.
Im ersten Abschnitt werden zur Beschreibung der Hydrolyseeigenschaften anhand von
Esterabbauraten und/oder Eduktbildungsgeschwindigkeiten geeignete Modellsubstanzen und
pharmakokinetische Parameter festgelegt. Insgesamt werden 15 Carbonsäureester untersucht,
die sich hinsichtlich ihrer chemischen Struktur im Acyl- und/oder Alkylrest unterscheiden. Diese
Ester befinden sich in der ständig aktualisierten JECFA Flavouring Agents Database (JECFA,
2002) und repräsentieren für Aromastoffe charakteristische Strukturelemente. Die Substanzen
werden in drei Strukturkassen unterteilt:
• Ethylester mit linear unverzweigtem Acylrest verschiedener Kettenlänge,
• Ethyl- und Benzylester mit verzweigtem oder aromatischem Acyl- oder Alkylrest und
• Ester mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer Struktur.
Ziel der Arbeit ist es, den strukturellen Moleküleigenschaften durch Ableitung von Struktur-
Wirkungsbeziehungen einen Zusammenhang zwischen chemischer Struktur und
Hydrolysierbarkeit zuzuordnen.
Einen Schwerpunkt bildet die Beurteilung der Hydrolyseeigenschaften von Tiglinsäureestern,
die sich in Studien mit Pankreas-, Darm- und Lebergewebe vom Schwein als langsam
hydrolysierbar erwiesen haben. Als Referenzsubstanz wird Phenylacetat verwendet. Diese
Verbindung wird in biologischen Medien mit Esteraseaktivität schnell hydrolysiert und ist daher
als Marker für Arylesteraseaktivität im Plasma geeignet (McCracken 45, 1993). Die von
Mutch (1992) und McCracken (1993) publizierten Hydrolyseparameter am Menschen werden
zur Plausibilitätskontrolle der erhaltenen Messergebnisse herangezogen.
Voraussetzung für die Metabolisierung eines Stoffes ist seine Verteilung im Körper.
Carbonsäureester besitzen meist hydrophobe Eigenschaften, woraus die geringe Löslichkeit im
wässrigen Medium resultiert. Diese wiederum beeinflusst die Verteilung der Substanzen im
Organismus und damit deren Eliminierung.
36 4 Problemstellung und Lösungsansätze
Voruntersuchungen sollen die Beurteilung der chemisch-physikalischen Eigenschaften der
Ester ermöglichen. Dazu wird die Löslichkeit der Ester experimentell bestimmt und die
Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten abgeleitet. Weiterhin wird ein geeignetes Verfahren
zur reproduzierbaren Gewinnung von Ratten- und Humanplasma etabliert. Als methodische
Vorversuche werden Hydrolyseexperimente in den biologischen Systemen Ratten- und
Humanplasma, künstliche Magenflüssigkeit sowie Rattenleberhomogenat durchgeführt.
Im Vordergrund der kinetischen Hydrolyseexperimente steht die Untersuchung von
Humanplasma. Rattenplasma wird zur Methodenvalidierung eingesetzt. Die in der
Vergangenheit veröffentlichten Studien zu Struktur-Wirkungsbeziehungen dienen als Ansatz für
die Methodenentwicklung sowie zur Gegenüberstellung von Zwischenergebnissen. Zusätzlich
wird die Hydrolysierbarkeit in Rattenleberhomogenat und künstlicher Magenflüssigkeit
untersucht.
Ein geeignetes chromatographischen Analyseverfahren soll die Erfassung des zeitlichen
Verlaufs der enzymatischen Hydrolyse anhand der Esterhydrolyseprodukte (Alkohol und
Carbonsäure) ermöglichen. Aus der Eliminationsgeschwindigkeit werden folgende
pharmakokinetische Kenngrößen berechnet:
• spezifische Hydrolyseaktivität,
• Halbwertzeit sowie
• enzymkinetische Parameter nach der Theorie von Michaelis-Menten.
Diese Parameter werden im Zusammenhang mit Reaktionsmechanismen der esterase-
katalysierten Hydrolyse sowie qualitativen und quantitativen Aussagen zu Reaktivität und
Struktur der Carbonsäureester interpretiert.
Die zusammenfassende Bewertung der Ergebnisse soll darin münden, die untersuchten
Carbonsäureester anhand ihrer Hydrolysierbarkeit, unter Berücksichtigung der strukturellen
Merkmale, in Gruppen einzuteilen.
Abschließend wird die Möglichkeit der Extrapolation von Ergebnisse aus Tierstudien auf den
Menschen unter Berücksichtigung verschiedener intrinsischer Unterschiede, der Kinetik und
Metabolisierung erörtert. Weiterhin soll die Übertragung von Daten aus in vitro Bedingungen auf
die Ableitung von in vivo Ergebnissen diskutiert werden.
37
5 Ergebnisse
5.1 Zur Auswahl der Carbonsäureester und Herangehensweise
Es wurden Ester ausgewählt, die sich hinsichtlich ihrer chemischen Struktur im Acyl- und/oder
Alkylrest unterscheiden (Abb. 17). Ausgehend von der Substanz Ethylheptanoat wurden
folgende Fragestellungen zur Beschreibung des Hydrolyseverhaltens gestellt:
• Einfluss der Kettenlänge des Acylrestes bei Ethylestern,
• Einfluss des Alkylrestes im Vergleich von Ethyl- und Benzylestern,
• Vergleich von Estern mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer
Struktur.
Ein Schwerpunkt lag auf der Beurteilung der Hydrolyseeigenschaften der Ester der Tiglinsäure
(trans-2,3-Dimethylacrylsäure): Ethyltiglat und Benzyltiglat. Tiglate haben sich in Studien mit
Pankreas-, Darm- und Lebergewebe vom Schwein als langsam hydrolysierbar erwiesen
(Grundschober, 1977).
Ethylpropionat
Ethylvalerat
Ethylheptanoat
Ethylundecanoat
Methyloctanoat
Ethylmyristat
Ethyltiglat
Ethylcinnamat
Ethylphenylacetat
Ethylisovalerat
Isoamylbutyrat
Ethylsalicylat
Benzyltiglat
Benzylphenylacetat
Benzylsalicylat
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OOH
O
OOH
O
O
O
O
O
O
O
O
Abb. 17: Substratübersicht für die enzymatische Hydrolyse in Humanplasma
Die Referenzsubstanz Phenylacetat (Abb. 18) wird in biologischen Medien mit Esteraseaktivität
sehr schnell hydrolysiert und ist in vorangegangenen Studien als Marker für
Arylesteraseaktivität im Plasma eingeführt worden (McCracken et al., 1993).
38 5 Ergebnisse
O
O
Abb. 18: Referenzsubstanz Phenylacetat
In der ersten Projektphase wurden Ethylheptanoat, Ethyltiglat, Benzyltiglat sowie Phenylacetat
untersucht und mit Rattenplasma als Hydrolysemedium zur Methodenentwicklung eingesetzt.
Diese Untersuchungen ermöglichten eine Abschätzung von Reproduzierbarkeit verschiedener
Hydrolyseexperimente und Einflussfaktoren. Diese Vorversuche führten zu allgemeinen
Aussagen, die eine Einordnung der hydrolytischen Aktivität von Humanblutplasma im Vergleich
mit anderen physiologischen Medien erlauben. Im einzelnen wurden Rattenblutplasma, Krebs-
Henseleit-Puffer als Leerwert für Plasma, künstliche Magenflüssigkeit sowie Leberhomogenat
untersucht.
5.2 Löslichkeit der Carbonsäureester im wässrigen Medium
Eine wesentliche Voraussetzung für die Metabolisierung eines Stoffes ist seine Verteilung im
Körper. Carbonsäureester werden im Allgemeinen als lipophile Substanzen bezeichnet, die sich
nicht oder schwer in Wasser lösen und damit schlecht ausgeschieden werden. Die Löslichkeit
ist somit ein wichtiger Parameter für die Resorption, Verteilung und Eliminierung in vivo.
Die Umwandlung lipophiler Substanzen zu hydrophilen Metaboliten ist essentiell für deren
Ausscheidung. Die Biotransformation von Carbonsäureestern erfolgt über den in Abschnitt 2.3
beschriebenen Weg. Darüber hinaus wird die Bioverfügbarkeit bei der enzymatischen
Hydrolyse maßgeblich von der Löslichkeit im jeweiligen Hydrolysemedium bestimmt. Eine
Abschätzung der Löslichkeit ist daher für die Beurteilung der Ergebnisse vorliegender Studie
unabdingbar.
Hansen und Andersen (1988) publizierten dazu sogenannte REM-Werte. Dieser Parameter
beschreiben als Relative Energy Difference ein Maß für die Affinität von Lösemitteln gegenüber
dem zu lösenden Agens. REM-Werte berücksichtigen Wechselwirkungen (unpolare, Dipol-,
Wasserstoffbrückenbindungen) und Energiedifferenzen zwischen Lösemittel und zu lösender
Substanz.
Die untersuchten und strukturverwandten Carbonsäureester sowie deren Metabolite
(Essigsäure, Benzoesäure, Benzylalkohol, Butyl- und sec-Butylacetat, Ethanol, Ethylacetat,
Ethylcinnamat, Isoamylacetat, Methanol, Methyloleat, Stearinsäure) weisen REM-Werte > 1 auf;
das heißt, sie besitzen eine geringe Affinität gegenüber Blutserum und werden somit als
schlecht löslich charakterisiert (Hansen & Andersen, 1988). Darauf beruht die Annahme der
Abstoßung und physikalischen Barriere zwischen Lösemittel und Substanz.
Eine weitere Messgröße zur Beschreibung des Löslichkeitsverhaltens sind Verteilungskoeffi-
zienten. Kaneko (1994) untersuchte Verteilungskoeffizienten in Ratten- und Humanplasma.
Acetatester zeigten in Rattenplasma eine gegenüber Humanplasma um den Faktor 2,8 erhöhte
5.2 Löslichkeit der Carbonsäureester im wässrigen Medium 39
Löslichkeit. Dieser Trend setzte sich bei C1 bis C5 -Alkoholen fort. Weiterhin liegen Hinweise
darauf vor, dass n-Alkylacetate im Vergleich mit iso-Alkylacetaten leichter löslich sind.
Die Löslichkeit der untersuchten Carbonsäureester wurde in Krebs-Henseleit-Puffer bei einer
Temperatur von 37 °C bestimmt. Krebs-Henseleit-Puffer wurde auf pH 7,4 eingestellt und
entsprach damit den physiologischen Werten für Mensch (Normalwert: 7,36 - 7,44) und Ratte
(Normalwert: durchschnittlich 7,36). Darüber hinaus besitzen Krebs-Henseleit-Puffer, Human-
und Rattenplasma eine ähnliche mineralische Zusammensetzung (Abb. 19 sowie Tab. 34 in
Anhang III).
0
1
10
100
1000
Natrium Kalium Magnesium Chlorid Phosphat
(anorg.)
Calcium
[10-3 mol /L]
Krebs-Henseleit-Puffer Rattenplasma Humanplasma
Abb. 19: Zusammensetzung von Krebs-Henseleit-Puffer im Vergleich mit Ratten- und
Humanplasma
Für den Puffer wurde bideionisiertes, membranfiltriertes Wasser verwendet, da Fremdionen
bekanntermaßen die Konformation von Proteinen beeinflussen können (Hayakawa, 1989;
Rick, 1990). Unter diesen Bedingungen wurden die Untersuchungsparameter der folgenden
Hydrolyseexperimente simuliert.
Tab. 9 zeigt eine Übersicht der ermittelten Ergebnisse im Vergleich mit Literaturangaben und
dem Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten (log PO/W). log PO/W wird häufig zur Abschätzung
der Affinität eines Analyten zu biologischen Membranen und damit als Maß für die
Bioakkumulation einer Substanz herangezogen. Er beschreibt modellhaft die Fähigkeit einer
Substanz, Membran-Lipidschichten durch Diffusion passieren zu können und wird zur
Beurteilung der Resorbierbarkeit einer Substanz aus dem Magen-Darm-Trakt genutzt (Hansch
& Leo, 1979). Analytisch stellt der Koeffizient die Verteilung einer Substanz in einem gesättigten
n-Octanol-Wasser-Lösemittelgemisch dar. Je größer der Koeffizient ist, desto höher ist in der
Regel die Affinität zur organischen Phase:
W
O
W/O c
c
)Plog( = cO = Konzentration des Analyten in der n-Octanol-Phase
cW = Konzentration des Analyten in der wässrigen Phase
40 5 Ergebnisse
Tab. 9: Löslichkeit von Carbonsäureestern in Krebs-Henseleit-Puffer (Messwerte) im Vergleich
mit Longland et al. (1977) in aqua dest. bei 37°C sowie dem Octanol/Wasser-
Verteilungskoeffizienten (log PO/W)
log PO/W [nach Longland et al., 1977] Messwerte
Substanz Summenformel Näherung3 „mg /100 ml H2O“ [mmol /L] [mmol /L]
Ethylpropionat C5 H10 O2 1,071 - -
183,2 ± 36,2 (n = 5)
Ethylbutyrat C6 H12 O2 - 600 56,8 -
Ethylvalerat C7 H14 O2 1,939 - -
11,30 ± 1,25 (n = 5)
230 17,7 - Ethylisovalerat C7 H14 O2 1,881
- -
13,90 ± 0,96 (n = 6)
Ethylcaproat C8 H16 O2 - 3,2 3,19 -
17 1,07 - Ethylheptanoat C9 H18 O2 2,807
- -
0,69 ± 0,18 (n = 7)
Ethylpelargoat C11 H22 O2 - 1,2 0,064 --
Ethylundecanoat C13 H26 O2 4,543 - - 0,091± 0,0038 (n = 3)
Ethyllaurat* C14 H28 O2 - 2,7 0,118 -
Ethylmyristat C16 H32 O2 5,845 - - 0,064 ± 0,040 (n = 4)
Ethyltiglat C7 H12 O2 1,904 - -
16,10 ± 2,04 (n = 6)
Benzyltiglat C12 H14 O2 3,324 - - 0,49 ± 0,06 (n = 4)
Benzylsalicylat C14 H12 O2 3,519 - - 0,24 ± 0,02 (n = 4)
Benzylphenylacetat C15 H14 O2 3,475 - - 0,21 ± 0,05 (n = 5)
Ethylphenylacetat C10 H12 O2 2,275 - - 8,59 ± 1,41 (n = 4)
Methylphenylacetat* C9 H10 O2 - 9 0,60 -
Ethylsalicylat C9 H10 O3 2,319 - -
1,83 ± 0,18 (n = 6)
Ethylcinnamat C11 H12 O2 3,099 - - 1,60 ± 0,41 (n = 6)
Methyloctanoat C9 H18 O2 2,838 - -
0,70 ± 0,06 (n = 6)
Heptylacetat C9 H18 O2 - -
0,86 ± 0,09 (n = 5)
24 1,52 - Isoamylbutyrat C9 H18 O2 2,749
- -
0,88 ± 0,13 (n = 7)
Isoamylcaproat C11 H22 O2 - 1,5 0,081 -
Phenylacetat C8 H8 O2 2,026 - -
35,1 ± 1,94 (n = 4)
Phenylethylacetat* C10 H12 O2 - 126 7,67 -
Die Löslichkeit von Ethylestern mit linear gesättigter Acylkettenlänge wurde von 3 bis 14
Kohlenstoffatomen untersucht (Abb. 20). Sie weist mit 0,064 mM für Ethylmyristat (C14) bis
183 mM für Ethylpropionat (C3) auf große Unterschiede in den polaren Eigenschaften der
Substanzen hin.
Mit zunehmender Kettenlänge des Acylrestes nimmt der unpolare Einfluss zu und führt zu
ansteigender Hydrophobie des Moleküls. Diese Beobachtung wird gestützt durch die
Übereinstimmung mit Literaturangaben für die Löslichkeit in destilliertem Wasser
((Longland, 1977). Ein signifikanter Unterschied zwischen der Löslichkeit in Krebs-Henseleit-
Puffer (pH 7,4) und destilliertem Wasser bei 37 °C wurde nicht festgestellt.
Ethylvalerat und –isovalerat zeigen, unter Bezugnahme auf die Literaturangabe (Longland
et al., 1977), keinen signifikanten Unterschied in der Löslichkeit. Ein polaritätsverändernder
Einfluss von Verzweigungen in kurzkettigen Acylresten auf das Gesamtmolekül konnte
demnach nicht nachgewiesen werden.
3 Abschätzung mittels interaktivem logP-Kalkulator miLog 1.2
5.2 Löslichkeit der Carbonsäureester im wässrigen Medium 41
0,01
0,10
1,00
10,00
100,00
1000,00
EP EB* EisoV* EisoV EV ECap* EH* EH EL* EU EPel* EM
Löslichkeit [mmol /l]
Abb. 20: Löslichkeit von Ethylestern mit aliphatisch linear gesättigtem Acylrest sowie
Ethylisovalerat in Krebs-Henseleit-Puffer bei 37°C im Vergleich mit Longland et al. (1977)
Aromatische Substituenten erhöhen den lipophilen Einfluss des jeweiligen Molekülrestes. Bei
Ethylestern mit aromatischen Acylresten wurde ein deutlicher Abfall der Löslichkeit beobachtet
(Ethylphenylacetat, -salicylat und –cinnamat). Substanzen, die aromatische Reste im Acyl- und
Alkylrest aufweisen, besitzen dagegen deutlich hydrophobere Eigenschaften
(Benzylphenylacetat und –salicylat; Ethyl- und Benzyltiglat), siehe Abb. 21.
Substanzen mit identischer Summenformel (C9H18O2) zeigen ähnliche polare Eigenschaften. Mit
zunehmender Kettenlänge steigt die Hydrophobie des Alkylrestes in der Reihenfolge
Methyloctanoat → Ethylheptanoat → Isoamylbutyrat. In gleichem Maße nehmen die hydrophilen
Eigenschaften des Acylrestes zu. Im Gesamtmolekül heben sich diese Einflüsse auf (Abb. 22).
0,01
0,10
1,00
10,00
100,00
ET EPA EPA* MPA* ES EC BT BPA BS
Löslichkeit [mmol /L]
Abb. 21: Löslichkeit von Ethyl- und Benzylestern in Krebs-Henseleit-Puffer bei 37°C im Vergleich
mit Longland et al. (1977)
42 5 Ergebnisse
0,01
0,10
1,00
10,00
100,00
MO EH* EH IAB* IAB IACap*
Löslichkeit [mmol /L]
Abb. 22: Löslichkeit von Estern mit identischer Summenformel und unterschiedlicher chemischer
Struktur sowie Isoamylcaproat (IACap) in Krebs-Henseleit-Puffer bei 37°C (Messwerte)
im Vergleich mit Longland et al. (1977) in Wasser bei 37°C
Anhand ihrer Löslichkeit gemäß Tab. 9 wurden die untersuchten Carbonsäureester den
folgenden drei Löslichkeitsklassen zugeordnet:
begrenzt löslich: Substanzen, in denen sich polarer und unpolarer Rest ausgleichen (Acyl-
und Alkylreste mit niederen und mittellangen Kohlenstoffketten, einzelne
aromatische Carbonsäuren): begrenzt löslich in Wasser, löslich in Ether,
bedingt löslich: Substanzen, in denen sich polarer und unpolarer Rest ausgleichen,
tendenziell ist der unpolare Einfluss erhöht (Acyl- und Alkylreste mit
aromatischen Carbonsäuren, niederen und mittellangen Kohlenstoff-
ketten): bedingt löslich in Wasser, löslich in Ether sowie
minimal löslich: Ester, in denen der unpolare Rest im Acyl- oder Alkylrest überwiegt
(> 6 Kohlenstoffatome, aromatische Carbonsäuren oder Alkohole):
minimal löslich in Wasser, löslich in Ether.
Die Mehrheit der untersuchten Ester wurde als begrenzt oder bedingt löslich eingestuft.
Besonders Ethylester mit kurzkettigen Fettsäuren (< 6 Kohlenstoffatome) können
übereinstimmend mit Literaturangaben (Jahreis, 1998 und Mills, 1999) als gut wasserlöslich
bezeichnet werden. Im Bereich eines mittellanges Acylrestes (bis 10 Kohlenstoffatome;
Goss, 1999) wurden bedingt wasserlösliche Eigenschaften nachgewiesen (Tab. 10).
Bei Ethylestern mit langkettigem Acylrest (> 10 Kohlenstoffatome) betrug die Löslichkeit
< 0,10 mM (Savary, 1970). Für diese im Wässrigen minimal löslichen Substanzen war der
Nachweis einer hydrolytischen Spaltung nur schwer möglich. Die große Schwankungsbreite der
Ergebnisse resultiert aus der Nähe der Messdaten zur Nachweisgrenze.
5.2 Löslichkeit der Carbonsäureester im wässrigen Medium 43
Tab. 10: Löslichkeit der untersuchten Carbonsäureester in Krebs-Henseleit-Puffer
Löslichkeitsklasse Substanz Löslichkeit in Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4; 37°C)
begrenzt löslich Ethylpropionat 10 mM > Löslichkeit < 250 mM
Ethylvalerat
Ethylisovalerat
Ethyltiglat
Ethylphenylacetat
Phenylacetat
bedingt löslich Ethylheptanoat 0,10 mM > Löslichkeit < 10 mM
Ethylcinnamat
Benzyltiglat
Benzylsalicylat
Benzylphenylacetat
Methyloctanoat
Isoamylbutyrat
minimal löslich Ethylundecanoat < 0,10 mM
Ethylmyristat
Zusätzlich lassen sich Aussagen über das Anreicherungsvermögen in biologischen Medien
ableiten. Man unterscheidet nach Schäfer & Marquardt (2004) drei Gruppen:
• (log PO/W < 0,5): nicht anreichernd bzw. schlechte Resorption aufgrund niedriger
Lipophilität,
• (0,5 ≥ log PO/W ≤ 2): leicht anreichernd bzw. gute Resorption sowie
• (log PO/W > 2): stark anreichernd bzw. zunehmend geringe Resorption aufgrund
schlechter Wasserlöslichkeit.
Außer Ethylpropionat, -valerat, –isovalerat und –tiglat besitzen alle untersuchten Ester mit
einem log PO/W > 2 eine starke Tendenz zur Anreicherung (Abb. 23). Für hydrophobe Ethylester
(Acylrest Cn > 6) wurde von Laposata et al. (1989) eine Anreicherung im Fettgewebe von Ratten
beschrieben. Die Substanzen werden im adipösen Gewebe gespeichert, gelangen nach und
nach in den Blutkreislauf und zirkulieren über mehrere Stunden im Körper (Saghir et al., 1997).
Abb. 23: Schematische Darstellung der negativen Korrelation von Löslichkeit in Krebs-Henseleit-
Puffer (37 °C) und Hydrophobizität von Carbonsäureestern log PO/W
0,01
1000,00
110
log PO/W
Löslichkeit [mmol /L]
EP
PA
EPA
ES EC
ET
EiV
EV
IAB
EH MO BT
BPA
BS
EU EM
44 5 Ergebnisse
0,01
0,10
1,00
10,00
100,00
1000,00
EP PA ET EiV EV EPA ES EC IAB MO EH BT BS BPA EU EM
log P
Löslichkeit
mmol /L
Abb. 24: Löslichkeit in Krebs-Henseleit-Puffer (37 °C) und Hydrophobizität log PO/W von
Carbonsäureestern
Die Geschwindigkeit der Diffusion durch lipophile Zellmembranen steigt nicht parallel zu
log PO/W. Bei sehr guter Verteilung und gleichzeitig sehr geringer Löslichkeit im Wässrigen rei-
chern sich lipophile Substanzen in der Membran an (Dekant, 1994). Tab. 9 zeigt in Verbindung
mit Abb. 24 die mit abnehmender Löslichkeit erwarteten ansteigenden Werte für log PO/W.
Dieser Zusammenhang bestätigt zusätzlich die experimentell erhaltenen Ergebnisse für die
Löslichkeit.
5.3 Plasmagewinnung
Blutplasma ist das zu Untersuchungen der Enzymaktivität oder auf dem Gebiet der Metabolis-
musstudien am häufigsten verwendete biologische Material außerhalb des klinisch-chemischen
Bereiches. Vollblut oder Serum spielen als Untersuchungsmaterial eine untergeordnete Rolle.
Vollblut besteht aus einer eiweißreichen Flüssigkeit, dem Blutplasma. Es macht ca. 55 % seines
Gesamtvolumens aus. Daneben sind Erythrozyten (44 Vol %), Leucozyten, Lymphozyten und
Thrombozyten (zusammen ca. 1 Vol %) im Blut enthalten (Pschyrembel, 2001;
Rapoport, 1987). Nach der Ausfällung des Fibrins im Plasma wird Blutserum erhalten. Dieser
als Spontangerinnung bezeichnete Vorgang dauert mindestens 30 Minuten.
Im Vordergrund dieser Studie stand die Untersuchung der so weit wie möglich originären
Esteraseaktivität im Plasma. Jeder Zeitverzug besonders bei Temperaturen über 4 °C würde
zum Abfall der Enzymaktivität führen. In Anlehnung an die Methodik von McCracken (1993)
wurde das Vollblut daher unmittelbar nach der Gewinnung auf 4 °C abgekühlt, 10 min gelagert
und im Anschluss zentrifugiert, ohne die Kühlkette zu unterbrechen. Bei der Plasmagewinnung
wird die Spontangerinnung durch den Zusatz eines Antikoagulans unterbunden. Calcium
katalysiert mehrere Stufen der Thrombinbildung und damit die Blutgerinnung. Die Wirkung
eines Antikoagulans besteht demnach im Entfernen entsprechender Ionen. Nur das verwendete
5.3 Plasmagewinnung 45
Heparinat bindet Calcium reversibel und zeitlich begrenzt. Es wird aus dem Plasma nicht
entfernt. Eine Konformationsänderung, hervorgerufen durch eine veränderte Ionenzusammen-
setzung bei Plasmaproteinen, kann damit weitestgehend ausgeschlossen werden. Andere
gerinnungshemmend wirkende Substanzen wie Citrate und EDTA (Komplexbildung) oder
Oxalat und Fluorid (Ausfällung) entfernen Calciumionen dauerhaft aus dem Plasma und sind
aus genannten Gründen für Metabolismus- oder Enzymaktivitätsbestimmungen ungeeignet
(Englhardt, 1974; Peter, 1977; Rick, 1990). Plasma ist im Gegensatz zu Serum praktisch frei
von Hämoglobin. Hämoglobin im Plasma zeigt die Lyse von Erythrozyten (Hämolyse) an und
weist auf Störungen bei der Plasmagewinnung hin. Die Freisetzung des Zellinhalts von Erythro-
zyten führt zur Erhöhung der Kalium- und Phosphatkonzentration sowie der Aktivität
verschiedener Enzyme (Rick, 1990). Hämolytisches Plasma wurde nicht für die Plasmapool-
gewinnung verwendet. Ziel der Plasmagewinnung war es, mehrere Pools mit vergleichbarer
Esteraseaktivität zu erhalten. Dabei wurden verschiedene Einflussfaktoren auf die spezifische
Enzymaktivität im Blutplasma berücksichtigt und wie folgt minimiert:
Interindividuelle Schwankungen
Mutch et al. (1992) quantifizierten die interindividuelle Schwankungsbreite der Esteraseaktivität
verschiedener Enzyme im Humanblut. Mit Phenylvalerat und -acetat wurde die spezifische
Esteraseaktivität mit 2,5 bis 16,2 (n = 113) und 38 bis 126 µmol /ml⋅min (n = 124) bestimmt. Die
Untersuchung der interindividuellen Schwankung war nicht Gegenstand der Dissertation. Durch
das Anlegen der Plasmapools wurde ein mittlerer Wert für die Esteraseaktivität ermittelt, der
eine speziesspezifische Betrachtung von Ratte und Mensch ermöglichte. Generell wurde ange-
strebt, dass sich bei wiederholter Gewinnung von Humanplasma die selben Probanden zur
Verfügung stellen. In Anlehnung an McCracken (1993) und Minagawa (1995) entstammten die
Ratten dem gängigen Zuchtstamm Wistar/Hann und wurden aus der institutseigenen Tierzucht-
anlage bezogen.
Geschlechtsspezifische Unterschiede
Geschlechtsspezifische Unterschiede sind bei der Ratte hinsichtlich der Carboxylesterase-
aktivität (Gad, 1994; Robbi, 1983) und beim Menschen aus der klinischen Diagnostik bekannt
(Feissli, 1966). In der vorliegenden Studie wurde ausschließlich Blut männlicher Probanden
verwendet. Alle Ratten waren männlichen Geschlechts.
Krankheitsspezifische Unterschiede
Organerkrankungen können zu einem erhöhten endogenen Enzymabbau (Proteinkatabolismus
und Proteinresorption über das lymphatische System) führen und verändern damit das Enzym-
verteilungsmuster im Blutplasma und den Organen (Englhardt, 1966; Haug, 1969). Alle Proban-
den waren nach eigenen Angaben gesund. Die inneren Organe der Ratten wurden
augenscheinlich begutachtet; es kam nur das Blut gesunder Tieren zur Anwendung.
Tagesschwankungen
Die Blutentnahme fand unter konstanten Bedingungen am nüchternen Probanden unter Ruhe-
bedingungen statt, da Tagesschwankungen den Enzymspiegel nach körperliche Belastung oder
Nahrungsaufnahme verändern (Massarat, 1964; Otto, 1964). Die Entnahme von Rattenblut
erfolgte einheitlich morgens, kurz nach Beginn des Tagrhythmus an der nüchternen Ratte.
46 5 Ergebnisse
Altersabhängige Schwankungen
Die männlichen Probanden wiesen ein weites Altersspektrum auf (Tab. 11). Die Humanpools
repräsentierten damit die Esteraseaktivität eines mittleren Alters von 42,8 ± 9,6 bis
44,4 ± 11,1 Jahren. Solbach und Merten veröffentlichten 1965 eine umfangreiche Studie zur
altersabhängigen Änderungen von Enzymaktivitäten im Humanblut. Dagegen konnten Williams
et al. (1989) keinen signifikanten Hinweis auf eine altersabhängige Esteraseaktivitäten beim
Menschen finden.
Tab. 11: Parameter zur Gewinnung von Humanplasma
Pool- Anzahl der Alter der Probanden [Jahre] Blutvolumen Plasmaausbeute Proteingehalt
Nummer Probanden Median Min Max je Proband [ml] [Vol %] [g /L]
(h) 002.003 10 44,4 ± 11,1 41 30 66 ca. 70 ca. 35,4 93,2 ± 0,7
(h) 014.704 14 44,6 ± 12,2 43 23 67 ca. 70 ca. 42,1 89,1 ± 0,5
(h) 020.504 16 42,8 ± 9,6 41 23 59 ca. 130 ca. 38,2 95,4 ± 0,6
Um diesen widersprüchlichen Angaben gerecht zu werden, wurde ein im Mittel vergleichbares
Alter der Probanden angestrebt. Entsprechend entstammten die Ratten meist einem Wurf und
hatten ein Alter von 60 bis 80 Tagen (Tab. 12).
Tab. 12: Parameter zur Gewinnung von Rattenplasma
Pool- Anzahl Alter1 Körpergewicht3 BlutVol4 BlutVol5 Plasma- Protein-
Nummer der Tiere der Tiere
Haltungs-
dauer2 KG [g] je Ratte [ml] je g KG [ml] ausbeute [Vol %] gehalt [g /L]
(r) 982.501 9 13 Wo. 14 d k. A. ± k. A. ca. 8,0 k. A. ca. 35,0 72,5 ± 1,0
(r) 982.903 3 15 Wo. 10 d k. A. ± k. A. ca. 10,0 k. A. ca. 33,3 68,9 ± 0,7
(r) 001.703 20 16 Wo. 6 d 526,5 ± 47,1 ca. 11,6 ca. 0,022 ca. 49,4 71,1 ± 0,5
(r) 003.602 23 12 Wo. 8 d 411,0 ± 15,2 ca. 8,1 ca. 0,020 ca. 38,5 61,5 ± 0,2
(r) 005.202 12 15 Wo. 27 d 454,0 ± 25,6 ca. 8,8 ca. 0,019 ca. 45,7 66,8 ± 0,7
(r) 011.501 10 17 Wo. 87 d 546,7 ± 31,1 ca. 10,2 ca. 0,019 ca. 51,0 68,2 ± 0,6
(r) 012.001 20 12 Wo. 25 d 380,2 ± 23,4 ca. 9,1 ca. 0,024 ca. 53,6 71,9 ± 1,1
(r) 015.002 11 10 Wo. 19 d 319,1 ± 15,4 ca. 8,7 ca. 0,027 ca. 49,5 61,1 ± 1,8
(r) 015.004 19 10 Wo. 21 d 326,2 ± 19,2 ca. 9,0 ca. 0,028 ca. 53,0 62,8 ± 0,7
1 Alter zum Zeitpunkt der Blutentnahme; 2 Haltungsdauer der Tiere vor Ort; 3 durchschnittliches Körpergewicht der Tiere am Tag
der Plasmagewinnung; 4 gewonnenes Blutvolumen je Tier; 5 gewonnenes Blutvolumen bezogen auf das Körpergewicht der Tiere
Im Anschluss jeder Plasmagewinnung wurde der Proteingehalt nach Lowry bestimmt. Für beide
Plasmaarten konnten gut reproduzierbare Proteingehalte ermittelt werden (Abb. 25 und
Abb. 26). Zur Plausibilitätsprüfung wurden Literaturangaben zur physiologischen Zusammen-
setzung herangezogen (Tab. 13):
Tab. 13: Literaturangaben zum Proteingehalt von Ratte und Mensch
Plasmaart Proteingehalt Anmerkungen Referenz
Rattenplasma 63,0 g /L mittlerer Wert für erwachsene männliche
Wistar-Ratten, ca. 3 Monate alt
Waynforth, 1992
Humanplasma 7,25 g /100 ml Gesamtprotein Biotest-Information, 2003 (www.biotest.de)
6 - 8 g /100 ml Gesamteiweiß Buddecke, 1999; Schenk, 1990
6,5 – 7,9 % Gesamtprotein Leuthardt, 1963
60 - 80 g /L Gesamtprotein, meist anionisch Mairbäurl, 2001
7 – 8 % Eiweißkörper Pschyrembel, 2001
72 ± 7 g /L Konzentration der Plasmaproteine Rapoport, 1987
5.3 Plasmagewinnung 47
0
20
40
60
80
100
Literatur
(r)982.501
(r)982.903
(r)001.703
(r)003.602
(r)005.202
(r)011.501
(r)012.001
(r)015.002
(r)015.004
Proteingehalt [g /L]
Abb. 25: Proteingehalt von Rattenplasma verschiedener Pools
Insgesamt wurden für Ratten –und Humanplasma gut reproduzierbare Proteingehalte bestimmt.
Auffällig ist der um bis zu 19 % erhöhte Proteingehalt für Humanplasma im Vergleich mit
Literaturangaben (Abb. 26). Da alle Messwerte gleichermaßen auf den Proteingehalt bezogen
wurden, hebt sich dieser Einfluss beim Vergleich mit Ergebnissen in Humanplasma auf.
Ursache könnte die Differenz in der Aminosäurezusammensetzung der verschiedenen Albumi-
ne sein, da die Fraktion V von Ratten- und Rinderserumalbumin im Gehalt von Tyrosin und
Tryptophan gegenüber Humanserumalbumin eine bessere Übereinstimmung zeigt.
0
20
40
60
80
100
Literatur (h)002.003 (h)014.704 (h)020.504
Proteingehalt [g /L]
Abb. 26: Proteingehalt von Humanplasma verschiedener Pools
48 5 Ergebnisse
5.4 Validierung der Methode
5.4.1 Versuchsaufbau und Reagenzien
Die Bedingungen zur Ermittlung von Zeit-Umsatz-Kurven wurden in Anlehnung an die standar-
disierte Methode zur Bestimmung von Enzymaktivitäten in biologischen Flüssigkeiten
(Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie, 1972) sowie unter Berück-
sichtigung der Vorschrift zur Durchführung der Hydrolyse in Abhängigkeit vom pH (Amtsblatt
der EG Nr. L 251/216 vom 19.9.84) festgelegt. Die allgemeinen Anforderungen zur
Durchführung enzymatischer Analysen gemäß § 35 LMBG L 0.00 23 (1992) wurden
berücksichtigt.
Abb. 27: Schematische Darstellung der säulenchromatographische Reinigung der Probe aus
biologischem Material
Die minimale Reaktionszeit bei der Erfassung von Zeit-Umsatz-Kurven betrug 4 Minuten. Ester
mit hoher Hydrolyserate wie Phenylacetat erforderten das Verdünnen von Blutplasma und
Leberhomogenat. Als Lösemittel wurde Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) eingesetzt. Der Puffer
ist hinsichtlich pH-Wert und mineralischer Zusammensetzung mit Blutplasma vergleichbar
(Abb. 19 in Abschnitt 5.2). Die Inkubationstemperatur der Ester im biologischen Medium betrug
5.4 Validierung der Methode 49
37 ± 1°C. Diese Temperatur simulierte die Körpertemperatur von Mensch (Normalwert Mensch:
36,5 - 37,8°C) und Ratte (Normalwert ∅ 38,1°C). Sie stellt einen mittleren Temperaturbereich
dar und repräsentiert das Optimum für Enzyme mit Esteraseaktivität.
Die enzymatische Hydrolyse wurde unverzüglich nach der Probenahme durch das Aufgeben
auf die Festphasensäule mit Extrelut gestoppt (Abb. 27). Extrelut ist ein weitporiges
Kieselgur, dass wässrige Proben vollständig aufnimmt. Mit den Lösemitteln Ethylacetat und n-
Hexan wurden der Analyt vollständig eluiert, während Wasser, Salze und Proteine auf der
Säule verbleiben. Anhand der Wiederfindungsraten wurde für alle Analyten demonstriert, dass
dieses Verfahren für die Untersuchungszwecke geeignet ist (Anhang II, Tab. 33).
Die Inhibition der Esteraseaktivität wurde in Vergangenheit durch Zusatz von starken Säuren
wie 4 N HCl oder 1,5 M H2SO4 (Albro, 1973), Fluorid (Arndt, 1973; Boyer, 1971; Toennes, 1999)
Aceton (Werner et al., 1997) oder Physostigmin (Junge et al., 1979) beschrieben. Junge et al.
(1979) zeigten anhand verschiedener Isoenzyme der Schweineleberesterase, dass Physostig-
min einzelne Fraktionen der Isoenzyme in ihrer Aktivität kaum beeinträchtigt. Säuren können
eine unerwünschte nichtenzymatische Esterhydrolyse induzieren und damit Messdaten
verfälschen. Die Esteraseinhibition durch Fluorid bis 98 % erfordert eine Inkubationszeit von ca.
30 min. Darüber hinaus beschreibt Dahl (1987) ein aufwendiges Verfahren durch Zusatz von
Isopropanol und Einfrieren in Flüssigstickstoff. Letztlich erwies sich das Abstoppen der Enzym-
reaktion durch Chemikalienzusatz als unpraktikabel und wurde verworfen.
5.4.2 Substratkonzentration
Voraussetzung für reproduzierbare Ergebnisse bei enzymkinetischen Untersuchungen ist die
exakte Vorlage einer definierten Initialkonzentration (Substratanfangskonzentration S0). Diese
wurde in der Hydrolysenlösung eingestellt, indem aus einer Substratstammlösung definierter
Konzentration ein definiertes Volumen in die Hydrolysenlösung gegeben wurde, aus der sich S0
rechnerisch ermitteln lässt. Diese Verfahrensweise erforderte ein für das Substrat geeignetes
Lösemittel. Tab. 14 gibt eine Übersicht der gebräuchlichen Lösemittel, die zum Abstoppen von
enzymatischen Reaktionen verwendet werden.
Tab. 14: Gegenüberstellung verschiedener Lösemittel für die Substratdotierung
Lösemittel Substrat Referenz Anmerkung
Wasser Ethylacetat Gallaher, 1977 zu geringe Löslichkeit
Methanol (1 M) Phenylacetat Junge, 1979 als Hydrolyseprodukt Einfluss auf das Reaktionsgleichgewicht;
Wechselwirkung mit Acyl-Transfer-Intermediat, non-kompetetiver
Inhibitor
Ethanol Acetate
Acrylate
Dahl, 1987;
McCarthy, 1977
als Hydrolyseprodukt Einfluss auf das Reaktionsgleichgewicht,
Wechselwirkung mit Acyl-Transfer-Intermediat,
1-Butanol Acetate Greenzaid, 1971 Wechselwirkung mit Acyl-Transfer-Intermediat,
2-Butanol - Zollner, 1999 Acetylesterase EC 3.1.1.6 – Inhibitor
Aceton Acetate Greenzaid, 1971 Denaturierungsmittel, als Lösemittel zu polar um hydrophobe
Ester zu lösen
Acetonitril Acetate Yan, 1999 Denaturierungsmittel, als Lösemittel zu polar um hydrophobe
Ester zu lösen
Dimethylsulfoxid für Ames- und
Mikrokerntest
Greenzaid, 1971 Denaturierungsmittel, als Lösemittel zu polar um hydrophobe
Ester zu lösen
1,4-Dioxan Acetate Greenzaid, 1971;
Zollner, 1999
keine Inhibitoreigenschaften; gute Löslichkeit aller Ester
50 5 Ergebnisse
Ester mit kurzkettigen Acyl- und Alkylgruppen sind schwach acide Lösemittel. Sie besitzen
nucleophile Eigenschaften gegenüber der Acylgruppe des Acyl-Transfer-Intermediats.
Greenzaid et al. (1971) beobachteten bei geringen Konzentrationen (Methanol < 0,5 M;
Ethanol < 0,3 M; 1-Butanol < 0,1 M) eine Steigerung und bei höheren Konzentrationen eine
Verringerung die Hydrolyserate. Methanol werden nonkompetitive Inhibitoreigenschaften
zugeschrieben. Es bindet nicht an das freie Enzym sondern an den Enzym-Substrat-Komplex,
woraus ein inaktiver Komplex entsteht, der nicht weiter reagieren kann.
In unserer Studie wurde 1,4-Dioxan als Substratlösemittel eingesetzt. Die Substanz erfüllte
folgende Anforderungen:
• keine Inhibitoreigenschaften gegenüber Esterase (Greenzaid, 1971; Zollner, 1999),
• gute Lösungseigenschaften der Carbonsäureester,
• geringe Toxizität,
• geringes Denaturierungspotential.
Im nächsten Schritt stand die Minimierung des Volumens der Substratstammlösung im
Vordergrund. Der Volumenanteil der Substratlösung im Hydrolyseansatz betrug 0,07 bis
maximal 0,17 Vol %. Daraus ergab sich ein Gesamtvolumenanteil des Lösemittels von
0,09 Vol % (Ethylmyristat) bis maximal 0,14 % (Ethylpropionat).
Maßgeblich für die Bewertung der Hydrolyserate der in Abschnitt 2.4 diskutierten enzym-
katalysierten Reaktionen ist ausschließlich die Substratanfangskonzentration S0. Ein Vergleich
der Hydrolysegeschwindigkeiten verschiedener Substanzen ist nur möglich, wenn unter
identischen Reaktionsbedingungen, einschließlich S0, gearbeitet wird. Um verlässliche und gut
reproduzierbare Werte für Werte für Km und Vmax zu erhalten, sollte S0 im Bereich
0,1 Km bis 5 Km liegen. Oberhalb dieses Konzentrationsbereiches ist praktisch kein Einfluss auf
die Reaktionsgeschwindigkeit mehr messbar (Rapoport, 1987).
In Vorversuchen wurde durch Einzelbestimmungen ein Schätzwert für die zu erwartende Größe
der Michaelis-Menten-Parameter ermittelt. Arndt (1973) wies bei der Hydrolyse von
Methylbutyrat durch Carboxylesterase aus Rattenleber ab S0 > 10 mM Substrathemmung nach.
Andere Studien verwendeten ähnliche Konzentrationen: „0“ – 2 mM (Britt, 1992); 5 – 10 mM
(Dahl, 1985); 0,5 – 4,0 mM (McCracken 46, 1993) oder 1 mM (Yan, 1999). Dagegen beschrieb
Gallaher (1977) die Hydrolysierbarkeit von Ethylacetat in Rattenplasma mit S0 = 22,70 mM.
Acrylatester wurden mit S0 = 0.005 - 0.250 mM und Carboxylesterase von Schweineleber
untersucht (McCarthy, 1997).
5.4.3 Clean up
Bei den untersuchten Analyten handelt es sich um Carbonsäureester, Alkohole und
Carbonsäuren (siehe Abschnitt 8.4, Tab. 25 und Tab. 26). Zunächst wurden die apolaren
Analyten aus dem polaren Hydrolysemedien (Blutplasma, künstliche Magenflüssigkeit, Krebs-
Henseleit-Puffer) säulechromatographisch an Extrelut isoliert. Ziel der Extraktion war die
quantitative Abtrennung der zu analysierenden Verbindung von der Probenmatrix und die
Überführung in ein Medium, das zur gaschromatographischen Analyse geeignet ist. Bei der
Extraktion wurde die wässrige Probe auf eine mit Extrelut gefüllte Glassäule gegeben. Nach
Zugabe des internen Standards auf die Säule wurden Analyt (Ester, Carbonsäure oder Alkohol)
5.4 Validierung der Methode 51
und interner Standard mittels n-Hexan (Analyt: Ester) oder Ethylacetat (Analyt: Carbonsäure
oder Alkohol) aus der wässrigen Phase extrahiert (siehe Abb. 27).
Die Carbonsäuren Propionsäure bis Octansäure sowie Tiglinsäure und Benzylalkohol stellen
leichtflüchtige Substanzen mit Molgewichten von 74 g/mol bis 144,22 g/mol dar. Die stark
polaren FFAP-Phase (Polyethylenglycol-2-nitroterephthalsäureesterphase) ermöglichte eine
direkte gaschromatografische Analyse dieser Substanzen aus der aufgereinigten Probe. Bei der
Hydrolyse von Benzyltiglat wurden Benzylalkohol- und Tiglinsäure simultan bestimmt (Abb. 28).
Benzylalkohol wurde im Vergleich zu Tiglinsäure mit ca. dreifach höherer Empfindlichkeit
gemessen, die sich aus den durchschnittlichen Responsefaktoren für Benzylalkohol
(RFx = 0,43) und Tiglinsäure (RFx = 1,14) abgeleiten lässt.
Abb. 28: GC-Chromatogramm mit MN permabond FFAP-DF-0.25 (30m x 0,32 mm) für
Tiglinsäure und Benzylalkohol aus der Hydrolyse von Benzyltiglat in Humanplasma
(Plasmacharge: (h)020.504; S0 = 1,00 mM; ti = 30 min, Interner Standard Pentansäure
12,58 ng/µl; Extraktionsmittel: Ethylacetat)
Unpolarere Carbonsäuren (> C8) bis Myristinsäure (C14) wurden mittels MN permabond SE-52-
DF-0.25 (5 % Diphenyl- 95 % Dimethylpolysiloxan) detektiert. Die Phase besitzt eine mittlere
Polarität und zeigte gegenüber der FFAP-Säule insbesondere bei Undecan- Myristin- und
Phenylessigsäure eine verbesserte Empfindlichkeit. Nach einer Hydrolysezeit von 20 min in
Humanplasma wurde aus Ethylphenylacetat bereits 17,8 ng/µL Phenylessigsäure freigesetzt.
Dagegen liegen bei der Hydrolyse von Ethylundecanoat in Humanplasma nach 30 min nur
3,35 ng /µL vor (Abb. 29). Ethylphenylacetat wurde demnach deutlich schneller als
Ethylundecanoat in Humanplasma hydrolysiert.
52 5 Ergebnisse
Abb. 29: GC-Chromatogramme mit MN permabond SE-52-DF-0.25 (25m x 0,32 mm) für
Undecan- und Phenylessigsäure aus der Hydrolyse von Ethylundecanoat und
Ethylphenylacetat in Humanplasma (Plasmacharge: (h)020.504; S0 = 1,00 mM;
ti = 30 min und 20 min, Interner Standard Decansäure: 18,33 und 16,56 ng/µl;
Extraktionsmittel: Ethylacetat)
5.4.4 Plasmapool und Lagerdauer
Die Studie erforderte die Gewinnung mehrerer Pools von Ratten- und Humanplasma. Die je
Pool gewonnene Vollblutmenge wurde limitiert durch einen mit zunehmendem Blutvolumen
steigenden Arbeitsaufwand. Nach maximal 2 Stunden sollte der Pool vorliegen und das Plasma
bei –84°C gelagert sein. Im Anschluss wurde zur Überprüfung des Pools die spezifische
Esteraseaktivität bestimmt. Auf diesem Wege konnte die Vergleichbarkeit der Pools hinsichtlich
ihrer spezifischen Enzymaktivität sichergestellt werden. Die Kenntnis um die physiologische
Variation einzelner Plasmapools sowie der Einfluss der Lagerdauer in Hinblick auf die
5.4 Validierung der Methode 53
Haltbarkeit von Plasma für Enzymaktivitätsuntersuchungen spielte bei die Beurteilung der
Vergleichbarkeit von Messdaten aus mehreren Pools eine bedeutende Rolle (Abschnitt 5.3).
Ebenso musste eine allgemeine Lagerdauer des Plasmas bei –84°C festgelegt werden. Die
Haltbarkeit von Plasma wurde definiert als Zeitraum, in dem keine wesentlichen Veränderungen
in der Plasma-Zusammensetzung zu erwarten waren und demnach die Aktivität der Enzyme als
konstant angesehen werden kann.
Bekannt ist, dass sich gereinigte Isoenzyme bei –80°C über Monate ohne Aktivitätsverlust
lagern lassen (Hosokawa, 1990). Für Plasma- und Serumproben wird bei einer
Lagertemperatur von -25°C eine maximale Aufbewahrungsdauer von 6 Monaten angegeben
(Englhardt, 1974). Südhof und Wötzel (1960) haben eine außerordentlich rasche Inaktivierung
der Esteraseaktivität von Serumproben festgestellt: 48 h bei 25°C bis zu -62 %; 4°C bis -42 %.
Demnach verlangsamt die Lagerung unter Kühlung den Aktivitätsabfall deutlich. Feissli (1966)
untersuchte die temperaturbedingte Alterungsgeschwindigkeit von Plasmaproben und
beobachtete ein deutlich verringertes Absinken der Enzymaktivität: 4°C: nach 3 Tagen
Abnahme um 10 %; 25°C: nach 3 Tagen Abnahme um 20 %. Der Normalbereich für
Unterschiede wurde für verschiedene Enzyme mit Mittelwert ± Standardabweichung
angegeben.
Abb. 30 (Anhang IV, Tab. 43) zeigt den Verlauf der Esteraseaktivität von 1:100 verdünntem
Rattenplasma während eines Arbeitstages bei 4°C. Die Abbildung zeigt, dass bei der gekühlten
Lagerung von Rattenplasma bei 4 °C über einen Zeitraum von 12 Stunden nicht mit einem
merklichen Abfall der Hydrolyseaktivität gegenüber Phenylacetat zu rechen ist. Dieses Ergebnis
kann auf andere Substrate übertragen werden. Wir können daher Einflüsse während der
Durchführung der Hydrolyseexperimente auf das Hydrolysemedium Plasma als nicht messbar
vernachlässigen. Das Plasma zum Zeitpunkt t = 1,00 h wird im Folgenden als „frisch“
bezeichnet. „Frisches Plasma“ wurde unmittelbar nach der Aufarbeitung von Vollblut gewonnen.
Dieser Vorgang erforderte eine Arbeitszeit von ca. einer Stunde.
Abb. 30: Substratumsatz von Phenylacetat in Rattenplasma Pool (r) 015.004, 1:100 verdünnt
Zeitpunkt der Plasmagewinnung (1.00 h - „frisch“; n = 1) über einen Zeitraum von 12 h im Vergleich mit Krebs-
Henseleit-Puffer (pH 7,4) n = 5, S0 = 0,25 mM (Lagerung bei 4°C)
0
20
40
60
80
100
1.00 h 1.25 h 1.50 h 3.00 h 12.00 h Puffer
[%]
0
20
40
60
80
100 Substratumsatz
nach 4.0 min [%]
Substratumsatz
[µmol /L je min]
[µmol /L je min]
54 5 Ergebnisse
020406080100
Humanplasma,
gelagert
Humanplasma,
frisch
Ha [µmol /min * g Protein]
(h) 014.704
(h) 020.504
Abb. 31: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei Phenylacetat in Abhängigkeit von
der Lagerdauer bei –84°C
Pool (h) 014.704: „frisch“ und 8 Wochen gelagert; Pool (h) 020.504: „frisch“ und 12 Wochen gelagert
Die dargestellten Werte stellen Einzelbestimmungen dar, die einen Trend anzeigen. Über einen
Zeitraum von 12 h wurde kein Abfall der Esteraseaktivität beobachtet. Im Vergleich dazu wurde
jeweils ein Wert für Krebs-Henseleit-Puffer (n = 5) bestimmt. Die Umsatzrate im Puffer lag nach
4 min bei durchschnittlich 2,2 %; im Plasma bei 93,2 %. Die Hydrolyseaktivität verringert sich
demnach bei der Lagerung über 12 h bei 4 °C nicht. Die Veränderung der Enzymaktivität bei
der Lagerung bei –84 °C über mehrere Wochen hinweg zeigt Abb. 31 (Anhang IV, Tab. 42). Zu
erkennen ist ein deutlicher Abfall der Hydrolyseaktivität um 27,6 % (h) 014.704 bzw. 15,5 %
(h) 020.504. Am Beispiel der Hydrolyse von Phenylacetat in „frischem“ Humanplasma der Pools
(h) 014.704 und (h) 020.504 wurden Aktivitätsunterschiede von bis zu 18,7 % nachgewiesen.
Abb. 32 (Anhang IV,Tab. 42) weist auf einen substratspezifischen Abfall der Esteraseaktivität
mit zunehmender Lagerdauer hin.
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
Ethylheptanoat
Ethyltiglat
Benzyltiglat
Ha [µmol /min * g Protein]
(h) 014.704
(w8)
(h) 020.504
Abb. 32: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma in Abhängigkeit von der Lagerdauer
Pool (h) 020.504: „frisch“, Pool (h) 014.704: 8 Wochen gelagert bei –84°C, n = 4, S0 = 0,25 mM
5.4 Validierung der Methode 55
Abb. 33: Spezifische Hydrolyseaktivität von Rattenplasma in Abhängigkeit von der Lagerdauer
Logarithmische Darstellung (n = 4; S0 = 0.25 mM): Pool (r) 015.004 sowie (r) 015.002 „frisch“, Pool (r) 001.703:
26 Wochen gelagert, Pool (r) 012.001: 21 Wochen gelagert, Lagertemperatur: -84°C.
Diese kann bei einer Lagertemperatur von –84°C und einer Lagerdauer von 8 Wochen bis zu
59,7 % für Ethyltiglat betragen. Für Benzyltiglat und Ethylheptanoat wurde ein geringerer Abfall
von 9,1 % und 10,9 % ermittelt.
Der mit zunehmender Lagerdauer substratspezifische Abfall der Hydrolyseaktivität wurde auch
bei der Lagerung von Rattenplasma beobachtet. Abb. 33 (Anhang IV Tab. 41) zeigt eine im
Mittel stets geringere Hydrolyseaktivität der 21 Wochen gelagerten Plasma-Charge (r)012.001
im Vergleich mit Charge (r)001.703, die 26 Wochen gelagert wurde. Diese Befund deutet auf
interindividuelle Unterschiede beider Chargen hin, da eine höhere Esterase-Aktivität bei der
Charge mit geringerer Lagerzeit - (r)012.001 - erwartet wurde. Insgesamt wurde der interindivi-
duelle Anteil im Vergleich zur absoluten Differenz der Esterase-Aktivität verschiedener
Substrate gemäß Abb. 33 als vernachlässigbar gering interpretiert. Bei einer Lagerung von
mehr als 20 Wochen wurden für Phenylacetat, Ethyl- und Benzyltiglat sowie Ethylheptanoat
deutlich verringerte Werte der Hydrolyseaktivität von Rattenplasma gefunden. Der Effekt ist im
Vergleich mit der Lagerdauer von 8 Wochen bei Humanplasma deutlicher ausgeprägt. Zur
Minimierung von Enzymaktivitätsverlusten bei der Plasmagewinnung wurden daher folgende
Bedingungen festgelegt:
• Die Aufbewahrung von Blutplasma erfolgte unter Tiefkühlbedingungen bei –84°C.
• Die Lagerzeit für Blutplasma, das für Enzymaktivitätsuntersuchungen verwendet wurde,
ist unter o.g. Bedingungen auf maximal 15 Wochen begrenzt worden.
• Die kritischen Phasen, die Enzymaktivitätsverluste besonders induzieren können, treten
beim Einfrieren und Auftauen auf (Lindl, 1994). Um Aussalzeffekte im Plasma zu
vermeiden, wurde besondere Sorgfalt auf diese Arbeitsschritte gelegt.
0,01 0,10 1,00 10,00 100,00 1000,00
Benzyltiglat
Ethyltiglat
Ethylheptanoat
Phenylacetat
Ha [µmol /min * g Protein]
(r) 015.002
(r) 015.004
(r) 001.703
(w26)
(r) 012.001
(w21)
56 5 Ergebnisse
5.4.5 Generieren der Rohdaten
Im Rahmen der Validierung wurde die Vollständigkeit der Hydrolyse im biologischem Medium
nachgewiesen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Abnahme der Substratkonzentration
mit der äquimolaren Zunahme der Metaboliten einhergeht. Am Beispiel von Ethylheptanoat
wurde der Hydrolyseverlauf zeitgleich mit der Abnahme der Esterkonzentration (Ethylheptanoat)
und der Zunahme der Hydrolyseprodukte (Ethanol und Heptansäure) verfolgt. Die Hydrolysen
wurden in Rattenplasma und künstlicher Magenflüssigkeit durchgeführt (Abb. 34, Tab. 35 und
Tab. 36 in Anhang III).
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 60 120 180 240 300 360 420
Zeit [min]
Konzentration [10 -3 mol /L]
Ethylheptanoat
Heptansäure
Ethanol
Künstliche Magenflüssigkeit (pH 1,2), n = 3, S0 = 0.25 mM
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
0 20 40 60 80 100 120
Zeit [min]
Konzentration [10 -3 mol /L]
Ethylheptanoat
Ethanol
Heptansäure
Rattenplasma, 1:100 verdünnt (pH 7,4), n = 3, S0 = 0.25 mM
Abb. 34: Hydrolyse von Ethylheptanoat in künstlicher Magenflüssigkeit und 1:100 verdünntem
Rattenplasma
Die Hydrolyse in künstlicher Magenflüssigkeit verlauft im Vergleich mit Rattenplasma nicht-
enzymatisch und damit sehr langsam, da Pepsin proteolytisch wirkt und keine esterspaltende
Aktivität besitzt. Für die zu untersuchenden Ester wurden Esterspaltprodukte mit guter Wieder-
findung im proteinhaltigen und –freien Medium bestimmt (Anhang II, Tab. 33). Die Hydrolyse-
verläufe wurden anhand der Bildung eines Hydrolyseproduktes (Carbonsäure und/oder Alkohol)
5.5 Pharmakokinetische Parameter 57
quantifiziert. Eine Ausnahme bildet Phenylacetat, bei dessen Hydrolyse der Substratabbau
anhand der Abnahme der Phenylacetat-Konzentration bestimmt wurde. Phenylacetat wird dabei
in Phenol und Essigsäure gespalten. Phenylacetat war im Vergleich zu Essigsäure mit besserer
Auflösung und niedrigerer Nachweisgrenze gaschromatographisch detektierbar.
5.5 Pharmakokinetische Parameter
5.5.1 Allgemeines
Die Messdaten wurden, vorbehaltlich anderer Angaben, als Mittelwerte ± Standardabweichung
aus n = 4 unabhängigen Experimenten angegeben. In der Literatur wird oftmals der Standard-
fehler des Mittelwertes Standard Error of the Mean (SEM) verwendet (Bernhardt, 1996;
Gad, 1994; Haber, 1993; McCracken, 1993; Williams, 1989; Saghir et al., 1999).
Die Angabe des SEM ist umstritten und wird entsprechend kritisch diskutiert (Bartko, 1985;
Hopkins, 2000; Montgomery, 1994). SEM beschreibt die Variabilität von Mittelwerten aus Stich-
proben mit gleichem Stichprobenumfang (n) und ist ein Maß für die Präzision der Schätzung
des Erwartungswertes durch den Mittelwert. Er wird berechnet aus der Standardabweichung (s)
nach Division durch n. Somit ist SEM stets kleiner als s, was vermutlich zu seiner „Beliebtheit“
beiträgt. Er lässt jedoch für die Beschreibung von Daten aus einer Stichprobe, im Gegensatz zu
Quantilen oder s, keine unmittelbare Interpretation zu (Lange & Bender, 2001).
5.5.2 Berechnung der spezifischen Hydrolyseaktivität
Die spezifische Hydrolyseaktivität gemäß Abschnitt 2.5.1 wurde aus dem Gesamtsubstrat-
umsatz (mol je Zeiteinheit) berechnet. Mit ansteigender Initialkonzentration S0 wurde für jeden
Ester eine zunehmende Umsatzrate beobachtet (Abb. 35, Anhang II, Tab. 31).
Abb. 35: Hydrolyseverlauf von Isoamylbutyrat in Humanplasma in Abhängigkeit von der
Initialkonzentration des Esters
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
01234
Zeit [min]
Ester-Konzentration [10 -3 mol /L]
0.25 mM
0.50 mM
0.75 mM
1.00 mM
1.25 mM
1.75 mM
2.50 mM
58 5 Ergebnisse
Die Proteinkonzentration des Blutplasmas verhält sich direkt proportional zur Enzymmenge mit
hydrolytischer Aktivität. Daher wird die Umsatzrate auf die Proteinkonzentration bezogen. Die
spezifische Hydrolyseaktivität wird mit der Einheit [mol /min
⋅
g Protein] angegeben.
Die Gesamthydrolysezeit wurde für jeden Ester in Abhängigkeit von der Produktbildungs-
geschwindigkeit individuell unter folgenden Maßgaben bestimmt:
• Die Konzentration des ersten Messpunktes t1 muss über der Bestimmungsgrenze der
Methode liegen.
• Der Konzentrationsunterschied zwischen aufeinander folgenden Messpunkten muss so
groß sein, dass keine Überschneidung der Vertrauensbereiche aus n = 4 resultiert.
5.5.3 Berechnung der Halbwertzeit
Die Berechnung der Halbwertzeit erfolgt entsprechend dem in Abschnitt 2.5.2 geschilderten
Linearisierungsverfahren. Abb. 36 (Anhang II, Tab. 31) zeigt repräsentativ für alle Substrate
eine mit zunehmender Substratkonzentration abnehmende Geschwindigkeitskonstante der
enzymatischen Hydrolysereaktion in Humanplasma. Gemäß Gleichung 1 (Abschnitt 2.4.2) steigt
damit die Halbwertzeit des Substrates im Hydrolysemedium.
y = 0,0720x
R2 = 0,9980
y = 0,0512x
R2 = 0,9926
y = 0,0396x
R2 = 0,9979
y = 0,0341x
R2 = 0,9916
y = 0,0280x
R2 = 0,9988
y = 0,0171x
R2 = 0,993
y = 0,0214x
R2 = 0,9978
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
0246810
Zeit [min]
ln [S0 /Si]
0.25 mM
0.50 mM
0.75 mM
1.00 mM
1.25 mM
1.75 mM
2.50 mM
Abb. 36: Ableitung der Geschwindigkeitskonstanten aus der enzymatischen Hydrolyse von
Ethylvalerat in Humanplasma in Abhängigkeit von der Initialkonzentration
5.5.4 Berechnung der kinetischen Parameter nach Michaelis-Menten
Die Initialgeschwindigkeit wurde nach der Reaktionsgleichung i
tk
ieSS ⋅−
⋅= 0für jeden
Hydrolyseverlauf nach dem Näherungsverfahren nach Gauß berechnet und daraus, in
Abhängigkeit von der Initialkonzentration S0, die Initialgeschwindigkeit der Reaktion als
negativer Anstieg der Tangente zum Zeitpunkt ti abgeleitet (mathematischer Algorithmus aus
5.5 Pharmakokinetische Parameter 59
Abschnitt 2.5.3). Häufig wird in der Literatur der Zeitpunkt der Ableitung ti unspezifisch mit „kurz
nach Reaktionsstart“ angegeben. Bergmeyer (1979) schlug ti = 0.00 vor.
Für unsere Studie wurde der Ableitungszeitpunkt ti = 0,10 min wie folgt hergeleitet:
Abb. 37 illustriert den Tangentenverlauf für vier Zeitpunkte ti : 0,00; 0,10; 0,20 sowie 0,50 min.
Die Darstellung zeigt einen mit zunehmender Zeit stetig fallenden Anstieg bzw. abnehmende
Initialgeschwindigkeit als Indikator für den Übergang der Reaktion 1. Ordnung in eine Reaktion
nullter Ordnung. Die Initialzeit ti = 0.50 min führt nach Extrapolation zu einer erheblichen
Differenz zwischen S0 und S0.50 . Sie kann demnach nicht als „Zeitpunkt kurz nach
Reaktionsstart“ angesehen werden.
y = 0,3283e-0,613x
R2 = 0,9322
y = -0,1893x + 0,3276
y = -0,1780x + 0,3259
y = -0,1481x + 0,3156
y = -0,2012x + 0,3282
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Zeit [min]
Konzentration [10 -3 mol /L]
ti = 0.50 min
ti = 0.20 min
ti = 0.10 min
ti = 0.00 min
Abb. 37: Ableitung der Initialgeschwindigkeit für die Hydrolyse von Phenylacetat in Humanplasma
(ti = 0,00; 0,10; 0,20 und 0,50 min) in 1:100 verdünntem Humanplasma; S0 = 0,50 mM
Die experimentelle Ausführung der Hydrolysen erforderte einen Zeitraum von ca. 6 Sekunden,
um nach Substratzugabe (ti = 0,00 min) und dem damit eingeleiteten Hydrolysestart eine
gleichmäßige Verteilung des Esters im Hydrolysemedium zu gewährleisten. Die
Substratverteilung im Hydrolysemedium war nach höchstens 6 Sekunden hergestellt. Aus
diesen praktischen Erwägungen heraus und dem Ziel, die Zeit zur Ableitung der Tangente zu
minimieren, wurde dieser Zeitpunkt auf einheitlich ti = 0,10 min festgelegt.
Der Lineweaver-Burk-Plot in Abb. 38 (Anhang III, Tab. 39) lässt einen mit fortschreitender
Initialzeit (0,00 min bis 0,50 min) zunehmenden Anstieg der Geraden um bis zu 32,4 %
erkennen. Daraus resultiert ein Anstieg von Km um 22,4 % sowie der Abfall von Vmax um 14,8 %.
Weitaus deutlicher sinkt dagegen der Quotient Vmax/Km (um -47,9 %).
60 5 Ergebnisse
Abb. 38: Lineweaver-Burk-Plot für die Hydrolyse von Phenylacetat in Humanplasma als Funktion
der Initialzeit
Abb. 39 ermöglicht den direkten Vergleich kinetischer Parameter in Abhängigkeit der
Initialzeiten 0,00 bis 0,50 min. Vergleicht man t = 0,00 min und t = 0,10 min miteinander, so wird
eine geringfügige Differenz der Michaelis-Menten-Parameter deutlich. Diese hebt sich im
Vergleich der Ester untereinander auf und bleibt ohne Einfluss auf die Interpretation der
Hydrolysierbarkeit. Der Anstieg der Regressionsgeraden in der Lineweaver-Burk-Darstellung
nimmt um 7,6 % zu, was zu einem Anstieg von Km um 4,9 % sowie Abfall von Vmax bzw. Vmax/Km
um 2,9 % bzw. 8,2 % führt.
0
1
2
3
4
ti = 0.00 ti = 0.10 ti = 0.20 ti = 0.50
Km [10-3 mol/L]
Vmax [10-3 mol /min*g Protein]
Vmax /Km [L /min*g Protein]
Km
Vmax
Vmax/Km
Abb. 39: Michaelis-Menten-Parameter für die Hydrolyse von Phenylacetat in Humanplasma als
Funktion der Initialzeit nach Lineweaver-Burk
y = 1,6812x + 0,6111
R2 = 0,9686
y = 1,8185x + 0,6288
R2 = 0,9696
y = 2,2981x + 0,6816
R2 = 0,9718
y = 1,5537x + 0,5935
R2 = 0,9674
-2
0
2
4
6
8
10
-2-1012345
1 /S0 [10+3 L /mol]
1 /vi, spez. [10+3 * g Protein min /mol]
ti = 0.50 min
ti = 0.20 min
ti = 0.10 min
ti = 0.00 min
5.5 Pharmakokinetische Parameter 61
Im Folgenden beziehen sich alle ermittelten kinetischen Parameter auf die Initialzeit 0,10 min.
Abb. 40 und Abb. 41 (Tab. 37 und Abb. 38) zeigen verschiedene Regressionsverfahren zur
Ableitung von Michaelis-Menten-Parametern. Der dargestellte Trend ist repräsentativ und lässt
sich auf alle untersuchten Carbonsäureester übertragen.
y = 1,6813x + 0,6107
R2 = 0,9686
-1
1
3
5
7
9
-2 -1 0 1 2 3 4 5
1 /S0 [10+3 * L /mol]
1 /vi, spez. [10+3 * g Protein min /mol]
y = 0,2243x + 2,0996
R2 = 0,4820
-1
1
3
5
7
9
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6
S0 [10-3 mol /L]
S0 /vi, spez. [g Protein * min /L]
y = -3,3150x + 2,0400
R2 = 0,3352
-0,5
0,5
1,5
2,5
3,5
4,5
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
vi, spez. /S0 [L /g Protein * min]
vi, spez. [10+3 mol /g Protein * min]
Lineweaver-Burk-Plot (1934) Hanes-Woolf-Plot (1932) Eadie-Hofstee-Plot (1942)
Abb. 40: Linearisierungsverfahren für die Hydrolyse von Phenylacetat in Humanplasma
Die Darstellung nach Cornish-Bowen erlaubt ausschließlich eine grobe Schätzung der Km-Werte
(Abszissenwert des gemeinsamen Schnittpunktes) und für Vmax (Ordinatenwert des gemein-
samen Schnittpunktes). Abb. 41 zeigt jeweils ein Beispiel für einen schwer auswertbaren
(Phenylacetat) und gut auswertbaren (Ethylphenylacetat) Plot.
0
1
2
3
4
5
-5-3-113579111315
-S0 [10-3 mol /L]
vi, spez. [10-3 mol /min*g Protein]
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
-3-113579111315
-S0 [10-3 mol /L]
vi, spez. [10 -3mol /min*g Protein]
Phenylacetat Ethylphenylacetat
Abb. 41: Cornish-Bowen-Plot für die Hydrolyse in Humanplasma
Der resultierende Einfluss auf die Berechnung kinetischer Parameter ist in Abb. 42 (Tab. 38 und
Tab. 39) dargestellt. Phenylacetat und Ethylphenylacetat geben einen Überblick über die
Übereinstimmung der errechneten Michaelis-Menten-Parameter nach Lineweaver-Burk, Hanes-
62 5 Ergebnisse
Woolf, Eadie-Hofstee sowie Cornish-Bowen. Ungeachtet der großen Schwankungsbreite der
Km-Werte stimmen die berechneten Quotienten Vmax /Km aus allen Plots mit einem
Variationskoeffizienten von 11,6 % (Phenylacetat) und 5,9 % (Ethylphenylacetat) gut überein.
Als Korrelationsparameter wurde das Bestimmtheitsmaß der Regressionsgeraden (R²)
herangezogen. R² ist das Quadrat des Pearsonschen Korrelationskoeffizienten, ein
dimensionsloser Index mit dem Wertebereich -1,0 ≤ r ≤ 1,0. Er ist ein Maß dafür, inwieweit
zwischen zwei Datensätzen eine lineare Abhängigkeit besteht. Der Lineweaver-Burk-Plot zeigte
für alle untersuchten Ester die beste Übereinstimmung und wurde daher einheitlich zur
Berechnung der Michaelis-Menten-Parameter verwendet.
0
2
4
6
8
10
Lineweaver-
Burk
Hanes-
Woolf
Eadie-
Hofstee
Cornish-
Bowden
Km [10-3 mol/L]
Vmax [10-3 mol /min*g Protein]
Vmax /Km [L /min*g Protein]
Km
Vmax
Vmax/Km
Phenylacetat
0
2
4
6
8
10
Lineweaver-
Burk
Hanes-
Woolf
Eadie-
Hofstee
Cornish-
Bowen
Km [10-3 mol/L]
Vmax [10-6 mol /min*g Protein]
Vmax /Km [10-3 L /min*g Protein]
Km
Vmax
Vmax/Km
Ethylphenylacetat
Abb. 42: Kinetische Parameter in Abhängigkeit von der Darstellungsform für die Hydrolyse von
Phenylacetat und Ethylphenylacetat in Humanplasma
Nach dem beschriebenen Verfahren wurde im Vorversuch die Methode validiert. Die Abhängig-
keit kinetischer Parameter von der Enzymkonzentration ist bekannt. Vmax steigt mit
zunehmender Enzymmenge je Volumeneinheit. Dagegen ist Km als substratspezifische Größe
unabhängig von der Enzymkonzentration. Der Quotient Vmax /Km kann aufgrund seiner Unab-
5.5 Pharmakokinetische Parameter 63
hängigkeit von der Enzymkonzentration als besonders geeigneter Parameter zur Beschreibung
der Hydrolysierbarkeit angesehen werden. In der Literatur ist er als gebräuchliche Kenngröße
für die Substratempfindlichkeit innerhalb eines enzymatischen Systems verbreitet (McCarthy &
Witz, 1996). Diese Zusammenhänge konnten in Voruntersuchungen experimentell bestätigt und
grafisch dargestellt werden (Abb. 43, Anhang III, Tab. 40).
y = 39,674x + 11,908
R2 = 0,9921
y = 13,819x + 2,4945
R2 = 0,9989
y = 2,2122x + 0,5260
R2 = 0,9798
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
-2 -1 0 1 2 3
1 /S0 [10-3 L /mol]
1 /vi [10+3 L*min /mol]
Plasma 1:50
verdünnt
Plasma 1:10
verdünnt
Plasma,
unverdünnt
Vmax-1
-Km-1
y = 330,11x + 15,104
R2 = 0,9963
y = 209,88x + 5,3558
R2 = 0,9915
y = 30,038x + 1,5819
R2 = 0,9987
-10
10
30
50
70
90
110
130
-0,50,00,51,01,52,0
1 /S0 [10+3 L /mol]
1 / vi [10+3 L*min /mol]
Plasma 1:50
verdünnt
Plasma 1:10
verdünnt
Plasma,
unverdünnt
Vmax-1
Km-1
Ethylvalerat Ethylisovalerat
Abb. 43: Lineweaver-Burk-Plot für die Hydrolyse von Ethylvalerat und Ethylisovalerat in
Rattenplasma in Abhängigkeit von der Plasma-Verdünnung
Die schnellere Hydrolysierbarkeit von Ethylvalerat kommt im Vergleich mit Ethylisovalerat im
erhöhten Wert für Vmax zum Ausdruck. Dagegen zeigt Ethylisovalerat einen deutlich erhöhten
Wert für Km (Abb. 44, Anhang III, Tab. 40).
Folgende Zwischenergebnisse zur Methode der Messdaten-Auswertung wurden festgehalten:
• Die Initialzeit „kurz nach Reaktionsstart“ wurde einheitlich mit ti = 0.10 min festgelegt.
• Als geeigneter Algorithmus zur Berechnung der kinetischen Parameter nach Michaelis-
Menten wurde das doppeltreziproke Linearisierungsverfahren nach Lineweaver-Burk
herangezogen (1/vi über 1/S0).
64 5 Ergebnisse
Ethylvalerat
Ethylisovalerat
Abb. 44: Michaelis-Menten-Parameter für die Hydrolyse von Ethylvalerat und Ethylisovalerat in
Rattenplasma in Abhängigkeit von der Plasma-Verdünnung (nach Lineweaver-Burk)
5.5.5 Phenylacetat als Referenz mit schnellster Hydrolysierbarkeit
Phenylacetat wird aufgrund seiner guten Hydrolysierbarkeit als Marker für Arylesteraseaktivität
im biologischen Medium verwendet (Child et al., 1971; Dahl & Miller, 1985; Mutch et al., 1992;
Stoops et al., 1969). In dieser Studie wurde Phenylacetat als Vergleichssubstanz eingesetzt, da
aufgrund seiner schnellen Hydrolysierbarkeit bereits geringe Änderungen der Esteraseaktivität
von Ratten- und Humanblutplasma sowie Rattenleberhomogenat anzeigt wurden.
Biologisches Material wurde verworfen, wenn ein statistisch gesicherter Abfall der Esterase-
aktivität (n = 4) um 10 % detektiert wurde. Der Hydrolyseansatz aus Blutplasma oder
Rattenleberhomogenat wurde generell 1:100 mit Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) verdünnt. Die
Aufzeichnung eines Hydrolyseverlaufs mit höherer Enzymkonzentration war nicht möglich, da
die Vollständigkeit der Hydrolyse vor der ersten Probenahme (0,5 min) bereits erreicht war. Ein
Vergleich mit anderen Substraten war möglich, da die Ergebnisse aus der Berechnung der
Hydrolyseaktivität und Vmax auf den Proteingehalt des Hydrolysemediums bezogen wurden. Die
Parameter lauten entsprechend spezifische Aktivität und spezifische Geschwindigkeit.
0
10
20
30
40
1:50 verdünnt 1:10 verdünnt unverdünnt
Km [10-3 mol /L]
Vmax [10-4 mol /L*min]
Vmax/Km [10-1 /min]
Km
Vmax
Vmax /Km
0
10
20
30
40
1:50 verdünnt 1:10 verdünnt unverdünnt
Km [10-3 mol /L]
Vmax [10-4 mol /L*min]
Vmax/Km [10-1/min]
Km
Vmax
Vmax /Km
5.6 Vergleich verschiedener physiologischer Medien 65
Tab. 15: Pharmakokinetische Parameter für Phenylacetat in Humanplasma
S0
[min]
spezifische Hydrolyseaktivität
Ha, spez. [mol /min g Protein]
Halbwertzeit4
t1/2 [min]
0,25 0,67 ± 0,03 .10 –4 0,80 ± 0,23
0,50 1,31 ± 0,04.10 –4 0,91 ± 0,15 Michaelis-Menten-Parameter:
1,00 2,73 ± 0,02 .10 –4 0,67 ± 0,05 (S0 = 0,25 – 2,50 mM)
2,00 4,96 ± 0,11 .10 –4 1,13 ± 0,07 Vmax = 1,66 ± 0,35 .10 –3 mol /min g Protein
3,00 7,45 ± 0,55 .10 –4 1,15 ± 0,23 Km = 2,83 ± 0,78 mM
4,00 8,66 ± 0,25.10 –4 2,06 ± 0,21
Die Substratanfangskonzentration von 0,25 mM bis 4,00 mM wurde in Anlehnung an eine
Studie mit Lebermikrosomen und Lebercytosol übernommen (McCracken et al., 1993 und
1993a). Enzymatisch katalysierte Hydrolysereaktion, die einer Reaktionsordnung ersten Grades
gehorchen, gehen in der Regel bei S0 > 5Km in eine Reaktion nullter Ordnung über. Oberhalb
dieser Konzentration hat die Substratkonzentration kaum noch Einfluss auf die
Reaktionsgeschwindigkeit (Rappoport, 1987). Der für Km ermittelte Durchschnittswert von
2,83 mM ergibt, multipliziert mit dem Faktor 5, eine Substratanfangskonzentration von 14,1 mM.
Darüber hinaus stellten Dahl & Miller (1985) bei S0 > 10 mM keinen weiteren Anstieg der
Initialgeschwindigkeit fest, was als beginnende Substrathemmung interpretiert werden kann.
5.6 Vergleich verschiedener physiologischer Medien
Im Körper von Menschen und Säugetieren tragen alle Gewebe und Körperflüssigkeiten mehr
oder weniger zur enzymatischen Hydrolyse von Carbonsäureestern bei. Leber, Niere, Gastro-
intestinaltrakt und Blut verfügen dabei über die größte hydrolytische Aktivität (Boyer, 1971;
Fahelbum & James, 1979, Knaak, 1995; Silverman, 1995). Charakteristisch und umfangreich
untersucht sind speziesspezifische Unterschiede (Buchwald & Bodor, 1999; Dahl, 1987;
Hosokawa et al., 1990; McCracken et al., 1993; Minagawa et al., 1995; Satoh, 1998). Die dabei
geläufigsten biologischen Medien wurden bereits in Abschnitt 3.3 erläutert.
Ein Ziel unserer Studie war der Vergleich unserer Methode mit Literaturangaben zu
Hydrolysestudien aus verschiedenen biologischen Systemen. In künstlicher Magenflüssigkeit,
Blutplasma von Mensch und Ratte sowie in Rattenleberhomogenat konnte die unterschiedliche
Hydrolysierbarkeit von Ethyl- und Benzyltiglat sowie der Referenzsubstanz Phenylacetat
gezeigt werden (Abb. 45, Anhang III Tab. 44). Phenylacetat wird in Rattenplasma um 2
Zehnerpotenzen schneller hydrolysiert. Der Unterschied zu Humanplasma betrug 3
Zehnerpotenzen.
Mit Hilfe von künstlicher Magenflüssigkeit und Rattenleberhomogenat kann zusätzlich zur
Hydrolyse in Blutplasma der Anteil unterschiedlicher biologischer Systeme am Metabolismus
von Estern abgeschätzt werden.
4 Humanplasma 1:100 verdünnt
66 5 Ergebnisse
Abb. 45: Hydrolyseaktivität künstlicher und physiologischer Körperflüssigkeiten bei Ethyltiglat und
Benzyltiglat
KMF (künstliche Magenflüssigkeit, pH 1,2); Human- und Rattenplasma „frisch“; S9-Fraktion aus Rattenleber (19 Monate bei –84°C
Wochen gelagert) – logarithmische Darstellung. S0 = 0,25 mM (*: für Phenylacetat keine Daten vorhanden).
Erwartungsgemäß wurde für künstliche Magenflüssigkeit die geringste Hydrolyseaktivität
nachgewiesen. Die Umsatzrate war vergleichbar mit der nichtenzymatischen, sauer
katalysierten Hydrolyse. Der Vergleich von Humanplasma mit künstlicher Magenflüssigkeit
ergab für Ethyl- und Benzyltiglat eine um den Faktor > 7,0 und > 2,3 erhöhte Umsatzrate.
Bereits Aldridge (1952) und Savary & Constantin (1970) konnten zeigen, dass der Hauptanteil
der enzymatischen Spaltung des Gastrointestinaltraktes im Dünndarm stattfindet.
Anzumerken ist, dass die Angaben zur Zusammensetzung von künstlicher Magenflüssigkeit in
der Literatur gelegentlich widersprüchlich und unvollständig sind (Longland, 1977). Schließlich
wurde für unsere Untersuchungen eine Zusammensetzung gewählt, die sich mit den häufigsten
Angaben (Castle, 1993; CEN/TC, 2000; Cooper et al., 1995; DIN EN 73-1, 1994) unter Berück-
sichtigung physiologischer Daten zum menschlichen Magensaft (Bergmeyer, 1970; Dokumenta-
Geigy, 1975; Pschyrembel, 2001) decken.
Die Hydrolyseaktivität in Blutplasma wird maßgeblich durch die Carboxylesterasemenge
bestimmt. Ursache für diese speziesspezifischen Unterschiede ist das im Vergleich zum
Menschen hohe Carboxylesteraselevel im Rattenplasma. Die hohe Cholinesteraseaktivität im
Humanplasma trägt nur in einem geringen Maß zur hydrolytischen Spaltung von
Carbonsäureestern im Plasma bei (McCracken et al., 1993 und 1993a). Mehrere Studien
wiesen in Rattenplasma, bzw. -vollblut eine gegenüber dem Menschen signifikant erhöhte
Hydrolyseaktivität nach (Aldridge, 1953; Buchwald & Bodor, 2000; Saghir et al., 1999).
Minagawa et al. (1995) wiesen anhand der Hydrolyse von Isocarbazylinmethylester eine
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
100,000
1000,000
KMF* Humanplasma
(h) 020.504
Rattenplasma
(r) 015.002
Rattenplasma
(r) 015.004
S9-Fraktion-Ratte
(s9)* 003.605
Ha, spez. [10-6 mol /min * g Protein]
Ethyltiglat
Benzyltiglat
Phenylacetat
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 67
gegenüber Humanblut in Rattenblut erhöhte Esteraseaktivität um den Faktor 400 nach. Die
Ergebnisse in Abb. 45 zeigen, dass die Hydrolyse von Carbonsäureestern in Rattenplasma
gegenüber Humanplasma deutlich schneller abläuft. Ethyltiglat wurde in Rattenplasma um den
Faktor 7,2 bis 9,9 und Benzyltiglat um den Faktor 33,7 bis 51,3 schneller umgesetzt. In
Rattenleberhomogenat wurde im Vergleich zu Rattenplasma eine ca. 600fach (Ethyltiglat) und
ca. 350fach (Benzyltiglat) erhöhte Hydrolyseaktivität gemessen. Auch diese Ergebnisse
stimmen mit publizierter Studien überein (Fahelbum & James, 1977; McCracken et al., 1993).
Dahl (1987) untersuchte die Umsatzrate von Pentyl- und Phenylacetat in Leber-S9-Fraktion
(250 und 510 µmol /min . g Protein). Der Schwerpunkt der Hydrolyseaktivität von Rattenleber
liegt mit einem Anteil von ca. 70 % in den parenchymalen Zellen (Gaustad et al., 1992).
McCracken et al. (1993) konnten Differenzen in der Hydrolyseaktivität von Mikrosomen und
Cytosol von Leber und Plasma bei der Ratte nachweisen. Lebermikrosomen hydrolysieren
Phenylacetat 16-mal schneller als Lebercytosol. Dagegen wird Phenylacetat in Plasmacytosol
4-mal schneller als in Lebercytosol umgesetzt. Der Vergleich Ratte-Mensch ergab einen
dreifach so schnellen Phenylacetat-Abbau in Lebermikrosomen. Die Hydrolyse in Lebercytosol
erfolgte dagegen beim Menschen fast 6-mal schneller als bei der Ratte (McCracken et al.,
1993a).
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma
5.7.1 Ethylester mit aliphatisch linear unverzweigtem Acylrest
Spezifische Hydrolyseaktivität
Die Bestimmung der Spezifischen Hydrolyseaktivität von Humanplasma für Ethylpropionat, -
valerat, -heptanoat, -undecanoat und -myristat erfolgte mit Substratanfangskonzentrationen von
0,25 bis 2,50 mM.
Für alle Ester wurde ein mit zunehmender Substratkonzentration steigender Umsatz je Zeit-
einheit festgestellt. Diese Art der Substrateliminierung folgt der in Abschnitt 2.5.1 beschriebenen
Reaktion 1. Ordnung. Die Konzentration, bei der ein Übergang in die Reaktionsordnung nullter
Ordnung (Umsatz je Zeiteinheit ist konstant und unabhängig von der Substratkonzentration)
erfolgt, wurde demnach nicht erreicht und liegt somit bei S0 > 2,50 mM.
Abb. 46 (Anhang II, Tab. 29) zeigt einen typischen Hydrolyseverlauf in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration. Die Reihenfolge der Ester im Hinblick auf ihre relative
spezifische Hydrolyseaktivität ändert sich innerhalb des Konzentrationsbereiches
0,25 bis 2,50 mM nicht. Von den untersuchten Substanzen zeigte Ethylvalerat als Pentylester
ein Maximum in der Umsatzrate.
Die spezifische Hydrolyseaktivität steigt von Ethylpropionat (C3) beim Übergang zu Ethylvalerat
(C5) zunächst an. Eine Verlängerung des Acylrestes bis C14 (Ethylmyristat) geht jedoch mit dem
rapiden Abfall des Substratumsatzes je Zeiteinheit einher.
68 5 Ergebnisse
Ethylpropionat
Ethylvalerat
Ethylheptanoat
Ethylundecanoat
Ethylmyristat
Abb. 46: Hydrolyseverlauf von Ethylestern mit aliphatisch linear unverzeigtem Acylrest in
Humanplasma
S0 = 1,00 mM, n= 4
Die spezifische Hydrolyseaktivität von Ethylmyristat im Vergleich mit Ethylvalerat steigt um den
Faktor 41,5 (S0 = 0,50 mM) bzw. 88,9 (S0 = 1,25 mM). Die Umsatzrate der enzymatischen
Esterspaltung im Blutplasma wird beeinflusst durch die Hydrophobizität bzw. Löslichkeit der
Ethylester und deren Hydrolyseprodukte im wässrigen Medium. Abb. 47 und Abb. 48
(Anhang II, Tab. 29) zeigen in der Gegenüberstellung die Freisetzungsrate der Carbonsäure in
Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration des Esters.
Abb. 47 zeigt mit zunehmender Substratkonzentration (0,25 mM bis 2,50 mM) eine steigende
Bildungsrate von Valeriansäure je Zeiteinheit. Diese Beobachtung weist auf den typischen
Verlauf einer Reaktion 1. Ordnung hin.
0,00
0,15
0,30
0,45
0246810
Zeit [min]
Konzentration [10 -3 mol /L]
0.25 mM
0.50 mM
0.75 mM
1.00 mM
1.25 mM
1.75 mM
2.50 mM
Abb. 47: Bildung von Valeriansäure bei der Hydrolyse von Ethylvalerat in Humanplasma
(n = 4)
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
0 1020304050
t [min]
Ester-Konzentration [10-3 mol /L]
Ethylpropionat
Ethylvalerat
Ethylheptanoat
Ethylundecanoat
Ethylmyristat
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 69
Weiterhin konnte in diesem Konzentrationsbereich weder Abfall noch Stagnation der
Umsatzrate festgestellt werden. Ein Abfall oder Stagnieren der Hydrolyseaktivität würde auf den
Effekt der Substrathemmung hinweisen. Ein Übergang in die Reaktion nullter Ordnung ist
ebenso auszuschließen. Diese Phänomene sind bei Substratanfangskonzentrationen > 2,5 mM
zu vermuten.
Die Hydrolyse von Ethylmyristat zeigt für ansteigende Substratanfangskonzentrationen
signifikant verringerte Hydrolyseraten (Abb. 48). Wir nehmen an, dass aufgrund der geringen
Löslichkeit dem Enzym nur eine konstant geringe Anzahl von im Plasma bei 37 °C gelösten
Substratmolekülen zur Verfügung steht. Die daraus resultierende geringe konstante Sättigungs-
konzentration ermöglicht nur einen minimalen enzymatisch katalysierten Substratumsatz. Eine
identische Substratanfangskonzentration führt zu einer konstanten Umsatzrate je Zeiteinheit.
Die Nähe der Messdaten zur Bestimmungsgrenze von Myristinsäure zeigte auch bei der
Vierfachbestimmung einen weiten und sich überlappenden Vertrauensbereich. Statistisch
abgesicherte Differenzen der Hydrolyseaktivität konnten für Ethylmyristat im gegebenen
Konzentrationsbereich (0,25 mM bis 2,50 mM) nicht detektiert werden.
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0 1020304050
Zeit [min]
Konzentration [10 -3 mol /L]
0.25 mM
0.50 mM
0.75 mM
1.00 mM
1.25 mM
1.75 mM
2.50 mM
Abb. 48: Bildung von Myristinsäure bei der enzymatischen Hydrolyse von Ethylmyristat in
Humanplasma
n = 4
Abb. 49 (Anhang IV, Tab. 45) gibt eine zusammenfassende Übersicht über die spezifische
Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei der enzymatischen Hydrolyse von Ethylestern.
Struktur-Wirkungsbeziehungen lassen sich aus der zunehmenden Acylkettenlänge und deren
Verzweigung (Ethylisovalerat) ableiten.
70 5 Ergebnisse
0,00
0,05
0,10
0,15
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Ha [10-6 mol / min *g Protein]
Abb. 49: Spezifische Hydrolyseaktivität bei Ethylestern mit aliphatisch linear unverzeigtem Acylrest
in Humanplasma
S0 = 0,25 mM, n = 4
Zu diskutieren ist die Verfügbarkeit des Substrats aufgrund der mit der Acylkettenlänge positiv
korrelierenden Hydrophobizität des Esters in Verbindung mit sterischen Hinderungen, die einen
Abfall der spezifischen Hydrolyseaktivität induzieren. Eine Ausnahme stellt Ethylvalerat dar; ein
Effekt der eine ideale Passform des Substrates in der Mehrheit reaktiven Zentren vermuten
lässt.
Die signifikant verschiedenen spezifischen Hydrolyseaktivitäten von Ethylvalerat und –isovalerat
lassen sich nicht durch Unterschiede in der Hydrophobizität (log PO/W) und Löslichkeit erklären,
da sich beide Ester diesbezüglich sehr ähneln. Die niedrigere Hydrolyseaktivität bei
Ethylisovalerat muss demnach auf sterische Effekte zurückgeführt werden.
Halbwertzeit
Der Verlauf von spezifischer Hydrolyseaktivität und Halbwertzeit unter identischen
Reaktionsbedingungen sollte negativ korrelieren. Die hohe spezifische Hydrolyseaktivität lässt
auf eine geringe Halbwertzeit der Ester im Hydrolysemedium schließen. Die
Geschwindigkeitskonstante der Reaktion 1. Ordnung leitet sich aus dem Anstieg der
Darstellung in Abb. 50 ab (Anhang II, Tab. 29). Ein steiler Anstieg der Regressionsgeraden
ergibt einen geringen Wert für die Halbwertzeit, die wiederum eine schnelle Elimination des
Substrats aus dem Hydrolysemedium vermuten lässt.
Der in dieser Studie vorgenommene Vergleich verschiedener Substrate anhand der Ableitung
von Struktur-Wirkungsbeziehungen aus Hydrolyseparametern erfordert die Bestimmung von
initialen Parametern in Abhängigkeit identischer Substratanfangskonzentrationen. Deshalb
wurde im Rahmen dieser Studie ausschließlich die initiale Halbwertzeit ermittelt. Ein anschau-
licheres Bild der Eliminierung eines Substrats aus einem Hydrolysesystem zeichnen auch
mittlere und terminale Halbwertzeit, deren Werte um ein Vielfaches höher sein können und sich
daher besonders zur Charakterisierung eines einzelnen Substrats eignen (Abschnitt 2.5.2).
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 71
Ethylpropionat
Ethylvalerat
Ethylheptanoat
Ethylundecanoat
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0 1020304050
Zeit [min]
ln [S0 / Si]
Ethylpropionat
Ethylvalerat
Ethylheptanoat
Ethylundecanoat
Ethylmyristat
Anstieg der Geraden = k [min-1 ]
Ethylmyristat
Abb. 50: Bestimmung von Geschwindigkeitskonstanten aus der Hydrolyse von Ethylestern in
Humanplasma
S0 = 0,25 mM, n = 4
Die initiale Halbwertzeit von Ethylestern mit unterschiedlicher Acylkettenlänge korreliert gut mit
der ansteigenden spezifischen Hydrolyseaktivität (Abb. 51, Anhang II, Tab. 46). Auffällig für
Substanzen mit zunehmend geringer Löslichkeit im Wässrigen ist die steigende Schwankungs-
breite der Ergebnisse. Ethylvalerat weist für jede Substratanfangskonzentration von 0,25 mM
bis 2,50 mM die gering-ste Halbwertzeit auf. Die Vertrauensbereiche schwanken im Bereich
4,8 % (Ethylpropionat) bis 21,3 % (Ethylmyristat). Die Reihenfolge der Substanzen in Abb. 51
ist bei allen untersuchten Substratkonzentrationen identisch. Die Halbwertzeit für Ethylmyristat
von 341 min (0,25 mM) ist gegenüber Ethylvalerat (9,7 min; 0,25 mM) um den Faktor 66 erhöht.
Ethylpropionat
Ethylvalerat
Ethylisovalerat
Ethylheptanoat
Ethylundecanoat
0
150
300
450
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Halbwertzeit [min]
Ethylmyristat
Abb. 51: Halbwertzeit von Ethylestern mit aliphatisch linear unverzeigtem Acylrest sowie
Ethylvalerat in Humanplasma
S0 = 0,25 mM, n = 4
72 5 Ergebnisse
In Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration nimmt die Halbwertzeit von
S0 = 0,25 mM bis 2,50 mM für Ethylvalerat um den Faktor 4,2 (9,7 min → 40,5 min) und für
Ethylmyristat um den Faktor 9,3 (341 min → 3177 min) zu.
Ethylisovalerat besitzt bis zu der Substratanfangskonzentration von 0,75 mM eine ähnliche
Halbwertzeit wie Ethylheptanoat. Diese Konzentration entspricht ungefähr der Löslichkeit von
Ethylheptanoat (0,69 mM) im wässrigen Medium bei 37 °C. Die Löslichkeit von Ethylisovalerat
liegt mit 13,9 mM deutlich darüber. Bei höheren Substratkonzentrationen stagniert die
Elimination von Ethylheptanoat anhand der Halbwertzeit zunehmend. Bei einer
Substratanfangskonzentration von 2,50 mM liegt die Halbwertzeit von Ethylheptanoat mit
239 min um einen Faktor von ca. 1,6 über der Halbwertzeit von Ethylisovalerat. Dieser
Zusammenhang deutet erneut auf den Einfluss der Löslichkeit des Substrates bei
enzymatischen Reaktionen hin.
Die Halbwertzeiten von Ethylvalerat und –isovalerat bei der enzymatischen Hydrolyse in
Humanplasma unterscheiden sich deutlich. Die Halbwertzeit von Ethylisovalerat ist gegenüber
Ethylvalerat um den Faktor 3,7 höher (S0 = 0,25 mM). Diese Differenz steigt sukzessive mit
zunehmender Substratanfangskonzentration bis Faktor 5,9 bei S0 = 2,50 mM.
Kinetische Parameter
Die Michaelis-Menten-Parameter Vmax und Km wurden mit dem linearen Plot nach Lineweaver &
Burk ermittelt (Abb. 52, Anhang II, Tab. 47). Eine sehr gute Korrelation bei der linearen
Regression der mittleren Messergebnisse zeigen Ethylpropionat, -valerat sowie –heptanoat.
Dagegen traten bei Ethylundecanoat und -myristat starke Abweichungen von der Trendlinie auf.
Die Michaelis-Menten-Parameter zeigten Variationskoeffizienten von bis zu 55,3 % (Tab. 19,
Abschnitt 6.4.4).
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
1 / S0 [10+3 L /mol]
1 /vi spez. [10+6 min* g Protein / mol]
Ethylpropionat
Ethylvalerat
Ethylheptanoat
Ethylundecanoat
Abb. 52: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von Ethylestern in Humanplasma
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 73
Aus dem Lineweaver-Burk-Plot für Ethylundecanoat lässt sich eine Abweichung von der
linearen Regressionsgeraden ableiten. Gemäß Arndt (1973) werden mit zunehmender
Substratkonzentration kleinere Werte für die Initialgeschwindigkeit bestimmt. Dieser Effekt wird
im Lineweaver-Burk-Plot als Abweichung von der Trendlinie angezeigt und gilt als Indikator für
substratinhibierende Effekte.
Die Maximalgeschwindigkeit der enzymatischen Hydrolyse bestätigt die Reihenfolge der
spezifischen Hydrolyseaktivität von Humanplasma gegenüber den untersuchten Ethylestern
(Abb. 53, Tab. 19). Im Vergleich mit der spezifischen Hydrolyseaktivität bei 2,50 mM (jeweils
höchste spezifische Aktivität) liegt der berechnetet Wert für Vmax bis zu einem Faktor von ca. 10
über dem experimentell bestimmten Wert. Ähnlich verhält sich der Quotient Vmax /Km. Der oben
abgeleitete Trend setzt sich fort. Eine Ausnahme bildet Ethylisovalerat.
Die spezifische Hydrolyseaktivität (Ha,spez.) zeigte im untersuchten Konzentrationsbereich von
0,25 mM bis 2,50 mM einen Trend zur asymptotischen Annäherung an den konstanten Wert für
Vmax (Anhang IV, Abb. 82). Bei Ethylundecanoat und Ethylmyristat tangiert der Vertrauens-
bereich für Ha,spez. den Wert für Vmax. Somit kann der Übergang der Reaktionsordnung in eine
nullte Ordnung ab einer Substratkonzentration von 1,75 mM für Ethylundecanoat nicht
ausgeschlossen werden. Die Schwankung der Ha,spez.-Werte für Ethylmyristat ist so hoch, dass
selbst bei einer Substratkonzentration ab 0,5 mM eine Reaktion nullter Ordnung angenommen
werden muss. Der daraus resultierende Saturierungseffekt wurde bei Estern mit höherer
Löslichkeit nicht beobachtet.
Aufgrund des geringen Km-Wertes kann aus dem geringeren Vmax/Km-Wert eine geringere
Hydrolysierbarkeit abgeleitet werden. Erwartungsgemäß deckt sich diese Interpretation mit der
geringen spezifischen Hydrolyseaktivität und großen Halbwertzeit. Die Berechnung der
konventionellen Parameter Halbwertzeit und Hydrolyseaktivität kann demnach durch die
Ermittlung kinetischer Parameter abgesichert werden.
Ethylpropionat
Ethylvalerat
Ethylisovalerat
Ethylheptanoat
Ethylundecanoat
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Propionat Valerat Isovalerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Vmax [10-6 mol / min*g Protein]
Vmax/Km [10-3 l /min*g Protein]
Vmax
Vmax/Km
Ethylmyristat
Abb. 53: Maximalgeschwindigkeit und Vmax/Km der enzymatischen Hydrolyse von Ethylestern in
Humanplasma
74 5 Ergebnisse
Km ist ein Maß für die Affinität des Enzyms oder Enzymsystems gegenüber einem Substrat,
unabhängig von der Substratanfangskonzentration und besitzt die Dimension einer
Konzentration (mol /L). Bei geringem Km-Wert erreicht das Enzymsystem bei kleinen
Substratkonzentration die erforderliche Substratsättigung, während bei hohen Michaelis-
Menten-Konstanten entsprechend höhere Substratmengen dem Enzym aktiv vorliegen müssen,
damit die halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht werden kann (Abb. 54, Tab. 19).
Abb. 54: Michaelis-Menten-Konstante Km der enzymatischen Hydrolyse von Ethylestern in
Humanplasma
Die ermittelten Km-Werte erfüllen die experimentelle Vorgabe, wonach gesicherte Ergebnisse zu
erwarten sind, wenn sich die Substratanfangskonzentrationen im Bereich 0,1⋅Km bis 10
⋅
Km
befinden. Alle errechnete Km-Werte liegen im Bereich im Bereich 0,1⋅Km < S0 < 5⋅Km. Die
detektierten Hydrolyseverläufe sind gemäß dieser Anforderungen an die Michaelis-Menten-
Kinetik einer Reaktion 1. Ordnung zuzuordnen.
Von einem signifikanten Unterscheid in der Affinität gegenüber verschiedenen
Substraten spricht man, wenn sich die Km-Werte mindestens um eine Größenordnung
von 10+2 bzw. 10-2 unterscheiden.
Unter Berücksichtigung der sich überschneidenden Vertrauensintervalle ist die Größe der
bestimmten Km-Werte von vergleichbarer Größe. Die Affinität des Enzymsystems Humanblut-
plasma gegenüber Ethylestern mit einem Acylkettenlänge von C3 bis C14 ist somit annähernd
gleich. Die Mittelwerte für pKm und Vmax aus n = 4 wurden in Abhängigkeit der Acylkettenlänge
aufgetragen (Abb. 55). Die pKm -Werte zeigen für die dargestellten Acylkettenlängen ähnliche
Werte und damit einen plateauförmigen Verlauf in der Abbildung.
Für Humanplasma wurde der Maximalwert für Vmax bei der Acylkettenlänge C5 (Ethylvalerat)
gemessen. Werden für die zu vergleichenden Substrate annähernd gleiche Km-Werte aus dem
Verlauf der Maximalgeschwindigkeit ermittelt, so ergibt sich der für die Hydrolysierbarkeit des
Substrats maßgebliche Parameter.
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
2,8
3,2
3,6
Propionat Valerat Isovalerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Km [10-3 mol /l]
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 75
Ein ähnlicher Verlauf ist der Studie von Arndt & Krisch (1973) zu entnehmen. Die Hydrolyse von
Methylestern mit linear gesättigt unverzeigtem Acylrest unterschiedlicher Kettenlänge (C2 bis
C7) in Rattenlebermikrosomen lieferte ebenso für die Acylkettenlänge C4 (Methylbutyrat) ein
signifikantes Maximum für Vmax.
1
2
3
4
02468101214
pKm
0,0
0,2
0,4
0,6
02468101214
Anzahl der C Atome im Acylrest
Vmax [10-6 mol /min * g Protein]
Abb. 55: Verlauf der Maximalgeschwindigkeit und dem negativen dekadischen Logarithmus von
Km (pKm) in Abhängigkeit von der Kettenlänge des Acylrests von Ethylestern bei der
Hydrolyse in Humanplasma
(x) Vmax; (z) pKm
Grundsätzlich gilt, dass sich aus der Interpretation von Km-Werten für Enzymsysteme, wie hier
Blutplasma, nur ein allgemeines und unspezifisches Enzym-Substrat-Verhalten ableiten lässt.
Es steht für die mittlere Enzymaffinität des Enzymsystems und ist wenig aussagekräftig. Eine
Differenzierung in der Affinität einzelner Hydrolysen kann nicht erfolgen, da die Interpretation
der Enzym-Substrat-Affinität das Isolieren und Aufreinigen der charakteristischen Hydrolasen
voraussetzt.
5.7.2 Ethyl- und Benzylester mit verzweigtem oder aromatischem Acylrest
Spezifische Hydrolyseaktivität
Der Verlauf der enzymatischen Hydrolyse von Ethyl- und Benzylester weist deutliche
Unterschiede auf. Abb. 56 (Anhang II, Tab. 29 und Tab. 30) zeigt den Substratumsatz innerhalb
verschiedener Gesamthydrolysezeiten für eine Substratanfangskonzentration (S0 = 1,00 mM).
Mit zunehmender Substratanfangskonzentration steigt im Bereich 0,25 mM bis 2,50 mM die
freigesetzte Carbonsäuremenge kontinuierlich an (Abb. 56).
76 5 Ergebnisse
Abb. 56: Hydrolyseverlauf von Ethyl- und Benzylestern bei der Hydrolyse in Humanplasma
(S0 = 1,00 mM; n=4)
Die höchste Umsatzrate zeigten die Phenylacetatester. Die geringste Umsatzrate wurde bei
Ethyltiglat und -cinnamat nachgewiesen. Die spezifische Hydrolyseaktivität stieg mit zuneh-
mender Substratanfangskonzentration. Die Reihenfolge der Ester im Vergleich der spezifischen
Hydrolyseaktivität von Humanplasma untereinander änderte sich nicht (Abb. 57).
O
OOH
Benzyl-
phenylacetat >> Ethyl-
phenylacetat >> Benzyl-
tiglat >Ethylisovalerat
Benzylsalicylat >Ethyliglat > Ethylcinnamat
202,7 : 16,3 : 5,4 :3,7 und 3,5 :1,8 : 1,0
Abb. 57: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei Ethyl- und Benzylestern mit
verzweigten oder aromatischem Acylrest
(S0 = 1,00 mM; n=4)
Verzweigungen im Acylrest von Ethyl- und Benzylestern der Tiglinsäure (trans-2-Methyl-2-
butensäure) führten zu signifikant niedrigeren Umsatzraten. Ethylisovalerat wurde doppelt so
schnell hydrolysiert wie Ethyltiglat.
Aromatische Acylreste rufen ein unterschiedliches Hydrolyseverhalten hervor. Am Beispiel der
Benzylester lässt sich in Abhängigkeit vom Acylrest folgende Reihenfolge für die spezifische
Hydrolyseaktivität für Humanplasma festlegen:
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 1020304050
t [min]
Ester-Konzentration [10-3 mol /L]
Benzyltiglat
Benzylphenylacetat
Benzylsalicylat
Ethylisovalerat
Ethyltiglat
Ethylphenylacetat
Ethylcinnamat
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 77
Phenylessigsäure >> Tiglinsäure > Salicylsäure
Abb. 58: Bildung von Benzylalkohol bei der enzymatischen Hydrolyse von Benzyltiglat in
Humanplasma
Für Ethylester ergibt sich folgende Abfolge:
Phenylessigsäure >> Isovaleriansäure > Tiglinsäure > Zimtsäure
Benzylalkohol und Tiglinsäure sind gaschromatographisch nebeneinander detektierbar (siehe
Abb. 28). In Abb. 58 und Abb. 59 ist die Bildungsrate von Benzylalkohol und Tiglinsäure in
Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration dargestellt.
Abb. 59: Bildung von Tiglinsäure bei der enzymatischen Hydrolyse von Benzyltiglat in
Humanplasma
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 1020304050
Zeit [min]
Konzentration [10 -3 mol /L]
0.25 mM
0.50 mM
0.75 mM
1.00 mM
1.25 mM
1.75 mM
2.50 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 1020304050
Zeit [min]
Konzentration [10 -3 mol /L]
0.25 mM
0.50 mM
0.75 mM
1.00 mM
1.25 mM
1.75 mM
2.50 mM
78 5 Ergebnisse
Die Wertepaare zeigen eine gute Übereinstimmung, insbesondere bei Daten aus
fortgeschrittener Hydrolysezeit (t ≥ 30 min). Die freigesetzte Tiglinsäure-Menge stieg bei der
Substratanfangskonzentration von 0,25 mM mit zunehmender Hydrolysezeit nur sehr langsam
an. Im Vergleich mit der zeitgleich zunehmenden korrespondierenden molaren Benzylalkohol-
konzentration lässt sich eine Differenz ableiten. Tiglinsäure besitzt bei der gaschromatogra-
phischen Analyse mit identischer stationärer FFAP-Phase (Polyethylenglycol-2-Nitroterephthal-
säureester) im Vergleich zum Benzylalkohol einen höheren Responsefaktor. Daraus resultierte
eine niedrigere Bestimmungsgrenze für Benzylalkohol. Damit konnten bereits geringere molare
Mengen an Benzylalkohol mit besserer Reproduzierbarkeit bestimmt werden.
Die Substratanfangskonzentration bestimmt die Höhe der spezifischen Hydrolyseaktivität der
einzelnen Ester sehr unterschiedlich. Während diese sich im Bereich von S0 = 0,25 mM bis
2,50 mM für Ethyltiglat annähernd verdoppelt, steigt sie bei Benzyltiglat um den Faktor 10. Die
geringste Steigerung der Hydrolysegeschwindigkeit erfährt Ethylcinnamat (Faktor 1,5). Der
Maximalwert wird bei Ethylphenylacetat erreicht (Faktor 18,8).
Derartige Schwankungen weisen auf substratspezifische Sättigungskonzentrationen hin. Der
Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient von Ethylcinnamat liegt etwas über dem Wert für
Ethylphenylacetat (Abschnitt 5.2). Die Hydrophobizität ist demnach nicht so signifikant
verschieden, als dass ein unterschiedliches Hydrolyseverhalten ableitbar wäre. Vielmehr deuten
strukturelle Merkmale auf eine sterische Hinderung bei der enzymkatalysierten Umsetzung hin.
Zimtsäure besitzt wie Phenylessigsäure eine Phenylgruppe und verfügt zusätzlich über eine
trans-Doppelbindung. Dieser Funktion werden sterisch hemmende Eigenschaften
zugeschrieben, wenn sie sich in der Nähe des sp2-hybridisierten Carbonylsauerstoffatoms
befindet. Ein ähnliches Verhalten zeigt die Hydroxy-Gruppe im Acylrest von Benzylsalicylat
(2-Hydroxybenzolcarbonsäurebenzylester).
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
Abb. 60: Spezifische Hydrolyseaktivität von Ethyl- und Benzylestern mit verzweigtem und/oder
aromatischem Acylrest in Humanplasma
S0 = 1,00 mM, n = 4; logarithmische Darstellung
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 79
Die Betrachtung des Alkylrestes im Estermolekül lässt keine schlüssige Vorhersage auf das
Hydrolyseverhalten des Esters zu (Abb. 60, Anhang II, Tab. 45). Es wurden Ethyl- und Benzyl-
ester mit identischem Acylrest gefunden, die in Humanplasma anhand der spezifischen
Hydrolyseaktivität als schnell hydrolysierbar eingestuft werden, wie die Phenylacetate. Dagegen
zeigten Ethyl- und Benzyltiglat ein nur langsames Hydrolyseverhalten.
Halbwertzeit
Die Halbwertzeit zeigt erwartungsgemäß im Vergleich von Ethyl- und Benzylestern eine
negative Korrelation zur spezifischen Hydrolyseaktivität. Die Messwerte aus dem Hydrolyse-
verlauf zur Berechnung der Halbwertzeit aus der Geschwindigkeitskonstante der Reaktion 1.
Ordnung korrelieren sehr gut mit der linearen Regressionsgeraden (Abb. 61).
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
0 102030405060
t [min]
ln [S0 / Si]
Benzyltiglat
Benzylphenylacetat
Benzylsalicylat
Ethylisovalerat
Ethyltiglat
Ethylphenylacetat
Ethylcinnamat
Abb. 61: Halbwertzeit von Ethyl- und Benzylestern bei der Hydrolyse in Humanplasma
(S0 = 1.00 mM; n=4)
Aus dem größten Anstieg der Geraden für Benzylphenylacetat ergibt sich die höchste
Geschwindigkeitskonstante k und damit die geringste Halbwertzeit. Annähernd deckungs-
gleiche Regressionsgeraden wurden für Ethyltiglat und –cinnamat sowie Ethylisovalerat und
Benzyltiglat ermittelt. Für die untersuchten Ethyl- und Benzylester ergibt sich für die
Halbwertzeit folgende Reihenfolge (Abb. 62, Tab. 46).
O
OOH
Benzyl-
phenylacetat >> Ethyl-
phenylacetat >> Ethylisovalerat
Benzyltiglat >Benzylsalicylat >Ethyltiglat > Ethylcinnamat
1,0 : 14,9 : 57,6 und 59,7 :105 :183 : 302
Abb. 62: Halbwertzeit von Ethyl- und Benzylestern mit verzweigtem oder aromatischem Acylrest in
Humanplasma
80 5 Ergebnisse
Mit Ausnahme von Benzyltiglat wurde mit zunehmender Substratkonzentration eine Erhöhung
der Halbwertzeit festgestellt; die in Abb. 62 dargestellte Reihenfolge der Ester hinsichtlich der
Halbwertzeiten änderte sich nicht. Die Substratkonzentration wurde von 0,25 mM bis 2,50 mM
um das 10fache erhöht. Die Halbwertzeit stieg maximal um den Faktor 7,5 für Ethylcinnamat
(232 min → 1733 min) und minimal um den Faktor 1,5 für Benzylsalicylat (192 min → 279 min).
Für Benzyltiglat konnte im Konzentrationsbereich 0,25 mM bis 2,50 mM kein signifikanter
Anstieg oder Abfall der Halbwertzeiten beobachtet werden. Die Werte schwanken plateauförmig
im Bereich 95 min bis 131 min.
Deutliche Abweichungen im Vergleich zum einheitlichen Verlauf der Ethylester zeigen (Abb. 63,
Tab. 46):
• Ethylphenylacetat (S0 = 1,00 mM, mäßiger Abfall der Halbwertzeit),
• Benzylphenylacetat (S0 = 2,50 mM, auffallend starker Anstieg der Halbwertzeit) sowie
• Benzylsalicylat (sehr schwacher Anstieg der Halbwertzeit und weite, sich über-
lappende Vertrauensintervalle).
Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die Vertrauensbereiche der Halbwertzeiten auffallend
deutlich unter den Werten für die spezifische Hydrolyseaktivität liegen. 80 % aller Variations-
koeffizienten liegen unterhalb von 15 %. Der maximale Wert wurde mit 23,4 % berechnet. Dem
entsprechend zeigt Abb. 63 eine scharfe Trennung der Ergebnisse.
Benzylphenylacetat besitzt die geringste Halbwertzeit (2,2 min). Seine Hydrolysierbarkeit wird
daher als schnell eingestuft. Die Eliminierungsgeschwindigkeit ist am höchsten.
Ethylphenylacetat weist mit 33 min eine mittlere Hydrolysierbarkeit auf. Die Halbwertzeiten der
verbleibenden Ester liegen oberhalb von 100 min.
1
10
100
1000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Halbwertzeit [min]
Abb. 63: Halbwertzeit von Ethyl- und Benzylestern mit verzweigtem und/oder aromatischem
Acylrest in Humanplasma
(S0 = 1,00 mM, n = 4)
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 81
Tiglate, Ethylsalicylat, -cinnamat und –isovalerat werden als vergleichsweise langsam hydroly-
sierbar charakterisiert. Diese Reihenfolge zeigt eine annähernd identische Übereinstimmung mit
den Schlussfolgerungen aus der spezifischen Hydrolyseaktivität. Ethyl- und Benzylester mit
aromatischen und/oder verzweigten Acylresten zeigen ein uneinheitliches Hydrolyseverhalten.
Die Ableitung einer Aussage zur Hydrolysierbarkeit aus dem Einfluss des Alkylrestes ist daher
nicht möglich. Den wesentlichen Einfluss besitzt dagegen der Acylrest. Beide Phenylacetatester
sind schnell hydrolysierbar. Tiglinsäureester werden dagegen langsam abgebaut.
Aus den Messdaten ließ sich keine Beeinträchtigung der enzymatischen Hydrolyse durch das
Überschreiten der Löslichkeit von Benzylphenylacetat (0,21 mM) ableiten. Ethyltiglat besitzt mit
einer Löslichkeit von 16,10 mM merklich hydrophilere Eigenschaften, ohne das die dadurch
erzielbare Verfügbarkeit von Estermolekülen eine schnellere Hydrolysierbarkeit zur Folge hätte.
Kinetische Parameter
Der Lineweaver-Burk-Plot für Ethyl- und Benzylester zeigt in Abb. 64 (Tab. 47) deutliche
Unterschiede hinsichtlich der Maximalgeschwindigkeit Vmax der enzymatischen Hydrolyse
(reziproker Wert aus dem Schnittpunkt mit der y-Achse). Demnach besitzen Substanzen, deren
Regressionsgeraden bei höheren Werten für 1/vi, spez. die Ordinate schneidet, eine geringe Vmax.
Entsprechend erreicht Benzylphenylacetat die höchste und Ethyltiglat die geringste Maximal-
geschwindigkeit. Die lineare Korrelation der einzelnen Messwerte zeigt mit Bestimmtheits-
maßen von R2 > 0,90 für alle untersuchten Ester eine gute Übereinstimmung. Substratinhibie-
rende Effekte wurden nicht festgestellt. Bei Ethyl- und Benzyltiglat sowie Benzylsalicylat konnte
eine Abweichung vom linearen Verlauf für hohe Werte für 1/S0 (geringe Substratkonzentration:
< 0.50 mM) nicht nachgewiesen werden.
-10
10
30
50
70
90
-2-10123456
1 / S0 [10+3 L /mol]
1 /vi spez. [10+6 min* g Protein / mol]
Benzyltiglat
Benzylphenylacetat
Benzylsalicylat
Ethyltiglat
Ethylphenylacetat
Abb. 64: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von verschiedenen Ethyl- und Benzylestern in
Humanplasma
82 5 Ergebnisse
Die Variation der Alkylreste führte bei den untersuchten Benzyl- und Ethylester zu
uneinheitlichen Verläufen der Regressionsgeraden im Lineweaver-Burk-Plot. Gemäß Abb. 64
lässt sich auf dem Lineweaver-Burk-Plot für die Phenylacetatester eine schnelle Hydrolysier-
barkeit mit hohen Werten für die maximale Reaktionsgeschwindigkeit Vmax ableiten. Die Tiglin-
säureester zeigen dagegen geringe Werte für Vmax .
Bei Ethyl- und Benzylestern lässt sich aus dem Alkylrest allein kein Zusammenhang zwischen
der Struktur des Carbonsäureesters und seiner enzymatischer Hydrolysierbarkeit in
Humanplasma herstellen. Um den Einfluss ausgewählter Acyl- und Alkylreste detaillierter
interpretieren zu können, wurden die grafischen Verläufe für Ethylvalerat- und isovalerat sowie
Ethyl- und Benzylphenylacetat und –tiglat einzeln dargestellt. Nach Abb. 65 bis Abb. 67 konnten
folgende Ergebnisse abgeleitet werden:
Aus dem unterschiedlichen Verlauf der Trendlinien in Abb. 65 resultieren verschiedene Werte
der Michaelis-Menten-Parameter. Vmax ist bei Ethylvalerat gegenüber –isovalerat um das
7,1fache erhöht. Der Wert für die Michaelis-Menten-Konstante Km ist bei Ethylvalerat annähernd
doppelt so hoch wie bei Ethylisovalerat. Ethylvalerat und –isovalerat besitzen bei identischem
Molekulargewicht eine unterschiedliche chemische Struktur. Sie zeigen ähnliche physikalische
Eigenschaften hinsichtlich der Löslichkeit bei 37 °C im Wässrigen (11,30 ± 1,25 mM und
13,90 ± 0,96 mM), spezifischer Dichte (0,87 und 0,86 g/cm3) sowie Hydrophobizität (log PO/W
von 1,939 und 1,881). Der signifikante Unterschied beider Substanzen in der Hydrolysierbarkeit
wird somit auf sterische Effekte zurückgeführt.
y = 1,5016x + 14,294
R2 = 0,791
y = 0,831x + 1,9464
R2 = 0,994
-5
0
5
10
15
20
25
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
1 / S0 [10+3 L /mol]
1 /vi spez. [10+6 min* g Protein / mol]
Ethylisovalerat
Ethylvalerat
Abb. 65: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von Ethylvalerat und –isovalerat in Humanplasma
Die geringere Affinität des Enzymsystem Humanplasma gegenüber Ethylisovalerat führt bereits
bei geringen Substratkonzentrationen zum Erreichen der Maximalgeschwindigkeit. Sie ist
jedoch im Gegensatz zu Ethylvalerat vergleichsweise gering. Der summarische Effekt lässt die
Schlussfolgerung zu, dass die Eliminierungsgeschwindigkeit maßgeblich durch Vmax bestimmt
wird und somit Ethylvalerat die schnellere Hydrolysierbarkeit besitzt.
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 83
In Abb. 66 und Abb. 67 sind Ethyl- und Benzylester mit verschiedenen Alkylresten
gegenübergestellt. Beide Abbildungen deuten auf ein durch den Alkylrest bestimmtes
Hydrolyseverhalten hin. Die Benzylester zeigen gegenüber dem Ethylester eine höhere
Maximalgeschwindigkeit. Der Unterschied von Vmax bei Tiglaten ist mit einem Faktor von 18,1
beträchtlich (Benzyl- >> Ethyl-), wogegen sich bei Phenylacetaten Vmax beim Benzylester nur
um den Faktor 4,6 erhöht (Benzyl- > Ethyl-).
y = 0,1338x + 0,1418
R2 = 0,9821
y = 3,5903x + 0,8874
R2 = 0,9979
-4
0
4
8
12
16
20
-4-20246
1 / S0 [10+3 L /mol]
1 /vi spez. [10+6 min* g Protein / mol]
Benzylphenylacetat
Ethylphenylacetat
Abb. 66: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von Ethyl- und Benzylphenylacetat in Humanplasma
y = 12,425x + 1,8365
R2 = 0,995
y = 24,077x + 30,939
R2 = 0,9249
-20
0
20
40
60
80
100
-2-101234
1 / S0 [10+3 L /mol]
1 /vi spez. [10+6 min* g Protein / mol]
Benzyltiglat
Ethyltiglat
Abb. 67: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von Ethyl- und Benzyltiglat in Humanplasma
84 5 Ergebnisse
Im Konzentrationsbereich 0,25 bis 2,50 mM zeigte die spezifische Hydrolyseaktivität einen
Trend zur asymptotischen Annäherung an den konstanten Wert für Vmax (Abb. 82). Für
Ethylisovalerat und Ethylcinnamat tangiert der Vertrauensbereich für Ha,spez. den Wert für Vmax.
Der Übergang der enzymatischen Hydrolyse von einer Reaktion erster in eine Reaktion nullter
Ordnung kann daher ab einer Substratkonzentration von 2,50 mM für Ethylisovalerat nicht
ausgeschlossen werden. Die Schwankung der Ha,spez.-Werte für Ethylcinnamat ist bei
Substratkonzentrationen oberhalb von 0,75 mM so hoch, dass ab hier eine Reaktion nullter
Ordnung angenommen werden muss. Ein derartiger Effekt wurde bei anderen Estern dieser
Strukturklasse nicht festgestellt und die Substratsättigung demzufolge nicht erreicht. Für die
Michaelis-Menten-Konstante ergibt sich eine entgegengesetzte Reihenfolge. Der Km–Wert für
Benzyltiglat ist mit 7,35 mM ca. 9,4-mal höher als bei Ethyltiglat bestimmt worden.
Ethylphenylacetat besitzt gegenüber Benzylphenylacetat einen 6fach erhöhten Km-Wert.
Gemäß Abb. 67 verläuft der Lineweaver-Burk-Plot bei Tiglaten innerhalb der relevanten
Wertepaare annähernd parallel. Die Phenylacetat-Plots schneiden sich in einem spitzen Winkel.
Ethylphenylacetat wird anhand von Vmax 2,6-mal schneller als Ethyltiglat hydrolysiert. Vmax von
Benzylphenylacetat ist um das 12fache gegenüber dem Tiglatester erhöht.
O
OOH
Abb. 68: Maximalgeschwindigkeit und Vmax/Km bei der enzymatischen Hydrolyse von Ethyl- und
Benzylestern in Humanplasma
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Vmax [10-9mol /min * g Protein]
Vmax/Km [10-6 l /min * g Protein]
Vmax
Vmax/Km
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 85
Aus der Maximalgeschwindigkeit ergibt sich folgende Reihefolge für die Hydrolysierbarkeit:
Benzyl-
phenylacetat >> Ethyl-
phenylacetat > Benzyl-
tiglat > Benzyl-
salicylat > Ethyl-
isovalerat > Ethyl-
tiglat > Ethyl-
cinnamat
682 : 149 : 56,3 : 12,1 : 7,1 : 3,1 : 1,0
Der Ethylester der Phenylessigsäure wird anhand der Maximalgeschwindigkeit 149-mal
schneller in Humanplasma hydrolysiert als der Zimtsäureethylester. Diese Reihenfolge stimmt
mit den Ableitungen aus der spezifischen Hydrolyseaktivität überein. Bei der Substratanfangs-
konzentration von 2,50 mM wurde eine um den Faktor 99,6 erhöhte Umsatzrate errechnet.
Vmax/Km als Parameter für die Hydrolysierbarkeit ergibt eine veränderte Reihenfolge:
Benzyl-
phenylacetat >> Ethyl-
isovalerat > Ethyl-
phenylacetat > Ethyl-
cinnamat > Benzyl-
tiglat > Benzyl-
salicylat > Ethyl-
tiglat
172 : 8,9 : 6,3 : 2,4 : 1,9 : 1,4 : 1,0
Aufgrund des geringen Km-Wertes wird eine hohe Substrataffinität angenommen, die zur
Erhöhung des Koeffizienten führt und als schnellere Hydrolysierbarkeit zu interpretieren ist. Die
Substrataffinität für Benzylester nimmt in der Reihenfolge –tiglat > -salicylat > -phenylacetat ab.
O
OOH
Benzyl
-tiglat
>
Ethyl-
phenylacetat > Benzyl-
salicylat
>
Benzyl-
phenylacetat
>
Ethyl-
tiglat
>
Ethyl-
isovalerat > Ethyl-
cinnamat
70,8 : 57,3 : 20,9 : 9,6 : 7,6 : 1,9 : 1,0
Ethylphenylacetat besitzt einen höheren Affinitätsparameter als Ethyltiglat. Die geringste
Michaelis-Menten-Konstante mit 1,04.10-3 mol /L besitzt Ethylcinnamat. Für die Benzylester
sowie Ethyltiglat und –phenylacetat konnte kein signifikanter Unterschied im Km-Wert
nachgewiesen werden. Die Affinität des Enzymsystems Humanplasma ist damit gegenüber den
untersuchten Estern annähernd gleich.
0,0
0,1
1,0
10,0
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Km [10-3 mol /L]
Abb. 69: Michaelis-Menten-Konstante Km der enzymatischen Hydrolyse von Ethyl- und
Benzylestern in Humanplasma
86 5 Ergebnisse
5.7.3 Ester mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer
Struktur
Spezifische Hydrolyseaktivität
Bei Methyloctanoat und Ethylheptanoat spricht man von inversen Estern, die neben der
identischen Summenformel auch eine gleiche Molekülgröße aufweisen. Diese Gemeinsamkeit
kann als Ursache für die im folgenden beschriebenen Differenzen zu Isoamylbutyrat mit
verzweigtem Alkylrest hinsichtlich der pharmakokinetischen Parameter angesehen werden.
Die spezifische Hydrolyseaktivität wurde in Humanplasma mit einer Substratanfangs-
konzentration im Bereich von S0 = 0,25 bis 2,50 mM ermittelt. Ein Anstieg von S0 ruft bei
Isoamylbutyrat, Ethylheptanoat und Methyloctanoat einen sukzessiven Anstieg der spezifischen
Hydrolyseaktivität hervor (Anhang II, Tab. 47). Im genannten Konzentrationsbereich erhöhte
sich die spezifische Hydrolyseaktivität für Ethylheptanoat um das 3,9fache, für Methyloctanoat
um das 5,3fache sowie für Isoamylbutyrat um das 6,6fache.
Methyloctanoat
Ethylheptanoat
Isoamylbutyrat
Abb. 70: Hydrolyseverlauf von Carbonsäureestern mit identischer Summenformel und
verschiedener chemischer Struktur in Humanplasma
S0 = 1,00 mM; n = 4
Isoamylbutyrat wurde mit signifikant höherer Umsatzrate je Zeiteinheit im Vergleich mit
Methyloctanoat und Ethylheptanoat im Humanplasma hydrolysiert. Die spezifische
Hydrolyseaktivität von Isoamylbutyrat war gegenüber Methyloctanoat und Ethylheptanoat um
den Faktor 19 bis 23 erhöht.
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 5 10 15 20
[min]
Ester-Konzentration [10 -3 mol /L]
Ethylheptanoat
Methyloctanoat
Isoamylbutyrat
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 87
Der in Abb. 70 dargestellte Hydrolyseverlauf kennzeichnet diesen Trend und zeigt in
Verbindung mit Abb. 71 die resultierende spezifische Hydrolyseaktivität. Der Graf für
Isoamylbutyrat zeigt eine hohe Standardabweichung der Ergebnisse. Dieser wird durch die
großen Vertrauensintervallen der Messwerte aus gaschromatographischen Buttersäurebe-
stimmung hervorgerufen.
Mit Abb. 71 deutet sich ein Einfluss der Kettenlänge des Acylrestes auf die Hydrolyseaktivität
an. Mit zunehmender Kettenlänge des Acylrestes (-butyrat C4; -heptanoat C6; -octanoat C8)
wurde ein Abfall der Hydrolyseaktivität in der Reihenfolge -butyrat >> -heptanoat > -octanoat
bestimmt. Entsprechend besteht bezüglich der spezifischen Hydrolyseaktivität und Kettenlänge
der Alkylreste Methyl- (C1), Ethyl- (C2) sowie Isoamyl- (iso-C5) eine reziproke Reihenfolge:
Isoamyl- >> -Ethyl- > Methyl-.
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Ha, spez. [10-6 mol / min *g Protein]
Abb. 71: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei Carbonsäureestern mit identischer
Summenformel und verschiedener chemischer Struktur in Humanplasma
S0 = 1,00 mM; n = 4
Halbwertzeit
Abb. 72 zeigt den linearen Plot zur Berechnung der Halbwertzeit für die Reaktion 1. Ordnung. In
der Grafik setzt sich der Einfluss des weiten Vertrauensintervalls für die Eduktbildung bei der
Hydrolyse von Isoamylbutyrat fort. Ausgehend von der hohen spezifischen Hydrolyseaktivität
bei Isoamylbutyrat ergibt sich erwartungsgemäß der geringste Wert für die Halbwertzeit bei der
Hydrolyse in Humanplasma. Bei Methyloctanoat und Isoamylbutyrat setzt für Konzentrationen
1,00 mM ≤ S0 ≤ 2,50 mM und 0,75 mM ≤ S0 ≤ 2,50 mM ein plateauförmiger Verlauf bzw. eine
Stagnation der Halbwertzeit ein. Ethylheptanoat zeigt dagegen mit steigender Substratanfangs-
konzentration einen Anstieg der Halbwertzeit (vgl. Anhang II, Tab. 46).
88 5 Ergebnisse
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
0 5 10 15 20
[min]
ln [S0 / Si]
Ethylheptanoat
Methyloctanoat
Isoamylbutyrat
Abb. 72: Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten k aus Hydrolyse von Estern mit identischer
Summenformel und verschiedener chemischer Struktur in Humanplasma
S0 = 1,00 mM; n = 4
Die Halbwertzeit in Humanplasma für die geringste der untersuchten Substratanfangs-
konzentrationen (0,25 mM) wurde für Isoamylbutyrat (IAB) mit 0,75 ± 0,13 min, für
Ethylheptanoat (EH) mit 45,0 ± 7,8 min sowie für Methyloctanoat (MO) mit 47,7 ± 3,3 min
bestimmt. Bei dieser Konzentration besitzen Ethylheptanoat und Methyloctanoat annähernd
identische Halbwertzeiten. Wird die Substratkonzentration erhöht, so divergieren EH und MO in
ihrer Halbwertzeit zunehmend. Bei S0 = 1,00 mM beträgt der Unterschied 21,6 % (EH:
87,9 ± 4,9 min und MO: 112,1 ± 6,6 min). Die Halbwertzeit für Isoamylbutyrat beträgt dagegen
nur 2,47 ± 0,25 min (Abb. 73). Bis zu der Substratkonzentration von 2,50 mM erhöht sich die
Differenz zwischen EH und MO gering auf 26,3 % (EH: 146,4 ± 10,0 min und
MO: 108,0 ± 17,3 min). Die Halbwertzeit für Isoamylbutyrat beträgt hier 2,87 ± 0,36 min.
Die Ester Isoamylbutyrat, Ethylheptanoat und Methyloctanoat haben eine identische
Summenformel. Diskutiert man Ergebnisse unter dem Gesichtspunkt der Hydrophobizität, so
ergeben sich folgende Aspekte:
Die drei Ester zeigen ähnliche polare Eigenschaften. Steigt mit abnehmender Kettenlänge die
Hydrophobie des Alkylrestes, so nehmen in gleichem Maße die hydrophilen Eigenschaften des
Acylrestes in der Reihenfolge Methyloctanoat → Ethylheptanoat → Isoamylbutyrat zu
(Abschnitt 5.2). Methyloctanoat, Ethylheptanoat sowie Isoamylbutyrat verfügen bei 37 °C über
eine ähnliche Löslichkeit in Krebs-Henseleit-Puffer (siehe Tab. 9). Der davon abweichende Wert
für Isoamylbutyrat von 1,52 mM wurde von Longland et al. (1977) bei 37 °C in destilliertem
Wasser ermittelt. In vorliegender Studie wurde die Löslichkeit von Isoamylbutyrat mit
0,88 ± 0,13 mM in Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) bei 37 °C gemessen.
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 89
0
20
40
60
80
100
120
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Halbwertzeit [min]
Abb. 73: Halbwertzeit von Carbonsäureestern mit identischer Summenformel und verschiedener
chemischer Struktur in Humanplasma
S0 = 1,00 mM; n = 4
Die stagnierende Halbwertzeit für S0 ≥ 1,00 mM und 0,75 mM für Methyloctanoat und Isoamyl-
butyrat kann auf die ermittelte Löslichkeitsgrenze zurückgeführt werden. Oberhalb dieser
Konzentration liegen keine zusätzlichen Substratmoleküle in Lösung vor, so dass eine
enzymatisch katalysierte Umsetzung nicht stattfinden kann. Ein derartiger Effekt wurde für
Ethylheptanoat nicht bestimmt.
Kinetische Parameter
Aus den Ergebnissen der spezifischen Hydrolyseaktivität und Halbwertzeit konnte für
Ethylheptanoat und Methyloctanoat ein ähnliches Hydrolyseverhalten abgeleitet werden. Diese
Tendenz kann anhand der Ableitung von kinetischen Parametern nach Michaelis-Menten durch
ähnlich verlaufende Lineweaver-Burk-Plots bestätigt werden (Abb. 74 und Abb. 75).
Die Maximalgeschwindigkeit der enzymatischen Hydrolyse von Ethylheptanoat liegt unterhalb
der von Methyloctanoat. Ein Unterschied um den Faktor 1,7 ist allerdings als nicht signifikant zu
bewerten und muss in Verbindung mit Parametern wie Hydrolyseaktivität und Halbwertzeit
interpretiert werden.
90 5 Ergebnisse
y = 0,1131x + 0,1445
R2 = 0,4095
y = 6,6208x + 5,3882
R2 = 0,8826
y = 9,3773x + 3,3171
R2 = 0,936
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
1 / S0 [10+3 L /mol]
1 /vi spez. [10+6 min* g Protein / mol]
Methyloctanoat
Ethylheptanoat
Isoamylbutyrat
Abb. 74: Lineweaver-Burk-Plot: Hydrolyse von Estern mit identischer Summenformel und
verschiedener chemischer Struktur in Humanplasma
Im untersuchten Konzentrationsbereich von 0,25 mM bis 2,50 mM wurde die asymptotische
Annäherung der spezifische Hydrolyseaktivität (Ha,spez.) an Vmax nicht festgestellt (Anhang IV,
Abb. 82). Der Übergang der Reaktionsordnung in eine Reaktion nullte Ordnung und
Substratsättigung konnte damit nicht nachgewiesen werden. Vmax für Isoamylbutyrat liegt um
das 1,6fache über der spezifischen Hydrolyseaktivität bei S0 = 2,50 mM. Für Ethylheptanoat und
Methyloctanoat wurden die Faktoren 1,3 und 1,7 berechnet. Die Reihenfolge im Sinne einer
schnelleren Hydrolysierbarkeit zeigt Abb. 76.
10
100
1000
10000
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Vmax [10-9mol /min * g Protein]
Vmax / Km [10-6 l /min * g Protein]
Vmax
Vmax/Km
Abb. 75: Maximalgeschwindigkeit und Vmax/Km der enzymatischen Hydrolyse von Estern mit
identischer Summenformel und verschiedener chemischer Struktur in Humanplasma
5.7 Hydrolyseuntersuchungen in Humanplasma 91
Isoamylbutyrat >> Methyloctanoat >> Ethylheptanoat
Vmax:
38,2 : 1,7 : 1,0
Isoamylbutyrat >> Ethylheptanoat >> Methyloctanoat
Vmax/Km:
81,8 : 1,7 : 1,0
Abb. 76: Maximalgeschwindigkeit und Vmax/Km bei der enzymatischen Hydrolyse von Ethyl- und
Benzylestern in Humanplasma
Der Quotient Vmax /Km bestätigt die Reihenfolge der Hydrolysierbarkeit entsprechend der
spezifischen Hydrolyseaktivität und Halbwertzeit. Vmax /Km kann zusätzlich Unterschiede oder
Ähnlichkeiten der untersuchten Substanzen im Hinblick auf ihre Hydrolysierbarkeit unter
Berücksichtigung des Affinitätsparameters Km deutlicher hervorheben.
0
1
2
3
4
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Km [10-3 mol /l]
Methyloctanoat > Ethylheptanoat > Isoamylbutyrat
Km: 3,7 : 1,3 : 1,0
Abb. 77: Michaelis-Menten-Konstante der Hydrolyse von Estern mit identischer Summenformel
und verschiedener chemischer Struktur in Humanplasma
Methyloctanoat und Ethylheptanoat verfügen als inverse Ester über ähnliche Hydrolyse-
eigenschaften. Insbesondere anhand von Vmax und Vmax/Km zeigt sich ein deutlicher Unterschied
im Vergleich mit alkylrestverzweigten Isoamylbutyrat. Die Substratanfangskonzentrationen
liegen im unteren Soll-Bereich von 0,1Km bis 10Km.
92 5 Ergebnisse
Ein signifikanten Unterschied in der Affinität verschiedener Substrate ist gegeben, wenn sich die
Km-Werte um eine Größenordnung von mindestens 102 unterscheiden. Somit ist die Affinität
zum Enzymsystem Humanblutplasma vergleichbar.
Der maximale Unterschied vom Km besteht nach Abb. 77 zwischen Methyloctanoat
(3,05 ± 0,54 mM) und Isoamylbutyrat (0,83 ± 0,23 mM). Der geringe Unterscheid zwischen den
Werten führt dazu, das die Höhe der Maximalgeschwindigkeit um das 10fache überwiegt
(Unterschied maximaler Faktor 32,8). Isoamylbutyrat wird unter den untersuchten
Reaktionsbedingungen schneller in Humanplasma hydrolysiert. Der Bereich der
Substratanfangskonzentration 0,25 mM bis 2,50 mM lag stets unterhalb von 5.Km. Somit wurde
die Grenze zur Reaktion nullter Ordnung nicht überschritten.
93
6 Diskussion
6.1 Metabolismus und Risikobewertung
Für die Bewertung des gesundheitlichen Risikos einer bestimmten Substanz müssen
verschiedene Aspekte berücksichtigt werden. Schon Philippus Aureolus Theophrastus Bombast
von Hohenheim (1493 – 1541), genannt Paracelsus, stellte fest: „dosis facit venenum“ – „Die
Dosis macht das Gift“.
Zunächst benötigt man qualitative Aussagen zum Toxizitätspotential, das heißt der Art des
Risikos. Im zweiten Schritt sind Informationen zur Wirkungsstärke erforderlich (Dosis-
Wirkungsbeziehung). Als drittes muss die Exposition des Menschen abgeschätzt werden. Dabei
gehen folgende Parameter ein:
• Dosis/Konzentration im Expositionsmedium
• Dauer und Häufigkeit der Exposition
• Einwirkort und Aufnahmewege
Weiter sind Informationen zu Kinetik und Metabolismus erforderlich, zusätzlich müssen
Risikogruppen (Kinder, Alte, Kranke, Ethnien) berücksichtigt werden.
In der Regel werden Risikobewertungen auf einer case by case Basis vorgenommen. Bei
Aromastoffen, die zum einen sehr zahlreich und zum anderen häufig Naturstoffe sind, hat man
sich für ein pragmatisches Bewertungsverfahren ganzer Substanzklassen entschlossen.
Das Munro-Prinzip (Abschnitt 3.2.2) wurde u.a. zur toxikologischen Bewertung von
Substanzklassen entwickelt und im Vorfeld unserer Studie bereits auf Ethyl- Isoamyl- und
Allylester angewendet (JECFA 1999 und 2000). Bei der Gruppenevaluierung wurden neben der
abgeschätzten täglichen Aufnahmemenge auch Daten zur Hydrolysierbarkeit bei der
toxikologischen Bewertung berücksichtigt.
Die Aufnahmemenge wurde für Europa und die USA separat abgeschätzt. Der für Europa
bestimmte Wert basiert auf den 1995 von der IOFI bereitgestellten Daten. Lebensmittel-
hersteller stellten hierfür Angaben der Gesamtmenge der Aromastoffe zur Verfügung, die im
Laufe eines Jahres zur Aromatisierung ihrer Produkte eingesetzt wurden. Daraus konnte die
Menge an Aromastoffen, die in den USA zwischen 1980 und 1987 verwendet wurde, durch
Gutachten unter Federführung der National Academy of Sciences (National Research Council)
in Zusammenarbeit mit der Food and Drug Administration abgeleitet werden (Semino, 1997).
Die für unsere Studie ausgewählten Substanzen kommen in unterschiedlich hoher Konzentra-
tion natürlicherweise in Lebensmitteln vor. Anhang I gibt einen Überblick der wichtigsten
Vorkommen und Konzentrationen in verarbeiteten und unverarbeiteten Nahrungsmitteln sowie
deren Verwendung in kosmetischen Mitteln.
Die Substanzen werden im Körper vollständig zu Alkohol (Methanol, Ethanol, Isoamylalkohol,
Benzylalkohol) und der korrespondierenden Carbonsäure hydrolysiert. Die Hydrolyseprodukte
sind endogene Intermediate. Der Metabolismus der Carbonsäuren und Ethanol wurde bereits
ausführlich in Abschnitt 2.3 beschrieben.
Die für diese Studie weiterhin relevanten Alkylreste werden wie folgt verstoffwechselt:
Benzylalkohol wird über Benzaldehyd zu Benzoesäure oxidiert. Diese wird über die Leber nach
94 6 Diskussion
mitochondraler Glycinkonjugation unter Hippursäurebildung metabolisiert. Isoamylalkohol wird
nach Glucuronidierung im Phase II – Metabolismus ausgeschieden. Phenol wird in Phase I zu
Hydrochinon und Catechol hydroxyliert. Diese werden teilweise zu Benzochinonen oder 1,2,4-
Trihydroxylbenzol oxidiert, der überwiegende Teil jedoch mit Sulfat oder Glucuronsäure
konjugiert. Die Detoxifizierung von Methanol erfolgt oxidativ durch Einwirkung von Alkohol- und
Formaldehyddehydrogenase, über Formaldehyd zur Ameisensäure. Ameisensäure wird
langsam zu Kohlendioxid metabolisiert und kann bei hohen Konzentrationen zur Übersäuerung
des Blutes führen (Acidose bei pH < 7,35).
In Obst, insbesondere Südfrüchten, wurden Carbonsäureestern mit Konzentrationen < 1 mg/kg
nachgewiesen. Die Ester werden direkt in Pflanzen synthetisiert. Das benötigte Acyl-CoA
stammt aus der β-Oxidation von Fettsäuren oder aus dem Stoffwechsel von Aminosäuren
(Beelitz et al., 2001). Höhere Ester-Mengen (> 1 mg/kg) werden bei der Verarbeitung oder
Zubereitung von Lebensmitteln gebildet und in Konzentrationen von bis zu 50 mg/kg
nachgewiesen (siehe Anhang I). Konzentrationen > 50 mg/kg können im Enderzeugnis erreicht
werden, wenn ein Zusatz von Essenzen erfolgt. Daraus resultiert die Annahme, dass die
überwiegende Aufnahme von Carbonsäureestern über den Verzehr entsprechend modifizierter
Lebensmittel stattfindet.
6.2 Validierung und Methodik
Für alle in vorliegender Studie zu Hydrolyseuntersuchungen eingesetzten Carbonsäureester
wurde zunächst die Löslichkeit in biologischen Medien bestimmt. Dieser Parameter stellt eine
wichtige Größe bei der Bewertung von pharmakokinetischen Parametern dar, da letztlich nur in
Lösung befindliche Moleküle für die enzymatische Umsetzung zur Verfügung stehen. Als
Lösemittel zur Bestimmung wurde Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) bei 37 °C verwendet. Der
Puffer besitzt unter diesen Bedingungen und in seiner chemischen Zusammensetzung mit
Ratten- und Humanplasma vergleichbare Eigenschaften. Es konnte gezeigt werden, dass mit
zunehmender Acylkettenlänge der Ethylester die Hydrophobizität des Gesamtmolekül stark
ansteigt und damit die Löslichkeit von 183 mmol/L (für C3) absinkt auf Werte von unter
0,1 mmol/L (> C11). Ethylvalerat und –isovalerat besitzen ähnliche polare Eigenschaften; damit
haben Verzweigungen in kurzkettigen Acylresten (< C6) keinen signifikanten Einfluss auf die
Polarität des Moleküls.
Aromatische Substituenten verstärken die unpolaren Moleküleigenschaften. Aromatische Reste
in Acyl- und Alkylrest von Carbonsäureestern verstärken zusätzlich die hydrophoben
Eigenschaften und setzen die Löslichkeit unter oben genannten Bedingungen deutlich herab.
Die analysierten Löslichkeiten zeigten eine gute Übereinstimmung mit vorhandenen Daten aus
der Literatur. Diese Korrelation konnte zusätzlich durch die Berechnung des Octanol/Wasser-
Verteilungskoeffizienten (log PO/W) verifiziert werden. Entsprechend wurden die Ester in drei
Löslichkeitskategorien eingeteilt und anhand ihres log PO/W -Koeffizienten in ihrer Tendenz zur
Anreicherung im Körper nach der Aufnahme über die Nahrung bewertet.
Als besonders schwer löslich (< 0,10 mmol/L) erwiesen sich Ethylester mit Acylkettenlängen
von mehr als 10 Kohlenstoffatomen (Ethylundecanoat, Ethylmyristat). Löslichkeiten bis
6.2 Validierung und Methodik 95
10 mmol/L wurden für Substanzen ermittelt, die mit gleicher Molmasse und unterschiedlicher
chemischer Struktur ähnliche polare Eigenschaften aufwiesen (Methyloctanoat, Ethylheptanoat,
Isoamylbutyrat). Zu dieser Gruppe gehörten ebenso alle untersuchten Benzylester (-tiglat, -
salicylat, -phenylacetat) sowie Ethylcinnamat. Ester mit einer begrenzten Löslichkeit im
Wässrigen (Löslichkeit bis 250 mmol/l) besitzen verzweigte oder unverzweigte Acyl- oder
Alkylrest und Kettenlängen von maximal fünf Kohlenstoffatomen. Dazu gehören Ethylpropionat,
-valerat, -isovalerat. Das Vorhandensein einer trans-Doppelbindung (Ethyltiglat) oder eines
aromatischen Rings (Ethylphenylacetat, Phenylacetat) verringert die Löslichkeit nicht signifikant.
Außer Ethylpropionat, -valerat und –isovalerat besitzen alle untersuchten Ester einen log PO/W –
Koeffizienten von > 2 und damit die starke Tendenz, sich im Körper anzureichern, wodurch
wiederum die Resorption der Substanzen gehemmt wird. Bei Ethylpropionat, -valerat und –
isovalerat ist dagegen mit 0,5 < log PO/W < 2 eine gute Resorption und eine nur leichte Tendenz
zur Anreicherung gegeben.
Das für die Hydrolyseexperimente verwendete Ratten- und Humanplasma wurde nach den in
Abschnitt 8.4.1 und 8.4.2 beschriebenen Methoden gewonnen. Eine Wichtung der Einflüsse, die
eine Veränderung der originären Hydrolyseaktivität beider Plasmaarten bewirken, wurde
ausführlich in Abschnitt 5.3 diskutiert. Es wurden einheitliche Verfahren erarbeitet, um
Einflussfaktoren wie interindividuelle Schwankungen, geschlechtsspezifische und krankheits-
spezifische Unterschiede, Tagesschwankungen sowie altersabhängige Schwankungen zu
minimieren.
Zusätzlich wurden der Bearbeitungszeitraum der Plasmagewinnung, Proteingehalt und
Hämolyse vereinheitlicht, um die Wiederholbarkeit der Hydrolyseaktivität einzelner Pools zu
erreichen. Die entsprechende Verifizierung wurde anhand von Ethylheptanoat, Ethyltiglat,
Benzyltiglat sowie Phenylacetat geführt. Die Voruntersuchungen ermöglichten die
Quantifizierung der Methodenreproduzierbarkeit und deren Einflussfaktoren.
Als hilfreich erwies sich die Verwendung von Phenylacetat als Referenzsubstanz. Phenylacetat
wurde in Leberhomogenat oder Blutplasma von Mensch oder Ratte durch das Einwirken von
unspezifischer Carboxylesterase (EC 3.1.1.1) und Arylesterase (EC 3.1.1.2) am schnellsten
hydrolysiert. Diese Ergebnisse belegen vorhandene Literaturangaben (McCracken, 1993a).
Durch die schnelle Hydrolyse konnten bei der Plasmapool-Validierung hemmende Einflüsse auf
die Hydrolyseaktivität wie Aussalzeffekte, Denaturierung oder Hämolyse rasch erkannt werden.
Die Ester wurden in 1,4-Dioxan gelöst und aus einer definierten Stammlösung heraus dem
Hydrolysemedium zudotiert. Im Hydrolyseansatz konnte damit eine hinreichend genaue
Substratanfangskonzentration (S0) eingestellt werden. Die sich ergebene Schwankung
resultierte aus der Skalierung der verwendeten Mikroliterspritze und wurde mit maximal 0,10 µl
abgeschätzt. Aus diesem Volumen wurde eine maximale Konzentrationsdifferenz für S0 von
1,25 % (4,00 ± 0,05 mmol/l) bis 5 % (0,25 ± 0,013 mmol/l) errechnet. Als geeignetes Lösemittel
für Plasma und Leberhomogenat wurde Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) verwendet. Er besitzt
in Bezug auf pH-Wert und mineralische Zusammensetzung ähnliche Eigenschaften und
minimiert damit den Einfluss auf die Proteinkonformation der Enzyme.
Individuelle Einflusse wie Alter, Geschlecht oder Tageszeit auf die Enzymkonstitution bei der
Plasmagewinnung wurden gemittelt. Die erhaltenen Plasmapools von Ratte und Mensch
repräsentierten eine mittlere Enzymkonstitution, die einen Vergleich der Hydrolysierbarkeit der
96 6 Diskussion
Ester untereinander erlaubt. Als Indikator dafür diente die spezifische Hydrolyseaktivität von
Phenylacetat, Ethylheptanoat, Ethyl- sowie Benzyltiglat. Es konnte gezeigt werden, dass die
Schwankung der spezifischen Hydrolyseaktivität der Pools gegenüber den einzelnen
Substanzen deutlich unter deren interindividuellen Schwankungen lag (Abschnitt 5.4.4).
Weiterhin wurde der Einfluss der Lagerdauer bei –84°C auf die spezifische Hydrolyseaktivität
von Blutplasma untersucht. Während die Lagerung von Plasma bis zu 12 Stunden bei 4 °C
keinen signifikanten Einfluss auf dessen Aktivität hatte, wurden langsam fallende Werte bei der
Lagerung bei –84 °C über einen Zeitraum von bis zu 21 Wochen festgestellt. Die Lagerdauer für
Plasma, dass für Hydrolyseexperimente zum Einsatz kam, wurde daher auf 15 Wochen
gegrenzt. Es wurde die Vermutung bestätigt, dass insbesondere der Auftauprozess zu starken
Aktivitätsverlusten des Plasmas führen kann. Vom kommerziellen Erwerb von Humanplasma für
Hydrolysestudien ist abzuraten. Die im Rahmen unserer Studie gewonnene Erfahrung hat
gezeigt, dass die einschlägigen Anbieter nur über lückenhafte Informationen in Bezug auf
Herkunft, Alter oder Anzahl der Spender verfügen.
Zwingende Voraussetzung für die Darstellung der Hydrolyseeigenschaften nach Michaelis-
Menten für eine enzymatische Reaktion 1. Ordnung ist die Bestimmung der Enzymaktivität
„kurz nach Reaktionsstart“ möglichst innerhalb des pre-steady-state und steady-state Bereichs.
Die Gesamthydrolysezeit wurde für jeden Ester in Abhängigkeit von der Produktbildungs-
geschwindigkeit individuell bestimmt.
Folgende Maßgaben wurden festgelegt:
• Die Konzentration des ersten Messpunktes t1 musste über der Bestimmungsgrenze der
jeweiligen Analyten liegen.
• Der Konzentrationsunterschied zwischen aufeinander folgenden Messpunkten musste
so groß sein, dass keine Überschneidung der Vertrauensbereiche aus n = 4 resultierte.
Zur Beschreibung des Hydrolyseverlaufs wurden die Esterhydrolyseprodukte Alkohol und/oder
Carbonsäure gaschromatographisch quantifiziert. Eine Übersicht der wichtigsten
Validierungsparameter wie Nachweis- und Bestimmungsgrenzen sowie Wiederfindungsraten
sind in Anhang II zusammengefasst.
Die Vollständigkeit der enzymatischen Hydrolyse wurde anhand der Produktbildungs- und
Eduktabbaugeschwindigkeit in künstlicher Magenflüssigkeit und Rattenplasma nachgewiesen.
Die zu analysierenden Hydrolyseprodukte wurden als Kontrollsubstanzen mit bekanntem
Reinheitsgrad käuflich erworben. Zur Bestimmung der Wiederfindungsrate wurde hitzein-
aktiviertes Humanplasma sowie Krebs-Henseleit-Puffer dotiert, die Konzentration des Analyten
gemessen und daraus die Wiederfindungsrate berechnet. Wiederfindungsraten der Ester-
hydrolyseprodukte wurden im Bereich von 90,8 bis 113,5 % errechnet. Auf die Einführung von
Korrekturfaktoren konnte daher verzichtet werden. Die Abwesenheit des Analyten in den
verwendeten Stammlösungen wurde durch Nachweis in den Lösungen mit höchster
Substratkonzentration (2,50 mM) belegt. Freie Hydrolyseprodukte (Alkohol oder Carbonsäure)
wurden in keiner Stammlösung nachgewiesen.
Die Zeitpunkte der Probenahme wurden für jeden Carbonsäureester individuell bestimmt. Dabei
wurde die Gesamthydrolysezeit nach dem Reaktionsstart (Substratzusatz) so kurz wie möglich
gehalten. Unerwünschte Einflüsse, die zur Abnahme der Enzymaktivität führen, wurden
dadurch minimiert. Relevant waren hierbei Denaturierungsprozesse des Enzyms, Produkt-
6.3 Esterhydrolyse in verschiedenen biologischen Medien 97
hemmung sowie die mit fortschreitender Hydrolysezeit ansteigende Produktkonzentration,
wodurch die Rückreaktion sukzessive zunehmenden Einfluss an der Gesamtreaktion gewinnt.
Die kinetischen Parameter nach Michaelis-Menten, Vmax und Km , wurden aus dem doppel-
reziproken Linearisierungsverfahren nach Lineweaver-Burk abgeleitet. Die Initialzeit „kurz nach
Reaktionsstart“ zur Ableitung des Tangentenanstiegs wurde einheitlich mit ti = 0,10 min
determiniert. Vorteile dieser Darstellung gegenüber anderen Linearisierungsverfahren waren:
• beste Übereinstimmung der linearen Korrelation sowie
• Möglichkeit des Erkennens von substratinhibierenden Eigenschaften durch Abweichung
der Messpunkte von der Geraden bei Überschreitung einer substratspezifischen
Konzentration.
Bei der Festlegung der verwendeten Substratanfangskonzentrationen (S0) wurden vorange-
gangene Studien zur Orientierung herangezogen. McCracken et al. 1993 und 1993a arbeiteten
bei der Untersuchung der hydrolytischen Eigenschaften von Lebercytosol und Lebermikro-
somen im Konzentrationsbereich von 0,25 mM bis 4,00 mM. Es wurde berücksichtigt, dass eine
Reaktion 1. Ordnung ab S0 > 5 Km in eine Reaktion nullter Ordnung übergeht, bei der die
Substratkonzentration keinen Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit hat (Rappoport, 1987).
Ab einer Substratkonzentration > 10 Km wurde durch Dahl & Miller (1985) Substrathemmung
festgestellt. Daraus wurde für alle untersuchten Ester ein einheitlicher Konzentrationsbereich
von 0,25 mM bis 2,50 mM festgelegt.
Zusätzlich wurde der Zusammenhang von Plasmakonzentration und Initialgeschwindigkeit der
enzymatischen Hydrolyse dargestellt. Die Initialgeschwindigkeit der Hydrolyse von Ethylvalerat
und –isovalerat in 1:50, 1:10 sowie unverdünntem Rattenplasma zeigt die in dieser Reihenfolge
stetig zunehmende Hydrolyseaktivität (Abb. 44, Tab. 40).
6.3 Esterhydrolyse in verschiedenen biologischen Medien
Ein nächster Abschnitt der Studie führte zu allgemeinen Aussagen, die eine Einordnung der
hydrolytischen Aktivität von Humanblutplasma im Vergleich mit anderen physiologischen
Medien gegenüber ausgewählten Estern erlauben. Vorangegangene Studien wurden zur
Prüfung der Plausibilität der Ergebnisse herangezogen.
Als Hydrolysemedien wurden verwendet:
• Rattenblutplasma,
• Krebs-Henseleit-Puffer als Leerwert für Plasma,
• künstliche Magenflüssigkeit sowie
• Rattenleberhomogenat.
Neben der Referenzsubstanz Phenylacetat wurden Ethylheptanoat, Ethyltiglat, Benzyltiglat
untersucht.
Bestimmend für die Hydrolyserate in biologischen Medien ist die Carboxylesterasemenge (EC-
Nr. 3.1.1.1). Ursache für deutliche speziesspezifische Unterschiede ist die jeweils vorhandene
Enzymmenge. Seit langem ist bekannt, dass die Ratte im Gegensatz zum Menschen über
einen erhöhten Carboxylesterase-Level verfügt (McCracken et al. 1993/1993a). Verschiedene
98 6 Diskussion
Studien konnte diese Eigenschaften anhand einer Gegenüberstellung von Mensch und Ratte
belegen (Aldridge, 1953; Buchwald & Bodor, 2000; Saghir et al., 1999). Minagawa et al. wiesen
1995 anhand der Hydrolyse von Isocarbazylinmethylester eine gegenüber Humanblut in
Rattenblut erhöhte Esteraseaktivität um den Faktor 400 nach.
Den Einfluss des speziesspezifischen Verteilungskoeffizienten im Blutplasma beschrieb
Kaneko (1994). Die Verteilungskoeffizienten von Acetatestern zeigten in Rattenplasma eine
gegenüber Humanplasma um den Faktor 2,8 erhöhte Löslichkeit. Daraus resultiert eine erhöhte
Verfügbarkeit des Substrats am reaktiven Zentrum der Enzyme im Rattenplasma und
gewährleistet damit die schnellere Umsetzung. Entsprechend wurde erwartet, dass die
Hydrolyse in künstlicher Magenflüssigkeit mit deutlich geringerer Umsatzrate verläuft. Quinn et
al. (1999) beschrieben die katalytische Wirkung von Esterasen im Vergleich zur
nichtenzymatischen Hydrolyse. Sie konnten am Beispiel von Acetylcholinesterase gegenüber
Acetylcholin zeigen, dass die enzymatische Hydrolyse bei pH 7,0 einen 1013-fach schnelleren
Reaktionsablauf aufweist.
Der Gastrointestinaltrakt besitzt einen wichtigen Einfluss auf die Eliminationsgeschwindigkeit
von Carbonsäureestern. Die enzymatische Spaltung findet hauptsächlich im Dünndarm und
nicht im Magen statt (Aldridge, 1953; Savary & Constantin, 1970). Die Hydrolyse in der Leber
läuft mit deutlich höherer Geschwindigkeit ab. Demnach erhöht sich die Halbwertzeit von z.B.
Ethylheptanoat in Leberhomogenat im Vergleich zu künstlicher Magenflüssigkeit um einen
Faktor von ca. 2,8⋅10+6. In unserer Studie konnte die beschriebene Reihenfolge der
spezifischen Hydrolyseaktivität anhand von Ethyl- und Benzyltiglat bestätigt werden:
Rattenleber-
homogenat
>> Rattenplasma
Pool (r)015.002
> Humanplasma
Pool (h)020.504
>> künstliche
Magenflüssigkeit
Ethyltiglat 3,8⋅10+4 : 69 : 7,0 : 1
Benzyltiglat 3,9⋅10+4 : 120 : 2,3 : 1
Die Ergebnisse der methodischen Vorversuche sind plausibel. Es sollte deshalb möglich ein,
mit den ausgearbeiteten Methoden mit Hilfe von Studien in Humanplasma allgemeine
Aussagen zur Struktur-Wirkungsbeziehung der Hydrolyse von Estern im Hinblick auf den
Metabolismus von Aromastoffen abzuleiten.
6.4 Hydrolyse in Humanplasma 99
6.4 Hydrolyse in Humanplasma
6.4.1 Ethylester mit aliphatisch linear verzweigtem und unverzweigtem
Acylrest
Ethylester durchlaufen bei der enzymatischen Hydrolyse den in Abschnitt 2.4.1 beschriebenen
Additions-Eliminations-Mechanismus mit einem Übergangszustand in Form des tetrahedralen
Intermediats. Mit zunehmender Acylkettenlänge nimmt die Säurestärke mit stärker werdenden
Induktionseffet (+I-Effekt) der korrespondierenden Säure in der Richtung Propionsäure,
Valeriansäure, Heptansäure, Undecansäure sowie Myristinsäure ab. Die Säurestärke der
Abgangsgruppe nimmt entsprechend zu und stabilisiert den Übergangszustand. Die
Säurestärke von Valeriansäure ist gegenüber Isovaleriansäure, aufgrund des zunehmenden +I-
Effekts, erhöht.
Die enzymatische Hydrolyse wird durch die Bildung des tetraedrischen Intermediats besonders
von sterischen Effekten behindert (Radhakrishnamurti, 1971). Die Verlängerung des Acylrestes
von Ethylestern um ein oder zwei Methylgruppen (z.B. Ethylacetat → Ethylpropionat) lässt einen
signifikanten Abfall der Hydrolysegeschwindigkeit erwarten. Dieser Trend setzt sich mit zuneh-
mender Kettenlänge nicht fort (Mitzner, 1981; Vollhardt & Schore, 1994).
Verzweigungen führen nur in unmittelbarer Nähe der Carbonylfunktion zum Abfall der
Hydrolysegeschwindigkeit. Je weiter sich diese Funktion von der funktionellen Gruppe entfernt,
umso geringer ist der Einfluss auf den Reaktionsablauf. Voluminöse Substituenten in α–Position
beeinträchtigen die Reaktivität der Carbonylfunktion (Barton, et al. 1994). Wird das
Reaktionszentrum durch benachbarte Substituenten sterisch abgeschirmt, verringert sich die
Geschwindigkeitskonstante (F-strain-Effekt).
Diese sterischen Effekte bewirken eine Hemmung der intermolekularen Beweglichkeit sowie
eine steigende Spannung im Übergangszustand, was dessen Bildungsgeschwindigkeit
herabsetzen oder ausschließen kann (Saleh, 1981; DeTar et al., 1980). Den sterischen
Substituenteneinfluss beschreibt Saleh (1981) anhand der sauren Hydrolyse von n- und iso-
Propylacetat. Die zunehmende Kettenlänge des Alkylrestes bei Acetaten führte zum Abfall der
Geschwindigkeitskonstante in der Reihenfolge Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, n-Amyl- und iso-
Amylacetat. In Anlehnung an Taft wurde berechnet, dass die Werte für die sterische
Substituentenkonstante (Es) in der Reihenfolge Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, n-Butyl-, iso-Propyl-,
iso-Butyl- und tert-Butylacetat abnehmen. In gleichem Maße wurde bei der sauren Hydrolyse
eine Verringerung der Geschwindigkeitskonstante beobachtet (Hancock, 1961).
Der α-Methylsubstitution wird ein geringer Einfluss auf Km und Vmax zugeschrieben (Hosokawa
et al., 1990). Die Einführung von Verzweigungen im Estermolekül wird mit einer Erhöhung der
Toxizität des jeweiligen Substanz beschrieben (Taylor & Dormedy, 1998). Für die
zusammenfassende Bewertung der Hydrolysierbarkeit werden im Folgenden die Trends für die
berechneten pharmakokinetischen Parameter zusammengestellt (Tab. 16).
100 6 Diskussion
Tab. 16: Reihenfolge der untersuchten Ethylester mit zunehmender Hydrolysierbarkeit und
Substrataffinität in Humanplasma
spezifische
Hydrolysierbarkeit
Ha, spez. – steigend
Halbwertzeit
t1/2 - fallend
Maximalgeschwindigkeit
Vmax - steigend
Michaelis-Menten-
Konstante
Km – fallend
Maximalgeschwindigkeit /
Michaelis-Menten-Konstante
Vmax/Km - steigend
Myristat Myristat Myristat Myristat Myristat
Undecanoat Undecanoat Undecanoat Undecanoat
Heptanoat Heptanoat Isovalerat Heptanoat
Isovalerat Isovalerat Heptanoat
Propionat Propionat Propionat
Isovalerat /Propionat
Valerat Valerat Valerat
Heptanoat,
Propionat,
Undecanoat
/Valerat/Isovalerat
Valerat
Mit zunehmender Hydrolysierbarkeit steigen die Werte für die Parameter, Ha, spez., Vmax und
Vmax/Km an und zeigen für die untersuchten Ester einen einheitlichen Trend. Eine negative
Korrelation von Hydrolysierbarkeit und Halbwertzeit oder Michaelis-Menten-Konstante bestätigt
dieses Ergebnis. Auffällig ist die einheitliche Abnahme der Hydrolysierbarkeit mit zunehmender
Acylkettenlänge. Longland et al. (1977) konnten diesen Effekt für künstliche Magen- und
Pankreasflüssigkeit, Leber- sowie Dünndarmmucosapräparationen belegen (vgl. Tab. 4).
Die zunehmende Kettenlänge des Acylrests führt zum Anstieg der hydrophoben Eigenschaften
des Esters (Tab. 9). Die Abhängigkeit der Hydrolyserate von der Kettenlänge des Acylrestes
wurde im Zusammenhang mit der Hydrophobizitätskonstante beschrieben (Dahl & Miller, 1985).
Bei der Hydrolyse von Methylestern durch Carboxylesterase (EC-Nr. 3.1.1.1) aus
Rattenlebermikrosomen wurde eine Vergrößerung von Vmax bei ansteigenden Acylkettenlänge
von C1 bis C5 beobachtet.
Nach dem Erreichen eines Maximums für Vmax bei der Acylkettenlänge C5 wurde mit weiter
ansteigender Kettenlänge ein Abfall der Vmax-Werte festgestellt. Anhand unserer Ergebnisse
konnte gemäß Abb. 55 ein ähnlicher Verlauf für die Hydrolyse von Ethylestern in Humanplasma
ermittelt werden. Der höchste Wert für Vmax wurde bei der Acylkettenlänge C5 (Ethylvalerat)
bestimmt. Bis C13 (Ethylmyristat) fällt Vmax auf ein Minimum ab. Damit werden Ethylvalerat und –
propionat als schnell in Humanplasma hydrolysierbar eingestuft. Ethylundecanoat und -myristat
wurden unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen vergleichsweise langsam hydrolysiert.
Ethylheptanoat weist eine mittlere Hydrolysierbarkeit auf.
Aus der hohen Hydrophobizität für Ethylmyristat und –undecanoat lässt sich eine erhöhte
Affinität des Enzymsystems bei der Substratbildung ableiten. Daher kann von einer
begünstigten lipatischen Hydrolyse der Ester ausgegangen werden. Der Hauptanteil der
enzymatischen Hydrolyse ist im Humanplasma jedoch auf die unspezifische Carboxylesterase
(EC-Nr. 3.1.1.1) zurückzuführen. Daraus folgt eine geringe Verfügbarkeit der Substrate am
reaktiven Zentrum und damit die vergleichsweise niedrige Umsatzrate.
Ethylisovalerat wird gegenüber Ethylvalerat in Humanplasma langsamer hydrolysiert. Am Bei-
spiel der sauren Hydrolyse von Ethylisovalerat konnte Vinnik (1976) zeigen, dass beim Angriff
des Nucleophils das Carbonylkohlenstoffatom mit mindestens einem Wassermolekül solvatisiert
vorliegt. Die Ursache der verschiedenen Reaktionsmechanismen von geradkettigen und α-
verzweigten Alkylestern kann damit der Solvatation zugeschrieben werden (Mitzner, 1981).
Buchwald & Bodor (2000) beschreiben die theoretische Ableitung der Halbwertzeit für die
enzymatische Hydrolyse unter Berücksichtigung der sterischen Hinderung in der Nähe des
6.4 Hydrolyse in Humanplasma 101
Carbonylsauerstoffatoms. Die sterische Hinderung wird als ein Faktor für die signifikant
verringerte Hydrolyserate für Ethylisovalerat im Vergleich zu Ethylvalerat angesehen.
Insbesondere die voluminösere Ausdehnung der Isovaleriansäure in α–Position des Esters
reduziert die Reaktivität der Carbonylfunktion besonders dann, wenn der betreffende
Substituent am Reaktionszentrum oder in dessen Nähe gebunden ist (Barton, et al. 1994).
Sterische Effekte bewirken damit eine Hemmung der intermolekularen Beweglichkeit sowie eine
steigende Spannung im Übergangszustand, was dessen Bildungsgeschwindigkeit herabsetzen
oder ausschließen kann (Saleh, 1981). Ein Maß für die ausgeübte Abschirmung ist die sterische
Substituentenkonstante Es. Je raumfüllender die Substituenten sind, um so negativer wird Es
und desto langsamer verläuft die Hydrolyse des entsprechenden Esters. Da Abstoßungskräfte
auf dem Weg zum Übergangszustand überwunden werden müssen, steigen die Werte für die
molare Reaktionsenthalpie entsprechend; die Reaktionsentropie wird negativer. Beide Einflüsse
führen über die Gibbs-Helmholtz-Gleichung zu einer Erhöhung der molaren Aktivierungs-
enthalpie.
Die aufeinanderfolgenden Abschnitte der enzymatischen Serin-Esterase-Hydrolyse (Acylation
und Deacylation) sind getrennt von einander zu betrachten und zu bewerten (DeTar und
Tenpas, 1976 und 1976a). Der zweite Reaktionsschritt der enzymatischen Spaltung, der Angriff
des Wassermoleküls nach der Protonierung des Esters, wird besonders durch sterische
Faktoren beeinflusst. Der vergleichsweise geringe polare Einfluss auf die Umsatzrate kann
vernachlässigt werden.
6.4.2 Ethyl- und Benzylester mit verzweigtem oder aromatischem Acylrest
Die zusammenfassende Gegenüberstellung der Ester zeigt, dass beide untersuchten Phenyl-
acetatester in Humanplasma am schnellsten hydrolysiert wurden (Tab. 17). Für Tiglate,
Cinnamate sowie Salicylate wurde einheitlich eine signifikant langsamere Hydrolysierbarkeit
bestimmt. Die Hydrolysierbarkeit von Ethylisovalerat ist mit diesen Substanzgruppen
vergleichbar.
Phenylacetatester sind die am schnellsten hydrolysierbaren Ester. Unter Berücksichtigung der
großen Halbwertzeit und geringen spezifischen Hydrolyseaktivität wurden Ethylisovalerat und
Ethylcinnamat trotz eines vergleichsweise hohen Vmax/Km-Quotienten als langsam hydroly-
sierbar bewertet. Geringe Michaelis-Menten-Konstanten erlauben das Erreichen der
Maximalgeschwindigkeit schon bei geringen Substratanfangskonzentrationen. Der Einfluss des
Parameters Vmax überwiegt und begründet obige Einstufung.
Die untersuchten Substanzgruppen verfügen über voluminöse Substituenten mit Hydroxy-
Gruppen und/oder Doppelbindungen in Kombination mit aromatischen Ringen sowie
Verzweigungen in der Nähe der Carbonylfunktion. Diese Faktoren bedingen sterische
Hinderungen, die wiederum einen hydrolysehemmenden Effekt hervorrufen.
In Verbindung mit der in Tab. 17 beschriebenen Reihenfolge lassen sich sterische Effekte als
Ursache für die abfallende Hydrolysierbarkeit ableiten. Diese Effekte wurden anhand verschie-
dener biologischer Materialien von der Ratte beschrieben. Die langsame Hydrolysierbarkeit von
Methylsalicylat wurde von Kakkar & Mayersohn (1998) durch in vivo Studien an der Ratte
untersucht. Die Plasmahalbwertzeit wurde mit ≈ 36 min angegeben.
102 6 Diskussion
Tab. 17: Reihenfolge der untersuchten Ethyl- und Benzylester mit zunehmender
Hydrolysierbarkeit und Substrataffinität in Humanplasma
spezifische
Hydrolysierbarkeit
Ha, spez. – steigend
Halbwertzeit
t1/2 - fallend
Maximal-
geschwindigkeit
Vmax - steigend
Michaelis-Menten-
Konstante
Km – fallend
Maximalgeschwindigkeit /
Michaelis-Menten-Konstante
Vmax/Km - steigend
Ethylcinnamat Ethylcinnamat Ethylcinnamat Benzyltiglat Ethyltiglat
Ethyltiglat Ethyltiglat Ethyltiglat Ethylphenylacetat Benzylsalicylat
Benzylsalicylat Ethylisovalerat Benzylsalicylat Benzyltiglat Benzylsalicylat und
Ethylisovalerat Benzylsalicylat Benzylphenylacetat Ethylcinnamat
Benzyltiglat
Benzyltiglat und
Ethylisovalerat Benzyltiglat Ethyltiglat Ethylphenylacetat
Ethylphenylacetat Ethylphenylacetat Ethylphenylacetat Ethylisovalerat Ethylisovalerat
Benzylphenylacetat Benzylphenylacetat Benzylphenylacetat Ethylcinnamat Benzylphenylacetat
Sterische Effekte werden durch Verzweigungen oder voluminöse Substitutenten hervorgerufen.
Zusätzlich können elektronische Faktoren wie Hydroxy-Gruppen die Carbonylaktivität der
funktionelle Gruppe herabsetzen, da diese eine erhöhte Polarität der Carbonylgruppe bewirken
und damit eine verstärkte Ausprägung der Solvathülle verursachen. Letztlich wird dadurch ein
Substratangriff auf das reaktive Zentrum der Hydrolyse erschwert (Rakshit & Datta, 1976 und
1979).
Mesomeriehinderung tritt auf, wenn die an der Konjugation beteiligten Atome gehindert werden,
in einer Ebene zu liegen und damit der M-Effekt gemindert wird. Substituentenkonstanten σ*
werden erheblich durch Resonanzeffekte beeinflusst. Wird wie bei Phenyl- oder Vinylestern die
Resonanz zwischen Carbonylgruppe und Substituent unterbunden, läuft im Vergleich zur
sauren Hydrolyse die alkalische schneller ab. Für ungesättigte Gruppen nehmen die Werte für
σ* entsprechend der Entfernung des ungesättigten Restes von der Estergruppe ab (Evans,
1971).
Den Einfluss von oxidierten Acylresten (Alkoxy- und α-Hydroxy-Gruppen) auf die
Hydrolyseaktivität von Lipasen beschreiben Adamczyk & Grote (1999). Die erhöhte Anzahl von
Sauerstoffatomen im Substratmolekül (Benzylphenoxyacetat im Vergleich zu Benzylphenyl-
acetat) setzt die Hydrolysierbarkeit durch Lipasen herab. Das zusätzliche Sauerstoffatom
verstärkt die Elektrophilie der Carbonylgruppe. Die Polarität des Moleküls wird erhöht und eine
Hydratation begünstigt. Entsprechend sinkt die Substratbindungswahrscheinlichkeit.
Beide Einflüsse sind besonders wirksam, wenn beeinflussende Moleküle in der Nähe des
Carbonylkohlenstoff- und/oder -sauerstoffatoms lokalisiert sind. Zimtsäure besitzt wie
Phenylessigsäure die Phenylgruppe im Acylrest und zusätzlich eine trans-Doppelbindung im
entsprechenden Molekülrest.
Doppelbindungen oder Ringe in der Nähe der Carbonylfunktion verringern bekanntermaßen die
Hydrolyserate. Für die Substituenten phenyloxypropanoat, phenylpropanoat, phenylcyclo-
propanoat und trans-3-phenylpropenoat (cinnamat) wurde ein Abfall der Umsatzrate in der
Reihenfolge 85 : 70 : 2 : 1 beschrieben (Basak et al., 1997).
6.4 Hydrolyse in Humanplasma 103
6.4.3 Ester mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer
Struktur
Die Gegenüberstellung der untersuchten Ester mit identischer Summenformel und
verschiedener chemischer Struktur zeigen gemäß Tab. 18 eine einheitliche Reihenfolge in der
Hydrolysierbarkeit.
Tab. 18: Reihenfolge der zunehmenden Hydrolysierbarkeit und Substrataffinität bei Estern mit
identischer Summenformel und verschiedener chemischer Struktur
spezifische
Hydrolysierbarkeit
Ha, spez. – steigend
Halbwertzeit
t1/2 - fallend
Maximalgeschwindigkeit
Vmax - steigend
Michaelis-Menten-
Konstante
Km – fallend
Maximalgeschwindigkeit /
Michaelis-Menten-Konstante
Vmax/Km - steigend
Methyloctanoat Methyloctanoat Ethylheptanoat Methyloctanoat Methyloctanoat
Ethylheptanoat Ethylheptanoat Methyloctanoat Ethylheptanoat Ethylheptanoat
Isoamylbutyrat Isoamylbutyrat Isoamylbutyrat Isoamylbutyrat Isoamylbutyrat
Die drei untersuchten Substanzen zeigen ähnliche polare Eigenschaften. Mit zunehmender
Kettenlänge steigt die Hydrophobie des Alkylrestes in der Reihenfolge Methyloctanoat,
Ethylheptanoat und Isoamylbutyrat. In gleichem Maße nehmen die hydrophilen Eigenschaften
des Acylrestes zu. Im Gesamtmolekül heben sich diese Einflüsse auf. Daher besitzt die
Hydrophobizität auf die Geschwindigkeit der enzymatischen Umsetzung nur einen
untergeordnete Einfluss.
Alle Bewertungsparameter ergaben die schnellste Hydrolysierbarkeit für Isoamylbutyrat, dessen
Hydrolyseeigenschaften sich damit deutlich von Ethylheptanoat und Methyloctanoat
unterscheiden. Eine Verzweigung löst sterische Effekte nur dann aus, wenn sie sich in
unmittelbarer Nachbarschaft zum Carbonylkohlenstoff- und/oder –sauerstoff befindet. Mit jeder
durch eine CH2-Gruppe hervorgerufene Entfernung von der Carbonylfunktion nimmt der
Einfluss exponentiell ab.
Der Isoamyl-Alkylrestes weist keine hemmenden Einflüsse auf die Umsatzrate auf. Dieser Effekt
ist auf den deutlichen Abstand des Isoamylrestes von der funktionellen Gruppe um drei
Kohlenstoffatome zurückzuführen. Ein sterischer Effekt, der mit inhibierenden
Hydrolyseeigenschaften einhergeht, wurde nicht nachgewiesen. Im Gegensatz dazu ruft eine
Verzweigung im Abstand von zwei C-Atomen im Acylrest (-isovalerat) eine deutlich reduzierte
Umsatzrate hervor.
Dieser signifikante Einfluss im Vergleich zum nichtverzweigten Isomer (-valerat) wurde bereits
in Abschnitt 5.7.1 erläutert. Im Vergleich der chemischen Struktur von Ethylvalerat und
Isoamylbutyrat wird zusätzlich deutlich, dass sich die iso-Amylgruppe von Isoamylbutyrat im
Alkylrest, und damit auf der carbonylfunktion-abgewandten Seite befindet. Demnach hat die iso-
Butyl-Gruppe nur einen geringen Einfluss auf Geschwindigkeit der enzymatische
Esterhydrolyse.
Unter der Voraussetzung, dass freigesetzte langkettige freie Fettsäuren weiter metabolisiert
werden (Abschnitt 2.3), kann die Hypothese aufgestellt werden, dass eine schnelle
enzymatische Hydrolyse auch bei Ethylheptanoat und Methyloctanoat erfolgt. Ein Nachweis der
Spaltprodukte aufgrund hoher Synthaseaktivitäten kann ein verfälschendes Bild zeichnen.
104 6 Diskussion
6.4.4 Bewertung der Hydrolysierbarkeit
Anhand der chemischen Struktur eines Moleküls ist es möglich, Rückschlüsse auf den zu
erwartenden Reaktionsverlauf und die Umsatzrate der Solvolyse zu ziehen. Die Bereitschaft
einer Substanz schnell oder langsam zu reagieren, stellt eine relative Eigenschaft dar, deren
Ableitung auf der Verallgemeinerung empirischer Beziehungen zwischen Struktur, Reaktivität
und Selektivität beruht. Diese Aspekte sind nur auf Reaktionen mit ähnlichem Mechanismus
anzuwenden und können qualitativer wie quantitativer Art sein.
Die Ableitung von Hydrolyseeigenschaften erfolgt anhand von Parametern, die möglichst
unabhängig von den experimentellen Gegebenheiten sind und sich unabhängig davon
interpretieren und somit verallgemeinern lassen. Die spezifische Hydrolyseaktivität ist unter den
Bedingungen einer enzymatischen Reaktion 1. Ordnung stets abhängig von der Substrat-
anfangskonzentration (S0). Die Studie hat gezeigt, dass die Halbwertzeit ebenso von S0
bestimmt wird. Kinetische Parameter können dagegen relativ unabhängig interpretiert werden.
Vmax beschreibt eine aus einem mathematischen Algorithmus heraus extrapolierte
Maximalgeschwindigkeit, die experimentell und in vivo nie erreicht werden kann.
Die Bioverfügbarkeit eines Substrats im Enzymsystem wird durch die Resorption in
Blutkapillaren und Membrantransport durch Diffusion bestimmt. Der passive Transport entlang
eines Konzentrationsgefälles, aber auch die erleichterte Diffusion durch Carriemoleküle (aktivier
Transport) wird durch den Affinitätsparameter Km bestimmt. Dieser Einfluss ist für die
untersuchten Substanzen annähernd gleich.
Der Quotient Vmax/Km wurde in der Literatur bereits als unabhängiger Parameter für die
Hydrolysierbarkeit beschrieben (McCarthy, 1996). Der Quotient ist stets größer als Vmax
(Vmax : Vmax/Km ≈ 1 : 2,1) und kann damit kleine Unterscheide in der Hydrolysierbarkeit anhand
von Vmax oder Ha,spez. deutlich machen oder statistisch gesicherte Reihenfolgen hervorheben
oder bekräftigen.
Abb. 78 bis Abb. 80 geben eine Zusammenstellung der kinetischen Parameter aller
untersuchter Ester in absteigender Reihenfolge ihrer Absolutwerte.
6.4 Hydrolyse in Humanplasma 105
0,01
0,10
1,00
10,00
BT EPA MO PA EM BS EH BPA EP IAB ET EU EV EisoV EC
10-3 mol /l
Abb. 78: Michaelis-Menten-Konstante Km für die enzymatische Hydrolyse von Carbonsäureestern
in Humanplasma
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
100,000
1000,000
10000,000
PA BPA IAB EPA BT EV EP MO EH BS EisoV ET EU EC EM
10-6 mol /min * g Protein
Abb. 79: Maximalgeschwindigkeit Vmax der enzymatischen Hydrolyse von Carbonsäureestern in
Humanplasma
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
100,000
1000,000
PA IAB BPA EV EP EisoV EPA EH MO EC BT EU BS ET EM
10-3 l /min * g Protein
Abb. 80: Vmax /Km für die enzymatische Hydrolyse von Carbonsäureestern in Humanplasma
106 6 Diskussion
Die zugehörigen Einzelwerte in Tab. 19 zeigen die sich in Bezug auf Km überschneidenden
Vertrauensintervalle. Die Affinität des Hydrolysesystems Humanplasma gegenüber den
untersuchte Carbonsäureestern, einschließlich Phenylacetat, ist demnach ähnlich. Dennoch
wurden enorme Unterschiede in der spezifischen Hydrolysierbarkeit, Halbwertzeit sowie Vmax
ermittelt. Die Michaelis-Menten-Konstante ist daher nur bedingt geeignet, die ermittelten
Unterschiede der Hydrolysierbarkeit in Humanplasma zu beschreiben.
Tab. 19: Kinetische Parameter nach Michaelis-Menten von Carbonsäureestern bei der
enzymatischen Hydrolyse in Humanplasma
Substanz S0 [mmol /L]l Km [mol /L] Vmax [mol /min * g Protein] Vmax / Km [min * g Protein /L]
Ethylpropionat 0,25 – 2,50 8,79⋅10-4 ± 1,84⋅10-4 3,37⋅10-7 ± 0,34⋅10-7 3,84⋅10-4
Ethylvalerat 0,25 – 2,50 4,44⋅10-4 ± 1,33⋅10-4 5,19⋅10-7 ± 0,48⋅10-7 1,17⋅10-3
Ethylisovalerat 0,25 – 2,50 2,00⋅10-4 ± 0,71⋅10-4 7,32⋅10-8 ± 0,93⋅10-8 3,65⋅10-4
Ethylheptanoat 0,25 – 2,50 1,07⋅10-3 ± 0,19⋅10-3 1,82⋅10-7 ± 0,11⋅10-7 1,71⋅10-4
Ethylundecanoat 0,25 – 2,50 5,20⋅10-4 ± 3,18⋅10-4 3,13⋅10-8 ± 1,11⋅10-8 6,01⋅10-5
Ethylmyristat 0,25 – 2,50 2,48⋅10-3 ± 0,83⋅10-3 6,98⋅10-9 ± 2,69⋅10-9 2,81⋅10-6
Ethyltiglat 0,25 – 2,50 7,84⋅10-4 ± 1,58⋅10-4 3,23⋅10-8 ± 0,30⋅10-8 4,12⋅10-5
Ethylphenylacetat 0,25 – 2,50 5,95⋅10-3 ± 0,83⋅10-3 1,55⋅10-6 ± 0,21⋅10-6 2,60⋅10-4
Benzyltiglat) 0,25 – 2,50 9,19⋅10-3 ± 3,54⋅10-3 6,64⋅10-7 ± 2,32⋅10-7 7,23⋅10-5
Benzylphenylacetat 0,25 – 2,50 1,00⋅10-3 ± 0,27⋅10-3 7,07⋅10-6 ± 0,59⋅10-6 7,09⋅10-3
Benzylsalicylat 0,25 – 2,50 2,17⋅10-3 ± 0,63⋅10-3 1,26⋅10-7 ± 0,34⋅10-7 5,82⋅10-5
Ethylcinnamat 0,25 – 2,50 1,04⋅10-4 ± 0,45⋅10-4 1,04⋅10-8 ± 0,07⋅10-8 1,00⋅10-4
Methyloctanoat 0,25 – 2,50 3,05⋅10-3 ± 0,54⋅10-3 3,13⋅10-7 ± 0,44⋅10-7 1,03⋅10-4
Isoamylbutyrat 0,25 – 2,50 8,28⋅10-4 ± 2,30⋅10-4 6,96⋅10-6 ± 0,84⋅10-6 8,40⋅10-3
Phenylacetat 0,25 – 4,00 2,83⋅10-3 ± 0,78⋅10-3 1,66⋅10-3 ± 0,35⋅10-3 5,86⋅10-1
Um einen Überblick über die chemische Struktur und daraus resultierende hydrolytische
Eigenschaften zu gewinnen, wurden die untersuchten Ester wurden in drei Kategorien
eingeteilt. Die Einteilung erfolgt in Anlehnung an die von Longland et al. (1977) und
Grundschober (1977) aus in vitro Experimenten postulierten Kategorien in Abhängigkeit von der
Halbwertzeit. Zum Vergleich wurde die Halbwertzeit bei S0 = 0,25 mM ausgewählt, da diese
geringe Konzentration am ehesten der durch orale Aufnahme im Körper maximal erzielten
Konzentration entspricht. Zusätzlich wurde der unabhängige Parameter Vmax/Km unter folgenden
Konventionen berücksichtigt:
• schnelle Hydrolysierbarkeit: t1/2 < 10 min,
V
max/Km > 1
⋅
10-3 min
⋅
g Protein /L
• mäßige Hydrolysierbarkeit: 10 min ≤ t1/2 ≤ 45 min,
1
⋅
10-3 ≤ Vmax/Km ≤ 2
⋅
10-4 min
⋅
g Protein /L
• langsame Hydrolysierbarkeit: t1/2 > 45 min;
V
max/Km < 2
⋅
10-4 min
⋅
g Protein /L.
Die entsprechende Zusammenfassung zeigt Abb. 81:
6.4 Hydrolyse in Humanplasma 107
schnelle Hydrolysierbarkeit: t1/2 < 10 min und Vmax/Km > 1
⋅
10-3 min⋅g Protein /L
Ethylvalerat
Isoamylbutyrat
Phenylacetat und Benzylphenylacetat
O
O
mäßige Hydrolysierbarkeit: 10 min ≤ t1/2 ≤ 45 min / 1
⋅
10-3 ≤ Vmax/Km ≤ 2⋅10-4 min⋅g Protein /L
Ethylpropionat und Ethylheptanoat
Ethylisovalerat
Ethylphenylacetat
langsame Hydrolysierbarkeit: t1/2 > 45 min und Vmax/Km < 2
⋅
10-4 min⋅g Protein /L
Ethylundecanoat und Ethylmyristat
Ethyltiglat
Benzyltiglat, Ethylcinnamat und
Benzylsalicylat
O
OOH
Abb. 81: Hydrolysierbarkeit der untersuchten Carbonsäureester anhand der Halbwertzeit in
Humanplasma
108 6 Diskussion
Die Kategorie „schnell hydrolysierbar“ ist ohne die Festlegung der angegebenen Grenzen
unspezifisch (Child et al., 1971, Ghittori et al., 1984). Die Studie von Longland et al. (1977)
zeigt, dass die Esteraseaktivität in unterschiedlichen Geweben nicht zu einer konsistenten
Einteilung führen kann. Ethylpelargonat wurde mit der Halbwertzeit 5,92 min in künstlicher
Pankreasflüssigkeit als schnell hydrolysierbar eingestuft. Die korrespondierende
Hydrolyseaktivität von 7,14 µM /min ist dagegen nur gering. Die Interpretation der Ergebnisse
kann demzufolge nur einer Gesamtheit erfolgen. Als Ursache für die von Longland et al. (1977)
publizierten widersprüchlichen Ergebnisse werden verschiedene Substratanfangskonzentration
im Hydrolyseansatzes angenommen.
Für Phenylacetat und Ethylphenylacetat konnte gezeigt werden, dass aromatische Ringe ohne
Verzweigungen weder im Acyl- noch im Alkylrest einen hemmenden Einfluss auf die Hydrolyse-
geschwindigkeit ausüben. Phenylacetat und Ethylphenylacetat wurden in Humanplasma schnell
hydrolysiert, denn neben den im Plasma befindlichen Carboxylesterasen (EC-Nr. 3.1.1.1)
hydrolysieren zusätzlich Arylesterase (EC-Nr. 3.1.1.7) diese Ester.
Befinden sich trans-Doppelbindungen im Molekülverband, verlangsamt sich die
Hydrolysegeschwindigkeit drastisch. Für Ethyltiglat (trans-2,3-Dimethylacrylsäureethylester)
konnte gezeigt werden, dass sich die Halbwertzeit im Vergleich zu Substanzen ohne derartige
Strukturelemente wie Ethylvalerat (3-Methylbutansäureethylester) mindestens verdoppelt.
Unverzeigte Acylketten mit mehr als sieben Kohlenstoffatomen sind Indikatoren für eine
langsame Hydrolyse. Ab Ethylheptanoat wurde mit Ethylundecanoat und Ethylmyristat ein steter
Abfall der spezifischen Hydrolyseaktivität gemessen. Ester mit stark hydrophoben
Eigenschaften sind nur bedingt oder minimal im Wässrigen löslich (Tab. 10). Im
Zusammenhang mit einer geringen Hydrolysierbarkeit in Verbindung ergibt sich eine längere
Verweildauer im Körper. Diese kann aus der Eliminationhalbwertzeit abgeschätzt werden.
Es ist davon auszugehen, dass die Elimination einer Substanz nach 4 bis 5 Halbwertzeiten
weitestgehend abgeschlossen ist (Forth & Henschler, 1992). Daraus resultiert insbesondere für
die Ester Ethylheptanoat, -undecanaot und –myristat, Ethylsalicylat und –cinnamat sowie Ethyl-
und Benzyltiglat eine längere Verweildauer im Körper, die mehrere Stunden betragen kann.
Fettsäureethylester mit langkettigen Acylresten zirkulieren im Blutkreislauf und sind dabei an
Phospholipide (LDL), Triglyceride, Cholesterinester und in geringem Maße an Albumin
gebunden (Doyle et al., 1994; Laposata et al., 1995; Szczepiorkowski eta l., 1995; Teruya et al.,
1995). Die Ester werden im Fettgewebe gespeichert und daraus sukzessive freigesetzt. Dabei
wurden Halbwertzeiten von 16 ± 1,6 Stunden gemessen (Laposata et al., 1989).
Benzylsalicylat besitzt neben aromatischen Ringen im Acyl- und Alkylrest eine Hydroxygruppe
in der Nähe der Carbonylgruppe. Die dadurch hervorgerufene Polarität der funktionellen Gruppe
setzt die Hydrolysierbarkeit durch Lipasen deutlich herab. Dieser Einfluss wurde wiederum
verstärkt in benachbarten Regionen der Carbonylfunktion beobachtet. Das zusätzliche
Sauerstoffatom erhöht die Elektophilie der Carbonylgruppe, die Polarität des Moleküls wird
verstärkt, dadurch die Hydratation begünstigt und die Substratbindungswahrscheinlichkeit am
hydrophoben reaktiven Zentrum herabgesetzt.
Carbonsäureester mit kurzen aliphatischen Ketten (Kohlenstoffketten mit weniger als sieben C-
Atomen) mit und ohne Verzweigungen wurden schnell hydrolysiert. Das Optimum der
spezifischen Hydrolyseaktivität lag bei der Acylkettenlänge von fünf Kohlenstoffatomen
6.4 Hydrolyse in Humanplasma 109
(Ethylvalerat). In Humanplasma wurde Ethylvalerat neben der Referenzsubstanz Phenylacetat
am schnellsten umgesetzt.
Der Einfluss von Verzweigungen im Molekül wird bestimmt durch deren Abstand zur
Carbonylgruppe. Die Verzweigung im Alkylrest von Isoamylbutyrat ist weiter von der
Carbonylgruppe entfernt als die Isovalerat-Funktion des langsamer hydrolysierten
Ethylisovalerats. Darüber hinaus befindet sich die verzweigte Acylfunktion auf der
carbonylfunktion-abgewandten Seite und hat damit einen geringeren Einfluss auf den Angriff
des reaktiven Enzymzentrums.
6.4.5 Struktur-Wirkungsbeziehungen
Die esterasekatalysierte Hydrolyse in Humanplasma wird bei der Bildung des tetrahedralen
Intermediats des Übergangszustandes von sterischen Effekten beeinflusst. Für die Struktur-
merkmale der untersuchten Carbonsäureester lassen sich zusammenfassend allgemein gültige
Einflussgrößen auf die Geschwindigkeit der Umsetzung in Humanplasma ableiten:
• Kettenlänge:
Die Verlängerung des Acylrestes um ein oder zwei Methylengruppen führte zu einem
signifikanten Abfall der Hydrolysegeschwindigkeit. Dieser Trend setzte sich mit
zunehmender Kettenlänge nicht fort. Ab einer Acylkettenlänge von mehr als sieben
Kohlenstoffatomen wurde die enzymatische Umsatzrate primär von der steigenden
Hydrophobizität und damit verringerten Substratverfügbarkeit am reaktiven Zentrum
behindert. Eine maximale Hydrolysierbarkeit von Ethylestern wurde bei einer
Acylkettenlänge von fünf Kohlenstoffatomen ermittelt.
Die Kettenlänge des Alkylrestes beeinflusst die Michaelis-Menten-Konstante.
Carbonsäureester mit kurzkettigen Alkylresten (Cn < 6) besaßen im Vergleich zu
längerkettigen einen höheren Km-Wert. Eine Veränderung der Kettenlänge mit
kurzkettigem Alkylrest bewirkte eine signifikante Änderung der Initialgeschwindigkeit, da
der geschwindigkeitsbestimmende Schritt des SN2-Mechanismus, Bildung und Zerfall
des tetrahedralen Intermediats, besonders durch dessen Struktur beeinflusst wird.
Die Kettenlänge des Acylrestes beeinflusst die Maximalgeschwindigkeit.
Nach einem mit zunehmender Acylkettenlänge verzeichneten Anstieg wurden die
Maximalwerte für Vmax bei Acylkettenlängen von C4 (Methylbutyrat, aus Arndt & Krisch
1973) und C5 (Ethylvalerat) ermittelt. Die weitere Verlängerung der Acylkettenlänge ging
mit einem Abfall von Vmax einher.
• Verzweigungen wie iso-, sec- oder tert-Funktionen:
Die Verzeigungen bei kurzkettigen Acylresten (Anzahl der Kohlenstoffatome < 6) bewirk-
ten keine signifikante Veränderung der Hydrophobizität. Sie wirkten sich besonders
sterisch hemmend auf die Hydrolysierbarkeit aus, wenn diese sich in der Nähe des sp2-
hybridisierten Carbonylsauerstoffatoms befanden.
110 6 Diskussion
Dieser Effekt wurde vornehmlich bei voluminösen Substituenten in α–Position
beobachtet, die durch die Abschirmung des reaktiven Zentrums eine Verringerung der
Geschwindigkeitskonstante hervorrufen. Die intermolekulare Beweglichkeit der
reagierenden funktionellen Gruppen ist herabgesetzt und führt zu Spannungen bei der
Bildung des Übergangszustandes. Die Einführung von Verzweigungen in Estermoleküle
wird als Indikator für eine erhöhte Toxizität beschrieben.
• aromatische Ringe:
Die Einführung eines aromatischen Rings in Estermoleküle mit kurzkettigen
Substitutenten ohne Verzweigungen im Molekül beeinträchtigte die Hydrolysierbarkeit
nicht. Arylester wurden rasch durch im Plasma befindliche Arylesterase umgesetzt und
daher im Vergleich zu Estern mit kurzen Acyl- und Alkylresten vergleichsweise schnell
abgebaut. Dieser Effekt überwog deutlich die hervorgerufene Steigerung der
Hydrophobizität durch aromatische Substituenten gegenüber kurzkettig verzweigten
oder kurzkettig unverzweigten Substituenten.
• aromatische Ringe mit polaren Gruppen wie 2-Hydroxy-Gruppen:
Polare Gruppen setzten die Carbonylaktivität der funktionellen Gruppe herab. Die
erhöhte Polarität der Carbonylgruppe begünstigte eine verstärkte Ausbildung einer
Solvathülle, wodurch der Substratangriff allgemein erschwert wird. Auch dieser Einfluss
war besonders stark ausgeprägt in der Nähe des sp2-hybridisierten Carbonylsauerstoff-
atoms. Weiterhin setzten Sauerstoffatome im Substratmolekül durch Erhöhung der
Polarität des Substrates die Hydrolyseaktivität von Lipasen herab.
• trans-Doppelbindungen:
trans-2- oder trans-3-Doppelbindungen im Acylrest des Esters verringerten die
Hydrolyserate des Substrats signifikant. Sie bewirkten eine voluminösere Ausdehnung
des Molekülrests und verringerten dadurch die Bindungsbereitschaft bei der Bildung des
Übergangszustandes. Zusätzlich wurde eine erhöhte Hydrophobizität hervorgerufen.
Diese verringerte die im Wässrigen gelöste Substratkonzentration.
• identische Summenformel und unterschiedliche chemische Struktur:
Die untersuchten Ester unterschieden sich in ihrer Hydrophobizität nicht. Die
unterschiedlichen polaren Eigenschaften von Acyl- und Alkylrest hoben sich gegenseitig
auf. Die Verzweigung bei Isoamylbutyrat befand sich in C3-Position des Alkylrestes und
damit an der carbonylfunktion-abgewandten Seite. Eine Verringerung der
Hydrolysierbarkeit wurde daher nicht festgestellt. Der gleichzeitig kurzkettige und
unverzweigte Acylrest (C4) rief eine gegenüber den Vergleichssubstanzen (C7 und C8)
erhöhte Abbaurate hervor.
6.4 Hydrolyse in Humanplasma 111
6.4.6 Bewertung der Hydrolyseergebnisse
Zunächst ist nach der oralen Aufnahme der Ester in den Organismus im Magen mit einer
langsamen Hydrolyse zu rechnen. Eine teilweise Resorption der unveränderten Ester im
Magen-Darm-Trakt kann somit nicht ausgeschlossen werden. Nach dem Durchtritt der
unhydrolysierten Ester durch die Magenschleimhaut gelangen diese ins Blut. Die aus Abb. 81
abgeleiteten Aussagen in Bezug auf Struktur und Hydrolyseeigenschaften ergeben ein
uneinheitliches Bild. In jeder Gruppe befinden sich Substanzen mit und/oder ohne
Verzweigungen, aromatischen Ringen sowie Doppelbindungen im Acyl- oder Alkylrest. Die
unterschiedlichen strukturellen Eigenschaften zeigen, dass grundsätzlich eine schnelle
Hydrolyse von Carbonsäureestern in Blutplasma des Menschen nicht unterstellt werden kann.
Mit der Möglichkeit einer langsamen Hydrolyse muss gerechnet werden, wenn Substanzen mit
voluminösen Substituenten in der Nähe des sp2-hybridisierten Carbonylsauerstoffatoms (α–
Position) auftreten. Dazu zählen insbesondere Acylkettenlängen > 4 Kohlenstoffatome, iso-,
sec- oder tert-Funktionen, aromatische Ringe mit polaren Gruppen wie 2-Hydroxy-Gruppen und
trans-Doppelbindungen.
Ratte und Mensch zeigen in der Aktivität der fremdstoffmetabolisierenden Enzyme qualitative
und quantitative Unterschiede. Daraus resultieren verschiedene Konzentrationen am Zielorgan
und Unterschiede in der Empfindlichkeit bei gleicher Dosis. So wurde eine schnelle Hydrolyse
von Tiglatestern in Rattenplasma nachgewiesen. Dagegen erfolgte die Hydrolyse in
Humanplasma langsam. Die Extrapolation von Ergebnissen von der Ratte auf den Menschen in
Bezug auf Blutplasma ist insoweit möglich, als dass aufgrund der verschiedenen Enzymkons-
titution bei der Ratte grundsätzlich mit einer schnelleren Hydrolyse von Carbonsäureestern zu
rechnen ist. Die am schnellsten ablaufende Hydrolyse in Rattenleberhomogenat lässt den
Schluss zu, dass auch beim Menschen unhydrolysierter Ester über die Blutbahn in die Leber
gelangt und dort rasch abgebaut wird. Somit kann die toxikologische Bewertung der
Substanzklasse Carbonsäureester auch anhand ihrer Hydrolyseprodukte vorgenommen
werden. Voraussetzung dafür ist, dass die gebildeten Alkohole und Carbonsäuren toxikologisch
unproblematisch sind.
Für die allgemeine Bewertung muss berücksichtigt werden, dass es sich um Ergebnisse aus in
vitro Experimenten handelt. Die verlässliche Extrapolation auf in vivo Bedingungen ist
schwierig, da sich komplexe Einflussgrößen nur schwer quantitativ verallgemeinern lassen.
Gallaher & Loomis (1975) zeigten mit Rattenvollblut eine um den Faktor 7 - 13 erhöhte
Umsatzrate unter in vivo Bedingungen im Vergleich zum in vitro Experiment. Hungund et al.
(1995) konnten eine um 25 % erhöhte in vivo – Hydrolysegeschwindigkeit von Ethyllineoat in
Rattenplasma nachweisen. Diverse Studien wiesen dagegen auf einen gegenteiligen Effekt hin,
wonach Enzyme unter physiologischen Bedingungen nur mit einem Bruchteil ihrer
Maximalgeschwindigkeit arbeiten (Gallaher, 1975: Faktor 10; Hungund, 1995: Faktor 2,7;
Saghir et al., 1999: Faktor 3,8). Daher wurden für unsere Studie optimierte Bedingungen
gewählt, die eine möglichst enge Annäherung an die maximale Reaktionsgeschwindigkeit
erlauben. Dennoch ist davon auszugehen, dass enzymkatalysierte Reaktionen unter
vergleichbaren Bedingungen in vivo um ein Vielfaches schneller ablaufen.
112 6 Diskussion
6.5 Fehlerbetrachtung
Die Fehlerbetrachtung beinhaltet die Abschätzung der Fehler einzelner Messmethoden. Es
erfolgt die quantitative Abschätzung der Einflussfaktoren auf die Messergebnisse der
Hydrolyseexperimente.
• Natürliche Schwankung des biologischen Materials
Die Konstitution des biologischen Materials wird als Hauptursache für die Schwankung der
pharmakokinetischen Parameter aus Anhang IV angesehen. Die relative Wiederholpräzision
(4fach wiederholtes Durchführen eines Hydrolyseexperiments) betrug ca. 10 %.
• Temperatur
Enzymkatalysierte Reaktionen sind empfindlich gegenüber Temperaturänderungen. Im
Temperaturbereich von 25 bis 37 °C wird bei einer Temperaturänderung um 1 K eine Aktivitäts-
änderung um bis zu 10 % erwartet. Der Temperaturkoeffizient der Reaktionsgeschwindigkeit
beträgt 10 % je Grad, das heißt: bei einer um 10°C erhöhten Reaktionstemperatur misst man
die Aktivität um 100 % zu hoch (Arrhenius-Gleichung). Die Messunsicherheit des Thermostaten
des verwendeten Schüttelwasserbades wurde mit ± 0,2 °C angegeben.
• pH-Wert
Enzyme besitzen einen engen optimalen pH-Wert-Bereich (Drauz & Waldmann, 1995). Die
Gerätetoleranz des pH-Meters betrug ± 0,05 pH-Einheiten.
• Substratanfangskonzentration
Essentiell für eine reproduzierbare Initialgeschwindigkeit der enzymatischen Hydrolyse ist die
verlässliche Substratdotierung. Das Substrat wurde in 1,4-Dioxan gelöst und mittels Mikroliter-
spritze dotiert. Die Spritze besaß ein Gesamtvolumen von 10 µL und eine Skalierung von 0,1 µl.
Der absolute Fehler wurde mit 0,05 µL geschätzt. Der daraus resultierende Fehler für S0 beträgt
bei der Substratstammlösung mit höchster Konzentration (3,00 mol/L) maximal 0,15 µmol.
Damit lässt sich bei einem Hydrolysevolumen von 3,00 ml eine maximale Schwankung für S0
von ± 0,05 mM ableiten.
• Reproduzierbarkeit der angewendeten Prüfmittel
Die Gerätetoleranzen betragen für:
Kolbenhubpipetten:
± 1 Vol% (relativer Fehler)
Analysenwaage: ± 0,00001 g
Laborwaage: ± 0,1 g
• Fehler erster Art
Der Fehler erster Art ist ein Ausdruck der Genauigkeit der ermittelten Hydrolyseparameter.
Dazu wurden Standardabweichungen ermittelt und die Ergebnisse in Form eines
Vertrauensintervalls für n = 4 angegeben. Die berechneten Vertrauensintervalle sind in der
Zusammenstellung aller Messwerte in Anhang II und IV angegeben als Mittelwert ±
Standardabeichung.
6.5 Fehlerbetrachtung 113
• Fehler zweiter Art
Bei der Berechnung von Michaelis-Menten-Parametern aus der grafischen Darstellung nach
Lineweaver-Burk besitzen nicht alle Messpunkte das gleiche Gewicht und können sich
hinsichtlich ihrer Präzision unterscheiden. Diese Diskrepanz resultiert aus der Verzerrung der
Messwertverteilung nach der reziproken Umformung. Insbesondere Initialgeschwindigkeiten,
die bei geringer Substratkonzentration (S0 = 0,25 mM) ermittelt wurden, unterliegen diesem
Einfluss. Weicht ein Messpunkt signifikant von der Regressionsgeraden ab, so wurde dieser,
nach Festlegung entsprechender Ausschlusskriterien, bei der Auswertung nicht berücksichtigt.
• Messunsicherheit der gaschromatographischen Analyse mit internem Standard
Der relative Fehler der Systempräzision (6fach Injizieren derselben Probe) betrug der relative
Fehler bezogen auf die berechnete Konzentration maximal 0,5 %. Die Wiederfindungsraten der
einzelnen Analyten wurden im Bereich 90,8 – 113,5 % berechnet (Tab. 33). Eine
Ergebniskorrektur unter Berücksichtigung der Wiederfindung wurde daher nicht durchgeführt.
Der relative Fehler der Analyse wurde mit 5 % abgeschätzt.
115
7 Ausblick
Die Ergebnisse unserer Hydrolyseuntersuchungen haben gezeigt, dass in Humanplasma ein
sehr heterogenes Hydrolyseverhalten gegenüber Carbonsäureestern vorherrscht. Insgesamt
ergaben sich uneinheitliche Ergebnisse in Bezug auf Struktur und Hydrolyseeigenschaften, da
sich in jeder Hydrolyseklasse Moleküle mit Verzweigungen und /oder aromatischen Ringen im
Molekül befanden. Zusätzlich wurde die Ableitung verallgemeinerbarer Aussagen durch
individuelle und multiple Einflüsse der biologischen Medien erschwert, was insbesondere durch
hohe Schwankungsbreiten der Messergebnisse zum Ausdruck kam.
Als Folge der zunehmenden Bedeutung von Hydrolysestudien für die toxikologische Bewertung
ähnlicher Substanzklassen erscheint es daher sinnvoll, eine Ableitung von Aussagen mit Hilfe
von mathematischen Modellen vorzunehmen. Eine Fragestellung wäre daher, inwieweit sich
aus Substituentenkonstanten nach Hammett oder Taft Hydrolyseparameter aus reaktions-
kinetischer Sicht theoretisch, ohne den Einfluss einer analytischen Messunsicherheit, ableiten
lassen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente können dabei als Grundlage für
weitergehende mathematische Beschreibungen dienen.
Zukünftig sollte das Ziel verfolgt werden, aus der Molekülstruktur verschiedene mathematische
Modelle für Struktur-Wirkungsbeziehungen abzuleiten. Mit einer solchen Herangehensweise
könnte man ohne die Verwendung von biologischem Material auskommen; ein Ziel, welches
aus ethischen Gesichtspunkten (Vermeidung von Tierversuchen) heraus verfolgt werden sollte.
Hierdurch sollte es möglich sein, ohne den Verbrauch von biologischem Material, schnell zu
Aussagen über die Hydrolysierbarkeit zu gelangen.
Bei oraler Aufnahme von Estern ist mit einer Resorption von unhydrolysiertem Ester aufgrund
der langsamen Hydrolysierbarkeit vor allem im Magen zu rechnen. Aus toxikologischer Sicht ist
die Untersuchung der Resorption von sehr langsam hydrolysierbaren Estern wie Ethyl- und
Benzyltiglat, Ethylundecanoat und -myristat oder Ethylsalicylat und -cinnamat von besonderer
Bedeutung. Hydrolyseuntersuchungen sollten mit Leberhomogenat vorgenommen werden, da
die Leber den größten Beitrag zum Metabolismus leistet.
Eine Differenzierung der Affinität einzelner Hydrolasen ist in unserer Studie nicht erfolgt, da die
spezifische Interpretation der Enzym-Substrat-Affinität das Isolieren und Aufreinigen der
charakteristischen Hydrolasen voraussetzt.
Mensch und Ratte unterscheiden sich in ihrer Esterasekonstitution grundlegend. Daraus ergibt
sich die Fragestellung, inwieweit sich Ergebnisse auf weitere Spezies oder Hydrolysemedien
übertragen lassen. Die Erweiterung des Untersuchungsspektrums auf in vivo Studien erscheint
grundsätzlich sinnvoll, da nur dadurch die Vorgänge des komplexen biologischen
Stoffwechselsystems, insbesondere auch Eliminationsvorgänge erfasst werden. Auf diesem
Wege könnte die Extrapolation von in vitro auf in vivo Ergebnisse modelliert werden. In diesem
Zusammenhang sollte der Einfluss des Acylrests auf die Hydrolysegeschwindigkeit in Bezug auf
die Fettsäureethylester-Synthaseaktivität in Geweben und Blutplasma diskutiert werden.
117
8 Experimenteller Teil
8.1 Allgemeines
Der experimentelle Teil der Studie basiert auf Arbeits- und Prüfvorschriften, die im Rahmen der
Akkreditierung des Laborbereiches nach DIN EN 17025 erstellt wurden.
8.2 Geräte
8.2.1 Tierhaltung
Für die in vitro Versuche wurde Blutplasma von männlichen Ratten vom Stamm Wistar/Hann
verwendet, deren Aufzucht in der Zentralen Versuchstieranlage des BfR erfolgte. Die
Einstallung am Ort der Plasmagewinnung begann 5 bis 10 Tage vor Versuchsbeginn. Die Tiere
hatten zum Zeitpunkt der Einstallung ein Körpergewicht von 120 – 250 g. Die Ratten wurden in
einem vollklimatisierten Tierstall, in Makrolonkäfigen des Typs III auf Weichholzgranulat
(Altromin), bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50-60 %, einer Raumtemperatur von 20-22°C
sowie einem 12 Stunden hell – 12 Stunden dunkel Zyklus gehalten. Die Einstreu wurde zweimal
wöchentlich gewechselt. Als Futter diente pelletiertes Standardfutter (Standarddiät Ratten und
Mäuse, Altromin). Leitungswasser stand ad libitum zur Verfügung. Durch tägliches Wiegen und
„Handling“ der Ratten wurden die Tiere an die neue Umgebung gewöhnt. Angaben über
Körpergewicht und Verhaltensauffälligkeiten wurden protokollarisch erfasst.
8.2.2 Narkose
Es wurde ein von Goll 1992 entwickeltes, offenes Inhalationssystem mit Tischabzug verwendet,
bei dem die Expirationsluft vom narkotisierten Tier an die Raumluft abgegeben wird. Es besteht
aus:
• der Druckgasflasche mit dem Trägergas Carbogen® GA 219,
• dem Flaschendruckminderer (Pluto Drägerwerk Lübeck), dessen Durchflussregulierventil
den Carbogen-Fluss zum Narkosemittelverdampfer steuert,
• dem Narkosemittelverdampfer (Enfluran Vapor 19.3, Drägerwerk AG Lübeck), der eine
Anreicherung mit dem Narkosemittel Ethrane im Trägergas von bis zu 5 Volumenprozent
ermöglicht,
• einer Plexiglasröhre (Innendurchmesser 35 mm, Länge 53 mm), die durch einen Schlauch
mit dem Verdampfer verbunden ist, wodurch das mit Ethrane angereicherte Carbogen
zum Kopf des Versuchstieres strömt,
• einem Tischabzug, der über einen flexiblen Kunststoffschlauch mit dem Raumabzug
verbunden werden kann, um den Narkosemitteleintrag in den Laborraum weitestgehend zu
unterbinden.
118 8 Experimenteller Teil
8.2.3 Gaschromatographie
Es standen zwei GC-Anlagen mit folgenden Konfigurationen zur Verfügung:
• Gaschromatograph HP 5890A Series, Flammenionisationsdetektor, gesteuert mit der HP
Chemstation Software Rev. A. 05.01
• Gaschromatograph HP 6890 Series, Flammenionisationsdetektor, gesteuert mit der HP
Chemstation Software Rev. A. 05.01
Als Trennsäule wurden folgende Kapillarsäulen verwendet:
• MN permabond SE-52-DF-0.25 (Macherey & Nagel, 25 m, ID 0,32 mm, Fth 0,25 µm – eine
50 m – Säule wurde geteilt; 5 % Diphenyl- 95 % Dimethylpolysiloxan), gekoppelt mit einer
Vorsäule der Fa. Restek, (5 m, ID 0,32 mm) Intermediate Polarity, Deactivated, Cat.# 10044
• MN permabond FFAP-0,25 (Macherey & Nagel, 30 m, ID 0,32 mm, Fth 0,25 µm), FFAP
(Free Fatty Acid Phase) = Polyethoxylierte (Di)-Carbonsäuren (stark polar) (Polyethyl-
englycol-2-Nitroterephthalsäureester) Säurekomponenten: Fumarsäure, Bernsteinsäure,
Terephthalsäure
8.2.4 Geräte zur Probenvorbereitung und Analyse
• Für die Zentrifugation wurde eine Heraeus Megafuge 1.0 (Vertrieb Heraeus Sepatech
GmbH, Osterode, Deutschland) mit max. 6000 U/min (max. RZB-Wert 6240g) verwendet.
• Das thermische Inaktivieren des Humanplasmas erfolgte im Wasserbad auf einem
Heizmagnetrührer IKAMAG Typ Ret mit fuzzy mit einem digital zwischen –10 und 400°C
regulierbaren Stabthermometer IKATRON Typ ETS-D4 (beides IKA Heiztechnik, Staufen,
Deutschland).
• Hydrolyseproben und Proben für die Proteinbestimmung wurden im Schüttelwasserbad
GFL TYP 1092 (10 bis 250 Bewegungen/min; 2°C über Kühlwassertemperatur bis 80°C) der
Firma Gesellschaft für Labortechnik mbH (Großburgwedel, Deutschland) temperiert.
• Zur Messung des pH-Wertes (pH 0 bis 14) wurde das Knick Mikroprozessor-pH-Meter 742
mit pH/Pt Einstabmesskette Typ SE 101 (Knick Elektronische Messgeräte GmbH, Berlin,
Deutschland) eingesetzt.
• Als Reaktionsgefäße dienten verschraubbare Glasvials aus Borosilikat der Marke Pico
Glass Vial - 7 ml (Vertrieb Canberra Packard GmbH, Dreieich, Deutschland).
8.2.5 Spektralphotometrie
Für spektralphotometrische Messungen wurde ein UV/VIS Spektrometer Lambda 2, gesteuert
vom Messprogramm PE Lambda 2 Version 3.7, Messbereich 190 bis 1100 nm (Perkin Elmer
Instruments GmbH, Rodgau-Jügesheim, Deutschland) sowie Einmalküvetten Plastibrand
PMMA 2,5 ml makro (Brand, Cat. No. 759105) verwendet.
8.3 Chemikalien und Materialien 119
8.2.6 Probenarchivierung
Blutplasma wurde bei –84°C im Tiefkühlschrank Typ IVF 8513 V12 der Firma Revco gelagert
(vgl. Abschnitt 8.4.1 und 8.4.2). Die Archivierung der Proben erfolgte bei –21°C im
Tiefkühlschrank des Typs GSN 3336 Premium no frost der Firma Liebherr (Ochsenhausen,
Deutschland).
8.3 Chemikalien und Materialien
Tab. 20: Chemikalien
Substanz CAS-Nummer Spezifikation Vertrieb
Benzylalkohol 100-51-6 99,5+ %, Merck
Benzylphenylacetat 102-16-9 98+ %, Sigma Aldrich
Benzylsalicylat 118-58-1 98+ %, Sigma Aldrich
Benzyltiglat 37526-88-8 98+ %, Sigma Aldrich
Buttersäure 107-92-6 > 99 % Merck
Decansäure 334-48-5 > 98 % Merck
1,4-Dioxan 123-91-1 mind. 99,8 % Merck
n-Dodecan 203-967-9 > 99 % Sigma Aldrich
Essigsäure 64-19-7 100 % Merck
Ethylacetat 141-78-6 > 99,8 % Merck
Ethylcinnamat 103-36-6 > 98 %, Merck
Ethylheptanoat 106-30-9 98+ %, Sigma Aldrich
Ethylisovalerat 108-64-5 > 98 %, Merck
Ethylmyristat 124-06-1 > 98 %, Merck
Ethylphenylacetat 101-97-3 > 98 %, Merck
Ethylpropionat 105-37-3 99 % Sigma Aldrich
Ethylsalicylat 118-61-6 > 98 %, Sigma Aldrich
Ethyltiglat 5837-78-5 98+ %, Sigma Aldrich
Ethylundecanoat 627-90-7 97+ % Sigma Aldrich
Ethylvalerat 539-82-2 > 98 % Merck
Heparin Ammonium Salz 60800-63-7 25000 U Sigma Aldrich
Heptansäure (Önanthsäure) 111-14-8 > 99 % Merck
n-Hexadecan 544-76-3 > 99 % Sigma Aldrich
n-Hexan 110-54-3 p.A. Merck
Hexansäure (Capronsäure) 142-62-1 > 98 % Merck
Isoamylbutyrat 106-27-4 > 98 % Merck
Isovaleriansäure
(3-Methylbutansäure)
503-74-2 > 99 % Merck
Kaliumchlorid 7447-40-7 p. A. Merck
Kaliumdihydrogenphosphat 7778-77-0 p. A. Merck
Kaliumnatriumtartrat-Tetrahydrat 6381-59-5 p. A. Merck
Kupfersulfat-Pentahydrat 7778-80-5 p. A. Merck
Laurinsäure 143-07-7 > 99 % Merck
Magnesiumsulfat-Heptahydrat 7487-88-9 > 98 % Merck
4-Methylanisol 104-93-8 > 99 % Merck
Methyloctanoat 111-11-5 mind. 99,5 % Merck
Natriumcarbonat, wasserfrei 497-19-8 p.A. Merck
Natriumchlorid 7647-14-5 p.A. Merck
Natriumdihydrogenphosphat * 2 H2O 13472-35-0 p.A. Merck
Natriumhydrogencarbonat 144-55-8 mind. 99,5 % Merck
di-Natriumhydrogenphosphat * 2 H2O 10028-24-7 p.A. Merck
Natriumsulfat 7757-82-6 p.A. Merck
Octansäure (Caprylsäure) 124-07-2 > 99 % Merck
Pepsin (EC 3.4.23.1) 9001-75-6 1:10.000 Sigma Aldrich
120 8 Experimenteller Teil
Fortsetzung Tab. 20
Substanz CAS-Nummer Spezifikation Vertrieb
Phenylacetat 122-79-2 > 98 % Merck
3-Phenylacrylsäure (Zimtsäure) 621-82-9 > 99 % Merck
Phenylessigsäure 103-82-2 > 99 % Sigma
Propionsäure 79-09-4 > 99 % Merck
Rinderserumalbumin
(Albumin bovine, RSA)
9048-46-8 Kristallin, Mr ca. 67000 Serva
Salicylsäure 69-72-7 > 99 % Merck
Salzsäure, 65% 7697-37-2 > 65 % Merck
Tiglinsäure
(trans-2,3-Dimethylacrylsäure)
80-59-1 > 98 % Sigma Aldrich
Undecansäure 112-37-8 > 98 % Merck
Valeriansäure (Pentansäure) 109-52-4 > 99 % Merck
Tab. 21: Lösungen
Bezeichnung Herstellung
Folin-Ciocalteus Phenolreagenz Vertrieb: Merck-Darmstadt, Art-Nr. 109001
Heparinammoniumsalz-Lösung 25000 Units Heparinammoniumsalz / 10 ml Wasser5 (2500 U /ml): Die
Lösung wurde unmittelbar vor der Plasmagewinnung angesetzt, Lagerung
bei Raumtemperatur maximal 3 Stunden.
Kaliumnatriumtartratlösung 2,7 g Kaliumnatriumtartrat-Tetrathydrat /100 ml Wasser5
Krebs-Henseleit-Puffer;
pH-Wert 7,40 ± 0,02
Einwaage je Liter Wasser5: Natriumchlorid (6,896 g), Kaliumchlorid
(0,354 g), Magnesiumsulfat-Heptahydrat (0,296 g),
Kaliumdihydrogenphosphat (0,163 g), Natriumhydrogencarbonat (2,100 g),
Lagerung bei 4°C maximal 2 Monate.
Kupfersulfatlösung 1,0 g Kupfersulfat-Pentahydrat /100 ml Wasser5
Künstliche Magenflüssigkeit6 320 mg Pepsin 1:10.000 (EC 3.4.23.1) bzw. 148,2*10+3 U /100 ml 0,07N
Salzsäurelösung (pH 1,50 ± 0,01; 4°C); Pepsinaktivität: 1482 U /ml
Natriumcarbonatlösung 2 % Natriumcarbonat, wasserfrei wurden in 0,1 N Natriumhydroxid-Lösung
gelöst.
Natriumphosphatpuffer,
0,1 M; pH 7,4
Lösung 1: 8,8995 g di-Natriumhydrogenphosphat * 2 H2O; Lösung 2 :
7,8005 g Natriumdihydrogenphosphat * 2 H2O in jeweils 500 ml Wasser5
gelöst.
500 ml Lösung 1 wurden vorgelegt und mit Lösung 2 auf pH 7,40 ± 0,02
eingestellt.
Phenolphthalein-Lösung 0,1%ige Lösung, Sigma-Aldrich Steinheim, Nr. 105-1
Physiologische Kochsalzlösung 0,9%ige Natriumchloridlösung
Reagenz A-Lösung 1 ml Kaliumnatriumtartrat-Lösung sowie 1 ml Kupfersulfat-lösung wurden
mit Natriumcarbonatlösung auf 100 ml aufgefüllt.
Salzsäure-Lösung,
0,07 N
In einem 1 Liter Maßkolben wurden ca. 500 ml destilliertes Wasser
vorgelegt, mit 5,60 ml konzentrierter Salzsäure versetzt, aufgefüllt und auf
pH 1,20 ± 0,01 eingestellt.
Salzsäure-Lösung,
1 N
Titrisol - Ampulle, Vertrieb: Merck-Darmstadt, Art-Nr. 109970
5 Wasser bideionisiert und membranfiltriert
6 Bergmeyer, 1970; Castle, 1993; Cooper, 1995; Deutsche Norm DIN EN 71.3, 1994; Documenta Geigy, 1975; European
Commission, 2002; Longland, 1977; Pschyrembel, 2000; Schäfer & Marquard, 2004
8.4 Prüfvorschriften 121
Tab. 22: Verbrauchsmaterial
Produkt Spezifikation / Vertrieb
Auslaufkanülen Einmalkanülen, Luer-Konus 0,65 /32, Henke Sass Wolf GmbH
Carbogen® GA 219 95 % O2; 5 % CO2, Linde AG, Höllriegelskreuth
Ethrane® Abbott GmbH, Wiesbaden, Wirkstoff Enfluran [2(Chlor)-1,1,2-trifluorethyl-
difluormethylether-Lösung]
Extrelut® Füllmaterial, 1 kg Merck, Darmstadt; Artikelnummer 15 093
Extrelut® NT 3, Glas-Fertigsäulen Merck, Darmstadt; Artikelnummer 15 095
Rattenleberhomogenat
(S9-Präparation)
RCC - Cytotest Cell Research GmbH, Roßdorf, Deutschland
Rundfilter Schleicher & Schuell, D-37582 Dassel 589/1, black ribbon, aschefrei,
∅ 15 mm; Ref.No. 10300030
Vacutainer Zentrifugenröhrchen
Natriumheparinat, 7 ml
Brand Meylan • sterile Gefäße, B.P.37 Frankreich
8.4 Prüfvorschriften
8.4.1 Gewinnung von Rattenplasma
Für einen Plasmapool wurden 3 – 23 männliche Tiere verwendet. Die Blutentnahme wurde von
einer Medizinisch Technischen Assistentin des BfR ausgeführt. Die Tiere wurden einzeln mit
Ethrane in der unter Abschnitt 8.2.2 beschriebenen Apparatur (2 min 5 Vol%, danach 2 min
2,5 Vol% Ethrane im Trägergas Carbogen) narkotisiert. Die Blutentnahme erfolgte durch
Punktion der Herzkammer. Als Antikoagulans wurde eine Heparinammoniumsalzlösung
(2500 U/ml dest. Wasser) verwendet. In Abhängigkeit vom Körpergewicht der Tiere wurden je
Punktion bis zu 4 ml Blut (< 350 g) bzw. bis zu 6 ml (> 350g) entnommen. Um die Soll-
Antikoagulanskonzentration im Blut von 75 U/ml (Peter, 1977) einzustellen, wurden in der
Spritze 30 µl Heparinammoniumsalzlösung/ ml Blut vorgelegt. Das Blut wurde in
Zentrifugenröhrchen überführt, ca. 10 min im Kühlschrank (4 °C) gelagert und im Anschluss
10 min mit 2000 U/min (693g) bei 4 °C zentrifugiert. Das Plasma wurde als Überstand
abpipettiert, danach zu einem Pool vereinigt und portioniert à 6 ml bei -85°C gelagert (vgl.
Abschnitt 8.2.6).
8.4.2 Gewinnung von Humanplasma
• Probanden
Für die Blutspenden stellten sich auf freiwilliger Basis jeweils 10 bis 16 männliche Mitarbeiter
des BfR zur Verfügung. Die Blutentnahme erfolgte durch Mitarbeiter des Betriebsärztlichen
Dienstes des BfR Standort Dahlem.
• Blutentnahme
Die allgemein üblichen Regeln zur Blutentnahme aus Rick (1977) wurden beachtet. Danach
erfolgte die Blutentnahme morgens am nüchternen, liegenden Patienten. Jedem Probanden
wurden ca. 70 ml Blut aus der Ellenbogenvene entnommen. Das venöse Blut wurde in einem
122 8 Experimenteller Teil
10-ml-Natriumheparinat-immobilisiertem Vacutainer®-Zetrifugenröhrchen aufgefangen. Die
Röhrchen wurden in Eiswasser und bei ca. 4°C im Kühlschrank rasch abgekühlt und unter
diesen Bedingungen ca. 10 min gelagert.
• Aufarbeitung
Zur Aufarbeitung erfolgte der rasche Transport unter Eiskühlung in die Laborräume. Dort wurde
das Blut 10 min mit 2000 U /min (693 g) bei 4°C zentrifugiert. Das Plasma wurde als Überstand
abpipettiert, danach zu einem Pool vereinigt, portioniert à 6 ml und tiefgekühlt bei –85°C
gelagert.
8.4.3 Zum Umgang mit Blutplasma
• Mindesthaltbarkeit
Die Aufbewahrungszeit von Plasma wird durch die Lagerbedingungen bestimmt. Sie umfasst
einen Zeitraum, in dem keine wesentlichen Veränderungen in der Plasmazusammensetzung zu
erwarten sind und somit die Aktivität von Enzymen als weitestgehend konstant angesehen
werden kann. Folgende Bedingungen wurden determiniert (Englhardt, 1974):
• Lagerung bei 4 ± 2°C: maximal 24 Stunden
• Lagerung bei –21 ± 2°C: maximal 6 Monate
• Lagerung bei –80 ± 2°C: maximal 12 Monate.
Größere Temperaturschwankungen, die an Kühlgeräten kurzzeitig (< 2 Stunden) auftraten,
beeinflussten die Hydrolyseaktivität von Plasma in einem nicht messbaren Ausmaß und wurden
daher vernachlässigt. Grundsätzlich wurde vor Versuchsbeginn anhand eines Standards (Ester
mit schneller Hydrolysierbarkeit, hier Phenylacetat) die Hydrolyseaktivität überprüft. Plasma,
das die oben genannte Lagerdauer überschritten hat, wurde nicht mehr zur Bestimmung von
Enzymaktivitäten eingesetzt.
• Auftauen
Um das Problem von Denaturierungseffekten zu minimieren, die mit dem Aussalzen von
Proteinen einhergehen, erfolgte das Auftauen entsprechend den Empfehlungen der Biochrom
AG (Biochrom, 2001). Zuerst wurde die entsprechende Plasma-Menge für ca. 10 min bei
Raumtemperatur vorgewärmt, bis sich ein Flüssigkeitsfilm zwischen Gefäß und Eis gebildet
hatte. Danach wurde das Gefäß in einem Schüttelwasserbad bei 37°C 1 min lang inkubiert.
Anschließend wurde das Gefäß per Hand durch langsames Drehen bewegt. Eine mechanische
Beanspruchung des Blutplasmas durch Schütteln wurde vermieden, um Denaturierungseffekte
zu vermeiden. Diese werden durch Schaumbildung angezeigt. Das Plasma wurde unverzüglich
nach dem Schmelzen der letzten Eiskristalle im Kühlschrank bei ca. 4°C oder am Arbeitsplatz
im Eiswasserbad aufbewahrt.
• Verdünnen
Blutplasma wurde mit Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) verdünnt.
8.4 Prüfvorschriften 123
• Hitzeinaktivierung
Basierend auf einer von Lindl 1994 publizierten Methode wurde auf dem Heizmagnetrührer in
einem Becherglas deionisiertes Wasser auf 56 ± 2°C erhitzt. Die Konstanz der Temperatur
wurde durch ein Stabthermometer geregelt. Nach Erreichen der Soll-Temperatur wurde das mit
ca. 6 ml Plasma gefüllte Gefäß über einen Zeitraum von 40 min ± 2 min inkubiert.
• Kontrolle der Vollständigkeit der Inaktivierung
Mit dem hitzeinaktivierten Blutplasma wurden drei Hydrolyseexperimente analog Abschnitt 8.4.4
durchgeführt. Die mittlere spezifische Enzymaktivität wurde mit dem Wert für nicht inaktiviertes
Plasma verglichen (Vertrauensbereiche dürfen sich nicht tangieren).
8.4.4 Allgemeine Durchführung eines Hydrolyseexperimentes
• Vorversuch
Vor der Durchführung des Hauptversuchs wurden folgende Parameter ermittelt:
- Zeitpunkte der Probenahmen (schnellstmöglich, da bei langer Inkubation des Plasmas bei
37°C Denaturierungseffekte auftreten)
- Wiederfindungsrate des Analyten (Tab. 33) sowie
- Proteingehalt des biologischen Materials (Abschnitt Tab. 11 und Tab. 12), wird bei der
Ergebnisangabe von spezifischen Aktivitätsparametern berücksichtigt.
• Hauptversuch
Das Reaktionsgefäß war zu ca. 90 Vol% mit Hydrolysenlösung gefüllt, um Verdunstungseffekte
bei leichtflüchtigen Estern zu vermeiden. Folgende Volumina an Hydrolysenlösung wurden als
geeignete Volumina als Vorlage für Hydrolysenexperimente ermittelt:
Bei Hydrolysen mit:
- unverdünntem Humanplasma,
- hitzeinaktiviertem Humanplasma oder
- unverdünntem Rattenplasma wurden 3000 µl und bei Experimenten mit
- Krebs-Henseleit-Puffer,
- künstlicher Magenflüssigkeit,
- verdünntem Human- und Rattenplasma oder
- verdünntem Rattenleberhomogenat wurden 6000 µl Hydrolysenlösung im Reaktionsgefäß
vorgelegt.
Im Schüttelwasserbad wurde die Hydrolysenlösung auf 37,0 ± 0,2°C bei ca. 120 U/min
temperiert. Nach 5,0 ± 0,2 min wurde die Substratlösung in die Hydrolysenlösung mittels
Mikroliterspritze injiziert (Reaktionsstart = t0). In Tab. 23 werden mögliche Parameter für einen
Hydrolysenansatz vorgeschlagen.
124 8 Experimenteller Teil
Tab. 23: Substratzusatz für den Hydrolyseansatz
Substratanfangskonzentration der Hydrolysenlösung S0 [mmol /L]
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,00 2,50 3,00 4,00
Volumen der
Hydrolysenlösung Zu injizierendes Volumen der Substratstammlösung in die Hydrolysenlösung [µl]
3000 µl 2,0a 4,0a 3,0b 4,0b 5,0b 3,5c - 5,0c - -
6000 µl 4,0a 4,0b 6,0b 8,0b 5,0c 7,0c 8,0c 5,0d 6,0d 8,0d
Konzentration der Substratstammlösung gelöst in 1,4-Dioxan: ca: 0,375 mol /L; cb: 0,75 mol /L; cc: 1,50 mol /L; cd: 3,00 mol /L
Nach der Substratzugabe (Reaktionsstart t0) wurde das Reaktionsgefäß ca. 10 Sekunden leicht
per Hand hin und her geschwenkt, um eine gleichmäßige Verteilung des Substrats im
Hydrolysemedium zu gewährleisten. Das Reaktionsgefäß wurde anschließend in das
Schüttelwasserbad zurückgegeben und nur kurz zur Probeentnahme (t1 bis t5) entnommen.
8.4.5 Probenahme
Die Probenahme erfolgte nach definierten Zeitabständen. Die Zeitpunkte der Probenahme
richteten sich grundsätzlich nach der Hydrolysegeschwindigkeit des Esters, da die
Konzentration der Hydrolyseprodukte zum Zeitpunkt t1 über der Bestimmungsgrenze des
Analyten liegen musste. Die gesamte Reaktionszeit sollte so kurz wie möglich sein, da langes
Inkubieren von Plasma bei 37°C zu Denaturierungseffekten führt. In Tab. 24 werden geeignete
Entnahmezeitpunkte aufgeführt:
Tab. 24: Zeitpunkte der Probenahme nach Reaktionsstart
Zeitpunkt der Probenahme ti t
1 t
2 t
3 t
4 t
5
Schnell hydrolysierte Ester (t1/2 < 5 min) 0,5 1 2 3 4
2 4 6 8 10
3 6 9 12 15
5 min < t1/2 < 20 min
4 8 12 16 20
5 10 15 20 25
10 20 30 40 50
Langsam hydrolysierte Ester (t1/2 > 20 min)
20 40 60 80 100
8.4.6 Probenaufarbeitung zur Analyse von Carbonsäureestern
Die Extraktion von Carbonsäureestern aus biologischem Material erfolgte durch
Festphasenextraktion an Extrelut (Merck, 2002). Zum Zeitpunkt ti wurden 1000 µl der
Hydrolysenlösung entnommen und mit 1000 µl Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) verdünnt. 1000
µl der verdünnten Probe wurden danach auf eine mit 1,2g Extrelut gefüllte Glassäule mit
Auslaufkanüle gegeben. Nach ca. 4 min wurden 1000 µl interner Standard hinzu gegeben und
danach der Ester sowie der interne Standard mit 3-mal ca. 1000 µl n-Hexan bis zu einem
Probenvolumen von ca. 3000 µl eluiert. Die Proben wurden gaschromatographisch analysiert.
8.4.7 Probenaufarbeitung zur Analyse von Esterhydrolyseprodukten
Die Extraktion von Esterhydrolysenprodukten aus biologischem Material erfolgte durch
Festphasenextraktion an Extrelut (Merck, 2002). Zum Zeitpunkt ti wurden 500 µl der
8.4 Prüfvorschriften 125
Hydrolysenlösung entnommen und mit 1000 µl 1 N HCl verdünnt und damit auf einen pH-Wert
von ca. 1,2 eingestellt. 1000 µl der verdünnten Probe wurden auf eine mit 1,2 g Extrelut
gefüllte Glassäule mit Auslaufkanüle gegeben. Nach 4 min wurden 1000 µl interner Standard
hinzu gegeben und Carbonsäure, Alkohol sowie der interne Standard mit 3-mal ca. 1000 µl
Ethylacetat bis zu einem Probenvolumen von ca. 3000 µl eluiert. Die Proben wurden
gaschromatographisch analysiert.
8.4.8 Gaschromatographische Analyse
Allgemeine GC-Parameter
• Trägergas: Helium 4.6, GA 330, Linde AG, Höllriegelkreuth
• Brenngase: Wasserstoff 5.0, GA 320, Linde AG, Höllriegelkreuth
• Make up Gas: Stickstoff 5.0, GA 221, Linde AG, Höllriegelkreuth
• Splitverhältnis: 1:10
• Injektionsvolumen: 1,0 µl
• Injektor/Detektortemperaturen: MN SE-52 (vgl. 8.2.3): 280°C/300°C
MN FFAP (vgl. 8.2.3): 220°C/220°C
Die Trägergasgeschwindigkeit betrug 2 ml/min. Es wurde im Pulsed Press Modus
(Säulenvordruck 1 min 180 kPa) gearbeitet.
Tab. 25: Temperaturprogramm für Carbonsäureester
Substanz GC-Säule Interner Standard Ofentemperaturprogramm
Benzylphenylacetat
Benzylsalicylat
Benzyltiglat
MN SE-52 n-Hexadecan 110→200°C (8°C/min) 200→290°C (120°C/min) 2 min isotherm
Ethylpropionat MN FFAP 4-Methylanisol
28°C, 3 min isotherm, 28→200°C (70°C/min), 2 min isotherm
Ethylcinnamat MN SE-52 n-Hexadecan
110°C, 1 min isotherm, 110→140°C (5°C/min) 140→290°C
(70°C/min) 2 min isotherm
Ethylheptanoat MN SE-52 n-Dodecan 60°C, 3 min isotherm, 60→105°C (10°C/min) 105→290°C
(120°C/min) 2 min isotherm
Ethylisovalerat MN FFAP 4-Methylanisol
35→50°C (2°C/min) 50→210 (120°C/min) 2 min isotherm
Ethylmyristat MN SE-52 n-Hexadecan
60°C, 3 min isotherm, 60→210°C (10°C/min) 210→290 (120°C/min),
2 min isotherm
Ethylphenylacetat MN SE-52 n-Hexadecan 85°C, 1 min isotherm, 85→105°C (3°C/min) 105→290°C (70°C/min) 2
min isotherm
Ethyltiglat MN FFAP 4-Methylanisol
60→110°C (10°C/min) 110→210 (120°C/min) 2 min isotherm
Ethylundecanoat MN SE-52 n-Hexadecan 105→150°C (10°C/min) 150→170°C (40°C/min) 170→290°C
(120°C/min) 2 min isotherm
Ethylvalerat MN FFAP 4-Methylanisol
50→70°C (4°C/min) 70→210°C (120°C/min) 2 min isotherm
Isoamylbutyrat MN SE-52 n-Undecan 65°C, 5 min isotherm, 65→72°C (50°C/min) 72→290°C (120°C/min) 2
min isotherm
Methyloctanoat MN SE-52 n-Undecan 70°C, 2 min isotherm, 70→105°C (10°C/min) 105→290°C
(120°C/min) 2 min isotherm
Phenylacetat MN SE-52 n-Decan 50°C, 2 min isotherm, 50→85°C (10°C/min) 85→290°C (120°C/min) 2
min isotherm
126 8 Experimenteller Teil
Tab. 26: Temperaturprogramm für Esterhydrolyseprodukte
Substanz GC-Säule Interner Standard Ofentemperaturprogramm
Benzylalkohol MN FFAP Valeriansäure
135→180°C (10°C/min) 180→210°C (120°C/min) 5 min isotherm
Buttersäure MN FFAP Valeriansäure
80→103°C (10°C/min) 103→200°C (50°C/min) 5 min isotherm
Heptansäure MN FFAP Valeriansäure
130→178°C (10°C/min) 178→200°C (120°C/min) 3 min isotherm,
200→210°C (120°C/min) 1 min isotherm
Isovaleriansäure MN FFAP Hexansäure 120→170°C (10°C/min) 170→210°C (20°C/min) 2 min isotherm
Myristinsäure MN SE-52 Laurinsäure
105→160°C (10°C/min) 160→290°C (120°C/min) 2 min isotherm
Octansäure MN SE-52 Heptansäure
155→220°C (10°C/min) 2 min isotherm
Phenylessigsäure MN SE-52 Decansäure 80°C, 1 min isotherm, 80→125°C (10°C/min) 125→290°C
(120°C/min) 2 min isotherm
Propionsäure MN FFAP Buttersäure
130→168°C (10°C/min) 168→210°C (120°C/min) 2 min isotherm
Tiglinsäure MN FFAP Valeriansäure
135→180°C (10°C/min) 180→210°C (120°C/min) 5 min isotherm
Undecansäure MN SE-52 Decansäure
80→125°C (10°C/min) 1 min isotherm, 125→290°C (120°C/min) 2
min isotherm
Valeriansäure MN FFAP Hexansäure
130→180°C (10°C/min) 180→210°C (20°C/min) 2 min isotherm
Zimtsäure MN SE-52 Decansäure
85→131°C (10°C/min) 131→290°C (120°C/min) 2 min isotherm
8.4.9 Validierung
Nachweis- und Bestimmungsgrenze
Als Nachweisgrenze wurde das Dreifache des Grundrauschens von Negativproben ermittelt.
Bei einem Signal-Rausch-Verhältnis von 3:1 (Peakhöhe Analyt: Höhe des Grundrauschens) galt
der Analyt als nachgewiesen. Für die Bestimmungsgrenze musste das Signal-Rausch-
Verhältnis 9:1 betragen. Die Kontrolle der Kalibrierung erfolgte arbeitstäglich durch Injizieren
einer Probe mit Analytkonzentration.
Für eine sichere Quantifizierung wurde eine Abweichung bis 10 % toleriert, im Bereich der
Nachweisgrenze bis zu 30%. Die Messergebnisse wurden durch Vierfachbestimmung
(Mindestwert) abgesichert und unter Angabe des Vertrauensintervalls (Mittelwert ±
Standardabweichung) dargestellt (vereinfachtes Verfahren nach DIN 32645).
Arbeitsbereich und Linearität
Der Nachweis der Linearität sowie die Festlegung des Arbeitsbereiches erfolgte nach
DIN 38402, Teil 51. Der lineare Bereich kennzeichnet den Konzentrationsbereich, in dem
zwischen Konzentration des Analyten und Signal ein linearer Zusammenhang besteht. Durch
eine Kalibrierung über Standardlösungen wird der lineare Bereich ermittelt.
Als Parameter der Korrelation dient der Korrelationskoeffizient der linearen Regressions-
geraden von mindestens 7 Messpunkten. Innerhalb des linearen Bereiches darf der
Korrelationskoeffizient einen Wert von 0.990 nicht unterschreiten. Abweichungen von der
Linearität sind gekennzeichnet durch eine hyperbelförmige Abweichung der Trendlinie von der
Linearität.
Kalibrierung mit internem Standard
Die Identifizierung von Analyt und internem Standard erfolgte anhand der Retentionszeiten. Für
die Kalibrierung wurden mindestens 7 Messpunkte, die innerhalb des Arbeitsbereiches lagen,
herangezogen. Aus den Verhältnissen von Konzentration (Amount Ratio) und Peakfläche
8.4 Prüfvorschriften 127
(Response Ratio) von Analyt zu internem Standard rechnergestützt (Chemstation Integrator) für
jeden Analyten Responsefaktoren berechnet. Die Konzentration des Analyten in der Probe
wurde aus dem Responsefaktor des Analyten, der Konzentration des internen Standards sowie
der Response Ratio der Probe berechnet. Die Kalibrierlösungen wurden durch unabhängige
Verdünnungsschritte aus einer Stammlösung hergestellt. Innerhalb des Arbeitsbereiches durfte
der Korrelationskoeffizient der Regressionsgeraden einen Wert von 0.990 nicht unterschreiten.
Die Konzentration des internen Standards lag ungefähr in der Mitte des Arbeitsbereiches sowie
in der Nähe der zu erwartenden Konzentration des Analyten.
Die Kontrolle der Kalibrierung erfolgte alternierend. Arbeitstäglich wurden vor und nach der GC-
Analyse zwei Kalibrierstandards, deren Konzentration in der Nähe des zu erwartenden
Konzentrationsbereichs der Probe liegen sollten, analysiert. Grundsätzlich wurden maximal
± 10 % Abweichung von der Soll-Konzentration toleriert. Sofern der untere Arbeitsbereich in der
Nähe der Nachweisgrenze liegen muss, wurden bis zu ± 40 % Abweichung toleriert.
Matrixeinflüsse und Wiederfindung
Extraktionsausbeuten wurden ermittelt, indem die Konzentration eines direkt injizierten Analyten
verglichen wurde mit der Konzentration, die nach Dotierung einer Probematrix (thermisch
inaktiviertes Plasma) sowie einem matrixfreien Medium (Krebs-Henseleit-Puffer),
anschließender Probenaufarbeitung und Analyse erhalten wurde (Nulltoleranzen).
Als Nulltoleranz/Blindwert wurde die Konzentration an Esterhydrolyseprodukt (Säure- und/oder
Alkoholkomponente) angesehen, die als Verunreinigung bereits in der verwendeten
Rohchemikalie vorlag. Dazu wurde eine hohe Substratanfangskonzentration (S0 = 0,25 mM) in
einem matrixfreien Hydrolysemedium (Krebs-Henseleit-Puffer) eingestellt und direkt nach
entsprechender Aufarbeitung vermessen.
Richtigkeit und Präzision
Die Richtigkeit einer Analysenvorschrift wurde durch den Vergleich von Proben mit bekannter
Konzentration (Kalibrierlösungen) mit der nach Probenaufarbeitung erhaltenen analysierten
Menge berechnet. Sie wurde in Form einer Wiederfindungsrate berechnet und musste in der
Regel innerhalb des Bereiches 90 % bis 110 % liegen.
Die Präzision ist ein Maß für die Streuung von Analysenergebnissen um einen Mittelwert. Sie
wurde nach der Analyse von 4 unabhängigen Proben bei der Ergebnisangabe in Form eines
Vertrauensintervalls mit angegeben.
8.4.10 Proteinbestimmung
Zur Bestimmung des Proteingehaltes von Blutplasma wurde die Methode nach LOWRY (1951)
angewendet. HARTREE (1972) verbesserte die Linearität des Lowry-Tests durch eine leicht
veränderte Zusammensetzung der Reagenzien. Die Farbbildung beruhen auf den im Protein
enthaltenen Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan. Diese reduzieren die
Wolframmolybdatophosphosäure zu einem blauen Molybdän (V) Farbstoff, dessen Absorption
sich bei 578 nm spektralphotometrisch erfassen lässt. Die Farbentwicklung wird somit von der
Aminosäurezusammensetzung des jeweiligen Proteins bestimmt. Der Kupferzusatz vermindert
128 8 Experimenteller Teil
die Unterschiede zwischen verschiedenen Proteinarten ohne die Farbreaktion zwischen
Tyrosin, Tryptophan und dem Folin-Ciocalteus Phenolreagenz zu beeinflussen.
Titration zur Herstellung der 1 N Folin-Ciocalteus Phenolreagenz-Lösung
Aus der original Folin-Ciocalteus Phenolreagenz-Lösung wurde eine 1 N Lösung hergestellt.
Der Verdünnungsfaktor wurde titrimetrisch ermittelt. 1 ml der original Folin-Ciocalteus Phenol-
reagenz-Lösung wird mit 30 ml deionisiertem Wasser im Titrierbecher vorgelegt. Titrator ist eine
0,1 N Natriumhydroxidlösung. Als Indikator wird 0,1 %iger Phenolphthaleinlösung verwendet.
Während des Titrierens wird der pH-Wert mittels pH-Meter kontrolliert. Der Äquivalenzpunkt
liegt bei einem pH-Wert von ca. 8,8.
Kalibrierung
Als Standardprotein diente das handelsübliche Rinderserumalbumin (Fraktion V; 67 kDa) von
Merck. Für die lineare Regressionsgerade wurden mindestens 5 Messpunkte gefordert. In der
Stammlösung wurde eine Konzentration von ca. 1 g /L Rinderserumalbumin in 0,1 M
Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) gelöst. Die Standardlösungen werden unabhängig voneinander
aus der Stammlösung verdünnt und liegen im Konzentrationsbereich 50 bis 500 mg /L.
Hauptversuch
Je 1 ml der Standardlösungen wird in ein 12ml-Zentrifugenröhrchen mit Normschliff pipettiert
und mit 5 ml frisch angesetzter Reagenz A – Lösung versetzt. Dazu werden 500 µl 1 N Folin-
Ciocalteus Phenolreagenzlösung langsam und tropfenweise unter Schütteln (15s - Takt)
gegeben. Die Lösung wird 30 min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert und anschließend
photometrisch am Zweistrahl-UV/VIS-Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 578 nm
gemessen. Der Reagenzienleerwert besteht aus 2 ml 0,1M Natriumphosphatpuffer sowie 500µl
1 N Folin-Ciocalteus Phenolreagenzlösung. Das Blutplasma wird ca. 1:400 mit 0,1 M
Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) verdünnt. Anschließend wird wie oben im Hauptversuch
verfahren.
8.4.11 Bestimmung der Löslichkeit von Carbonsäureestern
Prinzip
Krebs-Henseleit-Puffer wurde mit einem Überschuss an Carbonsäureester versetzt und 30 min
bei 37°C in einem Schüttelwasserbad inkubiert. Die wässrige Phase wurde mittels n-Hexan
ausgeschüttelt, mit internem Standard versetzt und gaschromatographisch analysiert.
Durchführung
In einem Reaktionsgefäß aus Glas mit Schraubverschluss wurden ca. 10 ml Krebs-Henseleit-
Puffer vorgelegt und mit einem Überschuss (z.B. ca. 500 µl) Carbonsäureester versetzt. Im
Schüttelwasserbad wurde die Probe ca. 30 min bei 37 ± 1°C (160 U/min) inkubiert. Die Probe
wurde zur Beschleunigung der Phasentrennung 1 min bei 1000U/min (693 g) zentrifugiert.
Durch Abpipettieren (DichteEster > DichtePuffer) oder mit Hilfe eines Scheidetrichters (DichteEster <
DichtePuffer) erfolgte die Abtrennung der wässrigen von der organischen Phase. Ein definiertes
8.4 Prüfvorschriften 129
Volumen der wässrigen Phase vw (z.B. 1000 µl) wurde mit einem definiertem Volumen an
Extraktionsmittel n-Hexan vo (z.B. 10000 µl) versetzt und ausgeschüttelt. 1000 µl der n-Hexan-
Phase wurden daraufhin mit 1000 µl internem Standard (gelöst in n-Hexan) vermischt. Die
Analyse der im Eluat enthaltenen Carbonsäureester-Konzentration erfolgte gaschromato-
graphisch gemäß Abschnitt 8.4.8.
Im Vorversuch wurde das optimale Extraktionsverhältnis von organischer zu wässriger Phase
(vo /vw) ermittelt, das zur vollständigen Extraktion des Esters aus der wässrigen Phase führte.
Die Extraktion galt als vollständig, wenn nach wiederholtem Ausschütteln die analysierte
Esterkonzentration in der organischen Phase unter der Nachweisgrenze lag.
131
Literaturverzeichnis
Abdel Razik, A.; Metwally, M.S.; El-Hadi, M.F.; El Wardany, M.A. (1992) Steric substituent effect
on the resin-catalyzed hydrolysis of alkyl acetate esters. Reaction Kinetics and Catalysis
Letters. 48, Nr. 1, 279
Acheampoung, A.; Abbott, F.; Burton, R. (1983) Identification of valproic acid metabolites in
human serum and urine using hexadeuterated valproic acid and gas chromatographic mass
spectrometric analysis. Biochemical Mass Spectroscopy 10 (11) 586-595
Adamczyk, M.; Grote, J. (1999) Use of lipase for regioselective one pot amidation and
hydrolysis. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9 No. 2, 245
Adler, A.J.; Kistiakowsky, G. B. (1962) Kinetics of pig liver esterases catalysis. Journal of the
American Chemical Society 84 No. 5, 695
Albro, P. W.; Thomas, R. O. (1973) Enzymatic hydrolysis of di-(2-ethylhexyl)phthalate by
lipases. Biochimica et Biophysica Acta 360, 380
Aldridge, W. N. (1953) Serum Esterases 1. Two Types of Esterase (A and B) hydolysing p-
Nitrophenyl Acetate, Propionate and Butyrate and a Method for their Determination; Serum
Esterases 2. An Enzyme hydrolysing Diethyl p-nitrophenyl phosphate (E 600) and its Identity
with the A-Esterase of mammalian Sera. Biochemical Journal 53, 110-24
Aleryani, S.; Kabakibi, A.; Cluette-Brown, J.; Laposata, M. (1996) Fatty acid ethyl ester
synthase, an enzyme for nonoxidative ethanol metabolism, is present in serum after liver and
pancreatic injury. Clinical Chemistry 42 No. 1, 24-7
Ammon, R. (1940) in „Handbuch der Enzymologie“ von Nord, F.F. und Weidenhagen; R.;
Akademischer Verlag Leipzig, 1. Auflage, 350 ff.
Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG, Untersuchungen von
Lebensmitteln. Allgemeine Durchführung von enzymatischen Analysen L 00.00-23, Juni 1992
Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaft Nr. L 251/216 vom 19.09.1984 C.10.: Abbaubarkeit.
OECD Test guideline III, Decision of the Council C (81) 30 Final
Arndt, R.; Krisch, K. (1973) Catalytic properties of an unspecific carboxylesterase (E1) from rat
liver microsomes. European Journal of Biochemistry 36, 129
Aromenverordnung vom 22.12.1981 in der aktuellen Fassung vom 13.01.2004
Augustinsson, K. B. (1961) Multiple Form of Esterase in vertebrate Blood plasma. Annals of the
New York Academy of Science 94, 844-860
Augustinsson, K. B. (1968) Titel. Journal of histochemical Cytochemistry 12, 744
Bär, F.; Griepentrog, F. (1967) Die Situation der gesundheitlichen Beurteilung der
Aromatisierungsmittel für Lebensmittel. Medizin und Ernährung 8, 244
Bartko, J. J. (1985) Reporting Standard Deviations rather than Standard Error of the Mean.
American Journal of Psychiatry 142 (9) 1060-1061
132
Barton, P.; Laws, A. P.; Page, M. I. (1994) Structure-activity relationships in the esterase-
catalyzed hydrolysis and transesterification of esters and lactones. Journal of the Chemical
Society, Perkin Transactions 2, Vol. 9, 2021-2029
Basak, A. Bhattacharya, G.; Palit, S. K. (1993) Selectivity in enzyme catalysed reaction:
preferential hydrolysis of saturated methyl ester over the corresponding unsaturated ester by
pig liver esterases. Biotechnology letters 15 No. 1, 19
Basak, A.; Bhattacharya, G.; Palit, S.K. (1997) Novel regioselective ester hydrolysis by pig-liver
esterase. Bulletin of the Chemical Society of Japan 70 No. 10, 2509
Baton, D. H. R.; Ollis, W. D. (1979) Comprehensive Organic Chemistry. The synthesis & reac-
tion of organic compounts. Volume 5: Biological Compounds. Pergamon Press Ltd., p. 914 ff.
Becker, H. G. O. et al. (1996) Organikum: Organisch-Chemisches Grundpraktikum. 20. Auflage,
Johann Ambrosius Barth Verlag, Hüthig GmbH Heidelberg Leipzig
Beelitz, H.-D.; Grosch, W., Schieberle, A. (2001) Lehrbuch der Lebensmittelchemie. 5.
überarbeitete Auflage, Springer Verlag Berlin Heidelberg, 112 ff., 332 ff.
Bergmeyer, H. U. (Hrsg) (1970) Methoden der enzymatischen Analyse. 2. Auflage, Band 1,
Verlag Chemie GmbH Weinheim; 111, 274, 963 ff, 968
Bernhardt, T. G.; Cannistraro, P. A.; Bird, D. A.; Doyle, K. M.; Laposata, M. (1996) Purification
of fatty acid ethyl ester by solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography.
Journal of Chromatography B 675, 198-96
Beyer; H.; Walter, W. (1984) Lehrbuch der organische Chemie. 20. überarbeitete und ergänzte
Auflage, S. Hirzel Verlag Stuttgart, 244 f.
Biochrom (2001) Kultur der Zelle, Produkte für Zellkulturen, Biochrom AG seromed, 11
Biotest-Info (2003) www.biotest.de
Bird, D. A.; Laposata, M.; Hamilton, J. A. (1996) Binding of ethyl oleate to low density
lipoprotein, phospholipid vesicles, and albumin: a 13C NMR study. Journal of Lipid Research 37,
1449-1458
Bird, D. A.; Szczepiorkowski, Z. M.; Trace, V. C.; Laposata, M. (1995) Low-density lipoprotein
reconstituted with fatty acid ethyl esters as a physiological vehicle for ethyl esters delivery to
intact cells. Alcoholism: Clinical and Experimental Research 19 No.5, 1265-1270
Boyer, P. D. (1971) The Enzymes. V, Hydrolysis: Sulfate Esters, Carboxyl Esters, Glycosidases;
Hydratation, 3rd edition, Academic Press New York and London, 43 ff.
Briggs, G.E.; Haldane, J.B.S. (1925) A note on the kinetics of enzyme action. Biochemical
Journal 19, 338-339
Britt, A. J.; Bruce, N.C.; Lowe, Ch. R. (1992) Identification of a cacaine esterase in a strain of
Pseudomonas maltophilia. Journal of Bacteriology 174 No. 7, 2087 - 2094
Brown, A.J. (1902) Enzyme Action. Journal of the Chemical Society (Trans.) 81, 373-388
Bruchhausen, von F. (Hrsg.) (1991) Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis. Band 2.
Methoden, 5., vollst. neubearbeitete Auflage Springer Verlag, Berlin Heidelberg New York,
844 ff.
133
Brunner, G. (1996) Mathematik für Chemiker I (Spektrum Hochschultaschenbuch). Spektrum
Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, Oxford, 137 f.
Buchwald, P. (2002) Structure-Metabolism Relationship: Steric Effects and the Enzymatic
Hydrolysis of Carboxylesters. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 1, Issue 1:
http://www.bentham.org/mrmc1-1
Buchwald, P.; Bodor, N. (1999) Quantitative Structure-Metabolism Relationships: Steric and
Nonsteric Effects in the Enzymatic Hydrolysis of Noncongener Carboxylic Esters. Journal of
Medical Chemistry 42, 5160-5168
Buchwald, P.; Bodor, N. (2000) Structure-based estimation of enzymatic hydrolysis rates and its
application in computer-aided retrometabolic drug design. Pharmazie 55, 210-217
Buddecke, E. (1994) Grundriss der Biochemie, Walter de Gruyter Verlag Berlin New York,
443 ff.
Castle, L.; Nichol, J.; Gilber, J. (1993) Migration from plasticized films into food. 6. Hydrolysis of
polymeric plasticizer under simulated gastric and intestinal conditions. Food additives and
contaminants 10 No. 5, 523
CEN/TC 52/WG 9 TG 3 (November /2000) Safety of Toys. Organic chemical compounds – Risk
Assessment, “Artificial intestinal fluids”, Addendum 2 to appendix 3, 2.1.2
Chandler, W.; David; Y.; Yongfei; Lee, Donald G. (1992) New kinetic methods. 2. An indirect
measurement of ester formation and hydrolysis rates. Journal of Physical and Organic
Chemistry 5 No. 6, 334-340
Child, J. J.; Oka, T.; Simpson, F. J.; Krishnamurty, H.G. (1971) Purification and properties of a
phenol carboxylic acid acyl esterase from Aspergillus flavus. Canadian Journal of Microbiology
17 No. 11, 1455 - 1463
CIVO-TNO (1991) Volatile Compounds in Food, Qualitative and Quantitative Data. 5th edition,
Edited by H. Maarse, C.A. Visscher, Supplement 2, TNO Biotechnology and Chemistry Institute,
Zeist NL
Cohen, S. G.; Elkind, J L.; Chishti, S. B.; Giner, J.-L., P.; Reese, H.; Cohan, J. B. (1984) Effects
of volume and surface property in hydrolysis by acetylcholinesterase. The trimethyl site, Journal
of Medical Chemistry 27 No. 12, 1643
Cooper, I.; Lord, T.; Tice, P. A. (1995) Hydrolysis studies on olamide in simulated
gastrointestinal fluids. Food additives and contaminants 12 No. 6, 769
Council of Europe (1970) Natural Flavouring Substances, Their Sources and Added Artificial
Flavouring Substances. Partial Agreement in the Social and Public Health Field , List A(1),
Series 2, Strasbourg
Council of Europe (1974) Natural Flavouring Substances, Their Sources and Added Artificial
Flavouring Substances. Partial Agreement in the Social and Public Health Field , List 1,
Strasbourg
Council of Europe (1981) Natural Flavouring Substances, Their Sources and Added Artificial
Flavouring Substances. Partial Agreement in the Social and Public Health Field , List 2,
Strasbourg
134
Dahl, A. R.; Miller, S. C. (1985) Hydrolytic enzymes in the respiratory tract. Inhalation
Toxicology Research Institute Annual Report, 152-155
Dahl, A. R.; Miller, S. C.; Petridou-Fischer, J. (1987) Carboxylesterases in the respiratory tracts
of rabbits, rats and syrian hamsters. Toxicology Letters 36 No. 2, 129-136
Dan, L.; Laposata, M. (1997) Ethyl palmitate and ethyl oleate are the predominant fatty acid
ethyl esters in the blood after ethanol ingestion and their synthesis is differentially influenced by
extracellular concentrations of their corresponding fatty acids, Alcoholism: Clinical and
experimental research 21 No. 2, 286-292
Dekant, W.; Vamvakas, Sp. (1994) Toxikologie für Chemiker und Biologen. Spektrum
Akademischer Verlag GmbH Heidelberg, Berlin, 111 f., 127 f.
Delbressine, L. P. C.; van Balen, H. C. J. G.; Seutter-Berlage, F. (1982) Isolation and
identification of mercapturic acid metabolites of phenyl substituted acrylate esters from urine of
female rats. Archives in Toxicology 49, 321-330
DeTar, DeLos F. (1980) Effects of alkyl groups on rates of acyl-transfer reactions. Journal of
Organic Chemistry 45 No. 45, 5166-5174
DeTar, DeLos F. (1980) Effects of alkyl groups on rates of SN2 reactions. Journal of Organic
Chemistry 45 No. 45, 5174-5176
DeTar, D. F.; Tenpas, C. J. (1976) Calculations of steric hindrance in ester hydrolysis based on
estimation of van der Waals strain energies of alkanes. Journal of the American Chemical
Society 98 No. 15, 4567-4571
DeTar, DeLos F.; Tenpas, C. J. (1976a) Theoretical calculation of steric effects in ester
hydrolysis, Journal of American Chemical Society 98 No. 25, 7903-7908
Deutsche Norm. Chemische Analytik. DIN 32 645: Nachweis,- Erfassungs- und
Bestimmungsgrenze, Mai 1994
Deutsche Norm. Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser, Abwasser- und
Schlammuntersuchung, DIN 38 402, Teil 51: Kalibrierung von Analysenverfahren, Auswertung
von Analysenergebnissen und lineare Kalibrierfunktionen für die Bestimmung von
Verfahrenskenngrößen, Mai 1986
Deutsche Norm. Sicherheit von Spielzeug. DIN EN 71-3 (März 1995) Teil 3: Migration
bestimmter Elemente
Dixon, M. (1953) The determination of enzyme inhibitor constants. Biochemical Journal 55, 170-
171
Dixon, M. (1972) The graphical determination of Km and Ki, Biochemical Journal 129, 197-202
Dixon, M.; Webb, E. C. (1966) Enzymes. Longmans, Green and Co., London NewYork Toronto,
183 ff.
Dokumenta Geigy (1975) Wissenschaftliche Tabellen, 7. Ausgabe, 639 ff.
Doyle, K. M.; Bird, D. A.; Al-Salihi, S.; Hallaq, Y.; Cluette-Brown, J. E.; Goss, K. A.; Laposata,
M. (1994) Fatty Acid Ethyl Esters are present in human serum after ethanol ingestion. Journal of
Lipid Research 35, 428-37
135
Doyle, K. M.; Cluette-Brown, J. E.; Dube, D. M.; Bernhardt, T. G.; Morse, C. R.; Laposata, M.
(1996) Fatty Acid Ethyl Esters in the Blood as Markers for Ethanol Intake. Journal of the
American Medical Association 276. No. 14, 1152-1156
Drauz, K.; Waldmann, H. (1995) Enzyme catalysis in organic synthesis, A comprehensive
Handbook, 26, 112 ff.
Eadie, G. S. (1942) The Inhibition of cholinesterase by physostigmine and prostigmine. Journal
of Biological Chemistry 146., 85
Empfehlung der Gesellschaft für Klinische Chemie, Standards und Methoden zur Bestimmung
der Enzymaktivität in biologischen Flüssigkeiten (1972) Zeitschrift für klinische Chemie 10, 182-
92
Englhardt, A. (1966) Die Enzymverteilungsmuster des menschlichen Serums und seine
Änderungen bei verschiedenen Krankheitszuständen. Medizinische Welt 16, 839
Englhardt, A. (1974) Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik, F.K. Schattauer Verlag,
Stuttgart – New York, 3 f.
Esch, O.; Schteingart, C. D.; Pappert, D.; Kirby, D.; Treich, R.; Hofman, A. F. (1993) Increased
Blood Levels of Methyl tert-Butyl Ether but not of Ethyl Propionate during Instillation with
Contact Gallstone Dissolution Agents in the Pig. Hepatology 18 No.2, 373-9
European Commission (2002) Health and Consumer Protection Directorate-General;
Directorate D – Food Safety: production and distribution chain, D3 – Chemical and physical
risks; surveillance. Food Contact materials – Practical Guide (updated to 1st March 2002)
Section 3 Note for Guidance, p. 100
European Commission (2002) Note for Guidance. Food Contact Materials, European
Commission, Health and Consumer Protection Directorate-General (update to 15.01.2002),
Annex 3.2.2
Evans, C. G.; Thomas, J. D. R. (1971) Effect of unsaturated substituents on the hydrolysis of
esters. Journal of the Chemical Society (B) 7, 1502-4
Fahelbum, I. M. S.; James, S. P. (1977) The absorbtion and metabolism of methyl cinnamate,
Toxicology 7, 123
Fahelbum, I. M. S.; James, S. P. (1979) Absorbtion, Distribution and metabolism of propyl
anthranilate. Toxicology 12, 75
Fenaroli´s Handbook of Flavor Ingredients (1995) Edited by T. E. Furia and N. Bellanca, 3nd
Edition, Vol. II, CRC Press Cleveland, OH
Feissli, S.; Forster, G.; Laudahn, G.; Schmidt, E.; Schmidt, F. W. (1966) Normal-Werte und
Alterung von Hauptketten-Enzymen im Serum, Klinische Wochenschrift 44, 390
Flavoring Extract Manufacturer´s Association (1965) Survey of flavouring ingredient usage
levels, Fd. Technol., Champaign 19 No. 2, part 2, 155
Ford, R. A.; Letizia, C.; Api, A. M. (1988) Monographs on fragrance raw materials. Food and
Chemical Toxicology 26 No. 4, 273-415
136
Forth, W.; Henschler, D.; Rummel, W.; Starke, K. (Hrsg.) (1992) Allgemeine und spezielle
Pharmakologie und Toxikologie. 6., völlig neubearbeitete Auflage, BI Wissenschaftsverlag
Mannheim Leipzig Wien Zürich, 26, 60
Froede, H. C.; Wilson, I. B. (1984) Direct Determination of Acetyl-Enzyme-Intermediate in the
Acetylcholinestrase-catalyzed Hydrolysis of Acetylcholine and Acetylthiocholine. The Journal of
Biological Chemistry 259 No. 17, 11010-3
Furth, E. F.; Sprecher, H.; Fisher, E. A.; Fleishman, H. D.; Laposata, M. (1992) An in vitro model
for essential fatty acid deficiency: HepG2 cells permanently maintained in lipid-free medium.
Journal of Lipid Research 33, 1719-26
Gad, M. Z. (1994) The distribution of non-specific carboxylesterases and glutathione s-
transferases in different rat liver cells. Biochemical Pharmacology 48 No. 1, 139 – 44
Gallaher, E. J.; Loomis, T. A. (1975) Metabolism of Ethyl Acetate in the Rat: Hydrolysis to Ethyl
Alcohol in Vitro and in Vivo. Toxicology and Applied Pharmacology 34, 309-13
Gaustad, R.; Berg, T.; Fonnum, F. (1992) Heterogeneity of carboxylesterase in rat liver cells.
Biochemical Pharmacology 44 (4) 827-829
Gesetz über den Verkehr mit Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und
sonstigen Bedarfsgegenständen (LMBG - Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz) vom
09.09.1997 in der aktuellen Fassung vom 25.11.2003
Ghanayem, B. I.; Maronpot, R. R.; Methews, H. B. (1985) Ethyl Acrylate-Induced Gastric
Toxicity. Toxicology and Applied Pharmacology 80, 336-344
Ghittori, S.; Imbriani, M.; Borlini, F.; Pezzagno, G.; Zadra, P. (1984) Studies on the stability of
esters in blood in vitro. Bollettino Società Italiana di Biologia Sperimentale 60, 2207-2213
Gnanasekharan, V.; Floros, J. D. (1997) Migration and sorption phenomena in packaged foods,
Critical reviews in food science and nutrition 37 No. 6, 519-59
Goldberg, M.; Thomas, D.; Legoy, M. D. (1990) The control of lipase-catalyzed
transesterification and esterification reaction rates. Effects of substrate polarity, water activity
and water molecules on enzyme activity. European Journal of Biochemistry 190 No. 3, 603-9
Goll, M. (1992) Untersuchungen zur enteralen Resorption des Phosphorsäureesters 0,0,S-
Trimethylphosphorothionat und zum Abbau von Malathion im Plasma verschiedener Spezies.
Dissertation. Freie Universität Berlin. Journal-Nr. 1599, 47 ff.
Gorski, N. P.; Nouraldin, H.; Dube, D. M.; Preffer, F. I.; Dombrowski, D. M.; Villa, E. M.;
Lewandrowski, K. B.; Weiss, R. D.; Hufford, C.; Laposata, M. (1996) Reduced fatty Acid Ethyl
ester Synthase Activity in the White Blood Cells of Alcoholics. Alcoholism: Clinical and
Experimental Research 20 No. 2, 268-74
Goss, K.; Alharethi, R.; Laposata, M. (1999) Fatty acid ethyl ester synthesis in the preparation
of Scotch Whiskey. Alcohol 17 No. 3, 241-5
Goto, M.; Kawasaki, M.; Kometani, T. (2000) Enzymatic resolution of 2-phenyl-1-propanol by
enantioselective hydrolysis of its ester having a bulk group in an acyl moiety. Journal of
Molecular Catalysis B: Enzymatic 9, 245-250
Gottwald, W. (1995) GC für Anwender. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, New York
137
Gottwald, W. (2000) Statistik für Anwender. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, NewYork
Gräser, H. (1971) Biochemisches Praktikum. Studienbuch für Biologen, Chemiker,
Pharmazeuten und Mediziner im 2. Studienabschnitt. Vieweg Verlag Braunschweig, 113 ff.
Greenzaid, P.; Jencks, W. P. (1971) Pig Liver esterase. Reactions with Alcohols, Structure-
Activity-Reactivity Correlations, and the Acyl-Enzyme Intermediate. Biochem. 10 Vol. 7, 1210
Grob, K. (2001) Split and Splitless Injection for Quantitative Gas Chromatography. Concepts,
Processes, Practical Guidelines, Sources of Error. 4. Auflage, Wiley-VCH Verlag
Gross, R (1977) Lehrbuch der Inneren Medizin. Schattauer Verlag, Stuttgart New York, 1161
Grundschober, F. (1977) Toxicological assessment of flavouring esters. Toxicology 8, 387
Haarmann & Reimer (2000) Auf den Geschmack gekommen... Informationen zu Aromen.
Informationsbroschüre der Haarmann und Reimer GmbH Holzminden
Haber, P. S.; Wilson, J. S.; Apte, M. V.; Pirola, R. C. (1993) Fatty acid ethyl esters increase rat
pancreatic lysosomal fragility. Journal of Laboratory and Clinical Medicine 121. 759-764
Hagan, E. C.; Hansen, W.H.; Fitzhugh, O. G.; Jenner, P. M.; Jones, W. I.; Taylor, J. M.; Long, E.
L.; Nelson, A. A.; Brouwer, J. B. (1967) Food flavourings and compounds of related structure. II.
Subacute and chronic toxicity. Food and Cosmetic Toxicology 5, 141-57
Hall, L. H.; Kier, L. B. (1981) The relation of molecular connectivity to molecular volume and
biological activity, European Journal of Medical Chemistry 16 No. 5, 399-407
Hancock, C.K.; Meyers, E.A.; Yager, B.J. (1961) Quantitative separation of hyperconjugation
effects from steric substituent constants. Journal of the American Chemical Society 83, 4211
Hanes, C. S. (1932) Studies on plant amylases. I. The effect of starch concentration upon the
velocity of hydrolysis by the amylase of germinated barley. Biochemical Journal 26. 1406-1421
Hansch, L.; Leo, A. (1979) Substituent constant for correlation analysis in chemistry and
biology. John Wiley & Sons, New York
Hansen, Ch. M.; Andersen, B. H. (1988) The Affinities of Organic Solvents in Biological
Systems. American Industrial Hygiene Association Journal. 49 (6) 301-308
Hartmann, K.; Lezki, E.; Schäfer, W. (1974) Statistische Versuchsplanung und –auswertung in
der Stoffwirtschaft. VEB Deutscher Verlag der Grundstoffindustrie Leipzig, 47 ff.
Hartree, E. F. (1972) Determination of protein: a modification of the Lowry method that gives a
linear photometric response. Anal. Biochem. 48, 422 – 427
Hasan, F. B.; Cohen, S. G.; Cohen, J. B. (1980) Hydrolysis by acetylcholinesterase. Apparent
molal volumes and trimethyl and methyl subsites. Journal of Biological Chemistry 255 No. 9,
3898-3904
Haug, H.; Mannes, H. (1969) Zur Frage des endogenen Abbaus von Enzymen, Klinische
Wochenschrift 47, 225 f.
Hauptmann, S. (1988) Organische Chemie. VEB Deutscher Verlag für Grundstoffindustrie, 319
138
Hayakawa, K.; Nakamura, S.; Inaki, K.; Miyazaki, M. (1989) Determination of Carboxylesters by
Indirect Photometric Ion Chromatrography with an On-Line Enzyme Immobilized Column.
Analytical Sciences 5, 691
Henri, V. (1902) General Theory of Action of Certain Hydrolases. Compt. rend. hebd. Acad. Sci.
Paris 135, 916-919 (1902)
Hess, B. (1966) Enzyme im Blutplasma, Biochemie und Klinik, Monographien in zwangloser
Folge; Erste Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 115 f.
Heymann, E.; Junge, W. (1979) Characterization ofthe Isoenzymes of Pig-Liver Esterase. 2.
Kinetic Studies. European Journal of Biochemistry 95, 519-525
Hofstee, B.H.J. (1954) TITEL. Journal of Biochemistry 207, 219
Holtzhauer, M. (1997) Biochemische Labormethoden. 3. Auflage. Springer Verlag Berlin, 238 f.
Hopkins, W. G. (2002) A new view of statistics. Internet Society for Sport Science:
http://www.sportsci.org/resource/stats
Hosokawa, M.; Maki, T.; Satoh, T. (1990) Characterisation of molecular species of liver
microsomal carboxylesterases of several animal species and humans. Archives of biochemistry
and biophysics 277 No. 2, 219-27
Hungund, B. L.; Goldstein, D. B.; Villegas, F.; Cooper, T. B. (1988) Formation of fatty acid ethyl
esters during chronic ethanol treatment in mice. Biochemical Pharmacology 37 No. 15, 3001-4
Hungund, B. L.; Zheng, Z.; Barkai, A. I. (1995) Turnover of ethyl linoleat in rat Blutplasma and
its distribution in various organs. Alcohol Clin. Exp. Res. 19, 374
Ibanez, P. (1988) Final report on the safety assessment of amyl acetate and isoamyl acetate.
Journal of the American College of Toxicology 7 No. 6, 705-19
Inoue, M.; Morikowa, M; Tsubo, M.; Ito, Y.; Sugiara, M. (1980) Comparative study of human
intestinal and hepatic esterases as related to enzymatic properties and hydrolysing activity for
ester-type drugs. Japanese Journal of Pharmacology 30, 529-35
Järv, J.; Kesvatera, T.; Aaviksaar, A. (1976) Structure-activity relations in acetylcholinesterase
reactions. Hydrolysis of non-ionic acetic esters. European Journal of Biochemistry 67 No. 2,
315-22
Jahreis, G.; Bochmann, K. (1998) Speisefette im Vergleich: Zur physiologischen Wirkung
enthaltener Fettsäuren. Ernährungs-Umschau 45 (6) 192-197
JECFA (1996) Evaluation of certain food additives and contaminants. 46th report of the Joint
FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. WHO Technical Report Series. No. 868. World
Health Organisation, Geneva, 221 ff.
JECFA (1997) 49th report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. WHO
Technical Report Series. World Health Organisation, Geneva, 221 ff.
JECFA (1999) Safety evaluation of certain food additives. 51st meeting of the Joint FAO/WHO
Expert Committee on Food Additives. WHO Food Additive Series No. 42. World Health
Organisation, Geneva, p. 222
139
JECFA (2000) 55th report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. WHO
Technical Report Series. World Health Organisation, Geneva, p. 221 ff.
Junge, W.; Heymann, E. (1979) Characterisation of the Isoenzymes or Pig-Liver Esterase. 2.
Kinetic Studies. European Journal of Biochemistry 95, 519-525
Kakkar, T.; Mayersohn, M. (1998) Simultaneous quantitative analysis of methyl salicylate, ethyl
salicylate and salicylic acid from biological fluids using gas chromatography-mass spectrometry.
Journal of Chromatography B 718 No. 1, 69-75
Kamlet, M. J.; Doherty, R. M.; Abraham, M. H.; Taft, R. W. (1988) Solubility properties in
biological media.12. Regarding the mechanism of nonspecific toxicity or narcosis by organic
nonelectrolytes. Quantitative Structure-Activity Relationship 7, 71-8
Kaneko, T.; Wang, P.Y.; Sato, A. (1994) Partition coefficients of some acetate esters and
alcohols in water, blood, olive oil, and rat tissues, Occupational and Environmental Medicine 51
No. 1, 68-72
Katz, Morris H. (1967) Chemical structure and odor. Aromatic cyclic compounds, Food Product
Development 1 No. 5, 23-6, 28, 31-2
Kier, L. B.; Murray, W. J.; Hall, L. H. (1975) Molecular connectivity. 4. Relations to biological
activities. Journal of Medical Chemistry 18 No. 12, 1272-4
Kier, L. B.; Di Paolo, T.; Hall, L. H. (1977) Structure activity studies on odor molecules using
molecular connectivity, Journal of Theoretical Biology 67 No. 3, 585-95
Kleber, H.-P.; Schlee, D. (1987) Biochemie I - Allgemeine und funktionelle Biochemie. Gustav-
Fischer Verlag, Jena
Kleber, H.-P.; Schlee, D.; Schöpp, W. (1997) Biochemisches Praktikum. 5. Auflage, Gustav
Fischer Verlag Jena, 11
Knaak, J. B.; Al-Bayati, M. A.; Raabe, O. G. (1995) Development of partition coefficient, Vmax
and Km values and allometric relationships. Toxicology Letters 79, 87-98
Kolditz, L. Hrsg. (1993) Anorganikum. Lehr– und Praktikumsbuch der anorganischen Chemie
mit der Einführung in die physikalische Chemie, Band 2, 13. völlig neu bearbeitete Auflage,
Johann Ambrosius Barth Leipzig, Berlin, Heidelberg, Edition Deutscher Verlag der
Wissenschaften, 318 ff; 994 ff.
Koszinowski, J.; Piringer, O. (1987) Food/package compatibility and migration. Journal of
Plastic Film and Sheeting 3 No. 2, 96-111
Krebs, H. A.; Henseleit, K. (1932) Untersuchungen über die Harnstoffbildung im Tierkörper.
Hoppe-Seylers Zeitschrift der physikalischen Chemie 210, 33-66
Kromidas, S. (1995) Qualität im analytischen Labor. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim
Kunzek, H.; Gloyna, D. (2000) Die Richtigkeit von Untersuchungsergebnissen. Deutsche
Lebensmittelrundschau 96 No. 3, 107–115
Landois-Garza, J.; Hotchkiss, Joseph H. (1988) Permeation of high-barrier films by ethyl esters.
Effect of permeant molecular weight, relative humidity and concentration. American Cancer
Society, Symposium Series 365 (Food Package Interaction) 42-58
140
Lange, S.; Bender, R. (2001) Variabilitätsmaße. Deutsche Medizinische Wochenschrift 126 Nr.
15, T29-T30
Lange, L. G.; Bergmann, S. R.; Sobel, B. E. (1981) Identification of fatty acid ethyl esters as
products of rabbit myocardial ethanol metabolism. J. Biol. Chem. 256. 12968-12973
Laposata, M. (1997) Fatty acid ethyl esters: Short-term and long-term serum markers of ethanol
intake. Clinical Chemistry 43 No. 8 (B) 1527-34
Laposata, M. (1998) Fatty acid ethyl esters: Ethanol metabolites which mediate ethanol-induced
organ damage and serve as markers of ethanol intake. Progress in Lipid Research 37 No. 5,
307-16
Laposata, M. (1999) Fatty acid ethyl esters: Current facts and speculations. Prostaglandins,
Leucotriens and Essential Fatty Acids 60 No. 5&6, 313-315
Laposata, M. (1999a) Fatty acid ethyl esters: Nonoxidative Ethanol Metabolites with Emerging
Biological and Clinical Significans. Lipids 34 Supplement 281-285
Laposata, M.; Scherrer, D. E.; Lange, L. G. (1989) Fatty acid ethyl esters in adipose tissue. A
laboratory marker for alcohol-related death. Archives in Pathology Laboratory Medicine 113.
762-766
Laposata, M.; Szczepiorkowski, Z. M.; Brown, J. E. (1995) Fatty acid ethyl esters: non-oxidative
metabolites of ethanol. Prostaglandins, Leukotrienes, Essential Fatty Acids 52 No. 2&3, 87-91
Lauridsen, C.; Hedemann, M. S.; Jensen, S. K. (2001) Hydrolysis of tocopheryl and retinyl
esters by porcine carboxyl ester hydrolase is affected by their carboxylate moiety and bile acids.
Journal of Nutritional Biochemistry 12 (4) 219
Lee, X. P.; Kumazawa, T.; Sato, K.; Watanabe, K.; Seno, H.; Suzuki, O. (1998) Determination of
solvent thinner components in human body fluids by capillary gas chromatography with trapping
at low oven temperature for headspace samples, Analyst 123 No. 1, 147-50
Lehninger, A. L. (2001) Biochemie, 3. vollständig überarbeitete und erweitere Auflage, VCH
Verlagsgesellschaft mbH Weinheim New York, 153 ff.
Leuthardt, F. (1963) Lehrbuch der physiologischen Chemie, 15. neu bearbeitete Auflage, Walter
de Gruyter Verlag Berlin, 561 ff.
Lensink, M. F.; Mavri, J.; Berendsen, H. J. C. (1999) Simulation of Slow Reaktion with Quantum
Character: Neutral Hydrolysis of Carboxylic Ester. Journal of Computational Chemistry 20 No. 8,
886-95
Lindl, T.; Bauer, J. (1994) Zell- und Gewebekulturen, 3., überarbeitete Und erweiterte Auflage,
Gustav Fischer Verlag Stuttgart, 75
Lineweaver, H.; Burk, D. (1934 ) The determination of enzyme dissociation constants. Journal
of the American Chemical Society 56, 658-666
London, G. M. (1988) Organic Chemistry. The Benjamin - Cummings Publishing Company, Inc.,
Menlo Park, California, 834 ff.
Longland, R. C.; Shilling, W. H.; Gangolli, S. D. (1977) The hydrolysis of flavouring esters by
artificial gastrointestinal juices and rat tissue preparations. Toxicology 8 No. 2, 197-204
141
Lottspeich, F.; Zorbas, H. (1998) Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 49 ff.
Loudon, G. M. (1988) Organic Chemistry. 2nd Edition, Benjamin/Cummings Publishing Company
Inc. Menlow Park California, 833
Lowry, O. H.; Rosebrough, N. J.; Farr, A. L.; Randal, R. J. (1951) Protein measurement with the
foline phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193, 265-75
Miad-Kohnert, U. (2001) Lexikon der Ernährung. Band 1. Spektrum – Akademischer Verlag
Heidelberg, Berlin, 165, 427
Manautou, J.E.; Carlson, G. P. (1991) Ethanol-induced fatty acid ethyl ester formation in vivo
and in vitro in rat lung. Toxicology 70 No. 3, 303-12
March, J. (1985) Advanced Organic Chemistry – Reactions, Mechanisms and Structure,
International Student 3rd Edition, John Wiley and Sons, New York, 349 ff.
Markus, M.; Hess, B. (1975) The analysis of kinetic data in biochemistry. A critical evaluation of
methods. FEBS Letters 63 No. 2, 225 - 30
Massarrat, S. (1964) Tagesschwankungen der Enzymaktivitäten der Glutamat-oxalacetat-,
Glutamat-pyruvat-Transaminasen und Lactatdehydrogenase im Serum bei Leberkranken und
Gesunden. Klinische Wochenschrift 42, 91-4
McCarthy, T. J.; Witz, G. (1997), Strukture-activity relationships in the hydrolysis of acrylate and
methacrylate esters by carboxylesterase in vitro. Toxicology 116, 153-8
McClelland, R. A.; Santry, L. J. (1983) Reactivity of Tetrahedral Intermediates. Accounts of
Chemical Research. American Chemical Society 16, 394-99
McCracken, N. W.; Blain, P. G.; Williams, F. M. (1993) Nature and role of xenobiotic
metabolizing esterases in rat liver, lung, skin and blood. Biochemical Pharmakology 45 No. 1,
31-6
McCracken, N. W.; Blain, P. G.; Williams, F. M (1993a) Human xenobiotic metabolizing
esterases in liver and blood. Biochemical Pharmacology 46 No. 7, 1125-9
Means, G. E.; Bender, M. C. (1975) Acetylation of human serum albumin by p-nitrophenyl
acetate. Biochemistry 14, 4989-4994
Mentlein, R.; Heymann, E. (1984) Hydrolysis of ester- and amidetype drugs by the purified
isoenzymes of nonspecific carboxylesterases from the rat. Biochemical Pharmacology 33,
1243-48
Merck (2002) Produktbeschreibung Extrelut
Michaelis, L.; Menten, M. L. (1913) Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift.
Beiträge zur chemischen Physiologie und Pathologie 49, 333-69
Mills, G. A.; Walker, V.; Mughal, H. (1999) Headspace solid-phase microextraction with 1-
pyrenyldiazomethane in-fibre derivatisation for analysis of faecal short-chain fatty acids. Journal
of Chromatography B 730. 113-122
Minagawa, T., Kohno, Y., Suwa, T., Tsuji, A. (1995) Species differences in hydrolysis of
isocarbacylin methyl ester (TEI-9090) by blood esterases, Biochemical Pharmacology 49
No. 10, 1361-5
142
Mitzner, R.; Lemke, F. (1981) Basic hydrolysis of alkyl acetates. Wissenschaftliche Zeitschrift
der Pädagogischen Hochschule „Karl Liebknecht“ Potsdam 25 Nr. 5, 687-97
Montgomery, D C. et al. (1994) Applied Statistics and Probability for Engineers. John Wiley and
Sons. 309-310
Moriguchi, I.; Kanada, Y. (1977) Quantitative structure-activity studies, Part III. Use of van der
Waals volume in structure-activity studies. Chemical and Pharmaceutical Bulletin 25 No. 5,
926 - 935
Mosciano, G.; Long, J.; Holmgren, C.; Ahmedi, S. (1998) Organoleptic characteristics of flavor
materials, Perfumer and Flavorist 23 No. 3, 56
Moseley, J. D.; Staunton, J. (2000) Influence of ester chain lenght, enzyme, and physical
parameters on lipase-catalysed hydrolyses of meso-oxiranedimethanol esters. Part 2.
Tetrahedron: Asymmetry 11, 3197 - 209
Munro, I. C.; Shubik, P.; Hall, R. (1998) Principles for the safety evaluation of flavouring
substances. Food and Chemical Toxicology 36, 529-40
Mutch, E.; Blain, P. G.; Williams, F. M. (1992) Interindividual Variations in Enzymes Controlling
Organophosphate Toxicity in Man. Human and Experimental Toxicology 11, 109-16
Myers, R. C.; Tyler, T. R. (1992) Acute toxicological evaluation of ethyl propionate. Acute
Toxicological Data 1 No. 3, 174
Nayak, P. L.; Rout, Mahendra K. (1971) Influence of solvent composition on the rates of basic
hydrolysis of cinnamic esters. Journal of the Indian Chemical Society 48 No. 2, 141-4
Nayak, P. L.; Rout, Mahendra K. (1971) Influence of solvent composition on the rates of basic
hydrolysis of cinnamic esters. Journal of the Indian Chemical Society 48 No. 2, 141-4
Niyaz Khan, M.; Olagbemiro, T. O. (1982) Kinetic evidence for the occurrence of the
oxydianionic tetrahedral intermediates in the hydrolysis of methyl salicylate nad methyl o-
methoxybenzoate in a highly alkaline medium. Journal of Organical Chemistry 47, 3695 - 99
NC-IUMBM (16.02.2002) Recommendations of the Nomenclature Committee of the
International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUMBM) on the Nomenclature
and Classification of Enzyme-Catalysed Reactions
(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme)
Ohta, N.; Kurono, Y.; Ikeda, K. (1983) Esterase like activity of human serum. Journal of
Pharmaceutical Sciences 72, 385-388
Opdyke D. L. J. (1975) Monographs on fragrance raw materials. Food and Cosmetic Toxicology
1, 99–100; 5, 545-53, 849 (Suppl.)
Opdyke, D. L .J. (1978) Monographs on Fragrance Raw Materials, Food and Cosmetics
Toxicology, Suppl. 1, 16, 731-91
Opdyke, D. L. J. (1979) Monographs on Fragrance Raw Materials, Food and Cosmetics
Toxicology, Suppl. 1, 17, 781-3
Opdyke, D. L. J. (1981) Monographs on Fragrance Raw Materials, Food and Cosmetics
Toxicology, Suppl. 1, 19, (2) 237-54
143
Opdyke, D. L. J. (1982) Monographs on Fragrance Raw Materials, Food and Cosmetics
Toxicology, Suppl. 1, 26, 321
Otto, P.; Schmidt, E.; Schmidt, F. W. (1964) Enzymspiegel im Serum bei körperlicher Arbeit und
ambulanten Patienten. Klinische Wochenschrift 42, 75
Peter, G. (1972) Klinische Chemie, Studienlehrbuch Medizin 16, Kurzlehrbuch und Kommentar
zum Gegenstandskatalog für den 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Rathgeber Verlag
München, 7 f.
Plata, J.; Orte, J. C.; Martinez, F.; Thomas, J. (1990) GLC of salicylic acid, methyl and ethyl
salicylates. Analysis 18. 146-47
Provencher, L.; Jones, J. B. (1994) A concluding specification of the dimension of the active site
model of pig liver esterase. Journal of Organic Chemistry 59, 2729-2732
Provencher, L.; Wynn, H.; Jones, J. B. (1994a) Enzymes in organic synthesis 51. Probing the
dimensions of the large hydrophobic pocket of the active site of pig liver esterase. Tetrahedron:
Asymmetry 4 (9) 2025-2040
Pschyrembel (2001) Klinisches Wörterbuch, 259. komplett überarbeitete, erweiterte,
aktualisierte Auflage, Walter de Gruyter Verlag, Berlin New York, 216
Qinn, D. M.; Medhekar, R.; Baker, N. R. (1999) „Chapter 5: Ester Hydrolysis“ in Comprehensive
Natural Products Chemistry. 5 Enzymes, Enzyme Mechanism, Proteins and Aspects of NO
Chemistry (Poulter, C. D.; Ed.) Elsevier Science , Oxford UK pp. 101-137
Radhakrishnamurti, P. S.; Patra, P. C. (1970) Conformational studies in ester hydrolysis.
Proceedings of Indian Acad. Sci., Sect. A 71 No. 4, 181-8
Rainsford, K. D.; Ford, N. L. V.; Brooks, P. M.; Watson, H. M. (1980) Plasma aspirin esterase in
normal individuals, patients with alcohol liver disease and rheumatoid arthritis. Characterisation
and the importance of enzymatic components. European Journal of Clinical Investigation 10,
413-420
Rakshit, S. C.; Datta, S. (1976) Role of water in the mechanism of hydrolysis of cinnamic esters.
Journal of the Indian Chemical Society 53 No. 11, 1104-7
Rakshit, S. C.; Datta, S. (1979) Kinetic of hydrolysis of substituted cinnamic esters. Indian
Journal of Chemistry 17A, 406 – 409
Rakshit, S. C.; Datta, S.; Mukherjee, Bani (1981) Extremal properties in kinetic studies. Journal
of the Indian Chemical Society 58 No. 8, 750-753
Randebrock, R. (1986) Geruch und Konstitution. Eine Beweisführung für die Molekulartheorie
des Geruches. Teil IV. Parfümerie und Kosmetik 67. 10 ff.
Rapoport, M. (1987) Medizinische Biochemie. VEB Verlag Volk und Gesundheit Berlin, 121 ff.,
143 ff., 540 ff.
Renger, B.; Jehle, H.; Fischer, M.; Funk, W. (1994) Validierung von Analysenverfahren in der
pharmazeutischen Analytik. Pharm. Ind. 56 No. 11, 993-1000
Renner, H. W. (1986) The antiplastogenic potential of fatty acid methyl esters. Mutation
Research 172, 265-269
144
Richtlinie des Rates zur Angleichung der Rechtsvorschriften der Mitgliedsstaaten über Aromen
zur Verwendung in Lebensmitteln und über Ausgangsstoffe für ihre Herstellung (88/388/EWG)
vom 22.06.1988
Rick, W. (1990) Klinische Chemie und Mikroskopie. 6. überarbeitete Auflage, Springer Verlag
Berlin, 8 f.
Riley, D. J. S.; Kyger, Erich M.; Spilburg, Curtis A.; Lange, Louis G. (1990) Pancreatic
cholesterol esterases. 2. Purification and characterisation of human pancreatic fatty acid ethyl
ester synthase. Biochemistry 29 No. 16, 3848-52
Robbi, M.; Beaufay, H. (1983) Purification and characterization of various esterases from rat
liver. European Journal of Biochemistry 137. 293-301
Römpp-Lexikon Chemie, Hrsg.: Falbe, J.; Regitz, M. (1977) Band 2, 9. Auflage, Georg Thieme
Verlag
Römpp-Lexikon Chemie, Hrsg.: Falbe, J.; Regitz, M. (1977) Band 2, 10. völlig überarbeitete
Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1837 f.
Rösch, N. (1993) Mathematik für Chemiker – Eine Einführung. Springer - Verlag Berlin
Heidelberg, 360
Rood, D. (1999) A Practical Guide to the Care, Maintenance, and Troubleshooting in Capillary
Gas Chromatographic Systems. Wiley-VCH Verlag
Rosenberry, T.L. (1975) Catalysis by acetylcholinesterase. Evidence that the rate-limiting
step for acylation with certain substrates precedes general acid-base catalysis, Proceedings of
the National Academy of Sciences of the USA 72 No. 10, 3834-3838
Rossiter, K. (1996) Quantitative relationships between structure and the fruity odor of esters.
Perfumer and Flavorist 21 No. 2, 33-6, 38-40, 42-4, 46
Ruzicka, V.; Cerveny, L.; Prochazka, J. (1970) Effect of the structure of esters on their pyrolysis
rate. Sbornik-Vysokè skoly chemicko-technologickè v Praze, Organickà chemie a technologie
15, 69-84
Sachs, L. (2002) Angewandte Statistik – Anwendungen statistischer Methoden. 10. Auflage,
Springer-Verlag Berlin Heidelberg
Saghir, M.; Blodget, E.; Laposata, M. (1999) The Hydrolysis of Fatty Acid Ethyl Esters in Low-
Density Lipoproteins by Red Blood Cells, White Blood Cells and Platelets. Alcohol 19 No. 2,
163-168
Saghir, M.; Werner, J.; Laposata, M. (1997) Rapid in vivo hydrolysis of fatty acid ethyl esters,
toxic nonoxidative ethanol metabolites. Research Communications in Alcohol and Substances
of Abuse 20, No. 3 & 4, 123-33
Saghir, M.; Werner, J.; Laposata, M. (1999) A comparison of the hydrolysis and metabolism in
rats of fatty acid ethyl esters within human low density lipoproteins and rat density lipoproteins.
Research Communications in Alcohol and Substances of Abuse 20, No. 3 & 4, 123-33
Saleh, R. M.; Sandulescu, D. (1982) Structure effects of alkyl group on kinetics of hydrolysis
reactions. Egyptian Journal of Chemistry 24 No. 4–6, 249 – 56
145
Salter, L. J.; Mottram, D. S.; Whitfield, F. B. (1988) Volatile Componds Produced in Maillard
Reactions Involving Glycine, Ribose and Phospholipids. Sci. Food Agric. 46, 227-2421
Sanders, T.; Sandaradura, S.; Slattery, F. (1993) Influence of ethyl myristate palmitate and
oleate on plasma lipoprotein metabolism in the hamster, Scientific Meeting of the Nutrition
Society, Nottingham, England, UK, July 12 - 15, 1993. Proceedings of the Nutrition Society 52
No. 3, 364A.
Satoh, T.; Hosokawa, M. (1998) The Mammalian Carboxylesterases: From Molecules to
Function. Annual Rev. Pharmacol. Toxicol. 38, 257-88
Savary, P.; Constantin, M. J. (1970) Intestinal hydrolysis and lymphatic absorption of isopropyl
esters of long - chain fatty acids in the rat. Biochimica et Biophysica Acta 218 No. 2, 195-200
Savary, P. (1972) Action of rat pancreatic juice and of purified pig pancreatic lipase upon the
esters of short-chain aliphatic monoacids and long-chain primary monoalcohols. Biochimica et
Biophysica Acta 270, 463-71
Schäfer, S. G.; Marquardt, H. - Hrsg. (2004) Lehrbuch der Toxikologie. BI Wissenschaftsverlag
Mannheim Leipzig Wien Zürich, 36, 35 f., 69 f.
Schellenberger, A. (1989) Enzymkatalyse. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 72 ff.
Schenk, M. (1990) Grundriss der physiologischen Chemie. 8. überarbeitete Auflage, Gustav
Fischer Verlag, 101 f., 386
Schomburg, D. ed. (1991) The Enzyme Handbook. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 1
Scientific Committee on Food (SCF) Practical Guidelines for Mutagenicity and Hydrolysis
Testing requested by the SCF, 2.1.2
Sell, C. S. (1986) Dependence of fruity notes on the molecular structure. Seifen, Öle, Fette,
Wachse 112 No. 8, 267-70
Semino, G. (1997) Application of the safety evaluation procedure to representative groups of
flavouring substances. Rivista Italiana EPPOS, Spec. Num., 86–95
Shmunes, E. (1993) Solvents and plasticizer. Occupational Skin Disease. Adams, R. M., Editor;
Grune and Stratton, New York, 279-97, 439-61
Sigma-Aldrich (2001-02), Flavors & Fragrances Katalog, International Edition, Taufkirchen,
Deutschland
Silverman, R.B. (1995) Medizinische Chemie. VCH Verlagsgesellschaft mbH Weinheim, New
York, 332
Smith, M. J. H. (1966) The Salicylates. A critical bibliographic review. John Wiley and Sons,
New York, London, Sydney
Soderberg, B. L.; Sicinska, E. T.; Blodget, E.; Cluette-Brown, J. E.; Suter, P. M.; Schuppisser,
T.; Vetter, W.; Laposata, M. (1999) Preanalytical Variables Affecting the Quantification of Fatty
Acid Ethyl esters in Plasma and Serum samples. Clinical Chemistry 45 No. 12, 2183-90
Solbach, H.-G.; Merten, R. (1965) Altersabhängige Änderungen von Enzymaktivitäten im Blut,
Mitteilungen der GBK II, 389-91
146
Stoops, J. K.; Horgan, D. J.; Runnegar, M. T. C.; de Jersey, J.; Webb, E. C.; Zerner, B. (1969)
Carboxylesterases (EC 3.1.1). Kinetic Studies on Carboxylesterases. Biochemistry 8 No. 5,
2026-33
Streitwieser, A.; Heathcock, C.H. (1994) Organische Chemie. 2. Auflage, VCH
Verlagsgesellschaft Weinheim, 530
Südhof, H.; Wötzel, E. (1960) Über die Haltbarkeit von zur Enzymaktivitätsbestimmung
vorgesehener Serumproben, Klinische Wochenschrift 38, 1165-67
Szczepiorkowski, Z. M.; Dickersin, G. R.; Laposata, M. (1995) Fatty Acid Ethyl Esters Decrease
Human Hepatoblastoma Cell Proliferation and Protein Synthesis. Gastroenterology 108, 515-22
Taft Jr., R.W. (1951) Polar and steric substituent constant for aliphatic and o-benzoate groups
from rates of esterification and hydrolysis of esters. Journal of the American Chemical Society
74, 2729-2732
Taft Jr., R.W. (1951) Linear free energy relationship from rates of esterification an hydrolysis of
aliphatic and o-substituted benzoate esters. Journal of the American Chemical Society 74,
3120-3128
Tanii, H.; Hashimato, K. (1982) Structure-toxicity relationships of acrylates and methacrylates,
Toxicology Letters 11, 125-129
Taylor, S. L.; Dormedy, E. S. (1998) The role of flavouring substances in food allergy and
intolerance. Advances in Food an Nutrition Research 42, 1-44
Teruya, J.; Cluette-Brown, J.; Szczepiorkowski, Z. M.; Laposata, M. (1995) Mode of transport of
fatty acid to endothelial cells influences intracellular fatty acid metabolism. Journal of Lipid
Research 36. 266-276
Toennes, W.S.; Kauert, G. (1999) Vacutainer mit Fluorid/Oxalat zur Blutentnahme für die
forensische-toxikologische Analytik, 8 - 14
Toone, E. J.; Werth, M. J.; Jones, J. B. (1990) Active Site Model for interpreting and predicting
the specificity of pig liver esterase. Journal of the American Chemical Society 112. 4946-4952
Trotta, F.; Maraglio, G.; Rapposelli, A. (1995) The effect of cyclodextrin on the hydrolysis of
carboxylic acid. Journal of Inclusion Phenomena and Molecular Recognition in Chemistry 20.
353-361
US Pharmacopoedia. The United States Pharmacopoeia XXII. Inc. US Pharmacopoeia
Convention, Twinbrook Parkway, Rockville, MD. 1990
Verordnung (EG) Nr. 2232/96 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 28.10.1996
zur Festlegung eines Gemeinschaftsverfahrens für Aromastoffe, die in oder auf Lebensmitteln
verwendet werden oder verwendet werden sollen
Verordnung (EG) Nr. 1565/2000 der Kommission vom 18.07.2000 zur Festlegung der
Maßnahmen, die für die Verabschiedung eines Bewertungsprogramms gemäß der Verordnung
(EG) Nr. 2232/96 des Europäischen Parlaments und des Rates erforderlich sind
Verordnung (EG) Nr. 622/2002 der Kommission vom 11.04.2000 zur Festsetzung von Fristen
für die Einreichung von Informationen zwecks Bewertung chemisch definierter Aromastoffe, die
in oder auf Lebensmitteln verwendet werden
147
Verordnung über die Kennzeichnung von Lebensmitteln (LMKV - Lebensmittel-Kennzeich-
nungsverordnung) vom 15.12.1999 in der aktuellen Fassung vom 13.01.2004
Vinnik, M.I.; Librovich, N.B. (1976) Hydrolysis of ethyl isovalerate in aqueous hydrochloric and
sulfuric acid solutions. Bulletin of the Academy of Sciences of the USSR Division of Chemical
Science 25, 1415
Vollhardt, K. P. C., Schore, N. E. (1995) Organische Chemie. 2. Auflage, VCH
Verlagsgemeinschaft mbH, Weinheim, 202, 830
Walker, C. H.; Mackness, M. I. (1983) Esterases: Problems of Identification and Classification.
Biochemical Pharmacology 32 No. 22, 3265-69
Waynforth, H. B.; Flecknell, P. A. (1992) Experimental and Surgical Technique in the Rat. 2nd
edition, Academic press Inc. London, Ltd., p. 342
Werner, J.; Laposata, M.; Fernández-Del Castillo, C.; Saghir, M.; Iozzo, R. V.; Lewandrowski, K.
B.; Warshaw, A. L. (1997) Pancreatic injury in rats induced by fatty acid ethyl esters, a
nonoxidative metabolite of alcohol. Gastroenterology 113. 286-294
WHO (1987) Principles for the Safety Assessment of Food Additives and Contaminants in Food.
WHO Environmental Health Criteria. International Program on Chemical Safety in Cooperation
with the Joint FAO (Food and Agriculture Organisation of the United Nations). Environmental
Health Criteria 70. WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA), Geneva
Williams, A. (1989) Concerted Mechanism of Acyl Group Transfer Reactions in Solution. Acc.
Chem. Res. American Chemical Society 22, 387-92
Williams, F. M (1985) Clinical Significance of Esterases in Man. Clinical Pharmacokinetics 10,
392-403
Wiliams, F. M.; Mutch, E. M.; Nicholson, E.; Wynne, P.; Wright, D.; Lambert, D.; Rawlins (1989)
Human liver and plasma aspirin esterase. Journal of Pharmacy and Pharmacology 41, 407-9
Wilson, L.Y.; Famini, G.R. (1991) Using theoretical descriptors in quantitative structure-activity
relationships: some toxicological indices. Journal of Medical Chemistry 34 No. 5, 1668-74
Yan, B.; Matoney; L. (1999) Human carboxylesterases in term placentae. Placenta 20, 599
Zollner, H. (1999) Handbook of enzyme inhibitors. Wiley-VCH Weinheim New York, 3rd revised
and enlarged edition, 324 ff., 557 f., 1051 ff., 2021-25, 2747
149
Anhang
I Eigenschaften und Verwendung von ausgewählten
Carbonsäureestern
Tab. 27: Organoleptische Eigenschaften, Vorkommen und Verwendung von Carbonsäureestern in
Lebensmitteln
Ethylpropionat
Organoleptik
süß, fruchtig, etherisch, aromatisch (Mosciano, 1998; Sigma-Aldrich 2001-02, S. 43; Geruch erinnert an Rum und Ananas
(Fenaroli 1995, S. 265)
Status
ADI von 1 mg /kg (COE 1974 No. 402, p. 207; FEMA No. 2456; Myers, 1988)
Vorkommen [mg /kg]
(CIVO-TNO 1991, S. 370)
Apfelsaft (0,01 - 0,4), Armagnac (0,8 – 46), Arrack (2), Bergpapaya/Carica pubescens (< 0,01), Bier (0,01 - 1,0), Bourbon Whisky
(0,8 - 1,0), Cider/Apfelwein (0,2), Cognac (0,3 – 40), Erdbeere/Fragaria species (0,01 - 0,1), Grapefruit Schalenöl (Spuren), Guave
/Psidium guajava L. (< 0,01 - 0,05), Irish Whisky (0,06 - 0,8), Kanadischer Whisky (0,04 - 0,8), Kiwifrucht/Actinidia chinensis
Planch. (0,008 - 0,1), Malt Whisky (1 - 4,4), Mandarinensaft/C. reticulata (Spuren), Miesmuschel (0,14), Parmesan (< 0,01),
Passionsfruchtsaft/purpurrot (< 0,1), Rotwein (Spuren – 20), Rum (Kategorie 2) 7 ( 50), Scotch Blended Whisky (0,4 – 6), Sherry
(0,27), Sparkling Wein/Schaumwein (0,5 - 2,5), Tomate (1,6 - 2,3), Weinbrand (0,4 – 79), Weißwein (0 - 0,9)
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 265)
Backwaren (84,72), Fette, Öle (0,10), Tiefgekühlte Milchprodukte (49,47), Fleischwaren (1,5), Weichbonbon (53,52), Gelatine,
Pudding (33,66), Alkoholfreie Getränke (19,92), Alkoholische Getränke (83,47), Soßen (4,00), Hartbonbon (77,04), Kaugummi
(678,7)
Ethylvalerat
Organoleptik
fruchtig, apfelartig (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 44; Fenaroli 1995, S. 272),Primärgeschmack: bittersüß; Aromatyp: Apfel, Banane
(Fenaroli 1995, S. 805)
Status
(COE 1974 No. p. ; FEMA No. 2462)
Vorkommen [mg/kg]
(IVO-TNO 1991, S. 351)
Apfelsaft (Spuren), (Bergpapaya/Carica pubescens (< 0,01), Guave/Psidium guajava L. (< 0,01), Kiwifrucht/Actinidia
chinensis/lanch. (Spuren), Parmesan (0,01 - 0,05), Passionsfruchtsaft/purpurrot (< 0,1), Portwein (Spuren), Rotwein (5,0 - 10,0),
Rum/Kategorie 2 (40), Weinbrand (0,1), Weißwein (1,3)
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 272)
Backwaren (39,71), Tiefgekühlte Milchprodukte (14,03), Weichbonbon (29,63), Gelatine, Pudding (13,64
Alkoholfreie Getränke (7,99), Alkoholische Getränke (3,93), Hartbonbon (16,95), Kaugummi (103,1)
7Rum (Kategorie 2): total volatiles 1100-3600 ppm
150
Fortsetzung Tab. 27
Ethylisovalerat
Organoleptik
streng, fruchtig, an Apfel erinnernd in Verbindung mit süßem Geschmack (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 40; Fenaroli 1995, S. 243),
Primärgeschmack: süß; Aromatyp: Apfel (Fenaroli 1995, S. 805)
Status
Level8 von 30 mg /kg (COE 1974, No. 442, p. 216; FEMA No. 2463)
Vorkommen [mg/kg]
(CIVO-TNO 1991, S. 228
Apfelsaft (0,9 - 3,5), Ananas/Ananas comosus (0,4), Bergpapaya/Carica pubescens (< 0,01), Bier (0,01), Cider/Apfelwein) (4),
Cognac (0,1), Erdbeere/Fragaria species (0,01 - 0,3), Heidelbeere/Vaccinium myrtillus L. (0,001 - 0,06), Mango/roh (0 - 0,01),
Miesmuschel (0,07), Orangensaft/C. sinensis L. Osbeck (0,01), Parmesan (0,01 - 0,05), Portwein (Spuren), Rotwein (0,01 - 0,11),
Rum/(Kategorie 2 (2,5), Sherry (0,29), Sparkling Wein/Schaumwein (0,01 - 0,16), Weinbrand (0,2 - 0,8), Weißwein (0,01 - 0,06)
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 243)
Backwaren (80,0), Frühstückscerealien (0,022), Milchprodukte (1,0), Käse (13), Tiefgefrorene Milchprodukte (13,0), Fruchtsaft (10),
Fruchteis (25), Fleischwaren (0,10), Weichbonbon (100), Zuckerwaren, Zuckerglasur (25), Marmelade (100,0), Gelatine, Pudding
(50,0), Snacks (2,0), Alkoholfreie Getränke (97), Alkoholische Getränke (3,3), Hartbonbon (13,08), Kaugummi (98,0), Gewürze (30)
Ethylheptanoat
Organoleptik
weinartig, fruchtig, Geruch und Geschmack erinnern an Cognac (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 39; Fenaroli 1995, S. 234)
Status
ADI von 1 mg /kg (COE 1974 No. 365, p. 202; FEMA No. 2437)
Vorkommen [mg/kg]
(CIVO-TNO 1991, S. 289)
Apfel, roh (0,05), Bier (0,03), Birnenbrandy (Spuren), Bourbon Whisky (< 0,8), Cognac (0,04), Grapefruitsaft/C. paradisis (0,001),
Irish Whisky (0 - 0,8), Malt Whisky (< 0,8), Parmesan (< 0,01), Passionsfruchtsaft/purpurrot (< 0,1), Portwein (Spuren),
Rum/Kategorie 2 (2,5), Scotch Blended Whisky (< 0,8), Weinbrand (0 - 1,2)
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 234)
Backwaren (41,74), Käse (13,07), Tiefgekühlte Milchprodukte (29,84), Weichbonbon (37,60), Gelatine, Pudding (52,41),
Alkoholfreie Getränke (13,81), Alkoholische Getränke (13,96), Hartbonbon (814,62), (Kaugummi (248,4)
Ethylundecanoat
Organoleptik
Geruch und Geschmack erinnern an Cognac und Kokosnuss (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 42; Fenaroli 1995, S. 271)
Status
(COE 1974 No. p. ; FEMA No. 3492)
Vorkommen
(CIVO-TNO 1991, S. 413)
Bourbon Whisky (0,8), Malt Whisky (< 0,8), Scotch Blended Whisky (< 0,8), Rum/Kategorie 3)9 (0,1),
Verwendung
(Fenaroli 1995, S. 271)
Alkoholfreie Getränke (2,0), Tiefkühldesserts (8,0), Zuckerwaren, Zuckerglasur (16,00), Alkoholische Getränke (8,0)
8 Level, that may be added to foodstuffs without hazard to public health
9 Rum (Kategorie 3): total volatiles 240-1100 ppm
151
Fortsetzung Tab. 27
Ethylmyristat
Organoleptik
mild wachsig, seifig (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 44), Geruch erinnert an Schwertlilie (Fenaroli 1995, S. 256)
Status
Level10 von 30 mg /kg (COE 1974, No. 385, p. 205; FEMA No. 2445)
Vorkommen [mg/kg]
(CIVO-TNO 1991, S. 400)
Armagnac (0,8), Bergpapaya/Carica pubescens (< 0,01), Birnenbrandy (Spuren), Bourbon Whisky (0,8 – 7,8), Brombeerbrandy
(0,7), Cognac (0,2 – 6), Guave/Psidium guajava L. (0,0004 - 0,14), Irish Whisky (0,14 – 2,6), Japanischer Whisky (Spuren - 1,5),
Kanadischer Whisky (0,3 – 0,8), Kokosnuss/(Cocos nucifera L. (< 0,1), Malt Whisky (0,3 – 3,7), Mango/roh (0 - 0,25), Muscat
Traube (0,1 – 0,6), Ouzo (0 - 0,04), Parmesan (< 0,01), Portwein (Spuren), Rum (Kategorie 1)11 (1,0 – 6,0), Rum/Kategorie 2
(1,0 - 2,0), Rum/Kategorie 3 (Spuren - 0,9), Scotch Blended Whisky (0,6 – 5,2), Sparkling Wein/Schaumwein (0,2 – 18), Weinbrand
(0,09 – 1,2)
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 256)
Backwaren (154,8), Tiefgekühlte Milchprodukte (195,1), Weichbonbon (156,1), Gelatine, Pudding (157,5), Alkoholfreie Getränke
(52,52), Alkoholische Getränke (30,00), Hartbonbon (28,78), Kaugummi (0,56)
Ethyltiglat
Organoleptik
fruchtig, caramelartig (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 44)
Status
empfohlenen Maximalkonzentration in Verbrauchererzeugnissen von 0,5 % (Ford, 1988), (COE 1981 No. 2185 p. 274;
FEMA No. 2460)
Vorkommen [mg/kg]
(CIVO-TNO 1991, S. 235)
Naranjilla Frucht (k. A.), (Solanum quitoense Lam. (k. A.), Sternfrucht (k. A.), (Averrhoa carambola L. (k.A.)
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 271)
Backwaren (35,00), Tiefgekühlte Milchprodukte (9,90), Weichbonbon (25,00), Gelatine, Pudding (15,00), Alkoholfreie Getränke
(7,00), Hartbonbon (0,84), Kaugummi (0,64)
Benzyltiglat
Organoleptik
pilzartiger Geruch mit rosenartigem Unterton (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 12)
Status
(FEMA No. 3330)
Vorkommen [mg/kg]
(CIVO-TNO 1991, S. 235)
Gewürznelke /Eugenia caryophyllata Thunberg (Spuren)
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 66)
Backwaren (8), Speisewürze (8)
10 Level, that may be added to foodstuffs without hazard to public health
11 Rum (Kategorie 1): total volatiles > 3600 ppm
152
Fortsetzung Tab. 27
Benzylsalicylat
Organoleptik
schwach süßer Geruch (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 12), Primärgeschmack: süß; Aromatyp: Himbeere (Fenaroli 1995, S. 803)
Status
(FEMA No. 2151)
Vorkommen [mg/kg]
(CIVO-TNO 1991, S. 216)
Amerikanische Preiselbeere/. macrocarpon (k .A.), Gewürznelke/ Eugenia caryophyllata Thunberg (k. A.), Pfefferminzöl/Mentha
piperita (k. A.)
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 66)
Backwaren (16,02), Tiefgekühlte Milchprodukte (4,12), Weichbonbon (6,15), Gelatine/Pudding (17,51), Alkoholfreie Getränke
(2,70)
Benzylphenylacetat
Organoleptik
süßer, blumiger (Jasmin, Rose) Geruch, leicht honigartiger Geschmack, (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 12;
Fenaroli 1995, S. 64)
Status
(FEMA No. 2149)
Vorkommen [mg/kg]
unbekannt
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 64)
Backwaren (14,82), Fette, Öle (0,109, Tiefgekühlte Milchprodukte (12,039, Weichbonbon (18,99), Gelatine, Pudding (14,699,
Alkoholfreie Getränke (4,249), Alkoholische Getränke (3,00), Kaugummi (7,49)
Ethylphenylacetat
Organoleptik
Geruch angenehm, streng, süß, an Honig erinnernd, bittersüßer Geschmack, (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 43; Fenaroli 1995, S.
263), Primärgeschmack: bittersüß; Aromatyp: Honig (Fenaroli 1995, S. 805)
Status
(COE 1970 No. 169 p. 101; FEMA No. 2452)
Vorkommen [mg/kg]
(CIVO-TNO 1991, S. 197)
Grapefruitsaft/C. paradisis (0,003), Armagnac (< 0,8), Bergpapaya/Carica pubescens (< 0,01), Birnenbrandy (Spuren),
Botrytisierter Wein/Trockenbeerenauslese (0,01), Cider/Apfelwein (0,02), Cognac (0,02 - 0,8), Guave/Psidium guajava L. (0,01 -
0,25), Kakao (0,1), Papaya/Carica papaya (0,002), Portwein (0,2 – 2), Rotwein (Spuren - 0,02), Weinbrand (0 - 0,8), Weißwein
(Spuren - 0,01)
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 263)
Backwaren (18,57), Tiefgekühlte Milchprodukte (9,84), Weichbonbon (13,53), Gelatine, Pudding (12,62), Alkoholfreie Getränke
(5,20), Alkoholische Getränke (5,00), Hartbonbon (20,32)
153
Fortsetzung Tab. 27
Ethylcinnamat
Organoleptik
süß, honigartig, balsamisch, pflaumenartig, zimtartig (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 37), Primärgeschmack: süß; Aromatyp: Aprikose,
Pfirsich (Fenaroli 1995, S. 805)
Status
(FEMA No. 2430)
Vorkommen
(CIVO-TNO 1991, S. 242)
Bier (< 0,01), Erdbeere/Fragaria species (0,02 - 0,05), Gewürznelke (Spuren), Kakao (Spuren - 1,1), Rotwein (0 - 0,008), Weißwein
(0,06)
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 222)
Backwaren (54,36), Tiefgekühlte Milchprodukte (41,26), Fleischwaren (20,00), Zuckerwaren/Zuckerglasur (20,00), Weichbonbon
(47,95), Gelatine/Pudding (19,73), Alkoholfreie Getränke (20,88), Alkoholische Getränke (31,61), Kaugummi (9,82)
Methyloctanoat
Organoleptik
grün, fruchtig (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 84)Geruch kraftvoll, weinartig, fruchtig, nach Orange; ölig und nach Orange schmeckend
(Fenaroli 1995, S. 534)
Status
(FEMA No. 2728)
Vorkommen [mg/kg]
(CIVO-TNO 1991, S. 340)
Apfel/roh (0,002), Gewürznelke (Spuren), Ananas/Ananas comosus (0,8), Bergpapaya/Carica pubescens (0,3 - 0,8), Birnenbrandy
(Spuren), Cider/Apfelwein (0,02), Erdbeere/Fragaria species (0,01 - 0,1), Guave/Psidium guajava L. (0,05 - 1,25), Kohlrabi
(Spuren), Kokosnuß/Cocos nucifera L. (0,1), Miesmuschel (0,14), Papaya/Carica papaya (0,0002), Parmesan (< 0,01), Portwein
(Spuren) Rum/Kategorie 2 (0,1), Schwarzer Tee (3,0 - 8,09, Weinbrand (0 - 0,3)
Verwendung [mg/kg]
(Fenaroli 1995, S. 534)
Backwaren (34,12), Tiefgekühlte Milchprodukte (20,46), Weichbonbon (25,13), Gelatine, Pudding (21,48), Alkoholfreie Getränke
(6,94), Alkoholische Getränke (1,00)
Isoamylbutyrat
Organoleptik
fruchtig, aprikosenartig, nach Ananas, Banane (Sigma-Aldrich 2001-02, S. 61) strenger, charakteristischer, fruchtiger (birnenartig)
Geruch; süß (Fenaroli 1995, S. 377)
Status
(FEMA No. 2060)
Vorkommen
(CIVO-TNO 1991, S. 340)
Apfel /roh (0,003), Bergpapaya/Carica pubescens (0,01 - 0,05), Erdbeere/Fragaria species (0,01 - 0,05), Guave/Psidium guajava L.
(0,01 - 0,25), Kumquat Schalenöl/Fortunella species (60), Mango/roh (0 - 0,05), Muscat Traube (0,1), Parmesan (< 0,01),
Rum/Kategorie 2 (1,5), Tomate (0,2)
Anwendung
(Fenaroli 1995, S. 377)
Backwaren (36,02), Tiefgekühlte Milchprodukte (25,20), Weichbonbon (24,44), Gelatine/Pudding (25,91), Alkoholfreie Getränke
(69,24), Alkoholische Getränke (20,00), Hartbonbon (42,14), Kaugummi (376,7)
154
Tab. 28: Verwendung von ausgewählten Carbonsäureestern in kosmetischen Mitteln
Konzentrationen [%] Mittelwert (Maximum)
Substanz Seife Detergenzien Cremes /Lotions Parfum Referenz
Ethylpropionat 0,01 (0,01) 0,001 (0,01) 0,005 (0,03) 0,08 (0,4) • COE (1974) No. 402, p. 207
• FEMA (1965) No. 2456
• Opdyke (1978), S. 749
Ethylisovalerat 0,01 (0,06) 0,001 (0,006) 0,005 (0,02) 0,08 (0,2) • COE (19784) No. 442, S. 216
• FEMA (1965) No. 2463
• Opdyke (1978), S. 743
Ethylheptanoat 0,005 (0,05) 0,001 (0,01) 0,003 (0,02) 0,04 (0,4) • COE (1974) No. 365, p. 202
• FEMA (1965) No. 2437
• Opdyke (1981), S. 247
Ethylmyristat 0,03 (0,3) 0,003 (0,03) 0,015 (0,1) 0,2 (1,2) • COE (1974) No. 385, S. 205
• FEMA (1965) No. 2445
• Opdyke (1978), S. 745
Ethylphenylacetat 0,05 (0,2) 0,005 (0,02) 0,01 (0,05) 0,2 (0,8) • COE (1970) No. 169, p. 101
• FEMA (1965) No. 2452
• Opdyke (1975)
155
II Messdaten und Validierungsparameter GC-Analytik
Tab. 29: Messdaten - Ethylester
Konzentration [10-6 mol /L]
Substrat / Analyt Ethylpropionat / Propionsäure / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
4 40.0 ± 8.2 45.8 ± 4.1 48.6 ± 0.9 69.0 ± 4.9 84.0 ± 14.5 85.0 ± 11.8 111.2 ± 7.4
8 64.4 ± 3.1 87.2 ± 2.1 105.6 ± 13.2 129.1 ± 8.3 144.5 ± 13.3 169.8 ± 4.9 211.6 ± 5.5
12 95.7 ± 8.7 124.2 ± 15.3 164.1 ± 6.7 184.4 ± 6.8 200.8 ± 22.2 234.5 ± 10.3 291.3 ± 12.6
16 112.6 ± 3.9 165.9 ± 3.1 193.5 ± 26.8 233.3 ± 3.4 288.7 ± 37.1 313.8 ± 6.3 368.3 ± 10.5
20 127.4 ± 6.2 184.0 ± 9.1 246.7 ± 6.0 283.7 ± 7.9 340.4 ± 24.6 369.5 ± 8.7 452.2 ± 11.3
NWG Analyt / BG Analyt: 2.60 µM / 7.80 µM
Substrat / Analyt Ethylvalerat / Valeriansäure / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
2 34.2 ± 7.9 42.4 ± 4.5 53.9 ± 7.0 65.5 ± 10.4 66.0 ± 8.3 70.5 ± 8.5 77.7 ± 6.5
4 63.0 ± 7.1 83.7 ± 10.9 104.5 ± 3.8 117.0 ± 3.3 125.7 ± 4.6 131.7 ± 7.0 178.2 ± 38.8
6 85.7 ± 14.7 125.6 ± 3.0 153.6 ± 11.9 175.4 ± 4.4 197.7 ± 10.5 210.8 ± 4.0 223.1 ± 10.6
8 107.2 ± 12.4 168.1 ± 17.9 204.5 ± 11.8 232.4 ± 6.9 248.8 ± 10.5 275.6 ± 8.8 316.5 ± 28.6
10 130.5 ± 6.6 207.0 ± 13.0 249.5 ± 10.7 302.7 ± 17.8 308.0 ± 7.5 343.1 ± 14.9 403.6 ± 17.5
NWG Analyt / BG Analyt: 4.83 µM / 14.49 µM
Substrat / Analyt Ethylheptanoat / Heptansäure / Plasma-Pool: (h) 014.704
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
4 14.6 ± 3.4 19.7 ± 6.2 22.6 ± 6.1 36.2 ± 9.5 28.5 ± 4.0 35.2 ± 6.0 40.3 ± 4.7
8 27.4 ± 10.2 32.5 ± 14.2 50.4 ± 4.9 58.5 ± 3.3 52.9 ± 5.7 68.2 ± 13.1 79.8 ± 4.8
12 35.4 ± 17.2 56.8 ± 6.8 59.4 ± 26.2 89.5 ± 9.3 81.5 ± 6.1 111.2 ± 12.8 128.4 ± 32.3
16 56.9 ± 17.2 75.0 ± 13.1 91.6 ± 6.6 108.2 ± 10.2 115.2 ± 6.2 152.6 ± 0.9 182.6 ± 15.3
20 68.2 ± 8.0 97.5 ± 15.1 111.4 ± 14.6 154.7 ± 14.4 151.8 ± 12.6 190.4 ± 8.2 240.9 ± 12.8
NWG Analyt / BG Analyt: 0.62 µM / 1.87 µM
Substrat / Analyt Ethylundecanoat / Undecansäure / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
10 < 1.55 < 1.55 12.9 ± 3.9 16.6 ± 1.1 16.7 ± 0.8 14.9 ± 1.7 23.4 ± 6.1
20 < 1.55 24.4 ± 5.9 26.0 ± 6.9 30.6 ± 7.5 32.4 ± 6.0 40.1 ± 13.4 44.3 ± 6.0
30 26.7 ± 11.3 36.8 ± 8.9 36.5 ± 5.3 37.1 ± 6.4 57.8 ± 3.0 69.2 ± 9.9 75.5 ± 24.6
40 33.2 ± 3.8 55.3 ± 11.4 56.4 ± 9.5 76.3 ± 10.9 76.0 ± 4.6 101.2 ± 19.0 106.3 ± 54.1
50 51.5 ± 5.1 89.4 ± 7.6 92.8 ± 15.3 97.1 ± 24.8 122.6 ± 11.3 141.2 ± 22.6 106.4 ± 29.8
NWG Analyt / BG Analyt: 1.55 µM / 4.65 µM
Konzentration [10-6 mol /L]
Substrat / Analyt Ethylmyristat / Myristinsäure / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
10 19.7 ± 7.2 < 1.42 14.0 ± 2.9 < 1.42 15.8 ± 1.6 14.4 ± 1.4 < 1.42
20 14.4 ± 3.1 < 1.42 32.3 ± 25.1 14.4 ± 1.5 15.7 ± 2.6 27.8 ± 12.8 18.8 ± 1.1
30 17.2 ± 3.2 17.9 ± 2.8 28.7 ± 16.9 17.8 ± 3.6 17.8 ± 2.4 17.1 ± 1.6 17.8 ± 3.8
40 19.6 ± 0.6 16.4 ± 1.0 17.7 ± 0.8 16.8 ± 1.2 18.3 ± 2.9 17.4 ± 1.8 24.4 ± 3.6
50 21.4 ± 6.1 21.0 ± 4.3 15.3 ± 3.4 18.1 ± 1.6 17.3 ± 2.2 20.3 ± 6.4 26.0 ± 6.8
NWG Analyt / BG Analyt: 1.42 µM / 4.26 µM
vorbehaltlich anderer Angaben gilt für alle Ergebnisse: n = 4; Verdünnungsfaktoren berücksichtigt
156
Fortsetzung Tab. 29
Konzentration [10-6 mol /L]
Substrat / Analyt Ethylisovalerat / Isovaleriansäure / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
5 28.5 ± 5.9 30.4 ± 2.1 39.1 ± 3.3 39.3 ± 5.2 43.1 ± 1.5 45.0 ± 4.2 53.8 ± 4.1
10 44.1 ± 4.4 43.2 ± 9.7 65.2 ± 1.8 68.8 ± 7.6 72.3 ± 2.4 68.0 ± 4.1 74.6 ± 6.2
15 62.5 ± 5.5 71.8 ± 6.6 84.9 ± 5.1 93.4 ± 6.2 133.5 ± 72.9 92.7 ± 4.9 96.8 ± 10.8
20 75.9 ± 10.5 97.2 ± 9.1 111.8 ± 4.8 121.6 ± 13.6 130.9 ± 11.2 118.2 ± 5.3 130.6 ± 4.9
25 96.4 ± 10.6 116.1 ± 12.8 144.6 ± 8.4 103.8 ± 42.1 151.2 ± 12.4 143.3 ± 10.2 164.1 ± 9.4
NWG Analyt / BG Analyt: 2.05 µM / 6.15 µM
Substrat / Analyt Ethyltiglat / Tiglinsäure / Plasma-Pool: (h) 014.704
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
10 15.2 ± 5.6 < 0.90 < 0.90 15.5 ± 1.5 21.7 ± 3.2 18.4 ± 2.2 20.9 ± 2.1
20 20.5 ± 1.5 16.8 ± 5.0 23.1 ± 5.3 22.7 ± 1.8 25.3 ± 2.1 27.9 ± 1.3 28.2 ± 1.4
30 32.4 ± 3.9 23.2 ± 4.3 32.8 ± 8.6 34.1 ± 3.2 35.9 ± 2.8 39.3 ± 1.2 43.8 ± 2.2
40 43.6 ± 1.8 31.2 ± 2.9 39.9 ± 15.7 43.7 ± 2.3 45.0 ± 1.3 48.2 ± 2.6 52.9 ± 1.2
50 55.6 ± 2.3 36.0 ± 3.5 53.5 ± 18.8 51.5 ± 0.8 49.5 ± 4.2 59.1 ± 1.9 65.6 ± 2.5
NWG Analyt / BG Analyt: 0.90 µM / 2.70 µM
Substrat / Analyt Ethylphenylacetat / Phenylessigsäure / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
5 43.3 ± 2.4 63.4 ± 6.3 70.3 ± 12.4 96.5 ± 3.5 101.1 ± 18.3 126.7 ± 13.4 246.4 ± 3.7
10 66.1 ± 6.1 103.1 ± 2.2 120.0 ± 6.3 182.5 ± 5.3 181.0 ± 35.1 247.5 ± 19.8 364.9 ± 15.3
15 87.9 ± 4.4 142.5 ± 2.6 176.1 ± 4.8 264.7 ± 6.8 276.8 ± 19.5 369.8 ± 23.6 541.6 ± 12.8
20 102.7 ± 5.3 165.9 ± 14.2 242.7 ± 15.9 339.5 ± 20.8 374.1 ± 27.6 510.6 ± 16.6 738.3 ± 65.9
25 123.6 ± 8.4 231.2 ± 2.5 318.9 ± 4.9 423.2 ± 20.5 487.0 ± 35.2 626.9 ± 39.8 931.0 ± 56.9
NWG Analyt / BG Analyt: 1.78 µM / 5.34 µM
Substrat / Analyt Ethylsalicylat / Salicylsäure / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
20 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1
40 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1
60 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1
80 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1
100 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1 < 12.1
NWG Analyt / BG Analyt: 12.1 µM / 36.3 µM
Substrat / Analyt Ethylcinnamat / Zimtsäuresäure / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
20 < 6.40 < 6.40 < 6.40 < 6.40 < 6.40 30.3 ± 1.1 34.9 ± 1.8
40 < 6.40 39.4 ± 5.0 45.5 ± 6.4 49.7 ± 6.2 49.0 ± 2.7 48.2 ± 3.0 44.0 ± 3.0
60 42.4 ± 6.8 60.8 ± 9.2 57.1 ± 6.0 62.0 ± 3.8 59.6 ± 8.3 63.9 ± 3.3 59.2 ± 5.4
80 55.6 ± 8.6 72.8 ± 7.6 70.0 ± 9.7 79.7 ± 5.4 78.1 ± 8.7 79.0 ± 3.6 74.6 ± 7.2
100 65.2 ± 4.3 69.6 ± 5.3 90.2 ± 7.6 99.8 ± 3.0 98.8 ± 12.8 89.5 ± 4.4 93.3 ± 7.0
NWG Analyt / BG Analyt: 6.4 µM / 19.2 µM
vorbehaltlich anderer Angaben gilt für alle Ergebnisse: n = 4; Verdünnungsfaktoren berücksichtigt
157
Tab. 30: Messdaten - Benzylester
Konzentration [10-6 mol /L]
Substrat / Analyt Benzyltiglat / Benzylalkohol / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
10 25.5 ± 15.8 38.9 ± 4.8 50.4 ± 3.2 50.6 ± 8.9 81.2 ± 6.9 86.8 ± 3.4 174.1 ± 29.0
20 29.2 ± 5.0 70.3 ± 5.4 86.0 ± 7.7 102.6 ± 4.2 151.0 ± 10.5 168.3 ± 1.3 300.4 ± 21.3
30 37.5 ± 3.3 89.0 ± 8.0 129.2 ± 7.1 158.4 ± 5.6 218.8 ± 4.8 254.3 ± 12.1 448.0 ± 33.0
40 49.3 ± 4.0 126.5 ± 2.0 169.7 ± 8.9 218.5 ± 10.8 291.2 ± 10.6 342.1 ± 4.4 595.7 ± 50.2
50 68.0 ± 8.9 155.4 ± 3.4 220.5 ± 8.7 271.3 ± 9.1 361.8 ± 4.0 444.1 ± 10.9 727.3 ± 38.9
NWG Analyt / BG Analyt: 0.60 µM / 1.80 µM
Substrat / Analyt Benzyltiglat / Tiglinsäure / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
10 42.1 ± 33.3 26.8 ± 3.5 29.7 ± 2.0 37.3 ± 4.9 52.2 ± 9.1 50.5 ± 2.9 115.6 ± 21.8
20 35.3 ± 20.0 54.2 ± 4.1 60.3 ± 4.5 77.1 ± 5.2 123.0 ± 10.4 124.2 ± 1.2 232.9 ± 19.5
30 29.8 ± 1.4 77.7 ± 11.1 107.0 ± 6.6 135.5 ± 2.9 192.1 ± 8.6 208.5 ± 9.3 381.7 ± 27.3
40 43.0 ± 5.6 110.7 ± 0.9 157.4 ± 1.8 189.6 ± 8.2 258.3 ± 13.2 301.2 ± 11.2 513.0 ± 40.9
50 47.9 ± 4.8 140.9 ± 3.8 199.9 ± 5.2 249.3 ± 14.6 327.3 ± 5.8 397.1 ± 14.8 659.2 ± 31.9
NWG Analyt / BG Analyt: 0.90 µM / 2.70 µM
Substrat / Analyt Benzylphenylacetat / Benzylalkohol / Plasma-Pool: (h) 014.704
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
0.5 42.0 ± 9.7 91.5 ± 25.8 84.2 ± 15.4 96.9 ± 33.0 93.5 ± 22.9 147.6 ± 76.6 169.5 ± 35.7
1.0 82.7 ± 3.2 168.1 ± 24.3 233.4 ± 119.9 225.4 ± 61.6 262.9 ± 85.0 296.7 ± 142.4 307.6 ± 41.3
2.0 138.0 ± 12.3 271.7 ± 39.6 376.8 ± 80.4 393.9 ± 63.6 441.7 ± 88.3 825.6 ± 290.2 657.4 ± 15.1
3.0 190.2 ± 3.8 328.7 ± 56.4 494.8 ± 53.4 661.4 ± 63.5 718.7 ± 46.7 1012 ± 223 1003 ± 273
4.0 216.6 ± 12.9 409.5 ± 38.2 581.1 ± 46.3 702.7 ± 69.8 811.6 ± 74.4 1122 ± 188 1303 ± 140
NWG Analyt / BG Analyt: 0.60 µM / 1.80 µM
Substrat / Analyt Benzylsalicylat / Benzylalkohol / Plasma-Pool: (h) 014.704
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
10 7.8 ± 2.0 13.2 ± 3.1 14.0 ± 5.4 17.1 ± 4.1 21.8 ± 3.9 28.6 ± 10.3 59.6 ± 13.5
20 18.0 ± 7.4 33.0 ± 6.5 36.9 ± 11.9 40.6 ± 5.9 62.9 ± 6.2 50.5 ± 37.8 133.6 ± 14.5
30 24.7 ± 3.6 48.4 ± 10.8 61.6 ± 3.8 66.6 ± 13.6 98.5 ± 26.9 89.7 ± 32.3 180.3 ± 15.4
40 30.9 ± 3.9 77.1 ± 16.3 92.8 ± 11.1 119.6 ± 17.5 143.7 ± 65.1 160.9 ± 74.4 229.9 ± 37.2
50 44.8 ± 6.6 102.4 ± 11.3 120.7 ± 8.9 162.1 ± 34.8 197.5 ± 23.4 233.0 ± 13.3 292.6 ± 40.7
NWG Analyt / BG Analyt: 0.60 µM / 1.80 µM
vorbehaltlich anderer Angaben gilt für alle Ergebnisse: n = 4; Verdünnungsfaktoren berücksichtigt
158
Tab. 31: Messdaten – Methyloctanoat, Isoamylbutyrat, Phenylacetat
Konzentration [10-6 mol /L]
Substrat / Analyt Methyloctanoat / Octansäure / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
4.0 13.7 ± 5.3 9.2 ± 1.2 10.2 ± 1.5 10.9 ± 1.7 14.4 ± 3.6 23.6 ± 8.5 32.9 ± 7.1
8.0 25.4 ± 7.7 18.5 ± 6.1 16.6 ± 4.5 20.8 ± 5.2 24.9 ± 5.2 44.3 ± 17.6 51.6 ± 8.3
12.0 37.1 ± 3.8 24.6 ± 2.9 29.0 ± 3.7 35.0 ± 3.4 39.2 ± 2.8 62.5 ± 17.0 89.7 ± 18.7
16.0 52.0 ± 4.5 33.5 ± 3.7 39.6 ± 6.4 46.3 ± 2.6 60.6 ± 5.7 93.0 ± 7.8 117.9 ± 116
20.0 65.5 ± 7.0 44.7 ± 4.5 59.6 ± 12.7 63.5 ± 4.5 76.3 ± 9.4 118.9 ± 22.2 174.8 ± 40.2
NWG Analyt / BG Analyt: 1.22 µM / 3.66 µM
Substrat / Analyt Isoamylbutyrat / Buttersäure / Plasma-Pool: (h) 020.504
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 0.75 mM S0 = 1.00 mM S0 = 1.25 mM S0 = 1.75 mM S0 = 2.50 mM
0.5 71.6 ± 9.1 102.1 ± 24.0 71.6 ± 10.7 103.9 ± 22.2 125.5 ± 58.8 164.1 ± 25.3 213.5 ± 19.0
1.0 123.9 ± 6.2 204.6 ± 23.7 145.8 ± 23.5 209.0 ± 29.7 215.9 ± 17.4 369.5 ± 38.0 421.5 ± 62.2
2.0 183.7 ± 8.9 303.8 ± 17.1 254.1 ± 24.7 378.0 ± 28.7 429.1 ± 25.5 687.8 ± 78.9 855.0 ± 109.3
3.0 224.5 ± 1.4 427.1 ± 25.1 396.2 ± 44.1 573.2 ± 37.5 643.3 ± 35.3 1057 ± 33 1235 ± 149
4.0 245.8 ± 4.5 458.4 ± 15.6 521.1 ± 62.6 692.5 ± 39.4 877.6 ± 31.4 1302 ± 42 1633 ± 93
NWG Analyt / BG Analyt: 1.80 µM / 5.40 µM
Substrat / Analyt Phenylacetat / Phenylacetat / Plasma-Pool: (h) 014.704 (1:100 verdünnt)
t [min] S0 = 0.25 mM S0 = 0.50 mM S0 = 1.00 mM S0 = 2.00 mM S0 = 3.00 mM S0 = 4.00 mM
0.5 84.5 ± 8.7 190.8 ± 13.8 185.2 ± 23.6 841.2 ± 109.6 1238 ± 197 1716 ± 213
1.0 62.9 ± 15.8 150.3 ± 25.1 148.8 ± 23.1 712.6 ± 59.4 1104 ± 147 1709 ± 261
2.0 37.2 ± 13.1 83.8 ± 26.4 88.1 ± 15.2 451.5 ± 24.5 804 ± 89 1378 ± 76
3.0 23.0 ± 11.8 48.5 ± 20.8 51.6 ± 14.1 320.0 ± 71.5 510 ± 239 1068 ± 194
4.0 15.1 ± 9.7 35.9 ± 16.4 28.6 ± 7.8 231.7 ± 47.5 247 ± 39 910 ± 106
NWG Analyt / BG Analyt: 1.03 µM / 3.08 µM
vorbehaltlich anderer Angaben gilt für alle Ergebnisse: n = 4; Verdünnungsfaktoren berücksichtigt
159
Tab. 32: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der gaschromatographischen Analyse
GC-Säule Analyt sV
[10-6 g /L]
NWG / BG
[10-6 mol /L]
GC-Säule
(vgl. 8.2.3) Analyt sV
[10-6 g /L]
NWG / BG
[10-6 mol /L]
BW
[10-6 mol /L]
MN FFAP Buttersäure k. A. 1.80 / 5.40 Ethylpropionat k. A. 2.22 / 6.66 < 2.22
Propionsäure k. A. 2.60 / 7.80 Ethylvalerat k. A. 1.32 / 3.97 < 1.32
Valeriansäure k. A. 4.83 / 14.49 Ethylisovalerat k. A. 1.31 / 3.94 < 1.31
Isovaleriansäure k. A. 2.05 / 6.15 Ethyltiglat 225.7 2.70 / 8.09 < 2.70
Heptansäure 52.9 0.62 / 1.87 Phenylacetat 136.5 1.53 / 4.60 < 1.53
Tiglinsäure k. A. 0.90 / 2.70
Benzylalkohol 43.4 0.60 / 1.80
MN SE-52 Octansäure k. A. 1.22 / 3.66 Ethylheptanoat 14.0 0.14 / 0.41 < 0.14
Undecansäure k. A. 1.55 / 4.65 Ethylundecanoat k. A. 0.07 / 0.21 < 0.07
Myristinsäure k. A. 1.42 / 4.26 Ethylmyristat 0.84 0.005 / 0.015 < 0.005
Salicylsäure k. A. 12.1 / 36.3 Ethylphenyl-
acetat k. A. 2.29 / 6.88 < 2.29
Phenylessigsäure k. A. 1.78 / 5.34 Ethylcinnamat k. A. 2.00 / 6.00 < 2.00
Zimtsäure k. A. 6.4 / 19.2 Ethylsalicylat k. A. 2.29 / 6.86 < 2.29
Benzyltiglat 208.6 1.68 / 5.04 < 1.68
Benzylphenyl-
acetat 74.9 0.51 / 1.52 < 0.51
Benzylsalicylat 149.1 1.00 / 3.00 < 1.00
Methyloctanoat 1.24 0.012 / 0.036 < 0.012
Isoamylbutyrat k. A. 1.02 / 3.06 < 1.02
Phenylacetat 91.4 1.03 / 3.09 < 1.03
Bestimmungsgrenze berechnet aus der Verfahrenstandardabweichung sV gemäß vereinfachter Methode nach DIN 32 645
(P = 99 %), n = 10
Blindwert, bestimmt als Nulltoleranz des Esterhydrolyseprodukts (Alkohol und Carbonsäure) in der Substratstammlösung
160
Tab. 33: Wiederfindungsrate der Analyten in Humanplasma und Krebs-Henseleit-Puffer in
Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
Wiederfindungsrate [%] in Abhängigkeit von S0 (n = 4)
Extrelut hitzeinaktiviertes Blutplasma
(pH 7,4)
Krebs-Henseleit-Puffer
(pH 7,4)
Analyt 0.25 mM 1.00 mM Probenahme [min] 0.25 mM 1.00 mM 0.25 mM 1.00 mM
Benzylalkohol 102,4 ± 3,2 105,1 ± 2,4 10 99,0 ± 4,3 100,8 ± 6,6 99,4 ± 2,9 101,4 ± 0,9
20
99,8 ± 3,8 98,6 ± 5,0 101,2 ± 10,7 104,0 ± 2,6
30
101,8 ± 5,5 108,4 ± 4,0 96,7 ± 3,4 104,4 ± 3,2
40
104,1 ± 5,3 104,0 ± 3,1 95,6 ± 1,5 104,8 ± 1,4
50
103,6 ± 5,5 102,2 ± 5,4 92,1 ± 5,4 103,7 ± 1,0
Propionsäure 103,1 ± 2,9 105,3 ± 2,4 4 98,3 ± 3,3 92,1 ± 3,5 99,0 ± 1,1 100,8 ± 3,3
8 95,7 ± 2,6 93,6 ± 3,8 98,1 ± 3,5 103,0 ± 3,1
12
91,4 ± 4,4 92,0 ± 1,2 99,0 ± 1,7 103,5 ± 1,8
16
94,8 ± 3,6 94,6 ± 3,3 95,9 ± 3,4 104,7 ± 3,1
20
105,9 ± 2,4 94,5 ± 0,8 97,3 ± 2,7 97,9 ± 8,7
Buttersäure 103,5 ± 2,9 102,7 ± 1,5 0,5 99,1 ± 4,6 96,0 ± 4,0 99,6 ± 6,7 96,8 ± 2,2
1,0
95,6 ± 5,8 96,3 ± 4,1 96,9 ± 10,0 96,0 ± 4,5
2,0
97,4 ± 5,4 94,4 ± 2,9 102,1 ± 8,5 94,9 ± 3,3
3,0
96,5 ± 5,1 96,4 ± 5,4 99,9 ± 8,5 96,2 ± 2,6
4,0
98,9 ± 2,9 97,0 ± 5,1 102,5 ± 7,3 95,6 ± 2,8
Valeriansäure 100,6 ± 3,3 103,8 ± 1,3 2 98,8 ± 3,7 94,4 ± 3,0 103,7 ± 2,8 94,0 ± 2,5
4 97,7 ± 4,5 96,3 ± 2,6 105,2 ± 2,2 100,3 ± 2,9
6 94,5 ± 1,8 96,3 ± 0,8 99,6 ± 1,4 101,7 ± 1,0
8 97,2 ± 1,1 96,7 ± 1,6 99,8 ± 2,5 102,5 ± 3,1
10
97,7 ± 1,2 100,2 ± 1,1 100,1 ± 1,3 104,1 ± 2,0
Isovaleriansäure 99,3 ± 1,3 102,0 ± 1,4 5 105,5 ± 7,0 104,4 ± 1,6 99,0 ± 5,3 97,7 ± 4,5
10
99,8 ± 5,1 107,2 ± 1,3 98,6 ± 3,7 96,6 ± 1,4
15
102,5 ± 5,2 104,4 ± 2,4 98,1 ± 2,7 96,4 ± 3,6
20
101,6 ± 3,7 104,6 ± 4,4 98,4 ± 3,1 97,9 ± 5,8
25
106,6 ± 6,1 105,7 ± 3,4 97,2 ± 1,6 99,3 ± 1,4
Heptansäure 4 101,6 ± 2,9 102,0 ± 1,9 105,5 ± 3,9 102,7 ± 5,5
8 107,3 ± 4,0 102,9 ± 0,8 105,6 ± 5,5 100,2 ± 4,2
12
108,5 ± 1,5 103,0 ± 1,1 96,6 ± 2,1 98,1 ± 5,1
16
106,7 ± 2,5 102,8 ± 1,6 103,1 ± 1,9 101,2 ± 0,7
20
108,3 ± 1,2 104,6 ± 6,2 106,0 ± 2,2 106,0 ± 6,7
Octansäure 2 94,1 ± 4,4 97,8 ± 4,2 98,3 ± 2,4 98,6 ± 2,8
4 95,3 ± 2,1 99,1 ± 4,4 ± 99,7 ± 3,5 98,4 ± 4,7
6 95,4 ± 3,2 100,5 ± 5,8 101,1 ± 5,9 100,0 ± 2,8
8 95,1 ± 3,1 101,3 ± 5,5 97,9 ± 3,9 99,3 ± 4,0
10
93,6 ± 2,4 100,6 ± 6,2 99,1 ± 4,1 101,7 ± 2,8
Undecansäure 10 107,3 ± 3,6 102,4 ± 0,8 100,4 ± 4,4 101,9 ± 3,7
20
107,6 ± 5,9 101,0 ± 1,2 99,8 ± 11,8 102,3 ± 1,5
30
107,5 ± 5,1 101,2 ± 0,8 99,8 ± 10,2 101,4 ± 2,9
40
107,2 ± 5,3 102,1 ± 1,3 99,6 ± 6,9 99,8 ± 1,5
50
107,9 ± 4,7 101,3 ± 0,7 101,0 ± 7,7 99,9 ± 0,9
Myristinsäure 10 99,4 ± 3,4 100,4 ± 3,4 98,4 7,2 101,3 ± 1,4
20
97,9 ± 6,0 94,9 ± 6,0 95,9 5,6 101,8 ± 1,2
30
97,4 ± 6,4 96,9 ± 4,0 95,2 ± 7,3± 101,1 ± 4,4
40
98,9 ± 6,6 94,4 ± 5,4 94,7 ± 3,0 101,1 ± 3,5
50
95,2 ± 8,0 97,9 ± 6,0 95,4 ± 5,9 100,2 ± 2,9
Tiglinsäure 10 91,5 ± 3,4 96,1 ± 3,7 110,6 ± 6,2 110,7 ± 4,1
20
91,5 ± 3,2 95,9 ± 1,4 109,3 ± 1,5 113,5 ± 1,4
30
90,8 ± 1,0 99,2 ± 1,1 111,2 ± 3,1 110,4 ± 4,5
40
94,4 ± 3,9 98,0 ± 2,3 110,6 ± 1,4 112,9 ± 2,8
50
89,4 ± 1,8 98,9 ± 0,7 112,1 ± 2,5 112,1 ± 3,0
161
III Methodenvalidierung
Tab. 34: Zusammensetzung von Krebs-Henseleit-Puffer im Vergleich mit Ratten- und
Humanplasma
Konzentration [mmol /L]
Bestandteil Krebs-Henseleit-Puffer Humanplasma12 Rattenplasma13
Natrium (Na+) 143,0 135 – 148 135,0
Kalium (K+) 5,95 3,6 - 5,1 4,90
Magnesium (Mg2+) 1,20 0,41 - 1,23 1,30
Chlorid (Cl-) 122,7 99 – 109 100,0
anorgan. Phosphat (PO34-) 1,20 0,87 - 1,94 2,30
Kalzium (Ca2+) 1,25 2,25 – 2,74 2,60
Tab. 35: Hydrolyse von Ethylheptanoat in künstlicher Magenflüssigkeit
Konzentration [mmol /L]
Hydrolysezeit
[min] Ethylheptanoat Ethanol Heptansäure
0 0,275 0,000 0,000
30 0,258 0,016 0,018
60 0,255 0,016 0,023
90 0,251 0,025 0,024
120 0,252 0,023 0,023
150 0,242 0,031 0,036
180 0,240 0,034 0,035
210 0,236 0,042 0,037
240 0,230 0,039 0,050
270 0,229 0,041 0,051
300 0,227 0,046 0,049
330 0,220 0,049 0,061
360 0,222 0,050 0,056
390 0,228 0,053 0,042
420 0,215 0,058 0,062
Tab. 36: Hydrolyse von Ethylheptanoat in 1:100 verdünntem Rattenplasma
Hydrolysezeit Konzentration [mmol /l]
[min] Ethylheptanoat Ethanol Heptansäure
0 1,58 0,00 0,00
10 1,10 0,29 0,12
20 0,92 0,53 0,52
30 0,73 0,85 0,81
45 0,53 1,18 1,21
60 0,24 1,43 1,45
90 0,07 1,50 1,45
120 0,01 1,54 1,58
12 Buddekke, 1999; Krebs, 1950; Leuthardt, 1963; Pschyrembel, 2001; Schenk, 1990
13 Waynforth, 1980
162
Tab. 37: Kinetische Parameter in Abhängigkeit von der Darstellungsform für Phenylacetat in
Humanplasma
Darstellungsform mittlerer Graf der Funktion Km
[mol /L]
Vmax
[mol /min⋅g Protein]
Vmax /Km
[L /min⋅g Protein]
Lineweaver-Burk y = 1,681x + 0,611 2,75⋅10-3 1,64⋅10-3 0,59
Hanes-Woolf y = 0,224x + 2,100 9,36⋅10-3 4,46⋅10-3 0,48
Eadie-Hofstee y = -3,315x + 2,040 3,32⋅10-3 2,04⋅10-3 0,62
Cornish-Bowen - 3,8⋅10-3 2,3⋅10-3 0,65
VK (%) - 64,1 48,4 11,6
Tab. 38: Kinetische Parameter in Abhängigkeit von der Darstellungsform für Ethylphenylacetat in
Humanplasma
Darstellungsform Graf der linearen Regression Km
[mol /L]
Vmax
[mol /min⋅g Protein]
Vmax /Km
[L /min⋅g Protein]
Lineweaver-Burk y = 3,814x + 0,681 5,60⋅10-3 1,47⋅10-6 0,26
Hanes-Woolf y = 0,607x + 3,902 6,43⋅10-3 1,65⋅10-6 0,26
Eadie-Hofstee y = -4,690x + 1,276 4,69⋅10-3 1,28⋅10-6 0,27
Cornish-Bowen - 4,1⋅10-3 1,2⋅10-6 0,29
VK (%) - 19,7 14,4 5,9
Tab. 39: Kinetische Parameter für Phenylacetat in Humanplasma in Abhängigkeit vom
Tangentenanstieg
mittlere
Tangentenfunktion
Km
[mol /L]
Vmax
[mol /min⋅g Protein]
Vmax /Km
[L /min⋅g Protein]
ti = 0.00 min y = 1.5537x + 0.5935 2,62⋅10-3 1,68⋅10-3 0,64
ti = 0.10 min y = 1.6812x + 0.6111 2,75⋅10-3 1,64⋅10-3 0,59
ti = 0.20 min y = 1.8185x + 0.6288 2,98⋅10-3 1,59⋅10-3 0,55
ti = 0.50 min y = 2.2981x + 0.6816 3,37⋅10-3 1,47⋅10-3 0,44
VK (%) - 11,3 5,9 16,0
Tab. 40: Initialgeschwindigkeit der enzymatischen Hydrolyse von Ethylvalerat und -isovalerat in
Rattenplasma in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration
v
i [10-6 mol /L *min]
Ethylvalerat Ethylisovalerat
S0 [mmol/L] Plasma 1:50
verdünnt
Plasma 1:10
verdünnt
Plasma un-
verdünnt
Plasma 1:50
verdünnt
Plasma 1:10
verdünnt
Plasma un-
verdünnt
0,53 11,5 35,0 215,5 k. A. 3,38 17,13
1,31 k. A. k. A. 398,5 k. A. k. A. k. A.
2,10 k. A. k. A. 748,9 k. A. k. A. k. A.
3,00 41,9 137,0 786,1 8,01 13,11 97,15
5,50 42,9 220,0 k. A. 13,08 24,02 129,43
8,02 73,4 256,8 k. A. 17,52 33,43 172,02
10,50 64,9 264,9 k. A. 21,90 35,44 k. A.
11,10 63,2 248,0 k. A. 24,05 43,68 k. A.
14,97 k. A. k. A. k. A. 25,30 49,03 k. A.
15,20 69,4 268,3 k. A. k. A. k. A. k. A.
(n = 1)
163
IV Biologisches Material und pharmakokinetische Parameter
Tab. 41: Hydrolyseaktivität von Rattenplasma in Abhängigkeit von der Lagerdauer
Substrat (S0 = 0,25 mM) spezifische Hydrolyseaktivität Ha [10-6 mol /min g Protein]
Pool-Nummer (r) 015.002 (r) 015.004 (r) 001.703 (w26) (r) 012.001 (w21)
Lagerdauer „frisch“ (1 h bei 4°C) 26 Wochen bei –84°C 21 Wochen bei –84°C
Phenylacetat 99,2 ± 1,3 (n = 5) 93,4 ± 1,2 (n = 5) 87,6 ± 2,88 (n = 4) 75,8 ± 3,9 (n = 4)
Ethylheptanoat 25,7 ± 7,6 (n = 5) 18,7 ± 1,8 (n = 5) 18,3 ± 0,08 (n = 5) 7,1 ± 1,7 (n = 4)
Ethyltiglat 0,298 ± 0,036 (n = 4) 0,218 ± 0,019 (n = 4) 0,169 ± 0,114 (n = 3) 0,147 ± 0,060 (n = 4)
Benzyltiglat 0,515 ± 0,079 (n = 4) 0,338 ± 0,033 (n = 4) 0,302 ± 0,005 (n = 4) 0,126 ± 0,021 (n = 4)
Tab. 42: Hydrolyseaktivität von Humanplasma in Abhängigkeit von der Lagerdauer
Substrat (S0 = 0,25 mM) spezifische Hydrolyseaktivität Ha [10-6 mol /min g Protein]
Pool-Nummer (h) 014.704 (h) 020.504 (h) 014.704 (w8) (h) 020.504 (w12)
Lagerdauer „frisch“ (1 h bei 4°C) 8 Wochen bei –84°C 12 Wochen bei –84°C
Phenylacetat 92,4 ± 3,5 (n = 4) 75,1 ± 6,0 (n = 4) 66,9 ± 3,0 (n = 4) 63,5 ± 0,6 (n = 4)
Ethylheptanoat k. A. 0,039 ± 0,006 (n = 4) 0,041 ± 0,007 (n = 4) k. A.
Ethyltiglat k. A. 0,030 ± 0,004 (n = 4) 0,012 ± 0,001 (n = 4) k. A.
Benzyltiglat k. A. 0,010 ± 0,001 (n = 4) 0,009 ± 0,002 (n = 4) k. A.
Tab. 43: Substratumsatz von Phenylacetat in Rattenplasma („frisch“; 1:100 verdünnt) in
Abhängigkeit von der Lagerdauer
Lagerdauer bei 4°C Substratumsatz [%] Substratumsatz [µmol /L je min]
1,00 h 92,6 (n = 1) 57,9 (n = 1)
1,25 h 93,1 (n = 1) 58,2 (n = 1)
1,50 h 93,9 (n = 1) 58,7 (n = 1)
3,00 h 93,0 (n = 1) 58,1 (n = 1)
12,00 h 95,7 (n = 1) 59,8 (n = 1)
Blindwert in Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) 2,20 ± 1,63 (n = 5) 5,40 ± 4,07 (n = 5)
Reaktionsdauer 4 min, S0 = 0.25 mM
Plasma-Pool (r) 015.004
Tab. 44: Spezifische Hydrolyseaktivität künstlicher und physiologischer Körperflüssigkeiten
anhand von Ethyltiglat, Benzyltiglat und Phenylacetat
S0 = 0,25 mM spezifische Hydrolyseaktivität Ha, spez. [10-6 mol /min * g Protein]
Hydrolysemedium Ethyltiglat Benzyltiglat Phenylacetat
Künstliche Magenflüssigkeit (pH 1,2) < 0,0043 ± 0,0000 (n = 4) < 0,0043 ± 0,0000 (n = 4) k. A.
Humanplasma „frisch“ (h)020.504 0,0301 ± 0,0044 (n = 4) 0,0100 ± 0,0010 (n = 4) 63,5 ± 0,6 (n = 4)
Rattenplasma „frisch“ (r))015.002 0,2983 ± 0,0359 (n = 4) 0,5151 ± 0,0791 (n = 4) 98,5 ± 0,8 (n = 4)
Rattenplasma „frisch“ (r))015.004 0,2182 ± 0,0189 (n = 4) 0,3380 ± 0,0325 (n = 5) 93,4 ± 1,2 (n = 4)
S9-Fraktion (Ratte) (s9)003.605
(19 Monate bei –84 °C gelagert)
164,3 ± 4,9 (n = 4) 168,1 ± 14,2 (n = 4) k. A.
164
Tab. 45: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei der enzymatischen Hydrolyse von
Carbonsäureestern in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
spezifische Hydrolyseaktivität Ha [10-6 mol /min * g Protein]
S0 Ethylpropionat Ethylvalerat Ethylisovalerat Ethylheptanoat Ethylundecanoat Ethylmyristat
0,25 mM 0,0668 ± 0,0033
(n = 4)
0,137 ± 0,007
(n = 4)
0,0414 ± 0,0044
(n = 4)
0,0351 ± 0,076
(n = 4)
0,0107 ± 0,0011 (n
= 4)
0,0046 ± 0,0011
(n = 4)
0,50 mM 0,095 ± 0,007
(n = 4)
0,213 ± 0,014
(n = 4)
0,0468 ± 0,0080
(n = 4)
0,052 ± 0,009
(n = 4)
0,0161 ± 0,0043 (n
= 4)
0,0051 ± 0,0016
(n = 4)
0,75 mM 0,127 ± 0,007
(n = 4)
0,254 ± 0,020
(n = 4)
0,0580 ± 0,0077
(n = 4)
0,063 ± 0,008
(n = 4)
0,0178 ± 0,0059 (n
= 4)
0,0032 ± 0,0007
(n = 4)
1,00 mM 0,143 ± 0,013
(n = 4)
0,297 ± 0,046
(n = 4)
0,0393 ± 0,0099
(n = 4)
0,087 ± 0,008
(n = 4)
0,0178 ± 0,0052 (n
= 4)
0,0039 ± 0,0004
(n = 4)
1,25 mM 0,178 ± 0,013
(n = 4)
0,323 ± 0,008
(n = 4)
0,0634 ± 0,0052
(n = 4)
0,085 ± 0,007
(n = 4)
0,0257 ± 0,0024 (n
= 4)
0,0036 ± 0,0005
(n = 4)
1,75 mM 0,194 ± 0,005
(n = 4)
0,360 ± 0,016
(n = 4)
0,0601 ± 0,0043
(n = 4)
0,107 ± 0,005
(n = 4)
0,0296 ± 0,0047 (n
= 4)
0,0045 ± 0,0012
(n = 4)
2,50 mM 0,237 ± 0,006
(n = 4)
0,423 ± 0,018
(n = 4)
0,0715 ±0,0069
(n = 4)
0,135 ± 0,007
(n = 4)
0,00223 ± 0,0062
(n = 4)
0,0055 ± 0,0014
(n = 4)
S0 Ethyltiglat Ethylphenylacetat Ethylsalicylat Benzyltiglat Benzylphenylacetat Benzylsalicylat
0,25 mM 0,0125 ± 0,0009
(n = 4)
0,052 ± 0,004
(n = 4)
< 12,1 µM 0,014 ± 0,002
(n = 4)
0,608 ± 0,036
(n = 4)
0,010 ± 0,001
(n = 4)
0,50 mM 0,0133 ± 0,0011
(n = 4)
0,088 ± 0,018
(n = 4)
< 12,1 µM 0,033 ± 0,001
(n = 4)
1,194 ± 0,184
(n = 4)
0,023 ± 0,003
(n = 4)
0,75 mM 0,0170 ± 0,0012
(n = 4)
0,126 ± 0,013
(n = 4)
< 12,1 µM 0,046 ± 0,002
(n = 4)
1,702 ± 0,259
(n = 4)
0,027 ± 0,002
(n = 4)
1,00 mM 0,0193 ± 0,0006
(n = 4)
0,170 ± 0,022
(n = 4)
< 12,1 µM 0,057 ± 0,002
(n = 4)
2,129 ± 0,421
(n = 4)
0,036 ± 0,008
(n = 4)
1,25 mM 0,0192 ± 0,0018
(n = 4)
0,204 ± 0,015
(n = 4)
< 12,1 µM 0,076 ± 0,001
(n = 4)
2,277 ± 0,209
(n = 4)
0,044 ± 0,005
(n = 4)
1,75 mM 0,0221 ± 0,0007
(n = 4)
0,263 ± 0,017
(n = 4)
< 12,1 µM 0,093 ± 0,002
(n = 4)
3,149 ± 0,527
(n = 4)
0,052 ± 0,003
(n = 4)
2,50 mM 0,0251 ± 0,0014
(n = 4)
0,976 ± 0,060
(n = 4)
< 12,1 µM 0,153 ± 0,008
(n = 4)
3,655 ± 0,394
(n = 4)
0,066 ± 0,009
(n = 4)
S0 Ethylcinnamat Methyloctanoat Isoamylbutyrat S0 Phenylacetat
0,25 mM 0,0066 ± 0,0006
(n = 4)
0,034 ± 0,004
(n = 4)
0,644 ± 0,012
(n = 4)
0,25 mM 66,9 ± 3,0
(n = 4)
0,50 mM 0,0073 ± 0,0006
(n = 4)
0,042 ± 0,008
(n = 4)
1,205 ± 0,042
(n = 4)
0,50 mM 130,6 ±3,9
(n = 4)
0,75 mM 0,0095 ± 0,0008
(n = 4)
0,060 ± 0,016
(n = 4)
1,271 ± 0,280
(n = 4)
k. A. k. A.
1,00 mM 0,0105 ± 0,0003
(n = 4)
0,062 ± 0,010
(n = 4)
1,751 ± 0,171
(n = 4)
1,00 mM 273,1 ±2,1
(n = 4)
1,25 mM 0,0104 ± 0,0013
(n = 4)
0,080 ± 0,010
(n = 4)
2,301 ± 0,082
(n = 4)
2,00 mM 496,0 ± 10,9
(n = 4)
1,75 mM 0,0094 ± 0,0005
(n = 4)
0,125 ± 0,023
(n = 4)
3,413 ± 0,110
(n = 4)
3,00 mM 745,2 ± 55,0
(n = 4)
2,50 mM 0,0098 ± 0,0007
(n = 4)
0,183 ± 0,042
(n = 4)
4,281 ± 0,245
(n = 4)
4,00 mM 865,5 ± 24,6
(n = 4)
165
Ethylpropionat Ethylvalerat
Ethylisovalerat Ethylheptanoat
Ethylundecanoat Ethylmyristat
Ethyltiglat Benzyltiglat
Abb. 82: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei der enzymatischen Hydrolyse von
Carbonsäureestern in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration im Vergleich
zu Vmax
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
0,24
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0,005
0,015
0,025
0,035
0,045
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
166
Ethylphenylacetat Benzylphenylacetat
Methyloctanoat Benzylsalicylat
Isoamylbutyrat Ethylcinnamat
Phenylacetat
Fortsetzung Abb. 82
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0
2
4
6
8
10
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0,005
0,007
0,009
0,011
0,013
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0
2
4
6
8
10
0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,75 2,50
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
0
500
1000
1500
2000
2500
0,25 0,50 1,00 2,00 3,00 4,00
S0 [mM]
Ha [10-6 mol /min * g Protein]
Vmax
167
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Ha [10-6 mol / min *g Protein]
0.25 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Ha [10-6 mol / min *g Protein]
0.50 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Ha [10-6 mol / min *g Protein]
0.75 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Ha [10-6 mol / min *g Protein]
1.00 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Ha [10-6 mol / min *g Protein]
1.25 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Ha [10-6 mol / min *g Protein]
1.75 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Ha [10-6 mol / min *g Protein]
2.50 mM
Abb. 83: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei der enzymatischen Hydrolyse von
Ethylestern in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
168
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
0.25 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
0.50 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
0.75 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
1.00 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
1.25 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
1.75 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
2.50 mM
Abb. 84: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei der enzymatischen Hydrolyse von
Ethyl- und Benzylestern in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
(logarithmische Darstellung)
169
10
100
1000
10000
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
0.25 mM
10
100
1000
10000
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
0.50 mM
10
100
1000
10000
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
0.75 mM
10
100
1000
10000
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
1.00 mM
10
100
1000
10000
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
1.25 mM
10
100
1000
10000
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
1.75 mM
10
100
1000
10000
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Ha [10-9 mol / min *g Protein]
2.50 mM
Abb. 85: Spezifische Hydrolyseaktivität von Humanplasma bei der enzymatischen Hydrolyse von
Carbonsäureestern mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer
Struktur in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
(logarithmische Darstellung)
170
Tab. 46: Halbwertzeit von Carbonsäureestern bei der enzymatischen Hydrolyse in Humanplasma
in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
Halbwertzeit t1/2 [min]
S0 Ethylpropionat Ethylvalerat Ethylisovalerat Ethylheptanoat Ethylundecanoat Ethylmyristat
0,25 mM 18,67 ± 0,90
(n = 4)
9,70 ± 1,20
(n = 4)
36,17 ±3,39
(n = 4)
45,04 ±7,83
(n = 4)
168,6 ± 18,6
(n = 4)
341,0 ± 72,7
(n = 4)
0,50 mM 29,08 ± 0,87
(n = 4)
13,56 ± 0,82
(n = 4)
66,23 ±5,72
(n = 4)
68,11 ±11,26
(n = 4)
212,4 ± 26,4
(n = 4)
690,5 ± 162,4
(n = 4)
0,75 mM 35,50 ± 1,46
(n = 4)
17,52 ± 1,02
(n = 4)
82,37 ± 3,22
(n = 4)
91,83 ±15,05
(n = 4)
321,3 ± 51,1
(n = 4)
1127,1 ± 459,5
(n = 4)
1,00 mM 41,27 ± 0,86
(n = 4)
20,31 ± 0,67
(n = 4)
126,46 ±23,15
(n = 4)
87,94 ±4,90
(n = 4)
373,7 ± 45,9
(n = 4)
1646,2 ± 173,3
(n = 4)
1,25 mM 44,08 ± 4,64
(n = 4)
24,72 ± 0,47
(n = 4)
121,19 ±13,39
(n = 4)
113,39 ±7,47
(n = 4)
391,3 ± 20,7
(n = 4)
1877,3 ± 288,8
(n = 4)
1,75 mM 57,30 ± 1,22
(n = 4)
32,34 ± 1,03
(n = 4)
197,21 ±12,25
(n = 4)
123,01 ±7,43
(n = 4)
461,6 ± 65,6
(n = 4)
2310,5 ± 0,0
(n = 4)
2,50 mM 68,31 ± 1,28
(n = 4)
40,50 ± 1,27
(n = 4)
239,18 ±29,34
(n = 4)
146,45 ±9,97
(n = 4)
778,0 ± 349,4
(n = 4)
3176,9 ± 577,6
(n = 4)
S0 Ethyltiglat Ethylphenylacetat Ethylsalicylat Benzyltiglat Benzylphenylacetat Benzylsalicylat
0,25 mM 141,0 ± 7,5
(n = 4)
25,01 ± 1,61
(n = 4)
n.m. 115,8 ±11,1
(n = 4)
1,44 ± 0,17
(n = 4)
192,3 ± 24,5
(n = 4)
0,50 mM 276,6 ± 28,4
(n = 4)
30,30 ± 1,12
(n = 4)
n.m. 95,0 ± 2,4
(n = 4)
1,76 ± 0,34
(n = 4)
170,0 ± 26,6
(n = 4)
0,75 mM 352,9 ± 29,7
(n = 4)
34,17 ± 1,09
(n = 4)
n.m. 104,8 ± 5,2
(n = 4)
1,94 ±0,14
(n = 4)
214,2 ± 16,0
(n = 4)
1,00 mM 402,1 ± 11,3
(n = 4)
32,71 ± 1,47
(n = 4)
n.m. 131,0 ± 6,4
(n = 4)
2,19 ±0,36
(n = 4)
229,3 ± 41,6
(n = 4)
1,25 mM 478,6 ± 19,1
(n = 4)
38,28 ± 3,92
(n = 4)
n.m. 103,9 ± 2,3
(n = 4)
2,68 ±0,40
(n = 4)
230,9 ± 54,1
(n = 4)
1,75 mM 617,0 ± 26,3
(n = 4)
40,75 ± 2,29
(n = 4)
n.m. 124,4 ± 2,8
(n = 4)
2,51 ±0,46
(n = 4)
296,0 ± 60,8
(n = 4)
2,50 mM 775,0 ± 71,0
(n = 4)
39,17 ± 2,58
(n = 4)
n.m. 102,8 ± 8,3
(n = 4)
4,00 ± 0,57
(n = 4)
279,5 ± 27,6
(n = 4)
S0 Ethylcinnamat Methyloctanoat Isoamylbutyrat S0 Phenylacetat14
0,25 mM 232,4 ± 41,7
(n = 4)
47,66 ± 3,28
(n = 4)
0,75 ± 0,13
(n = 4)
0,25 mM 0,80 ± 0,23
(n = 4)
0,50 mM 387,0 ± 32,3
(n = 4)
77,27 ± 1,87
(n = 4)
1,14 ± 0,14
(n = 4)
0,50 mM 0,91 ± 0,15
(n = 4)
0,75 mM 525,3 ± 39,3
(n = 4)
94,74 ± 7,19
(n = 4)
2,62 ± 0,50
(n = 4)
k. A. k. A.
1,00 mM 661,6 ± 36,4
(n = 4)
112,07 ± 6,55
(n = 4)
2,47 ± 0,25
(n = 4)
1,00 mM 0,67 ± 0,05
(n = 4)
1,25 mM 849,2 ± 104,4
(n = 4)
116,17 ± 10,28
(n = 4)
2,59 ± 0,14
(n = 4)
2,00 mM 1,13 ± 0,07
(n = 4)
1,75 mM 1213,0 ± 115,5
(n = 4)
105,38 ± 22,61
(n = 4)
2,21 ± 0,14
(n = 4)
3,00 mM 1,15 ± 0,23
(n = 4)
2,50 mM 1732,9 ± 0,0
(n = 4)
107,96 ± 17,26
(n = 4)
2,87 ± 0,36
(n = 4)
4,00 mM 2,06 ± 0,21
(n = 4)
14 Hydrolyse in 1:100 verdünntem Humanplasma
171
Ethylpropionat Ethylvalerat
15
25
35
45
55
65
75
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
5
15
25
35
45
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
Ethylisovalerat Ethylheptanoat
30
80
130
180
230
280
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
30
50
70
90
110
130
150
170
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
Ethylundecanoat Ethylmyristat
100
300
500
700
900
1100
1300
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
0
1000
2000
3000
4000
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
Ethyltiglat Benzyltiglat
100
300
500
700
900
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
20
60
100
140
180
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
Abb. 86: Halbwertzeit von Carbonsäureestern bei der enzymatischen Hydrolyse in Humanplasma
in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
172
Ethylphenylacetat Benzylphenylacetat
20
25
30
35
40
45
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
0
1
2
3
4
5
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
Methyloctanoat Benzylsalicylat
30
50
70
90
110
130
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
0
100
200
300
400
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
Isoamylbutyrat Ethylcinnamat
0
1
2
3
4
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
100
400
700
1000
1300
1600
1900
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
t1/2 [min]
Phenylacetat15
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0.25 mM 0.50 mM 1.00 mM 2.00 mM 3.00 mM 4.00 mM
t1/2 [min]
Fortsetzung Abb. 86
15 Hydrolyse in 1:100 verdünntem Humanplasma
173
1
10
100
1000
10000
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
t1/2 [min]
0.25 mM
1
10
100
1000
10000
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
t1/2 [min]
0.50 mM
1
10
100
1000
10000
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
t1/2 [min]
0.75 mM
1
10
100
1000
10000
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
t1/2 [min]
1.00 mM
1
10
100
1000
10000
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
t1/2 [min]
1.25 mM
1
10
100
1000
10000
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
t1/2 [min]
1.75 mM
1
10
100
1000
10000
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
t1/2 [min]
2.50 mM
Abb. 87: Halbwertzeit von Ethylestern bei der enzymatischen Hydrolyse in Humanplasma in
Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
(logarithmische Darstellung)
174
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
t1/2 [min]
0.25 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
t1/2 [min]
0.50 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
t1/2 [min]
0.75 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
t1/2 [min]
1.00 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
t1/2 [min]
1.25 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
t1/2 [min]
1.75 mM
1
10
100
1000
10000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
t1/2 [min]
2.50 mM
Abb. 88: Halbwertzeit von Ethyl- und Benzylestern bei der enzymatischen Hydrolyse in
Humanplasma in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
(logarithmische Darstellung)
175
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
t1/2 [min]
0.25 mM
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
t1/2 [min]
0.50 mM
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
t1/2 [min]
0.75 mM
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
t1/2 [min]
1.00 mM
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
t1/2 [min]
1.25 mM
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
t1/2 [min]
1.75 mM
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
t1/2 [min]
2.50 mM
Abb. 89: Halbwertzeit von Estern mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer
Struktur bei der enzymatischen Hydrolyse in Humanplasma in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration
(logarithmische Darstellung)
176
Tab. 47: Spezifische Initialgeschwindigkeit vi, spez. von Humanplasma bei der enzymatischen
Hydrolyse von Carbonsäureestern in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
Spezifische Initialgeschwindigkeit vi, spez. [10-6 mol /L * Protein]
S0 Ethylpropionat Ethylvalerat Ethylisovalerat Ethylheptanoat Ethylundecanoat Ethylmyristat
0,25 mM 0,0919 ± 0,0039
(n = 4)
0,1890 ± 0,0215
(n = 4)
0,0493 ±0,0072
(n = 5)
0,042 ±0,005
(n = 5)
0,0113 ±0,0012
(n = 4)
0,0041 ± 0,0014
(n = 4)
0,50 mM 0,1234 ± 0,0057
(n = 4)
0,2840 ± 0,0267
(n = 4)
0,0555 ±0,0072
(n = 4)
0,058 ±0,008
(n = 6)
0,0197 ±0,0022
(n = 4)
0,0044 ± 0,0020
(n = 4)
0,75 mM 0,1568 ± 0,0058
(n = 4)
0,3192 ± 0,0154
(n = 4)
0,0637 ±0,0028
(n = 4)
0,060 ± 0,019
(n = 5)
0,0195 ±0,0034
(n = 4)
0,0027 ± 0,0004
(n = 4)
1,00 mM 0,1707 ± 0,0035
(n = 4)
0,3715 ± 0,0252
(n = 4)
0,0687 ±0,0066
(n = 4)
0,083 ±0,015
(n = 5)
0,0216 ± 0,0034
(n = 4)
0,0037 ± 0,0006
(n = 4)
1,25 mM 0,2080 ± 0,0235
(n = 4)
0,3710 ± 0,0069
(n = 4)
0,0665 ±0,0054
(n = 4)
0,090 ±0,006
(n = 4)
0,0257 ±0,0026
(n = 4)
0,0029 ± 0,0007
(n = 4)
1,75 mM 0,2185 ± 0,0018
(n = 4)
0,4019 ± 0,0245
(n = 4)
0,0593 ±0,0035
(n = 4)
0,114 ±0,005
(n = 4)
0,0304 ±0,0056
(n = 4)
0,0032 ± 0,0009
(n = 4)
2,50 mM 0,2555 ± 0,0066
(n = 4)
0,4541 ± 0,0214
(n = 4)
0,0679 ±0,0032
(n = 5)
0,144 ±0,013
(n = 4)
0,203 ± 0,0095
(n = 4)
0,0059 ± 0,0025
(n = 4)
S0 Ethyltiglat Ethylphenylacetat Ethylsalicylat Benzyltiglat Benzylphenylacetat Benzylsalicylat
0,25 mM 0,0139 ± 0,0008
(n = 4)
0,0661 ± 0,0071
(n = 4)
< 12,1 µM 0,0141 ±0,0010
(n = 4)
1,519 ±0,343
(n = 4)
0,0106 ± 0,0017
(n = 4)
0,50 mM 0,0120 ± 0,0007
(n = 4)
0,1203 ± 0,0028
(n = 4)
< 12,1 µM 0,380 ±0,0007
(n = 4)
2,202 ±0,453
(n = 4)
0,0250 ± 0,0030
(n = 4)
0,75 mM 0,0171 ± 0,0019
(n = 4)
0,1711 ± 0,0043
(n = 4)
< 12,1 µM 0,0533 ±0,0024
(n = 4)
3,042 ±0,602
(n = 4)
0,0305 ± 0,0013
(n = 4)
1,00 mM 0,0199 ± 0,0006
(n = 4)
0,2367 ± 0,0175
(n = 4)
< 12,1 µM 0,0675 ±0,0042
(n = 4)
3,937 ±0,717
(n = 4)
0,0384 ± 0,0056
(n = 4)
1,25 mM 0,0193 ± 0,0014
(n = 4)
0,2577 ± 0,0183
(n = 4)
< 12,1 µM 0,0887 ±0,0015
(n = 4)
3,971 ±0,430
(n = 4)
0,0515 ± 0,0100
(n = 4)
1,75 mM 0,0226 ± 0,0011
(n = 4)
0,3306 ± 0,0240
(n = 4)
< 12,1 µM 0,1063 ±0,0025
(n = 4)
4,786 ±0,243
(n = 4)
0,0567 ± 0,0075
(n = 4)
2,50 mM 0,0224 ± 0,0023
(n = 4)
0,4797 ± 0,0343
(n = 4)
< 12,1 µM 0,1596 ±0,0324
(n = 4)
5,311 ±1,045
(n = 4)
0,0673 ± 0,0136
(n = 4)
S0 Ethylcinnamat Methyloctanoat Isoamylbutyrat S0 Phenylacetat
0,25 mM 0,0075 ± 0,0010
(n = 4)
0,0397 ± 0,0007
(n = 4)
3,510 ±1,238
(n = 4)
0,25 mM 143 ± 12
(n = 4)
0,50 mM 0,0083 ± 0,0004
(n = 4)
0,0477 ± 0,0049
(n = 4)
3,552 ±0,415
(n = 4)
0,50 mM 218 ± 31
(n = 4)
0,75 mM 0,0092 ± 0,0014
(n = 4)
0,0624 ± 0,0076
(n = 4)
2,409 ±0,580
(n = 4)
k. A. k. A.
1,00 mM 0,0105 ± 0,0009
(n = 4)
0,0677 ± 0,0032
(n = 4)
3,175 ±0,368
(n = 4)
1,00 mM 358 ±21
(n = 4)
1,25 mM 0,0101 ± 0,0013
(n = 4)
0,0830 ± 0,0093
(n = 4)
3,987 ±0,490
(n = 4)
2,00 mM 743 ±91
(n = 4)
1,75 mM 0,0091 ± 0,0001
(n = 4)
0,1276 ± 0,0174
(n = 4)
6,536 ±0,360
(n = 4)
3,00 mM 1268 ± 228
(n = 4)
2,50 mM 0,0098 ± 0,0013
(n = 4)
0,1813 ± 0,0345
(n = 4)
7,023 ±0,843
(n = 4)
4,00 mM 1278 ±171
(n = 4)
177
Ethylpropionat Ethylvalerat
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
Ethylisovalerat Ethylheptanoat
0,01
0,03
0,05
0,07
0,09
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
Ethylundecanoat Ethylmyristat
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
Ethyltiglat Benzyltiglat
0,01
0,02
0,03
0,04
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
Abb. 90: Spezifische Initialgeschwindigkeit vi, spez. in Abhängigkeit von der
Substratanfangskonzentration und Maximalgeschwindigkeit Vmax bei der Hydrolyse von
Carbonsäureestern in Humanplasma
178
Ethylphenylacetat Benzylphenylacetat
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
1
2
3
4
5
6
7
8
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
Methyloctanoat Benzylsalicylat
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
0,00
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
Isoamylbutyrat Ethylcinnamat
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
Phenylacetat
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0.25 mM 0.50 mM 1.00 mM 2.00 mM 3.00 mM 4.00 mM Vmax
[10-6 mol / min *g Protein]
Fortsetzung Abb. 90
179
Ethylpropionat Ethylvalerat
Ethylisovalerat Ethylheptanoat
Ethylundecanoat Ethylmyristat
Ethyltiglat Benzyltiglat
Abb. 91: Spezifische Initialgeschwindigkeit vi, spez. spezifische Hydrolyseaktivität Ha sowie
Maximalgeschwindigkeit Vmax bei der Hydrolyse von Carbonsäureestern in Humanplasma
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi, spez.
Ha
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi, spez.
Ha
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi, spez.
Ha
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi, spez.
Ha
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi,
Ha
0,000
0,004
0,008
0,012
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi, spez.
Ha
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi, spez.
Ha
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi, spez.
Ha
180
Ethylphenylacetat Benzylphenylacetat
Methyloctanoat Benzylsalicylat
Isoamylbutyrat Ethylcinnamat
Phenylacetat
Fortsetzung Abb. 91
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi,
Ha
0
2
4
6
8
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi,
Ha
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi, spez.
Ha
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi,
Ha
0
2
4
6
8
10
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi, spez.
Ha
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM 2.50 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi, spez.
Ha
0
600
1200
1800
2400
0.25 mM 0.50 mM 0.75 mM 1.00 mM 1.25 mM 1.75 mM
S0 [mmol /l]
10-6 mol /min * g Protein
Vmax
vi, spez.
Ha
181
0.25 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
0.50 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
0.75 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
1.00 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
1.25 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
1.75 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
2.50 mM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
Abb. 92: Spezifische Hydrolyseaktivität Ha, spezifische Initialgeschwindigkeit vi,spez. sowie
Maximalgeschwindigkeit Vmax von Humanplasma bei der enzymatischen Hydrolyse von
Ethylestern in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
182
0.25 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
0.50 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
0.75 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
1.00 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
1.25 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
1.75 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
2.50 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
Abb. 93: Spezifische Hydrolyseaktivität Ha, Spezifische Initialgeschwindigkeit vi,spez. sowie
Maximalgeschwindigkeit Vmax von Humanplasma bei der enzymatischen Hydrolyse von
Ethyl- und Benzylestern in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
(logarithmische Darstellung)
183
0.25 mM
0,01
0,10
1,00
10,00
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
0.50 mM
0,01
0,10
1,00
10,00
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
0.75 mM
0,01
0,10
1,00
10,00
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
1.00 mM
0,01
0,10
1,00
10,00
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
1.25 mM
0,01
0,10
1,00
10,00
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
1.75 mM
0,01
0,10
1,00
10,00
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
2.50 mM
0,01
0,10
1,00
10,00
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
10-6 mol /min * g Protein
Ha vi, spez. Vmax
Abb. 94: Spezifische Hydrolyseaktivität Ha , Spezifische Initialgeschwindigkeit vi, spez. sowie
Maximalgeschwindigkeit Vmax von Humanplasma bei der enzymatischen Hydrolyse von
Carbonsäureestern mit identischer Summenformel und verschiedener chemischer
Struktur in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
(logarithmische Darstellung)
184
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
Propionat Valerat iso-Valerat Heptanoat Undecanoat Myristat
Vmax Km Vmax/Km
Abb. 95: Kinetische Parameter von Ethylestern bei der enzymatischen Hydrolyse in Humanplasma
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
Ethyltiglat Benzyltiglat Benzyl-
salicylat
Benzyl-
phenylacetat
Ethyl-
phenylacetat
Ethyl-
cinnamat
Vmax Km Vmax/Km
Abb. 96: Kinetische Parameter von Ethyl- und Benzylestern bei der enzymatischen Hydrolyse in
Humanplasma
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
Methyloctanoat Ethylheptanoat Isoamylbutyrat
Vmax Km Vmax/Km
Abb. 97: Kinetische Parameter von Estern mit identischer Summenformel und verschiedener
chemischer Struktur bei der enzymatischen Hydrolyse in Humanplasma
Vmax [10-6 mol /min * g Protein]; Km [10-3 mol /L]; Vmax/Km [10-3 l /min * g Protein]
185
0.25 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
100,000
1000,000
PA IAB BPA EV EP EPA EisoV EH MO BT ET EU BS EC EM
10-6 mol /min * g Protein
0.50 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
100,000
1000,000
PA IAB BPA EV EP EPA EH EisoV MO BT BS EU ET EC EM
10-6 mol /min * g Protein
1.00 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
100,000
1000,000
PA BPA IAB EV EPA EP EH MO BT EisoV BS ET EU EC EM
10-6 mol /min * g Protein
Abb. 98: Spezifische Hydrolyseaktivität Ha von Humanplasma bei der enzymatischen Hydrolyse
von Carbonsäureestern in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
(Auswahl) (logarithmische Darstellung)
186
0.50 mM
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
10000,0
EM EC ET EU BS BT MO EH EisoV EPA EP EV BPA IAB PA*
Minuten
1.00 mM
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
10000,0
EM EC ET EU BS BT EisoV MO EH EP EPA EV IAB BPA PA*
Minuten
Abb. 99: Halbwertzeit t1/2 von Carbonsäureestern bei der enzymatischen Hydrolyse in
Humanplasma in Abhängigkeit von der Substratanfangskonzentration
(Auswahl) (logarithmische Darstellung)
* Humanplasma 1:100 verdünnt
0.25 mM
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
10000,0
EM EC BS EU ET BT MO EH EisoV EPA EP EV BPA IAB PA*
Minuten
187
0.25 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
100,000
1000,000
PA IAB BPA EV EP EPA EisoV EH MO BT ET EU BS EC EM
10-6 mol /min * g Protein
0.50 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
100,000
1000,000
PA IAB BPA EV EP EPA EH EisoV MO BT BS EU ET EC EM
10-6 mol /min * g Protein
1.00 mM
0,001
0,010
0,100
1,000
10,000
100,000
1000,000
PA BPA IAB EV EPA EP EH EisoV MO BT BS EU ET EC EM
10-6 mol /min * g Protein
Abb. 100: Spezifische Initialgeschwindigkeit vi, spez. von Carbonsäureestern bei der enzymatischen
Hydrolyse in Humanplasma
189
Lebenslauf
Name: Verena Arnold, geb. List
Geburtsdatum: 02.07.1971
Geburtsort: Annahütte /Niederlausitz
Familienstand: verheiratet
Kinder: eine Tochter (geb. 10.09.2004)
Ausbildung
Schule: 1978 – 1988 Polytechnische Oberschule in Annahütte/Niederlausitz
Abschluss: mittlere Reife
1988 – 1990 Erweiterte Oberschule in Senftenberg
Abschluss: Abitur
Hochschulstudium: 1990 – 1991 Studium Fachrichtung Biotechnologie,
Technische Hochschule Köthen /Sachsen-Anhalt
1991 – 1996 Studium der Lebensmittelchemie,
Technische Universität Berlin
Abschluss: 16.01.1996 Staatsprüfung in Lebensmittelchemie, Teil A
01 – 09/1996 Diplomarbeit „Analytik zur Charakterisierung von Alkylpoly-
glucosiden mittels Carbohydrolasen“,
Abschluss: 30.09.1996 Diplom-Hauptprüfung
10/1996 - 09/1997 Praktikantin der Lebensmittelchemie an der Landesuntersuchungsanstalt
für das Gesundheits- und Veterinärwesen Sachsen
Abschluss: 26.09.1997 Staatsprüfung in Lebensmittelchemie, Teil B
Promotion: 02/1998 – 02/2003 Prüfleiterin und Doktorandin im Fachbereich
„Toxikologie der Lebensmittel und Bedarfsgegenstände“ des
Bundesinstituts für Risikobewertung (früher BgVV, Bundesinstitut für
gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin) in Berlin
Thema: „Struktur-Wirkungsbeziehungen bei der enzymatischen Hydrolyse
von Carbonsäureestern“
Beruf: seit 05/2003 Qualitätsmanagerin und stellvertretende Laborleiterin im
Bereich Produktanalytik der Dr. Weßling Gruppe in Altenberge
Münster, 27.03.2005
