Isolierung und Strukturaufklärung von Sekundärmetaboliten aus
endophytischen Pilzen
An den Fachbereich Chemie und Chemietechnik
der Universität-Gesamthochschule Paderborn zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
– Dr. rer. nat. –
genehmigte Dissertation
von
Natalia Root
aus Geburtsort/Russland
Paderborn 2001
Referent: Prof. Dr. K. Krohn
Korreferent: Prof. Dr. N. Risch
Eingereicht am: 26.09.01
Mündliche Prüfung: 26.10.01
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 1998 bis Oktober 2001 im Fach
Organische Chemie des Fachbereichs 13 der Universität Paderborn unter Anleitung
von Herrn Prof. Dr. K. Krohn angefertigt.
Herrn Prof. Dr. N. Risch danke ich für die Übernahme des Korreferats.
Meinem Mann und den Kindern danke ich für die Unterstützung.
Weiterhin gilt mein Dank:
- Herrn Dr. W. Wray für die Aufnahme der NMR-Spektren und für die kollegiale
Mitarbeit,
- Herrn Dr. P. Schulze und Herrn Dr. Dülcks für die Aufnahme der
Massenspektren,
- Herrn Dr. U. Flörke für die Röntgenstrukturanalyse,
- Frau Dr. B. Merla für das unermüdliche Korrekturlesen,
- Herrn Dr. C. Biele für viele fruchtbare Diskussionen,
- Herrn Dr. P. Frese für die fachliche und menschliche Unterstützung,
- Herrn Dr. D. Sielemann, Herrn Dr. A. Walter, Herrn K. Steingröver, Herrn M.
Größer, Herrn R. Krelaus, Frau M. Zukowski, Frau J. Delbos-Krampe, Frau A.
Kröber sowie den anderen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Organischen
Chemie für das kollegiale und freundliche Arbeitsklima.
Meinem Vater und meiner Mutter
mit Liebe
und Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung................................................................................4
1.1 Suche nach neuen Wirkstoffen bei Pilzen........................................... 4
1.2 Biologische Aspekte von Pilzen........................................................... 5
1.3 Sekundärmetabolite............................................................................... 6
1.4 Biogenese der Sekundärmetaboliten................................................... 7
1.5 Alkaloide................................................................................................. 9
1.6 Aufgabenstellung................................................................................. 10
2 Isolierung und Aufklärung ihrer Struktur der
Naturstoffe aus den Pilzextrakten ......................................11
2.1 Der Pilzstamm 4729 ............................................................................. 11
2.1.1 Isolierung und Charakterisierung der Preussomerine G, H, I, J, K
und L..................................................................................................... 11
2.1.2 Strukturaufklärung und Beschreibung der Preussomerine G–L..... 13
2.1.2.1 Isolierung und Strukturaufklärung des Preussomerins L........................ 14
2.1.2.2 Isolierung und Strukturaufklärung von Preussomerin K......................... 23
2.1.2.3 Isolierung und Strukturaufklärung des Preussomerins J........................ 29
2.1.2.4 Isolierung und Strukturaufklärung des Preussomerins H....................... 32
2.1.2.5 Isolierung und Strukturaufklärung des Preussomerins G....................... 36
2.1.2.6 Isolierung und Charakterisierung des Preussomerins I.......................... 39
2.2 Biologische Aktivität der Naturstoffe G–L......................................... 41
2.2.1 Mikrobiologische Untersuchungen des Rohextraktes
(Braunschweig).................................................................................... 41
2.2.2 Biologische Aktivität der Reinsubstanzen ........................................ 42
2.2.3 Pflanzenschutz-Screening-Tests der BASF ...................................... 43
2.2.4 Zusammenfassung der bisherigen Ergebnisse ................................ 45
2.2.5 Bestimmung der absoluten Konfiguration der Preussomerine
G–L........................................................................................................ 51
2.3 Beschreibung, Isolierung und Strukturaufklärung der
Naturstoffe aus dem Pilzstamm 5049................................................. 57
2.3.1 Beschreibung des Pilzextraktes......................................................... 57
2.3.2 Isolierung der Naturstoffe aus dem Pilzextrakt 5049........................ 62
_____________________________________________________Inhaltsverzeichnis
2.3.2.1 Isolierung und Strukturaufklärung des Naturstoffes „P“ ......................... 63
2.3.2.1.1 Die allgemeinen Daten des Sekundärmethaboliten ............................... 63
2.3.2.1.2 Die NMR-Daten des Naturstoffes .......................................................... 65
2.3.2.1.3 Analyse der NMR-Daten und des Massenspektrums. ........................... 68
2.3.2.1.4 Das Molekül liegt als Biarylsystem vor................................................... 71
2.3.2.1.5 Der aliphatische Teil des Moleküls ........................................................ 72
2.3.2.1.6 Weitere Diskussion der Struktur des aliphatischen Fragments.............. 75
2.3.2.1.7 Diskussion der achsialen Chiralität ........................................................ 80
2.3.2.1.8 Zusammenfassung der Daten des neuen Naturstoffs............................ 81
2.3.2.1.9 Biologische Aktivität............................................................................... 82
2.3.2.2 Beschreibung und Isolierung des Sekundärmetaboliten Cytochalasin
L-696.474............................................................................................... 84
2.3.2.1.9 Biologische Aktivität............................................................................... 87
2.3.2.3 Isolierung und Beschreibung des Cytochalasins X ................................ 88
2.3.2.3.1 Zusammenfassende Beschreibung der Naturstoffe Cytochalasin L
und Cytochalasin X............................................................................. 92
2.3.2.4 Isolierung und Beschreibung der 3-Nitropropionsäure........................... 93
2.4 Der Pilzstamm 4295 ............................................................................. 95
2.4.1 Die 4-(2‘,3‘-Dimethoxy-4‘-methyl-phenyl)-4-oxo-Buttersäure........... 95
2.4.2 Biologische Aktivität ..........................................................................100
3 Zusammenfassung und Ausblick.....................................101
4 Experimenteller Teil ...........................................................104
4.1 Allgemeines zu den benutzten Analysen und Meßverfahren..........104
4.2 Die Synthese des Sekundärmetaboliten 2,6-Dihydroxy-8-
methoxy-3-oxo-3,4,5,6-tetrahydronaphtalin-1-carbaldehyd ............109
4.3 Die analytischen Daten der Naturstoffe............................................117
4.3.1 Die analytischen Daten des Preussomerins L .................................117
4.3.2 Die analytischen Daten des Preussomerins K .................................118
4.3.3 Die analytischen Daten des Preussomerins I...................................119
4.3.4 Die analytischen Daten des Preussomerins H .................................120
4.3.5 Die analytischen Daten des Preussomerins G.................................121
_____________________________________________________Inhaltsverzeichnis
4.3.6 Die analytischen Daten des Preussomerins J..................................122
4.3.7 Die analytischen Daten des Naturstoffs P........................................123
4.3.8 Die analytischen Daten des Diols......................................................124
4.3.9 Die analytischen Daten des Cytochalasins L-696.476.....................125
4.3.10 Die analytischen Daten des Cytochalasins X...................................126
4.3.11 Die analytischen Daten der 3-Nitropropionsäure.............................127
4.3.12 Die analytischen Daten der 4-(2‘,3‘-Dimethoxy-4‘-methyl-phenyl)-
4-oxo-Buttersäure...............................................................................128
4.4 Totalsynthese des Naturstoffes 2,6-Dihydroxy-8-methoxy-3-
oxo-3,4,5,6-tetrahydronaphthalin-1-carbaldehyd.............................129
4.4.1 4-(2‘,4‘-Dimethylphenyl)-4-oxobutansäure 1 ....................................129
4.4.2 4-(2’,4’-Dimethoxy-3’-methylphenyl)-butansäure 2..........................130
4.4.3 5,7-Dimethoxy-6-methyl-3,4-dihydro-2H-naphthalin-1-on 3 ............131
4.4.4 (R)-5,7-Dimethoxy-6-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalin-1-ol 4....132
4.4.5 5,7-Dimethoxy-6-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalin-1-ol 4..........132
4.4.6 5,7-Dimethoxy-6-methyl-1-pivaloyloxy-1,2,3,4-
tetrahydronaphthalin 5.......................................................................133
4.4.7 1,3-Dimethoxy-8-oxo-5-pivaloyoxy-5,6-dihydro-2H-naphthalin-2-
carbaldehyd 6......................................................................................134
4.4.8 6,8-Dimethoxy-7-methyl-4-pivaloyloxy-3,4-dihydro-2H-
naphthalin-1-on 12..............................................................................135
4.4.9 6,8-Dimethoxy-7-hydroxymethyl-4-pivaloyloxy-3,4-dhydro-2H-
naphthalin-1-on 13.........................................................................136
4.4.10 1-Hydroxy-3-methoxy-8-oxo-5-pivaloyloxy-5,6-dihydro-7H-
naphthalin-2-carbaldehyd 7 ...............................................................136
5 Verzeichnis der Abkürzungen...........................................138
6 Literatur...............................................................................139
Isolierung und Strukturaufklärung
4
1 Einleitung
1.1 Suche nach neuen Wirkstoffen bei Pilzen
Seit Jahrtausenden nutzt der Mensch die Stoffwechselprodukte von
Mikroorganismen und Pilzen für seine Zwecke. Die Bier- und Weinherstellung sowie
die Brotbereitung mit Hilfe von Sacharomyces cerevisiase und die Produktion von
Milchprodukten durch Lactobacteriase seien hier als Beispiele für klassische
Anwendungen genannt.[1]
Die Leistungsfähigkeit von Pilzen, in der Synthese biologisch aktiver Leitstrukturen,
ist bei weitem noch nicht erschlossen. Der Teil des Moleküls, der für die biologische
Aktivität verantwortlich ist, wird als “Leitstruktur“ bezeichnet. “Am Anfang steht die
Leitstruktur“ lautet ein Credo der modernen Forschung für Arznei- und
Pflanzenschutzmittel.[1] Die Trends der Leitstrukturfindung lassen sich in folgenden
Punkten zusammenfassen:
- Bis in die achtzige Jahre hinein war die zufällige Entdeckung neuer bioaktiver
Verbindungen die Regel. Oft stand die chemische Synthese einzelner
Verbindungen im Vordergrund.
- Die rasante Entwicklung der Rechnerleistung der modernen Computer führte zur
Anwendung von “Molecular Modeling“ bei der Leitstruktur-Optimierung
(dreidimensionale Anpassung einer Leitstruktur an das aktive Zentrum eines
Rezeptors). Das Verfahren stützt sich auf die Schlüssel-Schloss-Hypothese des
deutschen Chemikers Emil Fischer (Nobelpreis 1902). Aber auch heute spielt der
Zufall bei der Auffindung neuer Leitstrukturen noch eine Rolle.
- Durch den Vormarsch der kombinatorischen Synthese ist es möglich geworden,
tausende von Verbindungen parallel herzustellen. Da die Biochemie immer neue
Testsysteme entwickelt, werden sowohl die bekannten Verbindungen als auch die
neuen in diese Tests eingeschleust.
Von der Zahl her nimmt die Naturstoffchemie dabei einen bescheidenen Platz ein.
Am 15. Juni 2000 erfasste “Chemical Abstracts“ ca. 16 827 004 organische und
Isolierung und Strukturaufklärung
5
anorganische Verbindungen. Die Naturstoffdatenbank von Chapman & Hall
beinhaltet ca. 145 000 genau analysierte Naturstoffe. Dennoch demonstrieren die
nachfolgenden Beispiele die überragende Rolle der Naturstoffchemie in der
Pharmazie und im Pflanzenschutz:
- Entdeckung des Penicillins (1928 von Alexander Fleming) und die bis heute ständig
weiterentwickelten hochwirksamen β-Lactam-Antibiotika.
- zunehmender Erfolg der aus natürlichen Quellen gewonnenen Antitumormittel
(Antracycline, Taxol).
- die bekanntesten Immundepressiva (Cyclosporin, Rapamycin, KF-506) hemmen
bei der Transplantations-Chirurgie die Abstoßung der fremden Organe.[1]
Der Erfolg der Naturstoffe hat zwei Gründe:
1. Die Natur ist in der Lage, mit erstaunlich wenigen Biosynthesewegen eine große
Strukturvielfalt herzustellen.
2. Hypothetisch ausgedrückt, hat die Natur im Laufe der Evolution die
niedermolekularen Naturstoffe (Sekundärmetabolite) für den Überlebenskampf
entwickelt.
Der überwiegende Teil der Mikroorganismen und Pflanzen ist auf ihre Bestandteile
noch nicht untersucht.[1] Pilze zählen zu jenen Organismen, die einen intensiven
Stoffwechsel aufweisen. Dabei sind die Produkte ihres sekundären Stoffwechsels
von besonderem Interesse.[2]
Die Sekundärmetabolite sind Stoffe, die nicht für das Wachstum des
Produzentenstammes verantwortlich sind, aber den Stoffwechsel anderer
Organismen stark beeinflussen können. Auf den Begriff der Sekundärmetaboliten
wird im Kapitel 1.3 genauer eingegangen. Beispiele für Sekundärmetabolite sind
etwa die zahlreichen von Menschen als Antibiotika, Herbizide, Cytostatika oder
Fungizide genutzten Verbindungen.
1.2 Biologische Aspekte von Pilzen
Als Pilze bezeichnet man eine Gruppe chlorophyllfreier, heterotopher, eukaryotischer
Organismen. Als Eukaryonten verfügen sie wie Tiere und Pflanzen über einen echten
Isolierung und Strukturaufklärung
6
Zellkern sowie die typischen Zellorganellen im Protoplasma.[1] Je nach Lebensraum
und Ernährungsgrundlage unterscheidet man saprobiontische, parasitäre und
symbiotische Pilze. Saprobiotische Pilze leben auf totem Material wie z.B.
abgestorbenen Bäumen, bauen Nährstoffe daraus ab und absorbieren sie. Die
parasitären Pilze befallen einen lebenden Wirt und nehmen Nährstoffe aus dessen
Zellen auf. Die symbiotischen Pilze beziehen wie die parasitären Pilze Nährstoffe von
ihrem Wirt, sind diesem aber auch in unterschiedlicher Weise nützlich.[3]
Über die taxonomische Zuordnung der Pilze existieren verschiedene Auffassungen.
Man unterteilt die Pilze nach den Unterschieden in den Einzelheiten der
Reproduktion in drei Hauptgruppen. Diese Hauptgruppen sind: die Jochpilze
(Zygomycota), die Schlauchpilze (Ascomycota) und die Ständerpilze
(Basidiomycota). Sie werden wieder in Klassen, Ordnungen, Familien, Gattungen
und Arten unterteilt. Auf die Einzelheiten der Definition soll hier nicht näher
eingegangen werden.
1.3 Sekundärmetabolite
Den Stoffwechsel (Metabolismus) teilt man in zwei Bereiche, den Primär- und den
Sekundärmetabolismus. Der Primärmetabolismus umfaßt alle Stoffwechselvorgänge,
die zur direkten Ernährung des jeweiligen Organismus erforderlich sind. Die
Grundprinzipien, die Reaktionen und die Produkte des Primärmetabolismus sind bei
allen Lebewesen nahezu gleich. Dazu zählt man z. B. die Übersetzung des
genetischen Codes in Aminosäuren von Proteinen, die Struktur und Funktion von
Proteinen sowie die Organisation, den Ablauf und die Kontrolle wichtiger
Stoffwechselzyklen wie etwa den Citronensäurezyklus oder die oxidative
Phosphorylierung im Mitochondrium.[2]
Der Sekundärmetabolismus ist dagegen für den Stamm, die Art und die Gattung
charakteristisch. Eine scharfe Trennung zwischen beiden Stoffwechselsystemen ist
nicht möglich, da die Synthese der Sekundärmetaboliten vielfach von
Primärmetaboliten ausgeht. Die Produktion von Sekundärmetaboliten erfolgt im
Allgemeinen nur in Zellen, die sich nicht mehr teilen oder sich durch limitierte
Wachstumsraten auszeichnen.[3] Man unterscheidet daher eine Wachstumsphase
(Trophophase), in der der Primärstoffwechsel dominiert, und eine Produktionsphase
Isolierung und Strukturaufklärung
7
(Idiophase). Unter den zahlreichen Sekundärstoffen finden sich nicht nur Mykotoxine
(Gifte), sondern auch für den Menschen nützliche Verbindungen wie organische
Säuren oder medizinisch-pharmazeutisch wichtige Produkte (Antibiotika, Ergot-
Alkaloide, Cytochalasine, Siderochrome).[4]
1.4 Biogenese der Sekundärmetaboliten
Die Biogenese der Sekundärmetaboliten ist von der begrenzten Zahl der
Primärmetaboliten wie z.B. α-Aminosäuren, Acetyl-Coenzym A, Mevalonsäure und
den Derivaten der Shikimisäure abzuleiten. Die Klassifizierung der
Sekundärmetaboliten unterscheidet aufgrund der Ausgangsfragmente isoprenoide
(Terpene, Steroide), aromatische und alkaloide Verbindungen.[2]
Bereits 1922 vermutete Ruziska, dass sich die Terpene und Steroide aus
Isoprenoidmolekülen aufbauen. Die Biosynthese der aromatischen Verbindungen
erfolgt überwiegend auf zwei Wegen. Der erste Weg geht aus dem
Kohlenhydratstoffwechsel hervor und verläuft über die Shikimisäure. Der zweite Weg
geht von Fettsäuren aus (Polyketid-Weg).
Die Shikimisäure wurde 1885 aus der Frucht der Pflanze „Shikimi-no-ki“ „Illicium
refigiosum“ isoliert. Spätere Untersuchungen verdeutlichten die Rolle der
Shikimisäure als Schlüsselintermediat bei der Synthese der aromatischen
Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan.
Isolierung und Strukturaufklärung
8
CO2H
HO OH
OH
NH
NH2
CO2H
L-Tryptophan
R
CO2H
NH2
R = OH L-Tyrosin
R = H L-Phenylalanin
Schema 1: Die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren.
Bei dem Polyketid-Weg werden die Acetateinheiten (ausgehend aus Startmolekülen
wie z. B. Acetyl-CoA) nicht reduziert, sondern miteinander verknüpft und
anschließend als Polyketo-Verbindungen zu mono- bzw. polyzyklischen
aromatischen Verbindungen zyklisiert. Dieser Weg findet nur in Mikroorganismen
und höheren Pflanzen statt.
S
O
CoA S
OOO
CoA
n
Acetyl-CoA Poly-ß-Ketoacyl-CoA
Schema 2: Der Polyketid-Weg der Biosynthese der Aromaten.
Isolierung und Strukturaufklärung
9
1.5 Alkaloide
Alkaloide (zyklische organische Verbindungen, die ein Stickstoffatom in negativer
Oxidationsstufe beinhalten) bilden eine große Gruppe von Sekundärmetaboliten. Sie
sind nach ihrer Biosynthese in vier Nebengruppen zu unterteilen. Die erste
Nebengruppe umfaßt die stickstoffhaltigen Säuren, deren Stickstoffatom in die
Synthese eingeht.
NH2
NH2
CO2H
N
H
OH
Lupinin
Schema 3: Biosynthese des Lupinins.
Die zweite Untergruppe wird als „Pseudoalkaloide“ bezeichnet. Im Unterschied zu
der ersten ist das Kohlenstoffatomgerüst nicht von Aminosäuren abzuleiten, sondern
wird aus isoprenoiden Verbindungen gebildet. Das Stickstoffatom wird oft in Form
von NH3 später ins Molekül eingebaut.
S
O
CoA 4
O
HO
O
OO
N
Coniin
N
H
Schema 4: Die schematische Darstellung der Biosynthese des Coniins.
Isolierung und Strukturaufklärung
10
Bei der dritten Untergruppe (Peptidalkaloide) handelt es sich um zyklische
Oligopeptide, die 2 bis 20 Aminosäuren umfassen.
Die Decarboxylierungsprodukte der Aminosäuren (Protoalkaloide) und deren
Derivate werden einer vierten Untergruppe der Akaloide zugeordnet. Das
Stickstoffatom liegt bei diesen Verbindungen azyklisch vor. Die Protoalkaloide sind
in Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren frei oder gebunden relativ weit verbreitet. In
Tieren liegen Derivate der Protoalkaloide als Neurotransmitter vor (Acetylcholin,
Serotonin, Catecholamin).[2]
RNH
CO2H
-CO2RNH2
Schema 5: Die Biosynthese eines Protoalkaloides.
1.6 Aufgabenstellung
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Isolierung, Strukturaufklärung und Synthese von
Naturstoffen aus Pilzen. Das Ziel des Projektes ist das Auffinden neuer Leitstrukturen
für Pharmazie und Pflanzenschutz.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind chromatographische Trennungen der
biologisch aktiven Pilzextrakte und deren Untersuchung. Ziel ist bekannte und neue
Naturstoffe auzudecken, zu isolieren, physikochemisch zu charakterisieren und
hinsichtlich ihrer biologischen Wirkung zu untersuchen. Wegen der sich schnell
gegen Pflanzenschutzmittel und Antibiotika entwickelnden Resistenzen und der
Reduzierung der Nebenwirkungen besteht die ständige Notwendigkeit, nach neuen
Wirkstoffen zu suchen.
Die aus der TU Braunschweig kommenden Pilzextrakte stammen aus extremen
Bodenproben aus der Braunschweiger Region sowie phytopathogenen und
endophytischen Pilzen.
Isolierung und Strukturaufklärung
11
2 Isolierung und Aufklärung ihrer Struktur der Naturstoffe aus den
Pilzextrakten
2.1 Der Pilzstamm 4729
Der Pilzstamm 4729 ist ein aus der Wurzel der Atropa belladonna isolierter Endophyt
(Mycelia sterilia). Taxonomisch kann er zur Zeit nicht bestimmt werden.
2.1.1 Isolierung und Charakterisierung der Preussomerine G, H, I, J, K und L
Der Pilz wurde auf zwei verschiedenen Kulturmedien (insgesamt 6000 ml der
Biomalz- und Malz-Soja-Weichagarmedien) bei Raumtemperatur 70 Tage lang
kultiviert. Anschließend konnte der Rohextrakt nach Homogenisierung durch
einmalige Extraktion aus der Pilzkultur mit Petrolether (P) und mehrmalige
Extraktion mit Ethylacetat (E) gewonnen werden. Die organischen Phasen wurden
über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels erhielt man den
Rückstand aus Petrolether und Ethylacetat (ca. 3.3 g), der in ein Gemisch aus
Aceton und Methanol (1:1) aufgenommen wurde. Danach wurden Dünnschicht- und
Biogramme angefertigt.
Der Mycelia sterilia-Endophyt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (ca.
3.0 g) vorgetrennt. Die unpolarste Fraktion (ca. 2.0 g) bestand aus Fettsäuren und
Fettsäureestern. Die Fraktionierung der vier erhaltenen Hauptfraktionen gelang durch
mehrmalige präparative Dickschichtchromatographie (Kieselgelplatten 0.25-2.0 mm).
Alle oben genannten Naturstoffe G-L gehören zur Klasse der Preussomerine. In
Schema 6 ist die Vorgehensweise der Isolierung der Preussomerine
veranschaunlicht.
Isolierung und Strukturaufklärung
12
Endophyt aus Atropa belladonna
Rohextrakt
1. Filtrieren
2. Eluieren mit:
Cyclohexan 100 ml -ergab keine Produkte
Cyclohexan: Dichlormethan 1:1 150 ml
Dichlormethan 100 ml
2. Flash -Chromatographie an Kieselgel -ergaben 4 Fraktionen
Dichlormethan:EtAc 85:15 150 ml
50:50 100 ml
0:100 100 ml
Methanol 80 ml -ergab keine Produkte
4 relevante Fraktionen verschiedener Polarität
Chromatographie an Kieselgelplatten
G
1. CH2Cl2:PE
2:5
2. CH2Cl2
J
CH2Cl2
H
CH2Cl2
I
CH2Cl2:MeOH
98:2
K
CH2Cl2:MeOH
97:3
L
CH2Cl2:MeOH
95:5
Kristallisation:
PE
C2H12
CH2Cl2
gelbliche Kristalle
Schmp. 130-132°C
Kristallisation:
C6H12
MeOH
Schema 6 : Die Isolierung der Preussomerine G–L.
Isolierung und Strukturaufklärung
13
2.1.2 Strukturaufklärung und Beschreibung der Preussomerine G–L
OO
OO
H
O
O
O
OO
OO
H
O
O
O
H
G
OO
OO
H
O
O
OCH3
O
I
OO
OO
H
O
O
OH
O
OO
OO
H
O
HO
OH
O
OO
OO
H
O
O
O
OCH
3
O
L
K
J
Abbildung 1: Die aus dem Pilzstamm 4729 isolierten literaturbekannten (G–I) und neuen (J–L)
Preussomerine.
Isolierung und Strukturaufklärung
14
2.1.2.1 Isolierung und Strukturaufklärung des Preussomerins L
C20H14O8 M
r: 382
O
O
O
OO
H
O
O
O
OO
H
O
O
O
OO
H
HO
OH
O
1
2
3
456
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9' 10'
Das in der Literatur nicht bekannte Preussomerin L lag in einer Menge von 3.4 mg
zunächst als hellgelbes Öl vor. Im aliphatischen Bereich des 1H-NMR-Spektrums
erlaubten mehrere Signale keine sichere Interpretation. Die zahlreichen Versuche,
die Probe aufzureinigen, erwiesen sich als schwierig. Aus diesem Grund wurde die
Probe mit 3-5 Tropfen kaltem Methanol versetzt und die Lösung in ein anderes
Probegläschen übertragen. Die methanolische Lösung wurde mit 2-3 Tropfen
Cyclohexan versetzt. Nach zwei Wochen im Kühlschrank hatten sich Kristalle als
farblose Nadeln mit dem Schmelzpunkt 171-173 °C gebildet. Die in Dichlormethan
lösliche Fraktion enthielt in größerer Menge ölige Verunreinigungen, die eine
Kristallisation verhinderten.
Die Kristalle lösen sich gut in polaren Lösungsmitteln, wie z.B. dem Gemisch
Dichlormethan:Methanol = 95:5. Die Substanz hat im Laufmittel CH2Cl2/MeOH 95/5
den Rf-Wert 0.61. Der Drehwert des Naturstoffes beträgt [α]D = – 557°(c = 0.11g/100
ml, MeOH).
Das Massenspektrum ergibt nach hochauflösender Messung des Molekülions bei
m/z = 382.06888 die Summenformel C20H14O8. Im IR-Spektrum ist die
Absorptionsbande bei 1722 cm-1 ein Indiz für die Anwesenheit einer
Isolierung und Strukturaufklärung
15
Carbonylgruppe.[5] Die Bande bei 3382 cm-1 ist für eine chelatisierte Hydroxygruppe
charakteristisch.
Im 13C-NMR-Spektrum liegt ein doppelter Satz sehr ähnlicher Verschiebungen vor.
Es wird im folgenden vom „oberen“ und „unteren“ Teil des Moleküls gesprochen. Die
Verbindung enthält insgesamt acht Sauerstoffatome. Die totale Zahl der sp2-hybri-
disierten Kohlenstoffatome ist 14. Das 13C–NMR Spektrum zeigt zwei Signale für
zwei Carbonylgruppen und drei Signale für drei sp2-Kohlenstoffatome, die direkt mit
Heteroatomen verbunden sind. Acht Kohlenstoffatome liegen im olefinischen bzw.
aromatischen Bereich. Charakteristisch sind zwei Spiroacetal-C-Atome bei 95.66 und
95.71 ppm. Zwei sp3-hybridisierte Kohlenstoffatome bei 70.76 und 70.97 ppm sind
direkt an ein Heteroatom gebunden. Die zwei übrigen, bei 43.21 und 43.56 ppm
liegenden Kohlenstoffatome sind aliphatisch. Sie befinden sich in der Nähe eines
Heteroatoms und gehören zu einem zyklischen System. Die Daten und Kopplungen
der 13C- und 1N-NMR-Spektren sind in Tabelle 4 aufgelistet.
Das 1H - NMR-Spektrum zeigt zwei Hauptgruppen (1 und 2) von Signalen
(Abbildung 2). Ein scharfes Singulett bei 10.16 ppm (nicht abgebildet) deutet auf ein
chelatisiertes phenolisches OH-Proton hin. Die zwei Signale bei 3.33 und bei 4.79
ppm entsprechen den Signalen für Methanol, das dritte Singulett bei 2.18 ppm ist
nicht reproduzierbar (eventuell H2O). Bei der ersten Gruppe um 7-8 ppm handelt es
sich um fünf aromatische Protonen. Für die zweite Gruppe um 3-4 ppm sind
aliphatische Protonen verantwortlich. In der zweiten Gruppe des 1H-NMR-Spektrums
sind zwei Bereiche der Signale (vier doppelte Dubletts) zu erkennen. Für das erste
doppelte Dublett bei 3.59 ppm ist das Proton H-2a (äquatorial) verantwortlich. Das
zweite doppelte Dublett liegt um 3.49 ppm und entspricht dem Proton H-2‘a. Das
axiale Proton H-2b ergibt bei 2.97 ppm das dritte doppelte Dublett. Das Proton H-2‘b
entspricht dem Dublett bei 2.92 ppm. Die Kopplungskonstanten liegen bei allen vier
Dubletts zwischen 3.2 (H-2a, H-2‘a) und 2.7 Hz (H-2b,H-2‘b). Die Protonen H-2a,
H-2b und H-3a (H-2‘a, H-2‘b und H-3‘a) bilden ein ABX-System. Bei allen diesen
Signalgruppen beträgt die geminale Kopplungskonstante 18.3 Hz.
Isolierung und Strukturaufklärung
16
Abbildung 2: Das 1H-NMR-Spektrum des Preussomerins L.
Mit Hilfe der 2D-NMR-Spektren (HMQC, HMBC) kann für das aliphatische Fragment
des 1H-NMR-Spektrums ein Cyclohexenon-Ring konstruiert werden, der in Abbildung
3 dargestellt ist. Im HMBC-NMR-Spektrum (long-range-Spektrum) ist die direkte
Kopplung zwischen dem C-Atom-3‘, dem Proton H-3‘ und dem C-Atom-2‘ sowie den
Protonen H-2‘a/H-2‘b nicht unterdrückt worden. Daraus geht hervor, dass die
Kopplung zwischen dem C-3‘ (70.76/70.97 ppm, hat ein Sauerstoffatom als
elektronegativen Nachbarn) und den Methylenprotonen H-2’a und H-2’b eine
geminale Kopplung ist. Das Methylen-C-Atom-2‘, dessen chemische Verschiebung
(43.56 ppm) auf ein zyklisches System hindeutet, zeigt genau so im HMBC-NMR-
Spektrum eine 3J–Kopplung zu dem Proton 3’-OH. Das Acetal-C-Atom-4‘ koppelt
zum Proton 3’-OH. Die Nachbarschaft des Carbonyl–C-Atoms-1‘ zu den Protonen
H-2’a/b und 3’-OH wird durch das Signal im HMBC-NMR-Spektrum bestätigt.
Außerdem koppelt das Carbonyl–C-Atom-1‘ zu den aromatischen Protonen H-7’,
H-8’, H-9’, die im H-H-COSY untereinander eine meta- bzw. ortho-Kopplung zeigen.
Die chemische Verschiebung des quartären C-Atoms-6‘ (152.33 ppm), das mit den
2
1
Isolierung und Strukturaufklärung
17
Protonen H-7‘, H-8‘, H-9‘ koppelt, weist auf ein Sauerstoffatom als Substituenten am
Aromaten hin.
Tabelle 1: 1H- und 13C-NMR Daten des Preussomerins L (gemessen in CDCl3).
Atom.
Nr.:
13C-NMR
HMBC
1H-NMR H,H-COSY
1 202.24 3, 8 10-OH s 10.16 -
1’ 195.98 9’, 3’, 2‘a,2‘b - -
9 158.10 7.8 - -
6’ 152.33 7‘,8‘ - -
6 144.41 7, 8 - -
10’(5‘) 132.22 7’,8’,9’ - -
5’(10‘) 132.12 2‘a,2‘b - -
7 126.89 8 7 d 7.16 8
7’ 122.63 8’, 9’ 7’ dd 7.21 9’, 8’
8’(9‘) 121.65 7’, 8’,(9’) 8’ t 7.48 7’,9’
9’(8‘) 121.55 9’, (8‘) 9’ dd 7.63 7’,8’
8 121.08 7 8 d 6.97 7
5 119.55 8 - -
10 114.15 7 - -
4’ 95.71 3’, 2’a,2‘b - -
4 95.66 3 - -
3(3‘) 70.97 - 3/3’ dd 4.75
3‘-OH 3.68
2a,2b/ 2a’,2b’
-
3‘(3) 70.76 - 3-OH s 3.39 -
2(2‘) 43.56 - 2a dd 3.59
2b dd 2.97
2b,3
2a,3
2’(2) 43.21 - 2‘a dd 3.49
2‘b dd 2.92
2‘b,3‘
2‘a,3‘
Isolierung und Strukturaufklärung
18
Der Torsionswinkel zwischen den Protonen H-2‘a/2‘b und dem Proton H-3‘ liegt
aufgrund der 3J-Kopplungskonstanten (3.2, 2.7 Hz) um 60°. In der Tabelle 1 sind die
NMR-Daten aufgelistet.
OO
O
O
OH
H2'a
H2'b
H'3
H9'
H8'
H7'
1' 2'
3'
4'
Abbildung 3: Das „untere“ Tetralonfragment des Preussomerins L.
Das „obere“ Fragment sieht dem „unteren“ sehr ähnlich. Der Unterschied ist aber aus
den 1H-und 13C-MMR-Spektren sofort zu erkennen. Die chemische Verschiebung
des quartären C-Atoms-1 bei 202.24 ppm spricht für eine Carbonylgruppe mit
stärkerer Entschirmung als bei dem quartären C-Atom-1‘ (195.98 ppm). Das kann
durch die Chelatisierung der Carbonylgruppe mit einem in günstiger Position
stehenden Proton (9-OH, phenolisches Proton) erklärt werden (Abb. 4b). Die
Kopplung des Carbonylkohlenstoffatoms C-1 mit den aromatischen Protonen H-8
und H-7 ist zu erkennen. Die 3J-Kopplungskonstante zwischen den Protonen H-7 und
H-8 beträgt 9.2 Hz. Beide zeigen im H,H-COSY keine Kopplungen mit anderen
Protonen. Das spricht für einen hochsubstituierten Aromaten (Abb. 4a). Die in
Abbildung 4 a-d abgebildeten Teilstrukturen a, b, c und d wurden aufgrund der NMR-
Daten konstruiert. Die übrigen aliphatischen Signale fallen sehr dicht mit
entsprechenden Signalen für das „untere“ Fragment zusammen.
Isolierung und Strukturaufklärung
19
H
H
O
H
OO
Ha
Hb
HO
H
OO
H
a
b
c
d
7
82
3
9
194
Abbildung 4: Die Fragmente des „oberen“ Teils des Preussomerins L.
Der Befund, dass das Carbonyl-C-Atom-1 mit den aromatischen Protonen H-7 und
H-8 koppelt, erlaubt die Verknüpfung der Fragmente a und b.
OO
H
H
H
1
98
7
Abbildung 5: Die Kombination I der Fragmente a und b von Preussomerin L.
Der weitere Aufbau des Moleküls gelingt dank der Fernkopplungen des Spiroacetal-
C-Atoms-4 mit den Protonen H-3, H-2a, H-2b. Es gibt zwei Möglichkeiten, die
Fragmente b und c zu verknüpfen. Diese Möglichkeiten sind in der Abbildung 6
vorgestellt.
Isolierung und Strukturaufklärung
20
OO
Hb
HO
H
Ha
O
OO
HO
H
Hb
Ha
O
2
32
3
4
4
43.56
70.76
70.76
43.56
III
II
Abbildung 6: Mögliche Verknüpfung der Fragmente c und d aus Abbildung 4.
Folgende Argumente sprechen für das Fragment II:
Die chemische Verschiebung des C-Atoms-3 (70.8 ppm, es trägt die Protonen H-3
und 3-OH) deutet nicht auf eine direkte Nachbarschaft zu der chelatisierten
Carbonylgruppe.
Der Methinkohlenstoff C-2 kann sich aufgrund seiner chemischen Verschiebung
(43.56 ppm) nicht in direkter Nachbarschaft zu dem Acetalfragment befinden.
Die Ähnlichkeit der chemischen Verschiebungen der „oberen“ und „unteren“ Teile
deutet auf den ähnlichcen Aufbau der jeweiligen Fragmente.
Aus all diesen Überlegungen folgt, dass sich zwischen C-Atom-1 und dem Proton H-
3 das C-Atom-2 (ein Träger der Protonen H-2a und H-2b) befindet. Die long-range-
Kopplungen von zwei aromatischen quartären C-Atomen-10 und C-5 mit den
Protonen H-7 und H-8 und mit dem Proton 3-H unterstützen die in Abbildung 6
dargestellte Variante II.
Isolierung und Strukturaufklärung
21
OO
O
OO
Hb
H
HO
Ha
H
2
37
8
10
Abbildung 7: Das „obere“ Fragment des Preussomerins L.
Da von der Substanz ein Einkristall gezüchtet wurde, ist eine Röntgenstrukturanalyse
durchgeführt worden.
Abbildung 8: Die Röntgenstruktur des Preussomerins L.
Die aus der Röntgenstrukturanalyse entnommenen Werte der Bindungslängen und
Bindungswinkel des Naturstoffs 1 (in Lösung) sind mit den berechneten Werten für
4H-Benzo-[1,3]-dioxine als Vergleichssubstanz (Programm Spartan 5.1, MMFF94b
im Vakuum) verglichen worden. Sie zeigen trotz der Verdrehung der Spiroacetalringe
des Preussomerins L eine gute Übereinstimmung (Tabelle 2). Die Numerierung des
Gerüstes entspricht den Daten der RSA des Preussomerins L.
Isolierung und Strukturaufklärung
22
12
3
456
110 9
11
19 20
O
O1
2
3
4
12
OO
OO
O
H
HO
OH
H
H
O
Preussomerin L 4H-Benzo-[1,3]-dioxin
Abbildung 9: Die Strukturen des Preussomerins L und 4H-Benzo-[1,3]-dioxin.
Tabelle 2: Die gefundenen und berechneten Bindungswinkel und Bindungslängen von Preussomerin L
und 4H-Benzo-[1,3]-dioxin.
Preussomerin L, Winkel in °A 4H-Benzo-[1,3]-dioxin Winkel in ° A
gefunden berechnet berechnet
C1-O1-C19
C19-O3-C9
O3-C9-C10
O1-C19-C10
O3-C9-O2
O2-C11-C20
115.1
111.3
109.2
109.7
110.0
121.0
114.14
107.73
110.51
114.14
113.91
C1-O1-C2
O1-C2-O2
O2-C3-C4
C2-O2-C3
115.20
114.07
115.28
107.65
Preussomerin L, Bindungslänge °A
gefunden berechnet
4H-Benzo-[1,3]-dioxin
Bindungslänge °A berechnet
O1-C1
O1-C19
C19-O3
O3-C9
C9-O2
O2-C11
1.35
1.47
1.42
1.42
1.47
1.38
1.37
1.43
1.43
1.43
1.44
1.43
C1-O1
O1-C2
C2-O2
O2-C3
1.37
1.43
1.42
1.42
Isolierung und Strukturaufklärung
23
2.1.2.2 Isolierung und Strukturaufklärung von Preussomerin K
C20H12O8 Mr: 380
OO
OO
O
H
O
H
H
H
O
OH
1
2
3456
7
9
10
1' 2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9' 10'
8
Abbildung 10: Die Struktur und Numerierung des Sekundärmethaboliten Preussomerin K.
Das literaturunbekannte Preussomerin K ist eine hellgelbe ölige Substanz, die
weniger polar als Preussomerin L ist. Der Rf-Wert des Naturstoffes in CH2Cl2 beträgt
0.17. Die Substanz löst sich gut in Dichlormethan. Preussomerin K hat bei der
Konzentration c = 0.41 g/100 ml den Drehwert [α]25D = –150 °. Die IR- und UV-
Spektren der Probe sind denen des Naturstoffs L sehr ähnlich. Die exakte Masse
wurde durch HREIMS bestimmt und beträgt 380.05347 g/mol. Daraus ergibt sich
unter Berücksichtigung der NMR-Daten und der Zahl der Doppelbindungsäquivalente
(R+DB = 16) die Summenformel C20H12O8. In Abbildung 11 ist ein Ausschnitt des 1H-
NMR-Spektrums (CDCl3) dargestellt. Der aromatische Teil des Spektrums sieht dem
Spektrum des Naturstoffs L sehr ähnlich; im aliphatischen Bereich findet man jedoch
zwei gravierende Unterschiede.
Isolierung und Strukturaufklärung
24
gehören nicht
zur Verbind.
Abbildung 11: Der Ausschnitt des 1H-MNR-Spektrums des Preussomerins K (CDCl3).
Für zwei neue Dubletts bei 3.84 ppm (Abbildung 11 Signal Nr. 3) und bei 4.26 ppm
(Signal Nr. 2) sind die Protonen H-2 und H-3 an einem Epoxidring verantwortlich.
Die Signale der diastereotopen Protonen haben sich deutlich vereinfacht. Im
Vergleich zu dem Spektrum des Preussomerins L ist nur die Hälfte der Signale zu
sehen. Die diastereotopen Protonen H-2’a und H-2’b zeigen eine geminale
Kopplung; sie beträgt 2J = 18.3 Hz. Neben der vicinalen Kopplung (2.7/3.2 Hz) beider
Protonen H-2‘a und H-2‘b mit dem Proton H-3’ beobachtet man ein doppeltes Dublett
(ABX-Signal). Diese Kopplungskonstanten spiegeln sich beim Triplett bei 4.84 ppm
wieder (Signal 3‘). Aus den Kopplungskonstanten folgt, dass die Protonen H-2a‘/2b‘
nicht antiperiplanar zu dem Proton H-3‘ stehen.
In der Tabelle 3 sind die spektroskopischen Daten des Naturstoffes K
zusammengefasst.
2 3
2‘a 2‘b
3‘t
Wasserspuren
Isolierung und Strukturaufklärung
25
Tabelle 3: 1H- und 13C-NMR Daten des Preussomerins K (CDCl3).
Atom.
Nr.:
13C-NMR
HMBC
1H-NMR H,H-COSY
1 202.24 3, 8 10-OH s 10.16 -
1’ 9’,3’, 2‘a,2‘b - -
9 158.10 7,8 - -
6’ 152.33 7‘,8‘ - -
6 144.41 7, 8 - -
10’(5‘) 132.22 7’,8’,9’ - -
5’(10‘) 132.12 2‘a,2‘b - -
7 126.89 8 7 d 7.16 8
7’ 122.63 8’, 9’ 7’ dd 7.21 9’, 8’
8’(9‘) 121.65 7’, 8’,(9’) 8’ t 7.48 7’,9’
9’(8‘) 121.55 9’, (8‘) 9’ dd 7.63 7’,8’
8 121.08 7 8 d 6.97 7
5 119.55 8 - -
10 114.15 7 - -
4’ 95.71 3’, 2’a,2‘b - -
4 95.66 3 - -
3(3‘) 70.97 - 3/3’ dd 4.75
3‘-OH 3.68
2a,2b/ 2a’,2b’
-
3‘(3) 70.76 - 3-OH s 3.39 -
2(2‘) 43.56 - 2a dd 3.59
2b dd 2.97
2b,3
2a,3
2’(2) 43.21 - 2‘a dd 3.49
2‘b dd 2.92
2‘b,3‘
2‘a,3‘
Die Zuordnung der Signale gelingt aufgrund der 1D- und 2D-NMR-Daten. Aus den
HMBC-Spektren ergeben sich die C-Atome-2 (53.67 ppm) und C-3 (52.17 ppm) als
Träger der Protonen H-2 und H-3. Die chemische Verschiebung der Protonen H-2
und H-3 deutet auf die Nachbarschaft zu einem Sauerstoffatom hin. Die
Kohlenstoffatome C-2 und C-3 zeigen im long-range-Spektrum keine Kopplungen mit
Isolierung und Strukturaufklärung
26
anderen Protonen. Das C-Atom-4 (93.58 ppm, typisch chemische Verschiebung für
ein Acetal) kennzeichnet sich durch eine 3J-Kopplung mit dem Proton H-2. Außerdem
zeigt das Carbonyl-C-Atom-1 im long-range-Spektrum eine Kopplung mit den
Protonen H-3 und 9-OH. Im 1H-NMR-Spektrum taucht bei tieferem Feld (10.12 ppm)
ein Singulett auf. Die Chelatisierung eines OH-Protons durch die benachbarte
Carbonylgruppe C-1 ist offensichtlich.
O
H
H
OO
O
H
O
2
3
9
1
4
Abbildung 12: Das Fragment I des Preussomerins K.
Das C-Atom-9, an das die phenolische Hydroxygruppe gebunden ist, zeigt außer
Kopplungen mit dem Proton H-1, den aromatischen Protonen H-7 und H-8 keine
weiteren protonischen Kopplungen. Daraus folgt als ein weiteres Fragment:
OO
H
1
9
8
7
Abbildung 13: Das Fragment II des Preussomerins K.
Die in Abbildung 12 und 13 abgebildeten Fragmente I und II können verknüpft
werden. Sie bilden einen Teil des Moleküls, wie es auch bei den literaturbekannten
Preussomerinen G, H, I vorkommt.
Isolierung und Strukturaufklärung
27
OO
H
O
O
OO
1
98
7
2
34
Abbildung 14: Die Kombination A der Fragmente I und II für den „oberen“ Teil des Preussomerins K.
Der andere Teil des Moleküls kann aufgrund aller zur Verfügung stehenden
spektroskopischen Daten ermittelt werden. Es gelten die gleichen Überlegungen wie
für den Naturstoff Preussomerin L.
In Analogie zum Preussomerin L unterscheiden sich die beiden Carbonylgruppen C-
1 und C-1‘ (entsprechende Kohlenstoffatome bei 195.64 ppm und 193.39 ppm) in der
chemischen Verschiebung nicht eindeutig (Preussomerin L: C-Atom-1 bei 202.24
ppm, C-Atom-1‘ bei 195.98 ppm). Der kleine Überschuss der positiven Ladung am
Kohlenstoffatom C-1, der durch die Chelatisierung am Ort entsteht, wird durch den
Einfluss des Epoxidringes ausgeglichen. Im aromatischen Bereich des 1H-NMR-
Spektrums für den zweiten Teil des Moleküls sind insgesamt die 3 Protonen H-7’, H-
8’ und H-9’ zu erkennen, mit denen das Carbonyl-C-Atom-1‘ koppelt.
Oben wurde schon erwähnt, dass im aliphatischen Fragment des 1H-NMR-
Spektrums die Zahl der Signale der diastereotopen Protonen auf die Hälfte reduziert
wird. Das Kopplungsmuster bleibt aber erhalten. Eine Hydroxygruppe 3‘-OH und das
Proton H-3‘ bilden am C-Atom-3‘ (79.28 ppm) ein stereogenes Zentrum aus. Das
entsprechende „untere“ Fragment ist in Abbildung 15, das aufgrund der
spektroskopischen Daten konstruiert wurde, dargestellt.
Isolierung und Strukturaufklärung
28
OOO
O
OH
H
Ha
Hb
H
H
H7'
8'
9'
2'
3'
Abbildung 15: Das untere Fragment B des Preussomerins K.
Es liegt die Vermutung nahe, dass die Stereochemie am C-Atom-3‘ mit derjenigen
des Naturstoffs L übereinstimmt, da er aus demselben Pilzstamm isoliert worden ist
und ein biosynthetisches Folgeprodukt sein könnte (durch Reduktion des
Epoxidringes).[6] Man findet eine gute Übereinstimmung zwischen dem Wert der
Kopplungskonstante an dem Stereozentrum C-3’ des Preussomerins L (3J = 2.7 Hz)
einerseits und andererseits dem des Preussomerins K (3J = 3.3 Hz). Die absolute
Konfiguration der Preussomerine wird später genauer dargestellt (Kapitel 2.1.8).
Die Verknüpfung der Teile A und B kann, wie beim Naturstoff L beschrieben,
vorgenommen werden. Die Summenformel des Moleküls ergibt C20H12O8. Für den
Aufbau des ersten Teils werden zehn Kohlenstoffatome, fünf Protonen und sechs
Sauerstoffatome benötigt. Der zweite Teil des Moleküls besteht ebenso aus zehn
Kohlenstoffatomen, sieben Protonen und fünf Sauerstoffatomen. Drei der
Sauerstoffatome bilden folglich einen Spiroacetalring.
Isolierung und Strukturaufklärung
29
2.1.2.3 Isolierung und Strukturaufklärung des Preussomerins J
C22H14O8 Mr: 422
OO
OO
O
H
O
OCOCH3
O
1
2
3456
7
8
9
10
1' 2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9' 10'
11 12
Der in der Literatur nicht bekannte Naturstoff Preussomerin I wurde zusammen mit
einem anderen Vertreter der Preussomerine, dem literaturbekannten Preussomerin
J, aus demselben Pilzstamm in einer Menge von 1.7 mg isoliert. Preussomerin I lag
im Gemisch mit Preussomerin J als Hauptprodukt vor. Wegen Substanzmangels
wurden die Naturstoffe nicht voneinander getrennt. Es war möglich, die zum
Preussomerin I gehörenden Signale von Signalen des Preussomerins J aufgrund
ihrer unterschiedlichen Intensität (I/J = 3/1) zu unerscheiden.
Beide Naturstoffe zeigen bei 254 nm eine intensive UV-Absorption und bei 354 nm
eine charakteristische Fluoreszenz. Beim Besprühen mit Dinitrophenylhydrazin
erkennt man eine Carbonylgruppe. Die IR- und UV-Spektren liefern den
Preussomerinen L und K ähnliche Absorbtionsbanden. Mit Molybdänphosphorsäure
(DC-Sprühreagenz) entwickelt sich eine dunkelbraune Färbung wie bei allen
Preussomerinen.[7] Im Dünnschichtchromatogramm laufen die zwei Substanzen nahe
zusammen. Die Rf-Werte der Substanzen I und J in reinem Dichlormethan sind 0.43
für I und 0.51 für J.
Die Ergebnisse der Massenspektrometrie (EI) liefern die Molekülionen bei m/z = 422
und m/z = 394. Die hochauflösende Messung der Molekülionen ergibt die
Summenformeln C22H14O9 (Preussomerin I) bzw. C21H14O8 (Preussomerin J). Die
Summenformeldifferenz besteht aus einem CO-Fragment. Im Massenspektrum sind
auch die Fragmente bei m/z = 43 (entspricht dem Fragment CH3CO+) und m/z =
380 (Fragment C20H11O8+) zu finden. Die α-Spaltung zur Carbonylgruppe liefert das
Isolierung und Strukturaufklärung
30
stabile Molekülion bei m/z = 43; das andere m/z = 379 wird möglicherweise durch die
Anlagerung eines Protons stabilisiert.[8] Die Strukturaufklärung des Naturstoffes J
wird später erläutert (s. Kapitel 2.1.2.6).
Beim Betrachten der 1H- und 13C-NMR-Spektren findet man die charakteristischen
Signale eines Preussomeringerüstes, hier mit einem Epoxidring, über die schon bei
den Substanzen L und K mit Hilfe von Röntgenstrukturanalyse, HMBC, HMQC, 1H-
und 13C-NMR-Spektren berichtet wurde. Das im 13C-NMR-Spektrum neu
erscheinende Signal für C-11 (bei 169.40 ppm), das im long-range-Spekrum mit
einer Methylgruppe 12 (bei 1.99 ppm) koppelt (C-12 bei 20.94 ppm), spricht für eine
Acetoxyeinheit im Molekül. Dabei verschiebt sich das Signal für das Kohlenstoffatom
3‘ von 79.27 ppm (bei dem Naturstoff J) zu 70.62 (Preussomerin I). Durch den
Austausch einer Hydroxygruppe gegen eine Acetoxygruppe verschiebt sich das
Signal im 1H-NMR des H-Atoms-3’ von 4.75/4.78 ppm (bei den Preussomerinen L/K)
auf 5.93 ppm. Das Kopplungsmuster des C-Atoms-3‘ bleibt mit dem
Kopplungsmuster der Naturstoffe L und K identisch (koppelt im long-range-Spektrum
mit den diastereotopen Protonen H-2’a und H-2‘b). Die Werte der
Kopplungskonstanten für das entsprechende Fragment zeigen gute
Übereinstimmung. Ein Teil des Moleküls ist unten dargestellt.
O
O
OO
OCH
3
O
1' 2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9' 10'
11
12
Abbildung 16: Der „untere“ Teil des Preussomerins I.
Die NMR-Daten sind in der Tabelle 4 aufgelistet.
Isolierung und Strukturaufklärung
31
Tabelle 4: 1H- und 13C-NMR-Daten des Preussomerins I (CDCl3).
Atom.
Nr.:
13C-NMR
HMBC 1H-NMR
H,H-COSY
1 195.58 2 - 10-OH
1’ 192.42 9’, 2’a/b - -
11 169.40 12 - -
9 156.40 10-OH,7, 8 - -
6’ 149.66 7’, 8’ - -
6 142.49 7, 8 - -
10’ 131.14 - - -
7 126.43 - 7 d 7.05 8
8’ 121.76 9’ 8’ t 7.44 7’
8 121.46 - 8 d 6.95 7
7’ 120.89 8’ 7’ dd 7.09 8’, 9’
9’ 120.74 - 9’ dd 7.68 7’, 8’
5’ 119.75 9’ - -
5 115.69 7, 8 - -
10 110.20 10-OH, 8 10-OH s
10.12
-
4 93.08 - - -
4’ 92.20 2’a,2‘b - -
3’ 70.62 2’a,2‘b 3’ t 5.93 2’a,2‘b
2 53.48 3 2 d 4.23 -
3 52.07 2 3 d 3.82 3
2’ 40.26 - 2’a dd 3.47
2’b dd 3.05
3’, 2’b
3’, 2’a
12 20.94 12 12 s 1.99 -
Isolierung und Strukturaufklärung
32
2.1.2.4 Isolierung und Strukturaufklärung des Preussomerins H
C20H12O7 M
r: 364
OO
OO
O
H
O
O
1
2
3456
7
8
9
10
1' 2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9' 10'
Ein weiterer Vertreter aus der Reihe der Preussomerine, das literaturbekannte
Preussomerin H, wurde von S. Singh und D. L. Zink (1994) isoliert und
beschrieben.[6] Sie berichteten über die mäßige Aktivität dieses Preussomerins
gegen Ras Farnesyl-Protein Transferase (IC50 = 12 µM).[9] Ras Farnesyl-Protein
Transferase ist ein dimeres Enzym, dessen Inhibierung die Entstehung des
Pankreaskarzinoms hemmt.
Der Naturstoff wurde als hellgelbes Öl isoliert. Die Substanz besitzt in reinem
Dichlormethan einen Rf - Wert von 0.5 und ist in Dichlormethan gut löslich. Der
Drehwert des Naturstoffes beträgt bei der Konzentration c = 0.04 g/100 ml in
Dichlormethan bei [α]D20 = –233°. Die IR- und UV- Daten sind den oben
beschriebenen Preussomerinen sehr ähnlich. Die hochauflösende Masse des
Molekülions bei m/z = 364 ergibt die Summenformel C20H12O7. Man erkennt in den
1H-und 13C-NMR-Spektren das charakteristische Gerüst eines Preussomerins mit
einem chelatisierten Proton, fünf aromatischen Protonen, zwei Protonen direkt an
einem Epoxidring und vier aliphatische Protonen. Alle spektroskopischen Daten der
Substanz stimmen mit dem in der Literatur beschriebenen Preussomerin H überein.[9]
Da die Signale der aliphatischen Protonen in der Literatur nicht ausführlich
beschrieben sind, wird hier darauf genauer eingegangen.
Die spektroskopischen Daten des Preussomerins H sind in Tabelle 5 aufgelistet. Die
Interpretation der Signale der Protonen an Position 2‘ und 3‘ ist schwierig, weil ein
komplexes Muster mit 32 Linien auftritt. So ein Muster spricht für zwei prochirale
Isolierung und Strukturaufklärung
33
Gruppen mit vier diastereotopen Protonen. Jedes Proton in dem AB-System hat 3
verschiedene Kopplungspartner.
Den 2D-NMR-Daten ist zu entnehmen, dass den vier Protonen H-2‘a, H-2‘b, H-3‘a
und H-3‘b vier Gruppen von Signalen (bei 3.26 ppm, 2.88 ppm, 2.81 ppm und 2.51
ppm) entsprechen. Diese Signal-Gruppen sind paarweise angeordnet. Zwei Gruppen
der Signale können für die zwei axial stehenden Protonen, zwei andere für die zwei
äquatorialen Protonen verantwortlich sein. Die Zuordnung der Protonen gelingt mit
der Hilfe der HMQC-Spektren. Man sieht deutlich, dass die Protonen H-2‘a
(äquatorial, 3.26 ppm) und H-2‘b (axial, 2.88 ppm) an das C-Atom-2‘ (33.67 ppm)
direkt und die Protonen 3‘a (äquatorial) und 3‘b (axial) an das C-Atom 3‘ (32.70 ppm)
gebunden sind. Außerdem nehmen die Protonen H-2‘b und H-3b aufgrund der Größe
der Kopplungskonstanten (3J = 1.8 Hz, 3J = 5.5 Hz) keine axiale Position ein. Die
Halb-Sessel-Konformation am Cyclohexenongerüst ist durch die Spiroacetalringe
und durch die Chelatisierung des phenolischen Protons 9-OH festgelegt. Der
Anisotropieeffekt der Carbonylgruppe müßte sich für die Protonen H-2/H-2‘
unterschiedlich auswirken. Der Effekt macht sich in den NMR-Spektren bemerkbar.
Dafür findet man in den 1H-NMR-Spektren eine eindeutige Bestimmung der Position
der Protonen H-2‘a und H-2‘b, genau so wie der Protonen H-3‘a und H-3‘b. Aus der
Karplus-Kurve ergibt sich ein Torsionswinkel von 60° zwischen H-3‘b äquatorial und
H-2‘ axial (gauche-Konformation).
Der Theorie nach sind in einem Sechsring mit sterisch fixierter Sesselkonformation
äquatorial stehende Protonen im Vergleich zu den axialen um ca. 0.1-0.7 ppm zu
tiefem Feld verschoben. Der Grund dafür ist der Anisotropieeffekt der C3-C4 (C5-C6)
σ-Bindung, der aber deutlich kleiner als der Anisotropieeffekt der π-Elektronen ist.
Dank dieses Effektes liegt das äquatoriale Proton innerhalb der Entschirmungszone
einer Kugel.[10] Die schematische Darstellung zeigt Abbildung 17.
H
1
2
3
4
56
H
H
Abbildung 17: Die theoretische Darstellung des Anisotropieeffektes einer σ-Bindung im
Cyclohexanring.
Isolierung und Strukturaufklärung
34
Im Fall des Preussomerins H handelt es sich um einen Sechsring mit 3 sp2-Zentren
mit einer Carbonylgruppe. Der Anisotropieeffekt der Carbonylgruppe führt wegen der
π-Elektronen zu einer stärkeren Entschirmung beider Protonen. Der Effekt zeigt sich
besonders deutlich für das Proton H-2b (axial, 3.26 ppm), weil die nichtbindenden π-
Orbitale des Sauerstoffatoms am sp2-hybridisierten Carbonylkohlenstoff C-1‘ parallel
zu der Verbindungslinie 2‘C-H-2‘b ausgerichtet sind. Das Proton H-2‘a hat eine
chemische Verschiebung von 2.88 ppm.
Die Protonen H-3‘a (äquatorial, 2.81 ppm) und H-3‘b (axial, 2.51 ppm) sind im
Gegensatz zu den Protonen H-2‘a und H-2‘b zu höherem Feld verschoben. Die
Nachbarschaft der zwei Sauerstoffatome, die aber mit einem sp3-hybridisierten C-
Atom-4‘ direkt gebunden sind, kann man nicht mit dem Effekt der Carbonylgruppe
und dem Hybridisierungszustand des in α-Position stehenden C-Atoms-1‘
vergleichen. Wegen der größeren Entfernung dieser Protonen vom C-Atom-1‘ steht
der Anisotropieeffekt der C3-C4 σ-Bindung (s. Abb. 17) wieder im Vordergrund.
Angesichts der Konformation am Hexenonring (wird im Kapitel über die absolute
Konfiguration genauer dargestellt) ist die Größe der Kopplungskonstante für die
Protonen H-3‘b und H-2‘b von 3J = 1,8 Hz ein Beweis, dass sie nicht bisaxial stehen.
Die Kopplungskonstante zwischen dem Proton H-2’b (axial) und Proton H-3’a
(äquatorial) beträgt 5.5 Hz und liegt schon an der Obergrenze der Werte für einen
Cyclohexanring. Die Nachbarschaft (insgesamt drei Sauerstoffatome) und der
Hybridisierungszustand des C-Atoms-1‘ erklären die höheren Werte der
Kopplungskonstanten.
Da die Struktur des Naturstoffs gesichert ist und man eine große Übereinstimmung
aller spektroskopischer Daten mit der literaturbekannten Substanzen findet, werden
die restlichen Fragmente der Struktur hier nicht weiter diskutiert.
Isolierung und Strukturaufklärung
35
Tabelle 5: 1H- und 13C-NMR Daten des Preussomerins H (CDCl3).
Atom.
Nr.:
13C-NMR
HMBC HMQC
1H-NMR
H,H-COSY
1 195,40 3, 7 - - -
1’ 194.51 8’, 9’ - - -
9 156.96 9-OH, 7, 8 - 9-OH s 10.12 -
6’ 148.25 7’ - - -
6 143.65 7, 8 - - -
8’ 131.09 8‘ 8’ 8’ t 7.39 7’, 9’
10’ 130.76 8‘ - - -
7 126.34 7 7 7 d 7.03 8
7’ 121.89 7’ 7’ 7’ dd 7.06 8’, 9’
8 121.42 7 8 8 d 6.93 7
9’ 121.38 7‘,8‘ 9’ 9’ dd 7.64 7’, 8’
5’ 120.95 7‘ - - -
5 115.43 7, 8 - - -
10 109.97 9-OH, 8 - - -
4’ 93.88 3‘a, 3‘b - - -
4 93.00 - - - -
2 53.65 2 2 2 d 4.21 3
3 52.14 3 3 3 d 3.82 2
2‘ 33.67 3‘a, 3‘b 2’a, 2‘b 2’b m 3.26
2’a m 2.88
2‘b, 3‘a, 3‘b
2’a, 3’a, 3‘b
3‘ 32.70 2‘a,2‘b 3’a, 3‘b 3’a m 2.81
3’b m 2.51
2’a, 2‘b, 3’b
2’a, 2‘b, 3’a
Isolierung und Strukturaufklärung
36
2.1.2.5 Isolierung und Strukturaufklärung des Preussomerins G
C20H10O7 Mr: 362
OO
OO
O
H
O
O
1
2
3456
7
8
9
10
1' 2'
3'4'
5'
6'
7'
8'
9' 10'
Das literaturbekannte Preussomerin G liegt als hellgelber Feststoff vor und hat einen
Rf - Wert von 0.62 (CH2Cl2). Die Isolierung des Sekundärmetaboliten erfolgte mittels
präparativer Chromatographie (Dickschichtplatten) mit dem unpolaren
Laufmittelgemisch (PE:CH2Cl2 = 2:5). Die IR- und UV-Spektren der Substanz sind
den spektroskopischen Daten der Naturstoffe L, K, I und H sehr ähnlich. Die
hochauflösende Messung des Molekülions bei m/z = 362 ergibt die Summenformel
C20H10O7. Preussomerin G wurde von Gloer et al. isoliert und charakterisiert.[11, 12]
Die Daten des 1H-NMR-Spektrums deuten auf insgesamt 5 aromatische und
zusätzlich 2 olefinische Protonen hin. Zwei aromatische ortho-koppelnde Protonen
gehören zu einem 1,2,3,4-tetrasubstituierten Aromaten, drei sind in der Position
eines 1,2,3-trisubstituierten aromatischen Ringes. Aus den 1H- und 13C-NMR-Daten
erkennt man wieder das Gerüst eines Preussomerins mit den charakteristischen
Spiroacetaleinheiten und einem Epoxidring. Der Unterschied zu den schon
beschriebenen Preussomerinen besteht aus zwei zusätzlichen olefinischen Protonen
H-2’ und H-3’ (anstelle einer Methoxygruppe beim Preussomerin K). Diese
Unterschiede sind der Abbildung 18 zu entnehmen.
Isolierung und Strukturaufklärung
37
O
O
OO
H
H
O
O
OO
OMe
Preussomerin G Preussomerin K
Abbildung 18: Die strukturellen Unterschiede der Preussomerine G und K.
Die in der Literatur angegebenen spektroskopischen Daten stimmen mit unseren
sehr gut überein außer der Position des C-Atoms-10 im 13C-NMR. Das quartäre C-
Atom-10 korreliert (HMBC) eindeutig zu den Protonen H-8 und 9-OH und hat eine
chemische Verschiebung von 115.21 ppm (Lit.: 109.74 ppm). Die Position des
anderen quartären C-Atoms-5 bei 109.82 ppm (Lit.: 109.74 ppm) kann durch die
Korrelation (HMBC) zu den Protonen H-2 und H-7 festgelegt werden. Die Lage
beider Kohlenstoffatome sollte sich aufgrund der Chelatisierung der OH-Gruppe
deutlich unterscheiden, was sie in unseren gemessenen Spektren auch tut.
In Tabelle 6 sind die spektroskopischen Daten des Preussomerins G
zusammengefasst.
Isolierung und Strukturaufklärung
38
Tabelle 6: 1H- und 13C-NMR Daten des Preussomerins G (CDCl3).
Atom.
Nr.:
13C-NMR
HMBC 1H-NMR
H,H-COSY
1 195,45 3, 7 - -
1’ 183,73 8’, 9’ - -
9 156.11 1, 7, 8 9-OH s 10.22 -
6’ 148.76 7’ - -
6 143.39 7, 8 - -
3’ 140.73 3 3’ d 6.59 7
2’ 133.57 7 2’ d 6.95 3’
8’ 131.15 7’ 8’ d 7.24 7‘, 9’
10’ 130.32 2’, 7’ - -
7 126.73 7 7 d 7.05 8
8 121.31 9-0H, 8 8 d 7.03 7
7’ 120.86 7‘ 7’ t 7.41 8’, 9’
9’ 120.70 7’, 8’ 9’ dd 7.62 7’, 8’
5’ 120.59 9’ - -
10 115.21 9-OH, 2, 8 - -
5 109.82 9-OH, 3, 7 - -
4 93.96 - - -
4’ 89.98 2’ - -
2 53.70 9-OH, 2 2 d 3.84 3
3 52.17 3 3 d 4.26 2
Isolierung und Strukturaufklärung
39
2.1.2.6 Isolierung und Charakterisierung des Preussomerins I
C21H14O8 Mr: 394
OO
OO
O
H
O
OCH3
O
1
2
3456
7
8
9
10
1' 2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9' 10'
Der nächste Vertreter aus der Klasse der Preussomerine, das literaturbekannte
Preussomerin I (farblose Kristalle, Schmp. 130-132° C) wurde per Dickschichtplatte
(2.0 mm, SiO2, Macherey-Nagel) isoliert und mit dem Lösungsmittelgemisch CH2Cl2
(5 Tropfen), Petrolether (1-2 Tropfen) und Cyclohexan (5-6) Tropfen kristallisiert. Der
Naturstoff wurde von Singh et al. 1994 isoliert und beschrieben.[9] Das
Massenspektrum liefert das Molekülion bei m/z = 394. Die hochauflösende Messung
des Molekülions ergibt die Summenformel C21H14O8. Der Vergleich der 1H-NMR- und
13C-NMR-Spektren mit anderen Preussomerinen deutet auf ein Gerüst mit einem
Epoxidring und einer Methoxygruppe (das C-Atom-3‘ bei 79.27 ppm) hin. Das
Singulett um 3.53 ppm im 1H-NMR-Spektrum (-OCH3), die Daten des 13C-NMR-
Spektrums und besonders die long-range-Kopplungen (HMBC, C-Atom-3‘ koppelt mit
den Protonen 3’OCH3) zeigen die Gegenwart einer Methoxygruppe im Molekül an.
Die chemische Verschiebung des Carbonylkohlenstoffatoms C-1‘zum tieferen Feld
von 183.73 ppm (Preussomerin G) auf 193.39 ppm erfolgt durch die Anwesenheit der
Methoxygruppe.
Im 1H-NMR-Spektrum sind bei 3.53 und 3.05 ppm zwei Doppel-Dubletts zu
erkennen. Die Kopplungskonstante von 2J = 18.3 Hz spricht für die geminale
Kopplung zwischen den Protonen H-2’a und H-2’b. Außerdem koppeln beide
Protonen vicinal (3J = 3.05 Hz) mit dem Proton H-3’. Die Abnahme des Wertes der
3J-Kopplungskonstanten von 5.50 Hz (Preussomerin H) auf 3.05 Hz wird durch den
elektronegativen Substituenten (Methoxygruppe) bewirkt. Man findet eine gute
Isolierung und Strukturaufklärung
40
Übereinstimmungen der Werte der vicinalen Kopplungskonstanten mit
Verbindungen, die einen elektronegativen Substituenten enthalten. [Preussomerine
K (3.3 Hz), L (3.2 Hz), und I (3.3 Hz)].[13, 14]
Tabelle 7: 1H- und 13C-NMR Daten des Preussomerins I (CDCl3).
Atom.
Nr.:
13C-NMR
HMBC HMQC 1H-NMR
H,H-COSY
1 195,64 9-OH - - -
1’ 193.39 - - - -
9 156.06 9-OH,7 - 9-OH s 10.12 -
6 149.73 - - - -
6’ 142.50 8’ - - -
7’ 131.15 7’ 7’ 7’ t 7.39 8’, 9’
8 130.85 - 7 8 d 6.94 8
7 126.46 - 8 7 d 7.02 7
8’ 121.58 9’ 8’ 8’ dd 7.05 7’, 9’
10’ 120.32 - - - -
9’ 120.13 - 9’ 9’ dd 7.65 7’, 8’, 9’
5’ 119.23 8’, 9’ - - -
10 115.44 9-OH - - -
5 110.26 - - - -
4’ 94.38 2’b - - -
4 93.58 - - - -
3’ 79.27 3’OCH3 - 3’ t 4.33 2’a, 2‘b
3’OCH3 59.38 3’OCH3 3’OCH3 3’-H s 3.53 -
2 53.67 - 2 2 d 4.29 3
3 52.17 - 3 3 d 3.84 2
2’ 40.41 - 2’a, 2‘b 2’a dd 3.35
2’b dd 3.05
2’b, 3’
2’a, 3’
Isolierung und Strukturaufklärung
41
2.2 Biologische Aktivität der Naturstoffe G–L
2.2.1 Mikrobiologische Untersuchungen des Rohextraktes (Braunschweig)
Der Rohextrakt des Pilzstammes 4729 zeigte eine gute Wirkung gegen das gram-
positive Bakterium Basilis megaterium. Gegen den Pilz Fusarium repens und das
gram-positive Bakterium Mycotyphamicrospora sind der Petroletherextrakt und auch
der Essigesterextrakt nicht aktiv. Insbesondere der Essigesterextrakt zeigt eine
mäßige fungizide Wirkung gegen die Pilze Ustilago violacea und Eurotium repens.
In Diagramm 1 sind die Untersuchungen der biologischen Aktivität graphisch
dargestellt. Die Petrolether- und Essigesterextrakte verhalten sich unterschiedlich.
Mit den Polaritäten der isolierten Naturstoffe können die im Diagramm 1 aufgeführten
Ergebnisse erklärt werden, da die Naturstoffe entweder mittelpolar oder polar sind.
0
1
2
3
4
5
Ec Bm Ust Eur Mm Fu Chl
Hemmhofradius, cm
Diagramm 1: Die biologische Aktivität des Rohextraktes vom Stamm 4729.
Ec: Escherichia coli – gram-negatives Bakt.
Bm: Basillus megaterium - gram-positives Bakt.
Isolierung und Strukturaufklärung
42
Ust: Ustilago violacea - Pilz
Eur: Eurotium repens - Pilz
Mm: Mycotypha microspora-Pilz
Fu: Fusarium oxysporum-Pilz
Chl: Chlorella fusca - Alge
2.2.2 Biologische Aktivität der Reinsubstanzen
Die von den Biologen aus der Technischen Universität Braunschweig (AK Prof. Dr.
Aust, Fr. Dr. Schulz, Fr. Hu) durchgeführten Aktivitätstests für die Substanzen L, K, I,
J, H, G sind in Diagramm 2 dargestellt. Die Substanzen wurden in Aceton/Methanol
(1:1) 10 mg / 1 ml gelöst und anschließend auf algizide, fungizide und bakterizide
Wirkung getestet. Bei angegebenen Konzentrationen zeigen alle Sekundärmetabolite
mäßige Aktivität gegen die Pilze Ustilago violacea und Eurotium repens.
Biologische Aktivität der Preussomerine
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Chl. Bm. Ust. Eur. Mm. Fu.
Hemmhofradius, cm
G
H
J
I
K
L
Diagramm 2: Biologische Aktivität der isolierten Preussomerine.
*Abkürzungen sind auf der Seite 38 erläutert
Alle Naturstoffe sind auch gegen das gram-positive Bakterium Basillius megaterium
wirksam.[13, 14] Außerdem sind für die Preussomerine J, H und G pharmakologische
Tests durchgeführt worden. Sie erweisen sich (besonders Preussomerin G) als
wirksame Hemmer der FPTase.[9] FPTase ist ein dimeres Enzym, das die
Umsetzung der Farnesylgruppe zu Cystein katalysiert. Dieser Prozess ist eine
Isolierung und Strukturaufklärung
43
notwendige Bedingung für den Transport und die Assoziation des Ras-Peptides zur
Plasmamembran, was die Entstehung von Tumoren fördert. Ganz offensichtlich führt
die Hemmung des FPTase zu einem Antitumoreffekt. Der IC50-Wert beträgt für
Preussomerin G 1,2 µM, H – 12 µM, J -17 µM.[9] Die hohe biologische Aktivität
basiert vermutlich auf der Michael-Akzeptoreinheit, die von einem Nukleophil
angegriffen werden kann.[9, 15]
2.2.3 Pflanzenschutz-Screening-Tests der BASF
Im Pharma-Grundscreening wurden die Preussomerine K, L, I, J und G bei der Knoll-
AG getestet. Aus Substanzmangel konnte Preussomerin H nicht getestet werden. Es
konnten in den Pharma-Tests keine verfolgenswerten Wirkungen beobachtet
werden. Die Preussomerine G, I, J, K und L zeigen im Mikrotest (Pflanzenschutz)
gegen die Pilze Phytophtora und Pyriculria eine gute Wirkung. Besonders fällt im
Mikrotest das Preussomerin G auf. Die in Abildung 19 aufgeführten Abkürzungen
haben folgende Bedeutungen:
Phytin – Phytophtora infestans – der Erreger der Kraut- und Knollenfäule bei
Kartoffeln und Tomaten.
Botrci: Botrytis cinerea – Grauschimmel an Erdbeeren.
Pyrior: Pyricularia oryzae – Reisblast-Erreger.
In Abbildung 19 sind die Aktivitäten abgebildet.
Isolierung und Strukturaufklärung
44
Biologische Aktivität des Preussomerins K
0
20
40
60
80
100
120
ppm 0,03 0,125 0,6 2 8 31,00
Verdünung, ppm
Wachstum, %
Biologische Aktivität des Preussomerins G
0
20
40
60
80
100
120
ppm 0,03 0,125 0,6 2 8 31,00
Verdünung, ppm
Wachstum, %
Biologische Aktivität des Preussomerins J
0
20
40
60
80
100
120
ppm 0,03 0,125 0,6 2 8 31,00
Verdünung, ppm
Wacstum, %
Biologische Aktivität des Preussomerins I
0
20
40
60
80
100
120
ppm 0,03 0,125 0,6 2 8 31,00
Verdünung, ppm
Wachstum, %
Biolgische Aktivität des Preussomerins L
0
20
40
60
80
100
120
ppm 0,03 0,125 0,6 2 8 31,00
Verdünung, ppm
Wachstum, %
Phytin Botrci Pyrior
Abbildung 19: Die Ergebnisse der Pflanzenschutz-Screening-Tests der Preussomerine G–L.
Isolierung und Strukturaufklärung
45
2.2.4 Zusammenfassung der bisherigen Ergebnisse
Die ersten Vertreter der Klasse Preussomerine A-F wurden von Gloer et al. 1990
isoliert und charakterisiert.[11,°12,°16] Gloer wies auf die antibakteriellen und
antifungischen Eigenschaften dieser Naturstoffklasse hin.[17,°16,°18,°5, 19,°20,°21] Die
Arbeitsgruppe von S. Singh berichtete 1993 über die Preussomerine als neue
Inhibitoren der FPTase.[9] Das Preussomerin G wird im Pflanzenschutz (BASF) als
wirksames antifungalisches Mittel getestet.[19, 20, 21]
Die Verbindungen aus der Klasse Preussomerine zeigen in den IR- und UV-Spektren
große Ähnlichkeiten. Die Analyse der Spektren zeigt, dass alle sechs Preussomerine
G–L mit verschiedenen Intensitäten und mit geringen Abweichungen einen analogen
Satz an Banden besitzen. Die Bande um 750 cm-1 im IR-Spektrum verweist auf einen
trisubstituierten aromatischen Ring, die Bande um 810 cm-1 für einen
tetrasubstituierten aromatischen Ring, und für die Bande um 1740 cm-1 ist eine
Carbonylgruppe verantwortlich.
Die UV-Spektren sind durch drei Hauptbanden charakterisiert:
250–260 nm: α-Bande eines Aromaten, schwache Intensität
230–240 nm: β-Bande eines Aromaten, mittlere Intensität
190 nm: γ-Bande, größere Intensität
Singh et al. haben am Beispiel des Naturstoffes Preussomerin G die
Hydrierungsreaktionen untersucht. In Abbildung 20 sind die einzelnen Schritte der
palladiumkatalysierten Hydrierung im Lösungsmittelgemisch Ethylacetat-Methanol
abgebildet.[9]
Isolierung und Strukturaufklärung
46
OOH
OO
O
O
O
HO
OO
O
O
OH
O
HO
OO
O
O
OH
HO
OO
O
OCH3
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
O
OO
HO
OH
O
OH
O
G1
1
2
3
2
1
HO
OOO
OH
O
Hauptprodukt
1´
3´
2´
H2, Pd H2, Pd
H2, Pd
H2, Pd
H2, Pd
CH3OH
H2, Pd
H2, Pd
4
3
5
Abbildung 20: Die Hydrierungsreaktionen der Preussomerine nach S. Singh.[9]
Isolierung und Strukturaufklärung
47
Drei Befunde dieser Reaktion:
- Der Epoxidring wird bei hoher Regioselektivität (Regioisomere 1/2 = 4.0/0.1) in
einem protischen Lösungsmittel reduktiv geöffnet.
- Die benzylische Carbonylgruppe an C-1 wird nicht hydriert
- Das Spiroacetalfragment wird ebenfalls nicht hydrogenolytisch gespalten.[9,°11,°12,°22]
Die Massenspektren einer Rohprobe der Preussomerine liefern die Molekülpeaks bei
m/z = 366, 396, 384, 424. Die Differenz zu den entsprechenden Molmassen der
Preussomerine H (364), J (394), L (382), I (422) besteht aus zwei Protonen. Es
könnte sich hier angesichts der Hydrierungsreaktionen der Preussomerine um
Reduktionen entweder am Epoxidring, an der Doppelbindung im Cyclohexenonring,
oder an der Carbonylgruppe C-1‘ handeln.
Der gesamte Überblick über die isolierten und vorläufig bestimten Strukturen ist in
Abbildung 21 dargestellt. Die blau gezeichneten Strukturen sind isoliert worden, die
schwarz gezeichneten werden aufgrund der Daten der Massenspektren unter
Berücksichtigung der Hydrierungsreaktionen hypothetisch eingeführt.
Die Existenz der Struktur mit m/z = 366 und m/z = 396 (Abb. 21) ist sehr
wahrscheinlich, da sie mit den synthetisch hergestellten Verbindungen 3 und 4 (Abb.
20) identisch sind. Die Struktur mit m/z = 424 (Abb. 21) ist den Verbindungen 3 und 4
(Abb. 21) analog. Schließlich ist noch die Struktur mit m/z = 384 zu erwähnen. Die
Hydrierung der Carbonylgruppe an C-1‘wurde bei der chemischen Hydrierung im
Produkt 5 (Abb. 20) festgestellt.
Isolierung und Strukturaufklärung
48
OO
OO
H
HO
OH
OH
O
OO
O
H
O
O
O
O
O
O
OO
H
HO
O
O
O
OCH
3
O
O
OO
OO
H
O
OH
O
O
OO
O
H
O
HO
OH
OO
CH3
OO
O
H
O
OCH3
O
O
O
OO
O
H
O
OCH3
O
HO
O
OO
O
H
O
O
O
O
OO
O
H
O
O
HO
O
380-382 384
422-424
394-396
364-366
H
-32
+H
-44
H
17
-H
L
K
J
I
identisch mit der Struktur 3
aus Abb. 20
identisch mit der Struktur 4
aus Abb. 20
analog der Struktur 3
aus Abb. 20
analog der Struktur 5
aus Abb. 20
Abbildung 21: Überblick über die isolierten und hypothetisch eingeführte Preussomerine.
Isolierung und Strukturaufklärung
49
Der Vergleich mit Massenspektren analoger Verbindungen legt nahe, dass bei der
Fragmentierung eines Preussomerins folgende Prozesse ablaufen:
m/z C10H7O4
191
OO
O
H
O
HO
OH
O
O
OO
H
HO
O
O
O
O
m/z C10H6O3
H
174
OO
OO
H
O
HO
OH
O
12
4'
Abbildung 22: Schematische Darstellung der Fragmentierungspozesse des Preussomerins. [6]
Der Massenpeak bei m/z = 191 entspricht einem Fragment der Struktur, das vier
Sauerstoffatome enthält. Im Schritt 2 wird die zu der Carbonylgruppe C-4‘ ortho-
ständige Hydroxygruppe wegen elektronischer Abstoßung abgespalten. Das ergibt
einen Massenpeak bei m/z = 174. Die Intensität des Peaks bei m/z = 191/189 bzw.
m/z = 174 beträgt etwa 30-50 %. Bei der Fragmentierung aller epoxidhaltigen
Preussomerine ist das Molekülion bei m/z = 188/189 (entspricht dem Fragment mit
der Summenformel C10H5O4) zu erkennen, was vermutlich auf das Epoxidfragment
hindeutet. Die Hauptfragmentierungen der Preussomerine G-L sind der Tabelle 8 zu
entnehmen.
Isolierung und Strukturaufklärung
50
Tabelle 8: Fragmentierungen im Massenspektrum der Preussomerine nach EI-MS.
MS 382
L
MS 380
K
MS 422
I
MS 364
H
MS 362
G
MS 394
J
191
C10H7O4
191
C10H7O4
191
C10H7O4
189
C10H5O4
188
C10H4O4
189
C10H5O4
192
C10H8O3
174
C10H6O3
188
C10H4O4
174
C10H6O3
174
C10H6O3
174(5)
C10H7O3
174
C10H6O3
206
C11H10O4‘
-
Isolierung und Strukturaufklärung
51
2.2.5 Bestimmung der absoluten Konfiguration der Preussomerine G–L
Die Bestimmung der absoluten Konfiguration der aus dem Pilzstamm 4729 isolierten
Preussomerine G–L (Abb. 1) wurde anhand der Messung der optischen Aktivität, der
Röntgenstrukturanalyse (RSA, Dr. U. Flörke), der NMR-Spektroskopie (Dr. W. Wray),
der Konformationsberechnungen (Herr K. Steingröver, AK Prof. Dr. K. Krohn) und
der CD-Spektren (Prof. Dr. F. Zsilie, Budapest) durchgeführt.
Die Preussomerine G–L sind chirale Moleküle mit einem überbrückten
Bispiroacelatfragment. Sie haben an den Positionen 4/4‘ ein asymmetrisch
substituiertes Zentrum. Je nach Substitutionen an den Hexenonringen kommen neue
Stereozentren an den Positionen 2/2‘ und auch an den Positionen 3/3‘ hinzu.
Abbildung 23 zeigt die Stereozentren eines Preussomerins.
OO
OO
O
H
O
2
34
2'
3'
4'
S
S
Abbildung 23: Die Stereozentren eines Preussomerins.
Die relative Konfiguration eines Preussomerins an den stereogenen Zentren
(4S*,4‘S*) kann aus den Daten der Röntgenstrukturanalyse (Preussomerin G und L)
entnommen werden.[18] Beide Decalineinheiten stehen fast senkrecht zueinander.
Die Spiroacetalringe weisen C-O-C-Bindungswinkel auf von 109.7° bis 121.0° (O-C-
C) (Röntgenstrukturanalyse des Preussomerins L). Die Kombination der
aromatischen Ringe und des Bispiroacetalsystems dürften für eine relativ große
Energiebarriere zwischen verschiedenen Konformationen der Hexenonringe
verantwortlich sein.[16, 23]
Isolierung und Strukturaufklärung
52
Die NMR-Daten der Protonen H-2a/2a‘, H-2b/2b‘, H-3/3‘ (ohne Epoxidring siehe Abb.
1 Seite 12 ) der Preussomerine I, J, K und L könnten aufgrund der Ähnlichkeit der
Kopplungskonstanten (3J2a/2‘a-3/3‘ = 3.2 Hz, 3J2b/2‘b-3/3‘ = 2.7 Hz) und der Werte der
chemischen Verschiebungen (siehe NMR-Daten der Naturstoffe) für die gleiche
Konformation des Hexenonringes dieser Naturstoffe sprechen (siehe
Röntgenstruktur in Abbildung 8 S. 20). Der Torsionswinkel zwischen den Protonen 2-
H und 3-H ergibt sich aus der Karplus-Kurve und beträgt ca. 70-80°. Bei der anderen
Halb-Sessel-Konformation betrüge der Torsionswinkel um 180°.
Gloer et al. haben am Beispiel des Preussomerins A die absolute Konfiguration der
Preussomerine untersucht[21, 24]; deswegen haben sie das Ketal hydrolytisch
gespalten. Sie haben festgestellt, dass das Ketal bei Raumtemperatur recht
säurestabil ist. Erst bei 100°C in 6 M HCl - Aceton (1:1, 12 h) konnte (–)-Regiolon
außer anderen Nebenprodukten als Hauptprodukt isoliert werden. Die absolute
Konfiguration des gewonnenen Regiolons (4S) wurde aufgrund der chemischen
Korrelation mit dem isolierten (–)-Regiolon festgelegt.[24]
O
OH
OH
12
3
4
S
O
PhOCO
PhOCO
( ) -Regiolon
Abbildung 24: Die absolute Konfiguration (S) des (–)-Regiolons.[24]
Zum ersten Mal wurde die absolute Konfiguration des (–)-Regiolons von S. K.
Talapatra et al. festgelegt.[24] Sie haben das Abbauprodukt der Preussomerine (–)-
Regiolon aus der Pflanze Juglans regia L (aus Indien und Nepal) isoliert und anhand
der „aromatic chirality method“ die absolute Konfiguration bestimmt. Zu den Zweck
wurde das Regiolon in sein Dibenzoat-Derivat übergeführt und die Linkshändigkeit
des Moleküls postuliert (Abb 25). Für das natürlich vorkommende Regiolon sind die
Isolierung und Strukturaufklärung
53
gemessenen Daten: der Drehwert [α]D = –3.3°, c = 0.077, EtOH; die CD-Spektren:
negativer Cotton-Effekt bei 228 nm, ∆ε = –44.33.[24] Damit wurde die absolute
Konfiguration des Preussomerins A auf (1S, 4S, 4‘S) festgelegt. Die für Regiolon und
die Preussomerine A, E, G, H sowie für Deoxypreussomerin A aufgenommenen CD-
Spektren zeigen negative Cotton-Effekte.[9, 12, 24] Die Oxidation des Preussomerins A
(an den Positionen 1/1‘ jeweils eine Hydroxygruppe) mit PCC liefert das mit dem
Preussomerin G (Abb. 1) identische Diketon.[6]
Die von den Preussomerinen G–L im Bereich von 200–380 nm aufgenommenen CD-
Spektren sind um 217 nm durch einen negativen Cotton-Effekt gekennzeichnet. Die
experimentellen Daten aus den CD-Spektren der diskutierten Preussomerine sind in
Tabelle 9 aufgelistet. Das Vorzeichen des Cotton-Effektes ist von der Konfiguration
einer Verbindung und von der Konformation der Verbindung in der Nähe des
Chromophors abhängig. Zeigen zwei (mehrere) konstitutionell vergleichbare
Verbindungen einen Cotton-Effekt gleichen Vorzeichens, so ist ihre Konfiguration
dann gleich, wenn die Konformation in der Umgebung des Chromophors gleich ist.[25]
Diese Bedingung ist bei den Preussomerinen erfüllt.
Nach der Klassifikation von Moffitt und Moscowitz können chirale Moleküle „solchen
Gruppen, die einen inhärent chiralen Chromophor (z.B. C–4/4‘) enthalten“
zugeordnet werden.[25, 17] Diese Gruppe hat eine erheblich größere Rotationsstärke
(proportional der Amplitude im Cotton-Effekt) als Moleküle mit achiralem Chromophor
(C-1/1‘).[25, 17]
Bei Wechselwirkung zweier Aromaten (Chromophor) durch chirale O-C-O-Funktionen
(Chromophor) kann es im Falle geeigneter Geometrie der beiden (beide
Decalineinheiten stehen quasi senkrecht zueinander) zu besonders großen Werten
von ∆ε (∆ε = -54.81, Preussomerin L) für die n-π*/π-π*-Übergänge kommen. Grund
dafür ist die chirale Überlappung der p-Orbitale der π-Bindungen eines Aromaten mit
dem chiralen p-Orbital des Chromophors (O-C-O). Dadurch wird das elektrische
Übergangsmoment µ deutlich vergrößert. Das elektrische (µ) und das magnetische
(m) Übergangsmoment sind ein Maß für die Rotationsstärke R = mµcos(mµ). Die
erwähnte Regel ist als Helizitätsregel bekannt.[24]
Für die Berechnung der CD-Spektren des Preussomerins L wurden die zwei
Enantiomeren (RSSR) und (SRRS) herangezgen, die nach RSA noch möglich sind.
Isolierung und Strukturaufklärung
54
In Abbildung 25 sind die theoretisch berechneten CD-Kurven der Enantiomeren des
Preussomerins L der tatsächlich gemessenen CD-Kurve gegenübergestellt.
Der Vergleich der berechneten und gemessenen CD-Spektren der
Enantiomeren (SRRS) und (RSSR) des Preussomerins L
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
200 220 241 263 285 307,5 330 353 376,5 400
Wellenlänge, nm
Absorbtion, cm/mo
l
RSSR
SRRS
Messw.
Abbildung 25: Die CD-Spektren der Enantiomeren des Preussomerins L.
Aus dem Vergleich der gemessenen und berechneten CD-Kurven des
Preussomerins L wird auf die Konfiguration (RSSR) geschlossen.
Das gleiche Verfahren wurde auf die Preussomerine G, H, I, J und K (Abb. 1)
angewandt. Die Preussomerine G–K enthalten im „oberen“ Teil des Moleküls einen
Epoxidring. Der Epoxidring bedingt an den Positionen 2 und 3 zwei Stereozentren
und führt zu zwei Enantiomeren (2S,3R) und (2R,3S). In kleinem Dreiring sind aus
Gründen auftretender extremer Ringspannungen nur relative Konfigurationen
(2S,3R) oder (2R,3S) möglich. Aus Röntgenstrukturanalysen (RSA) der
Preussomerine L, G, und H kann zusätzlich die Stellung des Epoxidringes „hinter“
dem Hexenonring ermittelt werden.
Eine interessante Arbeit von Singh et al. (Merck Laboratories) trägt für die Klärung
der absoluten Konfiguration wichtige Information bei. Die Autoren haben die
Preussomerine D, G–I, die Palmarumycine C2 (Desoxypreussomerin A) und CP2
(Desoxypreussomerin B) aus einem Pilzstamm isoliert.[9] Dementsprechend wurde
Isolierung und Strukturaufklärung
55
ein biosynthetischer Zusammenhang zwischen den Preussomerinen
(Spirobisnaphthalingerüst mit 3 Sauerstoffbrücken) und den Palmarumycinen
(Spirobisnaphthalingerüst mit 2 Sauerstoffbrücken) angenommen. Die
Desoxypreussomerine A und B zeigen genauso wie die Preussomerine G–L einen
negativen Cotton-Effekt.[6] Die Untersuchung der absoluten Konfiguration des
Desoxypreussomerins A (Palmarumycin C2) gelang der Arbeitsgruppe von Prof. Dr.
Krohn (Dr. K. Beckmann).[22, 26]
Sie hat die absolute Konfiguration am Epoxidring durch den Vergleich der
berechneten CD-Spektren der Enantiomeren (2S,3R) und (2R,3S) mit dem
gemessenen Spektrum als 2S,3R ermittelt. Die gemessene CD-Kurve zeigt um 195
nm einen negativen Cotton-Effekt. Interessant ist der negative Cotton-Effekt um 220
nm, was mit unseren Daten gut übereinstimmt. Aufgrund der guten Übereinstimmung
der literaturbekannten Daten und der von uns gemessenen und berechneten CD-
Spektren, der Daten der RSA sowie des wahrscheinlichen biosynthetischen
Zusammenhangs zwischen den Preussomerinen (G–K) und dem Palmarumycin C2
kann die Stereochemie am Epoxidring für die Preussomerine G–H als 2S,3R
angenommen werden. Die absolute Konfiguration des Preussomerins L kann mit 3R,
4S, 3‘R, 4‘S als festgelegt gelten.
Die in Tabelle 9 aufgelisteten Werte der CD-Kurve (∆ε in Abhängigkeit von der
Wellenlänge) belegen die gleiche absolute Konfiguration der Naturstoffe G–L.
Die sechs isolierten Preussomerine G–L zeigen in Dichlormethan bei angegebener
Konzentration (g/100 ml) genauso wie das Regiolon negative Drehwerte (L [α]D= –
557° c 0.11, K [α]D= –150 c 0.04, I [α]D= –218° c 0.08, J [α]D= –37° c 0.006, G
[α]D= –173° c 0.03, H [α]D= –233° c 0.04).[11]
Isolierung und Strukturaufklärung
56
Tabelle 9: Die gemessenen CD-Spektren der Preussomerinen G-L.
Preussomerin G Preussomerin H Preussomerin I
λ (nm) ∆ε (M-1cm2) λ (nm) ∆ε (M-1cm2) λ (nm) ∆ε (M-1cm2)
368,5 -2,75 331 -3,44 331,5 -5,62
317,5 -4,62 276 -2,87 276,5 -4,92
264s -4,79 261,5 0,43 262 0,11
244 -23,38 236s -7,7 237.5s -10,22
217 -50,15 217,5 -37,95 218 -71,63
Preussomerin J Preussomerin K Preussomerin L
λ (nm) ∆ε (M-1cm2) λ (nm) ∆ε (M-1cm2) λ (nm) ∆ε (M-1cm2)
331 -3,94 331 -3,35 334 -1,37
274,5 -2,72 275,5 -3,19 268,5 -2,73
236.5s -12,67 240s -6,53 236.5s -4,31
217,5 -54,81 217,5 -51,16 219 -38,82
Isolierung und Strukturaufklärung
57
2.3 Beschreibung, Isolierung und Strukturaufklärung der Naturstoffe aus dem
Pilzstamm 5049
2.3.1 Beschreibung des Pilzextraktes
Die Pilzkultur wurde in der Technischen Universität (Braunschweig) auf zwei
verschiedenen Medien (insgesamt 6.000 ml Biomalz- und Malz-Soja-Flüssigkultur)
angesetzt. Sie wurde bei Raumtemperatur 70 Tage lang kultiviert, anschließend
wurden die Kulturen im Waringblender homogenisiert und das Homogenat einmal mit
Petrolether und dann dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen
wurden über Natriumsulfat getrocknet, der Rückstand bis auf 250 ml eingeengt und
mit 5 ml eines Aceton/Methanol-Gemisches (1:1) aufgenommen. Danach wurde er
auf biologische Aktivität (Plättchen-, Lemma-, Kresse-Tests) sowie
chromathographisch (DC) getestet. Die DC-Analytik zeigte keine signifikanten
Unterschiede in der Zusammensetzung der vom Nährmedium abhängigen
Einzelextrakte.
Die Rohextrakte dieses Pilzstammes (Essigsäureextrakt E und Petroletherextrakt P)
zeigen die in den verschiedenen Plättchentests im Diagramm 3 dargestellten
Aktivitäten. Die Zahlenwerte geben den Durchmesser der jeweiligen Hemmhöfe in
cm an. Unter den Abkürzungen Bio und MS sind folgende Begriffe zu verstehen:
Bio: Biomalzweichagar-Nährmedium, MS: Mais-Sojaextraktweichagar-Nährmedium.
Isolierung und Strukturaufklärung
58
Biologische Aktivität des Pilzextraktes
0
1
2
3
4
5
Ec Bm. Ust.
Hemmhofradius, cm
Bio PE 0 0,5 0,5 0,6 E 0,5 1,5 2 1,5
MS PE 0 0,5 0,5 0,5 E 0,5 1,5 2.0 1.0
Diagramm 3: Der Plättchentest des Pilzextraktes 5049.
∗- die Abkürzungen der biologischen Tests sind im Teil “Biologische Aktivität“ erläutert.
Dem Diagramm ist zu entnehmen, dass der Pilzextrakt eine mäßige Wirkung gegen
den Pilz Ustilago violacea sowie auch gegen das gram-positive Bakterium Bacillius
megaterium zeigt. Die Petrolether- und Essigesterextrakte beider Nährmedien lassen
unterschiedliche biologische Aktivitäten erkennen. Die aus diesem Pilzstamm
isolierten Sekundärmethabolite sind entweder mittelpolar (Naturstoff „P“,
Cytochalasin L, X) oder polar (3-Nitropropionsäure). Die höhere biologische Aktivität
der Essigsäureextrakte kann durch die Polarität der isolierten Stoffe erklärt werden.
Für den Lemnatest (zeigt die Wachstumshemmung der Testpflanzen) wurden 6.75
ml steriles Wasser und 0.25 ml der Probe (10 mg Substanz in 1 ml des Gemisches
Aceton/Methanol 1/1) in eine Petrischale pipettiert und mit einem Filterpapier
bedeckt. In jede Glaspetrischale wurden 4 Lemna-Pflanzen gelegt. Nach einem und
sieben Tagen erfolgte über die Beurteilung des Wachstums der Pflanzen und des
allgemeinen Zustandes der Blätter im Vergleich zu einem parallel angesetzten
Referenztests die Auswertung des Tests. Die Rohextrakte dieses Pilzstammes
(Petroletherextrakt P und Essigesterextrakt E) zeigten folgende Aktivitäten:
∗
Isolierung und Strukturaufklärung
59
Tabelle 10: Wirkung des Pilzextraktes 5049 im Lemnatest.
Versuchsmedien
Kontrolle
Blätterzahl 1 Tag
Zahl der Blätter
6-7 Tage
Zahl der Blätter
1.1 Aceton/MeOH Versuchsmedium 8 8 grün 30 grün
Probe Bio P 7 7 grün 21 grün
E 8 4 weiß
4 aufgelöst
6 weiß
Probe MS P 7 7 grün 16 grün
E 8 4 weiß
4 aufgelöst
5 weiß
Versuchsmedium – 2.50 ml steriles Wasser
Der Lemna-Test zeigte bereits nach einem Tag einen völligen Stillstand des
Pflanzenwachstums der Ethylacetatextrakte sowohl der Biomalzweichagar- als auch
der Mais-Sojaweichagar-Kulturen. Nach 6-7 Tage waren sämtliche Blätter der
Testorganismen weiß gefärbt, so dass von einer 100 %-igen Wachstumshemmung
gesprochen werden kann.
In der Tabelle 11 sind die Ergebnisse des Kressetests dargestellt. Sie demonstrieren
die Fähigkeit der Petroletherextrakte beider Nährmedien, das Wachstum der
Kressesamen zu hemmen.
Tabelle 11: Wirkung des Pilzextraktes 5049 im Kressetest. Als Testorganismus diente Lepidum
sativum (Kresse).
Versuchsdauer 1 Tag 6-7 Tage
Kontrolle 1 15 von15 Samen zeigen Wachstum 4 Samen gehemmt
Kontrolle 2 14 von 15 Samen zeigen Wachstum 4 Samen gehemmt
Probe Bio PE 3 von 15 Samen zeigen Wachstum 15 Samen gehemmt
E 0 von 15 Samen zeigen Wachstum 0 Samen gehemmt
MS PE 5 von 15 Samen zeigen Wachstum 13 Samen gehemmt
E 8 von 15 Samen zeigen Wachstum 0 Samen gehemmt
Isolierung und Strukturaufklärung
60
Zur Kontrolle wurden 2 Lösungen getestet :
Kontrolle 1 - 0.25 ml (1:1 Aceton / Methanol) + 2.25 ml steriles Wasser
Kontrolle 2 - 2.25 ml steriles Wasser
Die Proben (jeweils 0.25 ml des Extraktes, entspricht 10 mg des Extraktes) wurden in
2.25 ml sterilem Wasser aufgelöst und in Petrischale pipettiert. Darauf wurden 15
Kressesamen in die Schalen gegeben und mit Filterpapier bedeckt. Die Auswertung
der Tests erfolgte nach dem ersten und dem sechsten Tag durch Beurteilung des
Wachstums der Pflanzen und des allgemeinen Zustandes der Blätter im Vergleich zu
einem parallel angesetzten Referenztest. Die Extrakte aus Petrolether zeigten im
Vergleich zu denen aus Ethylacetat stark herbizide Eigenschaften. Die Ergebnisse
des Plättchentests deuten aber auch auf eine herbizide Wirksamkeit des
Etylacetatextraktes hin.
Aufgrund der Ähnlichkeit der biologischen Wirkungen wurden sämtliche Teilextrakte
(P+E der Bio- und MS-Nährmedien) zu einem Rohextrakt (von ca. 3.0 g) als Lösung
(Dichlormethan/Methanol 98/2) vereinigt, über einem Glasfilter filtriert und, wie bei
der Isolierung der Preussomerine beschrieben (Schema 1), fraktioniert. Bei der
säulenchromatographischen Aufarbeitung trat das Problem auf, dass die Probe
empfindlich auf die Verwendung von 4-5%-igem Methanol reagierte. Aus diesem
Grund wurden Petrolether- und Ethylacetatextrakte des Biomalz-Mediums (ca. 2.5 g)
zusammen mit 5-6 ml Petrolether, 10 ml Hexan und 1 ml Chloroform 1 Stunde lang
gerührt und anschließend abdekantiert. Der Rohextrakt löste sich im angegebenen
Lösungsmittel nicht vollständig und bildete zwei Phasen (dunkelbraunes Öl und hell-
gelbe Flüssigkeit). Die Flüssigkeit wurde abdekantiert und über Nacht stehen
gelassen. Es fielen Kristalle aus, die mit Diethylether gewaschen wurden. Sie
entsprechen einem literaturunbekannten Naturstoff-P.
Der dunkelbraune ölige Rückstand 1 (ca. 2.3 g) der ersten Fraktion wurde ebenfalls
mit 6-8 ml Chloroform 2 Stunden lang gerührt und dekantiert. Die Feintrennung des
Rückstandes 1 lieferte zwei Sekundärmetaboliten: das literaturbekannte
Cytochalasin L (10.0 mg) und das literaturunbekannne Cytochalasin X (2.0 mg).[27,
28]
Isolierung und Strukturaufklärung
61
Der schwarze ölige Rückstand 2 (ca. 1.7 g) der zweiten Fraktion wurde mit 8-10 ml
Dichlormethan 2 Stunden gerührt und abgesaugt. Die Feintrennung des
Rückstandes 2 lieferte 5.6 mg der 3-Nitropropionsäure.
Der in Methanol gut lösliche schwarze ölige Rückstand 3 (ca. 1.0 g) der dritten
Fraktion enthielt keine niedermolekularen Produkte.
Auf diese einfache Weise wurde der Pilzextrakt vorfraktioniert. Für die Feintrennung
wurden präparative chromatographische Verfahren (Dickschichtplatten 0.25 – 2.0
mm Kieselgel Si 60, PR 18; präparative Säule Kieselgel 60, SPE) und HPLC
(Kieselgel 60, RP-18) angewandt.[29]
Isolierung und Strukturaufklärung
62
2.3.2 Isolierung der Naturstoffe aus dem Pilzextrakt 5049
Schema 7: Isolierung der Naturstoffe aus dem Pilzextrakt 5049.
Im Schema 7 ist das Vorgehen zur Isolierung der vier Naturstoffe aus dem Pilzextrakt
5049 dargestellt. Zwei davon (3-Nitropropionsäure und Cytochalasin L) sind
literaturbekannt, die anderen (Cytochalasin X und „P“) sind literaturunbekannt.
Bio/Ms-Filtrat
PE/n-Hexan/Dichlormethan
1 : 2 : 0.2
dekantiert
Filtrat 1
Naturstoff “P“
(100 mg) Kristalle
Rückstand 1, Öl
2 h mit CH2Cl2
gerührt
Filtrat 2
Rückstand 2
Feintrennung
TLC, HPLC
Cytochalasin L (10.0 mg)
Cytochalasin X (2.0 mg)
2 h mit CH2Cl2
gerührt
Filtrat 3
Rückstand 3
Feintrennung
TLC, HPLC
3-Nitropropion-
säure (5.6 mg)
löslich in MeOH
keine Produkte
Isolierung und Strukturaufklärung
63
2.3.2.1 Isolierung und Strukturaufklärung des Naturstoffes „P“
C38H38O16 Mr.: 750.21 R+DB=20
1
2
3
4
4a
5
7
88a 99a
10 10a
12
13
14
15
16
1'
2'
3'
4'
10' 10'a
5'
6'
7'
8'
8'a
9'
9'a
12'
13'
15'
16'
6
11
O
O
O
O
O
11'
O
O
OH O OH
O
O
O
O
OH OH
14'
R+DB – Zahl der Doppelbindungen und Ringe im Molekül, ermittelt aus den Daten des
Massenspektrums.
Abbildung 26: Die Struktur des Sekundärmethaboliten.
2.3.2.1.1 Die allgemeinen Daten des Sekundärmethaboliten
Der literaturunbekannte Naturstoff P wurde in Form gelber Kristalle in einer Menge
von 100 mg direkt durch Kristallisieren aus dem Rohextrakt gewonnen. Der Rf-Wert
der Substanz in CH2Cl2/MeOH 98/2 beträgt 0.32. Die Substanz hat auf dem DC
(Kieselgel 60) eine charakteristische, schwach gelbe Farbe und konnte im UV-Licht
bei 254 nm sowie mit dem Sprühreagenz “Cer (IV)-ammoniummolybdat“ detektiert
werden.[30] Das IR-Spektrum der Substanz deutet auf die Anwesenheit von zwei
verschiedenen Carbonylgruppen, auf ein aliphatisches Fragment sowie auf einen
aromatischen Teil im Molekül hin.
Die Probe wurde durch 1D- (1H-NMR, 13C-NMR) und 2D-NMR-Spektren (H,H-COSY,
HMBC, HMQC, 600 MHz, CDCl3), IR-, UV- und Massenspektroskopie (EI)
charakterisiert. Die hochauflösende Messung des Molekülpeaks ließ mit m/z =
750.21463 (Intensität des Peaks: 55%) mehrere Summenformeln als möglich
Isolierung und Strukturaufklärung
64
erscheinen, von denen angesichts der NMR-Spektren die Formel C38H38O16 die
sinnvollste war. Die hochauflösende Messung des Basispeaks bei m/z = 677.19290
(Intensität des Peaks ist 100%) ergibt die Summenformel C35H33O14. Die Differenz
zwischen den beiden Molekülionen spricht für die Abspaltung einer Methylen-
Acetoxyguppe (CH3CO2CH2). In Anbetracht von m/z = 677 fallen drei Abspaltungen
der Masse m/z = 60 (möglicherweise Essigsäure) auf. Zum MS-Spektrum dieses
Naturstoffes ist noch zu bemerken, dass bei m/z = 242 und m/z = 302 doppelt
geladene Ionen auftreten, was auf ein sehr stabiles (und großes) konjugiertes bzw.
aromatisches System hindeutet. Das Signal bei m/z = 377 (entspricht etwa 20% der
Intensität des Molekülions) könnte dafür sprechen, dass die Hälfte des Moleküls zwei
zusätzliche Protonen [M+2H]+ aufweist.
Im Massenspektrum taucht ein Peak bei m/z = 121 auf, das vermutlich aus einem
Hydroxyphenylcarbonylderivat-Fragment stammt.
OH
O
Abbildung 27: Hydroxyphenylcarbonylfragment m/z = 121.
Isolierung und Strukturaufklärung
65
2.3.2.1.2 Die NMR-Daten des Naturstoffes
Abbildung 28: Das 1H-NMR-Spektrum des Sekundärmethaboliten.
Die NMR-Daten (1H-,13C-NMR) ergeben zahlmäßig genau die Hälfte der Zahlen der
C- und H-Atome der hochaufgelösten Masse. Folglich besteht das Molekül aus zwei
identischen Hälften mit einer C2-Symmetrieachse.[31, 32, 33, 34, 35] Es wird im Weiteren
in Bezug auf die NMR-Daten nur über eine Hälfte des Moleküls gesprochen. Die
Integration der Signale im 1H-NMR-Spektrum deutet auf genau 19 Protonen. Im
aromatischen Bereich des 1H-NMR–Spektrums erkennt man zwei Signale für zwei
miteinander koppelnde Protonen. Die Kopplungskonstante von 3J = 9.0 Hz deutet auf
eine ortho-Stellung der Protonen hin. Daraus ist abzuleiten, dass das Molekül ein
tetra-substituiertes aromatisches System besitzt.
Isolierung und Strukturaufklärung
66
Abbildung 29: Das 13C-NMR-Spektrum der Substanz.
Nach der Analyse des 13C-NMR-Spektrums liegen 19 C-Atome vor. Davon liegen vier
C-Atome im Bereich von 188.16 ppm bis 169.99 ppm und können als C-Atome einer
Carbonylfunktion bzw. als deren Enolform betrachtet werden. Dem aromatischen
Bereich sind sechs C-Atome zuzuordnen; zwei davon sind sekundär (C3 -141.56 und
C2 -109.91 ppm); die restlichen vier sind quartär. Das C-Atom-1 bei 161.93 ppm ist
ein phenolisches Kohlenstoffatom. Die chemische Verschiebung des zweiten
quartären C-Atoms-4a (154.25 ppm) deutet ebenso auf Bindung an ein
Sauerstoffatom hin. Das dritte C-Atom-9a (115.78 ppm) koppelt im long-range-
Spektrum mit beiden aromatischen Protonen H-2 und H-3. Das vierte aromatische
Kohlenstoffatom ist das quartäre C-Atom-4 (106.67 ppm), weil es mit dem
aromatischen Proton H-2 koppelt.
OHO
H2
H3
O
161.93
109.91
141.56
154.25
115.78
106.63
Abbildung 30: Der aromatische Teil des Moleküls.
Das Kohlenstoffatom C-8a (100.53 ppm) kann entweder als Acetalfragment oder als
Enolform vorliegen. Alle drei C-Atome [C-10a bei 80.78 ppm (quartär), C-5 bei 70.77
Isolierung und Strukturaufklärung
67
ppm (tertiär) und C-12 bei 64.99 ppm (sekundär)] haben ein Sauerstoffatom als
Nachbarn. Die NMR-Daten des Naturstoffes sind in der Tabelle12 aufgelistet.
Tabelle 12: Die NMR-Daten des Naturstoffs P (CDCl3).
Atom.
Nr.:
13C-NMR HMQC HMBC 1H-NMR H,H-COSY
9 188.16 s - - - -
8
178.08 s - 8-OH 8-OH s
14.07
-
13 170.47 s - 12a, 12b, 14 - -
15 169.99 s - 5, 16 - -
1 161.93 s - 1-OH, 2, 3 - -
4a 154.25 s - 2 - -
3 141.57 d 3 - d 7.43 2
9a 115.78 s - 2, 3 - -
2 109.92 d 2 1-OH d 6.56 3
4 106.67 s - 1-OH, 2 - -
8a
100.53 s
- 8-OH, 5, 12a,
12b, 7a,7b
- -
10a 80.78 s - 5, 12a, - -
5 70.77 d 5 6, 11, 12a,
12b
s 5.41 -
12
64.99 t 12a,12b - d 4.27
d 4.16
12b
12a
7
32.80 t 7a, 7b 8-OH, 5, 6,
7a, 7b, 11
m 2.37 -
6 27.98 d 6 5, 7a, 7b, 11 m 2.3 11
16 21.07 q 16 16 s 2.04 -
14 20.84 q 14 14 s 1.98 -
11 17.91 q 11 11, 5 d 0.99 6
Isolierung und Strukturaufklärung
68
2.3.2.1.3 Analyse der NMR-Daten und des Massenspektrums.
(Bestimmung der Funktionalitäten, die die Protonen H-1 und H-8 tragen)
Der Summenformel C38H38O16 ist zu entnehmen, dass das Molekül ein
hochoxidiertes System ist (es enthält 16 Sauerstoffatome). Deshalb können mit den
2D-NMR-Spektren (HMQC und C-H-COSY) nicht alle Strukturelemente sicher
aufgeklärt werden. Das andere 2D-NMR-Verfahren (HMBC) liefert keine exakte Zahl
der Bindungen. Außerdem ist es nicht immer möglich, nur aufgrund der chemischen
Verschiebungen alle Signale bestimmten Funktionalitäten zuzuordnen. [36, 37]
Im 1H-NMR-Spektrum sind zwei Singuletts für jeweils zwei Protonen bemerkenswert.
Beide sind zum tiefen Feld [bei 14.07 ppm (8-OH) und 11.48 ppm (1-OH)]
verschoben. Sie sind entweder durch die Chelatisierung mit einer in ortho–Position
stehenden Carbonylgruppe sehr stark entschirmt oder das Signal bei 11.98 ppm
könnte z. B. zu einer freien Carbonsäure gehören. Das Proton 1-OH ist mit großer
Wahrscheinlichkeit ein phenolisches Proton, das durch eine benachbarte
Carbonylgruppe chelatisiert ist. Als Bestätigung findet man im 13C-NMR bei 161.93
ppm ein Signal, das im long-range-Spektrum mit dem 1-OH Proton eine Kopplung
zeigt. Das chelierte phenolische Proton 1-OH ist fest gebunden. Es ändert bei der
Zugabe von Pyridin seine chemische Verschiebung nicht. Mit Diazomethan wird die
Phenolgruppe nicht methyliert.
Das zweite Proton 8-OH (bei 14.07 ppm ein Proton einer Säuregruppe oder ein
Proton eines Enols) konnte allein aufgrund der NMR-Daten nicht sicher zugeordnet
werden. Bei Beachtung der oben besprochenen Fragmente des Moleküls muß man
sieben von acht Sauerstoffatomen der einen Hälfte des Moleküls zuordnen. Wenn
angenommen wird, dass das Molekül eine Säurefunktion enthält, stimmt die Zahl der
Sauerstoffatome mit der Summenformel nicht überein. Anstatt auf acht
Sauerstoffatome kommt man auf neun (drei Kohlenstoffatome sind im aromatischen
Fragment beteiligt, vier Kohlenstoffatome sind für zwei Acetoxyfragmente
erforderlich). Die 1H- und 13C-NMR-Daten (17O-NMR war nicht möglich), IR- und UV-
Spektroskopie sind nicht ausreichend, um die chemische Umgebung des zweiten, zu
Isolierung und Strukturaufklärung
69
tiefem Feld verschobenen Protons zu identifizieren. Deswegen war es nicht möglich,
die entsprechende Gruppe sicher zu bestimmen.
Aus diesem Grund wurden mit dem Naturstoff zwei chemische Reaktionen
durchgeführt. Bei der ersten Reaktion handelte es sich um eine säurekatalysierte
Veresterung. Eine Säurefunktion ließe sich mit TMSCl in Methanol innerhalb von 2h
verestern. Diese Reaktion ist besonders gut für Systeme mit freien Säurefunktionen
geeignet.[38, 39] Sie verlangt keine aufwendige Aufarbeitung und verläuft unter milden
Bedingungen. Die DC-Analyse des Reaktionsproduktes ergab einen interessanten
Befund: das Produkt ist polarer (CH2Cl2/MeOH 98/2, Rf-Wert - 0.6). Das
Reaktionsprodukt wurde per SPE (RP-18 Octadecyl), TLC RP-18 (CH2Cl2/MeOH
95/5) gereinigt. Das Massenspektrum des Reaktionsproduktes ergab einen
Molekülpeak bei m/z = 582, dessen hochauflösende Messung die Summenformel
C30H30O12 liefert. Die Summenformeldifferenz zwischen dem Edukt und dem
Reaktionsprodukt ist 168, was einer Summenformel von C8H8O4 entspricht. Beim
Vorliegen einer dimeren Struktur sollte sich jede Hälfte des Moleküls um das
Fragment von C4H4O2 verkleinern. Hierbei bleibt die C2-Symmetrieachse im Molekül
erhalten. Die NMR-Daten des Produktes sind in der Tabelle 13 aufgelistet.
Tabelle 13: Die NMR-Daten des Reaktionsproduktes (CDCl3).
Atom.
Nr.:
13C-NMR
HMBC 1H-NMR
H,H-COSY
9 188.03 - - -
8 179.70 7a, 7b, 8-OH 8-OH s 14.01 -
1 161.98 1-OH, 2, 3 1-OH s 11.55 -
4a 154.17 3 - -
3 139.23 3 d 7.27 2
9a 116.25 2, 3 - -
2 110.85 2, 1-OH d 6.60 3
4 107.14 1-OH, 2 - -
8a 100.72 8-OH - -
10a 84.41 5, 12a - -
5 68.87 5, 12a, 7b,
11
d 4.29 6
Isolierung und Strukturaufklärung
70
12 64.37 - a d 3.84
b d 3.39
12b
12a
7 32.80 5, 8-OH, 11 a dd 2.50
b dd 2.33
6
6
6 28.48 7a, 7b, 11 m 2.11 5, 7, 11
11 17.77 5, 7a, 11 d 1.14 5, 7a
Aus dem 1H-NMR-Spektrum ist zu erkennen, dass die Protonen 8-OH und 1-OH bei
14.07 ppm und bei 11.55 ppm wieder erscheinen. Im Bereich um 4.0 ppm sind
deutlich verschobene Signale zu erkennen: Das Singulett für das Proton H-5 hat
seine Lage von 5.41 auf 4.29 ppm geändert. Ferner fehlen zwei Singulette für zwei
Methylgruppen bei 2.04 und 1.98 ppm. Die Acetoxyfragmente sind also abgespalten
worden. Die Abspaltung beider Acetoxyfragmente wird auch durch die Hochfeld-
Verschiebung des doppelten Dubletts (AB-Signal H-12a und H-12b) von 4.16 und
4.20 ppm auf 3.84 und 3.39 ppm bestätigt. Die erhöhte Polarität der Verbindung, die
Ergebnisse des Massenspektrums und die 1D-, 2D-NMR-Daten führen zu dem
Schluss, dass eine Umesterung stattgefunden hat. Aus zwei Acetoxygruppen sind
unter Säurekatalyse zwei Hydroxygruppen und Essigsäuremethylester entstanden.
TMSCl
MeOH
HOR'CH2OH 2 CH3CO2CH3
CH3CO2R'CH2CO2CH3
Abbildung 31: Der schematische Verlauf der Reaktion mit TMSCl anhand eines Fragments.
Beim Betrachten des 1H-NMR-Spektrums erkennt man, auf das Proton H-5 bezogen,
eine kleine Aufspaltung des Signals mit der Kopplungskonstanten von 0.7 Hz. Das
H,H-COSY-Spektrum deutet auf die Kopplung zwischen den Protonen H-5 und H-6
hin, die im Bisacetoxymolekül nicht zu sehen war. Im 1H-NMR-Spektrum sind die
Signale der diastereotopen Protonen H-7a (2.50 ppm) und H-7b (2.33 ppm) im
Verseifungsprodukt von dem Signal des Protons H-6 (2.11 ppm) deutlich zu
unterscheiden.
Die NMR-Daten, die Massenspektroskopie und die Ergebnisse der oben genannten
chemischen Versuche lassen sich durch eine Enolform mit 13C-NMR-Signalen bei
Isolierung und Strukturaufklärung
71
188.16, 178.08 ppm, 100.5 pmm) erklären. Das entsprechende Fragment ist in
Abbildung 32 dargestellt.
OHO
188.2
100.5
178.1
14.0
Abbildung 32: Das Enolfragment des Naturstoffs.
2.3.2.1.4 Das Molekül liegt als Biarylsystem vor
Die Analyse der Massenspektren, der 1H-NMR-, 13C-NMR-, HMQC- und HMBC-
Spektren ergibt, dass das Molekül unter Berücksichtigung der C2-Symmetrieachse
als Dimer zu bestimmen und ein Biarylsystem besitzt. Die chemischen
Verschiebungen von aromatischen Kohlenstoffatomen geben keinen eindeutigen
Hinweis auf die Verknüpfungsstelle im Molekül. Von sechs aromatischen
Kohlenstoffatomen sind zwei (C-Atom-2 und C-Atom-3) tertiär. Das C-Atom-1
(161.93 ppm) ist ein phenolisches Kohlenstoffatom. Die Chelatisierung des Protons
1-OH im 1H-NMR-Spektrum, das Signal bei 188.16 ppm im 13C-NMR-Spektrum und
der Peak bei m/z = 121 im Massenspektrum deuten zweifellos auf die β-Stellung
einer Carbonylfunktion zur phenolischen Gruppe hin (s. Abb. 34).
Die Verknüpfung der Carbonylgruppe mit dem Aromaten mögen die C-Atome-4
(106.67 ppm) und C-Atom-9a (115.78 ppm) übernehmen. Beide Kohlenstoffatome
müssen einen elektronegativen Partner haben. Bei der Anwesenheit des C-Atoms-4a
(154.3 ppm, verbunden mit einem Sauerstoffatom) kann das C-Atom-4 diese Position
eher nicht belegen. Die chemische Verschiebung des C-Atoms-9a sowie die long-
range-Korrelationen zu den aromatischen Protonen H-2 und H-3 bestätigen seine
direkte Nachbarschaft zur Carbonylfunktion. Außerdem trägt die Chelatisierung des
enolischen Protons 1-OH zur Hochfeldverschiebung bei.
Das Kohlenstoffatom C-10a (80.78 ppm) der Seitenkette des C-Atoms C-4a zeigt im
long-range Spektrum weitere Kopplungen mit den aliphatischen Protonen. Daraus
folgt, dass am C-Atom-4a keine Verknüpfung der C2-symmetrischen Fragmente
Isolierung und Strukturaufklärung
72
möglich ist. Die Verknüpfungsstelle ist höchstwahrscheinlich am C-Atom-4 (die C4-
C4‘-Bindung). In Abbildung 33 ist das Biarylsystem dargestellt.
OO
H
H
OO
H
H
O
H
H
OO
H
H
OO
H
H
161.9
109.9
141.5
106.6
154.3
115.7
188.2
OO
H
H
OO
H
H
161.9
109.9
141.5
106.6
154.3
115.7
188.2
OO
H
H
OO
H
H
H
H
O
161.9
109.9
141.5
106.6
154.3
115.7
188.2
1
2
3
4
4a
9a
9
4'
3'
2'
1' 9'a
4'a
9'
10a
AB
Abbildung 33: Das Biarylsystem des Naturstoffs (A: 13C-NMR-Verschiebungen, B: Numerierung).
2.3.2.1.5 Der aliphatische Teil des Moleküls
Die Zuordnung der Signale für die 12 aliphatischen Protonen (drei CH3-Gruppen,
zwei Methylenprotonen, ein Methinproton) gelingt mit Hilfe der 2D-Experimente. Die
Annahmen wurden durch die entsprechenden Signale im 13C-NMR-Spektrum
bestätigt (3 primäre C-Atome bei 17.91, 20.84 ppm und 21.07 ppm, ein sekundäres
C-Atom bei 33.6 ppm und ein tertiäres bei 27.98 ppm). Zwei der drei erwähnten
Methylgruppen gehören zu zwei Acetoxygruppen (C-Atome C-13 bei 170.47 ppm
und C-15 bei 169.99 ppm). Abbildung 34 zeigt oben besprochene Fragmente.
O
OHH
O
OH
12
14 13 15
16 5
AB
Abbildung 34: Zwei Acetoxyfragmente A und B des Sekundärmetaboliten.
Isolierung und Strukturaufklärung
73
Die Anordnung der Carbonylatome C-13 und C-15 (chemische Verschiebung von
170.08 ppm und 169.99 ppm) kann mit Hilfe der 2D-NMR-Daten ermittelt werden. Im
long-range-Spektrum zeigen beide Kohlenstoffatome ihre Korrelationen mit zwei
Methylprotonen H-16 und H-14. Außerdem korreliert C-Atom-13 mit zwei
Methylenprotonen H-12a und H-12b (doppeltes Dublett bei 4.27 ppm), die im C,H-
COSY-Spektrum mit dem C-Atom-12 (64.99 ppm) koppeln. Andererseits deutet die
chemische Verschiebung des C-Atoms-13 auf die direkte Nachbarschaft zum
Sauerstoffatom (Fragment A Abb.34) hin.
Die gleichen Argumente gelten für das C-Atom-15. Es koppelt im long-range-
Spektrum mit einem Methinproton H-5 (Singulett bei 5.41 ppm) und korreliert im C,H-
COSY-Spektrum mit dem C-Atom-5 (70.77 ppm Abb.34).
Die long-range-Korrelation der Methylenprotonen H-12a/H-12b mit dem Methin-C-
Atom 5 (bei 64.99 ppm) und umgekehrt die Korrelation des Methin-C-Atoms 5 zu den
Methylenprotonen H-12a/H-12b zeigen deutlich, dass die beiden Fragmente
zusammengehören (Abb. 35).
CH3O
OH12b
170.47
CH3O
OH5
169.9
H12a
Abbildung 35: Die long-range-Korrelationen beider Acetoxyfragmente.
Aus den 2D-NMR-Daten ist abzuleiten, dass die abgebildeten Fragmente über ein
quartäres C-Atom verknüpft sind. In Abbildung 35 ist die Verknüpfung von zwei
Acetoxyfragmenten über ein quartäres C-Atom-10a (80.78 ppm) dargestellt. Als eine
andere Verknüpfungsmöglichkeit käme das quartäre C-Atom-8a (100.53 ppm) in
Betracht, weil dieses im long-range-Spektrum zu den in Abbildung 35 dargestellten
Protonen H-12a/H-12b und dem Proton H-5 Konnektivitäten zeigt. Wenn aber die in
Abbildung 32 dargestellte Vermutung stimmt, kann nur das C-Atom-10a (80.78 ppm)
diese Position belegen.
Isolierung und Strukturaufklärung
74
64.9
170.5 169.9
80.8 70.8
O
OO
O
H12 H12 H5O
D
Abbildung 36: Das Fragment D des Naturstoffes.
Das Dublett im Protonenspektrum bei 0.99 ppm mit der Kopplungskonstanten von 3J
= 6.0 Hz und dessen Integration spricht für die dritte CH3-Gruppe 11, die das Proton
H-6 als Kopplungspartner hat (Abb. 37). Die Kopplung des Protons 6-H (nach 13C-
NMR-Daten ein Methinproton) mit der Methylgruppe sollte ein Quartett ergeben, das
mit den Signalen der Protonen H-7a und H-7b bestätigen. Die zwei diastereotopen
Protonen H-7a und H-7b sollten zwei doppelte Dublette ergeben, die unter dem
Multiplett mit der Kopplungskonstanten von 2J = 11.0 Hz zu erkennen sind. Das
Proton H-7a zeigt mit der Kopplungskonstante von 3J = 3.0 Hz eine vicinale
Kopplung mit dem Proton H-6. Daraus folgt, dass die Protonen H-7a und H-6 nicht
antiperiplanar zueinander stehen. Eine weitergehende Analyse des Multipletts
scheint nicht mehr möglich zu sein.
11
H7b
CH3H6H7a
H5
C
Abbildung 37: Das aliphatische Fragment C des Sekundärmetaboliten.
Das Doppelresonanzexperiment (NOE) liefert wegen der Entkopplung von
benachbarten Protonen zu stark verbreiterte Signale, die nicht zur Strukturaufklärung
beitragen. Zu diesem Fragment ist noch zu konstatieren, dass das Proton H-5 ein
scharfes Singulett (s. Tabelle 12) ergibt. Der Torsionswinkel zwischen den Protonen
H-6 und dem Proton H-5 ergibt sich aus der Karplus-Kurve und beträgt 90°.
Isolierung und Strukturaufklärung
75
2.3.2.1.6 Weitere Diskussion der Struktur des aliphatischen Fragments
Der weitere Aufbau des aliphatischen Fragments kann durch detaillierte Analyse der
Fernkopplungen bestimmt werden. Fünf Kohlenstoffatome (C-8a, C-10a, C-5, C-7, C-
6, das C-Atom-11 trägt eine Methylgruppe) zeigen im long-range-Spektrum
Konnektivitäten zu den aliphatischen Protonen H-5, H-6, H-7. Das
Methinkohlenstoffatom C-5 zeigt im long-range-Spektrum eine eindeutige Korrelation
zu dem Protonensignal H-7a (2.37 ppm). Das quartäre C-Atom-8a koppelt sowohl mit
dem Proton 8-OH als auch mit dem Methinproton H-5.
C100.53 C8a H8-OH, H5, H7a/ H7b, H12a/ H12b
C70.77 C5 H7a
C17.91 C11, H5
C32.80 C7 H8-OH, H5, H6/7, H11
Unten sind die Verknüpfungsvarianten laut 2D-NMR-Verfahren aufgeführt.
a
CH3
AcO
O
AcO
H
OH8O
8
7
6
5
10a
8a
10
4a
11
b
8
7
6
5
10a
11CH3
OO H8
H6
H5
H7a H5
H7b
8a
Abbildung 38: Die 3J-Kopplungen des C-Atoms-8a mit den Protonen 8-OH, H-5, H-7a,H-7b.
Man sieht, dass es strukturell mindestens zwei Möglichkeiten gibt (Abb. 38 a und b),
das Molekül gemäß der Entfernung des C-Atoms-8a von den Protonen 8-OH, H-5
sowie H-7a und H-7b aufzubauen, die den 2D-NMR-Daten entspricht. Zwei Punkte
sind bei der Diskussion zu erwähnen:
Isolierung und Strukturaufklärung
76
Für die Variante a muß der Sechsring so geschlossen werden, dass die
Methylenprotonen H-7a und H-7b am Sechsring zwei Kopplungspartner, nahmlich
die Protonen H-5 und H-6, oder nur einen Kopplungspartner, nähmlich das Proton H-
6, haben. Aber das scharfe Singulett bei 5.41 ppm im 1H-NMR-Spektrum deutet
entweder darauf hin, dass kein Kopplungspartner vorliegt, oder der Torsionswinkel
zwischen dem Proton H-5 und nur einem hypothetischen Nachbarn etwa 90° beträgt.
Das hieße, dass die Orbitale der Protonen orthogonal zueinander stehen.[10] Auf
Grund der long-range-Kopplung zwischen dem C-Atom-11 und dem Proton H-5
erscheint Variante b am plausibelsten.
Die long-range-Kopplung des C-Atoms-7 mit Proton 8-OH und die long-range-
Kopplung des C-Atoms-11 mit Proton H-5 legen die Struktur des aliphatischen
Fragmentes b fest.
Da alle Signale zugeordnet sind, wird das Fragment als ein Sechsring vorliegen.
Andererseits gibt es noch eine Variante, deren NMR-Daten und 2D- Korrelationen
nicht in Widerspruch zu der in der Abbildung 38 b dargestellten Struktur stehen.
Diese können unterschiedliche Ringgröße (des Siebenringes s. Abb. 39) sowie
Positionen am Ring des Protons H-5 bzw. des AcOCH2-Fragments zulassen.
10a
O
H
H
H
H
OO O
O
H
AcO
OAc
CH3
OH3C
OAc
HOAc
OO
H
H
HH
Abbildung 39: Eine mögliche Variante des unbekannten Naturstoffes
Der wichtigste Punkt bei der Beurteilung dieser Möglichkeit, außer dem schon oben
Besprochenen, ist die chemische Verschiebung des quartären C-Atoms C-10a
(80.78 ppm). Die Anwesenheit eines elektronegativen Substituenten reicht nicht aus,
Isolierung und Strukturaufklärung
77
um eine so starke Tieffeldverschiebung zu erreichen. Die nähere Position C-10a zur
Doppelbindung entspräche dieser Bedingung besser.
Die zwei anderen Arbeitshypothesen a und b (Abb. 40) zur Frage der Verknüpfung
beider Molekülfragmente sind unten dargestellt.
O
O
HOAc
CH3
O
OOO
O
HOAc
CH3
AcOCH2
AcOCH2O
HH
HH
O
HOAc
CH3
O
OOO
O
HOAc
CH3
AcOCH2
AcOCH2
HH
HH
O
O
ab
Abbildung 40: Die als Arbeitshypothese betrachteten Strukturen des Naturstoffs.
Diese Moleküle sind aber nicht mehr C2-symmetrisch und über drei Bindungen
miteinander verknüpft. Diese Annahmen sind kaum haltbar, da im Massenspektrum
ein Peak mit der Intensität von ca. 20 % bei m/z = 377 [1/2M+2]+ erscheint. Dazu
müssten bei der Elektronenspray-Ionisation drei Verknüpfungen gleichzeitig
gespalten werden, was sehr selten beobachtet wird. Fernerhin besäße die Variante a
einen 14-Ring, die Variante b zwei verbrückte 10-Ringe. Gleichartige Ringsysteme
erscheinen in der Natur relativ selten.
Für die Aufklärung der Struktur wurden die NOE-Experimente mit dem Gedanken
herangezogen, die räumliche Umgebung der Protonen H-5, H-6 und H-12
aufzuklären. In der Tabelle 14 sind die Ergebnisse der NOE-Differenzspektroskopie
aufgelistet.
Isolierung und Strukturaufklärung
78
Tabelle 14: NOE-Differenzspektroskopie.
Signalintensität der Atome
Gesättigte
Resonanz H12a/12b
H5 H
6 + H7a/7b 16CH3- 14CH3- 11CH3- H2- H3-
H12a/12b -
+50.3 +24.4 +17.2
- +10.3 +22.7
H5 +39.7
- +2.8 - - - - +41.7
11CH3 -
+26.4 +42.4 +52.6 - - -
Die Auswertung der NOE-Differenzspektren führt zu dem eindeutigen Ergebnis, dass
die Protonengruppen H-5 und H-11 trans zueinander stehen. Ebenfalls sind die
Protonengruppen H-11 und H-12 nicht in einer Ebene. Die Steigerung der
Signalintensität bei Sättigung des Signals von Proton H-5 sowie umgekehrt die
Steigerung von H-12 bei Sättigung von H-12 spricht für die gleiche räumliche
Anordnung dieser Gruppen. Logischerweise sollte die Methylgruppe 11 der
Methylengruppe 12 entgegengesetzt sein.
H11 H5
H5H11
H12 H11
H11 H12
H12a/b H5
H5H12a/b
Erklärbar ist die Vergrößerung der Signalintensität beider Methylprotonen H-16 und
H-14 der Acetoxyfragmente bei Sättigung des Signals H-11 durch die behinderte
Drehbarkeit der beiden. Interessant ist die deutliche Intänsitätsteigerung des
aromatischen Protons H-3 bei Absättigung des Protons H-5, die auf den ersten Blick
ungewöhnlich erscheint. Eine Erklärung kann nur bei Beachtung des Biarylsystems
im Molekül gegeben werden. Die gegenseitige räumliche Nähe der beiden wird
dadurch ermöglicht, dass sie nicht um die Biarylachse drehebar sind.
- keine Nachbarschaft
Isolierung und Strukturaufklärung
79
Die in Abbildung 41 dargestellte Struktur erscheint auf Grund aller Daten am
plausibelsten.
O
OH O OH
O
OO
O
1
2
3
4
4a
7
88a 99a
10
11
6
5
15
16
10a
12
13
14
Abbildung 41: Die „Halbstruktur“ des Naturstoffs.
Die gesammte Struktur des Moleküls ist in Abbildung 26 wiedergegeben. Die Struktur
des Umesterungsproduktes mit Numerierung zeigt in Abbildung 42.
1
2
3
4
4a
5
7
88a 99a
1'
2'
3'
4'
10' 10'a
5'
6'
7'
8'
8'a
9'
9'a
11 O
O
HO
11'
OH
OH
OH O OH
O
HO
OH OH
4'a
10
12
10a
12'
6
Abbildung 42: Das Umesterungsprodukt
Die Umkristallisation des Naturstoffes aus dem PE/Et2O/CH2Cl2 liefert hellgelbe
Plättchen-Kristalle. Die Röntgenstrukturanalyse der Substanz ist in Abbildung 43
dargestellt.
Isolierung und Strukturaufklärung
80
Abbildung 43: Die Röntgenstrukturanalyse des unbekannten Naturstoffs.
Man findet eine Identität der in Abbildung 26 gezeigten Struktur mit der Abbildung
aus der Röntgenstrukturanalyse.
2.3.2.1.7 Diskussion der achsialen Chiralität
Aus den NMR-Daten (CDCl3, RT) der Substanz geht hervor, dass das Molekül als ein
Dimer vorliegt und eine C2-Symmetrieachse besitzt. Die hochsubstituierte
Biphenyleinheit des Moleküls besitzt eine axiale Chiralität. Die NOE-Daten deuten
ebenso auf eine Verhinderung der Drehbarkeit der Biphenyleinheit. Die plausibelste
Erklärung dafür wäre die Höhe der Rotationsbarriere bei der Racemisierung der
Atropisomere.
Isolierung und Strukturaufklärung
81
2.3.2.1.8 Zusammenfassung der Daten des neuen Naturstoffs
Der Naturstoff gehört zur Klasse der Anthranoiden, die vom Anthracen abgeleitete,
natürlich vorkommende Verbindungen sind. Durch die Anwesenheit des
chromogenen trizyklischen Ringsystems mit Chinon-Struktur sowie der auxochromen
Hydroxy-Gruppen kann die gelbe Färbung der Verbindung erklärt werden.[40]
Der biosynthetische Vorläufer des Naturstoffs ist die Secalonsäure A (Ergochrome
A).[41] Im Römpp-Lexikon “Naturstoffchemie“ sind 15 Secalonsäuren beschrieben
worden.[40] Alle Secalonsäuren sind Dimere von verschiedenen Xanton-Monomeren.
Die Verknüpfung erfolgt in 2/2‘-Position. Die Bildung der Secalonsäure A (C32H30O14,
Mr 638.1635) ist durch die enzymatische oxidative Ringöffnung von Emodin (einem
tricyclischen Chinonderivat) erklärbar (Abb. 44).[41, 42, 43] Die Säure liegt als Dimer
vor, die Verknüpfungsstelle ist allerdings am C-Atom-2. Im Unterschied zur
Secalonsäure besitzt der Naturstoff an der Position 10a statt einer Methylestergruppe
eine Methylenactetoxygruppe. Es sind fünf Diastereoisomere der Säure (A, B, C, D,
F, G) isoliert und beschrieben worden, deren Konfiguration an den Positionen
5,5‘/6,6‘/10,10‘ unterschiedlich ist.[40] Diese Säure ist dem Naturstoff P am nächsten,
dessen Derivate aus Aspergillus ochraceus (secalonic acid A), A. aculeatus (D und
F), Pyrenochaeta terrestris (A, B und G) und Penicillium oxalicum (D) isoliert worden
sind.[40]
Isolierung und Strukturaufklärung
82
HO Me
OHOH O
O
HO Me
MeO2C
OH
OH
OHO
O
HO Me
O
OH
CO2Me
OH
OH
2
Enzym
Emodin
Abbildung 44: Der Metabolismus der Secalonsäure.
Der Vergleich der NMR-Daten der Secalonsäure G ( Signale für die Protonen 5‘,6‘)
mit dem unbekannten Naturstoff P läßt den Torsionswinkel um 90° C unberührt.[20]
2.3.2.1.9 Biologische Aktivität
Die Secalonic-Säure A zeigt mäßige antimikrobielle Wirkung gegen das gram-
positive Bakterium Bacillus megaterium, sonstige toxische Effekte sind nicht
bekannt.[41] Die mikrobiologische Wirkung des Naturstoffs P wurde in der
Technischen Universität Braunschweig getestet. Die Substanz wurde in einem 1:1-
Gemisch Aceton/Methanol mit 1mg/1ml bzw. 10mg/1ml gelöst und anschließend auf
algizide, fungizide und bakterizide Wirkung getestet. Die unten aufgelisteten
Ergebnisse deuten auf eine mäßige bakterizide Wirkung gegen das gram-positive
Bakterium Bacillus megaterium (B.m) sowie eine starke Wirkung gegen den Pilz
Ustilago violacea (Ust.).
Tabelle 15: Biologische Aktivität des Sekundärmetaboliten.
Subst. Chl. Bm. Ust.
Isolierung und Strukturaufklärung
83
1mg/1ml - 0.3-0.6 -
10mg/1ml 0,2 2-3-4 0.5-0.8
Von den dimeren Anthrachinonen sind andere natürlich vorkommende Vertreter
bekannt; deren Verknüpfungsstellen sind allerdings entweder am C-Atom-4 oder C-
Atom-10. Als Beispiele dafür können die Naturstoffe 4,4‘-Bichrysophanol (C30H18O8)
und 5,5‘-Bichrysophanol (C30H18O8) genannt werden.[44]
Das Umesterungsprodukt wurde ebenfalls in der TU Braunschweig auf biologische
Wirksamkeit getestet, zeigte aber keine interessanten Eigenschaften.
Pflanzenschutz-Screening (BASF)
Der Naturstoff „P“ zeigt im Pflanzenschutz-Screening (Mikrotest, BASF) starke
fungizide Aktivität. Die Ergebnisse der Tests bei angegebener Konzentration
(Wachstum in %) sind in Tabelle 16 aufgelistet.
Tabelle 16: Die Ergebnisse des Pflanzenschutz-Screenings.
ppm Phytin.∗ Botrci. Pyrior. Septtr.
125 2.2 8.8 0.0 0.9
31 0.4 8.7 0.5 0.3
8 99.2 8.0 0.1 0.4
2 100.0 73.3 42.3 68.5
∗Phytin.: Phytophtora infestans – der Erreger der Kraut- und Knollenfäule bei
Kartoffeln und Tomaten.
Botrci.: Botrytis cinerea – Grauschimmel an Erdbeeren.
Pyrior.: Pyricularia oryzae – Reisblast-Erreger.
Isolierung und Strukturaufklärung
84
2.3.2.2 Beschreibung und Isolierung des Sekundärmetaboliten Cytochalasin L-
696.474.
C30H39O4N Mr.: 477.29
HN
OO
O
OH
H
1
2
34
56
7
89
10
11 12
13
14
15
16
17
18
19
20
21 22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
H
H
H
Abbildung 45: Die Struktur und die Numerierung des Cytochalasins L-696.476.
Der literaturbekannte Naturstoff Cytochalasin L wurde nach Vortrennung (s. Schema
7) mittels präparativer Chromatographie (Dickschichtplatten, Si 60) gewonnen.[45] Die
Feintrennung gelang mittels HPLC (RP-18, column 4.6 mm×25 cm, Acetonitril 100%,
2.0 ml/min, 20° C).[46, 47] Die Substanz konnte mit UV-Licht (254 nm) detektiert
werden. Der Naturstoff hat einen Schmelzpunkt von 204-207° C (Lit.: 210° C).[48] Der
Rf-Wert in CH2Cl2/MeOH 97/3 beträgt 0.43. Der Sekundärmetabolit löst sich gut in
mittelpolaren Lösungsmitteln (Chloroform, Dichlormethan) sowie in Methanol. In
Wasser ist die Verbindung nicht löslich.
Die IR-Banden deuten auf zwei Carbonylfunktionen (eine Estergruppe bei 1741 cm-1
und eine Ketogruppe bei 1691) im Molekül hin. Die stark ausgeprägte
charakteristische Valenzschwingung der C-O-Gruppe bei 1230 cm-1 bestätigt die
Vermutung, dass das Molekül eine Estergruppe besitzt. Die zweite Bande spricht für
die Valenzschwingung einer Amidfunktion; beide Carbonylfunktionen könnten
aufgrund der Differenz zwischen den Absorptionsbanden von 50 cm-1 aber auch zu
einer 1,3-Dicarbonylverbindung gehören. Außerdem deuten die mittelintensiven
Banden um 2921 cm-1 auf einen aliphatischen Teil des Moleküls hin. Die Banden um
1454, 1383 und um 904 cm-1 charakterisieren den aromatischen Teil des Moleküls,
den man findet im Spektrum die mittelintensive Bande für die
Ringdeformationsschwingung bei 700 cm –1. Wegen der mittelstarken Absorption bei
966 cm-1 ist ein olefinischer Teil im Molekül nicht auszuschließen.
Isolierung und Strukturaufklärung
85
Die DCI-Massenspektren der Probe deuten auf ein Molekül der Masse m/z = 477 hin
(positiv: [M+H]+ bei m/z = 478, negativ: [M-H]-, [M+Cl]-, [M+Br]- bei m/z = 476, m/z =
512, m/z = 556). Das EI-Spektrum zeigt das Molekülion bei m/z = 477 sowie eine
Reihe von Fragmenten: m/z : 418 = M-59 entspricht der Abspaltung einer
Acetoxygruppe (CH3-COO-), m/z : 386 = 477-91 läßt eine benzylische Struktur
erkennen (C6H5-CH2-), zumal m/z = 91 auch im Spektrum zu sehen ist. Der Peak bei
m/z = 326 zeigt die Abspaltung beider funktionellen Gruppen, obwohl man
rechnerisch nur auf m/z = 327 kommt. Durch die Abspaltung eines Protons zur
Stabilisierung der Essigsäure kann die Massendifferenz erklärt werden.
Ausgehend von den NMR-Daten und der Summenformel des Moleküls, kommt man
über eine Literaturrecherche in der Chapman-Hall-Datenbank auf den Namen des
literaturbekannten Naturstoffes–Cytochalasin L-696,474.[45] Die NMR-Daten der
Verbindung stehen mit ihren Literaturdaten in guter Übereinstimmung. Die von uns
gemessenen Werte der chemischen Verschiebungen sind in Tabelle 17 aufgelistet.
Die vicinalen Kopplungskonstanten der olefinischen Protonen H-13 und H-14 sowie
der Protonen H-20 und H-19 (3J = 16.4 Hz) erlauben es, eine trans-Anordnung der
Doppelbindungen anzunehmen. Die Werte der vicinalen Kopplungskonstanten
stehen in guter Übereinstimmung mit den Literaturdaten.[45]
Tabelle 17: Die NMR-Daten des Cytochalasins L (CDCl3).
Atom.
Nr.:
13C-NMR HMQC HMBC 1H-NMR
ppm
H,H-COSY
1 174.31 s - 8, 4 - -
2 - - - 5.45 s -
3 53.76 d 3 2, 10a, 10b 3.24 m 4, 10a, 10b
4
50.70 d 4 2, 3, 10a, 10b,
11
2.12 t
3, 5
5 33.01 d 5 3, 4, 11,12a,
12b
2.87 m 4, 11
6 148.17 s - 4, 11, 12a. -
Isolierung und Strukturaufklärung
86
7 69.60 d 7 5, 7, 8, 12a,
12b
3.82 d 8
8 47.34 d 8 12a, 13, 14, 21 2.88 dd 7, 13
9 51.86 s - 2, 8, 14, 21 - -
10 45.74 t 10a
10b
4, 27/31
2.64 dd
2.60 dd
3
11 14.31 q 26 - 0,92d 5
12 113.89 t 12a
12b
12 5.10 s
5.35 s
12b
12a
13 127.51 d 13 8, 15a, 15b 5.76 m 8, 14
14 138.43 d 14 8, 15a 5.3 m 13, 15
15 42.55 t 15a
15b
13, 14, 17, 22 1.96 dd 14, 15b
16 33.42 d 16
14, 15a, 15b,
22
1.75 dd
1.38 br.s
14, 15a, 16
15, 17, 22
17 48.44 t 17a
17b
15a,15b, 22/23 1.60 m
1.36 m
17b, 18
17a
18 34.27 d 18 19, 20, 23/22 2.08 dd 17, 19, 23
19 135.91 d 19 21, 23 5.70 m 18, 20, 21
20 125.49 d 20 21 5.96 dd 19, 21
21 78.62 d 21 4, 8, 19, 20 5.54 dd 19, 20
22 22.13 q 22 22 1.01 d 18
23 25.30 q 23 23 1.00 d 17
24 170.13 s - 25 - -
25 20.90 q 25 25 2.21 s -
26
137.56 s - 10a, 10b,
28/30
- -
27,31 128.99 d 27,31 10a, 27/31 7.33 dd 27, 28, 30, 31
28,30
129.04 d 28,30 10a, 10b,
28/30
7.13 dd 27, 28, 30, 31
Isolierung und Strukturaufklärung
87
29 127.10 d 29 28/30, 27/31 7.22 m 27, 28, 30, 31
2.3.2.1.9 Biologische Aktivität
Die biologische Aktivität des Cytochalasins L-696.476 wurde ebenfalls in der
Technischen Universität Braunschweig getestet. Die Probe wurde in
Aceton/Methanol (1:1) mit 1mg/1ml bzw 5mg/1ml gelöst und anschließend auf
algizide, fungizide und bakterizide Wirkung getestet. Die Ergebnisse des
Plättchentests von Cytochalasin L-696,474 zeigen schwache Aktivitäten gegen die
aufgelisteten Mikroorganismen.
Tabelle 18: Die Ergebnisse des Plättchentests bei Cytochalasin L.
Subst. Chl. Bm Ec Ust Eur Mm Fu
1mg/1ml 0,1 0 0,1 0 0 0 0
5mg/1ml 0,7 0,1 - 0,2 - - -
∗Zahlenangaben in cm des Hemmhofradius.
Die in der Literatur publizierten Pharmakologischen Tests der Substanz weisen auf
hohe Wirksamkeit gegen HIV -1 hin.[49, 50]
Isolierung und Strukturaufklärung
88
2.3.2.3 Isolierung und Beschreibung des Cytochalasins X
C28H37O3 Mr: 435.28
HN
O
OH
H
1
2
34
56
7
89
10
11 12
13
14
15
16
17
18
19
20
21 22
23
26
27
28
29
30
31
H
H
H
OH
Abbildung 46: Der Sekundärmetabolit Cytochalasin X.
Der literaturunbekannte Naturstoff mit der Molmasse 435.27 g mol –1 ist dem
Cytochalasin L hinsichtlich seiner NMR- und IR-Daten sehr ähnlich. Der
Sekundärmetabolit wurde in einer Menge von 1.3 mg per DC (Kieselgel 60) isoliert
und mittels HPLC (RP 18, flow 1ml/min, MeOH, 25° C) gereinigt. Die Substanz ist im
Vergleich zum Cytochalasin L-696.476 polarer. Die Messung des Molekülpeaks bei
m/z = 435 ergibt bei Berücksichtigung der Zahl der Doppelbindungen und der Ringe
als sinnvollste Summenformel C28H37O3N. Aus dem Vergleich der NMR- und IR-
Daten sowie auch aus dem Massenspektrum (der Unterschied zwischen den
Summenformeln beider Cytochalasine besteht aus dem Fragment C2H2O) folgt, dass
der unbekannte Naturstoff keine Acetoxygruppe enthält. Stattdessen muss er eine
Hydroxygruppe besitzen, weil die chemische Verschiebung des C-Atoms-21 keine
starkeÄnderung erkennen läßt und die Lage des Protons H-21 (4.17 ppm) ebenso
auf einen elektronegativen Nachbarn hindeutet. Der Befund spiegelt sich im IR-
Spektrum wider. Die bei 1741 cm-1 fehlende Bande und die starke Bande bei 3373
cm-1 sprechen ebenfalls für das Fehlen der Acetoxygruppe. In Tabelle 19 sind die
NMR-Daten des literaturunbekannten Naturstoffes aufgelistet.
Isolierung und Strukturaufklärung
89
Tabelle 19: Die NMR-Daten des Sekundärmetaboliten Cytochalasin X (CDCl3).
Atom.
Nr.:
13C-NMR
HMQC HMBC 1H-NMR H,H-COSY
1 175.81 s - 3, 4, 8 - -
2 - - - 5.45 s -
3 53.87 d 3 4, 5, 10a, 10b 3.27 m 4, 10a, 10b
4 50.18 d 4 2, 3, 4, 5, 10a, 10b, 11 2.61 m 3, 5
5 33.10 d 5 3, 4, 11, 12a, 12b, 15a, 15b 2.91 m 3, 4, 12a, 12b
6 148.66 s 6 4, 8, 11 - -
7 69.79 d 7 8, 12, 14 3.82 d 8, 12a, 12b
8 46.16d 8 4, 13, 14 2.81 t 7, 13
9 53.13 s 9 4, 8 - -
10 45.76 t 10a 4, 25/29 a dd 2.92 3
11 14.22 q 11 4, 11 1.06 d 5
12 113.65 t 12a 7 a 5.33 s 12b
13 127.08 d 13 8, 15a, 15b 5.76 dd 8, 14
14/24 137.81 d 14 8, 15a, 15b 5.25 m 13, 15a, 15b
15 42.33 t 15a 13, 14, 22 a 1.97 m 13, 14, 15b
16 33.52 d 16 - 1.37 m 15, 17,22
17 48.33 t 17a 15a, 15b, 23 a m 1.72 17b, 18, 23
18 34.17 d 18 23 2.15 m 17a, 17b, 19,
19 134.32 d 19 20, 23 5.90 dd 20, 21
20 131.23 d 20 19, 21 6.19 dd 19, 21
21 77.26 d 21 4, 8, 19, 20 4.17 br.s 20
22 22.47 22 15, 22 0.98 d 18
23 25.22 q 23 23 1.01 d 16
24,18 137.81 s 24 3, 4, 10a, 10b, 26, 28 - -
25,29 128.94 d 25/29 10a, 10b, 26/28, 27 7.30 d 26/ 28
26,28 129.15 d 26/28 3, 10a, 10b, 25/29, 27 7.45 m 25/29, 27
27 128.04 d 27 25/29, 27 7.23 t 26, 27
Isolierung und Strukturaufklärung
90
Die Unterschiede zwischen den NMR-Daten beider Naturstoffe sind unten
dargestellt. In den 13C-NMR-Spektren sind folgende durch HMQC-Spektren
bestätigte Signale angedeutet:
Cytochalasin L Cytochalasin X
C21 77.26 ppm 78.62 ppm
C19 135.91 ppm 134.32 ppm
C20 125.49 ppm 131.23 ppm
C1 175.81 ppm 174.31 ppm
C24 170.13 ppm -
C25 20.90 ppm -
Im 1H-NMR-Spektrum findet man entsprechend für die Protonen H-21 und H-25
folgende Signale:
Cytochalasin L Cytochalasin X
H21 dd 5.54 ppm br. s 4.17 ppm
H25 s 2.21 ppm -
Das fehlende Fragment ist in Abbildung 47 in der Struktur des Cytochalasins X noch
einmal abgebildet.
Isolierung und Strukturaufklärung
91
24
25
O
Abbildung 47: Das fehlende Fragment des Cytochalasins X.
Dementsprechend kann die gesamte Struktur des Sekundärmetaboliten X in der
Abbildung 46 dargestellt werden. Die Konfiguration an den Stereozentren C-3, C-4,
C-5, C7, C-8, C-16, C-18, C-21 des Moleküls wird sich aufgrund der Ähnlichkeit der
Kopplungskonstanten von dem Cytochalasin L-696.476 nicht unterscheiden.
Der Drehwert (gemessen in Dichlormethan) ist dem des Cytochalasins L-696.476
sehr ähnlich.
Isolierung und Strukturaufklärung
92
2.3.2.3.1 Zusammenfassende Beschreibung der Naturstoffe Cytochalasin L
und Cytochalasin X
Die Cytochalasine sind aufgrund ihrer vielfältigen biologischen Wirkungen
interessant. Sie hemmen reversibel die Cytoplasmateilung (Cytokinese), aber nicht
die Kernteilung (Mitose). Cytochalasine können zu vielkernigen Riesenzellen oder
bei höherer Konzentration zum Austritt des Kerns aus der Zelle führen. Sie hemmen
in Säugetierzellen Bewegungsvorgänge, die mit der Mikrotubuli-Aggregation und
Actin-Filamenbildung zusammenhängen (z.B. Blutgerinnselbildung durch
Blutplättchen). Sie hemmen die Phagozitose, die Pinozytose bei Makrophagen, die
Fortbewegung von Fibroblasen und Amöben, aber nicht die Muskelkontraktion.
Weitere biologische Wirkungen sind antibiotische Eigenschaften.[40]
Cytochalasin X könnte als Hydrolyseprodukt von Cytochalasin L betrachtet werden.
Bei der Untersuchung an der TU Braunschweig der fungiziden, algiziden und
bakteriziden Aktivitäten des Cytochalasins L (Cytochalasin X wurde aus
Substanzmangel nicht getestet) wurden keine interessanten Ergebnisse festgestellt.
Im Mikrotest (Pflanzenschutz, BASF) zeigte sich der Cytochalasin L im
Pflanzenschutz-Screening als ein mittelstarker Wirkstoff.
Isolierung und Strukturaufklärung
93
2.3.2.4 Isolierung und Beschreibung der 3-Nitropropionsäure
C3H5O4N Mr.:119.08
HO N
O
O
O
HH
HH
123
Abbildung 48: Die Struktur der 3-Nitropropionsäure.
Die in Gestalt farbloser Kristalle isolierte Verbindung erwies sich als polarer
Naturstoff mit dem Rf-Wert = 0.70 (CDCl3/MeOH 95/5). Die Gewinnung des Stoffes
erfolgte mittels präparativer RP-18 Dickschichtplatten (Merck). Als Laufmittel wurde
das Gemisch MeOH/Acetonitril 10/90 verwendet. Der Naturstoff ist in Methanol gut
löslich. Auf dem Dünnschichtchromatogramm zeigt sich bei 254 nm eine intensive
UV-Löschung und mit Bromkresolgrün auf dem blauen Hintergrund eine intensiv
gelbe Anfärbung. Im IR-Spektrum ist die Bande einer OH-Valenzschwingung bei ν =
3396 cm-1 zu sehen; weitere charakteristische Banden finden sich bei ν = 1728 cm-1
(C=O) und bei ν = 1556 /1259 cm-1 (die asymmetrische/symmetrische
Valenzschwingung der Nitrogruppe). Das Massenspektrum läßt unter EI-
Bedingungen kein Molekülion erkennen. Im negativen DCI-Spektrum ist ein Peak bei
m/z = 119 zu sehen. Ein weiteres charateristisches Fragment tritt unter Abspaltung
von NO2 bei m/z = 73 (C3H5O2) hervor. Eine Suche über Library Possible Matches for
Scan SI: 679. führt zu 3-Nitropropanoic acid.
Im 13C-NMR-Spektrum sind nur drei Signale zu erkennen. Das Signal bei δ = 174.92
ppm weist auf ein Kohlenstoffatom einer Carbonsäure auf. Das zweite Signal bei δ =
69.66 ppm deutet auf Nachbarschaft zur Nitrogruppe hin. Das dritte Signal bei δ =
31.09 ppm weist die Nachbarschaft einer Carbonsäuregruppe aus. Die Zuordnung
der Protonen zu den Kohlenstoffsignalen und die Verknüpfung der Fragmente wurde
durch die Auswertung der zweidimensionalen heteronuklearen
Korrelationsexperimente (HMQC) bestätigt. Abbildung 49 zeigt die C-H-Korrelationen
der 3-Nitropropionsäure und die Struktur des Moleküls.
Isolierung und Strukturaufklärung
94
174,9
31.1
69.7
HO N
O
O
O
HH
HH
Abbildung 49: Die C-H-Korrelationen in 3-Nitropropionsäure.
Die NMR-Daten der 3-Nitropropionsäure sind in der Tabelle 20 aufgelistet (CD6OD).
Tabelle 20: Die NMR-Daten der 3-Nitropropionsäure.
Atom.
Nr.:
13C-NMR HMQC 1H-NMR 3J [Hz]
1 174.96 s 2,3 - -
2 69.66 t 3 4.72 t 6.0, 6.1
3 31.09 t 2 3.09 t 6.0, 6.1
Die 3-Nitropropionsäure ist ein toxischer Metabolit von Leguminosen, der auch von
Pilzen der Gattungen Penicillium und Aspergllius produziert wird. Sie kommt bei
Pflanzen sowohl in freier Form als auch mit Glucose verestert vor.[40] Die Säure
wurde bereits von mehreren Naturstoffchemikern isoliert und auf biologische Aktivität
untersucht. Sie zeigt sich als wirksames Mittel gegen Mycobacterium tuberculosis.[48]
Isolierung und Strukturaufklärung
95
2.4 Der Pilzstamm 4295
2.4.1 Die 4-(2‘,3‘-Dimethoxy-4‘-methyl-phenyl)-4-oxo-Buttersäure
Mr.: 252.10 C13H16O5
OH
OCH3
H3C
H3CO
O
O
1
2
3
4
1'
2'
3'
4' 5'
6'
7'
8'
9'
Abbildung 50: Die Struktur der Buttersäure.
Der literaturunbekannte Sekundärmetabolit wurde aus dem Pilzextrakt 4295 in der
Menge von 1.4 mg als fester, gelber Stoff gewonnen. Die Substanz ist in polaren
Lösungsmitteln wie Methanol und Wasser gut löslich, in Dichlormethan ist sie
schlecht löslich. Der Naturstoff läßt sich mittels Sprühreagens` “Bromkresolgrün“ als
eine Säure (gelber Fleck auf blauem Hintergrund) erkennen. Die Polarität der
Verbindung (Kieselgel 60, Rf = 0.71, Dichlormethan/Methanol 95/5) macht sich durch
den erhöhten Rf-Wert bemerkbar. Die Substanz ist durch UV-Licht (254 nm)
detektierbar.
Die Interpretation der IR-Spektren führt zu dem Ergebnis, dass das Molekül eine
aliphatische Kette (intensive Bande bei 2918 cm-1) sowie eine aromatische Einheit
und zwei Carbonylfunktionen (Absorbtionsbanden bei 1669 und 1703 cm-1) besitzt.
Die Lage der Carbonylgruppen ist wegen ihrer Neigung zu intra- und
intermolekularen Wechselwirkungen sehr variabel. Die relativ kurzwellige Absorbtion
der Carbonylfunktionen kann durch Konjugation mit dem Aromaten erklärt werden.
Die sehr breite Bande bei 3389 cm-1 könnte für die Valenzschwingung einer OH-
Gruppe in einer Wasserstoffbrücke sprechen. Zwei Absorbtionsbanden
unterschiedlicher Intensität eines Carboxylations bei 1595 (intensiv) und bei 1414 cm
–1 (schwach) sind ebenfalls zu finden.
Isolierung und Strukturaufklärung
96
Die Annahme, dass eine aromatische Verbindung vorliegt, wird durch die drei
Absorbtionsbanden bei 246 nm, 237 nm und 194 nm im UV-Spektrum bestätigt.
Das Massenspektrum liefert unter EI-Bedingungen (70 eV) ein Molekülpeak bei m/z
= 252. Die hochauflösende Messung ergibt die Summenformel C13H16O5. Als
Basispeak tritt der Peak bei m/z = 179 auf. Die Summenformeldifferenz zwischen
dem Molekülion und dem Basispeak erklärt sich durch Abspaltung des Fragments
C3H5O2 (Abb. 51). Vermutlich liegt eine α-Spaltung zu einem Heteroatom vor. Eine α-
Bindung wird bevorzugt gespalten, wobei die Ladung durch das Heteroatom
stabilisiert wird.
O
R
OH
O
m/z = 179 C3H5O2
Abbildung 51: Die Erklärung des Basispeaks.
Die weitere Fragmentierung (m/z = 91) zeigt eine benzylische Struktur. Der Peak bei
m/z = 149 könnte durch die Abspaltung einer Methoxygruppe [CH3O+H]+ von dem
Ion mit m/z = 179 erklärt werden. Allein aufgrund des Massenspektrums und des IR-
Spektrums kann man einige Rückschlüsse auf die Struktur des Moleküls ziehen: Das
Molekül enthält einen mehrfach substituierten Aromaten, eine aliphatische Kette,
eine Säurefunktion und eine Carbonylfunktion.
Im 13C-NMR-Spektrum findet man 13 Signale für acht sp2-hybridisierte
Kohlenstoffatome, die übrigen Kohlenstoffatome sind sp3-hybridisiert. Zu den acht
sp2-hybridisierten C-Atomen ist zu bemerken, dass 2 davon einer Carbonyl- und
Carboxylfunktion entsprechen. Die sp3-hybridisierten C-Atome sind ebenso aufgrund
ihrer chemischen Verschiebung in zwei Gruppen zu unterteilen: Zwei C-Atome haben
ein Sauerstoffatom als Nachbarn, die drei übrigen nicht. Die NMR-Daten des
Naturstoffes sind in Tabelle 21 aufgelistet.
Isolierung und Strukturaufklärung
97
Tabelle 21: Die NMR-Daten des Sekundärmetaboliten.
Atom.
Nr.:
13C-NMR HMQC 1H-NMR H,H-COSY
1 177.36 2, 3, 6‘ 1-OH s 12.48
2 28.48 2 *, 3 t 2.75 3
3 36.95 2, 3 * t 3.32 2
4 199.10 2, 3, 6‘ -
1‘ 124.86 6‘ - -
2‘ 163.36 1‘, 5‘, 6‘, 7‘, 9‘ - -
3‘ 120.39 6‘, 9‘ - -
4‘ 159.36 5‘, 6‘, 8‘, 9‘ - -
5‘ 102.02 5‘ *, 9‘ d 6.67 6‘
6‘ 128.90 6‘ *, 9‘ d 7.62 5‘
7‘ 61.95 7‘ * s 3.87 -
8‘ 8.99 5‘, 9‘ * s 2.16 -
9‘ 55.84 8‘ * s 3.75 -
∗- nicht unterdrückte direkte Kopplung
Die Chelatisierung des Säureprotons H-1 geht aus dem 1H-NMR-Spektrum (12.48
ppm) hervor. Das 1H-NMR-Spektrum erlaubt es, die direkte Nachbarschaft der
Protonen H-5‘ und H-6‘ am Aromaten zu bestimmen (zwei Dublette bei 7.62 und 6.67
ppm mit der vicinalen Kopplungskonstante von 3J = 8.7 Hz). Die Substitution des
Aromaten durch eine Methylgruppe (Singulett bei 2.16 ppm) stimmt mit dem
Massenspektrum (m/z = 91) gut überein. Charakteristisch ist die Lage der zwei
Methoxygruppen bei 3.87 und 3.75 ppm (spricht für eine direkte Substitution am sp2-
hybridisierten Kohlenstoffatom).[51] Als Fragment des Moleküls kann die unten
abgebildete Struktur angenommen werden.
Isolierung und Strukturaufklärung
98
H
H
H3C
H3CO 2
Abbildung 52: Das aromatische Fragment des Moleküls.
Zwei Triplette (3.32 und 2.75 ppm) mit der Kopplungskonstanten von 3J = 6.5 Hz
sprechen für zwei benachbarte Methylengruppen. Die chemische Umgebung beider
Methylengruppen kann die relative Tieffeldverschiebung erklären. Die weitere
Aufdeckung des Molekülaufbaus gelingt mittels der 2D-NMR-Spektren (HMBC). Die
long-range-Kopplungen der Carbonyl- und Carboxylkohlenstoffatome mit den
Methylengruppen führen zum in Abbildung 53 dargestellten Fragment.
O
OH
O
1
2
3
4
Abbildung 53: Der aliphatische Teil der Struktur.
Aussagen über die Verknüpfung der aliphatischen Kette mit dem Aromaten gelingen
dank der heteronuklearen Fernkopplungen (HMBC, Abb. 54).
O
OH
H
H
O
1
2
3
4
1'
2'
3'
4'
5'
6'
H3C
H3CO
2
Abbildung 54: Die heteronukleare Fernkopplungen der Substanz.
Der nächste Schritt ist die Zuordnung von zwei Methoxy- und einer Methylgruppe am
Aromaten. Die drei möglichen Regioisomere sind nachstehend abgebildet.
Isolierung und Strukturaufklärung
99
OCH3
H3CO
H3CO
O
H3C
H3CO
OCH3O
H3CO
H3C
OCH3
abc
1'
2'
3'
4' 5'
6'
4
8'
9'
7'
Abbildung 55: Drei mögliche Regioisomere des Naturstoffes.
Die quartären Kohlenstoffatome, an denen sich die Methoxygruppen befinden,
zeigen eine chemische Verschiebung von 163.36 ppm (C-2‘) und 159.36 ppm (C-4‘).
Diejenige Methoxygruppe, die der Carbonylgruppe (C-4) am nächsten steht, sollte
die Tieffeldverschiebung aufweisen.
Die Position der zweiten Methoxygruppe 9‘ kann nicht nur aufgrund von
Fernkopplungen ermittelt werden. Die Kohlenstoffatome C-3‘ und C-4‘ weisen
ähnliche Korrelationen zu den Protonen H-5‘, H-6‘, H-7‘/H-8‘, H-9‘ auf.
Logischerweise kann man annehmen, dass die Methoxygruppe 7‘ (61.95 ppm)
wegen der Tendenz zur Tieffeldverschiebung des C-Atoms-2‘ mit dem
Kohlenstoffatom C-2‘ direkt verknüpft ist. Die long-range-Korrelation zwischen C-
Atom-2‘ und der Metoxygruppe 7‘ und diejenige zwischen dem C-Atom-4‘ (159.36
ppm) und der Methoxygruppe 9‘ (55.84 ppm) könnten eher für die Variante b in
Abbildung 57 sprechen. Dennnoch reicht diese Information nicht für eine sichere
Lagebestimmung der Methoxygruppen aus. Einen wichtigen Beitrag zur Lösung
dieser Frage leistet die heteronukleare Kopplung des C-Atoms-8‘ der Methylgruppe
mit dem aromatischen Proton H-5‘ sowie auch die Kopplung des C-Atoms-5‘ mit den
Methylprotonen H-8‘.
Isolierung und Strukturaufklärung
100
OH
O
OOCH3
H
H
H3C
H3CO
1'
2'
3'
4'
5'
6'
8'
7'
9'
43
21
Abbildung 56: Die zu diskutierende Variante der Molekülstruktur und ihre relevanten Kopplungen.
Der entscheidende Punkt ist aber die chemische Verschiebung des C-Atoms C-5‘
(102.02 ppm). Diese signalisiert die direkte Nachbarschaft zu einer Methoxygruppe.
Die Abbildung 57 zeigt die plausibelste Bauvariante mit den chemischen
Verschiebungen aller C-Atome.
OH
O
O
OCH3
H3C
H3CO
177.36
28.48
36.95
199.10
124.86
163.36
120.39
159.36
102.02
128.90
61.95
8.99
55.84
Abbildung 57: Die Struktur der aromatischen Säure mit Eintragungen der chemischen
Verschiebungen.
2.4.2 Biologische Aktivität
Wegen Substanzmangels (1.4 mg) wurde der Naturstoff in der Technischen
Universität Braunschweig nicht auf fungizide, algizide und bakteriozide Wirkung
getestet. Im übrigen zeigte der Pilzextrakt in biologischen Tests keine interessanten
Eigenschaften.
Zusammenfassung und Ausblick
101
3 Zusammenfassung und Ausblick
Die Dissertation beschäftigt sich mit der Isolierung von Naturstoffen aus Pilzextrakten
und der Synthese von biologisch aktiven Naturstoffen.
Bei der Isolierung der Naturstoffe wurden insgesamt vier Pilzstämme bearbeitet.
Der erste Pilzstamm 4729 ist ein aus Atropa Belladonna isolierter Endophyt.
Taxonomisch konnte der Pilzstamm nicht identifiziert werden. Aus diesem Pilzstamm
konnten insgesamt sechs Sekundärmetabolite isoliert und identifiziert werden. Bei
allen Substanzen handelt es sich um Vertreter der in der Literatur beschriebenen
Klasse der Preussomerine. Drei der isolierten Preussomerine (Preussomerine J, K
und L) sind literaturunbekannt. Die isolierten Preussomerine G–L wurden auf ihre
fungizide, bakterizide und algizide Wirkung in der mikrobiologischen Abteilung der
TU Braunschweig getestet. Alle Naturstoffe sind gegen das gram-positive Bakterium
Basillius megaterium wirksam. Im Pharma-Grundscreening (BASF) konnten keine
verfolgenswerten Wirkungen der oben genannten Preussomerine beobachtet
werden. Die Preussomerine G, I, J, K und L zeigen im Mikrotest (Pflanzenschutz)
gegen die Pilze Phytophtora und Pyriculria eine gute Wirkung. Besonders fällt im
Mikrotest das Preussomerin G auf. Es wird auf Patentfähigkeit geprüft. In der
Literatur sind bereits die pharmakologischen Wirkungen der Preussomerine G, H und
J beschrieben. Sie erwiesen sich, besonders das Preussomerin G, als wirksame
Hemmer der FTPase, können also die Entstehung von Tumoren hemmen.
Der zweite bearbeitete Pilzstamm 5049 konnte ebenfalls nicht taxonomisch bestimmt
werden. Hieraus konnten insgesamt vier Sekundärmetaboliten isoliert werden. Einer
hiervon, die 3-Nitropropionsäure, wurde bereits 1946 isoliert. Zwei weitere
Naturstoffe, Cytochalasin L und X, gehören zu der Klasse der Cytochalasine. Das
Cytochalasin L wurde schon in der Literatur beschrieben. Das Cytochalasin X kann
als Hydrolyseprodukt von Cytochalasin L angesehen werden. Die Cytochalasine sind
aufgrund ihrer vielfältigen biologischen Eigenschaften interessant. Sie hemmen
reversibel die Cytoplasmateilung (Cytokinese), aber nicht die Kernteilung (Mitose).
Zusammenfassung und Ausblick
102
Cytochalasine können zu vielkernigen Riesenzellen oder in höheren Konzentrationen
zum Austritt des Kerns aus der Zelle führen. Sie hemmen in Säugetierzellen
Bewegungsvorgänge, die mit der Mikrotubuli-Aggregation und der Actin-
Filamenbildung zusammenhängen (z.B. Blutgerinnselbildung durch Blutplättchen).
Sie hemmen Phagozitose, Pinozytose bei Makrophagen, die Fortbewegung von
Fibroblasen und Amöben, aber nicht die Muskelkontraktion. Weitere Wirkungen sind
antibiotischer Natur.
Bei der Untersuchung des Cytochalasins L auf seine fungiziden, algiziden und
bakteriziden Aktivitäten in der TU Braunschweig wurden keine interessanten
Ergebnisse festgestellt (Cytochalasin X wurde aus Substanzmangel nicht getestet).
Im Mikrotest (Pflanzenschutz, BASF) zeigte sich das Cytochalasin L als ein
mittelstarkes Mittel gegen Phytophtora. Der letzte isolierte Sekundärmetabolit ist der
Naturstoff „P“. Er ist strukturell besonders interessant, da er als Dimer vorliegt. Der
Naturstoff gehört zu der Klasse von Anthraoiden, die von natürlich vorkommenden
Anthracenen abgeleitet sind. Der Naturstoff zeigt im Pflanzenschutz-Screening
(Mikrotest, BASF) starke fungizide Aktivität. Die Strukturaufklärung des Naturstoffes
fordert eine chemische Umsetzung zu einem Veresterungsprodukt. Es entstand ein
Diol, welches ebenfalls in der mikrobiologischen Abteilung der TU Braunschweig auf
fungizide, algizide und bakterizide Wirkung getestet wurde. Es zeigte aber keine
einschlägigen Aktivitäten.
Der dritte bearbeitete Pilzstamm 4295 konnte nicht taxonomisch bestimmt werden.
Es wurden keine interessanten biologische Wirkungen des Pilzextraktes beobachtet.
Aus diesem Pilz konnte aber ein Sekundärmetabolit isoliert werden: die literatur-
unbekannte 4-(2‘,3‘-Dimethoxy-4‘-methyl-phenyl)-4-oxo-buttersäure. Da nur sehr
geringe Substanzmengen isoliert wurden, konnte sie nicht auf seine biologische
Aktivität getestet werden.
Der vierte und letzte bearbeitete Pilzstamm 4729 enthielt keine Sekundärmetaboliten
und ist nicht biologisch aktiv.
Neben der Isolierung der Naturstoffe wurde die Synthese des Sekundärmetaboliten 8
optimiert. Eine Herstellung im Gramm-Maßstab ist möglich. Der Naturstoff 8 weist im
Zusammenfassung und Ausblick
103
pharmakologischen Grundscreening eine interessante biologische Aktivität als ICE-
Inhibitor (interleukin-converting-enzyme) auf.
Experimenteller Teil
104
4 Experimenteller Teil
4.1 Allgemeines zu den benutzten Analysen und Meßverfahren
Die analytische Dünnschichtchromatographie wurde mit Kieselgel-Fertigfolien
(Kieselgel 60) mit Fluoreszenzindikator (254 nm) oder mit RP-18-Octadecyl-
modifitierten Phasen einer Schichtdichte von 0.2 bis 2.0 mm der Firma E. Merck AG,
Darmstadt, durchgeführt. Die Detektion der Substanzen wurde durch UV-Licht
(Löschung der Fluoreszenz des Indikators bei λ = 254 nm oder Anregung der
Eigenfluoreszenz bei λ = 366 nm), durch Anwendung der Sprühreagentzien
ermöglicht:
1. Cer (IV)-Molybdatophosphorsäure (Universalreagens):
Eine Lösung aus 10 g Cer-(IV)-sulfat, 25 g Molybdatophosphorsäure in 60 ml
konz. H2SO4 und 940 ml H2O.
2. 2,4-Dinitrophenylhydrazin für Aldehyde und Ketone:
1 g des 2,4-Dinitrophenylhydrazins wurden in 1000 ml Ethanol mit 5 ml H2SO4
(98%) aufgelöst. Aldehyde und Ketone bilden beim Erwärmen gelbe bis braune
Flecken.
3. Bromkresolgrün für Säuren:
Eine 0.04 %ige Lösung von Bromkresolgrün in Isopropanol (Merck) entwickelt
Säuren, die als intensiv gelber Fleck auf einem blauen Hintergrund erscheinen.
4. Eisen(III)-chlorid-Lösung in Ethanol:
Die Lösung wurde für die Anfärbung der Phenole (blaue Einfärbung der
Substanz) bzw. der chelatisierten Hydroxygruppe (braune Einfärbung) benutzt.
5. Ninhydrin für Aminofunktionen:
Eine 0.2 %ige Lösung des Ninhydrins in Ethanol detektiert Aminogruppen.
Präparative Schichtchromatographie (PSC):
Für die präparative Schichtchromatographie wurden mit Kieselgel 60 und RP 18
beschichtete Fertigplatten der Schichtdicke von 0.2 bis 2.0 mm der Firmen Merck
oder Schleicher & Schüll (20×20cm) verwendet.
Experimenteller Teil
105
Säulenchromatographie
Für die präparative Säulenchromatographie diente Kieselgel 60 (Korngröße 0.040–
0.063 mm) der Firmen Merck KGaA oder Macherey-Nagel als stationäre Phase. Die
Zusammensetzung von Laufmittelgemischen ist in den Vorschriften angegeben; alle
Lösungsmittel wurden zuvor destilliert.
Solid Phase Extraktion (SPE)
Bei kleinen Substanzmengen (2-5 mg) und relativ großen Unterschieden der Rf-
Werte wurden die fertigen SPE PR 18 Octadecyl-Säulen der Firma Merck AG,
Darmstadt, angewendet. Die Säulen wurden je nach der Polarität und dem
hydrophoben Charakter der Substanz entweder mit einem polaren Lösungsmittel
(Methanol) oder einem unpolaren Lösungsmittel (Dichlormethan) konditioniert. Die
Zusammensetzung der Lösungsmittel ist in den Vorschriften angegeben.
HPLC
Zur Lösung schwieriger Trennprobleme kam eine HPLC-Anlage der Fa.
Merck/Hitachi zum Einsatz. Die Anlage besteht aus einer L-6000 Intelligent Pump,
einem L-3000 Photo Diode Array Detektor, einem LC-Organizer 885-5931 mit dem
Rheodyne 6-Wegeventil 7125 und dem Chromatographintegrator D 2000. Für die
HPLC-Anlage wurden folgenden Fertigsäulen der Fa. Merck benutzt:
Hibar-Fertigsäule RT (250-25) LiChrosorb Si 60 (7µm)
Macherey-Nagel CC 125/4 Nucleosik 100-5 C-1
LiChrosorb Si 60 (5 µm), Cat. 1.50388
LiChrosorb Si 60 (7 µm), Cat. 50935
LiChrosorb Si 60 (7 µm), Cat. 51435
Lichrospher 60 RPSelect B (10 µm)
Alle Lösungsmittel wurden zusätzlich im Ultraschallbad (Lobson 200) entgast.
NMR-Spektroskopie
Zur Messung der NMR-Spektren dienten folgende NMR-Spektrometer:
Experimenteller Teil
106
Bruker DMX-600, ARX-400, AM-300 der Gesellschaft für Biotechnologische
Forschung mbH Braunschweig
Bruker AMX-300, ARX-200 der Universität Paderborn
Die chemischen Verschiebungen δ sind in ppm angegeben und auf das TMS-Signal
als inneren Standard bezogen. Die Abkürzungen für die Multiplizitäten lauten:
(s) Singulett bzw. quartäres Kohlenstoffatom
(d) Dublett bzw. tertiäres Kohlenstoffatom
(t) Triplett bzw. sekundäres Kohlenstoffatom
(q) Quartett bzw. primäres Kohlenstoffatom
(m) Multiplett
An dieser Stelle möchte ich Herrn Dr. Wray (GBF, Braunschweig) besonders für die
Aufnahme der vielen NMR-Spektren und für ständige Diskussionsbereitschaft
danken.
Massenspektroskopie
Die Aufnahme der Massenspektren sowie die Bestimmung der Feinmassen erfolgte
durch Herrn Dr. Schulze und Herrn Dr. Dülcks von der Universität Bielefeld an einem
Finigan MAT 8200 (70 eV). Alle relativen Intensitäten sind auf den Basispeak
bezogen (ist jeweils in Klammern angeben).
Den genannten Personen sei an dieser Stelle herzlich gedankt.
Röntgenstrukturanalyse
Die Röntgenstrukturanalysen erfolgten durch Herrn Dr. U. Flörke (Uni Paderborn),
dem ich hiermit herzlich danke.
UV/VIS-Spektroskopie
Die UV-Spektren wurden mit einem Shimazu UV-2101 PC UV-VIS-
Spektralphotometer gemessen.
Optische Rotation
Experimenteller Teil
107
Die Drehwerte wurden unter Verwendung einer Natriumlampe (D-Linie, λ = 589 nm)
in einer nichtthermostatisierten Standardküvette (d = 1 dm) bestimmt. Dafür wurde
das Polarimeter 241 der Fa. Perkin-Elmer benutzt. Für die angegebenen Drehwerte
wurden die verwendeten Lösungsmittel und ihre Konzentration benannt.
Schmelzpunktbestimmung
Die Schmelzpunkte wurden in offenen Kapillaren mit einer
Schmelzpunktbestimmungsapparatur der Fa. Gallenkamp bestimmt und sind
unkorrigiert.
Mikrobiologische Arbeitsmethoden
Die Arbeitsgrupe von Herrn Prof. Dr. Aust, Institut für Mikrobiologie der TU
Braunschweig, fertigte die Rohextrakte der Pilzstämme an. An dieser Stelle möchte
ich für die geleistete Arbeit Frau Dr. Schulz, Frau Qunxiu Hu und Herrrn Dr. S.
Dräger meinen besonderen Dank aussprechen.
Anzucht der Pilzstämme
Die ausgewählten Pilzstämme wurden entweder auf einem Biomalzweichagar- oder
Malzextraktweichagar-Nährmedium kultiviert. Für diese Zwecke wurden 200 oder
250 ml des Mediums in Fernbachkolben bei ca. 120 °C und 2 bar sterilisiert.
Anschließend wurde der Pilz von einer Schrägagarkultur überimpft und bis zu 122
Tage lang inkubiert.
Zusammenfassung der Aktivitätstests
Für die Beurteilung der biologischen Aktivität der untersuchten Pilzextrakte wurden
verschiedene biologische Aktivitätstests durchgeführt:
das Biogram
der Agardiffusionstest
der Keimlingstest
Als Erstes wird für den Pilzextrakt ein Biogramm erstellt. Dazu werden verschiedene
Dünnschichtchromatogramme (unterschiedliche Laufmittel) mit einer Suspension des
Experimenteller Teil
108
Testorganismus (Cladosporium cucumernum) besprüht (6%ige Biomalzlösung) und
in einer Feuchtkammer zwei bis drei Tage lang inkubiert. Die schwarze Einfärbung
des DCs zeigt die Produktion und den Ort fungizider Substanzen noch vor der
präparativen Trennung an.
Unter dem Agardiffusionstest/Plättchentest versteht man die Untersuchung des
Pilzextraktes oder der Reinsubstanzen auf fungizide, bakterizide und algizide
Aktivität. Die benötite Konzentration der untersuchten Probe in Methanol oder Aceton
beträgt gewöhnlich 1mg/ml oder 10 mg/ml. Für die Untersuchung werden
Filterplättchen mit dem Kulturfiltrat getränkt und auf die Oberfläche von
Hartagarplatten gelegt. Diese werden mit einer Suspension der Testorganismen
besprüht.
Tabelle 22: Testorganismen für das Screening.
Bakterien Pilze Algen
Bacillius megaterium Ustilago maydis Chlorella fusca
Escherichia coli Eurotium repens
Mycothypha microspora
Fusarium oxysporum
Die zu untersuchenden Substanzen diffundieren ins Agar und hemmen je nach der
Aktivität der Substanz das Wachstum der Testorganismen. Bei den Bakterien und
Pilzen können die Ergebnisse nach zwei bis drei Tagen, bei Algen der Art Chlorella
fusca nach sieben Tagen abgelesen werden. Dabei ist die Größe des Hemmhofs von
Bedeutung.
Für den Keimlingstest werden die Pflanzen Medicago sativa (Luzerne) und
Lepidium sativium (Gartenkresse) genommen. 0.75 ml der zu testenden Substanz
werden in 6.75 ml Wasser aufgenommen, auf eine Petrischale pipettiert und mit
Filterpapier bedeckt. Auf das Filterpapier werden die Samen der Pflanzen gelegt. Die
Beurteilung des Testes erfolgt anhand der Zahl der gekeimten Samen, sowie der
Länge der Keimlinge im Vergleich zu einer Referenzplatte (ohne Testsubstanz).
Experimenteller Teil
109
4.2 Die Synthese des Sekundärmetaboliten 2,6-Dihydroxy-8-methoxy-3-oxo-
3,4,5,6-tetrahydronaphtalin-1-carbaldehyd
Der Sekundärmetabolit 8 besitzt ein Tetralongerüst. Der Naturstoff 8 weist im
pharmakologischen „Grundscreening“ gute Werte als ICE-Inhibitor auf.[52] Die
Stereochemie des Naturstoffs konnte wegen der geringen Substanzmenge nicht
bestimmt werden. Die Analyse der NMR-Daten deutet nur auf die axiale Anordnung
der Hydroxygruppe am Cyclohexenonring. Der Naturstoff ist optisch aktiv und besitzt
einen Drehwert von [α]20D = – 28.6 ° (c = 0.1; CH2Cl2).[24] Die Synthese des
Sekundärmetaboliten wurde am Beispiel eines Racemates nach einem von Dr. K.
Beckmann eingeführten Schema dahingehend optimiert, dass nun präparative
Darstellung im größeren Maßtab möglich ist. Das retrosynthetische Schema ist in
Abbildung 58 dargestellt.
OOH
O
H
O
OH OH
O
O
O
O
O
O
O
OH
O
OO
O
6
8
Abbildung 58: Die Retrosynthese des Sekundärmetaboliten.
Die Vorteile dieses Syntheseplans sind :
– Geringe Zahl der Stufen
– Die überwiegende Zahl der Reaktionen ist klassisch und liefert gute Ausbeuten.
Experimenteller Teil
110
O
O
O
O
O
AlCl3
CH2Cl2abs
20 h, RT
O
O
OH
O
O
Zn, HCl
20-22 h
reflux
O
O
OH
O
O
O
O
TFA/TFAA
0° C, 2 h
O
O
OH
THFabs
Oxazaborolidin
O
O
O
O
PvCl,
RT
Pyridin
12 h
OPv
O
O
OO
K2S2O8
CuSO4
AlCl3
CH2Cl2abs
O° C
OPv
OH
O
OO
OH
O
OO
OH
Et2O, O° C
(CH3)3CK
H2O
95%
98%
74%
AcCN/H2O
62%
95%
1
2
3
45
6
7
8
15%
Schema 8: Die Synthese des Sekundärmetaboliten 8 mit Ausbeuten.
Experimenteller Teil
111
Die Synthese der 4-Oxobuttersäure 1 (Schema 8) gelingt mit quantitativen
Ausbeuten von 95% über die Friedel-Crafts-Acyllierung. Ausgehend vom käuflichen
2,6-Dimethoxytoluol und von Bernsteinsäureanhydrid kann man in CH2Cl2abs nach
20-stündigem Rühren bei RT die Säure 1 erhalten. Die Desoxygenierung nach
Clemmensen zur Verbindung 2 muss unter Kontrolle der Menge der HClkonz
durchgeführt werden. Die Salzsäure soll portionsweise nach 1-2 Stunden zugetropft
werden. Wichtig ist dabei die vorherige Amalgamierung des Zn mit HgCl2/HCl/H2O.
Die Reaktion verläuft im wäßrigen Medium unter Rückfluß innerhalb von 20 bis 22
Stunden (Ausbeute: 99%). Bei Überdosierung der Salzsäure tritt oft als
Nebenreaktion die sauerkatalysierte Abspaltung einer der Methoxygruppen auf.
Dieser Schritt wird bei dem Ringschluss mit TFA/TFAA als O-Acyllierung (Abb. 59)
deutlich.
OH
O
OH
O60%
TFA/TFAA
0 °C, 2 h
O
O
O
Abbildung 59: Der schematische Verlauf der O-Acyllierung als Nebenreaktion.
Das Auftreten dieser Reaktion kann aber bei richtiger Dosierung der Salzsäure unter
DC- und 1H-NMR-Reaktionskontrolle vermieden werden. Der Ringschluss von 2 zum
Tetralon 3 verläuft unter saurer Katalyse mit TFA/TFAA und führt zu 74 %
chemischer Ausbeute.
Da die absolute Konfiguration des Sekundärmetaboliten nicht bestimmt worden ist,
wurde die Synthese aus Kostengründen am Beispiel des (R)-Alkohols durchgeführt.
Die enantioselektive Reduktion des Tetralons 3 zum Tetralol 4 (R) erfolgt mit dem
von Corey et al. entwickelten Oxazaborolidin 12 (CBS-Methode, Abb. 60).[6, 53, 54] Der
chirale Katalysator kann erhalten werden, wenn man vom käuflichen (S)-(—)-α-
Diphenylprolinol (1.5 eq) ausgeht und es mit Trimethylboroxine (1.0 eq) in Toluol
nach dem in Abbildung 60 dargestellten Mechanismus umsetzt.[54] Die
enantioselektive Reduktion des prochiralen Ketons 3 (Schema 8) erfolgt erst bei der
Experimenteller Teil
112
Zugabe des Diborans (in THF, Abb. 60-61) zum Pyrrolidin 11. Infolgedessen ist die
entstehende Verbindung 12 (ein CBS-Katalysator, Corey, Bakshi, Shibata) in der
Lage, wegen der Voraktivierung mit BH3∗THF eine Hydridübertragung zu starten
(Abb. 60). Der andere Vorteil dieses Katalysators ist seine Stabilität bei RT.[55, 6]
Corey wies auf die gleichen ee-Werte bei der TR und bei tieferen Temperaturen (-80°
C) hin. Die Reaktionszeiten dauern bei RT von 5 bis 20 min.[53, 54, 56, 57, 58, 59, 60]
(S)-(-)-a-Diphenylprolinol
NH
Ph
Ph
OH
H
N
O
H
B
PhPh
H
CH3
(CH3BO)3
0.67 equiv
Toluol, 20 °C O
B
CH3
O
H
N
O
H
B
PhPh
HCH3
N
O
H
B
PhPh
CH3
B2H6, THF
BH3
-CH3B(OH)2
Toluol
Wasserabscheider
910
11
12
Abbildung 60: Der Mechanismus der Oxaborolidinons-Synthese 12 (CBS-Katalysator).[61]
Das Zwischenprodukt 10 wurde nicht isoliert. Die zweimalige azeotrope Destillation
des Zwischenproduktes 10 in Toluol bei 130° C lieferte unter Abspaltung der in
Wasser gut löslichen Methylboronsäure die Verbindung 12.[62] Das verbrückte
bicyclische chirale Fünfringsystem und die Chelatisierung des Sauerstoffatomes
durch das B-Atom sorgen für die Enantioselektivität der Reaktion. Die Reduktion
eines prochiralen Ketons zu Enantiomeren reinem (R)-Alkohol unter Mitwirkung des
Experimenteller Teil
113
chiralen CBS-Katalysators ist in der Literatur am Beispiel der aromatischen Ketone
ausführlich beschrieben.[63]
B
H
H
H
N
O
H
B
PhPh
CH3
RsRL
OBH2
N
O
H
B
PhPh
CH3
RsRL
O
H
BH3
BH3
N
O
H
B
PhPh
CH3
RsRL
O
H
RSRL
OBH2
H
RSRL
O
H
2
BH
H2O
RSRL
OH
H
(R)-Alkohol
Abbildung 61: Die enantioselektive Reduktion des prochiralen Ketons unter CBS-Katalyse.[42]
Die nach Abbildung 60 und 61 durchgeführte Reduktion des Ketons 3 führte zu 72 %
chemischer Ausbeute. Der ee-Wert konnte mit chiraler Hydrodexsäule nicht bestimmt
werden. Der Drehwert des Alkohols wurde mit [α]20D =0 (c = 0.07; CH2Cl2) bestimmt.
Möglicherweise muß die Reduktion bei tieferen Temperaturen ausprobiert werden.
Die weitere Reduktion des Tetralons 3 wurde mit LiAlH4 durchgeführt.
Nach der Reduktion des Tetralons 3 zum Alkohol 4 wird dieser mit Pivaloylchlorid
zum geschützten Produkt 5 weiterentwickelt. Die Oxidation der beiden
nichtfunktionalisierten benzylischen Stellen zum Aldehyd 6 ist in der ganzen
Synthese wegen der zahlreichen Nebenprodukte und schlechten Ausbeuten der
schwierigste Schritt.[52, 64] Die Oxidation der beiden benzylischen Stellen wurde von
Dr. K. Beckmann mehrmals durchgeführt. Aus der großen Zahl der
Oxidationsmöglichkeiten wurde die radikalische Oxidation mit Kaliumperoxodisulfat
unter der Katalyse von Cu(II)SO4 ausgewählt, weil diese Reaktion die besten
Ausbeuten lieferte (30%).[52] Alle Variationen der Menge des Oxidationsmittels und
des Katalysators sowie der Temperatur und der Reaktionszeiten brachten als
Experimenteller Teil
114
Ergebnis, dass sich als Hauptprodukt das Keton 13 (Ausbeute 30-40%) bildet (Abb.
62).
O
O
O
OO
O
O
OO
H
O
O
O
O
O
O
K2S2O8
CuSO4
70-80° C
30-40%
10-15%
6
12
5
O
O
O
O
HO
O
25-30%
K2S2O8
CuSO4
70-80° C
K2S2O8
CuSO4
70-80° C
89%
13
Abbildung 62: Die Oxidation des geschützten Alkohols 5 zum Aldehyd 6.
Für den Fall, dass die Ausbeuten beim Schritt 5 nach 6 nicht verbessert werden
können, muss das retrosynthetische Schema geändert werden. Der Mechanismus
der radikalischen Oxidation mit K2S2O8/Cu(II) verläuft in folgenden Schritten:[65]
Experimenteller Teil
115
K2S2O8 (O-SO2-O)-2 2(O-S-O) Cu2+
+
Cu3+
CH3
+ Cu2+
CH3-H+
CH2CH2
CH2
OH
Cu3+ CH
O
+ Cu2+
-H+
RR
R R Cu3+ CH2
R
RR
Cu3+
Abbildung 63: Der Mechanismus der radikalischen Oxidation.[65]
Der Mechanismus zeigt, dass die Reaktion in mehreren Stufen verläuft. Die
Annahme, dass die Reaktion von der Verbindung 5 über 12 zur Verbindung 6 abläuft
(Abb. 62), hat sich nicht bestätigt. Daher wurden nach Feststellung der Verbindung
12 im Reaktionsgemisch der Oxidationsmittel (4 eq.) und ein Katalysator (0.40 eq)
zusätzlich zugegeben. Die Reaktion dauerte bei 70-80° C bis zu 17 Stunden (Lit.: 2-3
h).[65] Es wurde keine Steigerung der Ausbeute beobachtet.
Die Isolierung aus dem Reaktionsgemisch des Alkohols 13 erklärt der in Abbildung
62 dargestellte Mechanismus. Die Umsetzung des Alkohols 13 zum Aldehyd 6 mit 2
eq. des Oxidationsmittels und 0.10 eq. des Katalysators liefert das gewünschte
Produkt 6 in sehr guten Ausbeuten. Dadurch kann die gesamte Ausbeute des
Aldehyds 6 bis auf 40-45 % gesteigert werden.
Die durch die Behandlung von 6 mit der Lewis-Säure AlCl3 (CH2Cl2abs) bewirkte
selektive Methyletherspaltung an der Position C-8 liefert das Phenol 7.[66] Der Grund
für die Regioselektivität der Spaltung liegt wahrscheinlich in dem stabileren
Übergangszustand des AlCl3-Komplexes, der von zwei Sauerstoffatomen komplexiert
Experimenteller Teil
116
wird. Die Durchführung der Reaktion mit 5 eq. von AlCl3 bei RT (4 Tage) liefert das
Phenol 7 (Schema 8) in einer chemischer Ausbeute von 60 %.
Die Entschützung des Esters 7 mit sensibler Aldehydfunktion wurde nach dem
Verfahren durchgeführt, das sich besonders für sterisch gehinderte Ester bewährt
hat. Die Reaktionszeiten der Verseifung sind unterschiedlich (2-48 h).[65,°67] Die
Verseifung von 7 (1 mol) mit Kalium-tert.-Butylat (8 mol) und Wasser (2 mol) in
THFabs zeigt nach 5 h keine Umsetzung; bei längeren Zeiten wurde die Destruktion
des Eduktes beobachtet. Der Reaktionsschritt soll weiter optimiert werden.
Die Zusammenfassung der Synthese:
1. Die präparative Herstellung des Naturstoffs 8 in größerem Maßstab ist bei
Optimierung des letzten Schrittes möglich.
2. Die Durchführung der Oxidation unter Berücksichtigung des Alkohols 13 führt
zum gewünschten Aldehyd in einer Gesamteausbeute von 40-45 %.
3. Die enantioselektive Reduktion des prochiralen Ketons soll bei tieferen
Temperaturen durchgeführt werden.
Experimenteller Teil
117
4.3 Die analytischen Daten der Naturstoffe
4.3.1 Die analytischen Daten des Preussomerins L
Der systematische Name ist in der Literatur durch einen trivialen Namen ersetzt.
Rf-Wert = 0.61 (SiO2, CH2Cl2/MeOH 95:5).-
Schmelzpunkt: 171-173 °C.-
Drehwert: [α]25D = -557 °, (c 0.11, CH2Cl2).-
IR (KBr) ν = 3382, 2925, 2851, 1722, 1649, 1434, 1044, 870 cm-1.-
UV (CH2Cl2): λmax (lg ε) = 359 (2.96), 315 (2.89), 258 (3.52), 226 (3.61), 194 (2.92)
nm.-
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 2.99 (dd, 1H, J =18.3 Hz, J = 2.7 Hz, 2b‘-H), 2.97
(dd, 1H, J = 18.3 Hz, J = 2.7 Hz, 2b-H), 3.39 (s, 1H, 3‘-OH), 3.49 (dd, 1H, J = 3.2 Hz,
J = 18.3 Hz, 2a’-H), 3.59 (dd, 1H, J = 3.2 Hz, J = 18.3 Hz, 2a-H), 3.68 (s, 1H, 3‘-OH),
4.75 (dd, 2H, 3,3‘-H), 6.97 (d, 1H, J = 9.2 Hz, 8-H), 7.16 (d, 1H, J = 9.2 Hz, 7-H), 7.21
(dd, 1H, J = 8.2 Hz, J = 1.0 Hz, 7’-H), 7.48 (t, 1H, 8‘-H), 7.63 (dd, 1H, J = 7.8 Hz, J =
1.0 Hz, 9‘-H), 10.16 (s,1H, 10-OH).-
13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ = 43.21 (t, C-2/C-2‘ ), 43.56 (t, C-2‘/C-2), 70.76 (d, C-
3/C-3‘), 70.97 (d, C-3’/C-3), 95.66 (s, C-4), 95.71 (s, C-4’), 114.15 (s, C-10), 119.55
(s, C-5), 121.08 (d, C-8), 121.55 (d, C-9’/C-8‘), 121.65 (d, C-8’/C-9‘), 122.63 (d, C-7’),
126.89 (d, C-7), 132.12 (s, C-5’/C-10‘), 132.22 (s, C-10’/C-5‘), 144.41 (s, C-6),
152.33 (s, C-6’), 158.10 (s, C-9), 195.98 (s, C-1’), 202.24 (s, C-1
Summenformel: C20H14O8 Molmasse: 382.07 g mol-1.-
HRMS(EI): (m/z) = 382.06795 berechnet
382.06888 gefunden.-
Experimenteller Teil
118
4.3.2 Die analytischen Daten des Preussomerins K
Rf-Wert = 0.17 (SiO2, CH2Cl2).-
Schmelzpunkt: wegen öliger Konsistenz kein Schmelzpunkt bestimmbar.-
Drehwert: [α]25D = -150 °, (c 0.04, CH2Cl2).-
IR ν =3415, 2924, 2846, 1708, 1465, 1419, 1274, 1025, 932 cm-1 .-
UV (CH2Cl2): λmax (lg ε) = 363 (1.11), 314 (1.23), 250 (1.64), 260 (1.45), 230 (1.86)
nm.-
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 3.03 (dd, 1H, J = 2.7 Hz, J = 18.3 Hz, H-2‘b), 3.37
(dd, 1H, J = 3.3 Hz, J = 18.3 Hz 2’a-H), 3.84 (d, 1H, J = 4.0 Hz, 3-H), 3.53 (s, 1H, 3’-
OH), 4.26 (d, 1H, J = 4.0 Hz, 2-H), 4.84 (t, 1H, J =3.3 Hz, J = 2.7 Hz, 3’-H), 6.94 (d,
1H, J = 9.2 Hz, 8-H), 7.02 (d, 1H, J = 9.2 Hz, 7-H), 7.05 (dd, 1H, J = 8.1 Hz, J = 1.0
Hz, 7’-H), 7.39 (t, 1H, 8’-H), 7.65, (dd, 1H, J = 7.7, J = 1.0 Hz, 9’-H), 10.12 (s.1H, 9-
OH).-
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 41.30 (t, C-2’), 52.17 (d, C-3), 53.67 (d, C-2), 70.28
(d, C-3’), 93.58 (s, C-4), 94.38 (s, C-4’), 110.26 (s, C-10), 115.04 (s, C-5), 119.81 (s,
C-5’), 121.13 (d, C-9’), 120.32 (d, C-7), 121.52 (d, C-7’), 126.46 (d, C-8), 130.85 (d,
C-10’), 131.15 (d, C-8’), 142.52 (s, C-6), 149.73 (s, C-6’), 156.06 (s, C-9), 193.39 (s,
C-1’), 195.64 (s, C-1).-
Summenformel: C20H12O8 Molmasse: 380.05 g mol-1.-
HRMS(EI) (m/z): = 380.05347 gefunden
380.05322 berechnet.-
Experimenteller Teil
119
4.3.3 Die analytischen Daten des Preussomerins I
Rf-Wert = 0.43 (SiO2, CH2Cl2).-
Drehwert: [α]25D = -218 °, (c 0.08, CH2Cl2), für ein Gemisch aus den Preussomerinen
I und J.-
IR-Daten: ν = 3389, 2919, 2852, 1734, 1641, 1263, 1098, 1031, 922, 798 cm-1 .-
UV-Daten(CH2Cl2): λ (lg ε) = 360 (2.14), 319 (2.14), 253 (2.70), 228 (2.85) nm.-
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 1.99 (s, 3H, 12-H), 3.05 (dd, 1H, J = 18.8 Hz, J = 2.9
Hz, 2’b-H), 3.47 (dd, 1H, J =18.8 Hz, J = 3.3 Hz, 2’a-H), 3.82 (d, 1H, J = 4.0 Hz, 3-H),
4.23 (d, 1H, J = 4.0, 2-H), 5.93 (t, 1H, 3’-H), 6.95 (d, 1H, J = 9.1 Hz, 8-H), 7.05 (d, 1H,
J = 9.14 Hz, 7-H), 7.09 (dd, 1H, J = 8.2 Hz, J = 1.0 Hz, 7’-H), 7.44 (t, 1H, 8’-H), 7.68
(dd, 1H, J = 7.9, J = 1.0 Hz, 9’-H), 10.12 (s, 1H, 10-OH).-
13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ = 20.94 (q, C-12), 40.26 (t, C-2’), 52.07 (d, C-3), 53.48
(d, C-2), 70.62 (d, C-3’), 92.20 (s, C-4’), 93.08 (s, C-4), 110.20 (s, C-10), 115.69 (s,
C-5), 119.75 (s, C-5’), 120.74 (d, C-9’), 120.89 (d, C-7’), 121.46 (d, C-8), 121.76 (d,
C-8’), 126.43 (d, C-7), 131.14 (s, C-10’), 142.49 (s, C-6), 149.66 (s, C-6’), 156.40 (s,
C-9), 169.40 (s, C-11), 192.42 (s, C-1’), 195.58 (s, C’-1).-
Summenformel: C22H14O8 Molmasse: 422.06 g mol-1.-
HRMS(EI) :(m/z) = 422.06320 gefunden
422.06378 berechnet.-
Experimenteller Teil
120
4.3.4 Die analytischen Daten des Preussomerins H
Rf-Wert = 0.5 (SiO2, CH2Cl2).-
Drehwert: [α]25D = -233 ° (c 0. 04, CH2Cl2, 20° C) Lit.: -371 ° (c 0.07, CH2Cl2)[1].-
IR (KBr) ν= 3394; 2919; 2851; 1729; 1667; 1470; 1020; 956 cm-1.-
UV (CH2Cl2): λ (lg ε) = 371 (3.27), 310 (3.19), 250 (3.78), 229 (3.79) nm.-
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 2.51 (m, 1H, 2J = 18.7 Hz, 3J = 13.6 Hz, 3J = 5.5 Hz,
3b‘-H), 2.81 (m, 1H, 2J = 18.7 Hz, 3J = 5.5 Hz, 3J = 1.8 Hz, 3’a-H), 2.88 (m, 1H, 2J =
18.7 Hz, 3J = 5.5 Hz, 3J = 1.8 Hz, 2’b-H), 3.26 (m, 1H, 2J = 18.7 Hz, 3J = 13.6 Hz, 3J =
5.5 Hz, 2’a-H), 3.82 (d, 1H, J = 4.0 Hz, 3-H), 4.21 (d, 1H, J = 4.0 Hz, 2-H), 6.93 (d,
1H, J = 9.2 Hz, 8-H), 7.03 (d, 1H, J = 9.2 Hz, 7-H), 7.06 (dd, 1H, J = 7.4 Hz, J = 1.0
Hz, 7’-H), 7.39 (t, 1H, J = 7.7 Hz, J = 7.4 Hz, 8’-H), 7.64 (dd, 1H, J = 7.7 , J = 1.0 Hz,
9’-H), 10.12 (s.1H, 1-H).-
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 32.70 (t, C-3’); 33.67 (t, C-2’); 52.14 (d, C-3); 53.65
(d, C-2); 93.58 (s, C-4); 93.88 (s, C-4’); 109.97 (s, C-10); 115.43 (s, C-5); 120.95 (s,
C-5’); 121.38 (d, C-9’); 121.42 (d, C-8); 121.89 (d, C-7’); 126.34 (d, C-7); 130.76 (d,
C-10’); 131.09 (d, C-8’); 143.65 (s, C-6); 148.25 (s, C-4); 155.96 (s, C-9); 194.51 (s,
C-1’); 195.40 (s, C-1).-
Summenformel: C20H12O7 Molmasse: 364.06 g mol-1.-
HRMS(EI) (m/z) = 364.05829 berechnet
364.05750 gefunden.-
Experimenteller Teil
121
4.3.5 Die analytischen Daten des Preussomerins G
Rf-Wert = 0.62 (SiO2, CH2Cl2).-
Schmelzpunkt: 221-226 °C Lit.: 222-225° C.-
Drehwert: [α]25D = - 173 °, (c=0.03, CH2Cl2) Lit.: -688 °, (c=0.66, CH2Cl2)[1].-
IR (KBr) ν = 3395, 2919, 2851, 1740, 1662, 1470, 900, 810, 750 cm-1.-
UV-Daten (CH2Cl2): λ (lg ε) = 367 (3.05), 309 (2.96), 255 (3.56), 232 (3.46), 196
(2.93) nm.-
1H-NMR (300 MHz, CDCl3’): δ = 3.84 (d, 1H, J = 4.0 Hz, 2-H), 4.24 (d, 1H, J = 4.0 Hz,
3-H), 6.59 (d, 1H, J = 10.1 Hz, 3’-H), 6.95 (d, 1H, J = 9.2 Hz, 8-H), 7.03 (d, 1H, 3J =
7.9 Hz, 8’-H), 7.05 (d, 1H, J = 9.2 Hz, 7-H), 7.24 (d, 1H, J = 10.1 Hz, 2’-H), 7.41 (t,
1H, J = 7.9 Hz, J = 7.9 HZ, 7’-H), 7.62, (dd, 1H, J = 7.9 , J = 1.2 Hz, 9’-H), 10.22
(s.1H, 1-H).-
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 52.17 (d, C-3), 53.70 (d, C-2), 89.98 (s, C-4’), 93.96
(s, C-4), 109.82 (s, C-5), 115.21 (s, C-10), 120.59 (s, C-5’), 120.70 (d, C-9’), 120.86
(d, C-7’), 121.31 (d, C-8), 126.73 (d, C-7), 130.32 (d, C-10’), 131.15 (d, C-8’), 133.57
(d, C-2’), 140.73 (d, C-3’), 143.39 (s, C-6), 148.76 (s, C-6’), 156.11 (s, C-9), 183.73
(s, C-1’), 195.45 (s, C-1).-
Summenformel: C20H10O7 Molmasse: 362.04 g mol-1.-
HRMS (EI) (m/z) = 362.04266 berechnet
362.04158 gefunden.-
Experimenteller Teil
122
4.3.6 Die analytischen Daten des Preussomerins J
Rf-Wert = 0.71 (CH2Cl2).-
Schmelzpunkt: 130-132 °C, farblose Kristalle.-
Drehwert: [α]25D = - 37 °, (c = 0.006, CH2Cl2).-
IR (KBr) ν = 3417, 2920, 2854, 2515, 1734, 1648, 1445, 1258, 1040, 918, 813, 750
cm-1.-
UV (CH2Cl2): λ(lg ε) = 366 (1.59); 315 (1.52); 290 (1.62); 250 (2.15); 240 (2.15); 228
(2.21) nm.-
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 3.05 (dd, H, 3J = 3.1 Hz, 2J = 18.3 Hz, 2’b-H); 3.35
(dd, 1H, 2J =18.3 Hz, 2J = 3.1 Hz, 2’a-H); 3.84 (d, 1H, J = 4.1 Hz, 3-H), 3.53 (s, 3H,
3’OCH3); 3.29 (d, 1H, J = 4.1 Hz, 2-H); 4.33 (t, 1H, J = 3.1 Hz, J = 3.1 Hz 3’-H); 6.94
(d, 1H, J = 9.2 Hz, 8-H); 7.02 (d, 1H, J = 9.2 Hz, 7-H); 7.05 (dd, 1H, J = 8.2 Hz, 4J =
1.0 Hz, 7’-H); 7.39 (t, 1H, J = 7.7 Hz, J = 8.2 HZ, 8’-H); 7.65 (dd, 1H, J = 7.7 , 4J = 1.0
Hz, 9’-H); 10.12 (s, 1H, 1-H).-
13C-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 40.41 (t,C-2’); 52.17 (d, C-2); 53.67 (d, C-3); 59.38
(d, C-3’OCH3); 79.28 (d, C-17); 93.58 (s, C-4); 94.38 (s, C-4’); 110.26 (s, C-5);
115.44 (s, C-10); 119.23 (s, C-5’); 120.13 (d, C-9’); 120.32 (s, C-10’); 121.58 (d, C-
8’); 126.46 (d, C-7); 130.85 (d, C-8); 131.15 (d, C-7’); 142.50 (s, C-6’); 149.73 (s, C-
6); 155.06 (s, C-9); 193.39 (s, C-1’); 195.64 (s, C-1).-
Summenformel: C21H14O8.- Molmasse: 394.07 g mol-1.-
HRMS(EI) (m/z) = 394.06888 berechnet
394.06855 gefunden.-
Experimenteller Teil
123
4.3.7 Die analytischen Daten des Naturstoffs P
Rf-Wert = 0.43 (SiO2, CH2Cl2).-
Schmelzpunkt: 201-203° C.-
Drehwert: [α]25D = +36° C, (c 0.3, CH2Cl2).-
IR-Daten: ν = 3060; 2969; 1747; 1614; 1585; 1469; 1220; 1045; 917 cm-1 .-
UV-Daten(CH2Cl2): λ (lg ε) = 345 (78), 325 (86), 270 (47) nm.-
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 0.99 (d, 3H, J = 6.0 Hz, 11-H), 1.98 (s, 3H, 14-H),
2.04 (s, 3H, 16-H), 2.33 (m, 2H, 6-H), 2.37 (m, 1H, 7-H), AB-Signal (∆δ = 0.11, δA =
4.27, d, 1H, 2J =12.76, 12a-H, δB = 4.16, d, 1H, 2J = 12.76 Hz, 12b-H), 5.41 (s, 1H, 5-
H), 6.56 (d, 1H, J = 9.0 Hz, 2-H), 7.43 (d, 1H, J = 9.0 Hz, 3-H), 11.48 (s, 1H, 1-OH),
14.07 (s, 1H, 8-OH).-
13C-NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 17.91 (q, C-11), 20.84 (q, C-14), 21.07 (q, C-16),
27.98 (d, C-6), 33.60 (t, C-7), 64.99 (t, C-12), 70.77 (d, C-5), 80.78 (s, C-10a), 100.53
(s, C-8a), 106.67 (s, C-4), 109.92 (d, C-2), 115.78 (s, C-9a), 141.57 (d, C-3), 154.25
(s, C-4a), 161.93 (s, C-1), 169.99 (s, C-15), 170.47 (s, C-13), 178.08 (s, C-8), 188.16
(s, C-9).-
Summenformel: C21H14O8.- Molmasse: 394.07 g mol-1.-
HRMS(EI) (m/z) = 750.21599 berechnet
750.21463 gefunden.-
Experimenteller Teil
124
4.3.8 Die analytischen Daten des Diols
Rf-Wert = 0.53 (SiO2, CH2Cl2/MeOH 95/5).-
Schmelzpunkt: Öl.-
Drehwert: [α]25D = -31 °, (c 0.13, CH2Cl2).-
IR ν =3429, 2956, 2876, 1731, 1644, 1463, 1434, 1387, 1272, 1033 cm-1 .-
UV (CH2Cl2): λmax (lg ε) = 329 (4.0), 269 (3.65) nm.-
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.14 (d, 3H, J = 6.7 Hz, 11-H), 2.11 (m, 1H, J = 6.3,
Hz, J = 11.0 Hz, 6-H), 2.33 (dd, 1H, J = 11.0 Hz, J = 19.2 Hz, 7a-H), 2.50 (dd, 1H, J =
6.3 Hz, J = 19.2 Hz, 7b-H), AB-Signal (∆δ = 0.45, δA = 3.84, d, 1H, 2J = 13.0 Hz, 12a-
H, δB = 3.39, d, 1H, 2J =13.0 Hz, 12b-H), 5.29 (d, 1H, J = 0.7 Hz, 5-H), 6.60 (d, 1H, J
= 8.6 Hz, 2-H); 7.27 (d, 1H, J = 8.6 Hz, 3-H); 11.55 (s, 1H, 1-OH); 14.01 (s, 1H, 8-
OH).-
13C-NMR (CDCl3): δ = 17.77 (q, C-11), 28.48 (d, C-6), 32.80 (t, C-7), 64.37 (t, C-12),
68.87 (d, C-5), 84.41 (s, C-10a); 100.72 (s, C-8a), 107.14 (s, C-4); 110.85 (d, C-2),
116.25 (s, C-9a), 139.23 (d, C-3), 154.17 (s, C-4a), 161.98 (s, C-1), 179.70 (s, C-8),
188.03 (s, C-9).-
Summenformel: C30H30O12 Molmasse: 582.17 g mol-1.-
HRMS(EI) (m/z) = 582.17404 gefunden
582.17373 berechnet.-
Experimenteller Teil
125
4.3.9 Die analytischen Daten des Cytochalasins L-696.476
Rf-Wert = 0.43 (SiO2, CH2Cl2/MeOH 97/3).-
Schmelzpunkt: 204-207° C.-
Drehwert: [α]25D = +9°, (c 0.58, CH2Cl2).-
IR-Daten: ν = 2950, 2921,1741, 1691, 1454, 1230, 1027, 966, 700 cm-1 .-
UV-Daten(CH2Cl2): λ (lg ε) = 269 (35) nm.-
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 0.92 (d, 3H, J = 7.0 Hz, H-11), 1.00 (d, 3H, J = 7.0
Hz, H-23), 1.01 (d, 3H, J = 7.0 Hz, H-22), 1.38 (m, 1H, H-16), 1.36 (m, 1H, H-17b),
1.60 (m, 1H, H-17a), AB-Signal (= 0.21, 1.96, dd, 1H, 2J =11.0 Hz, 3J = 4.9 Hz, H-
15a, 1.75, dd, 1H, 2J = 11.0 Hz, 3J = 10.9 Hz, H-15b), 2.08 (m, 1H, H-18), 2.12 (t, 1H,
J = 4.0 Hz, J = 4.0 Hz, H-4), 2.21 (s, 3H, H-25), AB-Signal (∆δ = 0.04, δa = 2.64, dd,
1H, 2J = 13.4 Hz, 3J = 4.3 Hz, H-10a, δb = 2.60 dd, 1H, 2J = 13.4 Hz, 3J = 10.0 Hz, H-
10b), 2.87 (m, 1H, H-5), 2.88 (m, 1H, J = 10.1 Hz, J = 10.5 Hz, H-8), 3.24 (m, 1H, J =
4.3 Hz, J = 4.0 Hz, J = 10.0 Hz, H-3), 3.82 (d, 1H, J = 10.5 Hz, H-7), 5.10 (s, 1H, H-
12a), 5.30 (m, 1H, 2J = 16.4 Hz, 3J = 10.9 Hz, 3J = 4.9 Hz H-14), 5.35 (s, 1H, H-12b),
5.45 (s, 1H, H-2), 5.54 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H-21), 5.70 (m, 1H, 3J = 16.4 Hz, 3J = 5.2
Hz, 4J = 2.1 Hz, H-19), 5.76 (m, 1H, 3J = 16.4 Hz, 3J = 10.5 Hz, 4J = 1.0 Hz, H-13),
5.96 (dd, 1H, 3J = 16.4 Hz, 3J = 2.4 Hz, H-20), 7.13 (dd, 2H, J = 7.1 Hz, 4J = 1.4 Hz,
H-28/30), 7.22 (t, 1H, H-29), 7.33 (dd, 2H, J = 7.1 Hz, 4J = 2.2 Hz, H-27/31).-
13C-NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 14.31 (q, C-11), 20.90 (q, C-25), 22.13 (q, C-22),
25.30 (q, C-23), 33.01 (d, C-5), 33.42 (d, C-16), 34.27 (d, C-18), 42.55 (t, C-15),
45.74 (t, C-10), 47.34 (d, C-8), 48.44 (t, C17), 50.70 (d, C-4), 51.86 (s, C-9), 53.76 (d,
C-3), 69.60 (d, C-7), 78.62 (d, C-21), 113.89 (t, C-12), 125.49 (d, C-20), 127.10 (d, C-
29), 127.51 (d, C-13), 128,99 (d, C-27/31), 129.04 (d, C-28/30), 135.91 (d, C-19),
137.56 (s, C-26), 138.43 (d, 14), 148.17 (s, C-6), 170.13 (s, C-24), 174.31 (s, C-1).-
Experimenteller Teil
126
Summenformel: C30H39O4N Molmasse: 477.29 g mol-1.-
HRMS(EI) (m/z) = 477.28790 berechnet
477.28972 gefunden.-
4.3.10 Die analytischen Daten des Cytochalasins X
Rf-Wert = 0.36 (SiO2, CH2Cl2/MeOH 95/5).-
Schmelzpunkt: 132-134° C.-
Drehwert: [α]25D = +16°, (c 0.4, CH2Cl2).-
IR-Daten: ν = 3373, 2948, 2921, 1684,1436,1028, 970, 700 cm-1 .-
UV-Daten(CH2Cl2): λ (lg ε) = 283 (25), 280 (25) nm.-
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 0.98 (d, 3H, J = 7.0 Hz, H-22), 1.01 (d, 3H, J = 7.0
Hz, H-23), 1.06 (d, 3H, J = 6.7 Hz, H-11), 1.37 (m, 1H, H-16), AB-Signal (∆δ = 0.31,
δa = 1.72, m, 1H, H-17a, δb = 1.41, m, 1H, H-17b), AB-Signal (∆δ = 0.21, δa = 1.97, m,
1H, H-15a, δb = 1.76, m, 1H, H-15b), 2.15 (m, 1H, H-18), ), AB-Signal (∆δ = 0.34, δa =
2.92, dd, 1H, J = 13.4 Hz, J = 10.4 Hz H-10a, δb = 2.58, dd, 1H, J = 13.4 Hz, J = 3.7
Hz, H-10b), 2.61 (dd, 1H, J = 4.7 Hz, J = 2.4 Hz, H-4), 2.81 (t, 1H, H-8), 2.91 (m, 1H,
H-53.27 (m, 1H, H-3), 3.82 (d, 1H, J = 11.0 Hz, H-7), 4.17 (br. s, 1H, H-21), 5.10 (s,
1H, H-12b), 5.25 (m, 1H, J = 15.5 Hz, J = 11.0 Hz, J = 4.7 Hz, H-14), 5.33 (s, 1H, H-
12a), 5.45 (s, 1H, H-2), 5.76 (dd, 1H, J = 15.5 Hz, J = 10.0 Hz, H-13), 5.90 (m, 1H, J
= 16.4 Hz, J = 6.5 Hz, J = 2.2 Hz, H-19), 6.19 (dd, 1H, J = 16.4 Hz, J = 2.7 Hz, H-20),
7.23 (t, 1H, J = 6.6 Hz, J = 1.4 Hz, H-27), 7.30 (m, 2H, J = 7.4 Hz, J = 1.4 Hz, H-
25/29), 7.45 (m, 2H, H-26/28).-
Experimenteller Teil
127
13C-NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 14.22 (q, C-11), 22.47 (q, C-22), 25.22 (q, C-23),
33.10 (d, C-5), 33.52 (d, C-16), 34.17 (d, C-18), 42.33 (t, C-15), 45.76 (t, C-10),
46.16 (d, C-8), 48.33 (t, C17), 50.18 (d, C-4); 53.13 (s, C-9), 53.87 (d, C-3), 69.79 (d,
C-7), 77.26 (d, C-21), 113.63 (t, C-12), 131.23 (d, C-20), 128.94 (d, C-29/25), 127.08
(d, C-13), 128,04 (d, C-27), 129.15 (d, C-28/26), 134.32 (d, C-19), 137.81 (s, C-
24/18), 137.81 (d, 14), 148.6 (s, C-6), 175.81 (s, C-1).-
Summenformel: C28H37O3N Molmasse: 435.28 g mol-1.-
HRMS(EI) (m/z) = 435.27734 berechnet
435.27701 gefunden.-
4.3.11 Die analytischen Daten der 3-Nitropropionsäure
Rf-Wert = 0.70 (SiO2, CH2Cl2/MeOH 95/5).-
Schmelzpunkt: 62-64° C Lit.: 64-65° C.-
IR-Daten: ν = 3396, 2917,1727,1556,1259 cm-1 .-
UV-Daten(CH2Cl2): λ (lg ε) = 360 (2.14), 319 (2.14), 253 (2.70), 228 (2.85) nm.-
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 3.09 (t, 2H, J = 6.1 Hz, J = 6.0 Hz, H-3), 4.72 (t, 2H, J
= 6.1 Hz, J = 6.0 Hz, H-2).-
13C-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 174.96 (q, C-1), 69.66 (t, C-3), 31.09 (t, C-3).-
Summenformel: C3H5O4N Molmasse: 119.08 mol-1.-
Experimenteller Teil
128
4.3.12 Die analytischen Daten der 4-(2‘,3‘-Dimethoxy-4‘-methyl-phenyl)-4-oxo-
Buttersäure
Rf-Wert = 0.71 (SiO2, CH2Cl2/MeOH 95/5).-
IR (KBr) ν = 3321. 2918, 2844, 1709, 1662, 1595, 1454, 1424, 1266, 1111, 1024,
809 cm-1.-
UV-Daten (CH2Cl2): λ (lg ε) = 246 (3.39), 237 (3.35), 194 (0.57).-
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.16 (s, 3H, 8‘-H), 2.75 ( t, 2H, J = 6.5 Hz, 2-H), 3.32
(t, 2H, J = 6.5 Hz, 3-H), 3.75 (s, 3H, 9‘-H), 3.87 (s, 3H, 7‘-H), 6.67 (d, 1H, J = 8.7 Hz,
5‘-H), 7.67 (d, 1H, J = 8.7 Hz, 6‘-H).-
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 8.99 (q, C-8‘), 28.48 (t, C-2), 36.95 (t, C-3), 55.84 (q,
C-9‘), 61.95 (q, C-7‘), 102.02 (d, C-5‘), 120.39 (s, C-3‘), 124.86 (s, C-1‘), 128.90 (d,
C-6‘), 159.36 (s, C-4‘), 163.36 (s, C-2‘), 177.36 (s, C-1), 199.10 (s, C-4).-
Summenformel : C13H16O5 Molmasse : 252.10.-
HRMS(EI) (m/z) = 252.09977 berechnet
252.10028 gefunden.-
Experimenteller Teil
129
4.4 Totalsynthese des Naturstoffes 2,6-Dihydroxy-8-methoxy-3-oxo-
3,4,5,6-tetrahydronaphthalin-1-carbaldehyd
4.4.1 4-(2‘,4‘-Dimethylphenyl)-4-oxobutansäure 1
O
O
OH
O
O
1
2
3
4
1'
2'
3'
4' 5'
6'
1
2,6-Dimethoxytoluol (20.00 g, 0.13 mol) und Bernsteinsäureanhydrid (13.01 g, 0.13
mol) werden mit AlCl3 (34.658 g, 0.26 mol) in CH2Cl2abs bei 0° C portionsweise
versetzt. Die Mischung wird 20 Stunden lang bei RT gerührt. Die Reaktion wird durch
die Zugabe von HCl/Eiswasser abgebrochen.Für die Aufarbeitung soll der pH-Wert
auf 1 gestellt werden. Die organische Phase wird mehrmals mit Wasser extrahiert
und über MgSO4 getrocknet. Nach dem Einengen erhält man ein hellgelbes Öl.
Ausbeute: 31.122 g (95%).
1H-NMR (CDCl3): δ = 7.65 (d, 1H, 3J = 8.85 Hz, H-6‘), 6.71 (d, 1H, 3J = 8.85, H-5‘),
3.90 (s, 3H, H-7‘), 3.78 (s, 3H, H-9‘), 3.35 (t, 2H, 3J = 6.10 Hz, H-3), 2.79 (t, 2H, 3J =
6.10 Hz, H-2), 2.18 (s, 3H, H-8‘).-
13C-NMR (CDCl3): δ = 199.40 (s, C-4), 162.69 (s, C-2‘), 159.69 (s, C-4‘), 129.39 (s,
C-1‘), 125.18 (d, C-6‘), 120.72 (s, C-3‘), 106.44 (d, C-5‘), 62.35 (q, C-OCH3),
56.22.(q, C-OCH3), 37.28 (t, C-3). 28.96 (t, C-2), 9.4 (q, C-CH3).-
Experimenteller Teil
130
4.4.2 4-(2’,4’-Dimethoxy-3’-methylphenyl)-butansäure 2
O
O
OH
O
1
2
3
4
1'
2'
3'
4' 5'
6'
Zink (10.4 g, 0.16 mol) wird mit HgCl2 (0.005 g, 0.0002 mol) in Wasser/HCl durch
Ultraschallbad 5 min aktiviert.
Zu 20.0 g (0.08 mol) Buttersäure 2 wird die Suspension aus Zn und HgCl2 in Wasser
gegeben. Das Gemisch wird unter Rückfluss 20-22 Stunden lang gekocht und nach
jeder Stunde portionsweise mit HCl (2 ml, 0.004 mol) versetzt. Die heiße Mischung
wird filtriert; das Zn wird mehrmals mit Wasser gewaschen. Nach Abkühlen wird das
Filtrates mehrmals mit CH2Cl2 extrahiert. Falls die Ausbeuten nicht befriedigend sind,
wird es mit CH2Cl2 zusätzlich einige Stunden lang gerührt. Die vereinigten
organischen Phasen werden über MgSO4 getrocknet, filtriert und eingeengt. Das
Produkt liegt als hellgelbes Öl vor.
Ausbeute:19.60 g (98 %)
1H-NMR (CDCl3): δ = 7.00 (d, 1H, 3J = 8.40 Hz, H-6‘), 6.63 (d, 1H, 3J = 8.40 Hz, H-
5‘), 3.84 (s, 3H, H-OCH3), 3.75 (s, 3H, H-OCH3), 2.68 (t, 2H, 3J = 7.47 Hz, H-2), 2.43
(d, 2H, 3J = 7.47 Hz, H-4), 2.19 (s, 3H, H-CH3), 1.97 (t, 2H, 3J = 7.47 Hz, H-3).-
13C-NMR (CDCl3): δ = 181.21 (s, C-1), 157.34 (s, C-2‘/4‘), 157.67 (s, C-4‘/2‘), 127.45
(s, C-1‘), 126.64 (d, C-6‘), 120.03 (s, C-3‘), 106.57 (d, C-5‘), 61.08 (q, C-OCH3),
61.03 (q, C-OCH3), 34.45 (t, C-2), 29.30 (t, C-4), 26.34 (t, C-3), 9.63 (q, C-CH3).-
Experimenteller Teil
131
4.4.3 5,7-Dimethoxy-6-methyl-3,4-dihydro-2H-naphthalin-1-on 3
O
O
O12
3
4
5
6
7
8
4a
8a
3
Die Butansäure 2 (20.00 g, 0.08 mol) wird bei 0° C in TFA aufgenommen und eine
Stunde lang gerührt. Nach einer Stunde wird 1.0 eq TFAA (25.02 ml, 0.08 mol)
zugetropft und 1 Stunde lang bei 0° C weiter gerührt. Anschließend wird das
Reaktionsgemisch in eine gesättigte Eiswasser-Natriumhydrogencarbonatlösung
gegossen. Die wäßrige Mischung wird mehrmals mit CH2Cl2 extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen werden mittels 5%iger NaOH gewaschen, über
MgSO4 getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wird mit Hilfe von PS
(Petrolether/Dichlormethan 1/99) gereinigt.
Ausbeute: 14.73 g (74%)
1H-NMR (CDCL3): δ = 7.36 (s, 1H, H-8), 3.90 (s, 3H, H-OCH3), 3.76 (s, 3H, H-OCH3),
2.95 (t, 2H, 3J = 6.07 Hz, H-2), 2.67 (t, 2H, 3J = 6.51 Hz, H-4), 2.25 (s, 3H, H-CH3),
2.11 (dd, 2H, 3J = 6.07 Hz, 3J = 6.51 Hz, H-3).-
13C-NMR (CDCL3): δ = 198.57 (s, C-1), 157.48 (s, C-5/7), 156.78 (s, C-7/5), 131.80
(s, C-8a), 131.10 (s, C-4a), 127.07 (s, C-6), 103.61 (d, C-8), 60.60 (q, C-OCH3),
56.12 (q, C-OCH3), 39.35 (t, C-2), 23.54 (t, C-3/4), 23.49 (t, C-4/3), 10.10 (q, C-
CH3).-
Experimenteller Teil
132
4.4.4 (R)-5,7-Dimethoxy-6-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalin-1-ol 4
OH
O
O1
2
3
4
4a
5
6
7
8
4
Das Tetralon 3 (10 mg, 0.045 mol) wird in THFabs aufgenommen. Zu dieser Lösung
wird unter Schutzgasatmosphäre eine Lösung aus 0.05 eq. des Pyrrolidinons 11 (0.1
mg, 0.023 mmol) und B2H6*THF (1.5 Mol in THF, 0.0014 mmol, 0.92 ml) innerhalb
von wenigen Minuten getropft. Nach 15-20 Minuten wird die Reaktion mit 0.5 N HCl
in MeOH gequencht, mit CH2Cl2 extrahiert, abgetrennt und über MgSO4 getrocknet.
Der Alkohol liegt in Form eines farblosen Feststoffes vor.
Ausbeute: 6.2 mg (62 %), [α]20D = 0 °, kein R-Alkohol.
4.4.5 5,7-Dimethoxy-6-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalin-1-ol 4
OH
O
O1
2
3
4
4a
5
6
7
88a
4
Zur Lösung aus 3 (1.00 g, 0.0048 mol) in THFabs wird unter Schutzgasatmosphäre
rasch ½ eq. von LiAlH4 ( 0.091 g, 0.0024 mol) gegeben. Die erhaltene Suspension
wird bei RT 2 h gerührt und anschliessend mit 2 N HCl hydrolisiert bis keine
Wasserstoffentwicklung mehr beobachtet werden kann. Das Reaktionsgemisch wird
mehrmals mit CH2Cl2 extrahiert und über MgSO4 getrocknet.
Ausbeute: 0.75 g (75 %), farbloses Öl.
Experimenteller Teil
133
1H-NMR (CDCL3): δ = 6.79 (s, 1H, H-8), 4.72 (t, 1H, 3J = 4.65 Hz, H-1), 3.84 (s, 3H,
H-OCH3), 3.76 (s, 3H, H-OCH3), 2.70 (m, 2H, H-4), 2.16 (s, 3H, H-CH3), 1.85 (m, 4H,
H-2, 3).-
13C-NMR (CDCL3): δ = 157.28 (s, C-5/7), 156.95 (s, C-7/5), 137.90 (s, C-8a), 123.01
(s, C-4a), 119.35 (s, C-6), 106.30 (d, C-8), 68.88 (d, C-1), 60.16 (q, C-OCH3), 56.02
(q, C-OCH3), 32.84 (t, C-4), 23.51 (t, C-2), 19.11 (t, C-3), 9.37 (q, C-CH3).-
4.4.6 5,7-Dimethoxy-6-methyl-1-pivaloyloxy-1,2,3,4-tetrahydronaphthalin 5
O
O
O
O
1
2
3
4
4a
5
6
788a
5
Tetralol 4 (0.745 g, 0.0034 mol) wird in Pyridinabs bei 0° C gelöst. Zu dieser Lösung
gibt man 1.2 eq. ( 0.61 ml, 0.0041mol) des Pivaloylchlorids. Die Mischung lässt man
bei RT 12 h rühren. Das Reaktionsgemisch wird anschließend mit 2 N HCl
angesäuert und mehrmals mit CH2Cl2 extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
werden mit NH4Clges und Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet.
Ausbeute: 0.99 g (95%).
1H-NMR (CDCL3): δ =6.52 (s, 1H, H-1), 5.91 (dd, 1H, 3J = 4.1 Hz, H-1), 3.76 (s, 3H,
H-OCH3), 3.70 (s, 3H, H-OCH3), 2.90-2.55 (m, 2H, H-2), 2.18 (s, 3H, H-CH3), 2.04-
1.82 (m, 4H, H-3,4), 1.21 (s, 9H, H-C(CH3)3).-
13C-NMR (CDCL3): δ = 178.61 (s, C-CO2-), 157.10 (s, C-5), 157.00.(s, C-7), 133.88
(s, C-8a), 123.96 (s, 4a), 119.84 (s, C-6), 106.57 (s, C-8), 70.36 (d, C-1), 60.11 (q, C-
Experimenteller Teil
134
OCH3), 55.86 (q, C-OCH3), 39.22 (s, C-C(CH3)3), 27.49 (t, C-4), 26.89 (q, C-(CH3)3),
23.31 (t, C-2), 19.24 (t, C-3), 9.37 (q, C-CH3).-
4.4.7 1,3-Dimethoxy-8-oxo-5-pivaloyoxy-5,6-dihydro-2H-naphthalin-2-
carbaldehyd 6
O
O
O
OO
H
O
1
2
3
44a 5
6
7
8
8a
6
Zur Lösung aus 5 (0.172 g, 0.00056 mol) und Acetonitril wird eine Lösung aus
Kaliumperoxodisulfat ( 0.626 g, 0.0023 mol), Kupfersulfat ( 37 mg, 0.00023 mol) in
Wasser gegeben. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht bei RT gerührt und 3
Studen auf 70-80° C erhitzt. Im Laufe der Reaktion entstehen mehrere Produkte.
Drei davon (6, 12 und 13, Abb. 62) wurden isoliert und charakterisiert. Das
gewünschte Produkt 6 wurde per Platte (Si 60, CH2Cl2/MeOH 98/2) in der Menge von
0.026 g aus dem Reaktionsgemisch isoliert. Insgesamt dauert die Reaktion 17
Stunden.
Ausbeute: Produkt 6: 26 mg (15%), Nebenprodukt 12: 69 mg (40 %), Nebenprodukt
13: 52 mg (30 %).
1H-NMR (CDCL3): δ = 10.43 (s, 1H, H-CHO), 6.79 (s, 1H, H-4), 6.03 (m, 1H, H-5),
3.95 (s, 3H, H-OCH3), 3.94 (s, 3H, H-OCH3), 2.77 (m, 2H, H-7), 2.31 (m, 2H, H-6),
1.24 (s, 9H, H-C(CH3)3).-
13C-NMR (CDCL3): δ = 193.91 (d, C-8), 189.31 (s, C-CHO), 178.03 (s, C-CO2-), 165.
21 (s, C-1/3), 164.29 (s, C-3/1), 150.47 (s, C-4a), 120.44 (s, C-8a), 119.56 (s, C-2),
Experimenteller Teil
135
106.59 (d, C-4), 69.85 (d, C-5), 64.62 (q, C-OCH3), 56.78 (q, C-OCH3), 39.45 (s, C-
C(CH3)3), 36.28 (t, C-7), 28.14 (t, C-6), 27.47 (q, C-(CH3)3).-
4.4.8 6,8-Dimethoxy-7-methyl-4-pivaloyloxy-3,4-dihydro-2H-naphthalin-1-on 12
O
O
O
O
O
1
2
3
4
4a
5
6
788a
6'
1H-NMR (CDCL3): δ = 6.70 (s, 1H, H-5), 6.02 (m, 1H, H-4), 3.90 (s, 3H, H-C8OCH3),
3.81 (s, 3H, H-C6OCH3), 2.74 (m, 2H, H-2), 2.27 (m, 2H, H-3), 2.17 (s, 3H, H-CH3),
1.25 (s, 9H, H-C(CH3)3).-
13C-NMR (CDCL3): δ = 195.14 (s, C-1), 178.30 (s, C-CO2-),162.74 (s, C-6/8), 142.44
(s, C-4a), 122.40 (s, C.8a), 105.63 (d, C-4), 70.28 (d, C-5), 61.60 (q, C-OCH3), 56.16
(q, C-OCH3), 39.42 (s, C-C(CH3)3), 36.17 (t, C-2), 28.04 (t, C-3), 27.50 (q, C-
C(CH3)3), 8.84 (q, C-CH3).-
Experimenteller Teil
136
4.4.9 6,8-Dimethoxy-7-hydroxymethyl-4-pivaloyloxy-3,4-dhydro-2H-naphth-
alin-1-on 13
O
O
O
O
O
HO
1
2
3
4
4a
5
6
7
88a
1H-NMR (CDCL3): δ = 6.76 (s, 1H, H-5), 6.02 (dd, 1H, 3J = 3.82 Hz, 3J = 3.82 Hz, H-
4), 4.80 (s, 2H, H-CH2OH), 3.94 (s, 3H, H-OCH3), 3.91 (s, 3H, H-OCH3), 2.96-2.57
(m, 2H, H-2), 2.49-2.14 (m, 2H, H-3), 1.26 (s, 9H, H-C(CH3)3).-
13C-NMR (CDCL3): δ = 194.90 (s, C-1), 178.23 (s, C-CO2-), 162.59 (s, C-8), 160.97
(s, C-6), 145.19 (s, C-4a), 124.56 (s, C-8a), 119.35 (s, C-7), 106.35 (s, C-5), 70.07
(d, C-4), 63.29 (t, C-CH2OH), 56.39 (q, C-OCH3), 54.96 (q, C-OCH3), 39.43 (s, C-
C(CH3)3), 36.09 (t,C-2), 28.38 (t, C-3), 27.42 (q, C-(CH3)3).-
4.4.10 1-Hydroxy-3-methoxy-8-oxo-5-pivaloyloxy-5,6-dihydro-7H-naphthalin-2-
carbaldehyd 7
O
O
O
OOHO
1
2
344a 5
6
7
8
8a
7
24 mg (0.00007 mol) der Substanz 6 werden in CH2Cl2abs unter
Schutzgasatmosphäre mit 10 eq. (0.133 g) AlCl3 versetzt. Die Suspension wird bei
Experimenteller Teil
137
RT 4 Tage gerührt, anschließend mit Eiswasser/HCl-Lösung gequencht, abgetrennt
und über MgSO4 getrocknet. Das organische Produkt liegt in Form hellgelben Öls
vor. Das Produkt wurde mittels PC gereinigt.
Ausbeute:14 mg (60%).
1H-NMR (CDCL3): δ = 13.83 (s, 1H, H-OH), 10.52 (s, 1H, H-CHO), 6.54 (s, 1H, H-4),
6.02 (dd, 1H, 3J = 3.90 Hz, H –5), 4.01 (s, 3H, H-OCH3), 3.03-2.68 (m, 2H, H-7),
2.47-2.12 (m, 2H, H-6), 1.29 (s, 9H, H-C(CH3)3).-
13C-NMR (CDCL3): δ = 201.89 (s, C-8), 188.43 (s, C-CHO), 177.97 (s, C-CO2-),
167.51 (s, C-3/1), 167.07 (s, C-3/1), 150.51 (s, C-4a), 112.92 (s, C-8a/2), 111.15 (s,
C-2/8a), 101.76 (d, C-4), 69.07 (d, C-5), 56.81 (q, C-OCH3), 39.46 (s, C-C(CH3)),
34.73 (t, C-7), 28.14 (t, C-6), 28.48 (q, C-(CH3)3-).-
Abkürzungen
138
5 Verzeichnis der Abkürzungen
CI Chemische Ionisation
DCI Direkte chemische Ionisation
EI Elektronenstoß-Ionisation
HRMS High Resolution Mass Spektrometry
COSY Correlation Spektroskopy
HMBC Heteronuclear Multibond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
NOE Nuclear Overhausen Effect
SC Säulenchromatographie
PSC Präparative Schicht-Chromatographie
DC Dünnschichtchromatographie
SPE Solid Phase Extraktion
P Petrolether
E Ethylacetat
Literatur
139
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