Untersuchungen zur Aufnahme von
Antibiotika durch Nutzpflanzen
Von der Fakultät für Naturwissenschaften
Department Chemie
der Universität Paderborn
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
genehmigte Dissertation
von
Diplom-Chemikerin Christine Schwake-Anduschus, geb. Schwake
aus
Hameln
Paderborn 2008
2
Veröffentlichungen im Zusammenhang mit dieser Arbeit
Grote M., Schwake-Anduschus C., Michel R., Stevens H., Heyser W., Langenkämper G.,
Betsche T., Freitag M. (2007) Incorporation of veterinary antibiotics into crops from
manured soil, Landbauforschung Völkenrode - FAL Agricultural Research 57 (1), 25-32.
Grote M., Schwake-Anduschus C., Michel R., Langenkämper G., Betsche T., Hayen H.,
Heyser W., Freitag M. (2007) Aufnahme und Transport von Tierarzneistoffen in
Nutzpflanzen, in Müncher Beiträge zur Abwasser-, Fischerei- und Flussbiologie, Band 58,
Vorträge der 58.Fachtagung „Tierarzneimittel in der Umwelt“, Hrsg. Bayrisches Landesamt
für Umwelt, Oldenbourg Industrieverlag GmbH, ISBN 978-3-8356-3135-9, 161-173.
Grote M., Schwake-Anduschus C., Stevens H., Michel R., Betsche T., Freitag M. (2006)
Antibiotika-Aufnahme von Nutzpflanzen aus Gülle-gedüngten Böden – Ergebnisse eines
Modellversuchs, Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit 1, 38-50.
Vorträge
Schwake-Anduschus C., Nettmann E., Betsche T., Langenkämper G., Freitag M., Grote M.
(2003) Untersuchungen zur Aufnahme von Veterinärpharmaka verschiedener
Nutzpflanzen über die Wurzel, Tagung „Gesunde Umwelt für gesunde Pflanzen“ 9.-
10.10.2003, FAL Braunschweig.
Grote M., Schwake-Anduschus C., Yolcu D., Michel R., Heyser W., Hayen H.,
Langenkämper G., Betsche T., Freitag M. (2008) Incorporation of veterinary antibiotics into
wheat, 13th ICC Cereal and Bread Congress, Cerworld 21th, 15.06.-18.06.2008, Madrid,
Spain.
3
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Mai 2002 bis Dezember 2003 und von
Februar 2005 bis Mai 2006 an der Universität Paderborn im Fach Anorganische und
Analytische Chemie des Departments Chemie der Fakultät für Naturwissenschaften unter
der Leitung von Herrn Prof. Dr. Manfred Grote durchgeführt.
Die Arbeit wurde durch das Ministerium für Umwelt, Naturschutz, Landwirtschaft und
Verbraucherschutz MUNLV des Landes Nordrhein-Westfalen und durch die
Graduiertenkommission der Universität Paderborn gefördert.
4
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Manfred Grote danke ich herzlich für die Überlassung des interessanten
Themas und seine engagierte Betreuung.
Herrn Prof. Dr. Wolfgang Heyser (Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige
Technologien, UFT, Universität Bremen) danke ich für die Übernahme des Koreferats und
die Unterstützung bei der Planung und Durchführung der Tracerversuche.
Mein Dank gilt auch Herrn Dr. Thomas Betsche und Herrn Dr. Georg Langenkämper
(Bundesforschungsinstitut für Ernährung und Lebensmittel, Detmold, Max Rubner-Institut
MRI) für die Unterstützung bei der Durchführung der Hydrokulturversuche und deren stete
Diskussionsbereitschaft.
Frau Helga Wehrkamp (UFT Bremen) danke ich für die freundliche Unterstützung bei der
Durchführung der Tracer-Versuche am UFT.
Herrn Dr. Heiko Hayen (Institute for Analytical Siences, ISAS Dortmund) danke ich für die
Durchführung der FTICR-Messungen.
Ferner möchte ich mich bei allen jetzigen und ehemaligen Mitarbeitern des Arbeitskreises
an der Universität Paderborn für ihre kollegiale Zusammenarbeit bedanken.
Des weiteren danke ich allen, die außerhalb des Arbeitskreises zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen haben, insbesondere meiner Mutter, meinen Schwestern, meinem
Bruder, meinem Schwager und meinen Freundinnen und Freunden.
Für die finanzielle Förderung danke ich dem Ministerium für Umwelt, Naturschutz,
Landwirtschaft und Verbraucherschutz MUNLV des Landes Nordrhein-Westfalen und der
Graduiertenkommission der Universität Paderborn.
Bei meinem Ehemann Dr. Martin Anduschus, meinen Kindern Paul-Ole, Camilla und Nina
möchte ich mich für die Rücksichtnahme und das andauernde Verständnis sehr herzlich
bedanken. Sie haben einen großen Beitrag zum Gelingen dieser Arbeit geleistet.
5
Abkürzungen
AB Antibiotika
ACD/I-LAB Internet-based service for instant access to chemical databases
B Blatt
BfEL Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel, Standort Detmold,
seit 01.2008 Max Rubner-Institut
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlin
BfT Bundesverband für Tiergesundheit e.V.
Ci Curie
CTC Chlortetracyclin
d Tag / day
DDT Dichlordiphenyltrichlorethan
DGI Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie
DNT Dinitrotoluol
e-CTC 4-Epichlortetracyclin
e-DMC 4-Epidemeclocyclin
e-iso-CTC 4-Epiisochlortetracyclin
e-Oxy-CTC 4-Epioxychlortetracyclin
e-Oxy-TC 4-Epioxytetracyclin
e-TC 4-Epitetracyclin
FEDESA European Federation of Animal Health Industry
FG Frischgewicht
FS Feldsalat
GENARS German Network for Antimicrobial Resistance Surveillance
GFK Gesellschaft für Konsumforschung
HPLC High-Performance-Liquid-Chromatography (Hochleistungsflüssigkeits-
Chromatographie)
³H-SM (3,5)-³H-Sulfamethazin
³H-TC (7)-³H-Tetracyclin
IFAH International Federation for Animal Health
iso-CTC Isochlortetracyclin
IS Interner Standard
KBq Kilobequerel
Kon Kontrolle
Konz Konzentration
Kow oder P Verteilungskoeffizient Oktanol/Wasser
KW Kohlenwasserstoffe
LC-MS Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie
Nlös Nährlösung
MRI Max Rubner-Institut, Bundesforschungsinstitut für Ernährung und
Lebensmittel, Standort Detmold
MRL Maximum Residue Limit
MS Massenspektrometrie
MS/MS Tandem Massenspektrometrie von Vorläufer- und Produktionen
MS² Tandem Massenspektrometrie
MUNLV Ministerium für Umwelt, Naturschutz, Landwirtschaft und Verbraucherschutz
des Landes Nordrhein-Westfalens
NN nicht nachweisbar
6
OTC Oxytetracyclin
PEG Paul Ehrlich Gesellschaft für Chemotherapie e.V.
PCB Polychlorierte Biphenyle
pKa negativ dekadischer Logarithmus der Säurekonstante Ka
PM Möhrensorte „Pariser Markt“
RR Möhrensorte „Rote Riesen“
SFD Sulfadiazin
SMP Sulfamethoxypyridazin
SMZ Sulfamethazin
SRM Single Reaction Modus
TC Tetracyclin
TIC Total Ion Current
TM Trockenmasse
TNT Trinitrotoluol
tR Retentionszeit
UFT Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige Technologien, Universität
Bremen
Wu Wurzel
WW Winterweizen
7
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGEN ................................................................................................................5
INHALTSVERZEICHNIS.....................................................................................................7
1 EINLEITUNG..................................................................................................................10
2 AUFGABENSTELLUNG UND ZIELSETZUNG .............................................................12
3 ANTIBIOTIKA ................................................................................................................14
3.1 Verbrauchsmengen in der Human- und Veterinärmedizin...........................................14
3.2 Tetracycline .................................................................................................................17
3.3 Sulfonamide.................................................................................................................20
3.4 Verteilung in der Umwelt..............................................................................................21
4 PFLANZENPHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN ÜBER AUFNAHME UND
TRANSPORT VON STOFFEN ÜBER DIE WURZEL .......................................................23
4.1 Aufbau einer Wurzel ....................................................................................................23
4.1.1 Xylem........................................................................................................................26
4.1.2 Phloem .....................................................................................................................26
5 STOFFTRANSPORT DURCH PFLANZLICHE ZELLEN...............................................27
5.1 Grundlagen des Stofftransports...................................................................................27
5.2 Stofftransport in Abhängigkeit von physiko-chemischen Eigenschaften......................28
6 METABOLISMUS IN PFLANZEN..................................................................................31
7 STAND DER FORSCHUNG ZUR AUFNAHME VON ANTIBIOTIKA IN PFLANZEN....33
8 MATERIAL UND METHODEN.......................................................................................36
8.1 Aufnahmeexperimente.................................................................................................36
8.2 Anzucht der Pflanzen ..................................................................................................37
8.2.1 Vorbemerkung..........................................................................................................37
8.2.2 Vorbehandlung der Samen.......................................................................................37
8.2.3 Keimung der Samen.................................................................................................37
8.2.4 Entwicklung der Pflanzen .........................................................................................38
8.2.5 Bestimmung der Biomasse der Pflanzen..................................................................38
8.2.6 Zudotierung der Antibiotika.......................................................................................39
8.2.6.1 Aufnahmeexperimente mit unmarkierten Antibiotika..............................................39
8.2.6.2 Aufnahmeexperimente mit markierten Antibiotika .................................................39
8
8.2.7 Ernte und Lagerung..................................................................................................40
8.3 Analyse der Proben aus Versuchen mit ³H-markierten Antibiotika ..............................40
8.3.1 Flüssig-Szintillationszählung.....................................................................................40
8.3.2 Mikroautoradiographie..............................................................................................42
8.4 Analyse der Proben aus Versuchen mit unmarkierten Antibiotika ...............................42
8.4.1 Bestimmung von Sulfadiazin ....................................................................................43
8.4.2 Bestimmung von Chlortetracyclin und iso-Chlortetracyclin.......................................44
8.4.3 Untersuchungen zu Metaboliten in Pflanzenproben .................................................45
9 ERGEBNISSE UND DISKUSSION ................................................................................46
9.1 Modellrechnungen zur Pflanzenverfügbarkeit von Antibiotika .....................................46
9.2 Anzucht von Weizen, Feldsalat und Möhren ...............................................................46
9.2.1 Vorbehandlung der Samen.......................................................................................46
9.2.2 Keimung und Entwicklung ........................................................................................47
9.3 Aufnahmeexperimente mit Tritium-markierten Antibiotika ...........................................48
9.3.1 Feldsalat...................................................................................................................48
9.3.2 Winterweizen............................................................................................................49
9.3.3 Ergebnisse der Mikroautoradiographie.....................................................................51
9.3.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der ³H-Experimente..........................................53
9.4 Entwicklung der Rückstandsanalytik mit LC-MS..........................................................54
9.4.1 Qualitativer Nachweis von SFD, CTC und iso-CTC mit LC-MS/MS .........................54
9.4.2 Externe Kalibrierung .................................................................................................57
9.4.3 Optimierung der Probenaufarbeitung .......................................................................57
9.4.4 Nachweis der Analyten in Pflanzenextrakten............................................................59
9.4.5 Wiederfindung ..........................................................................................................60
9.4.6 Signalsuppression ....................................................................................................61
9.4.7 Anwendung eines Internen Standards zur SFD Bestimmung..................................63
9.4.8 Standardaddition ......................................................................................................65
9.5 Aufnahmeexperimente mit unmarkierten Antibiotika in Hydrokultur ............................66
9.5.1 Möhren .....................................................................................................................66
9.5.1.1 Aufnahme von SFD ...............................................................................................66
9.5.1.2 Aufnahme von CTC / iso-CTC...............................................................................68
9.5.2 Feldsalat...................................................................................................................71
9.5.2.1 Aufnahme von SFD ...............................................................................................71
9.5.2.2 Aufnahme von CTC / iso-CTC...............................................................................72
9.5.3 Winterweizen............................................................................................................74
9.5.3.1 Aufnahme von SFD ...............................................................................................74
9.5.3.2 Aufnahme von CTC / iso-CTC..............................................................................77
9.5.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der Methodenentwicklung und der
Aufnahmeexperimente mit unmarkierten Antibiotika....................................................82
9.6 Metabolisierung von Chlortetracyclin in Pflanzen ........................................................83
9.6.1 Einführung ................................................................................................................83
9.6.2 Mögliche Metabolite von CTC...................................................................................83
9.6.3 Nachgewiesene Metabolite von CTC........................................................................87
9.6.3.1 Nachweis von Metaboliten in Wurzeln des Winterweizen......................................87
9.6.3.2 Nachgewiesene Metabolite in ausgewählten Pflanzenproben...............................93
9.6.3.3 Metabolite in Pflanzen aus einem Freilandversuch ...............................................94
9.6.4 Zusammenfassung der Untersuchungsergebnisse auf Metabolite...........................95
9
10 ZUSAMMENFASSUNG ...............................................................................................96
11 EXPERIMENTELLER TEIL..........................................................................................99
11.1 Verwendete Geräte und Chemikalien........................................................................99
11.2 Durchführung...........................................................................................................104
11.2.1 Anzucht von Nutzpflanzen auf Hydrokultur mit unmarkierten Arzneistoff-dotierten
Nährlösungen (BfEL, Detmold) ..................................................................................104
11.2.2 Anzucht von Nutzpflanzen auf Hydrokultur mit markierten Arzneistoff-dotierten
Nährlösungen (UFT, Bremen)....................................................................................108
11.2.3 Analyse der Arzneistoffrückstände in Pflanzenproben mit LC-MS........................111
12 LITERATUR ...............................................................................................................114
ANHANG.........................................................................................................................124
A1 Verwendete Lösungen bei der Anzucht der Pflanzen ................................................124
A2 Verwendete Lösungen bei der Probenaufbereitung und Analytik...............................126
A3 Verwendete Lösungen bei den Versuchen mit Tritium-markierten Antibiotika und die
ermittelten Gehalte.....................................................................................................127
A3.1 Umrechnung von Radioaktivitätseinheiten ..............................................................134
10
1 Einleitung
Antibiotika gehören in der Human- und Veterinär-Medizin zu den verordnungsstärksten
Medikamenten (Sattelberger 1999, Ungemach 1999). In der Europäischen Union
einschließlich der Schweiz wurden 1997 10.500 t Antibiotika in der Veterinärmedizin und
in der Humanmedizin angewendet (FEDESA 1999), nur zwei Jahre später waren es
bereits 13.200 t (FEDESA 2001). Davon entfielen 35% auf Nutztiere und 65% auf
Menschen (ebd.). Bei den Nutztieren wurden 92% für die Behandlung von Krankheiten
und 6% als Wachstumsförderer mit der Tiernahrung eingesetzt (ebd.).
Die zunehmende Ausbreitung von resistenten Bakterienstämmen führte zum Verbot von
Antibiotikagaben zur Leistungsförderung in der Tiermast. Ab 2006 dürfen Antibiotika nur
noch nach tierärztlicher Verordnung gemäß VO (EG) 1831/2003 angewendet werden.
Antibiotika werden im Organismus nicht vollständig abgebaut. Vielmehr gelangen bis zu
80% der einem Lebewesen verabreichten Antibiotikadosen wieder in die Umwelt (Sedlak
2001). Nach Behandlung von Tieren gelangen die ausgeschiedenen Wirkstoffe und
Abbauprodukte über den Austrag von Gülle auf landwirtschaftlich genutzte Felder und
führen zur Belastung aquatischer und terrestrischer Systeme (Halling-Sǿrensen 1999,
Thiele-Brunn 2003, Hamscher 2002 + 2005, Grote 2005). Doch was passiert dann?
Können die Wirkstoffe und Metabolite von Nutzpflanzen aus güllegedüngten Böden
aufgenommen, in die menschlichen Nahrungskette gelangen und zur Bildung resistenter
Bakterienstämme beitragen?
Die Bildung und Verbreitung resistenter Bakterienstämme birgt für die Gesellschaft
erhebliche Risiken und wird deshalb von zahlreichen Forschungsgruppen untersucht (vgl.
z.B. das GENARS Projekt „German Network for Antimicrobial Resistance Surveillance“,
www.GENARS.de, die Arbeiten der PEG, Paul Ehrlich Gesellschaft für Chemotherapie
e.V. www.p-e-g.org; der Deutschen Gesellschaft für Infektiologie e. V. (DGI) www.dgi-
net.de; sowie der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM)
www.dghm.org). Heute wird die Bildung und Verbreitung resistenter Bakterienstämme
auch im Zusammenhang mit geringen Aufnahmemengen von Antibiotika und deren
Metaboliten diskutiert (Langewische und Bottermann 2003, Smith et al. 2005). Für
Lebensmittel tierischer Herkunft gibt es bereits Antibiotika-Rückstandshöchstmengen, weil
sie einen Beitrag zur Antibiotika-Aufnahme in die Nahrungskette bilden (Vockel 2005). Der
Eintragspfad von Antibiotika über die pflanzliche Nahrungskette ist bisher jedoch nur
wenig untersucht. Im ungünstigsten Fall gelangen Antibiotika nach der Verwendung in der
Veterinärmedizin wieder über Boden und Pflanzen in die menschliche und tierische
11
Nahrungskette und tragen, so das „worst case scenario“, zur Bildung und Verbreitung
resistenter Bakterienstämme bei. Damit ist das Hauptthema dieser Arbeit genannt: Es soll
untersucht werden, ob und in welchen Umfang Nutzpflanzen Antibiotika aufnehmen und
ob und in welchem Umfang ggf. für den Menschen toxikologisch relevante Metabolite in
Pflanzen gebildet werden.
Das Aufnahmepotenzial von Pflanzen für Antibiotika wurde bereits vor 50 Jahren erkannt
(Krasilnikow 1958). Damals wurde der Einsatz von Antibiotika in der Landwirtschaft zur
Ertragssteigerung und zum Pflanzenschutz untersucht. Penicillin und Streptomycin wurden
von Weizen (Triticum aestivum), Mais (Zea mays) und Feldsalat (Valerianella locusta)
„assimiliert“ und zeigten dadurch ein verändertes Wachstum. Die Befunde waren
allerdings nicht einheitlich und die Wirkungsmechanismen sind weitgehend unbekannt
geblieben. Manche Pflanzen reagieren zum Beispiel mit verzögertem Wachstum, wenn sie
Antibiotika ausgesetzt werden, andere scheinen gar nicht zu reagieren (Batchelder 1982,
Langhammer et al. 1990), während wieder andere durch Antibiotika schneller zu wachsen
scheinen. Außerdem wurde festgestellt, dass Pflanzen auch unterschiedlich auf
verschiedene Antibiotika reagieren. So können sich z.B. einige Sulfadimethoxine auf Mais
toxisch auswirken (Migliore 1998). Im Rahmen dieser Forschungen wurde festgestellt,
dass Antibiotika relevante Auswirkungen auf Nutzpflanzen haben können, die
Wechselwirkungen zwischen Antibiotika und Nutzpflanzen blieben jedoch weitestgehend
unbekannt (Farkas et al. 2007).
Insgesamt sind weder die Aufnahmewege noch die Aufnahmemengen von Antibiotika in
Pflanzen oder ihre Metabolite hinreichend bekannt. Damit ist auch das Risikopotential
durch Antibiotika in Nutzpflanzen kaum einschätzbar. Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen
einen Beitrag zur Klärung dieser grundlegenden Fragestellungen leisten. Denn wenn
Nutzpflanzen Antibiotika über die Gülle und den Boden aufnehmen, so können diese
Antibiotika und ihre Metabolite auch wieder in die Nahrungskette von Mensch und Tier
gelangen und somit letztendlich die Ausbreitung resistenter Bakterienstämme fördern.
12
2 Aufgabenstellung und Zielsetzung
In der vorliegenden Arbeit wird der Transfer von Antibiotika vom Boden in Nutzpflanzen
untersucht. Sie ist in das Forschungsprojekt „Antiinfektivaeinträge aus der Tierproduktion
in terrestrische und aquatische Kompartimente“ (Forschungsauftrag MUNLV Düsseldorf
IIA5-2038.06.0601-B/T/201 30.August 2001) einzuordnen (Grote 2005). In diesem
Forschungsprojekt wurde in einer praxisnahen Modellstudie der Weg der Antibiotika in der
Landwirtschaft untersucht, und zwar angefangen bei der kontrollierten Medikation von
Schweinen, über die Analyse der Ausscheidungen, dem Ausbringen der Gülle auf Felder,
der Analyse des Bodens und dem Anbau und der Analyse von Feldpflanzen. Bis zum Start
des Forschungsprojektes war nicht klar, ob und welche Mengen Antibiotika mit dem
Wirtschaftsdünger „Gülle“ auf Felder gelangen, welche Belastungen des Bodens sich
ergeben und insbesondere, wie und ob die Antibiotika in Pflanzen aufgenommen und
transportiert werden und somit wieder in den Nahrungskette von Mensch und Tier
gelangen können.
Im Rahmen des genannten Forschungsprojektes waren bis zu Beginn dieser Arbeit bereits
die folgenden Ergebnisse erzielt worden: Durch die kontrollierte Medikation von
Schweinen mit Chlortetracyclin, Sulfadiazin und Trimethoprim konnte nachgewiesen
werden, dass bis zu 90% dieser Antibiotika wieder ausgeschieden werden und in die Gülle
gelangen (Grote et al. 2004). In der Gülle wurden unter anderem die eingesetzten
Substanzen Chlortetracyclin und Sulfadiazin nachgewiesen. Diese Antibiotika liessen sich
dann auch im Boden nachweisen, auf den die Gülle ausgebracht wurde (Grote et al. 2004
und 2005). Diese Ergebnisse legen die Kernfrage der Arbeit nahe: tritt ein Transfer der
Antibiotika in die Pflanze auf?
1982 wurden von Batchelder Aufnahmexperimente mit radioaktiv markierten Sulfonamiden
durchgeführt (u.a. mit Weizen und Mais) die Hinweise darauf lieferten, dass Nutzpflanzen
Antibiotika über die Wurzel aufnehmen. Gesicherte Erkenntnisse lagen aber bis zum
Beginn dieser Arbeit noch nicht vor. Um hier zur Klärung beizutragen, sollen
Aufnahmeexperimente von Antibiotika durch Nutzpflanzen unter Hydrokulturbedingungen
durchgeführt werden. Bei den Nutzpflanzen handelt es sich um Winterweizen, Feldsalat
und Möhren; bei den Antibiotika um die in der Veterinärmedizin und deshalb in der
Modellstudie eingesetzen Verbindungen Chlortetracyclin (CTC) und Sulfadiazin (SFD)
kombiniert mit antibiotisch inaktivem Isochlortetracyclin (iso-CTC), welches neben den
eingesetzten Antibiotika als Hauptinhaltsstoff in der Gülle gefunden wurde (Grote et al.
13
2004). Zusätzlich zu der Frage, ob ein Transfer von Antibotika aus dem Boden in die
Nutzpflanzen und ein Transport innerhalb der Pflanzen erfolgt, werden auch erste
Analysen zum weiteren Verbleib von Antibiotika in Nutzpflanzen durchgeführt, also
Analysen zu sogenannten Metaboliten. Unter Metaboliten werden Umwandlungsprodukte
von Antibiotika verstanden, wobei in dieser Arbeit nur die „pflanzlichen Metabolite“
betrachtet werden, d.h. diejenigen Umwandlungsprodukte, die im pflanzlichen Material
vorhanden sind. Dabei wird der Bildungsort der Metaboliten z.B. (a) tierische Metabolite,
die ggf. vom Tier ausgeschieden und mit der Gülle auf Felder gelangen könnten, oder (b)
im Boden oder in der Rhizosphäre gebildete Metabolite, die als solche in die Pflanzen
gelangen könnten, in dieser Arbeit soweit möglich mitbetrachtet.
Die Aufgabenstellungen dieser Arbeit lauten im Einzelnen:
1. Kontrollierte Anzucht und Entwicklung von Weizen, Feldsalat und Möhren in
Hydrokultur. Dabei sollen die Pflanzen in der Nährlösung verschiedenen
Konzentrationen an Antibiotika ausgesetzt werden.
2. Entwicklung einer LC-MS/MS-basierten Methode zum Nachweis von Antibiotika in
den Nutzpflanzen.
3. Identifizierung und Quantifizierung von Antibiotika in den Pflanzen anhand der
entwickelten Methode.
4. Aufnahmeexperimente mit radioaktiv markierten Antibiotika unter vergleichbaren
Hydrokulturbedingungen wie unter 1.
5. Identifizierung pflanzlicher Metabolite mit Hilfe der entwickelten LC-MS-Methode.
Um sowohl unbelastete Pflanzen als auch Pflanzen, die antibiotikahaltiger Nährlösung
ausgesetzt sind, zur Verfügung zu haben, werden Pflanzen in Hydrokultur, mit und ohne
Antibiotika-Zugabe in der Nährlösung angezogen. Als Nutzpflanzen werden Winterweizen,
Feldsalat und Möhren gewählt. Sowohl zu Winterweizen als auch zu Feldsalat wird in der
landwirtschaftlichen Praxis mit Gülle gedüngt. Möhren wurden gewählt, weil der zum
Verzehr geeignete Bereich die Wurzel ist, und durch sie eine Aufnahme von Wasser und
darin gelöste Substanzen stattfindet. Mit diesen Pflanzen wird die Entwicklung und
Anwendung einer Methode zum Nachweis von Antibiotika in Nutzpflanzen auf Basis LC-
MS durchgeführt.
Aufgabenstellung 4, also der Nachweis der Aufnahme von Antibiotika mit Hilfe radioaktiv
markierter Stoffe, wurde gewählt, um die Ergebnisse der LC-MS-Methode zu verifizieren.
14
Des weiteren lässt sich mit Hilfe von radioaktiv markierten Verbindungen die Lokalisation
der Verbindungen innerhalb der Pflanze nachvollziehen.
Aufgabenstellung 5 betrachtet Metabolite von den ausgewählten Antibiotika. Diese
Aufgabenstellung ist relevant, weil die Aufnahme von Antibiotika durch Nutzpflanzen wenig
über den weiteren Verbleib und den Transport der Antibiotika innerhalb der Nutzpflanzen
aussagt. Vielmehr ist anzunehmen, dass Abbauprozesse und Umwandlungsprozesse
stattfinden. Doch welche Metabolite werden tatsächlich gebildet ?
Zum Einstieg in das Thema dieser Arbeit sind grundlegende Informationen über den
Einsatz und die physiko-chemischen Eigenschaften von Antibiotika angebracht.
3 Antibiotika
3.1 Verbrauchsmengen in der Human- und Veterinärmedizin
Der Verbrauch an Antibiotika wird in der EU und seinen Mitgliedsstaaten leider nicht
grundsätzlich dokumentiert, so dass Verbrauchsdaten nicht umfänglich bekannt sind.
Verbrauchsdaten werden in wenigen Ausnahmefällen von verschiedenen Stellen zur
Verfügung gestellt (wie die FEDESA, oder der Bundesverband für Tiergesundheit e.V.
BfT). Der Gesamtverbrauch von Antibiotika (Human- und Veterinärmedizin) lag demnach
1999 bei 13.200 t in der Europäischen Union (EU) einschließlich der Schweiz. Die
Verteilung auf Human- und Veterinärmedizin ist in der Abb.1 dargestellt.
800
3900
8500
Futterzusatz Tiermedizin Humanmedizin
Abb.1: Antibiotika-Verbrauch in der EU einschließlich der Schweiz in Tonnen (1999,
gesamt 13.200t), Quelle: European Federation of Animal Health Industry (FEDESA)
2001.
Die FEDESA wurde im Jahr 2003 in den Weltverband IFAH (International Federation for
Animal Health) integriert. Laut IFAH betrug der Einsatz von Antiinfektiva 15,8%, der
15
Antiparasitika 29% am weltweiten Tierarzneimittelverbrauch (IFAH 2005), der allerdings in
Umsatzzahlen, also in US Dollar und nicht in Mengen angegeben ist. Mengenangaben
werden von der IFAH nur spärlich veröffentlich, noch im Jahr 2007 finden sich
Zahlenangaben aus 1997.
Tab. 1: Abschätzung der Verkaufszahlen antimikrobakterieller Substanzen für Tiere in der
EU 1997, nach Wirkstoffgruppen (Angabe in Tonnen, Annahme: 100% Wirkstoff-
reinheit ) nach IFAH (2007)
Penicilline 322
Tetracycline 2294
Makrolide 424
Aminoglykoside 154
Fluorchinolone 43
Trimethoprim/Sulphate 75
Andere Therapeutika 182
Wachstumsbeschleuniger 1599
Summe 5093
Tab. 2: Abgeschätzer jährlicher Verbrauch antimikrobakterieller Substanzen von
Menschen und Tieren in der EU 1997: Angaben in Tonnen, Annahme: 100%
Wirkstoffreinheit (IFAH 2007)
In Menschen - Allgemeinärzte und Krankenhäuser 5400 52%
In Tieren - therapeutische Verabreichung 3494 33%
In Tieren - Futtermittelzusätze* 1599 15%
Summe 10493 100%
*Kokzidiostatika (Ionophore und ähnliche) sind ausgeschlossen
Für die zum Einsatz kommenden verschiedenen Wirkstoffgruppen der verwendeten
Antibiotika werden in der Literatur auch nur spärlich Angaben jüngeren Datums gefunden.
Nach Thiele-Bruhn (2003) liegen die Verbrauchsmengen an Tetracyclinen und
Sulfonamiden zwischen 20 und 50 Prozent des Gesamtverbrauchs, siehe Tabelle 3.
16
Tab.3: Antibiotika-Jahresverbrauch in der Veterinärmedizin in ausgewählten Ländern der
EU (Thiele-Bruhn 2003)
Dänemark, 1997 Frankreich, 1980 Großbritannien, 2000
t % t % t %
Tetracycline 13 23 117 19 228 52
Sulfonamide 13 23 139 22 94 22
Aminoglykoside 7,7 14 57 9 12 3
ß-Laktame 15 26 50 8 49 11
Makrolide 1,7 3 37 6 41 9
Andere 6,5 11 226 36 12 3
Gesamt 57 625 437
Für das Jahr 2003 kommt eine Erhebung des BfT (2005) auf eine Gesamt-
verbrauchsmenge an Antiinfektiva in Deutschland in der Tiermedizin auf 668,8 t.
Schätzungen von Schneidereit (2005), auf Grundlage des Veterinärpanel der Gesellschaft
für Konsumforschung (GFK), Nürnberg, ergeben für Deutschland ähnliche Werte (Tab. 4).
Tab. 4: Antibiotikaeinsatz in Deutschland (Veterinärmedizin) in den Jahren 2003 und
2005, Angaben in t
2003 2005
Antibiotika gesamt 724,2 784,4
Aminoglykoside 27,3 36,3
Beta-Laktame 155,2 199,2
Chinolone 3,5 3,7
Lincosamide 7,5 12,1
Makrolide 38,6 52,6
Phenicole 4,7 4,8
Pleuromutiline 6,8 6,4
Polypeptide 23,4 21,8
Sulfonamide 71,7 97,5
Tetracycline 385,5 350,0
Anhand der Tabellen 3 und 4 kann ein hoher Gebrauch an Tetracyclinen und
Sulfonamiden sowohl in Deutschland als auch in anderen Ländern der EU abgelesen
werden. Nach einer Untersuchung von Winkler und Grafe (2001) hatten Tetracycline 52%
17
und Sulfonamide 19% Anteil an den eingesetzten Antibiotika-Wirkstoffgruppen. Das
Forschungsprojekt „Antiinfektivaeinträge aus der Tierproduktion in terrestrische und
aquatische Kompartimente“ (Grote 2005) und die vorliegende Arbeit konzentrieren sich
deshalb auf Tetracycline und Sulfonamide, da diese einen Großteil der Antibiotika
ausmachen, die in der Tiermedizin verwendet werden. Deshalb werden in den folgenden
Unterkapiteln die Eigenschaften von Tetracyclinen und Sulfonamiden rekapituliert, die im
Rahmen der vorliegenden Untersuchungen relevant sind.
3.2 Tetracycline
Tetracycline sind Breitband-Antibiotika, die teilsynthetisch hergestellt werden. Sie wirken
gegen grampositive und gramnegative Bakterien, Chlamydien, Mykoplasmen und andere
Keime (Adam & Thoma 1994). Tetracycline wirken bakteriostatisch und hemmen die
ribosomale Proteinsynthese der Erreger (Onken 1979). Strukturell bildet das Grundgerüst
der Tetracycline ein Naphthacenring-System, der bei verschiedenen Tetracyclinen
unterschiedlich substituiert ist (Gräfe 1992) (siehe Abbildung 2). Als Wirkstoffe werden
heutzutage Tetracyclin (TC), Chlortetracyclin (CTC), Doxycyclin (DC) und Oxytetracyclin
(OTC) angewendet. Das früher in der Human- und Veterinärmedizin auch verwendete
Demeclocyclin (DMC) wurde aufgrund seiner toxischen und teratogenen Eigenschaften
1989 aus dem Handel genommen. Außer in einzelnen Spezialpräparaten, wie z.B. einem
in der Zahnmedizin verwendeten Kombinationspräparat „Dentalpulver“, darf es nicht mehr
angewendet werden. Demeclocyclin wurde durch Doxycyclin ersetzt (atd 2008).
Abb.2: Molekülstruktur ausgewählter Tetracycline
18
Aufgrund der verschiedenen funktionalen Gruppen im Molekül, liegt es in Abhängigkeit
vom pH-Wert unterschiedlich geladen vor. Tetracycline deprotonieren mit einem pKa-Wert
von 3,3 an der OH-Gruppe des C3-Atoms. Eine weitere Deprotonierung kann an der
phenolischen Diketon-Gruppe des C12-Atoms mit einem pKa-Wert von 7,7 stattfinden.
Basische Eigenschaften beruhen auf der protonierbaren Dimethylamino-Gruppe des A-
Ringes mit einem pKa-Wert von 9,6 (Claizzi & Klink 1969, Stephens et al. 1956). Im
umweltrelevanten pH-Bereich von 4 bis 8 können TCs entweder als Kation (+ 0 0), als
Zwitterionen-Spezies (+ - 0) oder als Anion (+ - -) vorkommen (Figueroa et al. 2004,
Sassman & Lee 2005), wobei die Zwitterionen-Variante die wahrscheinlichste zu sein
scheint. In Wasser sind Tetracycline schwer löslich, ihre Hydrochloride lösen sich jedoch
besser (Thiele-Bruhn 2003).
Mit bi- und trivalenten Metallkationen bilden Tetracycline Chelatkomplexe. Außerdem
binden sie an Silanolgruppen und Proteine ( Oka et al. 2000).
Tetracycline sind instabil in Abhängigkeit von Lichteinfluss, Temperatur, pH-Wert und
Lösemittel. Sie epimerisieren, wobei sich die räumliche Anordnung der Dimethylamino-
gruppe am A-Ring ändert, und isomerisieren sehr leicht ( siehe Abb.3).
Im mäßig sauren Bereich von pH 2-6 epimerisiert CTC reversibel zu e-CTC. Ebenfalls
epimerisiert iso-CTC, welches im alkalischen Milieu aus CTC gebildet wird, zu e-iso-CTC.
Unter stark saurem Einfluss spalten Tetracycline im B-Ring Wasser ab und es bilden sich
die Anhydroverbindungen. Diese wirken nicht bakteriostatisch sondern bakterizid, im
Gegensatz zu den Ausgangssubstanzen, aus denen sie sich durch Wasserabspaltung
bildeten, sind sie deshalb wirksam gegen TC-resistente Bakterienstämme (Halling-
Sǿrensen et al. 2002).
19
Abb. 3: Strukturen und Symbole einiger relevanter Umwandlungsprodukte des
Chlortetracyclins
Die im Alkalischen irreversibel aus CTC und e-CTC gebildeten Iso-Verbindungen (iso-CTC
und e-iso-CTC) zeigten in der Untersuchung von Halling-Sǿrensen et al. (2002) keine
toxische Wirkung auf Bodenbakterien (vgl. dazu auch die Ausführungen in A. Vockel,
2005). Desweiteren wird unter alkalischen Bedingungen die Keto-Enol-Tautomerisation an
der Position C11a und C12 begünstigt und es bildet sich aus CTC bzw. e-CTC das Keto-
analoge keto-CTC bzw. e-keto-CTC (Naidong et al. 1990, Vockel, 2005).
Im umweltrelevanten pH-Bereich unter 6,5 wurden die in folgender Tabelle dargestellten
Verbindungen gefunden.
20
Tab.5: Umwandlungs- und Abbauprodukte von CTC in wässriger Lösung in Abhängigkeit
vom pH-Wert (nach Halling-Sǿrensen et al. 2002, s. Abb.3)
Wirkstoff in
wässriger
Lösung
pH-Bereich nachgewiesene Verbindungen
< 6,5
e-CTC
e-Anhydro-CTC
keto-CTC CTC
> 6,5 iso-CTC
keto-CTC
Die Tabelle 5 zeigt, dass allein die pH-Wert Änderung einer CTC-haltigen Lösung bewirkt,
dass verschiedene Umwandlungsprodukte entstehen können.
3.3 Sulfonamide
Sulfonamide wirken bakteriostatisch gegen die meisten grampositiven und viele gram-
negative Organismen, wobei sie den Folsäurezyklus blockieren (Gräfe 1992). Oft werden
sie mit Trimethoprim verabreicht, welches ebenfalls den Folsäurezyklus des Bakteriums
hemmt. Die allgemeine Struktur der Sulfonamide und der hauptsächlich auftretenden N4-
Metabolite bei der Passage durch den Organismus sind in der Abbildung 4 dargestellt.
Abb.4: Allgemeine Strukturen, pKa- und log P-Werte von Sulfonamiden (links) und dem
N4-acetylierten Metaboliten (rechts), logP Verteilungskoeffizient Oktanol/Wasser (vgl.5.2),
*:kalkuliert über ACD/I-Lab service
21
Sulfonamide sind in der Regel schlecht wasserlöslich, ihre Natriumsalze lösen sich
dagegen gut. Aufgrund der pKa-Werte für die Aminogruppen sind die meisten Sulfonamide
im sauren Bereich positiv, im Bereich pH 2,5 bis 6 neutral und im alkalischen negativ
geladen (Haller et al. 2002).
Der Weg dieser Antibiotika von der Aufnahme durch das Tier bis zum Feld und damit die
Verteilung der Antibiotika in der Umwelt wird im nächsten Kapitel thematisiert.
3.4 Verteilung in der Umwelt
Durch die Anwendung der Antibiotika in der Veterinärmedizin gelangen Antibiotika und
ihre Metabolite in die Exkremente von Tieren und damit auch in den Wirtschaftsdünger, in
Oberflächen- und Abwässer. Die Expositionslage und das Umweltverhalten ist ungeklärt
und es besteht weiterer Forschungsbedarf (LUA 2007). In den letzten Jahren sind einige
Veröffentlichungen zum Thema Antibiotika in der Umwelt erschienen (Grote et al. 2004,
Kümmerer 2004, Boxall et al. 2004).
Dabei zeigten Grote et al. in dem mit dieser Arbeit verknüpften Modellversuch unter
praxisnahen Bedingungen, dass bis zu 360 mg/kg Frischgewicht Sulfadiazin, 303,7 mg/kg
N4-Acetyl-SFD und 87,5 mg/kg Chlortetracycline (Summe aller CTC-Rückstände) in
gelagerter Gülle enthalten waren, wobei der Metabolit von SFD (N4-Acetyl-SFD) wieder in
aktives SFD zurückgewandelt werden konnte. Auch Langhammer (1989) berichtet über
eine Rückführung des Metabolites N4-Acetylsulfamethazin zur Ausgangssubstanz
während der Güllelagerung.
Analysen von Hamscher et al. (2000 & 2002) ergaben Konzentrationen von
Chlortetracyclin und Tetracyclin in Gülleproben von 0,1 bis 4 mg/kg. In einer anderen
Gülleuntersuchung wurden in ca. 50 % der Proben Tetracycline mit bis zu 46 mg/kg
nachgewiesen. Für Sulfonamide ergaben sich Höchstwerte von 235 mg/kg (Engels 2004).
In einem weiteren Untersuchungsprogramm für Gülle als Wirtschaftsdünger zeigte sich
mindestens ein nachgewiesenes Antibiotikum in 70,5% der Gülle-Proben (Harms 2006).
Durch die landwirtschaftlich übliche Praxis, Gülle als Dünger zu verwenden, gelangen die
Antibiotika auf die Felder und somit in den Boden. Die Belastung von Böden mit
Antibiotika-Rückständen in unterschiedlichen Bodentiefen untersuchten Hamscher et al.
(2002) und Grote et al. (2006). Obwohl unterschiedliche Methoden der
Probenvorbereitung gewählt wurden, wurden in beiden Untersuchungen Chlortetracyclin-
Rückstände (bis zu 240 µg/kg) nur in den oberen Bodenschichten bis zu 30 cm Tiefe
gefunden, in den unteren Schichten jedoch nicht. Aus den Ergebnissen wird geschlossen,
22
dass Tetracycline stark an der Bodenmatrix haften und ein Transport über die flüssige
Phase in tiefere Schichten sehr unwahrscheinlich ist (Grote et al. 2007c). Bei wiederholter
Düngung mit antibiotikahaltiger Gülle tritt eine Konzentrationszunahme in den oberen
Bodenschichten auf, wobei innerhalb von 3 Monaten die extrahierbaren Gehalte bis in den
Bereich der Nachweis- und Bestimmungsgrenze sanken (Grote et al. 2006).
Nach Berechnungen von Harms (2006) würden Tetracyclineinträge durch Düngung mit
belasteter Gülle von 3 g/ha (im Bereich der Bestimmungsgrenze) bis zu 1,8 kg/ha
(gefundene Höchstmenge an Antibiotika in Gülle) führen.
Für Sulfonamide ergab sich ein anderer Befund. Obwohl die ausgebrachte Gülle in dem
Modellversuch (Grote et al. 2005) stärker mit Sulfonamid-Komponenten belastet war,
fanden sich in den Bodenschichten bis 30 cm maximal 90 µg/kg SFD. Die Ergebnisse
belegen die allgemeine Mobilitäts-Tendenz von Sulfonamiden, wonach sie mit dem
Bodenwasser in Richtung Grundwassersohle ausgetragen werden.
In Oberflächen- und Grundwässern konnten Human-Pharmazeutika auch bereits
nachgewiesen werden (Hirsch et al. 1999, Kümmerer 2001, Hamscher et al. 2002, Thiele-
Bruhn 2003, Yang et al. 2005). Im Einlauf einer Kläranlage in den Vereingten Staaten
konnten Yang et al. (2005) 11 Antibiotika, darunter u.a. Tetracyclin, Chlortetracyclin,
Demeclocyclin, Sulfamethazin (SMZ), im Konzentrationsbereich von 0,05 – 1,09 µg/L
bestimmen. Im Ablauf derselben Anlage wurden drei Substanzen nachgewiesen:
Chlortetracyclin, Doxycylin und Sulfamethoxazol im Bereich von 0,06 bis 0,21 µg/L. Göbel
et al. (2007) untersuchten den Abbau von Sulfonamiden, Makroliden und Trimethoprim in
verschiedenen Abwasserkläranlagen in der Schweiz. Die angegebenen Substanzen
wurden mit den bestehenden Abwasserbehandlungsmaßnahmen nur unvollständig
abgebaut. Im Zulauf der Anlagen traten dabei hohe Konzentrationen von Sulfonamiden
(60 – 1600 ng/L) auf.
Mit dem Ausbringen von antibiotikahaltigem Wirtschaftsdünger gelangen die Antibiotika
auf und in den Boden, so dass eine Aufnahme der Stoffe über die Wurzel prinzipiell
möglich ist. Inwieweit Antibiotika in Pflanzen gelangen, ist bisher jedoch wenig untersucht
worden (Jjemba 2002). Auf diese Frage konzentriert sich die vorliegende Arbeit. Der
nächste Abschnitt führt grundsätzlich in die Nährstoff- und Wasseraufnahme von Pflanzen
über die Wurzel ein. Denn als Basis für eine Analyse der Aufnahme von Antibiotika und
ihren Metaboliten in Nutzpflanzen ist ein Verständnis der pflanzenphysiologischen
Grundlagen unerlässlich.
23
4 Pflanzenphysiologische Grundlagen über Aufnahme und
Transport von Stoffen über die Wurzel
Die direkte Aufnahme einer Substanz über die Wurzel gelingt nur, wenn die Substanz im
Kontakt mit der Wurzel ist, sei es durch Bodenlösung oder durch umgebendes Wasser
(Abwassertechnik oder Hydrokultur). Dabei spielt die Beschaffenheit der Wurzel ebenfalls
eine wichtige Rolle, weshalb nachfolgend auf die Physiologie der Wurzel eingegangen
wird (Trapp et al. 2001a).
4.1 Aufbau einer Wurzel
Wurzeln geben Pflanzen Halt und sind für die Aufnahme von Nährstoffen und Wasser
verantwortlich. Man unterscheidet Tiefwurzler und Flachwurzler. Tiefwurzler bilden eine
Pfahlwurzel, die u.U. bis zum Grundwasser reicht und von hier die Wasserversorgung
gewährleistet. Flachwurzler bilden ein Wurzelgeflecht gleichartiger Wurzeln, welches sich
horizontal ausbreitet, und hauptsächlich auf die Aufnahme versickerndes
Oberflächenwassers angepasst ist. Neben den Grobwurzeln, die als Transport- und
Ankerorgan der Pflanze dienen, bilden sich Feinwurzeln, welche die Nährstoffe und
Wasser aufnehmen. Den prinzipiellen Aufbau einer Wurzel zeigt schematisch die
Abbildung 5.
Abb.5: Schematischer Querschnitt durch eine Wurzel (nach Eschrich 1995)
24
Die äußerste Schicht der Wurzeln bildet die Rhizodermis. Die Rhizodermiszellen besitzen
sehr dünne Zellwände, denen eine Kutikula „lateinisch »Häutchen« fehlt, die von
Epithelzellen nach außen abgeschiedene Schicht aus einer strukturlosen erhärtenden
Substanz (Cutin); bedeckt die Oberfläche vieler... Pflanzen als wirksamer mechanischer
Schutz und Verdunstungsschutz“ (Meyers 2007). Aus der Rhizodermis können sich
einzelne Zellen in den Boden ausstülpen, bilden somit die Wurzelhaare und erhöhen
dadurch die Wurzeloberfläche. Durch sie erfolgt zu einem hohen Anteil die Nährstoff- und
Wasseraufnahme (Eschrich 1995).
Weiter zum inneren Teil der Wurzel schließt sich das Rindenparenchym, auch Cortex
genannt, an. Durch diese Zellen läuft der Wasser- und Nährstofftransport und in ihnen
werden Assimilate gespeichert. Die innerste Rindenschicht, die Endodermis, umschließt
den Zentralzylinder und hat durch Einlagerung von Suberin, einem wachsartigen Stoff,
imprägnierte Zellwände. Die Einlagerungszone ist wasserundurchlässig und wird
Kasparischer Streifen genannt.
Es schließt sich der Zentralzylinder an, in dem die Festigungs- und Leitelemente (Xylem
und Phloem) der Wurzel verlaufen. Die äußerste Schicht des Zentralzylinders besteht aus
den lange teilungsfähigen Perizykel-Zellen. Aus ihnen werden die Seitenwurzeln gebildet.
In der Tabelle 6 sind die einzelnen Wurzelgewebe, ihre Funktionen sowie einzelne Begriffe
und ihre Definitionen zusammengestellt.
25
Tab.6: Wurzelgewebearten , Funktionen und Definitionen
Wurzelgewebe Funktion und Definition
(Straßburger 1998)
Plasmodesmata (1) /
Durchlasszellen
durchlässige Zellen in der Zellmembran, Interzellulärer
Transport kann hierüber stattfinden
Cortex/Wurzelparenchym (2) Füllgewebe der Wurzel, dient zur Speicherung (z.B. Stärke)
Endodermis (3) innerste Schicht der Wurzelrinde, mit Durchlasszellen (1)
Kasparischer Streifen wachsartige Ablagerung in den Radialwänden der
Endodermiszellen, ermöglicht der Zelle die kontrollierte
Wasser und Salzaufnahme
Perizykel (4) äußerste Schicht des Zentralzylinders, bildet Seitenwurzeln
Phloem / Siebteil (5) Transport von Assimilaten von den Blättern zur Wurzel
Xylem / Holzteil (6) Weiterleitung von Nährstoffen und Wasser, von den Wurzeln
zum Spross
Rhizodermis mit
Wurzelhaaren
äußere Abschlussschicht
Wurzelhaare nehmen Wasser und Salze auf
Zentralzylinder mit Xylem
und Phloem
enthält zentrales Leitbündel zur Nährstoffweiterleitung
Auftretende Begriffe der Zellebene
Cytosol flüssige Bestandteile des Zellplasmas
Plasmalemma Gesamtheit aller die Zelle nach außen abgrenzenden Membranen,
enthält Plasmodesmata
Apoplast umfasst alle Zellwände und die Zellzwischenräume
Symplast umfasst ab der Zellmembran alle Kompartimente innerhalb der Zellen
Tonoplast Gesamtheit aller Membranen, die das Cytosol von der Vakuole trennt
26
4.1.1 Xylem
Das Xylem besteht aus toten, d.h. abgestorbenen, langgestreckten Zellen, die
durchgehende Röhren bilden und den Ferntransport des Wassers sicherstellen. Sie
enthalten kein Cytosol mehr. Die Transpiration in den Blättern sorgt für einen osmotisch
bedingten Unterdruck in den Xylemgefäßen, so dass ein Sog entsteht. Einmal in die
Xylem-Zellen eingedrungendes Wasser ist einem geringen Transportwiderstand
ausgesetzt. Mit dem sogenannten Transpirationsstrom werden das aufgenommene
Wasser und die Nährstoffe von den Wurzeln zu den Blättern transportiert.
Zur Stabilisierung sind in die Zellwände der leitenden Xylemzellen (Tracheen und
Tracheiden) holzige Vernetzungen (Lignin) eingebaut. Die Zellen sind untereinander durch
„Tüpfeln“ (Poren) verbunden. Dadurch kann das Wasser nicht nur vertikal sondern auch
horizontal verteilt werden.
4.1.2 Phloem
Das Phloem besteht bei den untersuchten Pflanzen aus Siebröhren, Geleitzellen, Fasern
und Parenchym-Zellen. Die ersteren beiden bilden die Leitbahnen für den Transport der
Assimilate und sind im Unterschied zu den Xylem-Zellen lebend, besitzen aber keinen
Zellkern und auch keine Vakuole. Die Zellen sind senkrecht untereinander durch viele
Siebporen verbunden; durch sie strömt und verteilt sich der Zellsaft. Siebröhren sind mit
semipermeablem Plasmalemma umgeben und funktionieren dadurch als osmotische
Systeme, was für die Aufnahme und Abgabe von Assimilaten aber auch für die Verteilung
von pflanzlich fremden Stoffen, den Xenobiotika, entscheidend ist.
Xenobiotika sind Stoffe, die dem betreffenden Organismus fremd sind. Antibiotika sind für
Pflanzen Xenobiotika. Nach Trapp (2001) können die Xenobiotika über drei verschiedene
Wege in die Pflanze gelangen:
1. Sie werden im Transpirationsstrom gelöst in die Pflanze aufgenommen und über das
Xylem verteilt,
2. sie gelangen nach Ausgasen aus dem Boden gasförmig in bodennahe Blätter, oder
3. sie werden partikelgebunden durch Ablagerung von resuspendierenden Bodenpartikeln
in die Pflanze, hauptsächlich über die Blätter, aufgenommen.
Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Aufnahme von gelösten Antibiotika durch
die Wurzeln über den Transpirationsstrom, weshalb nachfolgend einige Überlegungen
zum Stofftransport durch pflanzliche Zellen beschrieben werden.
27
5 Stofftransport durch pflanzliche Zellen
5.1 Grundlagen des Stofftransports
Grundsätzlich können Wasser, Salze und Xenobiotika in der Wurzel über zwei
verschiedene Wege zur Endodermis gelangen, apoplasmatisch oder symplasmatisch
(McFarlane1995):
a) Apoplasmatisch durch die Zellwände im Rindenparenchym (vgl. Abb. 6):
Die Zellwände des Rindenparenchyms sind auch für größere Moleküle permeabel.
In diesen Zellwänden und auch Zwischenräumen können sich Wasser, Salze und
Xenobiotika mit der aufgenommenen Bodenlösung verteilen. Sie gelangen durch
Diffusion bis zur Endodermis.
b) Symplasmatisch von Zelle zu Zelle (vgl. Abb.6):
Die Zellmembran besitzt hydrophile und hydrophobe Bereiche, wodurch sowohl
Wasser als auch lipophilere Substanzen permeieren können (Lüttge 1988). Für
Ionen sind spezielle Transportprozesse (Carrier) nötig, da die Salzkonzentrationen
in den Wurzelzellen höher sein können als in der umgebenden Bodenlösung. Von
den Zellen wird ein Protonengradient aufgebaut und die einzelnen Ionen gelangen
über spezifische Transportproteine im Plasmalemma in die Zellen. Nach der
Aufnahme der Stoffe in die Zelle erfolgt der Transport von Nährstoffen und Wasser
von Zelle zu Zelle durch Tüpfel, symplastische Verbindungen zwischen den Zellen.
Abb.6: Apo- und symplasmatischer Transport in einer Wurzel vom Wurzelhaar bis in das
Xylem (verändert nach Mc Farlane 1995)
28
Durch die mit dem Kasparischen Streifen ausgestattete Endodermis erfolgt der weitere
Transport sowohl von Wasser als auch von Ionen und geladenen oder neutralen
Xenobiotika in den Zentralzylinder symplastisch.
Gelöste Stoffe gelangen je nach Ladung und Struktur durch Diffusion oder über Carrier bis
ins Xylem und werden mit dem Transpirationsstrom in höhere Teile der Pflanze
transportiert. Der Transport innerhalb der Pflanze ist gerichtet von der Aufnahme bzw.
dem Bildungsort hin zu Verbrauchs- bzw. Einlagerungsorten („from source to sink“).
5.2 Stofftransport in Abhängigkeit von physiko-chemischen Eigen-
schaften
Mit Ausnahme von einigen Pflanzenhormon-ähnlichen Stoffen ist die Aufnahme und der
Transport von Xenobiotika nach Trapp (1995) ein passiver Prozess, der einzig durch
Diffusion und Löslichkeiten der Stoffe in Membranen und im Wasser erfolgt, wobei die
physiko-chemischen Eigenschaften der Stoffe verantwortlich sein sollen.
Sehr polare Stoffe können die Zellmembranen nicht passieren wo hingegen sehr lipophile
Substanzen nicht bioverfügbar sind, da sie an der Biomasse im Boden sorbieren. In
Hydrokulturen spielt der Einfluss von Bodensorptionen keine Rolle, so dass auch
lipophilere Substanzen permeieren können. Eine Aufnahme in Pflanzen sollte für
Substanzen mit mittlerer Lipophilizität am besten sein (Trapp 2000). Ein Maß für die
Lipophilizität einer Substanz S ist der Verteilungskoeffizient der Substanz Kow (S)
zwischen Oktanol und Wasser:
Der Verteilungskoeffizient wird aus dem Quotienten der Gleichgewichtskonzentrationen
der Substanz S in Oktanol und in Wasser gebildet. Der KOW –Wert oder sein dekadischer
Logarithmus-Wert log Kow wird häufig herangezogen, wenn es um die Verteilung von
Substanzen in Umwelt-Kompartimenten geht (Sicbaldi 1993, Hawker 1989).
Oktanol besitzt eine polare Kopfgruppe und eine hydrophobe Kette. Diese strukturellen
Eigenschaften spiegeln die Eigenschaften von organischer Materie in Boden, in Sediment
oder in der Lipidphase (Membranen) lebender Organismen besonders gut wider. Je höher
der Kow ist, desto besser löst sich die Substanz in Oktanol und desto stärker wird sich die
29
Substanz im lipophilen Gewebe der Pflanze anreichern. Desto weniger ist sie allerdings
wasserlöslich, und ihre Konzentration im Transpirationsstrom der Pflanze wird klein sein.
Eine Abschätzung der Verteilung von unbekannten Substanzen allein auf Grund von dem
Verteilungskoeffizienten Kow vorzunehmen, kann nach Goss (2003) zu erheblichen Fehlern
führen. Der Ansatz von Goss berücksichtigt zusätzlich auch van-der-Waals- und
Wasserstoff-Brücken-Bindungen. Um in einer ersten Nährung Abschätzungen über die
Aufnahme von Antibiotika zu erhalten und damit auch den Versuchsaufbau entsprechend
steuern zu können, wird in der vorliegenden Arbeit der Verteilungskoeffizient zwischen
Oktanol und Wasser für die verwendeten Antibiotika herangezogen. Die von Goss
beobachtete Fehleranfälligkeit dieser Näherung spielte im Zusammenhang der
vorliegenden Arbeit keine entscheidende Rolle, da im Anschluss an theoretische
Überlegungen zum Verteilungskoeffizienten empirische Untersuchungen zur Aufnahme
von Antibiotika stattfanden.
Schnoor et al. (1995) berichten von der effektiven Pflanzenaufnahme von Stoffen mit
einem log Kow Wert zwischen 0,5 und 3. Substanzen mit log Kow > 3 sind zu fest an die
Wurzeloberfläche gebunden und können nur schwer aufgenommen werden. Während
Substanzen mit einem log Kow kleiner als 0,5 zu wasserlöslich und nur über
Carriersysteme durch die Wurzelmembran transportabel sind. Andere berichten von einer
Pflanzenaufnahme über die Wurzel von Substanzen mit log Kow < 4 (Harvey et al. 2002).
Abb.7: Mobilität von nicht ionischen Verbindungen und schwachen Säuren innerhalb der
Pflanzen in Abhängigkeit ihrer physiko-chemischen Eigenschaften (nach Bromilow
und Chamberlain 1995)
Eine funktionale Beziehung besteht zwischen dem log Kow und der Pflanzenaufnahme von
Herbiziden, die eine Gauss´sche Normalverteilungskurve mit einem Maximum bei log Kow
= 1,8 besitzt (Briggs 1983). Bromilow und Chamberlain, 1989 haben die Abhängigkeit der
30
Mobilität von nicht ionischen Verbindungen und schwachen Säuren innerhalb der Pflanze
veranschaulicht (Abb. 7).
Demnach ist die Mobilität einer Substanz abhängig von ihrem Oktanol-Wasser-
Verteilungskoeffizienten und ihrer Säuredissoziationskonstanten. Liegt die Substanz wenig
dissoziiert vor (hohe pKa-Werte), so sollte sie bis zu einem Verteilungskoeffizienten von
null sowohl im Xylem als auch im Phloem mobil sein. Für höhere log Kow Werte (bis 4) wird
eine ausschließliche Xylemmobilität beschrieben.
Verschiedene mathematische Modelle wurden entwickelt, um die Pflanzenverfügbarkeit
von Xenobiotika in Pflanzen abzuschätzen (Ryan et al. 1988, Trapp 1992, Schramm et
al.1990). Sie beruhen alle auf physiko-chemischen Eigenschaften der Substanzen und
können nur Näherungen bieten, weil andere Faktoren wie z.B. die Metabolitenbildung,
Ablagerung der Substanzen im Gewebe und die Evaporation der Substanz (bei leicht
verdampfbaren Substanzen) aus den Blättern nicht berücksichtigt werden. Neben
Mechanismen zum Stofftransport muss auch der Metabolismus von Pflanzen betrachtet
werden, wenn die Aufnahme von Antibiotika in Pflanzen geklärt werden soll. Der
Metabolismus von Pflanzen wird, so weit im Rahmen dieser Arbeit relevant, im folgenden
Kapitel 6 dargestellt.
31
6 Metabolismus in Pflanzen
Der Metabolismus in Pflanzen wurde intensiv untersucht, u.a. um die Aufnahme,
Umwandlung und den Abbau von Pflanzenschutzmitteln sowie Bodenkontaminanten in
Pflanzen zu untersuchen (Sens 1998). Einmal in die Pflanze aufgenommen, können
Substanzen durch enzymatische Prozesse in den pflanzlichen Zellen metabolisiert
werden.
Nach Coupland (1991) vollzieht sich der Abbau von Herbiziden in Pflanzen in drei Phasen.
In Phase 1 können die Xenobiotika mit Hilfe von Enzymen in reaktivere Verbindungen
umgewandelt werden (Funktionalisierungsreaktionen). So können durch Oxidation
Hydroxyl-Gruppen im Molekül entstehen. Es können auch Dealkylierungen und
Dehalogenierungen auftreten. In Phase 2 können die reaktiven Stellen im Molekül mit
Glutathion, Glukose oder Aminosäuren umgesetzt (Konjugationsreaktionen) und diese
Verbindungen in Phase 3 in die Vakuolen transportiert werden. Des Weiteren können die
Herbizide oder deren Metabolite aus Phase 1 oder 2 als nicht extrahierbare Rückstände
(z.B. in Zellwände) eingebunden werden (vgl. Abb.8).
Abb.8: Schematische Darstellung des Metabolismus von Herbiziden in Pflanzen (nach
Coupland 1991)
Einige Pflanzen nehmen zum Beispiel Herbizide auf und werden geschädigt, während
andere Pflanzenarten nicht geschädigt werden. Ein Grund für die unterschiedlichen
Auswirkungen der Herbizide auf verschiedene Pflanzen ist die Metabolisierung der
Herbizide in den Pflanzen. Während zum Beispiel Atrazin (6-Chlor-N²-ethyl-N4-isopropyl-
1,2,3-triazin-2,4-diamin) in Maispflanzen über verschiedene Reaktionen in eine nicht
32
phytotoxische Verbindung metabolisiert wird, und deshalb die Maispflanze nicht schädigt,
führt Atrazin in Graspflanzen zu starken Schädigungen, so dass diese in einem mit Atrazin
behandeltem Maisfeld absterben (Coleman et al. 2002).
Glägen et al. (1999) untersuchten den Metabolismus des Herbizids Isoproturon in Weizen-
und Soyabohnenzellen. Als Metabolite traten hier hauptsächlich demethylierte Produkte
auf.
Der Metabolismus des selektiven Kontaktpestizids Propanil (3,4-Dichlorpropionsäureanilid)
in der Wasserpflanze Lemna minor wurde von Mitsou et al. (2006) aufgeklärt. Dabei traten
als Metabolite durch Demethylierung und Decarboxylierung das 3,4-Dichloracetanilid und
3,4-Dichloranilin auf.
Harms und Bockern (1994) untersuchten die Aufnahme, den Metabolismus und das
Rückstandsverhalten organischer Xenobiotika in Pflanzen. In den Untersuchungen wurden
alle eingesetzten Chemikalien, auch unpolare, durch pflanzliche Systeme aufgenommen.
Als überwiegende Metabolite wurden polare Konjugate oder oxidierte Derivate gebildet,
die zum Teil toxischere Eigenschaften aufwiesen als die Ausgangssubstanz. Ein Teil der
Verbindungen und der gebildeten Metabolite wurde in Abhängigkeit von der Pflanzenart in
Zellwandkomponenten eingebaut.
Werden Antibiotika in Pflanzen aufgenommen, so ist eine Umsetzung in den Pflanzen
prinzipiell möglich (vgl. Kap.7). Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Pflanzen
auf potentielle Metabolite analysiert. Die dargestellten Abbauprozesse von Herbiziden in
Pflanzen dienten dabei zur Hypothesenbildung (in Bezug auf potentielle Antibiotika-
Metaboliten). Diese Hypothesen wurden dann einer empirischen Prüfung unterzogen.
Vorerst ist jedoch der aktuelle Stand der Forschung in Bezug auf die zum Einsatz
kommenden Antibiotika in Pflanzen zu rekapitulieren.
33
7 Stand der Forschung zur Aufnahme von Antibiotika in
Pflanzen
Bisher gibt es nur relativ wenige Arbeiten zur Aufnahme von Antibiotika in Pflanzen. Die
vorliegenden Ergebnisse ergeben aber kein einheitliches Bild. Forni et al. (2002)
untersuchten in einer Pflanzenkläranlage die Zusammensetzung von antibiotikahaltigem
Abwasser vor und nach dem Durchgang der Anlage. Dabei zeigte sich, dass aus den
Abwässern Sulfonamide eliminiert wurden. Es wurde aber keine direkte Aufnahme von
Sulfonamiden über die Wurzel in Pflanzen nachgewiesen, da das Pflanzenmaterial nicht
analysiert wurde. Anders war es bei den Untersuchungen von Migliore et al. (1995). Sie
untersuchten den Effekt von Sulfadimethoxin auf drei verschiedene Pflanzen. Das
Wachstum aller untersuchten Pflanzen in Agar wurde unter dem Einfluss von
Sulfadimethoxin mit unterschiedlichen Ausprägungen vermindert. Die Pflanzen
bioakkumulierten an einem Tag von 1,46 µg/g in Blättern von Mais (Zea mays) bis 254
µg/g in Wurzeln von Rispen-Hirse (Panicum miliaceum). Diese Befunde könnten eine
Belastung pflanzlicher Nahrung mit Sulfadimethoxin erwarten lassen, wenn mit
Sulfadimethoxin kontaminierte Dünger auf Felder ausgebracht werden, so die Autoren.
Migliore et al. (1998) untersuchten weiterhin den Effekt von Sulfadimethoxin auf Gerste
und Mais nicht nur in Agar sondern auch beim Wuchs auf kontaminierten Böden. Sie
stellten einen verminderten Wuchs und eine Sulfadimethoxin-Aufnahme in Wurzeln und
Blätter fest. Dabei war die aufgenommene Menge Sulfadimethoxin in Wurzeln immer
höher als in Blättern. Migliore et al. (2003) konnten ferner zeigen, dass Enrofloxazin von
verschiedenen Gemüsepflanzen (siehe Tab.7) bei hohen Konzentrationen im Substrat (5
mg/L) aufgenommen wird und sich der Pflanzenwuchs vermindert. Bei niedrigen
Enrofloxazinkonzentrationen (50 oder 100 µg/L) war der Wuchs teilweise leicht erhöht
(Hormesis) und es wurden Enrofloxazin-Gehalte von 0,03 bis 0,4 µg/g in Pflanzenteilen
ermittelt. Gujarathi et al. (2005) untersuchten das Phytoremediationspotential von den
Wasserpflanzen Wassersalat (Myrophyllum aquaticum) und Papageienfeder (Pistia
stratiotes) in Bezug auf Tetracyclin und Oxytetracyclin. Sie stellten eine nahezu komplette
Metabolisierung der beiden Antibiotika nach ca. 6 Tagen unter dem Einfluss der Pflanzen
bzw. ihren Exudaten fest. Bei dieser Untersuchung wurden allerdings die Epi- und
Isomerisierungstendenzen der Tetracycline nicht berücksichtigt und ausserdem nicht die
Pflanzen selbst, sondern das Wasser in der Kläranlage analysiert. Diese und andere
34
Untersuchungen der Effekte von Pharmazeutika auf Pflanzen sind in der folgenden
Tabelle 7 zusammengefasst.
Tab. 7: Effekte von Pharmazeutika auf Pflanzen (Literaturübersicht)
Substanz Pflanze Medium/
Konzentration
Effekt / Gehalte in der
Pfanze Literaturstelle
Chlortetracyclin/
Oxytetracyclin
Weizen /
Rettich/ Mais
Gartenbohne
Hydrokultur/
Boden
Wuchs gesteigert,
nicht beeinflusst oder
vermindert
Batchelder
1981, 1982
Sulfadimethoxin Mais , Hirse,
Erbse, Gerste
Agar/ 300mg/L Wuchs vermindert /
Aufnahme < 254 µg/g
Migliore et.
al. 1995,
1998
Enrofloxazin Gurke, Rettich
Gartensalat,
Gartenbohne,
Agar / 50, 100,
5000 µg/L
Wuchs gesteigert
oder vermindert
Aufnahme < 8,1µg/g
Migliore et.al.
2003
Enrofloxazin Salat Boden/
1mg/kg
Aufnahme von
2,8 µg/kg
Boxall et al.
2006
Chlortetracyclin Mais, Zwiebel,
Kohl
Boden / 1µg
pro Topf
Aufnahme von 10 bis
14,4 ng/g
Kumar et al.
2005
Tylosin Mais, Zwiebel,
Kohl
Boden / 1µg
pro Topf
Keine Aufnahme Kumar et al.
2005
Florfenicol Salat
Möhre
Boden/
1mg/kg
Aufnahme von
15 bzw. 5 µg/kg
Boxall et al.
2006
Trimethoprim Salat
Möhre
Boden/
1mg/kg
Aufnahme von
6 bzw. 5,3 µg/kg
Boxall et al.
2006
Levamisol Salat Boden/
1mg/kg
Aufnahme von
170 µg/kg
Boxall et al.
2006
Diazinon Möhre Boden/
1mg/kg
Aufnahme von
13 µg/kg
Boxall et al.
2006
Oxytetracyclin Luzerne Hydrokultur /
< 0,33 mM/L
Wuchs vermindert /
Aufn. 0,35 µmol/g
Kong et al.
2007
Chlortetracyclin Mais,
Bohnen
Boden Wuchs n. beeinflusst
od. verkrüppelt
Farkas et al.
2007
Sulfamethazin Mais, Salat,
Kartoffel
Boden Aufnahme von 0,1 bis
1,2 mg/kg TM
Dolliver et al.
2007
35
Die im Jahr 2006 von Boxall veröffentliche Studie über die Aufnahme von
Veterinärpharmazeutika durch Pflanzen zeigt, dass einige der eingesetzten
Pharmazeutika in Salatblätter (Lettuce leaves) aufgenommen werden, während andere
Stoffe, darunter Oxytetracyclin (OTC) und Sulfadiazin, in pflanzlichen Proben nicht
nachweisbar waren (Boxall et al. 2006). In Karotten waren einige andere Substanzen
detektierbar als im Salat, jedoch kein OTC und SFD.
Es bleibt festzustellen, dass sich die Ergebnisse der verschiedenen Arbeitsgruppen stark
unterscheiden und kein einheitliches Bild ergeben. Teilweise ist der Wuchs unter dem
Einfluss von Tetracyclinen vermindert, teilweise aber auch erhöht. In manchen Versuchen
werden Tetracycline und Sulfonamide in Pflanzenproben nachgewiesen, in anderen sind
sie nicht in Pflanzen nachweisbar. Insbesondere in Bezug auf die in der Veterinärmedizin
am meisten eingesetzten Antibiotika, die Tetracycline, sind die Ergebnisse nicht
einheitlich: So kann Boxall keinen Nachweis in Pflanzen erbringen, während Kumar genau
das Gegenteil feststellt (Boxall et al. 2006, Kumar et al. 2007). Diese divergierenden
Ergebnisse sind sicherlich auch auf teils sehr unterschiedliche Versuchsbedingungen (z.B.
Wachstumsphasen von einigen Tagen oder einigen Wochen) und die Art der Aufarbeitung
des Pflanzenmaterials zurück zu führen. Um so wichtiger ist es, gerade in Bezug auf
Tetracycline ein besseres Verständnis ihrer Aufnahme in Pflanzen zu erzielen und
Parameter zu bestimmen, von denen die Aufnahme von Antibiotika in Pflanzen abhängt.
Neben Tetracyclinen wurden in dieser Arbeit auch Sulfonamide eingesetzt, da auch diese
in erheblichem Umfang in der Veterinärmedizin eingesetzt werden und in Gülle
nachgewiesen wurden.
36
8 Material und Methoden
8.1 Aufnahmeexperimente
Um die Aufnahme von Antibiotika in Pflanzen analysieren zu können, mussten zuerst
geeignete Pflanzen herangezogen werden. Ausgewählt wurden dazu Feldsalat, Weizen
und Möhren. Diese Pflanzen entstammen unterschiedlichen Nutzpflanzenarten und
decken damit stellvertretend einen großen Teil unserer landwirtschaftlichen Nutzpflanzen
ab, zu denen Gülle gedüngt wird. Außerdem wurden Feldsalat und Weizen in dem mit
dieser Arbeit verknüpften Feldversuch angepflanzt (Grote 2005). Möhren wurden gewählt,
weil sie eine zum Verzehr geeignete Pfahlwurzel bilden, im Gegensatz zu Weizen und
Feldsalat, die Flachwurzler sind.
Die Aufnahmeexperimente in AB-dotierter Nährlösung wurden mit diesen Pflanzen in
Hydrokulturen durchgeführt. Die Pflanzen wuchsen dabei direkt in der Nährlösung und
kamen nicht, oder nur während des Keimens, mit Boden in Kontakt, um
Wechselwirkungen mit der Bodenmatrix auszuschließen. Mit Möhren wurden darüber
hinaus auch Kontrollversuche in Töpfen mit Erde vorgenommen. Diese Möhren wurden
dabei mit antibiotikahaltiger Nährlösung gegossen.
Bei den Hydrokulturen wurden der Nährlösung verschiedene Antibiotika (Chlortetracyclin
kombiniert mit iso-Chlortetracyclin, Sulfadiazin, (7)-³H-Tetracyclin [³H-TC] oder (3,5)-³H-
Sulfamethazin [³H-SM]) in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Es gab zwei
unterschiedliche Aufnahmeexperimente:
1. Den Nährlösungen wurden unmarkierte Antibiotika (CTC / iso-CTC / SFD)
zugesetzt; diese Versuche fanden am Bundesforschungsinstitut für Ernährung und
Lebensmittel, BfEL, heute Max Rubner-Institut (MRI), in Detmold statt.
2. Es wurden radioaktiv-markierte Antibiotika verwendet. Tritium-markiertes
Tetracyclin (³H-TC) oder Sulfamethazin (³H-SM) wurden in Kombination mit den
nicht markierten Verbindungen CTC und SFD derselben Wirkstoffklasse zur
Nährlösung gegeben. Diese Versuche fanden am Zentrum für Umweltforschung
und nachhaltige Technologien (UFT) der Universität Bremen statt.
Die Entwicklung der Pflanzen wurde visuell und auch anhand der Biomassen verfolgt. In
beiden Aufnahmeexperimenten wurden nach ein-, zwei- oder dreiwöchigem Wachstum
der Pflanzen auf antibiotikahaltiger Nährlösung die Pflanzenproben genommen und mit
unterschiedlichen Methoden analysiert. Für die Aufnahmeexperimente mit den radioaktiv-
37
markierten Verbindungen wurden Szintillationsmessungen und automikroradiographische
Untersuchungen an ausgesuchten Pflanzenkomponenten durchgeführt.
Für die Analyse der Pflanzenproben auf unmarkierte Antibiotika musste eine Methode zum
Nachweis von Antibiotika und potentiellen Metaboliten erst entwickelt werden. Mit einem
LC-MS-System (ESI-Ion Trap an der Universität Paderborn) wurde dieses verwirklicht.
Nachfolgend werden die einzelnen Methoden genauer beschrieben.
8.2 Anzucht der Pflanzen
8.2.1 Vorbemerkung
Die Entwicklung einer geeigneten Analysemethode zur Bestimmung von CTC und SFD in
Pflanzenproben mit LC-MS/MS setzte das Vorhandensein von vergleichbaren
Pflanzenproben voraus, die sowohl ohne als auch mit Antibiotika Dotierung unter sonst
identischen Bedingungen gewachsen waren. Deshalb wurden in jeder Versuchsreihe auch
Pflanzen angezogen, die keinen Antibiotika-Zusatz in der Nährlösung enthielten. Diese
Kontrollproben wurden bei der Rückstandsanalytik, insbesondere bei den Versuchen zu
Wiederfindungen (siehe Kap. 9.4.6) benötigt.
8.2.2 Vorbehandlung der Samen
Um einen Pilzbefall der Pflanzen möglichst zu vermeiden, wurden die verwendeten
Weizenkörner, Sorte Drifter, mit verschiedenen Desinfektionsmitteln behandelt. Getestet
wurden Tween® 80-, Natriumhypochlorit- und Wasserstoffperoxid-Lösungen. Feldsalat
und Möhren-Samen wurden handelsüblich erworben und nicht weiter vorbehandelt.
8.2.3 Keimung der Samen
Die Keimung der Samen sollte so erfolgen, dass sich erstens die bildenden Wurzeln ohne
Beschädigungen entwickeln können und zweitens die Wurzeln möglichst nicht
verschimmeln. Unter Feuchtigkeitseinfluss, jedoch nicht zu nass, und ohne Lichteinfluss
(Weizen ist ein „Dunkelkeimer“) wurden verschiedene Medien (Filterpapier, Watte, Erde)
getestet.
38
Weizen- Feldsalatkeimlinge
Abb. 9: Keimlinge von Weizen und Feldsalat
8.2.4 Entwicklung der Pflanzen
Die Feldsalat- und Möhrenpflanzen wurden nach dem Keimen solange in Anzuchterde
belassen, bis sich robuste Pflanzen entwickelt hatten. Anschließend wurden die Pflanzen
teilweise aus der Erde genommen, die Wurzeln von Erde befreit und auf Hydrokultur
umgesetzt. Möhrenpflanzen wurden teilweise auch in der Erde belassen und mit
Nährlösung gegossen. Weizenpflanzen wuchsen in Sieben in Hydrokultur. Der Einfluss
des pH-Wertes der Nährlösung auf die Entwicklung der Pflanzen wurde berücksichtigt.
Die Pflanzen wurden während ihrer Entwicklung entweder im Wachstumsschrank
(Phytotron) bei kontrollierten Bedingungen belassen (siehe Kap. 11), oder sie wuchsen
unter Laborbedingungen (³H-Experimente). Die Versuchsparameter finden sich im
Anhang.
Weizen Feldsalat Möhren
Abb. 10: Weizen, Feldsalat- und Möhrenpflanzen
8.2.5 Bestimmung der Biomasse der Pflanzen
Die Biomasse der Pflanzen einiger Versuchsreihen wurde durch Differenzwägung
(Anzucht-Apparatur mit und ohne Bepflanzung) bestimmt. Dabei wurde darauf geachtet,
39
dass anhaftende Nährlösung an den Wurzeln nicht zur Verfälschung der Ergebnisse führt.
Bei Aufnahmeexperimenten von Möhren in Erde konnte die tägliche Zunahme der
Biomasse nicht bestimmt werden.
8.2.6 Zudotierung der Antibiotika
8.2.6.1 Aufnahmeexperimente mit unmarkierten Antibiotika
CTC wurde zusammen mit iso-CTC oder SFD wurde den Nährlösungen zugesetzt. Beim
Wechsel der Nährlösungen alle zwei bis drei Tage wurde die entsprechende Menge an
Antibiotika -Stammlösung (siehe Anhang) in die Nährlösung pipettiert. Es wurden immer
parallel Pflanzen mit Antibiotikazusatz und Kontrollpflanzen ohne Antibiotikazusatz
herangezogen. Die Zusammenstellung der zugesetzten Mengen an Antibiotika in die
Nährlösung findet sich im Anhang.
Abb.11: Weizenpflanzen in Sieben auf Hydrokultur in konventionellen Blumenkästen mit
unmarkierten Antibiotika im Wachstumsschrank
8.2.6.2 Aufnahmeexperimente mit markierten Antibiotika
Es wurden den Nährlösungen, die analog zu den oben erwähnten Ansätzen unmarkierte
Antibiotika enthielten, zusätzlich ³H-markiertes Sulfamethazin (³H-SM) für SFD-haltige
Nährlösungen oder ³H-markiertes Tetracyclin (³H-TC) für CTC / iso-CTC-haltige
Nährlösungen zugesetzt. Die Gesamtkonzentrationen aller eingesetzten Antibiotika
wurden in den verschiedenen Experimentserien gleich eingestellt. Der Aufbau der
Versuche war prinzipiell ähnlich zu den Versuchen in Hydrokultur. Auf Grund der geringen
40
zur Verfügung stehenden Mengen an ³H-markierten Antibiotika und zur Vermeidung von
Entsorgungsproblemen aus Gründen des Strahlenschutzes, wurde die Nährlösung jedoch
nicht im 2-3 Tagesrythmus gewechselt. Vielmehr wurden die Pflanzen über die gesamte
Wachstumszeit in der ursprünglich angesetzten Nährlösung belassen.
Abb.12 : Weizenpflanzen in Hydrokultur mit markierten Antibiotika
8.2.7 Ernte und Lagerung
Nach ein- bis dreiwöchigem Wuchs auf dotierter Nährlösung wurden die Pflanzen
entnommen und unter fließendem Wasser gründlich gesäubert und mit Haushaltspapier
getrocknet. Die Pflanzen wurden in Blätter und Wurzeln getrennt, wobei der Bereich des
Überganges zwischen Wurzeln und Blättern verworfen wurde, um sicherzustellen, dass
kein Wurzelmaterial in Blattmaterial gelangt. Das Pflanzenmaterial wurde in Stücke
zerschnitten und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Eine genaue
Durchführungsbeschreibung befindet sich im Anhang.
Bis zur weiteren Analyse wurden die Proben im Falle der Versuche mit markierten
Antibiotika bei -25°C gelagert. Das Pflanzenmaterial aus den Versuchen mit
nichtmarkierten Antibiotika wurde bei -80°C gelagert.
8.3 Analyse der Proben aus Versuchen mit ³H-markierten Antibiotika
8.3.1 Flüssig-Szintillationszählung
Die aus den Versuchen mit markierten Antibiotika geernteten Pflanzenproben wurden
durch Zusatz verschiedener Reagenzien (siehe Experimenteller Teil und Anhang)
vorbereitet (s.u.) und im Szintillationszähler gemessen. Durch den radioaktiven Zerfall
werden bestimmte Bestandteile der Szintilliationslösung angeregt und dabei Strahlung
emittiert, die dann als counts per minute (cpm) im Szintillationszähler registriert wird. Die
41
Umrechnungen mit Hilfe der spezifischen Aktivität der eingesetzten radioaktiven
Verbindungen erlauben eine Berechnung der aufgenommenen Menge an Antibiotika. Im
folgenden Abschnitt wird die Szintillationsmessung genauer beschrieben:
Nur wenige Lösungsmittel zeigen nach dem Beschuss mit radioaktiver Strahlung eine
Fluoreszenz, dei der Licht sehr kurzer Wellenlängen emittiert wird, was über einen
Photomultiplier im Szintillationsmessgerät mit geringer Effektivität detektiert werden kann.
Der zu analysierenden Pflanzenprobelösung wird deswegen ein Fluorophor (primärer
Szintillator, z.B. 2,5-Diphenyloxazol PPO) zugesetzt, welcher die Energie aufnehmen kann
und selbst bei größerer Wellenlänge fluoresziert. Allerdings ist die Zählausbeute hier auch
noch relativ gering, weshalb ein sekundärer Szintillator („wavelength shifter“) z.B. 1,4-Di-
[2-(5-phenyl-oxazoyl)]-benzol POPOP zugesetzt wird (Wilson und Golding 1990). Der
sekundäre Szintillator emittiert Licht bei einer Wellenlänge, die die beste Zählausbeute im
Photomultiplier erlaubt, also bei maximaler Empfindlichkeit. Jedoch ist ein primärer
Szintillator nötig, sonst kann keine Energieübertragung vom Lösemittel auf den
sekundären Szintillator stattfinden. Die Energieübertragung findet in der folgenden
Reihenfolge statt:
Radioaktive Strahlung => angeregtes Lösungsmittel => angeregter primärer
Szintillator => angeregter sek. Szintillator => Licht [Registrierung am Photomultiplier]
Um die radioaktiven Pflanzenproben im Szintillationszähler vermessen zu können, müssen
ihnen dem obigen Abschnitt zufolge verschiedene andere Lösungen (z.B. prim., sek.
Szintillator, Gewebeauflöser) zugesetzt werden. Diese anderen Bestandteile der zu
vermessenden Lösung können selbst auch Strahlung aufnehmen (schlucken, engl. „to
quench“), wodurch die Intensität vermindert wird. Restgehalte an Wasser und anderen
Komponenten der Zellbestandteile sind weitere Quenchursachen. Um dennoch zu einem
korrekten Ergebnis zu gelangen, müssen so genannte Quenchfaktoren eingeführt und in
der Auswertung berücksichtigt werden. Dazu wird jede einzelne Lösung mit definiertem
Volumen bekannter Aktivität versetzt und gemessen, zu wie viel „counts per minute“ der
Zusatz in dieser Lösung führt. Es wird ein „Quench-Faktor“ ermittelt, mit dem die
Probenergebnisse multipliziert werden (siehe Anhang A3.1).
Normalerweise führt ein Quench zu niedrigeren Strahlenausbeuten. Es kann aber
vorkommen, dass Moleküle vorhanden sind, die selbst fluoreszieren und damit die
Lichtausbeute am Photomultiplier erhöhen. Somit würde ein Quench-Faktor ermittelt
42
werden, der kleiner als eins ist. Chlorophyll z.B. ist ein Molekül, das fluoresziert, wenn es
mit blauem Licht bestrahlt wird (Jensen et al. 1994). Das war auch bei den hier
durchgeführten Versuchen teilweise festzustellen.
8.3.2 Mikroautoradiographie
Ergänzend wurden an ausgewählten Proben mikroautoradiographische Untersuchungen
durchgeführt, um genaue Informationen über den Ablagerungsort von Antibiotika in
Pflanzen zu erhalten. Dazu wurden von ausgewählten Pflanzenproben sehr dünne
Schnitte angefertigt. Die Schnitte der Pflanzen wurden auf optisch empfindlichen Filmen
über eine längere Zeit (2 Wochen bis 3 Monate) fixiert. Findet in den pflanzlichen Proben
ein radioaktiver Zerfall statt, so erfolgt eine Registrierung. Einlagerungsorte von
radioaktiven Verbindungen werden so sichtbar. Diese Untersuchungen führten zu
Aussagen über die Lokalisation der eingelagerten Antibiotika in die verschiedenen
Gewebe der untersuchten Pflanzenteile. Die Lokalisation ist auf zellulärer Ebene möglich,
so dass gegebenenfalls auch Einlagerungen in Zellkompartimente detektiert werden
können (Durchführung siehe Kapitel 11.2.2).
8.4 Analyse der Proben aus Versuchen mit unmarkierten Antibiotika
Um die Pflanzenproben mit HPLC rückstandsanalytisch zu untersuchen, müssen die zu
bestimmenden Verbindungen (Analyten) in Lösung vorliegen. Das heisst, sie müssen aus
den pflanzlichen Kompartimenten extrahiert werden. Als erstes hat die Zerkleinerung
(Homogenisierung) der Proben einen Einfluss auf die Effektivität der Extraktion. Deshalb
wurde ein Ultra-Turrax® im Eiswasserbad und die mechanische Zerkleinerung im Mörser
unter Stickstoffkühlung getestet. Auch die Wahl des Extraktionsmittels ist von Bedeutung.
Erprobt wurden verschiedene Lösungsmittel wie McIllvaine-Puffer (Zusammensetzung
siehe Anhang), Methanol und Acetonitril in unterschiedlichen Mischungsverhältnissen im
Ultraschallbad. Es wurden z.B. auch gute Erfahrungen mit McIllvaine-Puffer gemacht, um
Tetracycline aus Schlachtproben oder Boden zu extrahieren (Hamscher 2002, Vockel
2005). Der Pflanzenextrakt ist, bevor er der HPLC-MS Messung zugeführt wird, mit Hilfe
der Festphasenextraktion noch weiter aufzureinigen und aufzukonzentrieren (Clean up).
Dazu gibt man den Extrakt über eine zuvor konditionierte und äquilibrierte Festpase. Die
Analyten adsorbieren an der Festphase und können nach dem Waschen der Festphase
mit einem Elutionsmittel wieder in Lösung gebracht werden. Eventuelle Störkomponenten
43
werden idealerweise abgetrennt, da sie nicht mit der Festphase wechselwirken. Getestet
wurden unterschiedliche Kartuschen-Größen.
Nachweis der Analyten mit HPLC-MSn
Durch unterschiedliche Wechselwirkungen mit dem Packungsmaterial der
Chromatographiesäule werden die Bestandteile der injizierten Probelösung aufgetrennt.
Die von der Säule bei unterschiedlichen Retentionszeiten (tR ) eluierenden Komponenten
werden im Detektor registriert. Um ein Massenspektrometer als Detektor verwenden zu
können, muss das MS-Gerät zuvor mit den zu bestimmenden Analyten optimiert werden
(„tunen“). Im Massenspektrometer werden die Analyten dann aufgrund ihres Masse zu
Ladungsverhältnisses registriert. Es wurde ein niedrig auflösendes Massenspektrometer
Finnigan LTQ Ion-Trap mit Elektrospray-Ionisation (ESI) verwendet (genaue
Geräteparameter siehe 11.1.4). Zur Untersuchung auf Metabolite der Antibiotika in
Pflanzenproben wurden zusätzlich zu den Analysen mit dem niedrig auflösenden
Massenspektrometer zur Bestätigung und Identifizierung auch das hoch auflösende
FTICR-Massenspektrometer des ISAS in Dortmund eingesetzt (siehe 11.1.4). Mit den
Untersuchungen der Proben an dem hochauflösenden Gerät können bis zu MS4
Stoßexperimente durchgeführt werden, die in Bezug auf die Strukturaufklärung von
unbekannten Metaboliten herangezogen werden.
Zur quantitativen Bestimmung der Analyten mit LC-MS muss das System zuvor kalibriert
werden. Durch Injektion einer Standardlösung (Analyt in Laufmittel) mit einer
Konzentration von 10 mg/L wurde das System zur Kalibrierung vorbereitet (die
Einstellungen der optimierten Geräteparameter finden sich unter 11.1.4). Vorläufer- und
Produktionen dienten zur Identifizierung und Quantifizierung in Kombination mit den
Retentionszeiten.
8.4.1 Bestimmung von Sulfadiazin
Externe Kalibrierung - Matrixeffekte
In der Regel wurde eine externe Kalibrierung durchgeführt, wobei sich die Matrix der
Standardlösungen (organisches Lösungsmittelgemisch) von der Matrix der Meßprobe
(Extrakt) unterscheidet.
Für die SFD-Bestimmung wurde der Einfluss von koeluierenden Matrixbestandteilen auf
die Signale untersucht. Dazu wurden verschieden konzentrierte Lösungen von Standards
44
in Laufmittel oder in Matrixlösung gemessen. Die Signalintensitäten mit und ohne Matrix
wurden miteinander verglichen.
Verwendung eines Internen Standards
Die Bestimmung mit Internem Standard (IS) ist eine Technik, in der eine
Standardverbindung direkt in die analytischen Probe gegeben und mit ihr in einem Lauf
analysiert wird. Messsignalschwankungen hervorgerufen durch z.B. unterschiedliche
Injektionsvolumina oder unterschiedliche Ionisierungsgrade in der Quelle werden
ausgeglichen, in dem der Analyt relativ zum IS ausgewertet wird.
Ein Interner Standard sollte eine ähnliche Retentionszeit und Empfindlichkeit wie der
Analyt besitzen. Er muss in der Matrix stabil sein, darf kein Bestandteil der Probe sein und
sollte adäquate chromatographische Peaks hervorrufen.
Sulfamethoxypyridazol (SMP, Struktur siehe Abb.20) wurde als Interner Standard für die
SFD Bestimmung getestet. Es wurde eine Kalibrierung unter Verwendung von SMP
durchgeführt und SFD-Gehalte ausgewählter Proben damit bestimmt.
Standardaddition
Um Matrixeffekte auszugleichen, wurden in der vorliegenden Arbeit an ausgewählten
Proben Standardadditionen durchgeführt. Dazu wurde die zu analysierende Mess-Probe
geteilt und mit unterschiedlichen Mengen an Standardlösung versetzt. Messsignal-
schwankungen hervorgerufen durch koeluierende Matrix sollten in jeder Probe ähnlich
sein. Es wurde eine Kalibriergerade aufgenommen, die in der negativen Verlängerung
über den Nullwert der x-Achse hinaus die x-Achse schneidet. Am Schnittpunkt wurde der
Betrag der Konzenteration des Analyten in der Probe abgelesen. Die Ergebnisse, mit
unterschiedlichen Auswerteverfahren berechnet (externe Kalibrierung, interne Kalibrierung
und Standardaddition), wurden verglichen.
8.4.2 Bestimmung von Chlortetracyclin und iso-Chlortetracyclin
Externe Kalibrierung - Matrixeffekte
Auch hier wurde der Versuch unternommen, den Einfluss koeluierender Matrixbestandteile
auf die Signalintensität zu evaluieren. Dazu wurden gleich konzentrierte Standard-
Lösungen in Laufmittel und in Standard-Matrix (lt. Anhang A3) vermessen und die
Signalintensitäten verglichen.
45
8.4.3 Untersuchungen zu Metaboliten in Pflanzenproben
Ausgewählte aufgearbeitete Extrakte von verschiedenen Pflanzenproben wurden auf
mögliche Metabolite von CTC untersucht. Dazu wurden die Proben mit LC-MS/MS
(niedrigauflösend) und bei positiven (oder unsicherem) Befund zur Bestätigung mit einem
hochauflösenden LC-MSn (FTICR-MS) am ISAS, Dortmund, analysiert.
Die Fourier Transform Ionen Cyclotron Resonanz-Massenspektrometrie (FTICR-MS) ist
die leistungsfähigste MS-Technik in Bezug auf Auflösungsvermögen (> 1.000.000) und
Massengenauigkeit. Die relative Massenabweichung zum theoretisch berechneten Wert
wird in ppm angegeben und kann weniger als 1 ppm betragen. Demzufolge kann die
Messung eines Ions mit 1000 Masseneinheiten bis auf die 3. Nachkommastelle genau
erfolgen. Im Gegensatz dazu sind bei niedrigauflösenden MS (z.B. Quadrupol-Massenfilter
oder Quadrupol-Ionenfalle) Auflösungen von 2000 und eine Massengenauigkeit von 0,2
Masseneinheiten üblich.
Der FTICR-MS liegen zwei physikalische Effekte zugrunde: Einerseits wird ein geladenes
Teilchen in einem homogenen mehrere Tesla starken Magnetfeld entlang einer
Magnetfeldlinie auf einer kreisförmigen Bahn bewegt. Diese Zyklotronbewegung
ermöglicht es, Ionen in einem definierten Volumen zu halten. Andererseits absorbiert jede
einzelne Ionenmasse eine spezifische Radiofrequenz und tritt mit ihr in Resonanz. Sind
die mit Hilfe der charakteristischen Radiofrequenz ausgewählten Ionen auf einer größeren
Kreisbahn, induzieren diese durch die Ionenbewegung eine Wechselspannung an zwei
gegenüberliegenden Detektorplatten. Um Ionen unterschiedlicher Masse/ Ladungszahl
gleichzeitig zu erfassen, werden alle Ionen gleichzeitig mit Hilfe eines Breitband-
Radiofrequenzsignals angeregt. Nach der Anwendung einer Fourier Transformation (FT)
werden die zeitabhängigen Rohsignale in frequenzabhängige Signale umgewandelt.
Daraus wird dann ein Massenspektrum generiert.
46
9 Ergebnisse und Diskussion
9.1 Modellrechnungen zur Pflanzenverfügbarkeit von Antibiotika
Die auf struktur- und physikochemischen Parametern beruhende Berechnung der
Lipophilie (pKow-Werte: Verteilungskoeffizient Oktanol/Wasser), erlaubt wie in den Kapiteln
4.3 und 4.4 beschrieben, eine Abschätzung der Aufnahme und Verteilung von Xenobiotika
in Pflanzen. Dabei ist zu berücksichtigen, dass Tetracycline und Sulfonamide über
mehrere acide bzw. basische Substituenten verfügen. Die Berechnungen nach „ACD/I-Lab
service“ ergaben folgende Verteilungskoeffizienten:
Tab.8: Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten der verwendeten Antibiotika (berechnet
nach logP v.6.0 ACD/I-Lab service www.acdi-lab.com)
Substanz Log Kow
SFD - 0,32 +/- 0,64
CTC - 0,04 +/- 0,75
iso-CTC 1,35 +/- 0,75
TC - 0,06 +/- 0,78
SMZ 0,80 +/- 0,26
Die kalkulierten logKow-Werte des Sulfadiazins und der Chlortetracycline liegen im Bereich
von 0 bis 2 (vgl. Kap. 5.2), wobei die relativ höchsten Werte für iso-CTC ermittelt wurden.
Aufgrund der LogKow–Werte kann grundsätzlich eine Aufnahme dieser Verbindungen von
Pflanzen über die Wurzel erwartet werden. Die aufgeführten Verbindungen sind nach
Bromilow und Chamberlain (1995) des Weiteren als Xylem- und / oder Phloem-mobil zu
klassifizieren.
Erste experimentelle Hinweise auf eine geringe Aufnahme von Sulfonamiden in die
Pflanzenwurzel hatten Langhammer et al. (1989) durch Tracerstudien erhalten.
9.2 Anzucht von Weizen, Feldsalat und Möhren
9.2.1 Vorbehandlung der Samen
Bei Weizen ergaben sich am wenigsten Verschimmelungen, wenn die Körner
nacheinander mit Tween® 80-, Natriumhypochlorit- und Wasserstoffperoxid-Lösungen
47
gewaschen wurden. Zwischen den „Waschungen“ wurde jeweils zweimal mit
bidestilliertem Wasser gespült. Feldsalat und Möhren Samen wurden handelsüblich
erworben und nicht weiter behandelt.
9.2.2 Keimung und Entwicklung
Mit Feldsalat und Möhren gelang die beste Keimung in Erde. Weizen hingegen keimte
sehr gut auf feuchtem Filterpapier im Dunkeln. Die beste Entwicklung in Hydrokultur wurde
für Weizen und Möhren bei einem pH-Wert von 4,7 erreicht. Dieser Wert stellte sich nach
dem Ansetzen der Nährlösung ein. Für Feldsalat wurde die Entwicklung in Nährlösung bei
einem pH-Wert von 6 durchgeführt. Dieser wurde durch Zusatz von Kaliumhydroxid-
Lösung zur Nährlösung mit einem pH-Meter eingestellt und erwies sich in Vorversuchen
als geeignet. Nähere experimentelle Angaben zur Anzucht und Entwicklung finden sich im
experimentellen Teil (Kapitel 11).
Die nachfolgend dargestellten Ergebnisse der Aufnahmeexperimente mit markierten und
unmarkierten Antibiotika in der Nährlösung entsprechen nicht der chronologischen
Reihenfolge der Durchführung der Experimente. Vielmehr wurden thematisch
zusammengehörige Versuche in Blöcken dargestellt.
48
9.3 Aufnahmeexperimente mit Tritium-markierten Antibiotika
9.3.1 Feldsalat
Die Ergebnisse zur Antibiotika-Aufnahme des Feldsalates sind in Abb.13 graphisch
dargestellt. Feldsalat wuchs in Nährlösung, die sowohl ³H-markiertes Antibiotikum als auch
das nicht markierte Antibiotikum derselben Wirkstoffklasse enthielt. Wie erkennbar, sind in
allen Feldsalatproben Sulfonamid- und Tetracyclinaktivitäten ermittelt worden, wobei
generell die Aufnahme an Tetracyclinen erheblich ausgeprägter ist. In den Wurzeln
wurden, bis auf eine Ausnahme (14 Tage, 5µmol/L CTC), deutlich höhere Werte gefunden
als in den Blättern des jeweiligen Wachstumsstadiums.
Abb. 13: Verteilung der Antibiotika (mg/kg FG) im Feldsalat in Abhängigkeit von
Wachstumszeit und Konzentration in der Nährlösung (SFD/³H-SMZ und CTC/iso-
CTC/³H-TC-Dotierung)
Die ermittelten Einlagerungsaktivitäten zeigen signifikant höhere Einlagerungswerte für
Tetracycline als für die Sulfonamide, was prinzipiell auch mit den ermittelten Oktanol-
Wasser-Verteilungskoeffizienten übereinstimmt, denn für Sulfadiazin wurde der kleinste
Kow-Wert ermittelt (vgl. 9.1).
714 21
SFD 10µmol/l
CTC 5µmol/l
CTC 10µmol/l
SFD 10µmol/l
CTC 5µmol/l
CTC 10µmol/l
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
mg/kg
Tage
Wurzeln
Blätter
49
9.3.2 Winterweizen
Wurzeln
In den Wurzeln von Winterweizen wurden die in Abbildung 13 dargestellten Antibiotika-
Gehalte nachgewiesen. Nach 7, 14 und 21 Tagen fanden sich jeweils nur geringe
Einlagerungen an Sulfonamiden, aber relativ höhere Werte für CTC bzw. ³H-TC, welche
die Aufnahmemengen in Feldsalatwurzeln erheblich überschreiten.
Bei einer Konzentration von 10 µmol/L SFD in der Nährlösung nahm die Aktivität in der
Wurzel mit der Zeit geringfügig zu. Gegenüber den 7 Tage-Werten zeigten die anderen
Wurzelproben im Laufe der Wachstumszeit ebenfalls eine Zunahme, jedoch ist bei den
Tetracyclinen kein eindeutiger linearer Zusammenhang zwischen Einlagerungsintensität,
Wachstumszeit und Antibiotikakonzentration zu erkennen. So bleiben die Werte nach 14
Tagen nahezu gleich (SFD 20 µmol/L und CTC 10 µmol/L) oder nehmen überproportional
zu (CTC 5µmol/L).
Abb. 14: Antibiotika-Gehalte in Wurzeln von Winterweizen (mg/kg FG) in Abhängigkeit von
Wachstumszeit und Konzentration in der Nährlösung (SFD/³H-SMZ und CTC/iso-
CTC/³H-TC-Dotierung)
Neben unterschiedlichen, pflanzenphysiologisch bedingten Entwicklungsmöglichkeiten der
einzelnen Pflanzen, könnten zu diesen Effekten auch nicht-konstante
Wachstumsbedingungen beigetragen haben (z.B. Schwankungen von Bestrahlungs-
intensität, Lufttemperatur und Feuchtigkeit), die schwankende Photosyntheseleistungen
714 21
10µmol/l
20µmol/l
5µmol/L
10µmol/l
0,03 0,03 0,05
0,01 0,02 0,09
0,0000
1,0000
2,0000
3,0000
4,0000
5,0000
6,0000
mg/kg
Tage
SFD
CTC
50
zur Folge hätten. Weitere Einflüsse hatte vermutlich auch das Algenwachstum, was
sporadisch in den Hydrokulturen auftrat.
Blätter
Von den Blättern der Weizenpflanzen wurden nach ein bis drei Wochen Wachstum die in
Abb. 15 im Überblick dargestellten Antibiotikamengen aufgenommen. Erneut wird deutlich,
dass erheblich mehr CTC in die Blätter transportiert wird als SFD, was mit dem oben
genannten unterschiedlichen Aufnahmevermögen der Weizenwurzeln korreliert (Abb. 13).
Abb. 15: Antibiotika-Gehalte junger und alter Weizenblätter (mg/kg FG) in Abhängigkeit
von Wachstumszeit und Konzentration in der Nährlösung (SFD / ³H-SMZ und CTC /
iso-CTC / ³H-TC-Dotierung)
In alten, vollentwickelten Blättern wurden generell mehr Tetracycline als in jungen Blättern
gefunden; hier zeigt sich ebenfalls eine Steigerung der Transportrate mit höherer
Chlortetracyclin-Konzentration in Nährlösung. Dementsprechend wurde der höchste Werte
für „alte Blätter“ nach 21 Tagen Wachstum bei einer Konzentration von 10µmol/L CTC /
iso-CTC in der Nährlösung erhalten.
714 21
jung 10µmol/l
alt 10µmol/l
jung 20µmol/l
alt 20µmol/l
jung 5µmol/l
alt 5µmol/l
jung 10µmol/l
alt 10µmol/l
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
0,3500
mg/kg
Tage
SFD
CTC
51
Die Sulfonamid-Einlagerung in Weizenblätter wird zur besseren Veranschaulichung
gesondert in Abb. 16 gezeigt. Zwischen den ermittelten niedrigen Werten für die SFD bzw.
³H-SMZ-Aufnahme und den Versuchsparametern (Konzentration, Zeit) sind
Abhängigkeiten nicht erkennbar.
Abb. 16: Sulfonamid-Gehalte junger und alter Weizenblätter (mg/kg FG) in Abhängigkeit
von Wachstumszeit und Konzentration in der Nährlösung (SFD/³H-SMZ und
CTC/iso-CTC/³H-TC-Dotierung)
9.3.3 Ergebnisse der Mikroautoradiographie
Die zuvor dargestellten Ergebnisse sind Summenwerte der Antibiotika-Gehalte in
verschiedenen Pflanzenteilen. Unklar bleibt z.B. bei Betrachtung der Wurzel, ob die
Antibiotika vornehmlich an der Rhizodermis adsorbiert vorliegen, ob es besondere
Einlagerungsorte gibt oder ob sie gleichmäßig verteilt in den Wurzelgeweben vorliegen.
Mit der mikroautoradiographischen Untersuchungtechnik ließ sich die Aufnahme der
Tritium-markierten Antibiotika ³H-SMZ und ³H-TC über die Wurzeln von Winterweizen und
Feldsalat auch auf zellulärer Ebene an Hand der Einlagerungsorte detailliert verfolgen.
7
14
21
jung 10µmol/l
alt 10µmol/l
jung 20µmol/l
alt 20µmol/l
0,0000
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
0,0025
0,0030
0,0035
mg/kg
Tage
Blä SFD
SFD Blä
52
Das schwächer vergrößerte Bild 17a zeigt einen Wurzelquerschnitt des Weizens, aus dem
sehr deutlich die Haupteinlagerungsorte von markiertem Sulfonamid (Dotierung 10µmol/L
SFD) hervorgehen. Es ist der Apoplast (Zellwände) der Rhizodermis und der ersten
Rindenlage (Exodermis). In diesem Bereich oder in noch jüngeren Teilen der Wurzel
erfolgt wahrscheinlich eine Aufnahme in die Zellen und ein Weitertransport in das
Leitgewebe. Sehr deutlich ist auch die Markierung in den Xylemgefäßen (Abb. 17a roter
Pfeil) zu erkennen, über die das Sulfonamid und/oder mögliche ³H-Metabolite dann in den
Spross und die Blätter transportiert werden. Das stärker vergrößerte Bild (630x) zeigt die
Einlagerung des ³H-Tetracyclins (Dotierung 5 µmol/L CTC + iso-CTC) bzw.
entsprechender Umlagerungsprodukte. Es ist der Bereich der Rhizodermis und der
äußeren Wurzelrinde (Exodermis) dargestellt, mit relativ starker Markierung, die in
anderen, hier nicht gezeigten Aufnahmen, oft viel diffuser erscheint. Sehr deutlich zu
erkennen ist, dass auch bei diesem Antibiotikum der Apoplast d.h. die Zellwände und
Interzellularenbereiche Haupteinlagerungsorte (Abb 17 b rote Pfeile) sind.
Abb. 17: Mikroautographien der Wurzelquerschnitte des Winterweizens
a) ³H-SMZ in 10 µmol/L SFD, 14 d b) ³H-TCin 5 µmol/LCTC/iso-CTC, 14d
Vergrößerung 160x Vergrößerung 630x
Abb. 18: Mikroautoradiographie Abb. 19: Mikroautoradiographie
Wurzelquerschnitt Feldsalatwurzel Junges Blatt – Weizen
³H-SMZ in 10 µmol/L SFD, 14 d ³H-SMZ in 10 µmol/L SFD, 7 d
Vergrößerung 630x Vergrößerung 1000x
Pfeile deuten auf die Haupteinlagerungsorte (nähere Erläuterungen im Text)
53
In Abb. 18 treten auch in der äußeren Wurzelrinde des Feldsalates starke Einlagerungen
von ³H-SMZ in 10 µmol/L SFD wie auch im Xylem des Leitbündels auf. Das junge Blatt
des Weizens lässt nach 7-tägiger Einwirkung des markierten Sulfonamids in 10 µmol/L
SFD, 1000fach vergrößert, im Blattmesophyll mit Leitbündeln – hier auch im Xylemteil des
Leitbündels und benachbarter Zellen - deutlich apoplastische Einlagerungen erkennen
(Abb. 19).
Die unterschiedlichen Intensitäten der Einlagerungen geben einen Hinweis auf eine
stärkere Immobilisierung des markierten Sulfonamids im Wurzelbereich im Vergleich zum
Tetracyclin, dessen diffusere Verteilung mit der durch die Tracerstudien vorgefundenen
größeren Mobilität bzw. höheren Transportraten in der Pflanze korreliert (vgl. Abb. 14
u.15).
9.3.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der ³H-Experimente
Die Tracerstudien und mikroautoradiographischen Untersuchungen mit Tritium-markiertem
Tetracyclin und Sulfamethazin zeigen, dass in Hydrokultur Feldsalat und Winterweizen
Antibiotika als solche oder metabolisiert, was hiermit nicht entschieden werden kann, über
die Wurzel aufnehmen und auch in der Pflanze mit dem Xylemsaft transportieren. Das
Sulfonamid wird im Vergleich zu den (Chlor-) Tetracyclinen von beiden Pflanzen in einem
erheblich geringeren Maße aufgenommen und in der Pflanze transportiert, was tendentiell
mit den geringeren pKow-Werten des Sulfonamids korreliert. Auch die in den
Mikroautoradiographien trotz geringerer Gesamtaufnahme des Sulfonamids stark
erscheinende Markierung in den Apoplastenbereichen sind im Einklang damit zu sehen.
Das Aufnahmevermögen der Wurzeln des Winterweizens ist für beide Antibiotika
signifikant höher als das der Feldsalatwurzeln:
Während beim Feldsalat in den Wurzeln eine Chlortetracyclin-Aufnahme bis
maximal 0,22 mg/kg FG erreicht wurde, lagen in den Weizenwurzeln die CTC-
Gehalte um den Faktor 20 höher.
Ebenso fällt auf, dass im Gegensatz zum Winterweizen beim Feldsalat die Unterschiede
zwischen Wurzel- und Blattgehalten gering sind. In Weizen-Blättern wurden im Vergleich
zum Feldsalat erheblich höhere Einlagerungswerte von Tetracyclinen (CTC/iso-CTC / ³H-
TC) als von Sulfonamiden (SFD / ³H-SMZ) ermittelt, wobei die älteren Weizenblätter stets
mehr Tetracycline enthielten als die noch nicht voll entwickelten jüngeren Blätter, was ein
54
Hinweis auf eine stärkere Transpirationsleistung älterer Blätter ist. Die Verteilung der
Antibiotika in der Pflanze erfolgt mit dem Xylemtransport.
Die Ergebnisse der Aufnahmeexperimente mit ³H-markierten Antibiotika entsprechen, wie
im folgenden Kapitel gezeigt wird, den rückstandsanalytischen Befunden mit der neu
entwickelten LC-MS-Methode.
9.4 Entwicklung der Rückstandsanalytik mit LC-MS
Zu Beginn der Untersuchungen stand aus der Literatur keine analytische Methode zur
Bestimmung von Antibiotika in pflanzlichen Proben zur Verfügung. Jedoch hatte sich
bereits bei der Bestimmung von verschiedenen Antibiotika in tierischen Proben, Boden
und Gülle eine LC-MS-Methode bewährt (Grote 2004). Es lag deshalb nahe, diese
Methode auch als Grundlage für die Bestimmung von Antibiotika in pflanzlichen Proben zu
verwenden, d.h. auf die Analyse von Pflanzenproben anzupassen und zu erweitern. Die
chromatographischen Bedingungen finden sich unter 11.1.4.
9.4.1 Qualitativer Nachweis von SFD, CTC und iso-CTC mit LC-MS/MS
Die Ionisierung der Analyt-Moleküle erfolgte durch Elektrospray-Ionisation im positiv
Modus (ESI+). Die Geräte-Parameter wurden durch Einstellen (Tunen) des Gerätes mit
einer Standard-Lösung des 10 mg/L Standards optimiert. Vorläufer- und Produktionen
dienten zur Identifizierung und Quantifizierung in Kombination mit den Retentionszeiten.
Für die ausgewählten Antibiotika ergaben die massenspektrometrischen Untersuchungen
des jeweiligen Standards im Laufmittel die in den folgenden Abbildungen (Abb. 20 bis Abb.
25) dargestellten Chromatogramme und MS/MS Spektren.
RT: 0,00 - 19,98
0 2 4 6 8 10 12 1
4
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
5,47
6,01 6,87 8,70 9,07 12,45 14,
0
4,34
3,45
0,49
sfd10_full2 #280 RT: 5,43 AV: 1NL: 2,51E5
F: + c ESI Full ms2 251,10@35,00 [ 65,00-260,00]
80 100 120 140 160 180 200 2
2
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
173,8
155,9
92,0 108,0 157,9 175,8
110,0 155,0
Abb.20: Chromatogramm der
Massenspur 251,1 m/z einer SFD-
Standard-Lösung (β=10mg/L), Synergi®
Säule, Gradient „SFD“
Abb.21: MS/MS-Spektrum von SFD,
fullscan (Vorläuferion 251,1 m/z)
einer SFD-Standard-Lösung
(β=10mg/L), niedrig auflösendes
MS
55
RT: 0,00 - 35,00
0 5 10 15 20 25 30
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relative Abundance
8,53
10,81
7,12
11,16
5,36 19,104,15 20,4314,63 30,6222,92 29,282,39 32,60
NL: 2,55E6
m/z= 442,0-463,0 F: +
c ESI SRM ms2
479,10@28,00 [
443,00-445,00;
460,90-462,90] MS
Std 1o02
Abb.22: Chromatogramm der Massenspur 479,1 m/z einer CTC / iso-CTC – Standard-
Lösung (β=10mg/L), 1. Peak tR=7,12 : e-iso-CTC, 2. Peak tR=8,53: iso-CTC, 3.
Peak tR=10,81: CTC, Säule (s.Abb.20), Gradient „CTC“
CTC-Stand5_060419141116 #510 RT: 10,20 AV: 1NL: 1,35E6
F: + c ESI SRM ms2 479,10@28,00 [ 443,00-445,00; 461,00-463,00]
444 446 448 450 452 454 456 458 460 462
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relative Abundance
461,9
443,9
461,1
444,7 462,6
Abb 23: MS/MS Spektrum von CTC, SRM-scan, Vorläuferion 479,1m/z: Produktionen
461,9 und 443,9 m/z
56
CTC-Stand5_060419141116 #394 RT: 7,88 AV: 1NL: 4,43E6
F: + c ESI SRM ms2 479,10@28,00 [ 443,00-445,00; 461,00-463,00]
444 446 448 450 452 454 456 458 460 462
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relative Abundance
462,0
462,8
Abb.24: MS/MS-Spektrum von iso-CTC, SRM-scan, Vorläuferion 479,1 m/z: Produktion
462,0 m/z
CTC-Stand5_060419141116 #318 RT: 6,36 AV: 1NL: 3,68E6
F: + c ESI SRM ms2 479,10@28,00 [ 443,00-445,00; 461,00-463,00]
444 446 448 450 452 454 456 458 460 462
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relative Abundance
462,0
461,2 462,8
Abb.25: MS/MS-Spektrum von e-iso-CTC, SRM-scan, Vorläuferion 479,1 m/z : Produktion
462,0 m/z
57
In der folgenden Tabelle sind die massenspektroskopischen Kenngrößen der Analyten aus
den Abb.20-25 zusammengefasst.
Tab.6: Massenspektroskopische Kenngrößen der Analyten (ermittelt mit 10 mg/L
Standardlösungen), niedrig auflösendes MS, chromatografisches System: Synergi®
Säule, Gradient „CTC“
Analyt M
[g/mol]
[M+H]+
gemessen
Stoß-
energie
Produktionen
(rel. Häufigkeit in %)
Retentionszeit
[min]
SFD 251,06 251,1 35 % 155,9 (84 -100)
173,9 (80 -100)
5,5
CTC 478,89 479,1 40 % 444,0 (60 – 85)
461,9 (100)
10,8
e-CTC 478,89 479,1 40 % 444,0 (50 – 80)
461,9 (100)
8,6
iso-CTC 478,89 479,1 40 % 462,0 (100) 8,5
e-iso-CTC 478,89 479,1 40 % 462,0 (100) 7,1
9.4.2 Externe Kalibrierung
Mit den Daten verschieden konzentrierter Standardlösungen an SFD und CTC wurden
Kalibriergeraden hergestellt (Konzentrationsbereiche von 0,1 bis 7 mg/L). Aus der
erhaltenen Funktion wurden die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für SFD und CTC
nach DIN 32645 berechnet. In der Tabelle 7 sind die Validierungsparameter
zusammengefasst.
Die Aufarbeitung der Proben und die Methode konnten nun im nächsten Schritt optimiert
werden, so dass ein empfindlicher Nachweis der Analyten in Extrakten von pflanzlichen
Proben möglich war.
9.4.3 Optimierung der Probenaufarbeitung
Die Zerkleinerung der Pflanzen mit einem Ultra-turrax® wurde im Eiswasserbad getestet.
Bei der Extraktion zeigte sich eine schlechte Ausbeute und diese war nicht reproduzierbar.
Vermutlich werden mit dieser Zerkleinerungstechnik nicht alle Zellorganellen zerstört, so
dass nur eine unvollständige Extraktion resultiert. Als geeignete Methode erwies sich die
Zerkleinerung der pflanzlichen Proben durch Mörsern in flüssigem Stickstoff. Damit und
bei der nachfolgenden Anwendung von Ultraschall werden Zellorganellen zerstört und die
nicht an Zellwände gebundenen, freien Antibiotika Rückstände können extrahiert werden.
58
Tab.7: Validierungsparameter für die Bestimmung von SFD und CTC in Pflanzenproben; Nachweisgrenze NWG und
Bestimmungsgrenze BG berechnet mit dem Programm „Valoo“ [www.analytik-software.de/valoo.html]
SFD CTC
Linearer Bereich [mg/L] 0,1 - 1 0,5 – 2,5 0,1-2 1-7
Kalibrierfunktion:
funktionaler
Zusammenhang
zwischen Konzentration
und Messsignal
(Peakfläche)
y=-3642+2820977,5x y=-841338+5277388,2x y=209223,5+6483277,12x y=714435 + 6255572,9x
Korrelationskoeffizent r² 0,986 0,993 0,999 0,996
Nachweisgrenze [mg/L]
nach DIN 32645 0,2 0,28 0,12 0,7
Bestimmungsgrenze [mg/L]
nach DIN 32645 0,68 0,8 0,4 2,23
Messpräzision [% srel] über
den Arbeitsbereich 16,1 8,3 4,4 6,2
59
Durch Vorversuche bei der Wahl des Extraktionsmittels, stellte sich der McIllvaine-
Citratpuffer als am geeignetsten heraus. Diese Citronensäure-Phosphat-Pufferlösung wird
auch zur Extraktion von Antibiotika aus Boden- und Fleischproben verwendet (Hamscher
2002, Vockel 2005). Getestet wurden ebenfalls Lösungen mit 1 bis 5 % Zusatz an
Methanol (v/v) oder Acetonitril, welche keine signifikante Verbesserung der Extraktionen
brachte.
Die besten Ergebnisse der anschließenden Festphasenextraktion lieferte die Verwendung
von „OASIS HLB 60 mg“-Kartuschen. Über diese Phase wurde dann auch das gesamte
Extrakt aufgereinigt. Der Durchbruch der 60 mg-Kartuschen wurde bei 70 mL Extraktions-
lösung (einer Winterweizenblattprobe mit 10 µmol/L CTC/iso-CTC in der Nährlösung)
festgestellt. Bei einer üblichen Extraktion fallen etwa 35 bis 40 mL Volumen an, so dass
ein Verlust des Analyten durch Durchbrechen der SPE-Phase weitestgehend
ausgeschlossen werden konnte. Die optimierte Aufarbeitungsmethode kann dem
experimentellen Teil der vorliegenden Arbeit entnommen werden (Kap. 11.2.3).
9.4.4 Nachweis der Analyten in Pflanzenextrakten
Die Retentionszeiten der Analyten waren abhängig von der Extraktmatrix. In Standard-
Lösungen wurden meistens die relativ höchsten Retentionszeiten gefunden. In den
aufgearbeiteten Probelösungen der Wurzelextrakte verkürzen sich die Retentionszeiten
aller Analyten. Dieser Effekt war in Probelösungen aus Blattproben noch stärker
ausgeprägt (vgl. Tab. 8).
Tab.8: Retentionszeiten [min] der Analyte in Standardlösungen sowie in Probelösungen
(Wurzel- und Blattextrakten nach der Festphasenextraktion SPE), Säule Synergi®,
Gradient CTC
Analyt Standardlösung Probelösung
Wurzelextrakt
Probelösung
Blattextrakt
SFD 5,5 5,2 - 5,5 5,3 - 5,8
CTC 10,8 10,7 - 11,0 10,1 -11,1
e-CTC 8,6 8,2 - 8,5 7,9 - 8,2
iso-CTC 8,5 8,2 - 8,4 7,8 - 8,0
e-iso-CTC 7,1 6,9 - 7,1 6,4 - 6,6
60
9.4.5 Wiederfindung
Zu ca. 5 g nicht dotierter Kontrollpflanzenprobe wurden definierte Mengen an SFD, SMP,
CTC und iso-CTC zugegeben. Diese Proben wurden nach entwickelter Analysen-
Vorschrift aufgearbeitet und der Gehalt bestimmt. Die Tabelle 9 zeigt die Ergebnisse.
Tab.9: Wiederfindungen in Winterweizenblattproben
Komponente Zugesetzte Menge
µg / 5g
Gefundene Menge
µg / 5g Wiederfindung in %
SFD 1 NN -
SFD 1 NN -
SFD 2 0,12 5,8
SFD 2 0,05 2,7
SMP* 1 0,75 75,0
SMP* 1 0,68 68,0
CTC 1 0,67 67,0
CTC 1 0,56 56,0
CTC 2 1,30 65,0
CTC 2 1,20 60,0
iso-CTC 1 0,39 39,0
iso-CTC 1 0,31 31,4
iso-CTC 2 0,69 34,8
iso-CTC 2 0,71 35,5
NN: nicht nachweisbar, *SMP wurde im weiteren Verlauf der Analytik als IS verwendet und
hier mit untersucht.
Die Wiederfindungen für SMP und CTC liegen zwischen 56 und 75 % und damit im
akzeptablen Bereich.
Iso-CTC wird nur zu ca. 35 % wiedergefunden. Es findet sich im Chromatogramm jeder
Probe, zu der iso-CTC zudotiert wurde, auch ein Signal für epi-iso-CTC, welches ca. 40%
des Signals für iso-CTC entspricht. Dieser Befund, der auch für CTC gilt, zeigt, dass im
Laufe der Probenaufarbeitung ca. 40% iso-CTC zu epi-iso-CTC umgewandelt wird. Die
Gesamt-Wiederfindung (Summe iso-CTC und epi-iso-CTC) beträgt somit ca. 50%. Die
Wiederfindung für SFD beträgt bei einem Zusatz von 2 µg SFD pro 5 g Pflanzenprobe nur
ca. 2,6 bis 5,7 %. Bei geringerer Zudotierung konnte gar kein SFD wiedergefunden
werden. Ursachen werden in einer Signalsuppression vermutet, was im nächsten Kapitel
9.4.6 näher erläutert wird.
61
9.4.6 Signalsuppression
Matrixbestandteile in einer Messprobe können die Ionisierung in der ESI-Quelle des
Massenspektrometers beeinflussen und damit die Quantifizierung verfälschen (Hajslova
und Zrostlikova 2003, Yang et al. 2005). Um diese Effekte in Bezug auf das entwickelte
LC-MS Verfahren zu überprüfen, wurden Extrakte von Kontroll-Pflanzenproben nach der
Aufarbeitung zu einer Lösung vereinigt. Diese „standardisierte Matrix-Lösung“ (genaue
Herstellung siehe Anhang A2) wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen an SFD, CTC
oder iso-CTC versetzt und analysiert. Die erhaltenen MS-Signalflächen für die
Komponenten sind in den folgenden Abbildungen 26 bis 28 dargestellt.
0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
60000000
70000000
80000000
024681012
SFD mg/L
Area
mit Matrix
ohne Matrix
Abb.26: MS-Signalflächen des SFD-Peaks (SRM-Scan) in Abhängigkeit vom SFD-Gehalt
in standardisierter Pflanzen-Matrix und in Standard-Lösung (ohne Matrix),
Mittelwerte aus 2 Messinjektionen bei 3 Wiederholproben.
62
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
120000000
140000000
160000000
180000000
024681012
CTC mg/L
Area
mit Matrix
ohne Matrix
Abb.27: MS-Signalflächen des CTC-Peaks (SRM-scan) in Abhängigkeit vom CTC-Gehalt
in standardisierter Pflanzen-Matrix und in Standard-Lösung (ohne Matrix),
Mittelwerte aus 2 Messinjektionen bei 3 Wiederholproben.
50000000
100000000
150000000
200000000
250000000
300000000
350000000
400000000
024681012
mg/L iso-CTC
Area
mit Matrix
ohne Matrix
Abb.28: MS-Signalflächen des iso-CTC-Peaks (SRM-scan) in Abhängigkeit vom iso-CTC-
Gehalt in standardisierter Pflanzen-Matrix und in Standard-Lösung (ohne Matrix),
Mittelwerte aus 2 Messinjektionen bei 3 Wiederholproben.
Für CTC wurde keine Signalunterdrückung in der ESI-Quelle gefunden, sondern ca. 10-
20% höhere Signale für CTC mit Matrix (Konzentrationsbereich 0,1 bis 10mg/L). Solche
Signal-Verstärkungseffekte sind ebenso wie Suppressionseffekte in der Literatur
beschrieben (z.B. Kloepfer et al. 2005).
63
Für iso-CTC lagen die Signalwerte mit Matrix in den niedrigeren Konzentrationsbereichen
über denen ohne Matrix, während in den höher konzentrierten Proben eine
Signalsuppression auftrat. Allerdings muss dabei auch die temperaturabhängige
Umwandlungstendenz des iso-CTCs in e-iso-CTC, sowie von CTC zu e-CTC,
berücksichtigt werden. Wie in Kapitel 3.2 beschrieben und in der Abbildung 2 dargestellt.,
epimerisieren alle Tetracycline im pH-Bereich 2-8. Diese Epimerisierung setzt in jeder
Probe ein. Neben dem eigentlichen Analyten, wie z.B. iso-CTC, wird immer auch e-iso-
CTC zu finden sein. Bei der Quantifizierung sollte deshalb die Summe der beiden
Verbindungen zu Grunde gelegt werden. Die verminderten Flächen von iso-CTC könnten
auch auf eine verstärkt stattfindende Epimerisierung zurückzuführen sein, was im Rahmen
dieser Arbeit nicht weiter untersucht wurde.
Zur Bestimmung von CTC und iso-CTC wurde die externe Kalibrierung über die Summe
aller Epimere als akzeptable Methode angewendet.
Für SFD wurden starke Signal-Suppressionseffekte nachgewiesen mit bis zu 50 bis 70%
schwächeren Signalen in Probenmatrix, was zu einem Minderbefund in den analysierten
Pflanzenproben führt.
Die auch hier festgestellten Probleme bei der Quantifizierung in der LC-MS Technik sind
ein viel beachtetes Problem (Willoughby 2002). Es gibt verschiedene Möglichkeiten trotz
Signalsuppression zu einem „korrekten“ Ergebnis zu kommen (Stüber und Reemtsma
2004). Hier wurde die Verwendung eines geeigneten Internen Standards und die
Standardaddition zur SFD- Bestimmung getestet.
9.4.7 Anwendung eines Internen Standards zur SFD Bestimmung
Sulfamethoxypyridazin, SMP (4-Amino-N-(6-methoxy-3-pyridazinyl)-benzolsulfonamid)
besitzt eine ähnliche Retentionszeit wie SFD, stört die chromatographische Trennung
nicht, ist chemisch stabil und ruft adäquate chromatographische Peaks hervor. Damit ist
SMP geeignet, als interner Standard für Sulfonamide zu fungieren (Willoughby 2002).
Abb.29: Struktur von Sulfamethoxypyridazol (SMP)
64
Tab.10: Physikalische und LC-MS/MS Daten von SMP
Summenformel C11H12N4O3S
Molmasse 280,3 g / mol
Retentionszeit C18-Synergy-Säule ~ 8 – 8,5 min
MH+ 281,3 m/z
Cap.Temperatur 200 °C
Cap.Spannung 32,00 V
Cab Lense 55,00
Sheat Gas 30
Vorläufer-Ion 281,3 m/z
Produkt-Ion 156 m/z
% Coll.energy 35
Sowohl Signalsuppressionen als auch Schwankungen der Retentionszeiten (tR) bei der
Analytbestimmung werden durch die relative Auswertung mit dem Internen Standard
rechnerisch ausgeglichen. Die Signalunterdrückung und Retentionszeitverschiebungen
betreffen nicht nur den Analyten sondern auch den Internen Standard, so dass sich auch
dessen tR verschiebt. Der Quotient (tR SMP/ tR SFD) aus der Retentionszeit des IS (SMP)
und der Retentionszeit des Analyten (SFD) unterliegt geringeren Abweichungen
(vgl.Tab.11) als die Retentionszeiten der einzelnen Analyte. Die Identifizierung der Analyte
in Realproben wird durch die Anwendung eines Internen Standards damit erleichtert, denn
in Proben unbekannter Matrix wird oft eine Retentionszeitverschiebung beobachtet (vgl.
Tab. 11).
Tab.11: Vergleich der Retentionszeiten von SFD und SMP in Pflanzenmatrix und
Standardlösung und den Quotienten der Retentionszeiten (tR SMP/ tR SFD)
Konzentration tR SFD[min] tR SMP[min] tR SMP/ tR SFD tR SMP/ tR SFD
[mg/L]
ohne
Matrix
mit
Matrix
ohne
Matrix
mit
Matrix ohne Matrix mit Matrix
0,1 5,46 5,53 8,48 8,69 1,55 1,57
5,50 5,53 8,65 8,70 1,57 1,57
5,51 5,53 8,74 8,70 1,59 1,57
0,5 5,52 5,54 8,68 8,78 1,57 1,58
5,52 5,54 8,69 8,78 1,57 1,58
5,52 5,61 8,70 8,78 1,57 1,57
1 5,53 5,62 8,70 8,86 1,57 1,58
5,46 5,62 8,71 8,79 1,59 1,56
5,54 5,56 8,71 8,87 1,57 1,60
5 5,52 5,56 8,71 8,83 1,58 1,59
5,53 5,56 8,66 8,77 1,57 1,58
5,52 5,65 8,71 8,76 1,58 1,58
10 5,52 5,55 8,68 8,74 1,57 1,57
5,53 5,56 8,69 8,75 1,57 1,57
5,53 5,56 8,69 8,81 1,57 1,59
Größter
Unterschied 0,08 0,12 0,26 0,18 0,04 0,03
65
Die beschriebene Methode zur Bestimmung von SFD unter Verwendung des internen
Standards SMP wurde wegen der gefundenen Signalsuppression des Weiteren auch auf
die Quantifizierung ausgewählter Proben angewendet. Die Ergebnisse finden sich in
Tabelle 12.
9.4.8 Standardaddition
Bei starken Matrixeffekten und niedrigen Analytgehalten, die bei der externen Kalibrierung
im Bereich der Bestimmungsgrenze liegen, kann die Anwendung der Standardaddition zur
korrekten Quantifizierung führen. Für die Bestimmung von SFD wurde die
Standardadditions-Methode auf die Pflanzenproben angewendet, die auch mit IS
gemessen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt.
Tab.12: Vergleich der SFD-Gehalte in Pflanzen nach externer Kalibrierung, mit Internem
Standard und Standardaddition, RR Möhrensorte „Rote Riesen“, PM Möhrensorte
„Pariser Markt“
SFD Gehalt [mg/kg]
Auswertung über
Probe Einwaage
[g]
Standard-
Addition
Interner
Standard
Externe
Kalibrierung
FB11
Feldsalat Blatt 5,15 0,15 +/- 0,03 0,097 +/-0,008 < BG
MB11
Möhre RR Blatt 5,16 0,17 +/- 0,03 0,052 +/- 0,002 < BG
MB 2
Möhre PM Blatt 5,19 0,54 +/-0,19 0,04* +/- 0,003 < BG
MR 1
Möhre Rübe 5,17 0,33 +/- 0,12 0,21 +/- 0,04 < BG
* Störung im LC-MS-System
Die SFD Gehalte der getesteten Proben sind mit der externen Kalibrierung nicht
quantifizierbar, weil die Messwerte kleiner als die Bestimmungsgrenzen sind. Bei
Anwendung der Standardaddition wurden vergleichsweise höhere Werte erhalten, als
unter Verwendung eines internen Standards. Die Unterschiede liegen, mit einer
Ausnahme (Möhre Blatt MB2 – bei der Messung trat eine Störung im MS-System auf),
jedoch im akzeptablen Bereich. Die Standardabweichungen bei dem Additionsverfahren
66
sind im Vergleich mit den Fehlergrenzen bei der Anwendung eines Internen Standards
größer. Bis zu 25 % höhere Gehalte werden bei der Anwendung des
Standardadditionsverfahrens im Vergleich mit der externen Kalibrierung auch von Stüber
und Reemtsma (2004) erhalten.
In der Routine eines Analysenlabors mit hohem Probendurchsatz wird das
Standardadditions-Verfahren nur an ausgewählten Proben durchgeführt werden können,
bei denen eine exakte Quantifizierung besonders wichtig ist, z.B. bei der Einhaltung von
Grenzwerten in der Lebensmittelüberwachung. Denn die Durchführung des Verfahrens
erfordert einen erheblichen Mehraufwand an Probenvorbereitung, Material und Messzeit.
Einmal etabliert wird ein Bestimmungsverfahren mit Verwendung eines Internen Standards
vermutlich ähnlich anwendbar sein, wie eine externe Kalibrierung.
Mit der beschriebenen Probenaufarbeitung bestehend aus ultraschallunterstützter
Extraktion, Zentrifugation, Festphasenextraktion und einer externen Kalibrierung konnten
nun die unterschiedlichen Pflanzenproben aufgearbeitet und mit der LC-MS-
Rückstandsanalytik analysiert werden.
9.5 Aufnahmeexperimente mit unmarkierten Antibiotika in Hydrokultur
9.5.1 Möhren
9.5.1.1 Aufnahme von SFD
Entwicklung
Möhren wuchsen zufriedenstellend sowohl in Hydrokultur als auch in Erde, die mit
dotierter Nährlösung gegossen wurde. In allen Kulturmedien wurden Rüben gebildet, wenn
auch teils in kleiner Größe. In Hydrokultur bildeten die Möhren sehr viele Seitenwurzeln
aus (Abb. 30 und 31 ).
67
Abb. 30:
Möhren „Rote Riesen“: nach einer Woche
in 2,5 mg/L SFD haltiger Nährlösung
Abb. 31:
Möhren „Pariser Markt“: nach 2 Wochen: links
Kontrolle, rechts mit 2,5 mg/L SFD in
Nährlösung
SFD-Gehalte in Möhren
In den Möhrenproben der Sorten „Rote Riesen“ und „Pariser Markt“, die bei
unterschiedlichen Bedingungen (in dotierter Nährlösung und in Erde, die mit dotierter
Nährlösung gegossen wurde) aufwuchsen, wurden die in Tab. 13a und b angegebenen
SFD-Gehalte gefunden.
Tab. 13a: SFD-Gehalte in Möhren (Hydrokultur)
Gehalt SFD
[mg/kg]
Pflanzenorgan
Zeit in
Nährlösung
[Tage]
Gehalt SFD
in
Nährlösung
[mg/L]
Rote Riesen
0,27 0,19 Wurzel 14 2,5
<NWG <NWG Blatt/Halm 14 2,5
<NWG <NWG Blatt/Halm 14 2,5
Pariser Markt 0,21 Wurzel 7 2,5
3,39 Seitenwurzeln 7 2,5
<NWG Blatt/Halm 7 2,5
68
Tab. 13b: SFD-Gehalte in Möhren (Wuchs auf Erde, dotierte Gießlösung)
Gehalt SFD
[mg/kg]
Pflanzenorgan
Gießzeit mit
Nährlösung
[Tage]
Gehalt SFD in
Nährlösung
[mg/L]
Rote Riesen
<NWG < BG Blatt/Halm 21 2,5
<NWG <NWG Blatt/Halm 21 2,5
< BG < BG Rübe 21 2,5
< BG < BG Rübe 21 2,5
Pariser Markt
<NWG Blatt/Halm 7 2,5
<NWG Blatt/Halm 21 2,5
Es ist festzustellen, dass mit Ausnahme der in Hydrokultur ausgebildeten Seitenwurzeln
(Tab. 13a) die SFD-Aufnahme durch die anderen Pflanzenteile der Möhren äußerst gering
ist. Vermutlich wird SFD in den Möhren im Apoplasten festgehalten (Heyser 2008).
9.5.1.2 Aufnahme von CTC / iso-CTC
Entwicklung
Die Kontrollmöhren sahen vital aus, bildeten viele Seitenwurzeln, neue Blätter und die
Rüben wuchsen weiter. Beide Sorten, „Rote Riesen“ und „Pariser Markt“, bildeten auf
5µmol/L CTC/iso-CTC haltiger Nährlösung relativ wenig Seitenwurzeln aus und die Rübe
nahm nicht an Dicke zu. Es bildeten sich dennoch teilweise neue Blätter. Die Wurzeln
waren verschleimt mit schwarzer Oberfläche und wirkten „krank“.
Erstaunlicherweise entwickelten sich die Rüben beider Sorten auf 10 µmol/L CTC/iso-CTC
haltiger Nährlösung besser, als die Möhren aus den niedriger dotierten Ansätzen. Sie
hatten weniger Seitenwurzeln gebildet als die Kontrollmöhren, jedoch mehr als bei 5
µmol/L. Auch nahmen die Rüben an Dicke zu und es bildeten sich neue Blätter.
Möglicherweise hatten die Möhren aus den Hydrokulturversuchen mit 5 µmol/L CTC eine
bakterielle Infektion, die bei höheren Antibiotika-Gehalten in der Nährlösung behoben war
(Langenkämper 2006).
69
CTC-Gehalte in Möhren
In den Seitenwurzeln der Möhren sind die Chlortetracyclin-Gehalte extrem hoch (Tab. 14),
in den Rüben dagegen um Größenordnungen geringer (auch hier ist wieder eine
„Ablagerung“ in Apoplastenbereichen zu vermuten). In den Blättern wird noch weniger
Gesamt-CTC gefunden als in den Rüben. Bei einer Konzentration von 5 µmol/L CTC / iso-
CTC in der Nährlösung lagen in Rüben und Blättern annähernd gleiche Gehalte vor.
Deutliche Anteile von Epimeren und Iso-Komponenten sind ab 10 µmol/L CTC/iso-CTC in
den Möhrenproben nachweisbar. Der e-CTC-Gehalt bildet bis auf eine Ausnahme immer
den geringsten Anteil am Gesamt-CTC-Gehalt, während CTC – auch im Vergleich zum
iso-CTC – überwiegt.
Insgesamt sind Abhängigkeiten zwischen Antibiotikadotierung, Wachstumszeit und CTC-
Gehalten in den einzelnen Pflanzenteilen festzustellen. Diese sind aber nicht einfach
proportional, d.h. mit zunehmender Dotierung und Laufzeit nimmt der nachweisbare
Gehalt an Antibiotika nicht automatisch weiter zu. Bei Blättern, Rübe und
Rübenseitenwurzeln ergab sich das folgende Bild:
• Nur in den Blättern von Möhren, die auf 10 µmol/L CTC/iso-CTC haltiger
Hydrokultur wuchsen, nimmt der Gesamt-CTC-Gehalt mit der Wachstumszeit zu.
Dieser Effekt beruht auf der Zunahme der iso- und e-iso-CTC-Gehalte, während
sich die Gehalte an e-CTC und CTC verringern.
• In den Rüben und Seitenwurzeln von Möhren, die auf 10 µmol/L CTC/iso-CTC
haltiger Hydrokultur wuchsen, nimmt der Gesamt-CTC-Gehalt mit der
Wachstumszeit erst zu und dann wieder ab. Dieser Befund könnte auf
Metabolisierungsprozesse in den entsprechenden Pflanzenteilen hinweisen.
• Dagegen nehmen bei Wurzeln und Seitenwurzeln sowie den Blättern der 5 µmol/L-
Ansätze die Gesamt-CTC-Gehalte mit der weiteren Entwicklung der Möhren ab.
70
Tab. 14: CTC-Gehalte in Möhren, Sorte Pariser Markt (Hydrokultur mit unmarkierten
Antibiotika) [mg/kg FG]
Organ
Dotie-
rung
[µmol/
L]
Zeit
[Woch
en]
CTC
e-CTC
Summe
CTC+
e-CTC
iso-
CTC
e-iso-
CTC
Summe
iso +
e-iso-
CTC
Summe
CTC
total
Blatt 5 1 NN 0,24 0,24 NN NN 0,24
2 NN 0,17 0,17 NN NN 0,17
Blatt 10 1 0,18 0,09 0,27 0,23 0,18
0,41 0,68
2 0,10 0,07 0,17 0,39 0,40
0,79 0,96
Rübe 5 1 NN 0,24 0,24 NN NN 0,24
2 NN 0,20 0,20 NN NN 0,20
Rübe 10 1 2,48 0,56 3,04 0,57 0,47
1,04 4,08
2 0,56 0,15 0,71 0,41 0,29
0,70 1,41
Seiten-
Wurzel 5 1 22,5 9,68 32,2 8,04 4,77
12,81 45,0
2 4,30 NN. 4,30 1,40 0,84
2,24 6,54
Seiten-
Wurzel 10 1 >400 6,17 >400 60,1 36,3
96,37 >500
2 181,1 2,30 183,4 22,2 12,9
35,11 218,5
Diese Effekte sollten insgesamt nicht überinterpretiert werden, da wegen teilweise
geringer Mengen des inhomogenen Pflanzenmaterials nur eine begrenzte
Repräsentativität der Probenzusammensetzung erreichbar war. Ebenso ist unklar, welche
Anteile der einzelnen Epimeren und Isomeren des Chlortetracyclins im
Pflanzenstoffwechsel oder als Artefakte der Probenvorbereitung zuzuordnen sind oder
über die Wurzel tatsächlich aufgenommen wurden. Aufgrund der Ergebnisse mit der
entwickelten LC-MS Methode konnte jedoch eindeutig festgestellt werden, dass Möhren
Antibiotika aufnehmen. Diese Befunde weisen auch darauf hin, dass Antibiotika in den
einzelnen Pflanzenteilen von Möhren unterschiedlich umgesetzt werden.
71
9.5.2 Feldsalat
9.5.2.1 Aufnahme von SFD
Entwicklung
Die Feldsalatpflanzen unterschieden sich in den ersten 2 Wochen Wachstum
augenscheinlich nicht auf dotierter Nährlösung und nicht-dotierter Nährlösung. Sie bildeten
ebenso viele Blattpaare und die Blattfarbe war ebenfalls ähnlich. Nach 2 wöchigem
Wachstum auf dotierter Nährlösung setzte Verschleimung der Wurzeln ein, und die Blätter
bildeten braune Blattränder. Die Feldsalatpflanzen bildeten nicht mehr so viele neue
Blattpaare wie die Kontrollpflanzen und die Blattfarbe änderte sich von grün zu gelb-grün.
Nach dreiwöchigem Wachstum auf SFD-haltiger Nährlösung sahen die Feldsalat-Pflanzen
geschädigt aus (Abb. 32).
Abb. 32:
Feldsalat nach 2 Wochen auf 2,5 mg/L
SFD –haltiger Nährlösung
Abb. 33:
Feldsalat nach 3 Wochen: oben mit 2,5
mg/L SFD-haltiger Nährlösung, unten:
ohne SFD-Dotierung; Kontrollversuch
In anderen Versuchen wurde jedoch kein Einfluss von Sulfadiazin auf die
Pflanzenentwicklung von z.B. Kopfsalat festgestellt (Boxall et al. 2006).
SFD-Gehalte in Feldsalat
In den analysierten Feldsalatproben wurden deutlich höhere Gehalte in den Wurzeln als in
den Blättern nachgewiesen (Tab. 15).
72
Tab. 15: SFD-Gehalte in Feldsalat (Hydrokultur), zwei Proben, Mittelwerte aus zwei
Injektionen
Gehalt SFD
[mg/kg FG]
Pflanzenorgan
Zeit
[Tage]
Gehalt SFD in Nährlösung
[mg/L]
Probe 1 Probe 2
0,69 n.a. Wurzel 7 2,5
0,06 0,01 Blatt 7 2,5
n.a.: nicht auswertbar, da Retentionszeitverschiebung > 2 min
Über Abhängigkeiten der SFD-Aufnahme von der Dotierungskonzentration sind auf Grund
der geringen Probenzahl keine Aussagen zu treffen.
9.5.2.2 Aufnahme von CTC / iso-CTC
Entwicklung
Feldsalat wuchs auf CTC / iso-CTC-haltiger Nährlösung ohne Unterschied zu nicht-
dotierter Nährlösung. Das gilt für Wurzeln und Blätter, die grün und vital aussahen. Visuell
war kein Unterschied zu den Kontrollpflanzen festzustellen.
CTC / iso-CTC -Gehalte in Feldsalat
Die in den Feldsalatproben gefunden Gehalte an den unterschiedlichen Chlortetracyclinen
sind in Tab. 16 zusammengefaßt und ergänzend in Abb. 13 dargestellt. Die Analysendaten
belegen, dass der dotierte Wirkstoff CTC und die iso-Form während des Wachtums der
Feldsalatpflanzen nachgewiesen werden. In den Wurzeln finden sich erheblich höhere
CTC/iso-CTC- Gehalte als in den Blättern.
Mit zunehmender Zeit auf dotierter Nährlösung und mit der Konzentration an
Chlortetracyclinen nehmen die CTC/iso-CTC-Gehalte in den Wurzeln zu.
73
Tab. 16: CTC-Gehalte in Feldsalat (Hydrokultur)[mg/kg FG]
n.a.: nicht auswertbar, charakteristische Peaks bei stark verschobenen Retentionszeiten
>2 min.
Innerhalb der dreiwöchigen Wachstumszeit auf mit 5 µmol/L CTC/iso-CTC-dotierter
Nährlösung erhöht sich stetig der CTC / iso-CTC Gehalt in den Blättern. Dieses gilt auch
bei verdoppelter Konzentration, allerdings nicht in linearem Verhältnis. Ob der sprunghafte
Anstieg der Gehalte in den Blättern nach der dritten Woche um den Faktor 35
physiologisch bedingt ist, oder ein analytischer Artefakt, ist nicht entscheidbar.
Auffällig ist, dass sich der Quotient der Massenanteile (CTC : iso-CTC) während des
Transportes von den Wurzeln (ca. 3) in die Blätter (ca. 1) deutlich zu Gunsten des iso-
CTC´s verschiebt. Möglicherweise isomerisiert CTC während des Transportes in die
Blätter zu iso-CTC, oder es wird tatsächlich, wie anhand des höheren Oktanol/
Wasserverteilungskoeffizienten zu erwarten wäre, mehr iso-CTC in höhere Pflanzenteile
Organ
Dotie-
rung
[µmol/L]
Zeit
[Wo
che]
CTC
e-CTC
Summe
CTC+
e-CTC
iso-
CTC
e-iso-
CTC
Summe
iso-CTC
+
e-iso-
CTC
Summe
CTC
total
Verhältnis
CTC
iso-CTC
Blatt 5 1 NN 1,05 1,05 1,31 0,74 2,05 3,10 0,51
2 1,27 0,96 2,23 1,19 0,67 1,86 4,09 1,2
3 1,5 1,18 2,72 1,50 0,85 2,35 5,07 1,16
Blatt 10 1 0,35 0,20 0,55 0,21 0,18 0,39 0,94 1,41
2 0,40 0,20 0,60 0,45 0,45 0,90 1,50 0,67
3 18,9 12,7 31,7 16,7 3,90 20,7 52,3 1,53
Wurzel 5 1 44,6 18,8 63,5 12,8 7,6 20,3 83,8 3,15
2 65,5 30,5 96,0 20,6 13,1 33,8 129,8 2,85
3 n.a. n.a. >11,4 >8,00
Wurzel 10 1 69,2 38,2 107,4 11,2 17,9 29,1 136,5 3,7
2 133,8 119,3 253,1 52,8 32,10 84,9 338,0 3,0
3 n.a. n.a. n.a. n.a.
74
transportiert. Dieses kann hier nicht entschieden und nur durch weitere Untersuchungen
herausgefunden werden.
Wurzel 5µmol/L 1.Wo
Wurzel 5µmol/L 2.Wo
Wurzel 10µmol/L 1.Wo
Wurzel 10µmol/L 2.Wo
Blatt 5µmol/L 1.Wo
Blatt 5µmol/L 2.Wo
Blatt 5µmol/L 3.Wo
Blatt 10µmol/L 1.Wo
Blatt 10µmol/L 2.Wo
Blatt 10µmol/L 3.Wo
CTC
e-iso-CTC
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
mg/kg
CTC e-CTC iso-CTC e-iso-CTC gesamt CTC
Abb. 34: Chlortetracyclin-Gehalte in Feldsalat als Funktion des Pflanzenorgans, der Zeit
und CTC/iso-CTC-Dotierung
9.5.3 Winterweizen
9.5.3.1 Aufnahme von SFD
Entwicklung
Die Weizenpflanzen, die auf SFD-dotierter Nährlösung wuchsen, sehen im Vergleich zu
Kontrollproben dunkler grün aus und bilden mehr braune Blattspitzen. Je höher die SFD-
Konzentration in der Nährlösung, desto mehr braune Blattspitzen wurden gebildet und
desto dunkler erschienen die Pflanzen. Die Größe der Pflanzen war dabei vermindert
(Abb. 35).
75
Abb 35: Winterweizenpflanzen nach 2 Wochen in SFD-dotierter Nährlösung,
links: kein SFD, Mitte: 2,5 mg/L SFD, rechts: 5 mg/L SFD
Diese Beobachtungen korrelieren positiv mit der in Abb.36 gezeigten Entwicklung der
Biomasse (Frischgewicht) der Winterweizenpflanzen über einen Zeitraum von 30 Tagen.
Die Dotierung der Nährlösung mit SFD erfolgte am 8. Tag in zwei Konzentrationen:
10µmol/L entsprechend 2,5 mg/L und 20 µmol/L entsprechend 5 mg/L.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [Tage]
Biomasse FG [g]
M ohne SFD
M mit 10µmol/L SFD
M mit 20µmol/L SFD
Abb. 36: Biomasseentwicklung von Winterweizen auf SFD- dotierter Nährlösung
Pflanzen, die in dotierter Nährlösung wuchsen, nahmen im Vergleich zu den
Kontrollproben in Abhängigkeit von der SFD-Konzentration weniger an Biomasse
zu.
SFD-Gehalte in Winterweizen
In Wurzeln des Winterweizens, der auf dotierter Nährlösung wuchs, wurde Sulfadiazin
nachgewiesen (Tab. 17). Mit länger andauernder Wachstumszeit steigen die SFD-Gehalte
76
der Pflanzenproben. Eine ähnliche Wirkung erzeugt die Erhöhung der Wirkstoff-
Konzentration.
Tab. 17: SFD-Gehalte in Wurzeln von Winterweizen
Gehalt SFD
[mg/kg FG]
Zeit
[Tage]
Gehalt
SFD in
Nährlösung
[mg/L]
Probe 1 Probe 2
2,27 -
14 2,5
3,17 3,35
21 2,5
6,58 5,92
14 5
10,3 8,36
21 5
9,56 - 7 7,5
9,0 -
14 7,5
18,3 -
21 7,5
7,1 -
7 10
10,4 -
14 10
In den analysierten Blatt- bzw. Halmproben sind Spuren von SFD nachweisbar, so dass
angenommen werden muss, dass ein Transport von SFD von der Wurzel in die Blätter
stattfand. Erneut zeigt sich, wie bei den Wurzeln, eine Zunahme des SFD-Gehaltes mit der
Zeit und mit der Konzentration in der Nährlösung (Tab. 18).
Tab. 18: SFD-Gehalte in Halm/Blatt-Proben von Winterweizen
Gehalt SFD
[mg/kg FG]
Zeit
[Tage]
Gehalt SFD
in Nährlösung
[mg/L]
Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4
0,01 0,02 0,02 0,02 7 2,5
0,04 0,03 0,03 0,04 14 2,5
0,03 0,08 0,15 0,05 21 2,5
0,07 0,06 - - 7 5
0,16 0,18 0,12 - 14 5
0,22 - - - 21 5
77
9.5.3.2 Aufnahme von CTC / iso-CTC
Entwicklung
Die Blätter der Pflanzen, die auf CTC/iso-CTC-haltiger Nährlösung wachsen, sehen
vergleichsweise dunkler grün aus, sind im Wuchs kleiner und bilden mehr braune
Blattspitzen (Abb. 37) als die Kontrollpflanzen.
Abb. 37: Winterweizen, nach 2 Wochen in CTC/-iso-CTC-dotierter Nährlösung,rechts:
Kontrolle, links: 5 µmol/L CTC / iso-CTC.
Die Wurzeln der arzneistoff-dotiert in Hydrokultur aufgewachsenen Pflanzen sind im
Vergleich zu den Wurzeln der Kontrollpflanzen dunkler und gelb verfärbt. Die Pflanzen
bilden anscheinend weniger Wurzelmasse aus.
Die Abbildung 38 zeigt die Entwicklung der Biomasse von Winterweizenpflanzen
(Frischgewicht, FG) über 30 Tage ohne Dotierung der Nährlösung und nach Dotierung am
7. Tag. Die Zusätze an CTC und iso-CTC lagen bei 5 und 10 µmol/L.
Der Zusammenhang zwischen reduziertem Wachstum und Chlortetracyclin-Konzentration
ist ähnlich deutlich ausgeprägt wie beim Sulfonamid (Abb. 36). Von einem vermindertem
Wachstum von Möhren und Kopfsalat in Topfexperimenten unter dem Einfluss von
Phenylbutazon, Oxytetracyclin und Enrofloxacin wird auch von Boxall et al. (2006)
berichtet.
78
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
1 3 6 8 10 13 15 17 20 22 25 28
Zeit [Tage]
Biomasse FG [g]
M Kontrolle ohne CTC / iso-CTC
M mit 5µmol/L CTC / iso-CTC
M mit 10µmol/L CTC / iso-CTC
Abb. 38: Biomasseentwicklung von Winterweizen auf CTC/iso-CTC- dotierter Nährlösung
CTC-Gehalte in Winterweizenpflanzen
Die ermittelten Gehalte an CTC-Komponenten in Pflanzenbestandteilen des
Winterweizens, der auf CTC/iso-CTC-haltiger Nährlösung wuchs, sind in Tab. 19
zusammengestellt.
Tab. 19: CTC-Gehalte in Wurzeln und Blättern von Winterweizen (Hydrokultur) [mg/kg FG]
Organ
Dotierung
[µmol/L]
Zeit
[Wo]
CTC
e-
CTC
Summe
CTC+
e-CTC
iso-
CTC
e-iso
CTC
Summe
iso+e-
iso-CTC
Summe
CTC
total
Verhältnis
CTC
iso-CTC
Wurzeln 5 1 18,1 20,7 38,8 5,3 4,12 9,42
48,3 4,1
Wurzeln 10 1 33,6 32,5 66,1 9,6 7,04 16,6
82,7 3,9
Blätter 5 3 NN NN NN 3,6 0,42 4,0
4,03 < 0,1
79
Fortsetzung Tab. 19: CTC-Gehalte in Wurzeln und Blättern von Winterweizen
(Hydrokultur) [mg/kg]
Organ
Dotierung
[µmol/L]
Zeit
[Wo]
CTC
e-
CTC
Summe
CTC+
e-CTC
iso-
CTC
e-iso
CTC
Summe
iso-
CTC+e-
iso-CTC
Summe
CTC
total
Verhältnis
CTC
iso-CTC
Blätter 10 3 0,14 NN 0,14 7,9 0,81 8,8
8,91 < 0,1
Verhältnis
iso-CTC
CTC
Blätter
jung 5 3 ~0,1 NN 0,10 1,5 0,34 1,87
1,97 18,7
Blätter
jung 10 3 0,15 NN 0,15 2,2 0,62 2,86
3,01 19,1
Blätter
alt 5 3 0,12 NN 0,12 7,5 1,76 9,33
9,45 77,8
Blätter
alt 10 3 0,30 NN 0,30 12,7 2,89 15,6
15,8 51,9
Die mehrfach gefundene Abhängigkeit zwischen Konzentration und Aufnahme von
Arzneistoffen durch die Pflanze findet sich erneut bei den vorgefundenen Chlortetracyclin-
Belastungen in Wurzeln und Blättern von Winterweizen bestätigt. Im Vergleich zu den
SFD-Dotierungen ist die Aufnahme an Chlortetracyclinen erheblich höher (vergl. Tab. 17
und 18).
80
Wurzel 5µmol/L 1.Wo
Wurzel 10µmol/L 1.Wo
Blätter 5µmol/L 3.Wo
Blätter 10 µmol/L 3.Wo
Blätter 5µmol/L jung 3.Wo
Blätter 10 µmol/L jung 3.Wo
Blätter 5 µmol/L alt 3.Wo
Blätter 10 µmol/L alt 3.Wo
CTC
e-iso-CTC
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
mg/kg FG
CTC e-CTC iso-CTC e-iso-CTC gesamt-CTC
Abb. 39: Chlortetracyclin-Gehalte in Winterweizen als Funktion des Pflanzenorgans, der
Zeit und CTC/iso-CTC-Dotierung
Besonders auffällig sind die unterschiedlichen Gehalte an CTC und iso-CTC in den
einzelnen Organen der Weizenpflanzen (Abb. 39). In den Wurzeln findet sich mehr CTC
als iso-CTC. Nach einer Woche Entwicklungszeit auf dotierter Nährlösung beträgt das
Verhältnis CTC zu iso-CTC in Wurzeln etwa 4, wobei dieser Wert bei beiden,
unterschiedlich dotierten Nährlösungen (5 und 10 µmol/L) gefunden wird.
In den Blättern von Winterweizen wurde im Unterschied zu den Wurzeln mehr iso-CTC als
CTC nachgewiesen. Nach drei Wochen Wachstum auf dotierter Nährlösung beträgt das
Verhältnis iso-CTC zu CTC in jungen Blättern ca. 19 (bei 5 und 10 µmol/L CTC/iso-CTC).
In älteren Blättern wurde sogar die 52 bis 78-fache Menge an iso-CTC vorgefunden.
81
Diese Befunde stehen mit den Modellrechnungen auf Basis des
Oktanolverteilungskoeffizienten im Einklang. Danach wurde für iso-CTC der höchste pKow
–Wert berechnet. Die größere Lipophilie erleichtert den symplasmatischen Transport,
wodurch diese Komponente im Vergleich zu den anderen Arzneistoffen vermehrt über die
Endodermis in höhere Pflanzenteile transportiert werden kann.
Hinzu kommt eine mögliche Isomerisierungstendenz von CTC, wonach pflanzenintern eine
Umwandlung von CTC in iso-CTC denkbar ist, aber nicht umgekehrt. Welcher Anteil an
dem höheren iso-CTC-Gehalt in Blättern aus der möglichen höheren Transportrate und
welcher Anteil möglicherweise pflanzenintern als Ergebnis durch Umlagerungen von CTC,
resultiert, kann hier nicht entschieden werden.
Insgesamt konnte aufgrund mit der entwickelten LC-MS Methode nachgewiesen werden,
dass Winterweizen Antibiotika aufnimmt. Dabei konnte eine denkbar einfache Korrelation
zwischen Antibiotikakontamination der Nährlösung, Wachstumszeit und Antibiotika-
aufnahme festgestellt werden: je mehr Antibiotika sich in der Nährlung befanden und je
länger die Pflanze in der Nährlösung verblieb, desto mehr Antibiotika nahm die Pflanze
auch auf. Dieser Befund ergab sich sowohl in Bezug auf die Wurzeln, als auch in Bezug
auf das entwickelte Blattmaterial. Ob sich diese Korrelation auch bei noch längeren
Zeiträumen und Kontaminationen fortsetzt, oder ob die Antibiotikamengen in der Pflanze
bei längeren Wachstumszeiten und höheren Kontaminationen ggf. durch Metabolisierung
wieder abnehmen, ist noch nicht untersucht (vgl. die entsprechenden Befunde bei
Möhren).
82
9.5.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der Methodenentwick-
lung und der Aufnahmeexperimente mit unmarkierten
Antibiotika
Zielsetzung der Arbeit war insbesondere die Entwicklung einer Analysenmethode zum
Nachweis von Antibiotika in Nutzpflanzen und die Anwendung dieser Methode auf
ausgewählte Nutzpflanzen, die unter Laborbedingungen gezogen worden waren. Im
Rahmen des „Antiinfektiva-Projektes“ (Grote et al. 2005) wurden mit dieser Methode auch
Feldpflanzen analysiert. In den vorhergehenden Kapiteln 8 und 9 wurde diese Methode
beschrieben und die Ergebnisse der Anwendung auf Winterweizen (Wurzeln und
Grünanteile) sowie Möhren und Feldsalat dargestellt.
Insgesamt kann festgestellt werden, dass alle unter Hydrokulturbedingungen entwickelten
Nutzpflanzen Antibiotika aufgenommen haben. Das in der Landwirtschaft besonders
häufig eingesetzte Antibiotikum CTC wird dabei im Vergleich zum SFD stärker über die
Wurzel aufgenommen. Bei den untersuchten Pflanzen und Pflanzenteilen wurden
signifikante Unterschiede festgestellt:. Im Gegensatz zu Möhren, wirken sich Antibiotika
unter den gewählten Hydrokulturbedingungen bei Winterweizen und Feldsalat negativ auf
die Pflanzenentwicklung aus. Diese Pflanzen haben sich mit Antibiotika schlechter
entwickelt als ohne Antibiotika. Bei ihnen gilt auch die folgende Faustformel: Je höher die
Dotierungskonzentrationen waren und je länger die Pflanzen den Antibiotika ausgesetzt
waren, desto mehr haben sie auch über die Wurzel aufgenommen und in der Pflanze
transportiert, so dass Grünanteile, sowie junge und alte Blätter, von Winterweizen und
Feldsalat entsprechend höhere Gehalte an Antibiotika aufwiesen. Bei Möhren wurde
dieser Zusammenhang nur bei den Blättern festgestellt. Bei den Rüben und Seitenwurzeln
der Möhre wurde dem gegenüber bei verlängerter Wachstumsphase in Antibiotika-
Nährlösung niedrigere Gehalte analysiert. Dieser Befund könnte auf verstärkt stattfindende
Metabolisierungen innerhalb dieser Pflanzenteile hinweisen.
Ausgewählte Pflanzen wurden deshalb auf Metabolite analysiert, was im folgenden Kapitel
beschrieben wird.
83
9.6 Metabolisierung von Chlortetracyclin in Pflanzen
9.6.1 Einführung
Da CTC von allen untersuchten Pflanzen in deutlich höherem Maße aufgenommen wurde
als SFD, konzentrierte sich der Nachweis von Metaboliten aus analytischem Grunde auf
mögliche CTC-Metabolite. Die Suche nach Metaboliten wurde auf Grundlage der
entwickelten HPLC-MS-Methode durchgeführt. An ausgewählten Proben mit positiven
Befunden wurden zur Absicherung MSn Experimente mit einem hochauflösenden FTICR-
MS des ISAS, Institute of Analytical Science, Dortmund, durchgeführt.
9.6.2 Mögliche Metabolite von CTC
Pflanzen besitzen kein Ausscheidungsorgan. Einmal in die Pflanze aufgenommen,
unterliegen Xenobiotika verschiedenen Transformationen (vgl. Abb. 8). Sie oder ihre
Umsetzungsprodukte können in Zellkompartimente (Zellwände) eingebaut oder
metabolisiert werden. Dabei werden sie in der Pflanze durch oxidative und reduktive
enzymatische Prozesse umgesetzt. Als Beispiel sei hier der Abbau von Trichlorethylen in
Weiden (Hybrid popular) erwähnt. Die am meisten auftretenden Produkte sind das oxidativ
entstandene Trichlorethanol, Trichloressigsäure und die Dichloressigsäure (Newman
1997), vgl. auch Kapitel 6.
Aus Chlortetracyclin können sich grundsätzlich verschiedene Produkte durch Oxidation,
Demethylierung und Dehalogenierung bilden (Coupland 1991), (Abb.8). Weil im Molekül
nur ein Chloratom vorhanden ist, kann auch nur ein dehalogeniertes Produkt auftreten,
nämlich Tetracyclin. Anders sind die Verhältnisse bei einer möglichen Demethylierung. Im
Molekül sind mehrere Methylgruppen vorhanden, deshalb könnten auch mehrere einfach
demethylierte Metabolite (s.u.) auftreten. Denkbar sind auch mehrfach demethylierte
Produkte (vgl. Abb.40). Durch Oxidation könnte aus CTC primär ein oxydiertes Molekül mit
einem Sauerstoffatom mehr als beim CTC entstehen. Weitere mögliche Oxidationen
können zu Keto-, Aldehyd- und Säurefunktionen führen (Korte 2000).
Durch Oxidation, Demethylierung und Dehalogenierung von CTC ist hypothetisch die
Bildung der in Abb. 40 dargestellten Verbindungen denkbar. CTC kann an zwei Stellen
demethyliert werden: Am C-Ring oder am Stickstoff der Aminogruppe des A-Ringes. Es
würden daraus Demeclocyclin oder N-Monodesmethyl-CTC entstehen. Weitere
Demethylierungen könnten stattfinden zu N-Monodesmethyl-Demeclocyclin oder N-
Didesmethyl-CTC.
84
Die Oxidation von Chlortetracyclin muss nicht zwangsläufig zu einer OH-Gruppe am B-
Ring führen (vgl. Abb. 2), prinzipiell sind alle primären, sekundären und tertiären C-Atome
des Chlortetracyclin oxidierbar. Die durch Oxidation oder Dehalogenierung von CTC
entstehenden Verbindungen Oxy-CTC oder TC können ebenfalls wieder demethyliert
werden.
Weiterhin können neben den in der Abb. 40 dargestellten Metaboliten auch deren Epimere
(räumliche Anordnung von –H und –N(CH3)2 am A-Ring-System unterschiedlich) und
Tautomere (keto- / enol-Verbindungen) auftreten.
Abb. 40: Ausgewählte, mögliche Metabolite von CTC (oben 2. v.li.) durch Dehalogenierung (DHal),
Demethylierung (DM) und Oxidation (OX). (Weitere Produkte sind möglich,
insbesondere weitere oxidierte Produkte).
Es sind somit eine Vielzahl von Metaboliten möglich, die teilweise exakt gleiche
Molekülmassen besitzen (z.B. Demeclocyclin und N-Monodesmethyl-CTC).
Um eine Identifizierung der Metabolite von CTC in pflanzlichen Proben vornehmen zu
können, ist der Vergleich mit Chromatogrammen und mit MS-Spektren der
Referenzsubstanzen nötig. Die Chromatogramme der zur Verfügung stehenden
Referenzsubstanzen sind in der Abb. 41 dargestellt. Für die am Stickstoff demethylierten
85
Verbindungen N-Desmethyl-CTC und N-Didesmethyl-CTC sowie dem Oxidationsprodukt
Oxy-CTC stehen aber keine Standards zur Verfügung.
RT: 0.0 - 26.0
0 5 10 15 20 25
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
50
100 10.8
15.0
8.6
18.7
23.1
1.3 5.92.2
15.0
14.7
10.8
18.7
14.0 20.2
9.3
8.7
8.1 10.5
8.3
10.7
11.3 12.7
10.7
14.3 14.5
14.8
15.8 16.7 19.5
NL: 7.28E5
TIC F: FTMS + p ESI Full ms [
400.00-550.00] MS 061107-43
NL: 8.22E5
m/z= 479.11438-479.12876 F:
FTMS + p ESI Full ms [
400.00-550.00] MS 061107-43
NL: 5.11E5
m/z= 461.14824-461.16208 F:
FTMS + p ESI Full ms [
400.00-550.00] MS 061107-43
NL: 5.05E5
m/z= 445.15386-445.16722 F:
FTMS + p ESI Full ms [
400.00-550.00] MS 061107-43
NL: 2.78E5
m/z= 465.09894-465.11290 F:
FTMS + p ESI Full ms [
400.00-550.00] MS 061107-43
TC
TIC
Oxy-TC
e-iso-CTC
DMC
CTC
iso-CTC +
e-CTC
e-TC
e-Oxy-TC
e-DMC
Abb.41:Totalionenstrom-Chromatogramm (TIC) und die einzelnen Massenspuren einer
Standard-Mischung von CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Oxy-TC, TC und DMC mit einer
Konzentration von jeweils 1mg/L in Acetonitril (FTICR-MS).
Es ist anzunehmen, dass Oxy-CTC und N-Monodesmethyl-CTC, ebenso wie andere
Tetracycline unter NH3- und H2O-Abspaltung fragmentieren (Zurhelle 2000 und 2000a).
Außerdem sollten die Retentionszeiten denen der anderen Tetracycline ähneln. Auf Grund
einer Polaritätszunahme beim Oxy-TC im Vergleich mit dem TC müsste sich zum Beispiel
die Retention zu kürzeren Zeiten verschieben, welches in der Abb.41 zu sehen ist. Die
mit dem zugehörigen Kalkulationsprogramm des FTICR-MS-Gerätes kalkulierten exakten
Massen der möglichen Metabolite von CTC sind in der Tabelle 20 aufgelistet.
86
Tab. 20: Berechnete exakte Massen der Metabolite von CTC
Verbindung Abkürzung Summenformel
m/z [M]
Monoisotope
n-masse
m/z [M+H]+
Quasimolekül-
ion
Oxychlortetracyclin Oxy-CTC C22H23ClN2O9 494.1092078 495.1164844
Chlortetracyclin CTC C22H23ClN2O8 478.1142932 479.1215698
Oxytetracyclin Oxy-TC C22H24N2O9 460.1481801 461.1554567
Tetracyclin TC C22H24N2O8 444.1532655 445.1605421
N-Monodesmethyl-
Oxychlortetracyclin
C
21H21ClN2O9 480.0935577 481.1008343
Demeclocyclin DMC C21H21ClN2O8 464.0986431 465.1059197
N-Monodesmethyl-
Chlortetracyclin
N-
Monodesmethyl
-CTC
C21H21ClN2O8 464.0986431 465.1059197
N-Monodesmethyl-
Tetracyclin
C
21H22N2O8 430.1376155 431.1448921
N-Monodesmethyl-
Oxytetracyclin
C
21H22N2O9 446.1325301 447.1398067
N-Didesmethyl-
Oxychlortetracyclin
C
20H19ClN2O9 466.0779077 467.0851843
N-Monodesmethyl-
Demeclocyclin
C
20H19ClN2O8 450.0829931 451.0902697
N-Didesmethyl-
Chlortetracyclin
N-Didesmethyl-
CTC
C20H19ClN2O8 450.0829931 451.0902697
N-Didesmethyl-
Oxytetracyclin
C
20H20N2O9 432.1168800 433.1241566
N-Didesmethyl-
Tetracyclin
C
20H20N2O8 416.1219654 417.1292420
N-Didesmethyl-
Demeclocyclin
C
19H17ClN2O8 436.0673430 437.0746196
Die exakten Massen der Verbindungen (Monoisotopenpeak) sind berechnet worden mit
dem jeweils häufigsten Isotop der beteiligten Elemente, im Unterschied zu mittleren
Molmassen, die unter Berücksichtigung der natürlichen Isotopenverteilung der Elemente
berechnet werden.
87
9.6.3 Nachgewiesene Metabolite von CTC
Die Ergebnisse werden im ersten Teil dieses Kapitels anhand einer Wurzelprobe von
Weizen exemplarisch im Detail dargestellt. Im nächsten Abschnitt findet sich dann eine
Übersicht über die Ergebnisse aller untersuchten Proben auf Metabolite.
9.6.3.1 Nachweis von Metaboliten in Wurzeln des Winterweizen
Eine Winterweizen-Wurzel Probe, nach 2 Wochen Wachstum in 5 µmol/L CTC / iso-CTC
haltiger Nährlösung, liefert folgendes Chromatogramm (Abb. 42)
RT: 0.0 - 30.5
0 5 10 15 20 25 30
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
50
100 22.9
11.9 17.0 23.2
12.1 17.5
12.7 23.522.5 25.0
9.5
8.8
2.2 3.7
11.8
12.1
12.3 16.77.2
6.4
22.9
11.9 17.0 23.2
12.1 17.5 23.5
16.4 17.7 24.2 25.5
9.6
11.9
28.7
12.6 27.3
7.3 23.8
13.3
12.1
16.4
12.5 16.6
11.4 13.1 22.3
17.6 26.5
NL: 7.37E6
TIC F: FTMS + p ESI Full ms [
400.00-550.00] MS 060921-10
NL: 1.76E4
m/z= 495.10905-495.12391 F:
FTMS + p ESI Full ms [
400.00-550.00] MS 060921-10
NL: 3.97E6
m/z= 479.11438-479.12876 F:
FTMS + p ESI Full ms [
400.00-550.00] MS 060921-10
NL: 4.76E4
m/z= 445.15386-445.16722 F:
FTMS + p ESI Full ms [
400.00-550.00] MS 060921-10
NL: 1.45E5
m/z= 465.09894-465.11290 F:
FTMS + p ESI Full ms [
400.00-550.00] MS 060921-10
Oxy-CTC
e-iso-CTC
TC
N-Monodesmethyl-
CTC
e-TC
iso-CTC
CTC
e-DMC
DMC
e-Oxy-CTC
Abb. 42: MS-Total-Ionenstrom-Chromatogramm TIC (oben) und Massenspuren einer
Winterweizen-Wurzel-Probe nach 2 Wochen Wachstum auf Hydrokultur (5 µmol/l
CTC/ iso-CTC in der Nährlösung), FTICR-MS
Für jeden einzelnen Peak lassen sich die gemessenen exakten Massen (hochauflösend)
mit den berechneten Massen vergleichen. Die erhaltenen Massenspuren sind in der
nachfolgenden Abbildung 43 exemplarisch für Demeclocyclin dargestellt.
88
Abb.43: Vergleich des gemessenen Massenspektrums einer Winterweizen-Wurzel-Probe
(vgl. Abb. 42) bei 12,1 – 12,65 min (oben) mit dem berechneten Massenspektrum
von e-DMC mit m/z = 465,010592 (unten)
Für jeden Peak aus dem Chromatogramm lassen sich die gemessen exakten
monoisotopischen Massen der Fragmente mit den berechneten Werten vergleichen. Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 21 zusammengefasst.
89
Tab. 21: Vergleich der gemessenen und berechneten m/z-Werte der Vorläuferionen (MS1),
und Produkt-Ionen (des jeweils intensivsten Vorläuferions) von CTC und ausgewählten
Metaboliten der WW-Probe (vgl.Abb.42), (^hochauflösendes MS, *niedrigauflösendes MS)
Verbindung
^MS1
m/z [M+H]+
berechnet
gemessen
Ab-
weich
-ung
[ppm]
*MS2
m/z [M-NH3+H]+
gemessen
*MS3
m/z [M-NH3-
H2O+H]+
gemessen
tR
[min]
CTC 479,12157
479,12167
0,1 462,0 (100%)
444,1 ( 40%)
444,1 22,9
iso-CTC 479,12157
479,12124
0,33 462,1 (100%) 444,1 17,0
e-iso-CTC 479,12157
479,12134
0,23 462,0 (100%) 444,1 11,9
TC 445,16054
445,16040
0,14 428,1 (100%)
410,1 ( 30%)
410,1 11,9
e-TC 445,16054
445,16030
0,24 427,1 (100%)
410,2 ( 30%)
410,2 9,6
Oxy-CTC 495,11648
495,11667
0,19 478,1 (100%)
477,2 ( 80%)
460,2 11,8
e-Oxy-CTC 495,11667
495,11667
0 478,1 (100%)
477,2 ( 80%)
460,2 7,2
DMC 465,10592
465,10602
0,1 448,1 (100%) 430,0 16,4
e-DMC 465,10592
465,10509
0,83 448,1 (100%) 430,0 12,1
N-
Monodesmethyl
-CTC
465,10592
465,10494
0,98
448,1 (100%)
430,0 11,4
Die im Chromatogramm (Abb. 42) angegebenen Verbindungen CTC, e-iso-CTC, iso-CTC,
e-TC, TC, DMC und e-DMC konnten über die MS-Spektren und den Vergleich mit den
Standards identifiziert werden. Für Oxy-CTC und N-Monodesmethyl-CTC belegen die
niedrigeren Retentionszeiten eine Polaritätszunahme im Vergleich zu CTC und DMC.
Daraus und aus den charakteristischen Fragmentierungen (Verlust von NH3 und Verlust
von Wasser aus dem [M+H]+) kann angenommen werden, dass es sich mit hoher
Wahrscheinlichkeit um die angegebenen Verbindungen handelt. Eine weitere Absicherung
der Identifizierung ist über den Vergleich der berechneten exakten Massen mit den
90
gemessenen Massen im hochauflösenden FTICR-MS möglich. Laut Hayen (2006) läßt
eine Massenabweichung zwischen berechneter und gemessener Masse von ≤ 2ppm eine
eindeutige Identifizierung der Substanz zu. Die in der Tabelle 21 angegebenen
Substanzen sind somit als Metabolite von CTC in Weizenwurzeln sicher identifiziert.
Zur Unterscheidung der exakt massengleichen Verbindungen Demeclocyclin und N-
Monodesmethyl-Chlortetracyclin wurden die MSn-Spektren der jeweils intensivsten
Vorläuferionen bis zu den MS4 Experimenten miteinander verglichen. Die FTICR-MSn-
Spektren unterscheiden sich erstmals im MS4 -Scan(vgl. Abb.44).
Abb.44: Vergleich der gemessenen Fragmentspektren MS4 der WW-Wurzel-Probe (Abb.
42) bei 11,4 min und 12,1 min zur Unterscheidung von N-Monodesmethyl-CTC
(oben) und e-DMC (unten). Die Fragmentierungen entsprechen einem Verlust von
NH3 (MS2; m/z 465 nach m/z 448) und einer Abspaltung von H2O (MS3; m/z 448
nach m/z 430)
91
Für Demeclocyclin tritt im MS4-Scan ein Fragment mit m/z 154,0 auf, während für N-
Monodesmethyl-CTC m/z 140 auftritt. Eine Vermutung, wie diese Fragmente gebildet
werden liefert die Abbildung 45. Nach der Wasser- und Ammoniakabspaltung liefern die
gestoßenen Molekülionen unterschiedliche Fragmente.
Abb. 45: Vorgeschlagene hypothetische Bildung der Fragmente mit m/z 140,0 und m/z
154,0 im MS4 zur Unterscheidung von Demeclocyclin und N-Monodesmethyl-CTC
(nach H. Hayen, ISAS)
Bei den angegebenen Fragmenten handelt es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit um die
Fragmente mit den Summenformeln C7H8O3N und C6H6O3N, weil die berechneten
Isotopenpeaks mit den gemessenen sehr gut übereinstimmen (Abb.46).
Bei einer Retentionszeit von 11,3 min wird im MS4 das Fragment m/z 140,0 registriert
(Abb. 44). Bei dem gleichen Peak taucht auch das Fragment m/z 154,0 auf, jedoch in
erheblich geringerer Intensität. Mit hoher Wahrscheinlichkeit lässt sich daraus auf die
Anwesenheit von N-Desmethyl-CTC schließen. Vermutlich koeluiert es mit einem DMC-
Epimer und anderen Matrixbestandteilen, weil noch weitere Peaks auftreten.
92
gemessen
berechnet
Abb.46: MS4 Spektren einer Weizen-Wurzel-Probe (m/z 465 auf 448 auf m/z 430); links
Fragment 154 Summenformel C7H8O3N, rechts Fragment m/z 140 Summenformel
C6H6O3N, oben gemessene, unten berechnete Fragmentspektren, zur Unterscheidung von
DMC und N-Monodesmethyl-CTC (vgl. Abb. 44 und 45)
Das Chromatogramm (Abb. 42) liefert anhand der Peakintensitäten bzw. Flächen auch
eine Einschätzung der Quantität der auftretenden Metabolite. Die der Nährlösung
zugegebenen Chlortetracyclin-Verbindungen (CTC und iso-CTC) wurden in den Wurzeln
von Weizen am intensivsten nachgewiesen. Die Peakintensitäten der auftretenden
Metabolite folgen der Reihe:
CTC / iso-CTC >>> DMC > TC > Oxy-CTC
93
9.6.3.2 Nachgewiesene Metabolite in ausgewählten Pflanzenproben
Eine Zusammenstellung der Ergebnisse von Proben, die auf Metabolite untersucht worden
sind, zeigt die Tabelle 22.
Tab. 22: Ergebnisse der Analyse auf Metabolite von CTC in Pflanzenproben
- negativer Befund
+ positiver Befund niedrig auflösende LC/MS2; ++ Bestätigung hochauflösende MS
Pflanze /
Probe
Interne
Proben-
Bez.
Einwaage[g] -
Antibiotika /
Konz. In
Nährlösung
Identifizierte (qualitativ
nachgewiesene) Antibiotika und
Metabolite
CTC/
iso-
CTC
Oxy-
CTC
Demethylierte
CTC`s TC
Möhre Rübe,
RR MD1 5 - CTC/iso-CTC
10µmol/L + + - -
Möhre Rübe,
RR MD2 5 - CTC/iso-CTC
10µmol/L + + - -
Möhre Rübe,
RR MD3 5 - CTC/iso-CTC
10µmol/L + + - -
Möhre Rübe,
RR MD4 5 - CTC/iso-CTC
10µmol/L + + - -
Möhre Rübe,
PM MD5 4,40 - CTC/iso-
CTC 10µmol/L + + - -
Möhre Rübe,
RR MD6 5 - CTC/iso-CTC
5µmol/L + + +
DMC -
Möhre Rübe,
PM MD7 5 - CTC/iso-CTC
5µmol/L + + - -
WW, jüngere
Blätter BD1 4,35 - CTC/iso-
CTC 5µmol/L + + - -
WW, ältere
Blätter BD2 4,20 - CTC/iso-
CTC 5µmol/L + + - -
WW,,jüngere
Blätter WD1 2,88 - CTC/iso-
CTC 10µmol/L + - + -
WW,,jüngere
Blätter WD2 2,78 - CTC/iso-
CTC 10µmol/L + - + -
WW, Halm
Blatt WD4 1,83 - CTC/iso-
CTC 10µmol/L + - + -
WW
Wurzel WD5 4,04 - CTC/iso-
CTC 5µmol/L
+
++
+
++
+
DMC ++
+
++
WW
Wurzel WD6 4,27 - CTC/iso-
CTC 10µmol/L
+
++
+
++
+
DMC
+
++
WW,
Halm WD10 5 - CTC/iso-CTC
5µmol/L
+
++
+
++
+
++ DMC ++
WW,
Halm WD11 5 - CTC/iso-CTC
10 µmol/L + + +
DMC +
WW,
Blatt/Stängel WD12 5 - CTC/iso-CTC
5µmol/L + + +
DMC +
WW,
Blatt/Stängel WD13 5 - CTC/iso-CTC
10µmol/L + + - +
94
In Wurzel-, Blatt- oder Halmproben von Winterweizen aus Hydrokultur werden die
folgenden Metabolite gefunden: Demethylierte (Demeclocyclin und andere), oxidierte und
dehalogenierte Chlortetracycline. In Wurzelproben konnten alle Metabolite im Fullscan-
Modus nachgewiesen werden, während die Konzentrationen der Metabolite in den
Blattproben geringer waren, und nur im Single Reaction Modus (srm) sicher nachweisbar
waren (LC/MS2 niedrig auflösend).
In Möhren konnten Chlortetracycline und oxidierte Chlortetracycline nachgewiesen
werden. Es fanden sich in einer Probe Hinweise auf demethylierte Chlortetracycline. In
allen anderen Möhrenproben konnten keine Demethylierungsprodukte und auch keine
dehalogenierten Produkte nachgewiesen werden.
Um zu prüfen, ob die nachgewiesenen Metabolite tatsächlich in der Pflanze und nicht in
der Nährlösung entstanden sind, wurden zwei Proben von unterschiedlichen
Nährlösungen (nach zwei Tagen Kulturzeit und 5 bzw. 10µmol/L CTC/iso-CTC in der
Nährlösung) auf Metabolite analysiert. Es konnten sowohl im Fullscan als auch im
empfindlicheren srm-Modus keine Metabolite nachgewiesen werden.
9.6.3.3 Metabolite in Pflanzen aus einem Freilandversuch
Die Metabolitensuche wurde auch auf ausgewählte Proben aus dem Freiland des
Modellversuchs „Antiinfektivaeinträge aus der Tierproduktion in terrestrische und
aquatische Kompartimente“ angewendet. Es wurden zwei Feldproben von Feld 2, was
zweifach mit Gülle gedüngt worden war, analysiert. Dabei wurden in beiden Proben
Tetracyclin und demethylierte Chlortetracycline nachgewiesen. Tetracyclin konnte
eindeutig identifiziert werden (hochauflösende MS). DMC konnte über den Vergleich mit
dem Standard im niedrig auflösenden LC-MS2 identifiziert werden. Es traten noch weitere
Peaks in derselben Massenspur auf. Es könnte sich dabei um N-Monodesmethyl-CTC
handeln. Die Retentionszeit lag bei 4,5 min. Damit zeigt sich, dass die Verbindung deutlich
polarer ist, was auf dieser analytischen Säule zu kürzeren Retentionszeiten führt. Mit dem
FTICR-MS konnten die demethylierten Produkte von CTC in den Feldpflanzen jedoch
nicht eindeutig nachgewiesen werden, so dass eine letzte Bestätigung hier ausbleibt.
In der Literatur finden sich nur sehr wenige Arbeiten zum Thema „Metabolite von
Antibiotika in Pflanzen“. Die Aufnahme von CTC wirkt sich zum Beispiel auf Mais und
95
Bohnen auf Grund des Metabolismus von CTC in den Pflanzen sehr unterschiedlich aus
(Farkas et al. 2007). Mais-Pflanzen können das CTC über ein gebildetes CTC-
Gluthathion-Konjugat entgiften, während CTC auf die Bohnen (Pinto-beans) phytotoxisch
wirkt, so die Autoren.
9.6.4 Zusammenfassung der Untersuchungsergebnisse auf Metabolite
Die Analysen mit Hilfe der niedrigauflösenden LC- und der hochauflösenden FTICR-MS
zeigen, dass in den untersuchten Weizen- und Möhren-Pflanzen tatsächlich Metabolite
aus Oxidation, Demethylierung und Dehalogenierung aus Chlortetracyclin entstehen.
Insbesondere das Auftreten des Demeclocyclin als Metabolit ist zu beachten.
Demeclocyclin wurde früher auch als Wirkstoff in der Humanmedizin eingesetzt, jedoch
darf es aufgrund seiner Toxikologie heute als Wirkstoff nur noch in speziellen Präparaten
eingesetzt werden. Als Tierarzneiwirkstoff ist Demeclocyclin nicht zugelassen. In weiteren
Projekten der Arbeitsgruppe von Prof. Grote wurden auf Grund dieser Ergebnisse auch
nach Demeclocyclin und weiteren Metaboliten in Getreideproben gesucht. In dem
„Screening Projekt“ wurden positive Befunde von Tetracyclinen (CTC, iso-CTC, DMC, DC)
auch in Getreide von Feldpflanzen, die unter landwirtschaftlich üblicher Praxis wuchsen,
gefunden (Freitag et al. 2008).
96
10 Zusammenfassung
Erhebliche Mengen von Antibiotika gelangen nach veterinärmedizinischer Anwendung
über den Austrag von Gülle auf landwirtschaftliche Nutzflächen. Werden diese Antibiotika
von Nutzpflanzen aufgenommen? Entstehen in den Pflanzen für den Menschen
gefährliche Metabolite? Und könnten diese Antibiotika und Metabolite somit in die
pflanzliche Nahrungskette gelangen? In der vorliegenden Arbeit werden diese Fragen am
Beispiel von Feldsalat, Winterweizen und Möhren behandelt.
Die Aufgabenstellung dieser Arbeit lautete im Einzelnen:
1. Kontrollierte Anzucht und Entwicklung von Weizen, Feldsalat und Möhren in
Hydrokultur. Dabei sollten die Pflanzen in der Nährlösung verschiedenen
Konzentrationen an Antibiotika ausgesetzt werden.
2. Entwicklung einer LC-MS/MS-basierten Methode zum Nachweis von Antibiotika
in den Nutzpflanzen.
3. Nachweis und Bestimmung von Antibiotika-Gehalten in den Pflanzen anhand
der entwickelten Methode.
4. Aufnahmeexperimente in Hydrokultur mit radioaktiv markierten Antibiotika.
5. Identifizierung von Metaboliten, die in den Pflanzen aus den Antibiotika gebildet
werden, mit Hilfe der entwickelten LC-MS-Methode.
Im ersten Schritt wurden Pflanzen kontrolliert angezogen und anschließend auf
Hydrokultur umgesetzt. Den Nährlösungen wurden verschiedene Tritium-markierte oder
nicht-markierte Antibiotika zugesetzt. Nach ein bis dreiwöchigem Wuchs auf den dotierten
Nährlösungen wurden Pflanzenproben genommen und dann jeweils analysiert.
Die durchgeführten Tracerstudien und mikroautoradiographischen Untersuchungen mit
Tritium-markiertem ³H-Tetracylin und ³H-Sulfamethazin zeigen, dass in Hydrokultur
Feldsalat und Winterweizen Antibiotika über die Wurzel aufnehmen und in der Pflanze
transportieren. Das Sulfonamid wird von beiden Pflanzen in geringerem Maß
aufgenommen als die (Chlor-) Tetracycline. Die Antibiotikagehalte in verschiedenen
Pflanzenteilen (zum Beispiel Wurzeln und Blätter) unterscheiden sich bei den
untersuchten Pflanzenarten erheblich voneinander. Die mikroautoradiographischen
Untersuchungen an Wurzelquerschnitten von Weizenpflanzen lassen deutlich die
Haupteinlagerungsorte der Antibiotika im Apoplast der Rhizodermis und der ersten
97
Rindenlage erkennen. Auch im Mesophyll der Blätter zeigen sich apoplastische
Einlagerungen.
Es wurde eine LC-MS basierte Methode zum Nachweis von Antibiotika und ihren
Metaboliten in pflanzlichen Proben entwickelt. Die entwickelte Methode basiert auf
ultraschallunterstützter Extraktion der zerkleinerten Pflanzenprobe mit anschließender
Festphasenextraktion und der Bestimmung der Analyten mit flüssigchromatographischer
Trennung und massenspektrometrischer Detektion. Mit der Methode gelang es,
Sulfadiazin (SFD) und Chlortetracyclin (CTC), sowie die Epi- und Isomere von CTC, in
pflanzlichen Proben nachzuweisen und zu quantifizieren.
Als Ergebnis der Analyse in Hydrokultur gewachsener Pflanzen mit der LC-MS Methode
kann folgendes festgestellt werden:
• Über die Wurzeln von Feldsalat, Möhren und Weizen werden Sulfadiazin,
Chlortetracyclin und iso-Chlortetracyclin aufgenommen.
• CTC und iso-CTC werden in höherer Menge aufgenommen als SFD.
• Der Transport der drei Wirkstoffe in der Pflanze ist abhängig von der Pflanzenart.
Während für Feldsalat und Weizen Antibiotika auch in den Blättern nachweisbar
sind, wurden in den Blättern von Möhren kein Sulfadiazin gefunden.
• Chlortetracyclin und iso-Chlortetracyclin wird in allen drei Nutzpflanzen gefunden.
Die in allen Pflanzen gefundenen niedrigeren Sulfadiazin-Gehalte sind möglicherweise
auch auf eine verminderte Nachweisempfindlichkeit von SFD in pflanzlichen Proben
zurückzuführen. In der Ionenquelle des Massenspektrometers wird die SFD-Ionenbildung
durch Matrixbestandteile stark unterdrückt. Die SFD-Bestimmung über eine
Standardaddition wurde an einigen ausgewählten Proben angewendet und und lieferte
höhere Gehalte an SFD als mit der Auswertung über die externe Kalibrierung.
Auch eine stärkere Bindung von SFD an Zellwandkomponenten im Aufnahmebereich der
Wurzeln hat einen geringeren SFD-Transport in der Pflanze zur Folge und führt damit zu
niedrigeren Gesamtkonzentrationen im Pflanzenmaterial.
Die entwickelte LC-MS-Methode wurde auch bereits für die Bestimmung von Antibiotika in
Feldpflanzen genutzt, die unter praxisnahen Bedingungen im Freiland wuchsen (vgl. auch
Projekt „Antiinfektiva-Einträge aus der Tierhaltung in aquatische und terrestrische
Kompartimente“). Insgesamt zeigten sich dabei mit der entwickelten Methode ähnliche
Befunde wie bei Pflanzen, die unter Laborbedingungen aufwuchsen (Grote et al. 2005):
98
• Feldsalat und Weizen nehmen über die Wurzel Sulfadiazin und Chlortetracyclin aus
mit güllebeaufschlagtem Boden auf.
• Sulfadiazin wird im Vergleich mit CTC in geringerem Maß aufgenommen.
Tendenziell stimmen die Ergebnisse der Aufnahmeversuche mit markierten Antibiotika mit
den rückstandsanalytischen Daten der in Hydrokultur mit unmarkierten Antibiotika-
Dotierungen gewachsenen Nutzpflanzen überein. Vergleichbare Befunde wurden auch
aus den untersuchten Pflanzen, die auf gülle-beaufschlagten Versuchsfeldern gewachsen
waren, erhalten (Grote et al. 2006). Des weiteren konnte nachgewiesen werden, dass
nach längerem Kontakt zu antibiotikahaltiger Nährlösung sowie mit höherem CTC Angebot
in der Nährlösung auch die CTC-Gehalte in Wurzeln und Blättern von Feldsalat und
Weizen ansteigen. Bei Möhren stagniert der CTC-Gehalt mit längerer Wachstumszeit auf
dotierter Nährlösung bzw. nimmt er sogar ab. Möglicherweise wird das aufgenommene
CTC in der Pflanze metabolisiert, oder in nicht extrahierbare Zellwandkomponenten
eingelagert, was in weiteren Projekten untersucht werden könnte.
Als viertes sollte untersucht werden, ob Metabolite von Chlortetracyclin in den
untersuchten Pflanzen nachgewiesen werden können. Dazu wurden zusätzlich mit der
entwickelten LC-MS-Methode auch an einem hochauflösenden Massenspektrometer
(FTICR-MS) Untersuchungen durchgeführt. Es konnten in den Hydrokultur-Pflanzen
extrahierbare Metabolite von Chlortetracyclin nachgewiesen werden. Dabei handelt es
sich um oxidierte, demethylierte und dehalogenierte Produkte des Chlortetracyclins. Je
nach Pflanzenart treten unterschiedliche Metabolite auf.
Insbesondere das nach Demethylierung entstehende Demeclocyclin (DMC) ist
toxikologisch relevant. Als Konsequenz dieser Ergebnisse wurde in einem „Screening-
Projekt“ (Grote 2007b), in dem Getreide aus der konventionellen Landwirtschaft in
viehstarken Gebieten beprobt wurde, auch Demeclocyclin in das Analysenprogramm mit
aufgenommen und in einigen Proben auch nachgewiesen. Da DMC nicht mehr
zugelassen ist, wird appliziertes CTC, das im Boden oder Pflanze metabolisiert wurde, als
DMC-Quelle vermutet (Freitag et al. 2008).
Ein Transfer von antibiotisch wirksamen Stoffen über pflanzliche Nahrungs- umd
Futtermittel zum Mensch und zum Tier ist somit grundsätzlich möglich. Weitere
Untersuchungen sind notwendig, um die tatsächliche Belastungssituation von Getreide
und anderen Nutzpflanzen zu erfassen und eine Risikobewertung durchführen zu können.
99
11 Experimenteller Teil
11.1 Verwendete Geräte und Chemikalien
Anzucht der Pflanzen
Geräte / Sonstiges Chemikalien
Hydrokultur
Kunststoff-Siebe mit einem
Innendurchmesser von 15 bis 17cm
Hoagland-Nährlösung (lt. Anhang) und
Hoagland-Nährlösung pH6 (lt. Anhang)
Kunststoff-Töpfe passend zu den
Sieben, Curver, Volumen 2,5L, ID
17cm
Sulfadiazin (SFD), Heumann,
Germany
Filterpapier, Schleicher und Schüll
300105, d=150mm, Weisband
Sulfadiazin-Stammlösung I mit 2,25
g/L SFD, pH 8,5 (lt. Anhang)
Blumenkästen [60 cm x 14 cm x 15 cm
(B/H/T)], Ebert Gartendesign Anr.7760
Sulfadiazin-Stammlösung II mit 1,125
g/L SFD, pH 8,5 (lt. Anhang)
Aquarium-Durchlüfter Elite 800 A-
10033
Chlortetracyclin (CTC), Acros 26824
Silikon-Schläuche (Innendurchmesser
von 4 mm)
Isochlortetracyclin (iso-CTC), Acros
26821
Pflanzenwuchsschrank VB1514,
Vötsch
Chlortetracyclin-Stammlösung mit
1,372 g/L CTC entspricht 2,86 mmol/L
CTC (lt. Anhang)
Anzuchtschalen, Werga (30cm x 50
cm)
Chlortetracyclin / Isochlortetracyclin
Stammlösung mit 8,68 mmol/L CTC
und 8,46 mmol/L iso-CTC (lt. Anhang)
Styroporplatten ( 60cm x 14cm x
18mm)
Tween 80, zur Synthese, Merck
8.22187
Schaumstoff-Streifen, PU, 1,5cm x
15cm
Wasserstoffperoxid 35% (w/w), Merck
1.08600
Blumenkästen [60cm x 14cm x 15cm
(L/B/T)], Ebert Gartendesign Anr.7760
Feldsalat-Samen, Sorte „Vit.g.S.“
Blumentöpfe, TEKU Container 20 cm
100
(d = 20 cm, Höhe = 19 cm)
Styroporplatten d =22 cm mit Löchern
Möhren-Samen, Sorten: „Rote Riesen“
(RR), „Pariser Markt“ (PM)
Anzuchterde, Floragard: Kräuter- und
Aussaaterde
Haushalts-Klarsichtfrischhalte-Folie
Tracer-Versuche
Aussaatschalen (3,5)-³H-Sulfamethazin,Moravec, USA
Blumenerde (7)-³H-Tetracyclin Moravec, USA
Weizen-Körner, Sorte Drifter Quicksafe A
Feldsalatsamen, Sorte Vit g.S. Biolute S
Probennahme
Geräte Chemikalien
Messer Flüssiger Stickstoff
Holz-Brettchen
Falcons-Kunststoffzentrifugengefäße,
Merck
Mörser und Pistill
Waage
Dewar-Gefäße
Aufarbeitung
Geräte Chemikalien
Zentrifuge, Zentrifugengläser Citratpuffer-Lösung (lt. Anhang)
Pipetten Methanol
Ultraschallbad, Rotifix 32, Hettich Methanol / Wasser ( 5% / 95%, v/v)
Waters Oasis HLB 3cc (60mg)
Festphasenkartusche
Glaswatte, reinst, silanisiert, SERVA
22367
Absaugeinheit für Kartuschen Acetonitril
101
11.1.4 Analyse
HPLC-System (Spectra):
Degasser: SCM 1000 Vakuum Membrane Degasser
Pumpe: P 4000 Gradient Pumpe
Injektionseinheit: AS 3000, Autosampler gekühlt (10°C) mit integriertem
Säulenofen (temperiert auf 30°C)
Trennsäule: Synergie 4µ Hydro-RP, 250 x 2,0 mm, Phenomenex oder
YMC-Pack ODS-AM, 150 x 3,0 i.d., S 5µm
UV-Detektor: UV 6000 LP
Messbereich: 190 – 800 nm
Detektionswellenlänge: 267 nm
Injektionsvolumen: 20 µL
Bei der HPLC wurden je nach zu bestimmenden Antibiotikum verschiedene
Gradientenprogramme verwendet (Abb. 47 und Abb. 48). Wurden SFD und CTC in einem
Lauf bestimmt wurde der „CTC-Gradient“ verwendet.
Flussrate: 0,4 mL/min
Laufmittel: A: Acetonitril / Wasser / Ameisensäure 10/89,9/0,1 % (v/v/v)
B: Acetonitril / Wasser / Ameisensäure 59,9/40/0,1 % (v/v/v)
0
20
40
60
80
100
0 1 5 9 11 13 20 min
%
Laufmittel A Laufmittel B
Abb. 47: Gradientenprogramm für die SFD-Bestimmung, „SFD-Gradient“
102
0
20
40
60
80
100
0 1,5 10 17 21 24 35 min
%
Laufmittel A Laufmittel B
Abb.48: Gradientenprogramm für die Bestimmung von CTC / iso-CTC, „CTC-Gradient“
LTQ-Advantage Ion-Trap (Thermo Electron): Ionisierungsmethode: ESI+ Electro-Spray-
Ionisation, positiv Mode [M+H]+ Bestätigung durch MS/MS-Stoßexperimente mit He,
Vorläufer- und Produkt-Ionen.
Geräteparameter:
Tune-Page-Parameter:
Mass Range: 80-2000[m/z]
Sheat Gas Flow Rate 47 [arb]
Auxillary Gas Flow Rate: 0 [arb]
Ion Spray Voltage: 5 [kV]
Capillary Temperature: 250 [°C]
Capillary Voltage: 9 [V]
Tube Lens Offset: -5.0 [V]
Multipole 1 Offset: -1.5 [V]
Lens Voltage: -32 [V]
Multipole 2 Offset: -5.5 [V]
LTQ FTICR-Fourier- Transformations- Ionen- Cyclotron- Resonance- Hybrid-
Massenspektrometer (Thermo Electron)
ISAS –Institute for Analytical Sciences- Dortmund
HPLC-System
Degasser: Surveyor Entgaser
Pumpe: Surveyor MS Pumpe
103
Injektionsautomat: Surveyor Autosampler
Trennsäule: YMC-Pack ODS-AM, 150 x 1,0 mm ID, S=5µm
Vorsäule: YMC-Pack ODS-AM, 10 x 1,0 mm ID, S=5µm
Injektionsvolumen: 5µL
Flussrate: 0,1mL/min
Fliessmittel: A : Wasser / Acetonitril / Ameisensäure 95/5/0,1 (v/v/v)
B : Acetonitril / Ameisensäure 100/0,1 (v/v)
Gradientenprogramm:
Zeit [min] Fließmittel A [%] Fließmittel B [%]
0,01 100 0
2 100 0
45 70 30
50 5 95
60 5 95
FTICR-MS:
Ionisierungsmethode: ESI, positiv Mode [M+H]+ und MSn Experimente
Spray Voltage: 3.8 [kV]
Sheath Gas Flow Rate: 38 [arb]
Auxiliary Gas Flow Rate: 4 [arb]
Sweep Gas Flow Rate: 2 [arb]
Ionen Transfer Tube Temperature: 300°C
Collision Energy: 25%
kombiniert mit einem 7.0 Tesla supraleitfähigem Magneten wurde eingesetzt um
ausgewählte Proben auf Metabolite zu untersuchen. Diese Versuche wurden am ISAS in
Dortmund durchgeführt und die Methode war ähnlich zu der beschrieben von Olsen et al.
(2004).
104
11.2 Durchführung
11.2.1 Anzucht von Nutzpflanzen auf Hydrokultur mit unmarkierten
Arzneistoff-dotierten Nährlösungen (BfEL, Detmold)
Winterweizen
Entkeimung und Entwicklung
Um die Oberfläche der Weizenkörner (Sorte Drifter) zu entkeimen, werden die eine Stunde
in Wasser vorgequellten Weizenkörner nacheinander mit
• 0,1 %iger wässriger Tween 80 Lösung (w/w),
• 0,5 %iger wässriger Natriumhypochlorit-Lösung (w/w),
• 0,75 %iger wässriger Wasserstoffperoxid Lösung (w/w) behandelt.
Zwischen den einzelnen Schritten werden die Körner jeweils 2 mal mit destilliertem
Wasser gespült. Die so behandelten Weizenkörner werden noch eine Nacht in
destilliertem Wasser gequollen.
Die Samen werden anschließend auf feuchtes Filterpapier ausgelegt und zum Auskeimen
über das Wochenende im Dunkeln stehen gelassen. Das Filterpapier liegt in einem Sieb,
welches auf einem Kunststoffbehälter plaziert ist. Der Kunststoffbehälter ist mit Wasser so
befüllt, dass der Siebboden die Wasseroberfläche erreicht und damit das Filterpapier
feucht gehalten wird (1.-3.Tag).
Nach dem Keimen werden die Keimlinge auf Siebe ohne Filterpapier überführt, wobei
mindestens zwei Wurzeln eines Keimlinges durch die Siebbodenlöcher die Lösung in dem
Kunststoffbehälter erreichen.
Jeweils 3 Siebe werden in einen konventionellen Blumenkasten gesetzt (vgl. Abb. 11). In
den Kasten werden 4,5 L Hoagland-Nährlösung gegeben, so dass die Wurzeln in der
Flüssigkeit hängen der Siebboden aber trocken bleibt, um Schimmelbildung zu
minimieren. Eine Pumpe sorgt über einen Silikon-Schlauch durch einen gleichmäßigen
Luftstrom für die Durchmischung und Belüftung der Nährlösung.
Die Kästen mit den Sieben werden in einen Pflanzenwuchsschrank (Phytotron VB1514)
gestellt, wobei nicht durch Siebfläche bedeckte Kastenoberfläche mit Aluminiumfolie
abgedeckt wird (Abdunkeln der Nährlösung um Algenbildung zu minimieren). Die Pflanzen
wachsen anschließend unter folgendem Wachstumsprogramm:
105
Tab. 23 Phytotronbedingungen für die Weizen-Anzucht
Zeit Temperatur
[°C]
relative
Feuchte [%]
Bestrahlungs-
stärke [%]
00:00 16 55 0
05:30 18 55 30
06:00 22 65 70
22:00 18 55 30
22:30 16 55 0
Der Wuchs der Pflanzen wird täglich kontrolliert und das Gewicht notiert. Eventuell
fehlende Nährlösung wird bis zur 4,5 L Marke des Blumenkastens aufgefüllt.
Verschimmelte Pflanzenteile oder ganze Pflanzen werden entfernt. Die Nährlösung wird
montags, mittwochs und freitags durch frisch angesetzte Hoagland-Lösung ersetzt. An
diesen Tagen werden die Blumenkästen nach einem bestimmten Schema innerhalb des
Phytotrons umgestellt (Rotation). Ungleichmäßige Wachstumsbedingungen innerhalb des
Wachstumsschrankes werden durch diese Maßnahme ausgeglichen.
Zudotierung der Arzneistoffe
Am 13. Tag werden die Hoagland-Lösungen durch Zugabe von Antibiotikum-Stammlösung
(lt. Anhang A1) dotiert (siehe Tabelle).
Tab.24: Antibiotika-Zusätze in die Nährlösung bei der Weizen-Anzucht
Antibiotikum Zusatz an Stammlösung Konzentration in Nährlösung
5 mL SFD-Stammlsg I 2,5 mg/L = 10 µmol/L
10 mL SFD-Stammlsg I 5 mg/L = 20 µmol/L
15 mL SFD-Stammlsg I 7,5 mg/L = 30 µmol/L
SFD in
4,5 L Nährlösung
20 mL SFD-Stammlsg I 10 mg/L = 40 µmol/L
3,8 mL SFD-Stammlsg II 2,5 mg/L = 10 µmol/L SFD in
1,7 L Nährlösung 7,6 mL SFD-Stammlsg II 5 mg/L = 20 µmol/L
3 mL Stammlsg CTC 5 µmol/L CTC in 1,7 L
Nährlsg 3 mL Stammlsg CTC 5 µmol/L (pH 3)
979,2 µL Stammlsg CTC /
iso-CTC
5 µmol/L CTC / 4,9 µmol/L iso-CTC CTC / iso-CTC
in 1,7 L
Nährlösung 1958,4 µL Stammlsg CTC
/ iso-CTC
10 µmol/L CTC / 9,7 µmol/L iso-CTC
106
Die Pflanzen wachsen bis zur Probennahme in dotierter Nährlösung bekannter Antibiotika-
Konzentration, die alle zwei Tage gewechselt wird.
Feldsalat
Aussaat und Keimung
Feldsalat-Samen werden in Anzuchtschalen auf Anzuchterde ausgesät (die Samen
werden nur mit wenig Erde bedeckt, ca. 2mm) und mit Wasser angefeuchtet. Die Haube
der Anzuchtschale wird auf der Schale belassen, so lange bis sich in den meisten
Parzellen Keimblätter zeigen. Danach wird die Haube entfernt und die Erde immer gut
feucht gehalten. Die Keimlinge werden wöchentlich vereinzelt, so dass sich pro Parzelle
eine Pflanze entwickelt.
Die Pflanzen wachsen in dem Phytotron unter folgenden Bedingungen:
Tab.25: Phytotronbedingungen bei der Feldsalat-Anzucht
Zeit Temperatur
[°C]
relative
Feuchte [%]
Bestrahlungs-
stärke [%]
Feldsalat mit Sulfadiazin-Dotierung
00:00 15 55 0
06:00 20 65 65
20:00 15 55 0
Feldsalat mit CTC / iso-CTC -Dotierung
0:00 18 55 0
06:00 22 70 70
22:00 18 55 0
Umsetzen auf Hydrokultur
Nach 35 Tagen werden die Feldsalat Pflanzen aus den Schalen genommen. Die Erde wird
erst trocken abgeschüttelt, anschließend wird sie von den Wurzeln mit Wasser vorsichtig
abgespült. Die Pflanzen werden unterhalb des Blattansatzes mit Schaumstoff umwickelt
und in die Löcher der Styroporplatte gesetzt. Die Wurzeln sollten zum größten Teil in die in
dem Blumenkasten befindliche Hoagland-Nährlösung pH 6 eintauchen, während die
Styroporplatte von der Nährlösung nicht benetzt werden sollte. In die Lösung wird über
einen Silikonschlauch, der ca. 1cm in die Flüssigkeit eintaucht und mit einer Pumpe
verbunden ist, Luft zugeführt.
107
Zudotierung der Arzneistoffe
Nach 4 bis 5 Tagen Akklimatisierung auf Hydrokultur werden die Nährlösungen mit
Antibiotikum dotiert. Alle 2 Tage werden die Nährlösungen gewechselt, wobei konstante
Mengen Antibiotika zugesetzt werden.
Tab.26: Antibiotika-Zusätze in die Nährlösung bei der Feldsalat-Anzucht
Antibiotikum Zusatz an Stammlösung Konzentration in
Nährlösung
SFD in 6 L Nährlösung 13,3 mL SFD-Stammlsg II 10µmol/L SFD
3,5 mL CTC / iso-CTC -
Stammlösung
5 µmol/L CTC / 4,9 µmol/L
iso-CTC
CTC +
iso-CTC in 6 L Nährlösung
7 mL CTC / iso-CTC -
Stammlösung
10 µmol/L CTC / 9,7
µmol/L iso-CTC
Möhren
Aussaat und Keimung
In die Blumentöpfe wird bis ca. 2 cm unter den Rand Anzuchterde gefüllt. Die Möhren-
Samen werden darauf gleichmäßig verteilt und mit Erde bedeckt (ca. 1cm). Die Erde wird
mit Wasser befeuchtet. Die Blumentöpfe werden mit Frischhaltefolie bedeckt und in den
Wachstumsschrank gestellt.
Die weitere Entwicklung erfolgt im Phytotron nach folgendem Programm.
Tab. 27: Bedingungen im Wachstumsschrank bei der Möhren-Anzucht
Zeit Temperatur
[°C]
relative
Feuchte [%]
Bestrahlungs-
stärke [%]
00:00 15 55 0
06:00 20 65 65
20:00 15 55 0
Sobald sich ein Großteil der Keimblätter zeigen, wird die Folie entfernt. Zu dicht stehende
Pflanzen werden von Zeit zu Zeit vereinzelt. Jede einzelne Pflanze benötigt zur optimalen
108
Entwicklung einen etwa fingerdicken Abstand zu der nächsten Pflanze. Die Erde wird
durch Giessen, anfangs von unten, mäßig feucht gehalten.
Weitere Entwicklung
a) In Erde
Ab dem 56.ten Tag werden die Möhren alle 2 Tage mit dotierter Nährlösung gegossen, die
10 µmol Antibiotikum ( 2,5 mg/L SFD) pro Liter enthält. Das Volumen beträgt ca. 1000 mL
alle 2 Tage.
b) Auf Hydrokultur
Nach 50 Tagen werden die Möhren aus der Erde genommen und die Erde gründlich durch
Waschen mit Wasser entfernt. Die Pflanzen werden in eine Styropor-Unterstützung
überführt, welche auf einen Kunststoff-Topf gesetzt wird, so dass die Rübe in die
Nährlösung gelangt. Die Blätter der Pflanzen dürfen keinen Kontakt mit der Nährlösung
haben. Eine Pumpe sorgt über einen gleichmäßigen Luftstrom für die Belüftung der
Nährlösung. Alle zwei Tage wird die Nährlösung gegen frisch angesetzte getauscht.
Zudotierung
Nach 6 Tagen Entwicklung auf Hydrokultur wird der Nährlösung Antibiotikum zugesetzt.
Folgende Konzentrationen wurden durch Zusatz von Stammlösung in der Nährlösung
erhalten.
Tab.28: Antibiotika-Zusatz in die Nährlösung bei der Möhren-Anzucht
Antibiotikum Zusatz an Stammlösung Konzentration in Nährlösung
SFD in 2 L
Nährlösung 4,5 mL SFD-Stammlsg II 10 µmol/L SFD
1,152 mL Stammlsg CTC 5 µmol/L CTC / 4,9 µmol/L
iso-CTC CTC / iso-CTC in
2 L Nährlösung 2,304 mL Stammlsg CTC 10 µmol/L CTC / 9,7 µmol/L
iso-CTC
11.2.2 Anzucht von Nutzpflanzen auf Hydrokultur mit markierten Arzneistoff-
dotierten Nährlösungen (UFT, Bremen)
Feldsalatsamen und Winterweizenkörner (Sorte Drifter) wurden auf konventioneller
Blumenerde unter Klarsichtfolie ausgesät. Die Erde wurde feucht gehalten. Sobald sich die
109
Keimblätter zeigten, wurde die Folie entfernt. Man wartete mehrere Tage, bis sich kleine
Pflanzen entwickelt hatten. Diese wurden der Erde entnommen, die Wurzeln vorsichtig
unter fließendem Wasser abgespült und in ein Glasgefäß mit Nährlösung überführt, so
dass die Wurzeln eintauchten. Jedes Gefäß enthielt 10 mL Hoagland-Nährlösung mit
einem Zusatz an CTC / iso-CTC (5 oder 10 µmol/L) oder SFD (10 oder 20 µmol/L). Die
Chlortetracyclin-haltigen Ansätze wurden zusätzlich mit 740 KBq (7)-3H Tetracyclin, die
Sulfonamid-haltigen mit 740 KBq (3,5)-3H-Sulfamethazine (Moravec Biochemicals, USA)
dotiert.
Nach 7, 14 oder 21-tägiger Wachstumszeit wurden von Feldsalatpflanzen Wurzel- und
Blattproben, von den Weizenpflanzen Wurzel-, Stängel- und Blattproben genommen,
schockgefrostet und lyophilisiert. Bei den 7 Tage-Experimenten erhielten die
Nährlösungen einen doppelten Belastungsimpuls von 40 µCi, welcher in der Auswertung
berücksichtigt wurde.
Eingewogene Pflanzenproben wurden mit 0,5 mL Tissue-solubiliser („Biolute S“) versetzt,
so dass sich das Pflanzengewebe nach mehreren Wochen auflöste. Die erhaltenen
Lösungen wurden mit 3 mL einer Szintillationsmischung („Quicksafe A“) versetzt,
geschüttelt und abermals eine Woche stehengelassen. Danach hatten sich die Proben
stabilisiert und konnten im Flüssig-Szintillationszähler vermessen werden.
Die aufgeführten Antibiotika-Aufnahmen beruhen auf der Auswertung Quenchkorrigierter
Einlagerungsaktivitäten (s. Anhang) unter Verwendung der spezifischen Aktivitäten der
verwendeten ³H-markierten Verbindungen.1
In der folgenden Tabelle 29 sind die Zusätze in der Nährlösung aufgeführt.
1 Die experimentellen Bedingungen bei den Versuchsreihen in Hydrokultur mit markierten und unmarkierten
Antibiotika waren ähnlich, aber nicht identisch:
Im Unterschied zu den Hydrokulturen mit unmarkierten Antibiotika-Zusätzen, konnten bei den
Tracerexperimenten die Nährlösungen nicht alle 2 Tage durch frisch angesetzte, in diesem Fall ³H-TC bzw.
³H-SMZ-haltige Nährlösungen, ausgetauscht werden. Deshalb standen über die Wachstumszeit den
Feldsalat- und Winterweizenpflanzen in beiden Versuchsreihen – trotz gleicher Ausgangskonzentrationen -
nicht identische Mengen an Antibiotika zur Verfügung. Außerdem wurde in einigen Gefäßen der Tracerstudie
Algenwachstum beobachtet, was einen zusätzlichen Einfluss auf die gemessenen Einlagerungsaktivitäten
ausgeübt haben könnte. Daher ist ein Vergleich der in beiden Versuchsreihen ermittelten Antibiotika-
Aufnahmen nur bedingt möglich.
110
Tab.29: Konzentrationen der angegebenen Antibiotika in der Tracer-Nährlösung
Zusatz AB kalt und heiß
Pflanze
Konz. AB kalt Konz. AB heiß
Weizen CTC / iso-CTC ³H-TC
5 oder 10 µmol/L 740 oder 1480 kBq
SFD ³H-SMZ
10 oder 20 µmol/L 740 oder 1480 kBq
Feldsalat CTC / iso-CTC ³H-TC
5 oder 10µmol/L 740 oder 1480 kBq
SFD ³H-SMZ
10 µmol/L 740 oder 1480 kBq
Probennahme und Analyse
Die Pflanzenprobe wird eingewogen und mit 0,5 mL Tissue-solubiliser (Biolute S) versetzt.
Man wartet mehrere Wochen bis sich das Gewebe aufgelöst hat. Dann werden 3 mL
Scintillationslösung (Quicksafe A) zugesetzt, geschüttelt und abermals eine Woche
stehengelassen. Danach hat sich die Probe stabilisiert und kann im Szintillationsmeßgerät
vermessen werden.
Mikroautoradiografie
Zum Versuchsende wurden aus ausgewählten Regionen der Wurzeln, der Stängel und der
Blätter kleine Gewebeproben ausgeschnitten und schlagartig in schmelzendem Stickstoff
(-210°C) eingefroren. Die markierten Proben wurden in einer Hochvakuum-
gefriertrockenanlage (LEIKA EM CFD) nach einem erprobten Schema im Verlauf von 286
Stunden gefriergetrocknet, nach der Trocknung gegebenenfalls zurechtgetrimmt und dann
einer Druckeinbettung mit Kunststoff (Spurr) unterzogen. Nach der Polymerisation des
Kunststoffes wurden am Ultramikrotom trocken Schnitte von ca. 900 nm hergestellt und
auf beschichtete Objektträger geklebt. Bei Dunkelkammerlicht erfolgte dann der Auftrag
der Photoemulsion (lford L4, Gelform, Korngröße 0,11 Mikrometer). Nach sorgfältiger
Trocknung erfolgte die Exposition in lichtdichten Boxen entweder im Kühlschrank bei 4°C
oder in der Tiefkühltruhe bei -22°C .Nach der Exposition von ca. 14 Tagen bis 3 Monaten
wurden die Schnitte mit dem Feinkornentwickler D19 A/S entwickelt. Nach der Fixierung
und Trocknung erfolgte die Auswertung an einem Zeiss Universalmikroskop mit
Fotoeinrichtung.
111
11.2.3 Analyse der Arzneistoffrückstände in Pflanzenproben mit LC-MS
Probennahme
Winterweizen
Nach 7, 14 oder 21 Tagen Zudotierung werden die Pflanzen aus je einem Sieb in Wurzeln
und Halme getrennt. Etwa 1 cm des Bereiches des Wurzel-Halm-Überganges wird
verworfen, um sicherzustellen, daß kein Wurzelmaterial in Halmproben gelangt. Die
Wurzeln werden gründlich mit Wasser gespült und trockengetupft. Das Pflanzenmaterial
wird mit Hilfe eines Messers oder einer Schere in ca. 0,5 cm lange Stücke geschnitten.
Jeweils 5-7g des zerschnittenen Materials werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren
und ebenfalls in flüssigem Stickstoff gemörsert.
Feldsalat
Nach 7, 14 oder 21 Tagen Wachstum auf dotierter Nährlösung werden 5 bis 6 Pflanzen
aus der Styroporunterstützung herausgenommen, der Schaumstoff wird entfernt und die
Wurzeln gründlich mit Wasser gespült. Die Pflanzen werden in Wurzeln und Blättern
getrennt, wobei ca. 0,5 cm des Bereiches zwischen Wurzel und Blatt verworfen wird. Das
Pflanzenmaterial wird in kleine Stücke geschnitten, gewogen und unter Stickstoff
gemörsert.
Möhren
Drei bis vier Pflanzen werden nach 7, 14 oder 21 Tagen Wachstum auf dotierter
Nährlösung aus der Nährlösung genommen und gründlich mit Wasser abgespült. Die
Pflanzen werden in Blätter mit Stiel, Rübe und Seitenwurzel zerlegt. Das Pflanzenmaterial
wird in 1-2 mm3 Stücke zerschnitten, gewogen und mit flüssigem Stickstoff zu feinem
Pulver gemörsert.
Bis zur weiteren Aufarbeitung werden die pulverisierten Proben bei -80 °C gelagert.
Probenaufarbeitung
Die zerkleinerten und unter flüssigem Stickstoff pulverisierten Proben werden in einem
Zentrifugenglas mit 15-30 mL Citratpuffer (lt. Anhang A2) übergossen, so dass der
Feststoff vollständig mit Flüssigkeit bedeckt ist, und 5 min in ein Ultraschallbad gestellt.
Die Proben werden zentrifugiert (10 min bei 4000 rpm) und der Überstand abgenommen.
Der Rückstand wird nochmals mit 5 mL Citratpuffer aufgeschlämmt, 1 min im
Ultraschallbad behandelt und zentrifugiert. Die Überstände werden vereinigt und über
112
eine mit 3 mL Methanol konditionierte und mit 3 mL Wasser äquillibrierte Festphasen-
Kartusche gegeben. Nach dem Waschen der Festphase mit 3 mL Wasser und 3 mL
Methanol / Wasser -Gemisch (5% Methanol v/v) wird mit 3 mL Methanol eluiert. Das Eluat
wird im Thermoblock bei 30°C mit Luft bis zur Trockne vaporisiert. Der Rückstand wird in 1
mL Laufmittel A (lt. Anhang A3) aufgenommen und 15 sek. auf einem Rüttler geschüttelt.
Sollte die Lösung trübe sein, wird über silanisierte Glaswatte filtriert. Dazu wird etwas
Watte zu einem lockeren Propfen gerollt und in eine Pasteurpipette eingeführt. Durch die
so vorbereitete Pipette wird die Probenlösung gegeben. Die aufgearbeitete Probe wird bis
zur LC-MS-Messung bei -20°C gelagert.
Standardaddition
Die Probe wird gemäß der obigen Pflanzenaufarbeitungsvorschrift aufgearbeitet und nach
dem Abdampfen des Elutionsmittels Methanol in 2 mL Laufmittel A aufgenommen. Aus
dieser Lösung werden 5 gleiche Teile à 300 µL abpipettiert. Zu den Lösungen werden die
in der Tabelle zusammengestellten Lösungen pipettiert.
Tab.30: Verwendete Volumina für eine Standardaddition
Volumina
Bezeichnung Probenlösung SFD-Lösung
β = 100 µg/mL Laufmittel A
ISTD
SMP-Lösung
β = 100 µg/mL
Probe +0 300µL - 5µL 15µL
Probe +5 300µL 5µL 15µL 0
Probe + 10 300µL 10µL 10µL 0
Probe + 15 300µL 15µL 5µL 0
Probe + 20 300µL 20µL 0 0
Verwendung eines Internen Standards
Generell werden zu jeder vermessenden Lösung (Standards und Probe) eine bestimmte
Menge an IS zugesetzt. Es wird eine Kalibrierkurve aufgenommen, in der die
Kalibrierstandards immer die gleiche Konzentration an IS enthalten. Schwankungen
aufgrund von unterschiedlicher Injektionsvolumina oder unterschiedlicher Ionisierung in
113
der Quelle betreffen beide Substanzen, sowohl die zu bestimmende Substanz SFD als
auch den zugesetzten Internen Standard, und werden somit eliminiert.
Die SFD-Peakflächen der Standards werden durch die SMP-Peakfläche IS dividiert. Der
gebildete Quotient wird gegen den Quotienten von Konzentration SFD durch
Konzentration SMP aufgetragen (siehe Abb. ). Als Steigung der Geraden ergibt sich der
Relative Response Factor RRF (Gl. 3).
Gl.2 y = m * X
Gl.3 Fläche STD / Fläche IS= RRF * Konz. STD / Konz. IS
Gl.4 RRF = (Fläche STD / Fläche IS) * (Konz. IS / Konz. STD)
Die Konzentrationsberechnung einer unbekannten Probe ergibt sich aus folgender
Gleichung :
Gl.5 Konz. Probe = (Fläche Probe / Fläche IS) * (Konz. IS / RRF)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
024
Konz.STD / Konz. IS
Fläche STD / Fläche IS
Abb.49: Grafische Darstellung einer idealen Funktion zur Auswertung mit einem Internem
Standard STD = Standard der zu analysierenden Substanz, IS = Interner Standard
114
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Wuppertal.
124
Anhang
A 1 Verwendete Lösungen bei der Anzucht der Pflanzen
Chlortetracyclin-Stammlösung
0,0738 g CTC x HCl werden in ca. 10 mL Methanol gelöst (Ultraschallbad) und mit
destilliertem Wasser auf 50 mL aufgefüllt. Die Lösung enthält 1,372 g/L CTC und wird im
Kühlschrank gelagert.
Chlortetracyclin-Lösung / Isochlortetracyclin-Stammlösung
0,4475 g CTC x HCl und 0,4362 g iso-CTC x·HCl werden in 50mL Methanol gelöst
(Ultraschallbad) und mit Methanol auf 100 mL aufgefüllt. 1 mL dieser Lösung enthält 8,68
µmol CTC und 8,46 µmol iso-CTC. Zur Lagerung wird sie in den Kühlschrank gestellt.
Hoagland-Nährlösung
Die Nährlösung nach Hoagland wird durch Verdünnen dreier Stammlösungen hergestellt.
Je 50 mL der Stammlösungen I, II und III werden in einen 5 L Meßkolben pipettiert und mit
destilliertem Wasser aufgefüllt.
Die Stammlösungen werden durch Einwaage folgender Salze jeweils in einem 2 L
Meßkolben hergestellt:
Stammlösung I:
MgSO4·7 H2O Magnesiumsulfat-Heptahydrat,
p.A., Merck 123386 49,296 g / 2 L Wasser
KNO3 Kaliumnitrat, p.A., Merck 5063 103,132 g / 2 L Wasser
NH4H2PO4 Ammoniumdihydrogenphosphat(V), p.A., Merck
1126 46,012 g / 2 L Wasser
Stammlösung II:
Ca(NO3)2·4 H2O Calciumnitrat-Tetrahydrat,
p.A., Merck 2121 188,921 g / 2 L Wasser
125
Stammlösung III:
FeCl3·6 H2O Eisen-(III)-chlorid-Hexahydrat,
p.A., Merck 1.03943 0,5406 g / 2 L Wasser
H3BO3 Borsäure, zur Analyse, Riedel-de-Haen
31146 0,5713 g / 2 L Wasser
MnCl2·2 H2O Mangan-(II)-chlorid-Dihydrat,
p.A., Merck 1.05934 0,2290 g / 2 L Wasser
ZnSO4 ·7 H2O Zinksulfat-Heptahydrat, p.A.,
Merck 1.08883 0,0500 g / 2 L Wasser
CuSO4·5 H2O Kupfersulfat- Pentahydrat, p.A.,
Merck 2790 0,0160 g / 2 L Wasser
Na2MoO4·2 H2O Natriummolybdat-Dihydrat,
p.A., Merck 1.146809 0.0498 g / 2 L Wasser
Na2SiO4 Natriumsilikat, Riedel-de-Haen 13726 0,0138 g / 2 L Wasser
CoCl2·6 H2O Kobaltchlorid-Hexahydrat,p.A.,
Merck 2539 0,0026 g / 2 L Wasser
KAl(SO4)2 ·12 H2O KaliumAluminiumsulfat-
Dodekahydrat, p.A., Merck1047 0,0095 g / 2 L Wasser
Spuren von Nickel ist aus Verunreinigungen ausreichend vorhanden und muss nicht extra
zugesetzt werden..
Die Stammlösungen I, II, III sind ca. 6 Wochen im Kühlschrank bei 4°C haltbar.
Die aus den Stammlösungen hergestellte Hoagland-Nährlösung hat einen pH-Wert von
4,7. Wird ein anderer pH-Wert benötigt (für Feldsalat pH 6), wird dieser durch
tropfenweisen Zusatz von ca. 2 mL 7% iger KOH-Lösung (w / w) eingestellt. Die Kontrolle
des pH-Wertes erfolgte mit einer pH-Elektrode.
Natriumhypochlorit-Lösung, 0,5% (w / w)
33,3 mL 3% ige NaOCl-Lösung werden mit 166,7 mL Wasser gemischt.
Sulfadiazin-Stammlösungen
I : 0,45 g SFD werden in 100 mL Wasser aufgeschlämmt und mit 1 mL 3 M NaOH
tropfenweise versetzt, bis eine klare Lösung entsteht. Anschließend wird der pH-Wert der
Lösung mit ca. 0,5 mL 1 M HCl auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und auf 200 mL
aufgefüllt.
126
II : 0,225 g SFD werden in 100 mL Wasser aufgeschlämmt und tropfenweise mit 2 mL 7%
iger Kalilauge (w / w) versetzt bis eine klare Lösung entsteht. Mit eine pH-Elektrode wird
der pH-Wert der Lösung gemessen und mit 1,5 mL einer 1M Salzsäure auf einen pH-Wert
von 8,5 eingestellt. Die Lösung wird auf 200 mL mit Wasser aufgefüllt. Sie hat eine
Konzentration von 1,125 mg SFD pro mL.
Tween 80 - Lösung, 0,1% (w/w)
0,2g Tween 80 (Merck 822187) werden in 199,8g Wasser gelöst.
Wasserstoffperoxid-Lösung, 0,75 % (w/w)
5g 30% ige H2O2-Lösung werden in 195g Wasser gelöst
A2 Verwendete Lösungen bei der Probenaufbereitung und Analytik
Laufmittel A (Wasser/Acetonitril/Ameisensäure, 89,9%/10%/0,1%, v/v/v)
1800 mL bidest. Wasser werden mit 200 mL Acetonitril und 2 mL Ameisensäure in einem
Becherglas gemischt.
Laufmittel B (Wasser/Acetonitril/Ameisensäure, 40%/59,9%/0,1%, v/v/v)
800 mL Acetonitril werden mit 1200 mL bidestilliertem Wasser und 2 mL Ameisensäure in
einem Becherglas gemischt.
McIllvain-Puffer = Citratpuffer
310 mL 0,1 M Citronensäure (Acros 124910010) – Lösung in Wasser
190 mL 0,2 M Dinatriunhydrogenphosphat Na2HPO4 (Merck 1.06580) – Lösung in Wasser
18,6 g EDTA / Titriplex (Merck 1.008418)
Die Lösungen werden in einem 1 L-Becherglas mit Hilfe eines Magnetrührers gemischt
und das EDTA löffelweise zugesetzt. Zum besseren Lösen kann etwas erhitzt werden.
Nach dem vollständigen Lösen wird der pH-Wert mit ca. 10 mL 1 M Salzsäure auf 4,1
eingestellt.
Standard-Matrix
10 Kontrollproben, die kein AB enthalten, wurden gemäß der Vorschrift (siehe 11.2.3)
aufgearbeitet. Nach dem Abdampfen des Methanols aus der Elution der
Festphasenkartouche wurden die Rückstände in je 1 mL Laufmittel A aufgenommen und
anschließend vereinigt. Diese Lösung wird Standard-Matrix genannt.
Mit ihr wurden die Versuche in Matrix durch Zupipettieren der verschiedenen SFD
Standard-Lösungen durchgeführt.
127
A3 Verwendete Lösungen bei den Versuchen mit Tritium-markierten
Antibiotika und die ermittelten Gehalte
Tab. 31: Antibiotika-Gehalte in Feldsalat und Weizen in mg/kg FG
Antibiotikum Konz. in
Nährlösung
Zeit
Pflanzenteil Feldsalat Weizen
[µmol/L] [d]
SFD 10 7 Wurzel 0,004 0,008
SFD 10 14 Wurzel 0,006 0,024
SFD 10 21 Wurzel 0,005 0,090
*CTC 5 7 Wurzel 0,044 0,422
CTC 5 14 Wurzel 0,066 3,901
CTC 5 21 Wurzel 0,164 3,110
CTC 10 7 Wurzel 0,154 1,451
CTC 10 14 Wurzel 0,221 1,434
CTC 10 21 Wurzel 0,221 5,321
Blatt jung alt
SFD 10 7 Blatt 0,007 0,0001 0,0003
SFD 10 14 Blatt 0,002 0,003 0,001
SFD 10 21 Blatt 0,003 0,001 0,001
CTC 5 7 Blatt 0,024 0,066 0,023
CTC 5 14 Blatt 0,202 0,011 0,051
CTC 5 21 Blatt 0,084 0,004 0,137
CTC 10 7 Blatt 0,017 0,033 0,118
CTC 10 14 Blatt 0,021 0,038 0,029
CTC 10 21 Blatt 0,005 0,094 0,343
* CTC: jeweils äquimolare Mischung aus CTC und iso-CTC
128
Tab. 32: Verwendete Tritium-markierte Antibiotika und Reagenzien
Bezeichnung
3,5-3H-
Sulfamethazine
1 mCi in 1mL Ethanol 0,74 MBq (20 µCi) oder
1,48 MBq (40 µCi) in 10
mL Hoagland-
Nährlösung
3H-SFD
7-3H(N)-
Tetracycline
1 mCi als Salz in 1mL
Methanol gelöst
0,74 MBq (20µCi) oder
1,48 MBq (40µCi) in
10mL Hoagland-
Nährlösung
3H-CTC
Zur Quenchkorrektur gemessene Lösungen
100 µL
3H-SFD +900 µL Biolute S Stammlösung
SFD
100 µL
3H-CTC +900 µL Biolute S Stammlösung
CTC
Quenchlösungen 10 µL Stammlösung
SFD
3 mL Quicksafe A
10 µL Stammlösung
CTC
3 mL Quicksafe A
12 Experimente 10 µL Stammlösung
CTC
5 Experimente 10 µL Stammlösung
SFD
3 Experimente a 50 µL Stammlösung
SFD
129
Tab. 33: Szintillationsmessungen: Experimentelle Bedingungen und Ergebnisse
Pflanze Antibiotikum Zeit Gewicht
[g]
Aktivität
(n=2)
Aktivität Quench-
Korrektur
[d]
CPM [CPM / mg] [CPM / mg]
Salat/Wurzel SFD(II)
2,5mg/l
7 0,0215 12570 584,6 576,6
Salat/Blatt SFD(II)
2,5mg/l
7 0,0112 943 84,2 74,9
Salat/Wurzel CTC+iso-CTC
5µmol/l
7 0,0275 4661 169,5 161,4
Salat/Blatt CTC+iso-CTC
5µmol/l
7 0,0147 1075 73,1 63,8
Salat/Wurzel CTC+iso-CTC
10µmol/l
7 0,0175 5856 334,6 326,6
Salat/Blatt CTC+iso-CTC
10µmol/l
7 0,0157 560 35,6 26,4
Salat/Wurzel SFD(II)
2,5mg/l
14 0,0222 8135 366,4 358,4
Salat/Blatt SFD(II)
2,5mg/l
14 0,0124 751 60,6 51,3
Salat/Wurzel CTC+iso-CTC
5µmol/l
14 0,0229 1795 78,4 70,4
Salat/Blatt CTC+iso-CTC
5µmol/l
14 0,0157 2609 166,1 156,9
Salat/Wurzel CTC+iso-CTC
10µmol/l
14 0,0169 2292 135,6 127,6
Salat/Blatt CTC+iso-CTC
10µmol/l
14 0,0203 367 18,1 8,8
Salat/Wurzel SFD(II)
2,5mg/l
21 0,0235 4673 198,8 190,8
Salat/Blatt SFD(II)
2,5mg/l
21 0,0155 1683 108,6 99,3
Salat/Wurzel CTC+iso-CTC
5µmol/l
21 0,0214 3889 181,7 173,7
Salat/Blatt CTC+iso-CTC
5µmol/l
21 0,0165 1236 74,9 65,6
Salat/Wurzel CTC+iso-CTC
10µmol/l
21 0,0162 2198 135,6 127,6
Salat/Blatt CTC+iso-CTC
10µmol/l
21 0,016 186 11,6 2,3
Salat/Wurzel Kontrolle 0,0225 155 6,9 8,0
Salat/Blatt Kontrolle 0,0128 143 11,2
Salat/Blatt Kontrolle 0,0174 213 12,2
Salat 2.1/Blatt alt Kontrolle 0,0153 109 7,1
Salat 2.1/Blatt jung 0,0151 101 6,7 9,3
Salat 2.1/Wurzel Kontrolle 0,0238 219 9,2
Weizen/Wurzel SFD 2,5mg/l 21 0,0123 43101 3504,1 3504,15
Weizen/Blatt alt SFD 2,5mg/l 21 0,0158 671 42,5 35,83
Weizen/Blatt
jung
SFD 2,5mg/l 21 0,0114 313 27,5 15,22
Weizen/Wurzel CTC+iso-CTC
5µmol/l
21 0,01112 30451 2738,4 2738,35
130
Fortsetzung
Tab. 33
Pflanze Antibiotikum Zeit
Gewicht
Aktivität
(n=2)
Aktivität
Quench-
Korrektur
[d] [g]
[CPM] [CPM / mg] [CPM / mg]
Weizen/Blatt alt CTC+iso-CTC
5µmol/l
21 0,0122 1041 85,3 78,6
Weizen/Blatt
jung
CTC+iso-CTC
5µmol/l
21 0,0173 289 16,7 4,4
Weizen/Wurzel SFD 2,5mg/l 14 0,0357 33791 946,5 946,5
Weizen/Blatt alt SFD 2,5mg/l 14 0,016 777 48,5 41,9
Weizen/Blatt
jung
SFD 2,5mg/l 14 0,0113 903 79,9 79,9
Weizen/Wurzel SFD 5mg/l 14 0,0197 14544 738,2 738,2
Weizen/Blatt alt SFD 5mg/l 14 0,0199 410 20,6 13,9
Weizen/Blatt
jung
SFD 5mg/l 14 0,0142 584 41,1 28,9
Weizen/Wurzel CTC+iso-CTC
5µmol/l
14 0,0115 39509 3435,6 3435,6
Weizen/Blatt alt CTC+iso-CTC
5µmol/l
14 0,0149 531 35,6 29,0
Weizen/Blatt
jung
CTC+iso-CTC
5µmol/l
14 0,0128 316 24,6 12,4
Weizen/Wurzel CTC+iso-CTC
10µmol/l
14 0,0221 15143 685,2 685,2
Weizen/Blatt alt CTC+iso-CTC
10µmol/l
14 0,0196 306 15,6 8,9
Weizen/Blatt
jung
CTC+iso-CTC
10µmol/l
14 0,0133 467 35,1 22,9
Weizen/Wurzel SFD 2,5mg/l 7 0,0266 13857 520,9 520,9
Weizen/Blatt alt SFD 2,5mg/l 7 0,0231 444 19,2 12,6
Weizen/Blatt
jung
SFD 2,5mg/l 7 0,014 246 17,6 5,3
Weizen/Wurzel SFD 5mg/l 7 0,0166 22067 1329,3 1329,3
Weizen/Blatt alt SFD 5mg/l 7 0,0163 382 23,4 16,8
Weizen/Blatt
jung
SFD 5mg/l 7 0,0206 208 10,1 -2,2
Weizen/Wurzel CTC+iso-CTC
5µmol/l
7 0,0212 13634 643,1 643,1
Weizen/Blatt alt CTC+iso-CTC
5µmol/l
7 0,0147 426 29,0 22,3
Weizen/Blatt
jung
CTC+iso-CTC
5µmol/l
7 0,0161 2208 137,1 124,9
Weizen/Wurzel CTC+iso-CTC
10µmol/l
7 0,0154 19952 1295,6 1277,7
Weizen/Blatt alt CTC+iso-CTC
10µmol/l
7 0,0163 1207 74,0 67,4
Weizen/Blatt
jung
CTC+iso-CTC
10µmol/l
7 0,0149 718 48,2 35,9
131
Fortsetzung
Tab. 33
Pflanze Antibiotikum Zeit Gewicht Aktivität
(n=2)
Aktivität Quench-
Korrektur
[d] [g]
[CPM] [CPM / mg] [CPM / mg]
Weizen/Wurzel SFD 5mg/l 21 0,0275 29322 1066,3 1048,4
Weizen/Blatt alt SFD 5mg/l 21 0,0217 323 14,9 8,2
Weizen/Blatt
jung
SFD 5mg/l 21 0,0125 501 40,0 27,8
Weizen/Wurzel CTC+iso-CTC
10µmol/l
21 0,0138 35323 2559,6 2541,7
Weizen/Blatt alt CTC+iso-CTC
10µmol/l
21 0,0172 1946 113,1 106,5
Weizen/Blatt
jung
CTC+iso-CTC
10µmol/l
21 0,0131 898 68,5 56,3
Weizen/Wurzel Kontrolle 0,0129 231 17,9
Weizen/Blatt
jung
Kontrolle 0,0132
162 12,2
Weizen/Blatt alt Kontrolle 0,0186 124 6,6
Tab. 34: Qenchfaktoren
Probenbestandteile Aktivität
[CPM] Quenchfaktor Matrix
Quicksafe A+10µL
CTC
4468
QA+BioS+10µLCTC 1560 2,864 Biolute S und CTC
Quicksafe A+10µL
SFD
7629
QA+BioS+10µLSFD 1871 4,077 Biolute S und SFD
QA+BioS+10µLCTC 1560
FS,Kon,Wu,
+10µLCTC
1987 0,785* FS Wurzel für CTC
QA+BioS+10µLCTC 1560
FS,Kon,Ba+10µLCTC 1619 0,964* FS Blatt alt für CTC
QA+BioS+10µLCTC 1560
FS,Kon,Bj+10µLCTC 1324 1,178 FS Blatt jung für CTC
132
Fortsetzung Tab. 34
FS, Blatt, Mittelwert 1,071 FS Blatt für CTC
QA+BioS+10µLSFD 1871
FS,Kon,Wu+10µLSFD 1733 1,08 FS Wurzel für SFD
QA+BioS+10µLSFD 1871
FS,Kon,Ba+10µLSFD 1300 1,439 FS Blatt alt für SFD
QA+BioS+10µLSFD 1871
FS,Kon,Bj+10µLSFD 1182 1,583 FS Blatt jung für SFD
FS, Kon Blatt
Mittelwert
1,511 FS Blatt für SFD
QA+BioS+10µLCTC 1560
WW,Kon,Wu
+10µLCTC
1757 0,888* WW Wurzel f. CTC
QA+BioS+10µLCTC 1560
WW,Kon,Ba
+10µLCTC
1141 1,367 WW Blatt alt f. CTC
QA+BioS+10µLCTC 1560
WW,Kon,Bj +
10µLCTC
2200 0,709* WW Blatt jung f. CTC
Quicksafe A+10µL
CTC
4468
FS, NLös, 5µmol, +10
µL CTC
1992 – 103
= 1889
2,365 FS Nährlösung CTC
5µmol/L für CTC
Quicksafe A+ 10µL
CTC
4468
133
Fortsetzung Tab. 34:
FS, NLös, 10µmol, +10
µL CTC
913 – 89=
824
5,422 FS Nährlösung CTC
10µmol/L für CTC
Quicksafe A+ 10µL
SFD
7629
FS, NLös, 2,5mg/L
SFD, +50 µL SFD
2175 / 5=
435 – 98 =
337
22,638 FS Nährlösung SFD
2,5 mg/L (10µmol/L
)für SFD
Quicksafe A+ 10µL
SFD
7629
WW, NLös, 2,5mg/L
SFD, +50 µL SFD
1960 / 5=
392 – 148=
244
31,266 WW Nährlösung SFD
2,5 mg/L (10µmol/L)
für SFD
Quicksafe A+ 10µL
CTC
4468
WW, NLös, 5µmol, +10
µL CTC
1570 – 155
= 1415
3,158 WW Nährlösung CTC
5µmol/L für CTC
Quicksafe A+ 10µL
CTC
4468
WW, NLös, 10µmol,
+10 µL CTC
2918 – 102=
2816
1,587 WW Nährlösung CTC
10µmol/L für CTC
* Faktor <1 Mögliche Ursache: Fluoreszierende Proben-Bestandteile
Verwendete Abkürzungen
B Blatt
BioS Biolute S = Gewebeauflöser
CPM counts per minute
DPM disintegrations per minute
FS Feldsalat
Kon Kontrolle
Nlös Nährlösung
QA Quicksafe A = Szintillationslösung
Wu Wurzel
WW Winterweizen
134
A 3.1 Umrechnung von Radioaktivitätseinheiten
Berechnung der Chemischen Konzentration anhand der radioaktiven Konzentration
und der spezifischen Aktivität:
Chem.Konz. [mmol/mL] = Radioaktive Konz. [mCi/mL] / Spezifische Aktivität [mCi/mmol]
Einheiten:
Ci [Curie] Bq [Bequerel] = 1/sec Cpm [Counts per
minute]
1 3,7 x 1010
2,7 x 10 -11 1
4,51 x 10 -11 1,67 100
Anfangswerte für Nährlösungen :
• In 10mL Hoagland-Nährlösung werden 20µCi (20µL der 3H-Ausgangslösung)
gelöst. Das sind 20 µCi X 100Cpm / 4,51 x 10-5 =
44 345 898 Cpm in 10 mL Hoaglandlsg ohne Quench. Oder
• 2 217 294,9 Cpm in 0,5mL
Stammlösung zum Quenchen:
• 100µCi + 900µL Biolute S, 10µL davon (= 1µCi) werden mit 3mL Quicksafe A gelöst
(=3010µL Lösung)
• Davon sind 10µL : 0,00332 µCi = 7361,4 Cpm
