ISOLIERUNG UND STRUKTURAUFKLÄRUNG VON
SEKUNDÄRMETABOLITEN AUS ENDOPHYTISCHEN
PILZEN UND VERSUCHE ZUR SYNTHESE DES
PSEUDOANGUILLOSPORINS A
Von der Fakultät für Naturwissenschaften
Department Chemie
der Universität Paderborn
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
genehmigte Dissertation
von
Ines Kock
aus Kassel
Paderborn 2005
Eingereicht am: 26. Januar 2005
Mündliche Prüfung am: 03. März 2005
Referent: Prof. Dr. Karsten Krohn
Korreferent: PD Dr. Hans Egold
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom 1. Juli 2001 bis zum 31. Dezember 2004 im
Fach Organische Chemie der Fakultät für Naturwissenschaften, Department Chemie der
Universität Paderborn unter Anleitung von Herrn Prof. Dr. Karsten Krohn angefertigt.
Herrn Prof. K. Krohn möchte ich für die Möglichkeit danken, diese Arbeit unter seiner
Leitung anzufertigen. Ich habe durch die gemeinsame Arbeit an diesem Projekt mehr gelernt,
als ich im Rahmen dieser Arbeit wiedergeben kann.
Herrn PD Dr. H. Egold danke ich für die Übernahme des Korreferats und für die Messung der
NMR-Spektren.
Frau Dr. Dai Jingqiu möchte ich für die gute Zusammenarbeit im Labor und für viele
anregende Diskussionen danken.
Bei Frau M. Zukowski und Herrn H. Weber möchte ich mich für die Messung der
Massenspektren bedanken.
Frau K. Stolte und Herrn D. Gehle danke ich für die Messung der NMR-Spektren.
Mein weiterer Dank gilt Herrn Dr. U. Flörke für die Messung der Röntgenstrukturen sowie
Herrn Prof. S. Antus und Herrn Dr. T. Kurtán für die Messung der CD-Spektren.
Frau Dr. B. Elsässer danke ich für die Berechnung der CD-Spektren.
Des weiteren möchte ich allen Mitarbeitern des Arbeitskreises für ihre Hilfsbereitschaft und
Freundlichkeit danken.
Hänge Dein Herz an kein vergänglich Ding.
Die Wahrheit richtet sich nicht nach uns, sondern wir müssen uns nach ihr richten.
(Matthias Claudius, 1740-1815)
Inhaltsverzeichnis I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG..............................................................................................................................................1
1.1 WAS SIND PILZE?..................................................................................................................................1
1.2 DIE BESONDERE LEBENSWEISE VON ENDOPHYTEN ...............................................................................3
1.3 SEKUNDÄRMETABOLITE AUS ENDOPHYTEN ALS PFLANZENSCHUTZMITTEL..........................................7
1.4 AUFGABENSTELLUNG .........................................................................................................................11
2 ISOLIERUNG UND STRUKTURAUFKLÄRUNG...............................................................................12
2.1 STAMM 5948.......................................................................................................................................12
2.2 STAMM 6282.......................................................................................................................................17
2.3 STAMM 6651.......................................................................................................................................22
2.4 STAMM 6577.......................................................................................................................................36
2.5 STAMM 7067.......................................................................................................................................45
2.6 STAMM 6754.......................................................................................................................................63
2.7 STAMM 6579.......................................................................................................................................65
2.8 STAMM 6586.......................................................................................................................................70
2.9 STAMM 7165.......................................................................................................................................75
2.10 BIOLOGISCHE AKTIVITÄT DER ROHEXTRAKTE UND REINSUBSTANZEN...............................................83
3 VERSUCHE ZUR SYNTHESE DES PSEUDOANGUILLOSPORINS A ...........................................87
3.1 MOTIVATION.......................................................................................................................................87
3.2 SYNTHESEPLAN...................................................................................................................................87
3.3 DURCHFÜHRUNG.................................................................................................................................89
4 ZUSAMMENFASSUNG...........................................................................................................................92
5 MATERIAL UND METHODEN .............................................................................................................96
5.1 ANALYTISCHE UND PRÄPARATIVE CHROMATOGRAPHIE .....................................................................96
5.2 INSTRUMENTELLE ANALYTIK .............................................................................................................97
5.3 MIKROBIOLOGISCHE ARBEITEN ..........................................................................................................98
6 PHYSIKALISCHE DATEN DER NATURSTOFFE ...........................................................................100
6.1 NATURSTOFFE AUS STAMM 5948......................................................................................................100
6.2 NATURSTOFFE AUS STAMM 6282......................................................................................................104
6.3 NATURSTOFFE AUS STAMM 6651......................................................................................................107
6.4 NATURSTOFFE AUS STAMM 6577......................................................................................................114
6.5 NATURSTOFFE AUS STAMM 7067......................................................................................................117
6.6 NATURSTOFF AUS STAMM 6754........................................................................................................124
6.7 NATURSTOFF AUS STAMM 6579........................................................................................................125
6.8 NATURSTOFFE AUS STAMM 6586......................................................................................................127
6.9 NATURSTOFFE AUS STAMM 7165......................................................................................................129
Inhaltsverzeichnis II
7 SYNTHESEVORSCHRIFTEN UND PHYSIKALISCHE DATEN....................................................134
7.1 DARSTELLUNG VON 3-METHOXY-PENT-2-ENSÄUREMETHYLESTER...................................................134
7.2 DARSTELLUNG VON (1,3-DIMETHOXYPENTA-1,3-DIENYLOXY)-TRIMETHYLSILAN............................134
7.3 DARSTELLUNG VON 3-CHLORPENT-2-ENDISÄUREDIMETHYLESTER ..................................................135
7.4 DARSTELLUNG VON PENTA-2,3-DIENDICARBONSÄUREDIMETHYLESTER...........................................136
7.5 DARSTELLUNG VON 4,6-DIMETHOXY-2-(2-METHOXY-2-OXOETHYL)-3-METHYL-
BENZOESÄUREMETHYLESTER UND 6-HYDROXY-4-METHOXY-2-(2-METHOXY-2-OXOETHYL)-3-
METHYL-BENZOESÄUREMETHYLESTER..............................................................................................136
7.6 DARSTELLUNG VON 2-(CARBOXYMETHYL)-4,6-DIMETHOXY-3-METHYL-BENZOESÄURE..................138
7.7 DARSTELLUNG VON 4,6-DIMETHOXY-2-(2-METHOXY-2-OXOETHYL)-3-METHYL-BENZOESÄURE .....139
7.8 DARSTELLUNG VON 2-(3,5-DIMETHOXY-2,6-DIMETHYLPHENYL)-ESSIGSÄURE-METHYLESTER.........140
7.9 DARSTELLUNG VON 6,8-DIMETHOXY-5-METHYL-4H-ISOCHROMEN-1,3-DION..................................142
7.10 VERSUCHE ZUR DARSTELLUNG VON 3-BUTYL-3,4-DIHYDRO-3-HYDROXY-6,8-DIMETHOXY-5-
METHYLISOCHROMEN-1-ON...............................................................................................................143
7.11 VERSUCH ZUR DARSTELLUNG VON 3-HEPTYL-6,8-DIMETHOXY-5-METHYL-1H-ISOCHROMEN-1-ON 143
8 ABKÜRZUNGEN ....................................................................................................................................145
9 LITERATUR............................................................................................................................................146
Einleitung 1
THEORETISCHER TEIL
1 EINLEITUNG
1.1 Was sind Pilze?
Pilze lassen sich weder dem Reich der Flora noch dem der Fauna eindeutig zuordnen, denn
sie weisen Gemeinsamkeiten mit Vertretern beider Reiche auf. Da sie keine Plastiden
besitzen, welche die Pflanzen zur Photosynthese befähigen, sind sie kohlenstoffheterotroph
und ihre Zellen enthalten einen Zellkern. Damit werden die Pilze zu der Gruppe der
Eukaryoten gezählt, zu der auch Tiere gehören. Aber eine Pilzzelle weist ebenso wie die
pflanzliche Zelle eine feste Zellwand auf, die bei den meisten Pilzen aus Chitin, einem
Polymer des N-Acetylglucosamins mit 1,4-glycosidischer Verknüpfung, besteht. Auf Grund
dieser Schwierigkeiten bei der Zuordnung werden die Pilze in einem eigenen Reich
zusammengefaßt.[1]
Das Reich der Pilze besteht aus vier Abteilungen: Chytridiomycota, Zygomycota,
Ascomycota und Basidiomycota.[2] Jede dieser Abteilungen wird in Klassen unterteilt, die
ihrerseits verschiedene Ordnungen beinhalten. Darauf folgen die weiteren Unterteilungen in
Familie, Tribus, Gattung und Art. Die Pilze erhalten nach ihrer Klassifizierung einen Namen,
der aus der Gattung und der Art zusammengesetzt ist und dem noch ein Kürzel nachgestellt
wird, das den Namen des Mykologen wiedergibt, der den Pilz identifiziert und klassifiziert
hat.
Die Kohlenstoffheterotrophie der Pilze läßt drei verschiedene Ernährungsweisen als
Saprobionten, Parasiten oder Symbionten zu. Saprobionten besiedeln bevorzugt abgestorbene
Pflanzenteile, sowie die Ausscheidungen und Kadaver von Tieren. Sie erfüllen damit eine
wichtige Rolle im Kreislauf der Natur, da sie die organischen Verbindungen wieder in ihre
anorganische Ausgangsform zurückführen und diese somit den Pflanzen erneut zur
Verfügung stellen. Alle Organismen, die tote Biomasse verwerten und abbauen, werden als
Destruenten bezeichnet.[3]
Doch Pilze können auch lebende Pflanzen und Tiere besiedeln und sich von ihnen ernähren,
wobei sie zu Parasiten oder Symbionten werden. Der Unterschied zwischen Parasiten und
Symbionten liegt in der Wirkung, die der Pilze auf den Wirt hat. Erwächst dem Wirt aus der
Besiedlung kein Nutzen, so ist der Pilz ein Parasit, liefert er dem Wirt jedoch wichtige
Metabolite, so ist er ein Symbiont. Für ein Leben als Symbiont sind Pilze in der Lage,
Nährstoffe bereitzustellen und im Rahmen ihres Sekundärmetabolismus z.B.
Einleitung 2
wachstumsfördernde Substanzen für den Wirt zu produzieren. Die Symbiose kann soweit
gehen, daß es zu einer gegenseitigen Abhängigkeit der Partner kommt. Das wohl bekannteste
Beispiel ist die Symbiose von Orchideen und den Mykorrizha, welche die Wurzeln von
Pflanzen besiedeln und ohne die eine Orchidee nicht gedeihen kann. Die Grenzen zwischen
der parasitischen und symbiotischen Lebensweise sind jedoch fließend.
Um sich zu ernähren, können Pilze Exoenzyme produzieren. Diese Enzyme werden
ausgeschieden und zersetzen außerhalb der Zelle das Substrat. Anschließend können die
gewonnenen Nährstoffe in gelöster Form die Zellwand passieren. Zu diesem Zweck bildet der
Pilz in der Phase des vegetativen Wachstums (Trophophase) Substratmycel, das in engem
Kontakt mit dem Substrat steht und dieses meistens vollständig durchzieht. Die Trophophase
ist durch den Primärmetabolismus gekennzeichnet, durch den alle Substanzen gebildet
werden, die zum Aufbau weiterer Biomasse nötig sind. Durch Verarmung des Substrats an
Nährstoffen wird bei dem Pilz der Wechsel in die Idiophase ausgelöst, in der der Pilz
Luftmycel und Sporen ausbildet, also an die Oberfläche des Substrats tritt und sich auf die
Vermehrung vorbereitet. Die Idiophase wird durch den Sekundärmetabolismus
gekennzeichnet, bei dem eine große Vielfalt von Substanzen gebildet wird, die man als
Sekundärmetaboliten bezeichnet und die eine große Anzahl von Funktionen erfüllen
können.[4] Sekundärmetaboliten können dazu dienen, andere Mikroorganismen und somit
Nahrungskonkurrenten abzutöten, sie können für Fraßfeinde giftig sein und im Falle einer
Symbiose wachstumsfördernd für den Wirt.
Abbildung 1: Pilz 7165 auf Biomalz-Festagar mit ausgebildetem Luftmycel
Einleitung 3
1.2 Die besondere Lebensweise von Endophyten
Endophyten sind Pilze oder Bakterien, die ihr gesamtes Leben oder wenigstens einen Teil
ihres Lebenszyklus in einer Pflanze verbringen. Dabei können sie das Gewebe der Pflanze
intra- oder interzellulär besiedeln. Ebenso kann die Besiedlung lokal oder systemisch sein und
je nach Ort der Besiedlung unterschiedliche Effekte bei der Pflanze hervorrufen.[5]
Typischerweise verursachen die Endophyten keine Krankheitssymptome bei der Pflanze; ist
diese jedoch geschwächt, können Infektionen auftreten. Häufiger sind jedoch die für die
Pflanze positiven Effekte, die ein Endophyt bewirken kann. Dazu gehören
Wachstumsförderung, Widerstandsfähigkeit gegen Umwelteinflüsse und der Schutz vor
Phytopathogenen und Fraßfeinden.[6]
Die symbiotische Gemeinschaft zwischen Gräsern und den Epichloë-Arten bewirkt bei den
Gräsern eine wesentliche Verbesserung der Stresstoleranz gegenüber Trockenheit,
Phytopathogenen, Herbivoren und Nematoden. Damit verschafft der endophytische Pilz
seinem Wirt einen Wettbewerbsvorteil gegenüber Pflanzen, die nicht in Symbiose mit einem
Pilz leben. Der Schutz vor Fraßfeinden läßt sich bei diesen endophytischen Pilzen auf die
Wirkung von Sekundärmetaboliten zurückführen[7]. Es handelt sich dabei um Alkaloide, wie
z.B. Ergovalin[8] (1) und Lolitrem B[9] (2, Abbildung 2).
N
HN
H
N
O
N
N
O
O
O
HO
O
N
HOO
O
OOH
O
Ergovalin (1) Lolitrem B (2)
Abbildung 2: Gräser, die Wirte der Epichloë-Arten sind, werden durch Ergovalin und Lolitrem B vor
Fraßfeinden geschützt
Ergovalin wirkt hauptsächlich gegen Wirbeltiere, zeigt aber auch insektizide Wirkung.[10] Bei
Säugetieren verursacht der Verzehr von Gräsern, die Ergovalin enthalten, eine erhöhte
Körpertemperatur und geringere Gewichtszunahme. Es wirkt sich außerdem negativ auf die
Fruchtbarkeit und Milchproduktion aus.[11]
Andere endophytische Pilze produzieren Phytohormone, wie 3-Indolessigsäure[12] (3,
Abbildung 3), die das Wachstum der Pflanzen beschleunigen. Ein beschleunigtes Wachstum
Einleitung 4
kann auch mit der erhöhten Aufnahme von Nährstoffen wie Stickstoff und Phosphor
zusammenhängen, die der endophytische Pilz bewirkt.[13]
H
N
O
OH
3-Indolessigsäure (3)
Abbildung 3: 3-Indolessigsäure ist ein Phytohormon, welches das Wachstum der Pflanzen fördert
Aus dem endophytischen Pilz Cryptosporiopsis cf. quercina konnte Cryptocin[14] (4,
Abbildung 4) isoliert werden, das den Wirt des Pilzes vor dem Befall durch Pyricularia
oryzae und anderen Phytopathogenen schützt. Ein weiterer fungizider Sekundärmetabolit
dieses Pilzes ist das Cryptocandin[15] (5), bei dem es sich um ein zyklisches Peptid handelt.
N
O
O
HO
HO
H
N
O
H2N
O
OH
HO
N
H
O
HN
OH
OH
N
NH
(CH2)14
O
O
OH
OH
NH
OH
O
H
H
O
NOH
O
O
Cryptocin (4) Cryptocandin (5)
Abbildung 4: Substanzen, die den Wirt von Cryptosporiopsis cf. quercina vor dem Befall durch
Phytopathogene schützen
Schließlich sind noch endophytische Pilze, wie die Phyllosticta sp. bekannt, die ihren Wirt
vor dem Befall durch Larven schützen. Aus diesem Pilz konnten Heptelidinsäure (6,
Abbildung 5) und Hydroheptelidinsäure (7) isoliert werden, die für Tannentriebwickler-
Larven (Choristoneura fumiferana) giftig sind.[16]
Einleitung 5
O
O
H
H
O
OH
O
HO OH
O
OH
H
O
Heptelidinsäure (6) Hydroheptelidinsäure (7)
Abbildung 5: Naturstoffe aus Phyllosticta sp., die für Tannentriebwickler-Larven giftig sind
Die Palette der produzierten Sekundärmetabolite umfaßt jedoch nicht nur Substanzen, deren
biologische Wirkung an die Bedürfnisse der Wirtspflanzen angepaßt ist. Im Laufe der Jahre
wurden Sekundärmetabolite mit den unterschiedlichsten Wirkungen isoliert. Dabei wurde in
der Forschung ein besonderes Augenmerk auf in der Humanmedizin einsetzbare Substanzen
gelegt. Dies liegt hauptsächlich an der Entwicklung von Resistenzen bei Mikroorganismen
wie z.B. Staphylococcus aureus. Außerdem gibt es nur wenige Antimykotika, weshalb
systemische Pilzinfektionen schwer zu behandeln sind. In der heutigen Zeit nehmen aber
gerade die Pilzinfektionen beim Menschen in dem Maße zu, wie die Zahl der Patienten, deren
Immunsystem durch AIDS oder die Einnahme von Immunsuppressiva nach
Organtransplantationen geschwächt ist.[17] Aus den genannten Gründen ist die Suche nach
neuen Wirkstoffen unumgänglich.
Unter den isolierten Verbindungen sind cytotoxische Substanzen wie die Leptosine G[18] (8)
und E[19] (9, Abbildung 6) zu finden, die von Leptosphaeria sp. produziert werden, der mit der
Alge Sargassum tortile assoziiert ist. Aber auch Substanzen mit Antimalaria-Aktivität, wie
das aus Aigialus parvus isolierte Aigialomycin D (10), das Aktivität gegen Plasmodium
falciparum zeigt.[20]
Einleitung 6
N
N
O
O
N
H
H
OH
S3
NH
H
N
N
O
O
N
H
H
OH
S3
H
N
N
O
O
H
N
H
OH
S4
H
O
OH
HO
O
OH
OH
OH
Leptosin G (8) Leptosin E (9) Aigialomycin (10)
Abbildung 6: Die cytotoxischen Substanzen Leptosin G und E aus Leptosphaeria sp. und Aigialomycin aus
Aigialus parvus, das gegen Malaria aktiv ist
Eines der interessantesten Krebstherapeutika ist das Taxol (11, Abbildung 7), welches
erstmals aus der pazifischen Eibe isoliert wurde.[21] Es weist einen zur Zeit der Entdeckung
neuartigen Wirkmechanismus auf. Anstatt die Bildung von Microtubuli zu unterdrücken, wie
das bei den Vincaalkaloiden[22] geschieht, stabilisiert das Taxol die Microtubuli und
verhindert deren Abbau. In beiden Fällen wird die Mitose unterbrochen. In den letzten Jahren
wurden immer wieder neue Wirkungen des Taxols entdeckt und der Bedarf steigt ständig an.
Aus den seltenen und langsam wachsenden Eiben kann der Bedarf an Taxol nicht gedeckt
werden. Zur Zeit wird die Hauptmenge an Taxol semisynthetisch aus Baccatin III
hergestellt[23], das aus den Nadeln der europäischen Eibe gewonnen wird.
OH
O
O
O
O
HO O
O
O
OH
NH
O
H
O
O
O
Taxol (11)
Abbildung 7: Das aus der pazifischen Eibe isolierte Taxol ist ein Antitumorwirkstoff, der Microtubuli
stabilisiert und zur Zeit semisynthetisch aus Baccatin III dargestellt wird
Einleitung 7
Parallel zu der Suche nach synthetischen Wegen zum Taxol begann eine Suche nach neuen
Quellen für den begehrten Naturstoff. Dabei boten sich endophytische Pilze als
Ausgangspunkt für die Suche an, denn sie haben vermutlich die Fähigkeit, Gene mit ihren
Wirten auszutauschen. Diese Möglichkeit wurde zuerst an dem phytopathogenen Pilz
Gibberella fujikuroi untersucht, dessen Biosyntheseweg der Gibberellinsäure mit dem der
Pflanzen identisch ist.[24,25] Der Austausch von Genen erfordert jedoch eine sehr starke
Assoziation der Zellen des Wirts mit dem Pilz. Deshalb wurde die pazifische Eibe auf
endophytische Pilze untersucht. Tatsächlich gelang es taxolproduzierende Pilze zu
isolieren.[26] Bislang sind die Mengen an produziertem Taxol jedoch noch zu gering um
kommerziell genutzt zu werden. Trotzdem bleiben die endophytischen Pilze mit ihren
speziellen Lebensgewohnheiten und den daraus resultierenden Eigenschaften nicht nur für die
Suche nach Taxolproduzenten ein vielfältiges Forschungsgebiet.
1.3 Sekundärmetabolite aus Endophyten als Pflanzenschutzmittel
Die Probleme des Pflanzenschutzes existieren bereits seit die Menschen seßhaft wurden und
die ersten Monokulturen anlegten. Wegen der Abhängigkeit der Menschen von einer
erfolgreichen Ernte konnten Pflanzenschädlinge Hungersnöte und Massenvergiftungen
auslösen.[27] Zu den am meisten gefürchteten Phytopathogenen gehörten im Mittelalter die
Pilze Fusarium graminearum und Claviceps purpurea, die verschiedene Getreidearten
befallen. Der Verzehr von kontaminierten Mehl führt zu schweren Vergiftungen, die im Falle
des Claviceps purpurea von den Mutterkornalkaloiden ausgelöst werden.[28] Zu den isolierten
und identifizierten Mutterkornalkaloiden zählt das Ergotamin (12, Abbildung 8), das heute in
der Humanmedizin gegen Migräne eingesetzt wird.[29] Als Hauptmetabolit des Fusarium
graminearum konnte das Trichothecen 13 identifiziert werden.[30]
N
HN
OH
N
N
N
O
O
OH
O
H
H
O
O
CH
2
OH
O
HO
O
Egotamin (12) 3-Acetyldeoxynivalenol (13)
Abbildung 8: Die Sekundärmetabolite von Claviceps purpurea und Fusarium graminearum waren im
Mittelalter für schwere Massenvergiftungen durch kontaminiertes Mehl verantwortlich
Einleitung 8
Um Pflanzen vor Phytopathogenen und Fraßfeinden zu schützen gibt es zwei grundsätzlich
verschiedene Maßnahmen. Die biotechnische Schädlingsbekämpfung verwendet Bakterien
und Pilze, die der Pflanze ihrerseits keinen Schaden zufügen und den Befall durch Schädlinge
reduzieren. Die Verwendung von lebenden Organismen für den Pflanzenschutz hat den
Vorteil, daß das Auftreten von Resistenzen minimiert wird, da die Organismen immer ein
Gemisch von vielen verschiedenen bioaktiven Substanzen produzieren. Der Umgang mit
lebenden Organismen erfordert allerdings Fachkenntnis und das Spektrum der produzierten,
aktiven Verbindungen unterliegt natürlichen Schwankungen.[31] Die zweite Möglichkeit ist
die chemische Bekämpfung von Schädlingen. Sie erfolgt durch die Verwendung von
Pflanzenschutzmitteln. Diese sind gemäß §2, IX des Pflanzenschutzgesetzes[32] „Stoffe, die
dazu bestimmt sind,
a. Pflanzen oder Pflanzenerzeugnisse vor Schadorganismen zu schützen,
b. Pflanzen oder Pflanzenerzeugnisse vor Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen zu
schützen, die nicht Schadorganismen sind,
c. die Lebensvorgänge von Pflanzen zu beeinflussen, ohne ihrer Ernährung zu dienen
(Wachstumsregler),
d. das Keimen von Pflanzenerzeugnissen zu hemmen,
ausgenommen sind Wasser, Düngemittel im Sinne des Düngemittelgesetzes und
Pflanzenstärkungsmittel; als Pflanzenschutzmittel gelten auch Stoffe, die dazu bestimmt sind,
Pflanzen abzutöten oder das Wachstum von Pflanzen zu hemmen oder zu verhindern, ohne
daß diese Stoffe unter Buchstabe a oder c fallen“.
Der Einsatz von chemischen Pflanzenschutzmitteln ist gegenüber den biotechnischen
Verfahren leichter zu handhaben, dafür treten aber verstärkt Resistenzen auf. Dieser
Problematik kann nur durch das Auffinden neuer, aktiver Verbindungen entgegengewirkt
werden.
Die ersten organischen Substanzen, die als Pflanzenschutzmittel eingesetzt wurden, waren das
Herbizid 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (14, Abbildung 9) und das Insektizid DDT (15).[33]
Später stellte sich heraus, daß DDT eine hohe Halbwertszeit hat und sich verstärkt im
Fettgewebe der Tiere anreichert, die in der Nahrungskette oben stehen.[34,35]
Einleitung 9
Cl
Cl
OOH
O
CCl3
Cl Cl
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (14) DDT (15)
Abbildung 9: Die ersten organischen Pflanzenschutzmittel; DDT hat eine hohe Halbwertszeit und reichert
sich im Fettgewebe an
Um ähnliche Probleme mit den neuen Pflanzenschutzmitteln zu vermeiden, wird das
chemische Verhalten der Substanzen (Wirkmechanismus), ihre möglichen Abbauprodukte,
Transportwege in der Umwelt und die Wirkung auf Lebewesen, die mit den Substanzen in
Kontakt kommen werden, untersucht.[36] Die Anforderungen, die dabei an ein chemisches
Pflanzenschutzmittel gestellt werden, sind die gleichen, die auch ein Medikament in der
Humanmedizin erfüllen muß. Es muß selektiv auf den Zielorganismus wirken, existierende
Resistenzen überwinden können und darf sich nicht in der Umwelt anreichern.
Um ein neues Pflanzenschutzmittel zu entwickeln und seine Zulassung zu erreichen sind
heute ca. 8-10 Jahre Forschung nötig. Deshalb ist die einzige Möglichkeit der
Resistenzbildung rechtzeitig entgegenzuwirken, die ständige Suche nach neuen, aktiven
Substanzen. Eine häufig genutzte Strategie zum Auffinden neuer Leitstrukturen ist die Suche
nach ungewöhnlichen und bislang unbeachteten Quellen für Naturstoffe. Unter der
Berücksichtigung der bereits geschilderten Eigenschaften der Endophyten, liegt es nahe, die
Sekundärmetabolite von endophytischen Mikroorganismen auf neue Leitstrukturen zu
untersuchen, was verstärkt seit etwa zwanzig Jahren geschieht.[37] Dabei hat es sich gezeigt,
daß die unveränderten Naturstoffe manchmal nicht stabil genug oder zu giftig sind, um direkt
einsetzbar zu sein. Zwei Beispiele jüngeren Datums sind das Strobilurin A[38], aus dem die
Fungizide Kresoxim-methyl (16, Abbildung 10) und Azoxystrobin[39] (17) hervorgegangen
sind, und das Nicotin, welches für die Insektizide Nitenpyram (18) und Imidacloprid[40] (19)
Pate stand.
Einleitung 10
O
N
O
O
O
CN
O
NN
O
OO
O
Kresoxim-methyl (16) Azoxystrobin (17)
N
Cl
NH
N
NNO
2
N
Cl
NNH
NO
2
Nitenpyram (18) Imidacloprid (19)
Abbildung 10: Pflanzenschutzmittel, die durch chemische Veränderung aus den Naturstoffen Strobilurin
A bzw. Nicotin hervorgegangen sind
Auch die Wasserlöslichkeit, starke Nebenwirkungen und mäßige Wirksamkeit können
Gründe für eine Derivatisierung sein. Andere Naturstoffe hingegen können in unveränderter
Form eingesetzt werden. Zu diesen Substanzen zählt das Avermectin A1a[41] (20), das durch
Fermentation gewonnen wird, da seine komplexe Struktur eine Synthese unwirtschaftlich
macht.
O
O
OH
O
O
H
O O
O
O
O
OH
O
H
O
H
H
H
H
H
Avermectin A1a (20)
Abbildung 11: Avermectin A1a wird durch Fermentation gewonnen
Die Vielfalt der organischen Verbindungen in der Natur sollte in den kommenden Jahrzehnten
keinen Mangel an neuen Leitstrukturen aufkommen lassen.[36] Pilze stellen dabei eine immer
Einleitung 11
noch weitgehend unerforschte Quelle dar, denn von den geschätzten 1 Millionen Pilzen, die
auf unserem Planeten existieren, sind erst ca. 10 % isoliert und beschrieben worden.[42]
1.4 Aufgabenstellung
Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des Projektes „Endophytische Pilze aus Algen und
Pflanzen verschiedener Meeresbiotope“ durchgeführt und hatte die Isolierung und
Strukturaufklärung von Sekundärmetaboliten aus endophytischen Pilzen sowie die
Untersuchungen zur Synthese aktiver Verbindungen zur Aufgabe. Dazu wurden
endophytische Pilze in der Arbeitsgruppe von Prof. Aust und PD Dr. B. Schulz an der TU
Braunschweig isoliert und kultiviert. Die Auswahl der Pilze erfolgte anhand der von der
BASF AG und der Arbeitsgruppe von Prof. Aust und PD Dr. B. Schulz durchgeführten
Aktivitätstest und nach den Ergebnissen des eigenen chemischen Screenings. Die isolierten
Reinsubstanzen wurden anschließend durch Agardiffusionstests (AG Prof. Aust & PD Dr.
Schulz) und in-vitro-Tests (BASF AG) auf ihre fungizide, antibiotische, herbizide und
insektizide Wirkung untersucht.
Isolierung und Strukturaufklärung 12
2 ISOLIERUNG UND STRUKTURAUFKLÄRUNG
2.1 Stamm 5948
Bei dem Stamm 5948 handelt es sich um Coniothyrium sp., der aus Fucus sp. aus der Nordsee
vor Helgoland isoliert wurde. Der Stamm wurde für 14 Tage in einer Biomalz-Flüssigkultur
fermentiert und anschließend mit Ethylacetat extrahiert.
2.1.1 Isolierung der Naturstoffe
Der Rohextrakt wurde durch Mitteldruckchromatographie an Kieselgel mit einem
Dichlormethan/Methanol-Gradienten in 6 Fraktionen aufgetrennt. Aus Fraktion 4 konnten
durch eine weitere Säulenchromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol als
Laufmittel die Naturstoffe 59484e (21) und 59484e2 (22) gewonnen werden. Fraktion 5
wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol gereinigt und
lieferte Naturstoff 59485a (23).
2.1.2 Naturstoff 59484e
Der Naturstoff 59484e wurde als farbloses Öl erhalten, das in Methanol löslich ist. Auf dem
DC (Rf-Wert 0.40, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) ist die Substanz durch eine rotbraune
Färbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure zu detektieren. Aus den 1H- und 13C-NMR-Spektren
ist zu entnehmen, daß der Naturstoff aus einer Methylgruppe, einer CH2-Gruppe und fünf CH-
Gruppen besteht. Das ESI-Massenspektrum zeigt eine Molmasse von 144 g/mol an, was
zusammen mit den NMR-Spektren auf eine Summenformel von C7H12O3 schließen läßt. Die
chemischen Verschiebungen von vier der fünf CH-Gruppen im Bereich von 54.7 bis
68.6 ppm zeigen eine Sauerstoffsubstitution an. Zwei der CH-Gruppen bilden ein Epoxid,
dessen Protonen im Vergleich zu denen an einer freien Hydroxygruppe einer höheren
Abschirmung ausgesetzt sind und somit eine niedrigere chemische Verschiebung von 54.7
und 58.0 ppm haben. Aus dem H,H-COSY lassen sich die in Abbildung 12 gezeigten
Kopplungen entnehmen, was zu der Struktur eines 3-Methyl-7-oxa-bicyclo[4.1.0]heptan-2,5-
diol führt.
Isolierung und Strukturaufklärung 13
Abbildung 12: Kopplungen aus dem H,H-COSY des Naturstoff 59484e
Zur Bestimmung der relativen Konfiguration des Naturstoffs mußten die
Kopplungskonstanten der einzelnen Protonen bestimmt werden. Da das 1H-NMR-Spektrum
des ursprünglichen Naturstoffs wegen der Überlagerung der Signale und der hohen
Linienbreite zu diesem Zweck ungeeignet war, wurden die beiden freien Hydroxygruppen
acetyliert, was das Lösungsverhalten verbessert und die Stabilität der Substanz erhöht. Durch
die Änderung der chemischen Verschiebung und die geringere Signalbreite konnten die
Kopplungskonstanten der Protonen an den Kohlenstoffatomen 1, 4 und 6 des acetylierten
Naturstoffs bestimmt werden. Es zeigt sich, daß eines der beiden Protonen der CH2-Gruppe zu
beiden benachbarten Protonen eine äquatorial-axial-Kopplung von 3.7 Hz aufweist, somit
müssen die Methylgruppe am Kohlenstoffatom 3 und die Hydroxygruppe am
Kohlenstoffatom 5 auf der gleichen Seite des Moleküls liegen (Abbildung 13, a).
Abbildung 13: Relative Stereochemie des acetylierten Naturstoffs aus den 1H-NMR-Kopplungen
Bei dem Signal des Protons am Kohlenstoffatom 6 handelt es sich um ein Triplett. Die
Kopplung von 3.7 Hz zeigt auch hier eine äquatorial-axial-Position der Protonen an
(Abbildung 13, b). Das Signal des Protons am Kohlenstoffatom 1 weist eine Kopplung von
3.7 Hz und eine von 1.9 Hz auf, woraus auch hier wieder auf eine äquatorial-axial-Stellung
der beiden benachbarten Protonen zu schließen ist (Abbildung 13, c). Somit ergibt sich für
den Naturstoff 59484e die Struktur 21 (Abbildung 14). Eine Recherche in den Chemical
Abstracts zeigte, daß der Naturstoff 59484e bisher in der Literatur nicht beschrieben ist. Ihm
wurde der Name Coniol gegeben. Da die Substanz eine so große Ähnlichkeit mit dem
Isolierung und Strukturaufklärung 14
ebenfalls isolierten, literaturbekannten (+)-Epoxydon hat, daß sie vermutlich auf dem gleichen
Biosyntheseweg produziert wird, sollte die absolute Konfiguration des Coniols der des
Epoxydons (Naturstoff 59485a, 23, Abbildung 17) entsprechen. In diesem Fall würde die
Abbildung 14 nicht nur die relative, sondern auch die absolute Konfiguration wiedergeben.
OH
OH
O
Coniol (21)
Abbildung 14: Ein literaturunbekannter Naturstoff aus Coniothyrium sp.
2.1.3 Naturstoff 59484e2
Der Naturstoff 59484e2 wurde als farbloses Öl erhalten, das sich gut in polaren
Lösungsmitteln wie Methanol löst. Auf dem DC ist die Substanz, die einen Rf-Wert von 0.46
(Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) hat, durch UV-Löschung bei 254 nm detektierbar. Das 13C-
NMR-Spektrum weist zehn Signale zwischen 113.3 und 157.1 ppm auf, von denen vier zu
quartären Kohlenstoffatomen gehören. Weiterhin zeigt das Spektrum noch zwei
sauerstoffsubstituierte und eine aliphatische CH2-Gruppe an. Aus den Kopplungen der
Signale des 1H-NMR-Spektrums ergibt sich, daß die aliphatische CH2-Gruppe bei 2.61 ppm
mit der sauerstoffsubstituierten CH2-Gruppe bei 3.58 ppm verbunden ist. Außerdem stellen
die Signale der CH2CH2-Einheit echte Tripletts und das der einzelnen CH2-Gruppe bei 4.42
ppm ein Singulettsignal dar. Damit kann keine der CH2-Gruppen Bestandteil eines
Ringsystems sein, da die Protonen jeder einzelnen CH2-Einheit chemisch äquivalent sind.
Anhand der chemischen Verschiebungen von 157.1 und 155.4 ppm erweisen sich zwei der
quartären Kohlenstoffatome ebenfalls als sauerstoffsubstituiert. Somit ergeben sich als
Substituenten für ein aromatisches System eine CH2CH2O-Einheit, eine CH2O-Einheit und
zwei Sauerstoffatome.
Es gibt zwei mögliche aromatische Ringsysteme, die zehn Kohlenstoffsignale aufweisen. Das
erste ist ein Naphthalin-Grundgerüst, das zweite mögliche Ringsystem besteht aus zwei
einzelnen Benzol-Ringen, von denen einer C2-symmetrisch ist. Da es unmöglich ist, die vier
Substituenten auf ein Naphthalin-Grundgerüst zu verteilen, weil nur vier quartäre
Kohlenstoffatome vorhanden sind, muß das zweite mögliche Ringsystem vorliegen. Das CI-
Massenspektrum bestätigt dies mit einem Molekülpeak bei 245 [M+H+], was einer
Isolierung und Strukturaufklärung 15
Summenformel von C15H16O3 entspricht. Aus dem HMBC-Spektrum lassen sich die in
Abbildung 15 dargestellten Fragmente A und B erkennen.
OO
O
O
AB
Abbildung 15: Fragmente aus dem HMBC-Spektrum von Naturstoff 59484e2
Unter Berücksichtigung der relativen Intensität der aromatischen Protonensignale läßt sich
Fragment A in Abbildung 15 zu einem para-substituierten Benzolring vervollständigen. Die
chemische Verschiebung der beiden Kohlenstoffe der sauerstoffsubstituierten CH2-Gruppen
von 63.7 und 63.2 ppm deutet auf eine Substitution mit freien Hydroxygruppen hin. Ebenso
spricht die sehr hohe Stabilität der Substanz gegen das Vorhandensein von freien
phenolischen Hydroxygruppen, so daß auf eine Verknüpfung der beiden Benzolringe über ein
Sauerstoffatom geschlossen werden kann. Damit ergibt sich die achirale Struktur 22
(Abbildung 16), deren chemische Bezeichnung 2-(4-(3-(Hydroxymethyl)phenoxy)phenyl)-
ethanol lautet. Diese Struktur wird noch zusätzlich durch das Massenspektrum bestätigt, in
dem ein Peak bei 121 zu erkennen ist. Dieser entspricht dem Fragment, das durch Spaltung
der Etherbrücke entsteht und eine Ar-CH2CH2OH-Einheit repräsentiert. Eine Recherche in
den Chemical Abstracts ergab, daß es sich bei Naturstoff 59484e2 um eine bisher
literaturunbekannte Substanz handelt, der der Name Coniothyren gegeben wird.
O
HO
OH
Coniothyren (22)
Abbildung 16: Ein literaturunbekannter Naturstoff aus Coniothyrium sp.
2.1.4 Naturstoff 59485a
Der Naturstoff 59485a wurde als farbloses Öl erhalten, das nach einiger Zeit eine
Braunfärbung aufweist. Die Substanz hat einen spezifischen Drehwinkel von +109.1° auf, ist
gut in Methanol löslich und auf dem DC (Rf-Wert 0.41, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) durch
Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar. Im Agardiffusionstest zeigte der
Naturstoff Aktivität gegen Bacillus megaterium und Chlorella fusca. Aus den NMR-Spektren
Isolierung und Strukturaufklärung 16
sind vier CH-Gruppen und eine CH2-Gruppe sowie zwei quartäre Kohlenstoffatome
erkennbar. Die chemischen Verschiebungen der CH2-Gruppe von 4.21 ppm und der drei CH-
Gruppen bei 3.44, 3.83 und 4.76 ppm deuten auf eine Sauerstoffsubstitution hin. Das quartäre
Kohlenstoffatom bei 194.3 ppm gehört zu einer Carbonylgruppe und die beiden
verbleibenden Kohlenstoffatome bilden eine Doppelbindung, deren chemische
Verschiebungen von 134.7 und 141.1 ppm einen die Doppelbindung polarisierenden
Substituenten anzeigen. Somit ergibt sich ein α,β-ungesättigtes Keton. Wie bei Naturstoff
59484e deuten auch in diesem Fall die chemischen Verschiebungen zweier CH-Gruppen von
53.5 und 54.3 ppm auf ein Epoxid hin. Die Kopplungen aus dem H,H-COSY-Spektrum
zeigen eine Verknüpfung eines Protons der Epoxid-Einheit mit der dritten
sauerstoffsubstituierten CH-Gruppe an, die wiederum mit der CH-Gruppe der Doppelbindung
verknüpft ist. Daraus ergibt sich die Struktur 23 (Abbildung 17), die nach einer Recherche in
den Chemical Abstracts als das bereits 1966 von A. Closse[43] beschriebene (+)-Epoxydon
identifiziert werden konnte. Ein Vergleich der 1H-NMR-Daten mit den Literaturwerten ergab
eine vollständige Übereinstimmung. In einer Veröffentlichung von 1999 wurde Epoxydon als
wirksam gegen eine als Kohlhernie bekannte Pflanzenkrankheit beschrieben.[44] Diese
Krankheit wird durch den Pilz Plasmodiophora brassicae ausgelöst und befällt die Wurzeln
kreuzblütiger Kulturpflanzen wie Kohl oder Raps. Dabei tritt ein ungesteuertes Wachstum der
Zellen in den Wurzeln auf, wodurch die Funktion der Wurzeln gestört wird und die Pflanze
abstirbt.
OOH
O
OH
(+)-Epoxydon (23)
Abbildung 17: Ein literaturbekanntes Epoxid, das erstmals von 1966 von Closse et al. isoliert wurde
Der Versuch, den Naturstoff zu acetylieren, führte statt zu dem gewünschten
Acetylierungsprodukt zu dem aromatischen, vierfach acetylierten Produkt 23a (Abbildung
18). Die Labilität von Epoxydon gegenüber Basen ist bekannt[45], so daß das entstandene
Acetylierungsprodukt als zusätzlicher Hinweis auf die Struktur gelten kann.
Isolierung und Strukturaufklärung 17
OAc
OAc OAc
AcO
23a
Abbildung 18: Die Labilität von Epoxydon gegenüber Basen führt zu der Bildung des aromatischen
Acetylierungsprodukts
2.2 Stamm 6282
Bei dem Stamm 6282 handelt es sich um Phoma sp., der aus Fucus serratus vor Helgoland
isoliert wurde. Der Stamm wurde 28 Tage auf Biomalz-Festagar fermentiert, lyophylisiert und
anschließend mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt zeigte antibiotische Aktivität gegen
Bacillus megaterium, Microbotryum violaceum und Chlorella fusca.
2.2.1 Isolierung der Naturstoffe
Der gewonnene Rohextrakt wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit
Dichlormethan/Methanol in 6 Fraktionen aufgetrennt. Aus Fraktion 2 konnte durch
Säulenchromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan und einer weiteren Reinigung an
Sephadex LH 20 der Naturstoff 62822b4a (24) gewonnen werden. Fraktion 3 lieferte nach
Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 den Naturstoff 62823b (25). Fraktion 4 enthielt
neben Epidioxy-5
α
,8
α
-ergosta-6,22E-dien-3
β
-ol die Naturstoffe 62824a1b (26) und 62824a2
(27), die durch Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 und Kieselgel mit
Dichlormethan/Methanol isoliert wurden.
2.2.2 Naturstoff 62822b4a
Der Naturstoff 62822b4a kristallisiert in orangen Nadeln (Smp.: 250–254 °C) aus
Dichlormethan/Methanol und ist gut löslich in Aceton. Auf dem DC (Rf-Wert 0.65,
Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) ist die Substanz bei Tageslicht durch ihre orange Farbe
erkennbar. Ein Behandeln des Dünnschichtchromatogramms mit Natronlauge führt zu einer
Rotfärbung der Substanz, was für ein Hydroxyanthrachinon spricht. Im 1H-NMR-Spektrum
zeigen sich vier Signale im Aromaten-Bereich mit der relativen Intensität 1 und ein Signal bei
2.50 ppm mit der relativen Intensität 3, sowie eine freie und zwei chelierte Hydroxygruppen.
Isolierung und Strukturaufklärung 18
Das 13C-NMR weist zwölf Signale im Aromatenbereich, ein Methylgruppensignal und zwei
Ketonsignale bei 181.7 und 191.3 ppm auf. Daraus ergibt sich als Grundgerüst ein vierfach
substituiertes Anthrachinon, bei dem sich zwei der Hydroxygruppen in Nachbarschaft zu
einer Carbonylgruppe befinden müssen. Die Kopplung zweier Signale von 2.4 Hz und die
fehlenden Kopplungen der restlichen zwei Signale im 1H-NMR-Spektrum läßt auf eine
Substitution in Metaposition an beiden aromatischen Ringen schließen. Unter
Berücksichtigung der sehr unterschiedlichen chemischen Verschiebungen der beiden
Ketogruppen ergibt sich für die Stellung der zwei chelierten Hydroxygruppen die 1,8-
Position. Damit handelt es sich bei Naturstoff 62822b4a um Emodin (24, Abbildung 19), das
unter anderem auch von T. R. Kelly[46] isoliert wurde. Ein Vergleich der Literaturdaten der
1H- und 13C-NMR-Spektren ergab eine vollständige Übereinstimmung.
O
O
OHOH
HO
Emodin (24)
Abbildung 19: Ein literaturbekannter Naturstoff mit Aktivität gegen Moskitolarven
In einer Veröffentlichung von Y.-C. Yang, M.-Y. Lim und H.-S. Lee aus dem Jahr 2003
wurde die Aktivität von Cassia obtusifolia gegen Moskitolarven untersucht.[47] Die Autoren
schrieben die Aktivität dem enthaltenen Emodin zu und bestimmten die LC50-Werte von
durchschnittlich 2 mg/L für die Larven dreier verschiedener Moskitoarten. Außerdem wird in
einer zweiten Veröffentlichung von 2003 die Wirkung von Emodin als Antioxidans[48]
beschrieben.
2.2.3 Naturstoff 62823b
Der Naturstoff 62823b bildet farblose Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 228–231 °C und
ist gut löslich in Methanol. Auf dem DC (Rf-Wert 0.67, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) ist die
Substanz durch UV-Löschung bei 254 nm detektierbar. Im 1H-NMR-Spektrum sind zwei
aromatische Protonen erkennbar, deren Kopplung von 9.1 Hz miteinander auf eine ortho-
Stellung hinweist. Des weiteren ist ein Methylsignal erkennbar, das zu einem Dublett
aufspaltet, was für eine Verknüpfung mit einer CH-Gruppe spricht. Die chemische
Verschiebung von 4.73 ppm des ebenfalls erkennbaren CH-Signals spricht für eine
Isolierung und Strukturaufklärung 19
Sauerstoffsubstitution. Schließlich sind noch zwei getrennte Signale einer CH2-Gruppe bei
2.65 und 3.22 ppm zu erkennen, die jeweils außer der geminalen Kopplung noch eine weitere
Dublettaufspaltung zeigen, was auf eine Verknüpfung mit der CH-Gruppe schließen läßt.
Außerdem bedeutet die Aufspaltung der CH2-Gruppe in zwei Signale, daß das beschriebene
Fragment Teil eines Ringsystems sein muß. Das 13C-NMR-Spektrum zeigt noch fünf quartäre
Kohlenstoffatome an, von denen eines zu der Carbonylgruppe eines Esters gehört und zwei
weitere zu sauerstoffsubstituierten aromatischen Kohlenstoffatomen. Die chemische
Verschiebung der tertiären Kohlenstoffatome deutet darauf hin, daß sich in ortho-Stellung zu
beiden CH-Gruppen die sauerstoffsubstituierten Kohlenstoffatome befinden. Daraus ergibt
sich für den Naturstoff 62823b die Struktur 25 (Abbildung 20), die erstmals von M. A.
DeAlvarenga[49] aus dem Holz von pilzinfizierter Virola caducifolia isoliert wurde. Ein
Vergleich mit den Literaturdaten[50] des 1H-NMR-Spektrums zeigte eine völlige
Übereinstimmung.
O
OOH
OH
(3R)-5-Hydroxymellein (25)
Abbildung 20: Dieser Naturstoff wurde erstmals aus dem Holz von pilzinfizierter Virola caducifolia
isoliert
2.2.4 Naturstoff 62824a1b
Der Naturstoff 628241b wurde in Form eines weißen Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von
105–107 °C erhalten, der sich gut in Dichlormethan löst, auf dem DC durch Anfärbung mit
Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar ist und einen Rf-Wert von 0.56 (Laufmittel
CH2Cl2/MeOH 9:1) hat. Die NMR-Spektren zeigen, daß die Substanz aus sechs CH-Gruppen
und einer CH3-Gruppe besteht. Die chemischen Verschiebungen von vier Kohlenstoffatomen
zwischen 123.3 und 153.8 ppm gehören zu zwei Doppelbindungen, von denen eine durch
Sauerstoffsubstitution polarisiert sein muß. Die chemischen Verschiebungen von 73.9 und
86.3 ppm sprechen für eine Sauerstoffsubstitution der beiden verbleibenden CH-Gruppen.
Anhand des H,H-COSY-Spektrums läßt sich das in Abbildung 21 dargestellte Fragment
erkennen.
Isolierung und Strukturaufklärung 20
O O
O
Abbildung 21: Fragment aus dem H,H-COSY-Spektrum von Naturstoff 62824a1b
Sowohl die vergleichsweise geringe Polarität als auch die chemische Verschiebung der
sauerstoffsubstituierten Kohlenstoffatome, die für eine offenkettige Verbindung zu hoch ist,
sprechen für ein Dihydrofuran. Außerdem bestätigt das CI-Massenspektrum eine
Molekülmasse von 126. Damit ergibt sich für den Naturstoff 62824a1b die Struktur 26
(Abbildung 22), die sich nach einer Recherche in den Chemical Abstracts als
literaturunbekannt erwies und den Namen Phomafuranol bekam.
O
OH
Phomafuranol (26)
Abbildung 22: Ein unbekanntes Dihydrofuran aus Phoma sp.
Die Kopplungskonstante der beiden aliphatischen Protonen beträgt 6.6 Hz. Ein Vergleich mit
den Kopplungskonstanten einiger synthetischer Produkte[51,52] (Abbildung 23) legt die
Vermutung nahe, daß die relative Konfiguration einer trans-Stellung der Protonen entspricht.
Auf Grund des geringen Unterschieds der trans- und cis-Kopplungen in einem
Dihydrofuransystem ist es jedoch nicht möglich dies mit Sicherheit zu sagen. Die Aufnahme
eines NOE-Spektrums war auf Grund der geringen Substanzmenge von 1.7 mg nicht möglich.
Abbildung 23: Kopplungskonstanten in Dihydrofuranen im Vergleich mit Phomafuranol
2.2.5 Naturstoff 62824a2
Die Substanz wurde als farbloses Öl erhalten, das sich gut in Dichlormethan löst. Die
Substanz ist auf dem DC (Rf-Wert 0.58, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) durch Anfärbung mit
Isolierung und Strukturaufklärung 21
Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar und zeigte im Hemmhoftest Aktivität gegen
Microbotryum violaceum, Bacillus megaterium und Chlorella fusca. Die NMR-Spektren
weisen große Ähnlichkeit mit denen des Naturstoff 62824a1b auf. Die Substanz besteht genau
wie der Naturstoff 62824a1b aus einer Methylgruppe und sechs CH-Gruppen, jedoch zeigt
sich im 13C-NMR-Spektrum ein weiteres Signal, das auf Grund seiner chemischen
Verschiebung von 164.4 ppm zu einer Estergruppe gehört. Die Kopplungen aus dem H,H-
COSY-Spektrum der Verbindung führen zu der gleichen Verknüpfung der Kohlenstoffatome,
wie sie bereits in Abbildung 21 dargestellt wurde. Die chemischen Verschiebungen der Z-
Doppelbindung von 122.6 und 145.8 ppm sprechen für eine weniger ausgeprägte
Polarisierung der Doppelbindung, so daß eine Verknüpfung mit der Estergruppe nahe liegt.
Daraus ergibt sich das in Abbildung 24 dargestellte Fragment.
O
OO
O
Abbildung 24: Fragment des Naturstoff 62824a2 aus den NMR-Spektren abgeleitet
Auch in diesem Fall spricht die Polarität der Substanz und die chemische Verschiebung der
sauerstoffsubstituierten CH-Gruppen für das vorliegen einer cyclischen Verbindung. Die
möglichen Strukturen sind in Abbildung 25 dargestellt.
OO
OH
O
O
HO
Abbildung 25: Mögliche Strukturen von Naturstoff 62824a2
Eine Recherche in den Chemical Abstracts führt zu einer Veröffentlichung von T.
Fukushima[53], der beide Strukturen aus Nigrospora sacchari isolierte. Ein Vergleich der
Literaturdaten beider Verbindungen ergab, daß es sich um (5S,6S)-5-Hydroxy-6-[(E)-1-
propenyl]-5,6-dihydro-2H-pyran-2-on handelte (27, Abbildung 26), das erstmals 1969 von R.
H. Evans[54] isoliert wurde und den Namen (+)-Phomalacton bekam.
Isolierung und Strukturaufklärung 22
OO
OH
Phomalacton (27)
Abbildung 26: Ein literaturbekannter Naturstoff mit nematozider Wirkung gegen Meloidogyne incognita
Die biologische Aktivität von Phomalacton wurde ausgiebig untersucht und es wurde über
eine nematozide Wirkung gegen Meloidogyne incognita berichtet, wobei im Vergleich mit
Aldicarb[55,56] eine geringere nematozide Wirkung gefunden wurde und eine vergleichbare
Wirkung für die Unterdrückung des Wurzelbefalls.[57] Ebenso wurden herbizide,[53] fungizide
und bakteriozide[58] Wirkungen gefunden.
2.3 Stamm 6651
Bei dem Pilz 6651 handelt es sich um Ascochyta sp., der aus Meliotus dentatus in der Nähe
von Ahrenshoop an der Ostsee isoliert wurde. Der Stamm war im Agardiffusionstest aktiv
gegen Microbotryum violaceum, Chlorella fusca, Septoria tritici und Phytophtora infestans,
wurde für 28 Tage auf Biomalz-Festagar angezüchtet und anschließend mit Ethylacetat
extrahiert.
2.3.1 Isolierung der Naturstoffe
Der gewonnene Rohextrakt wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel in 7 Fraktionen
aufgetrennt. Aus Fraktion 1 konnte durch Kristallisation aus Dichlormethan der Naturstoff
66511b (28) gewonnen werden. Die Fraktionen 2 und 3 wurden nachträglich wieder vereint
und enthielten zwei zweifach ungesättigte Fettsäuren sowie die Naturstoffe 66512a (29) und
66512b (30), die durch Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 und präparative
Schichtchromatographie isoliert werden konnten. Aus Fraktion 4 konnte durch
Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 der Naturstoff 66514a (31) gewonnen werden.
Fraktion 5 lieferte den Naturstoff 66515a (32) nach Kristallisation aus Diethylether.
2.3.2 Naturstoff 66511b
Der Naturstoff 66511b kristallisiert aus Dichlormethan in Form von farblosen Plättchen und
hat einen Schmelzpunkt von 186–187 °C. Er ist sehr gut in Dichlormethan löslich und auf
Isolierung und Strukturaufklärung 23
dem DC (Rf-Wert 0.69, Laufmittel CH2Cl2) unter UV-Licht (254 nm) durch
Fluoreszenzlöschung des Indikators detektierbar. Mit Anisaldehyd/Schwefelsäure färbt der
Naturstoff zunächst gelb, bei weiterem Erhitzen violett an. Im Agardiffusionstest erwies sich
die Substanz als aktiv gegen Chlorella fusca und Microbotryum violaceum. In vitro zeigte
sich Aktivität gegen Pyricularia oryzae. Das 1H-NMR-Spektrum zeigt ein Aldehyd-Proton
bei 10.15 ppm sowie zwei chelierte Hydroxygruppen bei 11.65 und 12.55 ppm.
Unter Einbeziehung der 13C- und DEPT-NMR-Spektren zeigt sich, daß die Substanz aus einer
Methylgruppe, einer CH-Gruppe, einer CH2-Gruppe, einer sp2-hybridisierten CH-Gruppe,
sechs quartären, sp2-hybridisierten Kohlenstoffatomen sowie zwei Carbonylgruppen besteht,
von denen eine zu einer Aldehydgruppe gehört und die andere zu einem Ester. Das
hochauflösende Massenspektrum ergab die Summenformel C12H10O5. Anhand der
chemischen Verschiebung des Kohlenstoffatoms der CH2-Gruppe von 98.3 ppm und der
geminalen Kopplungskonstante der beiden Protonen von 2.3 Hz läßt sich eine endständige
Doppelbindung erkennen, die mit einem Sauerstoffatom substituiert ist. Somit läßt sich aus
den vorhandenen acht sp2-hybridisierten Kohlenstoffatomen ein Benzolring und eine
Doppelbindung formulieren. Die chemische Verschiebung der sp2-hybridisierten CH-Gruppe
von 103.9 ppm spricht für eine Sauerstoffsubstitution in ortho-Position auf beiden Seiten. Aus
dem Kopplungsmuster des Methylgruppensignals (Dublett, 7.2 Hz) läßt sich schließen, daß
die Methylgruppe mit der sp3-hybridisierten CH-Gruppe verknüpft ist. Damit ergeben sich die
in Abbildung 27 dargestellten Fragmente A–E.
HO
OH
O
O
O
O
AB
CDE
Abbildung 27: Aus den 1H- und 13C-NMR-Spektren erkennbare Fragmente des Naturstoffs 66511b
Aus den Kopplungen im HMBC- und H,H-COSY-Spektrum ergibt sich die in Abbildung 28
dargestellte Verknüpfung der einzelnen Fragmente.
Isolierung und Strukturaufklärung 24
O
O
HO
OH O
Abbildung 28: Kopplungen aus dem HMBC von Naturstoff 66511b
Zur Bestätigung wurde die Röntgenstruktur (Abbildung 29) von Naturstoff 66511b gemessen.
Diese zeigte eindeutig, daß die Substanz mit ihrem spezifischen Drehwert von 308.2°
enantiomerenrein vorliegt.
Abbildung 29: Röntgenstruktur von Naturstoff 66511b
2.3.2.1 Bestimmung der absoluten Konfiguration
Zur Bestimmung der absoluten Konfiguration kann der Circulardichroismus herangezogen
werden. Dieser ist definiert als die Differenz ∆ε der Absorptionskoeffizienten von rechts und
links circular-polarisierten Lichtwellen.
∆ε = εR – εL
In chiralen Medien bewegen sich rechts und links circular-polarisierte Lichtwellen nicht nur
unterschiedlich schnell, sie werden auch unterschiedlich stark geschwächt. Der aus der
Isolierung und Strukturaufklärung 25
Überlagerung der Vektoren ER und EL resultierende Vektor E durchläuft nach Durchqueren
des chiralen Mediums eine Ellipse.[59] Wird die Ellipse im Uhrzeigersinn durchlaufen, spricht
man von einem positiven im anderen Fall von einem negativen Circulardichroismus.[60]
Die CD-Spektren sind für einen gegebenen Chromophor charakteristisch. Im Fall von
Enantiomeren sind diese an der X-Achse gespiegelt, daher läßt sich von dem CD-Spektrum
auf die absolute Konfiguration schließen, insofern Vorhersagen über das CD-Spektrum eines
der beiden Enantiomere eines Chromophors gemacht werden können.
Zu diesem Zweck wird das CD-Spektrum eines Enantiomers berechnet und mit dem
experimentellen CD-Spektrum verglichen.
Da die räumliche Struktur des Moleküls Auswirkungen auf das CD-Spektrum hat, wird
zunächst eine Konformationsanalyse mit Hilfe des Programms Spartan SGI Version 5.3
durchgeführt. Für jedes der energetisch günstigsten Konformere (bis 12 kJ Unterschied) wird
dann mit Hilfe des Programmpakets BDZDO/MCDSPD, welches von Downing entwickelt
und von Fleischhauer modifiziert wurde[61], ein CD-Spektrum berechnet. Anschließend wird
mit Hilfe der Bolzmann-Statistik eine Gewichtung der einzelnen CD-Spektren durchgeführt
und diese mit ihrer jeweiligen Gewichtung zu dem endgültigen Spektrum addiert.
Ein Vergleich von berechnetem und gemessenem Spektrum kann zu drei möglichen
Ergebnissen führen:
1. das berechnete Spektrum ist mit dem gemessenen Spektrum identisch
2. das berechnete Spektrum ist ein genaues Spiegelbild des gemessenen Spektrums
3. das berechnete Spektrum zeigt keine ausreichende Ähnlichkeit mit dem gemessenen
Spektrum.
Im ersten Fall ist die Konfiguration beider Moleküle identisch. Im zweiten Fall ist die
Konfiguration der Substanz spiegelbildlich zu der für die Berechnung angenommenen. In
beiden Fällen kann so eine Aussage über die absolute Konfiguration eines Moleküls gemacht
werden.
Im dritten Fall führen die für die Berechnung angewendeten Näherungen zu deutlichen
Abweichungen zwischen dem gemessenen und dem berechneten Spektrum, so daß keine
Aussage über die absolute Konfiguration des Moleküls getroffen werden kann.
Die vorliegenden berechneten CD-Spektren wurden im Arbeitskreis von Professor Krohn von
Brigitta Elsässer durchgeführt, die experimentellen Spektren wurden im Arbeitskreis von
Professor Antus von Dr. Tibor Kurtán aufgenommen.
Wie in Abbildung 30 dargestellt, weisen der Kurvenverlauf des berechneten und des
gemessenen CD-Spektrums gewisse Ähnlichkeiten auf. Beide zeigen einen ausgeprägten
Isolierung und Strukturaufklärung 26
positiven Cotton-Effekt, weisen aber eine Differenz von 60 nm auf. Deshalb kann keine
eindeutige Aussage über die absolute Konfiguration des Moleküls gemacht werden. Die
mögliche Ursache für die Abweichungen ist in der Komplexizität des Chromophors zu
suchen, da sowohl die endständige Doppelbindung als auch der Aldehyd-Substituent am
Benzolring den Cotton-Effekt beeinflussen. Es wurde vermutet, daß das Programm diese
Einflüsse bei der Berechnung nicht berücksichtigen kann.[62]
-10
-5
0
5
10
15
20
25
150 200 250 300 350 400
λ/nm
∆ε/L cm
-1
mol
-1
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
150 200 250 300 350 400
λ/nm
∆ε/L cm
-1
mol
-1
Abbildung 30: Berechnetes (oben) und gemessenes (unten) CD-Spektrum von Naturstoff 66511b
Um die absolute Konfiguration dennoch zu bestimmen, war es erforderlich, den Chromophor
den ausführlich untersuchten Dihydroisocoumarinen anzugleichen[63,64]. Dazu wurde eine
kleine Menge des Naturstoffs hydriert. Da die Methylgruppe in der Nachbarstellung zu der
endständigen Doppelbindung eine sterische Hinderung für den Angriff von dieser Seite
darstellt, sollte wie in Abbildung 31 gezeigt bei der Hydrierung mit Palladium/Kohlenstoff je
Isolierung und Strukturaufklärung 27
nach Konfiguration des Eduktes überwiegend das 3R,4R- oder 3S,4S-Produkt gebildet
werden.
O
(R)
(R)
OOH
HO
HO
O
(S)
(S)
OOH
HO
HO
O
OOH
HO
O
O
OOH
HO
O
Pd/C, H
2
Pd/C, H
2
Abbildung 31: Bildung des bevorzugten Diastereomers bei der Hydrierung mit Pd/C
Nach der Aufarbeitung und Reinigung des Hydrierungsproduktes durch präparative
Schichtchromatographie konnte anhand der Kopplungskonstanten aus dem 1H-NMR gezeigt
werden, daß tatsächlich nur eines von zwei möglichen Diastereomeren gebildet wird. Das
Hydrierungsprodukt hat also die erwartete 3R,4R- oder 3S,4S-Konfiguration.
Von dem Hydrierungsprodukt wurde nun ebenfalls ein CD-Spektrum gemessen. Es zeigt sich
ein ausgeprägter, negativer Cotton-Effekt bei 218 nm (–6.8).
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
190 210 230 250 270 290 310 330 350 370 390
λ/nm
∆ε/L cm
-1
mol
-1
Abbildung 32: Gemessenes CD-Spektrum des 6,8-Dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-3,4-dimethyl-3,4-
dihydro-1H-isochromen-1-on
Das Vorzeichen des Cotton-Effekts für den n-π*-Übergang bei 218 nm (–6.8) kann zur
Bestimmung der absoluten Konfiguration herangezogen werden. Die Helizitätsregel besagt,
Isolierung und Strukturaufklärung 28
daß bei einem Dihydroisocoumarin, welches in einer Halbsesselkonformation mit einem
pseudoaxialen Substituenten am Kohlenstoffatom 3 vorliegt, ein negativer Cotton-Effekt
durch M-Helizität entsteht. Ein positiver Cotton-Effekt tritt bei P-Helizität auf.[64] Das 6,8-
Dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-3,4-dimethyl-3,4-dihydro-1H-isochromen-1-on muß also eine
M-Helizität aufweisen, bei der der Substituent am Kohlenstoffatom 3 pseudoäquatorial und
der am Kohlenstoffatom 4 pseudoaxial orientiert sind (Abbildung 33). Dies wird durch die
Konformationsanalyse bestätigt. Daraus folgt die 3R,4R-Konfiguration des untersuchten
Moleküls.
O
O
Abbildung 33: M-Helizität (links) des 6,8-Dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-3,4-dimethyl-3,4-dihydro-1H-
isochromen-1-ons und berechnete Konformation (rechts)
Ein Vergleich mit dem berechneten CD-Spektrum des 3R,4R-Enantiomers (Abbildung 34)
ergibt eine gute Übereinstimmung zwischen dem berechneten und dem gemessenen
Spektrum. Das berechnete CD-Spektrum zeigt einen ausgeprägten, negativen Cotton-Effekt
bei 200 nm (–18.0). Die Abweichung der Extrempunkte der beiden Kurven liegt zwischen 3
und 18 nm. Die große Ähnlichkeit des Verlaufs beider Kurven und der Lage der
Extrempunkte läßt den Schluß zu, daß die Konfiguration der gemessenen Substanz mit der
des berechneten Moleküls identisch ist.
Isolierung und Strukturaufklärung 29
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
190 210 230 250 270 290 310 330 350 370 390
λ/nm
∆ε/L cm
-1
mol
-1
Abbildung 34: Berechnetes CD-Spektrum des Hydrierungsprodukts von Naturstoff 66511b
Damit kann das Hydrierungsprodukt als (3R,4R)-6,8-Dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-3,4-
dimethyl-3,4-dihydro-1H-isochromen-1-on (28a, Abbildung 35) identifiziert werden.
O
OOH
HO
HO
28a
Abbildung 35: Hydrierungsprodukt des Naturstoffs 66511b
Da eine Isomerisierung am Stereozentrum während der Reaktion ausgeschlossen werden
kann, muß es sich bei dem Naturstoff 66511b um (4R)-6,8-Dihydroxy-4-methyl-3-methylen-
1-oxo-3,4-dihydro-1H-isochromen-5-carbaldehyd (28, Abbildung 36) handeln, dem hiermit
der Name Ascochin gegeben werden soll.
O
OOH
HO
O
Ascochin (28)
Abbildung 36: Ein literaturunbekannter Naturstoff aus Ascochyta sp.
Isolierung und Strukturaufklärung 30
2.3.3 Naturstoff 66512a
Der Naturstoff 66512a wurde als farbloses Öl erhalten, das sich gut in Chloroform und
Dichlormethan löst und auf dem DC (Rf-Wert 0.54, Laufmittel CH2Cl2) durch Anfärben mit
Anisaldehyd/Schwefelsäure detektiert werden kann. Aus den 1H- und 13C-NMR-Spektren
lassen sich zwei Methylgruppen erkennen, eine Ketogruppe, eine CH-Gruppe und sechs CH2-
Gruppen. Die Multiplizität des einen Methylsignals (Dublett, 6.9 Hz) bei 1.05 ppm läßt
darauf schließen, daß die Methylgruppe mit der CH-Gruppe verknüpft ist. Die chemische
Verschiebung der zweiten Methylgruppe und der CH-Gruppe von 2.11 und 2.47 ppm zeigt
die Verknüpfung mit der Carbonylgruppe an. Die Multiplizität des CH-Signals (tq, 6.9 Hz)
deutet darauf hin, das die CH-Gruppe direkt an eine CH2-Gruppe geknüpft ist. Da die CH2-
Gruppen eine aliphatische Kette bilden, ergibt sich das in Abbildung 37 dargestellte
Fragment.
O
Abbildung 37: Aus den 1H- und 13C-NMR-Spektren abgeleitetes Fragment des Naturstoff 66512a
Das EI-Massenspektrum der Substanz zeigt einen Molekülpeak bei 324. Das in Abbildung 37
dargestellte Fragment ergibt jedoch nur eine Molekülmasse von 155. Da das 13C-NMR-
Spektrum keine anderen Signale enthält, muß das Molekül symmetrisch aufgebaut sein. Zwei
der Fragmente ergäben wiederum eine Molekülmasse von 310. Daher muß das Molekül noch
eine zusätzliche CH2-Gruppe enthalten, deren 13C-Signal mit einem der anderen
zusammenfällt. Das HR-EIMS bestätigt die Summenformel von C21H40O2, so daß es sich bei
Naturstoff 66512a um 3,17-Dimethylnonadecan-2-18-on handelt, dem der Name Ascoketon
(29, Abbildung 38) gegeben wird.
Das Vorhandensein einer optischen Aktivität mit einem spezifischen Drehwert von +19.8°
(c = 0.44, CH2Cl2) schließt das Vorliegen der Substanz in der meso-Form aus. Die absolute
Konfiguration konnte jedoch nicht ermittelt werden.
O O
Ascoketon (29)
Abbildung 38: Ein literaturunbekannter Naturstoff aus Ascochyta sp.
Isolierung und Strukturaufklärung 31
2.3.4 Naturstoff 66512b
Die Substanz wurde als farbloses Öl erhalten, welches sich gut in Dichlormethan und
Chloroform löst. Auf dem DC ist die Substanz durch ihre gelbe Anfärbung mit
Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar und hat einen Rf-Wert von 0.49 (Laufmittel CH2Cl2).
Der spezifische Drehwinkel des Naturstoffs beträgt –36.6° (c = 0.9, CH2Cl2). Aus den 1H- und
13C-NMR-Spektren läßt sich entnehmen, daß die Substanz aus drei Methylgruppen, sechs
CH2-Gruppen, einer CH-Gruppe, einer Carbonylgruppe und vier quartären
Kohlenstoffatomen besteht. Aus den chemischen Verschiebungen von drei der vier quartären
Kohlenstoffatome und einer der CH2-Gruppen zwischen 109.2 und 162.1 ppm lassen sich
zwei Doppelbindungen erkennen, von denen eine endständig ist. Außerdem zeigt sich noch
eine Polarisierung der zweiten Doppelbindung, die daher mit der Carbonylgruppe konjugiert
sein muß. Die Zuordnung der Protonen-Signale zu den dazugehörigen Kohlenstoff-Signalen
erfolgte mit Hilfe des HMQC-Spektrums. Die Daten der ein- und zweidimensionalen NMR-
Spektren sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1: Chemische Verschiebungen und Kopplungen des Naturstoff 66512b
Atomnummer 13C-NMR 1H-NMR H,H-COSY HMBC
1 128.8 - - -
2 199.1 - - -
3 33.8 2.42/2.54 4 1, 2, 4, 4a
4 37.5 1.78 3 3, 4a, 5, 10
4a 35.8 - - -
5 41.9 1.46/1.73 6 4a, 6, 7, 10
6 26.9 1.65/1.73 5, 7 7
7 45.9 2.07 6 -
8 32.9 2.07/2.76 - 1, 4a, 6, 7, 8a,11
8a 162.1 - - -
9 10.9 1.8 - 1, 8a
10 22.5 1.25 - 4, 5, 8a
11 149.2 - - -
12 109.2 4.8 - 7, 11, 13
13 20.7 1.81 - 12, 11
Zusammen mit dem H,H-COSY-Spektrum lassen sich die in Abbildung 39 dargestellten
Fragmente A–D erkennen.
Isolierung und Strukturaufklärung 32
O
ABCD
Abbildung 39: Aus den 1H-, 13C- und H,H-COSY-Spektren abgeleitete Fragmente des Naturstoff 66512b
Die Auswertung des HMBC-Spektrums ergab die Struktur 30 (Abbildung 40) und eine Suche
in den Chemical Abstracts führte zu dem α-Cyperon. Der Vergleich der Literaturdaten der
13C-Verschiebungen[65] ergab eine völlige Übereinstimmung. Der spezifische Drehwinkel[66]
des α-Cyperons zeigte jedoch einen entgegengesetzten Drehsinn, woraufhin der Naturstoff
66512b als ent-α-Cyperon identifiziert werden konnte, das erstmals 1990 von Yoshinori
Asakawa[67] isoliert wurde.
O
12
7
11
12
ent-α-Cyperon (30)
Abbildung 40: Ein literaturbekannter Naturstoff, der erstmals von Y. Asakawa isoliert wurde
2.3.5 Naturstoff 66514a
Der Naturstoff bildet schwach gelbe Kristalle (Smp.: 108–110 °C) und ist gut löslich in
Dichlormethan und Methanol. Im DC ist er durch seine UV-Löschung bei 254 nm
detektierbar und hat einen Rf-Wert von 0.36 (Laufmittel CH2Cl2). Die Substanz hat einen
spezifischen Drehwinkel von –39.2° (c = 0.25, MeOH) und zeigt im Agardiffusionstest
Aktivität gegen Bacillus megaterium, Microbotryum violaceum und Chlorella fusca. Aus den
NMR-Spektren lassen sich eine Methylgruppe, zwei sp3-hybridisierte CH-Gruppen, drei sp2-
hybridisierte CH-Gruppen sowie drei quartäre, sp2-hybridisierte Kohlenstoffatome und eine
Carbonylgruppe erkennen, deren chemische Verschiebung von 169.9 ppm für das
Strukturelement eines Esters spricht. Die Multiplizität und die Kopplungskonstante der
Methylgruppe bei 1.58 ppm spricht für eine Verknüpfung mit der CH-Gruppe bei 4.70 ppm,
Isolierung und Strukturaufklärung 33
deren Kopplungsmuster (dq) eine Verknüpfung mit der zweiten CH-Gruppe anzeigt. Die
chemischen Verschiebungen beider CH-Gruppen von 4.57 und 4.70 ppm zeigen eine
Sauerstoffsubstitution an. Das Kopplungsmuster der aromatischen Protonen zeigt eine ortho-
Stellung der drei CH-Gruppen im Aromaten an. Die Verschiebung eines der quartären
Kohlenstoffatome von 162.3 ppm und einer CH-Gruppe von 118.7 ppm spricht für eine
Sauerstoffsubstitution in ortho-Stellung zu dieser CH-Gruppe. Folglich besteht die Substanz
aus den in Abbildung 41 gezeigten Fragmenten A–C.
OH
O
O
O
O
A
BC
Abbildung 41: Aus den NMR-Spektren zu erkennende Fragmente des Naturstoff 66514a
Unter Berücksichtigung der im 1H-NMR-Spektrum erkennbaren, chelierten Hydroxygruppe,
ergibt sich als einzig sinnvolle Verknüpfung die Struktur 31 (Abbildung 42). Die relative
Konfiguration der beiden Stereozentren wurde aus der Größe der Kopplung der beiden
Protonen von 2.1 Hz geschlossen, die für eine axial-äquatorial-Position spricht. Eine Suche in
den Chemical Abstracts führte zu den beiden Enantiomeren des 4-Hydroxymelleins. Diese
Struktur wurde durch einen Vergleich der 1H- und 13C-NMR-Daten mit den Literaturdaten
bestätigt. Die absolute Konfiguration konnte durch einen Vergleich des gemessenen
spezifischen Drehwinkels von –39.2° mit den Literaturdaten[68] (
[]
20
D
α
= –31°) ermittelt
werden. Somit handelt es sich bei Naturstoff 66514a um (3R,4R)-4-Hydroxymellein, das
erstmals 1971 von Richard J. Cole[69] aus Aspergillus ochraceus isoliert wurde. Die Substanz
wird von vielen Pilzen produziert und wurde bereits mehrfach im Arbeitskreis von Prof.
Krohn gefunden. G. König et al. isolierten diese Substanz aus Microsphaeropsis sp. und
wiesen im Agardiffusionstest Aktivität gegen Eurotium repens und Ustilago violacea nach.[70]
Isolierung und Strukturaufklärung 34
O
O
OH
OH
(3R,4R)-4-Hydroxymellein (31)
Abbildung 42: Ein bekannter Naturstoff aus Aspergillus ochraceus mit fungizider Wirkung
2.3.6 Naturstoff 66515a
Der Naturstoff 66515a kristallisiert aus Dichlormethan in weißen Nadeln und hat einen
Schmelzpunkt von 101–102 °C. Auf dem DC (Rf-Wert: 0.51, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1)
ist die Substanz durch Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar und im
Agardiffusionstest zeigt sie Aktivität gegen Microbotryum violaceum und Bacillus
megaterium. In vitro ist die Substanz schwach aktiv gegen Septoria tritici. Das 1H-NMR-
Spektrum in Abbildung 43 zeigt drei sauerstoffsubstituierte CH-Gruppen und eine
Methylgruppe.
4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
17.34 2.932.001.97 1.03 1.021.00 0.930.87 0.81
Abbildung 43: 1H-NMR-Spektrum des Naturstoff 66515a in CDCl3 bei 500 MHz
Isolierung und Strukturaufklärung 35
Mit Hilfe des 13C-NMR- (Abbildung 44) und des DEPT-Spektrums können die weiteren
Protonensignale als elf CH2-Gruppen identifiziert werden. Auf Grund ihrer sehr ähnlichen
chemischen Verschiebungen müssen neun dieser CH2-Gruppen einer aliphatischen Kette
zugeordnet werden. Außerdem ist im 13C-NMR-Spektrum noch ein Carbonylgruppensignal zu
erkennen, welches zu einer Estergruppe gehört. Das hochauflösende Massenspektrum ergibt
eine Summenformel von C16H30O4.
170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
173.23
78.59
74.40
69.11
35.88 35.72
31.89
29.60
29.31
29.26
22.66
14.08
Abbildung 44: 13C-NMR-Spektrum des Naturstoff 66515a in CDCl3 bei 500 MHz
Die Kopplungen aus dem H,H-COSY-Spektrum führen zu dem in Abbildung 45 dargestellten
Fragment.
O
O O
Abbildung 45: Fragment aus dem H,H-COSY-Spektrum von Naturstoff 66515a
Das HMBC-Spektrum zeigt eine Verknüpfung der Carbonylgruppe mit der ersten CH-Gruppe
des in Abbildung 45 dargestellten Fragmentes. Außerdem läßt sich die Verknüpfung der
aliphatischen Kette mit der bereits im Fragment enthaltenen CH2-Gruppe am Ende der Kette
Isolierung und Strukturaufklärung 36
erkennen. Für einen Ringschluß ist nur das Sauerstoffatom in der Mitte des Fragments
geeignet, woraus sich für den Naturstoff 66515a die Struktur 32 (Abbildung 47) ergibt. Die
relative Konfiguration der Substanz konnte aus den Kopplungskonstanten der Protonen
abgeleitet werden. Wie in Abbildung 46 gezeigt, deutet die Kopplung von 9.7 Hz auf eine
axial-axial-Stellung der Protonen an den Kohlenstoffatomen 3 und 4 hin, wohingegen die
Protonen an den Kohlenstoffatomen 4 und 6 zu dem gleichen Proton der CH2-Gruppe eine
äquatorial-axial-Kopplung aufweisen.
Abbildung 46: Relative Konfiguration des Naturstoff 66515a aus den Protonen-Kopplungen
Eine Recherche in den Chemical Abstracts blieb erfolglos. Jedoch wurde das Lacton mit einer
um zwei Kohlenstoffatome kürzeren Seitenkette bereits von H. Toshima und H. Sato[71] aus
Seiridium unicorne isoliert. Die Autoren haben die absolute Konfiguration dieser Substanz
durch Synthese des Enantiomers aus D-Glucose ermittelt. Ein Vergleich des Drehwerts von
Naturstoff 66515a (
[]
20
D
α
= –37.1°) mit dem des literaturbekannten Lactons (
[]
20
D
α
= –35.0°)
ergab eine Übereinstimmung. Bei dem Naturstoff 66515a handelt es sich somit um das
literaturunbekannte (3S,4R,6S)-3,4-Dihydroxy-6-undecyltetrahydro-2H-pyran-2-on, dem der
Name Ascolacton (Abbildung 47) gegeben wird.
O
O
HO
HO
Ascolacton (32)
Abbildung 47: Ein literaturunbekannter Naturstoff aus Ascochyta sp.
2.4 Stamm 6577
Der Stamm 6577, Pseudoanguillospora sp. wurde aus der Rotalge Polyides rotundus aus der
Ostsee bei Ahrenshoop isoliert, 21 Tage auf Biomalz-Festagar kultiviert und anschließend mit
Isolierung und Strukturaufklärung 37
Ethylacetat extrahiert. Der Rohextrakt zeigte im Agardiffusionstest Aktivität gegen
Microbotryum violaceum und Bacillus megaterium.
2.4.1 Isolierung der Naturstoffe
Der Rohextrakt wurde mit Hexan gewaschen und der hexanunlösliche Teil in Dichlormethan
aufgenommen. Die Dichlormethanphase wurde ebenfalls vom unlöslichen Teil getrennt.
Durch Kristallisation aus der Dichlormethanphase konnte zunächst der Naturstoff 65772 (33)
gewonnen werden. Die Mutterlauge wurde anschließend durch Säulenchromatographie in 5
Fraktionen aufgetrennt. Aus Fraktion 3 konnte durch präparative Schichtchromatographie
(PSC) der Naturstoff 6577c3 (34) isoliert werden. Der in Dichlormethan unlösliche Teil des
Rohextraktes wurde noch einmal mit Methanol gewaschen und die Methanolphase ebenfalls
an Kieselgel chromatographiert und in 4 Fraktionen aufgetrennt. Aus Fraktion 4 konnte der
Naturstoff 6577m4 (35) durch PSC an RP-Kieselgel isoliert werden. Der Verlauf der
Isolierung ist in Abbildung 48 schematisch dargestellt.
Rohextrakt
Hexanphase Hexanunlöslicher Anteil
Dichlormethanphase Dichlormethanunlöslicher Teil
Naturstoff 65772 Mutterlauge
Fraktion 3
Methanolphase Methanolunlöslicher Teil
Fraktion 4
Naturstoff 6577c3 Naturstoff 6577m4
Waschen mit Hexan
Waschen mit Dichlormethan
Kristallisation aus Dichlormethan/Hexan Waschen mit Methanol
SC an Kieselgel SC an Kieselgel
PSC an Kieselgel PSC an RP-Kieselgel
Abbildung 48: Schematische Darstellung der Isolierung aus Stamm 6577
Isolierung und Strukturaufklärung 38
2.4.2 Naturstoff 65772
Der Naturstoff 65772 ist gut löslich in Dichlormethan und fällt durch Zugabe von Hexan in
Form eines gelben, amorphen Feststoffes aus (Zers.: >180 °C). Auf dem DC (Rf-Wert 0.49,
Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) ist der Naturstoff durch seine gelbe Farbe und durch die
Dunkelfärbung unter Licht und Sauerstoffeinfluß leicht detektierbar. Im Agardiffusionstest
zeigte die Substanz Aktivität gegen Bacillus megaterium und Microbotryum violaceum. In-
vitro zeigte sich eine Wirkung gegen Phytophtora infestans. Das 1H-NMR-Spektrum weist
ein Signal mit der relativen Intensität 3 bei 1.44 ppm, ein weiteres Signal mit der relativen
Intensität 2 bei 2.70 ppm sowie sechs Signale mit der relativen Intensität 1 auf, von denen
zwei im Aromatenbereich liegen. Drei der Signale sind Hydroxygruppen zuzuordnen, von
denen eine cheliert ist. Das letzte Signal bei 4.51 ppm deutet auf ein sp3-hybridisiertes
Kohlenstoffatom hin, das mit einem Sauerstoffatom verknüpft ist. Die Multiplizität der
Signale bei 1.44 und 2.70 ppm läßt auf eine Verknüpfung der Methylgruppe mit der sp3-
hybridisierten CH-Gruppe schließen, die ihrerseits mit der CH2-Gruppe verknüpft ist.
Das 13C-NMR-Spektrum weist zehn Signale im Aromatenbereich, ein Carbonylsignal bei
198.9 ppm und drei Signale im Aliphatenbereich auf. Die Auswertung der HMQC- und
HMBC-Spektren ergibt das in Abbildung 49 dargestellte Fragment.
O
O O OH
OH
H
Abbildung 49: HMBC-Kopplungen für Naturstoff 65772
Das Vorhandensein eines Molekülpeaks im EI-Massenspektrum mit der Masse von 518.3 läßt
darauf schließen, daß es sich bei dem Naturstoff 65772 um ein Dimer des in Abbildung 49
dargestellten Fragments handelt. Eine Recherche in den Chemical Abstracts führte zu dem
bekannten Naturstoff Cephalochromin (33, Abbildung 50), dessen Struktur erstmals von G.
Tertzakian et al.[72] beschrieben wurde. Ein Vergleich mit den Literaturdaten[73] der 1H-NMR-
Spektren bestätigte die Identität der Substanz mit dem Naturstoff Cephalochromin.
Isolierung und Strukturaufklärung 39
O
O
OOHOH
HO
OH
OH
OHO
Cephalochromin (33)
Abbildung 50: Ein literaturbekannter Naturstoff, der erstmals von G. Tertzakian et al. isoliert wurde
2.4.2.1 Bestimmung der Konformation der chiralen Achse
In der Literatur konnten keine Angaben über die Konfiguration der Stereozentren oder die
Konformation der chiralen Achse gefunden werden. Daher sollte der Versuch unternommen
werden, diese zu bestimmen. Dazu kann wie im Falle des Ascochins (Kapitel 2.3.2.1) der
Vergleich der gemessenen und berechneten CD-Spektren herangezogen werden. Im Falle des
Cephalochromins gilt jedoch zu beachten, daß es sich nach der Einteilung der Chromophore
nach Moscowitz[74,75] in inhärent dissymmetrische und inhärent symmetrische, aber
dissymmetrisch gestörte Chromophore bei 1,1’-Bisnaphtyl-Verbindungen um einen inhärent
dissymmetrischen Chromophor handelt[76]. Um den Chromophor genauer zu beschreiben,
werden die zu untersuchenden Moleküle in Sphären aufgeteilt. Dabei bildet der Chromophor
die erste Sphäre. Ein Ring, der den Chromophor beinhaltet, bildet die zweite Sphäre und
Substituenten am Ring die Dritte. Für Größe und Vorzeichen des Cotton-Effekts ist die
Chiralität der Sphäre entscheidend, die dem Chromophor am nächsten steht.[77] Daraus muß
für das Cephalochromin geschlossen werden, daß der Beitrag der chiralen Zentren in der
zweiten Sphäre die Form des CD-Spektrums nicht wesentlich beeinflußt. Daher kann aus dem
Vergleich der gemessenen und berechneten CD-Spektren nur die Konformation der chiralen
Achse bestimmt werden, nicht aber die absolute Konfiguration der chiralen Zentren. Für die
Berechnung des CD-Spektrums wurde die Konfiguration der Stereozentren willkürlich
festgelegt. Eine Konformationsanalyse lieferte für die aR-Konformation des Moleküls einen
Winkel von 88.34° als energetisch günstigstes Konformer. Für dieses Konformer wurde das in
Abbildung 51 dargestellte CD-Spektrum berechnet und mit dem gemessenen verglichen. Die
Berechnung der CD-Spektrums wurde von Brigitta Elsässer durchgeführt. Das experimentelle
CD-Spektrum wurde von Dr. Tibor Kurtán im Arbeitskreis von Professor Sándor Antus
gemessen.
Isolierung und Strukturaufklärung 40
-200
-150
-100
-50
0
50
100
150
200
205 255 305 355
λ/nm
∆ε/L cm
-1
mol
-1
Abbildung 51: Berechnetes (■) und gemessenes (▬) CD-Spektrum von Cephalochromin
Wie der Vergleich in Abbildung 51 zeigt, ist die Form der CD-Spektren fast identisch, woraus
die aR-Konformation für das Cephalochromin folgt (33, Abbildung 52).
O
O
OOHOH
HO
OH
OH
OHO
aR-Cephalochromin (33)
Abbildung 52: Absolute Konfiguration der chiralen Achse des Cephalochromins
2.4.3 Naturstoff 6577c3
Der Naturstoff 6577c3 wurde als gelblicher Feststoff (Smp.: 46–48 °C) erhalten, der sich gut
in Methanol löst und auf dem DC (Rf-Wert 0.64, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) durch seine
UV-Löschung bei 254 nm und seine charakteristische gelbe Anfärbung mit dem Sprühreagenz
Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar ist. Die Substanz zeigte Aktivität gegen Chlorella
fusca, Bacillus megaterium, Microbotryum violaceum, Pyricularia oryzae und Septoria tritici.
Aus den NMR-Spektren ist zu erkennen, daß die Substanz aus einem penta-substituierten
Benzolring, zwei Methyl- und acht CH2-Einheiten sowie einer CH-Einheit besteht. Das
Isolierung und Strukturaufklärung 41
HREIMS bestätigt die Summenformel von C17H26O3. Abbildung 53 zeigt das 1H-NMR-
Spektrum gemessen in deuteriertem Methanol.
6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
11.013.54 3.433.101.51 1.14 1.081.061.061.00
Abbildung 53: 1H-NMR-Spektrum des Naturstoff 6577c3 in Methanol-d4 bei 500 MHz
Die chemische Verschiebung des aromatischen Protons von 6.21 ppm sowie des
dazugehörigen Kohlenstoffatoms von 99.7 ppm deuten auf zwei sauerstoffsubstituierte
Kohlenstoffatome in ortho-Stellung zu der CH-Gruppe hin. Des weiteren zeigt eine der
Methylgruppen die charakteristische Verschiebung von 1.98 ppm für eine Verknüpfung mit
einem Aromaten. Ebenso sprechen die Verschiebungen von 2.33 und 2.57 ppm für eine CH2-
Gruppe, die mit einem Aromaten verknüpft ist. Die chemische Verschiebung einer zweiten
CH2-Gruppe von 4.51 und 4.85 ppm spricht für eine Sauerstoffsubstitution und die
Verknüpfung mit dem Aromaten. Die Aufspaltung der CH2-Gruppen in getrennte Signale für
jedes Proton läßt darauf schließen, daß beide CH2-Gruppen zu einem annellierten Ring
gehören. Die chemische Verschiebung der CH-Gruppe von 3.50 ppm spricht ebenfalls für
eine Sauerstoffsubstitution. Die verbleibenden sechs CH2-Gruppen bilden mit der zweiten
Methylgruppe eine aliphatische Kette. Daraus ergeben sich die in Abbildung 54 dargestellten
Fragmente A–C.
Isolierung und Strukturaufklärung 42
HO
OH
OOH
AB
C
Abbildung 54: Fragmente aus dem 1H- und 13C-NMR sowie dem DEPT135
Mit Hilfe des H,H-COSY-Spektrums läßt sich eine Verknüpfung der aliphatischen Kette mit
der CH-Gruppe erkennen, die ihrerseits mit der CH2-Gruppe des aromatischen Fragments
verknüpft ist. Daraus ergibt sich unter Berücksichtigung der erforderlichen Ringstruktur für
die CH2-Gruppen am Aromaten, die in Abbildung 55 dargestellte Struktur. Die Substanz
erwies sich nach einer Suche in den Chemical Abstracts als literaturunbekannt und erhielt den
Namen Pseudoanguillosporin A (34, Abbildung 58).
Abbildung 55: Kopplung aus dem H,H-COSY-Spektrum von Naturstoff 6577c3
2.4.3.1 Bestimmung der absoluten Konfiguration
Die absolute Konfiguration des Naturstoffes, der einen spezifischen Drehwert von –724.6°
aufweist, konnte mit Hilfe des CD-Spektrums ermittelt werden, das in Abbildung 56
dargestellt ist.
Isolierung und Strukturaufklärung 43
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
180 200 220 240 260 280 300
λ/nm
∆ε/L cm
-1
mol
-1
Abbildung 56: Gemessenes CD-Spektrum von Naturstoff 6577c3
Es zeigt sich ein ausgeprägter Cotton-Effekt bei 198 nm (–9.7). Die Helizitätsregel für den
Benzol-Chromophor von chiralen Tetralinderivaten kann auch auf Isochromanderivate
angewendet werden, wenn diese Substituenten mit einem starken Dipolmoment tragen.[64]
Aus einem negativen Cotton-Effekt im 1Lb-Band läßt sich auf M-Helizität des Moleküls
schließen. Der Substituent am Kohlenstoffatom 3 liegt dabei in einer äquatorialen Position
vor (Abbildung 57).
O
R
Abbildung 57: M-Helizität des Naturstoffs 6577c3 (R = C7H15) und berechnete Konfiguration
Damit muß es sich bei dem vorliegenden Molekül um (3R)-3-Heptyl-5-methyl-3,4-dihydro-
1H-isochromen-6,8-diol (Abbildung 58) handeln. Die Aufnahme des CD-Spektrums und
Bestimmung der absoluten Konfiguration wurde von Dr. Tibor Kurtán durchgeführt.
Isolierung und Strukturaufklärung 44
O
OH
HO
Pseudoanguillosporin A (34)
Abbildung 58: Absolute Konfiguration des neuen Naturstoffs aus Pseudoanguillospora sp.
2.4.4 Naturstoff 6577m4
Der Naturstoff wurde als gelbes Öl erhalten, das sich gut in Methanol löst und auf dem DC
(Rf-Wert 0.40, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) durch seine UV-Löschung bei 254 nm und
seine charakteristische, gelbe Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure leicht detektierbar
ist. Im Agardiffusionstest zeigte die Substanz eine wachstumshemmende Wirkung gegen
Bacillus megaterium und Microbotryum violaceum. Die NMR-Spektren weisen eine große
Ähnlichkeit mit denen des Pseudoanguillosporins A (34, Abbildung 58) auf. In Tabelle 2 sind
die chemischen Verschiebungen der Protonen zum Vergleich gegenübergestellt.
Tabelle 2: Chemische Verschiebungen der Protonen der Naturstoffe 6577c3 und 6577m4
Naturstoff 6577c3 Naturstoff 6577m4
6.21 s 6.21 s
4.51 d/4.85 d 4.50 d/4.84 d
- 3.73 m
3.50 m 3.51 m
2.33 dd/2.57 dd 2.33 dd/2.59 dd
1.98 s 1.98 s
1.31-1.66 m (6 × CH2) 1.27-1.70 m (5 × CH2)
0.92 t 1.17 d
Die wichtigsten Unterschiede sind die chemische Verschiebung und die Multiplizität
(Dublett) der Methylgruppe in der Seitenkette sowie die CH-Gruppe bei 3.73 ppm, deren
chemische Verschiebung auf eine Sauerstoffsubstitution schließen läßt. Des weiteren sind im
13C-NMR-Spektrum nur sieben statt acht CH2-Gruppen zu erkennen und das hochauflösende
Massenspektrum ergibt eine Summenformel von C17H26O4. Daraus läßt sich auf eine
Sauerstoffsubstitution am Kohlenstoffatom 14 der Seitenkette schließen. Es handelt sich bei
Isolierung und Strukturaufklärung 45
dem Naturstoff 6577m4 somit um die Struktur 35 (Abbildung 59), der der Name
Pseudoanguillosporin B gegeben wird.
O
OH
HO
OH
Pseudoanguillosporin B (35)
Abbildung 59: Ein literaturunbekannter Naturstoff aus Pseudoanguillospora sp.
Die absolute Konfiguration des Pseudoanguillosporins B am Kohlenstoffatom 3 wurde aus
dem Vergleich der spezifischen Drehwerte von Pseudoanguillosporin A und B
(A:
[]
20
D
α
= –625.0°, B:
[]
20
D
α
= –724.6°) abgeleitet. Über die Konfiguration am
Kohlenstoffatom 9 kann keine Aussage gemacht werden.
2.5 Stamm 7067
Der Stamm 7067, Coniothyrium sp. aus der Pflanze Carpobrotus edulis von Gomera, wurde
für 28 Tage auf Biomalz-Festagar kultiviert und mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt zeigte
im Agardiffusionstest Aktivität gegen Microbotryum violaceum, Chlorella fusca, Septoria
tritici und Phytophtora infestans.
2.5.1 Isolierung der Naturstoffe
Der gewonnene Rohextrakt wurde mittels Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem
Dichlormethan/Methanol-Gradienten in 7 Fraktionen aufgeteilt. Fraktion 4 lieferte nach einer
Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 durch Kristallisation aus Dichlormethan den
Naturstoff 70674a (36). Aus Fraktion 5 konnten mittels Säulenchromatographie an Sephadex
LH 20 und Kieselgel sowohl der Naturstoff 70675b (37) als auch der Naturstoff 70675c (39),
der nochmals mittels präparativer Schichtchromatographie gereinigt wurde, isoliert werden.
Die Fraktion 7 wurde durch eine weitere Säulenchromatographie an Kieselgel in 8
Unterfraktionen aufgeteilt, von denen die sechste nach Säulenchromatographie an Sephadex
LH 20 und Kieselgel den Naturstoff 70677c (40) lieferte. Aus der achten Unterfraktion konnte
durch Säulenchromatographie an Sephadex und anschließender Kristallisation der Naturstoff
70677d (42) gewonnen werden. Die Mutterlauge wurde einer weiteren Säulen-
Isolierung und Strukturaufklärung 46
chromatographie an Kieselgel unterzogen und lieferte den Naturstoff 70677e (43), der noch
einmal durch Säulenchromatographie gereinigt wurde. Der Verlauf der Isolierung ist in
Abbildung 60 schematisch dargestellt.
Rohextrakt
Fraktion 5 Fraktion 7
Fraktion 5cNaturstoff 70675b
Naturstoff 70675c
Fraktion 7.6 Fraktion 7.8
Naturstoff 70677c
Naturstoff 70677d
SC an Kieselgel
PSC
Kristallisation
Mutterlauge
Naturstoff 70677f
SC an Sephadex
und Kieselgel
SC an Kieselgel
SC an Sephadex
und Kieselgel
SC an Kieselgel
und Sephadex
Fraktion 4
Naturstoff 70674a
Kristallisation
Abbildung 60: Schematische Darstellung der Isolierung aus 7067
2.5.2 Naturstoff 70674a
Der Naturstoff 70674a kristallisiert aus Dichlormethan in farblosen Plättchen aus
(Smp.: 232–234 °C) und ist in fast allen Lösungsmitteln außer DMSO schwerlöslich. Die
Substanz hat einen Rf-Wert von 0.88 (Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) und ist auf dem DC
durch UV-Löschung bei 254 nm und Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar.
Das 1H-NMR-Spektrum weist ein Methylgruppensignal auf, zwei Methoxysignale und drei
Signale, die zu aromatischen Protonen gehören, von denen zwei in meta-Stellung zueinander
stehen. Außerdem sind zwei Hydroxygruppen zu erkennen, von denen eine cheliert ist. Das
13C-NMR-Spektrum zeigt zwölf aromatische Kohlenstoffsignale, von denen neun zu
quartären Kohlenstoffatomen gehören, und ein Carbonylsignal, das zu einer Estergruppe
gehört. Des weiteren sind noch ein Methylgruppensignal und zwei Methoxygruppensignale zu
Isolierung und Strukturaufklärung 47
erkennen. Unter der Annahme, daß die zwölf aromatischen Kohlenstoffatome zwei
Benzolringe bilden, besteht der Naturstoff 70674a aus den in Abbildung 61 gezeigten
Fragmenten A–H.
O
OO O OH OH
H
H
H
ABCDE
FG H
Abbildung 61: Fragmente des Naturstoff 70674a
Da für die beiden Benzolringe insgesamt maximal sieben Substituenten vorhanden sind,
müssen diese miteinander verknüpft sein, um auf neun quartäre Kohlenstoffatome zu
kommen. Aus dem gleichen Grund muß die Estergruppe mit beiden Ringen verbunden sein,
anstatt mit einer Methoxygruppe einen Methylester zu bilden. Unter Berücksichtigung der
chelierten Hydroxygruppe, kann als nächstes das in Abbildung 62 dargestellte
Benzochromenon-Grundgerüst formuliert werden.
O
OOH
Abbildung 62: Grundgerüst des Naturstoff 70674a
Die verhältnismäßig hohen chemischen Verschiebungen von zwei der sauerstoffsubstituierten
Kohlenstoffatome von 165.3 und 166.7 ppm sprechen für eine meta-Stellung der
Sauerstoffsubstituenten zueinander, wohingegen die relativ niedrigen chemischen
Verschiebungen von 138.6, 141.3 und 148.8 ppm eine ortho-Stellung der verbleibenden
sauerstoffsubstituierten Kohlenstoffatome anzeigen. Weiterhin läßt die chemische
Verschiebung eines der aromatischen Protonen von 6.51 ppm auf die Position zwischen den
Isolierung und Strukturaufklärung 48
beiden Sauerstoffsubstituenten schließen. Da dieses Proton eine meta-Kopplung aufweist,
ergeben sich die in Abbildung 63 dargestellten Substitutionsmuster A–C.
O
OOH
O
OOH
O
OOH
O
O
O
OO
O
OO
O
ABC
Abbildung 63: Mögliche Substitutionsmuster für Naturstoff 70674a
Eine Recherche in den Chemical Abstracts führte zu der Struktur 36 (Abbildung 64). Die
Substanz wurde 1997 von Takao Tanahashi[78] aus einer Flechte isoliert. Ein Vergleich mit
den Literaturdaten bewies die Identität des Naturstoffs 70674a mit dem literaturbekannten
Graphislacton A.
O
O
OH
OH
O
O
Graphislacton A (36)
Abbildung 64: Ein literaturbekannter Naturstoff, der erstmals aus einer Flechte isoliert wurde
2.5.3 Naturstoff 70675b
Der Naturstoff 70675b wurde in Form eines gelben Öls erhalten, das sich gut in
Dichlormethan löst. Die Substanz ist auf dem DC (Rf-Wert 0.65, Laufmittel
CH2Cl2/MeOH 9:1) durch ihre gelbe Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar
und zeigte im Agardiffusionstest Aktivität gegen Septoria tritici. Aus den NMR-Spektren sind
eine Methylgruppe, fünf CH-Gruppen, zwei CH2-Gruppen und drei quartäre
Kohlenstoffatome zu erkennen. Eines der quartären Kohlenstoffatome gehört zu einer
Estergruppe. Die Zuordnung der Protonensignale zu den entsprechenden Kohlenstoffsignalen
mit Hilfe eines HMQC-Spektrums zeigte eine CH2-Gruppe, die mit einer chemischen
Verschiebung von 89.6 ppm zu einer endständigen Doppelbindung gehören muß. Außerdem
läßt sich auf eine starke Polarisation dieser Doppelbindung schließen, was für eine
Isolierung und Strukturaufklärung 49
Sauerstoffsubstitution spricht. Auf Grund ihrer chemischen Verschiebungen zwischen 4.17
und 5.63 ppm müssen vier der fünf CH-Gruppen ebenfalls sauerstoffsubstituiert sein. Die
Multiplizität und Kopplungskonstante des fünften CH-Signals (q, 7.1 Hz) bei 1.95 ppm zeigt
eine Verknüpfung mit der Methylgruppe an. Das H,H-COSY-Spektrum weist Korrelationen
zwischen der endständigen Doppelbindung und einer der sauerstoffsubstituierten CH-
Gruppen auf. Ebenso zeigt sich die Verknüpfung der aliphatischen CH2-Gruppe mit einer
weiteren sauerstoffsubstituierten CH-Gruppe, die ihrerseits mit der dritten CH-Gruppe
verknüpft ist. Damit besteht der Naturstoff 70675b aus den in Abbildung 65 gezeigten
Fragmenten A–D, einer weiteren sauerstoffsubstituierten CH-Gruppe und einem quartären
Kohlenstoffatom.
OO
O
O
O
O
AB
CD
Abbildung 65: Fragmente des Naturstoffs 70675a
Mit Hilfe des HMBC-Spektrums ist eine Verknüpfung des Fragmentes B aus Abbildung 65
mit der verbliebenen CH-Gruppe und mit dem quartären Kohlenstoffatom erkennbar.
Weiterhin muß das quartäre Kohlenstoffatom mit der CH-Gruppe aus Fragment A und der
CH-Gruppe aus Fragment C verbunden sein. Eine weitere Verknüpfung der CH2-Gruppe aus
Fragment C mit der CH-Gruppe, die bereits mit Fragment B verknüpft ist, führt zu einem
Ringschluß. Damit ergibt sich das in Abbildung 66 dargestellte Fragment E.
Isolierung und Strukturaufklärung 50
2
8a
O
O
OO
O
E
Abbildung 66: Fragment des Naturstoffs 70675a abgeleitet aus dem HMBC-Spektrum
Das Einfügen des Esters am quartären Kohlenstoffatom und der Umstand das eine
endständige Doppelbindung mit einer freien Hydroxygruppe einer Tautomerie unterliegen
würde, führt zu einer Spiroverbindung. Außerdem läßt die vorhandene Kopplung zwischen
den Kohlenstoffatomen 2 und 8a auf eine Sauerstoffbrücke zwischen diesen schließen. Damit
ergibt sich für den Naturstoff 70675a die Struktur 37 (Abbildung 67).
O
O
OH
O
HO
Massarilacton A (37)
Abbildung 67: Ein literaturbekannter Naturstoff, der erstmals aus Massarina tunicata isoliert wurde
Eine Recherche in den Chemical Abstracts führte zu dem literaturbekannten Massarilacton A.
Der Vergleich mit den Literaturdaten bestätigte die Identität des Naturstoff 70675a mit dem
Massarilacton A, das von J. B. Gloer et al.[79] aus Massarina tunicata isoliert wurde und im
Agardiffusionstest eine antibiotische Wirkung gegen Bacillus subtilis aufwies.
2.5.3.1 Chemisches Verhalten von Massarilacton A
Durch eine Wartezeit für eine NMR-Messung wurde das Massarilacton A für 48 Stunden in
Chloroform gelöst stehengelassen. Die anschließende NMR-Messung ergab ein anderes
Spektrum als erwartet. Das 1H-NMR-Spektrum zeigte eine nahezu vollständige Umsetzung
des Massarilactons A zu einem einheitlichen Produkt, dessen Struktur im folgenden
aufgeklärt wurde. Die Substanz wurde als gelbes Öl erhalten und ist auf dem DC
(Rf-Wert 0.52, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) durch eine gelbe Anfärbung mit
Isolierung und Strukturaufklärung 51
Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar. Ein Vergleich der 1H-NMR-Spektren von
Massarilacton A und der veränderten Substanz zeigt das Fehlen der endständigen
Doppelbindung. Eine zusätzliche Methylgruppe bei 1.57 ppm und ein Kohlenstoffsignal bei
108.7 ppm im 13C-NMR-Spektrum, das zu einem quartären, zweifach sauerstoffsubstituierten
Kohlenstoffatom gehört, läßt auf eine Addition von Wasser an die endständige
Doppelbindung schließen. Damit ergibt sich die literaturunbekannte Struktur 38 (Abbildung
68). Die Reaktion wurde vermutlich durch kleine Mengen an HCl katalysiert, die in
Chloroform unter Lichteinfluß gebildet werden. Eine vergleichbare Reaktion einer
endständigen Doppelbindung, die sauerstoffsubstituiert und in ein sechsgliedriges Lacton
eingebunden ist, wurde in der Literatur beschrieben.[80] Die Addition von Wasser an die
Doppelbindung wurde in diesem Fall durch Schwefelsäure katalysiert.
O
O
OH
O
HO
OH
Hydroxymassarilacton (38)
Abbildung 68: Semisynthetische Substanz, die aus Massarilacton A durch säurekatalysierte Addition von
Wasser an die Doppelbindung entstanden ist
Die Kohlenstoffverknüpfungen werden durch das in Abbildung 69 dargestellte
INADEQUATE-Spektrum bestätigt.
Isolierung und Strukturaufklärung 52
Abbildung 69: INADEQUATE-Spektrum des Hydroxymassarilactons
2.5.4 Naturstoff 70675c
Der Naturstoff 70675c wurde als gelbes Öl erhalten, das sich gut in Dichlormethan löst. Auf
dem DC ist die Substanz, die einen Rf-Wert von 0.58 (Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) hat,
durch ihre auffällige gelbe Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar. Die
NMR-Spektren weisen große Ähnlichkeit mit denen des Massarilactons A auf. Die
chemischen Verschiebungen der Kohlenstoffatome von Massarilacton A und Naturstoff
70675c sind in Tabelle 3 vergleichend dargestellt. Die Bestimmung von primären,
sekundären, tertiären und quartären Signalen erfolgte anhand der DEPT- und HMQC-
Spektren.
Isolierung und Strukturaufklärung 53
Tabelle 3: Vergleich der 13C-Verschiebungen (ppm) von Massarilacton A und Naturstoff 70675c
Massarilacton A Naturstoff 70675c
14.2 (CH3) 15.1 (CH3)
- 28.7 (CH3)
38.5 (CH2) 38.2 (CH2)
46.0 (CH) 45.7 (CH)
- 52.3 (CH3)
61.5 (Cq) 64.5 (Cq)
66.3 (CH) 66.4 (CH)
69.4 (CH) 73.6 (CH)
76.8 (CH) 81.1 (CH)
83.8 (CH) 81.5 (CH)
89.6 (CH2) -
156.6 (Cq) -
171.8 (Cq) 170.8 (Cq)
- 206.9 (Cq)
Wie der Tabelle 3 zu entnehmen ist, fehlt die endständige Doppelbindung in Naturstoff
70675c und es sind zwei zusätzliche CH3-Gruppen erkennbar, von denen eine zu einer
Methoxygruppe gehört. Das HREIMS zeigt eine Summenformel von C12H18O6 an. Weiterhin
enthält der Naturstoff 70675c eine Ketogruppe, die im Massarilacton A ebenfalls nicht
vorhanden ist. Die ausgeprägte Ähnlichkeit der gegenübergestellten Spektren läßt darauf
schließen, daß das in Abbildung 70 dargestellte Fragment aus Massarilacton A auch
Bestandteil des Naturstoff 70675c ist.
O
O
O
15.1
45.7
81.1
38.2
66.4
73.6
64.5
Abbildung 70: Fragment aus Naturstoff 70675c abgeleitet aus dem Vergleich mit Massarilacton A
Das HMBC-Spektrum bestätigt dieses Fragment. Außerdem lassen sich die Verknüpfungen
des quartären Kohlenstoffatoms mit der verbliebenen CH-Gruppe bei 81.5 ppm und mit der
Estergruppe erkennen. Diese ist ihrerseits mit der Methoxygruppe verknüpft. Weiterhin zeigt
sich eine Verknüpfung der CH3-Gruppe bei 28.7 ppm mit der Ketogruppe, die wiederum mit
Isolierung und Strukturaufklärung 54
der CH-Gruppe bei 81.5 ppm verbunden ist. Eine Kopplung zwischen den beiden CH-
Gruppen bei 81.5 und 81.1 ppm läßt auf eine Etherverknüpfung schließen. Damit ergibt sich
für den Naturstoff 70675c die Struktur 39 (Abbildung 71). Auf Grund der Ähnlichkeit der
Struktur mit dem Massarilacton A (37, Abbildung 67) erfolgt die Darstellung beider
Naturstoffe mit hoher Wahrscheinlichkeit auf dem gleichen Biosyntheseweg. Die Substanz
könnte auch durch Umesterung des Lactons in methanolischer Lösung und anschließender
Tautomerisierung der endständigen Doppelbindung direkt aus dem Massarilacton A
entstanden sein. Deshalb konnte die absolute Konfiguration nach einem Vergleich der
Drehwerte von Massarilacton A[79] und Naturstoff 70675c vom Massarilacton A abgeleitet
werden. Dem literaturunbekannten Naturstoff wurde der Name Massarilacton C gegeben.
O
OH
O
HO
O
O
Massarilacton C (39)
Abbildung 71: Ein literaturunbekannter Naturstoff aus Coniothyrium sp.
2.5.5 Naturstoff 70677c
Der Naturstoff 70677c wurde in Form von farblosen Kristallen erhalten, die sich gut in
Methanol lösen und einen Schmelzpunkt von 84–88 °C haben. Die Substanz hat einen Rf-
Wert von 0.38 (Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) und ist auf dem DC durch Anfärbung mit
Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar. Aus den NMR-Spektren ist eine tetrasubstituierte
und eine disubstituierte Doppelbindung zu erkennen, wobei die tetrasubstituierte
Doppelbindung stark polarisiert ist. Daraus ergibt sich eine Sauerstoffsubstitution am einen
Ende und eine Verknüpfung mit einer Carbonylgruppe am anderen Ende der Doppelbindung.
Weiterhin sind drei sauerstoffsubstituierte CH-Gruppen, zwei Methylgruppen und ein
quartäres Kohlenstoffatom erkennbar. Mit Hilfe des H,H-COSY-Spektrums lassen sich die in
Abbildung 72 gezeigten Fragmente A und B formulieren.
Isolierung und Strukturaufklärung 55
2
4
4a
7a
O
O
OO
O
AB
Abbildung 72: Fragment aus den 1H-, 13C- und H,H-COSY-Spektren von Naturstoff 70677c
Unter Einbeziehung des HMBC-Spektrums kann eine Verknüpfung des Kohlenstoffatoms 4
des Fragmentes A mit dem Kohlenstoffatom 4a des Fragmentes B (Abbildung 72) bestimmt
werden. Eine weitere Kopplung der Kohlenstoffatome 2 und 7a aus Abbildung 72 zeigt eine
Etherbrücke zwischen den beiden Kohlenstoffatomen an. Weiterhin muß eine Verknüpfung
des quartären Kohlenstoffatoms mit der verbleibenden Methylgruppe und mit dem
Kohlenstoffatom 7a von Fragment B vorliegen. Damit ergibt sich das in Abbildung 73
dargestellte Fragment C.
O
HO
HO
O
O
C
Abbildung 73: Fragment des Naturstoff 70677c aus dem HMBC-Spektrum
Die chemische Verschiebung der Carbonylgruppe läßt auf eine Verknüpfung mit dem
quartären Kohlenstoffatom zu einem Ester schließen. Die chemische Verschiebung des
quartären Kohlenstoffatoms von 101.2 ppm deutet auf eine weitere Sauerstoffsubstitution hin.
Das CI-Massenspektrum weist einen Molekülpeak bei 243 auf. Somit ergibt sich für den
Naturstoff 70677c die Struktur 40 (Abbildung 74).
Isolierung und Strukturaufklärung 56
O
O
O
HO
HO OH
Massarilacton D (40)
Abbildung 74: Ein unbekannter Naturstoff aus Coniothyrium sp., mit großer Ähnlichkeit zu dem
Massarilacton B (41)
Damit weist die literaturunbekannte Substanz große Ähnlichkeit mit dem Massarilacton B
(41, Abbildung 75) auf, das ebenfalls von J. B. Gloer et al[79] aus Massarina tunicata isoliert
wurde.
O
O
O
HO
HO
Massarilacton B (41)
Abbildung 75: Ein literaturbekannter Naturstoff aus Massarina tunicata
Die absolute Stereochemie des Naturstoffs 70677c wurde nach einem Vergleich des
Drehwertes (
[]
20
D
α
= –116.1°) mit dem von Massarilacton B (
[]
20
D
α
= -109°) aus dessen
absoluter Stereochemie abgeleitet, die von den Autoren mittels der Röntgenstruktur des p-
Brombenzoats ermittelt wurde. Der Naturstoff 70677c erhielt den Namen Massarilacton D.
2.5.6 Naturstoff 70677d
Der Naturstoff 70677d wurde nach Kristallisation aus Dichlormethan/Methanol als weißer
Feststoff (Smp.: 283–285 °C) erhalten, der sich in Methanol löst. Der Naturstoff ist auf dem
DC (Rf-Wert 0.31, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) durch seine Anfärbung mit
Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar. Aus den NMR-Spektren, von denen das 1H-NMR-
Spektrum in Abbildung 76 zu sehen ist, lassen sich vier Methylgruppen, sechs CH2-Gruppen,
sieben CH-Gruppen und fünf quartäre Kohlenstoffatome erkennen. Das HREIMS bestätigte
eine Summenformel von C22H36O6.
Isolierung und Strukturaufklärung 57
5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
8.867.14 4.031.991.98 1.60 1.111.061.00 0.980.98 0.96
Abbildung 76: 1H-NMR-Spektrum des Naturstoff 70677d in Methanol-d4 bei 500 MHz
Die Zuordnung der 1H-NMR-Signale zu den jeweiligen 13C-NMR-Signalen erfolgte unter
Zuhilfenahme des HMQC-Spektrums und ist in Tabelle 4 aufgeführt. Wie der chemischen
Verschiebung der CH2-Gruppe 17 von 103.6 ppm zu entnehmen ist, handelt es sich um eine
endständige Doppelbindung. Weiterhin lassen sich noch fünf sauerstoffsubstituierte CH-
Gruppen zwischen 3.27 und 4.33 ppm erkennen.
Isolierung und Strukturaufklärung 58
Tabelle 4: Chemische Verschiebungen und Kopplungen des Naturstoff 70677d
Atomnummer 13C-NMR 1H-NMR H,H-COSY HMBC NOESY
1 39 0.99/1.58 2 13 -
2 18.2 1.43/1.58 1, 3 - -
3 41.9 1.17/1.35 2 - -
4 32.3 - - - -
4a 47.5 1.43 5 5 -
5 26.1 1.58/1.76 4a, 6 6, 6a -
6 74.1 3.57 5 4a, 6a -
6a 77.5 - - - -
7a 75.5 3.99 8 8, 9, 11 8, 11, 12a
8 68.9 4.33 7a, 17 - 7a, 10
9 147.9 - - - -
10 71.3 3.99 11, 17 - 8
11 78.8 3.27 10 12 7a, 12-Ha
11a 71.6 - - - -
12 30 1.58/1.99 12a 7a -
12a 42.1 2.27 12 1, 6a 4a, 12-Ha, 16
12b 36.8 - - - -
13 14.3 0.77 - 1, 4a, 12a, 12b -
14 32.1 0.81 - 3, 4, 4a, 15 -
15 20.3 0.76 - 3, 4, 4a -
16 23.1 1 - 6, 7a, 12a 4a, 6, 12-Ha
17 103.6 5.06/5.16 8, 10 8, 9, 10 -
Die Auswertung des H,H-COSY-Spektrums, dessen Kopplungen ebenfalls in Tabelle 4
aufgelistet sind, führt zu den in Abbildung 77 gezeigten Fragmenten A–D.
Isolierung und Strukturaufklärung 59
H H
HO OH
HO OH
17
9
810
7a
HO
4a
5
6
3
2
1
12a
12
11
AB
CD
Abbildung 77: Fragmente aus dem H,H-COSY-Spektrum von Naturstoff 70677d
Mit Hilfe des HMBC-Spektrums können die Fragmente B, C und D zusammen mit den
quartären Kohlenstoffatomen 4a, 6a und 12b, sowie den Methylgruppen 13, 14 und 15 zu dem
in Abbildung 78 dargestellten Fragment E zusammengefügt werden. Damit besteht die
Substanz aus den Fragmenten A und E, sowie dem quartären, sauerstoffsubstituierten
Kohlenstoffatom 11a, das in Abbildung 78 als Fragment F bezeichnet wird.
HO
HO
HO
HO
OH
OH
12
3
4
5
6
7a
6a
4a
8910
11
11a
12
12a
12b
13
1415
16
17
OH
E
A
F
Abbildung 78: Verknüpfung der Fragmente aus dem H,H-COSY-Spektrum mit Hilfe des HMBC-
Spektrums von Naturstoff 70677d
Für die Verknüpfung der Fragmente A, E und F aus Abbildung 78 gibt es nur eine sinnvolle
Möglichkeit, bei der das Kohlenstoffatom 11a mit den Kohlenstoffatomen 7a, 11 und 12
Isolierung und Strukturaufklärung 60
verbunden ist. Dabei ist jedoch noch die eingeschränkte Rotation der CH2-Gruppe 12 zu
beachten, die für das Vorliegen eines vierten Ringes spricht. Dieser entsteht durch eine
Etherbrücke zwischen den Kohlenstoffatomen 6a und 7a. Für den Naturstoff 70677d ergibt
sich somit die Struktur 42 (Abbildung 79), die sich bei einer Suche in den Chemical Abstracts
als literaturunbekannt erwies. Dem Naturstoff wurde der Name Coniothyrenol gegeben.
O
HO
HO
OH
OH
OH
H
H
H
Coniothyrenol (42)
Abbildung 79: Ein literaturunbekannter Naturstoff aus Coniothyrium sp.
Um die relative Konfiguration des Naturstoffs zu bestimmen, wurde zunächst ein NOESY-
Spektrum in deuteriertem Methanol gemessen. Aus den in Tabelle 4 aufgelisteten NOESY-
Kopplungen lies sich die relative Konfiguration der tertiären Kohlenstoffatome feststellen.
Wie in Abbildung 80 dargestellt, gibt es am Kohlenstoffatom 11a ein Stereozentrum über
dessen Konfiguration anhand des NOESY-Spektrums keine Aussage gemacht werden kann.
7a
11a
10
O
HO
HO
OH
OH
OH
H
H
H
Abbildung 80: Relative Konfiguration aus dem NOESY-Spektrum von Naturstoff 70677d
Um die relative Konfiguration des Kohlenstoffatoms 11a zu bestimmen wurde durch Herrn
PD Dr. H. Egold ein DPFGSE-NOE-Spektrum in deuteriertem DMSO gemessen. Die zentrale
Pulssequenz wirkt dabei ähnlich wie ein normales Spin Echo-Experiment mit einem
selektiven 180°-Puls. Dadurch wird nur das Proton detektiert, welches im Frequenzbereich
dieses Pulses liegt. Anschließend folgt die gewohnte Pulssequenz des NOE-Spektrums, die
um einen zusätzliche Feldgradienten erweitert ist. Detektiert werden auf diese Weise nur das
Isolierung und Strukturaufklärung 61
selektierte Signal (in anti-Phase) und die Signale, die einen NOE zeigen.[81] Für das
vorliegende Spektrum wurde das Multiplett bei 3.99 ppm gewählt, das zu den Protonen an
den Kohlenstoffatomen 7a und 10 gehört. Da beide Protonen auf die gleiche Seite des
Moleküls zeigen, kann bei einer Übertragung der Anregung auf die Hydroxygruppe von
beiden Protonen aus auf die gleiche Konfiguration geschlossen werden. Das gemessene
DPFGSE-NOE-Spektrum zeigt eine Übertragung der Anregung auf alle fünf Hydroxygruppen
des Moleküls. Da die Protonen der Hydroxygruppen untereinander schneller austauschen als
das Spektrum aufgenommen werden kann, ist es unmöglich, ein einzelnes Proton einer
Hydroxygruppe anzuregen. Dennoch kann die Konfiguration des Kohlenstoffatoms 11a
bestimmt werden, da wie in Abbildung 80 bereits gezeigt, vier der Hydroxygruppen räumlich
zu weit von den angeregten Protonen entfernt sind. Die ursprünglich angeregte
Hydroxygruppe kann also nur noch die am Kohlenstoffatom 11a sein, die somit in die gleiche
Richtung zeigen muß, wie das Proton am Kohlenstoffatom 7a. Daraus ergibt sich die in
Struktur 42 (Abbildung 79) gezeigte relative Konfiguration des Moleküls.
2.5.7 Naturstoff 70677f
Der Naturstoff 70677f wurde als farbloses Öl erhalten, das sich gut in Methanol löst. Auf dem
DC ist die Substanz durch ihre gelbe Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar
und hat einen Rf-Wert von 0.06 (Laufmittel CH2Cl2/MeOH 8:2). Aus dem 1H-NMR-Spektrum
lassen sich eine disubstituierte Doppelbindung mit einer cis-Kopplung, vier CH-Gruppen, von
denen zwei sauerstoffsubstituiert sind, und eine Methylgruppe erkennen. Im 13C-NMR-
Spektrum zeigt sich zusätzlich ein Carbonylgruppensignal bei 176.9 ppm. Das H,H-COSY-
Spektrum weist die in Abbildung 81 durch Pfeile symbolisierten Kopplungen auf.
Abbildung 81: Kopplungen aus dem H,H-COSY-Spektrum
Unter Berücksichtigung des CI-Massenspektrums, das eine Molekülmasse von 172.1 anzeigt,
läßt sich als Substituent für die letzte freie Position eine Carbonsäuregruppe bestimmen. Auf
die relative Konfiguration des Naturstoffs kann anhand der Größe der Kopplungskonstanten
geschlossen werden. Das Proton der CH-Gruppe 6 weist eine axial-äquatorial-Kopplung zu
Isolierung und Strukturaufklärung 62
dem Proton der CH-Gruppe 5 auf (Abbildung 82, a), wohingegen die Kopplung zu der CH-
Gruppe 1 einer axial-axial-Position der beiden Protonen entspricht. Das Proton der CH-
Gruppe 1 zeigt seinerseits noch eine axial-axial-Kopplung zu dem Proton der CH-Gruppe 2
(Abbildung 82, b).
Abbildung 82: Herleitung der relativen Konfiguration des Naturstoffs anhand der Kopplungen
Ein Vergleich mit dem bereits isolierten Massarilacton A läßt vermuten, daß beide Substanzen
auf dem gleichen Biosyntheseweg produziert werden und somit die gleiche absolute
Konfiguration haben sollten. Damit ergibt sich für Naturstoff 70677f die Struktur 43
(Abbildung 83), die vermutlich auch die absolute Konfiguration des Naturstoffs wiedergibt.
OH
HO
HO
O
Massarigenin E (43)
Abbildung 83: Ein literaturunbekannter Naturstoff aus Coniothyrium sp.
Der literaturunbekannte Naturstoff weist damit eine gewisse Ähnlichkeit mit dem
Massarigenin A (44, Abbildung 84) auf, das ebenfalls von J. B. Gloer et al.[82] aus Massarina
tunicata isoliert wurde und seinerseits von dem Massarilacton A (37, Abbildung 67)
abgeleitet werden kann. Auf Grund der Abstammung wird dem Naturstoff 70677f (43,
Abbildung 83) der Name Massarigenin E gegeben.
Isolierung und Strukturaufklärung 63
O
O
OH
HO
OH
Massarigenin A (44)
Abbildung 84: Ein bekannter Naturstoff aus Massarina tunicata
2.6 Stamm 6754
Der nicht identifizierte Stamm 6754, aus Trifolium dubium bei Wustrow an der Ostsee, wurde
für 28 Tage in einer Dinkel-Gerste-Kultur bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend
lyophylisiert. Das Lyophylisat wurde mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt zeigte im
Agardiffusionstest Aktivität gegen Bacillus megaterium, Microbotryum violaceum, Chlorella
fusca, Septoria tritici, Botrytis cinerea und Phytophtora infestans.
2.6.1 Isolierung des Naturstoffs
Der gewonnene Rohextrakt, wurde auf Grund des außergewöhnlich hohen Fettanteils mit
Hexan extrahiert und die Hexanphase verworfen. Der entfettete Rohextrakt wurde mittels
einer Säulenchromatographie an Kieselgel in 5 Fraktionen aufgeteilt. Fraktion 5 lieferte durch
Kristallisation aus Dichlormethan/Methanol den Naturstoff 67545 (45).
2.6.2 Naturstoff 67545
Der Naturstoff 67545 wurde in Form farbloser Kristalle erhalten, die sich gut in Methanol
lösen und einen Schmelzpunkt von 128–130 °C haben. Auf dem DC (Rf-Wert 0.16,
Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) ist die Substanz ausschließlich durch ihre schwach gelbe
Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure zu detektieren. Das 1H-NMR-Spektrum weist
neben einem Methylsignal bei 2.10 ppm vier Signale zwischen 3.81 und 4.40 ppm auf. Zwei
der Signale zeigen eine geminale Kopplung und bilden jeweils ein Doppeldublett, das dritte
ist ein Dublett und das vierte zeigt drei verschiedene Kopplungen. Daraus ergibt sich das in
Abbildung 85 dargestellte Fragment.
Isolierung und Strukturaufklärung 64
O
O
O
Abbildung 85: Fragment des Naturstoffs 67545 anhand des Kopplungsmusters
Das 13C-NMR-Spektrum weist neben den vier erwarteten sp2-hybridisierten
Kohlenstoffsignalen ein Carbonylgruppensignal bei 171.9 ppm auf. Zusammen mit dem
Methylsignal bei 19.5 ppm ergibt sich eine Acetylgruppe, die an eine der Hydroxygruppen
gebunden sein muß, wobei die chemische Verschiebung der beiden Protonen der CH2-Gruppe
von 4.19 und 4.40 ppm für eine Verknüpfung mit dem Sauerstoff an der CH2-Gruppe spricht.
Da das CI-Massenspektrum eine Molekülmasse von 266.2 anzeigt und das ermittelte
Fragment eine Molekülmasse von 133.1 hat, handelt es sich bei Naturstoff 67545 um die
symmetrische Struktur 45 (Abbildung 86).
O
OH
OH
OH
OH
O
O
O
1,6-Di-O-acetyl-D-mannitol (45)
Abbildung 86: Ein Naturstoff aus einem nicht identifizierten Pilz, der bislang nur als Syntheseprodukt
bekannt ist
Um die relative Konfiguration zu ermitteln, wurde die Röntgenstruktur eines Kristalls
gemessen. Wie aus Abbildung 87 zu erkennen ist, befinden sich die zwei äußeren
Hydroxygruppen in anti-Position zueinander, die zwei mittleren stehen in syn-Position.
Abbildung 87: Röntgenstruktur von Naturstoff 67545
Isolierung und Strukturaufklärung 65
Damit handelt es sich bei dem zugrunde liegenden Hexitol um Mannitol. Ein Vergleich des
spezifischen Drehwinkels von +10.5° mit denen von 1,6-Di-O-benzoyl-D-mannitol
(+12.0°)[83] und 1,6-Di-O-(2-isocyano-3-methylcrotonyl)-D-mannitol (+16.0°)[84], führt zu
dem Schluß, daß es sich bei Naturstoff 67545 um 1,6-Di-O-acetyl-D-mannitol handelt. Der
Naturstoff 67545 ist somit bislang nur aus der Synthese bekannt[85], nicht jedoch als
Sekundärmetabolit eines Pilzes.
2.7 Stamm 6579
Der Stamm 6579, Ulocladium sp. aus der Rotalge Polysiphonia sp. aus der Ostsee bei
Ahrenshoop, wurde auf Dinkel-Gerste-Medium 28 Tage bei Raumtemperatur kultiviert.
Anschließend wurde die Kultur lyophylisiert und das Lyophylisat mit Ethylacetat extrahiert.
Der Extrakt zeigte im Agardiffusionstest Aktivität gegen Bacillus megaterium, Microbotryum
violaceum und Chlorella fusca.
2.7.1 Isolierung des Naturstoffs
Der Rohextrakt wurde mittels Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem
Dichlormethan/Methanol-Gradienten in 4 Fraktionen aufgetrennt. Fraktion 3 lieferte nach
einer weiteren Säulenchromatographie an Kieselgel den Naturstoff 65793a (46).
2.7.2 Naturstoff 65793a
Der Naturstoff 65793a wurde in Form eines gelben Öls erhalten, das sich gut in
Dichlormethan löst. Die Substanz hat einen Rf-Wert von 0.93 (Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1)
und ist auf dem DC durch ihre intensive, gelbe Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure
detektierbar. Aus den 1H- und 13C-NMR-Spektren lassen sich sieben CH3-Gruppen, drei CH2-
Gruppen, elf CH-Gruppen und fünf quartäre Kohlenstoffatome erkennen. In Tabelle 5 sind
die chemischen Verschiebungen und alle eindeutig zuzuordnenden Kopplungen aus den 2D-
NMR-Spektren aufgeführt. Das EI-Massenspektrum zeigt einen Molekülpeak bei 429.3 und
läßt somit auf eine ungerade Anzahl an Stickstoffatomen im Molekül schließen. Außerdem
kann errechnet werden, daß die Struktur noch zusätzlich vier Sauerstoffatome enthalten muß,
woraus sich eine Summenformel von C26H39NO4 ergibt.
Isolierung und Strukturaufklärung 66
Tabelle 5: Kopplungen aus den 2D-NMR-Spektren von Naturstoff 65793a
Atomnummer 13C-NMR 1H-NMR H,H-COSY HMBC INADEQUATE
1 35.1 4.17 2, 8a
2, 4a, 8a, 9, 12,
21 -
2 51.4 2.33 1
2, 3, 4, 9, 21,
22, 23 1, 3, 21
3 125.1 5.26 4, 2 1, 2, 4a, 21 -
4 133.7 5.73 2, 3, 4a 2, 4a, 8a 3, 4a
4a 39.9 2 3, 5 - -
5 37.6 1 4a 4, 4a, 6 -
6 33.2 1.4 - - 5
7 37.8 1.64 - - -
8 37.7 1.21 - 7 -
8a 41.8 2.14 1 4a -
9 190.1 - - - 1
11 173.5 - - - -
12 103.8 - - - -
13 194.0 - - - -
14 69.8 3.6 16
11, 13, 16, 17,
19 -
15 26.6 2.87 - 11, 14 -
16 35.7 1.88 14, 17, 19 13, 14, 19 14, 19
17 25.1 1.49/1.64 18 14, 18 16, 18
18 12.4 0.9 17 - -
19 13.9 0.76 16 14, 16 16
21 62.9 - - - -
22 58.6 2.73 - 2, 21, 24 21
Aus dem H,H-COSY-Spektrum konnten die in Abbildung 88 dargestellten Fragmente A und
B ermittelt werden.
1
2
3
45
14
16
17
18
19
4a
AB
Abbildung 88: Fragmente aus dem H,H-COSY-Spektrum
Isolierung und Strukturaufklärung 67
Das zweidimensionale INADEQUATE-Spektrum ermöglicht die Erweiterung des Fragmentes
A zu dem Fragment C aus Abbildung 89. Weiterhin kann auf Grund der chemischen
Verschiebung des Kohlenstoffatoms 14 aus Fragment B in Abbildung 88 auf eine Sauerstoff-
oder Stickstoffsubstitution geschlossen werden. Damit enthält die Substanz die in Abbildung
89 dargestellten Fragmente.
9
X
1
2
3
456
8
14
16
17
18
19
21
22
23
4a
24
25
26
O
O
BCD
Abbildung 89: Fragmente aus dem INADEQUATE-Spektrum
Mit Hilfe des HMBC-Spektrums läßt sich das Fragment C mit dem Fragment D und den
Kohlenstoffatomen 7 und 12 zu dem Fragment E aus Abbildung 90 verknüpfen. Unter der
Berücksichtigung der chemischen Verschiebung des Kohlenstoffatoms 15 von 26.6 ppm, die
für eine Stickstoffsubstitution spricht, läßt sich Fragment B aus Abbildung 89 zu dem
Fragment F aus Abbildung 90 erweitern. Damit besteht die Struktur aus den in Abbildung 90
gezeigten Fragmenten E und F, sowie zwei weiteren Sauerstoffatomen.
N
1
2
3
4
56
7
8
9
11
12
13
14 15
16
17
18
19
21
22
23
4a
8a
24
25
26
O
E
O
F
Abbildung 90: Fragmente aus dem HMBC-Spektrum
Als einzige Möglichkeit ergibt sich eine Verknüpfung des Kohlenstoffatoms 12 aus
Fragment E (Abbildung 90) mit den Kohlenstoffatomen 11 und 13 zu einem Fünfring. Die
beiden Kohlenstoffatome 11 und 13 müssen außerdem noch sauerstoffsubstituiert sein. Damit
ergeben sich zwei mögliche Strukturen, bei denen die Doppelbindung entweder zwischen den
Kohlenstoffatomen 12 und 13 oder zwischen 11 und 12 liegt. Auf Grund der geringen
Stabilität eines gemischten N,O-Ketenacetals muß das Kohlenstoffatom 11 jedoch eine
Isolierung und Strukturaufklärung 68
Carbonylgruppe sein. Somit ergibt sich für den Naturstoff 65793a die Struktur 46 (Abbildung
91).
H
H
O
ON
HO
O
H
H
46
Abbildung 91: Der literaturbekannte Naturstoff (5S)-3-({(1S,2R,4aR,6S,8R,8aR)-2-[(2S,3S)-2,3-
Dimethyloxiran-2-yl]-6,8-dimethyl-1,2,4a,5,6,7,8,8a-octahydronaphthalin-1-yl}carbonyl)-5-sec-butyl-4-
hydroxy-1-methyl-1,5-dihydro-2H-pyrrol-2-on hat fungizide und insektizide Wirkung
Eine Suche in den Chemical Abstracts ergibt, daß es sich um eine fungizide und insektizide
Substanz handelt, die 1996 in den USA patentiert wurde.[86] Das Patent wurde in der
Zwischenzeit jedoch aufgegeben.
Betrachtet man die Struktur des Fünfringes, so fällt auf, daß theoretisch noch ein Tautomer
dieser Substanz existiert, bei dem sich die Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 9
und 12 befindet. Beide Strukturen sollten sich miteinander im Gleichgewicht befinden.
Isolierung und Strukturaufklärung 69
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70
C-12
C-11
C-14
C-9
C-13
Abbildung 92: Ausschnitt aus dem 13C-NMR-Spektrum von Substanz 65793a, die zueinander gehörenden
Signale der beiden Tautomere sind mit Pfeilen gekennzeichnet
Tatsächlich weisen die NMR-Spektren der Substanz eine Nebenkomponente auf, die von der
Hauptkomponente nicht trennbar ist. Wie in Abbildung 92 gezeigt wird, befindet sich in der
Nähe der Signale der Kohlenstoffatome 9, 11, 12, 13 und 14 jeweils ein leicht verschobenes
Signal, welches für das Vorhandensein des Tautomers 47 (Abbildung 93) spricht.
H
H
O
HO N
O
O
H
H
Antibiotikum PF 1052 (47)
Abbildung 93: Tautomer des Naturstoffs 65793a, das in Japan für seine antibiotische Wirkung patentiert
wurde
Isolierung und Strukturaufklärung 70
Das Tautomer 47 wurde in Japan patentiert und ihm wurde eine antibiotische Wirkung
nachgewiesen.[87]
2.8 Stamm 6586
Bei dem Stamm 6586 handelt es sich um Acremonium sp., der aus Enteromorpha linza bei
Ahrenshoop an der Ostsee isoliert wurde. Der Stamm wurde für 21 Tage bei Raumtemperatur
auf Biomalz-Festagar angezüchtet und nach Ablauf dieser Zeit tiefgefroren. Nach dem
Auftauen wurde die Kultur filtriert. Das Filtrat und die Biomasse wurden mit Ethylacetat
extrahiert. Der Rohextrakt zeigte im Agardiffusionstest Aktivität gegen Microbotryum
violaceum, Bacillus megaterium und Chlorella fusca.
2.8.1 Isolierung der Naturstoffe
Der resultierende Rohextrakt wurde mittels Säulenchromatographie an Kieselgel in sieben
Fraktionen aufgetrennt. Fraktion 3 enthielt den Naturstoff 65863a (48), der durch
Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 gewonnen wurde. Aus Fraktion fünf wurden
durch Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 der Naturstoff 65865a (49) und durch
anschließende Kristallisation der zweiten Fraktion der Gelchromatographie der Naturstoff
65865b (50) isoliert.
2.8.2 Naturstoff 65863a
Der Naturstoff 65863a wurde in Form eines schwach gelben Öls erhalten, das sich gut in
Dichlormethan und Chloroform löst. Auf dem DC ist die Substanz durch Anfärbung mit
Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar und hat einen Rf-Wert von 0.61 (Laufmittel
CH2Cl2/MeOH 9:1). Im 1H-NMR-Spektrum sind fünf Protonen im Bereich zwischen 5.67 und
6.70 ppm zu erkennen, wovon zwei mit ihren chemischen Verschiebungen von 5.67 und
6.29 ppm und der Kopplungskonstante von 9.7 Hz zu einer disubstituierten Doppelbindung in
Z-Konfiguration gehören. Das Kopplungsmuster der verbleibenden drei Signale weist ein
Doppeldublett mit einer ortho- und einer meta-Kopplung und zwei Dubletts auf, von denen
eines eine ortho- und das zweite eine meta-Kopplung zeigt. Daraus ergibt sich ein
aromatischer Ring mit einer 1,2,4-Substitution. Zuletzt ist noch ein Signal bei 1.44 ppm mit
der relativen Intensität 6 zu erkennen, das zu zwei Methylgruppen gehört. Das 13C-NMR-
Spektrum weist zusätzlich zu den CH3- und CH-Signalen noch die Signale von zwei
Isolierung und Strukturaufklärung 71
sauerstoffsubstituierten, aromatischen Kohlenstoffatomen, einem quartären, aromatischen
Kohlenstoffatom und einem quartären, sauerstoffsubstituierten Kohlenstoffatom auf. Die
beiden sauerstoffsubstituierten Kohlenstoffatome müssen in para-Position angeordnet sein, da
die meta-Position der beiden Sauerstoffe am Ring eine Verschiebung des Protonensignals des
mittleren Protons zu höherem Feld und eine ortho-Position der beiden Sauerstoffe eine
Verschiebung der beiden sauerstoffsubstituierten Kohlenstoffe zu höherem Feld bedingen
würde. Die Verknüpfung der Methylgruppen mit dem quartären Kohlenstoffatom stellt die
einzige Möglichkeit dar, zwei chemisch identische Methylgruppen zu erhalten. Somit besteht
die Substanz aus den in Abbildung 94 dargestellten Fragmenten A–C.
O
O
O
AB
C
Abbildung 94: Fragmente des Naturstoff 65863a
Unter Berücksichtigung der nicht sehr großen Polarität der Substanz, ergibt sich eine
Verknüpfung zweier sauerstoffsubstituierter Kohlenstoffatome über ein Sauerstoffatom. Dies
führt zu der Struktur 48, als einzig mögliche Verknüpfung.
O
HO
2,2-Dimethylchromen-6-ol (48)
Abbildung 95: Ein bekannter Naturstoff, der von B. M. Howard isoliert wurde
Eine Recherche in den Chemical Abstracts ergab, daß die Substanz bereits 1979 von B.M.
Howard isoliert wurde.[88] Der Vergleich mit den Literaturdaten des 1H-NMR-Spektrums
ergab eine völlige Übereinstimmung.
2.8.3 Naturstoff 65865a
Der Naturstoff 65865a bildet farblose Kristalle (Smp.: 118–122 °C), die sich gut in
mittelpolaren Lösungsmitteln wie Aceton lösen und sich unter Licht- und
Sauerstoffeinwirkung schwarz färben. Die Substanz hat einen Rf-Wert von 0.42 (Laufmittel
CH2Cl2/MeOH 9:1) und läßt sich auf dem DC mit Anisaldehyd/Schwefelsäure orange-braun
Isolierung und Strukturaufklärung 72
anfärben. Das 1H-NMR-Spektrum weist im Aromatenbereich das gleiche Kopplungsmuster
wie Naturstoff 65863a (48) auf, woraus sich wieder auf einen 1,2,4-trisubstituierten Aromaten
schließen läßt. Weiterhin zeigt sich noch ein Methylgruppensignal, das auf Grund der
chemischen Verschiebung direkt mit dem Aromaten verknüpft sein muß. Aus dem 13C-NMR-
Spektrum läßt sich ebenso wie im Fall des Naturstoffs 65863a auf eine Sauerstoffsubstitution
zweier aromatischer Kohlenstoffatome schließen. Damit ergibt sich für den Naturstoff 65865a
die Struktur 49, deren chemischer Name 1,4-Dihydroxy-2-methylbenzol lautet, und die unter
anderem unter dem Namen Toluquinol in der Literatur[89] zu finden ist. Ein Vergleich der 13C-
NMR-Daten ergab eine völlige Übereinstimmung.
OH
HO
Toluquinol (49)
Abbildung 96: Ein bekannter Naturstoff, der bereits 1979 von S. T. Carey isoliert wurde
2.8.4 Naturstoff 65865b
Der Naturstoff 65865b wurde in Form eines weißen Feststoffs erhalten, der sich gut in
Dichlormethan löst und einen Schmelzpunkt von 223–226 °C hat. Die Substanz hat einen Rf-
Wert von 0.50 (Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) und ist auf dem DC durch eine blaue
Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar. Das 1H-NMR-Spektrum weist die
Signale von acht Methylgruppen, drei sp2-hybridisierten CH-Gruppen, zwei
sauerstoffsubstituierten, sp3-hybridisierten CH-Gruppen sowie vierzehn weiteren Protonen
auf, deren Signale durch die starke Überlagerung nur mit Hilfe des HMQC-Spektrums
weiteren vier CH- und fünf CH2-Gruppen zugeordnet werden können. Das 13C-NMR-
Spektrum zeigt zusätzlich zu den acht Methyl-, neun CH- und fünf CH2-Gruppensignalen
noch fünf Carbonyl-, drei quartäre, sp2-hybridisierte und drei quartäre, aliphatische
Kohlenstoffsignale. Die chemischen Verschiebungen der Protonen und Kohlenstoffatome,
sowie ihre Zuordnung und Kopplungen aus den H,H-COSY- und HMBC-Spektren sind in
Tabelle 6 zusammengefaßt.
Isolierung und Strukturaufklärung 73
Tabelle 6: 1H- und 13C-NMR-Daten und Kopplungen aus den H,H-COSY- und HMBC-Spektren von
Naturstoff 65865b
Atomnummer 13C-NMR 1H-NMR H,H-COSY HMBC
1 157.3 7.33 2 3, 5, 6, 9, 10
2 127.8 5.89 1 -
3 201.4 - - -
4 40.4 2.8 5, 18 3, 5, 18
5 47.2 2.28 4 3, 7, 10, 18, 22
6 73.8 5.25 - 5, 8, 10
7 208.8 - - -
8 52.7 - - -
9 41.7 2.62 11 8, 10, 19
10 38.2 - - -
11 23.9 1.57/2.00 9, 12 -
12 25.9 1.85/2.50 11, 13 -
13 49.4 2.62 12 8
14 46.6 - - -
15 40.7 1.94/2.28 - 13, 14, 16, 17
16 73.5 5.89 - -
17 147.7 - - -
18 13.1 1.3 4 3, 4, 5
19 168.9 - - -
20 20.7 2.13 - 19
21 18.3 1.2 - 8, 9, 14
22 27.5 1.47 - 1, 5, 10
23 17.9 0.95 - 8, 13, 14, 15
24 170.2 - - -
25 20.5 1.97 - 24
26 174.1 - - -
27 130.4 - - -
28 28.6 2.5 - -
29 28.3 2.09 28, 30 -
30 122.8 5.13 29, 31, 33 -
31 132.9 - - -
32 25.7 1.71 30 30, 31
33 17.8 1.63 30 30, 31
Isolierung und Strukturaufklärung 74
Die chemischen Verschiebungen von zwei Carbonylgruppen von 201.4 und 208.8 ppm
gehören zu Ketonen, bei den verbleibenden drei Carbonylgruppen handelt es sich um zwei
Ester- und eine Säuregruppe. Die sechs sp2-hybridisierten Kohlenstoffatome bilden eine di-,
eine tri- und eine tetrasubstituierte Doppelbindung, wobei die chemischen Verschiebungen
der disubstituierten Doppelbindung von 127.8 und 157.3 ppm für eine Polarisierung durch die
Konjugation mit einer Carbonylgruppe sprechen. Die Auswertung des H,H-COSY-Spektrums
führte zu den in Abbildung 97 dargestellten Fragmenten A–D.
1
2
411
12
18
28
29
30
31
32
33
5
O
AB
CD
Abbildung 97: Fragmente aus den 1H-, 13C- und H,H-COSY-Spektren von Naturstoff 65865b
Mit Hilfe des HMBC-Spektrums konnten die Fragmente A, C und D aus Abbildung 97
zusammengefügt und zu dem in Abbildung 98 dargestellten Fragment E vergrößert werden.
Damit besteht der Naturstoff 65865b aus den Fragmenten B, E und F.
1
2
3467
8
9
11
12
13
141516
17
18 19 20
21
22
23 24
25 26
10
27
28
29
30
31
32
33
5
E
O
O
O
O
O
O
O
OH
BF
Abbildung 98: Fragmente aus dem HMBC-Spektrum von Naturstoff 65865b
Die chemischen Verschiebungen der tetrasubstituierten Doppelbindung von 130.4 und
147.7 ppm weisen ebenfalls auf eine Polarisierung der Doppelbindung hin, weshalb die
Isolierung und Strukturaufklärung 75
Fragmente E und F aus Abbildung 98 über das Kohlenstoffatom 27 verknüpft werden können.
Außerdem sprechen die chemischen Verschiebungen der Kohlenstoffatome 13, 14, 15 und 16
(siehe Tabelle 6) aus Abbildung 98 für das Vorliegen eines Fünfringes, woraus sich eine
Verknüpfung der Kohlenstoffatome 13 und 17 ergibt. Damit müssen die Fragmente B und E
über die Kohlenstoffatome 27 und 28 miteinander verbunden werden. Auf diese Weise ergibt
sich für den Naturstoff 65865b die Struktur 50 (Abbildung 99), die als Helvolinsäure bekannt
ist und bereits 1943 von Waksman et al.[90] unter dem Namen Fumigacin isoliert wurde.
Später konnte gezeigt werden, daß es sich bei dem isolierten Fumigacin um eine Mischung
aus Gliotoxin und der damals unbekannten, antibiotisch wirksamen Helvolinsäure
handelte.[91]
OH
O
O
O
O
O
O
OH
H
H
Helvolinsäure (50)
Abbildung 99: Ein bereits sein 1943 bekannter Naturstoff, der von Waksman et al. isoliert wurde
2.9 Stamm 7165
Bei dem Stamm 7165 handelt es sich um Nigrospora sp., der aus Viburnum rigidum von
Gomera isoliert wurde. Der Pilz wurde 28 Tage auf Biomalz-Festagar angezüchtet und mit
Ethylacetat extrahiert. Der Rohextrakt zeigte gute fungizide, algizide und antibakterielle
Aktivität und eine mittelmäßige herbizide Wirkung.
2.9.1 Isolierung der Naturstoffe
Der Rohextrakt wurde mittels Säulenchromatographie an Kieselgel in 5 Fraktionen
aufgetrennt. Aus Fraktion 1 kristallisierte der Naturstoff 71651b (52) aus
Dichlormethan/Hexan. Aus der Mutterlauge konnten mittels einer weiteren
Säulenchromatographie an Kieselgel die Naturstoffe 71651a (51) und 71651c (53) isoliert
Isolierung und Strukturaufklärung 76
werden. Fraktion 2 lieferte nach Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 die Naturstoffe
71652a (54) und 71652b (55).
2.9.2 Naturstoff 71651a
Der Naturstoff 71651a wurde in Form eines weißen Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von
51–52 °C erhalten, der sich gut in unpolaren Lösungsmitteln wie Dichlormethan und Hexan
löst. Auf dem DC (Rf-Wert 0.91, Laufmittel CH2Cl2) ist die Substanz durch UV-Löschung bei
254 nm und ihre leuchtend blaue Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure zu detektieren.
Das 1H-NMR-Spektrum weist sechs aromatische Protonen im Bereich von 6.73 bis 7.56 ppm,
eine schwach chelierte Hydroxygruppe bei 9.49 ppm sowie eine Methoxygruppe bei 3.97 ppm
auf. Von den sechs aromatischen Protonen sind zwei hochfeldverschoben, was auf eine
Nachbarschaft zu einem sauerstoffsubstituierten Kohlenstoffatom hindeutet. Das 13C-NMR-
Spektrum weist im Einklang dazu zwei tieffeldverschobene Signale bei 155.1 und 156.6 ppm
auf. Insgesamt lassen sich aus dem 13C-NMR- und dem DEPT-Spektrum zehn aromatische
Kohlenstoffatome erkennen, von denen vier quartär sind. Daraus läßt sich auf ein zweifach
sauerstoffsubstituiertes Naphthalin-Grundgerüst schließen. Die chemische Verschiebung der
beiden nicht-sauerstoffsubstituierten, quartären Kohlenstoffatome von 115.6 und 137.3 ppm
deutet darauf hin, daß beide Sauerstoffsubstitutionen in ortho-Stellung zu dem
Kohlenstoffatom bei 115.6 ppm und in meta-Stellung zu dem bei 137.3 ppm stehen müssen.
Damit ergibt sich eine 1,8-Substitution für das Naphthalin-Grundgerüst. Es handelt sich bei
Naturstoff 71651a somit um 8-Methoxynaphthalen-1-ol (51, Abbildung 100), das bereits 1995
von H. Anke isoliert wurde.[92]
OH O
8-Methoxynaphthalen-1-ol (51)
Abbildung 100: Ein bekannter Naturstoff, der schwache Aktivität gegen Phytophtora infestans, Botrytis
cinerea und Septoria tritici zeigt
Die Substanz erwies sich bei den in-vitro-Aktivitätstests, die an einer vorher im Arbeitskreis
von Prof. Krohn von Dr. Dai Jingqiu isolierten Probe durchgeführt wurden, als schwach aktiv
gegen Phytophtora infestans, Botrytis cinerea und Septoria tritici.
Isolierung und Strukturaufklärung 77
2.9.3 Naturstoff 71651b
Der Naturstoff 71651b wurde in Form farbloser Nadeln mit einem Schmelzpunkt von
154–157 °C erhalten, die sich gut in Dichlormethan lösen. Die Substanz hat einen Rf-Wert
von 0.80 (Laufmittel CH2Cl2) und ist auf dem DC durch UV-Löschung bei 254 nm und eine
leuchtend blaue Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar. Die 1H- und 13C-
NMR-Spektren zeigen eine Methoxygruppe, drei CH-Gruppen und drei quartäre
Kohlenstoffatome. Die chemische Verschiebung eines der drei quartären Kohlenstoffatome
von 157.5 ppm spricht für eine Sauerstoffsubstitution und die Lage der Signale einer CH-
Gruppe von 106.6 ppm für das Kohlenstoffatom und 6.90 ppm für das Proton zeigen die
Nachbarschaft zu dem sauerstoffsubstituierten Kohlenstoffatom an. Die Multiplizität dieses
Protonensignals mit einer ortho- und einer meta-Kopplung führt schließlich zu dem in
Abbildung 101 dargestellten Fragment.
O
H
H
H
Abbildung 101: Fragment des Naturstoff 71651b aus den 1H- und 13C-NMR-Spektren
Die chemischen Verschiebungen der beiden verbleibenden quartären Kohlenstoffatome von
137.8 und 118.0 ppm schließen eine weitere Heteroatomsubstitution aus. Deshalb bleibt nur
die Möglichkeit, daß es sich um ein symmetrisches Molekül handelt. Damit ergibt sich für
den Naturstoff 71651b die Struktur des 1,8-Dimethoxynaphthalins (52, Abbildung 102), das
1995 zusammen mit dem 8-Methoxynaphthalen-1-ol isoliert wurde.[92]
O O
1,8-Dimethoxynaphthalin (52)
Abbildung 102: Ein bekannter Naturstoff, der von H. Anke zusammen mit dem 8-Methoxy-
naphthalen-1-ol isoliert wurde
Das 1,8-Dihydroxynaphthalin, das den Naturstoffen 51 und 52 zugrunde liegt, stellt einen
Baustein zur Biosynthese der Palmarumycine dar. In Abbildung 103 ist das einfachste,
bekannte Palmarumycin dargestellt. Die Palmarumycine zählen zu den Spirobisnaphthalinen
Isolierung und Strukturaufklärung 78
und werden wahrscheinlich durch oxidative Kupplung der einzelnen Bausteine gebildet.[93]
Trotz des Vorhandenseins der Bausteine konnten jedoch keine Dimere aus dem untersuchten
Pilz isoliert werden.
O O
OHO
Palmarumycin CP1 (52a)
Abbildung 103: Der einfachste Vertreter der Gruppe der Palmarumycine
2.9.4 Naturstoff 71651c
Der Naturstoff 71651c wurde in Form eines schwach gelben Öls erhalten, das sich in
unpolaren Lösungsmitteln wie Dichlormethan und Hexan löst. Die Substanz ist durch eine
orangerote Anfärbung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure auf dem DC (Rf-Wert 0.85, Laufmittel
CH2Cl2) detektierbar. Im 1H-NMR-Spektrum sind eine Methylgruppe, eine CH2-Gruppe, eine
CH-Gruppe, drei aromatische Protonen und eine chelierte Hydroxygruppe zu erkennen. Die
Multiplizität des CH3-Gruppensignals (Dublett) mit einer Kopplungskonstante von 6.3 Hz
läßt auf eine Verknüpfung mit der CH-Gruppe schließen. Bei dem Signal der CH-Gruppe
handelt es sich um ein Multiplett mit sieben Linien, so daß die CH-Gruppe ihrerseits mit der
CH2-Gruppe verknüpft sein muß. Gleichzeitig zeigt die chemische Verschiebung des Protons
der CH-Gruppe eine Sauerstoffsubstitution an. Die drei aromatischen Protonen zeigen
ausschließlich ortho-Kopplungen, wobei zwei der Signale Dubletts sind und das dritte Signal
ein Triplett darstellt. Weiterhin läßt die chemische Verschiebung der beiden Dubletts mit 6.42
und 6.48 ppm auf Nachbarschaft zu einem sauerstoffsubstituierten Kohlenstoffatom
schließen. Dies wird durch das 13C-NMR-Spektrum bestätigt, das zwei sauerstoffsubstituierte,
aromatische Kohlenstoffatome bei 162.1 und 162.4 ppm zeigt. Die selbst für
sauerstoffsubstituierte Kohlenstoffatome sehr starke Tieffeldverschiebung spricht für eine
meta-Stellung der beiden Sauerstoffatome. Zusammen mit der im 13C-NMR-Spektrum
ebenfalls zu erkennenden Ketogruppe bei 198.9 ppm ergeben sich die in Abbildung 104
gezeigten Fragmente A–C.
Isolierung und Strukturaufklärung 79
O
O
O
O
ABC
Abbildung 104: Fragmente des Naturstoffs 71651c
Da das 1H-NMR-Spektrum eine chelierte Hydroxygruppe anzeigt, muß die Ketogruppe direkt
mit dem aromatischen Ring verknüpft sein. Außerdem sollte das Fragment A mit dem
Fragment C über eine Etherbrücke verbunden sein. Ein Ringschluß zwischen der Ketogruppe
und der CH2-Gruppe führt schließlich zu der Struktur 53 (Abbildung 105).
O
OOH
5-Hydroxy-2-methylchroman-4-on (53)
Abbildung 105: Ein bekannter Naturstoff, der zu den Polyketiden gehört und aus 5 Acetat-Einheiten
gebildet wird
Somit handelt es sich bei Naturstoff 71651c um 5-Hydroxy-2-methylchroman-4-on, das
bereits 1960 im Rahmen einer Untersuchung zu den Biosynthesewegen von Daldinia
concentrica[94] isoliert wurde. Ein Vergleich mit Literaturdaten[95] der 1H- und 13C-NMR-
Daten belegt die Identität der Substanz. Die vorliegende Probe weist keine optische Aktivität
auf, woraus geschlossen werden kann, daß der Naturstoff 71651c als racemisches Gemisch
gebildet wird.
Die Substanz erwies sich bei den in-vitro-Tests, die mit einer von Dr. Dai Jingqiu im
Arbeitskreis von Professor Krohn isolierten Probe durchgeführt worden, als schwach aktiv
gegen Phytophtora infestans und Pyricularia oryzae.
2.9.5 Naturstoff 71652a
Der Naturstoff 71652a wurde in Form von farblosen Kristallen (Smp.: 112–114 °C) erhalten,
die sich gut in Dichlormethan lösen. Die Substanz hat einen Rf-Wert von 0.73 (Laufmittel
CH2Cl2/MeOH 95:5) und ist auf dem DC durch eine rote Anfärbung mit
Isolierung und Strukturaufklärung 80
Anisaldehyd/Schwefelsäure zu detektieren. Im 1H-NMR-Spektrum sind eine Methylgruppe,
zwei CH2-Gruppen, drei aromatische Protonen, von denen zwei chemisch identisch sind,
sowie zwei Hydroxygruppen zu erkennen. Die Multiplizitäten der CH3- (t) und CH2-Gruppen
(tq und t) zwischen 1.03 und 3.16 ppm lassen eine Verknüpfung der drei Gruppen zu einem
n-Propylrest erkennen. Das Kopplungsmuster der aromatischen Protonen weist große
Ähnlichkeit mit dem des Naturstoffs 71651c (53, Abbildung 105) auf. Daher handelt es sich
um ein identisches Substitutionsmuster wie in Abbildung 104. Im 13C-NMR-Spektrum läßt
sich ebenso wie bei Naturstoff 71651c eine Ketogruppe bei 208.5 ppm erkennen. Zusammen
ergibt sich daraus für Naturstoff 71652a die Struktur 54 (Abbildung 106).
OH
OH
O
2,6-Dihydroxybutyrophenon (54)
Abbildung 106: Ein bekannter Naturstoff, der die Vorstufe auf dem Biosyntheseweg von Naturstoff
71651c darstellt
Die Substanz wurde ebenso wie Naturstoff 71651c (53, Abbildung 105) im Rahmen einer
Studie über die Biosynthesewege von Daldinia concentrica[94] isoliert.
2.9.6 Naturstoff 71652b
Der Naturstoff 71652b wurde in Form farbloser Kristalle mit einem Schmelzpunkt von
69–72 °C erhalten, die sich gut in Dichlormethan lösen. Die Substanz ist auf dem DC
(Rf-Wert 0.89, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) durch ihre braune Anfärbung mit
Anisaldehyd/Schwefelsäure detektierbar. Das 1H-NMR-Spektrum weist die Signale von fünf
Methylgruppen und drei CH-Gruppen auf, von denen eine zu einem sp2-hybridisierten und die
andere zu einem sauerstoffsubstituierten Kohlenstoffatom gehört. Bei dem
Methylgruppensignal bei 0.99 ppm handelt es sich um ein Dublett, dessen
Kopplungskonstante zu dem Signal der aliphatischen CH-Gruppe bei 2.72 ppm paßt. Mit
Hilfe des H,H-COSY-Spektrums läßt sich das in Abbildung 107 dargestellte Fragment
erkennen.
Isolierung und Strukturaufklärung 81
O
5
6
9
Abbildung 107: Fragment aus dem H,H-COSY-Spektrum des Naturstoffs 71652b
Das 13C-NMR-Spektrum weist zusätzlich zu den erwarteten fünf Methylgruppen- und drei
CH-Gruppensignalen zwei Carbonylsignale auf, von denen eines zu einem Ester gehört und
eines zu einem Keton. Das hochauflösende Massenspektrum ergibt eine Summenformel von
C12H18O3. Außerdem ist ein quartäres, sp2-hybridisiertes und ein quartäres, sp3-hybridisiertes
Kohlenstoffatom zu sehen. Mit Hilfe des HMBC-Spektrums lassen sich die Signale zu der in
Abbildung 108 gezeigten Kohlenstoffkette verknüpfen.
O
2
3
4
7
5
6
8
9
10
11
12
13
O
O
O
Abbildung 108: Verknüpfungen aus dem HMBC-Spektrum von Naturstoff 71652b
Da die Polarität der Substanz und die chemische Verschiebung der einen Carbonylgruppe von
174.4 ppm, die zu einer Estergruppe gehört, nicht für eine offenkettige Struktur mit freier
Hydroxygruppe sprechen, muß die Estergruppe 2 mit dem sauerstoffsubstituierten
Kohlenstoffatom 6 verbunden sein. Auf diese Weise ergibt sich für den Naturstoff 71652b die
Struktur 55 (Abbildung 109).
O
O
O
Helicascolid C (55)
Abbildung 109: Ein unbekannter Naturstoff aus Nigrospora sp., der seinen Namen von der Ähnlichkeit
mit den Helicascoliden A und B (55a & 55b) erhielt
Die relative Konfiguration des Moleküls mit einem spezifischen Drehwert von +35.0°
(c = 0.1, CH2Cl2) läßt sich aus der Größe der Kopplung der beiden Protonen an den
Isolierung und Strukturaufklärung 82
Stereozentren bestimmen. Wie in Abbildung 110 gezeigt, spricht eine Kopplung von 11.3 Hz
für eine axial-axial-Position der beiden Protonen und damit für eine 5R,6S- oder 5S,6R-
Konfiguration des Moleküls. Die absolute Konfiguration des Naturstoffs konnte nicht
bestimmt werden.
Abbildung 110: Ableitung der relativen Konfiguration aus der Größe der Kopplungskonstante der beiden
Protonen an den Stereozentren von Naturstoff 71652b
Der literaturunbekannte Naturstoff weist große Ähnlichkeit mit den beiden von J. B. Gloer et
al.[96] isolierten Naturstoffen Helicascolid A (55a, Abbildung 111) und B (55b) auf, weshalb
ihm der Name Helicascolid C gegeben wird.
O
O
OH
O
O
OH
Helicascolid A (55a) Helicascolid B (55b)
Abbildung 111: Die bekannten Naturstoffe wurden von J. B. Gloer et al. isoliert
2.9.7 Biosynthese der Naturstoffe aus Stamm 7165
D. C. Allport und J. D. Bu’Lock[94] haben im Jahre 1960 durch Fütterungsversuche mit
14C-makiertem Acetat an verschiedenen Mutanten von Daldinia concentrica bewiesen, daß
2,6-Dihydroxyacetophenon aus vier Acetat-Einheiten aufgebaut wird. In einer Mutante wurde
eine fünfte Acetat-Einheit eingebaut, was zu der Bildung von 2,6-Dihydroxybutyrophenon
(54, Abbildung 106) führte. Dieses wurde hauptsächlich weiter zu 5-Hydroxy-2-
methylchroman-4-on (53, Abbildung 105) und 5-Hydroxy-2-methyl-4H-chromen-4-on
umgesetzt. Eine weitere Mutante von Daldinia concentrica bildete 1,8-Dihydroxynaphthalin,
das dann in die Mono- und Dimethylether (51, Abbildung 100 & 52, Abbildung 102)
übergeführt wurde.
Isolierung und Strukturaufklärung 83
2.10 Biologische Aktivität der Rohextrakte und Reinsubstanzen
Die Aktivitätstests wurden im Arbeitskreis von Prof. Aust und PD Dr. Schulz an der TU
Braunschweig und von der BASF AG durchgeführt. Zur Bestimmung der Aktivität gibt es
zwei Methoden. Bei den Agardiffusionstests wird die Substanz auf ein Zellstoffplättchen
aufgetragen und auf eine Agarplatte gelegt, auf die der Testorganismus überimpft wird.
Während der Inkubationszeit diffundiert die Substanz von dem Zellstoffplättchen in den Agar
und hemmt im Falle einer Aktivität das Wachstum des Testorganismus. Dadurch entsteht ein
kreisförmiger Bereich in dem kein Wachstum stattfindet. Außerhalb dieses Kreises wächst der
Testorganismus ungehemmt. Der Bereich in dem kein Wachstum stattfindet, wird als
Hemmhof bezeichnet. Da durch die Diffusion der Testsubstanz ein Konzentrationsgradient
entlang des Hemmhofradius entsteht, ist seine Größe ein direktes Maß für die Aktivität der
untersuchten Substanz. Der Hemmhofradius wird abzüglich des Radius des
Zellstoffplättchens angegeben.
Bei einem in-vitro-Test mit Mikroorganismen wird eine Nährlösung auf einer Mikrotiterplatte
oder in einem Reagenzglas mit den Testsubstanzen versetzt und anschließend mit dem
Testorganismus angeimpft. Nach der Inkubationszeit wird das Wachstum der Proben mit
einer Blindprobe (ohne Testsubstanz) verglichen. Da die Konzentration der Testsubstanz in
der Lösung einheitlich ist (nicht wie beim Agardiffusionstest), werden mehrere Tests mit
unterschiedlichen Konzentrationen durchgeführt. Angegeben wird das Wachstum des
Testorganismus in Prozent relativ zu der Blindprobe. Nach Angaben der BASF AG wurde ein
Wachstumswert von weniger als 90 Prozent bei einer Konzentration von 2 ppm als gute
Aktivität eingestuft.
Isolierung und Strukturaufklärung 84
Tabelle 7: Biologische Aktivität der untersuchten Rohextrakte im Agardiffusionstest (Hemmhofradius in
mm, WH = Wachstumshemmung)
Stammnummer Bacillus
megaterium
Microbotryum
violaceum
Chlorella
fusca
Septoria
tritici
Botrytis
cinerea
Phytophtora
infestans
6282 30 33 50 - - -
6651 0.6 WH 27 15 17 0 27
6577 9 8 6 WH - - -
7067 7 7 8 7+15 WH 8 19
6754 8 21 15 14 8 35
6579 20 12 7.5 - - -
6586 10 13 7.5 - - -
7165 12 15 15 11 7 12
Tabelle 8: Biologische Aktivität der isolierten Reinsubstanzen im Agardiffusionstest (Hemmhofradius in
mm)
Substanznummer Bacillus
megaterium
Microbotryum
violaceum Chlorella fusca Septoria
tritici
59485a (1 mg/mL) 0 0 0 -
59485a (5 mg/mL) 6 0 5 -
62824a2 (1 mg/mL) 5 0 0 -
62824a2 (5 mg/mL) 15 6 8 -
65772 (1 mg/mL) 0 0 5 WH -
65772 (5 mg/mL) 0 5 5 -
6577c3 (1 mg/mL) 7 WH 5 WH 7 -
6577c3 (5 mg/mL) 7 + 6 WH 9 13 -
6577m4 (1 mg/mL) 0 0 0 -
6577m4 (5 mg/mL) 6 WH 7 WH 0 -
66511b (10 mg/mL) 7 WH 10 10 -
66514a (10 mg/mL) 25 12 12 -
66515a (10 mg/mL) 7 13 5 WH -
70675b (5 mg/mL) 0 0 0 5
Isolierung und Strukturaufklärung 85
Tabelle 9: Ergebnisse der in-vitro-Testung der Reinsubstanzen (Werte in %-Wachstum)
Substanznummer ppm
Phytophtora
infestans
Botrytis
cinerea
Pyricularia
oryzae Septoria tritici
125 5.3 0.2 0 3.9
31 2.4 0.2 0.3 0.4
8 58.5 42 0 0
2 100 83.6 0 68.6
0.5 100 82.3 87 100
6577c3
0.125 100 83.2 100 100
125 2.6 50.3 5.8 10.9
31 1.6 55.9 74.1 29.1
8 6.3 75.2 87.4 61.5
2 82.3 77.9 86.4 65.4
0.5 100 81.5 85.4 72.8
65772
0.125 100 77.3 84.5 74
125 42.6 90.7 100 100
31 85.1 85.6 92 100
8 99.5 76 89.5 99.3
2 95.2 79.8 88.9 90.4
0.5 100 80.7 91.2 86.1
6577m4
0.125 99.9 81.4 89.7 85.3
125 16 70.1 0 48.4
31 59.4 86.4 0.8 88
8 90.4 97.7 76.8 98.2
2 98.7 96.3 82.2 100
0.5 94.6 100 92.8 100
66511b
0.125 100 99.4 97.1 100
125 31.6 87.5 62.3 76.8
31 86.9 94.4 100 100
8 100 100 100 100
2 100 94.1 100 100
0.5 100 100 98.7 100
66514a
0.125 100 100 100 100
Isolierung und Strukturaufklärung 86
125 67.2 84.5 92.7 0
31 96.9 93.8 93.8 100
8 100 97.1 97.1 100
2 97.7 100 100 100
0.5 100 100 100 100
66515a
0.125 97.6 100 100 100
125 76.9 79.6 90.9 78.1
31 95.9 82.1 93.6 84.5
8 93.9 98.3 92.2 87.1
2 100 96.2 91.4 83.2
0.5 94.6 92.6 92.2 83.8
71651a*
0.125 98.9 92.9 93 84.4
125 7.2 5.7 0 0
31 6.6 43.9 0 64.9
8 82.1 41.3 51.7 81
2 93.4 76.5 86.6 82.5
0.5 100 89.1 91.6 84.1
71651c*
0.125 100 93.3 96 89
125 0 0 0 0
31 2.4 31 0 9.1
8 65.7 47.5 20.5 75.9
2 100 72.6 74.4 86.1
0.5 100 82.5 93.2 91.2
71652a*
0.125 100 84.6 94.7 99.5
* Die Testresultate stammen von Proben, die bereits im Arbeitskreis von Professor Krohn von Dr. Dai Jingqiu
isoliert wurden.
Versuche zur Synthese des Pseudoanguillosporins A 87
3 VERSUCHE ZUR SYNTHESE DES PSEUDOANGUILLOSPORINS A
3.1 Motivation
Pseudoanguillosporin A (34, Abbildung 58) wurde aus dem Pilz 6577,
Pseudoanguillospora sp., isoliert und wies im in-vitro-Test gute Aktivität gegen Pyricularia
oryzae und Septoria tritici auf (s. Kapitel 2.4.3). Deshalb schien es von Interesse, eine größere
Menge der Substanz für weitere Tests zur Verfügung zu stellen.
3.2 Syntheseplan
Bei dem Grundgerüst des Pseudoanguillosporins A handelt es sich um einen
pentasubstituierten Benzolring mit zwei Hydroxygruppen in meta-Position. Um das
ungewöhnliche Substitutionsmuster des aromatischen Rings aufzubauen, bietet sich eine
Diels-Alder-Reaktion mit den passenden Ausgangsverbindungen 58 (Abbildung 112) und 61
(Abbildung 113) an, deren Synthese[97,98,99] und Einsatz in einer Diels-Alder-Reaktion[100] in
der Literatur beschrieben ist. Eine analoge Synthesesequenz wurde im Arbeitskreis von
Professor Krohn bereits durch Herrn Dr. Vitz[101] durchgeführt, bei der durch die Diels-Alder-
Reaktion der 4,6-Dimethoxy-2-(2-methoxy-2-oxoethyl)-benzoesäuremethylester dargestellt
wurde und durch Verseifung und selektive Veresterung der aliphatischen Carbonsäure in das
Edukt für eine selektive Reduktion der Benzoesäuregruppe übergeführt wurde. Durch den
Austausch des ursprünglichen 1,3-Dimethoxybuta-1,3-dienyloxy)-trimethylsilans durch
1,3-Dimethoxypenta-1,3-dienyloxy)-trimethylsilan kann die zusätzliche Methylgruppe in
3-Position eingeführt werden (Abbildung 112).
OCH
3
O
OCH
3
OCH
3
OTMS
OCH
3
O O
OCH
3
57 5856
H
3
CO OCH
3
OCH
3
1. LDA
2. TMSCl
Abbildung 112: Synthese des 1,3-Dimethoxypenta-1,3-dienyloxy)-trimethylsilans
Versuche zur Synthese des Pseudoanguillosporins A 88
H3CO
OCl O
OCH3
C
H3CO
O
OCH3
O
H3CO
O O
OCH3
O
59 60 61
PCl5NEt3
Abbildung 113: Synthese des Penta-2,3-diendicarbonsäuredimethylesters
OR
H
3
CO
CO
2
CH
3
CO
2
CH
3
58 + 61
OCH
3
H
3
CO
CO
2
H
CO
2
H
OCH
3
H
3
CO
CO
2
H
CO
2
CH
3
OCH
3
H
3
CO CO
2
CH
3
OH
OCH
3
H
3
CO
O
O
OCH
3
H
3
CO
O
OH
OCH
3
H
3
CO
O
OCH
3
H
3
CO
O
OH
HO
O
62a: R = CH
3
62b: R = H
63 64
65
6667
68 69
34
KOH, H
2
O,
EtOH
CH
2
Cl
2
,
MeOH
BH
3
/THF
KOH
Heptyllithium
TsCl
H
2
, Pd/C
BBr
3
Abbildung 114: Syntheseplan für Pseudoanguillosporin A
Versuche zur Synthese des Pseudoanguillosporins A 89
Nach der selektiven Reduktion des Monoesters 64 soll eine Lactonisierung und die Addition
der Heptyl-Seitenkette in Form eines Lithiumorganyls, sowie die Eliminierung der
Hydroxygruppe folgen. Eine stereoselektive Hydrierung und das Entschützen der
Hydroxygruppen am Benzolring führt zu dem Pseudoanguillosporin A (34). In Abbildung 114
ist der vollständige Syntheseplan dargestellt.
3.3 Durchführung
Das Dien für die Diels-Alder-Reaktion wurde aus 3-Oxovaleriansäure (56) durch Umsetzung
mit Orthoameisensäuremethylester zu 3-Methoxypent-2-ensäuremethylester (57), der
wiederum mit Lithiumdiisopropylamid und Trimethylsilylchlorid in das Ketenacetal 58
(Abbildung 112) übergeführt wurde, dargestellt. Das Allen für die Diels-Alder-Reaktion
wurde aus 3-Oxopentandisäuredimethylester (59) durch Reaktion mit Phosphorpentachlorid
zu dem 3-Chlorpent-2-endisäuredimethylester (60) dargestellt, der durch β-Eliminierung zu
dem Allen 61 (Abbildung 113) umgesetzt wurde. Mit den Edukten 58 und 61 wurde die
Diels-Alder-Reaktion bei 0 °C durchgeführt, bei der ein Gemisch aus 4,6-Dimethoxy-2-(2-
methoxy-2-oxoethyl)-3-methyl-benzoesäuremethylester (62a) und 6-Hydroxy-4-methoxy-2-
(2-methoxy-2-oxoethyl)-3-methyl-benzoesäuremethylester (62b) im Verhältnis 7:2 entstanden
ist. Der Benzoesäuremethylester 62a wurde mit Kaliumhydroxid in wäßriger Lösung verseift
und mit Methanol und p-Toluolsulfonsäure selektiv zu dem Monoester 64 umgesetzt. Die
Reaktion mit BH3 in THF führte jedoch nicht zu dem erwarteten Produkt 65, sondern zu dem
2-(3,5-dimethoxy-2,6-dimethylphenyl)-essigsäuremethylester (70, Abbildung 115).
OCH
3
H
3
CO
CO
2
H
CO
2
CH
3
OCH
3
H
3
CO CO
2
CH
3
64 70
Abbildung 115: Ergebnis der Reaktion von 4,6-Dimethoxy-2-(2-methoxy-2-oxoethyl)-3-
methylbenzoesäure mit BH3 in THF
Um die Reduktion der Benzoesäuregruppe zu umgehen, sollte in einem ersten Versuch das
Anhydrid der Dicarbonsäure 63 durch Addition von Butyllithium und anschließender
Eliminierung der Hydroxygruppe in das Isochromenon 73 (Abbildung 116) übergeführt
werden.
Versuche zur Synthese des Pseudoanguillosporins A 90
OCH3
H3CO
CO2H
CO2H
OCH3
H3CO
63 71
O
O
O
OCH3
H3CO
O
OOCH3
H3CO
O
O
OH
73 72
Aceton
BuLi
TsCl
O
Cl
Abbildung 116: Syntheseplan für das 3-Butyl-6,8-dimethoxy-5-methyl-1H-isochromen-1-on
Das Anhydrid 71 wurde durch Rühren mit Acetylchlorid in Aceton[102] dargestellt. Der
Versuch Butyllithium zu addieren, blieb jedoch erfolglos, was vermutlich auf die Acidität der
benzylischen CH2-Gruppe zurückzuführen ist. Anstatt an die Carbonylgruppe zu addieren,
fungiert das Butyllithium als Base und deprotoniert die CH2-Gruppe des Anhydrids 71.
Um die Nukleophilie des metallorganischen Reagenzes zu erhöhen, wurde Butyllithium mit
trockenem Cerchlorid umgesetzt. Das in-situ erzeugte Cerorganyl[103,104] wurde direkt mit dem
Anhydrid 71 versetzt. Es konnte jedoch wieder kein Produkt isoliert werden.
In der Literatur[105,106,107] ist die Reaktion von 2-(Carboxymethyl)-4,6-dimethoxybenzoesäure
mit Dodecanoylchlorid zu dem 6,8-Dimethoxy-3-undecyl-1H-isochromen-1-on beschrieben.
Daher wurde die analoge Reaktion mit der Dicarbonsäure 63 und Octanoylchlorid
durchgeführt (Abbildung 117).
OCH3
H3CO
CO2H
CO2H
OCH3
H3CO
O
63 74
Octanoylchlorid
200 °C
O
Abbildung 117: geplante Reaktion zum Aufbau des 3-Heptyl-6,8-dimethoxy-5-methyl-1H-isochromen-1-
ons
Versuche zur Synthese des Pseudoanguillosporins A 91
Dazu wurde die Dicarbonsäure 63 mit einem vierfachen Überschuß an Octanoylchlorid
versetzt und für vier Stunden auf 200 °C erhitzt. Das gewünschte Produkt konnte jedoch nicht
isoliert werden. Ein DC-Vergleich zeigte, daß lediglich kleine Mengen an Anhydrid 71
gebildet wurden.
Zusammenfassung 92
4 ZUSAMMENFASSUNG
In der vorliegenden Arbeit wurde die Isolierung und Strukturaufklärung von
Sekundärmetaboliten aus neun endophytischen Pilzen, die aus Algen and Pflanzen mariner
Habitate stammen, durchgeführt.
Aus dem Pilz 5948, Coniothyrium sp., konnten drei Naturstoffe isoliert und deren Struktur
bestimmt werden. Bei zwei der Substanzen handelt es sich um die literaturunbekannten
Naturstoffe Coniol (21, Abbildung 14) und Coniothyren (22, Abbildung 16). Der Naturstoff
Coniol weist eine große Ähnlichkeit mit dem dritten isolierten Naturstoff, dem
literaturbekannten Epoxydon[43] (23, Abbildung 17) auf, das sich im Agardiffusionstest als
aktiv gegen Bacillus megaterium und Chlorella fusca erwies. In der Literatur wird außerdem
über die fungizide Aktivität von Epoxydon gegen den Pilz Plasmodiophora brassicae
berichtet, der die Wurzeln von kreuzblütigen Pflanzen befällt und dort ein unkontrolliertes
Wachstum auslöst.[44]
Der Stamm 6282, Phoma sp., lieferte vier Naturstoffe, von denen einer der
literaturunbekannte Naturstoff Phomafuranol (26, Abbildung 22) war. Bei den
literaturbekannten Substanzen handelte es sich um Emodin (24), das zu den Polyketiden zählt
und in der Literatur als aktiv gegen Larven verschiedener Moskitoarten[47] beschrieben wird.
Ein weiteres Polyketid, das isoliert werden konnte, ist das ebenfalls literaturbekannte (3R)-5-
Hydroxymellein[49] (25, Abbildung 20), das zu den Isocoumarinen gehört. Der vierte
Naturstoff weist strukturelle Ähnlichkeit mit dem Phomafuranol auf und ist aus der Literatur
als Phomalacton[54] (27, Abbildung 26) bekannt. Er zeigte im Agardiffusionstest Aktivität
gegen Microbotryum violaceum, Bacillus megaterium und Chlorella fusca. Außerdem wurde
ihm von verschiedenen Autoren eine nematizide[57], herbizide[53], fungizide und
bakteriozide[58] Wirkung nachgewiesen.
Aus dem Pilz 6651, Ascochyta sp., konnten fünf Naturstoffe isoliert werden, von den drei
literaturunbekannt waren. Von dem literaturunbekannten Naturstoff Ascochin (28, Abbildung
36) konnte eine Röntgenstruktur gemessen werden. Für die Bestimmung der absoluten
Konfiguration wurde der Naturstoff hydriert und das CD-Spektrum des Produktes gemessen.
Durch den Vergleich mit dem von Brigitta Elsässer berechneten CD-Spektrum konnte die
absolute Konfiguration bestimmt werden. Die Substanz bewies im Agardiffusionstest
Zusammenfassung 93
Aktivität gegen Bacillus megaterium und Microbotryum violaceum. Weiterhin konnten die
literaturunbekannten Naturstoffe Ascoketon (29, Abbildung 38) und Ascolacton (32,
Abbildung 47) isoliert werden. Bei letzterem konnte die relative Konfiguration anhand der
Kopplungskonstanten aufgeklärt werden. Die absolute Konfiguration ergab sich nach
Vergleich der Literaturdaten[71] mit einem strukturverwandten Naturstoff. Die Substanz war
im Agardiffusionstest aktiv gegen Bacillus megaterium und Microbotryum violaceum. Von
den literaturbekannten Naturstoffen ent-α-Cyperon[67] (30, Abbildung 40) und (3R,4R)-4-
Hydroxymellein[69] (31, Abbildung 42) war letzteres im Agardiffusionstest aktiv gegen
Microbotryum violaceum, Bacillus megaterium und Chlorella fusca.
Der Pilz 6577, Pseudoanguillospora sp., lieferte drei Naturstoffe, von denen zwei
literaturunbekannt waren. Bei der ersten literaturunbekannten Substanz handelt es sich um
Pseudoanguillosporin A (34, Abbildung 58), dessen absolute Konfiguration mit Hilfe des
CD-Spektrums aufgeklärt werden konnte. Die Substanz zeigte in-vitro Aktivität gegen
Pyricularia oryzae und Septoria tritici. Pseudoanguillosporin B (35, Abbildung 59) zeigt das
gleiche Grundgerüst wie Pseudoanguillosporin A, ist jedoch in der Seitenkette
sauerstoffsubstituiert. Der dritte isolierte Naturstoff ist das literaturbekannte
Cephalochromin[72] (33, Abbildung 50), bei dem die Konformation der chiralen Achse durch
Berechnen des CD-Spektrums bestimmt werden konnte. Die Rechnung ergab einen
Diederwinkel von 88.34° und die aR-Konformation.
Aus dem Pilz 7067, Coniothyrium sp., konnten sechs Naturstoffe isoliert werden, von denen
vier literaturunbekannt waren. Bei den literaturbekannten Naturstoffen handelt es sich um
Graphislacton A[78] (36, Abbildung 64) und Massarilacton A[79] (37, Abbildung 67), das im
Agardiffusionstest Aktivität gegen Septoria tritici zeigte. Der erste, literaturunbekannte
Naturstoff war das Massarilacton C (39, Abbildung 71), das formal durch Umesterung des
Lactons aus dem Massarilacton A zum Methylester und anschließende Tautomerisierung der
sauerstoffsubstituierten, endständigen Doppelbindung zum Methylketon entsteht. Der zweite,
literaturunbekannte Naturstoff war das Massarilacton D (40, Abbildung 74), das sich von dem
bekannten Massarilacton B[79] (41, Abbildung 75) durch eine zusätzliche
Sauerstoffsubstitution am Kohlenstoffatom 3 unterscheidet. Bei beiden Molekülen wurde die
absolute Konfiguration nach Vergleich der spezifischen Drehwerte von den literaturbekannten
Naturstoffen abgeleitet. Der dritte, unbekannte Naturstoff war das Coniothyrenol (42,
Abbildung 79), das mit den anderen isolierten Substanzen keine strukturellen Ähnlichkeiten
Zusammenfassung 94
aufweist. Die relative Konfiguration des Moleküls wurde anhand eines NOESY-Spektrums
und eines DPFGSE-NOE-Spektrums bestimmt. Der letzte, literaturunbekannte Naturstoff war
das Massarigenin E (43, Abbildung 83), das auf Grund der strukturellen Ähnlichkeit zu dem
Massarigenin A[82] (44, Abbildung 84) entweder eine Vorstufe in der Biosynthese der
Massarigenine und der Massarilactone darstellt oder ein Abbauprodukt derselben ist.
Der nicht identifizierte Pilz 6754 lieferte den Naturstoff 1,6-Di-O-acetyl-D-mannitol (45,
Abbildung 86), dessen relative Konfiguration durch eine Röntgenstruktur bestimmt werden
konnte. Die absolute Konfiguration ergab sich durch einen Vergleich der spezifischen
Drehwinkel verschiedener Mannitol-Derivate. Die Substanz ist als Syntheseprodukt[85]
bekannt, wurde aber noch nie als Naturstoff isoliert.
Aus dem Pilz 6579, Ulocladium sp., konnte der Naturstoff 65793a (46, Abbildung 91) isoliert
werden, der in einem Tautomeriegleichgewicht vorliegt. Die Substanz weist fungizide und
insektizide Wirkung auf und wurde deshalb 1996 in den USA patentiert.[86]
Der Pilz 6586, Acremonium sp., lieferte drei literaturbekannte Naturstoffe, von denen zwei die
strukturelle Gemeinsamkeit eines 1,2,4-trisubstituierten Benzolringes aufweisen. Bei den
beiden Naturstoffen handelt es sich um 2,2-Dimethylchromen-6-ol[88] (48, Abbildung 95) und
Toluquinol[89] (49, Abbildung 96). Bei der dritten Substanz handelt es sich um Helvolinsäure
(50, Abbildung 99), die bereits 1943 von Waksman et al.[90] isoliert wurde.
Aus dem Pilz 7165, Nigrospora sp., konnten fünf Naturstoffe isolierte werden, von denen
einer literaturunbekannt war. Bei den vier literaturbekannten Substanzen handelt es sich um
8-Methoxynaphthalen-1-ol[92] (51, Abbildung 100), 1,8-Dimethoxynaphthalen[92] (52,
Abbildung 102), 5-Hydroxy-2-methylchroman-4-on[94] (53, Abbildung 105) und
2,6-Dihydroxy-butyrophenon[94] (54, Abbildung 106). Im Rahmen einer Studie zur
Biosynthese wurden alle vier Substanzen aus verschiedenen Mutanten von Daldinia
concentrica isoliert. Die Autoren konnten zeigen, daß das 2,6-Dihydroxybutyrophenon aus
einem Polyketid aus fünf Acetat-Einheiten aufgebaut wird und die Vorstufe zu dem
5-Hydroxy-2-methylchroman-4-on darstellt.[94] Bei der fünften Substanz handelt es sich um
das literaturunbekannte Helicascolid C (55, Abbildung 109), das seinen Namen von den
literaturbekannten Helicascoliden A und B[96] erhielt, von denen es sich durch die formale
Oxidation einer Hydroxygruppe zu einer Carbonylgruppe unterscheidet.
Zusammenfassung 95
Im synthetischen Teil wurden Versuche zur Synthese des Pseudoanguillosporins A (34)
unternommen. Der Naturstoff 34 zeigte in-vitro eine gute Aktivität gegen Pyricularia oryzae
und Septoria tritici, weshalb es erstrebenswert schien, eine größere Menge der Substanz für
weitere Aktivitätstest und Derivatisierung zur Verfügung zu stellen. Es gelang, das
ungewöhnliche Substitutionsmuster des aromatischen Rings mit zwei meta-positionierten
Hydroxygruppen in 6,8-Position und einer Methylgruppe in 5-Position durch eine Diels-
Alder-Reaktion zwischen dem Dienophil Penta-2,3-diendicarbonsäuredimethylester (61,
Abbildung 113) und dem Dien (1,3-Dimethoxypenta-1,3-dienyloxy)-trimethylsilan (58,
Abbildung 112) aufzubauen. Die Vollendung der Synthese scheiterte bislang jedoch an der
Überreaktion des Homophthalsäuremonoesterderivats 64 zu dem defunktionalisierten
Phenylessigsäureesterderivat 70 (Abbildung 115). Um die Reduktion der Benzoesäure zu
umgehen, wurde das Anhydrid 71 dargestellt und in einer Testreaktion mit Butyllithium
umgesetzt. Die erhoffte Addition des Butyllithiums an die Carbonylgruppe konnte jedoch
nicht beobachtet werden. Auch der Versuch ein Cerorganyl an die Carbonylgruppe zu
addieren führte nicht zum Erfolg. Zuletzt wurde versucht, die in der Literatur beschriebene
Reaktion zwischen 2-(Carboxymethyl)-4,6-dimethoxybenzoesäure und Dodecanoylchlorid zu
dem 6,8-Dimethoxy-3-undecyl-1H-isochromen-1-on[105] mit der Dicarbonsäure 63 und
Octanoylchlorid nachzuvollziehen (Abbildung 117). Bei dieser Reaktion konnte jedoch nur
die Bildung kleiner Mengen des Anhydrids 71 beobachtet werden.
Material und Methoden 96
EXPERIMENTELLER TEIL
5 MATERIAL UND METHODEN
5.1 Analytische und präparative Chromatographie
Analytische Dünnschichtchromatographie (DC):
Die analytische Dünnschichtchromatographie wurde mit Kieselgel-Fertigfolien (Kieselgel 60,
F254) der Fa. E. Merck AG, Darmstadt durchgeführt. Die Detektion der Substanzen erfolgte
mit UV-Licht bei 254 und 366 nm und durch Verwendung folgender Sprühreagenzien:
Anisaldehyd/Schwefelsäure (Universalreagenz):
Zu 100 ml einer Stammlösung aus 85 ml Ethanol, 14 ml Eisessig und 1 ml Schwefelsäure fügt
man 1 ml Anisaldehyd hinzu. Das Reagenz ist ca. 7 Tage haltbar. Nach dem Besprühen der
DC-Folie wird diese erhitzt.
2,4-Dinitrophenylhydrazin für Aldehyde und Ketone:
Zu einer Lösung von 1 g 2,4-Dinitrophenylhydrazin in 1 L Ethanol werden 5 ml konz.
Schwefelsäure hinzugefügt. Beim Erwärmen des Dünnschichtchromatogramms bilden
Aldehyde und Ketone gelbe bis orangerote Flecken.
Säulenchromatographie an Kieselgel:
Als stationäre Phase diente Kieselgel 60 (230-400 mesh, 0.040-0.063 mm) der Fa. Merck AG,
Darmstadt.
Säulenchromatographie an Sephadex LH 20:
Als stationäre Phase diente Sephadex LH 20 der Firma Pharmacia LKB, Uppsala (Schweden).
Die Säule wurde auf das Laufmittel Dichlormethan/Methanol im Verhältnis 3:2 eingestellt.
Präparative Schichtchromatographie (PSC):
Für die präparative Schichtchromatographie wurden mit Kieselgel 60 bzw. RP-18
beschichtete Fertigplatten der Fa. Macherey und Nagel verwendet. Die Schichtdicken
variierten zwischen 0.5 und 2 mm und wurden nach Substanzmenge ausgewählt.
Material und Methoden 97
5.2 Instrumentelle Analytik
Schmelzpunktbestimmung:
Die Schmelzpunkte wurden in offenen Kapillaren mit einer Schmelzpunktbestimmungs-
apparatur der Fa. Büchi gemessen und sind nicht korrigiert.
Massenspektrometrie:
Die Aufnahme der Massenspektren und die Bestimmung der Feinmassen erfolgte durch Frau
Mariola Zukowski und Herrn Dr. Heinz Weber an einem Finnigan MAT 8200. Die relativen
Intensitäten, bezogen auf den Basispeak, sind hinter den Massen in Klammern angegeben.
Röntgenstrukturanalyse:
Die Röntgenstrukturanalyse wurde von Herrn Dr. Ulrich Flörke durchgeführt.
UV/VIS-Spektroskopie:
Die UV/VIS-Spektren wurden mit dem Spektrometer UV-2101 PC der Firma Shimadzu
gemessen. Das verwendete Lösungsmittel ist in Klammern angegeben.
Infrarotspektroskopie:
Die Aufnahme der IR-Spektren erfolgt mit dem FT/IR-Spektrometer 510 p der Firma Nicolet.
Die verwendete Probenmatrix wird in Klammern angegeben.
Optische Rotation:
Die Drehwerte wurden mit dem Polarimeter 241 MC der Firma Perkin-Elmer in einer nicht
thermostatisierten Standardküvette (d = 10 cm) unter Verwendung einer Natriumlampe (D-
Linie, λ = 589 nm) bestimmt. Das verwendete Lösungsmittel und die Konzentration sind in
Klammern angegeben.
CD-Spektroskopie:
Die CD-Spektren wurden von Herrn Dr. Tibor Kurtán in der Abteilung von Herrn Prof. Dr.
Sándor Antus, Debrecen, Ungarn gemessen.
NMR-Spektroskopie:
Die Kernresonanzspektren wurden an einem Bruker ARX 200- bzw. AVANCE 500-
Spektrometer aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen δ wurden auf das jeweils
verwandte deuterierte Lösungsmittel als inneren Standard bezogen und sind in ppm
angegeben. Die Abkürzungen der Multiplizitäten lauten:
(s) Singulett
(br. s) breites Singulett
(d) Dublett
(br. d) breites Dublett
Material und Methoden 98
(dd) Doppeldublett
(ddd) Dublett von einem Doppeldublett
(dt) Dublett von einem Triplett
(dq) Dublett von einem Quartett
(t) Triplett
(tq) Triplett von einem Quartett
(ps. t) Pseudotriplett
(q) Quartett
(m) Multiplett
(Cq) quartäres Kohlenstoffatom
(CH) tertiäres Kohlenstoffatom
(CH2) sekundäres Kohlenstoffatom
(CH3) primäres Kohlenstoffatom
Die Aufnahme der NMR-Spektren am AVANCE 500-Spektrometer erfolgte durch Herrn PD
Dr. Hans Egold, Frau Karin Stolte und Herrn Dietmar Gehle.
5.3 Mikrobiologische Arbeiten
Nährmedien:
Biomalz-Festagar:
50 g Biomalz werden in einem Liter Leitungswasser gelöst. Anschließend wird der pH-Wert
auf 5.6 eingestellt und 15 g Agar hinzugefügt.
Biomalz-Flüssigmedium:
In 1000 ml Wasser werden 50 g Malzextrakt (Biomalt der Firma Villa Natura
Gesundprodukte, Kirn) gelöst und 5 g Natriumchlorid versetzt.
Dinkel-Gerste:
200 g Perlgraupen, 200 g Dinkelflocken (Vollkorn) und 2 g Sojapepton werden gemischt und
mit 1 mL MnCl2-Lösung (20 g/L) und 250 mL dest. Wasser versetzt.
Isolierung und Bestimmung:
Die Isolierung der Pilze wurden von der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Aust und Frau PD Dr.
Schulz durchgeführt und ihre Bestimmung erfolgte durch Herrn Dr. S. Dräger im Institut für
Mikrobiologie der TU Braunschweig.
Material und Methoden 99
Anzucht:
Die Anzucht der Stämme auf Biomalz-Festagar und Dinkel-Gerste-Feststoffmedium erfolgte
ebenfalls in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Aust und Frau PD Dr. Schulz an der TU
Braunschweig.
Für die Anzucht der Stämme in Biomalz-Schüttelkulturen wurden neun Schikanekolben mit
je 500 mL Nährmedium befüllt und im Autoklaven sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurden
die Pilze überimpft und für 14 Tage bei Raumtemperatur und 180 rpm auf einem
Rundschüttler inkubiert.
Pilzauswahl:
Die Auswahl der zu bearbeitenden Pilze erfolgte anhand von Dünnschichtchromatogrammen
kleiner Extraktproben, die mittels UV-Detektion und den zuvor erwähnten Sprühreagenzien
ausgewertet wurden. Dazu wurden die Extraktproben in Dichlormethan/Methanol (99:1)
gelöst und auf eine DC-Karte aufgetragen. Das DC wurde dann mit Dichlormethan/Methanol
(9:1) entwickelt und unter UV-Licht (254 und 366 nm) begutachtet. Die UV-aktiven
Substanzen wurden markiert und das DC anschließend mit Anisaldehyd/Schwefelsäure
angesprüht. Dabei wurden jene Stämme als besonders interessant eingestuft, die sich deutlich
von den anderen unterschieden und/oder besondere Anfärbungen mit
Anisaldehyd/Schwefelsäure und 2,4-Dinitrophenylhydrazin zeigten. Als besondere
Anfärbungen gelten die orange Anfärbung mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin, was für Aldehyde
selektiv ist, sowie eine rote, orange, gelbe oder grün-gelbe Anfärbung mit
Anisaldehyd/Schwefelsäure. Eine grau-blaue bis blaue Anfärbung spricht für das
Vorhandensein von Steroiden und eine violett bis tiefblaue Anfärbung zeigt Fette und
Fettsäuren an, insbesondere wenn diese Substanzen nicht UV-aktiv sind. Auf Grund dieser
Auswertung wurden Extrakte, die hauptsächlich blau-graue und violette Anfärbungen mit
Anisaldehyd/Schwefelsäure zeigten, von einer zukünftigen Bearbeitung ausgeschlossen.
Physikalische Daten der Naturstoffe 100
6 PHYSIKALISCHE DATEN DER NATURSTOFFE
6.1 Naturstoffe aus Stamm 5948
6.1.1 Anzucht, Extraktion und Isolierung
Bei dem Stamm 5948 handelt es sich um Coniothyrium sp., der aus Fucus sp. aus der Nordsee
vor Helgoland isoliert wurde. Der Stamm wurde für 14 Tage bei Raumtemperatur in einer
1 L-Biomalz-Flüssigkultur auf einem Rundschüttler bei 180 rpm fermentiert. Anschließend
wurde die Kultur über Celite filtriert, Filtrat und Biomasse wurden je dreimal mit Ethylacetat
extrahiert und am Rotationsverdampfer eingeengt. Es resultierten 1.3 g Rohextrakt.
Der Rohextrakt wurde durch Mitteldruckchromatographie an Kieselgel mit einem
Dichlormethan/Methanol-Gradienten (100:0 bis 90:10) in 6 Fraktionen aufgetrennt. Aus
Fraktion 4 konnten durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol
(99:1) als Laufmittel die Naturstoffe 59484e (21, 5.5 mg) und 59484e2 (22, 6.0 mg) isoliert
werden. Fraktion 5 lieferte nach Säulenchromatographie an Kieselgel mit
Dichlormethan/Methanol (96:4) als Laufmittel den Naturstoff 59485a (23, 40 mg).
6.1.2 Coniol (Naturstoff 59484e)
OH
OH
O
123
4
5
6
78
21
Summenformel: C7H12O3.–
Molmasse: 144.17 g/mol.–
Rf-Wert: 0.40 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= –30.5° (c = 0.28, CH2Cl2).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.95 (d, J8,3 = 7.0 Hz, 3 H, 8-H), 1.31 (dt, Jgem = 14.4 Hz,
J4a,3 = J4a,5 = 2.8 Hz, 1 H, 4-Ha), 1.61 (ddd, Jgem = 14.4 Hz, J4,3 = 11.0 Hz, J4,5 = 5.3 Hz, 1 H,
Physikalische Daten der Naturstoffe 101
4-Hb), 1.93 (m, 1 H, 3-H), 2.40 (br. s, 2 H, OH), 3.39 (m, 1 H, 1-H), 3.44 (m, 1 H, 6-H), 4.08
(br. s, 1 H, 2-H), 4.16 (br. s, 1 H, 5-H).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 16.3 (CH3, C-8), 26.4 (CH, C-3), 32.4 (CH2, C-4), 54.7 (CH,
C-6), 58.0 (CH, C-1), 64.1 (CH, C-5), 68.6 (CH, C-2).–
ESIMS (200 °C): m/z = 145.0 [M++H+] (4.4), 127.1 [M+-H2O] (4.3), 109.1 [M+-2H2O] (1.3).–
6.1.2.1 5-(Acetyloxy)-3-methyl-7-oxabicyclo[4.1.0]hept-2-ylacetat
O
O
O
123
4
5
6
7
8
O
O
9
10
11
12
21a
Darstellung:
Zu einer Lösung von Naturstoff 59484e (6 mg, 0.042 mmol) in Pyridin (0.1 mL) wird
Acetylchlorid (0.1 mL, 1.4 mmol) getropft und 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach
Beendigung der Reaktion wird die Reaktionsmischung mit Eis versetzt und weitere 10 min
gerührt. Anschließend wird die Mischung mit Diethylether (2 × 5 mL) extrahiert und die
organische Phase mit 1 mol/L HCl-Lösung (10 mL) und Wasser (10 mL) gewaschen und über
Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt und das
Rohprodukt durch präparative Schichtchromatographie gereinigt. Es resultiert 5-(Acetyloxy)-
3-methyl-7-oxabicyclo[4.1.0]hept-2-ylacetat (7.2 mg, 0.032 mmol, 76.2 %) in Form eines
farblosen Öls.
Summenformel: C11H16O5.–
Molmasse: 228.24 g/mol.–
Rf-Wert: 0.85 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.91 (d, J10,3 = 7.0 Hz, 3 H, 10-H), 1.45 (dt, Jgem = 14.6 Hz,
J4a,3 = J4a,5 = 3.7 Hz, 1 H, 4-Ha), 1.69 (m, 2 H, 3-H, 4-Hb), 2.15 (br. s, 6 H, 9-H, 12-H), 3.29
Physikalische Daten der Naturstoffe 102
(dd, J1,6 = 3.7 Hz, J1,2 = 1.9 Hz, 1 H, 1-H), 3.48 (t, J6,1 = J6,5 = 3.7, 1 H, 6-H), 5.26 (m, 2 H,
2-H, 5-H).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 15.9 (CH3, C-10), 21.3 (CH3, C-9)*, 21.5 (CH3, C-12)*,
26.1 (CH, C-3), 29.6 (CH2, C-4), 51.8 (CH, C-6), 54.0 (CH, C-1), 67.3 (CH, C-5), 70.5 (CH,
C-2), 170.8 (Cq, C-8)**, 171.2 (Cq, C-8)**.–
Die Zuordnung der mit * und ** gekennzeichneten Signale ist vertauschbar.
ESIMS (200 °C): m/z = 229 [M+H+] (1.4), 169 [M+H+-COCH3] (0.4),
109 [M+H+-2 × COCH3] (2.6).–
6.1.3 Coniothyren (Naturstoff 59484e2)
O
HO
OH
123
4
5
6
7
811
13
14 12
9
10 15
22
Summenformel: C15H16O3.–
Molmasse: 244.29 g/mol.–
Rf-Wert: 0.46 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
UV (MeOH): λmax (log ε) = 276.5 (6.52).–
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ = 2.61 (t, J2,1 = 7.2 Hz, 2 H, 2-H), 3.58 (t, J1,2 = 7.2 Hz, 2 H,
1-H), 4.42 (s, 2 H, 15-H), 6.58 (m, 1 H, 14-H), 6.60 (d, J5,4 = 8.5 Hz, 2 H, 5-H, 7-H), 6.70 (m,
2 H, 10-H, 12-H), 6.92 (d, J4,5 = 8.5 Hz, 2 H, 4-H, 8-H), 7.03 (t, J13,12 = J13,14 = 8.0 Hz, 1 H,
13-H).–
13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ = 38.0 (CH2, C-2), 63.2 (CH2, C-1), 63.7 (CH2, C-15),
113.3 (CH, C-10)*, 113.7 (CH, C-14), 114.7 (CH, 2 C, C-5, C-7), 117.7 (CH, C-12)*, 128.9
(CH, C-13), 129.5 (CH, 2 C, C-4, C-8), 129.6 (Cq, C-3), 142.9 (Cq, C-11), 155.4 (Cq, C-6),
157.2 (Cq, C-9).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
CIMS (iso-Butan, 150 °C): m/z (%) = 245 [M+H+] (3.3), 227 [M+H+-H2O] (7.9), 163 (22.0),
121 (67.4).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 103
6.1.4 (+)-Epoxydon (Naturstoff 59485a)
OOH
O
OH
123
4
5
6
8
23
Summenformel: C7H8O4.–
Molmasse: 156.14 g/mol.–
Rf-Wert: 0.41 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= +109.1° (c = 0.31, MeOH) Lit.:
[]
20
D
α
= +93° (c = 0.29, MeOH).–
1H-NMR (200 MHz, CD3OD): δ = 3.44 (d, J1,6 = 4.0 Hz, 1 H, 1-H), 3.83 (m, 1 H, 6-H), 4.21
(m, 2 H, 8-H), 4.76 (t, J5,4 = J5,6 = 2.3, 1 H, 5-H), 6.52 (m, 1 H, 4-H).–
13C-NMR (50 MHz, CD3OD): δ = 53.5 (CH, C-1), 54.3 (CH, C-6), 58.5 (CH2, C-8), 64.9
(CH, C-5), 134.7 (Cq, C-3), 141.1 (CH, C-4), 194.3 (Cq, C-2).–
6.1.4.1 Essigsäure-2,4-(diacetyloxy)-6-(acetyloxymethyl)-phenylester
O
O
O
O
O
O
O
O
12
3
4
5
6
7
89
10
11
12
13
14 15
23a
Darstellung:
Zu einer Lösung von Epoxydon (12 mg, 0.077 mmol) in Pyridin (0.1 mL) wird Acetylchlorid
(0.1 mL, 1.4 mmol) getropft und 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der
Reaktion wird die Reaktionsmischung mit Eis versetzt und weitere 10 min gerührt.
Anschließend wird die Mischung mit Diethylether (2 × 5 mL) extrahiert und die organische
Phase mit 1 mol/L HCl-Lösung (10 mL) und Wasser (10 mL) gewaschen und über
Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt und das
Physikalische Daten der Naturstoffe 104
Rohprodukt durch präparative Schichtchromatographie gereinigt. Es resultiert Essigsäure-2,4-
(diacetyloxy)-6-(acetyloxymethyl)-phenylester (19.4 mg, 0.060 mmol, 78 %) in Form eines
schwach gelben Öls.
Summenformel: C15H16O8.–
Molmasse: 324.28 g/mol.–
Rf-Wert: 0.85 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.10 (s, 3 H, 15-H), 2.30 (s, 3 H, 2-H)*, 2.32 (s, 3 H,
10-H)*, 2.34 (s, 3 H, 12-H)*, 5.08 (s, 2 H, 13-H), 7.09 (d, J5,7 = 2.7 Hz, 1 H, 5-H), 7.14 (d,
J7,5 = 2.7 Hz, 1 H, 7-H).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 20.7 (CH3, C-15), 21.1 (CH3, C-2)*, 21.2 (CH3, C-10)*,
21.5 (CH3, C-12)*, 61.1 (CH2, C-13), 117.6 (CH, C-5), 120.5 (CH, C-7), 131.0 (Cq, C-8),
138.5 (Cq, C-3), 143.2 (Cq, C-4), 148.3 (Cq, C-6), 168.1 (Cq, C-1)**, 168.3 (Cq, C-9)**, 169.2
(Cq, C-11)**, 170.9 (Cq, C-14).–
Die Zuordnung der mit * und ** gekennzeichneten Signale ist vertauschbar.
6.2 Naturstoffe aus Stamm 6282
6.2.1 Anzucht, Extraktion und Isolierung
Bei dem Stamm 6282 handelt es sich um Phoma sp., der aus Fucus serratus vor Helgoland
isoliert wurde. Der Pilz wurde 28 Tage bei Raumtemperatur in einer 5 L-Kultur auf Biomalz-
Festagar mit 3.3 % Meersalz kultiviert und anschließend lyophylisiert. Das Lyophylisat wurde
mit Ethylacetat übergossen und mit einem Pürierstab zerkleinert. Anschließend wurde viermal
mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatphasen ergaben nach dem Einengen am
Rotationsverdampfer 2.2 g Rohextrakt.
Der so gewonnene Rohextrakt wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem
Gradienten von reinem Dichlormethan bis Dichlormethan/Methanol (9:1) in 6 Fraktionen
aufgetrennt. Aus Fraktion 2 konnte durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit
Dichlormethan und einer weiteren Reinigung durch Säulenchromatographie an Sephadex
LH 20 der Naturstoff 62822b4a (24, 1.3 mg) gewonnen werden. Fraktion 3 lieferte nach
Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 den Naturstoff 62823b (25, 2.6 mg). Fraktion 4
Physikalische Daten der Naturstoffe 105
enthielt neben Epidioxy-5
α
,8
α
-ergosta-6,22E-dien-3
β
-ol die Naturstoffe 62824a1b (26,
1.7 mg) und 62824a2 (27, 40 mg), die durch Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 und
Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol (95:5) isoliert wurden.
6.2.2 Emodin (Naturstoff 62822b4a)
O
OOH OH
OH
1
2
3
45
6
7
8
9
10
11
24
Summenformel: C15H10O5.–
Molmasse: 270.24 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 250–254 °C (Lit.: 260–263 °C).–
Rf-Wert: 0.65 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
1H-NMR (200 MHz, (CD3)2CO): δ = 2.50 (s, 3 H, 11-H), 6.70 (d, J7,5 = 2.4 Hz, 7-H), 7.18 (s,
1 H, 2-H), 7.29 (d, J5,7 = 2.4 Hz, 5-H), 7.60 (s, 1 H, 4-H), 10.19 (br. s, 1 H, 3-OH), 12.10 (s,
1 H, OH), 12.22 (s, 1 H, OH).–
13C-NMR (50 MHz, (CD3)2CO): δ = 21.5 (CH3, C-11), 108.4 (CH, C-2), 109.1 (CH, C-4),
110.0 (Cq, C-9a), 114.0 (Cq, C-8a), 121.0 (CH, C-5), 124.5 (CH, C-7), 133.8 (Cq, C-4a), 136.2
(Cq, C-10a), 149.1 (Cq, C-6), 162.8 (Cq, C-8), 165.7 (Cq, C-1)*, 165.8 (Cq, C-3)*, 181.7 (Cq,
C-10), 191.3 (Cq, C-9).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
6.2.3 (3R)-5-Hydroxymellein (Naturstoff 62823b)
12
3
4
5
6
7
8
9
O
OOH
OH
25
Summenformel: C7H10O2.–
Physikalische Daten der Naturstoffe 106
Molmasse: 126.15 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 228–231°C (Lit.: 234–237 °C).–
Rf-Wert: 0.67 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= –81.5° (c = 0.26, MeOH) Lit.:
[]
20
D
α
= –72°.–
1H-NMR (200 MHz, CD3OD): δ = 1.54 (d, J9,3 = 6.3 Hz, 3 H, 9-H), 2.65 (dd, Jgem = 16.9 Hz,
J4a,3 = 11.3 Hz, 1 H, 4-Ha), 3.22 (dd, Jgem = 16.9 Hz, J4b,3 = 3.5 Hz, 1 H, 4-Hb), 4.73 (m, 1 H,
3-H), 6.74 (d, J7,6 = 9.1 Hz, 1 H, 7-H), 7.06 (d, J6,7 = 9.1 Hz, 1 H, 6-H).–
13C-NMR (50 MHz, CD3OD): δ = 20.1 (CH3, C-9), 28.4 (CH2, C-4), 76.7 (CH, C-3), 108.2
(Cq, C-8a), 115.5 (CH, C-7), 124.0 (CH, C-6), 124.8 (Cq, C-4a), 146.0 (Cq, C-5), 155.4 (Cq,
C-8), 170.8 (CO, C-1).–
6.2.4 Phomafuranol (Naturstoff 62824a1b)
6
7
8
12
3
4
5
O
OH
26
Summenformel: C7H10O2.–
Molmasse: 126.15 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 105–107 °C.–
Rf-Wert: 0.56 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= –12.9° (c = 0.17, CH2Cl2).–
UV (CH2Cl2): λmax (log ε) = 272 (5.02).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.78 (d, J8,7 = 6.6 Hz, 3 H, 8-H), 4.22 (m, 1 H, 2-H), 5.03
(br. d, J3,2 = 5.9 Hz, 1 H, 3-H), 5.54 (ddd, J6,7 = 15.3 Hz, J6,2 = 7.3 Hz, J6,3 = 1.4 Hz, 1 H,
6-H), 5.91 (dq, J7,6 = 15.3 Hz, J7,8 = 6.6 Hz, 1 H, 7-H), 6.22 (m, 1 H, 4-H), 7.46 (d,
J5,4 = 5.8 Hz, 1 H, 5-H).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 107
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 18.3 (CH3, C-8), 73.9 (CH, C-2), 86.3 (CH, C-3), 123.3
(CH, C-4), 127.7 (CH, C-6), 132.2 (CH, C-7), 153.8 (CH, C-5).–
CIMS (iso-Butan, 150 °C): m/z (%) = 127 [M+H+] (2.2).–
6.2.5 (+)-Phomalacton (Naturstoff 62824a2)
7
8
9
OO
OH
1
2
3
4
5
6
27
Summenformel: C8H10O3.–
Molmasse: 154.06 g/mol.–
Rf-Wert: 0.58 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= +64.0° (c = 0.07, CHCl3) Lit.:
[]
20
D
α
= +174.0° (c = 0.1, CHCl3).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.79 (d, J9,8 = 6.1 Hz, 3 H, 9-H), 3.52 (br. s, 1 H, OH), 4.17
(br. s, 1 H, 5-H), 4.78 (br. d, J6,7 = 7.0 Hz, 1 H, 6-H), 5.75 (m, 1 H, 7-H), 5.92 (m, 1 H, 8-H),
6.05 (dd, J3,4 = 9.7 Hz, J3,5 = 1.3 Hz, 1 H, 3-H), 6.98 (ddd, J4,3 = 9.7 Hz, J4,5 = 5.3 Hz,
J4,6 = 1.6 Hz, 1 H, 4-H).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 18.4 (CH3, C-9), 63.4 (CH, C-5), 82.1 (CH, C-6), 122.6
(CH, C-3), 124.6 (CH, C-7), 133.1 (CH, C-8), 145.8 (CH, C-4), 164.6 (Cq, C-2).–
6.3 Naturstoffe aus Stamm 6651
6.3.1 Anzucht, Extraktion und Isolierung
Bei dem Pilz 6651 handelt es sich um einen Ascochyta sp., der aus Meliotus dentatus in der
Nähe von Ahrenshoop an der Ostsee isoliert wurde. Der Stamm wirkte im Agardiffusionstest
fungizid und wurde für 28 Tage bei Raumtemperatur in einer 12 L-Kultur auf Biomalz-
Festagar angezüchtet.
Die Kulturen wurden nach Ablauf der 28 Tage für 3 Tage eingefroren und nach dem Auftauen
von der wäßrigen Phase durch Filtration getrennt. Die wäßrige Phase und die Biomasse
Physikalische Daten der Naturstoffe 108
wurden getrennt jeweils sechsmal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten
Ethylacetatphasen ergaben nach Einengen am Rotationsverdampfer 29 g Rohextrakt.
Der gewonnene Rohextrakt wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem
Gradienten aus Dichlormethan/Methanol (0–10 % in 1 %-Schritten von je 500 mL) in
7 Fraktionen aufgetrennt. Aus Fraktion 1 konnte durch Kristallisation aus Dichlormethan der
Naturstoff 66511b (28, 1.6 g) gewonnen werden. Fraktionen 2 und 3 wurden nachträglich
wieder vereint und enthielten zwei zweifach ungesättigte Fettsäuren sowie die Naturstoffe
66512a (29, 89 mg) und 66512b (30, 9.0 mg), die durch Säulenchromatographie an Sephadex
LH 20 und präparativer Schichtchromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan isoliert
werden konnten. Aus Fraktion 4 konnte durch Säulenchromatographie an Sephadex LH 20
der Naturstoff 66514a (31, 527 mg) gewonnen werden. Fraktion 5 lieferte den Naturstoff
66515a (32, 413 mg) nach Kristallisation aus Diethylether.
6.3.2 Ascochin (Naturstoff 66511b)
3
4
10
9
11
1
5
6
78
O
OOH
HO
O
28
Summenformel: C12H10O5.–
Molmasse: 234.05 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 186–187 °C.–
Rf-Wert: 0.69 (CH2Cl2).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= +287.9° (c = 0.28, CH2Cl2).–
CD (CH3CN): λ (∆ε) = 223 (–14.9), 236 (0.0), 254 (52.7),286 (0.0), 316 (–6.3).–
UV (CH2Cl2): λmax (log ε) = 358 (6.09), 317 (6.85), 272 (7.36).–
IR (KBr): ν (cm-1) = 3126, 2981, 2931, 1703, 1664, 1626, 1597, 1452, 1419, 1365, 1338,
1288, 1271, 1227, 1107, 1063, 1024, 876, 864, 802, 783, 762, 586, 534.–
Physikalische Daten der Naturstoffe 109
Kristallsystem: Monoklin.–
Raumgruppe: P 21.–
Dimensionen der Zelle: a = 6.4068(4)
b = 25.767(1) β = 91.563(1)
c = 12.8166(8)
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.63 (d, J10,4 = 7.2 Hz, 3 H, 10-H), 4.36 (q, J4,10 = 7.2 Hz,
1 H, 4-H), 4.75 (d, Jgem = 2.3 Hz, 1 H, 9-Ha), 4.96 (d, Jgem = 2.3 Hz, 1 H, 9-Hb), 6.44 (s, 1 H,
7-H), 10.15 (s, 1 H, 11-H), 11.65 (s, 1 H, 6-OH), 12.55 (s, 1 H, 8-OH).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 25.4 (CH3, C-10), 33.2 (CH, C-4), 98.3 (CH2, C-9), 100.7
(Cq, C-8a), 103.9 (CH, C-7), 109.9 (Cq, C-5), 152.1 (Cq, C-4a), 155.0 (Cq, C-3), 165.9 (Cq,
C-1), 168.8 (Cq, C-8), 170.3 (Cq, C-6), 191.6 (CH, C-11).–
EIMS (70 eV, 175 °C): m/z (%) = 234 [M+] (100), 217 (13.8), 191 (9.1), 174 (31.9), 164
(39.7), 69 (10.1).–
HREIMS: ber.: 234.05282
gef.: 234.05253
6.3.2.1 (3R,4R)-6,8-Dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-3,4-dimethyl-3,4-dihydro-1H-
isochromen-1-on (66511bH)
3
4
10
9
11
1
5
6
7
8
O
OOH
HO
HO
28a
Darstellung:
Eine Lösung von Ascochin (28, 40 mg, 0.17 mmol) in trockenem THF (10 ml) wurde mit
einer katalytischen Menge Palladium/Kohlenstoff (5 Mol-%) versetzt. Anschließend wurde
unter Wasserstoff-Atmosphäre bei Raumtemperatur ca. 2 Stunden gerührt. Der Fortgang der
Reaktion wurde mittels DC-Kontrolle verfolgt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die
Reaktionslösung über Celite filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch
Physikalische Daten der Naturstoffe 110
präparative Schichtchromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol (95:5)
gereinigt. Es resultierte (3R,4R)-6,8-Dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-3,4-dimethyl-3,4-dihydro-
1H-isochromen-1-on (28a, 32 mg, 0.13 mmol, 80 %) in Form eines weißen Feststoffes.
Summenformel: C12H14O5.–
Molmasse: 238.24 g/mol.–
Schmelzpunkt: Zers. = 200 °C.–
Rf-Wert: 0.63 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
CD (CH3CN): λ (∆ε) = 218.5 (–6.9), 236.0 (6.0), 247.5 (1.8), 267.5 (8.7), 308.0 (–0.6).–
1H-NMR (200 MHz, CD3OH): δ = 1.19 (d, J10,4 = 7.1 Hz, 3 H, 10-H), 1.49 (d, J9,3 = 6.5 Hz,
3 H, 9-H), 3.26 (dq, J4,10 = 7.1 Hz, J4,3 = 2.5 Hz, 1 H, 4-H), 4.61 (d, Jgem = 11.8 Hz, 1 H,
11-Ha), 4.70 (m, 1 H, 3-H), 4.69 (d, Jgem = 11.8 Hz, 1 H, 11-Hb), 6.32 (s, 1 H, 7-H).–
13C-NMR (50 MHz, CD3OH): δ = 12.7 (CH3, C-10), 16.9 (CH3, C-9), 33.6 (CH, C-4), 54.3
(CH2, C-11), 77.9 (CH, C-3), 99.3 (Cq, C-8a), 101.0 (CH, C-7), 116.2 (Cq, C-5), 148.8 (Cq,
C-4a), 164.2 (Cq, C-8)*, 164.3 (Cq, C-6)*, 171.1 (Cq, C-1 ).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
6.3.3 Ascoketon (Naturstoff 66512a)
O O
29
Summenformel: C21H40O2.–
Molmasse: 324.54 g/mol.–
Rf-Wert: 0.54 (CH2Cl2).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= +19.8° (c = 0.44, CH2Cl2).–
IR (Film): ν (cm-1) = 3460, 2925, 2854, 1712, 1460, 1356.–
Physikalische Daten der Naturstoffe 111
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ = 1.05 (d, J20,3 = 6.9 Hz, 6 H, 20-H, 21-H), 1.23 (s, 22 H, 5-H,
6-H, 7-H, 8-H, 9-H, 10-H, 11-H, 12-H, 13-H, 14-H, 15-H), 1.32 (m, 2 H, 4-Ha, 16-Ha), 1.62
(m, 2 H, 4-Hb,16-Hb), 2.11 (s, 6 H, 1-H, 19-H), 2.47 (tq, J3,20 = J3,4 = 6.9, 2 H, 3-H, 17-H).–
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ = 16.1 (CH3, 2 C, C-20, C-21’), 27.2 (CH2, 2 C, C-5, C-15),
27.9 (CH3, 2 C, C-1, C-19), 29.4 (CH2, 2 C, C-7, C-13)*, 29.5 (CH2, 3 C, C-9, C-10, C-11)*,
29.5 (CH2, 2 C, C-8, C-12)*, 29.6 (CH2, 2 C, C-6, C-14)*, 32.9 (CH2, 2 C, C-4, C-16), 47.2
(CH, 2 C, C-3, C-17), 212.7 (Cq, 2 C, C-2, C-18).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
EIMS (70 eV, 175 °C): m/z (%) = 324 [M+] (7), 253 (21), 85 (14), 72 (100), 43 (56).–
HREIMS: ber.: 324.30283
gef.: 324.30268
6.3.4 (-)-α-Cyperon (Naturstoff 66512b)
O
123
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
8a 4a
30
Summenformel: C15H21O.–
Molmasse: 218.33 g/mol.–
Rf-Wert: 0.49 (CH2Cl2).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= –36.6° (c = 0.9, CH2Cl2) Lit.:
[]
20
D
α
= –92.2° (c = 2.04).–
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ = 1.25 (s, 3 H, 9-H), 1.46 (m, 1 H, 5-Ha), 1.65 (m, 1 H, 6-Ha),
1.73 (m, 2 H, 6-Hb, 5-Hb), 1.78 (m, 2 H, 4-H), 1.80 (s, 3 H, 10-H), 1.81 (d, J13,12 = 1.1 Hz,
3 H, 13-H), 2.07 (m, 2 H, 8-Ha, 7-H), 2.42 (ddd, Jgem = 16.9 Hz, J3a,4a = 4.5 Hz,
J3a,4b = 3.5 Hz, 1 H, 3-Ha), 2.54 (ddd, Jgem = 16.9 Hz, J3b,4a = 13.8 Hz, J3b,4b = 5.8 Hz, 1 H,
3-Hb), 2.76 (m, 1 H, 8-Hb), 4.80 (d, J12,13 = 1.1 Hz, 2 H, 12-H).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 112
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ = 10.9 (CH3, C-10), 20.7 (CH3, C-13), 22.5 (CH3, C-9), 26.9
(CH2, C-6), 32.9 (CH2, C-8), 33.8 (CH2, C-3), 35.8 (Cq, C-4a), 37.5 (CH2, C-4), 41.9 (CH2,
C-5), 45.9 (CH, C-7), 109.2 (CH2, C-12), 128.8 (Cq, C-1), 149.2 (Cq, C-11), 162.1 (Cq, C-8a),
199.1 (Cq, C-2).–
6.3.5 (3R,4R)-4-Hydroxymellein (Naturstoff 66514a)
1
3
4
5
69
8
7
O
O
OH
OH
31
Summenformel: C10H10O4.–
Molmasse: 194.18 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 108–110 °C (Lit.: 112–117 °C).–
Rf-Wert: 0.36 (CH2Cl2).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= –39.2 (c = 0.25, MeOH) Lit.:
[]
20
D
α
= –31° (MeOH).–
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 1.58 (d, J9,3 = 6.6 Hz, 3 H, 9-H), 4.57 (d, J4,3 = 2.1 Hz, 1 H,
4-H), 4.70 (dq, J3,9 = 6.6 Hz, J3,4 = 2.1 Hz, 1 H, 3-H), 6.93 (d, J7,6 = 7.4 Hz, 1 H, 7-H)*, 6.99
(dd, J5,6 = 8.4 Hz, J5,7 = 0.9 Hz, 1 H, 5-H)*, 7.52 (dd, J6,5 = 8.4 Hz, J6,7 = 7.4 Hz, 1 H, 6-H),
10.93 (br. s, 1 H, 8-OH).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 16.4 (CH3, C-9), 67.5 (CH, C-3), 78.8 (CH, C-4), 107.2 (Cq,
C-8a), 118.7 (Cq, C-7)*, 118.9 (Cq, C-5)*, 137.2 (CH, C-6), 141.0 (Cq, C-4a), 162.3 (Cq, C-8),
169.7 (Cq, C-1).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
Physikalische Daten der Naturstoffe 113
6.3.6 Ascolacton (Naturstoff 66515a)
O
O
HO
HO
3
4
5617
8
7
32
Summenformel: C16H30O4.–
Molmasse: 286.41 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 101–102 °C.–
Rf-Wert: 0.51 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= –37.1° (c = 0.8, CH2Cl2).–
IR (KBr): ν (cm-1) = 3440, 2954, 2920, 2850, 1755, 1722, 1469, 1385, 1227, 1122, 1092,
1070, 872, 721.–
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ = 0.90 (t, J17,16 = 6.9 Hz, 3 H, 17-H), 1.28 (s, 16 H, 8 x CH2),
1.39 (m, 1 H, 8-Ha), 1.48 (m, 1 H, 8-Hb), 1.64 (m, 1 H, 7-Ha), 1.77 (m, 1 H, 7-Hb), 1.83 (dt,
Jgem = 13.6 Hz, J5a,4 = J5a,6 = 11.7 Hz, 1 H, 5-Ha), 2.28 (dt, Jgem = 13.6 Hz, J5b,4 =
J5b,6 = 3.6 Hz, 1 H, 5-Hb), 3.27 (br. s, 1 H, OH), 3.88 (br. s, 1 H, OH), 4.01 (d, J3,4 = 9.7 Hz,
1 H, 3-H), 4.06 (m, 1 H, 4-H), 4.34 (m, 1 H, 6-H).–
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ = 14.1 (CH3, C-17), 22.7 (CH2, C-16), 24.8 (CH2, C-8), 29.3
(CH2), 29.3 (CH2), 29.4 (CH2), 29.5 (CH2), 29.6 (CH2), 29.7 (CH2), 31.9 (CH2, C-15), 35.7
(CH2, C-7)*, 35.9 (CH2, C-5)*, 69.1 (Cq, C-4), 74.4 (Cq, C-3), 78.6 (Cq, C-6), 173.2 (Cq,
C-2).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
EIMS (70 eV, 200 °C): m/z (%) = 286 (3), 223 (7), 211 (9), 193 (5), 180 (4), 166 (4), 137 (5),
123 (7), 111 (9), 95 (17), 69 (17), 60 (100), 43 (23).–
HREIMS: ber.: 286.21442
gef.: 286.21405
Physikalische Daten der Naturstoffe 114
6.4 Naturstoffe aus Stamm 6577
6.4.1 Anzucht, Extraktion und Isolierung
Der Stamm 6577 , Pseudoanguillospora sp. wurde aus der Rotalge Polyides rotundus aus der
Ostsee bei Ahrenshoop isoliert und 21 Tage bei Raumtemperatur in einer 5 L-Kultur auf
Biomalz-Festagar kultiviert.
Die Agarplatten wurden für 3 Tage eingefroren und nach dem Auftauen durch Filtration vom
flüssigen Anteil getrennt. Filtrat und Mycel wurden jeweils viermal mit Ethylacetat extrahiert.
Nach Einengen der vereinigten Ethylacetatphasen resultierten 18 g Rohextrakt.
Der Rohextrakt wurde mit Hexan gewaschen und die Hexanphase verworfen. Anschließend
wurde der hexanunlösliche Teil in Dichlormethan aufgenommen und die Dichlormethanphase
erneut vom unlöslichen Teil getrennt. Durch Kristallisation aus der Dichlormethanphase
konnte zunächst der Naturstoff 65772 (33, 14.9 g) gewonnen werden. Die Mutterlauge wurde
anschließend durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem Gradienten von reinem
Dichlormethan bis zu einem Gemisch aus Dichlormethan und Methanol (9:1) in 5 Fraktionen
aufgetrennt. Aus Fraktion 3 konnte durch präparative Schichtchromatographie an Kieselgel
mit Dichlormethan/Methanol (93:7) der Naturstoff 6577c3 (34, 1.5 g) isoliert werden. Der in
Dichlormethan unlösliche Teil des Rohextraktes enthielt ein größere Menge des
Abbauproduktes von Naturstoff 65772 und wurde deshalb noch einmal mit Methanol
gewaschen. Die Methanolphase wurde ebenfalls an Kieselgel chromatographiert und mit
einem Gradienten von reinem Dichlormethan bis zu einem Gemisch aus
Dichlormethan/Methanol (9:1) in 4 Fraktionen aufgetrennt. Aus Fraktion 4 konnte der
Naturstoff 6577m4 (35, 222 mg) durch PSC an RP-Kieselgel mit Methanol/Wasser (1:1)
isoliert werden.
6.4.2 Cephalochromin (Naturstoff 65772)
2
34
56
O
O
OOHOH
HO
OH
OH
OHO
7
10
8
9
11
33
Summenformel: C28H22O10.–
Physikalische Daten der Naturstoffe 115
Molmasse: 518.12 g/mol.–
Schmelzpunkt: Zers. = 180 °C (Lit.: >300 °C).–
Rf-Wert: 0.49 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= +618.2° (c = 0.11, Dioxan) Lit.:
[]
20
D
α
= +727° (c = 0.19, Dioxan).–
1H-NMR (200 MHz, CD3OD): δ = 1.44 (d, J11,2 = 6.1 Hz, 6 H, 11-H, 11’-H), 2.70 (d,
J3,2 = 7.4 Hz, 4 H, 3-H, 3’-H), 4.51 (m, 2 H, 2-H, 2’-H), 5.94 (s, 2 H, 10-H, 10’-H), 6.17
(br. s, 2 H, 8-OH, 8’-OH), 6.53 (s, 2 H, 7-H, 7’-H), 9.63 (s, 2 H, 6-OH, 6’-OH), 14.98 (s, 2 H,
5-OH, 5’-OH).–
13C-NMR (50 MHz, CD3OD): δ = 21.3 (CH3, 2 C, C-11, C-11’), 43.6 (CH2, 2 C, C-3, C-3’),
73.7 (CH, 2 C, C-2, C-2’), 100.0 (CH, 2 C, C-10, C-10’), 100.3 (CH, 2 C, C-7, C-7’), 102.7
(Cq, 2 C, C-9, C-9’)*, 102.8 (Cq, 2 C, C-4a, C-4a’)*, 105.8 (Cq, 2 C, C-5a, C-5a’), 142.6 (Cq,
2 C, C-9a, C-9a’), 156.7 (Cq, 2 C, C-10a, C-10a’), 160.5 (Cq, 2 C, C-8, C-8’), 161.1 (Cq, 2 C,
C-6, C-6’), 164.8 (Cq, 2 C, C-5, C-5’), 198.9 (Cq, 2 C, C-4, C-4’).–
*Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
EIMS (70 eV, 200 °C): m/z (%) = 518 [M+] (27.6), 194 (8.8), 166 (9.5), 149 (14.3), 125
(10.6), 111 (13.3), 97 (21.3), 83 (27.3), 69 (36.3), 57 (64.4), 43 (100), 28 (95.6).–
6.4.3 Pseudoanguillosporin A (Naturstoff 6577c3)
16
10
11
12
13
14
15
3
4
9
1
5
6
7
8
O
OH
HO
34
Summenformel: C17H26O3.–
Molmasse: 278.39 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 46–48 °C.–
Rf-Wert: 0.64 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 116
Drehwert:
[]
20
D
α
= –724.6° (c = 0.65, MeOH).–
CD (CH3CN): λ (∆ε) = 198 (–9.8), 231 (0.0), 238 (0.7), 254 (0.0), 282 (–0.5).–
UV (CH3CN): λ (log ε) = 283 (3.42), 201 (4.72).–
IR (Film): ν (cm-1) = 3437, 3330, 2952, 2922, 2852, 1604, 1462, 1452, 1254, 1105, 1043.–
1H-NMR (200 MHz, CD3OD): δ = 0.92 (t, J15,14 = 6.8 Hz, 3 H, 15-H), 1.33 (m, 8 H, 11-H,
12-H, 13-H, 14-H), 1.42 (m, 1 H, 10-Ha), 1.60 (m, 3 H, 9-H, 10-Hb), 1.98 (s, 3 H, 16-H), 2.33
(dd, Jgem = 16.4 Hz, J4a,3 = 10.8 Hz, 1 H, 4-Ha), 2.57 (dd, Jgem = 16.4 Hz, J4b,3 = 2.6 Hz, 1 H,
4-Hb), 3.50 (m, 1 H, 3-H), 4.51 (d, Jgem = 14.7 Hz, 1 H, 1-Ha), 4.85 (d, Jgem = 14.7 Hz, 1 H,
1-Hb), 6.21 (s, 1 H, 7-H).–
13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ = 9.1 (CH3, C-16), 13.2 (CH3, C-15), 22.4 (CH, C-14), 25.4
(CH2, C-10), 29.1 (CH2, C-12)**, 29.5 (CH2, C-11)**, 31.7 (CH2, C-13), 32.3 (CH2, C-4),
36.0 (CH2, C-9), 64.7 (CH2, C-1), 75.0 (CH, C-3), 99.7 (CH, C-7), 112.7 (Cq, C-5)*, 112.8
(Cq, C-8a)*, 133.4 (Cq, C-4a), 150.8 (Cq, C-8), 153.5 (Cq, C-6).–
Die Zuordnung der mit * und ** gekennzeichneten Signale ist vertauschbar.
EIMS (70 eV, 200 °C): m/z (%) = 278 [M+] (20), 179 (9), 150 (78), 99 (26), 86 (58), 57 (27),
44 (100), 28 (31).–
HREIMS: ber.: 278.18819
gef.: 278.18869
6.4.4 Pseudoanguillosporin B (Naturstoff 6577m4)
16
10
11
12
13
14
15
3
4
9
1
5
6
7
8
O
OH
HO
OH
35
Summenformel: C17H26O4.–
Molmasse: 294.18 g/mol.–
Rf-Wert: 0.40 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 117
Drehwert:
[]
20
D
α
= –625.0° (c = 0.76, MeOH).–
UV (MeOH): λmax (log ε) = 427 (4.64), 338 (5.39), 286 (6.36).–
IR (Film): ν (cm-1) = 3383, 2931, 2858, 1606, 1462, 1335, 1259, 1107, 1045.–
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ =1.17 (d, J15,14 = 6.2 Hz, 3 H, 15-H), 1.49 (m, 10 H, 9-H,
10-H, 11-H, 12-H, 13-H), 1.98 (s, 3 H, 16-H), 2.33 (dd, Jgem = 16.6 Hz, J4a,3 = 10.8 Hz, 1 H,
4-Ha), 2.59 (dd, Jgem = 16.6 Hz, J4b,3 = 2.2 Hz, 1 H, 4-Hb), 3.51 (m, 1 H, 3-H), 3.73 (m, 1 H,
14-H), 4.50 (d, Jgem = 14.7 Hz, 1 H, 1-Hb), 4.84 (d, Jgem = 14.7 Hz, 1 H, 1-Ha), 6.21 (s, 1 H,
7-H).–
13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ = 9.0 (CH3, C-16), 22.2 (CH3, C-15), 25.3 (CH2, C-12)**,
25.5 (CH2, C-10)**, 29.5 (CH2, C-11), 32.3 (CH2, C-4), 35.8 (CH2, C-9), 38.8 (CH2, C-13),
64.6 (CH2, C-1), 67.3 (CH, C-14), 74.9 (CH, C-3), 99.6 (CH, C-7), 112.7 (Cq, C-5)*, 112.8
(Cq, C-8a)*, 133.4 (Cq, C-4a), 150.8 (Cq, C-8), 153.5 (Cq, C-6).–
Die Zuordnungen der mit * und ** gekennzeichneten Signale sind untereinander vertauschbar.
EIMS (70 eV, 200 °C): m/z (%) = 294 [M+] (2), 279 (3), 177 (5), 143 (13), 111 (7), 97 (11),
71 (18), 56 (32), 45 (62), 31 (100).–
HREIMS: ber.: 294.18311
gef.: 294.18316
6.5 Naturstoffe aus Stamm 7067
6.5.1 Anzucht, Extraktion und Isolierung
Bei dem Stamm 7067 handelt es sich um Coniothyrium sp. aus der Pflanze Carpobrotus
edulis von Gomera. Der Stamm wurde für 28 Tage in einer 12 L Kultur auf Biomalz-Festagar
bei Raumtemperatur kultiviert. Die Agarplatten wurden für drei Tage bei –10 °C eingefroren
und nach dem Auftauen filtriert. Filtrat und Biomasse wurden je fünfmal mit Ethylacetat
extrahiert und die vereinigten organischen Phasen eingeengt. Es resultierten 27.8 g
Rohextrakt.
Der Rohextrakt wurde mittels Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem
Dichlormethan/Methanol-Gradienten (0–10% in 1 %-Schritten von je 500 mL) in
7 Fraktionen aufgeteilt. Fraktion 4 lieferte nach einer Säulenchromatographie an Sephadex
Physikalische Daten der Naturstoffe 118
LH 20 durch Kristallisation aus Dichlormethan den Naturstoff 70674a (36, 52.8 mg). Aus
Fraktion 5 konnten mittels Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 und Kieselgel mit
Dichlormethan/Methanol (9:1) sowohl der Naturstoff 70675b (37, 1.03 g) als auch der
Naturstoff 70675c (39, 32.7 mg), der nochmals mittels präparativer Schichtchromatographie
(Laufmittel Dichlormethan/Methanol, 92:8) gereinigt wurde, isoliert werden. Die Fraktion 7
wurde durch eine weitere Säulenchromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol
(95:5) in 8 Unterfraktionen aufgeteilt, von denen die sechste nach Säulenchromatographie an
Sephadex LH 20 und Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol (98:2) den Naturstoff 70677c
(40, 134.5 mg) lieferte. Aus der achten Unterfraktion konnte durch Säulenchromatographie an
Sephadex LH 20 und anschließender Kristallisation aus Dichlormethan/Methanol (3:2) der
Naturstoff 70677d (42, 8.2 mg) gewonnen werden. Die Mutterlauge wurde einer weiteren
Säulenchromatographie an Kieselgel unterzogen und lieferte den Naturstoff 70677f (43,
3.1 mg), der noch einmal durch Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 gereinigt wurde.
6.5.2 Graphislacton A (Naturstoff 70674a)
O
O
OH
OH
O
O
1
2
3
4
4a
5
6
6a
7
8
9
10
10a
10b
11
12
13
36
Summenformel: C16H14O6.–
Molmasse: 302.28 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 232–234 °C (Lit.: 236–237 °C).–
Rf-Wert: 0.88 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
1H-NMR (DMSO-d6, 200 MHz): δ = 2.61 (s, 3 H, 11-H), 3.87 (s, 3 H, 12-H)*, 3.88 (s, 3 H,
13-H)*, 6.51 (d, J8,10 = 1.9 Hz, 1 H, 8-H), 6.83 (s, 1 H, 2-H), 7.07 (br. s, 1 H, 10-H), 9.17 (s,
1 H, OH), 11.89 (s, 1 H, OH).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
13C-NMR (DMSO-d6, 50 MHz): δ = 25.5 (CH3, C-11), 56.5 (CH3, C-12)*, 56.8 (CH3, C-13)*,
99.2 (Cq, C-6a), 100.1 (CH, C-8), 104.4 (CH, C-10), 111.2 (Cq, C-10b), 113.6 (CH, C-2),
Physikalische Daten der Naturstoffe 119
126.9 (Cq, C-1), 133.1 (Cq, C-10a), 138.6 (Cq, C-4), 141.3 (Cq, C-3), 148.8 (Cq, C-4a), 164.8
(Cq, C-6)**, 165.3 (Cq, C-7)**, 166.7 (Cq, C-9).–
Die Zuordnung der mit * und ** gekennzeichneten Signale ist vertauschbar.
6.5.3 Massarilacton A (Naturstoff 70675b)
O
O
OH
O
HO
2
435
65a
8
9
10
11
8a
37
Summenformel: C11H14O5.–
Molmasse: 226.23 g/mol.–
Rf-Wert: 0.65 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= +15.5° (c = 0.35, CH2Cl2) Lit.:
[]
20
D
α
= +8.7° (c = 0.3, CH2Cl2).–
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ = 1.07 (d, J11,9 = 7.1 Hz, 3H, 11-H), 1.78 (ddd,
Jgem = 15.6 Hz, J3a,4 = 6.0 Hz, J3a,2 = 1.9 Hz, 1 H, 3-Ha), 1.95 (q, J9,11 = 7.1 Hz, 1 H, 9-H),
2.18 (dd, Jgem = 15.6 Hz, J3b,2 = 3.0 Hz, 1 H, 3-Hb), 4.17 (m, 3 H, 2-H, 4-H, 5-H), 4.52 (dd,
Jgem = 2.7 Hz, J10a,8a = 2.2 Hz, 1 H, 10-Ha), 4.71 (d, Jgem = 2.7 Hz, 1 H, 10-Hb), 5.63 (t,
J8a,10a = 2.2 Hz, 1 H, 8a-H).–
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ = 14.2 (CH3, C-11), 38.5 (CH2, C-3), 46.0 (CH, C-9), 61.5
(Cq, C-5a), 66.3 (CH, C-4)*, 69.4 (CH, C-5)*, 76.8 (CH, C-8a), 83.8 (CH, C-2), 89.6 (CH2,
C-10), 156.6 (Cq, C-8), 171.8 (Cq, C-6).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
Physikalische Daten der Naturstoffe 120
6.5.3.1 Hydroxymassarilacton
O
O
OH
O
HO
2
435
65a
8
9
10 11
8a
OH
38
Summenformel: C11H16O6.–
Molmasse: 244.24 g/mol.–
Rf-Wert: 0.52 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ = 0.89 (d, J11,9 = 6.9 Hz, 3 H, 11-H), 1.57 (s, 3 H, 10-H), 1.62
(dd, Jgem = 14.6 Hz, J3Ha,4 = 5.7 Hz, 1 H, 3-Ha), 1.86 (m, 1 H, 9-H), 2.41 (dd, Jgem = 14.6 Hz,
J3b,4 = 2.2 Hz, 1 H, 3-Hb), 4.21 (m 2 H, 2-H, 4-H), 4.56 (d, J8a,5 = 2.0 Hz, 1 H, 8a-H), 4.71
(dd, J5,4 = 4.4 Hz, J5,8a = 2.0 Hz, 1 H, 5-H).–
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ = 14.5 (CH3, C-11), 17.0 (CH3, C-10), 35.6 (CH2, C-3), 41.2
(CH, C-9), 67.8 (Cq, C-5a), 73.4 (CH, C-4), 79.7 (CH, C-5), 82.0 (CH, C-2), 86.6 (CH, C-8a),
108.7 (Cq, C-8), 174.1 (Cq, C-6).–
EIMS (70 eV, 200 °C): m/z (%) = 226 (6.5), 166 (94.9), 139 (21.2), 93 (28.4), 43 (100.0).–
6.5.4 Massarilacton C (Naturstoff 70675c)
1
234
5
7
8
9
10
11
12
13
O
OH
O
HO
O
O
39
Summenformel: C12H18O6.–
Molmasse: 258.27 g/mol.–
Rf-Wert: 0.58 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 121
Drehwert:
[]
20
D
α
= +51.1° (c = 0.7, CH2Cl2).–
IR (Film): ν (cm-1) = 3446, 2949, 1732, 1720, 1271, 1248, 1111, 1093, 1070, 1014.–
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ = 1.01 (d, J9,8 = 7.0 Hz, 3 H, 9-H), 1.79 (ddd, Jgem = 15.5 Hz,
J4a,3 = 5.7 Hz, J4a,5 = 1.2 Hz, 1 H, 4-Ha), 1.86 (q, J8,9 = 7.0 Hz, 1 H, 8-H), 2.16 (s, 3 H, 13-H),
2.20 (dd, Jgem = 15.5 Hz, J4b,5 = 3.8 Hz, 1 H, 4-Hb), 3.69 (s, 3 H, 11-H), 4.11 (d, J2,3 = 5.5 Hz,
1 H, 2-H), 4.14 (m, 1 H, 3-H), 4.18 (m, 1 H, 5-H), 5.07 (s, 1 H, 7-H).–
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ = 15.1 (CH3, C-9), 28.7 (CH3, 13-C), 38.2 (CH2, C-4), 45.7
(CH, C-8), 52.3 (CH3, C-11), 64.5 (Cq, C-1), 66.4 (CH, C-3), 73.6 (CH, C-2), 81.1 (CH, C-5),
81.5 (CH, C-7), 170.8 (Cq, C-10), 206.9 (Cq, C-12).–
EIMS (70 eV, 200 °C): m/z (%) = 258 (1.3) [M+], 227 (6.0) [M+-OCH3], 215 (47.1)
[M+-COCH3], 183 (100.0), 153 (27.8), 137 (26.0).–
HREIMS: ber.: 258.11035
gef.: 258.10992
6.5.5 Massarilacton D (Naturstoff 70677c)
O
O
O
HO
HO
2
3
44a 7
8
9
10
11
7a
5
OH
40
Summenformel: C11H14O6.–
Molmasse: 242.23 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 84–88 °C.–
Rf-Wert: 0.38 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= –116.1° (c = 0.56, MeOH).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 122
IR (Film): ν (cm-1) = 3404, 2918, 1747, 1678, 1441, 1308, 1209, 1140, 1051, 1024, 966, 930,
903.–
1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δ = 1.63 (s, 3 H, 11-H), 1.77 (dd, J10,9 = 6.5 Hz, J10,8 = 1.3 Hz,
3 H, 10-H), 3.82 (t, J3,2 = J3,4 = 4.2 Hz, 1 H, 3-H), 4.31 (d, J4,3 = 4.2 Hz, 1 H, 4-H), 4.85 (dd,
J2,8 = 7.9 Hz, J2,3 = 4.2 Hz, 1 H, 2-H), 5.79 (m, 1 H, 8-H), 5.95 (m, 1 H, 9-H).–
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δ = 16.6 (CH3, C-10), 21.8 (CH3, C-11), 62.9 (CH, C-4), 71.2
(CH, C-3), 84.9 (CH, C-2), 99.9 (Cq, C-4a), 101.2 (Cq, C-7), 125.2 (CH, C-8), 131.7 (CH,
C-9), 170.1 (Cq, C-5), 174.2 (Cq, C-7a).–
CIMS (iso-Butan, 150 °C): m/z (%) = 485 [2M+H+] (73.1), 243 [M+H+] (100.0), 225
[M-H2O+H+] (11.5), 181 (18.3).–
6.5.6 Coniothyrenol (Naturstoff 70677d)
O
HO
HO
OH
OH
12
3
4
5
6
8
91011
12 13
1415
16
17
OH
12a
12b
4a
6a
7a
11a
H
H
H
42
Summenformel: C22H36O6.–
Molmasse: 396.52 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 283–285 °C.–
Rf-Wert: 0.31 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= +11.1° (c = 0.19, MeOH).–
1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δ = 0.76 (s, 3 H, 15-H), 0.77 (s, 3 H, 13-H), 0.81 (s, 3 H,
14-H), 0.99 (m, 1 H, 1-Ha), 1.00 (s, 3 H, 16-H), 1.17 (dt, Jgem = J3Ha,2Ha = 13.3 Hz,
J3Ha,2Hb = 3.9 Hz, 1 H, 3-Ha), 1.35 (br. d, Jgem = 13.3 Hz, 1 H, 3-Hb), 1.43 (m, 2 H, 2-Ha,
4a-H), 1.58 (m, 4 H, 1-Hb, 2-Hb, 5-Ha, 12-Ha), 1.76 (dt, Jgem = 13.1 Hz, J5Hb,6 =
Physikalische Daten der Naturstoffe 123
J5Hb,4a = 2.6 Hz, 1 H, 5-Hb), 1.99 (t, Jgem = J12Hb,12a = 14.4 Hz, 1 H, 12-Hb), 2.27 (dd,
J12a,12Hb = 14.3 Hz, J12a,12Ha = 4.4, 1 H, 12a-H), 3.27 (d, J11,10 = 9.6 Hz, 1 H, 11-H), 3.57 (t,
J6,5Hb = J6,5Ha = 2.6 Hz, 1 H, 6-H), 3.99 (m, 2 H, 7a-H, 10-H), 4.33 (d, J8,17Ha = 2.0 Hz, 1 H,
8-H), 5.06 (q, Jgem = J17Ha,8 = J17Ha,10 = 2.0 Hz, 1 H, 17-Ha), 5.16 (t, Jgem = J17Hb,10 = 2.0 Hz, 1
H, 17-Hb).–
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δ = 14.3 (CH3, C-13), 18.2 (CH2, C-2), 20.3 (CH3, C-15),
23.1 (CH3, C-16), 26.1 (CH2, C-5), 30.0 (CH2, C-12), 32.1 (CH3, C-14), 32.3 (Cq, C-4), 36.8
(Cq, C-12b), 39.0 (CH2, C-1), 41.9 (CH2, C-3), 42.1 (CH, C-12a), 47.5 (CH, C-4a), 68.9 (CH,
C-8), 71.3 (CH, C-10), 71.6 (Cq, C-11a), 74.1 (CH, C-6), 75.5 (CH, C-7a), 77.5 (Cq, C-6a),
78.8 (CH, C-11), 103.6 (CH2, C-17), 147.9 (Cq, C-9).–
EIMS (70 eV, 200 °C): m/z (%) = 396 (4.1) [M+], 378 (12.2) [M+-H2O], 360 (38.3) [M+-2
H2O], 331 (34.9), 293 (100.0), 189 (35.0), 177 (40.9), 123 (93.1).–
HREIMS: ber.: 396.25119
gef.: 396.25116
6.5.7 Massarigenin E (Naturstoff 70677f)
123
4
5
6
7
8
OH
HO
HO
O
43
Summenformel: C8H12O4.–
Molmasse: 172.18 g/mol.–
Rf-Wert: 0.06 (CH2Cl2/MeOH 8:2).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= +58.1° (c = 0.16, MeOH).–
1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δ = 1.07 (d, J8,2 = 7.0 Hz, 3 H, 8-H), 2.40 (ps. t, J1,2 ≈
J1,6 ≈ 10.9 Hz, 1 H, 1-H), 2.49 (m, 1 H, 2-H), 3.78 (dd, J6,1 = 11.3 Hz, J6,5 = 4.0 Hz, 1 H, 6-H),
4.03 (ps. t, J5,4 ≈ J5,6 ≈ 4.7 Hz, 1 H, 5-H), 5.69 (dd, J3,4 = 9.9 Hz, J3,2 = 1.9 Hz, 1 H, 3-H), 5.80
(ddd, J4,3 = 9.9 Hz, J4,5 = 5.3 Hz, J4,2 = 2.6 Hz, 1 H, 4-H).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 124
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δ = 18.4 (CH3, C-8), 35.2 (CH, C-2), 50.5 (CH, C-1), 65.0
(CH, C-5), 70.8 (CH, C-6), 125.3 (CH, C-4), 135.0 (CH, C-3), 176.9 (Cq, C-7).–
CIMS (iso-Butan, 150 °C): m/z (%) = 173 [M+H+] (3.1), 155 [M+H+-H2O] (4.6), 137 [M+H+-
2H2O] (1.6).–
6.6 Naturstoff aus Stamm 6754
6.6.1 Anzucht, Extraktion und Isolierung
Der noch nicht identifizierte Stamm 6754, aus Trifolium dubium bei Wustrow an der Ostsee,
wurde für 28 Tage in einer 12 L Kultur auf Dinkel-Gerste-Medium bei Raumtemperatur
inkubiert und anschließend lyophylisiert. Das Lyophylisat wurde fünfmal mit je 3 L
Ethylacetat extrahiert und am Rotationsverdampfer eingeengt. Es resultierten 44.4 g
Rohextrakt, die auf Grund des außergewöhnlich hohen Fettanteils mit 250 mL Hexan
extrahiert wurden. Die verbleibenden 8.4 g entfetteten Rohextrakts wurden mittels einer
Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem Dichlormethan/Methanol-Gradienten (0–12 %
Methanol in 1 %-Schritten von je 300 mL) in 5 Fraktionen aufgeteilt. Fraktion 5 lieferte durch
Kristallisation aus Dichlormethan/Methanol (88:12) den Naturstoff 67545 (45, 956.9 mg).
6.6.2 1,6-Di-O-acetyl-D-mannitol (Naturstoff 67545)
O
OH
OH
OH
OH
O
123456
7
8910
O
O
45
Summenformel: C10H18O8.–
Molmasse: 266.25 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 128–130 °C (Lit.: 129 °C).–
Rf-Wert: 0.16 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= +10.5° (c = 0.62, MeOH).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 125
IR (KBr): ν (cm-1) = 3357, 2949, 2920, 2482, 1741, 1400, 1365, 1242, 1082, 1043, 931, 897,
750, 604, 553, 480, 407.–
Kristallsystem: Triklin.–
Raumgruppe: P 1.–
Dimensionen der Zelle: a = 7.249(3) α = 77.48(1)
b = 7.326(3) β = 87.80(1)
c = 11.974(5) γ = 86.67(1)
1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δ = 2.10 (s, 6 H, 8-H, 10-H), 3.81 (d, J3,2 = 8.8 Hz, 2 H, 3-H,
4-H), 3.89 (ddd, J2,3 = 8.8 Hz, J2,1a = 6.1 Hz, J2,1b = 2.5 Hz, 2 H, 2-H, 5-H), 4.19 (dd,
Jgem = 11.5 Hz, J1a,2 = 6.1 Hz, 2 H, 1-Ha, 6-Ha), 4.40 (dd, Jgem = 11.5 Hz, J1b,2 = 2.5 Hz, 2 H,
1-Hb, 6-Hb).–
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δ = 19.5 (CH3, 2 C, C-8, C-10), 66.6 (CH2, 2 C, C-1, C-6),
68.9 (CH, 2 C, C-2, C-5)*, 69.2 (CH, 2 C, C-3, C-4)*, 171.9 (Cq, C-7, C-9).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
CIMS (iso-Butan, 150 °C): m/z (%) = 267 [M+H+] (52.8), 249 [M+H+-H2O] (100.0), 231
[M+H+-2H2O] (18.2).–
6.7 Naturstoff aus Stamm 6579
6.7.1 Anzucht, Extraktion und Isolierung
Der Stamm 6579, Ulocladium sp. aus der Rotalge Polysiphonia sp. aus der Ostsee bei
Ahrenshoop, wurde in einer 12 L-Kultur auf Dinkel-Gerste-Medium 28 Tage bei
Raumtemperatur kultiviert. Anschließend wurde die Kultur lyophylisiert und das Lyophylisat
fünfmal mit Ethylacetat extrahiert. Es resultierten 11.4 g Rohextrakt.
Der Rohextrakt wurde mittels Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem
Dichlormethan/Methanol-Gradienten (0–10 % Methanol in 1 %-Schritten von je 300 ml) in 4
Fraktionen aufgetrennt. Fraktion 3 lieferte nach einer weiteren Säulenchromatographie an
Kieselgel mit reinem Dichlormethan als Laufmittel den Naturstoff 65793a (46, 866.8 mg).
Physikalische Daten der Naturstoffe 126
6.7.2 (5S)-3-({(1S,2R,4aR,6S,8R,8aR)-2-[(2S,3S)-2,3-Dimethyloxiran-2-yl]-6,8-
dimethyl-1,2,4a,5,6,7,8,8a-octahydronaphthalin-1-yl}carbonyl)-5-sec-butyl-
4-hydroxy-1-methyl-1,5-dihydro-2H-pyrrol-2-on (Naturstoff 65793a)
1
2
3
4
56
7
8
9
11
12
13 14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
4a
8a
24
25
26
H
H
O
ON
HO
O
H
H
46
Summenformel: C26H39NO4.–
Molmasse: 429.59 g/mol.–
Rf-Wert: 0.93 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= +36.7° (c = 0.42, CH2Cl2).–
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ = 0.76 (dd, J19,16 = 6.9 Hz, J19,14 = 2.1 Hz, 3 H, 19-H), 0.82 (d,
J26,8 = 7.3 Hz, 3 H, 26-H), 0.90 (m, 6 H, 18-H, 25-H), 1.00 (m, 2 H, 5-H), 1.09 (d,
J23,22 = 2.9 Hz, 3 H, 23-H), 1.21 (m, 4 H, 8-H, 24-H), 1.40 (m, 1 H, 6-H), 1.49 (m, 1 H,
17-Ha), 1.64 (m, 3 H, 7-H, 17-Hb), 1.88 (m, 1 H, 16-H), 2.00 (m, 1 H, 4a-H), 2.14 (m, 1 H,
8a-H), 2.33 (br. d, J2,3 = 9.9 Hz, 1 H, 2-H), 2.73 (m, 1 H, 22-H), 2.87 (d, J15,14 = 2.5 Hz, 3 H,
15-H), 3.60 (m, 1 H, 14-H), 4.17 (m, 1 H, 1-H), 5.26 (d, J3,2 = 9.9 Hz, 1 H, 3-H), 5.73 (m,
1 H, 4-H).–
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ = 12.1 (CH3, C-23), 12.4 (CH3, C-18), 13.9 (CH3, 2 C, C-19,
C-24), 20.4 (CH3, C-26), 22.2 (CH3, C-25), 25.1 (CH2, C-17), 26.6 (CH3, C-15), 33.2 (CH,
C-6), 35.1 (CH, C-1), 35.7 (CH, C-16), 37.6 (CH2, C-5), 37.7 (CH, C-8), 37.8 (CH2, C-7),
39.9 (CH, C-4a), 41.8 (CH, C-8a), 51.4 (CH, C-2), 58.6 (CH, C-22), 62.9 (Cq, C-21), 69.8
(CH, C-14), 103.8 (Cq, C-12), 125.1 (CH, C-3), 133.7 (CH, C-4), 173.5 (Cq, C-11), 190.1 (Cq,
C-9), 194.0 (Cq, C-13).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 127
EIMS (70 eV, 200 °C): m/z (%) = 429 [M+] (13.5), 411 [M+-H2O] (39.4), 393 [M+-2H2O]
(11.8), 358 (15.7), 196 (100.0), 169 (38.6).–
6.8 Naturstoffe aus Stamm 6586
6.8.1 Anzucht, Extraktion und Isolierung
Bei dem Stamm 6586 handelt es sich um Acremonium sp., der aus Enteromorpha linza bei
Ahrenshoop an der Ostsee isoliert wurde. Der Stamm wurde in einer 12 L-Kultur für 21 Tage
bei Raumtemperatur auf Biomalz-Festagar angezüchtet und nach Ablauf dieser Zeit bei –17°
C tiefgefroren. Nach dem Auftauen wurde die Kultur filtriert und das Filtrat und die Biomasse
jeweils viermal mit Ethylacetat extrahiert. Nach dem Einengen der Ethylacetatphase
resultierten 11.4 g Rohextrakt.
Der resultierende Rohextrakt wurde mittels Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem
Dichlormethan/Methanol-Gradienten (0–7 % Methanol in 1 %-Schritten von je 300 mL) in
sieben Fraktionen aufgetrennt. Fraktion 3 enthielt den Naturstoff 65863a (48, 11.9 mg), der
durch Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 gewonnen wurde. Aus Fraktion fünf wurde
durch Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 der Naturstoff 65865a (49, 27.7 mg) und
durch anschließende Kristallisation der zweiten Fraktion der Gelchromatographie aus
Methanol der Naturstoff 65865b (50, 13.5 mg) isoliert.
6.8.2 2,2-Dimethylchromen-6-ol (Naturstoff 65863a)
O
HO
2
3
4
5
4a
6
7
8
8a
9
10
48
Summenformel: C11H12O2.–
Molmasse: 176.21 g/mol.–
Rf-Wert: 0.61 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 1.44 (s, 6 H, 9-H, 10-H), 5.67 (d, J4,3 = 9.7 Hz, 1 H, 4-H),
6.29 (d, J3,4 = 9.7 Hz, 1 H, 3-H), 6.53 (d, J5,7 = 2.8 Hz, 1 H, 5-H), 6.61 (dd, J7,8 = 8.6 Hz,
J7,5 = 2.8 Hz, 1 H, 7-H), 6.70 (d, J8,7 = 8.6 Hz, 1 H, 8-H).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 128
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 28.0 (CH3, C-9, C-10), 76.2 (Cq, C-2), 113.2 (CH, C-5),
115.9 (CH, C-7), 117.3 (CH, C-8), 122.5 (Cq, C-4a), 122.6 (CH, C-4), 132.3 (CH, C-3), 147.0
(Cq, C-8a), 150.0 (Cq, C-6).–
6.8.3 Toluquinol (Naturstoff 65865a)
OH
HO
1
2
3
4
5
6
7
49
Summenformel: C7H8O2.–
Molmasse: 124.14 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 118–122 °C (Lit.: 123–124 °C).–
Rf-Wert: 0.42 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 2.14 (s, 3 H, 7-H), 6.47 (dd, J5,6 = 8.3 Hz, J5,3 = 3.0 Hz, 1 H,
5-H), 6.59 (m, 2 H, 3-H, 6-H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 16.4 (CH3, C-7), 113.3 (CH, C-5), 115.8 (CH, C-3), 117.7
(CH, C-6), 125.8 (Cq, C-2), 148.2 (Cq, C-1), 149.8 (Cq, C-4).–
6.8.4 Helvolinsäure (Naturstoff 65865b)
OH
O
O
O
O
O
O
OH
H
H
1
2
3467
8
9
11
12
13
14
15
16
17
18 19 20
2122
23
24 25
26
10
27
28
29
30
31
32
33
5
50
Summenformel: C33H44O8.–
Physikalische Daten der Naturstoffe 129
Molmasse: 568.70 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 223–226 °C (Lit.: 230 °C).–
Rf-Wert: 0.50 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= –111.9° (c = 0.68, CHCl3) Lit.:
[]
20
D
α
= –88.9° (c = 1, CHCl3).–
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ = 0.95 (s, 3 H, 23-H), 1.20 (s, 3H, 21-H), 1.30 (d,
J18,4 = 6.9 Hz, 18-H), 1.47 (s, 3 H, 22-H), 1.57 (m, 1 H, 11-Ha), 1.63 (s, 3 H, 33-H), 1.71 (s,
3 H, 32-H), 1.85 (m, 1 H, 12-Ha), 1.94 (d, Jgem = 14.8 Hz, 1 H, 15-Ha), 1.97 (s, 3 H, 25-H),
2.00 (m, 1 H, 11-Hb), 2.09 (m, 2 H, 29-H), 2.13 (s, 3 H, 20-H), 2.28 (m, 2 H, 5-H, 15-Hb),
2.50 (m, 3 H, 12-Hb, 28-H), 2.62 (m, 2 H, 9-H, 13-H), 2.80 (m, 1 H, 4-H), 5.13 (m, 1 H,
30-H), 5.25 (s, 1 H, 6-H), 5.89 (m, 2 H, 2-H, 16-H), 7.33 (d, J1,2 = 10.1 Hz, 1 H, 1-H).–
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ = 13.1 (CH3, C-18), 17.8 (CH3, C-33), 17.9 (CH3, C-23),
18.3 (CH3, C-21), 20.5 (CH3, C-25), 20.7 (CH3, C-20), 23.9 (CH2, C-11), 25.7 (CH3, C-32),
25.9 (CH2, C-12), 27.5 (CH3, C-22), 28.3 (CH2, C-29), 28.6 (CH2, C-28), 38.2 (Cq, C-10),
40.4 (CH, C-4), 40.7 (CH2, C-15), 41.7 (CH, C-9), 46.6 (Cq, C-14), 47.2 (CH, C-5), 49.4 (CH,
C-13), 52.7 (Cq, C-8), 73.5 (CH, C-16), 73.8 (CH, C-6), 122.8 (CH, C-30), 127.8 (CH, C-2),
130.4 (Cq, C-27), 132.9 (Cq, C-31), 147.7 (Cq, C-17), 157.3 (CH, C-1), 168.9 (Cq, C-19),
170.2 (Cq, C-24), 174.1 (Cq, C-26), 201.4 (Cq, C-3), 208.8 (Cq, C-7).–
6.9 Naturstoffe aus Stamm 7165
6.9.1 Anzucht, Extraktion und Isolierung
Bei dem Stamm 7165 handelt es sich um Nigrospora sp., der aus Viburnum rigidum von
Gomera isoliert wurde. Der Pilz wurde für 28 Tage bei Raumtemperatur in einer 12 L-Kultur
auf Biomalz-Festagar angezüchtet, anschließend in kleine Stücke geschnitten, mit Ethylacetat
überschichtet und für 24 h stehengelassen. Nach 24 Stunden wurde das Ethylacetat
abdekantiert, der Pilz mit frischem Ethylacetat überschichtet und dieser Vorgang fünfmal
wiederholt. Die vereinigten Ethylacetatphasen ergaben 10.9 g Rohextrakt.
Der gewonnene Rohextrakt wurde mittels Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem
Dichlormethan/Methanol-Gradienten (0–10 % Methanol in 1 %-Schritten von je 500 mL) in 5
Fraktionen aufgetrennt. Aus Fraktion 1 kristallisierte der Naturstoff 71651b (52, 185.6 mg)
aus Dichlormethan. Aus der Mutterlauge konnten mittels einer weiteren
Physikalische Daten der Naturstoffe 130
Säulenchromatographie an Kieselgel mit reinem Dichlormethan die Naturstoffe 71651a (51,
219.7 mg) und 71651c (53, 135.5 mg) isoliert werden. Fraktion 2 lieferte nach
Säulenchromatographie an Sephadex LH 20 die Naturstoffe 71652a (54, 10.7 mg) und
71652b (55, 43.5 mg).
6.9.2 8-Methoxynaphthalin-1-ol (Naturstoff 71651a)
OH O
1
2
3
4
7
5
6
8
9
51
Summenformel: C11H10O2.–
Molmasse: 174.20 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 51–52 °C (Lit.: 55-56 °C).–
Rf-Wert: 0.91 (CH2Cl2).–
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 3.97 (s, 3 H, 9-H), 6.75 (d, J7,6 = 7.6 Hz, 1 H, 7-H), 7.07
(dd, J2,3 = 7.1 Hz, J2,4 = 1.6 Hz, 1 H, 2-H), 7.43 (m, 4 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H), 9.49 (s, 1 H,
OH).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 56.4 (CH3, C-9), 104.4 (CH, C-2), 110.9 (CH, C-7), 115.6
(Cq, C-8a), 119.4 (CH, C-4), 122.3 (CH, C-5), 126.2 (CH, C-6), 128.2 (CH, C-3), 137.3 (Cq,
C-4a), 155.1 (Cq, C-8), 156.6 (Cq, C-1).–
6.9.3 1,8-Dimethoxynaphthalin (Naturstoff 71651b)
O O
1
2
3
4
7
5
6
8
910
52
Summenformel: C12H12O2.–
Physikalische Daten der Naturstoffe 131
Molmasse: 188.22 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 154–157 °C (Lit.: 158-161 °C).–
Rf-Wert: 0.80 (CH2Cl2).–
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 4.03 (s, 6 H, 9-H, 10-H), 6.90 (dd, J2,3 = 6.6 Hz,
J2,4 = 2.3 Hz, 2 H, 2-H, 7-H), 7.40 (m, 4 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 56.9 (CH3, 2 C, C-9, C-10), 106.6 (CH, 2 C, C-2, C-7),
118.0 (Cq, C-8a), 121.3 (CH, 2 C, C-4, C-5), 126.8 (CH, 2 C, C-3, C-6), 137.8 (Cq, C-4a),
157.5 (Cq, 2 C, C-1, C-8).–
6.9.4 5-Hydroxy-2-methylchroman-4-on (Naturstoff 71651c)
O
OOH
2
3
4
7
5
6
89
53
Summenformel: C10H10O3.–
Molmasse: 178.19 g/mol.–
Rf-Wert: 0.85 (CH2Cl2).–
Drehwert:
[]
20
D
α
= 0° (c = 0.1, CH2Cl2).–
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 1.51 (d, J9,2 = 6.3 Hz, 3 H, 9-H), 2.68 (m, 2 H, 3-H), 4.55
(m, 1 H, 2-H), 6.42 (dd, J6,7 = 8.3 Hz, J6,8 = 0.6 Hz, 1 H, 6-H)*, 6.48 (dd, J8,7 = 8.3 Hz,
J8,6 = 0.6 Hz, 1 H, 8-H)*, 7.34 (t, J7,6 = J7,8 = 8.3 Hz, 1 H, 7-H), 11.73 (s, 1 H, OH).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 21.2 (CH3, C-9), 44.2 (CH2, C-3), 74.2 (CH, C-2), 107.7
(CH, C-6)*, 108.4 (Cq, C-4a), 109.5 (CH, C-8)*, 138.5 (CH, C-7), 162.1 (Cq, C-5)**, 162.5
(Cq, C-8a)**, 198.9 (Cq, C-4).–
Die Zuordnungen der mit * und ** gekennzeichneten Signale sind vertauschbar.
Physikalische Daten der Naturstoffe 132
6.9.5 2,6-Dihydroxybutyrophenon (Naturstoff 71652a)
5
OH
OH
O
1
2
3
4
7
6
8
9
10
54
Summenformel: C10H12O3.–
Molmasse: 180.20 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 112–114 °C (Lit. 116-118 °C).–
Rf-Wert: 0.73 (CH2Cl2/MeOH 95:5).–
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 1.03 (t, J10,9 = 7.4, 3 H, 10-H), 1.78 (tq, J9,10 = J9,8 = 7.4 Hz,
2 H, 9-H), 3.16 (t, J8,9 = 7.4 Hz, 2 H, 8-H), 6.43 (d, J3,4 = 7.8 Hz, 2 H, 3-H, 5-H), 7.25 (t, J4,3
= J4,5 = 7.8 Hz, 1 H, 4-H), 10.06 (br. s, 2 H, OH).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 14.3 (CH3, C-10), 18.2 (CH2, C-9), 47.1 (CH2, C-8), 108.7
(CH, 2 C, C-3, C-5), 110.6 (Cq, C-1), 136.1 (CH, C-4), 161.8 (Cq, 2 C, C-2, C-6), 208.5 (Cq,
C-7).–
6.9.6 Helicascolid C (Naturstoff 71652b)
O
O
O
23
4
7
5
6
8
9
10
11
12
13
55
Summenformel: C12H18O3.–
Molmasse: 210.27 g/mol.–
Schmelzpunkt: Smp. = 69–72 °C.–
Rf-Wert: 0.89 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
Physikalische Daten der Naturstoffe 133
Drehwert:
[]
20
D
α
= +35.0° (c = 0.1, CH2Cl2).–
IR (KBr): ν (cm-1) = 2979, 2935, 2864, 1745, 1716, 1466, 1387, 1346, 1302, 1271, 1157,
1119, 1011, 995, 854, 764.–
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ = 0.99 (d, J9,5 = 6.8 Hz, 3 H, 9-H), 1.43 (s, 6 H, 7-H, 8-H),
1.70 (m, 6 H, 12-H, 13-H), 2.72 (dq, J5,6 = 11.3 Hz, J5,9 = 6.8 Hz, 1 H, 5-H), 4.48 (d,
J6,5 = 11.3 Hz, 1 H, 6-H), 5.64 (m, 1 H, 11-H).–
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ = 9.7 (CH3, C-13), 9.9 (CH3, C-9), 13.3 (CH3, C-12), 23.5
(CH3, C-7), 23.6 (CH3, C-8), 43.8 (CH, C-5), 51.6 (Cq, C-3), 85.0 (CH, C-6), 128.4 (CH,
C-11), 130.4 (Cq, C-10), 174.4 (Cq, C-2), 208.5 (Cq, C-4).–
EIMS (70 eV, 200 °C): m/z (%) = 210 [M+] (7.2), 182 (8.9), 126 (13.2), 96 (33.5), 70
(100.0).–
HREIMS: ber.: 210.12559
gef.: 210.12543
Synthesevorschriften und Physikalische Daten 134
7 SYNTHESEVORSCHRIFTEN UND PHYSIKALISCHE DATEN
7.1 Darstellung von 3-Methoxy-pent-2-ensäuremethylester
O O
O
57
Eine Lösung von 3-Oxovaleriansäuremethylester (50.0 g, 0.38 mol) und
Orthoameisensäuretrimethylester (40.8 g, 0.38 mol) in Methanol (50 mL) wird mit konz.
H2SO4 (15 Tropfen) versetzt und 4 Tage gerührt. Anschließend wird der Ansatz 3 h unter
Rückfluß erhitzt, Ameisensäuremethylester und Methanol werden abdestilliert und das
zurückbleibende Rohprodukt wird im Vakuum fraktionierend destilliert. Der Enolether wird
in Form einer farblosen Flüssigkeit erhalten (49.4 g, 0.34 mol, 90 %, Sdp. 119–122 °C/165
mbar).
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 1.04 (t, J5,4 = 7.5 Hz, 3 H, 5-H), 2.69 (q, J4,5 = 7.5 Hz, 2 H,
4-H), 3.56 (s, 3 H, OCH3), 3.59 (s, 3 H, OCH3), 4.90 (s, 1 H, 2-H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 12.0 (CH3, C-5), 25.7 (CH2, C-4), 50.8 (CH3, OCH3), 55.6
(CH3, OCH3), 89.7 (CH, C-2), 168.2 (Cq, C-3), 178.3 (Cq, C-1).–
7.2 Darstellung von (1,3-Dimethoxypenta-1,3-dienyloxy)-trimethylsilan
O O
O
TMS
58
Zu einer auf –10 °C gekühlten Lösung aus Diisopropylamin (22 mL, 156 mmol) in trockenem
THF (100 mL) wird unter Ar-Atmosphäre langsam n-Butyllithium-Lösung (62 mL, 156
mmol) getropft. Die Lösung wird 20 min bei dieser Temperatur gehalten. Anschließend wird
auf –78 °C abgekühlt und tropfenweise mit 3-Methoxy-pent-2-ensäuremethylester (20 g, 139
mmol) in THF (20 mL) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei –78 °C gerührt und
anschließend mit einer Lösung aus TMSCl (23 mL, 182 mmol) in THF (20 mL) versetzt.
Nach 30 min wird das Gemisch auf RT erwärmt und das THF am Rotationsverdampfer
größtenteils entfernt. Der Rückstand wird in Hexan aufgenommen, filtriert und erneut
eingeengt. Das Produkt wird als blaßgelbes Öl erhalten (28.6 g, 132 mmol, 95 %).
Synthesevorschriften und Physikalische Daten 135
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 0.26 (s, 12 H, TMS), 1.66 (d, J5,4 = 6.9 Hz, 3 H, 5-H), 3.54
(s, 3 H, OCH3), 3.59 (s, 3 H, OCH3), 4.03 (s, 1 H, 2-H), 4.88 (q, J4,5 = 6.9 Hz, 1 H, 4-H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 0.7 (CH3, TMS), 10.7 (CH3, C-5), 55.3 (CH3, OCH3), 57.8
(CH3, OCH3), 74.7 (CH, C-2), 104.7 (CH, C-4), 151.8 (Cq, C-3), 158.2 (Cq, C-1).–
7.3 Darstellung von 3-Chlorpent-2-endisäuredimethylester
O
OCl O
O
60
In einen trockenen 500 mL Dreihalskolben mit Stopfen, Gaseinlass und Trockenrohr wird 3-
Oxopentandisäuredimethylester (60 g, 297 mmol) gegeben und unter stetiger Schutzgaszufuhr
Phosphorpentachlorid (65 g, 313 mmol) in kleinen Portionen über einen Zeitraum von einer
halben Stunde hinzugegeben. Nach beendeter Zugabe wird die Reaktionsmischung im
Wasserbad für eine halbe Stunde auf 40 °C erwärmt, anschließend in einem Eisbad gekühlt,
auf 100 g Eis gegeben und für 15 min gerührt. Nach Abtrennen der organischen Phase, wird
die wäßrige Phase dreimal mit Dichlormethan extrahiert (je 100 mL) und die vereinigten
organischen Phasen über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt.
Das erhaltene rote Öl wird in einem 500 mL Rundhalskolben mit trockenem Methanol (300
mL) und konzentrierter Schwefelsäure (20 mL) versetzt und für 18 Stunden unter Rückfluß
erhitzt. Anschließend wird das Lösungsmittel entfernt und das erhaltene gelbe Öl auf Wasser
(100 mL) gegeben und mit NaCl gesättigt. Die Mischung wird mit Ether extrahiert
(8 × 100 mL) und die vereinigten organischen Phasen nacheinander mit gesättigter NaHCO3-
Lösung (150 mL) und NaCl-Lösung (150 mL) gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Das
Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt. Nach Destillation im Vakuum wird der
Ester als farbloses Öl erhalten (24.3 g, 126 mmol, 43 %, Sdp.: 70–77 °C/0.9 mbar)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 3.74 (s, 3 H, OCH3), 3.76 (s, 3 H, OCH3), 4.12 (s, 2 H,
4-H), 6.28 (s, 1 H, 2-H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 41.7 (CH2, C-4), 52.2 (CH3, OCH3), 52.8 (CH3, OCH3),
122.0 (CH, C-2), 147.5 (Cq, C-3), 165.0 (Cq, C-1), 168.7 (Cq, C-5).–
Synthesevorschriften und Physikalische Daten 136
7.4 Darstellung von Penta-2,3-diendicarbonsäuredimethylester
C
O
O
O
O
61
Zu einer Lösung von 3-Chlorpent-2-endicarbonsäuredimethylester (24.3 g, 126 mmol) in
trockenem THF (100 mL) wird unter Schutzgasatmosphäre bei 0 °C langsam Triethylamin
(20 ml, 145 mmol) getropft. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei 0–5 °C gerührt und
anschließend der entstandene Feststoff durch eine Vakuumfiltration entfernt und mit Ether
(3 × 75 mL) gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen werden mit HCl-Lösung
(1 mol/L, 3 × 75 mL) und gesättigter NaCl-Lösung (3 × 75 mL) gewaschen, über MgSO4
getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Allen wird als gelbes, viskoses
Öl erhalten (19.2 g, 123 mmol, 98 %).
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 3.78 (s, 6 H, 2 x OCH3), 6.05 (s, 2 H, 2-H, 4-H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 52.9 (CH3, 2 C, 2 x OCH3), 92.5 (CH, 2 C, C-2, C-4), 164.1
(Cq, 2 C, C-1, C-5), 220.1 (Cq, C-3).–
7.5 Darstellung von 4,6-Dimethoxy-2-(2-methoxy-2-oxoethyl)-3-methyl-
benzoesäuremethylester und 6-Hydroxy-4-methoxy-2-(2-methoxy-2-
oxoethyl)-3-methyl-benzoesäuremethylester
O
O
CO
2
CH
3
CO
2
CH
3
OH
O
CO
2
CH
3
CO
2
CH
3
+
62a 62b
Bei 0 °C wird unter Rühren und Schutzgasatmosphäre (1,3-Dimethoxypenta-1,3-dienyloxy)-
trimethylsilan (28.6 g, 132 mmol) zu dem vorgelegten Penta-2,3-diendicarbonsäure-
dimethylester (19.2 g, 123 mmol) gegeben. Das sich unter Reaktion dunkel verfärbende
Gemisch wird 5 h bei 0–5 °C gerührt und anschließend unter Kühlung mit methanolischer
Synthesevorschriften und Physikalische Daten 137
HCl (1.54 mmol/L) versetzt bis ein Farbumschlag nach gelborange eintritt. Das Lösungsmittel
wird im Vakuum entfernt und das Rohprodukt chromatographisch gereinigt. Nach
Säulenchromatographie an Kieselgel (Hexan/Dichlormethan 1:1) werden die Substanzen
4,6-Dimethoxy-2-(2-methoxy-2-oxoethyl)-3-methyl-benzoesäuremethylester (15.7 g, 55.6
mmol, 45 %, Smp.: 76 °C) und 6-Hydroxy-4-methoxy-2-(2-methoxy-2-oxoethyl)-3-methyl-
benzoesäure-methylester (4.2 g, 15.6 mmol, 13 %, Smp.: 63–64 °C) erhalten
(Gesamtausbeute 58 %).
4,6-Dimethoxy-2-(2-methoxy-2-oxoethyl)-3-methyl-benzoesäuremethylester (62a):
Summenformel: C14H18O6.–
Molmasse: 282.29 g/mol.–
Rf-Wert: 0.86 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
UV (CH2Cl2): λ (log ε) = 289 (6.7).–
IR (KBr): ν (cm-1) = 3010, 2956, 2900, 2846, 1741, 1728, 1599, 1469, 1442, 1431, 1317,
1267, 1221, 1203, 1169, 1149, 1088, 991, 964, 945, 820.–
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ = 2.08 (s, 3 H, 3-CH3), 3.64 (s, 2 H, 2-CH2), 3.65 (s, 3 H,
OCH3), 3.80 (s, 3 H, OCH3), 3.82 (s, 3 H, OCH3), 3.84 (s, 3 H, OCH3), 6.41 (s, 1 H, 5-H).–
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ = 11.7 (CH3, 3-CH3), 36.0 (CH2, 2-CH2), 52.0 (CH3, OCH3),
52.1 (CH3, OCH3), 55.6 (CH3, 4-OCH3), 56.1 (CH3, 6-OCH3), 94.4 (CH, C-5), 116.4 (Cq,
C-1), 118.5 (Cq, C-3), 132.4 (Cq, C-2), 156.1 (Cq, C-6), 159.5 (Cq, C-4), 168.5 (Cq, CO) 171.0
(Cq, CO).–
EIMS: m/z (%) = 282 (33.1), 250 (42.5), 222 (100.0), 207 (68.9).–
HREIMS: ber.: 282.11034
gef.: 282.11048
6-Hydroxy-4-methoxy-2-(2-methoxy-2-oxoethyl)-3-methyl-benzoesäuremethylester (62b):
Summenformel: C13H16O6.–
Synthesevorschriften und Physikalische Daten 138
Molmasse: 268.26 g/mol.–
Rf-Wert: 0.88 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
UV (CH2Cl2): λ (log ε) = 311 (6.8), 272 (6.7).–
IR (KBr): ν (cm-1) = 3437, 3020, 2989, 2956, 2885, 1730, 1651, 1603, 1433, 1367, 1333,
1286, 1240, 1200, 1151, 1117, 1066, 1016, 982, 947, 837, 810, 775.–
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ = 2.05 (s, 3 H, 3-CH3), 3.66 (s, 3 H, OCH3), 3.78 (s, 3 H,
OCH3), 3.82 (s, 3 H, OCH3), 3.84 (s, 3 H, OCH3), 3.90 (s, 2 H, 2-CH2), 6.37 (s, 1 H, 5-H),
11.34 (s, 1 H, OH).–
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ = 11.7 (CH3, 3-CH3), 37.6 (CH2, 2-CH2), 52.1 (CH3, 2 C,
2 × OCH3), 55.9 (CH3, 4-OCH3), 98.7 (CH, C-5), 105.5 (Cq, C-1), 119.6 (Cq, C-3), 135.6 (Cq,
C-2), 163.0 (Cq, C-6), 163.4 (Cq, C-4), 171.6 (Cq, CO), 172.1 (Cq, CO).–
EIMS: m/z (%) = 268 (52.6), 236 (61.0), 208 (100.0), 193 (79.6), 165 (47.3).–
HREIMS: ber.: 268.09469
gef.: 268.09463
7.6 Darstellung von 2-(Carboxymethyl)-4,6-dimethoxy-3-methyl-
benzoesäure
O
O
CO
2
H
CO
2
H
63
Zu einer Lösung von 4,6-Dimethoxy-2-(2-methoxy-2-oxoethyl)-3-methyl-
benzoesäuremethylester (10.0 g, 39 mmol) in Ethanol (100 mL) und Wasser (100 mL) wird
KOH (8 g) gegeben und die Lösung 48 h unter Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Reaktion
(DC-Kontrolle) wird das Reaktionsgemisch mit HCl (1 mol/L) angesäuert und das Ethanol im
Vakuum entfernt. Die 2-(Carboxymethyl)-4,6-dimethoxy-3-methyl-benzoesäure (9.1 g,
35.8 mmol, 91 %, Smp.: 200–201 °C) fällt als weißer Feststoff aus.
Synthesevorschriften und Physikalische Daten 139
Summenformel: C12H14O6.–
Molmasse: 254.24 g/mol.–
Rf-Wert: 0.05 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
UV (CH3OH): λ (log ε) = 290 (6.6), 269 (6.3).–
IR (KBr): ν (cm-1) = 3419, 3105, 3020, 2956, 2850, 1716, 1693, 1595, 1469, 1437, 1321,
1290, 1236, 1159, 1119, 1090, 1012, 935, 833.–
1H-NMR (CD3OD, 200 MHz): δ = 2.12 (s, 3 H, 3-CH3), 3.76 (s, 2 H, 2-CH2), 3.88 (s, 3 H,
OCH3), 3.90 (s, 3 H, OCH3), 6.63 (s, 1 H, 5-H).–
13C-NMR (CD3OD, 50 MHz): δ = 10.3 (CH3, 3-CH3), 35.9 (CH2, 2-CH2), 55.3 (CH3, OCH3),
55.6 (CH3, OCH3), 94.6 (CH, C-5), 117.3 (Cq, C-1)*, 118.5 (Cq, C-3)*, 132.8 (Cq, C-2), 156.4
(Cq, C-6), 159.9 (Cq, C-4), 171.1 (Cq, COOH), 173.4 (Cq, COOH).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
EIMS: m/z (%) = 254 (32.8), 236 (100.0), 208 (64.7), 192 (89.4) 134 (77.5).–
HREIMS: ber.: 254.07904
gef.: 254.07886
7.7 Darstellung von 4,6-Dimethoxy-2-(2-methoxy-2-oxoethyl)-3-methyl-
benzoesäure
O
COOH
COOCH
3
O
64
Eine Lösung von 2-(Carboxymethyl)-4,6-dimethoxy-3-methyl-benzoesäure (8.7 g, 34 mmol)
in CH2Cl2 (140 mL) und Methanol (25 mL) wird mit p-Toluolsulfonsäure (20 mg) für 5 h
unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt, der Rückstand in
Methanol (30 mL) aufgenommen und die Lösung 24 h unter Rückfluß erhitzt, um die
Veresterung zu vervollständigen. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt
Synthesevorschriften und Physikalische Daten 140
und der Rückstand durch Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt. Der Monoester
(4.1 g, 15 mmol, 44 %, Smp.: 133–134 °C) wird als weißer Feststoff erhalten.
Summenformel: C13H16O6.–
Molmasse: 268.26 g/mol.–
Rf-Wert: 0.55 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
UV (CH2Cl2): λ (log ε) = 295 (6.7), 268 (6.4).–
IR (KBr): ν (cm-1) = 3122, 3024, 2981, 2954, 2848, 2636, 2536, 1724, 1664, 1591, 1481,
1468, 1439, 1331, 1269, 1219, 1173, 1119, 1093, 1009, 933, 850, 822, 760, 739, 658.–
1H-NMR (CD3OD, 200 MHz): δ = 2.10 (s, 3 H, 3-CH3), 3.69 (s, 3 H, OCH3), 3.79 (s, 2 H,
2-CH2), 3.88 (s, 3 H, OCH3), 3.90 (s, 3 H, OCH3), 6.64 (s, 1 H, 5-H).–
13C-NMR (CD3OD, 50 MHz): δ = 10.4 (CH3, 3-CH3), 35.7 (CH2, 2-CH2), 51.5 (CH3, OCH3),
55.3 (CH3, OCH3), 55.6 (CH3, OCH3), 94.6 (CH, C-5), 117.5 (Cq, C-1)*, 118.4 (Cq, C-3)*,
132.4 (Cq, C-2), 156.3 (Cq, C-6), 159.9 (Cq, C-4), 171.1 (Cq, COOH), 172.1 (Cq, COOCH3).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
EIMS: m/z (%) = 268 (89.8), 222 (100.0), 208 (98.3), 193 (67.5), 165 (37.6).–
HREIMS: ber.: 268.09469
gef.: 268.09483
7.8 Darstellung von 2-(3,5-dimethoxy-2,6-dimethylphenyl)-essigsäure-
methylester
O
O O
O
70
Zu einer Lösung von 4,6-Dimethoxy-2-(2-methoxy-2-oxoethyl)-3-methylbenzoesäure
(100 mg, 0.4 mmol) in THF (7 mL) wird unter Schutzgasatmosphäre bei 0 °C eine BH3/THF-
Synthesevorschriften und Physikalische Daten 141
Lösung (1 mol/L, 0.6 mL) langsam zugetropft und der Reaktionsverlauf dünnschicht-
chromatographisch verfolgt. Nach beendeter Reaktion wird mit verdünnter HCl (2 mol/L)
angesäuert und die wäßrige Phase mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird mit
gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer entfernt. Das Rohprodukt wird durch Säulenchromatographie an
Kieselgel mit Dichlormethan gereinigt. Es resultierten 83 mg (0.35 mmol, 83 %,
Smp.: 60–61 °C)
Summenformel: C13H18O4.–
Molmasse: 238.28 g/mol.–
Rf-Wert: 0.90 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
UV (CH2Cl2): λ (log ε) = 288 (6.6).–
IR (KBr): ν (cm-1) = 2999, 2958, 2933, 2831, 1730, 1601, 1491, 1471, 1435, 1306, 1236,
1200, 1151, 1105, 1018, 993, 804.–
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 2.19 (s, 6 H, 2-CH3, 6-CH3), 3.72 (s, 3 H, OCH3), 3.77 (s, 2
H, 1-CH2), 3.86 (s, 6 H, 3-OCH3, 5-OCH3), 6.49 (s, 1 H, 4-H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 12.0 (CH3, 2 C, 2-CH3, 6-CH3), 36.0 (CH2, 1-CH2), 52.3
(CH3, OCH3), 56.3 (CH3, 3-OCH3, 5-OCH3), 95.5 (CH, C-4), 118.2 (Cq, C-2, C-6), 133.9 (Cq,
C-1), 156.5 (Cq, C-3, C-5), 172.2 (Cq, CO).–
EIMS: m/z (%) = 238 (67.6), 178 (43.7), 165 (100.0).–
HREIMS: ber.: 238.12051
gef.: 238.12091
Synthesevorschriften und Physikalische Daten 142
7.9 Darstellung von 6,8-Dimethoxy-5-methyl-4H-isochromen-1,3-dion
OCH
3
H
3
CO
O
O
O
1
10 3
4
5
6
7
8
9
11
71
Zu einer Suspension von 4,6-Dimethoxy-2-(2-methoxy-2-oxoethyl)-3-methylbenzoesäure
(1 g, 3.9 mmol) in trockenem Aceton (30 mL) wird Acetylchlorid (20 g, 70 mmol) getropft.
Die Reaktionsmischung wird 2 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend am
Rotationsverdampfer eingeengt. Das Rohprodukt wird mit Hexan gewaschen und
anschließend aus Hexan/Dichlormethan (1:1) kristallisiert. Es resultieren 808 mg
6,8-Dimethoxy-5-methyl-4H-isochromen-1,3-dion (3.4 mmol, 87 %, Smp.: 215–217 °C) in
Form eines weißen Feststoffs.
Summenformel: C12H12O5.–
Molmasse: 236.22 g/mol.–
Rf-Wert: 0.83 (CH2Cl2/MeOH 9:1).–
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ = 2.10 (s, 3 H, 9-H), 3.93 (s, 2 H, 4-H), 3.99 (s, 3 H, 10-H)*,
4.03 (s, 3 H, 11-H)*, 6.50 (s, 1 H, 7-H).–
* Die Zuordnung der Signale ist vertauschbar.
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 10.9 (CH3, C-9), 33.5 (CH2, C-4), 56.3 (CH3, C-10)*, 56.7
(CH3, C-11)*, 94.6 (CH, C-7), 104.0 (Cq, C-8a), 116.1 (Cq, C-5), 135.9 (Cq, C-4a), 159.0 (Cq,
C-1), 163.1 (Cq, C-6)**, 164.2 (Cq, C-8), 166.0 (Cq, C-3).–
Die Zuordnung der mit * und ** gekennzeichneten Signale ist vertauschbar.
EIMS: m/z (%) = 236 (100.0), 192 (91.7), 134 (79.4).–
HREIMS: ber.: 236.06847
gef.: 236.06859
Synthesevorschriften und Physikalische Daten 143
7.10 Versuche zur Darstellung von 3-Butyl-3,4-dihydro-3-hydroxy-6,8-
dimethoxy-5-methylisochromen-1-on
OCH
3
H
3
CO
O
O
OH
72
Versuch 1:
Zu einer Lösung von 6,8-Dimethoxy-5-methyl-4H-isochromen-1,3-dion (140 mg, 0.6 mmol)
in trockenem THF wird unter Schutzgasatmosphäre bei –78 °C Butyllithium in Hexan
(0.4 mL, 1.353 mol/L) getropft. Die Reaktionsmischung wird 2 h bei –78 °C gerührt und dann
langsam auf Raumtemperatur erwärmt. Anschließend wird die Reaktionsmischung mit 1
mol/L HCl angesäuert, mit Dichlormethan extrahiert und über MgSO4 getrocknet. Es konnte
kein Produkt isoliert werden.
Versuch 2:
Wasserfreies Cerchlorid (0.42 mmol, 103.5 mg) wird bei 0 °C unter Rühren mit trockenem
THF versetzt und für 18 h bei Raumtemperatur unter Schutzgas gerührt. Anschließend wird
die Suspension auf -78 °C abgekühlt, n-Butyllithium (0.27 mL, 0.42 mmol) zugetropft und für
1.5 h gerührt. Nach Ablauf dieser Zeit wird eine Lösung von 6,8-Dimethoxy-5-methyl-4H-
isochromen-1,3-dion (100 mg, 0.42 mmol) in THF (5 mL) zugetropft, erneut über nacht
gerührt und nach Beendigung der Reaktion wasserhaltiges NaSO4 hinzugegeben und 1 h
weitergerührt. Anschließend wird das Salz abfiltriert, mit Methanol gewaschen und das
Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Es konnte kein Produkt isoliert werden.
7.11 Versuch zur Darstellung von 3-Heptyl-6,8-dimethoxy-5-methyl-1H-
isochromen-1-on
OCH
3
H
3
CO
O
O
74
Synthesevorschriften und Physikalische Daten 144
Eine Mischung aus 2-(Carboxymethyl)-4,6-dimethoxy-3-methyl-benzoesäure (100 mg, 0.39
mmol) und Octanoylchlorid (256 mg, 0.27 ml, 1.6 mmol, 4 Äquiv.) wird unter Rühren für 4 h
auf 200 °C erhitzt. Es konnte kein Produkt isoliert werden.
Abkürzungen 145
8 ABKÜRZUNGEN
Ac Acetyl
CIMS Chemische Ionisation Massenspektrometrie
CDCl3 deuteriertes Chloroform
CD3OD deuteriertes Methanol
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO Dimethylsulfoxid
DPFGSE Double Pulsed Field Gradient Spin Echo
EIMS Elektronenstoß-Ionisation Massenspektrometrie
ESIMS Electon Spray Ionisation Mass Spectroscopy
HRMS High Resolution Mass Spectroscopy
H,H-COSY Proton Correlation Spectroscopy
HMBC Heteronuclear Multibond Correlation
HSQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
Hz Hertz
INADEQUATE Incredible Natural Abundance Double Quantum Transition Experiment
MeOH Methanol
NOESY Nuclear Overhauser Effect Spektroscopy
ppm parts per million
PSC präparative Schichtchromatographie
RP Reversed Phase
rpm rotations per minute
SC Säulenchromatographie
THF Tetrahydrofuran
TMSCl Trimethylsilylchlorid
Literatur 146
9 LITERATUR
[1] Schwantes, H. O.; Biologie der Pilze, Verlag Eugen Ulmer, Stuttgart, 1996, S. 10 ff.
[2] Bugni, T. S.; Ireland, C. M., Nat. Prod. Rep., 2004, 21, 143–163.
[3] Schwantes, H. O.; Biologie der Pilze, Verlag Eugen Ulmer, Stuttgart, 1996, S. 300–301.
[4] Schwantes, H. O.; Biologie der Pilze, Verlag Eugen Ulmer, Stuttgart, 1996, S. 106–137.
[5] Boyle, C.; Götz, M.; Dammann-Tugend, U.; Schulz, B., Symbiosis, 2001, 31, 259–281.
[6] Azevedo, J. L.; Maccheroni Jr., W.; Pereira, J. O.; Luiz de Araújo, W., Electr. J. Biotech., 2000, 3, 40–
65.
[7] Bush, L. P., Wilkinson, H. H.; Schardl, C. L., Plant Physiol., 1997, 114, 1–7.
[8] Brunner, R.; Stuetz, P. L.; Tscherter, H.; Stadler, P. A., Can. J. Chem., 1979, 57, 1638–1641.
[9] Mantle, P. G.; Weedon, C. M., Phytochemistry, 1994, 36, 1209–1217.
[10] Siegel, M. R.; Bush, L. P., Recent Adv. Phytochem., 1996, 30, 81–120.
[11] Strickland, J. R.; Bailey, E. M.; Abney, L. K.; Oliver, J. W., J. Animal Sci., 1996, 74, 1664–1671.
[12] Lu, H.; Zou, W. X.; Meng, J. C.; Hu, J.; Tan, R. X., Plant Science, 2000, 151, 67–73.
[13] Gasoni, L.; De Gurfinkel, B. S., Mycol. Res., 1997, 101, 867–870.
[14] Li, J. Y.; Strobel, G.; Harper, J.; Lobkovsky, E.; Clardy, J., Org. Lett., 2000, 2, 767–770.
[15] Strobel, G. A.; Miller, R. V.; Martinez-Miller, C.; Condron, M. M.; Teplow, D. B.; Hess, W. M.,
Microbiology, 1999, 145, 1919–1926.
[16] Calhoun, L. A.; Findlay, J. A.; Miller, J. D.; Whitney, N. J., Mycol. Res., 1992, 96, 281–286.
[17] Strobel, G. A., Microbes and Infection, 2003, 5, 535–544.
[18] Takahashi, C.; Takai, Y.; Kimura, Y.; Numata, A.; Shigematsu, N., Tanaka, H., Phytochemistry, 1995,
38, 155–158.
[19] Takahashi, C.; Numata, A.; Ito, Y.; Matsumura, E.; Araki, H.; Iwaki, H.; Kushida, K., J. Chem. Soc,
Perkin Trans. I, 1994, 1859–1864.
[20] Isaka, M.; Suyarnsestakorn, C.; Tanticharoen, M.; Kongsaeree, P.; Thebtaranonth, Y., J. Org. Chem.,
2002, 67, 1561–1566.
[21] Wani, M. C., Taylor, H. C.; Wall, M. E.; Coggon, P.; McPhail, A. T., J. Am. Chem. Soc., 1971, 93,
2325–2327.
[22] Lobert, S.; Vulevic, B.; Correia, J. J., Biochemistry, 1996, 35, 6806–6814.
[23] Ojima, I.; Habus, I.; Zhao, M.; George, G. I.; Jayasinghe, L. R., J. Org. Chem., 1991, 56, 1681–1683.
[24] Stowe, B. B.; Yamaki, T., Ann. Rev. Plant Physiol., 1957, 8, 181–216.
[25] Lang, A., Ann. Rev. Plant Physiol., 1970, 21, 537–570.
[26] Stierle, A.; Strobel, G.; Stierle, D.; Grothaus, P.; Bignami, G., J. Nat. Prod., 1995, 58, 1315–1324.
[27] Müller, U., Pure Appl. Chem., 2002, 74, 2241–2246.
[28] Denkow, W., Gifte der Natur, Weltbild Verlag, Augsburg, 2004, S. 160–162.
[29] Silberstein, S. D.; McCrory, D. C., Headache, 2003, 37, 144–166.
[30] Greenhalgh, R.; Hanson, A. W.; Miller, J. D.; Taylor, A., J. Agric. Food Chem., 1984, 32, 945–948.
[31] Warrior, P., Pest Manag. Sci., 2000, 56, 681–687.
Literatur 147
[32] Veröffentlicht in BGBl. I, 1998, 971, berichtigt am 18. Juni 1998, BGBl. I ,1998, 1527 und am 27.
November 1998, BGBl. I, 1998, 3512.
[33] Wheeler, W. B., J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 4151–4155.
[34] Kiflom, W. G.; Wandiga, S. O.; Namau, G. N., Pure Appl. Chem., 2001, 73, 1907–1916.
[35] Sleicher, C. A.; Hopcraft, T. J., Environ. Sci. Technol., 1984, 18, 514–518.
[36] Stetter, J.; Lieb, F., Angew. Chem. Int. Ed., 2000, 39, 1724–1744.
[37] Tan, R. X.; Zou, W. X., Nat. Prod. Rep., 2001, 18, 448–459.
[38] Anke, T.; Oberwinkler, F.; Steglich, W.; Schramm, G., J. Antibiot., 1977, 30, 806–810.
[39] Sauter, H.; Steglich, W.; Anke, T., Angew. Chem. Int. Ed., 1999, 38, 1328–1349.
[40] Yamamoto, I., Reviews in Toxicology, 1998, 2, 61–69.
[41] Burg, R. W.; Miller, B. M.; Baker, E. E.; Birnbaum, J.; Currie, S. A.; Hartman, R.; Kong, Y.-L.;
Monaghan, R. L.; Olson, G., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1979, 15, 361–367.
[42] Hawksworth, D. C.; Rossman, A. Y., Phytophath., 1987, 87, 888–891.
[43] Closse, A.; Mauli, R.; Sigg, H. P., Helv. Chim. Acta, 1966, 49, 204–213.
[44] Arie, T.; Kobayashi, Y.; Kono, Y.; Gen, O.; Yamaguchi, I., Pestic. Sci., 1999, 55, 602–604.
[45] Corey, E. J.; Hopkins, P. B.; Munroe, J. E.; Marfat, A.; Hashimoto, S., J. Am. Chem. Soc., 1980, 102,
7987–7988.
[46] Kelly, T. R.; Chandrakumar, N. S.; Walters, N.; Blancaflor, J., J. Org. Chem., 1983, 48, 3573–3574.
[47] Yang, Y.-C.; Lim, M.-Y.; Lee, H.-S., J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 7629–7631.
[48] Ng, T. B.; Liu, F.; Lu, Y.; Cheng, C. H. K.; Wang, Z., Comparative Biochemistry and Physiology, Part
C: Toxicology & Pharmacology, 2003, 136C, 109–115.
[49] De Alvarenga, M. A.; Braz Fo, R.; Gottlieb, O. R.; De P. Dias, J. P.; Magalhaes, A. F.; Magalhaes, E.
G.; De Magalhaes, G. C.; Magalhaes, M. T.; Maia, J. G. S., Phytochemistry, 1978, 17, 511–516.
[50] Venkatasubbaiah, P.; Chilton, W. S., J. Nat. Prod., 1990, 53, 1628–1630.
[51] Paquette, L. A.; Lanter, J. C.; Johnston, J. N., J. Org. Chem., 1997, 62, 1702–1712.
[52] Le Ménez, P.; Fargeas, V.; Berque, I.; Poisson, J.; Ardisson, J., J. Org. Chem., 1995, 60, 3592–3599.
[53] Fukushima, T.; Tanaka, M.; Gohbara, M.; Fujimori, T., Phytochemistry, 1998, 48, 625–630.
[54] Evans, R. H. Jr.; Ellestad, G. A.; Kunstmann, M. P., Tetrahedron Lett., 1969, 10, 1791–1794.
[55] Fava, L.; Bottoni, B.; Crobe, A.; Caracciolo, A. B.; Funari, E., Pest Manag. Sci., 2001, 57, 1135–1141.
[56] Woodham, D. W.; Edwards, R. R.; Reeves, R. G.; Schutzmann, R. L., J. Agric. Food Chem., 1973, 21,
303–307.
[57] Khambay, B. P. S.; Bourne, J. M.; Cameron, S.; Kerry, B. R.; Zaki, M. J., Pest Manag. Sci., 2000, 56,
1098–1099.
[58] Guiraud, P.; Steiman, R.; Seigle-Murandi, F.; Bartoli, M. H., Pharmazie, 1994, 49, 279–281.
[59] Snatzke, G., Angew. Chem., 1968, 80, 15–26.
[60] Hesse, M.; Meier, H.; Zeh, B., Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie, 6. Aufl.,
Thieme-Verlag, Stuttgart, New York, 2002, S. 24–29.
[61] BDZDO/MCDSPD Program Paket Version Z-07A von J. W. Downing, Department of Chemistry and
Biochemistry, University of Colorado, Boulder, USA; modifiziert von J. Fleischauer, W. Schlecker und
B. Kramer; und DZDO Programm Version 4.23, ZDO Programm Version of 22.06.2001
Literatur 148
[62] Elsässer, B., Dissertation, Universität Paderborn, 2004.
[63] Krohn, K.; Bahramsari, R.; Flörke, U.; Ludewig, K.; Kliche-Spory, C.; Michel, A., Aust, H.-J.; Draeger,
S.; Schulz, B.; Antus, S., Phytochemistry, 1997, 45, 313–320.
[64] Antus, S.; Snatzke, G.; Steinke, I., Liebigs Ann. Chem., 1983, 2247–2261.
[65] Huffman, J. W.; Swain, W. E.; Jacobus, J.; McPhail, A. T., J. Org. Chem., 1980, 45, 3088–3096.
[66] Zhabinskii, V. N.; Minnaard, A. J.; Wijnberg, J. B. P. A.; de Groot, A., J. Org. Chem., 1996, 61, 4022–
4027.
[67] Asakawa, Y.; Tori, M.; Masuya, T.; Frahm, J. P., Phytochemistry, 1990, 29, 1577–1584.
[68] Assante, G.; Locci, R.; Camarda, L.; Merlini, L.; Nasini, G., Phytochemistry, 1977, 16, 243–247.
[69] Cole, R. J.; Moore, J. H.; Davis, N. D.; Kirksey, J. W.; Diener, U. L., J. Agric. Food Chem., 1971, 19,
909–911.
[70] Höller, U.; König, G. M.; Wright, A. D., J. Nat. Prod., 1999, 62, 114–118.
[71] Toshima, H.; Watanabe, A.; Sato, H.; Ichihara, A., Tetrahedron Lett., 1998, 39, 9223–9226.
[72] Tertzakian, G.; Haskins, R. H.; Slater, G. P.; Nesbitt, L. R., Proc. Chem. Soc., 1964, June, 195–196.
[73] Matsumoto, M.; Minato, H.; Kondo, E.; Mitsugi, T.; Katagiri, K., J. Antibiot., 1975, 28, 602–604.
[74] Moscowitz, A., Tetrahedron, 1961, 13, 48–56.
[75] Moscowitz, A.; Mislow, K.; Glass, M. A. W.; Djerassi, C., J. Am. Chem. Soc., 1962, 84, 1945–1955.
[76] Lightner, D. A.; Gurst, J. E., Organic Conformational Analysis and Stereochemistry from Circular
Dichroism Spectroscopy, John Wiley & Sons, Inc., New York, Chichester, Weinheim, Brisbane,
Singapore, Toronto, 2000, S. 415–418.
[77] Snatzke, G., Angew. Chem., 1979, 91, 380–393.
[78] Tanahashi, T.; Kuroishi, M.; Kuwahara, A.; Nagakura, N.; Hamada, N., Chemical & Pharmaceutical
Bull., 1997, 45, 1183–1185.
[79] Oh, H.; Swenson, D. C.; Gloer, J. B.; Shearer, C. A., Tetrahedon Lett., 2001, 42, 975–977.
[80] Blay, G.; Cardona, L.; García, B.; Lahoz, L.; Pedro, J. R., Eur. J. Org. Chem., 2000, 2145–2151.
[81] Claridge, T. D. W., High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry, Pergamon, Amsterdam,
Lausanne, New York, Oxford, Shannon, Singapore, Tokyo, 1999, S. 320–321, 355–356.
[82] Oh, H.; Swenson, D. C.; Gloer, J. B.; Shearer, C. A., J. Nat. Prod., 2003, 66, 73–79.
[83] Bhaskar, V. K.; Duggan, P. J.; Humphrey, D. G.; Krippner, G. Y.; McCarl, V.; Offermann, D., J. Chem.
Soc, Perkin Trans. I, 2001, 1098–1102.
[84] Wuest, H. H.; Bardenhagen, J.; Schoellkopf, U., Liebigs Ann. Chem., 1985, 9, 1825–1837.
[85] Mella, M.; Fagnoni, M.; Albini, A., Tetrahedron, 2001, 57, 555–561.
[86] Manker, D. C.; Rosendahl, C. N.; Heide, M.; Bachmann, T. L.; Nielsen, R. I., U.S., 1996, 10 pp. Cont.-
in-part of U.S. Ser. No. 901,369, abandoned.
[87] Sasaki, T.; Takagi, M.; Yaguchi, M.; Nishiyama, K.; Yaguchi, T.; Koyama, M., Jpn. Kokai Tokkyo
Koho, 1992, 6 pp.
[88] Howard, B. M.; Clarkson, K.; Bernstein, R. L., Tetrahedron Lett., 1979, 20, 4449–4452.
[89] Carey, S. T.; Nair, M. S. R., J. Nat. Prod., 1979, 42, 231.
[90] Waksman, S. A.; Horning, E. S.; Spencer, E. L., J. Bact., 1943, 45, 233–248.
[91] Cram, D. J.; Allinger, N. L., J. Am. Chem. Soc., 1956, 78, 5275–5284.
Literatur 149
[92] Anke, H.; Stadler, M.; Mayer, A.; Sterner, O., Can. J. of Botany, 1995, 73, 932–939.
[93] Krohn, K.; Michel, A.; Flörke, U.; Aust, H.-J.; Draeger, S.; Schulz, B., Liebigs Ann. Chem., 1994, 11,
1099–1108.
[94] Allport, D. C.; Bu’Lock, J. D., J. Chem. Soc, Abstracts, 1960, 654–662.
[95] Gray, L. E.; Gardner, H. W.; Weisleder, D.; Leib, M., Phytochemistry, 1999, 50, 1337–1340.
[96] Poch, G. K.; Gloer, J. B., J. Nat. Prod., 1989, 52, 257–260.
[97] Bryson, T. A.; Dolak, T. M., Org. Synth., 1977, 57, 62–65.
[98] Brynes, S. D.; Fedor, L. R., J. Am. Chem. Soc., 1972, 94, 7016–7019.
[99] Midland, M. M.; Koops, R. W., J. Org. Chem., 1990, 55, 5058–5065.
[100] Roush, W. R.; Murphy, M., J. Org. Chem., 1992, 57, 6622–6629.
[101] Vitz, J., Dissertation, Universität Paderborn, 2004.
[102] Tamura, Y.; Fukata, F.; Sasho, M.; Teruhisa, T.; Kita, Y., J. Org. Chem., 1985, 50, 2273–2277.
[103] Mudryk, B.; Shook, C. A.; Cohen, T., J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 6389–6391.
[104] Imamoto, T., Takiyama, N.; Nakamura, K.; Hatajima, T.; Kamiya, Y., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111,
4392–4398.
[105] Saeed, A., Helv. Chim. Acta, 2003, 86, 377–383.
[106] Nozawa, K K.; Yamada, M.; Tsuda, Y.; Kawai, K. I.; Nakajima, S., Chem. Pharm. Bull., 1981, 29,
2491–2495.
[107] Nozawa, K. K.; Yamada, M.; Tsuda, Y.; Kawai, K. I.; Nakajima, S., Chem. Pharm. Bull., 1981, 29,
3486–3493.
