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Untersuchungen zur

Charakterisierung und Standardisierung

von Allergenextrakten

aus Milbenkulturen

Vom Fachbereich Erziehungswissenschaft - Psychologie -

Sportwissensehaft der Universität Paderborn

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum medicinalium

- Dr. rer. medic. -

genehmigte Dissertation

von

Ulrich Deppe

in Neuenkirchen

Paderborn, den 8. Februar 2002

DANKSAGUNG

Die vorliegende Arbeit wurde in den Jahren 1998 bis 2001 am Sportmedizini-

schen Institut (Leiter: Prof. Dr. med. Heinz Liesen) der Universität Paderborn er-

arbeitet. Für die Unterstützung und Begleitung während meiner Promotion

möchte ich mich an dieser Stelle sehr herzlich bedanken.

Herrn Prof. Dr. med. Heinz Liesen danke ich nicht nur für die materielle und mo-

ralische Unterstützung der Arbeit, sondern vor allem für die gewährten Freiheiten.

Herrn Prof. Dr. med. Michael Weiß (Sportmedizinisches Institut, Universität Pa-

derborn) danke ich neben der Übernahme des Erstgutachtens für die stete Be-

reitschaft zur Diskussion.

Herrn Prof. Dr. Dr. med. Henrich Hasko Paradies (Physikalische Technik, MFH

Iserlohn) gilt mein besonderer Dank. Das Aufzeigen immer neuer Denkansätze,

die engagierte Unterstützung und die lebhaften Diskussionen haben in hohem

Maße zum Erfolg beigetragen.

Herrn Dr. med. Horst Müsken und Herrn Prof. Dr. med. Karl Christian Bergmann

(Allergie- und Asthma-Klinik, Bad Lippspringe) danke ich herzlich für die span-

nende Zusammenarbeit, aus der die Fragestellung der vorliegenden Arbeit ent-

stand.

Herrn Dr. Jörg-Thomas Franz schulde ich Dank für die sehr gute und engagierte

Zusammenarbeit, auch und besonders unter oft schwierigen Bedingungen.

Bei Herrn PD Dr. Bernhard Westermann und Herrn Prof. Dr.-Ing. Hans Joachim

Warnecke möchte ich mich für die Unterstützung bedanken.

Zum Schluß gilt mein Dank dem Team der Sportmedizin. Es war eine klasse Zeit,

in der man vor den Scherzen der Kollegen nie sicher war. Vielen Dank dafür!

INHALTSVERZEICHNIS

1 Motivation und Zielsetzung 1

2 Einführung in das Thema 4

2.1 Immunsystem und Allergie................................................................................................4

2.2 Die Entstehung allergischer Erkrankungen.....................................................................5

2.3 Biologie der Milben ............................................................................................................6

2.4 Sensibilisierungen gegenüber Domestic Mites ...............................................................8

2.5 Biochemie der Allergene .................................................................................................10

2.5.1 Antigene und Allergene...........................................................................................10

2.5.2 Nomenklatur der Allergene.....................................................................................11

2.5.3 Was macht ein Allergen zu einem Allergen?.........................................................11

2.5.3.1 Some allergens are more major than other - wann ist ein Protein ein Major-

allergen? ...........................................................................................................13

2.5.3.2 Epitope, die aktiven Zentren der Allergene .......................................................13

2.5.4 Struktur und Allergenität.........................................................................................15

2.5.4.1 Polymorphismus und Isoallergene - Variation einzelner Aminosäuren in der

Primärsequenz (1D)..........................................................................................15

2.5.4.2 Veränderungen der Sekundärstruktur (2D).......................................................17

2.5.5 Funktion und Allergenität .......................................................................................18

2.5.5.1 Proteaseaktivität................................................................................................18

2.5.5.2 Kreuzallergenität ...............................................................................................21

2.6 Klassifizierung und Beschreibung ausgewählter Milbenallergene..............................24

2.7 Allergenextrakte ...............................................................................................................30

2.7.1 Bedeutung in der Diagnostik..................................................................................31

2.7.2 Bedeutung in der Therapie .....................................................................................31

2.7.2.1 Peptidtherapie mit Allergoiden ..........................................................................32

2.7.2.2 Unspezifische passive Immuntherapie durch anti-IgE-Antikörper.....................33

2.7.2.3 Spezifische Immuntherapie (SIT)......................................................................33

2.7.3 Herstellung von Allergenextrakten – eine Übersicht............................................34

2.7.4 Stabilisierung von Allergenextrakten.....................................................................35

2.7.4.1 Polyethylenglykol ..............................................................................................40

3 Methoden und Verfahren 42

3.1 Ablauf der Untersuchungen ............................................................................................42

3.2 Probenvorbereitung .........................................................................................................43

3.2.1 Verwendete Milbenkulturen ....................................................................................43

3.2.2 Aufschluss der Milbenkulturen ..............................................................................43

3.2.3 Bestimmung der Proteingesamtmasse nach Lowry.............................................46

3.2.3.1 DC Protein Assay..............................................................................................47

3.2.3.2 Proteinbestimmung nach Lowry (modifiziert) ....................................................47

3.2.4 Spezifische Bestimmung von Einzelallergenen mittels Enzym-Linked-

Immuno-Sorbent-Assay (ELISA).............................................................................48

3.2.4.1 Bestimmung von Der p 1...................................................................................49

3.2.4.2 Bestimmung von Der p 2...................................................................................50

3.2.5 UV/VIS-Spektroskopie der Allergenextrakte..........................................................51

3.2.6 Ausschlusschromatographie (SEC).......................................................................52

3.2.7 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (Disk-SDS-PAGE).............54

3.2.8 Native Elektrophorese.............................................................................................58

3.2.9 Isoelektrische Fokussierung (IEF)..........................................................................60

3.2.10 Färbung, Dokumentation und Auswertung von Elektrophoresegelen...............62

3.2.10.1 Kolloidale Coomassie-Färbung [190] ................................................................62

3.2.10.2 Silberanfärbung [191]........................................................................................62

3.2.10.3 Trocknen der Gele ............................................................................................63

3.2.10.4 Dokumentation und Auswertung der gefärbten Proteinspektren.......................64

3.2.11 Immunoblotting........................................................................................................64

3.2.11.1 Chromogene Immundedektion mit BCIP/NBT...................................................67

3.2.11.2 Immunoblotting mit Chemilumineszenz (CSPD)-Detektion...............................69

3.2.12 Patientenseren.........................................................................................................70

3.2.13 Zymogramm .............................................................................................................71

4 Ergebnisse und Diskussion 74

4.1 UV/VIS-Spektroskopie......................................................................................................74

4.2 Spezifische Bestimmung der Majorallergene Der p 1 und Der p 2...............................76

4.3 Ausschlusschromatographie (SEC) ...............................................................................78

4.4 SDS-PAGE.........................................................................................................................82

4.4.1 Verwendung dissoziierender Reagenzien am Beispiel Dithiotreitol (DTT).........84

4.4.2 Unregelmäßigkeiten der Standardallergene..........................................................86

4.5 native Elektrophorese......................................................................................................88

4.6 Isoelektrische Fokussierung (IEF) ..................................................................................90

4.7 Immunoblotting ................................................................................................................93

4.8 Beurteilung der proteolytischen Aktivität mittels Zymogramm .................................101

4.9 MALDI-TOF-MS ...............................................................................................................104

4.10 Exkurs: Diffuse Klein- und Weitwinkel-Röntgenstreuung......................................111

4.11 Abschliessende Diskussion der Ergebnisse...........................................................114

4.11.1 Empfehlung für eine zukünftige Abfolge.............................................................117

5 Zusammenfassung und Ausblick 121

5.1 Zusammenfassung der Einzelergebnisse....................................................................121

5.2 Ausblick...........................................................................................................................123

6 Literatur 125

7 Akürzungsverzeichnis 134

1 MOTIVATION UND ZIELSETZUNG

Allergenextrakte zur Diagnostik und Therapie werden im deutschen Arzneimittel-

gesetz vom 1. Februar 2001 als Arzneimittel klassifiziert und unterliegen somit

den entsprechenden Qualitätskriterien (§ 4 Abs. 15):

„Qualität ist die Beschaffenheit eines Arzneimittels, die nach Identität, Gehalt,

Reinheit, sonstigen chemischen, physikalischen, biologischen Eigenschaften

oder durch das Herstellungsverfahren bestimmt wird.“

Allgemeingültige Methoden zur Extraktherstellung und zur Standardisierung feh-

len bis auf wenige Ausnahmen [1]. Bei Arzneizubereitungen mit und ohne wirk-

samkeits-bestimmenden Substanzen (Chemische Verbindungen, Naturstoffe mit

definierter pharmakologischer Wirkung) ist der gesamte Anteil des „Extraktes“

maßgebend und auch qualitätsbestimmend, d.h. eine Normierung auf nur einen

Inhaltsstoff kann somit nicht erfolgen. Die Standardisierung ergibt sich aus der

Spezifikation der Extraktzubereitung des so beschrieben Standards, der reprodu-

zierbar erreicht werden muss. Das Verhältnis von nativem Extrakt zu technischen

Hilfsmitteln muss bei allen Chargen konstant sein und bleiben (Stabilität, Lage-

rungsfähigkeit, zwei Jahresfrist und Stresstest). Da das allergisch wirksame Pro-

tein oder Proteingemisch als der wirksamkeitsbestimmende Inhaltsstoff angese-

hen werden kann, muss hier pharmakologisch von einer Normierung und nicht

von einer Standardisierung gesprochen werden.

Das Fehlen nationaler und internationaler Standards bedingt große Qualitätsun-

terschiede zwischen den Präparaten verschiedener Hersteller [2] und erfordert so

eine komplexe und aufwendige Qualitätssicherung. Diese wird mit einem ganzen

Arsenal analytischer Verfahren mit höchst unterschiedlicher Aussagekraft betrie-

ben, die zudem vom Anwender aufgrund fehlender Vorgaben individuell zusam-

mengestellt werden. Qualität ist bei der Herstellung von Allergenextrakten kein

wohl definierter, allgemein anerkannter und geprüfter Zustand, sondern eine indi-

viduelle Interpretation des Herstellers. Ein Vergleich mit anderen Herstellern ist

nicht vorgeschrieben und führt in der Regel zu großen qualitativen Unterschieden

[2]. Die Schwankungsbreiten der Aktivitätsbestimmungen industriell hergestellter

Extrakte liegen zwischen 12 und 30 % [3], womit sich die Unternehmen aber im-

mer noch im Rahmen der von der Europäischen Kommission vorgegebenen Va-

rianz von 50 bis zu 200 % bewegen [4].

Als einzige Vorgabe zur Qualitätssicherung und -erreichung wurde daher gefor-

dert, dass Herstellungs- und Kontrollmethoden nach dem jeweiligen „Stand der

wissenschaftlichen Erkenntnis“ angewandt werden müssen. Eine in-vivo Haut-

testung zur biologischen Aktivität ist nur bei der erstmaligen Zulassung des Prä-

parates vorgeschrieben, die nachfolgende Chargenkontrolle erfolgt in-vitro.

In Ermangelung verbindlicher nationaler und/oder internationaler Vorgaben zur

Allergenstandardisierung und Qualitätskontrolle werden Extrakte hinsichtlich ihrer

globalen Aktivität

• auf biologischer Basis (Histaminäquivalent im Pricktest), und

• durch eine in-vitro-Methodik (z.B. EAST1-Inhibition oder Histamiliberation)

eingeschätzt.

Flankierend werden Untersuchungen zur Zusammensetzung durch SDS-PAGE2,

IEF3 und andere unspezifische Fraktionierungen durchgeführt. Eine Allergeni-

dentifizierung durch Immunoblotting sowie eine Bestimmung weniger Majoraller-

gene runden die Charakterisierung ab [5].

Die Standardisierung der Allergenstandards anhand biologischer Einheiten ist

sinnvoll, da sie die Summe aller individuellen Aktivitäten repräsentieren. Aller-

dings sind keinerlei Rückschlüsse auf individuelle Allergenkonzentrationen mög-

lich, so dass eine hohe Aktivität u.U. auch ohne Majorallergene zustande kom-

men kann. Des weiteren ist eine biologische Standardisierung nur möglich, wenn

die Anamnese genauestens bekannt ist. Ansonsten kann es zu einer erheblichen

Diskrepanz zwischen den Hauttestergebnissen und der IgE- basierten in vitro

Diagnostik kommen [6].

Betrachtet man hingegen die allergene Aktivität eines Allergenextraktes als die

Summe einzelner Komponenten, wobei jede Komponente bzw. jedes Allergen

einen individuellen Beitrag liefert, so bekommt die Bestimmung von Einzelaller-

genen und die Zuordnung individueller spezifischer Aktivitäten eine neue Be-

deutung. Das Zukunftsszenario eines solchen modularen „Baukastens“ mit Aller-

genen als „Bauklötzen“, die frei zu patientenspezifischen Extrakten für Diagnostik

und zur Therapie kombiniert werden können, erscheint als ein reizvolles Ziel.

In der vorliegenden Arbeit wurden zu diesem Zweck u.a. Untersuchungen

1. zum schonenden Aufschluss von Milbenkulturen,

2. zur physikalisch-chemischen Charakterisierung,

3. zur funktionellen Aktivität des Extraktes sowie

1 Enzyme Allergo Sorbent Assay

2 Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

3 Isoelektrische Fokussierung

4. zur Fragmentierung und Struktur der allergenen Komponenten unternommen.

Objekt der Untersuchungen waren Kulturen der Hausstaubmilbe Dermatophagoi-

des pteronyssinus verschiedener Hersteller und eine Kultur der Vorratsmilbe Le-

pidoglyphus destructor.

2 EINFÜHRUNG IN DAS THEMA

2.1 IMMUNSYSTEM UND ALLERGIE

Das Immunsystem besteht aus funktionell ausdifferenzierten Leukozyten, die im

Blut und in den Lymphgefäßen auf der Suche nach fremden Antigenen zirkulie-

ren.

Die Immunabwehr setzt sich aus zwei unterschiedlichen Komponnten zusam-

men, dem angeborenen und adaptiven Immunsystem. Das angeborenen System

besteht aus Makrophagen, Neutrophilen, Mastzellen, Granulozyten und NK-

Zellen4, alle ohne spezifische Antigen Rezeptoren. Die Reaktion dieses Teils des

Immunsystems erfolgt in allen Individuen gleich [7].

Das adaptive Immunsystems proliferiert nach dem Erstkontakt mit einem körper-

fremden Antigen spezifische Zellen identischer Ausprägung und Rezeptoreigen-

schaften. Diese B- und T-Zellen besitzen Antigen-spezifische Rezeptoren. B-

Zellrezeptoren bestehen aus spezifischen Immunglobulin-(Ig)-funktionen, wäh-

rend T-Zellen eigene Rezeptoren (TcR) auf ihrer Oberfläche besitzen. Diese e-

xistieren im Gegensatz zu den Immunglobulinen nicht in freier Form, sondern nur

zellgebunden. Ein weiter Unterschied besteht darin, dass B-Zellen Antigene di-

rekt erkennen (hauptsächlich konformationelle Epitope) [8], T-Zellrezeptoren hin-

gegen an peptidartige, lineare Antigenbruchstücke binden (sequenzielle Epitope),

die in Kombination mit dem Major Histokompatibillitäts Komplex (MHC) auf der

Oberfläche antigenpräsentierender Zellen (APC) den T-Zellen präsentiert wer-

den. Als APC kann jede Zelle bezeichnet werden, die MHC an ihrer Oberfläche

exponiert, wodurch Peptide gebunden werden. Besonders B-Zellen, Dendritische

Zellen und Monozyten bzw. Makrophagen fungieren als APC, aber auch Endo-

thelzellen und Fibroblasten sind hierzu in der Lage [9]. APC nehmen bevorzugt

aggregierte oder partikuläre Antigene auf. Je größer und je komplexer ein Protein

ist und je weniger es mit körpereigenen verwandt ist, um so größer ist die Wahr-

scheinlichkeit, dass es Peptidfragmente enthält, die an MHC-II-Moleküle binden

und sich von körpereigenen Peptiden unterscheiden [10]. Die MHC Moleküle

werden in zwei Klassen, MHC I und MHC II, eingeteilt und besitzen den höchsten

bekannten Grad an allelen Polymorphismen. B- und T-Zellen bilden einen wichti-

4 Natural Killer Zellen

gen Teil des immunologischen Gedächtnisses, da es sich um sehr langlebige

Zellen handelt [11].

2.2 DIE ENTSTEHUNG ALLERGISCHER

ERKRANKUNGEN

Allergische Erkrankungen durch Milben sind nach der Einteilung von Coombs

und Gell [12] Hypersensibilisierungsreaktionen vom Typ I. Hierbei dringt das Al-

lergen in den Körper ein und wird an der Eintrittsstelle, z.B. den Bronchial-

schleimhäuten, von den APC aufgenommen, durch Proteasen prozessiert und

gebunden an den MHC II-Komplex auf der Oberfläche als Peptidbruchstücke

präsentiert. Die T-Zellrezeptoren erkennen die Kombination MHC II Allergenpep-

tid. T-Helferzellen (TH) können anhand ihres produzierten Zytokinspektrums in

drei Klassen unterteilt werden. TH1-Zellen produzieren hauptsächlich IFN-γ, IL-2

und TNF-α, TH2-Zellen produzieren IL-4, IL-5 und IL-13. TH0-Zellen produzieren

das Zytokinspektrum von TH1- und TH2-Zellen [13]. IL-4 und IL-13 stimulieren B-

Zellen zur Produktion von allergenspezifischem IgE, das auf der Oberfläche von

Mastzellen und Basophilen an den hoch affinen IgE-Rezeptor (FcεRI) bindet.

Nachfolgend exponiertes Allergen wird durch den FcεRI-IgE-Komplex auf der

Mastzelle gebunden (bridging) und führt zur Ausschüttung von Mediatoren (z.B.

Histamin, Tryptase, Leukotriene, IL-4, IL-5 und IL-13) [14, 15], was wiederum

binnen Minuten die typischen Symptome (Juck- und Niesreiz sowie Nasalblocka-

de) einer allergischen Sofortreaktion auslöst. IL-5 hingegen stimuliert Eosinophile

[13], die wiederum für die Spätreaktionen binnen 6-24 Stunden nach der Sofort-

reaktion verantwortlich sind. IFN-γ unterdrückt den Effekt von IL-4 [14], somit die

Entwicklung von TH2, unterstützt aber die TH1-Bildung und die vermehrte Bil-

dung von MHC II. Das Verhältnis IL-5 zu IFN-γ spiegelt wieder, ob die Zellen ein

TH1 oder TH2 Zytokinmuster aufweisen [16]. Abbildung 1 veranschaulicht die

Entstehung einer allergischen Reaktion.

Die Anzahl allergischer Erkrankungen nimmt seit Jahrzehnten stetig zu [17, 18].

Personen mit einer genetischen Prädisposition besitzen ein erhöhtes Atopierisiko

[19], wobei ein Zusammenhang zwischen allergen-spezifischer Immunantwort

und HLA -Allelen besteht. Jedes Individuum besitzt einen spezifischen HLA-Typ,

wodurch individuelle Epitop-Bindungsmöglichkeiten bestehen [20]. Mit dem

Chromosom 11q13 wurde die genetische Region lokalisiert, die den hoch affinen

IgE-Rezeptor (FcåRI) codiert, und damit der erste direkte Zusammenhang zur

Atopie entdeckt [21]. Die Verbindung zu 11q13 und einem weiteren Chromosom-

abschnitt, 6p21, konnte für Dermatophagoides pteronyssinus spezifisches IgE

bestätigt werde [22]. Eine weitere und genetisch interessante Region von Inte-

resse ist die des Chromosoms 5q, wo die Informationen für die mit Atopie asso-

ziierten Zytokine (IL-4 , IL-5, IL-9, IL-13 und GM-CSF) gespeichert sind [23]. Aus-

schließlich genetisch bedingte Faktoren für die Zunahme allergischer Erkrankun-

gen in der Bevölkerung verantwortlich zu machen, ist allerdings nicht zulässig.

Ein Anstieg nur aufgrund genetischer Modifikation des Erbmaterials bedarf der

Abfolge mehrerer Generationen. Polymorphismen des IL-4 Promoters [24] und in

der Codierung des IL-13 [25] verstärken die Annahme, dass auch andere Fakto-

ren zur Allergieentstehung und -entwicklung beitragen. Angeführt seien hier vor

allem die sich verändernden Lebensverhältnisse und die daraus resultierenden

Auswirkungen auf den Menschen. Ein besonderes Augenmerk wird in der For-

schung auf die, vor allem im Kindesalter, sinkende Infektionsrate, die Umstellung

der Ernährungsgewohnheiten (Nahrungsmittelallergien) sowie der Wohnverhält-

nisse und der daraus resultierenden mikroklimatischen Veränderungen (pereniale

Atopien wie z.B. Milbenallergien) gerichtet [26].

2.3 BIOLOGIE DER MILBEN

Milben (Acari) gehören innerhalb der Wirbellosen zu den Spinnentieren (Arachni-

dia: Chelicerata) und werden in eine Vielzahl von Ordnungen insbesondere unter

dem Aspekt der Ausbildung der Atemöffnungen (u.a. Astigmata (keine), Prostig-

Abbildung 1 – Die Entstehung einer allergischen Reaktion.

mata (vorne), Cryptostigmata (versteckt), Mesostigmata (Mitte), Metastigmata

(hinten) eingeteilt. Die im wesentlichen für allergische Erkrankungen verantwortli-

chen Milben gehören zu den astigmatischen Superfamilien Pyroglyphoidea und

Acaroidea [27]. Insgesamt wurden bislang weltweit etwa 150 verschiedene Mil-

benarten in Häusern nachgewiesen, insgesamt werden bis zu 40.000 verschie-

denen Arten vermutet [28]. Eine Übersicht der taxonomischen Verhältnisse liefert

Abbildung 2.

Die Einteilung erfolgte in der Vergangenheit in Hausstaubmilben (Pyroglyphoi-

dea) und Vorratsmilben (Acaroidea), und entsprach dem damaligen Wissenstand

über deren Habitate, aber nicht den taxonomischen Gegebenheiten. Die klassi-

schen Hausstaubmilben Dermatophagoides farinae und Dermatophagoides pte-

ronyssinus wurden bevorzugt im direkten menschlichen Wohnumfeld gefunden,

die später entdeckten Vorratsmilbenarten wie z.B. Acarus siro, Tyrophagus

putrescentiae, Glyciphagus domesticus und Lepidoglyphus destructor konnten

vor allem in landwirtschaftlichen Vorratsräumen (Getreidesilo, Stallungen, etc.)

lokalisiert werden [29]. Hausstaub- und Vorratsmilben werden seit geraumer Zeit

als Domestic Mites bezeichnet, da beide Milbenklassen im häuslichen Umfeld

vorkommen und IgE-basierte Sensibilisierungen hervorrufen [27].

Gegenstand dieser Arbeit sind die in Europa allergologisch relevantesten Milben

ihrer Klassen, die Hausstaubmilbe Dermatophagoides pteronyssinus (Abbildung

3) und die Vorratsmilbe Lepidoglyphus destructor (Abbildung 4). Zur besseren

Nachvollziehbarkeit werden in der vorliegenden Arbeit weiterhin die alten Be-

zeichnungen Hausstaubmilbe (HSM) bzw. Vorratsmilbe (VRM) verwendet.

Im menschlichen Wohnumfeld kommen Milben gewöhnlich nicht in direkten

Kontakt mit den Menschen vor, aber sie überleben, entwickeln und ernähren sich

im Hausstaub. Ein Gramm Hausstaub enthält ca. 700 Millionen Partikel, von de-

nen fünf bis sechs Millionen biologische und biogene Substanzen sind. Haus-

staub ist ein heterogenes Substrat, zusammengesetzt aus Synthetik- und Natur-

fasern, Haaren, Mineralien, Salzen, Asche, Pollen, Pilzsporen und Pilzmycel so-

wie Insektenfragmenten, wobei jeder Hausstaub in seiner Zusammensetzung

variiert.

Menschliche Hautschuppen sind die Hauptnahrung der Hausstaubmilben (HSM).

Der Mensch verliert pro Tag 1 bis 1,5 g Hautschuppen, genügend zur Ernährung

hunderttausender Milben. Im Magendarmtrakt der Milben wurden darüber hinaus

Schimmelpilze, Pollen und Bakterien gefunden. Bevorzugte Habitate der Haus-

staubmilben sind Matratzen, Polstermöbel und Teppiche, in denen sich Haut-

schuppen ansammeln können [30].

Acaroidea (VRM) bevorzugen Habitate im menschlichen Umfeld, vor allem in der

Landwirtschaft, in denen Vorräte wie Getreide, Mehl, Stroh, Heu, Hefe, Käse,

Trockenfisch oder Früchte gelagert werden [29]. Vorratsmilben werden zwar be-

vorzugt in landwirtschaftlichen Betrieben gefunden, aber auch in den Städten

kommen sie in relevanter Quantität vor. 82,4 % der gefundenen Milben waren

HSM, 17,6% VRM [31]. In einer deutschen Großstadt wurde die Milbenpopulation

wie folgt identifiziert: D. pteronyssinus (72,8 %), D. farinae (10,0 %), L. destructor

(5,4 %), T. putrescentiae (1,4 %), Euroglyphus maynei (1,2 %), G. domesticus

(0,4 %) und A. siro (0,2 %) [32]. Im Staub landwirtschaftlicher Betriebe konnten

38 astigmatische und 14 prostigmatische Milbenarten [33], davon 14 mit allergo-

logischer Relevanz [34], identifiziert werden. Jede Milbenart mit mehr als ca. 100-

200 Milben pro Gramm Staub wird als potentielle Allergenquelle betrachtet [35].

2.4 SENSIBILISIERUNGEN GEGENÜBER DOMESTIC

MITES

Der höchsten Grad der Sensibilisierung im Patientengut wird in Europa durch D.

pteronyssinus und, im geringeren Umfang, von D. farinae verursacht [36, 35].

Schon früh konnten aber auch Vorratsmilben als eigenständige Allergenquelle

mit spezies-spezifischem Allergenspektrum identifiziert werden [37, 38, 39].

Abbildung 2 – Ausschnittsweise Betrachtung der Taxonomie einiger Milben.

L. destructor ist in Nordamerika weit verbreitet [40] und scheint in Europa das

höchste allergene Potential der Vorratsmilben zu bergen, so dass mit ihr die ers-

ten Ansätze zur Immuntherapie bei Vorratsmilben vollzogen wurden [41]. Eine

spanische Studie fand trotz einer um den Faktor 50 erhöhten Proteinmenge aus

T. putrescentiae, eine geringere Sensibilisierungsrate im Patientengut als gegen

L. destructor [42]. Eine isländische Studie zeigte eine Sensibilisierungsrate in der

Gesamtbevölkerung gegen L. destructor von 6,3 % und gegen D. pteronyssinus

von 10,9 % [43]. Im Norden Deutschlands wurde bei berufsbedingt unter pneu-

mologischen Beschwerden leidenden Landwirten positive RAST-Ergebnisse wie

folgt ermittelt: 12 % L. destructor, 16 % D. pteronyssinus und 14 % D. farinae

[44]. Neuere Untersuchungen konnten eine „Mono“-Sensibilisierung gegenüber

Vorratsmilben von 16,3 % aufzeigen. Das vorrangige Allergierisiko stellen nach

wie vor die Hausstaubmilbenarten mit 42,5 % Sensibilisierungen dar. 41,3 % der

Patienten zeigten Reaktionen gegenüber beiden „Milbenklassen“ [42].

Abbildung 3 – Dermatophagoides pteronyssinus

Abbildung 4 – Lepidoglyphus destructor

Eine Sensibilisierung gegenüber Hausstaubmilben wird in der Regel durch eine

Zweitsensibilisierung gegenüber mindestens einer Vorratsmilbe begleitet [45]. In

den Niederlanden sind dies vor allem G. domesticus und T. putrescentiae und in

geringerem Umfang L. destructor [46]. In Skandinavien überwiegt L. destructor

[47]. Eine spanische Untersuchung ergab bei 86 % der gegen Hausstaubmilben

sensibilisierten Patienten eine Zweitdisposition gegenüber Vorratsmilben, und

hier vor allem gegenüber L. destructor. Die meist aus ländlichen Gegenden

stammenden Patienten zeigten neben höheren Gesamt-IgE-Werten auch er-

höhte Titer an spezifischem IgE gegen Vorrats- und Hausstaubmilben als „nur“

gegen die eine oder andere Milbenklasse sensibilisierte Patienten [48].

Da höhergradige Sensibilisierungen gegenüber Vorratsmilben in der Stadtbevöl-

kerung nachgewiesen werden konnten, ist es nicht zulässig, diese nur auf Sensi-

bilisierungen gegenüber Hausstaubmilben zu testen [49, 50].

2.5 BIOCHEMIE DER ALLERGENE

2.5.1 Antigene und Allergene

Antigene sind Moleküle, die mit Antikörpern reagieren. Ihren Namen verdanken

sie der Fähigkeit, in einem Immunsystem Antikörper zu produzieren. Allerdings

sind nicht alle Antigene in der Lage, eine Antikörperbildung hervorzurufen, so

dass nur die Antigene, die eine Immunantwort hervorrufen können, als komplette

Antigene bzw. Immunogene bezeichnet werden. Einige Substanzen sind zu klein,

um eine immunogene Wirkung hervorrufen zu können, sie werden als in-

komplette Immunogene bezeichnet und können durch Bindung an einen geeig-

neten Carrier die notwendigen Voraussetzungen, in diesem Fall Größe, zur Akti-

vierung des Immunsystems erlangen. Diese, auch als Haptene bezeichneten

Moleküle, können aus den unterschiedlichsten chemischen Stoffklassen stam-

men.

Allergene sind eine Gruppe von Antigenen, die eine unmittelbare Hyperreaktion

im Menschen mit Wechselwirkung von zellgebundenen spezifischen IgE im

Bronchial- und Gastrointestinaltrakt, im Blut, der Haut oder Schleimhäuten her-

vorrufen. Physikochemische Eigenschaften, nach denen Antigene von Allerge-

nen differenziert werden können, existieren allerdings nicht. Im folgenden soll

daher zwischen Antigen und Allergen nicht weiter unterschieden werden.

Allergene besitzen ähnlich den immunogenen Antigenen eine gewisse Größe,

wobei sie zwei Funktionen zur Auslösung einer Allergie erfüllen müssen.

1. In der Sensibilisierungsphase, dem Erstkontakt bzw. „priming“, muss die auf-

genommene Substanz vom Immunsystem als fremd erkannt werden und zur

Produktion von IgE-Antikörpern führen.

2. Bei einem neuerlichen, auch Monate oder Jahre später erfolgten Zweitkontakt

mit dem Allergen muss das Allergen Zugang zu IgE-präsentierenden Zellen

erlangen, um die IgE-Antikörper auf der Zelloberfläche zu vernetzen. Dies

wiederum ist das Signal zur Freisetzung entzündlicher Mediatoren mit der

anschließenden allergischen Symptomatik.

2.5.2 Nomenklatur der Allergene

Die allgemein für Allergene gültige Nomenklaturempfehlung des Subkomitees der

WHO und der International Union of Immunological Societies soll anhand des

Majorallergens der Hausstaubmilbe D. pteronyssinus, Der p 1, verdeutlicht wer-

den [51].

Die Gattung, hier Dermatophagoides, wird mit den ersten drei Buchstaben abge-

kürzt, gefolgt vom Anfangsbuchstaben der Art, hier pteronyssinus, und der Aller-

gennummer. Die Allergennummer wird in der Reihenfolge der Entdeckung des

Allergens vergeben; homologe Proteine verwandter Arten erhalten die gleiche

Nummer. So erhielt das Majorallergen der Hausstaubmilbe D. farinae mit einer

Sequenzhomologenität von über 80 % zu Der p 1, die Bezeichnung Der f 1.

Homologe Allergene verwandter Milbenarten werden in Gruppen zusammenge-

fasst. Die schon erwähnten Der p 1 und Der f 1 bilden u.a. mit ihren Homologen

der Spezies D. microceras und E. maynei, Der m 1 und Eur m 1, die Gruppe 1.

Aus der beschriebenen Sequenzhomologenität resultieren für Allergene gleicher

Gruppenzugehörigkeit sehr große Übereinstimmungen in ihren physikalisch-

chemischen Eigenschaften, z.B. Molekulargewicht und Isoelektrischer Punkt,

sowie ihrer Funktionalität im Milbenorganismus.

2.5.3 Was macht ein Allergen zu einem Allergen?

Neben einer genetischen Prädisposition des Individuums spielen folgende Ei-

genschaften von Allergenen eine Rolle, damit das Allergen auch verborgene Be-

reiche des Immunsystems erreichen kann.

• Eine Mindestgröße von 5-10 kDa sollte gegeben sein. Kleinere Peptide unter

30 Aminosäuren sind nur sehr schwach immunogen und zu hohe Molekular-

gewichte verhindern den Transport durch Haut- und Schleimhautbarrieren.

Die Molekulargewichte der meisten Allergene liegen in der Regel zwischen

10 und 100 kDa, teilweise aber auch erheblich darüber (>250 kDa). Mit an-

steigender Größe wächst auch die Wahrscheinlichkeit, dass als fremd er-

kannte Epitopstrukturen auf der Oberfläche vorhanden sind [10, 52, 53, 54].

• Die Fähigkeit, physikalische Barrieren zu durchdringen, um einen Zugang

zum Immunsystem zu erlangen [52].

• Beim Herauslösen der Proteine aus einer komplexen Matrix, wie z.B. aus den

Kotpellets oder der Abtrennung von luftgetragenen Partikeln spielt u.U. der

hydrophile Charakter, der wiederum in Bezug zum Lösungsverhalten und der

kinetischen Verteilung (aktiver oder passiver Transport, Verteilungsvolumen)

sowie die Stabilität der Allergene eine entscheidende Rolle [52, 53].

• Damit eine allergische Reaktion hervorgerufen werden kann, ist eine Vernet-

zung der an Fcε-Rezeptoren gebundenen IgE-Antikörper an der Oberfläche

von Mastzellen und Basophilen notwendig. Hierzu müssen mindestens zwei

identische zur Erkennung frei zugängliche Epitope vorliegen. Unterschiedli-

che Epitope führen nur zu einer Vernetzung, wenn die entsprechenden IgE-

Antikörper bivalent ausgebildet sind [10].

• Ein komplexer Strukturaufbau fördert die Immunogenität. Polymerisierte Mo-

noaminosäuren sind nicht immunogen, die Kopplung verschiedener Amino-

säuren mit zum Teil großen Unterschieden in ihrem immunogenem Potential

ist unabdingbar [28, 52, 54].

• Die immunogene Potenz einer Aminosäure ist abhängig von der jeweiligen

Seitenkette. Polare Aminosäuren wie die sauren Glutaminsäure, Aspargin-

säure, Cystein, und den sehr basischen Lysin und Arginin sowie den Amino-

säuren mit „bulky“ (großen, raumerfüllenden) Seitenketten bzw. Ringstruktu-

ren wie Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan sind hier zu nennen [54].

• Eine große chemische Differenz des Immunogens zum immunisierten Indivi-

duum, in der Regel durch evolutionäre Differenzierung bedingt, erhöht den

körperfremden Charakter und somit die Möglichkeit vom Immunsystem als

‚fremd‘ erkannt zu werden und eine Immunreaktion einleiten zu können [28,

54].

• Umfaltung und Aggregation können die immunogene Potenz erhöhen oder

erniedrigen [55, 54].

• Das Immunogen muss von Antigen-präsentierenden Zellen (Monozyten und

verwandte Zellen des Immunsystems) zum Teil prozessiert und in Teilstruktu-

ren auf deren Oberfläche präsentiert werden können [11, 53, 54].

2.5.3.1 Some allergens are more major than other - wann ist ein

Protein ein Majorallergen?

Aus allergologischer Sicht bindet ein Majorallergen in mehr als 50 % der getes-

teten Seren von Atopikern spezifisches IgE oder ruft eine Hautreaktion hervor.

Wird in weniger als 10 % der Patienten eine Sensibilisierung nachgewiesen,

spricht man von Minorallergenen. Intermediärallergene sind in der Lage, zwi-

schen 10 und 50 % Sensibilisierung hervorzurufen [11].

Diese Betrachtung basiert auf der Prevalenz der IgE- oder Haut-Reaktivität in

sensibilisierten Individuen gegenüber dem gesamten Extrakt. Diese Betrachtung

ist unscharf, da der Einfluss des einzelnen Allergens im Extrakt nicht berücksich-

tigt wird. Es sollte einen Unterschied ergeben, wenn ein Majorallergen aus dem

Extrakt entfernt wird. Ein Majorallergen ist beispielsweise für 20 % der allergenen

Reaktivität in 20 % der Individuen verantwortlich. Die Allergenität des Restex-

traktes sollte untersucht werden, damit die Potenz, vormals durch das Majoraller-

gen „verdeckter“ Allergene, beurteilt werden kann. Hierzu müssen das Majoral-

lergen aus dem Extrakt oder die spezifischen IgE-Antikörper aus dem Serum

entfernt werden.

Des weiteren ist ein Majorallergen nicht synonym als Hauptallergierisiko zu be-

zeichnen. Patatin ist ein Majorallergen der Kartoffel, aber aufgrund der Exposition

und Verbreitung kein Hauptallergierisiko. Milben Gruppe 1 Allergene bedeuten

ein höheres Allergenrisiko als das Hundemajorallergen Can f 1 [53].

2.5.3.2 Epitope, die aktiven Zentren der Allergene

Die Bindung der IgE und/oder auch IgG-Antikörper an das Allergen erfolgt über

antigene Determinanten, den sogenannten Epitopen. Dabei beruht die Bindung

auf der sterischen Komplementarität, den Wasserstoffbrücken- und Ionenbindun-

gen, den van-der-Waals-Kräften und hydrophoben Wechselwirkungen [56]. Die

Affinität von Antigenen, eine Bindung mit dem entsprechenden Antikörper einzu-

gehen kann daher stark variieren. Homologe Antigene, z.B. spezies-spezifische

Antikörper besitzen die stärkste Affinität. Kreuzreaktive Antigene (heterogene

Antigene), haben gewöhnlich eine geringere Passgenauigkeit bzw. Affinität, die

mit den ursprünglichen Immunogenen nicht identisch, sondern nur chemisch

verwandt sind [54].

Kristallographischen Berechnungen zufolge, ist die bei der Allergen-Antikörper-

bindung benötigte Oberfläche zwischen 54-89 nm2 groß [53]. Ein sphärisches 20

kDa Protein hat eine externe Oberfläche von ca. 500 nm2, die für H2O erreichba-

re Oberfläche beträgt gar 1000 nm2. Die Wechselwirkung mit einem Antikörper

würde somit zwischen 5 und 10 % der Oberfläche eines solchen Proteins okku-

pieren, so dass aus sterischen Gründen nur zwischen fünf und zehn Antikörper

binden könnten.

Ein Epitop besteht aus fünf bis acht L-Aminosäuren, die sich in unterschiedlichs-

ter Form zu einer Antikörperbindungsstelle formieren können. Grundsätzlich wer-

den zwei Arten der Epitopbildung unterschieden [54].

1. Die sequenzielle oder kontinuierliche Anordnung bedeutet eine unmittelbar

benachbarte Position der beteiligten Aminosäuren auf einem Polypeptid-

strang.

2. Als eine konformationsbedingte bzw. diskontinuierliche Struktur bezeichnet

man die aus nicht unmittelbar aneinandergereihten L-Aminosäuren entspre-

chend ihrer Primärstruktur (1D) zusammengesetzte dreidimensionale (3D o-

der Quartärstruktur) Bindungsstelle.

Die Klassifizierung lineares oder konformationelles Epitop wurde linearen Se-

quenzen sowie Informationen aus der gefalteten Form des Allergens im Immu-

noblot entnommen. Auskünfte zur 3D Struktur können so aber nicht gewonnen

werden. Dass überhaupt positive Immunoblotergebnisse erzielt werden konnten,

kann darauf zurück geführt werden, dass viele Proteine sich nach dem Verlust

des SDS aus der Elektrophorese wieder in ihre 3D Struktur zurück falten, spe-

ziell, wenn die Reoxidation von Disulfiden möglich ist [53]. Lineare Peptide erga-

ben selbst in der direkten Inkubation mit T-Zelllinien nur sehr geringe Bindungs-

stärken [57]. Bislang ist mit Par o 1 erst ein lineares Peptid beschrieben worden,

das zu einer erheblichen IgE-Bindung geführt hat [58].

Erst durch den Einsatz kristallographischer Verfahren konnte gezeigt werden,

dass alle betrachteten Proteinepitope konformationeller Struktur sind [53]. An der

Antikörperbindung beteiligte Aminosäuren sind somit über die ganze Sequenz-

kette verteilt. Diese Ergebnisse konnten auch für Milbenallergene, unter anderem

für Gruppe 1 Allergene [59] und Gruppe 2 Allergene [60], schon früh bestätigt

werden. Gleiches gilt für das Gruppe 2 Allergen der Vorratsmilbe L. destructor

Lep d 2 [61].

Hieraus folgt allerdings, dass durch eine Beschädigung der 3D und 4D Struktur

die konformationelle Epitopstruktur nachhaltig zerstört werden kann. Konformati-

onsänderungen (Umfaltung, geringe räumliche Änderungen der Seitenketten der

L-Aminosäuren) können zur biologischen Inaktivierung des Epitopes führen. Des

weiteren kann eine Entfaltung durch Disulfidbindungsspaltungen im Zuge einer

Extraktion der Allergenquelle oder durch proteolytischen und temperaturbeding-

ten Abbau entstehen. Wird die Epitopstruktur hierbei zerstört, kommt es zu einer

entsprechenden Verringerung der allergenen Potenz. Kann ein Epitop durch eine

solche Aufspaltung besser von Antikörperparatopen, den Antigenbindungsstellen

der Antikörper, erreicht werden, kommt es zu einer Verstärkung der Bindungsaf-

finität mit Auswirkungen auf den Ablauf der immunologischen Folgereaktion. Die

sterische Behinderung kann z.B. durch Seitenkettenwechselwirkungen, Ände-

rungen in der 2D Struktur sowie elektrostatischer und/oder Wasserstoffbrücken-

Wechselwirkungen abnehmen. Eine gewisse Grundstabilität konnte aber selbst

für konformationelle Allergenepitope nachgewiesen werden [62].

2.5.4 Struktur und Allergenität

Im folgenden Abschnitt sollen Strukturmerkmale in den verschiedenen Proteindi-

mensionen (1D, 2D, 3D und 4D) hinsichtlich ihres Einflusses auf die Allergenität

betrachtet werden. Einen ersten Exkurs lieferte bereits die Beschreibung der E-

pitopstrukturen, die im Bereich der Tertiär- und Quartärstruktur (3D, 4D) anzusie-

deln ist.

2.5.4.1 Polymorphismus und Isoallergene - Variation einzelner

Aminosäuren in der Primärsequenz (1D)

Als Polymorphismus bezeichnet man das Auftreten von Genomen mit verschie-

denen Allelen in einer Population, die sich durch verschiedenen Aminosäuresub-

stitutionen unterscheiden. Unterschiede der einzelnen Sequenzen bis zu 3 %

werden als Varianten klassifiziert [51].

Untersuchungen zum Polymorphismus der Der p 1 Sequenz aus Milbenkulturen

unterschiedlicher Herkunft auf DNS-Ebene [63] ergaben, dass der Polymorphis-

mus auf einige wenige Aminosäure-Positionen beschränkt war. Bezogen auf die

Herkunft der Milbenkulturen bestanden Unterschiede, die zu einer unterschiedli-

chen Stimulation peripherer T-Zellen führten. Für Der p 2 konnten bezogen auf

das Ausmaß als auch die betroffenen Positionen fast identische Polymorphismen

festgestellt werden [63, 64]. Die Gruppe 3 weist im Vergleich zu den Gruppen 1

und 2 ein sehr abweichendes Spektrum an Variationen auf.

Auffällig ist, dass vor allem die Majorallergene über einen hohen Grad an Poly-

morphismus verfügen. Vermutet wird daher, dass diese Art der Variation eine

Voraussetzung für die Wirkung eines Antigens als Majorallergen ist, denn hier-

durch wird die Anzahl ähnlicher Epitope erhöht, die mit den MHC-Molekülen

(Major Histocompatibility Complex) reagieren können, das wiederum die Zahl der

potentiellen Reaktanden mit dem Allergen erhöht. In dieses Bild fügt sich, dass

die Allergene der Gruppen 1, 2 und 3 in der jeweiligen Spezies durch nur ein Gen

codiert werden. Die Variation liegt somit in den Allelen begründet [65].

Des weiteren konnte festgestellt werden, das niedrig affine Wechselwirkungen

des Allergens mit den MHC- und T-Zell-Antigen-Rezeptoren vermehrt zu einer

TH2-Immunantwort führt und die Exposition gegenüber einer ganzen Bandbreite

an Epitopstrukturen eine höhergradige Sensibilisierung hervorrufen kann.

Auch Unterschiede zwischen Allergenen aus gezüchteten Milbenkulturen und

aus der Natur entnommenen Kulturen wurden nachgewiesen [65]. Es gibt weiter

Hinweise, dass Aminosäuresubstitutionen die Reaktion auf ein Allergen mit be-

einflussen können. So wird die T-Zell-Reaktion gegenüber dem Der p 1 Peptid-

strang 45-60 durch die Aminosäureposition 50 beeinflusst. Dies geschieht aber

nur, wenn die Position 50 durch Tyrosin und nicht Histidin besetzt ist. Tyrosin auf

dieser Position wurde nur bei aus der Natur entnommenen Milben gefunden [65].

Als Isoallergene bezeichnet man die Allergene, die sich durch geringe Differen-

zen in der Primärsequenz des Allergens, wie Polymorphismus und/oder

posttranslationale Modifikationen wie z.B. O- oder N-Glykosylierung einzelner

Positionen, unterscheiden. Posttranslationale Veränderungen können die Aller-

genität durch das Induzieren neuer Epitope, die Beeinflussung der Löslichkeit,

der Größe, der Stabilität und Empfindlichkeit gegenüber Proteasen, verändern.

Die Prozessierung der Allergene durch Antigen Präsentierende Zellen (APC)

kann hierzu führen [53]. Zudem sind die meisten Allergene extrazelluläre Protei-

ne. Damit das Protein aus der Zelle wandern kann, ist die Anwesenheit eines N-

terminalen Leitpeptides notwendig, um das Protein durch die Membran des En-

doplasmatischen Retikulums (ER) zu transportieren. Dieses Protein wird durch

Proteasen im ER abgetrennt. Dies können, wie z.B. bei der Glykosylierung der

Fall, mehrstufige Prozesse sein, in die viele verschiedene Enzyme involviert sind.

Hieraus resultiert häufig eine gewisse Heterogenität der transferierten Proteine.

Eine Glykosylierung scheint allerdings kein Hauptgrund für Allergenität zu sein,

da einige Majorallergene nicht und andere stark glykosyliert sind [53].

Isoallergene sind demnach definierte Allergene mit unterschiedlichem isoelektri-

schen Punkt pI und mindestens 67 % Sequenzhomologie [51]. Isoallergene be-

sitzen sowohl spezifische als auch gemeinsame T-Zell-Epitope. Ein gutes Bei-

spiel hierfür ist Der p 1, von dem bis zu zehn verschiedene Isoallergene mit un-

terschiedlichen isoelektrischen Punkten im pH-Bereich vom 0,7-4,1 publiziert

wurden, wobei alle Variationen die für dieses Allergen spezifischen Epitopstruktu-

ren besitzen. Für Der p 3 werden mindestens acht Isoallergene postuliert [66].

2.5.4.2 Veränderungen der Sekundärstruktur (2D)

Als Sekundärstruktur bezeichnet man „regelmäßige, periodisch wiederkehrende

räumliche Anordnungen benachbarter Aminosäuren in einer Polypeptidkette. Die

wichtigsten Typen von Sekundärstrukturen sind die α-Helix und die β-

Faltblattstruktur.“ [56].

In [53] wurden über 40 verschiedene Allergene hinsichtlich ihrer Sekundärstruktur

in vier Gruppen eingeteilt. Es konnten keinen allgemeingültigen Zusammenhänge

zur Allergenität identifiziert werden.

1. Antiparallele β-Stränge der Immunoglobulinfamilie (Gräserpollen Gruppe 2,

Milbe Gruppe 2) [60, 67], Serinproteasen (Milben Gruppen 3, 6, 9) und Soja-

bohnen Trypsininhibitor (Ole e 1, Gräser-Gruppe 11);

2. Antiparallele β-Faltblattstrukturen mit mindestens einer α-Helix (Baumpollen-

Gruppe 1, Lipocalin, Profilin, Aspartatprotease (Kakkerlake-Gruppe 2));

3. α- und β-Strukturen als nicht unmittelbar assoziierte Strukturformen (Milbe-

Gruppe 1, Lysozym/Lactalbulmin, Wespenallergene);

4. α-Helizes: unspezifische Lipidtransferproteine, Hämoglobin (Insekten), Par-

valbumin (Fisch), Kalmodulin (Pollen), Mellitin (Bienengift), Fel d 1-Kette 1,

Serumalbulmin

Proteine werden zum Teil auch durch das Knüpfen von Disulfidbindungen in ihrer

dreidimensionalen Struktur gefestigt. Milben Gruppe 2 Allergene weisen drei Di-

sulfidbindungen auf. Ein Durchtrennen dieser kovalenten Bindungen bewirkt ei-

nen Abfall der Allergenität, der mit der Anzahl der gekappten Bindungen zunimmt

[68, 62, 69]. Für Lep d 2 wurden ebenfalls drei Disulfidbindungen mit hoher Se-

quenzhomologie für die Aminosäurepositionen identifiziert (zu Der p 2 - 52 % zur

Der f 1 - 57 %) [70]. Die Disulfidbrücken fixierenden Cysteinpositionen, sind in

allen Gruppe 2 Allergenen konserviert [61]. Spezifisches Durchtrennen der Disul-

fidbindungen bei Der f 2 führte zu einem 10-100 fachen Verlust der Hautreaktivi-

tät in Milbenatopikern, aber nicht zu Veränderungen der T-Zellproliferation in vitro

[67, 71]. Derart modifizierte Allergene könnten bei deutlich bis nicht vorhandener

Allergenität, aber gleichbleibender Immunogenität einen lohnenswerten Thera-

pieansatz darstellen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Allergene heterogen und ohne ge-

meinsame strukturelle Merkmale sind. Auch die Überprüfung 150 verschiedener

Allergene ergab keine gemeinsamen Merkmale. Allerdings wird ein Zusammen-

hang zwischen der Funktion und der Allergenität postuliert [72]. Die einzige Ge-

meinsamkeit scheint zu sein, dass sie in der Lage sein müssen, Immun- und

Mastzellen zu erreichen und zu stimulieren. Neben Homologenitäten mit huma-

nen Proteinen scheinen spezifische Eigenschaften für die Ausbildung der Aller-

genität eine entscheidende Rolle zu spielen. Für Nahrungsmittelallergene ist z.B.

die Art der Verdauung, für luftgetragene Allergene die Größe und Löslichkeit

wichtig [53].

2.5.5 Funktion und Allergenität

Der These, dass die Funktion des Allergens einen Einfluss auf seine Allergenität

besitzt, soll anhand der proteolytischen Aktivität einiger Milbenallergene nachge-

gangen werden.

2.5.5.1 Proteaseaktivität

Allergene, vor allem aus Milben- und Schimmelpilzextrakten, besitzen zum Teil

erhebliche proteolytische Enzymaktivität. Diese Eigenschaft führt, verglichen mit

Extrakten nicht proteolytischer Allergene, zu einem erweiterten Wirkspektrum

[73].

Proteasen sind Enzyme, welche die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysie-

ren. Entsprechend ihrem Wirkmechanismus und aktivem Zentrum werden sie in

vier Gruppen eingeteilt: Serin-, Cystein-, Aspartat- und Metalloproteasen. Des

weiteren wird zwischen Endo- und Exoproteasen unterschieden. Endoproteasen

spalten jeweils an spezifischen internen Aminosäuren, Exoproteasen bauen

Proteine vom C- oder N-terminalen Ende ab. [74].

Milbenallergene sind Endoproteasen und gehören zu den Cystein- (Gruppe 1)

und Serinproteasen (Gruppe 3, 6 und 9), wobei Trypsin (Gruppe 3) und Chy-

motrypsin (Gruppe 6) der Milbe die Eigenschaften wie Größe, Aminosäurese-

quenz, Autolysefähigkeit und Substratspezifität mit Säugetierserinproteasen tei-

len. Cysteinproteasen der Gruppe 1 sind die Allergene mit der größten klinischen

Relevanz und stammen aus dem Gastrointestinaltrakt der Milbe [75].

Der Wirkmechanismus ist bei beiden Proteasetypen vergleichbar. Aufgrund der

Nukleophilität der beiden Aminosäuren L-(+)-Serin und L-(+)-Cystein im Über-

gangszustand, kommt es bei der Hydrolyse der Peptidbindung zur Bildung eines

relativ stabilen kovalenten Übergangszustandes. Hierbei spielen pH, Temperatur,

Kinetik und das Verhältnis Enzym zu Substrat eine Rolle [54, 76]. Gelagerte Mil-

benextrakte haben unter Umständen ein anderes Wirkspektrum und eine verän-

derte Allergenität als die native Milbenkultur.

Neuere Untersuchungsergebnisse lassen den Schluss zu, dass neben der ur-

sprünglichen Allergenität die Proteaseaktivität in erheblichem Maß zur allergenen

Potenz beiträgt [77]. Die Bronchialschleimhäute sind der primäre Angriffspunkt.

Physikochemische Eigenschaften, welche die Art und Weise des Kontakts mit

immunkompetenten Zellen (Dendritische Zellen) unter der Epithelschicht beein-

flussen, sind in der Lage, die spezifische IgE-Produktion zu erhöhen. Die proteo-

lytischen Allergene der Milben haben zudem einen direkten Effekt auf das Epithel

und dessen Permeabilität [75, 78], können IgE-unabhängige Mastzelldegranula-

tion bewirken [79] und induzieren die Cytokinfreisetzung [80].

Metalloproteaseinhibitoren verhindern die Histaminausschüttung, so dass eine

Beteiligung dieser Proteaseklasse bei der Entstehung allergischer Reaktionen

vermutet wird [76].

Die Immunisierung von Mäusen mit proteolytischem Der p 1 führte zu einer signi-

fikanten Steigerung der Gesamt-IgE- sowie der Der p 1 spezifischen IgE-

Synthese gegenüber Mäusen, die irreversibel mit Cysteinproteaseinhibitor E-64

geblockt wurden [81]. Auch durch sehr geringe D. pteronyssinus Extraktkonzent-

rationen (für Zelltod und Beschädigung der Epithelzellen zu geringe Dosis)

kommt es zu Leitfähigkeitssteigerungen in den trachealen Epithelzellen von Rat-

ten. Durch spezifische Inhibierung der Proteaseaktivität des Extraktes mit E-64

wurde dieser Effekt aufgehoben [82].

Die Cysteinproteaseaktivität von Der p 1 kann die allergene Potenz dieses Aller-

gens beeinflussen, und zwar durch Spaltung der Rezeptoren (CD 23, CD 25),

durch IgE unabhängige Mastzell-Aktivierung, durch Erhöhung der Epithelzellper-

meabilität und Hemmung endogener Serinproteaseinhibitoren [83]. Des weiteren

wird berichtet, dass die proteolytische Aktivität der Allergene zur Freisetzung von

proinflammatorischen Cytokinen in humanen Bronchial-Epithelzellen führt, ein

diskreter Einfluss auf den intrazellulären Ca-Spiegel besteht, und dass Proteasen

die Fähigkeit besitzen, die Permeabilität der Bronchialschleimhäute und der Ge-

fäße zu verändern [80]. Der p 1 z.B. besitzt eine gemischte Cystein-Serin-

Proteaseaktivität, da verschiedene Peptidbindungen, abhängig von der Reakti-

onsklasse des angebotenen Inhibitors, gespalten werden [77].

Der Vergleich des Der p 1 Sequenzabschnitts Leu147-Gln160 mit den entspre-

chenden Bereichen von Cysteinproteasen anderer Milben, Pflanzen, Menschen

und Parasiten ergab, dass alle Strukturen einen zentralen Tyrosinrest besitzen

[84]. Zur fundierten Bewertung der Kreuzallergenitäten bedarf es allerdings In-

formationen zur 3D-Struktur der Epitope, die aus einem einfachen Sequenzver-

gleich nicht zu gewinnen sind.

Untersuchungen mittels Elektrophorese und Immunoblotting ergaben bei Haus-

staubmilbenextrakten Proteaseaktivitäten im Molekulargewichtsbereich von 45-

66 kDa und schwache Aktivitäten bei 32 kDa. Ein pH-Optimum wurde bei pH 6

gefunden, ein Verlust der Aktivität ab pH 3,5 und 8,5 beobachtet. Die Immunre-

aktion auf polyklonales HSM-Serum ergab Präzpitate bei 200, 110, 65, 60, 43

kDa, wobei die Proteinbande bei 200 kDa die höchste Antigenität aufwies [85].

Das erst in letzter Zeit aus D. farinae entdeckte M177 ist ein proteasesensitives

Allergen. Die Fragmente von M177 besitzen eine höhere allergene Potenz als

das intakte Allergen. [55].

Eine Studie zur Proteaseaktivität von Vorratsmilben berichtet, dass sowohl Serin-

als auch Cysteinproteasen in L. destructor Extrakten vorhanden sind. Die Se-

rinproreaseaktivität ist bei vergleichbarer Cysteinproteaseaktivität gegenüber den

Dermatophagoides spp um den Faktor zwei erhöht. VRM-Extrakte enthalten

Trypsin, Chymotrypsin, Esterasen, Lipasen, Glykosidasen, Cellulasen, Amylasen,

Lysozyme und Chitinasen in unterschiedlicher quantitativer und qualitativer Zu-

sammensetzung [86].

Sollte sich herausstellen, dass die Proteaseaktivität einen Einfluss auf die Aller-

genität hat, so ist das Einbringen von spezifischen, noch zu entwickelnden Inhi-

bitoren vielleicht ein sinnvoller Therapieansatz.

Die meisten Allergene besitzen keine Proteaseaktivität, so dass die entsprechen-

den Milbenallergene einen IgE-fördernden Effekt besitzen. Da die Prevalenz an

Milbenallergien in Gegenden mit niedrigerer Milbendichte nicht unbedingt gerin-

ger ist [53], sollte der Zusammenhang zwischen Enzymaktivität und Allergenität

näher untersucht werden.

N-Glykane

Immunisierung von Tieren mit Pflanzen- oder Insektenallergenen münden oft in

hoch kreuzreaktiven Antikörpern. Ein Grund hierfür können sehr immunogene

und ubiquitär vorhandene N-verknüpfte Zuckerdeterminanten, die N-Glykane,

sein. Sie sind sehr immunogen, da sie mehrere Monosaccharide mit dem Grund-

gerüst in einer Art verknüpft, die bei Säugern unbekannt sind. Antikörper gegen

diese Struktur zeigen ein breites Spektrum an Kreuzallergenität [87, 88, 89].

2.5.5.2 Kreuzallergenität

Kreuzallergenität bedeutet eine gleichzeitige Sensibilisierung gegenüber biolo-

gisch oder chemisch verwandten Substanzen mit einer Teilidentität der allerge-

nen Strukturen, wodurch es schon beim Erstkontakt zu einer allergischen Reakti-

on kommen kann [90]. Die Einschätzung der Kreuzallergenität ist wichtig bei der

Beurteilung der klinischen Relevanz einer Allergenspezies, zur sicheren Dia-

gnostik und zur Einleitung der richtigen Therapie.

Wie kommt es zu Kreuzallergenität?

Sollen Antigen bzw. Allergen und Antikörper mit genügender Affinität reagieren,

so müssen sie eine strukturelle Komplementarität wie Schlüssel und Schloss

oder Abdruck und Matrize aufweisen. Dies bedingt die Spezifität der Bindung.

Ursache hierfür ist, dass die für die Bindung verantwortlichen Kräfte äußerst

schwach und nur auf sehr kurze Distanz wirksam sind. Eine ausreichende Bin-

dungsstärke wird erst erreicht, wenn genügend große Flächen auf den Oberflä-

chen der Antikörper und der Allergene komplementär sind. Neben diesen struktu-

rellen Gegebenheiten müssen diese Flächen mit einer ausreichenden Anzahl

funktioneller, miteinander in Wechselwirkung tretender, Gruppen bestückt sein.

Dies erklärt, dass sehr verschiedene Komponenten durch denselben Antikörper

gebunden werden können und es fließende Übergänge zwischen einer maxima-

len Bindung und einer eben noch ausreichenden Affinität gibt [5]. Antikörper rea-

gieren somit auf spezifische Oberflächenmuster, geprägt durch Struktur und

Funktionalität.

Angewandt auf die allergieauslösende Reaktion zwischen Allergen und spezifi-

schem IgE und/oder den Rezeptoren auf der Oberfläche der Immunzellen be-

deutet dies, dass im Gegensatz zur Allergenität die Kreuzallergenität stark durch

strukturelle Gegebenheiten beeinflusst wird. Allergene sind nur dann kreuzreak-

tiv, wenn sie strukturelle Gemeinsamkeiten haben [53].

Alle bislang in der Literatur beschriebenen Kreuzallergenitäten besitzen Homolo-

gien in der Primär- und Tertiärstruktur und zeigen den gleichen Faltungstyp [53].

Der Umkehrschluss gilt nicht: Eine identische Faltung ist nicht gleichbedeutend

mit Kreuzallergenität. Die Faltung hängt nicht so sehr von der Sequenzhomologie

ab, da identische Faltungen auch mit weniger als 25 % Sequenzhomologie ge-

funden wurden. Die Substitution einzelner Aminosäuren führt eher zur Verände-

rung der Epitopstruktur an der Proteinoberfläche und moduliert so die Allergeni-

tät. Kreuzallergenität unterhalb 50 %iger Sequenzhomologenität ist selten, sie

liegt meistens bei 70 % und darüber [53]. Der erste Schritt zur Bewertung der

Kreuzallergenität ist daher der Vergleich der Proteinfaltung. Ist diese nicht iden-

tisch, so ist eine Kreuzallergenität ausgeschlossen.

Grundsätzlich ist anzumerken, dass der Anteil ähnlicher Allergenstrukturen mit

dem Grad der taxonomischen Verwandtschaft der Milbenarten untereinander

ansteigt. Jede Art besitzt zudem einen spezies-spezifischen Allergenanteil, der

zu eigenständigen Sensibilisierungen führen kann [46, 91]. Die hohe Ähnlichkeit

der Allergenstrukturen der Hausstaubmilben untereinander ist klar aus dem en-

gen Verwandtschaftsgrad innerhalb der Dermatophaginae Subfamilie (D. farinae,

Dermatophagoides pteronyssinus) und zur Subfamilie Pyroglyphinae (E. maynei)

zu erklären. Beide gehören zur gleichen Familie (Pyroglyphidae) und Superfami-

lie (Pyroglyphoidae) (siehe „Biologie der Milben“).

Neben der hohen Kreuzallergenität zwischen einzelnen Hausstaubmilbenspezies

[92, 93] bestehen nur sehr schwache Kreuzreaktivitäten zu den Vorratsmilben

[94, 91]. Eine Studie mit isolierten Allergenen bestätigt die nur geringen Über-

schneidungen [95].

Andere Studien kommen allerdings sehr wohl zu einen hohen Grad an Kreuzal-

lergenität zwischen Vorrats- und Hausstaubmilben [96, 97]. Immunoblotinhibitio-

nen ergaben mindestens eine gemeinsame allergene Komponente zwischen L.

destructor und D. pteronyssinus bei 25 kDa. Um allerdings das Majorallergen von

L. destructor, Lep d 2 (15 kDa) zu 50 % zu inhibieren, müsste theoretisch die

2000 fache Menge an D. pteronyssinus Extrakt zugefügt werden [98]. Hierzu sind

zwei Kritikpunkte anzumerken: Seren unterschiedlicher Herkunft und Beschaf-

fenheit führen ebenso zu unterschiedlichen, nicht vergleichbaren Ergebnissen,

wie die Verwendung komplexer und schwer zu standardisierender Allerge-

nextrakte [47, 99]. Aufgrund begleitender Bestimmung der Allergenmengen in

den Matratzen der Patienten kommt eine spanische Studie zu dem Schluss, dass

es sich eher um Mehrfachsensibilisierungen als um Kreuzallergenitäten zu den

Hausstaubmilben handelt [48].

Vorratsmilben besitzen in hohem Maße spezies-spezifische Allergene, die stark

innerhalb der Vorratsmilben kreuzreagieren [100, 101, 102, 103, 104]. Für L. de-

structor besteht eine besondere Kreuzallergenität zu G. domesticus, die ca. um

den Faktor 1000 höher ist, als zu D. pteronyssinus [105]. Auch die geographisch

weit voneinander entfernt vorkommende Milben Blomia tropicalis (Amerika) und

L. destructor (Europa) zeigen einen erstaunlich hohen Grad an Kreuzallergenität.

Besonders gilt dies für die 14,5 kDa Fraktion aus B. tropicalis mit Lep d 2 [106].

Diese Ergebnisse entsprechen den taxonomischen Gegebenheiten, da Vorrats-

milben einer anderen Superfamilie, den Acaroidea, als die Hausstaubmilben zu-

gerechnet werden. Dies hat zur Folge, dass Vorratsmilben mit ihrem spezifischen

Allergenspektrum gesondert diagnostiziert und therapiert werden müssen.

Studien zur Kreuzallergenität sind sehr schwierig objektiv zu gestalten. Zum ei-

nen erschwert die Verwendung von Gesamtextrakten die Beurteilung der Potenz

des einzelnen Allergens und zum anderen sind die verwendeten Seren mit einer

regionalen Prädisposition gegenüber einer oder mehrerer Milbenspezies belastet.

Die vorherrschende Milbenart der Region ist immer in die Überlegungen mit ein-

zubeziehen, monosensibilisierte Patientenseren wären hier notwendig. Eine Al-

ternative ist die Herstellung monoklonaler Antikörper. Hierbei ist darauf zu ach-

ten, dass alle auf dem Allergen vorhandenen allergenen Determinanten auch

erkannt werden, was das Vorhaben erheblich erschwert. Auch rekombinante Al-

lergene sind hilfreich. Erste erfolgreiche Hauttestungen sind hier bereits erfolgt

[107]. Zu einer abschließenden Betrachtung und Einschätzung der Allergenität

und Kreuzallergenität ist es notwendig, alle relevanten Allergene in ausreichen-

dem Maße vorrätig zu halten. Nur die Kombination mAK mit isoliertem bzw. re-

kommbinantem Allergen ist erfolgversprechend.

Bei mindestens 20 klinisch relevanten Milbenspezies mit jeweils ca. 15 bis 25

verschiedenen Allergenen, bedarf es hier noch viel Forschungsarbeit, zumal zur

Beurteilung der Kreuzallergenität auch die Epitopstruktur bekannt sein sollte.

2.6 KLASSIFIZIERUNG UND BESCHREIBUNG

AUSGEWÄHLTER MILBENALLERGENE

Nach der differenzierten Betrachtung der Struktureigenschaften und der Funktio-

nalität Allergenen, soll nun eine gruppenweise Darstellung der Milbenallergene

vorgenommen werden. Die Tabelle 1 zeigt eine Zusammenfassung.

Gruppe 1

Die zur Gruppe 1 zusammengefassten Allergene wurden anhand ihrer Amino-

säuresequenzen als Cysteinproteasen klassifiziert [108, 63] und weisen eine sehr

hohe Homologie in der Sequenz (80 %) und den chemisch-physikalischen Eigen-

schaften auf [109]. Der p 1 stand als erstes hoch gereinigtes Allergen zur Verfü-

gung und bindet IgE in der Regel in allen getesteten Seren. 50-70 % des gegen-

über einem D. pteronyssinus Extrakt gebildeten IgE ist Der p 1-spezifisch. Die

Anzahl der Aminosäurepositionen, 222 für Der p 1, 223 für Der f 1 und Eur m 1

[63, 109] sowie das gleiche Molekulargewicht von 25 kDa belegen dies [110,

109]. Die isoelektrischen Punkte befinden sich zwischen pH 4,7 und 7,5, ihre IgE-

Bindungsfrequenz im Patientengut liegt bei 80 %. Ein Sequenzvergleich ergab

170 in allen drei Allergenen identisch besetzte Aminosäurepositionen. Die

Cysteinpositionen und die N-glykosylierte Position ist allen Sequenzen gemein

[110], was mit dem gefundenen Kohlenhydratanteil korreliert [75]. Gruppe 1 Al-

lergene sind als Verdauungsenzyme in den Kotpellets angereichert, hitzelabil

und werden bei 80° C bzw. pH 2 oder pH 12 inaktiviert [111].

Gruppe 2

Die Gruppe 2 Allergene zeigen eine Sequenzhomologenität (28 %) mit Epidy-

malenzymen von Wirbellosen und Säugetieren und scheinen bei der Fortpflan-

zung (Der p 2) [112] und/oder der Verdauung (Lep d 2) [113] eine Rolle zu spie-

len. Da Der f 2 an der Oberfläche von E. coli-Bakterien bindet wird vermutet,

dass es Teil des antibakteriellen Abwehrmechanismus der Milbe ist [60]. In ihrer

IgE-Bindungsaktivität von ≥80 % gleichen sie den Gruppe 1 Allergenen [110, 75,

114, 115]. Gruppe 2 Allergene sind hitze- [116] und pH-stabile Proteine [111].

Die Aminosäurensequenzen sind vergleichbar: Der f 2 und Der p 2 je 145/129

(cDNS/nativ) Positionen, Eur m 2 145/123 [110] und Lep d 2 141/125 [117]. Die

Molekulargewichte betragen 14 kDa (Der p 2/Der f 2/Eur m 2) [110] und 13,3 kDa

(Lep d 2) [117]. N-glykosylierte Positionen wurden in keiner, Disulfidbrücken in

allen Sequenzen gefunden. Letztere sind von großer Bedeutung für die Allerge-

nität [68, 62, 69]. Die sechs Cysteinpositionen sind in allen Gruppe 2 Allergenen

der Hausstaubmilben konserviert und bilden die Fixationspunkte für die Disul-

fidbrücken [61, 118].

Die Sequenzhomologenität zwischen Der p 2 und Der f 2 beträgt 88 %. Für Lep d

2 (Der p 2 - 52 %; Der f 1 - 57 %) [70, 119] und Eur m 1 (Der p 2 und Der f 2 – je

84 %) [110] bestehen ebenfalls Überschneidungen zu den beiden Majormilben.

Die Homologenität untereinander (Lep d 2 vs. Eur m 2) beträgt 39 %.

Lep d 2, vormals als Lep d 1 bezeichnet, ist bislang als einziges von bis zu 20

Allergenen [120] aus Lepidoglyphus destructor umfassend charakterisiert. Die

Sequenz ist bekannt [118], genauso wie die Existenz zweier Isoallergene, deren

Sequenz 10 % differiert [119]. Lep d 2 reagiert im Pricktest mit 59 % der L. de-

structor Sensibilisierten [107].

Gruppe 3

Die Gruppe 3 Allergene sind Serinproteasen vom Trypsintyp und scheinen Ver-

dauungsenzyme zu sein, da sie nur in den Ausscheidungen und nicht im Körper

der Milben gefunden wurden [121, 66]. Das Ausmaß der Sensibilisierungsreakti-

on gegenüber der Gruppe 3 wird von niedrig (17 %) [122] bis hin zu 100 % der

Gruppen 1 und 2 beschrieben [123]. Diese widersprüchlichen Ergebnisse könn-

ten unter anderem in der unterschiedlichen Reinheit der untersuchten Allergene

begründet sein. Die Molekulargewichte der Gruppe 3 Allergene bewegen sich

zwischen 28 kDa und 34 kDa (SDS-Page), die isoelektrischen Punkte für D. pte-

ronyssinus zwischen pH 3,7 und 7,4. Aus D. farinae konnten nur zwei Isoformen

mit pI 4,2 und 4,4 isoliert werden [66]. Der Einzelvergleich von Der p 3, Der f 3

und Eur m 3 ergab 81 % Sequenzhomologenität, innerhalb der Gruppe 75 %

[75].

Gruppe 4

Der p 4 wurde als α-Amylase identifiziert [124] und bindet IgE in 46 % der Er-

wachsenen und 25 % der Seren atopischer Kinder. Die Molekulargewichte liegen

zwischen 56 und 60 kDa, die isoelektrischen Punkte von Der p 4 befinden sich

zwischen pH 5 und 7 [75].

Gruppe 5

Für Der p 5 konnte eine aus 132/112 Aminosäuren (cDNS/nativ) bestehende

Sequenz und ein Molekulargewicht von 15 kDa (SDS) bestimmt werden, die we-

der N-glykosylierte Positionen noch Cystein aufweist [125]. Aus kommerziell er-

hältlichen Milbenkulturen wurden fünf unterschiedliche Der p 5 Klone ermittelt,

die im Gegensatz zu den Majorallergenen der Gruppen 1, 2 und 3, nur eine ein-

zige Aminosäurevariation enthielten [75]. Der f 5 und Der p 5 induzieren in über

50 % der Patientenseren eine IgE-Bindung [126]. Das jüngste Allergen dieser

Gruppe, Lep d 5 (110 Aminosäuren/ 12,5 kDa), zeigt lediglich 9 % IgE-Bindung.

Die für diese Gruppe geringe Bindungsfrequenz liegt vermutlich darin begründet,

dass zur Bestimmung ein kloniertes Protein verwendet wurde. Sequenzhomol-

gien von Lep d 5 bestehen mit Blo t 5 (46 %) und Der p 5 (36 %) [127].

Gruppe 6

Die Serinproteasen [75] der Gruppe 6 Allergene wurden mit einem Molekularge-

wicht von 25 kDa aus D. pteronyssinus und D. farinae isoliert [128]. Die je 231

Positionen langen Sequenzen weisen eine Chymotrypsin-Substratspezifität bei

einem pI von pH 5,2 auf. Sie sind serologisch nicht mit den Gruppe 3 Trypsinen

verwandt, was auch in der niedrigen Sequenzhomologenität mit Der p 3 (37 %)

zum Ausdruck kommt [129]. Die Allergene der Gruppe 6 reagieren mit ca. 40 %

der Patientenseren bei mittlerer Affinität [128, 75].

Gruppe 7

Gruppe 7 Allergene (Der f 7, Der p 7 und Lep d 7) binden in ca. 50-60 % der Pa-

tientenseren spezifisches IgE, dessen Titer unter Umständen über dem der

Gruppe 2 Allergene liegen kann [130]. Der p 7 besitzt 215/198 (cDNS/natives

Protein) Aminosäuren und ein Molekulargewicht von 22.2 kDa. [131]. Der f 7 be-

steht aus 213/193 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 22.4 kDa mit

86 % Sequenzhomologie zu Der p 7 [132]. Beide Proteine besitzen keine

Cysteinpositionen sowie nur eine isolierte N-glykosylierte Position.

Das native Lep d 7 besteht aus 197 Aminosäuren bei einem Molekulargewicht

von 22 kDa, besitzt weder eine Cysteinposition noch, im Gegensatz zu den restli-

chen Vertretern der Gruppe 7, eine N-glykosylierte Position. Sequenzhomologien

bestehen zu Der p 7 (29 %) und Der f 7 (27 %) [133].

Die Besonderheit der Gruppe 7 Allergene sind ihre multiplen Banden in der Im-

mundetektion. So reagieren Antikörper gegen das rekombinante Der p 7 mit

Komponenten der Größe 24, 27 und 29 kDa, alle größer als das mature Protein

[134]. Mindestens 6 Isoallergene mit pI zwischen pH 5,6 und 6 und Molgewichten

um 25, 30 und 31 kDa wurden identifiziert. Es handelt sich vermutlich um glyko-

sylierte Varianten der 22 kDa Allergene [130, 135]. Fragmente existieren bei

11,5, 13 (Der p 7) [132] und 18 kDa (Der f 7) [135].

Gruppe 8

Der p 8 besteht bei einem Molekulargewicht von 26 kDa aus 219 Aminosäuren

(cDNS) und reagiert mit ca. 40 % der Patientenseren [136]. Sequenzhomologien,

wenn auch nur geringe, zu Glutathion-S-Transferasen aus anderen, nur weitläu-

fig verwandten Allergenquellen wie z.B. dem Bla g 5 der Kakerlake Blatella ger-

manica, lassen einen grundsätzlich allergenen Charakter dieser Enzymklasse

vermuten [75].

Gruppe 9

Der p 9, eine Serinprotease, bindet ähnlich Der p 3 in 80 % der Patientenseren

IgE, aber mit niedrigerer Bindungsaffinität. Die anti-Der p 9 Reaktivität von IgE in

Patientenseren korrelierte mit der Reaktivität von Der p 2 und Der p 6, wobei al-

lerdings durch RAST-Inhibierung nur eine sehr geringe Kreuzallergenität festge-

stellt werden konnte. Ein weiterer Unterschied zu den Gruppen 3 und 6 ist die

collagenolytische Aktivität von Der p 9. Das Molekulargewicht von Der p 9 beträgt

24 kDa [137, 75].

Gruppe 10

Für Der f 10 wird eine zu Der f 1 vergleichbare Reaktivität angegeben [138], an-

dere Arbeiten berichten von geringeren Reaktionen (50 %) mit unterschiedlicher

Bindungsaffinität [126]. Bei 3 von 31 Personen wurden hohe IgE-Titer gegenüber

Der f 10, aber keine Bindung zu Der f 1 und/oder Der f 2 festgestellt. Der p 10

und Der f 10 zeigen 98,5 % Sequenzhomologenität. Der f 10 besteht aus 284

Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 33 kDa [75].

Erste Hinweise zu einem Gruppe 10 Allergen aus L. destructor (Lep d 10) mit 34-

39 kDa [139, 140, 127] und 46,5 % RAST-positiven Patientenseren [141] liegen

vor.

Die Allergene der Gruppe 10 gehören zu den Tropomyosinen der Wirbellosen (75

% Sequenzhomologie) [75] und besitzen eine in der Evolution hoch konservierte

Aminosäuresequenz, was sich auch in Kreuzreaktionen mit nicht-Milben-

Tropomyosinen zeigt [138]. Es wird eine dimere coiled-coil-Struktur für Tropo-

myosine beschrieben [142].

Gruppe 11

Der f 11 ist ein Paramyosin, ein strukturelles Muskelprotein bei Wirbellosen, mit

einem Molekulargewicht von 98 kDa und bindet IgE in ca. 80 % der Patientense-

ren mit hoher Affinität und Frequenz [143]. Ähnlich den Tropomyosinen (Gruppe

10) besteht Paramyosin aus zwei identischen coiled-coil α-Helizes, wird, anders

als Tropomyosin, nur in Insekten gefunden und ist ein bekanntes Immunogen

[144].

Gruppe 12

Ein Vertreter der Gruppe 12 ist bislang nur in Blomia tropicalis identifiziert wor-

den. Blo t 12 besitzt 144/124 Aminosäuren (cDNS/nativ) und ein Molekularge-

wicht von 14.2 kDa. Eine N-glykosylierte Position wurde nicht gefunden, die IgE-

Bindungsfrequenz wird mit 50 % angegeben [145].

Gruppe 13

Die Gruppe 13 wird durch Allergene aus B. tropicalis (Blo t 13), Acarus siro (Aca

s 13) und L. destructor (Lep d 13) vertreten. Bei Blo t 13 handelt es sich um ein

130 Aminosäuren großes Protein mit einem Molekulargewicht von 14.8 kDa und

einer IgE-Bindungsfrequenz von 11 % [146]. Hierzu passend besteht Lep d 13

aus 131 Positionen bei einem Molekulargewicht von 14.6 kDa und besitzt weder

N-glykosylierte- noch Cysteinpositionen. Isoformen werden nicht vermutet, die

IgE-Bindungsfrequenz in Lepidoglyphus sensibilisierten Patienten liegt bei 13 %.

Homologien der Sequenz bestehen mit Blo t 13 (78 %) und Aca s 13 (60 %)

[127].

Gruppe

Allergen

Spezies

Molekulargewicht

[kDa]

IgE-Bindungsfrequenz

[%]

Aminosäurepositionen

Isoelektrischer Punkte

[pH]

Funktion

1Der p 1

Der f 1

D. pteronyssinus

D. farinae

~80

222

223

4,7–

7,5

Cysteinproteasen

2Der p 2

Der f 2

Lep d 2

D. pteronyssinus

D. farinae

L. destructor

13,3

>80

~60

129

125

6,6 Fortpflanzung

Bakterielle Abwehr

Verdauung

3Der p 3

Der f 3

D. pteronyssinus

D. farinae

28 - 34 17 -

>80

233 3,7–

7,4

4,2–

4,2

Serinproteasen vom

Trypsintyp

4Der p 4

Der f 4

D. pteronyssinus

D. farinae

56 - 60 25-46 5-7 α-Amylase

5Der p 5

Der f 5

Lep d 5

D. pteronyssinus

D. farinae

L. destructor

12,5

>50

~10

112

110

6Der p 6

Der f 6

D. pteronyssinus

D. farinae

~40 231

231

5,2 Serinproteasen;

Chymotrypsin-

Substratspezifisch

7Der p 7

Der f 7

Lep d 7

D. pteronyssinus

D. farinae

L. destructor

50-60 198

193

197

5,6-7 Multiple Banden in

Immundetektion

(11,5, 13, 24, 27, 29,

30, 31 kDa)

8Der p 8 D. pteronyssinus 26 ~40 219 4,8;

7,8

Glutathion-

Transferase

9Der p 9 D. pteronyssinus 24 ~80 284 Serinproteasen; Col-

lagenase

10 Der p 10

Der f 10

Lep d 10

D. pteronyssinus

D. farinae

L. destructor

34 - 39

50–80

~50

~280

284

Tropomyosine

11 Der f 11 D. farinae 98 ~80 Paramyosin

12 Blo t 12 B. tropicalis 14 ~50 124

13 Blo t 13

Lep d 13

B. tropicalis

L. destructor

14,8

14,6

~11

~13

130

131

14 Der f 14

(M177)

D. farinae + D.

pteronyssinus

189

(cDNS)

~65 Apolipoporin ähnlich

14b MAG51

MAG3

D. farinae + D.

pteronyssinus

39 Glutathion-

Transferase

M177 Fragmente

Keiner Gruppe zugeordnet

MAG29 D. farinae 67 ~10 145

?L. destructor 79 + 93

∑ 172

Tabelle 1 – Klassifizierung der Milbenallergene der untersuchten Spezies D. pteronyssinus

und L. destructor sowie einiger anderer wichtiger Milbenarten.

5 Mite Antigen Gen

Gruppe 14

Ein zunächst als M177, inzwischen als Der f 14 bezeichnetes Allergen, konnte

aus D. farinae rief bei ca. 65 % der getesteten Milbenallergiker spezifische IgE-

Reaktion hervor [133]. Aufgrund proteolytischen Abbaus konnten in gelagerten

Extrakten nur noch geringe Konzentrationen nachgewiesen werden. Zudem war

die Allergenität der Fragmente im Vergleich zum „Mutterallergen“ erhöht [55].

Weitergehende Untersuchungen mittels cDNS-Klonierung ergaben ein Polypeptid

mit 1.650 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 189,5 kDa [147]. Die

bislang als eigenständig geführten Allergene MAG 1 (39 kDa Gluthation-S-

Transferase) [148] und MAG3 wurden als M177-Fragmente eingestuft [147]. E.

maynei und D. pteronyssinus exprimieren die homologen Sequenzabschnitte

(MAG1, MAG3) und das M177-Äquivalent mit über 80 % Sequenzhomologie

[147, 149]. Die Sequenz besitzt große Ähnlichkeit zu den Apolipoproteinen der

Insekten, einer hydrophoben Proteinklasse aus den Lipidtransportvesikeln des

haemolymphischen Systems („Insektenblut“).

Bislang nicht eindeutig zugeordnete Allergene

MAG 29 wurde als ein 67 kDa Allergen aus D. farinae Extrakten (whole mite bo-

dy) mit 145 Aminosäuren und sehr geringer IgE-Bindungsfrequenz (9,8 %) iden-

tifiziert. Es weist Ähnlichkeiten (65,4 %) zu HSP 71 aus der Familie der HSP 70-

Proteine auf [138]. Möglicherweise wird es zukünftig als Der f 15 klassifiziert.

Ein hochmolekularer dimerer Proteinkomplex, bestehend aus einem 79 kDa und

einem 93 kDa Fragment, wurde aus L. destructor identifiziert [140] und konnte im

Frontbereich des Exoskeletons der Milbe lokalisiert werden. In den Kotpellets

gelang mit monoklonalen Antikörpern kein Nachweis [113]. Eine Klassifizierung

wurde noch nicht vorgenommen. Das 93 kDa Fragment passt hinsichtlich des

Molekulargewichts in die Gruppe 11, das 79 kDa Fragment kann aufgrund der

Größe keiner Gruppe zugeordnet werden. Die Summe von 172 kDa lässt wieder-

um die Gruppe 14 interessant erscheinen.

2.7 ALLERGENEXTRAKTE

Allergenextrakte (siehe Motivation und Zielsetzung) sind im Gegensatz zu syn-

thetisch hergestellten chemischen und gentechnologischen Arzneimitteln kom-

plexe Mischungen aus Proteinen, Glykoproteinen und anderen potentiell allergie-

auslösenden bzw. irritierenden Komponenten. Sie werden in verschiedenen Be-

reichen der Diagnostik und Therapie allergischer Erkrankungen eingesetzt. So

sind pulverförmige, wenig aufgereinigte oder in Glycerol eingebundenen Allerge-

ne zur Kutantestung, hochaufgereinigte, gut charakterisierte und sterilisierte Lö-

sungen zur Prick- und Provokationstestung (nasal und bronchial) bekannt sowie

individuell eingestellte Therapielösungen.

2.7.1 Bedeutung in der Diagnostik

Allergenextrakte in der Diagnostik werden in-vivo von der Epikutantestung, über

subkutane Prick- und Scratchtestung, bis hin zur nasalen und bronchialen Provo-

kationstestung eingesetzt. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die in-vitro-

Testung in Forschung und Praxis, angefangen von Lösungen zur RAST/EAST-

Klassenbestimmung und RAST/EAST-Inhibition zur Bestimmung des allergi-

schen Potentials, bis hin zu einem breiten Spektrum immunologischer Verfahren

(Immunoblotting und Elektrophoresen). Idealerweise müssen Extrakte zur Dia-

gnostik vor allem

• verfügbar sein, d.h. die allergene Quelle muss reproduzierbar aufgeschlossen

werden und applizierbar sein,

• frei von Fremdallergenen und anderen Komponenten (Schwermetalle, Toxi-

ne, Farbstoffen) sein,

• definierte Mengen der einzelnen, klinisch relevanten Allergene (Major- oder

Intermediärallergen) in nativer, biologisch aktiver und stabilisierter Form ent-

halten.

Heutige Testextrakte enthalten Mischungen allergener Komponenten einer Aller-

genquelle. Extrakte der Hersteller differieren u.a. aufgrund unterschiedlicher

Rohkulturen (Milben) und Verarbeitungsprozeduren in ihrer Zusammensetzung

(qualitativ und quantitativ). Ergebnisse können so falsch negativ oder falsch posi-

tiv erscheinen. Die größten Probleme bereitet es, allergene Proteine in ausrei-

chender Menge zu isolieren, zu stabilisieren und deren biologische Aktivität zu

erhalten.

2.7.2 Bedeutung in der Therapie

Derzeit kann weder die genetische Veranlagung therapeutisch gezielt vermindert

noch die Allergenexposition wirksam verhindert werden. Mit Hilfe der Immunthe-

rapie können eine Verminderung der Symptome oder eine spezifischen Toleranz

gegenüber einem Allergene erzielt werden. In der Therapie existieren drei auf

immunologischen Reaktionen basierende Konzepte, welche die Bereitstellung

verschiedenster Formen von Allergenextrakten erfordern.

1. Peptidtherapie mit Allergoiden

2. Unspezifische passive Immuntherapie durch anti-IgE-Antikörper

3. Allergen-Antikörper-Reaktion der spezifische Immuntherapie (SIT)

2.7.2.1 Peptidtherapie mit Allergoiden

Allergoide sind an anorganischen Trägern immobilisierte immunogene Aller-

genfragmente. Diese Peptide sind Produkte des proteolytischen Abbaus der Al-

lergene durch APC und deren Epitope bestehen aus einer linearen Kette von 10

bis 25 Aminosäuren [16]. Sie besitzen nicht mehr die Konformation des nativen

Moleküls, sondern sind flexibel, zumal durch die Bindung an die MHC-Klasse II

Moleküle eine abweichende räumliche Struktur entsteht [150]. Die Peptide wer-

den in Kombination mit den MHC-Klasse II-Molekülen von den spezifischen T-

Zellrezeptoren erkannt. T-Zellepitope sind sequenzabhängige Epitope, B-

Zellepitope sind hingegen konformationsabhängige Epitope mit mindestens 16

Aminosäuren [78].

Ziel ist es, zur Modulation der TH-Lymphozytenantwort nur die Anteile der Aller-

genmoleküle zu präsentieren, die T-Zellepitope tragen. IgE-bedingte Nebenwir-

kungen bzw. die allergischen Symptome, sind aufgrund der zerstörten oder nicht

vorhandenen B-Zellepitope stark reduziert. Allergoide besitzen eine deutlich nied-

rigere Allergenität, d.h. Bindungsaffinität zu spezifischen IgE, und weisen im Ver-

gleich zu nativen Allergenen im EAST-Hemmtest erst bei 100- bis 1000 fachen

Konzentrationen vergleichbare Hemmwerte (50 %) auf [16]. Die Formulierung

erfolgt durch Denaturierung, kovalente Kopplung an Formaldehyd, Glutaraldehyd

oder synthetische Polymere (PEG, Kopolymere aus D-Glutaminsäure und D-

Lysin) [151].

Gravierender Nachteil der Methodik ist, das T-Zellepitope HLA-Typ abhängig sind

und jedes Allergen von mehreren T-Zellepitopen erkannt wird. Diese Vielfalt be-

dingt, dass ein Cocktail aus mehreren Peptidfragmenten verabreicht werden

muss [150, 11]. In welchem Ausmaß Allergoide zur Hyposensibilisierung einge-

setzt werden können, muss in jedem Einzelfall überprüft werden.

2.7.2.2 Unspezifische passive Immuntherapie durch anti-IgE-

Antikörper

Die neuste Therapieentwicklung sind anti-IgE-Antikörper. Diese binden dosisab-

hängig an alle freien IgE-Antikörper aus der Blutbahn am selben Epitop wie der

hoch affine FcεRI-Rezeptor und werden als Immunkomplexe durch die Nieren

ausgeschieden. IgE bildet sich in einem Zeitraum von zwei bis drei Wochen im

gleichen Umfang zurück, eine erneute Applikation wird hierdurch notwendig. Es

wird nur freies IgE und kein zellfixiertes IgE gebunden, so dass die allergene

Persistenz erhalten bleibt. Die Minderung der Symptome erfolgt durch eine her-

abgesetzte Produktion von FcεRI-Rezeptoren auf der Mastzelloberfläche [152].

Die Präparate sind in der klinischen Testung und bewirken dort eine erhebliche

Reduzierung in der oralen und inhalativen Gabe von Kortikosteroiden. Aufgrund

des kurzen Wirkzeitraums wird vor allem eine Anwendung in der saisonalen Al-

lergie (Pollen) gesehen. Aussagen zu langfristig auftretenden Nebenwirkungen

sind noch nicht möglich, systemische klinisch relevante Nebenwirkungen in Zu-

sammenhang mit einer Kurzzeitgabe wurden nicht beobachtet [153]. Zur Zeit

bleibt die Methode deshalb auf kurze saisonale Allergieformen bei Patienten mit

einem starken Krankheitsbild und Mehrfachsensibilisierungen beschränkt [154].

2.7.2.3 Spezifische Immuntherapie (SIT)

Die klassische Variante der Immuntherapie ist die sog. spezifische Immunthera-

pie (SIT), auch als Hyposensibilisierung bezeichnet. Durch die Applikation (sub-

kutan oder sublingual) ansteigender Mengen eines definierten Allergenextraktes

kommt es zu einem Wechsel der Immunantwort von TH2 zu TH1. TH-Zellen von

Allergikern reagieren auf niedrige Allergendosen mit der Produktion eines TH2-

Zytokinmusters (IL-5), mit zunehmender Allergenkonzentration erfolgt eine Ver-

schiebung zu einem TH1/TH0-Muster (IFN-γ). Es erfolgt zunächst ein Anstieg

und dann ein langsamer Abfall der IgE-Konzentration bei gleichzeitigem Anstieg

des spezifischen IgG-Titers [155]. Der Nachteil der SIT ist, das eine Besserung

der allergischen Symptome erst durch der Gabe hoher Allergenmengen, verteilt

über einen längeren Zeitraum, eintritt. Der therapeutische Einsatz hoher Aller-

gendosen wird aber durch die IgE-bedingten Nebenwirkungen, von der lokalen

Reaktion bis hin zur systemischen und unvorhersehbaren Anaphylaxie, begleitet

[156].

2.7.3 Herstellung von Allergenextrakten – eine Übersicht

Aufgrund der Verschiedenartigkeit allergener Komponenten soll im folgenden ein

detaillierter Überblick der biochemischen Grundlagen zur Extraktherstellung ge-

ben werden.

Ausgangsmaterial zur Herstellung von Milbenextrakten sind entweder „Whole

Mite Cultures“ (WMC), bestehend aus Milbenkörpern, Kotpellets und Resten des

Futtermediums, letzteres in möglichst geringem Ausmaß, oder „Purified Mite Bo-

dys“ (PMB), isolierten Milbenkörpern. Wird eine WMC verwendet, ist die Aller-

genzusammensetzung des Extraktes von der Wachstumsphase der Entnahme-

kultur abhängig. Mit ansteigender Kulturzeit wird zunehmend Futtermedium durch

eine anwachsende Milbenzahl verstoffwechselt. Dies bedeutet neben dem ab-

nehmenden Futteranteil eine steigende Anzahl an Milben (lebend und tot) sowie

Stoffwechselprodukten in Form von Kotpellets [157]. Hierdurch verändert sich die

Gewichtung vor allem der Majorallergene der Gruppen 1 und 2 zueinander [158].

Während die Quantität der Gruppe 2 Allergene durch die Anzahl der Tiere be-

grenzt ist, kumuliert die Menge der in den Ausscheidungen der Milben befindli-

chen Gruppe 1 Allergene während der gesamten Kulturzeit und erreicht zum En-

de ein Maximum.

Auch regionale Unterschiede müssen bedacht werden. So sind in Japan ca. 80

% der Milbenatopiker gegen das Minorallergen Der p 10, einem Skeletonprotein

aus der Tropomyosinfamilie sensibilisiert. Pricktestungen werden meistens aus

WMC (Milbenkörper und Exkremente) hergestellt. Verwendet man hingegen nur

PMC als Rohmaterial, so kann der Der p 10 Wert auf das 1000 fache ansteigen

[158] und der im Extrakt enthaltene Anteil der Gruppe 1 Allergene ist im Vergleich

zum Gruppe 2 Anteil sehr viel geringer als bei einem WMC Extrakt, da nur die in

den Verdauungsorganen der Milben befindlichen Gruppe 1 Allergene zur Verfü-

gung stehen. Vergleichbares gilt für viele Milbenallergene [159].

Die Extraktion findet in wässrigen Medien mit relativ moderaten Salzfrachten zur

Pufferung des pH-Wertes statt. Geeignete Puffersysteme sind 0,1 M PBS, pH

7,4, also Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 0,125 M Ammoniumhydrogencar-

bonat pH 7,9 oder auch Cocas Lösung (0,1 M NaCL; 0,03 M NaHCO3 ohne Phe-

nolzusatz) pH 8,2. Es können auch weit geringere Salzfrachten, z.B. 0,01 M, ein-

gesetzt werden [160].

Übliche Extraktionszeiten betragen zwischen 6 und 14 h bei 4° C, wobei ein Op-

timum aus Ausbeute, Reproduzierbarkeit und Stabilität der Proteine gefunden

werden muss. Allergene beginnen aufgrund ihres hydrophilen Charakters unmit-

telbar aus der Allergenquelle in das Extraktionsmedium zu wandern. Schon nach

5min wird bis zu 30 %, nach 30 min gar bis zu 50 % der allergenen Gesamtakti-

vität des Extraktes erreicht. Hierbei wird allerdings nur ein Bruchteil der Gesamt-

proteinmenge aus der Allergenquelle überführt. Eine quantitative Ausbeute ist je

nach Ausgangsmaterial nach 24 bis 48 h erreicht. Reproduzierbare Extrakte, d.h.

mehrere Extrakte aus der gleichen Charge mit dem Ziel gleichförmiger Ergebnis-

se, sollten mindestens vier Stunden andauern [157].

Die Abtrennung der Milbenkörper, Kotpellets und restlichen Futterpartikel erfolgt

durch Zentrifugation und Filtration, mit der gleichzeitig eine Sterilisation vorge-

nommen wird. Eine Abgrenzung zum niederen Molekulargewichtsbereich wird

durch eine Dialyse oder Ultrafiltration mit einer Ausschlussgrenze von 500 –

3.000 Da erreicht. Alternativ kann nach der Zentrifugation auch eine Aufreinigung

des Extraktes mittels Säulenchromatographie erfolgen. Auch hier ist je nach Zie-

lallergen ein Optimum zu ermitteln.

Die Stabilisierung der aufgereinigten Extrakte kann durch Lyophilisation und an-

schließender Lagerung bei –20 bis +4° C oder alternativ durch Behandlung mit

Stickstoffkälte und/oder bei –80° C erreicht werden. Ein Optimum ist auch hier

Problembezogen zu ermitteln, da es zu Veränderungen und Schädigungen der

allergenen Quartärstruktur kommen kann [111].

2.7.4 Stabilisierung von Allergenextrakten

Unter der Annahme, dass alle biologisch aktiven Proteine im Extrakt zusammen

eine „Quartärstruktur“ durch diskrete Assoziation zu größeren biochemisch akti-

ven Proteinen bzw. Aggregaten aufbauen, oder im Zusammenspiel mit einzelnen

Proteinen eine vielfältige biologische Wirkung induzieren, können die Gründe für

eine Schädigung dieser „Quartärstruktur“ (4D) und somit der Verlust der biologi-

schen Aktivität unterschiedlicher Natur sein. Danach richten sich die Möglichkei-

ten, solche „Quartärstrukturen“ zu stabilisieren.

Die native Quartärstruktur eines Proteins ist die biologisch aktive Form. Sie wird

durch nicht kovalente Wechselwirkungen wie hydrophobe und ionische Wech-

selwirkungen sowie Wasserstoffbrückenbindungen gestaltet. Bei einem zusam-

mengesetzten Protein mit gleichen oder verschiedenen Untereinheiten („subu-

nits“), z. B Strukturen der Form α2, α2β2, (αβγ)2 mit definierter Symmetrie, z.B.

D1, D2 oder Cn etc., ist die biologisch aktive Form streng an diese Symmetrien

gebunden. Diese Strukturen werden im allgemeinen als Quartärstruktur (4D) be-

zeichnet. Im Gegensatz zu den anderen, bekannten Proteinstrukturen, welche

die aminosäure-spezifische Sequenz (1D), ihre Sekundärstuktur (2D) bzw., die

dreidimensionale Faltung (3D) beinhalten, ist die 4D Struktur je nach Ausgestal-

tung der Berührungsflächen (heterolog vs. homolog) der Untereinheiten durch

nicht kovalente Bindungen charakterisiert [56].

Insbesondere aufgrund der verschiedenen Wechselwirkungen, sind die Gründe

für eine Schädigung der Quartärstruktur und dem damit verbundenen möglichen

Verlust der biologischen Aktivität vielfältig:

• Aggregation und Dissoziation;

• Autolyse;

• Endogene und exogene Proteolyse;

• pH-Extrema;

• Oxidation bzw. Reduktion;

• Temperatureinflüsse;

• Mechanische Beanspruchung;

• Oberflächenaktive Verbindungen, z.B. Detergenzien;

• Organische Lösungsmittel, z.B. unpolare Lösungsmittel, oder DMSO.

Die Protein-Stabilisierung spielt für Allergenextrakte eine entscheidende Rolle.

Die Vielzahl der im Extrakt vorkommenden Proteine, die zum Teil sehr ähnlichen

Strukturen, Sequenzen und Molekulargewichtsverteilungen, sind von großer Be-

deutung hinsichtlich Stabilität, Standardisierung, Haltbarkeit und biologischer

Aktivität bzw. als Zulassungskriterien für Behörden.

Durch die Verwendung verschiedener Salze können Proteine in ihrer aktiven

Form stabilisiert werden. Eine Unterteilung der Salze erfolgt nach der Hofmeis-

ter-Serie, wobei Anionen und Kationen auf der linken Seite eine Stabilisierung

bewirken.

SO42- > CH3COO- > CL- > Br- > NO3- > ClO4- > I- > SCN-

NH4+ > K+ > Na+ > Cs+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+

So kann es unter anderem zu einer Reduzierung der Löslichkeit der hydropho-

ben Gruppen durch die Erhöhung der Ionenstärke kommen [74]. Es erfolgt die

Bildung von H2O-Clustern an der Oberfläche oder in Taschen des Proteins, was

zu einem Verlust an Freier Energie (∆G) des Systems und einer Entropieabnah-

me des H2O führt. Die Reduzierung der Freien Energie (∆G) bei gleichzeitiger

Entropieabnahme (∆S) des Wassers führt zur Bildung von quasi-kristallinen

Wasserstrukturen (Scherkräfte, Hydromechanik, Ultraschall, Schütteln) insbe-

sondere an der externen Oberfläche des Proteins (1. Schicht). Die zweite H2O-

Schicht ist wesentlich mobiler als die erste H2O-Schicht, so dass es zum Aus-

tausch mit dem Wasser des Mediums („bulk water“) kommen kann. Diese Schicht

ist besonders empfindlich gegenüber Scherkräften, da sie eine Relaxationszeit

besitzt, die in der Nähe der Relaxationszeit des Proteins liegt, daher von der

Form, Größe und ersten Hydratation abhängig ist und somit die Kompaktheit des

Proteins oder Makromoleküls gewährleistet. Diese zweite Wasserschicht ist da-

her unter anderem angreifbar gegenüber Alkoholen, z.B. Methanol, Ethanol, Gly-

cerol, oder Aceton, und kann unter Umständen zur irreversiblen Entfaltung des

Proteins über die Zeit führen. Deshalb werden zur Stabilisierung bzw. Lagerung

von Proteinen, außer Glycerol, Alkohole wenig bis gar nicht eingesetzt.

Anionen und Kationen auf der rechten Seite der Hofmeister-Serie destabilisieren

und entfalten die Proteine durch Bindung an geladene Seitenketten der Proteine,

z.B. Glutamin- oder Asparaginseitenkettenreste, und verändern das Dipolmoment

unter Umständen erheblich, wodurch die Zahl der Wassercluster um die Proteine

verringert wird. Ein ansteigender Salzgehalt (Ionenstärke) einer wässrigen oder

gepufferten Proteinlösung bewirkt eine Reduzierung der geordneten Wasserhülle

und in der Folge werden hydrophobe Bereiche exponiert (Umfaltung). Proteine in

wässriger Lösung interagieren bei ansteigendem Salzgehalt über hydrophobe

Oberflächenbereiche mit sich selbst, ohne dabei ihre Hydratationshülle zu verlie-

ren, so dass sie schließlich (reversibel) ausfallen (Aussalzeffekt) [161].

Des weiteren können Salze Pufferfunktionen übernehmen und vermeiden somit

extreme pH-Wertänderungen. Niedrige pH-Werte unterhalb des isoelektrischen

Punktes des Proteins führen unter Umständen zu einer Entfaltung der Polypep-

tidkette und somit zur biologischen Inaktivierung. Je nach Art des Proteins kann

dieser Vorgang reversibel oder irreversibel sein, wobei im letzteren Fall dann von

Denaturierung gesprochen werden kann.

Die Bindung anionischer, kationischer und nicht-ionischer Detergenzien an Pro-

teine ist eine Funktion der freien Detergenzkonzentration, die im Gleichgewicht

mit dem Protein steht. Nach Erreichen der kritischen Mizellkonzentration (CMC)

erfolgt nur noch eine sehr geringe zusätzliche Detergenzbindung an das Protein.

Wird die Monomerkonzentration des Detergenz über die Anzahl der zur Absätti-

gung der Oberflächenbindungsstellen erhöht, so erfolgt eine weitere Bindung an

anderer Stelle mit einhergehender Entfaltung des Proteins. Dies ermöglicht die

Anlagerung von Detergenzien an zunächst verborgene Bindungsstellen. Durch

Hitzeeinwirkung werden die Proteine in Gegenwart von Detergenzien vollständig

entfaltet. In der Elektrophorese verwendet man Natriumdodecylsulfat (SDS), um

den Proteinen eine definierte Menge an Detergenz anzulagern (1,4 g SDS/g

Protein). Proteine mit dem gleichen Masse/Ladungsverhältnis haben im Gel die

gleiche elektrophoretische Mobilität, so dass die Trennung ausschließlich nach

dem durchschnittlichen Molekulargewicht erfolgt [162].

Die häufigste Ursache für Inaktivierung ist Wärme. Durch diese wird die kineti-

sche Energie des Proteins, genauer der Faltung, soweit erhöht, dass zunächst

verborgene hydrophobe Bereiche dem Lösungsmittel gegenüber exponiert wer-

den. Es kommt mit zunehmender Temperatur zur Aggregation oder Dissoziation

bei 4D Strukturen, oder auch zum monomolekularen konformationellen Netzbil-

dung oder „random coil“ Bildung, d.h. einem Verstricken der Polypeptidkette in

sich selbst, in der nur „Nahordnungs-Wechselwirkungen“ eine Rolle spielen.

Nicht kovalente Bindungen einschließlich der Wasserstoffbrückenbindungen ge-

hen verloren. Bei der Rückkehr zu normalen Temperaturen halten nicht kovalente

und andere nicht native Wechselwirkungen das Protein in der netz-ähnlichen

oder „random coil“ Struktur, trotzdem die thermodynamische instabilere Form

überwiegt.

Gruppe 2 Allergene der Hausstaubmilben sind thermoresistenter als Gruppe 1

Allergene (Cysteinproteasen), die Majorallergene von Katze Fel d 1 (Uteroglobin)

und Hund Can f 1 (Lipocalin) sind demgegenüber noch stabiler [116, 62]. Die

Lagerung von Whole Mite Body-Extrakten ist bei 4° C bis zu drei Monaten ohne

große Verluste an biologischer Aktivität möglich. Eine Aufbewahrung bei 23° C

führte zu partiellen Verlusten im Gesamtproteinspektrum, die Erhöhung auf 36° C

zu substantiellen Verlusten [163].

Generell kann es durch Hitzeeinwirkung zur Deamidierung von Asparagin- oder

Glutamin- bzw. Gluthationresten kommen, oder zur Hydrolyse von Peptidbindun-

gen und zur Oxidation von Cystein, Methionin sowie zur Zerstörung von Disulfid-

bindungen.

Ein weiteres Problem ist das Einfrieren und Auftauen von Allergenlösungen. Eine

allgemein gültige Lösung gibt es im Augenblick nicht, jede Proteinlösung stellt ein

eigenständiges Problem dar, das es zu optimieren gilt. Die Aussage, dass die

Lagerfähigkeit eines Proteins ohne Verlust der biologischen Aktivität bis zu nied-

rigen Temperaturen zunimmt, ist nicht bewiesen. Es gibt viele Ausnahmen, wobei

Temperaturen um 5° C oftmals effektiver sind als -40° C [164, 165, 111]. Beim

Einfrieren und Auftauen kann es sowohl zu reversibler als auch irreversibler In-

aktivierung kommen.

Eine zunächst reversible Denaturierung wird häufig durch auftauen/einfrieren

irreversibel. Besonders empfindliche Seitenketten, wie z.B. Methionin, Cystein

und Cystin können durch das Einfrieren oxidiert werden, so auch phenolische

Seitenketten, z.B. des Tyrosins. Die Konzentration an molekularem Sauerstoff

liegt in partiell gefrorenem System bei -3° C um bis zu 1000 fach höher als bei 0°

C. Identische Konzentrationsgradienten können durch Dehydratation bzw. Ly-

ophilisation aufgebaut werden und zu irreversibler Inaktivierung führen [164].

Der Grund liegt z.B. in der Lyopilisation von Ammoniumsalzen, die während der

Gefriertrocknung aus dem Extrakt entfernt werden (NH3↑), wodurch es zu erheb-

lichen pH-Wertverschiebungen kommt.

Ein weiteres Problem ist die mechanische Beanspruchung von Proteinlösungen.

Schütteln führt zu erhöhten Reaktionen am Gas-Flüssig-Übergang. Proteine

entfalten sich, um die maximale Anzahl an hydrophoben Aminosäuren gegen-

über der Luft zu exponieren. Es kommt zu Aggregation aufgrund der hohen An-

zahl an freigelegten hydrophoben Bindungsstellen. Scherkräfte an Filtern oder

Gefäßwänden führen ebenfalls zu Konformationsänderungen mit Freilegung von

hydrophoben Bindungsstellen, wobei der Grad der Inaktivierung eine Funktion

von Dauer und Stärke der Scherkraft ist [164].

Ionisierende und nicht-ionisierende Strahlung beeinflusst sowohl das Protein

selbst als auch die umgebenden Wassermoleküle. Direkter Einfluss ionisierender

Strahlung führt zu Veränderungen der kovalenten Primärstruktur in Form von

Radikalbildung, Quervernetzung und Zerstörung einzelner Aminosäuren. Das

Ergebnis ist ein Verlust an nativer Aktivität oder Aggregation [164, 166].

Direkte UV-Strahlung führt zur Zerstörung von Aminosäuren wie Cystein, Tryp-

tophan und Histidin durch Oxidation [167].

Ultraschallbehandlungen erzeugen Mikrobläschen von schnell entweichenden

Gasen. Diese kollabieren, was wiederum zu einer mechanischen und chemi-

schen Reagenzwirkung (Radikalbildung) führt [164].

Glycerol, als bis zu 50 %iger Anteil der Proteinlösung, ist aufgrund von Solvatati-

onseffekten ein guter Gefrierschutz und ist deshalb keine Gefahr für die geord-

nete Wasserhülle der Proteine. Die Epitopstabilität bleibt bei Gruppe 1 und 2 Al-

lergenen für mindestens ein Jahr bei 4° C gewährleistet [168]. Allerdings kann

Glycerol bei Temperaturen unter –20° C und über 4° C den erheblichen Verlust

an biologischer Aktivität nicht verhindern. DMSO wirkt ebenfalls durch Solvatati-

onseffekte als Gefrierschutz, ist aber als Arzneimittelzusatz nicht zugelassen

[111].

2.7.4.1 Polyethylenglykol

Polyethylenglykol (PEG) kann als „salting-out“-Reagenz wirken, wobei ein steri-

scher Ausschluss („steric exclusion“) zu einer Stabilisierung der nativen Protein-

struktur in wässriger Lösung führt [169].

PEG hat einen größenabhängigen Einfluss auf die Thermostabilität von Protei-

nen [170]. Dieser ist abhängig von der Beschaffenheit des Proteins und der Grö-

ße des PEG, wobei PEG mit der größeren Hydrophobizität die bessere Wirkung

erzielt. Die Hydrophobizität wiederum steigt mit wachsender Molekulargewicht

(>400). PEG 1000 interagiert mit den Proteinen bei hohen Temperaturen, wird

bei niedrigen Temperaturen aber von der nativen Form ausgeschlossen. PEG ist

hydrophob und bindet bevorzugt an die bei der Entfaltung freigelegten hydropho-

ben Bereiche der Proteine. Dies führt zu einer Stabilisierung des ungefalteten

Zustandes bei höheren Temperaturen, also zu einer Herabsenkung der Über-

gangstemperatur in den entfalteten Zustand. PEG 6000 wird zur Isolierung von

Antikörpern (IgG) aus Serum durch Aggregation und Ausfällung verwendet. Die

Modifikation von Proteinen mit PEG resultiert in einem Komplex nicht bekannter

Immunogenität, erhöhter Lebensdauer und Stabilität und ermöglicht so in vielen

Fällen die Proteintherapie. So können Lösungen mit einer für die Hypersensibili-

sierung notwendigen hohen Proteinkonzentrationen hergestellt werden [171].

Eine weitere Möglichkeit der Proteinstabilisierung mit PEG ist die kovalente Bin-

dung an die Proteinoberfläche (s. Peptidtherapie mit Allergoiden). Sogenanntes

mPEG ist ungeladen, linear, hydrophob, flexibel und in einer Vielzahl unter-

schiedlicher Molekulargewichte erhältlich. Es ist durch die Food and Drug Admi-

nistration (FDA) der USA für die Verwendung in Pharmazeutika zur oralen, pa-

renteralen und epidermalen Applikation zugelassen. Ausgeschieden wird es

hauptsächlich durch die Nieren [171].

Generell ist bei mPEG modifizierten Proteinen die Stabilität und proteolytische

Widerstandskraft erhöht. Weitere Vorteile sind keine oder nur sehr geringe Im-

munogenität, eine reduzierte Allergenität bei gleichzeitigem minimalen Verlust

der biologischen Aktivität, eine erhöhte Verweildauer des Proteins im Körper so-

wie sehr geringe Toxizität. Die Aktivität bleibt auch in organischen Lösungsmittel

(Benzol, Toluol, Ethanol und DMF) erhalten. Die Effekte sind das Resultat einer

Formation von PEG-Molekülen um das Protein herum, so dass aus sterischen

Gründen keine Reaktion mit TH-Zellen erfolgen kann. Die proteolytische Inakti-

vierung der Antigene bleibt aus, die Aktivität des Proteins kann im Einzelfall so-

gar gesteigert werden [171, 172]. Erfolge konnten hier bei Gräserpollen erzielt

werden, wohingegen Milbenallergene scheinbar für diese Anwendung nicht ge-

eignet sind [5].

Zum Ende dieses Abschnitts soll auf die proteolytische Aktivität einiger wichtiger

Milbenallergene in Extrakten hingewiesen werden. Hierbei spielen pH, Tempe-

ratur, Kinetik und das Verhältnis Enzym zu Substrat eine Rolle [173, 76]. Bei der

Herstellung von Allergenextrakten sollte deshalb schnell und bei möglichst nied-

rigen Temperaturen gearbeitet werde. Die Auswirkungen von Veränderungen des

pH sowie der Extraktzusammensetzung auf das allergene Potential sind von Fall

zu Fall neu zu prüfen.

Der Zusatz von Proteaseinhibitoren zu Allergenextrakten kann einen Teilverlust

der allergenen Potenz des Extraktes bewirken. Zudem scheint der Einsatz klassi-

scher Proteasinhibitoren keinen oder nur sehr geringen Einfluss auf die Aller-

genstabilität zu haben. Es wird berichtet, dass Aktivitätsverluste nicht durch Pro-

teasen sondern durch den Verlust an nativen Inhibitoren oder an spezifischer

Instabilität des oder der Proteine hervorgerufen wird [111]. Auch eine Lagerung

bei 4° C ist einem Abbau durch Proteasen unterlegen. Eine Aufbewahrung als 50

%ige Glycerollösung bei –20° C wird deshalb favorisiert [73].

3 METHODEN UND VERFAHREN

3.1 ABLAUF DER UNTERSUCHUNGEN

Zur Einführung in den experimentellen Teil sollen zunächst die vorgenommenen

Methoden und Verfahren anhand eines Ablaufschemas dem Untersuchungsab-

lauf zugeordnet werden (Abbildung 5). Die im Schema aufgeführte „Präparative

Isolierung“ (3.1) war nur Gegenstand von Voruntersuchungen und wird im fol-

genden Abschnitt deshalb nicht thematisiert.

Abbildung 5 – Ablaufschema der durchgeführten Untersuchungen. Blau hervorgehobene

Positionen wurden der Vorgehensweise eines Pharmaunternehmens entnommen, grün mar-

kierte Positionen entstammen dem eigenen Ablauf. Nicht farblich gekennzeichnete Positio-

nen waren Bestandteil beider Varianten.

3.2 PROBENVORBEREITUNG

3.2.1 Verwendete Milbenkulturen

Es wurden folgende Milbenkulturen zur Extraktherstellung verwendet:

1. „Purified Mite Body-Kultur“ der Hausstaubmilbe Dermatophagoides pte-

ronyssinus

Bezugsquelle: a) Allergon, Schweden und b) CSL, Australien

Die Kulturen bestanden laut Zertifikat aus ca. 95 % Milbenkörper und 5 %

kleineren Komponenten (Futterreste, Kotpellets), wurden lyophilisiert, 48 h

mit Aceton gewaschen und bei 2-8° C gelagert.

2. „Whole Mite-Kultur“ der Vorratsmilbe Lepidoglyphus destructor

Bezugsquelle: Dr. J. T. Franz, Universität Paderborn

Die Kultur enthielt mindestens 70 % Milbenkörper (mikroskopische Kontrolle).

Der Rest bestand aus Futterresten sowie Rückständen der Milben (Exkre-

mente und Körperteile). Die Kultur wurde lyophilisiert und bei 2-8° C gelagert.

3.2.2 Aufschluss der Milbenkulturen

In dieser Arbeit kamen zwei verschiedene Aufschlusswege zur Anwendung, die

sich in folgender Weise unterschieden.

Variante 1

„Pharmaunternehmen“

Variante 2

„Uni Paderborn“

Extraktionsmedium modifizierte Cocas‘-Lösung Ammoniumhydrogencarbonat

Abtrennung niedermoleku-

larer Komponenten

Dialyse -

Überführung in lagerfähigen

Zustand

Lyophilisation Stickstoffkühlung

Lagerung -20° C -80° C

Tabelle 2 – Vergleich der Aufschlussverfahren

Variante 1 „Pharmaunternehmen“

Der unter leicht basischen Bedingungen praktizierte Aufschluss entsprach der

Vorgehensweise in einem zertifizierten Pharmaunternehmen zur Verarbeitung

von Rohkulturen zu Diagnostik- und Therapieprodukten. Niedermolekulare Sub-

stanzen unter 3.500 Da wurden zur Vermeidung von unerwünschten Nebenwir-

kungen abgetrennt.

• Aufschluss

2 % (w/v) Milbenkultur in modifizierter Cocas‘ Lösung; 4 h; 4° C; Über-

kopfschüttler.

• Zentrifugation

3000 x g; 15 min; 4° C.

• Filtration

Der Überstand wird nacheinander durch 0,8, 0,4 und 0,2 µm Spritzenfilter

passiert. Die nächst kleinere Porenweite wurde erst nach vollständigem Pas-

sieren des Überstandes durch einen Filter gewählt.

• Bestimmung des pH-Wertes

• Dialyse

Zur Anwendung kam eine Membran6 mit einem Größenausschluss von 3500

Da, dialysiert wurde gegen 3 x 1000 mL H2Odd ü/N bei 4° C.

• Bestimmung des pH-Wertes

Aliquotierung zu je 1 mL.

• Lyophilisation

Gefriertrocknung der aliquotierten Extrakte für 1,5 h in einer SpeedVac.

• Lagerung bei –20° C

Variante 2 „Universität Paderborn“

Diese Aufschlussvariante unter moderat basischen Bedingungen wurde ohne

Abtrennung niedermolekularer Bestandteile formuliert, da alle im Extrakt vorhan-

denen Komponenten einer analytischen Betrachtung unterzogen werden sollten.

• Aufschluss

- 2 % (w/v) Hausstaubmilbenkultur

- 5 % (w/v) Vorratsmilbenkultur

in 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung für 6 h und 4° C bei nur leichter

Durchmischung (keine Blasenbildung) auf dem Vertikalmischer.

• Zentrifugation

3000 g; 15 min; 4° C.

6 Spectraphor 3500

• Filtration

Überstand wird nacheinander durch 0,8, 0,4 und 0,2 µm Spritzenfilter pas-

siert. Die nächst kleinere Porenweite wird erst nach vollständigem Passieren

des Überstandes durch einen Filter gewählt.

• Aliquotierung

Schnelles Tieffrieren in flüssigem Stickstoff.

• Lagerung bei –80° C

Modifikation der Variante 2 „Universität Paderborn“

Die Modifikation zur Variante 2 bestand aus einem Zusatz von 10 % (v/v) ei-

ner gleichteiligen Polyethylenglykolmischung aus PEG 2007 und PEG 4008

zum Extraktionsmedium.

In Vorversuchen kam ein 10 %iger Zusatz mit PEG 6009 zum Einsatz (Probe

22). Optional wurde 0,5 M ß-Mercaptoethanol oder Dithiotreitol (DTT) hinzu-

gegeben (Proben 20, 21, 22).

Cocas-Lösung modifiziert (ohne Phenol); pH 8,2

Natriumchlorid 5 g

Natriumhydrogencarbonat 2,5 g

mit H2Odd auf 1000 mL auffüllen.

0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung, pH 7,8

Ammoniumhydrogencarbonat 7,906 g

mit H2Odd auf 1000 mL auffüllen.

7 Molmasse 190 – 210 g/moL

8 Molmasse 380 – 420 g/moL

9 Molmasse 570 – 630 g/moL

Proben-

Nr.

Probenbeschreibung

Spezies/Hersteller - Einwaage/Volumen Puffer - Zusatz

Variante Status*

1D. pteronyssinus (Pharmaunternehmen) Referenzextrakt 1 F

2D. pteronyssinus (CSL) 0,82 g/41 mL („Stammlyophilisat“) 1 L

3D. pteronyssinus (Allergon) 1,0 g/50 mL („Stammlyophilisat“) 1 L

4** D. pteronyssinus (Allergon) 0,2 g/10 mL (10 % PEG)*** 2 F

5** L. destructor (Uni Paderborn) 0,5 g/10 mL 2 F

6** L. destructor (Uni Paderborn) 0,5 g/10 mL (10 % PEG) 2 F

7** D. pteronyssinus (Allergon) 0,2 g/10 mL 2 F

8** Probe 1b (CSL) rekonstituiert 193 µg Protein/2 mL (10 % PEG) 1 L

9** Probe 1b (CSL) rekonstituiert 193 µg Protein/2 mL 1 L

10** Probe 1c (Allergon) rekonstituiert 175 µg Protein/2 mL (10 % PEG) 1 L

11** Probe 1c (Allergon) rekonstituiert 175 µg Protein/2 mL 1 L

12 D. pteronyssinus (Allergon) 0,1 g/5 mL 2 F

13 D. pteronyssinus (Allergon) 0,1 g/5 mL (10 % PEG) 2 F

14 L. destructor (Uni Paderborn) 0,2 g/5 mL 2 F

15 L. destructor (Uni Paderborn) 0,2 g/5 mL (10 % PEG) 2 F

16 Probe 1c (Allergon) rekonstituiert 175 µg Protein/2 mL 1 L

17 Probe 1c (Allergon) rekonstituiert 175 µg Protein/2 mL (10 % PEG) 1 L

18 Probe 1b (CSL) rekonstituiert 193 µg Protein/2 mL 1 L

19 Probe 1b (CSL) rekonstituiert 193 µg Protein/2 mL (10 % PEG) 1 L

20 D. pteronyssinus (Allergon) 0,2 g/10 mL 2 F

21 L. destructor (Uni Paderborn) 0,2 g/10 mL 2 F

22 L. destructor (Uni Paderborn) 0,2 g/10 mL (10 % PEG600) 2 F

23 Probe 1b (CSL) rekonstituiert 193 µg Protein/2 mL Cocas Lösg. 1 L

24 Probe 1b (CSL) rekonstituiert 193 µg Protein/2 mL H2Odd 1 L

25 Probe 1c (Allergon) rekonstituiert 175 µg Protein/2 mL H2Odd 1 L

26 D. pteronyssinus (Allergon) 0,01636 g/0,5 mL 2 F

27 L. destructor (Uni Paderborn) 0,0176 g/0,5 mL 2 F

28 D. pteronyssinus (Allergon) 0,248 g/6,195 mL 2 F

29 L. destructor (Uni Paderborn) 0,29 g/7,25 mL 2 F

***

Erklärungen zum Probenstatus

Frische Proben wurden direkt nach dem Aufschluss analysiert, in flüssigem

Stickstoff gefrostet und dann bei –20 bzw. –80° C gelagert.

Lyophilisate wurden bis zur Rekonstitution in H2Odd bei –20° C gelagert.

Proben 2-9 enthielten 0,176 g/mL Ammoniumsulfat

PEG = Mischung aus PEG200 und PEG400 im Verhältnis 1:1.

Tabelle 3 – Liste, der im Verlauf der Arbeit verwendeten Proben.

3.2.3 Bestimmung der Proteingesamtmasse nach Lowry

Die Bestimmung des Proteingesamtgehaltes erfolgte zur „Normalisierung“ der

Proben untereinander und als Ausgangspunkt für weitergehende Untersuchun-

gen. Die Ergebnisse wurden nicht eigenständig interpretiert.

Der Nachweis des hier angewandten Lowry-Assays basiert auf der Reaktion der

Proteine mit einer alkalischen Kupferlösung und dem Folin-Reagenz. Zwei auf-

einanderfolgende Schritte führen zur Farbentwicklung. Die Reaktion zwischen

den Proteinen und der alkalischen Kupferlösung und die folgende Reduktion des

Folin durch den Protein-Kupfer-Komplex. Hauptverantwortlich für die Färbung

sind die Aminosäuren Tyrosin, Tryptophan und im schwächeren Ausmaß auch

Cystin, Cystein und Histidin. Die Proteine bewirken eine Reduktion des Folin

durch den Verlust von ein, zwei oder drei Sauerstoffatomen, wodurch eine cha-

rakteristische blaue Färbung mit einem Maximum zwischen 650-750 nm bildete

[174]. Es kamen zwei Modifikationen der Lowry-Methodik zur Anwendung:

3.2.3.1 DC Protein Assay

Kommerzieller Kit (BioRad) zur Bestimmung der Proteingesamtmasse in Proben

mit Detergenzien. Die Reaktion erreicht 90 % der maximalen Farbentwicklung

nach 15 min und benötigt als Mikroassay lediglich 5 µL Probenvolumen. Die

Standardreihe ist im gleichen Puffer anzusetzen wie die Probe und enthielt die

Konzentrationen 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5 und 2,0 µg/mL.

Reagenzienvorbereitung und Versuchsbedingungen nach Herstellerangaben.

3.2.3.2 Proteinbestimmung nach Lowry (modifiziert) [175, 174]

Die Standardreihe wurde mit Humanserumalbumin (HSA) aus den Konzentratio-

nen 1, 2, 5, 10, 15, 20, 40 und 50 µg/mL formuliert.

Probenvorbereitung

Das Probenvolumen ist so zu wählen, dass der zu erwartende Proteinwert im

Bereich der Standardkurve zwischen 1–50 µg liegt (Verdünnungen einsetzen). Ist

das eingesetzte Probenvolumen kleiner als 1 mL, wird es mit H2Odd auf 1 mL

aufgefüllt. Wird eine Probenvolumen oberhalb 1 mL eingesetzt, so ist Trichlores-

sigsäure im Verhältnis 1:2 zu pipettieren. Liegt eine phenolische Probenlösung

vor, so ist die TCA-Fällung einmal zu wiederholen. Standard und Proben werden

als Dreifachbestimmung ausgelegt.

1. Zugabe von 10 µL Natriumdesoxycholat-Lösung zu jedem Röhrchen, danach

gut durchmischen und 15 min bei RT inkubieren lassen. Wird mehr als 1 mL

Probenvolumen eingesetzt, so ist die Zugabe entsprechend zu erweitern.

2. Zugabe von 1 mL 18 %iger TCA (4-8° C), gut durchmischen und bei RT 15

min inkubieren lassen.

3. Zentrifugation: 45 min, 3600 x g, 4-8° C.

4. Überstand mit einer Pasteurpipette absaugen.

5. Niederschläge durch Zugabe von je 1 mL Lösung 3 unter leichtem Mischen

lösen und für 10 min bei RT inkubieren.

6. Zugabe von je 100 µL Folin-Lösung, sofort mischen und danach 30 min im

Dunkeln bei RT inkubieren.

7. Standards und Proben werden bei >650 nm im Photometer gegen den Blind-

wert gemessen.

8. Kalkulation der Ergebnisse - Mittelwertbildung mit Standardabweichung (%)

aus Dreifachbestimmung und der Standardkurve.

Lösung 1

Natriumcarbonat 20 g

Kalium-Natrium-Tartrat x 4 H2O 0,27 g

In 1000 mL 0,1 N Natronlauge lösen.

Die Lösung ist bei 4° C drei Monate stabil.

Lösung 2

Kupfersulfat x 5H2O 1,56 g

In 100 mL H2Odd lösen

Die Lösung ist bei 4° C drei Monate stabil.

Lösung 3

Lösung 1 und Lösung 2 im Verhältnis 100:1 frisch ansetzen.

Folin-Lösung

Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz10 1:1 mit H2Odd frisch ansetzen.

Lösung 1 und Lösung 2 im Verhältnis 100:1 frisch ansetzen.

Natriumdesoxycholat

2 % (w/v) Natriumdesoxycholat in H2Odd lösen und zu 1 mL aliquotieren.

Die Lösung ist bei –20° C für zwei Jahre stabil.

Trichloressigsäure (TCA)

250 g TCA zu 1389 mL H2Odd ergibt eine 18 %ige TCA-Lösung.

3.2.4 Spezifische Bestimmung von Einzelallergenen mittels

Enzym-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA)

Der einfache und schnelle qualitative und quantitative Nachweis einzelner Majo-

rallergene in komplexen Allegenextrakten ist ein weiterer Schritt hin zu einer ver-

besserten Standardisierung und reproduzierbaren Extraktherstellung. Es werden

Einzelkomponenten bestimmt und nicht over-all-Parameter wie z.B. die allergene

Aktivität. Neben den hieraus resultierenden Vorteilen liegen die Nachteile in einer

nur eingeschränkten Verfügbarkeit der monoklonalen Antikörper (mAk) für einige

ausgewählte Majorallergene und ihrer Spezifität, wichtige Isoformen werden zum

Teil nicht erkannt. Dieses Manko kann durch Verwendung von mehreren mAK

vermieden werden, die an unterschiedliche Epitope des Allergens koppeln und

zu einem Immunoassay zusammengestellt werden können. In dieser Arbeit ist

ein solches System [176], bestehend aus zwei verschiedenen mAK (Indoor Bio-

technologies, Charlottesville US) verwendet und auf die Problemstellung opti-

miert worden.

3.2.4.1 Bestimmung von Der p 1

• Beschichten der Mikrotiterplatte MTP (Immuno Plate C96 Maxisorp, Nunc)

Der Fangantikörper mAk 5H8 (2 mg/mL) gegen Der p 1 wird 1/1000 in Inku-

bationspuffer verdünnt und 50 µL/Kavität auf die MTP aufgetragen. Die Inku-

bationszeit beträgt 2 h bei 37° C oder ü.N. bei 4° C.

Mit der Inkubation ü.N. werden die gleichmäßigeren Ergebnisse erzielt.

• Waschen der Platte mit Waschpuffer (3x).

• Absättigen der MTP für 30 min bei RT mit 50 µL/Kavität Blockierungspuffer.

• Waschen der Platte mit Waschpuffer (3x).

• Die Standard-Verdünnungsreihe aus der Der p 1-Stammlösung (2500 ng/mL)

wird wie folgt mit Waschpuffer hergestellt:

Standard-Nr. Zielkonzentration

[ng Der p 1/mL Puffer]

Der p 1-Standard

[µL]

Zugabe an Puffer

[µL]

250

125

12,5

5,26

2,5

1,25

0,5

100

25 von (1)

10 von (1)

4 von (1)

4 von (2)

900

950

970

980

990

995

975

990

995

996

Tabelle 4 - Standard-Verdünnungsreihe von Der p 1.

• Erstellen einer Probenverdünnungsreihe, ausgehend von einer 1:100-1:1000

Verdünnung der Originalprobe, mit je nach Problemstellung 5-10 Einzelver-

dünnungen (1:2) in Waschpuffer.

• Es werden je 50 µL/Kavität der Proben und der Standards (Doppelbestim-

mungen) aufgegeben und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.

10 Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz (Merck 109001)

• Waschen der Platte mit Waschpuffer (3x).

• Der biotinylierter mAk 4C1 wird 1/1000 mit Blockierungspuffer verdünnt, 50

µL/Kavität aufgegeben und 1 h bei RT inkubiert.

• Waschen der Platte mit Waschpuffer (5x).

• Die MTP wird für 30 min bei RT mit 50 µL/Kavität einer 1/1000-Verdünnung

von Streptavidin-Peroxidase inkubiert. Die Verdünnung wird mit 1 % RSA in

PBS-T hergestellt.

• Waschen der Platte mit Waschpuffer (5x).

• Zugabe von 50 µL/Kavität Substratlösung.

• Stoppen der Reaktion nach 20-30 min durch Zugabe von 50 µL Stopplö-

sung/Kavität.

• Die Mikrotiterplatte wird bei 450 nm vermessen und anhand der sigmoidalen

Standardkurve ausgewertet. Es werden nur die Konzentrationen der Extrakt-

lösungen zur Auswertung herangezogen, die im linearen Bereich dieser Ka-

librierkurve liegen. Das Endergebnis wird durch Mittelwertbildung aus diesen

Verdünnungen gebildet.

3.2.4.2 Bestimmung von Der p 2

Die Durchführung und Auswertung erfolgt identisch zur Quantifizierung von Der p

1. Lediglich Unterschiede der Konzentrationen des Fangantikörpers 1D8, der Der

p 2 Standardlösung und des biotinylierten Detektionsantikörpers 7A1 müssen

beachtet werden.

Standard-Nr. Zielkonzentration

[ng Der p 2/mL Puffer]

Der p 2-Standard

[µL]

Zugabe an Puffer

[µL]

250

125

12,5

5,26

2,5

1,25

0,5

50 von (1)

25 von (1)

10 von (1)

5 von (1)

4 von (2)

950

975

985

990

995

950

975

990

995

996

Tabelle 5 - Standard-Verdünnungsreihe von Der p 2.

Der Fangantikörper mAk 1D8 lag in einer Konzentration von 10 mg/mL vor und

wurde 1/1000 verdünnt zur Inkubation der MTP verwendet. Der biotinylierte mAk

7A1 wird 1/3000 mit 0,1 % RSA in PBS-T verdünnt. Die Der p 2 Standardlösung

hatte eine Konzentration von 5000 ng/mL, woraus das Pipetierschema der Ta-

belle 5 resultierte.

Inkubationspuffer; pH 9,6

Dinatriumcarbonat 1,59 g

Natriumhydrogencarbonat 2,93 g

Thimerosal11 0,1 g

in 1000 mL H2Odd lösen.

Waschpuffer; pH 7,4

Natriumchlorid 8 g

Kaliumdihydrogencarbonat 0,2 g

Dinatriumhydrogencarbonat 1,15 g

Kaliumchlorid 0,2 g

Thimerosal 0,1 g

Tween 20 0,5 mL

in 1000 mL H2Odd lösen.

Blockierungspuffer

1 % RSA in Waschpuffer

Streptavidin-Peroxidase-Lösung

250 µg Streptavidin-Peroxidase (S 5512, Sigma) in 1 mL H2Odd lösen und in 25 µL-Portionen bei –

20° C lagern. Für den Gebrauch im Assay wird eine 1/1000-Verdünnung mit Blockierungspuffer

hergestellt.

Substratlösung

Je eine OPD12-Tablette (Sigma) und 1 Harnstoffperoxidtablette (Sigma) werden nach Herstelleran-

gabe in H2Odd gelöst.

Stoplösung

1,5 M Schwefelsäure

Schwefelsäure (98 %) und H2Odd mischen (1:11).

3.2.5 UV/VIS-Spektroskopie der Allergenextrakte

In der UV/VIS-Spektroskopie werden u.a. Valenzelektronen durch Einstrahlung

monochromatischen Lichtes im Wellenlängenbereich von 180-400 nm auf ein

höheres Energieniveau angeregt. Bei ihrem Rückfall in den vor der Anregung

eingenommene Grundzustand wird die Energie wieder abgegeben, und man er-

hält wellenlängenabhängige Absorptionsspektren spezifischer Wellenlänge [177].

Die Ergebnisse ermöglichen u.a. Aussagen zum aromatischen Charakter, den

Seitengruppen und zur Sekundärstruktur der unbekannten Probe [178].

In den vorliegenden Messungen wurde ein scannendes UV/VIS-Spektrometer

(DU-65, Beckman) mit einer Scannrate von 750 nm/min im Bereich 200-300 nm

eingesetzt. Zum Einsatz kamen Quarzküvetten (1 cm). Die Proben wurden mit

11 Thimerosal kann zur Sterilisierung als Alternative zu Natriumazid eingesetzt werden, da dieses die Enzym-

detektion einiger Amplifikatoren (ABTS) stören kann. Natriumazid kann als Stoppreagenz alternativ zu 1,5M

Schwefelsäure oder 1M Salzsäure eingesetzt werden.

Puffer und H2Odd kalibriert. Die UV/VIS-Spektren wurden im Absorptionsmodus

vermessen.

Untersucht wurden die folgenden Proben:

1. D. pteronyssinus Lyophilisat (CSL); Probe 16 in Cocas-Lösung

• Verdünnungsreihe 1:2-1:16

• Zugabe von 1 N Natronlauge zur 1:16 Verdünnung; je 2 x 1 Tropfen bis

zu einem pH 8

• Zugabe von 1 N Natronlauge zur 1:2 Verdünnung

• Zugabe von 6 N Harnstoff zur 1:2 Verdünnung

2. D. pteronyssinus Lyophilisat (CSL); 193 µg/mL H2Odd

• Verdünnung 1:4

• Zugabe von konzentrierter Essigsäure (1:1)

3. D. pteronyssinus Lyophilisat (Allergon); 175 µg/mL H2Odd

• Verdünnung 1:2

3.2.6 Ausschlusschromatographie (SEC)13

Die Ausschlusschromatographie trennt gelöste Moleküle nach ihrer Größe und

basiert auf der unterschiedlichen Permeabilität der Analyten in ein poröses Trä-

germaterial definierter Porengröße. Das Porenmaterial ist durch einen wirksamen

Bereich gekennzeichnet. Das hydrodynamische Volumen der Analyten ist hierbei

für das Trennverhalten verantwortlich, wobei die kleinsten Substanzen die

längste Aufenthaltsdauer in der Gelmatrix haben und als letzte eluiert werden.

Die mobile Phase dient nur als Lösungsmittel und hat keinen unmittelbaren Ein-

fluss auf die Trennung. Durch die Auswahl von Trenngel, Elutionspuffer und pH-

Wert sowie Probenvolumen bzw. Säulendurchmesser ist die Selektivität vorge-

geben. Einzig die Flussrate kann noch variiert werden [179].

Die Ausschlusschromatographie wird bei der Herstellung kommerzieller Allerge-

nextrakte u.a. zur Fraktionierung eingesetzt [180]. Das für jeden Extrakt charakte-

ristische Elutionsprofil wird zudem zur Überprüfung der Gleichförmigkeit von Pro-

duktionschargen gegenüber hausinternen Referenzen herangezogen. Das Säu-

lenmaterial beeinflusst die Allergenität und das Allergenmuster nicht entschei-

dend [181].

12 o-Phenylendiamin-di-hydrochlorid

13 Size Exclusion-Chromatographie

Die Molekulargewichtsbestimmung ist eine weitere wichtige Applikation [182],

wobei die optimale Trennleistung eher zweitrangig ist, so dass es teilweise zu

ausgeprägtem Tailing und Fronting kommt [183]. Die Probenbestandteile beein-

flussen sich zudem gegenseitig, so dass sich die individuellen Retentionszeiten

verschieben. Ein Rückschluss von der Retentionszeit der einzelnen Substanz auf

die Retentionszeit im Gemisch erlaubt daher nur eine näherungsweise Bestim-

mung der Molekulargewichtsverteilung. Externe Standards unterliegen der glei-

chen Verschiebung der Retentionszeiten und können daher dieses Unsicherheit

nicht beseitigen.

Aus der großen Anzahl aktiver Oberflächengruppen der Proteine können erhöhte

Wechselwirkungen mit dem Trennsystem (Gelmatrix, Eluent) resultieren. Die

Stabilität der Allergene während einer chromatographischen Trennung ist vergli-

chen mit der elektrophoretischen Stabilität meistens geringer [183]. Trotz dieser

Einschränkungen ist die Ausschlusschromatographie eine schnelle und effektive

Methodik zur Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung einer komplexen

Proteinprobe, die in Kombination z.B. mit der Massenspektrometrie valide Aus-

sagen zu Fragmentierungsmustern erlaubt.

Methodik

Säulenmaterial: Pharmacia Superdex 7514, 3,2 x 300 mm, Bead size 13 µm

Trennbereich: 3-70 kDa

Wellenlänge: 280 nm

Eluent: 0,5 M Ammoniumacetat, pH 6,5

Flussrate: 0,9 mL min-1

Verwendete Standardproteine in der Reihenfolge ihrer Retentionszeiten:

1. Thyroglobulin 670 kDa -/-

2. Gammaglobulin 158 kDa -/-

3. Ovalbulmin 44 kDa 10,92 min

4. Myoglobulin 17 kDa 13,10 min

5. Vitamin B 12 1.35 kDa 19,16 min

Proben

1. Extraktvarianten von

D. pteronyssinus (Ganzkörperkultur):

• Lyophilisat der „Hausreferenz“ des Pharmaunternehmens (Probe 1)

• Lyophilisat von CSL (Probe 2)

• Lyophilisat von Allergon (Probe 3)

• Erste Charge Dialysewasser – Allergon

• Erste Charge Dialysewasser – CSL

14 Superdex 75 besteht aus hoch vernetzter Agarose, Dextran ist kovalent gebunden .

2. Isolierte Standardallergene,

• Der p 1

• Der p 2

Die mittels Affinitätschromatographie isolierten Standardallergene entstammten

dem Referenzpool eines Pharmaunternehmens und wurden dort in der Routine-

kontrolle eingesetzt. Die Aufgabe der Proben und Standards erfolgte mittels einer

Hamilton-Spritze via eines Probenaufgabenventils.

3.2.7 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (Disk-

SDS-PAGE)

Die Disk-Page ist eine Variante der diskontinuierlichen Elektrophorese (s. Native

Elektrophorese), die zur Verwendung von SDS15 weiterentwickelt wurde [184].

Durch den SDS-Zusatz wird jedem Protein pro Gramm ca. 1,4 g SDS angelagert.

Hierdurch wird die Proteinladung gänzlich durch die starke negativ polarisierte

Ladung des SDS überdeckt, so dass für alle Proteine eine negative Nettoladung

resultiert. Dies bewirkt eine nur von der Größe abhängige Wanderungsgeschwin-

digkeit in einer elektrophoretischen Gelmatrix. Gleichzeitig werden ebenfalls mit

SDS beladene Markerproteine aufgetrennt, so dass über diese eine Kalkulation

des Molekulargewichtes des unbekannten Proteins möglich wird. In der vorlie-

genden Arbeit wurde sie zur Bestimmung des Proteinpatterns der Allerge-

nextrakte und der zugehörigen Molekulargewichte, sowie als vorbereitende Tren-

nung für ein nachfolgendes Immunoblotting verwendet.

Es wurden je nach Fragestellung selbst hergestellte Tris16-Glycin-Gele mit einem

Polymerisationsgrad von 10–15 %, einem Kopolymerisationsgrad von 2,7 % und

den Gelmaßen 8,3 x 6 cm x 1mm verwandt. Die anschließenden Trennungen

erfolgten in einem Mini-Protean II-Tanksystem (BioRad).

Ergänzend kamen 10 %ige Bis17-Tris-Fertiggele (Invitrogen) in einer XCell II-Mini-

Cell (Invitrogen) zum Einsatz. In dieser nach Schaegger und Jagow [185] weiter-

entwickelten Variante des Tris-Glycine-Systems wird mit geringeren pH-Werten

gearbeitet. Die Gele enthielten kein SDS und sind aufgrund der neutralen pH-

Werte des MES18-Puffers (pH 7,2) besonders gut für anschließende massen-

15 Sodium Dodecyl Sulfat

16 Trishydroxymethylaminomethan

17 N,N-bis(2-Hydroxyethyl)glycin

18 3-(N-morpholino)ethansulfonsäure

spektroskopische Analysen oder Verfahren geeignet, die eine möglichst geringe

Modifikation der zu untersuchenden Proteine voraussetzen.

Probenvorbereitung

Die Proben wurden in Probenpuffer aufgenommen. Dieser war vierfach (4x) kon-

zentriert und wurde entsprechend der Probenkonstitution, fest (Lyophilisat) oder

flüssig (Extrakt) sowie der Proteinzielkonzentration direkt zugesetzt bzw. mit

H2Odd verdünnt. Anschließend wurden die Proben in Reaktionsgefäßen (Eppen-

dorf) für 5 min in einem ca. 80° C heißen Wasserbad erhitzt, aber nicht verkocht.

Letzteres, damit nicht durch zu große Energiezufuhr Proteinstrukturen zerstört

bzw. fragmentiert wurden.

Herstellen der Polyacrylamidgele

Der zur Mini Protean II-Kammer gehörende Gießstand mit der Gelkassette wurde

auf einem Nivelliertisch unter dem Abzug positioniert. Nach dem Zusammenbau

erfolgte stets die Kontrolle auf Dichtigkeit der Gießkassette, indem Wasser zwi-

schen die Glasplatten gegossen wurde. War die Kassette dicht, wurde das Was-

ser abgegossen und die Gelmischung für das Trenngel konnte mittels einer Pi-

pette zwischen die Glasplatten der Gelkassette bis ca. 2 cm unterhalb der Glas-

plattenoberkante gegeben werden. Grundsätzlich ist beim Gießen darauf zu

achten, dass keine Blasen entstehen. Zur Abdichtung der Geloberfläche gegen-

über Luftsauerstoff wurde das Trenngel mit 1 mL n-Butanol überschichtet. Nach

ca. 30-45 min war das Trenngel vollständig polymerisiert, das n-Butanol konnte

entfernt und die Gelmischung für das Sammelgel bis zur Oberkante der Glas-

platte aufgefüllt werden. Unmittelbar im Anschluss wurde der Probentaschen-

kamm (10 oder 15 Probentaschen) vorsichtig zwischen den Glasplatten in das

Sammelgel gedrückt.

Die Ammoniumpersulfatlösung wurde frisch hergestellt (Haltbarkeit nur einige

Tage) und zusammen mit TEMED19 erst unmittelbar vor dem Gelgießen zur

Gelmischung zu gegeben.

Die Bis-Tris-Fertiggele wurden den Herstellerangaben entsprechend in der XCell

II-Mini-Cell (Invitrogen) Elektrophoresekammer fixiert.

19 N, N, N‘, N‘- Tetramethylethylendiamin

Probenaufgabe

Nach vollständiger Polymerisation des Sammelgels wurde der Probenkamm vor-

sichtig entfernt und die innere Kammer der Elektrophorese nach Beschreibung

des Herstellers zusammengesetzt. Auch hier erfolgte zunächst eine Prüfung der

Dichtigkeit der inneren Kammer, in dem diese halb mit Laufpuffer gefüllt und auf

einem Filterpapier platziert wurde, so dass anhand der möglicherweise auslau-

fenden Pufferlösung ein Leck lokalisiert werden konnte. War dies der Fall, wurde

nach erneutem Zusammenbau der Kammer wiederholt die Dichtigkeit geprüft.

War die innere Kammer dicht, so konnten die Probentaschen mit Laufpuffer

durchspült und je nach Untersuchungsdesign mittels einer Hamilton-Spritze die

Proben und Molekulargewichtsmarker appliziert werden. Die Probenmenge war

abhängig von den Nachweisgrenzen der geplanten Visualisierung. Für eine an-

schließende Coomassie-Färbung sollten 20-30 ng und für eine Silberfärbung 1-5

ng eines Proteins je µL Probenvolumen vorhanden sein.

Anschließend wurde die innere Kammer bis kurz unter den oberen Rand mit

Laufpuffer gefüllt und in den äußeren Kammertank eingehängt. Dieser wurde

anschließend mit ca. 500 mL Laufpuffer gefüllt und die Kammer mit der Strom-

Spannungsquelle verbunden.

Die Laufbedingungen waren wie folgt:

Spannung 125 V (konstant über die Laufzeit)

Stromstärke Start: ca. 30-40 mA

Ende: 8-12 mA

Laufzeit 90 min

Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel vorsichtig aus der Kammer

entnommen und entsprechend dem experimentellen Verlauf durch Coomassie-

oder Silberfärbung visualisiert bzw. mittels Westernblotting einer anschließenden

Immundetektion zugeführt.

Rezepturen für Gele mit verschiedenen Polymerisationsgraden

Der Polymerisationsgrad des Trenngels sollte dem Trennproblem entsprechend

gewählt werden. Grundsätzlich gilt, desto kleiner das Zielprotein, desto höher der

Polymerisationsgrad. Die Zielproteine dieser Arbeit lagen im Bereich zwischen 10

und 100 kDa. Für diesen Bereich kommen Gele mit einem Polymerisationsgrad

zwischen 10 und 15 % in Frage, ein Optimum an Trenneffizienz wurde mit 12

%igen Gelen erreicht. Proteine mit einem mittleren Molekulargewicht von >100

kDa sollten mit Polymerisationsgraden von 10 % und darunter, Proteine unter 10

kDa mit 15 %igen Gelen, aufgetrennt werden. Dient die elektrophoretische Tren-

nung als vorbereitender Schritt zum Westernblotting, sollte der Polymerisations-

grad nicht zu hoch gewählt werden, da mit zunehmendem Vernetzungsgrad die

Transfereffektivität für größere Proteine leidet.

Trenngel Sammelgel

7,5 % 10 % 12 % 15 % 4 %

H2Odd 1,96 mL 1,38 mL 0,81 mL 0,23 mL 0,98 mL

1,5 M Tris-HCL, pH 8,8 1,25 mL

0,5 M Tris-HCL, pH 6,8 -0,625 mL

10 % (w/v) SDS 50 µL 25 µL

Rotiphorese Gel A* 1,22 mL 1,62 mL 2,03 mL 2,44 mL 0,62 mL

Rotiphorese Gel B* 0,505 mL 0,675 mL 0,85 mL 1,02 mL 0,25 mL

10 % (w/v) APS**20 40 µL 20 µL

TEMED** 5 µL 2,5 µL

* Nach Zugabe ca. 5 Minuten im Ultraschallbad entgasen!

** Zugabe erst unmittelbar vor der Gelherstellung!

Tabelle 6 - Rezepturen zur Herstellung von Gelen unterschiedlicher Konzentrationen.

1,5 M Tris-HCL, pH 8,8

Tris 90,75 g

In 400 mL H2Odd lösen, mit HCL auf pH 8,8 titrieren und mit H2Odd auf 500 mL auffüllen.

0,5 M Tris-HCL, pH 6,8

Tris 6,05 g

In 80 mL H2Odd lösen, mit HCL auf pH 6,8 titrieren und mit H2Odd auf 100 mL auffüllen.

Rotiphorese Gel A

Stabilisierte, gebrauchsfertige, 30 %ige Acrylamid-Stammlösung (Roth).

Rotiphorese Gel B

Stabilisierte, gebrauchsfertige, 2 %ige Bisacrylamid-Stammlösung (Roth).

Die Fertiggellösungen A und B lassen sich je nach Trennproblematik in einem entsprechenden

Verhältnis mischen. Die entsprechenden Volumina für die in Tabelle 6 angegebenen Polymerisati-

onsgrade wurden anhand der vom Hersteller beigefügten Formelvorlagen berechnet. Die Monome-

re des Acrylamids und des Bisacrylamids sind neurotoxisch, weshalb Handschuhe zu tragen sind.

Probenpuffer; pH 8,45 1 x 4 x

Glycerol 1,09 M 4,0 g

Tris 141 mM 0,682 g

Tris-HCL 106 mM 0,666 g

LDS21 73 mM 0,8 g

EDTA 22 0,51 mM 0,006 g

Serva Blue G 25023 0,22 mM 0,75 mL einer 1 %igen Lösung

Phenolrot 0,175 mM 0,25 mL einer 1 %igen Lösung

Mit H2Odd auf 10 mL auffüllen.

Der Puffer wurde als Fertigpuffer NuPage LDS Sample Buffer (Invitrogen) bezogen. Die Lithium-

form kam zur Vermeidung von Proteinaggregation anstelle des Natriums als Zentralion zum Ein-

satz.

20 Ammoniumpersulfat

21 Lithium Dodecyl Sulfat

22 Ethylendiamintetraessigsäure

23 Coomassie Brilliant Blue G-250

Laufpuffer für Tris-Glycine-Gel; pH 8,3

1x 10x

Tris 25 mM 29 g

Glycin 192 mM 144 g

SDS 0,1 % (w/v) 10 g

Mit H2Odd auf 1000 mL auffüllen.

Laufpuffer (MES) für Bis-Tris-Fertiggel; pH 7,2

1x 20x

MES 50 mM 97,6 g

SDS 3,5 mM 10,0 g

EDTA 1 mM 3,0 g

Mit H2Odd auf 500 mL auffüllen.

Der Puffer wurde als Fertigpuffer NuPage MES SDS Running Buffer (Invitrogen) bezogen.

Molekulargewichtsmarker

1. Low Molecular Weight Calibration Kit (Amersham Pharmacia Biotech)

94, 67, 43, 30, 21,1 und 14,4 kDa

Der Marker war ungefärbt.

2. MultiMark Multi Colored Standard (Invitrogen)

250, 148, 60, 42, 30, 22, 17, 6 und 4 kDa.

Die Proteine des Markers waren unterschiedlich angefärbt, so dass die Auftrennung im Gel

und der Transfererfolg nach einem Westernblotting unmittelbar beurteilt werden konnten.

3.2.8 Native Elektrophorese

Die Untersuchung der Zusammensetzung und Struktur nativer Proteine bedingt

sowohl den Erhalt der biologischen Aktivität als auch der Konformation. Denatu-

rierende Detergenzien wie z.B. SDS sind zu vermeiden [186, 187].

In dieser Arbeit wurde ein diskontinuierliches Tris-Chlorid/Tris-Glycin-System

verwendet [188, 189]. Die Diskontinuität bezog sich auf vier Parameter:

• Gelmatrix (Auftrennung in Sammel- und Trenngel)

• pH-Wert der Puffer

• Ionenstärke der Puffer

• Art der Ionen im Gel und im Elektroden-Puffer

Als Anionen werden im Puffer langsame Folgeionen (Glycin), im Gel ausschließ-

lich schnelle Leitionen (Cl-) eingesetzt. Das Glycin ist bei pH 8,8 im Sammelgel

nicht geladen. Die Proteine trennen sich nach dem Start in der Reihenfolge ihrer

Mobilität auf („tracking“), wobei es zu einer Fokussierung mit erhöhter Banden-

schärfe kommt. Aufgrund der Großporigkeit des Sammelgels ist die Mobilität nur

von der Ladung abhängig, eine Aggregation wird aufgrund des trackings verhin-

dert. Das Proteingemisch wandert zum Rand des Trenngels und wird dort abge-

bremst. Das kleine Glycin überholt die Proteine. Die Proteine befinden sich nun in

einem homogenen Puffermillieu, das Proteingemisch löst sich auf und die Protei-

ne trennen sich nach dem zonenelektrophoretischen Prinzip auf. Die Mobilität ist

abhängig von der Ladung und der Größe. Der pH Wert steigt auf 9,5 (pK-Wert

der basischen Aminogruppe des Glycins), wodurch die Proteine höhere Nettola-

dungen erhalten und daher schneller wandern.

Der Tris-Glycin Puffer darf nicht mit Salzsäure titriert werden, da in diesem Fall

ausschließlich Chloridionen wandern und der Trenneffekt nicht auftritt. Die Folge

sind lange Laufzeiten (bis über Nacht) und ungenügend differenzierte Banden.

Basische Proteine mit einem Isoelektrischen Punkt oberhalb pH 6,8 wandern im

Tris-Glycin-System zur Kathode und gehen verloren [186].

Die Zusammensetzung und Herstellung der Gele sowie die Probenapplikation in

der beschriebenen Methodik war, bis auf den Verzicht an SDS, identisch mit der

Disk-SDS-PAGE. Um die Diffusion der Ionen vor dem Start zu verhindern, wurde

das Sammelgel erst kurz vor der Trennung auf das Trenngel polymerisiert.

Die Laufbedingungen waren wie folgt:

Spannung 125 V (konstant über die Laufzeit)

Stromstärke Start: ca. 30-40 mA

Ende: 8-12 mA

Laufzeit 1,5–4 h

Aufgrund der mit erhöhter Laufzeit einhergehenden Wärmeentwicklung fand die

Elektrophorese in einem Kühlschrank statt.

Laufpuffer; pH 8,3

1x 10x

Tris 25 mM 29 g

Glycin 192 mM 144 g

Mit H2Odd auf 1000 mL auffüllen und bei 4° C für ein Jahr haltbar.

Probenpuffer; pH 6,8

1x 5x

Tris-HCl 106 mM 0,666 g

Glycerol 1,09 M 4,0 g

Serva Blue G 250 0,22 mM 0,75 mL einer 1 %igen Lösung

Mit H2Odd auf 10 mL auffüllen.

Feste Proben (Lyophilisate) wurden in 1x Puffer, bereits gelöste Proben in 5x-

Probenpuffer aufgenommen werden. Zielkonzentration war der 1x-Puffer. Die

Proben wurden nicht erhitzt, sondern nur in Probenpuffer aufgenommen, durch-

mischt (Vortex) und umgehend appliziert.

3.2.9 Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Ein Protein wandert in einem elektrischen Feld durch einen in einem Gel immobi-

lisierten pH-Gradienten solange, bis seine Nettoladung gleich Null ist. An diesem

Punkt, dem isoelektrischen Punkt (pI) ist auch die Wanderungsgeschwindigkeit

gleich Null. Trägt man daher an ein Proteingemisch wie z.B. einen Allerge-

nextrakt, an einer Stelle des pH-Gradienten auf, so besitzen die Proteine an die-

sem Punkt unterschiedliche Nettoladungen. Die Proteine beginnen zu wandern

und stoppen erst an ihren spezifischen isoelektrischen Punkten. Diese Fokussie-

rung funktioniert nur bei amphoteren Substanzen wie z.B. Proteinen und Pepti-

den. Ursache sind die amphoteren Aminosäuren, deren Carboxylgruppen bei

niedrigen pH-Werten neutral und bei hohem pH-Wert positiv geladen sind. Hierzu

reziprok verhalten sich die Amino-, Imidazol- und Guanidingruppen der Amino-

säuren. Durch diese Eigenschaften ihrer Aminosäuren können Proteine in einem

pH-Gradienten durch Anlegen eines elektrischen Stroms fokussiert und vonein-

ander differenziert werden. Proteine, die sich nur durch eine Aminosäure unter-

scheiden, können getrennt werden, so dass ein Einsatz in der Speziesdifferenzie-

rung gute Ergebnisse ergibt. Proteinpattern komplexer Proteingemische sind al-

lerdings noch umfangreicher und schwerer auswertbarer als Molekulargewichts-

pattern, da Proteine je nach Faltungszustand unterschiedliche pI besitzen kön-

nen und die pI nicht als einzelne pH-Werte, sondern als pH-Wertebereich ange-

geben werden müssen. Ein anschließendes Westernblotting mit Immundetektion,

kann so unterschiedliche Banden für ein Allergen zeigen und zu schwer differen-

zier- und auswertbaren Ergebnisse führen. Allergene werden zudem anhand ih-

rer Molekulargewichte klassifiziert, so dass die Isoelektrische Fokussierung in der

Allergenanalytik nur in Kombination mit der SDS-PAGE zur 2D-Elektrophorese

von Bedeutung ist. Allerdings ist der pI ein wichtiger und spezifischer physikali-

scher Parameter eines Proteins [162].

Methodik

In dieser Arbeit sind ausschließlich Fertiggele (5 % Polyacrylamid, 2 % Ampho-

lyte) mit einem pH-Gradienten pH 3-10 und einer Dicke von 1mm (Invitrogen)

verwendet worden. Die Trennung erfolgte in der XCell II-Mini Cell (Invitrogen), als

Spannungsquelle diente das EPS 3500 (Amersham Pharmacia Biotech).

Die Proben wurden in Probenpuffer (2x) entsprechend ihres Grundzustandes

aufgenommen und gut durchmischt. Nach dem Arretieren des Gels in der Trenn-

kammer wurde der so gebildete innere Tank mit 150 mL Kathodenpuffer, alle

Probentaschen müssen hierbei geflutet sein und der äußere Tank mit 300 mL

Anodenpuffer gefüllt. Proben und Marker wurden in der Zielkonzentration ent-

sprechenden Volumina mittels einer Hamilton-Spritze in die Probentaschen ap-

pliziert.

Nach Beendigung des Laufs wurden ein spezifischer Fixationsschritt angeschlos-

sen, in dem das Gel für 0,5 h in 100 mL Fixierlösung geschwenkt wurde. Im An-

schluss wurde das Gel direkt der entsprechenden Färbung zugeführt, ohne den

für diese spezifischen Fixierschritt zu durchlaufen.

Die Laufbedingungen waren wie folgt:

Spannung (V) Laufzeit (min)

Stufe 1: 100 60

Stufe 2: 200 60

Stufe 3: 500 30

Kathodenpuffer, pH 3-10

1x 10x

Arginin 20 mM 3,5 g

Lysin 20 mM 2,9 g

Mit H2Odd auf 100 mL auffüllen und gut durchmischen.

Dieser Puffer stand als Stammlösung 10x zur Verfügung (Invitrogen).

Anodenpuffer, pH 2,4

1x 10x

Phosphorsäure, 85 % 7 mM 2,4 mL

Mit H2Odd auf 1000 mL auffüllen und gut durchmischen.

Dieser Puffer stand als Stammlösung 10x zur Verfügung (Invitrogen).

Fixierlösung

Sulfosalicylsäure 3,46 g

Trichloressigsäure 15,46 g

Mit H2Odd auf 100 mL auffüllen und gut durchmischen.

Probenpuffer

1x 2

Arginin 20 mM 2 mL Kathodenpuffer

Lysin 20 mM 2,9 g

Glycerol 15 % 3 mL

Mit H2Odd auf 10 mL auffüllen und gut durchmischen.

Dieser Puffer stand als Stammlösung 2x zur Verfügung (Invitrogen).

Markerproteine

Broad Calibration Kit, pH 3-10 (Amersham Pharmacia Biotech)

Der Kit enthielt lyophilisierte Proteine mit den folgenden isoelektrischen Punkten:

3,50; 3,75; 4,55; 5,20; 5,85; 6,55; 6,85; 7,35; 8,15; 8,45; 8,65 und 9,30.

3.2.10 Färbung, Dokumentation und Auswertung von

Elektrophoresegelen

Im Anschluss an eine elektrophoretische Trennung wurden die Gele entweder

einer Visualisierung durch Anfärbung oder einem Westernblotting mit anschlie-

ßender Immundetektion zugeführt. Die Visualisierung erfolgte durch eine der bei-

den im folgenden beschriebenen Färbetechniken.

3.2.10.1 Kolloidale Coomassie-Färbung [190]

• Fixierung der Proteine im Gel in 100 mL Fixierlösung für 60 min.

• Färbung des Gel in 100 mL Färbelösung ü/N.

• Waschen des Gels in 100 mL Waschlösung für 5 min zur Entfernung über-

schüssiger Farbkomplexe.

Alle Schritte fanden unter ständiger Durchmischung niedriger Intensität auf einem

Horizontalschüttler bei Raumtemperatur statt.

Fixierlösung

o-Phosphorsäure (35 %) 1 mL

Methanol 20 mL

H2Odd 79 mL

Färbelösung

Methanol 20 mL

H2Odd 60 mL

Roti-Blue (5x) (Roth) 20 mL

Gut durchmischen.

Waschlösung

Methanol 25 mL

H2Odd 75 mL

3.2.10.2 Silberanfärbung [191]

• Fixierung der Proteine im Gel in 100 mL Fixierlösung für 60 min.

• Waschen des Gels mit 100 mL Waschlösung (3 x 10 min).

• Inkubation in Sensibilisierungslösung für 1 min.

• Waschen des Gel mit 100 mL H2Odd (3 x 20 sec).

• Imprägnierung des Gels mit 100 mL Imprägnierlösung für 20 min.

• Waschen des Gel mit 100 mL H2Odd (3 x 20 sec).

• Entwicklung mit 100 mL Entwicklungslösung, bis die Banden ausreichend

gefärbt sind. Gel färbt noch nach, so dass vor dem Erreichen des ge-

wünschten Färbegrades die Entwicklung beendet werden muss.

• Waschen und Stoppen der Färbung mit 100 mL H2Odd (2 x 20s).

• Stoppen der Färbung durch 100 mL Stopplösung (2 x 30 s und 1 x 10 min).

• Waschen des Gel mit 100 mL Waschlösung für 30 min.

Alle Schritte fanden unter geringer ständiger Durchmischung Intensität auf einem

Horizontalschüttler bei Raumtemperatur statt.

Entwicklungslösung

Dinatriumcarbonat 60 g/L 20 mL

Natriumthiosulfat x 5 H2O 4 mg/L 1 mL

p-Formaldehyd, 37 % (v/v) 0.5 mL 75 µL

Mit H2Odd auf 100 mL auffüllen und gut durchmischen.

Fixierlösung

Ethanol 15 mL

Eisessig 12 mL

p-Formaldehyd, 37 % (v/v) 50 µL

Mit H2Odd auf 100 mL auffüllen und gut durchmischen.

Imprägnierlösung

Silbernitrat 2 g/L 1 mL

p-Formaldehyd, 37 % (v/v) 0.5 mL 75 µL

Mit H2Odd auf 100 mL auffüllen und gut durchmischen.

Sensibilisierungslösung

Natriumthiosulfat x 5 H2O 0,25 g/L 1 mL

Mit H2Odd auf 100 mL auffüllen und gut durchmischen.

Stopplösung

Ethanol 45 mL

Essigsäure 36 mL

Mit H2Odd auf 300 mL auffüllen und gut durchmischen.

Waschlösung

Ethanol 15 mL

Mit H2Odd auf 300 mL auffüllen und gut durchmischen.

3.2.10.3 Trocknen der Gele

Die angefärbten Gele wurden im Anschluss gegen Quellen und mechanische

Beanspruchung geschützt, sowie durch Trocknen in einen langfristig lagerfähigen

Zustand überführt.

• Inkubation der Gele für 30 min unter leichtem Schwenken in 100 mL Trockn-

erlösung.

• Einschlagen der Gele in Cellophanfolie (Amersham Pharmacia Biotech).

Hierzu wurde eine Cellophanfolie in H2Odd getränkt und auf einer Glasplatte

blasenfrei glattgestrichen. Das Gel wurde auf der Mitte der Platte abgelegt

und mit H2Odd gewässert. Zum Abschluss wurde eine zweite gewässerte Fo-

lie auf dem Gel platziert und blasenfrei glattgestrichen. Die überstehenden

Folienenden wurden an der Unterseite der Glasplatte glattgestrichen.

• Das so fixierte Gel ü/N an der Luft trocknen. Eine schnellere Trocknung kann

durch Überleiten eines warmen Luftstroms erzielt werden, wobei es aufgrund

unregelmäßiger Trocknung aber zu Gelrissen kommen kann.

Trocknerlösung

Glycerin (99,5 %) 10 mL

Ethanol 20 mL

Mit H2Odd auf 100 mL auffüllen und gut durchmischen.

3.2.10.4 Dokumentation und Auswertung der gefärbten

Proteinspektren

Die getrockneten Gel- und Blotfolien wurden mittels eines Scanners mit Durch-

lichteinheit (JX-330, Sharp) und der entsprechenden Software (ScanJX/Win 4.2,

Sharp) in ein 8-bit 256-Graustufen-Bild im TIF-Format digitalisiert und mit der 1D-

Image- Master-Software (Amersham Pharmacia Biotech) ausgewertet. Hierdurch

erfolgte die Zuordnung der Markerbanden und die anschließende Kalkulation der

Molekulargewichte bzw. der isoelektrischen Punkte.

3.2.11 Immunoblotting

In einer Polyacrylamidmatrix fokussierte Proteine können durch ein senkecht

angelegtes elektrisches Feld unter Beibehaltung ihrer Auftrennung eluiert und auf

eine Membranoberfläche transferiert werden. Die Membran dient hierbei als „In-

terface“ zur weiteren Analytik der Proteine, wie einer anschließenden Immunde-

tektion oder massenspektroskopische Untersuchung. Die Kombination der e-

lektrophoretischen Trennung komplexer Proteinextrakte und die anschließende

Fixierung auf einer Membran ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung

der Komponenten, einschließlich der IgE-bindenden Bestandteile.

In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Immundetektion nach der Inkubation mit

Allergikerserum durch ein anti-Human IgE-AP-Konjugat24, die anschließende

24 Immunglobulin E mit Alkalischer Phosphatase als enzymatischer Amplifikator

Farbentwicklung entweder durch ein Chromogen-(BCIP25/NBT26) oder Chemilu-

mineszenz-(CSPD)-Substrat27. Bei letzterem fand die Visualisierung auf einem

Röntgenfilm statt. Die Nachweisgrenzen lagen nach Angaben der Hersteller für

das BCIP/NBT bei 10-50 ng und für CSPD bei bis zu 10 ng. Ausführliche Be-

schreibungen zum Elektroblotten [186, 162], sowie grundlegenden Arbeiten zur

Anwendung des Immunoblottings in die Allergendiagnostik sind in der Literatur zu

finden [192, 193].

Nach anfänglichen Vergleichen des Transfers zwischen dem Tank- und Semidry-

Verfahren kam ausschließlich das Semidry-Verfahren zum Einsatz. Das Verfah-

ren ist einfacher, ressourcenschonender und benötigt keine Kühlung. Die starke

Hitzeentwicklung im Tankblotting kann zur Schädigung der Proteine in ihrer bio-

logischen Aktivität führen, wobei eine Kühlung nur mit sehr hohem Aufwand

gleichmäßig zu gestalten ist, unregelmäßige Blottergebnisse sind die Folge. Zu-

dem sind Immunnachweise nach Semidryblotten empfindlicher, da der Transfer

schonender ist als der durch Tankblotten [186]. Die Proteine wandern offensicht-

lich weniger tief in die Membran und bleiben eher auf der Oberfläche haften, wo

sie besser detektiert werden können.

Methodik

Gelelektrophorese

1. Auftrennung der Proteinlösungen durch elektrophoretische Verfahren (SDS-

PAGE, IEF oder native Elektrophorese).

2. Lösen des Gels aus der Kammer und äquilibrieren im Kathodenpuffer für 5

min.

Das Gel nicht überladen, als Beispiel ca. 10-20 µg einer komplexen Proteinlö-

sung auf einem Minigel (Lanebreite 8 mm, BioRad MiniProtean II).

Vorbereiten der Blotmembran

1. Schneiden der Blotmembran auf die exakten Gelmaße und markieren einer

Ecke.

2. Aktivieren der PVDF28-Membran (0,45 µm, Invitrolon PVDF, Invitrogen) für 15

sec in 100 % Methanol.

25 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-1-phosphatase

26 Nitro-blue-tetrazolium

27 Disodium 3-(4-metho xyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro) tricyclo (3.3.1.1 3,7) decan}-4-yl) phenyl phos-

phate

28 Polyvinylidenfluorid

3. Waschen der Membran in H2Odd für 2 min.

4. Äquilibrieren in Anodenpuffer II für 5 min.

Semidry-Transfer

1. Sättigen der Graphitelektroden (Anode und Kathode) mit H2Odd.

2. Wässern zweier Filterpapiere29 (exakt auf Gelgröße schneiden) in Anoden-

puffer I und platzieren auf der Anode. Luftblasen durch Walzen des Filtersta-

pels mit einer Pasteurpipette entfernen.

3. Wässern eines Filters (exakt auf Gelgröße schneiden) in Anodenpuffer II und

platzieren auf den ersten beiden Filtern. Luftblasen entfernen.

4. Plazieren der vorbereiteten Membran auf dem Filterstapel.

5. Plazieren des Gels auf der Membran und die Zuordnung Markierung Gel und

Membran beachten.

6. Wässern dreier Filter (exakt auf Gelgröße schneiden) mit Kathodenpuffer und

auf dem Blotstapel platzieren. Luftblasen entfernen.

7. Komplettieren der Bloteinheit durch fixieren der Kathodenelektrode und an

den Stromkreis der Kammer anschließen. Beschweren der oberen Elektrode

durch Glasplatten oder ein vergleichbares Gewicht, wodurch ein gleichmäßi-

ger Transfer gewährleistet wird.

Die einzuregelnden Stromstärken sind für eine Gelfläche von 50 cm2 abhängig von der Zeit:

Stromstärke pro Fläche [mA/cm2] Stromstärke (Summe) [mA] Zeit [min]

0,8 40 60-120

1,2 60 60

2,5 125 30-45

4,0 200 10-30

Mit ansteigender Stromstärke ist zu beachten, dass größere Proteine zwar leich-

ter aus der Gelmatrix wandern, kleine Proteine aber unter Umständen die Memb-

ran durchschießen. Die gleichmäßigsten Blotergebnisse wurden bei einer Strom-

stärke von 0,8 mA/cm2 und einer Dauer von 1,5 h erzielt.

8. Nach Beendigung des Transfers die Strom-Spannungsquelle ausschalten

und die Verbindung zur Kammer unterbrechen.

9. Vorsichtiges Abheben der oberen Kathode und der auf dem Gel und der

Membran liegenden Filter.

Der Bloterfolg kann anhand

29 Filter mit hoher Flüssigkeitskapazität notwendig, „extra dick“ (<1 mm), z.B. GB004 Schleicher & Schüll).

• farbiger Markerproteine auf der Membran und im Gel,

• einer reversiblen Anfärbung der Membran durch Ponceau S und

• der kolloidalen Coomassie-Färbung des Gels verfolgt werden.

Besonders während der Optimierung der Transferbedingungen ist diese Kontrolle

unbedingt zu empfehlen.

Verwendet wurde das Semidry-Sytem (NovaBlot) in Verbindung mit Multiphor II-

Kammer und der Strom-Spannungsquelle EPS 3500 (Ammersham-Pharmacia

Biotech).

3.2.11.1 Chromogene Immundedektion mit BCIP/NBT

Für die chromogene Immundetektion hat sich eine Vorgehensweise der Fa. Milli-

pore [194] bewährt, die auf die Problemstellung optimiert wurde.

PVDF-Membrane müssen hierbei nicht notwendigerweise geblockt oder durch

ausgedehnte Waschschritte von überschüssigen Reagenzien befreit werden.

Trocknen der Membran versetzt sie in den hydrophoben Grundzustand zurück,

Antikörper binden so nur spezifisch an bereits membrangebundene Proteine.

1. Blockieren der freien Bindungsstellen der Membran mit Blockierungspuffer für

30 min.

2. Trocknen der Membran entweder bei 37° C oder bei Raumtemperatur für 1

bzw. 2 h. Die Membran muss vor dem nächsten Schritt vollständig trocknen.

Auf der Membran verbleibende Wassertropfen verursachen hohe Hinter-

grundfärbungen.

3. Kennzeichnen der einzelnen Lanes auf der Membran und schneiden der

Membran in 4-5 mm breite Streifen.

4. Inkubation der Blotmembran mit verdünnten Patientenseren über Nacht bei

RT auf der Wippe in Inkubationstrays (BioRad). Das Serum wird 1:5 in Inku-

bationspuffer verdünnt.

5. Waschen der Membran in Wasch-Puffer (3 x 10 min).

6. Inkubation für 3-4 h mit dem Alkalische-Phosphatase gekoppelten Detektion-

santiköper (mouse anti-human IgE-AP konjugiert, 36413E, Pharmingen)

1:1000 in Inkubationspuffer verdünnt.

7. Waschen der Membran in Wasch-Puffer (3 x 10 min).

8. Zugabe von je 1 mL des chromogenen Substrates (Novex) pro Lane zur

Farbentwicklung der alkalischen Phosphatase. Die Entwicklungszeit beträgt

je nach Problemstellung und gewünschter Farbintensität zwischen 20-60 min.

9. Waschen der Membran in Wasch-Puffer (3 x 10 min).

10. Lichtgeschützt trocknen und umgehend dokumentieren.

Es wurde ein diskontinuierliche Puffersystem [162] ohne den vorgeschlagenen

20 %igen Methanolzusatz verwendet, da Methanol die biologische Aktivität der

Proteine beeinflusst.

Anodenpuffer I

Tris 0,3 M/L 36,3 g

Natriumazid30 0,01 % 0,1 g

Mit H2Odd auf 1000 mL auffüllen und gut durchmischen, pH 6,8.

Anodenpuffer II

Tris 25 mM/L 3,03 g

Natriumazid 0,01 % 0,1 g

Mit H2Odd auf 1000 mL auffüllen und gut durchmischen, pH 8,6.

Kathodenpuffer

Glycin 39 mM/L 2,93 g

SDS (w/v) 0,01 % 0,1 g

Natriumazid 0,01 % 0,1 g

Mit H2Odd auf 1000 mL auffüllen und gut durchmischen.

PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung)

Kaliumphosphat 10 mM/L 1,74 g

Natriumchlorid 15 mM/L 0,88 g

Mit H2Odd auf 1000 mL auffüllen und gut durchmischen, pH 7,4.

Inkubationspuffer

PBS mit 0,1 % (w/v) Rinder Serum Albulmin (Fraktion V)

Blockierungspuffer

PBS mit 0,05 % Tween 20

5 % (w/v) Magermilchpulver oder 1 % (w/v) Rinder Serum Albulmin (Fraktion V)

Waschpuffer

PBS mit 0,05 % Tween 20

Chromogenes Substrat

Mischen des chromogenen Substrates (Novex) mit H2Odd (3:2)

30 Natriumazid stört einige Enzymdetektionsmethoden.

3.2.11.2 Immunoblotting mit Chemilumineszenz (CSPD)-

Detektion

1. Die PVDF-Membran wird für 15 sec in Methanol getränkt und anschließend

für 5 min in Waschpuffer getaucht

2. Die Blotmembran in ein Inkubationsrohr (Kroll) überführen und 30 min mit 6

mL Blocking-Reagenz absättigen.

3. Waschen: 5 min mit 6 mL Waschpuffer.

4. Inkubation des Blots ü/N bei RT mit Humanserum-Lösung (Se-

rum:Waschpuffer 1:5)

5. Waschen: 3 x 10 min mit je 6 mL Waschpuffer.

6. Inkubation des Blots mit 6 mL Maus-anti-Human IgE-AP-Konjugat (Aller-

gopharma F-PL-Ka, 1:1000 Fertiglösung) bei RT für 2 h

7. Waschen: 3 x 10 min mit je 6 mL Waschpuffer.

8. Waschen: 2 x 5 min mit je 6 mL Assay-Puffer.

9. Inkubation des Blots mit 6 mL CSPD-Substrat-Lösung

10. Die Blotmembran wird vorsichtig auf eine durchsichtige PE-Folie in einer

Röntgenfilm-Kassette gelegt, mit einer weiteren Folie abgedeckt, die mit Te-

safilm am Kassettenrand fixiert wird.

11. Licht aus, Infrarot-Lampe an!

12. Für jeweils 10, 20 und 40 min wird ein Röntgenfilm (Kodak X-Omat AR) auf-

gelegt und entwickelt.

Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10 x

Dinatriumhydrogenphosphat 82,3 g

Natriumdihydrogenphosphat x 4 H2O 23,5 g

Natriumchlorid 40,0 g

Natriumazid 0,5 g

Auf 100 mL mit H2Odd auffüllen, pH (6,8-7,2). Lagerung bei RT bis zu drei Monate.

Waschpuffer

Tween 20 (v/v) 0,1 %

100 mL PBS (10x) geben und auf 1000 mL auffüllen.

Lagerung bei RT bis 1 Monat.

Blockinglösung

500 mg Blocking-Reagenz (Magermilchpulver)

PBS (10x) 25 mL

TWEEN 20 (v/v) 0,05 %

250 mL H2Odd im Wasserbad bei 40° C lösen.

Bei höheren Temperaturen Gerinnungsgefahr. Lagerung bei 4° C bis zu einem Monat.

Assay-Puffer; pH 10

Diethanolamin 9,6 mL

Magnesiumchlorid x 6 H2O 250 mg

in ca. 900 mL H2Odd lösen

mit 1N Salzsäure auf pH 9,9-10,1 einstellen.

mit H2Odd auf 1000 mL auffüllen.

Lagerung bei 4° C bis zu einem Monat.

CSPD-Substrat-Lösung

CSPD (Serva) 60 µL

Assay-Puffer 6 mL

3.2.12 Patientenseren

Die verwendeten Patientenseren (Tabelle 7) entstammten bis auf das Poolserum

des Pharmaunternehmes der Serenbank der Allergie- und Asthma Klinik, Bad

Lippspringe und kamen als Einzelserum zum Einsatz. Die Patienten wurden nach

positiver Anamnese und Hauttestung auf Hausstaub- und/oder Vorratsmilben

vorselektiert und mittels des CAP-Tests (Amersham Pharmacia Biotech) auf ih-

ren Gehalt an spezifischen IgE hin untersucht.

Die folgenden Seren wurden verwendet:

Nr. d 1 d 2 d 70 d 71 d 72 d 73 d 74

15 4 2 2 2 1 2

26 5 4 5 4

36 6 4 4 4

46 6 3 4 4 2 2

53 3 0 0 0 0 0

65 5 3 3 3 2

75 4 4 4 4 3 4

84 3

93 4

10 6 6

11 6 6

12 4 4

13 3 3

14 4 4

15 6 5

d 1

d 2

d 70

d 71

d 72

d 73

d 74

Dermatophagoides pteronyssinus

Dermatophagoides farinae

Acarus siro

Lepidoglyphus destructor

Tyrophagus putrescentiae

Glycyphagus domesticus

Euroglyphus maynei

Tabelle 7 – Verwendete Patientenseren

Abschließend erfolgte die Einordnung der Ergebnisse in Sensibilisierungsklas-

sen, den RAST-Klassen. Eine Zuordnung der CAP- zur RAST-Klassifizierung

zeigt Tabelle 8.

CAP-RAST-Klasse allergenspezifische IgE-Konzentration

[kU/L]31 RAST-Klasse

0< 0,35 0

10,35 - 0,70 1

20,70 - 3,5 2

33,5 - 17,5 3

417,5 – 50 4

550 – 100 4

6> 100 4

Tabelle 8 – CAP-RAST-Klassen im Vergleich zur RAST-Klassen-Einteilung

3.2.13 Zymogramm

Ein Zymogramm ermöglicht die Bestimmung von Metalloproteasen, Colla-

genasen und weiteren Proteasen, die in der Lage sind, Casein oder auch Gelatin

als Substrat umzusetzen. Hierzu wird das entsprechende Substrat in der Polya-

crylamidmatrix von Elektrophoresegelen eingebunden und die Probe identisch zu

einer SDS-PAGE aufgetrennt. Damit die Umsetzung des Substrates durch die

Proteasen vonstatten gehen kann, wird nach Beendigung der Trennung das Gel

für eine bestimmte Zeit bei 37° C inkubiert. An den Stellen im aufgetrennten

Bandenspektrum des Gels, an dem sich Proteasen befinden, wird das Substrat

aus dem Gel umgesetzt. Die anschließende Coomassie-Färbung ergibt an dieser

Stelle keine Färbung, wohingegen das Gel an allen Stellen kräftig durchgefärbt

wurde, an denen noch Reste des Substrates im Gel verblieben [195]. Die Zuord-

nung der Proteasen erfolgt über den Vergleich mit Molekulargewichtsmarkern

bzw. dem Bandenmuster der „normal“ in einer SDS-PAGE aufgetrennten identi-

schen Probe.

In dieser Arbeit wurden 12 %ige Tris-Glycine-Fertiggele (Invitrogen) mit Casein

verwendet. Da sie identisch mit den in der SDS-PAGE verwendeten Gelen wa-

ren, konnten bei gleichen elektrophoretischen Bedingungen ein direkter Übertrag

der Molekulargewichtsmarker und des Bandenspektrums erfolgen. Die Nach-

weisgrenze des Gaseingels lag laut Herstellerangabe bei 7 x 10-4 Trypsineinhei-

ten.

Methodik

Die frisch hergestellten bzw. rekonstituierten Proben wurden 1:1 mit dem aus der

SDS-PAGE bekannten Probenpuffer versetzt und für 10 min bei Raumtemperatur

inkubiert und anschließend in der entsprechenden Konzentration in die Proben-

31 Kilo Units/Liter

taschen des Gels appliziert. Die Probenkonzentration betrug bei allen Proben

zwischen 180 und 200 µg/mL. Die elektrophoretischen Trennung wurde in einer

XCell II-Mini-Cell (Invitrogen) durchgeführt und entsprach in ihren Bedingungen

(Puffer, Spannung und Laufzeit) der in dieser Arbeit verwendeten SDS-PAGE.

Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel unter leichtem Schwenken

für 30 min bei Raumtemperatur in 100 mL Renaturierungslösung inkubiert. An-

schließend folgte die Inkubation in 100 mL Entwicklerlösung bei Raumtempera-

tur. Danach wurde die Entwicklerlösung gewechselt und es erfolgte die abschlie-

ßende Inkubation bei 37° C. Die Dauer des letzten Schrittes hing von der prote-

olytischen Aktivität der Proben und dem gewünschten Substratumsetzungsgrad

ab und betrug zwischen 1,5 h und 12 h (ü/N). Die Visualisierung erfolgte für 30

min in einer Coomassie-Färbung, die zur Steigerung des Kontrastes gegenüber

der üblicherweise verwendeten Rezeptur einen höheren Anteil an Farbpigmenten

enthielt. Die Entfärbung erfolgte bis zum gewünschten Kontrast in 100 mL Ent-

färbungslösung unter leichtem Schwenken.

Die Laufbedingungen waren wie folgt:

Spannung 125 V (konstant über die Laufzeit)

Stromstärke Start: ca. 30-40 mA

Ende: 8-12 mA

Laufzeit 90 min

Probenpuffer; pH 8,45

1 x 4 x

Glycerol 1,09 M 4,0 g

Tris 141 mM 0,682 g

Tris-HCL 106 mM 0,666 g

LDS 73 mM 0,8 g

EDTA 0,51 mM 0,006 g

Serva Blue G 250 0,22 mM 0,75 mL einer 1 %igen Lösung

Phenolrot 0,175 mM 0,25 mL einer 1 %igen Lösung

Mit H2Odd auf 10 mL auffüllen.

Der Puffer wurde als Fertigpuffer NuPage LDS Sample Buffer (Invitrogen) bezogen.

Laufpuffer; pH 8,3

1x 10x

Tris 25 mM 29 g

Glycin 192 mM 144 g

SDS (w/v) 0,1 % 10 g

Mit H2Odd auf 1000 mL auffüllen.

Renaturierungslösung

1x 10x

Triton X-10032 2,7 % in H2Odd 135 g

Mit H2Odd auf 500 mL auffüllen.

32 t- Octylphenoxypolyethoxyethanol

Entwicklerlösung

1x 10x

Tris 50 mM 30,2 g

Salzsäure (6 N) 40 mM 33 mL

Natriumchlorid 200 mM 58,5 g

Calciumchloriddihydrat 5 mM 3,7 g

Brij 3533 (w/v) 0,2 % 1,0 g

Mit H2Odd auf 500 mL auffüllen.

Färbelösung

Coomassie Brilliant Blue (w/v) 0,5 % 0,5 g

Mit Entfärberlösung auf 100 mL auffüllen und gut durchmischen.

Entfärbungslösung

Essigsäure 10 % (v/v) 10 mL

Methanol 30 % (v/v) 30 mL

Mit H2Odd auf 100 mL auffüllen.

33 Polyethylen-23-Laurylether

4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

4.1 UV/VIS-SPEKTROSKOPIE

Es wurden in den Proben 23, 24 und 25 die für Proteine typischen Absorptions-

spektren gefunden [178]. Zu einen das stark ausgeprägte Maximum des n-π*-

Übergang der Peptidbindungen bei 220 nm und zum anderen das auf entschie-

den niedrigerem Niveau verlaufende Maximum des π - π*-Übergangs der chro-

mophoren Aminosäuren bei 260-280 nm (Abbildung 5, A).

Der molare Extinktionskoeffizient nm259 cmmol/L ⋅

= 0,513 x 10-3 entspricht bei einer

Schichtdicke der Küvette von 1cm einem mittleren Molgewicht von 19,5-22 kDa.

Der scheinbare Extinktionswert wurde zu )nm259%(1

mL/mg

= 0,107 bestimmt. Dies ent-

spricht einer optischen Dichte von OD1%(259nm) = 1,0 für eine Proteinkonzentrati-

ondie von 107 µg.

Mit zunehmender Verdünnung der Probe 23 (Abbildung 6; A-C) nahm die Extink-

tion bei 260 nm entsprechend dem Lambert-Beerschen-Gesetz34 linear gegen die

Konzentration [µg/mL] ab. Es kann daraus geschlossen werden, dass mit zu-

nehmender Verdünnung keine bemerkenswerte Dissoziation und/oder Umfaltung

eintrat, sondern - wenn überhaupt - der Grad der Aggregation der Moleküle un-

tereinander schwindet [178]. Das Maximum der Peptidbindung sank proportional

der Verdünnung, wobei die Verschiebung des Maximums von 225 nm hin zu 205

nm in der 1:8-Verdünnung auf das Abnehmen der Wasserstoffbrückenbindungen

bzw. eine Veränderung der Sekundärstruktur hinweisen könnte. Welche Grund-

struktur überwiegt, α-, β-Struktur oder random-Coil, lässt sich z.B. mittels opti-

scher Rotationsdispersion (ORD) oder Circulardichroismus (CD)-Spektroskopie

abschließend beurteilen. Die unterschiedlichen Sekundärstrukturen können auf-

grund verschiedener Polarisationsrichtungen wellenlängen-abhängig (210-280

nm) voneinander differenziert werden [177].

Die Absorption bei 260 nm erwies sich zudem als pH-abhängig bei konstanter

Temperatur und Ionenstärke und Proteinkonzentration. Die Zugabe von Essig-

säure zur Probe 24 führte zu einem starken Absinken des chromophoren Ab-

34 A= log (Io/I) = ε x c x d

Bei konstantem molaren Extinktionskoeffizienten ε und unveranderter Messbreite (Kuvettendicke) d verhalt sich

die Absorption A zur Konzentration c linear proportional.

sorptionsanteils bei 260 nm und einer Überlagerung der Peptidbindungen bei 220

nm mit dem Essigsäurespektrum (nicht gezeigt).

Die Zugabe 1 N Natronlauge zur Probe 23 führte zu einem proportionalen Absin-

ken des chromophoren Maximums, aber nicht zu einer Verschiebung zu höheren

Wellenlängen (Abbildung 7, D) hin. Hieraus kann gefolgert werden, dass der

chromophore Anteil hauptsächlich durch Phenylalanin, dessen spezifisches Ma-

ximum bei 257 nm liegt, und nicht durch Tyrosin (275 nm) oder Tryptophan (280 -

291 nm) hervorgerufen wird [178]. Im alkalischen Milieu verändern letztere ihre

Abbildung 6 – UV-Absorptionsspektren eines D. pteronyssinus Extraktes (Lyophilisat Probe

23). A. Originalextrakt; B. 1:2 Verdünnung mit Cocas‘-Puffer; C. 1:8 Verdünnung.

chromophoren Systeme, so dass es zur angesprochenen Verschiebung des Ma-

ximums kommen würde.

6 N Harnstoff bewirkte in der Probe 23 eine n-π* Verschiebung bei 220 nm um

ca. 5 nm (Abbildung 7, E). Das Glätten der Peakspitze zeigte den gleichzeitigen

Verlust an Sekundärstruktur und damit eine Verschiebung von einem Struktur- zu

einem Bandenspektrum [196]. Im Gegensatz zur Verdünnung mit Pufferlösung,

resultierte die Harnstoffzugabe lediglich in einer Abnahme des n-π*-Maximums

um ca. 10 %.

Ein Vergleich zwischen Extrakten aus Kulturen gleicher Milbenspezies aber un-

terschiedlichen Ursprungskulturen, Allergon (Probe 25) vs. CSL (Probe 23), er-

gab anhand des Peakhöhenverhältnis 220 vs. 260 nm einen höheren aromati-

schen Charakter des CSL-Lyophilisates.

4.2 SPEZIFISCHE BESTIMMUNG DER

MAJORALLERGENE DER P 1 UND DER P 2

Verschiedene Extrakte (Proben 1, 12, 16, 18) der Milbe D. pteronyssinus wurden

ab einem Verdünnungsverhältnis von 1:1000 analysiert. Die Ergebnisse der

ELISA-Bestimungen können der Tabelle 9 entnommen werden. Die gleichzeitige

Analyse eines frischen L. destructor Extraktes (Probe 14) ergab optische Dichten

in der Größenordnung der jeweiligen Leerwerte für den Der p 1- und den Der p 2-

Abbildung 7 – UV-Absorptionsspektren eines D. pteronyssinus Extraktes (Lyophilisat). D.

1:2 Verdünnung der Ausgangsprobe (Abb. 6A) mit 600 µL 6 N Harnstoff; E. 1:2 Verdünnung

der Ausgangsprobe mit 600 µL 1 N Natronlauge.

ELISA. Eine Kreuzreaktion der monoklonalen Antikörper gegen die Hausstaub-

milbe mit Epitopen der fremden Spezies Vorratsmilbe bestanden demnach nicht.

Probe

Nr.

Probenbeschreibung Der p 1

[ng/mL]

Der p 2

[ng/mL]

Der p 1/Der p 2

1Referenzextrakt Pharmaunternehmen 48,2 35,0 1:0,73

12 Allergon-Kultur (Frischer Extrakt) 39,3 27,7 1:0,7

16 Allergon-Kultur (Lyophilisat) 25,8 25,0 1:0,96

18 CSL-Kultur (Lyophilisat) 26,6 19,8 1:0,74

Tabelle 9 - Ergebnisse der spezifischen Allergenbestimmung

Der Referenzextrakt (Probe 1) enthielt im Vergleich die höchste Konzentration an

Der p 1 und Der p 2 in einem Verhältnis von 1:0,73. Eine genaue Beschreibung

des Herstellungsprozesses für den Referenzextrakt des Pharmaunternehmens

konnte nicht eingesehen werden. Es wird angenommen, dass die höhere Aus-

beute aufgrund einer längeren Extraktionszeit zustande kam, da bei selbst

durchgeführten Extraktionen ein vergleichbares Verhältnis von 1:0,7 für einen

frischen Extrakt (Probe 12) erzielt werden konnte. Belegt wird diese Annahme

durch die ebenfalls erhöhten Ausbeuten des frisch hergestellten Allergon-

Extraktes, dessen Extraktionszeit sechs anstatt wie bei den Lyophilisaten vier

Stunden andauerte.

Das Verhältnis Der p 1/Der p 2 der lyophilisierten CSL-Probe (Probe 18) stimmte

sehr gut mit der Referenz und auch dem frisch hergestellten Extrakt überein. Da-

her wird vermutet, dass sich die CSL-Kultur entweder grundsätzlich stabiler ge-

genüber der Gefriertrocknung verhält und/oder die Ausgangskultur der Referenz-

kultur in ihrer Zusammensetzung sehr nahe kommt. Der fast identische Anteil an

Der p 1 und Der p 2 im Allergon-Lyophilisat (Probe 16) deutet auf mögliche Ver-

änderungen durch die Gefriertrocknung hin, da der frische Allergon-Extrakt (Pro-

be 12) der Referenz entspricht. Untersuchungen zur proteolytischen Aktivität

zeigten für das Allergon-Lyophilisat (Probe 16) die insgesamt höchste Aktivität.

Das CSL-Lyophilisat (Probe 18) entsprach der Referenz und zeigte im Zy-

mogramm die geringste Proteaseaktivität. Ein direkter Zusammenhang zwischen

dem Verhältnis der Majorallergene zueinander und der proteolytischen Aktivität

ist zukünftig zu prüfen.

Insgesamt lassen die Ergebnisse den Schluss zu, dass alle Kulturen zu einem

sehr hohen Grad ausschließlich Milbenkörper enthielten und Kotpellets nahezu

vollständig abgetrennt wurden. Wären die Kulturen mit größeren Mengen an Kot-

pellets verunreinigt, so wäre der Der p 1-Gehalt gegenüber Der p 2 um ein Viel-

faches erhöht [158] (siehe „Herstellung von Allergenextrakten–eine Übersicht“).

4.3 AUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE (SEC)

γ-Globulin (158 kDa) und Thyroglobulin (670 kDa) wurden durch die Säulenmat-

rix (Ausschlussvolumen ~70 kDa) nicht getrennt, so dass nur der scheinbare

durchschnittliche Molekulargewichtsbereich (gewichts- und zahlenmäßig) von

1,35 bis 44 kDa zur Molekulargewichtsbestimmung herangezogen werden konn-

te. Die Analyse der erhaltenen Elutionsprofile einschließlich ihrer Retentionszei-

ten wurde unter der Annahme durchgeführt, dass sich die Standardproteine in

engen hydrodynamischen Grenzen bewegen, d.h. ähnliches partielles spezifi-

sches Volumen und sphärische Form einnehmen sowie unter den Elutionsbedin-

gungen weder dissoziieren noch aggregieren. Die auf diese Art und Weise kalib-

rierte Säule wurde zur Molgewichtsbestimmung der Proteinanteile im Extrakt he-

rangezogen. Das Methodenprofil konnte nicht variiert werden, da es sich um eine

genormte analytische Methode in einem pharmazeutischen Unternehmen han-

delte und auch dort durchgeführt werden konnte.

Allergon

(Probe 3)

CSL

(Probe 2)

Hausreferenz

(Probe 1)

Der p 1 Der p 2Marker

[Da]

Lyophilisat Dialyse-

wasser

Lyophilisat Dialyse-

wasser

670.000

158.000 151.000 141,554 147.022

75.584

44.000 44.463 43.721 42.810

31.348

17.000 16.459 15.780 15.780 15.452

8.181 6.382

1.350 1.797 1.624 1.804 1.812 1.812

959 963 928 908 939

643

534 541

200

173 168 162

105

50 46 51 48 52

20 20 18 20

Tabelle 10 - Molekulargewichtsfraktionen in Dalton

In der Hausreferenz konnten neun Fraktionen zwischen 200 und 147.000Da be-

stimmt werden (Abbildung 8). Alle Extrakte zeigten Komponenten in den Berei-

chen 140-150, 42-43, 15, und 1,8 kDa sowie 95 Da (Tabelle 10). Es wird ange-

nommen, dass sich die Allergene der D. pteronyssinus Extrakte aus diesen

Komponenten zusammensetzten und größere Proteine aus der Kombination

kleinerer Proteine kombiniert werden. Den Molekulargewichtsfraktionen ab 900

Da und darunter fehlt aufgrund mangelnder Masse die Funktionalität, sie sollen

daher nicht weiter betrachtet werden. Die berechneten Molekulargewichte von

ca. 150 kDa könnten, aufgrund der für diesen Bereich nur sehr eingeschränkt

anwendbaren Standardreihe, durchaus im höheren Molekulargewichtsbereich

angesiedelt sein. Eigene massenspektroskopische Untersuchungen konnten im

Bereich von ca. 170 kDa die größten proteinogenen Extraktbestandteile identifi-

zieren. Für die eng verwandte Hausstaubmilbe D. farinae wurde ein Protein mit

einem Molekulargewicht von 177 kDa publiziert [55].

Zusätzlich wurden die Majorallergene Der p 1 und Der p 2 analysiert. Das für Der

p 2 berechnete Molekulargewicht von 15,5 kDa ist identisch mit dem durch SDS-

PAGE bestimmten Wert von 15,6 kDa (siehe „Unregelmäßigkeiten der Standar-

dallergene“). Der für Der p 1 erzielte Wert von 6,4 kDa stimmte hingegen nicht

mit dem Literaturwert von ca. 25 kDa überein. Allerdings wurde bei der SDS-

PAGE ein Wert von 24,5 kDa gefunden (siehe „Ergebnisse-SDS-PAGE“); die

anschließende Kontrolle durch Immunoblotting ergab ein schwaches, aber ein-

deutig positives Signal. Eine weitere Komponente mit vergleichbarem Molekular-

gewicht konnte mit 8,2 kDa nur im Referenzextrakt nachgewiesen werden. Aller-

dings zeigen alle drei Extrakte (1, 2 und 3) sowohl in der SDS-PAGE als auch im

Immunoblotting eindeutige Banden im 25 kDa-Bereich. Es kann daher vermutet

werden, dass sich Der p 1 unter den angewandten ionischen Bedingungen der

SEC in etwa vier gleich große Untereinheiten aufgespalten hat. Die Summe aus

4 x 6,4 kDa ergibt 25,5 kDa, das dem Ergebnis der SDS-PAGE entsprach.

Abbildung 8 – Das Chromatogramm der „Hausreferenz“ des Pharmaunternehmens zeigte

das vollständigste Fraktionierungsmuster.

Zur Massenbilanzierung hinsichtlich der Proteine bei der Dialyse wurde der je-

weils erste Pufferwechsel analysiert, wobei ein schwacher Peak (0,25 % Anteil

am Gesamtspektrum der Proteine) bei einer Retentionszeit von 11,68 min gefun-

den wurde, der einem berechneten Molgewicht von 31,4 kDa im Lyophilisat der

Allergonprobe entsprechen würde (Abbildung 9). Bei einem Molekularge-

wichtsausschluss der Dialysemembran von 3,5 kDa liegt der theoretische Radius

in Bezug zur Penetration eines Proteins mit Molgewicht von 3,5 kDa unabhängig

von der Form bei ca. 10 Å. Durch die Dialyse der hochsalzigen (0,5 M) Allerge-

nextrakte gegen H2Odd wurde ein hoher osmotischer Druck (~1,5 x 103 Pa) auf-

gebaut, der über den gesamten Dialysezeitraum von >12 h anstand. Da insbe-

sondere native Proteine mit ihrem spezifischen Hydrationsgehalt (normalerweise

um die 0.2 - 0.5 g/mL) sowie ihrer Ionenwolke (Debye-Hückel-Länge) auf osmoti-

sche Drucke dieser Größenordnung sehr empfindlich reagieren können, kann es

unter Umständen zu Umfaltungen oder Änderungen in der Form, welche auch die

hydrodynamischen Formfaktoren, z.B. sphärische, frei durchspülte Knäuel oder

stäbchenartige Formen, kommen. So ist es durchaus nicht verwunderlich, dass

das gefundene Protein mit Molgewicht 31,4 kDa u.U. eine stäbchenförmige

und/oder flexible Form angenommen hat und durch die Dialysemembran ge-

schlüpft ist [197]. Ergebnisse aus Röntgen-Kleinwinkel- und Weitwinkelstreuun-

gen (Cu Kα1-Stahlung, λ = 1.541 Å) stehen nicht unbedingt im Widerspruch zu

diesen Annahmen.

Abbildung 9 – Chromatogramm des ersten Wasserwechsels der Dialyse der Allergon-Kultur.

Der Peak bei 11,68 min wurde mit 31.348 Da kalkuliert.

Vor diesem Hintergrund macht auch der Einsatz von PEG bei der Extraktion

Sinn, da es die polaren Wassermoleküle von der Porteinoberfläche fern hält.

Durch den Einsatz von PEG kann es allerdings zu Verschiebungen des Moleku-

largewichtes zu höheren Molgewichten kommen, da die nicht kovalent gebunde-

nen PEG-Moleküle einen Beitrag zum Molgewicht liefern. Im Gegensatz dazu ist

die Aussalzung u.U. bei sehr polaren Proteinen ineffektiv, da diese noch bei ho-

hem Salzgehalt nicht fällbar sind (Einsalzeffekt).

Scheinbare Moleku-

largewichte

[Da]

Hausreferenz

Probe 1

[%]

CSL

Probe 2

[%]

Allergon

Probe 3

[%]

150.000 49,9 26,9 23,3

75.000 0,3

43.000 1,5 0,9 0,6

16.000 3,4 1,8 4,5

1.800 2,8 41,7 55,4

900 24 25,5 15,3

600 8

200 1,8 0,9

50 4,2 1,5 0,8

20 0,8 0,1 0,2

Tabelle 11 - Anteil einzelner Fraktionen am Gesamtspektrum in Prozent bezogen auf die

Peakfläche

Betrachtet man die Anteile der einzelnen Fraktionen an der gesamten Fragmen-

tierung (Tabelle 11), so ist festzustellen, dass durch die Lyophilisation eine er-

hebliche Verschiebung zu kleineren Fragmenten hin erfolgt. Vor allem der Anteil

der 150 kDa Fraktion sinkt konstant in beiden Lyophilisaten um ca. 50 %. Da im

Gegenzug der Anteil der 1,8 kDa Fraktion von 2,8 % (Referenz) auf 41,7 %

(CSL) bzw. 55,4 % (Allergon) ansteigt, liegt die Vermutung nahe, dass es sich

um eine direkte Verschiebung handelt. In der Gewichtung des Allergon-

Lyophilisates konnte die Fragmentierung zudem auf einem höheren Molekular-

gewichtsniveau gehalten werden, da der Anteil der 1,8 kDa Fraktion erheblich

(14,3 %) über dem des CSL Lyophilisates lag und diesbezüglich der Anteil der

900 Da Fragmente um 10,2 % verringert war. Nimmt man nun weiter für eine

aktive T-Zell-Epitopstruktur eine Sequenzfolge von 8-12 Aminosäuren mit einem

durchschnittlichen Molekulargewicht von ~150 Da an, so resultiert ein Fragment-

gewicht von 1,2-1,8 kDa. 1.8 kDa ist dementsprechend das kleinste Fragment,

dass durch Human-IgE erkannt werden könnte. Der erhöhte Anteil dieser Frakti-

on im Extrakt müsste zu einer erhöhten Aktivität des Allergon-Extraktes gegen-

über dem CSL-Extrakt führen. Für die proteolytische Aktivität konnte dies mittels

Zymogramms nachgewiesen werden (siehe „Proteaseaktivität“), eine erhöhte

allergische Aktivität kann nur vermutet werden, da hierzu eine EAST-Inhibition

und/oder eine Pricktestung durchgeführt werden müsste.

Des weiteren konnte, mit Ausnahme der Standards, in jedem untersuchten Ex-

trakt, eine Fraktion bei 900 Da aufgetrennt werden. Die Vermutung liegt nahe,

dass es sich hierbei um eine „Sollbruchstelle“ handelt. Die nächst kleinere Frakti-

on bei 500 Da tritt hingegen nur in den Dialysaten auf, so dass es sich um eine

spezifische Fragmentierung durch den osmotischen Stress der Dialyse handeln

dürfte.

Den Beleg, dass es sich bei den erzielten Molekulargewichten der

Ausschlusschromatographie um scheinbare Molekulargewichte handelte, lieferte

die MALDI-TOF-MS. Dort konnten weder die Molekulargewichte noch deren An-

teil am Gesamtspektrum bestätigt werden. Trotz dieser Einschränkung, lieferte

die Ausschlusschromatographie schnell erste Hinweise auf die Fraktionierung

und Verteilung der Proteine im Extrakt sowie ein Spektrum, das zur Chargenkon-

trolle herangezogen werden kann.

4.4 SDS-PAGE

Die Ergebnisse der Molekulargewichtsbestimmung mittels SDS-PAGE ergaben

für die untersuchten Extrakte gut differenzierte Bandenmuster im Bereich von 14

bis 150 kDa. In der Tabelle 12 sind die Molekulargewichte der verschiedenen

Extrakte aufgeführt, wobei vorhandene Banden durch eine „1“, nicht vorhandene

durch ein „leeres Kästchen“ erkennbar sind.

Alle Spektren zeigten mit bzw. ohne 10 %igen PEG-Zusatz zwischen 21 und 25

verschiedene Banden. Das durchschnittlichen Molekulargewichte variierte zwi-

schen 45 und 54 kDa.

Der Vergleich frischer Extrakte der Spezies D. pteronyssinus (Probe 12) mit L.

destructor (14) untereinander, ergab kaum Unterschiede in der Bandenzahl (25

vs. 24), das durchschnittliche Molekulargewicht war mit 48,6 kDa vs. 52,2 kDa für

L. destructor leicht erhöht. Insgesamt wurde eine 59 %ige Übereinstimmung der

Bandenmuster (12 vs. 14) festgestellt.

Die Lyophilisate zeigten generell gegenüber nicht lyophilisierten Proben ein um

zwei bis fünf Banden ärmeres Spektrum und lagen mit ihren durchschnittlichen

Molekulargewichten von 54,3 kDa für Allergon (Probe 14) und 45,0 kDa für CSL

(Probe 16) am oberen bzw. unteren Ende der Skala. Dem entsprechend konnte

nur eine 70 %ige Übereinstimmung der Lyophilisate festgestellt werden, im Ver-

gleich mit dem frischen Extrakt (Probe 12) wurden mit 76 % für Allergon (Probe

14) und 71 % für CSL (Probe 16) höhere Werte erzielt. Die Resultate des Mat-

chings sind in Tabelle 13 gelistet.

Frische Extrakte Lyophilisierte Extrakte

Spezies D. pteronyssinus L. destructor D. pteronyssinus D. pteronyssinus

Hersteller Allergon Uni Paderborn Allergon CSL

Proben-Nr.

[kDa]

12 13

PEG

14 15

PEG

16 17

PEG

18 19

PEG

151,1 1 1 1 1 1 1 1 1

131,7 1 1 1 1

117,0 1 1 1 1 1

106,3 1 1 1 1 1 1

96,9 1 1 1 1 1

85,8 1 1 1 1 1 1 1

79,1 1 1 1 1

74,3 1 1 1 1 1

65,3 1 1 1 1 1 1

59,3 1 1 1 1 1 1

56,6 1 1 1 1 1 1 1

53,1 1

50,9 1 1 1 1 1 1 1 1

49,0 1 1 1

43,8 1 1 1 1 1 1 1

39,8 1 1 1 1 1 1 1

38,4 1 1

34,5 1 1 1 1 1 1 1

31,7 1 1 1

29,5 1 1

26,8 1 1

25,7 1 1 1 1 1 1 1 1

24,1 1 1 1 1 1 1 1

22,1 1 1 1 1 1

21,6 1 1 1

21,0 1 1 1 1

20,2 1 1 1

19,7 1 1 1

18,4 1 1 1 1 1 1 1

17,9 1 1

17,7 1 1

17,4 1 1 1 1 1 1 1 1

16,7 1 1 1

16,6 1 1 1 1 1 1

16,5 1 1 1

16,2 1 1 1 1 1

15,5 1 1 1 1 1

14,9 1 1 1 1 1 1 1

Statistik

MW 48,6 50,9 52,2 54,4 54,3 42,8 45,0 47,1

∑

∑∑

∑ Banden 25 26 24 24 23 21 21 22

Tabelle 12 - Molekulargewichte der untersuchten Extrakte. Detektierte Banden sind mit 1

gekennzeichnet.

Der 10 %ige PEG-Zusatz bewirkte bei den frischen Extrakten (Probe 13) und

dem CSL-Lyophilisat (Probe 19) nur geringe Schwankungen im durchschnittli-

chen Molekulargewicht, wobei in den Extrakten mit PEG jeweils um 1-2 kDa er-

höhte Werte gefunden wurden. Das durchschnittliche Molekulargewicht des Al-

lergon-Lyophilisates (Probe 17) sackte gegenüber dem nicht mit PEG versetztem

Pendant (Probe 16) um 12 kDa ab. Dass aber nicht nur im Allergon-Lyophilisat

durch den PEG-Zusatz größere Veränderungen induziert wurden, konnte anhand

des Vergleiches der PEG-Extrakte mit ihren Ursprungsproben erhaltenen Werte

ersichtlich. Es wurden für alle Extrakte Veränderungen im Umfang von 16-23 %

festgestellt.

Proben

Nr.

12 13 14 15 16 17 18 19

10 10,84 0,59 0,68 0,76 0,74 0,71 0,68

11 0,84 10,51 0,56 0,64 0,63 0,64 0,61

12 0,59 0,51 10,820,63 0,67 0,63 0,5

13 0,68 0,56 0,82 1 0,74 0,72 0,68 0,6

14 0,76 0,64 0,63 0,74 10,84 0,76 0,73

15 0,74 0,63 0,67 0,72 0,84 10,7 0,67

16 0,71 0,64 0,63 0,68 0,76 0,7 10,77

17 0,68 0,61 0,5 0,6 0,73 0,67 0,77 1

Tabelle 13 - Matching der SDS-PAGE-Bandenspektren. Eine 1 bedeutet 100 % Übereinstim-

mung und erhält man durch Vergleich der Probe mit sich selbst. Den Grad der Übereinstim-

mung mit den anderen Proben kann man links bzw. rechts neben der Vergleichsprobe in der

Waagerechten ablesen. Die Probe 15 ist im Beispiel weiß hinterlegt.

4.4.1 Verwendung dissoziierender Reagenzien am Beispiel

Dithiotreitol (DTT)

Zu Beginn der Untersuchungen wurden einige elektrophoretische Trennungen

durch die Zugabe von DTT (25 mM/L) unter sog. dissoziierenden Bedingungen

durchgeführt. Erst DTT bewirkt die weitestgehende Streckung der Proteinstränge.

Hierdurch werden bestehende Disulfidbindungen gekappt und die entstehenden

SH-Gruppen geschützt, wodurch eine Rückfaltung und Aggregation verhindert

wird [162]. Entsprechend behandelte Proben lassen durch die erhöhte Fragmen-

tierung vor allem im niedermolekularen ein differenzierteres Spektrum mit er-

höhter Bandenanzahl Bereich erwarten.

Die untersuchten Milbenextrakte (Proben 16, 17, 18 und 19) verhalten sich unter

den skizzierten Bedingungen konträr. In Abbildung 10 wird je ein Coomassie ge-

färbtes Bandenmuster für eine Behandlung mit (links) und ohne (rechts) DTT-

Zugabe gezeigt. Die Proben A-AD, B-BD, C-CD und D-DD bilden Probenpaare,

die sich nur im Zusatz an DTT unterscheiden. Alle anderen Parameter wie Kon-

zentration, Gelkonstitution, Lauf- und Färbebedingungen waren identisch. Die

Reihe M zeigt den Molekulargewichtsmarker.

Ohne DTT zeigten die Proben über den gesamten Trennbereich das eindeutig

differenzierte und reichhaltigere Bandenspektrum. Die Zugabe von DTT bewirkte

hingegen ein „verwischen“ der Banden. Unterhalb von 14,4 kDa und oberhalb 94

kDa fehlen ganze Bereiche des Spektrums. Im Bereich zwischen 14,4 kDa und

94 kDa fehlen Banden komplett bzw. sind nur sehr undeutlich zu erkennen. Die

beobachteten Veränderungen sind ein Indiz für vorhandene Disulfidbrücken, zu-

dem ist für DTT eine Cysteinprotease aktivierende Wirkung bekannt .

Das hier in aller Kürze beschriebene Phänomen ist aus der Literatur bekannt

[198, 193] und bislang nur für Milbenextrakte beobachtet worden. Normalerweise

werden Allergenextrakte, wie z.B. aus Schimmelpilzen oder Gräsern unter disso-

ziierenden Bedingungen analysiert [199].

Abschließend ist festzuhalten, dass auch die Solubilisierung durch SDS Verände-

rungen in der Probe hervorruft, wie z.B. hochmolekulare Fragmente, allerdings

nicht in dem Umfang, wie durch den DTT-Zusatz. Sind nach der elektrophoreti-

schen Trennung Untersuchungen beabsichtigt, die biologisch aktive Proteine

benötigen, so ist eine Native Elektrophorese zu bevorzugen.

Abbildung 10 – Die Verwendung dissoziierender Reagenzien am Beispiel Dithiotreitol (DTT).

Die Proben (Lyophilisate) wurden auf der linken Seite ohne und auf der rechten Seite mit

DTT aufgetrennt. A. Allergon (16), B. Allergon + 10 % PEG (17), C. CSL (18), D. CSL + 10 %

PEG (19), M. Low Molecular Marker.

4.4.2 Unregelmäßigkeiten der Standardallergene

Die in dieser Arbeit in der SDS-PAGE und im Immunoblot verwendeten Standar-

dallergene Der p 1 und Der p 2 kamen als Routinestandards in der Chroma-

tographie, der Elektrophorese und in immunologischen Verfahren, wie z.B.

ELISA, im Pharmaunternehmen zum Einsatz. Sie wurden affinitätschroma-

tographisch aus Standardextrakten isoliert.

In der Anwendung zeigten sich vor allem für Der p 1 verschiedene Unregelmä-

ßigkeiten (Abbildung 11-Reihe G1). Neben der erwarteten kräftigen Bande bei

24,5 kDa wurden in der SDS-PAGE vier weitere Banden bei 16,5 (Nr. 1), 30 (Nr.

2), 32 (Nr. 3) und 34 kDa (Nr. 4) festgestellt. Allerdings zeigte die 24,5 kDa Ban-

de nur eine sehr schwache Immunreaktion (Abbildung 11-Reihe B1), die weder in

Umfang noch Intensität mit der "SDS-PAGE-Bande" vergleichbar war (Nr. 6). Bei

16,5 kDa (Nr. 1b) konnte keine Reaktion festgestellt werden, alle weiteren Ban-

den (Nr. 2b, 3b, 4b) zeigten eine positive Resonanz auf das Poolserum. Es wird

angenommen, das die zusätzlichen Banden bei höherem Molekulargewicht Ag-

gregate aus Fragmenten der 24,5 und der 16,5 kDa Banden bestehen, die auch

im Gesamtextrakt nachgewiesen wurden (Abbildung 11-Reihe B3). Aufgrund der

Abbildung 11 - Unregelmäßigkeiten der Standardallergene. Die Reihen G1 und G2 zeigen

den SDS-PAGE-Ausschnitt von Der p 1 bzw. Der p 2, die Reihen B1 und B2 die entsprechen-

den Blotergebnisse. Das Blotergebnis der D. pteronyssinus „Hausreferenz“ (Probe 1) zeigt

Reihe B3, den Molekulargewichtsmarker Reihe M.

bekannten Proteaseaktivität von Der p 1, könnte die niedermolekulare Bande ein

proteolytisches Fragment sein.

Im Gegensatz hierzu, zeigte der Referenzextrakt (Probe 1) eine der SDS-PAGE

an Umfang und Anfärbungsgrad vergleichbare Reaktion mit dem bekannten

Poolserum (Nr. 6b). Dies lässt vermuten, dass an der starken Reaktion bei 24,5

kDa neben Der p 1 auch andere Allergene beteiligt sein müssen. Aus Tabelle 1

(„Klassifizierung der Milbenallergene“) wird ersichtlich, dass im Bereich 22-27

kDa mit den Allergenen Der p 6 (25 kDa), Der p 7 (22 kDa), Der p 8 (26 kDa) und

Der p 9 (24 kDa) fünf weitere Allergene aus der Literatur bekannt sind. Diese

Annahme wird durch eine Analyse des frischen D. pteronyssinus Extraktes (Pro-

be 26) mittels MALDI-TOF-MS belegt, der eine Vielzahl deutlicher Peaks im Be-

reich 22-27 kDa zeigte (Abbildung 12; Klammer A). Es wird daher angenommen,

dass die verschiedenen Banden in der SDS-PAGE als „eine Bande laufen“ und

nicht differenziert werden. Des weiteren ist es denkbar, dass sich die verschiede-

nen Allergene im Extrakt gegenseitig in ihrer Aktivität beeinflussen. Die für Der p

1 aus der Literatur bekannte Frequenz spezifischer IgE-Bindung von >80 % (Ta-

belle 1) ist somit in Frage zu stellen. Es handelt sich vielmehr um die Summe der

Aktivitäten verschiedener Allergene. Eine Auftrennung und Zuweisung des An-

teils einzelner Allergene an der Gesamtaktivität könnte z.B. durch eine 2D-

Elektrophorese mit anschließender Immundetektion erfolgen.

Der Gelausschnitt des Der p 2 Standards (Abbildung 11-Reihe G2) zeigte neben

der kräftigen Bande bei 15,6 kDa nur eine weitere schwache Bande bei 30 kDa

(Nr. 5), wobei es sich um ein Dimer handeln dürfte. Beide Banden wurden in ver-

gleichbaren Intensitäten im Immunoblot nachgewiesen (Abbildung 10-Reihe B2).

Im Massenspektrum konnten bei 15 kDa wiederum mehrere intensive Peaks

nachgewiesen werden (Abbildung 12; Klammer B). Da aber die Intensitäten in

der SDS-PAGE und des Immunoblots übereinstimmten, ist bei affinitätschroma-

tographischer Isolierung des Standards anzunehmen, das hauptsächlich Der p 2

allein für die Immunreaktion verantwortlich ist.

Abschließend ist festzustellen, dass aufgrund der hier aufgezeigten Ergebnisse

die Massenbestimmung mittels MALDI-TOF-MS der durch SDS-PAGE eindeutig

überlegen war.

4.5 NATIVE ELEKTROPHORESE

Die Native Elektrophorese wurde mit dem Ziel eingesetzt, Fragmentierungsmus-

ter der Extraktproteine in ihrer nativen funktional gefalteten Form, vergleichbar

der Ausschlusschromatographie, zu erhalten. Der Verzicht auf SDS sollte ermög-

lichen, die Proteine ohne Verlust ihrer allergenen Aktivität ihren waren Molekular-

gewichten zuzuordnen. Die gewünschten Ergebnisse wurde aber nur in einem

sehr geringem Umfang erzielt, da eine zufriedenstellende Auftrennung der Pro-

teine nicht erreicht werden konnte. Abbildung 13 zeigt exemplarisch ein mit Silber

gefärbtes Gel nach 185 min Trennzeit. Es waren nur sehr schwache Banden im

niedermolekularen (1.0-2.5 kDa) und hochmolekularen Bereich (67-90 kDa) er-

kennbar. Tabelle 14 zeigt die vollständige Liste der gefundenen Banden, wobei

die Anzahl hochmolekularer Banden als ein Indiz für nicht dissoziierte „Mutteral-

lergene“ angesehen wurde.

Aufgrund des fehlenden SDS-Zusatzes besaßen die Proteine ihre ursprüngliche

spezifische Oberflächenladung pro Volumen. Daraus resultierende starke Inter-

aktionen der Proteine untereinander und ihre ähnlichen pk-Werte führten zur

schlechten Differenzierung, da sich große und kleine Komponenten gegenseitig

in ihrer Wanderungsgeschwindigkeit beeinflussten. Dass es sich hier eher um

eine probenspezifische Problematik handelte, wurde anhand des entschieden

besser aufgetrennten Standards erkennbar. Der methodenbedingte verminderte

Abbildung 12 - Ausschnitt des MALDI-TOF-Massenspektrum eines frischen D. pteronyssinus

Extraktes (Laserenergie 0,48 µJ; positive Polarität; Matrix Sinapinsäure). Gekennzeichnet

sind die Molekulargewichtsbereiche um die Majorallergene Der p 2 (B) und Der p 1 (A).

Siebeffekt erlaubte allerdings auch für die Standards im Bereich 14,4-43 kDa nur

eine unzureichende Differenzierung. Die durchschnittliche Proteinbeladung von

~6 µg je Probe war trotz einer Silberfärbung für diese Problemstellung wahr-

scheinlich zu gering. Eine proteolytische Aktivität während der langen Tren-

nungszeit muss aufgrund der gut sichtbaren niedermolekularen Banden ange-

nommen werden.

Frische Extrakte Lyophilisierte Extrakte

Spezies D. pteronyssinus L. destructor D. pteronyssinus D. pteronyssinus

Hersteller Allergon Uni Paderborn Allergon CSL

Proben-Nr.

[kDa]

12 13

PEG

14 15

PEG

16 17

PEG

18 19

PEG

90 1 1 1 1

82,5 1 1 1 1 1

78 1 1 1 1

67 1 1 1 1 1 1

59 1 1

38,5 1 1

1-2,5 1 1 1 1 1

Tabelle 14 - Molekulargewichte aus der nativen Elektrophorese

Da die Ergebnisse mit einer hohen Ungenauigkeit behaftet waren, wurden sie in

der weiteren Diskussion nicht berücksichtigt.

Abbildung 13 – Auftrennung der Extrakte unter nativen Bedingungen. Die Reihe M ist der

Molekulargewichtsmarker. Die Ziffern oberhalb des Gels entsprechen den Probennummern

der Tabelle 14.

4.6 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG (IEF)

Die festgestellten isoelektrischen Punkte der Extrakte bewegten sich im Bereich

der Standards von pH 4,55 und 8,65 und sind in Abbildung 14 dargestellt. Die im

Markergemisch enthaltenen pI-Marker bei 3,5, 3,75 und 9,3 wanderten im Laufe

der isoelektrischen Fokussierung über die Gelbegrenzungen hinaus. Tabelle 15

zeigt das sehr bandenreiche und differenzierte Bandenspektrum. Des weiteren

konnte durch die erzielte Auflösung die beiden Spezies D. pteronyssinus und L.

destructor eindeutig differenziert werden. Außerdem wurden deutliche Unter-

schiede der Ursprungskulturen innerhalb der Spezies D. pteronyssinus anhand

der Lyophilisate der Hersteller Allergon und CSL festgestellt (Tabelle 17). Die

durch den Extraktionszusatz PEG hervorgerufenen Veränderungen konnten dem

Bandenspektrum zugeordnet werden. Die weitaus meisten Proteine der Milben-

extrakte lagen im sauren pH-Bereich (~70 %) mit den in allen Extrakten am

stärksten ausgeprägten Banden bei pH 6,3, 6,0 und 5,7.

Abbildung 14 – Isoelektische Fokussierung der Milbenextrakte in einem immobilisierten pH-

Gradienten (pH 3-10). Der Unterschied der Vorratsmilbenextrakte (Proben 14, 15) gegenüber

den Hausstaubmilben (Proben 12, 13, 16, 17, 18, 19) ist im Bereich von pH 8,15 besonders

deutlich zu erkennen.

Frische Extrakte Lyophilisierte Extrakte

Spezies D. pteronyssinus L. destructor D. pteronyssinus D. pteronyssinus

Hersteller Allergon Uni Paderborn Allergon CSL

Proben-Nr.

pI [pH]

12 13

PEG

14 15

PEG

16 17

PEG

18 19

PEG

8,65 1 1

8,46 1 1

8,31 1 1 1 1

8,18 1 1 1

8,07 1 1 1 1

7,99 1

7,81 1 1 1

7,69 1 1 1 1 1 1 1

7,62 1

7,39 1 1 1 1 1 1

7,31 1 1 1 1 1 1 1 1

7,26 1

7,13 1 1 1 1 1 1 1 1

7,04 1 1 1 1

6,9 1 1 1 1 1 1

6,77 1 1 1 1

6,68 1 1 1 1 1 1

6,57 1 1 1 1

6,51 1 1 1 1

6,42 1 1 1 1

6,38 1 1 1 1

6,32 1 1 1 1 1 1 1

6,26 1 1

6,14 1 1 1 1 1 1

6,1 1 1 1 1 1 1 1

6,06 1 1 1 1 1 1

5,98 1 1 1 1 1 1 1 1

5,87 1 1 1 1 1 1 1

5,83 1 1 1 1 1 1 1 1

5,76 1 1 1 1 1 1 1 1

5,69 1 1 1 1 1 1

5,64 1 1 1 1 1 1 1 1

5,57 1 1 1 1 1 1 1 1

5,48 1 1 1 1 1 1 1

5,37 1 1 1 1 1 1 1

5,34 1 1 1

5,29 1 1 1 1 1 1

5,22 1 1 1 1 1 1

5,1 1

4,99 1

4,65 1

4,57 1 1 1 1

Statistik der Banden

pI 6,65 6,60 6,53 6,51 6,75 6,32 6,93 6,46

> pH 7 9 7 6 5 7 7 6 9

< pH 7 17 19 21 20 14 14 20 21

Summe 26 26 27 25 21 21 26 30

Tabelle 15 - Bandenspektrum der untersuchten Extrakte – Die IgE-reaktiven pH-Bereiche

sind weiß unterlegt, die fett gedruckte Ziffer gibt die Anzahl reaktiver Banden an. Am Ende

der Tabelle sind die Gesamtsumme der Banden sowie ihre Verteilung im sauren und alkali-

schen pH-Bereich dargestellt.

Große visuelle Unterschiede konnten im sauren Bereich weder zwischen den

Spezies noch innerhalb der Spezies D. pteronyssinus, bzw. zwischen frischen

und lyophilisierten Extrakten festgestellt werden. Die auffälligsten Banden im al-

kalischen Bereich befanden sich für die D. pteronyssinus Extrakte (lyophilisiert

(Proben 16-19) und frisch hergestellt (Probe 12, 13) bei pH 7,4, 7,7 und 8,3. Ein

deutlich zur Hausstaubmilbe differenziertes Bandenspektrum wurde für L. de-

structor (Proben 14, 15) festgestellt. Die auffälligsten Banden der Vorratsmilbe

lagen bei pH 7,4 und 7,8. Banden oberhalb pH 8 wurden nicht gefunden. Die

durchschnittlichen pI-Werte lagen zwischen 6,5 und 6,9, wobei die Lyophilisate

gegenüber den frisch hergestellten Extrakten leicht erhöhte Werte aufwiesen.

Die Inkubation der Extrakte ohne PEG (Proben 12, 14, 16 und 18) mit Patienten-

serum 10 der höchsten CAP-RAST-Klasse (6) ergab für beide Spezies IgE-

reaktive Banden im alkalischen und sauren Bereich, wobei vier von fünf Banden

der frischen Extrakte im alkalischen Bereich lagen (Tabelle 16). Die pI-Werte der

IgE-aktiven Banden der frischen Extrakte lagen damit um ca. 0,6 Einheiten über

dem Summendurchschnitt aller Proteinbanden. Die aktiven Banden der Lyophili-

sate variierten leicht (Allergon - 0,1; CSL + 0,2) um ihren durchschnittlichen pI-

Wert, wobei das Allergon-Lyophilisat durch seinen um ca. 0,6 pH-Einheiten nied-

rigeren Summen-pI auffiel. In beiden Lyophilisaten (16, 19) konnte eine höhere

Bandenanzahl beobachtet werden, als im frisch hergestellten Extrakt (Probe 12).

Proben-Nr 12 14 16 18

pI 8,13

7,72

7,55

7,39

5,45

8,13

7,55

7,21

7,04

5,85

8,13

7,86

7,72

7,39

5,85

5,69

5,45

5,23

8,13

7,86

7,72

7,55

5,86

5,69

pI 7,25 7,15 6,65 7,13

Anzahl 5586

Tabelle 16 - Auflistung der pI-Werte der IgE-reaktiven Banden

Durch die mit der Lyophilisation einhergehende Fragmentierung könnten Epitope

freigelegt worden sein, die bis zu diesem Zeitpunkt im Inneren der Asozialen oder

Proteinen verborgen waren. Nach ihrer Freilegung durch das elektrische Feld

trugen sie zum erhöhten Bandenspektrum bei. Die hohe IgE-reaktive Bandenan-

zahl des Allergon-Extraktes (Probe 16) lässt auf eine erhöhte Gesamtreaktivität

des Lyophilisates schließen. Untersuchungen zur proteolytischen Aktivität un-

terstreichen die hohe Potenz gerade des Allergon-Lyophilisates.

Die zum Teil erheblichen Unterschiede der Extrakte konnten durch eine Korrela-

tionsberechnung mit der Auswertesoftware Image Master 1D Elite (Amersham

Pharmacia Biotech) nochmals verdeutlicht werden. Die Ergebnisse sind in Ta-

belle 17 dargestellt. So wurde zwischen der Hausstaubmilbe D. pteronyssinus

(Probe 12) und der Vorratsmilbe L. destructor (Probe 14) nur eine 68 %ige Über-

einstimmung gefunden. Noch geringere Gemeinsamkeiten konnten zu den Ly-

ophilisaten mit 69 % zu CSL (Probe 18) und zur identischen Allergon-

Ursprungskultur (Probe 12) lediglich 60 % festgestellt werden. Ergebnisse ande-

rer Untersuchungen in dieser Arbeit (SEC, SDS, MS, Zymogramm) bestätigen

die hier festgestellten Veränderungen durch Lyophilisation.

Proben-

12 13 14 15 16 17 18 19

10 10,81 0,68 0,67 0,6 0,51 0,69 0,75

11 0,81 10,87 0,82 0,68 0,51 0,85 0,86

12 0,68 0,87 10,96 0,71 0,63 0,87 0,81

13 0,67 0,82 0,96 10,7 0,61 0,82 0,76

14 0,6 0,68 0,71 0,7 10,76 0,55 0,67

15 0,51 0,51 0,63 0,61 0,76 10,51 0,51

16 0,69 0,85 0,87 0,82 0,55 0,51 10,82

17 0,75 0,86 0,81 0,76 0,67 0,51 0,82 1

Tabelle 17 - Korrelation der Extrakte - Gezeigt wird eine typische Korrelationsmatrix. Da der

Extrakt mit sich selbst zu 100 % korreliert, wurde er mit 1 bewertet. Die Übereinstimmung

der anderen Extrakte mit Ausgangsextrakt kann in den Spalten links und rechts abgelesen

werden.

Die Lyophilisate der Spezies D. pteronyssinus unterschiedlicher Hersteller (Aller-

gon, Schweden und CSL, Australien) besaßen nur 51 % Übereinstimmung, ein

Indiz für Unterschiede in den Ausgangskulturen und/oder durch die Lyophilisati-

on.

Der Einsatz von PEG bewirkte beim frischen D. pteronyssinus Extrakt eine um

ca. 20 % verringerte Übereinstimmung der Bandenmuster. Selbst die einfache

Zugabe von 10 % PEG zur Rekonstitution der Lyophilisate erzielte eine 20 %ige

Veränderung. Lediglich auf den L. destructor Extrakt schien PEG mit nur 0,04 %

Abweichung keinen Einfluss auszuüben.

4.7 IMMUNOBLOTTING

Frisch hergestellte Extrakte von D. pteronyssinus (Probe 26) und L. destructor

(Probe 27) sowie das Allergon-Lyophilisat von D. pteronyssinus (Probe 16) wur-

den mit verschiedenen Patientenseren inkubiert. Aus den in Abbildung 14 ge-

zeigten Ergebnissen sind die Unterschiede in der spezifischen IgE-Bindung zwi-

schen der Vorratsmilbe L. destructor (Reihen 1-7) und den beiden Extrakten der

Hausstaubmilbe (Frischer Extrakt: Reihen 8-15; Lyophilisat: Reihen 16-23) klar

ersichtlich. Während das Vorratsmilbenpräparat nur ein sehr eingeschränktes

Bandenspektrum im niederen Molekulargewichtsbereich zwischen 15 und 24 kDa

zeigte, wurde für beide Hausstaubmilbenextrakte ein Spektrum über den ge-

samten Molekulargewichtsbereich von 13 bis über 150 kDa gefunden. Die Er-

gebnisse des Immunoblottings werden in den Tabellen 18-20 gezeigt, wobei aus

der Literatur bekannte Allergene durch eine grüne Schrift gekennzeichnet, Aller-

gene anderer Spezies blau unterlegt wurden. Konnten Komponenten der unter-

suchten Extrakte zugeordnet werden, so wurden diese entsprechend farblich

gekennzeichnet. Besonders auffällige Banden sind fett gedruckt, besonders

schwache Banden unterstrichen.

Immunreaktionen gegenüber L. destructor (Tabelle 18) wurden bei 14 und 22

kDa lokalisiert. Die 22 kDa Reaktion korreliert mit Lep d 7, die Reaktion bei 14

kDa kann den Allergenen Lep d 2, Lep d 5 und Lep d 13 zugeschrieben werden.

Eine Aussage über den individuellen Anteil an der Gesamtaktivität war nicht

möglich. Wie in Tabelle 1 ausgeführt, besteht für Lep d 2 mit ~60 % gegenüber je

~10 % für Lep d 5 und Lep d 13 die höchste IgE-Bindungsfrequenz. Auffällig war,

dass neben dem CAP-RAST-negativen Serum Nr. 5 (Tabelle 18-Reihe 1) auch

das CAP-RAST-4-positive Serum 7 keine Reaktion zeigte, obwohl die anderen

CAP-RAST-4 bzw. 5-positiven Seren Reaktionen bei 14 und 22 kDa zeigten. Hier

lag entweder ein falsch positives CAP-RAST-Ergebnis und/oder eine Schädigung

des Serums vor. CAP-RAST-3-positive Seren reagierten entsprechend des ver-

minderten Sensibilisierungsgrades in geringerem Umfang, wobei Serum 2 (Ab-

bildung 14-Reihe 2) bei 22 kDa und Serum 6 (Abbildung 14-Reihe 5) bei 14 kDa

auch individuelle Unterschiede zeigten. Die schwache Färbung bei 18 kDa wurde

nur durch Serum 4 (Abbildung 14-Reihe 4) detektiert und konnte keinem be-

Tabelle 18 - IgE-Reaktionen gegenüber einem frischen L. destructor Extrakt (Probe 27) in

kDa. Auffällige Banden sind fett unterlegt, schwache Reaktionen sind unterstrichen. Grün

markierte Molekulargewichte konnten bekannten Allergenen zugeordnet werden. Bereiche

hohen Allergenvorkommens, in denen die Zuordnung aufgrund der Anzahl schwierig war,

wurden durch Klammern symbolisiert. Am unteren Ende der Tabelle erfolgte die Zuordnung

der Patientenseren mit dem entsprechenden Sensibilisierungsgrad.

kannten Allergen zugeordnet werden. Ob es sich um ein neues Allergen handelt,

muss zukünftig untersucht werden.

Die in dieser Arbeit verwendete Kultur von L. destructor beinhaltete bis zu 30 %

Rückstände des Kulturmediums. Im Rahmen einer Pricktestung während einer

früheren Untersuchung zur klinischen Relevanz konnte für die zur Anwendung

gekommenen Futterbestandteile keine positive Reaktion ermittelt werden [34].

Die IgE-Reaktionen gegenüber dem frischen D. pteronyssinus Extrakt entspra-

chen in ihrer Breite der Literatur [200] und werden in Tabelle 19 veranschaulicht.

Auch hier ergaben die Seren mit den höchsten Sensibilisierungsgraden die um-

fangreichsten Reaktionen. Auffällig war, dass nur die CAP-RAST-6-positiven Se-

ren Immunreaktionen im Molekulargewichtsbereich ab 70 kDa erzeugten und

sich so vom CAP-RAST-5-positiven Serum 1 (Abbildung 14-Reihe 17) erheblich

unterschieden. Die Erweiterung der „alten“ vier RAST-Klassen auf sechs CAP-

RAST-Klassen macht vor diesem Hintergrund Sinn.

Aus der Literatur ist bekannt, dass eine hohe CAP-RAST-Klasse nicht gleichbe-

deutend mit einer hohen Reaktivität im Immunoblotting ist [2]. Dies konnte an-

hand von Serum 8 (Reihe 10) bestätigt werden, das lediglich eine schwache 15

kDa Bande aufwies. Die CAP-RAST-3-positiven Seren 5, 9 und 13 (Reihen 8, 15

und 13) zeigten entweder mehr (Serum 9) oder kräftig ausgebildete Banden (Se-

ren 5 und 13).

Die in Serum 10 (Reihe 14) erhaltene Färbung bei 42 kDa könnte zu dem aus D.

farinae identifizierten MAG 1 homologe Komponente sein. Im gleichen Serum

wurde eine kräftige Komponente bei 44 kDa erhalten, die in keinem anderen Se-

rum nachgewiesen und bekannten Allergenen nicht zugeordnet werden konnte.

Alle RAST-6-positive Seren (15, 11 und 10) zeigten ein 95 kDa Allergen, welche

dem aus D. farinae bekannten Gruppe 11 Allergen entsprachen und bislang für

D. pteronyssinus noch nicht beschrieben wurden. Eine Zuordnung der schwa-

chen ~100 kDa Bande des Serums 15 (Reihe 11) konnte nicht erfolgen. Die e-

benfalls nur in den CAP-RAST-6-positiven Seren gefundenen ~150 kDa Kompo-

nenten könnten dem Gruppe 14 Allergen (189 kDa) aus D. farinae entsprechen,

da die 150 kDa Bande aufgrund des Fehlers der Molekulargewichtsbestimmung

mittels SDS-PAGE bei hohen Werten durchaus höher liegen könnten.

Abbildung 15 – (Seite 96) Immunoblots der Probe 27 – L. destructor (Reihen 1-7), der Probe

26 – D. pteronyssinus (Reihen 8-15) und der Probe 16 D. pteronyssinus Lyophilisat (Reihen

16-23).

Die spezifischen IgE-Reaktionen mit dem D. pteronyssinus Lyophilisat (Probe 16)

erfolgten mit den aus der Inkubation mit dem frischen Extrakt bekannten Seren in

identischer Reihenfolge. Die Ergebnisse sind in Tabelle 20 aufgeführt, wobei sich

für die Seren 1, 8 und 13 (Reihen 17, 18 und 20) keine Veränderungen gegen-

über dem frischen Extrakt ergaben. Das Serum 5 (Reihe 16) zeigte neben der

aus dem frischen Extrakt bekannten 57 kDa Komponente und zwei weitere

Fragmente bei 33 und 45 kDa. Die Annahme, dass durch die Lyophilisation ver-

mehrt kleinere Fragmente entstehen, wurde durch den Verlust der 150 kDa

Komponente in den Seren 10 und 11 (Reihen 22 und 21) bestätigt. Das Spekt-

rum ab 95 kDa zu kleineren Molgewichten blieb bis auf das 25 kDa Fragment des

Serum 11 komplett für beide Seren erhalten. Eine erhöhte Fragmentierung zeigte

ebenfalls Serum 15 (Reihe 19) durch zusätzliche Reaktionen bei 120 und 25-28

kDa. Gegenüber dem frischen Extrakt fehlten die 36 und 70 kDa Komponenten

Tabelle 19 – IgE-Reaktionen gegenüber einem frischen D. pteronyssinus Extrakt (Probe 26)

in kDa. Auffällige Banden sind fett unterlegt, schwache Reaktionen sind unterstrichen. Far-

bige Molekulargewichte konnten bekannten Allergenen (grün für D. pteronyssinus und blau

für D. farinae) zugeordnet werden. Klammern symbolisieren Bereiche hohen Allergenvor-

kommens, in denen die Zuordnung aufgrund der Anzahl schwierig war. Am unteren Ende

der Tabelle erfolgte die Zuordnung der Patientenseren mit dem entsprechenden Sensibilisie-

rungsgrad.

und die vormals differenzierten Banden bei 52 und 54 kDa verschmolzen zu einer

55 kDa Bande. Eine ebenfalls durch Serum 15 induzierte Reaktion bei 170 kDa

steht im Widerspruch zu der Annahme, das durch eine Lyophilisation eine Frag-

mentierung großer Proteine in kleinere Untereinheiten forciert wird. Dieses Er-

gebnis war für Serum 9 (Reihe 15) noch ausgeprägter. Neben dem Verlust der

13 und 53 kDa Banden wurden Reaktionen im Bereich 95 und 150 kDa erhalten,

die im frischen Extrakt nicht induziert werden konnten.

Die für das untersuchte Lyophilisat erhaltene spezifische IgE-Reaktivität ist von

der Molekulargewichtsverteilung mit dem frischen Extrakt vergleichbar. Ein Hin-

weis, dass es sich bei den niedermolekularen Allergenen wahrscheinlich um

Fragmente größerer Allergenstrukturen handelt, ist die Beobachtung, dass durch

die Fragmentierung keine willkürlichen neuen Komponenten entstehen, sondern

Untereinheiten mit der Größe bekannter Allergene. Durch die mit der Lyophilisa-

tion einhergehende Fragmentierung können zusätzliche Oberflächenepitope für

eine IgE-Bindung erschlossen werden, die den Verlust hochmolekularer allerge-

ner Bestandteile kompensieren und insgesamt eine für Diagnostik und Therapie

ausreichende Reaktivität erhalten wird.

Tabelle 20 - IgE-Reaktionen gegenüber einem frisch rekonstituierten D. pteronyssinus Ly-

ophilisat (Allergon) in kDa. Auffällige Banden sind fett unterlegt, schwache Reaktionen sind

unterstrichen. Farbige Molekulargewichte konnten bekannten Allergenen (grün für D. ptero-

nyssinus und blau für D. farinae) zugeordnet werden. Klammern symbolisieren Bereiche

hohen Allergenvorkommens, in denen die Zuordnung aufgrund der Anzahl schwierig war.

Am unteren Ende der Tabelle erfolgte die Zuordnung der Patientenseren mit dem entspre-

chenden Sensibilisierungsgrad.

Allgemeine Betrachtung der spezifischen Immundetektion

Für die Vorratsmilbe L. destructor wurde das gegenüber der Hausstaubmilbe mit

durchschnittlich zwei Immunreaktionen je Serum schwächere Bandenspektrum

erhalten. Allerdings standen für die Inkubation gegenüber den D. pteronyssinus

Extrakten mit CAP-RAST-6-positiven Seren auch hochgradig sensibilisiertes Pa-

tientengut zur Verfügung. Vergleichbar sensibilisierte Seren der CAP-RAST-

Klassen 3 bis 5 zeigten mit ein bis drei Banden auch ein vergleichbares Reakti-

onsspektrum. Die für L. destructor erhaltenen verschiedenen Verteilungsmuster

der IgE-Reaktivität bestätigen, dass gegenüber der Hausstaubmilbe ein eigen-

ständiges Sensibilisierungspotential besteht. Der geringe Verwandtschaftsgrad

der Spezies und ein unterschiedliches Expositionsrisiko sorgen für eine weitere

Differenzierung. Negative Ergebnisse

zur Kreuzreaktivität aus RAST-Inhi-

bitionen zwischen D. pteronyssinus und

L. destructor unterstreichen die Ver-

schiedenartigkeit [201].

Auffällig war, dass die Bindung hoch-

molekularer Komponenten ≥ 95 kDa

ausschließlich durch CAP-RAST-6 posi-

tive Seren erfolgte. Grundsätzlich ist die

Epitopbindung konzentrationsabhängig

und liegt im nanomolaren Bereich. Der

Konzentrationsschritt von den Klasse 6-

positiven Seren zur Sensibilisierungs-

klasse 5 ist hier ausschlaggebend.

Der Befund der Mehrfachsensibilisie-

rung für das Serum 1 aus dem CAP-

RAST konnte eindeutig bestätigt wer-

den. Dort war eine Sensibilisierung der

Klasse 5 gegenüber D. pteronyssinus

und der Klasse 2 gegen L. destructor

festgestellt worden. Diese „klinische

Kreuzallergenität“ ist nicht zu verwech-

seln mit einer biochemischen Kreuzallergenität, die Übereinstimmungen in der

Epitopstruktur voraussetzt. Das Ergebnis für Serum 5 stimmte mit einem positi-

Abbildung 16– Chemilumineszenz Blot.

1. Hausreferenz (Probe 1), 2. CSL-

Lyophilisat (2), 3. Allergon-Lyophilisat

(3).

100

ven und einem negativen CAP-RAST-Befund für D. pteronyssinus bzw. L. de-

structor überein. Das auch für den schwachen Sensibilisierungsgrad 2 ein ein-

deutiges Ergebnis im Immunoblotting erhalten werden konnte, spricht für die an-

gewandte Methodik.

Eine Einteilung in Major-, Intermediär- und Minorallergene wurde aufgrund der

eingeschränkten Serenanzahl nicht durchgeführt. Die bislang in der Literatur an-

gegebenen hohen Bindungsfrequenzen für Der p 1 von ~80 % konnten nicht

bestätigt werden. Zusammenfassend mit den in dieser Arbeit durchgeführten

Untersuchungen zu verwendeten Standardallergenen wird vermutet, dass es sich

bei den Immunreaktionen bei 25 kDa um eine Summenaktivität aus mehreren

allergenen Komponenten handelte. Die hohen Bindungsfrequenzen für Der p 2

bei 15 kDa scheinen sich hingegen zu bestätigen, da hier mit Der p 5 nur ein

weiteres Allergen aus der Literatur bekannt ist. Die gegenüber Der p 2 geringere

Bindungsfrequenz von Der p 1 könnte in einer verminderten Stabilität begründet

sein. Die erhöhte Hitzelabilität von Der p 1 ist ein Hinweis hierauf.

Tabelle 21 - IgE-Reaktionen gegenüber der D. pteronyssinus Hausreferenz (Reihe 1) und den

frisch rekonstituierten Lyophilisaten von CSL (Reihe 2) und Allergon (Reihe 3) in kDa. Inku-

biert wurde gegen das Poolserum des Pharmaunternehmens. Auffällige Banden sind fett

unterlegt, schwache Reaktionen unterstrichen. Farbige Molekulargewichte konnten bekann-

ten Allergenen (grün für D. pteronyssinus und blau für D. farinae) zugeordnet werden.

Klammern symbolisieren Bereiche hohen Allergenvorkommens, in denen die Zuordnung

aufgrund der Anzahl schwierig war.

101

Vergleicht man die dargestellte Methodik mit der ebenfalls durchgeführten Im-

mundetektion mit anschließender Chemilumineszenzfärbung (Abbildung 16), so

konnte trotz Einsatz eines multivalenten Poolserums durch letztere Methodik nur

ein eingeschränktes Spektrum allergener Komponenten nachgewiesen werden

(Tabelle 21). Allerdings enthalten Poolseren große Mengen an IgE gegen Majo-

rallergene und wenig gegen Minorallergene. Die IgE gegen Minorallergene

schwimmen quasi in einem See von IgE gegen Majorallergene.

4.8 BEURTEILUNG DER PROTEOLYTISCHEN

AKTIVITÄT MITTELS ZYMOGRAMM

Zur Einschätzung der Proteaseaktivität wurden neben unmittelbar vor der Be-

stimmung hergestellte Extrakte aus D. pteronyssinus (Probe 26) und L. destruc-

tor (Probe 27), lyophilisierte D. pteronyssinus Extrakte der Hersteller Allergon

(Probe 16) und CSL (Probe 18) nach unterschiedlichen Inkubationszeiten durch

Casein-Zymogramme untersucht. Die Ergebnisse nach 1,5 und 10 h sind in Ab-

bildung 16 dargestellt. Es zeigten sich erhebliche Unterschiede sowohl zwischen

den beiden Spezies als auch innerhalb der Spezies D. pteronyssinus, zwischen

dem frischen HSM-Extrakt und den beiden Lyophilisaten sowie zwischen den

beiden Lyophilisaten.

Die aus der Literatur bekannten Milbenallergene mit Proteaseaktivität sind für D.

pteronyssinus die der Gruppen 1, 6 und 9 mit je 25 kDa, der Gruppe 3 mit 28

kDa, der Gruppe 4 mit 60 kDa sowie für L. destructor der Gruppe 2 mit 14 kDa.

Eine Inkubation von 1,5 h reichte aus, um erste Proteaseaktivitäten bei allen un-

tersuchten Extrakten nachweisen zu können. Die CSL-Probe zeigte schwache

Entfärbungen bei ca. 43 kDa und 60 kDa, womit sie lediglich der Gruppe 4 der

Literatur entsprach. Für Allergon wurde die stärkste Aktivität aller Proben dieser

Kurzzeitinkubation festgestellt. Die identifizierten Banden von 28 bis 43 kDa und

22-25 kDa, sowie einer zusätzlichen schwache Entfärbung bei ca. 20 kDa ent-

sprachen der Literatur in vollem Umfang. Des weiteren zeigte sich eine zu höhe-

ren Molekulargewichten schwächer werdende, „schweifartige“ Entfärbung. Im

frischen HSM-Extrakt konnte lediglich eine gut abgegrenzte Bande bei 43 kDa

und leichte Entfärbung bei 60 kDa nachgewiesen werden. Die 43 kDa Bande

entsprach nicht der Literatur, wurde aber als Fraktion in der Ausschlusschroma-

tographie gefunden.

102

Abbildung 17 – Casein-Zymogramme der Proben 16 (Allergon - D. pteronyssinus Lyophili-

sat), 18 (CSL - D. pteronyssinus Lyophilisat), 26 (HSM - D. pteronyssinus) und 27 (VRM - L.

destructor), Probe) nach 1,5 und 10 h Inkubation bei 37 °C.

103

Die VRM-Probe (L. destructor) zeigte eine kontraststarke Bande bei ca. 25 kDa,

wodurch sie sich von den anderen Extrakten der Milbe D. pteronyssinus unter-

schied und der Literatur entsprach.

Nach einer Inkubation über Nacht (10 h), entwickelten die Extrakte eine so starke

Proteaseaktivität, dass einzelne Probenreihen zum Teil nicht mehr voneinander

abgegrenzt werden konnten. Für CSL wurde wieder die schwächste Gesamtakti-

vität mit den drei Hauptbereichen bei 25-32, 40-50 und ca. 55-75 kDa nachge-

wiesen und entsprach nun auch der Literatur. Das Allergon-Lyophilisat zeigte

eine durchgängige Entfärbung, angefangen von ca. 8 kDa bis zu den Probenta-

schen. Aufgrund der maximalen Breite der Entfärbung zwischen 20 und 43 kDa,

wurde für diesen Bereich die höchste proteolytische Aktivität angenommen. Pro-

teaseaktivitäten unterhalb 25 kDa wurden für Milbenallergene bislang nicht publi-

ziert.

Der frische HSM-Extrakt zeigte, nach der CSL-Probe, die schwächste Gesamt-

aktivität, die sich neben einer starken Bande bei 22-25 kDa auf die Komponenten

zwischen 26 und 75 kDa verteilte. Für den frischen VRM-Extrakt konnte ebenfalls

eine durchgängige Entfärbung über den gesamten Bereich oberhalb 14 kDa mit

einem Maximum zwischen 20 und 30 kDa ermittelt werden. Kleinere Fragmente

<14 kDa wurden nicht gefunden. Die Ergebnisse zeigten, dass L. destructor über

ein den Hausstaubmilben vergleichbares Spektrum verschiedener Proteasen

verfügt, und bekräftigen die bislang einzigen Untersuchungen in Vorratsmilben

[86]. Die aktivste Komponente (Entfärbung nach 1,5 h) frischer Extrakte der

Hausstaubmilbe D. pteronyssinus lag bei ca. 43 kDa und die der Vorratsmilbe bei

ca. 25 kDa.

Generell konnten Unterschiede zwischen den verschiedenen Konzentrationen

einzelner Extrakte bis auf eine Ausnahme (Allergon nach 1,5 h) nicht festgestellt

werden. Für die geringere Probenkonzentration (5 µL) wurde bei der Aller-

gonprobe nach 1,5 h Inkubationszeit eine stärkere Entfärbung beobachtet als für

die doppelt so hohe Konzentration (10 µL). Es kann deshalb angenommen wer-

den, dass auch der Einsatz kleinster Konzentrationen zu einer vollständigen Um-

setzung des Substrates Casein führte.

Die Gegenüberstellung eines frisch hergestellten Extraktes (HSM) mit seinem

lyophilisierten Pendant (Allergon) ergab eine auch nach kurzer Zeit (1,5 h) ein-

deutig höhere Aktivität für das Lyophilisat. Durch die Gefriertrocknung scheinen

Epitope mit proteolytischer Funktion nicht zerstört, sondern aus dem Inneren der

Proteine freigelegt zu werden. Sie tragen dann zu einer erhöhten proteolytischen

104

Gesamtaktivität der Lyophilisate bei. Der grundsätzlich gegenüber frischen Ex-

trakten erhöhte Anteil niedermolekularer Komponenten wurde in der

Ausschlusschromatographie eindeutig festgestellt. An den Ergebnissen des Im-

muno-blottings ist erkennbar, dass eine hohe Proteaseaktivität nicht mit einer

hohen immunologischen Aktivität, bzw. Allergenität, gleichzusetzen ist. Hieraus

zu folgern, dass Lyophilisate grundsätzlich die höher Proteaseaktivität besitzen,

ist falsch und wird eindeutig durch den Vergleich der beiden Lyophilisate CSL

und Allergon widerlegt. Die CSL-Probe zeigte die geringste Aktivität bei gleich-

zeitig am besten differenziertem Bandenmuster aller Extrakte. In der

Ausschlusschromatographie zeigte sie die für ein Lyophilisat typische Verschie-

bung hin zu kleineren Molekulargewichten. Im Vergleich zum Allergon-Lyophilisat

fragmentierte die CSL-Probe allerdings in einen 10 % höheren Anteil in 900 Da

Komponenten, der Anteil der 1.8 kDa Fraktion war hingegen um 14 % erniedrigt.

Bei einem unteren Molekulargewicht von ca. 1.2-1.8 kDa für ein funktionales E-

pitop könnte der geringere Anteil des 1.8 kDa Fragments ein Grund für die ver-

minderte Proteaseaktivität sein.

Weitere Gründe für die verminderte Aktivität könnten die unterschiedliche Her-

kunft der Milbenkultur (Allergon, Europa vs. CSL, Australien) [64] und/oder ein

anderer Entnahmezeitpunkt der Probe aus der Zuchtkultur des Herstellers sein,

wodurch der Proteasegehalt stark variieren könnte [159].

Die eingeschränkten Möglichkeiten und die Ausrichtung dieser Arbeit erlaubten

nur einen geringen Einblick in die Problematik. Dass Proteasen eine entschei-

dende Rolle in der Allergieentstehung spielen, wurde an früherer Stelle dieser

Arbeit ausgeführt (siehe „Funktion und Allergenität“).

4.9 MALDI-TOF-MS

Die massenspektroskopische Untersuchungen ergaben sehr gute Ergebnisse, so

dass selbst aus direkt applizierten Gelstücken ein aussagefähiges Spektrum er-

halten werden konnte. Aufgrund insgesamt zu niedriger Konzentrationen konnten

allerdings nur nicht reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden, die an dieser

Stelle keiner weiteren Betrachtung unterzogen wurden. Allerdings ist festzuhal-

ten, dass die Polyacrylamidmatrix kein störendes Untergrundsignal mit der vor-

liegenden Probenkonstellation erzeugte und in zukünftigen Untersuchungen eine

aufwendige Probenvorbereitung entfallen kann.

105

Durch die Massenspektrometrie wurde in kurzer Zeit sehr umfangreiches Infor-

mationsmaterial erhalten, so dass im Rahmen dieser Arbeit nur ausgewählte Er-

gebnisse vorgestellt werden konnten. Oberhalb der gezeigten Molmassenberei-

che (>200 kDa) konnten in keinem Spektrum Komponenten lokalisiert werden.

Da die kleinste immunreaktive Komponente bei ~14 kDa erhalten wurde, ergab

sich eine untere Begrenzung der Spektren bei ~10 kDa.

Den IgE-spezifischen Reaktionen der eigenen Immunoblots konnten ausnahms-

los exponierte Peaks in den Massenspektren zugeordnet werden. Die Abbildun-

gen 16, 17 und 18 führen die Ergebnisse des Immunoblottings mit den MALDI-

TOF-Untersuchungen für den frischen L. destructor Extrakt (Probe 29) und sowie

den frischen Extrakt (Probe 28) und das Lyophilisat (Probe 16) aus D. pteronys-

sinus jeweils in einer Grafik zusammen.

Das für L. destructor (Abbildung 18) erhaltene Massenspektrum zeigt über die

gesamte Breite exponierte Peaks, die in Intensität und Anzahl mit dem D. ptero-

nyssinus-Spektrum vergleichbar waren. Trotz der gefundenen hochmolekularen

Komponenten, konnten spezifische Immunreaktionen gegenüber L. destructor in

den zur Verfügung stehenden Patientenseren nur im niedermolekularen Bereich

festgestellt werden. Betrachtet man den Massenbereich bei ~15 kDa genauer, so

ist aufgrund der Peakintensitäten zu vermuten, dass für die intensive Immunre-

aktion vor allem Lep d 2 verantwortlich war und Lep d 5 bzw. Lep d 13 nur unter-

geordnete Beiträge leisteten. Durch die Kombination einer 2D-Elektrophorese mit

Immunoblotting und Massenspektrometrie könnte hier endgültige Klärung erzielt

werden. Die aus der Literatur bekannten und bislang nicht namentlich klassifi-

zierten Komponenten bei 79 (Lep d ?a) und 93 kDa (Lep d ?b) ergaben keine

IgE-spezifische Reaktion, konnten durch die Massenspektrometrie aber im Ex-

trakt lokalisiert werden. Auch der Immunreaktion bei ~18 kDa konnte ein expo-

nierter Massenpeak zugeordnet und somit ein falsch positives Ergebnis im Im-

munoblot ausgeschlossen werden. Ob es sich hierbei um ein bislang unbekann-

tes Allergen handelt, muss zukünftig untersucht werden.

Der D. pteronyssinus Extrakt (Abbildung 19) zeigte ein Molmassenspektrum ent-

sprechend seiner Reaktionen im Immunoblot bis in den hohen Massenbereich.

Alle aus der Literatur für D. pteronyssinus bekannten Allergene bis auf Der p 9

(~24 kDa) konnten im eigenen Extrakt zugeordnet werden. Schon im Immu-

noblotting wurden die bislang nur für D. farinae bekannten Allergene MAG 39,

MAG 29 sowie das Gruppe 11 Allergen spezifischen Reaktionen zugeordnet.

Durch das Massenspektrum konnten auch hier falsch positive Reaktionen aus

dem Immunblotting ausgeschlossen werden.

106

107

108

Abbildung 18 – (Seite 106) MALDI-TOF Spektrum (negative Polarität) des frischen L. destruc-

tor Extraktes. Matrix: Sinapinsäure; Laserenergie 0,59 µJ. Die Molekularbereiche der aus der

Literatur bekannten Allergene sind grau hinterlegt. Die Farbauswahl der Kennung verdeut-

licht das Blotergebnis: positiv (grün), negativ (schwarz). Der rot unterlegte Bereich zeigte

ein positives Blotergebnis, für das kein Allergen aus der Literatur bekannt war. Ob der Mas-

senpeak 167.322,9 Da das Gruppe 14-Homolog (177 kDa, 189 kDa cDNS) zu D. farinae war,

lies sich nur vermuten. Der Immunreaktion bei ~150 kDa konnten zwei exponierte Peaks

zugeordnet werden, wobei hier zu klären ist, ob es sich um neue Allergene handelte.

Abbildung 19 – (Seite 107) Das Spektrum des Allergon-Lyophilsates von D. pteronyssinus

zeigte im direkten Vergleich mit dem frischen Extrakt Peaks geringerer Intensität. Die in der

Immunreaktion zusätzlich gezeigte Reaktion bei ~170 kDa konnte eindeutig zugeordnet wer-

den. Der frische Extrakt zeigte in dem Bereich nur einen schwachen Massenpeak bei 167

kDa, so dass die dort fehlende Reaktion erklärt werden konnte. Sowohl das Lyophilisat als

auch der frische Extrakt zeigten Massenpeaks bei 120 kDa. Allerdings zeigte nur das Ly-

ophilisat ein eindeutiges Immunsignal. Die geringe Massendifferenz von 1495 Da lässt ver-

muten, dass durch die Lyophilisation einige Aminosäuren abgespalten wurden, so dass ein

Epitop zur spezifischen IgE-Bindung freigelegt oder geschaffen werden konnte. Hierzu pas-

send sind Ergebnisse der Ausschlusschromatographie, die eine Anreicherung mit Fragmen-

ten dieser Größe ergaben.

Die Intensität der Massenpeaks des CSL-Lyophilisates von D. pteronyssinus

(Abbildung 20, A) war mit der des Allergon-Lyophilisates (Abbildung 20, B) ver-

gleichbar. Waren in der Ausschlusschromatographie noch vergleichbare Vertei-

lungsmuster erhalten worden, so ergaben sich deutliche Unterschiede in der

Verteilung der Massen. Insgesamt und besonders im hochmolekularen Bereich

zeigte das CSL-Produkt weniger Massenpeaks. Jede Probe zeigte einen indivi-

duellen Fingerprint, so dass eine Differenzierung nach Ursprungskultur trotz glei-

cher Spezies effektiv und sicher möglich war. Zur Veranschaulichung wurden

einige Gemeinsamkeiten beider Lyophilisate in der Grafik grün, gravierende Un-

terschiede rot markiert. Der auffällige Intensitätsanstieg der Massenpeaks unter-

halb ~8 kDa ist ein weiteres Indiz für die mit der Lyophilisation einhergehende

Fragmentierung.

N-Glykane wurden in keinem der untersuchten Extrakte gefunden. Charakteristi-

sche Peaks dieser Stoffklasse bilden ein wiederkehrendes Muster ab 120 kDa

aufwärts im Abstand der Masse eines Glykanrestes (~150 Da).

Zum Abschluss sollen die Spektren eines selbst hergestellten D. pteronyssinus

Extraktes gezeigt werden, der ca. vier Wochen bei 4° C und im Dunkeln gelagert

wurde. Das in Abbildung 21 gezeigte Massenspektrum positiver (A) und negati-

ver (B) Polarität veranschaulicht eindrucksvoll das Werk der im Extrakt vorhan-

denen Proteasen. Es konnten keinerlei Komponenten oberhalb 1200 Da lokali-

siert werden.

109

110

Abbildung 20 – (Seite 109) Vergleich der Lyophilisate aus D. pteronyssinus unterschiedli-

cher Ursprungskulturen.

Vor diesem Hintergrund scheint die MALDI-TOF-Massenspektroskopie aufgrund

ihrer hohen Effektivität die ideale Analysemethode zur Charakterisierung von

proteolytischen Milbenextrakten zu sein. Zukünftig wird die aus der Proteomana-

lyse bekannte Kombination der 2D-Elektrophorese mit der Massenspektrometrie

eine viel genauere Charakterisierung von Allergenen ermöglichen. Dies gilt vor

allem auch für kleine Fragmente (mz < 1000 Da), die durch die jeweilige Auflö-

sung des Massenspektrometers eindeutig durch die Variation der Matrizes, der

Energie und der Polarität, sowie nach Auftrennung der Fragmente durch Hoch-

leistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Kapillarelektrophorese sowohl

identifiziert, als auch ihrer Sequenz zugeordnet werden können. Unter Einbezie-

hung von tryptischen und proteolytischen Fragmenten und deren Analyse mit der

skizzierten kombinierten Technik, sollte es möglich sein, viele Allergenepito-

muster zu charakterisieren. Hierdurch könnte eine Differenzierung der klinischen

von der biochemischen Kreuzallergenität erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit

konnte nur ein erster Einblick gegeben werden.

Abbildung 21 - MALDI-TOF-Spektren eines D. pteronyssinus Extraktes nach vierwöchigen

Lagerung bei 4° C mit positiver (A) und negativer (B) Polarität. Die grau unterlegte Fläche

kennzeichnet den Molekulargewichtsbereich zwischen 1.200-1.800 Da, der Mindestgröße

eines funktionellen Epitopes. Matrix: Sinapinsäure; Laserenergie: 0,42 µJ

111

4.10 EXKURS: DIFFUSE KLEIN- UND WEITWINKEL-

RÖNTGENSTREUUNG

Trotz der erheblichen proteolytischen Aktivitäten in den Extrakten, konnten Rönt-

gen-Streuungs-Messungen durchgeführt werden, insbesondere durch die kurzen

Belichtungszeiten während der Verwendung von Synchrotronstrahlung. Beispiel-

haft sind die durchgeführten Messungen der Probe 735 am Synchrotron in Dares-

bury, U.K., an der BeamLine A-11, operiert von der University of Salford, De-

partment of Physics, Joule Physics Laboratory, Center of Materials Research

Science, Manchester, ergaben erste Hinweise zur Struktur der Mischung. Die

Messungen wurden im Kleinwinkelbereich von 0,3162 ≤ Q36 ≥ 0,8 nm-1 und bei λ

= 0,15412 nm durchgeführt (T = 17° C) und ergaben folgende charakteristische

Parameter:

1. den durchschnittlichen elektronischen Massenradius, g

R [nm]

2. das durchschnittliche gewichtsmäßiges Molgewicht, w

M [Da]

3. die spezifische Oberfläche, S/V [nm-1].37

Nach Auftragung von log I/C38 vs. Q2 nach Guinier [202] wurde ein durchschnittli-

cher elektronischer Massenradius von g

R= 2,58 ± 0,04 nm bestimmt (Abbildung

22, A), wobei g

R aus der negativen Steigung des Guinier-Plots39 erhalten werden

konnte. Die entsprechende Messung nach 24 h (Abbildung 22, B) ergab ein g

R =

2,03 ± 0,02 nm und nach weiteren 24 h nahm der Massenradius auf ~0,97 nm ab

und näherte sich asymptotisch mit der Zeit auf ~0.57 nm. Die Abnahme des

Massenradius (Rg) mit der Zeit erklärt sich durch die Selbstauflösung des Prote-

ins („suicide enzyme“) durch im Extrakt anwesende Proteasen. Es fiel auf, dass

das Fragment nach 24 h für die Messungen relativ beständig war, d.h. ohne dass

die Fehlerquote durch den proteolytischen Angriff zum Tragen kam. Dieses Er-

gebnis lässt einen metastabilen Zwischenzustand vermuten.

Die Absenkung des pH-Wertes mit 0,01 M Essigsäure auf pH 5,5, (25° C) ergab

mit Rg = 2,05 ± 0.02 nm ein zur Proteaseaktivität nach 24 h vergleichbares Er-

35 Unveröffentlichte Ergebnisse der von Prof. Paradies am Central Laboratory of the Research Councils (CLRS)

in Daresbury, Warrington, Cheshire durchgeführten Röntgen-Kleinwinkelstreuung.

36 Q = Streuung [nm-1]

37 S = spezifische Oberfläche [nm2]; V = Volumen [nm3]

38 I = Intensität; C = Konzentration

39 3

)(Iln

−

112

gebnis, so dass für die Gesamtstabilität des Extraktes eine pH-Wertabhängigkeit

festzuhalten war.

Die auf absolute Masseeinheiten skalierten gemessenen Intensitäten ergaben für

die beiden verschiedenen Proben (A und B) folgende durchschnittliche Molge-

wichte:

1. A

M = 81.000 ± 15.000 bei pH 7,5, und A

R= 2.58 ± 0.04 nm,

2. B

M= 62.760 ±12.500 bei pH 5,5, und B

R= 2.03 ± 0.02 nm.

Für das partielle spezifische Volumen wurde demnach ein Wert von V2 = 0,723

mL/g angenommen, was einer Dichte der Trockenmasse des Extraktes von

1,3831 g/mL entspricht. Der resultierende Hydratationsgrad von 0,26 g/mL und

die entsprechenden hydrodynamischen Radien ergaben unter Einbeziehung ei-

ner sphärischen Form (in erster Näherung) 3,331 nm (A) bzw. 2,621 nm (B).

Interessant ist, dass die Moldifferenz von 19-20 kDa eine wiederkehrende Einheit

im Extrakt zu sein scheint. Die Extrapolation der Minima im Weitwinkelbereich

(Abbildung 23), bei Qmin1 = 0,13 nm-1 und Omin2 = 0,23 nm-1 erzielte ein Verhältnis

von Qmin2/Qmin1= 1,76. Der theoretische Wert einer Kugeleinheit entspricht 1,73

[202]. Unter der Annahme, dass es sich strukturell um identische Untereinheiten

("domains") handeln könnte, ergib sich ein theoretischer hydrodynamischer Ra-

dius von ~7,69 nm, und damit errechnet sich ein Molgewicht von ~15.8 kDa für

eine mögliche wiederkehrende Untereinheit.

Abbildung 22 - Guinier-Plot eines D. pteronyssinus Extraktes (Probe 5). Teilbereich A zeigt

einen durchschnittlichen elektronischen Massenradius von 25,8 ± 0,4 Å, dies entspricht 2,58

± 0,4 nm. Teilbereich B zeigt mit 2,03 ± 0,2 nm das Ergebnis nach 24 h.

113

Aus der Literatur und eigenen Untersuchungen (siehe „Unregelmäßigkeiten der

Standards“) liegt die Vermutung nahe, dass Der p 2 die wiederkehrende Unter-

einheit mit ~15.8 kDa sein könnte. Die höchste Frequenz in der spezifischen IgE-

Sensibilisierung sowie die große Anzahl an Proteinpeaks in der Massenspektro-

metrie in diesem Bereich sprechen für die hohe Aktivität und Präsenz von Kom-

ponenten dieser Größe im Extrakt. Im Gegensatz zu Der p 1 stimmte die Inten-

sität in der SDS-PAGE mit der IgE-spezifischen Intensität im Immunoblot überein.

Hierfür gibt es zwei Erklärungsansätze:

1. Die zur Aufreinigung des Der p 2-Standards verwendeten Antikörper waren

nicht monoklonal, so dass mehrere der in diesem Bereich gefundenen Kom-

ponenten einen Beitrag zur Gesamtaktivität beitragen.

2. Der p 2 ist eine definierte wiederkehrende Substruktur im Extrakt der Milbe D.

pteronyssinus.

Gegen Annahme 1 spricht, dass neben Der p 2 weitere Allergene oder Isoformen

von Der p 2 im Molekulargewichtsbereich um 15 kDa zu definieren wären. Aus

der Literatur ist allein Der p 2 bekannt. Eine endgültige Klärung hätte durch eine

MALDI-TOF-MS-Analyse des Standards erbracht werden können, der aber nicht

zur Verfügung stand. Für Annahme 2 spricht, dass von allen bekannten Allerge-

Abbildung 23– Weitwinkelstreumessung der Probe 5 (D. pteronyssinus Extrakt). Tel A ist die

direkte Messung, Teil B das Ergebnis nach 24 h. Die Extrapolation der Minima im Weitwin-

kelbereich, bei Qmin1 = 0,13 und Omin2 = 0,23 nm-1 erzielte ein Verhältnis von Qmin2/Qmin1= 1,76,

dem theoretischen Wert einer Kugeleinheit.

114

nen Der p 2 in der höchsten Frequenz durch IgE spezifisch gebunden wurde.

Dies gilt für die Literatur und eigene Untersuchungen.

4.11 ABSCHLIESSENDE DISKUSSION DER

ERGEBNISSE

Abschließend sollen die verschiedenen Wege der Extraktherstellung und cha-

rakterisierenden Analytik des Pharmaunternehmen und der eigenen Vorgehens-

weise diskutiert werden. Die Orientierung erfolgte hierbei entlang des in Abbil-

dung 5 (Seite 42) gezeigten Ablaufschemas.

Kultur

Es standen reine Milbenkörperkulturen von D. pteronyssinus der Hersteller Aller-

gon und CSL sowie eine Urprungskultur von L. destructor zur Verfügung. Letzte-

re enthielt neben den Milbenkörpern 20-30 % Rückstände des Kulturmediums

und Exkremente der Tiere. Im Verlauf der Untersuchungen zeigte jedoch auch

die „verunreinigte“ L. destructor Kultur der Literatur entsprechende spezifische

IgE-Reaktionen und eine der Hausstaubmilbe entsprechende Molmassenvertei-

lungen. Unterschiedliche Kulturen gleicher Spezies (CSL vs. Allergon) konnten

anhand der Massenspektren eindeutig differenziert werden.

Aufschluss

Der Aufschluss der Kulturen ergab für beide Extraktionsmedien vergleichbare

Proteinspektren. Argumente für oder gegen eine Methode wurden nicht identifi-

ziert. Der 10 %ige Zusatz von PEG zur Ammoniumsulfatlösung führte zu erhebli-

chen Veränderungen der SDS-PAGE- und IEF-Bandenspektren. Durch die Appli-

kation von PEG kam es während der Extraktion zur Phasenseparation in eine

1. wässrige Extraktionsphase;

2. PEG-Phase;

3. Phase mit hochmolekularen Bestandteilen des Extraktes wie Milbenkörper,

Kotpellets und Fremdstoffe (Farbstoffe, etc.).

Interessant war die Bildung einer trüben Proteinschicht zwischen der wässrigen

und der PEG-Phase. Die Interpretation dieser Ergebnisse bedarf weiterer Unter-

suchungen, wie z.B. der Variation des PEG-Anteils sowie der eingesetzten Mol-

massen des Polymers.

115

Extraktvorbereitung

Die Variante „Pharmaunternehmen“ sah zur Abtrennung niedermolekularer Kom-

ponenten einen Dialyseschritt vor. Dialysierte Extrakte zeigten in eigenen Vor-

untersuchungen einen erheblichen proteolytischen Abbau (Ergebnisse nicht ge-

zeigt), so dass im weiteren Verlauf der Untersuchungen auf eine Dialyse ver-

zichtet wurde.

Die in der Variante „Pharmaunternehmen“ durchgeführte Bestimmung des Pro-

teingesamtgehaltes mit einer vorherigen Fällung der Proteine durch TCA ist aus

der Literatur als die genauere Methodik bekannt, war aber durch eine kompli-

zierte Handhabung und hohe Zeiterfordernis dem ungenaueren Fertigkit unterle-

gen. Der Proteingesamtwert wurde lediglich zur Normalisierung der Proben vor

einem nachfolgenden analytischen Untersuchungsschritt eingesetzt. Eine weiter-

gehende Interpretation der Proteingesamtwerte wurde aufgrund der sehr gerin-

gen Probenanzahl nicht durchgeführt.

Die mit der Lyophilisation einhergehende Fragmentierung der Extrakte konnte mit

den angewandten Analyseverfahren klar nachgewiesen werden. Trotz eines in

der Ausschlusschromatographie klar erkennbaren erheblichen Verlustes an

hochmolekularen Komponenten zeigten die Lyophilisate auch bei hohen Mol-

massen spezifische IgE-Reaktionen, die durch MALDI-TOF-MS alle Massen-

peaks zugeordnet werden konnten. Die Lyophilisation scheint in Ermangelung

wirkungsvoller Alternativen dem derzeitigen Stand der Technik zur Stabilisierung

von Allergenextrakten zur Diagnostik und Therapie zu entsprechen. Sollen die

Extrakte einer weitergehenden analytischen Untersuchung zugeführt werden, ist

eine Lyophilisation allerdings zu vermeiden.

Die Voruntersuchungen zu einer präparativen Isolierung der Proteine durch Am-

moniumsulfatfällungen waren nicht erfolgreich. DNS-Fragmente konnten durch

eine eingesetzte 30 %ige Ammoniumsulfatlösung sowie durch eine 1 %ige

Streptomycin-Lösung nicht abgetrennt werden. Die weitere Erhöhung des Salz-

gehaltes auf 70 % konnte ebenfalls keine Fällung der vorhandenen Proteine in-

duzieren, so dass die Isolierung der Proteine mittels dieser sog. Cohnschen-

Fraktionierung für die vorhandene Probenmatrix nicht weiter verfolgt wurde. Ein

Wechsel von Ammoniumsulfat zu Dinatriumsulfat ist alternativ zu prüfen.

Fraktionierung

Die angewendeten Verfahren waren bis auf die native Elektrophorese zur

schnellen Auftrennung komplexer Extrakte geeignet. Allerdings ist die native E-

116

lektrophorese eine wertvolle Methode, Proteine in ihrer biologisch aktiven Form

aufzutrennen. So können reale Molmassenverteilungen erzielt werden und

nachfolgende Analyseschritte werden nicht durch einhergehende Veränderun-

gen der Proteine verfälscht. Durch die Ausschlusschromatographie konnte

schnell ein recht genaues Fragmentierungsmuster erhalten und die erhöhte

Fragmentierung nach der Lyophilisation aufgezeigt werden. Als Nachteil war der

nach oben begrenzte Molmassenbereich von 70 kDa zu kritisieren.

Die SDS-PAGE ergab eine schnelle und reproduzierbare Auftrennung des Ex-

traktes. In welchem Umfang es zu Veränderungen durch die Solubilisierung der

Proteine mit SDS kam, konnte nicht quantifiziert werden. Die Verwendung von

Reduktionsmitteln wie z.B. DTT ist bei Milbenextrakten zu vermeiden.

Als eine Methode von hoher Trenneffizienz erwies sich die isoelektrische Fokus-

sierung. Die Milbenspezies konnten voneinander differenziert und qualitative

Unterschiede in der Verwendung von PEG aufgezeigt werden. Aufgrund des sehr

bandenreichen Spektrums war eine Interpretation erschwert.

Identifizierung

Die Identifizierung ausgewählter Allergene mittels monoklonalen Antikörpern war

Bestandteil aller Charakterisierungen. Grundsätzlich ist die Bestimmung von

Majorallergenen durch mAK ein wertvolles Tool zur Standardisierung. Wichtig zur

Standardisierung ist das Verhältnis der Majorallergene zueinander. Nachteilig

könnte eine zu große Spezifität der Antikörper sein, so dass der Beitrag von Iso-

formen zur Bindungsaktivität nicht zugeordnet werden kann [158]. Es sei hier auf

die widersprüchlichen Ergebnisse der Untersuchungen der Standardallergene

Der p 1 und Der p 2 verwiesen.

Die spezifische IgE-Bindung erfolgte ebenfalls in beiden Varianten, wobei sich

die eigene Methodik mit einem visualisierenden chromogenen Substrat als ein-

deutig leistungsfähiger heraus stellte. Dies zeigte sich in einer deutlich verbes-

serten Differenzierung einzelner Immunkomponenten voneinander als auch in

der vereinfachten technischen Handhabung.

Massenspektroskopische Untersuchungen hatten bislang noch keinen Einzug in

die Charakterisierung von Allergenextrakten gefunden, so dass komplexe Mil-

benextrakte im Rahmen dieser Arbeit erstmals massenspektroskopisch unter-

sucht wurden. Die Ergebnisse zeigten die Leistungsfähigkeit der Methodik, die

bis zur Einführung in die Routine nur noch geringer Optimierung bedarf.

117

Struktur

Informationen zur Struktur bzw. Fragmentierung wurden einzig durch die eigene

Untersuchungsvariante erhalten. Hierbei konnten durch die UV/VIS-Spektros-

kopie erste Hinweise zur Sekundärstruktur und Substruktur erhalten werden. Die

MALDI-TOF-MS lieferte Informationen zur Fragmentierung und die Klein- bzw.

Weitwinkelstreuung zu wiederkehrenden Substrukturen.

Funktion

Eine Einschätzung der proteolytischen Aktivität der Milbenallergene konnte durch

ein Zymogramm gewonnen werden. Die Ergebnisse der Klein- bzw. Weitwinkel-

streuung lassen zudem erhebliche Zersetzungserscheinungen schon nach 24 h

erkennen.

Als Manko beider Untersuchungsabläufe ist allerdings das Fehlen eines beglei-

tenden Aktivitätstests, wie z.B. der EAST/RAST-Inhibition zu monieren.

4.11.1 Empfehlung für eine zukünftige Abfolge

Als ein Ergebnis der Arbeit sollen im folgenden Empfehlungen zu einer zukünfti-

gen Charakterisierung von Milbenkulturen gegeben werden. Es werden lediglich

Änderungen zur eigenen Abfolge diskutiert, die in Abbildung 24 in das bekannte

Ablaufdiagramm (Abbildung 5 – Seite 42) eingearbeitet wurden.

Milbenkulturen

Eine Grundcharakterisierung kann anhand wenig gereinigter Kulturen, wie z.B.

der in dieser Arbeit verwendeten Vorratsmilbenkultur, durchgeführt werden. Mit

ansteigendem Anspruch an Reinheit und Reproduzierbarkeit sollten nur noch

Ganzkörpermilbenkulturen verwendet werden. Die Entnahme sollte immer im

„linearen“ Bereich der exponentiellen Wachstumsphase der Kultur erfolgen und

die Ursprungskultur und der Hersteller nicht gewechselt werden.

Aufschluss

Grundsätzlich sollten wässrige Extraktionsmedien mit niedrigen Salzfrachten

(0,01-0,1 Mol/L) verwendet und die Extraktionszeiten sollten entsprechend der

vorliegenden Arbeit gewählt werden. Der Zusatz von Extraktionshilfen (z.B. PEG)

ist jeweils zu prüfen.

118

Ein Aktivitätstest zur Überwachung der spezifischen und gesamten allergenen

Aktivität ist an dieser Stelle einzuführen und nach jedem weiteren Schritt im Ab-

lauf anzuwenden, der Veränderungen im Extrakt hervorrufen könnte. Hilfreich ist

hier einen EAST-Inhibition, die im Ergebnis aber nur eine Gesamtaktivität ergibt

und keine Rückschlüsse auf die individuellen Beiträge der Einzelallergene er-

laubt. Minorallergene sowie Unterschiede in der individuellen und/oder der kol-

lektiven regionalen Sensibilisierungssituation im Patientengut werden nicht be-

rücksichtigt. Die Beseitigung einiger Nachteile verspricht die Aktivitätsbestim-

Abbildung 24 – Vorschlag für eine zukünftige Vorgehensweise zur Aufarbeitung von Milben-

kulturen. Ergänzende Methoden und Verfahren, die nicht Gegenstand der vorliegenden Ar-

beit waren, aber in eine zukünftige Vorgehensweise eingebettet werden sollten, wurden grün

beschriftet.

119

mung anhand der Mediatorenausschüttung mononosensibilisierter basophiler

leukämischer Rattenzellen [203, 204]. Die breite Anwendung in der Routine steht

allerdings noch aus.

Extraktvorbereitung

Neben der beschriebenen Filtration sollte eine Abtrennung niedermolekularer

Komponenten aus dem Extrakt vermeiden werden. Zur analytischen Betrachtung

bzw. Charakterisierung ist das ganze potentielle Allergenspektrum zu erhalten.

Ist beabsichtigt, die Extrakte zur Therapie und Diagnostik einzusetzen, so ist aus

Sicherheitsgründen eine Abtrennung der niedermolekularen Komponenten vor-

zunehmen. Eine Diafiltration sollte alternativ zur Dialyse vorgenommen werden.

Begleitend sind Proteingesamtbestimmungen und UV/VIS-Untersuchungen zu

empfehlen.

Lagerfähigkeit ist durch Lyophilisation oder Tieffrieren zu erzielen. Der Einsatz

von Stabilisatoren (Salz, PEG) und Proteasehemmern (z.B. Humanserumalbumin

im Überschuß als statistischer Schutz) ist situationsabhängig zu prüfen und kann

nicht generell empfohlen werden.

Fraktionierung

Die klassischen elektrophoretischen Verfahren, SDS-PAGE und IEF, sollten ver-

mehrt kombiniert als 2D-Elektrophorese zur Anwendung kommen und durch die

Kapillarelektrophorese ergänzt werden. Erste Hinweise zur Fragmentierung und

Molekulargewichtsverteilung können durch die Ausschlusschromatographie so-

wie eine native Elektrophorese erhalten werden.

Identifizierung

Eine Zuordnung und Identifizierung allergener Komponenten ist aufbauend auf

bzw. in Kombination mit der zur Auftrennung verwendeten Methode durch spezi-

fische IgE-Bindung und MALDI-TOF-MS vorzunehmen. Die qualitative und quan-

titative Bestimmung durch monoklonale Antikörper ist unabdingbar.

Struktur

Informationen zur 1D-Struktur werden durch eine Aminosäuresequenzierung er-

halten und Daten zur Fragmentierung durch die MALDI-TOF-MS. Neben der

schon erwähnten UV/VIS-Spektroskopie ergeben optische Rotationsdispersion

120

(ORD) und Circulardichroismus (CD) weitere Informationen zur 2D-Struktur.

Komplexere Untersuchungsmethoden wie Klein- und Weitwinkelstreumessungen,

Röntgenstruktur- und Kernresonanz (NMR)-Untersuchungen erlauben die Cha-

rakterisierung der 3D und, falls vorhanden, der 4D-Struktur. Diese Informationen

sind für die Aufklärung von Struktur-Wirkungsbeziehungen notwendig.

Funktion

Die Funktionsaufklärung wie z.B. Trypsin- und Proteaseaktivität geben Auf-

schluss über Wirkmechanismen und erlauben die Entwicklung von Stabilisie-

rungsstrategien.

121

5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

Im Zuge der vorliegenden Arbeit wurde der Ablauf zur Charakterisierung von Al-

lergenextrakten anhand der Milben Dermatophagoides pteronyssinus und Lepi-

doglyphus destructor erarbeitet. Die Vorgehensweise eines Pharmaunterneh-

mens diente hierbei als Ausgangspunkt der Untersuchungen. Der Zusatz von

Polyethylenglykol (PEG) zum Aufschlussmedium wurde untersucht sowie eine

präparative Isolierung durch Aussalzung mit Ammoniumsulfat unternommen.

Klassische Verfahren wie die SDS-PAGE, die isoelektrische Fokussierung (IEF),

die Ausschlusschromatographie (SEC), sowie spezifische Allergenbestimmungen

durch monoklonale Antikörper (ELISA) und Patientenseren (Immunoblotting),

wurden durch analytische Verfahren abseits der Routine erweitert. Neben der

UV/VIS-Spektroskopie und der nativen Elektrophorese war dies vor allem die

MALDI-TOF-Massenspektroskopie. Weitere Informationen zur Struktur und Frag-

mentierung wurden durch die Klein- und Weitwinkelstreuung, sowie zur Funktion

durch zymographische Proteaseaktivitätsbestimmung erhalten.

5.1 ZUSAMMENFASSUNG DER

EINZELERGEBNISSE

Milbenkulturen waren sowohl hochaufgereinigt als auch mit Kulturmedien ver-

setzt zur Charakterisierung geeignet. Unterschiede zwischen den verwendeten

Aufschlussmedien Cocas‘-Lösung und Ammoniumhydrogencarbonat wurden

nicht festgestellt. Der Zusatz von Polyethylenglykol führte zu qualitativen Verän-

derungen im Extrakt, deren Bewertung allerdings noch weiterer Untersuchungen

bedarf. Die Dialyse zur Abtrennung niedermolekularer Komponenten ist aufgrund

erhöhter Fragmentierung und latenter Proteaseaktivität der Milbenextrakte zu

vermeiden. Eine verbesserte Lagerfähigkeit der Extrakte konnte durch eine Ly-

ophilisation erreicht werden. Diese führte zwar zu einer Verschiebung des Frag-

mentierungsmusters hin zu niedermolekularen Fragmenten, andererseits konnte

ein Allergenspektrum über den gesamtem Molekulargewichtsbereich in der spe-

zifischen IgE-Bestimmung durch Inkubation mit Patientenseren erhalten werden.

Alternativ ist ein Tieffrieren der Extrakte durch flüssigen Stickstoff und die an-

schließende Lagerung bei -80° C möglich. Gegenüber einer präparativen Isolie-

rung durch Ammoniumsulfatfällung (Cohnsche Fraktionierung) zeigten sich die

Extraktproteine stabil und DNS-Fragmente konnten nicht ausgefällt werden. Das

erhaltene Verhältnis der Majorallergene Der p 1 und Der p 2 zueinander bestä-

122

tigte für alle Extrakte aus D. pteronyssinus Kulturen den hohen Anteil an Milben-

körpern und somit Klassifizierung als „Purified Body“-Kultur. Die Testung des L.

destructor Extraktes mit den mAk gegen Der p 1/Der p 2 verlief negativ. Die

durchgeführte Ausschlusschromatographie erlaubte eine schnelle Bestimmung

der im Extrakt vorhandenen scheinbaren Molekulargewichtsfraktionen sowie eine

Einschätzung der Veränderungen durch vorhergehende Aufbereitungsschritte

wie z.B. eine Dialyse oder die Lyophilisation.

Qualitative Veränderungen im Proteinspektrum konnten durch die SDS-PAGE

und die IEF ermittelt werden. Die hier erhaltenen Informationen genügten zu ei-

ner groben Einschätzung, nicht aber zu einer differenzierten Charakterisierung.

Durch die mit diesen Trennverfahren einhergehenden Veränderungen (z.B. So-

lubilisierung mit SDS) sowie der Zusatz reduzierender Reagenzien wie z.B. DTT

zeigten die Limitierungen dieser Verfahren. Weiterhin unentbehrlich blieben sie

als vorgeschaltete Trennverfahren zum Immunoblotting.

Die Reaktionen der Extrakte beider Milbenspezies gegenüber den Patientense-

ren entsprachen bis auf wenige Ausnahmen der Literatur. Eine aus der Taxono-

mie heraus erklärbare Verschiedenheit der beiden Milbenspezies konnte im Im-

munoblot deutlich herausgearbeitet werden. Während die D. pteronyssinus ein

Spektrum an Immunreaktionen zwischen 14 und >150 kDa zeigte, beschränkte

sich das dieses für L. destructor auf den Bereich 14-22 kDa. Bisher unbekannte

Immunkomponenten konnten für L. destructor bei 18 kDa und für bei 44 kDa er-

mittelt werden. Des weiteren konnten für D. pteronyssinus bei 42, 70, 95 und 150

kDa Immunreaktionen in bislang nur für die eng verwandte Spezies D. farinae

ausgemacht werden. Die in der Literatur aufgezeigte Bindungsfrequenz für Der p

1 in Patientenseren von ~80 % konnte nicht bestätigt werden. Es handelte sich

vielmehr um eine Summenaktivität verschiedener im 25 kDa Bereich angesie-

delter Allergene.

Die Proteaseaktivitätsbestimmung mittels Casein-Zymogramm deckte trotz recht

unspezifischer Methodik Unterschiede in den Molekulargewichtsbereichen als

auch in der Gesamtaktivität zwischen den Lyophilisaten unterschiedlicher Ur-

sprungskulturen (Europa vs. Australien) der gleichen Spezies D. pteronyssinus

auf. Ob es sich hierbei um grundsätzliche in der Ursprungskultur begründete

Unterschiede oder um produktionstechnische Effekte wie z.B. durch Gefriertrock-

nung handelte, konnte nicht zugeordnet werden. Die Molekulargewichtsbereiche

mit Proteaseaktivität frisch hergestellter Extrakte beider Spezies entsprachen der

Literatur.

123

Die MALDI-TOF-Massenspektroskopie konnte als hoch effektives Analyseverfah-

ren erstmals auf komplexe Milbenextrakte angewandt werden. Ergebnisse

durchgeführter Immunreaktionen sowie chromatographischer und elektrophoreti-

scher Trennverfahren konnten im Detail bestätigt und zugeordnet werden. Für

jede Probe wurde eine individuelle, einem Fingerabdruck vergleichbare, Massen-

verteilung erhalten, die zur Identifizierung herangezogen werden konnte.

Die Ergebnisse der Klein- und Weitwinkelstreuung ergaben erste Informationen

auf eine wiederkehrende Untereinheit im vermessenen D. pteronyssinus Extrakt

bei ~15.800Da und bestätigten erste Hinweise aus der UV/VIS-Spektroskopie.

Der dort erhaltene molare Extinktionskoeffizient nm259 cmmol/L ⋅

= 0,513 x 10-3 ergab bei

einer Küvettenschichtdicke von 1cm eine mittlere Partikelgröße von 19,5-22 kDa.

Die Analyse der erhaltenen Ergebnisse mündeten in einer Bewertung der in der

Routine durchgeführten Produktion von Allergenextrakten. Die größten Nachteile

der Vorgehensweise „Pharmaunternehmen“ sind, dass nur scheinbare Moleku-

largewichte bestimmt, Minorallergene nicht berücksichtigt, nur Allergenfragmente

betrachtet und keine Strukturdaten erhalten wurden. Der Fokus liegt eindeutig

auf dem Erhalt der Chargengleichförmigkeit. Zudem konnten Unregelmäßigkeiten

der in der Routine verwendeten Standardallergene aufgezeigt werden.

Die zusammenfassende Betrachtung der Verfahrens- und Analyseschritte in

Kombination mit den Empfehlungen zur Vorgehensweise bilden die Grundlage

einer zukünftig durchgeführten Charakterisierung unbekannter Milbenkulturen

hinsichtlich ihres allergenen Potentials und die Produktion von Extrakten zur Dia-

gnostik und Therapie.

5.2 AUSBLICK

Basierend auf der vorliegenden Arbeit werden die im folgenden skizzierten Un-

tersuchungen als notwendig erachtet:

• Einführung eines Aktivitätstestes.

• Testung von Zusätzen zur Stabilisierung (z.B. PEG, Aminoalkohole, Suchro-

se, Na2SO4) und Proteaseinhibitoren zur Stabilisierung der Allergenextrakte

aus Milben.

• Untersuchungen der Extrakte hinsichtlich ihrer Fragmentierung nach defi-

nierten proteolytischen Mustern sowie der Bestätigung der erhaltenen Sub-

struktur(en). Hierbei ist zu klären, ob die Allergene Fragmente eines

124

Ursprungsallergenes oder unterschiedlicher Herkunft sind. Dies ist wichtig zur

Identifizierung von „Mutterallergenen“, die, einmal identifiziert, Informationen

über Struktur-Wirkungsbeziehungen von Allergenen liefern können.

• Zur Zielerreichung ist der Einsatz kombinierter analytischer Verfahren vielver-

sprechend. Hervorzuheben sind hier die 2D-Elektrophorese in Kombination

mit einer spezifischen IgE-Bestimmung und anschließender MALDI-TOF-

Massenspektroskopie, sowie die Kopplung der Kapillarelektrophorese mit der

MALDI-TOF-MS. Letztere Kombination erlaubt durch das hohe Automatisie-

rungspotential einen Routineeinsatz.

Das Ziel der Bestimmung aller Einzelallergene mit der Zuordnung ihrer individu-

ellen allergenen Aktivität, wird entscheidend von der weiteren Entwicklung spezi-

fischer analytischer Möglichkeiten, wie z.B. der Herstellung von rekombinaten

monoklonalen Antikörpern und Standardallergenen oder der Erschließung mono-

sensibilisierter Zelllinien für den Routineeinsatz, abhängen. Weitergehende In-

formationen zur Struktur-Wirkungsbeziehung können nur durch hochkomplexe,

physikalische Analyseverfahren erhalten werden. Die beschriebenen weißen Fle-

cken auf der „Allergenlandkarte“ sind aufgrund ihrer Komplexität nur durch fach-

übergreifende Forschung zu lösen. Hier lag für den Kandidaten auch die Motiva-

tion für diese Arbeit, die im Verlauf stetig stieg.

125

6 LITERATUR

[1] Maasch HJ, Wahl R & Fuchs T (1987). Application of the First International Standard of

Dermatophagoides pteronyssinus (house dust mite) in the evaluation of allergens extracts

produced from two different source materials. Int Archs Allergy appl Immun (84) 363-372.

[2] Stratmann T, Höltz G & Haustein D (1995). Ein Vergleich von Milbenallergenextrakten

verschiedener Hersteller im Inhibitions-RAST und im Western Blot. Allergologie (18) 5; 179-

184.

[3] Wahl R & Paap A (1990). Untersuchungen zur reproduzierbaren Herstellung von Milben-

(Dermatophagoides pteronyssinus) Allergenextrakten. Allergologie (13) 10; 376-380.

[4] Council of Europe (1997). European Pharmacopeia; Third Edition. Strasbourg

[5] Jäger L. (1989). Klinische Immunologie und Allergologie. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart

[6] Casas R et al. (1999). Biologic activity of Dermatophagoides siboney and Blomia tropicalis

allergens in exposed and unexposed mite-allergic individuals. Effect of patient selection on

the biologic standardization of mite extracts. Allergy (54) 392-396.

[7] Howard J, Rothenberg E & Streilein J (1995). Grundbegriffe der Immunologie; in Janeway

C & Travers P (Hrsg.) Immunologie (1-43): Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg

[8] Liebers V et al. (1996). Overview on denominated allergens. Clin Experim Allerg (26) 494-

516.

[9] Bieber T (1996). Fc epsilon RI on antigen-presenting cells. Curr Opin Immunol (8) 6; 773-7.

[10] Murphy D (1995). Auslösen, Messen und Beeinflussen der Immunantwort; in Janeway C &

Travers P (Hrsg.) Immunologie (45-112). Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

[11] Geha R et al. (1995). Immunreaktion in Abwesenheit einer Infektion; in Janeway C & Tra-

vers P (Hrsg.) Immunologie (489-538). Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

[12] Coombs R & Gell P (1975). Classification of allergic reactions for clinical hypersensitivity

and disease; in Gell P, Coombs R & Lachmann P (Hrsg.) Clin Aspects Immunology (761-

781): Blackwell Scientific, Oxford.

[13] Romagnani S (2000). The role of lymphocytes in allergic disease. J Allergy Clin Immunol

(105) 3; 399-408.

[14] Pene J et al. (1988). IgE production by normal human lymphocytes is induced by interleukin

4 and suppressed by interferons gamma and alpha and prostaglandin E2. Proc Natl Acad

Sci USA (85) 18; 6880-4.

[15] Del Prete G et al. (1988). IL-4 is an essential factor for the IgE synthesis induced in vitro by

human T cell clones and their supernatants. J Immunol (140) 12; 4193-8.

[16] Fiebig H (1997). Allergenextrakte - Allergoide - Peptide. Allergologie (20) 11; 599-606.

[17] UCB (1997). Allergy - European White Paper. Braine-LAlleud, Aviso, Belgien.

[18] Ring J & Wenning J (2000). Weißbuch Allergie in Deutschland 2000.

[19] Ruffilli A & Bonini S (1997). Susceptibility genes for allergy and asthma. Allergy (52) 256-

273.

[20] Borish L (1999). Genetics of allergy and asthma. Ann Allergy Asthma Immunol (82) 413-

426.

[21] Cookson WO et al. (1989). Linkage between immunoglobulin E responses underlying

asthma and rhinitis and chromosome 11q. Lancet (1) 865; 1292-5.

[22] Hizawa N et al. (1998). Linkage analysis of Dermatophagoides pteronyssinus-specific IgE

responsiveness with polymorphic markers on chromosome 6p21 (HLA-D region) in Cauca-

sian families by the transmission/disequilibrium test Collaborative Study on the Genetics of

Asthma (CSGA). J Allergy Clin Immunol (102) 3; 443-8.

[23] Cookson WO & Moffatt MF (2000). Genetics of asthma and allergic disease. Hum Mol

Genet (9) 16; 2359-64.

[24] Song Z et al. (1996). Polymorphic nucleotides within the human IL-4 promoter that mediate

overexpression of the gene. J Immunol (156) 2; 424-429.

[25] Gould HJ, Beavil RL & Vercelli D (2000). IgE isotype determination: Epsilon-germline gene

transcription, DNS recombination and B-cell differentiation. Br Med Bull (56) 4; 908-24.

126

[26] Platts-Mills TAE et al. (1997). The role of domestic allergens; Ciba Found Symp (206) 173-

185.

[27] Spieksma F (1997). Domestic mites from an acarologic perspective. Allergy (52) 4; 360-

368.

[28] Nathanson M (1969). Arthropods and allergy. J Asthma Res (7) 2; 55-63.

[29] van Hage-Hamsten M & Johansson SGO (1992). Storage mites. Exp Appl Acarol (16)

117-128.

[30] Franz J (2000). Biologie und Ökologie der Domestic Mites - Habitate. http://chemie.uni-

paderborn.de/arbeitskreise/biologie/WWW/Forschung/JTFd/index-10.html.

[31] Franz J et al. (1997). Erweiterte Untersuchungen zur Domestic Mite-Fauna im rein städti-

schen Milieu. Allergo J (6) SA 14-15.

[32] Keil H (1983). Ökofaunistische Untersuchungen der Hausstaubmilben in Hamburg. Ento-

mologische Mitteilungen Zoologisches Museum Hamburg (7) 118; 343-386.

[33] Franz JT et al. (1997). Mite fauna of German farms. Allergy (52) 1233-1237.

[34] Müsken H et al. (2000). Sensitization to different mite spezies in German farmers: Clinical

aspects. J Allergy Clin Immunol (10) 6; 346-351.

[35] Fernández-Caldas E (1997). Mite species of allergologic importance in Europe. Allergy

(52) 383-387.

[36] Aalberse R (1998). Allergens from mites: Implications of cross-reactivity between inver-

tebrate antigens. Allergy (53) 47-48.

[37] Spieksma F & Voorhorst R (1969). Comparison of skin reactions to extracts of house dust,

mites, and human skin scales. Acta Allergol (24) 2; 124-146.

[38] Angrisano A et al. (1990). Dermatophagoides and storage mites: statistical analysis of

RAST results. Ann Allergy (64) 358-361.

[39] Müsken H et al. (1996). Häufigkeit von Sensibilisierungen gegen die Raubmilbe Cheyletus

eruditus und Vorratsmilben bei Patienten mit Hausstaubmilben-Sensibilisierung. Allergologie

(19) 1; 29-34.

[40] Campbell A et al. (1989). Aeroallergens in dairy barns near Cooperstown, New York and

Rochester, Minnesota. Am Rev Respir Dis (140) 2; 317-320.

[41] Armentina-Medina A et al. (1995). Immuntherapy with the storage mite Lepidoglyphus

destructor. Allergol Immunopathol (223) 5; 211-223.

[42] Boquete M et al. (2000). Factors influencing the clinical picture and the differential sensiti-

zation to house dust mites and storage mites. J Invest Allerg Clin Immunol (10) 4; 229-234.

[43] Gislason D & Gislason T (1999). IgE-mediated allergy to Lepidoglyphus destructor in an

urban population - an epidemiologic study. Allergy (54) 876-883.

[44] Radon K et al. (2000). Distribution of dust-mite allergens (Lep d 2, Der p 1; Der 2) in pig-

farming environments and sensitization of the respective farmers. Allergy (55) 219-225.

[45] Müsken H et al. (2001). Sensitization to other mite species in Tyrophagus putrescentiae,

Lepidoglyphus destructor and Acarus siro skin test positive patients in Germany. J Investig

Allergol Clin Immunol (10) 346-51.

[46] van der Heide S et al. (1998). Prevalence of sensitization to the storage mite Acarus siro,

Tyrophagus putrescentiae, and Lepidoglyphus destructor in allergic patients with different

degrees of sensitization to the house dust mite Dermatophagoides. Allergy (53) 426-430.

[47] van Hage-Hamsten M et al. (1990). Comparison of clinical significance and allergenic

cross-reactivity of storage mites Blomia kulagini and Lepidoglyphus destructor in Sweden

and Brazil. Allergy (45) 409-417.

[48] Vidal C et al. (1997). Sensitization to Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae,

and Acarus siro in patients to house dust mites (Dermatophagoides spp). J Allergy Clin Im-

munol (100) 5; 716-718.

[49] Ebner C et al. (1994). Sensitization to storage mites in house dust mite (Dermatophagoides

pteronyssinus) allergic patients. Comparison of a rural and an urban population. Clin Exp

Allergy (24) 347-352.

[50] Müsken H et al (2000). Sensitization to different mite spezies in German farmers: Clinical

aspects. J Allerg Clin Immunol (10) 6; 346-351.

127

[51] King TP et al. (1995). Allergen nomenclature. Allergy (50) 765-774.

[52] Thompson J & Stewart G (1996). Allergene; in Holgate ST; Church MK; Kapp A (Hrsg.)

Allergologie (1-15). UIllstein Mosby, Berlin.

[53] Aalberse R (2000). Structural biology of allergens. J Allergy Clin Immunol (106) 2; 228-238.

[54] Lottspeich F & Zorbas H (1995). Proteinanalytik - Immunologische Techniken; in

Lottspeich F & Zorbas H (Hrsg.) Bioanalytik (67-102). Spektrum Akademischer Verlag, Hei-

delberg.

[55] Fujikawa A et al. (1998). Altered antigenicity of M-177, a 177-kDa allergen from the house

dust mite Dermatophagoides farinae, in stored extracts. Clin Exp Allergy (28) 1549-1558.

[56] Lehninger A, Nelson D & Cox M (1994). Die dreidimensionale Struktur von Proteinen;

Prinzipien der Biochemie (177-223). Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

[57] van Neerven RJJ et al. (1993). T Cell Epitopes of house dust mite major allergen Der p II. J

Immunol (151) 4; 2326-2335.

[58] Scotto d'Abusco A et al. (1996). Characterization of a dominant antigenic determinant of

Par o I encoded by recombinant DNS. Clin Exp Allergy (26) 2; 223-231.

[59] Collins SP et al. (1996). Absence of continous epitopes in the house dust mite major aller-

gens Der p I from Dermatphagoides pteronyssinus and Der f I from Dermatophagoides fari-

nae. Clin Exp Allergy (26) 36-42.

[60] Ichikawa S et al. (1998). Solution structure of Der f 2, the major mite allergen for atopic

diseases. J Biol Chem (273) 1; 356-360.

[61] Eriksson T et al. (1998). Cloning and characterization of a group II-allergen from the dust

mite Tyrophagus putrescentiae. European J Biochem (251) 443-447.

[62] Lombardero M et al. (1990). Conformational stability of B cell epitopes on group I and

group II Dermatophagoides spp. allergens. J Immunol (144) 4; 1353-1360.

[63] Chua KY et al. (1988). Sequence analysis of cDNS coding for a major house dust mite

allergen, Der p 1. J Exp Med (167) 175-182.

[64] Thomas WR et al. (1997). Functional effects of polymorphism of house dust mite allergen.

Int Arch Allergy Immunol (113) 96-98.

[65] Thomas WR, Smith W & Hales BJ (1998). House dust mite allergen characterisation:

Implications for T-cell responses and immunotherapy. Int Arch Allergy Immunol (115) 9-14.

[66] Stewart GA et al. (1992). The group III allergen from the house dust mite Dermatophagoi-

des pteronyssinus is a trypsin-like enzyme. Immunology (75) 29-35.

[67] Mueller GA.; Benjamin D & Rule G (1998). Tertiary structure of the major house dust mite

allergen Der p 2: sequential and structural homoöodies. Biochemistry (37) 37; 12707-12714.

[68] Nishiyama C et al. (1993). Determination of three disulfide bonds in a major house dust

mite allergen, Der f II. Int Arch Allergy Immunol (101) 159-166.

[69] Lind P (1985). Purification and partial characterization of two major allergens from the hou-

se dust mite Dermatophagoides pteronyssinus. J Allergy Clin Immunol (76) 5; 753-761.

[70] Olsson S, van Hage-Hamsten M & Whitley P (1998). Contribution of disulfide bonds to

antigenicity of Lep d 2, the major allergen of the dust mit Ledpidoglyphus destructor. Mol

Immunol (35) 1017-1023.

[71] Takai T et al. (2000). Unlocking the allergenic structure of the major house dust mite aller-

gen Der f 2 by elimination of key intramolecular interactions. FEBS Letters (484) 102-107.

[72] Musu T et al. (1997). The relationship between the biochemical properties of allergens and

their immunogenicicty. Clin Exp Allergy (15) 485-499.

[73] Esch RE (1991). Role of proteases on the stability of allergenic extracts. in Kurth R & Hau-

stein D (Hrsg.) - 8th International Paul Ehrlich Seminar. Arbeiten aus dem Paul-Ehrlich-

Institut, 171-179.

[74] Lottspeich F (1998). Proteinreinigung; in Lottspeich F & Zorbas H (Hrsg.) Bioanalytik (9-

33). Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

[75] Stewart GA & Thompson PJ (1996). The biochemistry of common aeroallergens. Clin Exp

Allergy (26) 1020-1044.

[76] Nduwimana J et al. (1995). Proteases. Ann Biol Clin (53) 251-264.

128

[77] Hewitt C et al. (1997). Heterogeneous proteolytic specifity and activity of the house dust

mite proteinase allergen Der p 1. Clin Exp Allergy (27) 2; 201-207.

[78] Robinson C et al. (1997). On the potential significance of the enzymatic activity of mite

allergens to immunogenicity. Clues to structure and function revealed by molecular charac-

terization. Clin Exp Allergy (27) 10-21.

[79] Stewart G et al. (1994). Immunobiology of the serine protease allergens from house dust

mites. Am J Ind Med (25) 11; 105-107.

[80] King C et al. (1998). Dust mite proteolytic allergens induce cytokine release from cultured

airway epithelium. J Immunol (161) 7; 3645-51.

[81] Gough L et al. (1999). The cysteine protease activity of the major dust mite allergen Der p 1

selectively enhances the immunoglobulin E antibody response. J Exp Med (190) 12; 1897-

1902.

[82] Roche N et al. (2000). Dermatophagoides pteronyssinus and bioelectric properties of air-

way epithelium: Role of cysteine proteases. Eur Respir J (16) 2; 09-315.

[83] John R et al. (2000). Functional effects of the inhibition of the cysteine protease activity of

the major house dust mite allergen Der p 1 by a novel peptide-based inhibitor. Clin Exp Al-

lergy (30) 6; 784-793.

[84] Furmonaviciene R, Sewell H & Shakib F (2000). Comparative molecular modelling identi-

fies a common putative IgE epitope on cysteine protease allergens of diverse sources. Clin

Exp Allergy (30) 9; 1307-1313.

[85] Iraneta S et al. (1999). Proteinase and gelatinolytic activities of house dust mite and

cockroach extracts. J Inv Allerg Clin Immunol (9) 4; 235-240.

[86] Stewart GA et al. (1998). An enzymatic analysis of the storage mite Lepidoglyphus de-

structor. Com Biochem Physiol (119B) 2; 341-347.

[87] Tretter V et al. (1993). Frucose alpha 1,3-linked to the core region of glycoprotein N-glycans

creates an important epitopes for IgE from honeybee venom allergic individuals. Int Arch

Allergy Immunmol (102) 3; 259-66.

[88] Kristensen A, Schou C & Roepstorff P (1997). Determination of isoforms, N-linked glycan

structure and disulfide linkages of the major cat allegen Fel d 1 by mass spectrometric ap-

proach. Biol Chem (378) 8; 899-908.

[89] Fotisch K et al. (1999). Involvement of carbohydrate epitopes in the IgE response of celery-

allergic patients. Int Arch Allergy Immunmol (120) 1; 30-42.

[90] De Gruyter Verlag (2001). Pschyrembel - Klinisches Wörterbuch. De Gruyter, Berlin.

[91] van Hage-Hamsten M & Johansson E (1998). Clinical and immunological aspects of sto-

rage mite allergy. Allergy (53) 49-53.

[92] Arlian L et al. (1987). Investigations of culture medium-free house dust mites. IV. Cross

antigenicity and allergenicity between the house dust mites, Dermatophagoides farinae and

D. pteronyssinus. J Allergy Clin Immunol (79) 3; 467-476.

[93] Arlian L, Rapp C & Fernandez-Caldas E (1993). Allergenicity of Euroglyphus maynei and

its crossreactivity with Dermatophagoides species. J Allergy Clin Immunol (91) 5; 1051-

1058.

[94] Griffin P et al. (1989). Allergenic and antigenic relationship between three species of stora-

ge mite and the house dust mite, Dermatophagoides pteronyssinus. J Allergy Clin Immunol

(84) 1; 108-117.

[95] Gafvelin G et al. (2001). Crossreactivity studies of a new group 2 allergen from the dust

mite Glycyphagus domesticus, Gly d 2, and group 2 allergens from Dermatophagoides pte-

ronyssinus, Lepidoglyphus destructor, and Tyrophagus putrescentiae with recombinant al-

lergens. J Allergy Clin Immunol (107) 3; 511-518.

[96] Luczynska CM et al. (1990). Prevalence of specific IgE to storage mites (A. siro, L. de-

structor and T. Iongior) in an urban population and crossreactivity with the house dust mite

(D. pteronyssinus). Clin Exp Allergy (20) 4; 403-406.

[97] Puerta Llerena L et al. (1991). Sensitization to Blomia tropicalis and Lepidoglyphus de-

structor in Dermatophagoides spp-allergic individuals. J Allergy Clin Immunol (88) 6; 943-

949.

129

[98] Johansson E et al. (1991). Immunoblot multi-allergen inhibition studies of allergenic cross-

reactivity of the dust mites Lepidoglyphus destructor and Dermatophagoides pteronyssinus.

Clin Exp Allergy (21) 511-518.

[99] Shen HD et al. (1997). Molecular cloning and expression od a Penicillium citrinum allergen

with sequence homology and antigenic crossreactivity to a hsp 70 human heat shock prote-

in. Clin Exp Allergy (27) 6; 682-690.

[100] van Hage-Hamsten M et al. (1987). Lack of allergenic crossreactivity between storage

mites and Dermatophagoides pteronyssinus. Clin Allergy (17) 1; 23-31.

[101] Arlian LG, Vyszenski-Moher DL & Fernandez-Caldas E (1993). Allergenicity of the mite,

Blomia tropicalis. J Allergy Clin Immunol (91) 5; 1042-1050.

[102] Ferrándiz R, Casas R & Dreborg S (1998). Crossreactivity between Dermatophagoides

siboney and other domestic mites. II. Analysis of individual crosss-reacting allergens after

SDS-PAGE and western blotting inhibition. Int Arch Allergy Clin Immunol (116) 116; 206-

214.

[103] Johansson E, Johansson SGO & van Hage-Hamsten M (1994). Allergenic characterizati-

on of Acarus siro and Tyrophagus putresentiae and their crossreactivity with Lepidoglyphus

destructor and Dermatophagoides pteronyssinus. Clin Exp Allergy (24) 743-751.

[104] Simpson A, Arruda K & Chapman M (1997). Antigenic interrelationship among mite aller-

gens (Blomia and Dermatophagoides spp). Clin Rev Allergy Immunol (15) 461-469.

[105] Harfast B et al. (1992). Monoclonal antibodies to Lepidoglyphus destructor: Delineation of

crossreactivity between storage mites and house dust mites. Clin Exp Allergy (22) 11; 1032-

1037.

[106] Johansson E et al. (1997). Allergenic crossreactivity between Lepidoglyphus destructor

and Blomia tropicalis. Clin Exp Allergy (27) 691-699.

[107] Kronquist M et al. (2000). Skin prick test and serological analysis with recombinant group 2

allergens of the house dust mites L. destructor and T. putrescentiae. Clin Exp Allergy (30)

670-676.

[108] Chambers L et al. (1997). Is the dust mite allergen Der p1 cysteine proteinase ? Biochem

Soc Trans (25).85 S

[109] Dilworth RJ, Chua KY & Thomas WR (1991). Sequence analysis of cDNS coding for a

major house dust mite allergen, Der f I. Clin Exp Allergy (21) 25-32.

[110] Smith W et al. (1999). Molecular Analysis of the Group 1 and 2 Allergens from the house

dust mite, Euroglyphus maynei. Int Arch Allergy Immunol (118) 15-22.

[111] Soldatova LN et al. (2000). The stability of house dust mite allergens in glycerinated. J

Allergy Clin Immunol (105) 3; 482-488.

[112] Thomas W & Chua K (1995). The major mite allergen Der p 2 - a secretion of the male mite

reproductive tract? Clin Exp Allergy (25) 667-669.

[113] van Hage-Hamsten M et al. (1995). Localization of major allergens in the dust mite Lepi-

doglyphus destructor with confocal laser scanning microscopy. Clin Exp Allergy (25) 536-

542.

[114] Johansson E et al. (1999). Evaluation of specific IgE to the recombinant group 2 mite aller-

gens Lep d 2 and Tyr p 2 in the Pharmacia CAP system. Int Arch Allergy Immunol (120) 1;

43-49.

[115] Ventas P, Careira J & Polo F (1991). Identification of IgE-binding proteins from Lepi-

doglyphus destructor and production of monoclonal antobodies to a major allergen. Immunol

Lett (29) 3; 229-234.

[116] Cain G et al. (1998). The effect of dry heat on mite, cat, and dog allergens. Allergy (53) 12;

1213-5.

[117] Ventas P, Carreira J & Polo F (1992). Purification and characterization of Lep d I, a major

allergen from the mite Lepidoglyphus destructor. Clin Exp Allergy (22) 454-460.

[118] Varela J et al. (1994). Primary structure of Lep d I, the main Lepidoglyphus destructor aller-

gen. Eur J Biochem (225) 93-98.

[119] Schmidt M et al. (1995). cDNS analysis of the mite allergen Lep d 1 identifies two different

isoallergens and variants. FBES (370) 11-14.

130

[120] Johansson E, van: Hage-Hamsten M & Johansson SG (1988). Demonstration of allergen

components in the storage mite Lepidoglyphus destructor by an immunoblotting technique.

Int Arch Allergy Appl Immunol (85) 1; 8-13.

[121] Ando T et al. (1993). Trypsin-like protease of mites: purification and characterization of

trypsin-like protease from mite faecal extract Dermatophagoides farinae. Relationship bet-

ween trypsin-like protease and Der f III. Clin Exp Allergy (23) 777-784.

[122] Heymann P et al. (1989). Antigenic and structural analysis of group II allergens (Der f II and

Der p II) from house dust mites (Dermatophagoides spp). J Allergy Clin Immunol (83) 6;

1055-1067.

[123] Thomas WR, Chua K- & Smith W- (1992). Molecular polymorphism of house dust mite

allergens. Exp Appl Acarol (16) 153-164.

[124] Lake FR et al. (1991). House dust mite-derived amylase: Allergenicity and physicochemical

characterization. J Allergy Clin Immunol (87) 6; 1035-1042.

[125] Tovey ER et al. (1989). Cloning and sequencing of a cDNS expressing a recombinant hou-

se dust mite protein that binds human IgE and corresponds to an important low molecular

weight allergen. J Exp Med (170) 4; 1457-1462.

[126] Thomas WR & Smith W (1998). House dust mite allergens. Allergy (53) 821-832.

[127] Eriksson TLJ et al. (2001). Cloning of three new allergens from the dust mite Lepi-

doglyphus destructor using phage surface display technology. Eur J Biochem (268) 287-

294.

[128] Yasueda H et al. (1989). Comparative analysis of physicochemical and immunochemical

properties of the two major allergens from Dermatophagoides pteronyssinus and the cor-

responding allergens from Dermatophagoides farinae. Int Arch Allergy Appl Immunol (88)

402-407.

[129] Bennett BJ & Thomas WR (1996). Cloning and sequencing of the group 6 allergen of Der-

matophagoides pteronyssinus. Clin Exp Allergy (26) 1150-1154.

[130] Shen HD et al. (1995). Characterization of the house dust mite allergen Der p 7 by monoc-

lonal antibodies. Clin Exp Allergy (25) 5; 416-422.

[131] Shen H et al. (1993). Molecular cloning of a house dust mite allergen with common antibody

binding specificities with multiple components in mite extracts. Clin Exp Allergy (11) 934-

940.

[132] Shen H et al. (1996). Molecular cloning and immunological characterization of the group 7

allergens of house dust mites. Adv Exp Med Biol (409) 241-242.

[133] Eriksson T (2001). Dust mite allergens: Cloning, Characterisation and T-cell epitopes. Dis-

sertation, Karolinska Institut, Schweden

[134] Shen HD et al. (1996). IgE and monoclonal antibody binding by the mite allergen Der p 7.

Clin Exp Allergy (26) 3; 308-315.

[135] Shen HD et al. (1997). Characterization of the allergen Der f 7 from house dust mite

extracts by species-specific and crossreactivity monoclonal antibodies. Clin Exp Allergy (27)

7; 824-832.

[136] O'Neill GM et al. (1995). Glutathione S-transferase a major allergen of the house dust mite,

Dermatophagoides pteronyssinus. Immunol Lett (48) 103-107.

[137] O'Neill G, Donovan G & Baldo B (1994). Sequence of the native form of a major house

dust mite allergen and its nascent polypeptide. Mol Immunol (31) 18; 1447-1448.

[138] Aki T et al. (1994). Cloning and expression of cDNS coding for a new allergen from the

house dust mite, Dermatophagoides farinae: Homology with human heat shock cognate

proteins in the heat shock protein familiy. J Biochem (115) 435-440.

[139] Ansotegui I et al. (1991). Identification of a new major allergen of 39 kilodaltons of the sto-

rage mite Lepidoglyphus destructor. Immunol Lett (27) 2; 127-130.

[140] Olsson S et al. (1994). Detection of at least one high-molecular-mass, IgE-binding compo-

nent of the dust mite Lepidoglyphus destructor. Allergy (49) 8; 620-625.

[141] van Hage-Hamsten M et al. (1993). Occurence of IgE antibodies against the 39-kDa aller-

gen components of the mite Lepidoglyphus destructor in urban and rural subjects. Allergy

(48) 3; 209-211.

[142] Reese G, Ayuso R & Lehrer S (1999). Tropomyosin: an invertebrate pan-allergen. Int Arch

Allergy Immunol (114) 4; 247-258.

131

[143] Tsai L et al. (1998). Isolation and characterization of a novel 98-kd Dermatophagoides fari-

nae mite allergen. J Allergy Clin Immunol (102) 2; 295-303.

[144] Tsai L et al. (2000). Protein sequence amalysis and mapping of IgE and IgG epitopes of an

allergenic 98-kDa Dermatophagoides farinae paramyosin, Der f 11. Allergy (55) 141-147.

[145] Puerta L et al. (1996). Nucleotide sequence analysis of a complementary DNS coding for a

Blomia tropicalis allergen. J Allergy Clin immunol (98) 5; 932-937.

[146] Caraballo L et al. (1997). Cloning and IgE binding of a recombinant allergen from the mite

Blomia tropicalis, homologous with fatty acid-binding proteins. Int Arch Allergy Immunol

(112) 4; 341-347.

[147] Epton MJ et al. (1999). High-molecular-weight-allergens of the house dust mite: An apoli-

pophorin-like cDNS Has sequence identity with the major M-177 allergen and the IgE-

binding peptide fragments Mad 1 and Mag 3. Int Arch Allergy Clin Immunol (120) 185-191.

[148] Fujii S et al. (1997). Identification of T-cell epitope sequences on an important mite antigen.

Clin Exp Allergy (27) 1086-1094.

[149] Fujikawa A et al. (1996). Cloning and characterization of a new allergen, Mag 3 from the

house dust mite Dermatophagoides farinae: Crossreactivity with high-molecular weight al-

lergen. Mol Immunol (33) 3; 311-319.

[150] Lehrer SB, Horner WE & Reese G (1996). Why are some proteins allergenic? Implications

for biotechnology. Crit Rev Food Sci Nutr (36) 6; 553-564.

[151] Maasch H (1982). Herstellung und Kontrolle von Allergoiden; in Allergopharma Joachim

Ganzer (Hrsg.) 7. Allergopharma-Symposium 15, (23-31).

[152] Milgrom H et al. (2001). Treatment of childhood asthma with anti-immunoglobulin E antibo-

dy (omalizumab). Pediatrics (108) 2; E36.

[153] Rohane P (2000). Anti-IgE (rhuMAB-E25) Therapy; in Kurth R & Haustein D (Hrsg.) 9th

International Paul-Ehrlich-Seminar, 9-11 September 1999 93, (253-256). GIT, Darmstadt.

[154] Pichler W (2001). Specific and nonspecific (anti-IgE) immuntherapy of allergic disease.

Therapeutische Umschau (58) 5; 329-36.

[155] Norman P (1997). Responses to T cell tolerogenic peptides; in Kurth R & Haustein D

(Hrsg.) 8th International Paul Ehrlich Seminar, 11-13 März 1996 91, (40-44). Gustav Fi-

scher, Stuttgart.

[156] Schopf R (1997). Allergologie systematisch. Uni-Med Verlag, Bremen

[157] Maasch HJ, Maass J & Geissler W (1983). Untersuchungen zum Einfluß der Extraktions-

zeit auf den Gehalt von Inhaltsstoffen von Dermatophagoides pteronyssinus Extrakt. Aller-

gologie (6) 2; 52-54.

[158] van Ree R (1997). Ananlytical aspects of the standardization of allergenic extracts. Allergy

(52) 795-805.

[159] Martinez J et al. (1999). Enzymatic analyses of house dust mite extracts from Dermatopha-

goides pteronyssinus and Dermatophagoides farinae (Acari: Pyroglyphidae) during different

phases of culture growth. J Med Entomol (36) 3; 370-375.

[160] Lehrer S & Reese G (1997). Natural allergen extracts: Is there a future in allergy diagnosis

and therapy?; in Kurth R & Haustein D (Hrsg.) 8th International Paul Ehrlich Seminar 91,

(73-78). Gustav Fischer, Stuttgart.

[161] Timasheff SN & Arakawa T (1989). Stabilization of protein structure by solvents; in

Creighton T (Hrsg.) Protein structure (331-345). IRL Press, Oxford.

[162] Westermeier R (1990). Elektrophorese Praktikum. VCH Chemie, Weinheim.

[163] Ackland J SG (1984). Quantitation and thermal stability of the mite allergen DPT 12 in

whole mite extracts. J Allergy Clin Immunol (74) 6; 848-854.

[164] Volkin DB & Klibanov AM (1989). Minimizing protein inactivation; in Creighton TE (Hrsg.)

Protein function (1-22). IRL Press, Oxford.

[165] Bergemeyer H et al. (1974). in Bergemeyer H (Hrsg.) Methods of Enzymatic Analysis 1,

(166ff). Academic Press, New York.

[166] Florkin M & Stolz E (1967). Comparative Biochemistry and Physiology (27)

[167] Ford SA, Tovey ER & Baldo BA (1989). Effect of reduction and heat on the detection of

house dust mite (Dermatophagoides pteronyssinus) allergen Der p I protein blotting. INt

Arch Allergy Appl Immunol (89) 2-3; 318-320.

132

[168] Liu T & Lin Y (1998). The epitope stability of group 1 and group 2 allergens in mite extracts.

Ann Allergy Asthma Immunol (80) 2; 177-183.

[169] Arakawa T & Timasheff SN (1985). Mechanism of poly (ethylene glycol) interaction with

proteins. Biochemistry (24) 24; 6756-6762.

[170] Lee LLY & Lee JC (1987). Thermal stability of proteins in the presence of poly (ethylene

glycols). Biochemistry (26) 24; 7813-7819.

[171] Nucci ML, Shoor R & Abuckowski A (1991). The therapeutic value of poly(ethylene gly-

col)-mofified proteins. Adv Drug Del Rev 6; 133-151.

[172] Dreborg S & Akerblom E (1990). Immunotherapy wittht monoethoxypolyethylene glycol

modified allergens. CRC Crit Rev Ther Drug Carrier Syst (6) 4; 315-365.

[173] Lottspeich F & Zorbas H (1998). Proteinanalytik - Spaltung von Proteinen; in Lottspeich F

& Zorbas H (Hrsg.) Bioanalytik (179-194). Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

[174] Lowry O et al. (1951). Protein measurement with the Folin-Phenol reagent. J Biol Chem

(193) 265-275.

[175] Wahl R, Geissler W; Maasch & Maasch H (1985). Comparison of classical Lowry, modi-

fied Lowry and a dye-binding assay for the estimation of protein in allergen extracts and the

influence of different parameters on the modified Lowry assay. Biol Chem (10) 979-984.

[176] Luczynska CM et al. (1989). A two-site monoclonal antibody ELISA for the quantification of

the major Dermatophagoides spp. allergens, Der p I and Der f I. J Immunol Methods (118)

227-235.

[177] Mäntele W (1998). Spektroskopie; in Lottspeich F & Zorbas H (Hrsg.) Bioanalytik (131-178).

Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

[178] Paradies H (2000). Absorption and Emission of Radiation; Basic Physical Chemistry in

Biochemistry (167-179). Iserlohn

[179] Kellner R (1998). Chromatographische Trennmethoden; in Lottspeich F & Zorbas H (Hrsg.)

Bioanalytik (195-215). Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

[180] Rubio N, Brieva A & Alcazar B (1987). Purification of allergens by high-performance liquid

chromatography; IV. Purification of the allergen of olive pollen (Olea europea). J Chromatogr

(403) 312-318.

[181] Wahl R, Maasch HJ & Geissler W (1986). High-Performance liquid chromatography mole-

cular weigth determination of allergen extracts; Examination of the influence of the column

material on allergenic activity and allergen patterns. J Chromatogr (351) 39-46.

[182] Wahl R & Maasch HJ (1987). HPCL a useful tool in allergen extract research and control.

International Analysts

[183] Pacáková V, Stutlik K & Tichá M (1997). High-performance separations in isolation and

characterization of allergens. J Chromotogr B (699) 403-418.

[184] Lämmli U (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacte-

riophage T4. Nature (227) 680-685.

[185] Schaegger H & von Jagow G (1987). Tricine-sodium-dodecyl-sulfate polyacryalamide gel

electrophoresis for the separation for proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem

(166) 368-379.

[186] Görg A & Westermeier R (1998). Elektrophoretische Verfahren; in Lottspeich F & Zorbas H

(Hrsg.) Bioanalytik (217-252). Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

[187] Kleinert T (1990). Elektrophoretische Methoden in der Proteinanalytik. Georg Thieme Ver-

lag, Stuttgart.

[188] Ornstein L (1964). Disc Electrophoresis, 1, Background and Theory. Annals New York

Academy of Sciences (121) 321-349.

[189] Davis B (1964). Disc Electrophoresis. 2, Method and application to human serum proteins.

Annals New York Academy of Sciences (121) 404-427.

[190] Diezel W, Kopperschlager G & Hofmann E (1972). An improved procedure for protein

staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem

(48) 617-620.

[191] Blum H, Beier H & Gross H (1987). Improved silver staining of plant proteins, RNA and

DNS in polyacrylamide gels. Electrophoresis (8) 93-99.

[192] Baldo BA (1983). Standardization of allergens. Allergy (38) 535-546.

133

[193] Tovey ER & Baldo BA (1987). Characterisation of allergens by protein blotting. Electropho-

resis (8) 452-463.

[194] Mansfield A & McDonald C (2000). Rapid immunodetection of blotted proteins without

blocking. www.millipore.com:

[195] Paech C (1993). Zymogram of proteases made with developed film from nondenaturing

polyacrylamide gels after electrophoresis. Anal Biochem (208) 2; 249-254.

[196] Paradies H (2000). Circular dichroism and optical rotatory dispersion; Bas Phys Chem Bio-

chem (202-238).

[197] Paradies H.H.; Franz A. (1976). Geometry of the protein S4 from Escherichia coli riboso-

mes. Eur J Biochem (67) 1; 23-29.

[198] de la Hoz F & Carreira J (1986). Identification of main allergens from Dermatophagoides

farinae and their properties under native and dissociating conditions. Int Archs Allergy appl

Immun (79) 238-245.

[199] Weber B, Fiebig H & Cromwell O (1998). Die Quantifizierung von Hauptallergenen als Teil

der Qualitätsprüfung industriell hergestellter Allergenpräparate. Allergologie (21) 3; 116-124.

[200] Tovey ER & Baldo BA (1987). Comparison by electroblotting of IgE-binding components in

extracts of house dust mite bodies and spent mite cultures. J Allergy Clin Immunol (79) 1;

93-102.

[201] Garcia-Robaina JC et al. (1998). Extracts from various mite species contain crossreactive

IgE epitopes. A RAST inhibition study. J Invest Allerg Clin Immunol (8) 5; 285-289.

[202] Guinier A (1955). Small Angle Scattering of X-Rays. Wiley, New York.

[203] Hoffmann A et al. (1997). Potency determination of allergenic extracts using mediator re-

lease of rat basophil leukemia cells; in Kurth R & Haustein D (Hrsg.) Arbeiten aus dem Paul

Ehrlich Institut - 8th International Paul Ehrlich Seminar (203-208). Gustav Fischer Verlag,

Stuttgart.

[204] Hoffmann A, Vieths S & Haustein D (1997). Biologic allergen assay for in vivo test aller-

gens with an in vitro model of the murine type I reaction. J Allergy Clin Immunol (99) 2; 227-

232.

134

7 AKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Auswahl wichtiger Abkürzungen, die Kapitelübergreifend verwendet wurden.

APC Antigenpräsentierende Zellen

CAP-RAST RAST-System der Fa. Amersham Pharmacia Biotech

Da Dalton

DNS Desoxyribonukleinsäure

DTT Dithiotreitol

EAST Enzyme Allergo Sorbent Assay

ELISA Enzym Linked Immuno Sorbent Assay

H2Odd zweifach destilliertes Wasser

HSM Hausstaubmilbe

IgE Immunglobulin E

IEF Isoelektrische Fokussierung

IL Interleukin

IFN-γInterferon-Gamma

kDa Kilodalton

MAG Mite Antigen Gen

MAk monoklonale Antikörper

MALDI-TOF-MS Matrix unterstützte Laser Desorption Ionisation Massenspektroskopie

MHC Major Histokompatibillitäts Komplex

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Kernresonanz)

OD Optische Dichte

PEG Polyethylenglykol

pI Isoelektrischer Punkt

PMB Purified Mite Bodys

RAST Radio Allergo Sorbent Assay

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

TH1, TH2, TH0 T-Helferzellen verschiedener Ausprägung

VRM Vorratsmilbe

WMC Whole Mite Cultures

SEC Ausschlusschromatographie

RSA Rinderserumalbulmin

UV/VIS Ultraviolett/Visibel-Spektroskopie