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Einfluss von Ozon auf den

Allergengehalt von Graspollen

Von der Fakult¨

at f¨

ur Naturwissenschaften

der Universit¨

at Paderborn

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

Dr. rer. nat.

genehmigte Dissertation

von

Kristin Galler

aus

Bad Driburg

Paderborn, Mai 2003

Die vorliegende Dissertation wurde in der Zeit von Oktober 1998 bis Mai 2003 im

Fachgebiet Technische Chemie und Chemische Verfahrenstechnik der Universit¨

Paderborn angefertigt.

Referent: Prof. Dr. H.-J. Warnecke

Korreferent: Prof. Dr. H. Paradies

Tag der Abgabe: 30. 5.2003

Tag der m¨

undlichen Pr¨

ufung: 27.6.2003

Herrn Prof. Dr. H.-J. Warnecke danke ich f¨

ur die interessante, fach¨

ubergreifende

Themenstellung und die gew¨

ahrten Freir¨

aume bei der Bearbeitung der Arbeit.

Herrn Prof. Dr. H. Paradies danke ich f¨

ur die ¨

Ubernahme des Korreferates, die

Beratung bei biochemischen Fragestellungen und die vielen guten Anregungen.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. M. Weiß und allen Mitarbeitern des

sportmedizinischen Institutes, vor allem Dr. Ulrich Deppe, Dr. Maya Vangala,

Barbara G¨

otte und Michaela Langrock f¨

ur die Nutzung des Labors und die freund-

schaftliche Zusammenarbeit.

Dr. Peter Dapprich und Anke Holtzmann, FH Soest, FB Agrarwirtschaft danke

ich f¨

ur die Nutzung des Gew¨

achshauses, Betreuung der Pflanzen und Rat bei

allen Grasproblemen.

Der DSV, besonders Herrn Dr. Feuerstein, Herrn Dr. Bothe und Herrn Dr. Eick-

meyer danke ich f¨

ur Bereitstellung von Pflanzen und Saatgut und das Interesse

an meiner Arbeit.

Dem Landesumweltamt in Essen-Kettwich danke ich f¨

ur Nutzung der Begasungs-

kammern und die Betreuung der Pflanzen.

Frau D. Comisel danke ich f¨

ur jahrelange gute Zusammenarbeit und die M¨

oglich-

keit, Erfahrungen zu sammeln, die ich nicht missen m¨

ochte.

F¨

ur Hilfe bei allen biologischen Fragen, schweren Kisten und Korrekturlesen

m¨

ochte ich Dr. J¨

org-Thomas Franz danken.

F¨

ur die L¨

osung von Tex-Problemen, Tee, Kekse und viel Spaß w¨

ahrend der letz-

ten Jahre danke ich meinen B¨

urokollegen Hermann-Josef Post und Oliver Smits

sowie Joachim Kleine und Petra M¨

uller. Ohne euch w¨

are ich nie so weit gekom-

men.

Mein Dank gilt allen nicht namentlich genannten Mitarbeitern, die mir mit Rat

und Tat zur Seite gestanden haben. Sie trugen durch ein angenehmes Arbeitskli-

ma zum Gelingen dieser Arbeit bei.

Ganz besonders danke ich meinen Eltern f¨

ur ihre Unterst¨

utzung, meinen Schwes-

tern, die mich immer auf andere Gedanken bringen konnten, und Wolfgang.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Aufgabenstellung 1

2 Theoretische Grundlagen 3

2.1 Immunsystem und Allergien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.1.1 Das menschliche Immunsystem . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.1.2 Antik¨

orper und ihre Bindungseigenschaften . . . . . . . . . 4

2.1.3 Allergien............................ 6

2.1.4 Allergene und ihre Nomenklatur . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.1.5 Pollen ............................. 10

2.1.6 Allergene des Weidelgrases . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.2 Erh¨

ohte Ozonwerte und ihre Auswirkungen auf Pflanzen . . . . . 16

2.2.1 Erh¨

ohteOzonwerte...................... 16

2.2.2 Auftreten von erh¨

ohten Ozonwerten . . . . . . . . . . . . . 17

2.2.3 Auswirkungen von erh¨

ohten Ozonwerten auf Pflanzen . . . 18

2.2.4 Ozonsch¨

aden an Weidelgras . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.2.5 Pollen und Luftschadstoffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.2.6 Ozonsch¨

aden an Weidelgraspollen . . . . . . . . . . . . . . 21

3 Material und Methoden 24

3.1 Ozonisierungskammern und Pflanzenmaterial . . . . . . . . . . . . 24

3.1.1 Begasungskammern LUA Essen . . . . . . . . . . . . . . . 24

3.1.2 Begasungskammern Paderborn . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.2 Biochemische Analytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.2.1 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) . . . . . . . 30

3.2.2 Bestimmung des Gesamtproteingehaltes . . . . . . . . . . 31

3.2.3 Elektrophorese ........................ 32

3.2.4 Kapillarelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.2.5 Proteinf¨

arbunginGelen ................... 36

3.2.6 Blotting ............................ 37

3.2.7 FTIR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.2.8 Extraktion........................... 41

3.3 Pflanzenmaterial ........................... 42

INHALTSVERZEICHNIS ii

4 Ergebnisse und Diskussion 44

4.1 Protein- und Allergengehalt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.1.1 Klimakammern Paderborn . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.1.2 Klimakammern Essen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.1.3 Fazit.............................. 47

4.2 SDS-Gelelektrophorese und Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.2.1 Nachweis der Allergene im Gel . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.2.2 Vergleich ozonisierte und Kontrollextrakte . . . . . . . . . 51

4.3 Kapillarelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.3.1 Methodenentwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.3.2 Versuche zur Identifizierung von Allergenen im Elektrophe-

rogramm............................ 55

4.3.3 Vergleich von ozonisierten und Kontrollextrakten . . . . . 57

4.3.4 Fazit.............................. 60

4.4 FTIR.................................. 61

4.4.1 Spektren............................ 61

4.4.2 Vergleich begaste - unbegaste Probe . . . . . . . . . . . . . 62

4.4.3 Fazit.............................. 65

5 Zusammenfassung und Ausblick 67

A Abk¨

urzungsverzeichnis 70

B Begasungsversuche und Pflanzen 71

B.0.4 Lolium multiflorum ...................... 71

B.0.5 Lolium perenne ........................ 71

B.0.6 Lolium westerwoldicum .................... 71

B.0.7 Verwendete Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

B.0.8 Lampen in den Klimakammern . . . . . . . . . . . . . . . 72

B.0.9 Kalibrierung der Feuchtesensoren . . . . . . . . . . . . . . 73

C Versuchsdurchf¨

uhrungen 74

C.1 Extraktion der Pollen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

C.2 Proteingesamtbestimmung (Lowry-Test) . . . . . . . . . . . . . . 74

C.3 ELISA................................. 75

C.4 Denaturierende, nicht reduzierende SDS-Gelelektrophorese . . . . 76

C.4.1 Puffer ............................. 76

C.4.2 GießendesGels........................ 76

C.4.3 Vorbereitung der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

C.4.4 Durchf¨

uhrung der Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . . 77

C.5 Kolloidale Coomassief¨

arbung..................... 77

C.6 Westernblot im Anschluss an die Gelektrophorese . . . . . . . . . 78

C.6.1 Semidry ............................ 78

INHALTSVERZEICHNIS iii

C.6.2 Kapillarblot.......................... 79

C.7 Immunchemische Detektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

C.8 Kapillarelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

C.9 FTIR.................................. 81

C.10 Chemikalien und Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

Literaturverzeichnis 83

Kapitel 1

Einleitung und Aufgabenstellung

Allergien z¨

ahlen in den Industriel¨

andern zu den h¨

aufigsten Krankheiten. Haupt-

ausl¨

oser sind neben Milben (ganzj¨

ahrig) vor allem Pollen von Gr¨

asern und

B¨

aumen (saisonale Allergie). Nach Sch¨

atzungen des ¨

Arzteverbandes deutscher

Allergologen [1] leiden ca. 12 Millionen Deutsche an einer Pollenallergie. Bei

etwa 40 % der Betroffenen entsteht daraus ein Bronchialasthma.

In den letzten Jahrzehnten beobachtet man einen Anstieg der Allergieh¨

aufigkeit,

was auf verschiedene Ursachen zur¨

uckgef¨

uhrt wird. Zum einen f¨

uhren ver¨

anderte

Lebensbedingungen wie mehr Hygiene, weniger Kinderkrankheiten und Parasiten

dazu, dass das Immunsystem weniger gefordert ist. Es kann dann, vor allem bei

genetisch daf¨

ur veranlagten Menschen, auf eigentlich harmlose Stoffe mit einer

Allergie reagieren.

Zum anderen k¨

onnen auch Umweltschadstoffe wie Stickoxide, Ozon oder

Rußpartikel zu Reizungen der Atemwege und damit zu erh¨

ohter Anf¨

alligkeit

f¨

uhren. Luftschadstoffe ”alten Typs“ (SO2, Rußpartikel) der sogenannten Klasse

I f¨

uhren u.a. zu Bronchialerkrankungen. Typisches Beispiel hierf¨

ur war die

DDR. Bronchitis war dort die Hauptatemwegserkrankung, Allergien waren weit

weniger verbreitet als in Westdeutschland, wo Luftverschmutzung vom Typ II

(NOx, Photooxidantien wie Ozon) vorherrschte. In den Jahren nach der Wieder-

vereinigung glichen sich sowohl Luftverschmutzung als auch Allergieh¨

aufigkeit

in Ostdeutschland den Werten der westlichen L¨

ander an [2]. Auswirkungen

von Photooxidantien sind dabei haupts¨

achlich auf Ozon zur¨

uckzuf¨

uhren. Es

ist nachgewiesen, dass Ozon die Lungenfunktion und die Atemwege negativ

beeinflusst [3]. Es kann bei bereits sensibilisierten Individuen die Wirkung von

Allergenen verst¨

arken, eine erh¨

ohte Sensibilisierungsrate unter Ozoneinfluss

konnte aber nicht nachgewiesen werden.

Pollen kommen, w¨

ahrend sie vom Wind transportiert werden, mit Luftschad-

stoffen in Ber¨

uhrung. An ihrer Oberfl¨

ache k¨

onnen sich Partikel anlagern, die

dann gemeinsam mit dem Pollen in die Atemwege gelangen. Gleichzeitig k¨

onnen

KAPITEL 1. EINLEITUNG UND AUFGABENSTELLUNG 2

Pflanzen:

Wachstum

und

Pollenreifung

Pollen in der Atmosphäre

Allergene Aerosole

Menschlicher

Organismus

Luftschadstoffe,

Klimafaktoren

Stress / Schädigung

Anlagerung

Reaktion

Mögliche Änderung: Allergengehalt,

Struktur der Allergene,

Pollenmenge,

Morphologie

Anlagerung von

Allergenen an

Partikeln,

Partikel an Pollen

Änderung von Morphologie,

Allergenfreisetzung

Abbildung 1.1: Auswirkungen von Schadstoffen auf Mensch und Pflanze

sich durch Feuchtigkeit freigesetzte Allergene an den Partikeln anlagern. Kontakt

mit Schadgasen kann zu Ver¨

anderungen der Pollenoberfl¨

ache und damit der

Allergenfreisetzung f¨

uhren [4].

Umweltverschmutzung sch¨

adigt neben dem Menschen auch Fauna und Flora.

W¨

ahrend des Wachstums und der Bl¨

uhperiode der meisten Pflanzen im Sommer

treten erh¨

ohte Ozonwerte auf, die f¨

ur die Pflanzen oxidativen Stress bedeuten

und zu ¨

Anderungen in ihrem Stoffwechsel f¨

uhren k¨

onnen. Das kann vermehrte

Bildung von Hormonen oder ”Stressproteinen“ verursachen. In Versuchen an

Birken [5] wurde eine ¨

Ahnlichkeit des Majorallergens Bet v 1 mit Stressproteinen

von Bohne und Petersilie festgestellt. Dies ist ein Hinweis auf eine verst¨

arkte

Expression dieser allergenen Proteine unter Stress. Diese Reaktionen der Pflanze

verbrauchen Energie, so dass weniger f¨

ur den Aufbau von Biomasse oder Pollen

zur Verf¨

ugung steht. K¨

onnen die Abwehrmechanismen den oxidativen Stress

nicht mehr kompensieren, treten Sch¨

aden an den Pflanzen auf, die Auswirkungen

auf Pollenmenge und Einlagerung von Allergenen haben k¨

onnen.

Masuch et al. [6] und Hayek et al. [7] konnten erste Beweise f¨

ur das Auftreten

von erh¨

ohtem Allergengehalt in Gras- bzw. Getreidepollen unter Ozoneinfluss

anf¨

uhren. Die vorliegende Arbeit soll diese Ergebnisse absichern und zur weiteren

Kl¨

arung des Einflusses von Ozonbelastung auf den Allergengehalt von Pollen

beitragen.

Kapitel 2

Theoretische Grundlagen

2.1 Immunsystem und Allergien

2.1.1 Das menschliche Immunsystem

Die Aufgabe des Immunsystems umfasst den Schutz des K¨

orpers vor Viren,

Bakterien und sonstigen Fremdk¨

orpern. Toleranz gegen k¨

orpereigene Stoffe ist

dabei besonders wichtig. Fehlt sie, kommt es zu Autoimmunerkrankungen wie

multibler Sklerose oder rheumatischer Arthritis. Reagiert das Immunsystem auf

eigentlich ungef¨

ahrliche Stoffe, entstehen Allergien.

Die wichtigsten Zellen f¨

ur das Immunsystem sind die Lymphozyten, eine Gruppe

weißer Blutk¨

orperchen. Sie gliedern sich in B-Lymphozyten, auch B-Zellen

genannt, die im Knochenmark heranreifen, und T-Lymphozyten, die im Thymus

reifen. B-Zellen produzieren die Antik¨

orper oder Immunglobuline wie IgM, IgG

und IgE. Die Antik¨

orper sind dann auf der Oberfl¨

ache der B-Zellen gebunden

oder zirkulieren frei in der Blutbahn. Jeder Antik¨

orper bindet spezifisch an

Strukturen (Epitope) auf einem bestimmtem Antigen nach dem Schl¨

ussel-

Schloss-Prinzip.

Um mit der riesigen Menge von verschiedenen Fremdstoffen, die der K¨

orper

abwehren muss, fertig werden zu k¨

onnen, m¨

ussen auch große Variationsm¨

oglich-

keiten f¨

ur die Antik¨

orper gegeben sein. Dazu arbeiten die B-Zellen mit

Rekombination und Mutation der Antik¨

orpergene und k¨

onnen so ¨

uber eine

Million Antik¨

orpervariationen produzieren. Im reifen Zustand entsteht in

jeder B-Zelle nur ein Antik¨

orpertyp, der auf der Zelloberfl¨

ache sitzt. Trifft ein

passendes Antigen auf die Zelle und wird vom Antik¨

orper gebunden, wird die

Zelle aktiv, teilt sich und produziert bis zu 20 Millionen Antik¨

orper pro Stunde.

Die Antik¨

orper neutralisieren zum Beispiel Viren im Blut, indem sie sich an sie

binden, die Andockstellen an gesunde Zellen blockieren und so die Infizierung

von weiteren Zellen verhindern.

Ein wichtiger Faktor des Immunsystems, an dem die Antik¨

orper beteiligt sind,

ist das Komplementsystem. Binden Antik¨

orper an Zellen oder an Bakterien,

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 4

werden Enzymen im Blut aktiv, die sogenannten Komplementfaktoren. Sie

binden an die Antik¨

orper, erkennen so die Bakterien bzw. Zellen und t¨

oten sie,

indem sie die Zellmenbran durchl¨

ochern. Die Makrophagen (Fresszellen) haben

ein ¨

ahnliches Erkennungssystem und t¨

oten markierte Zellen [8].

2.1.1.1 Die zellul¨

are Immunantwort

Die zellul¨

are Immunantwort ist gegen Viren und Mikroben gerichtet, die Zellen

infiziert haben und sich in ihnen ”verstecken“. Es gibt einen Mechanismus, der im

ersten Schritt infizierte Zellen identifiziert und im zweiten Schritt Abwehrzellen

dagegen mobilisiert. Wichtig sind hierbei die von fast allen Zellen produzier-

ten MHC-Molek¨

ule (Major histocompatibility complex). Klasse-1-MHC kommen

in allen K¨

orperzellen vor, MHC der Klasse 2 nur in Zellen des Immunsystems.

Sie transportieren Peptide von infekti¨

osen Erregern aus der Zelle an die Zell-

oberfl¨

ache. Diese Komplexe werden von T-Lymphozyten erkannt. Virusinfizier-

te Zellen pr¨

asentieren virale Proteinfragmente zusammen mit MHC-1 auf ihrer

Oberfl¨

ache. Eine Unterart der T-Zelle, der T8-Lymphozyt oder die Zytotoxische

Zelle mit dem passenden Rezeptor t¨

otet die infizierte Zelle ab, so dass sie keine

weiteren Viren produzieren kann. T4-Zellen erkennen Proteinfragmente zusam-

men mit MHC-2 Molek¨

ulen. Sie rufen Entz¨

undungen hervor und stimulieren die

Makrophagen zur Selbstverteidigung.

Eine weitere Untergruppe von T4-Zellen, die T-Helferzellen, steuern die B-Lym-

phozyten. Bindet ein Fremdmolek¨

ul an die oberfl¨

achengebundenen Antik¨

orper

auf einer B-Zelle, wird es ins Zellinnere transportiert, zerlegt und von MHC-2

auf der Zellmembran pr¨

asentiert. Die T4-Helferzelle bindet an diesen Komplex

und signalisiert der B-Zelle durch Botenstoffe, dass sie sich stark vermehren und

Antik¨

orper ins Blut aussch¨

utten soll.

Insgesamt ist bis jetzt aber erst ein Teil des komplizierten Zusammenspiels der

Zellen des Immunsystems verstanden [9].

2.1.2 Antik¨

orper und ihre Bindungseigenschaften

Es gibt beim Menschen f¨

unf Antik¨

orpertypen, Immunglobulin A (IgA), Im-

munglobulin D (IgD), Immunglobulin E (IgE), Immunglobulin G (IgG) und Im-

munglobulin M (IgM). Sie bestehen alle aus einer variablen Region, die f¨

ur die

Bindung der verschiedenen Antigene zust¨

andig ist und einer konstanten Region,

die den Wirkungs- oder Effektormechanismus, zum Beispiel die Bindung an eine

Zelle, erm¨

oglicht. Die Grundeinheiten der Immunglobuline bilden zwei schwere

Ketten, (Index H, heavy chain) mit Molmassen von je 50 kD und zwei leichte

Ketten (Index l, light chain) mit Molmassen von je 25 kD. Sie sind ¨

uber Disul-

fidbr¨

ucken miteinander verkn¨

upft. Inzwischen sind viele Aminos¨

auresequenzen

der Ketten bekannt. Jede besteht aus Untereinheiten von 110 Aminos¨

auren, die

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 5

leichten Ketten enthalten davon 2, die schweren 4 (Cx1-Cx4). Das x steht hier als

Abk¨

urzung f¨

ur den Antik¨

orpertyp, z.B. f¨

ur IgE oder µf¨

ur IgM.

Die aminoterminalen Sequenzen der Antik¨

orper unterscheiden sich stark vonein-

ander. In dieser variablen Region liegen die Antigenbindungsstellen, die Paratope.

Die c-terminalen Untereinheiten sind bez¨

uglich der Zusammensetzung fast kon-

stant. Hier sind auch Kohlenhydratketten angelagert.

Die verschiedenen Antik¨

orpertypen unterscheiden sich in der konstanten Region.

Bei IgE und IgM gibt es zum Beispiel keine Gelenkregion, daf¨

ur eine zus¨

atzliche

Dom¨

ane im konstanten Bereich. Auch die Kohlenhydratgruppen sind unterschied-

lich angeordnet. IgM und IgA k¨

onnen Polymere bilden, IgM vorwiegend Pentame-

re, IgM Dimere. Dadurch bindet IgM besser an sich wiederholende Epitope wie

bakterielle Zellwandpolymere, bei IgA scheint Dimerisierung den ¨

Ubergang durch

die Epithelien zu erleichtern. IgA ist wichtig f¨

ur die Immunit¨

at der Mukosa, IgM

und IgG k¨

onnen das Komplementsystem aktivieren. Die Funktion des IgD ist

noch unbekannt. IgE scheint f¨

ur die Abwehr von Parasiten von Bedeutung zu

sein.

Allergien vom Soforttyp laufen ¨

uber das IgE ab. Es wurde erst 1967 von Jo-

hansson [10] und Ishizaka [11] entdeckt, da es nur in einer Konzentration von

17-450 ng/ml im Serum enthalten ist.

2.1.2.1 Epitope

Die Bindung zwischen Paratop und Epitop beruht auf verschiedenen Prinzipien:

•Wasserstoffbr¨

uckenbindungen,

•Ionenbindung,

•van der Waals Kr¨

afte

•und hydrophobe Wechselwirkungen [12].

Die Affinit¨

at der Bindung kann sehr unterschiedlich sein. Homologe Antigen-

Antik¨

orper-Komplexe mit artspezifischen Antik¨

orpern binden am st¨

arksten. He-

terogene Komplexe mit kreuzreaktiven Antigenen zeigen eine geringere Passge-

nauigkeit, da sie mit dem spezifischen Antigen nur verwandt und nicht chemisch

identisch sind.

Man unterscheidet sequenzielle (oder kontinuierliche) Epitope, die aus 5-8 Ami-

nos¨

auren, die unmittelbar nacheinander auf dem Peptidstrang liegen, und kon-

formationsbedingte, diskontinuierliche Epitope, die durch die Faltungen der drei-

dimensionalen Struktur der Proteine zustandekommen.

Die Spezifit¨

at einer Antigen-Antik¨

orperbindung ist abh¨

angig von der Bindungs-

st¨

arke (Avidit¨

at) und setzt sich zusammen aus:

1. der Affinit¨

at, der monovalenten Bindungsst¨

arke zwischen Paratop und Epi-

top, die ¨

uber die Gleichgewichtskonstante bestimmt wird,

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 6

2. der Multivalenz eines Antik¨

orpers und

3. der Fc-Assoziation von unterschiedlichen Ig-Molek¨

ulen zur Antik¨

orperbin-

dung.

Die Avidit¨

at ist ein eher funktioneller Begriff, der nur ¨

uber die Geschwindigkeit

der Antigen-Antik¨

orperreaktion zu bestimmen ist.

2.1.2.2 Proteine

Proteine sind hochmolekulare Naturstoffe, die aus den 20 nat¨

urlich vorkom-

menden L-Aminos¨

auren aufgebaut sind. Die Sequenz der Aminos¨

auren wird als

Prim¨

arstruktur bezeichnet und ist genetisch vorgegeben. Bei der ribosomalen Pro-

teinbiosynthese wird nach den Informationen, die in der DNA codiert sind, diese

Sequenz aufgebaut. Anschließend sind posttranslative Modifikationen wie Glyko-

sylierung m¨

oglich. Das Ende der Aminos¨

aurekette, das die freie α-Aminogruppe

tr¨

agt, wird als N-Terminus bezeichnet, der C-Terminus hat die Carbons¨

aurefunk-

tion.

Wichtig f¨

ur die physiologischen und chemischen Eigenschaften der Proteine ist

ihre dreidimensionale Struktur. Als Sekund¨

ar- und Terti¨

arstruktur bezeichnet

man periodisch wiederkehrende Faltungen wie die α-Helix oder das β-Faltblatt,

die durch Wasserstoffbr¨

ucken stabilisiert sind. Besteht ein Protein aus mehreren

Peptidstr¨

angen (Untereinheiten), bezeichnet man das als Quart¨

arstruktur. Sie

wird durch Disulfidbr¨

ucken zwischen zwei Cysteinresten, Wasserstoffbr¨

ucken, hy-

drophobe und ionische Wechselwirkungen zwischen den Aminos¨

aureseitenketten

stabilisiert.

Die Struktur der Proteine ist empfindlich gegen ¨

Anderungen von z.B. Tempera-

tur, UV-Bestrahlung, pH-¨

Anderung und Ver¨

anderungen im Salzgehalt [13]. Da-

durch kann es zu einer reversiblen (Um-)faltung mit Verlust der biologischen Akti-

vit¨

at kommen (Ausf¨

allung durch organische L¨

osemittel, Aussalzen). Es kann auch

zur irreversiblen Denaturierung der Proteine, z.B. durch W¨

arme kommen [14].

Da Proteine sowohl saure als auch basische Gruppen im selben Molek¨

ul enthalten,

haben sie amphotere Eigenschaften. Der pH-Wert, bei dem ihre Ladung neutral

ist, wird als isoelektrischer Punkt (pI) bezeichnet.

Proteine erf¨

ullen zahlreichen Aufgaben im Organismus. Es gibt Enzyme, Trans-

portproteine, N¨

ahrstoff- und Speicherproteine, Strukturproteine und Abwehrstof-

fe wie die Immunglobuline. Sie k¨

onnen mit verschiedenen chemischen Komponen-

ten konjugiert sein, wie Lipiden (Lipoproteine), Zuckergruppen (Glykoproteine),

Metallatomen (Metalloproteine) oder Minerals¨

auren [12].

2.1.3 Allergien

Als Allergie [8, 15] bezeichnet man eine ¨

Uberreaktion des Immunsystems

auf einen im Prinzip harmlosen Stoff. Schnell nach Kontakt mit einem al-

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 7

lergieausl¨

osenden Stoff (Allergen) auftretende Reaktionen, Reaktionen des

Soforttyps, werden vom IgE vermittelt. Sie f¨

uhren durch Mastzellaktivierung zu

den typischen Entz¨

undungsreaktionen.

Der typische Ablauf ist folgender: Nach Erstkontakt mit dem Allergen werden

die Fremdmolek¨

ule von Makrophagen aufgenommen und auf ihrer Oberfl¨

ache

pr¨

asentiert. Eine Gruppe von T-Helferzellen erkennt diese Komplexe und sch¨

uttet

Botenstoffe wie z.B. Interleukin 4 aus, die benachbarte B-Zellen, die das Antigen

auch erkannt haben, zur Produktion von spezifischen IgE-Molek¨

ulen anregen.

Diese binden an den Oberfl¨

achen von Mastzellen und basophilen Granulozyten.

Diese Sensibilisierungsphase dauert oft mehrere Jahre, und es erfolgt immer

wieder Kontakt mit dem Antigen, ohne dass eine Erkrankung sichtbar wird.

B-Lymphozyt

Antigen

Spezifisches IgE

Erstkontakt mit Antigen

Zweitkontakt mit dem Antigen

Vernetzung der

gebundenen IgE

Histamin

Mastzellaktivierung

Freisetzung von

Entzündungsmediatoren

1. Beim Kontakt mit Allergen bildet der B-Lym-

phozyt spezifisches IgE

2. Das IgE bindet auf der Oberfläche der

Mastzellen

3. Bei erneutem Allergenkontakt vernetzen

die gebundenen IgEs

4. Entzündungsmediatoren wie Histamin

werden freigesetzt

Mastzelle

IgE Fc RI

IgE-Bindung an

Fc RI auf Mastzellen

Abbildung 2.1: Mechanismus der Typ 1 Allergie

Das passiert erst, wenn ein ausreichend hoher IgE-Spiegel erreicht ist. Bei er-

neutem Allergenkontakt reagiert das Allergen mit dem zellgebundenen IgE, das

vernetzt und die Mastzellen zur Aussch¨

uttung von Histamin anregt. Dieser

Entz¨

undungsmediator l¨

ost Symptome wie Schnupfen, Asthma und tr¨

anende Au-

gen aus. Die Art der Symptome h¨

angt von der Art der Antigenaufnahme ab. Bei

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 8

intraven¨

oser Aufnahme (Medizin, Serum, Gifte) kann es zu systemischer Anaphy-

laxie kommen, bei subkutanem Eintritt (Allergietest, Insektenstiche) zu Quaddel-

bildung, bei oraler Aufnahme (Nahrungsmittelallergie) zu Erbrechen, Durchfall

und Urtikaria und bei inhalativer Aufnahme (Pollen, Milbenallergie) zu Heu-

schnupfen bis hin zu Asthma bronchiale.

Nicht alle Individuen reagieren auf Allergenkontakt mit einer allergischen Reak-

tion. Voraussetzung hierf¨

ur ist zum einen eine genetische Disposition. Den Aller-

gikern gemeinsam ist ein erh¨

ohter IgE-Spiegel, der genau wie die F¨

ahigkeit zur

Bildung von Antik¨

orpern gegen Antigene aus speziellen Pflanzengattungen wie

z.B. Pollen von Ambrosia vererbt wird. Normalerweise betr¨

agt der Gehalt an IgE

im Blut 1 mg/ml, bei schwerer Atopie (oder bei Wurminfektionen) kann er bis auf

1000 mg/ml ansteigen. Atopiker produzieren nach Allergenkontakt IgE; w¨

ahrend

bei ”gesunden“ Individuen IgM, IgG und nur Spuren von IgE gebildet werden.

Sie zeigen eine h¨

ohere Anzahl von Fc-Rezeptoren und davon ist eine gr¨

ossere

Zahl mit IgE belegt als bei Nichtatopikern.

2.1.4 Allergene und ihre Nomenklatur

Allergien werden haupts¨

achlich von Proteinen und Polypeptiden verursacht, ob-

wohl auch Glyco- und Lipoproteine und Polysaccharide als Allergene agieren

k¨

onnen. Dabei reagieren Atopiker nur auf wenige der tausend Proteine, die sie

t¨

aglich aufnehmen. Was ein potentes Allergen auszeichnet, ist noch nicht gekl¨

art,

es gibt aber Voraussetzungen, die f¨

ur alle allergieausl¨

osenden Stoffe gelten.

Nur Proteine l¨

osen eine T-Zellantwort aus, deshalb muss eine Eiweißkomponente

vorhanden sein. Die Allergene diffundieren in die Schleimhaut des Menschen, sie

sollten also leicht wasserl¨

oslich sein und ein nicht zu hohes Molekulargewicht (ca.

5000-100000 Da) haben. Aminos¨

auren und kleinere Peptide sind normalerweise

nicht immunogen. Zudem wirken nur Molek¨

ule mit einer gewissen Komplexit¨

als Allergene. Polymerisierte Monoaminos¨

auren sind nicht allergen. Statistisch

gesehen weisen solche Epitope einen hohen ”Antigenindex“ auf, die eher hydro-

phile Aminos¨

auren enthalten, an der Oberfl¨

ache liegen und sich aus verschiedenen

Komponenten zusammensetzen. Sie zeigen wenig β-Faltblattstrukturen und ent-

halten geh¨

auft L-Prolin und L-Glycin [16].

Allergene treffen nur in geringen Dosen auf unser Immunsystem. Bei Pollen wur-

den wenige µg pro Tag berechnet, das sind 0,06 µg allergenes Protein pro Jahr.

Diese geringe Konzentration beg¨

unstigt die Aktivierung von Il-4 (Interleukin 4)

produzierenden CD4-T-Helferzellen.

Einige gut charakterisierte Allergene zeigen Proteaseaktivit¨

at. Das kann dazu

beitragen, dass sie in die Schleimhaut eindringen und CD4-T-Helferzellen akti-

vieren. Einige Proteine werden physiologisch von Adjuventien begleitet, die die

IgE-Synthese beg¨

unstigen. Eine große evolution¨

are Distanz und damit chemi-

sche Differenz zwischen antigen- und antik¨

orperbildendem Individuum scheint

ein weiterer beg¨

unstigender Faktor bei Ausbildung von Allergien zu sein. Um

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 9

die Vernetzung von IgE zu verursachen, ben¨

otigt ein Protein zwei (verschiedene)

IgE-bindende Epitope [17].

Die Allergenit¨

at eines Proteins ist noch schwierig vorherzusagen. Die Analyse von

vierzig Allergenen mit bekannter Struktur zeigt, dass sie fast alle vier Struktur-

familien zugeordnet werden k¨

onnen.

1. Antiparallele β-Str¨

ange: die immunglobulin¨

ahnlich-gefaltete Familie, z.B.

Gras Gruppe 2, Milbe Gruppe 2, Serin Proteasen wie Milbe Gruppe 3, 6

und 9 und Soybean-type Trypsin-Inhibitoren (Ole e 1)

2. Antiparallele β-Faltbl¨

atter direkt verbunden mit einer oder mehr α-Helices:

B¨

aume Gruppe 1, Lipocalin, Profilin, K¨

uchenschabe Gruppe 2

3. α+β-Strukturen, in denen die α- und β-Strukturelemente nicht direkt ver-

bunden sind, wie Milbe Gruppe 1, Lysozym, Lactalbumin, Vespid (Wespe)-

Gruppe 5

4. α-Helices: Fel d 1, Pollen Calmodulin [18]

Auch in diesen Untersuchungen konnten keine f¨

ur Allergene charakteristischen

strukturellen Eigenschaften nachgewiesen werden. Selbst wenn ein Protein einer

der oben genannten Gruppen angeh¨

ort, bedeutet das nicht, dass es ein Allergen

ist.

2.1.4.1 Nomenklatur

Allergene werden gem¨

aß den Regeln der WHO/IUIS (World Health Organisati-

on) (International Union of Immunological Societies) Allergen Nomenklatur [19]

nach den taxonomischen Namen ihrer Quellen bezeichnet. Zuerst kommen die

ersten drei Buchstaben der Gattung, dann der erste Buchstabe der Art und eine

Nummer. Die Nummern werden in der Reihenfolge der Entdeckung des Molek¨

uls

vergeben, dieselbe Nummer wird f¨

ur homologe Allergene aus verwandten Spezi-

es verwendet. Das zuerst entdeckte Allergen des Weidelgrases (Lolium perenne)

heißt demnach Lol p 1, das homologe Protein aus Wiesenlischgras (Phleum pra-

tense) Phl p 1. Reichen die ersten drei bzw. der erste Buchstabe nicht aus, um

die Art oder die Gattung eindeutig anzugeben, wird ein weiterer Buchstabe an-

geh¨

angt, z.B. bei den Wespenallergenen (Vespula vidula Ves vi x und Vespula

vulgaris Ves v x).

Molek¨

ule, auf die mehr als 50 % der Patienten allergisch reagieren, werden als

Majorallergene bezeichnet, auf Minorallergene reagieren nur weniger als 10 % der

Allergiker. Bei verwandten Allergenquellen (Gr¨

asern, Milben usw.) gibt es kreuz-

reaktive Proteine, das heißt, Patienten, die auf eine Art reagieren, reagieren auch

auf die Verwandte, obwohl sie zuvor noch nie Kontakt mit der Spezies hatten.

Antik¨

orper gegen Proteine aus Art 1 binden auch die Proteine der zweiten Art

uber gleiche oder ¨

ahnliche Epitope. Die Pollen vieler Grasarten enthalten z.B.

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 10

ein Protein, das mit Antik¨

orpern gegen Phl p 5 reagiert. Diese Allergene werden

zusammengefasst als ”Gruppe 5-Allergene“ bezeichnet. Die Zusammenfassung

in einer Gruppe beruht vor allem auf ¨

ahnlichen immunologischen Eigenschaften

(Antik¨

orperbindung) und auf ¨

ahnlichen molekularen Massen.

Ein Allergen einer Spezies kann aus mehreren Isoallergenen bestehen. Sie sind

anhand der molekularen Masse nicht zu unterscheiden und werden auch von den-

selben Antik¨

orpern erkannt. Sie haben aber verschiedene isoelektrische Punkte

und unterschiedliche Aminos¨

auresequenzen. Bei einer Sequenzidentit¨

at von 67 %

oder dar¨

uber gelten zwei Proteine als Isoallergene, es gibt aber Ausnahmen und

Grenzf¨

alle [20].

2.1.5 Pollen

Pollen sind die Tr¨

ager des m¨

annlichen Erbguts einer Pflanze. Die Verbreitung

kann ¨

uber Bienen und andere Insekten erfolgen; in diesem Fall sind die Pollen

relativ groß und haften am K¨

orper der Tiere, von denen sie weitergetragen

werden. Insektenbest¨

aubte Pflanzen haben meist bunte, duftende Bl¨

uten. Ihre

Pollen verursachen nur wenige Allergien. F¨

ur den Allergiker relevant sind die

Pollen der windbest¨

aubten (anemophilen) Pflanzen. Sie sind klein, werden durch

die Luft transportiert und vom Menschen eingeatmet. Windbest¨

aubt sind etwa

ein Zehntel der 250 000 Pollenproduzenten, zum Beispiel B¨

aume wie Birke und

Erle, Kr¨

auter, Gr¨

aser und Getreide. Sie produzieren Pollen in großen Mengen.

So enth¨

alt eine Roggen¨

ahre bis zu 4,2 Millionen Pollenk¨

orner [21]. Die K¨

orner

k¨

onnen ¨

uber weite Strecken transportiert werden, Graspollen fliegen bei einem

Wind von 10 m/s bis zu 175 km weit.

2.1.5.1 Aufbau eines Pollenkorns

Pollen sind von einer sehr stabilen Doppelschicht umgeben. Die ¨

außere H¨

ulle, die

Exine, zeigt eine artspezifische Morphologie und besteht aus dem lipophilen Spo-

ropollein, das sehr restistent gegen ¨

außere Einfl¨

usse ist. Pollen k¨

onnen deshalb

mehrere hundert Jahre unbesch¨

adigt ¨

uberstehen. Die innere Schicht, die Intine,

umschließt das Cytoplasma mit den Zellorganellen wie Kern, St¨

arkek¨

orner und

Polysaccaridpartikel. In der Exine gibt es Mikrokan¨

ale, die Exine und Intine ver-

binden, und Poren (bei Gr¨

asern eine), durch die das Pollenschlauchwachstum

m¨

oglich ist [22].

Pollen enthalten etwa 37 % ( [24], keine Einheitsangabe, vermutlich w/w) Koh-

lenhydrat, 20 % Protein, 4 % Lipide, 3 % Mineralien und 36 % Wasser. Wel-

cher Anteil von diesen Komponenten bei w¨

assriger Extraktion in L¨

osung geht,

ist nicht bekannt. St¨

arke wird w¨

ahrend der Pollenentwicklung eingelagert. Bei

Lolium perenne enth¨

alt der reife Pollen nur Amyloplasten mit einem einzelnen

St¨

arkekorn. Auch l¨

osliche Zucker wie Glukose, Fruktose und Sucrose konnten in

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 11

Stärkekörner

Polysaccharid-

partikel

Cytoplasma

Intine

Exine

Abbildung 2.2: Aufbau eines Pollenkorns [23]

Pollen verschiedener Arten nachgewiesen werden [25]. Sie k¨

onnen durch Abbau

der St¨

arke entstehen und h¨

angen mit der Dehydrierung der Pollen zusammen [26].

Die Lokalisation der Allergen in den Pollen ist schwierig, da eine streng wasser-

freie Fixierung notwendig ist, um zu verhindern, dass die wasserl¨

oslichen Allerge-

ne sofort ausgewaschen werden [27]. Allergenfreisetzung erfolgt bei Kontakt mit

Feuchtigkeit, zum Beispiel auf der menschlichen Schleimhaut. Osmotische Kr¨

afte

f¨

uhren zur Freisetzung von St¨

arkek¨

ornern (Amyloplasten) durch die Pore. Die-

se Partikel tragen Allergene an ihrer Oberfl¨

ache [28]. Bei hoher Luftfeuchte und

Regen entsteht ein allergenhaltiges Aerosol in der Luft. Liegen in diesem Aero-

sol Kohlenstoffpartikel (z.B. Dieselruß) vor, k¨

onnen Allergenmolek¨

ule an diese

binden und so eingeatmet werden [29]. Zus¨

atzlich enthalten die Pollen Enzy-

me (Proteasen, Glucosidasen, Lyasen [30]), die die Ephithelzellen der Atemwege

sch¨

adigen k¨

onnen [31]. Die Aktivit¨

at solcher Proteasen konnte in Graspollenex-

trakten nachgewiesen werden [32]. Petersen et al. vermuten, dass Phl p 1 in dieser

Weise wirkt [33].

Die Menge an Allergen im Pollen kann durchaus unterschiedlich sein [34],

abh¨

angig vom Jahr der Pollenernte. Genauso schwankt der Gehalt an Zucker.

2.1.5.2 Entwicklung des Pollens

Acht Stadien der Pollenentwicklung wurden wie folgt definiert [35]:

1. Tetradenstadium, Dauer etwa 5 Tage

2. freie Spore: Mikrosporen (Keimzellen) mit d¨

unner Exine, Durchmesser bei

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 12

Lolium 18 µm, Dauer: weniger als 1 Tag

3. Prevakuolisiertes Stadium: Exine und Pore sind erkennbar, Dauer: weniger

als ein Tag

4. Fr¨

uhes vakuolisiertes Stadium: Vakuolen sind vorhanden, deren Durchmes-

ser bis zur H¨

alfte des Pollenkorns reicht, Dauer ca. 2 Tage

5. Mittleres vakuolisiertes Stadium: Vakuolen f¨

ullen das Korn, ”Siegelring“-

Stadium, Dauer ca. 2 Tage

6. Sp¨

ates vakuolisiertes Stadium: Cytoplasma bildet sich, eif¨

ormiges Pollen-

korn, Durchmesser ca. 28 µm, Dauer ca. 2 Tage

7. Fr¨

uhes Reifestadium: erste Pollenmitose hat stattgefunden, Cytoplasma

f¨

ullt das Korn

8. Sp¨

ates Reifestadium: zweite Mitose hat stattgefunden, Pollenk¨

orner sind

dreizellig, das Cytoplasma mit St¨

arkek¨

ornern f¨

ullt den Pollen, durchschnitt-

licher Durchmesser: 30 µm

Die beiden letzten Stadien dauern zusammen etwa eine Woche, die genaue

Dauer wurde nicht bestimmt. W¨

ahrend dieser Zeit finden zwei Mitosen statt,

und Reserven (St¨

arke) werden eingelagert.

W¨

ahrend des Endstadiums der Pollenreife in den Antheren erfolgt auch die

Einlagerung von Allergenen, beginnend zum Zeitpunkt der Beladung mit St¨

arke.

Die erfolgt etwa 5-6 Tage nach der Meiose, das sind 6 Tage vor der Freisetzung

der Pollen. Das allergene Potential ist beim reifen Pollen dann am gr¨

oßten. Auch

der Proteingehalt steigt w¨

ahrend der Pollenreife st¨

andig an, am h¨

ochsten ist er

in reifen Pollen [36].

2.1.6 Allergene des Weidelgrases

Graspollenallergene im allgemeinen und die des Weidelgrases sind schon lange be-

kannt und gut untersucht [37]. Erste Arbeiten dazu stammen aus den sechziger

Jahren von Johnson und Marsh [38, 39, 40] und wurden in verschiedenen Arbeits-

gruppen weitergef¨

uhrt. Durch Identifizierung von Strukturgenen, die ein Allergen

codieren, konnten die Sequenzen mehrerer Majorallergene ermittelt werden [41].

Die Lage von Epitopen wurde durch Reaktion von verschiedenen Bruchst¨

ucken

mit Antik¨

orpern bestimmt. Sekund¨

ar- und Terti¨

arstrukturen k¨

onnen in einigen

wenigen F¨

allen durch Computersimulation und/oder Vergleich mit bekannten

Proteinen ¨

ahnlicher Sequenz erschlossen werden. Auf ¨

ahnliche Weise werden Aus-

sagen ¨

uber die Funktionen der Allergene in der Pflanze getroffen.

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 13

Bezeichnung Molmasse pI’s Funktion glykos. SwissProt-

Nummer

Lol p 1 27 kD (35) ca. 5 - ja P14946

Lol p 2 11 kD ca. 5 - nein P14947

Lol p 3 11 kD 9-9,4 - nein P14948

Lol p 4 ca. 60 kD 9 - ja

Lol p 5a 31 kD 9 - nein Q40240

Lol p 5b 31 kD 7 Ribunuclease [42] nein Q40237

Lol p 5c 27,5 6,7 - nein Q9SC99

(TrEmbl)

Lol p 10 ? ? Cytochrom c -

Lol p 11 18 5,5 - ja -

Tabelle 2.1: ¨

Ubersicht ¨

uber die Allergene des Weidelgrases (Swissprot:

www.expasy.ch)

2.1.6.1 Lol p 1

Lol p 1 wurde zum ersten Mal 1965 von Marsh und Johnson [38] isoliert und

charakterisiert. Howlett et al. (1981) [43] beschreiben es als Glykoprotein bei 30

kD (5% Kohlenhydratanteil) bestehend aus 3 Isoallergenen mit pIs von 5,1; 5,3

und 5,5; Cottam [44] gibt 1991 die Molmasse mit 31 kD und den pI mit 5,8 an.

Das acide Glykoprotein besteht aus 240 Aminos¨

auren (mature Form), die Mol-

masse betr¨

agt 26,6 kD. Durch die Glykosylierung erscheint es in der SDS-Page bei

35 kD. Die Aminos¨

auresequenz wurde fast gleichzeitig von Perez et al. [45] und

Griffith et al. [46] aufgekl¨

art. Der ¨

uberdurchschnittlich hohe Anteil an Glycin und

Lysin weist auf ein sekretiertes Protein hin. Der saure isoelektrische Punkt (pI)

wird durch 14 Glutamat- und 19 Aspartatreste verursacht, was in Pocaee-Gr¨

asern

sehr verbreitet ist [47]. Die 99 C-terminalen Aminos¨

auren zeigen Sequenz¨

ahnlich-

keiten mit Lol p 2 und 3, die letzten 28 Aminos¨

auren enthalten ein Epitop. Im

N-terminus liegt eine cysteinreiche Region, 7 Cystein an den Positionen 41, 61,

74, 77, 82, 88 und 133 erlauben die Bildung von Schwefelbr¨

ucken zur Struktursta-

bilisierung. Es existieren mehrere Isoformen von Lol p 1 (mindestens zwei) [45],

die sich sehr ¨

ahnlich sind. Nur vier Aminos¨

auren sind verschieden, was sich in

leicht verschiedenen pI’s bemerkbar macht.

Die Kohlenhydratkomponente ist wahrscheinlich f¨

ur die beobachtete Kreuzreak-

tivit¨

at mit Bromelain verantwortlich [48]. Sie besteht aus Glukose, Galactose,

Mannose, Arabinose und N-Acetylglucosamin im Verh¨

altnis 3:3:1:2:2:1 [43]. Ob-

wohl die Sequenz ¨

Ahnlichkeiten mit Proteinasen und Cysteinasen aufweist, zeigt

Lol p 1 keine enzymatische Aktivit¨

at. Durch sein Vorkommen auf der Ober-

fl¨

ache der Pollen wird eine Funktion in der Pollen-Stigma-Erkennung vermutet

[49]. Etwa 95 % aller Graspollenallergiker haben spezifisches IgE gegen Lol p 1.

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 14

Damit ist es das Hauptallergen des Weidelgrases, wo es ungef¨

ahr 10 % des ge-

samten Pollenproteins ausmacht [47]. Durch Modellierung [50] wurde Lol p 1 den

β-Expansinen zugeordnet, einer Stoffgruppe, die vermutlich an der L¨

osung von

Zellw¨

anden und bei Zellvergr¨

oßerungen zum Wachstumsprozess der Pflanze be-

teiligt ist. Die Cellulose bindende Region (CBD) besteht aus zwei β-Faltbl¨

attern,

die in einer Sandwich-Struktur arrangiert sind. Jedes der Faltbl¨

atter enth¨

alt vier

Str¨

ange, einer ist geknickt und geh¨

ort zu beiden Bl¨

attern. Die von den mensch-

lichen Antik¨

orpern erkannten Epitope k¨

onnten in den gleichen Regionen liegen

wie die CBD.

Gruppe 1 Allergene sind stabil und zeigen zellwanddehnende Effekte, aber keine

proteolytischen Eigenschaften [51], obwohl sie strukturell mit den β-Expansinen

verwandt sind [52]. Durch Spaltung von rekombinantem Phl p 1 und ELISA-Test

der Bruchst¨

ucke mit Allergikerseren wurden vier konformationsbedingte Epito-

pe [33] und mehrere sequenzielle Epitope identifiziert, die aber weniger Bedeu-

tung haben. Disulfidbr¨

ucken spielen f¨

ur die Allergenit¨

at eine Rolle. Reduktion

und Carboxymethylierung der SH-Gruppe f¨

uhrt zu einer Reduktion der IgE-

Bindungskapazit¨

at um 25 %.

2.1.6.2 Lol p 5

Das zweite Majorallergen des Weidelgrases ist das Gruppe 5 Allergen. Etwa

90% der Gr¨

aserpollenallergiker haben Antik¨

orper dagegen. In den 60er und

70er Jahren war noch keine Unterscheidung zu Lol p 1 m¨

oglich aufgrund

der sehr ¨

ahnlichen Molmassen der Proteine. Ford [37] entdeckte 1986 durch

Serendetektion im SDS-Page-Blot in der Region zwischen 28 und 35 kD mehrere

sehr reaktive Banden. Erst in den 90er Jahren wurden diese Banden von

verschiedenen Arbeitsgruppen Isoallergenen von Lol p 5 zugeordnet. Zuerst

beschrieben wurde Lol p 5a [53], noch unter der Bezeichnung Lol p 1b. Es

besteht aus 283 Aminos¨

auren, hat eine Molmasse von 31 kD (SDS-PAGE) und

einen pI von ca. 9. Es ist besonders reich an Alanin (23 %) und Prolin (13 %),

nicht glykosyliert und zeigt keine Homologien zu Lol p 1, 2 oder 3, daf¨

ur starke

Kreuzreaktivit¨

at mit Phl p 5 (Gruppe 5 Allergen aus Phleum pratense) was erste

Hinweise zur Einordnung zu den Gruppe 5 Allergenen ergab. Lol p 5a konnte

in den St¨

arkek¨

ornern lokalisiert werden [53]. Es wird als Precursor im Cytosol

synthetisiert und gelangt dann in den Amyloplasten. Die wiederholte Sequenz

Pro-Ala-Thr kann auf eine strukturelle Funktion hinweisen. Weitere vermutete

Funktionen w¨

aren eine Rolle in der Pollenentwicklung, beim Pollenschlauch-

wachstum, bei der Pollen-Stigma-Erkennung oder der St¨

arkemobilisierung

w¨

ahrend der Germination. Transgene Pflanzen, in denen die Expression von Lol

p 5 unterdr¨

uckt wurde, zeigten eine normale Pollenentwicklung, was gegen diese

Theorie spricht [54, 55].

Ong et al. [56] beschrieben 1993 das Lol p 5b, mit einer Molmasse von 31,3

kD (mature form), 314 Aminos¨

aureresten und einem pI von 7,1. Es scheint ein

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 15

Strukturprotein zu sein, worauf eine Alanin-reiche Region hinweist. Zu Lol p

5a ist Lol p 5b 66 % identisch und zu 80 % ¨

ahnlich. Immunologisch sind die

beiden Proteine verschieden, haben aber gemeinsame Epitope. Eine m¨

ogliche

Begr¨

undung w¨

aren artinterne genetische Variationen.

Lol p 5c ist das kleinste der Gruppe 5 Allergene mit 27,5 kD und 276 Aminos¨

aur-

en. Der berechnete pI liegt bei 6,7. Zu Lol p 5a besteht 95 % Sequenzidentit¨

at,

zu Lol p 5b nur 56.6 % [57]. Lol p 5c hat 11 eigene Aminos¨

aurereste, davon ein

Cystein, was zu verschiedener Sekund¨

ar-/Terti¨

arstruktur durch eine zus¨

atzliche

Disulfidbr¨

ucke f¨

uhren kann. Inhibierung von Patientenseren mit Lol p 5c f¨

uhrt zu

einer reduzierten Erkennung von Banden in der 50 kD Region in der SDS-PAGE,

was auf die Bildung von Dimeren oder ein immunologisch verwandtes Protein

hindeutet.

Lol p 5c scheint eine st¨

arkere klinische Relevanz zu besitzen als Lol p 5a, die

IgE-Bindung ist bei 72 % der Patienten stark, w¨

ahrend auf Lol p 5a nur 9,2 %

stark reagieren.

Ragashankar et al. gelang es 2002 [58], die Struktur eines 11 kD-Fragments von

rPhl p 5b (rekombinantes Phl p 5b) mittels R¨

ontgenstrukturanalyse aufzukl¨

aren.

Kristalle von rPhl p 5 wurden durch Dampf-Diffusionstechnik aus einer Mischung

von Proteinl¨

osung und Phosphat (1,6 M, pH 4.0, 0,5 mM MgCl2, 0,1 mM ATP)

gewonnen. Unter den verwendeten experimentellen Bedingungen spalteten sich

von rPhl p 5 zwei Fragmente ab, was auf Verunreinigungen mit einer Protease

oder auf Autoprotolyse zur¨

uckzuf¨

uhren sein kann. Das untersuchte Bruchst¨

uck

zeigte im Patiententest dieselbe allergene Aktivit¨

at wie das Gesamtprotein. Es

besteht ausschließlich aus α-Helices und bildet ein durch eine Schwefelbr¨

ucke

stabilisiertes Dimer. Zwischen den Gruppe 5 Allergenen besteht eine starke

Kreuzreaktivit¨

at durch ¨

Ahnlichkeit in der aminoterminalen Sequenz [59].

Neben diesen beiden Majorallergenen enth¨

alt Weidelgras mehrere weniger

gut erforschte Allergene.

Lol p 2 wurde 1989 von Ansari et al. [60] beschrieben. Es ist ein acides

Protein aus 97 Aminos¨

auren, einem pI von 5,0-5,3 und einem berechneten

Molekulargewicht von 10882 Da (Edman-Abbau). Es besteht aus mindestens

zwei Isoformen [61], die durch Elektrophorese getrennt werden k¨

onnen. Das

Allergen enh¨

alt weder Cystein noch Glutamin, es gibt kein Anzeichen von

Glykosylierung. Etwa 45 % der Allergiker besitzen spezifische Antik¨

orper gegen

Lol p 2 [62], es gibt keine Kreuzreaktivit¨

at mit Lol p 1.

Lol p 3, ebenfalls 1989 von Ansari beschrieben [63], ist Lol p 2 sehr ¨

ahnlich.

Es besteht aus 97 Aminos¨

auren, 57 davon sind mit Lol p 2 gleich (59% Iden-

tit¨

at) [61]. Daraus erkl¨

art sich die starke Kreuzreaktivit¨

at der beiden Allergene.

Lol p 3 ist eine Gruppe von basischen Proteinen (pI 9,0-9,4), die h¨

aufigsten sind

Lol p 3a (pI 9,4) und Lol p 3b (pI 9,0). Die berechnete Molmasse von Lol p 3

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 16

liegt bei 10909 Da. Es enth¨

alt keine Cysteinreste und ist nicht glykosyliert. Lol

p 2 und Lol p 3 haben gemeinsame Segmente mit Lol p 1, zeigen aber keine

Kreuzreaktivit¨

at.

Lol p 4 ist ein Glykoprotein mit einer Molmasse von 57 kD [43, 64] und einem

pI gr¨

oßer 9. ¨

Uber 70 % der Pollenallergikerseren enthalten Antik¨

orper gegen

Lol p 4. Der Kohlenhydratanteil liegt bei 12 %, der Eiweißanteil enth¨

alt 12

Methionin-, 31 Lysin- und 24 Argininreste. Es bestehen Kreuzreaktivit¨

aten zu

Gruppe 4-Allergenen zahlreicher anderer Gr¨

aser [65].

Lol p 11 besteht aus mehreren Isoformen mit einem Molekulargewicht von 18

kD und einem pI zwischen 5 und 6 [66]. Es enth¨

alt einen Kohlenhydratanteil,

der ca. 8 % der Gesamtmasse ausmacht. Bei einigen Patienten treten Antik¨

orper

gegen diesen Kohlenhydratanteil auf, die zu Kreuzreaktivit¨

aten mit anderen Pol-

lenallergenen und auch Nahrungsmittelallergenen f¨

uhren k¨

onnen.

Der Eiweißanteil besteht aus 134 Aminos¨

aureresten, darunter 6 Cysteine, was

zur Ausbildung von drei potentiellen Schwefelbr¨

ucken bef¨

ahigt. Sequenzhomo-

logien zu anderen Grasallergenen sind nicht bekannt. Im Immunoblot wird es

selten erkannt, vielleicht aufgrund von Konformations¨

anderungen w¨

ahrend der

SDS-PAGE.

2.2 Erh¨

ohte Ozonwerte und ihre Auswirkungen

auf Pflanzen

2.2.1 Erh¨

ohte Ozonwerte

Ozon (O3) z¨

ahlt zur Schadstoffgruppe der Photooxidantien zusammen mit PAN

(Peroxyacetylnitrat) oder PPN (Peroxypropionylnitrat). Diese Stoffe entstehen

unter Lichteinfluss in Anwesenheit von NOxvor allem aus fl¨

uchtigen organischen

Kohlenwasserstoffen (VOC). Ozon ist ein farbloses giftiges Gas und wurde 1840

von Prof. Sch¨

onbein (Basel) entdeckt.

Der Hauptanteil des Ozons (90 %) der Atmosph¨

are befindet sich in der Stratos-

ph¨

are (ca. 15-50 km ¨

uber dem Erdboden). Dort absorbiert es die ultraviolette

Strahlung der Sonne (230-295 nm). Die Zerst¨

orung dieser Ozonschicht durch an-

trophogene Spurengase wie FCKW’s bedingt eine Zunahme der UV-B Strahlung

auf der Erdoberfl¨

ache und damit Sch¨

aden an Mensch, Tier und Pflanzen. Die

restlichen 10 % des atmosph¨

arischen Ozons befinden sich in der Troposph¨

are (0-

15 km ¨

uber dem Erdboden). Es wird entweder aus der Stratosph¨

are eingetragen

oder entsteht durch photochemische Prozesse in der Troposph¨

are. Die Bildung

von Ozon erfolgt durch eine von NOxkatalysierte photochemische Oxidation von

CO, Methan oder h¨

oherer Kohlenwasserstoffe.

Aufgrund der Reaktionsmechanismen in Tabelle 2.2 tritt das Tagesmaximum der

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 17

CH4+2O2+ 2 NO →Oxidation von Methan

HCHO + H2O+2NO2

2 NO2→NO + O*Photochemisches NO-NO2

Gleichgewicht

O*+ O2+ M →O3+ M Beim Zusammentreffen von Sauer-

stoffradikal und -molek¨

ul ist ein dritter

inerter Stoßpartner (M) wie Stickstoff

zur Aufnahme von Energie n¨

otig. Fehlt

er, zerf¨

allt das Ozonmolek¨

ul sofort wie-

der.

NO + O3→O2+ NO2Zerfall von Ozon bei Dunkelheit

Tabelle 2.2: Entstehung und Zerfall von Ozon

Ozonwerte um die Mittagszeit auf.

2.2.2 Auftreten von erh¨

ohten Ozonwerten

In den 40er Jahren des letzten Jahrhunderts wurde zum ersten Mal das Auftreten

von photochemischem Smog in Los Angeles beobachtet (deshalb ”Los Angeles-

Smog“). Die Einwohner bemerkten einen sauren, die Augen irritierenden Dunst.

Die Analytik war aufgrund wenig entwickelter Messmethoden nicht einfach. Ozon-

werte wurden z.B. durch das Auftreten und die Tiefe von Rissen in Gummistreifen

bestimmt. In den 50er Jahren wurden dann von Stephens et al. [67] Peroxyace-

tylnitrat (PAN) und Ozon als Hauptbestandteile des photochemischen Smogs

nachgewiesen. In L.A. wurde als Spitzenwert mittags 580 ppb (1160 µg/m3) ge-

messen, in Deutschland sind schon 275 ppb (550 µg/m3) aufgetreten.

Von 1978 bis 1990 hat sich die mittlere Ozonkonzentration von knapp unter

40 ppb auf 50 ppb erh¨

oht. Dabei nahm der Gehalt in Ballungsgebieten und ande-

ren belasteten Gebieten weniger stark zu (1977-1983: 3 %) als in den l¨

andlichen

Gebieten (selber Zeitraum: 16 %). ¨

Uberhaupt f¨

allt auf, dass in Gebieten fern von

Industrie und Verkehr (z.B. auf der Zugspitze) die Ozonwerte h¨

oher liegen als in

Industrieregionen.

In industriellen Regionen kommt es auch nachts zur fortgesetzten Emission von

NO durch Autos und Industrie. Durch NO wird vorhandenes Ozon fast sofort in

O2und NO2umgewandelt. NO2ist langlebiger als O3und kann nachts unzersetzt

uber weite Strecken transportiert werden. Am Tag wird dann unter Lichteinfluss

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 18

Mittelwerte Ozonmesstationen

050 100

1989 1991 1993 1995

µg/m3

Mittelwert aller

Messstationen

verkehrsnahe

Messstationen

städt. Messstationen

ländl. Messstationen

Bergstationen

Abbildung 2.3: ¨

Ubersicht ¨

uber die Ozonwerte in verschiedenen Regionen (Quel-

le: Bundesumweltamt)

wieder Ozon gebildet. In l¨

andlichen Gebieten fehlt NO zum Abbau des Ozons.

Deshalb gibt es an quellfernen Orten oft h¨

ohere Ozonbelastungen als in quell-

nahen. Betroffen sind hier vor allem Reinluftgebiete. Um das Auftreten hoher

Ozonwerte zu verhindern, muss die Emission von Stickoxiden eingeschr¨

ankt wer-

den. Deshalb gilt bei einem Ozonwert von ¨

uber 240 µg/m3im Stundenmittel

Fahrverbot f¨

ur nicht schadstoffarme Fahrzeuge [68].

Ozon beeintr¨

achtigt die Lungenfunktionen [69] vor allem von Kindern [70]

und ¨

alteren Menschen. Entz¨

undliche Schleimhautver¨

anderungen f¨

uhren zu einer

erh¨

ohten Permeabilit¨

at der Schleimhaut [71]. Die allergische Reaktion eines Asth-

matikers kann durch Ozonexposition verst¨

arkt werden, Ozon selbst f¨

uhrt aber zu

keiner Reaktion [72, 73, 3].

2.2.3 Auswirkungen von erh¨

ohten Ozonwerten auf Pflan-

zen

Das Auftreten von Ozonsch¨

aden wurde zum ersten Mal 1952 im Osten der

USA an Tabakpflanzen beobachtet. Die Bl¨

atter zeigten gelbe Verf¨

arbungen und

Chlorosen, die sie zum Einwickeln von Zigarren unbrauchbar machten. In den

50er Jahren konnten diese Ph¨

anomene auf Ozon zur¨

uckgef¨

uhrt werden durch

Vergleiche mit ¨

ahnlichen Sch¨

aden, die an Bohnen beobachtet wurden. Bis 1959

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 19

wurden analoge Krankheiten bei Grapefruit, Spinat, Roggen usw. entdeckt. In

den letzten dreißig Jahren wurde die Sensivit¨

at verschiedener Nutzpflanzen und

B¨

aumen untersucht. Als typische akute Ozonsch¨

aden bei hohen Konzentrationen

wurden weißliche, blasse Flecken, Lesionen und Nekrosen, die zu Streifen zusam-

menwachsen k¨

onnen, beschrieben. Geringf¨

ugig erh¨

ohte Ozonwerte w¨

ahrend der

Wachstumsperiode k¨

onnen zu vorzeitiger Blattalterung und reduzierter Ernte

f¨

uhren [74, 75].

2.2.3.1 Mechanismus der Sch¨

adigung

Der Ozongehalt der Luft wird ¨

ublicherweise 3-5 m oberhalb des Erdbodens be-

stimmt. Der Gehalt, dem die Pflanzen ausgesetzt sind, h¨

angt von weiteren Fakto-

ren ab [Abb. 2.4]. Der aerodynamische Widerstand beruht auf der Bildung einer

Lokale Ozonwerte

Aerodynamischer Widerstand

Aufnahmerate der Stomata

Biochemische Stressabwehr im Amyloplast

Veränderter Stoffwechsel

Abbildung 2.4: Einfluss von Ozon auf Pflanzen

Grenzschicht mit geringer Luftbewegung oberhalb einer Pflanzenschicht. Konvek-

tion von Luftschichten verschiedener Temperatur sorgen f¨

ur Durchmischung der

Atmosph¨

are. Die Rauigkeit einer Pflanzenschicht f¨

uhrt dabei zu Wirbelbildung

und besserer Durchmischung. Glatte Pflanzenschichten wie Wiesen oder Getrei-

defelder erzeugen dabei weniger Wirbel als z.B. W¨

alder mit verschieden hohen

B¨

aumen. In einem Feld gibt es daher gr¨

oßere Ozongradienten [76].

Ozon tritt durch die Stomata in die Bl¨

atter von Pflanzen ein. Die Aufnahmerate

h¨

angt von der Art der Pflanzen und den Umweltbedingungen, vor allem Feuchte,

ab. In der Pflanze l¨

ost sich Ozon zum Teil im Wasser auf den Zelloberfl¨

achen.

Es bilden sich Radikale sowie verschiedene Ionen. Sie k¨

onnen Zellkomponenten

und Membranbestandteile wie Proteine, SH-Gruppen der Aminos¨

auren oxidie-

ren. Laut einer Simulation von Urbach et al. (1989) [77] erreichen noch 80 % des

Ozons die Membran, 18 % das Cytosol und 2 % den Chloroplasten. Die Photo-

synthese wird durch Sch¨

adigung der Struktur der Chloroplasten gest¨

ort. F¨

ur die

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 20

CO2-Fixierung wichtige Enzyme wie Carboxylasen k¨

onnen in ihrer Aktivit¨

at ge-

hemmt werden. Außerdem wird die Permeabilit¨

at von Membranen ver¨

andert [78].

Die Zusammensetzung der Proteine der Plasmalemma zeigt Ver¨

anderungen. Es

wurde ein zus¨

atzliches Protein beobachtet [79]. Assimilat wird in der gestressten

Pflanze anders verteilt als in einer Ungestressten aufgrund von Sch¨

aden an den

Speicherorganen der Pflanze [80].

Da Ozon ein nat¨

urlich vorkommendes Schadgas ist, haben Pflanzen Abwehr-

mechanismen, die Radikale abfangen und dem oxidativen Stress entgegenwir-

ken k¨

onnen [81, 82]. Ascorbat ist ein wichtiger Radikalf¨

anger, es wird zu De-

hydroascorbat oxidiert. ¨

Uber den Glutation-Cyclus wird Ascorbat wiederherge-

stellt. Weitere Abbaumechanismen setzen Carotinoide, Vitamin E und phenoli-

sche Komponenten ein. Erst wenn der Ozonwert so hoch ist, dass diese Systeme

uberfordert sind, treten Sch¨

aden auf. Wann dieser Fall eintritt, h¨

angt von Art,

Variet¨

at und Individuum ab. Wichtige Faktoren sind auch Wasserversorgung,

Temperatur und vor allem Luftfeuchte w¨

ahrend des Ozoneinflusses. Nachts rea-

gieren Pflanzen unempfindlicher als tags¨

uber, wenn die Stomata ge¨

offnet sind.

Pflanzen zeigen bei erh¨

ohten Ozonwerten einen ver¨

anderten Stoffwechsel [83, 84].

Es gibt Aktivit¨

atsver¨

anderungen von Enzymen, die mit Stressabwehr verbunden

sind, wie z.B. Superoxiddismutase (SOD). Die Ethylenproduktion ist deutlich

erh¨

oht [85, 86, 87] und es werden Gene von pathogen-related (PR) Proteinen

aktiviert [88], wie β-1,3-Glucanase [89, 90, 91, 92]. Diese Reaktionen ¨

ahneln den

Abwehrmechanismen gegen virale und mikrobiologische Pathogene [93, 94]. Brei-

teneder und Scheiner [5] zeigten 1998, dass das Gruppe 1 Allergen der Birke,

Bet v 1, weitgehend homolog mit diesen PR-Proteinen ist, was f¨

ur eine Funkti-

on des Allergens in der Stressantwort der Birke spricht. Das eine Stressantwort

mit erh¨

ohtem Allergengehalt durch Luftschadstoffe ausgel¨

ost wird, konnte nicht

nachgewiesen werden [95].

Die Sensitivit¨

at von Pflanzen gegen¨

uber Ozon h¨

angt von der Art, Sorte und Kul-

tivar ab und kann v¨

ollig unterschiedlich sein [96].

2.2.4 Ozonsch¨

aden an Weidelgras

Deutsches Weidelgras (Lolium perenne Manhattan) zeigt bei niedrigen (ambient)

Ozonwerten mittlere Sensitivit¨

at. Die Blattfl¨

achen sind signifikant reduziert [97],

es bilden sich braune Verf¨

arbungen und Nekrosen. Dabei waren ¨

altere und jun-

ge Bl¨

atter weniger betroffen. Bei Italienischem Weidelgras (Lolium multiflorum)

zeigten sich bei Ozonwerten von 90 ppb ¨

uber acht Stunden pro Tag keine sicht-

baren Sch¨

aden. Allerdings ist das Trockengewicht pro Pflanze reduziert, ebenso

wie die Blattfl¨

ache pro Pflanze und das Verh¨

altnis von Wurzel zu Spross. Die

Empfindlichkeit des Blattsystems wird durch eine erh¨

ohte Assimilationsrate kom-

pensiert.

Verschiedene Kultivare einer Pflanzenart k¨

onnen ganz unterschiedlich auf Ozon-

werte reagieren, wie man an Kentucky Blue Gras [98] sieht.

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 21

2.2.5 Pollen und Luftschadstoffe

Untersuchungen zur Wirkung von erh¨

ohten Ozonkonzentrationen auf die Ent-

wicklung von Pollen zeigen, dass die Keimf¨

ahigkeit der Pollen eingeschr¨

ankt sein

kann. In Mais ist der Gehalt an freien Aminos¨

auren im Pollen erh¨

oht, vor al-

lem Alanin, Prolin und Glutamat. Der Gehalt an reduzierenden und neutralen

Zuckern geht nach 5-st¨

undiger Ozonexposition zur¨

uck [99]. Dies kann auf die

verringerte Photosyntheserate zur¨

uckzuf¨

uhren sein. Auch ¨

Anderungen in der All-

ergenit¨

at und der Molmasse der Allergene wurde bei Exposition mit NO2, SO2

und CO beobachtet [100].

Luftschadstoffe wirken auch auf reife Pollen in vitro. Bei Pollen, die mit poly-

aromatischen Partikeln beladen sind, wurde verst¨

arkte Allergenfreisetzung, ver-

mutlich durch morphologische Ver¨

anderungen am Pollen beobachtet. Begasung

mit SO2bei unterschiedlichen Luftfeuchtigkeiten f¨

uhrt zu geringerer Allergen-

freisetzung [4]. Begasung von reifen Maispollen mit Ozon f¨

uhrt zu geringerer

Keimf¨

ahigkeit, einem h¨

oheren Anteil an freien Aminos¨

auren und geringerer Kon-

zentration an reduzierendem Zucker [101]. ¨

Ahnliche Versuche mit Dactylus glome-

rata-Pollen zeigten keinen ver¨

anderten Allergengehalt bei Ozonbehandlung [102].

Auch ultrastrukturelle Ver¨

anderungen wurden beobachtet [103].

2.2.6 Ozonsch¨

aden an Weidelgraspollen

Seit 1994 werden in der Arbeitsgruppe ”Allergene“ der Universit¨

at Paderborn

Auswirkungen von erh¨

ohten Ozonwerten w¨

ahrend der Bl¨

utezeit auf den Aller-

gengehalt und die Entwicklung von Weidelgraspollen untersucht.

2.2.6.1 Allergengehalt

Zun¨

achst wurde in einer Freilandstudie die Wirkung von Ozon auf Wildpflanzen

von Lolium perenne ¨

uberpr¨

uft. Dabei wurde der Gehalt an Gruppe 5 Allergen

von Pflanzenpollen aus Schwerte (industrienaher Standort, niedrige Ozonwerte)

und vom Velmerstot (Reinluftgebiet) verglichen. Die Allergenkonzentration im

Reinluftgebiet betrug 33 ng/µg Gesamtprotein gegen¨

uber 20 ng/µg am Standort

Schwerte. Zus¨

atzlich wurden in Open-Top Chambers am Velmerstot Pflanzen in

gefilterter Luft kultiviert und mit Pflanzen aus dem Freiland verglichen. Auch

hier waren die Allergenwerte unter Ozoneinfluss erh¨

oht [104, 105, 6].

Bei solchen Versuchen muss beachtet werden, dass auch Parameter wie unter-

schiedliche Temperatur, Wasser- und Lichtverh¨

altnisse und Bodenbeschaffen-

heit die Ergebnisse beeinflussen k¨

onnen. Deshalb wurde 1996 Lolium perenne

in Closed-Top Chambers des Landesumweltamtes Essen-Kettwig [Abschitt 3.1]

einer Ozonkonzentration von 130 µg/m3¨

uber den ganzen Tag ausgesetzt. Der Ex-

trakt aus den begasten Pollen zeigt einen h¨

oheren Gehalt an Gruppe 5 Allergen

und einen h¨

oheren Gesamtproteingehalt als die in gefilterter Luft gewachsenen

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 22

Vergleichspflanzen.

Dieses Experiment wurde 1997 wiederholt mit einem dem nat¨

urlichen Verlauf der

Ozonwerte angen¨

aherten Programm. Die Belastung mit 130 µg/m3war auf die

Lichtphase begrenzt bei einer durchg¨

angigen Grundlast von 40 µg/m3. In einer

zweiten Versuchsreihe erhielten die Pflanzen 220 µg/m3als Spitzenwert ¨

uber 4

Stunden, so dass die Tagesdosis an Ozon dieselbe war. Der Trend der Ergebnisse

vom Vorjahr wurde best¨

atigt [106].

Gefilterte Luft 130/40 µg/m3O3220/40 µg/m3O3

µg Protein/g Einwaage 117.330 108.740 97.500

µg Gr.5/g Einwaage 1.046 1.325 1.323

ng Gr.5/µg Protein 8,92 12,18 13,56

Tabelle 2.3: Gehalt an Gesamtprotein und Gruppe 5 Allergen in Lolium perenne

Pollen nach 28 Tagen Exposition (1997)

2.2.6.2 Histologische Sch¨

aden

Ozon kann im Pollen eine unvollst¨

andige Entwicklung ausl¨

osen. Die gesch¨

adigten

Pollen lagern in diesem Fall keine St¨

arke ein, was durch Fehlen des Amyloplasten

erkennbar wird. Untersuchungen der Arbeitsgruppe Masuch [108] zeigen, dass

bei kurzzeitigen Spitzenbelastungen wesentlich mehr gesch¨

adigte Pollen vorhan-

den (58 %) sind als in Antheren, die sich in gefilterter Luft entwickeln konnten

(9 %). Bei mittlerer Belastung ¨

uber den ganzen Tag ist die Sch¨

adigung weniger

ausgepr¨

agt (18 %).

Fehlende St¨

arkeeinlagerung wird auch bei Trockenstress w¨

ahrend der Meiose in

Weizen beobachtet [109].

KAPITEL 2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN 23

(a) gesunde Anthere

(b) gesch¨

adigte Anthere

Abbildung 2.5: Mikroskopaufnahmen von gesunden und ozongesch¨

adigten Pol-

len [107]

Kapitel 3

Material und Methoden

3.1 Ozonisierungskammern und Pflanzen-

material

3.1.1 Begasungskammern LUA Essen

Das Landesumweltamt Essen verf¨

ugt ¨

uber 12 sechseckige Freilandbegasungskam-

mern (Seitenl¨

ange 1,2 m, Grundfl¨

ache 36,65 m2, H¨

ohe 2,6 m) mit Betonsockel

und einem Glasaufbau mit Fl¨

ugelt¨

uren. Die Pflanzen stehen auf einem Dreh-

teller, der sich sechsmal pro Minute dreht, um einen gleichm¨

aßigen Lichteinfall

zu gew¨

ahrleisten. Beschattung ist ¨

uber Rollos m¨

oglich. Die Luftzufuhr erfolgt an

der Kammerdecke, ein Ventilator mit variabler Drehgeschwindigkeit (0,5-1,5 m/s)

sorgt f¨

ur ausreichende Durchmischung. Die Verweilzeit der Luft in der Kammer

betr¨

agt 2 Minuten. Als Zuluft wird Außenluft verwendet, die durch verschiedene

Filter geleitet wird, zun¨

achst durch einen Regenabweiser, Grob- und Feinstaub-

filter, Aktivkohle, Puratex und Aktivkohle mit KOH zur Oxidation von NO zu

NO2und zur Neutralisation von sauren Bestandteilen der Luft. Die Abluft wird

durch einen Ventilator abgesaugt.

Der Zuluft k¨

onnen je nach Problemstellung verschiedene Schadgase zugesetzt

werden. Ozon wird durch einen Ozonisator (OG5, VTU, Rheinbach) durch elek-

trische Entladung aus reinem Sauerstoff erzeugt. Die in den Kammern erhaltene

Gaskonzentration wird von einem Ozonanalysator (Dasibi, Env. Corp. Colorado,

Typ 1008) ¨

uber UV-Absorption gemessen. Nacheinander werden die Ozonmen-

gen in allen Kammern bestimmt, wobei Teflonventile alle 5 Minuten eine Kammer

weiterschalten. Zum Durchsp¨

ulen der Leitungen sind 3 Minuten notwendig, weite-

re 2 Minuten um den Messwert zu erhalten. Ist- und Sollwerte in den Kammern

werden verglichen und geregelt. Alle 22 h erfolgt eine Kalibrierung des Mess-

ger¨

ates [74].

Vorteile dieser Freiluftkammern sind die naturnahen Licht- und Temperatur-

verh¨

altnisse, die M¨

oglichkeit zur genauen Dosierung verschiedener Schadgase und

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 25

Filter-

einheit

Ozon-

messung

SO2

NOX

Abbildung 3.1: Begasungskammern LUA Essen

die große Menge an Pflanzen, die hier exponiert werden k¨

onnen. Allerdings ist

durch die Witterungsabh¨

angigkeit keine Reproduzierbarkeit der Versuche gege-

ben. Die Kammern k¨

onnen nur zwischen Mai und September genutzt werden.

3.1.2 Begasungskammern Paderborn

3.1.2.1 Aufbau

Um das ganze Jahr ¨

uber Pollen von Kontroll- und ozonisierten Pflanzen

gewinnen zu k¨

onnen, wurden zwei Begasungskammern in Betrieb genommen.

Ein Kellerraum garantiert eine gleichbleibende Temperatur von 20 ◦C, ohne dass

Temperierung n¨

otig ist.

Die Kammern (H¨

ohe 170 cm, Breite 130 cm, Tiefe 85 cm) bestehen zur besseren

Beleuchtung aus Plexiglas. Auf einer Lochplatte 10 cm oberhalb des Bodens

stehen die Pflanzen, die Abluft wird darunter direkt in den Abzug gef¨

uhrt.

Die Zuluft liegt unter der Deckenplatte jeder Kammer, eine Lochplatte 10

cm unterhalb sorgt f¨

ur gute Verteilung und Durchmischung in den Kammern

(Abb. 3.2).

Uber Druckminderer und Str¨

omungsmesser (Rotameter) wird ein Luftstrom

von 4-5 m3/h eingestellt, was einem zweimaligen Luftaustausch pro Stunde

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 26

Biolux Biolux

Ozongenerator

Ozonmessgerät

Temp,

Feuchte

Temp,

Feuchte

Abbildung 3.2: Begasungskammern Paderborn

entspricht. Bei der Ozonkammer wird die Zuluft mit ozonangereicherter Luft

vermischt, um Konzentrationen im ppb-Bereich, wie sie nat¨

urlich vorkommen, zu

erhalten. Das Ozon wird in einem Ansyco-Ozonisator aus gefilterter temperierter

Luft durch Aufspaltung von Sauerstoffmolek¨

ulen mit UV-Licht und anschlie-

ßende Rekombination erzeugt. ¨

Uber die manuelle Regelung der Stromst¨

arke

oder durch Steuerung mittels PC k¨

onnen verschiedene Ozonmengen aufgegeben

werden. Die bei einer voreingestellten Luftmenge von 4 m3/h erhaltenen Ozon-

konzentrationen in der Kammer sind in Abbildung 3.3 dargestellt.

Die Ozonwerte werden mit einem Ansyco-Messger¨

at M O3 41 durch UV-

Absorption abwechselnd im Pr¨

ufgas und in ozonfreier (gefilterter) Luft als

Nullabgleich bestimmt. Durch f¨

unf Teflon-Magnetventile und daran ange-

schlossene Teflonschl¨

auche k¨

onnen abwechselnd die verschiedenen Messstellen

- Außenluft, Kontrollkammer und an mehreren Punkten der Ozonkammer -

gemessen werden. Dazu wird der Schlauch zun¨

achst 2 Minuten mit Pr¨

ufluft

gesp¨

ult, dann wird der sich innerhalb von weiteren 40 Sekunden am Messger¨

einstellende Wert im PC gespeichert und das n¨

achste Ventil ge¨

offnet.

Der Ozongehalt wird nicht ¨

uber die Messwerte geregelt, da das Messsystem

so tr¨

age ist, dass es zu einer Aufschaukelung kommen k¨

onnte. Stattdessen

werden ¨

uber den PC Stromwerte f¨

ur den O3-Generator abh¨

angig von der

Tageszeit vorgegeben. Der Generator erzeugt dann einen relativ konstanten

Ozonwert (+-10 ppb) in der Kammer. Es k¨

onnen der Natur nachempfundene

Tagesprogramme gefahren werden, nachts kann der Ozonwert auf null gedrosselt

werden. Der Messrechner erfasst zus¨

atzlich zu den Ozonwerten die Temperatur

und die Luftfeuchte in jeder Kammer.

Pflanzen brauchen Licht mit hohem Rotanteil, um die Lichtreaktion in ihren

Bl¨

attern ablaufen zu lassen. Daher befinden sich ¨

uber jeder Kammer 10 Leucht-

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 27

4 6 8

10 12 14 16 18 20 22

100

150

200

250

300

350

400

450

500

mit Beleuchtung

Volumenstrom 40 %

Ozon in 140 cm Höhe

Ozon in 85 cm und 20 cm Höhe

Ozon [ppb]

Strom [mA]

Abbildung 3.3: Ozonwerte in Abh¨

angigkeit vom Generatorstrom

stoffr¨

ohren Biolux (Osram), deren Emissionsspektrum dem des Sonnenlichtes

ahnelt, aber wesentlich weniger intensiv ist. Die Luxwerte nehmen vom Boden

der Kammern hin zu den Lichtquellen ann¨

ahernd exponentiell zu (Abb. 3.4).

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

100

120

140

160

Lux

Höhe über dem Boden [cm]

Abbildung 3.4: Lichtmenge in Abh¨

angigkeit von der H¨

ohe der Klimakammer

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 28

3.1.2.2 Verteilungsversuche

In den leeren Kammern werden zun¨

achst Versuche zum Anfahr- und Durch-

mischungsverhalten durchgef¨

uhrt. Um die Ozonverteilung ¨

uber die H¨

ohe zu

bestimmen, wurden im Zuluftstrom, in der Mitte der Kammer (85 cm) und

20 cm ¨

uber dem Boden je eine Messstelle eingerichtet und Ozon gemessen.

Nach etwa 30 Minuten ist die Ozonkonzentration konstant. Die ”Spitzen“, die

in der Zuluft auftreten, h¨

angen mit Schwankungen in der Druckluftversorgung

zusammen. Sie verschwinden in der Kammer aufgrund der Konvektion.

0 2 4 6 8

100

150

200

250

Aussenluft

unteres und mittleres Drittel

oberes Drittel Ozonkammer

Volumenstrom 4 m

Beleuchtung an

[ppb]

Zeit /h

(a) Verlauf der Ozonwerte

0 5

10 15 20

Temperatur Vergleichskammer

Temperatur Ozonkammer

Temp [°C]

Zeit /h

100

Luftfeuchte Vergleichskammer

Luftfeuchte Ozonkammer

Feuchte [%]

(b) Temperatur und Feuchte

Abbildung 3.5: Ozonwerte, Temperatur und Luftfeuchte in leeren Begasungs-

kammern

Das Einschalten der Lampen f¨

uhrt zu einem Ozongradienten. Im oberen Drittel

liegt der Wert je nach Ausgangswert 30-50 ppb h¨

oher als im Rest der Kammer,

vermutlich durch eine leichte Aufheizung der oberen Luftschicht. Obwohl der

W¨

armeeintrag der Neonr¨

ohren nur wenige Watt betr¨

agt, reicht er offenbar aus,

um die Durchmischung zu behindern [Abb. 3.5]. Graspflanzen erreichen das obere

Drittel der Kammern nicht, daher kann die dortige schlechte Durchmischung

vernachl¨

assigt werden.

Um die horizontale Vermischung zu ¨

uberpr¨

ufen, werden in 40 cm H¨

ohe ¨

uber dem

Boden Messstellen angebracht, in der Mitte der Kammern und am Rand. Nach

wenigen Minuten liegen identische Ozonkonzentrationen vor.

Bei den Durchmischungsversuchen muss die Tr¨

agheit des Messsystems ber¨

uck-

sichtigt werden. Es dauert etwa 3 Minuten, bis ein aktueller Ozonwert vorliegt,

so dass ¨

uber kleinere Zeitintervalle keine Aussage getroffen werden kann.

Befinden sich Pflanzen in den Kammern, so sind die Str¨

omungsverh¨

altnisse

v¨

ollig anders. Bei einj¨

ahrigem Weidelgras, das etwa 30 cm hoch wird, gibt

es nur geringe Einfl¨

usse auf die Durchmischung. Wenn man zwischen den

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 29

Pflanzen Ozonwerte ermittelt, liegen die Konzentrationen um 20 ppb niedriger

als oberhalb der Pflanzenschicht.

0 5

10 15 20

-10

Vergleichskammer

Aussenluft

oberhalb der Pflanzen

zwischen den Pflanzen

[ppb]

Zeit /h

(a) Verlauf der Ozonwerte mit Bepflanzung

0 5

10 15 20

Temperatur Ozonkammer

Temperatur Kontrollkammer

Temp [°C]

Zeit /h

Luftfeuchte Ozonkammer

Luftfeuchte Kontrollkammer

Feuchte [%]

(b) Temperatur und Feuchte

Abbildung 3.6: Typische Ozonwerte, Temperatur und Luftfeuchte in Bega-

sungskammern mit Bepflanzung im Tagesverlauf

Bei hohen Gr¨

asern (bis 80 cm) muss zus¨

atzlich ein Ventilator eingesetzt werden,

um den Ozonwert ¨

uber die Grundfl¨

ache der Kammer konstant zu halten. In der

H¨

ohe besteht immer noch ein Ozongradient [Abb. 3.6]. Die Bl¨

uten sind etwa 10

cm h¨

oher als der Pflanzenk¨

orper und wachsen st¨

andig, so dass es schwierig zu

beurteilen ist, welcher Ozonwert f¨

ur eventuelle Sch¨

aden ausschlaggebend ist. In

den Kammern in Essen wird der Ozonwert weit oberhalb der Gr¨

aser bestimmt,

so dass auch hier der Ozonwert ¨

uber den Pflanzen angegeben wird.

Die Temperaturen in Ozon- und Vergleichskammer sind fast ¨

uber den ganzen

Tag identisch. Durch die Lampen bedingt gibt es einen Unterschied von 1,5 ◦C

zwischen Nacht- und Mittagstemperatur. Die Luftfeuchte, die in leeren Kammern

etwa 10 % betr¨

agt [Abb. 3.5], steigt durch die Verdunstung der Pflanzen an.

W¨

ahrend des Tages werden so je nach Luftdurchsatz und Gr¨

oße der Pflanzen bis

zu 60 % Luftfeuchte erreicht [Abb. 3.6].

In den Ozonkammern sind Licht- und Temperaturverh¨

altnisse reproduzierbar,

und es k¨

onnen ¨

uber das ganze Jahr Pollen erzeugt werden.

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 30

3.2 Biochemische Analytik

3.2.1 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)

Der ELISA beruht auf dem Vorhandensein von spezifischen Antik¨

orpern gegen

ein Antigen und deren selektive Bindungseigenschaften. In der einfachsten Form

wird das interessierende Antigen an eine Festphase (¨

ublicherweise eine Mikroti-

terplatte mit hoher Proteinbindungskapazit¨

at) gekoppelt. Ein enzymmarkierter

Antik¨

orper bindet selektiv an das Antigen. Nachdem in einem Waschschritt nicht

gebundene Antik¨

orper entfernt wurden, kann ¨

uber eine Farbreaktion das Antigen

quantifiziert werden [16].

Es existieren zahlreiche Varianten des ELISA. Hier kommt der sogenannte

Sandwich-ELISA zum Einsatz. Daf¨

ur werden zwei Antik¨

orper ben¨

otigt, die gegen

verschiedene Epitope des Antigens gerichtet sind. Der eine Antik¨

orper wird als

Fangantik¨

orper an die Festphase gekoppelt und bindet das Antigen aus der im

n¨

achsten Schritt zugegebenen Probe. Der zweite Antik¨

orper ist mit einem Enzym

markiert. Er bindet an das Antigen. Der Nachweis erfolgt durch ein Substrat, das,

wenn es vom Enzym umgesetzt wird, einen Farbumschlag zeigt. Eine Standard-

reihe bekannter Konzentrationen dient zur Kalibrierung. Durch diese Anordnung

l¨

asst sich die Genauigkeit gegen¨

uber dem einfachen ELISA stark verbessern [15].

Man erh¨

alt eine Kurve der optischen Dichte abh¨

angig von der Konzentration ¨

ahn-

lich Abbildung 3.7. Zur Auswertung k¨

onnen nur Proben herangezogen werden,

die im linearen Bereich der Kurve liegen, da nur dort geringe Konzentrations¨

ande-

rungen gen¨

ugend starke Ver¨

anderungen der optischen Dichte bewirken.

Verwendet man statt direkt enzymmarkierter Antik¨

orper das Biotin-Avidin-

System, wird die Sensitivit¨

at des Assays erh¨

oht. Biotin, auch bekannt als Vitamin

H, hat eine besondere Affinit¨

at zu Avidin (Affinit¨

atskonstante 1015 M-1), vier Bio-

tinmolek¨

ule k¨

onnen an jedes Avidin binden. Durch kovalente Bindung mehrerer

Biotinmolek¨

ule an den Detektionsantik¨

orper kann das Signal amplifiziert werden

[110]. Avidin wird heute in den meisten F¨

allen durch Streptavidin, ein Produkt

des Pilzes Streptomyces avidinii, ersetzt. Es hat ¨

ahnliche Eigenschaften wie Avi-

din, neigt als Glykoprotein aber weniger zu unspezifischen Bindungen, und sein

pH-Wert ist ann¨

ahernd neutral [111]. Am Streptavidin ist Meerettichperoxidase

(POD) gebunden. POD ist eins der am h¨

aufigsten eingesetzen Detektionsenzyme

im ELISA. Es bildet aus dem Substrat o-Phenylendiamin (OPD) einen gelben

Farbstoff, der beim Abstoppen der Reaktion mit S¨

aure in orange umschl¨

agt und

bei 492 nm vermessen wird.

F¨

ur Graspollenallergen steht ein ELISA f¨

ur Phl p 5, das Gruppe 5-Allergen von

Phleum pratense zur Verf¨

ugung. Aufgrund der Kreuzreaktivit¨

at zwischen den

Gruppe 5-Allergenen der Gr¨

aser wird auch Lol p 5 erkannt. Zur Erstellung der

Standardkurve wird ein definfierter Extrakt von Phleum pratense-Pollen verwen-

det.

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 31

Konzentration

Beschichten einer Mikrotiterplatte

mit primärem Antikörper

Zugabe des Antigengemisches

Zugabe des enzymmarkierten

sekundären Antikörpers Entwicklung durch

Zugabe von Substrat,

das vom Enzym farbig

umgesetzt wird

Optische Dichte

Probe 1

Probe 2 Probe 2

Probe 2

Abbildung 3.7: Schema eines Sandwich-ELISA

3.2.2 Bestimmung des Gesamtproteingehaltes

Die Bestimmung des Proteingehaltes der L¨

osung ist ein entscheidender Schritt

zur Charakterisierung eines Allergenextraktes, da er als Bezugsgr¨

osse f¨

ur weitere

Analysen wie ELISA und SDS-Elektrophorese dient. Zur Gesamtproteinbestim-

mung gibt es zahlreiche Methoden. Die wichtigsten sind die Proteinbestimmung

nach Bradford und nach Lowry.

3.2.2.1 Proteinbestimmung nach Bradford [112]

Der Bradford-Test beruht auf der Reaktion des aciden Farbstoffs Coomassieblau

mit Arginin und anderen basischen und aromatischen Aminos¨

auren in Protei-

nen. Das Absorptionsmaximum verschiebt sich von 465 nm (braun) nach 595

nm (blau). Durch Vergleich mit einer Kalibrierkurve (meist Rinderserumalbu-

min, BSA) wird der Proteingehalt der Probe bestimmt. Ungenauigkeiten treten

durch verschiedene Zusammensetzung von Standard- und Probenprotein auf. Bei

unterschiedlichem Gehalt an basischen und aromatischen Aminos¨

auren werden

unterschiedliche Farbstoffmengen gebunden. Beim Bradford-Assay werden nur

Proteine mit Molmassen gr¨

osser 3-5 kD erfasst.

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 32

3.2.2.2 Proteinbestimmung nach Lowry [113]

Die Lowry-Methode ist ebenfalls ein colorimetrischer Test. Er beruht auf der

Komplexierung von Cu2+-Ionen durch die Peptidbindung. Dieser Komplex

unterst¨

utzt die Reduktion von Molybdat bzw. Wolframat aus dem Folin-

Ciocalteau-Phenol Reagenz durch Tryptophan und Tyrosin. Dabei findet

vermutlich eine Reduktion des Cu2+ aus dem Kupfer-Protein-Komplex zu Cu+

statt. Die charakteristisch blaue Farbe entsteht durch Abspaltung von ein bis

drei Sauerstoffatomen von Folins Reagenz. Der Farbumschlag wird bei 650 nm

vermessen.

Vor allem der Anteil an Tyrosin, Tryptophan, Cystein und Histidin bestimmt die

St¨

arke der Farbentwicklung. Der Lowrytest ist sehr st¨

oranf¨

allig, zahlreiche in der

Proteinchemie h¨

aufig verwendete Reagenzien beeintr¨

achtigen die Genauigkeit.

Durch verschiedene Modifikationen wurde aus dem Lowry-Test ein Mikroassay

entwickelt, der stabiler und genauer ist [114].

K¨

onnen Beeintr¨

achtigungen des Assays ausgeschlossen werden und sieht man von

einigen Ausnahmen ab, k¨

onnen bei verschiedenen Bestimmungsmethoden f¨

ur das

gleiche Protein immer noch Abweichungen zwischen 5 und 20 % auftreten. Bei

Rohproteinl¨

osungen sind die Unterschiede noch gr¨

osser. Daher ist die Angabe der

Testmethode, die zu einem Ergebnis gef¨

uhrt hat, sehr wichtig.

3.2.3 Elektrophorese

Als Elektrophorese bezeichnet man die Wanderung von geladenen Teilchen in

einem homogenen elektrischen Feld. Das urspr¨

ungliche Verfahren wurde von Ti-

selius in den 30er Jahren entwickelt. Er trennte Seren in einem mit Puffer gef¨

ullten

U-Rohr und wies so zum ersten Mal nach, dass Proteine Makromolek¨

ule mit de-

finierter Gr¨

osse, Ladung und Form sind. Darauf aufbauend wurden verschiedene

Verfahren etabliert, die heute in der Bioanalytik, der Molekularbiologie und der

forensischen Medizin Anwendung finden.

Wichtigste Weiterentwicklung ist die Elektrophorese in por¨

osen Medien wie Aga-

rosegel (Hjerten 1961) und Polyacrylamid (PA) (Raymond und Weintraub 1959).

Durch die Porenstruktur der Gele werden die Teilchen abh¨

angig von der Gr¨

osse

retardiert, so dass eine Trennung nach Masse-Ladungs-Verh¨

altnis erfolgt. Agaro-

segele werden vor allem in der Immunelektrophorese (Rocket-E.) und zur Tren-

nung von DNA-Fragmenten eingesetzt. In der Proteinanalytik haben sich PA-

Gele durchgesetzt, sie sind stabiler als Agarosegele, inert und transparent. Durch

Variation von PA-Konzentration und Vernetzungsgrad kann die Porengr¨

osse ein-

gestellt werden, um verschiedene Trennprobleme zu optimieren.

Proteine als amphotere Substanzen werden bei der Elektrophorese nach ihrem

effektiven Radius und der Ladung getrennt. Je nach eingesetztem Puffersystem

variieren die Ladungen und es kann sein, dass basische Proteine aus dem Gel her-

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 33

---

Proteine in verschiedenen

Größen, mit SDS ver-

kocht

Abbildung 3.8: Schema einer SDS-Gelektrophorese

auswandern und nicht erfasst werden. Zur Molmassenbestimmung von Proteinen

m¨

ussen die Ladungen der Proteine ”¨

uberdeckt“ werden. Das passiert durch Ko-

chen mit dem anionischen Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS). Ein Gramm

Protein bindet ca. 2,4 g SDS. Es entstehen Micellen mit negativer Ladung, die zur

Anode wandern. Bei der SDS-Elektrophorese nach Laemmli mit einem Puffersys-

tem aus HCl/Tris und Glycin l¨

asst sich ¨

uber einen weiten Bereich eine lineare

Beziehung zwischen Wanderungsgeschwindigkeit und Molmasse der Proteine er-

halten.

Eine moderne Variante der Elektrophorese ist die Kapillarelektrophorese (CE).

Sie findet tr¨

agerfrei in Kapillaren mit Innendurchmessern um die 100 µm statt.

Als Trennmedien werden w¨

assrige Puffersysteme eingesetzt. Die Detektion er-

folgt ¨

ublicherweise durch UV-Absorption, Fluoreszenz oder auf elektrochemi-

schem Weg [16].

3.2.4 Kapillarelektrophorese

Die Kapillarelektrophorese beruht auf demselben Prinzip wie die tr¨

agerfreie Elek-

trophorese im offenen Rohr. Seit Anfang der achtziger Jahre sind zuverl¨

assige und

automatisierte Ger¨

ate erh¨

altlich, so dass die CE zunehmend in der Routineana-

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 34

lytik eingesetzt wird. Wichtig hierf¨

ur war die Entwicklung von Kapillaren mit

einem Innendurchmesser von 100 µm und weniger. Durch das kleine Oberfl¨

ache-

zu-Durchmesser-Verh¨

altnis gibt es wenig Konvention und die gute W¨

armeabfuhr

erm¨

oglicht das Anlegen hoher Spannungen. Die Kapillare wird mit einem w¨

ass-

rigen Puffer gef¨

ullt, der den pH-Wert ¨

uber die Trennstrecke konstant h¨

alt und

den Ladungstransport gew¨

ahrleistet. Im sauren pH-Bereich werden h¨

aufig Citrat-

oder Phosphatpuffer eingesetzt, im basischen Borat oder Tris. Es kommen auch

zwitterionische Puffersubstanzen wie MOPS, MES oder CAPS zum Einsatz [16].

3.2.4.1 Aufbau der CE

Grundbestandteile der CE sind die Kapillare, Detektor, Spannungsquelle, zwei

Elektroden und Puffervials. An modernen Ger¨

aten sind ¨

ublicherweise auch ein

Fraktionssammler, automatischer Probenaufgeber und eine M¨

oglichkeit zur Tem-

perierung der Kapillare vorhanden [Abb. 3.9].

Die Spannungsquelle in der CE kann entweder mit konstantem Strom oder mit

konstanter Spannung betrieben werden. Dabei werden Spannungen bis zu 30 kV

und Stromst¨

arken um die 100 mA verwendet. H¨

ohere Spannungen k¨

onnen zu

Problemen durch Entladung am Geh¨

ause oder durch Luftfeuchte f¨

uhren. Die

Spannungsrichtung kann umgekehrt werden, da je nach Anwendung Detektion

an der Kathoden- oder Anodenseite notwendig ist.

Als Kapillarmaterial wird ¨

ublicherweise amorpher Quarz (fused silica) eingesetzt.

Er ist UV-transparent zur Detektion und chemisch stabil ¨

uber einen weiten pH-

Bereich. Der Innendurchmesser einer Kapillare liegt bei 50-100 µm, der Außen-

durchmesser bei ca 350 µm. Daher wird die Oberfl¨

ache der Kapillare mit einer

Polyimidschicht gesch¨

utzt und stabilisiert. Am Detektorfenster muss diese Schicht

entfernt werden.

Um keine Bandenverbreiterung zu erzeugen, d¨

urfen nur geringe Probenvolumina

(einige Nanoliter) mit hoher Reproduzierbarkeit aufgegeben werden. Dies kann

elektrokinetisch oder hydrodynamisch (durch Druck auf der Eingangsseite oder

Vakuum auf der Detektorseite) geschehen. Die Druckinjektion ist heute am ge-

br¨

auchlichsten, wobei Standardabweichungen von etwa 1 % bei der Probemenge

erzielt werden. Bei der elektrokinetischen Injektion wird die Probe durch Anlegen

einer Hochspannung elektrophoretisch und -osmotisch in die Kapillare transpor-

tiert. Die Probemenge ist dabei abh¨

angig von der Mobilit¨

at ihrer Ionen. Technisch

ist das leicht zu realisieren und bei gleicher Probe gut reproduzierbar, bei unter-

schiedlichen Matrices aber nicht sinnvoll, da Unterschiede in der Probenmenge

um den Faktor 100 auftreten k¨

onnen. Bei gelgef¨

ullten Kapillaren ist hydrodyna-

mische Injektion nicht m¨

oglich, daher wird hier die elektrokinetische angewendet.

Zur Detektion werden je nach Anwendung verschiedenste Methoden eingesetzt,

vor allem UV-Absorption, Diodenarray, Fluoreszenz- oder Leitf¨

ahigkeitsmessung

oder elektrochemische Detektion.

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 35

Fluss

Kapillare, 20-100 cm

Hoch-

spannungs-

quelle

Detektor

Outlet PufferInlet Puffer/

Probeninjektion

Abbildung 3.9: Aufbau einer Kapillarelektrophorese

3.2.4.2 Verfahren

Legt man an eine mit Puffer gef¨

ullte Kapillare eine Hochspannung an, wandern

die Kationen am Detektor vorbei zur Kathode. Aber auch Neutralteilchen und

Anionen k¨

onnen in der CE aufgrund des elektroosmotischen Flusses (EOF) erfasst

werden. Die Silanolgruppen auf der inneren Kapillarwand sind je nach pH-Wert

negativ geladen und ziehen Kationen aus dem Puffer an. Es bildet sich eine Ionen-

schicht, deren positive Ladungsdichte mit der Entfernung von der Wand exponen-

tiell abnimmt. Diese innere Helmholtz- oder Stern-Layer ist praktisch statisch.

Weiter entfernt von der Wand liegt die outer Helmholtz Plane (OPL), eine diffu-

se Ionenschicht. Ionen aus der OPL wandern zur Kathode und ziehen durch ihre

Hydrath¨

ulle Wassermolek¨

ule mit sich. Aufgrund der Koh¨

asionskr¨

afte des Wassers

bewegt sich der gesammte Puffer in Richtung Kathode und erm¨

oglicht auch die

Detektion von neutralen und negativ geladenen Teilchen. Der EOF tr¨

agt nicht zur

Peakverbreiterung bei wie die Str¨

omung in der HPLC, da praktisch ein plug-flow

angenommen werden kann.

3.2.4.3 CE von Proteinen

Nach der Theorie von Debey-H¨

uckel h¨

angt die Mobilit¨

at µvon Teilchen von ihrer

Ladung q, dem Stokesschen Radius r und der Viskosit¨

at h des Umgebungsmedi-

ums ab [115].

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 36

Bei Proteinen werden r und q von der dreidimensionalen Struktur der Molek¨

ule

bestimmt. Sie ist schwer vorherzusagen und ¨

andert sich durch An- und Abwe-

senheit von Co-Faktoren und mit der chemischen und physikalischen Umgebung.

Ein weiteres Problem sind Wechselwirkungen mit den W¨

anden der Kapillare.

Bei Kapillaren aus fused silica beschreibt Gleichung 3.1 die Deprotonierung der

Silanolgruppen:

[SiOH]s↔[SiO−] + [H+] (3.1)

Der pK-Wert dieser Reaktion liegt zwischen 4,5 und 5. Bei pH-Werten unterhalb

von 4 sind die Silanolgruppen protoniert, es gibt keine elektrostatische Adh¨

asion

der Proteine, wohl aber hydrophobe Adsorption, die zu Anlagerung an der Ober-

fl¨

ache f¨

uhrt. Zwischen pH 4 und 8 variiert der EOF stark und damit der Einfluss

auf die Migrationszeit der Proteine. Deshalb arbeitet man bevorzugt unterhalb

von 4 oder oberhalb des pI-Wertes der Proteine, so dass alle anionisch/neutral

vorliegen.

Versuche, Allergene mittels CE zu trennen und zu analysieren wurden vor allem

von Pacakova (Biene, Gras) [116], Besler (H¨

uhnerei) [117] und Chen (Latex) [118]

unternommen. Problematisch ist das Fehlen kommerziell erh¨

altlicher gereinigter

Pollenallergene als Vergleichsubstanzen.

3.2.5 Proteinf¨

arbung in Gelen

Nach der Elektrophorese m¨

ussen Proteine durch unspezifische F¨

arbung im Gel

sichtbar gemacht werden. Hierf¨

ur gibt es zwei Standardmethoden, die Impr¨

agnie-

rung mit metallischem Silber (Silberf¨

arbung) und die F¨

arbung mit organischen

Farbstoffen, vor allem Coomassie-Blau. F¨

ur die Silberimpr¨

agnierung gibt es ver-

schiedene Methoden, zum Beispiel von Oakley (1980) mit ammoniakalischer Sil-

berl¨

osung, die Silbernitratf¨

arbung von Merril et al. (1981) oder nach Blum et al.

(1987). Die Silberf¨

arbung bietet die gr¨

oßte Empfindlichkeit von allen Methoden,

das Gel kann aber anschließend nicht f¨

ur Blots o.¨

a. weiterverwendet werden. Au-

ßerdem ist die Reproduzierbarkeit problematisch, da die erhaltene Farbintensit¨

stark von der Einwirkzeit abh¨

angt [110].

Bei der konventionellen Coomassief¨

arbung mit Coomassieblau R250 bindet der

Triphenylmethanfarbstoff im sauren Medium vor allem durch elektrostatische

Wechselwirkungen an freie geladene Amino- und Iminogruppen der Proteine. Die

Farbintensit¨

at korreliert mit dem Gehalt an Lysin-, Arginin- und Histidinresten.

Die F¨

arbung erfolgt direkt in der Fixierl¨

osung, Hintergrundf¨

arbung wird durch

anschließendes Waschen entfernt. Die Nachweisgrenze der Methode liegt bei 0.3-1

µg/Bande.

Bei der kolloidalen Coomassief¨

arbung wird Coomassieblau G250, eine methylsub-

stituierte Form von R250 mit reduzierter L¨

oslichkeit im sauren Medium, verwen-

det. G 250 kann als kolloidale L¨

osung auf das Gel aufgebracht werden. Der gel¨

oste

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 37

Anteil f¨

arbt die Proteine, die Hauptmasse dringt aber nicht ins Gel ein, so dass

praktisch keine Hintergrundf¨

arbung entsteht. Somit ist kein Auswaschen mehr

n¨

otig. Außerdem ist die Empfindlichkeit der Methode deutlich h¨

oher als die der

urspr¨

unglichen Coomassief¨

arbung, das Gel ist f¨

ur nachfolgende densiometrische

Auswertung geeignet und kann auch geblottet werden. Man muss beachten, dass

das Gel nicht dicker als 1 mm ist, die Proben gut vorbereitet sind und vollst¨

andig

ins Gel einwandern. Das Gel darf nicht ¨

uberladen werden und sollte lange genug

(¨

uber Nacht) im F¨

arbebad bleiben, um eine gleichm¨

aßige F¨

arbung zu erzielen.

3.2.6 Blotting

Die Fixierung von Proteinen auf Membranen zur anschließenden Immunde-

tektion, Massenspektrometrie oder Aminos¨

aureanalyse wird als ”Blotting”

(auftropfen) bezeichnet. Im einfachsten Fall, dem Dot-Blotting, wird eine Pro-

teinl¨

osung auf eine Membran aus PVDF (Polyvinyldifluorid) oder Nitrocellulose

aufgetropft. Die Proteine haften durch physikalische Wechselwirkungen. Man

ben¨

otigt je nach Eiweißkonzentration zwischen 0,2 und 10 µl L¨

osung. Die

Membran wird anschließend mit BSA oder Magermilchpulver geblockt, um

unspezifische Bindung an freien Bindungsstellen der Membran zu verhindern. Im

n¨

achsten Schritt reagieren die immobilisierten Antigene mit einem spezifischen

Antik¨

orper, der mit einem enzymmarkierten Detektionsantik¨

orper ¨

uber eine

Farbreaktion (¨

ahnlich dem ELISA-Prinzip) sichtbar gemacht wird. Auf diese

Weise kann schnell getestet werden, ob eine L¨

osung ein bestimmtes Antigen

enth¨

alt oder es kann die Reinheit eines Antigens ¨

uberpr¨

uft werden. Vorausetzung

ist das Vorhandensein spezifischer Antik¨

orper.

Nach einer Elektrophorese ist es m¨

oglich, Proteine zur weiteren Untersuchung

aus dem Gel zu eluieren. Oft entstehen dabei Probleme durch zu geringe

Proteinkonzentration, Verunreinigungen durch Gelbruchst¨

ucke oder zu große

Mengen Salze oder Detergenzien; große oder sehr hydrophobe Proteine eluieren

schlecht.

Deshalb entwickelten Renart und Tombin (1979) [119] eine Methode zur direkten

Ubertragung aus dem Gel auf eine Membran mittels elektrischer Spannung,

wobei das Proteinmuster des SDS-PAGE-Gels erhalten bleibt. Dieser ”Western-

blot“ wird heute in verschiedenen Varianten durchgef¨

uhrt. Die bekanntesten

sind Tank- und Semidry-Blot. Beim Tankblot wird ein vertikaler Puffertank ver-

wendet, in dem die Elektroden in gegen¨

uberliegenden W¨

anden angebracht sind.

Gel und Membran sind zwischen Filterpapieren in einer Kassette eingeklemmt.

Bei konstantem elektrischen Feld wandern die negativ geladenen Proteine aus

dem Gel auf die Membran. Der Strom steigt dabei von 500 mA am Anfang stetig

an, so dass zur K¨

uhlung gr¨

oßere Mengen an Puffer (ca. 2 l) n¨

otig sind [16].

Beim Semidry-Blot liegen Gel und Membran zwischen puffergetr¨

ankten Filter-

papieren horizontal zwischen den Elektrodenplatten [Abb. 3.10]. Es wird weniger

Strom angelegt (ca. 1 mA/cm2), der w¨

ahrend des Blots ansteigt. Gasentwicklung

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 38

Graphitplatte

Filterpapier mit

Puffer

Filterpapier mit

Puffer

Gel

Membran

Kathode

Anode

Abbildung 3.10: Schematischer Aufbau des Blotsandwich beim Semidry-

Verfahren

aus dem Wasser kann das Blotsandwich auseinanderdr¨

ucken, deshalb wird es mit

einem Gewicht beschwert. Diese Variante hat sich immer mehr durchgesetzt, da

sie sparsamer im Pufferverbrauch ist und die Proteine mehr an der Oberfl¨

ache

der Membran bleiben, wo sie leichter detektiert werden k¨

onnen.

Bei beiden Methoden entstehen Probleme bei sehr großen Proteinen, die das

Gel schlecht verlassen. Zu hohe Spannungen k¨

onnen dazu f¨

uhren, dass kleine

Proteine die Membran durchschlagen und der Detektion verlorengehen.

3.2.7 FTIR-Spektroskopie

Schwingungsspektroskopie wird in den verschiedensten Bereichen biochemischer

Analytik (Lebensmittelanalytik, Medizin oder Mikrobiologie) und zur Kl¨

arung

unterschiedlichster Fragestellungen eingesetzt. Bedeutend f¨

ur die Ausweitung

der Anwendungsm¨

oglichkeiten gerade der IR-Spektroskopie war die Entwicklung

der Fourier-Transformations-Infrarot Spektroskopie in der Mitte der 80er Jah-

re. Der Aufbau eines FT-IR ist in der Literatur beschrieben [120]. Grunds¨

atz-

lich wird dabei das gesamte Interferogramm ¨

uber einen Wellenzahlenbereich er-

fasst und anschließend mittels Fourier-Transformation in ein Spektrum ¨

uberf¨

uhrt.

Vorteile gegen¨

uber der konventionellen IR-Technik ist eine bessere Ausnutzung

der Lichtintensit¨

at und damit ein besseres Signal-Rausch-Verh¨

altnis. Spektren

k¨

onnen schneller (ca. 1 Minute, je nach Aufl¨

osung) und mit großer Empfindlich-

keit bei hoher Wellenzahlpr¨

azision aufgenommen werden.

Bei Makromolek¨

ulen k¨

onnen nicht wie ¨

ublich Normalschwingungen ausgewer-

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 39

tet werden, sondern es werden Gruppenschwingungen betrachtet. Das heißt, ein

Molek¨

ul wird in einzelne Gruppen und Bindungen zerlegt, die in erster N¨

ahe-

rung unabh¨

angig voneinander schwingen. Gerade die IR-Spektren von Prote-

inen sind gut erforscht und k¨

onnen zu Vorhersagen der Sekund¨

arstruktur her-

angezogen werden. Verschiedene Banden konnten den Schwingungen des Pep-

tidger¨

ustes oder den Seitenketten zugeordnet werden. Miyazawa et al. [121] er-

forschten ab 1958 an N-Methylacetamid die Schwingungsmoden des Peptidr¨

uck-

grates, die sogenannten Amidbanden. Wichtig f¨

ur Strukturvorhersagen ist dabei

vor allem die Amid 1-Bande, die aus C=O-Streck-, C-N-Streck-, und C-C-N-

Deformationsschwingungen besteht. Die genauen Werte der Wellenzahlen sind

von der Umgebung der Proteine, vor allem von der Ausbildung von Wasserstoff-

br¨

ucken abh¨

angig. Gerade in Gemischen, wie sie typischerweise bei biologischen

Proben vorliegen, ist die Auswertung einzelner Banden durch starke ¨

Uberlage-

rungen problematisch. Man kann aber Regionen einteilen, in denen bestimmte

Absorptionsbanden liegen. Tabelle 3.1 zeigt verschiedene Schwingungsmodi und

ihre Wellenzahlen.

Da in komplexen biologischen Proben die Betrachtung von einer Bande oder

Wellenzahl [cm-1] Art der Schwingung

≈3500 -OH, Hydroxylgruppe

≈3200 NH-Streckschw. aus Protein (Amid A)

≈2959 CH-Str., assym. aus CH3Methylgruppen

≈2934 CH-Str. assym. aus CH2Methylengruppen

≈2921 CH-Str. aus Methylengruppen von Fetts¨

auren

2898 CH-Str. aus CH-Gruppen

2872 CH-Str. assym. aus Methylgruppen

2852 CH-Str. assym. aus Fetts¨

auren

1741 C=O aus Estergruppen

1715 C=O str. protonierter Carbonylgruppen, Carbons¨

auren

1695, 1685, 1675 Amid 1, verschiedene Komponenten,

≈1655 Amid 1, α-Helix

˜1637 Amid 1, β-Faltblatt

1550 Amid 2

1515 Schwingung von Tyrosinresten in Proteinen

≈1470 CH-Beugeschwingungen von CH2

≈1400 C=O symm. von Carbons¨

aureresten

1310-1240 Amid 3

1200-900 Ringschwingungen von Kohlehydraten

900-600 Fingerprint-Region

Tabelle 3.1: Typische IR-Absorptionsbanden [122]

Intensit¨

at nicht ausreicht, um die vorhandene Heterogenit¨

at zu erfassen, werden

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 40

statistische Methoden wie z.B. die Clusteranalyse angewandt, die im folgenden

Kapitel dargestellt wird.

3.2.7.1 Clusteranalyse

Als Clusterananlysen bezeichnet man Klassifizierungsmethoden, um ausgehend

von Distanzmatrizes die zu klassifizierenden Objekte in Klassen einzuteilen. ¨

Ahn-

liche Objekte werden dabei zusammengefasst, un¨

ahnliche weit voneinander ge-

trennt. Man unterscheidet hierarchische und nichthierarchische Verfahren. Erstere

k¨

onnen aufsteigend oder absteigend sein. Bevorzugt werden hierarchische Verfah-

ren angewendet, da angenommen wird, sie beschreiben am besten die inh¨

arenten

hierarchische Struktur der Klasseneinteilung in einem Datensatz.

Der typische Algorithmus einer hierarchisch aufsteigenden Methode sieht wie folgt

aus:

1. Anhand eines ¨

Ahnlichkeitsmaßes werden die zwei ¨

ahnlichsten Objekte zu

einem Cluster zusammengefasst.

2. Die Abst¨

ande des neuen Clusters zu den restlichen Objekten wird bestimmt.

3. Wie in 1. werden die beiden ¨

ahnlichsten Objekte zusammengefasst.

4. Es folgt eine erneute ¨

Ahnlichkeitsberechnung usw.

So wird verfahren, bis alle Objekte in einem Cluster fusioniert sind [123]. Die

AB C D E F G

Abbildung 3.11: Beispiel eines Clusters

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 41

spektrale Distanz zweier Spektren y1und y2kann zum Beispiel ¨

uber den Pear-

son’schen Produktmoment Korrelationskoeffizient r ausgedr¨

uckt werden.

ry1,y2=(Pn

i=1 y1,i ∗y2,i)−ny1∗y2

q(Pn

i=1 y2

1,i −ny2

1)∗(Pn

i=1 y2

2,i −ny2

2)(3.2)

y1,i, y2,i: y-Werte der Spektren, z.B. Extinktionswerte bei Wellenzahl i

n: Anzahl der Datenpunkte

Aus r kann dann die spektrale Distanz d berechnet werden:

dy1,y2= (1 −ry1,y2)∗1000 (3.3)

r kann dabei Werte zwischen null (keine ¨

Ahnlichkeit), eins (identische Objekte)

und minus 1 (vollst¨

andige negative Korrelation) annehmen. Alternativ k¨

onnen

spektrale Abst¨

ande durch z.B. euklidische Distanzen im zweidimensionalen Fak-

torraum ausgedr¨

uckt werden. Verschiedene Clusteranalyseverfahren unterschei-

den sich in der Berechnung dieser Distanzen. Bei ”Average Linkage“ entsprechen

die Fusionswerte im Dendogramm in etwa den urspr¨

unglichen Distanzen. Die Ent-

fernung eines neuen Clusters zum Cluster iwird hier durch einen ungewichteten

Mittelwert bestimmt:

dneu,i = 1/2(dpi+dqi) (3.4)

Beim Ward’schen Algorithmus ist ein ”Zuwachs an Heterogenit¨

at“ ein Maß f¨

den Abstand. Er wird ¨

uber Quadratsummen gebildet, daher wachsen die Werte

rasch an und sind von der Anzahl der Spektren abh¨

angig. Die erhaltenen Werte

kann man nicht mehr als Distanzen interpretieren.

Problematisch ist bei allen Verfahren, ob und inwieweit sie die Realit¨

at richtig

wiedergeben. Der Cluster in Abbildung 3.11 wurde mit ”Average Linkage“ er-

stellt. Auf den ersten Blick scheint A weit außerhalb der anderen ”Spektren“ zu

liegen, die Trennung zwischen den beiden Clustern erfolgt aber zwischen AB-

CD und EFG. Die Objekte D und E, obwohl sehr ¨

ahnlich, driften immer weiter

auseinander. Deshalb pr¨

uft das Programm Opus intern, ob ganz am Anfang der

Analyse zwei Spektren n¨

aher zusammenliegen als nach dem Zusammenschluss.

Wenn sie noch nicht verbunden sind, gibt das Programm eine Warnmeldung aus

[124].

Eine Entscheidung, welcher Algorithmus f¨

ur welches Probenkollektiv am geeig-

netsten ist, kann nur durch Versuch und Irrtum getroffen werden. Bei komplexen

biologischen Proben haben sich aber vor allem ”Average Linkage“ und Wards

Algorithmus bew¨

ahrt.

3.2.8 Extraktion

In der Literatur werden zahlreiche Methoden zur Extraktion von Allergenen aus

Pollen beschrieben. Dabei kommen verschiedene Extraktionspuffer wie Coca’s

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 42

L¨

osung oder Ammoniumhydrogencarbonat zur Anwendung. Ebenso variieren das

Verh¨

altnis Pollen zu Puffer und die Dauer und Bedingungen der Extraktion.

Wichtig sind milde Bedingungen, um die Strukturen der Allergene und die Epi-

tope weitgehend zu erhalten, und zu vermeiden, dass sie von Proteasen abgebaut

werden. Dazu sind 4 ◦C ausreichend - zumindest bei Pollenallergenen. Bei ein-

facher Hydratation wird der Großteil des IgE-bindenden Proteins schon nach

den ersten 10 min in L¨

osung gehen [125]. Verwendet man Detergenzien, liegt

mehr allergisch irrrelevantes Protein im Extrakt vor. Maasch et al. untersuchten

die Zeitabh¨

angigkeit bei der Allergenextraktion [126]. Bereits nach 5 Minuten

waren alle Allergene in L¨

osung nachweisbar, eines (Gruppe 2) war sogar schon

vollst¨

andig extrahiert. Der Gehalt an Gruppe-1 stieg bis zu 13 Stunden an, ebenso

wie der Proteingehalt, der noch 48 Stunden leicht ansteigt. Proteolytische Zerset-

zung konnte unter den gew¨

ahlten Bedingungen (4 ◦C) nicht beobachtet werden.

Die geeigneten Extraktionsbedingungen sind also ein Kompromiss aus schonender

Behandlung der Proteine und vollst¨

andiger Gewinnung der Allergene.

3.3 Pflanzenmaterial

Weidelgras (Lolium) wird hier als Modellpflanze genutzt, da es eine große Bedeu-

tung als Futterpflanze im gem¨

aßigten Klima (Europa und Australien) hat und

Sensibilisierung gegen Weidelgraspollen weit verbreitet ist. Die Pollen lassen sich

aufgrund der schlanken ¨

Ahren und des großen Ertrags gut gewinnen. Die Allerge-

ne der Weidelgraspollen sind schon gut erforscht (siehe Kapitel 2) und Antik¨

orper

sind kommerziell erh¨

altlich. Weidelgras kommt in drei Hauptarten vor, mehrj¨

ahri-

ges (Lolium perenne, Deutsches Weidelgras), ¨

uberj¨

ahriges (Lolium multiflorum,

Welsches Weidelgras)und einj¨

ahriges Weidelgras (Lolium westerwoldicum).

3.3.0.1 Lolium perenne

Lolium perenne ist ein ausdauerndes wintergr¨

unes Horstgras, das vor allem im

Seeklima gut gedeiht. Die Bl¨

utezeit beginnt im Mai bis Juni und zieht sich ¨

uber

den ganzen Sommer bis in den Herbst hinein. Lolium perenne kommt vor al-

lem auf Grasland, Wegen, Rainen, Rasenfl¨

achen und Graspl¨

atzen vor, da es sehr

trittfest ist. Als wichtiges Futter- und Weidegras vertr¨

agt es Verbiss sehr gut und

w¨

achst rasch nach. Es ist in Nordamerika, Nordafrika und im gem¨

aßigten Asien

eingeb¨

urgert worden. Sch¨

adlich f¨

ur Lolium perenne sind Frost, eine ausgedehnte

Schneeperiode und Trockenheit.

Lolium perenne kommt nur nach dem Winter zur Bl¨

ute. Nach der Aussaat und

einer gewissen Anwachszeit muss es einem k¨

unstlichen Winter (Vernalisation)

ausgesetzt werden (ca. 7 ◦C f¨

ur 6 Wochen), langsam wieder an Temperaturen

um 20 ◦C gew¨

ohnt werden und dann durch Lichtperioden l¨

anger als 16 Stunden

pro Tag (Langtagpflanze) die Bl¨

ute induziert werden. Dies ist im Gew¨

achshaus

KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN 43

problematisch, die Pflanzen erholen sich nach der K¨

alteperiode oftmals schlecht,

die Vernalisation ist nicht erfolgreich oder die Pollenertr¨

age sind gering, wenn

uberhaupt vorhanden.

3.3.0.2 Lolium multiflorum

Lolium multiflorum ist ein ein- bis mehrj¨

ahriges Horstgras, das bis zu 1 m hoch

werden kann. Nach dem Schnitt w¨

achst es schnell nach und schiebt neue Bl¨

uten.

Es ¨

uberwintert je nach Witterungsbedingungen ein oder mehrmals. Deshalb ist es

nicht f¨

ur Grasland geeignet. Zur Gr¨

unfuttergewinnung wird es h¨

aufig angebaut,

da es hohe Ertr¨

age liefert.

Auch Lolium multiflorum muss vernalisiert werden, um zu bl¨

uhen. Bei Entnahme

aus dem Freiland nach dem Winter bl¨

uht es auch in den Begasungskammern bis

zu zweimal und liefert große Pollenmengen. Allerdings kann es nur zwischen Mai

und Juli verwendet werden, da dann die Bl¨

utezeit endet.

3.3.0.3 Lolium westerwoldicum

Lolium westerwoldicum ist von der Morphologie dem mehrj¨

ahigen Weidelgras sehr

ahnlich. Es handelt sich um eine Unterart, allerdings ¨

uberwintert es nicht. Es geht

ohne Vernalisation von der vegetativen in die generative Phase ¨

uber, so dass es

sich zur Untersuchung gut eignet [127]. Etwa sechs Wochen nach der Aussaat

bl¨

uhen die Graspflanzen, abh¨

angig von den Wetterbedingungen. Wachsen die

Pflanzen im Freiland heran, werden sie gr¨

oßer und kr¨

aftiger als im Labor oder

direkt in den Begasungskammern. Auch Sch¨

adlinge wie Blattl¨

ause oder Mehltau

verursachen dann weniger Probleme.

Kapitel 4

Ergebnisse und Diskussion

4.1 Protein- und Allergengehalt

Der Gehalt an Gruppe 5 Allergen im Pollenextrakt l¨

aßt sich ¨

uber den ELISA

sehr genau bestimmen (im Bereich ng/ml). Problematisch ist die Auswahl

einer geeigneten Bezugsgr¨

oße. Die Ergebnisse der Gesamtproteinbestimmung

sind weniger genau als die des ELISAs (siehe Kapitel 3) und k¨

onnen unter

Umst¨

anden Trends in den Ergebnissen ¨

uberdecken. Deshalb werden zum einen

die Gruppe 5-Gehalte der Extrakte und auch das Verh¨

altnis Gruppe 5 Allergen

zum Gesamtprotein angegeben.

4.1.1 Klimakammern Paderborn

In den Paderborner Klimakammern werden haupts¨

achlich Lolium multiflorum

und Lolium westerwoldicum eingesetzt. Lolium perenne ist nur einmal verwendet

worden, wobei nur eine Probe genommen werden konnte. Bei den ersten Versu-

chen wurden insgesamt nur wenig Pollen erhalten, so dass Sammelproben ¨

uber

mehrere Tage untersucht werden mußten. Bei Versuchen mit Lolium multiflorum

und sp¨

ater auch mit Lolium westerwoldicum konnte jeden Tag eine ausreichende

Menge Pollen zur Extraktion geerntet werden.

Das verwendete Begasungsprogramm war identisch bei allen Versuchsreihen (au-

ßer beim ersten Versuch). Die Pflanzen erhielten acht Stunden ¨

uber Nacht kein

Ozon, w¨

ahrend der Lichtphase (sechzehn Stunden) wurde Ozon von 80 bzw. 140

ppb aufgegeben. In der Kontrollkammer blieben die Ozonwerte immer unterhalb

der Erfassungsgrenze.

4.1.1.1 Lolium multiflorum.

1. durchgehende Ozonbegasung ¨

uber 24 Stunden

Es konnten drei Proben genommen und untersucht werden. Im Allergen-

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 45

Proteinverh¨

altnis wurde kein eindeutiger Trend festgestellt. Allerdings sind

die Allergenwerte der ersten beiden Proben (Pollen vom 26.5. und vom

30.5.) außergew¨

ohnlich niedrig und die Pollen selbst klumpig, so dass es

nicht ausgeschlossen werden kann, dass sie mit zu hoher Feuchtigkeit in

Kontakt gekommen sind.

2. Tag-Nacht Programm

Die Gruppe 5-Gehalte der Extrakte von ozonisierten und Kontrollpollen so-

wie der Proteingehalt pro Gramm Pollen sind in Abbildung 4.1 dargestellt.

468

10 12 14 16

100

Gruppe 5 Ozon

Gruppe 5 Kontrolle

µg Gruppe 5/ml

Tage Ozon

100

mg Protein/g Pollen

Proteingehalt Ozon

Proteingehalt Kontrolle

Abbildung 4.1: Lolium multiflorum, Allergen- und Proteinwerte

Die Allergengehalte zeigen keine signifikanten Unterschiede. Im Proteinge-

halt liegen die Kontrollpollen teilweise deutlich h¨

oher als die ozonisierten.

Dadurch ist das Verh¨

altnis Gruppe 5 Allergen - zu - Masse - Protein bei

den ozonisierten Pollen gr¨

oßer als bei der Kontrolle [Abb. 4.2].

Bei einer Wiederholung des Versuchs konnte dieses Ergebnis nicht best¨

atigt

werden, die Proteingehalte waren nicht sigifikant verschieden. Auch im All-

ergen - zu - Proteinverh¨

altnis zeigte sich kein Unterschied.

Bei allen Versuchen konnte sowohl bei der Kontrolle als auch bei den begasten

Pollen eine Abnahme der Gesamtproteinmenge als auch des Allergengehaltes ¨

uber

die Zeit beobachtet werden. Ob das ein Effekt ist, der vielleicht von den subop-

timalen Lichtverh¨

altnissen in den Kammern verursacht wird, oder ein zuf¨

alliger

Verlauf, kann nicht beurteilt werden.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 46

4 6 8

10 12 14 16

ozonisierte Pflanzen

Kontrolle

µg Allergen /mg Protein

Tage Ozon

Abbildung 4.2: Lolium multiflorum Verh¨

altnis Allergen zu Protein

4.1.1.2 Lolium westerwoldicum

Die ersten Versuche mit Lolium westerwoldicum wurden mit einem Tag-Nacht-

Programm (8h 0 ppb Ozon, 16 h 80 ppb) durchgef¨

uhrt. Wie in Abb. 4.3 illustriert

ist, ist das Verh¨

altnis von Gruppe 5 Allergen zu Protein bei den ozonisierten

Pollen h¨

oher als bei der Kontrolle. Die Unterschiede sind allerdings gering. Auch

der Gesamtproteingehalt ist bei den ozonisierten Pollen h¨

oher, ebenso die Menge

an Gruppe 5-Allergen im Extrakt.

Um den Effekt deutlicher sichtbar zu machen, wurden h¨

ohere Ozonwerte (um die

140 ppb tags¨

uber) eingesetzt. Bei den ersten beiden Proben (13.2.02 und 6.3.02)

best¨

atigte sich dieser Effekt, bei den weiteren Proben nicht. Das kann an einer

Gew¨

ohnung der Pflanze an den Stressfaktor Ozon liegen oder an einer so schweren

Sch¨

adigung durch Ozon, das der Stoffwechsel der Pflanze zu stark ver¨

andert ist.

Auch bei einem dritten Versuch ¨

uber 20 Tage, bei dem jeden Tag eine Probe

genommen wurde, ließ sich kein eindeutiger Effekt nachweisen.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 47

4--34

35-49

ab 49

Gruppe 5 ozonisiert

Gruppe 5 Kontrolle

µg/ml

Tage Ozon

100

120

Proteingehalt Ozon

Proteingehalt Kontrolle

mg Protein/g Pollen

(a) Protein- und Allergenwerte

4--34

35-49

ab 49

Gruppe 5 ozonisiert

Gruppe 5 Kontrolle

µg Allergen/ g Protein

Tage Ozon

(b) Verh¨

altnis Allergen zu Protein

Abbildung 4.3: Lolium multiflorum, tags¨

uber 80 ppb, nachts 0 ppb Ozon

4.1.2 Klimakammern Essen

Im Jahr 2001 konnte Lolium multiflorum in Essen ¨

uber mehrere Wochen in

den Klimakammern begast werden. Dabei dienten zwei Kammern als Kontrolle

(0 ppb Ozon). In zwei Kammern wurde ein ”l¨

andliches Ozonmuster“ (50-60

ppb ¨

uber 24 h) aufgegeben und in zwei weiteren Kammern ein ”st¨

adtisches

Muster“ (nachts 40 ppb, tags¨

uber bis zu 100 ppb).

Die Protein- und Allergenwerte dieser Versuchsreihe sind recht einheitlich. Nur

eine Probe bei Begasung mit ”st¨

adtischem Muster“ liegt weit unterhalb des

Durchschnittswertes. Es ist kein Trend oder Unterschied zwischen Kontrolle und

ozonisierten Pollen zu erkennen.

4.1.3 Fazit

Bei mehreren Wiederholungen der Versuche konnte im ELISA keine signifikante

Anderung des Gehalts an Gruppe 5-Allergen nachgewiesen werden.

Gruppe 5 ist nur eines der Majorallergene der Gr¨

aser. Um eine Aussage ¨

uber die

Allergenit¨

at eines Extraktes zu machen, m¨

ußten noch weitere Allergene bestimmt

werden, wie zum Beispiel Gruppe 1. Daf¨

ur steht leider kein funktionierender

ELISA zur Verf¨

ugung.

Die Menge an Lol p 5 im Extrakt h¨

angt stark von der Grassorte, den Anzucht-

bedingungen und Extraktionsbedingungen ab. W¨

ahlt man ein abweichendes

Pollen-Pufferverh¨

altnis – setzt man zum Beispiel mehr Puffer ein, wenn zu

geringe Pollenmengen vorhanden sind – ist der Gruppe 5-Gehalt erh¨

oht. Der

Proteingehalt ist dann geringer, w¨

ahrend bei dem ¨

ublichen Extraktionsverh¨

altnis

von 2 % w/v der Proteingehalt der Extrakte recht konstant ist.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 48

Die Allergen- und Proteinwerte unterscheiden sich leicht, je nach Lolium-Art.

Lol p 5 Protein Protein % Allergen

Art im Extrakt im Extrakt pro g Pollen vom Protein

Lolium perenne 40 µg/ml 1,65 mg/ml ca. 80 mg 2,5

Lolium multiflo-

rum

50-130µg/ml 1,3-2 mg/ml 50-70 mg 5-6

Lolium wester-

woldicum

80-120 µg/ml 1,4-2 mg/ml 75-105 mg 4-7

Tabelle 4.1: Durchschnittliche Protein- und Allergengehalte verschiedener

Lolium-Arten

In Lolium westerwoldicum ist im Verh¨

altnis am meisten Allergen enthalten,

in Lolium perenne am wenigsten (Tabelle 4.1). Die hier untersuchten Pollen

werden unter unnat¨

urlichen Verh¨

altnissen in den Klimakammern gesammelt.

Zum Vergleich werden auch Pollen aus dem Freiland untersucht, z.B. von Lolium

multiflorum Pflanzen, die aus der selben Aufzucht stammen wie die aus den

Kammern und in den gleichen T¨

opfen heranwachsen, allerdings im Freiland

unter nat¨

urlichen Lichtverh¨

altnissen. Die Proteinwerte liegen bei etwa 65 mg pro

g Pollen und die Menge an Lol p 5 im Extrakt bei 70 µg/ml. Zus¨

atzlich wurden

Pollen von Loliumpflanzen im Freiland gesammelt. Allerdings liegen hier keine

Informationen ¨

uber die Sorte vor. Der Proteingehalt war mit 89-120 mg pro g

Pollen wesentlich h¨

oher als unter Laborbedingungen, der Allergengehalt mit ca.

30 µg pro mg Protein geringer.

Quantifizierung von Allergenen in Pollenextrakten wurde von z.B. Fahlbusch

et al. [128] oder Sch¨

appi et al. [129] vorgenommen. Da die Werte sehr von der

Extraktionsmethode abh¨

angen, ist ein Vergleich schwierig. Fahlbusch unter-

suchte den Gruppe 5- und Gruppe 1-Gehalt verschiedener Gr¨

aser, f¨

ur Lolium

perenne werden 38 µg Gruppe 5 pro mg Protein gefunden, das sind ca. 4 % des

Gesamtproteins. Bei einem Extraktionsverh¨

altnis von 10 % w/v erhalten sie 2

mg/ml Protein im Extrakt, was in etwa den hier gefundenen Werten entspricht.

Der Anteil an Gruppe 1 Allergen ist etwa doppelt so hoch wie der an Gruppe 5.

Sch¨

appi et al. verglichen Lolium perenne und Lolium multiflorum und finden

einen Anteil von Gruppe 5 am Gesamtprotein von 18,2 % bzw von 28,2 %. Durch

die abweichenden Extraktionsbedingungen erhalten sie einen Proteingehalt von

485 bzw 584 µg/ml.

Obwohl man zwischen ozonbegasten und nicht begasten Pollen keinen sig-

nifikanten Unterschied im Allergengehalt nachweisen kann, ist es durchaus

m¨

oglich, dass andere Majorallergene in verschiedenen Konzentrationen auftre-

ten.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 49

Das Fehlen einer absoluten Bezugsgr¨

oße f¨

ur den Allergengehalt ist ein weiteres

Problem. Wenn bei begasten Pollen (wie in Kapitel 2 vermutet), die St¨

arkeein-

lagerung nicht oder nur eingeschr¨

ankt stattfindet, w¨

aren diese Pollen leichter

und das Extraktionsverh¨

altnis w¨

urde verf¨

alscht. Da keine M¨

oglichkeit besteht,

die Pollen vor dem Einwiegen zu z¨

ahlen und auf fehlende St¨

arkek¨

orner zu

untersuchen, kann das nicht ausgeschlossen werden.

Der Proteingehalt der Extrakte ist nicht unterschiedlich. Das kann an der man-

gelnden Sensitivit¨

at des Assays liegen. Dadurch werden eventuell verhandene

geringe Unterschiede im Proteingehalt nicht entdeckt. Trotzdem wird er hier als

Bezugsgr¨

oße gew¨

ahlt.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 50

4.2 SDS-Gelelektrophorese und Blots

Da es sich bei Graspollenallergenen um Proteine handelt, k¨

onnen qualitative

und eingeschr¨

ankt auch quantitative Ver¨

anderungen im Allergengehalt der Pol-

len ¨

uber SDS-Gelelektrophorese nachgewiesen werden. Durch Blot und Detektion

mit Allergiker-Seren k¨

onnen Bindungseigenschaften der Allergene zu spezifischem

IgE auf Modifikationen ¨

uberpr¨

uft werden.

4.2.1 Nachweis der Allergene im Gel

Um zu ¨

uberpr¨

ufen, welche der Banden im SDS-Gel allergene Wirkung haben,

wird der Blot mit monoklonalen Antik¨

opern gegen Gruppe 1 und 5 und zwei

Seren inkubiert. Zum Vergleich dient eine mit Ponceau-S gef¨

arbte Bahn mit Pol-

lenextrakt bzw. Molgewichtsmarkern [Abb. 4.4].

Der Pollenextrakt (Lane 2) zeigt viele scharfe Banden, die Proteine konnten

Abbildung 4.4: Identifizierung von Allergenen im Western-Blot, Lane 1: Mar-

ker; Lane 2: Lolium-Extrakt, Coomassief¨

arbung; Lane 3: mAbs

gegen Gruppe 5; Lane 4: mAbs gegen Gruppe 1; Lanes 5 und

6: Allergikerseren; Gel 12 %/4 %, Tris-HCl-Glycin

sauber getrennt werden. Der monoklonale Antik¨

orper (Lane 4) gegen Gruppe 1

bindet an eine Doppelbande bei ca. 30 kD. Laut Literatur zeigt Lol p 1 eine

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 51

einzelne Bande bei 31 kD. Die Abweichung kann durch Abspaltung eines Frag-

ments (vielleicht des Kohlenhydratanteils) und dadurch bedingte Ver¨

anderung

des Molekulargewichts zustandekommen. Das Epitop, gegen das der Antik¨

orper

gerichtet ist, bleibt aber intakt. Es ist auf der anderen Seite m¨

oglich, dass der

verwendete Antik¨

orper nicht gen¨

ugend spezifisch ist und mit einem anderen Pro-

tein reagiert.

Der Antik¨

orper gegen Gruppe 5 (Lane 3) erkennt eine Dreifachbande zwischen

30 und 36 kD, was sich in guter ¨

Ubereinstimmung mit der Literatur befindet. Im

gef¨

arbten Gel ist die Unterscheidung zwischen den Banden von Lol p 1 und Lol p

5(a-c) schwierig, da sie sehr nah nebeneinander liegen. Was im Blot als intensive

Bande herauskommt, ist in der F¨

arbung m¨

oglicherweise nur eine d¨

unne Bande

von vielen, da die Immundetektion wesentlich empfindlicher ist.

Die Seren (Lanes 5 und 6) binden im Bereich um die 30 kD mehrere Proteine, sie

enthalten spezifisches IgE gegen Gruppe 1 und 5. Serum D erkennt eine weitere

Bande bei ca. 60 kD. Laut Literatur kann es sich hier um Lol p 4 handeln. Theo-

retisch ist ein Dimer von Gruppe 5 m¨

oglich, was in der Literatur beschrieben ist,

aber ein solches sollte von den mAbs gegen Lol p 5 oder einem Serum mit Gruppe

5-spezifischem IgE erkannt werden. Bei Serum E ist keine Bande bei 60 kD zu

erkennen.

Die schwachen Banden unterhalb von 30 kD und oberhalb von 60 kD k¨

onnen kei-

nen Allergenen zugeornet werden. Es kann sich hier auch um eine unspezifische

Bindung handeln.

4.2.2 Vergleich ozonisierte und Kontrollextrakte

4.2.2.1 Bandenmuster

Zum Vergleich werden ozonisierte und Kontrollpollenextrakte im Gel nebenein-

ander aufgetragen und angef¨

arbt [Abb. 4.5]. Die Extrakte stammen von Lolium

multiflorum-Pflanzen, die zwischen 11 und 15 Tagen erh¨

ohten Ozonwerten in den

Klimakammern ausgesetzt waren.

Im Bandenmuster ist kein Unterschied zu erkennen. Die Hauptbanden liegen

jeweils bei 31, 36, 55, 61, 70 und 85 kD. Bei den begasten Pollen sind keine

zus¨

atzlichen Banden aufgetreten, es gibt auch keine Bandenverschiebung, was

ein Hinweis auf Ver¨

anderungen der Sequenz oder Struktur eines bestimmten Pro-

teins ist. Auch in den Gelen der weiteren Versuchsextrakte waren keine Unter-

schiede zwischen begasten und Kontrollpflanzen zu erkennen. Die verschiedenen

Lolium-Arten zeigen praktisch identische Bandenmuster, was auf die ¨

Ahnlichkeit

der Extrakte hinweist.

Die Gele werden eingescannt und ¨

uber die optische Dichte semiquantitativ aus-

gewertet. Dabei werden vor allem die Banden bei 30, 36 und 60 kD betrachtet.

Wie in Tabelle 4.2 zu erkennen, gibt es keine signifikanten Unterschiede.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 52

Abbildung 4.5: SDS-Page von ozonisierten (O3) und unbehandelten (V) Pol-

lenextrakten, M: Pharmacia Low molecular weight marker, Gel

12%/4%, Tris-HCl-Glycin

Probe 36 kD (Gr1) 60 kD (Gr4) 30 kD (Gr 5)

Gel 1

20.6. V 88,7 76,6 68,7

20.6. Oz 74,8 60,5 73,2

23.6. V 85,6 54,2 57,9

23.6. Oz 71,2 59,5 69,2

24.6. V 68,0 66,5 58,7

24.6. Oz 64,0 46,6 63,2

25.+26.6. V 76,1 46,6 52,7

25.+26.6. Oz 74,5 41,3 75,5

Gel 2

27.6. V 92,4 59,3 59,8

27.6. Oz 101,0 79,8 81,8

28.6. V 90,0 76,6 64,1

28.6. Oz 85,4 76,0 70,6

30.6. V 91,2 60,3 65,1

30.6. Oz 103,0 64,2 77,8

2.7. V 109,0 84,8 77,1

2.7. Oz 104,8 77,6 72,6

Tabelle 4.2: Densiometrisch bestimmte Bandenintensit¨

aten - Lolium multiflo-

rum, V: Vergleich, Oz: Ozon

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 53

4.2.2.2 Bindung von spezifischem IgE im Blot

Um zu ¨

uberpr¨

ufen, ob sich die Bindungseigenschaften der Proteine zu spezifi-

schem IgE durch Ozon ver¨

andern, wurden Kontroll- und Ozonproben gelelektro-

phoretisch getrennt, geblottet und mit Patientenseren detektiert [Abb. 4.6].

Abbildung 4.6: Detektion von begasten und Kontrollpollen mit Allergikerseren

(Serum D und E) und mAbs (1D11 gegen Gruppe 5, 3G5 gegen

Gruppe 1), K Kontrolle, Oz Ozon

Die Banden zeigen keine Unterschiede zwischen begasten und unbegasten Pollen.

Anderungen k¨

onnen sich zum Beispiel durch Punktmutationen ergeben, die zum

Austausch einer Aminos¨

aure f¨

uhren. Die daraus folgende leichte Differenz in der

Molmasse ist im SDS-Gel nicht zu erkennen, kann aber zur Zerst¨

orung eines

Epitopes f¨

uhren, so dass Antik¨

orper das Protein nicht mehr erkennen. In Pati-

entenseren liegen Mischungen von IgE vor, die gegen verschiedene Epitope eines

einzigen Antigens gerichtet sein k¨

onnen, daher m¨

ussten schon mehrere Epitope

ver¨

andert sein, damit es nicht mehr gebunden wird. Die verwendeten monoklona-

len Antik¨

orper, die alle gegen ein Epitop gerichtet sind, reagieren empfindlicher

auf Ver¨

anderungen. Aber in den Lanes 3-6 sind auch keine Unterschiede zwischen

Kontrollextrakt und ozonsiertem Pollen zu erkennen.

Der immunochemische Nachweis der Proteine ist empfindlicher als die unspezi-

fische F¨

arbung der Proteine im Gel. Eine Quantifizierung der Banden ist nicht

m¨

oglich, da keine direkte Beziehung zwischen Farbintensit¨

at und Proteinmenge

besteht.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 54

4.3 Kapillarelektrophorese

4.3.1 Methodenentwicklung

Die Kapillarelektrophorese bietet die M¨

oglichkeit, die Allergene weitgehend nativ

zu untersuchen. Es ist kein Verkochen oder eine andere wenig schonende Proben-

vorbereitung n¨

otig. Dieser Vorteil soll auch bei der Entwicklung der Trennmetho-

de erhalten bleiben. Auf extreme pH-Werte sollte daher verzichtet werden. Am

geeignetsten sind hierf¨

ur beschichtete Kapillaren, die die Adh¨

asion der Proteine

an den Kapillarw¨

anden minimiert. Da nur unbeschichtete Fused-silica-Kapillaren

zur Verf¨

ugung standen, m¨

ussen pH-Werte unterhalb von 4 oder oberhalb des pIs

der Proteine gew¨

ahlt werden. Erste Versuche mit Phosphatpuffern (pH-Wert 1-2)

zeigten eine gute Trennung, aber eine schlechte Reproduzierbarkeit. Verschiedene

Boratpuffer bei pH-Werten oberhalb von 9,6 wurden getestet, wobei ein pH-Wert

von 10,1 die beste Trennung bei noch annehmbaren Analysezeiten ergab.

Neben der direkten Quantifizierung der erhaltenen Peaks ¨

uber UV-Absorption

bietet die CE die M¨

oglichkeit zur Aufnahme eines UV-Spektrums f¨

ur jeden Peak.

Damit k¨

onnen die Reinheit und auch gewisse Eigenschaften der Substanzen ¨

uber-

pr¨

uft werden. Ein Nachteil der Methode ist die lange Analysenzeit von 60 Mi-

nuten pro Probe. Außerdem f¨

uhren schon geringe ¨

Anderungen in der Pufferzu-

sammensetzung, wie sie w¨

ahrend eines Laufs vorkommen, zu ¨

Anderungen in den

Retentionszeiten. Nach jedem Lauf sollte daher frischer Puffer verwendet werden.

10 20 30 40 50

-2000

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

53,7

41,4

33,4

30,3

20,2

12,5

28,5

Absorption

min

Abbildung 4.7: Lolium westerwoldicum, typisches Elektropherogramm

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 55

180 200 220 240 260 280 300

-5000

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

Peak bei 28.617 min

Absorbance units

Abbildung 4.8: UV-Spektrum des Peaks bei 28 min

In Abbildung 4.7 ist ein typisches Elektropherogramm einer Pollenprobe dar-

gestellt. Die ersten Peaks bis etwa 13 Minuten enthalten die Ionen aus dem

Probenpuffer. Zwischen 15 und 25 Minuten erscheint ein schlecht aufgel¨

oster

Multipeak. Die Trennung konnte in diesem Bereich nicht verbessert werden. Der

scharfe Peak bei 28 Minuten geh¨

ort zu einem Protein, wie man am UV-Spektrum

[Abb. 4.8] sieht. Bei etwa 214 nm liegt eine Schulter typisch f¨

ur Absorption durch

die Peptidbindung. Das zweite Maximum bei 258 nm deutet auf aromatische

Aminos¨

auren wie Tryptophan oder Phenylalanin hin. Der Fl¨

achenanteil dieser

Substanz liegt bei etwa 30 %.

Zwischen 30 und 55 Minuten liegen mehrere Peaks, deren Muster und Fl¨

achen-

anteile je nach Pflanzencharge variieren. Im Bereich von 258 nm zeigen sie

Absorption, was auf aromatische Komponenten hindeutet. Die Allergene des

Weidelgrases enthalten aromatischen Aminos¨

auren in verschiedenen Anteilen, so

dass es sich hier um Allergene handeln k¨

onnte.

4.3.2 Versuche zur Identifizierung von Allergenen im

Elektropherogramm

Um herauszufinden, welche der Proteine im Elektropherogramm allergisch

relevant sind, wurden verschiedene Ans¨

atze erprobt, da die Allergene des

Weidelgrases in reiner Form kommerziell nicht erh¨

altlich sind.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 56

•Aus einem pr¨

aparativen SDS-Gel wurden die allergisch relevanten Ban-

den ausgeschnitten und das Protein daraus eluiert. Mithilfe des Dotblot

wurde best¨

atigt, dass das interessierende Protein in der L¨

osung vorhan-

den ist. Diese Proteinl¨

osungen wurden in der Kapillarelektrophorese als

Standard verwendet. Als Vergleich dient ein Puffer, mit dem freies SDS-

Gel extrahiert wurde. Es konnte kein Proteinpeak im Elektropherogramm

identifiziert werden. Vermutlich durch Gelbruchst¨

ucke, die ¨

uber den ganzen

Zeitraum im Elektropherogramm erscheinen, wird das Allergen ¨

uberdeckt.

Durch das Kochen mit SDS kann die Ladung des Proteins im nativen Ex-

trakt so ver¨

andert worden sein, dass die Wanderungsgeschwindigkeit im

elektrischen Feld v¨

ollig anders ist als die des nativen Proteins. Versuche

mit einer nativen Gelelktrophorese brachten keine besseren Ergebnisse.

•Die Sammlung einzelner Fraktionen nach einem Lauf der Kapillarelektro-

phorese und anschließende Dotblot-Detektion der Allergene ist aus appara-

tiven Gr¨

unden nicht m¨

oglich.

•Mischt man eine L¨

osung eines Allergens mit einem spezifischen Antik¨

orper,

findet eine Reaktion zwischen den Molek¨

ulen statt und es entsteht abh¨

angig

von der Bindungsst¨

arke ein Allergen-Antik¨

orperkomplex. Nimmt man das

Elektropherogramm der Allergenl¨

osung auf und vergleicht es mit dem Elek-

tropherogramm des Allergen-Antik¨

orpergemisches, sollte ein Proteinpeak

verschwinden und ein neuer Komplexpeak auftauchen.

Ein Pollenextrakt wurde mit mAb gegen Phl p 5 in verschiedenen Kon-

zentrationsverh¨

altnissen gemischt und die L¨

osung in der CE getrennt. Es

konnte kein Peak als Allergen identifiziert werden. Der gew¨

ahlte pH-Wert

von 10 ist vielleicht zu alkalisch und die entstandene Allergen-Antik¨

orper-

bindung ist zu schwach, um unter diesen Bedingungen bestehen zu bleiben.

Ahnliche Versuche wurden mit Allergikerseren unternommen. Da hier An-

tik¨

orper gegen mehrere Proteine enthalten sind, ist das Elektropherogramm

der Mischung dem des reinen Allergenextraktes kaum noch ¨

ahnlich. Fast alle

Peaks ¨

andern ihre Position, vielleicht auch durch unspezifische Bindungen,

so dass auch hier kein Allergen zugeornet werden kann. Beim Arbeiten mit

Serum, auch mit gefiltertem, kommt es h¨

aufig zum Verstopfen der Kapillare.

Obwohl es nicht gelungen ist, den Signalen des Elektropherogramms Allergene zu-

zuordnen, kann man die Kapillarelektrophorese einsetzen, um die Zusammenset-

zung von Extrakten zu vergleichen. Man ist nicht wie bei der SDS-Elektrophorese

auf Proteine beschr¨

ankt, alle UV-aktiven Substanzen geben ein Signal. Durch den

direkten Zusammenhang zwischen Absorptionsintensit¨

at und Menge sind Men-

genvergleiche genauer m¨

oglich als bei den gescannten Gelen.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 57

4.3.3 Vergleich von ozonisierten und Kontrollextrakten

4.3.3.1 Lolium westerwoldicum 2001

Bei den Pollen, die bei einem Tag-Nacht-Programm mit 80 ppb/0 ppb Ozon

begast wurden, zeigte sich im Elektropherogramm bei 45 min ein zus¨

atzlicher

Peak [Abb. 4.9].

10 20 30 40 50 60

-2000

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

45.3

39.2

31.7

Ozon 1

Kontrolle 1

Absorbance bei 214 nm

min

Abbildung 4.9: Elektropherogramm von begasten und unbegasten Pollenpro-

ben

Auch bei den in derselben Versuchsreihe gemessenen Proben best¨

atigte sich das

Vorhandensein eines zus¨

atzlichen Peaks. Das UV-Spektrum dieses Peaks ist in

Abbbildung 4.10 zu sehen. Das Absorptionsmaximum der Substanz liegt bei

195 nm, ein weiteres Maximum bei 260 nm ist nicht zu erkennen. Der Stoff

enth¨

alt daher vermutlich keine aromatischen Anteile. Ob es sich um ein Protein

handelt, kann zur Zeit nicht bestimmt werden. Der Anteil an der Fl¨

ache betr¨

agt

zwischen 5 und 6 %.

In dem SDS-Gel der oben genannten Proben sind keine zus¨

atzlichen Banden

bei den ozonisierten Proben zu erkennen. Das weist darauf hin, dass es sich

nicht um ein Protein handelt, sondern vielleicht um ein Kohlenhydrat oder einen

sonstigen Pflanzeninhaltsstoff.

Bei einem Ozon-Tageswert von 140 ppb ist ebenso wie bei 80 ppb ein weiterer,

intensiver Peak bei 39 Minuten zu beobachten [Abb. 4.11]. Dessen Anteil an der

Fl¨

ache ist h¨

oher als bei der vorhergehenden Proben (20 %).

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 58

180 200 220 240 260 280 300

10000

20000

30000

40000

50000

Absorbance units

Peak bei 45.308 min

Abbildung 4.10: UV-Spektrum des zus¨

atzlichen Peaks

10 20 30 40 50

-2000

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

19,8 min

39 min

27,6 min

Ozon

Kontrolle

Absorbance units

min

Abbildung 4.11: Vergleich ozonbegaste Proben-Kontrolle (Charge 2)

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 59

Diese Ergebnisse ließen sich in den t¨

aglich gesammelten Proben von 2002 nicht

wiederholen. Die Elektropherogramme von begasten und unbegasten Pollen zei-

gen hier ein sehr ¨

ahnliches Peakmuster [Abb. 4.12], das heißt keine zus¨

atzlichen

Peaks. Beim Großteil der Versuche sind nur geringe Unterschiede in der Menge

oder leichte Verschiebungen der Retentionszeiten zu erkennen, die keinem be-

stimmten Verlauf folgen.

10 20 30 40 50 60

-2000

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

38 min

16 min

23 min

Kontrolle 5.8.

Ozon 5.8.

Absorbance units

min

Abbildung 4.12: Elektropherogramm Lolium multiflorum Pollenextrakt

4.3.3.2 Lolium multiflorum

Bei Proben von Lolium multiflorum Pollen konnte in keiner Probe ein zus¨

atzlicher

Peak beobachtet werden.

Auch ¨

uber den Vergleich der prozentualen Fl¨

achenanteile der einzelnen Peaks

sind keine Unterschiede in der Menge an Substanz zu erkennen, die man auf Ozon

zur¨

uckf¨

uhren k¨

onnte. Bei den in den Klimakammern in Essen gewonnenen Proben

zeigt sich ein abweichendes Peakmuster, was auf die l¨

angere Lagerung (obwohl bei

-20 ◦C) zur¨

uckzuf¨

uhren sein kann. Proteine fallen bei l¨

angerer Lagerung aus oder

werden von Proteasen zersetzt. In den Probegef¨

aßen ist teilweise ein Niederschlag

zu beobachten.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 60

4.3.4 Fazit

In den Elektropherogrammen zeigen sich nur in zwei Versuchsreihen mit Lolium

westerwoldicum Unterschiede in der Zusammensetzung. Es ist ein zus¨

atzlicher

Peak bei etwa 40 min zu erkennen. Es kann nicht nachgewiesen werden, um

welche Substanz es sich handelt, aufgrund des UV-Spektrums ist ein Protein

unwahrscheinlich. Bei den weiteren Untersuchungen mit Lolium westerwoldicum

und Lolium multiflorum konnte dieses Ergebnis nicht wiederholt werden. Mit der

CE k¨

onnen Aussagen ¨

uber Ver¨

anderungen in der Zusammensetzung einer Probe

gemacht werden. Um diese Diskrepanzen zu charakterisieren, sind begleitende

Untersuchungen n¨

otig.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 61

4.4 FTIR

4.4.1 Spektren

Abbildung 4.13 zeigt das typische FTIR-Spektrum eines Pollenextraktes. Auf-

grund der Heterogenit¨

at der Probe ¨

uberlappen sich die einzelnen Banden

stark, aber die Schwingungsbereiche sind noch zu erkennen. Zwischen 3000 und

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

500

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

2930

1046

1404

1574

1624

Absorption

/cm

Abbildung 4.13: Typisches FT-IR eines Lolium-Pollenextrakts

3500 cm-1 liegen die Absorptionsbanden der -OH Gruppen aus verschiedenen

Substanzen wie zum Beispiel Carbons¨

auren. Die Bande bei 2900 cm-1 ist auf

C-H Schwingungen zur¨

uckzuf¨

uhren. Die Haupt-Amid 1-Bande schwingt bei 1635

cm-1, die Amid 2-Bande ist als Schulter bei 1574 cm-1 zu erkennen. Zwischen 1260

und 1460 cm-1 liegen die Schwingungsbanden der Carbons¨

aurefunktion, zwischen

1000 und 1200 cm-1 schwingen Kohlenhydrate. Unterhalb von 1000 cm-1 beginnt

der Fingerprintbereich. Auff¨

allig ist die fehlende Unterteilung der Amidbande in

Amid 1 und 2, wie sie z.B. bei BSA zu erkennen ist. Hier scheint eine weitere

Stoffgruppe zu schwingen, vielleicht aus l¨

oslichem Zucker wie Glukose (Abb. 4.14

a)) oder St¨

arke (Abb. 4.14 b)), die in einem Pollenextrakt vorhanden sein kann.

In dieser Gegend schwingen auch Phosphat- gegen Zuckergruppen, so dass auch

phosphorylierte Zucker vorliegen k¨

onnen (Glukose-1 bzw.-6 phophat, sowie N-

acetyldiglukosamin, 4 diphosphate [130]).

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 62

4000 3000 2000 1000

0,8

0,2

0,4

0,6

(a) St¨

arke

4000 3000 2000 1000

0,2

0,4

0,6

0,8

(b) Glukose

Abbildung 4.14: FT-IR Spektren typischer Polleninhaltsstoffe (Spektren: Bru-

ker Optics, Ettlingen)

4.4.2 Vergleich begaste - unbegaste Probe

Mit bloßem Auge sind in den Spektren von begasten und unbegasten Pollen

keine Unterschiede zu erkennen. In der 1. Ableitung der Spektren von Lolium

westerwoldicum sind die Kurvenverl¨

aufe im Bereich zwischen 1200 und 900 cm-1

aber doch verschieden (Abb. 4.15). F¨

uhrt man eine Clusteranalyse in diesem

Bereich durch (Abb. 4.16), werden die Spektren nach ihrer Ozonexposition

geordnet. Die Heterogenit¨

at ist mit 0,1 sehr gering.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 63

1040 1020 1000

980 960

-0,0004

-0,0002

0,0000

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

Ozon 3.6.

Ozon 4.6.

Vergleich 3.6.

Vergleich 4.6.

Absorption

/cm

Abbildung 4.15: Erste Ableitung von ozonbegasten und Kontrollpollenextrak-

ten

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.1

Heterogenität

O31.1

O32.0

V1.1

V2.0

Methode: Vektornormalisierung, Ward’s Algorithmus

Wellenzahl: 1210-927 /cm

Abbildung 4.16: Clusteranalyse Lolium westerwoldicum

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 64

Beim zweiten Versuch mit Lolium westerwoldicum sind die Heterogenit¨

aten

zwischen den Spektren gr¨

oßer, es treten aber Fehlermeldungen auf, das heißt,

es gibt Spektren, die einem Spektrum außerhalb des Clusters ¨

ahnlich sind. Die

Proben vom 14.8. und vom 29.7. fallen heraus, vermutlich wegen zu geringer

Proteinkonzentration (Abb. 4.17).

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Heterogenität

oz14-8.0

oz3-8.0

oz29-7.0

oz5-8.1

v3-8.0

v6-8.0

v7-8.0

v5-8.0

oz6-8.0

oz7-8.0

oz1-8.0

oz9-8.0

Wellenzahl: 914 - 1482 /cm

Methode: Vektornormalisierung, Ward’s Algorithmus

Abbildung 4.17: Clusteranalyse Lolium westerwoldicum, August 2002

Bei den Versuchen mit Lolium multiflorum zeigte sich eine Heterogenit¨

at von 0,3

zwischen begasten und Kontrollpollen (Abb. 4.18). Innerhalb jedes Clusters be-

tr¨

agt die Heterogenit¨

at etwa 0,1. Liegt zwischen diesen Werten ein Faktor gr¨

oßer

als zwei, kann man von einer signifikanten Unterscheidung sprechen. Am deut-

lichsten wird der Unterschied jeweils bei Verwendung des Wellenzahlenbereichs

um 1000 cm-1. Das weist auf Differenzen im Kohlenhydratanteil der Extrakte

hin. Allerdings sind diese Unterschiede sehr gering, mit bloßem Auge nicht zu

erkennen. In der Summe erm¨

oglichen sie aber eine Unterscheidung der Spektren.

4.4.2.1 Unterschiedliche Weidelgrasarten

Durch Clusteranalyse im Fingerprintbereich k¨

onnen die Spekten von Lolium mul-

tiflorum und Lolium westerwoldicum unterschieden werden (Abb. 4.19). Hier liegt

die Heterogenit¨

at bei 0,6. Die Arten zeigen also mehr Verschiedenheit unterein-

ander als durch Ozon hervorgerufen werden.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 65

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Heterogenität

oz24-6a.0

oz25+26-6.0

oz27-6.0

oz30-6.0

v24-6a.0

v25+26-6.0

v27-6.0

v30-6.0

Wellenzahl: 920-1488 /cm

Methode: Vektornormalisierung, Ward’s Algorithmus

Abbildung 4.18: Clusteranalyse Lolium multiflorum

4.4.3 Fazit

Zwischen den Spektren von ozonisierten und Kontrollpollen bestehen nur gerin-

ge Differenzen. Damit sind die Zusammensetzungen der Extrakte sehr ¨

ahnlich.

Geringe Wellenzahlschwankungen, wie sie durch unterschiedliche Faltungen von

Proteinen hervorgerufen w¨

urden, gehen in der Zusammensetzung der Probe ver-

loren.

KAPITEL 4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 66

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

v10-6.0

v6-6.0

v12-6.0

v28-6.0

v28-6.1

v5-6.0

v3-6.0

v8-6.0

v4-6.0

v28-6a.0

v1-8.0

v12-8.0

v6-8.0

v14-8.0

v7-8.0

v9-8.0

v3-8.0

v5-8.0

Frequenzbereich: 523-940 /cm

Methode: Vektornormalisierung, Ward’s Algorithmus

Heterogenität

Abbildung 4.19: Unterscheidung von Lolium multiflorum und westerwoldicum

in der Clusteranalyse (V1-8 bis V14-8: Lolium westerwoldi-

cum, V3-6 bis V28-6: Lolium multiflorum)

Kapitel 5

Zusammenfassung und Ausblick

Erh¨

ohte Ozonwerte in den Sommermonaten bedeuten f¨

ur Pflanzen oxidativen

Stress. Durch verschiedene Mechanismen sind sie in der Lage, den Stress in ge-

wissem Maß abzuwehren. Dar¨

uberhinaus entstehen Sch¨

aden an der Pflanze. In

dieser Arbeit wird ¨

uberpr¨

uft, ob sich durch Induktion dieser Mechanismen oder

durch Sch¨

adigung der Pflanzen ¨

Anderungen in der Allergenit¨

at von Graspollen

ergeben.

Um Graspflanzen unter definierten Ozonwerten sowie Licht- und Temperatur-

verh¨

altnissen zur Bl¨

ute bringen zu k¨

onnen, wurden zwei Begasungskammern mit

der M¨

oglichkeit zur Aufgabe verschiedener Ozonwerte aufgebaut.

Pollen, die unter Ozoneinfluss gebildet worden sind, und Kontrollpollen wurden

mit verschiedenen analytischen Methoden untersucht.

•Mit ELISA-Tests wurde der Gehalt an Gruppe 5-Allergen in den Extrak-

ten bestimmt und zum Gesamtproteingehalt in Beziehung gesetzt. Dabei

ließen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen ozonisierten und Kon-

trollpollen nachweisen.

•Das Gesamtproteinspektrum beider Probenarten wurde durch SDS-

Elektrophorese verglichen. Dabei konnten keine Unterschiede in den Ban-

denmustern und -intensit¨

aten beobachtet werden. Im Westernblot zeigten

begaste und unbegaste Pollen keine unterschiedlichen Eigenschaften in der

Antik¨

orperbindung.

•Durch Kapillarelektrophorese wurde die Zusammensetzung der nativen Ex-

trakte verglichen. Bei zwei Chargen konnte ein zus¨

atzlicher Peak bei 45

Minuten beobachtet werden. Um welche Art der Substanz es sich hier han-

delt, konnte nicht bestimmt werden.

•Durch FTIR-Spektroskopie sind Vergleiche der ¨

Ahnlichkeit der Extrakte auf

statistischer Basis m¨

oglich. In der Clusteranalyse zeigten sich nur geringe

Differenzen zwischen ozonisierten und Kontrollpollen. Sie scheinen vor allem

im Bereich der Schwingungen von Kohlenhydraten zu liegen.

KAPITEL 5. ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 68

Die wahrscheinlichste Hypothese f¨

ur das Auftreten erh¨

ohter Allergengehalte bei

Ozonexposition ist die st¨

arkere Expression eines Stressproteins, das als Allergen

wirkt. Allerdings konnte nur die Menge von Gruppe 5 Allergen bestimmt

werden. Dass sich die Mengen der anderen Allergene ge¨

andert haben, kann nicht

ausgeschlossen werden. Um Aussagen ¨

uber die Allergenit¨

at der Extrakte machen

zu k¨

onnen, w¨

aren RAST-Hemmtests mit einem Poolserum n¨

otig gewesen. SDS-

Elektrophorese ist zur Erfassung solcher Unterschiede im Nanogramm-Bereich

zu ungenau.

Durch Ozon kann es zu ¨

Anderungen in der Struktur, fehlerhafte Expression von

Proteinen oder ver¨

anderten posttranslativen Modifikationen kommen. Allergene

k¨

onnen auch nur in Bruchst¨

ucken vorhanden sein. Dadurch auftretende Mol-

massenverschiebungen konnten in der Elektrophorese nicht beobachtet werden.

Epitope k¨

onnen zerst¨

ort sein oder f¨

ur Antik¨

orper besser zug¨

anglich sein. Auch

ver¨

anderte Bindungseigenschaften durch modifizierte Epitope konnten im Blot

nicht nachgewiesen werden.

Auch die Expression eines zus¨

atzlichen Proteins w¨

are m¨

oglich. Damit es eine

allergene Wirkung haben kann, muss es IgE-bindende Epitope mit bereits

etablierten Allergenen gemeinsam haben oder zu einer eigenen Sensibilisierung

f¨

uhren.

Die FTIR-Spektren weisen auf Modifikationen im Kohlenhydratanteil der

Extrakte hin. Davon kann ein glykosyliertes Protein betroffen sein, ebenso

wie l¨

osliche St¨

arke oder Zucker im Pollen. Schon in fr¨

uheren Arbeiten wurden

Ver¨

anderungen in der St¨

arkeeinlagerung durch Ozon beobachtet. Ob es eine

Verbindung zur Allergenit¨

at gibt, konnte nicht nachgewiesen werden.

Obwohl es in der vorliegenden Arbeit nicht gelang, einen Zusammenhang

zwischen ver¨

anderter Allergenit¨

at von Graspollen und erh¨

ohten Ozonwerten

nachzuweisen, kann die These auch nicht widerlegt werden.

Es konnte hier nur eine Grassorte untersucht werden. Andere Arten oder Sorten

zeigen andere Sensitivit¨

aten gegen¨

uber Ozon und damit andere Reaktionen.

Es besteht die M¨

oglichkeit, dass sogar Individuen einer Art verschieden auf

Ozon reagieren. Das kann neben der genetischen Disposition auch von den

Lebensbedingungen der Pflanze vor und w¨

ahrend der Ozonexposition abh¨

angen.

Die Aufnahmerate von Ozon ¨

uber die Stomata wird stark von der (Luft-)Feuchte

beeinflusst. Ist sie gering, verdunstet die Pflanze wenig Wasser, die Stomata

bleiben geschlossen, und die Aufnahme von Ozon ist geringer als bei großer

Feuchtigkeit. Ein Zusammenwirken mit der nat¨

urlichen UV-Strahlung bei der

Sch¨

adigung ist auch m¨

oglich. UV-Strahlung ist in den Indoor-Klimakammern

nicht vorhanden.

Aus Zeitgr¨

unden konnten nur wenige verschiedene Ozonprogramme ausprobiert

werden. Das Zeitfenster zur Sch¨

adigung der Pollen ist m¨

oglicherweise verpasst

worden oder die Ozonwerte lagen in einem falschen Konzentrationsbereich. Bei

Exponierung ¨

uber l¨

angere Zeit trat vielleicht ein Gew¨

ohnungseffekt ein, der zur

KAPITEL 5. ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 69

Abwehr des Stressfaktors Ozon beitr¨

agt.

Weitere Forschung ist zur Bestimmung der nat¨

urlichen Schwankung des Allergen-

gehalts in Pollen in Abh¨

angigkeit von den Lebensbedingungen wie Temperatur,

Feuchte, Licht und Boden und auch von der individuellen Pflanze n¨

otig. In

verschiedenen Jahren geerntete Pollenchargen k¨

onnen durchaus voneinander

in Protein- und Zuckergehalt abweichen. Variationen in diesen Parametern

uberdecken unter Umst¨

anden alle durch Ozon verursachten Ver¨

anderungen.

Ein besonders wichtiger Parameter f¨

ur den Allergiker ist die Menge an Pollen,

die eine Pflanze freisetzt. Die Sch¨

aden durch Ozon k¨

onnen dazu f¨

uhren, dass eine

Pflanze weniger Pollen bildet, was eine ver¨

anderte Allergenit¨

at des einzelnen

Pollen weniger bedeutungsvoll macht.

Anhang A

Abk¨

urzungsverzeichnis

BSA Bovine Serum Albu-

min

ppb parts per billion

CHAPS (3-[(3-

Cholamidopropyl)-

dimethylammonio]-

propan- sulfonat)

ppm parts per million

CBD Cellulose binding do-

main

PPN Peroxypropionylnitrat

CE Kapillarelektrophorese PR-

Protein

pathogen-related Pro-

tein

ELISA Enzyme linked immu-

nosorbent assay

PVDF Polyvinyldifluorid

EOF Electroosmotic flow SDS Sodiumdodecylsulfat

mAb monoklonaler An-

tik¨

orper

Tris Tris(hydroxymethyl)-

aminomethan

MES 2-

Morpholinoethansulfons¨

aure-

Monohydrat

MOPS 3-

Morpholinopropansulfons¨

aure

NC Nitrocellulose

OPD o-Phenyldiamin

PA Polyacrylamid

PAN Peroxyacetylnitrat

pI isoelektrischer Punkt

POD Meerettichperoxidase

Anhang B

Begasungsversuche und Pflanzen

B.0.4 Lolium multiflorum

Pflanzen Lolium multiflorum Partie PC 70302 (2002) bzw. WV8RKPH6-101

(2001) werden aus einem Feld der DSV (Deutsche Saatgutveredelung, Th¨

ule, Salz-

kotten) ausgegraben. Sie werden in je drei Pflanzen geteilt, so dass drei genetisch

identische Individuen entstehen. Jede Pflanze wird in einen Topf (Durchmesser

15 cm, H¨

ohe 12 cm, 2 l) gepflanzt und in einen Topf mit Wasserreservoir (H¨

ohe

21 cm) gestellt. ¨

Uber einen Docht aus Asbestfasern (2000) oder Bew¨

asserungsfließ

(ab 2001) wird das Wasser in die T¨

opfe gesaugt und sorgt f¨

ur gleichm¨

aßig feuchte

Erde. Lolium multiflorum wurde in den Begasungskammern des LUA Essen und

in Paderborn eingesetzt.

Da die Pflanzen im Freiland ¨

uberwintern konnten, ist keine Vernalisation not-

wendig.

B.0.5 Lolium perenne

Lolium perenne v. Livree wird in Kulturt¨

opfen im Gew¨

achshaus anges¨

at, etwa 3

Wochen nach dem Keimen vereinzelt und weitere 6 Wochen heranwachsen gelas-

sen. Anschließend werden sie einem k¨

unstlichen Winter (2 Wochen bei 14 ◦C, 6

Wochen bei 7 ◦C, 2 Wochen bei 14 ◦C) ausgesetzt. Danach kann durch Lichtpha-

sen l¨

anger als 16 Stunden die Bl¨

uhphase induziert werden.

B.0.6 Lolium westerwoldicum

Lolium westerwoldicum v. Lifloria wird in Kisten von 60 mal 80 cm (H¨

ohe 15 cm)

oder 55 mal 60 cm (H¨

ohe 10 cm) ausges¨

at. Die Dichte betr¨

agt etwa 2,5 g Samen

pro 0,3 m2. Bei dichterer Saat bleiben die Pflanzen und ¨

Ahren klein und erge-

ben geringere Pollenausbeute. Nach etwa 6 Wochen auf dem Balkon im Sommer

oder im Winter im Labor oder in den Kammern bl¨

uhen die Pflanzen. Beim An-

wachsen unter nat¨

urlichem Licht wachsen die Gr¨

aser schneller und sind weniger

ANHANG B. BEGASUNGSVERSUCHE UND PFLANZEN 72

empfindlich gegen Sch¨

adlinge.

B.0.7 Verwendete Materialien

B.0.7.1 Pflanzerde Spezifikation

Hochmoortorf, m¨

aßig stark zersetzt (H2-H8) 60 %

Rindenhumus 30 %

Gr¨

unschnittkompost 30 %

Salzgehalt 3,0 g/l

pH (CaCl2) 5,0-6,5

N¨

ahrstoffe: 200-500 mg/l N

200-500 mg/l P2O5

300-600 mg/l K2O

B.0.7.2 D¨

unger

Wuxal N:K:P 12:4:6 5 ml auf 1 l Wasser, alle 3 Wochen

B.0.7.3 Sch¨

adlingsbek¨

ampfung

gegen Blattl¨

ause: Pirimor (Wirkstoff Primicarb) 5 % in Wasser

gegen Mehltau: Milgo-E (Ethirimol) 0,3 % in Wasser

Sch¨

adlingsbek¨

ampfung wurde, wenn n¨

otig, gleichm¨

aßig in beiden Kammern

durchgef¨

uhrt.

B.0.8 Lampen in den Klimakammern

Abbildung B.1: Osram Biolux Lichtfarbe 72-966, 36 W

ANHANG B. BEGASUNGSVERSUCHE UND PFLANZEN 73

B.0.9 Kalibrierung der Feuchtesensoren

Die Feuchtesensoren wurden durch verschiedene Schwefels¨

auren kalibriert, ¨

uber

denen sich abh¨

angig von der Konzentration, eine bestimmte Luftfeuchte einstellt.

δ(H2SO4) Konzentration (mol/l) Luftfeuchte oberhalb (%)

1,50 9,2 18,8

1,30 5,3 58,3

1,25 4,3 70,4

1,20 3,4 80,4

1,15 2,5 88,8

Abbildung B.2: Klimakammern Paderborn

Anhang C

Versuchsdurchf¨

uhrungen

C.1 Extraktion der Pollen

Extraktionspuffer pH 7,8

0,1 m/l NH4HCO37,9 g/l

NaN3(optional) 0,01 g/l

Pollenproben werden im Verh¨

altnis 2 % w(Pollen)/v(Puffer) mit dem Extrakti-

onspuffer gemischt und bei 4◦C 23 h auf dem Sch¨

uttler extrahiert. Anschließend

werden die Extrakte bei 4◦C und 2000 x g f¨

ur 25 min zentrifugiert und der ¨

Uber-

stand abgenommen, aliquotiert und sofort bei -20◦C eingefroren.

C.2 Proteingesamtbestimmung (Lowry-Test)

Arbeitsschritt verwendete L¨

osung Zeit

Ansetzen der Standardreihe BSA in Probenpuffer: 0,1;

0,25; 0,5; 1,0; 1,5 und 2,0

mg/ml

Pipettieren in die Wells der

MTP

5µl Probe bzw. Standard

oder Blindl¨

osung

25 µl L¨

osung A

200 µl L¨

osung B

Mixen im Plattenreader 5 s

Inkubationszeit 15 min

Vermessen bei 650 nm

Die Konzentrationen der Standards werden gegen die optische Dichte aufgetragen

und die Kalibrierkurve durch lineare Regression erstellt (Programm: ”Easy-Fit“).

ANHANG C. VERSUCHSDURCHF ¨

UHRUNGEN 75

C.3 ELISA

Alle Puffer und L¨

osungen werden mit doppelt destiliertem Wasser angesetzt.

Beschichtungspuffer pH 9,6 PBS/Tween

Na2CO321,0 g/l NaCl 8,4 g/l

NaHCO316,8 g/l NaH2PO40,24 g/l

nicht titrieren Na2HPO41,08 g/l

Tween 20 500 µl/l

Ansetzen der Standardverd¨

unnungsreihe: 10 Verd¨

unnungen

1. 2,5 µg Phl p 5/ml 10µl Phl p-Extrakt 81292 + 1,2 ml PBS-Tween

2. 250,0 ng/ml 100 µl Extrakt 1 + 900 µl PBS-Tween

3. 125,0 ng/ml 500 µl Extrakt 2 + 500 µl PBS-Tween

4. 62,5 ng/ml 500 µl Extrakt 3 + 500 µl PBS-Tween

usw.

10. 0,98 ng/ml 500 µl Extrakt 9 + 500 µl PBS-Tween

Arbeitsschritt L¨

osung Volumen oder Zeit

Beschichten der Mikro-

titerplatte mit Anti-

k¨

orper

10 µg/ml AB 1D11 in

Beschichtungspuffer

50 µl/well, ¨

uber Nacht,

4◦C

3 x waschen PBS/Tween 100 µl/well

Auftragen der Proben

bzw. Standardreihe in

Doppel- oder Dreifach-

bestimmung

50 µl/well 1 h, 37◦C

3 x waschen PBS/Tween 100 µl/well

Reaktion mit biotini-

liertem AB

AB 2B3 in

PBS/Tween, 1:250

verd.

50 µl/well, 1 h, 37◦C

3 x waschen PBS/Tween 100 µl/well

Reaktion mit

Streptavidin-

Peroxidase

Streptavidin-

Peroxidase-Konjugat

(0,25 µg/ml) in

PBS/Tween 1:1000

50 µl/well, 1 h, 37◦C

3 x waschen PBS/Tween 100 µl/well

Reaktion mit POD-

Substrat

POD/Harnstoff/H2O2

in Wasser

50 µl/well, ca. 15 min

im Dunklen

Abstoppen 1,5 n H2SO450 µl/well

Die Absorbtion wird bei 492 nm im Plattenreader SLT Spectra gemessen und

mit dem Programm ”SLT EasyFit“ ausgewertet.

ANHANG C. VERSUCHSDURCHF ¨

UHRUNGEN 76

C.4 Denaturierende, nicht reduzierende SDS-

Gelelektrophorese

Elektrophoresen wurden mit einer Biorad Mini-2D-Cell (Gelgr¨

oße 8 cm x 10 cm,

Dicke der Gele 0,5 cm) und einem Netzger¨

at Biorad Power Supply 1000 durch-

gef¨

uhrt.

C.4.1 Puffer

Gelpuffer Trenngel 1,5 mol/l Tris mit HCl auf pH 8,8 einstellen

Gelpuffer Sammelgel 0,5 mol/l Tris mit HCl auf pH 6,8 einstellen

Probenpuffer Sammelgelpuffer 2,5 ml

Glycerin 2,0 ml

10 % w/v SDS 4,0 ml

Bromphenolblau (0,1 %) 0,5 ml

mit H2O auf 10 ml auff¨

ullen

Laufpuffer Tris Base 29 g

Glycin 144 g

SDS 10 g

mit H2O auf 1 l auff¨

ullen pH ca 8,3; nicht einstellen

C.4.2 Gießen des Gels

Trenngel, c=2,7 % T=10 % 12 % 15 %

H2Odd 1,38 ml 0,81 ml 0,23 ml

Trenngel-Puffer 1,25 ml 1,25 ml 1,25 ml

10 % w/v SDS 50 µl 50 µl 50 µl

Lsg. Gel A 1,62 ml 2,03 ml 2,44 ml

Lsg. Gel B 0,675 ml 0,85 ml 1,02 ml

APS 10 %w/v 40 µl 40 µl 40 µl

TEMED 5 µl 5 µl 5 µl

Sammelgel, c=2,7 % T=4 %

H2Odd 1,96 ml

Sammelgelpuffer 1,25 ml

10 % w/v SDS 50 µl

Lsg. Gel A 1,22 ml

Lsg. Gel B 0,5 ml

APS 10 % w/v 40 µl

TEMED 5 µl

ANHANG C. VERSUCHSDURCHF ¨

UHRUNGEN 77

Zun¨

achst wird die Trenngell¨

osung gemischt, Katalysator (APS) und TEMED

d¨

urfen erst unmittelbar vor dem Gießen des Gels zugegeben werden. 5 ml der

L¨

osung werden vorsichtig am Rand der Glasplatte entlang in die Gießkassette

pipettiert und mit ca. 1 ml Terti¨

arbutanol ¨

uberschichtet. Nach 45 Minuten ist das

Gel polymerisiert, der Alkohol wird abgesch¨

uttet und die Kassette bis zum Rand

mit Sammelgelmischung gef¨

ullt. Zum Formen von Probentaschen wird sofort ein

passender Kamm in die L¨

osung gedr¨

uckt, so dass keine Luftblasen eingeschlossen

werden. Nach etwa 30 Minuten ist die Polymerisation abgeschlossen, der Kamm

kann entfernt und das Gel verwendet werden.

C.4.3 Vorbereitung der Proben

Proteinl¨

osung wird im Verh¨

altnis 1:1 mit Probenpuffer versetzt, gut durchmischt

und etwa 10 Minuten im Wasserbad verkocht. Nach dem Abk¨

uhlen k¨

onnen die

Proben mit einer Mikrospritze auf das Gel gegeben werden.

C.4.4 Durchf¨

uhrung der Elektrophorese

Die Kathodenkammer der Mini-2D-Cell wird mit 100 ml Laufpuffer gef¨

ullt und

die Proben werden aufgetragen. In die Anodenkammer werden 500 ml Laufpuffer

gegeben, die Elektrophoresezelle geschlossen und eine Spannung von 125 V an-

gelegt. W¨

ahrend des Laufes f¨

allt der Strom von etwa 30 mA auf bis zu 10 mA.

Wenn die Farbstofffront das Ende des Gels erreicht hat (ca. 90 Minuten), kann

die Elektrophorese beendet werden.

C.5 Kolloidale Coomassief¨

arbung

Arbeitsschritt verwendete L¨

osung Zeit

Fixieren der Protei-

79 ml H2O, 1 ml o-

Phosphors¨

aure, 20 ml

Methanol

1 h auf dem Sch¨

uttler

F¨

arben 60 ml H2O, 20 ml Roti-

Blue 5x, 20 ml Methanol

uber Nacht auf dem

Sch¨

uttler

Waschen 25 % Methanol in H2Odd 10 min

Trocknen 70 ml H2O, 10 ml Glyce-

rin, 20 ml Ethanol

30 min auf dem Sch¨

utt-

ler

Anschließend kann das Gel zwischen zwei nassen Cellophanfolien auf einer Glas-

platte getrocknet werden (ca. 24 h). Es wird eingescannt und mit dem Programm

Image1D von Pharmacia ausgewertet.

ANHANG C. VERSUCHSDURCHF ¨

UHRUNGEN 78

C.6 Westernblot im Anschluss an die Gelektro-

phorese

Nitrocellulose (NC) oder PVDF-Membran auf Gelgr¨

osse schneiden, eine Ecke

markieren; sechs Blotfilterpapiere auf Gelgr¨

oße schneiden.

C.6.1 Semidry

Kathodenpuffer:Anodenpuffer 1 pH 6,8

39 ml/l Glycin 2,93 g/l 0,3 mol/l Tris 36,3 g/l

0,01 % SDS (w/v) 0,1 g/l 0,01 % NaN3(s.o.) 0,1 g/l

0,01 % NaN3(optional) 0,1 g/l

Anodenpuffer 2 pH 8,6

25 mmol/l Tris 3,03 g/l

0,01 % NaN3(s.o.) 0,1 g/l

Arbeitsschritt verwendete L¨

osung Zeit

Gel ¨

aquilibrieren Kathodenpuffer 5 min

Membran aktivieren

(nur PVDF)

Methanol 15 s

H2O 2 min

Anodenpuffer 2 5 min

Aufbau des Blotsand-

wich

Graphitelektroden

w¨

assern

- 2 Filterpapiere in AP1

tr¨

anken, auf der Anode

plazieren

- 1 Filter in AP2 ge-

tr¨

ankt

- Membran

- Gel

- 3 Filterpapiere in KP

getr¨

ankt

- Kathode + Gewicht

Luftblasen durch Walzen mit Pasteurpipette entfernen

Blot 0,8 mA/cm2Gel: 1-2 h

1,2 mA/cm2Gel: 1 h

2,5 mA/cm2Gel: 30-45

min

ANHANG C. VERSUCHSDURCHF ¨

UHRUNGEN 79

Kontrolle des ¨

Ubergangs

- Ponceau S-F¨

arbung der Membran,

- farbige Markerproteine,

- kolloidale Coomassief¨

arbung des Gels

C.6.2 Kapillarblot

Blotpuffer pH 8,3

20 mmol/l Tris 2,41 g/l

150 mmol/l Glycin 10,25 g/l

Aufbau des Blotsandwich

•3 Filterpapiere gut in Puffer tr¨

anken, auf eine Glasplatte platzieren, Enden

in Pufferreservoirs

•Gel darauf, gut mit Puffer tr¨

anken, Luftblasen entfernen

•Membran

•3 auf Gelgr¨

oße geschnittene trockene Filterpapiere

•trockenes, saugf¨

ahiges Material

•mit Glasplatte und Gewicht beschweren

Der Blot erfolgt durch Kapillarkr¨

afte ¨

uber Nacht.

Uberpr¨

ufung des Bloterfolgs s.o.

ANHANG C. VERSUCHSDURCHF ¨

UHRUNGEN 80

C.7 Immunchemische Detektion

Auf den Blotmembranen k¨

onnen die Allergene je nach Fragestellung mit Human-

seren oder monoklonalen Antik¨

orpern detektiert werden.

Waschpuffer: PBS + 0,05 % Tween 20 (siehe ELISA)

Inkubationspuffer: PBS + 0,1 % BSA (Fraktion 5)

mAb’s 1D11 bzw 3G5: 2 µg/ml in Inkubationspuffer

Allergiekerseren: 1:5 in Inkubationspuffer

Chromogenes Subtrat Novex: 1:1 mit H2O

Arbeitsschritt verwendete L¨

osung Zeit

Blockieren der freien

Bindungsstellen

Blockierungsl¨

osung

Western Breeze Kit

30 min auf dem Sch¨

utt-

ler

Trocknen der Membran 37 ◦C 1-2 h

Kennzeichnen der Lanes, schneiden in 4-5 mm Streifen und ¨

Uberf¨

uhren in

Inkubationstray (Biorad)

Inkubation mit

prim¨

arem Antik¨

orper

1 ml verd. Serum oder

AB-Lsg pro Lane

uber Nacht auf

Kippsch¨

uttler

Waschen Waschpuffer je 1 ml 3 x 10 min

Inkubation mit se-

kund¨

arem Antik¨

orper •Bei Serum: anti-

human mouse

IgE-AP 1:1000 in

Inkubationspuf-

fer

•bei mAB: Wes-

tern Breeze Anti-

Mouse AP, 1 ml

pro Lane

3-4 h auf dem Sch¨

uttler

Waschen Waschpuffer je 1 ml 3 x 10 min

Farbreaktion Chromogenes Substrat

1 ml pro Lane

20-60 min bis Banden

erscheinen

Die Membranstreifen werden im Dunklen getrocknet und eingescannt.

ANHANG C. VERSUCHSDURCHF ¨

UHRUNGEN 81

C.8 Kapillarelektrophorese

Ger¨

at: Beckman-Coulter PACE-MDQ

Kapillare: Fused-silica, unbelegt, ID 75 µm, L=60/50 cm,

CS-Chromatographie Service

Puffer: 100 mmol/l Na2B4O7, mit 0,1 n NaOH pH-Wert

auf 10,1 einstellen

Vor jeder Analyse sp¨

ulen: 2 min mit 1 n NaOH und 20 psi Druck

2 min mit 0,1 n NaOH, 20 psi

2 min mit Wasser, 20 psi

2 min mit Boratpuffer, 20 psi

Injektion 9 sec, 0,7 psi

Trennung 15 kV, 20◦C, Boratpuffer, 50-60 min

Detektion PDA-Detektor, 190-300 nm

Nach jeder Analyse sp¨

ulen: 4 min 1 n NaOH, 20 psi

2 min H2O, 20 psi

Auswertung: PACE-MDQ Software

Die Proben werden bei Raumtemperatur aufgetaut, zentrifugiert, um Teilchen,

die die Kapillare verstopfen k¨

onnen, abzutrennen, und vermessen.

C.9 FTIR

FTIR-Spektren werden mit einem Spektrometer Bruker IFS 28/B aufgenommen.

Dazu werden 30 µl (zweimal nacheinander 30 µl bei sehr geringer Proteinkonzen-

tration) auf das Probenrad gegeben und im Exsikkator getrocknet. Die Messung

erfolgt mit einer modifizierten MO-Methode mit 256 Scanns. Zum Abgleich wird

jeweils der Hintergrund vermessen. Auswertung und Messung erfolgt mit dem

Programm ”OPUS NT“ bzw. ”OPUS 4.0“.

ANHANG C. VERSUCHSDURCHF ¨

UHRUNGEN 82

C.10 Chemikalien und Reagenzien

C.10.0.1 Markerproteine f¨

ur die SDS-Elektrophorese:

MG Marker14-94 LMW Electrophoresis Calibration Kit, Pharmacia

Protein MG (Da) Protein MW (Da)

Phosphorylase b 94 000 Carbonic Anhydrase 30 000

Bovine Serum Albumin 67 000 Soybean Trypsin Inhibitor 20 100

Ovalbumin 43 000 α-Lactalbumin 14 400

C.10.0.2 Acrylamidl¨

osungen

Rotiphorese Fertigl¨

osungen Roth

Gel A: 30 % w/v Acrylamid

Gel B: 2 % w/v Bisarylamid

C.10.0.3 ELISA-Test Phl-p-5

Antik¨

orper Allergopharma J. Ganzer KG

Antik¨

orper 1D11, monoklonal (von der Maus)

biotynilierter Nachweisantik¨

orper 3B2 (Maus)

Peroxidase Substrat Sigma

o-Phenylendiamin Dihydrochlorid

Urea Hydrogen Peroxide

Mikrotiterplatten Nunc Maxisorp C96

C.10.0.4 Blot

Blotpapier Schleicher und Schuell GB 404 Gel Blotting Paper

Membran PVDF Invitrogen Invitrolon PVDF-Filterpaper Sandwich, 0,45 µm pore size

C.10.0.5 WesternBreeze

NOVEX-Invitrogen

Chromogenic Western Blotting Immunodetection System

bestehend aus Blocking solution, Washing Solution, Secondary AB Solution and

Chromogenic Solution

C.10.0.6 Kolloidale Coomassie-F¨

arbung

Roti-Blue 5-fach Konzentrat Roth

ANHANG C. VERSUCHSDURCHF ¨

UHRUNGEN 83

C.10.0.7 Proteintest Lowry

Biorad DC Protein Assay

L¨

osung A alkalisches Cu-tartrat

L¨

osung B Folins Reagenz

C.10.0.8 Sonstige Chemikalien

Ammoniumhydrogencarbonat Riedel

Ammoniumperoxodisulfat APS Roth

Anti-Human IgE, AP-konjugiert Pharmingen International

Bovine serum Albumin V BSA

Bromphenolblau Sigma

Glycin Merck

Glycerin wasserfrei Merck

Methanol Roth

Kaliumphosphat Merck

Natriumazid Sigma

Natriumcarbonat Merck

Natriumchlorid Merck

Natriumdihydrogenphosphat Fluka

Di-Natriumhydrogenphosphat Fluka

Natriumhydrogencarbonat Roth

Natriumdodecylsulfat Biorad

Natriumhydroxid Merck

ortho-Phosphors¨

aure Merck

Salzs¨

aure Merck

Schwefels¨

aure

Sodiumdodecylsulfat SDS Merck

Streptavidin Sigma

1,2-Bis(dimethylamino)ethan TEMED Roth

Tris-(hydroxymethyl)aminomethan Tris Roth

Polyoxyethylensorbitan-monolaurat Tween 20 Sigma

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