Document [original]

Stereoselektive Biohydrolyse von Epoxiden

- Analyse, Optimierung und Modellierung

Von dem Department Chemie

der Universit¨at Paderborn genehmigte

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

von

Diplom-Chemiker

Thorsten Bruß

aus Jarlingen

Paderborn, M¨arz 2003

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Januar 1999 bis M¨arz 2003 im Fachge-

biet f¨ur Technische Chemie und Chemische Verfahrenstechnik und im Fachgebiet f¨ur

Organische Chemie im Department Chemie der Universit¨at Paderborn angefertigt.

Referent: Prof. Dr.-Ing. H.-J. Warnecke

Universit¨at Paderborn

Fachbereich Chemie und Chemietechnik

Technische Chemie und Chemische Verfahrenstechnik

Korreferent: Priv. Doz. Dr. rer. nat. B. Westermann

Universit¨at Paderborn

Fachbereich Chemie und Chemietechnik

Organische Chemie

Datum der Abgabe: 12. M¨arz 2003

Datum der m¨undlichen Pr¨ufung: 17. April 2003

Damit das M¨ogliche entsteht,

muss immer wieder das Unm¨ogliche

versucht werden.

Hermann Hesse (1877-1962)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

1.1 Stand des Wissens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Problemstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

2 Theorie 4

2.1 Chiralit¨at und Enantioselektivit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.2 Gewinnung enantiomerenreiner Epoxide . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.2.1 Kinetische Racematspaltung mit Epoxidhydrolasen . . . . . . 6

2.2.2 Mikrobiologische Epoxidhydrolasen . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.2.3 Substrate filament¨oser Pilz-Epoxidhydrolasen katalysierter Re-

aktionen.............................. 9

2.3 Chirale Analytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.3.1 Polarographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.3.2 Kernresonanzspektroskopie in der Stereoisomerenanalytik . . 12

2.3.3 Chromatographie an chiralen Phasen . . . . . . . . . . . . . . 13

2.4 Immobilisierung von Biokatalysatoren . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.4.1 Allgemeine ¨

Ubersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.4.2 Verkapselung von Biokatalysatoren . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.5 Beauveria bassiana und Aspergillus niger in der organischen

Synthese.................................. 17

2.6 Modellierungsbeispiele in der Biokatalyse . . . . . . . . . . . . . . . 18

3 Experimentelles 20

3.1 Analytik.................................. 20

INHALTSVERZEICHNIS II

3.1.1 Bestimmung der Styrolepoxid-Stereoisomeren . . . . . . . . . 20

3.1.2 Bestimmung der 1,2-Phenylethandiol-Stereoisomeren . . . . . 20

3.1.3 Messung der Phenylacetaldehydkonzentration . . . . . . . . . 21

3.1.4 Messung des gesamten organischen Kohlenstoffgehaltes in L¨osun-

gen................................. 21

3.1.5 Strukturbeweis der Produkte mittels NMR-Spektroskopie . . 21

3.1.6 Messung der Kohlenwasserstoffkonzentration in der Gasphase 22

3.1.7 Messung der Biotrockenmasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2 Biokatalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2.1 Pilzkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2.2 Biomassenanzucht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2.3 Messung der Wachstumskurven . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2.4 Biohydrolyse mit freiem Pilz . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3.2.5 Biohydrolyse mit gefriergetrocknetem Pilz . . . . . . . . . . . 25

3.2.6 Biohydrolyse in organischen L¨osemitteln . . . . . . . . . . . . 26

3.2.7 Bestimmung der Autohydrolyse- und Folgereaktion . . . . . . 26

3.3 Immobilisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.3.1 Verkapselung der Biokatalysatoren in eine Polyvinylalkohol-

matrix............................... 27

3.3.2 Biohydrolyse mit Immobilisaten . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.3.3 Bestimmung des Diffusionsmechanismus . . . . . . . . . . . . 27

3.3.4 Bestimmung der Diffusionskoeffizienten . . . . . . . . . . . . 28

3.4 Aufschluss der Pilzzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.4.1 Aufschluss durch Gefriertrocknung . . . . . . . . . . . . . . . 29

INHALTSVERZEICHNIS III

3.4.2 Aufschluss mit dem Zellaufschlussger¨at . . . . . . . . . . . . 29

3.4.3 Aufschluss mit Ultraschall . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.4.4 Aufschluss mit dem Ultraturrax . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.4.5 Aufschluss mit gek¨uhlten L¨osemitteln . . . . . . . . . . . . . 30

3.4.6 Kombination der Aufschlussverfahren . . . . . . . . . . . . . 30

3.4.7 Anreicherung der Enzymfraktion . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.4.8 Bestimmung der Substratbreite . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4 Ergebnisse 32

4.1 Anzucht der Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

4.1.1 Wachstumskurve Aspergillus niger ............... 32

4.1.2 Wachstumskurve Beauveria bassiana .............. 34

4.1.3 Optimierung der Wachstumstemperatur . . . . . . . . . . . . 36

4.1.4 Zusammensetzung des N¨ahrmediums . . . . . . . . . . . . . . 36

4.2 Analytik.................................. 39

4.2.1 Extraktion der Analyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

4.2.2 Enantiomerentrennung der Epoxide . . . . . . . . . . . . . . 39

4.2.3 Enantiomerentrennung der Diole mittels chiraler Hochleistungs-

fl¨ussigkeitschromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4.3 Reaktionssystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.4 Reaktionsverlauf im Detail . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.4.1 Autohydrolyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.4.2 Folgereaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.4.3 Racemasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

INHALTSVERZEICHNIS IV

4.4.4 Enzymatische Hauptreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4.4.5 Enzymatische Nebenreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4.4.6 Enzymatische R¨uckreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.4.7 Inhibition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4.4.8 Das Reaktionssystem f¨ur die Modellierung . . . . . . . . . . . 52

4.5 Reaktion mit suspendiertem Pilz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

4.5.1 Wahl des optimalen Reaktionsmediums . . . . . . . . . . . . 53

4.5.2 Reaktionsverlauf mit gefriergetrocknetem Pilz . . . . . . . . . 54

4.5.3 Reaktion unter O2-Atmosph¨are . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

4.6 Reaktion in organischen L¨osemittelsystemen . . . . . . . . . . . . . . 57

4.6.1 Wahl der geeigneten L¨osemittel . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.6.2 Wahl des Konzentrationsbereiches der L¨osemittel . . . . . . . 60

4.6.3 Konzentrationssteigerung des Eduktes . . . . . . . . . . . . . 60

4.7 Aufschluss der Pilzzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.8 Immobilisierung der Biokatalysatoren . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

4.8.1 Reaktion mit PVA verkapselten Mikroorganismen . . . . . . 65

4.8.2 Wiederverwendung der PVA-Kapseln . . . . . . . . . . . . . . 66

4.8.3 Bestimmung des Diffusionskoeffizienten in den PVA-Immobilisaten 67

4.9 Bewertung der Substratbreite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

5 Modellierungen der Biohydrolyse 73

5.1 Reaktion mit suspendiertem Pilz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

5.2 Eindimensionale Diffusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

INHALTSVERZEICHNIS V

5.3 Batch-Reaktionsansatz unter Ber¨ucksichtigung der Immobilisatgeo-

metrie ................................... 79

6 Zusammenfassung und Ausblick 82

7 Anhang 85

Notation 85

7.1 Bestimmung des Diffusionskoeffizienten in PVA-Membranen . . . . . 87

7.2 Anpassungsroutinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

7.2.1 Biohydrolyse mit Pilzsuspension . . . . . . . . . . . . . . . . 90

7.2.2 Eindimensionale Diffusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

7.2.3 Biohydrolyse mit Immobilisaten . . . . . . . . . . . . . . . . 93

Literatur 99

Dank 106

Abstract 107

1 EINLEITUNG 1

1 Einleitung

1.1 Stand des Wissens

Synthese- und Trennschritte zu enantiomerenreinen Produkten sind in der chemi-

schen und pharmazeutischen Industrie der Schl¨ussel zu einer hohen Wertsch¨opfung

in einem Markt mit einer hohen Dynamik. Das Wachstum des Marktvolumens an

enantiomerenreinen Feinchemikalien wird mit 13.2% j¨ahrlich bis 2007 prognostiziert

[83] und ist so ¨uberdurchschnittlich hoch. Außerdem ist sp¨atestens seit der Conter-

gankatastrophe 1962 der Bedarf an enantiomerenreinen Wirkstoffen unumstritten

[66], [77]. Dieser f¨uhrt in der Industrie zu einem starken Anstieg der eingesetzten

100

120

140

160

1960 1970 1980 1990 2002

Jahr

Anzahl biotechnologischer Prozesse

Abbildung 1.1: Anzahl der eingesetzten biotechnologischen industriellen Prozesse

biokatalytischen Prozesse zur Gewinnung von enantiomerenreinen Substanzen, der

in Abbildung 1.1 dargestellt ist. Im Jahre 2002 wurden 138 großtechnische, bio-

technologische Prozesse in Betrieb genommen [84]. Das wissenschaftliche Interesse

an der Bereitstellung enantiomerenreiner Produkte wird besonders durch die Verlei-

1 EINLEITUNG 2

hung des Nobelpreises f¨ur Chemie im Jahre 2001 an Knowles, Noyori und Sharpless

f¨ur ihre Pionierarbeiten auf dem Gebiet dokumentiert [51]. Exemplarisch f¨ur die-

ses Forschungsgebiet ist die Konkurrenz bei der Herstellung von enantiomerenreinen

Epoxiden und deren korrespondierenden Diolen, um diese sehr interessanten ”buil-

ding blocks” zur Verf¨ugung zu stellen.

Einer der Nobellaureaten, Sharpless, entwickelte 1980 den nach ihm benannten Kata-

lysator, um Allylalkohole enantioselektiv zu epoxidieren [81]. Die Entwicklung dieses

Katalysators stellt einen Meilenstein in der Synthese enantiomerenreiner Epoxide

dar. Allerdings wird man bedingt durch den Reaktionsmechanismus bei der Edukt-

wahl auf Allylalkohole beschr¨ankt. Neben der asymetrischen Synthese ist die kineti-

sche Racematspaltung ein weiteres stark bearbeitetes Arbeitsgebiet. Bei den Epoxi-

den sind einige Beispiele f¨ur die Spaltung verschiedener Racemate mit Hilfe von

Epoxidhydrolasen aus unterschiedlichen Zellen bekannt [3], [25], [26]. Besonders her-

vorzuheben sind die Hydrolasen aus filament¨osen Pilzen [3], [45], da sie durch gezielte

Anzucht der Mikroorganismen in ausreichenden Mengen zur Verf¨ugung stehen. Als

Beschr¨ankungen der Reaktionsf¨uhrung treten hier die f¨ur Ganzzellsysteme typischen

Probleme [20], wie geringe Eduktkonzentration und die Wiederverwendbarkeit der

Katalysatoren, auf. Von Bedeutung f¨ur pharmazeutische Produkte ist außerdem die

vollst¨andige Abtrennbarkeit der Mikroorganismen nach der Reaktion. In der Lite-

ratur ist eine hohe Anzahl von Substraten f¨ur diese Reaktion beschrieben [25], [42],

[44], die allerdings alle unter den oben genannten Beschr¨ankungen leiden, so dass

eine Optimierung der Reaktionssf¨uhrung zu einem technisch interessanten Prozess

f¨uhren kann.

1.2 Problemstellung

Als Modellsystem wird in dieser Arbeit die enantioselektive Biohydrolyse von Sty-

rolepoxid mit den filament¨osen Pilzen Aspergillus niger und Beauveria bassiana un-

tersucht (Abbildung 1.2). Beide enantiomerenreine Produkte sind interessante Zwi-

schenprodukte in der chemischen und pharmazeutischen Industrie [25], [45], [61].

In der vorliegenden Arbeit soll mit verschiedenen Strategien die Reaktionsf¨uhrung

optimiert werden. Hierzu ist ein genaues Verst¨andnis des Reaktionssystems notwen-

dig, um Nebenreaktionen zu unterdr¨ucken und die Enantiomeren¨ubersch¨usse anzu-

heben. F¨ur die Verfolgung des Reaktionsverlaufes wird eine geeignete Analytik aller

beteiligten Stoffe etabliert, die es erlaubt das Reaktionssystem vollst¨andig zu erfas-

1 EINLEITUNG 3

Beauveria bassiana

Aspergillus niger

rac-Styrolepoxid

H H

(R)-Phenylethan-1,2-diol

(S)-Styrolepoxid

(R)-Styrolepoxid

H H

(R)-Phenylethan -1,2-diol

Abbildung 1.2: Stereoselektive Biohydrolyse von Styrolepoxid mit den filament¨osen

Pilzen Beauveria bassiana und Aspergillus niger

sen.

Zur Optimierung des Reaktionsverlaufes werden folgende Ans¨atze verfolgt und ge-

gebenenfalls kombiniert:

•Variation des Reaktionsmediums

•Immobilisation des Biokatalysators

•Aufschluss der Mikroorganismen

•Modellierung des Reaktionsverlaufes

Durch die Verwendung von organischen L¨osemitteln als Reaktionsmedium soll die

Eduktkonzentration erh¨oht und gegebenenfalls Nebenreaktionen unterdr¨uckt wer-

den. Die geeignete Immobilisation des Biokatalysators soll eine Wiederverwendung

und kontinuierliche Verfahrensweise erm¨oglichen. Parallel dazu kann ein Aufschluss

des Biokatalysators mit anschließender Aufkonzentration des Enzymes und einer

Immobilisation zu h¨oherer Raum-Zeit-Ausbeute f¨uhren. Es soll mit einem einfachen,

auch unter technischen Bedingungen handhabbaren Verfahren gearbeitet werden.

Schließlich soll die Modellierung des Reaktionssystems und die Anpassung des Mo-

dells an Meßdaten die Modellvorstellung validieren und nicht experimentell zug¨angli-

che kinetische Daten liefern. Die Modellbildung soll aus den experimentell ermittelten

kinetischen Daten in einem kommerziell erh¨altlichen Programm erfolgen.

2 THEORIE 4

2 Theorie

2.1 Chiralit¨at und Enantioselektivit¨at

Die 1848 von Pasteur entdeckte Stoffeigenschaft der Chiralit¨at [68] tritt bei Mo-

lek¨ulen auf, die sich nicht mit ihrem Spiegelbild in Deckung bringen lassen. Auf

molekularer Ebene muss hierzu ein asymmetrisches Zentrum oder eine Symmetrie-

achse Cnvorhanden sein. Das Molek¨ul darf hingegen keine Symmetrieebenen oder

Drehspiegelachsen enthalten. Die beiden Molek¨ule mit spiegelbildlicher Topologie

nennt man Enantiomere. Ihre physikalischen Eigenschaften stimmen bis auf die Ab-

lenkung der Drehrichtung der Schwingungsebene von linear polarisiertem Licht ¨ube-

rein. Große Unterschiede treten in der Pharmakokinetik und Toxizit¨at der Enan-

tiomeren auf, die mit ihrer verschiedenen Topologie und damit verbundener Wech-

selwirkungsf¨ahigkeit mit Zellstrukturen zusammenh¨angen. F¨ur die Verwendung von

Wirkstoffen ist die enantiomerenreine Gewinnung und Quantifizierung der Reinheit

von gr¨oßter Bedeutung. Die Reinheit von stereogenen Substanzen wird durch den

Enantiomeren¨uberschuss (ee-Wert) angegeben, der durch die Formel 2.1 definiert ist.

ee =(xR)−(xS)

(xR)+(xS)∗100% (2.1)

Der Enantiomeren¨uberschuss betr¨agt bei einem Racemat, einem ¨aquimolaren Ge-

misch beider Enantiomere, 0% und bei einem rein vorliegenden Enantiomeren 100%.

Die im Verlauf der Reaktion umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Stoff-

menge einer bestimmten Komponente wird in der Reaktionstechnik als Umsatzgrad

(U oder kurz Umsatz) bezeichnet (Formel 2.2). Sie kann bei einer enantioselektiven

Reaktion ebenfalls aus den Enantiomeren¨ubersch¨ussen des Substrates (ees) und des

Produktes (eep) berechnet werden. Der Umsatz steigt im Verlauf der Reaktion von

0, beim Reaktionsstart, bis auf 1 bei vollst¨andiger Reaktion.

U≡ni0−ni

ni0

=ees

ees+eep

(2.2)

F¨ur die Bewertung enantioselektiver Reaktionen wird die Enantioselektivit¨at (E-

Wert, Formel 2.3) verwendet [28]. Die Enantioselektivit¨at ist f¨ur die jeweilige Re-

aktion eine Konstante unabh¨angig von den Substratkonzentrationen und dem Um-

satz. Sie quantifiziert die F¨ahigkeit des Katalysators zur Unterscheidung der beiden

um einen Katalysatorenplatz konkurrierenden Enantiomeren. Ein E-Wert von 1 ent-

spricht einer unselektiven Reaktion, ab einem Wert von 100 erh¨alt man bei einem

2 THEORIE 5

Umsatz von 0,5 ein optisch reines Produkt. In diesem Fall spricht man von einer

hochselektiven Reaktion.

E≡Vmax

KMR

Vmax

KMS

=ln[(1 −U)(1 −ees)]

ln[(1 −U)(1 + ees)] =ln[(1 −U)(1 −eeP)]

ln[(1 −U)(1 + eeP)] (2.3)

Ab einem E-Wert von 20 sind enantioselektive Reaktionen meist pr¨aparativ nutzbar,

da sich bei einem bestimmten Umsatz ein stark enantiomerenangereichertes Produkt

isolieren l¨asst.

2.2 Gewinnung enantiomerenreiner Epoxide

Enantiomerenreine Epoxide sind interessante Edukte in der organischen Synthese

und ”building blocks” in der Wirkstoffherstellung. Dank ihrer hohen Ringspannung

stellen sie exzellente Reaktionspartner f¨ur fast alle Nukleophile dar. Als Strategie zu

ihrer Darstellung wurden die asymmetrische Synthese und die kinetische Racemat-

spaltung entwickelt.

Bei der asymmetrischen Synthese wird von einer prochiralen Verbindung ausgegan-

gen. Mit Hilfe von chiralen Reagenzien (chirale Pers¨auren, chirale Dioxirane oder

chirale Borate), chiralen Auxiliaren oder chiralen Katalysatoren gelangt man zu ei-

nem chiralen Epoxid [17]. Diese Verfahren sind nicht in allen F¨allen hochselektiv. Bei

der Reaktion einer chiralen Pers¨aure mit einem trans-Alken ist das Stereozentrum

zu weit von den neu zu bildenden Zentren entfernt f¨ur eine hochwirksame Wechsel-

wirkung. Erst eine sterisch anspruchsvolle Seitengruppe an dem Alken, die einen der

m¨oglichen ¨

Ubergangszust¨ande stark bevorzugt, erm¨oglicht hohe Selektivit¨aten [47].

Die genauere Untersuchung des Mechanismus ergab, dass ein sterischer Einfluss nicht

ausreicht, um die Ergebnisse der Reaktion zu erkl¨aren. Es wird ein ¨

Ubergangszustand

angenommen, bei dem die eingef¨ugte Seitengruppe die Pers¨aure in der richtigen Po-

sition fixiert. Diese ¨

Uberlegung f¨uhrte schließlich zu der Idee, Metallkatalysatoren

f¨ur die Reaktion einzusetzten.

Die wohl bekannteste Reaktion zu einem enantiomerenreinen Epoxid ist die in den

1980er Jahren entwickelte Sharpless-Katsuki-Oxidation, die ausgehend von Allylal-

koholen mit Hilfe von tert-Butylhydroperoxid und Titan-Tatrat-Komplexen zu den

entsprechenden Glycidolen f¨uhrt. Das bevorzugte Enantiomer kann hierbei ¨uber das

am Katalysator gebundene Enantiomere des Tatrates bestimmt werden [80], [89].

2 THEORIE 6

Die Reaktion f¨uhrt im Allgemeinen zu hohen Enantiomeren¨ubersch¨ussen. Die ally-

lische Hydroxidgruppe koordiniert das Substrat am Titanzentrum. Das Tatrat ist

ebenfalls am Titan koordiniert und erzeugt eine chirale Umgebung. Die eigentliche

Oxidation erfolgt ¨uber einen ¨

Ubergangszustand, an dem das tert-Butylhydroperoxid

ebenfalls am Titanzentrum koordiniert ist [17]. Die Limitierung des Substrates auf

Allylalkohole wird durch den Mechanismus auch theoretisch einsichtig.

Eine Weiterentwicklung der enantioselektiven Epoxidation sind die Katalysatoren

nach Jacobsen und Katsuki [35], die in den 1990er Jahren entwickelt wurden. Dabei

handelt es sich um eine Katalysatorgruppe, in der ein C2-symmetrisches Mn(III)-

Salen-Zentrum unterschiedlich substituiert ist. In der Literatur wurden ¨uber 100 ka-

talytisch aktive Komplexe dieses Types beschrieben [57], von denen der N,N-Bis(3,5-

di-t-butylsalicyliden)-1,2-cyclohexandiaminomangan(III)chlorid, der sogenannte Ja-

cobsen Katalysator, der effizienteste und meistgenutzte ist. Mittlerweile ist der luft-

stabile, lange lagerbare Komplex kommerziell erh¨altlich, was seine Verbreitung in

pr¨aparativen Laboren weiter vorantreibt. Als Substrate eignene sich konjugierte cis-

Alkene und di- und trisubstituierte Olefine. Die asymmetrische Epoxidation von

trans-Alkenen stellt immer noch ein ungel¨ostes Problem dar.

2.2.1 Kinetische Racematspaltung mit Epoxidhydrolasen

Alternativ zur asymmetrischen Synthese bildet die kinetische Racematspaltung mit

Epoxidhydrolasen einen interessanten Zugang zu enantiomerenreinen Epoxiden und

deren korrespondierenden Diolen [6]. Nach der Internationalen Komission f¨ur Enzy-

me werden Epoxidhydrolasen der Klasse EC 3.3.2.3 zugeordnet [48]. Diese spalten

eine Etherbindung regio- und enantiospezifisch unter Anlagerung von Wasser. Vi-

cinale trans-Diole (Abbildung 2.1) werden so durch eine SN2 Reaktion gebildet.

Epoxidhydrolase

Wasser

Abbildung 2.1: Hydrolyse eines Epoxids durch Epoxidhydrolasen

Epoxide haben einen stark elektrophilen Charakter und sind ein gutes Alkylierungs-

reagenz. Daraus resultiert ihr Verm¨ogen, den Informations- und Strukturerhalt le-

2 THEORIE 7

bender Zellen zu st¨oren [64]. Sie werden zum Beispiel bei dem Abbau von Aroma-

ten ¨uber Monooxidasen gebildet [22]. Wegen ihrer Giftigkeit, Cancerogenit¨at und

Teratogenit¨at besitzen alle Zellen zu ihrem Schutz Epoxidhydrolasen, die Epoxide

zu biologisch weniger problematischen, wasserl¨oslichen und sehr gut sekretierbaren

trans-1,2-Diolen umwandeln [25]. In h¨oheren Organismen sind Epoxidhydrolasen da-

her verst¨arkt in katabolisch aktiven Organen, wie der Leber, zu finden. Eukarionten,

wie Mammalia- und Pilzzellen, weisen ebenfalls eine nachweisbare Hydrolaseaktivit¨at

auf [29]. Neuere Untersuchungen zeigen auch eine Verbreitung der Epoxidhydrolasen

in Bakterienzellen [36].

F¨ur die mit Epoxidhydrolasen katalysierte Reaktionen wurde ein Mechanismus vor-

geschlagen, der die trans-antiperiplanare Addition von Wasser unter Inversion an

dem angegriffenen Kohlenstoffatom erkl¨art (Abbildung 2.2) [25], [27]. An dieser Re-

aktion sind keine Cofaktoren und auch keine Metallzentren beteiligt.

Asp

His

Tyr

Asp

His N

H O

Asp

His N

H+

"Glycol-

momoester

intermediat"

Abbildung 2.2: Mechanismus der Epoxid¨offnung mit microsomaler Epoxidhydrolase

Die Carboxylatgruppe des Aspartatrestes der ”active site” des Enzyms greift nu-

kleophil den Oxiranring unter Bildung eines Glycolmonoesterintermediats an. Das

ben¨otigte Proton wird synchron hierzu von einem Tyrosin ¨ubertragen. Im darauf fol-

genden Schritt wird die Esterbindung des Glycomonoesters basenkatalysiert durch

ein Histidinrest hydrolysiert und das Diol von der ”active site” abgespalten.

2 THEORIE 8

2.2.2 Mikrobiologische Epoxidhydrolasen

Epoxidhydrolasen (EH) aus Mikroorganismen k¨onnen nach ihrer Herkunft und gleich-

zeitig nach ihrem Substratmuster in drei Gruppen eingeteilt werden [25]:

•EH aus Rotalgen (Bsp. Rhodutorula und Rhodosporidium Spezies),

•EH aus Pilzzellen (Bsp. Aspergillus und Beauveria Spezies),

•EH aus Bakterien (Bsp. Rhodococcus und Nocadia Spezies).

W¨ahrend die Epoxidhydrolasen aus Rotalgen die h¨ochste Enantioselektivit¨at mit

monosubstituierten Epoxiden zeigen, werden die Epoxidhydrolasen aus Pilzzellen

am erfolgreichsten f¨ur Styrolepoxid-Typ Substrate eingesetzt. Epoxidhydrolasen aus

Bakterien zeigen ihr h¨ochstes katalytisches Potential bei h¨ohersubstituierten 2,2- und

2,3-disubstituierten Epoxiden.

Monosubstituierte Epoxide sind sehr flexibel und bieten wenig Oberfl¨ache f¨ur ei-

ne chirale Erkennung. Daher sind die Reaktionen der Epoxidhydrolasen mit einer

hohen Enantiomerenselektivit¨at die Ausnahme. Die Ring¨offnung erfolgt unter dem

Angriff des sterisch weniger abgeschirmten Kohlenstoffatoms unter Bevorzugung des

(S)-Enantiomeren. Styroloxid-Typ Epoxide bilden aufgrund des benzylischen Koh-

lenstoffatoms eine spezielle Gruppe von Substraten. Durch den aromatischen Ring

kann ein Carbeniumion sehr gut resonanzstabilisiert werden. Außerdem ist es ste-

risch gehindert, so dass mehrere Reaktionswege ¨uber Inversion und Retention des

Kohlenstoffzentrums m¨oglich sind. Eine klare Bevorzugung eines Enantiomeren ist

in dieser Reaktion nicht feststellbar. Sterisch anspruchsvollere Substrate wie 2,2-

und 2,3-disubstituierte Epoxide werden von Epoxidhydrolasen mit guten Enantio-

meren¨ubersch¨ussen unter Bevorzugung der (S)-Enantiomere hydrolysiert.

Die komplement¨are Enantioselektivit¨at bei der Hydrolyse von Styrolepoxid durch

die Pilze Beauveria bassiana und Aspergillus niger, die in Abbildung 2.3 dargestellt

ist, er¨offnet die M¨oglichkeit aus einem racemischen Edukt mittels zweier Biokataly-

satoren ein enantiomerenreines Diol zu gewinnen [45].

F¨ur 2,2-substituierte Oxirane konnte ein solches Verfahren durch den Mangel an en-

antiokomplement¨ar arbeitenden bakteriellen Enzymen nicht etabliert werden. Des-

halb wurde auf ein Zwei-Schritt-Mechanismus mit der enzymatischen ¨

Offnung und

2 THEORIE 9

Beauveria bassiana

Aspergillus niger

rac-Styrolepoxid

H H

(R)-Phenylethan-1,2-diol

(S)-Styrolepoxid

(R)-Styrolepoxid

H H

(R)-Phenylethan -1,2-diol

Abbildung 2.3: Enantiokomplement¨are Epoxidhydrolyse durch Beauveria bassiana

und Aspergillus niger

mild saurer chemischer Hydrolyse des enantiomerenreinen ¨uberbleibenden Epoxids

unter Inversion ausgewichen [25].

2.2.3 Substrate filament¨oser Pilz-Epoxidhydrolasen katalysierter Reak-

tionen

F¨ur Reaktionen vom Edukttyp Styroloxid mit Epoxidhydrolasen aus Pilzen als Ka-

talysator wurden verschiedene Substratmuster untersucht, um die Substratbreite

zu ermitteln. Abbildung 2.4 zeigt das allgemeine Substitutionsmuster, w¨ahrend in

Tabelle 2.2 die Substituenten und die in der Literatur beschriebenen Enantiome-

ren¨ubersch¨usse zusammengefasst sind [25].

Tabelle 2.1: Enantiomeren¨ubersch¨usse anderer Substrate

Substrat Nr. Mikroorganismus eeEUEeeDUDLit.

[%] [%] [%] [%]

1B. bassiana 98 20 69 48 [44]

2B. bassiana 98 38 77 49 [44]

3A. niger 99 43 62 43 [38],[37]

4A. niger 99 28 65 50 [40]

4B. bassiana 98 34 83 45 [39]

5A. niger 96 36 70 48 [4]

6A. niger 99 40 92 42 [2]

2 THEORIE 10

rac

Epoxidhydrolase R2

Puffer

R3R3R3

Abbildung 2.4: Reaktionsschema der literaturbeschriebenen Substrate

Tabelle 2.2: Substituenten und Selektivit¨aten der literaturbeschriebenen

Styroloxidtyp-Substrate

R1R2R3X Mikroorganismus eeEUEeeDUDLit.

[%] [%] [%] [%]

H H H - A. niger 99 28 65 50 [45]

H H H - B. bassiana 98 34 83 45 [45]

CH3H H - A. niger 73 13 32 60 [45]

CH3H H - B. bassiana 53 10 10 80 [45]

H H CH3-A. niger - - - - [45]

H H CH3-B. bassiana 98 30 90 38 [45]

H CH3H - A. niger - - - - [45]

H CH3H - B. bassiana 20 42 99 42 [45]

H CH3CH3-A. niger - - - - [45]

H CH3CH3-B. bassiana - - - - [45]

H H H CH3A. niger 95 34 66 - [2]

H H H CH3B. bassiana 98 30 76 - [2]

H H H F A. niger 98 35 81 - [2]

H H H F B. bassiana 96 25 78 - [2]

H H H Br A. niger 98 34 80 - [2]

H H H Br B. bassiana 96 33 79 - [2]

H H H CN A. niger 99 38 76 - [2]

H H H CN B. bassiana 15 59 50 - [2]

H H H p −NO2A. niger 98 37 70 - [46]

H H H p −NO2B. bassiana 20 50 49 - [46]

Weitere Substrate dieser Epoxidhydrolasenklasse sind bicyclische Systeme (1,2), Li-

monenenoxid (4), Bower´s Reagenz (5) und Verbindungen mit heterocyclischen Aro-

maten (3), die in Abbildung 2.5 zusammengefasst sind. Die Selektivit¨aten dieser

Reaktionen sind in Tabelle 2.1 aufgef¨uhrt. Interessant ist vor allem die ¨

Offnung von

Glycidylacetal-Derivaten (6), die zeigen, dass die Epoxidhydrolasen aus filament¨osen

Pilzen nicht ausschließlich auf Styrolepoxidderivate begrenzt sind.

2 THEORIE 11

1 2 3

4 5 6

Abbildung 2.5: Weitere Substrate filament¨oser Pilzepoxidhydrolasen

2.3 Chirale Analytik

Die Enantiomerenanalytik bildet einen zentralen Bestandteil der Synthese chiraler

”building blocks”. Aufgrund der wenigen physikalischen Eigenschaften, die bei Enan-

tiomeren unterschiedlich sind, kommen nur recht wenige Verfahren f¨ur die Analytik

in Frage. Neben der Derivatisierung der Enantiomeren zu Diastereoisomeren und

anschließenden klassischen Analytik, z.B. durch HPLC, haben sich die Polarogra-

phie, die Kernresonazspektroskopie und die Chromatographie an chiralen Phasen

etabliert. Bei der Wahl des geeigneten Verfahrens m¨ussen folgende Aspekte beachtet

werden:

•Gr¨oße der verf¨ugbaren Probenmenge

•Anzahl der Proben

•Art und Anzahl der Isomeren

•Art und Anzahl der funktionellen Gruppen f¨ur die Derivatisierung und f¨ur

Wechselwirkungen mit chiralen Phasen

•Anwesenheit von Chromophoren

•Literaturwerte f¨ur den spezifischen Drehwert bzw. f¨ur die Eluationsreihe der

Stereoisomere

•Notwendigkeit der Bestimmung der absolute Konfiguration

2 THEORIE 12

2.3.1 Polarographie

Das klassische Verfahren der Enantiomerenanalytik beruht auf der Ablenkung der

Schwingungsebene von linear polarisiertem Licht durch die Probe. Der Ablenkungs-

betrag ist bei beiden Enantiomeren gleich, weist aber das entgegengesetzte Vorzei-

chen auf. Ein Racemat ergibt somit kein Signal. Hinweise auf die Enantiomeren-

reinheit kann man daher nur bei Kenntnis der spezifischen Rotation der Substanz

gewinnen. Eine Weiterentwicklung dieser Methode ist die Optische Rotationsdisper-

sion (ORD) bei der die Ablenkung als Funktion der Wellenl¨ange gemessen wird.

Bei dem Cirkulardichroismus (CD), einer weiteren optischen Methode, muss das

Substrat ein Chromophores aufweisen, welches die Messwellenl¨ange absorbiert. Alle

polarographischen Verfahren sind in der Regel nicht automatisierbar, was f¨ur ein

hohes Probenaufkommen notwendig w¨are. Da keine Konzentrationen mehrerer Ste-

reoisomere in einer Messung bestimmt werden k¨onnen, ist sie eher das Verfahren der

Wahl bei Einzelmessungen zur Reproduktion der Literaturwerte und zur schnellen

Kontrolle der Stereoisomerenanreicherung.

2.3.2 Kernresonanzspektroskopie in der Stereoisomerenanalytik

Bei der Kernresonanzspektroskopie in der Stereoisomerenanalytik werden die Enan-

tiomeren der Probe derivatisiert oder solvatisiert, um separierte Signale im Spektrum

zu erhalten. F¨ur die Modifikation stehen folgende Methoden zur Verf¨ugung:

•Chirale Derivatisierungsreagenzien (CDA´s)

•Achirale Derivatisierungsreagenzien

•Chirale Shiftreagenzien (CSR)

•Chirale L¨osemittel (CSA)

Die Vorteile der Verfahren sind die Bestimmung der relativen Konzentrationen der

Enantiomeren und die M¨oglichkeit der Bestimmung der absoluten Konfiguration.

Nachteilig ist der Verbrauch an chiralen Reagenzien und der apparative Aufwand.

Eine Automation f¨ur ein hohes Probenaufkommen ist prinzipiell m¨oglich, bis jetzt

aber un¨ublich. Kernresonanzspektroskopie ist das Verfahren der Wahl f¨ur Einzel-

proben, bei denen die absolute Konfiguration der Stereoisomeren bestimmt werden

soll.

2 THEORIE 13

2.3.3 Chromatographie an chiralen Phasen

Die Chromatographie an chiralen Phasen beruht auf der Bildung von tempor¨aren

Diastereoisomeren, die eine unterschiedliche Stabilit¨at und somit unterschiedliches

Verweilzeitverhalten in der S¨aule aufweisen [86]. Die Enantiomeren werden mit der

mobilen Phase an der chiralen station¨aren Phase entlang eluiert. W¨ahrenddessen

bilden sie mit den funktionellen Gruppen der chiralen station¨aren Phase Diastereoi-

somere unterschiedlicher Stabilit¨at (Abbildung 2.6).

Chirale Phase

Analyt Adsorbat

stabil labil

Abbildung 2.6: Bildung von tempor¨aren Diastereoisomeren in der chiralen Chroma-

tographie

Da das stabile Adsorbat eine h¨ohere Verweilzeit als das labile Adsorbat aufweist,

kommt es zur Enantiomerentrennung. Die Konzentrationen der Enantiomeren wer-

den ¨uber Verd¨unnungsreihen mit Standards ermittelt. Dabei k¨onnen auch Einzel-

konzentrationen in Mehrstoffgemischen bestimmt werden. Die Chromatographie an

chiralen Phasen ist als gaschromatographisches und fl¨ussigkeitschromatographisches

Verfahren etabliert. Sie ist automatisierbar und somit auch f¨ur h¨ohere Probenauf-

kommen das Verfahren der Wahl. F¨ur die station¨are Phase werden in der Regel

modifizierte Cyclodextrine, Mehrfachzucker und Peptidphasen verwendet.

2.4 Immobilisierung von Biokatalysatoren

2.4.1 Allgemeine ¨

Ubersicht

Biokatalysatoren, speziell isolierte Enzyme, sind wasserl¨osliche globulare Proteine,

deren Terti¨ar- und Quart¨arstruktur ausschlaggebend f¨ur ihre katalytische Aktivit¨at

2 THEORIE 14

ist. Alle Enzyme weisen auf ihrer Oberfl¨ache eine Reihe von katalytischen, regula-

torischen und Substratbindungszentren auf. Aufgrund dessen sind sie in der Lage,

bei moderaten Temperaturen und Drucken in einem neutralen pH-Bereich spezies-,

regio- und stereoselektive Reaktionen zu katalysieren. Um diese Eigenschaften f¨ur

technische Prozesse zu nutzen und energie- und resourcensparende Prozesse zu eta-

blieren, ist es h¨aufig sinnvoll, Biokatalysatoren einzusetzen. Die optimalen Prozessbe-

dingungen liegen jedoch nicht immer im physiologischen Optimum des Enzymsy-

stems. Daher ist es notwendig, Enzyme zum Schutz des Enzymsystems, zur Erhal-

tung der Aktivit¨at, zur R¨uckgewinnung und zu ¨ortlichem Zusammenhalt mit einem

notwendigen Cofaktorregenerationssystems zu immobilisieren. Immobilisierte Enzy-

me sind solche, die unter Erhaltung ihrer katalytischen Aktivit¨at physikalisch oder

chemisch an Tr¨agermaterialien gebunden sind, so dass sie wiederholt oder kontinu-

ierlich genutzt werden k¨onnen [48]. Nach dieser Definition lassen sich die Immobili-

sierungsarten wie in Abbildung 2.7 gliedern.

Kovalente

Bindung

Adsorptive

Bindung Einschluss

Anlagerung

Quervernetzung

Ionische Bindung

Adsorption

Geleinschluss

Mikroverkapselung

Membraneinschluss

Immobilisierungsarten

Abbildung 2.7: Gliederung der wichtigsten Immobilisierungsarten

Vorteile der Immobilisierung sind die gute Wiedergewinnbarkeit bzw. Zur¨uckhalt-

barkeit in kontinuierlichen Reaktoren, mechanische Stabilit¨at und gute Dosierbarkeit

der Biokatalysatoren. Weniger offensichtliche Vorteile sind die Trennung der Enzym-

2 THEORIE 15

proteine von der Produktphase, Schaffung einer Mikroumgebung mit optimaleren

Reaktionsbedingungen f¨ur den Katalysator und gegebenenfalls der r¨aumliche Zu-

sammenhalt von Cofaktorregenerierung und cofaktorverbrauchender Reaktion. Die

resultierenden Nachteile entsprechen denen der heterogenen Katalyse, wie teurer

Katalysator durch den vorgeschalteten Immobilisierungsschritt und ein Stofftrans-

portwiderstand an den aktiven Katalysezentren. In der Biokatalyse werden h¨aufig die

Quervernetzung von Enzymen mit Glutardialdehyd, die Bindung an Ionentauscher-

harzen und die Verkapselung von Enzymen und Zellsystemen in geeigneten Matrices

angewandt [50].

2.4.2 Verkapselung von Biokatalysatoren

Der Einschluss oder die Umh¨ullung von Biokatalysatoren mit einer polymeren Matrix

wird als Verkapselung bezeichnet. Hierf¨ur sind vier Herstellungsprinzipien etabliert:

•Polyanionen-Polykationenkomplexe (Bsp. Sulfoethylcellulose, Chitosan),

•F¨allung durch mehrwertige Ionen (Bsp. Alginat in Ca2+),

•Sol-Gel-Verfahren (Bsp. Poly(alkoxysilanole)),

•Stabilisierung durch Trocknung und Zugabe mehrwertiger Ionen (Bsp. Polyvi-

nylalkohole).

Zur Herstellung von Polyanionen-Polykationenkomplexen wird der Katalysator mit

einer Polyanionenl¨osung vermengt und in die Polykationenl¨osung eingetropft. Durch

Bildung einer Membran an der Oberfl¨ache kommt es zur Ausbildung von Hohlku-

geln mit einem Durchmesser von 1,5 bis 5 mm. Die Partikelgr¨oße kann durch die

Tropfengr¨oße eingestellt werden.

Bei der F¨allung von mehrwertigen Ionen wird die Katalysator-Polyanionenl¨osung in

ein F¨allbad mit mehrwertigen Kationen getropft. Die Partikelgr¨oße wird ebenfalls

durch die Tropfengr¨oße bestimmt. Die Immobilisate k¨onnen je nach F¨allungsdauer

eine Umh¨ullungsmembran aufweisen oder durchgeliert werden.

Monodisperse Tropfen f¨ur beide Immobilisierungsverfahren werden durch das Vibra-

ting Nozzel-Verfahren oder durch einen Strahlschneider erzeugt [72]. Bei dem Vi-

brating Nozzel-Verfahren wird die Zubereitung durch eine schnell schwingende D¨use

2 THEORIE 16

gedr¨uckt. Durch die Schwingungen zerreißt der Fl¨ussigkeitsstrom in monodisperse

Tropfen, die durch eine elektrostatische Aufladung an der Integration in der Luft

gehindert werden. Die Tropfengr¨oße kann sowohl durch den Durchmesser als auch

durch die Schwingungsfrequenz der D¨use eingestellt werden. Dabei werden Tr¨opfchen

von 0,1 bis 1,5 mm erzeugt. Bei der Strahlschneidung wird der Fl¨ussigkeitsstrom

durch ein rotierendes Rad mit Schneidelementen zerteilt. Hier wird die Tropfengr¨oße

ebenfalls durch die D¨usengr¨oße und zus¨atzlich durch die Geschwindigkeit des Schnei-

derades bestimmt. Dieses Verfahren ist f¨ur technische Einsatzgebiete f¨ur Teilchen mit

einem Durchmesser von 150 nm bis 3 mm geeignet.

Die Sol-Gel-Verfahren zur Verkapselung von Biokatalysatoren beginnen wie das klas-

sische Sol-Gel Verfahren mit der Herstellung eines Precursors [8]. Ein Alkylsilikat,

ein Alkoximetallat oder ein Alkoxisilan wird zu Alkoxiderivaten hydrolysiert und

in einer Kaskade von Kondensationsreaktionen zu einem wasserl¨oslichen kolloidia-

len phasenseparierten Polymer umgesetzt. Dieses Kolloid wird mit dem Katalysator

vermischt und bildet die Matrix des Immobilisates. Es kann durch die verschiedenen

Verfahren zu Immobilisaten geformt werden. Als letzter Schritt erfolgt die Sol-Gel-

Umwandlung und gegebenenfalls Trocknung zum Xerogel.

Das in dieser Arbeit verwendete Verfahren basiert auf der Trocknung und anschlie-

ßender Stabilisierung durch mehrwertige Ionen. Der Katalysator wird mit einer ge-

schmolzenen Polyvinylzubereitung vermengt, auf eine Unterlage aufgetropft und die

erzeugten Partikel anschließend getrocknet [49], [91]. Bei einem bestimmten Feuch-

tigkeitsgehalt konkurrieren zwei in der Zubereitung vorhandenen PVA-Phasen um

die verbleibende Feuchtigkeit und es kommt zur Gelierung.

3 - 4 mm

200 - 400 µm

Abbildung 2.8: Schema eines Polyvinylalkoholimmobilisats

2 THEORIE 17

Die Partikel klaren dabei sichtbar auf. Zur endg¨ultigen Verfestigung werden die ge-

lierten Partikel mit einer Salzl¨osung mehrwertiger Ionen stabilisiert. Der Katalysator

ist in eine gelierte Matrix verkapselt. Durch die Verarbeitung resultiert eine Linsen-

form, die in Abbildung 2.8 dargestellt ist [92], [93]. Die Partikelbildung kann im

Labor durch eine Spritze oder einen Stempel erfolgen. Technisch werden die Partikel

mittels D¨usen auf ein Trockenband abgelegt, welches in einem F¨allbad endet. Erste

technische Anwendungen zeigen eine sehr hohe Standzeit der Immobilisierungsma-

trix. Immobilisierte Denitifizierer konnten 9 Monate in einer Kl¨arstufe eingesetzt

werden [19]. F¨ur die Herstellung von Difructoseanhydrid (DFA III) aus Inulin als

Waschmittelzusatz und Kuststoffweichmacher ist die Produktion ¨uber immobilisier-

te, genetisch ver¨anderte Mikroorganismen in der Entwicklung [56].

2.5 Beauveria bassiana und Aspergillus niger in der organischen

Synthese

Die in dieser Arbeit verwendeten Pilze Beauveria bassiana und Aspergillus niger

werden neben der stereoselektiven ¨

Offnung verschiedener Epoxide auch als Biokata-

lysatoren f¨ur einige andere Reaktionen verwendet [42], [45].

Aspergillus niger wird zur Fermentation von R¨ubenkraut zur Zitronens¨auregewin-

nung in Submerskulturen eingesetzt [18]. Dieses Verfahren stellt eine Weiterentwick-

lung einer Oberfl¨achenfermentation dar, bei der aus Kohlenhydratgemischen Zitro-

nens¨aure gewonnen wird. Die hierbei auftretenden St¨orungen durch anorganische

Verbindungen, die in dem als Rohstoff gew¨unschten R¨ubenkraut vorhanden sind,

wurden durch gezielte Feed-Strategien umgangen. Großtechnisch wird Aspergillus

niger samt Mutantenst¨ammen ebenfalls f¨ur die Fermentation von Glucose zu Glu-

cons¨aure in stark saurer L¨osung eingesetzt [70]. Dieses Verfahren bietet einige Vor-

teile gegen¨uber bakteriellen Ans¨atzen, da bei diesen Biotransformationsbedingungen

ein geringeres Kontaminationsrisiko durch Konkurrenten besteht.

Beauveria bassiana wurde von Petch 1914 als Parasit auf einer Seidenwurmlarve

isoliert [85], [71]. Hieraus ergaben sich die Versuche, ihn zur biologischen Insekten-

vertilgung einzusetzten [31], [53]. In der Literatur der Biokatalyse sind die Reduktion

von α, β-unges¨attigten Ketonen [59], die Modifikation von Imipraminen mit polaren

Gruppen [55], die Glycolisierung von phenolischen Hydroxylgruppen [60] und die

Oxygenierung von Dialkylbenzen [88] mittels Beauveria bassiana als Katalysator

beschrieben. Gerade bei der Reduktion von α, β-unges¨attigten Ketonen wurde eine

2 THEORIE 18

Vielzahl von Verbindungen mit einer Cyclohex-2-en-1-on ¨ahnlichen Struktur unter-

sucht mit dem Ziel steroselektiv Carvone zu reduzieren. Dabei ergaben sich hohe Ste-

reoselektivit¨aten bei den korrespondierenden ges¨attigten Ketonen, wenn ein asym-

metrisches Kohlenstoffatom gebildet wird. Eine hohe katalytische Aktivit¨at wurde

ebenfalls bei der Reduktion struktur¨ahnlicher α, β-unges¨attigter Aldehyde beschrie-

ben.

2.6 Modellierungsbeispiele in der Biokatalyse

In der Biokatalyse wurden bereits zahlreiche Prozesse modellhaft erfasst und opti-

miert. Im einfachsten Fall wird die Kinetik des Reaktionssystems ermittelt und an die

gemessenen Reaktionsverl¨aufe angepasst. F¨ur Enzymsysteme wird dabei h¨aufig die

Michaelis-Menten-Kinetik oder von ihr abgeleitete Ans¨atze verwendet [13]. Ein vor-

geschaltetes Gleichgewicht (Formel 2.4) zur Bildung eines Enzym-Substrat-Kompexes

und eine anschließende irreversible Enzymreaktion bilden den Ausgangspunkt der

Herleitung.

[S]+[E]

)

k−1

[ES]k

→[P]+[E] (2.4)

δcS

δt =V[S]

k1+ [S]=V[S]

+ [S] (2.5)

In der Literatur wurden mehrere abgeleitete Ans¨atze f¨ur Gleichgewichtsenzymre-

aktionen oder Mehrsubstratreaktionen dargestellt [1]. Diese Ans¨atze k¨onnen auch

f¨ur freie Enzyme in homogenen Reaktionsmedien verwendet werden. Bei immobi-

lisierten Enzymen muss zus¨atzlich der Stofftransport an den Katalysator beachtet

werden. Meist sind die immobilisierte Biokatalysatoren an der Oberfl¨ache der Immo-

bilisatpartikel gebunden. Diese Partikel schwimmen in einer homogen durchmischten

Bulkphase oder werden als Festbettpackung durchstr¨omt. In diesen Verfahren wur-

den bisher ausschließlich kugelf¨ormige Partikel modelliert, da sie sich mathematisch

gut beschreiben lassen. Zur Vereinfachung wird nur ein Kugelsegment berechnet,

was die Rechenzeiten begrenzt und ausreichende Informationen ¨uber die zu unter-

suchenden Partikel ergibt. Die Kerngleichungen der Modelle sind die Kinetiken der

Hauptreaktion und ein Stofftransportterm an den Katalysator.

Hilker modelierte die Epoxidation von unges¨attigten Pflanzen¨olen mittels oberfl¨ache-

nimmobilisierter Lipase B von Candida antarctica [54]. Das Enzym ist in diesem

2 THEORIE 19

Prozess auf der Oberfl¨ache eines kugelf¨ormigen Ionenaustauscherharzes immobili-

siert. Das Reaktionssystem besteht aus der Bildung der Pers¨aure aus Carbons¨auren

und Wasserstoffperoxid und der eigentlichen enzymatischen Prileschajew-Reaktion.

Vor der Pers¨aurebildung ist eine Gleichgewichtseinstellung vorgeschaltet, bei der

die organische Reaktionsphase aus einer w¨aßrigen L¨osung mit Wasserstoffperoxid

ges¨attigt wird. Die Deaktivierung der Enzyme bei bestimmten Reaktionsbedingun-

gen wird ebenfalls in dem Modell ber¨ucksichtigt. Dieses ”overall-kinetic” Modell be-

schreibt den untersuchten Prozess ausreichend f¨ur eine Simulation bei verschiedenen

Reaktionsbedingungen.

Ein weiteres interessantes Modell f¨ur immobilisierte Biokatalysatoren ist das ”dead

core” Model [21]. Cruz modelierte die Cephalosporin C Bildung w¨ahrend einer spe-

ziellen Mangelwachstumsphase von Cephalosporium acremonium in kugelf¨ormigen

Alginatgelperlen. Die Modellbildung ergab, dass die aktiven Zellen in dieser spezi-

ellen Wachstumsphase nur in einer ¨außeren H¨ulle des Immobilisates vorliegen. Die

berechneten Sauerstoffprofile zeigen deutlich, dass nur eine ¨außere Schale in dieser

Wachstumsphase vorhanden ist. Die berechneten Profile konnten mittels Scanning

Elektronenmikroskopie (SEM) best¨atigt werden.

3 EXPERIMENTELLES 20

3 Experimentelles

3.1 Analytik

3.1.1 Bestimmung der Styrolepoxid-Stereoisomeren

Die Konzentrationen der Styrolepoxidenantiomeren wird mittels chiraler Gaschro-

matographie ermittelt. 2 mLder w¨assrigen Reaktionsbr¨uhe werden mit demselben

Volumen Hexan extrahiert. Das Extrakt wird ¨uber Natriumsulfat getrocknet und

gaschromatographisch vermessen. Hierzu wird ein Chrompack CP 2002 Gaschroma-

tograph mit einem Probenaufgabesystem Modell 911 genutzt. Als Trenns¨aule wird

eine 12,5 m lange, modifizierte Cyclodextrins¨aule [Heptakis-(6-O-butyldimethylsilyl-

2,3-di-O-methyl)-β-cyclodextrin] verwendet. Helium mit einem Fluß von 20 mL/min,

einem Druck von 100 kPa und einem Splitverh¨altnis 1:20 wird als mobile Phase ver-

wendet. Es werden jeweils 5 µL Probe bei einer Injektortemperatur von 230oC aufge-

geben. Die getrennten Enantiomeren werden mit einem Flammenionisationsdetektor

erfasst. Die Datenaufnahme und Auswertung erfolgt mit dem Programm Maitre

Chromatography Data Sytem Version 2.5 der Firma Chrompack. Bei der isothermen

Analyse bei 90oC hat das (R)-Styrolepoxid eine Retentionszeit von 9,05 min und das

(S)-Enantiomeres basisliniengetrennt eine Retentionszeit von 9,75 min. Die Integrale

der Signale ergeben bei einem Racemat ein Verh¨altnis von 1:1. Die Bestimmung der

Konzentrationen in den Proben erfolgt ¨uber die Aufnahme einer Kalibriergeraden

bestehend aus drei Standards (0,25 g/L, 0,5 g/L und 1,0 g/L rac-Styrolepoxid mit

den gleichen Konzentrationen Phenyalacetaldehyd).

3.1.2 Bestimmung der 1,2-Phenylethandiol-Stereoisomeren

Die Konzentrationen der Enantiomeren des 1,2-Phenylethandiols werden mittels chi-

raler HPLC bestimmt. Es wird ein Merck-Hitachi Lachrom System mit folgenden

Komponenten verwendet: Pumpe L7100, Degaser L7612, Autosampler L7200, UV-

VIS Detektor L7420 und Interface D7000. Zur Trennung der Diole wird die S¨aule

Chiracel OB-H der Firma Daicell verwendet. Es wird ein isokratischer Fluss von

0,6 mL/min bestehend aus 91% Hexan und 9% Isopropanol angelegt. Die Detektion

findet bei einer Wellenl¨ange von 219 nm (Absorptionsmaximum) statt. Die Daten-

aufnahme und Auswertung erfolgt mit Hilfe der Software ”HPLC System Manager

7000” der Firma Hitachi in der Version 4.0. Die Bestimmung ergibt eine Retentions-

3 EXPERIMENTELLES 21

zeit von 22,6 min f¨ur das (R)-Enantiomere und von 28,5 min f¨ur das (S)-Enatiomere.

Styrolepoxid weist eine Retentionszeit von 15,8 min auf, wird aber nicht in die En-

antiomeren getrennt. Die Bestimmung der Konzentrationen in den Proben erfolgt

¨uber die Aufnahme einer Kalibriergeraden bestehend aus drei Standarts (0,25 g/L,

0,5 g/L und 1,0 g/L rac-1,2-Phenylethandiol).

3.1.3 Messung der Phenylacetaldehydkonzentration

Phenylacetaldehydkonzentrationen werden ebenfalls wie die Styrolepoxidkonzentra-

tionen gaschromatographisch bestimmt. Die Retentionszeit in dem oben beschriebe-

nen System betr¨agt 10,65 min.

3.1.4 Messung des gesamten organischen Kohlenstoffgehaltes in L¨osun-

gen

Der gesamte organische Kohlenstoffgehalt der Fermentationsbr¨uhe wird als Maß der

Glucosekonzentration in den Wachstumskurven verwendet. Er wird mittels eines

Wasseranalysators Dimatoc100 (Dimatec Analysentechnik GmbH) ermittelt. Das

Meßprinzip beruht auf der thermisch-katalytischen Oxidation von kohlenstoffhal-

tigen Verbindungen. Das entstehende Kohlenstoffdioxid wird mittels eines Infrarot-

detektors quantitativ erfasst. Die Bestimmung des TC-Wertes erfolgt bei 850oC und

8 L/min Tr¨agergasstrom mir dem TC-Kugelkatalysator (Nr.G3195, Dimatec) und

Platinwolle. Der TIC Kanal arbeitet bei 160oC und mit dem TIC-Katalysator Nr.

G3250 (Dimatec). Die Probe der Fermentationsbr¨uhe wird mit VE Wasser 1:100

verd¨unnt (Meßbereich C-Konzentration kleiner 10 mg/L) und durch einen Faltenfil-

ter partikelfrei filtriert. Die so vorbehandelte Probe wird mittels TC- (total carbon)

und TIC-Kanal (total inorganic carbon) vermessen. Der TOC-Gehalt, der als Maß

f¨ur den verstoffwechselbaren Glucosegehalt angenommen wird, ergibt sich aus der

Differenz des TC- und TIC-Gehaltes.

3.1.5 Strukturbeweis der Produkte mittels NMR-Spektroskopie

Die NMR-Spektren werden mit dem NMR-Spektrometer Bruker ARX 200 (200/50

MHz) gemessen. Als L¨osemittel wird deuteriertes Chloroform verwendet. Es ergeben

sich die in Tabelle 3.1 angegebenen Verschiebungen.

3 EXPERIMENTELLES 22

Tabelle 3.1: NMR Daten der Edukte und Produkte

Verschiebung Signalart Protonen

Styrolepoxid

7,3 ppm m Aromatenprotonen

3,9 ppm q Protonen am sekund¨aren Epoxidkohlenstoff

2,8 und 3,2 ppm q Protonen am prim¨aren Epoxidkohlenstoff

1,2-Phenylethandiol

7,3 ppm m Aromatenprotonen

3,9 ppm s Protonen am sekund¨aren Alkoholkohlenstoff

2,8 und 3,1 ppm t Protonen am prim¨aren Alkoholkohlenstoff

1,2 und 1,4 ppm t Alkoholprotonen

Phenylacetaldehyd

7,3 ppm m Aromatenprotonen

3,7 ppm d Protonen am sekund¨aren Seitenkettenkohlenstoff

9,8 ppm t Protonen am Aldehydkohlenstoff

Epoxypropyl-isopropylether

3,5 ppm d Protonen am sekund¨aren Seitenkettenkohlenstoff

3,19 ppm m Protonen am tert. i-Propylkohlenstoff

2,8 ppm q Protonen am sekund¨aren Epoxidkohlenstoff

2,5 ppm q Protonen am prim¨aren Epoxidkohlenstoff

1,16 ppm m Protonen an den Methylgruppen des i-Propylrestes

Epoxypropyl-phenylether

7,3 ppm m Aromatenprotonen

4,2 und 4,1 ppm m Protonen an der Kohlenstoffkette

3,9 ppm q Protonen am sekund¨aren Epoxidkohlenstoff

2,8 ppm q Protonen am prim¨aren Epoxidkohlenstoff

Benzyloxiran

7,3 ppm m Aromatenprotonen

2.68 ppm m Protonen an der Kohlenstoffkette

2,92 ppm q Protonen am sekund¨aren Epoxidkohlenstoff

2,5 ppm q Protonen am prim¨aren Epoxidkohlenstoff

3.1.6 Messung der Kohlenwasserstoffkonzentration in der Gasphase

Zur Ermittlung der Kohlenwasserstoffkonzentration in der Gasphase wird ein Flam-

menionisationsdetektor (Bernath Atomic Modell 3006) eingesetzt. Als Umrechnungs-

faktor wird der Strukturfaktor von Styrol verwendet. Bei Versuchen in Fermentern

wird aus dem Volumenstrom der Begasung und dem Meßwert die ausgegaste Stoff-

3 EXPERIMENTELLES 23

menge berechnet.

3.1.7 Messung der Biotrockenmasse

Die Biotrockenmasse wird durch Einwaage von ca. 0,5 g der abgesaugten Pilzpro-

be, Trocknung bei 102oC bis zur Massenkonstanz (24 h) und Zur¨uckw¨agung be-

stimmt. Es wird davon ausgegangen, dass die Trockenmasse des Pilzes bei identi-

schen Anzucht- und Erntebedingungen als Maß f¨ur die Zellzahl verwendet werden

kann.

3.2 Biokatalyse

3.2.1 Pilzkulturen

Es werden Pilzkulturen Beauveria bassiana (DSM 1344) und Aspergillus niger (DSM

823), die bei der Deutschen Sammlung f¨ur Mikroorganismen und Zellkulturen hin-

terlegt sind, verwendet.

3.2.2 Biomassenanzucht

Die Biomasse wird in Fermentern (1-4,5 L Nutzvolumen) mit einer N¨ahrl¨osung aus 20

g/L Corn Steep Liquor (Sigma C-4648) und 10 g/L Glucose herangezogen. Zur Ver-

hinderung der Schaumbildung wird 1 mLAntischaummittel (Antifoam O-30, Sigma

A-8082) hinzugegeben. Die hitzesterilisierte Supension wird auf 27oC temperiert und

mit sterilfiltrierter Luft (3 L/min) begast. Zum Animpfen wird pro Liter N¨ahrl¨osung

1 cm2einer 7 Tage alten Pilzkultur auf Sabourand 2% Glucose Agar (Merck) hinzu-

gegeben. Nach 72 h (Beauveria bassiana) und 66 h (Aspergillus niger) Inkubationszeit

wird der Pilz durch Zentrifugation (5 min bei 10000 U/min) isoliert.

3.2.3 Messung der Wachstumskurven

Die Wachstumskurven der beiden Pilzkulturen werden in dem 4,5 L Nutzvolumenfer-

menter aufgenommen. 4,5 L der Standardn¨ahrl¨osung (siehe 3.2.2) werden angeimpft

und bei 27oC inkubiert. In regelm¨aßigen Abst¨anden werden die Parameter pH- und

3 EXPERIMENTELLES 24

pO2mittels Elektroden bestimmt. In den gleichen Intervallen werden Kulturpro-

ben ¨uber das Heberohr gezogen und der TOC-Wert (siehe Abschnitt 3.1.4) und die

Biotrockenmasse (siehe Abschnitt 3.1.7) bestimmt. Zum Ende der exponentiellen

Phase, mehrfach in der station¨aren Phase und am Anfang der Absterbephase wird

etwas Biomasse isoliert und auf Epoxidhydrolaseaktivit¨at entsprechend Kapitel 3.2.4

beschrieben untersucht.

Die Optimierung der Wachstumstemperatur wird mittels eines temperierbaren Sch¨utte-

linkubators (IKA KS130) mit Thermoaufsatz durchgef¨uhrt. In Probenr¨ohrchen mit

5 mLStandardn¨ahrl¨osung wird nach Animpfung mir einer Zellsuspension 2 Tage bei

verschiedenen Temperaturen inkubiert. Anschließend wird die Biotrockenmasse wie

in Kapitel 3.1.7 beschrieben bestimmt.

Zur Optimierung der N¨ahrbodenkonzentration werden in 100 mLErlenmeyerkolben

jeweils 50 mLN¨ahrl¨osung mit den im Ergebnisteil angegebenen Konzentrationen

angesetzt. Die Animpfung erfolgt mit 100 µL einer gut durchmischten Zellsupension,

die aus 1 mLRingerl¨osung, 100 µL SDS-L¨osung und 2 Impf¨osen Pilzzellen einer 3

Tage alten Agarkultur besteht. Nach einer Inkubationsdauer von 3 Tagen wird die

Biomasse isoliert und die Biotrockenmasse bestimmt. Die Hydrolyseaktivit¨at wird

durch Reaktion mit 1 g der Biofeuchtmasse in 20 mLPhosphatpuffer und 20 µL

Styrolepoxid untersucht.

3.2.4 Biohydrolyse mit freiem Pilz

Generelle Vorgehensweise:

Die stereoselektiven Hydrolysen werden in 100 mLErlenmeyerkolben in einem Sch¨utte-

linkubator (Braun BBiotech) bei 170 H/min und 27oC durchgef¨uhrt. Es werden,

wenn nicht anders vermerkt, 50 mLeines 0,1 mol/L Phosphatpuffers pH 7 und 2 g

Biofeuchtmasse eingesetzt. Zur Reaktionskontrolle werden je 2 Proben a 2 mLRe-

aktionsbr¨uhe entnommen und mit 2 mLHexan (Edukt) oder 2 mLDichlormethan

(Produkt) extrahiert.

Abweichungen f¨ur spezielle Fragestellungen:

Bei der Analyse des Reaktionssystems im Detail wird die Reaktion wie oben be-

schrieben durchgef¨uhrt. Als Edukt wird jedoch enantiomerenreines Styrolepoxid ver-

wendet. Die R¨uckreaktion wird durch Verwendung von enantiomerenreinem 1,2-

3 EXPERIMENTELLES 25

Phenylethandiol untersucht.

Zur Messung der Inhibition der Reaktion wird zus¨atzlich zum Edukt 1,2-Phenylethandiol

in den untersuchten Konzentrationen vorgelegt.

Die Wahl der geeignetesten Reaktionsmedien wird durch die Biohydrolyse, wie oben

beschrieben, in verschiedenen Puffern bei verschiedenen Konzentrationen durch-

gef¨uhrt. Der Vergleich verschiedener Puffersysteme wird bei pH 8 vorgenommen.

Es wird Kalium-, Natriumphosphatpuffer, TRIS-HCl-Puffer, Ringerl¨osung und VE-

Wasser verwendet. Natriumphosphatpuffer wird in den Konzentrationen 1; 0,5; 0,25;

0,1; 0,05 mol/L eingesetzt. Die Puffer werden aus laborhandels¨ublichen Chemikalien

in p.a. Qualit¨at hergestellt.

F¨ur die Messung der Reaktion im Detail wird in einem 1000 mLErlenmeyerkolben

30 g Biofeuchtmasse in 500 mLPhosphatpuffer pH 8 suspendiert und zu Beginn

der Reaktion mit 0,5 mLStyrolepoxid beschickt. Zur Reaktionskontrolle werden in

dichten Abst¨anden (zu Beginn alle 5 Minuten ansteigend auf 60 min Abst¨ande) Pro-

ben, wie bereits oben beschrieben, entnommen, aufgearbeitet und vermessen. Die

Ausgasung wird durch Messung der Kohlenwasserstoffkonzentration in der Gaspha-

se mittels FID angen¨ahert. Zur Verringerung des Eduktverlustes durch Ausgasung

wird der Versuch zus¨atzlich in verschließbaren Flaschen durchgef¨uhrt. F¨ur die Mo-

dellanpassung werden Meßkurven mit 200 mL Puffer pH 8 mit 12 g Biofeuchtmasse

in einem verschlossenen Reaktionsgef¨aß aufgenommen. 160 µL Styrolepoxid werden

in dem gleichen Volumen Ethanol gel¨ost und kurz vor der Zugabe des Biokatalysators

mittels Ultraturax in der Reaktionsl¨osung vollst¨andig gel¨ost. Die genaue Anfangs-

konzentration wird mittels GC und HPLC wie zuvor beschrieben bestimmt.

3.2.5 Biohydrolyse mit gefriergetrocknetem Pilz

F¨ur die Gefriertrocknungsversuche werden 3 g des abgesaugten Pilzes bei -20oC ein-

gefroren und anschließend in der Gefriertrocknung (Christ Alpha 1-2LD) am ¨

Olpum-

penvakuum bei 0,45 mbar ¨uber Nacht getrocknet. Das Gasbalastventil wird zur End-

trocknung f¨ur 30 min geschlossen und die Biomasse bei Maximalvakuum getrocknet.

Anschließend wird die entsprechende Reaktionsl¨osung nach Beendigung des Trock-

nungsvorganges schnell hinzugegeben.

Glycerin (10 mLZellsuspension mit 3 g Biofeuchtmasse in Wasser mit 10% Glycerin)

3 EXPERIMENTELLES 26

wird bei der Gefriertrocknung von Beauveria bassiana als Schutzstoff hinzugegeben

und die Suspension 60 min auf dem Sch¨uttelinkubator inkubiert. Anschließend wird

die Zubereitung eingefroren und wie oben beschrieben gefriergetrocknet. Es wird ein

Ansatz mit 0,5% Na-L-Ascorbat (Goldblume Handelsgesellschaft) als Antioxidans

angesetzt. Als weitere Variante wird eine Zellsupension in einer L¨osung mit 20%

Magermilchpulver (Sucofin Magermilchpulver) mit 0,5% Na-L-Ascorbat verwendet.

Zur Untersuchung der Lagerstabilit¨at des gefriergetrockneten Pilzes wird 1 g Bio-

trockenmasse, die bei 20oC unter Luftabschluss gelagert wird, mit 2 mLPhosphat-

puffer pH 8 analog der Reaktion mit freiem Pilz durchgef¨uhrt. Nach einer Stunde

Reaktionszeit wird die Supension in zwei H¨alften geteilt und wie in Kapitel 3.1 be-

schrieben extrahiert und analysiert.

3.2.6 Biohydrolyse in organischen L¨osemitteln

Die Biohydrolyse in organischen L¨osemitteln wird wie unter 3.2.4 beschrieben durch-

gef¨uhrt. Statt Wasser wird das entsprechende L¨osemittel in Synthesequalit¨at oder

ein L¨osemittel-Wasser-Gemisch verwendet. Die Analytik der getrockneten L¨osemit-

telproben erfolgt direkt, w¨ahrend die Untersuchung der Proben aus den L¨osemittel-

Wasser-Gemischen nach einer Extraktion stattfindet.

3.2.7 Bestimmung der Autohydrolyse- und Folgereaktion

Die Autohydrolyse wird durch Vorlage von Phosphatpuffern im pH-Bereich von 6,5-

9 in verschließbaren Flaschen mit 100 mLVolumen gemessen. Nach Zugabe von

1 g/L Styrolepoxid wird der Reaktionsansatz auf einem Sch¨uttelinkubator bei 170

H/min durchmischt. Die Reaktionskontrolle findet wie unter 3.1 beschrieben statt.

Zur Untersuchung der Folgereaktion wird statt des Styrolepoxids zum Reaktionsstart

1 g/L 1,2-Phenylethandiol zu den pH-Puffern hinzugegeben. Die entnommenen Pro-

ben werden zur Reaktionskontrolle mit Dichlormethan extrahiert und mittels HPLC

vermessen.

3 EXPERIMENTELLES 27

3.3 Immobilisierung

3.3.1 Verkapselung der Biokatalysatoren in eine Polyvinylalkoholmatrix

Die Biokatalysatoren werden nach dem Verfahren der Firma GeniaLab (Braun-

schweig) in Polyvinylalkohol zu sog. LentiKats r

verkapselt [49]. Hierzu wird eine

Suspension von 3 g isolierter Biomassse in 20 mLRingerl¨osung mit 80 mLPVA Zu-

bereitung verarbeitet. Das PVA wird entsprechend der Herstellerangaben bei 80oC

vollst¨andig geschmolzen, auf 30oC temperiert, mit der Biokatalysatorsuspension ver-

mischt und verarbeitet. Zur Bilanzierung wird die PVA/Biokatalysatorsuspension

mittels einer Spritze mit Kan¨ule auf Polystyrolpetrischalen zu 3 mm großen Trop-

fen aufgegeben. F¨ur gr¨oßere Ans¨atze wird eine Stempelvorrichtung (LentiKatPrin-

ter, GeniaLab, Braunschweig) verwendet. Hierbei wird mittels einer Stempelplatte

mit 400 gleichm¨aßigen Metallstiften aus einem Bad PVA/Biokatalysatorsuspension

entnommen und auf Polystyrolpetrischalen abgestreift. Die nach beiden Verfahren

gewonnenen Partikeln werden in der Cleanbench auf 20% ihres Gewichtes getrocknet

(ca. 90 min). Die linsenf¨ormigen Partikel werden anschließend in einer mitgelieferten

Salzl¨osung unter R¨uhren 2 h stabilisiert.

3.3.2 Biohydrolyse mit Immobilisaten

Die stereoselektiven Hydrolysen werden in 100 mLErlenmeyerkolben in einem Sch¨utte-

linkubator (Braun BBiotech) bei 170 H/min und 27oC durchgef¨uhrt. Es werden,

wenn nicht anders vermerkt, 50 mLeines 0,1 mol/L Phosphatpuffers pH 7 und die

oben gewonnene Masse an Immobilisat eingesetzt. Die Reaktionskontrolle wird ana-

log der Biohydrolyse mit freiem Pilz durchgef¨uhrt.

3.3.3 Bestimmung des Diffusionsmechanismus

Die PVA-Oberfl¨ache wurde mit einem Rasterelektronenmikroskop (Joel Typ 640F,

Uni-Bielefeld) untersucht.

Die Untersuchung auf Poren im Berich zwischen 2-100 nm wird nach dem Verfahren

der Thermoporometrie [63], [69] mit dem Differential Scanning Calorimeter Pyris 1

der Firma Perkin Elmer durchgef¨uhrt. F¨ur die Bestimmung wurden 30 mg des PVA´s

in einen Aluminiumtiegel (PE 0219-0041) gef¨ullt und ausreichend ¨

Uberschusswasser

3 EXPERIMENTELLES 28

hinzugegeben. Zuvor wurde das PVA gr¨undlich in VE-Wasser gewaschen. Die Pro-

be wurde in dem Meßbereich von -30oC bis 2oC mit einer Aufheizrate von 0,5oC

vermessen.

3.3.4 Bestimmung der Diffusionskoeffizienten

Die Bestimmung der Diffusionskoeffizienten durch einen PVA-Film wurde in einer

2*120 mLMeßzelle durchgef¨uhrt (Abbildung 3.1).

Retentat

(turbulent durchmischt)

Permeat

(turbulent durchmischt)

PVA-Membran

Abbildung 3.1: Schema der Diffusionsmeßzelle

Zur Membranherstellung wird in einer Petrischale eine ca. 5 mm dicke PVA-Schicht

gegossen und entsprechend der Herstellungsanweisung der LentiKats r

weiterverar-

beitet. Die Membrandicke wird mit einem Mikomereterdickenmesser bestimmt (ge-

messene und gemittelte Dicke V1= 0,45 mm, V2= 0,43 mm, V3= 0,46 mm). Aus der

stabilisierten Membran wird ein gleichm¨assiges, blasenfreies 3*5 cm großes St¨uck her-

ausgeschnitten und in die Trennwand der Meßzelle eingebaut. Die Trennung der Meß-

zellen erfolgt durch ein freies kreisf¨ormiges Membranst¨uck von 2 cm Durchmesser.

Die Einzelzellen werden mittels Magnetr¨uhrer turbulent durchmischt (200 U/min).

Aus beiden Teilzellen (VP=VB= 100 mL) werden in regelm¨aßigen Zeitabst¨anden 2

mLProbe gezogen und wie in Kapitel 4.1.1 und 4.1.2 beschrieben aufgearbeitet und

vermessen.

3 EXPERIMENTELLES 29

3.4 Aufschluss der Pilzzellen

Bei allen beschriebenen Aufschlussverfahren wird der abgenutschte Pilz mit ca. 20 mL

Aufschlusspuffer in einem M¨orser vordispergiert, um eine gleichm¨assige Behandlung

im anschließenden Verfahren zu gew¨ahrleisten. Ziel ist es ein zellfreies Extrakt zu

gewinnen, dessen Hydrolyseaktivit¨at erhalten bleibt. Es wird jeweils ein Ausstrich

auf einem Sabourand-2%-Glucose-Agar angelegt und 3 Tage bei 27oC inkubiert. Die

katalytische Aktivit¨at wird mittels Biohydrolyse wie in Kapitel 4.2.3 beschrieben

bestimmt.

F¨ur alle Aufschl¨usse wird folgender Puffer verwendet: 10 mM TRIS (Merck), 1 mM

Cystein (Aldrich), 1 mM EDTA (Aldrich), 0,3 mM Phenylmethansulfonylfluorid

(Fluka). Die L¨osung wird mit Salzs¨aure auf pH 7,0 eingestellt.

3.4.1 Aufschluss durch Gefriertrocknung

3 g des abgesaugten Pilzes werden bei -20oC eingefroren und anschließend in der

Gefriertrocknung (Gerstell Nimbus 2000) am ¨

Olpumpenvakuum bei 0,45 mbar ¨uber

Nacht getrocknet. Zur Endtrocknung wird f¨ur 30 min das Gasbalastventil geschlossen

und die Biomasse bei Maximalvakuum getrocknet. Nach der Trocknung wird sofort

der entsprechende Puffer hinzugegeben.

3.4.2 Aufschluss mit dem Zellaufschlussger¨at

F¨ur den Zellaufschluss durch Scheerung wird ein Zellaufschlussger¨at (Braun BBio-

tech) verwendet. Die Zellsuspension wird dabei auf Eis gek¨uhlt und bei einer Dreh-

zahl von 250 U/min f¨ur 5 bzw. 10 min. behandelt (vergl. [14]).

3.4.3 Aufschluss mit Ultraschall

Die entsprechende Pilzmenge wird in dem Aufschlusspuffer vorgelegt, suspendiert

und mit Eis gek¨uhlt. Die Ultraschallsonde des Aufschlussger¨ates (Sonicator 6,7; Ul-

trasonoc Inc.) wird in die Mitte des Becherglases eingef¨uhrt, die Leistung des Ger¨ates

auf 300 mW eingestellt und die Suspension 15 min beschallt.

3 EXPERIMENTELLES 30

3.4.4 Aufschluss mit dem Ultraturrax

Die Pilzsuspension in Aufschlusspuffer wird mit dem Ultraturrax unter K¨uhlung

zerscheert. Zur Stabilisierung der Enzyme wird ein Zuschlag von 2,5% Paraffin und

2,5% Glycerin verwendet.

3.4.5 Aufschluss mit gek¨uhlten L¨osemitteln

3 g Biofeuchtmasse werden in 20 mLAufschlusspuffer suspendiert, mit doppeltem

Volumen gek¨uhlten Aceton (-20oC) ¨ubergossen und durchmischt. Die Suspension

wird 15 min gek¨uhlt (-20oC) und alle 5 min erneut durchmischt. Anschließend wird

der aufgeschlossene Pilz abgenutscht und zur Reakton eingesetzt. Das Verfahren wird

ebenfalls mit Butylacetat durchgef¨uhrt.

3.4.6 Kombination der Aufschlussverfahren

Die aussichtsreichen Einzelaufschlussverfahren wurden miteinander kombiniert. Nach

dem ersten Aufschlussschritt wird die Biomasse ggf. abzentrifugiert, dem zweiten

Verfahren zugef¨uhrt und anschließend auf Biohydrolyseakivit¨at untersucht.

3.4.7 Anreicherung der Enzymfraktion

Die katalytisch aktiven Zellbruchst¨ucke werden durch Dialyse (vergl. [75], [14]) an-

gereichert. Hierzu wir eine Dialysemembran (Medicell, 12-14 kDa cut-off) f¨ur 30

min in EDTA-L¨osung ausgekocht, zweifach mit VE-Wasser gewaschen und mit der

anzureicherenden L¨osung gef¨ullt. Die Membran wird bei 2oC in Polyethylenglycol

(PEG 200, Aldrich) geh¨angt und regelm¨assig durchmischt. Nach der gew¨unschten

Anreicherung wird das Retentat aus der Membran isoliert.

3.4.8 Bestimmung der Substratbreite

F¨ur die Bestimmung der Substratbreite wird die Biohydrolyse in Erlenmeyerkolben

wie oben beschrieben durchgef¨uhrt. Die Substrate werden in Ethanol (1:1) gel¨ost

und in die Fermentationssuspension bis zur Endkonzentration von 1 g/L zugegeben.

Es werden Epoxypropyl-phenylether, Epoyxpropyl-isopropylether und Benzyloxiran

3 EXPERIMENTELLES 31

in purum-Qualit¨at (Fluka) eingesetzt. 1,2-Indenepoxid wurde aus Inden mittels der

Prileschajew-Reaktion mit m-Chlorbenzoes¨aure als Oxidationsmittel hergestellt. Die

Synthese des 1,2-Dihydronaphtalinoxid erfolgte nach dem Bromhydrinverfahren [11].

4 ERGEBNISSE 32

4 Ergebnisse

4.1 Anzucht der Mikroorganismen

Die Mikroorganismen Aspergillus niger und Beauveria bassina werden in der Biokata-

lyse neben den in Kapitel 2.2.2 aufgef¨uhrten Anwendungen auch zur stereoselektiven

Offnung von Epoxiden verwendet. Hierzu werden sie als rastende Zellen (resting cells)

eingesetzt. Die Zugabe von Epoxiden in eine Batchkultur in der logarithmischen Pha-

se f¨uhrt zu einer sofortigen Verstoffwechselung als Kohlenstoffquelle. Schon 30 min

nach der Zugabe ist kein Styrolepoxid in der Fermentationsbr¨uhe nachweisbar.

4.1.1 Wachstumskurve Aspergillus niger

Zur Bestimmung des optimalen Erntezeitpunktes einer Batchkultur ist eine Wachs-

tumskurve f¨ur den eingesetzten Mikroorganismus ausschlaggebend. In Abbildung 4.1

werden die aufgenommenen Parameter pH-, pO2-Wert, die Biotrockenmasse (BTM)

und der gesammte organische Kohlenstoffgehalt (TOC-Wert) f¨ur eine Aspergillus

niger Kultur dargestellt. Aus dem Verlauf der Biotrockenmasse sind bis Stunde 10

die lag-Phase, bis Stunde 27 die log-Phase, bis Stunde 50 die station¨are Phase und

anschließend die Absterbephase zu erkennen. In dem ¨

Ubergang aus der lag- in die

log-Phase um die Stunde 10 der Biomassenanzucht beginnt der pO2-Wert als Zeichen

der einsetzenden katabolischen Aktivit¨at zu sinken. Gleichzeitig sinkt der pH-Wert

von pH 7 auf pH 6. In der logarithmischen Phase sinkt der TOC-Wert, der als ein-

fach zu bestimmendes Summenmaß f¨ur die Kohlenstoffquellen verwendet wird. Der

Ubergang zu der station¨aren Phase ist gekennzeichnet durch die starke Abnahme

des TOC-Wertes und den gleichzeitigen Anstieg des pH-Wertes. Der ¨

Ubergang in

die station¨are Phase wird durch eine Glucoselimitierung induziert. Im Laufe dieser

Phase nimmt der TOC-Wert weiter ab. Gleichzeitig steigt der pO2-Wert an. Der

von Vermehrung auf Erhalt umgestellte Stoffwechsel der Pilze kommt nun mit we-

niger Glucose aus. Nach dem Durchlaufen des TOC-Wertminimums beginnt in der

Sterbephase der Kultur eine Autolyse der Zellen, die zu dem leichten Wiederanstieg

des TOC-Wertes f¨uhrt. Gleichzeitig erreicht der pO2-Wert wieder den S¨attigungs-

wert. Der pH-Wert der Kultur steigt w¨ahrend der gesamten station¨aren Phase bis

auf pH 8 an. Zur einfachen Detektion der Wachstumsphasen der Batchkultur von

Aspergillus niger scheiden die ¨ublichen Verfahren, wie die Messung optischer Dichte,

aufgrund der hohen Zelldichte und der starken Tr¨ubung des Mediums aus. Von den

4 ERGEBNISSE 33

untersuchten Parametern kann der

-20

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Zeit (h)

TOC, pO2, Biomasse

TOC (50 mg) pO_2 BTM (mg) pH

Abbildung 4.1: Wachstumskurve von Aspergillus niger (DSM 823)

pO2-Wert am besten zur Detektion der Wachstumsphase der untersuchten Kultur

verwendet werden. Als Detektionskriterien werden folgende Punkte eingesetzt:

•erster Abfall des pO2-Wertes zum Minimum ⇒¨

Ubergang aus der lag- in die

log-Phase,

•Anstieg des pO2-Wertes aus dem Minimum ⇒¨

Ubergang aus der log- in die

station¨are Phase,

•80% des Maximal-pO2-Wertes ⇒¨

Ubergang aus der station¨aren in die Sterbe-

phase.

In jeder detektierten Wachstumsphase werden mehrfach die katalytischen Aktivit¨aten

bestimmt, welche in Tabelle 4.1 als ee-Wert des Styrolepoxids nach 1 h Reaktions-

zeit aufgef¨uhrt sind. Der optimale Erntezeitpunkt wird bei einer hohen Aktivit¨at mit

4 ERGEBNISSE 34

einer hohen Selektivit¨at und gleichzeitiger maximaler Biomasse im Anzuchtsreaktor

erreicht. F¨ur Aspergillus niger liegt er bei 49,5 h am Ende der station¨aren Phase.

Tabelle 4.1: Katalytische Aktivit¨at von Aspergillus niger

Zeit BTM ee-Wert Umsatz Wachstums-

(h) (g) (Epoxid, %) (%) phase

15,5 40 - - log-

20,5 70 - - Phase

28,5 80 4,8 0,37

32,5 80 10,2 0,56 station¨are

40,5 80 20,5 0,68 Phase

45,0 80 42,7 0,51

49,5 80 62,5 0,63

55,5 65 8,8 0,61 Absterbephase

W¨ahrend der station¨aren Phase wird bei Pilzen h¨aufig das Enzymsystem stark um-

gebaut, um den ver¨anderten Umweltbedingungen gerecht zu werden [85], [70]. Der

Aufbau der stereoselektiven Epoxidhydrolasen in der station¨aren Phase l¨aßt sich

deutlich in der Tabelle 4.1 ablesen. Die katalytische Aktivit¨at von Aspergillus niger

nimmt im Verlauf der station¨aren Phase zu, um am Ende der Phase ein Maximum

zu erreichen. In der Absterbephase nimmt das Verm¨ogen die Epoxide enantioselektiv

zu hydrolysieren schnell ab.

4.1.2 Wachstumskurve Beauveria bassiana

Die Wachstumskurve von Beauveria bassiana ist in Abbildung 4.2 dargestellt. Die

lag-Phase dieser Kultur dauert bis zu Stunde 7, wonach sich die log -Phase bis Stunde

31 anschließt. Die station¨are Phase dauert bis Stunde 62 an, um dann in die Ab-

sterbephase ¨uberzugehen. Der pH-Wertverlauf zeigt im ersten Drittel der log-Phase

ein Minimum bei pH 5,8, gefolgt von einem Anstieg bis zum Ende der log-Phase auf

pH 7,6. W¨ahrend der station¨aren Phase steigt der pH-Wert gleichm¨aßig und erreicht

in der Absterbephase den Wert pH 8,8. Nach dem der TOC-Wert um 74% gefallen

ist, wechselt die Kultur in die station¨are Phase, in welcher der TOC-Wert auf sein

Minimum sinkt. Er steigt erst wieder w¨ahrend der Sterbephase durch die Zelllyse

an. Der pO2-Wert f¨allt zu Beginn der station¨aren Phase auf sein Minimum ab und

steigt erst am Ende dieser Phase wieder an. Seinen Maximum erreicht er schon in der

4 ERGEBNISSE 35

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Zeit (h)

TOC, pO2, Biomasse

TOC (50 mg) pO_2 BTM (mg) pH

Abbildung 4.2: Wachstumskurve von Beauveria bassiana (DSM 1344)

Mitte der station¨aren Phase nach 40 h. Die Onlinedetektion der Wachstumsphasen

erweist sich bei der Batchkultur von Beauveria bassiana als schwierig. Der ¨

Ubergang

der lag- in die log-Phase und der ¨

Ubergang der log-Phase in die station¨are Phase er-

folgen analog der Aspergillus niger Kultur durch den Abfall des pO2-Wertes auf sein

Minimum. Der pO2-Wert erreicht jedoch schon zur Mitte der station¨aren Phase sei-

nen Maximalwert und kann so nicht zur Detektion des Phasen¨uberganges eingesetzt

werden. Als Indikator f¨ur das Ende der station¨aren Phase kann der erste Anstieg des

TOC-Wertes genutzt werden. Die Werte f¨ur die stereoselektive Hydrolyseaktivit¨at

sind in Tabelle 4.2 aufgef¨uhrt. Die Enzyme werden analog denen des Aspergillus ni-

ger erst am Ende der station¨aren Phase aktiv. Der optimale Erntezeitpunkt liegt

nach 54 h Anzucht.

4 ERGEBNISSE 36

Tabelle 4.2: Katalytische Aktivit¨at von Beauveria bassiana

Zeit BTM ee-Wert Umsatz Wachstums-

(h) (g) (Epoxid, %) (%) phase

16,5 35 - - log-

21,5 52 - - Phase

30,5 62 - 0,37

40,5 62 29 0,56 station¨are

45,5 60 21 0,68 Phase

54,5 60 50 0,51

65,5 50 1,7 0,63 Absterbe-

76,5 25 - 0,61 phase

4.1.3 Optimierung der Wachstumstemperatur

F¨ur eine wirtschaftliche Biokatalysatorgewinnung ist die Anzucht der Mikroorganis-

men unter optimalen Bedingungen entscheidend. Dabei ist die maximale Biomassen-

ausbeute bei maximaler katalytischer Aktivit¨at erw¨unscht. In Abbildung 4.3 werden

die Biotrockenmassen nach 50 h Wachstumszeit dargestellt. Daraus ergibt sich ein

Maximum bei einer Wachstumstemperatur von 31oC f¨ur Aspergillus niger und von

29oC f¨ur Beauveria bassiana.

Die katalytische Aktivit¨aten lassen sich aus dem ee-Wert der Biohydrolyse mit dem

Schimmelpilz, der bei den entsprechenden Temperaturen gewachsen ist, bewerten.

Die ee-Werte des entstehenden 1,2-Phenylethandiols sind in Tabelle 4.3 aufgef¨uhrt.

Die Enantiomeren¨ubersch¨usse in der Tabelle dienen nur der Absch¨atzung eines Trends,

da f¨ur die Biohydrolyse mit Beauveria bassiana nur sehr wenig Biomasse verwendet

werden kann. Es ist deutlich zu sehen, dass die Aktivit¨at des Beauveria bassiana,

der bei 29oC wuchs, am h¨ochsten ist. Die Biomasse, die bei anderen Temperaturen

gewachsen ist, zeigt keine signifikante Selektivit¨at. Bei dem Aspergillus niger hinge-

gen ist die Selektivit¨at bei allen Wachstumstemperaturen hoch. Ein Maximum ergibt

sich bei den Temperaturen zwischen 29oC und 31oC.

4.1.4 Zusammensetzung des N¨ahrmediums

Die Konzentrationen der N¨ahrmediumsbestandteile Glucose und Corn Steep Liquor

wurden variiert und die nach 50 h nach Animpfung gebildete Biomasse nach Mas-

4 ERGEBNISSE 37

25 26 27 28 29 30 31 32 33

Temperatur (°C)

BTM (g/L)

BTM B.bassiana (g/L) BTM A.niger (g/L)

Abbildung 4.3: Biomassen von Beauveria bassiana und Aspergillus niger bei verschie-

denen Wachstumstemperaturen

Tabelle 4.3: Hydrolyseselektivit¨at bei verschiedenen Wachstumstemperaturen

Wachstumstemperatur Beauveria bassiana Aspergillus niger

(oC) ee-Wert in % ee-Wert in %

26 - 60

27 10 61

29 26 62

31 7 62

se und Aktivit¨at bewertet. Die Biomassenkonzentrationen sind in Tabelle 4.4 auf-

gef¨uhrt. Die optimalen Konzentrationen sind 10 g/L Glucose und 25 g/L Corn Steep

Liquor f¨ur Beauveria bassiana und 30 g/L Glucose und 20 g/L Corn Steep Liquor

f¨ur Aspergillus niger. Die Aktivit¨at wird nach 2 h Reaktionszeit als ee-Wert des Sty-

4 ERGEBNISSE 38

rolepoxids und des entstehenden 1,2-Phenylethandiols gemessen. Die bestimmten

Aktivit¨aten der Biomassen sind bei allen Chargen im Rahmen der Meßgenauigkeit

gleich hoch.

Tabelle 4.4: Optimierung der N¨ahrmedienzusammensetzung

N¨ahrmedium Masse

CSL Glucose B. bassiana A. niger

g/L g/L g/L g/L

0 10 - -

10 10 0,2 1,3

15 10 0,3 1

20 10 0,4 1,3

25 10 1,5 1,1

30 10 1,0 0,6

35 10 1,0 0,6

40 10 1,0 0,6

50 10 1,0 0,6

60 10 1,0 0,6

20 0 1,1 1,3

20 5 0,3 1,2

20 10 0,4 1,3

20 15 1,3 1,4

20 20 1,3 2,3

20 30 0,2 2,7

20 40 0,7 2,4

4 ERGEBNISSE 39

4.2 Analytik

4.2.1 Extraktion der Analyten

Die analytische Erfassung der Enantiomerenkonzentrationen der Edukte und der

Produkte wird mit chiraler Hochleistungsfl¨ussigkeitschromatogrphie (HPLC) und

Gaschromatographie (GC) durchgef¨uhrt. Da die dazu eingesetzten Phasen hydro-

lyseempfindlich sind, m¨ussen die Stoffe in ein nichtw¨assriges L¨osemittel ¨uberf¨uhrt

werden. F¨ur die Quantifizierung der Extraktion wird ein reproduzierbarer Vertei-

lungskoeffizient bestimmt. Die in der Arbeit verwendeten Systeme sind in Tabelle

4.5 zusammengefasst. Die Extraktionszeit muss auf der Stufe 8 eines Laborsch¨uttlers

mindestens 10 s betragen, um eine ausreichende Reproduzierbarkeit zu gew¨ahrlei-

sten.

Tabelle 4.5: Extraktionssysteme

Analyt Extraktions- Verteilungs- Standard-

mittel koeffizient abweichung

1,2-Phenylethandiol Dichlormethan 0,257 0,003

Styrolepoxid n-Hexan 0,315 0,024

Phenylacetaldehyd n-Hexan 0,083 0,078

4.2.2 Enantiomerentrennung der Epoxide

Die Optimierung der Enantiomerentrennung auf der Gaschromatographies¨aule [Heptakis-

(6-O-butyldimethylsilyl-2,3-di-O-methyl)-β-cyclodextrin] von Prof. K¨onig (Univer-

sit¨at Hamburg) ergibt die in Tabelle 4.6 angegebenen Bedingungen. Die Signale

der einzelnen Enantiomeren sind basisliniengetrennt und ausreichend reproduzier-

bar f¨ur eine Quantifizierung. Um die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Werte zu

verbessern, wird die Injektionstemperatur variiert. Es wird ein Optimum bei einer

Injektortemperatur von 230oC gefunden, bei der die durchschnittliche Abweichung

der Signalintensit¨aten unter 5% liegt.

4 ERGEBNISSE 40

Tabelle 4.6: Enantiomerentrennung der Epoxide mittels chiraler Gaschromatographie

Analyt Retentions- Retentions- Temperatur-

zeit (R) zeit (S) programm

Styrolepoxid 8,8 min 9,6 min 90oisotherm

α-Methylstyrolepoxid 58,1 min 58,7 min 45oab 46 min 15o/min

α-Ethylstyrolepoxid 14,0 min 14,7 min 95oisotherm

Benzoxiran 32,7 min 33,8 min 82oisotherm

Epoxipropyl-isopropylether 6,5 min 6,8 min 60oisotherm

Epoxipropyl-phenylether 35,6 min 36,4 min 75oisotherm

4.2.3 Enantiomerentrennung der Diole mittels chiraler Hochleistungs-

fl¨ussigkeitschromatographie

Die Enantiomerentrennung der entstehenden Diole wird mittels chiraler HPLC durch-

gef¨uhrt. Es wird die S¨aule OB-H der Firma Daicel mit Hexan, Isopropanol und Etha-

nol als mobile Phase verwendet. Die Detektion erfolgt bei 219 nm. Die Bedingungen

f¨ur die optimierten Trennungen sind in Tabelle 4.7 aufgef¨uhrt. Die Signale der Diole

sind basisliniengetrennt und gut von einem Eduktsignal, das bei 16 min auftritt,

getrennt. Dieses Signal kann bei den Trennungsbedingungen der Diole nicht in die

einzelnen Enatiomerensignale getrennt werden und ist somit nicht f¨ur die Eduktana-

lytik geeignet.

Tabelle 4.7: Enantiomerentrennung der Diole

Analyt Retentions- Retentions- Eluent Fluss

zeit (R) zeit (S) (ml/min)

1,2-Phenylethandiol 20,3 min 25,5 min 91:9 a) 0,8

α-Methylphenylethan-1,2-diol 29,5 min 34,5 min 92:8 a) 0,75

α-Ethylphenylethan-1,2-diol 18,5 min 20,0 min 94:6 a) 0,8

Phenylpropan-1,2-diol 18,5 min 24,5 min 92:8 a) 0,75

Propyl-1,2-diol-phenylether 35,5 min 38,5 min 94:6 b) 0,75

a) Hexan:i-Propanol b) Hexan:Ethanol

4 ERGEBNISSE 41

4.3 Reaktionssystem

Die Analyse des Reaktionssystems mit Gaschromatographie und Hochleistungsfl¨ussig-

keitschromatographie zur Trennung und mit der Kernresonanzspektroskopie zur Iden-

tifikation der Substanzen ergab, dass an dem System folgende Spezies beteiligt sind:

•(R)-Styrolepoxid,

•(S)-Styrolepoxid,

•(R)-1,2-Phenylethandiol,

•(S)-1,2-Phenylethandiol,

•Phenylacetaldehyd.

Die Konzentrationen dieser Substanzen werden w¨ahrend eines Versuchansatzes auf-

genommen. Sie werden zur Aufkl¨arung des vorliegenden Reaktionssystems in folgen-

dem Kapitel diskutiert. In Abbildung 4.4 sind die chromatographischen Trennungen

der beteiligen Substanzen exemplarisch abgebildet. Es sind deutlich voneinander ba-

sisliniengetrennte Signale sichtbar. Die Signale sind in dem Konzentrationsbereich

bis 1 g/L proportional, so dass eine Kalibrierung m¨oglich ist.

4.4 Reaktionsverlauf im Detail

In Abbildung 4.5 sind die Konzentrationsverl¨aufe aller am Reaktionssystem betei-

ligten Stoffe ¨uber die Reaktionszeit aufgetragen. Hierbei wurde exemplarisch mit

Aspergillus niger gearbeitet. Die Konzentrationskurven von Beauveria bassiana zei-

gen den gleichen Verlauf, sind aber zu h¨oheren Reaktionszeiten verschoben. In der

Darstellung ist erkennbar, dass die Schwankungen innerhalb der Konzentrations-

verl¨aufe ca. 5% betragen. Das Meßverfahren zeigt somit f¨ur die Modellbildung und

Anpassung eine ausreichende Genauigkeit.

Der Enantiomeren¨uberschuß des 1,2-Phenylethandiols ist zu Beginn der Reaktion

sehr hoch und nimmt ¨uber die Reaktonszeit langsam ab. Dies ist durch eine Autohy-

drolyse des Epoxids zu erkl¨aren. Zur Beginn der Reaktion dominiert die Bildung des

(R)-1,2-Phenylethandiols durch die Biohydrolyse. W¨ahrend des Reaktionsverlaufes

4 ERGEBNISSE 42

GC-Trennung von (R)- und (S)- Styrolepoxid und Phenyacetaldehyd

HPLC-Trennung von (R)- und (S)- 1,2-Phenylethandiol

Abbildung 4.4: Chromatographische Trennung der beteiligten Komponenten

kommt das durch die unspezifische Autohydrolyse langsamer zu gleichen Teilen gebil-

dete (R)-und (S)- 1,2-Phenylethandiol hinzu. Hierdurch sinkt der Enatiomeren¨uber-

schuss des 1,2-Phenylethandiols langsam. Die Konzentration des (S)-Styrolepoxids

sinkt ab dem Versuchsstart schnell ab. Das (R)-Enantiomere hingegen wird nur durch

die Autohydrolyse oder eine langsame Nebenreaktion abgebaut, was durch die sehr

viel langsamere Konzentrationsabnahme dokumentiert wird. Der Enantiomeren¨uber-

schuss des Styrolepoxids steigt gleichm¨aßig auf ein hohes Niveau um 90%. Bei dem

durch die Folgereaktion aus dem 1,2-Phenylethandiol gebildeten Phenylacetaldeyd

steigt die Konzentration bei dem im Versuch gew¨ahlten pH-Wert von 8 nur sehr

langsam an.

Die Summenkonzentration der f¨unf Komponenten sinkt mit dem Reaktonsverlauf, da

Styrolepoxid ¨uber die Grenzfl¨ache Reaktionsmedium-Luft entweicht. Dies kann mit

Hilfe eines Flammenionisationsdetektors (FID) nachgewiesen werden. Da kein defi-

nierter Luftstrom durch den Kolbenhals str¨omt, ist eine exakte Bilanz nicht m¨oglich.

Die Konzentrationssumme sinkt nach 500 min auf 55%. Nach 24 h betr¨agt sie noch

4 ERGEBNISSE 43

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Zeit (min)

Konzentration (g/L)

100

ee-Wert (%)

c (S)-Epoxid c (R)-Epoxid c (R)-Diol c (S)-Diol

ee-Epoxid ee-Diol S (Summe,%)

Abbildung 4.5: Konzentrationsverl¨aufe aller beteiligten Stoffe bei der Biohydrolyse

mit Aspergillus niger

45% des Anfangswertes.

Die Verluste ¨uber die Gasphase k¨onnen durch ein geschlossenes Reaktionsgef¨aß mi-

nimiert werden. Da es sich bei dem Biokatalysator um rastende Zellen handelt, ist

keine Begasung notwendig. Der Reaktionsverlauf in geschlossenen Reaktionsgef¨aßen

ist in Abbildung 4.6 dargestellt. Die Summe der Konzentrationen betr¨agt nach 10

h Reaktionszeit ¨uber 90%. Das deutet darauf hin, dass in der Betrachtung keine

gravierende Senke unerkannt gebleiben ist.

Aus den Konzentrationsverl¨aufen der Einzelsubstanzen sind die in Abbildung 4.7

dargestellten Reaktionswege m¨oglich. Die enzymatische Hauptreaktion f¨uhrt zu dem

gew¨unschten Hauptprodukt (R)-1,2-Phenylethandiol und hinterl¨aßt (S)-Styrolepoxid.

Aus den beiden Styrolepoxidenatiomeren entsteht ¨uber eine statistische Autohydro-

lyse racemisches 1,2-Phenylethandiol. Ein Anhaltspunkt hierf¨ur ist die Verringerung

4 ERGEBNISSE 44

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 2 4 6 8 10

Zeit (h)

Konzentration (g/L)

100

ee-Wert (%)

c (R)-Epoxid c (S)-Epoxid c Phenylacetaldehyd

c (R )-Diol c (S)-Diol ee-Epoxid

ee-Diol Summe (%)

Abbildung 4.6: Konzentrationsverl¨aufe aller beteiligten Stoffe bei der Biohydrolyse

mit Aspergillus niger in einem geschlossenen Reaktionsgef¨aß

des Enantiomeren¨uberschusses des 1,2-Phenylethandiols. Eine Diolracemasenakti-

vit¨at der Pilze kann ebenfalls f¨ur diesen Effekt verantwortlich sein. Der nicht 99%igen

Enatiomeren¨uberschuss des Epoxids kann durch eine Racemasenaktivit¨at des Pilzes

f¨ur das Styrolepoxid hervorgerufen werden. Schließlich ist eine Folgereaktion des 1,2-

Phenylethandiol zu dem Phenylacetaldehyd und R¨uckreaktionen m¨oglich.

Im folgenden Abschnitt werden die m¨oglichen Reaktionen einzeln untersucht, um

ihre Verl¨aufe durch geeignete Versuche direkt zug¨anglich zu machen. Die Relevanz

f¨ur das Modell wird bestimmt und gegebenenfalls ihre Kinetik ermittelt.

4 ERGEBNISSE 45

(R)-Styrolepoxid

(S)-Styrolepoxid

Autohydrolyse

enzymatische

Hauptreaktion

enzymatische

Nebenreaktion

H H

(R)-Phenylethan-1,2-diol

H H

(S)-Phenylethan -1,2-diol

Weiterreaktion

Phenylacetaldehyd

Racemasen

Abbildung 4.7: Stoffspezies und m¨ogliche Reaktionen bei der Biohydrolyse mit Be-

auveria bassiana

4.4.1 Autohydrolyse

Die statistisch verlaufende Autohydrolyse l¨auft nach einem s¨aure- oder basekataly-

sierten Mechanismus ab [87]. Dabei handelt es sich um eine Reaktion pseudo erster

Ordnung bezogen auf die Styrolepoxidkonzentration (Formel 4.1 ).

∂cE(R)

∂t =−kAH ∗c(E)(4.1)

Die Kinetik dieser Umsetzung wird durch eine Reaktion ohne Biokatalysator be-

stimmt. Bei dem pH-Wert 9 liegt das Minimum der Reaktionsgeschwindigkeiten. Die

Reaktionsverl¨aufe bei verschiedenen pH-Werten sind in Abbildung 4.8 dargestellt.

Die nach der Methode der Anfangsgeschwindigkeit ermittelten kinetischen Konstan-

ten sind in Tabelle 4.8 aufgef¨uhrt.

Die deutlich messbare Autohydrolyse ist aufgrund ihrer Geschwindigkeit f¨ur eine

Modellierung des Reaktionssystems relevant.

4.4.2 Folgereaktion

Als Folgereaktion zur Autohydrolyse ist eine Eliminierung von Wasser und anschlie-

ßende Keto-Enol-Tautomerie denkbar (Abbildung 4.9) [87]. Ebenfalls m¨oglich ist

4 ERGEBNISSE 46

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 5 10 15 20 25 30

Zeit (h)

Konzentration (g/L)

pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 pH 8 pH 8,5 pH 9

Abbildung 4.8: Reaktionsverl¨aufe der Autohydrolysereaktion bei verschiedenen pH-

Werten

Tabelle 4.8: Geschwindigkeit der Autohydrolyse

pH-Wert Reaktionsgeschwindigkeitskonstante

(1/s)

6,5 −1,930 ∗10−5

7,0 −6,305 ∗10−6

7,5 −4,666 ∗10−6

8,0 −3,472 ∗10−6

8,5 −2,722 ∗10−6

9,0 −2,694 ∗10−6

auch eine anschließende Weiterreaktion des Ketons zu einem Oligomeren. Messungen

in dem Konzentrationsbereich des Reaktionsmixes ergaben weder eine signifikante

Zunahme der Phenylacetaldehyd- noch eine Abnahme der 1,2-Phenylethandiolkonzentration

4 ERGEBNISSE 47

im pH-Bereich 6,5 -9. F¨ur die Modellierung der Bohydrolyse von Styrolepoxid spielt

sie somit keine Rolle. Dieses Ergebnis kann nicht auf andere Styrolepoxidtyp-Substrate

¨ubertragen werden. Gerade die Substrate mit einem weiterem Ring weisen diese Ne-

benreaktion auf (Siehe auch Kapitel 4.9).

H H

OH -H2O

+OH

- H+

+ H+

- H+

Abbildung 4.9: Reaktionsmechanismus der Folgereaktion mit Keto-Enol-Tautomerie

4.4.3 Racemasen

Die Aktivit¨aten der Racemasen f¨ur 1,2-Phenylethandiol und Styrolepoxid konnten

nicht nachgewiesen werden. In Abbildung 4.10 sind die Reaktionsverl¨aufe bei vorge-

legtem enantiomerenreinem 1,2-Phenylethandiol dargestellt. Die Konzentration des

entsprechenden Isomeren sinkt in den 24 Stunden Reaktionszeit nicht signifikant. Ei-

ne Racemasenaktivit¨at f¨ur das 1,2-Phenylethandiol kann somit ausgeschlossen wer-

den.

Um eine Racemasenaktivit¨at f¨ur das Styrolepoxid festzustellen, wird das Enantiome-

re vorgelegt, welches von dem Pilz nicht umgesetzt wird. Bei der Bildung des kompli-

ment¨aren Epoxids liegt eine Racemasenaktivit¨at vor. Ein weiterer Anhaltspunkt ist

ein m¨oglicher Anstieg der (R)-1,2-Phenylethandiolkonzentration. Das durch Race-

masen entstehende Epoxid wird durch die Epoxidhydrolyse enantioselektiv ge¨offnet.

Der Reaktionsverlauf mit (S)-Styrolepoxid und Aspergillus niger ist in Abbildung

4.11 dargestellt. Die Diolbildung ist racemisch und es findet keine signifikante (S)-

Styrolepoxidbildung statt. Somit ist keine Epoxidracemasenaktivit¨at feststellbar. Die

Reaktion mit Beauveria bassiana unter Vorlage von (R)-Styrolepoxid liefert die glei-

chen Erkenntnisse.

4 ERGEBNISSE 48

B. bassiana (R)-Diol

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 5 10 15 20 25

Zeit (h)

Konzentration (g(/L)

c (R)-Epoxid c (S)-Epoxid c Aldehyd c Summe. c (R)-Diol c (S)-Diol

A. niger (S)-Diol

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25

Zeit (h)

Konzentration (g(/L)

c (R)-Epoxid c (S)-Epoxid c Aldehyd c Summe. c (R)-Diol c (S)-Diol

B. bassiana (S)-Diol

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 5 10 15 20 25

Zeit (h)

Konzentration (g(/L)

c (R)-Epoxid c (S)-Epoxid c Aldehyd c Summe. c (R)-Diol c (S)-Diol

A. niger (R)-Diol

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 5 10 15 20 25

Zeit (h)

Konzentration (g(/L)

c (R)-Epoxid c (S)-Epoxid c Aldehyd c Summe. c (R)-Diol c (S)-Diol

Abbildung 4.10: Konzentrationsverl¨aufe mit enantiomerenrein vorgelegten 1,2-

Phenylethandiolen zur Untersuchung auf Diol-Racemasenaktivit¨at

4 ERGEBNISSE 49

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25

Zeit (h)

Konzentration (g(/L)

c (R)-Epoxid c (S)-Epoxid c Aldehyd c Summe c (R)-Diol c (S)-Diol

Abbildung 4.11: Konzentrationsverl¨aufe einer Reaktion mit Aspergillus niger und

(S)-Styrolepoxid zur Untersuchung der Epoxid-Racemasenaktivit¨at

4.4.4 Enzymatische Hauptreaktion

Die enzymatische Hauptreaktion kann experimentell nicht getrennt von den oben

genannten Reaktionen erfasst werden. Das Reaktionsgeschwindigkeitsgesetz und die

dazugeh¨origen Konstanten k¨onnen nur durch Anpassung verschiedener Gesetze unter

Ber¨ucksichtigung der bereits erfassten Kinetiken ermittelt werden.

4.4.5 Enzymatische Nebenreaktion

Die Aussagen ¨uber eine m¨ogliche enzymatische Nebenreaktion k¨onnen nur ¨uber eine

Gesamtstoffbilanz der Reaktion oder durch eine Reaktion mit dem entsprechenden

reinen Enantiomeren getroffen werden. Bei der Reaktion des (S)-Styrolepoxid mit

Aspergillus niger als Katalysator wurde der in Abbildung 4.11 dargestellte Verlauf ge-

funden. Darin ist kein signifikanter Anstieg der (R)-1,2-Phenylethandiolkonzentration,

4 ERGEBNISSE 50

wie bei einer enzymatischen Nebenreaktion zu erwarten w¨are, erkennbar. Daraus

folgt, dass eine solche Nebenreaktion f¨ur das Modell nicht signifikant ist.

4.4.6 Enzymatische R¨uckreaktion

Die Reversibilit¨at der enzymatischen Reaktion wird durch Vorlage des 1,2-Phenylethandiols

und Messung der Styrolepoxidkonzentration ermittelt. Auch nach einer 30-st¨undi-

gen Reaktionszeit bei einer Ausgangskonzentration von 1g/L rac-1,2-Phenylethandiol

konnte keine Styrolepoxidbildung festgestellt werden. Dieses Verhalten ist in Abbil-

dung 4.12 dargestellt. Die enzymatische Reaktion im gegebenen Konzentrationsbe-

reich kann demzufolge f¨ur das Modell als irreversibel angenommen werden.

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 5 10 15 20 25 30 35

Zeit (h)

Konzentration (g/L)

c (R)-Styrolepoxid c (S)-Styrolepoxid c (R)-Diol c (S)-Diol

Abbildung 4.12: Konzentrationsverl¨aufe bei der enzymatischen R¨uckreaktion

4 ERGEBNISSE 51

4.4.7 Inhibition

M¨ogliche Inhibitionen der Reaktion durch das Produkt wurden durch Vorlage des

rac-1,2-Phenylethandiols untersucht. Das 1,2-Phenylethandiol wurde in der maximal

zu erwartenden Produktkonzentration (1 g/l) und doppelt konzentriert eingesetzt.

Wie in Abbildung 4.13 zu sehen ist, liegt dabei keine signifikante Produkthemmung

vor.

100

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Zeit (h)

ee Wert (%)

ohne Diol 1g/L Diol 2g/L Diol

Abbildung 4.13: Inhibition der Biohydrolyse durch 1,2-Phenylethandiol

Eine m¨ogliche Hemmung der Biohydrolyse durch Phenylacetaldehyd wird ebenfalls

durch Vorlage der Substanz untersucht. Die Verl¨aufe der Enantiomeren¨ubersch¨usse

des Styrolepoxids sind in Abbildung 4.14 dargestellt. Bei beiden Pilzen ist keine

signifikante Hemmung in dem Konzentrationsbereich bis 20 µg/L Phenylacetaldehyd,

das der maximal zu erwartenden Nebenproduktkonzentration entspricht, feststellbar.

4 ERGEBNISSE 52

100

0 5 10 15 20 25

Zeit (h)

ee-Wert (%)

B.bassiana / Ref. B.bassiana Phenylacetaldehyd

A.niger / Ref. A.niger Phenylacetaldehyd

Abbildung 4.14: Inhibition der Biohydrolyse durch Phenylacetaldehyd

4.4.8 Das Reaktionssystem f¨ur die Modellierung

Durch die zuvor beschriebene Bestimmung der Einzelreaktionen wird f¨ur die Modell-

bildung das in Abbildung 4.15 dargestellte Reaktionssystem eingesetzt.

4 ERGEBNISSE 53

(S)-Styrolepoxid

(R)-Styrolepoxid

Autohydrolyse

enzymatische

Hauptreaktion

H H

(R)-Phenylethan-1,2-diol

(S)-Phenylethan -1,2-diol

Abbildung 4.15: Experimentell erfasstes Reaktionssystem

4.5 Reaktion mit suspendiertem Pilz

4.5.1 Wahl des optimalen Reaktionsmediums

Zur Optimierung der Reaktionsbedingungen wurden folgende Reaktionsl¨osungen ver-

glichen:

•VE-Wasser, Na-Phosphatpuffer

•Ringer L¨osung als Minimalmedium mit Na-Phosphatpuffer

•Na- und K-Phosphatpuffer

•Verschiedene Konzentrationen des Na-Puffers

Bei dem Vergleich der Reaktionsverl¨aufe im Na- und K-Phosphatpuffer bei einer

Konzentration von 0,1 mol/L kann kein signifikanter Unterschied festgestellt werden.

Die Wahl des Puffers kann hier nach reinen Kostenkriterien erfolgen.

Der Vergleich der Reaktionen in VE-Wasser und Ringer L¨osung mit Na-Phosphatpuffer

ergab eine deutliche Reaktionsverlangsamung. Das N¨ahrsalzangebot durch die Rin-

gerl¨osung wird von dem Pilz in der station¨aren Phase nicht durch eine h¨ohere Reak-

tionsgeschwindigkeit honoriert. Den geringsten Umsatz erh¨alt man bei dem Versuch

mit VE-Wasser, wie man in Abbildung 4.16 f¨ur Aspergillus niger sehen kann. Somit

ist eine Pufferung des Reaktionsmediums notwendig.

4 ERGEBNISSE 54

Die Pufferkonzentration ist wichtig f¨ur die Kapazit¨at des Puffers und die osmoti-

sche Umgebung der Pilzzellen. Die Variation der Pufferkonzentration ergab, dass die

optimale Konzentration 0,1 mol/L K-Phosphatpuffer betr¨agt. Der pH-Wert dieser

L¨osung bleibt w¨ahrend der gesamten Reaktionszeit konstant. Bis zu einer Konzen-

tration von 0,05 mol/L ist keine verl¨aßliche Pufferung des Mediums gew¨ahrleistet.

Eine Erh¨ohung der Pufferkonzentration ¨uber 0,1 mol/L verschlechtert die Reakti-

onsgeschwindigkeit wieder.

F¨ur Beauveria bassiana ergeben sich vergleichbare Effekte.

100

0 10 20 30 40 50 60 70

Zeit (min)

ee-Wert (Styrolepoxid, %)

0,1 mol 0,5 mol 0,25 mol Ringer Lösung Dest. Wasser

Abbildung 4.16: Variation der Pufferkonzentration bei der Biohydrolyse

4.5.2 Reaktionsverlauf mit gefriergetrocknetem Pilz

F¨ur die Flexibilisierung der Reaktionsdurchf¨uhrung ist eine stabile Lagerung des

Biokatalysators von Vorteil. Die Lagerung von gefriergetrocknetem Pilz ist hierzu

4 ERGEBNISSE 55

ein g¨angiger Ansatz [14]. In Abbildung 4.17 ist eine Reaktion von freiem Pilz mit ei-

ner Reaktion der gleichen Menge Pilz, der gefriergetrocknet wurde, verglichen. Beide

Reaktionen verlaufen mit dem Pilz Aspergillus niger im Rahmen der Meßgenauig-

keit gleich schnell. Bei Beauveria bassiana l¨aßt die Biohydrolyseaktivit¨at nach der

Gefriertrocknung nach. Zur Gefriertrocknung muss der Pilz zuvor mit Schutzstof-

fen behandelt werden, damit die Proteinausstattung intakt bleibt. Es wurde mit

Glycerin (10%ig) und Magermilch gearbeitet. Beide Stoffe sch¨utzen die Pilzzellen

w¨ahrend der Gefriertrocknung vor der Denaturierung der Proteine [10]. Als Anti-

oxidant wird Na-L-Ascorbat in einer Konzentration von 0,5 % hinzugegeben. Die

100

0 5 10 15 20 25

Zeit (h)

ee-Wert (%)

ee-Epoxid A.niger, roh ee-Diol A.niger, roh

ee-Epoxid A.niger, gefriergetrocknet ee-Diol A.niger, gefriergetrocknet

Abbildung 4.17: Vergleich der Reaktion mit frischem und gefriergetrocknetem Pilz

Ergebnisse der Reaktion mit gefriergetrocknetem Pilz und Zuschlagsstoffen nach 6 h

Reaktionszeit sind in Tabelle 4.9 angegeben. Bei dem Pilz Beauveria bassiana zeigen

die Zubereitungen geringere Aktivit¨aten als der herk¨ommlich gefriergetrocknete Pilz.

Mit Aspergillus niger hingegen bleibt in der Zubereitung mit 20% Milchpulver und

0,5 % Ascorbins¨aure die hydrolytische Aktivit¨at vollst¨andig erhalten.

4 ERGEBNISSE 56

Tabelle 4.9: Enantiomeren¨uberschuss der Gefriertrocknungszubereitungen nach 6 h

Reaktionszeit

Zuschl¨age B.bassiana A.niger

ee-Wert Styrolepoxid

Referenz 68 % 45 %

Referenz, gefroren 23 % 12 %

10% Glycerin 23 % 12 %

10%Glycerin, 0,5%Ascorbins¨aure 11 % 17 %

20% Milchpulver 36 % 25 %

20% Milchpulver, 0,5%Ascorbins¨aure 40 % 100 %

10%Glycerin, 20% Milchpulver, 0,5%Ascorbins¨aure 29 % 32 %

Massenanteil zu der Zellsuspension, 1 h Einwirkzeit

Die Abbildung 4.18 zeigt den ee-Wert des Styrolepoxids nach einer Stunde Reaktion

der Ans¨atze mit unterschiedlich lange bei 5oC gelagertem gefriergetrocknetem Pilz.

Die Aktivit¨at liegt nach 15 Tagen sowohl bei Aspergillus niger als auch bei Beau-

veria bassiana auf gleichbleibend hohem Niveau. Die Meßwerte weisen eine relativ

hohe Schwankung auf, da nur mit einem geringen Reaktionsvolumen gearbeitet wer-

den kann. Der Enantiomeren¨uberschuss des entstehenden 1,2-Phenylethandiols ist

ebenfalls gleichm¨aßig hoch (nach 1 h Reaktionszeit bei allen Versuchen 80 %). Die

Lagerung des gefriergetrockneten Pilzes ist unter diesen Bedingungen f¨ur 10 Tage

unter Beibehaltung der katalytischen Aktivit¨at m¨oglich.

4.5.3 Reaktion unter O2-Atmosph¨are

Der Einfluss der Sauerstoffkonzentration in der Gasatmosph¨are auf die Biohydroly-

se wurde ebenfalls untersucht. Die Reaktionsgeschwindigkeit in einem geschlossenen

Beh¨alter wird mit der in einem Beh¨alter, der mit O2beaufschlagt wird, verglichen.

Die Verl¨aufe der Enantiomeren¨ubersch¨usse des Styrolepoxids sind in Abbildung 4.19

dargestellt, wo ein deutlich schnellerer Anstieg des ee-Wertes feststellbar ist. Die

Pilze befinden sich zwar am Ende der station¨aren Phase mit einem deutlich einge-

schr¨ankten und auf Zellerhalt eingestelltem Metabolismus [70], eine Erh¨ohung des

Sauerstoffgehaltes erh¨oht trotzdem ihre katalytische Aktivit¨at.

4 ERGEBNISSE 57

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Zeit (t)

ee-Wert (%)

A.niger B.bassiana

Abbildung 4.18: Aktivit¨at des gefriergetrockneten Pilzes nach Lagerung

4.6 Reaktion in organischen L¨osemittelsystemen

4.6.1 Wahl der geeigneten L¨osemittel

Um die L¨oslichkeit der Edukte zu erh¨ohen und gegebenenfalls die Autohydrolyse

durch Verringerung der Wasserkonzentration zu minimieren, wird ein geeignetes Co-

solvens gesucht. Kriterien hierbei sind eine m¨oglichst niedrige Verringerung der Hy-

drolyseaktivit¨at der Biokatalysatoren, gutes L¨osungsverm¨ogen f¨ur die Epoxide und

eine geringe Nucleophilie. Aliphatische L¨osemittel, die zwei letzten Anforderungen

sehr gut erf¨ullen, scheiden aus, da sie die Aktivit¨at der Epoxidhydrolasen vollst¨andig

auf reduzieren. Vermutlich zerst¨oren lipophile L¨osemittel die f¨ur die Enzyme wichti-

gen Membranen. Diese Eigenschaft wird in der Analytik zum Abbruch der Reaktion

w¨ahrend der Probenahme genutzt. F¨ur biokatalytische Reaktionen werden h¨aufig

wasser¨ahnliche L¨osemittel, wie Dimethylsulfoxyd und Dimethylformamid, als Cosol-

4 ERGEBNISSE 58

012345678

Zeit (h)

ee-Wert (%)

B. bassiana / Ref. B. bassiana O_2 A. niger / Ref. A. niger O_2

Abbildung 4.19: Vergleich des Enantiomeren¨uberschusses von Styrolepoxid in einer

Reaktion mit Luft und Sauerstoffatmosph¨are

ventien genutzt [25]. In Abbildung 4.20 werden Reaktionsverl¨aufe mit unterschiedli-

chen L¨osemitteln gezeigt.

Die Reaktion mit Aspergillus niger als Katalysator f¨uhrt mit Aceton und DMSO in ei-

ner Versuchszeit von 24 h zu hohen ee-Werten. Die L¨osemittel Dioxan und t-Butanol

ergeben mittlere Enantiomeren¨ubersch¨usse, die bei den anderen untersuchten L¨ose-

mitteln unter der 50%-Grenze verbleiben. Bei Beauveria bassiana hingegen ergeben

nur DMSO und Aceton geringe Enatiomeren¨ubersch¨usse bei 20% L¨osemittelanteil.

Die anderen L¨osemittel unterdr¨ucken hingegen die Reaktion.

4 ERGEBNISSE 59

100

0 5 10 15 20 25 30

Zeit (h)

ee-Wert (%)

Puffer, A.niger DMSO, A.niger DMF, A.niger Dioxan, A.niger

THF, A.niger T-Butanol, A.niger Aceton, A.niger Ethanol, A.niger

Abbildung 4.20: Biohydrolyse mit A.niger in 20% des angegebenen L¨osemittels als

Cosolvens

Tabelle 4.10: ee-Werte der Biohydrolyse nach 11 h Reaktionszeit und 20% Cosolvens

A.niger B.bassiana

Cosolvens ee-Werte ee-Werte ee-Werte ee-Werte

20% Epoxid Diol Epoxid Diol

Wasser 82% 73% 66% 68%

Aceton 80% 72% 10% 55%

DMSO 74% 73% 14% 61%

t-Butanol 53% 68% 8% 26%

DMF 51% 68% 3% 12%

THF 42% 63% 2% 5%

Dioxan 37% 66% 2% 58%

Ethanol 32% 61% 2% 30%

4 ERGEBNISSE 60

4.6.2 Wahl des Konzentrationsbereiches der L¨osemittel

Die Konzentration der interessanten Cosolventien wird variiert. Die dabei auftre-

tenden Enantiomeren¨ubersch¨usse sind in Tabelle 4.11 zusammengefasst. Bei der Re-

aktion mit Aspergillus niger als Katalysator ist die Verwendung von 10% DMSO

(E-Wert 48) und Aceton (E-Wert 35) am g¨unstigsten. Die Reaktion wird durch die

L¨osemittelzugabe jedoch stark verlangsamt. Nach 9 Stunden ergibt sich ein Umsatz

von nur 0,44 bzw. 0,35.

Bei dem Pilz Beauveria bassiana ergibt sich mit 10% Aceton im Reaktionsgemisch ein

E-Wert von 45. Es wird ebenfalls ein Umsatz von 0,45 nach 9 Stunden erreicht. 10%

Dioxan ergeben einen E-Wert von 56 bei einem Umsatz von 0,48. F¨ur ein System mit

beiden Biokatalysatoren ist Aceton mit einer Konzentration von 10% das Cosolvens

der Wahl. Die Reaktion wird allerdings verlangsamt, was eine Aufkonzentrierung des

Katalysators notwendig macht.

4.6.3 Konzentrationssteigerung des Eduktes

In Tabelle 4.12 werden L¨oslichkeiten von Styrolepoxid in verschiedenen L¨osemittel-

gemischen aufgef¨uhrt. Im Gegensatz zu einer L¨oslichkeit von 1 g/L in reinem Wasser

l¨aßt sich die Eduktkonzentration mit einem L¨osemittelgemisch steigern. Als Preis

daf¨ur erh¨alt man aber eine geringere Aktivit¨at des Biokatalysators.

In Tabelle 4.13 werden die gemessenen Reaktionsgeschwindigkeiten bei Eduktsteige-

rungen aufgetragen. Auch hier wird deutlich, dass eine Aufkonzentrierung des Ka-

talysators die Reaktion in diesen Medien erst in einen interessanten Bereich brin-

gen kann. Da die Geschwindigkeit der Autohydrolyse von der Katalysatormenge un-

abh¨angig ist, k¨onnen so das Verh¨altnis Nebenreaktion zu Hauptreaktion zu g¨unstige-

ren Werten ver¨andert und der Enantiomeren¨uberschuss des Diols deutlich gesteigert

werden.

4 ERGEBNISSE 61

Tabelle 4.11: ee-Wert nach 9 h bei einer Biohydrolyse mit verschiedenen Cosolvensan-

Pilz Cosolvens Anteil ee-Wert ee-Wert E-Wert

Epoxid Diol

A.niger Aceton 5 % 66 % 87 % 29

Aceton 10 % 53 % 91 % 35

Aceton 20 % 71 % 74 % 15

Aceton 30 % 7 % 80 % 10

A.niger DMSO 5 % 72 % 84 % 25

DMSO 10 % 72 % 91 % 48

DMSO 20 % 66 % 71 % 11

DMSO 30 % 40 % 94 % 44

A.niger DMF 5 % 35 % 71 % 8

DMF 10 % 19 % 70 % 7

DMF 20 % 41 % 71 % 8

DMF 30 % 5 % - -

B.bassiana Aceton 5 % 51 % 58 % 7

Aceton 10 % 45 % 93 % 45

Aceton 20 % 10 % 54 % 5

Aceton 30 % 2 % 35 % 3

B.bassiana Dioxan 5 % 10 % 84 % 9

Dioxan 10 % 85 % 91 % 56

Dioxan 20 % 2 % 49 % 3

Dioxan 30 % 5 % 70 % 5

Tabelle 4.12: L¨oslichkeit von Styrolepoxid in L¨osemittelgemischen

L¨osemittel 5 % 10 % 20 %

Aceton 2,0 g/L 3,0 g/L 4,0g/L

Dioxan 2,2 g/L 3,0 g/L 4,0 g/L

DMSO 2,4 g/L 3,1 g/L 4,0 g/L

4.7 Aufschluss der Pilzzellen

Verschiedene Aufschluß- und Zellwandperforationsverfahren wurden f¨ur die unter-

suchten Pilze ausprobiert und anschließend ein Aktivit¨atstest f¨ur die Epoxidhydro-

lyse durchgef¨uhrt. Die Vitalit¨at des Aufschlusses wird durch Auftragung auf eine

Agarplatte und Inkubation ¨uber 3 Tage bestimmt. Das Ziel dieser Versuche ist einen

4 ERGEBNISSE 62

Tabelle 4.13: ee-Wert der Biohydrolysen mit verschiedenen Eduktkonzentrationen

nach 8 h

Pilz Cosolvens Konzentration ee-Wert ee-Wert E-Wert

Styrolepoxid Epoxid Diol

A.niger Aceton 1 g/L 48 % 74 % 6

Aceton 5 g/L 29 % 64 % 6

Aceton 10 g/L - % 36 % -

A.niger DMSO 1 g/L 75 % 85 % 28

DMSO 5 g/L 72 % 76 % 15

DMSO 10 g/L - % 39 % -

B.bassiana Dioxan 1 g/L 33 % 98% 1,3

Dioxan 5 g/L 8 % 37 % 1,8

Dioxan 10 g/L - % - % -

m¨oglichst vollst¨andigen Zellaufschluss mit einer hohen Epoxidhydrolyseaktivit¨at zu

erhalten. In Tabelle 4.14 sind die dabei ermittelten Ergebnisse zusammengefasst.

Tabelle 4.14: Aufschlussverfahren mit den resultierenden Aktivit¨aten und Vitalit¨aten

Aspergillus Beauveria

niger bassiana

Aufschlussverfahren Hydolyse- Vitalit¨at Hydolyse- Vitalit¨at

aktivit¨at aktivit¨at

% %

Gefriertrocknung 100 hoch 50 hoch

Acetonaufschluss 0 nicht vorh. 0 nicht vorh.

Butylacetataufschluss 0 nicht vorh. 0 nicht vorh

Zelldisruptor 40 halbiert 40 halbiert

Ultraschall 70 hoch 75 hoch

Lipaseaufschluss 100 hoch 100 hoch

Mit den hier verwendeten Aufschlussverfahren lassen sich Pilzzellen nicht unter Bei-

behaltung der hohen Epoxidhydrolaseaktivit¨at aufschließen. Bei dem mechanischen

Verfahren wird ein Teil der Zellen zerscheert, der Rest gut verteilt. Es verbleibt eine

Hydrolaseaktivit¨at, die aber von den erhaltenen Zellen herr¨uhren kann. Auch eine

Verl¨angerung der Aufschlußzeit ver¨andert das Bild nicht. Nach den L¨osemittelauf-

schl¨ussen sind die Pilzzellen nicht mehr vital, aber die Hydrolyseaktivit¨at ist verloren

gegangen. Ein vollst¨andiger Aufschluss ist auch mit dem Ultraschallaufschluss nicht

4 ERGEBNISSE 63

m¨oglich. Hier f¨uhrt der Aufschluss einer sehr verd¨unnten L¨osung und anschließende

Aufkonzentration durch Umkehrosmose auch nicht zu einer aktiven Fraktion. Die Vi-

talit¨at der Pilzzellen wurde auch durch den Aufschluss mit Lipasen nicht ver¨andert.

Die verwendeten Aufschlussverfahren haben sich bei anderen Problemen bew¨ahrt

[9]. Bakterien und Hefezellen wurden damit erfolgreich unter Beibehaltung ihrer Ak-

tivit¨aten aufgeschlossen. Da die Zellwand der Schimmelpilze eine andere chemische

Zusammensetzung und somit auch andere mechanische Eigenschaften aufweist, tre-

ten beim Aufschluss dieser Zellen zus¨atzliche Schwierigkeiten auf. Die Beibehaltung

der Hydrolaseaktivit¨at stellt bei den rabiateren Verfahren ein zus¨atzliches Problem

dar. Der Einsatz von Proteaseinhibitoren zur Verhinderung des Abbaus der Epoxid-

hydrolasen durch eventuell vorhandene zelleigene Proteasen, f¨uhrt zu dem Effekt,

dass die Epoxidhydrolasen ebenfalls vollst¨andig duch die Inhibitoren gehemmt wer-

den. Die Hinzugabe von Proteaseinhibitoren sowohl zu dem ganzen Zellsystem als

auch zu den Zellaufschl¨ussen resultiert in einem vollst¨andigen Verlust der Epoxidhy-

drolaseaktivit¨at.

Zur Stabilisierung und Vernetzung der Proteine k¨onnen verschiedene Stoffe dem Auf-

schlusspuffer hinzugegeben werden. Die Salzkonzentration spielt dabei eine wichtige

Rolle. Weiterhin k¨onnen Paraffin und Glycerin membrangebundene Proteine stabi-

lisieren w¨ahrend Glutardialdehyd h¨aufig in der ist, Lage Proteine zu vernetzten. In

Tabelle 4.15 werden die Auswirkungen der

Zuschlagsstoffe auf eine Reaktion mit einem mechanisch aufgeschlossenen Pilz be-

wertet. Hierzu wird die relative Hydrolyseaktivit¨at mit einer ohne Zuschlagstoffen

aufgeschlossenen Referenzreaktion verglichen.

Glycerin und Paraffin als Zuschlagsstoffe hemmen die Reaktion nicht, genau wie

Glucose, die keinen Einfluß auf die Reaktion zeigt. Glutardialdehyd hemmt die Re-

aktion ebenfalls nicht, so dass eine Vernetzung einer angereicherten Enzymfraktion

so m¨oglich ist. Bei einer Natriumchloridkonzentration von 10 g/L ist eine Reaktions-

beschleunigung von 20% zu beobachten und demzufolge sollte der optimierte Auf-

schlusspuffer diese Salzkonzentration aufweisen. Die aussichtsreichen Aufschlussver-

fahren (Aktivit¨at bei verbleibender Vitalit¨at) wurden miteinander kombiniert. Die

Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 4.16 zusammengefasst.

Bei den Kombinationen der Aufschlussverfahren wird keine brauchbare Kombinati-

on aus einer geringen Vitalit¨at bei hoher Aktivit¨at erreicht. Mit den hier verwende-

4 ERGEBNISSE 64

Tabelle 4.15: Zuschlagsstoffe zu einem mechanischen Aufschluss und ee-Werte nach

8 h Biohydrolyse

Aspergillus

niger

Zuschlagsstoff Hydolyseaktivit¨at

ee-Wert

Epoxid

ohne Zuschlag 52

1g/L NaCl 53

5g/L NaCl 69

10g/L NaCl 61

15g/L NaCl 54

1g/L Glucose 73

Glycerin 51

Paraffin 53

Glutardialdehyd 50

Tabelle 4.16: Kombinationen aussichtsreicher Aufschlussverfahren mit den resultie-

renden Aktivit¨aten und Vitalit¨aten

Aspergillus Beauveria

niger bassiana

Aufschlussverfahren Hydolyse- Vitalit¨at Hydolyse- Vitalit¨at

aktivit¨at aktivit¨at

Gefriertrocknung 70% hoch - nicht vorhanden

und Ultraschall

Gefriertrocknung 69% gering - nicht vorhanden

und Acetonaufschluss

Gefriertrocknung 38% mittel - nicht vorhanden

und Ultraschall

ten Methoden ist kein einfacher, technisch verwendbarer Aufschluss der Pilzzellen

m¨oglich. Demzufolge muss hier ein aufwendiges Laborverfahren eingesetzt werden.

4 ERGEBNISSE 65

4.8 Immobilisierung der Biokatalysatoren

4.8.1 Reaktion mit PVA verkapselten Mikroorganismen

Ein Einschluss von ganzen Zellen von Beauveria bassiana in Polyvinylalkohol ist

unter Beibehaltung der Hydrolyseaktivit¨at m¨oglich. Aspergillus niger hingegen ver-

liert die stereoselektive Hydrolyseaktivit¨at vollst¨andig. Der hierf¨ur zust¨andige Be-

arbeitungsschritt konnte durch schrittweise Durchf¨uhrung und anschließenden Akti-

vit¨atstest nicht identifiziert werden.

100

0 100 200 300 400 500

Zeit (min)

ee-Wert (%)

freier Pilz Pilz immobilisiert in Lentikats

Abbildung 4.21: Reaktionsverlauf mit freiem und immobilisiertem Beauveria bassia-

Die PVA-Kapsel stellt eine Diffusionsbarriere dar, die vom Edukt und Produkt ¨uber-

wunden werden muß. Durch diesen zeitintensiven Schritt kommt es zu einer Ver-

langsamung der Gesamtreaktionsgeschwindigkeit, die in Abbildung 4.22 dargestellt

ist. Hierdurch steigt die Konzentration des Nebenproduktes (S)-1,2-Phenylethandiol

4 ERGEBNISSE 66

durch die Autohydrolyse des Eduktes st¨arker als bei einer Reaktion mit freien Pilz-

zellen. Der Enantiomeren¨uberschuss des Produktes ist geringer, was auch aus der

Abbildung 4.22 hervorgeht.

100

0 100 200 300 400 500

Zeit (min)

ee-Wert (%)

1.Reaktion 2.Reaktion 3.Reaktion 4.Reaktion

Abbildung 4.22: ee-Werte des 1,2-Phenylethandiols bei der Biohydrolyse mit Lenti-

Kats unter Wiederverwendung des Immobilisates

4.8.2 Wiederverwendung der PVA-Kapseln

Die durch Filtration vollst¨andig zur¨uckgewonnen PVA-Kapseln behalten eine Hy-

drolyseaktivit¨at bei, die jedoch mit der Zeit abnimmt. Die Verl¨aufe der Enantiome-

ren¨ubersch¨usse des Eduktes sind in Abbildung 4.23 f¨ur Reaktionen am Herstellungs-

tag, nach einem Tag, sowie nach 5 und 6 Tagen aufgetragen. Nach dem 5.Tag ist

eine deutliche Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit feststellbar.Die Selektivit¨at

nimmt im weiteren Verlauf zus¨atzlich ab und liegt nach 6 Tagen bei einer Reaktions-

zeit von 500 min unter 60%. Der Enantiomeren¨uberschuss des 1,2-Phenylethandiol

4 ERGEBNISSE 67

zeigt den typischen Verlauf mit einem hohen Wert von ¨uber 95 %, der ¨uber die Reak-

tionszeit auf ca. 90 % abnimmt. Mit steigender Umlaufzahl ist eine leichte Abnahme

feststellbar, die aber im Rahmen der Meßgenauigkeit liegt.

100

0 100 200 300 400 500

Zeit (min)

ee-Wert (%)

frische LentiKats 1 Tag alt 5 Tage alt 6 Tage alt

Abbildung 4.23: Enantiomeren¨ubersch¨usse von Styrolepoxid mit wiederverwendeten

LentiKats

4.8.3 Bestimmung des Diffusionskoeffizienten in den PVA-Immobilisaten

Zur Festlegung des Diffusionsmechanismus muss entschieden werden, ob Porendiffu-

sion oder ein L¨osungs-Diffusionsmechanismus vorliegt. Hierzu wurde das PVA auf das

Vorliegen einer Porenstruktur untersucht. In der REM Aufnahme konnte bis zu ei-

ner Vergr¨oßerung von 100000 keine Oberfl¨achenstruktur mit Porenm¨undern erkannt

werden (Abbildung 4.24). Bei st¨arkeren Vergr¨oßerungen (Beschleunigungsspannung

von ¨uber 3 kV) wird die Oberfl¨ache durch den Beschuß mit Elektronen besch¨adigt

und quillt blumenkohlartig auf.

4 ERGEBNISSE 68

Abbildung 4.24: REM Aufnahme der Oberfl¨ache eines LentiKats

Um in dem Bereich von 100 bis 2 nm Poren nachzuweisen bzw. auszuschließen, wur-

de das Verfahren der Thermoporometrie verwendet. Hierbei wird die Energiemenge

und die Temperatur gemessen, die f¨ur einen fl¨ussig-fest Phasen¨ubergang von Was-

ser in dem Material gebraucht wird. Bei dem Vorhandensein der Poren sinkt die

Schmelztemperatur von Wasser unter 0oC. Die Signalbreite und die Schmelztempe-

ratur sind von dem Porendurchmesser und der Porenverteilung abh¨angig [69]. Mit

diesem Verfahren konnte ebenfalls keine Porenstruktur nachgewiesen werden. F¨ur

das Modell wird daher ein L¨osungs-Diffusionsansatz verwendet. Die Difffusion in

den PVA-Immobilisaten wurde durch Messungen des Stofftransportes durch einen

PVA-Film angen¨ahert.

Die Konzentrationsverl¨aufe f¨ur die turbulent durchmischten Bulk- und Permeatpha-

sen sind in Abbildung 4.25 aufgetragen. Zur Auswertung der Konzentrationsverl¨aufe

in den beiden Phasen wurde das 1. Ficksche Gesetz (Formel 4.2)

J=−D∂xc(4.2)

4 ERGEBNISSE 69

f¨ur die station¨are Diffusion zwischen zwei geschlossenen Halbr¨aumen gel¨ost (Anhang

2) und die Konzentrationen der Bulkphase entsprechend der Geradengleichung 4.3

aufgetragen.

ln(1 −cp(t)

c∞

) = −αt (4.3)

Der Diffusionskoeffizient l¨asst sich aus der Steigung der Geraden bestimmen.

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 20 40 60 80 100

Zeit (h)

Konzentration (g/L)

-3

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

(1-(cp(t)/cuo))

Abgabe (R) Aufnahme (R) Formel 4.3

Abbildung 4.25: Konzentrationsverl¨aufe von 1,2-Phenylethandiol in der Bulk- und

Permeatphase und die logarithmische Darstellung der Permeatphase nach Gleichung

4.3

F¨ur Glucose und Styrolepoxid ergeben sich vergleichbare Verl¨aufe. Die bestimmten

Diffusionskoeffizienten in dem Polyvinylalkohol sind in Tabelle 4.17 angegeben.

Der Vergleich der Diffusionskoeffizienten mit Werten f¨ur Glucose im Wasser ergibt,

dass die Diffusion in PVA um eine Gr¨oßenordnung langsamer verl¨auft. Dies ist ein

plausibles Ergebnis, da das PVA eine Matrix um das Wasser erzeugt, die die Mobilit¨at

des gel¨osten Stoffes verringert.

4 ERGEBNISSE 70

Tabelle 4.17: Gemessene Diffusionskoeffizienten

Substanz Diffusionskoeffizient ( m2/s) Lit:

1,2-Phenylethandiol 5,897∗10−10 -

Styrolepoxid 5,897∗10−10 -

Glucose 3,538∗10−10 -

Literaturdaten:

Glucose in Wasser 0,521∗10−9[5]

Na+in Wasser 1,33∗10−9[5]

Cl−in Wasser 1,78∗10−9[94]

4.9 Bewertung der Substratbreite

Um die Substratbreite der Reaktion zu untersuchen, werden an den in Abbildung 4.26

gekennzeichneten Stellen Substituenten angebracht und deren Einfluß auf die Bio-

hydrolyse untersucht. Ebenfalls werden eine Verl¨angerung der Verbindung zwischen

dem Oxiranring und dem Benzolring, Substrate mit einer Ethergruppe (Abbildung

4.27) und kondensierte Ringsysteme, wie in Abbildung 4.28 dargestellt, untersucht.

Abbildung 4.26: Styrolepoxidtypsubstrate

Durch das Hinzuf¨ugen von Substituenten an den Positionen R1-R3 wird im Vergleich

zu Styrolepoxid die Reaktionsgeschwindigkeit verringert. Die Enatiomeren¨ubersch¨usse

nach bestimmten Reaktionszeiten sind in Tabelle 2.2 aufgef¨uhrt und mit denen des

Styrolepoxids verglichen. Die Quellen der Daten sind ebenfalls aufgef¨uhrt. Bei der

Hydrolyse mit Beauveria bassiana l¨aßt sich eine Verringerung der Hydrolyseaktivit¨at

in der Reihenfolge R3> R1> R2feststellen. Die Variation des Substituenten am

Aromaten f¨uhrt zu dem Ergebnis, dass die Reaktionsgeschwindigkeit herabgesetzt

wird, aber hohe Enantiomeren¨ubersch¨usse f¨ur das Epoxid erzielt werden k¨onnen.

Bei Beauveria bassiana ergibt sich die Reihenfolge ∼CH3∼Br ∼F > CN > NO2.

In diesem Fall scheint es elektronische Gr¨unde f¨ur die Reihenfolge zu geben. CN und

NO2haben einen elektronenziehenden Effekt (+M und +I), w¨ahrend die besser hy-

4 ERGEBNISSE 71

drolysierbaren Verbindungen Substituenten mit eher elektronenlieferndem Charakter

aufweisen. Besser hydrolysiert werden auch Verbindungen mit einem elektronenrei-

cheren Aromaten. Die hohen Ums¨atze mit geringer Selektivit¨at der elektronenzie-

henden Substituenten weisen darauf hin, dass die elektronen¨armeren Aromaten das

Enzym blockieren und so die unselektive Autohydrolyse die Selektivit¨at der Gesam-

treaktion verringert. Der Unterschied im elektronischen Einfluß wird auch durch die

Biohydrolyse des Pyridinderivates dokumentiert. Bei dem in dieser Hinsicht unemp-

findlicheren Aspergillus niger verl¨auft die Reakton zu hohen Ums¨atzen bei hoher

Selektivit¨at, w¨ahrend die Reaktion mit Beauveria bassiana nicht abl¨auft.

Abbildung 4.27: Die Substrate Benzyloxiran (K1), Epoxypropyl-phenylether (K2)

und Epoyxpropyl-isopropylether (K3)

Tabelle 4.18: Enantiomeren¨ubersch¨usse von Biohydrolysen der Substrate mit

verl¨angerten Seitenketten

Substrat Mikroorganismus eeEeeDReaktionszeit

[%] [%] [h]

K1 A. niger 65 90 4

K1 B. bassiana 10 95 30

K2 A. niger 80 56 1

K2 B. bassiana 56 25 30

K3 A. niger 80 - 3

K3 B. bassiana 35 - 24

Die Verl¨angerung der Seitenkette f¨uhrt zu einem Einbruch der Hydrolyseaktivit¨at bei

Beauveria bassiana, die bei der Verl¨angerung der Seitenkette um ein Kohlenstoffa-

tom die st¨arkste Verringerung der Biohydrolyse zeigt. Nach 30 h Reaktionszeit ergibt

sich ein Enantiomeren¨uberschuss des Edukts Benzyloxirans von 10%. Die flexible-

4 ERGEBNISSE 72

ren sauerstoffverbr¨uckten Seitenketten der Substrate Epoxypropyl-phenylether (K2)

und Epoxypropyl-isopropylether (K3) f¨uhren zu einer etwas h¨oheren Selektivit¨at, die

aber weit unter der des Styrolepoxids liegt. Bei der Biohydrolyse mit Aspergillus ni-

ger sind generell h¨ohere Selektivit¨aten und Reaktionsgeschwindigkeiten feststellbar.

Die sauerstoffverbr¨uckten Seitenketten der Substrate Epoxypropyl-phenylether und

Epoxypropyl-isopropylether hindern nicht eine schnelle Biohydrolyse. Die bei der

Variation der Substituenten am Aromaten festgestellten sterischen Einfl¨usse k¨onnen

durch die Flexibilit¨at der Seitenkette offensichtlich umgangen werden. Die Verbin-

dungen K1 bis K3 markieren den ¨

Ubergang zu langkettigen Substraten, die in die

Gruppe der monosubstituierten Epoxide einzuordnen sind. F¨ur diese Substrate wer-

den typischerweise Epoxidhydrolasen aus Rotalgen verwendet. Durch sie wird die

Sonderstellung der Pilzepoxidhydrolasen unterstrichen.

Die Hydrolyse der kondensierten Ringsysteme 1,2-Indenepoxid und 1,4-Epoxy-1,2,3,4-

Tetrahydro-Naphtalin verl¨auft mit Beauveria bassiana erwartungsgem¨aß langsamer

als bei Styrolepoxid (siehe Tabelle 2.1). Die Biohydrolyse mit Aspergillus niger findet

nicht statt. Das Ringsystem ist f¨ur das Enzym offensichtlich zu starr.

Abbildung 4.28: Ringf¨ormige Substrate, 1,4-Epoxy-1,2,3,4-Tetrahydro-Naphtalin

und 1,2-Indenepoxid

5 MODELLIERUNGEN DER BIOHYDROLYSE 73

5 Modellierungen der Biohydrolyse

Die Modellierung der Biohydrolyse in dieser Arbeit gliedert sich in drei Schritte:

•Gewinnung einer geeigneten Beziehung f¨ur die Kinetik der enzymatischen Haupt-

reaktion durch Anpassung veschiedener Modellans¨atze an komplette Meßwerts¨atze,

•Hinzuf¨ugen eines Stofftransportwiderstandes eindimensional,

•¨

Ubertragung des Modells auf eine 3D-Geometrie und Modellierung einer Bat-

chreaktion mit LentiKats

Die ersten zwei Schritte werden in Matlab (R 13) aufgesetzt und berechnet. Die

Geometrie und Diskretisierung f¨ur den dritten Schritt wird mit Hilfe des Programm-

paketes Femlab durchgef¨uhrt und an Matlab ¨ubergeben, wo auch die anschließende

numerische Berechnung durchgef¨uhrt wird. Im ersten Schritt ist eine analytische

L¨osung des Modells noch m¨oglich, da es sich ausschließlich um einfache Differen-

tialgleichungen handelt. Die Behandlung des Stofftransportwiderstandes erfordert

das Aufstellen partieller Differentialgleichungen, die analytisch nicht mehr zu l¨osen

sind [96]. In Matlab wird mit dem Solver ODE 45 gearbeitet, der das gew¨ohnliche

Differentialgleichungssystem numerisch l¨ost. Zuvor werden die partiellen Differential-

gleichungen mittels der orthogonalen Translokation in ein System von gew¨ohnlichen

Differentialgleichungen zerlegt.

5.1 Reaktion mit suspendiertem Pilz

Das zu modellierende Reaktionssystem ist in Abbildung 5.1 dargestellt.

Der Bilanzraum ist eine vollst¨andig durchmischte Phase. Zus¨atzlich werden die An-

nahmen getroffen, dass es keine Konzentrationsgradienten gibt, dass der Katalysator

homogen verteilt ist und dass die Autohydrolyse und die enzymatischen Reaktionen

ablaufen. Im Bilanzraum sind keine weiteren Quellen und Senken vorhanden. Die

Bilanzen f¨ur die Stoffe ergeben sich wie folgt:

∂cER

∂t =−f(Enzymreaktion)−f(Autohydrolyse)(5.1)

∂cES

∂t =−f(Autohydrolyse)(5.2)

5 MODELLIERUNGEN DER BIOHYDROLYSE 74

(S)-Styrolepoxid

(R)-Styrolepoxid

Autohydrolyse

enzymatische

Hauptreaktion

H H

(R)-Phenylethan-1,2-diol

(S)-Phenylethan -1,2-diol

Abbildung 5.1: Das Reaktionssystem f¨ur Aspergillus niger (DSM 823)

∂cDR

∂t =f(Enzymreaktion)+f(Autohydrolyse)(5.3)

∂cDS

∂t =f(Autohydrolyse)(5.4)

Die Autohydrolyse konnte experimentell als Reaktion 1. Ordnung bezogen auf die

Epoxidkonzentration bestimmt und ihre Reaktionsgeschwindigkeitskonstante ermit-

telt werden (siehe Kapitel 4.8). Die Kinetik der Enzymreaktion hingegen muss durch

Anpassung ermittelt werden. Bei einem Ansatz mit cnbezogen auf die Styrolepoxid-

konzentration ist der Reaktionsverlauf f¨ur das Edukt f¨ur n=1 zu steil. Die Erh¨ohung

von n f¨uhrt zu einer starken Kr¨ummung der Kurve, w¨ahrend sich n kleiner 1 anpas-

sen l¨aßt, aber keine sinnvolle theoretische Deutung der Daten ergibt. Das Einsetzen

einer Michaelis-Menton-Kinetik [13] ergibt:

∂cER

∂t = 2 ∗(−k∗

AH ∗cH2O∗cER)−k∗

max ∗cEnz ∗cER

kd+cER

(5.5)

∂cES

∂t = 2 ∗(−k∗

AH ∗cH2O∗cES) (5.6)

∂cDR

∂t =k∗

AH ∗cH2O∗cER +k∗

AH ∗cH2O∗cES +k∗

max ∗cEnz ∗cER

kd+cER

(5.7)

5 MODELLIERUNGEN DER BIOHYDROLYSE 75

∂cDS

∂t =k∗

AH ∗cH2O∗cER +k∗

AH ∗cH2O∗cES (5.8)

Da Wasser im ¨

Uberschuss vorhanden ist, wird die Wasserkonzentration als konstant

angenommen. Die Katalysatorkonzentration ist ebenfalls konstant. Daher werden die

beiden Konzentrationen mit den Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten zusammenge-

fasst. Es ergibt sich folgendes Gleichungssystem:

∂cER

∂t = 2 ∗(−kAH ∗cER)−kmax ∗cER

kd+cER

(5.9)

∂cES

∂t = 2 ∗(−kAH ∗cES) (5.10)

∂cDR

∂t =kAH ∗cER +kAH ∗cES +kmax ∗cER

kd+cER

(5.11)

∂cDS

∂t =kAH ∗cER +kAH ∗cES (5.12)

F¨ur die Anpassung des Modells an die Meßwerte wird ein Programm, das auf den

Differentialgleichungen 5.9-5.12 beruht, verwendet (Kapitel 7.2.1). Das oben aufge-

stellte Gleichungssystem gilt f¨ur die Biohydrolyse mit dem Pilz Beauveria bassiana.

F¨ur eine Biohydrolyse mit Aspergillus niger m¨ussen in den Bilanzgleichungen 5.9 und

5.10 die Konzentrationsbezeichnungen der beiden Epoxidenantiomeren miteinander

vertauscht werden. Die Reaktionskonstanten f¨ur die Autohydrolyse sind in Tabelle

4.8 in Kapitel 4.8 aufgef¨uhrt.

Eine Meßkurve mit dem angepassten Modell f¨ur Beauverisa bassiana bei einer Eduk-

tanfangskonzentration von 0,5 g/L ist in Abbildung 5.2 dargestellt. Das Modell passt

sich gut an die Meßdaten an und beschreibt im Rahmen der Meßgenauigkeit alle im

System auftretenden Ph¨anomene. Die ermittelten Konstaten der Michaelis-Menton-

Kinetik f¨ur Anpassungen an Reaktionsverl¨aufe mit unterschiedlichen Anfangskon-

zentrationen sind in Tabelle 5.1 aufgef¨uhrt. Bei allen Versuchen liegt die Geschwin-

digkeitskonstante in der Gr¨oßenordnung um 0,37 1/s und das cmax bei 2 g/L.

5 MODELLIERUNGEN DER BIOHYDROLYSE 76

Tabelle 5.1: Aus den Anpassungen des Modells ermittelten Konstanten

Anfangskonzentration Reaktionsgeschwindigkeitskonstante vmax

(g/L) (1/s) (g/L*s)

1 0,353 2,491

0,8 0,389 2,164

0,5 0,378 2,248

0,2 0,389 2,450

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00

Zeit (h)

c (g/L)

c RE mod cRD mod cSE mod cSD mod c RE cRD cSE cSD

Abbildung 5.2: An die Meßdaten angepasstes Modell von Beauveria bassiana

5.2 Eindimensionale Diffusion

Bei der Betrachtung des Reaktionssystems mit immobilisierten Biokatalysatoren er-

geben sich zwei Bilanzr¨aume. Die vollst¨andig durchmischte Bulkphase (b), in der die

Autohydrolyse abl¨auft und die Immobilisatphase (i). Die Vorg¨ange in der Bulkphase

5 MODELLIERUNGEN DER BIOHYDROLYSE 77

werden durch folgende Formeln beschrieben:

∂cERb

∂t =−fcb

ER Autohydrolyse −fcb

ER Stoffuebergang−in−LK. (5.13)

∂cESb

∂t =−fcb

ES Autohydrolyse −fcb

ES Stoffuebergang−in−LK. (5.14)

∂cDRb

∂t = +fcb

DRAutohydrolyse +fcb

DRStoffuebergang−aus−LK. (5.15)

∂cDSb

∂t = +fcb

DS Autohydrolyse +fcb

DS Stoffuebergang−aus−LK. (5.16)

In der Immobilisatphase liegen Stofftransporthemmung, beschrieben durch das 2.

Fick´sche Gesetz und die Autohydrolyse, die von der enzymatischen Reaktion ¨uber-

lagert wird, vor. Es ergibt sich folgendes Differentialgleichungssystem:

∂cERi

∂t =−fci

ER Autohydrolyse −fci

ER Biohydrolyse −fci

ER Diffusion (5.17)

∂cESi

∂t =−fci

ES Autohydrolyse −fci

ES Diffusion (5.18)

∂cDRi

∂t = +fci

DRAutohydrolyse +fci

ER Biohydrolyse −fci

DRDiffusion (5.19)

∂cDSi

∂t = +fci

DS Autohydrolyse −fci

DS Diffusion (5.20)

Die enzymatische Aktivit¨at wird als ideal ¨uber das Immobilisat verteilt angenom-

men. Der Phasenanteil des Immobilisates ist 0,5. Die Oberfl¨ache wird ¨uber zwei

Kreise mit dem Radius der LentiKats (4mm) angen¨ahert. Es liegen 204 LentiKats

pro g Immobilisat vor. Die Kopplung der beiden Phasen erfolgt ¨uber die Formel 5.21,

die den Stofftransport ¨uber die Phasengrenzfl¨ache beschreibt. Da die Immobilisat-

phase ein Hydrogel ist, und als eine durch Matrix fixierte Wasserphase angesehen

werden kann, wird ohne einen formalen Stoff¨ubergangswiderstand gearbeitet. Es wird

5 MODELLIERUNGEN DER BIOHYDROLYSE 78

an der Oberfl¨ache der Immobilisatphase mit einer einsetzenden Diffusionshemmung

modelliert.

∂cK

∂t 



x=L=DA

∂cK

∂x 



x=L

(5.21)

Die Kopplung des Stofftransportwiderstandes mit der Reaktion im Immobilisat er-

gibt die Formel 5.22.

∂cK

∂t =D∂2cK

∂x2−fcK(5.22)

Das Differentialgleichungssystem lautet:

∂cERb

∂t = 2 ∗(−kAH ∗cER)−DA

∂cER

∂x |x=L(5.23)

∂cESb

∂t = 2 ∗(−kAH ∗cES)−DA

∂cES

∂x |x=L(5.24)

∂cDRb

∂t = +kAH ∗cER +kAH ∗cES −DA

∂cDR

∂x |x=L(5.25)

∂cDSb

∂t =kAH ∗cER +kAH ∗cES −DA

∂cDS

∂x |x=L(5.26)

∂cERi

∂t = 2 ∗(−kAH ∗cER)−kmax ∗cER

kd+cER

−D∂2cER

∂x2(5.27)

∂cESi

∂t = 2 ∗(−kAH ∗cES)−D∂2cES

∂x2(5.28)

∂cDRi

∂t =kAH ∗cER +kAH ∗cES +kmax ∗cER

kd+cER

−D∂2cDR

∂x2(5.29)

∂cDSi

∂t = +kAH ∗cER +kAH ∗cES −D∂2cDS

∂x2(5.30)

5 MODELLIERUNGEN DER BIOHYDROLYSE 79

Die Diskretisierung innerhalb der Immobilisatphase wird in Matlab mit dem Verfah-

ren der orthogonalen Translokation durchgef¨uhrt. Dieses Verfahren ergibt bei vier

St¨utzstellen gute Ergebnisse bei einem akzeptablen Rechenaufwand. Die f¨ur die Be-

rechnungen notwendigen Daten sind in Tabelle 5.2 zusammengefasst. Das verwen-

dete Matlabprogramm ist in Kapitel 7.2.3 aufgef¨uhrt. Als typisches Ergebnis ist in

Abbildung 5.3 die Anpassung an eine Biohydrolyse abgebildet.

Tabelle 5.2: Daten f¨ur die Anpassung des Immobilisatmodells

Konstante Wert

Diffusionskonstante 5,868 ∗10e−9s

kAutohydrolyse 1,033 ∗10e−91

Dicke LentiKat 1,50 ∗10e−8m

Durchmesser LentiKat 4,00 ∗10e−4m

Phasenanteil LentiKat 0,5

Anzahl LentiKat pro mL Reaktionssuspension 204

Startkonzentration 0,5g/L

Das Modell kann gut an die Meßwerte angepasst werden. Es wurden Meßdaten mit

einer geringen Startkonzentration von 0,225 g/L verwendet. Hierdurch wird vermie-

den, dass nicht gel¨ostes Edukt nachgel¨ost wird, und im Anfangsbereich der Meßdaten

eine konstante Konzentration der Edukte vort¨auscht. In den Meßkurven wie auch im

Modell kann deutlich der Verd¨unnungsvorgang am Anfang des Prozesses abgelesen

werden. Bis zur Minute 60 sinken beide Konzentrationen der Eduktenantiomeren

gleich schnell ab. Beide Edukte diffundieren in die Immobilisatphase und reagieren

erst dort enantioselektiv ab. Die kinetische Racematspaltung setzt auch erst dann

ein. Die ermittelten Konstanten liegen mit 0,39 1/s und 2,4 g/L in dem Bereich der

verteilten Reaktion.

5.3 Batch-Reaktionsansatz unter Ber¨ucksichtigung der Immobili-

satgeometrie

Das Gleichungssystem 5.23 - 5.30 wird auf eine in Femlab aufgesetzte und diskreti-

sierte Geometrie angewandt, welche die Linsenform der Immobilisate ber¨ucksichtigt.

Die Geometrie mit dem Diskretisierungsgitter ist in Abbildung 5.4 dargestellt.

Um die Rechenzeit in einem akzeptablen Rahmen zu halten, wird die Linse um die

Rotationsachse geteilt und die Randbedingung an dieser Grenze so gesetzt, dass

5 MODELLIERUNGEN DER BIOHYDROLYSE 80

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 1 2 3 4 5 6

c RE c RD c SE c SD

Abbildung 5.3: An die Meßdaten angepasstes Modell von Beauveria bassiana unter

Ber¨ucksichtigung zweier Phasen

kein Stofftransport m¨oglich ist. ¨

Uber die gekr¨ummten Grenzfl¨achen zu der Bulkpha-

se ist, wie in Formel 5.21 beschrieben, ein Stofftransport m¨oglich. F¨ur die Anpassung

werden ebenfalls die in Tabelle 5.2 aufgelisteten Parameter verwendet. Das Anpas-

sungsergebnis ist in Abbildung 5.5 dargestellt.

Die Anpassung des 3D-Modells erfolgte an die gleichen Meßdaten wie unter 5.2.

Dabei wird ebenfalls eine gute Anpassung an die Meßdaten erzielt. Die ermittelten

Konstanten liegen mit 0,4 1/s und 2,5 g/L etwas h¨oher als bei dem 2D-Modell.

Dies kann durch die gr¨oßere spezifische Stoff¨ubergangsoberfl¨ache bedingt durch die

Ber¨ucksichtigung Linsengeometrie erkl¨art werden.

5 MODELLIERUNGEN DER BIOHYDROLYSE 81

Abbildung 5.4: Gitter f¨ur das Modell unter Ber¨ucksichtigung der Immobilisatgeome-

trie

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0123456

c RE c RD c SE s SD

Abbildung 5.5: An die Meßdaten angepasstes Modell von Beauveria bassiana unter

Ber¨ucksichtigung zweier Phasen und der Immobilisatgeometrie

6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 82

6 Zusammenfassung und Ausblick

Enantiomerenreine Epoxide und ihre korrespondierenden Diole sind interessante Syn-

thesebausteine in der chemischen und pharmazeutischen Industrie. Sie sind wichtige

Zwischenprodukte bei der Herstellung heterogener Katalysatoren und Wirkstoffe,

z.B. Indinavir zur HIV Behandlung. Zu ihrer Gewinnung bieten sich biotechnologi-

sche Verfahren an. In der vorliegenden Arbeit wurde die stereoselektive Biohydrolyse

von Styrolepoxid und seinen Derivaten als Modellsystem mit Epoxidhydrolasen aus

Aspergillus niger (DSM 823) und Beauveria bassiana (DSM 1344) untersucht (siehe

Abbildung 6.1).

Beauveria bassiana

Aspergillus niger

rac-Styrolepoxid

H H

(R)-Phenylethan-1,2-diol

(S)-Styrolepoxid

(R)-Styrolepoxid

H H

(R)-Phenylethan -1,2-diol

Abbildung 6.1: Stereoselektive Biohydrolyse von Styrolepoxid mit Aspergillus niger

und Beauveria bassiana

Als entscheidende Schwierigkeiten dieser Biohydrolyse sind die geringe L¨oslichkeit

des Eduktes und die Reaktionsf¨uhrung mit einer Pilzsupension bekannt. Eine Stei-

gerung der Eduktkonzentration und eine gute R¨uckhaltbarkeit des Katalysators mit

m¨oglicher Wiederverwendung sind aber f¨ur eine technische Nutzung notwendig. Hier-

zu wurde nach der Optimierung der Zellanzucht in Bezug auf maximale Zellzahl

und hohe Hydrolyseaktivit¨at das Reaktionssystem analysiert. Die Autohydrolyse des

Eduktes wurde dabei als wichtigste Nebenreaktion quantifiziert. Weitere in biokata-

lytischen Reaktionen mit Ganzzellsystemen vorkommenden Reaktionen und Effekte,

wie Racemasenaktivit¨at, R¨uckreaktionen und Inhibitionen konnten anhand geeig-

neter Experimente im untersuchten System ausgeschlossen werden. Eine Weiterre-

aktion des Produktes zum Aldehyd ist in der Substanzklasse nachweisbar, findet

aber bei 1,2-Phenylethandiol unter den gew¨ahlten Reaktionsbedingugen nicht statt.

Zur Erh¨ohung der Eduktkonzentration wurden Biohydrolysen in L¨osemittel-Puffer-

6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 83

Gemischen durchgef¨uhrt. Es zeigte sich, dass sich durch den Einsatz dieser Gemische

die Eduktl¨oslichkeit deutlich steigern l¨aßt. Die Aktivit¨at der Biokatalysatoren wird

bei den f¨ur die Pilze optimalen Konzentration nur in Maßen verringert.

Um den Biokatalysator wirksam von der Produktl¨osung zur¨uckzuhalten, wurden die

Pilzhyphen in Polyvinylalkohol verkapselt. Es wurde gezeigt, dass die Biohydrolyse

innerhalb von 6 Tagen mit wiedergewonnenem Biokatalysator ohne Selektivit¨atsver-

lust durchgef¨uhrt werden kann. Die Untersuchung der Diffusionsvorg¨ange in dem Po-

lyvinylalkohol ergab, dass sie am besten durch einen L¨osungs-Diffusionsmechanismus

beschrieben werden k¨onnen. Die Diffusionskonstanten wurden in Diffusionsversuchen

durch eine PVA Membran ermittelt.

F¨ur eine schnelle kontinuierliche Reaktionsf¨uhrung ist eine Anreicherung der En-

zymkonzentration notwendig. Hierf¨ur wurden verschiedene Zellaufschlussverfahren

f¨ur die Pilzzellen getestet. Mit den unter technischen Bedingungen durchf¨uhrbaren

Verfahren kann aber keine Anreicherung erfolgen. Hier sind in Zukunft noch weitere

molekulabiologische Methoden anzuwenden, um die Enzyme gegebenenfalls zu iso-

lieren. Zur Ermittlung der Substratbreite der untersuchten Reaktion, wurden noch

nicht beschriebene etherverbr¨uckte Substrate erfolgreich hydrolysiert (siehe Abbil-

dung 6.2). Mit den Pilzepoxidhydrolasen k¨onnen neben den bekannten substituierten

Styrolepoxiden auch Ringsysteme und die etherverbr¨uckten Epoxide stereoselektiv

ge¨offnet werden. Ein interessantes Substratsegment konnte somit auch der kineti-

schen Racematspaltung unterzogen werden.

Abbildung 6.2: In der vorliegenden Arbeit neu eingef¨uhrten Substrate f¨ur Pilzepoxid-

hydrolasen

Im abschließenden Modellierungsteil wurde aus dem zuvor identifizierten Reaktions-

system und den gewonnenen kinetischen Daten ein Modell f¨ur die Biohydrolyse mit

den suspendierten Pilzzellen aufgestellt und an die Meßdaten angepasst. Hierdurch

6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 84

lassen sich Aussagen ¨uber die nicht direkt bestimmbare biokatalytische Reaktion

machen. Der Modellansatz mit einer Michaelis-Menton-Kinetik f¨ur die Biohydrolyse

lieferte die besten Ergebnisse bei den Anpassungen. Im zweiten Schritt wurde das

Modell erweitert, um die Biohydrolyse mit den Immobilisaten zu beschreiben. Hier-

zu wurde ein Zweiphasenmodell erstellt. In die Immobilisatphase wurde dabei ein

Stofftransportwiderstandsterm eingef¨ugt und die zuvor ermittelten Diffusionskoeffi-

zienten eingesetzt. Die analytisch schwer zu modellierende linsenf¨ormige Geometrie

konnte bei der Simmulation mit nummerisch arbeitenden Werkzeugen entsprechend

beschrieben werden.

Zur weiteren Verbesserung dieses Prozesses ist die Anreicherung der Epoxidhydrola-

senaktivit¨at notwendig. Dieses kann der Anwendung der verwendeten Immobilisate

zu einem Durchbruch in der Technik verhelfen. Die hierzu notwenigen molekularbio-

logischen Methoden werden zur Zeit bereits bei Aspergillus niger eingesetzt, mit dem

Ziel verbesserte Mikroorganismen oder sogar das reine Enzym zu isolieren. Die in der

vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse k¨onnen dann direkt auf Hydrolysen

mit dem reinen Enzym angewandt werden.

7 Anhang

Notation

Symbol Einheit Bedeutung

A[m2] Fl¨ache

α[1/L] spezifische Grenzfl¨ache

BFM [g] Biofeuchtmasse

Brm3Kugelvolumen

BTM [g] Biotrockenmasse

c[g/L] Konzentration

˙c[g

Ls ] zeitliche ¨

Anderung der Konzentration

d[−] Dublett

D[cm2/s] Diffusionskoeffizient

div [−] Divergenz

DMF [−] Dimethylformamid

DMSO [−] Dimethylsulfoxid

DSC [−] Differential Scanning Calorimeter

(Dynamisches Differenzkalorimeter)

DSMZ [−] Deutsche Sammlung f¨ur Mikroorganismen und Zellkulturen

E [−] Enatioselektivit¨at

ee [%] Enantiomerer ¨

Uberschuss

EH [−] Epoxidhydrolase

FID [−] Flammenionisationsdetektor

GC [−] Gaschromatographie

HPLC [−] high performance liquid chromatographie

(Hochleistungsfl¨ussigkeitschromatographie)

J[mol/min] Stoffstrom

k[mol/s] Reaktionsgeschwindigkeitskonstante

NMR [−] nuclear magnetic resonanz (Kernresonanz)

m [−] Multiplett

MHZ [−] Megaherz

p.a. [−] Analysenqualit¨at

ppm [−] parts per million, Verschiebung

PVA [−] Polyvinylalkohol

q [−] Quartett

(R) [−] recktus (rechts)

REM [−] Rasterelektronenmikroskopie

(S) [−] sinister (links)

Symbol Einheit Bedeutung

s [−] Singulett

SDS [−] Natriumdodecylsulfat

t [−] Triplett

t[h] Zeit

TC [mg/L] gesammter Kohlenstoffgehalt

THF [−] Tetrahydrofuran

TIC [mg/L] gesammter anorganischer Kohlenstoffgehalt

TOC [mg/L] gesammter organischer Kohlenstoffgehalt

TRIS [−] (Hydroxymethyl)aminomethan

V[L] Volumen

Indices

AH Autohydrolyse

bBulkphase

DDiol

DR (R)-1,2-Phenylethandiol

DS (S)-1,2-Phenylethandiol

EEpoxid

ER (r)-Styrolepoxid

ES (s)-Styrolepoxid

iImmobilisatphase

lOrtsindex im LentiKat

pPermeatphase

RRetentatphase

SStyrolepoxid

WR Weiterreaktion

x, δ Ortsindex

7.1 Bestimmung des Diffusionskoeffizienten in PVA-Membranen

x = 0 x = d

Bulk Membran Permeat

Abbildung 7.1: Bilanzraum der Diffusionsmessung

Bilanzen:

Vb˙cb=−AJ|x=0 (7.1)

∂tc+divJ = 0 (0 < x < δ) (7.2)

Vp˙cp=AJ|x=δ(7.3)

Stoffstrom: Fick´sches Gesetz

J=−D∂xc(7.4)

A - Grenzfl¨ache Membran - Bulk bzw. Permeat

Vb- Bulkvolumen

Vp- Permeatvolumen

Randbedingungen:

c(t, 0) = cb(t), c(t, δ) = cp(t)

Anfangsbedingungen:

cb(o) = cb

0, c(0, x) = 0 (0 < x < δ), cp(0) = 0

Vereinfachungen:

Volumenverh¨altnis:

q=Vp/V b

spezifische Grenzfl¨ache:

a=A/V b

Modell:

˙cb=aD∂xc(0) (7.5)

∂tc=D∂2

xc, (0 < x < δ) (7.6)

˙cp=1

qaD∂xc(δ) (7.7)

c(t, 0) = cb(t), c(t, δ) = cp(t) (7.8)

cb(0) = cb

0, c(0, x) = 0, cp(0) = 0 (7.9)

Quasistation¨ares Modell: station¨are Diffusion

0 = D∂2

xc in 0< x < δ, c(0) = cb, c(δ) = cp(7.10)

⇒∂xc≡konst. =cp−cb

δ(7.11)

Einsetzen in die Bulk-Permeatbilanz:

˙cb=−aD

δ(cb−cp) (7.12)

q˙cp=aD

δ(cb−cp) (7.13)

Massenerhaltung:

˙cb(t) + q˙cp= 0 (7.14)

⇒cb+qcp=konst =cb

0(7.15)

⇒cb(t) = cb

0−qcp(t) (7.16)

Einsetzen in die Permeatbilanz:

q˙cp=aD

δ(cb

0−(1 + q)cp) (7.17)

⇒˙cp=α(c∞−cp) (7.18)

mit

α= (1 + 1/q)aD

δ(7.19)

c∞=cb

1 + q(7.20)

L¨osen der Differentialgleichung:

˙cp

cp−c∞

=−α(7.21)

⇒[ln |cp−c∞|]t

0=−αt (7.22)

⇒lncp(t)−c∞

−c∞

=−αt (7.23)

ln(1 −cp(t)

c∞

) = −αt (7.24)

1−cp(t)

c∞

=e−αt (7.25)

cp(t) = c∞(1 −e−αt) (7.26)

Aus der Auftragung entsprechend der Formel 7.24 resultiert die Steigung (α) und

daraus der Diffusionskoeffizient (D).

7.2 Anpassungsroutinen

7.2.1 Biohydrolyse mit Pilzsuspension

function [k,Fehlerq]=Anpassen

% Funktion zum Anpassen von Messdaten

load d1gl

daten = d1gl;

fhaendle = figure;

plot(daten(:,1),daten(:,2),’r*’,daten(:,1),daten(:,3),’g*’,

daten(:,1),daten(:,4),’b*’,

daten(:,1),daten(:,5),’y*’);

C=daten;

options=optimset(’ShowStatusWindow’,’iter’,

’LevenbergMarquardt’,’off’);

[k,Fehlerq]=LSQNONLIN(@Differenzen,[1,1,1],[0 0 0],[],

options,C,fhaendle);

global T CSim

h=[T,CSim];

save Sim.dat -ASCII -TABS h

% --------------------------------------------------------------------------

function F = Differenzen(k,C,fhaendle)

global T CSim

options = odeset(’jacobian’,@Jacobian);

delete(findobj(’Tag’,’iterline’));

[T,CSim] = ODE45(@DGLSystem,[0, 10],[0.58; 0; 0.58; 0],

options,k);

figure(fhaendle);

lhaendle = [line([T],CSim(:,1),’color’,’r’),line([T],CSim(:,2),

’color’,’b’),line([T],

CSim(:,3),’color’,’g’),line([T],CSim(:,4),’color’,’y’)];

set(lhaendle,’Tag’,’iterline’,’Marker’,’none’);

CSimTER = INTERP1(T,CSim(:,1),C(:,1));

CSimTDR = INTERP1(T,CSim(:,2),C(:,1));

CSimTES = INTERP1(T,CSim(:,3),C(:,1));

CSimTDS = INTERP1(T,CSim(:,4),C(:,1));

F = [CSimTER-C(:,2),CSimTDR-C(:,4),CSimTES-C(:,3),

CSimTDS-C(:,5)];

% --------------------------------------------------------------------------

function dcdt = DGLSystem(t,c,k)

dcdt = [-k(1)*c(1)/(k(2)+c(1))-2*k(3)*c(1);... \%ER

k(1)*c(1)/(k(2)+c(1))+k(3)*c(1)+k(3)*c(3);...\%DR

-2*k(3)*c(3);... \%ES

k(3)*c(1)+k(3)*c(3)]; \%DS

% --------------------------------------------------------------------------

function dfdc = Jacobian(t,c,k)

dfdc = [-k(1)*c(2), -k(1)*c(1), 0;... \% df1dc1 df1dc2 df1dc3

-k(2)*c(2), -k(2)*c(1), 0;... \% df2dc1 df2dc2 df2dc3

k(3)*c(2), k(3)*c(1), 0]; \% df3dc1 df3dc2 df3dc3

7.2.2 Eindimensionale Diffusion

function [k,Fehlerq]=Anpassen

close all;

global nk np nd

np=3;

nk=4;

nd=np+1;

feval(@octplot,[],[],’initall’);

options=optimset(’LevenbergMarquardt’,’on’,’Display’,’iter’,’ShowStatusWindow’,’off’,’Diagnostics’,’on’,’LargeScale’,’off’);

[X,RESNORM,RESIDUAL,EXITFLAG,OUTPUT,LAMBDA,JACOBIAN]=LSQNONLIN(@Fehler,[10,1],[0.1 0.000001],[500 50],options);

ci = nlparci(X,RESIDUAL,JACOBIAN)

function F=Fehler(k_O)

global nk np nd

Oberflache=5127;

VolumenLsg=1;

L_Lenti=150e-6;

D_Lenti=1e-10;

k_Auto=3.47e-6;

k_D=[D_Lenti D_Lenti D_Lenti D_Lenti];

k_RL=[-2*k_Auto 0 0 0;+k_Auto 0 +k_Auto 0;0 0 -2*k_Auto 0;+k_Auto 0 +k_Auto 0];

k_RB=[0 0 0 0;0 0 0 0;0 0 0 0;0 0 0 0];

k_RB=[-2*k_Auto 0 0 0;+k_Auto 0 +k_Auto 0;0 0 -2*k_Auto 0;+k_Auto 0 +k_Auto 0];

k_MM_1=[-k_O(1) 0 0 0;k_O(1) 0 0 0;0 0 0 0;0 0 0 0];

k_MM_2=[k_O(2) 1 1 1;k_O(2) 1 1 1;1 1 1 1;1 1 1 1];

c_0=[0.5 0 0.5 0];

xc=oknullsy(np,0,0);

[A,B]=orthkol(xc,0,1);

xc=[xc;1];

Diffusion=spalloc(nk*nd,nk*nd,nk*nd*np);

for i=[0:(nk-1)]

Diffusion((1:np)+i*nd,(1:nd)+i*nd)=k_D(i+1)/L_Lenti^2*B(1:np,1:np+1);

end

Stoffuebergang=spalloc(nk*nd,nk*nd,nk*nd);

for i=[0:(nk-1)]

Stoffuebergang(nd+i*nd,(1:nd)+i*nd)=-k_D(i+1)/L_Lenti*Oberflache/VolumenLsg*A(nd,:);

end

Reaktion=spalloc(nk*nd,nk*nd,nk*nd);

for i=[0:(nk-1)]

for j=[0:(nk-1)]

for k=[1:(np)]

Reaktion(i*nd+k,j*nd+k)=k_RL(i+1,j+1);

end

ReaktionB=spalloc(nk*nd,nk*nd,nd);

for i=[0:(nk-1)]

for j=[0:(nk-1)]

ReaktionB((nd)+i*nd,(nd)+j*nd)=k_RB(i+1,j+1);

end

J=Diffusion+Stoffuebergang+ReaktionB+Reaktion;

c0=zeros(1,nd*nk);

for i=[0:(nk-1)]

c0(nd+i*nd)=c_0(i+1);

end

options=odeset(’Jacobian’,@Jac,’MaxStep’,5,’outputfcn’,@octplot,’bdf’,’off’,’stats’,’off’);

[t,c]=ode15s(@dfdt,[0:0.1:25],c0,options,J,1,xc,np,nk,nd,Reaktion,k_MM_1,k_MM_2);

load(’daten.mat’);

feval(@octplot,t,c,’plot’);

CSimT1 = INTERP1(t,c(:,nd),t_mess);

CSimT2 = INTERP1(t,c(:,2*nd),t_mess);

CSimT3 = INTERP1(t,c(:,3*nd),t_mess);

CSimT4 = INTERP1(t,c(:,4*nd),t_mess);

F = [CSimT1-c_mess(:,1);CSimT2-c_mess(:,2);CSimT3-c_mess(:,3);CSimT4-c_mess(:,4)];

function dc=Jac(t,c,J,F,xc,np,nk,nd,Reaktion,k_MM_1,k_MM_2)

ReaktionMM=spalloc(nk*nd,nk*nd,nk*nd);

for i=[0:(nk-1)]

for j=[0:(nk-1)]

if k_MM_1(i+1,j+1) ~= 0

for k=[1:(np)]

ci=c(i*(nd)+k);

ReaktionMM(i*nd+k,j*nd+k)=-k_MM_1(i+1,j+1)*k_MM_2(i+1,j+1)*ci/(k_MM_2(i+1,j+1)+ci).^2+k_MM_1(i+1,j+1)/(k_MM_2(i+1,j+1)+ci);

end

dc=J+ReaktionMM;

function dfdc=dfdt(t,c,J,F,xc,np,nk,nd,Reaktion,k_MM_1,k_MM_2)

ReaktionMM=zeros(nk*nd,1);

for i=[0:(nk-1)]

for j=[0:(nk-1)]

if k_MM_1(i+1,j+1) ~= 0

ci=c((1:np)+j*nd);

ReaktionMM((1:np)+i*nd)=ReaktionMM((1:np)+i*nd)+k_MM_1(i+1,j+1).*ci./(k_MM_2(i+1,j+1)+ci);

end

dfdc=J*c+ReaktionMM;

function state=octplot(t,c,flag,varargin)

state=0;

colors={’r’,’b’,’g’,’y’,’w’};

global hl hb hm hf1 hf2

global np nk nd

switch flag

case ’initall’

load(’daten.mat’);

hf1=figure(’position’,[650,200,500,350],’renderer’,’zbuffer’)

set(gca,’color’,[0.7,0.7,0.5],’box’,’on’,’yLim’,[0,1.1*max(max(c_mess))])

for i=[1:4]

m(i)=line(t_mess,c_mess(:,i));

set(m(i),’Marker’,’*’,’LineStyle’,’none’,’linewidth’,1,’color’,colors{i});

end

hf2=figure(’position’,[100,200,500,350],’renderer’,’zbuffer’);

set(gca,’XLim’,[0,1.2],’XLimMode’,’manual’,’YLim’,[0,1.3*max(max(c_mess))],’YLimMode’,’manual’,’Color’,’none’,...

’box’,’on’,’XTick’,[0:0.2:1]);

patch([1,1,1.2,1.2],[0 1 1 0],[0 0 0 0],’facecolor’,[0.7,0.7,0.5]);

case ’init’

delete(findobj(’Tag’,’a’));

figure(hf2)

for i=[0:(nk-1)]

hl(i+1)=line(varargin{3}’,c((1:nd)+i*nd)’);

set(hl(i+1),’Marker’,’o’,’LineStyle’,’none’,’color’,colors{i+1},’Tag’,’a’);

hb(i+1)=line([1 1.2],[c(nd+i*nd) c(nd+i*nd)]);

set(hb(i+1),’Linewidth’,2,’LineStyle’,’-’,’color’,colors{i+1},’Tag’,’a’);

end

case ’plot’

figure(hf1)

delete(findobj(’Tag’,’LineOld’));

set(findobj(’Tag’,’LineNew’),’linewidth’,1.0,’LineStyle’,’- -’,’Tag’,’LineOld’)

for i=[0:(nk-1)]

hm(i+1)=line(t,c(:,(nd)+i*nd)’);

set(hm(i+1),’Marker’,’none’,’LineStyle’,’-’,’linewidth’,1.5,’color’,colors{i+1},’Tag’,’LineNew’);

end

case ’’

for i=[0:(nk-1)]

set(hl(i+1),’ydata’,c((1:nd)+i*nd)’)

set(hb(i+1),’ydata’,[c(nd+i*nd) c(nd+i*nd)])

end

end;

drawnow;

7.2.3 Biohydrolyse mit Immobilisaten

function [k,Fehlerq]=Anpassen

close all;

load fem2

fem=meshinit(fem,’out’,’fem’,’hmax’,0.05,’hnum’,1200);

% fem=meshrefine(fem,’out’,’fem’);

mf=figure(’name’,’Mesh’,’color’,[1,1,1],’Render’,’opengl’);

geomplot(fem.geom3D,’parent’,gca,’Detail’,’Extra Fine’)

axis image

set(gca,’visible’,’off’,’view’,[-161,-78]);

set(findobj(’Type’,’Patch’),’Facealpha’,0.2,’FaceLighting’,’phong’,’FaceColor’,[0.6,0.6,0.9]);

meshplot(fem,’Parent’,gca);

D_Lenti=5.86e-9;

fem.const={’D’ D_Lenti};

fem.equ.be{1}={{’-D./r’ ’0’}};

fem.equ.f{1}{1}=’0’;

fem.equ.c{1}{1}={’D’};

[K,L,M,N,DA] = assemble(fem,’tpoint’,’gauss1’);

[KE,LE,NULL,UD,DE] = femlin(fem,’uscale’,’none’,’out’,{’Ke’,’Le’,’Null’,’ud’,’De’},’tpoint’,’gauss1’);

[AR,G1X,G1Y,G2X,G2Y,G3X,G3Y]=FLTRG(fem.mesh.p,fem.mesh.t);

ng=size(G1X,2);

Ev = sparse([fem.mesh.t(1,:),fem.mesh.t(2,:),fem.mesh.t(3,:)],...

[[1:ng],[1:ng],[1:ng]],...

[ones(1,ng),ones(1,ng),ones(1,ng)]);,

s = sum(Ev’);

sh=1./s;

Ev = sparse( [fem.mesh.t(1,:),fem.mesh.t(2,:),fem.mesh.t(3,:)],...

[[1:ng],[1:ng],[1:ng]],...

sh([fem.mesh.t(1,:),fem.mesh.t(2,:),fem.mesh.t(3,:)]));

Cx = sparse( [fem.mesh.t(1,:),fem.mesh.t(2,:),fem.mesh.t(3,:)],...

[[1:size(G1X,2)],[1:size(G1X,2)],[1:size(G1X,2)]],...

[G1X,G2X,G3X]);

Cy = sparse( [fem.mesh.t(1,:),fem.mesh.t(2,:),fem.mesh.t(3,:)],...

[[1:size(G1X,2)],[1:size(G1X,2)],[1:size(G1X,2)]],...

[G1Y,G2Y,G3Y]);

Abx= Ev*Cx’;

Aby= Ev*Cy’;

idx = [find(fem.mesh.e(5,:)==2)];

idxl = fem.mesh.e(1,idx);

idxr = fem.mesh.e(2,idx);

deltax = abs(fem.mesh.p(1,idxr)-fem.mesh.p(1,idxl));

deltay = abs(fem.mesh.p(2,idxr)-fem.mesh.p(2,idxl));

r=2*pi*fem.mesh.p(1,:);

intelx = sparse([ones(1,size(idx,2))],idxl,deltay/2.*r(idxl),1,size(Abx,1));

interx = sparse([ones(1,size(idx,2))],idxr,deltay/2.*r(idxr),1,size(Abx,1));

intely = sparse([ones(1,size(idx,2))],idxl,deltax/2.*r(idxl),1,size(Aby,1));

intery = sparse([ones(1,size(idx,2))],idxr,deltax/2.*r(idxr),1,size(Aby,1));

intex = intelx+interx;

intey = intely+intery;

v=-D_Lenti*[intex*Abx+intey*Aby]*NULL;

t=-D_Lenti*[intex*Abx+intey*Aby]*UD;

idx = [find(fem.mesh.e(5,:)==3)];

idxl = fem.mesh.e(1,idx);

idxr = fem.mesh.e(2,idx);

deltax = abs(fem.mesh.p(1,idxr)-fem.mesh.p(1,idxl));

deltay = abs(fem.mesh.p(2,idxr)-fem.mesh.p(2,idxl));

r=2*pi*fem.mesh.p(1,:);

intelx = sparse([ones(1,size(idx,2))],idxl,deltay/2.*r(idxl),1,size(Abx,1));

interx = sparse([ones(1,size(idx,2))],idxr,deltay/2.*r(idxr),1,size(Abx,1));

intely = sparse([ones(1,size(idx,2))],idxl,deltax/2.*r(idxl),1,size(Aby,1));

intery = sparse([ones(1,size(idx,2))],idxr,deltax/2.*r(idxr),1,size(Aby,1));

intex = intelx+interx;

intey = intely+intery;

v=v+D_Lenti*[intex*Abx+intey*Aby]*NULL;

t=t+D_Lenti*[intex*Abx+intey*Aby]*UD;

np=size(v,2);

nd=np+1;

feval(@octplot,[],[],’initall’);

options=optimset(’LevenbergMarquardt’,’on’,’Display’,’none’,’ShowStatusWindow’,’off’,’Diagnostics’,’on’,

’LargeScale’,’off’,’MaxIter’,10);

[X,RESNORM,RESIDUAL,EXITFLAG,OUTPUT,LAMBDA,JACOBIAN]=LSQNONLIN(@Fehler,[4,10,0.02],

[0 0.001 0.001],[20 20 20],options,...

K,L,M,N,DA,KE,LE,NULL,UD,DE,v,t,ng,np,nd,D_Lenti,fem,AR);

ci = nlparci(X,RESIDUAL,JACOBIAN)

function F=Fehler(k,K,L,M,N,DA,KE,LE,NULL,UD,DE,v,t,ng,np,nd,D_Lenti,fem,AR)

Oberflache=5127;

VolumenLsg=1;

L_Lenti=150e-6;

k_Auto=k(3);

k_MM_1s=k(1);

k_MM_2s=k(2);

k_D=[D_Lenti D_Lenti D_Lenti D_Lenti];

k_RL=[-2*k_Auto 0 0 0;+k_Auto 0 +k_Auto 0;0 0 -2*k_Auto 0;+k_Auto 0 +k_Auto 0];

k_RB=[0 0 0 0;0 0 0 0;0 0 0 0;0 0 0 0];

k_RB=[-2*k_Auto 0 0 0;+k_Auto 0 +k_Auto 0;0 0 -2*k_Auto 0;+k_Auto 0 +k_Auto 0];

k_MM_1=[-k_MM_1s 0 0 0;k_MM_1s 0 0 0;0 0 0 0;0 0 0 0];

k_MM_2=[k_MM_2s 1 1 1;k_MM_2s 1 1 1;1 1 1 1;1 1 1 1];

c_0=[0.225 0 0.225 0];

nk=3;

L_Grenze=1;

KX=-[KE,NULL’*K*UD;v,t];

[KXi,KXj,KXw]=find(KX);

Diffusion=spalloc(nd*4,nd*4,size(KXi,1)*4);

for i=[0:3]

Diffusion=Diffusion+sparse(KXi+i*nd,KXj+i*nd,KXw,nd*4,nd*4);

end

DX=[DE,zeros(size(DE,1),1);zeros(1,size(DE,2)),1/204000000];

[DXi,DXj,DXw]=find(DX);

Mass=spalloc(nd*4,nd*4,size(DXi,1)*4);

for i=[0:3]

Mass=Mass+sparse(DXi+i*nd,DXj+i*nd,DXw,nd*4,nd*4);

end

Mef = sparse( [fem.mesh.t(1,:),fem.mesh.t(2,:),fem.mesh.t(3,:)],...

[[1:ng],[1:ng],[1:ng]],...

[repmat(1/3,1,ng),repmat(1/3,1,ng),repmat(1/3,1,ng)]);

Mnf = sparse( [fem.mesh.t(1,:),fem.mesh.t(2,:),fem.mesh.t(3,:)],...

[[1:ng],[1:ng],[1:ng]],...

[1/3*AR,1/3*AR,1/3*AR]);

ReaktionL=spalloc(4*nd,4*nd,4*nd);

ReaktionB=spalloc(4*nd,4*nd,16);

RL=[NULL’*Mnf*Mef’*NULL,NULL’*Mnf*Mef’*UD];

[RLi,RLj,RLw]=find(RL);

for i=[0:3]

for j=[0:3]

ReaktionL=ReaktionL-k_RL(i+1,j+1)*1*sparse(RLi+i*nd,RLj+j*nd,RLw,nd*4,nd*4);

ReaktionB(np+1+nd*i,np+1+nd*j)=-1/204000000*k_RB(i+1,j+1);

end

J=Diffusion-ReaktionL-ReaktionB;

%r=symamd(J);

r=1:size(J,1);

c0=zeros(1,nd*4);

for i=[0:3]

c0(nd+i*nd)=c_0(i+1);

end

options=odeset(’Mass’,Mass(r,r),’Jacobian’,@Jac,’MaxStep’,2,’bdf’,’off’,’AbsTol’,1e-4,’RelTol’,1e-2,’stats’,

’on’,’outputfcn’,@octplot);

[t,c(:,r)]=ode15s(@dfdt,[0:0.0125:1,1.25:0.25:7],c0(r),options,J,fem,NULL,UD,k_MM_1,k_MM_2,Mef,

Mnf,np,nk,nd,ng,r,ReaktionL,L_Grenze);

gidx=find(c(:,nd)+c(:,3*nd)>L_Grenze);

c(gidx,nd)=c(gidx,nd)./(c(gidx,nd)+c(gidx,nd+2*nd))*L_Grenze;

c(gidx,nd+2*nd)=c(gidx,nd+2*nd)./(c(gidx,nd)+c(gidx,nd+2*nd))*L_Grenze;

load(’daten.mat’);

feval(@octplot,t,c,’plot’,J,fem,NULL,UD,k_MM_1,k_MM_2,Mef,Mnf,np,nk,nd,ng,r,ReaktionL,L_Grenze);

CSimT1 = INTERP1(t,c(:,nd),t_mess);

CSimT2 = INTERP1(t,c(:,2*nd),t_mess);

CSimT3 = INTERP1(t,c(:,3*nd),t_mess);

CSimT4 = INTERP1(t,c(:,4*nd),t_mess);

assignin(’base’,’h’,[t,c(:,nd),c(:,2*nd),c(:,3*nd),c(:,4*nd)]);

F = [CSimT1-c_mess(:,1);CSimT2-c_mess(:,2);CSimT3-c_mess(:,3);CSimT4-c_mess(:,4)];

function dc=Jac(t,c,J,fem,NULL,UD,k_MM_1,k_MM_2,Mef,Mnf,np,nk,nd,ng,r,ReaktionL,L_Grenze)

ReaktionMM=spalloc(4*nd,4*nd,4*nd);

c(r)=c;

if (c(nd)+c(nd+2*nd)>L_Grenze)

c(nd)=0;

c(nd+2*nd)=0;

end

for i=[0:3]

for j=[0:3]

if k_MM_1(i+1,j+1) ~= 0

ci=Mef’*(NULL*c((1:np)+j*nd)+UD*c(j*nd+np+1));

Jh=(-k_MM_1(i+1,j+1)*k_MM_2(i+1,j+1)*ci./(k_MM_2(i+1,j+1)+ci).^2+k_MM_1(i+1,j+1)./

(k_MM_2(i+1,j+1)+ci));

Mnfm = Mnf.* sparse( [fem.mesh.t(1,:),fem.mesh.t(2,:),fem.mesh.t(3,:)],...

[[1:ng],[1:ng],[1:ng]],...

[Jh,Jh,Jh]);

[Jhi,Jhj,Jhw]=find(NULL’*Mnfm*Mef’*NULL);

ReaktionMM=ReaktionMM+sparse(Jhi+i*nd,Jhj+j*nd,Jhw,nd*4,nd*4);

end

dc=J(r,r)+ReaktionMM(r,r);

function dfdc=dfdt(t,c,J,fem,NULL,UD,k_MM_1,k_MM_2,Mef,Mnf,np,nk,nd,ng,r,ReaktionL,L_Grenze)

ReaktionMM=zeros(4*nd,1);

c(r)=c;

if (c(nd)+c(nd+2*nd)>L_Grenze)

c(nd)=c(nd)/(c(nd)+c(nd+2*nd))*L_Grenze;

c(nd+2*nd)=c(nd+2*nd)/(c(nd)+c(nd+2*nd))*L_Grenze;

end

for i=[0:3]

for j=[0:3]

if k_MM_1(i+1,j+1) ~= 0

ci=Mef’*(NULL*c((1:np)+j*nd)+UD*c(j*nd+np+1));

ReaktionMM((1:np)+i*nd)=ReaktionMM((1:np)+i*nd)+NULL’*Mnf*

(k_MM_1(i+1,j+1).*ci./(k_MM_2(i+1,j+1)+ci));

end

dfdc=J(r,r)*c(r)+ReaktionMM(r);

function state=octplot(t,c,flag,J,fem,NULL,UD,k_MM_1,k_MM_2,Mef,Mnf,np,nk,nd,ng,r,

ReaktionL,L_Grenze)

state=0;

colors={’r’,’b’,’g’,’y’,’w’};

global hl hb hm hf1 hf2 s1 s2 s3 s4 su1 su2 su3 su4

switch flag

case ’initall’

load(’daten.mat’);

hf1=figure(’position’,[650,200,500,350],’renderer’,’zbuffer’)

set(gca,’color’,[0.7,0.7,0.5],’box’,’on’,’yLim’,[0,0.3])

for i=[1:4]

m(i)=line(t_mess,c_mess(:,i));

set(m(i),’Marker’,’*’,’LineStyle’,’none’,’linewidth’,1,’color’,colors{i});

end

hf2=figure(’position’,[100,200,700,550],’renderer’,’opengl’);

s1=subplot(2,2,1);

s2=subplot(2,2,2);

s3=subplot(2,2,3);

s4=subplot(2,2,4);

set([s1 s2 s3 s4],’color’,[0.7,0.7,0.5],’box’,’on’,’zLim’,[-0.02 0.33],’view’,[-45,45]);

case ’init’

c(r)=c(:,1);

if (c(nd)+c(nd+2*nd)>L_Grenze)

c(nd)=c(nd)/(c(nd)+c(nd+2*nd))*L_Grenze;

c(nd+2*nd)=c(nd+2*nd)/(c(nd)+c(nd+2*nd))*L_Grenze;

end

delete(findobj(’Tag’,’su’));

fem.sol.u=NULL*c([1:np],1)+UD*c(np+1,1);

su1=postplot(fem,’tridata’,’u’,’triz’,’u’,’parent’,s1,’Tribar’,’off’,’view’,get(s1,’view’),’axisequal’,’on’);

fem.sol.u=NULL*c([nd+1:nd+np],1)+UD*c(nd+np+1,1);

su2=postplot(fem,’tridata’,’u’,’triz’,’u’,’parent’,s2,’Tribar’,’off’,’view’,get(s2,’view’),’axisequal’,’on’);

fem.sol.u=NULL*c([2*nd+1:2*nd+np],1)+UD*c(2*nd+np+1,1);

su3=postplot(fem,’tridata’,’u’,’triz’,’u’,’parent’,s3,’Tribar’,’off’,’view’,get(s3,’view’),’axisequal’,’on’);

fem.sol.u=NULL*c([3*nd+1:3*nd+np],1)+UD*c(3*nd+np+1,1);

su4=postplot(fem,’tridata’,’u’,’triz’,’u’,’parent’,s4,’Tribar’,’off’,’view’,get(s4,’view’),’axisequal’,’on’);

set([su1 su2 su3 su4],’Tag’,’su’);

set([s1 s2 s3 s4],’zLim’,[0 0.3] );

case ’plot’

figure(hf1)

delete(findobj(’Tag’,’LineOld’));

set(findobj(’Tag’,’LineNew’),’linewidth’,1.0,’LineStyle’,’- -’,’Tag’,’LineOld’)

for i=[0:3]

hm(i+1)=line(t,c(:,(nd)+i*nd)’);

set(hm(i+1),’Marker’,’none’,’LineStyle’,’-’,’linewidth’,1.5,’color’,colors{i+1},’Tag’,’LineNew’);

end

case ’’

c(r)=c(:,1);

if (c(nd)+c(nd+2*nd)>L_Grenze)

c(nd)=c(nd)/(c(nd)+c(nd+2*nd))*L_Grenze;

c(nd+2*nd)=c(nd+2*nd)/(c(nd)+c(nd+2*nd))*L_Grenze;

end

u=NULL*c([1:np],1)+UD*c(np+1,1);

set(su1,’zdata’,[u(fem.mesh.t(1,:)),u(fem.mesh.t(2,:)),u(fem.mesh.t(3,:))]’,’cdata’,[u(fem.mesh.t(1,:)),

u(fem.mesh.t(2,:)),u(fem.mesh.t(3,:))]’);

set(s1,’CLim’,[min(u),max(u)]);

u=NULL*c([nd+1:nd+np],1)+UD*c(nd+np+1,1);

set(su2,’zdata’,[u(fem.mesh.t(1,:)),u(fem.mesh.t(2,:)),u(fem.mesh.t(3,:))]’,’cdata’,[u(fem.mesh.t(1,:)),

u(fem.mesh.t(2,:)),u(fem.mesh.t(3,:))]’);

set(s2,’CLim’,[min(u),max(u)]);

u=NULL*c([2*nd+1:2*nd+np],1)+UD*c(2*nd+np+1,1);

set(su3,’zdata’,[u(fem.mesh.t(1,:)),u(fem.mesh.t(2,:)),u(fem.mesh.t(3,:))]’,’cdata’,[u(fem.mesh.t(1,:)),

u(fem.mesh.t(2,:)),u(fem.mesh.t(3,:))]’);

set(s3,’CLim’,[min(u),max(u)]);

u=NULL*c([3*nd+1:3*nd+np],1)+UD*c(3*nd+np+1,1);

set(su4,’zdata’,[u(fem.mesh.t(1,:)),u(fem.mesh.t(2,:)),u(fem.mesh.t(3,:))]’,’cdata’,[u(fem.mesh.t(1,:)),

u(fem.mesh.t(2,:)),u(fem.mesh.t(3,:))]’);

set(s4,’CLim’,[min(u),max(u)]);

end;

drawnow;

LITERATUR 99

Literatur

[1] Aintsworth, S.; 1977, Steady state Enzyme Kinetics, 1. Aufl., Sheffield, The

Macmillan Press LTD.

[2] Archelas, A.; 1998, Fungal epoxide hydrolases: new tool for the synthesis of

enantiopure epoxides and diols, Journal of Molecular Catalysis B, Nr. 55, S.

79-85.

[3] Archer, I.V.J.; 1997, Epoxide Hydrolases as Asymetric Catalysts, Tetrahedron,

Vol. 53, Nr. 46, S. 15167-15662.

[4] Archelas, A.; Delbecque, J.-P.; Furstoss, R.; 1993, Microbiological Transforma-

tions 30, Enantioselective hydrolysis of racemic epoxides: The Synthesis of En-

antiopure Insect Juvenile Hormone Analogs (Bower Compound), Tetrahedron:

Asymmetry, Vol. 4, Nr. 12, S. 2445-2446.

[5] Atkins, W.P.; 1990, Physikalische Chemie, 1. Aufl., Weinheim, Verlag Chemie.

[6] Azerad, R.; 1994, Aplication of biocatalysts in organic synthesis, Bull. Soc. Fr.,

Nr. 132, S. 17-51.

[7] Baerns, M.; Hofmann, H.; Renken, A.; 1992, Chemische Reaktionstechnik, 2.

Aufl., Stuttgart, Georg Thieme Verlag.

[8] Ballesteros, A.; Gill, I.; 2000, Bioencapsulation with synthetic polymers (Part1):

Sol-Gel Encapsulated Biologicals, Tibtech, Nr. 18, S. 282-296.

[9] Baratti, C., Moussou, P.; Archelas, A.; Furstoss, R.; 2000, Clues for the existence

of two different epoxid hydrolase aktivities in the fungus Beuveria bassiana,

Enzyme and Microbial Technology, Nr. 26, S. 414-420.

[10] Bast, E.; 1999, Mikrobiologische Methoden, 1.Aufl., Heidelberg, Spektrum Aka-

demischer Verlag.

[11] Becker, H.; 2001, Organikum: organisch-chemisches Grundpraktikum, 21. Aufl.,

Weinheim, Verlag Chemie.

[12] Beyer, H.; Walther, W.; 1997, Lehrbuch der Organischen Chemie, 23. Aufl.,

Stuttgart, S. Hirzel Verlag.

[13] Bisswanger, H.; 2000, Enzymkinetik Theorie und Methoden, 3. Aufl., Weinheim,

Verlag Chemie.

[14] Boyer, R.F.; 1992, Modern Experimental Biochemistry, 2. Aufl., Redford City,

Benjamin Cummings Publishing Company.

[15] Braun, C.; Kalinowski, H.-O. Berger; S.; 1998, 150 and More Basic NMR Ex-

periments, 2. Aufl., Weinheim, Verlag Chemie.

LITERATUR 100

[16] Brodbeck, U.; 1980, Enzyme Inhibitors, 1. Aufl., Weinheim, Verlag Chemie.

[17] Carey, F.A.; Sundberg, R.J.; 1995, Organische Chemie, 1. Aufl., Weinheim,

Verlag Chemie.

[18] Clement, M.T.; 1951, Citric Acid Fermentation of Beet Molasses by Aspergillus

niger in Submerged Culture, Ottawa, Canadian Journal of Technology, Nr. 30,

S. 82-88.

[19] Cost 840 Workshop; 2001, Practical Aspects of Encapsulation Technologies,

Book of Abstracts, 1.Aufl., Braunschweig, FAL Eigenverlag.

[20] Crueger, W.; Crueger, A.; 1989, Biotechnologie-Lehrbuch der angewandten Mi-

krobiologie, 3.Aufl., M¨unchen, Oldenbourg.

[21] Cruz, A.J.G.; Almeida R.M.R.G.; Araujo M.L.G.C.; Giordano R.C.; Hokka

C.O.; 2001, The dead core model applied to beads with immobilized cells

in a fed-batch cephalosporin C production bioprocess, Chemical Engineering

Science, Nr. 56, S. 419-425.

[22] Dekant, W.; Vanvokag, S.; 1995, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis Vol. 1,

1. korrigierter Nachdruck., Heidelberg, Spektrum Akademischer Verlag.

[23] Drauz, K; Waldmann, H.; 1995, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis Vol. 1,

1. Aufl., Weinheim, Verlag Chemie.

[24] Drauz, K; Waldmann, H.; 1995, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis Vol. 2,

1. Aufl., Weinheim, Verlag Chemie.

[25] Faber, K.; 1999, Biotransformations in Organic Chemistry, 4.Aufl., Berlin,

Springer.

[26] Faber, K.; Mischitz, M.; Kroutil, W.; Wandel, U.; 1995, Asymmetric Microbial

Hydrolysis of Epoxides, Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 6, Nr. 6, S. 1261-1272.

[27] Faber, K.; Mischitz, M.; Hechtberger, P.; Wirnsberger, M.; Klempier, N.; 1993,

Asymmetric Hydrolysis of Epoxides using an Immobilised Enzyme Preparation

from Rhodococcus sp., Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 4, Nr. 6, S. 1161-1164.

[28] Faber, K.; Mischitz, M.; Mirtl, C.; Saf, R.; 1996, Regioselectivity of Rhodococcus

NCIMB 11216 Epoxid Hydrolase: Applicacibility of E-Values for Description of

Enantioselectivity Depends on Substrate Structure, Tetrahedron: Asymmetry,

Vol.7, Nr. 7, S. 2041-2046.

[29] Faber, K.; Orru, R.; 1999, Stereoselectivities of Microbial Epoxide Hydrolases,

Current Opinion in Chemical Biology, Vol. 3, S. 16-21.

[30] Fargali, S.; 2000, Untersuchungen zur stereoselektiven ¨

Offnung von Epoxiden

mit Pilzen, Diplomarbeit, Paderborn.

LITERATUR 101

[31] Feustel, H.; 1977, Die Welt der Pilze, 1. Aufl., Darmstadt, Anthes.

[32] Fersht, A.; 1977, Enzyme Structure and Mechanism, 1. Aufl., San Francisco,

W.H. Freeman and Company.

[33] Finlayson, B. A.; 1980, Nonlinear Analysis in Chemical Engineering, Chemical

Engineering Series, 1. Aufl., New York, McGraw-Hill.

[34] Fitzer, E.; Fritz, W.; Emig G.; 1995, Technische Chemie, 4. Aufl., Berlin, Sprin-

ger.

[35] Flessner, T.; Doye, S.; 1999, N,N-Bis(3,5-di-t-butylsalicylidene)-1,2-

cyclohexanediaminomanganes(III)chlorid - the Jacobsen Catalyst, Journal

f¨ur Praktische Chemie, Vol. 314, Nr. 5, S. 436-444.

[36] Furstoss, R.; Archelas, A.; 2001, Synthetic application of epoxide hydrolases,

Current Opinion in Chemical Biology, Nr. 5, S. 112-119.

[37] Furstoss, R.; Archelas, A.; Genzel, Y.; Broxtermann, Q.B.; Schulze, B.; 2001, Mi-

crobiological Transformation 47. A Step towards a Green Chemistry Preparation

of Enantiopure (S)-2-, -3- and -4-pyridyloxirane via epoxide hydrolase-catalysed

kinetic resulution, J. Org. Chem., Nr. 66, S. 538-543.

[38] Furstoss, R.; Archelas, A.; Genzel Y.; Broxtermann Q.B.; Schulze B.; 2000,

Preparation of enantiopure (S)-2-pyridyloxirane via epoxide hydrolase-catalysed

kinetic resulution, Tetrahedron: Asymmetry, Nr. 11, S. 3041-3044.

[39] Furstoss, R.; Chen, C.; Archelas, A.; 1993, Microbiological Transformations 27,

The First Example for Preparative-Scale Enantioselective or Diastereoselective

Epoxid Hydrolyses Using Microorganisms. An Unequivocal Access to All Four

Bisabolol Stereoisomeres, J. Am. Soc., Nr. 58, S. 5528-5532.

[40] Furstoss, R.; Cleij, M.; Archelas, A.; 1998, Microbiological Transformations 42,

TA two liquid phase preparative scale process for an epoxide hydrolase cataly-

sed resolution of para-bromo-a-methyl styrene oxide. Occurrence of a suprising

enantioselectivty enhancement, Tetrahedron: Asymmetry, Nr. 9, S. 1839-1842.

[41] Furstoss, R.; Pedragosa-Moreau, S.; Archelas, A.; 1993, Epoxide Hydrolases as

a Preparative Access to both Enantiomers of Styrene Oxide, J. Am. Soc., Nr.

58, S. 5533-5536.

[42] Furstoss, R.; Pedragosa-Moreau, S.; Archelas, A.; 1998, Use of Epoxide Hydro-

lases for the Synthesis of Enantiopure Alkyl Epoxides, Tetrahedron, Nr. 54, S.

1563-1572.

[43] Furstoss, R.; Pedragosa-Moreau, S.; Archelas, A.; Guitton C.; Faucher D.; Ba-

ratti J.C.; 1999, Purification and characterisation of a highly enantioselective

epoxide hydrolase from Aspergillus niger, European Journal of Biochemistry,

Nr. 263, S. 386-395.

LITERATUR 102

[44] Furstoss, R.; Pedragosa-Moreau, S.; Archelas, A.; 1996, Synthesis of Enantio-

pure Epoxides and Vicinal Diols using Fungal Epoxide Hydrolase Mediated

Hydrolysis, Tetrahedron Letters, Nr. 19, Vol. 37, S. 3319-3322.

[45] Furstoss, R.; Pedragosa-Moreau, S.; Archelas, A.; 1996,Use of Epoxide Hydrola-

se Mediated Biohydrolysis as a Way to Enantiopure Epoxides and Vicinal Diols:

Application to Substituted Styrene Oxide Derivatives, Tetrahedron, Nr. 52, S.

4593-4606.

[46] Furstoss, R.; Pedragosa-Moreau, S.; Archelas, A.; Morisseau, C.; Baratti, J.;

1996, Microbiological Transformations 33, Fungal Epoxid Hydrolases Applied to

the Synthesis of Enantiopure Para-Substituted Styrene Oxides. A Mechanistic

approach, J. Org. Chem., Nr. 61, S. 7402-7407.

[47] Gawlwy, R.E.; Aube, J.; 1996, Tetrahedron Organic Chemistry Series, Volume

14, Principles of Asymmetric Synthesis, 1.Aufl., Oxford, Elsevier.

[48] Gerhartz, W.; 1990, Enzymes in Industry, 1. Aufl., Weinheim, Verlag Chemie.

[49] GeniaLab; 2001, Tips und Tricks, 6. Aufl., Braunschweig, Firmenschrift,

www.GeniaLab.com, Eigenverlag, Braunschweig.

[50] Gemeiner, G.; 1992, Enzyme Engineering Immobilized Biosystems, 1. Aufl., New

York, Ellis Horwood.

[51] Hartung, J.; 2001, Katalysen, Kinasen, Kondensate, Frankfurt, Nachrichten aus

der Chemie, Nr. 12, S. 1390.

[52] Hesse, M.; Meier, H.; Zeeh, B.; 1991, Spektroskopische Methoden in der orga-

nischen Chemie, 4. Aufl., Stuttgart, Thieme.

[53] Hicks, B.-J.; Watt, A.-D.; Cosens, D.; 2000, The potential of Beauveria bassiana

as a biological control agent aganist the pine beauty moth, Forest Ecology and

Management, Vol. 149, S. 275-281.

[54] Hilker, I.; Bothe D.; Pr¨uss J.; Warnecke H.-J.; 2001, Chemo-enzymatic epoxida-

tion of unsaturated plant oils, Chemical Engineering Science, Nr. 56, S. 427-432.

[55] Hufforrd, D.; Capiton, G.; Clark, M.; Baker J.; 1981, Metabolism of Imipamine

by Microorganisms, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 70, Nr. 2, S. 151-

155.

[56] Jahnz, U.; Schubert, M.; Vorlop, K.-D.; 2002, Process development for produc-

tion of FDA from inulin on an industrial scale: Screening, genetic engineering

and immobilisation, Landbauforschung V¨olkerode, Sonderheft 241, 113-119.

[57] Jakobsen, E.N.; 1993, Catalytic Asymmetric Synthesis, 1. Aufl., Weinheim, Ver-

lag Chemie.

LITERATUR 103

[58] Jakubith, M.; 1991, Chemische Verfahrenstechnik, 1. Aufl., Weinheim, Verlag

Chemie.

[59] Kergomard, A.; Renard M.; Veschambre H.; 1982, Microbiological Reduction

of α, β-Unsaturated Ketons by Beauveria sulfurescens, Journal of Organic Che-

mistry, Nr. 47, S. 792-798.

[60] Kieslich, K.; 1976, Microbiological Glucosidation of a Phenolic Hydroxyl Group,

Chemische Berichte, Nr. 109, S. 2259-2265.

[61] Liese A.; Karutz M.; Kamphuis J.; Wandrey C.; Kragel U.; 1996, Enzymatic Re-

solution of 1-Phenyl-1,2-ethandiol by Enantioselective Oxidation: Overcoming

Product Inhibition by Continuous Extraction, Biotechnology and Bioenginee-

ring, Vol. 51, S. 544-550.

[62] L¨owe, A.; 2002, Chemische Reaktionstechnik mit MATHLAB und SIMULINK,

1. Aufl., Weinheim, Verlag Chemie.

[63] Maloney, T.C.; 2000, Messung der Porengr¨oßenverteilung mittels DSC, User-

Com, Nr. 2, S. 14-17.

[64] Marquardt, H.; 1997, Lehrbuch der Toxikologie, 1. Auflage, Heidelberg, Spek-

trum Akademischer Verlag.

[65] Matsumoto, K.; Fuwa, S.; Kitajima, H.; 1995, Enzyme-Mediated Enantioselec-

tive Hydrolysis of Cyclic Carbonates, Tetrahedron Letters, Nr. 36, Vol. 36, S.

6499-6502.

[66] McCoy, M.; 1999, Biocatalysis Grows for Drug Synthesis, CuEN, Nr. 4, S. 10-14.

[67] Mika, D.; 2001, Untersuchungen zur enantioselektiven Ring¨offnung von Epoxi-

den durch Biokatalyse, Diplomarbeit, Paderborn.

[68] Morrison, R.T; Boyd, R.N.; 1986, Lehrbuch der Organischen Chemie, 3. Aufl.,

Weinheim, Verlag Chemie.

[69] Mulder, M.; 1996, Basic Principles of Membrane Technology, 2. Aufl., Dordrecht,

Kluwer Academic Publishers.

[70] M¨uller, E.; 1992, Mykologie, 5. Aufl., Stuttgart, Thieme.

[71] Munk, K.; 2001, Grundstudium Biologie Mikrobiologie, 1. Aufl., Heidelberg,

Spektrum Akademischer Verlag.

[72] Pr¨uße, U.; Jahnz, U.; Wittlich, R.; Bredford, J.; Vorlop, K.-D.; 2002, Bead

production with JetCutting and rotating disc/nozzle technologies, Landbaufor-

schung V¨olkerode, Sonderheft 241, S.1-10.

[73] Rappaport, Z.; 1967, Handbook of Tables for Organic Compound Identification,

3. Aufl., Ohio, CRC Press.

LITERATUR 104

[74] Rehm, H.-J.; Reed, G.; P¨uhler, A.; Stadler, P.; 1991, Biotechnology Vol. 4,

Measuring Modelling and Control, 2.Aufl., Weinheim, Verlag Chemie.

[75] Rehm, H.; 1997, Der Experimentator: Proteinbiochemie, 2. Aufl., Stuttgart,

Fischer.

[76] Reichelt, R.; 1988, Solvents and Solvent Effects in Organic Chemistry, 2. Aufl.,

Weinheim, Verlag Chemie.

[77] R¨ompp; 1988, Lexikon der Chemie, 9.Aufl., Stuttgart, Thieme.

[78] Sch¨ugerl, K.; 1985, Bioreaktionstechnik Band 1, Grundlagen, Formalkinetik,

Reaktortypen und Prozessf¨uhrung, 1.Aufl., Aarau, Salle und Sauerl¨ander.

[79] Sch¨ugerl, K.; 1991, Bioreaktionstechnik Band 2, Bioreaktoren und ihre Charak-

terisierung, 1.Aufl., Aarau, Salle und Sauerl¨ander.

[80] Sharpless, K.B.; 2002, Auf der Suche nach neuer Reaktivit¨at, Angewandte Che-

mie, Nr. 114, S. 2126-2135.

[81] Sharpless, K.B.; Katsuki T.; 1980, The First Practical Method for Asymmetric

Epoxidation, J.Am.Soc., Nr. 102, S. 4263.

[82] Sinclair, G.C.; Kristiansen, B.; 1987, Fermentation Kinetics and Modelling,

1.Aufl., Manchester, Open University Press.

[83] Stinson, S.C.; 2001, Chiral Chemistry, C&EN, Nr. 20, Vol. 79, S.2.

[84] Straathof, A.A.-J.; Panke, S.; Schmidt, A.; 2002, The production of fine chemi-

cals by biotransformations, Current Opinion in Biotechnology, Nr. 13, S. 548-

556.

[85] Schwantes, H.O.; 1995, Biologie der Pilze, 1.Aufl., Stuttgart, Verlag Chemie.

[86] Schwedt, G.; 1994, Chromatographische Trennmethoden, 3.Aufl., Stuttgart,

Thieme.

[87] Sykes, P.; 1988, Reaktionsmechanismen in der Organischen Chemie, 9.Aufl.,

Weinheim, Verlag Eugen Ulmer.

[88] van Beyma; 1973, Oxygenation of Dialkylbenzenes, Bioorganic Chemistry, Nr.

2, S. 99-100.

[89] Vollhardt, K.P.; 1990, Organischen Chemie, 1.Aufl., Weinheim, Verlag Chemie.

[90] Vollmert, B.; 1985, Grundriss der Makromolekularen Chemie, Band 2, 1.Aufl.,

Karlsruhe, Verlag E. Vollmert.

[91] Vorlop, K-D.; Jekel, M.; 2000, Patentschrift DE 19827552C1 Verfahren zur Her-

stellung eines Geles aus Polyvinylalkohol und nach dem Verfahren hergestelltes

mechanisch hochstabiles Gel.

LITERATUR 105

[92] Vorlop, K-D.; Remmers, P.; 1991, Patentschrift DE 4027218C1 Verfahren zur

Herstellung von Biokatalysatoren.

[93] Vorlop, K-D.; Ding, W-A.; 1997, Patentschrift DE 4327923C1 Gel aus Polyvi-

nylalkohol und Verfahren zu seiner Herstellung.

[94] Wedler, G.; 1987, Lehrbuch der Physikalische Chemie, 3.Aufl., Weinheim, Verlag

Chemie.

[95] Willetts, A.; Grogan G.; Rippe C.; 1997, Biohydrolysis of substituted styrene

oxides by Beauveria densa, Journal of Molecular Catalysis B, Nr. 3, S. 253-257.

[96] Zachmann, H. G.; 1990, Mathematik f¨ur Chemiker, 4.Aufl., Weinheim, Verlag

Chemie.

————————————

Hiermit m¨ochte ich mich bei allen bedanken, die durch ihre Unterst¨utzung und Hilfe

das Gelingen dieser Arbeit erm¨oglicht haben. Insbesondere gilt mein Dank:

Herrn Prof. Dr. Hans-Joachim Warnecke f¨ur die interessante Themenstellung und

seine intensive fachliche und herzliche pers¨onliche Betreuung.

Herrn PD. Dr. Bernhardt Westermann f¨ur die sehr engagierte Betreuung, f¨ur die

vielen Diskussionen und die ¨

Ubernahme des Korreferates.

Frau Dipl. Chem. Samira Fargalli und Herrn Dipl. Chem. Ing. Daniel Mika f¨ur ihr

Engagement w¨ahrend ihrer Diplomarbeiten und vieler Diskussionen.

Frau Ulrike Schnittker f¨ur die Unterst¨utzung bei den GC-Messungen und Thomas

Ahrens und den Auszubildenden f¨ur ihr Engagement w¨ahrend ihrer Eins¨atze in mei-

nem Labor.

Der Arbeitsgruppe Warnecke f¨ur die gute Arbeitsatmosph¨are und Zusammanarbeit.

Speziell Dipl. chem. Hermann Post f¨ur die Unterst¨utzung bei der Modellprogramie-

rung, PD Dr. Bothe f¨ur die Hilfe bei der L¨osung des Diffusionsproblems und Michael

Motzigemba, Hendrik Reimann, Oliver Reipschl¨ager, und Marina Lovrinovic f¨ur al-

les.

Der Arbeitsgruppe Westermann f¨ur die hervorragende Zusammenarbeit und die Un-

terst¨utzung bei organisch chemischen Fragestellungen.

Allen nicht namentlich genannten Mitarbeitern und Freunden, die mich mit Rat und

Tat unterst¨utzt haben.

Einen besondern Dank meiner Familie, ohne deren Glauben an mich und ihrer Un-

terst¨utzung diese Arbeit nicht m¨oglich w¨are.

————————————

Abstract of the PhD Thesis

Stereoselective Biohydrolysis of Epoxides:

Analysis, Optimisation and Modelling

By Thorsten Bruss

Enantiopure Epoxides and their corresponding diols are versatile synthons in the

chemical and pharamaceutical industry. The present work deals with the stereose-

lective biohydrolysis of styrinepoxide und derivates with epoxidhydrolasis from the

fungi Aspergillus niger (DSM 823) and Beauveria bassiana (DSM 1344) in a whole

cell fermentation (figure .1).

Beauveria bassiana

Aspergillus niger

rac-Styrolepoxid

H H

(R)-Phenylethan-1,2-diol

(S)-Styrolepoxid

(R)-Styrolepoxid

H H

(R)-Phenylethan -1,2-diol

Abbildung .1: Enatiokonvergent biohydrolysis of styrinepoxide with Aspergillus niger

(DSM 823) and Beauveria bassiana (DSM 1344)

After optimisation of growing conditions in a batch fermenter and determination of

the optimal harvest time, the reaction system was analysed and kineticly quantifica-

ted for mathematic modelling. For the enhancement of the reaction mode, in order

to receive higher substrate concentration, the reaction behaviour in cosolvent system

was measured. Subsequently, an immobilisation process in polyvinylalcohol (Lenti-

Kats) was established, which enables an application of the biocatalyst for 7 days.

The substrat range of this biohydrolysis was extanded by a new type of etherbridged

epoxides. Using the messured kinetic data a mathematic model was establised, which

includes different kinetic aspects and substrat transport limitation in the immobilised

biocatalyst.