Isolierung, Strukturaufklärung und Untersuchungen zur Synthese
biologisch aktiver Sekundärmetabolite aus Pilzen und Pflanzen
Vom Fachbereich Chemie und Chemietechnik
der Universität-Gesamthochschule Paderborn
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
− Dr. rer. nat. −
genehmigte Dissertation
von
Markus John
aus Anröchte
Paderborn 1998
Referent: Prof. Dr. K. Krohn
Korreferent: Prof. Dr. N. Risch
Eingereicht am: 29. April 1998
Tag der mündlichen Prüfung: 28. Mai 1998
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Januar 1996 bis April 1998 im Fach Organische
Chemie des Fachbereichs Chemie und Chemietechnik der Universität-Gesamthochschule
Paderborn angefertigt.
Herrn Prof. K. Krohn danke ich für die interessante Themenstellung sowie die gewährte
Freizügigkeit bei der Bearbeitung der Thematik. Desweiteren haben seine Diskussions-
bereitschaft und seine Anregungen viel zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Herrn Prof. Dr. N. Risch danke ich für die Übernahme des Korreferats.
Mein besonderer Dank gilt meiner Frau Anke und meiner Familie für ihre Unterstützung.
Weiterhin danke ich den Herren S. Bernhard, J. Küpke, K. Steingröver, H.-J. Vetter und
G. Zimmermann für die konstruktive Zusammenarbeit und die vielen heiteren Stunden im
Labor. Den anderen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern aller Arbeitskreise der Organischen
Chemie Danke ich für das kollegiale und sehr angenehme Arbeitsklima.
Für Anke
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung.......................................................................................1
1.1. Klassifizierung der Pilze........................................................................................1
1.2. Sekundärmetabolite...............................................................................................4
1.3. Biogenese der Sekundärmetabolite......................................................................5
1.3.1. Isoprenoide Verbindungen....................................................................................5
1.3.2. Aromatische Verbindungen................................................................................10
1.3.2.1. Shikimisäure-Weg..................................................................................................10
1.3.2.2. Polyketid-Weg.......................................................................................................12
1.3.3. Alkaloide Verbindungen.....................................................................................15
1.3.3.1. Die echten Alkaloide..............................................................................................15
1.3.3.2. Pseudoalkaloide ....................................................................................................16
1.3.3.3. Peptidalkaloide.......................................................................................................17
1.3.3.4. Protoalkaloide........................................................................................................18
2. Aufgabenstellung und Zielsetzung ...........................................................19
3. Hauptteil ...........................................................................................................20
3.1. Stamm 3037..........................................................................................................20
3.1.1. Pilzbeschreibung ..................................................................................................20
3.1.2. Isolierung der Naturstoffe 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7.................................................20
3.1.3. Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe..................................21
3.1.3.1. Naturstoff 1............................................................................................................21
3.1.3.2. Naturstoff 2............................................................................................................26
3.1.3.3. Naturstoff 3............................................................................................................28
3.1.3.4. Naturstoff 4............................................................................................................30
3.1.3.5. Naturstoff 5............................................................................................................33
3.1.3.6. Naturstoff 6............................................................................................................37
3.1.3.7. Naturstoff 7............................................................................................................41
3.1.3.7.1. Biosynthese des Cladosporins (7)..........................................................................43
3.1.4. Biologische Aktivität............................................................................................45
3.1.4.1. Erläuterung und Bewertung der Bioaktivitätsmessungen......................................45
3.1.4.1.1. Pflanzenschutztestung der Mikrobiologie in Braunschweig..................................45
3.1.4.1.2. Kurzbeschreibung der Pharma-Grundscreening-Tests der BASF.........................47
3.1.4.2. Biologische Aktivität der Naturstoffe des Pilzstammes 3037...............................50
3.1.4.2.1. Pflanzenschutz-Screening der Mikrobiologie in Braunschweig............................50
Inhaltsverzeichnis
3.1.4.2.2. Pharmakologische Aktivität...................................................................................53
3.2. Stamm 2225..........................................................................................................53
3.2.1. Pilzbeschreibung ..................................................................................................53
3.2.2. Isolierung der Naturstoffe 8 und 9.....................................................................54
3.2.3. Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe 8 und 9....................55
3.2.3.1. Naturstoff 8............................................................................................................55
3.2.3.2. Naturstoff 9............................................................................................................57
3.2.4. Biologische Aktivität der Naturstoffe des Pilzstammes 2225..........................59
3.2.4.1. Pflanzenschutz-Screening der Mikrobiologie in Braunschweig............................59
3.3. Stamm 3184..........................................................................................................61
3.3.1. Pilzbeschreibung ..................................................................................................61
3.3.2. Isolierung der Naturstoffe 10, 11 und 12...........................................................61
3.3.3 Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe 10, 11 und 12..........62
3.3.3.1. Naturstoff 10..........................................................................................................62
3.3.3.1.1. Biosynthese des Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3on................................................64
3.3.3.2. Naturstoff 11..........................................................................................................65
3.3.3.3. Naturstoff 12..........................................................................................................68
3.3.3.3.1. Biosynthese der Naturstoffe 11 und 12..................................................................73
3.3.4. Biologische Aktivität der Naturstoffe des Pilzstammes 3184..........................74
3.3.4.1. Pflanzenschutz-Screening der Mikrobiologie in Braunschweig............................74
3.3.4.2. Pharmakologische Aktivität...................................................................................76
3.4. Stamm 3004..........................................................................................................77
3.4.1. Pilzbeschreibung ..................................................................................................77
3.4.2. Isolierung der Naturstoffe 13, 14, 15 und 16.....................................................77
3.4.3. Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe 13−16......................78
3.4.3.1. Naturstoff 13..........................................................................................................78
3.4.3.2. Naturstoff 14..........................................................................................................80
3.4.3.3. Naturstoff 15..........................................................................................................83
3.4.3.4. Naturstoff 16..........................................................................................................85
3.4.4. Biosynthese der Naturstoffe 13, 15 und 16........................................................86
3.4.5. Biologische Aktivität der Naturstoffe des Pilzstammes 3004...............................88
3.4.5.1. Pflanzenschutz-Screening der Mikrobiologie in Braunschweig............................88
3.5. Stamm 3304..........................................................................................................90
3.5.1. Pilzbeschreibung ..................................................................................................90
Inhaltsverzeichnis
3.5.2. Isolierung der Naturstoffe 17, 18 und 19...........................................................90
3.5.3. Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe 17, 18 und 19..........90
3.5.3.1. Naturstoff 17..........................................................................................................90
3.5.3.2. Naturstoff 18..........................................................................................................94
3.5.3.3. Naturstoff 19..........................................................................................................96
3.5.4. Biologische Aktivität der Naturstoffe des Pilzstammes 3304........................101
3.5.4.1. Pflanzenschutz-Screening der Mikrobiologie in Braunschweig..........................101
3.6. Naturstoff aus der Pflanze Usnea dasypoga Rohi............................................103
3.6.1. Isolierung des Naturstoffs 20............................................................................103
3.6.2. Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffs 20...........................103
4. Synthese...........................................................................................................110
4.1. Planung und Durchführung erster Syntheseschritte zur Darstellung des
Naturstoffs Stemphyperylenol (11)..................................................................110
4.1.1. Motivation...........................................................................................................110
4.1.2. Syntheseplanung ................................................................................................110
4.1.3. Durchführung.....................................................................................................112
5. Zusammenfassung und Ausblick............................................................116
6. Experimenteller Teil....................................................................................119
6.1. Allgemein verwendete Analysen- und Meßmethoden....................................119
6.2. Mikrobiologische Arbeitsmethoden.................................................................121
6.2.1. Anreicherung der Pilze in Submerskultur.......................................................121
6.3. Experimenteller Teil zur Naturstoffisolierung................................................121
6.3.1. Strukturdaten und Substanzcharakteristika der Naturstoffe 1−7...............122
6.3.2. Strukturdaten und Substanzcharakteristika der Naturstoffe 8 und 9.........130
6.3.3. Strukturdaten und Substanzcharakteristika der Naturstoffe 10−13...........132
6.3.4. Strukturdaten und Substanzcharakteristika der Naturstoffe 13−16...........135
6.3.5. Strukturdaten und Substanzcharakteristika der Naturstoffe 17−19...........140
6.3.6. Strukturdaten und Substanzcharakteristika des Naturstoffs 20 und
dessen Triacetats................................................................................................143
6.4. Experimenteller Teil zur Naturstoffsynthese des Stemphyperylenols (11)......145
7. Abkürzungen..................................................................................................152
8. Literaturverzeichnis ....................................................................................152
Einleitung 1
1. Einleitung
1.1. Klassifizierung der Pilze
Als Pilze (lat. Fungi, griech. Myces) bezeichnet man im weiteren Sinn eine polyphyletische
Gruppe chlorophyll-freier, heterotropher, eukaryotischer Organismen. Als Eukaryonten
verfügen sie wie Tiere und Pflanzen über einen echten Zellkern sowie die typischen
Zellorganellen im Protoplasma.[1] Nach der Lebensweise lassen sich zwei Gruppen von
Pilzen unterscheiden. Saprobische Organismen beziehen die notwendigen Kohlenstoff-
verbindungen aus dem oxidativen Abbau von organischen Rückständen, während biotrophe
Pilze, als Symbionten oder Parasiten Pflanzen, Tiere, Algen, Protozoen, Bakterien oder
andere Pilze benötigen. Zu dieser chemoorganoheterotrophen Ernährung sind Pilze durch eine
Vielzahl von Enzymen (neben Oxidasen, z. B. Amylasen, Lipasen, Trehalasen, Peptidasen)
befähigt. Obwohl die Pilze durch morphologische und ökologische Charakteristika von
anderen Lebewesen abgegrenzt werden können, handelt es sich bei ihnen keineswegs um eine
homogene Verwandtschaftsgruppe. Zur Klassifizierung der Pilze werden diese in die in
Abbildung 1 und 2 dargestellten Kategorien eingeteilt.[2] Dabei muß angemerkt werden, daß
bei der Zuordnung unterschiedliche Auffassungen existieren. Besonders die Definition des
Reiches ist nicht klar abgegrenzt.[2−5]
Abb. 1: Klassifizierung der Pilze. In Klammern sind die systematischen Namensendungen angegeben.[6]
Reich
Abteilung
[-mycota]
Unterabteilung
[-mycotina]
Klasse
[-mycetes]
Ordnung
[-ales]
Gattung
Art
Unterklasse
[-mycetidae]
2Einleitung
Das Reich „Fungi“ (echte Pilze) setzt sich als wahrscheinliche Abstammungsgemeinschaft
aus den früheren Eumycota (Eumycotina, Eumycophytina, höhere Pilze) und den Zygomycota
(Jochpilze, früher eine Abteilung der niederen Pilze) zusammen, während die pilzähnlichen
Protisten die übrigen, phylogenetisch vermutlich voneinander weitgehend unabhängigen
Abteilungen der niederen Pilze und der Schleimpilze (Myxomycota, Myxomycotina,
Myxomycophytina, Mycetozoa, Pilztierchen) umfassen.
Abb. 2: Klassifizierung der „Fungi“ (echte Pilze) und der Protisten.
Abteilung
Abteilung
Myxomycota
Plasmodio-
phoromycota
Labyrinthulo-
mycota
Oomycota
Hyphochy-
triomycota
mycota
Chytridio-
mycota
Basidiomycota
Ascomycota
Zygomycota
Klasse
Klasse
Klasse
Basidiomycetes
(Ständerpilze)
Ascomycetes
(Schlauchpilze)
Endomycetes
(Hefepilze)
Zygomycetes
(Jochpilze)
Trichomycetes
Deuteromycota
Fungi imperfecti
Protisten
Fungi
Reich
Einleitung 3
Das Reich Fungi besteht aus annähernd 125.000 in der Literatur beschriebenen Pilzarten,
deren Keime keinerlei Einrichtung zur Eigenbewegung besitzen. Aufgrund der wichtigsten
Merkmale ihrer geschlechtlichen Entwicklung werden die Fungi in die drei Abteilungen
Zygomycota (Jochpilzartige), Ascomycota (Schlauchpilzartige) und Basidiomycota
(Ständerpilzartige) gegliedert. Echte Pilze, die nur nach ihren asexuellen Zuständen
(Anamorphe) beurteilt werden, deren Entwicklung aber unvollständig oder unvollständig
bekannt ist, gehören zur Formabteilung der Deuteromycota oder fungi imperfecti.
Als pilzähnliche Protisten werden die sechs phylogenetisch voneinander unabhängigen
Abteilungen Myxomycota, Plasmodiophoromycota, Labyrinthulomycota, Oomycota,
Hyphochytriomycota und Chytridiomycota zusammengefaßt. In jeder Abteilung kommen
aktiv bewegliche Keime vor, am häufigsten Zoosporen, manchmal amöboide Zellen oder
beides. Teile der meisten Abteilungen haben sich, wie die echten Pilze als Ganzes, zu
Festlandbewohnern entwickelt. Das gesamte Agglomerat der pilzähnlichen Protisten macht
mit etwa 2.000 bekannten Arten nur etwa 2 % der Pilze aus, umspannt aber eine
beachtenswerte Vielfalt an Lebensformen.[2]
Die Vermehrung der Pilze verläuft wie bei allen Eukaryonten durch Mitose oder Meiose und
durch die Bildung geschlechtlicher oder ungeschlechtlicher Sporen oder auch durch
Sprossung.
Viele Pilze und pilzähnliche Organismen leben als Parasiten und sind in dieser Eigenschaft
häufig pathogen. Man kennt human- und tierpathogene Pilze, die als krankheitserregende
Hygieneschädlinge Ursachen von Lebensmittelvergiftungen und von Mykosen sind.[7]
Nicht weniger zahlreich sind phytopathogene Pilze, die als Erreger von Pflanzenkrankheiten
wie Brand, Rost (z. B. an Getreide und Kaffee), Mehltau, Fäule usw. großen Schaden
verursachen, mitunter auch regelrechte Epidemien hervorrufen, wie z. B. die Ulmenkrankheit.
Einen interessanten Aspekt bieten die Pilze als Bio-Pestizide („Fungi-Herbizide“, „Fungi-
Insektizide“ und „Fungi-Fungizide“).
Viele Bodenpilze leben in Symbiose mit den Wurzeln von Bäumen und Pflanzen, sie bilden
eine sogenannte Mykorrhiza, eine Stoffwechselgemeinschaft, die für manche der betreffenden
Pflanzen (z. B. Orchideen) obligatorisch ist. Eine Dauersymbiose zwischen Pilzen
(Mykobionten) und Algen und/oder den als Blaualgen bekannten Cyanobakterien
(Photobionten) ist in Flechten (Lichenes) entstanden. Eine Ektosymbiose stellen die von
Blattschneiderameisen und Termiten angelegten Pilzkulturen dar.
4Einleitung
1.2 Sekundärmetabolite
Ähnlich den Pflanzen produzieren die Pilze in ihrem Stoffwechsel oftmals Substanzen, die
nicht dem Primärstoffwechsel zuzuordnen sind. Häufig haben diese als Sekundärmetabolite
bezeichneten Stoffe im Gegensatz zum essentiellen Primärstoffwechsel für den sie pro-
duzierenden Pilz eine geringe oder keine unmittelbar erkennbare Bedeutung, wie z. B. Anti-
biotika oder Mykotoxine. Ein weiterer Unterschied zwischen Primär- und Sekundärstoff-
wechsel liegt in der Spezifität. Während der Sekundärmetabolismus für den Stamm, die Art,
die Gattung oder seltener eine Familie charakteristisch ist, verläuft der Primärstoffwechsel bei
allen Organismen im wesentlichen gleich.[8−16] Eine scharfe Trennung zwischen beiden
Stoffwechselsystemen ist jedoch nicht möglich, da die Synthese der Sekundärmetabolite
vielfach von Primärmetaboliten ausgeht.[17]
Die Produktion von Sekundärmetaboliten erfolgt im Allgemeinen nur in Zellen, die sich nicht
mehr teilen oder sich durch limitierte Wachstumsraten auszeichnen.[15] Man unterscheidet
daher zwischen einer Wachstumsphase (Trophophase), in der der Primärstoffwechsel
dominiert, und einer Produktionsphase (Idiophase). Unter den zahlreichen Sekundärstoffen
finden sich nicht nur Mykotoxine, d. h. Gifte, sondern auch nützliche Verbindungen wie
organische Säuren oder medizinisch-pharmazeutisch wichtige Produkte (Antibiotika, Ergot-
Alkaloide, Cytochalasane, Siderochrome). Die Sekundärmetabolite können für den
Organismus vielfältige vorteilhafte Funktionen übernehmen und damit bei der Evolution von
Bedeutung sein.[2,18−21]
Hierzu sind zu zählen:
•Abwehrreaktion nach außen (Fraßverhinderung durch Mykotoxine, Hemmung von
Konkurrenten durch Antibiotika)
•Angriffreaktion nach außen (Schwächung des Wirtes zur besseren Infiltration in
diesen)
•Kommunikation (Lockstoff, z. B. Antherdiol als Sexuallockstoff bei Oomycetes und
Trisporsäure bei Zygomycetes, Sirenin als Lockstoff für Gameten bei Allomyces und
Chytridiomycetes)
•zufällige Entstehung neuer Enzyme (akzidentelle Synthese)
•Verwertung überschüssiger Zwischenprodukte mit Hilfe von Enzymen
•im Rahmen der Phylogenese unabgeschlossener Selektionsvorgang
Einleitung 5
1.3. Biogenese der Sekundärmetabolite
Interessanterweise ist die Biosynthese der Sekundärmetaboliten im wesentlichen von einer
begrenzten Anzahl an Primärmetaboliten wie α-Aminosäuren, Acetyl-Coenzym A, Mevalon-
säure und Intermediaten der Shikimisäure abzuleiten. Zur Klassifizierung der Sekundärmeta-
bolite bzw. deren Strukturfragmente werden diese daher unter Berücksichtigung ihrer
Ausgangskomponenten in die Kategorien der isoprenoiden, aromatischen und alkaloiden
Verbindungen eingeteilt.
1.3.1. Isoprenoide Verbindungen (Terpene und Steroide)
Beide Naturstoffklassen, die Terpene und Steroide[22], zeigen große Ähnlichkeit in ihrem
strukturellen Aufbau. Bereits im Jahre 1922 sprach Ruzicka die Vermutung aus, daß sich die
verschiedenen Terpene aus Isoprenmolekülen (Abb. 3) aufbauen. Diese Isoprenregel wurde
später in dem Sinne erweitert, daß primär nicht nur Additionen von Isoprenmolekülen
erfolgen, sondern sekundär auch Umwandlungen bzw. Umlagerungen eintreten können.
Heute weiß man, daß beim Aufbau der Terpene und Steroide im Pflanzen- und Tierreich als
„Isoprenbaustein“ die (R)-Mevalonsäure fungiert. Diese biogenetischen Zusammenhänge
geben Veranlassung, beide Stoffklassen allgemein als Isoprenoide zu bezeichnen.
Schwanz
Kopf
Abb. 3: Isoprenmolekül.
Nach der Anzahl der Isoprenreste (C5-Einheiten) lassen sich die Terpene in Mono-, Sesqui-,
Di-, Sester-, Tri-, Tetra- und Polyterpene[23] unterteilen (Abb. 4). Die Steroide leiten sich von
einer Gruppe von Triterpenen, dem Methylsterol ab. Isoprenoide Bausteine werden auch als
Bestandteile anderer Naturstoffe wie der Alkaloide, Chinone oder der Chlorophylle gefunden.
6Einleitung
+n C5
+ C5
D*
+ C5
D*
+ C5
Abb. 4: Schematische Darstellung der Biosynthese der isoprenoiden Verbindungen.
D*: Schwanz-Schwanz-Kondensation.
Ruzicka[24] konnte 1953 seine biogenetische Isopren-Regel formulieren, nach der sich die
natürlichen isoprenoiden Verbindungen von acyclischen Vorstufen – Geraniol (C10), Farne-
sol (C15), Geranylgeraniol (C20) und oder Squalen (C30) – ableiten. Ausgangspunkte der Bio-
synthese ist die Mevalonsäure, die aus 3 Mol Acetyl-Coenzym A („aktivierte Essigsäure“) ge-
bildet wird (Abb. 5). Durch Decarboxylierung und Eliminierung von Wasser entsteht aus dem
Mevalonsäurepyrophosphat Isopent-3-enylpyrophosphat („aktiviertes Isopren“), das durch
eine Isomerase in das stabilere 3,3-Dimethylallylpyrophosphat umgelagert wird (Abb. 5). Die
Entdeckung des Allylpyrophosphats geht auf Lynen[25] zurück.
Geranylpyrophosphat
Polyterpene C
n
Tetraterpene C
40
Monoterpene
C
10
Sesquiterpene C
15
Diterpene C
20
Sesterterpene C
25
Triterpene C
30
Farnesylpyrophosphat
Geranylgeranylpyrophosphat
Geranylfarnesylpyrophosphat
Einleitung 7
"Aktiviertes Isopren"
3,3-Dimethylallylpyro-
phosphat
Isopent-3-enylpyro-
phosphat
Mevalonsäurepyrophosphat
OP P
OP P
H2O
CO2
OP
OH
HO2CP
1. Reduktive Abspaltung
von CoA
2. Phosphorylierung
"Aktivierte Essigsäure"SCoA
O
OH
HO2C
3 Mol
O
SCoA
Abb. 5: Biosynthese des Mevalonsäure- bzw. Isopent-3-enylpyrophosphats.
Das 3,3-Dimethylallylpyrophosphat (DAPP) wirkt als stark elektrophiles Reagenz und greift
unter Addition an der als Nucleophil wirkenden Doppelbindung von Isopentenylpyrophosphat
(IPP) an (Kopf-Schwanz-Kondensation). Durch diesen kombinierten Substitutions-
Eliminierungsmechanismus wird Geranylpyrophosphat gebildet, das wiederum als
Allylderivat elektrophil an einem weiteren Isopentenylpyrophosphat (IPP) angreifen kann.
Auf diese Weise entstehen die acyclischen Vorstufen der natürlichen isoprenoiden
Verbindungen (Abb. 6). Die Doppelbindungen sind dabei trans-ständig angeordnet.
OP P OP P
H
+
(DAPP)(IPP)
H
OPP
-
-
OP P + IPP
Geranylpyrophosphat
OP P + IPP usw.
Farnesylpyrophosphat
Abb. 6: Biosynthese acyclischer Terpene.
8Einleitung
Neben dieser Kopf-Schwanz-Kondensation kann noch eine Schwanz-Schwanz-Kondensation
erfolgen, die zu einer Dimerisierung führt (Abb. 4).
Der geschilderte Substitutions-Eliminierungsmechanismus, der zur Bildung acyclischer
Verbindungen führt, kann sich auch innerhalb eines Moleküls abspielen. Die zahlreichen
Möglichkeiten dieser intramolekularen Cycloaddition bedingen die Vielfalt der cyclischen
Strukturen innerhalb der isoprenoiden Verbindungen. Bei den intramolekularen
Cycloadditionen können im wesentlichen zwei Typen unterschieden werden. Bei den
Terpenen mit geringer Anzahl von C-Atomen (Mono-, Sesquiterpene) greift eine
Doppelbindung nucleophil an dem C-Atom an, das den Pyrophosphatrest trägt. Aus sterischen
Gründen muß davon ausgegangen werden, daß als Vorstufen für die als Beispiel
herangezogenen Sesquiterpene (Abb. 7) sowohl 2-cis-5-trans- (a) als auch 2-trans-6-trans-
Farnesylpyrophosphat (b) fungieren können. Durch die Abspaltung des Pyrophosphats
entstehen zunächst vielgliedrige nichtklassische Carbokationen (c, d, e), die nach Cyclisieren
zu den Carbokationen f, g, h, i und j durch 1,2- und 1,3-Hydridverschiebungen, „Mar-
kownikoff“- und „Anti-Markownikoff“-Cyclisierungen, Wagner-Meerwein-Umlagerungen
und 1,2-Methylverschiebungen die verschiedenen Sesquiterpen-Grundkörper bilden (Abb. 7).
OP P OP P
ab
cde
fghij
BisabolaneCadinaneHumulaneGermacraneEudesmane
(Selinane)GuaianeCayophyllanePseudoguaiane
Abb. 7: Angenommene Bildungsmöglichkeiten einiger Sesquiterpengrundgerüste.[26]
Bei den Diterpenen und den Terpenen mit einer größeren Anzahl von Kohlenstoffatomen
überwiegt dagegen eine andere Art der Cyclisierung, bei der die terminale, nicht phosphory-
lierte Isopropyliden-Einheit als kationisches Zentrum die Reaktion einleitet. Diese Art der
Einleitung 9
Cyclisierung wurde zuerst zur Erklärung der Cyclisierung des Triterpen-Kohlenwasserstoffs
Squalen im Verlaufe der Biosynthese tetracyclischer Triterpene angenommen. Die
biosynthetische Reaktionskette wird eingeleitet durch die Bildung des Squalenoxids (Abb. 8).
2
6
77
6
2
O
[O]
Abb. 8: Bildung des Squalenoxids.
Es wird angenommen, daß dann durch Protonierung des Sauerstoffatoms dieser Epoxid-
gruppierung am C-2-Atom ein kationisches Zentrum entsteht, welches durch die Doppel-
bindung in 6,7-Stellung angegriffen wird. Die weitere Cyclisierung kann man dann als
Sequenz erneuter elektrophiler Additionen an den sich bildenden kationischen Zentren
auffassen. Bei trans-ständigen Doppelbindungen ist eine trans-Verknüpfung der Ringe, bei
cis-ständigen Doppelbindungen eine cis-Verknüpfung zu erwarten. Das bei der Cyclisierung
von Squalen anfallende Ringsystem besitzt also eine trans-anti-trans-anti-trans-Geometrie
(trans-ständige Verknüpfung der Ringe und anti-ständige Substituenten an den Positionen 9,
10 und 8, 14) (Abb. 9).
7
6
2
O
H
H
H
H
10
9814
H
H
H
HO Damaradienol
Abb. 9: Biosynthese tetracyclischer Terpene.
10 Einleitung
1.3.2. Aromatische Verbindungen
Carbocyclische aromatische Verbindungen sind in Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren
weit verbreitet. Die Biosynthese dieser Verbindungen erfolgt überwiegend auf zwei Wegen.
Der erste Weg geht aus vom Kohlenhydratstoffwechsel und verläuft über die Shikimisäure
(Shikimisäure-Weg). Dieser Weg wird vor allem von der höheren Pflanze beschritten.
Der zweite Weg schließt sich dagegen an die Fettsäuresynthese an. Im Unterschied zur Fett-
säuresynthese werden jedoch die durch aufeinanderfolgende Anknüpfung von C2-Einheiten
(Acetat) entstehenden Ketocarbonsäure-Derivate nicht reduziert, sondern als Polyketo-
Verbindungen zu mono- bis polycyclischen aromatischen Verbindungen cyclisiert (Polyketid-
Weg). Der Polyketid-Weg wird vorzugsweise von Mikroorganismen beschritten.
1.3.2.1. Shikimisäure-Weg
Eine Verbindung von unerwarteter Wichtigkeit wurde 1885 aus der Frucht Illicium refigiosum
isoliert. Dieser wurde der Name Shikimisäure gegeben, abgeleitet von dem japanischen
Namen „Shikimi-no-ki“ für diese Pflanze. Spätere Untersuchungen ergaben, daß die
Shikimisäure unter anderem ein Schlüsselintermediat in der Biosynthese der aromatischen
Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan in Pflanzen und Mikroorganismen
darstellt.
Die Biosynthese der Shikimisäure geht aus von Erythrose-4-phosphat, aus dem durch
Reaktion mit Phosphoenolpyruvat die Heptose 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonsäure-7-
phosphat (Abb. 10) gebildet wird. Deren Cyclisierung führt zur 5-Dehydrochinasäure, aus der
die Shikimisäure, aber auch die in Pflanzen weit verbreitete Chinasäure entsteht.
Einleitung 11
COOH
COP
CH2
HCO
CH OH
COHH
CH
H
OP
C
CH OH
COHH
CH
H
OP
HO H
CHH
CO
COOH
OH
COOHHO
OH
HO
O OH
COOHHO
OH
OH
OH
HO
COOH
H2O1.)-
2.) Phosphory-
lierung
Phospho-
enolpyruvatErythrose-4-
phosphat3-Desoxy-D-arabino-
heptulosonsäure-7-
phosphat
Shikimisäure
Chinasäure
5-Dehydro-
chinasäure
Abb. 10: Biosynthese der Shikimisäure.
Von der Shikimisäure leiten sich zahlreiche in Pflanzen vorkommende Aromaten ab, so die
Protocatechusäure. Vom Shikimisäure-Weg zweigt auch die Biosynthese der Gallussäure ab,
die Bestandteil der hydrolysierbaren Gerbstoffe ist.[27] Nach Phosphorylierung wird aus der
Shikimisäure die Chorisminsäure gebildet, aus der durch eine enzymkatalysierte pericyclische
Claisen-Umlagerung die chinoide Prephensäure bzw. über die Anthranilsäure die essentielle
Aminosäure Tryptophan entstehen (Abb. 11). Von der Prephensäure ausgehend, wird durch
reduktive Aminierung und anschließender Aromatisierung das Phenylalanin bzw. Tyrosin
gebildet. Die direkte Aromatisierung führt zur Phenylbrenztraubensäure, die als Ausgangs-
punkt für Cumarine, Flavonoide, Lignin und Lignane dienen kann.
12 Einleitung
OH
OH
HO
COOH
O
OH
PO
COOH
COOH
COOH
OH
OH
O
OH
COOH
O
COOH
COOH
NH2
N
H
CH2
CHH2N
COOH
OH
HOOC
OCOOH
CH2
R
CH
NH2
COOH CH2C
O
COOH
a) Phenylalanin (R = H)
b) Tyrosin (R = OH)
Shikimisäure
3-Enolpyruvyl-shikimi-
säure-5-phosphat
ChorisminsäureAnthranilsäureTryptophan
Protocatechu-
säure
Prephensäure
Phenylbrenztrauben
-
säure
Abb. 11: Shikimisäure-Weg zur Biosynthese von Aromaten.
1.3.2.2. Polyketid-Weg
Unter Polyketiden werden aromatische Naturstoffe verstanden, die über Polyketosäuren als
Intermediate gebildet werden. Da β-Ketosäurederivate auch als Intermediate bei der Fett-
säuresynthese gebildet werden, bestehen enge Beziehungen zwischen der Biosynthese der
Fettsäuren und dieser aromatischen Verbindungen. Dieser Weg der Biosynthese aromatischer
Verbindungen findet nur in Mikroorganismen und höheren Pflanzen statt. Durch Versuche
mit radioaktiven Precursoren konnte gesichert werden, daß die Bildung derartiger linearer
β-Polyketosäuren durch wiederholte Reaktion eines Start-Moleküls mit Malonyl-CoA er-
Einleitung 13
folgen muß. Als Start-Molekül dient meist Acetyl-CoA, aber auch Propionyl-(Anthracycline),
Malony-(Cycloheximid), Malonamido-(Tetracycline), Caproyl-(Cannabinoide) oder Cinna-
moyl-CoA (Flavanoide)[28,29] (Abb. 12).
S
O
CoAO
O
S
O
CoA
Acetyl - CoAMalonyl - CoA
+CO2
CoAS
-
-SCoA
O O
O
O
SCoA
O
+
O O
SCoA
O
n
n
Poly-β-ketoacyl-CoA
Abb. 12: Bildung linearer β-Polyketosäuren.
Die als Intermediate angenommenen Polyketosäure-Derivate H
3C−CO−(CH2−CO)n−CH2 −
COOH konnten allerdings – wahrscheinlich aufgrund ihrer Labilität – noch nicht isoliert
werden. Im Verlaufe der Fettsäuresynthese werden die β-Ketosäure-Derivate durch Reduktion
in Fettsäurereste übergeführt. Wenn einige Schritte der Reduktion der Ketogruppen zur
Methylengruppe ausgelassen werden entstehen Hydroxy-Carbonsäuren, die durch Lactoni-
sierung Makrolide bilden können. Bei der Synthese der Polyketide dagegen werden
Polyketosäuren durch intramolekulare Kondensationen unter Aromatisierung cyclisiert.
Ein derartiger Polyacetat-Weg zur Synthese von Aromaten wurde 1907 zuerst von Collie[30]
vermutet. Eine wesentliche Rolle bei der Aufklärung dieses Bildungsweges haben dann vor
allem die Arbeiten von Birch und Robinson[31−33] gespielt. Als Cyclisierungsreaktionen
werden insbesondere die Aldolreaktion und die Claisen-Kondensation diskutiert. Die
Abbildung 13 zeigt einige von einem Tetraketid ausgehende Bildungsmöglichkeiten für
benzoide Aromaten.
14 Einleitung
SEnzym
R
O
O
O O
Aldolreaktion
HO R
CO2H
OH
R = CH3: Orsellinsäure
R = CHC6H5: Stilbene
Claisen-Kondensation
R
S
O
O
O O
EnzymHO OH
OH O
R
R = CH3: Phloaacetophenoe
R = CHCHC6H5: Chalcone
R = CH2CH2C6H5: Dihydrochalcone
Flavanoide
R = C6H5: Benzophenone
Xanthone
Abb. 13: Angenommene Biosynthese-Wege ausgehend von β-Triketo-Verbindungen.[34]
Wertvolle Erkenntnisse zum Polyketid-Weg konnten aus biomimetischen Synthesen
gewonnen werden. Wegen der extremen Instabilität der Polyketo-Verbindungen wird für
derartige Synthesen von geschützten Verbindungen ausgegangen. Als geschützte Ketone
werden Pyrone oder Ketale eingesetzt. Ein Beispiel einer biomimetischen Synthese eines
Aromaten ist die Synthese des Emodins (Emodine kommen in Pilzen und Flechten vor),
wobei das als instabiles Zwischenprodukt auftretende Polyketon aus Oxoglutarsäureester und
dem Dienolat des Acetylacetons gebildet wird. Das nicht isolierbare Polyketid cyclisiert zum
Naphthalinderivat, aus dem durch weitere Reaktionen Emodin entsteht (Abb. 14).
Einleitung 15
Emodin
O
O
OH
HO
OH
OH OH O
O
OH
O
O
O
O
O O
O O O
OO
2
+
O
O
OO
O
O
Abb. 14: Biomimetische Synthese des Emodins.
1.3.3. Alkaloide Verbindungen
Ein Alkaloid ist nach der Definition von Pelletier[35] eine cyclische organische Verbindung,
die Stickstoff in negativer Oxidationsstufe enthält und unter Organismen nur begrenzt
verbreitet ist. Sie bilden eine große Gruppe mit unterschiedlichsten Strukturen.[36,37] Die
Alkaloide sind nach ihrer Biosynthese in vier Gruppen zu unterteilen.
1.3.3.1. Die „echten“ Alkaloide
Die Hauptgruppe läßt sich von proteinogenen Aminosäuren oder einigen ihnen biochemisch
nahestehenden stickstoffhaltigen Säuren herleiten. Der Stickstoff geht mit einigen Kohlen-
stoffatomen in die Synthese ein. Das Carbonylkohlenstoffatom der Aminogruppe geht meist
verloren. Die Vorstufen dieser Alkaloide sind bevorzugt die aromatischen Aminosäuren
Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan und die zweibasigen Aminosäuren Ornithin und Lysin,
daneben noch Derivate der Anthranilsäure und der Nikotinsäure. In den einfachsten Fällen ist
überhaupt nur eine Aminosäure mit einem oder mehreren Molekülen an der Bildung eines
heterocyclischen Systems beteiligt. Als einfaches Beispiel wurde die Biosynthese des Lupi-
nins und des Sparteins aufgeführt. Lysin kann durch oxidative Desaminierung und Decar-
boxylierung über Cadaverin in einen Aminoaldehyd verwandelt werden, der leicht im Sinne
der Bildung einer Schiffschen Base cyclisiert und damit den Tetrahydropyridin-Ring ergibt.
Solche Reaktionen können auch mit mehreren Lysinmolekülen ablaufen. So entstehen die
16 Einleitung
typischen Lupinen-Alkaloide. Aus zwei Lysin-Molekülen entsteht das Lupinin, aus drei
Lysin-Molekülen das Spartein (Abb. 15).
Spartein
Lupinin
N
N
H
H
H
H
N
OH
H
N
3,4,5,6-Tetrahydro-
pyridin
5-Amino-
valeraldehyd
NH2
O
Cadaverin
Lysin
NH2
NH2
NH2
NH2
CO2H
2 x3 x
Abb. 15: Biosynthese des Lupinin und des Spartein.
Dieses Beispiel stellt nur einen sehr einfachen Fall dar. Die große Mannigfaltigkeit, in der die
verschieden Alkaloid-Typen in Erscheinung treten, werden im wesentlichen noch durch
folgende Faktoren verursacht:
− Hydrierung und Dehydrierung
− durch Anlagerung von Sauerstoff unter Mitwirkung von mischfunktionellen Oxidasen
− durch Methylierungen am Stickstoff, am Sauerstoff oder auch am Kohlenstoff unter Mit-
wirkung von transmethylierenden Enzymsystemen, bei denen entweder aktiviertes Methionin,
Tetrahydrofolsäure oder Cholin die CH2-Spender sind.
1.3.3.2 Pseudoalkaloide
Als Pseudoalkaloide bezeichnet man Verbindungen, deren Kohlenstoffgrundgerüst nicht von
Aminosäuren herrührt. Das C-Gerüst der Pseudoalkaloide wird vor allem von isoprenoiden
Verbindungen (Steroid-Alkaloide) oder Polyketiden gebildet. Der Stickstoff (in Form von
NH3) wird bei den Pseudoalkaloiden meist erst in einer späteren Phase der Biosynthese
eingebaut. Als Beispiel soll die Biosynthese des Pseudoalkaloids Coniin angeführt werden,
die ausgehend von vier Molekülen Acetat, über das in Abb. 16 dargestellte hypothetische
Polyketid erfolgt. Coniin und das zunächst gebildete γ-Conicein sind leicht ineinander
Einleitung 17
überführbar. Isoprenoide Verbindungen und Polyketide können aber auch neben Aminosäuren
als Bausteine von Alkaloiden dienen.
-2H
+
+2H
NH3
Coniin
γ-Conicein
N
H
N
HO
O
O
O O
4 MolSCoA
O1.
2.Red.
Abb. 16: Biosynthese des γ-Coniceins bzw. Coniins.
1.3.3.3. Peptidalkaloide
Eine dritte Gruppe wird als Peptidalkaloide klassifiziert. Es handelt sich meist um cyclische
Oligopeptide von 2−20 Aminosäuren, die sich gehäuft in Rhamnaceen und Celastraceen
finden. Bei diesem Typ bleibt die Carboxylgruppe der Aminosäuren erhalten, ihr C-Atom
geht in die Ringbildung mit ein. Es entsteht so ein heterocyclisches System, das zudem oft
basischen Charakter hat (Abb. 17).
N-Dimethylphenylalanin
Phenylalanin
p-Hydroxystyrylamin
trans-3-Hydroxy-
prolin
Isoleucin
N
O
N
H
NH
O
N H
O
N
O O
Abb. 17: Das Peptidalkaloid Amphibin-B.
18 Einleitung
1.3.3.4. Protoalkaloide
Als Protoalkaloide bezeichnet man die Decarboxylierungsprodukte von Aminosäuren
(biogene Amine) (Abb. 18) und deren Substitutionsprodukte (Alkyl- und Hydroxyderivate)
sowie Aminosäurederivate, bei denen das Stickstoffatom noch acyclisch vorliegt.
R
CO2H
NH2RNH2+ CO2
Abb. 18: Bildung der Protoalkaloide durch Decarboxylierung von Aminosäuren.
Die Protoalkaloide sind in Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren frei oder gebunden relativ
weit verbreitet. Einige sind Bestandteile von Lipiden (Colamin, Cholin) oder Coenzymen
(Cysteamin, β-Alanin, Propanolamin). In Tieren dienen Derivate der Protoalkaloide als
Neurotransmitter (Acetylcholin, Catecholamine, Tryptamin, Serotonin, Histamin). Die
Diamine Putrescin und Cadaverin sind Fäulnisprodukte. Von Putrescin leiten sich die Poly-
amine Spermidin [Mono-(γ-aminopropyl)putrescin] und Spermin [Di-(γ-aminopropyl)put-
rescin] ab, die DNS-Assoziate bilden.
Die bedeutendsten Gruppen von Protoalkaloiden stellen die Phenylethylamine (Mescalin,
Ephedrin, etc.) und die Indolylalkylamine (Tryptamin, Serotonin, Gramin, etc.) dar, von
denen sich die Isochinolin- bzw. Indolalkaloide ableiten.[38, 39]
EphedrinMescalin
NHCH3
HO H
H
NH2
OCH3
CH3O
CH3O
Abb. 19: Die Phenylethylamine Mescalin und Ephedrin.
Aufgabenstellung und Zielsetzung 19
2. Aufgabenstellung und Zielsetzung
Trotz aller Fortschritte auf den Gebieten der Wirkstoffentwicklung im Pflanzenschutz und in
der Pharmaforschung besteht nach wie vor ein großer Bedarf an neuen innovativen
Leitstrukturen und Wirkstoffen. Dies bezieht sich in der Agrochemie insbesondere auf
Verbindungen, die optimal ökologisch verträglich, in kleineren Mengen selektiv wirksam und
dennoch kostengünstiger als bereits am Markt etablierte Produkte sind. In der
Pharmaforschung besteht ein großes Interesse an Wirkstoffen gegen nahezu alle
Stoffwechselerkrankungen, immunologische Krankheitsformen, die verschiedenen Krebs-
erkrankungen sowie auch neuro-degenerative Erkrankungen und parasitäre, virale und
bakterielle Infektionen.
Eine wichtige Plattform bei der Suche nach neuen Wirkstoffen bildet die Auswahl origineller
Naturstoffquellen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, aus der bisher wenig
untersuchten Pilzgruppe der endophytischen Pilze und aus Pilzen, die extreme Standorte
bevorzugen, pflanzenschutz- und pharmawirksame Sekundärmetabolite zu isolieren, zu
charakterisieren und gegebenenfalls zu synthetisieren.
Die Durchführung erfolgte im Rahmen eines vom BMBF geförderten Forschungsprojekts für
„Molekulare Naturstofforschung“ in Zusammenarbeit mit dem Institut für Mikrobiologie der
Technischen Universität Braunschweig und der BASF AG Ludwigshafen.
Die Auswahl, Aufzucht und Kultivierung der Pilze sowie erste Pflanzenschutztests der
Rohextrakte und der Naturstoffe wurden im Arbeitskreis von Herrn Prof. Aust unter Leitung
von Frau Dr. Schulz im Institut für Mikrobiologie in Braunschweig durchgeführt. Für das
pharmakologische Screening mittels molekularer Testsysteme sowie die weiterführende
Testung bei einigen vielversprechenden Substanzen im Pflanzenschutz war die BASF AG
verantwortlich.
20 Hauptteil
3. Hauptteil I
3.1 Stamm 3037
3.1.1. Pilzbeschreibung
Der Pilz 3037 wurde aus einer Erdprobe von der Spitze des Enlang-Berges (China, 4000 m)
isoliert. Taxonomisch wurde dieser der Art Oidiodendron truncata Barron zugeordnet.
Oidiodendron gehört zur Abteilung Deuteromycota und ist eine anamorphe Gattung der
teleomorphen Gattung Myxotrichum und Byssoascus. Bekannt ist, daß Pilze der Gattung
Oidiodendron häufig Symbiosen (Mykorrhiza) mit der Pflanzengruppe Ericacean (Moos-
beeren, Heidekraut usw.) eingehen.[40] So wurden die Arten Oidiodendron echinulatum und
truncatum aus Koniferen-Sümpfen in Wisconsin isoliert, aber auch aus offenen Mooren,
Mischwäldern und aus der Rhizosphäre von Weizenpflanzen.[41]
3.1.2. Isolierung der Naturstoffe 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7
Der Pilz wurde sowohl auf einem Biomalz-Flüssigmedium als auch auf einem Biomalz-
Weichagarmedium 27 bzw. 70 Tage kultiviert. Anschließend wurde die Kulturbrühe mit
Eiswasser verdünnt und mit einem Warring-Blender homogenisiert. Danach wurde einmal mit
Petrolether und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden über
Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen und der so
erhaltene Rückstand abschließend in Methanol/Aceton 1:1 aufgenommen.
Während das Petrolether- und Ethylacetat-Extrakt der Biomalz-Flüssigkultur starke Wirkung
gegen Ustilago violacea und Chlorella fusca zeigte, war diese Wirkung in der Biomalz-
Weichagarkultur nur im Ethylacetat-Extrakt zu beobachten.
Die Vorfraktionierung des Ethylacetat-Rohextraktes (ca. 2.1 bzw. 2.6 g) erfolgte mittels
Säulenchromatographie. Als Elutionsmittel diente eine Dichlormethan/Methanol–Mischung
mit einem Methanolgehalt von 0−5 %. Die mit Abstand größte und unpolarste Fraktion (ca.
1.6 bzw. 2.2 g) bestand aus einem symmetrischen Triglycerid, welches aus zwei Linol- und
einem Ölsäurerest aufgebaut ist. Die weitere Fraktionierung gelang durch mehrmalige
präparative Schichtchromatographie (PSC). Dabei wurden neben Linolsäure 8 mg eines Ge-
misches der Naturstoffe 1 und 2 isoliert. Deren Trennung gelang durch PSC mit einer 1:4-
Mischung Ethylacetat/Hexan.
Hauptteil 21
Die Naturstoffe 3, 4, 5 und 6 konnten neben einer großen Fraktion des Naturstoffs 1 aus einer
weiteren Biomalz-Flüssigkulturcharge isoliert werden. Diese wurde 27 Tage bei 17 °C
kultiviert. Die 2.3 g des Ethylacetat-Extraktes wurden analog zu den bereits untersuchten
Extrakten vorgetrennt. In der Fraktion des Naturstoffs 1 konnte der Sekundärmetabolit 3
(10 mg) (Rf-Wert = 0.77 (CH2Cl2/MeOH 98:2) durch PSC isoliert werden. Ebenso gelang die
Isolierung der Naturstoffe 4 (15 mg), 5 (13 mg) und 6 (3 mg) aus einer polareren Fraktion.
Die abschließende Reinigung der Naturstoffe 1, 3 und insbesondere die der polaren
Naturstoffe 4, 5 und 6 erfolgte mittels Kristallisation in Dichlormethan/Cyclohexan bzw.
Methanol. Angemerkt sei desweiteren, daß die gewählte Nummerierung der Sekundärmeta-
bolite 1−6 mit der zunehmenden Polarität der Substanzen korreliert. Der Naturstoff 7 (10 mg)
wurde aus dem Petroletherextrakt (200 mg) dieser Charge durch PSC und Kristallisation aus
einem Dichlormethan/Cyclohexan-Gemisch gewonnen.
3.1.3. Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe
3.1.3.1. Naturstoff 1
Der Naturstoff 1 kristallisiert in Form farbloser Prismen, die bei 231 °C schmelzen. Die
Kristalle lösen sich gut in Lösungsmitteln mittlerer Polarität, wie Chloroform und
Dichlormethan. Die Verbindung besitzt einen spezifischen Drehwert von [α]D
20 = + 91 °
(c = 0.98, MeOH) und ist durch UV-Licht der Wellenlänge 254 nm detektierbar. Die scharfen
Absorptionsbanden bei 1773 cm−1 und 1717 cm−1 im IR-Spektrum sind ein Indiz für die
Anwesenheit zweier Carbonylgruppen. Die Bande bei ν = 1773 cm−1 ist aufgrund ihrer relativ
großen Verschiebung nach höheren Frequenzen sogar ein bemerkenswert zuverlässiger
Hinweis auf ein γ-Lacton. Dem 1H -, 13C-NMR-Spektrum und dem DEPT 135-Experiment ist
zu entnehmen, daß die Substanz jeweils drei Methyl- und Methylengruppen sowie fünf
Methingruppen und sechs quartäre Kohlenstoffatome besitzt (Tabelle 1).
22 Hauptteil
Naturstoff 1
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
129.9 (t) 1.44-1.80 (m)
217.9 (t) 1.44-1.80 (m)
328.7 (t) 1.44-1.80, 2.15-2.28 (m)
442.3 (s) −
544.1 (d) 1.90 (d)
672.3 (d) 4.95 (dd)
753.4 (d) 4.02 (d)
856.6 (s) −
9157.5 (s) −
10 36.3 (s) −
11
118.8 (d) 6.04 (s)
12 162.6 (s) −
13 99.9 (d) 5.46 (s)
14
25.6 (q) 1.29 (s)
15 180.6 (s) −
16 24.5 (q) 1.14 (s)
17
58.1 (q) 3.67 (s)
Tabelle 1: 1H- und 13C-NMR-Daten des Naturstoffs 1.
Die Summenformel ohne Heteroatomanteil lautet demnach C
17H20 und entspricht einer
vorläufigen Molmasse von 224. Die massenspektroskopischen Untersuchungen (CI) ergeben,
daß die Molmasse der Substanz 320 beträgt. Die Massendifferenz von 96 und die chemischen
Verschiebungen im 1H- und 13C-NMR-Spektrum lassen vermuten, daß die korrekte Summen-
formel C17H20O6 lautet. Durch die Bestimmung der Präzisionsmasse des [M−H]−-Peaks zu
319.118 ± 2 ppm konnte dies verifiziert werden.
Die konstitutionelle Strukturaufklärung erfolgt mittels ein- und zweidimensionaler
NMR-Spektroskopie. Das Protonenspektrum zeigt zwei Singuletts bei 1.14 und 1.29 ppm, die
aufgrund ihrer Integrale zwei Methylgruppen zuzuordnen sind (Tab. 1). Ein weiteres Drei-
Protonen-Singulett bei 3.67 ppm weist auf eine Methoxygruppe hin. Die Protonensignale 7-H
und 6-H sowie die im H,C-COSY korrelierenden 13C-Peaks bei 53.4 und 72.3 ppm zeigen,
daß diese Kohlenstoffatome einfach oxygeniert sind. Das Methinprotonensignal 13-H
korreliert im H,C-COSY mit dem 13C-NMR-Signal bei 99.9 ppm, das charakteristisch für
einen zweifach oxygeniertes Kohlenstoffatom ist. Das Singulett bei 6.04 ppm im
Protonenspektrum ist einer olefinischen CH-Gruppe zuzuordnen, deren 13C-Verschiebung bei
118.8 ppm liegt. Die quartären 13C-NMR-Signale bei 180.6 ppm und 162.6 ppm sind typisch
Hauptteil 23
für Ester- oder Lactoncarbonylgruppen bzw. α,β-ungesättigte Ester oder Lactone (Eine
Carbonsäurefunktion kommt aufgrund des unpolaren Charakters der Verbindung nicht in
Frage).
Zum Aufbau des Strukturgerüstes wird die zweidimensionale NMR-Technik genutzt. Das
H,H-COSY zeigt, daß die drei Methylengruppen 1-H, 2-H und 3-H nur untereinander
koppeln. Desweiteren sind im HMBC-Spektrum 2J- bzw. 3J-Konnektivitäten zwischen beiden
quartären Kohlenstoffatomen C-10 und C-4 und den Methylenprotonen zu beobachten. Die
Singulettsignale der Methylgruppen bei 1.14 und 1.29 ppm zeigen im HMBC-Spektrum
ihrerseits fast erwartungsgemäß 2J-Kopplungen zu den quartären Kohlenstoffatomen C-10
und C-4, so daß die Teilstruktur I konstruiert werden kann.
R
R
R
R
1
2
34
10
16
14
Teilstruktur I
Dem HMBC-Spektrum ist weiter zu entnehmen, daß sowohl die beiden quartären
Kohlenstoffatome C-10 und C-4, als auch die beiden Methylgruppen und die Methylengruppe
C-3 mit einer Methingruppe mit der Protonenresonanz δ = 1.90 ppm koppelt. Diese Methin-
gruppe (C-5) zeigt ihrerseits, wie die Methylgruppe bei δ = 1.29 ppm und die Methylengruppe
C-3, eine 3J-Kopplung zum 13C-NMR-Signal bei 180.6 ppm, welches einem Lacton oder
Ester zuzuordnen ist (Teilstruktur II).
O
OR
R
R
1
2
34
10
16
14 15
5
Teilstruktur II
Für das Duplett der Methingruppe C-5 wird ebenso wie für das Doppelduplett der Methin-
gruppe C-6 eine Kopplungskonstante von J = 4.4 Hz registriert. Das H,H-COSY-Spektrum
liefert ebenfalls einen Beleg für die Kopplung der beiden Protonen. Das Doppelduplett 6-H
24 Hauptteil
koppelt desweiteren im H,H-COSY mit einer Methingruppe mit der chemischen
Verschiebung von δ = 4.02 ppm (Teilstruktur III).
O
OR
R
R
R
R
1
2
34
10
16
14 15
567
Teilstruktur III
Im HMBC-Spektrum ist, ausgehend vom Protonensignal 6-H, ein Kreuzsignal zum quartären
Kohlenstoffatom C-8 zu beobachten. Ferner ist auch von der Methylgruppe C-16 eine
3J-Konnektivität zu dem Kohlenstoffatom C-9 detektierbar, so daß Teilstruktur IV konstruiert
werden kann.
O
OR
R
R
R
R
R
1
2
34
10
16
14 15
567
8
9
Teilstruktur IV
Die quartären Kohlenstoffatome C-10 und C-8 zeigen beide eine vicinale Kopplung zu dem
Proton der olefinischen CH-Gruppe C-11, für welches seinerseits eine 2J-Kopplung zum
Kohlenstoffatom mit der chemischen Verschiebung δ = 162.6 ppm registriert wird. Im
HMBC-Spektrum ist, ausgehend vom Kohlenstoffatom C-8, eine Kopplung zum Protonen-
signal δ = 5.46 ppm (13-H) detektierbar. Vom entsprechenden 13C-Signal bei δ = 99.9 ppm ist
im HMBC-Spektrum ein deutliches Kreuzsignal zur Methoxygruppe vorhanden. Die Tieffeld-
verschiebung der Methingruppe C-13 ist, wie vermutet, auf eine Zweifach-Oxygenierung
zurückzuführen, so daß, wie in Teilstruktur V ersichtlich, ein α,β-ungesättigtes Lacton
formuliert werden kann.
Hauptteil 25
O
O
O
O
O
R
R
R
R
1
2
34
10
16
14 15
567
8
9
11 12
13
17
Teilstruktur V
Ein weiteres Indiz für die Richtigkeit der Struktur sind die typischen 13C-NMR-Ver-
schiebungen für olefinische Kohlenstoffatome, die α- bzw. β-ständig zu einer Carbonyl-
gruppe stehen. Durch die Knüpfung des Sauerstoffs an die Methingruppe C-6 erhält man das
anhand des IR-Spektrums prognostizierte γ-Lacton. Die chemischen Verschiebungen der
Methingruppe C-7 und des Kohlenstoffatoms C-8 sowie die anhand der Präzisionsmasse
bestimmte Summenformel zeigen, daß zur Vervollständigung der Struktur nur noch ein
Sauerstoffatom zur Bildung des Epoxids eingefügt werden muß. Der Naturstoff 1 besitzt
demnach die in Abbildung 1 dargestellte Struktur.
O
O
O
O
O
O
H
1
2
34
10
16
14
15
5
67
8
9
11 12
13
17
Abb. 20: Absolute Konfiguration des Naturstoffs 1.
Die Literaturrecherche ergibt, daß dieses Terpenoidlacton mit der Bezeichnung Antibiotic
PR 1388 erstmals 1984 von Andersen[42] ebenfalls aus Oidiodendron truncatum isoliert und
charakterisiert wurde. Der Schmelzpunkt wird mit 232−233 °C und der Drehwert mit
[α]D
20 = + 84 ° (c = 0.3; MeOH) angegeben. Auf die absolute Konfiguration des Natur-
stoffs 1 wurde von Anderson anhand von strukturell ähnlichen Terpenoiden geschlossen,
26 Hauptteil
deren absolute Konfiguration bereits bekannt ist und die ebenfalls bei der Biosynthese dieses
Pilzes gebildet werden.
3.1.3.2. Naturstoff 2
Der in farblosen Nadeln kristallisierende Naturstoff 2 zeigt einen Schmelzpunkt von 223−
224 °C. Dünnschichtchromatographisch ist er mit UV-Licht der Wellenlänge 254 nm
detektierbar. Der spezifische Drehwert beträgt [α]D
20 = − 13.2 ° (c = 0.24; CH2Cl2). Die
Löslichkeit des Sekundärmetaboliten 2 in Lösungsmitteln mittlerer Polarität (Dichlormethan,
Chloroform) ist gut. Die charakteristischen Absorptionsbanden im IR-Spektrum sind
bei 1778 cm−1 und 1716 cm−1 zu finden. Dies deutet in Analogie zum Naturstoff 1 auf die
Anwesenheit eines γ-Lactons und eines α,β-ungesättigten Lactons hin. Ein Vergleich der
1H und 13C-NMR-Spektren der Naturstoffe 1 und 2 zeigt, daß beide Verbindungen fast
identische bzw. identische Signale aufweisen (siehe Tab. 2).
Naturstoff 1Naturstoff 2
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
129.9 (t) 1.44-1.80 (m) 28.4 (t) 1.40-1.76 (m)
217.9 (t) 1.44-1.80 (m) 17.5 (t) 1.40-1.76 (m)
328.7 (t) 1.44-1.80, 2.15-2.28 (m) 29.6 (t) 1.40-1.76, 2.15-2.28 (m)
442.3 (s) −41.9 (s) −
544.1 (d) 1.90 (d) 43.8 (d) 1.90 (d)
672.3 (d) 4.95 (dd) 72.2 (d) 4.98 (dd)
753.4 (d) 4.02 (d) 53.2 (d) 3.90 (d)
856.6 (s) −55.5 (s) −
9157.5 (s) −157.6 (s) −
10
36.3 (s) −35.9 (s) −
11
118.8 (d) 6.04 (s) 118.4 (d) 6.04 (s)
12 162.6 (s) −162.5 (s) −
13
99.9 (d) 5.46 (s) 71.9 (t) 4.13 (d), 4.71 (d)
14
25.6 (q) 1.29 (s) 25.3 (q) 1.30 (s)
15 180.6 (s) −180.2 (s) −
16
24.5 (q) 1.14 (s) 24.0 (q) 1.15 (s)
17
58.1 (q) 3.67 (s)
Tabelle 2: 1H- und 13C-NMR-Daten der Naturstoffe 1 und 2.
Auffällig ist, daß im Protonenspektrum des Naturstoffs 2 das Signal für die Methoxygruppe
fehlt. Ein weiterer signifikanter Unterschied läßt sich am Kohlenstoffatom C-13 erkennen.
Hauptteil 27
Während das C-13-Signal im 13C-NMR-Spektrum des Naturstoffs 1 einer durch den
Sauerstoff des Lactons und der Methoxygruppe zweifach-oxygenierten Methingruppe
zuzuordnen ist, ist im 13C-NMR-Spektrum des Naturstoffs 2 eine Methylengruppe, die eine
chemische Verschiebung von δ = 71.9 ppm aufweist, zu finden. Die entsprechenden
Protonensignale bei 4.13 und 4.71 ppm bilden ein AB-Spinsystem mit einem schwach
ausgeprägtem Dacheffekt und einer geminalen Kopplungskonstanten von 12.4 Hz. Der
Naturstoff 2 sollte demnach im Gegensatz zu Naturstoff 1 die in Abb. 2 dargestellte Struktur
besitzen. Verifiziert wurde die Struktur des literaturunbekannten Sekundärmetaboliten 2
durch die ein- und zweidimensionale NMR-Spektroskopie. Die Methylengruppe in Position
C-13 zeigt im HMBC-Spektrum ebenso wie die Methingruppe in Verbindung 1 2J- und
3J-Kopplungen zu den Kohlenstoffatomen C-8, C-9 und C-12. Desweiteren ist im Massen-
spektrum (CI) ein Molpeak bei m/z = 290 detektierbar, welcher der angenommenen
Summenformel C
16H18O5 entspricht. Durch die HRMS, die eine Präzisionsmasse von
290.115 ± 2 ppm liefert, wird die Summenformel der Verbindung bestätigt. Aufgrund der
gleichen Kopplungskonstanten des AMX-Systems 5-H, 6-H und 7-H, der fast identischen
chemischen Verschiebung in den 1H- und 13C-NMR-Spektren und des wohl gleichen Biosyn-
theseweges ist davon auszugehen, daß das Diterpenoid 2 die gleiche Konfiguration wie Ver-
bindung 1 besitzt.
Der literaturunbekannte Naturstoff 2 ist nach unserem Kenntnisstand der einizige Vertreter
dieser Terpenoid-Lactone, der am Kohlenstoffatom C-13 keinen Substituenten trägt. Selbst
unter den strukturell sehr ähnlichen Nagilactonen, Inumakilactonen oder Podolactonen ist
keine derartiger Verbindung bekannt (Chapman-Hall- und Beilstein-Datenbank-Recherche).
O
O
O
O
O
H
1
2
34
10
16
14
15
5
67
8
9
11 12
13
Abb. 21: Der literaturunbekannte Naturstoff 2.
28 Hauptteil
3.1.3.3. Naturstoff 3
Der in farblosen Prismen kristallisierende Feststoff besitzt einen Schmelzpunkt von 222 °C.
Der spezifische Drehwert beträgt [α]D
20 = − 206 ° (c = 0.45, MeOH). Dünnschicht-
chromatographisch ist der Naturstoff bei 254 nm gut detektierbar. Das IR-Spektrum zeigt bei
1765 cm−1, 1735 cm−1 und 1720 cm−1 wiederum Absorptionsbanden, die auf ein γ-Lacton-
Strukturfragment und ein α,β-ungesättigtes Lacton hindeuten. Die 13C-NMR-spektros-
kopischen Untersuchungen zeigen, daß die Substanz ebenso wie Naturstoff 1
17 Kohlenstoffatome besitzt. Ein Vergleich der 1H- und 13C-NMR-Spektren (Tab. 3) mit
denen des Terpenoids 1 deuten wiederum darauf hin, daß die Verbindungen hohe strukturelle
Ähnlichkeiten aufweisen.
Naturstoff 1Naturstoff 3
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
129.9 (t) 1.44-1.80 (m) 28.1 (t) 1.51-1.90 (m)
217.9 (t) 1.44-1.80 (m) 17.8 (t) 1.51-1.90 (m)
328.7 (t) 1.44-1.80, 2.15-2.28 (m) 30.3 (t) 1.51-1.90, 2.27-2.42 (m)
442.3 (s) −43.2 (s) −
544.1 (d) 1.90 (d) 48.4 (d) 1.96 (d)
672.3 (d) 4.95 (dd) 71.7 (d) 5.06 (dd)
753.4 (d) 4.02 (d) 124.4 (d) 6.60 (d)
856.6 (s) −133.3 (s) −
9157.5 (s) −157.9 (s) −
10
36.3 (s) −35.4 (s) −
11 118.8 (d) 6.04 (s) 112.2 (d) 5.80 (s)
12 162.6 (s) −163.1 (s) −
13
99.9 (d) 5.46 (s) 101.6 (t) 5.78 (s)
14 25.6 (q) 1.29 (s) 25.1 (q) 1.30 (s)
15 180.6 (s) −181.2 (s) −
16
24.5 (q) 1.14 (s) 24.2 (q) 1.21 (s)
17 58.1 (q) 3.67 (s) 57.9 (q) 3.76 (s)
Tabelle 3: 1H- und 13C-NMR-Daten der Naturstoffe 1 und 3.
Im Protonenspektrum des Sekundärmetaboliten 3 fehlt das Signal bei 4.02 ppm für das Proton
7-H. Statt dessen wird ein neues Signal bei 6.60 ppm mit einer Kopplungskonstanten von
J = 4.6 Hz registriert. Das Protonensignal des Protons 6-H ist im Vergleich zum Naturstoff 1
um 0.11 ppm tieffeldverschoben. Das dem 13-H entsprechende Ein-Proton-Singulett ist sogar
Hauptteil 29
um 0.32 ppm zu tiefem Feld verschoben. Im 13C-Spektrum werden statt der für Epoxide
typischen 13C-Signale bei δ = 53.4 ppm und δ = 56.6 ppm zwei neue Signale bei
δ = 124.4 ppm und δ = 133.3 ppm beobachtet. Naturstoff 3 besitzt offensichtlich anstelle der
Epoxidstruktur eine konjugierte Doppelbindung γ,δ-ständig zum Sechsringlacton (Abb. 22 ).
17
13
12
11
98
7
6
5
15
14
16
10
4
3
2
1
O
O
O
O
H
O
Abb. 22: Naturstoff 3.
Die von Herrn Dr. U. Flörke angefertigte Röntgenstrukturanalyse (Abb. 23) bestätigt die
Strukturaufklärung des Naturstoffs 3 und verifiziert gleichzeitig die relativen Konfigurationen
der Naturstoffe 1 und 2.
Abb. 23: Der Naturstoff 3 im Kristall.
Erstmals isoliert wurde das Diterpenoid (3), das als Antibiotic LL-Z 1271α oder Antibiotic
PR1387 bezeichnet wird, von G.A. Ellestad[43] aus einer Acrostalagmus Spezies. Andersen et
al.[42] isolierte diese Verbindung aus einem Pilz der Art Oidiodendron truncatum. Weiterhin
wurde der Naturstoff 1988 von Van Eijk et al.[44] in einem Ascomyceten namens Holwaya
mucida gefunden. Experimente von Kakisawa[45] zur Aufklärung der Biosynthese zeigten,
30 Hauptteil
daß diese offenbar über ein Diterpen wie Labdadienol[46] verläuft, das zwischen C-12 und
C-13 oxidativ gespalten wird. Literatur über die Synthese des Sekundärmetaboliten 3 findet
sich bei Adinolfi[47,48] und bei Welch et al.[49].
3.1.3.4. Naturstoff 4
Der Naturstoff 4 kristallisiert in Form farbloser Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 241 °C.
Er löst sich gut in Methanol, dagegen schlecht in Dichlormethan und Chloroform. Der
spezifische Drehwert der Substanz beträgt [α]D
20 = − 34.1 ° (c = 0.23, MeOH). Im UV-Licht
der Wellenlänge 254 nm ist der Naturstoff 4 mit einem R
f-Wert von 0.62 (CH2Cl2/
MeOH 4%) registrierbar. Das IR-Spektrum zeigt wiederum die für ein γ-Lacton charak-
teristische Absorptionsbande bei 1788 cm−1. Eine weitere intensive Bande ist bei 1696 cm−1
zu beobachten. Die relativ breite Bande bei 3336 cm−1 hingegen ist typisch für eine OH-Va-
lenzschwingung.
Naturstoff 1Naturstoff 4
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
129.9 (t) 1.44-1.80 (m) 30.0 (t) 1.39-1.74 (m)
217.9 (t) 1.44-1.80 (m) 18.0 (t) 1.39-1.74 (m)
328.7 (t)
1.44-1.80, 2.15-2.28 (m)
28.8 (t)
1.39-1.74, 2.10-2.20 (m)
442.3 (s) −42.3 (s) −
544.1 (d) 1.90 (d) 44.4 (d) 1.80 (d)
672.3 (d) 4.95 (dd) 72.4 (d) 4.90 (dd)
753.4 (d) 4.02 (d) 54.1 (d) 3.92 (d)
856.6 (s) −57.4 (s) −
9157.5 (s) −156.5 (s) −
10
36.3 (s) −36.1 (s) −
11 118.8 (d) 6.04 (s) 117.6 (d) 5.99 (s)
12
162.6 (s) −163.0 (s) −
13
99.9 (d) 5.46 (s) −5.54 (s, breit)
14 25.6 (q) 1.29 (s) 24.5 (q) 1.23 (s)
15
180.6 (s) −180.6 (s) −
16
24.5 (q) 1.14 (s) 24.5 (q) 1.07 (s)
17 58.1 (q) 3.67 (s) − −
Tabelle 4: 1H- und 13C-NMR-Daten der Naturstoffe 1 und 4.
Hauptteil 31
Die 1H- und 13C-NMR-Spektren des Sekundärmetaboliten 4 weisen wiederum ähnliche
chemische Verschiebungen wie Naturstoff 1 auf, so daß offensichtlich auch hier eine
strukturell enge Verwandtschaft zwischen den Verbindungen vorliegen wird (Tab.4).
Bemerkenswert ist im Protonenspektrum der Substanz 4 das Ein-Proton-Signal bei 5.54 ppm,
das aufgrund seiner unscharfen Gestalt einem raschen intermolekularen Protonenaustausch
unterliegen könnte. Dieses Verhalten zeigen im allgemeinen Protonen, die an ein Heteroatom
(OH, NH, SH) gebunden sind. Das Austauschexperiment mit D
2O zeigt jedoch, daß die
Signalverbreitung nicht auf eine rasche Austauschbarkeit dieses Protons zurückzuführen ist.
Das 13C-NMR-Spektrum der Verbindung 4 unterscheidet sich von dem des Naturstoffs 1
signifikant durch das Fehlen der Signale für die Methingruppe C-13 und der Methoxygruppe
C-17 (Tab. 4). Auffällig ist auch das außerordentlich breite und daher schwer detektierbare
13C-NMR-Signal für die Methingruppe C-11. Anhand dieser Information kann in Analogie
zum Naturstoff 1 die in Abb. 24 dargestellte Teilstruktur formuliert werden.
1
2
34
10
16
14
15
5
67
8
9
11 12 O
O
O
O
O
R
R
H
Abb. 24: Teilstruktur des Naturstoffs 4.
Die Verifizierung erfolgt ebenfalls durch die 2D-NMR-Technik (H,H-COSY, H,C-COSY und
HMBC). Die in Abb. 24 gezeigte Teilstruktur besitzt demnach die Summenformel C15H16O5
und eine Masse von 276. Dem Massenspektrum (CI) ist aber zu entnehmen, daß die
Verbindung die Molmasse 306 besitzt. Berücksichtigt man das offensichtliche Fehlen der
Methoxygruppe in den Protonen- und 13C-NMR-Spektren der Verbindung 4, die ausgeprägte
OH-Valenzbande im IR-Spektrum sowie die Massendifferenz von 14 zum Naturstoff 1, so
kann für den Naturstoff 4 die in Abb. 25 gezeigte Struktur postuliert werden.
32 Hauptteil
O
O
O
O
OH
O
H
1
2
34
10
16
14
15
5
67
8
9
11 12
13
Abb. 6: Hypothetische Struktur des Naturstoffs 4.
Sollte der Sekundärmetabolit 4 tatsächlich die in Abb. 25 dargestellte Struktur besitzen, so
müßte im 13C-NMR-Spektrum ein für ein zweifach oxygeniertes Kohlenstoffatom typisches
Signal bei ca. 100 ppm registrierbar sein, das vermutlich aufgrund der in Abb. 26 illustrierten
Äquilibrierung[50] nicht beobachtbar ist.
O
O
O
O
OH
O
H
OH
O
O
O
OO
H
Abb. 26 : Äquilibrierung des Naturstoffs 4.
Zur Detektion des Signals wird die inverse zweidimensionale NMR-Spektroskopie genutzt,
da aufgrund der Schwerlöslichkeit der Verbindung die NMR-Tieftemperaturmessungen schei-
terten. Im invers aufgenommenen H,C-COSY-Spektrum ist, ausgehend von dem breiten Pro-
tonensignal bei 5.54 ppm, ein Signal beobachtbar, das mit einem nicht sichtbaren 13C-NMR-
Signal bei 97.2 ppm korreliert. Die zweifach-oxygenierte CH-Gruppe zeigt also im Protonen-
spektrum eine chemische Verschiebung von 5.54 ppm und im 13C-Spektrum von 97.2 ppm.
Ein weiterer Hinweis für die Richtigkeit der aufgestellten Hypothesen liefert die genaue
Auswertung des Protonenspektrums, in dem anhand eines kleinen Signals für ein Aldehyd-
Proton auf einen ca. 1−3 % großen Anteil an Aldehyd geschlossen werden kann. Die
abschließend angefertigte Röntgenstrukturanalyse dieser Verbindung (Abb. 27) belegt die
Hauptteil 33
Strukturaufklärung. Im Gegensatz zum Naturstoff 1 weist Naturstoff 4 aber interessanterweise
R- statt S-Konfiguration an C-13 auf, was vermutlich mit oben beschriebener Äquilibrierung
zu erklären ist.
Abb. 27: Der literaturunbekannte Naturstoff 4 im Kristall.
Um sicherzustellen, daß der literaturunbekannte Sekundärmetabolit 4 nicht bei der Extraktion
des Pilzmycels mit Ethylacetat durch „Demethoxylierung“ von Naturstoff 1 entsteht, wurde
dieser mit einem Essigsäure/Ethylacetat-Gemisch (1:1) versetzt und vierzehn Tage auf-
bewahrt, ohne daß eine Umsetzung beobachtet wurde.
3.1.3.5. Naturstoff 5
Der aus Methanol in farblosen Prismen auskristallisierende Naturstoff 5 besitzt einen
Schmelzpunkt von 237 °C. Der spezifische Drehwert der Substanz beträgt [α]D
20 = − 38.5 °
(c = 0.21, MeOH). Dünnschichtchromatographisch ist er weder bei 254 nm noch bei 366 nm
detektierbar. Durch Besprühen des DC‘s mit Bromkresol-Grün verfärbt sich der
Substanzfleck gelb, so daß auf das Vorhandensein einer Carbonsäurefunktion geschlossen
werden kann. Der Rf-Wert von 0.31 (CH2Cl2/MeOH 4 %) und der langgezogene Substanz-
fleck auf dem DC sind weitere Hinweise, auf eine Carbonsäure. Das IR-Spektrum zeigt bei
1719 cm−1 und 1692 cm−1 zwei intensive Signale, die für Carbonylgruppen charakteristisch
sind. Ferner ist eine OH-Valenzschwingung bei 3400 cm−1 zu beobachten. Dem 1H- und
13C-NMR-Spektren ist zu entnehmen, daß der Naturstoff 5 zwei Methyl-, fünf Methylen-, je
zwei aliphatische und olefinische Methingruppen und vier quartäre Kohlenstoffatome besitzt,
wobei von letzteren das Signal bei δ = 176.4 ppm einer Ester- oder Säurefunktion zuzuordnen
34 Hauptteil
ist. Das HMBC-Spektrum zeigt das bemerkenswerte Phänomen, daß die Protonensignale 5-H,
14-H und 3-H mit einer 13C-NMR-Verschiebung von ca. 178 ppm korrelieren, obwohl dort
im 13C-Spektrum kein Signal beobachtbar ist. Zur Detektion des Signals wird eine 13C-NMR-
Tieftemperatur-Messung (− 20 °C) durchgeführt, die bei 177.9 ppm eindeutig ein Signal
registrierbar macht, das aufgrund der chemischen Verschiebung einer zweiten Ester- oder
Carbonsäurefunktion entspricht.
Der Vergleich der 1H- und 13C-Spektren der Naturstoffe 1 und 5 zeigt, daß beide Verbin-
dungen neben unterschiedlichen chemischen Verschiebungen auffällig gleiche Verschie-
bungen und Kopplungsmuster aufweisen (Tab.5).
Naturstoff 1Naturstoff 5
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
129.9 (t) 1.44-1.80 (m) 37.7 (t) 1.05-1.22 (m)
217.9 (t) 1.44-1.80 (m) 19.2 (t) 1.45-1.49, 1.54-1.57 (m)
328.7 (t)
1.44-1.80, 2.15-2.28 (m)
37.5 (t) 2.18, 1.81-1.88 (m)
442.3 (s) −42.9 (s) −
544.1 (d) 1.90 (d) 51.7 (d) 2.04 (pt)
672.3 (d) 4.95 (dd) 134.4 (d) 6.65 (dd)
753.4 (d) 4.02 (d) 122.7 (d) 5.73 (dd)
856.6 (s) −84.2 (s) −
9157.5 (s) −49.7 (d) 2.29 (pd)
10
36.3 (s) −36.5 (s) −
11 118.8 (d) 6.04 (s) 31.7 (t) 2.95 (dd) u. 2.35 (pd)
12
162.6 (s) −176.4 (s) −
13
99.9 (d) 5.46 (s) 69.0 (t) 3.46 (d) u. 3.66 (d)
14 25.6 (q) 1.29 (s) 28.0 (q) 1.30 (s)
15
180.6 (s) −177.9 (s) −
16
24.5 (q) 1.14 (s) 12.1 (q) 0.76 (s)
17 58.1 (q) 3.67 (s) − −
Tabelle 5: 1H- und 13C-NMR-Daten der Naturstoffe 1 und 5.
Die größte Übereinstimmung der chemischen Verschiebung ist im A-Ring beobachtbar. In
Analogie zum Naturstoff 1 ist dem H,H-COSY-Spektrum der Substanz 5 zu entnehmen, daß
die drei CH2-Gruppen nur untereinander koppeln. Ferner sind im HMBC-Spektrum
Kopplungen zu den quartären Kohlenstoffatomen C-4 und C-10 und zu den Methylgruppen
C-14 und C-16 registrierbar, so daß wiederum die dargestellte Teilstruktur I formuliert
werden kann.
Hauptteil 35
R
R
R
R
1
2
34
10
16
14
Teilstruktur I
Aus dem HMBC-Spektrum ist weiterhin ersichtlich, daß die beiden Methylgruppen und
quartären Kohlenstoffatome mit der Methingruppe bei δ = 51.7 ppm koppeln. Das Proton 5-H
zeigt seinerseits eine 3J- und eine allylische 4J-Kopplung zu den olefinischen Protonen.
Desweiteren sind von den quartären Kohlenstoffatomen C-4 und C-10 im HMBC-Spektrum
vicinale Kopplungen zu dem olefinischen Protonensignal bei δ = 6.65 ppm beobachtbar.
Unter Berücksichtigung der oben bereits erwähnten vicinalen Kopplungen zwischen 3-H, 5-H
und 14-H und der vermutlichen Carbonsäurefunktion bei δ = 177.9 ppm kann Teilfragment II
konstruiert werden.
O
RR
OH
1
2
34
10
16
14 15
5
6
7
Teilstruktur II
Die weitere Analyse des HMBC-Spektrums ergibt, daß C-10 und C-7 mit der Methingruppe
C-9 koppelt, dessen Proton wiederum im H,H-COSY-Spektrum ein Kreuzsignal zu den
beiden Protonen der Methylengruppe 11-H zeigen. Die Protonen 11-H korrelieren im HMBC-
Spektrum ihrerseits mit den quartären Kohlenstoffatomen C-10 und C-8, wobei zwischen C-8
und C-6 eine weitere 3J-Kopplung detektierbar ist (s. Teilstruktur III).
36 Hauptteil
O
O
R
R
R
H
1
2
34
10
16
14 15
5
6
7
8
9
11
Teilstruktur III
Ebenso wie die Methylengruppe C-11 zeigt auch C-9 im HMBC-Spektrum ein Kreuzsignal
zur Carbonylgruppe mit der chemischen Verschiebung δ = 176.4 ppm. Eine vicinale
Kopplung ist, ausgehend von C-9, zu der Methylengruppe C-13 beobachtbar, die eine weitere
3J-Kopplung zu C-7 zeigt. Die chemischen Verschiebungen der Kohlenstoffatome C-8 und
C-13 sind charakteristisch für einfach oxygenierte Kohlenstoffatome, so daß die in Abb. 28
dargestellte Struktur dem Naturstoff 5 entspricht.
O
O
OH
O
O
H
H
1
2
34
10
16
14
15
5
6
7
13
98
11 12
Abb. 28: Der literaturunbekannte Naturstoff 5.
Die Aufklärung der relativen Konfiguration der literaturunbekannten Verbindung erfolgt
anhand der chemischen Verschiebungen, Kopplungskonstanten und der NOE-Spektroskopie.
Sättigt man das Protonensignal der Methylgruppe C-14, so wird die Intensität des 6-H Protons
um 6 % und die des 5-H Protons um 3.5 % erhöht, während die von 16-H unbeeinflußt bleibt.
A- und B-Ring der Verbindung 5 sind demnach, wie in den Naturstoffen 1−4, trans-ver-
knüpft. Strahlt man ebenfalls auf die Methylgruppe C-16 ein, so ist nur für das äquatorial
angeordnete Proton 11-H ein Kern-Overhauser-Effekt von 3.3 % detektierbar. Die Ringe B
und C müssen also wie in Abb. 29 dargestellt cis-verknüpft sein. Für die pseudo-axiale
Anordnung der OH-Gruppe spricht zum einen die starke 1,3-diaxiale Wechselwirkung der
OH-Gruppe und des axial angeordneten Protons 11-H, welches dadurch eine relativ starke
Hauptteil 37
Tieffeldverschiebung erfährt, und zum anderen die ähnlichen chemischen Verschiebungen der
13-H Protonen, sowie der Hochfeldshift der Methylgruppe C-16. Die relative Konfiguration
des literaturunbekannten Sekundärmetaboliten 5 entspricht somit der der bereits isolierten
Lacton-Diterpene 1−4. Eine große strukturelle Ähnlichkeit ist ebenfalls zwischen dem
Naturstoff 5 und den Labdenen bzw. Labdadienen vorhanden, die vermutlich eine Vorstufe
der Naturstoffe 1−5 darstellen. Die meisten dieser Verbindungen weisen die gleiche relative
Konfiguration auf. Desweiteren besitzen einige dieser Labdene, analog zum Naturstoff 5, am
A-Ring in gleicher Position ebenfalls eine freie Carbonsäurefunktion.
Abb. 29: Dreidimensionale Darstellung des Naturstoffs 5.
3.1.3.6. Naturstoff 6
Der Naturstoff 6 kristallisiert in Form farbloser Prismen. Er besitzt einen Schmelzpunkt von
226 °C und einen spezifischen Drehwert von [α]D
20 = − 22.5 °. In Lösungsmitteln mittlerer
Polarität ist er kaum löslich. Auf dem DC ist die Substanz durch Besprühen mit einer
EtOH/H2SO4-Lösung (8 %) und nachfolgendem Brennen mit einem R
f-Wert von 0.27
(CH2Cl2/MeOH 4 %) detektierbar. Durch Besprühen des Dünnschichtchromatogramms mit
Bromkresol-Grün verfärbt sich der Substanzfleck gelb, so daß davon auszugehen ist, daß der
Sekundärmetabolit 6 eine Carbonsäurefunktion besitzt.
Im IR-Spektrum sind zwei Carbonylabsorptionsbanden bei 1728 und 1701 cm−1 zu beob-
achten. Die breiten Banden bei 3503 und 3152 cm−1 sind OH-Valenzschwingungen zuzu-
ordnen.
38 Hauptteil
Den 1H-, 13C-NMR-Spektren und dem DEPT-135-Experiment ist zu entnehmen, daß der
Naturstoff 6 zwei Methyl-, sechs Methylen-, eine aliphatische und olefinische Methingruppe
und sechs quartäre Kohlenstoffatome besitzt (Tab.6).
Naturstoff 5Naturstoff 6
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
137.7 (t) 1.05-1.22 (m) 30.1 (t) 1.33-1.44, 180-1.97 (m)
219.2 (t) 1.45-1.49, 1.54-1.57 (m) 19.4 (t) 1.55-1.63, 1.87-2.04 (m)
337.5 (t) 2.18, 1.81-1.88 (m) 38.3 (t)
1.01-1.20, 2.14-2.24 (m)
442.9 (s) −43.9 (s) −
551.7 (d) 2.04 (pt) 43.2 (d) 2.13 (dd)
6134.4 (d) 6.65 (dd) 24.6 (t)
2.33-2.49, 2.88-2.96 (m)
7122.7 (d) 5.73 (dd) 126.2 (d) 5.89 (m)
884.2 (s) −130.9 (s) −
949.7 (d) 2.29 (pd) 72.9 (s) −
10
36.5 (s) −40.3 (s) −
11 31.7 (t) 2.95 (dd) u. 2.35 (pd) 37.3 (t) 2.64 (d) u. 2.80 (d)
12
176.4 (s) −174.7 (s) −
13
69.0 (t) 3.46 (d) u. 3.66 (d) 69.8 (t) 4.79 (m) u. 4.90 (m)
14 28.0 (q) 1.30 (s) 28.2 (q) 1.28 (s)
15
177.9 (s) −180.2 (s) −
16
12.1 (q) 0.76 (s) 15.1 (q) 0.84 (s)
17 −−−−
Tabelle 6: 1H- und 13C-NMR-Daten der Naturstoffe 5 und 6.
Beim Vergleich der ein- und zweidimensionalen NMR-Spektren der Naturstoffe 5 und 6 fällt
auf, daß beide Verbindungen jeweils drei Methylenprotonen besitzen, die im H,H-COSY-
Spektrum nur untereinander koppeln. Im HMBC-Spektrum zeigen die CH2-Gruppen mit den
13C-NMR-Verschiebungen von 38.3 bzw. 30.1 ppm 3J-Kopplungen zu den Methylgruppen
bei 28.3 bzw. 15.1 ppm. Ebenfalls im HMBC-Spektrum sind, ausgehend von diesen
Methylgruppen, geminale Konnektivitäten zu den quartären Kohlenstoffatomen C-4 und C-10
und jeweils eine vicinale Kopplung zur Methingruppe mit der chemischen Verschiebung von
43.2 ppm registrierbar. Die Methingruppe und die Methylgruppe C-14 koppeln desweiteren
mit dem quartären Kohlenstoffatom C-15, das aufgrund seiner chemischen Verschiebung
einer Carbonsäure- bzw. Carbonsäureesterfunktion zugeordnet werden kann (Teilstruktur I).
Hauptteil 39
R
R
R
O
OR
1
2
34
10
16
14
15
Teilstruktur I
Im Protonenspektrum ist für das Methinproton C-5 ein Doppelduplett beobachtbar, das
Kopplungskonstanten von 5.9 bzw. 11.3 Hz aufweist. Im H,H-COSY-Spektrum koppelt die
Signalgruppe mit den Multipletts bei 2.33−2.49 und 2.88−2.96 ppm, die laut HMQC-
Spektrum der Methylengruppe mit der chemischen Verschiebung von 24.6 ppm (C-6)
zuzurechnen sind. Im H,H-COSY-Spektrum zeigen beide Multipletts Kreuzkopplungen zu
der olefinischen Methingruppe (7-H) bei 5.89 ppm und den Methylenprotonensignalen bei
4.79 und 4.90 ppm (13-H), die jeweils ein ABMX-Spinsystem mit einem ausgeprägten Dach-
effekt, einer großen geminalen Kopplungkonstanten von 12.6 Hz, einer allylischen 4J-Kopp-
lung und einer homoallylischen 5J-Kopplung bilden. Die Kopplungskonstanten der long-
range-Kopplungen sind aufgrund der begrenzten spektralen Auflösung des NMR-Gerätes
nicht genau zu bestimmen, sie bewegen sich aber zwischen 1 und 3 Hz (Teilstruktur II).
R
R
R
O
OR
1
2
34
10
16
14 15
567
8
13
Teilstruktur II
Die Protonenverschiebungen bei 4.79 und 4.90 ppm korrelieren im HMQC-Spektrum mit
einer 13C-NMR-Verschiebung von 69.8 ppm, die typisch für monooxygenierte
Kohlenstoffatome ist. Im HMBC-Spektrum zeigen die Protonensignale der Methylengruppe
C-13 eine Kreuzkopplung zu dem quartären Kohlenstoffatom bei 72.9 ppm (C-9), der
aufgrund seiner chemischen Verschiebung ebenfalls monooxygeniert sein muß. Das quartäre
Kohlenstoffatom C-9 koppelt desweiteren mit der Methylgruppe C-16 und der Methylen-
gruppe mit den Protonenresonanzen von 2.64 bzw. 2.80 ppm (11-H). Beide Protonensignale
bilden ein AB-Spinsystem mit einer geminalen Kopplung von 15.2 Hz. Im HMBC-Spektrum
40 Hauptteil
zeigen diese eine 2J-Kopplung zum quartären Kohlenstoffatom bei 174.7 ppm, so daß die in
Abbildung 30 dargestellte Struktur konstruiert werden kann.
O
O
O
O
H
H
OH
1
2
34
10
16
14
15
5
6
7
13
9
8
11 12
Abb. 30: Die Struktur des literaturunbekannten Naturstoffs 6.
Der Naturstoff 6 besitzt wie Naturstoff 5 die Summenformel C16H22O5. Das Massenspektrum
(DCI) sowie die Präzisionsmasse des [M−H]−-Peaks von 293.13826 bestätigen die Struktur.
Die Aufklärung der relativen Konfiguration erfolgt durch die Messung von Kern-Overhauser-
Effekten und der Auswertung der Kopplungskonstanten. Sättigt man das Drei-Protonen-
Singulett der Methylgruppe C-14, so beobachtet man eine Intensitätssteigerung für die
Protonen 6-H (2.39−2.49 ppm, 6.5 %) und 5-H (2.13 ppm, 7.6 %), während das Signal für die
Methylgruppe C-16 unbeeinflußt bleibt. Die Kopplungskonstante von 11.3 Hz für das Proton
5-H und das axial angeordnete Proton der Methylengruppe C-6 belegt, daß das Proton 5-H
ebenfalls axial angeordnet ist. Die Ringe A und B sind demnach wie in den Naturstoffen 1−5
trans-verknüpft. Wird auf die Methylgruppe C-16 eingestrahlt, so erfährt nur das Duplett bei
2.80 ppm (11-H) eine Intensitätssteigerung von 7.2 %, woraus gefolgert werden kann, daß die
Ringe B und C, wie in Abb. 31 dargestellt, miteinander verknüpft sind. Für die trans-axiale
Anordnung der Methylgruppe C-16 zur OH-Gruppe spricht zum einen die
Hochfeldverschiebung von C-16 und zum anderen die relativ ähnlichen Verschiebungen der
Protonen der Methylengruppe C-11. Die relative Konfiguration des ebenfalls literatur-
unbekannten Terpenoids 6 entspricht demzufolge der des bereits isolierten Naturstoffs 5.
Strukturell könnte es sich bei Naturstoff 6 um eine Vorstufe des Naturstoffs 2 handeln, denn
durch Lactonisierung, Epoxidierung und Dehydratisierung gelangt man ausgehend vom
Naturstoff 6 zum Sekundärmetaboliten 2 (siehe Seite 27).
Hauptteil 41
Abb. 31: Dreidimensionale Struktur des literaturunbekannten Naturstoffs 6.
3.1.3.7. Naturstoff 7
Die Reinsubstanz kristallisiert in Form farbloser prismenförmiger Kristalle, die bei
187−188 °C schmelzen. Der spezifische Drehwert der Substanz beträgt [α]D
20 = − 22.8 °
(c = 0.18, EtOH). Im IR-Spektrum ist neben einer OH-Valenzschwingung bei 3410 cm−1 eine
Carbonylschwingung bei 1734 cm−1 zu beobachten. Das 13C- und 1H-NMR-Spektrum der
Verbindung weist eine Methyl-, fünf Methylen-, drei monooxygenierte Methingruppen (bei
66.29, 68.09 und 76.08 ppm), sowie zwei olefinische oder aromatische Methingruppen und
fünf quartäre Kohlenstoffatome auf. Das Signal bei δ = 169.79 ppm deutet auf eine
Carbonsäure-, Ester- oder Lactonfunktion hin. Markant sind ebenfalls die Signale bei 163.20
und 164.07 ppm, die unter Berücksichtigung der weiteren quartären 13C-NMR-Signale bei
101.18 und 141.47 ppm und der beiden Methinkohlenstoffatome bei 101.73 und 106.62 ppm
auf ein aromatisches System mit zwei Sauerstoffsubstituenten hinweisen. Weitere Bestätigung
erhält die Hypothese durch die Betrachtung des Protonenspektrums, das zwei Dupletts mit
einer typischen meta-Kopplungskonstanten von 1.9 Hz und einer chemischen Verschiebung
von 6.17 und 6.30 ppm zeigt. Auffallend ist auch die extreme Differenz der chemischen
Verschiebung der quartären Kohlenstoffatome bei 101.18 und 141.47 ppm, die
charakteristisch für Kohlenstoffatome sind, die α- bzw. β-ständig zu einer Carbonylgruppe
stehen. Gestützt wird diese Vermutung durch das für chelierte OH-Proton signifikante Signal
bei δ = 11.07 ppm. Unter Berücksichtigung dieser chemischen Verschiebungen sowie der
Kopplungskonstanten läßt sich das folgende Fragment konstruieren:
42 Hauptteil
OH
HO
OR
O
R
164.07
163.20
106.62
169.78
141.47
101.18
101.73
6.30
6.17
Mit den vorliegenden eindimensionalen NMR-Spektren kann aufgrund der sich partiell
überlagernden und daher relativ schlecht aufgelösten Protonensignale keine weitere Aussage
über die Konstitution des Moleküls gemacht werden. Deshalb wurden die geeigneten Kristalle
dieser Substanz zur Anfertigung einer Röntgenstrukturanalyse genutzt. Das Ergebnis zeigt,
daß es sich bei Naturstoff 7 um Cladosporin[51−55] handelt (Abb. 32).
O
OH
HO
O
O
H H
Abb. 32: Der Naturstoff 7 im Kristall.
Cladosporin (7) ist ein Sekundärmetabolit von Aspergillus flavus bzw. Aspergillus repens. Er
wurde zuerst von Scott[51] aus dem erstgenannten Pilz isoliert. Ebenfalls aus Aspergillus
flavus wurde Cladosporin (7) von Grove[52] isoliert. Der Naturstoff 7 zeigt antimikrobielle,
insektizide und phytotoxische Eigenschaften.[56]
Mitarbeitern der Firma Merck gelang mittels Röntgenstrukturanalyse die Aufklärung der rela-
tiven Konfiguration. Die absolute Konfiguration wurde durch den Vergleich der CD-Spektren
des Cladosporins (7) und des (R)-(−)-Melleins (22) (Abb. 33) bestimmt. Die gute
Übereinstimmung des spezifischen Drehwertes des von uns isolierten Metaboliten 7 mit dem
in der Literatur angegebenen Wert von [α]D
20 = − 24.8 (c = 0.96, EtOH) zeigt, daß beide die
gleiche absolute Konfiguration besitzen.
Haupteil 43
O
OOH
H
H
Abb. 33: Die Struktur des (R)-(−)-Melleins (22).
3.1.3.7.1. Biosynthese des Cladosporins (7)
Durch den Einbau von Natrium-[1-13C]-, [2-13C2]-, [1,2-13C2]-, [1-13C,18O2]-, [1-13C, 2H3]-
und [2-13C, 2H2]-Acetaten in Cladosporin, gefolgt von 13C-NMR-Untersuchungen am
Diacetat der Verbindung, konnte der Biogeneseweg der Verbindung aufgeklärt werden.[57]
Die postulierten Strukturen der Enzymintermediate sind in Abb. 34 dargestellt.
Die acht Acetateinheiten im Caldosporin zeigen dabei die für die Polyketid-Biogenese
typische Kopf/Schwanz-Verknüpfung. Die Tetrahydropyran-Cyclisierung erfolgt direkt nach
der Addition einer C2-Einheit an das C8-Gerüst. Die Knüpfung weiterer C2-Bausteine durch
die Polyketid-Synthase führt schließlich zu einem C
16-Baustein, der vermutlich in einen
β-Keto-γ,δ-ungesättigten-Thioester umgewandelt wird, der seinerseits dann intramolekular
aldolartig cyclisiert.
C10
C8
C6
C4
C2
HH
H
CH3
H
O
H
OH
RS
O
+C2, [H]
Cyclisierung
HH
H
CH3
HO
RS
O
H
[H],
+ C2
H2O, [H]
-
O
HH
H
CH3
RSHO
-H2O, [H]
C2
+,[H]
RS
H
H
HO CH3
O
[H],
+ C2
OCH3
SR
Abb. 34: Fortsetzung nächste Seite.
44 Hauptteil
Abb. 34: Biosyntheseweg des Cladosporins (7).
C2
C2
C2
H
H
CH3
H
O
H
OH
O
O
SHH
O
R = Enzym
C16
O
OH
HO
O
O
HH
H
H
CH3
H
O
H
OH
O
O
SHH
O
O
Haupteil 45
3.1.4. Biologische Aktivität
3.1.4.1. Erläuterung und Bewertung der Bioaktivitätsmessung
3.1.4.1.1. Pflanzenschutztestung der Mikrobiologie in Braunschweig
Zur Bestimmung der biologischen Aktivität der Rohextrakte und der Reinsubstanzen werden
im wesentlichen fünf sich ergänzende Methoden angewandt:
1. Das Biodiagramm
2. Der Agardiffusionstest
3. Der Keimlingstest
4. Der Lemnatest
5. Die Photosyntheseaktivitäts-Messung
Nachfolgend werden die einzelnen Verfahren kurz beschrieben und bewertet:
1. Das Biodiagramm
Diese Methode wird hauptsächlich zur Lokalisierung von aktiven Verbindungen aus dem
Rohextrakt genutzt. Dabei werden vom Rohextrakt Dünnschichtchromatogramme angefertigt
und mit einer Suspension eines Testorganismus´ besprüht. Als Testorganismus wird
Cladosporium cucumerinum, ein gegenüber Fungiziden sehr sensitiver Organismus, in
6 %iger Biomalzlösung verwendet. Nach gleichmäßigem Besprühen der Dünnschichten wird
in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Auswertung erfolgt nach zwei bis drei Tagen. Die dabei
entstehenden Hemmhöfe spiegeln in günstigen Fällen Rf-Werte der aktiven Substanzen wider.
2. Der Agardiffusionstest
Beim Agardiffusionstest, der auch als Plättchentest bezeichnet wird, werden vom Rohextrakt
bzw. den isolierten Reinsubstanzen Lösungen in Aceton oder Methanol angesetzt. Die
Konzentration der Probenlösungen beträgt gewöhnlich 10 mg/ml. Zur Untersuchung auf
fungizide, bakteriozide und algizide Aktivität werden Filterplättchen mit der jeweiligen
Lösung getränkt und auf die Oberfläche von Hartagarplatten gelegt. Diese werden dann mit
den folgenden Testorganismen besprüht:
46 Hauptteil
Chl. Chlorella fusca Chlorophyt
E.C. Escherichia coli gram-negatives Bakterium
B.m. Bacillus megaterium gram-positives Bakterium
Ust. Ustilago violacea Ustomycet
Eur. Eurotium repens Ascomycet
M.m. Mycothypha microspora Zygomycet
Fus. Fusarium oxysporum Deuteromycet
Bei den Bakterien und Pilzen werden nach zwei bis drei Tagen, bei Chlorella nach vier bis
sieben Tagen die entsprechenden Hemmhöfe ausgewertet. Dabei ist neben der Größe der
Hemmhöfe auch die Vollständigkeit der Hemmung in den Höfen von Bedeutung.
3. Der Keimlingstest
Für den Keimlingstest werden 6.75 ml steriles Wasser und 0.75 ml der zu testenden Lösung
(10 mg Substanz in 1 ml Aceton oder Methanol) in eine Petrischale pipetiert und mit
Filterpapier bedeckt. Darauf werden vierzehn Samen der entsprechenden Keimlinge zum
Keimen ausgelegt. Als Testorganismen dienen Lepidum sativum (Kresse) und Medicago
sativa (Alfalfa). Die Auswertung des Tests erfolgt über die Messung der Länge und die
Beurteilung des allgemeinen Zustandes der Keime im Vergleich zu einem parallel angesetzten
Referenztest.
4. Der Lemnatest
Für den Lemnastest werden 6.75 ml steriles Wasser und 0.75 ml der zu testenden Lösung
(10 mg Substanz in 1 ml Aceton oder Methanol) in eine Petrischale pipetiert und mit
Filterpapier bedeckt. Darauf werden einige Lemna-Pflänzchen (Wasserlinse) ausgelegt. Die
Auswertung des Tests erfolgt über die Beurteilung des Wachstums der Pflänzchen und des
allgemeinen Zustandes der Blätter im Vergleich zu einem parallel angesetzten Referenztest.
5. Der Photosyntheseaktivitäts-Test
Zur Vorbereitung einer Photosyntheseaktivitäts-Messung wird eine Probenkammer mit 5 ml
einer Algensuspension (Chlorella fusca) gefüllt und mit dem Elektrodenschalter verschlossen.
Haupteil 47
Zuvor wird die Zellkonzentration der Algensuspension auf 2 x 107 Zellen/ml
[Carbonat/Hydrogencarbonat-Puffer] (15 % 0.1 mol/l Na2CO3-Lösung, 85 % 0.1 mol/l
NaHCO3-Lösung) eingestellt. Bei einer Meßtemperatur von 25 °C wird die Suspension
abgedunkelt durchmischt, bis der Sauerstoffgehalt durch die Atmung der Algen auf 0 %
abgesunken ist. Ab diesem Zeitpunkt wird die Verdunkelung entfernt und zur Erhöhung der
photosynthetischen Sauerstoffproduktion eine Kaltlichtlampe zugeschaltet. Auf einem
Schreiber kann die Veränderung des Sauerstoffgehaltes der Suspension beobachtet werden.
Ab einer Konzentration von ca. 50 % O2 werden 100 µl der in Methanol/Aceton gelösten
Substanz mit einer Injektionsnadel in die Probenkammer gegeben. Als Kontrolle wird die
Reaktion der Alge auf Methanol/Aceton überprüft. Die Abweichung der Photosynthese-
aktivität der Zellkultur vor und nach Applikation der Probe wird quantitativ erfaßt.
3.1.4.1.2. Kurzbeschreibung der Pharma-Grundscreening-Tests der BASF
1. PAI-1
Die Bildung (Koagulation) und der Aufbau (Fibrinolyse) von Blutgerinnseln werden durch
eine Vielzahl von körpereigenen Faktoren geregelt. PAI-1, der physiologische Inhibitor von
tPA (tPA aktiviert Plasminogen → Plasmin → Fibrinolyse), ist eine wichtige Komponente in
diesem Regelwerk. Erhöhte PAI-1-Spiegel im Blut, die bei verschiedenen Erkrankungen
gemessen wurden (u.a. Herzinfarkt, Sepsis, Hyperlipoproteinämie), stehen offensichtlich im
Zusammenhang mit einer reduzierten fibrinolytischen Aktivität und könnten daher zur
Bildung von Thrombose führen.
PAI-1-Inhibitoren sollen das fibrinolytische Gleichgewicht normalisieren und damit
Thrombosen vorbeugen bzw. deren Lyse erleichtern. Im PAI-1-Inhibitor-Assay werden
Substanzen gesucht, die die Bildung von PAI-1 an tPA inhibieren und damit die
Hemmwirkung von PAI-1 neutralisieren.
2. Fibrinogen
Auf der Basis epidemiologischer Studien konnte eine Erhöhung des Fibrinogenspiegels im
Plasma als Risikofaktor in der Etiologie folgender Krankheitsbilder identifiziert werden:
48 Hauptteil
• Ischämie des Herzens (IHD)
• Myokardinfarkt
• periphere, arterielle Verschlußkrankheit (PAOD)
• Reokklusion
• venöser Bypässe
• Sepsis.
Dies weist auf eine pathologische Bedeutung des Fibrinogens bei artheriosklerotischen bzw.
thrombotischen Prozessen hin. Ziel des vorliegenden Testsystems ist die Identifizierung oral
verfügbarer, niedermolekularer Substanzen, die eine Fibrinogensenkung im Rahmen einer
Langzeittherapie ermöglichen. Eine Reduzierung des Risikofaktors Fibrinogen wäre von
größter Bedeutung bei der Prävention des Myokardinfarktes.
3. Serotonin-Rezeptoren
Serotonin (5-Hydroxytryptamin) ist wie Dopamin ein Neurotransmitter, der für die
Regulation verschiedenster physiologischer Funktionen wie Blutdruck, Stimmung, Angst,
Aggression u. a. eine wichtige Rolle spielt. Gegenwärtig werden Migräne, Depression und
Anxiolyse als Hauptindikationsgebiete für Serotonin-Agonisten bzw. Antagonisten
angesehen. Da auch funktionelle Verbindungen zwischen serotoninergenen und
dopaminergenen Systemen bestehen, ist auch ein Einfluß solcher Wirkstoffe auf psychotische
Prozesse gegeben. Mehr als 10 Serotonin-Rezeptorsubtypen sind derzeit bekannt, deren
funktionelle Einordnung jedoch z. T. noch sehr unsicher ist. Ziel ist es, Agonisten und
Antagonisten mit möglichst selektiver Rezeptorsubtypspezifität zu charakterisieren, um in
weiteren Untersuchungen deren indikationsbezogene Relevanz zu ermitteln und gleichzeitig
Therapeutika mit geringeren Nebenwirkungen zu entwickeln.
4. ICE-Inhibition
Interleukin-1β gehört zur Klasse der Cytokine, die als Signalstoffe eine wichtige Rolle in der
Aufrechterhaltung der normalen Zell- und Gewebefunktionen spielen. Erhöhte Interleukin-1β-
Spiegel wurden bei akuten und chronischen entzündlichen Erkrankungen beobachtet. Zur
Senkung des Interleukin-1β-Spiegels werden Inhibitoren des ICE (interleukin converting
enzyme) gesucht. ICE katalysiert die Freisetzung des aktiven Interleukin-1β aus der inaktiven
Vorstufe Pre-Interleukin-1β.
Haupteil 49
5. SH2
Dieser Test dient der Suche nach niedermolekularen Substanzen, die die Aktivierung der
T-Lymphozyten inhibieren. Diese Inhibitoren sollen als Immunsuppressiva zur Therapie von
Autoimmunkrankheiten oder zur Verhinderung der Transplantatabstoßung eingesetzt werden.
Bei der Aktivierung der T-Lymphozyten spielen Interaktionen zwischen 2H2-Domänen und
spezifischen Targetproteinen eine wichtige Rolle (Signaltransduktions-Kaskade). Durch den
Aufbau eines in-vitro-Bindungsassays können bei diesem Test Substanzen identifiziert
werden, die die Bindung einer bestimmten SH2-Domäne an ihr Targetprotein hemmen.
Diese Substanzen werden in weiterführenden zellulären Assays auf ihr Potential geprüft, die
Aktivierung von T-Lymphozyten zu inhibieren.
6. cdc25
Bei der Krebsentstehung sind sehr häufig Gene betroffen, die direkt oder indirekt den
Zellzyklus regulieren. Substanzen, die selektiv den Zellzyklus hemmen, würden diesen
Aspekt der Tumorzellwachstumsregulation direkt angehen und sind daher als potentielle
Zytostatika von besonderem Interesse. Solche Substanzen wären eventuell auch bei
Hyperproliferationskrankheiten, wie Restenose und Entzündung, einsetzbar.
Das Screening sucht nach Inhibitoren einer neuen Protein-Tyrosin-Phosphatase-Klasse, die
den Zellzyklus regulieren. Diese Phosphatasen, die cdc25-Familie, kontrollieren den
Zellzyklus durch Dephosphorylierung der cyclin/ckd Komplexe.
7. Immunologie PTKs
Ziel des Tests ist die Identifizierung von Protein-Tyrosin-Kinase-Inhibitoren als Inhibitoren
der T-Zellenaktivierung. Spezifische Inhibitoren der T-Zellenaktivierung würden eine neue
Klasse von Immunsuppressiva beschreiben, die potentiell wirksamer und weniger toxisch
sind. Sie könnten bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, Psoriasis und zur
Prophylaxe der Organabstoßung nach Transplantationen eingesetzt werden.
50 Hauptteil
8. Onkologie PTKs
Identifizierung von Protein-Tyrosin-Kinase-Inhibitoren für eine neue Klasse von Wirkstoffen
zur Krebsbehandlung.
Die Bewertungen der Screening-Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt. Dabei sei
angemerkt, daß das Massenscreening nur ungefähre Werte liefert, die in Nachtests bestätigt
werden müssen.
Massenscreening Schwellwert
Konzentration (mol/l) Max. Wirkung Gute Wirkung
PAI-1-Inhibition ≈ e−04 > 80% IC50 < e−04
Fibrinogen ≈ e−06 > 50% IC50 ≤ e−06
Serotonin-Rezeptor ≈4.00e−06 > 80% IC50 ≤ e−08
ICE-Inhibition ≈ e−04 > 80% IC50 < e−04
SH2-Inhibition ≈ e−04 > 50%
cdc-25-Inhibition ≈ e−04 > 80% IC50 < 3.00e−05
PTKs ≈ 5.00e−05 > 50% IC50 < 3.00e−05
Tabelle 8: Bewertungen der Screening-Ergebnisse.
3.1.4.2. Biologische Aktivität der Naturstoffe des Pilzstammes 3037
3.1.4.2.1. Pflanzenschutz-Screening der Mikrobiologie in Braunschweig
Im Diagramm 1 sind die Ergebnisse des Agardiffusionstests der Rohextrakte aufgeführt.
Außergewöhnlich ist die sehr starke Wirkung sowohl gegen Ustilago violacea als auch gegen
Chlorella fusca. Zur richtigen Einordnung der Ergebnisse sei erwähnt, daß ein Hemmhof-
radius von 35 mm den größten meßbaren Radius darstellt. Desweiteren ist auch die Aktivität
gegenüber Escherichia coli und Bacillus megaterium noch als gut zu bezeichnen.
Haupteil 51
0
5
10
15
20
25
30
35
Hemmhof-
radius
[mm]
Chl. E.C. B.M. Ust. Eur. M.m. Fus.
Agardiffusionstest: Biomalzweichagar
Ethylacetatphase
Petroletherphase
Diagramm 1: Ergebnisse des Agardiffusionstests der Rohextrakte.
Ein Vergleich mit den Biodiagrammen der Naturstoffe 1, 3, 4, 5 und 7 zeigt eindeutig, daß die
Substanzen 1 und 3 hauptsächlich für die im Rohextrakt beobachtete Wirkung verantwortlich
sind (Diagramm 2). Besonders hervorzuheben ist die außerordentlich starke Aktivität des
Naturstoffs 3 gegen Ustilago violacea und Chlorella fusca. Aus Substanzmangel konnte von
dem Sekundärmetaboliten 3 nur noch die Wirkung gegen Bacillus megaterium getestet
werden. Naturstoff 1 besitzt ebenfalls eine als gut zu bezeichnende Wirkung gegen Ustilago
violacea und Chlorella fusca (Diagramm 2).
0
5
10
15
20
25
30
35
Hemmhof-
radius
[mm]
Chl. E.C. B.M. Ust. Eur. M.m. Fus.
Agardiffusionstest: Biomalzweichagar
Naturstoff 1
Naturstoff 3
Naturstoff 4
Naturstoff 5
Naturstoff 7
Diagramm 2: Ergebnisse der Agardiffusionstests der Naturstoffe 1, 3, 4, 5 und 7.
Die stark herbiziden Eigenschaften des Sekundärmetaboliten 1 werden durch die Ergebnisse
des Keimlings- und Lemna-Tests belegt (Tab. 9 u. 10 ). Im Keimlingstest war nach sieben
Tagen eine vollkommene Hemmung des Keimwachstums zu beobachten.
52 Hauptteil
Keimlingstest
Versuchsdauer 2 Tage 7 Tage
Naturstoff 1*2 von 15 Samen zeigen Keimwachstum 0 von 15 Samen sind gekeimt
Referenz 1**
14 von 15 Samen zeigen Keimwachstum
15 von 15 Samen sind gekeimt
Referenz 2*** 14 von 15 Samen zeigen Keimwachstum 15 von 15 Samen sind gekeimt
Tabelle 9: Wirkung des Naturstoffs 1 im Keimlingstest. Als Testorganismus dient Lepidum sativum (Kresse).
* 0.25 ml einer Lösung von 10 mg Naturstoff 1 in 1ml Aceton/Methanol (1:1) und 2.25 ml steriles Wasser.
** 0.25 ml Aceton/Methanol (1:1) und 2.25 ml steriles Wasser.
*** 2.50 ml steriles Wasser.
Der Lemna-Test zeigte bereits nach zwei Tagen einen völligen Stillstand des Pflanzen-
wachstums. Nach sieben Tagen waren sämtliche Blätter der Testorganismen weiß gefärbt, so
daß von einer 100 %igen Wachstumshemmung gesprochen werden kann.
Lemnatest
Versuchsdauer 0 Tage 2 Tage 7 Tage
Naturstoff 1*
(9 Blätter
grün)
9 Blätter grün 9 Blätter teilweise weiß 9 Blätter alle weiß
Referenz 1**
(8 Blätter
grün)
8 Blätter grün 17 Blätter alle grün 37 Blätter alle grün
Referenz 2***
(9 Blätter grün 9 Blätter grün 20 Blätter alle grün 45 Blätter alle grün
Tabelle 10: Wirkung des Naturstoffs 1 im Lemnatest.
* 0.25 ml einer Lösung von 10 mg Naturstoff 1 in 1ml Aceton/Methanol (1:1) und 2.25 ml steriles Wasser.
** 0.25 ml Aceton/Methanol (1:1) und 2.25 ml steriles Wasser.
*** 2.50 ml steriles Wasser.
Bemerkenswert ist auch, daß Naturstoff 4 im Gegensatz zu Naturstoff 1 (Diagramm 2) fast
keine Wirkung mehr zeigt. Fraglich bleibt, ob dies auf das Fehlen der Methoxygruppe, auf die
schlechte Löslichkeit der Verbindung oder auf Fehler bei der Testung zurückzuführen ist.
Das isolierte Cladosporin (7) zeigt ebenfalls eine - wenn auch deutlich schwächere – Aktivität
gegen Chlorella fusca und Ustilago violacea. Aus Substanzmangel konnte ebenfalls nur noch
gegen Bacillus megaterium getestet werden.
Haupteil 53
3.1.4.2.2. Pharmakologische Aktivität
Die Testergebnisse des „Pharma-Grundscreenings“ sind in den Tabellen 11 und 12 aufge-
führt. Zur besseren Einordnung der Testergebnisse sei auf die Tabelle 8 (Seite 50) verwiesen.
Im Fibrinogen-Test zeigte der Naturstoff 3 bei einer Konzentration von 5 x 10−6 mol/l eine
beachtliche Hemmung von 81 %. Nachtests ergaben, daß trotz dieser starken Aktivität die
Wirkung der Substanz als nicht verfolgenswert einzustufen ist.
Naturstoff 1
Konzentration (mol/l) Hemmung/Wirkung (%)
cdc25 5.00e−06 −2.97
Imunnologie PTKs Kinase KDR6 5.00e−06 19.2
Onkologie PTKs Kinase TEK 5.00e−06 3.77
Tabelle 11: Pharmakologische Aktivität des Naturstoffs 1.
Naturstoff 3
Konzentration (mol/l) Hemmung/Wirkung (%)
Serotonin RB 5-HT1D 4.00e−06 2.09
Imunnologie PTKs Kinase ZAP0 5.00e−05 3.75
Fibrinogen 5.00e−06 81.0
ICE-Inhibition 5.00e−05 −0.115
Tabelle 12: Pharmakologische Aktivität des Naturstoffs 3.
3.2 Stamm 2225
3.2.1. Pilzbeschreibung
Der Pilzstamm 2225 wurde in einer aus Ägypten stammenden Erdprobe entdeckt. Er gehört
zu der nicht näher bestimmten Gattung Fusarium sp.. Bisher sind über 50 Arten dieser
Gattung bekannt. Telemorphe Gattungen sind Gibberella und Nectria. Seit den vierziger
Jahren sind aus den verschiedenen Arten von Fusarium eine große Zahl chemisch unter-
schiedlicher Stoffe isoliert und charakterisiert worden.[58,59] Substanzen von einigen
Fusarium sp. sind gegen Mycobakterien aktiv. Es sind aus ihnen Fusarium-Toxine wie
Butenolide und Depsipeptide bekannt. Desweiteren bilden Fusarium sp. verschiedene gegen
Wirbeltiere wirksame Toxine, z. B. Steroidtoxine.[60] So verursachen sie unter anderem
Fruchtbarkeitsstörungen bei Schweinen und Rindern sowie eine Verringerung der Lege-
54 Hauptteil
leistung bei Hühnern. Sie produzieren auch Hemmstoffe der Proteinsynthese und solche
Toxine, die beim Menschen die alimentäre toxische Aleukie (ATA) verursachen.[58]
Im integrierten Pflanzenschutz haben Mower et al.[61] Fusarium roseum als Hyperparasit
gegen den Mutterkornpilz (Claviceps purpurea) erfolgreich eingesetzt. Fusarium sp. enthalten
neben saprophytischen Vertretern auch einige wirtschaftlich wichtige Pflanzenparasiten. Sie
verursachen bei Kartoffeln (Fusarium solani), Erbsenwurzel und Tomaten (Fusarum-Welke)
große Schäden.[62]
3.2.2. Isolierung der Naturstoffe 8 und 9
Der Pilz der Gattung Fusarium sp. wurde in 36 Fernbachkolben auf den Nährmedien
Biomalz- und Malz-Soja-Weichagar angesetzt. Die Kultivierungsdauer betrug genau 90 Tage.
Anschließend wurde das vom Nährmedium getrennte Kulturgut mit Wasser und zerstoßenem
Eis verdünnt und im Warring-Blender homogenisiert. Die so erhaltenen homogenen
Kulturbrühen wurden in einen Scheidetrichter übergeführt, um nachfolgend einmal mit
Petrolether und dreimal mit Ethylacetat extrahiert zu werden. Das Ethylacetat selber wurde
vor dem Gebrauch mit 100 ml 1 %iger NaHCO3-Lösung je Liter Ethylacetat ausgeschüttelt.
Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand der Petrol- und Ethylacetat-
phase in 20 bzw. 30 ml einer 1:1-Lösung Aceton/Methanol aufgenommen, um so erste
Bioaktivitätstests durchzuführen.
Zur Auftrennung der rotbraun gefärbten Rohextrakte wurde die Säulenchromatographie und
die präparative Schichtchromatographie genutzt. Den vorher angefertigten Dünnschicht-
chromatogrammen war zu entnehmen, daß die Hauptfraktion aus einer unpolaren Substanz
mit einem R
f-Wert von 0.95 (CH2Cl2/MeOH 1 %) bestand. Die rote Substanz, die
wahrscheinlich auch für die Färbung des Rohextrakts verantwortlich ist, färbte sich bei einem
Rf-Wert von 0.2−0.5 (CH2Cl2/MeOH 2 %) zuerst violett und dann schwarz. Der
langgezogene schwarze Substanzfleck veränderte seine Lage selbst durch mehrmaliges
Entwickeln der DC-Karte in einer Dichlormethanlösung mit einem Methanolgehalt von 10 %
nicht mehr, so daß davon auszugehen ist, daß sich die Substanz auf dem DC zersetzte.
Neben einer Vielzahl kleinerer Fraktionen konnte ein definierter Substanzfleck mit einem
Rf-Wert von 0.1−0.2 (CH2Cl2/MeOH 8 %) detektiert werden. Die Vorfraktionierung der
Ethylacetat-Rohextrakte erfolgte mittels Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittel-
gradienten von 1−10 % Methanol in Dichlormethan. In der unpolarsten Fraktion befand sich
Haupteil 55
ein Triglycerid, bestehend aus einem Linolsäure- und zwei Ölsäureresten. Die rote Substanz
färbte sich, wie auf der DC-Karte, dunkelrot bis schwarz und war durch Erhöhung des Metha-
nolanteils nur in Spuren zu eluieren. Aus der unpolarsten, violettgefärbten Fraktion (21 mg)
gelang nach mehrmaliger präparativer Schichtchromatographie die Isolierung eines weißen
Feststoffs. NMR- und massenspektroskopische Untersuchungen belegten, daß der weiße
Feststoff aus einem 1:1-Gemisch der Naturstoffe 8 und 9 bestand. Die Trennung der beiden
Sekundärmetaboliten war partiell durch Kristallisation aus Methanol möglich.
3.2.3. Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe 8 und 9
3.2.3.1. Naturstoff 8
Der aus Methanol in farblosen Prismen kristallisierende Sekundärmetabolit 8 schmilzt bei
118−120 °C. Im chemischen Screening auf DC-Folie (Rf = 0.35, CH2Cl2/MeOH 10 %)
reagierte die Substanz positiv mit dem Sprühreagenz Bromkresol-Grün, was ein sicherer
Hinweis auf eine Carbonsäurefunktion ist. Der Naturstoff 8 ist nur in polaren Lösungsmitteln
wie Methanol oder DMSO in Lösung zu bringen. Im 1H- und 13C-Spektrum werden zwei
aliphatische Methylengruppen, eine olefinische Methylengruppe, vier aromatische oder
olefinische Methingruppen und drei aromatische quartäre Kohlenstoffatome registriert, wobei
das Signal bei 166.03 ppm wohl der Carbonsäurefunktion zuzuordnen ist. Auffällig ist im
Protonenspektrum das tieffeldverschobene Ein-Proton-Signal bei 8.53 ppm, das im C,H-
COSY mit dem 13C-NMR-Signal bei 149.46 ppm koppelt. Charakteristisch sind diese extrem
zu tiefem Feld verschobenen Signale für die 2- bzw. 6-Position in Pyridinderivaten. Der
ungerade Molpeak von 177 sowie das Fragmention m/e = 92 sind weitere Hinweise auf einen
Pyridinabkömmling. Der Pyridingrundkörper muß ferner in 2-Position substituiert sein, da nur
ein Proton diese charakteristische Tieffeldverschiebung aufweist. Das tieffeldverschobene
Singulettsignal des Protons in 6-Postion spricht für einen weiteren Substituenten in 5-Position
(Teilstruktur I). Die Duplett-Signale bei 7.94 und 7.80 ppm für die beiden verbleibenden
Protonen bestätigen mit einer für ortho-ständige Protonen typischen Kopplungskonstanten
von 7.5 Hz und einem Kreuzsignal im H,H-COSY-Spektrum diese Annahme.
56 Hauptteil
N
R
R
Teilstruktur I
Dem H,H-COSY-Spektrum ist weiter zu entnehmen, daß das Triplett bei 2.75 ppm, welches
einer aliphatischen Methylengruppe zuzuordnen ist, mit einem Multiplett bei 2.35 ppm
koppelt, welches ebenfalls einer CH2-Gruppe zugeordnet wird. Das Multiplett seinerseits
koppelt mit dem olefinischen Ein-Proton-Signal bei 5.79 ppm, das erwartungsgemäß ein
Kreuzsignal zur olefinischen Methylengruppe zeigt, so daß ein 1-Butenyl-Fragment
konstruiert werden kann. Das Pyridinderivat ist demnach von einem 1-Butenylrest und einer
Carbonsäurefunktion in 2- bzw. 5-Position substituiert. Die Zuordnung, welcher Substituent
in 2- bzw. in 5-Position zu finden ist, wird mit Hilfe des H,C-COLOC-Experiments geklärt.
So zeigt dieses Experiment eine 3J-Kopplung zwischen dem C-6 Kohlenstoffatom mit der
chemischen Verschiebung von 149.46 ppm und der Methylengruppe mit der Protonen-
verschiebung von 2.75 ppm, woraus zu folgern ist, daß der Butenylrest die 5-Position besetzt
(Abb. 35).
NCO2H
Abb. 35: Naturstoff 8.
Zur Verifizierung des Strukturvorschlags wurde abschließend eine Röntgenstrukturanalyse
angefertigt, die die Richtigkeit der postulierten Struktur belegt (Abb. 36). Interessanterweise
ist der Naturstoff 8 demzufolge über eine Wasserstoffbrückenbindung mit seiner
Betainstruktur verknüpft.
Haupteil 57
Abb. 36: Der Naturstoff 8 im Kristall.
Die Literaturrecherche ergibt, daß der Naturstoff 8, der als Dehydrofusarinsäure bezeichnet
wird, erstmals 1954 von Stoll[63] aus Gibberella fujikauroi isoliert wurde. Drei Jahre später
gelang der gleichen Arbeitsgruppe die Isolierung der Substanz aus Fusarium lycopersici[64].
Die Synthese dieser als Welkstoff bekannten phytotoxischen Substanz wurde erstmals von
Steiner[65] beschrieben.
3.2.3.2. Naturstoff 9
Der bei 82−84 °C schmelzende Naturstoff 9 reagiert ebenfalls im chemischen Screening auf
DC-Folie positiv mit dem Sprühreagenz Bromkresol-Grün. Die Schwerlöslichkeit der
Verbindung in Lösungsmitteln mittlerer Polarität sowie das Laufverhalten (Rf = 0.35,
CH2Cl2/MeOH 10 %) auf der DC-Karte sind weitere Indizien, die für eine Carbonsäure-
funktion sprechen. Ein Vergleich der 1H- und 13C-NMR-Spektren der Naturstoffe 8 und 9
belegt, daß beide Verbindungen aufgrund der fast gleichen chemischen Verschiebung
strukturell große Ähnlichkeit aufweisen sollten. So zeigt das Protonen- und 13C-NMR-
Spektrum des Sekundärmetaboliten 9 wiederum bei 8.53 bzw. 149.31 ppm die
charakteristischen Signale für eine Methingruppe in 2- bzw. 6-Position eines Pyridinderivates.
Auch die restlichen chemischen Verschiebungen und Kopplungskonstanten, die dem
Pyridingrundkörper zuzuordnen sind, weisen fast identische Signale auf. Größere Differenzen
58 Hauptteil
zwischen den chemischen Verschiebungen sind nur in der Seitenkette auszumachen. Während
in den Spektren der Verbindung 8 eine olefinische CH2- und CH-Gruppe sowie zwei
aliphatische Methylengruppen registriert werden konnten, sind in den Spektren des
Naturstoffs 9 eine aliphatische Methylgruppe und drei Methylengruppen mit den chemischen
Verschiebungen von 0.86, 1.26, 1.55 und 2.64 ppm im Protonenspektrum zu beobachten. Der
Naturstoff 9 besitzt demnach statt einer 1-Butenylseitenkette einen (n)-Butylrest in 5-Position
des Picolingrundkörpers. Der im Vergleich zu Naturstoff 8 um zwei Masseneinheiten größere
Molpeak bei 179 belegt gleichfalls, daß Naturstoff 9 die hydrierte Form des Naturstoffs 8
darstellt (Abb. 37).
NCO2H
Abb. 37: Die Struktur des Naturstoffs 9.
Der als Fusar- bzw. Fusarinsäure bezeichnete Naturstoff 9 wurde erstmals 1934 von Yabula
und Mitarbeitern[66] aus Kulturfiltraten von Fusarium heterosporium Xees isoliert und struk-
turell aufgeklärt. Desweiteren wurde er gemeinsam mit Dehydrofusarinsäure (8) in wechseln-
den Mengenverhältnissen von Stoll[63] aus Gibberella fujikuroi und Fusarium lycopersici[64]
isoliert. Dabei wurde festgestellt, daß beide Kulturen nach kurzer Inkubationszeit nur
Fusarinsäure (9) enthielten, während die Dehydrofusarinsäure (8) erst bei älteren Kulturen
auftrat. Die vermeintliche Schlußfolgerung, daß die Fusarinsäure (9) eine Vorstufe der
Dehydrofusarinsäure (8) ist, konnte von Pitel[67] nicht belegt werden, da der Naturstoff 8
seinerseits einer Umwandlung in die Fusarinsäure (9) unterliegt, so daß keine einfache Edukt-
Produkt-Beziehung zwischen beiden Komponenten ableitbar war. Ferner konnte an
14C-markierter Fusarin- (9) bzw. Dehydrofusarinsäure (8) gezeigt werden, daß beide weiter
zur 10-Hydroxyfusarinsäure und 11-Chloro-10-hydroxyfusarinsäure metabolisiert werden.
Anhand von Plattners[68] Untersuchungen waren 1954 erste Aussagen zur Phytotoxizität der
Fusarinsäure (9) möglich. Ihm gelang der Nachweis, daß ein aus Fusarium lycopersici Sacc.,
dem Erreger der Tomatenwelke, isoliertes Stoffwechselprodukt mit Fusarinsäure (9) identisch
ist. Weitere 15 Jahre danach fanden Hiduka et al.[69] in der Fusarinsäure (9) einen Hemmstoff
der Dopamin-β-Hydrolase (DBH) mit stark antihypertensiver Wirkung. Ferner ist bekannt,
Haupteil 59
daß Naturstoff 9 auch in andere Stoffwechselvorgänge eingreift, z.B. beeinflußt er den
Serotonin-Metabolismus.[70,71]
Aufgrund des breiten Wirkspektrums ist es nicht verwunderlich, daß bereits 1954 von
Plattner[67] erste Versuche zur Synthese dieser Verbindung durchgeführt wurden. Unter der
Vielzahl der weiteren Synthesen[72−75] sollte speziell die von Waldner[76,77] genannt werden.
Ihm gelang es, ausgehend von α,β-ungesättigten Hydrazonen und 2-Chloracrylnitril in einer
zweistufigen Synthese Fusarinsäure und einige Derivate herzustellen.
3.2.4. Biologische Aktivität der Naturstoffe des Pilzstammes 2225
3.2.4.1. Pflanzenschutz-Screening der Mikrobiologie in Braunschweig
Im Diagramm 3 sind die Ergebnisse der Agardiffusionstests der Ethylacetatphasen der Rohex-
trakte dargestellt. Aus diesem ist ersichtlich, daß, im Bezug auf das Nährmedium, keine
großen Aktivitätsunterschiede festzustellen sind. Die Wirkung gegen Chlorella fusca ist mit
einem Hemmhofradius von 14 bzw. 16 mm als gut zu bezeichnen. Eine mäßige Aktivität
zeigen die Rohextrakte gegen Escherichia coli, Bacillus megaterium und Ustilago violacea.
Erwähnt sei desweiteren, daß die Petroletherphasen der Biomalz- und Malz-Soja-
Weichagarmedien keine Hemmung zeigten.
0
5
10
15
20
25
30
35
Hemmhof-
radius
[mm]
Chl. E.C. B.M. Ust. Eur. M.m. Fus.
Agardiffusionstest
Biomalz-Weichagar
Malz-Soja-Weichager
Diagramm 3: Agardiffusionstests der Rohextrakte (Ethylacetatphasen).
Die sehr starken herbiziden Eigenschaften der Rohextrakte wurden durch den Keimlings- und
Lemnatest belegt. In beiden Tests wurde eine 100 %ige Wachstumshemmung festgestellt. Die
Auswertung der Tests mit Erklärung sind in Tabelle 13 illustriert.
60 Hauptteil
Keimlingstest
Versuchsdauer 6 Tage
Biomalz* 0 von 15 Samen sind gekeimt
Malz-Soja* 0 von 15 Samen sind gekeimt
Referenz 1** 15 von 15 Samen sind gekeimt
Referenz 2*** 14 von 15 Samen sind gekeimt
Tabelle 13: Wirkung der Biomalz- und Malz-Soja-Weichagar-Rohextrakte im Keimlingstest (* 0.25 ml einer
Lösung des Rohextraktes in 30 ml Aceton/Methanol (1:1) und 2.25 ml steriles Wasser; **, *** Referenzen und
Testorganismus siehe Seite 52, Tabelle 9).
Der Vergleich der Ergebnisse der Agardiffusionstests der Rohextrakte und der Fusarinsäure
(Diagramm 4) belegt eindeutig, daß mit dieser Substanz die aktive Komponente aus dem
Pilzextrakt isoliert wurde. Aus Substanzmangel konnte auch hier nur gegen Chlorella fusca,
Bacillus megaterium und Ustilago violacea getestet werden.
0
5
10
15
20
25
30
35
Hemmhof-
radius
[mm]
Chl. E.C. B.M. Ust. Eur. M.m. Fus.
Agardiffusionstest
Naturstoff 9
Diagramm 4: Der Agardiffusionstest des Naturstoffs 9.
Haupteil 61
3.3. Stamm 3184
3.3.1. Pilzbeschreibung
Beim Pilzstamm 3184, der aus der Pflanze Robinia pseudacacia (Niedersachsen) isoliert
wurde, handelt es sich um einen endophytisch lebenden Pilz der Gattung Monodictys
fluctuata. Er gehört zur Abteilung der Fungi imperfecti. In der Testung ist der Stamm
hauptsächlich wegen seiner herbiziden Wirkung aufgefallen.
3.3.2. Isolierung der Naturstoffe 10, 11 und 12
Der Pilz der Gattung Monodictys fluctuata wurde auf den Nährmedien Biomalz- und Malz-
Soja-Weichagar 73 Tage kultiviert. Danach wurde das Kulturgut mit Wasser und zerstoßenem
Eis im Warring-Blender homogenisiert und einmal mit Petrolether und dreimal mit
Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wurde zuvor mit 1 %iger Natriumhydrogen-
carbonatlösung neutral gewaschen. Anschließend wurde das organische Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer abgezogen und der Rückstand in 5 ml eines Aceton-Methanol-
Gemisches (1:1) aufgenommen. Die vor der Fraktionierung angefertigten Dünnschicht-
chromatogramme zeigten, daß die Biomalz- und Malz-Soja-Rohextrakte im wesentlichen aus
einer unpolaren Substanz (Rf-Wert: 0.84 CH2Cl2/MeOH 1 %) und einem Bereich mit polaren
Substanzen besteht (Rf-Wert: 0.2−0.6 CH2Cl2/MeOH 4 %). Die Vorfraktionierung erfolgte
mittels Säulenchromatographie. Als Elutionsmittel wurde Dichlormethan mit einem
Methanolgehalt von 1−5 % verwandt. In der unpolarsten Fraktion (Rf-Wert: 0.48−0.86;
CH2Cl2/MeOH 1 %) befanden sich zwei Fette, die nicht weiter charakterisiert wurden, und
der schwach UV-aktive Naturstoff 10 (Rf-Wert: 0.48; CH2Cl2/MeOH 1 %), der durch zwei-
malige präparative Schichtchromatographie in reiner Form (10 mg) erhalten wurde.
Die polarste Fraktion enthielt neben einer Vielzahl buntgefärbter, nicht isolierbarer
Substanzen zwei Naturstoffe, die durch ihre starke UV-Aktivität leicht zu detektieren und
isolieren waren. Die Reinigung der Sekundärmetabolite 11 und 12 gelang durch mehrmalige
präparative Schichtchromatographie. Als Elutionsmittel wurde ein Lösungsmittelgemisch,
bestehend aus Dichlormethan und 4 % Methanol, verwandt. Von den in Aceton gut löslichen
Naturstoffen 11 und 12 konnte auf diese Weise insgesamt 58 bzw. 8 mg isoliert werden.
62 Hauptteil
3.3.3. Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe 10, 11 und 12
3.3.3.1. Naturstoff 10
Der gelbe Feststoff besitzt einen Schmelzpunkt von 85−87 °C. Mit UV-Licht der Wellenlänge
254 nm ist er dünnschichtchromatographisch (Rf = 0.48, CH2Cl2/MeOH 1 %) detektierbar.
Der Naturstoff 10 löst sich gut in Lösungsmitteln mittlerer Polarität wie Dichlormethan oder
Chloroform. Schlecht ist er in unpolaren Lösungsmitteln wie Hexan oder Petrolether löslich.
Der spezifische Drehwert der Substanz beträgt [α]D
20 = + 537 ° (c = 0.67 in CH2Cl2). Die
NMR-Spektren der Verbindung zeigen, daß die Substanz sechs Methylgruppen besitzt. Zwei
dieser Methylgruppen zeigen im Protonenspektrum ein Singulett bei 0.96 bzw. 1.00 ppm,
während für die restlichen vier CH3-Gruppen je ein Duplett mit einer chemischen
Verschiebung von 0.83, 0.85, 0.93 und 1.06 ppm detektierbar ist. Desweiteren sind noch
sechs Methylen-, jeweils fünf aliphatische und olefinische Methingruppen, zwei aliphatische
quartäre Kohlenstoffatome und eine Carbonylfunktion mit einer chemischen Verschiebung
von δ = 199.65 ppm registrierbar. Im IR-Spektrum ist bei 1685 cm−1 eine scharfe Bande zu
beobachten, die in Übereinstimmung mit der chemischen Verschiebung im 13C-NMR-
Spektrum für ein α,β-ungesättigtes Keton spricht. Weitere signifikante Hinweise sind
ebenfalls die chemischen Verschiebungen der olefinischen Methingruppe bei 123.00 ppm und
der quartären 13C-NMR-Signale bei 124.49, 156.18 und 164.54 ppm, die für einen
konjugativen Effekt der Ketogruppe sprechen. Belegt wird diese Hypothese durch
Auswertung des HMBC-Spektrums. Es zeigt, daß die Methingruppe bei 123.00 ppm eine
geminale Kopplung zur Carbonylgruppe und eine vicinale Kopplung zur Methingruppe bei
124.49 ppm aufweist, wobei für letztere im H,H-COSY- bzw. Protonenspektrum eine cis-
Kopplung (J = 9.5 Hz) zu dem Proton der Methingruppe mit der 13C-NMR-Verschiebung von
134.11 ppm registrierbar ist. Das zugehörige Protonensignal bei 6.60 ppm zeigt im HMBC-
Spektrum wiederum Kreuzsignale zu den quartären C-Atomen bei 156.18 bzw. 164.54 ppm,
so daß Teilstruktur I formuliert werden kann.
O
R
RR R
R
199.65
123.00
164.54
124.24
134.11
124.49
156.1
8
Teilstruktur I
Haupteil 63
Desweiteren zeigen die beiden olefinischen Methingruppen mit den chemischen
Verschiebungen von 123.00 und 124.24 ppm im HMBC-Spektrum eine 3J-Kopplung zu dem
quartären Kohlenstoffatom bei 36.80 ppm. Von diesem ausgehend, sind 2J- und 3J-Kopp-
lungen zu einer Methylgruppe bei 16.68 ppm, einer Methingruppe bei 44.36 ppm und zu zwei
Methylengruppen bei 34.13 und 19.01 ppm zu beobachten. Während die Methylengruppen
wiederum mit der Carbonylgruppe koppeln, zeigt die Methingruppe bei 44.36 ppm im H,H-
COSY- und HMBC-Spektrum ein Kreuzsignal zu den Methylengruppen bei 25.79 und
34.16 ppm. Letztere CH2-Gruppe koppelt mit dem C-Atom bei 156.18 ppm, so daß folgende
Teilstruktur formuliert werden kann:
O
R
RR
199.65
123.00
164.54
124.24
134.11
124.49
156.1
8
34.13
19.01
16.68
36.80
34.16
44.36
25.79
Teilstruktur II
Dem H,H-COSY ist weiter zu entnehmen, daß die Methylengruppen mit den
13C-NMR-Verschiebungen von 35.62 und 27.74 ppm miteinander koppeln. Letztere zeigt ein
weiteres Kreuzsignal mit einer Methingruppe bei 55.74 ppm, die ebenfalls im HMBC-
Spektrum eine 3J-Kopplung zu einem Singulett-Signal einer Methylgruppe mit der
chemischen Verschiebung von 18.99 ppm zeigt. Diese erzeugt im HMBC-Spektrum weitere
Kreuzkopplungen zu den quartären Kohlenstoffatomen bei 44.03 und 156.18 ppm, so daß das
als Teilstruktur III bezeichnete Steroidgrundgerüst konstruiert werden kann.
O
R
199.65
123.00
164.54
124.24
134.11
124.49 156.18
34.13
19.01
16.68
36.80
34.16
44.36
25.79 44.03
35.62
27.7
4
55.74
18.99
Teilstruktur III
64 Hauptteil
Die Methingruppe bei 55.74 ppm zeigt im H,H-COSY ein Kreuzsignal zur Methingruppe bei
39.31 ppm. Desweiteren ist im HMBC-Spektrum ebenfalls eine geminale Konnektivität zur
Methingruppe und eine vicinale Kopplung zur Methylgruppe bei 21.25 ppm detektierbar. Die
Methyl- und Methingruppen erzeugen ferner Kreuzkopplungen zu den olefinischen
CH-Gruppen bei 132.58 und 135.04 ppm, die im H,H-COSY- bzw. im HMBC-Spektrum
weitere 2J- und 3J-Konnektivitäten mit den Methingruppen bei 42.91 und 33.12 ppm
eingehen. Während letztere im H,H-COSY mit zwei Methylgruppen koppelt, kann für die
Methingruppe bei 42.91 ppm nur eine Kopplung zu einer Methylgruppe registriert werden,
was zur Konstruktion der in Abb. 38 dargestellten Struktur führt.
O199.65
123.00
164.54
124.24
134.11
124.49 156.18
34.13
19.01
16.68
36.80
34.16
44.36
25.79 44.03
35.62
27.74
55.74
18.99 39.31
21.25 132.58
135.05
42.91
33.12
17.67
19.6
9
20.01
Abb. 38: Absolute Konfiguration des Naturstoffs 10.
Eine Literaturrecherche ergibt, daß das Steroid namens Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on (10)
von Schulte[78] 1968 isoliert wurde. In terrestrischen Basidomyceten wie z. B. Astraeus
hygrometricus[79], Ganoderma australe und Skleroderma polyrhizum[80] ist das Steroid weit
verbreitet. Selbst aus den marinen Deuteromyceten Dendryphiella salina[81] konnte es isoliert
werden.
3.3.3.1.1. Biosynthese des Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3ons (10)
Fütterungsversuche mit 3H-markierten Steroiden bewiesen[82], daß Ergosterol (22) eine
Vorstufe des Sekundärmetaboliten 10 darstellt. Das Markierungsexperiment zeigte deutlich,
daß das Ergosterol (22) in das in Abbildung 39 gezeigte Triol 23 übergeführt wird, das durch
weitere Oxidation in das 3-Keto-5α,8-diol 24 umgewandelt wird. Durch die zweimalige
Dehydrogenierung gelangt man schließlich zum Naturstoff 10.
Haupteil 65
10
24
23
22
HO
[Ox.]
HO OH
OH
[Ox.]
OH
OH
O
H2O
_
O
Abb. 39: Biosynthese des Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ons (10).
3.3.3.2. Naturstoff 11
Der Sekundärmetabolit 11 fällt als hellgelber Feststoff mit einem R
f-Wert von 0.32
(CH2Cl2/MeOH 4 %) und einem Zersetzungspunkt von ca. 250 °C an. Er löst sich gut in
Aceton und Methanol, schlecht dagegen in Lösungsmitteln mittlerer Polarität, wie z. B.
Chloroform. Das IR-Spektrum zeigt eine für Carbonylgruppen charakteristische Bande bei
1647 cm−1 und eine breite Bande bei 3410 cm−1, die für OH-Gruppen typisch ist. Im
13C-NMR-Spektrum der Verbindung sind zehn Kohlenstoffatome detektierbar. Die
Auswertung der 1H-, 13C-NMR- und DEPT-Spektren zeigt, daß diese Signale einer ali-
phatischen Methylengruppe, zwei aliphatischen und aromatischen Methingruppen, vier
aromatischen quartären Kohlenstoffatomen und einer Carbonylgruppe bei 203.60 ppm
zuzuordnen sind. Dem Protonenspektrum ist zu entnehmen, daß die aromatischen Protonen
ein AX-Spin-System mit einer ortho-Kopplung (J = 8.8 Hz) bilden und das scharfe Singulett
bei 12.10 ppm dem Signal einer chelierten OH-Gruppe entspricht. Das relativ stark hoch-
feldverschobene Signal bei δ = 6.18 ppm ist offensichtlich in ortho-Position zur OH-Gruppe
zu finden. Die Tieffeldverschiebung des zweiten aromatischen Protons bei 8.14 ppm ist
66 Hauptteil
typisch für ein Proton, das sich in meta-Position zur OH-Gruppe und para-Position zur Car-
bonylgruppe befindet. Weitere Indizien, die für die Teilstruktur I sprechen, sind die charak-
teristischen 13C-NMR-Verschiebungen für die aromatische CH-Gruppe bei 115.08 ppm und
die der quartären Kohlenstoffatome bei 160.52, 115.39 und 143.21 ppm.
R
O
R
R
OH
6.81
115.08
130.38
8.14
135.16
160.52
115.39
203.60
143.21
Teilstruktur I
Im H,H-COSY werden, ausgehend von der Methingruppe bei 4.75 ppm, Kreuzsignale zu dem
Protonensignal der Methylengruppe mit den chemischen Verschiebungen von 3.03 und
3.15 ppm und der Methingruppe bei 3.75 ppm beobachtet. Die CH-Gruppe bei 4.75 ppm
weist eine weitere Kopplung zu einem Duplett bei 5.05 ppm (J = 5.4 Hz) auf, das aufgrund
der Austauschbarkeit der Protonen und der 13C-NMR-Verschiebung der CH-Gruppe
(67.81 ppm) als OH-Proton identifiziert wird.
R
R
R
OH
3.15
47.29 4.75
67.81
3.75
45.42
5.05
Teilstruktur II
Die Protonen der Methylengruppe zeigen im Protonenspektrum jeweils eine geminale
Kopplung von 14.5 Hz sowie eine vicinale Kopplung von 5.8 bzw. 11.9 Hz. Im COLOC-
Spektrum beobachtet man ausgehend von diesen Signalen eine Korrelation zur Carbonyl-
gruppe. Von der Methingruppe bei 3.75 ppm sind Konektivitäten zu den quartären
Kohlenstoffatomen bei 143.21 und 130.38 ppm detektierbar, so daß das Fragment II nur, wie
in Teilstruktur III dargestellt, mit dem aromatischen Rest verknüpft sein.
Haupteil 67
O
R1
OH
OH
R2
6.81
115.08
130.38
8.14
135.16
160.52 115.39
203.60
143.21
3.15
47.29
4.75
67.81
3.75
45.42
5.05
Teilstruktur III
Als vorläufige Summenformel erhält man C
10H8O3R1R2. Das Molekulargewicht des
Naturstoffs 11 muß also größer als 176 g/mol sein und die Reste R
1 und R2 dürfen kein
weiteres 1H- und 13C-NMR-Signal erzeugen. Das Massenspektrum zeigt, daß die Verbindung
eine Molmasse von 352 besitzt. Die Reste R1 und R2 besitzen also gleichfalls eine Masse von
176. Das einzige Fragment, welches beide Bedingungen erfüllt, ist das in Teilstruktur III
dargestellte Fragment mit der Summenformel C
10H8O3 selbst. Die Verknüpfung dieser
Fragmente erfolgt aufgrund einer im COLOC-Spektrum beobachteten 3J-Kopplung zwischen
dem Kohlenstoffatom bei 135.16 ppm und der Methingruppe bei 3.75 ppm (Abb. 40).
OOH
OH
HO
O OH
1
2
3
4
6b
12b
8
7
11
3a
9a
6a
12a
109
12
6
5
3b
9b
Abb. 40: Die Struktur des Naturstoffs 11.
Die Aufklärung der relativen Konfiguration des Naturstoffs 11 erfolgt durch die Auswertung
der Kopplungskonstanten. Die vicinalen Kopplungskonstanten zwischen C-2 bzw. C-8 und C-1
bzw. C-7 (Jae = 5.8 Hz und Jaa = 11.9 Hz) zeigen, daß der Cyclohexanonring vorzugsweise in
einer Halbsessel-Konformation mit der Hydroxylgruppe in äquatorialer Position vorliegt. Die
3J-Kopplung zwischen C-1 bzw. C-7 und C-12b bzw. C-6b besitzt mit 9.0 Hz ebenfalls einen
für axial-axial angeordnete Protonen typischen Wert. Das nur der haploide Satz an Protonen-
68 Hauptteil
und 13C-NMR-Resonanzen in den NMR-Spektren registrierbar ist läßt sich nur durch die
Existenz einer C2-Achse senkrecht zur Molekülebene und somit einer cis-Anordnung der
Protonen 6b-H und 12b-H erklären (Abb.40).
OOH
OH
HO
O OH
H H
1
2
3
4
6b
12b
8
7
11
3a
9a
6a
12a
109
12
6
5
3b
9b
Abb. 41: Die absolute Konfiguration des Naturstoffs 11.
Eine Recherche in der Chapman-Hall-Datenbank ergab, daß der in Abb. 41 dargestellte
Naturstoff namens Stemphyperylenol (11) 1986 von Nasini[83] aus Stemphylium botrysum
var. Lactucum isoliert und charakterisiert wurde. Ihm gelang auch die Aufklärung der
absoluten Konfiguration. Strobel[84] isolierte 1989 den phytotoxisch wirkenden Naturstoff aus
Alternaria cassiae.
3.3.3.3. Naturstoff 12
Der Naturstoff 12 wird als gelber Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 150−152 °C isoliert.
Die Substanz besitzt einen R
f-Wert von 0.25 (CH2Cl2/MeOH 4 %) und einen spezifischen
Drehwert von [α]D
20 = 451° (c = 0.07; MeOH). Das IR-Spektrum zeigt wiederum zwei scharfe
Absorptionsbanden bei 1651 cm−1 und 1645 cm−1, die für zwei Carbonylbanden sprechen.
Desweiteren sind drei relativ breite Banden bei 3238, 3418 und 3473 cm−1 detektierbar.
Durch die hochauflösende Massenspektroskopie wird die Molmasse zu 368.089 ± 3 ppm
bestimmt, woraus sich unter Berücksichtigung der 1H- und 13C-NMR-Daten eine Summen-
formel von C20H16O7 ergibt.
Die Auswertung der 1H-, 13C-NMR-Spektren und des DEPT-Experiments läßt erkennen, daß
die Verbindung aus zwei aliphatischen Methylgruppen, drei einfach oxygenierten alipha-
Haupteil 69
tischen Kohlenstoffatomen, vier aromatischen CH-Gruppen, acht aromatischen oder ole-
finischen quartären Kohlenstoffatomen und zwei Carbonylgruppen aufgebaut ist, wobei es
sich bei letzteren aufgrund ihrer chemischen Verschiebung (204.03 und 204.32 ppm) und
ihrer IR-Absorptionsbanden um Arylketone handelt. Die vier aromatischen Protonen mit den
chemischen Verschiebungen von 6.95, 7.06, 7.95 und 8.01 ppm zeigen jeweils nur ein ortho-
koppelndes AX-Spin-System. Das H,H-COSY-Spektrum bestätigt, daß das Proton bei
6.95 ppm und 7.05 ppm nur eine 3J-Kopplung mit dem Proton bei 7.95 bzw. 8.01 ppm
eingeht. Hervorzuheben sind desweiteren die scharfen Signale bei 12.35 und 12.58 ppm. Sie
sind charakteristisch für chelatisierte OH-Gruppen. Die chemischen Verschiebungen im
13C-NMR-Spektrum von 162.00 und 162.08 ppm und die hochfeldverschobenen Protonen-
resonanzen sind weitere Indizien.
Im HMBC-Spektrum sind, ausgehend vom Protonensignal bei 6.95 ppm, Kreuzsignale zu den
quartären Kohlenstoffatomen bei 117.63, 162.00 (oder 162.08) und 126.52 (oder 126.69) ppm
zu beobachten. Die in Klammern aufgeführten chemischen Verschiebungen sollen andeuten,
daß eine zweifelsfreie Zuordnung zwischen den Signalen mit fast identischer Verschiebung
nicht möglich ist. Die 2J- und 3J-Kopplungen des ortho-ständigen Protons bei 7.95 ppm zu
den quartären Kohlenstoffatomen bei 126.52 (oder 126.69), 162.00 (oder 162.08) und
138.75 ppm führt zur Konstruktion der Teilstruktur Ia.
R
OOH
R
R
162.00
(162.08)
6.95
116.80
7.95
133.33 126.52
(126.69)
138.75
117.63
204.03
(204.32
)
Teilstruktur Ia
Ausgehend vom Proton bei 7.06 ppm sind im HMBC-Spektrum analoge geminale und
vicinale Kopplungen zu den quartären Kohlenstoffatomen mit der chemischen Verschiebung
von 114.96, 162.08 (oder 162.00) und 126.69 (oder 126.52) ppm registrierbar. Ebenso zeigt
das ortho-ständige Proton bei 8.01 ppm auffällig ähnliche Konnektivitäten zu den quartären
Kohlenstoffatomen bei 126.69 (oder 126.52), 162.08 (oder 162.00) und 140.10 ppm
(Teilstruktur Ib).
70 Hauptteil
R
OOH
R
R
162.08
(162.00)
7.06
119.16
8.01
134.05 126.69
(126.52)
140.10
114.96
204.32
(204.03
)
Teilstruktur Ib
Dem H,H-COSY-Spektrum ist weiter zu entnehmen, daß die Methingruppe mit der
13C-NMR-Verschiebung von 54.48 ppm mit einer CH-Gruppe koppelt, die aufgrund ihres
Protonensignals bei 4.75 ppm und der 13C-NMR-Verschiebung von 66.06 ppm wohl einfach
oxygeniert ist. Diese zeigt ein weiteres Kreuzsignal zur Methylengruppe bei 46.73 ppm. Im
HMBC-Spektrum koppelt diese Methylengruppe mit dem quartären Kohlenstoffatom bei
117.63 ppm, mit der Keto-Gruppe und der Methingruppe bei 54.48 ppm. Die Methingruppe
ihrerseits zeigt 2J- und 3J-Konnektivitäten zu den quartären Kohlenstoffatomen bei 117.63,
126.52 (oder 126.69) und 138.75 ppm, so daß Teilstruktur IIa formuliert werden kann.
OOH
R
OR
R
162.00
(162.08)
6.95
116.80
7.95
133.33 126.52
(126.69)
138.75
117.63
204.03
(204.32)
3.00/46.73
4.75/66.06
3.15
54.48
Teilstruktur IIa
Im aliphatischen Bereich des H,H-COSY-Spektrums sind Kreuzsignale der Methylengruppe
mit der 13C-NMR-Verschiebung von 42.97 ppm zum Doppel-Duplett-Signal bei 4.67 ppm
detektierbar, das aufgrund seiner 13C-NMR-Verschiebung von 70.74 ppm ebenfalls
monooxygeniert ist. Dem HMBC-Spektrum ist zu entnehmen, daß die Methylengruppe mit
einer Ketogruppe, einem quartären Kohlenstoffatom bei 114.96 ppm und einem einfach
oxygenierten quartären Kohlenstoffatom mit der chemischen Verschiebung von 71.75 ppm
koppelt (Teilstruktur IIb).
Haupteil 71
162.08
(162.00)
7.06
119.16
8.01
134.05 126.69
(126.52)
140.10
114.96
204.32
(204.03)
OOH
R
R
RR
R
OR
4.67/70.74
71.75
42.97
Teilstruktur IIb
Der Vergleich der Teilstrukturen IIa und IIb mit der Teilstruktur III des Naturstoffs 11 (Seite
67) zeigt, daß diese strukturell sehr große Ähnlichkeit aufweisen. Aufschluß über die
Verknüpfung der Teilstrukturen IIa und IIb erhält man durch die weitere Auswertung des
HMBC-Spektrums. Aus diesem ist ersichtlich, daß die Methingruppe bei 54.48 ppm
(Teilstruktur IIa) sowohl mit den einfach oxygenierten Kohlenstoffatomen bei 70.74 und
71.75 ppm als auch mit dem quartären 13C-NMR-Signal bei 140.10 ppm koppelt. Unter
Berücksichtigung der massenspektroskopisch bestimmten Summenformel muß der
Naturstoff 12 die in Abb. 42 dargestellte Struktur besitzen.
OOH
OH
OHOH
OH O
162.00
(162.08)
6.95
116.80
7.95
133.33
126.52
(126.69)138.75
117.63
204.03
(204.32)
3.00/46.73
4.75/66.06
3.15
54.48
42.97
71.75
4.67/70.74
204.32
(204.03)
114.96
140.10
126.69
(126.52)
8.01
134.05
7.06
119.16
162.08
(162.00)
Abb. 42: Die Struktur des Naturstoffs 12.
Die Aufklärung der relativen Konfiguration erfolgt durch die Auswertung der Kopplungs-
konstanten. Die vicinalen Kopplungskonstanten zwischen den Protonen der Methingruppe bei
54.48 ppm und 66.06 ppm (
3J = 8.6 Hz) zeigen, daß die OH-Gruppe in dem in
Halbsesselkonformation vorliegenden Cyclohexanonring ebenso wie bei Naturstoff 11 in
äquatorialer Position angeordnet sein muß und die Protonen die axialen Positionen einnehmen
(Abb. 43).
72 Hauptteil
OOH
OH O
HOH
OHOH
3.00/46.73
4.75/66.06
3.15
54.48
42.97
71.75 4.67/70.74
Abb. 43: Die relative Konfiguration und dreidimensionale Struktur des Naturstoffs 12.
Im zweiten Cyclohexanonring ist ebenfalls eine große vicinale Kopplungskonstante von
J = 12.5 Hz zwischen den Protonen der Methingruppe bei 70.74 ppm und dem axial
angeordneten Proton der Methylengruppe bei 42.97 ppm zu beobachten, so daß auch hier die
OH-Gruppe äquatorial angeordnet sein muß. Um beide Cyclohexanonringe verknüpfen zu
können, muß die OH-Gruppe am quartären Kohlenstoffatom mit der chemischen
Verschiebung von 71.75 ppm axial angeordnet sein. Die so konstruierbare relative
Konfiguration des literaturunbekannten Sekundärmetaboliten 12 ist in Abb. 43 dargestellt.
Der Vergleich der Kopplungskonstanten, der chemischen Verschiebungen der 1H- und
13C-NMR-Spektren sowie die fast ideale Übereinstimmung der CD-Spektren mit dem
strukturell fast identischen Stempyltoxin I (25)[83] (Abb. 44) belegt, das beide Verbindungen
die gleiche relative Konfiguration besitzen. Bei Naturstoff 12 handelt es sich demnach um
einen neuen interessanten Vertreter aus der Klasse der Stemphyl- bzw. Altertoxine, die als
Phytotoxine aus Stemphylium botryosum, Alternaria tenius, Alternaria mali bzw. Alternaria
cassiae bekannt sind.[85−89]
Haupteil 73
OOH
OH O
H
OHOH
O
25
Abb. 44: Die relative Konfiguration des Stemphyltoxins I (25).
3.3.3.3.1. Biosynthese der Naturstoffe 11 und 12
Okuno et al.[90] zeigten durch Fütterungsversuche mit [2-13C]-markiertem Natriumacetat, daß
die Biosynthese des Alterperylenols (26) (Abb. 45) wahrscheinlich über die oxidative
Kupplung zweier Tetralon-Derivate 28 verläuft.
26
OOH
OH O
OH
HOH
Abb. 45: Alterperylenol (26).
Eine hypothetische Vorstufe dieser Tetralon-Derivate 28 sollte dem Markierungsexperiment
zufolge ein 13C-markiertes Pentaketid 27 sein (Abb. 46). Aufgrund der strukturellen
Ähnlichkeit kann vermutet werden, daß die Naturstoffe 11 und 12 einen vergleichbaren Bio-
syntheseweg besitzen. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, daß der Naturstoff 11
74 Hauptteil
unter einer Vielzahl von Perylen-Derivaten die einzige Verbindung ist, die statt der üblichen
Kopf/Kopf-Verknüpfung der Tetralon-Derivate eine Kopf/Schwanz-Verknüpfung aufweist.
OH O
OH O
OH
OH
13
13
13
13
13
13 13
13
13
13
13 13 13
13
13
13
13 13
13
13
OH O
OH
OH O
OH
13 13 13
13
13 OH
O O
O
O O
13 O- Na
O
27
28
26
Abb. 46: Biosynthese des Alterperylenol (26).
3.3.4. Biologische Aktivität der Naturstoffe des Pilzstammes 3184
3.3.4.1. Pflanzenschutz-Screening der Mikrobiologie in Braunschweig
Im Agardiffusionstest zeigte der Biomalz- und Malz-Soja-Rohextrakt eine gute Wirkung
gegen Ustilago violacea und eine sehr gute Aktivität gegen Chlorella fusca (Diagramm 5).
Durch den Lemna-Test wird die sehr starke herbizide Wirkung der Rohextrakte bestätigt
(Tab. 14). Für die Petroletherphasen beider Rohextrakte war keinerlei Wirkung feststellbar.
Haupteil 75
0
5
10
15
20
25
30
35
Hemmhof-
radius
[mm]
Chl. E.C. B.M. Ust. Eur. M.m. Fus.
Agardiffusionstest: Ethylacetatphase
Biomalz-Extrakt
Malz-Soja-Extrakt
Diagramm 5: Agardiffusionstest des Biomalz- und Malz-Soja-Rohextraktes.
Lemnatest
Versuchsdauer 1. Tag 2. Tag 6. Tag
Biomalz-Extrakt* 4 Blätter gelb-grün 4 Blätter gelb-weiß 4 Blätter weiß
Malz-Soja-Extrakt*
4 Blätter gelb-grün 4 Blätter weiß 4 Blätter weiß
Referenz 1** 4 Blätter grün 9 Blätter grün 21 Blätter grün
Referenz 2*** 4 Blätter grün 8 Blätter grün 21 Blätter grün
Tabelle 14: Lemnatest der Biomalz- und Malz-Soja-Rohextrakte (* 0.25 ml einer Lösung des Rohextraktes in
5 ml Aceton/Methanol (1:1) und 2.25 ml steriles Wasser; **, *** Referenzen und Testorganismus siehe Seite 52,
Tabelle 10).
Das in Diagramm 6 dargestellte Ergebnis des Agardiffusionstests des Steroids 10 zeigt, daß
dieses eine mäßige Wirkung gegen Ustilago violacea und Chlorella fusca besitzt.
Beachtlicher ist das Wirkpotential des Stemphyperylenols (11), insbesondere seine stark
herbiziden Eigenschaften, die durch eine 89 %ige Abnahme der Photosynthese-Aktivität
belegt wird (Tab. 15). Zudem macht der Vergleich der Agardiffusionstests der Rohextrakte
und des Naturstoffs 11 deutlich, daß vermutlich dieser aufgrund des fast identischen
Wirkspektrums für die Aktivität des Pilzextraktes verantwortlich ist.
76 Hauptteil
0
5
10
15
20
25
30
35
Hemmhof-
radius
[mm]
Chl. E.C. B.M. Ust. Eur. M.m. Fus.
Agardiffusionstest:
Naturstoff 10
Naturstoff 11
Diagramm 6: Ergebnisse der Agardiffusionstests der Naturstoffe 10 und 11.
Photosyntheseaktivitätsmessung*
Photosyntheseaktivitätsmessung [µmol O2/(h∗ml)] Abnahme der Photo-
syntheseaktivität
Testsubstanzen Vor der Applikation
des Naturstoffes
Nach der Applikation des
Naturstoffes
[µmol O2/(h∗ml)](%)
Naturstoff 11 0.28 0.03 0.25 (89)
Referenz** 0.52 0.41 0.11 (21)
Tabelle 15: Photosyntheseaktivitätsmessung des Stemphyperylenols (11).
* Zählkammertiefe: 0.1 mm.
Zellkonzentration: 2∗10−7 Zellen/ml.
Konzentration der Testsubstanz: 100 µl der gelösten Substanz (100mg/ml Aceton/Methanol 1:1) auf 3 ml
Zellsuspension.
** Kontrollmessung mit Lösungsmittelgemisch Aceton/Methanol 1:1.
3.3.4.2. Pharmakologische Aktivität
Die Testergebnisse der Immunologie-, Onkologie- und des Serotonin-Rezeptortests für den
Sekundärmetaboliten 11 sind in Tabelle 16 dargestellt. Die Auswertung der Tests ergab, daß
die Substanz keine verfolgenswerten Wirkungen in den Testsystemen zeigte.
Haupteil 77
Naturstoff 11
Konzentration (mol/l) Hemmung/Wirkung (%)
Serotonin RB 5-HT1D 4.00e−06 −10.8
Imunnologie PTKs Kinase ZAP0 5.00e−05 −12.7
Onkologie PTKs Kinase TEK 5.00e−05 −21.2
Tabelle 16: Die Ergebnisse der pharmakologischen Testung des Stemphyperylenol (11).
3.4. Stamm 3004
3.4.1. Pilzbeschreibung
Der Pilzstamm 3004 stammt aus einer Bodenprobe aus China (4000 m). Die taxonomische
Bestimmung war aufgrund fehlender Sporulation noch nicht möglich.
3.4.2. Isolierung der Naturstoffe 13, 14, 15 und 16
Die Isolierung der Naturstoffe 13, 14, 15 und 16 erfolgte aus dem Pilzstamm 3004. Als
Nährmedien dienten Biomalz- und Malz-Soja-Weichagar. Nach einer Kultivierungsdauer von
128 Tagen wurde das grüne Pilzmycel mit Wasser und zerstoßenem Eis verdünnt und
anschließend in einem Warring-Blender homogenisiert. Das Kulturgut wurde in einen
Scheidetrichter übergeführt und einmal mit Petrolether und dreimal mit Ethylacetat extrahiert.
Das Ethylacetat wurde vor dem Gebrauch mit 100 ml 1 %iger Natriumhydrogen-
carbonatlösung ausgeschüttelt. Nach dem Abdampfen des Petrolethers und des Ethylacetats
wurde der Rückstand in einer Aceton-Methanol-Lösung (1:1) aufgenommen. Die Anzucht
einer zweiten Charge des Pilzstammes erfolgte unter gleichen Kultivierungsbedingungen. Die
Aufarbeitungsmethodik war mit der oben beschriebenen weitgehend identisch. Statt
Petrolether und Ethylacetat wurde das homogenisierte Pilzmycel zur besseren Phasentrennung
mit Dichlormethan extrahiert. Die Aufnahme des Rückstandes in einer Aceton-Methanol-
Lösung (1:1) entfiel ebenfalls.
In den Dünnschichtchromatogrammen der herkömmlich aufgearbeiteten Rohextrakte konnte
ein auffällig fluoreszierender, isolierter Substanzfleck mit einem R
f-Wert von 0.6 in
Dichlormethan detektiert werden. Die Isolierung der als Naturstoff 13 bezeichneten Substanz
gelang durch einmalige Säulenchromatographie mit einer Ausbeute von 57 mg aus insgesamt
1.82 bzw. 1.68 g Rohextrakt. Als Laufmittel diente eine Dichlormethanlösung mit 2 %
Methanolanteil. Ein weiterer definierter Substanzfleck war in einer braun gefärbten Fraktion
78 Hauptteil
bei einem R
f-Wert von 0.3 (CH2Cl2/MeOH 2 %) zu beobachten. Durch mehrmalige
präparative Schichtchromatographie konnte aus der Fraktion der braune Naturstoff 14 mit
einem Rf-Wert von 0.91 (CH2Cl2/MeOH 4 %) in reiner Form isoliert werden.
Aus den mit Dichlormethan extrahierten Rohextrakten wurde in Analogie zu den
herkömmlichen Rohextrakten der Naturstoff 13 durch einfache Säulenchromatographie
isoliert. Aus dem vorfraktionierten Pilzextrakt konnten in einer polaren Fraktion (Rf-Wert:
0.4−0.7 (CH2Cl2/MeOH 2 %)) die Naturstoffe 15 und 16 mit einem Rf-Wert von 0.8 und 0.9
(CH2Cl2/MeOH 3 %) durch mehrmalige Schichtchromatographie isoliert werden.
3.4.3. Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe 13, 14, 15 und 16
3.4.3.1. Naturstoff 13
Der Naturstoff 13 kristallisiert in Form gelber Nadeln, die bei 256 °C schmelzen. Die relativ
unpolare Substanz (Rf-Wert = 0.6 in CH2Cl2) löst sich gut in Lösungsmitteln mittlerer
Polarität, wie Chloroform oder Dichlormethan. Bemerkenswert ist dabei die auffällige violette
Fluoreszenz der Substanz. Der spezifische Drehwert beträgt [α]D
20 = + 75.1 (1.36 in CHCl3).
Das IR-Spektrum zeigt bei 1709 cm−1 eine intensive Absorptionsbande, die für
Carbonylgruppen typisch ist. Die relativ breite Bande bei 3436 cm−1 hingegen ist
charakteristisch für eine OH-Valenzschwingung. Den 1H-, 13C-NMR-Spektren und dem
DEPT 135-Experiment ist zu entnehmen, daß die Substanz vier Methylgruppen, jeweils eine
aliphatische und aromatische Methingruppe und zwölf quartäre Kohlenstoffatome besitzt, von
denen eines aufgrund der 13C-NMR-Verschiebung sp3-Charakter besitzt (Tab.17).
Haupteil 79
Naturstoff 13
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
1165.73 (s) −
2− −
3
164.59 (s)
−
3a 93.75 (s) −
3b 135.61 (s) −
4
164.59 (s)
−
5
119.50 (s)
−
6166.57(s) −
6a
108.84 (s)
−
7
150.28 (s)
−
7a
824.14(q)
117.60(d) 2.83 (s)
6.82 (s)
9166.25 (s) −
9a 97.51 (s) −
1‘ 14.93 (q) 1.53 (d)
2‘ 92.48 (d) 4.75 (q)
3‘ 43.83 (s) −
4‘
5‘ 21.10 (q)
25.83(q) 1.34 (s)
1.59 (s)
Tabelle 17: 1H- und 13C-NMR-Daten des Naturstoffs 13.
Für drei der vier Methylgruppen sind im Protonenspektrum Singulett-Signale registrierbar.
Die vierte zeigt ein Duplett-Signal mit einer Kopplungskonstanten von 6.6 Hz. Das zum
gleichen Spin-System gehörende Quartett ist bei 4.75 ppm detektierbar. Die scharfen Signale
bei 11.39 und 11.62 ppm im Protonenspektrum sind charakteristisch für chelierte OH-Pro-
tonen. Die 13C-NMR-Verschiebung der entsprechenden Carbonylsignale zeigen mit 166.25
und 164.59 ppm eine für Aryl- bzw. α,β-ungesättigte Ester, Lactone oder Carbonsäure-
anhydride signifikante Hochfeldverschiebung. Die vorläufige Summenformel mit Hetero-
atomanteil lautet demnach C18H16O6 bzw. C18H16O5, was einer Molmasse von 328 bzw. 312
entspricht.
Die massenspektroskopischen Untersuchungen belegen, daß der Naturstoff 13 mit einer
Molmasse von 328 sechs Sauerstoffatome besitzt. Im 13C-Spektrum der Verbindung fallen
neben den tieffeldverschobenen oxygenierten quartären Arylkohlenstoffatomen C-4, C-9 und
C-6 die hochfeldverschobenen 13C-Resonanzen der quartären Arylkohlenstoffatome bei 93.8,
97.5 und 108.8 ppm auf. Aufgrund der chemischen Verschiebung ist davon auszugehen, daß
80 Hauptteil
diese ebenso wie die Methingruppe C-8 in ortho-Position zu den phenolischen OH-Gruppen
zu finden sind.
Unter Berücksichtigung der Informationen aus den IR-, Massen- und NMR-Spektren wurde
eine Recherche in der Chapman-Hall-Datenbank durchgeführt. Diese ermöglichte eine
eindeutige Identifizierung des Sekundärmetabolits 13 als eine literaturbekannte Verbin-
dung.[91] Der Naturstoff 13 wurde erstmals durch Oxidation von Atrovenetin (29) (Abb. 50)
erhalten[92,93] und später aus Kulturen von Penicillium herquei[94], Roesleria pallida[95],
Roesleria hypogea[96] und Aspergillus silvaticus[97] isoliert. Die absolute Konfiguration des
Anhydrids 13 wurde von Homma et al.[97] durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt.
O O
OHHO
O
O
1 3
4
3a
3b
5
6
6a
7
7a
8
9
9a
1'
2'
3'4'
5'
Abb. 47: Die Struktur des Naturstoffs 13.
3.4.3.2. Naturstoff 14
Der Naturstoff 14 wird als brauner Feststoff isoliert. Er besitzt einen Schmelzpunkt von
231 °C. Die Substanz, die in Lösungsmitteln mittlerer Polarität gut löslich ist, zeigt einen
Rf-Wert von 0.91 (CH2Cl2/MeOH 4 %). Im IR-Spektrum werden bei 1711, 1645 und
1631 cm−1 intensive Absorptionsbanden beobachtet, die für Carbonylgruppen charakteristisch
sind. Die breite Bande bei 3407 cm−1 spricht wiederum für eine OH-Valenzschwingung.
Die chemischen Verschiebungen des Protonenspektrums entsprechen weitgehend denen der
Verbindung 13 (Tab. 18). Im 1H-NMR-Spektrum des Sekundärmetaboliten 14 ist im Gegen-
satz zum Naturstoff 13 ein weiteres Drei-Protonen-Singulett bei 2.22 ppm und ein Duplett bei
3.33 ppm detektierbar. Auffällig ist aber auch das Auftreten von Doppelpeaks (Tab. 18).
Insbesondere im 13C-NMR-Spektrum der Verbindung weisen einige der insgesamt 33 Signale
fast gleiche chemische Verschiebungen auf.
Haupteil 81
Naturstoff 13 Naturstoff 14
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
1165.73 (s) −197.57/199.78 (s) −
2
2a
2b
2c
−
−
−
−
−
−
−
−
77.67 (s)
51.96/52.29 (t)
206.45/206.76 (s)
31.13/31.27 (q)
−
3.31/3.36 (s)
−
2.22 (s)
3164.59 (s) −199.78 (s) −
3a
93.75 (s) −103.08 (s) −
3b
135.61 (s) −137.85 (s) −
4164.59 (s) −165.77/165.82 (s) −
5119.50 (s) −
118.75/118.88 (s)
−
6166.57(s) −
166.53/166.57 (s)
−
6a 108.84 (s) −110.08 (s) −
7150.28 (s) −
149.48/149.54 (s)
−
7a
824.14(q)
117.60(d) 2.83 (s)
6.82 (s) 24.63 (q)
118.25 (d) 2.75 (s)
6.76 (s)
9166.25 (s) −166.53 (s) −
9a
97.51 (s) −105.98 (s) −
1‘ 14.93 (q) 1.53 (d) 14.86 (q) 1.49/1.50 (s)
2‘ 92.48 (d) 4.75 (q) 91.97 (d) 4.66 (q)
3‘ 43.83 (s) −43.67/43.70 (s) −
4‘
5‘ 21.10 (q)
25.83(q) 1.34 (s)
1.59 (s) 21.00 (q)
25.88/26.11 (q) 1.30/1.33 (s)
1.54/1.55 (s)
Tabelle. 18: Vergleich der 1H- und 13C-NMR-Daten der Naturstoffe 13 und 14.
Dem Massenspektrum ist zu entnehmen, daß die Verbindung 14 eine Molmasse von 398
besitzt. Mit der HREIMS wird die Molmasse zu 398.136 ± 3 ppm bestimmt, woraus sich
unter Berücksichtigung der NMR-Daten eine Summenformel von C
22H22O7 ergibt.
Bemerkenswert ist ferner, daß das Massenspektrum der Verbindung 14 ein fast identisches
Fragmentierungsmuster wie Naturstoff 13 zeigt.
Die genaue Auswertung der ein- und zweidimensionalen NMR-Spektren belegt ebenso die
strukturelle Ähnlichkeit der Naturstoffe 13 und 14. So ist anhand der fast identischen
chemischen Verschiebung sowie der analogen 2J-und 3J-Kopplungen im HMBC-Spektrum
das gleiche Naphthalingrundgerüst konstruierbar (Teilstruktur I).
82 Hauptteil
1 3
4
3a
3b
5
6
6a
7
7a
8
9
9a
1'
2'
3'4'
5'
O
OHHO
O
O
RR
Teilstruktur I
Die beiden Carbonylbanden C-1 und C-3 zeigen im HMBC-Spektrum desweiteren eine
Kreuzkopplung zu den Protonensignalen bei 3.31 bzw. 3.36 ppm, welche laut HMQC-
Spektrum mit den 13C-NMR-Signalen der Methylengruppe bei 52.29 bzw. 51.96 ppm
korrelieren. Die Methylengruppen koppeln ihrerseits mit dem für aliphatische Ketogruppen
typischen 13C-NMR-Signal bei 206.45 bzw. 206.76 ppm, einem quartären, vermutlich
monooxygenierten Kohlenstoffatom bei 77.67 ppm und mit der Methylgruppe bei 2.22 ppm,
so daß unter Berücksichtigung der ermittelten Summenformel die in Abb. 48 dargestellte
Struktur formuliert werden kann.
2c
2b
2a
O
OHHO
O
O
O
HO
5'
4'
3'
2'
1'
9a
9
8
7a
76a6
5
3b 3a
4
3
2
1
Abb. 48: Die Struktur des Naturstoffs 14.
Eine Literaturrecherche ergibt, daß der Naturstoff 14 erstmals von Ayer et al.[91] aus dem
Ascomyceten Gremmeniella abietina isoliert wurde. Ayer stellte dabei fest, daß das Aceton-
Addukt 14 durch eine Aldolreaktion des entsprechenden Triketons mit Aceton in Gegenwart
von katalytischen Mengen an Essigsäure gebildet wird. Das so entstandene Diastereomeren-
gemisch erklärt auch das Auftreten der vielen fast identischen chemischen Verschiebungen im
1H- und 13C-NMR-Spektrum.
Haupteil 83
3.4.3.3. Naturstoff 15
Naturstoff 15 wird in Form eines grünen Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 217 °C
isoliert. Der Naturstoff 15 löst sich gut in Lösungsmitteln mittlerer Polarität und besitzt einen
Rf-Wert von 0.79 (CH2Cl2/MeOH 4 %).
Das IR-Spektrum zeigt wiederum eine typische Carbonylabsorptionsbande bei 1641 cm−1 und
eine breite Bande bei 3421 cm−1. Die massenspektroskopischen Untersuchungen ergeben, daß
die Verbindung eine Molmasse von 340 besitzt. Das Protonenspektrum des Naturstoffs 15
weist ebenfalls sehr große Ähnlichkeit mit dem des Naturstoffs 13 auf und zeigt zudem wie
Naturstoff 14 Signale mit fast identischer chemischer Verschiebung. Im 13C-NMR-Spektrum
sind analog dem 13C-NMR-Spektrum des Naturstoffs 14 34 Signale detektierbar, von denen
einige ebenfalls diese „Doppelpeak-Charakteristik“ aufweisen.
Naturstoff 13 Naturstoff 15
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
1165.73 (s) −196.00 (s) −
2− − 86.95/177.02 (s) −
3164.59 (s) −193.76 (s) −
3a 93.75 (s) −105.05 (s) −
3b
135.61 (s) −
138.34/138.68 (s)
−
4164.59 (s) −166.76 (s) −
5119.50 (s) −119.12/119.50 (s) −
6166.57(s) −168.27 (s) −
6a
108.84 (s) −
110.34/110.96 (s)
−
7150.28 (s) −150.40/152.40 (s) −
7a
824.14(q)
117.60(d) 2.83 (s)
6.82 (s) 24.69/24.97 (q)
118.47/119.01 (d) 2.74/2.77 (s)
6.64/6.71 (s)
9166.25 (s) −167.29 (s) −
9a
97.51 (s) −
108.21/109.84 (s)
−
1‘ 14.93 (q) 1.53 (d) 14.90 (q) 1.48/1.50 (s)
2‘ 92.48 (d) 4.75 (q) 92.25/92.91 (d) 4.68/4.77 (q)
3‘ 43.83 (s) −43.60/43.66 (s) −
4‘
5‘ 21.10 (q)
25.83(q) 1.34 (s)
1.59 (s) 20.98 (q)
25.67/25.91 (q) 1.31/1.32 (s)
1.55 (s)
Tabelle 19: Vergleich der 1H- und 13C-NMR-Daten der Naturstoffe 13 und 15.
84 Hauptteil
Die Auswertung der ein- und zweidimensionalen NMR-Spektren führt zur Konstruktion des
bereits bei Naturstoff 13 und 14 beschriebenen Naphthalingrundgerüsts (Seite 82/ Teilstruk-
tur I). Aufgrund der Masse von 312 der Teilstruktur I und den 13C-NMR-Signalen bei 193.16
und 196.00 ppm handelt es sich bei den Carbonylgruppen wohl um Ketogruppen, so daß zur
im Massenspektrum registrierten Molmasse von 340 nur eine Massendifferenz von 28
beobachtbar ist, die einer weiteren Carbonylgruppe entsprechen würde. Man gelangt so fast
erwartungsgemäß, bedingt durch das bereits angesprochene abgewandelte Extraktions-
verfahren, zu dem als Atrovenetinon bezeichneten Triketon 15 (Abb. 49).
O
OHHO
O
O
O
123
4
3a
3b
5
6
6a
7
7a
8
9
9a
1'
2'
3'4'
5'5'
4'
3'
2'
1'
9a
9
8
7a
76a6
5
3b 3a
4
3
2
1
O
OHHO
O
O
OHHO
Abb. 49: Die Struktur des Naturstoffs 15 und dessen Hydrats.
Die Verbindung wurde 1986 erstmals von Ayer[91] aus Gremmeniella abietina isoliert und
charakterisiert. Die große Vielzahl der 13C-NMR-Signale wird von Ayer et al. durch die
Bildung eines Hydrats erklärt (Abb. 49). Er stellte fest, daß bei einem Wechsel des
Lösungsmittels von DMSO-d6 zu CD2Cl2 das Signal bei 88 ppm verschwindet und ein
weiteres Carbonylsignal bei ca. 176 ppm detektierbar ist. In unseren Spektren ist also davon
auszugehen, daß beide Verbindungen vorliegen werden. Die Darstellung des Naturstoffs 15
gelang L.C.Vining[94] bereits 1963 durch Oxidation des Atrovenetins (29) (Abb. 50) mit
Benzochinon.
5'
4'
3'
2'
1'
9a
9
8
7a
76a6
5
3b 3a
4
3
2
1
O
OHHO
O
OH
HO
Abb. 50: Die Struktur des Atrovenetins (29).
Haupteil 85
3.4.3.4. Naturstoff 16
Der Naturstoff 16 wird als brauner Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 202 °C isoliert. Die
Substanz besitzt einen R
f-Wert von 0.87 (CH2Cl2/MeOH 4 %) und ist gut löslich in
Lösungsmitteln mittlerer Polarität wie Dichlormethan oder Chloroform. Der spezifische
Drehwert beträgt [α]D
20 = − 101.1 (c = 0.11 in CHCl3). Im Massenspektrum der Verbindung 16
ist ein Molpeak bei 312 beobachtbar. Ein Vergleich der 1H- und 13C-NMR-Spektren der
Naturstoffe 13 und 16 zeigt, daß diese wiederum strukturell sehr große Ähnlichkeit aufweisen
(Tab. 20).
Naturstoff 13 Naturstoff 16
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
1165.73 (s) −196.00 (s) −
2− − 86.95/177.02 (s) −
3164.59 (s) −193.76 (s) −
3a 93.75 (s) −105.05 (s) −
3b 135.61 (s) −138.34/138.68 (s) −
4164.59 (s) −166.76 (s) −
5119.50 (s) −119.12/119.50 (s) −
6166.57(s) −168.27 (s) −
6a
108.84 (s) −
110.34/110.96 (s)
−
7150.28 (s) −150.40/152.40 (s) −
7a
824.14(q)
117.60(d) 2.83 (s)
6.82 (s) 24.69/24.97 (q)
118.47/119.01 (d)
2.74/2.77 (s)
6.64/6.71 (s)
9166.25 (s) −167.29 (s) −
9a
97.51 (s) −
108.21/109.84 (s)
−
1‘ 14.93 (q) 1.53 (d) 14.90 (q) 1.48/1.50 (s)
2‘ 92.48 (d) 4.75 (q) 92.25/92.91 (d) 4.68/4.77 (q)
3‘ 43.83 (s) −43.60/43.66 (s) −
4‘
5‘ 21.10 (q)
25.83(q) 1.34 (s)
1.59 (s) 20.98 (q)
25.67/25.91 (q) 1.31/1.32 (s)
1.55 (s)
Tabelle 20: Vergleich der 1H- und 13C-NMR-Daten der Naturstoffe 13 und 16.
Auffällig ist im 1H-NMR-Spektrum des Sekundärmetaboliten 16, daß die OH-Protonen
aufgrund der fehlenden Chelatisierung als typisch breite Signale bei 7.63 bzw. 7.89 ppm
registriert werden. Unter Berücksichtigung der Molmasse der Verbindung, der bereits
bekannten NMR-Signale für das Naphthalingrundgerüst und der Carbonylsignale bei 186.53
und 190.06 ppm kann die in Abb. 51 dargestellte Struktur formuliert werden.
86 Hauptteil
O
OHHO
O
O
5'
4'
3'
2'
1'
9a
9
8
7a
76a6
5
3b 3a
4
31
Abb. 51: Die Struktur des Naturstoffs 16.
Eine Literaturrecherche ergibt, daß das Enantiomer der Verbindung 1986 ebenfalls von
Ayer[91] aus dem Ascomyceten Gremmeniella abietina isoliert und charakterisiert werden
konnte. Abschließend sei noch angemerkt, daß die als Sclerodinon bezeichnete Ver-
bindung 16 das einzig bekannte Beispiel für einen Naturstoff ist, der eine Acenaphthalin-
Chinon-Struktur besitzt.
3.4.4. Biosynthese der Naturstoffe 13, 15 und 16
Biosynthetische Studien[98] mit [1-13C]-markiertem Natriumacetat haben gezeigt, daß der
Phenalenon-Kern aus einem Heptaketid (30) aufgebaut wird (Abb. 52). Der Dihydrofuranring
hingegen wird durch ein Mevalonat gebildet. Das Ergebnis dieses Biosyntheseweges ist das
Atrovenetin (29) bzw. der Naturstoff 15 (Atrovenetinon), der durch Oxidation des Atro-
venetins (29) entsteht.
O- Na
O
13
HO
O
O
O
O
OO
O
13 13
13
13 13
13
13
15a
O
OHHO
O
OH
HO
123
4
3a
3b
5
6
6a
7
7a
8
9
9a
1'
2'
3'4'
5'5'
4'
3'
2'
1'
9a
9
8
7a
76a6
5
3b 3a
4
3
2
1
O
OHHO
O
O
O
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
15
Abb. 52: Die Biosynthese des Atrovenetinons (15).
Haupteil 87
Durch weitere separat ausgeführte Experimente[99] mit [1-13C]- und [2-13C]-markiertem
Natriumacetat konnte ferner bewiesen werden, daß Atrovenetinon (15) eine Vorstufe des
Naturstoffs 16 ist, der durch Verlust des C-2-Kohlenstoffatoms entsteht. Ein möglicher Bio-
syntheseweg ist in Abb. 53 dargestellt. Durch die nachfolgende Oxidation des Naturstoffs 16
gelangt man schließlich zum Naturstoff 13, der im Experiment erwartungsgemäß das gleiche
Anreicherungsmuster wie Naturstoff 16 zeigte.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13 13
13 5'
4'
3'
2'
1'
9a
9
8
7a
76a6
5
3b 3a
4
31
13
13
13
13
13
13
O
OHHO
O
O
O
16
_CO2
[O]
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13 13
13 5'
4'
3'
2'
1'
9a
9
8
7a
76a6
5
3b 3a
4
3
1
13
13
13
13
13
O
OHHO
O
O
O-
OHHO
O
O
OH+
HO
13
13
13
13
13
1
2
3
4
3a
3b
5
6
6a
7
7a
8
9
9a
1'
2'
3'4'
5'
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13 13
13
13
13
13
13
13
O
OHHO
O
O
HO OH
123
4
3a
3b
5
6
6a
7
7a
8
9
9a
1'
2'
3'4'
5'
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13 13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13 13
13
O- Na
O
O- Na
O
13
13 5'
4'
3'
2'
1'
9a
9
8
7a
76a6
5
3b 3a
4
3
2
1
O
OHHO
O
O
O
13
13
13
13
13
15
Abb. 53: Die Biosynthese der Naturstoffe 13 und 16.
88 Hauptteil
Ob die Naturstoffe 13, 15 und 16 originärer Herkunft sind oder durch in vitro Luftoxidation
des Atrovenetins (29) gebildet werden, wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Ayer[99] ist
der Ansicht, daß aufgrund der relativ langsamen Luftoxidation des Sclerodions (16) oder des
Atrovenetins (29) dies nicht die einzige Quelle dieser Naturstoffe sein kann. Er hält es für
wahrscheinlich, daß Gremmeniella abietina die Oxidation des Atrovenetins (29) katalysiert.
3.4.5. Biologische Aktivität der Naturstoffe des Pilzstammes 3004
3.4.5.1. Pflanzenschutz-Screening der Mikrobiologie in Braunschweig
Der Agardiffusions-, Kresse- und Lemnatest wurde nur von den herkömmlich aufgearbeiteten
Rohextrakten angefertigt. Die in Diagramm 7 und den Tabellen 21 und 22 dargestellten
Testergebnisse belegen, daß die Rohextrakte nur eine sehr geringe oder gar keine herbi-,
fungi- oder bakteriozide Wirkung besitzen.
0
5
10
15
20
25
30
35
Hemmhof-
radius [mm]
Chl. E.C. B.M. Ust. Eur. M.m. Fus.
Agardiffusionstest
Ethylacetatphase
Petroletherphase
Diagramm 7: Die Ergebnisse der Agardiffusionstests der Rohextrakte.
Keimlingstest
Versuchsdauer 1. Tag 7. Tag
Biomalz-Extrakt* 4 von 15 Samen zeigen Wachstum 4 von 15 Samen sind gekeimt
Malz-Soja-Extrakt* 10 von 15 Samen zeigen Wachstum 10 von 15 Samen sind gekeimt
Referenz 1** 14 von 15 Samen zeigen Wachstum 15 von 15 Samen sind gekeimt
Referenz 2*** 14 von 15 Samen zeigen Wachstum 15 von 15 Samen sind gekeimt
Tabelle 21: Wirkung der Biomalz- und Malz-Soja-Rohextrakte im Keimlingstest (* 0.25 ml einer Lösung des
Rohextraktes in 5 ml Aceton/Methanol (1:1) und 2.25 ml steriles Wasser; **, *** Referenzen und Test-
organismus siehe Seite 52, Tabelle 9).
Haupteil 89
Lemnatest
Versuchsdauer 1. Tag 4. Tag 5. Tag
Biomalz-Extrakt* 8 Blätter grün 8 Blätter grün 13 Blätter weiß
Malz-Soja-Extrakt*
7 Blätter grün 7 Blätter weiß 7 Blätter weiß
Referenz 1** 11 Blätter grün 11 Blätter grün 16 Blätter grün
Referenz 2*** 12 Blätter grün 12 Blätter grün 14 Blätter grün
Tabelle 22: Lemnatest der Biomalz- und Malz-Soja-Rohextrakte (*, **, *** Referenzen und Testorganismus
siehe Seite 52, Tabelle 9).
Die aus den herkömmlich aufgearbeiteten Rohextraktchargen stammenden Reinsubstanzen 13
und 14 zeigen erwartungsgemäß im Agardiffusionstest fast keine Wirkung. Im Gegensatz
dazu besitzen das Sclerodion (16) und insbesondere das Atrovenetinon (15) eine als gut
einzustufende Aktivität gegen Ustilago violacea. Beide Naturstoffe wurden bekanntlich aus
dem mit Dichlormethan extrahierten Rohextrakten isoliert.
0
5
10
15
20
25
30
35
Hemmhof-
radius
[mm]
Chl. E.C. B.M. Ust. Eur. M.m. Fus.
Agardiffusionstest
Naturstoff 13
Naturstoff 14
Naturstoff 15
Naturstoff 16
Diagramm 8: Die Ergebnisse der Agardiffusionstests der Naturstoffe 13, 14, 15 und 16.
90 Hauptteil
3.5. Stamm 3304
3.5.1. Pilzbeschreibung
Der Pilzstamm 3304 stammt aus einer Bodenprobe von der Richards Bay in Südafrika.
Taxonomisch konnte auch dieser noch nicht bestimmt werden.
3.5.2. Isolierung der Naturstoffe 17, 18 und 19
Der Pilzstamm 3304 wurde in 24 Fernbachkolben 91 Tage bei Raumtemperatur auf den
Nährmedien Biomalz- und Malz-Soja-Weichagar kultiviert. Anschließend wurden die Pilz-
kulturen, wie bereits beschrieben, homogenisiert und einmal mit Petrolether und zweimal mit
Ethylacetat extrahiert. Die organischen Lösemittel wurden abgedampft und der Rückstand für
die Bioaktivitätsmessung in 5 ml einer Aceton-Methanol-Lösung (1:1) aufgenommen. Die
Isolierung der Reinsubstanzen erfolgte mittels Säulen- und präparativer Schichtchromato-
graphie.
Die erste säulenchromatographische Vorfraktionierung des Rohextraktes lieferte den
Naturstoff 17 (37 mg) mit einem Rf-Wert von 0.82 (CH2Cl2/MeOH 1 %) in reiner Form.
Durch Erhöhung des Methanolgehalts von 2 auf 6 % wurde der Rohextrakt in insgesamt
zwölf Fraktionen eingeteilt. Aus der zweiten Fraktion konnte mit einem Rf-Wert von 0.62
(CH2Cl2/MeOH 2 %) durch präparative Schichtchromatographie der Naturstoff 18 (24 mg)
isoliert werden. Der Naturstoff 19 wurde in der neunten Fraktion detektiert. Die Verbindung
zeigte auf dem Dünnschichtchromatogramm einen langgezogenen Substanzfleck, der von einer
großen Linolsäurematrix überlagert wurde. Die Isolierung des Naturstoffs 19 (7 mg) gelang
durch präparative reversed-phase Schichtchromatographie (Rf-Wert: 0.72 MeOH/H2O 10 %).
3.5.3. Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe 17, 18 und 19
3.5.3.1. Naturstoff 17
Der unpolare, optisch inaktive Naturstoff 17 wird als gelbes Öl isoliert. Er ist mit einem
Rf-Wert von 0.82 (CH2Cl2/MeOH 1 %) gut mit UV-Licht der Wellenlänge 254 nm detek-
tierbar. Das IR-Spektrum weist eine für Carbonylgruppen typische Bande bei 1705 cm−1 auf.
Im Protonenspektrum werden vier Drei-Protonen-Singuletts bei 2.01, 3.76, 3.87 und 3.92 ppm
Haupteil 91
registriert, wobei die Signale von 3.76−3.92 ppm aufgrund ihrer chemischen Verschiebung
Methoxygruppen zuzuordnen sind. Zwischen 6.27 und 7.47 ppm werden weitere Signale
beobachtet, die anhand ihrer chemischen Verschiebungen, Kopplungskonstanten und
Integralgrößen als sieben olefinische und aromatische Protonen identifiziert werden.
Die Auswertung der 13C-NMR-, DEPT- und HMQC-Spektren ergibt, daß die Verbindung
eine Methylgruppe, drei Methoxy-, sieben olefinische bzw. aromatische Methingruppen und
sechs quartäre Kohlenstoffatome besitzt, von denen das Signal bei 168.14 ppm unter
Berücksichtigung der IR-Bande bei 1705 cm−1 einem α,β-ungesättigten Ester zugeschrieben
werden muß (Tab. 23).
Naturstoff 17
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
1110.46 (d) 6.87 (d)
2155.34 (s) −
3121.48 (s) −
4130.49 (d) 7.27 (d)
5119.49 (d) 6.92 (dd)
6138.30 (s) −
7130.68 (d) 6.44 (d)
8127.66(d) 6.61 (dd)
9129.93 (d) 6.27 (dd)
10
132.61 (s) −
11
12
111.06 (s)
159.36 (d) −
7.46 (s)
13 168.14 (s) −
14
24.17 (q) 2.01 (s)
15
62.38 (q) 3.87 (s)
16 52.03 (q) 3.76 (s)
17
56.49 (q) 3.92 (s)
Tabelle 23: 1H- und 13C-NMR-Daten des Naturstoffs 17.
Die vorläufige Summenformel der Verbindung lautet demnach C17H19O4 bzw. C17H19O5.
Das Massenspektrum zeigt einige „Doppelpeaks“, die sich um zwei Einheiten unterscheiden
und die aufgrund ihrer Signalgrößen dem Isotopenverhältnis (3:1) der Chlorisotope 35Cl und
37Cl entsprechen. Der Molpeak der Verbindung bei 322 bzw. 324 entspricht demzufolge der
Summenformel C17H19ClO4. Die konstitutionelle Strukturaufklärung erfolgt mittels ein- und
zweidimensionaler NMR-Spektroskopie. Das Proton mit der chemischen Verschiebung von
92 Hauptteil
6.61 ppm koppelt laut H,H-COSY-Spektrum mit den Protonen bei 6.44 und 6.27 ppm. Das
Proton mit der chemischen Verschiebung von 6.27 koppelt seinerseits sowohl im H,H-COSY-
als auch im HMBC-Spektrum mit dem Drei-Protonen-Singulett der Methylgruppe bei
2.01 ppm (14-H) (Teilstruktur I).
R
R
7
8
9
10
14
Teilstruktur I
Ausgehend von der Methoxygruppe mit der chemischen Verschiebung von 3.76 ppm (16-H)
im Protonenspektrum, ist im HMBC-Spektrum eine 3J-Konnektivität zur Estercarbonylgruppe
bei 168.14 ppm zu beobachten. Diese zeigt weiter eine vicinale Kopplung zum Singulett-
Signal bei 7.46 ppm (12-H), das wiederum mit der Methoxygruppe mit den chemischen
Verschiebungen von 3.87 ppm bzw. 62.38 ppm (C-15) und den quartären Kohlenstoffatomen
bei 111.06 (C-11) und 132.61 ppm (C-10) koppelt. Unter Berücksichtigung der im HMBC-
Spektrum ersichtlichen Kreuzkopplungen dieser quartären Kohlenstoffatome zur Methyl-
gruppe mit der chemischen Verschiebung von 2.01 ppm und der markanten Hochfeld-
verschiebung des Kohlenstoffatoms bei 111.06 ppm läßt sich Teilstruktur II konstruieren.
R
O
O O
7
8
9
10
14
11 12
13
15
16
Teilstruktur II
Die Protonensignale bei 6.61 (8-H) und 6.44 ppm (7-H) weisen im HMBC-Spektrum vicinale
bzw. geminale Kopplungen zu einem quartären Kohlenstoffatom bei 138.30 ppm auf. Weitere
3J-Kopplungen sind, ausgehend vom Proton mit der chemischen Verschiebung von 6.44 ppm,
zu den Methingruppen bei 110.44 (C-1) und 119.49 ppm (C-5) zu registrieren. Die
entsprechenden Protonensignale bei 6.87 (1-H) und 6.92 ppm (5-H) bilden zusammen mit der
Protonenresonanz bei 7.27 ppm (4-H) ein ABC-Spinsystem. Das Doppelduplett bei 6.92 ppm
zeigt mit 1.7 Hz erwartungsgemäß eine meta-Kopplung zum Proton 1-H und desweiteren eine
ortho-Kopplung zum Proton bei 7.27 ppm. Die Protonenresonanzen bei 6.87 (1-H) bzw. 7.27
ppm (4-H) zeigen im HMBC-Spektrum Kopplungen zu den quartären Kohlenstoffatomen mit
Haupteil 93
den chemischen Verschiebungen von 121.48 (C-3) und 155.34 ppm (C-2), wobei für letzteres
Signal eine weitere 3J-Kopplung zur Methoxygruppe bei 3.92 ppm (17-H) registrierbar ist.
Aufgrund der relativ starken Hochfeldverschiebung des Protons bei 6.87 ppm ist davon aus-
zugehen, daß sich dieses in ortho-Position zur Methoxygruppe befindet, so daß die in Abb. 54
dargestellte Struktur formuliert werden kann.
16
15
13
12
11
14
10
9
8
7
O
O O
O
Cl
1
2
3
4
5
6
17
Abb. 54: Die Struktur des Natustoffs 17.
Während die trans-Anordnung der Protonen 7-H und 8-H durch die Größe der Kopplungs-
konstanten von 15.5 Hz eindeutig bestimmbar ist, kann anhand der Kopplungskonstanten von
10.3 Hz der Protonen 8-H und 9-H keine gesicherte Aussage über die Stereochemie der
Doppelbindung gemacht werden.
Eine Literaturrecherche ergibt, daß der als Strobilurin B bezeichnete Naturstoff 17 erstmals
1977 von Anke et al. aus dem Basidomyceten Strobilurus tenacellus isoliert[100] und
charakterisiert[101] wurde. Später wurde diese Verbindung in Mycelkulturen von Pilzen der
Gattungen Mycene zephira, Oudemasiella mucida, Hydropus, Cyphellopsis und Xerula aufge-
funden.[101,102] Untersuchungen zur Stereochemie der Protonen 7-H, 8-H und 9-H belegten,
daß die Protonen trans zueinander angeordnet sind. Kontrovers wurde die Konfiguration der
Doppelbindung in 9-Stellung diskutiert. Schramm und Steglich[101] postulierten ebenso wie
Sedmera und Vondracek[103,104] eine (9E)-Konfiguration. Steglich[105] korrigierte sechs
Jahre später die früher vorgeschlagene (9E)-Konfiguration. Aufgrund dieser widersprüch-
lichen Ergebnisse wurden eigene NOE-Messungen durchgeführt, die zeigten, daß durch die
Sättigung der Protonenresonanz der Methylgruppe C-14 die Intensität des 9-H-Signals um 18 %
erhöht wird, d. h. die Methylgruppe C-14 und das Proton 9-H also cis-angeordnet sind und die
Doppelbindung somit Z-konfiguriert ist.
Strobilurin B besitzt von den bekannten Strobilurinabkömmlingen die stärkste fungizide Wir-
kung. Verantwortlich für die überaus starke Wirkung gegen saprophytische und phytopatho-
gene Pilze ist die (E)-β-Methoxyacrylat-Einheit.[106] Die Synthese des Strobilurin B (17)
wurden von Schramm[105] sowie der Arbeitsgruppe von Vondracek[107] durchgeführt.
94 Hauptteil
3.5.3.2. Naturstoff 18
Der Naturstoff 18 wird in Form eines gelben Öls mit einem R
f-Wert von 0.62
(CH2Cl2/MeOH 2 %) isoliert. Er löst sich gut in Lösungsmitteln mittlerer Polarität und besitzt
einen spezifischen Drehwert von [α]D
20 = + 21.0 ° (c = 0.64, EtOH). Die scharfe Absorptions-
bande bei 1708 cm−1 ist ein Indiz für eine Carbonylgruppe.
Naturstoff 17 Naturstoff 18
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
1110.46 (d) 6.87 (d) 122.79 (d) 6.94 (d)
2155.34 (s) −
147.24 (s)
−
3121.48 (s) −151.18 (s) −
4130.49 (d) 7.27 (d)
121.02 (d)
6.87 (d)
5119.49 (d) 6.92 (dd)
121.96 (d)
6.97 (d)
6138.30 (s) −134.12 (s) −
7130.68 (d) 6.44 (d)
130.75 (d)
6.38 (d)
8127.66(d) 6.61 (dd)
126.07 (d)
6.52 (d)
9129.93 (d) 6.27 (dd) 130.20 (d) 6.24 (d)
10
132.61 (s) −
131.19 (s)
−
11
12 111.06 (s)
159.36 (d) −
7.46 (s)
111.23 (s)
159.24 (s) −
7.45 (s)
13
168.14 (s) −
168.23 (s)
−
14 24.17 (q) 2.01 (s) 24.09 (q) 1.99 (s)
15
62.38 (q) 3.87 (s) 62.35 (q) 3.87 (s)
16
52.03 (q) 3.76 (s) 52.04 (q) 3.77 (s)
17 56.49 8q) 3.92 (s) 69.13 (t) 3.98 u. 4.26 (m)
18
− − 82.37 (t) 3.53 (d)
19
− − 81.01 (s) −
20 − − 21.21 (q) 1.25 (s)
21
− − 28.13 (q) 1.50 (s)
22
− − 67.77 (t) 4.10 u. 4.15 (m)
23 − − 121.31 (d) 5.36 (m)
24
− −
137.82 (s)
−
25
− − 26.24 (s) 1.79 (s)
26 − − 18.51 (s) 1.72 (s)
Tabelle 24: Vergleich der 1H- und 13C-NMR-Daten der Naturstoffe 17 und 18.
Haupteil 95
Dem 1H-, 13C-Spektren und dem DEPT-Experiment ist zu entnehmen, daß die Substanz fünf
Methyl-, zwei vermutlich monooxygenierte Methylen-, zwei Methoxy-, neun Methingruppen
und acht quartäre Kohlenstoffatome besitzt (Tab. 24).
Die Molmasse der Substanz beträgt laut Massenspektrum 442, woraus sich aufgrund der
Informationen aus den 1H- und 13C-NMR-Spektren die Summenformel C26H34O6 ergibt. Ein
Vergleich der Protonen vom 13C-NMR-Spektrum der Naturstoffe 17 und 18 zeigt, daß beide
Verbindungen einige fast identische Signale aufweisen (Tab. 24). So ist der Hexatrien-Rest,
der eine endständige β-Methoxyacrylat-Gruppierung enthält, ebenso wie der trisubstituierte
Aromat ein Bestandteil des Naturstoffs 18. Unter Berücksichtigung der chemischen Verschie-
bung von 151.18 ppm des C-3-Kohlenstoffatoms und der Hochfeldverschiebung sämtlicher
aromatischer Protonensignale ist davon auszugehen, daß der aromatische Kern neben dem
Hexatrien-Rest von zwei Sauerstoffatomen substituiert ist (Teilstruktur I).
16
15
13
12
11
14
10
9
8
7
O
O O
O
O
R
R
1
2
3
4
5
6
Teilstruktur I
Dem HMBC-Spektrum ist zu entnehmen, daß die Methylgruppen mit den chemischen
Verschiebungen von 18.51 (C-26) und 26.24 ppm (C-25) jeweils mit der anderen Methyl-
gruppe koppeln, mit dem quartären Kohlenstoffatom bei 137.82 ppm (C-24) und der
Methingruppe bei 121.31 ppm (C-23). Letztere zeigt im H,H-COSY-Spektrum eine Kreuz-
kopplung zur Methylengruppe, die aufgrund ihrer chemischen Verschiebung von 4.15 und
67.77 ppm (C-22) wohl monooxygeniert ist. Im HMBC-Spektrum sind, wiederum ausgehend
von den Protonensignalen der CH2-Gruppe, 2J- und 3J-Konnektivitäten zu der Methingruppe
bei 121.31 ppm, dem quartären Kohlenstoffatom bei 137.82 und einer Methingruppe bei
82.37 ppm (C-18) detektierbar (Teilstruktur II).
O
R R
26
25
24 23
22
18
Teilstruktur II
96 Hauptteil
Im H,H-COSY-Spektrum zeigen das Protonensignal der Methingruppe C-18 Kopplungen zu
den beiden Protonen der Methylengruppe bei 69.13 ppm. Die Methylengruppe ihrerseits
koppelt im HMBC-Spektrum mit dem quartären Kohlenstoffatom bei 81.01 ppm (C-19).
Dieser koppelt desweiteren geminal mit den beiden Methylgruppen bei 21.21 und 28.13 ppm.
Fast erwartungsgemäß sind, ausgehend von den beiden Methylgruppen, vicinale Kopplungen
zu der Methingruppe C-18 registrierbar, so daß Teilstruktur III formuliert werden kann.
2625 24
23
22
18
O
R
R
19
17
20 21
Teilstruktur III
Unter Berücksichtigung der 3J-Kopplung der Methylengruppe (C-17) und dem quartären
aromatischen Kohlenstoffatom bei 151.18 ppm (C-3) kann Teilstruktur III mit Teilstruktur I
in der in Abb. 55 dargestellten Weise verknüpft werden.
16
15
13
12
11
14
10
9
8
71
2
3
4
5
6
26
25 24
23
22
18
O
O
O O
O
O
19
17
20
21
Abb. 54: Die Struktur des Naturstoffs 18.
Eine Literaturrecherche ergibt, daß der als Strobilurin G bezeichnete Naturstoff 18 1990 von
Fredenhagen[108,109] aus dem Ascomyceten Bolinea lutea Sacc. isoliert und charakterisiert
wurde. Die Stereochemie der optisch aktiven Verbindung am C-18-Kohlenstoffatom konnte
bis heute nicht bestimmt werden. Strobilurin G zeigt neben der fungiziden Wirkung auch in
vitro Antitumoraktivität gegen menschliche T-24 Harnblasenkrebszellinien.[110]
3.5.3.3 Naturstoff 19
Der Naturstoff 19 wird in Form eines gelben Öls isoliert, das nach ca. zwei Tagen talgartig
erstarrt. Der Schmelzpunkt des amorphen Feststoffs beträgt 47−49 °C. Im IR-Spektrum wird
eine scharfe Carbonylabsorptionsbande bei 1653 cm−1 detektiert. Unter Berücksichtigung der
Haupteil 97
relativ niedrigen Wellenzahl und der Absorptionsbanden bei 3458 und 3378 cm−1, die (N−H)-
Valenzschwingungen zuzuordnen sind, wird die Carbonylgruppe als ein Carbonsäureamid
identifiziert.
Dem 1H-, 13C-NMR-Spektren und dem DEPT-135-Experiment ist zu entnehmen, daß die
Substanz vier Methyl-, jeweils fünf Methylen- und Methingruppen sowie acht quartäre
Kohlenstoffatome und drei austauschbare Protonen bei 6.00 (2 Protonen) bzw. 6.12 ppm
(1 Proton) besitzt (Tab. 25).
Naturstoff 19
C13C-NMR
(δ/ppm)
1H-NMR
(δ/ppm)
1128.12 (d) 7.53 (d)
2
126.30 (s)
−
3126.81 (d) 7.74 (d)
4
120.53 (s)
−
5
153.01 (s)
−
6129.86 (s) −
7 29.41(t) 3.44 (d)
8121.00(d) 5.35 (t)
9138.55 (s) −
10
40.12 (t) 1.94-2.12 (m)
11
12 26.92 (t)
124.27 (d) 1.94-2.12 (m)
5.11 (m)
13
135.75 (s)
−
14 40.12 (t) 1.94-2.12 (m)
15 27.11 (t) 1.94-2.12 (m)
16
124.74 (d)
5.13 (m)
17 131.76 (s) −
18 16.71 (q) 1.77 (s)
19
16.47 (q) 1.62 (s)
20 18.13 (q) 1.62 (s)
21 26.14 (q) 1.70 (s)
22
168.57 (s)
−
Tabelle 25: 1H- und 13C-NMR-Daten des Naturstoffs 19.
Im Protonenspektrum werden bei 7.53 und 7.74 ppm zwei Protonenresonanzen registriert, die
ein AX-Spinsystem bilden. Aufgrund der Kopplungskonstanten von 1.8 Hz und der
chemischen Verschiebung ist davon auszugehen, daß es sich bei diesen um aromatische
ortho-koppelnde Protonen handelt.
98 Hauptteil
Dem HMBC-Spektrum ist zu entnehmen, daß die beiden Protonen mit einem quartären
Kohlenstoffatom bei 168.57 ppm koppeln, das aufgrund seiner chemischen Verschiebung
dem Carbonsäureamid zuzuordnen ist. Desweiteren ist für beide Protonen eine 3J-Kopplung
zu einem quartären 13C-NMR-Signal detektierbar, das mit 153.01 ppm eine charakteristische
Verschiebung für ein oxygeniertes aromatisches Kohlenstoffatom zeigt. Die Austauschbarkeit
des Protonensignals bei 6.12 ppm und das Fehlen weiterer typischer Signale für mono-
oxygenierte Kohlenstoffatome im Protonen- und 13C-NMR-Spektrum sprechen gleichfalls,
für eine phenolische OH-Gruppe (Teilstruktur I).
O
H2NR
OH
R
22
1
2
3
4
5
6
Teilstruktur I
Während für das Protonensignal bei 7.74 ppm (3-H) im HMBC-Spektrum nur eine weitere
Kopplung zu einem quartären 13C-NMR-Signal bei 120.53 ppm (C-4) registriert wird, zeigt
das Protonensignal bei 7.53 ppm (1-H) zwei weitere Kopplungen zu einem quartären
Kohlenstoffatom bei 129.86 ppm und einer aliphatischen Methylengruppe (C-7) mit den
Protonen- bzw. 13C-NMR-Resonanzen von 3.44 bzw. 29.41 ppm. Das Duplett bei 3.44 ppm
koppelt im H,H-COSY-Spektrum mit einem Triplett bei 5.35 ppm (8-H). Die Korrelation des
Tripletts zu einer 13C-NMR-Verschiebung von 121.00 ppm im HMQC-Spektrum belegt
eindeutig den olefinischen Charakter der Methingruppe. Im HMBC-Spektrum koppelt die
Methingruppe (C-8) mit einem quartären Kohlenstoffatom bei 138.55 ppm (C-9), der
Methylgruppe C-18 und einer Methylengruppe (C-10) mit den chemischen Verschiebungen
von 1.94−2.12 bzw. 40.12 ppm. Die Methylgruppe C-18 zeigt 2J- und 3J-Konnektivitäten
zum quartären Kohlenstoffatom bei 138.55 ppm und zur CH2-Gruppe bei 40.12 ppm. Die
Protonenresonanzen der Methylengruppe korrelieren im H,H-COSY- bzw. HMBC-Spektrum
mit einer Methylengruppe mit den chemischen Verschiebungen von 1.94−2.12 ppm und 26.92
bzw. 27.11 ppm (Teilstruktur II).
Haupteil 99
11
10
9
8
7
6
5
4
3
21
22
O
H2N
OH
R
R
18
Teilstruktur II
Im H,H-COSY- bzw. HMBC-Spektrum sind, ausgehend von den Methylengruppen C-10 und
C-11, Kopplungen zur Methingruppe bei 5.11 bzw. 5.13 ppm zu beobachten. Die
entsprechenden 13C-NMR-Signale werden bei 124.27 bzw. 124.74 ppm detektiert. Die
Kohlenstoffatome der Methingruppen zeigen wiederum ein Kreuzsignal zu einem Drei-
Protonen-Singulett bei 1.62 ppm, das wiederum mit dem quartären Kohlenstoffatom C-13 und
einer CH2-Gruppe mit einer chemischen Verschiebung von 40.12 ppm koppelt. Die
Protonensignale der Methylengruppe zeigen im H,H-COSY-Spektrum gleichfalls Kopplungen
zu einer Methylengruppe bei 26.92 bzw. 27.91 ppm, die ihrerseits im H,H-COSY-Spektrum
mit einer Methingruppe bei 5.11 bzw. 5.13 ppm koppelt. Im HMBC-Spektrum zeigt die
Methingruppe 3J-Kopplungen zu zwei Methylgruppen (C-20 und C-21) mit einer chemischen
Verschiebung von 1.70 bzw. 1.62 ppm, die desweiteren im HMBC-Spektrum miteinander und
mit dem quartären Kohlenstoffatom C-17 koppeln, so daß folgende Teilstruktur konstruiert
werden kann:
O
H2N
OH
R
22
1
2
3
4
5
67
8910
11
12 13 14
15
16 17
18 19 20
21
Teilstruktur III
Der Vergleich der Literaturdaten[111−113] belegt, daß die Doppelbindungen der als Farnesyl-
rest bezeichneten Seitenkette sämtlich (E)-Konfiguration aufweisen. Die anhand der
Summenformel C22H30NO2R berechnete Molmasse der Verbindung beträgt 340 + mR. Die
massenspektroskopischen Untersuchungen ergeben, daß der Sekundärmetabolit 19 eine
Molmasse von 375 bzw. 377 besitzt. Die Massendifferenz von 35 bzw. 37 und das
Intensitätsverhältnis von 3:1 des Peaks bei 375 zum Peak bei 377 belegen eindeutig, daß der
100 Hauptteil
Benzolkern ein Chloratom als weiteren Substituenten trägt (Abb. 55). Durch die Bestimmung
der Präzisionsmasse zu 375.19740 ± 5 ppm wurde dies abschließend verifiziert.
O
H2N
OH
Cl
22
1
2
3
4
5
67
8910
11
12 13 14
15
16 17
18 19 20
21
Abb. 55: Die Struktur des Naturstoff 19.
Die Literaturrecherche ergibt, daß der vorliegende Naturstoff 19 noch unbekannt ist.
Strukturelle Ähnlichkeit besitzt der Sekundärmetabolit 19 einerseits zu dem bereits in diesem
Pilzextrakt gefundenen Strobilurin B (17) und andererseits zu einer Verbindung namens
Coniothyriomycins (31) (Abb. 56), die aus Coniothyrium[114] isoliert wurde, wobei jedoch
anzumerken ist, daß die für die Wirksamkeit der Verbindungen verantwortliche (E)-β-Me-
thoxyacrylat- bzw. Fumaramidsäuremethylester-Einheit in diesem Molekül nicht vorhanden
ist.
OH
Cl
N
O O
O
OH
31
Abb. 56: Coniothyriomycin.
Haupteil 101
3.5.4. Biologische Aktivität der Naturstoffe des Pilzstammes 3304
3.5.4.1. Pflanzenschutz-Screening der Mikrobiologie in Braunschweig
Im Diagramm 9 sind die Agardiffusionstests der auf Biomalz- und Malz-Soja-Weichagar
kultivierten Rohextrakte dargestellt. Die Petrolether- und Ethylacetatfraktionen wiesen eine
vergleichbare Wirkung auf. Auch im Bezug auf das Nährmedium konnten keine gravierenden
Unterschiede in den Bioaktivitäten festgestellt werden. Eine ganz hervorragende Wirkung
zeigten alle Rohextrakte gegen Pilze. Besonders hervorzuheben ist die überaus starke
Wirkung gegen Eurotium repens (Ascomycet) und Ustilago violacea (Ustomycet). Auch die
Wirkung gegen Mycotypha microspora (Zygomycet) und Fusarium oxysporum ist noch als
sehr gut zu bezeichnen.
Die Kresse- und Lemnatests belegen, daß auch die herbiziden Wirkungen der Rohextrakte als
gut einzustufen sind.
0
5
10
15
20
25
30
35
Hemmhof-
radius
[mm]
Chl. E.C. B.M. Ust. Eur. M.m. Fus.
Agardiffusionstest
Ethylacetatphase
Petroletherphase
Diagramm 9: Die Ergebnisse der Agardiffusionstests der Rohextrakte.
Keimlingstest
Versuchsdauer 1. Tag 6. Tag
Biomalz-Extrakt* 1 von 15 Samen zeigt Wachstum 0 von 15 Samen sind gekeimt
Malz-Soja-Extrakt* 1 von 15 Samen zeigt Wachstum 0 von 15 Samen sind gekeimt
Referenz 1**
14 von 15 Samen zeigen Wachstum
15 von 15 Samen sind gekeimt
Referenz 2*** 15 von 15 Samen zeigen Wachstum 15 von 15 Samen sind gekeimt
Tabelle 26: Wirkung der Biomalz- und Malz-Soja-Rohextrakte im Keimlingstest (* 0.25 ml einer Lösung des
Rohextraktes in 5 ml Aceton/Methanol (1:1) und 2.25 ml steriles Wasser; **, *** Referenzen und Testorganis-
mus siehe Seite 52, Tabelle 9).
102 Hauptteil
Lemnatest
Versuchsdauer 0. Tag 1. Tag 6. Tag
Biomalz-Extrakt* 8 Blätter grün 5 Blätter weiß 8 Blätter weiß
Malz-Soja-Extrakt* 8 Blätter grün 6 Blätter weiß 8 Blätter weiß
Referenz 1** 8 Blätter grün 10 Blätter grün 24 Blätter grün
Referenz 2*** 7 Blätter grün 9 Blätter grün 27 Blätter grün
Tabelle 27: Lemnatest der Biomalz- und Malz-Soja-Rohextrakte (* 0.25 ml einer Lösung des Rohextraktes in
5 ml Aceton/Methanol (1:1) und 2.25 ml steriles Wasser; **, *** Referenzen und Testorganismus siehe Seite 52,
Tabelle 10).
Der Vergleich der Testergebnisse der Agardiffusionstests der Rohextrakte mit denen des
Strobilurin B (17) und Strobilurin G (18) belegen, daß die stark fungizide Wirkung auf diese
Substanzen zurückzuführen ist. Besonders das Strobilurin B (17), daß als Leitstruktur für die
von der BASF AG vertriebenen Strobilurin-Fungzide diente, zeigt gegen Ustilago violacea
und Eurotium repens Maximalwerte der Hemmung. Der Naturstoff 19 besitzt eine mäßig gute
Aktivität gegen Ustilago violacea und Eurotium repens und eine sehr gute Wirkung gegen
Bacillus megaterium.
0
5
10
15
20
25
30
35
Hemmhof-
radius
[mm]
Chl. E.C. B.M. Ust. Eur. M.m. Fus.
Agardiffusionstest
Naturstoff 17
Naturstoff 18
Naturstoff 19
Diagramm 10: Die Ergebnisse der Agardiffusionstests der Naturstoffe 17, 18 und 19.
Haupteil 103
3.6. Naturstoff aus der Pflanze Usnea dasypoga Rohi
3.6.1. Isolierung des Naturstoffs 20
Die Isolierung des Naturstoffs 20 gelang der Arbeitsgruppe von Dr. Wahyudi Priyono
Suwarso (Indonesien) aus einem Kilogramm getrocknetem Pflanzenmaterials der oben
genannten Spezie. Über das Extraktionsverfahren liegen keine weiteren Informationen vor.
3.6.2. Strukturaufklärung und Beschreibung des Naturstoffs 20
Der Naturstoff 20 kristallisiert in Form farbloser bzw. weißer Nadeln, die einen Schmelzpunkt
von 109−110 °C besitzen. Der Drehwert des optisch aktiven Sekundärmetaboliten beträgt
[α]D
20 = − 2.5° (c = 0.6; CH2Cl2). Dünnschichtchromatographisch ist der Naturstoff durch
Besprühen mit einer Ethanol-Schwefelsäure-Lösung (8 % H
2SO4) mit einem R
f-Wert von
0.45 (CH2Cl2/MeOH 4 %) detektierbar. Das IR-Spektrum zeigt bei 1728 cm−1 eine intensive
Carbonylabsorptionsbande. Ein weiteres Charakteristikum ist die breite Bande bei 3435 cm−1,
die für eine OH-Valenzschwingung spricht.
Im 13C-NMR-Spektrum werden insgesamt zehn unterschiedliche Signale registriert, wobei
das Signal bei 177.16 ppm unter Berücksichtigung der Carbonylabsorption im IR-Spektrum
für einen Ester bzw. eine Carbonsäure spricht. Die weitere Auswertung des Protonen- und
DEPT-135-Experiments ergibt, daß die Substanz neben der Carbonylgruppe aus drei Methyl-
gruppen, die im Protonenspektrum jeweils ein Duplett zeigen, vier Methingruppen, von denen
zwei aufgrund ihrer 13C-NMR-Verschiebung von 71.11 bzw. 77.05 ppm monooxygeniert
sind, und zwei Methylengruppen besteht. Im Protonenspektrum werden bei 3.97 und 3.23
ppm zwei für austauschbare Protonen charakteristische Signale registriert. Durch das
Austauschexperiment mit D
2O und die typischen 13C-NMR-Verschiebungen für
monooxygenierte Kohlenstoffatome können diese Signale als OH-Gruppen identifiziert
werden. Auffällig ist desweiteren die Unschärfe der übrigen Protonensignale, die trotz
optimaler Abstimmung des NMR-Gerätes auf die Probe nicht vollständig beseitigt wird.
Die konstitutionelle Strukturaufklärung erfolgt mittels ein- und zweidimensionaler NMR-
Spektroskopie. Dem HMBC-Spektrum ist zu entnehmen, daß die Ester- bzw. Carbon-
säuregruppe bei 177.05 ppm mit einer Methingruppe mit den chemischen Verschiebungen
von 2.56 bzw. 44.10 ppm und einer Methylgruppe bei 1.09 bzw. 14.44 ppm koppelt. Die
104 Hauptteil
Methylgruppe zeigt im Protonenspektrum ein Duplett mit einer Kopplungskonstanten von
6.7 Hz. Für das Protonensignal der Methingruppe wird ein nicht ausreichend aufgespaltenes
Multiplett mit einer Kopplungskonstanten von 7.0 Hz detektiert. Im H,H-COSY-Spektrum ist,
ausgehend von der Methylgruppe, ein Kreuzsignal zur Methingruppe registrierbar. Diese zeigt
im H,H-COSY-Spektrum eine weitere Kopplung zur Methingruppe bei 3.61 ppm. Im HMQC-
Spektrum korreliert dieses Protonensignal mit einem 13C-NMR-Signal bei 77.05 ppm. Die
Protonen- und 13C-NMR-Resonanzen sprechen dafür, daß diese Methingruppe mono-
oxygeniert ist. Desweiteren sind im HMBC-Spektrum, ausgehend von den Protonensignalen
der Methylgruppe bei 1.09 ppm, Kreuzsignale zu den Kohlenstoffatomen der beiden
Methingruppen registrierbar, so daß Teilstruktur I konstruiert werden kann.
ROR
OOR
1.09
14.44
2.56
44.10
3.61/77.05 177.05
Teilstruktur I
Im Protonenspektrum wird für das Ein-Proton-Signal bei 3.61 ppm ein Doppel-Duplett mit
Kopplungskonstanten von 2.4 und 8.8 Hz detektiert. Im H,H-COSY-Spektrum wird folglich
eine weitere Kopplung zur CH-Gruppe mit der chemischen Verschiebung von 1.54 ppm
beobachtet. Die entsprechende 13C-NMR-Resonanz ist bei 34.71 ppm zu finden. Diese
Methingruppe zeigt erwartungsgemäß im H,H-COSY-Spektrum eine Kreuzkopplung zu
einem weiteren Drei-Protonen-Duplett mit den chemischen Verschiebungen von 0.78 bzw.
12.04 ppm. Im HMBC-Spektrum werden, ausgehend von dem Protonensignal der Methyl-
gruppe, Kopplungen zur Methylengruppe mit der 13C-NMR-Verschiebung von 29.82 ppm
und den beiden Methingruppen bei 34.71 und 77.05 ppm beobachtet (Teilstruktur II).
OR
OOR
R77.05
3.61
1.09
14.44
2.56
44.10 177.05
1.54
34.71
0.87
12.04
1.35-1.50
29.82
Teilstruktur II
Haupteil 105
Die Methylengruppe bei 29.82 ppm korreliert laut HMQC-Spektrum mit den
Protonenverschiebungen von 1.35−1.50 ppm. Diese zeigen im H,H-COSY-Spektrum
Kreuzsignale zu Protonenresonanzen bei 1.47−1.68 ppm, die zu einer weiteren Methylen-
gruppe mit einer chemischen Verschiebung von 34.07 ppm gehören. Im HMBC-Spektrum ist
von dieser Verschiebung eine 3J-Konnektivität zur Protonenresonanz der Methylgruppe bei
1.26 ppm registrierbar. Diese zeigt wiederum im H,H-COSY-Spektrum eine Kopplung zur
Methingruppe bei 5.06 ppm, die aufgrund ihrer Korrelation zur 13C-NMR-Verschiebung von
71.11 ppm monooxygeniert ist. Abschließende Bestätigung findet die so konstruierbare Teil-
struktur III durch die Kreuzkopplung des Protons bei 5.06 ppm zu den Protonensignalen bei
1.47−1.68 ppm.
OR
OOROR
77.05
3.61
1.09
14.44
2.56
44.10 177.05
1.54
34.71
0.87
12.04
1.35-1.50
29.82
1.47-1.68
34.07
1.26 71.11
5.06
20.62
Teilstruktur III
Die massenspektroskopischen Untersuchungen ergeben, daß der Naturstoff 20 eine Molmasse
von 558 besitzt. Die Summenformel der Teilstruktur III lautet, unter Berücksichtigung des
OH-Protonensignals im 1H-NMR-Spektrum, C10H18O4R1R2. Dies entspricht einer Molmasse
von M = 202 + m
R1 + m
R2. Unterstellt man weiter, daß die Verbindung aufgrund der
geringen Anzahl von 10 registrierbaren 13C-NMR-Signalen sehr symmetrisch aufgebaut ist,
so legt dies den Schluß nahe, daß die Carboxygruppe mit einem der beiden Hydroxygruppen
verestert ist. Die Masse eines solchen Teilfragments mit der Summenformel C
10H18O3
beträgt demnach 186. Daraus kann gefolgert werden, daß die Verbindung 20 vermutlich aus
drei Einheiten dieser Dihydroxycarbonsäure, die aus Symmetriegründen ein cyclisches
Makrolacton bilden, aufgebaut ist. Fraglich ist nur, welche der in Abbildung 57 dargestellten
Strukturvarianten das Molekül aufweist.
106 Hauptteil
Ring 24 Ring 12
O
O O
OH
O
O
HO
OOH
O
HO
O
O
O
O
OH
O
OH
Abb. 57: Mögliche Strukturvarianten des Naturstoffs 20.
Vergleicht man die Protonensignale der monooxygenierten Methingruppen miteinander, so
spricht die stärkere Tieffeldverschiebung des Signals bei 5.06 ppm für eine stärkere Ent-
schirmung, die durch den Elektronensog eines Esters bzw. Lactons verursacht wird, also für
das 24-gliedrige Lacton. Möglicherweise, wenn auch nicht sonderlich wahrscheinlich, sind
aber auch andere Effekte, wie z.B. Anisotropieeffekte, verursacht durch die Carbonylgruppen,
für den Tieffeldshift verantwortlich, so daß auch das 12-gliedrige Lacton eine probabilistische
Struktur darstellt. Zur absolut zweifelsfreien strukturellen Aufklärung wurde deshalb von
2 mg des Naturstoffs 20 ein Triacetat hergestellt, das entweder für das Signal bei 5.06 oder
3.61 ppm einen deutlichen Tieffeldshift zeigen sollte. Tatsächlich ist im Protonenspektrum
des Triacetats für das Doppel-Duplett bei 3.61 ppm eine Tieffeldverschiebung zu 5.14 ppm zu
beobachten, die eindeutig belegt, daß das Makrolacton 20 eine 24er Ringgröße besitzt.
Die Aufklärung der relativen Konfiguration erfolgt durch die Auswertung der Kopplungs-
konstanten und der NOE-Differenzspektren. Die Methingruppe bei 3.61 ppm zeigt im
Protonenspektrum bekanntlich ein Doppel-Duplett mit Kopplungskonstanten von 2.4 und
8.8 Hz. Für die benachbarte Methingruppe mit einer chemischen Verschiebung von 2.56 ppm
ist ein Sechstett detektierbar, daß vier Kopplungskonstanten von 7.0 bzw. 7.1 Hz und eine von
1.7 Hz aufweist. Idealerweise müßte für das Protonensignal der CH-Gruppe durch die
Kopplung zur Methylgruppe bei 1.09 ppm und zur Methingruppe bei 3.61 ppm ein Oktett
registrierbar sein. Da das Duplett der Methylgruppe eine Kopplungskonstante von 7.0 Hz
besitzt, sollte die zweite Kopplungskonstante einen vergleichbaren Wert zeigen, so daß zwei
Peaks gleiche chemische Verschiebungen aufweisen. Der Vergleich der Kopplungsmuster
Haupteil 107
belegt eindeutig, daß die zweite Kopplungskonstante einen Wert von 8.8 Hz besitzt, d. h. daß
die Protonen der Methingruppe der Karplus-Kurve entsprechend einen relativ großen
Torsionswinkel einschließen. Im Gegensatz dazu sollte der Torsionswinkel der Methingruppe
bei 3.61 und 1.54 ppm aufgrund der Kopplungskonstanten von 2.4 Hz relativ klein sein
(Abb. 58).
5.06
0.87
1.26
1.54 2.56
3.61
1.09
O
O O
O
O
O
H OHH
H H
H
HO
H
H
H
HH
OH
H
H
Abb. 58: Die Struktur und relative Konfiguration des Naturstoffs 20.
Bestätigung findet die Auswertung der Kopplungskonstanten durch die Messung von NOE-
Differenzspektren. Sättigt man das Protonensignal der Methylgruppe bei 0.87 ppm, so
beobachtet man für das Proton bei 2.56 ppm eine Intensitätssteigerung von 8.6 %. Der
vergleichweise große Wert spricht für eine nahezu ekliptische Anordnung der Methylgruppe
zum Proton. Ebenso erfährt das Protonensignal bei 3.61 ppm eine Intensitätssteigerung von
4 %, wenn die Protonenresonanz der Methylgruppe bei 1.09 ppm gesättigt wird. Desweiteren
ist durch die Sättigung dieses Signals ein NOE-Effekt für das Proton bei 5.06 ppm (3.1 %)
und 1.54 ppm registrierbar. Strahlt man abschließend auf die Protonenresonanz der dritten
Methylgruppe bei 1.26 ppm ein, so erfahren die Protonen bei 2.56 (1.9 %) und 3.61 ppm
(1.7 %) eine Intensitätssteigerung, so daß der Naturstoff 20 unter Berücksichtigung der
Kopplungskonstanten zwangsläufig die in Abb. 59 dargestellte dreidimensionale Struktur
besitzen muß.
108 Hauptteil
Abb. 59: Dreidimensionale Struktur des Naturstoffs 20.
Der Sekundärmetabolit 20 stellt ein literaturunbekanntes, C3-symmetrisches Makrolid dar.
Der Makrolacton-Ring entsteht wahrscheinlich, wie bei anderen Makroliden auch, auf dem
Polyketid-Biosyntheseweg.[116] Bis heute sind mehr als 500 verschiedene Makrolide
bekannt.[115] Das Wirkungsspektrum, der meist biologisch aktiven Verbindungen, ist sehr
unterschiedlich. Wegen dieser Vielfalt werden die Makrolide hauptsächlich in die folgenden
Klassen eingeteilt.
Die von Streptomyceten produzierten, klassischen Makrolide enthalten einen 12-, 14-, oder
16gliedrigen Lacton-Ring und 1−3 Zuckerbausteine. Zu nennen sind u. a. Carbomycin, Ery-
thromycin und Oleandomycin[115], die auch klinisch eingesetzt werden. Sie wirken bei
geringer Toxizität vornehmlich gegen Gram-positive Bakterien, aber zum Teil auch gegen
Spirochaeten und/oder Viren. Sie hemmen die Proteinbiosynthese durch Bindung an die
50S-Untereinheit der prokaryotischen 70S-Ribosomen. Ihnen gegenüber stehen die von
Streptomyceten und Pilzen gebildeten, nicht-klassischenMakrolide gegenüber, die in der
Ringgröße vergleichbar sind, aber keine Zuckerbausteine aufweisen und trotzdem biologisch
aktiv sind (z.B. Albocyclin, Soraphen, Brefeldin A).
Die überwiegend von Streptomyceten produzierten Polyen-Makrolide enthalten
20−38gliedrige Lacton-Ringe, die auf der einen Seite eine unterschiedliche Anzahl
konjugierter Doppelbindungen (4−7), auf der anderen eine Poly-(1-hydroxy-1,2-ethandiyl)-
Kette aufweisen. Sie sind häufig mit einem Aminozucker (z.B. D-Mycosamin) glykosiert. Die
Haupteil 109
Polyen-Makrolide zeigen als amphiphile Moleküle Wechselwirkungen mit der Zellmembran
eukaryotischer Zellen und sind bei nicht zu vernachlässigender (Nieren-)Toxizität durchweg
antifungisch wirksam. Klinisch werden sie daher zum Teil gegen Pilz- und Hefeinfektionen
eingesetzt.
Zu den Spiro-Makroliden gehören Avermectine und Milbemycine, die gegen Endo- und
Ektoparasiten bei Tieren und als Insektizide im Pflanzenschutz einen großen Markt besitzen.
Die Pleco-Makrolide weisen neben dem Lacton-Ring eine gefaltete Seitenkette auf. Sie sind
hochaktive ATPase-Inhibitoren (z.B. Concanamycin A, Bafilomycin A
1). Daneben gibt es
eine zunehmende Zahl ungewöhnlicher Makrolactone mit bis zu 60 Ringgliedern (Quinolido-
mycin A1), die aus verschiedenen, auch marinen Organismen stammen.
110 Synthese
4. Synthese
4.1 Planung und Durchführung erster Syntheseschritte zur Darstellung des Naturstoffs
Stemphyperylenol (11)
4.1.1. Motivation
Der aus dem endophytisch lebenden Pilz der Gattung Monodictys fluctuata stammende
Sekundärmetabolit 11 zeigte sowohl im Agardiffusionstest als auch im Photosynthese-
aktivitätstest eine sehr starke herbizide Wirkung. Aus diesem Grund besteht ein berechtigtes
Interesse, diese synthetisch vernachlässigte Stoffklasse durch eine einfache Synthesestrategie
zugänglich zu machen und durch Derivatisierung die Wirksamkeit der Verbindung noch zu
erhöhen.
4.1.2. Syntheseplanung
Zum Aufbau des Naturstoffs 11 können unter Berücksichtigung der C
2-Symmetrie des
Moleküls retrosynthetisch verschiedene Schnitte angesetzt werden. Einige dieser Varianten
sind in Abb. 62 dargestellt.
32
11
OH O
O OH
OH
HH
HO
HO
OH
OH
HO
OH
HO
O
O
Abb. 62: Retrosynthetische Varianten zur Darstellung des Stemphyperylenols (11).
Die synthetisch am einfachsten zugängliche Basiskomponente stellt vermutlich ein in 9,10-
Position funktionalisiertes Anthracenderivat (32) dar (Abb. 62). Als Ausgangsverbindung für
diesen Syntheseweg sollte demnach ein Anthrachinonderivat (33) dienen (Abb. 63), das im
ersten Schritt zum 2,6-Dihydroxyanthracen (34) reduziert wird. Der Schutz der
Synthese 111
Hydroxygruppen erfolgt in der nächsten Stufe durch Veretherung mit Dimethylsulfat. Durch
eine Diels-Alder-Reaktion und nachfolgender Verseifung des entstehenden cyclischen
Carbonats (36) wird die Verbindung in das Diol (37) übergeführt, das durch eine
Natriumperjodatspaltung in den Dialdehyd (38) umgewandelt wird. Der nucleophile Angriff
von carbanioniden Organometallverbindungen kann im nächsten Schritt mit den klassischen
Grignardreagenzien erfolgen. Vorzuziehen sind jedoch Organotitan- oder Organozirkonium-
reagenzien, da insbesondere die Organozirkoniumreagenzien eine bedeutend höhere
Carbonylophilie und geringere Basizität als Grignardreagenzien besitzen.[117,118] Die Hy-
droxyfunktionen werden wiederum durch Veretherung mit Dimethylsulfat geschützt. Mittels
einer Lemieux-Rudloff-Oxidation[119] mit Kaliumpermanganat und Natriumperjodat in
Dioxan/Wasser und genauer Kontrolle des pH-Wertes gelangt man zur Dicarbonsäure (41),
die säurekatalysiert zur Verbindung (42) cyclisiert werden kann.[120] Die abschließende Spal-
tung der Ethergruppen mit BCl3 führt zum Stemphyperylenol (11).
39
38
37
36
34
33
H
O
H
O
O
O
OH
OH
O
O
O
O
O
O
O
HO
OH
O
O
HO
OH
1.) Veretherung
2.) Diels-Alder
Reduktion
KOH
NaIO4Zr(OC6H5)3
OH
HO
O
O
Abb. 63: Forsetzung nächste Seite.
112 Synthese
42
41
11
O OH
HO O
O
OO
O
O O
O O
O
O
1.) Veretherung
2.) Lemieux-Rudloff-
Oxidation Säurekatalysierte
Cyclisierung
OH O
O OH
OH
HO
BCl3
Abb. 63: Syntheseplan zur Darstellung von Stemphyperylenol (11).
4.1.3. Durchführung
Über die Reduktion von Anthrachinonderivaten zu Anthracenderivaten ist in der Literatur
vielfach berichtet worden.[121−123] Die Reduktion des 2,6-Dihydroxyanthrachinons (33) mit
Zinkstaub in Pyridin oder Ammoniakwasser führt zu stark schwankenden Ausbeuten von
15−45 %. Durch Kelly‘s und Shanon’s Variante[124] mit Zinkstaub und Cyclohexyl-p-
toluolsulfonat konnte hauptsächlich das in Abb. 64 gezeigte Bianthryl 44 hergestellt werden.
Die Darstellung des Cyclohexyl-p-toluolsulfonats erfolgte, ausgehend von p-Toluolsulfon-
säure und Cyclohexanol, nach dem Verfahren von Hickingbotton und Rogers.
Synthese 113
O
O
O
O
Zn
Cyclohexyl-p-toluol-
sulfonat
O
O
O
O
43 44
Abb. 64: Reduktion des 2,6-Dimethoxyanthrachinons (43) mit Zinkstaub und Cyclohexyl-p-toluolsulfonat.
Auch die Umsetzung des 2,6-Dimethoxyanthrachinons (43) nach der Methode von
Clemmensen[125] lieferte schlechte Ausbeuten.
Die einzig gangbare Variante[126], durch die eine hervorragende Ausbeute von 92 % erzielt
wurde, stellte die Reduktion mit einem Überschuß an Natriumborhydrid dar (Abb. 65). Die so
erhaltene Verbindung wurde nach der Reinigung durch Flash-Chromatographie mit
Dimethylsulfat in trockenem Aceton verethert.[127] Die Reinigung erfolgte durch Umkristalli-
sation in Eisessig und Waschen mit Wasser.
35
33
O
O
OH
HO
NaBH4O
O
1.)
2.)(CH3O)2SO2
3
O
O
OH
HO
NaBH4O
O
1.)
2.)(CH3O)2SO2
Abb. 65: Reduktion von 2,6-Dihydroxyanthrachinon (33) mit Natriumborhydrid und Veretherung der Hydroxy-
gruppen mit Dimethylsulfat.
Die Diels-Alder-Reaktion[128] des 2,6-Dimethoxyanthracens (35) wurde in Vinylencarbonat (45),
das gleichzeitig als Dienophil fungierte, vorgenommen (Abb. 66). Die Temperatur der
Reaktionslösung wurde auf 170−180 °C eingestellt. Eine maximale Ausbeute von 71 %
konnte bei Reaktionszeiten von ca. sechs Stunden erzielt werden. Bei längeren
Reaktionszeiten entstand ein beträchtlicher Anteil an Zersetzungsprodukt. Die Reinigung des
cyclischen Carbonats 36 erfolgte säulenchromatographisch. Als Lösungsmittel wurde Di-
chlormethan verwandt.
114 Synthese
36
45
35
O
O
O
O
O
170-180 °C
OO
O
+
O
O
Abb. 66: Darstellung des cyclischen Cabonats 36 mittels Diels-Alder Reaktion.
Die Herstellung des Vinylencarbonats (45) gelang nach einer Methode von Newman und
Addor.[129] Ethylencarbonat wurde im ersten Schritt mit Sulfurylchlorid unter UV-Be-
strahlung in trockenem Tetrachlorkohlenstoff zum Monochlorethylencarbonat umgesetzt
(Abb. 67). Die Kontrolle der sehr heftig einsetzenden Reaktion erfolgte durch die Regulierung
der Intensität der Bestrahlung. Ferner mußte darauf geachtet werden, daß das entstehende
SO2- und HCl-Gas in wässriger Natronlauge absorbiert wurde. Das destillierte Produkt-
gemisch, bestehend aus ca. 75 % Monochlorethylencarbonat 46 (1H-NMR-Analyse), Ethylen-
carbonat (47) und Dichlorethylencarbonat, wurde ohne weitere Trennung in der nächsten
Stufe eingesetzt, in der die Eliminierung mittels Triethylamin durchgeführt wurde (Abb. 67).
Die Reinigung des Vinylencarbonats (45) erfolgte mittels Kugelrohrdestillation.
45
46
47
OO
O
+SO2Cl2h νOO
O
Cl
N(Et)3
NH(Et)3Cl
-OO
O
Abb. 67: Darstellung des Vinylidencarbonat (45).
Zur Darstellung des cyclischen Diols 37 wurde das Diels-Alder-Produkt 36 in einer ethano-
lischen Kaliumhydroxidlösung zwei Stunden bei 60 °C gerührt (Abb. 68). Das in 96 %iger
Ausbeute isolierbare Produkt wurde ohne weitere Reinigung in der nachfolgenden Perjodat-
spaltung eingesetzt. Diese lieferte in einer hervorragenden Ausbeute von 93 % den
Dialdehyd 38 (Abb. 68).
Synthese 115
38
37
36
H
O
H
O
O
O
NaIO4
OH
OH
O
O
O
O
O
O
O
KOH
Abb. 68: Darstellung des Diols 37 und des Dialdehyds 38.
Da der Strukturaufklärung einiger hochinteressanter Sekundärmetabolite Vorrang gegeben
wurde, mußte die Synthese an dieser Stelle unterbrochen werden.
116 Zusammenfassung und Ausblick
5. Zusammenfassung und Ausblick
In der vorliegenden Arbeit wurde die Isolierung, Identifizierung und biologische Wirksamkeit
unterschiedlicher, von Pilzen produzierter Sekundärmetabolite beschrieben. Gewonnen
wurden die Naturstoffe aus den Pilzstämmen 3037, 2225, 3184, 3004 und 3304, die entweder
endophytisch lebende Pilze (3184) waren oder an extremen Standorten in China (3037, 3004),
Ägypten (2225) oder Südafrika (3304) gefunden wurden.
Aus dem Pilzstamm 3037 konnten sieben Sekundärmetabolite isoliert und identifiziert
werden, von denen sechs der großen Gruppe der Diterpene zugeordnet werden konnten. Bei
den Naturstoffen 1−4 handelt es sich um Terpenoid-Lactone, die strukturell sehr große
Ähnlichkeit zu den Inumakilactonen, Nagilactonen und Podolactonen aufweisen.
Während die Naturstoffe 1 und 3 erstmals von Andersen[42] und Ellestad[43] charakterisiert
werden konnten, stellen die Sekundärmetabolite 2 und 4 literaturunbekannte Verbindungen
dar. Der Metabolit 2 ist dabei unter der Vielzahl der strukturverwandten Substanzen die
einzige, die am Kohlenstoffatom C-13 keinen Substituenten trägt. Der Naturstoff 4 wurde aus
polareren Fraktionen des Pilzextraktes isoliert. Ungewöhnlich ist, daß dieser im Gegensatz zu
den Verbindungen 1 und 3 R- statt S-Konfiguration am C-13 aufweist.
Die unbekannten Sekundärmetabolite 5 und 6 sind gleichfalls der Gruppe der Diterpenoide
zuzuordnen. Im Gegensatz zu den Naturstoffen 1−4 besitzen diese anstatt des 5-Ringlactons
eine freie Carbonsäurefunktion und in Analogie zum Naturstoff 2 keinen Substituenten am
C-13. Interessanterweise scheint es sich bei Naturstoff 6 tatsächlich um eine Vorstufe des
Naturstoffs 2 zu handeln, denn durch wenige chemische Modifikationen könnte die
Verbindung 6 in den Naturstoff 2 umgewandelt werden.
Desweiteren gelang es, aus dem Pilzstamm 3037 den Sekundärmetaboliten Cladosporin (7) zu
isolieren. Bekannt ist, daß diese erstmals von Scott[51] isolierte Verbindung antimikrobielle,
insektizide und phytotoxische Eigenschaften besitzt.[56]
Die biologische Testung ergab, daß mit den Naturstoffen 1−7 im wesentlichen die
Komponenten isoliert wurden, die für Bioaktivität des Rohextraktes verantwortlichen waren.
Besonders hervorzuheben ist die hervorragende fungizide Wirkung des Naturstoffs 3, die den
Ergebnissen des Agardiffusionstests zufolge, vergleichbar ist mit der Wirkung von handels-
üblichen Fungiziden. Desweiteren besitzt die Substanz 3 neben einer sehr guten herbizide
Aktivität auch eine starke Wirkung als Fibrinogen-Hemmer.
Da die Naturstoffe 2, 3, 4, 5 und 6 aus Substanzmangel nur in beschränktem Umfang getestet
werden konnten und der Pilz eine beachtenswerte Vielfalt an Sekundärmetaboliten produziert,
Zusammenfassung und Ausblick 117
sei an dieser Stelle angemerkt, daß eine nochmalige Anzucht des Pilzstammes 3037 ratsam
erscheint.
Aus dem Pilzstamm 2225 gelang die Isolierung der Dehydrofusarinsäure (8) und der Fusarin-
säure (9). Die Dehydrofusarinsäure (8) wurde von Stoll[63] aus Gibberella fujikauroi isoliert,
die Fusarinsäure (9) konnte aus dem Pilz der Art Fusarium heterosporium Xees gewonnen
werden.[66] Das Picolinsäurederivat 9 besitzt neben einer ausgeprägten phytotoxischen
Aktivität[67] auch die Eigenschaften, die Dopamin-β-Hydrolase[69] zu hemmen und andere
Stoffwechselvorgänge wie z.B. den Serotonin-Metabolismus[70,71] zu beeinflussen.
Die Naturstoffe 10, 11 und 12 konnten aus dem Pilzstamm 3184 isoliert werden. Bei
Verbindung 10 handelt es sich um das literaturbekannte Steroid Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-
3-on (10), das 1968 von Schulte[78] erstmals beschrieben wurde. Der Sekundärmetabolit 11
stellt ein ebenfalls literaturbekanntes Perylenderivat namens Stemphyperylenol (11) dar, das
1986 von Nasini[83] aufgeklärt wurde. Der Naturstoff 12 dagegen ist in der Literatur noch
nicht beschrieben worden, wenngleich dieser mit den bereits bekannten Vertretern aus der
Klasse der Stemphyl- bzw. Altertoxine strukturell sehr eng verwandt ist. Die Aufklärung der
relativen Konfiguration erfolgte durch die Auswertung der Kopplungskonstanten des Proto-
nenspektrums und dem Vergleich des CD-Spektrums mit dem des strukturell sehr ähnlichen
Stemphyltoxin I (25). Die Aufklärung der absoluten Konfiguration der Verbindung 12 durch
den Vergleich des experimentell bestimmten CD-Spektrums mit dem quantenmechanisch
berechneten CD-Spektrum steht zur Zeit noch aus. Sollte dies gelingen, so wäre dies ein
wertvoller Beitrag zur Aufklärung der absoluten Konfiguration sämtlicher strukturell eng ver-
wandter Substanzen dieser Stoffklasse.
Die biologische Testung des Stemphyperylenol (11) zeigte, das die Verbindung sehr gute
herbizide Eigenschaften besitzt. Zudem macht der Vergleich der Agardiffusionstests der
Rohextrakte und des Naturstoffs 11 deutlich, daß dieser aufgrund des fast identischen
Wirkspektrums für die Aktivität des Pilzextraktes verantwortlich ist.
Aus dem Pilzstamm 3004 wurden insgesamt vier Sekundärmetabolite isoliert und identi-
fiziert. Aus den herkömmlich aufgearbeiteten Rohextrakten konnten das Naphthalinderivat 13
und das Acetonadukt 14 des Naturstoffs 15 gewonnen werden. Der Sekundärmetabolit 13
wurde 1963 aus Kulturen von Penicillium herqei[94] isoliert. Aus den, ohne Ethylacetat und
Aceton aufgearbeiteten Pilzkulturen, gelang die Isolierung der Naphthalinderivate 15 und 16,
die von Ayer erstmals 1986 beschrieben worden sind.[91] Im Agardiffusionstest zeigte
lediglich Naturstoff 15 eine als gut zu bezeichnende Wirkung gegen Ustilago violacea.
118 Zusammenfassung und Ausblick
Die Isolierung der Naturstoffe 17, 18 und 19 erfolgte aus dem Pilzstamm 3304. Bei Natur-
stoff 17 handelt es sich um das von Anke und Steglich[100] isolierte und charakterisierte
Strobilurin B, das als Leitstruktur für die von der BASF AG vertriebenen Strobilurin-Fun-
gizide diente. Der Sekundärmetabolit 18 stellt ein weiteres Strobilurinderivat dar, das erstmals
1990 von Fredenhagen[108,109] aufgeklärt wurde. Die als Strobilurin G (18) bezeichnete
Substanz zeigt neben interessanten fungiziden Eigenschaften auch in vitro Tumoraktivität
gegen menschliche T-24 Harnblasenkrebszellinien.[110] Der Naturstoff 19 stellt ein literatur-
unbekanntes mit einem Farnesylrest substituiertes Benzoesäureamid dar, das strukturelle Ähn-
lichkeit zum Strobilurin B (17) und zu einer Verbindung namens Coniothyriomycin (31) auf-
weist. Der Agardiffusionstest der Naturstoffe 17 und 18 belegt die hervorragende fungizide
Wirkung der Strobilurinderivate, insbesondere das Strobilurin B (17) zeigt Maximalwerte der
Hemmung gegen Ustilago violacea und Eurotium repens. Der literaturunbekannte Sekundär-
metabolit 19 besitzt eine sehr gute Aktivität gegen Bacillus megaterium.
In Kooperation mit dem Arbeitskreis von Herrn Dr. Wahyudi Priyono Suwarso (Indonesien)
wurden uns zur Strukturaufklärung 14 mg des Naturstoffs 20 überlassen. Der Sekundär-
metabolit 20 wurde von der oben genannten Arbeitsgruppe aus dem Pflanzenextrakt der
Pflanze Usnea dasypoga Rohi isoliert. Die Identifizierung der Substanz 20 ergab, daß es sich
bei dieser um ein literaturunbekanntes, C3-symmetrisches 24-gliedriges Makrolacton handelt.
Zur Zeit befindet sich der strukturell außergewöhnliche Sekundärmetabolit 20 in der
pharmakologischen Testung der BASF AG.
Im synthetischen Teil der vorliegenden Arbeit wurden die ersten Schritte zur Darstellung des
Stemphyperylenols (11) vorgestellt. Der Naturstoff 11 zeigte sowohl im Agardiffusionstest
als auch im Photosyntheseaktivitätstest sehr starke herbizide Wirkung, so daß Interesse
bestand, diese synthetisch vernachlässigte Stoffklasse durch eine einfache Synthese zu-
gänglich zu machen und durch Derivatisierung die Wirksamkeit der Verbindung gegebenen-
falls noch zu erhöhen. Als Ausgangskomponente diente das 2,6-Dihydroxyanthrachinon (33),
das durch die Reduktion mit NaBH4 und anschließender Veretherung in sehr guten Ausbeuten
in das Anthracenderivat 35 übergeführt wurde. Dieses wurde durch eine Diels-Alder-Reaktion
mit Vinylencarbonat (45) zum cylischen Carbonat 36 umgesetzt, welches nachfolgend in
einer ethanolischen KOH-Lösung zum Diol 37 verseift wurde. Die anschließende Perjodat-
spaltung lieferte ebenfalls in sehr guten Ausbeuten den Dialdehyd 38. Da der Strukturauf-
klärung einiger sehr interessanter Naturstoffe Vorrang gegeben wurde, mußte an dieser Stelle
die Synthese unterbrochen werden. Dennoch konnte gezeigt werden, daß durch die
eingeschlagene Synthesestrategie ein eleganter Zugang zur Verbindung 11 möglich scheint.
Experimenteller Teil 119
6. Experimenteller Teil
6.1. Allgemein verwendete Analysen- und Meßmethoden
Analytische Dünnschichtchromatographie (DC):
Die analytische Dünnschichtchromatographie wurde mit Kieselgel-Fertigfolien (Kieselgel 60
F254) der Fa. E. Merck AG, Darmstadt durchgeführt. Die Detektion der Substanzen erfolgte
mit UV-Licht (λ = 254 nm und 366 nm). Zur zusätzlichen Detektion einzelner Substanzen
wurden folgende Sprühreagenzien verwandt :
• Schwefelsäure-Reagenz (Universalreagenz)
Eine 8 %ige ethanolische Schwefelsäurelösung diente als Sprühreagenz. Die DC-Folie wird
anschließend so lange mit der Heizpistole erwärmt, bis die Substanz sichtbar wird.
• Bromkresol-Grün
Es wurde eine 0.04 %ige Lösung in Isopropanol, die mit 2N Natronlauge auf pH-7 eingestellt
wurde, benutzt. Säuren bilden sofort gelbe Flecken.
Schmelzpunktbestimmung:
Die Schmelzpunkte wurden in offenen Kapillaren mit einer Schmelzpunktsbestimmungs-
apparatur der Fa. Gallenkamp gemessen und sind unkorrigiert.
Säulenchromatographie:
Als stationäre Phase diente Kieselgel 60 (230−400 mesh, 0.040−0.063 mm) der Fa. Merck
AG, Darmstadt.
Präparative Schichtchromatographie:
Für die präparative Schichtchromatographie wurden mit Kieselgel 60- und RP-18
beschichtete Fertigplatten der Fa. Macherey und Nagel verwandt. Desweiteren wurden
selbstangefertigte Dickschichtplatten, die mit Kieselgel 60 PF254 plus Gips (Fa. Merck)
beschichtet waren, benutzt.
HPLC:
Für die HPLC wurde von der Fa. Merck eine Hibar-Fertigsäule RT (250−25) LiChrosorb
Si 60 (7 µm) mit einer Hibar-Vorsäule (30−4) LiChrosorb Si 60 (5 µm) bzw. eine LiChrosorb
RP 18 (7 µm)-Säule, die Pumpen mit der Bezeichnung L-6000 bzw. L-5200 Intelligent Pump,
der LC-Organizer 885-5931 mit dem Rheodyne 6-Wegeventil 7125, der Detektor 655 A bzw.
L-3000 Photo Diode Array und der Chromato-Integrator D 2000 der Fa. Merck/Hitachi
verwandt. Die Proben wurden vor ihrer Verwendung über eine kurze Kieselgelsäule bzw.
Keramikfritte filtriert. Die Reinigung der Lösungsmittel wurde nach Standardmethoden
120 Experimenteller Teil
vorgenommen. Für die HPLC wurden die Lösungsmittel zusätzlich noch im Ultraschallbad
(Laboson 200) entgast.
Massenspektroskopie:
Die Massenspektren sowie die Bestimmung der Feinmassen wurden von Herrn Dr. Schiebel
und Frau Döring von der TU Braunschweig an einem Finnigan MAT 8430 (70 eV), von
Herrn Jonk an einem Fison MD 800 und von Herrn Dr. Schulze von der Universität Bremen
an einem Finigan MAT 8200 (70 eV) aufgenommen. Den genannten Personen sei an dieser
Stelle herzlich gedankt. Die relativen Intensitäten, bezogen auf den Basispeak, sind hinter den
Massen in Klammern angegeben.
Röntgenstrukturanalyse:
Die Röntgenstrukturanalysen wurden von Herrn Dr. U. Flörke (Uni-GH Paderborn) durch-
geführt, dem ich hiermit herzlich danke.
Infrarotspektroskopie:
Die IR-Spektren der untersuchten Substanzen wurden mit dem FTIR-Gerät 510 p der Fa.
Nicolet aufgenommen. Die Bearbeitung der Spektren erfolgte mit Hilfe des PCIR-Programms
derselben Firma. Die Angabe der Probenmatrix erfolgt in Klammern, die der Wellenzahlen in
[cm−1].
UV/VIS-Spektroskopie:
Zur Aufnahme der UV/VIS-Spektren wurde das Spektrometer UV-2101 PC der Fa. Shimazu
verwendet.
Optische Rotation:
Die Drehwerte wurden in den angegebenen Lösungsmitteln und Konzentrationen mit dem Po-
larimeter 241 der Fa. Perkin-Elmer in einer unthermostatisierten Standardküvette (d = 1 dm)
unter Verwendung einer Natriumlampe (D-Linie, λ = 589 nm) bestimmt.
CD-Spektroskopie:
Die Aufnahme der CD-Spektren erfolgte an dem Spektrometer J-20 der Fa. Jasco.
NMR-Spektroskopie:
Die Kernresonanzspektren wurden an einem Bruker ARX 200-, ARX 400- bzw. DMX 600-
Spektrometer aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen δ wurden auf das jeweils
verwandte deuterierte Lösungsmittel als inneren Standard bezogen und sind in ppm ange-
geben. Die Abkürzungen für die Multiplizitäten lauten:
Experimenteller Teil 121
(s) Singulett bzw. quartäres Kohlenstoffatom
(d) Duplett bzw. tertiäres Kohlenstoffatom
(t) Triplett bzw. sekundäres Kohlenstoffatom
(q) Quartett bzw. primäres Kohlenstoffatom
(m) Multiplett
(ps) Pseudo-Singulett
(pd) Pseudo-Duplett
(pt) Pseudo-Triplett
(pq) Pseudo-Quartett
Für die Aufnahme der NMR-Spektren am ARX 400- und DMX 600-Spektrometer bedanke
ich mich recht herzlich bei Herrn Dr. V. Wray (GBF Braunschweig).
6.2. Mikrobiologische Arbeitsmethoden
Die Auswahl, Anzucht, Pilzbestimmung und die Durchführung der Aktivitätstests wurden von
der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Aust, Institut für Mikrobiologie der TU Braunschweig,
durchgeführt. Für die geleistete Arbeit und die gute Kooperation möchte ich an dieser Stelle
Frau Dr. B. Schulz, Frau Qunxiu Hu und Herrn Dr. S. Dräger meinen besonderen Dank aus-
sprechen.
6.2.1. Anreicherung der Pilze in Submerskultur
Alle in dieser Arbeit aufgeführten Pilzstämme wurden entweder auf Biomalz- oder Malz-
Soja-Weichagar-Nährmedien kultiviert. Hierzu wurden 200 oder 250 ml des Mediums in
Fernbachkolben gefüllt. Nach der Sterilisation im Autoklaven (121 °C, 2 bar) wurde der
entsprechende Pilz von einer Schrägagarkultur überimpft und stehend bei Raumtemperatur bis
zu 122 Tage inkubiert.
6.3. Experimenteller Teil zur Naturstoffisolierung
Zur Nummerierung der Kohlenstoffatome innerhalb der Zeichnungen sei vorab angemerkt,
daß diese nicht den Anspruch erhebt, „IUPAC-konform“ zu sein. Vielmehr wurde die Num-
merierung der bekannten oder strukturell verwandten Verbindungen aus der Literatur
übernommen.
122 Experimenteller Teil
6.3.1. Strukturdaten und Substanzcharakteristika der Naturstoffe 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7.
6.3.1.1. 7-Methoxy-3a,10b-dimethyl-6,6a-epoxy-1,2,3,3a,5a,7,10b,10c-octahydro-5,8-
dioxa-acephenanthrylen-4,9-dion (1)
O
O
O
O
O
O
H
1
2
34
10
16
14
15
5
67
8
9
11 12
13
17
Summenformel: C17H20O6.−
Molmasse: 320.−
Schmelzpunkt: 231 °C.−
Drehwert: [α]D
20 = + 91 ° (c = 0.98, MeOH).−
Rf-Wert: 0.78 (CH2Cl2/MeOH 2 %).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3421, 1773, 1717, 1458.−
MS (CI/NH3 (pos.)) m/z (%): 338 [M+NH4]+ (50), 321 [M+H]+ (18).−
MS (CI/NH3 (neg.)) m/z (%): 319 [M−H]− (25).−
HRMS (CI/NH3 (neg.)): theor.: 319.118 [M−H]−
exper.: 319.118 ± 2 ppm Res.: 10.000
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.14 (s, 3H, 16-H), 1.29 (s, 3H, 14-H), 1.44−1.80 (m, 5H,
1-H, 2-H, 3-H), 1.90 (d, 1H, J5,6 = 4.4 Hz, 5-H), 2.15−2.28 (m, 1H, 3-H), 3.67 (s, 3H, 17-H),
Experimenteller Teil 123
4.02 (d, 1H, J7,6 = 1.1 Hz, 7-H), 4.95 (dd, 1H, J6,5 = 4.4 Hz, J6,7 = 1.1 Hz, 6-H), 5.46 (s, 1H,
13-H), 6.04 (s, 1H, 11-H).−
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 17.9 (t, C-2), 24.5 (q, C-16), 25.6 (q, C-14), 28.7 (t, C-3),
29.9 (t, C-1), 36.3 (s, C-10), 42.3 (s, C-4), 44.1 (d, C-5), 53.4 (d, C-7), 56.6 (s, C-8), 58.1 (q,
C-17), 72.3 (d, C-6), 99.9 (d, C-13), 118.8 (d, C-11), 157.5 (s, C-9), 162.6 (s, C-12), 180.6 (s,
C-15).−
6.3.1.2. 3a,10b-Dimethyl-6,6a-epoxy-1,2,3,3a,5a,7,10b,10c-octahydro-5,8-dioxa-acephen-
anthrylen-4,9-dion (2)
O
O
O
O
O
H
1
2
34
10
16
14
15
5
67
8
9
11 12
13
Summenformel: C16H18O5.−
Molmasse: 290.−
Schmelzpunkt: 223−224 °C.−
Drehwert: [α]D
20 = − 13.2 ° (c = 0.24, CH2Cl2).−
Rf-Wert: 0.78 (CH2Cl2/MeOH 2 %).−
UV (CH3OH): λmax [nm](ε): 270.5 (14513), 249.5 (8152).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 1778, 1716, 1212, 1041, 951.−
124 Experimenteller Teil
MS (200 °C) m/z (%): 290 [M]+ (2), 232 (25), 219 (70), 204 (80), 189 (50), 176 (45),
160 (100).−
MS (CI/NH3 (pos.)) m/z (%): 308 [M+NH4]+ (100), 291 [M+H]+ (12).−
MS (CI/NH3 (neg.)) m/z (%): 290 [M]−.
(50).−
HRMS (CI/NH3 (neg.)): theor.: 290.115
exper.: 290.115 ± 2 ppm Res.: 10.000
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.15 (s, 3H, 16-H), 1.30 (s, 3H, 14-H), 1.39−1.61 (m, 5H,
1-H, 2-H, 3-H), 1.90 (d, 1H, J5,6 = 4.4 Hz, 5-H), 2.15−2.28 (m, 1H, 3-H), 3.90 (d, 1H,
J7,6 = 1.4 Hz, 7-H), 4.13 (d, 1H, J13,13 = 12.4 Hz, 13-H), 4.71 (d, 1H, J13,13 = 12.4 Hz, 13-H),
4.98 (dd, 1H, J6,5 = 4.4 Hz, J6,7 = 1.4 Hz, 6-H), 6.04 (s, 1H, 11-H).−
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 17.5 (t, C-2), 24.0 (q, C-16), 25.3 (q, C-14), 28.4 (t, C-1),
29.6 (t, C-3), 35.9 (s, C-10), 41.9 (s, C-4), 43.8 (d, C-5), 53.2 (d, C-7), 55.5 (s, C-8), 71.9 (d,
C-13), 72.2 (t, C- 6), 118.4 (d, C-11), 157.6 (s, C-9), 162.5 (s, C-12), 180.2 (s, C-15).−
6.3.1.3. 7-Methoxy-3a,10b-dimethyl-1,2,3,3a,5a,7,10b,10c-octahydro-5,8-dioxa-
acephenanthrylen-4,9-dion (3)
17
13
12
11
98
7
6
5
15
14
16
10
4
3
2
1
O
O
O
O
H
O
Experimenteller Teil 125
Summenformel: C17H20O5.−
Molmasse: 304.−
Schmelzpunkt: 222 °C.−
Drehwert: [α]D
20 = − 206 ° (c = 0.45, MeOH).−
Rf-Wert: 0.74 (CH2Cl2/MeOH 2 %).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3398, 1765, 1735, 1720, 1459.−
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.21(s, 3H, 16-H), 1.37 (s, 3H, 14-H), 1.51−1.90 (m, 5H,
1-H, 2-H, 3-H), 1.96 (d, 1H, J = 4.8 Hz, 5-H), 2.27−2.42 (m, 1H, 3-H), 3.76 (s, 3H, 17-H),
5.06 (t, 1H, J = 4.6 Hz, 6-H), 5.78 (s, 1H, 13-H), 5.80 (s, 1H, 11-H), 6.60 (d, 1H, J = 4.6 Hz,
7-H).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 17.8 (t, C-2), 24.2 (q, C-16), 25.1 (q, C-14), 28.1 (t, C-1),
30.3 (t, C-3), 35.4 (s, C-10), 43.2 (s, C-4), 48.4 (d, C-5), 57.9 (q, C-17), 71.7 (d, C-6), 101.6
(d, C-13), 112.2 (d, C-11), 124.4 (d, C-7), 133.3 (s, C-8), 157.9 (s, C-9), 163.1 (s, C-12),
181.2 (s, C-15).−
6.3.1.4. 7-Hydroxy-3a,10b-dimethyl-6,6a-epoxy-1,2,3,3a,5a,7,10b,10c-octahydro-5,8-
dioxa-acephenanthrylen-4,9-dion (4)
O
O
O
O
OH
O
H
1
2
34
10
16
14
15
5
67
8
9
11 12
13
126 Experimenteller Teil
Summenformel: C16H18O6.−
Molmasse: 306.−
Schmelzpunkt: 241 °C.−
Drehwert: [α]D
20 = − 34.1 ° (c = 0.23; MeOH).−
Rf-Wert: 0.62 (CH2Cl2/MeOH 4 %).−
UV (CH3OH): λmax[nm] (ε): 271 (13500).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3336, 1788, 1696, 1089.−
MS (CI/NH3 (pos.)) m/z (%): 324 [M+NH4]+ (100).−
MS (CI/NH3 (neg.)) m/z (%): 305 [M−H]− (35), 278 (100).−
HRMS (DCI/NH3 (neg.)): theor.: 305.10251 [M−H]−
exper.: 305.10237 ± 0.5 ppm Res.: 3000 (10 % Tal-Def)
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.07 (s, 3H, 16-H), 1.23 (s, 3H, 14-H), 1.39−1.74 (m,
2H, 1-H), 1.39−1.74 (m, 2H, 2-H), 1.39−1.74 (m, 1H, 3-H), 1.80 (d, 1H, J5,6 = 4.4 Hz, 5-H),
2.10−2.20 (m, 1H, 3-H), 3.92 (d, 1H, J7,6 = 1.1 Hz, 7-H), 4.90 (dd, 1H, J6,5 = 4.4 Hz,
J6,7 = 4.4 Hz, 6-H), 5.54 (bs, 1H, 13-H), 5.99 (s, 1H, 11-H).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 18.0 (t, C-2), 24.5 (q, C-14), 24.5 (q, C-16), 28.8 (t, C-3),
30.0 (t, C-1), 36.1 (s, C-10), 42.3 (s, C-4), 44.4 (d, C-5), 54.1 (d, C-7), 57.4 (s, C-8), 72.4 (d,
C-6), 97.2 (d, C-13), 117.6 (d, C-11), 176.5 (s, C-9), 163.0 (s, C-12), 180.6 (s, C-15).−
Experimenteller Teil 127
6.3.1.5. 8-Hydroxy-12-oxo-(8α)-13-oxa-podocarpan-16-säure (5)
O
O
OH
O
O
H
H
1
2
34
10
16
14
15
5
6
7
13
98
11 12
Summenformel: C16H22O5.−
Molmasse: 294.−
Schmelzpunkt: 237 °C.−
Drehwert: [α]D
20 = − 38.5 ° (c = 0.21, MeOH).−
Rf-Wert: 0.31 (CH2Cl2/MeOH 4 %).−
UV (CH3OH): λmax [nm] (ε): 272.5 (12130).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3400, 1719, 1692.−
MS (150 °C) m/z (%): 263 (30), 189 (10), 118 (100).−
MS (CI/NH3 (pos.)) m/z (%): 312 [M+NH4]+ (100).−
MS (CI/NH3 (neg.)) m/z (%): 294 [M]−.
(35), 276 [M−H2O]+ (100).−
HRMS (CI/NH3 (neg.)): theor.: 294.1467
exper.: 294.1504 Res.: 5000 (10% Tal.Def.)
128 Experimenteller Teil
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.76 (s, 3H, 16-H), 1.05−1.22 (m, 2H, 1-H), 1.30 (s, 3H,
14-H), 1.45−1.49 (m, 1H, 2-H), 1.44−1.57 (m, 1H, 2-H), 1.81−1.88 (m, 1H, 3-H), 2.04 (pt,
1H, J5,6 = 2.4 Hz, 5-H), 2.18−2.22 (m, 1H, 3-H), 2.29 (pd, 1H, J9,11 =9.1 Hz, 9-H), 2.35 (pd,
1H, J11,11 = 17.8 Hz, 11-H), 2.95 (dd, 1H, J11,9 = 9.5 Hz, J11,11 = 17.8 Hz, 11-H), 3.46 (d, 1H,
J13,13 = 11.4 Hz, 13-H), 4.43 (bs, 1H, OH), 5.73 (dd, 1H, J7,5 = 3.0 Hz, J7,6 = 10.4 Hz, 7-H),
6.65 (dd, 1H, J6,5 = 1.7 Hz, J6,7 = 10.4 Hz, 6-H), 10.00−11.50 (bs, 1H, OH).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 12.1 (q, C-16), 19.2 (t, C-2), 28.0 (q, C-14), 31.7 (t, C-11),
36.5 (s, C-10), 37.5 (t, C-3), 37.7 (t, C-1), 42.9 (s, C-4), 49.7 (d, C-9), 51.7 (d, C-5), 69.0 (t,
C-13), 84.2 (s, C-8), 122.7 (d, C-7), 134.4 (d, C-6), 176.4 (s, C-12), 177.9 (s, C-15).−
6.3.1.6. 9-Hydroxy-12-oxo-(8)-13-oxa-podocarpan-16-säure (6)
O
O
O
O
H
H
OH
1
2
34
10
16
14
15
5
6
7
13
9
8
11 12
Summenformel: C16H22O5.−
Molmasse: 294.−
Schmelzpunkt: 226 °C.−
Drehwert: [α]D
20 = − 22.5 ° (c = 0.08; MeOH)
Rf-Wert: 0.27 (CH2Cl2/MeOH 4 %).−
UV (CH3OH): λmax [nm] (ε): 272.0 (13674).−
Experimenteller Teil 129
IR (KBr): ν[cm−1] = 3502, 3152, 1728, 1701.−
MS (DCI/NH3 (pos.)) m/z (%): 312 [M+NH4]+ (50), 294 [M]+ (25).−
MS (DCI/NH3 (neg.)) m/z (%): 293 [M−H]− (60), 292 (100).−
HRMS (DCI/NH3 (neg.)): theor.: 293.13890 [M−H]−
exper.: 293.13826 ± 2.1 ppm, Res.: 3000 (10 % Tal-Def)
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.84 (s, 3H, 16-H), 1.01−1.20 (m, 1H, 3-H), 1.28 (s, 3H,
14-H), 1.33−1.44 (m, 1H, 1-H), 1.55−1.63 (m, 1H, 2-H), 1.80−1.97 (m, 1H, 1-H), 1.87−2.04
(m, 1H, 2-H), 2.13 (dd, 1H, J5,6 = 5.9 Hz, J5,6 = 11.3 Hz, 5-H), 2.14−2.24 (m, 1H, 3-H),
2.33−2.49 (m, 1H, 6-H), 2.64 (d, 1H, J11,11 = 15.2 Hz, 11-H), 2.80 (d, 1H, J11,11 = 15.2 Hz,
11-H), 2.88−2.96 (m, 1H, 6-H), 4.79 (m, 1H, J13,13 = 12.6 Hz, 13-H), 4.90 (m, 1H,
J13,13 = 12.6 Hz, 13-H), 5.89 (m, 1H, 7-H).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 15.1 (q, C-16), 19.4 (t, C-2), 24.6 (t, C-6), 28.2 (q, C-14),
30.1 (t, C-1), 37.3 (t, C-11), 38.3 (t, C-3), 40.3 (s, C-10), 43.2 (d, C-5), 43.9 (s, C-4), 69.8 (t,
C-13), 72.9 (s, C-9), 126.2 (d, C-7), 130.9 (s, C-8), 174.7 (s, C-12), 180.2 (s, C-15).−
6.3.1.7. 3,4-Dihydro-6,8-dihydroxy-3-(6-methyl-2-tetrahydropyranylmethyl)-isocumarin (7)
O
OH
HO
O
O
H H
1
3
4
5
6
7
88a
9
10
11
12
13
14
15
4a
Summenformel: C16H20O5.−
Molmasse: 292.−
130 Experimenteller Teil
Schmelzpunkt: 187−188 °C.−
Drehwert: [α]D
20 = − 22.8 ° (c = 0.18, EtOH).−
Rf-Wert: 0.35 (CH2Cl2/MeOH 2 %).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3410, 1734, 1648, 1637.−
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.22 (d, 3H, J15,14 = 6.5 Hz, 15-H), 1.33 (m, 1H, 11-H),
1.35 (m, 1H, 13-H), 1.67 (m, 2H, 12-H), 1.67 (m, 1H, 11-H), 1.67 (m, 1H, 13-H), 1.85 (dd,
1H, J9,10 = 2.8 Hz, J9,3 = 9.0 Hz, 9-H), 1.95 (dd, 1H, J9,10 = 3.9 Hz, J9,3 = 10.1 Hz, 9-H),
2.81 (m, 2H, 4-H), 3.99 (m, 1H, 14-H), 4.12 (m, 1H, 10-H), 4.7 (m, 1H, 3-H), 6.17 (d, 1H,
J5,7 = 1.9 Hz, 5-H), 6.30 (d, 1H, J7,5 = 1.9 Hz, 7-H), 11.07 (s, OH).−
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 18.42 (t, C-12), 19.31 (q, C-15), 30.62 (t, C-11), 30.72 (t,
C-13), 33.42 (t, C-4), 39.04 (t, C-9), 66.29 (d, C-10), 68.09 (d, C-14), 76.08 (d, C-3), 101.18
(s, C-8a), 101.73 (d, C-7), 106.62 (d, C-5), 141.47 (s, C-4a), 163.20 (s, C-6), 164.07 (s, C-8),
169.74 (s, C-1).−
6.3.2. Strukturdaten und Substanzcharakteristika der Naturstoffe 8 und 9.
6.3.2.1. 5-Butyl-3-enylpicolinsäure (8) (Dehydrofusarinsäure)
NCO2H
1'
2'
3'
4'
2
3
4
5
6
Summenformel: C10H11NO2.−
Molmasse: 177.−
Schmelzpunkt: 118−120 °C.−
Experimenteller Teil 131
Rf-Wert: 0.35 (CH2Cl2/MeOH 10 %).−
MS (200 °C) m/z (%): 177 [M]+ (5), 136 (45), 135 (100), 92 (30), 91 (28).−
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.35 (m, 2H, 2‘-H), 2.75 (t, 2H, J1‘,2‘ = 7.4 Hz, 1‘-H), 4.97
(m, 2H, 4‘-H), 5.79 (m, 1H, 4‘-H), 7.80 (m, 1H, 4-H), 7.94 (d, 1H, J3,4 = 7.5 Hz, 3-H), 8.53
(s, 1H, 6-H).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 35.02 (t, C-2‘), 32.10 (t, C-1‘), 116.70 (t, C-4‘), 125.30 (d,
C-3), 138.08 (d, C-4), 138.18 (d, C-3‘), 141.62 (s, C-5), 146.07 (s, C-2), 149.46 (d, C-6),
166.03 (s, CO2H).−
6.3.2.2. 5-Butylpicolinsäure (9) (Fusarinsäure)
NCO2H
1'
2'
3'
4'
2
3
4
5
6
Summenformel: C10H13NO2.−
Molmasse: 179.−
Schmelzpunkt: 82−84 °C.−
Rf-Wert: 0.35 (CH2Cl2/MeOH 10 %).−
MS (200 °C) m/z (%): 179 [M]+ (5), 135 (100), 133 (35), 92 (30), 91 (28).−
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.86 (t, 3H, J4‘,3‘ = 7.2 Hz, 4‘-H), 1.26 (m, 2H, 2‘-H), 1.55
(m, 2H, 2‘-H), 2.64 (t, 2H, J1‘,2‘ = 7.5 Hz, 1‘-H), 7.80 (m, 1H, 4-H), 7.94 (d, 1H,
J3,4 = 7.5 Hz, 3-H), 8.53 (s, 1H, 6-H).−
132 Experimenteller Teil
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 14.55 (q, C-4‘), 22.53 (t, C-3‘), 33.35 (t, C-2‘), 32.56 (t, C-
1‘), 125.22 (t, C-3), 137.92 (t, C-4), 140.76 (s, C-5), 145.96 (s, C-2),149.31 (d, C-6), 166.03
(s, CO2H).−
6.3.3. Strukturdaten und Substanzcharakteristika der Naturstoffe 10, 11 und 12
6.3.3.1. Ergosta- 4, 6, 8 (14), 22-tetraen-3-on (10)
O
1
2
34567
8
9
10
11 12 13
14 15
16
17
18
19
20
21 22
23 24
25
26
27
28
Summenformel: C28H40O.−
Molmasse: 392.−
Schmelzpunkt: 85−87 °C.−
Drehwert: [α]D
20 = + 537 ° (c = 0.67 ; CH2Cl2)
Rf-Wert: 0.48 (CH2Cl2/MeOH 1 %).−
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 0.83 (d, 3H, J = 6.7 Hz, 28-H), 0.85 (d, 3H, J = 6.8 Hz,
27-H), 0.93 (d, 3H, J = 6.7 Hz, 25-H), 0.96 (s, 3H, 18-H), 1.00 (s, 3H, 19-H), 1.06 (d, 3H,
J = 6.7 Hz, 21-H), 1.26 (m, 1H, 17-H), 1.31 (m, 1H, 16-H), 1.49 (m, 1H, 26-H), 1.55 (m, 1H,
15-H), 1.60 (m, 1H, 1-H), 1.70 (m, 1H, 1-H), 1.80 (m, 1H, 12-H), 1.83 (m, 1H, 15-H), 1.87
(m, 1H, 24-H), 2.01 (m, 1H, 12-H), 2.08 (m, 1H, 16-H), 2.14 (m, 1H, 9-H), 2.15 (m, 1H,
20-H), 2.31 (m, 1H, 12-H), 2.31 (m, 1H, 11-H), 2.46 (m, 1H, 11-H), 2.50 (m, 2H, 2-H), 5.24
Experimenteller Teil 133
(m, 1H, 22-H), 5.24 (m, 1H, 23-H), 5.74 (s, 1H, 4-H), 6.03 (d, 1H, J = 9.5 Hz, 6-H), 6.61 (d,
1H, J = 9.5 Hz, 7-H).−
13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ = 16.68 (q, C-19), 17.67 (q, C-25), 18.99 (q, C-18), 19.01 (t,
C-1), 19.69 (q, C-28), 20.01 (q, C-27), 21.25 (q, C-21), 25.79 (t, C-11), 27.74 (t, C-16), 33.12
(d, C-26), 34.13 (t, C-2), 34.16 (t, C-12), 35.62 (t, C-15), 36.80 (s, C-10), 39.31 (d, C-20),
42.91 (d, C-24), 44.03 (s, C-13), 44.36 (d, C-9), 55.74 (d, C-17), 123.00 (d, C-4), 124.49 (d,
C-6), 124.49 (s, C-8), 132.58 (d, C-22), 134.11 (d, C-7), 135.04 (d, C-23), 156.18 (s, C-14),
164.54 (s, C-5), 199.65 (s, C-3).−
6.3.3.2. 1,2,6b,7,8,12b-Hexahydro-1,4,7,10,-tetrahydroxy-3,9-perylendion (11) (Stemphy-
perylenol)
9b
3b
5
6
12
9 10
12a
6a
9a
3a
11
7
8
12b
6b
43
2
1
OOH
OH
HO
O OH
H H
Summenformel: C20H16O6.−
Molmasse: 352.−
Schmelzpunkt: 250 °C (Zers.).−
Drehwert: [α]D
20 = + 378 ° (c = 0.20; MeOH).−
Rf-Wert: 0.32 (CH2Cl2/MeOH 4 %).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3410, 1647, 1467, 1228, 1066.−
MS (200 °C) m/z (%): 353 [M + H]+ (8), 352 [M]+ (10), 308 (72), 280 (62), 262 (82), 152 (100).−
134 Experimenteller Teil
1H-NMR (200 MHz, Aceton-d6): δ = 3.03 (dd, 2H, J = 5.8 Hz, J = 14.5 Hz, H- 2a, 8a-H),
3.15 (dd, 2H, J = 11.9 Hz, J = 14.5 Hz, 2b-H, H- 8b), 3.75 (d, 2H, J = 9.0 Hz, 6b-H, 12b-H),
4.75 (m, 2H, 1-H, 7-H), 5.04 (d, J = 5.4 Hz, 1H, OH), 6.81 (d, 2H, J = 8.8 Hz, 5-H, 11-H), 8.14
(d, 2H, J = 8.8 Hz, 6-H, 12-H), 12.10 (s, 2H, OH).−
13C-NMR (50 MHz, Aceton-d6): δ = 45.42 (d, C-6b, C-12b), 47.29 (t, C-2, C-8), 67. 81 (d,
C-1, C-7), 115.08 (d, C-5, C-11), 115.39 (s, C-3a, C-9a), 130.38 (s, C-6a, C-12a), 135.16 (d,
C-6, C-12), 143. 21 (s, C-3b, C-9b), 160.52 (s, C-4, C-10), 203.60 (s, C-3, C-9).−
6.3.3.3. (1S*,12S*,12aR*,12bS*)-1,4,9,12,12a-Pentahydroxy3,10-dioxo-1,2,3,10,11,12,12a,
12b-octahydroperylen (12)
OOH
OH O
HOH
OHOH
1
2
34
5
6
7
8
910
11
12
12a
12b
6a
6b
3a
3b
9a
9b
Summenformel: C20H16O7.−
Molmasse: 368.−
Schmelzpunkt: 180-182 °C.−
Drehwert: [α]D
20 = 451 ° (c = 0.07; MeOH).−
Rf-Wert: 0.25 (CH2Cl2/MeOH 4 %).−
UV (CH3OH): λmax [nm] (ε): 254 (24513), 285.5 (11817), 353.5 (4162).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3473, 3418, 3238, 1651, 1645, 1352, 1223.−
Experimenteller Teil 135
CD (c = 3.94∗10−4 g/ml in MeOH) [nm] (∆ε): 390 (+ 2.8) , 347 (+ 3.7), 294 (+ 5.8).−
MS (200 °C) m/z (%): 369 [M+H]+ (100), 368 [M]+ (70), 307 (60), 306 (80).−
HREIMS: theor.: 368.090
exper.: 368.089 ± 3 ppm Res.: 10.000 (10 % Tal-Def)
1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6): δ = 2.82 (dd, 1H, J = 4.5 Hz, J = 16.3 Hz, 11-H), 2.99 (d,
1H, J = 2.8 Hz, 2-H), 3.01 (d, 1H, J = 8.1 Hz, 2-H), 3.15 (d, 1H, J = 8.6 Hz, 12b-H), 3.17 (dd,
1H, J = 12.5 Hz, J = 16.3 Hz, 11-H), 4.67 (dd, 1H, J = 4.5 Hz, J = 12.5 Hz, 12-H), 4.75 (m,
1H, 1-H), 6.13 (s, 2H, OH), 6.95 (d, 1H, J = 8.7 Hz, 5-H), 7.06 (d, 1H, J = 8.7 Hz, 8-H), 7.95
(d, 1H, J = 8.7 Hz, 6-H), 8.01 (d, 1H, J = 8.7 Hz, 7-H), 12.35(s, 1H, OH), 12.58 (s, 1H, OH).−
13C-NMR (50 MHz, Aceton-d6): δ = 42.97 (t, C-11), 46.73 (t, C-2), 54.48 (d, C-12b), 66.06
(d, C-1), 70.74 (d, C-12), 71.75 (s, C-12a), 114.96 (s, 9a), 116.80 (d, C-5), 117.63 (s, C-3a),
119.16 (d, C-8), 126.52 (s, C-6a oder 6b), 126.69 (s, C6a oder C-6b), 133.33 (d, C-6), 134.05
(d, C-7), 138.75 (s, C-3b), 140.10 (s, C-9b), 162.00 (s, C-4 oder C-9) 162.08 (s, C-4 oder
C-9), 204.03 (s, C-3 oder C-10), 204.32 (s, C-3 oder C-10).−
6.3.4. Strukturdaten und Substanzcharakteristika der Naturstoffe 13, 14, 15 und 16
6.3.4.1. 2,3-Dihydro-4,7-dihydroxy-2,3,3,9-tetramethylnaphtho-[1,2-b]furan-5,6-
dicarbonsäureanhydrid (13)
5'
4'
3'
2'
1'
9a
9
8
7a
76a6
5
3b 3a
4
31
O O
OHHO
O
O
Summenformel: C18H16O6.−
Molmasse: 328.−
136 Experimenteller Teil
Schmelzpunkt: 256 °C.−
Drehwert: [α]D
20 = + 75.1 ° (c = 1.36; CHCl3)
Rf-Wert: 0.60 (CH2Cl2).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3436, 1709, 1623, 1459, 1302, 1035.−
MS (200 °C) m/z (%): 328 [M]+ (37), 312 (100), 295 (29), 269 (58), 257 (30).−
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.34 (s, 3H, 4‘-H), 1.53 (d, 3H, J1‘,2‘ = 6.6 Hz, 1‘-H), 1.59
(s, 3H, 5‘-H), 2.83 (s, 3H, 7a-H), 4.75 (q, 1H, J2‘,1‘ = 6.6 Hz, 2‘-H), 6.82 (s, 1H, 8-H), 11.38
(s, 1H, OH), 11.62 (s, 1H, OH).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 14.92 (q, C-1‘), 21.10 (q, C-5‘), 24.14 (q, C-7a), 25.89 (q,
C-4‘), 43.83 (s, C-3‘), 92.48 (d, C-2‘), 93.74 (s, C-3a), 97.49 (s, C-9a), 108.83 (s, C-6a),
117.60 (d, C-8), 119.50 (s, C-5), 135.61 (s, C-3b), 150.29 (s, C-7), 164.59 (s, C-4), 165.16 (s,
C-3), 165.72 (s, C-1), 166.24 (s, C-9), 166.58 (s, C-6).−
6.3.4.2. 8,9-Dihydro-3,5,7-trihydroxy-1,8,8,9-tetramethyl-5-(1-propyl-2-on)-4H-phenaleno-
[1,2-b]furan-4,6-dion (14)
2c
2b
2a
O
OHHO
O
O
O
HO
5'
4'
3'
2'
1'
9a
9
8
7a
76a6
5
3b 3a
4
3
2
1
Experimenteller Teil 137
Summenformel: C22H22O7.−
Molmasse: 398.−
Schmelzpunkt: 231 °C.−
Rf-Wert: 0.91 (CH2Cl2/MeOH 4 %).−
UV (CH3OH): λmax [nm] (ε): 344.5 (41234), 267.5 (29328), 239 (16634).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3407, 1711, 1645, 1632, 1382.−
MS (200 °C) m/z (%): 398 [M]+ (13), 355 (25), 327 (55), 313 (100), 297 (75), 269 (35).−
HREIMS: theor.: 398.135979
exper.: 398.136553 ± 3 ppm Res.: 5000
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.30 (s, 3H, 4‘-H), 1.33 (s, 3H, 4‘-H), 1.49 (d, 3H,
J1‘,2‘ = 6.6 Hz, 1‘-H), 1.50 (d, 3H, J1‘,2‘ = 6.6 Hz, 1‘-H), 1.54 (s, 3H, 5‘-H), 1.55 (s, 3H,
5‘-H), 2.22 (s, 6H, 2c-H), 2.75 (s, 6H, 7a-H), 3.31 (s, 2H, 2a-H), 3.36 (s, 2H, 2a-H), 3.68 (bs,
2H, OH), 4.66 (q, 2H, J2‘,1‘ = 6.6 Hz, 2‘-H), 6.76 (s, 2H, 8-H), 12.84 (d, 2H, OH), 13.36 (d,
2H, OH).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 14.86 (q, C-1‘), 15.03 (q, C-1‘), 21.00 (q, C-4‘), 24.63 (q,
C-7a), 25.88 (q, C-5‘), 26.11 (q, C-5‘), 31.13 (q, C-2c), 31.27 (q, C-2c), 43.67 (s, C-3‘), 43.70
(s, C-3‘), 51.96 (t, C-2a), 52.29 (t, C-2a), 77.67 (s, C-2), 91.97 (d, C-2‘), 103.08 (s, C-3a),
105.98 (s, C-9a), 110.08 (s, C-6a), 118.25 (d, C-8), 118.75 (s, C-5), 118.88 (s, C-5), 137.85 (s,
C-3b), 149.48 (s, C-7), 149.54 (s, C-7), 165.77 (s, C-4), 165.82 (s, C-4), 166.33 (s, C-9),
166.41 (s, C-9), 166.53 (s, C-6), 166.57 (s, C-6), 197.52 (s, C-3), 197.57 (s, C-3), 199.78 (s,
C-1), 206.45 (s, C-2b), 206.76 (s, C-2b).−
138 Experimenteller Teil
6.3.4.3. 8,9-Dihydro-3,7-dihydroxy-1,8,8,9-tetramethyl-4H-phenaleno-[1,2-b]furan-4,5,6-
trion (15)
5'
4'
3'
2'
1'
9a
9
8
7a
76a6
5
3b 3a
4
3
2
1
O
OHHO
O
O
O
Summenformel: C19H16O6.−
Molmasse: 340.−
Schmelzpunkt: 217 °C.−
Rf-Wert: 0.79 (CH2Cl2/MeOH 4 %).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3421, 1641, 1610, 1447, 1593.−
UV (CH3OH): λmax[nm] (ε): 340.5 (4110), 269.0 (27050), 239.0 (13543).−
MS (200 °C) m/z (%): 340 [M]+ (30), 327 (35), 312 (27), 297 (100), 269 (40).−
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.31 (s, 3H, 4‘-H), 1.32 (s, 3H, 4‘-H), 1.48 (d, 3H,
J1‘,2‘ = 6.5 Hz, 1‘-H), 1.50 (d, 3H, J1‘,2‘ = 5.5 Hz, 1‘-H), 1.55 (s, 3H, 5‘-H), 2.74 (s, 3H,
7a-H), 2.77 (s, 3H, 7a-H), 4.68 (pt, 1H, J2‘,1‘ = 6.5 Hz, 2‘-H), 4.77 (pt, 1H, J2‘,1‘ = 6.6 Hz,
2‘-H), 6.64 (s, 1H, 8-H), 6.71 (s, 1H, 8-H), 12.71 (s, 1H, OH), 12.93 (s, 1H, OH), 1.20 (s,
1H,OH), 13.82 (s, 1H, OH).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 14.90 (q, C-1‘), 20.98 (q, C-4‘), 24.69 (q, C-7a), 24.97 (q,
C-7a), 25.67 (q, C-5‘), 25.91 (q, C-5‘), 43.60 (s, C-3‘), 43.66 (s, C-3‘), 86.95 (s, C-2), 92.25
(d, C-2‘), 92.91 (d, C-2‘), 102.28 (s, C-3a), 105.05 (s, C-3a), 108.21 (s, C-9a), 109.84 (s,
Experimenteller Teil 139
C-9a), 110.34 (s, C-6a), 110.96 (s, C-6a), 118.47 (d, C-8), 119.01 (d, C-8), 119.12 (s, C-5),
119.50 (s, C-5), 138.34 (s, C-3b), 138.68 (s, C-3b), 150.40 (s, C-7), 152.10 (s, C-7), 166.76 (s,
C-4), 167.29 (s, C-6), 168.27 (s, C-9), 168.78 (s, C-9), 177.02 (s, C-2), 179.28 (s, C-3),
179.52 (s, C-1), 193.76 (s, C-3), 196.00 (s, C-1).−
6.3.4.4. 7,8-Dihydro-3,6-dihydroxy-1,7,7,8-tetramethylacenaphthol[5,4-b]furan-4,5-dion (16)
1 3
4
3a
3b
5
6
6a
7
7a
8
9
9a
1'
2'
3'4'
5'
O
OHHO
O
O
Summenformel: C18H16O5.−
Molmasse: 312.−
Schmelzpunkt: 202 °C.−
Rf-Wert: 0.79 (CH2Cl2/MeOH 4 %).−
[α]D
20 = − 101.1 ° (c = 0.11; CHCl3)
IR (KBr): ν[cm−1] = 3432, 1685, 1634, 1617, 1364.−
MS (200 °C) m/z (%): 312 [M]+ (28), 297 (75), 285 (20), 269 (100), 241 (20), 213 (32).−
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.31 (s, 3H, 4‘-H), 1.50 (d, 3H, J1‘,2‘ = 6.7 Hz, 1‘-H), 1.55
(s, 3H, 5‘-H), 2.76 (s, 3H, 7a-H), 4.70 (q, 1H, J2‘,1‘ = 6.3 Hz, 2‘-H), 6.67 (s, 1H, 8-H), 7.63 (s,
1H, OH), 7.89 (s, 1H, OH).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 14.89 (q, C-1‘), 21.43 (q, C-4‘), 22.42 (q, C-7a), 26.08 (q,
C-5‘), 43.69 (s, C-3‘), 92.35 (d, C-2‘), 106.49 (s, C-3a), 107.44 (s, C-9a), 109.57 (s, C-6a),
140 Experimenteller Teil
117.85 (d, C-8), 119.96 (s, C-5), 146.81 (s, C-7), 151.56 (s, C-3b), 154.72 (s, C-9), 155.28 (s,
C-4), 164.78 (s, C-6), 186.53 (s, C-3), 190.06 (s, C-1).−
6.3.5. Strukturdaten und Substanzcharakteristika der Naturstoffe 17, 18 und 19
6.3.5.1. 3‘-Methoxy-4‘-chloromucidin (Strobilurin B) (17)
16
15
13
12
11
14
10
9
8
7
O
O O
O
Cl
1
2
3
4
5
6
17
Summenformel: C17H19ClO4.−
Molmasse: 322.−
Rf-Wert: 0.82 (CH2Cl2/MeOH 1 %).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 1705, 1622, 1235, 1121.−
MS (200 °C) m/z (%): 322 [M]+ (100), 290 (36), 263 (50), 231 (35), 206 (35), 185 (80).−
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.01 (s, 3H, 14-H), 3.76 (s, 3H, 16-H), 3.87 (s, 3H, 15-H),
3.92 (s, 3H, 17-H), 6.27 (dd, 1H, J9,14 = 1.3 Hz, J8,9 = 10.3 Hz, 9-H), 6.44 (d, 1H, J7,8 = 15.5 Hz,
7-H), 6.61 (dd, 1H, J8,7 = 15.5 Hz, J8,9 = 10.3 Hz, 8-H), 6.87 (d, 1H, J1,5 = 1.7 Hz, 1-H), 6.92
(dd, 1H, J5,1 = 7.1 Hz, J5,4 = 8.2 Hz, 5-H), 7.27 (d, 1H, J4,5 = 8.2 Hz, 4-H), 7.46 (s, 1H,
12-H).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 24.17 (q, C-14), 52.03 (q, C-16), 56.49 (q, C-17), 62.38 (q,
C-15), 110.46 (d, C-1), 111.06 (s, C-11), 119.49 (d, C-5), 121.48 (s, C-3), 127.66 (d, C-8),
129.93 (s, C-9), 130.49 (d, C-4), 130.68 (d, C-7), 132.61 (s, C-10), 138.30 (s, C-6), 155.34 (s,
C-2), 159.36 (d, C-12), 168.14 (s, C-13).−
Experimenteller Teil 141
6.3.5.2. [2(E),3Z,5E]-6-[3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-3-[(3-methyl-2-butenyl)oxy]-2H-1,5-
benzodioxepin-7-yl]-2-(methoxymethylen)-3-methyl-3,5-hexadiensäure-
methylester (18)
16
15
13
12
11
14
10
9
8
71
2
3
4
5
6
26
25 24
23
22
18
O
O
O O
O
O
19
17
20
21
Summenformel: C26H34O6.−
Molmasse: 442.−
Rf-Wert: 0.62 (CH2Cl2/MeOH 2 %).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 1708, 1500, 1266, 1118.−
Drehwert: [α]D
20 = + 21.0 ° (c = 0.64, EtOH)
MS (200 °C) m/z (%): 442 [M]+ (20), 305 (40), 237 (60), 153 (100).−
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.25 (s, 3H, 20-H), 1.50 (s, 3H, 21-H), 1.72 (s, 3H, 26-H),
1.79 (s, 3H, 25-H), 1.99 (s, 3H, 14-H), 3.53 (dd, 1H, J17,18 = 3.3 Hz, J17,18 = 7.7 Hz, 18-H),
3.77 (s, 3H, 16-H), 3.87 (s, 3H, 15-H), 3.98 (m, 1H, 17-H), 4.10 (m, 1H, 22-H), 4.15 (m, 1H,
22-H), 4.26 (m, 1H, 17-H), 5.36 (m, 1H, 23-H), 6.24 (dd, 1H, J9,14 =1.3 Hz, J9,8 = 10.0 Hz,
9-H), 6.38 (d, 1H, J7,8 = 15.3 Hz, 7-H), 6.52 (dd, 1H, J8,9 = 10.0 Hz, J8,7 = 15.3 Hz, 8-H), 6.87
(d, 1H, J4,5 = 8.8 Hz, 4-H), 6.94 (d, 1H, J1,5 2.0 Hz, 1-H), 6.97 (d, 1H, J5,4 = 8.8 Hz, J5,1 = 2.0 Hz,
5-H), 7.45 (s, 1H, 12-H).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 18.51 (q, C-26), 21.21 (q, C-20), 24.09 (q, C-14), 26.24 (q,
C-25), 28.13 (q, C-21), 52.04 (q, C-16), 62.35 (q, C-15), 67.77 (t, C-22), 69.13 (t, C-17),
81.01 (s, C-19), 82.37 (d, C-18), 111.23 (s, C-11), 121.02 (d, C-4), 121.31 (d, C-23), 121.96
(d, C-5), 122.79 (d, C-1), 126.07 (d, C-8), 130.20 (d, C-9), 130.75 (d, C-7), 131.19 (s, C-10),
142 Experimenteller Teil
134.12 (s, C-6), 137.82 (s, C-24), 147.24 (s, C-2), 151.18 (s, C-3) 159.24 (d, C-12), 168.23 (s,
C-13).−
6.3.5.3. 3-Chlor-4-hydroxy-(3,7,11-trimethyl-2,6,10-dodecatrienyl)-benzoesäureamid (19)
O
H2N
OH
Cl
22
1
2
3
4
5
67
8910
11
12 13 14
15
16 17
18 19 20
21
Summenformel: C22H30ClNO2.−
Molmasse: 375.−
Schmelzpunkt: 47−49 °C.−
Rf-Wert: 0.31−0.42 (CH2Cl2/MeOH 3 %).−
UV (CH2Cl2): λmax [nm] (ε): 429 (599), 274.5 (45270), 257.5 (7786), 233.5 (5847).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3458, 3378, 3197, 1654, 1388.−
MS (200 °C) m/z (%): 377 [M (37Cl)]+ (4), 375 [M (35Cl)]+ (12), 239 (41), 222 (20), 191
(40), 184 (30), 136 (46), 81 (32), 69 (100), 41 (45).−
HREIMS: theor.: 375.1965
exper.: 375.1974 ± 5 ppm Res.: 8.000 (10 % Tal-Def)
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.62 (s, 6H, 19-H, 20-H), 1.70 (s, 3H, 21-H), 1.77 (s, 3H,
18-H), 1.94−2.12 (m, 8H, 10-H, 11-H, 14-H, 15-H), 3.44 (d, 2H, J7,8 = 7.2 Hz, 7-H), 5.11 (m,
1H, 12-H), 5.13 (m, 1H, 16-H), 5.35 (t, 1H, J8,7 = 7.2 Hz, 8-H), 6.00 (bs, 2H, NH2), 6.12 (bs,
1H, OH), 7.53 (d, 1H, J1,3 = 1.8 Hz, 1-H), 7.74 (d, 1H, J3,1 = 2.0 Hz, 3-H).−
Experimenteller Teil 143
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 16.47 (q, C-19), 16.71 (q, C-18), 18.13 (q, C-20), 26.14 (q,
C-21), 26.92 (t, C-11), 27.11 (t, C-15), 29.41 (t, C-7), 40.12 (t, C-10), 40.12 (t, C-14), 120.53
(s, C-4), 121.00 (d, C-8), 124.27 (d, C-12), 124.74 (d, C-16), 126.30 (s, C-2), 126.81 (d, C-3),
128.12 (d, C-1), 129.86 (s, C-6), 131.76 (s, C-17), 135.75 (s, C-13), 138.55 (s, C-9), 153.01
(s, C-5), 168.57 (s, CONH2).−
6.3.6. Strukturdaten und Substanzcharakteristika des Naturstoffs 20 und dessen
Triacetats
6.3.6.1. 3,7-Dihydroxy-2,4,-dimethyloctansäure-7,7‘,7‘‘-trilactid (20)
1
2345
6
78
9
10 O
O O
O
O
O
H OHH
H H
H
HO
H
H
H
HH
OH
H
H
Summenformel: C30H54O9.−
Molmasse: 558.−
Schmelzpunkt: 108−110 °C.−
Drehwert: [α]D
20 = − 2.5 ° (c = 0.6; CH2Cl2).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 3435, 1728, 1458, 1375, 1182, 1124.−
MS (200 °C) m/z (%): 558 [M]+ (1.5), 540 (2), 530 (2.5), 355 (5), 270 (18), 187 (92), 169
(100), 113 (88), 95 (22).−
144 Experimenteller Teil
MS (CI/NH3 (pos.)) m/z (%): 576 [M+NH4]+ (100), 558 [M]+ (10).−
HRMS (DCI/NH3 (neg.)): theor.: 557.37679 [M−H]−
exper.: 557.36562 ± 3.3 ppm Res.: 3000 (10 % Tal-Def)
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.87 (d, 3H, J6,5 = 6.5 Hz, 6-H), 1.09 (d, 3H, J9,8 = 7.0 Hz,
9-H), 1.26 (d, 3H, J1,2 = 6.3 Hz, 1-H), 1.35−1.50 (m, 2H, 4-H), 1.47−1.68 (m, 2H, 3-H), 1.54
(m, 1H, 5-H), 2.56 (m, 1H, 8-H), 3.61 (dd, 1H, J7,5 = 2.4 Hz, J7,8 = 8.8 Hz, 7-H), 5.06 (m, 1H,
2-H).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 12.04 (q, C-6), 14.44 (q, C-9), 20.62 (q, C-1), 29.12 (t, C-4),
34.07 (t, C-3), 34.71 (d, C-5), 44.16 (d, C-8), 71.11 (d, C-2), 77.05 (d, C-7), 177.05 (s,
C-10).−
6.3.6.2. 3-Acetoxy-7-hydroxy-2,4,-dimethyloctansäure-7,7‘,7‘‘-trilactid
O
O O
O
O
O
H OH
H H
H
O
H
H
H
HH
O
H
H
O
O
O
1
2345
6
78
9
10
11
12
Der Macrolid 20 (2 mg, 3.6 µmol) wird in Essigsäureanhydrid (0.1 ml) mit Pyridin (0.03 ml)
und DMAP (1 mg) versetzt. Nach zweistündigem Rühren bei Raumtemperatur wird der
Reaktionsansatz in Dichlormethan aufgenommen und siebenmal mit 2 molarer Salzsäure
gewaschen. Anschließend wird die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und
das Lösungsmittel mit einer Heißluftpistole (Stufe 1) abgedampft. Das so erhaltene
gelbgefärbte Öl wird nochmals unter Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung
vermessen (Ausbeute: ca. 2.2 mg, 90 %)
Experimenteller Teil 145
Rf-Wert: 0.8 (CH2Cl2/MeOH 2 %).−
IR (KBr): ν[cm−1] = 1742, 1726, 1273, 1183, 1027.−
MS (DCI/NH3 (neg.)) m/z (%): 683 [M−H]−.−
HRMS (DCI/NH3 (neg.)): theor.: 663.39651 [M−H]−.−
exper.: 663.40063 ± 4.1 ppm Res.: 3000 (10 % Tal-Def)
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.90 (d, 3H, J6,5 = 6.8 Hz, 6-H), 1.18 (d, 3H, J1,2= 6.5 Hz,
1-H), 1.20 (d, 3H, J9,8= 7.1 Hz, 9-H), 1.30−2.00 (m, 5H, 3-H, 4-H, 5-H), 2.11 (s, 3H, 12-H),
2.83 (m, 1H, 8-H), 4.90 (m, 1H, 2-H), 5.15 (dd, 1H, J7,5 = 4.0 Hz, J7,8 = 8.2 Hz, 7-H).−
6.4. Experimenteller Teil zur Naturstoffsynthese des Stemphyperylenols (11)
6.4.1. 2,6-Dihydroxyanthracen (34)
OH
HO
1
2
3
4
5
6
7
89
10
9a
5a4a
8a
In einem 500 ml Dreihalskolben wird 2,6-Dihydroxyanthrachinon (33) (3.0 g, 0.0125 mol)
mit Natriumborhydrid (6.0 g, 0.1546 mol) in einer 2N Natriumcarbonatlösung (100 ml) sechs
Stunden bei Raumtemperatur unter heftiger Gasentwicklung gerührt. Der Reaktionsansatz
verfärbt sich dabei dunkelrot. Nach Beendigung der Gasentwicklung und erfolgter
Umsatzkontrolle mittels Dünnschichtchromatographie wird der Ansatz mit 6N Salzsäure
(150 ml) angesäuert und der Feststoff abgesaugt. Dieser wird abschließend durch Flash-Chro-
matographie (LM: CH2Cl2/MeOH 3 %) gereinigt. Die Ausbeute an gelbem 2,6-Dihydroxy-
anthracen 34 beträgt 2.42 g (92 %) (Smp.: 270 °C (Zers.); Lit.[126]).
Rf-Wert: 0.3 (CH2Cl2/MeOH 3 %).−
146 Experimenteller Teil
1H-NMR (200 MHz, Aceton-d6): δ = 7.14 (dd, 2H, J3,4 (7,8) = 9.0 Hz, J3,1 (7,5) = 2.4 Hz, 3-H,
7-H), 7.24 (d, 2H, J1,3 (5,7) = 2.2 Hz, 1-H, 5-H), 7.85 (d, 2H, J4,3 (8,7) = 9.0 Hz, 4-H, 8-H), 8.15
(s, 2H, 9-H, 10-H), 8.62 (s, 2H, 2 OH).−
13C-NMR (50 MHz, Aceton-d6): δ = 107.44 (d), 120.54 (d), 123.83 (d), 128.91 (s),
129.70 (d), 131.83 (s), 154.19 (s).−
6.4.2. 2,6-Dimethoxyanthracen (35)
O
O
1
2
3
4
5
6
7
89
10
9a
5a4a
8a
11
12
Zu einer Mischung bestehend aus 2,6-Dihydroxyanthracen (34) (3.5 g, 0.0147 mol) und
Kaliumcarbonat (11.7 g, 0.0847 mol) in 500 ml trockenem Aceton wird unter Rühren
Dimethylsulfat (42 ml) getropft. Nach sechsstündigem Refluxieren wird der Reaktionsansatz
auf Raumtemperatur abgekühlt und mittels eines Tropftrichters mit Triethylamin (50 ml)
versetzt. Das Aceton und Trimethylamin werden am Rotationsverdampfer abgezogen und der
Rückstand auf Eiswasser (400 ml) gegossen. Der Feststoff wird abgesaugt und in Eisessig
(100 ml) umkristallisiert. Man erhält das Dimethoxyanthracen 35 in Form eines hellgelben
Feststoffs (Ausbeute: 3.4 g, 86 %) (Smp.: 251 °C, Lit.[127] 257 °C).
Rf-Wert: 0.8 (CH2Cl2).−
MS (200 °C) m/z (%): 238 [M]+ (53), 223 (10), 208 (50), 195 (48), 165 8100), 152 (35).−
1H-NMR (200 MHz, Aceton-d6): δ = 4.00 (s, 6H, 11-H, 12-H), 7.18 (dd, 2H, J3,4 (7,8) =
8.8 Hz, J3,1 (7,5) = 2.5 Hz, 3-H, 7-H), 7.21 (s, 2H, 1-H, 5-H), 7.88 (d, 2H, J4,3 (8,7) = 8.8 Hz,
4-H, 8-H), 8.24 (s, 2H, 9-H, 10-H).−
Experimenteller Teil 147
6.4.3. 2,6-Dimethoxy-9,10-dihydro-9,10-ethanoanthracen-11,12-carbonat (36)
13
10b
10
9b
12
1
2
3
4
5
6
7
89
9a
5a4a
8a
11
O
O
O
O
O
2,6-Dimethoxyanthracen (35) (0.25 g, 1.1 mmol) wird in einem 25 ml Dreihalskolben mit
Vinylencarbonat (45) zehn Stunden bei 170−180 °C unter Argonatmosphäre refluxiert. Nach
Beendigung der Reaktion und anschließender Umsatzkontrolle wird das überschüssige
Vinylencarbonat (45) abdestilliert und im nächsten Ansatz wiederverwandt. Der verbleibende
schwarze Rückstand wird mit Dichlormethan (4 x 25 ml) ausgelaugt. Das Lösungsmittel wird
am Rotationsverdampfer abgezogen und der Rückstand säulenchromatographisch (LM:
CH2Cl2) gereinigt. Die Ausbeute an weißem Diels-Alder-Produkt 36 beträgt 0.243 g (71 %).
Rf-Wert: 0.4 (CH2Cl2).−
Schmelzpunkt: 150 °C.−
IR (KBr): ν[cm−1] = 1789, 1779, 1619, 1484, 1165, 1020.−
MS (200 °C) m/z (%):325 [M+H]+ (10), 324 [M]+ (25), 238 (100), 195 (38).−
HREIMS: theor.: 324.09976
exper.: 324.10048 ± 2.2 ppm
UV (CH2Cl2): λmax [nm] (ε): 283.5 (47114), 229.5 (4158).−
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.82 (s, 6H, 11-H, 12-H), 4.61 (d, 2H, J9,9b (10,10b) = 1.7 Hz,
9-H, 10-H), 4.89 (pt, 2H, J9b,9 (10b,10) = 1.7 Hz, 9b-H, 10b-H) 6.74−6.82 (m, 2H, 3-H, 7-H),
6.97 (d, 2H, J1,3 (5,7) = 2.4 Hz, 1-H, 5-H), 7.30 (d, 2H, J4,3 (8,7) = 8.2 Hz, 4-H, 8-H).−
148 Experimenteller Teil
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 47.49 (d), 47.64 (d), 55.78 (q), 55.93 (q), 76.80 (d), 112.22
(d), 112.81 (d), 112.92 (d), 113.02 (d), 126.93 (d), 127.84 (d), 128.25 (s), 129.78 (s), 138.65
(s), 140.07 (s), 154.70 (s), 159.54 (s), 159.69 (s).−
6.4.4. 2,6 Dimethoxy-9,10-dihydro-9,10-ethanoanthracen-11,12-diol (37)
10b
10
9b
12
1
2
3
4
5
6
7
89
9a
5a4a
8a
11
OH
OH
O
O
Das cyclische Anthracencarbonat (36) (0.3 g, 0.9 mmol) wird zu einer Lösung aus Kalium-
hydroxid (0.1 g, 1.8 mmol) in Wasser (0.3 ml) und Ethanol (2.4 ml) gegeben und auf 70 °C
erwärmt. Nach beendeter Gasentwicklung (ca. zwei Stunden) wird nochmals Kaliumhydroxid
(0.05 g, 0.9 mmol) in den Reaktionsansatz gegeben und weitere 1.5 Stunden erhitzt. Der
Feststoff wird abfiltriert und mit Dichlormethan ausgelaugt. Die wässrige Phase wird von
dem übrigen Filtrat abgetrennt. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet
und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen. Die Reinigung des Produktes
erfolgt mittels Säulenchromatographie (LM: CH2Cl2:MeOH 99:1). Man erhält das Diol 37 in
Form eines weißen Feststoffs (Ausbeute: 0.265 g, 96 %).
Rf-Wert: 0.4 (CH2Cl2/MeOH 2 %).−
Schmelzpunkt:224−226 °C.−
IR (KBr): ν[cm−1] =3384, 3365, 3183, 1611, 1484, 1255, 1142, 1029.−
UV (CH2Cl2): λmax [nm] (ε): 287.0 (37423), 241.5 (5755).−
MS (200 °C) m/z (%): 298 [M]+ (2), 238 (100), 195 (30).−
Experimenteller Teil 149
MS (CI/NH3 (pos.)) m/z (%): 316 [M+NH4]+ (100), 298 [M]+ (25).−
MS (DCI/NH3 (neg.)) m/z (%): 297 [M−H]− (70), 268 (100).−
HRMS (DCI/NH3 (neg.)): theor.: 297.11267 [M−H]−
exper.: 297.11169 ± 3.3 ppm Res.: 4000 (10 % Tal-Def)
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.04 (s, 2H, OH) 3.79 (s, 6H, 11-H, 12-H), 4.10 (s, 2H,
9-H, 10-H), 4.31 (s, 2H, 9b-H, 10b-H) 6.71 (m, 2H, 3-H, 7-H), 6.94 (d, 2H, J1,3 (5,7) = 2.4 Hz,
1-H, 5-H), 7.26 (d, 2H, J4,3 (8,7) = 8.5 Hz, 4-H, 8-H).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 51.14 (q), 51.24 (q), 55.79 (d), 68.48 (d), 68.62 (d), 111.45
(d), 111.60 (d), 111.75 (d), 113.25 (d), 125.94 (d), 127.50 (d), 130.95 (s), 132.43 (s), 141.28
(s), 142.42 (s), 158.91 (s), 158.97 (s).−
6.4.5.2,6-Dimethoxy-9,10-dihydro-anthracen-9,10-dicarbaldehyd (38)
H
O
H
O
O
O
8a
4a
5a
9a
9
8
7
654
3
2
1
12
9b
10
10b
Eine Lösung von Natriumperjodat (1.02 g, 4.7 mmol) in Wasser (3.7 ml) wird zu einer
Suspension bestehend aus dem Diol 37 (1.25 g, 4.2 mmol), Wasser (48 ml) und Ethanol
(0.75 ml) gegeben. Der Reaktionsansatz wird vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach
Beendigung der Reaktion wird mit Dichlormethan (100 ml) extrahiert. Die organische Phase
wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend wird das Lösungsmittel am Rotations-
verdampfer abgezogen und der verbleibende Feststoff säulenchromatographisch (LM:
CH2Cl2) gereinigt. Die Ausbeute an Dialdehyd 38 beträgt 0.94 g (93 %).
150 Experimenteller Teil
Rf-Wert: 0.4 (CH2Cl2/MeOH 1 %).−
Schmelzpunkt: 173 °C.−
IR (KBr): ν[cm−1] = 1723, 1713, 1610, 1510, 1230, 1031.−
UV (CH2Cl2): λmax [nm] (ε): 450.0 (2134), 340.0 (7527) 287.5 (44025).−
MS (200 °C) m/z (%): 296 [M]+ (1), 267 (15), 239 (100), 238 (60), 195 (30).−
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 3.87 (s, 6H, 11-H, 12-H), 4.86 (d, 2H, J9.9b (10,10b) = 2.2 Hz,
9-H, 10-H), 6.97 (m, 2H, 3-H, 7-H), 7.01 (d, 2H, J1,3 (5,7) = 2.4 Hz, 1-H, 5-H), 7.33 (d, 2H,
J4,3 (8,7) = 8.3 Hz, 4-H, 8-H), 9.39 (d, 2H, J9b,9 (10b,10) = 2.1 Hz, 9b-H, 10b-H).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 55.85 (q), 59.75 (d), 114.67 (d), 115.36 (d), 122.33 (s),
131.12 (d), 132.06 (s), 160.18 (s), 196.96 (d).−
6.4.6. 4-Chlorethylencarbonat (46)
OO
O
Cl
2
45
Ethylencarbonat (47) (20.0 g, 0.23 mol) und Sulfurylchlorid (30.1 g, 0.23 mol) werden in
125 ml trockenem CCl4 gelöst und in einem UV-Reaktor unter Bestrahlung mit einer 500 W
UV- Lampe auf 80 °C erhitzt. Die Kontrolle der heftig einsetzenden Reaktion erfolgt durch
die Regulierung der Intensität der Bestrahlung. Freiwerdendes SO2- und HCl-Gas wird
mittels eines PVC-Schlauches aus der Apparatur direkt in die Entlüftung des Abzuges
geleitet. Nach 3 Stunden wird der Reaktionsansatz auf Raumtemperatur abgekühlt. Die untere
Phase des Zweiphasengemisches, welche hauptsächlich CCl4 enthält, wird abgetrennt und im
nächsten Ansatz wiederverwandt.
Experimenteller Teil 151
Die obere Phase wird am Rotationsverdampfer eingeengt und destillativ (90 °C, 47 mbar) ge-
reinigt. Man erhält 25.8 g eines Gemisches, bestehend aus 75 % 4-Chlorethylencarbonat (46)
(1H-NMR-Analyse) und 25 % Ethylencarbonat (47), das direkt in der nächsten Stufe einge-
setzt wird.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 4.54−4.64 (m, 1H, 5-H), 4.81−4.90 (m, 1H, 5-H), 6.48 (dd,
1H, J4,5 = 5.5 Hz, J4,5 = 1.5 Hz, 4-H).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 74.50 (t, C-5), 86.09 (d, C-4), 153.17 (s, C-2).−
6.4.7. Vinylencarbonat (45)
OO
O
Zu einem 3:1-Gemisch (25.8 g), bestehend aus Chlorethylencarbonat 46 und Ethylencarbo-
nat 47 wird in 30 ml trockenem Diethylether unter Rückflußbedingungen 4 Stunden Triethyl-
amin (27.2 g, 0.269 mol) getropft. Nach 39-stündigem Refluxieren wird der schwarze
Rückstand viermal mit Dichlormethan (4 x 150 ml) ausgelaugt. Das Lösungsmittel wird am
Rotationsverdampfer abgezogen und der Rückstand durch zweimalige Kugelrohrdestillation
gereinigt. Man erhält des Vinylencarbonat in Form von farblosen Kristallen (15.3 g, ca. 79 %,
Sdp. 120 °C, 43 mbar, Schmp. 22 °C, Lit.[129,130] 22 °C).
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 7.17 (s, 2H, 4-H, 5-H).−
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 132.06 (d, C-4, C-5), 153.75 (C-2).−
152 Abkürzungen/Literaturverzeichnis
7. Abkürzungen
CI Chemische Ionisation
DCI Direkte chemische Ionisation
EI Elektronenstoß-Ionisation
HRMS High Resolution Mass Spectrometry
COLOC Correlation Spectroscopy via Long-Range Coupling
COSY Correlation Spectroscopy
HMBC Heteronuclear Multibond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
NOE Nuclear Overhauser Effect
SC Säulenchromatographie
PSC Präparative Schicht-Chromatographie
8. Literaturverzeichnis
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Lebenslauf
Persönliche Daten: Markus John
Buschweg 13
59609 Anröchte
geb. am 09. August 1966 in Lippstadt
verheiratet, 1 Kind
Schulausbildung:
1973 – 1977 Grundschule in Anröchte
1977 – 1983 Realschule in Anröchte
Abschluß: Fachoberschulreife
1986 – 1989 Abendgymnasium in Lippstadt
Abschluß: allgemeine Hochschulreife
Berufsausbildung:
1983 – 1986 Ausbildung zum Werkzeugmacher
Hella KG in Lippstadt
Berufstätigkeit:
1986 – 1989 Werkzeugmacher
Studium:
1989 Studium der Tiermedizin an der tiermedizinischen
Hochschule in Hannover
1990 – 1995 Studium der Chemie an der Universität-Gesamthochschule
Paderborn
Vordiplom 02/1993
Diplom 10/1995
Thema der Diplomarbeit: Synthese und Untersuchung des
Schmelzverhaltens von flüssigkristallinen Azofarbstoffen
Promotion:
1996 − 1998 Experimenteller Teil der Dissertation unter der Leitung von
Herrn Prof. K. Krohn an der Universität-Gesamthochschule
Paderborn
Berufspraxis:
11/1995 – 05/1998 wissenschaftlicher Mitarbeiter in der Organischen Chemie an
der Universität-Gesamthochschule Paderborn
Betreuung und Wartung des Kernresonanzspektrometers
