Die Rolle von p53 in der zellulären Antwort
auf Natriumselenit und Selenomethionin
vorgelegt von Diplom-Lebensmittelchemikerin
Viola Klaus
aus Gräfelfing
von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin (TU)
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat.-
Genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. J. Kurreck
Berichter: Prof. Dr. A. Hartwig
Berichter: Prof. Dr. L. W. Kroh
Berichter: Prof. Dr. L.-O. Klotz
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 05.07.2010
Berlin 2010
D83
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung.......................................................................................... 1
2 Einleitung........................................................................................................ 4
2.1 Selen......................................................................................................... 4
2.1.1 Vorkommen und Bedarf............................................................................................
4
2.1.2 Aufnahme und Metabolismus...................................................................................
5
2.1.3 Funktion.....................................................................................................................
7
2.1.4 Toxikologie ................................................................................................................
8
2.1.5 Einfluss auf Aspekte der humanen Gesundheit........................................................
8
2.2 Tumorsuppressorprotein p53 ................................................................. 12
2.2.1 Funktion und Struktur............................................................................................
12
2.2.2 Regulation über Phosphorylierung ........................................................................
14
2.2.3 Rolle von p53 in der DNA-Reparatur......................................................................
15
2.2.3 Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle ................................................................
18
2.2.4 Rolle von p53 in der Apoptose...............................................................................
20
2.3 Bedeutung von Selen für die genomische Stabilität................................ 22
3 Fragestellung ................................................................................................ 24
4 Material und Methoden............................................................................... 26
4.1 Zellkultur................................................................................................. 26
4.1.1 Zelllinien .................................................................................................................
26
4.1.2 Kulturbedingung und Behandlung .........................................................................
26
4.2 Koloniebildungsfähigkeit......................................................................... 27
4.3 Aufnahmeuntersuchung mittels AAS ...................................................... 27
Inhaltsverzeichnis
II
4.4 Immunologischer Nachweis zellulärer Proteine ...................................... 29
4.4.1 Western Blot ..........................................................................................................
29
4.4.2 Konformationsspezifische Immunopräzipitation von p53.....................................
31
4.5 Genexpression ........................................................................................ 32
4.6 Alkalische Entwindung ............................................................................ 35
4.7 Zellzyklusuntersuchungen mittels Durchflusszytometer ......................... 37
4.8 Kernlokalisation von AIF.......................................................................... 38
4.9 Aktivität der Effektor-Caspasen 3/7 ........................................................ 39
5 Ergebnisse und Diskussion............................................................................ 40
5.1 Zytotoxizität der Selenverbindungen ...................................................... 40
5.1.1 Zytotoxizität in HCT116 Zellen ...............................................................................
40
5.1.2 Zytotoxizität in A549 Zellen....................................................................................
45
5.2 Zelluläre Aufnahme................................................................................. 47
5.2.1 Aufnahme in HCT116 Zellen...................................................................................
47
5.2.2 Aufnahme in A549 Zellen.......................................................................................
51
5.3 Konformationsspezifische Analyse von p53 ............................................ 53
5.4 Phosphorylierung von p53 ...................................................................... 55
5.5 Oxidative DNA-Schäden .......................................................................... 59
5.5.1 Bestimmung von oxidativen DNA-Schäden mittels alkalischer Entwindung.........
59
5.5.2 Stabilisierung von p53............................................................................................
62
5.5.3 Genexpression und Proteingehalt von BER-Proteinen ..........................................
63
5.5.4 Genexpression und Proteingehalt von NER-Proteinen..........................................
66
5.5.5 Bewertung der Ergebnisse .....................................................................................
70
5.6 Zellzykluskontrolle .................................................................................. 75
Inhaltsverzeichnis
III
5.6.1 Zellzyklusuntersuchungen mittels Durchflusszytometer.......................................
75
5.6.2 Genexpression und Proteingehalt von Zellzykluskontrollproteinen......................
82
5.6.3 Bewertung der Ergebnisse .....................................................................................
85
5.7 Apoptose ................................................................................................ 89
5.7.1 Kernlokalisation von AIF.........................................................................................
89
5.7.2 Genexpression von Bax..........................................................................................
91
5.7.3 Aktivität der Effektor-Caspasen 3/7.......................................................................
93
5.7.4 SubG1 Peak.............................................................................................................
95
5.7.5 Bewertung der Ergebnisse .....................................................................................
98
5.8 Inhibierung der p53-abhängigen zellulären Antwort durch
Cadmiumchlorid................................................................................... 101
6 Zusammenfassende Diskussion.................................................................. 104
7 Literatur...................................................................................................... 111
8 Anhang........................................................................................................ 125
8.1 Abkürzungsverzeichnis.......................................................................... 125
8.2 Chemikalien .......................................................................................... 127
8.3 Antikörper............................................................................................. 130
8.4 Puffer und Lösungen............................................................................. 131
8.5 Geräte................................................................................................... 134
8.6 Verbrauchsmaterialien.......................................................................... 136
8.7 PCR-Primer-Systeme............................................................................. 137
8.8 Sequenz des Bax-Gens und Lage der Primer ......................................... 138
8.9 Gelelektrophoretische Überprüfung des Amplifikat.............................. 139
9 Publikationsliste ......................................................................................... 140
10 Danksagung .............................................................................................. 144
Inhaltsverzeichnis
IV
Zusammenfassung
1
1 Zusammenfassung
Das Spurenelement Selen wird aufgrund seiner antioxidativen und postulierten
krebspräventiven Wirkung als Nahrungsergänzungsmittel angeboten. Den antioxidativen
Eigenschaften als Bestandteil verschiedener Selenoproteine, wie der plasmatischen
Glutathion-Peroxidase, steht jedoch das prooxidative Verhalten reduzierbarer Selen-
verbindungen gegenüber. Neben Selenhefe, die vorwiegend das vollständig reduzierte
Selenomethionin beinhaltet, wird häufig Natriumselenit angeboten, in dem das Selen in
einer reduzierbaren Oxidationsstufe vorliegt. Auch aufgrund des reduktiven Metabolismus
von Natriumselenit sind Oxidationen von sensitiven Strukturen, wie der DNA oder Proteinen,
durch das redoxaktive Element denkbar. Als potentielle Angriffspunkte sind Thiolgruppen in
Zink-bindenden Strukturen, wie sie z. B. in Transkriptionsfaktoren oder DNA-Reparatur-
proteinen vorkommen, zu nennen. Ein Beispiel ist das Tumorsuppressorprotein p53, das in
seiner DNA-Bindungsdomäne ein Zinkion koordiniert. Nur wenn diese Struktur intakt ist,
kann p53 als Transkriptionsfaktor von Genen der Zellzykluskontrolle, der DNA-Reparatur und
der Apoptose zur Erhaltung der genomischen Stabilität beitragen.
In der vorliegenden Arbeit wurde der direkte Einfluss von Natriumselenit und
Selenomethionin auf die Wildtyp-Konformation von p53 sowie die Rolle des Tumor-
suppressors bei der zellulären Antwort auf diese Selenverbindungen untersucht. In einem
subzellulären Testsystem zeigte sich eine inaktivierende Entfaltung der nativen
Konformation von p53 durch Natriumselenit, während Selenomethionin keinen Einfluss
hatte. Diese Inaktivierung von p53 durch reduzierbare Selenverbindungen könnte auf eine
oxidative Zinkfreisetzung zurückzuführen sein. Dieser Mechanismus schien jedoch im
zellulären System aus p53-profizienten und p53-defizienten HCT116 Kolonkarzinomzellen
nicht relevant zu sein. Vielmehr war die zelluläre Antwort nach Inkubation mit Natrium-
selenit stark abhängig vom p53-Status der Zellen. So reagierten die p53-profizienten Zellen
sensitiver auf Natriumselenit als die p53-defizienten Zellen. Einhergehend damit wurden p53
stabilisiert und p53-abhängig die Zellzykluskontrolle, die DNA-Reparatur und die Apoptose
eingeleitet. Z. B. wurde das Zellzykluskontrollgen p21 induziert, für das p53 als
Transkriptionsfaktor fungiert. Daraus resultierte eine Arretierung der p53-profizienten Zellen
vornämlich in der G1-Phase. Erst in vergleichsweise hoher Konzentration an Natriumselenit
kam es zu der Ausbildung eines p53-unabhängigen S-Phase-Arrests. Zudem traten bis in
vergleichsweise hohe Konzentrationen an Natriumselenit in den p53-profizienten Zellen
keine oxidativen DNA-Schäden auf, erst unter stark zytotoxischen Bedingungen konnten Fpg-
sensitive Läsionen und DNA-Strangbrüche detektiert werden. Neben verschiedenen
Zusammenfassung
2
Angriffspunkten innerhalb der Basenexzisionsreparatur (BER) wurde die Induktion von p53-
abhängigen Genen der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) als möglicher Mechanismus, über
den p53 die Kapazität der BER steigert, identifiziert. Schon mit beginnender Zytotoxizität,
bevor DNA-Schäden akkumulierten, wurden in den p53-profizienten Zellen zudem
apoptotische Prozesse beobachtet. Die Apoptose wurde ohne Steigerung der Aktivität der
Effektor-Caspasen 3 und 7 über den intrinsischen Weg eingeleitet. Die Induktion des
proapoptotischen Bcl-2-Gens Bax führte zur Freisetzung von AIF aus den Mitochondrien. Die
Apoptose wurde durch die Bildung apoptotischer Körperchen abgeschlossen, die als SubG1-
Peak nachgewiesen wurden. Im Vergleich dazu akkumulierten die p53-defizienten Zellen
bereits in nicht-zytotoxischen Konzentrationen an Natriumselenit hohe Gehalte an DNA-
Strangbrüchen, und bei vergleichsweise hohen Konzentrationen traten wie in den p53-
profizienten Zellen gleichermaßen Fpg-sensitive Läsionen und DNA-Strangbrüche auf. Trotz
DNA-Schädigung wurden zunächst keine tumorsuppressiven Reaktionen eingeleitet.
Wiederum erst unter stark zytotoxischen Bedingungen arretierten die p53-defizienten Zellen
in der S-Phase. Dabei könnte das Zellzykluskontrollgen GADD45 eine Rolle gespielt haben.
Auch der Zelltod, der als SubG1-Peak bestimmt wurde, setzte erst im oberen
Konzentrationsbereich ein und wurde weder durch die Aktivierung von Effektor-Caspasen,
die Induktion von Bax noch die Kernlokalisation von AIF begleitet.
Durch die Koinkubation mit Cadmiumchlorid konnte in den p53-defizienten Zellen eine
gewisse p53-Defizienz simuliert werden. Cadmiumionen führen zur Entfaltung des
Tumorsuppressors in eine inaktive Konformation, sodass die p53-abhängige Schadens-
antwort nach Natriumselenit-Exposition trotz DNA-Schädigung inhibiert wurde.
Im Vergleich dazu spielte p53 bei der zellulären Reaktion auf Selenomethionin kaum eine
Rolle. Unabhängig vom p53-Status der Zellen war Selenomethionin erst in viel höheren
Konzentrationen als Natriumselenit zytotoxisch. Auch DNA-Strangbrüche wurden erst im
höheren Konzentrationsbereich detektiert. Darauf reagierten beide Zelllinien mit der
Induktion von Zellzyklusarresten und dem Zelltod. Letztere wurde jedoch nicht von der
Induktion von Bax oder der Kernlokalisation von AIF begleitet. Ein weiterer Unterschied
zwischen den beiden Selenverbindungen zeigte sich in ihrer zellulären Aufnahme. Während
Natriumselenit erst bei Erreichen der Zytotoxizität zur Akkumulation von intrazellulärem
Selen führte, reicherten sich große Mengen an Selen bereits bei sehr niedrigen
Inkubationskonzentrationen an Selenomethionin an. Dies kann auf den unspezifischen
Einbau von Selenomethionin im Austausch für Methionin in zelluläre Proteine erklärt
werden.
Insgesamt macht diese Arbeit in Zellkulturversuchen deutlich, wie unterschiedlich die
Eigenschaften verschiedener Selenverbindungen sind, die gleichermaßen in der Nahrungs-
ergänzung eingesetzt werden. Die prooxidative Wirkung des Natriumselenits bedingt seine
Zusammenfassung
3
vergleichsweise hohe Zytotoxizität und Genotoxizität. Verglichen damit wirkt
Selenomethionin kaum zytotoxisch, akkumuliert jedoch intrazellulär sehr viel stärker, und
wirkt bei Überladung der Zelle genotoxisch. Überraschend ist vor allem die unterschiedliche
Rolle von p53 bei der zellulären Schadensantwort auf die beiden Verbindungen. Während
Selenomethionin keine entscheidenden p53-abhängigen Prozesse induziert, wird p53 als
Reaktion auf die DNA-schädigende Wirkung des Natriumselenits durch Phosphorylierung
stabilisiert und leitet tumorsuppressive Reaktionen ein. In Abwesenheit des Tumor-
suppressors akkumulieren die Zellen DNA-Schäden, ohne dass die Proliferation verringert
wird. Dies könnte z. B. in premalignen und malignen Strukturen, die häufig Mutationen im
p53-Gen aufweisen, zur weiteren Entartung führen.
Einleitung
4
2 Einleitung
2.1 Selen
2.1.1 Vorkommen und Bedarf
Das essentielle Spurenelement Selen wird vorwiegend über die Nahrung aufgenommen.
Pflanzliche Nahrungsmittel enthalten z. B. die Aminosäure Selenomethionin. Dabei hängt die
enthaltene Menge vornehmlich vom Selengehalt des Bodens ab. So kann Getreide zwischen
10 und 500 mg/kg Selen aufweisen. Besonders reich an Selen ist die in Südamerika
wachsende Paranuss mit bis zu 5000 µg Selen/kg. In tierischen Produkten ist die
Hauptselenquelle das Selenocystein. Je nach Selengehalt des Futters oder erfolgter
Supplementation enthält Muskelfleisch zwischen 20-150 µg Selen/kg (zusammengefasst in
RKI, 2006). Zum Einsatz in Nahrungsergänzungsmitteln sind laut Nahrungsergänzungs-
mittelverordnung nur die anorganischen Salze Natriumselenat, Natriumhydrogenselenit und
Natriumselenit (Abbildung 1) zugelassen (NemV, 2004). Zudem gibt es eine Übergangs-
regelung für Stoffe, für die eine Zulassung in Deutschland beantragt wurde. In dieser Liste
finden sich L-Selenomethionin (Abbildung 1) und selenangereicherte Hefe, welche somit
ebenfalls eingesetzt werden dürfen (Bundesanzeiger, 2006). Die Deutsche Gesellschaft für
Ernährung schätzt den Bedarf auf 30-70 µg Selen/Tag (DGE, 2000). Die Versorgungssituation
der deutschen Bevölkerung lässt sich nur ungefähr abschätzen, da die Aufnahme regional
unterschiedlich ist, liegt aber etwa im unteren bis mittleren Bereich der DGE-Empfehlung
(BfR, 2004 a).
Selenomethionin Natriumselenit
Se
O
OO
Na
+
2
+ IV
NH
3
Se
COOH
- II
Selenomethionin Natriumselenit
Se
O
OO
Na
+
2
+ IV
NH
3
Se
COOH
- II
Selenomethionin Natriumselenit
Se
O
OO
Na
+
2
+ IV
Se
O
OO
Na
+
2
+ IV
NH
3
Se
COOH
- II
NH
3
Se
COOH
- II
Abbildung 1: Strukturformeln und Oxidationsstufen von Natriumselenit und
Selenomethionin.
Natriumselenit enthält Selen in einer reduzierbaren Oxidationsstufe,
während das Selenatom in Selenomethionin vollständig reduziert vorliegt. Weiterhin
unterscheiden sich die beiden Selenverbindungen in der Aufnahme, dem Metabolismus und
ihren Eigenschaften.
Einleitung
5
2.1.2 Aufnahme und Metabolismus
Über die Effizienz der Absorption von Selen aus seinen anorganischen Salzen oder
organischen Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren, findet man in der Literatur differierende
Angaben. Zum einen wird berichtet, dass die Effizienz gleichermaßen bei 70-95 % je nach
Matrix liegt (zusammengefasst in Schomburg and Köhrle, 2007), zum anderen soll die
Absorption von Selenomethionin besser sein als die von Natriumselenit (95-97 % zu 44-70 %)
(zusammengefasst in Whanger, 1998). Ein Grund für diese Diskrepanz könnte in der
Betrachtung verschiedener Parameter zur Messung der Aufnahme bestehen. Wird nach
Supplementation die Ausscheidung von Selen oder der Anstieg der Plasma-
Selenkonzentration bestimmt, zeigt sich, dass Selenomethionin zu einer geringeren
Ausscheidung und höheren Plasmaspiegeln führt. Dies kann auf den unspezifischen Einbau
von Selenomethionin in Proteine erklärt werden. Im Vergleich dazu zeigt sich bei der
Induktion der Aktivität der plasmatischen Glutathion-Peroxidase kein Unterschied zwischen
den beiden Selenverbindungen. Insgesamt sollte deshalb zwischen Aufnahme und
Bioverfügbarkeit unterschieden werden.
Die Selenverbindungen werden im Zwölffinger- sowie Dünndarm aber über verschiedene
Transportmechanismen resorbiert. So wird Selenomethionin wie Methionin über ein Na
+
-
abhängiges Aminosäure-Carriersystem aufgenommen. Für Natriumselenit wird zum einen
ein Na
+
-unabhängiger, passiver Transport (zusammengefasst in Schomburg and Köhrle,
2007) als auch ein Transport analog zum Sulfit diskutiert (Park and Whanger, 1995).
Nach Resorption werden die Selenverbindungen nach Konjugation an Glutathion zur Leber
transportiert (zusammengefasst in Schomburg and Köhrle, 2007). Selenit wird unter
anderem auch in den Erythrozyten zu Hydrogenselenid reduziert (zusammengefasst in RKI,
2006). In der Leber wird Selenoprotein P, in welchem Selenocystein gespeichert und
transportiert wird, synthetisiert. Selenoprotein P macht so auch die Hauptform des Selens im
humanen Plasma aus. Daneben findet man als selenhaltiges Protein z. B. die plasmatische
Glutathion-Peroxidase. Nur wenn große Mengen von Selenomethionin aufgenommen
werden, dominiert dieses gebunden im Hämoglobin und Plasmaalbumin, da es unspezifisch
im Austausch für Methionin eingebaut wird (zusammengefasst in Whanger, 1998).
Der zelluläre Metabolismus von Selenomethionin und Natriumselenit ist in Abbildung 2
dargestellt. Selenomethionin wird in Abhängigkeit vom Methionin-Haushalt freigesetzt und
durch Transsulfurierung in Selenocystein überführt und gelangt mittels der Selenocystein-
Lyase in den Hydrogenselenid-Pool. Zum anderen kann Selenomethionin von der γ-Lyase zu
Monomethylselenid metabolisiert werden. Im Vergleich dazu wird Natriumselenit mittels
Glutathion reduziert und NADPH-abhängig von der Glutathion-Reduktase zu Hydrogen-
selenid verstoffwechselt. Ausgehend vom Hydrogenselenid kann eine ATP-abhängige
Einleitung
6
Aktivierung zum Selenophosphat erfolgen, welches zum Einbau von Selenocystein in
Selenoproteine benötigt wird (zusammengefasst in Brigelius-Flohé, 2008; Ip, 1998).
Hydrogenselenid und Monomethylselenid können jeweils ineinander überführt werden
(Ohta and Suzuki, 2008). Folgen weitere Methylierungen entstehen Dimethylselenid,
welches exhaliert wird, und Trimethylselenonium-Ionen, welche über den Urin
ausgeschieden werden (zusammengefasst in Brigelius-Flohé, 2008; Ip, 1998). Weitere
wichtige Stoffwechselprodukte, die auch im Urin gefunden werden, sind Selenozucker
(Kuehnelt et al., 2005).
Selenomethionin
Körperproteine
Reduktiver
Metabolismus
(Depletion von
Glutathion?)
Direkte
Oxidation?
(Depletion von
Glutathion?)
H
2
Se
CH
3
SeH
(CH
3
)
2
SeH
Selenit,
SeO
32-
GS-Se-SG
GS-Se-H
(CH
3
)
3
Se
+
Selenocystein
Selenophosphat
Selenoproteine
(als Selenocystein)
Urin
γ-Lyase
Sec-Lyase
4 GSH
Glutathion-
Reductase,
NADPH
Atemluft
Direkte
Oxidation von
sensitiven
Strukturen?
ROS
CH
3
SeOH
O
2· -
+ Se
0
O
2
O
2
-GSH
Selenomethionin
Körperproteine
Reduktiver
Metabolismus
(Depletion von
Glutathion?)
Direkte
Oxidation?
(Depletion von
Glutathion?)
H
2
Se
CH
3
SeH
(CH
3
)
2
SeH
Selenit,
SeO
32-
GS-Se-SG
GS-Se-H
(CH
3
)
3
Se
+
Selenocystein
Selenophosphat
Selenoproteine
(als Selenocystein)
Urin
γ-Lyase
Sec-Lyase
4 GSH
Glutathion-
Reductase,
NADPH
Atemluft
Direkte
Oxidation von
sensitiven
Strukturen?
ROS
CH
3
SeOH
O
2· -
+ Se
0
O
2
O
2
-GSH
Selenomethionin
Körperproteine
Reduktiver
Metabolismus
(Depletion von
Glutathion?)
Direkte
Oxidation?
(Depletion von
Glutathion?)
H
2
Se
CH
3
SeH
(CH
3
)
2
SeH
Selenit,
SeO
32-
GS-Se-SG
GS-Se-H
(CH
3
)
3
Se
+
Selenocystein
Selenophosphat
Selenoproteine
(als Selenocystein)
Urin
γ-Lyase
Sec-Lyase
4 GSH
Glutathion-
Reductase,
NADPH
Atemluft
Direkte
Oxidation von
sensitiven
Strukturen?
ROS
CH
3
SeOH
O
2· -
+ Se
0
O
2
O
2
-GSH
CH
3
SeOH
O
2· -
+ Se
0
O
2
O
2
-GSH
O
2· -
+ Se
0
O
2
O
2
-GSH
Abbildung 2: Metabolismus von Natriumselenit und Selenomethionin.
Selenit
wird reduktiv metabolisiert, während Selenomethionin enzymatisch zu den gemeinsamen
Zwischenmetaboliten Hydrogenselenid (H
2
Se) und Monomethylselenid (CH
3
SeH) umgesetzt
wird. Nach der Aktivierung zum Selenophosphat folgt die Inkorporation in Selenoproteine.
Durch Methylierung entstehen Ausscheidungsprodukte. Prooxidative Mechanismen können
vom Selenit aber auch von den Metaboliten ausgehen.
Als oxidative Mechanismen wären direkte Reaktionen des Selenits, wie z. B. die Bildung von
gemischten Disulfiden, oder auch die Depletion von Glutathion während des reduktiven
Selenit-Metabolismus zu nennen. Weiterhin wird jedoch auch ein oxidatives Potential
wichtiger Metaboliten postuliert. So soll Hydrogenselenid mit Sauerstoff zu Superoxid-
radikalen und elementarem Selen regieren und auf diesem Wege Apoptose induzieren
können. Ebenso wird die Reaktion von Monomethylselenid mit Sauerstoff zu Selenensäuren
Einleitung
7
diskutiert. Diese können wiederum direkt mit oxidationsempfindlichen Strukturen angreifen
oder unter Glutathion-Depletion zurückreagieren (zusammengefasst in Brigelius-Flohé,
2008).
Zudem wurde in dieser Arbeit Phenylseleninsäure verwendet. Über den Metabolismus
dieser reduzierbaren Selenverbindung ist aus der Literatur nichts bekannt. Analog zu den
Selensäuren sind prooxidative Reaktionen denkbar (Abbildung 3).
Se
O
OH
+ II
Se
O
OH
+ II
SeH
4 GSH 2 GSSG
- II
Se
O
OH
+ II
Se
O
OH
+ II
SeH
Se
O
OH
+ II
Se
O
OH
+ II
SeH
4 GSH 2 GSSG
- II
Abbildung 3: Strukturformel und Oxidationsstufe von Phenylseleninsäure.
In
Phenylseleninsäure weist das Selenatom eine Oxidationsstufe von +II auf. Unter Oxidation
von Glutathion kann Phenylselenol entstehen.
2.1.3 Funktion
Selen übt seine biologische Funktion vor allem in Form der Selenoproteine aus, in die es als
Selenocystein eingebaut ist. Selenocystein hat durch das Selenatom einen geringeren pKa-
Wert als Cystein (5,2 zu 8,3) und eine höhere Reaktivität. Somit ist Selen entscheidender
Bestandteil des aktiven Zentrums dieser Enzyme. Der Einbau des Selenocysteins ist genetisch
über ein sonst als Translationsstopp fungierendes UGA-Codon codiert und erfolgt im
Zusammenspiel mit einem Selenocystein-Insertions-Sequenz-Element (Secis-Element) sowie
SECIS-bindenen Proteinen. Die benötigte Selenocysteinyl-tRNA wird aus einer tRNA mit
Serylrest und aktiviertem Selenophosphat syntethisiert. Bisher wurden 25 humane
Selenoproteine identifiziert. Eine der am besten untersuchten Selenoprotein-Familien ist die
der Glutathion-Peroxidasen (GPx). Die einzelnen Mitglieder sind für den Glutathion-
abhängigen Abbau von Peroxiden verantwortlich, wobei sie sich z. T. in ihren Substraten, wie
z. B. Wasserstoffperoxid oder Lipidperoxiden, und in der Lokalisation unterscheiden. So trägt
z. B. die GPx-3 zur antioxidativen Kapazität im Plasma bei. Eine weitere Familie bilden die
Thioredoxin-Reduktasen, die über die Regeneration von Thioredoxin an Redox-Prozessen
verschiedener Gewebe, wie z. B. der Nukleotid-Synthese, teilhaben. Daneben gibt es die Iod-
Thyronin-Deiodasen, welche z. B. die Aktivierung bzw. Inaktivierung von Schilddrüsen-
hormonen steuern. Zudem sind die Selenophosphat-Syntethase, die Methionin-Sulfoxid-
Reduktase und weitere Selenoproteine, die mit Buchstaben benannt wurden, deren
Funktionen jedoch weitestgehend ungeklärt sind, bekannt. Für das Selenoprotein P wird vor
Einleitung
8
allem eine Funktion als Speicher- und Transportform des Selens angenommen, zudem
jedoch auch eine Schwermetall-komplexierende Wirkung diskutiert (zusammengefasst in
Schomburg and Köhrle, 2007; Reeves and Hoffmann, 2009).
Weiterhin werden Selenoprotein-unabhängige Funktionen einzelner Selenspezies diskutiert
(siehe Abschnitt 2.1.5).
2.1.4 Toxikologie
Bei einer Aufnahme von unter 20 µg Selen pro Tag können Selenmangelerscheinungen, wie
Müdigkeit, Muskelschwäche, Haarausfall und Weißfärbung der Nägel, auftreten. Schwere
Selenmangelerkrankungen, wie sie in selenarmen Gebieten Chinas vorkommen, treten im
Vergleich dazu wahrscheinlich erst im Zusammenspiel mit weiteren Faktoren auf. So scheint
die Schwächung des Immunsystems durch einen Selenmangel zur gesteigerten Virulenz des
Coxsackie-Virus und somit zur Keshan-Krankheit, einer Herzmuskelerkrankung, zu führen.
Die Kashin-Beck-Krankheit, bei der das Knochenwachstum gestört ist, wird hingegen erst
durch einen zusätzlichen Iodmangel hervorgerufen (zusammengefasst in Schomburg and
Köhrle, 2007).
Die tolerierbare Höchstaufnahmemenge (UL, tolerable upper intake level) wird je nach
Gremium auf 300 bis 450 µg Selen pro Tag geschätzt bzw. der NOAEL (No Observed Adverse
Effect Level) auf 800 bis 850 µg Selen pro Tag (Scientific Committee on Food, SCF: 300 bzw.
850 µg/Tag; Food and Nutrition Board: 400 bzw. 800 µg/Tag; Expert group on Vitamin and
Minerals, EVM: 450 µg/Tag) (zusammengefasst in BfR, 2004 a). Ab einer Aufnahme von etwa
1000 µg Selen pro Tag können Symptome einer Selenintoxikation (Selenosis), wie z. B.
Veränderung der Nägel, Haare und Zähne bis hin zu deren Verlust, Hautausschläge,
knoblauchartiger Atemgeruch (verursacht durch Dimethylselenid) und Leistungsschwäche,
auftreten (zusammengefasst in RKI, 2006). Aktuell wird die Erhöhung der Diabetesprävalenz
durch Selen diskutiert (siehe Abschnitt 2.1.5). Auf dieser Grundlage wurde der MAK-Wert
von Selen und seinen anorganischen Verbindungen (einschließlich Selenwasserstoff) auf
0,02 mg/Selen/m
3
abgesenkt (DFG, 2010). Die genannten Stoffe sind hinsichtlich ihrer
krebserzeugenden Wirkung in die Kategorie 3 B eingeordnet worden (DFG, 2010).
2.1.5 Einfluss auf Aspekte der humanen Gesundheit
Studien zur postulierten krebspräventiven Wirkung
Nach seiner Entdeckung galt Selen als Gift, erst 1957 wurde seine Essentialität erkannt und
mittlerweile wird diesem Element eine postulierte krebspräventive Wirkung zugesprochen.
Einleitung
9
Insgesamt werden die Ergebnisse der Studien zur krebspräventiven Wirkung des Selens
jedoch kontrovers diskutiert.
Das Nutritional Prevention of Cancer Trial (NPC) war die erste große Interventionsstudie auf
diesem Gebiet (Clark et al., 1996). Ansatzpunkt für die Studie war eine Fall-Kontroll-Studie,
die zeigte, dass Hautkrebspatienten niedrigere Plasma-Selenspiegel als andere Patienten
hatten (0,141 vs 0,155 µg/g) (Clark et al., 1984). In der NPC-Studie wurde daraufhin der
Einfluss einer Supplementation mit 200 µg Selen als Selenhefe auf das Wiederauftreten von
Hautkrebs in einem US-amerikanischen Hautkrebsrisikokollektiv untersucht. Bei der
Auswertung der Daten von 1983 bis 1993 zeigte sich kein präventiver Effekt auf das
Primärziel, jedoch war die allgemeine Krebsrate, die Rate an Prostata-, Lungen- und
Dickdarmkrebs sowie die allgemeine krebsbedingte Mortalitätsrate in der Selen-
supplementierten Gruppe signifikant gesenkt (Clark et al., 1996). Nach Auswertung aller
Daten bis 1996 wurden die präventiven Einflüsse des Selens geringer und waren hinsichtlich
Lungen- und Dickdarmkrebs nicht mehr vorhanden (Duffield-Lillico, 2002). Duffield-Lillico et
al. (2002) wiesen darauf hin, dass die Biopsieraten in den verschiedenen Probandengruppen
bei abnormal hohen Werten an PSA (prostate-specific antigen) unterschiedlich hoch war. In
der Selen-supplementierten Gruppe wurde seltener biopsiert, sodass Krebsfälle unentdeckt
geblieben sein könnten. Dies ist ein starker Kritikpunkt, der sich zudem auf die Ergebnisse
der Gesamtkrebsrate und -mortalität ausgewirkt haben könnte. Zudem bleiben die
Definierung sekundärer Endpunkte erst nach Randomisierung sowie die Verallgemeinerung
der Ergebnisse aus einem Risikokollektiv kritisch zu betrachten.
Die NPC-Studie war ein Ansatzpunkt für das Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial
(SELECT), das mit über 30.000 männlichen Probanden die bisher größte Interventionsstudie
zur chemopräventiven Wirkung von Selen ist (Lippman et al., 2009). In dieser Studie wurden
200 µg Selen als Selenomethionin und Vitamin E, jeweils allein oder in Kombination,
verabreicht, um primär den Einfluss auf das Prostatakrebsrisiko zu untersuchen. In keiner
Gruppe wurde eine präventive Wirkung festgestellt. Vielmehr zeigte sich nach siebenjähriger
Laufzeit eine nicht-signifikante Steigerung des Prostatakrebsrisikos in der mit ausschließlich
Vitamin E supplementierten Gruppe und ein nicht-signifikant erhöhtes Diabetes Mellitus Typ
II-Risiko in der Selen-supplementierten Gruppe. Daraufhin wurde die Studie im Oktober 2008
vorzeitig abgebrochen. Auch sekundäre Endpunkte, wie das Lungen-, Darm- und
Gesamtkrebsrisiko sowie die Gesamtkrebsmortalitätsrate waren in keiner
Supplementationsgruppe beeinflusst. Insgesamt wurden die Ergebnisse der NPC-Studie hier
also nicht bestätigt. Lippman et al. (2009) wiesen darauf hin, dass in der NPC-Studie, nur
Probanden mit niedrigen Basis-Plasma-Selenspiegel profitierten, die Spiegel von 78 % der
Probanden der SELECT-Studie sogar über dem mittleren Terzil lagen. Die Probanden der
NPC-Studie stammten von der Ostküste der USA, wo die Selenaufnahme vergleichsweise
Einleitung
10
niedrig ist (Clark et al., 1996). Korreliert man die Prostatakrebsinzidenzen mit den
Selengehalten der Böden in den einzelnen Staaten der USA, wird diese Hypothese jedoch
nicht belegt (Abbildung 4). Jedoch ist die Aussagekraft dieser Korrelation aufgrund von
Migration und Import von Lebensmitteln begrenzt. Auf der anderen Seite liegt die
Prostatakrebsinzidenz in Deutschland trotz geringerer Selenaufnahme mit etwa 100
Fällen/100.000 (2002) deutlich unter dem US-Durchschnitt (RKI, 2007).
Selen-reiche und Selen-arme Regionen
(Cowgill, 1997)
Selen-reiche und Selen-arme Regionen
(Cowgill, 1997)
Abbildung 4: Prostatakrebs-Insidenz in den USA (2005).
Dargestellt sind die
Prostatakrebsfälle pro 100.000 Einwohner. (http://statecancerprofiles.cancer.gov/cgi-bin/
quickprofiles/profile.pl?00&066)
Eine Fall-Kontroll-Studie beschreibt eine inversive Korrelation zwischen dem Selengehalt in
Fußnägeln und der Prostatakrebsinzidenz (Yoshizawa et al., 1998). Bei näherer Betrachtung
der veröffentlichten Daten, zeigt sich jedoch vielmehr in vier Quintilen kein Effekt und nur im
Quintil der niedrigsten Selengehalte eine fragliche Steigerung der Inzidenz. Zudem lassen
Fall-Kontroll-Studien keinen Schluss auf eine Ursache-Wirkungsbeziehung zu. In der
SU.VI.MAX-Studie (supplémentation en vitamines et minéraux antioxydants), einer
Interventionsstudie, in der Selen in Kombination mit Antioxidantien und Mineralstoffen
eingesetzt wurde, konnte auch keine signifikante Reduktion eines Prostatakrebsrisikos
belegt werden (Meyer et al., 2005). Weiterhin konnte in der „Nurses’ Health-Studie“ kein
Zusammenhang zwischen Selenaufnahme und Gesamtkrebs und Brustkrebs bei Frauen
festgestellt werden (Garland et al., 1995). Insgesamt zeigten also die großangelegte SELECT-
Studie sowie einige weitere Studien keine Prävention vor Prostatakrebs oder Gesamtkrebs,
während es starke Kritik an der NPC-Studie, in der ein präventiver Effekt auftrat, gibt. Ob
Studien in Ländern mit einer geringeren Selenversorgung als den USA andere Ergebnisse
geliefert hätten, ist fraglich und bleibt offen, da weitere Interventionsstudien aufgrund
Einleitung
11
neuerer Erkenntnisse zum Einfluss von Selen auf das Diabetes Mellitus Typ 2 Risiko
unwahrscheinlich sind.
Einfluss auf das Risiko von Diabetes Mellitus Typ 2
Aktuell wird der Einfluss von Selen auf ein erhöhtes Diabetes Mellitus Typ 2 Risiko diskutiert
und damit auch wieder das Zusammenspiel der prooxidativen und antioxidativen
Eigenschaften des Selens. Die Erkrankung an Diabetes wird mit oxidativem Stress in
Zusammenhang gebracht, sodass Antioxidantien einen postulierten präventiven Effekt
haben sollen. Dies konnte in der SU.VI.MAX-Studie, in der eine Kombination verschiedener
Antioxidantien und Mineralstoffe, darunter auch Selen, verabreicht wurden, nicht bestätigt
werden (Czernichow et al., 2006). Vielmehr wurde in einem Follow-up der NPC-Studie
unerwartet ein erhöhtes Diabetes Mellitus Typ 2 Risiko in der Selen-supplementierten
Gruppe gefunden. Dieser Zusammenhang war im Terzil der Probanden mit den höchsten
Basis-Plasma-Selenspiegeln signifikant (Stranges et al., 2007). In der SELECT-Studie zeigte
sich ebenfalls die Korrelation zwischen Selen und Diabetes, jedoch war diese hier nicht-
signifikant (Lippman et al., 2009). Dies ist vielleicht auf die kürzere Zeit des Follow-up
zurückzuführen. Da zu Beginn der Studie die Basis-Plasma-Selenspiegel nur von ca. 3 % der
Probanden bestimmt wurden, ist zudem eine Auswertung der einzelnen Terzile nicht
möglich. Zudem wurde in der Studie NHANES III (Third National Examination Survey) eine
Korrelation zwischen hohen Selenspiegeln und der Inzidenz von Diabetes in einer US-
amerikanischen Population festgestellt (Bleys et al., 2007; Laclaustra et al., 2009).
Diabetes Mellitus Typ 2 ist mit einer Insulin-Resistenz verbunden. Diese kann sowohl von
den prooxidativen Eigenschaften einiger Selenverbindungen, wie z. B. der Bildung reaktiver
Sauerstoffspezies (Bleys et al., 2007), als auch durch die antioxidativen Eigenschaften erklärt
werden. So wurde eine Insulin-Resistenz in Mäusen beobachtet, welche die Glutathion-
Peroxidase 1 überexprimieren (McClung et al., 2004). In weiteren in vitro-Studien und
Tierexperimenten stellte sich die insulin-antagonistische Protein-Tyrosin-Phosphatase 1B
(PTP1B) als Schlüsselenzym im Zusammenhang zwischen Selen und Diabetes heraus (Müller,
2008). Dieses Enzym wird redox-reguliert, eine Oxidation führt zur Inhibierung während die
Reduktion eine Aktivierung und bei dauerhafter Aktivierung schlussendlich eine Resistenz
gegenüber Insulin verursacht. Zudem wird durch Selen die PTP1B-Expression verstärkt.
Insgesamt scheint ein ausgewogenes Verhältnis aus antioxidativen Effekten, wie die der GPx-
1, sowie prooxidativen Eigenschaften der reduzierbaren Selenverbindungen für den Glucose-
Metabolismus und den Schutz vor Diabetes von Vorteil zu sein. Selenat, das zusätzlich auch
noch eine insulinomimetische Wirkung hat (zusammengefasst in Stapleton, 2000), scheint
dahingehend sehr geeignet zu sein (Müller, 2008).
Einleitung
12
2.2 Tumorsuppressorprotein p53
P53 wurde 1979 erstmals beschrieben (Lane and Crawford, 1979; Linzer and Levine, 1979).
Zunächst wurde p53 eine fördernde Rolle in der malignen Transformation gesunder Zellen zu
Tumorzellen zugeschrieben und erst 1988 wurde es zu den Tumorsuppressoren gezählt
(zusammengefasst in Gannon, et al, 1990). Die Prävalenz von p53-Mutationen ist vom
Tumortyp abhängig und liegt z. B. bei Darmkrebs bei 50 % der Tumoren (Greenblatt, 1994).
2.2.1 Funktion und Struktur
Das Tumorsuppressorprotein p53 spielt vor allem als Transkriptionsfaktor von Genen,
welche die Zellzykluskontrolle, die DNA-Reparatur und die Apoptose regulieren, eine große
Rolle bei der Erhaltung der genomische Integrität. Aber auch über direkte Mechanismen, wie
der Interaktion mit anderen Proteinen, übt p53 seine tumorsuppressive Wirkung aus. In
normalen Zellen wird der Proteingehaltes an p53 durch ständige Degradation relativ gering
gehalten, sodass das Protein Zelltyp-abhängig nur eine Halbwertszeit von 5-20 Minuten hat
(zusammengefasst in Giaccia and Kastan, 1998). Erst nach genotoxischem oder nicht-
genotoxischem Stress wird p53 stabilisiert und akkumuliert im Zellkern.
P53 hat ein Molekulargewicht von 53 k Da, besteht aus 393 Aminosäuren (AS) und wird in
drei Abschnitte, den N-Terminus (AS 1-100), die Core-Domäne (AS 100-300) und den C-
Terminus (AS 300-393), unterteilt (Abbildung 5). Diese formalen Bereiche enthalten
wiederum verschiedene Domänen. So gliedert sich der N-Terminus in die Transaktivierungs-
und eine prolinreiche Domäne (AS 1-42 bzw. 43-100), während die Core-Domäne die DNA-
Bindungsdomäne (AS 200-300) beinhaltet. Der C-Terminus setzt sich aus der
Tetramerisierungs- und Regulationsdomäne (AS 300-360 bzw. 360-393) zusammen.
Die Transaktivierungsdomäne dient zur Steuerung der transkriptionellen Aktivierung oder
Repression der p53-abhängigen Gene, z. B. über die Interaktion mit Transkriptionsfaktoren,
wie TFIID (Thut et al., 1995). Zudem liegt in diesem Bereich auch die Bindungsstelle des
negativen Regulators Mdm2 (Kussie et al., 1996). Namengebend für die prolinreiche Domäne
sind die fünf Wiederholungen der Aminosäureabfolge PXXP, wobei P für Prolin und X für eine
beliebige Aminosäure steht. Dieses Motiv (AS 64-90) ist eine Bindungsstelle für SH3-
Domänen (src homology domain) und somit eine wichtige Struktur für die Protein-Protein-
Interaktion. Fehlt der N-Terminus, können wichtige Gene wie MDM2, Bax und GADD45 nicht
mehr p53-abhängig exprimiert werden (Zhu et al., 1998).
Einleitung
13
1 393
Transaktivierungs-
domäne
Sequenzspezifische DNA-
Bindungsdomäne
Tetramerisierungs-
domäne
Regulations-
domäne
Prolin-reiche
Domäne
Ser
15
42 100 300 350
Cys
242
Cys
238
Cys
176
His
179
Zn
2+
Ser
20
Ser
46
Ser
392
Stabilisierung Apoptose Tetramerisierung
1 393
Transaktivierungs-
domäne
Sequenzspezifische DNA-
Bindungsdomäne
Tetramerisierungs-
domäne
Regulations-
domäne
Prolin-reiche
Domäne
Ser
15
42 100 300 350
Cys
242
Cys
238
Cys
176
His
179
Zn
2+
Ser
20
Ser
46
Ser
392
Stabilisierung Apoptose Tetramerisierung
Transaktivierungs-
domäne
Sequenzspezifische DNA-
Bindungsdomäne
Tetramerisierungs-
domäne
Regulations-
domäne
Prolin-reiche
Domäne
Transaktivierungs-
domäne
Sequenzspezifische DNA-
Bindungsdomäne
Tetramerisierungs-
domäne
Regulations-
domäne
Prolin-reiche
Domäne
Sequenzspezifische DNA-
Bindungsdomäne
Tetramerisierungs-
domäne
Regulations-
domäne
Prolin-reiche
Domäne
Ser
15
42 100 300 350
Cys
242
Cys
238
Cys
176
His
179
Zn
2+
Ser
20
Ser
46
Ser
392
Stabilisierung Apoptose Tetramerisierung
Ser
15
42 100 300 350
Cys
242
Cys
238
Cys
176
His
179
Zn
2+
Ser
20
Ser
46
Ser
392
Stabilisierung Apoptose Tetramerisierung
Abbildung 5: Struktur des Tumorsuppressorproteins p53.
P53 gliedert sich in
verschiedene Domänen. Die Phosphorylierung wichtiger Serin-Reste (Ser) reguliert die
Funktion des Tumorsuppressors. Drei Cysteine (Cys) und ein Histidin (His) koordinieren ein
Zinkion und stabilisieren die Konformation der DNA-Bindungsdomäne.
Weiterhin ist die DNA-Bindungsdomäne entscheidend für die Funktionsfähigkeit des
Transkriptionsfaktors. Innerhalb dieser Domäne wird ein Zinkion über drei Cysteine (Cys 176,
238 und 242) und ein Histidin (His 179) koordiniert (Cho et al., 1994). Diese Zink-bindende
Struktur ist keine „Zinkfinger“-Struktur, wie sie in vielen Transkriptionsfaktoren direkt an der
DNA-Bindung beteiligt ist. Vielmehr stabilisiert das koordinierte Zinkion die Tertiärstruktur
relativ weit auseinander liegender Proteinketten. Die Zinkbindung ist essentiell für die DNA-
Bindungsfähigkeit und abhängig von den Redox-Bedingungen. Oxidationen der an der
Zinkbindung beteiligten Aminosäuren führen zur Entfaltung der DNA-Bindungsdomäne und
zum Verlust der Funktion (Hainaut and Milner, 1993a; Hainaut and Milner, 1993b; Delphin,
1994). Auch Agenzien, welche die Zinkbindung über andere Mechanismen inhibieren, wie
Metall-Chelatoren (Hainaut and Milner, 1993a) oder Cadmium (Méplan et al., 1999; Thuy,
2006; Schwerdtle et al., 2010) inaktivieren den Transkriptionsfaktor. Die Konsensussequenz
der spezifischen DNA-Bindungsdomäne lautet 5’-PuPuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy-3’ (Pu: A/G; Py:
T/A) und muss in zwei Kopien auftreten (El-Deiry et al., 1992).
Im C-Terminus liegt die Tetramerisierungsdomäne, innerhalb derer die Aminosäure 323 bis
355 über hydrophobe Wechselwirkungen für die Tetramerisierung von p53 verantwortlich
sind (Jeffrey et al, 1995). Weiterhin befinden sich Kernexport- und Kernlokalisierungssignale
im C-terminalen Ende von p53. Erst als kernlokalisiertes Tetramer ist der
Transkriptionsfaktor funktionsfähig. Die Regulationsdomäne bindet unspezifisch an DNA-
Strukturmerkmale, wie z. B. Deletionsschlaufen (deletion loop) oder DNA-Enden, und erhöht
daraufhin die spezifische DNA-Bindung der DNA-Bindungsdomäne in der Core-Domäne.
Einleitung
14
2.2.2 Regulation über Phosphorylierung
In normalen Zellen ist p53 inaktiv und hat je nach Zelltyp eine Halbwertszeit von ca. 5-20
Minuten (zusammengefasst in Giaccia and Kastan, 1998). Erst nach nicht-genotoxischem
oder genotoxischem Stress, wie z. B. oxidativem Stress, wird p53 nicht transkriptionell,
sondern über posttranslationale Modifikationen auf der Proteinebene stabilisiert und als
Transkriptionsfaktor aktiviert. Vor allem Phosphorylierungen an Serin- und Threoninresten
durch Kinasen, wie z. B. ATM und ATR, sind von entscheidender Bedeutung (zusammen-
gefasst in Meek, 1998 und Giaccia and Kastan, 1998). Die bekannten Phosphorylierungen am
p53-Protein sind bereits in Abbildung 5 dargestellt. Aber auch andere Modifikationen, wie z.
B. Acetylierungen (Sakaguchi et al., 1998) und Sumoylierungen (Rodriguez et al., 1999),
spielen eine Rolle. Mechanistisch bewirken die Modifikationen eine Veränderung der
Interaktion mit anderen Proteinen, indem Phosphorylierungen die negative Ladung erhöhen,
während Acetylierungen und Sumoylierungen die Ladung am Protein verringern. Zudem wird
diskutiert, ob Phosphorylierungen zu leichten Konformationsänderungen führen, welche die
Stabilität und Aktivität beeinflussen könnten (Shieh et al., 1997).
Die Phosphorylierung von N-terminalen Serinen und Threoninen in der Transaktivierungs-
domäne im N-Terminus von p53 (Serin-6, -9, -15, -20, -33 und -37 sowie Threonin-18) wird
mit einer Stabilisierung des Proteins in Verbindung gebracht (Chehab et al., 2000; Honda et
al., 1999; Pise-Masison et al., 1998; Sakaguchi et al., 1998; Shieh et al., 1997). Sakaguchi et
al. (1998) beschreiben die Phosphorylierung an Threonin-18 als entscheidend für die
Stabilisierung von p53, wobei diese Modifikation am Ende einer Phosphorylierungskaskade
steht und somit weitere Phosphorylierungen, z. B. von Serin-15, notwendig sind (Sakaguchi
et al., 2000). Die negative Ladung der Phosphatgruppen behindert die Interaktion mit der
hydrophoben Bindungstasche des negativen Regulators Mdm2. Dieser bindet an eine
helikale Struktur von p53, die von den Aminosäuren 18 bis 23 gebildet wird (Kussie et al.,
1996). Die Interaktion mit Mdm2 führt zur Ubiquitin-abhängigen, proteasomalen
Degradation von p53. Neben der Stabilisierung von p53 beeinflussen die Phosphorylierungen
im N-Terminus auch die transkriptionelle Aktivität des Tumorsuppressors (Siliciano et al.,
1997), da sie die Interaktion mit verschiedenen Coaktivatoren, wie p300 (Avantaggiati et al.,
1997), verbessern.
In der prolinreichen Region des N-Terminus wird die Phosphorylierung von Serin-46 mit der
Induktion von Apoptose in Verbindung gebracht (siehe Abschnitt 2.2.4). Innerhalb der Core-
Domäne und vor allem der dort enthaltenen DNA-Bindungsdomäne ist wenig über
Phosphorylierungsstellen bekannt. Buschmann et al. (2001) zeigten, dass die
Phosphorylierung an Threonin-81, welches außerhalb der DNA-Bindungsdomäne liegt, die
transkriptionelle Aktivität von p53 erhöht.
Einleitung
15
In der Tetramerisierungsdomäne des C-terminalen Endes von p53 begünstigt die
Phosphorylierung von Serin-392 die Tetramerisierung des Tumorsuppressors (Sakaguchi et
al., 1997). Eine Konformationsänderung ausgelöst durch diese Phosphorylierung soll dabei
die Stabilisierung des Tetramers katalysieren (Hupp, 1999). Dies steigert die Aktivität von
p53 als Transkriptionsfaktor, da tetramerisiertes p53 eine stärkere sequenzspezifische DNA-
Bindung aufweist (Hupp et al., 1993). Auch Dephosphorylierung kann die Aktivität erhöhen.
So wird Serin-376 nach Behandlung mit ionisierender Strahlung dephosphoryliert, wodurch
die sequenzspezifische DNA-Bindungsfähigkeit gesteigert wird (Waterman et al., 1998). Als
Transkriptionsfaktor induziert p53 Gene der Zellzykluskontrolle (p21), der DNA-Reparatur
(p48, XPC) und der Apoptose (Bax).
2.2.3 Rolle von p53 in der DNA-Reparatur
Basenexzisionsreparatur (BER)
Oxidative DNA-Schäden, wie oxidative Basenmodifikationen, Strangbrüche und abasische
Stellen, werden über die Basenexzisionsreparatur repariert. Im Fall von oxidativen
Basenmodifikationen wird zunächst die geschädigte Base von einer DNA-Glykosylase, wie
hOGG1 (8-Oxoguanin-DNA-Glykosylase 1), ausgeschnitten, dann wird durch die
Endonuklease APE1 (Apurin/Apyrimidin-Endonuklease 1) ein Strangbruch gesetzt und durch
die DNA-Polymerase Polß ein neues Nukleotid eingesetzt. Bei der „short patch“-Reparatur
bereinigt Polß das 3’-Ende, sodass die Ligase III in einem Komplex mit XRCC1 (X-ray-repair-
cross-complementing) den Strang wieder ligieren kann. Im Vergleich dazu wird im PCNA-
abhängigen (proliferating cell nuclear antigen) „long patch“-Reparaturweg von der
Polymerase δ ein Oligonukleotid syntethisiert, das 3’-Ende durch die Flap-Endonuklease 1
(FEN-1) bereinigt und der Strang von der DNA-Ligase 1 geschlossen (siehe Abbildung 6)
(zusammengefasst in Hegde et al., 2008).
P53-profiziente Zellen haben eine höhere BER-Kapazität als p53-defiziente Zellen (Achanta
and Huang, 2004). P53 wird in der BER vorwiegend eine direkte Rolle zugeschrieben, da es
im C-Terminus unspezifisch mit schadhafter DNA und im N-Terminus mit den
Reparaturenzymen hOGG1, APE-1 und Polß interagieren kann (Achanta and Huang, 2004;
Zhou et al., 2001). Durch Zusammenführung von hOGG1 mit geschädigter DNA könnte p53
somit an der Schadenserkennung beteiligt sein. In jedem Fall erhöht p53 die Aktivität von
hOGG1. Dies wurde in subzellulären Testsystemen gezeigt und ist somit unabhängig von
einer transkriptionellen Induktion (Achanta and Huang, 2004). Zusätzlich scheint aber auch
die Genexpression von hOGG1 vom p53-Status der Zellen abzuhängen (Chatterjee et al.,
2006).
Einleitung
16
dRp
dRp
Glykosylase: hOGG1
Endonuklease: APE1
Polymerase:
Pol ß
Ligase: LigIII/XRCC1
Polymerase: Pol ß
„short patch“-
Reparatur
„long patch“-
Reparatur
Polymerase:
Pol δ/ε
PCNA
5‘ 3‘
dRpdRp
dRpdRp
Glykosylase: hOGG1
Endonuklease: APE1
Polymerase:
Pol ß
Ligase: LigIII/XRCC1
Polymerase: Pol ß
„short patch“-
Reparatur
„long patch“-
Reparatur
Polymerase:
Pol δ/ε
PCNA
5‘ 3‘
Abbildung 6: Ablauf der Basenexzisionsreparatur.
Oxidative DNA-Schäden können
über die „short patch“- oder die „long patch“-Reparatur prozessiert werden.
Welchen Einfluss p53 auf die Aktivität dieser Reparaturenzyme hat, wird in der Literatur
kontrovers diskutiert. Seo et al. (2002 a) berichten, dass p53 weder zu einer Zunahme des
APE1-Spiegels noch zu einer erhöhten Aktivität führt, während Achanta and Huang (2004)
durchaus eine Steigerung der Aktivität finden. Zudem kann p53 nach starker, Camptothecin-
induzierter DNA-Schädigung als negativer Regulator von APE1 auf der Ebene der
Genexpression fungieren und zur Akkumulation von oxidativen DNA-Schäden führen. Dies
wird als ein Mechanismen diskutiert, über den p53 Apoptose einleiten kann (Zaky et al.,
2008).
Im Falle von Polß soll p53 zur Stabilisierung und Anreicherung beitragen (Seo et al., 2002 a)
und zusätzlich die enzymatischen Reaktionen von Polß begünstigen. Letzteres geschieht über
die Stabilisierung der Bindung von Polß an abasische DNA. Dadurch wird z. B. die Bereinigung
des 3’-Endes, ein limitierender Schritt der BER, begünstigt (Zhou et al., 2001). Cabelof et al.
(2002) zeigten, dass oxidativer Stress zur Stabilisierung von p53, zur Anreicherung von Polß
und einer gesteigerten BER-Kapazität führt. Zudem wäre es denkbar, dass p53 mit seiner
proof-reading-Aktivität die Fehlerrate von Polß senkt.
Einleitung
17
Nukleotidexzisionsreparatur (NER)
Über die NER werden Helix-verzerrende DNA-Schäden repariert. Neben der globalen
genomischen Reparatur (GGR) gibt es die transkriptionsgekoppelte Reparatur (TCR). Letztere
ist nicht im gesamten Genom sondern in den transkribierten Bereichen aktiv und
unterscheidet sich vor allem in der Schadenserkennung. Die GGR gliedert sich in die
Schadenserkennung, die Bildung des Inzisionskomplexes, das Ausschneiden des Schadens,
die Reparatursynthese und die Ligation des Stranges. In diesem komplexen Reparaturweg
mit über 30 beteiligten Proteinen greift p53 vor allem als Transkriptionsfaktor von DDB2 und
XPC ein. Dabei reguliert p53 sowohl die basale Expression als auch die Induktion dieser
beiden an der Schadenserkennung der GGR beteiligten Faktoren nach DNA-Schädigung
(zusammengefasst in Ford, 2005). Ein weiteres Protein, das jedoch p53-unabhängig
transkribiert wird, ist das Zink-bindende XPA. Dieses ist für die Bildung des
Inzisionskomplexes notwendig.
Schnittstellen zwischen der NER und BER
Obwohl über die BER und NER sehr unterschiedliche Schadenstypen repariert werden, gibt
es Schnittstellen zwischen den beiden Reparaturwegen (Abbildung 7). XPC, welches an der
Schadenserkennung während der NER beteiligt ist, scheint zudem die Aktivität und den
Substratumsatz von hOGG1, einer Glykosylase der BER, zu steigern. Angenommen wird, ob
dies auf eine Verdrängung von hOGG1 von der AP-Stelle zurückzuführen ist (D’Errico et al.,
2006). Insgesamt wird die NER als möglicher „Back up“-Mechanismus für die BER diskutiert,
da oxidativer Stress zur Induktion von NER-Genen, wie XPC und XPA, führt (Langie et al.,
2007). Unterstützend dazu wurde gezeigt, dass gewisse Polymorphismen im xpa-Gen zu
höheren Gehalten an Strangbrüchen in Lymphozyten eines mit Asbest und Steinwolle
exponierten Kollektivs (Dušinská et al., 2006). Dies wurde von den Autoren als Beweis für
eine gesenkte BER-Kapazität diskutiert.
Oxidativer
Stress
XPC
XPA
steigert Umsatz von hOGG1
Polymorphismus führt zum
vermehrten Auftreten von
DNA-Strangbrüchen
Oxidativer
Stress
XPC
XPA
steigert Umsatz von hOGG1
Polymorphismus führt zum
vermehrten Auftreten von
DNA-Strangbrüchen
Abbildung 7: Rolle von NER-Proteinen in der BER.
Einleitung
18
2.2.3 Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle
Der Zellzyklus gliedert sich in die Mitose und die Interphase, wobei letztere die G0-, G1-, S-
und G2-Phase umfasst. Sich nicht teilende Zellen verbleiben in der Ruhe-/G0-Phase. In der
G1-Phase bereitet sich die Zelle auf die anschließende Synthese-/S-Phase vor, indem sie z. B.
Nukleotide synthetisiert. Während der S-Phase wird die DNA repliziert und nach der
Vorbereitung in der G2-Phase, erfolgt die Mitose. Die komplexe Regulation des Zellzyklus
wird vorwiegend von Cyclin-abhängigen Kinasen (Cdks) und deren Aktivierung durch
Komplexbildung mit den dazugehörigen Cyclinen bestimmt. Dazu kommen aktivierende
Prozesse, wie z. B. die Phosphorylierung der Cdks durch Cdk-aktivierende Kinasen (CAK), und
inhibierenden Prozesse, wie z. B. die direkte Protein-Protein-Interaktion mit p21 (zusammen-
gefasst in Malumbres and Barbacid, 2005). Die Substrate der aktivierten Cdks sind z. B.
Transkriptionsfaktoren, die nach Phosphorylierung Proteine zum Fortschreiten des
Zellzykluses induzieren. Der Zellzyklus kann jedoch an Kontrollpunkten in der G1-, S- und G2-
Phase angehalten werden. Dies geschieht z. B. nach DNA-Schädigung, um der DNA-
Reparatur Zeit zu verschaffen und eine Replikation geschädigter DNA bzw. eine Zellteilung
mit geschädigtem Genom zu verhindern. Bei der Aktivierung der Kontrollpunkte zum Ende
der G1- und der G2-Phase wird p53 eine große Bedeutung zugesprochen, wobei zum Teil
auch p53-unabhängige Mechanismen existieren. Im Vergleich dazu ist eine Beteiligung von
p53 am Intra-S-Phase-Arrest noch unklar und wird sehr kontrovers diskutiert
(zusammengefasst in Giono and Manfredi, 2006). Die Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle
ist Abbildung 8 zusammengefasst.
Bei der Aktivierung des G1-Kontrollpunktes spielt p53 eine wichtige Rolle als
Transkriptionsfaktor von p21. P21 inhibiert die Aktivierung des CycA/Cdk2- und des
CycE/Cdk2-Komplexes, sodass das Retinoblastom-Protein (pRB) von der Cdk2 nicht
phosphoryliert wird. Das hypophosphorylierte pRB bindet und inhibiert den Transkriptions-
faktor E2F, sodass die Expression wichtiger Gene zum Fortgang des Zellzykluses in die S-
Phase nicht stattfindet (zusammengefasst in Giono and Manfredi, 2006). Zudem kann das
Zellzyklusprotein GADD45, das p53-abhängig und p53-unabhängig induziert werden kann,
zur Arretierung in der G1-Phase führen, wobei der Mechanismus noch unklar ist (Smith et
al., 1994).
Der Intra-S-Phase-Arrest ist meist weniger persistent als die Arreste in der G1- und
G2-Phase und wird in der Literatur oft als p53-unabhängig beschrieben (zusammengefasst in
Iliakis et al., 2003). Trotzdem gibt es Hinweise darauf, dass p53 zum Teil doch involviert ist, z.
B. beim durch Cdc7-induzierten S-Phase-Arrest (zusammengefasst in Giono and Manfredi,
2006). Ebenso ist die Rolle von p21 im S-Phase-Arrest widersprüchlich. P21 ist ein Inhibitor
von PCNA (proliferating cell nuclear antigen), welches an der Replikation aber auch an der
Einleitung
19
DNA-Reparatur beteiligt ist. Allgemein wird von einer gezielten Degradation von p21
während des S-Phase-Arrests ausgegangen. In Abwesenheit von p21 kann somit die PCNA-
abhängige Reparatur von DNA-Schäden während eines transienten S-Phase-Arrests
ablaufen. Es wird diskutiert, ob bei stark geschädigtem Genom eine p53-abhängige Induktion
von p21 und Hemmung von PCNA für eine Verlängerung und Persistenz des S-Phase-Arrests
sorgt (zusammengefasst in Gottifredi and Prives, 2005).
p53
P
GADD45
?
G1
S
G2
M
p53
P
p21
CycE/Cdk2
E2F E2F/pRB
p53
P
p21
p21 PCNA
?
GADD45
14-3-3δ
Cdk1
Cdc7
?
?
G0
GADD45
?
?
p53
P
p53
P
GADD45
?
G1
S
G2
M
p53
P
p21
CycE/Cdk2
E2F E2F/pRB
p53
P
p21
p21 PCNA
?
GADD45
14-3-3δ
Cdk1
Cdc7
?
?
G0
GADD45
?
?
GADD45
?
G1
S
G2
M
p53
P
p21
CycE/Cdk2
E2F E2F/pRB
p53
P
p21
p21 PCNA
?
GADD45
14-3-3δ
Cdk1
Cdc7
?
?
G0
GADD45
?
?
?
G1
S
G2
M
p53
P
p53
P
p21
CycE/Cdk2
E2F E2F/pRB
p53
P
p53
P
p21
p21 PCNA
?
GADD45
14-3-3δ
Cdk1
Cdc7
?
?
G0
GADD45
?
?
Abbildung 8: Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle
Weiterhin kann der Zellzyklus p53-abhängig in der G2-Phase vor dem Eintritt in die Mitose
angehalten werden. Die für die Überschreitung dieses Checkpoints und zum Eintritt in die
Mitose entscheidende Cdk1, kann von p53 durch verschiedenste Mechanismen inhibiert
werden. Zum einen hemmt p53 die Expression der Cdk2 selbst aber auch des aktivierenden
Cyclins B1. Zum anderen inhibieren die p53-abhängig induzierten Proteine GADD45, p21 und
14-3-3σ die Cdc2. Ein p53-unabhängiger G2-Arrest kann z. B. über Chk1 und 2 hervorgerufen
werden, die von ATM und ATR aktiviert werden. Ein weiteres Substrat dieser Kinasen ist p53,
sodass unterschiedliche Wege zur Aktivierung des Kontrollpunktes führten (zusammen-
gefasst in Taylor and Stark, 2001).
Einleitung
20
2.2.4 Rolle von p53 in der Apoptose
Es gibt zahlreiche Formen von Zelltod, von denen die Apoptose und die Nekrose die
bekanntesten sind (zusammengefasst in Kroemer et al., 2009). Im Gegensatz zur Nekrose ist
die Apoptose ein aktiver, genetisch gesteuerter Prozess, bei dem die Zellmembran
kontrahiert, das Zytoskelett abgebaut, Ausstülpungen der Plasmamembran abgeschnürt und
die DNA in membranumschlossenen, sogenannten apoptotischen Körperchen verpackt
werden.
Die Apoptose kann durch extrinsische (z. B. Sauerstoffmangel) oder intrinsische (z. B. DNA-
Schäden) Signale ausgelöst werden. Beim extrinsischen Signalweg werden nach Bindung
eines Liganden an einen membrangebundenen Todesrezeptor kaskadenartig zunächst die
Initiator-Caspasen (cysteinyl-aspartate specific protease) und anschließend die Effektor-
Caspasen aktiviert. Die Aufgabe letzterer besteht in der proteolytischen Deaktivierung von
antiapoptotischen Proteinen, der proteolytischen Aktivierung von apoptotischen Proteinen,
wie z. B. DNasen und der Degradation von Strukturproteinen, wie z. B. Aktin (zusammen-
gefasst in Fan et al., 2005). Der intrinsische Signalweg geht von den Mitochondrien aus. Das
Membranpotential der Mitochondrien wird vom Verhältnis von antiapoptotischen (z. B. Bcl-
2) zu proapoptotischen (z. B. Bax (Bcl-2-associated X protein)) Proteinen der Bcl2-Familie
bestimmt. Überwiegen die proapoptotischen Proteine wird die Membran permeabel für
Cytochrom C, welches aus dem Intermembranraum ins Zytoplasma ausgeschüttet wird. Dort
bildet Cytochrom C mit weiteren Faktoren das Apoptosom, welches die Effektor-Caspasen
aktiviert und somit die oben beschriebenen Mechanismen auslöst. Daneben kann die
intrinsische Apoptose jedoch auch Caspase-unabhängig über AIF (apoptosis inducing factor)
ablaufen. Das mitochondriale Flavoprotein wird während der Apoptose ins Zytosol
ausgeschüttet dort aktiviert und transloziert als DNase in den Kern, wo es die DNA-
Fragmentierung einleitet (zusammengefasst in Huerta et al., 2007). In der Literatur wird AIF
vorwiegend mit der Caspase-unabhängigen Apoptose in Zusammenhang gebracht, wobei
auch Verknüpfungspunkte mit der Caspase-Kaskade diskutiert werden (zusammengefasst in
Candé et al., 2002; Cregan et al., 2004).
P53 ist ein Schlüsselprotein in der durch DNA-Schäden induzierten Apoptose (zusammen-
gefasst in Roos and Kaina, 2006). Es wird angenommen, dass z. B. bei einer geringen Anzahl
an Doppelstrangbrüchen der Gehalt an p53 nur so stark ansteigt, dass das Zellzyklus-
kontrollgen p21 exprimiert wird. Erst wenn hohe Schadensraten zu einer Akkumulation von
p53 über einen Schwellenwert führen, werden dieser Hypothese nach proapoptotische Gene
induziert (zusammengefasst in Roos and Kaina, 2006). Es wird angenommen, dass die
Phosphorylierung von p53 an Serin-46 essentiell für die transkriptionelle Aktivierung
proapoptotischer Gene ist (Oda et al., 2000). Kurihara et al. (2007) zeigen jedoch, dass diese
Einleitung
21
Phosphorylierung nicht immer zur Apoptose, sondern zum Teil auch zur Seneszenz führen
kann. Zu den p53-abhängigen proapoptotischen Genen gehören z. B. die Todesrezeptoren
Fas/Apo1 (TNF) und Killer/DR5 (TRAIL), Bax, PUMA (p53 upregulated modulator of
apoptosis), NOXA, PIGs (p53 induced genes), IGF-BP3, p53AIP1 (p53-regulated apoptosis-
inducing protein1), PAG608 und p85 (zusammengefasst in Moll and Zaika, 2001). Die basale
Expression von AIF ist in p53-profizienten Zellen stärker, wobei p53 nach DNA-Schädigung
nicht zu einer weiteren Induktion von AIF führt (Stambolsky et al., 2006). Zudem ist p53 an
der Kernlokalisation von AIF beteiligt, da die Ausschüttung von AIF aus den Mitochondrien in
das Zytoplasma z. B. von Bax induziert werden kann (Cregan et al., 2002). P53-abhängige
Apoptose kann jedoch trotz gehemmter transkriptioneller Aktivierung proapoptotischer
Gene ablaufen, sodass auch andere Mechanismen ablaufen müssen. Einer davon ist die
transkriptionelle Repression von antiapoptotischen Genen, wie Bcl-2, MAP4 und Galectin-3
(Cecchinelli, B., 2006; zusammengefasst in Ho and Benchimol, 2003), und Genen, die DNA-
Reparaturproteine codieren, wie APE1 (Zaky et al. 2008; siehe Abschnitt 2.2.3), durch p53.
p53
Transkription
Repression
Direkte
Interaktion
Bax, NOXA, PIGs,
PUMA, Fas/Apo1,
Killer-DR5 etc.
Bcl-2, APE1,
Galectin-3,
MAP4 etc.
Bindung von Bcl-2,
Transfer von Fas,
ROS
p53
Transkription
Repression
Direkte
Interaktion
Bax, NOXA, PIGs,
PUMA, Fas/Apo1,
Killer-DR5 etc.
Bcl-2, APE1,
Galectin-3,
MAP4 etc.
Bindung von Bcl-2,
Transfer von Fas,
ROS
Abbildung 9: Rolle von p53 in der Apoptose.
P53 kann über transkriptionelle
Induktion oder Repression von Genen bzw. direkte Interaktionen mit Proteinen Apoptose
einleiten.
Neben den transkriptionellen Mechanismen werden auch direkte Einflüsse auf das
mitochondriale Membranpotential durch Bindung an antiapoptotische Proteine der Bcl-2-
Familie (Mihara et al., 2003), den Transfer von bestehenden Fas-Proteinen zur
Kernmembran, die Generation von ROS und eine FADD-unabhängige Aktivierung von
Caspase-8 diskutiert (zusammengefasst in Schuler and Green, 2001). Die Rolle von p53 in der
Apoptose ist in Abbildung 9 zusammengefasst.
Einleitung
22
2.3 Bedeutung von Selen für die genomische Stabilität
Die Versorgung der deutschen Bevölkerung mit dem Spurenelement Selen liegt nur im
unteren bis mittleren Bereich der empfohlenen Zufuhrmenge von 30-70 µg/Tag, welche die
Deutsche Gesellschaft für Ernährung als Schätzwert angibt (DGE, 2000; BfR, 2004 a). Es stellt
sich deshalb die Frage, ob eine Supplementation sinnvoll ist und welche Selenverbindung
dafür geeignet wäre. Häufig in der Nahrungsergänzung angeboten werden das anorganische,
reduzierbare Natriumselenit oder das organische, vollständig reduzierte Selenomethionin in
Form von Selenhefe. Diese beiden Selenverbindungen unterscheiden sich in der
Oxidationsstufe des Selenatoms sowie in ihrer Aufnahme, ihrem Metabolismus und ihren
Eigenschaften. Aufgrund der antioxidativen Wirkung des Selens, als essentieller Bestandteil
der plasmatischen Glutathion-Peroxidase, werden diesem Spurenelement viele positive
Wirkungen auf die menschliche Gesundheit zugeschrieben. Postuliert werden z. B.
präventive Effekte auf kardiovaskuläre Erkrankung und Krebsentstehung, wobei Studien zur
Krebsprävention uneinheitlich sind (siehe Abschnitt 2.1.5). Neben den antioxidativen
Eigenschaften werden hinsichtlich der postulierten chemopräventiven Wirkungen zudem
Selenoprotein-unabhängige, zum Teil prooxidative Mechanismen diskutiert, wie der Einfluss
auf die Regulation der Zellzykluskontrolle und der Zinkhomöostase (Chen and Maret, 2001)
sowie auf die Induktion von Apoptose, DNA-Reparatur (Seo et al., 2002 b) oder Phase-II-
Enzymen (zusammengefasst in Brigelius-Flohé, 2008). Für Redox-Reaktionen ist Selen
geeignet, da es in den Oxidationsstufen von –II bis +VI vorliegen kann. Dabei ist die
Begünstigung der genannten prooxidativen Mechanismen vor allem durch reduzierbare
Selenverbindungen oder reaktive Zwischenmetabolite wie Hydrogenselenid denkbar.
Mechanistisch kann dabei die Modifikation von Thiolen an Proteinen zugrunde liegen, wie
sie z. B. bei der Redox-Regulation von Transkriptionsfaktoren eine Rolle spielt (zusammen-
gefasst in Jackson and Combs, 2008). Entsprechend könnte die Bereitstellung von Zink aus
dem Zinkspeicherprotein Metallothionein, welches sieben Zinkionen über 20 Cysteine
koordinieren kann, ablaufen. Jacob et al. (1999) zeigten, dass reduzierbare Selen-
verbindungen im isolierten System auch im Überschuss von reduziertem Glutathion in der
Lage waren, Zink aus Metallothionein freizusetzen. Damit werden jedoch auch oxidative
Schädigungen empfindlicher Strukturen, wie der DNA oder von Proteinen, möglich. So
belegen Studien unserer Arbeitsgruppe, dass reduzierbare Selenverbindungen oxidative
DNA-Schäden induzieren und Zink aus den isolierten Zinkfingerproteinen Fpg und XPA
freisetzten können (Blessing et al., 2004; Hall, 2008). Die Interaktion mit Reparaturproteinen
könnte eine Hemmung von DNA-Reparaturwegen zur Folge haben. Z. B. ist XPA an der
Reparatur Helix-verzerrender DNA-Schäden, der NER, beteiligt. Bei der Betrachtung der
Reparatur von Benzo[a]pyren (BPDE)-induzierter DNA-Schäden zeigte sich, dass
Einleitung
23
Natriumselenit in vergleichsweise geringen Konzentrationen und Selenomethionin in
zytotoxischen Konzentrationen die Reparatur der BPDE-Addukte hemmen (Hall, 2008).
Demgegenüber stehen Arbeiten von Seo et al. (2002), in denen Selenomethionin die NER-
Kapazität nach UV-Schädigung p53-abhängig verstärkte. Dies wurde auf die Generierung
einer reduktiven Umgebung zurückgeführt, welche die Oxidation von Thiolgruppen
verhindert und damit die DNA-Bindungsfähigkeit des Tumorsuppressorproteins p53 steigert.
Insgesamt stellen die Zink-bindenden Thiole von p53 jedoch auch Angriffspunkte für die
prooxidative Wirkung reduzierbarer Selenverbindungen dar. Dadurch können p53-abhängige
Mechanismen wie Zellzykluskontrolle, verschiedene DNA-Reparaturwege oder Apoptose
inhibiert werden. Das Redox-aktive Selen kann demnach in Form seiner Verbindungen
unterschiedliche Eigenschaften haben und so in unterschiedlichster Weise in die Redox-
Regulation der Zelle eingreifen. Ein gut reguliertes Verhältnis zwischen antioxidativen und
prooxidativen Kapazitäten könnte dabei entscheidend für die Erhaltung der genomischen
Stabilität sein.
Fragestellung
24
3 Fragestellung
Es wird kontrovers diskutiert, ob die deutsche Bevölkerung ausreichend mit dem
Spurenelement Selen versorgt ist oder ob eine Supplementation zu empfehlen ist. Es ist eine
Vielzahl von selenhaltigen Nahrungsergänzungsmitteln erhältlich, die mit der antioxidativen
Wirkung des Selens als Bestandteil der Selenoproteine, wie z. B. der plasmatischen
Glutathion-Peroxidase, werben. Dabei werden verschiedene Selenquellen mit differierenden
Eigenschaften eingesetzt, wie Selenhefe, die hauptsächlich die Aminosäure Selenomethionin
enthält, oder anorganische Salze, wie Natriumselenit. Während das Selen im
Selenomethionin vollständig reduziert vorliegt, kann es im Natriumselenit reduziert werden.
Das Redox-aktive Element kann jedoch in Form von reduzierbaren Selenverbindungen auch
prooxidative Einflüsse auf sensitive Strukturen von Proteinen, wie Zink-bindene Thiole, oder
der DNA ausüben. Vorangegangene Untersuchungen der Arbeitsgruppe belegen die
Oxidation der isolierten Zinkfingerproteine Fpg und XPA durch reduzierbare
Selenverbindungen (Blessing et al., 2004; Hall, 2008). Eine Interaktion mit DNA-
Reparaturproteinen oder Transkriptionsfaktoren könnte die genomische Stabilität
beeinflussen.
Im Fokus dieser Arbeit steht die Integrität und Funktion des Tumorsuppressorproteins p53,
das in seiner DNA-Bindungsdomäne ebenfalls eine Zink-bindende Struktur enthält. Nach
DNA-Schädigung induziert p53 als Transkriptionsfaktor Gene der Zellzykluskontrolle, der
DNA-Reparatur und der Apoptose. P53 spielt somit eine entscheidende Rolle bei der
Erhaltung der genomischen Stabilität und dementsprechend steht seine Inaktivierung, z. B.
durch Mutationen, im Zusammenhang mit der Entstehung von Krebs. Zunächst soll in dieser
Arbeit ein direkter Einfluss von Natriumselenit und Selenomethionin auf die intakte
Konformation des Tumorsuppressors in einem subzellulären System untersucht werden.
Eine mögliche Inaktivierung von p53 soll daraufhin im zellulären System verfolgt werden. Als
Modellsystem dienen HCT116 Kolonkarzinomzellen, die p53 exprimieren, sowie deren
isogene, p53-defiziente Zelllinie. Zunächst sollen in beiden Zelllinien grundlegende
Endpunkte wie die Zytotoxizität und die Aufnahme der Selenverbindungen betrachtet
werden. Als weiterer Parameter für prooxidative Mechanismen werden oxidative DNA-
Schäden quantifiziert, auch hier steht der Einfluss des p53-Status der Zellen im Vordergrund.
Als Folge von zytotoxischen und genotoxischen Effekten soll eine Stabilisierung und
Phosphorylierung von p53 sowie die Einleitung tumorsuppressiver Reaktionen untersucht
werden. Dabei wird wiederum die p53-Abhängigkeit der zellulären Schadensantwort
ermittelt. Als Endpunkte werden dafür die Einleitung von Zellzyklusarresten, die Induktion
von Zellzykluskontrollproteinen sowie DNA-Reparaturproteinen auf Gen- und Proteinebene
Fragestellung
25
und die Einleitung von Apoptose herangezogen. Die Induktion der Apoptose soll zudem auch
mechanistisch näher betrachtet werden, wofür mehrere geeignete Methoden ausgewählt
werden. Z. B. wird ein real time RT-PCR-System zur Bestimmung der Genexpression des
proapoptotischen Proteins Bax etabliert.
Um zelltypspezifische Unterschiede, z. B. in der Zytotoxizität oder der Aufnahme der beiden
Selenverbindungen, zu erfassen, werden A549 Lungenadenokarzinomzellen zum Vergleich
herangezogen. Daneben wird der Einfluss der Oxidationsstufe des Selens durch Vergleiche
mit Phenylseleninsäure näher betrachtet. Das Selenatom dieser Selenverbindung ist
ebenfalls reduzierbar, hat jedoch eine niedrigere Oxidationsstufe als im Natriumselenit.
Insgesamt soll in dieser Arbeit der Einfluss von Natriumselenit und Selenomethionin auf p53
sowie die Rolle des Tumorsuppressors bei der zellulären Antwort auf diese Selen-
verbindungen untersucht werden.
Material und Methoden
26
4 Material und Methoden
4.1 Zellkultur
Die verwendeten Chemikalien, Lösungen und Puffer sowie Geräte und Verbrauchs-
materialien sind im Anhang aufgelistet.
4.1.1 Zelllinien
In dieser Arbeit wurden p53-profiziente HCT116 Kolonkarzinomzellen sowie die isogene p53-
defiziente Knock-out-Zelllinie (Bunz et al., 1998) verwendet. HCT116 Zellen haben einen
Defekt im Mismatch-Reparaturweg (Parsons, 1993). Zudem wurden A549 Lungenadeno-
karzinomzellen eingesetzt, die ebenfalls Wildtyp-p53 exprimieren. A549 Zellen weisen eine
Mutation im Protoonkogen K-ras auf (Imai et al, 1994) und sind nicht in der Lage, das am
Zellzyklus beteiligte Gen p16 zu exprimieren (Otterson et al, 1994).
4.1.2 Kulturbedingung und Behandlung
Die verwendeten Zelllinien wurden im Zellkulturmedium DMEM, versetzt mit 10 % fötalem
Kälberserum (FKS) sowie 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, bei 37 °C,
5 % Kohlendioxid und 100 % Luftfeuchte kultiviert. Die adhärent als Monolayer wachsenden
Zellen wurden zwei- bis dreimal pro Woche vereinzelt und weitergesetzt. Dazu wurde das
Zellkulturmedium abgesaugt, die Zellen mit Trypsin gespült, erneut für 30 s mit Trypsin
versetzt und wiederum abgesaugt. Die HCT116 Zelllinien wurden dann für etwa 2 min und
die A549 Zellen für etwa 3 min in den Brutschrank gestellt. Die Zellen wurden in frischem
Zellkulturmedium aufgenommen und Aliquots in neue Zellkulturschalen überführt. Die
Zellen wurden dabei ggf. mit einem automatischen Zellzählgerät gezählt (Casy). Nach etwa
zwanzig Passagen wurden die Zellen entsorgt und neue Zellen in Kultur genommen. Dazu
wurden die HCT116 Zelllinien in einem Einfriermedium bestehend aus 70 % DMEM versetzt
mit FKS und Antibiotika, 20 % FKS und 10 % DMSO und die A549 Zellen in 90 % FKS und 10 %
DMSO bei -196 °C in flüssigem Stickstoff gelagert.
Für das sterile Arbeiten wurden Medien, Puffer und Lösungen sterilfiltriert, Glaspipetten
heißsterilisiert sowie Schott-Flaschen mit Kunststoffdeckeln und Verbrauchsmaterialien, wie
Pipettenspitzen, autoklaviert.
Material und Methoden
27
Zur Inkubation der Zellen wurden mit bidestilliertem Wasser Stammlösungen mit
Konzentrationen von 100 mM Selenomethionin, 10 mM Natriumselenit bzw. 10 mM
Phenylseleninsäure hergestellt und durch einen Spritzenfilter sterilfiltriert. Die
Stammlösungen wurden bei 4 °C gelagert bzw. im Falle der Phenylseleninsäure immer frisch
angesetzt. Aus den Stammlösungen wurden mit sterilem, bidestilliertem Wasser
Verdünnungen hergestellt, von denen entsprechende Mengen in das Kulturmedium gegeben
wurden.
4.2 Koloniebildungsfähigkeit
Während die Bestimmung der Zellzahl nach Inkubation der Zellen etwas über die akute
Zytotoxizität aussagt, werden durch die Koloniebildungsfähigkeit die längerfristigen Effekte
erfasst.
Dafür wurden 3,5 x 10
5
A549 oder HCT116 Zellen in Zellkulturschalen (60 mm) ausgesät.
Nach 24 h wurden die Zellen mit der jeweiligen Verbindung inkubiert. Nach 24 h Inkubation
wurden die Zellen abgelöst, mit einem automatischen Zellzählgerät (Casy) gezählt und
mindestens 1:20 in Zellkulturmedium verdünnt. Es wurden dreimal 300 Zellen in Schalen
(60 mm) weitergesetzt und für 7 bis 9 Tage zu mit bloßem Auge sichtbaren Kolonien
wachsen gelassen. Danach wurde das Zellkulturmedium abgesaugt, die Schalen mit 2 ml PBS
versetzt und erneut abgesaugt. Die Zellen wurden mit 2 ml Ethanol (-20 °C) ca. 5 min fixiert
und nach Absaugen des Ethanols mit Giemsa-Lösung (5 % in Wasser) für 30 min gefärbt. Die
Färbelösung wurde abgegossen und die Schalen mit destilliertem Wasser gewaschen. Die
Kolonien wurden ausgezählt und auf Kontrollzellen bezogen als „% der Kontrolle“
angegeben.
4.3 Aufnahmeuntersuchung mittels AAS
Mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) wurde die intrazelluläre Selenkonzentration
nach einer nassen, sauren Veraschung von Zellpellets bestimmt. Diese Methode beruht auf
der Resonanzabsorption von Gasen im atomaren Zustand. Durch die Absorption von
Strahlung einer für das Element charakteristischen Wellenlänge, gehen Elektronen in einen
angeregten Zustand über. Als Strahlungsquelle diente in dieser Arbeit eine elektrodenlose
Entladungslampe (EDL). Die Atomisierung fand in einem Graphitrohrofen statt.
Material und Methoden
28
Zellkultur und Aufarbeitung
Es wurden 1 x 10
6
A549 oder HCT116 Zellen in Zellkulturschalen (10 cm) ausgesät. Nach 24 h
folgten 24 h Inkubation mit der jeweiligen Verbindung. Danach wurden die Zellen mit
Trypsin abgelöst, mit 5 ml Zellkulturmedium aufgenommen, in ein 15 ml-Röhrchen überführt
und bei 4 °C und 314 g für 4 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 5 ml PBS II (4 °C)
resuspendiert und die Zellzahl, sowie das mittlere Zellvolumen am Zellzählgerät (Casy)
bestimmt. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Pellet mit 750 µl PBS II in ein 1,5 ml-
Reaktionsgefäß überführt. Das Röhrchen wurde mit weitern 750 µl PBS II gespült und die
Fraktionen vereinigt. Anschließend wurde bei 1000 g und 4 °C für 4 min zentrifugiert und das
Pellet bis zum Zellaufschluss bei -20 °C gelagert.
Für den Aufschluss der Zellen wurden die Pellets mit 500 µl eines 1:1-Gemisches aus
65 %iger HNO
3
und 30 %igem H
2
O
2
versetzt und auf einem Thermoschüttler zunächst bei
65 °C für 30 min und dann bei 95 °C für 7-10 h verascht. Die Asche wurde in bidestilliertem
Wasser aufgenommen. Die Lagerung der Probenlösung bis zur Messung erfolgte bei 4 °C.
AAS-Messung
Die Messungen wurden an einem Graphitrohrofen-Atomabsorptionsspektrometer
(AAnalyst800, Perkin-Elmer) durchgeführt. Die Messung und die Signalauswertung erfolgten
mithilfe der Software AA Winlab32. Es wurde über die Peakflächen quantifiziert. Das
verwendete Temperaturprogramm ist in Tabelle 1 aufgeführt. Argon wurde als Schutzgas
verwendet. Es wurde eine 5-Punkt-Kalibrierung im Bereich von 2–10 µg Se/l durch
Verdünnung einer Selen-Atomspektroskopie-Standardlösung (c
Se
=100 µg/l; Fluka) mit 0,14 N
HNO
3
vorgenommen. Jeweils 20 µl der Probenlösungen wurden mit 5 µl Modifier-Lösung
(0,005 mg Palladium, 0,003 mg Magnesium pro Messung) mittels AAS-Autosampler AS800 in
das Graphitrohr pipettiert.
Tabelle 1: Temperaturprogramm
Schritt Temperatur
[°C]
Anstiegszeit
[s]
Haltezeit
[s]
Gasfluss
[ml/min]
Trocknung der Probe
110 1 10 250
Trocknung der Probe
130 35 30 250
Pyrolyse 1200 10 30 250
Atomisierung 2000 0 3 0
Ausheizen 2450 1 3 250
Material und Methoden
29
Die Nachweisgrenze betrug 0,2 µg Selen/l, die Erfassungsgrenze 0,4 µg Selen/l und die
Bestimmungsgrenze 0,6 µg Selen/l. Die Wiederfindung lag bei allen verwendeten Zelllinien
im Mittel bei 74 % (Schneider, 2009).
4.4 Immunologischer Nachweis zellulärer Proteine
4.4.1 Western Blot
Nach gelelektrophoretischer Auftrennung lassen sich Proteine auf eine Membran
transferieren, mittels spezifischer Antikörper detektieren und über Chemilumineszenz
densitometrisch quantifizieren.
Präparation der Proteinextrakte
Es wurden 1 x 10
6
A549 oder HCT116 Zellen in Zellkulturschalen (100 mm) ausgesät und
nach 24 h mit der jeweiligen Verbindung inkubiert. Nach der Inkubationszeit (24 h oder 45 h)
wurden die Zellen mit Trypsin abgelöst, in PBS, versetzt mit 5 % FKS, aufgenommen und in
einem 15 ml-Röhrchen bei 340 g und 4 °C für 4 min zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 1 ml
PBS gewaschen, in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß überführt und bei 2500 g und 4 °C für 3 min
zentrifugiert. Für die Lyse wurde das Pellet in 100 µl RIPA-Puffer aufgenommen und 15 min
auf Eis geschüttelt. Nach einer Zentrifugation bei 16000 g und 4 °C für 20 min wurde der
Proteinextrakt abgenommen.
Proteingehaltsbestimmung
Die Proteinkonzentration wurde nach Bradford bestimmt. Diese photometrische Messung
beruht auf der Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffes Coomassie bei der
Komplexbildung mit Proteinen. Dazu wurden die Proteinextrakte mindestens 1:150
verdünnt, davon je 20 µl in eine 96-Lochplatte pipettiert und mit 180 µl verdünntem
Bradford-Reagenz (Mastermix: Probenzahl x (40 µl + 140 µl dest. Wasser); Bio-Rad-Protein-
Assay-Reagenz) versetzt. Zur Quantifizierung wurde jeweils eine Kalibrierung aus
Rinderserumalbumin (BSA) mit den Konzentrationen 0, 10, 25, 50 und 75 µg/ml mitgeführt.
Nach 5 min wurde die Absorption bei 595 nm am Mikrotiterplattenlesegerät (TECAN Spektra
Fluor) gemessen.
Die Proben wurden mit Wasser, Ladepuffer (1:5) und DTT (1:20) (beides Fermentas) versetzt,
sodass eine Endkonzentration von 3 µg Protein/µl resultierte. Es folgte eine 5 minütige
Denaturierung bei 95 °C im Heizschüttler.
Material und Methoden
30
Elektrophorese und Western Blot
Es wurden Gele (8 x 10 cm) bestehend aus einem 12 %igen Trenn- und 4 %igen Sammelgel
hergestellt. Die Elektrophoresekammer wurde mit zwei Gelen bestückt und mit Lämmli-
Laufpuffer gefüllt. Es wurden pro Probe 45 µg Protein und in einer Tasche 3 µl eines
Molekulargewichtsmarkers (Fermentas) aufgetragen. Die Gelelektrophorese erfolgte bis zum
Übergang ins Trenngel bei 80 V (ca. 30 min), anschließend für ca. 2 h bei 100 V.
Nach Abbruch der Elektrophorese wurde das Sammelgel entfernt und das Trenngel in
Transferpuffer equilibriert. Die PVDF-Membran wurde auf Größe des Trenngels
zugeschnitten und 10 s in Methanol, 5 min in destilliertem Wasser und 20 min in
Transferpuffer geschwenkt. Zugeschnittenes Whatman-Papier (6 Stück je Gel) wurde in
Transferpuffer getränkt.
Für den Transfer wurden Stapel aus drei Whatman-Papieren, der Membran, dem Gel und
erneut drei Whatman-Papieren in eine Semidry-Blot-Apparatur eingebracht. Die Proteine
wurden für 1 h bei 1,2 mA pro cm
2
auf die Membran transferiert. Anschließend wurde die
Membran mit PBS gespült und 1 h in Blockierlösung gegeben.
Detektion
Der jeweilige primäre Antikörper wurden in Blockierlösung verdünnt (von 1:500 bis 1:5000;
siehe Anhang 8.3) und mit der Membran in Kunststofffolie eingeschweißt. Es folgte eine
Inkubation über Nacht unter Drehbewegung im Kühlschrank. Die Membran wurde dreimal
5 min in PBS-T (PBS mit 0,05 % Tween 20) gewaschen und 1 h mit dem jeweiligen
sekundären Antikörper (1:2500 verdünnt in Blockierlösung) inkubiert. Dazu wurde die
Membran erneut eingeschweißt und bei Raumtemperatur auf einem Rotator gedreht.
Danach wurde die Membran wiederum dreimal 5 min in PBS-T gewaschen und einmal 2 min
in PBS gespült. Die Membran wurde 1 min mit etwa 750 µl des ECL-Detektionsreagenz
inkubiert. Im Geldokumentationsgerät (LAS 3000; Bildauswertesoftware: Aida, Raytest)
wurde die Chemilumineszenz gemessen. Die Messung beruht auf der Oxidation von Luminol
durch eine Meerrettich-Peroxidase, die an den sekundären Antikörper gekoppelt ist. Das
Substrat wird somit in einen angeregten Zustand überführt, und beim Rückfall in den
Grundzustand wird die Lumineszenz emittiert.
Phosphorylierung von p53
Zur Detektion von bestimmten Phosphorylierungen an p53 wurde das Protokoll
abgewandelt. Anstelle von PBS bzw. PBS-T wurde jeweils TBS bzw. TBS-T (TBS mit 0,1 %
Tween-20) verwendet. Zudem wurde ECL Advance-Detektionsreagenz verwendet, welches
eine sensitivere Detektion ermöglicht. Mit diesem wurde die Membran vor der Messung 5
Material und Methoden
31
min inkubiert. Als Positivkontrolle wurden 0,5 µM Doxorubicin (24 h Inkubation) mitgeführt
(Thompson, 2004).
4.4.2 Konformationsspezifische Immunopräzipitation von p53
Die Wildtyp-Konformation von p53 wird durch ein Zinkion in der DNA-Bindungsdomäne
stabilisiert. Durch Zink-Freisetzung entsteht eine entfaltete, inaktive Konformation. Diese
Konformationen können mittels spezifischer Antikörper in einer Immunopräzipitation (IP)
getrennt werden (Méplan et al., 1999).
Es wurden je 5 x 10
6
A549 Zellen pro Zellkulturschale (150 mm) ausgesät. Nach 48 h wurde
das Medium abgesaugt und zweimal mit je 10 ml kaltem PBS gewaschen. Dieser und die
folgenden Schritte wurden auf Eis, im Kühlschrank oder in einer auf 4 °C gekühlten
Zentrifuge durchgeführt. 500 µl IP-Puffer wurden auf die Zellen gegeben, diese mit dem
Zellschaber geerntet und in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß überführt. Die Schale wurde mit
weiteren 500 µl IP-Puffer gespült, sodass pro Schale etwa 1 ml Zellextrakt erhalten wurden.
Es folgte eine 30 minütige Lyse auf dem Rotor. Im Anschluss folgte die Inkubation mit der
jeweiligen Verbindung und Konzentration für 8 min bei 37 °C. Die Proben wurden 5 min bei
15000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und zur Vorklärung mit einem
unspezifischen Antikörper (normal mouse antigen, 1 µg pro Probe) und 20 µl Protein A/G-
Suspension versetzt. Nach 45 min Inkubation unter Drehbewegung wurden die Proben 2 min
bei 10000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und zur Proteinbestimmung
nach Bradford eingesetzt (siehe Abschnitt 4.4.1). Von jeder Probe wurden zwei Aliquots mit
der gleichen Proteinmenge (zwischen 2000-3000 µg; innerhalb eines Versuchs für alle
Proben die gleiche Proteinmenge) abgenommen und mit IP-Puffer auf gleiches Volumen
gebracht. Für die Immunopräzipitation wurde nun jeweils ein Aliquot mit 1 µg des
Antikörpers spezifisch für die Wildtyp-Konformation (PAb 1620) bzw. für die entfaltete
Konformation (PAb 240) versetzt. Zusätzlich wurden je 15 µl Protein A/G-Suspension
hinzugefügt und die Proben über Nacht auf dem Rotor inkubiert. Das Präzipitat wurde durch
eine 2 minütige Zentrifugation bei 10000 g separiert und zweimal mit je 500 µl IP-Puffer und
einmal mit PBS gewaschen. Das Volumen des Präzipitats wurde bestimmt und entsprechend
mit Lämmli-Ladepuffer (vierfach konzentriert) versetzt, bei 95 °C 10 min denaturiert und
vollständig für die Gelelektrophorese (3 h, 300 V) eingesetzt. Es wurden große Gele (16 x 18
cm) und etwa 4 l Laufpuffer verwendet. Die weitern Schritte wurden analog zum Western
Blot durchgeführt (siehe Abschnitt 4.4.1). Zur Detektion auf der Membran wurde ein
polyklonaler, gegen p53 gerichteter Antikörper (NCL-P53-CM1), der im Kaninchen erzeugt
Material und Methoden
32
wurde, verwendet. Die Verwendung eines monoklonalen, in der Maus generierten p53-
Antikörpers würde die Detektion der p53-Bande stören, da der sekundäre gegen
Mausproteine gerichtete Antikörper zudem die schwere Kette der spezifischen, zur
Immunopräzipitation eingesetzten Antikörper erkennen würde.
4.5 Genexpression
Zur Bestimmung der Expression von Genen wurde die real time Reverse Transkriptase-PCR
(real time RT-PCR) verwendet. Dazu wurde die RNA aus Kontrollzellen und inkubierten Zellen
isoliert und in cDNA umgeschrieben. Mittels spezifischer Primer wurde die relative
Expression von Genen in Bezug auf das Haushaltsgen Glycerinaldehyd-3-phosphat-
dehydrogenase (GAPDH) bestimmt. Zur Quantifizierung wurde der interkalierende DNA-
Farbstoff SYBR® Green eingesetzt. Da dieser Farbstoff unspezifisch doppelsträngige DNA
detektiert, folgte nach jeder PCR eine Schmelzkurvenanalyse des Amplifikats.
Zellkultur
Es wurden 1 x 10
6
HCT116 Zellen in Zellkulturschalen (100 mm) ausgesät und nach 24 h mit
der jeweiligen Verbindung inkubiert. Nach der jeweiligen Inkubationszeit wurden die Zellen
mit Trypsin abgelöst, in PBS, versetzt mit 5 % FKS, aufgenommen und bis zu 5 x 10
6
Zellen in
einem 15 ml-Röhrchen bei 340 g und 4 °C für 4 min zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 1 ml
PBS gewaschen, in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß überführt und bei 850 g und 4 °C für 3 min
zentrifugiert. Die Pellets wurden bei – 20 °C gelagert.
RNA-Isolierung und -Quantifizierung
Zur RNA-Isolierung wurde nach Anleitung des MN Nucleo Spin II-Kits durchgeführt. Die
Durchführung erfolgte bei Raumtemperatur. Nach jedem Zentrifugationsschritt wurde die
Säule in einem neuen Reaktionsgefäß positioniert. Die Pellets wurden mit je 100 µl PBS
resuspendiert und zur Zelllyse mit 350 µl RA1-Puffer und 3,5 µl Mercaptoethanol versetzt
und gründlich auf dem Vibrationsmischer gemischt. Durch fünfmaliges Aufziehen der Proben
durch ein 0,4 mm Kanüle wurden die Proben durch Scherung verflüssigt. Nach Zugabe von
350 µl Ethanol (70 %) wurde wiederum gut gemischt, die Probe auf die Säule gegeben und
30 s bei 7700 g zentrifugiert. Die Säule wurde mit 350 µl Membrane-desalting-buffer (MDB)
gewaschen. Nach 1 min Zentrifugation bei 11500 g fand ein DNA-Verdau statt. Dazu wurde
die Säule mit 95 µl DNase-Lösung (1:10 mit DNase Reaktionspuffer verdünnt) 15 min
inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl RA2-Puffer wurde 30 s bei 7700 g zentrifugiert. Es folgte
ein Waschschritt mit 600 µl RA3-Puffer und eine Zentrifugation für 30 s bei 7700 g. Nach
Zugabe von 250 µl RA2-Puffer wurde für 2 min bei 16000 g zentrifugiert. Zur Elution der RNA
Material und Methoden
33
in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß wurde die Säule zweimal mit je 50 µl RNase-freiem Wasser
versetzt und für je 1 min bei 16000 g zentrifugiert. Die RNA wurde bei – 80 °C gelagert.
Die Quantifizierung der RNA erfolgte durch Messung der Absorption der unverdünnten
Probe bei 260 nm am NanoDrop-Spektralphotometer.
Die Integrität der RNA nach Isolierung mittels des MN Nucleo Spin II-Kitsystems wurde über
eine denaturierende RNA-Elektrophorese geprüft. Die Durchführung erfolgte nach Thuy
(2006).
cDNA-Synthese
Die cDNA-Synthese wurde nach Anleitung des qScript™ cDNA Synthesis Kits durchgeführt. Es
wurden 1 µg RNA jeder Probe mit RNase-freiem Wasser auf 15 µl ergänzt und mit 5 µl eines
Mastermixes aus Reaktionspuffer und Enzym ((4 µl + 1 µl) x Probenzahl) versetzt. Die
Reverse Transkription erfolgte im Thermocycler iCycler (BioRad) nach dem in Tabelle 2
aufgeführten Temperaturprogramm.
Tabelle 2: Temperaturprogramm der cDNA-Synthese
Schritt Temperatur Zeit
Annealing der random Primer 25 °C 5 min
Reverse Transkription 42 °C 30 min
Inaktivierung des Enzyms 85 °C 5 min
Ende 4 °C hold
Real time RT-PCR
Das Reaktionsvolumen der PCR-Ansätze betrug jeweils 25 µl. Zur Detektion wurde der B-R
SYBR® Green SuperMix for iQ™ (Quanta) verwendet, der zweifach konzentriert ist. Zunächst
wurde pro Primersystem ein Mastermix aus SYBR® Green, beiden Primern und Wasser (ad
15 µl) hergestellt. Zudem wurde die DNA 1: 10 mit Wasser verdünnt und jeweils 10 µl pro
Reaktion eingesetzt. Nachfolgend ist ein beispielhaftes Pipettierschema für das GAPDH-
Primersystem dargestellt:
Pipettiervolumen Ausgangskonz. Endkonz.
SYBR® Green SuperMix 12,5 µl x Probenzahl 2fach 1fach
Primer (je forward/revers) 0,5 µl x Probenzahl 10 pmol/µl 0,2 µM
Wasser (ad 25 µl) 1,5 µl x Probenzahl
cDNA 1 µl x Probenzahl
Wasser (ad 10 µl) 9 µl x Probenzahl
Material und Methoden
34
In PCR-Reaktionsgefäßen wurde zunächst der SYBR® Green-Primer-Mastermix vorgelegt, die
verdünnte DNA dazugegeben und der Ansatz herunterzentrifugiert. Die real time RT-PCR
wurde im Thermocycler iCycler (BioRad) mit dem in Tabelle 3 aufgeführten
Temperaturprogramm durchgeführt.
Tabelle 3: Temperaturprogramm der real time RT-PCR
Schritt (Zyklenzahl) Prozess Temperatur [°C] Zeit [min:s]
1 (1x) Enzymaktivierung 95,0 1:30
Denaturierung 95,0 0:30
Annealing 60,0 1:00
2 (40x)
Elongation 72,0 0:15
3 (1x) Denaturierung 95,0 1:00
4 (1x) Bildung doppelsträngiger Produkte 60,0 1:00
5 (70x) Schmelzkurve 60,0 (steigender
Gradient um je 0,5 °C)
0:10
6 (1x) Ende 4,0 hold
Zur Quantifizierung werden die sogenannten threshold cycle (Ct)-Werte heranzogen, die
angeben, bei welcher Zyklenzahl das Signal aus dem Untergrund in eine exponentielle Phase
übergeht. Es handelt sich um eine relative Quantifizierung, da die Ct-Werte der betrachteten
Gene in Bezug zu den Ct-Werten des Haushaltsgens GAPDH gesetzt werden. Zudem fließt die
Effizienz (E) der Amplifikationsreaktion mit in die Bestimmung der relativen Expression (R)
ein:
Die Effizienzen der einzelnen Primersysteme, die nach der Vermessung von
Verdünnungsreihen von der Software berechnet wurden, sind im Anhang (8.7) aufgeführt.
Design von Primern und Optimierung der PCR-Bedingungen
Es wurde ein PCR-System zur Bestimmung der Genexpression von Bax etabliert. Dazu wurde
zunächst mithilfe NCBI-Datenbank (National Center for Biotechnology Information;
www.ncbi.nlm.nih.gov/) die Gensequenz ermittelt (Anhang 8.8). Mittels der Software
Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) wurden innerhalb dieser Sequenz Primer der
Länge von etwa 20 Nukleotiden und einer Schmelztemperatur von etwa 60 °C generiert. Es
R =
(E
Gen
)
(E
GAPD
)
(Ct
Kontrolle,GAPDH
–
Ct
Behandlet,GAPDH
)
(Ct
Kontrolle,GenX
–
Ct
Behandlet,GenX
)
R =
(E
Gen
)
(E
GAPDH
)
(Ct
Kontrolle,GAPDH
–
C
t
Behandlet,GAPDH
)
(Ct
Kontrolle,GenX
–
Ct
Behandlet,GenX
)
Material und Methoden
35
wurde darauf geachtet, dass die Primer nicht in anderen Bereichen des menschlichen
Genoms fehlpaaren oder Primerdimere bilden. Das Amplifikat sollte etwa 100 bp lang sein.
In diesem Fall waren beide Primer 20-mere, die zu einem Amplifizierungsprodukt von 99 bp
führen.
Die Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg) lyophilisiert geliefert und in TE-
Puffer (Gibco) aufgenommen (Stammlösung: 100 pmol/µl). Weitere Verdünnungen wurden
mit Wasser (NucleoSpin RNA II Kit) vorgenommen (Arbeitslösung: 10 pmol/µl). Zunächst
wurde die Primer-Annealing-Temperatur optimiert. Dazu wurde die PCR bei fünf
Temperaturen zwischen 55,5 und 60 °C durchgeführt. Da sich keine Unterschiede in der
Effizienz der Reaktion zeigten, wurde analog zu den bereits etablierten Primersystemen eine
Temperatur von 60 °C ausgewählt. Zudem wurde die optimale Primerkonzentration
bestimmt, indem die Effizienzen bei Konzentrationen zwischen 0,2 und 0,8 µM verglichen
wurden. Eine Konzentration von 0,5 µM erwies sich als optimal. Zu dieser Konzentration
wurde die Effizienz anhand einer Verdünnungsreihe (acht Konzentrationen in
Dreifachbestimmung) ermittelt.
4.6 Alkalische Entwindung
DNA-Strangbrüche lassen sich mittels alkalischer Entwindung quantifizieren. Durch den
Zusatz der Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (Fpg) können zu dem auch oxidative
Basenmodifikationen und Läsionen, wie z. B. 8-Oxoguanin, imidazolringoffene Purine und
abasische Stellen, bestimmt werden. Das bakterielle Reparaturenzym setzt bei Läsionen, die
zu seinem Substratspektrum gehören, einen Strangbruch. Nach Lyse der Zellen führt eine
hochkonzentrierte Salzlösung zur Trennung der Histone von der DNA. Diese wird dadurch
zugänglicher für die Fpg. Im Bereich von DNA-Strangbrüchen entwindet sich die
doppelsträngige DNA im alkalischen Milieu (pH 12,3). Nach Sonifikation entstandene
einzelsträngige DNA wird durch eine Hydroxylapatit-Chromatographie von doppelsträngiger
DNA getrennt. Die Fraktionen werden mit einem DNA-Farbstoff gefärbt und die
Fluoreszenzsignale gemessen. Aus dem Verhältnis der einzelsträngigen zur doppelsträngigen
DNA lässt sich die Anzahl an DNA-Schäden berechnen (Hartwig et al., 1996;
zusammengefasst in Hartwig, 1998).
Alkalische Entwindung
Zur Vermeidung zusätzlicher oxidativer DNA-Schäden wurde der Versuch in abgedunkelten
Räumen durchgeführt. Es wurden je 4 x 10
4
Zellen in 30 Zellkulturschalen ausgesät. 24 h
nach dem Ansetzen wurden die Zellen für 45 h in Dreifachbestimmung mit der jeweiligen
Verbindung inkubiert. Nach der jeweiligen Inkubationszeit wurden das Zellkulturmedium
Material und Methoden
36
entfernt, die Schalen mit 2 ml PBS versetzt und auf Eis gestellt. Das PBS wurde abgesaugt
und die Schalen 5 min mit Lyse-Puffer versetzt. Nach Absaugen wurde für 2 min mit
Salzlösung inkubiert und 8 min nachinkubiert. Es folgte eine 30 minütige Inkubation von je
drei von sechs Schalen einer Konzentration mit Fpg-Protein (1:1000 Verdünnung eines Fpg-
haltigen Zellextrakts in Fpg-Puffer) bzw. dem enzymfreien Puffer bei 37 °C. Im Anschluss
wurden die Schalen in 1 minütigem Abstand mit alkalischer Lösung versetzt. Jede Schale
wurde nach Ablauf einer 30 min Inkubation mit 0,1 N Salzsäure auf pH 6,80 +/- 0,02
neutralisiert. Das benötigte Volumen an Salzsäure wurde dazu mithilfe eines pH-Meters vor
dem Versuch bestimmt. Die Proben wurden gut gemischt, in Glasröhrchen überführt, 15 s
bei 30 Watt auf Eis sonifiziert, mit 15 µl einer 10 %igen SDS-Lösung versetzt und wiederum
gemischt. Bis zur Chromatographie wurden die Proben bei -20 °C gelagert.
Hydroxylapatit-Chromatographie
Für die Hydroxylapatit-Chromatographie wurden die verwendeten Puffer, Proben und
Säulen auf 60 °C temperiert. Zur Präparation der Chromatographie-Säulen wurde
Hydroxylapatit in 0,01 M Natriumphosphatpuffer (1 g/ml) 30 min quellen gelassen. 2 ml-
Spritzen wurden mit Glasfaserfiltern, 1 ml Hydroxylapatit-Suspension und einem weiteren
Glasfaserfilter bestückt. Die Säulen wurden mit 1,5 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer stringent
gewaschen und mit 1,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer vorkonditioniert. Die Proben
wurden auf die Säulen gegeben und nicht-bindende Bestandteile mit 2,5 ml 0,01 M
Natriumphosphatpuffer entfernt. Danach wurde die einzelsträngige DNA mit 1,5 ml 0,15 M
Kaliumphosphatpuffer in 24-Loch-Platten eluiert. Mit 1,5 ml 0,35 M Kaliumphosphatpuffer
wurde im nächsten Schritt ebenso die doppelsträngige DNA eluiert. Auf jeder Platte wurde
ein Puffer-Blindwert mitgeführt. Die Säulen wurden für je drei Durchläufe verwendet.
Zur Detektion wurden die Proben mit 4,25 µl Höchst-Farbstoff 33258 (4,1 mg/25ml;
Endkonzentration 7,5 x 10
-7
M) versetzt. Nach 30 min Inkubation im Dunklen wurde die
Fluoreszenz bei einer Emission von 455 nm (Anregung bei 360 nm) im
Mikrotiterplattenlesegerät (TECAN Spektra Fluor) gemessen.
Berechnung der DNA-Läsionen
Die Anzahl der DNA-Läsionen wurde nach Hartwig et al. (1996) berechnet. Zunächst wurde
dafür der Anteil doppelsträngiger DNA (ds DNA) bestimmt:
ds DNA =
relative Fluoreszenz (Doppelstrang)
relative Fluoreszenz (Do
ppelstrang)+ 2,1 x relative Fluoreszenz (Einzelstrang)
Material und Methoden
37
Der Korrekturfaktor 2,1 gleicht die unterschiedliche Affinität des Höchstfarbstoffes zu
einzelsträngiger bzw. doppelsträngiger DNA aus (Hartwig et al., 1993).
Zur Berechnung der DNA-Strangbrüche pro Zelle wurden die Proben ohne Fpg-Inkubation
auf die Kontrollen ohne Fpg-Inkubation bezogen. Analog dazu wurden die Fpg-sensitiven
Stellen pro Zelle berechnet, indem die Proben mit Fpg-Inkubation auf die Mittelwerte der
Proben ohne Fpg-Inkubation bezogen wurden. Der Korrekturfaktor 16666 ergibt sich aus der
Kalibrierung nach DNA-Schädigung mit Röntgenstrahlung (Hartwig et al., 1996).
Anzahl der DNA-Strangbrüche/Zelle = -ln x 16666
ds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)
Anzahl der DNA-Strangbrüche/Zelle = -ln x 16666
ds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)
Zur Umrechnung von DNA-Läsionen pro Zelle auf die Anzahl von Schäden pro 10
6
Basen-
paare wurde durch 6000 dividiert.
Anzahl der DNA-Läsionen/10
6
Basenpaare = Anzahl der DNA-Läsionen/Zelle
6000
Anzahl der DNA-Läsionen/10
6
Basenpaare = Anzahl der DNA-Läsionen/Zelle
6000
4.7 Zellzyklusuntersuchungen mittels Durchflusszytometer
Mittels Durchflusszytometrie lassen sich Zellen in Abhängigkeit von ihrer Größe, Gestalt,
Granularität und spezifischen Markierungen unterscheiden und zählen. Zur Bestimmung der
Zellzyklusverteilung wird die DNA der Zellen mit dem Farbstoff 4’,6-Diamidino-2-phenylindol
(DAPI), der an AT-reiche Regionen der DNA bindet, gefärbt. Da der DNA-Gehalt der Zellen
während des Zellzyklus durch Replikation während der S-Phase zunimmt, können die Zellen
der G1-, S- und G2-Phase unterschieden werden. Zudem lässt sich über den sogenannten
SubG1-Peak die Induktion von Apoptose bestimmen. In der späten Phase der Apoptose wird
die DNA fragmentiert und in sogenannten apoptotischen Körperchen verpackt. Es entstehen
demnach Partikel mit geringerem DNA-Gehalt, die im Histogramm vor dem G1-Peak
auftreten. Da nekrotische Zellen ihre DNA nicht in membranumschlossenen Partikeln
abgeben, erfordert dieses Testsystem keine Nekrose-Gegenfärbung (Frederich et al., 2003;
Erhart et al., 2005; Wu et al., 2008).
Es wurden 3 x 10
5
Zellen in Zellkulturschalen (60 mm) ausgesät und nach 24 h mit der
jeweiligen Verbindung inkubiert. Nach der entsprechenden Inkubationszeit wurden die
Zellen mit Trypsin abgelöst, in PBS, versetzt mit 5 % FKS, aufgenommen und in einem 15 ml-
Röhrchen bei 340 g und 4 °C für 4 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml PBS
resuspendiert und auf dem Vibrationsmischer langsam mit 3 ml Ethanol (4 °C) versetzt. Die
Material und Methoden
38
Proben wurden mindestens über Nacht bei – 20 °C gelagert. Vor der Vermessung am
Durchflusszytometer wurden die Proben erneut zentrifugiert (siehe oben) und das Pellet in
1 ml DAPI-Färbelösung (CyStainDNA, Partec) resuspendiert. Nach 4 h bei 4 °C erfolgte die
Messung. Dazu wurden die Proben in spezielle Messröhrchen pipettiert und diese im
Probenhalter des Durchflusszytometers positioniert. Nach Anregung des Farbstoffes durch
eine UV-Lampe wurde die Fluoreszenz (435-475 nm) auf Einzelzellebene gemessen und so
Histogramme aus Zellen unterschiedlichen DNA-Gehaltes erstellt. Die Messung sowie die
Auswertung der Zellzyklusverteilung bzw. des subG1-Peaks erfolgten mit der Software
FloMax (Partec).
Zur Bestimmung des SubG1-Peaks wurde in Abweichung dazu das Zellkulturmedium mit
bereits abgelösten toten Zellen mit den abtrypsinierten Zellen vereinigt und für die Messung
am Durchflusszytometer herangezogen.
4.8 Kernlokalisation von AIF
Während der Apoptose wird AIF (apoptosis inducing factor) aus den Mitochondrien
freigesetzt, welches im Zellkern akkumuliert und dort Chromatin-Kondensation sowie DNA-
Fragmentierung einleitet. Der Nachweis von AIF erfolgte mittels Immunofluoreszenz-
mikroskopie. Mithilfe eines spezifischen Antikörpers gegen AIF und einem
fluoreszenzgekoppelten, sekundären Antikörper wurde das Fluoreszenzsignal im Zellkern
bestimmt. Als Schablone wurde dazu der Zellkern mit dem DNA-Farbstoff 4’,6-Diamidino-2-
phenylindol (DAPI) angefärbt.
Deckgläschen (12 mm) wurden in Diethylether 5 min entfettet, 10 min mit Alcian-Blue
(1 mg/ml in Ethanol) gefärbt, mit 70 %igem Ethanol und zweimal mit destilliertem Wasser
gespült, poliert und autoklaviert. Auf die beschichten Deckgläschen wurden in 6-Loch-
Platten je Kavität 2,5 x 10
5
HCT116 Zellen in 2 ml Kulturmedium ausgesät. Nach 24 h wurden
die Zellen mit der jeweiligen Verbindung für die entsprechende Zeit inkubiert. Als
Positivsubstanz wurde Staurosporin mitgeführt (800 nM, 16 h).
Nach Ablauf der Inkubationszeit folgte die Fixierung der Zellen auf den Deckgläschen. Dazu
wurde das Zellkulturmedium entfernt, die Deckgläschen in PBS II (4 °C) gespült und 10 min in
Methanol (-20 °C) auf Eis fixiert. Anschließend wurden für 1 h je 50 µl Blockierlösung (5 %
FKS in PBS II) auf die Deckgläschen gegeben. Die 1 h Inkubation mit dem primären
Antikörper (Anti-AIF H300; 1:50 verdünnt in Blockeierlösung; 50 µl pro Deckgläschen) fand
bei 37 °C statt. Es folgten drei Waschschritte mit je 50 µl Blockierlösung und die 1 h
Inkubation mit dem sekundären Antikörper (Anti-Kaninchen, H+L, Rhodamin; 1:400 verdünnt
Material und Methoden
39
in Blockierlösung) bei 37 °C. Es wurde wiederum dreimal gewaschen. Die Deckgläschen
wurden mit Vectashield Mounting Medium (DAPI) auf Objektträgern eingedeckt.
Am Fluoreszenzmikroskop (Axio Imager.M1, Carl Zeiss) wurden mit 63facher Vergrößerung
im DAPI- und Rhodamin-Kanal pro Objekt ca. 20 Bilder aufgenommen. Die Software
AxioVision unterstütze dabei sowohl die Bildaufnahme als auch die quantitative Auswertung
der Signale.
4.9 Aktivität der Effektor-Caspasen 3/7
Die Effektor-Caspasen 3 und 7 stellen Schlüsselfaktoren im Ablauf der Apoptose dar, da sie
proapoptotische Proteine, wie Nukleasen, aktivieren und antiapoptotische Enzyme
inaktivieren oder Strukturproteine abbauen. Zum Nachweis der Enzymaktivität wurde der
„Caspase-Glo® 3/7 Assay“ (Promega) verwendet. Durch Reagenzzugabe werden die Zellen
lysiert und die Caspasen freigesetzt. Das Reagenz enthält ein Caspase 3/7-Substrat und eine
Luciferase. Nach Abspaltung eines Tetrapeptids vom Substrat durch die Caspasen setzt die
Luciferase das Produkt um, und es entsteht ein quantifizierbares Lumineszenz-Signal.
In einer nicht-transparenten 96-Lochplatte (Brand) wurden pro Kavität 1 x 10
4
Zellen in
100 µl Kulturmedium ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen mit der jeweiligen Verbindung
für bis zu 4,5 h inkubiert. Als Positivkontrolle wurde 1 µM Staurosporin (3 - 4,5 h) mitgeführt.
Im Anschluss an die Inkubation wurde das Volumen des Mediums bestimmt und die
äquivalente Menge an Caspase-Glo® 3/7-Reagenz dazugegeben und 30 s im
Mikrotiterplattenlesegerät (infinite M200, Tecan) geschüttelt (Amplitude 1 mm, linear). Die
Messung erfolgte nach 60 min im gleichen Gerät mit der Software Tecan i-Control
(Integration time: 1000 ms).
Ergebnisse und Diskussion
40
5 Ergebnisse und Diskussion
5.1 Zytotoxizität der Selenverbindungen
Zur Bestimmung der Zytotoxizität wurde sowohl die Zellzahl als auch die Koloniebildungs-
fähigkeit ermittelt. Dabei ist die Zellzahl ein Maß für die akute Toxizität einer Substanz,
während die Koloniebildungsfähigkeit längerfristige Effekte, die z. B. auch eine starke
Wachstumshemmung beinhalten, erfasst. Durch die Verwendung von p53-profizienten
HCT116 Zellen sowie der isogenen p53-Knock-out-Zelllinie konnte die p53-Abhängigkeit der
Effekte ermittelt werden. Zelltypspezifische Unterschiede wurden durch den Vergleich der
HCT116 Kolonkarzinomzellen mit A549 Lungenadenokarzinomzellen, die ebenfalls Wildtyp-
p53 exprimieren, bestimmt.
5.1.1 Zytotoxizität in HCT116 Zellen
Die p53-profizienten HCT116 Zellen reagierten sehr viel sensitiver auf Natriumselenit als die
p53-defiziente Zelllinie (Abbildung 10). Bei den p53-defizienten Zellen zeigten sich
zytotoxische Effekte auf die Zellzahl und die Koloniebildungsfähigkeit erst bei der
vergleichsweise hohen Konzentration von 8 µM Natriumselenit. Dagegen hatten bereits
3 µM Natriumselenit in der p53-profizienten Zelllinie eine zytotoxische Wirkung. Ab dieser
Konzentration unterschieden sich sowohl die Zellzahl als auch die Koloniebildungsfähigkeit
signifikant zwischen den beiden Zelllinien. Z.B. lag die Koloniebildungsfähigkeit bei 3 µM
Natriumselenit in den p53-profizienten Zellen im Mittel nur noch bei 61 % der Kontrolle,
während sie in den p53-defizienten Zellen 103 % betrug.
Králová et al. (2009) zeigten kürzlich im gleichen Zellsystem, dass p53 die Zellen gegenüber
Selenit sensibilisiert. Dafür verwendeten sie Proliferationstests, wie die Messung von DNA-
Synthese (BrdU-ELISA), des Gesamtproteingehaltes (Coomassie Brillant Blue Assay) oder der
Integrität der Atmungskette (WST-1; water soluble tetrazolium). Die beiden erstgenannten
Methoden lieferten vergleichbare Ergebnisse zu der hier angewendeten Koloniebildungs-
fähigkeit, während das WST-1-Testsystem vergleichsweise unsensitiv war und die
Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien relativ gering ausfielen. Generell liefern
verschiedene Zytotoxizitätstests differierende Ergebnisse (Schröterová et al., 2009), sodass
die Wahl eines guten Testsystems entscheidend ist. Empfohlen werden Tests, die das „clonal
survival“ betrachten (Komissarova et al., 2005). Die Koloniebildungsfähigkeit ist somit die
Methode der Wahl.
Ergebnisse und Diskussion
41
Abbildung 10: p53-abhängige Zytotoxizität von Natriumselenit.
P53-profiziente
und p53-defiziente HCT116 Zellen wurden 24 h mit Natriumselenit inkubiert. Dargestellt sind
Mittelwerte der Zellzahl (A) und der Koloniebildungsfähigkeit (B) aus mindestens 3
unabhängigen Bestimmungen ± SD. Signifikante Unterschiede zwischen den Zelllinien:
*p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Im Vergleich dazu war die Zytotoxizität von Selenomethionin unabhängig vom p53-Status
der Zellen (Abbildung 11). In beiden Zelllinien setzte die zytotoxische Wirkung bei 250 µM
Selenomethionin ein (Zellzahl: 65 % der Kontrolle; Koloniebildungsfähigkeit: 75 % der
Kontrolle). Auch Goel et al. (2006) fanden im gleichen Zellmodell mittels MTT-Test nach 24 h
keinen Einfluss des p53-Status auf die Zytotoxizität. Allerdings zeigte sich dort, dass p53 die
1
10
100
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Natriumselenit [µM]
Zellzahl (% der Kontrolle)
HCT116 p53
-
/
-
A
HCT116 p53+/+
***
***
***
***
***
1
10
100
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Natriumselen
it
Koloniebildungsfähigkeit
(% der Kontrolle)
B
HCT116 p53
-
/
-
HCT116 p53+/+
***
***
***
***
***
Ergebnisse und Diskussion
42
Zellen nach längeren Inkubationszeiten gegenüber Selenomethionin sensibilisierte (z. B.
100 µM nach 72 h).
Natriumselenit ist sehr viel zytotoxischer als Selenomethionin. Nur in einer Studie wurden
für Selenomethionin und Natriumselenit in verschiedenen Darmkrebszelllinien mittels MTT-
Test eine vergleichbare Zytotoxizität gefunden: In HT29 und SW 480 Zellen waren beide
Verbindungen bereits ab 1 µM zytotoxisch und in SW 620 Zellen jeweils ab 16 µM
(Schröterová et al., 2009). Ein deutlicher Unterschied in der Zytotoxizität der beiden
Selenverbindungen ist jedoch sehr viel plausibler. Zum einen weist das reduzierbare
Natriumselenit direkte prooxidative Eigenschaften auf. Zum anderen spielen auch die
Unterschiede im Metabolismus eine Rolle (vgl. Abschnitt 2.1.2). Selenomethionin wird
zunächst vorwiegend unspezifisch anstelle von Methionin in zelluläre Proteine eingebaut
und steht dem Metabolismus nicht unmittelbar zur Verfügung. Besonders deutlich wird das
Ausmaß der Fähigkeit von Zellen Selenomethionin zu akkumulieren bei der Bestimmung der
intrazellulären Selenkonzentration mittels AAS nach Inkubation der Zellen (siehe Abschnitt
5.2). Der Selenomethionin-Metabolismus bei moderater Selenomethionin-Zufuhr ist
abhängig vom Methionin-Metabolismus und erst bei einer Überladung mit Selenomethionin
kommt es zu einer verstärkten Verstoffwechselung. Dabei entstehen auf enzymatischem
Wege die beiden Metabolite Hydrogenselenid und Monomethylselenid. Diese können durch
Reaktionen mit Sauerstoff ROS induzieren bzw. durch Depletion von Glutathion zu
oxidativen Stress führen (siehe Abschnitt 2.1.2). Im Vergleich dazu wird Natriumselenit
unmittelbar zu diesen beiden Metaboliten umgesetzt. Dies ist zudem ein reduktiver Prozess,
der Glutathion- und NADPH-abhängig ist und somit bereits antioxidative Kapazitäten der
Zelle nutzt.
Die Zytotoxizität von Phenylseleninsäure war ebenfalls p53-unabhängig (Abbildung 12) und
lag hinsichtlich der Konzentration zwischen den beiden oben genannten Selenverbindungen.
Ebenso liegt die Oxidationsstufe des Selenatoms in der Phenylseleninsäure mit +II zwischen
denen von Natriumselenit (+IV) und Selenomethionin (-II).
Für die reduzierbare Phenylseleninsäure wird ähnlich wie Natriumselenit ein reduktiver
Metabolismus angenommen. Es kann an dieser Stelle nicht geklärt werden, weshalb die
Zytotoxizität von Phenylseleninsäure im Vergleich zu Natriumselenit unabhängig vom p53-
Status der Zellen ist, da nur wenig über diese Selenverbindung in zellulären Systemen
bekannt ist. Auffallend ist, dass die Zellzahl im Vergleich zur Koloniebildungsfähigkeit
deutlich schneller sinkt. So beginnt der zytotoxische Bereich, wenn man die Zellzahl
heranzieht, bereits bei einer Konzentration von 30 µM Phenylseleninsäure (etwa 60 % der
Kontrolle), während vergleichbare Effekte auf die Koloniebildungsfähigkeit erst ab 75 µM
auftreten.
Ergebnisse und Diskussion
43
Abbildung 11: p53-unabhängige Zytotoxizität von Selenomethionin.
P53-
profiziente und p53-defiziente HCT116 Zellen wurden 24 h mit Selenomethionin inkubiert.
Dargestellt sind Mittelwerte der Zellzahl (A) und der Koloniebildungsfähigkeit (B) aus
mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen ± SD. Signifikante Unterschiede zwischen den
Zelllinien: *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Selenomet
hionin [µM]
Zellzahl (% der Kontrolle)
10
100
0
250
500
750
1000
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
A
Selenomethionin [µM]
Koloniebildungsfähigkeit
(% der Kontrolle)
10
100
0
250
500
750
1000
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
B
Ergebnisse und Diskussion
44
Abbildung 12: p53-unabhängige Zytotoxizität von Phenylseleninsäure.
P53-
profiziente und p53-defiziente HCT116 Zellen wurden 24 h mit Phenylseleninsäure inkubiert.
Dargestellt sind Mittelwerte der Zellzahl (A) und der Koloniebildungsfähigkeit (B) aus
mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen ± SD. Signifikante Unterschiede zwischen den
Zelllinien: *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Phenylseleninsäure [µM]
Zellzahl (% der Kontrolle)
10
100
0
20
40
60
80
100
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
A
Phenylseleninsäure [µM]
Koloniebildungsfähigkeit
(% der Kontrolle)
10
100
0
20
40
60
80
100
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
B
Ergebnisse und Diskussion
45
5.1.2 Zytotoxizität in A549 Zellen
Die Zytotoxizität der drei Selenverbindungen in A549 Zellen folgte der gleichen Reihenfolge
wie in den HCT116 Zelllinien: Natriumselenit > Phenylseleninsäure > Selenomethionin
(Abbildung 13).
Der zytotoxische Bereich begann in den A549 Zellen bei 4 µM Natriumselenit, da die
Koloniebildungsfähigkeit bei dieser Konzentration bereits auf 56 % der Kontrolle abfiel,
während die Zellzahl erst bei 5 µM Natriumselenit auf etwa 70 % sank. Damit reagierten die
A549 Zellen weniger sensitiv auf Natriumselenit als die p53-profizienten HCT116 Zellen,
jedoch sensitiver als die p53-defiziente Zelllinie.
Auf Selenomethionin reagierten die A549 Zellen nur geringfügig toleranter als die HCT116
Zelllinien. Während in den HCT116 Zellen 250 µM Selenomethionin bereits zytotoxisch
waren, lag in A549 Zellen bei dieser Konzentration der Übergang vom nicht-zytotoxischen in
den zytotoxischen Bereich (Zellzahl und Koloniebildungsfähigkeit bei etwa 78 %). Bei 500 µM
Selenomethionin zeigten sich dann in A549 Zellen starke zytotoxische Effekte; die
Koloniebildungsfähigkeit fiel auf 56 % der Kontrolle.
Auch Phenylseleninsäure wirkte in A549 Zellen etwas weniger zytotoxisch als in den HCT116
Zelllinien. Sowohl die Zellzahl als auch die Koloniebildungsfähigkeit lagen bis 50 µM
Phenylseleninsäure bei über 80 % der Kontrolle und sanken bei 100 µM auf etwa 60 % der
Kontrolle in den zytotoxischen Bereich.
Vergleicht man abschließend den Einfluss des Zelltyps auf die Zytotoxizität der eingesetzten
Selenverbindungen lässt sich sagen, dass die Lungenadenokarzinomzellen und Kolon-
karzinomzellen bei gleichem p53-Status vergleichbare zytotoxische Reaktionen zeigten,
wobei die Lungenzellen jeweils etwas weniger sensitiv waren. Die p53-defizienten
Kolonkarzinomzellen waren nur hinsichtlich einer Exposition mit Natriumselenit deutlich
resistenter, da sich dessen Zytotoxizität als p53-abhängig herausgestellt hatte.
Ergebnisse und Diskussion
46
Abbildung 13: Zytotoxizität von Natriumselenit, Selenomethionin und
Phenylseleninsäure in A549 Zellen.
A549 Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen
Selenverbindung inkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte der Zellzahl (A) und der
Koloniebildungsfähigkeit (B) aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen ± SD.
Selenverbindung [µM]
Koloniebildungsfähigkeit
(% der Kontrolle)
1
10
100
0
250
500
750
1000
Natriumselenit
Selenomethionin
Phenylseleninsäure
1
10
100
0
1 2 3 4
5
B
Selenverbindung [µ
M]
Zellzahl (% der Kontrolle)
Natriumselenit
Selenomethionin
Phenylseleninsäure
1
10
100
012
3
4
5
6
7
8
1
10
100
0
250
500
750
1000
A
Ergebnisse und Diskussion
47
5.2 Zelluläre Aufnahme
Generell werden gemessene Endpunkte in Zellkulturversuchen mit der Inkubations-
konzentration korreliert. Dies sagt jedoch nichts über aufgenommene Menge und somit die
intrazellulären Konzentrationen einer Substanz aus. So ist neben äquimolaren intra- und
extrazellulären Konzentrationen auch eine schwache Aufnahme oder eine starke
Akkumulation möglich. Zudem bleiben Unterschiede in der Aufnahme zwischen
verschiedenen Zelllinien unberücksichtigt.
Zur Bestimmung der tatsächlichen Aufnahme der Selenverbindungen wurde die
intrazelluläre Selenkonzentration nach einer nassen, sauren Veraschung von Zellpellets
mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) gemessen. Diese Elementbestimmung kann
Zelltyp- und Substanz-abhängige Unterschiede in der Aufnahme sichtbar machen. Da es sich
jedoch nicht um eine Spezies-Analyse handelt, können keine Aussagen über den Grad der
Metabolisierung gemacht werden.
5.2.1 Aufnahme in HCT116 Zellen
Die Aufnahme von Natriumselenit war in p53-profizienten und –defizienten HCT116 Zellen
sehr unterschiedlich. Die p53-profizienten Zellen nahmen über den gesamten
Inkubationsbereich jeweils mehr Natriumselenit auf, wobei sich die intrazellulären
Selenkonzentrationen erst ab einer Inkubationskonzentration von 3 µM Natriumselenit
signifikant von denen der p53-defizienten Zellen unterschieden (Abbildung 14).
Die p53-profizienten Kontrollzellen enthielten ohne Natriumselenit-Inkubation bereits etwa
1 µM Selen. Im unteren Inkubationsbereich bis 4 µM Natriumselenit verlief die Aufnahme in
etwa äquimolar, während es im Bereich darüber zu einem starken Anstieg der intrazellulären
Selenkonzentration kam. So resultierte z. B. aus einer Konzentration von 5 µM Natrium-
selenit im Medium ein doppelt so hoher Gehalt in den Zellen. Ein Maximum wurde bei der
Inkubationskonzentration von 7 µM Natriumselenit erreicht; hier wurden 120 µM Selen in
der Zelle gemessen.
Im Vergleich dazu wiesen die p53-defizienten Kontrollzellen mit etwa 0,5 µM Selen nur
ungefähr die Hälfte des Gehaltes an diesem Spurenelement auf als die Wildtyp-Zelllinie. Bis
zu einer Inkubationskonzentration von 5 µM Natriumselenit waren die intrazellulären
Selenkonzentrationen jeweils geringer als im Medium. Bei 6 µM Natriumselenit waren die
intrazelluläre sowie extrazelluläre Konzentration annähernd äquimolar. Bei höheren
Inkubationskonzentrationen akkumulierten die Zellen das Selen intrazellulär.
Ergebnisse und Diskussion
48
Abbildung 14: Aufnahme von Natriumselenit in HCT116 Zellen.
P53-profiziente
und p53–defiziente Zellen wurden 24 h mit Natriumselenit inkubiert. Die intrazelluläre
Selenkonzentration wurde mittels AAS bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus
mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD. Statistisch signifikante Unterschiede
zwischen den Zelllinien: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Es stellt sich die Frage, ob p53 eine Rolle in der zellulären Aufnahme von Selenit spielen
kann. Insgesamt ist weitestgehend ungeklärt, in welcher Form und über welche Transporter
Selen in die einzelnen Zellen aufgenommen wird (zusammengefasst in Rosen and Liu, 2009).
Ganyc und Self (2008) schlussfolgern aus Versuchen in einem Keratinozyten-Modell, dass
Selenit passiv über einen Anionen-Transporter aufgenommen wird. Erst die extrazelluläre
Reduktion zum Hydrogenselenid soll die Selen-Aufnahme enorm steigern, die dann aktiv
über einen ATP-abhängigen Mechanismus über einen weiteren Anionentransporter
funktioniert. Ebenso zeigten Olm et al. (2009), dass die Aufnahme von Selenit in
Lungenzellen begünstigt ist, wenn extrazellulär Thiole zur Reduktion bereitstehen. Die
Menge an extrazellulären Thiolen kann erhöht werden, indem Cystein aus der Zelle
ausgeschleust und nach Oxidation als Cystin wieder aufgenommen wird. Die Transkription
der Transportproteine für diesen Kreislauf, der XC
-
-Antiporter und MRPs (multidrug
resistance proteins) wird über das regulatorische Element ARE (antioxidant response
elements) gesteuert (Olm et al., 2009). Gene, die AREs in ihrem Promoter enthalten, werden
jedoch von p53 gehemmt (Faraonio et al., 2006). Dies spricht gegen eine p53-abhängige
Aufnahme von Selenit. Anhand von Literaturergebnissen lässt sich somit die höhere
Aufnahme von Selenit in die p53-profizienten HCT116 Zellen bisher nicht erklären, trotzdem
sollte ein direkter Einfluss von p53 nicht ausgeschlossen werden.
0
0
2
0
4
0
6
0
80
100
120
140
160
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Natriumselenit [µM]
IntrIntrazelluläres Selen [µM]
HCT116 p53
-
/
-
0
2
4
6
8
1
0
1
2
0
1
2
3
4
5
*
*
**
*
**
**
*
**
HCT116 p53+/+
16 p53+/+
***
**
**
Ergebnisse und Diskussion
49
Neben dem direkten Einfluss von p53 auf die Aufnahme von Selenit wären auch indirekte
Einflüsse denkbar. Hier wäre z. B. ein p53-abhängiger Verlust der Zellintegrität zu nennen,
welches aufgrund von Membranveränderungen wiederum eine passive Aufnahme des
Selenits beeinflussen könnte. Dagegen spricht allerdings, dass die p53-profizienten Zellen
bereits im nicht-zytotoxischen Bereich jeweils höhere Selengehalte aufweisen. Zudem
handelt es sich hier um apoptotische Prozesse (siehe Abschnitt 5.7), die sich dadurch
auszeichnen, dass die Membranintegrität weitestgehend bewahrt bleibt. Trotzdem bleibt es
auffällig, dass jeweils mit Erreichen der Zytotoxizität von Natriumselenit die Akkumulation
von intrazellulärem Selen stark zunimmt.
Im Vergleich zur Aufnahme von Natriumselenit war die Aufnahme von Selenomethionin
unabhängig vom p53-Status der Zellen. Die Inkubation mit Selenomethionin führte zudem zu
einer viel stärkeren Akkumulation von Selen in der Zelle (Abbildung 15).
Wiederum enthielten die p53-profizienten Zellen ohne Seleninkubation etwa 1 µM Selen
und die p53-defizienten Zellen etwa 0,5 µM Selen. Bei einer Inkubationskonzentration von
10 nM Selenomethionin zeigte sich noch kein Unterschied zu den Kontrollzellen, wohingegen
bereits 50 nM Selenomethionin im Medium den intrazellulären Selengehalt beider Zelllinien
gleichermaßen auf über 2 µM anstiegen ließen. Die intrazelluläre Selenkonzentration war
also etwa 40mal höher als die Selenomethioninkonzentration im Medium. Dies war auch bei
höheren Inkubationskonzentrationen der Fall: aus 1 µM Selenomethionin im Medium
resultierten etwa 40 µM Selen in der Zelle, nach Inkubation mit 5 µM Selenomethionin
wurden über 200 µM intrazelluläres Selen gemessen und 50 µM Selenomethionin führten zu
einer Akkumulation von fast 2000 µM Selen in der Zelle. Bei höheren Inkubations-
konzentrationen war die Akkumulation weniger stark, so resultierten aus 100 µM, 500 µM
bzw. 1000 µM Selenomethionin im Medium etwa 3000 µM, 5000 µM bzw. 5500 µM Selen in
der Zelle (Abbildung 15).
Die starke Akkumulation von Selen in der Zelle nach Inkubation mit Selenomethionin ergibt
sich aus dem unspezifischen Einbau dieser Aminosäure in zelluläre Proteine im Austausch für
Methionin. In dieser Speicherform ist Selen jedoch nicht unmittelbar bioverfügbar, da dazu
erst eine Umwandlung zu den Metaboliten Hydrogenselenid oder Monomethylselenid
stattfinden muss. Der Grad der Metabolisierung kann mit einer Elementanalyse wie der AAS
nicht bestimmt werden. Da die Akkumulation bei hohen Inkubationskonzentrationen von
Selenomethionin stagnierte, kann von einer Ausschöpfung der Speicherkapazität
ausgegangen werden, die zu einer Überladung und zum Absterben der Zelle führt. Dies ist in
Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Koloniebildungsfähigkeit, nach denen der
zytotoxische Bereich bei 250 µM Selenomethionin beginnt (siehe Abschnitt 5.1).
Ergebnisse und Diskussion
50
Abbildung 15: Aufnahme von Selenomethionin in HCT116 Zellen.
P53-
profiziente und p53–defiziente Zellen wurden 24 h mit Natriumselenit inkubiert. Die
intrazelluläre Selenkonzentration wurde mittels AAS bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte
aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD. Statistisch signifikante Unterschiede
zwischen den Zelllinien: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’scher t-Test).
Weiterhin soll hier die gemessene Selenkonzentration in den Kontrollzellen diskutiert
werden. Diese zeigt, dass die Zellen Selen aus dem Kulturmedium akkumulieren können. Das
verwendete DMEM enthielt nach Herstellerangaben kein Selen. Dies wurde durch eigene
AAS-Messungen bestätigt (Daten nicht gezeigt). Im FKS hingegen konnte ein Selengehalt von
etwa 1,4 µg/l bestimmt werden. Daraus resultiert eine Konzentration von etwa 2 nM Selen
im gebrauchsfertigen Zellkulturmedium (Schneider, 2009). Es ist schwer die gefundene
Selenkonzentration der uninkubierten HCT116 Zellen mit der in realem Darmgewebe zu
vergleichen. In der Literatur wird z. B. eine Konzentration von 0,22 µg Selen/g Feuchtgewebe
(kanadische Probanden) angegeben (ATSDR, 2003). Unter der vereinfachten Annahme, dass
1000 g einem Volumen von 1 l entsprichen, errechnet sich eine Konzentration von etwa
2,8 µM. Insgesamt bleibt die Frage, ob die Zellen durch das Kulturmedium adäquat mit Selen
versorgt werden. Zum Teil wird eine Supplementation von Zellkulturen mit z. B. 100 nM
Natriumselenit empfohlen (mündliche Mitteilung von Prof. Josef Köhrle).
Zu erwähnen bleibt, dass die Wiederfindung in allen drei Zelllinien bei etwa 75 % lag. Dies
konnte auch durch die Variation des nassen, sauren Aufschlusses nicht verbessert werden
(Schneider, 2009). Als Alternative sollte ein Mikrowellenaufschluss in Betracht gezogen
werden.
35
Selenomethionin [µM]
Intrazelluläres Selen [µM]
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
1
5
10
25
50
75
100
250
500
1000
1500
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
0
5
10
15
20
25
30
40
45
50
0
0,01
0,05
0,1
0,5
1
Ergebnisse und Diskussion
51
5.2.2 Aufnahme in A549 Zellen
Die Aufnahme von Natriumselenit in A549 Zellen (Abbildung 16) war von der
Größenordnung vergleichbar mit der Aufnahme in die HCT116 Zelllinien. Die A549 Zellen
wiesen ohne Inkubation Gehalte zwischen 0,5 und 1 µM Selen auf. Bis zu einer
Inkubationskonzentration von 6 µM akkumulierten die A549 Zellen etwas mehr Selen als die
p53-profizienten HCT116 Zellen. Bereits bei einer Inkubationskonzentration von 4 µM
Natriumselenit kam es zu einer Akkumulation auf Gehalte von 12 µM intrazellulärem Selen.
Bei Inkubationskonzentrationen von 6 bis 8 µM wurden in den A549 Zellen geringere
Selenkonzentrationen als in den p53-profizienten HCT116 Zellen gemessen. Die
intrazellulären Selenkonzentrationen stagnierten in diesem hochzytotoxischen Bereich
zwischen 40 und 60 µM.
Abbildung 16: Aufnahme von Natriumselenit in A549 Zellen.
A549 Zellen wurden
24 h mit Natriumselenit inkubiert. Die intrazelluläre Selenkonzentration wurde mittels AAS
bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD.
Hinsichtlich der Aufnahme von Selenomethionin unterschieden sich die A549 Zellen kaum
von den beiden HCT116 Zelllinien. Auch in den A549 Zellen kam es zu einer starken
Akkumulation von Selen in der Zelle, welche mit Beginn des zytotoxischen
Inkubationsbereichs stagnierte (Abbildung 17). Dies ist vermutlich wiederum auf den
unspezifischen Einbau von Selenomethionin in zelluläre Proteine bis zur Überladung der
Zelle zurückzuführen (siehe Abschnitt 5.2.1).
Natriumselenit [µM]
Intrazelluläres Selen [µM]
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
1
2
3
4
5
6
7
0
1
2
3
Ergebnisse und Diskussion
52
Abbildung 17: Aufnahme von Selenomethionin in A549 Zellen.
A549 Zellen
wurden 24 h mit Selenomethionin inkubiert. Die intrazelluläre Selenkonzentration wurde
mittels AAS bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen
Bestimmungen + SD.
Es ist schwer die gefundene Selenkonzentration in den unbehandelten A549 Zellen mit der in
realem Lungengewebe zu vergleichen. In der Literatur finden sich z. B. Gehalte von 0,13 µg/g
(deutsche Probanden) bis 0,30 µg/g (US amerikanische Probanden) jeweils bezogen auf das
Feuchtgewicht (zusammengefasst ATSDR, 2003). Unter der vereinfachenden Annahme, dass
1000 g einem Volumen von 1 l entsprichen, erhält man Konzentrationen von 1,7 – 3,8 µM.
Selenomethionin [µM]
Intrazelluläres Selen [µM]
0
1000
2000
3000
4000
5000
600
0
1
5
10
25
50
75
100
250
500
1000
1500
0
10
20
30
40
50
0
0,01
0,05
0,1
0,5
1
Ergebnisse und Diskussion
53
5.3 Konformationsspezifische Analyse von p53
Die Integrität der Zink-bindenden Domäne von p53 ist entscheidend für die
Funktionsfähigkeit des Tumorsuppressors (zusammengefasst in Abschnitt 2.2.1). Kommt es
zum Verlust des Zinkions durch Metall-Chelatoren (Hainaut and Milner, 1993a), eine
Verdrängung durch z. B. Cadmium (Méplan et al., 1999; Thuy, 2006; Schwerdtle et al., 2010)
oder zu einer Oxidation von Thiolen, die an der Bindung beteiligt sind (Hainaut and Milner,
1993a; Hainaut and Milner, 1993b; Delphin, 1994), entfaltet sich die native, aktive Wildtyp-
Konformation in eine fehlgefaltete, inaktive Konformation. Letztere ist nicht mehr in der
Lage als Transkriptionsfaktor an DNA zu binden. Diesen Verlust der tumorsuppressiven
Wirkung kennt man sonst vor allem von Phänotypen von p53-Mutanten mit Mutationen
wichtiger Aminosäuren in der DNA-Bindungsdomäne, weshalb die Zink-freie Konformation
auch als sogenannte „mutante“ Konformation bezeichnet wird. Arbeiten in diesem
Arbeitskreis konnten zeigen, dass reduzierbare Selenverbindungen Zink aus der
Zinkfingerdomäne des XPA-Proteins freisetzten und die Aktivität des Zinkfingerproteins Fpg
inhibieren können (Blessing et al., 2004 a). In diesem Zusammenhang wurde zudem in ersten
Versuchen der Einfluss von Phenylseleninsäure auf eine Entfaltung von p53 betrachtet. Diese
reduzierbare Selenverbindung war in der Lage p53 in Zelllysaten von MCF7 Zellen in hohen
Konzentrationen (300 µM) vollständig zu entfalten. Nach Inkubation von intakten MCF7
Zellen konnte mit beginnender Zytotoxizität (70 µM Phenylseleninsäure) höchstens eine
marginale Bildung der inaktiven Konformation bei gleichbleibend hoher Konzentration an
Wildtyp-p53 beobachtet werden (Blessing, 2004 b).
In dieser Arbeit sollte nun der Einfluss von Natriumselenit und Selenomethionin, zweier für
die Ernährung relevanter Selenverbindungen, untersucht werden. Dazu wurde in einer
Immunopräzipitation mittels konformationsspezifischer Antikörper die native Wildtyp- und
die entfaltete, inaktive Konformation separiert und nachgewiesen. Dazu wurden Zelllysate
von A549 Zellen verwendet, um unabhängig von Aufnahme, Metabolisierung und anderen
Einflüssen einen generellen Effekt der Selenverbindungen auf die Konformation von p53 zu
detektieren. In diesem subzellulären System können zudem hohe Konzentrationen gewählt
werden, da es keine Limitierungen durch die Zytotoxizität z. B. von Natriumselenit gibt. Es
zeigte sich, dass p53 in A549 Zellen fast vollständig in der Wildtyp-Konformation vorliegt.
Hohe Konzentrationen des reduzierbaren Natriumselenits waren in der Lage p53 nach
Inkubation des Zelllysats vollständig zu entfalten. Fast ebenso stark war der Effekt der
Phenylseleninsäure, während die Wildtyp-Konformation durch das vollständig reduzierte
Selenomethionin unbeeinflusst blieb (Abbildung 18 A).
Ergebnisse und Diskussion
54
Abbildung 18: Konformationsspezifische Analyse von p53.
Zelllysate von A549
Zellen wurden 8 min bei 37 °C mit vergleichsweise hohen Konzentrationen verschiedener
Selenverbindungen (A) bzw. mit verschiedenen Natriumselenitkonzentrationen (B) inkubiert.
Die native Wildtyp- (n) bzw. fehlgefaltete (f) Konformation wurden nach
Immunopräzipitation mit konformationsspezifischen Antikörpern im Western Blot
detektiert. Dargestellt sind repräsentative Western Blots. Cadmiumchlorid wurde als
Positivkontrolle mitgeführt (Méplan et al., 1999).
Natriumselenit führte bereits bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen konzentrations-
abhängig zur Zunahme der inaktiven Konformation, wobei auch die Wildtyp-Konformation
zunahm. Erst nach einer Inkubation mit 100 µM Natriumselenit lag p53 zum Großteil
entfaltet vor (Abbildung 18 B). Diese Konzentration ist vergleichsweise hoch, selbst wenn
man berücksichtigt, dass Natriumselenit in intakten Zellen akkumulieren kann. Die AAS-
Messungen zeigten, dass nach Inkubation mit z. B. 4 µM Natriumselenit, einer beginnend
zytotoxischen Konzentration, intrazellulär ein Gehalt von etwa 13 µM Selen resultiert (siehe
Abschnitt 5.2.2). Diese Element-spezifische Analyse sagt jedoch nichts darüber aus,
inwieweit das gemessene Selen noch als Natriumselenit vorliegt. Der reduktive
Metabolismus von Natriumselenit und ein Redoxcycling der prooxidativen Metabolite
könnte den oxidativen Stress und somit den inaktivierenden Einfluss auf p53 verstärken
(siehe Abschnitt 2.1.2). Inwiefern aus den subzellulären Versuchen abgeleitet werden kann,
in welchem Maße Natriumselenit die Konformation von p53 in intakten Zellen beeinflusst, ist
spekulativ.
Insgesamt sollte jedoch auch die Bildung von geringen Mengen der Zink-freien p53-
Konformation nicht unterschätzt werden. Dieser dominant-negative Phänotyp kann zum
einen eine Aggregation von Wildtyp-p53 verursachen (Butler and Loh, 2003) und zum
Natriumselenit [µM]
0 1 5 10 50 100
n f n f n f n f n f n f
Zinkfreisetzung
Entfaltung
p53
p53
nativ fehlgefaltet
Phenylselenin- Natrium- Seleno- Cadmium- [µM]
säure selenit methionin chlorid
0 1000 1000 1000 100
n f n f n f n f n f
A
B
Ergebnisse und Diskussion
55
anderen in einem Heterotetramer mit Wildtyp-p53 dessen tumorsuppressiven Eigenschaften
inhibieren (Nicholls et al., 2002).
5.4 Phosphorylierung von p53
Neben einer möglichen Inaktivierung von p53 durch Natriumselenit aufgrund von
Thioloxidationen in der DNA-Bindungsdomäne ist auch eine Stimulation von p53 durch die
DNA-schädigende Wirkung von Natriumselenit denkbar. P53 wird nach genotoxischem oder
nicht-genotoxischem Stress durch Phosphorylierungen auf der Proteinebene stabilisiert und
aktiviert (siehe Abschnitt 2.2.2).
Nach 24 h Inkubation von A549 Zellen mit Natriumselenit resultierte eine Phosphorylierung
von p53 an den Serin-Resten 15, 20 und 392 (Abbildung 19 A). Dies war jeweils ab 6 µM
Natriumselenit, also einer stark zytotoxischen Konzentration, der Fall. Die Phosphorylierung
an Serin-15 und -20 werden zum einen mit der Stabilisierung des Proteins (Shieh et al., 1997;
Chehab et al., 2000) in Zusammenhang gebracht. Zum anderen erhöht die Phosphorylierung
an Serin-15 auch die transkriptionelle Aktivität (Chehab et al., 2000). Einhergehend mit
diesen beiden Phosphorylierungen wurde tatsächlich eine Zunahme des Proteingehaltes an
p53 beobachtet (Abbildung 19 A).
Die ebenfalls beobachtete Phosphorylierung an Serin-392 nach Natriumselenit-Exposition
(Abbildung 19 A), begünstigt die Tetramerisierung von p53 (Sakaguchi et al., 1997). Als
Tetramer weist der Transkriptionsfaktor seine stärkste spezifische DNA-Bindungsfähigkeit
auf (Hupp et al., 1993). Weiterhin wurde die Phosphorylierung an Serin-46, die eine Rolle bei
der Induktion von p53-abhängier Apoptose spielen soll (Oda et al., 2000), untersucht. Dieser
Serin-Rest wurde unter den gewählten Versuchsbedingungen durch Natriumselenit nicht
phosphoryliert (Abbildung 19 A).
Im Vergleich zu Natriumselenit hatte die Inkubation von A549 Zellen mit Selenomethionin
keine Phosphorylierung von p53 an den untersuchten Serin-Resten und keine Zunahme von
Gesamt-p53 zur Folge (Abbildung 19 B). Dies deutet daraufhin, dass selbst in zytotoxischen
Konzentrationen von Selenomethionin, welche antiproliferative Prozesse (Zellzyklusarreste,
Zelltod) induzierten, p53 mechanistisch keine Rolle spielt.
Ergebnisse und Diskussion
56
Abbildung 19: Phosphorylierung von p53 durch Natriumselenit und
Selenomethionin.
A549 Zellen wurden 24 h mit Natriumselenit (A) bzw. Selenomethionin
(B) inkubiert. In Western Blot-Analysen wurde das Phosphorylierungsmuster bzw. Gesamt-
p53 bestimmt. Aktin wurde jeweils als Ladekontrolle mitgeführt. Doxorubicin (Dox)
phosphoryliert p53 an diversen Serin-Resten (Thompson et al., 2004) und wurde als
Positivkontrolle verwendet. Dargestellt ist jeweils ein repräsentativer Blot aus drei
unabhängigen Versuchen.
Serin-15
Aktin
Serin-20
Aktin
Serin-46
Aktin
Serin-392
Aktin
Gesamtes p53
Aktin
Natriumselenit [µM]
3 5 6 7 8 0 Dox
Selenomethionin [µM]
1 10 100 1000 0 Dox
Serin-15
Aktin
Serin-20
Aktin
Serin-46
Aktin
Serin-392
Aktin
Gesamtes p53
Aktin
Ergebnisse und Diskussion
57
Phenylseleninsäure führte bereits in nicht-zytotoxischen Konzentrationen zur
Phosphorylierung von p53 an Serin-20 und Serin-392 sowie zum Anstieg des Gesamt-p53-
Gehaltes. Im Vergleich dazu wurde Serin-15 erst in vergleichsweise hohen Konzentrationen
phosphoryliert. Die Stabilisierung von p53 als Reaktion auf diese Selenverbindung scheint
demnach anders als beim Natriumselenit unabhängig von der Modifizierung an Serin-15 zu
sein, könnte also über Serin-20 ablaufen. Die Phosphorylierung an Serin-392 weist auf die
Aktivierung des Transkriptionsfaktors hin. Auch nach Inkubation mit Phenylseleninsäure
wurde kein an Serin-46 phosphoryliertes p53 detektiert (Abbildung 20).
Abbildung 20: Phosphorylierung von p53 durch Phenylseleninsäure.
A549 Zellen
wurden 24 h mit Phenylseleninsäure inkubiert. In Western Blot-Analysen wurde das
Phosphorylierungsmuster bzw. Gesamt-p53 bestimmt. Aktin wurde jeweils als Ladekontrolle
mitgeführt. Doxorubicin (Dox) wurde als Positivkontrolle verwendet (Thompson et al., 2004).
Dargestellt ist jeweils ein repräsentativer Blot aus drei unabhängigen Versuchen. Von einer
densiometrische Quantifizierung und Darstellung in der Einheit „% der Kontrolle“ wurde
abgesehen, da es aufgrund von nichtvorhandenem phosphorylierten p53 in Kontrollzellen
hierbei zu großen Schwankungen kommen würde.
Phenylseleninsäure [µM]
Dox 0 30 50 100 200
Serin
-
15
Aktin
Serin
-
20
Aktin
Serin
-
46
Aktin
Serin
-
392
Aktin
Gesamtes p53
Aktin
Ergebnisse und Diskussion
58
Insgesamt gliedern sich die Ergebnisse weitestgehend stimmig in die Literatur ein. In H1299
Lungenkrebszellen (p53-/-, mit Wildtyp-p53-Gen transfiziert) wurde nach Natriumselenit-
Exposition die Phosphorylierung von p53 an Serin-20, -37 und -46 beobachtet, während
Selenomethionin darauf keinen Einfluss hatte (Smith et al., 2004). In der vorliegenden Arbeit
konnte im Vergleich dazu kein durch Natriumselenit an Serin-46-phosphoryliertes p53
detektiert werden. Um die Funktionsfähigkeit des verwendeten Anti-phospho-p53 (Ser-46)-
Antikörpers zu überprüfen, wurden die Zellen mit Doxorubicin, welches in der DNA
interkaliert und die Topoisomerase II hemmt, inkubiert (Abbildung 19). Dieses genotoxische
Anthracyclin führt zur starken Phosphorylierung an den entscheidenden Serin-Resten von
p53 (Thompson et al., 2004). Trotzdem kann nicht ausgeschlossen werden, dass die
Sensitivität nicht ausreichend war, um Effekte durch Natriumselenit zu detektieren. Die
Arbeitsgruppe um Lü zeigte in Prostatakrebszellen, dass Selenit zur Phosphorylierung von
p53 an Serin-15 und -20 führt (Jiang et al., 2004 a; Hu et al., 2006). Zudem beschrieben sie,
dass ihre Detektionsmethode (Röntgenfilm) zu wenig sensitiv war, um die
Phosphorylierungen an Serin-6, -37, -46 und -392 untersuchen zu können (Jiang et al., 2004
a). In der vorliegenden Arbeit traten Probleme bei der Detektion von phosphoryliertem p53
an den Serinen 6, 9 und 37 auf. Dies wurde weitestgehend auf die unspezifischen
Eigenschaften der primären Antikörper zurückgeführt, da hier zum Teil starke unspezifische
Banden detektiert wurden. Die Phosphorylierung von p53 an Serin-15 wurde zudem auch in
HeLa Hep-2 Zellen beobachtet (Rudolf et al., 2008).
Saito et al. (2003) zeigten, dass A549 und HCT116 Zellen auf diverse genotoxische und nicht-
genotoxische Stimuli mit dem gleichen Phosphorylierungsmuster von p53 reagieren.
Insgesamt kann also davon ausgegangen werden, dass die hier beschriebenen Ergebnisse
nach Inkubation mit den Selenverbindungen in A549 Zellen auf die HCT116 Zellen
übertragbar sind.
Ergebnisse und Diskussion
59
5.5 Oxidative DNA-Schäden
In mehreren Studien wurde beschrieben, dass die reduzierbare Selenverbindung
Natriumselenit DNA-Strangbrüche induziert (Lu et al., 1995; Kim et al., 2001; Rudolf et al.,
2008). DNA-Strangbrüche führen mehr als andere DNA-Läsionen zur Stabilisierung von p53
und zur Einleitung einer p53-abhängigen Signaltransduktion (Nelson et al., 1994). Oxidative
DNA-Schäden werden über die BER repariert. Es wird diskutiert, ob die NER dabei als „Back
up“-Mechanismus fungieren kann (Langie et al., 2007). In dieser Arbeit wurde mittels
Alkalischer Entwindung die Induktion von DNA-Strangbrüchen und Fpg-sensitiven
Basenmodifikationen durch verschiedene Selenverbindungen in Abhängigkeit des p53-Status
der Zellen bestimmt. Zudem wurde die Induktion von Proteinen der BER und NER auf Gen-
und Proteinebene betrachtet.
5.5.1 Bestimmung von oxidativen DNA-Schäden mittels alkalischer
Entwindung
Die Bestimmung der oxidativen DNA-Schäden in Abhängigkeit des p53-Status der Zellen
wurde nach 45 h Inkubation durchgeführt. Diese vergleichsweise lange Inkubationszeit
wurde gewählt, da die Stabilisierung von p53 erst nach 45 h deutlich wurde und die
Expression verschiedener p53-abhängiger Gene sich erst zu diesem Zeitpunkt in den beiden
Zelllinien deutlich unterschied (siehe Abschnitt 5.5.2/4).
Die beiden HCT116 Zelllinien zeigten nach Natriumselenit-Inkubation sehr unterschiedliche
Gehalte an oxidativen DNA-Schäden. Die p53-defizienten HCT116 Zellen akkumulierten
bereits bei nicht-zytotoxischen Konzentrationen an Natriumselenit hohe Gehalte an DNA-
Strangbrüchen, während die p53-profizienten Zellen bis in den zytotoxischen
Konzentrationsbereich kaum DNA-Schäden aufwiesen (Abbildung 21). Erst ab 5 µM
Natriumselenit traten in der p53-defizienten Zelllinie zudem Fpg-sensitive Läsionen auf. Bei
der vergleichsweise hohen Konzentration von 8 µM Natriumselenit wurde in beiden
Zelllinien gleichermaßen hohe Gehalte an DNA-Schäden detektiert, dabei war bei dieser
Konzentration das Verhältnis zwischen DNA-Strangbrüchen und Fpg-sensitiven Läsionen
ausgeglichen.
Ergebnisse und Diskussion
60
Abbildung 21: Oxidative DNA-Schäden nach Inkubation mit Natriumselenit.
P53-profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 45 h mit Natriumselenit inkubiert. Mittels
Alkalischer Entwindung wurden Strangbrüche und Fpg-sensitive Stellen quantifiziert. Zudem
wurde die Zellzahl bestimmt. Dargestellt sind jeweils Mittelwerte aus mindestens 3
unabhängigen Bestimmungen + SD. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den
Zelllinien: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Im Vergleich dazu war das Auftreten von DNA-Schäden nach Inkubation mit
Selenomethionin unabhängig vom p53-Status der Zellen. Ab 500 µM Selenomethionin stieg
in beiden Zelllinien der Gehalt an DNA-Strangbrüchen an (Abbildung 22).
Phenylseleninsäure induzierte in beiden Zelllinien DNA-Strangbrüche beginnend bei einer
Konzentration von 20 µM, wobei die DNA-Schädigung in den p53-defizienten Zellen marginal
höher war (Abbildung 23).
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
1
10
100
***
***
***
*
Zellzahl (% der Kontrolle)
HCT116 p53+/+
Strangbrüche
Fpg-sen. Stellen
Zellzahl
HCT116 p53-/-
Strangbrüche
Fpg-sen. Stellen
Zellzahl
Läsionen pro 10
6
Basenpaare
Ergebnisse und Diskussion
61
Abbildung 22: Oxidative DNA-Schäden nach Inkubation mit Selenomethionin.
P53-profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 45 h mit Selenomethionin inkubiert.
Mittels Alkalischer Entwindung wurden Strangbrüche und Fpg-sensitive Stellen quantifiziert.
Zudem wurde die Zellzahl bestimmt. Dargestellt sind jeweils Mittelwerte aus mindestens 3
unabhängigen Bestimmungen + SD. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den
Zelllinien: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Abbildung 23: Oxidative DNA-Schäden nach Inkubation mit
Phenylseleninsäure.
P53-profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 45 h mit
Phenylseleninsäure inkubiert. Mittels Alkalischer Entwindung wurden Strangbrüche und Fpg-
sensitive Stellen quantifiziert. Zudem wurde die Zellzahl bestimmt. Dargestellt sind jeweils
Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0
10
100
500
1000
Selenomethionin [µM]
Läsionen pro 10
6
Basenpaare
1
10
HCT116 p53+/+
Strangbrüche
Fpg-sen. Stellen
Zellzahl
HCT116 p53-/-
Strangbrüche
Fpg-sen. Stellen
Zellzahl
100
Zellzahl (% der Kontrolle)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0
1
10
20
30
Phenyl
seleninsäure [µM]
Läsionen pro 10
6
Basenpaare
1
Zellzahl (% der Kontrolle)
HCT116 p53+/+
Strangbrüche
Fpg-sen. Stellen
Zellzahl
HCT116 p53-/-
Strangbrüche
Fpg-sen. Stellen
Zellzahl
100
10
Ergebnisse und Diskussion
62
5.5.2 Stabilisierung von p53
Infolge von genotoxischem Stress wird p53 stabilisiert. Daher wurde der p53-Proteingehalt
mittels Western Blot nach Inkubation mit Natriumselenit bzw. Selenomethionin bestimmt.
Natriumselenit stabilisierte p53: Nach 24 h Inkubation führten 5 µM Natriumselenit zu einer
signifikanten Steigerung des Proteingehaltes um 40 %, wobei diese Zunahme bei 8 µM nicht
mehr vorhanden war. Nach 45 h Inkubation war bereits bei niedrigen Konzentrationen ein
marginaler Anstieg zu verzeichnen. Bei 5 µM Natriumselenit hatte sich der basale p53-Gehalt
annähernd verdoppelt und blieb auch bei 8 µM konstant erhöht (Abbildung 24).
In den p53-defizienten Zellen akkumulierten DNA-Strangbrüche nach 45 h Inkubation bereits
ab 1 µM Natriumselenit. Es ist auffällig, dass die Stabilisierung nach 45 h Inkubation jedoch
erst ab 5 µM Natriumselenit deutlich zunahm. Daraus lässt sich ableitet, dass bereits der
basale Gehalt von p53 die BER-Kapazität erhöht.
Abbildung 24: Proteingehalt an p53 nach 24 h bzw. 45 h Inkubation mit
Natriumselenit.
P53-profiziente Zellen wurden 24 h (A) bzw. 45 h (B) mit Natriumselenit
inkubiert. Der Proteingehalt wurde in Western Blot-Analysen ermittelt (A, B). Aktin wurde als
Ladekontrolle mitgeführt. Mittels Dargestellt sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen
Versuchen +SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05,
**p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Nach 45 h resultierte auch aus der Selenomethionin-Exposition eine Stabilisierung von p53
(Abbildung 25). Diese trat bei 100 µM Selenomethionin ein, der Konzentration bei der
bereits DNA-Strangbrüche detektiert wurden (vgl. Abschnitt 5.5.1).
0
50
100
150
200
250
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Proteingehalt an p53
(% der Kontrolle)
0
50
100
150
200
250
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Proteing
ehalt an p53
(% der Kontrolle)
A
24 h
B
45 h
HCT116 p53+/+
**
***
*
**
***
Ergebnisse und Diskussion
63
Abbildung 25: Proteingehalt an p53 nach 45 h Inkubation mit
Selenomethionin.
P53-profiziente Zellen wurden 45 h mit Selenomethionin inkubiert. Der
Proteingehalt wurde in Western Blot-Analysen ermittelt. Aktin wurde als Ladekontrolle
mitgeführt. Dargestellt sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen +SD. Statistisch
signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
(Student’ scher t-Test).
5.5.3 Genexpression und Proteingehalt von BER-Proteinen
Oxidative DNA-Schäden werden mittels BER repariert. Es wird zwischen dem „short patch“-
und „long-patch“-Reparaturweg unterschieden. Bei starker Expression von p21 wird PCNA
und damit die PCNA-abhängige „long patch“-Reparatur inhibiert (zusammengefasst in Fortini
and Dogliotti, 2007). Da Natriumselenit p53-abhängig zur Induktion von p21 führte (siehe
Abschnitt 5.6.2), wurde in dieser Arbeit die Expression der Gene der „short patch“-Reparatur
betrachtet. Analog zu der Bestimmung der oxidativen DNA-Schäden wurde eine
Inkubationszeit von 45 h gewählt.
In der Literatur wird p53 nicht mit einer erhöhten Transkription von hOGG1 nach DNA-
Schädigung sondern mit einer Erhöhung des Basalgehaltes an hOGG1 in Zusammenhang
gebracht (Chatterjee et al., 2005). Daher wurde die basale Expression verschiedener BER-
Gene (hOGG1, APE1, Polß, LigIII, XRCC1) in den p53-profizienten und p53-defizienten
HCT116 Zellen verglichen. Es zeigte sich, dass die basale Expression in den p53-defizienten
Zellen jeweils höher war (Abbildung 26 A). Damit weisen die hier vorgelegten Ergebnisse auf
erhöhten endogenen, oxidativen Stress bei p53-Defizienz hin.
Natriumselenit hatte in den p53-profizienten Zellen keinen Einfluss auf die Expression von
hOGG1, APE1, LigIII und XRCC1 (Abbildung 26 B, C, E, F). Jedoch wurde eine deutliche
Induktion von Polß bei 3 µM und 5 µM Natriumselenit detektiert (Abbildung 26 D). Bei 8 µM
Natriumselenit wurde Polß, evtl. aufgrund der hochzytotoxischen Inkubationsbedingungen,
nur marginal induziert. Im Vergleich dazu war die Expression von Polß in den p53-defizienten
Zellen trotz Natriumselenit-Inkubation konstant, wobei die basale Expression verglichen mit
0
50
100
150
200
0
1
10
100
500
Selenomethionin [µM]
Proteingehalt von p53
(% der Kontrolle)
p53
45 h
**
***
Ergebnisse und Diskussion
64
den p53-profizienten Zellen bereits um den Faktor 1,5 gesteigert war. Die Transkription der
anderen betrachteten Gene wurden in den p53-defizienten Zellen durch Natriumselenit
reprimiert. Dabei war die Repression nur bei hOGG1 und APE1 signifikant (Abbildung 26 B, C,
E, F).
Abbildung 26: Expression von BER-Genen nach Inkubation mit
Natriumselenit.
P53-profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 45 h mit
Natriumselenit inkubiert. Mittels real time RT-PCR wurde die relative Genexpression von
hOGG1 (B), APE1 (C), Polß (D), LigIII (E) und XRCC1 (F) bestimmt. Die basale Expression in den
beiden Zelllinien wurde verglichen (A). Dargestellt sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen
Versuchen +SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05,
**p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Überraschenderweise ergaben Western Blot-Analysen mit einem gegen Polß gerichteten
Antikörper auf der Proteinebene ein anderes Bild. Hier hatte Natriumselenit in beiden
Zelllinien gleichermaßen vielmehr einen repressiven Effekt, der mit der Zeit zunahm und bei
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0
1
3
5
8
C
APE1
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von APE1
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0
1
3
5
8
E
LigIII
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
L
igIII
F
XRCC1
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
XRCC1
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0
1
3
5
8
B
hOGG
1
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
hOGG
1
D
Polß
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
P
olß
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
hOGG
1
APE
1
Pol
ß
L
igIII
XR
CC
1
Relative Genexpression
A
**
**** **
**
**
**
**
Ergebnisse und Diskussion
65
45 h bereits bei 3 µM Natriumselenit begann (Abbildung 27). Zudem sind diese Ergebnisse
inkonsistent zu Studien von Seo et al. (2002), nach denen p53 durch direkte Protein-Protein-
Interaktion zur Stabilisierung des Polß-Proteins führen soll.
Abbildung 27: Proteingehalt an Polß nach Inkubation mit Natriumselenit.
P53-
profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 24 h (A) bzw. 45 h (B) mit Natriumselenit
inkubiert. In Western Blot-Analysen wurde der Gehalt an Polß bestimmt. Aktin wurde jeweils
als Ladekontrolle mitgeführt. Dargestellt sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen
+SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01,
***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Da die Akkumulation von DNA-Strangbrüchen im Falle von Selenomethionin unabhängig von
p53 erfolgte, wurde auf Expressionsstudien der BER-Gene verzichtet. Interessanterweise
zeigte sich jedoch auf der Proteinebene, dass Polß beginnend bei 100 µM Selenomethionin
induziert/stabilisiert wurde (Abbildung 28). Bei dieser Konzentration wurden zudem DNA-
Strangbrüche detektiert (siehe Abschnitt 5.5.1).
Abbildung 28: Proteingehalt an Polß nach Inkubation mit Selenomethionin.
P53-profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 45 h mit Selenomethionin inkubiert. In
Western Blot-Analysen wurde der Gehalt an Polß bestimmt. Aktin wurde jeweils als
Ladekontrolle mitgeführt. Dargestellt sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen +SD.
Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01,
***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
0
20
40
6
0
80
100
120
140
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Gehalt an Polß
(% der Kontrolle)
0
20
40
60
80
100
120
140
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Gehalt an Polß
(% der Kontrolle)
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
A
B
*
**
***
**
*
***
0
50
100
150
200
250
0
1
10
100
500
Selenomethionin [µM]
Proteingehalt an Polß
(% der Kontrolle)
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
*
**
***
*
Ergebnisse und Diskussion
66
5.5.4 Genexpression und Proteingehalt von NER-Proteinen
Im Vergleich zur BER wird p53 in der NER ein viel stärkerer transkriptioneller Einfluss
zugeschrieben (zusammengefasst in Seo and Jung, 2004). Zudem wird die NER und hier vor
allem die Induktion von XPC und XPA als „Back up“-Mechanismus für die BER diskutiert
(Langie et al., 2007). Deshalb wurde die Induktion von NER-Proteinen auf mRNA- und
Proteinebene untersucht. Neben XPC und p48, für die p53 als wichtiger Transkriptionsfaktor
fungiert, wurde auch XPA ausgewählt, welches p53-unabhängig transkribiert wird.
Der p53-Status der Zellen sowie die Stabilisierung von p53 (vgl. Abschnitt 5.5.2) wirkten sich
auf die p53-abhängigen NER-Gene, p48 und XPC, aus. Die basale Expression von p48 lag in
den p53-defizienten Zellen etwa 40 % niedriger. In den p53-profizienten Zellen wurde p48
nach Natriumselenit-Inkubation induziert. Hinsichtlich Inkubationskonzentration und –zeit
verlief die p48-Induktion weitestgehend analog zur Stabilisierung von p53. Nach 24 h stieg
die Expression beginnend mit 5 µM Natriumselenit an und nahm bei 8 µM jedoch weiter,
insgesamt auf das Zweifache der basalen Expression, zu. Nach 45 h Inkubation führten
bereits niedrige Natriumselenitkonzentrationen zu einer geringen Zunahme an p48-mRNA,
und ein starker Anstieg der Genexpression auf das Vierfache war ab 5 µM zu verzeichnen. Im
Vergleich dazu hatte Natriumselenit keinen induzierenden Einfluss auf p48 in der p53-
defizienten Zelllinie. Eher zeigte sich eine marginale Repression (Abbildung 29).
Abbildung 29: Genexpression von p48 nach 24 h bzw. 45 h Inkubation mit
Natriumselenit.
P53-profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 24 h (A) bzw. 45 h (B)
mit Natriumselenit inkubiert. Mittels real time RT-PCR wurde die relative Genexpression
bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen +SD. Statistisch
signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
(Student’ scher t-Test).
Im Falle von XPC gab es Unterschiede in der basalen Expression nach den verschiedenen
Inkubationszeiten. Nach 24 h war der Grundgehalt an mRNA in der p53-profizienten Zelllinie
0
1
2
3
4
5
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
p48
0
1
2
3
4
5
0
1
3
5
8
Natr
iumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
p48
A
24 h
B
45 h
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
*
*
*** **
*
Ergebnisse und Diskussion
67
geringfügig höher, während die p53-defizienten Zellen nach 45 h eine etwa 1,5fach
gesteigerte Genexpression aufwiesen. Diese Diskrepanz ist schwer zu erklären, vor allem da
diese sich auch nicht auf die Proteinebene auszuwirken schien. Hier lag der Gehalt an XPC in
den p53-profizienten Zellen jeweils geringfügig höher.
Die Induktion der Genexpression von XPC nach Natriumselenit-Inkubation zeigte analog zu
p48 ein vergleichbares Bild. Nach 24 h Inkubation stieg der mRNA-Gehalt in den p53-
profizienten Zellen erst bei vergleichsweise hohen Konzentrationen an Natriumselenit. Bei
längerer Inkubationszeit begann die Induktion bereits bei 3 µM Natriumselenit und stieg ab
5 µM sprunghaft auf das Vierfache der basalen Expression an. In den p53-defizienten Zellen
blieb die Expression nach 24 h Inkubation konstant, nach 45 h war tendenziell eher ein
repressiver Effekt durch Natriumselenit erkennbar (Abbildung 30 A, B).
Abbildung 30: Genexpression und Proteingehalt von XPC nach 24 h bzw. 45 h
Inkubation mit Natriumselenit.
P53-profiziente und p53–defiziente Zellen wurden 24 h
(A, C) bzw. 45 h (B, D) mit Natriumselenit inkubiert. Mittels real time RT-PCR wurde die
relative Genexpression von XPC bestimmt (A, B). Der Proteingehalt wurde in Western Blot-
Analysen ermittelt (C, D). Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen
Bestimmungen + SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle:
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Die p53-abhängige Steigerung der Genexpression von XPC spiegelte sich nach 24 h nicht auf
der Proteinebene wieder. Erst ab 45 h Inkubation nahm der Proteingehalt an XPC ab 5 µM
Natriumselenit um den Faktor 1,5 zu. In der p53-defizienten Zelllinie kam es zu beiden
**
0
1
3
5
8
0
1
2
3
4
5
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
XPC
0
1
2
3
4
5
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
XPC
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
0
50
100
150
200
Proteingehalt an XPC
(% der Kontrolle)
0
50
100
150
200
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Proteingehalt an XPC
(% der Kontrolle)
A
24 h
B
45 h
C
24 h
D
45 h
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
*
**
*
***
**
**
**
**
Ergebnisse und Diskussion
68
Zeitpunkten zu einer geringfügigen Senkung des Proteingehalt nach Natriumselenit-
Exposition (Abbildung 30 C, D). Ein genereller Effekt auf die Genexpression wird jedoch
ausgeschlossen, da die Bestimmung der Genexpression von XPA, welches p53-unabhängig
reguliert wird, andere Ergebnisse brachte.
Die basale Expression von XPA war in den p53-defizienten Zellen höher als in den p53-
profizienten Zellen. Dies wirkte sich gleichsinnig auf den basalen Proteingehalt aus. XPA
wurde im Vergleich zu XPC und p48 durch Natriumselenit nicht p53-abhängig induziert. Nach
45 h Inkubation mit Natriumselenit blieb die Genexpression von XPA in den p53-profizienten
Zellen konstant. In der p53-defizienten Zelllinie fiel der mRNA-Gehalt mit steigender
Konzentration an Natriumselenit ab, jedoch nicht signifikant und nicht unter den Gehalt in
der p53-profizienten Zelllinie. Ebenfalls war der Gehalt an XPA-Protein nach Inkubation mit
Natriumselenit in den p53-defizienten Zellen jeweils höher. Nach 24 h Inkubation waren die
Gehalte bis 5 µM Natriumselenit konstant und fielen bei 8 µM. Nach 45 h Inkubation war die
Repression in beiden Zelllinien ausgeprägter (Abbildung 31).
Abbildung 31: Genexpression und Proteingehalt von XPA nach 24 h bzw. 45 h
Inkubation mit Natriumselenit.
P53-profiziente und p53–defiziente Zellen wurden 24 h
(B) bzw. 45 h (A, C) mit Natriumselenit inkubiert. Mittels real time RT-PCR wurde die relative
Genexpression von XPA bestimmt (A). Der Proteingehalt wurde in Western Blot-Analysen
ermittelt (B, C). Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen
+ SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01,
***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Natriumselenit [µM]
0
1
3
5
8
Proteingehalt an XPA
(% der Kontrolle)
0
50
100
150
200
Natriumselenit [µM]
0
1
3
5
8
0
1
2
3
4
5
Relative Genexpression
von
XPA
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Proteingehalt an XPA
(% der Kontrolle)
0
50
100
150
200
A
45 h
B
24 h
C
45 h
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
*
**
***
***
***
Ergebnisse und Diskussion
69
Selenomethionin induzierte weder p48 noch XPC p53-abhängig. Die Genexpression von p48
und XPC blieb nach 24 h Inkubation in beiden Zelllinien relativ konstant. Daraufhin wurde
der Proteingehalt an XPC erst nach 45 h bestimmt. Hier kam es nur marginal zu einer p53-
unabhängigen Erhöhung. Im Falle von XPA hatte Selenomethionin in den p53-defizienten
Zellen weder einen Einfluss auf die Genexpression nach 24 h bzw. auf den Proteingehalt
nach 45 h. In der p53-profizienten Zelllinie war die Transkription ebenfalls nicht beeinflusst,
während sich eine geringfügige Reduktion im Proteingehalt von XPA zeigte (Abbildung 32).
Abbildung 32: Genexpression und Proteingehalt von NER-Proteinen nach 24 h
bzw. 45 h Inkubation mit Selenomethionin.
P53-profiziente und p53–defiziente
Zellen wurden 24 h (A, B, C) bzw. 45 h (D, E, F) mit Selenomethionin inkubiert. Mittels real
time RT-PCR wurde die relative Genexpression von p48, XPC und XPA bestimmt (A, B, C). Der
Proteingehalt von XPC und XPA wurde in Western Blot-Analysen ermittelt (D, E, F).
Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD. Statistisch
signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
(Student’ scher t-Test).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0
1
10
100
500
Selenomethionin [µM]
Relative Genexpression
von
p48
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0
1
10
100
500
Selenomethionin [µM]
Relative Genexpression
von
XPC
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0
1
1
0
100
500
Selenomethionin [µM]
Relative Genexpression
von
XPA
0
1
10
100
500
Selenomethionin [µM]
Proteingehalt an XPC
(% der Kontrolle)
0
50
100
150
200
0
50
100
150
200
0
1
10
100
500
Selenomethionin [µM]
Proteingehalt an XPA
(% der Kontro
lle)
A
p48
B
XPC
C
XPA
F
XPA
E
XPC
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
*
** **
* *
Ergebnisse und Diskussion
70
5.5.5 Bewertung der Ergebnisse
Die Akkumulation von DNA-Strangbrüchen war nur im Falle von Natriumselenit abhängig
vom p53-Status der Zellen. Dabei konnte nur in den p53-defizienten Zellen bereits in nicht-
zytotoxischen Konzentrationen an Natriumselenit hohe Gehalte an DNA-Strangbrüchen
detektiert werde. Erst bei einer vergleichsweise hohen Konzentration wiesen beide Zelllinien
gleichermaßen DNA-Strangbrüche und Fpg-sensitive Läsionen auf. In der Literatur finden
sich Beispiele zur Induktion von DNA-Strangbrüchen durch Natriumselenit in p53-
profizienten und p53-defizienten Zellen. Kim et al. (2001) fanden in HL-60 Zellen (p53-
defizient) nach 24 h Inkubation mit 20 µM Natriumselenit Einzel- und Doppelstrangbrüche.
In murinen Brustkrebszellen (p53-Status nicht bekannt) wurden hohe Gehalte an DNA-
Einzel- und Doppelstrangbrüchen bereits nach 2 h Inkubation mit 5 µM Natriumselenit
detektiert (Lu et al., 1995). In HeLa Hep-2 Zellen (p53-profizient) wurden DNA-Strangbrüche
durch 5 µM und 50 µM Natriumselenit induziert, die zeitabhängig beginnend bei 6 h
Inkubation zunahmen. Allerdings wurde in diesen drei Studien jeweils kein Fpg oder eine
andere Glykosylase verwendet, so dass ausschließlich DNA-Strangbrüche aber keine DNA-
Basenmodifikationen oder AP-Stellen detektiert werden konnten. In Arbeiten von Stewart et
al. (1999) wurde zudem die oxidative Basenmodifikation 8-Hydroxydeoxyguanosin mittels
HPLC-Methode nach Inkubation von murinen Keratinozyten (p53-profizient) mit 5 µM
Natriumselenit nachgewiesen. Mechanistisch wird die DNA-schädigende Wirkung des
Natriumselenits mit der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies in Verbindung gebracht. So
konnte der Gehalt an DNA-Strangbrüchen nach Vorinkubation mit MnTMPyP (Mn[III]
Tetrakis[4-Benzoesäure] Porphyrin), einem Superoxid-Dismutase- und Katalase-Mimetic,
gesenkt werden, während BSO (Buthioninsulfoximin), eine Glutathion-depletierende
Substanz, diesen steigerte (Rudolf et al., 2008). Insgesamt wurde das Superoxidanion als
Auslöser für die DNA-Schädigung identifiziert (Hu et al., 2006; Li et al., 2007). Studien
unserer Arbeitsgruppe sprechen ebenfalls dafür, dass die DNA-Schädigung nicht auf einem
direkten Mechanismus beruht, sondern auf eine ROS-Produktion während der
Metabolisierung zurückzuführen ist. So konnten bei der Inkubation von isolierter PMII-DNA
selbst bei Konzentrationen von 1000 µM Natriumselenit weder DNA-Strangbrüche noch Fpg-
sensitive Läsionen detektiert werden (unpublizierte Daten).
Oxidative DNA-Schäden werden über die Basenexzisionsreparatur repariert. Unter normalen
Bedingungen werden DNA-Einzelstrangbrüche relativ schnell repariert (Dally and Hartwig,
1997). Die gemessenen hohen DNA-Strangbruchgehalte in den p53-defizienten Zellen
könnten demnach aus einer anhaltenden Schädigung durch die Natriumselenit-Exposition in
Kombination mit einer weniger effizienten Reparatur resultieren. Die DNA-Strangbrüche
Ergebnisse und Diskussion
71
könnten dabei zum einen direkt induziert oder als Reparatur-Intermediate aus Fpg-
sensitiven Läsionen gebildet worden sein. Folgende kinetische Untersuchungen können evtl.
Aufschluss bringen.
Um die protektive Rolle von p53 hinsichtlich der DNA-Schädigung durch Natriumselenit zu
untersuchen, wurde zunächst die Expression der BER-Gene in den beiden Zelllinien
verglichen. Interessanterweise war die basale Expression der an dem „short patch“-
Reparaturweg beteiligten Proteine in der p53-defizienten Zelllinie höher. Dies deutet auf
einen endogen erhöhten oxidativen Stress in Abwesenheit von p53 hin und unterstreicht die
Funktion von p53 bei der Zellantwort bereits bei einem „steady state-Level“ an oxidativen
DNA-Schäden. Abweichend davon fanden Chatterjee et al. (2005), dass p53-profiziente
HCT116 Zellen im Vergleich zur isogenen p53-defizienten Zelllinie sowohl eine höhere
Expression an hOGG1 als auch eine höhere Aktivität dieser Glykosylase aufweisen. Dies steht
im Widerspruch zu den hier vorgestellten Ergebnissen sowie zu weiteren Studien unserer
Arbeitsgruppe zur hOGG1-Aktivität. So hatten die p53-defizienten Zellen in einem
Inzisionstest basal aber auch nach Inkubation mit Cadmium oder Kupfer jeweils eine höhere
hOGG1-Aktivität als die p53-profizienten Zellen (Hamann, 2009; König, 2010).
In der p53-defizienten Zelllinie resultierten aus der Natriumselenit-Exposition eine
Akkumulation von DNA-Strangbrüchen. Natriumselenit hatte in diesen Zellen jedoch keinen
Einfluss auf die Expression von Polß und einen repressiven Einfluss insbesondere auf hOGG1
und APE1. Im Folgenden wird diskutiert, ob eine Repression dieser beiden Gene nach
Inkubation mit Natriumselenit zur Akkumulation von DNA-Strangbrüchen geführt haben
könnte. Wenn Natriumselenit DNA-Strangbrüche induziert, kann eine Repression von hOGG1
nicht zu deren Akkumulation führen, da hOGG1 nicht an deren Reparatur beteiligt ist. Sollten
Fpg-sensitive Läsionen als Ursprungsschäden aufgetreten sein, würde man bei einer
Repression von hOGG1 eine Akkumulation von Fpg-sensitiven Läsionen nicht aber von
Strangbrüchen erwarten. Im Gegensatz dazu gibt es zwei mögliche Mechanismen, die bei
starker Repression von APE1 zur Akkumulation von DNA-Einzelstrangbrüchen führen. Der
erste Mechanismus hängt mit der Lyase-Aktivität von hOGG1 zusammen. Die Lyase-Aktivität
dieser bifunktionellen Glykosylase ist nur sehr schwach ausgeprägt, sodass AP-Stellen das
Hauptprodukt darstellen. Erst bei fehlender APE1 öffnet hOGG1 den Strang via ß-
Eliminierung und bildet dabei Enden, die zunächst von APE1 bereinigt werden müssen, bevor
sie von Polß prozessiert werden können (zusammengefasst in Hedge et al., 2008). Auf
ähnliche Weise akkumulieren ROS-induzierte DNA-Strangbrüche in Abwesenheit von APE1,
da diese oft unbereinigte 3’-Enden aufweisen (Izumi et al., 2000). Die Repression von APE1 in
den p53-defizienten Zellen erklärt die starke Akkumulation der DNA-Strangbrüche jedoch
nicht vollständig, da die Genexpression trotz Repression in den p53-defizienten Zellen noch
über oder auf Höhe der Expression in den p53-profizienten Zellen lag. Der repressive Einfluss
Ergebnisse und Diskussion
72
von Natriumselenit in den p53-defizienten Zellen auf LigIII und XRCC1 war zu gering, um hier
den Grund für die unterschiedlichen Gehalte an DNA-Schäden in den beiden Zelllinien zu
finden.
In der p53-profizienten Zelllinie blieb die Genexpression von hOGG1, APE1, LigIII und XRCC1
nach Natriumselenit-Exposition weitestgehend konstant. Dabei wäre ein repressiver Einfluss
auf APE1 in der p53-profizienten Zellen eher zu erwarten gewesen, da p53 unter
zytotoxischen Bedingungen ein negativer Regulator von APE1 auf der Genexpressionsebene
ist (Zaky et al., 2008). Dies wird als Mechanismus diskutiert, über den p53 Apoptose
einleitet. Bei der Reparatur von DNA-Strangbrüchen kann unter gewissen Umständen auch
Polß ein limitierender Faktor sein (Izumi et al., 2000). Ein heterozygoter Polß-„Knockout“ in
Mäusen führt zur Akkumulation von DNA-Strangbrüchen (Cabelof et al., 2002). Im Gegensatz
zu den p53-defizienten Zellen zeigte sich in den p53-profizienten Zellen ab 3 µM
Natriumselenit ein induktiver Einfluss auf die Genexpression von Polß. Trotzdem wurde in
den p53-profizienten Zellen auf der Proteinebene keine Zunahme an Polß detektiert,
sondern vielmehr eine Abnahme in beiden Zelllinien gleichermaßen. Dies überrascht, da aus
der Literatur bekannt ist, dass p53 Polß auf der Proteinebene stabilisiert (Seo et al., 2002)
und generell der Gehalt an Polß nach oxidativer DNA-Schädigung steigt (Cabelof et al., 2002).
Trotzdem ist es möglich, dass die p53-profizienten Zellen unter unseren
Versuchsbedingungen eine höhere Polß-Aktivität aufgewiesen haben, da p53 durch direkte
Interaktion die DNA-Bindungsfähigkeit von Polß verbessert (Cabelof et al., 2002). In
Abbildung 33 sind Einflüsse von p53 auf Gene bzw. Proteine der BER, die in der Literatur
beschrieben werden, zusammengefasst und unseren Ergebnissen nach Natriumselenit-
Exposition gegenüber gestellt.
Interessant könnte auch die Rolle von GADD45 sein, einem „down stream“-Gen von p53,
welches jedoch auch p53-unabhängig transkribiert werden kann. GADD45 wird vor allem mit
der Zellzykluskontrolle (Smith et al., 1994) aber auch mit der NER in Verbindung gebracht
(zusammengefasst in Zhan, 2005). Weniger bekannt ist die Funktion von GADD45 in der BER.
So weisen GADD45-defiziente Zellen eine verlangsamte BER auf. Dies wird z. B. darauf
zurückgeführt, dass GADD45 die Funktionsfähigkeit von APE1 positiv beeinflussen soll (Jung
et al., 2007). Die Konsequenzen eines inaktivierenden Einflusses auf APE1 wurden bereits
diskutiert. Die Genexpressionsanalysen zeigten, dass GADD45 auch von den p53-defizienten
Zellen nach Natriumselenit-Exposition induziert werden konnte, die Expression nach 45 h
Inkubation mit 3 µM oder 5 µM Natriumselenit jedoch in den p53-defizienten Zellen deutlich
höher lag (siehe Abschnitt 5.6.2).
Ergebnisse und Diskussion
73
APE1
Pol ß
Pol ß
dRpdRp
dRpdRp
LigIII/XRCC1
hOGG1
Basallevel in den p53-defizienten
Zellen jeweils höher; Einfluss von
Natriumselenit: jeweils konstante
Expression in den p53-
profizienten Zellen; jeweils
marginale Repression in den p53-
defizienten Zellen
Basallevel in den p53-defizienten
Zellen höher; Einfluss von
Natriumselenit: Induktion auf
mRNA-Ebene nur in der p53-
profizienten Zelllinie; jedoch keine
Induktion auf der Proteinebene,
vielmehr Repression in beiden
Zelllinien
P53-abhängige Stabilisierung
des Proteins
(Seo et al., 2002)
Proteingehalt steigt nach
oxidativer DNA-Schädigung
(Cabelof et al., 2002)
Direkte Interaktion mit p53
verbessert DNA-Bindung
(Zhou et al., 2001)
Basallevel in den p53-defizienten
Zellen höher; Einfluss von
Natriumselenit: Repression nur in
den p53-defizienten Zellen
Aktivität unabhängig vom p53-
Status
(Seo et al., 2002)
P53 als negativer Regulator auf
der Genebene
(Zaky et al., 2008)
Inaktivierung führt zu
Einzelstrangbrüchen
(Izumi et al., 2000)
Basallevel in den p53-defizienten
Zellen höher; Einfluss von
Natriumselenit: p53-unabhängige
Repression
P53-abhängiger Basallevel
(Chatterjee et al., 2005)
ErgebnisseLiteratur
Basallevel in den p53-defizienten
Zellen jeweils höher; Einfluss von
Natriumselenit: jeweils konstante
Expression in den p53-
profizienten Zellen; jeweils
marginale Repression in den p53-
defizienten Zellen
Basallevel in den p53-defizienten
Zellen höher; Einfluss von
Natriumselenit: Induktion auf
mRNA-Ebene nur in der p53-
profizienten Zelllinie; jedoch keine
Induktion auf der Proteinebene,
vielmehr Repression in beiden
Zelllinien
P53-abhängige Stabilisierung
des Proteins
(Seo et al., 2002)
Proteingehalt steigt nach
oxidativer DNA-Schädigung
(Cabelof et al., 2002)
Direkte Interaktion mit p53
verbessert DNA-Bindung
(Zhou et al., 2001)
Basallevel in den p53-defizienten
Zellen höher; Einfluss von
Natriumselenit: Repression nur in
den p53-defizienten Zellen
Aktivität unabhängig vom p53-
Status
(Seo et al., 2002)
P53 als negativer Regulator auf
der Genebene
(Zaky et al., 2008)
Inaktivierung führt zu
Einzelstrangbrüchen
(Izumi et al., 2000)
Basallevel in den p53-defizienten
Zellen höher; Einfluss von
Natriumselenit: p53-unabhängige
Repression
P53-abhängiger Basallevel
(Chatterjee et al., 2005)
ErgebnisseLiteratur
Abbildung 33: Einfluss von p53 auf die Gene bzw. Proteine der BER und
Zusammenfassung der Ergebnisse nach Natriumselenit-Exposition.
Während die BER für die Reparatur oxidativer DNA-Schäden verantwortlich ist, repariert die
NER Helix-verzerrende DNA-Schäden. Trotzdem werden NER-Proteine wie XPC, XPA und
ERCC4 durch oxidativen Stress hochreguliert (Langie et al., 2007). Zudem zeigte sich ein
Zusammenhang zwischen einem Polymorphismus im XPA-Gen und dem erhöhten Auftreten
von oxidativen DNA-Schäden bei Asbest-exponierten Arbeitern (Dušinaká et al., 2006). Für
XPC wurde gezeigt, dass es die Aktivität von hOGG1 steigert, wahrscheinlich indem es die
Glykosylase nach dem Ausschneiden der Base von der AP-Stelle verdrängt und somit ihren
Umsatz steigert (D’Errico et al., 2006). Da die NER deshalb als „Back up“-Mechanismus für
die BER diskutiert wird, wurde in dieser Arbeit auch der Einfluss von Natriumselenit auf die
Expression von NER-Genen in den beiden HCT116 Zelllinien untersucht. Es zeigte sich, dass
die Genexpression von XPC und p48 tatsächlich p53-abhängig induziert wurde. Dies wirkte
sich gleichsinnig auf den Proteingehalt von XPC aus. Dabei war die Induktion dieser Gene, für
die p53 ein wichtiger Transkriptionsfaktor darstellt, auch begleitet von einer Stabilisierung
von p53 auf der Proteinebene. Im Vergleich wurde unabhängig vom p53-Status der Zellen
Ergebnisse und Diskussion
74
keine Induktion von XPA detektiert. Neben dem oben diskutierten Einflüssen auf APE1, Polß
und GADD45 könnten somit die p53-abhängigen NER-Gene eine Rolle bei der
unterschiedlichen BER-Kapazität in den beiden HCT116 Zelllinien gespielt haben. Dies könnte
z. B. anhand von XPC-defizienten Zellen überprüft werden.
Im Vergleich zum Natriumselenit akkumulierten beide Zelllinien nach Inkubation mit
Selenomethionin gleichermaßen erst bei vergleichsweise hohen Konzentrationen DNA-
Strangbrüche. Aufgrund der gleichen prooxidativen Zwischenmetabolite ist diese DNA-
Schädigung, die jedoch geringer ist als beim Natriumselenit nicht überraschend und wurde in
der Literatur bereits beschrieben (zusammengefasst in Letavayová et al., 2006). Interessant
ist hingegen, dass das Auftreten von DNA-Strangbrüchen unabhängig vom p53-Status ist,
zumal p53 die BER-Kapazität generell erhöht (Zhou et al., 2001) und DNA-Strangbrüche ein
sehr starker Induktor von p53 sind (Nelson et al., 1994). Selenomethionin führte in unseren
Versuchen auch tatsächlich zur Stabilisierung von p53. Dies wurde auch von Goel et al.
(2006) nach 72 h Inkubation in den von uns verwendeten HCT116 Zellen beschrieben.
Deshalb kann abschließend auch nicht erklärt werden, warum nicht auch im Falle von
Selenomethionin die DNA-Strangbrüche vermehrt in der p53-defizienten Zelllinie auftraten.
Überraschend war hier zudem, dass Selenomethionin p53-unabhängig den Proteingehalt an
Polß steigerte, beginnend bei der Konzentration, bei der auch die DNA-schädigende Wirkung
eintrat. Hingegen wird in der Literatur beschrieben, dass die Stabilisierung von Polß auf der
Proteinebene durch p53 verbessert wird (Seo et al., 2002). Bezüglich der NER-Gene bzw.
-Proteine hatte Selenomethionin unabhängig vom p53-Status der Zellen keinen
induzierenden Einfluss.
In Natriumselenit liegt das Selenatom im Vergleich zum Selenomethionin reduzierbar vor. Es
wurde als weitere reduzierbare Selenverbindung die Phenylseleninsäure hinsichtlich ihrer
DNA-schädigenden Wirkung in den beiden Zelllinien untersucht. Auch diese Verbindung
generiert DNA-Strangbrüche weitestgehend unabhängig vom p53-Status der Zellen. Die
Gehalte an DNA-Strangbrüchen lagen zwar in den p53-defizienten Zellen leicht über denen
der p53-profizienten Zellen, traten jedoch jeweils bei den gleichen Inkubations-
konzentrationen auf. Zur Induktion von DNA-Schäden durch Phenylseleninsäure ist der
Literatur nichts beschrieben.
Ergebnisse und Diskussion
75
5.6 Zellzykluskontrolle
Die Zellzykluskontrolle ist ein wichtiger Prozess bei der Erhaltung der genomischen Stabilität.
Dabei wird p53 eine Rolle in der Induktion von Zellzyklusarresten in der G1- und G2-Phase
zugeschrieben, während seine Beteiligung bei einer Arretierung in der S-Phase weniger
ausgeprägt zu sein scheint (siehe Abschnitt 2.2.3). In dieser Arbeit wurde der Einfluss
verschiedener Selenverbindungen sowohl auf die Zellzykluskontrolle als auch auf die
Induktion der Zellzykluskontrollproteine p21 und GADD45 (Genexpression und
Proteinebene) in p53-profizienten und p53-defizienten HCT116 Zellen untersucht. Durch die
Inhibierung verschiedener Cyclin-abhängiger Kinasen führt p21 zur Arretierung der Zellen in
der G1- bzw. G2-Phase. P21 kann zudem infolge der inhibierenden Interaktion mit PCNA
einen S-Phase-Arrest induzieren. Über vergleichbare Mechanismen wird der Zellzyklus durch
GADD45 in der S- bzw G2-Phase arretiert, während die Rolle von GADD45 bei der Induktion
eines G1-Phase-Arrest mechanistisch noch unklar ist (vgl. Abschnitt 2.2.3).
5.6.1 Zellzyklusuntersuchungen mittels Durchflusszytometer
Der Einfluss von Natriumselenit auf den Zellzyklus war weitestgehend abhängig vom p53-
Status der HCT116 Zellen. So induzierten 3 – 6 µM Natriumselenit in den p53-profizienten
Zellen nach 24 h Inkubation signifikant einen G1-Phase-Arrest, während in diesem
Konzentrationsbereich die Zellzyklusverteilung der p53-defizienten Zellen unbeeinflusst war.
Erst bei der vergleichsweise hohen Konzentration von 8 µM Natriumselenit arretierten beide
Zelllinien p53-unabhängig in der S-Phase (Abbildung 34). Somit traten die Zellzyklusarreste
nach 24 h Inkubation in beiden Zelllinien jeweils mit beginnender Zytotoxizität des
Natriumselenits ein (siehe Abschnitt 5.1.1).
Nach 45 h Inkubation war der G1-Phase-Arrest in den p53-profizienten Zellen nicht mehr
signifikant ausgeprägt. Neben einer leichten Arretierung in der S-Phase zeigte sich vielmehr
ein p53-abhängiger G2-Phase-Arrest bei vergleichsweise hohen Konzentrationen an
Natriumselenit. In der p53-defizienten Zelllinie zeigte sich nach der längeren Inkubationszeit
eine Verstärkung des S-Phase-Arrests (Abbildung 35).
Im Vergleich dazu war der Einfluss von Selenomethionin weniger stark vom p53-Status der
HCT116 Zellen abhängig. Nach 24 h Inkubation führte Selenomethionin in nicht-
zytotoxischen Konzentrationen nicht zur Induktion von Zellzyklusarresten. Erst über 250 µM
Selenomethionin wurde die Zellzyklusverteilung in beiden Zelllinien beeinflusst. So kam es
p53-unabhängig zur Depletion der S-Phase und gleichzeitig zu G1-und G2-Phase-Arresten,
Ergebnisse und Diskussion
76
wobei der G1-Phase-Arrest in der p53-profizienten Zelllinie stärker ausgeprägt war und die
p53-defizienten Zellen vor allem in der G2-Phase arretierten (Abbildung 36).
Abbildung 34: Zellzyklusverteilung nach Inkubation mit Natriumselenit nach
24 h Inkubation.
P53-profiziente (A) und p53–defiziente (B) Zellen wurden 24 h mit
Natriumselenit inkubiert. Am Durchflusszytometer wurde der Anteil der Zellen in der G1-, S-
bzw. G2/M-Phase bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen
Bestimmungen + SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle:
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
A
HCT116 p53+/+
0
10
20
30
40
50
60
0
1
3
4
5
6
8
Natriumselenit [µM]
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
*
***
*
** **
**
***
0
10
20
30
40
50
60
0
1
3
4
5
6
8
Natriumselenit [µM]
Anteil der Zellen (%)
B
HCT116 p53-/-
**
Ergebnisse und Diskussion
77
Nach 45 h Inkubation fiel der Einfluss von Selenomethionin auf den Zellzyklus jeweils
geringer aus. In beiden Zelllinien war weiterhin der Anteil der Zellen in der S-Phase gesenkt,
wobei dieser Effekt in den p53-defizienten Zellen nicht mehr signifikant war. Zudem zeigte
sich in beiden Zelllinien ein leichter G2-Arrest (Abbildung 37).
Abbildung 35: Zellzyklusverteilung nach Inkubation mit Natriumselenit nach
45 h Inkubation.
P53-profiziente (A) und p53–defiziente (B) Zellen wurden 45 h mit
Natriumselenit inkubiert. Am Durchflusszytometer wurde der Anteil der Zellen in der G1-, S-
bzw. G2/M-Phase bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen
Bestimmungen + SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle:
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
0
10
20
30
40
50
60
70
0
1
3
4
5
6
8
Natriumselenit [µM]
Anteil der Zellen (%)
A
HCT116 p53+/+
G1
S
G2/M
*
*
*
**
***
***
***
0
10
20
30
40
50
60
70
0
1
3
4
5
6
8
Natriumselenit [µM]
Anteil der Zellen (%)
B
HCT116 p53-/-
*
***
**
**
**
**
**
***
***
Ergebnisse und Diskussion
78
Nach 45 h wurde jeweils eine Zunahme der Kontrollzellen in der G1-Phase detektiert. Dies ist
wahrscheinlich auf den Übergang der Zellen in die G0-Phase nach dieser verhältnismäßig
langen Wachstumszeit zurückzuführen.
Abbildung 36: Zellzyklusverteilung nach Inkubation mit Selenomethionin nach
24 h Inkubation.
P53-profiziente (A) und p53–defiziente (B) Zellen wurden 24 h mit
Selenomethionin inkubiert. Am Durchflusszytometer wurde der Anteil der Zellen in der G1-,
S- bzw. G2/M-Phase bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen
Bestimmungen + SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle:
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
1
10
50
100
250
500
1000
Selenomethionin [µM]
Anteil der Zellen (%)
A
HCT116 p53+/+
G1
S
G2/M
**
**
*
*
***
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
1
1
50
100
250
500
1000
Selenomethionin [µM
]
Anteil der Zellen (%)
B
HCT116 p53-/-
**
*
*
***
***
***
Ergebnisse und Diskussion
79
Abbildung 37: Zellzyklusverteilung nach Inkubation mit Selenomethionin nach
45 h Inkubation.
P53-profiziente (A) und p53–defiziente (B) Zellen wurden 45 h mit
Selenomethionin inkubiert. Am Durchflusszytometer wurde der Anteil der Zellen in der G1-,
S- bzw. G2/M-Phase bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen
Bestimmungen + SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle:
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Nach 24 h Inkubation führten 10 µM Phenylseleninsäure zu Änderungen im Zellzyklus beider
Zelllinien: Während die p53-profizienten Zellen einen S-Phase-Arrest induzierten, arretierten
die p53-defizienten Zellen vielmehr in der G2-Phase (Abbildung 38). Im Vergleich dazu
G1
S
G2/M
0
1
1
0
50
100
250
500
1000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Selenomethionin [µM]
Anteil der Zellen (%)
A
HCT116 p53+/+
*
*
***
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Selenomethionin [µM]
Anteil der Zellen (%)
0
1
10
50
100
250
500
1000
B
HCT116 p53-/-
*
*
Ergebnisse und Diskussion
80
induzierten 45 h Inkubation p53-unabhängig einem leichten S-Phase- und G2-Phase-Arrest
(Abbildung 39).
Abbildung 38: Zellzyklusverteilung nach Inkubation mit Phenylseleninsäure
nach 24 h Inkubation.
P53-profiziente (A) und p53–defiziente (B) Zellen wurden 24 h mit
Phenylseleninsäure inkubiert. Am Durchflusszytometer wurde der Anteil der Zellen in der
G1-, S- bzw. G2/M-Phase bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3
unabhängigen Bestimmungen + SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen
Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
0
10
20
30
40
50
60
Phenylseleninsäure
Anteil der Zellen (%)
0
1
10
30
50
100
A
HCT116 p53+/+
G1
S
G2/M
*
**
**
**
**
0
10
20
30
40
50
60
0
1
10
30
50
100
Phenylseleninsäure [µM]
Anteil der Zellen (%)
B
HCT116 p53-/-
*
**
*
**
**
Ergebnisse und Diskussion
81
Abbildung 39: Zellzyklusverteilung nach Inkubation mit Phenylseleninsäure
nach 45 h Inkubation.
P53-profiziente (A) und p53–defiziente (B) Zellen wurden 45 h mit
Phenylseleninsäure inkubiert. Am Durchflusszytometer wurde der Anteil der Zellen in der
G1-, S- bzw. G2/M-Phase bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3
unabhängigen Bestimmungen + SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen
Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
0
10
20
30
40
50
60
70
0
1
10
30
50
100
Phenylseleninsäure [µM]
A
nteil der Zellen (%)
A
HCT116 p53+/+
G1
S
G2/M
*
*
**
*** ***
*
0
1
10
30
50
100
Phenylseleninsäure [µM]
Anteil der Zellen (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
B
HCT116 p53-/-
*
*
**
Ergebnisse und Diskussion
82
5.6.2 Genexpression und Proteingehalt von Zellzykluskontroll-
proteinen
Aufgrund der Bedeutung von p21 für die Zellzykluskontrolle wurde seine Induktion in
Abhängigkeit vom p53-Status der Zellen betrachtet. Die basale Expression von p21 war in
den p53-profizienten und p53-defizienten HCT116 Zellen unterschiedlich ausgeprägt. So fand
sich in den p53-defizienten Zellen nur ein Drittel an p21-mRNA verglichen mit den p53-
profizienten Zellen. Auf der Proteinebene zeigte sich ein ähnliches Bild (siehe Abbildung 40).
Abbildung 40: Genexpression und Proteingehalt von p21 nach 24 h bzw. 45 h
Inkubation mit Natriumselenit.
P53-profiziente und p53–defiziente Zellen wurden 24 h
(A, C) bzw. 45 h (B, D) mit Natriumselenit inkubiert. Mittels real time RT-PCR wurde die
relative Genexpression von p21 bestimmt (A, B). Der Proteingehalt wurde in Western Blot-
Analysen ermittelt (C, D). Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen
Bestimmungen + SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle:
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Zudem war auch die Induktion von p21 nach Inkubation mit Natriumselenit p53-abhängig. In
der p53-profizienten Zelllinie stieg die Expression von p21 ab 5 µM Natriumselenit nach 24 h
Inkubation stark an (4,4-fach). Zwar nahm auch in der p53-defizienten Zelllinie die
Expression nach Natriumselenit-Inkubation zu, stieg jedoch nur auf die basale Expression der
p53-profizienten Zellen (Abbildung 40 A). Auf der Proteinebene zeigte sich in p53-
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Natriumselenit [µM]
Proteingehalt an p21
(% der Kontrolle)
0
1
3
5
8
0
1
2
3
4
5
6
7
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
p21
0
1
3
5
8
0
2
4
6
8
10
12
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
p21
0
1
3
5
8
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Proteingehalt an p21
(% der Kontrolle)
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
B
45 h
D
45 h
***
**
**
**
A
24 h
p21
C
24 h
**
***
**
*
*
***
***
*****
Ergebnisse und Diskussion
83
profizienten Zellen zu diesem Zeitpunkt eine leichte Zunahme an p21 um z. B. 35 % der
Kontrolle bei einer Inkubationskonzentration von 5 µM Natriumselenit, während der p21-
Gehalt in den p53-defizienten Zellen konstant blieb (Abbildung 40 C).
Nach 45 h Inkubation stieg der p21-mRNA-Gehalt bereits deutlich bei 3 µM Natriumselenit
und die Expression bei 5 µM Natriumselenit war auf das 8,1-fache gesteigert (Abbildung 40
B). Ein Rückgang der relativen Expression bei 8 µM Natriumselenit kann auf die
hochzytotoxischen Bedingungen zurückgeführt werden. Aus der Induktion von p21 auf der
Genexpressionsebene resultierte ein starker Anstieg des Proteingehaltes bereits bei
vergleichsweise niedrigen Konzentrationen an Natriumselenit. Beispielsweise enthielten die
p53-profizienten Zellen nach 45 h Inkubation mit 5 µM Natriumselenit 2,5mal mehr p21 als
Kontrollzellen (Abbildung 40 D). In der p53-defizienten Zelllinie wurde nach 45 h Inkubation
mit Natriumselenit erneut nur eine geringfügige Induktion von p21 detektiert, die sich
wiederum nicht auf eine Steigerung des Proteingehaltes auswirkte (siehe Abbildung 40 B, D).
Verglichen mit p21 schien GADD45 zum Teil auch stark über p53-unabhängige
Mechanismen transkriptionell reguliert zu sein. Z. B. war die basale Expression in beiden
Zelllinien vergleichbar (siehe Abbildung 41 und 42 C). Die Induktion von GADD45 nach
Inkubation mit Natriumselenit war in p53-profizienten Zelllinie zwar stärker ausgeprägt,
jedoch fiel der Unterschied zwischen den beiden Zelllinien deutlich geringer aus als bei der
Induktion von p21. Bei hochzytotoxischen Inkubationsbedingungen (8 µM Natriumselenit,
45 h) fand sich in den p53-defizienten Zellen sogar eine höhere Expression an GADD45
(Abbildung 41).
Abbildung 41: Genexpression von GADD45 nach Inkubation mit
Natriumselenit.
P53-profiziente und p53–defiziente Zellen wurden 24 h (A) bzw. 45 h (B)
mit Natriumselenit inkubiert. Mittels real time RT-PCR wurde die relative Genexpression von
p21 bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen
+ SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01,
***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
GADD
45
0
5
10
15
20
25
0
1
3
5
8
0
5
10
15
20
25
0
1
3
5
8
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression
von
GADD
45
HCT116
p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
A
24 h
B
45 h
*
*
***
**
**
***
***
**
*
*
*
Ergebnisse und Diskussion
84
Im Vergleich zum Natriumselenit führte Selenomethionin in sehr viel geringerem Maße zur
Induktion der beiden Zellzykluskontrollgene. Selbst zytotoxische Konzentrationen an
Selenomethionin steigerten nach 24 h Inkubation die Genexpression von p21 in der p53-
profizienten Zelllinie nicht. In den p53-defizienten Zellen kam es zwar zu einer Verdoppelung
des mRNA-Gehaltes, welcher jedoch aufgrund der niedrigen basalen Expression weiterhin
noch unter dem basalen mRNA-Gehalt der p53-profizienten Zellen lag (Abbildung 42 A). Da
nach 24 h Inkubation demnach keine Auswirkungen auf die Proteinebene zu erwarten
waren, wurden Western Blot-Analysen erst nach 45 h Inkubation mit Selenomethionin
durchgeführt. Hier zeigte sich eine deutliche Zunahme des p21-Gehaltes in den p53-
profizienten Zellen sowie eine marginale Steigerung in der p53-defizienten Zelllinie
(Abbildung 42 B). Im Falle von GADD45 verdoppelte sich die relative Genexpression bei
vergleichsweise hohen Konzentrationen an Selenomethionin nach 24 h Inkubation. Der
Effekt schien in der p53-defizienten Zelllinie bei etwas niedrigeren Konzentrationen
einzusetzen und geringfügig stärker ausgeprägt zu sein (Abbildung 42 C).
Abbildung 42: Genexpression und Proteingehalt von p21 und GADD45 nach
Inkubation mit Selenomethionin.
P53-profiziente und p53–defiziente Zellen wurden
24 h (A, C) bzw. 45 h (B) mit Selenomethionin inkubiert. Mittels real time RT-PCR wurde die
relative Genexpression von p21 (A) und GADD45 (C) bestimmt. Der Proteingehalt von p21
wurde in Western Blot-Analysen ermittelt (B). Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3
unabhängigen Bestimmungen + SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen
Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
0
1
2
3
4
5
6
7
Selenomethionin [µM]
Relative Genexpression
von
p21
0
1
10
100
500
0
2
4
6
8
10
12
Selenomethionin [µM]
Relative Genexpression
von
GADD
45
0
1
10
100
500
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0
1
10
100
500
Selenomethionin [µM]
Proteingehalt an p21
(% der Kontrolle)
A
p21
B
p21
C
GADD
45
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
***
****
****
***
***
*** *** ***
Ergebnisse und Diskussion
85
5.6.3 Bewertung der Ergebnisse
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Natriumselenit im Vergleich zu
Selenomethionin die Zellzykluskontrolle p53-abhängig beeinflusst. Je nach Inkubationszeit
wurden in den p53-profizienten Zellen durch Natriumselenit G1- bzw. G2-Phase-Arreste
induziert, während erst in vergleichsweise hohen Konzentrationen p53-unabhängige S-
Phase-Arreste auftraten. Die einhergehende Expression des Zellzykluskontrollgens p21 war
weitestgehend p53-abhängig. P53 ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor für p21, wobei
dieses jedoch auch p53-unabhängig exprimiert werden kann. Dies wird auch in unseren
Studien deutlich. So ist p21-mRNA in p53-defizienten HCT116 Zellen detektierbar, der
Basallevel liegt jedoch in der p53-profizienten Zelllinie um das 3Fache höher. Zudem fanden
sich relevante Induktionen von p21 nur in der Gegenwart von p53. P21 könnte somit ein
Faktor in der p53-abhängigen Zellzykluskontrolle nach Natriumselenit-Inkubation sein. Im
Vergleich zur Expression von p21 waren die p53-defizienten Zellen in der Lage,
vergleichsweise hohe Mengen an GADD45 zu exprimieren. GADD45 wird ebenfalls über p53-
abhängige und p53-unabhängige Mechanismen reguliert (zusammengefasst in Zhan, 2005).
In Folge von genotoxischem und nicht-genotoxischem Stress wird GADD45 induziert und soll
z. B. über die Interaktion mit p21, PCNA oder Cdc2 zu G2/M-Arresten führen.
(zusammengefasst in Sheikh et al., 2000). Zudem wurde beschrieben, dass GADD45 den G1-
Phase-Checkpoint aktivieren kann, sodass die Zellen in der G1-Phase arretieren (Smith et al.,
1994). Die beschriebene Bindung von GADD45 an PCNA könnte die Bereitstellung von PCNA
für die Replikation mindern (Smith et al., 1994). Demnach wäre es denkbar, dass GADD45
zur Arretierung in der S-Phase führt. Dies wäre ein ähnlicher Mechanismus, wie er bereits für
p21 diskutiert wird (siehe Abschnitt 2.2.3). Somit könnte GADD45 eine Funktion bei der
Induktion der beobachteten p53-unabhängigen Zellzyklusarreste gespielt haben.
Bei der zellulären Reaktion auf Selenomethionin schien p53 eine weniger große Rolle zu
spielen, da die Zellzykluskontrolle in beiden Zelllinien bei gleichen Konzentrationen
eingeleitet wurde und der Anteil der Zellen in der S-Phase gleichermaßen sank. Jedoch war
die Prävalenz des jeweiligen Arrests vom p53-Status abhängig. So arretierten die p53-
profizienten Zellen stärker in der G1-Phase, während die p53-defizienten Zellen vor allem
einen G2-Phase-Arrest einleiteten. Insgesamt lässt sich sagen, dass prinzipiell sowohl der G1-
als auch der G2-Phase-Arrest p53-unabhängig eingeleitet werden können. Trotzdem wird
p53 bei der Einleitung des G1-Phase-Arrests eine größere Rolle zugeschrieben
(zusammengefasst in Abschnitt 2.2.3). Letzteres gilt ebenso für p21. Nach Inkubation mit
Selenomethionin wurden wiederum nur in den p53-profizienten Zellen hohe Gehalte an p21
Ergebnisse und Diskussion
86
erreicht, wobei die Induktion erst nach verhältnismäßig langer Inkubationszeit einsetzte. Die
Induktion von GADD45 war in beiden Zelllinien vergleichsweise gering.
Basierend auf der Hypothese, dass Selen vor allem bei Prostatakrebs präventiv wirkt, finden
sich in der Literatur Studien, die den Einfluss von Natriumselenit auf die Zellzykluskontrolle
in verschiedenen Prostatakrebszelllinien untersuchen. In humanen DU145 Prostatakrebs-
zellen, die mutiertes p53 exprimieren, wurde nach Natriumselenit-Inkubation ein S-Phase-
Arrest detektiert. Dieser Arrest war demnach p53-unabhängig. Zudem spielte auch p21 keine
Rolle (Jiang et al., 2002). Dies entspricht den hier beschriebenen Ergebnissen in der p53-
defizienten Zelllinie HCT116. Auf der anderen Seite zeigte sich aber durch Natriumselenit
sowohl in p53-profizienten (LNCaP) als auch p53-defizienten (PC3) Prostatakrebszellen kein
Einfluss auf den Zellzyklus. Trotzdem wurde unabhängig vom p53-Status eine Induktion von
p21 auf der Proteinebene detektiert (Zhao et al., 2009). Dies entspricht den in dieser Arbeit
dargestellten Ergebnissen nicht, da Natriumselenit in den HCT116 Zellen je nach
Konzentration und Inkubationszeit verschiedene Zellzyklusarreste induzierte und die
Induktion von p21 vor allem auf der Proteinebene p53-abhängig war. Insgesamt zeigt der
Vergleich mit der Literatur demnach, dass Unterschiede je nach Zelltyp und Zelllinie
auftreten können. Neben Studien in Prostatakrebszellinien gibt es auch Daten aus
Darmkrebszelllinien. So führten zytotoxische Konzentrationen an Natriumselenit in HAT-29
Zellen, die mutiertes p53 exprimieren, zur Arretierung in der S- und G2-Phase und zur
Induktion von p21 und GADD45 auf mRNA-Ebene (Zeng and Davis, 2003). Im Vergleich dazu
wurde in der vorliegenden Arbeit in p53-defizienten HCT116 Zellen nach Natriumselenit-
Exposition nur einen S-Phase-Arrest beobachtet. Die Expression der beiden
Zellzykluskontrollgene war auch hier gesteigert, wobei gerade die Induktion von p21 im
Vergleich zu der p53-profizienten Zelllinie marginal erschien und sich nicht auf die
Proteinebene auswirkte. Die Proteinmenge wurde von Zeng und Davis jedoch nicht
betrachtet. In der Literatur wurde aktuell auch über den Einfluss von Natriumselenit auf
Zellzyklusprozesse in dem von uns gewählten Darmkrebszellmodell berichtet. Kráolvá et al.
(2009) inkubierten p53-profiziente und p53-defizintente HCT116 Zellen mit 10 µM
Natriumselenit (8 – 48 h) und untersuchten mittels Western Blot die Gehalte an PCNA, Cyclin
B1, Cyclin D1, Cdc2, und p21. Die Autoren beschreiben, dass sie in beiden Zelllinien nach 24
h Inkubation eine Suppression von PCNA und Cyclin D1 und eine Induktion der restlichen
Faktoren fanden. Daraus wurde gefolgert, dass Natriumselenit wahrscheinlich eine
Arretierung in der G2-Phase p53-unabhängig verursachte. Die publizierten Western Blots
zeigten jedoch ein anderes Bild: Der Gehalt an PCNA lag bei 196 % der Kontrolle und der
Gehalt an Cdc2 bei 76 %. Zudem war die Suppression bzw. Induktion von Cyclin B1 und Cdc2
gegensätzlich, sodass die vorgenommene Argumentation hinfällig ist. Insgesamt ersetzt die
Ergebnisse und Diskussion
87
Betrachtung einiger Zellzykluskontrollproteine jedoch nicht eine durchflusszytometrische
Bestimmung der Zellzyklusverteilung. Diese wurde von Kráolvá et al. (2009) nur teilweise
erbracht. Dargestellt waren Histogramme der Zellzyklusverteilung nach 24 h Inkubation mit
2,5, 5 und 10 µM Natriumselenit. Die Autoren bestimmten den Anteil der Zellen im SubG1-
Peak und wiesen allgemein auf eine Veränderung der Zellzyklusverteilung hin, ohne gezielt
einen Phase-Arrest zu benennen oder Daten einer Software-unterstützte Auswertung
wiederzugeben. Visuell ist eine Auswertung der gezeigten Histogramme jedoch kaum
möglich, wobei erschwerend eine uneinheitliche Skalierung hinzukommt. Insgesamt ist es
also kaum möglich, diese Daten mit denen aus dieser Arbeit zu vergleichen. Jedoch zeigen
unserer Ergebnisse davon abweichend, dass nur die p53-profizienten Zellen nach
verhältnismäßig langer Inkubationszeit (45 h) und vergleichsweise hohen Konzentrationen
an Natriumselenit in einen G2-Phase-Arrest gingen, während nach 24 h Inkubation
konzentrationsabhängig ein G1- bzw. S-Phase-Arrest vorherrschte. Die p53-defizienten
Zellen arretierten im Vergleich dazu bei hohen Konzentrationen unabhängig von der Zeit in
der S-Phase.
Auch im Falle von Selenomethionin wurde in der Literatur der Einfluss auf den Zellzyklus
p53-profizienter und p53-defizienter Prostatakrebszellen betrachtet. Dabei wurde in LNCaP
Zellen (p53+/+; Androgenrezeptor vorhanden) nach Inkubation mit 150 µM Selenomethionin
(24 h bis 72 h Inkubation) ein G1-Phase-Arrest und eine deutliche Reduktion von Zellen in
der S-Phase gefunden, während in PC3 Zellen (p53-/-; Androgenrezeptor nicht vorhanden)
ein leichter G2-Phase-Arrest ohne Beeinflussung des Anteils von Zellen in der S-Phase auftrat
(Venkateswaran et al., 2002). Es wurde nicht abschließend geklärt, ob die Arretierung in der
G1- bzw. G2-Phase tatsächlich vom p53-Status der Zellen abhing. Es wurde jedoch gezeigt,
dass der Unterschied im Verlauf der S-Phase durch das Vorhandensein bzw. Fehlen des
Androgenrezeptors beeinflusst wurde. Zudem konnten nur die LNCaP Zellen p21 induzieren,
während es in den PC3 Zellen sogar zu einer Repression von p21 als Antwort auf 150 µM
Selenomethionin kam. In dieses Bild fügen sich unsere Ergebnisse stimmig ein. Auch in der
vorliegenden Arbeit führte Selenomethionin zur Depletion der Zellen in der S-Phase und zur
Präferenz der p53-profizienten Zellen in der G1-Phase zu arretieren, während in den p53-
defizienten Zellen der G2-Phase-Arrest ausgeprägter war. Ebenso konnte eine starke
Zunahme an p21-Protein in den p53-profizienten Zellen nach verhältnismäßig langer
Inkubationszeit detektieren. Im Gegensatz zu den Literaturdaten in Prostatakrebszellen
zeigten die p53-defizienten HCT116 Zellen jedoch keine Repression von p21 sondern eine
marginale Induktion, was sich z. B. auf Zelltyp-spezifische Unterschiede zurückführen lassen
könnte.
Weiterhin wurden Studien zur Zellzyklusverteilung mit Selenomethionin auch in p53-
profizienten und p53-defizienten HCT116 Zellen gemacht. So beschrieben Goel et al. (2006),
Ergebnisse und Diskussion
88
dass Konzentrationen bis 100 µM Selenomethionin nach 48 h nicht zur Veränderung des
Zellzykluses führten und nach 72 h Inkubation nur bei der höchsten Konzentration von
100 µM ein G2-Phase-Arrest in den p53-profizienten Zellen detektiert wurde. Analog zu den
anderen Testsystemen führten wir die Versuche auch bei kürzeren Inkubationszeiten (24 h
und 45 h) und höheren Konzentrationen (bis zu 1000 µM) durch. Dabei fanden wir
Zellzyklusarreste erst bei Konzentrationen über 250 µM, sodass sich kein Widerspruch mit
den Literaturdaten ergibt.
Ergebnisse und Diskussion
89
5.7 Apoptose
Natriumselenit führt über die Bildung von Superoxid einhergehend mit der Induktion von
DNA-Strangbrüchen zur Apoptose (Hu et al., 2006; Li et al., 2007). Die Apoptose-
induzierende Wirkung von Natriumselenit wurde mit diversen Testsystemen in
verschiedenen Zelllinien gezeigt (Jiang et al., 2004 a; Hu et al., 2006; Li et al., 2007; Rudolf et
al., 2008; Zhao et al., 2009; Králová et al., 2009).
Davon ausgehend wurde in dieser Arbeit die Induktion von Apoptose durch Natriumselenit
und Selenomethionin in Abhängigkeit des p53-Status der Zellen untersucht. Dazu wurden
Parameter bzw. Testsysteme ausgewählt, mit denen die Induktion verschiedener Apoptose-
Merkmale untersucht werden konnten: Eine Beteiligung von Caspasen wurde über die
Aktivität der Effektor-Caspasen 3 und 7 betrachtet, während die Initiierung des intrinsischen
Wegs über eine AIF-Kernlokalisation untersucht wurde. Der transkriptionelle Einfluss von
p53 sowie der Ablauf über einen mitochondrialen Weg wurden über die Genexpression von
Bax bestimmt. Zur Untersuchung einer abschließenden DNA-Fragmentierung wurde die
Messung des SubG1-Peaks herangezogen.
5.7.1 Kernlokalisation von AIF
Während der Apoptose wird der apoptosis inducing factor (AIF) aus dem Intermembranraum
der Mitochondrien ins Zytosol abgegeben. Dort wird AIF durch die Interaktion mit
Cyclophilin A aktiviert und translokalisiert als aktive DNase in den Zellkern, wo diese zur
Fragmentierung der DNA in vergleichsweise große Bruchstücke von 50 kB führt und eine
Chromatinkondensation initiiert (zusammengefasst in Cregan et al., 2004; Huerta et al.,
2007).
Natriumselenit führte nach 24 h Inkubation in den p53-profizienten HCT116 Zellen zur
Kernlokalisation von AIF (Abbildung 43). Dieser Effekt setzte bei 3 µM Natriumselenit, also
mit beginnender Zytotoxizität, ein. In den p53-defizienten Zellen konnte keine Zunahme des
AIF-Fluoreszenzsignals nach 24 h Inkubation detektiert werden. Nach 48 h Inkubation
verstärkte sich der Effekte in den p53-profizienten Zellen: Bereits 1 µM Natriumselenit
induzierte die Lokalisation von AIF im Kern und 3 µM Natriumselenit führten zu einer
Verdopplung des AIF-Signals verglichen mit der 24 h Inkubation (Daten nicht gezeigt). Die
stark zytotoxische Wirkung von 5 µM Natriumselenit nach 48 h Inkubation erschwerte die
Fixierung der Zellen auf den Deckgläschen, sodass mit diesem Testsystem keine
vertrauenswürdigen Ergebnisse mehr gewonnen werden konnten.
Ergebnisse und Diskussion
90
Abbildung 43: AIF-Kernlokalisation nach Natriumselenit-Exposition.
P53-
profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 24 h mit Natriumselenit inkubiert. Mittels
Immunfluoreszenzmikroskopie wurde die Lokalisation von AIF im Kern detektiert. Dargestellt
sind repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen des DAPI- und des Rhodamin-
Kanals bzw. beider Kanäle (A) und die Mittelwerte aus mindestens 4 unabhängigen
Versuchen (B) +SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05,
**p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Im Vergleich dazu induzierten 24 h Inkubation mit Selenomethionin weder in p53-
profizienten noch in p53-defizienten Zellen die Anreicherung von AIF im Kern (Abbildung 44).
Dies war selbst bei zytotoxischen Konzentrationen an Selenomethionin der Fall.
DAPI Rhodamin DAPI/Rhodamin
Kontroll-
zellen
Natrium-
selenit
5 µM
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0
1
3
5
Natriumselenit [µM]
AIF
-
Fluoreszenzsignal im Kern
(Fache Kontrolle)
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
A
B
**
**
Ergebnisse und Diskussion
91
Abbildung 44: AIF-Kernlokalisation nach Selenomethionin-Exposition.
P53-
profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 24 h mit Selenomethionin inkubiert. Mittels
Immunfluoreszenzmikroskopie wurde die Lokalisation von AIF im Kern detektiert. Dargestellt
sind Mittelwerte aus mindestens 4 unabhängigen Versuchen +SD. Statistisch signifikant
verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-
Test).
5.7.2 Genexpression von Bax
Bax ist ein proapoptotisches Mitglied der Bcl2-Familie, das p53-abhängig induziert werden
kann und dann zu den Mitochondrien translokalisiert. Das Membranpotential der
Mitochondrien wird vom Verhältnis an proapoptotischen zu antiapototischen Mitgliedern
der Bcl2-Familie in der Mitochondrienmembran bestimmt. Überwiegen die proapototischen
Proteine, wie Bax, wird zum einen AIF und zum anderen Cytochrom C ausgeschüttet (Cregan
et al., 2002).
Durch Auswahl geeigneter Primer und die Optimierung der Amplifikationsbedingungen
wurde ein PCR-System zur Detektion der relativen Expression des Gens Bax etabliert. Beide
Primer waren 20-mere, die zu einem Amplifizierungsprodukt von 99 bp führten. Mithilfe
einer gelelektrophoretischen Auftrennung und einer Schmelzpunktanalyse wurde bestätigt,
dass mit diesem PCR-System nur ein Amplifikat gebildet wurde (siehe Anhang 9.9). Es wurde
eine optimale Annealing-Temperatur von 60 °C und eine optimale Primerendkonzentration
von 0,5 µM bestimmt. Unter diesen Bedingungen ergab sich eine Effizienz der PCR von
1,919.
Selenomethionin [µM]
AIF
-
Fluoreszenzsignal im Kern
(Fache Kontrolle)
0
,0
0,
5
1
,
0
1
,5
2
,
0
0
10
100
1
000
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
Ergebnisse und Diskussion
92
Natriumselenit führte in HCT116 Zellen zu einer p53-abhängigen Bax-Induktion: Nach 24 h
Inkubation stieg die relative Expression beginnend mit 5 µM Natriumselenit in den p53-
profizienten Zellen auf 1,6, während sich kein Einfluss auf die p53-defiziente Zelllinie zeigte
(Abbildung 45 A).
Abbildung 45: Genexpression von Bax nach Natriumselenit-Exposition.
P53-
profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 24 h (A) und 45 h (B) mit Natriumselenit
inkubiert. Mittels real time RT-PCR wurde die relative Genexpression von Bax bestimmt.
Dargestellt sind Mittelwerte von Doppelbestimmungen aus 3 (A) bzw. 2 (B) unabhängigen
Versuchen +SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05,
**p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Natriumselenit [µM]
Relative Genexpression von
Bax
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0
1
3
5
8
B
4
5 h
**
**
** **
***
***
Natriumselenit
[µM]
Relative Genexpression von
B
ax
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0
1
3
5
8
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
A
24h
*
**
Ergebnisse und Diskussion
93
Nach 45 h verstärkte sich der Effekt in den p53-profizienten Zellen, indem die Bax-Induktion
bereits bei 3 µM Natriumselenit signifikant war und bei 5 µM Natriumselenit bereits 2,8
betrug. Überraschenderweise hatte Natriumselenit in den p53-defizienten HCT116 Zellen
nach 45 h Inkubation einen suppressiven Einfluss auf die Bax-Expression. Lag der Basallevel
in den p53-defizienten Zellen noch leicht über dem der p53-profizienten Zellen, halbierte
sich der mRNA-Gehalt von Bax bei höheren Konzentrationen an Natriumselenit (Abbildung
45 B). Ein genereller, induzierender Effekt auf die Genexpression in den p53-profizienten
Zellen durch Natriumselenit wird ausgeschlossen, da keine Induktion von XPA aufgetreten
war (siehe Abschnitt 5.5.4).
24 h Inkubation mit Selenomethionin zeigten weder in den p53-profizienten noch in
den p53-defizienten HCT116 Zellen einen signifikanten Einfluss auf die Genexpression von
Bax (Abbildung 46).
Abbildung 46: Genexpression von Bax nach Selenomethionin-Exposition.
P53-
profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 24 h mit Selenomethionin inkubiert. Mittels
real time RT-PCR wurde die relative Genexpression von Bax bestimmt. Dargestellt sind
Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen +SD. Statistisch signifikant verschieden von der
jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
5.7.3 Aktivität der Effektor-Caspasen 3/7
Die Effektor-Caspasen sind wichtige Faktoren bei der Exekution der Caspase-abhängigen
Apoptose. Sie können zum einen über den Rezeptor-vermittelten, extrinsischen Signalweg
von den Initiator-Caspasen und zum anderen über den mitochondrialen Weg nach
Selenomethionin [µM]
Relative
Genexpression von
B
ax
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0
1
10
100
500
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
Ergebnisse und Diskussion
94
Cytochrom C-Ausschüttung aktiviert werden. Um eine Aktivierung über den erstgenannten
Pfad zu untersuchen, sollten vergleichsweise kurze Inkubationszeiten gewählt werden (siehe
Abschnitt 5.7.5). Zu den Substraten der Effektor-Caspasen 3 und 7 gehören z. B. Procaspasen
und PARP (zusammengefasst in Fan et al., 2005).
Natriumselenit hatte in den p53-profizienten Zellen nach 4,5 h Inkubation keinen Einfluss auf
die Aktivität der Effektor-Caspasen 3 und 7. Jedoch zeigte sich in den p53-defizienten Zellen
ein signifikanter, konzentrationsabhängiger Abfall in der Caspase-Aktivität bereits bei nicht-
zytotoxischen Konzentrationen an Natriumselenit. Bei 5 µM Natriumselenit z. B. betrug die
Reduktion etwa 20 % (Abbildung 47).
Abbildung 47: Einfluss von Natriumselenit auf die Effektor-Caspase-Aktivität.
P53-profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 4,5 h mit Natriumselenit inkubiert. Mittels
Caspase-Glo® 3/7-Kit wurde die Aktivität der Effektor-Caspasen 3 und 7 bestimmt.
Dargestellt sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen +SD. Statistisch signifikant
verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-
Test).
Im Vergleich dazu erhöhte Selenomethionin ab einer Konzentration von 100 µM die
Caspase-Aktivität in den p53-profizienten Zellen um etwa 20 % und reduzierte diese in den
p53-defizienten Zellen um etwa 20 % (Abbildung 48).
Natriumselenit [µM]
Caspase
-
Aktivität
(Fache der Kontrolle)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
0
3
5
10
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
**
*
Ergebnisse und Diskussion
95
Abbildung 48: Einfluss von Selenomethionin auf die Effektor-Caspase-
Aktivität.
P53-profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 4,5 h mit Selenomethionin
inkubiert. Mittels Caspase-Glo® 3/7-Kit wurde die Aktivität der Effektor-Caspasen 3 und 7
bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen +SD. Statistisch
signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
(Student’ scher t-Test).
5.7.4 SubG1 Peak
Während der Apoptose wird die DNA durch Nukleasen fragmentiert und in sogenannten
apoptotischen Körperchen abgetrennt. Diese DNA-enthaltenden, membranumschlossenen
Partikel können nach DNA-Färbung am Durchflusszytometer vor dem G1-Peak der
Zellzyklusverteilung detektiert werden. In Kombination mit weiteren Apoptose-Parametern
gibt die Bestimmung des SubG1-Peaks Auskunft über eine abgeschlossene apoptotische
Reaktion. Die Methode wurde unter Verwendung der Apoptose-induzierenden Substanz
Staurosporin etabliert (Graupner, 2009).
Natriumselenit führte zur Zunahme der Signale im SubG1-Bereich. Dabei waren die Effekte
stark abhängig vom p53-Status der Zellen. In den p53-profizienten Zellen stieg ab 5 µM
Natriumselenit der Anteil der Zellen im SubG1-Bereich sprunghaft auf etwa 22 % an.
Demgegenüber zeigte sich in den p53-defizienten Zellen erst ab 8 µM ein signifikanter
Anstieg an apoptotischen Zellen auf etwa 19 % (Abbildung 49).
0
20
40
60
80
100
120
140
0
10
100
1000
Selenomethionin [µM]
Caspase
-
Aktivität
(% der Kontrolle)
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
* *
***
**
Ergebnisse und Diskussion
96
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
62,9 ± 8,0%
8 µM
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
22,2 ± 5,4 %
5 µM
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,8 ± 1,5 %
3 µM
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,0 ± 2,0 %
1 µM
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,1 ± 1,2 %
0 µM
HCT116 p53+/+
*****
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
62,9 ± 8,0%
8 µM
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
22,2 ± 5,4 %
5 µM
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,8 ± 1,5 %
3 µM
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,0 ± 2,0 %
1 µM
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,1 ± 1,2 %
0 µM
HCT116 p53+/+
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
62,9 ± 8,0%
8 µM
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
22,2 ± 5,4 %
5 µM
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,8 ± 1,5 %
3 µM
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,0 ± 2,0 %
1 µM
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
62,9 ± 8,0%
8 µM
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
62,9 ± 8,0%
8 µM
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
22,2 ± 5,4 %
5 µM
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
22,2 ± 5,4 %
5 µM
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,8 ± 1,5 %
3 µM
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,8 ± 1,5 %
3 µM
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,0 ± 2,0 %
1 µM
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,0 ± 2,0 %
1 µM
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
4,1 ± 1,2 %
0 µM
HCT116 p53+/+
*****
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 µM
5,1 ± 0,6 %
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
1 µM
4,0 ± 0,2 %
0 200 400
0
200
400
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1000
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0
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400
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800
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0
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400
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800
1000
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0
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0
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**
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400
600
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1000
counts
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0
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400
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800
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counts
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0
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400
600
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1000
counts
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1000
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HCT116 p53-/-
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200
400
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400
600
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200
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200
400
600
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1000
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200
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200
400
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1000
counts
3 µM
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200
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1000
counts
3 µM
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400
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400
600
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1000
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0
200
400
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1000
counts
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0
200
400
600
800
1000
counts
5 µM
4,2 ± 0,4 %
HCT116 p53-/-
**
Abbildung 49: SubG1-Peak nach Inkubation mit Natriumselenit.
P53-profiziente
(A) und p53-defiziente (B) Zellen wurden 24 h mit Natriumselenit inkubiert. Mittels
Durchflusszytometer wurde der SubG1-Peak bestimmt. Dargestellt sind repräsentative
Histogramme und die mittlere Partikelzahl im SubG1-Bereich aus 3 unabhängigen Versuchen
±SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01,
***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Ergebnisse und Diskussion
97
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
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400
600
800
1000
counts
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200
400
600
800
1000
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400
600
800
1000
counts
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200
400
600
800
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counts
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200
400
600
800
1000
counts
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200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
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0 200 400
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200
400
600
800
1000
counts
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200
400
600
800
1000
counts
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200
400
600
800
1000
counts
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200
400
600
800
1000
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400
600
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0
200
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0
200
400
600
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1000
counts
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HCT116 p53+/+
***
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
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400
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counts
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counts
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1000
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counts
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800
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HCT116 p53+/+
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800
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counts
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1000
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600
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400
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1000
counts
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200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
250 µM
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400
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800
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counts
1000 µM
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HCT116 p53+/+
***
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0
200
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1000
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400
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counts
0 200 400
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200
400
600
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counts
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1000
counts
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HCT116 p53-/-
**
*
*
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400
600
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200
400
600
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counts
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0 200 400
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200
400
600
800
1000
counts
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400
600
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1000
counts
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200
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counts
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200
400
600
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1000
counts
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200
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1000
counts
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counts
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1000
counts
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200
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800
1000
counts
500 µM
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1000
counts
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400
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1000
counts
250 µM
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HCT116 p53-/-
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counts
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0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
1 µM
4,4 ± 1,0 %
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
10 µM
3,8 ± 0,5 %
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
10 µM
3,8 ± 0,5 %
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
100 µM
4,1 ± 0,3 %
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
100 µM
4,1 ± 0,3 %
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
1000 µM
8,6 ± 1,0 %
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
1000 µM
8,6 ± 1,0 %
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
500 µM
8,3 ± 1,4 %
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
0 200 400
0
200
400
600
800
1000
counts
500 µM
8,3 ± 1,4 %
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
250 µM
5,7 ± 0,5 %
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
0
200
400
0
200
400
600
800
1000
counts
250 µM
5,7 ± 0,5 %
HCT116 p53-/-
**
*
*
Abbildung 50: SubG1-Peak nach Inkubation mit Selenomethionin.
P53-
profiziente (A) und p53-defiziente (B) Zellen wurden 24 h mit Selenomethionin inkubiert.
Mittels Durchflusszytometer wurde der SubG1-Peak bestimmt. Dargestellt sind
repräsentative Histogramme und die mittlere Partikelzahl im SubG1-Bereich aus 3
unabhängigen Versuchen ±SD. Statistisch signifikant verschieden von der jeweiligen
Kontrolle: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student’ scher t-Test).
Ergebnisse und Diskussion
98
Im Vergleich dazu war die Entwicklung des SubG1-Peaks nach Inkubation mit
Selenomethionin in den beiden Zelllinien vergleichbar und war generell, auch bei
vergleichsweise hohen Konzentrationen, weniger ausgeprägt als bei Natriumselenit. So
betrug der Anteil an Signalen im SubG1-Bereich nach Inkubation mit 1000 µM
Selenomethionin in beiden Zelllinien etwa 9 % (Abbildung 50).
5.7.5 Bewertung der Ergebnisse
Insgesamt konnte gezeigt werden, dass Natriumselenit p53-abhängig Apoptose über den
intrinischen Weg einleitet. Dies geschah ohne Aktivierung der Effektor-Caspasen 3 und 7
über einen AIF-vermittelten Weg. Die Freisetzung von AIF aus den Mitochondrien kann dabei
über die Induktion von Bax erklärt werden, für das p53 als Transkriptionsfaktor fungiert. Der
apoptotische Prozess endete mit der Fragmentierung der DNA, welche als SubG1-Peak
detektiert wurde. In den p53-defizienten Zellen konnten selbst bei zytotoxischen
Konzentrationen keine apoptotischen Merkmale detektiert werden. Dies lässt in
Abwesenheit von p53 auf Nekrose schließen, die jedoch erst bei vergleichsweise hohen
Konzentrationen an Natriumselenit einsetzt.
Die verschiedenen Aspekte werden im Folgenden in die bestehende Literatur eingeordnet.
Bax führt zur Ausschüttung von AIF ins Zytosol (Cregan et al., 2002) und wird während der
Natriumselenit-induzierten Apoptose in verschiedenen Zelltypen hochreguliert (Hu et al.,
2006; Xiao et al., 2006; Rudolf et al., 2008; Zhao et al., 2009).
Eine Translokalisation von AIF durch Natriumselenit wurde kürzlich erstmals in HeLa Hep-2
Zellen beobachtet (Rudolf et al., 2008). Während der resultierenden Apoptose wurde keine
Steigerung der Caspase 3-Aktivität detektiert (Rudolf et al., 2004; Rudolf et al., 2008).
Weitere Studien zeigen ebenfalls keine Zunahme einer Caspase 3-Aktivität während der
Selenit-induzierten Apoptose (Jiang et al., 2002, Jiang et al., 2004). Auf der anderen Seite
gibt es Arbeiten, die eine Aktivierung von Caspasen belegen. So haben Králová et al. (2009)
analog zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kürzlich berichtet, dass die p53-
profiziente HCT116 Zelllinie sensitiver auf Natriumselenit reagieren als die p53-defizienten
Zellen, da sie vermehrt in die Apoptose gehen. Gezeigt wurde dies jedoch bei 10 µM
Natriumselenit, einer sehr hohen Konzentration, die zum Teil bis zu 48 h inkubiert wurde. Als
Parameter wurden dafür die Spaltung von PARP1, die Aktivierung der Caspase 3 sowie der
SubG1-Peak herangezogen. Nach 24 h zeigte sich hier tatsächlich in beiden Zelllinien eine
gesteigerte Effektor-Caspase-Aktivität, welche in den p53-profizienten Zellen ausgeprägter
war. Wir fanden nach Kurzzeitinkubation ebenfalls einen Unterschied in den beiden
Zelllinien: Während Natriumselenit in der p53-profizienten Zelllinie keinen Einfluss hatte,
Ergebnisse und Diskussion
99
kam es in der p53-defizienten Zelllinie sogar zu einer konzentrationsabhängigen Reduktion
der Caspase-Aktivität. Die Daten von Králová et al. (2009) stehen nicht unmittelbar im
Widerspruch zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, sondern können anhand der
Versuchsführung erklärt werden. Um die Induktion von Apoptose über eine Caspasen-
Kaskade zu untersuchen, wird eine Inkubationszeit von 4 h empfohlen (Promega, Caspase-
Glo®3/7 Assay, Technical Bulletin, 2005). Es wurde sichergestellt, dass diese
Inkubationsdauer unter Verwendung der Positivsubstanz Staurosporin zum positiven
Nachweis einer gesteigerten Effektor-Caspase-Aktivität führt (Graupner, 2009). Daraufhin
wurde für die Selenverbindungen ebenfalls 4 h Inkubation gewählt. Bei einer Messung zu
späteren Zeitpunkten kann nicht mehr unterschieden werden, ob die Effektor-Caspasen von
den Initiator-Caspasen oder über einen mitochondrialen Weg aktiviert wurden. Letzteres
ergibt sich dadurch, dass die AIF-Ausschüttung aus den Mitochondrien auch die Freisetzung
von Cytochrom C stimuliert, was wiederum die Effektor-Caspasen aktiviert (Candé et al.,
2002). Aus der Wahl der Inkubationszeit ergibt sich somit der jeweilige Endpunkt bzw. die
eigentliche Aussage. In dieser Arbeit stand dabei die Frage im Vordergrund, über welche
Mechanismen Natriumselenit den Beginn der Apoptose einleitet.
Insgesamt ist also davon auszugehen, dass die Natriumselenit-induzierte Apoptose zunächst
Caspase-unabhängig eingeleitet wird. Vielmehr kommt es zur p53-abhängigen Induktion von
Bax und der Kernlokalisation von AIF. Dieser Weg kann nachgeschaltet durch die Cytochrom
C-vermittelte Aktivierung der Effektor-Caspasen unterstützt werden.
Übereinstimmend damit wurde gezeigt, dass die Selenit-induzierte Apoptose in
Prostatakrebszellen durch Caspase-Inhibitoren nur zum Teil aufgehoben werden kann (Li et
al., 2007). Auch in der zitierten Studie wurde die p53-Abhängigkeit der Apoptose belegt, da
sich p53-Mutationen protektiv auswirkten. Ebenso zeigten Hu et al. (2006) in
Prostatakrebszellen, dass Natriumselenit zu einer p53-abhängigen Induktion von Bax und
einer Aktivierung von Effektor-Caspasen, letzteres wiederum zu vergleichsweise späten
Zeitpunkten, führte. Unter Verwendung einer anderen p53-defizienten Prostatakrebszelllinie
beobachteten Zhao et al. (2009) jedoch auch eine p53-unabhängige Zunahme von Bax auf
Proteinebene und Apoptose nach Selenit-Inkubation, wobei die Apoptose-Inzidenz in den
p53-profizienten Zellen deutlich höher war. Trotzdem kann nicht ausgeschlossen werden,
dass Natriumselenit nicht auf verschiedenste zelluläre Zielmoleküle wirkt und so die
unterschiedlichsten apoptotischen Prozesse in Gang setzt. Dies kann zudem je nach
Zeitpunkt, Konzentration und Zelltyp differieren.
Eine Fragmentierung der DNA, also der Abschluss der Apoptose, nach Natriumselenit-
Exposition wurde in verschiedenen Zelllinien und Studien dokumentiert: So wurde z. B. in
murinen Nervenzellen und in Prostakrebszellen ein stark ausgeprägter SubG1-Peak sowie
eine „DNA-Leiter“ beobachtet (Jiang et al., 2002; Jiang et al., 2004 a; Xiao et al., 2006).
Ergebnisse und Diskussion
100
Kürzlich wurde zudem die p53-Abhängigkeit des SubG1-Peaks in unserem HCT116–
Zellmodell publiziert (Králová et al., 2009). Abweichend davon fanden Rudolf et al. (2004)
während der Natriumselenit-induzierten Apoptose in Hela Hep-2 Zellen nicht die typische
oligonukleosomale DNA-Fragmentierung, sodass unterschiedliche Reaktionen in
Abhängigkeit vom Zelltyp möglich sein können.
Überraschenderweise konnte trotz einer p53-Abhängigkeit der Selenit-induzierten Apoptose
keine Phosphorylierung von p53 an Serin-46 detektiert werden. Diese Modifizierung wird mit
der p53-abhängigen Apoptose in Zusammenhang gebracht (Oda et al., 2000) und wurde in
H1299 Lungenkrebszellen, die mit p53 transfiziert wurden, nach Natriumselenit-Exposition
gefunden (Smith et al., 2004). Ein Grund könnte die Sensitivität des verwendeten
Antikörpers sein (siehe Abschnitt 5.4).
Im Fall von Selenomethionin wurde weder eine Aktivierung der Caspase-abhängigen noch
der AIF-vermittelten Apoptose gefunden. Zudem zeigte sich keine Induktion des p53-
abhängigen Gens Bax und nur ein gering ausgeprägter SubG1-Peak. Dies alles war
unabhängig vom p53-Status der Zellen. Im Gegensatz dazu detektierten Goel et al. (2006)
p53-abhängige Apoptose im gleichen Zellmodell mithilfe einer durchflusszytometrischen
Methode mittels Annexin V. Dabei betrug die Inkubationszeit jedoch mindestens 48 h,
während in der vorliegenden Arbeit bis zu 24 h inkubiert wurde. Selenomethionin-induzierte
Apoptose ist auch in A549 Zellen (Wildtyp-p53) und HT29 Zellen bekannt, wobei dies nur
anhand der Morphologie mittels Mikroskopie belegt wurde (Redman et al., 1997).
Zusammenfassende Diskussion
101
5.8 Inhibierung der p53-abhängigen zellulären Antwort
durch Cadmiumchlorid
Die Einleitung tumorsuppressiver Reaktionen nach Natriumselenit-Exposition verlief p53-
abhängig. Es ist bekannt, dass Cadmiumchlorid zur Entfaltung der Wildtyp-Konformation des
p53-Proteins führt und somit den Tumorsuppressor inaktiviert (Méplan et al., 1999; Thuy,
2006; Schwerdtle et al., 2010). Daher wurden Kotoxizitätsstudien von Natriumselenit und
Cadmiumchlorid durchgeführt. Als Endpunkt wurde die Koloniebildungsfähigkeit gewählt.
Abbildung 51: Kotoxizität von Natriumselenit und Cadmiumchlorid.
P53-
profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 2 h mit Cadmiumchlorid vorinkubiert und 24 h
mit Natriumselenit und Cadmiumchlorid koinkubiert. Es wurde die Koloniebildungsfähigkeit
bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen + SD.
Zunächst wurden die Zellen 2 h mit Cadmiumchlorid vorinkubiert, um eine Inaktivierung von
p53 bereits zu Beginn der Natriumselenit-Exposition zu gewährleisten. Es folgte eine
Koinkubation von Natriumselenit und Cadmiumchlorid für 24 h. Eingesetzt wurden 15 µM
Cadmiumchlorid. Diese Konzentration war in beiden Zelllinien nicht-zytotoxisch, wobei die
p53-defizienten Zellen sensitiver reagierten. Daneben wurden 5 µM Natriumselenit gewählt,
0
20
40
60
80
100
120
Koloniebildungsfähigkeit
(% der Kontrolle)
Natriumselenit
-
+
+
-
[5µM]
Cadmiumchlorid
- -
+
+
[15 µM]
130
HCT116 p53+/+
HCT116 p53
-
/
-
Ergebnisse und Diskussion
102
welche in Abwesenheit von Cadmiumchlorid in den p53-profizienten Zellen zur Senkung der
Koloniebildungsfähigkeit auf 24 % der Kontrolle führten, während die Koloniebildungs-
fähigkeit in den p53-defizienten Zellen unbeeinflusst blieb (vgl. Abschnitt 5.1.1). Nach
Koinkubation der beiden Verbindungen betrug die Koloniebildungsfähigkeit in der p53-
profizienten Zelllinie 51 % der Kontrolle und war damit etwa doppelt so hoch verglichen mit
der Natriumselenit-Exposition in Abwesenheit von Cadmiumchlorid. Im Vergleich dazu hatte
Cadmiumchlorid in den p53-defizienten Zellen keinen Einfluss auf die Zytotoxizität von
Natriumselenit (Abbildung 51). Damit stellte sich die Frage, inwiefern oxidative DNA-Schäden
trotz gesteigerter Proliferation in den p53-profizienten Zellen auftreten.
Abbildung 52: Kotoxizität von Natriumselenit und Cadmiumchlorid.
P53-
profiziente und p53-defiziente Zellen wurden 2 h mit Cadmiumchlorid vorinkubiert und 24 h
mit Natriumselenit und Cadmiumchlorid koinkubiert. Es wurden die DNA-Strangbrüche
mittels Alkalischer Entwindung bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen
Versuchen + SD.
Während Natriumselenit in Abwesenheit von Cadmiumchlorid nur eine geringfügige DNA-
Schädigung zufolge hatte, traten bei Koinkubation mit Cadmiumchlorid mit etwa 0,44 DNA-
Strangbrüchen pro 10
6
Basenpaare deutlich höhere Gehalte an DNA-Schäden auf. In etwa
die gleiche Menge an DNA-Strangbrüchen wurde durch die Inkubation mit Cadmiumchlorid
Natriumselenit
-
+
+
-
[5µM]
Cadmiumchlorid
- -
+
+
[15 µM]
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
DNA Strangbrüche/
10
6
Basenpaare
p53+/+
HCT116
HCT116 p53+/+
Zusammenfassende Diskussion
103
in Abwesenheit von Natriumselenit induziert (Abbildung 52). Fpg-sensitive Läsionen traten
nicht auf (Daten nicht gezeigt).
Insgesamt reduzierte Cadmiumchlorid die Zytotoxizität von Natriumselenit in Abhängigkeit
des p53-Status der Zellen. Dies könnte darauf hinweisen, dass p53-abhängige Prozesse durch
Cadmiumchlorid inhibiert wurden. Entscheidend könnte hier die Hemmung der
Natriumselenit-induzierten Apoptose gewesen sein.
Zusammenfassende Diskussion
104
6 Zusammenfassende Diskussion
Das Tumorsuppressorprotein p53 leitet nach DNA-Schädigung die Zellzykluskontrolle, die
DNA-Reparatur und die Apoptose ein. Wie wichtig p53 für die Erhaltung der genomischen
Stabilität ist, wird dadurch deutlich, dass in 50 % der Darmkrebstumore p53 mutiert vorliegt
(Greenblatt, 1994). In dieser Arbeit wurde zum einen die direkte Entfaltung der aktiven
Wildtyp-Konformation von p53 durch reduzierbare Selenverbindungen und zum anderen der
Einfluss von p53 auf die Toxizität verschiedener Selenverbindungen sowie auf die
resultierenden zellulären Reaktionen untersucht.
In einem subzellulären Testsystem konnte zunächst gezeigt werden, dass die reduzierbaren
Selenverbindungen Natriumselenit und Phenylseleninsäure die DNA-Bindungsdomäne von
p53 entfalten. Dieser Effekt trat im Falle von Natriumselenit bereits bei niedrigen
mikromolaren Konzentrationen auf, konnte jedoch nicht bei dem vollständig reduzierten
Selenomethionin nachgewiesen werden. Die Entfaltung der Wildtyp-Konformation könnte
auf einer oxidativen Zinkfreisetzung durch Selen in reduzierbaren Oxidationsstufen beruhen.
In der entfalteten Konformation kann p53 nicht mehr als Transkriptionsfaktor fungieren und
verliert somit wesentliche tumorsuppressive Eigenschaften.
Deshalb wurde in einem weiteren Teil der Arbeit der Einfluss von Natriumselenit auf die
Induktion der Zellzykluskontrolle, DNA-Reparatur und Apoptose in p53-profizienten und p53-
defizienten HCT116 Darmkrebszellen untersucht. Während sich im subzellulären System eine
Inaktivierung von p53 durch Natriumselenit andeutete, schien dieser Mechanismus im
zellulären System nicht relevant zu sein. Vielmehr war die zelluläre Antwort nach Inkubation
mit Natriumselenit stark abhängig vom p53-Status der Zellen (Tabelle 4). Hierbei reagierten
die p53-profizienten Zellen sensitiver auf eine Inkubation mit Natriumselenit als die p53-
defizienten Zellen. Bereits bei einer Inkubation mit 3 µM Natriumselenit sank in den p53-
profizienten Zellen die Koloniebildungsfähigkeit. Studien zur zellulären Aufnahme zeigten,
dass es mit beginnender Zytotoxizität zu einem sprunghaften Anstieg in der Aufnahme an
Natriumselenit kam, d. h. ab einer Inkubationskonzentration von 5 µM im Medium waren
die intrazellulär gemessenen Selenkonzentrationen mehr als äquimolar. Mit der Zytotoxizität
einhergehend wurde zwischen 3 µM und 5 µM die Zellzykluskontrolle eingeleitet. Dies zeigte
sich anhand der Induktion von p21 und GADD45 sowie der Einleitung von Zellzyklusarresten.
Zudem wurde in diesem Konzentrationsbereich die Apoptose eingeleitet, wie die
Kernlokalisation von AIF, die Induktion von Bax und die Messung des SubG1-Peaks zeigten.
Hingegen wurde während der Einleitung der Apoptose keine Steigerung der Aktivität der
Effektor-Caspasen 3 und 7 detektiert. Die Sensitivität der p53-profizienten Zellen gegenüber
Zusammenfassende Diskussion
105
Natriumselenit setzt sich somit aus der Arretierung des Zellzykluses und der Induktion von
Apoptose zusammen.
Erstaunlicherweise führte die Inkubation mit Natriumselenit bis in vergleichsweise hohe
Konzentrationen in den p53-profizienten Zellen nicht zur Akkumulation von DNA-Schäden.
Erst ab 8 µM Natriumselenit wurden oxidative DNA-Schäden detektiert. Analysen zum
Expressionsmuster von BER-Genen zeigten, dass unter den BER-Genen nur Polß durch
Natriumselenit (ab 3 µM) induziert wurde. Dies spiegelte sich jedoch nicht auf der
translationalen Ebene wieder. Eine starke Induktion wurde jedoch bei den p53-abhängigen
NER-Genen p48 und XPC detektiert. Zum anderen wurde XPA, für das p53 nicht als
Transkriptionsfaktor fungiert, durch Natriumselenit vielmehr reprimiert.
Tabelle 4: Effekte nach Inkubation mit Natriumselenit in Abhängigkeit des
p53-Status der Zellen
RepressionRepressionSteigender Polß-Proteingehalt (24 h und 45 h)
NATRIUMSELENIT
marginale
Repression
---
Steigende Aktivität der Effektor-Caspasen 3/7
(4,5 h)
RepressionRepressionInduktion von XPA (Gen- und Proteinebene)
(24 h und 45 h)
---≥5 µM / ≥1 µM
Stabilisierung von p53 (24 h / 45 h)
---≥3 µM
Steigende Genexpression Polß (45 h)
≥1 µM≥8 µM
DNA-Strangbrüche (45 h)
≥8 µM≥5 µM
SubG1-Peak (24 h)
Repression
≥5 µM / ≥3 µM
Steigende Genexpression von Bax (24 h / 45 h)
---≥3 µM
Kernlokalisation von AIF (24 h)
≥5 µM / ≥3 µM≥3 µM
Steigende Genexpression von GADD45
(24 h / 45 h)
marginal
≥3 – 5 µM
Induktion von p21 (Gen- und Proteinebene)
(24 h und 45 h)
≥8 µM≥3 µM
Zellzyklusarreste (24 h)
---≥5 µM
Steigende Genexpression von XPC und p48
(24 h und 45 h)
≥7 µM≥5 µM
Starke intrazelluläre Akkumulation (24 h)
≥8 µM≥3 µM
Zytotoxizität (24 h)
HCT116 p53-/-HCT116 p53+/+Endpunkte
RepressionRepressionSteigender Polß-Proteingehalt (24 h und 45 h)
NATRIUMSELENIT
marginale
Repression
---
Steigende Aktivität der Effektor-Caspasen 3/7
(4,5 h)
RepressionRepressionInduktion von XPA (Gen- und Proteinebene)
(24 h und 45 h)
---≥5 µM / ≥1 µM
Stabilisierung von p53 (24 h / 45 h)
---≥3 µM
Steigende Genexpression Polß (45 h)
≥1 µM≥8 µM
DNA-Strangbrüche (45 h)
≥8 µM≥5 µM
SubG1-Peak (24 h)
Repression
≥5 µM / ≥3 µM
Steigende Genexpression von Bax (24 h / 45 h)
---≥3 µM
Kernlokalisation von AIF (24 h)
≥5 µM / ≥3 µM≥3 µM
Steigende Genexpression von GADD45
(24 h / 45 h)
marginal
≥3 – 5 µM
Induktion von p21 (Gen- und Proteinebene)
(24 h und 45 h)
≥8 µM≥3 µM
Zellzyklusarreste (24 h)
---≥5 µM
Steigende Genexpression von XPC und p48
(24 h und 45 h)
≥7 µM≥5 µM
Starke intrazelluläre Akkumulation (24 h)
≥8 µM≥3 µM
Zytotoxizität (24 h)
HCT116 p53-/-HCT116 p53+/+Endpunkte
Zusammenfassende Diskussion
106
In Abwesenheit von p53 zeigte sich nach Natriumselenit-Exposition ein deutlich anderes Bild.
Bereits bei niedrigen Konzentrationen an Natriumselenit akkumulierten die p53-defizienten
Zellen hohe Gehalte an DNA-Strangbrüchen. Weder BER- noch NER-Gene wurden begleitend
dazu induziert. Zudem setzte erst bei viel höheren Konzentrationen eine zelluläre
Schadensantwort ein. So wurde die Koloniebildungsfähigkeit erst durch 8 µM Natriumselenit
gesenkt. Ähnlich wie in den p53-profizienten Zellen begann eine starke Akkumulation von
Selen in der Zelle mit Beginn der Zytotoxizität. Einhergehend mit der sinkenden
Koloniebildungsfähigkeit wurden Zellzyklusarreste erst bei vergleichsweise hohen
Konzentrationen induziert. Während diese spät einsetzende p53-unabhängige Zellzyklus-
kontrolle wahrscheinlich nicht p21-vermittelt ablief, könnte GADD45 eine Rolle gespielt
haben. Der Zelltod, der durch die Messung des SubG1-Peaks detektiert wurde, setzte ebenso
erst im oberen Konzentrationsbereich an Natriumselenit ein und wurde nicht von einer
Kernlokalisation von AIF, der Induktion von Bax oder einer gesteigerten Aktivität der
Effektor-Caspasen 3 und 7 begleitet. Demnach wurden in den p53-defizienten Zellen trotz
DNA-Schädigung keine tumorsuppressiven Reaktionen eingeleitet. Daraus resultiert eine
Gefährdung der genomischen Integrität und unterstreicht die Bedeutung von p53 als
Tumorsuppressor.
Im Fall von Selenomethionin war die zelluläre Antwort weitestgehend unabhängig vom p53-
Status der Zellen (Tabelle 5). So setzte die Zytotoxizität in p53-profizienten und p53-
defizienten Zellen gleichermaßen bei vergleichsweise hohen Konzentrationen ein. Studien
zur intrazellulären Aufnahme zeigten, dass die Inkubation mit Selenomethionin bereits in
sehr niedrigen, nicht-zytotoxischen Konzentrationen zur Akkumulation von Selen in beiden
Zelllinien führt.
Mit beginnender Zytotoxizität wurde die Zellzykluskontrolle eingeleitet, jedoch war die
Prävalenz des jeweiligen Zellzyklusarrests vom p53-Status der Zellen abhängig. P21 könnte in
der p53-profizienten Zelllinie die stärkere Ausprägung des G1-Phase-Arrests bewirkt haben.
GADD45 wurde in beiden Zelllinien vergleichsweise gering induziert, sodass eine Rolle in der
p53-unabhängigen Zellzykluskontrolle nach Inkubation mit Selenomethionin fraglich ist.
Mit der Zytotoxizität einhergehend wurde nach Inkubation mit Selenomethionin in den p53-
profizienten und in den p53-defizienten Zellen eine Zunahme des SubG1-Peaks detektiert.
Der Zelltod war jedoch jeweils nicht von einer Kernlokalisation von AIF oder einer Induktion
von Bax begleitet. Ein Unterschied zwischen den beiden Zelllinien konnte nur in der Aktivität
der Effektor-Caspasen gefunden werden. Hier zeigten die p53-profizienten Zellen eine
marginale Aktivitätssteigerung, während es in den p53-defizienten Zelllinie zu einer leichten
Senkung kam. Wie die Bestimmung des SubG1-Peaks gezeigt hatte, schien sich dieser
Unterschied jedoch nicht auf die Einleitung des Zelltods auszuwirken.
Zusammenfassende Diskussion
107
Die DNA-schädigende Wirkung korrelierte ebenfalls mit der Zytotoxizität des
Selenomethionins. Die p53-profizienten Zellen stabilisierten bei einsetzender DNA-
Schädigung p53. Dies schien jedoch kaum einen Einfluss auf die zelluläre Reaktion zu haben,
da der Gehalt an DNA-Strangbrüchen sowie die Induktion von Polß in beiden Zellen gleiche
gleichermaßen auftraten.
Selenomethionin führte bereits in sehr niedrigen, nicht-zytotoxischen Konzentrationen zur
Akkumulation von intrazellulärem Selen unabhängig vom p53-Status der Zellen.
Tabelle 5: Effekte nach Inkubation mit Selenomethionin in Abhängigkeit des
p53-Status der Zellen
≥100 µM≥100 µM
Steigender Polß-Proteingehalt (24 h und 45 h)
SELENOMETHIONIN
marginale
Repression
marginalSteigende Aktivität der Effektor-Caspasen 3/7
(4,5 h)
------
Induktion von XPA (Gen- und Proteinebene)
(24 h und 45 h)
---≥100 µM
Stabilisierung von p53 (45 h)
≥500 µM≥500 µM
DNA-Strangbrüche (45 h)
≥250 µM≥250 µM
SubG1-Peak (24 h)
------
Steigende Genexpression von Bax (24 h)
------
Kernlokalisation von AIF (24 h)
marginalmarginalSteigende Genexpression von GADD45 (24 h)
marginal
≥10 µM
Induktion von p21-Protein (45 h)
≥250 µM≥250 µM
Zellzyklusarreste (24 h)
------
Steigende Genexpression von XPC und p48
(24 h und 45 h)
≥50 nM≥50 nM
Starke intrazelluläre Akkumulation (24 h)
≥250 µM≥250 µM
Zytotoxizität (24 h)
HCT116 p53-/-HCT116 p53+/+Endpunkte
≥100 µM≥100 µM
Steigender Polß-Proteingehalt (24 h und 45 h)
SELENOMETHIONIN
marginale
Repression
marginalSteigende Aktivität der Effektor-Caspasen 3/7
(4,5 h)
------
Induktion von XPA (Gen- und Proteinebene)
(24 h und 45 h)
---≥100 µM
Stabilisierung von p53 (45 h)
≥500 µM≥500 µM
DNA-Strangbrüche (45 h)
≥250 µM≥250 µM
SubG1-Peak (24 h)
------
Steigende Genexpression von Bax (24 h)
------
Kernlokalisation von AIF (24 h)
marginalmarginalSteigende Genexpression von GADD45 (24 h)
marginal
≥10 µM
Induktion von p21-Protein (45 h)
≥250 µM≥250 µM
Zellzyklusarreste (24 h)
------
Steigende Genexpression von XPC und p48
(24 h und 45 h)
≥50 nM≥50 nM
Starke intrazelluläre Akkumulation (24 h)
≥250 µM≥250 µM
Zytotoxizität (24 h)
HCT116 p53-/-HCT116 p53+/+Endpunkte
Abschließend zeigte der Vergleich von Natriumselenit und Selenomethionin, dass
Natriumselenit die höhere Zytotoxizität aufwies, Selenomethionin bei geringerer
Zytotoxizität durch unspezifischen Einbau in Proteine jedoch stärker in der Zelle
akkumulierte. Selenomethionin führte erst in vergleichsweise hohen, zytotoxischen
Konzentrationen zur Akkumulation von DNA-Schäden. Dabei war die zelluläre
Schadensantwort weitestgehend p53-unabhängig. Natriumselenit hingegen rief nach DNA-
Zusammenfassende Diskussion
108
Schädigung p53-abhängige Reaktionen hervor. Die Unterschiede zwischen diesen beiden
Verbindungen können nicht allein auf die verschiedenen Oxidationsstufen des Selens
zurückgeführt werden, da Phenylseleninsäure, ebenfalls reduzierend, ähnlich wie
Selenomethionin weitestgehend p53-unabhängige Effekte induzierte. Insgesamt wird aus
dieser Arbeit im Zellkulturmodell deutlich, wie stark sich verschiedene Selenverbindungen in
ihren Eigenschaften unterscheiden. Daher sollte in der Nahrungsergänzung nicht allgemein
von Selen, sondern konkret von der jeweiligen Selenverbindung gesprochen werden. Welche
der Selenverbindung vorzuziehen ist, muss weiterhin diskutiert werden. Natriumselenit ist
aufgrund seiner prooxidativen und zytotoxischen Wirkung kritisch zu betrachten. Auf der
anderen Seite sollte eine mögliche chronische Toxizität durch starke Akkumulation von
Selenomethionin nicht unterschätzt werden. Aus diesem Grund rät auch das Bundesinstitut
für Risikobewertung von einer Supplementation mit Selenomethionin ab (BfR, 2004 b).
Während Natriumselenit im Organismus eine Halbwertszeit von 65-115 Tagen aufweist, liegt
diese bei Selenomethionin mit 200-300 Tagen mehr als doppelt so hoch (RKI, 2006).
In Bezug auf den Menschen sind die in dieser Arbeit eingesetzten Konzentrationen durchaus
relevant. Berechnet man die empfohlene Tagesdosis in Nahrungsergänzungsmitteln, die bei
30 µg Selen liegt (BfR, 2004 b), auf einen Mageninhalt von 1,5 l, ergib sich eine
Selenkonzentration von etwa 0,25 µM. Diese Konzentration ist zwar geringer als die
Inkubationskonzentrationen in den Zellkulturversuchen, jedoch ist von einer intrazellulären
Akkumulation auszugehen. Dies zeigt zum einen der Vergleich mit realem Darmgewebe, in
dem Gehalte von 2,8 µM gefunden werden (ATSDR, 2003; vgl. Abschnitt 5.2.1), und zum
anderen die Bestimmung der Aufnahme mittels AAS.
In Bezug auf den Menschen sind die in dieser Arbeit eingesetzten Konzentrationen durchaus
relevant. Berechnet man die empfohlene Tagesdosis in Nahrungsergänzungsmitteln, die bei
30 µg Selen liegt (BfR, 2004 b), auf einen Mageninhalt von 1,5 l, ergib sich eine
Selenkonzentration von etwa 0,25 µM. Diese Konzentration ist geringer als die
Inkubationskonzentrationen in den Zellkulturversuchen, jedoch ist von einer intrazellulären
Akkumulation auszugehen. Dies zeigt zum einen der Vergleich mit realem Darmgewebe, in
dem Gehalte von 2,8 µM gefunden werden (ATSDR, 2003), und zum anderen die
Bestimmung der zellulären Aufnahme mittels AAS (siehe Abschnitt 5.2.1).
Ausblickend wären weitere Untersuchungen sinnvoll, welche die höhere BER-Kapazität in
den p53-profizienten Zellen nach Natriumselenit-Exposition ergründen. Um direkte
Interaktionen zwischen p53 und den BER-Proteinen zu betrachten, könnten
Zusammenfassende Diskussion
109
Aktivitätsmessungen der jeweiligen Proteine durchgeführt werden. Versuche in z. B. XPC-
defizienten Zellen könnten hingegen die Rolle der NER-Gene abklären. Zudem könnten die
Entstehung und Akkumulation der oxidativen DNA-Schäden durch kinetische
Untersuchungen weitergehend verfolgt werden. Weiterhin könnten Vergleiche mit
Schwefelanaloga erfolgen, um die Selen-Spezifität der Effekte zu belegen. Ähnliches wurde
in unserer Arbeitsgruppe bereits gemacht (Blessing et al., 2004a). Außerdem könnten
weitere Zink-bindende Proteine als oxidationsempfindliche Angriffspunkte untersucht
werden, selbst wenn keine inaktivierende Wirkung des Natriumselenits auf p53 im zellulären
System gefunden wurde. Ein Zielprotein wäre der Androgen-Rezeptor, der das Wachstum
von Prostatakrebszellen steuert und dessen Aktivität als Transkriptionsfaktor von zwei
Zinkfingern in der DNA-Bindungsdomäne abhängt. Die Aktivität dieses Rezeptors kann z. B.
über ein Reporter-Gen-Assay bestimmt werden (Crounauer et al., 2007). Es wurde jedoch
bereits gezeigt, dass Natriumselenit die Genexpression des Rezeptors repressiert (Husbeck
et al., 2006). Im Reporter-Gen-Assay kann bei einer reduzierten Aktivität aber nicht zwischen
einer Inaktivierung durch Zink-Freisetzung bzw. einer gesenkten Genexpression
unterschieden werden. Deshalb müsste zur Bestimmung eines Einflusses auf die Zinkfinger-
Domäne eine Zink-Freisetzung direkt mittels Metall-Chelatoren in der Zelle detektiert
werden (Berendji et al., 1997).
Zusammenfassend zeigte sich, dass die Inaktivierung von p53, die im subzellulären System
auftrat, im zellulären System nicht zum Tragen kam. Die Ergebnisse in p53-profizienten und
p53-defizienten HCT116 Zellen machen vielmehr deutlich, dass p53 eine entscheidende Rolle
bei der Schadensantwort der Zelle auf Natriumselenit spielt (Abbildung 53 A).
Als Reaktion auf die DNA-schädigende Wirkung des Natriumselenits wurde p53 durch
Phosphorylierung stabilisiert. Als aktiver Transkriptionsfaktor induzierte p53 Gene der DNA-
Reparatur, Zellzykluskontrolle und Apoptose. Über die Induktion von p21 wurden
Zellzyklusarreste eingeleitet. Durch eine verstärkte Expression von Bax und die
Kernlokalisation von AIF wurde die Apoptose eingeleitet. Daneben induzierte p53 die DNA-
Reparatur, da oxidative DNA-Schäden in Anwesenheit von p53 erst bei einer stark
zytotoxischen Konzentration von 8 µM Natriumselenit akkumulierten. Dabei könnten p53, z.
B. durch direkte Interaktionen mit BER-Proteinen, oder p53-abhängige Gene der NER in
einem „Back up“-Mechanismus eine Rolle gespielt haben (vgl. Abschnitt 5.5.5). In
Abwesenheit von p53 akkumulierten DNA-Strangbrüche bereits in niedrigen, nicht-
zytotoxischen Konzentrationen von Natriumselenit, ohne dass tumorsuppressive Reaktionen
Zusammenfassende Diskussion
110
eingeleitet wurden. Vielmehr war das Wachstum der p53-defizienten Zellen trotz DNA-
Schädigung unbeeinflusst.
In Abwesenheit von Cadmium In Anwesenheit von Cadmium
A B
Umfaltung in eine
inaktive Konformation
Na
2
SeO
3
p53
DNA-Schädigung
Phosphorylierung
Zellzyklusarrest Apoptose
p21 Bax
Intakte
transkriptionelle
Regulation
Basenexzisionsreparatur
Protein-Protein-Interaktion?
Zusätzlich Transkription von
NER-Genen?
p53
P
Proliferation trotz
DNA-Schädigung
Inhibierung tumor-
suppressiver Prozesse
In Abwesenheit von Cadmium In Anwesenheit von Cadmium
A B
Umfaltung in eine
inaktive Konformation
Na
2
SeO
3
p53p53
DNA-Schädigung
Phosphorylierung
Zellzyklusarrest Apoptose
p21 Bax
Intakte
transkriptionelle
Regulation
Basenexzisionsreparatur
Protein-Protein-Interaktion?
Zusätzlich Transkription von
NER-Genen?
Basenexzisionsreparatur
Protein-Protein-Interaktion?
Zusätzlich Transkription von
NER-Genen?
p53
P
p53p53
PP
Proliferation trotz
DNA-Schädigung
Inhibierung tumor-
suppressiver Prozesse
Abbildung 53: Einfluss von Natriumselenit und Cadmiumchlorid auf p53-
abhängige Prozesse.
Die tumorsuppressiven Reaktionen in den p53-profizienten Zellen konnten durch Cadmium-
chlorid inhibiert werden, da Cadmiumionen p53 entfalten und in eine inaktive Konformation
überführen (Abbildung 53 B). Es konnte gezeigt werden, dass Cadmiumchlorid die
Zytotoxizität von Natriumselenit reduziert. Weitergehende Kotoxizitätsstudien werden die
Inhibierung anderer p53-abhängiger Prozesse, wie z. B. der Apoptose, untersuchen.
Die Akkumulation von DNA-Einzelstrangbrüchen in p53-defizienten Zellen nach Natrium-
selenit-Exposition bei gleichzeitiger Proliferation der Zellen ist bedenklich. Aus DNA-
Einzelstrangbrüchen können in proliferierenden Zellen DNA-Doppelstrangbrüche generiert
werden (zusammengefasst in Caldecott, 2008), welche umso mehr die Integrität des Genoms
gefährden können. Solch ein Mechanismus könnte vor allem in premalignen und malignen
Strukturen mit inaktivem p53 zur weiteren Entartung führen. Dies ist in sofern alarmierend,
als dass p53 ein sehr häufig mutiertes Gen in Tumoren darstellt.
Literatur
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Anhang
125
8 Anhang
8.1 Abkürzungsverzeichnis
AAS Atomabsorptionsspektroskopie
AIF apoptosis inducing factor
APE1 Apurin/Apyrimidin-Endonuklease 1
ARE antioxidant response element
AS Aminosäure
ATM Ataxia telangiectasia mutated
ATR ATM and Rad3 related
ATSDR Agency for Toxic Substances and Disease Registry
Bax Bcl-2-associated X protein
BER Basenexzisionsreparatur
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung
Bp Basenpaare
Caspase cysteinyl-aspartate specific protease
Cdk Cyclin-abhängige Kinase
DGE Deutsche Gesellschaft für Ernährung
DMEM Dulbecos Modified Eagle Medium
FKS Fötales Kälberserum
Fpg Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase
GADD45 growth arrest DNA damage induced gene 45
GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase
GPx plasmatische Glutathion-Peroxidase
GSH Glutathion
GSSG Glutathiondisulfid
hOGG1 humane 8-Oxoguanin-DNA-Glykosylase 1
LigIII Ligase III
MAK-Wert Maximale Arbeitsplatzkonzentrationswerte gesundheitsgefährdender
Stoffe
Anhang
126
MDM2 murine double minute 2
MRPs multidrug resistance proteins
MTT [3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl Tetrazolium Bromid]
NemV Nahrungsergänzungsmittelverordnung
NER Nukleotiexzisionsreparatur
PARP Poly(ADP-Ribose)-Polymerase
PCNA proliferating cell nuclear antigen
Polß Polymerase ß
ROS reaktive Sauerstoffspezies
RT-PCR Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion
SD Standardabweichung
SECIS-Element Selenocystein-Insertions-Sequenz-Element
SELECT Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial
SU.VI.MAX supplémentation en vitamines et minéraux antioxydants
WST-1 water soluble tetrazolium
XPA Xeroderma Pigmentosum Protein A
XPC Xeroderma Pigmentosum Protein C
XRCC1 X-ray cross complementing protein 1
Anhang
127
8.2 Chemikalien
Bezeichnung Lieferant
2-Mercaptoethanol Serva (Heidelberg)
2-Propanol Roth (Karlsruhe)
Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung (37,5:1; 40 %) Roth (Karlsruhe)
Alcian Blue 8GX Fluka BioChemika (Buchs, Schweiz)
Ammoniumacetat Merck (Darmstadt)
Aprotinin (aus der Rinderlunge, 3-7 TIU/mg) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Bio-Rad-Protein-Assay-Reagenz Bio-Rad (München)
B-R SYBR® Green SuperMix for iQ™ Quanta Bioscinces über VWR
International (Dresden)
Casyton (isotone Salzlösung) Schärfe System (Reutlingen)
DAPI-Färbelösung (CyStainDNA) Partec (Münster)
Dikaliumhydrogenphosphat (K
2
HPO
4
) Roth (Karlsruhe)
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Dinatriumhydrogenphosphat (Na
2
HPO
4
) Roth (Karlsruhe)
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Sigma-Aldrich (Steinheim)
ECL Advance Western blotting Detektionskit GE Healthcare (Freiburg)
ECL Western blotting Detektionsreagenzien GE Healthcare (Freiburg)
Ethanol, 96 %, vergällt Bundesmonopolverwaltung für
Branntwein (Offenbach)
Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz Riedel-de Haen (Seelze)
Dihydrat (EDTA)
Fötales Kälberserum (FKS) Sigma-Aldrich (Steinheim)
(bis Ende 2006)
Gibco, Invitrogen (Karlsruhe)
(ab Ende 2006)
Giemsa (Azur-Eosin-Methylenblaulösung) Merck (Darmstadt)
Glycin Roth (Karlsruhe)
Hydroxylapatit (high resolution) Calbiochem (ca Jolle, Kanada)
Igepal Ca 630 (NP-40) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Immersionsöl Zeiss (Oberkochen)
Anhang
128
Kaliumchlorid (KCl) Merck (Darmstadt)
Kaliumdihydrogenphosphat (KH
2
PO
4
) Roth (Karlsruhe)
Leupeptin (Hydrochlorid, 90 %) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Magermilchpulver Roth (Karlsruhe)
Magnesium-Matrixmodifier Merck (Darmstadt)
Methanol Roth (Karlsruhe)
Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) Merck (Darmstadt)
Natriumchlorid (NaCl) AppliChem (Darmstadt)
Natriumfluorid (NaF, 99 %) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO
3
) Merck (Darmstadt)
Natriumorthovanadat (Na
3
VO
4
, 99,98 %) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Natriumselenit (Na
2
SeO
3
, 99 %) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Natronlauge (NaOH, 4 N) Kraft (Duisburg)
NucleoSpin RNA II Macherey-Nagel (Düren)
Palladium-Modifier Merck (Darmstadt)
PCR-Primer MWG Biotech (Ebersberg)
Penicillin-Streptomycin-Lösung Sigma-Aldrich (Steinheim)
Pepstatin A (aus mikrobieller Quelle) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Phenylmethansulfonylfluorid (99,0 %) Fluka BioChemika (Buchs, Schweiz)
qScript™ cDNA Synthesis Kit Quanta Bioscinces über VWR
International (Dresden)
Rinderserumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Salpetersäure (HNO
3
, 65 %) Kraft (Duisburg)
Salzsäure (HCl, 37 %) Kraft (Duisburg)
Salzsäure (HCl, 1 N) Kraft (Duisburg)
SDS-Lösung (10 %) Merck (Darmstadt)
Selen-Atomspektroskop-Standardlösung Fluka (Buchs, Schweiz)
L(+)-Selenomethionin (99 %) Acros Organics (Geel, Belgien)
Staurosporin (aus Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Sterilium Bode Chemie (Hamburg)
TEMED Roth (Karlsruhe)
TE-Puffer Gibco, Life Technologies (New York, USA)
Anhang
129
Tris-Base Roth (Karlsruhe)
Triton X-100 Fluka (Buchs, Schweiz)
Trypsin (10x) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Tween 20 Roth (Karlsruhe)
Tween 20 Sigma Ultra Sigma-Aldrich (Steinheim)
Vectashield Mounting Medium mit DAPI Vector Laboratories (Burlingame, USA)
Wasserstoffperoxid (H
2
O
2
, suprapur, 30 %) Merck (Darmstadt)
Anhang
130
8.3 Antikörper
Tabelle 6: Primäre Antikörper
Antikörper Applika-
tion
Verdünnung Herkunft /
Spezifität
Lieferant
Aktin (I-19) WB 1:1000 rabbit polycl. Santa Cruz Biotechnology
AIF (H300) IF 1:50 rabbit polycl. Santa Cruz Biotechnology
DNA Pol ß (18s) WB 1:1000 mouse monocl. Thermo Scientific
normal mouse
IgG
IP 1 µg/Probe (control IgG) Santa Cruz Biotechnology
p21 WB 1:1000 mouse monocl. Acris Antibodies
p53 (DO-7) WB 1:1000-5000 mouse monocl. DakoCytomation
p53 (CM1) WB
(nach IP)
1:1000 rabbit polycl. Novo Castra
P53 (PAb1620) IP 1 µg/Probe mouse monocl. Calbiochem
P53 (PAb240) IP 1 µg/Probe mouse monocl. Calbiochem
Phospho-p53,
Ser15
WB 1:1000 rabbit polycl. Cell Signaling Technology
Phospho-p53,
Ser20
WB 1:1000 rabbit polycl. Cell Signaling Technology
Phospho-p53,
Ser37
WB 1:1000 rabbit polycl. Cell Signaling Technology
Phospho-p53,
Ser46
WB 1:1000 rabbit polycl. Cell Signaling Technology
Phospho-p53,
Ser392
WB 1:1000 rabbit polycl. Cell Signaling Technology
XPA (FL-273) WB 1:1000 rabbit polycl. Santa Cruz Biotechnology
XPC WB 1:500 rabbit polycl. Santa Cruz Biotechnology
Anhang
131
Tabelle 7: Sekundäre Antikörper
Antikörper Applika-
tion
Markierung Verdünnung Lieferant
Anti-Kaninchen
(goat)
IF Cy3 1:400 Jackson Immuno
Research Labories
Anti-Kaninchen
(goat)
WB HRP 1:2500
Santa Cruz Biotechnology
Anti-Maus
(goat)
WB HRP 1:2500
Santa Cruz Biotechnology
8.4 Puffer und Lösungen
Zellkultur
PBS (pH7,4) 100 mM NaCl
4,5 mM KCl
7 mM Na
2
HPO
4
3 mM KH
2
PO
4
gebrauchsfertige Trypsin-Lösung 0,25 % Trypsin in PBS
mit 0,5 mM EDTA
Western Blot
RIPA-Puffer 10 mM Tris pH 7,6
150 mM NaCl
1 mM EDTA
1 % Triton X-100
1 % Natriumdesoxycholat
0,1 % SDS
1 mM PMSF (in 2-Propanol)
1 µg/ml Aprotinin
(in 50 mM Tris, pH7)
1 µg/ml Leupeptin (in bidest. H
2
O)
1 µg/ml Pepstatin A (in DMSO)
50 mM Natriumfluorid
1 mM Natriumorthovanadat
Anhang
132
Lämmli-Laufpuffer 25 mM Tris
0,1 % SDS
192 mM Glycin
Trenngel (12 %) 0,375 M Tris (pH 8,8)
0,1 % SDS
12 % Acrylamid
0,08 % TEMED
0,1 % APS
Sammelgel (4 %) 0,0125 M Tris, pH 6,8
0,1 % SDS
4 % Acrylamid
0,064 % TEMED
0,1 % APS
Transfer-Puffer 0,048 M Tris
0,039 M Glycin
0,001 M SDS
20 Vol% Methanol
TBS, pH 7,6 0,200 M Tris
0,137 M NaCl
Immunopräzipitation
IP-Puffer 10 mM Tris (pH 7,6)
0,14 M NaCl
0,5 % Igepal, NP40
0,5 mM PMSF (in 2-Propanol)
0,5 µg/ml Leupeptin (in bidest. H2O)
2 µg/ml Aprotinin
(in 50 mM Tris, pH 7)
0,7 µg/ml Pepstatin A (in DMSO)
Alkalische Entwindung
Lysepuffer. pH 7,5 0,137 M NaCl
0,003 M KCl
0,001 M KH
2
PO
4
0,006 M Na
2
HPO
4
0,1 % Triton X-100
Salzlösung, pH 8,0 2 M NaCl
0,1 M EDTA
0,002 M Tris
Anhang
133
Fpg-Puffer, pH 8,0 0,008 M NaH
2
PO
4
0,042 M Na
2
HPO
4
0,01 M EDTA
Alkalische Lösung 0,1075 M NaOH
0,02 M EDTA
0,69 NaCl
Natriumphosphatpuffer, 0,01 M, pH 6,9 0,0051 M NaH
2
PO
4
0,0049 M Na
2
HPO
4
Kaliumphosphatpuffer, 0,15 M, pH 6,9 0,0765 M KH
2
PO
4
0,0735 M K
2
HPO
4
Kaliumphosphatpuffer, 0,35 M, pH 6,9 0,1785 M KH
2
PO
4
0,1715 M K
2
HPO
4
Kaliumphosphatpuffer, 0,5 M, pH 6,9 0,255 M KH
2
PO
4
0,245 M K
2
HPO
4
Immunofluoreszenz
PBS II (pH7,4) 1,18 mM KH
2
PO
4
0,1368 M NaCl
2,15 mM KCl
8,45 mM Na
2
HPO
4
Anhang
134
8.5 Geräte
Bezeichnung Modell/Hersteller
AAS-Autosampler AS 800Perkin Elmer (Rodgau-Jügesheim)
Atomabsorptionsspektrometer AAnalyst 800, Perkin Elmer
(Rodgau-Jügesheim)
Auflichtmikroskop Axiovert 25, Carl Zeiss (Oberkochen)
Autoklav Varioklav 75 S, H+P (Oberschleißheim)
Brutschrank B6, Heraeus (Hanau)
CO
2
-Inkubator Hera Cell 150, Kendro (Langenselbold)
Digitalwaage PL300, Mettler (Giessen)
Digitalwaage BP61S, Sartorius (Göttingen)
Durchflusszytometer PAS, Partec (Münster)
Elektrophoresekammer Hoefer SE260, Amersham Scientific
(Freiburg)
Feinwaage Micro MC, Sartorius (Göttingen)
Fluoreszenzmikroskop Axio Imager.M1, Carl Zeiss (Oberkochen)
Geldokumentationsgerät LAS 3000, Fuji (Tokio, Japan)
Heißlufttrockenschrank SUT 6200, Kendro (Langenselbold)
Kolbenhubpipetten Reference, Eppendorf (Hamburg)
Kühl- und Gefrierschränke Liebherr (Ochsenhausen)
Kühlzentrifuge Biofuge Pico freeze, Kendro
(Langenselbold)
Kühlzentrifuge 5810 R, Eppendorf (Hamburg)
Laborspülmaschine G7883, Miele (Bielefeld)
Mikrotiterplattenlesegerät SpectraFluor, Tecan (Crailsheim)
Mikrotiterplattenlesegerät infinite M200, Tecan (Crailsheim)
Netzgerät EPS 601, Amersham Biosciences
(Freiburg)
Netzgerät EPS 2A200, Amersham Biosciences
(Freiburg)
Anhang
135
pH-Meter pH320, WTW (Weilsheim)
Pipettierhilfe pipetus akku, Hirschmann (Eberstadt)
Rotator Neolab (Heidelberg)
Schüttelinkubator CAT SH26, CAT Ingenieurbüro (Staufen)
Semi-Dry-Blotting-Apparatur Perfect Blue, peqlab (Erlangen)
Spektralphotometer Nanodrop ND 1000, NanoDrop
Technologies (Wilmington, USA)
Sterilbank Hera Safe KS 18, Hereus (Hanau)
Stickstoffbehälter MVE (Burnsville, USA)
Taumler 3012, GFL (Burgwedel)
Thermocycler iCycler, BioRad (München)
Tiefkühlgerät HFU 686 Top, Kendro (Langenselbold)
Trockenschrank T5042EK, Hereus (Hanau)
Ultraschallgerät Sonifier 250, Branson (Danbury, USA)
Vortex Genie2, Scientific Industries
(Bohemia, USA)
Wasseraufbereitungssystem Ultra Clear UV-TM, SG (Barsbüttel)
Wasserbad Typ WB14, Memmert (Schwabach)
Zellzählgerät Casy 1 Modell TT, Schärfe System
(Reutlingen)
Zentrifuge Biofuge Pico, Kendro (Langenselbold)
Anhang
136
8.6 Verbrauchsmaterialien
Casycups Schärfe System (Reutlingen)
Chromatographiepapier Whatman (Maidstone, UK)
Deckgläschen (12 mm) Roth (Karlsruhe)
Glasfilter (Whatman, UK)
Graphitrohröfen mit Endkappen Perkin Elmer (Rodgau-Jügrsheim)
Hybond-P PVDF Membran GE Healthcare (Freiburg)
Kryoröhrchen Greiner (Frickenhausen)
6-Loch-Platten Biochrom (Berlin)
24-Lochplatten Sarstedt (Nümbrecht)
96-Lochplatten Sarstedt (Nümbrecht)
96-Lochplatten (PS, weiß/schwarz, Zellkultur) Brand (Wertheim)
Messröhrchen (3,5 ml für PAS, Partec) Sarstedt (Nümbrecht)
Objektträger (75x25 mm) VWR (Darmstadt)
PCR-Reaktionsgefäße Sarstedt (Nümbrecht)
Pipettenspitzen (0,1-10 µl) VWR (Darmstadt)
Pipettenspitzen (0,5-20 µl) Sarstedt (Nümbrecht)
Pipettenspitzen (100-1000 µl) VWR (Darmstadt)
Pipettenspitzen (10-200 µl) Roth (Karlsruhe)
Pipettenspitzen (500-5000 µl) Eppendorf (Hamburg)
Probengefäße (AAS-Autosampler) Perkin Elmer (Rodgau-Jügrsheim)
Reaktionsgefäße (1,5 und 2 ml) Sarstedt (Nümbrecht)
Reaktionsgefäße (2,2 ml) Greiner (Frickenhausen)
Sterilfilter (0,2 µM) Sartorius (Göttingen)
Zellkulturschalen Biochrom (Berlin)
Zentrifugenröhrchen (15 und 50 ml) Sarstedt (Nümbrecht)
Anhang
137
8.7 PCR-Primer-Systeme
Tabelle 8: Primer-Systeme für die real time RT-PCR
Gen reverse/
forward
Sequenz
5’ 3’
Konzentration
[µM]
Effizienz
for GCT GCC TGG ACT CTC TCA TC APE-1
rev AAA CTT TGA GTG GGC ACT GG
0,6 1,990
for CAG TTG AAG TTG CCG TCA GA Bax
rev GGA GCT GCA GAG GAT GAT TG
0,5 1,919
for GAG CTC CTG CTC TTG GAG GADD45
rev GAA TGT GGA TTC GTC ACC AGC
0,2 1,886
for CTG CAC CAC CAA CTG CTT AG GAPDH
rev GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG
0,2 1,873
for GAT CAC GTG CCA CCT ACC TT LigIII
rev GTC CAC ACA GAA CCG TTG C
0,6 2,034
for CGA TGT TGT TGT TGG AGG AAC hOGG1
rev ACT TCC AAG AGG TGG CTC AG
0,4 1,908
for CCT CAT CCC GTG TTC TCC TTT p21
rev GTA CCA CCC AGC GGA CAA GT
0,2 1,830
for CCT GAA CCC ATG CTG TGA TTG p48
rev GCT GGC TTT CCC TCT AAC CTG
0,2 1,930
for TGG CAG TTT CAG AAG AGG TG Polß
rev CAG TTT TGG CTG TTT GGT TG
0,2 2,011
for CCG ACA GGA AAA CCG AGA AA XPA
rev TTC CAC ACG CTG CTT CTT ACT
0,2 1,990
for CGT GGA CGG GAA GGT GC XPC
rev GGC CAC GCG GTG TAG AT
0,2 1,887
for CGG ATG AGA ACA CGG ACA GT XRCC1
rev CCC CGT AAA GAA AGA AGT GC
0,2 1,958
Anhang
138
8.8 Sequenz des Bax-Gens und Lage der Primer
1 TCACGTGACCCGGGCGCGCTGCGGCCGCCCGCGCGGACCCGGCGAGAGGCGGCGGCGGGA
61 GCGGCGGTGATGGACGGGTCCGGGGAGCAGCCCAGAGGCGGGGGGCCCACCAGCTCTGAG
121 CAGATCATGAAGACAGGGGCCCTTTTGCTTCAGGGTTTCATCCAGGATCGAGCAGGGCGA
181 ATGGGGGGGGAGGCACCCGAGCTGGCCCTGGACCCGGTGCCTCAGGATGCGTCCACCAAG
241 AAGCTGAGCGAGTGTCTCAAGCGCATCGGGGACGAACTGGACAGTAACATGGAGCTGCAG
>>>>>>>>>>
301 AGGATGATTGCCGCCGTGGACACAGACTCCCCCCGAGAGGTCTTTTTCCGAGTGGCAGCT
>>>>>>>>>>
361 GACATGTTTTCTGACGGCAACTTCAACTGGGGCCGGGTTGTCGCCCTTTTCTACTTTGCC
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<
421 AGCAAACTGGTGCTCAAGGCTGGCGTGAAATGGCGTGATCTGGGCTCACTGCAACCTCTG
481 CCTCCTGGGTTCAAGCGATTCACCTGCCTCAGCATCCCAAGGAGCTGGGATTACAGGCCC
541 TGTGCACCAAGGTGCCGGAACTGATCAGAACCATCATGGGCTGGACATTGGACTTCCTCC
601 GGGAGCGGCTGTTGGGCTGGATCCAAGACCAGGGTGGTTGGGACGGCCTCCTCTCCTACT
661 TTGGGACGCCCACGTGGCAGACCGTGACCATCTTTGTGGCGGGAGTGCTCACCGCCTCGC
721 TCACCATCTGGAAGAAGATGGGCTGAGGCCCCCAGCTGCCTTGGACTGTGTTTTTCCTCC
781 ATAAATTATGGCATTTTTCTGGGAGGGGTGGGGATTGGGGGACATGGGCATTTTTCTTAC
841 TTTTGTAATTATTGGGGGGTGTGGGGAAGAGTGGTCTTGAGGGGGTAA
KEYS (in order of precedence):
>>>>>> left primer
<<<<<< right primer
Anhang
139
8.9 Gelelektrophoretische Überprüfung des Amplifikat
200 Bp
75 Bp
200 Bp
75 Bp
Abbildung 54: Gelelektrophoretische Überprüfung des Amplifikats.
Es wurden
Aliquots des Amplifikats nach der Polymerase-Kettenreaktion aufgetragen, um die Größe
von 99 Basenpaaren (Bp) zu überprüfen. Es wurden zudem keine Nebenprodukte detektiert.
140
9 Publikationsliste
Publikationen in Fachzeitschriften
1,4-Naphthoquinones as inducers of oxidative damage and stress signaling in HaCaT
human keratinocytes. Klaus, V., Hartmann, T., Gambini, J., Graf, P., Stahl, W., Hartwig, A.,
Klotz, L.-O. (2010) Archives of Biochemistry and Biophysics, 496 (2), pp. 93-100
Kurzbeiträge
Impact of selenium compounds on the cell cycle control. Klaus, V., Blessing, H., Hartwig, A.
(2007) Proceedings of the European Conference on Metallobiolomics, Herbert Utz Verlag,
ISBN 978-3-8316-0827-0, pp. 139-143
Einfluss von Selenverbindungen auf die Zellzykluskontrolle. Klaus, V., Blessing, H., Hartwig,
A. (2009) Anwendung und Bedeutung ausgewählter Spurenelemente und Mineralstoffe in
der Medizin, Herbert Utz Verlag, ISBN 978-3-8316-0894-2, pp. 58-62
Einfluss von Selen auf die Integrität des Genoms. Klaus, V., Hall, C., Schneider, J., Hartwig,
A., Schriftreihen der Gesellschaft für Mineralstoffe und Spurenelemente e.V., in press
Veröffentlichte Abstracts
Einfluss des Spurenelements Selen auf die genomische Stabilität. Klaus, V., Hall, C.,
Blessing, H., Hartwig, A. (2007) Lebensmittelchemie, 60 (6): 173
Einfluss von Selen auf zelluläre Schutzmechanismen. Klaus, V., Hartwig, A. (2009)
Lebensmittelchemie, 63: 44
Anhang
141
Selen und die genomische Stabilität. Klaus, V., Graupner, A., Schneider, J., Hartwig, A. (2010)
Lebensmittelchemie, 64: 23
Vorträge auf Fachtagungen
24
th
GMS Annual Meeting, Society for Minerals and Trace Elements (GMS), Berlin, 13.-
15.11.2008, Impact of selenium on the integrity of the genome. Klaus, V., Hall, C., Graupner,
A., Hartwig, A.
Gemeinsame Arbeitstagung 2009 der Regionalverbände Nord/Nord-Ost/Süd-Ost der
Lebensmittelchemischen Gesellschaft, Gesellschaft Deutscher Chemiker (GdCh), Berlin, 02.-
03.04.2009, Selen – Maßlos gut? Klaus, V., Graupner, A., Schneider, J., Hartwig, A.
38. Deutscher Lebensmittelchemikertag 14.-16.09.2009, Gesellschaft Deutscher Chemiker
(GdCh), Selen und die genomische Stabilität. Klaus, V., Graupner, A., Schneider, J., Hartwig,
A.
Poster auf Fachtagungen
22. Tagung der Gesellschaft für Umwelt -Mutationsforschung (GUM), Darmstadt, 21.-
24.02.2006, Einfluss ausgewählter Selenverbindungen auf das Tumorsuppressorprotein
p53. Klaus, V., Blessing, H., Hartwig, A.
Regionaltagung der Lebensmittelchemischen Gesellschaft, Gesellschaft Deutscher Chemiker
(GDCh), Berlin, 23.-24.03.2006, Einfluss von Selenverbindungen auf den Gehalt und die
Struktur des Tumorsuppressorproteins p53. Klaus, V., Blessing, H., Hartwig, A.
57. Mosbacher Kolloquium, Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie (GBM),
Mosbach, 06.-08.04.2006, Impact of selenium compounds on the tumor suppressor protein
p53. Klaus, V., Blessing, H., Hartwig, A.
142
9. DNA-Reparatur Tagung der Deutschen Gesellschaft für DNA-Reparaturforschung (DGDR),
Hamburg, 12.-15.09.2006, Differential effects of selenium compounds on the tumor
suppressor protein p53. Klaus, V., Blessing, H., Hartwig, A.
35. Deutscher Lebensmittelchemikertag, Gesellschaft Deutscher Chemiker (GdCh), Dresden,
18.-20.09.2006, Einfluss des Spurenelements Selen auf die genomische Stabilität. Klaus, V.,
Hall, C., Blessing, H., Hartwig, A.
22. Jahrestagung der Gesellschaft für Mineralstoffe und Spurenelemente (GMS), Berlin, 09.-
11.11.2006, Reducible selenium compounds affect the stability, the phosphorylation
pattern and the conformation of p53. Klaus, V., Blessing, H., Hartwig, A.
23. Jahrestagung der Gesellschaft für Mineralstoffe und Spurenelemente (GMS), Stuttgart,
28.-29. September 2007, Einfluss von Selen auf die Zellzykluskontrolle. Klaus, V., Hartwig, A.
5
th
European Conference on Metallobiolomics, Berlin, 29.-30. November 2007, Impact of
selenium on the cell cycle control. Klaus, V., Hartwig, A.
37. Deutscher Lebensmittelchemikertag, Gesellschaft Deutscher Chemiker (GdCh),
Kaiserslautern, 08.-10.09.2008, Einfluss von Selen auf zelluläre Schutzmechanismen. Klaus,
V, Hartwig, A.
DNA Repair 2008, 10
th
Biennial Meeting of the DGDR (Deutsche Gesellschaft für DNA-
Reparaturforschung), Berlin, 02.-05.-09.2008. The impact of selenium compounds on cell
cycle control and DNA damage in p53-proficient and p53-deficient cells. Klaus, V., Hartwig,
A.
38
th
Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society (EEMS), Cavtat, 21.-
25.09.2008, The impact of different selenium compounds on the p53-dependent stress
response. Klaus, V., Hartwig, A.
Anhang
143
24. Tagung der Gesellschaft für Umwelt-Mutationsforschung (GUM), Wien, 17.-20.02.2009,
P53-Abhängigkeit der Aufnahme verschiedener Selenverbindungen und der zellulären
Schadensantwort. Klaus, V., Schneider, J., Richter, C., Hartwig, A.
Preise und Stipendien
35. Deutscher Lebensmittelchemikertag, Gesellschaft Deutscher Chemiker (GdCh), Dresden,
18.-20.09.2006, Reisestipendium der GdCh
23. Jahrestagung der Gesellschaft für Mineralstoffe und Spurenelemente (GMS), Stuttgart,
28.-29. September 2007, Posterpreis
38
th
Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society (EEMS), Cavtat, 21.-
25.09.2008, Reisestipendium der Gesellschaft für Umwelt-Mutationsforschung (GUM)
144
10 Danksagung
Zuallererst danke ich Frau Professor Dr. Andrea Hartwig für die motivierende Begleitung und
die freundliche Unterstützung während meiner Promotion.
Zudem gilt mein Dank Frau Professor Dr. Tanja Schwerdtle, die jederzeit ein offenes Ohr für
Fragen hatte.
Dem gesamten Arbeitskreis, auch ehemaligen Mitarbeitern, danke ich herzlich für die gute
Zusammenarbeit und die angenehme Arbeitsatmosphäre. Ganz besonders danke ich Frau
Dr. Claudia Großkopf und Frau Dr. Caroline Hall für die freundschaftliche Begleitung im und
außerhalb des Labors. Genauso danke ich Frau Dr. Claudia Keil für ihre große
Hilfsbereitschaft. Daneben danke ich den Mitarbeitern des Arbeitskreises von Herrn
Professor Dr. Kroh für den freundlichen Zusammenhalt im Institut.
Zudem gilt mein Dank meinen Diplomandinnen: Frau Janina Schneider war sehr engagiert
bei den AAS-Messungen, Frau Anne Graupner hat mich bei der Etablierung des AIF-
Testsystems sowie der Messung der Caspase-Aktivität unterstützt und Frau Rebecca Voß
machte weiterführende Versuche zur Kotoxizität von Selen- und Cadmiumverbindungen.
Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich während des gesamten Studiums
unterstützt und motiviert haben. Und meiner Schwester danke ich dafür, dass sie immer für
mich da ist. Zum Ende meiner Arbeit hat mir der Antrieb durch meinen Freund sehr
geholfen. Dir dafür vielen Dank!
