Isolierung, Strukturaufklärung und Syntheseversuche von biologisch aktiven Sekundärmetaboliten aus endophytischen Mikromyceten / von Karl-Heinz E. Drogies [original]

Isolierung, Strukturaufklärung und Syntheseversuche von biologisch

aktiven Sekundärmetaboliten aus endophytischen Mikromyceten

Vom Fachbereich Chemie und Chemietechnik

der Universität-Gesamthochschule-Paderborn

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

– Dr. rer. nat. –

genehmigte Dissertation

von

Karl-Heinz E. Drogies

aus Bad Driburg

Paderborn 1997

Referent: Prof. Dr. Karsten Krohn

Koreferent: Prof. Dr. Nikolaus Risch

Eingereicht am: 03. Oktober 1997

Tag der mündlichen Prüfung: 27. November 1997

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom Februar 1997 bis zum Oktober 1997 im

Fachbereich Chemie und Chemietechnik der Universität-GH-Paderborn unter der

Leitung von Herrn Prof. Dr. Karsten Krohn angefertigt.

Herrn Prof. Dr. Karsten Krohn danke ich für die interessante Themenstellung und die

wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. Nikolaus Risch danke ich für die bereitwillige Übernahme des

Koreferats.

Weiterhin gilt mein Dank all meinen Kunden für die finanzielle Unterstützung.

Die vorliegende Arbeit wurde in Kooperation mit der BASF AG Ludwigshafen und

finanzieller Unterstützung des BMBF (Bundesministerium für Bildung und

Forschung) angefertigt.

Für den einsamsten Menschen der Welt, den Verkäufer.

Für die wunderbarsten „natural products“, Gabriele, Phillip und Lilly.

INHALTSVERZEICHNIS

1EINLEITUNG...................................................................................1

1.1 Klassifizierung der Pilze.....................................................................1

1.2 Sekundärstoffwechsel und Sekundärmetabolite ................................3

1.3 Antibiotika und Mykotoxine ..............................................................5

2Problemstellung.................................................................................9

3Hauptteil I.........................................................................................10

3.1 Stamm 1948......................................................................................10

3.1.1 Pilzbeschreibung ___________________________________________10

3.1.2 Isolierung_________________________________________________10

3.1.3 Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe_______________11

3.1.3.1 Naturstoff 1948.I________________________________________11

3.1.3.2 Naturstoff 1948.II _______________________________________13

3.1.4 Biologische Aktivität________________________________________14

3.1.5 Kurzbeschreibung der Pharma-Grundscreeningtests ________________15

3.2 Stamm 2049......................................................................................17

3.2.1 Pilzbeschreibung ___________________________________________17

3.2.2 Isolierung_________________________________________________17

3.2.2.1 Naturstoff 2049.I________________________________________17

3.2.3 Strukturaufklärung und Charakteristik des Naturstoffes 2049.I ________18

3.2.4 Biologische Aktivität________________________________________20

3.3 Substanz 2049.II...............................................................................20

3.4 Stamm 1727......................................................................................21

3.4.1 Pilzbeschreibung ___________________________________________21

3.4.2 Isolierung des Naturstoffes 1727.I und 1727.II ____________________21

3.4.3 Strukturaufklärung des Naturstoffes 1727.I _______________________22

3.4.4 Biologische Aktivität________________________________________24

3.4.5 Naturstoff 1727.II __________________________________________25

3.5 Stamm 2072......................................................................................27

3.5.1 Pilzbeschreibung ___________________________________________27

3.5.2 Isolierung_________________________________________________27

3.6 Strukturaufklärung des Naturstoffes 2072.I....................................28

3.6.1 Ermittlung der relativen Konfiguration __________________________35

3.6.2 Biosynthese des Naturstoffes 2072.I ____________________________36

3.6.3 Strukturaufklärung des Naturstoffes 2072.II ______________________37

3.6.3.1 Ermittlung der relativen Konfiguration _______________________40

INHALTSVERZEICHNIS

3.6.4 Biologische Aktivität des Naturstoffes 2072.II ____________________41

3.6.5 Strukturaufklärung des Naturstoffes 2072.III______________________42

3.6.6 Strukturaufklärung des Naturstoffes 2072.IV______________________44

3.6.7 Aufklärung der relativen Konfiguration des Naturstoffes 2072.IV______52

3.6.8 Stamm 3042 ______________________________________________54

3.6.9 Pilzbeschreibung ___________________________________________54

3.6.10 Isolierung aus dem Stamm 3042 ______________________________54

3.6.10.1 Naturstoffe 3042.I–3042.VI______________________________54

3.6.11 Strukturaufklärung der Naturstoffe ____________________________55

3.6.11.1 Naturstoff 3042.I ______________________________________55

3.6.11.2 Naturstoff 3042.II _____________________________________57

3.6.11.3 Naturstoff 3042.III_____________________________________58

3.6.11.4 Naturstoff 3042.IV_____________________________________59

3.6.11.5 Naturstoff 3042.V _____________________________________61

3.6.11.6 Naturstoff 3042.VI_____________________________________62

3.6.12 Biosynthese der Colletorine und Ascochlorine ___________________62

3.6.13 Biologische Aktivität_______________________________________63

4Hauptteil II.......................................................................................64

4.1 Retrosynthetische Überlegungen zur Partialsynthese......................64

4.2 Durchführung...................................................................................66

5Zusammenfassung und Ausblick.................................................69

6EXPERIMENTELLER TEIL......................................................71

6.1 Allgemeine Methoden und Meßverfahren........................................71

6.2 Durchführung der Aktivitätstests ....................................................73

6.3 Experimenteller Teil der Naturstoffisolierung .................................74

6.3.1 Pilzstamm 1948____________________________________________74

6.3.1.1 Isolierung _____________________________________________74

6.3.2 Strukturdaten und physikalische Eigenschaften ____________________75

6.3.2.1 Ergosta-4,7,22-trien-3-on (1948.I)___________________________75

6.3.2.2 5,8-Epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol (1948.II)__________76

6.3.3 Pilzstamm 2049____________________________________________77

6.3.3.1 Isolierung _____________________________________________77

6.3.4 Strukturdaten und physikalische Eigenschaften ____________________78

6.3.4.1 1,2-Diacetyl-5,10-dihydroxy-3,7,8,12-tetramethoxy-1,2–dihydro-

benzo[ghi]-perylen-4,11-dion (2049.I)_____________________________78

6.3.5 Stamm 1727 ______________________________________________79

INHALTSVERZEICHNIS

6.3.5.1 Isolierung _____________________________________________79

6.3.6 Strukturdaten und physikalische Eigenschaften ____________________79

6.3.6.1 3,4,4a,5,6,7-Hexahydro-8-hydroxy-3-methyl-1H-2-benzopyran-1-on

(1727.I)___________________________________________________79

6.3.6.2 3-(2-Hydroxypropyl)-cyclohexan-1-on (1727.II)________________80

6.3.7 Stamm 2072 ______________________________________________81

6.3.7.1 Isolierung _____________________________________________81

6.3.8 Strukturdaten und physikalische Eigenschaften ____________________82

6.3.8.1 2-(1´-cis-3´,5´-Dimethylhept-1´-enyl)-3,4-dihydroxy-7-methyl-

2,3,4,4a,7,7a-tetrahydrofuro[3,4-b]pyran-5-on (2072.I)_________________82

6.3.8.2 3,4-Dihydroxy-2-(1´-cis-5´-Hydroxy-3´,5´-Dimethylhept-1´-enyl)-7-

methyl-2,3,4,4a,7,7a-hexahydrofuro[3,4-b]pyran-5-on (2072.II)__________83

6.3.8.3 3,4,8-Trihydroxy-3,4,4a,8a-tetrahydro-2H-naphtalin-1-on (2072.III)85

6.3.8.4 [3R*-[3α,3aβ,4aα,5β,6β,8aβ,9α,10S*(Ξ),11R*]]-3a,4,4´,5´,8,8a,9,9a-

Octahydro-5,9,11-trihydroxy-9a-methyl-10-(2-Methyl-1-oxobutyl)spiro[9,11-

epoxy-3,4a-ethano-4aH-furo]3,2-g][2]benzopyran-6,2´(5´H,3´H)-furan]-

2(3H)on (2072.IV)____________________________________________86

6.4 Stamm 3042......................................................................................87

6.4.1.1 Isolierung _____________________________________________87

6.4.1.2 3-(3´,7´-Dimethyl-2´,6´-octadienyl)-2,4-dihydroxy-6-

methylbenzaldehyd (3042.I)_____________________________________87

6.4.1.3 5-Chlor-3-(3´,7´-Dimethyl-2´,6´-octadienyl)-2,4-dihydroxy-6-

methylbenzaldehyd (3042.II)____________________________________88

6.4.1.4 2,4-Dihydroxy-6-methyl-3-(3,7,11-trimethyl-2,6,10-dodecatrienyl)-

benzaldehyd (3042.III)_________________________________________89

6.4.1.5 3-[5-(3-Acetyl-5-chlor-2,6-dihydroxy-4-methylphenyl)-3-methylpent-

3-enyl]-2,3,4-trimethylcyclohexanon (3042.IV)______________________90

6.4.1.6 3-[5-(3-Acetyl-5-chlor-2,6-dihydroxy-4-methyl-phenyl)-3-methyl-

penta-1,3-dienyl]-2,3,4-trimethyl-cyclohexanon (3042.V)_______________91

6.4.1.7 3-[5-(3-Acetyl-2,6-dihydroxy-4-methylphenyl)-3-methylpent-3-enyl]-

2,3,4-trimethylcyclohexanon (3042.VI)____________________________92

7Literaturverzeichnis.......................................................................93

1EINLEITUNG

1 EINLEITUNG

1.1 Klassifizierung der Pilze

In unserem Leben haben wir ständig Umgang mit Mikromyceten (Schimmel- oder He-

fepilze). Es vergeht kein Tag an dem wir nicht Nutzen oder Schaden aus ihnen ziehen,

jedoch kommt es dabei immer auf den Blickwinkel an, ob der Pilz als Schädling oder

Nützling definiert wird. So enthalten die Sklerotien des Mutterkornpilzes Claviceps

purpurea Toxine, die Vergiftungen verursachen, wenn die Mutterkörner in das Getrei-

demehl gelangen. Diese Toxine werden jedoch gezielt aus Fermenterkulturen von

Claviceps-Myzel gewonnen, um in der Geburtshilfe eingesetzt zu werden (Mutter-

kornextrakte wurden schon vor 2000 Jahren in China angewendet, um Gebärmutter-

blutungen einzudämmen). Weitere Beispiele für nützliche Mikromyceten sind Pilz-

kulturen im Sauerteig zur Brotherstellung, im Wein, im Bier oder im Käse. Die Anzahl

der Pilzarten wird z. Zt. mit 100 000 bis 120 000 beschriebenen Arten angegeben,

jedoch schätzt man die tatsächliche Anzahl auf über 300 000 Arten, so daß die Anzahl

der Pilzspecies diejenige der Samenpflanzen übersteigt.

Die Biologen[1] definieren die Mikromyceten als Zellkerne enthaltende, Sporen tra-

gende, chlorophyllfreie Organismen, die sich im sowohl geschlechtlich als auch unge-

schlechtlich fortpflanzen. Die somatischen Strukturen sind typischerweise von Zell-

wänden umgeben, die Zellulose oder Chitin oder beides zugleich enthalten.

Nach der Lebensweise lassen sich Pilze (Fungi) in zwei Gruppen einteilen. Eine

Gruppe stellen die saprophytischen Pilze dar, die notwendige Kohlenstoffverbindun-

gen aus organischen Rückständen beziehen. Die andere Gruppe sind biotrophe Pilze,

die als Symbionten oder Parasiten leben und Pflanzen, Bakterien, Tiere oder andere

Pilze besiedeln. Durch ihre heterotrophe Lebensweise unterscheiden sich Pilze von

Pflanzen und Algen, die mit Kohlendioxid als einziger Kohlenstoffquelle auskommen.

Von den prokaryontischen Bakterien unterscheiden sie sich dadurch, daß sie echte

Zellkerne besitzen.

Die Taxonomie von Pilzen ist aufgrund ihrer Ähnlichkeit sehr schwierig[2]. Gleiche

Pilze werden oft von verschiedenen Autoren mit unterschiedlichen Namen versehen.

Die Gliederung in verschiedene Abteilungen erfolgt aufgrund ihrer geschlechtlichen

Entwicklung in Zygomycota (Jochpilzartige), Ascomycota (Schlauchpilzartige) und

Basidiomycota (Ständerpilzartige). Echte Pilze, die nur nach ihren asexuellen Zustän-

den beurteilt werden können, weil ihre geschlechtliche Entwicklung unvollständig

oder unvollständig bekannt ist, gehören zur Formabteilung Fungi Imperfecti. Diese

Pilze sind jedoch nicht geschlechtslos, sondern bei ihnen laufen zur Reproduktion ge-

hörende Prozesse, wie die Verschmelzung der Protoplasten (Plasmogamie), die Ver-

EINLEITUNG

schmelzung der Kerne (Karyogamie) und die Reduktionsteilung (Meiose) ebenfalls ab,

jedoch nicht an bestimmten Stellen des Vegetationskörpers und in bestimmten

Entwicklungszuständen.

Jede dieser Klassen (Endung -myceten) wird in eine Vielzahl von Ordnungen mit fest-

gelegten Rangstufen unterteilt, die durch bestimmte Endungen kenntlich gemacht wer-

den[3]:

regnum (Organismusbereich) Fungi

subregnum

divisio (Abteilung) -mycota

subdivisio (Unterabteilung) -mycotina

classis (Klasse) -mycetes

subclassis (Unterklasse) -mycetidae

superordo (Überordnung) -mycetanae

ordo (Ordnung) -ales

subordo (Unterordnung) -ineae

familia (Familie) -aceae

subfamilia (Unterfamilie) -oideae

tribus (Tribus) -iae

subtribus (Subtribus) -inae

genus (Gattung)

species (Art)

subspecies (Unterart)

varietas (Varietät)

form (Form)

Von der Gattung eines Pilzes gibt es meistens mehrere Arten. So sind z. B. von der

Pilzgattung Aspergillus u. a. die Arten ochraceus, sulphureus, melleus, sclerotiorum,

alliaceus und ostianus bekannt. Handelt es sich um parasitäre Pilze, die keine Unter-

scheidungsmerkmale aufweisen, kann eine Art weiter in Unterarten, Varietäten, For-

men und Rassen unterteilt werden.

3EINLEITUNG

1.2 Sekundärstoffwechsel und Sekundärmetabolite[4]

In der Entwicklung der Mikromyceten sind zwei verschiedene Phasen zu unterschei-

den. Die vegetative Entwicklungsphase (Trophophase), in der die Vertreter zahlreicher

Pilzgruppen übereinstimmen, und die Iodophase. Während der Trophophase werden

durch den Primärstoffwechsel Makromoleküle und Lipide synthetisiert sowie Energie

und Grundbausteine für den Stoffumsatz geliefert. Dabei stehen die Nährstoff-

aufnahme und -verwertung im Gleichgewicht. Zu den Primärmetaboliten zählen unter

anderem Aminosäuren, Vitamine und Nucleotide, sowie Zwischenprodukte des

Intermediärstoffwechsels (z. B. die Säuren des Zitronensäurezyklus).

In der Iodophase, der Phase eines gestörten Gleichgewichtes durch Verarmung des

Nährstoffangebotes oder Änderung der Umweltbedingungen, kann es zu einer Störung

des Gleichgewichtes kommen. Die Gleichgewichtsstörung verursacht eine Umstellung

von Primär- zum Sekundärstoffwechsel, so daß es zu einer Anreicherung von Primär-

metaboliten kommt. Diese werden dann nicht mehr weiter umgesetzt, sondern indu-

zieren und aktivieren durch diese Vermehrung Enzyme, die die Primärmetabolite dann

in sekundäre Metabolite umwandeln können.

Die auf dieser Entwicklungsstufe aufgebauten zahlreichen Sekundärmetabolite werden

in den Zellen angereichert oder in das umgebende Medium ausgeschieden bezie-

hungsweise unter den sich kontinuierlich durch den Verbrauch der Nährstoffe variie-

renden Bedingungen im Nährsubstrat weiter metabolisiert.

Im Gegensatz zum Primärmetabolismus scheint der Sekundärmetabolismus für den

Organismus nicht essentiell zu sein. So gibt es auch keine allgemeingültige Theorie,

sondern nur Erklärungsansätze zur Aufgabe des Sekundärstoffwechsels, wie ungenü-

gende Regulation primärer Stoffwechselprodukte, die Verwertung überschüssiger

Stoffwechselprodukte, Entgiftungsreaktionen im Stoffwechsel, Abwehrwirkung nach

außen durch Antibiotikahemmung von Konkurrenten oder Fraßverhinderung durch

Mykotoxine.

EINLEITUNG

Beispiele für den Zusammenhang zwischen Primär- und Sekundärstoffwechsel zeigt

folgende Grafik (Abb. 1):

Primärstoffwechsel Primärmetabolite Sekundärmetabolite

Abb. 1: Beispiele für den Zusammenhang zwischen Primär und Sekundärstoffwechsel[5]

Polysaccharide

Hexosephosphat

Pentosephos-

phatzyklus

Zucker

Polysaccharide

Glykoside

Nukleinsäuren

Acetylcoenzym A

Triosephosphat

Acetacetyl-CoA

Shikimisäure

Citronensäure-

zyklus

Mykotoxine

Terpene,

Steroide

Malonyl-CoA

Aflatoxine,

Antibiotika

Brenztrauben-

säure

aromatische

Aminosäure

aliphatische

Aminosäure

Penicilline,

Cephalosporine

Proteine

Isoprenoide

Polyketide

5EINLEITUNG

1.3 Antibiotika und Mykotoxine

Innerhalb der Sekundärmetabolite stellen die Antibiotika und die Mykotoxine zwei

verschiedene Gruppen dar. Der Begriff der Mykotoxine wird dabei in der Literatur

nicht einheitlich verwendet, aber meistens auf die Metabolite von Mikromyceten be-

schränkt, die unter dem Begriff Schimmelpilze zusammengefaßt werden. Von ihnen

sind einige Hundert bekannt, die von ca. 120 Schimmelpilzen produziert werden. Die

Hauptherkunftsgruppen einiger Mykotoxine[6] aus den Zwischenprodukten des Primär-

stoffwechsels sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

Polyketide Terpene Tricarbonsäurezyklus

Acetat-Malonat Mevalonat Pyruvat-Acetat Aminosäuren

Aflatoxine Fumagallin Byssochlaminsäure Aspergillinsäure

Citirinnin Roridin Erythroskyrin Cyclopenein

Citreoviridin Trichothecen Glauconsäure Cyclopenol

Cytochalasin Diacetoxy- Rubratoxin Cycopia-

Emodin scirpenol zonsäure

Luteoskyrin Ergot-Alkaloide

Maltoryzin Calvin-Alkaloide

Ochratoxin Fumitremorgen

Patulin Gliotoxin

Penicillinsäure Islanditoxin

Sterigmatocystin Paspalin

Zearalenon Tryptoquivalin

Penitrem

Sporodesmin

Tabelle 1: Hauptherkunftsgruppen von Mykotoxinen aus den Zwischenprodukten des Primärstoff-

wechsels[7]

Die bekanntesten Mykotoxine sind die Aflatoxine (1), mit ca. 20 verschiedenen Deri-

vaten, deren Grundgerüst ein Difuran-Cumarinbaustein ist. Sie werden im mensch-

lichen und tierischem Organismus durch oxidative Enzyme epoxidiert und wirken so

cancerogen und mutagen.

EINLEITUNG

OCH3

Abb. 2: Aus Mikromyceten isolierte Sekundärmetabolite: Aflatoxin B1 (1)

Andere wichtige Metabolite sind das Patulin (2) als Hydroxypyrofuran und das Nie-

rengift Citrinin (3), eine Benzopyrancarbonsäure.

HOOC

2 3

Abb. 3: Aus Mikromyceten isolierte Sekundärmetabolite: Patulin (2) und Citrinin (3)

Citrin wird von mehreren Aspergillus und Penicillium-Arten gebildet und wirkt auch

antibiotisch, so daß eine eindeutige Unterscheidung zwischen Mykotoxinen und Anti-

biotika nicht immer möglich ist.

Von den etwa 5000 bekannten Antibiotika[8] wird ungefähr ein Viertel von Pilzen ge-

bildet, von denen weniger als 100 medizinisch verwendet werden. Die wichtigsten

Vertreter sind die β-Lactame Penicillin (4), das Cephalosporin C (5) und die Tetracy-

cline (6) sowie Griseofulvin (7) und Fusidinsäure (8).

7EINLEITUNG

OCOOH

CH3

CH2OAc

COOH

CH3

NHR

4 5

Abb. 4: Aus Mikromyceten isolierte β-Lactame: Penicillin (4) und Cephalosporin (5)

OHO OH

O O

MeHO

MeMe

NH2

Abb. 5: Durch Fermentation von Streptomyces-Arten in Submerskulturen isolierbares Antibiotikum

Tetracyclin (6)

COOH

CH3

H3C

CH3

OCH3

H3CO

OCH3

CH3

7 8

Abb. 6: Aus Mikromyceten isolierte Sekundärmetabolite: Griseofulvin (7) und Fusidinsäure (8)

EINLEITUNG

Die zahlreichen anderen Antibiotika besitzen nur eine geringe Wirksamkeit, eine hohe

Toxizität oder eine ungünstige Pharmakokinetik. Einen groben Überblick über anti-

biotische Metabolite gibt die folgende Tabelle:

Polyketide Terpene Tricarbonsäurezyklus

Acetat-Malonat Mevalonat Aminosäuren

Wirkung allgemein antibiotisch

Albidin Grifolin Candidulin

Asperlin Pleuromutilin

Mycolphenolsäure Viridin

Canescin

Palitantin

Wirkung antibakteriell

Atrovenetin Fusidinsäure Fusidinsäure

Fumagatin Helvolinsäure Chephalosporine

Geodin Fusarinsäure

Herquein Mycelianamid

Javanacin Penicilline

Nidulin Viradicatin

Spinulosin

Wirkung antimykotisch

Griseofulvin Frequentin

Pullvilorinsäure Trichothecin

Gladiolinsäure Wortmannin

Cyclopaldinsäure

Terreinsäure

Tardin

Tabelle 2: Aufstellung biologisch aktiver Metabolite[9]

9PROBLEMSTELLUNG

2 PROBLEMSTELLUNG

Als Naturstoffe werden Kohlenstoffverbindungen bezeichnet, die mikroorganischen,

pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sind. Die Anzahl dieser strukturell aufgeklärten

Naturstoffe hat bis heute stark zugenommen und wird in Zukunft noch stärker steigen,

da das besondere Interesse[10] ihrem Einsatz als biologisch aktive Substanzen im Be-

reich der Pflanzenschutzmittel, der Schädlingsbekämpfungsmittel und der Arzneimittel

gilt. Historisch wurden diese Substanzen direkt aus Pflanzen, Invertebraten und

Mikroorganismen isoliert. Heute hat die Naturstoffchemie durch die modernen kom-

binatorischen Techniken und die Biochemie starke Konkurrenz bekommen.

Ein Vorteil der Naturstoffe ist jedoch ihre extrem große molekulare Diversität, so daß

die Wirkstoffe aus natürlichen Quellen eine Ergänzung zu den synthetischen Verbin-

dungen darstellen. Schon macht das geflügelte Wort vom „grünen Gold“ die Runde.

Immer mehr chemische und pharmazeutische Unternehmen forcieren die Naturstoff-

isolierung um neue Leitstrukturen zu finden. So macht es die Resistenzbildung vieler

Unkräuter, Insekten oder Krankheitserreger gegen Pestizide oder Pharmaka notwen-

dig, auf das weite Feld ungewöhnlicher Strukturen, Biosynthesewege und Wirkme-

chanismen zurückzugreifen, die durch die Evolution im Laufe von Jahrmillionen her-

vorgebracht wurden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Ziele verfolgt:

Die Isolierung, Strukturaufklärung und biologische Testung von Sekundärmetaboliten

aus komplex zusammengesetzten Mikromycetenrohextrakten der Klassen Deutero-

mycetes und Ascomycetes (Hauptteil I).

Die Entwicklung einer konvergenten Synthese, eines antiviralen und anti-HIV

wirksamen Naturstoffes, der Klasse der Hypocrelline (Hauptteil II).

Die Arbeit ist Teil eines vom BMBF geförderten Forschungsprojektes in Kooperation

mit der Arbeitsgruppe von Prof. Aust (Institut für Mikrobiologie der TU Braun-

schweig) und der BASF AG Ludwigshafen. Auswahl, Aufzucht und Kultivierung der

Mikromyceten erfolgte unter Aufsicht von Frau Dr. Barbara Schulz, die taxonomische

Bestimmung führte Dr. Siegfried Dräger durch (beide Arbeitsgruppe Prof. Aust).

Die Aktivitätstests mit biologischen Targets wurde von Frau Dr. B. Schulz durchge-

führt, die mit molekularen Targets bei der Knoll AG in Ludwigshafen.

HAUPTTEIL I

3 HAUPTTEIL I

3.1 Stamm 1948

3.1.1 Pilzbeschreibung

Der Stamm 1948 gehört zur Gattung Sirodithis sp., einem Deuteromyceten, Anamorph

des Teleomorphs Tympanis (Leotiaceae, Ascomycet). Er wurde als Endophyt aus einer

Lärche isoliert.

3.1.2 Isolierung

Der Pilz wurde 87 Tage lang bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 6 in einem

Biomalzmedium inkubiert. Das Kulturfiltrat zeigt Aktivität gegen die Testorganismen

Chlorella fusca, Ustilago violacae, Chladosporium und Eurotium repens.

Um die unterschiedlich polaren Bestandteile des Filtrates zu extrahieren, wurde

mehrmals mit Lösemitteln unterschiedlicher Polarität (Petrolether, Ethylacetat) ausge-

schüttelt. Die so erhaltene Ethylacetatfraktion zeigte im Plättchentest gegenüber der

Petroletherfraktion eine signifikant erhöhte biologische Aktivität, so daß weitere Auf-

trennungen mit der Ethylacetatfraktion erfolgten.

Nach mehrmaliger Säulenchromatographie mit verschiedenen Stufengradienten

(PE/Ether 1:1, CH2Cl2, CH2Cl2/MeOH 1%, 2%, 3%, 5%, 8%), wurden zwei mittel-

polare Fraktion erhalten. Aus der ersten Fraktion wurde durch präparative Schicht-

chromatographie (PSC) und anschließende Aufreinigung durch Säulenchromatogra-

phie mit Sephadex 1 mg des unpolaren Naturstoffes 1948.I isoliert. Aus der zweiten

Fraktion wurde durch PSC (dreifach entwickelt) 2 mg des mittelpolaren Naturstoffes

1948.II isoliert.

11HAUPTTEIL I

3.1.3 Strukturaufklärung und Beschreibung der Naturstoffe

3.1.3.1 Naturstoff 1948.I

Abb. 7: Aus Pilzstamm 1948 isolierter Metabolit: Ergosta-4,7,22-Trien-3-on (9)

Der Naturstoff 1948.I ist gelb, kristallin und hat einen Schmelzpunkt von 129 °C. Er

ist auf dem DC im UV-Licht bei 254 sowie 312 nm nicht detektierbar und färbt beim

Besprühen mit dem Anisaldehydreagenz grün an. Die Kristalle sind in Lösungsmitteln

mittlerer Polarität (Chloroform, Methylenchlorid) gut löslich. Das IR-Spektrum zeigt

eine für eine Carbonylgruppe charakteristische Bande bei

= 1630 cm–1.

Das 13C-NMR-Spektrum und die DEPT-135- und DEPT-90-Spektren, zeigen ein Car-

bonylsignal bei 200 ppm, vier quartäre C-Signale, sowie zehn CH-, sieben CH2- und

sechs CH3-Signale. Davon sind zwei quartäre und vier tertiäre C-Signale sp2-hybridi-

siert. Bestätigt wird diese Zuordnung durch die DEPT-135- und DEPT-90-Spektren,

die zwischen primären, sekundären, tertiären und quartären C-Atomen differenzieren

und so eine eindeutige Zuordnung der jeweiligen Signale ermöglichen. Aus diesen

Informationen ergibt sich eine Teilsummenformel ohne Heteroatome von C28H42, mit

dem O-Atom der Carbonylgruppe eine von C

28H42O und damit eine Teilmasse von

384. Das Massenspektrum zeigt einen Molpeak mit m/z = 384, die Teilmasse ent-

spricht somit der Molekülmasse, so daß außer dem Sauerstoff der Carbonylgruppe

keine weiteren Heteroatome im Molekül enthalten sind. Das 1H-Spektrum zeigt

Signale für sechs Methylgruppen, von denen zwei als Singulett und vier zum Dublett

HAUPTTEIL I

aufgespalten sind. Das Aufspaltungsmuster des 1H-Spektrums, sowie das 13C- Muster

weisen auf einen Naturstoff aus der Klasse der Steroide und Terpene hin. Eine Analyse

der H,H- und C,H-COSY-Spektren zeigt Signale für zwei Methylengruppen mit

diastereotopen Protonen, die sich aufgrund ihrer chemischen Verschiebung im 1H-

Spektrum in direkter Nachbarschaft zur Carbonylgruppe befinden. Das HMBC-

Spektrum (heteronuclear multi bond correlation), in dem sich die Identität der

heteronuklearen Weitbereichskopplungen direkt aus der Zuordnung der 2-D-

Kreuzsignale ergibt (nJC,H mit n = 2 oder 3), zeigt eine α,β-ungesättigte Carbonyl-

gruppe sowie eine weitere Doppelbindung, die wie die zur Carbonylgruppe konju-

gierte Doppelbindung aus einem quartären und einem tertiären C-Atom im Steroid-

grundkörper besteht und die sich beide zwischen einer Methylengruppe befinden. Eine

dritte Doppelbindung befindet sich in einer Seitenkette des Steroids. Mit diesen

Informationen, der Summenformel, dem Drehwert und dem Schmelzpunkt kann die

Substanz als Ergosta-4,7,22-trien-3-on, ein Steroid aus der Gruppe der α-Ergostane,

identifiziert werden. Eine Datenbankrecherche in der Chemical-Concepts Massen-

spektrendatenbank bestätigt diese Zuordnung eindeutig.

Erstmals wurde die Substanz 9 1976 isoliert[11], aber schon 1959 als Derivat synthe-

tisiert[12]. Weitere bekannte Formen sind die 9β,22E-Form, die 10α,22E-Form und das

Lumista-4,7,22-trien-3-on (9β,10α,22E-Form).

Generell werden alle Verbindungen, die aus einem Perhydro-cyclopenta[a]phenan-

threngrundkörper aufgebaut sind, als Steroide[13] bezeichnet. Normalerweise sind die

Cyclohexan-Ringe der Steroide in der thermodynamisch stabileren trans-Stellung mit-

einander verbunden, wodurch sie eine starre, flache Form annehmen (griech.: stereos =

starr, fest und eides = gestaltet). Sie schließen den weiten Bereich der Naturstoffe ein,

zu denen die Gallensäuren, die Sexualhormone, die D-Gruppe der Vitamine, Bufa-

dienolide, Corticoide, Sapogenine und weitere kleine Gruppen gehören. Ihre Biosyn-

these verläuft über (zunächst) nach der Isopren-Regel gebildete Zwischenstufen. Ins-

gesamt gibt es über 200 000 bekannte synthetische und natürliche Steroide, die spe-

zifisch als Cardika, anabole Steroide, Pheromone, Antikontrazeptiva oder Antiphlo-

gistika wirken[14]. Sie sind auch heute noch Gegenstand intensiver Forschung, wie z. B.

die Rolle des Cholesterins, einem Cholestanderivat, bei der Entstehung von Arterio-

sklerose oder Coronarerkrankungen.

13HAUPTTEIL I

3.1.3.2 Naturstoff 1948.II

Abb. 8: Aus Pilzstamm 1948 isolierter Naturstoff: Ergosterolperoxid (10)

Die zweite, aus der mittelpolaren Fraktion isolierte Verbindung liegt ebenfalls kristal-

lin vor. Die farblosen Kristalle haben einen Schmelzpunkt von 174 °C und sind in

mittelpolaren bis polaren Lösemitteln gut löslich.

Im 13C-Spektrum ist wieder das für ein Steroid typische Signalmuster zu erkennen. Es

setzt sich aus Signalen für vier quartäre, elf sekundäre, sieben primäre und sechs ter-

tiäre C-Atome zusammen. Die chemischen Verschiebungen der Signale zweier quar-

tärer und eines tertiären C-Atoms weisen auf Substitution mit Heteroatomen hin. Vier

der tertiären Atome sind olefinische C-Atome. Aus diesen Informationen ergibt sich

eine Teilfragmentmasse von 374. Berücksichtigt man den im Massenspektrum regis-

trierten Molpeak [M+] = 428, so kann die Summenformel um die aus den chemischen

Verschiebungen identifizierbaren drei Heteroatome ergänzt, zu C

28H44O3 bestimmt

werden.

Die Analyse des 1H-Spektrums zeigt Signale für vier olefinische Protonen sowie ein

Signal für ein durch Heteroatomeinfluß tieffeldverschobenes Proton. Von den sechs

Methylgruppensignalen sind vier zum Dublett aufgespalten, zwei liegen als Singulett

vor. Die Interpretation der H,H-COSY-, C,H-COSY- und der HMBC-Spektren ergibt,

das der Substanz ebenfalls ein Ergostangrundgerüst zugrunde liegt. Das Grundgerüst

ist in 3-Position mit einer Hydroxygruppe substituiert, die Atome fünf und acht des B-

Ringes sind über eine Peroxidbrücke miteinander verknüpft. Ein Vergleich mit Lite-

raturdaten (1H-, 13C-Daten) und die Datenbankrecherche (Chapman & Hall) über die

HAUPTTEIL I

Summenformel und den Schmelzpunkt ergeben, daß es sich bei der Substanz 10 um

5,8-Epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol handelt.

Die Substanz, mit dem Trivialnamen Ergosterolperoxid, wurde erstmals 1926 iso-

liert[15] und ihre Struktur im Jahr 1947 durch Röntgenstrukturanalyse[16],[17] aufgeklärt.

Von ihr existieren noch das 24-Epimer und das 5,8-Diepimer. Sie kommt häufig in

Pilzen und Flechten, sowie in Ananas comosus, im Schwamm Axinella cannabina und

Typha latifolia vor.

3.1.4 Biologische Aktivität

Der Metabolit 1948.II wurde, wie alle in ausreichender Substanzmenge isolierten Na-

turstoffe, in einem Pharmagrundscreeningtest auf seine pharmakologische Aktivität

hin untersucht. Die Testergebnisse sind in den folgenden Tabellen dokumentiert. Die

Testassays sind in Abschnitt 3.1.5 erklärt.

Pharmakologische Aktivität

Substanz RF AMPA-Rezeptor GA ACTIV.

Fibrinogen RB 5-Hat

Serotonin CDC25 Hemmung

329/9

1948.II > 4.00e-06 > 5.00e-06 > 4.00e-06 > 1.00e-04

Pharmakologische Aktivität

Substanz ICE Hemmung

281/MS (Thiol) Kinase (341)

KDR6 Kinase (342)

TEK Kinase (344)

KDR7

1948.II > 5.00e-05 > 5.00e-05 > 5.00e-05 > 5.00e-05

Tabelle 3: Pharmakologische Aktivität von 1948.II (Konzentration [mol/l] bezogen auf IC50 %)

Die Substanz 1948.II wurde neben dem pharmakologischen Screening, auch einem

biologischen Screening, als potentielles Pestizid, mit verschiedenen Testorganismen

unterzogen. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle aufgeführt:

Agardiffusionstest (c = 1 [mg/ml])

Hemmhofradien [mm]

Substanz Chl. E. C. B. m. Ust. Eur. M. m. Fus.

1948.II 0350701

Tabelle 4: Biologische Aktivität von 1948.II

Bei einer Bewertung der Ergebnisse der pharmakologischen und biologischen Tester-

gebnisse ist die Substanz als mäßig aktiv und somit nicht auffällig einzustufen.

15HAUPTTEIL I

3.1.5 Kurzbeschreibung der Pharma-Grundscreeningtests[18]

Folgende Tests wurden im Pharma-Grundscreening durchgeführt:

Ø Cdc25 (Test 329): Bei der Krebsentstehung sind sehr häufig Gene betroffen, die

direkt oder indirekt den Zellzyklus regulieren. Substanzen, die selektiv den Zell-

zyklus hemmen, würden diesen Aspekt der Tumorzellenwachstumsregulation di-

rekt angehen und sind daher als potentielle Zytostatika von besonderem Interesse.

Dieser Test ist spezifisch für Inhibitoren einer neuen Protein-Tyrosin-Phosphatase-

Klasse. Diese Phosphatasen kontrollieren den Zellzyklus durch Dephosphorylie-

rung der cyclin/cdk-Komplexe[19].

Ø Elisa (Phosphotyrosin-Anitkörper) PTKs (Test 31, 343): Identifizierung von Pro-

tein-Tyrosin-Kinase-Inhibitoren als Inhibitoren der T-Zellenaktivierung. Spezi-

fische Inhibitoren der T-Zellenaktivierung würden eine neue Klasse von Immun-

suppressiva beschreiben, die potentiell wirksamer und weniger toxisch sind. Sie

könnten bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten und zur Prophylaxe der

Organabstoßung nach Transplantatioen eingesetzt werden.

Ø Onkologie PTKs (Test 342, 344): Der Test dient zur Identifizierung von Protein-

Tyrosin-Kinase-Inhibitoren für eine neue Klasse von Wirkstoffen zur Krebsbe-

handlung. Es handelt sich hier um eine Assay vom Typ ELISA mit Phosphotyro-

sin-Antikörpern.

Ø GA ACTIV. T3: Durchgeführt wird ein zellulärer Assay zur Identifizierung nieder-

molekularer, oral verfügbarer Substanzen, die die T3-Wirkung im Herzen ge-

websspezifisch antagonisieren. Es sollen Substanzen für die Indikation der ventri-

kulären und supraventrikulären Arrhythmien des Herzens entwickelt werden.

Ø RF AMPA-Rezept.: Calpain Hemmung.: Glutamat dient der chemischen Signal-

übertragung zwischen Nervenzellen. Darüber hinaus ist es aber an Mechanismen

beteiligt, die die Stärke der Signalweiterleitung zwischen Neuronen regulieren. Bei

einigen Erkrankungen trägt eine Dysregulation von Glutamat zum Entstehen dieser

Krankheiten oder deren Symptome bei. Eine wirksame Therapie solcher Erkran-

kungen, denen ein Zuviel an Glutamat zugrunde liegt, sieht man in Antagonisten

von Glutamatrezeptoren und Inhibitoren des Calpains. Wichtige Indikationsgebiete

können Schlaganfall, Hirntrauma, Epilepsie und die Parkinson-Erkrankung sein.

HAUPTTEIL I

Ø RB 5-HT Serotonin: Serotonin (5-Hydroxytryptamin) ist wie Dopamin ein Neu-

rotransmitter, der für die Regulation verschiedenster physiologischer Funktionen

wie Blutdruck, Stimmung, Angst, Aggression u. a. eine wichtige Rolle spielt. Ge-

genwärtig werden Migräne, Depression und Anxiolyse als Hauptindikationsgebiete

für Serotonin-Agonisten bzw. Antagonisten angesehen. Da auch funktionelle

Verbindungen zwischen serotoninergen und dopaminergen Systemen bestehen, ist

auch der Einfluß solcher Wirkstoffe auf physiologische Prozesse gegeben. Mehr

als 10 Serotonin-Rezeptorsubtypen sind derzeit bekannt, deren funktionelle Ein-

ordnung jedoch z. T. noch sehr unsicher ist. Ziel ist es, Agonisten und Antagonis-

ten mit möglichst selektiver Rezeptorsubtypspezifität zu charakterisieren, um in

weiteren Untersuchungen deren indikationsbezogene Relevanz zu ermitteln und

gleichzeitig Therapeutika mit geringeren Nebenwirkungen zu entwickeln.

Ø ECE-Hemm: Endothelin ist ein körpereigenes, vasokonstriktorisches Peptid. Es ist,

im Zusammenspiel mit anderen konstriktorischen und relaxierenden Faktoren an

der Regulation des Gefäßtonus beteiligt und wirkt wahrscheinlich über den En-

dothelin-Rezeptor. Bei Krankeiten wie Herzinfarkt, akutem Nierenversagen,

Vasospasemen und Lungenhochdruck spielen erhöhte Endothelinspiegel wahr-

scheinlich eine wichtige Rolle. Eine Möglichkeit zur Senkung des Endothelin-

Spiegels ist die Hemmung des "endothelin-converting-enzyme" ECE, das die Frei-

setzung des aktiven Endothelins aus der inaktiven Vorstufe "big-Endothelin" be-

wirkt. Gute Wirkung liegt bei IC 50 % < 10−4 mol/l vor.

Ø Fibrinogen: Ein erhöhter Fibrinogenspiegel im Plasma, konnte als Risikofaktor für

verschiedene Gefäßkrankheiten identifiziert werden. Es gibt Hinweise auf eine pa-

thologische Bedeutung des Fibirinogens bei artheriosklerotischen bzw. thrombo-

tischen Prozessen. Ziel des vorliegenden Testsystems ist die Identifizierung oral

verfügbarer, niedermolekularer Substanzen, die eine Fibrinogensenkung im Rah-

men einer Langzeittherapie ermöglichen. Eine Reduzierung des Risikofaktors Fi-

brinogen wäre von größter Bedeutung bei der Prävention des Myokardinfaktes.

Ø Zytotox.: Dieser Test an verschiedenen Zellgeweben dient zur Differenzierung zwi-

schen spezifisch pharmakologischen und unspezifisch zytotoxischen Effekten.

Stark toxische Substanzen sind außerdem in der Onkologie von Interesse. Gute

Wirkung liegt bei IC 50 % ≤ 10−7 mol/l vor.

17HAUPTTEIL I

Bewertet man die Screeningergebnisse allgemein, so gilt, daß sie nur ungenaue Werte

ergeben. Substanzen die nicht auffallen, können bei einer neu angepaßten Testpalette

in einem neuen Test als aktiv auffallen.

3.2 Stamm 2049

3.2.1 Pilzbeschreibung

Pilzstamm 2049 wurde als nicht bestimmter Endophyt aus Vaccinium vitis-idaea iso-

liert.

3.2.2 Isolierung

3.2.2.1 Naturstoff 2049.I

Der Pilzstamm 2049 wurde auf zwei Medien (Biomalz, M/S) und diese jeweils bei

verschiedenen Temperaturen, 17 °C und 20 °C, 40 und 45 Tage lang kultiviert. Das

Mycel und die Flüssigkultur wurden mit einem Warring-Blender homogenisiert. Durch

einmalige Extraktion mit Petrolether und dreimalige Extraktion mit Ethylacetat wur-

den daraus 1.2 g Rohextrakt erhalten. Alle Extrakte zeigten gleich gute biologische

Aktivität gegen Bakterien, Pilze und Keimlinge. Die DC-Analytik ergab, daß das Me-

tabolitenspektrum gleich war, so daß sie vereinigt wurden.

Das Rohextrakt wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel, mit einem Stufen-

gradienten von 50% Petrolether (30 - 50)/50 % Dichlormethan über reines Dichlor-

methan bis zu Dichlormethan/Methanol 10 % (in 2% Schritten) aufgetrennt. Aus den

Vorfraktionen konnte durch erneute Trennung mit dem Chromatotron und einem

quarternärem Lösemittelgemisch aus Methylenchlorid/n-Hexan/Aceton/Methanol (35 :

35 : 25 : 5) 8 mg des mittelpolaren Naturstoffes 2049.I isoliert werden.

HAUPTTEIL I

3.2.3 Strukturaufklärung und Charakteristik des Naturstoffes 2049.I

OOH

MeO

OMe

OOH

MeO

OMe

Abb. 9: Aus Pilzstamm 2049 isolierter Sekundärmetabolit: Elsinochrom A (11)

Der Naturstoff 2049.I ist eine tiefrote, amorphe kristalline Substanz, mit einem

Schmelzpunkt von 224 °C. Die Kristalle lösen sich sehr gut in den meisten Lösungs-

mitteln mittlerer Polarität wie Chloroform und Dichlormethan. Auf dem DC ist sie

ohne Ansprühreagenz mit bloßem Auge als roter Substanzfleck zu erkennen.

Das 1H-Spektrum zeigt keine Kopplungssysteme, sondern nur singuläre Resonanzen.

Die Integration der einzelnen Signale ergibt eine Protonenresonanz (16.2 ppm), zwei

tieffeldverschobene Protonensignale (7.0 ppm, 5.2 ppm) und drei Methylgruppensig-

nale bei (4.3 ppm, 4.1 ppm, 2.0 ppm). Die auffällige Tieffeldverschiebung des Pro-

tonensignals bei 16.2 ppm weist auf eine extreme Entschirmung hin, die charakteris-

tisch für intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen ist, wie sie z. B. in der Enol-

Form des 2,3-Butandions vorkommt.

Die Strukturdaten aus den 13C-Spektren zeigen ein Carbonylsignal (205 ppm), neun

quartäre Kohlenstoffsignale zwischen 180 und 112 ppm, die sp2-hybridisierten Koh-

lenstoffatomen zugeordnet werden können sowie ein tertiäres Signal eines sp2-hybridi-

sierten C-Atoms (102 ppm). Der Aliphatenbereich enthält drei primäre und ein

tertiäres C-Signal. Damit erhält man eine vorläufige Summenformel von C15H11O mit

einer Molmasse von 207. Aus den charakteristischen Verschiebungen einiger Kohlen-

stoffatomsignale kann man ableiten, daß die dazugehörigen C-Atome mit Heteroa-

19HAUPTTEIL I

tomen substituiert sind. Es handelt sich dabei um zwei Methoxygruppen, zwei Car-

bonylgruppen sowie um ein OH-substituiertes aromatisches C-Atom. Daraus ergibt

sich eine Summenformel von C15H12O5 und eine Molmasse von 272.

Durch Auswertung der Konnektivitäten in den H,H-COSY und HMBC-Spektren läßt

sich folgendes Molekül konstruieren, das an den gekennzeichneten Positionen (*) mit

im 13C-Spektrum nicht detektierbaren Heteroatomen substituiert sein könnte.

** *

OOH

MeO

OMe

Abb. 10: Elsinochromteilfragement mit hetero-long-range Kopplungen

Den zur Strukturaufklärung entscheidenden Hinweis liefert das Massenspektrum. Es

zeigt einen Molekülpeak von 544, also unter Berücksichtigung der Isotopenmasse der

Kohlenstoffatome einen genau doppelt so großen Molekülpeak, wie er nach den NMR-

Spektren zu erwarten gewesen wäre. Es kann sich somit bei der Substanz 2049.I nur

um ein Dimer des Teilfragmentes handeln. Eine Recherche mit der Gesamtstruktur in

der Naturstoffdatenbank (Chapman & Hall) zeigt, das es sich bei dem isolierten Natur-

stoff um das seit 1963 bekannte Elsinochrom A (11) handelt[20], dessen physikalische

Daten mit denen des isolierten Naturstoffes identisch sind.

Bisher wurde das Pigment nur aus den Pilzen Elsinoe annonae und Sphaceloma randii

isoliert[21]. Es gehört strukturell zur Gruppe der Hypocrelline, von denen einige

bekannte Vertreter, wie z. B. das Hypericin, in der photodynamischen Therapie[22],[23],

zur Krebsbekämpfung eingesetzt werden. Dort führt die Bestrahlung von Hypericin

zur Produktion von Singulett-Sauerstoff als primärem reaktivem Oxidans, auf dem die

Wirksamkeit gegen Krebszellen beruht. Andere pharmakologische Eigenschaften sind

die Aktivität gegen mehrere Virentypen, einschließlich des HIV-Virus, sowie die

cytotoxische Wirkung gegen Tumorzellen[24] und die Wirkung als Antidepressiva[25].

Da bisher noch keine Totalsynthese vom 11 durchgeführt wurde, sollte in einer kon-

vergenten Synthesestrategie eine Partialsynthese entwickelt werden (siehe Hauptteil

II, Kapitel 4).

HAUPTTEIL I

3.2.4 Biologische Aktivität

Die Metabolit 2049.I wurde in einem Pharmagrundscreeningtest auf seine pharmako-

logische Aktivität hin untersucht. Die Testergebnisse sind in den Folgenden Tabellen

dokumentiert.

Pharmakologische Aktivität

Substanz RF AMPA-Rezept. GA ACTIV.

Fibrinogen RB 5-HT Serotonin CDC25 Hemmung

329/9

2049.I 28.1, > 4.00e-06 350, > 5.00e-06 32.7, > 4.00e-06 1, > 1.00e-04

Pharmakologische Aktivität

Substanz ICE Hemmung

281/MS (Thiol) Kinase (341)

KDR6 Kinase (342)

TEK Kinase (344)

KDR7

2049.I 1.3, > 5.00e-05 37.3, > 5.00e-05 7.8, > 5.00e-05 29.3, > 5.00e-05

Tabelle 5: Pharmakologische Aktivität von 2049.I (11) (Konzentration [mol/l] bezogen auf IC50 %)

Die Substanz 11 wurde neben dem pharmakologischen Screening, auch einem biolo-

gischen Screening, als potentielles Pestizid, mit verschiedenen Testorganismen unter-

zogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt:

Agardiffusionstest (c = 1 [mg/ml])

Hemmhofradien [mm]

Substanz Chl. E. C. B. m. Ust. Eur. M. m. Fus.

2094.I 0 0 0 15 000

Tabelle 6: Biologische Aktivität von 2049.I

Bei einer Bewertung der Ergebnisse der pharmakologischen und biologischen Tester-

gebnisse ist die Substanz als gut einzustufen. Sie zeigt Aktivität als Protein-Tyrosin-

Kinase-Inhibitor und besitzt demnach die Eigenschaften eines Wirkstoffes zur Krebs-

behandlung. Im von den Mikrobiologen durchgeführten biologischen Screening zeigt

11 eine sehr gute Aktivität gegen den Pilz Ustilago violacea. Die antifungische Wirk-

samkeit war bisher noch nicht literaturbekannt und sollte Gegenstand weiterer biolo-

gischer sowie chemischer Untersuchungen sein.

3.3 Substanz 2049.II

Bei Substanz 2049.II handelt es sich um den schon aus Pilzstamm 1948 isolierten Se-

kundärmetaboliten Ergosterolperoixid (10) (siehe Kapitel 3.1.3.2)

21HAUPTTEIL I

3.4 Stamm 1727

3.4.1 Pilzbeschreibung

Der Stamm 1727, Tuberculina petalotia, wurde aus einer chinesischen Erdprobe (aus

3000 m Höhe) isoliert.

3.4.2 Isolierung des Naturstoffes 1727.I und 1727.II

Die Kultivierung des Pilzes erfolgte auf Biomalzweichagar, der pH-Wert der Nähr-

lösung wurde auf pH = 6 eingestellt. Nach 84 Tagen wurden das Mycel und der

Weichagar homogenisiert und dreimal mit Ethylacetat ausgeschüttelt. Der Extrakt

wurde anschließend im Vakuum bei einer Badtemperatur von 40 °C bis zur Trockene

eingeengt.

Die Plättchentests zeigten gute Wirkung gegen alle im biologischen Screening einge-

setzten Testorganismen, besonders gegen Eurotium repens.

Nach mehrmaliger säulen- und plattenchromatographischer Trennung mit Gemischen

wechselnder Zusammensetzung aus n-Hexan/Aceton, wurde eine unpolare kristalline

Substanz (1727.I) und ein unpolares Öl (1727.II) erhalten, das etwas polarer war als

der Naturstoff 1727.I.

HAUPTTEIL I

3.4.3 Strukturaufklärung des Naturstoffes 1727.I

OHO

Abb. 11:Aus Pilzstamm 1727 isolierter Sekundärmetabolit: Ramulosin

Der Naturstoff kristallisiert in farblosen Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 116 °C.

Er ist UV-inaktiv und färbt mit dem DC-Universalsprühreagenz (Cer/Molyb-

dän/Schwefelsäure) dunkelblau an. Der Drehwert wird zu αD

= +18° (c = 5 in

CH2Cl2) bestimmt.

Im 13C-NMR-Spektrum erscheinen die Signale von zehn C-Atomen. Anhand der

DEPT-Spektren können diese als drei quartäre, zwei tertiäre, vier sekundäre und ein

primäres C-Atom identifiziert werden. Die Addition dieser Fragmente ergibt eine Teil-

summenformel von C10H13 mit einer Teilmasse von 133. Unter Berücksichtigung der

Masse von m/z = 182 und der 1H- (OH-Gruppe) und 13C-Signale (Estercarbonyl-

gruppe) enthält das Molekül noch drei Sauerstoffatome als Heteroatome, sowie das

zusätzliche Proton der OH-Gruppe. Dieses Protonensignal ist im 1H-NMR-Spektrum

bei 13.0 ppm zu sehen, was darauf schließen läßt, daß es sich um ein mit einer Car-

bonylgruppe intramolekular chelatisiertes Hydroxyproton handelt. Aus der Gesamt-

summenformel von C

10H14O3 errechnen sich vier Doppelbindungsäquivalente, von

denen eines der im 13C-Spektrum auftretenden Estercarbonylgruppe zuzuordnen ist.

Die beiden verbleibenden quartären 13C-Signale, können die C-Atome einer Doppel-

bindung sein oder einer weiteren Estercarbonylgruppe (173.3 ppm) und einem Halb-

ketal (97 ppm) zugeordnet werden. Da aber nur noch ein weiteres Sauerstoffatom im

Molekül vorhanden ist, kann es sich nur um eine oxygenierte Doppelbindung handeln,

die in Konjugation zur Estercarbonylgruppe steht. Dieses Teilfragment enthält alle in

dem Molekül vorhandenen Heteroatome, somit muß an die Doppelbindung eine Hy-

droxygruppe gebunden sein, deren Proton mit dem Carbonylsauerstoff chelatisiert.

23HAUPTTEIL I

OO H

Fragment I:

Die weitere Auswertung der 1H- und HMBC-Spektren über die chemischen Verschie-

bungen, Kopplungskonstanten und Kreuzsignale ergänzen das Teilfragment zur Natur-

stoffstruktrur. Der Naturstoff kann als Ramulosin identifiziert werden, das erstmals

1964 aus Pestalotia ramulosa als Sekundärmetabolit isoliert[26] und 1985 von Takano

synthetisiert wurde[27]. Ein Vergleich der gemessenen 1H- und 13C-Daten mit den Lite-

raturdaten bestätigt die getroffene Zuordnung.

Weitere bisher isolierte Co-Metabolite[28] sind das 3,4,4a,5,6,7,8,8a-Octahydro-8-hy-

droxy-3-methyl-1H-2-benzopyran-1-on (8,8a-Dihydroramulosin) aus dem Endophyten

Conoplea elegantula das gegen Spulbandwurmlarven toxisch wirkt und 3,4,4a,5,6,7-

Hexahydro-4,8-dihydroxy-3-methyl-1H-2-benzopyran-1-on (4-Hydroxyramulosin).

Ramulosin ist ein Melleinderivat und gehört zu den Ochratoxinen[29], einer Klasse von

Mykotoxinen aus Aspergillus ochraceus.

OHO

HOOC

OOH

13 14

Abb. 12: Mellein (Ochracin) (13) Ochratoxin A (14)

HAUPTTEIL I

3.4.4 Biologische Aktivität

Die Metabolit 1727.I wurde in dem Pharmagrundscreeningtest auf seine pharmakolo-

gische Aktivität hin untersucht. Die Testergebnisse sind in den folgenden Tabellen

dokumentiert.

Pharmakologische Aktivität (Hemmung in %)

Substanz RF AMPA-Rezept. GA ACTIV.

Fibrinogen RB 5-HAT

Serotonin CDC25 Hemmung

329/9

1727.I >4.00 e-06 32.7 > 5.00e-06 27.9 > 4.00e-06 0.1 > 1.00e-04 8.6

Pharmakologische Aktivität (Hemmung in %)

Substanz ICE Hemmung

281/MS (Thiol) Kinase (341)

KDR6 Kinase (342)

TEK Kinase (344)

KDR7

1727.I > 5.00e-05 11.8 > 5.00e-05 11.0 > 5.00e-05 29.3 > 5.00e-05 10.2

Tabelle 7: Pharmakologische Aktivität von 1727.I (Konzentration [mol/l] bezogen auf IC50 %)

Die Substanz 1727.I wurde auch dem biologischen Screening unterzogen. Die Ergeb-

nisse sind in Tabelle 8 aufgeführt:

Agardiffusionstest (c = 1 [mg/ml])

Hemmhofradien [mm]

Substanz Chl. E. C. B. m. Ust. Eur. M. m. Fus.

1727.I 0003000

Tabelle 8: Biologische Aktivität von 1727.I

Bei einer Bewertung der pharmakologischen Testung ist die Substanz als mäßig aktiv

und somit nicht auffällig einzustufen, biologisch ist sie fast inaktiv.

25HAUPTTEIL I

3.4.5 Naturstoff 1727.II

Abb. 13: Aus Pilzstamm 1727 isolierter Sekundärmetabolit: 1727.II

Bei dem isolierten Naturstoff 1727.II handelt es sich um ein farbloses Öl, mit einem

Drehwert von

[

]

α = +18 (c = 5 in CH2Cl2). Er ist in den meisten Lösemitteln mitt-

lerer Polarität löslich und UV-inaktiv. Auf dem DC färbt er mit dem Universalsprüh-

reagenz hellblau an. Im Massenspektrum (EI) ist ein Molpeak von m/z = 156 und ein

für Cyclohexanon charakteristisches Fragmentierungsmuster zu erkennen.

Das 1H-Spektrum zeigt Signale für eine CH3-Gruppe, die als Dublett aufspaltet, sowie

für eine tieffeldverschobene CH-Gruppe, die mit einem Heteroatom substituiert ist. Im

H,H-COSY und C,H-COSY erkennt man im Aliphatenbereich Signale für drei Me-

thylengruppen, deren Protonen geminale Kopplungen zeigen. Die geminalen Kopp-

lungen sind typisch für diastereotope Methylenprotonen, die einem Stereozentrum

benachbart sind.

Im 13C-Spektrum sind ein charakteristisches Signal für ein Carbonylkohlenstoffatom

und ein Signal für ein tertiäres Kohlenstoffatom zu erkennen, an das ein Sauerstoff-

atom fixiert ist. Es zeigt zudem noch fünf Signale für sekundäre, ein Signal für ein ter-

tiäres und ein Signal für ein primäres C-Atom. Aus diesen Informationen ergibt sich

die Summenformel zu C

9H16O2, die durch das Massenspektrum bestätigt wird. Das

Molekül enthält demnach zwei Doppelbindungsäquivalente, von denen eines für die

Carbonylgruppe abgezogen werden muß, so daß das Molekül ein Ringsystem enthal-

ten muß. Die Analyse der H,H-COSY- und HMBC-Spektren bestätigt, daß der Natur-

stoff eine Cyclohexanonring enthält, der in 2-Position mit einer Propan-2-ol-1-yl Sei-

tenkette substituiert ist.

Die Substanz war bisher als Naturstoff literaturunbekannt und dürfte ein aus Ramu-

losin entstandenes Biosyntheseprodukt sein. Hypothetisch könnte die Transformation

nach folgendem Weg ablaufen:

HAUPTTEIL I

HOOC

OHO

H2O

-CO2

Schema 1: Hypothetische Biosyntheseroute des Naturstoffes 1727.II aus Ramulosin

Die hypothetische Biosyntheseroute kann über eine Lactonspaltung mit anschließender

Decarboxylierung des β-Ketocarbonsäurerestes verlaufen. Im letzten Biosynthese-

schritt entsteht dann durch Rückbildung der Carbonylgruppe aus der Enolform des

Intermediates der neue Sekundärmetabolit. Der strukturabhängige Drehwert des op-

tisch aktiven Co-Metaboliten zeigt wie beim Ramulosin ein positives Vorzeichen, so

daß davon ausgegangen werden kann, daß der Naturstoff die gleiche absolute Kon-

figuration besitzt.

27HAUPTTEIL I

3.5 Stamm 2072

3.5.1 Pilzbeschreibung

Der Stamm 2072, Fusidium sp, wurde als Endophyt aus Mentha arvensis von einer

Feuchtwiese bei Hahausen isoliert.

Die Gattung Fusidium gehört zu den Deuteromyceten. Als teleomorphe Form ist die

Gattung Biostictus bekannt.

3.5.2 Isolierung

Der Pilzstamm 2072 wurde auf Biomalzweichagar angesetzt und im Labor 91 Tage

lang kultiviert. Alternativ wurde der Pilz auch in einer Flüssigkultur (Biomalz 50 g/l)

angesetzt und 11 Tage angezogen.

Anschließend wurden die Kulturen mit Wasser in einem Warring-Blender homoge-

nisiert und mit Ethylacetat extrahiert. Die biologische Aktivität des Rohextraktes

wurde im Plättchentest bestimmt, die Ergebnisse sind in Tabelle 9 aufgeführt:

Agardiffusionstest (c = 1 [mg/ml])

Hemmhofradien [mm]

Substanz Chl. E. C. B. m. Ust. Eur. M. m. Fus.

2072 10 2 2 0 7 0 5

Tabelle 9: Biologische Aktivität von Pilzstamm 2072 (Rohextrakt)

Beim chemischen Screening zeigten sich auf dem Dünnschichtchromatogramm im UV

(254/360 nm) mehrere Substanzbereiche. Nach dem Ansprühen mit dem Universal-

Sprühreagenz "Cer/Molybdän" wurden zusätzlich noch einige UV-inaktive Substanz-

flecken sichtbar, die auf Metaboliten ohne chromophore Gruppen hinweisen.

An die Optimierung des Laufmittels zur Auftrennung des Rohextraktes schloß sich die

präparative Auftrennung durch Flashchromatographie mit Petrolether (30–

50)/Diethylether (2:1, 1:1) und Methylenchlorid/Methanol (93:3, 93:7) in fünf

Hauptfraktionen (2072 a bis e) an. Die Hauptfraktionen wurden weiter durch Flash-

chromatographie, präparative Dickschichtchromatographie und HPLC aufgetrennt.

HAUPTTEIL I

Durch präparative Schichtchromatographie (PSC) konnte dabei eine nicht UV-aktive

Verbindung isoliert werden. Dazu wurde die Hauptfraktion 2072 a zuerst durch

Flashchromatographie mit einem Gemisch aus Methylenchlorid/Methanol (94:6) auf-

getrennt. Dadurch wurde die Fraktion 2072 e2 erhalten. Anschließend wurde mit dem

gleichen Laufmittel von Fraktion 2072 e2 ein präparatives Dickschichtchromato-

gramm aufgenommen. Der Fraktionsbereich mit einem Rf-Wert von 0 bis 0.35 wurde

von der Platte separiert und erneut mit einem Lösemitttelgemisch aus Methylen-

chlorid/Methanol (94:6) aufgetrennt.

3.6 Strukturaufklärung des Naturstoffes 2072.I

7´ 6´ 5´ 4´ 3´ 2´

1´

Abb. 14: Aus Pilzstamm 2072 isolierter Sekundärmetabolit: 2072.I (16)

Der Naturstoff liegt als gelbliches Öl vor, das sich in den meisten Lösemitteln mittlerer

Polarität wie Methylenchlorid und Chloroform löst. In Kohlenwasserstoffen und

Methanol ist er schlecht löslich. Die Substanz ist auf dem DC UV-aktiv und färbt sich

beim chemischen Screening mit dem Universalsprühreagenz hellblau.

Die durch Massenspektrometrie (CI, i-Butan) bestimmte Masse liefert einen Molpeak

[M + H+] von m/z = 311, die Feinmasse wird zu 311.1930 ± 3 ppm bestimmt.

Im 13C-NMR-Spektrum lassen sich die verschiedenen Signale anhand charakteristi-

scher Verschiebungen zuordnen. Es zeigt Signale für vier primäre, zwei sekundäre,

zwei tertiäre, vier heterosubstituierte tertiäre, zwei sp2-hybridisierte tertiäre, sowie drei

sp2-hybridisierte quartäre Kohlenstoffatome.

Die Auswertung der Integralstufen im 1H-NMR ergibt für den Bereich hoher (δ = 6.0–

5.0) und mittlerer (δ = 5.0 – 2.3) Verschiebungen, daß die Intensität der Signale 6

29HAUPTTEIL I

Protonen entspricht. Die Auswertung der Integralstufen im Aliphatenbereich ergibt 18

Protonen.

Mit diesen Informationen ergibt sich eine Teilsummenformel ohne Heteroatome von

C17H24 und ein Molekulargewicht von 228. Um auf ein Molekulargewicht von 310 zu

kommen, müssen noch die fehlenden Heteroatome bestimmt werden.

Im IR-Spektrum sind eine für γ-Lactone typische Estercarbonylbande (

= 1780

cm–1), eine Bande für Hydroxyfunktionen (

= 3427 cm–1) und zwei charakteristische

Alkyletherbanden (

= 1068 und 1020 cm–1) zu erkennen. Die Signale der tieffeld-

verschobenen tertiären heterosubstituierten Kohlenstoffatome liegen in einem Ver-

schiebungsbereich von 65 bis 80 ppm, der typisch für einfach O-substituierte C-Atome

ist. Das quartäre C-Atom (C-1) mit dem Signal bei δ = 178 ppm weist auf ein Ester-

carbonylkohlenstoffatom hin. Weitere Heteroatome sind wegen des Fehlens von spezi-

fischen Isotopenmustern, bzw. Peaks im Massenspektrum und fehlender IR-Banden

auszuschließen. Wird jetzt die an 310 fehlende Masse durch Kombination von Sauer-

stoff und Hydroxyprotonen ergänzt, ergibt sich als einzig sinnvolle Kombination

H2O5. Die Summenformel des Naturstoffes 2072.I ergibt sich zu C

17H26O5, daraus

können fünf Doppelbindungsäquivalente berechnet werden. Ein Äquivalent kann für

die Carbonylgruppe und zwei für die nach Auswertung der 13C- und 1H-Spektren er-

haltenen Doppelbindungen abgezogen werden, so daß das Molekül aus einem Zwei-

ringsystem besteht.

Das 1H-Spektrum enthält im Bereich olefinischer Frequenzen zwei Signale, die ein

AB-System bilden, (δ2´ = 5.63: pt, 3J = 11.0 Hz, δ1´ = 5.95 ppm: pt, 3J = 10.5 Hz). Die

Kopplungskonstante der 3J-Kopplung von 11.0 Hz zwischen den beiden olefinischen

Protonen, ist typisch für eine cis-Anordnung der Doppelbindung. Die Tieffeldver-

schiebung der Signale für die Methinprotonen (δ2 = 4.56 ppm, δ7 = 4.17 ppm, δ4 =

3.92 ppm, δ3 = 3.34 ppm) sowie die δ-Werte der direkt daran gebundenen Kohlen-

stoffatome (C-2: δ = 79.9 ppm; C-7: δ= 76.0 ppm, C-4: δ = 68.8 ppm, C-3: δ = 74.0

ppm), sind ein sehr starkes Indiz dafür, daß jeweils ein Sauerstoffatom an diese Koh-

lenstoffatome gebunden ist.

Bei kleineren Frequenzen zeigt das 1H-NMR-Spektrum zwei Dubletts (H-7–CH3: δCH3

= 1.43 ppm, 9´: δ3´–CH3 = 0.98 ppm), die in ihrer Intensität jeweils drei Protonen ent-

sprechen. Hierbei handelt es sich in Übereinstimmung mit den DEPT-135- und DEPT-

90-Spektren um zwei Methylgruppen, die beide jeweils direkt einem Methinproton

benachbart sind und ein AB- (H-5´–CH3, H-5´) sowie ein AX-System (H-3´–CH3, H-

3´) bilden.

Das Signal H-7´ (δ7´ = 0.85 ppm) bildet ein Triplett (3J = 7.3 Hz), das Signal H-5´–

CH3 (δ5´–CH3 = 0.8 ppm) ein Dublett (3J = 6.2 Hz), es sind zwei Methylgruppen, von

denen eine mit einem Methinproton, die andere mit zwei Methylenprotonen koppelt.

HAUPTTEIL I

Um die weiteren Konnektivitäten der Atome zu bestimmen, wird von den

Olefinprotonen bzw. der Doppelbindung ausgegangen. Diese nimmt eine zentrale

Bezugsposition im Molekül ein, denn von ihr kann in dem H,H-COSY-Spektrum in

zwei verschiedene Richtungen ausgegangen werden. Ausgehend von dem Olefin-

proton bei δ = 5.63 ppm, sind nur Kreuzsignale zum Aliphatenbereich hin erkennbar

und vom benachbarten Proton nur Signale zum Bereich mittlerer und hoher Verschie-

bungen.

Das C,H-COSY-Spektrum zeigt im Bereich tiefer Frequenzen Signale für vier primäre,

zwei sekundäre und zwei tertiäre Kohlenstoffatome, von denen sich alle Signale im

Aliphatenbereich des 1H-Spektrums lokalisieren lassen. Ausnahme ist ein primäres

Kohlenstoffatom, das im H,H-COSY-Spektrum eine Konnektivität zu einem Signal für

ein heterosubstituierten C-Atom zeigt und somit nicht dem Bereich der aliphatischen

Seitenkette zuzuordnen ist. Für den aliphatischen Bereich verbleibt somit ein Molekül-

fragment C7H13. Im H,H-COSY-Spektrum ist ein Kreuzpeak eines olefinischen Proto-

nensignals zu einem Methinprotonensignal zu erkennen, das wiederum ein Signal zu

einem Methylgruppensignal und zwei Signale zu einem Methylengruppensignal zeigt.

Aus diesen Informationen läßt sich das Fragment II konstruieren.

4´ 3´

2´

1´

Fragment II:

Die Kopplungskonstanten des Methinprotonensignals, das zu einem Multiplett auf-

spaltet, lassen sich nicht bestimmen. Das Methylgruppensignal ist durch die Kopplung

mit dem Methinprotonensignal H-3´ zu einem Dublett (3J = 6.6 Hz) aufgespalten. Die

an dieses Stereozentrum gebundene Methylengruppe zeigt Signale für zwei geminal

koppelnde, diastereotope Protonen. Im C,H-COSY-Spektrum spaltet das Kreuzsignal

des C-Atoms der Methylengruppe zu beiden Protonen auf. Für den aliphatischen Rest

bleiben nach dieser Zuordnung nur noch eine Methingruppe, eine Methylengruppe und

zwei Methylgruppen übrig. Da eine Methyl- und eine Methylengruppe ein A

3X2-Sys-

tem bilden, sieht die einzig sinnvolle Anordnung dieser Fragmente wie folgt aus

(Fragment III):

31HAUPTTEIL I

5´6´

7´

Fragment III:

Die entsprechenden Signale dieses Fragmentes finden sich im H,H-COSY-Spektrum,

ein Kreuzpeak zwischen dem Methinprotonensignal und dem Signal der vicinalen

Methylgruppe, die im 1H-Spektrum zu einem Dublett aufspaltet, sowie ein Kreuzpeak

für das Methinprotonensignal zum Methylengruppensignal und von dieser zum Signal

der terminalen Methylgruppe, das zu einem Triplett aufspaltet. Das Gesamtfragment

für die aliphatische Seitenkette hat demnach Fragmentstruktur IV, mit zwei Stereo-

zentren.

7´

6´

5´

4´

3´

2´

1´

* *

Fragment IV:

Die Struktur der Seitenkette wurde zusätzlich noch durch das Massenspektrum be-

stätigt. Es zeigt vier Peaks, die nach Abspaltung von H2O, als Fragmentionen der Sei-

tenkette zu interpretieren sind, und zwar m/z = 221 [M-H2O-C5H11]+, m/z = 211 [M-

C7H15]+, m/z = 193 [M-H2O-C7H15]+ sowie das unter Abspaltung von zwei Wasser-

stoffatomen entstandene Fragmention m/z = 172 [M-CH3-C9H15]+.

Die für die Seitenkette mit literaturbekannten Inkrementregeln[30] berechneten 13C-

Verschiebungen stimmen sehr gut mit den gemessenen Werten überein (Tabelle 10).

C-Atom 7´ 6´ 5´ 5´-CH34´ 3´ 3´-CH3

δC (gem.) 11.7 30.1 30.9 19.4 44.8 32.4 22.2

δC (ber.) 11.5 30.4 31.8 20.2 44.0 32.7 21.5

∆δC0.2 0.3 0.9 0.8 0.8 0.3 0.7

Tabelle 10: Berechnete und gemessene 13C-Verschiebungen der Fragmentstruktur III

HAUPTTEIL I

Auf der anderen Seite der Doppelbindung des Moleküls kann man aus den Korrela-

tionen des H,H-COSY-Spektrums Fragment V konstruieren:

1´

Fragment V:

Die Anordnung der Atome wird durch eine genauere Analyse der Peakmuster und der

Kopplungskonstanten bestätigt[31]. Es zeigen sich folgende Aufspaltungsmuster und

Kopplungskonstanten in Fragment V:

Ø Das Olefinprotonensignal für 1´ ist in ein Dublett vom Dublett auf (dd, 3J = 11.0

Hz und 8.9 Hz)aufgespalten

Ø Das mit dem Signal des Olefinprotons koppelnde Signal H-2 ist ein Pseudotriplett

(pt, 3J = 9.0 Hz)

Ø das Protonensignal für H-3 spaltet zu einem Pseudotriplett (3J = 9.2 Hz) auf

Ø Zwischen den Protonensignalen von H-4 und H-7 ist im H,H-COSY-Spektrum ein

intensives Kreuzsignal zu erkennen

Im 1H-Spektrum spaltet das Signal für H-4 zu einem Doppeldublett (dd, 3J = 6.0 Hz

und 1.6 Hz) und das Signal für H-7 zu einem Dublett vom Quartett (dq, 3J = 1.3 Hz

und 6.9 Hz) auf. Die sehr kleine Kopplungskonstante ist entweder auf eine syn-Anord-

nung der vicinalen Protonen mit einem Interplanarwinkel um 90° zurückzuführen oder

zeigt an, daß es sich hier um eine longe-range-Kopplung handelt.

Das 1H-Signal von H-7 ist Bestandteil eines A

3X-Systemes, mit der Teilstruktur

O-CHX-CH3A. Mit diesem Teilfragment sind alle protonentragenden Gerüstatome

zugeordnet. Bei den noch fehlenden Molekülbausteinen handelt es sich um einen Car-

bonylkohlenstoff. Die Tieffeldverschiebung spricht dafür, daß ein Carbonsäurederivat

vorliegt. Danach verbleiben nur noch die beiden quartären sp2-hybridisierten Kohlen-

stoffatome C-4a und C-7a, die zu einer Doppelbindung gehören. Deren Anordnung

läßt sich ausschließlich durch eine genaue Analyse des HMBC-Spektrums klären.

Auch bei welchen lt. Summenformel noch verbleibenden Sauerstoffatomen es sich um

33HAUPTTEIL I

die Ringatome für die zwei im Molekül enthaltenen Ringe handelt, kann über das

HMBC-Spektrum geklärt werden. So erfüllt einzig die in Abbildung 15 dargestellte

Struktur alle Signalzuordnungen widerspruchsfrei.

OOH

Abb. 15: Aus Pilzstamm 2072 isolierter Sekundärmetabolit 2072.I (mit allen im HMBC-Spektrum

sichtbaren long-range Kopplungen)

Die Zuordnung läßt sich wie im Folgenden erläutert, aus dem HMBC-Spektrum ent-

wickeln. Welches Signal im 13C-Spektrum zum Estercarbonylkohlenstoffatom oder

zum sauerstoffsubstituierten C-Atom der Doppelbindung gehört, läßt sich nicht anhand

der chemischen Verschiebung bestimmen, denn beide Signale zeigen eine ähnliche

chemische Verschiebung (178.0 ppm, 172.3ppm). Das hochfeldverschobene C-Atom

der Doppelbindung C-4a muß aufgrund der 3J-long-range-Kopplung von Proton H-3

des Fragmentes VI, direkt mit dem C-Atom C-4 verknüpft sein. Der Ringschluß zum

Pyranringfragment, erfolgt wegen einer schwachen 3J-Kopplung von H-2, über das

Sauerstoffatom, zu C-7a der Doppelbindung. Mit C-7a kann das A3X-System (H-7, H-

7–CH3) verknüpft werden, das 3J-Kopplungen von der Methylgruppe und 2J-

Kopplungen vom Methinproton zu C-7a zeigt. Der Ringschluß zum γ-Lacton ergibt

sich aus der 3J-Kopplung im C,H-COSY-Spektrum von H-7 zu C-5.

HAUPTTEIL I

Abb. 16: Aus Pilzstamm 2072 isolierter Sekundärmetabolit 2072.I (mit den für die Lokalisierung der

Doppelbindung und der Ringschlüsse notwendigen lon-range-Kopplungen)

Die Position der zwei freien OH-Gruppen (C-3–OH, C-4–OH) wird über einen H/D-

Austausch im 13C-Spektrum bestätigt. Dadurch wird die Elektronendichte der C-

Atome, an die die OH-Gruppen gebunden sind, geringfügig aber meßbar verändert.

Beim Vergleich der chemischen Verschiebungen zwischen dem 13C-Spektrum in

CDCl3 und dem Spektrum in CDCl3/D2O zeigt sich, daß die chemischen Verschiebun-

gen für alle Kohlenstoffsignale bis auf maximal 0.05 ppm Abweichung identisch sind.

Ausnahme sind die zwei C-Atome C-3 und C-4. Bei diesen weicht die chemische Ver-

schiebung um 0.21 ppm bzw. um 0.17 ppm voneinander ab. Werden die Verschie-

bungen statistisch aufbereitet, ergibt sich, daß die Verschiebungen signifikant unter-

schiedlich sind.

Eine abschließend durchgeführte Berechnung der chemischen Verschiebungen mit

dem Programm Specinfo, zeigte für die Struktur eine recht gute Übereinstimmung mit

den gemessenen chemischen Verschiebungen (Tabelle 11).

C-Atom 7a 34a 72347-CH3

δC (gem.) 178.0 172.3 101.0 79.7 74.6 72.3 65.3 17.6

δC (ber.) 176.1 173.4 107.6 76.8 76.3 71.0 63.6 16.5

∆δC1.9 1.1 6.6 2.9 1.7 1.3 1.7 0.1

Tabelle 11: Berechnete (δC (ber.)) und gemessene (δC (gem.)) 13C-Verschiebung des Naturstoffes 2072.I in

ppm

35HAUPTTEIL I

3.6.1 Ermittlung der relativen Konfiguration

Da die Kopplungskonstanten neben Substituenteneinflüssen wesentlich vom Molekül-

bau abhängen, können aus ihrer Größe Rückschlüsse auf die räumliche Anordnung

gezogen werden. Die Kopplungskonstanten sind dabei von den Parametern Bindungs-

länge, Bindungswinkel und Torsionswinkel abhängig. Unter Berücksichtigung dieser

Faktoren läßt sich die Konfiguration des Naturstoffes 2072.I folgendermaßen disku-

tieren: Die Kopplungskonstante von 8.9 Hz zwischen den Protonensignalen von H-2

und H-3 spricht für eine trans-diaxiale-Stellung (Abb. 17). Die Kopplungskonstante

der Signale von H-3 und H-4 (8.9 Hz bzw. 9.2 Hz) entspricht der Größenordnung von

3Jaa und deutet ebenfalls auf eine trans-diaxiale-Anordnung hin. Zu berücksichtigen ist

jedoch der Einfluß der elektronegativen Sauerstoffsubstituenten, ohne den die Kopp-

lungskonstanten noch größer wären. Die durch Analyse der Kopplungskonstanten

getroffene Zuordnung der räumlichen Stellung der Protonen wird durch NOE-

Differenzspektren bestätigt.

OHO

CH3

HHH

77a

4a 4 3

Abb. 17: Ermittlung der relativen Konfiguration des Naturstoffes 2072.I anhand der NOE-Signale

Die relative Konfiguration des Sechsringsystems zu der des Fünfringsystems, läßt sich

nicht über Kern-Overhauser-Effekte klären, da die räumliche Entfernung der Protonen

aus dem Sechs- und dem Fünfring zu groß für einen NOE-Effekt ist. Man kann jedoch

davon ausgehen, daß beide Naturstoffe aus einer Biosyntheseroute entstanden sind, der

Naturstoff 2072.I durch Dehydrierung aus 2072.II oder 2072.II durch Hydrierung aus

2072.I. Die relative Konfiguration kann deshalb für beide Sekundärmetabolite als

gleich angesehen werden. Somit kann für 16 die gleiche relative Konfiguration wie für

den Naturstoff 2072.II angenommen werden (Abbildung 21).

Die relative Konfiguration der Alkylseitenkette kann nicht aus den NOE-Spektren auf-

geklärt werden, da hier keine starres Molekülgerüst mit fixierten Atomen, sondern eine

Kette mit um ihre Bindungsachsen frei rotierenden Atomen vorliegt. Die relative Kon-

figuration kann jedoch über einen NMR-Spektrenvergleich aufgeklärt werden. Bei

HAUPTTEIL I

dem Vergleichsmolekül handelt es sich um die Seitenkette der Saragossasäure A

[32],

deren Methylgruppen in der syn-Anordnung zueinander stehen.

Abb. 18: Seitenkette der Saragossasäure A, mit syn-ständigen Methylgruppen

Da sowohl die 1H-, als auch die 13C-Daten an den Positionen 3´,4´,5´,8´und 9´ zwi-

schen der Seitenkette des Naturstoffes 2072.I und der der Saragossasäure stark von-

einander abwichen und sie somit eine unterschiedliche Stereochemie besitzen, kann

für die Seitenkette von 9 eine anti-Anordnung der Methylgruppen postuliert werden.

Um von den Naturstoffen 2072.I und 2072.II Einkristalle zu erhalten, wurden die

Acetat- und o-Brombenzoate synthetisiert. Die so erhaltenen Kristalle waren aber bei

der Röntgenstrukturanalyse zu reflexarm um verwertbare Röntgenstrukturen zu

erhalten.

3.6.2 Biosynthese des Naturstoffes 2072.I

Um die Biosynthese des Naturstoffes aufzuklären, müssen 13C-markierte Precusor, wie

13C-Acetat, -Malonat oder ähnliche an die Mikroorganismen verfüttert werden. Der

Metabolit wird anschließend isoliert und die 13C-markierten Sequenzen der verfütter-

ten Precusor ermöglichen Rückschlüsse auf die Biosynthese des Metaboliten.

Literaturbekannte Verbindungen, die ähnliche Teilstrukturen wie die des Naturstoffes

enthalten, sind Substanzen, die nach dem Polyketidweg gebildet werden. Dies sind

zum Beispiel die Avenaciolide[33], die aus Acetat, Malonat und Succinyl-CoA als

Grundbausteinen produziert werden.

37HAUPTTEIL I

3.6.3 Strukturaufklärung des Naturstoffes 2072.II

4a 4

1´

2´

3´4´

5´

6´

7´

Abb. 19: Aus Pilzstamm 2072 isolierter Sekundärmetabolit: 2072.II (17)

Der Naturstoff 2072.II wurde in geringer Menge (8 mg) aus dem Kulturansatz isoliert.

Er schmilzt bei 156 °C und kristallisiert aus Aceton/n-Hexan in weißen Kristallnadeln.

Er ist in polaren Lösemitteln wie Aceton und Methanol gut löslich und hat in einem

Gemisch aus Methylenchlorid/Methanol (95:5) einen Rf-Wert von 0.3.

Eine IR-Bande bei

= 1773 cm–1 deutet auf eine γ-Lactoncarbonylfunktion hin.

Weitere signifikante Banden sind bei

= 3427 cm–1 für eine OH-Funktion und bei

= 1090 cm–1 und 1011 cm–1 für eine Alkyletherfunktion zu erkennen.

Im Massenspektrum (CI - NH3) ist der Molekülpeak bei m/z = 328 gleichzeitig der

Basispeak. Spezifische Isotopenmuster sind nicht zu erkennen, so daß von Sauerstoff

als einzigem Heteroatom ausgegangen werden kann. Daraus ergibt sich unter Berück-

sichtigung der NMR-Daten eine Summenformel von C17H28O6.

Das 13C-Spektrum enthält Signale für ein quartäres Estercarbonylkohlenstoffatom

(177.7 ppm) und ein quartäres oxygeniertes C-Atom (73.9 ppm). Weitere Signale sind

zwei sp2-hybridisierte tertiäre, sieben tertiäre, von denen fünf heterosubstituiert sind,

zwei sekundäre und vier primäre Kohlenstoffatome. Danach ergibt sich eine Teilsum-

menformel von C17H25O3. Ergänzt man die Teilsummenformel noch um die fehlenden

Heteroatome, so fehlen an der durch die Masse bestimmten Summenformel drei Sau-

erstoff- und drei Wasserstoffatome. Demnach müssen zwei Hydroxy-, eine Ether-

funktionen und eine Lactoncarbonylgruppe im Molekül vorhanden sein. Die Anzahl

der Doppelbindungsäquivalente ergibt sich zu vier, von denen nach Abzug zweier

HAUPTTEIL I

Äquivalente für die Carbonylgruppe und einer Doppelbindung noch zwei für ein Zwei-

ringsystem verbleiben.

Im 1H-Spektrum entsprechen für den Bereich hoher (δ = 6.0 – 5.0) und mittlerer (δ =

5.0 – 2.5) Frequenzen die Integralstufen der Signale jeweils einem Proton. Die beiden

Signale im Bereich hoher Frequenzen (δ2´ = 5.53 ppm, δ1´ = 5.25 ppm) bilden ein AB-

System (pt, 3J = 11.0 Hz, dd, 3J = 10.1 und 9.0 Hz). Die Kopplungskonstante der 3J-

Kopplung von 11.0 Hz zwischen den beiden olefinischen Protonen ist typisch für eine

cis-Anordnung der Protonen. Weitere erkennbare signifikante Signalgruppen im Ali-

phatenbereich sind ein A3X2-System (A3: 0.86 ppm, X2: 1.47 ppm), zwei jeweils zum

Dublett aufgespaltene Methylgruppensignale (0.98 ppm, 1.36 ppm) sowie ein Methyl-

gruppensingulettsignal (1.12 ppm).

Die Doppelbindung nimmt eine zentrale Position ein, von der aus das Molekül durch

Analyse der H,H- und CH-COSY-Spektren sukzessive aufgebaut werden kann.

Dabei können aus den Kopplungskonstanten und Aufspaltungsmustern des

1H-Spektrums sowie den Kreuzsignalen des H,H-COSY-Spektrums folgende Molekül-

fragmente konstruiert werden:

O1´

2´

3´

4´

5´

6´

7´ 2

Fragment VI: Fragment VII: Fragment VIII:

77a 4a

Fragment IX: Fragment X:

39HAUPTTEIL I

Versucht man diese Partialstrukturen über die Estercarbonylgruppe (Fragment X) und

das heterosubstituierte quartäre C-Atom (Fragment VII) zum Gesamtmolekül zu ver-

knüpfen, so bleibt immer eine Verknüpfungsstelle über zwei C-Atome offen. Das be-

deutet aber, das die zwei Fragmente VIII und IX doch direkt miteinander verknüpft

sein müssen. Ein Indiz liefert ein sehr schwaches Kreuzsignal im H,H-COSY zwi-

schen den Protonensignalen von H-3 und H-4. Das Kopplungsmuster des Protonen-

signals von H-3 läßt sich jedoch nicht analysieren, da es ein Multiplett ohne erkenn-

bare Feinstruktur ist. Die Lösung des Problems liefert das H/D-ausgetauschte Proto-

nenspektrum. Hier spaltet das Signal H-3 zu einem Dublett vom Dublett mit den

Kopplungskonstanten 6.75 Hz und 9.0 Hz auf, es koppelt demnach mit dem Pseudotri-

plett des Protons H-4 (9.0 Hz). Bestätigt wird diese Kopplung durch die Auswertung

des HMBC-Spektrums, das auch die Verknüpfung der Ringsysteme über die Sauer-

stoffatome klärt.

1´

2´

3´

4´

5´

6´

7´

Abb. 20: Im HMBC-Spektrum sichtbare nJC,H-Kopplungen (n = 2 – 3) des Naturstoffes 2072.II

Der Naturstoff wurde erstmals von mir isoliert und beschrieben und läßt sich keiner

bekannten Naturstoffklasse zuordnen. Seine biologischen und pharmazeutischen Ei-

genschaften sind noch nicht geklärt, er befindet sich aber gerade im Wirkstoffscree-

ning der BASF.

HAUPTTEIL I

3.6.3.1 Ermittlung der relativen Konfiguration

Die relative Konfiguration des Naturstoffes 2072.II läßt sich aus den Kopplungskon-

stanten, den Kopplungsmustern sowie aus NOE- und NOESY-Spektren herleiten.

H3C

1´

8.7

11.0

9.2

6.8

9.2

3.6

6.7

6.5

2.7

6.5

3.1

8.9

Abb. 21: Naturstoff 2072.II mit seinen Kopplungskonstanten (Kopplungskonstanten in Hz)

Die Kopplungskonstante von 8.9 Hz spricht für eine bevorzugte trans-diaxiale-Stell-

ung der Protonen H-1´ und H-2 (Abb. 21). Die Kopplungskonstante der Protonen H-2

und H-3 von 8.9 Hz bzw. 9.2 Hz entspricht der Größenordnung von 3Jaa für eine trans-

bisaxiale Anordnung, genauso wie die Kopplungskonstante der Protonen H-3 und H-4

(3J = 9.2 Hz). Die Kopplung des Protons H-4 mit H-4a (3J = 6.7 Hz) liegt für eine

normale 3Jaa-Kopplungskonstante in einem sechsgliedrigen Ringsystem an der unteren

Grenze. Hierbei muß aber berücksichtigt werden, daß das Proton H-4a an ein Brücken-

C-Atom mit einem Sauerstoff gebunden ist. Deshalb spricht nichts gegen eine axiale

Position der beiden Protonen. Die durch Analyse der Kopplungskonstanten getroffene

Zuordnung der räumlichen Stellung der Protonen, wird durch NOE-Differenzspektren

und NOESY-Experimente bestätigt.

Bei den Fünfringen sind die Beziehungen zwischen den Kopplungskonstanten und der

Position der Protonen zueinander nicht so klar wie bei den Sechsringen. Die Inter-

pretation der räumlichen Anordnung erfolgt hier ausschließlich über Kern-Overhauser-

Effekte. Aus den entsprechenden Spektren ergibt sich, daß die Protonen H-3 und H-4a

1,3-diaxial zueinander stehen. Für die Protonen H-2 und H-3 ergibt sich daraus, wie

über die Kopplungskonstanten schon bestätigt wurde, eine trans-diaxiale Anordnung.

Die Protonen H-2 und H-7a stehen ebenfalls 1,3-diaxial zueinander.

Die Stellung des Protons H-7 und der CH3-Gruppe H-7–CH3 ist aus den NOE-Diffe-

renzspektren nicht zu entnehmen. Der große Unterschied zwischen den beiden Sig-

nalintensitäten läßt keine vernünftige Phasenkorrektur der NOE-Differenzspektren zu,

41HAUPTTEIL I

daher ist eine eindeutige Auswertung ist nicht möglich. Die Information über die

Raumlage gibt in diesem Fall nur das NOESY-Spektrum. Es zeigt Kreuzpeaks von

dem Methylgruppensignal H-7–CH3 zu den Signalen der Protonen H-7 und H-7a, die

ausschließlich bei einer äquatorialen Stellung der Methylgruppe möglich sind. Die

Protonen H-7 und H-7a stehen folglich trans zueinander. Mit den Kopplungskon-

stanten und den Informationen aus den NOE-Spektren kann für den Naturstoff 2072.II

folgende Konformation (Abb. 22) vorgeschlagen werden. Danach ergibt sich für alle

Substituenten die thermodynamisch günstigere äquatoriale Position.

54a 43

CH3

OHH

Abb. 22: Die relative Konfiguration des Naturstoffes 2072.II (↔, gemessene Nuklear-Overhauser-

Effekte)

3.6.4 Biologische Aktivität des Naturstoffes 2072.II

Im biologischen Screening war der Naturstoff als unauffällig einzustufen. Die Hemm-

hofradien sind in Tabelle 12 aufgeführt.

Agardiffusionstest (c = 1 [mg/ml])

Hemmhofradien [mm]

Substanz Chl. E. C. B. m. Ust. Eur. M. m. Fus.

2072.II 3220604

Tabelle 12: Biologische Aktivität von 17

HAUPTTEIL I

3.6.5 Strukturaufklärung des Naturstoffes 2072.III

OOH

88a

Abb. 23: Aus Pilzstamm 2072 isolierter Naturstoff 2072.III, Hydroxy-6-deoxyscytalon (18)

Der Naturstoff wurde in Form farbloser Kristallnadeln mit einem Schmelzpunkt von

82 °C aus der polaren Rohextraktfraktion isoliert. Auf dem DC färbt die bei 254 nm

UV-detektierbare Substanz mit dem Universalsprühreagenz hellblau an. Das IR-Spek-

trum zeigt charakteristische Banden für Hydroxy- (

= 3427 cm–1) und Carbonyl-

gruppen (

= 1640 cm–1), sowie für substituierte Aromaten.

Im Massenspektrum (EI) zeigt der Naturstoff einen Molpeak [M+] bei m/z = 194, für

den sich in Übereinstimmung mit den NMR-Daten die Summenformel zu C

10H10O4

berechnet.

Die Auswertung des 1H-Spektrums zeigt ein für chelatisierte Hydroxyprotonen ty-

pisches Signal (δ = 12.04 ppm), das durch CD3OD austauschbar ist. Im Aromaten-

bereich ist das typische Aufspaltungsmuster für ein AMX-System mit den entspre-

chendem ortho- und meta-Kopplungen sichtbar. Der für heteroatomsubstituierte Sig-

nale charakteristische Verschiebungsbereich des 1H-NMR-Spektrums weist zwei

Methinprotonensignale auf, deren komplementäre 13C-Signale (73.1 ppm, 71.8 ppm)

vorliegen. Im Aliphatenbereich findet sich nur ein Signal, das nach Auswertung der

Protonenintegralstufen und des C,H-COSY-Spektrums einer CH2-Gruppe zugeordnet

werden kann. Weitere signifikante Signale treten für eine Carbonylgruppe (δ = 206

ppm) und ein oxygeniertes aromatisches C-Atom auf (δ = 164.3 ppm). Aus diesen In-

formationen können mit Hilfe des H,H-COSY-Spektrums zwei Partialstrukturen er-

mittelt werden (Fragment XI, Fragment XII)

43HAUPTTEIL I

Fragment XI Fragment XII

Die Konnektivitäten werden durch das HMBC-Spektrum ermittelt. Danach ergibt sich

die Stellung der Carbonylgruppe direkt zwischen der Methylengruppe H-2 und der

Aromatenpostion C-8a. Der Ringschluß zum laut Doppelbindungsäquivalenten vorlie-

genden Zweiringsystem erfolgt über die noch freie Stelle des aliphatischen Fragmentes

an die Position 4a des Aromaten. Danach verbleibt für die noch nicht zugeordnete Hy-

droxyfunktion nur die Position 8a am Aromaten, von der aus die Hydroxyfunktion mit

der Carbonylgruppe chelatisieren kann. Die Kopplungskonstante von 5.3 Hz zwischen

den Protonen H-4 und H-3 ist typisch für eine cis-Anordnung.

Durch Vergleich mit den Literaturdaten, kann der Naturstoff als literaturbekanntes

Tetralonderivat cis-4-Hydroxy-6-deoxyscytalon identifiziert werden, das neben

Scytalon (Abb. 24), erstmals 1981 aus dem Pilz Phialophara lagerbergii isoliert

wurde[34].

OOH

OHOH

Abb. 24: Scytalon (19)

In einer Arbeit von Sankawa[35] wurde durch Verfüttern von radioaktiv markiertem [2-

13C, 2-2H3]-Acetat an den Pilz der Biosyntheseweg des Metaboliten 18 aufgeklärt.

Demnach ist der Naturstoff polyketider Herkunft und wird aus einem Hexaketid gebil-

det.

HAUPTTEIL I

3.6.6 Strukturaufklärung des Naturstoffes 2072.IV

4´´

3´´

2´´

1´´

HO OH

1´

2´

3´ 4´

5´

Abb. 25: Aus Pilzstamm 2072 isolierter Naturstoff: 2072.IV (20)

Von dem nur in polaren Lösemitteln wie z. B. Aceton oder Methanol löslichen Natur-

stoff wurden 2 mg isoliert. Durch chemische Ionisation (CI - MS; NH4+) wurde ein

Spektrum mit einem Feinmassemolekülionenpeak [M + NH4+] bei m/z = 456.22391

erhalten, daraus ergibt sich die Summenformel des Metaboliten zu C22H30O9.

Im IR-Spektrum sind bei

= 1775 cm–1 eine charakteristische γ-Lactoncarbonylbande

und bei

= 1701 cm–1 eine Carbonylbande zu erkennen. Weitere signifikante Banden

sind bei

= 3438 cm–1 für eine OH-Funktion und bei

= 1095 cm–1 und 1081 cm–1

für eine Alkyletherfunktion zu erkennen.

Im 1H-Spektrum liegen drei durch Deuterium austauschbare Protonensignale vor, zwei

Singuletts (δ9-OH = 5.51 ppm, δ11-OH = 5.45 ppm) und ein Dublett (δ5-OH = 4.19 ppm).

Im Bereich mittlerer Frequenzen zeigt das Spektrum ein Singulettsignal, das einem

Proton entspricht (δ10 = 4.28 ppm), ein Multiplettsignal (δ5´,8 = 4.00 ppm), unter dem

zwei Protonen liegen und ein Doppeldublettsignal, das einem Proton entspricht (δ8 =

3.91 ppm). Im C,H-COSY-Spektrum zeigt das Signal des Kohlenstoffatoms C-8 ein

Kreuzsignal zu dem Multiplett und dem Doppeldublett, es handelt sich hier demnach

um die geminal koppelnden Protonen einer Methylengruppe. Weitere Signale, die je-

weils einem Proton entsprechen, sind ein Dublett (δ5 = 3.08 ppm), ein Multiplett (δ2´´ =

45HAUPTTEIL I

3.01 ppm) und ein weiteres Dublett (δ3 = 2.81 ppm). Im Aliphatenbereich sind Signale

für drei Methylgruppen zu erkennen:

Ø ein Singulett (δ9a-CH

= 1.46 ppm)

Ø ein Dublett (δ2´-CH

= 1.10 ppm)

Ø ein Triplett (δ4´´ = 0.85 ppm)

Zusätzlich zeigt das 1H-Spektrum Signale für eine CH-Gruppe (δ8a = 2.15 ppm), die

zum Doppeldublett aufspaltet und Signale für drei CH2-Gruppen zwischen 2.4 und 1.2

ppm (4´, 3´, 3´´) mit nichtäquivalenten Protonen die jeweils zum Multiplett aufspalten.

Aus den 1H- und dem H,H-COSY-Spektrum können über die Kopplungskonstanten

und die Kreuzsignale mehrere Spinsysteme identifiziert werden. Das erste ist

Fragment XIII, dessen Vierspinsystem eine Methylgruppe (4´´) beinhaltet, die durch

die direkt benachbarte Methylengruppe (3´´) zu einem Triplett aufspaltet. Die

Methylengruppe zeigt neben der Kopplung mit der Methylgruppe eine geminale

Kopplung, die auch über Aufspaltung des C,H-COSY Signals belegt ist, sowie eine

Kopplung mit einem Methinproton (2´´), das weiter mit der zum Dublett aufgespal-

tenen Methylgruppe (2´´-CH3) koppelt. Die noch verbleibende freie Valenz des Koh-

lenstoffatoms, an das die Methylgruppe und das Methinproton gebunden sind, wird

durch eine Carbonylgruppe (δ1´´ = 216.9 ppm) abgesättigt, zu der die Protonen 2´´–

CH3 und H-3´´ im HMBC-Spektrum 3J-Kopplungen und H-2´´ eine 2J-Kopplung zei-

gen.

1´´

2´´

3´´

4´´

Fragment XIII: Mit eingezeichneten H,H-COSY-( ) und HMBC-Kopplungen ( )

Eine weitere Partialstruktur (XIV) ist ein Dreispinsystem, das aus drei Methylengrup-

pen besteht. Die Konnektivitäten ergeben sich direkt aus dem H,H-COSY-Spektrum.

Alle drei Gruppen zeigen geminale Kopplungen, d. h. sie sind diastereotop. Die Tief-

feldverschiebungen der Protonensignale für H-5´α,β (δH5´α,β = 4.1 – 4.0 ppm) und des

Kohlenstoffatomsignals C-5´ (δC5´ = 71.36 ppm) sprechen für einen Heterosubstituen-

ten an dem C-Atom. Die Protonen am C-Atom 3´ (H-3´α : δH3´α = 2.2 ppm, H-3´β :

δH3´β = 2.0 ppm) zeigen, außer zu der CH2-Gruppe H-4´α,β keine weiteren 3J-Kopp-

HAUPTTEIL I

lungen, demnach muß an das C-Atom C-3´ ein quartäres C-Atom gebunden sein. Wel-

ches quartäre C-Atom an diese CH2-Gruppe gebunden ist, läßt sich nur anhand des

HMBC-Spektrums ermitteln. Hier zeigen alle Methylenprotonen 2J- bzw. 3J-Kopplun-

gen zum quartären C-Atom C-6. Die extreme Tieffeldverschiebung des Signals für das

C-Atom bei δC6 = 110.0 ppm ist ein Indiz dafür, daß es sich um ein ketalisches C-

Atom handelt. Die Kopplung der Methylenprotonen an C-5´ könnte eine 4J-Kopplung

sein, jedoch ist diese sehr ungewöhnlich, und es handelt sich hier mit größerer Wahr-

scheinlichkeit um eine 3J-Kopplung über das Sauerstoffatom hinweg, an das die Me-

thylengruppe gebunden ist. Dieses Sauerstoffatom ist direkt mit dem quartären ketali-

schen C-Atom C-6 verbunden, so daß sich folgender Heterocyclus als Fragment ergibt:

3´

4´

5´ 6

3´

4´

5´

Fragment XVI: Mit eingezeichneten HMBC-( ) und H,H-COSY-Kopplungen ( )

Das Dreispinsystem mit den Protonen H-3a (CH), H-3 (CH) und H-4 (CH2), stellt ein

weiteres Fragment dar (Fragment XV), dessen Aufbau sich direkt aus den Kopp-

lungskonstanten des Protonenspektrums und den Kreuzsignalen des H,H-COSY-

Spektrums ergibt. Alle freien Valenzen der durch das C,H-COSY bestimmten C-

Atome an die jeweils H-3a, H-3 und H-4 gebunden sind, werden direkt durch quartäre

C-Atome abgesättigt. Um welche C-Atome es sich handelt, kann aus den Kopplungs-

signalen des HMBC-Spektrums nicht eindeutig bestimmt werden, da sich zu viele

Verknüpfungsmöglichkeiten ergeben. Es muß daher versucht werden, das Fragment

später schlüssig in das rudimentäre Gesamtmolekül einzupassen, was mit den bisher

aufgeklärten Partialstrukturen an dieser Stelle noch nicht möglich ist.

Fragment XV: Mit eingezeichneten HMBC-( ) und H,H-COSY-Kopplungen ( )

47HAUPTTEIL I

Aus den noch nicht zugeordneten Signalen des H,H-COSY-Spektrums erkennt man

ein AB-Spinsystem, das aus einer direkt an ein Sauerstoffatom gebundenen CH2-

Gruppe (C-8) mit geminal koppelnden Protonen besteht und einer CH-Gruppe (C-8a),

die direkt an zwei weitere quartäre C-Atome gebunden sein muß. Eines der quartären

C-Atome ergibt sich aus dem HMBC-Spektrum zu C-9. Von diesem C-Atom mit

Halbketalstruktur koppelt das Proton der Hydroxygruppe mit einer 2J-Kopplung zu

C-9 und mit einer 3J-Kopplung zu C-8a. Die HMBC-Kopplungen sind nur bei nicht

gegen Deuterium ausgetauschten OH-Protonen sichtbar, z. B. wenn das Spektrum in

Deuteroaceton aufgenommen wird. Dann können die Hydroxyprotonen 2J-Kopplungen

zu dem direkt an den Sauerstoff gebundenen C-Atom und 3J-Kopplungen zu den direkt

benachbarten C-Atomen zeigen.

O O

Fragment XVI: Mit eingezeichneten HMBC-( ) und H,H-COSY-Kopplungen ( )

Mit diesem Strukturelement sind alle Spinsysteme des Moleküls vollständig aufge-

klärt. Es verbleiben nur drei singuläre Protonenresonanzen, deren Konnektivitäten im

Molekül noch nicht zugeordnet sind. Ein Singulettsignal (C-9a–CH3) gehört zu einer

Methylgruppe, die im HMBC-Spektrum Signale zu den Kohlenstoffatomen C-3a, C-9a

und C-9 zeigt. Da die Methylgruppe aber an ein quartäres C-Atom gebunden sein muß,

kann die CH-Gruppe C-3a als Bindungspartner ausgeschlossen werden. Es verbleiben

nur noch C-9 und C-9a als Bindungsstellen für die Methylgruppe.

Das zweite noch nicht zugeordnete Signal ist ein Dublett (H-5), das direkt an das hy-

droxysubstituierte C-Atom C-5 (δC5 = 74.2 ppm) gebunden ist. Das Proton koppelt mit

der OH-Gruppe, entsprechende Kreuzsignale sind im H,H-COSY- und

HMBC-Spektrum zu sehen. Das OH-Signal zeigt 3J-Heterokopplungen zu C-6 und

C-4a, die demnach beide direkt an C-5 gebunden sind, entsprechende HMBC-Signale

von H-5 bestätigen die getroffene Zuordnung. Das Fragment XVI kann aufgrund der

Kopplungen um diese Konnektivitäten zu Fragment XVII erweitert werden.

HAUPTTEIL I

3´

4´

5´

Fragment XVII: Mit eingezeichneten HMBC-( ) und H,H-COSY-Kopplungen ( )

Die Knüpfung der Etherbrücke über das freie Ketalsauerstoffatom erfolgt mit der CH2-

Gruppe (C-8) des Teilfragmentes XVI, da die Methylenprotonen H-8 ein intensives

Heterokopplungssignal zu C-6 zeigen. Außerdem müssen C-4a und C-8a miteinander

verknüpft sein, da H-5 im HMBC-Spektrum ein intensives Kreuzsignal zu C-8a zeigt.

Für die Vervollständigung der Molekülstruktur über das zentrale quartäre C-Atom C-

4a sprechen zusätzlich die 2JC,H-Kopplungen der Protonen H-5 und H-8a zu C-4a.

3´

4´

5´

5 4a

88a 9

Fragment XVIII: Mit eingezeichneten HMBC-( ) und H,H-COSY-Kopplungen ( )

Alle weiteren über das Fragment XVIII hinausgehenden gemeinsamen Kopplungen

der Protonen H-8a und H-5 müssen 3J-Kopplungen über C-4a sein. Im HMBC-

Spektrum sind das die 3J-Kopplungen von H-8a und H-5 zu den C-Atomen C-4 und C-

10, die somit beide direkt an C-4a gebunden sind. Ergänzt man die Partialstruktur um

diese C-Atome mit ihren entsprechenden Spinsystemen, so ergibt sich folgendes

Fragment:

49HAUPTTEIL I

4´

5´

3´

78a 9

Fragment XIX: Mit eingezeichneten HMBC-( ) und H,H-COSY-Kopplungen ( )

Bestätigt wird diese Zuordnung durch die Kopplungen der ergänzten Spinsysteme zum

bisher identifizierten Molekülgerüst.

Über das C-Atom C-10 läßt sich die Molekülstruktur weiter vervollständigen, denn

dieses zeigt als einziges C,H-long-range-Kopplungen zum Carbonylkohlenstoff C-1´´

und zum Kohlenstoffatom C-2´´, so daß die Seitenkette an das Kohlenstoffatom C-10

gebunden sein muß. Da das Proton H-10 im 1H-Spektrum ein Singulettsignal zeigt,

fehlt noch ein weiteres quartäres C-Atom an C-10, das als das zweite C-Atom mit

Halbketalstruktur (C-11) identifiziert werden kann. Denn das Hydroxyproton des

Halbacetals zeigt ein Kreuzsignal zu den C-Atomen C-10, C-11 und zu dem C-Atom

C-3, das direkt an das C-Atom C-11 gebunden ist.

4´´

3´´

2´´

1´´

10 11

5 4a

5´

4´

3´

HOOH

Fragment XX: Mit eingezeichneten HMBC-( ) und H,H-COSY-Kopplungen ( )

Die bis jetzt noch nicht zugeordneten Atome sind eine Carbonylgruppe, das quartäre

sauerstoffsubstituierte Kohlenstoffatom C-9a und die Methylgruppe C-9a–CH3. Das

einzige Kreuzsignal im HMBC-Spektrum, das zum C-Atom der Methylgruppe zeigt,

geht vom Proton H-3a aus. Die Protonen der Methylgruppe zeigen Kreuzsignale zum

HAUPTTEIL I

quartären C-Atom C-9a, zu C-3a und zu C-9, die jeweils mit einem quartären C-Atom

verknüpft sein müssen. Demnach ist die einzig widerspruchsfreie Position des Kohlen-

stoffatoms C-9a diejenige als Ringatom zwischen den C-Atomen C-3a und C-9, mit

der Methylgruppe C-9a–CH3 als Substituenten. Die Verknüpfung der Estercarbonyl-

gruppe erfolgt über das Sauerstoffatom an C-9a, die der beiden halbketalischen C-

Atome C-9 und C-11 miteinander über eine Etherbrücke. Die verbleibende Estercar-

bonylgruppe (C´-2, 173.01 ppm) wird mit der noch letzten freien Position der Mole-

külstruktur an C-3 zum γ-Lacton verknüpft, dessen Carbonylschwingungsbande sich

im IR-Spektrum bei

= 1775 cm–1 zeigt.

88a 9

4´´

3´´

2´´

1´´

5´

4´

3´

O O

Abb. 26: Der Naturstoff 2072.IV mit eingezeichneten HMBC-Signalen

Eine genauere Analyse der Fernkopplungen des H,H-COSY-Spektrums bestätigt die

Molekülstruktur und liefert über die W-Kopplungen Informationen über die relative

Konfiguration des Moleküls, die durch das NOESY-Spektrum verifiziert werden.

Der Sekundärmetabolit ist bisher literaturunbekannt und enthält einige ungewöhnliche

Strukturelemente. Eine Recherche in der Chapman & Hall Naturstoffdatenbank ergab,

daß nur ungefähr 2% aller Naturstoffe eine Spiroketalstruktur enthalten. Ebenso un-

gewöhnlich sind die beiden etherverbrückten Halbketale, die nur 35 Naturstoffe von

ca. 120 000 bekannten aufweisen. Das ungewöhnlichste Strukturelement ist jedoch der

Adamantangrundkörper mit einem Halbketalsauerstoffringatom. Dieses Oxaada-

mantanstrukturelement ist bisher bei Pilzmetaboliten völlig unbekannt gewesen. In

Naturstoffen kommt ein Oxaadamantangrundkörper nur in dem Alkaloid

5,15-Oxidolycpodan[36] vor (22), das 1990 aus der Pflanze Lycopodium annotinum

isoliert wurde und als Dioxaadamantan im Tetrodotoxin[37], dem Gift des japanischen

Kugelfisches Spheroides rubripes.

51HAUPTTEIL I

CH2OH

21 22

Abb. 27: Tetrodotoxin 5,15-Oxidolycpodan

Das synthetische Äquivalent in Form eines Halbketal-ketals ist ebenfalls bekannt, es

handelt sich um das von Stetter et al.[38] aus Bicyclo[3.3.1]nonan-3,7,9-trion syntheti-

sierte 3,6-Dimethoxy-2-oxaadamantan-1,6-diol.

OCH3

MeOH

23 24

Schema 2: Darstellung von 3,6-Dimethoxy-2-oxaadamantan-1,6-diol aus Bicyclo[3.3.1]nonan-3,7,9-

trion

HAUPTTEIL I

3.6.7 Aufklärung der relativen Konfiguration des Naturstoffes 2072.IV

An dem Oxaadamantangrundkörper ist die relative Konfiguration des Naturstoffes an

den Positionen 9a und 3 durch das γ-Lacton vorgegeben und nur an den Positionen 8a

und 10 zu bestimmen. Die relative Konfiguration der Seitenkette an dem Stereozen-

trum 2´´ kann nicht durch die NOE-Spektren aufgeklärt werden, da die Seitenkette frei

rotieren kann.

O O

3´

4´

5´

8a 4

4a 10

1´´

2´´

3´´

4´´

Abb. 28: Der Naturstoff mit eingezeichneten Signalen aus dem NOESY-Spektrum

Das Protonensignal für H-10 zeigt im H,H-COSY-Spektrum ein sehr intensives

Kreuzsignal zu dem Protonensignal von Hβ-4. Dieses Kreuzsignal ist durch eine W-

Kopplung zu erklären, die aber so klein ist, das sie im 1H-Spektrum nicht zu erkennen

ist. Demnach müßte das Proton eine axiale Position einnehmen um die W-Kopplung

zu ermöglichen. Den entscheidenden Hinweis für diese Konfiguration liefert das

NOESY-Spektrum. Es zeigt einen NOE-Effekt zwischen dem Protonensignal von

H-10 und von Hα-8, der nur auftreten kann, wenn sich das Proton H-10 in der axialen

Position und der Spiroacetal-Heterozyklus relativ zum O-Sechsring des Oxaada-

mantangrundkörpers in der cis-Konfiguration befindet. Zwischen den diastereotopen

Protonen Hα-8 und Hβ-8 kann differenziert werden, weil Hα-8 trans-diaxial und Hβ-8

äquatorial zum Proton H-8a steht. Danach ergibt sich eine ungefähre Kopplungskon-

stante aus der Karplus-Conroy-Beziehung[39] für Hα-8 zu H-8a von 11 Hz und für Hβ-8

zu H-8a von 4.5 Hz. Mit der geminalen Kopplungskonstante von 11.6 Hz spaltet das

Signal für das Proton Hα-8 zum Pseudotriplett und das Signal für das Proton Hβ-8 zum

Doppeldublett auf, beide Signalmuster treten im 1H-Spektrum auf. Weitere NOE-

53HAUPTTEIL I

Signale, die diese Konfiguration des Naturstoffes bestätigen, zeigen die Protonen der

Methylgruppe H-9a–CH3 und das Methinproton H-8a zum Proton Hβ-4.

Die relative Konfiguration des Protons H-5, kann durch ein schwaches NOE-Signal zu

H-10 und durch NOE-Signale des Hydroxyprotons OH-5 zu Hβ-4 und H-8a aufgeklärt

werden. Es steht demnach äquatorial zu Hβ-4.

Die relative Konfiguration des Fünfringspiroacetalfragments ergibt sich durch ein Sig-

nal im NOE-Spektrum zwischen den Protonen H-5´ des Fünfringspiroacetals und dem

Proton H

α-8 des Sechsringspiroacetals. Interpretiert man das Signal zwischen den

Protonen Hα-8 und H-5´ als NOE-Signal, ergibt sich für das Gesamtmolekül die in

Abbildung 29 dargestellte Konfiguration, dessen Konformation Molekül-mechanisch

mit der MM+-Methode optimiert wurde.

Abb. 29: Räumliche Darstellung der relativen Konfiguration des Naturstoffes 2072.IV (die Konfor-

mation wurde mit dem Programm Hyperchem (MM+) optimiert, die Sauerstoffatome sind schwarz

dargestellt)

HAUPTTEIL I

3.6.8 Stamm 3042

3.6.9 Pilzbeschreibung

Pilzstamm 3042 ist ein Fusarium sp., der aus einer chinesischen Bodenprobe (aus

4000 m Höhe) isoliert wurde.

3.6.10 Isolierung aus dem Stamm 3042

3.6.10.1 Naturstoffe 3042.I–3042.VI

Normalerweise wurden die von den Biologen in Braunschweig angesetzten Pilzkul-

turen visuell auf ihr Größenwachstum hin kontrolliert. War die Trophophase beendet,

wurden die Agarplatten von uns aufgearbeitet. Bei dieser Kultur vom Pilzstamm 3042

wurde aber gezielt versucht, eine Umstellung vom Primärstoffwechsel zum Sekundär-

stoffwechsel zu erreichen. Da eine Verarmung des Nährstoffangebotes und Verände-

rung der Umweltbedingungen die Umstellung induzieren, wurde der Pilz auf den

Weichagarplatten weiter wachsen gelassen bis die Platten ausgetrocknet und die Pilz-

kulturen abgestorben waren.

Danach wurden die Kulturen im Warring-Blender mit Ethylacetat homogenisiert und

anschließend die mit Rohextrakt angereicherte Ethylacetatphase abfiltriert und bis zur

Trockene eingeengt. Im Gegensatz zu den anderen konventionell kultivierten Pilzen

konnten nicht wie üblich nur 1–2 g, sondern 8 g Rohextrakt isoliert werden. Der Roh-

extrakt wurde mit einer Kieselgelsäule und Dichlormethan als Lösungsmittel filtriert,

um ihn für die MPLC- und HPLC-Auftrennung an Lobarsäulen vorzubereiten. Durch

die sich anschließende chromatographische Auftrennung unter isokratischen Bedin-

gungen mit Dichlormethan/Methanol (97:3) als Laufmittel, konnten sechs Naturstoffe

(3042.I–3042.VI) isoliert werden, die nach Aufreinigung durch PSC als Reinstoffe

erhalten wurden.

55HAUPTTEIL I

3.6.11 Strukturaufklärung der Naturstoffe

3.6.11.1 Naturstoff 3042.I

Abb. 30: Aus Pilzstamm 3042 isolierter Sekundärmetabolit 3042.I (25): Colletorin B

Die Verbindung 3042.I fällt in Form eines weißen Feststoffes mit einem Schmelz-

punkt von 124–126 °C an. Sie ist optisch inaktiv und fällt aus einer konzentrierten

Dichlormethanlösung in Form schwach gelber Prismen an. Sie besitzt einen Rf-Wert

von 0.9 (Methylenchlorid) und ist auf dem DC im UV-Licht bei einer Wellenlänge von

254 nm gut zu detektieren. Beim Besprühen des Chromatogramms mit einer 2,4-

Diphenylhydrazinlösung färbt er orange an, so daß mindestens eine Carbonylfunktion

im Naturstoff vorliegen muß. Das IR-Spektrum zeigt auch eine stark ausgeprägte Car-

bonylbande bei

= 1640 cm–1 und bestätigt das Vorliegen einer Carbonylfunktion.

Eine IR-Bande bei

= 3441 cm–1 weist auf eine chelatisierte Hydroxyfunktion hin, im

Fingerprintbereich wird ein Aromat angezeigt.

Das Massenspektrum zeigt einen Molpeak [M+] bei m/z = 288, der in Kombination mit

den NMR-Daten auf eine Summenformel von C18H24O3 schließen läßt.

Im 1H-NMR-Spektrum erkennt man drei Singulettsignale (12.75 ppm, 10.07 ppm,

6.20 ppm), die jeweils einem Proton entsprechen. Bei 12.75 ppm liegt ein Signal für

eine chelatisierte Hydroxyfunktion vor, bei 10.07 ein Signal für ein Aldehyd- und bei

6.2 ppm ein Signal für ein Aromatenproton. Weitere Signale sind das Signal für ein

Methinproton (5.04 ppm, J = 7.2 Hz), das zum Triplett aufspaltet und das Signal für

eine Methylengruppe (3.39 ppm, J = 6.9 Hz), das zum Dublett aufgespalten ist. Im

Aliphatenbereich zeigt das Spektrum Signale für drei Methylgruppen als Singuletts

und ein Multiplettsignal, das zwei Methylengruppen entspricht. Auffällig ist die Tief-

feldverschiebung der Resonanzen des Aliphatenbereichs. Bei einem Deuteriumaus-

tausch mit CD3OD verschwindet das Signal für das chelatisierte Hydroxyproton. Im

HAUPTTEIL I

13C- und den DEPT-Spektren sind im Bereich zwischen 200 und 100 ppm Signale für

einen tertiärer Aldehydkohlenstoff, drei weitere tertiäre sp2-hybridierte Signale, sowie

sieben quartäre sp2-hybridisierte Kohlenstoffatomsignale zu erkennen. Zwei der Sig-

nale für die quartären C-Atome weisen eine für sauerstoffsubstituierte aromatische C-

Atome typische Tieffeldverschiebung (163.6 ppm, 162.7 ppm) auf. Die Gerüst-

schwingungen im IR-Spektrum weisen schon auf ein Aromatenfragment hin, das we-

gen fehlender aromatischer Protonen im 1H-Spektrum mindestens fünffach substituiert

sein muß. Im Aliphatenbereich des Spektrums befinden sich Signale für drei sekundäre

und vier primäre Kohlenstoffatome, die alle auffallend tieffeldverschoben sind. Bei

diesem Naturstoff trat die besondere Schwierigkeit auf, daß den 1H-NMR-Spektren die

für eine Gerüstanalyse relevanten Informationen der vicinalen Kopplungen fehlten.

Die Substituenten treten alle durch schwache Fernkopplungen über den aromatischen

Kern hinweg miteinander in Wechselwirkung. Die zur Gerüstanalyse des Naturstoff-

moleküls notwendigen Informationen liefert allein das HMBC-Spektrum über die C,H-

Fernkopplungen (nJC,H mit n = 2–3), nach denen sich die Struktur des Naturstoffes wie

folgt ergibt:

Abb. 31: Colletorin B, mit allen sichtbaren HMBC-Kopplungen

Die Literaturrecherche ergab, daß es sich bei dem Naturstoff um Colletorin B, einen

erstmals 1974 aus Cephalosporium diospyri isolierten Sekundärmetaboliten handelt[40].

57HAUPTTEIL I

3.6.11.2 Naturstoff 3042.II

OHO

Abb. 32: Aus Pilzstamm 3042 isolierter Naturstoff 3042.II (26): Colletochlorin B

Der Naturstoff 3042.II liegt in Form weißer amorpher Kristalle vor und hat in Methy-

lenchlorid einen Rf-Wert von 0.6. Auf dem DC ist er im UV-Licht bei einer Wellen-

länge von 254 nm gut zu detektieren, mit dem Ansprühreagenz auf Aldehyde und Ke-

tone reagiert er positiv. Er ist optisch inaktiv und hat einen Schmelzpunkt von 90 °C.

Im IR-Spektrum sind wie beim Naturstoff 3042.I eine ausgeprägte Carbonylbande zu

erkennen und eine Bande, die auf eine chelatisierte OH-Funktion hinweist. Besonders

auffällig ist das Massenspektrum, es zeigt einen Molpeak [M+] bei m/z = 322 und ei-

nen intensiven [M+ + 2] Peak, dessen Auftreten charakteristisch für monohalogenierte

Chlorverbindungen ist.

Das 1H-Spektrum ist bis auf das fehlende Singulettsignal für das aromatische Proton

identisch mit dem des Naturstoffes 3042.I. Das gleiche gilt für das 13C-Spektrum im

Aliphatenbereich mit drei sekundären und vier primären Signalen. Im Bereich zwi-

schen 200–100 ppm fehlt das tertiäre C-Signal des Aromaten, stattdessen ist dort ein

quartäres sp2-hybridisiertes C-Signal vorhanden.

Aus den Informationen des Massenspektrums und der NMR-Spektren kann auf eine

Summenformel C18H23ClO3 geschlossen werden. Die Vermutung liegt nahe, daß es

sich um ein halogeniertes Derivat des Colletorins B handelt, bei dem anstelle des aro-

matischen Protons in 5-Position ein Chloratom zu finden ist. Die Auswertung der

COSY- und HMBC-Spektren sowie einer Datenbankrecherche bestätigen diese An-

nahme. Es handelt sich um den Naturstoff Colletochlorin B, der erstmals 1974 aus

Colletotrichum nicotianae isoliert[41] und 1994 synthetisiert[42] wurde. Bei den Natur-

stoffen 3042.I und 3042.II handelt es sich wahrscheinlich um zwei Folgeprodukte des

HAUPTTEIL I

gleichen Biosyntheseweges. Sie sind hier erstmals aus einem Pilz isoliert worden und

nicht wie bisher aus zwei verschiedenen Pilzarten.

3.6.11.3 Naturstoff 3042.III

Abb. 33: Aus Pilzstamm 3042 isolierter Naturstoff 3042.III (27): LL-Z 1272β

Bei der dritten aus dem Rohextrakt isolierten Verbindung handelt es sich um ein gelb-

liches Öl mit einem Rf-Wert von 0.7 (Laufmittel: Methylenchlorid). Die Substanz ist

optisch inaktiv, läßt sich im UV-Licht bei 254 nm detektieren und färbt mit dem Phe-

nylhydrazin-Sprühreagenz gelb an, so daß im Naturstoff eine Carbonylfunktion vor-

liegen muß.

Im Massenspektrum erkennt man einen Molpeak bei [M+] = 342, Isotopenpeaks sind

nicht vorhanden.

Das 1H-Spektrum zeigt die charakteristischen Protonensignale für ein chelatisiertes

Hydroxyproton sowie ein Aldehydproton. Weitere Signale sind ein Aromatenproto-

nensignal sowie im Bereich olefinischer Protonen ein Singulettproton und zwei sich

überlagernde Singulettprotonen. Im Aliphatenbereich zeigt das Spektrum drei CH3-

Signale, die als Singuletts vorliegen, außerdem ein Singulett, das aus zwei sich über-

lagernden Methylgruppen besteht. Zusätzlich sind noch zwei Multipletts zu erkennen,

dessen Signalintensität vier Protonen entspricht und eine Methylengruppe, die zum

Dublett aufspaltet.

Das 13C-Spektrum zeigt im Bereich zwischen 200 ppm und 100 ppm ein Signal für

einen Aldehydkohlenstoff, Signale für zwei tieffeldverschobene hydroxysubstituierte

quartäre aromatische C-Atome sowie sechs weitere Signale für quartäre sp2-hybridi-

sierte Kohlenstoffatome. Im Aliphatenbereich kann mit Hilfe des DEPT-135-Expe-

rimentes zwischen vier Signalen für sekundäre und fünf Signalen für primäre C-Atome

differenziert werden.

59HAUPTTEIL I

Eine genauere Analyse der Signale des 13C-Spektrums zeigt, daß der Naturstoff das

gleiche aromatische Fragment wie Colletorin B enthält. Der Unterschied zum Colle-

torin B besteht in der Seitenkette. Hier weist der Naturstoff 3042.III zusätzlich eine

Methylgruppe, eine Methylengruppe sowie zwei olefinische C-Atome und ein olefini-

sches Proton auf. Die Analyse des HMBC-Spektrums ermöglicht die genaue Zuord-

nung dieser Atome, so daß die Struktur des Naturstoffes wie folgt aufgeklärt werden

kann:

Abb. 34: Aus Pilzstamm 3042 isolierter Naturstoff 3042.III (27)

Der Naturstoff ist als Antibiotikum LL-Z 1272β[43] literaturbekannt und wurde erst-

mals 1969 isoliert und seine Struktur durch Röntgenstrukturanalyse charakterisiert[44].

Gegenüber dem literaturbekannten Colletorin B, ist die Seitenkette um eine Isopren-

einheit verlängert. Ebenso wie beim Colletorin B, ist auch das in 5-Position mit Chlor

substituierte Derivat als Antibiotikum Ilicicolin A bekannt[45].

3.6.11.4 Naturstoff 3042.IV

ClO

Abb. 35: Aus Pilzstamm 3042 isolierter Sekundärmetabolit 3042.IV (28): 4,5-Dihydroascochlorin

HAUPTTEIL I

Der Naturstoff konnte in geringen Mengen isoliert werden und liegt als Öl vor. Das

Massenspektrum zeigt einen Molekülpeak bei [M+] = 406, sowie den für die Halogene

Brom oder Chlor typischen [M+ + 2] Peak.

Anhand der Intensität des [M+ + 2] Peaks und der chemischen Verschiebungswerte aus

den 1-D- und den Konnektivitäten aus den 2-D-NMR-Spektren, kann der Metabolit als

ein weiteres Colletochlorinderivat identifiziert werden. Bis auf die terminale, mit zwei

Methylgruppen substituierte Doppelbindung enthält er das Colletochlorin B-Grund-

gerüst.

Abb. 36: Colletochlorin Grundkörper

Durch Kombination der NMR- und massenspektrometrischen Daten erhält man als

Summenformel für den Naturstoff C23H31ClO4. Das fehlende Fragment hat demnach

eine Teilsummenformel von C9H15O. Es besteht aus einer Carbonylgruppe, zwei Me-

thylen- und zwei Methingruppen, drei Methylgruppen sowie einem quartären Kohlen-

stoffatom. Anhand der H,H-COSY- und HMBC-Spektren, kann das zweite Fragment

als Cyclohexanongrundkörper identifiziert und um die Partialstruktur des Colletorin B

zum Naturstoffmolekül ergänzt werden.

Fragment XXI:

61HAUPTTEIL I

Die Literaturrecherche ergab, daß es sich bei dem Naturstoff um 4,5-Dihydro-

ascochlorin handelt. Er wurde bisher aus Nectria coccinea und Chephalosporium dio-

spyri isoliert und als Antibiotikum LL-Z 1272δm bezeichnet[45].

3.6.11.5 Naturstoff 3042.V

ClO

Abb. 37: Aus Pilzstamm 3042 isolierter Sekundärmetabolit 3042.V (29): Ascochlorin

Der in großer Menge isolierte Naturstoff kristallisiert in Form kleiner Nadeln und kann

anhand der NMR-Spektren den Ascochlorinen zugeordnet werden. Im Vergleich zu

4,5-Dihydroascochlorin sind jedoch im 1H-NMR-Spektrum zwei zusätzliche Signale

für olefinische Protonen (6.0ppm, 7.0 ppm) sowie im 13C-NMR-Spektrum Signale für

die diese Protonen tragenden tertiären C-Atome vorhanden. Dafür fehlen im Proto-

nenspektrum zwei Methylengruppen und die C-Resonanzen dieser Gruppen. Dem ent-

spricht das Massenspektrum mit einem Molpeak [M+] von 404, dem charakteristischen

[M+ + 2]-Peak und einer daraus abgeleiteten Summenformel von C

23H29ClO4. Die

Auswertung des HMBC-Spektrums und die Literaturrecherche ergeben, daß es sich

bei dem isolierten Naturstoff um Ascochlorin handelt[45].

Der Metabolit wurde 1969 zusammen mit 4,5-Dihydroascochlorin isoliert. Er ist anti-

biotisch und antiviral wirksam, die LD50 Dosis für Mäuse liegt bei 20 mg/kg[45].

HAUPTTEIL I

3.6.11.6 Naturstoff 3042.VI

Abb. 38: Aus Pilzstamm 3042 isolierter Sekundärmetabolit 3042.VI (30): 4,5-Dihydrodechloro-

ascochlorin

Von dem Naturstoff wurden 17 mg in Form weißer Kristalle isoliert. Er färbt mit dem

Phenylhydrazinsprühreagenz orange an und hat in Dichlormethan einen Rf-Wert von

0.5.

Die Informationen aus dem EI-Massenspektrum als auch aus dem IR-Spektrum legen

die Struktur eines weiteren Ascochlorinderivates nahe. Jedoch fehlen im Massenspek-

trum die sonst für Halogene typischen Isotopenmuster, so daß es sich hier um ein nicht

halogeniertes Derivat handelt. Ein Vergleich mit den NMR-Spektren der bisher iso-

lierten Ascochlorine zeigt im 1H-NMR-Spektrum die typischen Aufspaltungsmuster

und eine zusätzliche Protonenresonanz im aromatischen Verschiebungsbereich. Im

13C-NMR-Spektrum ist im Aliphatenbereich das gleiche und im Aromatenbereich das

typische Signalmuster für das 4,5-Dihydroascochlorin zu erkennen, bis auf das

quartäre Cl-substituierte C-Atom, an dessen Stelle ein tertiäres aromatisches C-Atom

getreten ist. Die Analyse des HMBC-Spektrums ergänzt und bestätigt die Vermutung,

daß es sich bei dem Naturstoff um 4,5-Dihydrodechloroascochlorin handelt, der aus

Nectria coccinea und Fusarium sp. isoliert wurde[45].

3.6.12 Biosynthese der Colletorine und Ascochlorine

Erstmals konnten aus einem einzigen Pilz die Naturstoffe aus der Klasse der Colleto-

rine und Ascochlorine isoliert werden und damit der Nachweis erbracht werden, daß

63HAUPTTEIL I

beide Substanzklassen auf einem gemeinsamen Biosyntheseweg produziert werden.

Dieser Biosyntheseweg wurde für die Ascochlorine schon aufgeklärt

Eine strukturelle Verwandtschaft besteht zu den Ubichinonen, deren Seitenkette eben-

falls eine isoprenoide Struktur hat, Es handelt sich dabei um p-Chinone, die in den

Zellen des Pflanzen und Tierreichs zu finden sind. Aufgrund ihrer Redoxfunktion in

der Atmungskette sind sie als Hilfssubstrat für den Wasserstoffaustausch von Bedeu-

tung.

3.6.13 Biologische Aktivität

Die Naturstoffe 3042.I–3042.VI befinden sich zur Zeit im pharmakologischen Scree-

ning der BASF, aber wurden schon im biologischen Screening untersucht. Die Ergeb-

nisse sind in folgender Tabelle aufgeführt:

Agardiffusionstest (c = 1 [mg/ml])

Hemmhofradien [mm]

Substanz Chl.E. C. B. m. Ust. Eur. M. m. Fus.

3042.I 4056006

3042.II 4015005

3042.III 0014005

3042.IV 0 0 10 1 0 0 0

3042.V 0002000

3042.VI 0 0 0 3 15 0 0

Tabelle 13: Biologische Aktivität der Naturstoffe 3042.I-3042.VI

Alle Naturstoffe zeigen biologische Aktivitäten, von denen besonders die außeror-

dentlich gute antifungische Wirksamkeit von 4,5-Dihydrodechloroascochlorin gegen

den Ascomyceten Eurotium repens hervorzuheben ist.

HAUPTTEIL II

4 HAUPTTEIL II

4.1 Retrosynthetische Überlegungen zur Partialsynthese

Aus einem nicht bestimmten Endophyt in Vaccinium vitis idea (Stamm 2049), wurde

der Sekundärmetabolit Elsinochrom A (11) isoliert, der zur Klasse der natürlichen Pe-

rylenchinone gehört. Die ebenfalls zu dieser Klasse gehörenden und strukturell eng mit

den Elsinochromen verwandten Hypocrelline zeigen sehr gute therapeutische an-

titumorale und antivirale (speziell gegen HIV-Viren) Wirkung und befinden sich we-

gen ihrer breiten Einsatzmöglichkeit zur Zeit im Zentrum der aktuellen Forschung. Da

von den Elsinochromen bisher noch keine Totalsynthese existierte, sollte im Rahmen

dieser Arbeit eine konvergente Partialsynthese ausgearbeitet werden, um einen Zugang

zu dem physiologisch und chemisch interessanten Naturstoff zu ermöglichen. Aus-

gangsmolekül für diese Überlegungen war das Monomer des Elsinochromgrundkör-

pers, der sich nach bekannten Methoden dimerisieren läßt[46],[47].

353431

OOH

MeO

OMe

OOH

MeO

OMe

OOH

MeO

OMe

MeO

OMe

SiMe3

OOH

MeO

Schema 3: Retrosynthese des Naturstoffes 11

65HAUPTTEIL II

Aus dem Retrosyntheseschema 3 geht hervor, daß sich der Grundkörper der Monome-

reneinheit 31 formal in zwei Fragmente (31 A, 31 B) zerlegen läßt. Das Fragment 31

A soll über das Schlüsselintermediat 32 zugänglich gemacht werden. Durch formale

Entfernung des Methyletherfunktion aus dem Teilfragment 31 B gelangt man zum

Fragment 33. Über den formalen Bindungsbruch zwischen der C-C-Bindung C-1–C-8a

sowie C-4–C-4a erhält man das Teilfragment 33 B. Durch weitere Rücktransformation

gelangt man von 33 B über die Verbindung 34 zur Dihydropyranonverbindung 35, die

das zweite Schlüsselintermediat repräsentiert. Für die Verknüpfung der Schlüssel-

intermediate 32 und 35 wurde die Michael-Addition gewählt. 28 kann dabei als inter-

mediär gebildetes Magnesiumcuprat als Nukleophil in einer 1,4-Addition reagieren.

Für die Synthese des Magnesiumcuprates sollte als Edukt 3,5-Dimethoxybenzoesäure

eingesetzt werden. Die 3,5-Dimethoxybenzoesäure wird durch Reduktion in den Al-

kohol und sich anschließende Bromierung und Umsetzung mit Magnesium in ein

Grignardreagenz (47) überführt. Das Grignardreagenz kann man dann durch Zusatz

katalytischer Mengen eines Kupfer(I)-Halogenides in das gewünschte Magnesium-

cuprat überführen.

Der Michaelakzeptor (35) soll in einer zweiten Reaktionssequenz über die [4 + 2]-

Cycloadditionsreaktion des Trimethylsilylketens 37 mit dem Vinylketenacetal 36 ge-

bildet werden (Schema 5).

Die nach den oben angeführten Reaktionssequenzen erhaltenen Schlüsselintermediate

32 und 35 sollen dann weiter nach der in Schema 7 abgebildeten Synthese über die

Michael-Addition zum Addukt 38 umgesetzt werden. Im Anschluß an die Michael-

Addition kann dann die Spaltung des Lactonrings von Verbindung 38, mit darauf fol-

gender Friedel-Crafts-Acylierung zu 39, erfolgen. 39 würde schließlich durch Oxy-

dation mit Selendioxid und Methylierung des Produktes 40 in das Monomer des Elsi-

nochromgrundkörpers überführt werden.

HAUPTTEIL II

i. SeO2

OMe

MeO

i. TFA

ii. AlCl3

OMe

MeO

38 39

OMe

MeO

OMe

i. MeI

OMe

MeO

40 41

Schema 4: Syntheseplan zur Monomereneinheit des Elsionchroms A

4.2 Durchführung

Die theoretischen und praktischen Arbeiten über die hier angewendeten [4 + 2]-Cyclo-

additonsreaktionen wurden von T. Aoyama[48] durchgeführt. Durch Umsetzung von

Trimethylsilylketen als Heterodienophil mit variierenden Ketenacetalen als 1,3-Dien-

komponente synthetisierte er unterschiedliche 2-Pyranonderivate.

Für die Darstellung des 2-Methylpyranons (35) wurde 1,3-Dimethoxy-1-trimethyl-

siloxy-1,3-butadien (36) eingesetzt, das aus Crotonsäuremethylester[49] zugänglich ist.

Das Trimethylsilylketen wurde nach einer Vorschrift von M.A. Pericas[50,51] in vier

Stufen erhalten. Wurde das Ketenacetal (36) direkt aus dem Syntheseansatz ohne Auf-

reinigung mit dem Silylketen (37) umgesetzt, so erfolgte eine spontane Polymerisation

des Ketens zu einem unlöslichen Polymer. Die Polymerisation wurde durch Verun-

reinigungen in dem Reaktionsgemisch des Pyranons initiiert. Deshalb wurde das Ke-

tenacetal durch Destillation aufgereinigt und sofort eingesetzt. Dadurch wurde die

Polymerisation von 37 unterbunden, aber eine Umsetzung zu 35 wurde trotzdem nicht

beobachtet (Schema 5).

67HAUPTTEIL II

SiMe3

OMe

SiMe3

29 30 27

Schema 5: Umsetzung des Ketenacetals (29) mit dem Silylketen (30) in Benzol, 48 h Rückfluß

Die Berechnung der Elektronendichteverteilung des eingesetzten 1-Methoxy-1-trime-

thylsiloxy-1,3-butadiens (36) mit AM1 zeigte eine andere Elektronendichteverteilung

im Vergleich zu den von Aoyama eingesetzten Systemen, die als Modellsystem ge-

nutzt wurden und auch in guten Ausbeuten reproduzierbar reagierten. Daraus wäre die

mögliche Erklärung abzuleiten, daß das eingesetzte System wegen der anderen Elek-

tronendichteverteilung nicht reagierte.

Da das Pyranon über diesen Syntheseweg nicht darstellbar war, wurde ein alternativer

Syntheseweg gewählt (Schema 6). Dazu wurde Methylvinylketon (42) in einer Cu-

katalysierten Michael-Addition mit Malonsäuredimethylester (43) umgesetzt. An-

schließende Decarboxylierung des Michaeladduktes 44 durch Erhitzen in feuchtem

DMSO/NaCl ergab den Ketoester 45, der durch Verseifung und anschließende Lacto-

nisierung des Hexensäure-enolates das Lacton 46 lieferte. Dieses konnte in guten Aus-

beuten (71%) durch Dehydrierung mit Pd/C in p-Cymen als hochsiedendem Lösemit-

tel zu 35 dehydriert werden.

OMe

OOMe

42 43 44 45

HAUPTTEIL II

iii O

46 35

Schema 6: i = CH2Cl2, Ni(acac)2, 24 h Rückfluß; ii = 5% wäßrige Na2CO3-Lsg., 4h 60°; iii = 2 eq.

NaCl, DMSO, 0.5% H2O, 8 h Rückfluß; iv = Essigsäureanhydrid, 0.1% Acetylchlorid, p-Toluolsul-

fonsäure, 4 h Rückfluß; p-Cymenabs., Pd/C 10%, 0.5 h Rückfluß.

In der sich anschließenden Reaktionssequenz wurde 3,5-Dimethoxybensoesäure mit

LiAlH4 in Dimethylether zum Alkohol reduziert und nachfolgend in CCl4 mit PBr3

zum 3,5-Dimethoxybenzylbromid bromiert. Der nächste Syntheseschritt bestand in der

Michaeladdition der aus dem 3,5-Dimethoxybenzylbromid und Magnesium herge-

stellten Grignardverbindung (47) an 35 zu 38 (Schema 7).

OOMe

MeO

OMe

MgBr

47 35 38

Schema 7: a) i = THF; b) i = THF, CuBr; c) i = THF, CuBr*Me2S, -5°C; d) i = Ether; e) i = Ether,

CuBr; f) i = Ether, CuBr*Me2S, - 0°C; g) i = Ether, CuBr*Me2S, RT; h) i = THF, CuI; i) i = THF,

CuI*Me2S, -5°C; j) i = Ether, CuI; k) i = Ether, CuI*Me2S, - 0°C; l) i = Ether, CuI*Me2S, RT

Jedoch erfolgte hier keine Umsetzung, weder mit der metallorganischen Grignardver-

bindung, noch mit der Magnesiumcupratverbindung. Auch nach Variation der Reak-

tionstemperatur (– 5 °C, 0 °C, RT) und des Katalysators (CuBr, CuI, CuBr*Me2S,

CuI*Me2S) sowie des Lösemittels (THF, Ether) konnte keine Umsetzung beobachtet

werden und die Synthesestratgie wurde verworfen. Ähnliche Systeme, an denen die

1,4-Addition beobachtet werden konnte, waren in 4-Position zusätzlich durch einen

weiteren Elektronenakzeptor (-S-R, -COOR) aktiviert, so das 35 in der 4-Position

wahrscheinlich nicht elektrophil genug war, um mit den gewählten Reagenzien zu rea-

gieren.

69ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

Die Resistenzbildung vieler Unkräuter, Insekten oder Krankheitserreger gegen Pesti-

zide oder Pharmaka macht es notwendig immer neue biologisch aktive Leitstrukturen

zu finden, die als Pestizid oder Pharmazeutika eingesetzt werden können. Deshalb

wurden im Rahmen des BMBF/BASF-Projektes "Naturstoffisolierung" fünf verschie-

dene Mikromycetenstämme als potentielle Produzenten von Sekundärmetaboliten mit

großer molekularer Diversität untersucht. Dabei waren auch Metabolite von Interesse,

die keine oder nur geringe biologische Aktivität zeigten.

Aus dem Pilzstamm 1947 wurden die Steroide Ergosta-4,7,22-trien-3-on (9) und Er-

gosterolperoxid (10) aus der Klasse der α-Ergostane isoliert und identifiziert. Die Se-

kundärmetabolite sind literaturbekannt und wurden 1926 (10), bzw. 1976 (9) isoliert.

Im biologischen und pharmakologischen Test waren beide Steroide unauffällig.

Der Pilzstamm 2049, ein nicht bestimmter Endophyt aus Vaccinium vitis idea, lieferte

ebenfalls zwei Sekundärmetabolite. Der erste Metabolit war das schon aus Pilzstamm

1947 isolierte Ergosterolperoxid, bei dem zweiten Metaboliten handelte es sich um

Elsinochrom A (11). 11 gehört zur Klasse der natürlichen Perylenchinone, von denen

z. B. die Hypocrelline sehr gute antitumorale und antivirale (speziell gegen HIV-

Viren) Wirkung zeigen. Der Naturstoff 11 zeigte im pharmakologischen Screening

eine befriedigende Antitumorwirkung und ragte im biologischen Screening heraus.

Hier zeigte er exzellente antifungische Eigenschaften im Test mit Ustilago violacea.

Von den beiden aus dem Pilzstamm 1727 isolierten Naturstoffen war das Ramulosin

(12), schon literaturbekannt. Es wurde 1964 aus Pestalotia ramulosa isoliert. Der Co-

Metabolit 1727.II (15) war ein bisher literaturunbekanntes Ramulosinderivat. Beide

Metabolite waren im biologischen und pharmakologischen Screening als mäßig aktiv

einzustufen.

Die Metabolite 2072.I–2072.IV (16, 17, 18, 20) wurden aus Pilzstamm 2072 isoliert,

einem Endophyten aus Mentha arvensis. Von diesen Naturstoffen war bisher nur 18

literaturbekannt, er wurde 1981 erstmals aus dem Mikromycet Phialophara lager-

bergii isoliert. Die drei weiteren Naturstoffe wurden bisher in der Literatur nicht be-

schrieben und konnten auch keiner bekannten Substanzklasse zugeordnet werden. Von

ihnen war der Metabolit 2072.IV (20) strukturell und chemisch besonders auffällig. Er

zeigte drei sehr ungewöhnliche Strukturelemente, von denen eines, ein Oxaadamantan-

grundgerüst, bei Pilzmetaboliten bisher völlig unbekannt war. Der isolierte Naturstoff

repräsentiert somit den ersten Vertreter dieser für Pilzmetabolite neuartigen

Verbindungsklasse. Wegen der geringen zur Verfügung stehenden Substanzmenge

konnte die biologische Aktivität von 20 nicht untersucht werden.

Aus dem Pilzstamm 3042 wurden sechs Antibiotika (25–30) aus den Substanzklassen

der Colletorine und Ascochlorine isoliert. Hierdurch konnte erstmals wahrscheinlich

ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

gemacht werden, daß die Vertreter der Colletorine und Ascochlorine biosynthetisch

nicht zwei verschiedenen, sondern einer einzigen Substanzklasse angehören. Von den

biologischen Eigenschaften ist die sehr gute bakterizide Wirkung des Naturstoffes 4,5-

Dihydroascochlorin (28) im Test gegen Bacillus megaterium und herausragende fun-

gizide Wirkung von 4,5-Dihydrodechloroascochlorin (30) gegen Eurotium repens

erwähnenswert.

Durch die Versuche zur partialsynthetischen Darstellung der Monomereneinheit des

Elsinochrom A (11) konnte gezeigt werden, daß der gewählte Syntheseweg, über eine

Michael-Addition an einen in 4-Position nicht zusätzlich aktiviertes 6-Methylpyran-2-

on, nicht durchführbar ist. Zu überprüfen bleibt die Möglichkeit, ob der Schlüssel-

schritt der Michael-Addition an einen in 4-Position aktiviertes Pyrangrundgerüst, ana-

log zu den in der Literatur beschriebenen Umsetzungen, realisierbar ist.

71EXPERIMENTELLER TEIL

6 EXPERIMENTELLER TEIL

6.1 Allgemeine Methoden und Meßverfahren

Die Schmelzpunkte wurden in offenen Kapillaren mit einer Gallenkamp Apparatur

gemessen und sind unkorrigiert angegeben.

Elementaranalysen wurden von Herrn Karrasch mit einem Perkin-Elmer Elementar-

Analysator 240 bestimmt.

Die optische Drehung wurde an einem Polarimeter der Firma Perkin-Elmer, Modell

241, bei der D-Linie des Natriums und den jeweils angegebenen Temperaturen und

Lösemitteln bestimmt.

UV-Spektren wurden mit einem Shimazu UV-2101 PC UV-VIS-Spektralphotometer

gemessen. Die Wellenlängen sind in [nm] angegeben und die Logarithmen der mola-

ren Extinktionskoeffizienten in Klammern.

Die Massenspektren wurden von Herrn Dr. Kuck und Mitarbeitern aus Bielefeld an

einem Fison MD 800 aufgenommen. Die relativen Intensitäten, bezogen auf den Ba-

sispeak sind hinter den Massen in Klammern angegeben.

Die IR-Spektren wurden mit einem Nicolet 510 P FT-IR Spektrometer aufgenommen.

Die Probenmatrix wurde in Klammern angegeben, die Absorptionsbanden in Wellen-

zahlen.

Gaschromatographische Untersuchungen wurden auf einem Hewlett-Packard Gerät,

Modell 5890 Serie II durchgeführt. Dabei wurde eine 25 m Kapillarsäule OV-1, Stick-

stoff als Trägergas und als Detektor ein FID verwendet.

Soweit nicht anders angegeben wurden die NMR-Spektren auf einem Bruker AMX-

600 Spektrometer aufgenommen. (1H-NMR: 600 MHz, 13C-NMR: 100 MHz). Die

chemische Verschiebung δ, wurde relativ zum verwendeten Lösungsmittel angegeben.

Die Signalmultiziplitäten der 1H-Spektren wurden wie nachfolgend bezeichnet: s

(Singulett), ps (Pseudosingulett), d (Dublett), t (Triplett), pt (Pseudotriplett), q (Quar-

tett), m (Multiplett). Die Multiplizitäten der Kohlenstoffatome wurden den DEPT-

Spektren entnommen. Für die Bezeichnung der Kohlenstoffmultiplizitäten wurden

nachstehende Abkürzungen verwendet: q (quartäres Kohlenstoffatom), t (tertiäres

Kohlenstoffatom), s (sekundäres Kohlenstoffatom).

Die NMR-Spektren wurden von Frau A. Cimburek und Herrn Prof. Dr. H. Marsmann

an der Universität Paderborn sowie von Dr. V. Wray (COSY-, HMBC-, NOESY-Ex-

perimente) an der GBF Braunschweig gemessen.

Analytische und präparative Trennungen wurden an Kieselgel und Sephadex-LH-20

als stationäre Phase durchgeführt. Für die Säulen- und Flashchromatographie wurde

Kieselgel 60 (230-400 mesh) der Firma Merck, Darmstadt verwendet. Für die präpa-

EXPERIMENTELLER TEIL

rative Schichtchromatographie (PSC) wurden Dünnschichtplatten der Firma Schlei-

cher & Schüll (20x20 cm), mit einer Schichtdicke von 0.5 und 1.0 mm eingesetzt.

Platten mit einer Schichtdicke von 2 mm wurden im Labor hergestellt. Die Platten-

präparation erfolgte nach der Arbeitsvorschrift für die Beschichtung der Chroma-

totronplatten. Das Beschichtungsmaterial war Kieselgel 60 PF 254 plus Gips, der

Firma Merck.

Für die Radialchromatographie wurde mit dem Chromatotron Modell 8924, der Firma

Harrison Research in Palo Alto, der Pumpe Modell RH 00 (Fluid Metering Inc. Oyster

Bay), einer Carmac UV-Lampe (254/366 nm) und dem Kieselgel 60 PF 254 plus Gips,

der Firma Merck gearbeitet. Die Chromatotronplatten wurden gründlich gereinigt und

von Fett befreit. Anschließend wurde eine auf 0 °C abgekühlte Suspension des Kie-

selgels PF 250 mit Gips aufgetragen. Die Platte wurde anschließend ca. 1h zum Setzen

der Gipsschicht stehengelassen und anschließend ca. 18 h bei 60 °C im Trocken-

schrank ausgehärtet. Daran anschließend wurde die Platte auf die gewünschte Höhe

geschliffen und unter Argonatmosphäre mit den angegebenen Elutionsmitteln zur

Trennung eingesetzt.

LPLC und HPLC wurde mit Merck Lobar-Fertigsäulen der Größe B (310-25) LiChro-

prep Si 60 (40-63 µm) und einer Hibar-Fertigsäule (30-4) Lichrosorb Si 60 (5 µm)

durchgeführt. Für die Gelchromatographie wurde eine präparative Säule mit Sepha-

dex-LH 20 Gel gepackt. Für alle chromatographischen Verfahren wurden folgende

Geräte der Firma Merck/Hitachi eingesetzt: Pumpe (L 6000), UV-Detektor (655 A),

Steuereinheit (LC-Organizer 885-5931), Integrator (D-2000). Aufgabeventil war ein 6-

Wege-Ventil der Firma Rheodyne.

Zur DC-Detektion beim chemischen Screening wurden folgende Sprühreagenzien

verwendet[52]:

Ø Cer-Molybdän/Schwefelsäure (Universalsprühreagenz): Ein Gemisch aus 60 ml

konz. H2SO4 und 940 ml dest. H2O wird mit 25 g Molybdatophosphorsäure und 10

g Cer(IV)sulfat versetzt. Nach Erhitzen bilden sich sofort blaue Flecken.

Ø Bromkresolgrün für Säuren: Eine 0.04 proz. Lösung in Isopropanol wird mit 2 N

NaOH auf pH 7 eingestellt. Säuren bilden sofort gelbe Flecken auf blauem Grund.

Ø 2,4-Dinitrophenylhydrazin für Aldehyde und Ketone: Eine Lösung von 1 g 2,4 Di-

nitrophenylhydrazin in 1000 ml Ethanol wird mit 10 ml HCl versetzt. Nach dem

Ansprühen bilden sich unter Erwärmen gelbe bis orange Flecken.

Ø Anisaldehydsprühreagenz für Zucker, Steroide und Terpenoide: Konzentrierte

Schwefelsäure (8 ml) wird mit 0.5 ml Anisaldehyd versetzt und unter Eiskühlung

und Rühren zu einem Gemisch aus 85 ml MeOH und 10 ml Eisessig gegeben.

73EXPERIMENTELLER TEIL

Nach Ansprühen und Erhitzen bilden sich violette, blaue, grüne oder graue

Flecken.

6.2 Durchführung der Aktivitätstests

Von den Mikrobiologen der Arbeitsgruppe Prof. Dr. Aust wurden die aktivsten Pilz-

stämme nach einem biologischen Vorscreening in Submerskultur angezogen. Ent-

weder wurden sie dazu auf einem Biomalzweichagar- oder Malzextraktweichagar in

Fernbachkolben kultiviert und bei definierten Temperaturen in Klimakammern inku-

biert.

Die biologische Aktivität der isolierten Naturstoffe wurde durch ein Biodiagramm und

den Agardiffusionstest geprüft. Im Biodiagramm-Verfahren werden von den Rohex-

trakten DC´s angefertigt und mit einer Suspension von Bioindikatororganismen in 6

proz. Biomalzlösung besprüht. Die Testorganismen sind der gegenüber Fungiziden

empfindliche Pilz Cladosporium und die Alge Chlorella Fusca. Nach dem Ansprühen

wird für zwei bis drei Tage in einer Feuchtkammer inkubiert. Aktive Sekundärmeta-

bolite sind daran zu erkennen, daß sich Wachstumshemmhöfe auf dem DC gebildet

haben, die bei Bakterien und Pilzen nach zwei bis drei Tagen und bei Chlorella nach

4–7 Tagen ausgewertet werden.

Mit dem Agardiffusionstest wird auf die gesamte Palette biozider Wirksamkeit ge-

prüft. Hierzu wurden in der Mikrobiologie in Braunschweig Filterplättchen mit dem zu

untersuchenden Naturstoff getränkt und auf Agarplatten gelegt, die mit folgenden

Testorganismen besprüht wurden:

Chl. Chlorella fusca Chlorophyt

E.c. Escherichia coli Gram-negatives Bakterium

B.m. Bacillus megaterium Gram-positives Bakterium

U.v. Ustilago violacea Ustomycet

E.r. Eurotium repens Ascomycet

M.m. Mycotypha microspora Zygomycet

F.o. Fusarium oxysporium Deuteromycet

Auch hier zeigte sich biozide Wirksamkeit in der Ausbildung von Wachstumshemm-

höfen.

Zusätzlich wurden für einige Substanzen Keimlingstests durchgeführt. Dabei wurden

6.75 ml steriles Wasser und 0.75 ml der zu testenden Lösung in einer Petrischale mit

Filterpapier bedeckt. Auf das Filterpapier wurden dann 14 Samenkörner von Lepidum

EXPERIMENTELLER TEIL

sativum (Kresse) zum Keimen gelegt. Das Längenwachstum sowie der Allgemeinzu-

stand wird mit einer Kontrollgruppe verglichen und ausgewertet.

6.3 Experimenteller Teil der Naturstoffisolierung

6.3.1 Pilzstamm 1948

6.3.1.1 Isolierung

Der Pilz wurde 87 Tage lang bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 6 in einem

Biomalzmedium inkubiert.

Um die unterschiedlich polaren Bestandteile des Filtrates zu extrahieren, wurde

mehrmals mit Lösemitteln unterschiedlicher Polarität (Petrolether, Ethylacetat) extra-

hiert und die Extrakte jeweils getrennt im Vakuum bis zur Trockene eingeengt.

Nach mehrmaliger Säulenchromatographie mit verschiedenen Stufengradienten

(PE/Ether 1:1, CH2Cl2, CH2Cl2/MeOH 1%, 2%, 3%, 5%, 8%), wurden zwei mittel-

polare Fraktion erhalten. Aus der ersten Fraktion wurde durch präparative Schicht-

chromatographie (PSC) mit n-Hexan/AcOEt 20% (Zweifachentwicklung) und an-

schließende Aufreinigung durch Säulenchromatographie mit Sephadex LH 20

(CH2Cl2/MeOH 3%) 1 mg des Naturstoffes 1948.I isoliert. Aus der zweiten mittel-

polaren Fraktion wurde durch PSC mit n-Hexan/AcOEt 35% 2 mg des Naturstoffes

1948.II isoliert.

75EXPERIMENTELLER TEIL

6.3.2 Strukturdaten und physikalische Eigenschaften

6.3.2.1 Ergosta-4,7,22-trien-3-on (1948.I)

Summenformel: C28H42O. –

Schmelzpunkt: 129 °C (Lit.: 131 °C)[11]. –

Drehwert: αD

= − 18.1 ° (c = 1.05 mg/ml, CH2Cl2) (Lit.: − 16.3 ° (CH2Cl2))[11]. –

Rf-Wert: 0.6 (CH2Cl2/MeOH 3%). –

IR (KBr):

= 1720 cm–1 (Carbonyl). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 6.50 (d, J7,6 = 8.6 Hz, 1 H, 7-H), 6.23 (d, J6,7 = 8.4 Hz, 1 H, 6-

H), 5.23 (dd, J20,22 = 8.0 Hz, J22,23 = 15.0 Hz, 1 H, 22-H), 5.15 (dd, J23,24 = 8.3 Hz,

J23,22 = 15.2 Hz, 1 H, 23-H), 3.96 (m, 1 H, 3-H), 0.99 (d, J20,21 = 6.6 Hz, 3 H, 21-H),

0.91 (d, J24,28 = 6.7 Hz, 3 H, 28-H), 0.88 (s, 3 H, 19-H), 0.83 (d, J25,27 = 6.7 Hz, 3 H,

27-H), 0.82 (s, 3 H, 18-H), 0.81 (d, J25,26 = 6.5 Hz, 3 H, 26-H). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 199.4 (s, C-3), 169.01 (s, C-5), 139.6 (s, C-8), 135.5 (d, C-

22), 132.3 (d, C-23), 122.7 (d, C-4), 115.6 (d, C-7), 55.9 (d, C-17), 55.0 (d, C-14),

45.9 (d, C-9), 43.5 (s, C-13), 42.9 (d, C-24), 40.1 (d, C-20), 39.1 (t, C-12), 37.0 (t, C-

4), 38.1 (s, C-10), 34.2 (t, C-1), 33.2 (d, C-25), 32.2 (t, C-2) 28.1 (t, C-16), 22.9 (t, C-

EXPERIMENTELLER TEIL

15), 22.05 (q, C-21), 21.3 (t, C-11), 20.0 (q, C-27), 19.9 (q, C-26), 19.7 (q, C-19), 17.6

(q, C-28), 12.2 (q, C-18). –

MS (EI / 230 °C): m/z (%) = 394 (100) [M+], 350 (19), 296 (16), 267 (57). –

HRMS (C28H42O): Ber.: 394.3235

Gef.: 394.3205 ± 3 ppm

6.3.2.2 5,8-Epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol (1948.II)

Summenformel: C28H44O3. –

Schmelzpunkt: 179 °C (Lit.: 181.5 – 183 °C)[15]. –

Drehwert: αD

= – 25 ° (c = 1.05 mg/ml, CH2Cl2) (Lit.: – 16.3 ° (CHCl3))[15]. –

Rf-Wert: 0.3 (CH2Cl2/MeOH 3%). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 6.50 (d, J7,6 = 8.6 Hz, 1 H, 7-H), 6.23 (d, J6,7 = 8.4 Hz, 1 H, 6-

H), 5.23 (dd, J20,22 = 8.0 Hz, J22,23 = 15.0 Hz, 1 H, 22-H), 5.15 (dd, J23,24 = 8.3 Hz,

J23,22 = 15.2 Hz, 1 H, 23-H), 3.96 (m, 1 H, 3-H), 0.99 (d, J20,21 = 6.6 Hz, 3 H, 21-H),

0.91 (d, J24,28 = 6.7 Hz, 3 H, 28-H), 0.88 (s, 3 H, 19-H), 0.83 (d, J25,27 = 6.7 Hz, 3 H,

27-H), 0.82 (s, 3 H, 18-H), 0.81 (d, J25,26 = 6.5 Hz, 3 H, 26-H). –

77EXPERIMENTELLER TEIL

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 135.4 (d, C-6), 135.2 (d, C-22), 132.3 (d, C-23), 130.7 (d, C-

7), 82.2 (s, C-5), 79.5 (s, C-8), 66.5 (d, C-3), 56.2 (d, C-17), 51.7 (d, C-14), 51.1 (d, C-

9), 44.6 (s, C-13), 42.8 (d, C-24), 39.7 (d, C-20), 39.3 (t, C-12), 37.0 (t, C-4), 36.9 (s,

C-10), 34.7 (t, C-1), 33.1 (d, C-25), 30.1 (t, C-2) 28.7 (t, C-16), 23.4 (t, C-15), 20.9 (q,

C-21), 20.7 (t, C-11), 20.0 (q, C-27), 19.7 (q, C-26), 18.2 (q, C-19), 17.6 (q, C-28),

12.9 (q, C-18). –

MS (EI / 230 °C): m/z (%) = 428 (20) [M+], 410 (30), 396 (100), 363 (40). –

HRMS (C28H44O3): Ber.: 428.329

Gef.: 428.36105 ± 8 ppm

6.3.3 Pilzstamm 2049

6.3.3.1 Isolierung

Das Rohextrakt wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit einem Stufen-

gradienten von 50% Petrolether (30-50)/50 % Dichlormethan über reines Dichlor-

methan bis zu Dichlormethan/Methanol 10 % (in 2% Schritten) aufgetrennt. Aus den

Vorfraktionen konnte durch erneute Trennung mit dem Chromatotron und einem

quarternärem Lösemittelgemisch aus Methylenchlorid/n-Hexan/Aceton/Methanol (35 :

35 : 25 : 5) 8 mg des Naturstoffes (2049.I) isoliert werden.

EXPERIMENTELLER TEIL

6.3.4 Strukturdaten und physikalische Eigenschaften

6.3.4.1 1,2-Diacetyl-5,10-dihydroxy-3,7,8,12-tetramethoxy-1,2–dihydro-

benzo[ghi]-perylen-4,11-dion (2049.I)

OOH

MeO

OMe

OOH

MeO

OMe

Summenformel: C30H24O10. –

Schmelzpunkt: 224 °C (Lit.: 235 °C)[20]. –

Rf-Wert: 0.3 (CH2Cl2/n-Hexan/Aceton/MeOH, 35:35:25:5). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 16.12 (s, 2 H, 10-H, 8-OH), 6.60 (s, 2 H, 9-H, 6-H), 5.19 (s, 2

H, 1-H, 2-H), 4.42 (s, 6 H, 12-H, 3-H), 4.08 (s, 6 H, 8-H, 7-H), 2.02 (s, 6 H, 15-H, 16-

H). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 204.9 (s, C-13, C-16), 179.9 (s, C-11, C-4), 172.0 (s, C-19, C-

18), 167.5 (d, C-12, 3), 150.1 (s, C-8, C-7), 130.3 (t, C-20, C-17), 122.8 (t, C-10, C-5),

121.6 (t, C-2a, C-12a), 118.7 (t, C-10a, 4a), 107.8 (q, C-8a, C-7a), 102.5 (q, C-6, C-9),

61.2 (q, C-23, C-24), 56.5 (q, C-21, C-22), 48.7 (d, C-1, C-2), 28.1 (q, C-14, C-15). –

HRMS (C30H24O10): Ber.: 544.1369

Gef.: 544.1344 ± 4 ppm

79EXPERIMENTELLER TEIL

6.3.5 Stamm 1727

6.3.5.1 Isolierung

Nach mehrmaliger säulen- und plattenchromatographischer Trennung (1. Stufensäule,

LM: n-Hexan/Aceton 5%, 15%, 35%; 2. Chromatotron, 2 mm, LM: Methylenchlo-

rid/Methanol 0%, 3%, 5%, 15%; 3. SC (3x) 10 x 10 x2, LM Methylenchlo-

rid/Methanol 1%) wurde eine apolare kristalline Substanz (1727.I) und ein apolares Öl

(1727.II) erhalten.

6.3.6 Strukturdaten und physikalische Eigenschaften

6.3.6.1 3,4,4a,5,6,7-Hexahydro-8-hydroxy-3-methyl-1H-2-benzopyran-1-on

(1727.I)

OHO

Summenformel: C10H14O3. –

Schmelzpunkt: 116 °C (Lit.: 120 – 121 °C)[26]. –

Drehwert: αD

= + 13 ° (c = 3.65 mg/ml, CH2Cl2) (Lit.: + 18.0 ° (EtOH))[27]. –

IR (KBr):

= 3523 cm–1 (OH), 1742 (Carbonyl). –

EXPERIMENTELLER TEIL

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 13.23 (s, 1 H, 8-OH), 4.45 (m, 1 H, 3-H), 2.52 (t, J6,7 = 9.2 Hz,

2 H, 7-Hα), 2.42 (m, 1 H, 7-Hβ), 2.42 (m, 1 H, 4a-H), 1.95 (m, 1 H, 4-H), 1.72 (m, 1 H,

6-H), 1.35 (d, J3,10 = 6.3 Hz, 3 H, 10-H), 1.24 (m, 1 H, 6-Hα), 1.72 (m, 1 H, 6-Hβ). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 174.5 (s, C-8), 171.6 (s, C-1), 96.6 (s, C-8a), 76.3 (d, C-3),

37.2 (d, C-4a), 32.7 (t, C-4), 29.3 (t, C-7), 28.8 (t, C-5), 21.5 (t, C-6), 20.7 (q, C-9). –

MS (EI): m/z (%) = 182 (90) [M+], 154 (52), 123 (100). –

HRMS (C10H14O3): Ber.: 182.0942

Gef.: 181.99205 ± 3 ppm

6.3.6.2 3-(2-Hydroxypropyl)-cyclohexan-1-on (1727.II)

Summenformel: C9H16O2. –

Drehwert: αD

= + 9.3 ° (c = 0.93 mg/ml, CH2Cl2). –

IR (KBr):

= 3512 cm–1 (OH), 1701 (Carbonyl). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 3.96-3.89 (m, 1 H, 2´-H), 2.47-1.89 (m, 6 H, 2-H, 6-H, 1´-H),

1.56-1.16 (m, 7 H, 3-H, 4-H, 5-H, 3´-H), 1.21 (d, J2´,3´ = 6.1 Hz, 3 H, 3´-H). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 211.4 (s, C-1), 65.2 (d, C-2´), 48.3 (t, C-2), 45.7 (t, C-6), 41.2

(t, C-4), 35.6 (d, C-3), 30.7 (t, C-1´), 24.9 (t, C-5), 24.1 (q, C-3´). –

MS (EI): m/z (%) = 156 (3) [M+], 38 [M+ - H2O] (18), 123 (100).–

HRMS (C10H14O3): Ber.: 182.0001

Gef.: 181.99205 ± 2 ppm

81EXPERIMENTELLER TEIL

6.3.7 Stamm 2072

6.3.7.1 Isolierung

Die Kulturbrühe wurde mit einem Mixer homogenisiert und viermal mit Ethylacetat

extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und anschlie-

ßend filtriert. Nach dem Einengen der getrockneten organischen Phase am Rotations-

verdampfer wurden 1200 mg Rohextrakt erhalten.

Die präparative Auftrennung erfolgte durch Flashchromatographie an Kieselgel mit

Petrolether (30–50)/Diethylether (2:1) und Petrolether/Diethylether (1:1) in 5

Hauptfraktionen (2072 a bis e). Die Hauptfraktionen wurden weiter durch Flash-

chromatographie, präparative Dickschichtchromatographie und HPLC aufgetrennt.

Metabolit 2072.I wurde aus der ersten unpolarsten Fraktion (2072 a) isoliert, indem

mit dem Eluenten Methylenchlorid/Methanol (94:2) ein präparatives Dickschichtchro-

matogramm aufgenommen wurde. Nach Mehrfachentwicklung wurde der Fraktions-

bereich mit einem Rf-Wert von 0.5 bis 0.6 von der Platte separiert. Diese Kieselgel-

fraktionen wurden dreimal mit 4 ml eines Gemisches aus Methylen-

chlorid/Ether/Methanol (60:33:7) eluiert. Die Lösung wurde anschließend im Vakuum

bis zur Trockene eingeengt und lieferte sechs Milligramm einer öligen Substanz

(2072.I).

Der Metabolit 2072.II wurde aus der mittelpolaren Fraktion 2072.c isoliert, indem

diese durch SC (30 cm x 2 cm, Si 60) mit CH2Cl2/MeOH (0–15%) als Elutionsmittel,

in drei Unterfraktionen aufgetrennt wurde. In der zweiten Fraktions war eine Kompo-

nente stark angereichert, die durch nochmalige SC (10 cm x 20 cm, Si 60) mit

CH2Cl2/MeOH 5% weiter angereichert wurde. Durch mehrfache PSC (20 cm x 20 cm,

0.1 cm) mit n-Hexan/Aceton 30% wurde diese Hauptkomponente isoliert und durch

SC (10 cm x 0.5 cm, Sephadex LH 20) mit CH2Cl2/MeOH 5% so aufgereinigt, daß 6

mg des weißen Naturstoffes aus CH2Cl2 auskristallisierten.

Der Metabolit 2072.III wurde aus der ersten Unterfraktion des Metaboliten 2072.II

isoliert, indem die Fraktion durch dreimalige PSC mit CH2Cl2/MeOH 3%, aufgetrennt

wurde. Anschließende Aufreinigung durch SC (10 cm x 0.5 cm, Sephadex LH 20)

CH2Cl2/MeOH 5% ergab 2 mg des kristallinen Naturstoffes.

Der Metabolit 2072.IV wurde aus der polarsten Vorfraktion 2072.e isoliert. Durch

Auftrennung der Fraktion mittels Chromatotron (Si 60, 4 mm, CH2Cl2, CH2Cl2/MeOH

1%, 4%, 8%) wurden drei Unterfraktionen erhalten. Die polarste Unterfraktion wurde

durch SC mit einem Stufengradienten (n-Hexan/Aceton 20%, 35%, 50%) aufgetrennt.

Dadurch wurde eine Fraktion erhalten, deren Hauptkomponente der Naturstoff war.

EXPERIMENTELLER TEIL

Durch PSC (1 mm, CH2Cl2/MeOH 3%) mit Mehrfachentwicklung, wurde der Natur-

stoff als Hauptkomponente isoliert. Eine weitere Aufreinigung des Naturstoffes er-

folgte durch SC (10 cm x 0.5 cm, Sephadex LH 20) CH2Cl2/MeOH 5%, dabei wurden

von den eingesetzten 8 mg des Natursstoffes, ein großer Teil irreversibel auf der Säule

absorbiert und nur 2 mg des Metaboliten von der Säule eluiert.

Die Polarität der Naturstoffe nahm in der Reihenfolge der Numerierung der

Naturstoffe zu. 2072.I war der unpolarste (löslich in CH2Cl2) und 2072.IV der polarste

(löslich in Methanol) Naturstoff aus Pilzstamm 2072.

6.3.8 Strukturdaten und physikalische Eigenschaften

6.3.8.1 2-(1´-cis-3´,5´-Dimethylhept-1´-enyl)-3,4-dihydroxy-7-methyl-

2,3,4,4a,7,7a-tetrahydrofuro[3,4-b]pyran-5-on (2072.I)

7´ 6´ 5´ 4´ 3´ 2´

1´

Summenformel: C17H26O5. –

Drehwert: αD

= + 8.2 ° (c = 1.2 mg/ml, CH2Cl2). –

Rf-Wert: 0.6 (CH2Cl2/MeOH 3%). –

UV (Methanol): λmax (lg ε) = 217 (3.122). –

83EXPERIMENTELLER TEIL

IR (KBr):

= 3428 cm–1 (OH), 2961, 2920, 1780 (Carbonyl, γ-Lacton), 1761, 1358,

1188 (Alkyl-O), 1115, 1068 (Alkyl-O). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 5.66 (pt, J1´,2´ = J2´,3´ = 10.5 Hz, 1 H, 2´-H), 5.52 (dd, J1´,2´ =

10.0 Hz, J1´,2 = 10.0 Hz, 1 H, 1´-H), 4.96 (pt, J2,1´ = J2,3 = 8.9 Hz, 1 H, 2-H), 4.84 (dq,

J8,7 = 7.0 Hz, J7,4 = 1.8 Hz, 1 H, 7-H), 4.58 (dd, J3,4 = 6.0 Hz, J4,7 = 1.7 Hz, 1 H, 4-H),

3.78 (dd, J2,3 = 8.4 Hz, J3,4 = 7.8 Hz, 1 H, 3-H), 2.52–2.70 (m, 1 H, 3´-H), 1.47 (d, J7,8

= 6.9 Hz, 3 H, 8-H), 1.40–1.06 (m, 6 H, 3´-H, 4´-H, 5´-H, 6´-H), 1.01 (d, J3´,8´ = 6.8

Hz, 3 H, 8´-H), 0.86 (t, J6´,7´ = 6.9 Hz, 3 H, 7´-H), 0.80 (d, J5´,9´ = 6.1 Hz, 3 H, 9´-H). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 178.0 (s, C-7a), 172.3 (s, C-5), 146.0 (d, C-2´), 121.7 (d,

C-1´), 101.0 (s, C-4a), 79.7 (d, C-2), 74.6 (d, C-7), 72.3 (d, C-4), 65.3 (d, C-3), 44.7 (t,

C-4´), 32.5 (d, C-3´), 30.8 (d, C-5´), 30.5 (t, C-5´), 22.2 (q, C-8´), 19.4 (q, C-9´), 17.6

(q, C-8), 11.7 (q, C-7´). –

MS (EI / 230 °C): m/z (%) = 311 (1) [M + H+], 240 (1), 221 (21), 168 (31) [M+ + H+ –

C5H11 – C3H4O2], 137 (18), 124 (22), 97 (100). –

MS (CI – i-Butan): m/z (%) = 311 (100) [M + H+]. –

HRMS (C17H27O5): Ber.: 311.193674 [M + H+]

Gef.: 311.190552 ± 3 ppm [M + H+]

6.3.8.2 3,4-Dihydroxy-2-(1´-cis-5´-Hydroxy-3´,5´-Dimethylhept-1´-enyl)-7-methyl-

2,3,4,4a,7,7a-hexahydrofuro[3,4-b]pyran-5-on (2072.II)

4a 4

1´

2´

3´4´

5´

6´

7´

EXPERIMENTELLER TEIL

Summenformel: C17H28O6. –

Schmelzpunkt: 156 °C. –

Drehwert: αD

= + 10.2 ° (c = 2.1 mg/ml, CH2Cl2). –

IR (KBr):

= 3428 cm–1 (OH), 2961, 2920, 1780 (Carbonyl, γ-Lacton), 1761, 1358,

1188 (Alkyl-O), 1115, 1068 (Alkyl-O). –

UV (Methanol): λmax (lg ε) = 208 (2720). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 5.57 (pt, J1´,2´ = J2´,3´ = 10.6 Hz, 1 H, 2´-H), 5.28 (dd, J1´,2´ =

10.9 Hz, J1´,2 = 8.9 1 H, 1´-H), 4.71 (dq, J7,7a = 2.7 Hz, J7,8 = 6.5 Hz, 1 H, 7-H), 4.40

(pt, J = 3.1, 1 H, 7a-H), 4.10 (pt, J1´,2 = J2,3 = 9.0 Hz, 1 H, 2-H), 3.91 (dd, J4,4a = 6.8

Hz, J3,4 = 9.0 Hz, 1 H, 4-H), 3.38 (dd, J4a,7a = 3.3 Hz, J4a,4 = 6.5 Hz, 1 H, 4a-H), 3.20

(pt, J2,3 = J3,4 = 9.1 Hz, 1 H, 3-H), 2.88–2.78 (m, 1 H, 3´-H), 1.50 (d, J4´,3´ = 5.8 Hz, 2

H, 4´-H),1.46 (q, J7´,6´ = 7.4 Hz, 2 H, 6´-H), 1.35 (d, J7,8 = 6.6 Hz, 3 H, 8-H), 1.12 (s, 3

H, 8´-H), 0.99 (d, J3´,9´ = 6.4 Hz, 3 H, 9´-H), 0.85 (t, J6´,7´ = 7.5 Hz, 3 H, 7´-H). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 177.9 (s, C-5), 144.1 (d, C-2´), 125.3 (d, C-1´), 79.6 (d, C-7),

76.8 (d, C-7a), 75.1 (d, C-2), 74.6 (d, C-3), 72.7 (s, C-5´), 72.3 (d, C-4), 49.4 (t, C-4´),

47.7 (d, C-4a), 35.1 (t, C-6´), 29.3 (d, C-3´), 27.8 (q, C-9´), 23.5 (q, C-8´), 13.8 (q, C-

8), 8.5 (q, C-7´). –

MS (EI / 230 °C): m/z (%) = 328 (8) [M+], 310 (24) [M+ – H2O], 240 (19), 223 (25)

[M+ – H2O – C5H11], 213 (7) [M+ – C7H15], 195 (22) [M+ – H2O –C7H15], 174 (19) [M+

– CH3 – C9H15],167 (60) [M+ – C5H11 – C3H4O2], 137 (40), 89 (99) 97 (100). –

HRMS (C17H28O6): Ber.: 328.18855

Gef.: 328.19002 ± 3 ppm

85EXPERIMENTELLER TEIL

6.3.8.3 3,4,8-Trihydroxy-3,4,4a,8a-tetrahydro-2H-naphtalin-1-on (2072.III)

OOH

Summenformel: C10H10O4. –

Schmelzpunkt: 118 °C. –

Drehwert: αD

= + 6.7 ° (c = 0.51 mg/ml, CH2Cl2). –

Rf-Wert: 0.3 (CH2Cl2/MeOH 5%). –

1H-NMR (Aceton-d6): δ = 12.40 (s, 1 H, 8-OH), 7.49 (pt, J7,6 = J6,5 = 9.0 Hz, 1 H, 6-

H), 7.10 (dd, J6,5 = 2.3 Hz, J7,5 = 9.0 Hz, 1 H, 5-H), 6.80 (dd, J6,7 = 8.9 Hz, J5,7 = 2.0

Hz, 1 H, 7-H), 4.68 (d, J4,3 = 2.9 Hz, 4-H), 4.15-4.08 (m, 1 H, 3-H), 3.1-3.0 (m, 2 H, 2-

H). –

13C-NMR (Aceton-d6): δ = 206.5 (s, C-1), 164.3 (s, C-8), 147.6 (s, C-4a), 137.9 (s, C-

5), 127.6 (s, 8a), 119.9 (d, C-7), 117.2 (d, C-6), 73.1 (d, C-3), 71.8 (d, C-4), 47.1 (t, C-

2). –

EXPERIMENTELLER TEIL

6.3.8.4 [3R*-[3α,3aβ,4aα,5β,6β,8aβ,9α,10S*(Ξ),11R*]]-3a,4,4´,5´,8,8a,9,9a-Oc-

tahydro-5,9,11-trihydroxy-9a-methyl-10-(2-Methyl-1-oxobutyl)spiro[9,11-epoxy-3,4a-

ethano-4aH-furo]3,2-g][2]benzopyran-6,2´(5´H,3´H)-furan]-2(3H)on (2072.IV)

4´´

3´´

2´´

1´´

HO OH

1´

2´

3´ 4´

5´

Summenformel: C22H30O9. –

Schmelzpunkt: 187 °C. –

Drehwert: αD

= + 26.2° (c = 0.21 mg/ml, CH2Cl2). –

IR (KBr):

= 3458 cm–1 (OH), 2961, 2920, 1775 (Carbonyl, γ-Lacton), 1701 (Car-

bonyl), 1195 (Alkyl-O), 1062 (Alkyl-O). –

UV (Methanol): λmax (lg ε) = 216 (2.463). –

1H-NMR (Aceton-d6): δ = 5.51 (s, 1 H, 9-OH), 5.45 (s, 1 H, 11-OH), 4.28 (s, 1 H, 10-

H), 4.19 (d, JOH,5 = 8.2, 1 H, 5-OH), 4.01 (pt, J8α,8a = J8α,8β = 11.6 Hz, 1 H, 8-Hα)

4.07-3.93 (m, 2 H, 5´-Hα, 5´-Hβ), 3.91 (dd, J8β,8α = 11.7 Hz, J8β,8a = 4.6 Hz, 1 H, 8-Hβ),

3.08 (d, J5,5-OH = 7.1 Hz, 1 H, 5-H), 3.05-2.96 (m, 1 H, 2´´-H), 2.86 (d, J3a,3 = 5.2 Hz,

3-H), 2.75-2.70 (m, 1 H, 3a-H), 2.31 (dd, J4,4 = 14.3 Hz, J4,3a = 3.5 Hz, 1 H, 4-Hα),

2.15 (dd, J8a,8α = 4.7 Hz, J8β,8a = 11.5 Hz, 1 H, 8a-H), 2.08-1.80 (m, 5 H, 3´-Hα, 3´-Hβ,

4´-Hα, 4´-Hβ), 1.74-1.61 (m, 1 H, 3´´-Hα), 1.46 (s, 3 H, 9a-CH3), 1.25–1.15 (m, 1 H,

3´´-Hβ), 1.10 (d, J2´´,5´´ = 6.9 Hz, 3 H, 2´´-CH3), 0.85 (t, J4´´,3´´ = 7.3 Hz, 3 H, 4´´-H). –

13C-NMR (Aceton-d6): δ = 216.7 (s, C-1´´), 174.4 (s, C-2), 108.6 (s, C-6), 98.5 (s, C-

9), 95.7 (s, C-11), 85.5 (s, C-9a), 70.8 (d, C-5), 68.8 (t, C-5´), 56.6 (t, C-8), 54.5 (d, C-

87EXPERIMENTELLER TEIL

10), 53.5 (s, C-2´´), 50.0 (s, C-3), 44.2 (d, C-3a), 43.2 (s, C-4a), 38.6 (d, C-8a), 37.3 (t,

C-3´), 25.4 (t, C-4), 24.9 (t, C-3´´), 22.9 (t, C-4´), 17.0 (q, 9a-CH3), 15.7 (q, 2´-CH3),

11.9 (q, C-4´´). –

MS (CI – NH4+): m/z (%) = 456 (100) [M + H+]. –

HRMS (C22H30O9): Ber.: 438.18898

Gef.: 438.18805 ± 4ppm

6.4 Stamm 3042

6.4.1.1 Isolierung

Die Kulturen auf den Agarplatten wurden im Warring–Blender mit Ethylacetat homo-

genisiert. Die mit Rohextrakt angereicherte Ethylacetatphase wurde abfiltriert und bis

zur Trockene eingeengt. Das Rohextrakt wurde mit einer Kieselgelsäule (45 cm x 6

cm, Si 60) und Dichlormethan als Lösungsmittel filtriert, um ihn für die MPLC-Auf-

trennung an Lobarsäulen vorzubereiten. Durch die sich anschließende chromatogra-

phische Auftrennung unter isokratischen Bedingungen mit Dichlormethan/Methanol

(97:3) als Laufmittel, konnten sechs Naturstoffe mit unterschiedlichen Retentionszei-

ten (3042.I-3042.VI) isoliert werden, die nach Aufreinigung durch PSC mit Dichlor-

methan/Methanol (97:3) als Reinstoffe erhalten wurden. Alle Naturstoffe waren relativ

unpolar (löslich in Methylenchlorid). Eine Abstufung nach steigender Polarität ergab

die Rangfolge: 3042.I, 3042III, 3042.II, 3042.VI, 3042.V, 3042.IV.

6.4.1.2 3-(3´,7´-Dimethyl-2´,6´-octadienyl)-2,4-dihydroxy-6-methylbenzaldehyd

(3042.I)

Summenformel: C19H26O3. –

Schmelzpunkt: 124 °C (Lit.: 124-126 °C)[40]. –

EXPERIMENTELLER TEIL

Rf-Wert: 0.8 (CH2Cl2/MeOH 3%). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 12.75 (s, 1 H, 2-OH), 10.07 (s, 1 H, 8-H), 6.20 (s, 1 H, 5-H),

5.25 (t, J1´,2´ = 7.1 Hz, 1 H, 2´-H), 5.04 (t, J5´,6´ = 6.6 Hz, 1 H, 6´-H), 3.39 (d, J2´,1´ = 7.2

Hz, 2 H, 1´-H), 2.48 (s, 3 H, 7-H), 2.16-2.04 (m, 4 H, 4´-H, 5´-H), 1.80 (s, 3 H, 8´-H),

1.67 (s, 3 H, 9-H), 1.58 (s, 3 H, 10´-H). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 193.4 (d, C-8), 164.0 (s, C-2), 163.1 (s, C-4), 142.4 (s, C-6),

139.9 (s, C-3´), 132.5 (s, C-7´), 124.1 (d, C-6´), 121.4 (d, C-2´), 113.9 (s, C-1), 112.1

(s, C-3), 111.3 (d, C-5), 40.0 (t, C-4´), 26.7 (t, C-5´), 26.1 (q, C-8´), 21.6 (t, C-1´), 18.4

(q, C-6), 18.1 (q, C-9´), 16.6 (q, C-10´). –

HRMS (C19H26O3): Ber.: 302.18819

Gef.: 302.18854 ± 3 ppm

6.4.1.3 5-Chlor-3-(3´,7´-Dimethyl-2´,6´-octadienyl)-2,4-dihydroxy-6-methylbenz-

aldehyd (3042.II)

OHO

Summenformel: C18H23O3Cl. –

Schmelzpunkt: 88 °C (Lit.: 90-96 °C)[40]. –

Rf-Wert: 0.7 (CH2Cl2/MeOH 2%). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 12.72 (s, 1 H, 2-OH), 10.17 (s, 1 H, 8-H), 6.40 (s, 1 H, 4-OH),

5.25 (t, J1´,2´ = 7.3 Hz, 1 H, 2´-H), 5.09 (m, 1 H, 6´-H), 3.43 (d, J2´,1´ = 7.3 Hz, 2 H, 1´-

89EXPERIMENTELLER TEIL

H), 2.63 (s, 3 H, 7-H), 2.16-1.94 (m, 4 H, 4´-H, 5´-H), 1.82 (s, 3 H, 8´-H), 1.68 (s, 3 H,

9-H), 1.60 (s, 3 H, 10´-H). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 193.6 (d, C-8), 162.6 (s, C-2), 156.9 (s, C-4), 138.0 (s, C-6),

137.4 (s, C-3´), 131.9 (s, C-7´), 124.5 (d, C-6´), 121.1 (d, C-2´), 114.7 (s, C-1), 113.9

(s, C-3), 113.7 (d, C-5), 40.2 (t, C-4´), 27.0 (t, C-5´), 26.1 (q, C-8´), 22.4 (t, C-1´), 18.1

(q, C-6), 16.6.1 (q, C-9´), 14.9 (q, C-10´). –

HRMS (C18H23O3Cl): Ber.: 322.1335

Gef.: 322.1329 ± 3 ppm

6.4.1.4 2,4-Dihydroxy-6-methyl-3-(3,7,11-trimethyl-2,6,10-dodecatrienyl)-benzal-

dehyd (3042.III)

OHO

Summenformel: C23H32O3. –

Schmelzpunkt: 96 °C (Lit.: 98-100°C)[43]. –

Rf-Wert: 0.7 (CH2Cl2/MeOH 2%). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 12.79 (s, 1 H, 2-OH), 10.10 (s, 1 H, 8-H), 6.20 (s, 1 H, 5-H),

5.30 (t, J1´,2´ = 7.1 Hz, 1 H, 2´-H), 5.10 (m, 2 H, 6´-H, 10´-H), 3.43 (d, J2´,1´ = 7.3 Hz, 2

H, 1´-H), 2.52 (s, 3 H, 7-H), 2.16-2.04 (m, 6 H, 4´-H, 5´-H, 8´-H, 9´H), 1.80 (s, 3 H,

15´-H), 1.67 (s, 3 H, 14´-H), 1.58 (s, 6 H, 13´-H, 12´-H). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 193.4 (d, C-8), 164.0 (s, C-2), 163.0 (s, C-4), 142.4 (s, C-6),

140.3 (s, C-3´), 136.1 (s, C-7´), 132.5 (s, C-10´), 124.7 (d, C-6´), 123.9 (d, C-9´),

121.4 (d, C-2´), 113.6 (s, C-1), 111.9 (s, C-3), 111.3 (d, C-5), 40.1 (t, C-1´), 26.7 (t, C-

5´), 26.1 (q, C-8´), 21.6 (t, C-1´), 18.4 (q, C-6), 18.1 (q, C-9´), 16.6 (q, C-10´). –

EXPERIMENTELLER TEIL

HRMS (C23H32O3): Ber.: 356.2351

Gef.: 356.2347 ± 3 ppm

6.4.1.5 3-[5-(3-Acetyl-5-chlor-2,6-dihydroxy-4-methylphenyl)-3-methylpent-3-

enyl]-2,3,4-trimethylcyclohexanon (3042.IV)

OHO

ClO

Summenformel: C24H35O4Cl. –

Schmelzpunkt: 130 °C (Lit.: 130-131°C)[43]. –

Drehwert: αD

= + 9 ° (c = 2.7 mg/ml, CH2Cl2) (Lit.: + 6 ° (MeOH))[43]. –

Rf-Wert: 0.7 (CH2Cl2/MeOH 2%). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 12.60 (s, 1 H, 2-OH), 10.07 (s, 1 H, 8-H), 6.40 (s, 1 H, 4-OH),

5.82 (t, J1´,2´ = 7.2 Hz, 1 H, 2´-H), 3.32 (d, J2´,1´ = 7.2 Hz, 2 H, 1´-H), 2.53 (s, 3 H, 7-

H), 2.4-2.19 (m, 4 H, 9´-H, 10´-H), 2.03-1.74 (m, 4H, 4´-H, 5´H), 1.74 (s, 3 H, 15´-H),

1.65-1.49 (m, 2 H, 11´-H, 7´-H), 0.83 (d, 3 H, J7´,14´ = 6.5 Hz, 14´-H), 0.80 (d, 3 H,

J11´,12´ = 6.8 Hz, 12´-H), 0.49 (s, 3 H, 6-H). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 215.1 (s, 8´), 194.2 (d, C-8), 163.2 (s, C-2), 157.3 (s, C-4),

138.6 (s, C-6), 137.6 (d, C-2´), 121.9 (d, C-4´), 115.3 (s, C-1), 114.6 (s, C-3), 114.2 (d,

C-5), 51.7 (d, C-4), 44.2 (t, C-5), 42.6 (d, C-4´), 37.0 (t, C-5´), 36.6 (t, C-8´), 23.1 (t,

C-1´), 17.4 (q, C-6), 16.3 (q, C-9´), 16.1 (q, C-10´) 15.5(q, C-14´), 8.57 (q, C-7). –

HRMS (C24H35O4Cl): Ber.: 422.22238

Gef.: 422.2223 ± 3 ppm

91EXPERIMENTELLER TEIL

6.4.1.6 3-[5-(3-Acetyl-5-chlor-2,6-dihydroxy-4-methyl-phenyl)-3-methyl-penta-1,3-

dienyl]-2,3,4-trimethyl-cyclohexanon (3042.V)

OHO

ClO

Summenformel: C24H33O4Cl. –

Schmelzpunkt: 168 °C (Lit.: 172–173 °C)[45]. –

Drehwert: αD

= - 24 ° (c = 2.8 mg/ml, CH2Cl2) (Lit.: - 31.0 ° (MeOH))[45]. –

Rf-Wert: 0.6 (CH2Cl2/MeOH 3%). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 12.72 (s, 1 H, 2-OH), 10.14 (s, 1 H, 8-H), 6.47 (s, 1 H, 4-OH),

5.88 (d, 1 H, J4´,5´ = 16 Hz, 4´-H), 5.46 (t, J1´,2´ = 7.2 Hz, 1 H, 2´-H), 5.30 (d, J4´,5´ = 16

Hz, 1 H, 5´-H), 3.47 (d, J2´,1´ = 7.4 Hz, 2 H, 1´-H), 2.54 (s, 3 H, 7-H), 2.40-2.19 (m, 4

H, 9´-H, 10´-H), 1.82 (s, 3 H, 15´-H), 1.65-1.49 (m, 2 H, 11´-H, 7´-H), 0.77 (d, 3 H,

J7´,14´ = 6.9 Hz, 14´-H), 0.74 (d, 3 H, J11´,12´ = 6.5 Hz, 12´-H), 0.63 (s, 3 H, 6-H). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 213.8 (s, 8´), 194.2 (d, C-8), 163.2 (s, C-2), 157.2 (s, C-4),

138.8 (s, C-6), 136.6 (d, C-5´), 135.1 (s, C-3´), 134.2 (d, C-2´), 128.5 (d, C-4´), 114.8

(s, C-1), 114.7 (s, C-3), 114.2 (d, C-5), 40.2 (t, C-4´), 27.0 (t, C-5´), 26.1 (q, C-8´),

22.4 (t, C-1´), 18.1 (q, C-6), 16.6.1 (q, C-9´), 14.9 (q, C-10´) 8.4 (q, C-7). –

HRMS (C24H35O4Cl): Ber.: 420.20673

Gef.: 420.2066 ± 3 ppm

EXPERIMENTELLER TEIL

6.4.1.7 3-[5-(3-Acetyl-2,6-dihydroxy-4-methylphenyl)-3-methylpent-3-enyl]-2,3,4-

trimethylcyclohexanon (3042.VI)

OHO

Summenformel: C24H36O4. –

Rf-Wert: 0.7 (CH2Cl2/MeOH 2%). –

Schmelzpunkt: 171 °C (Lit.: 170–173 °C)[26]. –

Drehwert: αD

= - 121 ° (c = 2.2 mg/ml, CH2Cl2). –

1H-NMR (CD2Cl2): δ = 12.74 (s, 1 H, 2-OH), 10.09 (s, 1 H, 8-H), 6.26 (s, 1 H, 5-H),

5.30 (t, J1´,2´ = 7.2 Hz, 1 H, 2´-H), 3.39 (d, J2´,1´ = 7.2 Hz, 2 H, 1´-H), 2.52 (s, 3 H, 7-

H), 2.4-2.19 (m, 4 H, 9´-H, 10´-H), 2.03-1.74 (m, 4H, 4´-H, 5´H), 1.85 (s, 3 H, 15´-H),

1.65-1.49 (m, 2 H, 11´-H, 7´-H), 0.93 (d, 3 H, J7´,14´ = 6.5 Hz, 14´-H), 0.91 (d, 3 H,

J11´,12´ = 6.3 Hz, 12´-H), 0.59 (s, 3 H, 6-H). –

13C-NMR (CD2Cl2): δ = 215.1 (s, 8´), 193.4 (d, C-8), 164.1 (s, C-2), 162.7 (s, C-4),

142.3 (s, C-6), 138.6 (d, C-2´), 121.8 (d, C-4´), 113.6 (s, C-1), 112.4 (s, C-3), 111.0 (d,

C-5), 50.9 (d, C-4), 43.9 (t, C-5), 42.0 (d, C-4´), 36.5 (t, C-5´), 36.0 (t, C-8´), 21.6 (t,

C-1´), 16.9 (q, C-6), 15.7 (q, C-9´), 15.5 (q, C-10´) 15.4(q, C-14´), 8.0 (q, C-7). –

HRMS (C24H36O4): Ber.: 388.26135

Gef.: 388.26137 ± 2 ppm

93LITERATURVERZEICHNIS

7 LITERATURVERZEICHNIS

[1]J. von Arx, Pilzkunde, Verlag von J.C. Cramer, 1969.

[2]H.G. Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart,

1985/86.

[3]J. Weber, Pilze, eine Einführung, 1. Auflage, Springer Verlag Berlin,

Heidelberg, New York, 1983.

[4]E. Müller, W. Löffler, Mykologie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1982, S.

107.

[5]Luckner M., Secondary Metabolism in Microorganisms, Plants and

Animals, Fischer Verlag, Jena und Berlin, 1990.

[6]P.S. Steyn, The Biosynthesis of Mykotoxins. A Study in Secondary

Metabolism, Jon Wiley and Sons, New York, 1980.

[7]H.O. Schwantes, Biologie der Pilze, UTB, Stuttgart, 1995.

[8]A. Neumann, Antibiotika-Kompendium, Pergamon Press, 1985.

[9]R.B. Herbert, The biosynthesis of secondary Metabolites, Chapmann and

Hall, London, Second edition 1989.

[10]B. Franck, Angew. Chem., 1979, 91, 453.

[11]H.D. Munro, O.C. Musgrave, J. Chem. Soc. C, 1971, 685.

[12]J. Castells, E.R.H. Jones, G.D. Meakins, R.W. Williams, J. Chem. Soc.,

1959, 1159.

[13]R. Wiedert, Angew. Chem., 82, 1970, 331-342.

[14]R. Wiedert, Angew. Chem., 89, 1977, 513-520.

[15]A. Windaus, Liebigs Ann. Chem., 1928, 460, 225.

[16]A. Windaus, Z. Elektrochem. Angew. Phys. Chem., 1942, 276, 280.

[17]Y. Osabi, M. Nagase, S. Matsueda, Chem. Ind., 1985, 411.

[18]BASF, Interne Mitteilungen.

[19]K. Galaktionov, X. Chen, D. Beach, Nature, 1996, 382, 511-517.

[20]T.J. Batterham, Proc. Chem. Soc., London, 1963, 89.

[21]U. Weiss, G. Nasini, Prog. Chem. Org. Nat. Prod., 1987, 52, 1-72.

[22]F. Sureau, P. Miskovsky, L. Chinsky, P.Y. Turpin, J. Am. Chem. Soc.,

1996, 118, 9484.

[23]C. Thomas, R.S. MacGill, G.C. Miller, R.S. Pardini, Photochem.

Photobiol., 55, 1992, 47-53.

[24]P. Jardon, N. Lazortchak, R. Gautron, J. Chim. Phys, 85,1988, 971-977.

LITERATURVERZEICHNIS

[25]S.N. Okpanyi, M.L. Weischer, Arzneim. Forsch., 37, 1987, 10-13.

[26]F.H. Stodola, C. Cabot, C.R. Benjamin, Biochem. J., 1964, 93, 92.

[27] S. Takano, Y. Shimazaki, K. Ogasawaru, Heterocycles, 29, 1989, 2101.

[28]J.A. Findlay, S. Buthelezi, R. Lavoie, L. Pena-Rodriguez, J. Nat. Prod., 58,

1995, 11, 1759-1766.

[29]Cole und Cox, Handbook of Toxic Fungal Metabolites, New York,

Academic Press, 1981, p. 129.

[30] H. Duddeck, Topics in Stereochemistry, 1986, Jon Wiley and Sons, New

York, 16, 293.

[31]T.R. Hoye, P.R. Hanson, J.R. Vyvyan, J. Org. Chem., 1994, 59, 4096-4103.

[32]E.K. Wilson, R.M. Burk, J Org. Chem., 1992, 57, 7151-7158.

[33] R.B. Herbert, The biosynthesis of secondary Metababolites, Chapmann and

Hall, London, 1989, second edition, p. 56-57.

[34]U. Sankawa, H. Shimada, T. Sato, T. Kinoshita, K. Yanasaki, Chem.

Pharm. Bull., 1981, 29, 3536.

[35]U. Sankawa, H. Shimada, T. Sato, T. Kinoshita, K. Yanasaki, Tetrahedron.

Lett., 1977, 483.

[36]W.A. Ayer, L.M. Browne, A.W. Elgersma, P. Singer, Can. J. Chem., 1990,

68, 1300.

[37]A. Yokoo, J. Chem. Soc., 1950, 71, 590.

[38]H. Stetter, J. Lennartz, Liebigs Ann. Chem., 1977, 1807-1816.

[39]M. Hesse, H. Meier, B. Zee, Spektroskopische Methoden in der

organischen Chemie, 1991, G. Thieme Verlag, Stuttgart, 4. Überarbeitete

Auflage, S. 134.

[40]Y. Kosuge, A. Suzuki, S. Hirata, S. Tamura, Agric. Biol. Chem., 1973, 37,

455.

[41]K. Mori, M. Ohki, M. Matsui, Tetrahedron, 1974, 30, 715.

[42]H. Saimoto, J. Veda, H. Sashiwa, Y. Shigemasa, Bull. Chem. Soc. Jpn.,

1994, 67, 1178-1185.

[43]G.A. Ellestad, R.H. Evans jr., M.P. Kunstmann, Tetrahedron, Vol. 25,

1969, 1323-1329.

[44]Y. Nawata, K. Ando, G. Tamura, K. Arima, Y. Iitaka, J. Antibiotics, 1969,

22, 511-512.

[45]G.A. Ellestad, R.H. Evans jr., M.P. Kunstmann, Tetrahedron, Vol. 25,

1969, 1330-1338.

95LITERATURVERZEICHNIS

[46]Z. Diwu, J. W. Lown, Tetrahedron, Vol. 48, No. 1, 1992, 45-54.

[47]P. Baierweck, U. Simmross, K. Mullen, Chem. Ber., 1988, 121, 2195.

[48]T. Aoyama, T. Ito, Tetrahedron Letters, Vol. 34, No. 41, 1993, 6583-6586.

[49]J. Savar, P. Brassard, Tetrahedron, Vol. 40. No. 18, 1984, 3455-3464.

[50] M. Pericas, F. Serratosa, E. Valenti, Tetrahedron, Vol. 43, No. 10, 1987,

2311-2316.

[51]M. Pericas, E. Valenti, J.Org. Chem., Vol. 55, 1990, 2311-2316.

[52] H. Jonk, W. Frank, W. Fischer, H. Wimmer, Dünnschichtchromatographie,

VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1989.

LEBENSLAUF

Angaben zur Person:

Name: Karl-Heinz Emil Drogies

Geburtsdatum: 23.03.1962

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: verheiratet, zwei Kinder

Schulbildung:

07/78–06/81 Missionshaus St. Xaver Bad Driburg,

Abschluß: Abitur

Studium:

10/81–08/85 Universität Paderborn, Fachbereich Chemie

und Chemietechnik

Abschluß: Diplom-Chemieingenieur (Analytische Chemie)

Diplomarbeit: Entwicklung und Erprobung eines modifizierten Meßsystems

für Quecksilber mit Hilfe der AAS

04/90–02/95 Universität Paderborn, Fachbereich Chemie und

Chemietechnik

Abschluß: Diplomchemiker

Diplomarbeit: Untersuchung des Sekundär-Metaboliten-Spektrums aus endo-

phytischen Pilzen der Klasse Fungi Imperfecti

Dissertation: 03/95–10/97 BASF/BMBF-Projekt: Isolierung, Strukturaufklärung und

Syntheseversuche von biologisch aktiven Sekundärmetaboliten

aus endophytischen Mikromyceten

Beruflicher Werdegang:

10/85–03/88 Diplom-Chemieingenieur im BASF-Werk Hiltrup (Glasurit)

Seit 04/88 Selbständig als Anlageberater

Ehrenamtlich tätig als Leiter des Büros Ostwestfalen

für den Bundesverband Finanzdienstleistungen Berlin e.V.

03/95–05/97 Wissenschaftlicher Mitarbeiter an der Universität Paderborn