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POSTTRANSKRIPTIONELLE EINFLÜSSE AUF DIE

EXPRESSION DES TRANSKRIPTIONSFAKTORS

ACHAETE-SCUTE HOMOLOG-1 (ASCL1)

vorgelegt von

Dipl.-Ing. Edgar Benko

aus Berlin

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. Jens Kurreck, Technische Universität Berlin

Gutachter: Prof. Dr. Michael Fähling, Charité-Universitätsmedizin Berlin

Gutachter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. Ulf Stahl, Technische Universität Berlin

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 29. Oktober 2013

Berlin 2013

D 83

Die Arbeit wurde von April 2008 bis August 2013 unter der Leitung von Prof. Dr. Mi-

chael Fähling am Institut für Vegetative Physiologie der Charité-Universitätsmedizin

Berlin angefertigt.

Die Betreuung von Seiten der Fakultät III der Technischen Universität Berlin wurde

von Prof. Dipl.-Ing. Dr. Ulf Stahl übernommen.

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis 1

Tabellenverzeichnis 3

Abkürzungsverzeichnis 5

1 Einleitung 9

1.1 Der Transkriptionsfaktor Achaete-Scute Homolog-1 . . . . . . . . . 10

1.1.1

Strukturelle und funktionelle Eigenschaften von basischen

Helix-Loop-Helix (bHLH) Proteinen . . . . . . . . . . . . 10

1.1.2

Bedeutung von Achaete-Scute Homolog-1 in der Neurogenese

1.1.3 Achaete-Scute Homolog-1 und Tumoren . . . . . . . . . . 14

1.1.4 Regulation von Achaete-Scute Homolog-1 . . . . . . . . . 15

1.2 Posttranskriptionelle Regulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.2.1 Regulationsebenen der Genexpression . . . . . . . . . . . . 16

1.2.2 Posttranskriptionelle Regulation der Genexpression . . . . . 17

1.2.2.1 Prozessierung im Zellkern und Export . . . . . . 18

1.2.2.2 mRNA-Abbau im Cytosol . . . . . . . . . . . . . 19

1.2.2.3 Der Translationsvorgang und seine Kontrolle . . . 20

1.2.2.4 mRNA-Trafficking und -Lokalisation im Cytosol . 21

1.2.3 Einfluss der untranslatierten Regionen einer mRNA (UTRs) 23

1.2.3.1 5’-UTR ...................... 24

1.2.3.2 3’-UTR ...................... 25

1.3 Zielstellung dieser Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2 Material und Methoden 29

2.1 Molekularbiologische und biochemische Arbeitsmethoden . . . . . 29

2.1.1 PCRs und Mutagenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.1.2 Klonierung und verwendete Vektoren . . . . . . . . . . . . 29

2.1.3 Plasmid-DNA-Präparationen . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.1.4 RNA-Isolierung........................ 33

2.1.5 mRNA-Quantifizierung mittels Realtime-PCR . . . . . . . 34

2.1.6 Gesamt-Proteinpräparationen . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis

2.1.7 Isolierung von cytosolischen Proteinen und Kernproteinen . 35

2.1.8

Cytosol-Isolierung mit Komplexen in nativen Konstellationen

2.1.9 Westernblotting und Proteinquantifizierung . . . . . . . . . 36

2.1.10 Polysomengradienten-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.1.11 In vitro-Transkription..................... 37

2.1.12 UV-Crosslinking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.2 Zellkultur ............................... 38

2.2.1 Zelllinien und Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.2.2 PrimäreZellen ........................ 40

2.2.3 Immunfluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

2.2.4 Stimulierung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

2.2.5 Transfektion ......................... 41

2.2.6 Reportergenassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.2.7 mRNA-Stabilitätsassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.2.8 Protein-Stabilitätsassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.2.9 Bioinformatische Sequenzanalysen . . . . . . . . . . . . . 43

2.3 Statistik ................................ 44

3 Ergebnisse 45

3.1 Analyse der hASH1-UTRs nach cis-Elementen . . . . . . . . . . . 45

3.2 Screening nach Stimuli mit Einfluss auf die hASH1-UTRs . . . . . 46

3.2.1 Aufbau des Reporterkonstrukts . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.2.2 Screening im Reportergenassay . . . . . . . . . . . . . . . 48

3.3 Einfluss von Phorbolester (PMA) auf die hASH1-Expression . . . . 49

3.3.1

Die Wirkung von PMA im Reportergenassay ist konzentra-

tionsabhängig......................... 50

3.3.2 PMA erniedrigt die hASH1-mRNA-Menge . . . . . . . . . 50

3.3.3 PMA erniedrigt die hASH1-Protein-Menge . . . . . . . . . 51

3.3.4

Zeitlicher Vergleich des Verhaltens von hASH1-Promotor

und -UTRs im Reportergenassay . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.3.5

Kurzfristig ist eine mRNA-Destabilisierung für die hASH1-

Herabregulation verantwortlich . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.3.6

Inhibitoren der Proteinkinase C (PKC) können den Effekt

von PMA im Reportergenassay (partiell) aufheben . . . . . 56

3.3.7

Auf mRNA-Ebene lässt sich die Wirkung von PMA eben-

falls mithilfe von PKC-Inhibitoren abschwächen . . . . . . 58

3.3.8 Suche nach trans-Faktoren.................. 60

3.3.9 Suche nach verantwortlichen cis-Elementen in den UTRs . . 61

3.4 Einfluss von Hypoxie auf die hASH1-Expression . . . . . . . . . . 62

3.4.1

Sinkender Sauerstoffpartialdruck führt zu einer Abnahme

der hASH1-Proteinmenge . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

Inhaltsverzeichnis

3.4.2

Im Gegensatz zur hASH1-Proteinmenge bleibt die mRNA-

Menge unter Hypoxie unverändert . . . . . . . . . . . . . . 63

3.4.3

Eine Hemmung der Translation ist für die hASH1-Abnahme

unter Hypoxie verantwortlich . . . . . . . . . . . . . . . . 64

3.4.4

Die Deletion dreier Differenzierungskontroll-Elemente (DI-

CE) hebt den Einfluss der 3’-UTR bei der hASH1-Abnahme

unterHypoxieauf ...................... 66

4 Diskussion 71

5 Zusammenfassung 85

6 Summary 87

7 Publikationen im Rahmen dieser Arbeit 89

8 Literaturverzeichnis 91

Danksagung 127

iii

Abbildungsverzeichnis

1.1 Darstellung eines an DNA gebundenen bHLH-Dimers . . . . . . . . 11

1.2 Posttranskriptionelle Prozesse, denen ein Transkript unterliegt . . . 17

1.3 cis-Elemente in den UTRs einer mRNA . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.1 Prinzip des Crosslinkings . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

2.2 Funktionsweise des Reportergenassays . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.1 BLAT-Analyse der hASH1-UTRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.2 Aufbau des Reporterkonstrukts mit den UTRs von hASH1 . . . . . 47

3.3

Screening nach Stimuli mit UTR-vermitteltem Einfluss auf die

hASH1-Expression .......................... 50

3.4 Dosis-Wirkungs-Beziehung von PMA im Reportergenassay . . . . . 51

3.5 Zeitkinetik der mRNA-Menge von hASH1 unter PMA . . . . . . . 52

3.6 Zeitkinetik der hASH1-Proteinmenge unter PMA . . . . . . . . . . 53

3.7 Mash1-Immunfluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.8

Vergleich von hASH1- und Mash1-Mengen von Kelly-Zellen und

Kortexzellen (Ratte) unter PMA-Einfluss . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.9

Zeitlicher Verlauf der Reportergenaktivitäten des UTR- und Promo-

torkonstrukts von hASH1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.10 mRNA-Stabilität in Kelly-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

3.11 hASH1-Proteinstabilität unter PMA . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

3.12

Einfluss von PKC-Inhibitoren auf die PMA-Wirkung im Reporter-

genassay................................ 58

3.13

Zeitkinetik des Staurosporin- und GF109203X-Einflusses auf die

mRNA-Menge von hASH1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

3.14

Einfluss von PKC-Inhibitoren auf die PMA-Wirkung auf mRNA-Ebene

3.15 Crosslinking-Experimente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.16

Vergleich des Einflusses von

- und

-UTR bei der Vermittlung der

PMA-Wirkung ............................ 62

3.17

Einfluss verschiedener Sauerstoffpartialdrücke auf die hASH1-

Proteinmenge............................. 64

3.18

Zeitkinetik der Protein- und mRNA-Menge von hASH1 unter Hypoxie

3.19 Polysomengradienten-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis

3.20 Analyse der verschiedenen Polysomen-Fraktionen unter Hypoxie . . 67

3.21

Untersuchung der hASH1-UTRs im Reportergenassay bzgl. ihres

Hypoxie-Einflusses.......................... 68

4.1 Zusammenfassung der PMA-Wirkung auf die hASH1-Expression . 76

4.2 Zusammenfassung der Hypoxie-Wirkung auf die hASH1-Expression 83

Tabellenverzeichnis

2.1 Primer der Mutagenese-PCRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.2 In Reportergenassays benutzte Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.3 Zur Quantifizierung in Realtime-PCRs benutzte Primer . . . . . . . 34

2.4 Verwendete Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Abkürzungsverzeichnis

A Adenin (Base)

Ago1 Argonautenprotein-1

Ago1-4 Argonautenproteine 1 bis 4

ASCL1

Achaete-Scute Komplex

Homolog-1

AS-C Achaete-Scute Komplex

ASH1 Achaete-Scute Homolog-1

ATP Adenosintriphosophat

AUF1

AU-rich element binding

protein 1; Heterogeneous

nuclear ribonucleoprotein

D0/ hnRNP D0 (engl.)

BLAST

Basic Local Alignment

Search Tool (engl.)

BLAT

BLAST-Like Alignment

Tool (engl.)

C Cytosin (Base)

◦C

Grad Celsius (Temperatu-

reinheit)

cAMP

Cyklisches Adenosinmono-

phosphat;

Adenosin-

-mono-

phosphat

CBC

Kappenbindender Komplex

(engl. cap binding complex)

cDNA

zu mRNA komplementäre

einzelsträngige DNA

Co Kobalt

CoCl2Kobaltchlorid

cpm

Zerfälle pro Minute (engl.

counts per minute)

DICE

Differenzierungskontroll-

Element (engl. differenti-

ation control element)

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

2,2-DP

2,2-Dipyridyl (auch: 2,

Bipyridin)

DTT Dithiothreitol

EDTA

EthylendiamintetraEssigsäure

eIF

eukaryontischer Translati-

onsinitiationsfaktor

EJC Exon-Junction-Komplex

engl. Englisch

EtOH Ethanol

Fe Eisen

FIH

HIF-inhibierender Faktor

(engl. factor inhibiting HIF)

G Guanin (Base)

Erdbeschleunigung =

9,81m/s2

g Gramm (Masseneinheit)

GABA γ-Aminobuttersäure

GAPDH

Glycerinaldehyd-3-phos-

phat-Dehydrogenase

GEF

G-Nukleotid-Austausch-

faktor

GTP Guanosintriphosphat

h Stunde (Zeiteinheit)

H2O Dihydrogenmonoxid

hνPhoton, Lichtquant

hASH1 humanes ASH1

HEPES

2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-

piperazinyl)-ethansulfon-

säure

HIF

Hypoxie-induzierbarer Fak-

tor (engl. Hypoxia-inducible

factor)

hnRNP

heterogenes nukleäres Ribo-

nukleoprotein (engl. Hetero-

geneous nuclear ribonucleo-

protein)

HRP Meerrettich-Peroxidase

HuR

Hu-Antigen R; ELAV-like

protein 1(engl.)

IRE

auf Eisen reagierendes Ele-

ment (engl. iron response

element)

IRES

interne Ribosomeneintritts-

stelle (engl. internal ribo-

some entry site)

IRP

Eisen regulatorisches Prote-

in (engl. Iron regulatory ele-

ment)

JNK c-Jun N-terminale Kinase

kb Kilobasen

KCl Kaliumchlorid

Liter (Volumeneinheit)

(= dm3)

komplexes Nährmedium für

Bakterien (engl. lysogeny

broth)

15-LOX engl. 15-lipoxygenase

m Meter (Längeneinheit)

M Molar (= mol/l)

Mash1

Säuger- bzw. Nagerhomolog

von ASH1

Mdm2

(murine) double minute 2

protein; E3 ubiquitin-protein

ligase Mdm2 (engl.)

Met Methionin

MgCl2Magnesiumchlorid

min Minute (Zeiteinheit)

miRNA

microRNA, kurze nichtko-

dierende RNA

mmHg

Millimeter-Quecksilber-

säule (Nicht-SI-Einheit

des Druckes;

1mmHg ≈

133.322Pa)

mol

Mol (Einheit der Stoffmen-

ge)

mRNA

Boten-RNA (engl. messen-

ger RNA)

mRNP

messenger ribonucleopro-

tein (engl.)

N Asparagin

beliebige Base (A, G, C oder

T/U)

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natriumhydroxid

NMD

Nonsens-vermittelter mR-

NA Abbau (engl. nonsense

mediated mRNA decay)

NPC

Kernporenkomplex (engl.

nuclear pore complex)

ns nicht signifikant

nt Nukleotide

O2Sauerstoff

32P

radioaktives Phosphor-

Isotop (β-Strahler)

Pascal (Einheit des Druckes)

PABPC

Poly(A)-Bindungsprotein

des Cytosols

PABPN1

Poly(A)-Bindungsprotein

des Kerns

PAGE

Polyacrylamid-Elektropho-

rese

Prozessierungskörper (engl.

P-bodies)

PBS

Phosphatgepufferte Salzlö-

sung

PCR

Polymerase Kettenreaktion

(eng. Polymerase Chain Re-

action)

PHD

Prolylhydroxylase (engl.

prolyl hydroxylase domain

protein)

PMA

Tetradecanoyl-Phorbol-

acetat (engl. Phorbol 12-

myristate 13-acetate)

PNEC

pulmonale neuroendokri-

ne Zellen (engl. pulmonary

neuroendocrine cells)

PNS peripheres Nervensystem

pO2Sauerstoffpartialdruck

POU3F2

POU domain, class 3, tran-

scription factor 2 (engl.);

BRN2

pVHL

Von-Hippel-Lindau Tumor

Suppressor

Q Glutamin

RBP RNA-bindendes Protein

Realtime-PCR Echtzeit-PCR

Re-Oxy Reoxygenierung

RISC

RNA-induced silencing

complex (engl.)

RNA Ribonukleinsäure

RNAi RNA-Interferenz

rpm

Umdrehungen in der Minute

(engl. rounds per minute)

rRNA ribosomale RNA

s Sekunde (Zeiteinheit)

Svedberg (Einheit des

Sedimentationskoeffizien-

ten)

S. Seite

Standardabweichung (engl.

standard deviation)

SDS Natriumdodecylsulfat

SGs

Stress-Granula (engl. Stress

granules)

SGZ

subgranuläre Zone des Gy-

rus dentatus

Internationales Einheiten-

system

SVZ subventrikuläre Zone der la-

teralen Ventrikel

T Thymin (Base)

TBE TRIS-Borat-EDTA

Tris

Tris(hydroxymethyl)-

aminomethan

tRNA Transfer-RNA

U Uracil (Base)

Unit (engl.) (Aktivitätsein-

heit)

uORF

offener Leserahmen strom-

aufwärts des eigentlichen

Startcodons (engl. upstream

open reading frame)

UTR

untranslatierte Region der

mRNA

UV ultraviolett

ZNS zentrales Nervensystem

Verwendete SI-Vorsätze:

k Kilo (Faktor 103)

d Dezi (Faktor 10−1)

c Zenti (Faktor 10−2)

m Milli (Faktor 10−3)

μMikro (Faktor 10−6)

n Nano (Faktor 10−9)

1 Einleitung

Eines der faszinierendsten Probleme der Biologie stellt die Entwicklung einer be-

fruchteten Eizelle zu den verschiedenen Geweben und Organen eines ausgewach-

senen Organismus dar. Das genetische Material wird jeweils an die Tochterzellen

weitergegeben, angefangen bei der Zygote, nach der initialen Verschmelzung der

haploiden Genome von Eizelle und Spermium, bis hin zu den verschiedenen, aus

unterschiedlichen Zellen zusammengesetzten komplexen Strukturen, die den ferti-

gen Organismus bilden. Eine dieser komplexen Strukturen ist das Nervensystem,

welches die Gesamtheit aller Nerven- und der sie unterstützenden Gliazellen ei-

nes Organismus umfasst. Nervenzellen ermöglichen innerhalb eines vielzelligen

Organismus die schnellste Art der Informationsübertragung, die innerhalb einer

Nervenzelle nicht auf Diffusion oder gerichtetem Transport von Signalmolekülen,

sondern auf der Ausbreitung einer Änderung der elektrischen Spannung über der

neuronalen Plasmamembran beruht. Mit dieser Eigenschaft sind Nervenzellen gut

gerüstet, ihrer Aufgabe nachzukommen: Signale zu empfangen, weiterzuleiten und

zu filtern. Das Nervensystem ist dadurch in der Lage, Informationen über innere

und äußere Bedingungen zu sammeln, zu verarbeiten und daraufhin angemessene

Reaktionen hervorzurufen.

Doch wie ist es möglich, dass sich aus ein und demselben Genom während der

Embryogenese derartige Strukturen mit Zellen unterschiedlichster Eigenschaften

bilden können? Bei diesem Prozess spielen vielfältige Regulationsmechanismen zur

Steuerung der Zusammensetzung des Proteinrepertoires von Zellen eine Rolle. U.a.

erlaubt das abgestimmte Eingreifen von zahlreichen Transkriptionsfaktoren, die an

spezifischen Bindungsstellen nahe oder auch weiter entfernt vom Transkriptionsstart

der Zielgene binden, eine solche Steuerung in einer zeitlich, räumlich und Zelltyp

spezifischen Weise. Dies wiederum lässt Zellen mit unterschiedlichen Eigenschaften

entstehen. So können unterschiedliche Zelloberflächenproteine, wie beispielsweise

Rezeptoren eine Interaktion mit anderen Zellen erlauben oder verwehren. Des Wei-

teren ist die Zellfunktion an die Expression spezifischer Gene gekoppelt. So wird

beispielsweise Insulin nur durch die

-Zellen der Langerhans’schen Insel-Zellen des

Pankreas synthetisiert. Diese Zellen reagieren auf Erhöhungen des Blutzuckerspie-

gels mit der Ausschüttung dieses Hormons und sorgen damit für eine gesteigerte

Glucose-Aufnahme verschiedener Zellen, welche letztendlich zu einer Normalisie-

rung des Blutzuckerspiegels führt.

Kapitel 1 Einleitung

Ein Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle bei der Reifung neuronaler Zellen,

ihrer sogenannten Differenzierung, bzw. der Spezifizierung des neuronalen Subtyps

spielt, ist das Achaete-Scute Komplex Homolog-1 (ASCL1; hASH1).

1.1 Der Transkriptionsfaktor Achaete-Scute

Homolog-1

Schon im frühen 20. Jahrhundert wurden verschiedene Mutanten von Drosophila

melanogaster beobachtet, welche eine gestörte Ausbildung der, auf Thorax und

Kopf befindlichen, großen Borsten (Macrochaetae) aufwiesen [100, 96]. Diesen

Veränderungen zugrunde lagen verschiedene Allele des Achaete- und des Scute-

Gens, wobei diese jeweils zu einem Ausbleiben unterschiedlicher Untergruppen der

Borsten führten [72, 2, 95, 94]. Zusammen mit zwei weiteren Genen (lethal of scute,

asense) verwandter bHLH-Transkriptionsfaktoren und den angrenzenden Sequenzen,

welche cis-regulatorische Elemente enthalten, wird der 40 kb große Achaete-Scute-

Komplex (AS-C) gebildet. Heute weiß man, dass der AS-C von Bedeutung für die

ordnungsgemäße Entwicklung des peripheren und zentralen Nervervensystems in

Drosphila ist [100, 269, 96].

Das Nagerhomolog von Achaete-Scute, Mash1, wurde ursprünglich unter Benutzung

von degenerierten Primern, die auf Gensequenzen von Drosophila Achaete-Scute

beruhten, aus einer sympathoadrenalen Vorläufer-Zelllinie der Ratte kloniert [155].

Frühe Experimente zeigten, dass Mash1 für eine ordnungsgemäße Entwicklung des

vegetativen Nervensystems sowie von olfaktorischen Neuronen notwendig ist [117].

Mäuse ohne intaktes Mash1 waren nicht mehr imstande, sympathische, parasym-

pathische oder enterische Ganglien zu bilden und starben kurz nach der Geburt

aufgrund von u.a. Atmungsinsuffizienz. In neueren Experimenten ist es gelungen,

ausdifferenzierte Zellen nicht-neuronalen Ursprungs mithilfe von Mash1 umzu-

programmieren. So genügte die Überexpression von Mash1 zusammen mit zwei

weiteren Faktoren (POU domain, class 3, transcription factor 2 (POU3F2); myelin

transcription factor 1-like protein (Myt1l)) um Maus-Fibroblasten embryonalen und

postnatalen Ursprungs in funktionale Neuronen zu überführen [321].

1.1.1 Strukturelle und funktionelle Eigenschaften von

basischen Helix-Loop-Helix (bHLH) Proteinen

hASH1 gehört zu den basischen Helix-Loop-Helix-Proteinen (bHLH-Proteine). Das

bHLH-Motiv (siehe

Abbildung 1.1

) zeichnet sich dadurch aus, dass es einerseits

1.1 Der Transkriptionsfaktor Achaete-Scute Homolog-1

Abbildung 1.1:

Exemplarische Dar-

stellung eines bHLH-Dimers (hier:

E47 und NeuroD1) gebunden an

DNA. Die Dimerisierung wird über

die

-Helices ermöglicht. Darunter

ist das aus zwei Teilen (grün und

orangefarben) zusammengesetzte E-

Box-Motiv, welches durch bHLH-

Dimere gebunden wird, dargestellt.

Entnommen [192].

für die DNA-Bindung zuständig ist und andererseits der Dimerisierung dient. Die

Helices sind amphipathisch, wobei die hydrophoben Aminosäuren derart alternie-

rend angeordnet sind, dass sie alle auf einer Seite der Helix präsentiert werden.

Die Interaktion mit einem weiteren bHLH-Protein erfolgt nun über die hydropho-

ben Seiten der Helices [136]. Der basische Bereich des bHLH-Motivs hingegen ist

für die DNA-Bindung zuständig. Das bHLH-Motiv wurde bereits in 125 humanen

Transkriptionsfaktoren gefunden [175]. bHLH-Proteine können Homo- sowie He-

terodimere bilden, wobei die Wahl des Dimerisierungspartners Auswirkungen auf

Zellproliferation und Differenzierung haben kann [200].

Eine Einteilung der bHLH-Proteine in verschiedene Klassen I-VII erfolgte aufgrund

unterschiedlicher Eigenschaften wie z.B. ihrer Verteilung in den Geweben, ihrem

Dimerisierungsverhalten und ihrer DNA-Bindungsspezifitäten [200, 219]. Proteine

der Klasse I und II dimerisieren ausschließlich über ihre bHLH-Domäne, während

Mitglieder anderer Klassen über weitere Dimerisierungsdomänen wie beispielsweise

das Leucin-Zipper-Motiv verfügen [194]. Klasse I Proteine wie E12 und E47 werden

ubiquitär exprimiert und können Homodimere bilden. Klasse II Proteine, zu denen

auch ASCL1 gehört, werden hingegen gewebsspezifisch exprimiert und benötigen

im Allgemeinen Klasse I Proteine als Dimerisierungspartner.

bHLH-Faktoren binden als Dimer eine pseudo-palindromische Konsensussequenz,

CANNTG, die als E-Box bezeichnet wird [24]. Die Bindungspräferenzen für die

beiden zentralen Basen sowie die an das E-Box-Motiv angrenzenden Basen wer-

den durch die Zusammensetzung des Dimers bestimmt, wobei jedes Monomer

je eine Halbseite des E-Box-Motives erkennt. Neben den aktivierenden bHLH-

Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise ASCL1, gibt es auch solche, die eine

reprimierende Funktion ausüben. Dazu gehört z.B. das Säugerhomolog 1 des Dro-

sophila-Gens hairy and enhancer of split (HES-1). Dieser Transkriptionsfaktor

bindet anstelle des E-Box-Motivs mit höherer Affinität N-Box-Motive bzw. Klasse

Kapitel 1 Einleitung

C-Bindungsstellen (CACNAG bzw. CACG(C/A)G). HES-1 kann die Transkription

an Bindungsstellen selbst oder über die Rekrutierung von Korepressoren aktiv repri-

mieren. Zudem kann er mit bHLH-Proteinen Dimere bilden, die dann nicht mehr in

der Lage sind E-Box-Motive zu erkennen, was zu einer passiven Reprimierung der

betroffenen Gene führt [156].

1.1.2 Bedeutung von Achaete-Scute Homolog-1 in der

Neurogenese

Die Vorläuferzellen, die das Nervensystem von Vertebraten bilden, können in ihrer

Entwicklung bis auf eine epitheliale Zellschicht, das Ektoderm, welches die äußere

Schicht des Embryos während der Gastrulation bedeckt, zurückverfolgt werden. Die

ektodermalen Zellen bilden verschiedene Zell- bzw. Gewebsabkömmlinge abhängig

von ihrer axialen Position. Der am weitesten dorsal gelegene Bereich des Ektoderms

verdickt sich und bildet dabei die Neuralplatte, eine Struktur mit der Form eines

Schlüssellochs und einem kaudal gelegenen breiten Ende. Während eines komplexen

morphogenetischen Prozesses, der Neurulation, kommt es zur Bildung des Neural-

rohres. Dabei entsteht in der Neuralplatte eine schmale Vertiefung, wobei sich daran

beidseitig angrenzend Wülste erheben und letztendlich von der Mitte des Keimlings

aus miteinander verschmelzen [296].

Das so gebildete Neuralrohr stellt den Ausgang für Gehirn und Rückenmark, den bei-

den Bestandteilen des zentralen Nervensystems (ZNS), dar, wobei aus dem Bereich

der Verschmelzung der Wülste die Zellen der Neuralleiste hervorgehen. Diese Zellen

sind der Ursprung zur Bildung des peripheren Nervensystems (PNS). Am rostralen

Ende des Neuralrohres bilden sich drei miteinander verbundene Kammern, wobei

aus dem sie umgebenden Gewebe die drei Hauptanteile des Gehirns hervorgehen:

Prosencephalon (bestehend aus Telencephalon und Diencephalon), Mesencephalon

und Rhombencephalon (aus Cerebellum, Pons und Medulla oblongata bestehend).

Aus den Kammern gehen die später Ventrikel genannten Liquor-gefüllten Hohlräume

des Gehirns hervor. Die proliferierenden Zellen des Neuralrohrs in der ventrikulären

Zone bilden nun die Grundlage für Nerven- und Gliazellen des ZNS und migrieren

von dort zu den Orten ihres zukünftigen Wirkens [296].

Im ZNS von Säugern werden verschiedene Neurone vielschichtig miteinander ver-

schaltet, um komplexe neuronale Funktionen zu erfüllen. Für die Entstehung dieses

komplexen ZNS-Aufbaus müssen verschiedene Populationen an Neuronen, die zu

spezifischen Regionen zeitlich präzise während der Embryogenese wandern, gene-

riert werden. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch nicht

gänzlich aufgeklärt. Die bHLH-Transkriptionsfaktoren scheinen jedoch eine zen-

trale Rolle bei der Erzeugung der neuronalen Diversität, über die Regulierung der

1.1 Der Transkriptionsfaktor Achaete-Scute Homolog-1

Subtyp-Spezifizierung sowie bei der Differenzierung, einzunehmen [21].

Mash1 ist ein bHLH-Transkriptionsfaktor, dessen räumlich spezifische Expression

auf proliferierende Regionen des sich entwickelnden Gehirns und des Rückenmarks

begrenzt ist. Dabei ist die Mash1-Expression nur transienter Natur und geht zu-

rück sobald die Mash1-exprimierenden Zellen den Zellzyklus verlassen und zum

Ort ihres zukünftigen Wirkens migrieren. Verschiedene Studien an Mausembryos

mit ausgeschalteter Mash1-Expression deuten darauf hin, dass Mash1 ein neurona-

ler Differenzierungsfaktor ist, der für die Bildung von verschiedenen spezifischen

neuronalen Subtypen während der Entwicklung des zentralen und peripheren Ner-

vensystems von Bedeutung ist [86, 127, 141, 220, 245, 247].

Viele Neuronen und Oligodendrocyten, Zellen eines Gliazelltyps, gehen auf Mash1-

exprimierende neuronale Vorläuferzellen verschiedener Phasen der Embryogenese

zurück. So konnten Zellen die einstmals Mash1 exprimiert hatten, beispielsweise in

jedem der Hauptanteile des Mäusegehirns nachgewiesen werden [160]. Die Gruppe

der, nach Mash1-Expression gebildeten, reifen Zellen beinhaltet im Prosencephalon

u.a. Interneurone des Riechkolbens, Interneurone der Hirnrinde, cholinerge Interneu-

rone der Amygdala und hippocampale Pyramidenzellen sowie Körnerzellen [160,

191, 239, 44, 198, 256]. Im Mesencephalon beinhaltet diese Gruppe z.B. glutamater-

ge und GABAerge Neuronen von Colliculi inferiores/superiores, Zellen der Nuclei

(Ansammlung von Nervenzellkörpern/Somata) des Thalamus und neuroendokriner

Zellen des Hypothalamus [160, 212, 221, 318, 323, 205]. Und im Rhombencepha-

lon gehören zu den reifen Zellen mit vormaliger Mash1-Expression beispielsweise

die Purkinjezellen des Cerebellums, noradrenerge Neuronen des Locus caeruleus

und serotonerge Neurone des Nucleus raphe dorsalis [160, 263, 135, 245] und im

Rückenmark z.B. die dI3-, dI5- und v2-Neuronen [127, 179, 330].

In Abkömmlingen von Neuralleistenzellen ist Mash1 an der Bildung des vegetativen

Nervensystems beteiligt. Sobald sich im Nager die Neuralleistenzellen um die

dorsalen Aorten aggregiert haben, beginnt in ihnen die Expression von Mash1

[116, 188]. Im ZNS wirkt Mash1 als proneurales Protein [21, 273] und ist zudem

involviert in die Spezifizierung des neuronalen Subtyps [240]. Das scheint jedoch bei

Neuronen die aus Neuralleistenzellen hervorgehen nicht der Fall zu sein. Hier wird

Mash1 für die Expression von pan-neuronalen Markergenen benötigt [240, 294].

Die große Bandbreite an verschiedenen neuronalen Subtypen (und zusätzlich den

Oligodendrocyten), die aus Mash1-exprimierenden Zellen hervorgehen, lässt sich

durch das Zusammenwirken von Mash1 mit verschiedenen anderen Faktoren bei

der Spezifizierung des Subtyps erklären. Zu diesen Faktoren gehören beispielsweise

andere bHLH-Proteine, Homeodomänenproteine wie Phox2b und Phox2a [189, 216,

242, 243, 299] und auch Zinkfingerproteine wie GATA-3 [181, 235].

Durch seine Beteiligung an der Reifung dieser Vielzahl an Neuronen ist es nicht ver-

Kapitel 1 Einleitung

wunderlich, dass bei Verlust von Mash1 viele Bereiche des Nervensystems betroffen

sind. Dabei muss es nicht unbedingt nur zum Verlust verschiedener Neuronentypen

kommen, es kann ebenso zur verspäteten Bildung bestimmter Neurone führen, da

Mash1 auch in die zeitliche Koordination von Differenzierungsvorgängen involviert

ist [244].

Die Wirkung von Mash1 ist nicht nur auf die Embryonalentwicklung beschränkt.

Auch im adulten Organismus findet eine Differenzierung von Zellen unter Mitwir-

kung von Mash1 statt. Orte für die Neubildung von Zellen aus adulten Stammzellen

sind die subventrikuläre Zone (SVZ) der lateralen Ventrikel sowie die subgranuläre

Zone (SGZ) des Gyrus dentatus, einem Teil des Hippocampus [90, 8, 306]. Die

adulte Neurogenese scheint dabei entscheidend für die Gehirnfunktion zu sein und

könnte auch bei neurologischen Erkrankungen eine Rolle spielen [280, 345]. Mash1

wird in Ratten jedoch nur in der SVZ exprimiert. Man nimmt an, dass Mash1 dabei

an der Generierung von zumindest einigen olfaktorischen Neuronen mitwirkt, die

während des gesamten Lebens gebildet werden [239, 161]. Eine retroviral-vermittelte

Überexpression von Mash1 in der SVZ zeigte auch keine großen Veränderungen

der olfaktorischen Neurogenese, wogegen eine solche Überexpression in adulten

hippocampalen Stammzellen der SGZ (welche eigentlich keine Mash1-Expression

aufweisen) dazu führte, dass statt der eigentlich von diesen Zellen gebildeten exzita-

torischen Körnerzellen, aus ihnen Oligodendrocyten ausgebildet wurden [150].

1.1.3 Achaete-Scute Homolog-1 und Tumoren

Während der Neurogenese büßen die anfänglich pluripotenten Zellen auf ihrem Weg

hin zur ausdifferenzierten Zelle nach und nach ihr Vermögen ein, sich in unterschied-

liche Zelltypen zu entwickeln. Dabei verlieren die Zellen bestimmte Fähigkeiten

der Vorläuferzellen und gewinnen andere Eigenschaften, wie z.B. die Fähigkeit zur

Synthese von Neurotransmittern im differenzierten Zustand hinzu. Im Gegensatz

zu stärker differenzierten Zellen bilden unreifere Zellen aggressivere Tumore [124].

Die Krebszellen verfügen dabei über eine Reihe von für den Organismus nachteili-

gen Eigenschaften der Ausgangszellen, wie eine hohe Proliferationsrate, Plastizität

und erweiterte Migrationsfähigkeiten, welche maßgeblich die Gefährlichkeit der

Krebszellen bestimmen.

Neuroblastome sind Tumore, die in erster Linie bei Kindern vor dem fünften Le-

bensjahr auftreten. Die Neuroblastomzellen haben dabei Eigenschaften, die denen

von undifferenzierten Zellen des sich entwickelnden Sympathikus ähneln. Deshalb

werden Neuroblastoma-Zelllinien nicht nur benutzt um Charakteristika des ent-

sprechenden Tumors, sondern um neuronales Wachstum und Differenzierung im

Allgemeinen zu untersuchen [14]. In einer Studie zeigte ein Großteil der getesteten

1.1 Der Transkriptionsfaktor Achaete-Scute Homolog-1

humanen Neuroblastom-Zelllinien eine hASH1-Expression, welche bei induzierter

Differenzierung schnell herabreguliert wurde [113]. Zudem war es nicht möglich

in Zelllinien ohne hASH1-Expression mit derselben Behandlung eine Differen-

zierung zu induzieren [113, 144]. Doch konnte bei einer Studie mit 61 primären

Neuroblastomen, von denen 40 hASH1 exprimierten, kein klarer Zusammenhang

von hASH1-Expression zu klinischen Parametern wie dem Stadium des Tumors

hergestellt werden [98, 144]. Zudem war es möglich Neuroblastom-Zellen mit kon-

stitutiver hASH1-Expression zu erzeugen, in denen dennoch eine Differenzierung

induziert werden konnte [293].

hASH1 scheint aber auch bei einigen Formen von Lungenkrebs von Bedeutung zu

sein. So wird hASH1 nicht nur in normalen fetalen pulmonalen neuroendokrinen

Zellen (engl.pulmonary neuroendocrine cells, PNECs) sondern auch in Bronchi-

alkarzinomen mit neuroendokrinen Eigenschaften exprimiert [29, 16, 183]. Von

PNECs nimmt man an, dass sie wichtig für die Entwicklung und Wachstumsre-

gulation von Epithelzellen der Lunge sind. Es konnte gezeigt werden, dass ein

Verlust von Mash1 zum Verlust von PNECs in der Lunge führt [29], wohingegen

eine konstitutive Mash1-Expression die Bildung von Lungentumoren mit neuroen-

dokrinen Eigenschaften begünstigte [182]. Dass Achaete-Scute Homolog-1 einen

förderlichen Einfluss auf Wachstum und Überleben von Tumoren mit neuroendo-

krinen Eigenschaften ausübt, lässt sich wohl über seine Fähigkeit erklären, putative

Tumorsuppressorgene zu reprimieren [228].

1.1.4 Regulation von Achaete-Scute Homolog-1

Obwohl man schon einiges über die Funktion von Achaete-Scute Homolog-1 und

seine Rolle bei der Differenzierung und Subtypspezifikation von Neuronen weiß,

so ist doch über seine eigene Regulation wenig bekannt. Auf transkriptioneller

Ebene wurde mit HES-1 der bisher einzige direkte Modulator der Achaete-Scute

Homolog-1-Expression gefunden. Seine Überexpression führte zu einer Hemmung

der durch NGF (engl. Nerve growth factor) stimulierten Differenzierung hippocam-

paler Neurone und zu einer Abnahme der endogenen Mash1-Expression [46]. Eine

Möglichkeit der hASH1-Regulation über HES-1 verläuft über den Notch Signal-

weg [113]. Die Aktivierung von Notch-Rezeptoren führt zu deren Interaktion mit

dem DNA-Bindungsprotein RBP-Jk (engl. recombining binding protein suppressor

of hairless). Dieses wiederum hat eine verstärkte Bildung von HES-1 zur Folge,

welches nun seinerseits Zielgene wie hASH1 reprimiert [51, 13, 14].

Zudem gibt es Hinweise dass der Transkriptionsfaktor POU3F2 (engl. POU do-

main, class 3, transcription factor 2) an der hASH1-Regulation in bestimmten

Bronchialkarzinom-Zelllinien beteiligt ist [145]. Transkriptionsfaktoren der POU-

Kapitel 1 Einleitung

Familie sind unentbehrlich für Zelldifferenzierung und eine ordnungsgemäße Or-

ganentwicklung [278, 122, 67]. Putative POU3F2-Bindungsstellen in der hASH1-

Promotorregion könnten diese Regulation vermitteln, wobei der Nachweis einer

direkten transkriptionellen Aktivierung der hASH1-Expression durch POU3F2 noch

fehlt [145].

Auf posttranskriptioneller Ebene konnte das Fragile X Mental Retardation Protein

(FMRP) als Regulator identifiziert werden [83]. Dieses RNA-Bindungsprotein in-

teragiert mit einer U-reichen Sequenz in der

untranlsatierten Region (UTR) der

hASH1-mRNA. Das führt dazu, dass die Translationseffizienz der hASH1-mRNA

steigt. So konnte mittels Polysomengradienten-Analyse bei FMRP-Überexpression

ein höherer Besetzungsgrad der hASH1-Transkripte mit Ribosomen gezeigt werden,

was als Hinweis auf eine erhöhte Translationsrate gilt. Eine Fehlregulation des zu

FMRP gehörigen Gens FMR1 ist verbunden mit neuronalen Erkrankungen wie dem

Fragilen X-Syndrom [225, 167, 320, 332].

Da der Fokus dieser Arbeit auf der posttranskriptionellen Kontrolle der hASH1-

Synthese lag, soll im Folgenden ein Überblick über Prozesse und Mechanismen der

postranskriptionellen Regulation gegeben werden.

1.2 Posttranskriptionelle Regulation

1.2.1 Regulationsebenen der Genexpression

Die Gesamtheit aller in einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimierten

Proteine, ihr sogenanntes Proteom, ist nicht nur von Zelltyp zu Zelltyp verschie-

den, sondern muss sich auch zeitlich bzw. situationsbedingt anpassen. Die Kon-

trolle der Genexpression kann dabei auf verschiedenen Ebenen stattfinden (siehe

Abbildung 1.2). So unterliegt die Transkription einer Kontrolle durch cis-Elemente

wie Promotoren, Enhancer und Silencer sowie den daran bindenden Faktoren. Epige-

netische Veränderungen der DNA und deren Chromatinstruktur sind dabei ebenso

von Bedeutung [227, 17, 178, 121].

Posttranskriptionelle Prozesse spielen ebenfalls eine entscheidende Rolle bei der Re-

gulation der Genexpression. Eine Regulation kann dabei während der Prozessierung,

beim Export aus dem Kern sowie der zellulären Lokalisation, der mRNA-Stabilität

und Tranlationseffizienz stattfinden.

Hinzu kommt, dass Proteine oftmals selbst einer Regulation unterliegen. So können

Proteine vielfältigen Modifizierungen ausgesetzt sein. Dazu gehören u.a. Ubiquitinie-

rungen, Phosphorylierungen, Hydroxylierungen, Glykosylierungen, proteolytische

1.2 Posttranskriptionelle Regulation

Spaltungen und das Anhängen von Fettsäuren. Anlagerung oder Dissoziation von

anderen Faktoren können ebenso wie die Modifizierungen zu Aktivitätsänderungen

von Proteinen aber auch zur Änderung ihrer Stabilität führen.

Abbildung 1.2:

Das primäre Transkript ist vielfältigen Reifungsschritten unterworfen, bis es als

mRNA im Cytosol der Translation zugeführt wird, einem Transport zu seinem Zielort unterliegt

oder abgebaut wird.

1.2.2 Posttranskriptionelle Regulation der Genexpression

Die posttranskriptionelle Regulation stellt nicht nur ein Werkzeug zum abgestimmten

Feintuning der Genexpression dar. Sie ermöglicht auch eine maßgebliche Verstär-

kung über die in der Transkription vorgegebene Aktivierung oder Reprimierung

hinaus. Mehr noch: Sie gestattet oftmals eine deutlich schnellere Reaktion. So liegen

selbst bei komplettem Transkriptionsstopp eines Gens immer noch Restbestände

an mRNA vor, die weiter translatiert werden könnten. D.h. die Auswirkungen auf

den Protein-Pool würden erst mit einiger Verzögerung eintreten können. Eine post-

transkriptionelle Regulation über eine Stilllegung der mRNA auf Translationsebene

würde sich somit deutlich früher auswirken. Eine Antwort auf posttranskriptioneller

Ebene kann z.B. auf Entwicklungs- oder Umgebungsstimuli wie Cytokine, Hormo-

ne oder Temperaturänderungen aber auch als Reaktion auf Stresssituationen wie

Hypoxie, Hypokalzämie, virale Infektionen oder Gewebsverletzungen hin erfolgen.

Zudem konnten fehlregulierte posttranskriptionelle Prozesse bereits mit verschiede-

Kapitel 1 Einleitung

nen Erkrankungen wie beispielsweise der Thalassämie oder der Alzheimer-Krankheit

in Zusammenhang gebracht werden [327, 61, 42].

1.2.2.1 Prozessierung im Zellkern und Export

Die Prozessierung einer Prä-

mRNA

beginnt schon während ihrer Transkription.

Dazu gehört das Anfügen einer

-Kappenstruktur, welche durch ein methyliertes

Guanosin gebildet wird, das über drei Phosphatreste in einer

Bindung mit dem

ersten Nukleotid des Transkripts verknüpft wird [343, 290]. Auch das Spleißen findet

ko-transkriptionell statt [59], wobei das Spleißosom den katalytisch tätigen Komplex,

der die enzymatischen Reaktionen beim Entfernen der Introns und der Ligation

der flankierenden Exons übernimmt, darstellt. In höheren Eukaryonten führt die

pure Anwesenheit von putativen Spleißstellen allein jedoch nicht notwendigerweise

zu deren Auswahl durch das Spleißosom. Flankierende regulatorische Elemente

der Prä-mRNA bzw. die daran bindenden trans-Faktoren können die Rekrutierung

von Spleißosom-Komponenten fördern oder unterdrücken und bilden damit die

Grundlage für alternatives Spleißen, so dass aus ein und derselben Prä-mRNA

verschiedene Proteine hervorgehen können [43, 292].

Das RNA-Editing sei hier nur kurz erwähnt, da es zwar auch in Neuronen und

Zellen des Immunsystems relevant ist, jedoch hauptsächlich bei der Expression

mitochondrialer Gene eine Rolle spielt. Dabei kommt es zu einem Austausch bzw.

einer Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide im Transkript und

kann somit auch zu abgeänderten Proteinen oder veränderter Expression führen [25,

109, 237, 207].

Die Fertigstellung des

-Endes stellt den letzten Schritt der Prozessierung der

Prä-mRNA dar. Dieser Vorgang ist auch gleichzeitig an den Abbruch der Transkrip-

tion gekoppelt. Bis auf wenige Ausnahmen wird hierbei das Transkript

10−30nt

stromabwärts einer Signal-Sequenz (konservierte AAUAAA Sequenz in Säugern)

unter Mitwirkung mehrerer Proteine endonukleolytisch geschnitten und an der

Schnittstelle durch die Poly(A)-Polymerase polyadenyliert [260]. Der so gebildete

Poly(A)-Schwanz ist mit der

-Kappenstruktur insofern vergleichbar, als dass auch

er wichtig für die Stabilität sowie die Translationseffizienz der

mRNA

ist [70]. So

bestimmt die Länge des Poly(A)-Schwanzes maßgeblich die Halbwertzeit einer

mRNA mit. Ähnlich dem Spleißen können Transkripte auch mehrere potentielle

Polyadenylierungsstellen besitzen, die ebenfalls zu verschieden langen

-UTRs

aber auch zu unterschiedlichen Proteinen führen können [315]. Die der alternativen

Polyadenylierung zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch noch weitgehend

ungeklärt [336].

Fertig prozessierte mRNAs müssen für die Translation ins Cytosol exportiert wer-

1.2 Posttranskriptionelle Regulation

den. Der Export einer reifen mRNA über die Kernporenkomplexe (NPCs) verläuft

dabei nur im Kontext mit den im Zellkern, auch infolge der Prozessierung, am

Transkript angelagerten Proteinen [159, 215]. So findet sich beispielsweise an der

Kappenstruktur der aus zwei Untereinheiten aufgebaute Kappen-bindende Komplex

(CBC) ein [287], und infolge des Spleißens bildet sich etwa

20nt

stromaufwärts von

der Spleißstelle ein als Exon-Junction-Komplex (EJC) bezeichneter Protein-Komplex

als Überbleibsel bzw. Markierung eines stattgefundenen Spleißvorgangs [133]. Und

auch am Poly(A)-Schwanz bindet ein, als Merkmal einer reifen mRNA, wichtiges

Protein, das Poly(A)-Bindungsprotein des Kerns (PABPN1)[196]. Dazu kommen

weitere RNA-bindende Proteine (RBPs), die in ihrer Gesamtheit das Transkript

um eine weitere Facette an Informationen ergänzen, die für Export, Lokalisation,

Translation und Stabilität der mRNA von Bedeutung sind [105, 215].

Die an der reifen mRNA angelagerten Proteine können nun selbst oder über Inter-

aktion mit anderen Proteinen mit Komponenten des NPC sowie mit für den Export

wichtigen Faktoren in Wechselwirkung treten. Einige der mit dem Transkript assozi-

ierten Proteine bleiben mit der

mRNA

über den Export hinaus verbunden, während

andere auf den Zellkern beschränkt dort verbleiben. Im Cytosol selbst findet ein wei-

terer Austausch an Proteinen an der mRNA statt. Hierbei spielt insbesondere der erste

Translationsdurchgang (engl.pioneering round of translation) eine entscheidende

Rolle [197].

1.2.2.2 mRNA-Abbau im Cytosol

Die Regulation der mRNA-Stabilität im Cytosol stellt einen wichtigen Kontrollpunkt

der Genexpression dar. Die Stabilität einer mRNA wird dabei durch spezifische

Interaktionen zwischen ihren strukturellen Elementen und RBPs gesteuert. Die-

se Wechselwirkungen können allgemeinerer Natur oder für eine gewählte mRNA

spezifisch sein [115].

Cytosolische mRNA-Level spiegeln einerseits die Raten von Transkription, Prozes-

sierung sowie Export und andererseits deren cytosolische Abbauraten wieder. Stabile

mRNAs erlauben ein ausgedehnteres Zeitfenster für die Translation von Genen, die

auf hohem Niveau exprimiert werden müssen, wie es beispielsweise für

-Globulin

der Fall ist [277]. Im Gegensatz dazu verfügen mRNAs von Proteinen, die nur in

kurzen kräftigen Schüben aufgrund von externen oder internen Stimuli exprimiert

werden, über geringe Halbwertszeiten [281, 272, 246, 300].

Der Poly(A)-Schwanz und an ihn gebundenes Poly(A)-Bindungsprotein (PABPC)

tragen maßgeblich zum Schutz der mRNA vor vorzeitigem nukleolytischem Ab-

bau bei. Außerdem fördert ein intakter Poly(A)-Schwanz die Translation, welche

ihrerseits wiederum die mRNA-Stabilität beeinflusst [279, 272]. Daher ist es nicht

Kapitel 1 Einleitung

verwunderlich, dass ein Weg des mRNA-Abbaus über die Deadenylierung des Tran-

skripts führt, woran mindestens eine Poly(A)-Ribonuklease (PARN) beteiligt ist

[164, 165]. Daran gekoppelt ist in Hefe wie auch in Säugern die Entfernung der

-Kappenstruktur [57, 19]. Diese bildet normalerweise mit dem Translationsini-

tiationsfaktor eIF4E im Cytoplasma einen mRNA-stabilisierenden Komplex [262].

Zudem würde der Wegfall der

-Kappenstruktur einen gleichzeitigen exonukleolyti-

schen Abbau über die 50-Seite ermöglichen [32].

Der Nonsens-vermitteltete Abbau (NMD) scheint Teil eines mRNA-Überwa-

chungssystems gegen fehlerhafte Transkripte im Cytosol zu sein. Diesem Abbau kön-

nen Transkripte anheimfallen, welche übermäßig lange

-UTRs besitzen, über unge-

spleißte Introns oder über im Leserahmen liegende Stopp-Codons stromaufwärts von

EJCs verfügen. Dadurch wird verhindert, dass unüblich verkürzte Proteine syntheti-

siert werden. In der Hefe beinhaltet dieser Weg eine Deadenylierungs-unabhängige

Entfernung der

-Kappe gefolgt von einem Abbau der mRNA in

-Richtung

[58, 129, 128, 335, 47]. Die Kontrolle der Transkriptqualität scheint aber nicht die

einzige Aufgabe des NMD zu sein. So regulieren eine Reihe von Spleißfaktoren ihre

eigene Expression bei zu hohen zellulären Proteinkonzentrationen über den NMD.

Dieses wird durch eine Veränderung des Spleißmusters erreicht, so dass infolge von

alternativem Spleißen eine mRNA gebildet wird, die einen EJC stromabwärts eines

Stopp-Codons trägt und die mRNA somit als NMD-Substrat ausweist [204, 298].

Einige mRNAs in Säugern werden endonukleolytisch und somit Deadenylierungs-

unabhängig abgebaut [19]. Dabei folgt dem endonukleolytischen Schnitt des Tran-

skripts ein exonukleolytischer Abbau der beiden Fragmente, wobei das

-Fragment

-Richtung und das

-Fragment wohl in

-Richtung abgebaut wird. Einige

der Endonukleasen sind konstitutiv aktiv, so dass eine Regulation über ihren Zugang

zu den Schnittstellen stattfindet. Während andere Endonukleasen hingegen direkt

reguliert werden [180].

1.2.2.3 Der Translationsvorgang und seine Kontrolle

Die Translation kann in drei unterschiedliche Phasen eingeteilt werden: Initiation,

Elongation und Termination. Unter Initiation versteht man alle Ereignisse, die zur

Positionierung des zur Elongation fähigen 80S-Ribosoms am Translationsstartcodon

führen. Während der Elongation findet die Synthese des Polypeptids statt. Das fertige

Polypeptid wird entlassen sobald das Ribosom auf ein Stopp-Codon während der

Termination der Translation trifft [170]. Vieles spricht dafür, dass die Initiation den

Geschwindigkeits-bestimmenden Schritt der Translation darstellt. Daher ist es kaum

überraschend, dass ein Großteil der Regulation der Translation über die Kontrolle

der Initiation verläuft [97, 138, 201, 259].

1.2 Posttranskriptionelle Regulation

Der erste Schritt der Bildung des 43S-Präinitiationskomplexes ist die Zusammenla-

gerung des ternären Komplexes. Dieser setzt sich aus dem eukaryontischen Trans-

lationsinitiationsfaktor eIF2, der Starter-tRNA Met-tRNA

iMet

und GTP zusammen.

Seine Bildung wird durch den G-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF) eIF2B reguliert.

Die Bindung des ternären Komplexes an die kleine ribosomale Untereinheit wird

unabhängig voneinander durch die Initiationsfaktoren eIF1, eIF1A und eIF3 in Säu-

gern unterstützt [253, 259, 6]. Der so gebildete 43S-Präinitiationskomplex ist nun

bereit zur Bindung an das 50-Ende der mRNA.

Die Erkennung der

-Kappenstruktur wird über den im Cytosol zur Kappenstruktur

rekrutierten Translationsinitiationsfaktor eIF4E im Verbund mit eIF4G und eIF4A

vermittelt. eIF4G wirkt dabei als Gerüstprotein während eIF4A über seine Helikase-

Aktivität ein Aufwinden von Sekundärstrukturen in der

-UTR und darüber das

Scannen des Präinitiationskomplexes entlang der mRNA hin zum Translationsstart

ermöglicht [131, 253, 259]. Sobald der Präinitiationskomplex auf das Startcodon

trifft, führt die durch eIF5 geförderte Hydrolyse des von eIF2 gebundenen GTPs

zur Dissoziation der meisten Translationsinitiationsfaktoren von der kleinen ribo-

somalen Untereinheit [131]. Die Anlagerung der großen ribosomalen Untereinheit

(60S) wird nun durch eIF5B-GTP gefördert, wobei die Bildung des 80S-Ribosoms

seinerseits die GTP-Hydrolyse durch eIF5B stimuliert und das Ribosom in einen zur

Peptidsynthese kompetenten Komplex überführt [176, 252, 289].

Alle hier vorgestellten Schritte der Initiation der Translation können einer Regulation

unterliegen. So kann die Bildung von aktivem ternären Komplex gestört werden,

indem eine der Untereinheiten von eIF2 phosphoryliert wird. Dies verhindert bei

eIF2 den Austausch von GDP zu GTP. Hinzu kommt, dass eIF2B, der zugehörige

GEF, eine höhere Affinität zu phosphoryliertem eIF2 besitzt [275]. Dadurch wird die

Bildung von aktivem ternären Komplex behindert und die Translation somit global

herabreguliert [63, 97, 138, 270]. Eine andere Möglichkeit stellt die Inhibition von

eIF4E dar. Dabei binden inhibitorische Proteine (4E-BPs) an eIF4E und verhindern

damit seine Interaktion mit eIF4G [266]. Zusätzlich zu den 4E-BPs können aber auch

andere Proteine an eIF4E in einer mRNA-spezifischen Weise binden und ebenfalls

die Initiation der Translation stören. Weitere Möglichkeiten der Translationskon-

trolle wie beispielsweise die Verhinderung der Assoziation der beiden ribosomalen

Untereinheiten sollen weiter unten noch ausführlicher betrachtet werden.

1.2.2.4 mRNA-Trafficking und -Lokalisation im Cytosol

Die gezielte Lokalisation einer mRNA innerhalb einer Zelle ermöglicht die räumli-

che Kopplung von der Synthese des von ihr kodierten Proteins mit dem Ort seines

zukünftigen Wirkens [68]. Bei Nervenzellen etwa können die Längen der Zellausläu-

fer wie Dendriten oder Axon ein Vielfaches des Somadurchmessers erreichen. Der

Kapitel 1 Einleitung

gerichtete Transport von mRNAs ermöglicht hier ein effizientes Wiederauffüllen

der distalen Bereiche eines Neurons mit neuen Proteinen [68]. Zudem kann die

lokale Kotranslation spezifischer Polypeptide auch die Bildung von Komplexen

begünstigen, ohne dass dabei die einzelnen Komponenten des Komplexes übermäßig

mit unerwünschten Bindungspartnern konkurrieren müssen [214].

Die Zelle besitzt verschiedene Möglichkeiten um spezifische mRNAs an bestimmten

subzellulären Zielorten anzureichern. Dazu gehören (i) der aktive Transport über

das Cytoskelett mithilfe von Motorproteinen, (ii) die Diffusion mit anschließender

Verankerung am Zielort sowie (iii) der örtliche Schutz vor Abbau der mRNA. Meist

kommen Kombinationen davon für die richtige Lokalisation einer mRNA zum

Einsatz [214]. Beim Transport einer mRNA zu ihrem Zielort sind alternativ zu

Peptid-Signalsequenzen an neu synthetisierten Proteinen, wie bei Proteinen mit

endoplasmatischer Prädestination, auch Sekundärstrukturen der mRNA selbst von

Bedeutung. Der Transport einer mRNA geht dabei gewöhnlich bis zum Erreichen

des Zielorts mit einer Inhibition der Translation einher [139].

Als besondere Abbau- aber auch Lagerorte von mRNAs haben sich sogenannte

Prozessierungskörper (engl.P-bodies, PBs) und Stress-Granula (engl. stress granules,

SGs) herausgestellt [9, 87]. Bei einer Stress-induzierten Stilllegung der Translati-

onsinitiation und der dabei eintretenden Disassemblierung von Polysomen, kommt

es zu einer verstärkten Bildung von PBs oder SGs [238, 10]. PBs scheinen sich um

mRNP-Aggregate, welche translational inaktiv sind, zu bilden. Sie sind reich an

Proteinen, die für den mRNA-Abbau von Bedeutung sind und fungieren wohl als

Sammelorte für deadenylierte mRNAs, die ihrem Abbau entgegensehen [238]. Da-

neben konnten in PBs auch Proteine mit einer Rolle in der RNA-Interferenz (RNAi)

nachgewiesen werden. Darunter befanden sich beispielsweise Komponenten des

RISC (engl. RNA induced silencing complex) wie die Argonautenproteine Ago1-4

und miRNAs [78, 185, 255, 286]. Der RISC kann dabei entweder zur Degradati-

on zugehöriger mRNAs führen oder eine translationale Stilllegung entsprechender

mRNAs herbeiführen [80, 334]. Da mRNAs PBs jedoch auch wieder verlassen und

anschließend translatiert werden können, sind PBs wohl ebenso als vorrübergehende

Lagerstätten für translational stillgelegte mRNAs anzusehen [31, 23].

SGs enthalten im Gegensatz zu PBs keine Proteine des mRNA-Abbaus, sondern statt-

dessen verstärkt Komponenten der Translationsinitiation [10, 238, 87, 79]. Sie stellen

sich als vorrübergehender Ruhesitz von mRNAs unter Stress-Bedingungen dar. Ob-

wohl unter bestimmten Stress-Bedingungen die Translation großräumig zurückgefah-

ren wird, erlaubt die selektive Translation von Chaperonen und Reparatur-Enzymen

sowie einigen Transkriptionsfaktoren der Zelle die Behebung von Stress-induzierten

Schäden bei gleichzeitiger Einsparung von Energie. Sobald sich die Situation der

Zelle normalisiert hat, können die durch die SGs freigegebenen mRNAs entwe-

der wieder zum translational aktiven Pool zurückkehren oder in den PBs abgebaut

1.2 Posttranskriptionelle Regulation

Abbildung 1.3:

Verschiedene cis-Elemente in den UTRs einer mRNA (modifiziert nach einer Ab-

bildung aus [249]). Einzelheiten siehe Text. Es bedeuten:

Cap

(Kappenstruktur des

-Endes),

uORF

(Offener Leserahmen stromaufwärts des eigentlichen Translationsstarts),

CDS

(offener

Leserahmen),

IRES

(interne Ribosomenbindungsstelle),

CPE

(cytoplasmatisches Polyadenylie-

rungselement [322]).

werden [101, 11].

1.2.3 Einfluss der untranslatierten Regionen einer mRNA

(UTRs)

Posttranskriptionelle Expressionskontrolle kann einerseits auf globaler Ebene er-

folgen und andererseits ausschließlich die Regulation einer spezifischen mRNA

betreffen. So kann beispielsweise über ein allgemeines Anpassen der Translation die

Translationseffizienz vieler mRNAs gleichzeitig moduliert werden [97].

Die Regulation der Translation auf globaler Ebene wird im Allgemeinen über Modi-

fizierungen der Translationsinitiationsfaktoren erreicht. Soll jedoch nur eine kleinere

Gruppe oder eine einzige mRNA reguliert werden, so sind spezifische Sequenz-

motive oder Strukturmotive auf der mRNA, sogenannte cis-Elemente, von großer

Bedeutung (siehe

Abbildung 1.3

). Diese können zwar entlang der gesamten mRNA

auftreten, sind jedoch vornehmlich in den nicht-kodierenden Bereichen, den untrans-

latierten Regionen der mRNA (UTRs), zu finden. Daneben lassen sich jedoch auch

regulatorische Mechanismen mit Einfluss auf die Expression finden, die nicht auf

cis-Elementen in der reifen mRNA beruhen. So hat man beispielsweise festgestellt,

dass gespleißte mRNAs translationsaktiver als ihre cDNA-Pendants sind [134]. Da-

für verantwortlich sind die als Markierungen des Spleißvorgangs auf dem Transkript

zurückgelassenen EJCs. Diese fördern nämlich den ersten Translationsdurchlauf

[215].

Einzelsträngige RNA neigt stärker als doppelsträngige DNA dazu, Sekundärstruktu-

ren auszubilden. In vielen Fällen ist das gebildete Strukturmotiv und nicht etwa die

Sequenz entscheidend für ein cis-Element. Da man bei bestimmten RNA-Sequenzen

Kapitel 1 Einleitung

jedoch nicht ohne weiteres auf die Sekundärstruktur schließen kann bzw. umgekehrt

einer Sekundärstruktur nicht einfach eine RNA-Sequenz zuordnen kann, ist das Auf-

finden von bereits beschriebenen cis-Elementen auf einer neuen RNA komplizierter,

als es auf DNA-Ebene der Fall ist.

1.2.3.1 5’-UTR

cis-Elemente, die für die Kontrolle der mRNA-Stabilität eine Rolle spielen, finden

sich zwar vornehmlich in der

-UTR, sind aber nicht auf diese beschränkt. Ein

Beispiel hierfür ist die mRNA von Interleukin-2. In ihrer

-UTR konnte ein cis-

Element (JNK Response Element) identifiziert werden, welches zur Stabilisierung

der mRNA während der T-Zell-Aktivierung beiträgt. Zwei RBPs (Nucleolin und

YB-1) binden spezifisch an dieses Element und stabilisieren die mRNA [48].

Der Hauptteil der Regulation über die

-UTR betrifft jedoch die Translation. Bei

den meisten zellulären mRNAs findet die Translationsinitiation

-Kappen-abhängig

statt. Daneben besteht jedoch über interne Ribosomen-Bindungsstellen (IRES) auch

die Möglichkeit der Kappen-unabhängigen Translationsinitiation, wobei die IRES

selbst eine aktive Rolle bei der Rekrutierung der kleinen ribosomalen Untereinheit

besitzen. Dabei enthalten die IRES weniger konservierte Konsensussequenzen. Viel-

mehr scheinen IRES über ähnliche Sekundärstruktur-Elemente in den

-UTRs von

mRNAs zu verfügen [15]. IRES wurden zwar zuerst in viralen mRNAs entdeckt,

doch schätzt man, dass bis zu

10%

aller zellulären Transkripte das Potential, die

Translation über IRES zu initiieren, besitzen [154]. Sie werden unter normalen Be-

dingungen meist nur schwach translatiert, können jedoch bei einer Herabregulation

der Kappen-abhängigen Translation durchaus mit gesteigerter Effizienz translatiert

werden [88, 126, 147, 295, 301].

Eine andere Möglichkeit der Zelle, die Translation einer mRNA zu regulieren, ver-

läuft über die Verhinderung der Anlagerung des 43S-Präinitiationskomplexes an

die mRNA. Ein Beispiel dafür ist das Iron Response Element (IRE, auf Eisen rea-

gierendes Element) auf der

-UTR der Ferritin-mRNA nahe der Kappenstruktur.

Ferritin ist ein Speicherprotein für Eisen und unter Eisenmangel binden die Eisen

Regulatorischen Proteine IRP1 und IRP2 an dieses Element und blockieren eine

Anlagerung des 43S-Präinitiationskomplexes an die mRNA und inhibieren somit

seine Translation. Bei reichhaltigem Eisenangebot dagegen wird IRP1 über post-

translationale Modifikationen inaktiviert und IRP2 proteasomal abgebaut [3, 110,

274].

Sekundärstrukturen in der

-UTR können aber auch ohne zugehörige RBPs eine

Wirkung auf die Translation entfalten, indem sie den Zugang zur Kappenstruktur

selbst verwehren oder den Scanning-Prozess behindern, wenn sie weiter von der

1.2 Posttranskriptionelle Regulation

Kappe entfernt liegen [110, 166]. Als Beispiel sei hier die mRNA von Mdm2 genannt

(engl. double minute 2 protein). Mdm2 ist eine E3 Ubiquitin-Ligase und wirkt als

negativer Regulator des Tumorsuppressors p53 u.a. über dessen Polyubiquitinierung

und anschließendem proteasomalen Abbau. Mdm2 kann von zwei Promotoren aus

transkribiert werden, was zu Transkripten mit verschieden langen

-UTRs führt.

Die lange Version der

-UTR hemmt den Scanvorgang. Die kurze führt dagegen zu

einer deutlich effizienteren Translation [56, 339, 173, 40, 41].

Kleine offene Leserahmen stromaufwärts des eigentlichen Startcodons (uORFs)

können ebenfalls einen Einfluss auf die Translation haben. In der Hefe besitzt die

GCN4-mRNA vier uORFs. Dieses Gen kodiert einen Transkriptionsfaktor, der wich-

tig für die Aminosäure-Biosynthese ist [132, 130]. Bei Aminosäure-Mangel kommt

es zur Phosphorylierung der

-Untereinheit von eIF2 und somit zur Senkung der

Menge an aktivem ternären Komplex. Ribosomen neigen nun eher dazu, über die

letzten uORFs hinweg zu scannen und umgehen dabei die nach Translationster-

mination üblicherweise erfolgende Dissoziation vom Transkript. Das führt dazu,

dass es am richtigen Startcodon verstärkt zur Translationsinitiation kommt [131].

uORFs können jedoch auch über andere Mechanismsen wirken. Beispielsweise

können RBPs über die Bindung von cis-Elementen einer mRNA das Erkennen eines

uAUGs (Startcodon eines uORFs) durch den 43S-Präinitiationskomplex fördern und

somit die eigentliche Translation des stromabwärts gelegenen Gens behindern [206].

Oder das aus einem uORF hervorgegangene Peptid kann über Interaktion mit einem

Release-Faktor dafür sorgen, dass das Ribosom auf der mRNA stehen bleibt und

somit den Weg für weitere Ribosomen versperrt [149].

1.2.3.2 3’-UTR

Obwohl die oben aufgeführten Beispiele für die posttranskriptionelle Regulation über

die

-UTR vielseitig sind, wird der Großteil der posttranskriptionellen Regulation

über cis-Elemente in der sehr viel längeren

-UTR abgewickelt. cis-Elemente

in der

-UTR können dabei mRNA-Stabilität, Translationseffizienz und mRNA-

Lokalisation kontrollieren [69, 112, 12, 258, 331, 307].

AU-reiche Elemente (ARE) sind die am weitesten verbreiteten cis-Elemente mit

einer Funktion bei der Regulierung der Stabilität von Säuger-mRNAs. Sie finden

sich bei vielen kurzlebigen mRNAs in der

-UTR [49, 333, 22]. Das ARE-Motiv

zeichnet sich bei einer Größe von

50−150nt

durch eine variable Anzahl von oftmals

auch überlappenden AUUUA-Pentameren meist innerhalb oder in der Nähe einer

U-reichen Region aus. Zwar beschleunigen AREs in den

-UTRs von mRNAs deren

Abbau, doch sind die zugrunde liegenden Mechanismen in Bezug auf Ausprägung

und Art des Abbaus verschieden. Diese Vielfalt beruht auf den unterschiedlichen

Kapitel 1 Einleitung

RBPs, die in der Lage sind, dieses Motiv zu binden [115]. AREs, die die mRNA-

Stabilität in vivo regulieren, eint, dass sie als starke Stimulatoren von Deadenylierung

sowie der Entfernung der

-Kappe wirken [93, 338]. Zwei der trans-Faktoren, die

dieses Motiv binden, sind AUF1 (engl. AU-rich element RNA-binding protein 1) und

HuR (engl. Hu-antigen R). Man nimmt an, dass diese beiden RBPs entgegengesetzte

Wirkungen entfalten. AUF1 hat einen destabilisierenden Einfluss auf gebundene

mRNAs, wohingegen HuR einen stabilisierenden Einfluss ausübt [106, 27]. Je nach

Gewebe bzw. nach physiologischen Bedingungen findet sich in Zellen ein unter-

schiedliches Expressionsverhältnis beider Proteine, so dass ARE-tragende mRNAs

dadurch wechselnden Abbauraten unterliegen. Weiteren Einfluss auf die Stabilität

einer mRNA kann die Zelle aber auch über die Lokalisation von ARE-bindenden

Proteinen sowie über Änderungen ihrer Aktivität bzw. ihrer Bindungseigenschaften

zu AREs ausüben [22]. AREs wirken jedoch nicht nur auf die Stabilität einer mRNA.

Sie können auch eine veränderte Translationseffizienz hervorrufen [254, 66].

Das IRE, ein anderes cis-Element, hat einen stabilisierenden Einfluss auf die mRNA.

Wie in

Unterabschnitt 1.2.3.1

beschrieben wirkt ein IRE in der

-UTR der Ferritin-

mRNA bei der Regulation der Translationsinitiation mit. In der Transferrinrezeptor-

mRNA finden sich jedoch fünf IREs in der

-UTR. Hier bewirken drei dieser

Haarnadelstrukturen unter Eisenmangel durch Bindung von IRP1 und IRP2 eine

Stabilisierung der mRNA und ermöglichen letztendlich die Eisenaufnahme [236].

Bei starkem Eisenangebot werden IRP1 und IRP2 jedoch inaktiviert bzw. abgebaut

und können so die Transferrinrezeptor-mRNA nicht mehr vor Abbau schützen. Die

so erniedrigte Transferrin-Rezeptor-Expression hat nun ihrerseits eine verringerte

Eisenaufnahme zur Folge [236].

Die Kontrolle der Translationsinitiation über cis-Elemente in der

-UTR wurde

schon weiter oben beschrieben. Die räumliche Nähe dieser cis-Elemente zum Ort der

Bildung des Initiations-Komplexes lässt diese Regulation plausibel erscheinen. Es

ist jedoch auch cis-Elementen in der

-UTR möglich, Einfluss auf die Translationsi-

nitiation zu nehmen. Dieser Umstand lässt sich aus der Tatsache ableiten, dass sich

beide Enden einer mRNA, aufgrund von Interaktionen miteinander, in räumlicher

Nähe zueinander befinden [91, 319]. Diese Interaktionen können direkter Natur sein,

wie bei einigen viralen mRNAs [118], oder über angelagerte Proteine vermittelt wer-

den. So konnte in Hefe gezeigt werden, dass das am Poly(A)-Schwanz befindliche

Pab1p (Hefehomolog von PABPC) und der Translationsinitiationfaktor eIF4G in

Wechselwirkung miteinander treten [311]. Da eIF4G an das Kappenbindungsprotein

eIF4E bindet, bildet die mRNA so eine geschlossene Schleife [326, 329]. Dies hat

u.a. den Vorteil, dass sich Ribosomen nach Termination der Translation in der Nähe

der Kappe aufhalten. Ein effizientes Recycling der Ribosomen zur erneuten Translati-

onsinitiation ist daher möglich. Als Beispiel für eine Regulation der Translation von

einem cis-Element der

-UTR sei hier das Differenzierungskontroll-Element (DICE)

1.3 Zielstellung dieser Arbeit

genannt. Während der Erythropoese kommt es zu einer translationalen Stilllegung

der 15-Lipoxygenase-mRNA [230, 229]. Diese mRNA besitzt in ihrer

-UTR ein

als DICE bezeichnetes CU-reiches Element. Die Bindung der heterogenen nukleären

Ribonucleoproteine (hnRNP) K und E1 an DICE führt zur Bildung eines Kom-

plexes, der die Translation verhindert. Dabei werden zwar weder die Bildung des

Präinitiationskomplexes noch der Scanning-Vorgang beeinträchtigt, doch führt die

Verhinderung der Anlagerung der großen ribosomalen Untereiheit zur Bildung des

zur Translation fähigen 80S-Ribosoms ebenfalls zur Stilllegung der mRNA.

Die subzelluläre Lokalisation einer mRNA wird ebenfalls durch Elemente in der

-UTR bestimmt. So wird der Transport von

-Actin-mRNA an die Zellperipherie in

Fibroblasten, unter Bedingungen der erhöhten Actin-Synthese in diesen Bereichen,

durch eine als Zipcode-Element (engl.„Postleitzahl“) bezeichnete Sequenz in der

-UTR gesteuert. Die Ausschaltung dieses Signals führt zu einer gestörten

-Actin-

Verteilung und Zellmotilität [162, 267, 143, 233].

1.3 Zielstellung dieser Arbeit

Bei der Regulation der Genexpression spielt nicht nur die Kontrolle der Transkrip-

tion über an die genomische DNA bindende Transkriptionsfaktoren eine Rolle. Es

gehen auch posttranskriptionelle Einflüsse in die Regulation ein. Diese Einflüsse

können beispielsweise insbesondere unter Stress-Bedingungen sowie bei Differen-

zierungsvorgängen eine entscheidende Funktion ausüben. Die Kontrollelemente für

eine solche Regulation finden sich vornehmlich in den untranslatierten Regionen

(UTRs) einer mRNA. Zugehörige trans-Faktoren, wie microRNAs (miRNAs) oder

RNA-Bindungsproteine (RBPs), erkennen diese Kontrollelemente und modulieren

beispielsweise die Stabilität oder die Translationseffizienz der mRNA. Ziel die-

ser Arbeit war die Untersuchung der Regulation der hASH1-Expression, wobei

posttranskriptionelle Einflüsse im Fokus standen.

2 Material und Methoden

2.1 Molekularbiologische und biochemische

Arbeitsmethoden

2.1.1 PCRs und Mutagenese

Sequenzen von Interesse wurden mithilfe des peqGOLD Taq DNA Polymerase

Kits (peqlab) via PCR unter Verwendung spezifischer Primer amplifiziert. Im Allge-

meinen wurden dabei 30-34 Zyklen durchlaufen, wobei sich die jeweils gewählte

Annealingtemperatur an den von der Synthesefirma (TIB MOLBIOL GmbH) ange-

gebenen Schmelztemperaturen der Primer orientierte.

Um einen bestimmten Abschnitt innerhalb einer Sequenz (die schon in einen Vektor

integriert wurde) zu verändern, wurde die Mutation über Primer eingeführt. Dazu

wurden jeweils zwei PCRs durchgeführt. Beide Ansätze enthielten jeweils einen

der beiden endständigen Primer als Hinprimer sowie einen der beiden (zueinander

komplementären) innenliegenden mutierten Primer (siehe

Tabelle 2.1

) als Rückpri-

mer. Beide PCR-Produkte konnten nun vereinigt werden und dienten zusammen

als Template für eine erneute PCR mit den endständigen Primern. Das so erzeugte

PCR-Produkt trug nun die Mutation und konnte wieder in den Vektor integriert

werden. Die Mutationen wurden mittels Sequenzierung überprüft (MWG Biotech

AG).

2.1.2 Klonierung und verwendete Vektoren

PCR-Produkte wurden entweder direkt unter Benutzung des

QIAquick

PCR Purifi-

cation Kits (QIAGEN) gereinigt oder als Bande nach Auftrennung in einer Agarose-

Gelelektrophorese mit dem

QIAquick

Gel Extraction Kit (QIAGEN) isoliert. Zur

Klonierung der Amplifikate wurde das TOPO TA Cloning®Dual Promoter Kit (In-

vitrogen

™

) nach Herstellerangaben verwendet. Die aus der PCR hervorgegangenen

-Adenin-Überhänge der PCR-Produkte konnten hierbei mit den

-T-Überhängen

des mitgelieferten Vektors für die Ligation kombiniert werden. Chemisch kompetente

Kapitel 2 Material und Methoden

Tabelle 2.1: Liste mit den in den Mutagensee-PCRs eingesetzten Primern

Primer Sequenz

hASH1_50_Fw 50-CCA GAA GTA GTG AGG AGG CT

hASH1_50_Re 50-CAG CGT AAG TGA TGT CCA CC

hASH1_50TOPdel_Fw 50-AAG CTT GCC AGG GAA CGT GGA

AGG

hASH1_30_Fw 50-GTC GCC AGT CAA GTA ACA AC

hASH1_30_Re 50-GAA GAC AGT CAT AAG TGC GG

hASH1_30DICE-Adel_Fw 50-AAA CGA AAA CAG TCA ACC AAC

CGA GGC ATG CCT GAG AGA C

hASH1_30DICE-Adel_Re 50-GTC TCT CAG GCA TGC CTC GGT TGG

TTG ACT GTT TTC GTT T

hASH1_30DICE-Bdel_Fw 50-TTG CTC GGG TCC CTT CAC CTT GCA

GTT CTT AGC CCT CTA G

hASH1_30DICE-Bdel_Re 50

-CTA GAG GGC TAA GAA CTG CAA GGT

GAA GGG ACC CGA GCA A

hASH1_30DICE-Cdel_Fw 50-GTG TCT TTC GTC TCA GTA GCC TGT

AGA CAT TGG TTT ACA GTG

hASH1_30DICE-Cdel_Re 50

-CAC TGT AAA CCA ATG TCT ACA GGC

TAC TGA GAC GAA AGA CAC

hASH1_30XXdel_Fw 50-GAA CTC TCA TAG GTG AGA TCG TAC

TTC AGC ACC AAT GTG TCT TAC

hASH1_30XXdel_Re 50-GTA AGA CAC ATT GGT GCT GAA GTA

CGAT CTC ACC TAT GAG GAG AGT TC

hASH1_30IRESdel_Re 50-GTC GAC GAA AAA GTT TTA TTA CAA

GAA AAA AAA AGG CAG TAA TAG AAA

TCT C

2.1 Molekularbiologische und biochemische Arbeitsmethoden

TOP10F’ E. coli-Zellen (Invitrogen

™

) wurden transformiert und Klone über die Am-

picillinresistenz selektiert. Hierzu wurden die kompetenten Zellen mit den ligierten

Plasmiden für

5min

auf Eis inkubiert und anschließend auf vorgewärmte (

37◦C

) LB-

Agar Platten (

1,5%

Agar;

100µg/ml

Ampicillin) ausplattiert und über Nacht bei

37◦C

inkubiert. TOPO-Klone wurden via PCR auf richtige Insert-Größe sowie T7-sense

Orientierung, für eine mögliche später erfolgende in vitro-Transkription, getestet.

Von korrekten Klonen wurden Kryokulturen angelegt, wobei

500 −700µl

einer

über Nacht Schüttelkultur (LB-Medium mit

100µg/ml

Ampicillin) mit demselben

Volumen Glycerin versetzt und bei −80◦C eingefroren wurden.

Die Überführung von Zielsequenzen in die entsprechenden Vektoren für die Repor-

tergenassays erfolgte über natürliche in den Sequenzen vorkommende bzw. über

durch Primer in der PCR eingeführte Restriktionsschnittstellen. Nach Verdau der

Plasmide mit den entsprechenden Restriktionsenzymen (New England Biolabs oder

Fermentas) erfolgte eine Auftrennung durch Agarose-Gelelektrophorese und die

Isolierung der DNA per

QIAquick

Gel Extraction Kit (QIAGEN). Die anschlie-

ßende Ligation der Fragmente (im molaren Verhältnis von 1:2 bis 1:3 Vektor zu

Insert) wurde mithilfe des LigaFast

™

Rapid DNA Ligation Systems (Promega) nach

Herstellerangaben durchgeführt. Die Transformation kompetenter Zellen sowie die

Erzeugung von Kryokulturen erfolgte wie oben dargestellt.

Eine Überprüfung der klonierten Sequenzen erfolgte per Sequenzierung durch die

MWG Biotech AG. Die in der Arbeit benutzten fertigen Plasmide sind in

Tabelle 2.2

aufgeführt.

Tabelle 2.2: Liste mit den in dieser Arbeit im Reportergenassay verwendeten Plasmide.

Name Bemerkungen Referenz

pGL3p

Ausgangsvektor/

Kontrollvektor mit SV40

Promotor

Promega

p251 Reporter unter Kontrolle des

hASH1-Promoters [324]

pGL3p_hASH1-

_5Luc

Reporter unter Kontrolle der

50-UTR von hASH1 [83]

pGL3p_hASH1_5-

TOPdel-Luc

Reporter unter Kontrolle der

50-UTR von hASH1, wobei die

TOP-Sequenz deletiert wurde

diese Arbeit

pGL3p_hASH1_5-

AUdel-Luc

Reporter unter Kontrolle der

50-UTR von hASH1, wobei

eine AU-reiche Sequenz

deletiert wurde

[83]

Kapitel 2 Material und Methoden

Fortsetzung: Liste mit den in dieser Arbeit im Reportergenassay verwendeten

Plasmiden.

Name Bemerkungen Referenz

pGL3p_hASH1_5-

GQdel-Luc

Reporter unter Kontrolle der

50-UTR von hASH1, wobei ein

G-Quartet deletiert wurde

[83]

pGL3p_hASH1_5-

OligoUdel-Luc

Reporter unter Kontrolle der

50-UTR von hASH1, wobei

eine U-reiche Sequenz deletiert

wurde

[83]

pGL3p_hASH1-

_Luc3

Reporter unter Kontrolle der

30-UTR von hASH1 [83]

pGL3p_hASH1-

_5Luc3

Reporter unter Kontrolle beider

UTRs von hASH1 [83]

pGL3p_hASH1-

_Luc3-488del

Reporter unter Kontrolle der

30-UTR von hASH1, wobei

488nt des 50-gelegenen

Bereichs deletiert wurden

[83]

pGL3p_hASH1-

_Luc3_del_DICE-A

Reporter unter Kontrolle der

30-UTR von hASH1, wobei

DICE-Element A deletiert

wurde

diese Arbeit

pGL3p_hASH1-

_Luc3_del_DICE-B

Reporter unter Kontrolle der

30-UTR von hASH1, wobei

DICE-Element B deletiert

wurde

diese Arbeit

pGL3p_hASH1-

_Luc3_del_DICE-C

Reporter unter Kontrolle der

30-UTR von hASH1, wobei

DICE-Element C deletiert

wurde

diese Arbeit

pGL3p_hASH1-

_Luc3_del_DICE-

Reporter unter Kontrolle der

30-UTR von hASH1, wobei

DICE-Elemente A und B

deletiert wurden

diese Arbeit

pGL3p_hASH1-

_Luc3_del_DICE-

Reporter unter Kontrolle der

30-UTR von hASH1, wobei

DICE-Elemente A und C

deletiert wurden

diese Arbeit

2.1 Molekularbiologische und biochemische Arbeitsmethoden

Fortsetzung: Liste mit den in dieser Arbeit im Reportergenassay verwendeten

Plasmiden.

Name Bemerkungen Referenz

pGL3p_hASH1-

_Luc3_del_DICE-

Reporter unter Kontrolle der

30-UTR von hASH1, wobei

DICE-Elemente B und C

deletiert wurden

diese Arbeit

pGL3p_hASH1-

_Luc3_del_DICE-

ABC

Reporter unter Kontrolle der

-UTR von hASH1, wobei alle

DICE-Elemente wurden

diese Arbeit

pGL3p_hASH1-

_5Luc3_del_DICE-

ABC

Reporter unter Kontrolle der

beider UTRs von hASH1,

wobei alle DICE-Elemente

wurden

diese Arbeit

pGL3p_Mash1-

_Luc3

Reporter unter Kontrolle der

30-UTR von Mash1 (Mus

musculus)

diese Arbeit

pGL3p_Mash1-

_5Luc3

Reporter unter Kontrolle beider

UTRs von Mash1 (Mus

musculus)

diese Arbeit

2.1.3 Plasmid-DNA-Präparationen

Plasmid-DNA-Präparationen wurden mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (QIA-

GEN) oder dem PureLink

™

HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit (Invitrogen

™

) nach

Herstellerangaben durchgeführt. Die DNA wurde am Schluss in nukleasefreiem Was-

ser (Gibco) aufgenommen. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte photometrisch

bei einer Wellenlänge von 260nm.

2.1.4 RNA-Isolierung

Nach einmaligem Waschen mit

1×PBS

(Biochrom AG) wurden Zellen mit RNA-

Bee

™

(AMS Biotechnology) versetzt und nach Herstellerangaben weiter behandelt.

Dabei kam es durch Zugabe von Chloroform zur Ausbildung zweier Phasen, wobei

die RNA in der wässrigen Oberphase lokalisiert war und mithilfe von Isopropa-

nol über Nacht bei

−20◦C

gefällt wurde. Nach zweimaligem Waschen mit

70%

Ethanol wurde das RNA-Pellet in nukleasefreiem Wasser (Gibco) aufgenommen.

Kapitel 2 Material und Methoden

Die Konzentrationsbestimmung erfolgte photometrisch bei einer Wellenlänge von

260nm.

2.1.5 mRNA-Quantifizierung mittels Realtime-PCR

Für die Realtime-PCR mussten aus mRNA erst DNA-Templates erzeugt werden.

Dazu wurde

1µg

der RNA-Präparation mittels Reverser Transkriptase in cDNA unter

Nutzung des High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)

umgeschrieben. Als Primer wurden die im Kit enthaltenen randomisierten Primer

verwendet.

20ng

der so erzeugten cDNA wurden nun in der Realtime-PCR je Ansatz einge-

setzt. Bei dieser Methode ist es durch den interkalierenden Fabstoff SYBR Green I

(Invitrogen

™

) möglich, die Menge an PCR-Produkt in Echtzeit zu messen, da die

Fluoreszenz proportional zur Menge an Komplex aus Farbstoff und doppelsträngiger

DNA zunimmt. Die quantitative Analyse einer Probe wurde in dreifach Ansätzen

mit dem GeneAMP 5700 System (Applied Biosystems) durchgeführt. Dabei wurde

für die Realtime-PCR ein fertiger Mix (Bioline) aus DNA-Polymerase, dNTPs sowie

Puffer verwendet. Spezifische Intron-überspannende Primer wurden zur Quantifi-

zierung von hASH1-mRNA benutzt, wobei entweder auf die mRNA-Menge von

GAPDH oder β-Actin nach der ΔCt Methode [187] normiert wurde.

Die verwendeten Primer (siehe Tabelle 2.3) wurden von der TIB MOLBIOL GmbH

synthetisiert.

Tabelle 2.3: Liste mit den in der Realtime-PCR eingesetzten Primern.

Primer Sequenz

hASH1 Q Fw 50-CGACTTCACCAACTGGTTCT

hASH1 Q Re 50-CCGTGAATGATTGGAGTGC

ACTB Q Fw 50-TGAAGTGGTACGTGGACATC

ACTB Q Re 50-GTCATAGTCCGCCTAGAAGC

GAPDH Q Fw 50-CACCATCTTCCAGGAGCGAG

GAPDH Q Re 50-GCAGGAGGCATTGCTGAT

2.1.6 Gesamt-Proteinpräparationen

Zellen wurden nach einmaligem Waschen mit

1×PBS

und vorsichtigem Abschaben

von den Zellkulturschalen mit Laemmli-Probenpuffer

10mM

DTT [171] versetzt. Es

2.1 Molekularbiologische und biochemische Arbeitsmethoden

folgte entweder ein 15-minütiges Kochen der Proben bei

95◦C

oder eine Ultraschall-

behandlung und darauf folgend ein 5-minütiges Kochen (

95◦C

) der Proben. Die

Proteinkonzentrationen wurden photometrisch bei einer Wellenlänge von

280nm

bestimmt. Eine Verdünnung der Proben für die SDS-PAGE wurde in Laemmli-

Probenpuffer mit 0,02% Bromphenolblau (Endkonzentration) durchgeführt.

2.1.7 Isolierung von cytosolischen Proteinen und

Kernproteinen

Zur getrennten Gewinnung von cytosolischen Proteinen und Kernproteinen wurden

Zellen nach einmaligem Waschen mit

1×PBS

und vorsichtigem Abschaben von den

Zellkulturschalen in doppeltem Volumen Lysepuffer (

10mM

Tris, pH 7,5;

140mM

NaCl

;

1mM

EDTA;

20%

Glucose;

0,1%

SDS;

0,5%

Nonidet P-40,

1mM

DTT;

1×

Complete Protease Inhibitor Mix (Roche Diagnostics GmbH)) auf Eis für

10min

inkubiert. Eine 10-minütige Zentrifugation bei

4◦C

und

10000×g

sorgte für die

Trennung der cytosolischen Fraktion (Überstand) von den Kernen (Pellet). Zum

Aufschließen der Kerne wurden diese mit Laemmli-Probenpuffer versetzt und in

einem Thermoschüttler bei

95◦C

für

15min

bei

1200rpm

geschüttelt. Die Konzen-

trationsbestimmung wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von

280nm

mit

Lysepuffer bzw. Laemmli-Probenpuffer als Leerkontrolle ermittelt. Eine Verdün-

nung der Proben für die SDS-PAGE wurde in Laemmli-Probenpuffer mit

0,02%

Bromphenolblau (Endkonzentration) durchgeführt.

2.1.8 Cytosol-Isolierung mit Komplexen in nativen

Konstellationen

Um Ribosomem-besetzte mRNP-Komplexe für die Polysomengradienten-Analyse

zu gewinnen, wurden die Ribosomen mithilfe von Cycloheximid (Sigma-Aldrich

)

an ihren mRNAs fixiert. Dazu wurden die Zellen mit Cycloheximid (

100µg/ml

)

versetzt und

15min

bei

37◦C

inkubiert. Es folgte ein zweimaliges Waschen mit

1×PBS+100µg/ml

Cycloheximid und die Aufnahme in Cycloheximid-haltigem

Lysepuffer (

20mM

Tris, pH 7,4;

150mM

KCl;

30mM MgCl2

;

0,5%

Nonidet P40;

1mM

DTT;

100µg/ml

Cycloheximid;

1×PIC

;

200U/ml

RNaseOUT (Invitrogen

™

life technologies)). Nach 10-minütiger Lyse auf Eis wurden die Kerne über eine

10-minütige Zentrifugation bei

10000×g

und

4◦C

abgetrennt. Der Überstand konnte

nun in Polysomengradienten-Analysen eingesetzt werden. Die Konzentrationsbe-

stimmung erfolgte photometrisch bei einer Wellenlänge von 280nm.

Kapitel 2 Material und Methoden

2.1.9 Westernblotting und Proteinquantifizierung

30−60µg

der Protein-Präparation wurden über SDS-PAGE aufgetrennt anschlie-

ßend auf Roti

-PVDF Membranen (Carl Roth GmbH & Co. KG) geblottet. Für

das Blockieren wurde die Membran eine Stunde lang in

Milchpulver (Carl

Roth GmbH & Co. KG) in

1×TBS-T

(

20mM

Tris,

137mM NaCl

0,1%

Tween 20)

inkubiert. Die anschließende Inkubation mit Primärantikörper (siehe

Tabelle 2.4

)

fand über Nacht bei

4◦C

statt. Nach dreimaligem Waschen à

10min

mit TBS-T

folgte eine einstündige Inkubation mit HRP-konjugiertem Sekundärantikörper (siehe

Tabelle 2.4

). Die Detektion erfolgte nach erneutem Waschen (wieder

3×10min

) mit

1×TBS-T

unter Zuhilfenahme des ChemiGlow West Chemiluminescence Substrate

Kits (Cell Biosciences). Hierbei wird die durch die HRP erzeugte Lichtreaktion

zur Proteinquantifizierung genutzt. Die Detektion dieser Lichtreaktion fand über

die Exposition von photosensitiven Filmen statt, wobei Amersham Hyperfilm ECL

(Amersham) verwendet wurden. Nach Scannen der Signale auf den Filmen wurden

diese mithilfe der Scion Image Software (Scion Corporation) quantifiziert.

Vor erneuter Nutzung der Blots zum Nachweis anderer Proteine wurden die Blots

erst mit entionisiertem Wasser für

5min

auf dem Schüttler gewaschen, anschließend

mit

0,2M NaOH

für

2−5min

gestrippt und daraufhin abermals mit entionisiertem

Wasser gewaschen. Nun wurden die Membranen, angefangen beim Blocken, wie

oben beschrieben weiterbehandelt. So war auch eine Normierung von im ersten

Durchlauf ermittelten Bandenintensitäten auf die Bandenintensitäten von GAPDH

oder β-Aktin als interne Beladungskontrolle möglich.

2.1.10 Polysomengradienten-Analyse

Ein kontinuierlicher Saccharose-Gradient wurde unter Verwendung einer

17%

-igen

und einer

51%

-igen Saccharoselösung in Gradientenpuffer (

20mM

Tris pH

7,4

;

150mM KCl

;

5mM MgCl2

;

1mM

DTT) mithilfe eines automatischen Mischsystems

in Polyallomer-Röhrchen aufgebaut.

200µl

einer Cytosol-Präparationen (gewonnen

wie in

Unterabschnitt 2.1.8

beschrieben) mit einer Konzentration von

10µg/µl

wurden

auf diesen Saccharose-Gradienten (17−51%) geladen.

Durch die anschließende Ultrazentrifugation bei

37000rpm

(

≈100000 ×g

) für

(Beckmann L70 Ultrazentrifuge, SW-41 Rotor) wurden die Ribonukleoprotein-

Komplexe entsprechend ihrer Masse im Gradienten aufgetrennt. Diese ist abhängig

vom Beladungsgrad mit Ribosomen. Vom Boden des Zentrifugenröhrchens aus wur-

de die Gradientenlösung mittels einer Pumpe abgesaugt. Dabei wurde die Absorption

kontinuierlich bei einer Wellenlänge von 254 nm gemessen und dokumentiert. Die

2.1 Molekularbiologische und biochemische Arbeitsmethoden

Tabelle 2.4:

Liste der verwendeten Antikörper. Die Antikörper wurden in TBS-T mit

10%

Chemical

Blocking solution (Millipore) verdünnt auf die Blots gegeben.

Name Hersteller Verdünnung

1.Antikörper

Mouse Anti-Mash1 BD Pharmingen™,

Katalognummer: 556604 1 : 500

Anti-β-Actin

Chemicon,

Katalognummer:

MAB1501R

1 : 4000

Anti-GAPDH Acris, Katalognummer:

BM439 1 : 1500

Anti-hnRNP-E1

(PCBP1 Antibody)

Aviva Systems Biology,

Katalognummer:

ARP40630_T100

1 : 1000

Anti-hnRNP-K

Novus Biologicals,

Katalognummer:

NB100-2123

1 : 1000

Anti-TTP (Anti

ZFP-36)

Aviva Systems Biology,

Katalognummer:

ARP34385_P100

1 : 1000

2.Antikörper

goat anti-mouse Santa Cruz,

Katalognummer: sc2031 1 : 100.000

donkey anti-rabbit Santa Cruz,

Katalognummer: sc2317

1 : 50.000 bis

1 : 100.000

Gradientenlösung wurde zur weiteren Aufarbeitung in 12 Fraktionen à 1 ml unterteilt.

Die RNA der einzelnen Fraktionen wurde nun mithilfe des E.Z.N.A RNA Total Kits

(VWR International) nach Herstellerangaben isoliert, wobei die Elution der RNA

von der Säule mit nukleasefreiem Wasser (Gibco) erfolgte. Eine Quantifizierung

spezifischer mRNAs wurde nach Umschreiben in cDNA über Realtime-PCR wie

unter Unterabschnitt 2.1.5 beschrieben durchgeführt.

2.1.11 In vitro-Transkription

Im ersten Schritt wurden die Templates für die in vitro-Transkription mittels PCR

aus hASH1-UTR-tragenden TOPO

II-Vektoren erzeugt. Unter Nutzung des Vek-

torprimers TOPO II M13 Fw sowie jeweils spezifischen Rückprimern konnten

Amplikons erzeugt werden, die die T7-Promotorsequenz aus dem TOPO

II Vektor

(Invitrogen

™

) sowie die jeweilige Zielsequenz unter Kontrolle dieses Promotors

enthielten. Die in vitro-Transkription wurde mit T7-RNA-Polymerase (Promega) mit

Kapitel 2 Material und Methoden

den entsprechenden Amplikons nach Herstellerangaben durchgeführt.

Die so erzeugten in vitro-Transkripte wurden anschließend mit Chroma Spin

™

-100

DEPC colums (Clontech) nach Herstellerangaben aufgereinigt.

2.1.12 UV-Crosslinking

Eine Möglichkeit des Nachweises einer Wechselwirkung zwischen RNA-Bin-

dungsfaktoren und einer spezifischen RNA stellt das UV-Crosslinking dar. Hierbei

werden mit einem radioaktiven Nukleotid markierte in vitro-Transkripte erzeugt und

mit cytosolischen Extrakten (

Unterabschnitt 2.1.8

) inkubiert. Mittels UV-Licht wer-

den die Protein-RNA-Komplexe kovalent miteinander verknüpft. Ein anschließender

Verdau der RNA degradiert die Bereiche der Transkripte, die nicht mit Proteinen in

Wechselwirkung standen (siehe

Abbildung 2.1

). Nach Auftrennung in einer SDS-

PAGE sind nur Proteine, welche während des UV-Crosslinkings in direktem Kontakt

mit der RNA standen, radioaktiv makiert und können mittels eines Röntgenfilms

detektiert werden.

Die Transkripte wurden wie in

Unterabschnitt 2.1.11

beschrieben oder in Anwesen-

heit von

α32P

-U/C/A/GTP zur radioaktiven Markierung erzeugt. Für die Komplexbil-

dung wurden

3,5µl

cytosolischer Extrakt (

10µg/µl

Proteinkonzentration) mit

5,5µl

Puffer (

10mM

HEPES, pH 7,2;

3mM MgCl2

;

Glycerin;

1mM

DTT;

150mM

KCl

;

2U/µl

RNaseOUT (Invitrogen

™

);

50ng/µl

Kaninchen rRNA) und

1−2ng

in vitro-Transkript (

100.000cpm

) für

30min

bei Raumtemperatur inkubiert. Die

RNA/Protein-Komplexe wurden mit UV-Licht (

255nm

1,6Joule

, UV-Stratalinker)

bestrahlt. Eine Behandlung mit RNase-A (

30µg/ml

Endkonzentration) und RNase-T1

(

750U/ml

Endkonzentration) für

bei

37◦C

folgte. Die Ansätze wurden mit Lade-

puffer (Roti

-Load 1, Carl Roth GmbH & Co. KG) versetzt und per SDS-PAGE

aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele für

30min

in Fixierungs-

Lösung (

10%

Essigsäure,

10%

Methanol) fixiert und anschließend auf einem Filter

getrocknet. Die Signale wurden über das Phospho-Imager-System (Fujifilm FLA-

3000) sowie durch Exposition von Filmen (Kodak Biomax MR-1) dokumentiert.

2.2 Zellkultur

2.2.1 Zelllinien und Kultivierung

Die humane Neuroblastoma-Zelllinie Kelly (ACC 355) wurde von der DSMZ (Deut-

sche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) bezogen. Die Kultur

2.2 Zellkultur

Abbildung 2.1:

Vereinfachte Darstellung des Prinzips des Crosslinkings. Radioaktiv markierte

Transkripte werden mit cytosolischen Extrakten inkubiert. Nach der Komplexbildung werden

RNA sowie RNA-Bindungsproteine mittels UV-Licht kovalent miteinander verknüpft. Nach einem

anschließenden Verdau der RNA können Proteine die mit der RNA (in der Abbildung rot dargestellt)

interagierten, radiographisch detektiert werden. Proteine ohne direkte Wechselwirkung mit der

RNA bleiben auch nach dem Crosslinking unmarkiert (grün dargestellt).

der Zellen fand in

6cm

- und

10cm

-Zellkulturschalen (TPP Techno Plastic Products

AG) oder auf 96-Well Platten (

Clear Platte 96K, Greiner BIO-ONE GmbH) bei

37◦C und 5% CO2statt. Als Wachstums-Medium diente RPMI-Medium (PAA La-

boratories GmbH) mit

10%

fetalem Kälberserum (Biochrom AG, Katalognummer:

S0115) sowie

100U/ml

Penicillin,

100µg/ml

Streptomycin und

Glutamat (Invi-

trogen

™

). Die Zellen konnten bis zu einer Konfluenz von

80−90%

wachsen und

wurden dann je nach Anforderung unterschiedlich stark gesplittet. Zudem wurden

die Zellen höchstens bis zur 50. Passage verwendet.

Die Zellen je einer

10cm

-Zellkulturschale (mit einer Konfluenz von etwa

80%

)

wurden für je eine Kryokultur geerntet und in

1ml

Kryomedium (RPMI +

20%

fetalem Kälberserum +

10%

DMSO) langsam auf

−80◦C

heruntergekühlt und

anschließend in flüssigem Stickstoff gelagert.

Kapitel 2 Material und Methoden

2.2.2 Primäre Zellen

Zur Gewinnung von primären Neuronen wurden Ratten gemäß der Erlaubnis (LaGe-

So, 0122/07) vom Landesamt für Arbeitsschutz, Gesundheitsschutz und technische

Sicherheit Berlin und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Europäischen

Union getötet. Dabei wurden Kortex-Zellen von E19 Wistar Ratten wie von Eichler

et al. [74] für Hippocampus-Zellen beschrieben präpariert und in mit B27 (Gibco

)

und

fetalem Kälberserum supplementiertem Neurobasal Medium (Gibco

) für

acht Tage kultiviert [34].

2.2.3 Immunfluoreszenz

In Kortex-Zellkulturen von E19 Wistar Ratten wurde Mash1 mithilfe von Mouse

Anti-Mash1 (1:500, BD Pharmingen

™

) sowie mit Tetramethylrhodaminisothio-

cyanat-gekoppeltem Zweitantikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories) sicht-

bar gemacht. Dazu wurden die Neurone auf Deckgläschen kultiviert und mit einer

Eis-gekühlten Mischung aus

Paraformaldehyd und

Saccharose in PBS für

15min

bei Raumtemperatur fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden

die Deckgläschen über Nacht in PBS/Gelatine bei

4◦C

inkubiert. Die Deckgäschen

wurden mit Erst- und Zweitantikörper jeweils für

und

45min

inkubiert. Zwischen

den Antikörper-Inkubationen wurden die Deckgläschen viermal mit PBS/Gelatine

gewaschen. Die Deckgläschen wurden dann auf Objektträgern angebracht und DAPI-

enthaltendes Vectashield Medium (Vector Laboratories) zur Sichtbarmachung der

Zellkerne eingesetzt.

Die Quantifizierung des Mash1-Fluoreszenssignals wurde über Intensitätsmessungen

innerhalb kreisförmiger Bereiche von Interesse (

5µm

im Durchmesser) durchgeführt.

Die Hintergrund-Fluoreszenz (Rauschen) wurde entsprechend bestimmt, wobei je-

doch Zell-freie Bereiche von Interesse gewählt wurden. Zur erleichterten Darstellung

der Messwerte wurden die ursprünglichen Signalintensitäten (von 0 bis 255 reichend,

wobei „0“ für starke Lichtintensität (weiß) und „255“ für schwache Lichtintensität

(schwarz) steht) vom Wert 255 abgezogen, so dass höhere Werte nun für eine erhöhte

Lichtintensität stehen.

2.2.4 Stimulierung der Zellen

Die Chemikalien für die Stimulationsversuche an den Zellen wurden in Ethanol

oder DMSO gelöst, so dass mindestens eine 1:1000 Verdünnung in den Kulturme-

dien für die Inkubation der Zellen vorlag. Kontrollzellen wurden in den jeweiligen

2.2 Zellkultur

Lösungsmitteln für die gleichen Zeiträume inkubiert. Kelly-Zellen hatten bei Sti-

mulierung mindestens eine Konfluenz von

50%

. Sollte der PMA-Einfluss unter

Bedingungen der Proteinkinase C-Inhibition getestet werden, so wurden die Zellen

vor PMA-Inkubation einer 4-stündigen Präinkubation mit Staurosporin (

40nM

, Sig-

ma Aldrich

) bzw. GF109203X (

5µM

, Sigma Aldrich

) sowie zur Kontrolle dem

Proteinkinase A-Inhibitor KT-5720 (2µM, Enzo Lifesciences GmbH) ausgesetzt.

Die Anfangs-Zelldichte der primären Kortex-Zellen betrug

68000/cm2

. Die 6-

stündige Inkubation mit PMA (Sigma Aldrich

) wurde am zweiten Tag in vitro

durchgeführt.

2.2.5 Transfektion

Zur transienten Transfektion von Zellen mit den Reportergen-Konstrukten wurde das

Liposomen-basierte System Roti

-Fect (Carl Roth GmbH & Co. KG) nach Herstel-

lerangaben verwendet. Hierbei wurden für je

3µg

eingesetzter DNA-Gesamtmenge

10µl

Roti

-Fect Reagenz zur Komplexbildung (

20min

) eingesetzt. Die Zellen wur-

den mit dem Transfektionsmix für mindestens 6h inkubiert, wonach ein Austausch

mit frischem Medium folgte.

Als alternative Methode wurde Magnetofection

™

-PolyMag (OZ Biosciences) nach

Herstellerangaben verwendet. Hierbei bildet die Nukleinsäure mit magnetischen

Partikeln Komplexe. Diese Komplexe werden dann mithilfe eines Magneten auf

die Zellen gezogen, so dass es schon nach kurzer Zeit zu einer starken Aufkonzen-

trierung der zu transfizierenden DNA an den Zellen kommt. Für die 30-minütige

Komplexbildung wurden

10µl

PolyMag je

µg

eingesetzter DNA verwendet. Nach

20-minütiger Inkubation der Zellen mit den Nukleinsäurekomplexen erfolgte ein

Austausch des Mediums.

2.2.6 Reportergenassay

Im Reportergenassay werden die Auswirkungen auf die Expression eines Lucifera-

sereportergens, welches jeweils unter Kontrolle des hASH1-Promotors oder der

UTRs sowie verschiedenen Deletionsvarianten der UTRs steht, beobachtet. Das

Luciferasegen stammt vom Leuchtkäfer Photinus pyralis (siehe Abbildung 3.2 auf

Seite 47). Dieser nutzt die von der Luciferase erzeugte Biolumineszenz in der Natur

zum Auffinden von Paarungspartnern. Das Enzym katalysiert dabei eine Oxidation

von Luciferin zu Oxyluciferin, wobei elektronisch angeregte Zwischenstufen erzeugt

werden, die beim Fall auf ihren Grundzustand Energie in Form von Lichtquanten

emittieren (siehe Abbildung 2.2) [107].

Kapitel 2 Material und Methoden

Die Menge an gebildeter Luciferase lässt sich nun über die Stärke des emittierten

Lichts ableiten und kann als Maß für die Aktivität des Promotors und der UTRs

von hASH1 unter den gegebenen Bedingungen dienen. Da bei den UTR-abhängigen

Reportergenassays in den Reportervektoren ein konstitutiver Promotor vorlag, konnte

nach Normierung auf den Kontrollvektor, der nur denselben konstitutiven Promotor

nicht aber die UTRs enthielt, direkt auf den UTR-Einfluss rückgeschlossen werden.

Abbildung 2.2:

Funktionsweise des Reportergenassays. Kelly-Zellen werden mit Reportergenvek-

toren transfiziert und bilden je nach Stimulus mehr oder weniger Luciferase als Kontroll-Zellen.

Dieses äußert sich in veränderten Lichtintensitäten in der durch die Luciferase katalysierten

Lichtreaktion.

Für die Reportergenassays wurden Kelly-Zellen auf 96-Well Platten (

Clear Platte

96K, Greiner BIO-ONE GmbH) überführt und darin für

24h

kultiviert. Es folgte

eine Transfektion mit

100ng

Reporterkonstrukt sowie mit

175ng

Renilla Luciferase

Vektor phRL-TK (Promega) je Well wie in

Unterabschnitt 2.2.5

beschrieben. Die

Renilla-Luciferase diente als Kontrolle für die Transfektionseffizienz (bzw. gege-

benenfalls für die Zelldichte). Da die Renilla-Luciferase ein anderes pH-Optimum

besitzt sowie ein anderes Substrat umsetzt, können mit aufeinanderfolgend zugegebe-

nen Substrat-Puffer-Lösungen (PJK GmbH) die Lichtreaktionen der verschiedenen

Luciferasen nacheinander gemessen werden. So lässt sich die Lichtintensität der

Firefly-Reaktion durch Normierung auf die Lichtintensität der Renilla-Reaktion

vom Einfluss der Transfektionseffizienz befreien, so dass sich die Streubreite der

Messwerte verringert.

24−48h

nach der Transfektion der Zellen folgte die Inkubation der Zellen mit den

Stimuli bzw. den erniedrigten Sauerstoffbedingungen. Danach wurden die Zellen

mithilfe von Passive Lysis 5X Buffer (Promega) lysiert. Die anschließende Detektion

der Luciferseaktivitäten wurde in einem Luminometer (Labsystems Luminoscan RS),

programmiert mit institutseigener Software (Luminoscan-RalfII, Dr. Ralf Mrowka),

2.2 Zellkultur

durchgeführt.

2.2.7 mRNA-Stabilitätsassay

Zur Überprüfung der mRNA-Stabilität in Zellen die zuvor mit oder ohne PMA

kultiviert wurden, wurde die weitere Transkription in den Zellen per Actinomycin

D (

5µg/ml

Endkonzentration im Kulturmedium, Sigma-Aldrich

) unterbunden und

nach verschiedenen Zeitpunkten der Actinomycin D-Inkubation die RNA der Zellen

isoliert (in Unterabschnitt 2.1.4 beschrieben).

Nach Quantifizierung über Realtime-PCR (in

Unterabschnitt 2.1.5

beschrieben)

konnten so für spezifische mRNAs Abbaukinetiken (unter PMA sowie ohne PMA)

erstellt werden. Da durch Actinomycin D die mRNA-Neusynthese blockiert wur-

de, repräsentiert die Abnahme an mRNA die Abbaurate unter den vorliegenden

Bedingungen.

2.2.8 Protein-Stabilitätsassay

Um die Proteinstabilität zu testen, wurde die Translation in Zellen, die zuvor mit

oder ohne PMA inkubiert wurden, mit Cycloheximid (

20µg/ml

Endkonzentration im

Kulturmedium, Sigma-Aldrich

) gestoppt. Nach verschiedenen Zeitpunkten wurden

Gesamt-Proteinpräparationen durchgeführt (beschrieben in

Unterabschnitt 2.1.6

)

und Proteinmengen per SDS-PAGE und anschließendem Westernblotting bestimmt

(beschrieben in

Unterabschnitt 2.1.9

). Durch die blockierte Protein-Neusynthese

ist die Protein-Abnahme auf die Abbaurate unter den vorliegenden Bedingungen

zurückzuführen.

2.2.9 Bioinformatische Sequenzanalysen

Zur Sequenzanalyse wurden im Netz frei zugängliche Programme genutzt. Dabei

wurden die Sequenzen von Interesse entweder der Bibliothek des National Center for

Biotechnology Information (

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

) oder der Biblio-

thek des Ensemble Genome Browsers (

http://www.ensembl.org/index.html

)

entnommen. Die Überprüfung der UTRs hinsichtlich enthaltener cis-Elemente fand

mit BIG Staff UTRscan (

http://itbtools.ba.itb.cnr.it/utrscan

) statt. Zur

Untersuchung der UTRs auf konservierte Sequenzen wurde die BLAT-Suche des

UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/) verwendet.

Kapitel 2 Material und Methoden

2.3 Statistik

Die im Folgenden präsentierten Ergebnisse beruhen auf mindestens zwei Versuchs-

serien mit jeweils drei unabhängigen Einzelproben. Dabei wurden die Ergebnisse als

Mittelwerte

Standardabweichung dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde

unter Verwendung eines 2-seitigen Student’schen t -Testes berechnet (dabei bedeuten:

*p<0,05; ** p<0,01 und *** p<0,001).

3 Ergebnisse

3.1 Analyse der hASH1-UTRs nach

cis-Elementen

Die hASH1-UTRs sind mit

559nt

(

-UTR) und

1197nt

(

-UTR) auffällig lang, da

durchschnittliche Längen für die

-UTR

300nt

und für die

-UTR

770nt

betragen

[172]. Zur Untersuchung der hASH1-UTRs nach cis-Elementen wurde ein im Netz

verfügbares Programm (BIG Staff UTRscan (

http://itbtools.ba.itb.cnr.it/

utrscan

) genutzt [111, 211, 251, 210, 250, 248]. Hierbei wurden sowohl die

als auch die

-UTR nach Sequenzmotiven durchsucht, welche schon mit einer

regulativen Funktion beschrieben wurden. Dabei wurden in der

-UTR eine als

TOP-Motiv (engl.

-terminal oligopyrimidine) bezeichnete und in der

-UTR drei

als DICE-Elemente (Differenzierungskontroll-Element) bezeichnete putative cis-

Elemente offenbart. Zudem fand sich in der

-UTR ein IRES-Element (Ribosomen-

Bindungsstellen). Getestet wurden 30 cis-Elemente1.

Befund der 30-UTR (Länge: 1197nt)

15-LOX-DICE seq: [177,193]: CCCCATCGCC AACT AAG

seq: [431,448]: CCCCGCCCTTT CTTA AAG

seq: [499,513]: CCCCACCCCA AT AAG

IRES

seq: [1102,1197]:TCTTAC TGTTTT ATTAC AA ACTTA

CAAAAA TATGT ATAAC CCTGT TTTAT ACAAA CTAGT

TTC GTAATA AAAC TTTTT CCTTTTTT TAAAA TGAAA

Befund der 50-UTR (Länge: 559nt)

TOP seq: [1,6] : C TTCT G

Getestete cis-Elemente: Histone

-UTR stem-loop structure, IRE, SECIS-1, SECIS-2, APP, CPE,

TGE, NANOS_TCE, 15-LOX-DICE, ARE2, TOP, Glut1, TNF, VIMENTIN, IRES, MSL2-5UTR,

MSL2-3UTR, BRE, ADH_DRE, BYDV, Proneural-Box, K-Box, Brd-Box, GY-Box, Androgen-

Receptor, Elastin G3A, Insulin

-UTR stability, Beta-actin

-UTR zipcode, Gap-43 stabilization

element, Dendritic localization element

Kapitel 3 Ergebnisse

Eine weitere Untersuchung der UTRs hinsichtlich konservierter Sequenzen erfolgte

mithilfe einer BLAT-Analyse (engl. BLAST-Like Alignment Tool) unter Nutzung des

UCSC Genome Browsers (

http://genome.ucsc.edu/

) [257, 291, 26, 52, 283].

Sequenzen von Bedeutung für eine Regulation oder auch kodierende Sequenzen

zeichnen sich häufig durch eine stärkere Konserviertheit zwischen verschiedenen

Spezies gegenüber Abschnitten ohne eine solche Bedeutung aus, da hier eingeführte

Mutationen größere negative Auswirkungen auf den Organismus haben können.

Dementsprechend sind regulatorisch wichtige Sequenzen innerhalb der UTRs eher

unter den konservierten Abschnitten zu vermuten. Allerdings werden Sequenzen,

die nur von Bedeutung für die Spezies-spezifische Regulation sind, bei diesem

Ansatz nicht erfasst. Die BLAT-Analyse der hASH1-UTRs zeigte jedoch auch einige

konservierte Bereiche, die insbesondere mit dem für die

-UTR ungewöhnlichen

IRES-Motiv überlagerten (siehe Abbildung 3.1).

Abbildung 3.1:

BLAT-Analyse unter Nutzung des UCSC Genome Browsers (

http://genome.

ucsc.edu/

). Eine höhere Konserviertheit einer Base ist hier durch einen stärkeren Auschlag über

dem UTR-Bereich dargestellt. Die durch BIG Staff UTRscan (

http://itbtools.ba.itb.cnr.

it/utrscan

) gefundenen Motive sind in den UTR-Bereichen eingezeichnet. Die Balken über den

Strahlen zur Darstellung des Konservierungsgrades stellen Längenmaßstäbe dar.

3.2 Screening nach Stimuli mit Einfluss auf die

hASH1-UTRs

Die Zielstellung dieser Arbeit war die Untersuchung der posttranskriptionellen

Kontrolle der hASH1-Expression. Die posttranskriptionelle Regulation beruht meist

auf Interaktionen von RNA-bindenden Faktoren mit Motiven auf der mRNA. Da

sich diese Motive vornehmlich in den untranslatierten Regionen (UTR) der mRNAs

befinden, wurde in einem ersten Schritt nach Bedingungen gesucht, die in der Lage

3.2 Screening nach Stimuli mit Einfluss auf die hASH1-UTRs

sind die hASH1-Expression UTR-vermittelt zu modulieren. Zu diesem Zweck sollten

verschiedene Stimuli im Reportgenassay mithilfe eines hASH1-UTR-Konstrukts

getestet werden.

3.2.1 Aufbau des Reporterkonstrukts

Das im Reportergenassay einzusetzende Konstrukt (pGL3p-hASH1-

-UTR-Luc-

UTR) enthielt den konstitutiv aktiven viralen SV40-Promotor sowie ein Luciferase-

Reportergen unter Kontrolle der hASH1-

-UTR und

-UTR (siehe

Abbildung 3.2

Dabei diente der pGL3-promoter Vektor (Promega) als Ausgangsplasmid und wurde

im Folgenden als Kontrollvektor verwendet.

Abbildung 3.2:

Schematische Darstellung des hASH1-UTR-Konstrukts (pGL3p-hASH1-

-UTR-

Luc-

-UTR). Ausgangsvektor war der pGL3-promotor Vektor (Promega) mit Luciferase-

Reportergen vom Leuchtkäfer unter Kontrolle des konstitutiven SV40-Promotors. Für das hASH1-

UTR-Konstrukt wurden die Vektor-eigenen UTRs durch die UTRs von hASH1 ausgetauscht [83].

Das Bild des Leuchtkäfers wurde Wikipedia entnommen.

Im Reportergenassay werden Zellen transient mit UTR-Reporterkonstrukten sowie

dem Ausgangsvektor als Kontrolle transfiziert. Nach einer definierten Zeit für die

Expression sowie der Inkubation mit bzw. ohne Stimulus werden die Zellen lysiert

und mit einem Überschuss an Luciferin versetzt. Die Intensität des so entstehenden

Lichtsignals ist nun von der Menge an erzeugter Luciferase abhängig und gibt somit

Aufschluss über die durch den Promotor und die UTRs bedingte Stärke der Expressi-

on unter den gegebenen Bedingungen (siehe

Abbildung 3.2

). Um etwaige gemessene

Einflüsse auf den Promotor nicht fälschlicherweise den UTRs zuzuschreiben, wurde

in jeder Serie auf den Ausgangsvektor normiert, der den Luciferase-Reporter nur

unter Kontrolle des SV40-Promotors nicht aber der hASH1-UTRs enthielt.

Kapitel 3 Ergebnisse

3.2.2 Screening im Reportergenassay

Da hASH1 in der neuronalen Entwicklung bzw. in der Differenzierung zu Neuronen

eine wichtige Rolle spielt, wurde als Zellmodell die Neuroblastoma-Zelllinie Kelly

gewählt. Neuroblastomzellen sind entartete Zellen, die noch verschiedene Eigen-

schaften von neuronalen Vorläuferzellen aufweisen. So zeichnen sich Kelly-Zellen

durch eine konstitutive hASH1-Expression aus und scheinen somit über ein intaktes

hASH1-Gen sowie ein zur hASH1-Expression nötiges Set an Faktoren zu verfügen.

Nach Transfektion mit dem oben beschriebenen UTR-Konstrukt (pGL3p-hASH1-

UTR-Luc-

-UTR) wurden die Zellen mit verschiedenen Substanzen für

48h

inku-

biert. Die hierbei getesteten Substanzen wurden mit verschiedenen Zellreaktionen

beschrieben. So vermitteln Dopamin und Adenosin ihre Wirkung über spezifische

Rezeptoren in der Zellmembran. Dabei wurden für Dopamin bisher fünf und für Ade-

nosin vier verschiedene Rezeptoren identifiziert. Diese liegen G-Protein-gekoppelt

vor und können, abhängig von der Beschaffenheit des G-Proteins, über eine Akti-

vierung oder Inhibition von Adenylatcyclase eine Änderung des cAMP-Spiegels

innerhalb der Zelle bewirken. Dieser wiederum kann z.B. über cAMP-abhängige

Proteinkinasen die Aktivität verschiedener anderer Proteine beeinflussen. Zudem

können noch weitere Wirkungen, wie beispielsweise die Aktivierung von Phospholi-

pase C oder Ionenkanälen in der Zellmembran, durch diese Rezeptoren vermittelt

werden [264, 18, 89]. Das Diterpenoid Forskolin dagegen wirkt nicht über einen Re-

zeptor, sondern direkt über eine Anlagerung an das cytosolisch gelegene katalytische

Zentrum von Adenylatcyclase. Die damit verbundene Aktivierung dieses Enzyms

führt ihrerseits zu einer Anhebung des cAMP-Spiegels [62, 4].

Ascorbinsäure wird über spezifische Transporter in das Zellinnere transportiert [317,

276]. Da Ascorbinsäure einen Elektronendonor darstellt und reaktive Sauerstoffs-

pezies (ROS) reduziert, nimmt man an, dass es Reaktionen in der Zellkultur, wie

beispielsweise die Aktivitätsänderung einiger Transkriptionsfaktoren, vornehmlich

über eine Änderung des Redoxstatus der Zellen hervorruft [71, 271, 38, 203, 64, 169,

5, 7, 346]. Da es jedoch aufgrund von Verunreinigungen mit Spuren an katalytisch

wirksamen Übergangsmetallen in den Kulturmedien zu einer Autooxidation von

Ascorbinsäure kommt, könnten beobachtete Reaktionen aber ebenso auf das bei

dieser Autooxidation gebildete Wasserstoffperoxid zurückzuführen sein [37, 119].

Phorbolester wie PMA stellen 1,2-Diacylglycerol-Analoga dar und wurden schon

mit verschiedenen Zellantworten in Verbindung gebracht, wie beispielsweise Sti-

mulierung von Proliferation, Förderung von Tumorwachstum, Differenzierung oder

Apoptose. Als 1,2-Diacylglycerol-Analoga wirken sie vornehmlich über eine Akti-

vierung von Proteinkinase C [186, 158, 102, 123, 54, 223, 328, 36, 103, 104].

Kobaltchlorid und 2,2-Dipyridyl (2,2-DP) wirken als Hypoxie-Mimetika. Bei der

3.3 Einfluss von Phorbolester (PMA) auf die hASH1-Expression

zellulären Antwort auf Hypoxie spielt der heterodimere Transkriptionsfaktor HIF

(Hypoxie-induzierbarer Faktor) eine essentielle und bedeutende Rolle [81, 325, 285].

Die alpha-Untereinheit dieses Faktors wird während normoxischer Bedingungen

unter Mitwirkung von Prolylhydroxylasen (PHDs) und dem Von-Hippel-Lindau Pro-

tein (pVHL), dem Bestandteil eines E3-Ubiquitin-Ligase Komplexes, fortwährend

proteasomal abgebaut [202, 55]. Zudem sorgt die Asparaginhydroxylase FIH (engl.

factor inhibiting HIF) unter normoxischen Bedingungen zusätzlich zu einer Verrin-

gerung der transkriptionellen Aktivität von HIF [195, 75, 174]. Unter hypoxischen

Bedingungen hingegen bleibt der Abbau der alpha-Untereinheit aus, so dass der

dimere Transkriptionsfaktor seine Tätigkeit bei der Expression von Genen, die unter

Sauerstoffmangel benötigt werden, aufnehmen kann [184, 81, 45]. Die Hypoxie-

Mimetika täuschen der Zelle hypoxische Bedingungen u.a. vor, indem sie in die

soeben beschriebenen Prozesse eingreifen. So führen Eisenchelatoren wie 2,2-DP

zu einer intrazellulären

Fe2+

-Verknappung. Da

Fe2+

u.a. ein wichtiger Kofaktor der

PHDs und FIH ist, bleibt in diesem Fall offenbar der Abbau bzw. die transkriptionelle

Inhibition von HIF aus [342, 282]. Der Wirkmechanismus von Kobaltchlorid wird

ebenfalls mit einer Inaktivierung der PHDs in Verbindung gebracht. So nimmt man

an, dass

Co2+

die Eisen-Bindungsstelle im aktiven Zentrum der Enzyme besetzt,

ohne jedoch im Stande zu sein, die entsprechenden Enzymreaktionen zu katalysieren

[76]. Auch scheint

Co2+

in der Lage zu sein an die alpha-Untereinheit von HIF zu

binden und dabei ihre Interaktion mit pVHL zu stören [342].

Drei der getesteten Substanzen zeigten eine Veränderung der Reportergenexpressi-

on gegenüber der Kontrolle (siehe

Abbildung 3.3

). PMA sowie Kobaltchlorid und

2,2-DP führten dabei zu einer Halbierung oder noch stärkeren Herabsetzung der Luci-

feraseaktivität. Die weiteren getesteten Substanzen zeigten hingegen keinen Einfluss

auf die hASH1-UTR-kontrollierte Reportergenaktivität (siehe Abbildung 3.3).

Der PMA- sowie der Hypoxie-Einfluss auf die posttranskriptionelle Kontrolle der

hASH1-Synthese sollen im Folgenden ausführlich nacheinander behandelt werden.

3.3 Einfluss von Phorbolester (PMA) auf die

hASH1-Expression

Da PMA schon in anderen Zelllinien neuronalen Ursprungs Differenzierungspro-

zesse auszulösen vermochte [231] und hASH1 u.a. bei Differenzierungsvorgängen

eine entscheidende Rolle spielt, sollte im Folgenden dieser Aspekt sowie zugehörige

Mechanismen untersucht werden.

Kapitel 3 Ergebnisse

Abbildung 3.3:

Screening nach Substanzen mit dem Vermögen die hASH1-UTR vermittelte Re-

portergenaktivität zu verändern. Gezeigt ist eine Auswahl der getesteten Stimuli bzw. Inhibitoren.

Kelly-Zellen wurden dafür mit dem hASH1-UTR-Konstrukt transfiziert und anschließend für

48h

mit verschiedenen Substanzen (

100nM

PMA;

100nM

Forskolin;

100nM

Adenosin;

50nM CoCl2

;

100nM

2,2-DP;

100nM

Ascorbinsäure;

100nM

Dopamin) inkubiert. Dabei zeigten PMA,

CoCl2

und 2,2-DP eine deutliche Reduzierung der Repotergenaktivität im Vergleich zur Reportergenakti-

vität von Kontroll-Zellen (nur mit den Lösungsmitteln EtOH, DMSO oder H2O behandelt).

3.3.1 Die Wirkung von PMA im Reportergenassay ist

konzentrationsabhängig

Zur Überprüfung, ob die im Screening eingesetzte Konzentration optimal für den

Effekt war, wurden Kelly-Zellen nach Transfektion mit den Reporterkonstrukten

mit verschiedenen PMA-Konzentrationen für

48h

inkubiert. Dabei zeigte sich eine

Konzentrationsabhängigkeit des PMA-Einflusses mit der stärksten Herabregulation

der hASH1-UTR-vermittlten Reportergen-Expression bei einer PMA-Konzentration

von

40nM

auf unter

30%

bezogen auf die Kontrolle (siehe

Abbildung 3.4

). Die im

Screening getestete Konzentration von

100nM

zeigte einen starken Einfluss mit

einer Herabregulation auf etwa

40%

, so dass im Weiteren nur noch diese beiden

PMA-Konzentrationen eingesetzt wurden. Diese PMA-Konzentrationen entsprechen

denen, welche üblicherweise in Zellkulturexperimenten verwendet wurden.

3.3.2 PMA erniedrigt die hASH1-mRNA-Menge

Um die im vorangegangen Reportergenmodell gemachten Beobachtungen zu über-

prüfen, wurde getestet, ob unter PMA die hASH1-mRNA-Menge ebenfalls zu-

rückgeht. Dazu wurden Kelly-Zellen für unterschiedlich lange Perioden mit PMA

3.3 Einfluss von Phorbolester (PMA) auf die hASH1-Expression

Abbildung 3.4:

Dosis-Wirkungs-Beziehung von PMA im Reportergenassay mit dem hASH1-UTR-

Konstrukt (pGL3p-hASH1-

-UTR-Luc-

-UTR). Dazu wurden Kelly-Zellen mit dem Vektor

transfiziert und mit unterschiedlichen Konzentrationen an PMA für

48h

inkubiert. PMA zeigte

dabei bei einer PMA-Konzentration von 40nM die stärkste Abschwächung des Reportersignals.

inkubiert. Anschließend wurde die Gesamt-RNA der Zellen isoliert und in cDNA

umgeschrieben. Diese cDNA diente in der sich anschließenden Realtime-PCR als

Template für die Quantifizierung der hASH1-mRNA.

Der Eindruck, dass PMA einen negativen Einfluss auf die hASH1-Expression ausübt,

konnte auch auf Ebene der mRNA bestätigt werden. So zeigte sich, dass die hASH1-

mRNA unter PMA schon nach

auf unter die Hälfte der mRNA-Menge der

Kontroll-Zellen herab-reguliert wird. Die hASH1-mRNA-Menge ging nach

unter

PMA sogar auf etwa

1/5

verglichen mit der Kontrolle zurück, erholte sich dann aber

wieder auf über 50% nach 48h (siehe Abbildung 3.5).

3.3.3 PMA erniedrigt die hASH1-Protein-Menge

Als wichtige Überprüfung musste sich nun noch zeigen, ob sich PMA auch auf der

hASH1-Proteinebene auswirkt. Dazu wurden von Kelly-Zellen, nach unterschiedlich

langen Inkubationszeiten mit PMA, Protein-Präparationen hergestellt. Diese wurden

dann per SDS-PAGE aufgetrennt und nach Western-Blotting mittels spezifischer

Antikörper detektiert.

Hier zeigte sich deutlich, dass hASH1 unter PMA herabreguliert wird. So geht die

hASH1-Proteinmenge schon nach

auf unter

50%

der Kontrolle zurück. Jedoch

fand hier im Gegensatz zu den mRNA-Daten über den gesamten getesteten Zeitraum

Kapitel 3 Ergebnisse

Abbildung 3.5:

Zeitlicher Verlauf der hASH1-mRNA-Menge in Kelly-Zellen nach Inkubation mit

PMA (

100nM

) verglichen mit Kontrollzellen ohne PMA-Behandlung. Als interner Marker für die

in der Realtime-PCR eingesetzte Gesamt-cDNA-Menge wurde hier auf GAPDH normiert (eine

ebenfalls durchgeführte Normierung auf β-Aktin führte zu vergleichbaren Ergebnissen).

eine sukzessive Abnahme der hASH1-Proteinmenge statt, so dass nach

48h

nur noch

etwa

1/5

der hASH1-Proteinmenge verglichen mit Zellen ohne PMA-Behandlung

nachweisbar waren (siehe Abbildung 3.6).

Ob der beobachtete PMA-Einfluss möglicherweise einen nur auf Neuroblastoma-

Zellen begrenzten Effekt darstellt, sollte eine Überprüfung in primären Zellen klä-

ren. Hierzu wurde Mash1 in primären Kortex-Zellen von E19 Ratten in situ mit

Antikörper-gekoppeltem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt. Dabei zeigte sich, dass

Mash1 in den Kortex-Zellen nach zwei Tagen in vitro-Kultivierung exprimiert wird

und PMA die Mash1-Fluoreszenzintensität deutlich senkte (siehe

Abbildung 3.7

A und B). Unter Kontrollbedingungen zeigte die Mash1-Expression eine zellulä-

re Heterogenität die unter PMA-Behandlung nicht zu beobachten war (Standard-

abweichung in

Abbildung 3.7

C). Zudem ließ sich der Dendriten-Marker MAP2

(engl. microtubule-associated protein 2) unter PMA-Einfluss verstärkt nachweisen

(

Abbildung 3.7

D). Aus dem MAP2 Gen gehen verschiedene Spleißvarianten hervor.

Man nimmt von diesen Proteinen an, dass sie über ihre Mikrotubuli-stabilisierende

Aktivität eine Rolle bei Regulation der Mikrotubuli-Netzwerke in den Dendriten

von Neuronen spielen [60]. Da ihre Expression in neuronalen Vorläuferzellen nur

schwach, aber einen Tag nach der Expression der Neuronen-spezifischen Tubulin-

Isoform III

stark, ausgeprägt ist, wird MAP2 als sensitiver und spezifischer Marker

für reife Neuronen eingesetzt [209, 261].

3.3 Einfluss von Phorbolester (PMA) auf die hASH1-Expression

Abbildung 3.6:

Zeitlicher Verlauf der hASH1-Proteinmenge in Kelly-Zellen nach Inkubation mit

PMA (100nM). Eine repräsentative Originaldarstellung wird in (B) gezeigt.

Eine Westernblot-Analyse bestätigte diese Ergebnisse. Hierzu wurden Kelly-Zellen

und zum Vergleich primäre Kortex-Zellen aus der Ratte mit PMA für

inkubiert.

Hierbei konnte eine vergleichbare Abnahme vom Nagerhomolog Mash1 auf Protein-

Ebene beobachtet werden (siehe Abbildung 3.8).

3.3.4 Zeitlicher Vergleich des Verhaltens von

hASH1-Promotor und -UTRs im Reportergenassay

Inwieweit bei der Herabregulation von hASH1 der Promotor involviert ist, sollte eine

Aufklärung des zeitlichen Ablaufs der Reportergen-Aktivität von UTR-Konstrukt

(pGL3p-hASH1-

-UTR-Luc-

-UTR) im Vergleich zu einem hASH1-Promotor-

Konstrukt (p251) in Kelly-Zellen zeigen. Dieses Promotor-Konstrukt besitzt an Stelle

des SV40-Promotors des Kontrollvektors (ohne hASH1-UTRs) eine

1,4kb

lange

Kapitel 3 Ergebnisse

Abbildung 3.7:

Mash1-Immunofluoreszenz in primären Kortex-Zellen der Ratte. (A) Mash1 ließ sich

in Kontrollzellen nach zwei Tagen in vitro-Kultivierung nachweisen. (B) Unter PMA-Behandlung

ging die Mash1-Fluoreszenzintensität der Zellen zurück. (C) Die quantitative Analyse der Fluores-

zenzintensitäten zeigte bei PMA-behandelten Zellen in etwa eine Halbierung. Hierbei werden stei-

gende Fluoreszenzintensitäten durch steigende Werte wiedergegeben. Die Hintergrund-Fluoreszenz

(Rauschen) war bei unbehandelten und PMA-behandelten Zellen identisch. Die Standartabwei-

chung (SD) diente als Maß für die zelluläre Heterogenität der Mash1-Expression. (D) Zudem

wurde der Dendriten-Marker MAP2 bei Zellen unter PMA-Einfluss verstärkt gebildet. Zur Kennt-

lichmachung der Zellkerne (A,B) sowie zur Normierung der MAP2-Mengen (D) wurde DAPI

(4´,6-Diamidin-2-phenylindol) eingesetzt.

3.3 Einfluss von Phorbolester (PMA) auf die hASH1-Expression

Abbildung 3.8:

Vergleich der Proteinmengen von hASH1 in Kelly-Zellen und Mash1 in primären

Kortex-Zellen (Ratte) nach 6-stündiger Inkubation mit PMA (20nM).

stromaufwärts des Translationsstarts gelegene Sequenz der hASH1-Promotorregion.

Dabei zeigte sich, dass während beim UTR-Konstrukt schon nach

12h

eine deutliche

Reduzierung des Reporter-Signals gegenüber dem Kontrollvektor zu beobachten

war, eine Verminderung beim Promotor-Konstrukt erst nach

48h

stattfand (siehe

Abbildung 3.9).

3.3.5 Kurzfristig ist eine mRNA-Destabilisierung für die

hASH1-Herabregulation verantwortlich

Zur Aufklärung der dem PMA-Effekt zugrunde liegenden Mechanismen, sollte im

Folgenden eine Änderung der mRNA-Stabilität überprüft werden. Hierzu wurden

Kelly-Zellen für

und

48h

mit PMA inkubiert. Anschließend wurde die Tran-

skription in den Zellen mit Actinomycin D unterbunden und die RNA der Zellen,

nach unterschiedlich langen Inkubations-Zeiträumen mit dem Transkriptionsinhi-

bitor, isoliert. Eine Quantifizierung der hASH1-mRNA wurde per Realtime-PCR

vorgenommen.

Bei kürzerer Inkubationszeit mit PMA kam es zu einer Stabilitätsminderung der

hASH1-mRNA (siehe Abbildung

3.10a

). Diese ist nach länger anhaltender PMA-

Behandlung aber nicht mehr zu beobachten (siehe Abbildung 3.10b).

Da die hASH1-Proteinmenge jedoch kontinuierlich abnimmt, sollte geklärt wer-

den, ob bei längerer PMA-Behandlung möglicherweise ein verstärkter hASH1-

Proteinabbau stattfindet. Dazu wurden Kelly-Zellen für

48h

mit PMA (

100nM

)

inkubiert und die Translation mithilfe von Cycloheximid gestoppt. Nach verschieden

Kapitel 3 Ergebnisse

Abbildung 3.9:

Vergleich des zeitlichen Verlaufs der Reportergenaktivitäten in Abhängigkeit von

den hASH1-UTRs (A) bzw. hASH1-Promotor (B) im Reportergenassay. In diesem Modell kommt

es in beiden Fällen zu einer Absenkung der Luciferaseaktivität, doch tritt die UTR-vermittelte

Reaktion auf PMA deutlich früher als die des Promotors ein.

langen Inkubations-Zeiträumen mit dem Translationsinhibitor wurden die Zellen

geerntet und die hASH1-Proteinmengen bestimmt.

Hierbei zeigte sich jedoch, dass die hASH1-Proteinstabilität durch 48-stündige PMA-

Behandlung unbeeinflusst blieb, so dass die Halbwertzeit von hASH1 mit und ohne

PMA-Behandlung etwa 1,5 h betrug (siehe Abbildung 3.11).

3.3.6 Inhibitoren der Proteinkinase C (PKC) können den

Effekt von PMA im Reportergenassay (partiell)

aufheben

Da PMA ein bekannter Aktivator von Proteinkinase C (PKC) ist, wurde geprüft,

ob PKC eine Rolle bei der hASH1-Regulation spielt. Dazu wurde getestet, ob die

beiden PKC-Inhibitoren Staurosporin und GF109203X in der Lage wären, den

PMA-Einfluss im Reportergenassay abzuschwächen bzw. aufzuheben.

Für diesen Reportergenassay wurden Kelly-Zellen mit dem hASH1-UTR-Konstrukt

(pGL3p-hASH1-

-UTR-Luc-

-UTR) sowie dem Kontrollvektor (pGL3p) transfi-

ziert. Die Zellen unterlagen dann einer 24-stündigen PMA-Behandlung mit sowie

ohne PKC-Inhibitor. Bei Zellen die mit PKC-Inhibitor behandelt wurden, ging der

3.3 Einfluss von Phorbolester (PMA) auf die hASH1-Expression

(a) nach 6h (b) nach 48h

Abbildung 3.10:

hASH1-mRNA-Stabilität in Kelly-Zellen

(A) und

48h

(B) nach PMA (

100nM

)

Einwirkung. Es lässt sich eine deutliche Abnahme der hASH1-mRNA-Stabilität nach 6-stündiger

Inkubation feststellen. Diese war jedoch nach längerer Inkubationszeit nicht mehr nachweisbar.

Abbildung 3.11:

Bestimmung von Proteinstabilitäten mittels Arrest der Translation mit Cyclohe-

ximid nach 48-stündiger Inkubation mit und ohne PMA (

100nM

). Die hASH1-Proteinstabilität

(A) bleibt durch PMA ebenso unbeeinflusst wie die der β-Aktin-Kontrolle (B).

Kapitel 3 Ergebnisse

eigentlichen Inkubation mit PMA und PKC-Inhibitor eine 4-stündige Präinkubation

nur mit dem Inhibitor voraus, um die Funktionsfähigkeit von PKC schon vor der

PMA-Behandlung einzuschränken.

Es zeigte sich, dass Staurosporin, und in stärkerem Maße GF109203X, den von

PMA hervorgerufenen Effekt abschwächten (

Abbildung 3.12

). Der als Kontrolle ein-

gesetzte Proteinkinase A-Inhibitor KT-5720 vermochte dagegen nicht die Wirkung

von PMA zu mildern.

Abbildung 3.12:

Die beiden PKC-Inhibitoren Staurosporin (

40nM

) und GF109203X (

5µM

) konnten

den hemmenden Einfluss von PMA auf das hASH1-UTR-Konstrukt (

-Luc-

) im Vergleich

zum Kontroll-Vektor (pGL3p) im Reportergenassay partiell aufheben, wobei der Einfluss von

GF109203X im Vergleich zu Staurosporin stärker ausgeprägt war. Der zur Kontrolle miteingesetzte

Proteinkinase A-Inhibitor KT-5720 (2µM) zeigte dagegen keinen Effekt.

3.3.7 Auf mRNA-Ebene lässt sich die Wirkung von PMA

ebenfalls mithilfe von PKC-Inhibitoren abschwächen

Da zumindest der frühe Einfluss von PMA auf hASH1 eine post-transkriptionelle

Komponente über eine Destabilisierung der mRNA beinhaltet, sollte auch auf Ebene

der mRNA überprüft werden, ob die PKC-Inhibitoren die PMA-Wirkung schwächen.

Um die alleinige Wirkung der PKC-Inhibitoren auf hASH1 zu untersuchen, wurden

Kelly-Zellen unterschiedlich lang entweder mit Staurosporin oder GF109203X allein

inkubiert und anschließend die RNA isoliert. Mit spezifischen Primern wurden die

hASH1-mRNA-Mengen per Realtime-PCR quantifiziert. Dabei zeigte sich, dass

3.3 Einfluss von Phorbolester (PMA) auf die hASH1-Expression

Abbildung 3.13:

Zeitlicher Verlauf von hASH1-mRNA-Menge bei Inkubation von Kelly-Zellen mit

den beiden getesteten PKC-Inhibitoren Staurosporin und GF109203X. Schon nach 4-stündiger

Inkubation der Zellen mit Staurosporin ist eine deutliche Senkung von hASH1 auf mRNA-Ebene

zu beobachten. GF109203X hingegen führt abgesehen von einer leichten Erhöhung nach 4h zu

keiner Veränderung gegenüber unbehandelten Zellen.

sich GF109203X kaum auf die mRNA-Menge von hASH1 auswirkte. Staurosporin

hingegen reduzierte die hASH1-mRNA-Menge schon nach

auf etwa die Hälfte

verglichen mit den Kontrollzellen (siehe Abbildung 3.13).

Im nächsten Schritt wurden Kelly-Zellen unterschiedlich langen PMA-Inkuba-

tionszeiten mit und ohne PKC-Inhibitoren ausgesetzt und danach geerntet. Da-

bei ging der PMA-Inkubation eine 4-stündige Präinkubation mit den PKC-

Inhibitoren voraus. Die isolierte RNA wurde abermals per Realtime-PCR mit hASH1-

spezifischen Primern analysiert. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden die hASH1-

mRNA-Mengen bei PMA-behandelten Zellen auf die Mengen der unbehandelten

Zellen bzw. auf die Mengen der nur mit dem jeweiligen PKC-Inhibitor behandelten

Zellen normiert.

Und auch hierbei bestätigte sich der Eindruck, dass PKC eine Rolle bei der hASH1-

Expression spielt. So vermochten die beiden PKC-Inhibitoren insbesondere zu frühe-

ren Zeitpunkten (bis

24h

) die durch PMA hervorgerufene hASH1-Herabregulation

abzumildern (siehe Abbildung 3.14).

Kapitel 3 Ergebnisse

Abbildung 3.14:

Kelly-Zellen wurden unterschiedlich lang mit PMA und PKC-Inhibitoren be-

handelt. Anschließend wurde die hASH1-mRNA-Menge bestimmt. Es zeigte sich, dass beide

PKC-Inhibitoren auch auf mRNA-Ebene den PMA-Einfluss abschwächten. Vergleichbar zu den

UTR-abhängigen Reportergenassays zeigte GF109203X den stärkeren Effekt im Vergleich zu

Staurosporin. Hierbei dienten unbehandelte Zellen als Kontrolle für die PMA-Behandlung und nur

mit dem jeweiligen PKC-Inhibitor behandelte Zellen als Kontrolle für Zellen, die mit PMA sowie

PKC-Inhibitor inkubiert wurden.

3.3.8 Suche nach trans-Faktoren

Um mögliche trans-Faktoren zu ermitteln, die in die hASH1-Regulation unter PMA-

Behandlung involviert sind, wurden Crosslinking-Experimente durchgeführt. Hierbei

wurden radioaktiv markierte in vitro-Transkripte der hASH1-UTRs mit Proteinen

nativer Konformation von Cytosolpräparationen aus Kelly-Zellen inkubiert. Dabei

bildeten sich RNA-Proteinkomplexe. Diese Interaktionen wurden anschließend mit-

tels UV-Bestrahlung fixiert. Nach einem Abbau der RNA waren nur Proteine, die in

direktem Kontakt zur RNA standen, radioaktiv markiert. Nach Trennung in einem

Gel sollten sich Änderungen im Bandenmuster zwischen Cytosolpräparationen von

PMA-behandelten Zellen und Kontrollzellen auf mögliche in die hASH1-Regulation

involvierte trans-Faktoren zurückführen lassen. Mit unterschiedlichen Nukleoti-

den markierte RNAs sollten zudem Rückschlüsse auf die Bindungsspezifitäten der

involvierten Faktoren zulassen.

Die Crosslinking-Experimente zeigten jedoch nur schwache Veränderungen zwi-

schen PMA-behandelten Zellen und Kontrollzellen. Die deutlichste Musterverän-

derung offenbarte die

-UTR von hASH1 hervorgerufen durch einen möglichen

trans-Faktor mit einer Präferenz für eine U- und C-reiche Bindungsstelle (siehe

Abbildung 3.15).

3.3 Einfluss von Phorbolester (PMA) auf die hASH1-Expression

Abbildung 3.15:

UV-Crosslinking-Experimente mit in vitro-Transkripten der hASH1-UTRs und

den Cytosolpräparationen von PMA-behandelten Zellen sowie Kontrollzellen. Nur die

-UTR

zeigte eine Musterveränderung aufgrund eines putativen Bindungsfaktors mit einer Größe von

etwa 60kDa und einer CU-reichen Bindungsstelle (durch Pfeile markiert).

3.3.9 Suche nach verantwortlichen cis-Elementen in den

UTRs

Um für die hASH1-Herabregulation unter PMA mögliche cis-Elemente ausfindig

zu machen, wurden für eine erste Eingrenzung des Bereichs Reporter-Konstrukte

verwendet, die entweder nur die hASH1-

-UTR (pGL3p-hASH1-

-UTR-Luc) oder

aber die

-UTR (pGL3p-hASH1-Luc-

-UTR) enthielten (siehe

Abbildung 3.16

Nachdem Kelly-Zellen mit den verschiedenen Konstrukten transfiziert wurden und

einer PMA-Inkubation für

48h

unterlagen, konnte keine der UTRs einzeln für den

PMA-Effekt verantwortlich gemacht werden (siehe

Abbildung 3.16

). Da beide UTRs

einen additiven, jedoch voneinander unabhängigen Anteil an der Herabregulation

von hASH1 unter PMA haben, scheinen hier mehrere verschiedene Faktoren mit

Kapitel 3 Ergebnisse

Bindungsstellen in beiden UTRs bei der Vermittlung des PMA-Effekts zusammen-

zuwirken.

Auch mit einer weiteren genaueren Untersuchung, mit unterschiedlich langen PMA-

Inkubationszeiten unter Nutzung verschiedener UTR-Deletionsvarianten, gelang

es nicht, den PMA-Effekt einem einzigen Bereich zuzuordnen (Daten nicht ge-

zeigt). Deshalb wurde im Folgenden auch auf eine weiterreichende Suche nach

trans-Faktoren, ohne in Reportergenassays gewonnene klar definierte cis-Elemente,

verzichtet.

Abbildung 3.16:

Zum Auffinden an der PMA-Regulation beteiligter cis-Elemente wurden hASH1-

UTR-Konstrukte im Reportergenassay getestet die nur die hASH1-

- oder

-UTR enthielten.

Dabei wurde Kelly-Zellen mit den Vektoren transfiziert und einer 48-stündigen Inkubation mit

PMA ausgesetzt. Es war jedoch nicht möglich, den PMA-Einfluss auf eine der beiden UTRs

zurückzuführen. Beide UTRs vermitteln additiv den PMA-Einfluss.

3.4 Einfluss von Hypoxie auf die

hASH1-Expression

Sauerstoff spielt als terminaler Elektronenakzeptor in der Atmungskette der Mit-

ochondrien eine entscheidende Rolle bei der Energieproduktion der eukaryontischen

Zelle. Deshalb ist eine Reaktion der Zelle auf Sauerstofflimitierungen von äußerster

Wichtigkeit für den Energiehaushalt der Zelle. Unter Hypoxie kommt es allgemein

zu einer Suppression u.a. von Transkription, Translation und Proteinabbau. Jedoch

unterliegen ausgewählte Gene einer ausgeprägteren Stilllegung sowie andere im

Gegensatz dazu gar einer verstärkten Expression. Die Regulation ist hierbei sehr

komplex und schließt auch posttranskriptionelle Prozesse ein [82, 81].

Wie im Screening nach Substanzen mit potentiell posttranskriptionalem Einfluss

auf die hASH1-Synthese zu sehen war, führten zusätzlich zu PMA auch die bei-

3.4 Einfluss von Hypoxie auf die hASH1-Expression

den Hypoxie-Mimetika

CoCl2

und 2,2-DP zu einer Verringerung der Reportergen-

Aktivität beim hASH1-UTR-Konstrukt (siehe

Abbildung 3.3

auf Seite 50). Die

beiden Hypoxie-Mimetika sind in der Lage die Auswirkungen hypoxischer Bedin-

gungen u.a. auf die alpha-Untereinheit von HIF (Hypoxie-induzierbarer Faktor),

eines heterodimeren Transkriptionsfaktors, welcher eine bedeutende Rolle bei der

Antwort der Zelle auf Sauerstoffmangel spielt, zu imitieren [282].

Der folgende Teil soll sich nun mit der UTR-vermittelten hASH1-Kontrolle unter

Hypoxie bzw. Sauerstoffmangel beschäftigen.

3.4.1 Sinkender Sauerstoffpartialdruck führt zu einer

Abnahme der hASH1-Proteinmenge

Um zu beurteilen, ob sich die im Reportergenassay gemachten Beobachtungen auch

auf hASH1-Protein-Ebene unter tatsächlich hypoxischen Bedingungen manifestieren,

wurden Kelly-Zellen verschiedenen Sauerstoffpartialdrücken ausgesetzt. Nach

18h

wurden die Zellen geerntet und die hASH1-Proteinmengen in den Zelllysaten mittels

Immunoblotting bestimmt.

Es bestätigte sich, dass hypoxische Bedingungen zu einer Herabregulation von

hASH1 führen. Dabei blieb hASH1 über einen Bereich von

21%

bis

Sauer-

stoff konstant und nahm erst bei niedrigeren Sauerstoffpartialdrücken ab (siehe

Abbildung 3.17

). Deshalb soll im Folgenden bei Normoxie auf einen Sauerstoff-

gehalt von

21%

(entspricht einem Partialdruck

pO2

von etwa

160mmHg

) Bezug

genommen werden und bei Hypoxie auf einen Sauerstoffgehalt von

(entspricht

einem Partialdruck pO2von 7,6mmHg).

3.4.2 Im Gegensatz zur hASH1-Proteinmenge bleibt die

mRNA-Menge unter Hypoxie unverändert

Um den zeitlichen Verlauf der mRNA- und Proteinmenge von hASH1 unter Hypoxie

zu untersuchen, wurden Kelly-Zellen unterschiedlich lange hypoxischen Bedingun-

gen ausgesetzt und danach geerntet. Die hASH1-Menge der Zelllysate wurde dann

per Immunoblotting bestimmt.

Dabei zeigte sich, dass hASH1 nach

unter Hypoxie auf die Hälfte verglichen mit

normoxischen Kontrollbedingungen abnimmt. Dabei wird die stärkste Ausprägung

der hASH1-Abnahme auf

1/5

der Kontrollmenge schon nach

unter Hypoxie

erreicht. Dieser Effekt scheint relativ konstant zu bleiben, relativiert sich bei län-

ger andauernder Hypoxie jedoch etwas. Die hASH1-Abnahme scheint zudem ein

Kapitel 3 Ergebnisse

Abbildung 3.17:

Kelly-Zellen wurden verschiedenen Sauerstoffpartialdrücken für

18h

ausgesetzt.

Die anschließende Überprüfung der hASH1-Proteinmengen offenbarte, dass hASH1 erst ab einem

Sauerstoffgehalt von kleiner als

mit einer Abnahme reagiert. Die hASH1-Proteinmengen

wurden auf β-Aktin normiert.

reversibler Prozess zu sein (

Abbildung 3.18

). So wurde das hASH1-Ausgangslevel

nach

48h

unter Hypoxie und anschließender 6-stündiger Inkubation unter Normoxie

(Re-Oxygenierung) wieder erreicht.

Im Gegensatz dazu zeigte die hASH1-mRNA-Menge kaum Veränderungen unter

Hypoxie über die Zeit und blieb in etwa auf Kontrollniveau (siehe

Abbildung 3.18

3.4.3 Eine Hemmung der Translation ist für die

hASH1-Abnahme unter Hypoxie verantwortlich

Eine mRNA-unabhängige Abnahme der Proteinmenge kann auf eine Hemmung der

Protein-Syntheserate zurück gehen. Der Beladungsgrad mit Ribosomen ist ein gutes

Maß für die Translationsaktivität einer mRNA. So sind translationsinaktive mRNAs

in der Regel nur mit Proteinen zu RNP-Komplexen assoziiert. Eine Möglichkeit den

Beladungsgrad von mRNAs zu bestimmen stellt die Polysomengradienten-Analyse

dar. Durch Cycloheximid-Behandlung werden die Ribosomen von cytosolischen

Extrakten an den von ihnen gebundenen mRNAs fixiert. Die so behandelten Extrakte

werden dann in einem Saccharose-Gradienten mittels Ultrazentrifugation aufge-

trennt. Die Polysomen und mRNP-Komplexe werden während der Zentrifugation

entsprechend ihrer Masse mehr oder weniger stark innerhalb des Konzentrationsge-

fälles bewegt (siehe

Abbildung 3.19

), wobei stärker mit Ribosomen besetzte mRNA-

Komlexe eine höhere Masse besitzen und sich somit nach Ultrazentrifugation im

3.4 Einfluss von Hypoxie auf die hASH1-Expression

Abbildung 3.18:

Zeitlicher Verlauf der Protein- und mRNA-Menge von hASH1 unter Hypoxie

bezogen auf die Normoxie-Niveaus. Linke Seite: Westernblots zeigen einen Abfall von hASH1

unter Hypoxie. Rechte Seite: Im Vergleich dazu bleibt die hASH1-mRNA-Menge auch bei längerer

Hypoxie-Dauer unbeeinflusst. Eine 6-stündige Reoxygenierung bringt die hASH1-Proteinmenge

wieder auf das Ausgangsniveau.

Abbildung 3.19:

Schematische Darstellung

der Polysomengradienten-Analyse. Durch

Ultrazentrifugation werden die mRNP-

Komplexe je nach Besetzungsgrad mit

Ribosomen innerhalb eines Saccharose-

Gradienten aufgetrennt. Stärker mit Riboso-

men besetzte mRNP-Komplexe finden sich

somit nach Ultrazentrifugation in Bereichen

höherer Dichte (im Schema weiter unten).

Abbildung entnommen aus [81].

Kapitel 3 Ergebnisse

unteren Teil des Gradienten (höhere Dichte) sammeln. Anschließend werden die im

Gradienten aufgetrennten Polysomen und mRNP-Komplexe in verschiedene Fraktio-

nen aufgeteilt. Nach Isolierung der RNA können nun mithilfe spezifischer Primer

definierte mRNAs einzelnen Fraktionen per Realtime-PCR quantitativ zugeordnet

werden.

Da sich unter Hypoxie die hASH1-Proteinmenge verringert, die mRNA-Menge

jedoch unverändert bleibt, sollte geprüft werden, ob eine Änderung der Translations-

aktivität vorliegt. Dazu wurden Kelly-Zellen

18h

lang hypoxischen Bedingungen

bzw. zur Kontrolle normoxischen Bedingungen ausgesetzt. Die cytosolischen Ex-

trakte der Zellen wurden dann einer Polysomengradienten-Analyse unterzogen.

Dabei war allgemein eine leichte Verlagerung der RNAs hin zur nicht-polysomalen

Fraktion zu beobachten (siehe

Abbildung 3.20

A). Diese Beobachtung deckt sich

mit dem bekannten Phänomen, wonach Hypoxie zu einer allgemeinen bzw. globalen

Hemmung der mRNA-Translation führt [82], welche nach

jedoch noch nicht

sehr stark ausgeprägt ist. In viel stärkerem Ausmaß zeigte sich aber die Verlagerung

der hASH1-mRNA hin zu translationsinaktiven mRNP-Komplexen. Hier war die

hASH1-mRNA unter Hypoxie fast gänzlich in der translationsinaktiven Fraktion zu

finden (siehe Abbildung 3.20 B/C).

3.4.4 Die Deletion dreier

Differenzierungskontroll-Elemente (DICE) hebt den

Einfluss der 3’-UTR bei der hASH1-Abnahme unter

Hypoxie auf

Um den Bereich aufzufinden, der den Hypoxie-Einfluss auf hASH1 vermittelt, wur-

den zunächst UTR-Konstrukte die nur die hASH1-

-UTR oder

-UTR sowie beide

UTRs enthielten in Kelly-Zellen getestet. Dabei wurde deutlich, dass cis-Elemente

sowohl in der hASH1-

-UTR als auch der

-UTR jeweils allein die Antwort auf

Hypoxie vermitteln konnten. So zeigten Reporterkonstrukte mit entweder nur der

-UTR oder nur der

-UTR eine starke Herabregulation der Reportergenaktivi-

tät. Waren jedoch beide UTRs im Reporterkonstrukt zugegen, verstärkte sich der

Hypoxie-Effekt kaum gegenüber den Konstrukten mit jeweils nur einer der beiden

UTRs (siehe Abbildung 3.21).

Im nächsten Schritt sollte eine weitere Eingrenzung der dem Hypoxie-Effekt zu-

grunde liegenden cis-Elemente erfolgen. Dazu wurden UTR-Konstrukte mit unter-

schiedlichen Deletionen im Reportergenassay eingesetzt. Dabei gelang es, den für

die Hypoxie wichtigen Anteil in der

-UTR auf einen 488 Basen großen Bereich

-Ende der UTR einzugrenzen (siehe

Abbildung 3.21

). Zellen, die mit einem

3.4 Einfluss von Hypoxie auf die hASH1-Expression

Abbildung 3.20:

(A) Ribosomales Profil. Während der Fraktionierung wurde die Absorption bei

254nm

kontinuierlich gemessen. Durch Hypoxie kommt es allgemein zu einer Nettoverschiebung

der mRNAs zu Fraktionen mit geringerem Beladungsgrad mit Ribosomen. (B/C) Die Verteilungs-

profile von hASH1-mRNA (B) und

-Aktin-mRNA (C) in den Fraktionen der Polysomengradienten-

Analyse gehen auf eine Quantifizierung durch Realtime-PCR zurück. Dabei bedeuten frühe Frak-

tionen eine hohe Saccharose-Konzentration und dementsprechend einen hohen Besetzungsgrad mit

Ribosomen und spätere Fraktionen einen geringen Besetzungsgrad (die einzelnen Fraktionen be-

deuten: 1-7 Polysomen; 8 Monosomen; 9-12 mRNPs/freie Proteine; (siehe hierzu

Abbildung 3.19

Deutlich ist ein Shift der hASH1-mRNA in die Fraktionen geringerer Dichte unter Hypoxie zu

erkennen. Das zur Kontrolle ebenfalls getestete

-Aktin dagegen zeigt kaum eine Verlagerung

seiner mRNA durch Hypoxie.

Kapitel 3 Ergebnisse

Konstrukt (pGL3p-hASH1-Luc-

-UTR-488del) transfiziert wurden, bei dem diese

488 Basen deletiert wurden (und die hASH1-

-UTR fehlte), wiesen unter Hypoxie

keine Herabregulation des Reporters mehr auf.

Abbildung 3.21:

Verschiedene hASH1-UTR-Konstrukte wurden im Reportergenassay auf ihre

Fähigkeit die Reportergenaktivität unter Hypoxie (

18h

) herabzuregulieren getestet. Es wurden

zuerst

-UTR und

-UTR einzeln sowie ihre Kombination geprüft. Dabei wurde deutlich, dass

der Hypoxie-Einfluss sowohl über die

- als auch über die

-UTR von hASH1 vermittelt wird.

Der Einfluss der

-UTR lässt sich sowohl durch Deletion eines

488bp

großen Bereichs als auch

über die Deletion dreier DICE-Elemente aufheben. Ist jedoch zusätzlich die hASH1-

-UTR im

Reporterkonstrukt zugegen, so bleibt der Hypoxie-Einfluss erhalten. Bei den Reporterkonstrukten

mit den Maus-UTRs konnte nur die Kombination aus

- und

-UTR den Hypoxie-Effekt zeigen,

nicht aber das Reporterkonstrukt mit der Mash1-

-UTR allein. Das ebenfalls getestete Konstrukt

mit der Mash1-

-UTR allein zeigte eine zu geringe Expression, um sinnvoll ausgewertet zu werden

(Daten nicht gezeigt).

Eine in silico-Analyse (siehe dazu

Abschnitt 3.1

auf Seite 45) offenbarte zwei von

drei Differenzierungskontroll-Elementen (DICE). Ein Reporterkonstrukt (pGL3p-

hASH1-Luc-

-UTR-del_DICE-ABC), in dem diese DICE-Stellen deletiert wurden,

verlor ebenfalls die Fähigkeit den Hypoxie-Einfluss im Reportergenassay zu ver-

mitteln (siehe

Abbildung 3.21

). Diese durch die Deletionen in der

-UTR bedingte

Aufhebung des Hypoxie-Effekts konnte jedoch durch die Anwesenheit der 50-UTR

wieder kompensiert werden. So zeigte ein Reporterkonstrukt (pGL3p-hASH1-

Luc-

-UTR-del_DICE-ABC) mit der Deletionen enthaltenden

-UTR aber vollständiger

-UTR eine vergleichbare Herabregulation der Reportergenaktivität unter Hypoxie

3.4 Einfluss von Hypoxie auf die hASH1-Expression

wie das Konstrukt mit beiden vollständigen UTRs (siehe

Abbildung 3.21

). Dieser

Sachverhalt ließe sich durch einen unabhängigen Einfluss der 50-UTR erklären.

Einen weiteren Einblick in die Regulation unter Hypoxie sollten Reporterkonstrukte

mit den UTRs der Maus ergeben. Lassen sich ähnliche Effekte unter Hypoxie be-

obachten, sind die für die Hypoxie wichtigen cis-Elemente vermutlich unter den

zwischen Mensch und Maus konservierten Bereichen der UTRs zu suchen. Tatsäch-

lich konnte der Hypoxie-Einfluss auf die Reportergenaktivität auch bei dem Kon-

strukt, das beide Maus-UTRs enthielt, beobachtet werden (siehe

Abbildung 3.21

Interessanterweise jedoch war die Mash1-

-UTR allein nicht in der Lage, die Her-

abregulation der Reportergenaktivität zu vermitteln (siehe

Abbildung 3.21

). Diese

Beobachtung passt jedoch gut zu der Tatsache, dass der Mash1-

-UTR die DICE-

Stellen der humanen 30-UTR fehlen.

4 Diskussion

Eine Zelle muss entsprechend innerer sowie äußerer Reize ihr Proteinrepertoire den

Bedürfnissen entsprechend anpassen. Diese Anpassung umfasst dabei Änderungen in

den exprimierten Mengen bestimmter Proteine bis hin zum kompletten An- und Ab-

schalten der Expression spezifischer Gene. Eine Nervenvorläuferzelle beispielsweise

muss andere Aufgaben erfüllen bzw. andere Eigenschaften für diese Obliegenheiten

aufweisen, als die ausdifferenzierte reife Nervenzelle. So muss die Vorläuferzelle

z.B. über erhöhte Migrationseigenschaften verfügen, um die Orte ihres zukünftigen

Wirkens als Neuron zu erreichen, auf welche die fertige Nervenzelle hingegen nicht

mehr angewiesen ist. Diese aber wiederum muss im Gegensatz zu ihrem Vorläufer

in der Lage sein, beispielsweise Neurotransmitter zu erzeugen, um ihrer Aufgabe

zur Informationsübertragung nachzukommen.

Um aus ein und demselben Genom die vielfältigsten Expressionsmuster zu erzeugen,

kann auf verschiedenen Ebenen eingriffen werden. So schließen die beteiligten Me-

chanismen dabei nicht nur die Kontrolle auf Ebene der Transkription sondern auch

posttranskriptionelle Regulationsmechanismen ein. Diese können beispielsweise die

mRNA-Stabilität oder die Translationseffizienz einer mRNA, welche sich ebenso

wie eine Änderung der Transkription letztlich auf die exprimierte Proteinmenge

auswirken, betreffen. Die Informationen für diese posttranskriptionellen Regulations-

mechanismen befinden sich vornehmlich in den untranslatierten Bereichen (UTRs)

einer mRNA.

Der bHLH-Transkriptionsfaktor hASH1 spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle

der neuronalen Entwicklung und Differenzierung [21, 273, 142] und scheint ebenso

bei bestimmten Tumoren und Karzinomen von Bedeutung zu sein [228, 151]. Die

hASH1-mRNA zeichnet sich durch überduchschnittlich lange UTRs aus. Zudem

zeigte eine in silico-Analyse der UTRs Bereiche mit starker Konservierung und

einige putative cis-Elementen (siehe

Abbildung 3.1

auf Seite 46), welche ebenso

eine Regulation von hASH1 auf posttranskriptioneller Ebene nahelegten. Gegenstand

dieser Arbeit ist die Untersuchung posttranskriptioneller Einflüsse auf die hASH1-

Regulation im Hinblick auf die durch PMA und Hypoxie hervorgerufte Änderung

der Expression.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass hASH1 einer starken Suppression in der

Neuroblastoma-Zelllinie Kelly unter dem Einfluss von PMA unterliegt. Dies konnte

Kapitel 4 Diskussion

auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene beobachtet werden. Da Mash1 auch in Cortex-

Zellen der Ratte unter PMA herabreguliert wird, scheint der zugrunde liegende

Mechanismus nicht nur für einen bestimmten Zelltyp spezifisch zu sein. Phorbolester

wie PMA stellen in Bezug auf Proteinkinase C (PKC) Analoga des sekundären

Botenstoffs (engl. second messenger) 1,2-Diacylglycerol (DAG) dar. Sie werden

jedoch langsamer abgebaut, so dass sie in der Zellkultur wie auch in in vivo Modellen

als bevorzugte Aktivatoren von PKC eingesetzt werden [28]. Phorbolester wurden

schon mit verschiedenen zellulären Reaktionen, wie Zellwachstum, Differenzierung

oder Apoptose, in Verbindung gebracht [157, 1, 120]. In dieser Arbeit werden die

der hASH1-Herabregulation zugrunde liegenden Mechanismen unter PMA genauer

untersucht.

Eine schnelle und signifikante Abnahme der hASH1-mRNA-Menge auf unter die

Hälfte des Kontrollwerts konnte schon nach kurzer Inkubation (

) mit PMA be-

obachtet werden. Diese Beobachtung steht im Einklang mit Daten anderer Ver-

öffentlichungen, in denen eine durch PMA induzierte Differenzierung anderer

Neuroblastoma-Zellen ebenfalls zu einer hASH1-Abnahme führte [231, 293, 113].

Der schnelle Abfall der hASH1-mRNA-Menge wird gefolgt von einer leichten Ab-

schwächung des Effekts bei längeren Inkubationszeiten (

48h

). Im Gegensatz dazu

nimmt die Menge an hASH1-Proteinmenge kontinuierlich über den beobachteten

Zeitraum ab.

Kelly-Zellen die mit einem Reporterkonstrukt transfiziert wurden, welches das

Luciferase-Reportergen unter Kontrolle der hASH1-UTRs enthielt, zeigten ebenfalls

eine starke Herabregulation des Reporters unter Inkubation mit PMA. Das deutet dar-

auf hin, dass die UTRs und somit posttranskriptionelle Prozesse maßgeblich an der

hASH1-Herabregulation unter PMA beteiligt sind. Eine Konzentrationskinetik mit

PMA zeigte eine sukzessive Steigerung des PMA-Effekts (und somit stärkerer Her-

abregulation des Reporters) mit steigender PMA-Konzentration, wobei der Effekt bei

einer Konzentration von

40nM

am ausgeprägtesten war und danach wieder abnahm

(siehe

Abbildung 3.4

). Dieser Umstand korrespondiert mit einer früheren Studie in

der die Neuroblastoma-Zelllinie SH-SY5Y mit

16nM

PMA am stärksten zur Diffe-

renzierung stimuliert werden konnte [231]. Höhere PMA-Konzentrationen führten

auch hier zu einer schwächeren Ausprägung der Differenzierung. Im Vergleich zu

einem Reporterkonstrukt das den Reporter unter Kontrolle des hASH1-Promotors

enthielt, stellte sich heraus, dass der frühe Einbruch der hASH1-Expression wohl

auf die UTRs und somit posttranskriptionelle Einflüsse zurückzuführen ist. Zwar

reagierte auch der hASH1-Promotor mit einer Herabregulation des Reportergens

unter PMA, doch erst deutlich später als die UTRs.

Darauf folgende Stabilitätsassays zeigten, dass der UTR-vermittelte Einfluss haupt-

sächlich auf einer Abnahme der hASH1-mRNA-Stabilität beruht. Die mRNA-

Stabilität von Transkripten wird oft über die Länge des Poly(A)-Schwanzes be-

Diskussion

stimmt. Jedoch stellen auch endonukleolytische Schnittstellen im Transkript, wie

beispielsweise AREs, entscheidende regulatorische Elemente dar [272, 115]. Obwohl

die Stabilität einer mRNA oft von cis-Elementen in ihrer

-UTR vermittelt wird,

scheinen bei hASH1 die

-UTR und die

-UTR unabhängig voneinander einen

Einfluss auf die Stabilität zu haben. Das deutet auf ein Zusammenwirken mehrerer

trans-Faktoren bei der Steuerung der hASH1-mRNA-Stabilität unter PMA hin. Ein

ähnlicher Mechanismus wurde bei der Regulation des bHLH-Transkriptionsfaktors

c-myc gefunden. Zellen der humanen Leukämie-Zelllinie K562 wurden mit PMA zur

Differenzierung zu Megakaryoblasten stimuliert [33]. Während der Differenzierung

nahm die Expression von c-myc zumindest teilweise aufgrund einer Destabilisierung

seiner

mRNA

ab. Interessanterweise scheint die Destabilisierung dabei auf einem

Deadenylierungs-unabhängigen Abbaumechanismus zu beruhen.

Die transkriptionelle Reprimierung der hASH1-Synthese in Neuroblastoma-Zellen

über Phorbolester wurde schon mit der Aktivierung des Notch Signalwegs und der

damit hervorgerufenen verstärkten Expression von HES-1 in Verbindung gebracht

[14]. Dabei kann die Herabregulation der hASH1-mRNA-Menge durch aktivierten

Notch1 jedoch stärker als durch HES-1 allein ausfallen [297]. Zusammengenommen

deuten die Daten darauf hin, dass die herabgesetzte hASH1-mRNA-Menge bei

PMA-induzierter Differenzierung das Resultat von erniedrigter mRNA-Stabilität und

erniedrigter Transkription ist. Die schnelle Reaktion ist dabei auf den gesteigerten

mRNA-Abbau zurückzuführen, wohingegen die herabgesetzte Promotoraktivität

unter längeren Bedingungen, wenn die Erniedrigung der mRNA-Stabilität wieder

aufgehoben ist, im Wesentlichen für die hASH1-Herabregulation verantwortlich ist.

Unter längerer PMA-Behandlung (

48h

) ging die hASH1-Proteinmenge auf etwa

1/5

der Kontrollmenge zurück, wogegen der Abfall auf mRNA-Ebene mit etwa

60%

der Kontrollmenge weniger stark ausfiel. Das deutet darauf hin, dass noch

weitere Mechanismen in der Kontrolle der Expression eine Rolle spielen. Die UTR-

abhängigen Reportergen-Assays stützen die Ansicht, dass obgleich die hASH1-

mRNA-Destabilisierung schon vorüber ist, die UTRs dennoch einen reprimierenden

Einfluss ausüben. Diese Differenz ließe sich möglicherweise auf eine verringerte

Translationseffizienz zurückführen. Doch wurde die hASH1-Abnahme nach Notch-

Aktivierung auch einem erhöhten hASH1-Proteinumsatz zugeschrieben [297]. Im

Gegensatz dazu zeigte sich nach

48h

unter PMA jedoch keine Veränderung der

hASH1-Proteinstabilität (siehe

Abbildung 3.11

auf Seite 57), so dass die beobachte-

ten Veränderungen in der hASH1-Proteinmenge wohl auf eine veränderte Translati-

onsrate zurückgehen. Da die gemessenen mRNA- und Proteinwerte die Nettoeffekte

aller aktivierten Mechanismen in der Kontrolle der Expression eines bestimmten

Gens wiederspiegeln, deuten die Daten darauf hin, dass der schnelle, starke und

lang-anhaltende herabregulierende Einfluss auf hASH1 unter PMA-Einfluss auf

verschiedene trans-Faktoren, die synergistisch und zumindest teilweise unabhängig

Kapitel 4 Diskussion

voneinander wirken, zurückzuführen ist. Im Crosslinking-Experiment konnte zwar

nur eine deutliche Änderung des Bandenmusters beobachtet werden, doch werden

beim Crosslinking beispielsweise Änderungen des Phophorylierungsstatus eines

Proteins, sofern sie die Bindungseigenschaften zur RNA unverändert lassen, nicht

erfasst. Desweiteren lassen sich im Crosslinking nur Proteine mit direktem Kontakt

zur RNA aufspüren. Proteine die wichtig für die Regulation sind, jedoch über weitere

Proteine mit der RNA assoziiert sind, können so nicht detektiert werden.

Um einen umfassenderen Eindruck von dem PMA-vermittelten Effekt zu erhalten,

wurde überprüft, ob die Herabregulation von hASH1, mit dem Hauptaugenmerk auf

die frühe posttranskriptionelle Komponente, auf die Mitwirkung von PKC zurück-

geht. PKCs repräsentieren die bekanntesten Ziele der Wirkung von Phorbolestern

[224, 186]. Die PKC-Familie der Serin/Threonin-Kinasen wird aus mindestens 10

verschiedenen Isoformen gebildet. Diese können in drei Gruppen, basierend auf

strukturellen und biochemischen Eigenschaften, eingeteilt werden. Nur zwei dieser

Gruppen, die klassischen PKC (engl. classical PKCs, zusätzlich über

Ca2+

aktiviert)

und die ’neuartigen’ PKCs (engl. novel PKCs, nicht von

Ca2+

abhängig), werden

durch Phorbolester aktiviert. Zudem variieren die Expressionsmuster der PKCs

abhängig von Zelltyp bzw. Gewebe [208, 222].

In der Neuroblastoma-Zelllinie SH-SY5Y konnte schon gezeigt werden, dass PKC

wohl nicht nur für die Initiierung der Differenzierung, sondern sehr wohl auch

eine Rolle während des weiteren PMA-induzierten Differenzierungsvorgangs, spielt

[241]. So konnte in dieser Studie nachgewiesen werden, dass PKC-

, ein Mitglied

der klassischen PKCs, während der gesamten PMA-induzierten Differenzierung

(wobei PMA alle 4 Tage erneuert wurde) nicht nur zugegen war, sondern auch,

gemessen an endogenem und in vitro-Substrat, aktiviert vorlag.

Um eine Beteiligung von PKC bei der Vermittlung der posttranskriptionellen PMA-

Wirkung nachzuweisen, wurden Zellen vor der PMA-Behandlung mit den bekannten

PKC-Inhibitoren Staurosporin oder GF109203X vorinkubiert [310, 316]. Beide

Inhibitoren vermochten den herabregulierenden Effekt von PMA im Reporterge-

nassay und auf mRNA-Ebene zu verringern jedoch nicht vollständig aufzuheben.

Das lässt den Schluss zu, dass auch PKC-unabhängige Mechanismen an der PMA-

vermittelten Inhibition der hASH1-Synthese teilhaben. Interessanterweise führte

die Behandlung mit GF109203X zu einer fast kompletten Aufhebung der hASH1-

UTR-vermittelten PMA-Wirkung im Reportergenassay, wogegen Staurosporin einen

weitaus schwächeren Einfluss hatte. Diese Diskrepanz lässt sich möglicherweise mit

den unterschiedlichen Spezifitäten beider Inhibitoren erklären. So wurde gezeigt,

dass Staurosporin auch andere Kinasen zusätzlich zu PKC hemmt [316]. Daher

erscheint es möglich, dass die PKC-unabhängigen Effekte von Staurosporin die Ant-

wort der hASH1-UTRs auf PMA-Behandlung beeinflussen oder sogar übertreffen

könnten. Zudem zeigten bereits zwei Studien, dass Staurosporin selbst in der Lage

Diskussion

war, in den beiden Neuroblastoma-Zelllinien SH-SY5Y sowie NB-1 Differenzie-

rungsvorgänge auszulösen [148, 217]. Das deckt sich mit der Beobachtung, dass

schon die 4-stündige Präinkubation mit Staurosporin die hASH1-mRNA-Menge

herabsetzte (siehe

Abbildung 3.13

). Der zusätzliche Abfall der mRNA-Menge durch

PMA jedoch war weniger stark ausgeprägt als bei Zellen die nur mit PMA behandelt

wurden, was auch hier den Schluss nahelegt, dass PMA zwar PKC-abhängig wirkt

aber auch PKC-unabhängige Mechanismen nutzt.

Eine Zusammenfassung der hier vorgestellten Daten gibt Abbildung 4.1 wieder.

Kapitel 4 Diskussion

Abbildung 4.1: Schematische Darstellung der PMA-Wirkung in Kelly-Zellen. Diese verfügen über

eine konstitutive hASH1-Expression. Nach PMA-Behandlung steigt u.a. PKC-abhängig kurzfristig

die hASH1-mRNA-Abbaurate, so dass weniger Transkripte für die Translation zur Verfügung

stehen. Daneben scheinen noch PKC-unabhänguge Faktoren eine Rolle zu spielen (angedeutet

durch das Fragezeichen). Langfristig wird diese Reprimierung durch eine verringerte hASH1-

Transkriptionsrate, mit demselben Effekt einer reduzierten hASH1-Bildung, abgelöst.

Diskussion

Ein weiterer Stimulus, der in dieser Arbeit als potentiell posttranskriptionell auf

die hASH1-Synthese wirkend identifiziert wurde, ist der Sauerstoffmangel bzw. die

Hypoxie. Sauerstoff spielt als finaler Elektronenakzeptor in der Atmungskette eine

wichtige Rolle bei der Energiegewinnung der Zelle. Er ist zudem auch ein schneller

Regulator des zellulären Metabolismus. So wirkt sich der Sauerstoffpartialdruck auf

vielfältige Bereiche des Lebens, einschließlich Wachstum und Entwicklung, aus.

Hypoxie bezeichnet den Zustand erniedrigter Sauerstoffkonzentration im Vergleich

zum Normalzustand. Werden Zellen hypoxischen Bedingungen ausgesetzt, wird über

Signalkaskaden eine Antwort induziert, welche die metabolischen Anforderungen

der reduzierten Sauerstoffverfügbarkeit anzupassen versucht. Diese Reaktion der

Zelle führt letztlich zu einer veränderten Expression einer Vielzahl von Genen [81, 82,

45, 234, 344]. Dabei ist zu beachten, dass sich die normalen Sauerstoffpartialdrücke

in den verschiedenen Organen und Geweben deutlich voneinander unterscheiden

können. So variieren die Partialdrücke im Körper beispielsweise von

150mmHg

(

≈21% O2

) in den oberen Atemwegen bis hin zu nur

5mmHg

(

≈1% O2

) in der

Retina [313]. Deshalb unterscheiden sich auch die einzelnen Sauerstoffpartialdrücke,

die in verschiedenen Organen als hypoxisch angesehen werden.

Mit einem Verbrauch von etwa

20%

stellt das Gehirn einen der größten Sauer-

stoffkonsumenten des Körpers dar [199]. Doch sind die Sauerstofflevel verglichen

mit anderen Teilen des Körpers in fast allen Hirnbereichen, mit beispielsweise

27±6mmHg

(

≈4% O2

) in der Großhirnrinde,

20±3mmHg

(

≈3% O2

) im Hip-

pocampus oder

4,1mmHg

(

≈0,55% O2

) im Mesencephalon, sehr gering [146, 65,

77]. Dazu kommt, dass die Entwicklung einer ganzen Reihe von Organen eines

Embryos einschließlich des ZNS in einer sauerstoffarmen Umgebung stattfindet

[85, 50]. So beginnt die embryonale Neurogenese in der frühen Schwangerschaft,

noch bevor der placentale Gasaustausch eingesetzt hat, unter sehr niedrigen Sauer-

stoffpartialdrücken von

≤15,2mmHg

(

≈2% O2

) [344, 85, 309]. Die Neurogenese

in sauerstoffarmer Umgebung setzt sich aber auch später noch fort [50, 177]. So

konnte beispielsweise der Hypoxie-Marker EF5, welcher Sauerstoffumgebungen

von weit weniger als

7,6mmHg

(

≈1% O2

) anzeigt [193], im Neuralrohr im Bereich

des Rhombencephalon und des Mesencephalons nachgewiesen werden [50].

Auch scheint in der Neurogenese adulter neuronaler Stammzellen, welche nur in der

subventrikulären Zone (SVZ) der lateralen Ventrikel sowie der subgranulären Zone

(SGZ) des Gyrus dentatus des adulten Gehirns stattfindet [306], die Sauerstoffumge-

bung der Stammzellen eine wichtige Rolle zu spielen. So konnte beobachtet werden,

dass die SVZ mit einem dichten Netzwerk an Blutgefäßen durchzogen wird. Zellen,

die Stammzell-Marker exprimierten, wurden in engem Kontakt mit der extrazellulä-

ren Matrix, die die vaskulären Endothelialzellen umschließen, nachgewiesen [288].

Zusammengenommen mit Daten anderer Gruppen könnte das bedeuten, dass hier

der erhöhte Sauerstoffpartialdruck um die Blutgefäße in der SVZ notwendig für die

Kapitel 4 Diskussion

Aufrechterhaltung der adulten Stammzellen ist [312, 30, 344].

Bei der oben dargelegten Zusammenstellung, unter welchen Sauerstoffverhältnissen

neuronale Stammzellen gedeihen bzw. Neurogenese stattfindet, scheint es kaum

verwundernswert, dass die beiden chemischen Hypoxie-Mimetika

CoCl2

und 2,2-

DP auch einen Einfluss auf die hASH1-Expression ausüben. Wurden Kelly-Zellen,

welche mit einem Reportergenvektor unter Kontrolle der hASH1-UTRs transfiziert

wurden, jeweils einer dieser beiden Substanzen ausgesetzt, so schwächte sich die

Expression des Reportergens im Vergleich zu transfizierten Kontrollzellen, welche

nur mit den entsprechenden Lösungsmitteln behandelt wurden, ab. Eine Überprü-

fung mit tatsächlicher Hypoxie bestätigte diese Vorbefunde. Wurden Kelly-Zellen

18h

lang hypoxischen Bedingungen

(≤3%O2)

ausgesetzt, so verringerte sich die

hASH1-Proteinmenge in Abhängigkeit vom Sauerstoffpartialdruck. Ein Minimum

der hASH1-Proteinmenge (auf etwa

1/5

der Kontrollmenge) wurde dabei am kleins-

ten untersuchten Sauerstoffgehalt von

0,5%

gemessen. Da hASH1 aber zwischen

21% O2

(Umgebungsbedingungen) und

6% O2

keinerlei Veränderung zeigte, wur-

den

21% O2

im Weiteren als Kontrollwert verwendet. Diese Befunde legen nahe,

dass die Sauerstoff-abhängige hASH1-Regulation unter physiologisch relevanten Be-

dingungen erfolgt (d.h.

pO2<5%

bzw.

pO2<38mmHg

). Hyperoxie (

pO2<5%

)

hat keinen Einfluss auf die hASH1-Synthese und folglich wahrscheinlich nicht die

hASH1-abhängige Differenzierung.

Einen ersten Hinweis darauf, dass bei dieser hASH1-Herabregulation posttranskrip-

tionelle Einflüsse eine Rolle spielen könnten, deuteten schon die Reportergenassays

des Eingangs-Screenings (siehe

Abbildung 3.3

auf Seite 50 ) mit dem Reporterkon-

strukt, welches den Reporter unter Kontrolle der hASH1-UTRs enthielt, an. Hier

führten die beiden getesteten chemischen Hypoxie-Mimetika

CoCl2

und 2,2-DP zu

einer Herabregulation der Reportergenaktivität. Auch in diesem Fall zeigte die Über-

prüfung mit tatsächlicher Hypoxie eine Herabregulation der Reportergenaktivität.

Um den zeitlichen Verlauf der hASH1-Herabregulation unter Hypoxie nachzuvollzie-

hen, wurden Kelly-Zellen nach verschieden langen Inkubationszeiten unter Hypoxie

geerntet. Auf Protein-Ebene war hierbei eine schnelle Herabregulation von hASH1

zu beobachten. Die Proteinmenge war schon nach

auf die Hälfte gefallen und er-

reichte nach

ihr Minimum, wobei sich die hASH1-Menge nach längerer Hypoxie

(

48h

) wieder etwas erholte. Eine 6-stündige Re-Oxygenierung, bei der die Zellen im

Anschluss an die Hypoxie unter normoxischen Bedingungen inkubiert wurden, ließ

das hASH1-Proteinlevel wieder auf Kontrollniveau steigen. Das deutet darauf, dass

die Stress-bedingte Herabregulation von hASH1 einen reversiblen Prozess darstellt.

Interessanterweise jedoch ließ sich dieser Befund nicht auf die hASH1-mRNA-

Ebene übertragen. Im Gegensatz zur hASH1-Herabregulation unter PMA, welche

sich sowohl auf Protein- sowie mRNA-Ebene wiederspiegelte, wirkte sich die Hy-

Diskussion

poxie nicht auf die hASH1-mRNA-Menge in den Zellen aus und blieb während

der gesamten untersuchten Zeitspanne

(48h)

vergleichsweise unverändert. Die Ab-

nahme an hASH1-Protein lässt sich somit nicht über eine veränderte Transkription

oder mRNA-Stabilität erklären. Diese Feststellung steht jedoch in Einklang mit dem

Eingangsversuch, der ein Mitwirken posttranskriptioneller Mechanismen nahelegte.

Da also weder eine Änderung der Transkriptionaktivität noch eine veränderte

mRNA-Stabilität, welche sich in einer Änderung der Menge der hASH1-mRNA

widergespiegelt hätten, für die Regulation unter Hypoxie verantwortlich schie-

nen, erfolgte eine Überprüfung der Translationseffizienz. Die dazu durchgeführte

Polysomengradienten-Analyse ergab eine allgemeine Verschiebung der mRNAs

in die leichteren Fraktionen bei der Ultrazentrifugation nach 18-stündiger Hypo-

xie verglichen mit der normoxischen Kontrolle. Dies ist deshalb sehr naheliegend,

da Hypoxie und damit einhergehender ATP-Mangel zu einer globalen Hemmung

der Translation führen. Schließlich entfallen etwa

25 −30%

des gesamten ATP-

Verbrauchs einer Zelle auf den Translationsvorgang [268]. Erst im späteren Verlauf

der durch Hypoxie verursachten Energieverknappung wird die Hemmung auch

auf Transkriptionsebene ausgedehnt [337, 304]. Zusätzlich zu dieser allgemeinen

Translationshemmung jedoch konnte bei der hASH1-mRNA eine viel stärkere Verla-

gerung in die Fraktionen geringerer Dichte verglichen mit der hASH1-mRNA von

Kontrollzellen beobachtet werden. War bei normoxischen Zellen hASH1-mRNA

vornehmlich in den polysomalen Fraktionen zu finden, so kam es unter Hypoxie zu

einem deutlichen Shift hin zu Fraktionen mit translationsinaktiven

mRNAs

(siehe

Abbildung 3.20

). Die hASH1-Abnahme unter Hypoxie ist somit auf eine spezifi-

sche translationale Stilllegung der mRNA zurückzuführen (siehe Abbildung 4.2 auf

Seite 83).

Um die an der Translationsinaktivierung beteiligten cis-Elemente aufzufinden, wur-

den weitergehende Reportergenassays durchgeführt. Dabei wurde deutlich, dass

unter Hypoxie sowohl die hASH1-

-UTR als auch die

-UTR einen starken sup-

pressiven Einfluss auf den Reporter ausübten. Interessanterweise zeigte auch das

Reporterkonstrukt, in welchem der Reporter unter Kontrolle der Maus-UTRs vorlag,

eine Herabregulation unter Hypoxie. Ein Konstrukt, das nur die Mash1-

-UTR

enthielt, konnte die Herabregulation allein jedoch nicht mehr vermitteln. Mithilfe

eines Reporterkonstrukts mit einer verkürzten hASH1-

-UTR konnte der Bereich,

der für den Hypoxie-Einfluss innerhalb der

-UTR wichtig ist, auf einen

488nt

großen Abschnitt am

-Ende der

-UTR eingegrenzt werden. Fehlte dieser Bereich,

so war auch die humane

-UTR nicht mehr in der Lage, die Reportergenaktivität

unter Hypoxie herunter zu regulieren.

Drei sogennante DICE-Stellen, wovon sich zwei in diesem

488nt

Bereich befanden,

kamen als putative cis-Bereiche für eine Translationsinaktivierung in Frage. Diese

Elemente wurden schon für eine Vermittlung einer mRNA-Stilllegung durch die

Kapitel 4 Diskussion

beiden RBPs hnRNP-E1 und hnRNP-K beschrieben [230, 229]. Wurden diese

DICE-Stellen in der

-UTR des Reporterkonstrukts entfernt, verhielt es sich im

Reportergenassay identisch wie das um

488nt

deletierte Reporterkonstrukt, was für

eine Beteiligung dieser cis-Elemente an der hASH1-Herabregulation unter Hypoxie

spricht. Diese Annahme wird durch den Umstand, dass auch die

-UTR der Maus

keine DICE-Elemente vorweisen kann, unterstützt, da diese ebenfalls keine Rolle

unter Hypoxie zu spielen scheint.

Zukünftige Experimente sollten weitergehenden Aufschluss über die Identität der

beteiligten Transfaktoren ergeben. Ein vielversprechender Ansatz wäre beispiels-

weise das Ausschalten bestimmter RBPs über siRNAs und die Überprüfung der

Auswirkungen, die dadurch auf die hASH1-Expression unter Hypoxie bewirkt wer-

den. Eine weitere Möglichkeit etwa wäre über die Überexpression verschiedener

RBPs und der Beobachtung der hASH1-Expression gegeben. Um möglichst alle

Kandidaten für die posttranskriptionelle Kontrolle der hASH1-Expression zu erfas-

sen, würde sich eine Affinitätschromatographie anbieten. Hierbei könnte mithilfe

von in vitro-transkribierten UTRs oder UTR-Abschnitten von hASH1 nach Interakti-

onspartnern in Cytosolpräparationen „gefischt“ werden. Eine Identifizierung aller

an die RNAs gebundenen Proteine wäre massenspektrometrisch möglich. Mengen-

mäßige Unterschiede einzelner Proteine zwischen normoxischen und hypoxischen

Cytosolpräparationen würden geeignete Kandidaten für die Vermittlung der Hypoxie

auf die hASH1-Expression aufzeigen.

Doch welche Bedeutung könnte die Tatsache, dass hASH1 in dieser Neuroblastoma-

Zelllinie unter Hypoxie über ein Aussetzen der Translation herabreguliert wird,

haben? Einerseits könnte man meinen, diese Beobachtung ginge darauf zurück, dass

auch hier Differenzierungsvorgänge, wofür die Herabregulation von hASH1 ein

wichtiges Indiz sein könnte, durch die Hypoxie ausgelöst wurden. So konnte an

neuronalen Vorläuferzellen des Mesencephalons des Rattenembryos gezeigt werden,

dass es durch eine Verringerung des Sauerstoffpartialdruckes von

152mmHg

(

≈

21%

) auf

22,8±15,2mmHg

(

≈

) zu einer Verdreifachung des Anteils an Zellen

mit dopaminergem Phänotyp kam [305]. Ähnliches konnte auch für Stammzellen

der Neuralleiste nachgewiesen werden, wo unter verringerter Sauerstoffumgebung

(

38mmHg

) der Anteil an Zellen mit katecholaminerger Differenzierung anstieg

[218], wie auch für humane neuronale Vorläuferzellen des Mesencephalons, welche

unter hypoxischen Bedingungen dopaminerge Neurone bildeten [303, 302].

In einem Schlaganfall-Modell im adulten Rattenhirn, bei welchem mithilfe eines

Lasers Thrombozyten photochemisch zum Verschluss von Blutgefäßen gebracht

wurden, konnte ebenfalls beobachtet werden, dass es durch die dabei hervorgerufene

Ischämie und den dadurch ausgelösten Sauerstoffmangel im betroffenen Bereich zur

Neubildung von Neuronen kam [114]. Dabei sind Neurogenese und Angiogenese

eng miteinander verkettet, wobei wohl aber dem erhöhten Sauerstoffpartialdruck um

Diskussion

die Blutgefäße herum eine Schlüsselrolle bei der durch Schlaganfall verursachten

Neurogenese zukommt [226, 314, 344].

Daneben konnten hypoxische Bedingungen Zellen nicht nur zur Differenzierung

stimulieren, sondern beispielsweise auch die Proliferationsrate oder Überlebensrate

der Zellen in Kultur begünstigen [305, 218]. Zudem war es möglich, bei neuronalen

Stammzellen aus dem Telencephalon von Mausföten durch eine Erniedrigung des

Sauerstoffpartialdrucks unter

15,2mmHg

(

≈

), ihrer optimalen Sauerstoffum-

gebung im Hinblick auf Proliferation und Differenzierung, einen Wechsel bei der

Differenzierung bezüglich des entstehenden Subtyps von GABA-positiven Neuronen

hin zu Glutamat-positiven Neuronen zu bewirken [140].

Erschwerend bei der Deutung dieser hASH1-Herabregulation kommt hinzu, dass

man annimmt, dass hypoxische Bedingungen in verschiedenen Stammzell- und

Vorläuferzellpopulationen einen undifferenzierten Zustand fördern [213]. Es wird

vermutet, dass die geringeren Sauerstoffpartialdrücke in Stammzellnischen den

Stammzellen einen selektiven Vorteil verschaffen, indem beispielsweise der oxida-

tive Stress, welcher bei Zellen mit aeroben Metabolismus auftritt, minimiert wird.

Schädingungen an der DNA etwa durch so entstehende reaktive Sauerstoffspezies,

welche insbesondere bei Stamm- und Vorläuferzellen nachteilig für den Organismus

wären, würden in diesen sauerstoffarmen Nischen vermieden werden [53, 39]. So

konnte gezeigt werden, dass murine embryonale Fibroblasten, die bei 20% Sauerstoff

kultiviert wurden, deutlich mehr Mutationen anhäuften im Vergleich zu Zellen, die

bei 3% Sauerstoff kultiviert wurden [39]. Auch bei induzierten pluripotenten Stamm-

zellen, welche aus embryonalen Mausfibroblasten und aus humanen somatischen

Zellen durch Transfektion mit vier spezifischen Transkriptionsfaktoren generiert

wurden, zeigte sich, dass sich zumindest milde hypoxische Bedingungen förderlich

auf die Ausbeute an induzierten Stammzellen auswirkten [308, 341, 340]. Zudem

schien die Umprogrammierung der Zellen schneller unter Hypoxie abzulaufen und

es war sogar möglich, induzierte pluripotente Stammzellen mittels Transfektion mit

nur zwei der ursprünglich vier Transkriptionsfaktoren zu erzeugen [340]. Auch diese

Beobachtungen können als Indiz dafür gesehen werden, dass niedrige Sauerstoffpar-

tialdrücke einen Stammzell-Phänotyp begünstigen.

Dass es sich bei der in dieser Arbeit beschriebenen hASH1-Herabregulation unter

Hypoxie wohl nicht um Differenzierungsvorgänge handelt, sondern die Hypoxie

wohl eher reversibel einen stärker undifferenzierten Zustand in den Neuroblastom-

zellen fördert, wird auch durch folgende Beobachtungen unterstützt: So scheinen

hypoxische Tumorzellen zu dedifferenzieren und dabei Stammzell-ähnliche Eigen-

schaften zu erlangen. Dies konnte u.a. für Brustkrebszellen, Prostatakrebszellen

sowie Neuroblastomzellen gezeigt werden [125, 99, 152]. Es zeigte sich somit, dass

Neuroblastomzellen, welche unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden, die

Expression einer Reihe von neuronalen sowie neuroendokrinen Markergenen redu-

Kapitel 4 Diskussion

zierten [152, 153]. Daneben konnte eine verstärkte Expression von Genen, welche

mit einem Phänotyp von Zellen der Neuralleiste in Verbindung gebracht werden,

beobachtet werden [152, 153, 190, 232]. Diese in vitro Beobachtungen konnten auch

in vivo reproduziert werden. So wurde die Expression von Differenzierungsmarker-

genen in hypoxischen Bereichen eines Tumors aus humanen Neuroblastomzellen,

welcher in nackte Mäuse xenotransplantiert wurde, ebenfalls herabreguliert [152].

Bisher hat man die Herabregulation von hASH1 unter Hypoxie jedoch eher mit einer

parallel beobachteten verstärkten Expression von HES-1 und Notch-1 zu erklären

versucht [152]. Diese hASH1-Regulation über Notch/HES-1 würde jedoch nur eine

Reprimierung der Transkription von hASH1 zur Folge haben, welche in dieser Arbeit

nicht beobachtet wurde. Doch gibt es Hinweise, dass Notch auch HES-1-unabhängig

an der hASH1-Herabregulation mitwirken kann [297]. Zudem zeichneten sich nicht

alle der getesteten Neuroblastomzelllinien durch eine erhöhte HES-1-Expression

unter Hypoxie aus [152]. In zwei der vier getesteten Zelllinien blieb HES-1 unverän-

dert, was auch hier den Schluss zulässt, dass weitere Mechanismen, wie die in dieser

Arbeit vorgestellte Stilllegung der Translation, bei der Herabregulation von hASH1

unter Hypoxie eine Rolle spielen.

Neuroblastomzellen rühren von Vorläuferzellen bzw. unreifen Zellen des sympa-

thischen Nervensystems her und sind während verschiedener Phasen der Differen-

zierung stehen geblieben. Primärtumore können an nahezu allen Strukturen des

sympathischen Nervensystems entstehen [73]. Tumore neigen dazu, Bereiche mit

hypoxischen Bedingungen auszubilden, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen

ist, dass die Neubildung von Blutgefäßen nicht mit dem schnellen Wachstum der

Tumorzellen schritthalten kann. Außerdem sind Blutgefäße innerhalb von Tumo-

ren oftmals missgebildet und in ihrer Funktion beeinträchtigt [137]. Hypoxie eines

Tumors und seine Gefährlichkeit korrelieren häufig miteinander [92]. Dies könnte

einerseits darauf zurück gehen, dass Tumore aufgrund hypoxischer Bedingungen

aggressiver werden, oder aber aggressive Tumore durch ihr schnelles Wachstum

eher zur Hypoxie neigen. Wenngleich man diesen Sachverhalt noch nicht gänzlich

klären konnte, kennt man jedoch einige nachteilige Auswirkungen der Hypoxie auf

die Tumorbehandlung. So schränkt Hypoxie die Sensitivität des Tumors gegenüber

verschiedenen therapeutischen Verfahren ein. Daneben scheinen hypoxische Tu-

more erfolgreicher zu metastasieren und zeigen zudem interessanterweise höhere

Mutationsraten als weniger hypoxische Tumore [284, 108, 35, 265]. Letztere Ei-

genschaft geht auf die Herabregulation einer Reihe von DNA-Reparatur-Genen bei

hypoxischen Tumoren zurück [163, 168]. Die erhöhte Aggressivität hypoxischer

Tumore aufgrund beispielsweise der verbesserten Metastatisierungseigenschaften

lässt sich möglicherweise aus dem durch die Hypoxie hervorgerufenen Wechsel

der Krebszellen hin zu einem unreiferen Zustand ableiten. Die über die Hypoxie

wiedergewonenen Stammzelleigenschaften tragen so maßgeblich zur Gefährlichkeit

Diskussion

des Tumors bei [152].

Da hASH1 eine wichtige Rolle bei der Ausdifferenzierung zukommt, liegt die

Vermutung nahe, dass auch die Herabregulation von hASH1 unter Hypoxie, bei

der Wiedergewinnung von Stammzelleigenschaften der Tumorzellen, von großer

Relevanz ist. Eine weitegergehende Analyse der translationalen Stilllegung von

hASH1 könnte somit neue Angriffspunkte bei der Behandlung von Neuroblastomen

aufzeigen.

Abbildung 4.2:

Schematische Darstellung der Auswirkungen der Hypoxie auf die Bildung von

hASH1 in Kelly-Zellen. Unter hypoxischen Bedingungen gehen die hASH1-mRNAs in einen

translationsinaktiven Zustand über, wobei die Transkription jedoch unbeeinflusst bleibt.

5 Zusammenfassung

Eine Zelle muss die Zusammenstellung ihres Proteinrepertoires entsprechend den

auftretenden Bedürfnissen qualitativ und quantitativ anpassen. Bei der Expression

eines Gens können neben der Kontrolle der Transkription seiner mRNA über den

Promotor noch vielfälltige weitere Mechanismen zum Tragen kommen. Diese so-

genannte posttranskriptionelle Kontrolle der Genexpression kann beispielsweise

über eine Veränderung der Prozessierung der mRNA, eine Anpassung der mRNA-

Stabilität oder eine Änderung der Translationseffizienz die Regulation über die

Transkription hinaus deutlich verstärken aber auch eine erheblich beschleunigte

Antwort der Zelle ermöglichen. Die für diese Art der Regulation verantwortlichen

Bereiche befinden sich vornehmlich in den untranslatierten Regionen der mRNA

(UTRs).

Der bHLH-Transkriptionsfaktor Achaete-Scute Homolog-1 (ASCL1, hASH1) hat

eine wichtige Funktion während der neuronalen Entwicklung. Er ist von Bedeutung

für die Differenzierung bzw. die Subtypspezifizierung von neuronalen Zellen. Jedoch

ist über seine direkte Regulation wenig bekannt. In silico-Analysen offenbarten

konservierte Bereiche sowie putative cis-Elemente in den überdurchschnittlich lan-

gen UTRs der hASH1-mRNA und legten ein Mitwirken von posttranskriptionellen

Mechanismen bei der hASH1-Regulation nahe. Diese Mechanismen sollten in dieser

Arbeit genauer untersucht werden.

Hierbei traten zwei verschiedene posttranskriptionelle Regulationsmechanismen

zutage. Unter Stimulierung mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) wird hASH1

in der humanen Neuroblastom-Zelllinie Kelly herabreguliert. Dabei geht der an-

fängliche schnelle hASH1-Abfall auf eine Destabilisierung seiner mRNA zurück.

Später übernimmt eine transkriptionelle Reprimierung die Hemmung von hASH1.

Insbesondere bei der Vermittlung des posttranskriptionellen Einflusses scheint dabei

Proteinkinase C (PKC) involviert zu sein.

Auch unter Hypoxie konnte eine Herabregulation von hASH1 in Kelly-Zellen beob-

achtet werden. Diese kommt jedoch vornehmlich durch eine Inhibition der Translati-

on zustande. Beide hASH1-UTRs scheinen jeweils für sich allein den Hypoxie-Effekt

vermitteln zu können, wobei wohl drei Differenzierungskontroll-Elemente (DICE)

für den Hypoxie-Einfluss auf die

-UTR der hASH1-mRNA verantwortlich sind.

Kapitel 5 Zusammenfassung

Bekannte Bindungsproteine für dieses Motiv sind das heterogene nukleäre Ribo-

nukleoprotein E1 (hnRNP-E1) und das heterogene nukleäre Ribonukleoprotein K

(hnRNP-K), welche schon mit der Stilllegung der Translation von bestimmten mR-

NAs beschrieben wurden. Diese reversible translationale Stilllegung von hASH1

ist möglicherweise ein Anzeichen bzw. Bedingung dafür, dass die Neuroblastom-

zellen in einen unreiferen Zustand wechseln, welcher bei Tumorzellen mit einer

stärkeren Ausprägung unerwünschter Eigenschaften, wie beispielsweise erhöhter

Überlebensrate und verbesserten Migrationseigenschaften der Zellen, einhergeht.

6 Summary

Cells have to change the composition of their protein inventory to adapt to changing

requirements. Gene expression can be controlled by the rate of transcription but also

by several posttranscriptional mechanisms. These mechanisms include, for example,

a change in mRNA stability, an alteration in mRNA processing as well as a change

in the translation rate of an mRNA. Due to these posttranscriptional mechanisms, a

cell is able to amplify its transcriptional response and also react to changing needs

in a faster way. The elements responsible for these control mechanisms are mainly

located in the untranslated regions of an mRNA (UTRs).

The bHLH transcription factor Achaete-scute complex homolog 1 (ASCL1, hASH1)

plays an important role during neuronal development. It is involved in differentiation

and subtype specification of neurons. However, knowledge about its regulation is

sparse. An in silico analysis revealed conserved regions as well as putative cis-

elements in its higher-than-average long UTRs. This suggests a participation of

posttranscriptional mechanisms in hASH1 regulation. The examination of this topic

was the aim of this study.

Two different mechanisms of posttranscriptional control were shown to be involved

in the regulation of hASH1. Under phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) adminis-

tration hASH1 is down-regulated in the human neuroblastoma cell line Kelly. At

first, the rapid, strong down-regulation is caused by a destabilization of its mRNA.

Under prolonged treatment, this down-regulation results also from transcriptional

repression. Protein kinase C (PKC) seems to be particularly involved in the posttran-

scriptional down-regulation of hASH1.

A down-regulation of hASH1 in Kelly cells was also be observed under hypoxic

conditions. But in this case, an inhibition of the translation of the hASH1 mRNA was

mainly responsible for this decline. Both hASH1 UTRs were able to down-regulate

hASH1 under hypoxia. Three differentiation control elements (DICE) appear to be

responsible for the influence of the 3

-UTR. Known binding proteins of DICE are

heterogeneous nuclear ribonucleoprotein E1 (hnRNP-E1) and heterogeneous nuclear

ribonucleoprotein K (hnRNP-K), which were previously shown to cause translational

arrest of certain mRNAs. This reversible arrest of hASH1 could be a prerequisite for

the neuroblastoma cells to acquire a less differentiated state, which is accompanied

Kapitel 6 Summary

by better survival rates or improved migratory abilities that are characteristics of

aggressive neuroblastomas.

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dieser Arbeit

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126

Danksagung

Hiermit möchte ich mich bei Prof.

Ulf Stahl

für die Unterstützung bei der Erstellung

dieser Arbeit, die Begutachtung selbiger sowie für die Leitung des Promotions-

verfahrens bedanken. Außerdem gilt mein Dank Prof.

Michael Fähling

für die

Begutachtung und exzellente Betreuung meiner Arbeit.

Bei Prof.

Holger Scholz

bedanke ich mich für die hilfreichen Anmerkungen und

Verbesserungsvorschläge. Zudem danke ich Prof.

Jochen Meier

für die Durchfüh-

rung der Versuche mit den primären Rattenzellen, sowie die Möglichkeit an der

Mitarbeit an einem Projekt seiner Arbeitsgruppe.

Ganz herzlich möchte ich mich auch bei allen Mitarbeitern des Instituts für Vegetative

Physiologie für die gute Arbeitsatmosphäre, die Hilfestellungen und die zahlreichen

Zuarbeiten bedanken. Dabei gilt mein besonderer Dank Frau

Regine Stöbe

und

Jeannette Werner

. Frau Dr.

Angela Skalweit

möchte ich zudem für die vorzügliche

Einarbeitung in die Lehre diverser vom Institut ausgerichteter Praktika danken.

Meinen lieben Eltern danke ich für die bemerkenswerte Unterstützung während der

Entstehung dieser Arbeit sowie die großartige Hilfe meines Vaters beim Editieren

dieser Arbeit.

127