Galanthamin als AChE-Inhibitor – Beiträge zum rationalen Wirkstoffdesign
Vom Fachbereich Chemie und Chemietechnik
der Universität-GH Paderborn genehmigte
Dissertation
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
– Dr. rer. nat. –
von Diplom-Chemiker
Christian Pilger
aus Cobbenrode
Paderborn 2000
Die vorliegende Arbeit wurde im Fachbereich 13 – Chemie und Chemietechnik – der
Universität-GH Paderborn im Zeitraum von Juli 1997 bis Mai 2000 unter der Leitung von
Herrn Prof. Dr. G. Fels im Fach Organische Chemie angefertigt.
Veröffentlichungen im Zusammenhang mit dieser Promotionsarbeit
- C. Pilger, C. Bartolucci, D. Lamba, A. Tropsha, G. Fels, Accurate Prediction of the Bound
Conformation of Galanthamine in the Active Site of Torpedo Californica
Acetylcholinesterase using Molecular Docking, Journal of Molecular Graphics and
Modelling 1999, zur Veröffentlichung angenommen
- C. Bartolucci, E. Perola, C. Pilger, G. Fels, D. Lamba, Three-dimensional Structure of a
Complex of Galanthamine (Nivaline®) with Acetylcholinesterase from Torpedo
californica: Implications for the Design of New Anti-Alzheimer Drugs, Proteins:
Structure Fuction and Genetics 1999, zur Veröffentlichung eingereicht
- C. Pilger, B. Westermann, U. Flörke, G. Fels, A New Stereoselective Approach Towards
the Galanthamine Ring System via an Intramolecular Heck Reaction, Synlett 2000, 1163-
1165
- C. Pilger, A. Tropsha, G. Fels, Galanthaminderivate als Acetylcholinesterase-Inhibitoren –
eine QSAR-Studie, Vortrag, JCF Workshop 1998, Bielefeld
- C. Pilger, A. Tropsha, G. Fels, Galanthamin als Acetylcholinesterase-Inhibitor – eine
QSAR-Studie, Vortrag, JCF Workshop 1999, Paderborn
- C. Pilger, G. Fels, Docking Study on the AChE/(–)-Galanthamine Complex, Vortrag, 13.
Molecular Modelling Workshop 1999, Darmstadt
- C. Pilger, G. Fels, Docking Study on the AChE/(–)-Galanthamine Complex, Posterbeitrag,
12th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationships Molecular
Modelling and Prediction of Bioactivity 1998, Kopenhagen/Dänemark
- C. Pilger, C. Bartolucci, D. Lamba, A. Tropsha, G. Fels, Galanthamine as Acetylcho-
linesterase Inhibitor – Results of a Docking Study, Posterbeitrag, IUPAC-Kongress 1999,
Berlin
1. Referent: Prof. Dr. G. Fels
2. Referent: Prof. Dr. N. Risch
Eingereicht am: 23. Mai 2000
Tag der mündlichen Prüfung: 04. Juli 2000
Herrn Prof. Dr. G. Fels danke ich für die herausfordernde Themenstellung sowie für sein Inte-
resse am Fortgang der Arbeit und seine Unterstützung durch viele anregende Diskussionen.
Herrn Prof. Dr. N. Risch danke ich für die bereitwillige Übernahme des Korreferats und seine
Anregungen für die präparativen Arbeiten.
Bei Herrn PD Dr. B. Westermann möchte ich mich für seine stete Diskussionsbereitschaft
bedanken.
Weiterhin danke ich Nicole Diedrichs, Axel Dietrich, Birte Krebs sowie allen Mitarbei-
terinnen und Mitarbeitern des Fachs Organische Chemie für ihre kollegiale Zusammenarbeit.
Ihre Unterstützung durch Rat und Tat hat wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Dem Fonds der Chemischen Industrie danke ich für die Gewährung eines Promotionsstipen-
diums. Bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft möchte ich mich für die Förderung
meines Aufenthalts an der University of North Carolina at Chapel Hill, North Carolina/USA
bedanken.
Meinen Eltern
in Dankbarkeit
Zusammenfassung
Die Alzheimer'sche Demenz manifestiert sich durch einen progessiven Verlust des Erinne-
rungsvermögens, der bei den Betroffenen im späteren Verlauf zu ausgeprägten Persönlichkeits-
änderungen führt. Die Krankheit wird von Störungen innerhalb des Systems der cholinergen
Neurotransmission im zentralen Nervensystem begleitet. Das Enzym
Acetylcholinesterase (AChE) terminiert die chemische Reizweiterlei-
tung in cholinergen Synapsen durch Spaltung des Neurotransmitters
Acetylcholin. Die reversible Inhibition dieses Enzyms führt zu einer
Erhöhung der Konzentration des Neurotransmitterspiegels, was sich
bei Alzheimer Patienten positiv auswirkt. Diese auf der sog. choli-
nergen Hypothese fußende Behandlungsweise ist bisher der einzige Ansatz zur symptomatischen
Therapie der Alzheimer'schen Demenz. Das Amaryllidaceae Alkaloid (–)-Galanthamin ist in der
Lage, die AChE zu inhibieren. Sein pharmakologisches bzw. toxikologisches Profil machen
Galanthamin zu einer aussichtsreichen Leitstruktur für die Entwicklung von Alzheimer-Thera-
peutika der nächsten Generation.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuer Weg zur Synthese des Alkaloids beschritten, der als
Schlüsselschritt eine stereoselektive Heck-Reaktion beinhaltet. Die Synthese führt zum tetra-
cyclischen Grundgerüst von Galanthamin. Im Hinlick auf die Darstellung neuer Derivate dieser
Leitstruktur zeichnet sich die entwickelte Strategie durch eine hohe Flexibilität aus. Da beträcht-
liches Interesse an Galanthamin-Derivaten besteht, wurde unter diesem Aspekt das Potential der
neuen Synthese untersucht.
Parallel dazu wurden Molecular Modeling Studien an einer Datenbank von bekannten Galan-
thamin-Derivaten durchgeführt. Diese umfassen Untersuchungen zu den Wechselwirkungen
zwischen dem Enzym und den potentiellen Inhibitoren auf molekularer Ebene (Docking-
Studien) sowie die Erstellung von 3D-QSAR Modellen. Mit den verwendeten Verfahren war es
u.a. möglich, die räumliche Struktur des Galanthamin/AChE-Komplexes (Spezies: Torpedo
Californica) korrekt vorherzusagen. Die auf Basis der Struktur der menschlichen AChE gewon-
nenen 3D-QSAR Modelle sind mit verschiedenen statistischen Methoden validiert worden. Sie
erwiesen sich als robust und sollen zur Abschätzung der biologischen Aktivitäten neuer Derivate
herangezogen werden.
O
O
N
OH
(–)-Galanthamin
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung...............................................................................................................................1
2 Zielsetzung.............................................................................................................................6
3 Ergebnisse und Diskussion – Präparative Arbeiten..........................................................7
3.1 Analyse und Retrosynthese von Galanthamin.....................................................................9
3.2 Beschreibung der Versuche...............................................................................................11
3.2.1 Synthese des primären Zielmoleküls..............................................................................11
3.2.2 Weitere Funktionalisierung der Peripherie.....................................................................18
3.2.3 Variation der Größe des D-Rings....................................................................................22
3.2.4 Versuche zur Variation des Substitutionsmusters des C-Rings......................................23
3.3 Zusammenfassung – Präparativer Teil...............................................................................25
4 Molecular Modeling Teil – Allgemeine Vorbemerkungen..............................................26
4.1 Docking-Studie..................................................................................................................27
4.1.1 Struktur der Acetylcholinesterase...................................................................................27
4.1.2 Analyse der konformativen Flexibilität der TcAChE.....................................................29
4.1.3 Beschreibung der Arbeitsweise von AutoDock..............................................................31
4.1.4 Vorbereitung des Dockens von Galanthamin in TcAChE..............................................33
4.1.5 Durchführung..................................................................................................................34
4.1.6 Beschreibung der Röntgenstruktur des TcAChE/Galanthamin-Komplexes...................35
4.1.7 Ergebnisse und Diskussion.............................................................................................37
4.1.8 Reproduktion der TcAChE/Galanthamin-Struktur mit AutoDock.................................42
4.1.9 Alternative Methoden zur Berechnung von Bindungsenergien......................................46
4.2 Docken des Galanthamin-Datensatzes...............................................................................48
4.2.1 Vorbereitung der Strukturen...........................................................................................48
4.2.2 Ergebnisse und Diskussion.............................................................................................50
4.3 QSAR-Studien – Vorbemerkungen zur Theorie................................................................51
4.3.1 3D-QSAR – Comparative Molecular Field Analysis.....................................................52
4.3.2 Statistische Methoden: Principal Component Analysis (PCA).......................................54
4.3.3 Statistische Methoden: Partial Least Squares (PLS).......................................................56
4.3.4 Variablenselektion – die GOLPE-Methode....................................................................59
4.3.5 3D-QSAR Untersuchungen zur anti-AChE-Aktivität der Galanthamin-Derivate..........61
4.3.5.1 Auswahl der Sonden....................................................................................................62
4.3.5.2 Bestimmung der optimalen Gitterauflösung................................................................63
4.3.5.3 Variablenselektion.......................................................................................................68
4.3.6 Quasi-externe Vorhersagen.............................................................................................71
4.4 Zusammenfassung – Molecular Modelling Teil................................................................75
5 Ausblick................................................................................................................................76
6 Experimenteller Teil...........................................................................................................77
6.1 Synthesen...........................................................................................................................77
6.2 Molecular Modeling...........................................................................................................97
6.2.1 Enzymvorbereitung/Inhibitorvorbereitung (SYBYL 6.6)...............................................97
6.2.2 Docking/SYBYL-Optimierung.......................................................................................98
6.2.3 QSAR-Rechnungen.........................................................................................................98
7 Literaturverzeichnis..........................................................................................................100
8 Glossar und Abkürzungsverzeichnis...............................................................................113
9 Anhang...............................................................................................................................114
1
1 Einleitung
Der anatomische Aufbau des menschlichen Gehirns ist schon bald nach der Geburt abge-
schlossen. Danach beginnt es sich unter dem Einfluß seiner Umgebung funktionell zu organi-
sieren. Es bilden sich Kontakte zwischen den Nervenzel-
len, wodurch ein neuronales Netzwerk entsteht. Anders als
andere Körperzellen sind die Neuronen des zentralen Ner-
vensystems nicht zur Teilung befähigt. Allerdings unter-
liegt das Muster der Kontakte der Zellen untereinander
einem lebenslangen, durch das Erlebte geprägten Wandel.
Alle Veränderungen der Gehirnfunktionen wie Lernen und Erfahrung, Veränderung in Ver-
halten und Charakter sowie die Kompensation krankheitsbedingter Verluste kommen durch
Modulation der vorhandenen Vernetzung, d.h. durch die Knüpfung bzw. Eliminierung von
Kontakten zwischen den Nervenzellen zustande.[1]
Daß das komplexe System des zentralen Nervensystems nicht immer störungsfrei funktio-
niert, zeigt sich an den zahlreichen Gehirnerkrankungen. In einer Publikation von 1907
beschreibt der Arzt Alois Alzheimer die bei einer seiner Patientinnen auftretenden Symptome
folgendermaßen:
... Eine Frau von 51 Jahren zeigte als erste auffällige Krankheitserscheinung... eine rasch zu-
nehmende Gedächtnisschwäche...; sie fand sich in ihrer Wohnung nicht mehr zurecht... Sie ist
zeitlich und örtlich desorientiert. Gelegentlich macht sie Äußerungen, daß sie alles nicht ver-
stehe, sich nicht auskenne... Zeitweilig ist sie völlig delirant... und scheint Gehörshaluzinatio-
nen zu haben. Oft schreit sie viele Stunden lang mit gräßlicher Stimme. Ihre Merkfähigkeit ist
aufs schwerste gestört. Zeigt man ihr Gegenstände, so benennt sie dieselben meist richtig,
gleich darauf hat sie alles wieder vergessen... Beim Sprechen gebraucht sie häufig Verlegen-
heitsphrasen, einzelne paraphrasische Ausdrücke.... Den Gebrauch einzelner Gegenstände
scheint sie nicht mehr zu wissen... Nach 4½ jähriger Krankheitsdauer tritt der Tod ein. Die
Kranke war schließlich völlig stumpf, mit angezogenen Beinen zu Bett gelegen... [2]
Die später nach ihm benannte Alzheimer'sche Demenz ist eine Erkrankung des zentralen
Nervensystems, bei der es zu einem Nachlassen der Erinnerung sowie zu einem Verlust von
Antrieb und Willenskraft kommt. Diese Symptome treten allmählich auf und verstärken sich
2
im weiteren Verlauf. Die Erkrankung ist häufig von ausgeprägten emotionalen Störungen und
Veränderungen der Persönlichkeit der betroffenen Patienten begleitet.[3]
Das Auftreten dieser Krankheit beim Menschen ist altersabhängig und wächst von unter 1%
bei 60-65 jährigen auf mehr als 30% oberhalb eines Alters von 85 Jahren.[4] Nach Prognosen
des US-amerikanischen National Institute of Health (NIH) wird im Jahr 2000 weltweit mit
etwa 24 Millionen Krankheitsfällen gerechnet, was Behandlungskosten im Rahmen von etwa
2.5 Milliarden US$ mit sich bringt.[5,6] Bei der älteren Bevölkerung steht die Alzheimer'sche
Demenz an vierter Stelle der Todesursachen.[7]
Die Herkunft der Alzheimer'schen Demenz ist derzeit Gegenstand intensiver Untersuchungen.
Im Hinblick auf auslösende Faktoren werden genetische sowie umweltbedingte Einflüsse
diskutiert.[8]
Studien, die an Gehirnen verstorbener Alzheimer-Patienten durchgeführt wurden, zeigen
charakteristische Proteinablagerungen im zentralen Nervensystem, die sich zu den sog.
Amyloid Plaques aggregieren.[9,10,11] Darüber hinaus geht das Fortschreiten der Krankheit,
d.h. der Schweregrad der eingangs beschriebenen kognitiven Defizite, mit gravierenden Ver-
änderungen unterschiedlicher Komponenten des Systems der cholinergen Neurotransmission
einher. So ist die Konzentration des für die Synthese des Neurotransmitters Acetylcholin ver-
antwortlichen Enzyms deutlich herabgesetzt.[12] Außerdem ist die Anzahl der nicotinischen
Acetylcholinrezeptoren in bestimmten Gehirnarealen stark vermindert, während die Funktion
und die Konzentration anderer Rezeptoren von der Krankheit scheinbar unbeeinflußt
bleiben.[4,8]
Gerade aber bei Lernvorgängen, bei der Erinnerung sowie beim Erkennen spielt das choliner-
ge System eine wichtige Rolle.[13] Verletzungen und pharmakologische Manipulation choli-
nerger Nuclei sind mit der Verminderung von Lernleistungen im Tiermodell korreliert.[14,15]
Auch beim Menschen ist dieser Zusammenhang für die mit Alterungsvorgängen oder De-
menzerkrankungen einhergehenden kognitiven Defizite belegt.[16,17] Nicotinische Rezeptoren
üben dabei eine besondere Funktion aus, denn Nikotin beeinflußt sowohl kurz- und mittelfri-
stige Gedächtnisleistungen als auch die allgemeine Aufmerksamkeit positiv.[7,18]
3
Therapieansätze für die Alzheimer'sche Demenz
Innerhalb einer Zelle pflanzt sich ein Impuls als elektrisches Signal entlang der Membran fort.
Bei der interzellulären Kommunikation wird dieses elektrische Signal der sendenden Zelle in
der Regel durch Freisetzung eines Neurotransmitters in ein chemisches Signal überführt. Der
Neurotransmitter diffundiert durch den synaptischen Spalt zur Membran
der empfangenden Zelle und löst dort eine physiologische Antwort aus.
Danach wird der Neurotransmitter deaktiviert, so daß ein neues Signal
übertragen werden kann. Bei der cholinergen Neurotransmission erfolgt
die Übertragung des Nervenimpulses durch den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh). Das
Acetylcholin diffundiert von der präsynaptischen zur postsynaptischen Membran und bindet
dort an seinen Rezeptor (Abbildung 1). Im synaptischen Spalt befindet sich das Enzym Ace-
tylcholinesterase (AChE), das den chemischen Impuls durch Spaltung des Neurotransmitters
terminiert.[19]
Abbildung 1: Vorgänge bei der cholinergen Neurotransmission
Basierend auf den bisherigen Erkenntnissen fußen gegenwärtige therapeutische Ansätze zur
Behandlung der Alzheimer'schen Demenz auf der cholinergen Hypothese. Konkret bedeutet
das, daß die mit der Krankheit einhergehenden kognitiven Defizite durch gezielte Eingriffe in
das cholinerge System des zentralen Nervensystems gemildert werden sollen. In der Praxis
verfolgt man derzeit die Strategie, durch Inhibition der AChE die Konzentration des Neuro-
transmitters ACh im synaptischen Spalt zu erhöhen (Abbildung 2). Allein dieser Ansatz hat
bisher überhaupt zu ersten Erfolgen bei der Therapie der Alzheimer'schen Demenz geführt.
Acetylcholin (ACh)
O
N
+
4
Bei den Medikamenten (Abbildung 3) handelt es sich um zentral wirksame, reversible AChE-
Inhibitoren, die den Abbau des ACh im synaptischen Spalt verlangsamen.
Abbildung 2: Erhöhung der ACh-Konzentration durch Inhibierung der AchE
Die einzigen bisher von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zur
Behandlung der Alzheimer'schen Demenz zugelassenen Therapeutika sind die AChE-
Hemmer Tacrin[20] (Cognex®) und E2020[21] (Donapecil, Aricept®).
Das Amaryllidaceae Alkaloid Galanthamin ist ebenfalls in der Lage, die AChE reversibel zu
inhibieren. In Form seines Hydrobromids (Nivalin®) wird es seit etwa 30 Jahren zur Be-
handlung neurologischer Krankheiten, wie z.B. der Poliomyelitis[22] und als anti-Curare Mittel
in der Anästhesie[23,24] eingesetzt. Galanthamin besitzt ein verläßliches Wirkungsspektrum
und wird im allgemeinen gut toleriert.[25] Das Potential des Alkaloids zur Behandlung von
Alzheimer-Patienten wurde erst vor kurzem entdeckt.
N
NH2N
O
O
O
O
N
O
OH
Tacrin Donapecil Galanthamin
Abbildung 3: Zugelassene Medikamente zur Behandlung der Alzheimer'schen Demenz
5
Galanthamin befindet sich derzeit in der Endphase der klinischen Tests[26] und hat bereits in
Schweden und Österreich die Zulassung erhalten.
Galanthamin ist allerdings nicht ausschließlich wegen seiner anti-AChE Wirkung für die Be-
handlung von Alzheimer-Patienten von Interesse. Das Alkaloid ist vielmehr auch in der Lage,
den nicotinischen Acetylcholinrezeptor als nicht-kompetitiver Agonist (NCA) direkt zu stimu-
lieren. Darüber hinaus kann es den Effekt des Acetylcholins auf diesen Rezeptor allosterisch
potenzieren (APL).[4] Das bedeutet, daß die physiologische Antwort des nicotinischen Acetyl-
cholinrezeptors auf seinen Liganden in Gegenwart von Galanthamin verstärkt wird. Eine nie-
drige ACh-Konzentration im synaptischen Spalt kann auf diese Weise theoretisch durch Ver-
abreichung von Galanthamin kompensiert werden.
Die anti-AChE- und die NCA/APL-Wirkung verhalten sich also synergistisch, d.h. sie ver-
stärken sich gegenseitig und können somit zu einer Verringerung der zu verabreichenden Ein-
zeldosis führen.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß bisher nur auf der Grundlage der cholinergen
Hypothese Therapeutika zur Behandlung der Alzheimer'schen Krankheit entwickelt werden
konnten. Diese greifen direkt in die Prozesse der cholinergen Neurotransmission im zentralen
Nervensystem ein, um die mit der Demenz einhergehenden kognitiven Defizite zu mildern.
Aufgrund des pharmakologischen Profils von Galanthamin ist die Auswahl dieses Alkaloids
als Leitstruktur für die Entwicklung von Alzheimer-Medikamenten der nächsten Generation
sinnvoll.
6
2 Zielsetzung
Bei der Weiterentwicklung von Medikamenten kommt es darauf an, die gewünschte Eigen-
schaft der Wirksubstanz zu optimieren und gleichzeitig unerwünschte Nebenwirkungen zu
minimieren. Beim rationalen Wirkstoffdesign auf Basis einer Leitstruktur wird eine Sequenz
aus Derivatsynthese, biologischer Evaluierung der Derivate, rechnerbasierter Aufstellung von
Struktur-Wirkungs-Beziehungen und gegebenenfalls röntgenographischen Untersuchungen
von Protein/Inhibitor-Komplexen iterativ durchlaufen.
Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war es, Beiträge zur Entwicklung neuer Alzheimer-
Therapeutika auf der Grundlage von Galanthamin zu leisten.
Dies beinhaltete die Entwicklung einer neuen, flexiblen Synthesestrategie, die es ermöglichen
sollte, Derivate der Leitstruktur herzustellen, die mit den bisherigen Methoden nicht oder nur
unter sehr großem präparativem Aufwand zugänglich sind.
Ferner bestand die Aufgabe, durch rechnerbasierte Verfahren in einer Docking-Studie die
Wechselwirkungen zwischen Galanthamin und dem Zielprotein AChE auf molekularer Ebene
zu untersuchen und die gewonnenen Erkenntnisse auf eine Datenbank von Derivaten der
Leitstruktur mit bekannter anti-AChE Aktivität zu übertragen. Auf diesem Weg erhält man für
jede Verbindung des Datensatzes eine sinnvolle Hypothese für deren aktive Konformation, in
der der potentielle Wirkstoff am Protein bindet.
Auf der Basis dieser Strukturen sollten schließlich quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehun-
gen zur Abschätzung der Aktivitäten neuer Galanthamin-Derivate aufgestellt werden.
Die Arbeit erfolgte in Kooperation mit den Arbeitsgruppen von Prof. Dr. J. Fröhlich und Prof.
Dr. U. Jordis von der TU Wien (Synthese), Prof. Dr. A. Tropsha von University of North
Carolina at Chapel Hill (Molecular Modelling) sowie Dr. C. Bartolucci und Dr. D. Lamba
vom CNR Rom (Proteinkristallographie).
7
O
OH
O
N
(-)-Galanthamin (1)
3 Ergebnisse und Diskussion – Präparative Arbeiten
(–)-Galanthamin (3-Methoxy-11-methyl-4a,5,9,10,11,12-hexahydro-6H-benzofuro[3a,3,2-ef]
[2]benzazepin-6-ol, 1) ist ein natürlich vorkommendes Alkaloid der Amaryllidaceen Familie,
das zum ersten Mal aus dem kaukasischen Schneeglöckchen
Galanthus woronowi isoliert wurde.[27]
Im Hinblick auf eine nähere Untersuchung des pharmakologischen
Potentials dieser Verbindung besteht großes Interesse an Quellen, aus
denen Galanthamin möglichst preiswert und mit gleichbleibender
Qualität bezogen werden kann. Häufig ist es schwierig, bei durch Ex-
traktion aus Pflanzenteilen gewonnenen Wirkstoffen eine gesicherte Versorgung zu gewähr-
leisten. Zudem besteht z.B. aus klimatischen Gründen die Gefahr von Ernteausfällen. Daher
wurden Untersuchungen zur in vitro Produktion von Galanthamin in Narcissus Kulturen an-
gestellt.[28,29,30] Daneben sind in der Literatur mehrere Totalsynthesen für das Alkaloid be-
schrieben, von denen eine Auswahl in Tabelle 1 mit Angabe der Syntheseschritte und den
Gesamtausbeuten zusammengestellt ist.
Tabelle 1: Überblick über publizierte Totalsynthesen des Galanthamins
Jahr Autor Stufen Produkt Ausbeute Referenz
1962 Barton et al. > 81(+/–)-Galanthamin 0.7% [31]
1969 Kametani et al. > 71(+/–)-Galanthamin 8.8% [32]
1978 Shimizu et al. > 91(+)-Galanthamin 5.6% [33]
1988 Szewczyk et al. 5 (+/–)-Galanthamin 7.5% [34]
1989 Vlahov et al. 14 (+/–)-Galanthamin 1.9% [35]
1995 Szewczyk et al. 8 (–)-Galanthamin 7.1% [36]
1996 Czollner et al. 9(–)-Galanthamin 18.0-21.0% [37,38]
1998 Kita et al. 8 (+/–)-Galanthamin 36% [39]
1die Angabe bezieht sich auf die in der Primärpublikation beschriebene Anzahl von Stufen
Die von Czollner et al. entwickelte Totalsynthese hat sich bei der Produktion von optisch rei-
nem Galanthamin durchgesetzt und wird inzwischen im Kilogramm-Maßstab durchgeführt.
8
Schlüsselreaktion beim Aufbau des Galanthamin-Gerüsts ist bei allen bislang publizierten
Synthesen die intramolekulare oxidative Kupplung zweier Phenoleinheiten, die in Schema 1
exemplarisch für N-(p-Hydroxyphenethyl)-N-(2-bromo-5-hydroxy-4-methoxybenzyl)-form-
amid (2) wiedergegeben ist (vgl. Synthese nach Ref. [34,37,38]).
1
OH O
O
NO
Br
3
O
N
O
O
Br
O
4
A
B
C
D
oxidative Phenolkupplung
N
O
OH
Br
O
OH
2
Schema 1: Schlüsselschritt in der „klassischen“ Totalsynthese von Galanthamin
In der offenkettigen Vorstufe 2 kommt es, bezogen auf die phenolischen Hydroxylgruppen, zu
einer ortho-para Verknüpfung der durch 4 Einheiten (3 Methylengruppen und ein Stickstoff-
atom) voneinander getrennten aromatischen Systeme, wobei zunächst das Dienonsystem 3
entsteht. Dieses geht durch eine spontane intramolekulare Michael-Addition in 1-Brom-11-
formylnarwedin (4) über. In diesem eleganten Reaktionsschritt werden A- und C-Ring des
Galanthamin-Gerüsts stereoselektiv unter gleichzeitiger Bildung der beiden Heterocyclen (B-
und D-Ring) miteinander verknüpft. Der Tetracyclus 4 läßt sich in wenigen Schritten in
Galanthamin (1) überführen.
Im Hinblick auf die Synthese von Galanthamin-Derivaten stellt die oxidative Phenolkupplung
jedoch einen limitierenden Faktor dar, da sie die Variationsmöglichkeiten bei den Ringgrößen
einschränkt. Bei den Carbocyclen A und C ist dies einleuchtend, da hier jeweils ein phenoli-
scher Baustein benötigt wird, d.h. diese beiden Ringe sind a priori Sechsringe. Da die
Hydroxylgruppe an Ring A durch eine intramolekulare Michael-Addition an das Dienon-
System den B-Ring ausbildet, besteht auch keine Möglichkeit zur Veränderung des furano-
iden Fragments. Zur Variation der Größe des D-Rings läßt sich in der Literatur kein Beispiel
9
finden. In der Praxis hat sich die oxidative Kupplung als nicht durchführbar erwiesen, wenn
der Abstand zwischen den Phenoleinheiten kleiner ist als der in Verbindung 2.[40]
Die präparative Zielsetzung dieser Promotionsarbeit bestand in der Entwicklung einer fle-
xiblen Synthesestrategie zum Aufbau des Galanthamin-Gerüsts, die insbesondere im Hinblick
auf eine Änderung der Größen von C- und D-Ring vielfältige Derivatisierungsmöglichkeiten
bieten soll.
3.1 Analyse und Retrosynthese von Galanthamin
Bei der Entwicklung einer Synthese für Galanthamin (1) muß das Hauptaugenmerk auf der
Erzeugung der korrekten relativen Konfiguration beider asymmetrischer Zentren innerhalb
des Ringsystems liegen. Das quartäre Kohlenstoffatom des Galanthamin-Gerüsts wird auf
einer Seite von einer olefinischen Doppelbindung und auf einer anderen Seite von einem aro-
matischen Ring flankiert. Prinzipiell kann zum Aufbau derartiger Systeme die Heck-Reaktion
genutzt werden. Der Schlüsselschritt für die entsprechende Retrosynthese ist in Schema 2 dar-
gestellt.
O
R
Br
B
retro Heck-Reaktion
O
R
H
A
Schema 2: Aufbau Tetrahydrodibenzofuran-Systems über die Heck-Reaktion
Durch Anwendung einer intramolekularen Heck-Reaktion kann das Tetrahydrodibenzofuran-
System A, welches den Kern des Galanthamin-Gerüsts bildet, ausgehend von einem offenket-
tigen Ether des Typs B aufgebaut werden. Aus stereochemischer Sicht ist die Nutzung der
Heck-Reaktion besonders interessant, denn es ist bekannt, daß die intramolekulare Variante
dieser Palladium-katalysierten Reaktion selektiv zu einer cis-Verknüpfung von Ringen führen
kann. Gleichzeitig wird die Wanderung der olefinischen Doppelbindung unter Ausbildung
eines quartären Zentrums beobachtet. In der Literatur finden sich zahlreiche Beispiele, in
denen die intramolekulare Heck-Reaktion als Schlüsselschritt bei der Synthese von
Morphium und seinen Derivaten sowie bei anderen Amaryllidaceae Alkaloiden eingesetzt
wurde.[41,42,43,44,45,46,47]
10
Als primäres Zielmolekül wurde der Tetracyclus 5 identifiziert, der zwar in seiner Peripherie
von Galanthamin abweicht, sich jedoch in seinem Ringsystem nicht vom Naturstoff unter-
scheidet. Unter der Bedingung, daß beim Aufbau des quartären Zentrums dieser Verbindung
die Heck-Reaktion eingesetzt werden soll, läßt sich für 5 folgende Retrosynthese entwickeln
(Schema 3a-c).
Spaltet man das Lactam in 5 (gestrichelte Bindung), so führt die Konvertierung der Carbonyl-
funktion zum Ester und die Überführung der Aminogruppe in den Aldehyd zur tricyclischen
Zwischenstufe 6 (Schritt i, Schema 3a).
iiiO
OBr
O
O
O
7
O
OO
O
O
6
O
N
OO
5
Schema 3a: Aufbau des tetracyclischen Gerüsts von 5
Der Tricyclus 6 besteht aus einem substituierten Tetrahydrodibenzofuran-System (vgl. A in
Schema 2). Wird in 6 die gestrichelt dargestellte Bindung gespalten und die olefinische Dop-
pelbindung verschoben, so gelangt man im zweiten retrosynthetischen Schritt zu dem Ether 7.
Für die Vorwärtssynthese ist geplant, hier eine intramolekulare Heck-Reaktion zu verwenden.
Aus stereochemischer Sicht liegt in dieser Reaktion der Schlüssel für die gesamte Sequenz, da
an dieser Stelle das quartäre Kohlenstoffzentrum aufgebaut wird. Es muß die Frage geklärt
werden, ob sich in der Praxis mittels der Heck-Reaktion eine stereoselektive Verknüpfung
beider Ringe erreichen läßt.
Die Vorstufe 7 kann auf das Phenol 8 und den Allylalkohol 9 zurückgeführt werden (Schritt
iii, Schema 3b).
+
OH
O
O
9
O
OH
Br
O
8
7
iii
Schema 3b: Bildung des Ethers 7
11
Eine Analyse des Bausteins 8 führt zu Isovanillin (10) als Ausgangsprodukt (Schritt iv, Sche-
ma 3c). Der Allylalkohol 9 läßt sich aus dem α,β-ungesättigten Keton 11 gewinnen, das man
seinerseits auf 2-Methoxybenzoesäure (12) zurückführen kann (Schritte v und vi, Schema 3c).
8
9
O
OH
O
2-Methoxybenzoesäure (12)
OH
O
O
Isovanillin (10)
iv
vi
v
O
O
O
11
Schema 3c: Rückführung der Synthese auf kommerziell erhältliche Edukte
Durch die retrosynthetische Analyse kommt man auf eine Gesamtzahl von 6 Schritten, die
ausgehend von kommerziell erhältlichen Edukten zur tetracyclischen Verbindung 5 führen.
Diese besitzt große Ähnlichkeit zum Galanthamin (1) und sollte sich durch Funktionalisierung
der Allylposition und Reduktion des Lactams zum Amin in den Naturstoff überführen lassen.
3.2 Beschreibung der Versuche
3.2.1 Synthese des primären Zielmoleküls
Bei den literaturbekannten Verfahren zur Herstellung der Ausgangsverbindung 2-Bromisova-
nillin (8) wird ein Gemisch aus monobromierten Aromaten erhalten.[48,49] Demgegenüber ließ
sich Isovanillin (10) in Gegenwart von tert.-Butylamin bei –70°C selektiv in Position 2 bro-
mieren.[50] Das gewünschte Produkt wurde nach Umkristallisation aus Methanol/Wasser rein
erhalten (Schema 4).
12
Br2, tert.-BuNH2, -70°C
CH2Cl2
89%
10
OH
O
O
Br
8
Schema 4: Bromierung von Isovanillin (10)
Um die Anwendbarkeit der intramolekularen Heck-Reaktion auf die Synthese des Galantha-
min-Gerüsts zu prüfen, wurde 2-Bromisovanillin (8) zunächst mit 2-Bromcyclohexenon (13)
in einer Williamson'schen Ethersynthese zu dem Testsystem 2-Bromo-3-(cyclohex-2-enyl-
oxy)-4-methoxy-benzaldehyd (14) umgesetzt (Schema 5).[51]
Br
O
O
O
+
14
8
Br
13
95%
Aceton, ∆
∆∆
∆
K2CO3
Schema 5: Synthese des Testsystems 14
Der Ether 14 ist anschließend einer intramolekularen Heck-Reaktion[41,42,43,44,45,46] mit Palla-
dium(II)-acetat und Tri(o-tolyl)phosphin in Triethylamin unterworfen worden (Schema 6).
Als Reaktionsprodukt konnte 4-Methoxy-5a,6,7,9a-tetrahydro-dibenzofuran-1-carbaldehyd 15
als Gemisch der cis/trans-Diastereomeren erhalten werden.
+
O
O
O
H
15a (cis)
14
O
O
O
H
15b (trans)
Pd(OAc2)2, P(o-Tol)3
Et3N
87%
Schema 6: Intramolekulare Heck-Reaktion an 14
13
Die Heck-Reaktion läßt sich also beim Aufbau des tricyclischen Systems 15 anwenden,
wodurch zwei stereogene tertiäre Kohlenstoffzentren entstehen.
Der nächste Schritt besteht in der Untersuchung, ob eine Palladium-katalysierte intramoleku-
lare Kupplungsreaktion auch bei Ethern des Typs 14 durchführbar ist, die an der olefinischen
Verknüpfungsposition substituiert sind.
Zur Synthese eines geeigneten Ausgangsstoffs wurde 2-Methoxybenzoesäure (12) einer alky-
lierenden Birch-Reduktion unterzogen (Schema 7).[52,53]
24%
1. Na, fl. NH3, -78°C
2. BrCH2COOCH3
12
O
O
O
11
Schema 7: Alkylierende Birch-Reduktion von 12
Dazu wurde 12 mit einer Lösung aus Natrium in flüssigem Ammoniak umgesetzt. Das inter-
mediär auftretende Dianion ließ sich mit Bromessigsäuremethylester alkylieren. Durch
Erhitzen des Rohprodukts in einer Mischung aus Chloroform und 25%-iger Schwefelsäure
wurde der Enolether gespalten. Nachfolgend setzte die instabile β-Ketosäure Kohlendioxid
frei und die Lage der Doppelbindung verschob sich in Konjugation zur Ketogruppe, wodurch
es zur Bildung von (6-Oxo-cyclohex-1-enyl)-essigsäuremethylester (11) kam (Schema 8).
H+
OO
O
O
OH
O
O
O
11
12
OO
OO
OH
- CH3OH - CO2
O
O
O
--
2 e-BrCH2COOMe
H+/H2O
Schema 8: Denkbarer Mechanismus der alkylierenden Birch-Reduktion von 12
14
Die geringe Effizienz der alkylierenden Birch-Reduktion wirkt sich sehr nachteilig auf die
Gesamtausbeute der Synthese aus. Dies ist aber trotzdem akzeptabel, da dieser Schritt der
erste in der Sequenz ist und darüber hinaus in einem relativ großen Maßstab durchgeführt
werden kann.
Das α,β-ungesättigte Keton 11 konnte mit Natriumborhydrid bei 0°C im Beisein von CerIII-
Salzen (Luche-Bedingungen) quantitativ zu (6-Hydroxy-cyclohex-1-enyl)-essigsäuremethyl-
ester (9) in racemischer Form reduziert werden (Schema 9).[54]
NaBH4, CeCl3∗7 H2O, 0°C
OH
O
O
9
11 THF, Methanol
98%
Schema 9: 1,2-Reduktion des α,β-ungesättigten Ketons 11
Die Verknüpfung von 2-Bromisovanillin (8) mit dem Allylalkohol 9 erfolgte durch Umset-
zung mit Azodicarbonsäurediethylester (DEAD) und Triphenylphosphin in Toluol bei 0°C
(Mitsunobu-Bedingungen, Schema 10).[55,56] Das Produkt dieser Reaktion ist [6-(2-Bromo-3-
formyl-6-methoxy-phenoxy)-cyclohex-1-enyl]-essigsäuremethylester (7). Die relativ geringe
Ausbeute dieser Stufe ist darauf zurückzuführen, daß die Bedingungen bisher nicht optimiert
worden sind.
7
DEAD, PPh3
Toluol
40%
O
O
Br
O
O
O
89
+
Schema 10: Mitsunobu-Reaktion zwischen 8 und 9
Unter Bedingungen, die die Bildung von 4-Methoxy-5a,6,7,9a-tetrahydro-dibenzofuran-1-
carbaldehyd (15) zur Folge hatten (Palladiumacetat, Tri(o-tolyl)phosphin, Triethylamin),
konnte im Fall des Ethers 7 kein Umsatz erzielt werden. Demgegenüber führte die Verwen-
dung von Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium als Katalysator und Kaliumcarbonat als
Base in Toluol zur Bildung des gewünschten Produkts [6-(2-Bromo-3-formyl-6-methoxy-
phenoxy)-cyclohex-1-enyl]-essigsäuremethylester (6) (Schema 11).
15
7
O
O
O
O
O
6
Pd(PPh3)4, K2CO3
Toluol, 107°C
84%
Schema 11: Intramolekulare Heck-Reaktion von 7
Die spektroskopischen Daten von 6 zeigen, daß die Reaktion im Gegensatz zur intramolekula-
ren Kupplung des unsubstituierten Ethers 14 hoch stereoselektiv verläuft. Aus der Röntgen-
struktur von 6 geht hervor, daß 7 unter den gewählten Heck-Bedingungen ausschließlich zum
cis-verknüpften Produkt reagiert (vgl. Konfigurationen an C1 und C6, Abbildung 4). Erwar-
tungsgemäß ist die olefinische Doppelbindung im Ring gewandert (C4 und C5).
C1
C6
C5
C4
Abbildung 4: Röntgenstruktur des Tricyclus 6
Die beobachtete Stereoselektivität der intramolekularen Heck-Reaktion soll durch mechanisti-
sche Betrachtung rationalisiert werden.[45,57]
Als katalytisch aktive Spezies stellt man sich bei dieser Reaktion einen 14-Elektronen Palla-
diumkomplex (PdL2) vor, der durch Abspaltung von zwei Phosphin-Liganden aus Tetrakis-
(triphenylphosphin)-palladium entsteht. An diesem Komplex kommt es zu einer oxidativen
Addition der halogenierten Verbindung 7, wobei das Palladium in die Kohlenstoff-Brom-
Bindung insertiert (Schema 12). Der resultierende Komplex 7a spaltet einen weiteren
Phosphin-Liganden ab.
16
O
O
O
O
O
Pd
L
L
Br
7
7a
- 2 L
PdL4
PdL2
L: PPh3
O
O
O
O
O
Pd
L
Br
7b
- L
Schema 12: Mechanismus der intramolekularen Heck-Reaktion von 7
An die frei gewordene Koordinationsstelle von 7b lagert sich die olefinische Doppelbindung
als
η
2-Komplex an (Schema 13). In diesem Schritt liegt der Schlüssel für die beobachtete
hohe Stereoselektivität der intramolekularen Heck-Reaktionen. Zur Bildung eines
η
2-Kom-
plexes, aus der eine trans-Verknüpfung der Ringe resultieren würde, müßte sich das Palla-
dium in Schema 13 auf der unteren Seite der Cylohexen-Einheit befinden. In dieser Konfor-
mation liegt zwischen dem Metallatom und der Doppelbindung eine relativ große Distanz, so
daß die koordinative Bindung, sofern sie sich überhaupt ausbildet, nur sehr schwach ist. Im
Gegensatz dazu können sich das Palladium und das Olefin in der Konformation, die zu Kom-
plex 7c und damit zu einer cis-Verknüpfung der Ringe führt, sehr viel näher kommen. Die
beobachtete Diastereoselektivität der Reaktion ist in diesem Fall also auf kinetische Effekte
zurückzuführen, da sich der Komplex 7c schneller bildet als der, der zur trans-Verknüpfung
der Ringe führt.
O
O
O
Pd
OO
LBr
O
Pd
O
O
O
O
Br
L
trans-Verknüpfung cis-Verknüpfung
7b
7c
Schema 13: Stereoselektivität bei der intramolekularen Heck-Reaktion
Der nächste Schritt bei der Heck-Reaktion ist die Insertion der Doppelbindung in die Palla-
dium-Kohlenstoff
σ
-Bindung (Schema 14). Die Insertion erfolgt am substituierten Kohlen-
17
stoffatom der Doppelbindung, da sich dieses näher am Aromaten befindet. Das Palladium
wandert zum zweiten Kohlenstoffatom der Doppelbindung. Anschließend tritt ein Phosphin-
Molekül an die frei gewordene Koordinationsstelle des Metalls.
7c
O
O
O
O
O
Pd
L
Br L
+ L
- HBr
- PdL2
6
Schema 14: Insertion und reduktive Eliminierung
In einer
β
-Eliminierung wird ein Wasserstoffatom von der vormals allylischen Position
abstrahiert, was die formale Abspaltung von Bromwasserstoff und der katalytisch aktiven
Palladium-Spezies nach sich zieht und zur Bildung des Tricyclus 6 führt.
CH3NH2
Methanol
NaBH4
Methanol
O
N
O
O
O
16
6
(über alle Stufen)
84%
O
N
O
O
O
H
17
O
O
N
O
5
Schema 15: Bildung des Lactams 4
Die im Fall der intramolekularen Heck-Reaktion der Testsubstanz 14 beobachtete geringe
Diastereoselektivität ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß der unsubstituierte Cyclo-
hexenteil eine höhere konformative Flexibilität besitzt als das substituierte Olefin in 7, so daß
18
sich bei 14 zwischen den beiden intermediär auftretenden Komplexen (vgl. Schema 13) ein
Gleichgewicht einstellen kann, bevor der Insertionsschritt stattfindet (vgl. Schema 14).
In der nachfolgenden Umsetzung von 6 mit Methylamin reagierte die Aldehydgruppe zum
korrespondierenden Imin 16. In situ Reduktion dieser Schiff'schen Base mit Natriumborhy-
drid führte zum sekundären Amin 17, das bei der Aufarbeitung in acidem Milieu spontan zum
Lactam 5 cyclisierte (Schema 15). Das intermediär auftretende Amin 17 wurde zu Charakteri-
sierungszwecken isoliert.
Das primäre Zielmolekül 3-Methoxy-11-methyl-4a,5,9,10,11,12-hexahydro-6H-benzofuro
[3a,3,2-ef][2]benzazepin-10-on (5) läßt sich ausgehend von den kommerziell erhältlichen
Edukten Isovanillin (10) und 2-Methoxybenzoesäure (12) durch die entwickelte sechsstufige
Synthese in einer Gesamtausbeute von 6% synthetisieren. Die relativ geringe Effizienz dieser
Sequenz wird hauptsächlich durch die mäßigen Ausbeuten bei der Herstellung von 11 und 7
bedingt und läßt sich vermutlich durch eine weitere Optimierung der zu 7 führenden
Mitsunobu-Reaktion erhöhen. Die Synthese von 11 wurde bereits optimiert, die geringe Aus-
beute ist hier aber nicht so gravierend, da es sich um den ersten Schritt der Reaktionssequenz
handelt, der darüber hinaus auf einem relativ großen Maßstab durchgeführt werden kann.
3.2.2 Weitere Funktionalisierung der Peripherie
Im Verlauf dieser Promotionsarbeit wurde die Struktur des Torpedo Californica AChE/
Galanthamin-Komplexes röntgenographisch gelöst. Dabei hat sich gezeigt, daß die Hydroxyl-
Gruppe in Allylposition des Sechsrings eine starke Wasserstoffbrücken-Bindung mit einer
Seitenkette des Enzym eingeht (vgl. Abschnitt 4.1.6). Wird diese Hydroxyl-Gruppe chemisch
transformiert oder aus dem Molekül entfernt, so sinkt die Aktivität um etwa 4 Zehnerpoten-
zen. Da diese Hydroxyl-Gruppe demnach essentiell für die Wirkung des Alkaloids ist, ergibt
sich die Notwendigkeit, Untersuchungen zur Einführung eines Sauerstoffatoms in der allyli-
schen Position in 5 anzustellen.
Zunächst wurde versucht, eine oxidative Funktionalisierung der Allylposition im Tetracyclus
5 zu erreichen. Bei der Umsetzung von 5 mit einem in situ aus Chromtrioxid und 3,5-Dime-
thylpyrazol hergestellten Reagenz[58] konnte jedoch lediglich eine Spaltung des Lactams unter
gleichzeitiger Oxidation der benzylischen Position zum Aldehyd beobachtet werden (18,
Schema 16). Für benzylische und allylische Oxidationen mit Chrom-Reagenzien werden in
der Literatur ionische oder radikalische Reaktionsmechanismen diskutiert.[59]
19
O
O
O
N
O
H
5
CrO3, 3,5-Dimethylpyrazol
CH2Cl2, -20°C
18
Schema 16: Oxidation des Tetracyclus 4
Die beobachtete Spaltung des Lactams läßt sich darauf zurückführen, daß die Benzylposition
in 5 reaktiver als die Allylposition ist, da sich hier ein Radikal bzw. ein Carbenium-Ion aus-
bilden kann, das sowohl durch den aromatischen Ring als auch durch das Stickstoffatom des
Lactams stabilisiert wird.
Tabelle 2: Reagenzien für Oxidationsversuche an 6
Reagenz Referenz Beobachtungen
CrO3, 3,5-Dimethylpyrazol [58] kein Umsatz
SeO2[60] kein Umsatz
SeO2/tert.-Butylhydroperoxid [61] kein Umsatz
Pd(OAc)2/tert.-Butylhydroperoxid [62] kein Umsatz
Pd(OAc)2/MnO2/p-Benzochinon [63] kein Umsatz
CuBr/Perbenzoesäure [64] Zersetzung
Aufgrund dieser Beobachtung wurden weitere Oxidationsversuche ausgehend vom Tricyclus
6 durchgeführt. Die gewünschte Funktionalisierung von 6 konnte jedoch unter keiner der in
Tabelle 2 zusammengestellten Bedingungen erreicht werden.
R = CH2COOCH3
O
O
O
ROH
20
O
O
O
O
O
OH
19
+
6
1. NBS, AIBN, CCl4
2. AgOAc, Aceton
43% (über alle Stufen)
Schema 17: Funktionalisierung des Tricyclus 6
20
Die radikalische Bromierung mit N-Bromsuccinimid (NBS) ist eine weitere Methode, mit der
sich Allylpositionen funktionalisieren lassen.[60]
Die Reaktion von 6 mit NBS in Gegenwart eines Radikalstarters ergab einem chromatogra-
phisch nicht trennbaren Gemisch. Die Umsetzung dieses Gemischs mit Silberacetat führte zu
den regioisomeren Alkoholen 19 (25%) und 20 (18%), wobei 19 als Diastereomerengemisch
gebildet wurde, während 20 in einheitlicher Form entstand (Schema 17).
O
O
O
O
O
O
21
Dess-Martin Oxidation
90%
19
R = CH2COOCH3
O
O
O
RO
22
93%
20
Schema 18: Oxidation der Alkohole 19 und 20
Die relative Konfiguration von 20 konnte bisher nicht aufgeklärt werden. Es läßt sich nicht
zweifelsfrei entscheiden, ob die zu 20 führende Allylverschiebung im Sechsring bei der Bro-
mierung von 6 oder nachfolgend im nucleophilen Substitutionsschritt mit Silberacetat stattfin-
det. Die bromierten Zwischenstufen sowie die Alkohole 19 und 20 sind in Form bislang nicht
kristallisierbarer Öle angefallen, was die röntgenographische Aufklärung der Strukturen ver-
hinderte. Da sich an dieser Stelle eine eindeutige Charakterisierung der erhaltenen Verbin-
dungen als problematisch erwies, wurden die beiden Alkohole unter Dess-Martin Bedingun-
gen zu den α,β-ungesättigten Ketonen 21 und 22 umgesetzt, was zu besser interpretierbaren
Spektren führte (Schema 18).[65] Die Strukturen dieser Ketone konnten u.a. durch H,H-COSY
NMR-Spektren aufgeklärt werden.
21
In den erfolgreichen Synthesen von 5 und 21 zeigt sich, daß die entwickelte Strategie für die
Darstellung von Galanthamin (1) prinzipiell geeignet ist. Ein Syntheseplan ausgehend vom
Alkohol 19 ist in Schema 19 wiedergegeben.
O
OH
N
O
O
1
O
O
N
O
iii iv
19
O
OH
N
O
iii
Schema 19: Syntheseplan für Galanthamin (1) (i: 1. CH3NH2, 2. NaBH4, ii: LiAlH4,
iii: Dess-Martin Reagens; iv: L-Selectrid®)
Der erste Schritt besteht in der reduktiven Aminierung von 19, wobei sich ein zu 5 analoges
tetracyclisches Lactam bilden sollte. Dieses kann im Anschluß daran durch Behandlung mit
Lithiumaluminiumhydrid in ein Amin übergeführt werden (Schritt ii). Die Reduktion von
Amiden/Lactamen gehört zu den Standardreaktionen zur Herstellung von Aminen, was sich
an zahlreichen literaturbekannten Beispiele zeigt.[66,67,68,69] Sollte es nicht gelingen, die diaste-
reomeren Alkohole auf einer dieser Stufen zu trennen, so ist es notwendig, den Allylalkohol
zunächst in Analogie zu 21 zum α,β-ungesättigten Keton zu oxidieren (Schritt iii). Bei dieser
Verbindung handelt es sich um das Amaryllidaceae Alkaloid Narwedin, das in der Totalsyn-
these von Galanthamin (1) als Zwischenprodukt auftritt und sich durch sterisch anspruchs-
volle Hydridüberträger diastereoselektiv zu 1 reduzieren läßt (Schritt iv).[36,38,37]
Die hier dargestellte Sequenz führt zu racemischem Galanthamin. Prinzipiell können die
Enantiomere auf der Stufe des Narwedins durch eine asymmetrische Transformation ineinan-
der überführt werden.[70] Dieser Schritt läßt sich bei dem entwickelten Verfahren jedoch mög-
licherweise umgehen, wenn man den Allylalkohol 9 in enantiomerenreiner Form einsetzt.
Eine Möglichkeit zur enantioselektiven Reduktion von 11 besteht in dem von Corey et al. ent-
wickelten Verfahren, bei dem chirale Oxazaborolidin-Katalysatoren die stereochemische
Information übertragen.[71,72] Die Reaktionen, die dem weiteren Gerüstaufbau dienen, verlau-
22
fen mit hoher Stereoselektivität. Für die Mitsunobu-Reaktion, bei der der Ether 7 gebildet
wird, ist bekannt, daß sie streng nach einem SN2-Mechanismus verläuft.[73] Für die Heck-
Reaktion, die zum Tricyclus 6 führt, konnte ein stereoselektiver Ablauf nachgewiesen
werden.
Das Keton 22 besitzt ein großes Potential im Hinblick auf die Synthese neuer Galanthamin-
Derivate. Ausgehend von 20 sollte es möglich sein, das tetracyclische Grundgerüst in
Analogie zu dem in Schema 19 dargestellten Weg durchzuführen (Schema 20).
O
O
O
N
20
Schema 20: Synthese von Galanthamin-Derivaten ausgehend von 20
Das so gewonnene α,β-ungesättigte Keton kann dann einer Vielzahl von chemischen Trans-
formationen unterworfen werden, wobei z.B. Epoxidierung, Michael-Reaktionen oder Diels-
Alder-Reaktionen in Frage kommen. Die Synthese optisch reiner Derivate ist unter dem
Aspekt der zuvor bezüglich der Synthese des Galanthamins (1) gemachten Aussagen ebenfalls
denkbar.
3.2.3 Variation der Größe des D-Rings
Die Wahl des Elektrophils bei der alkylierenden Birch-Reduktion (Schema 10) bestimmt die
Größe des D-Rings im Endprodukt. Um den D-Ring um eine Methylengruppe zu erweitern,
wurde diese Reaktion mit 3-Brompropionsäureethylester durchgeführt (Schema 21).
12
28%
1. Na, fl. NH3, -78°C
2. BrCH2CH2COOCH2CH3
O
O
O
23
Schema 21: Alkylierende Birch-Reduktion von 12
23
Das α,β-ungesättigte Keton 23 ließ sich in 3 Stufen (Reduktion: 23a, Mitsunobu-Reaktion:
23b, Heck-Kupplung: 23c) in den Tricyclus 24 überführen (Schema 22).
1. NaBH4, CeCl3∗7 H2O, CH3OH/THF
2. 8, DEAD, PPh3, Toluol
3. Pd(PPh3)4, K2CO3, Toluol
32% (über alle Stufen)
23
O
O
O
O
O
24
Schema 22: Synthese des Tricyclus 24
Reduktive Aminierung von 24 mit Methylamin und Natriumborhydrid führte bei Aufar-
beitung im sauren Milieu direkt zum tetracyclischen Lactam 25 (Schema 23).
24
1. CH3NH2, CH3OH
2. NaBH4, CH3OH
78%
25
O
NO
O
Schema 23: Reduktive Aminierung von 24 und Ringschluß
Damit konnte gezeigt werden, daß sich die entwickelte Synthesestrategie prinzipiell zur
Vergrößerung des D-Rings eignet.
3.2.4 Versuche zur Variation des Substitutionsmusters des C-Rings
Zu Beginn der präparativen Arbeiten war versucht worden, α,β-ungesättigte Ketone vom Typ
11 auf zwei verschiedenen Wegen herzustellen. Die alkylierende Birch-Reduktion führte hier
als erste zu Erfolgen (s.o.). Bei einer alternativen Route wurde 1,3-Cyclohexandion (26)
durch Natriummethanolat deprotoniert und mit Bromessigsäuremethylester umgesetzt. Die re-
lativ geringe Ausbeute an dem C-alkylierten Produkt 27 ist dadurch zu erklären, daß bei die-
ser Reaktion eine große Menge des O-alkylierten Produkts entsteht.[74] Die vinyloge
Carbonsäure 27 wurde anschließend mit Diazomethan verestert, was zu Verbindung 28 führte
(Schema 24).[51]
24
O
O
OO
O
O
26
1. NaOCH3, CH3OH
2. BrCH2COOCH3
38%
CH2N2
Et2O
81%
28
OH
O
O
O
27
Schema 24: Alternative Route zum Aufbau des C-Rings von 1
Durch Umsetzung des vinylogen Esters 28 bei –78°C mit Methylmagnesiumbromid konnte
nach saurer Aufarbeitung das α,β-ungesättigte Keton 29 erhalten werden, das sich von 11
durch eine Methylgruppe in β-Stellung unterscheidet (Schema 25).
O
O
O
29
28
CH3MgBr
Et2O, -78°C
53%
Schema 25: Alkylierung des vinylogen Esters 28
Diese Sequenz läßt sich prinzipiell zur Synthese von Galanthamin-Derivaten nutzen, deren C-
Ring substituiert ist.
Eine weitere denkbare Anwendung besteht in der Herstellung von Derivaten, die sich in der
Größe des C-Rings von der Leitstruktur unterscheiden, was z.B. durch den Einsatz von 1,3-
Cycloheptandion anstelle von 26 in Schema 24 möglich ist.
25
3.3 Zusammenfassung – Präparativer Teil
Im präparativen Teil dieser Promotionsarbeit konnte eine neue Synthesestrategie für
Galanthamin (1) entwickelt werden, die als Schlüsselschritt eine intramolekulare Heck-Reak-
tion beinhaltet. Diese Reaktion verläuft hoch stereoselektiv, was sich röntgenographisch an ei-
nem Einkristall der Zwischenstufe 6 nachweisen ließ. Die vorgestellte Sequenz ist sehr flexi-
bel und gibt viele Ansatzpunkte für die Synthese neuer Galanthamin-Derivate, die über den
„klassischen“ Weg (oxidative Phenolkupplung) nicht oder nur mit hohem präparativen Auf-
wand zugänglich sind. So ließ sich auf diesem Weg bereits eine weitere Methylengruppe in
den D-Ring des Galanthamin-Gerüsts einführen (25). Darüber hinaus besteht die Möglichkeit,
die Produkte in optisch reiner Form zu erhalten, wenn der Allylalkohol vom Typ 9 enantiome-
renrein eingesetzt wird.
26
4 Molecular Modeling Teil – Allgemeine Vorbemerkungen
Der therapeutische Effekt eines Medikaments beruht auf Wechselwirkungen des verabreich-
ten Wirkstoffs mit spezifischen biologischen Makromolekülen im Körper, wie beispielsweise
der gezielten Inhibition eines Enzyms. Demgegenüber gehen die häufig beobachteten Neben-
wirkungen auf unspezifische Wechselwirkungen innerhalb des Organismus zurück. Ziel beim
rationalen Design von Wirkstoffen ist es, die gewünschte Eigenschaft einer Verbindung zu
optimieren und gleichzeitig die unerwünschten Nebenwirkungen zu minimieren.
Häufig geht man bei der Entwicklung von Wirkstoffen von zuvor identifizierten Leitstruk-
turen mit bekannten pharmakologischen Profilen aus. Traditionell stehen dabei die Synthesen
von Derivaten dieser Leitstrukturen gefolgt von ihrer Evaluierung in geeigneten Testsystemen
(in vitro oder in vivo) im Vordergrund. Die manuelle Analyse der mit Modifikationen der
Leitstruktur einhergehenden Wirksamkeitsänderungen (Struktur-Wirkungs-Beziehungen)
kann zur Identifizierung essentieller funktioneller Gruppen und somit zur Aufstellung von
Pharmakophorhypothesen führen. Mit zunehmender konformativer Flexibilität der betrachte-
ten Substanzen sowie auch ganz allgemein bei größeren Datensätzen ist es jedoch häufig nicht
möglich, pharmakophore Fixpunkte intuitiv auszumachen.
Bei modernen Strategien zur Neu- und Weiterentwicklung von Medikamenten kommen an
dieser Stelle rechnerbasierte Verfahren zum Einsatz. Sie erlauben beispielsweise genaue Un-
tersuchungen zur konformativen Flexibilität der potentiellen Wirkstoffe. Vorteilhaft, wenn
auch nicht notwendig, ist die Kenntnis der räumlichen Struktur des Zielproteins. Durch den
Einsatz entsprechender Programme besteht in solchen Fällen die Möglichkeit, die spezifi-
schen Wechselwirkungen zwischen dem Protein und den potentiellen Wirkstoffen auf mole-
kularer Ebene zu analysieren. Mit Hilfe der gewonnenen Erkenntnisse können Erklärungen
für die gemessenen biologischen Aktivitätswerte abgeleitet werden. Auf diese Weise lassen
sich die Struktur-Wirkungs-Beziehungen in sog. QSAR-Modellen (engl.: Quantitative
Structure Activity Relationship) quantifizieren, die zur Vorhersage der Aktivitäten neuer
Derivate dienen, bevor diese synthetisiert bzw. getestet worden sind.[75]
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene rechnerbasierte Verfahren zur
Analyse der anti-AChE-Aktivität von Galanthamin-Derivaten mit dem Ziel der Aufstellung
und Validierung von QSAR-Modellen eingesetzt, um so Beiträge zur Entwicklung neuer
Galanthamin-basierter AChE-Hemmer mit verbessertem Wirkungsprofil zu leisten.
27
4.1 Docking-Studie
Zunächst wurden die Wechselwirkungen zwischen der Leitstruktur Galanthamin und dem
Enzym durch simuliertes Docken untersucht. Dies dient der Ermittlung der verschiedenen
Bindungsmöglichkeiten des Inhibitors innerhalb der AChE. Zu diesem Zweck gibt es eine
Reihe von Programmen, zu denen Dock[76], CAVEAT[77], FlexX[78], Hammerhead[79],
Builder[80], MSMC[81], QXP[82] und AutoDock[83,84] gehören. In dieser Arbeit wurde das Pro-
gramm AutoDock verwendet. Im Regelfall liefert AutoDock mehrere Vorschläge für günstige
Enzym/Inhibitor-Anordnungen. Verfeinerte Energieberechnungen sollten im Anschluß an das
Docking die Anzahl möglicher Bindungsmodi auf eine einzelne Konformation und Orientie-
rung des Alkaloids reduzieren, die der aktiven Konformation des Galanthamins entspricht.
Die erarbeitete Methodik wurde dann im nächsten Schritt auf eine Datenbank aus Derivaten
der Leitstruktur übertragen. Auch hier will man die Vielzahl aller möglichen Konformationen,
die jede Verbindung des Datensatzes einnehmen kann, auf je einen individuellen Repräsen-
tanten einschränken, der optimal mit dem Enzym in Wechselwirkung treten kann. Man stellt
also für jede Verbindung des Datensatzes eine sinnvolle Hypothese für die aktive Konforma-
tion auf.
4.1.1 Struktur der Acetylcholinesterase
Die biologische Aufgabe der AChE besteht in der Terminierung der chemischen Reizüber-
tragung in cholinergen Synapsen durch Spaltung des Neurotransmitters Acetylcholin (vgl.
Abschnitt 1).[19] In der letzten Dekade konnten die Strukturen der AChEs unterschiedlicher
Spezies röntgenographisch aufgeklärt werden (Tabelle A1, Anhang). In einigen Fällen gelang
es dabei zusätzlich die Lagen und Orientierungen „kleiner“ organischer Verbindungen (z.B.
Inhibitoren) innerhalb des Enzymkristalls zu erfassen, so daß sich Aussagen über spezifische
Wechselwirkungen zwischen den beiden Molekülen sowie über die konformative Flexibilität
des Enzyms treffen lassen. Die AChE des Zitterrochens der Gattung Torpedo Californica
(TcAChE) ist das derzeit am besten untersuchte Enzym in dieser Gruppe, was sich in der
großen Anzahl publizierter Enzymstrukturen dieser Spezies im Vergleich zu anderen (Mus
Musculus, Electrophorus Electricus) widerspiegelt. Aus diesem Grund werden die nachfol-
genden Betrachtungen auf TcAChE beschränkt.
Die TcAChE-Röntgenstrukturen lassen sich in vier Gruppen unterteilen (Tabelle 3). Die erste
Gruppe beinhaltet die Strukturen, bei denen das reine Enzym kristallisiert wurde. Die Struktur
28
2ACE ist zugleich die älteste aller bekannten TcAChE-Strukturen. Die übrigen Vertreter die-
ser Gruppe stammen aus einer Studie, bei der die Folgen der Einwirkung von Synchrotron-
strahlung auf den Enzym-Einkristall untersucht worden ist. Allen Enzym/Molekül-
Komplexen (Gruppe 2 und Gruppe 3) ist gemeinsam, daß die organische Verbindung jeweils
im Bereich des aktiven Zentrums der TcAChE lokalisiert ist. Bei Gruppe 3 (kovalent gebun-
dene Inhibitoren) erfolgt die Bindung über die Hydroxylgruppe der Aminosäure Serin 200.
Diese Gruppe läßt sich weiter unterteilen, da das Serin 200 bei den Strukturen 1VXR, 1VXO,
1SOM, 1CFJ und 2DFP phosphoryliert ist, wohingegen bei 1OCE und 1AMN organische
Moleküle an die Hydroxylgruppe dieser Aminosäure gebunden sind. Die vierte Gruppe be-
steht aus nur einer Struktur, bei der die TcAChE zusammen mit dem aus 61 Aminosäuren auf-
gebauten Toxin Fasciculin co-kristallisiert wurde (1FSS). Das Toxin bindet nicht im Bereich
des aktiven Zentrums.
Tabelle 3: Klassifizierung der TcAChE-Röntgenstrukturen
Gruppe Strukturen
Freies Enzym 2ACE, 1QID, 1QIE, 1QIF, 1QIG,
1QIH, 1QII, 1QIJ, 1QIK, 1QIM,
Enzym-Molekül-Komplex ohne kovalente Bindung 1ACJ, 1ACL, 1AX9, 2ACK, 1EVE,
1VOT, 1DX6, 1QTI
Enzym/Molekül-Komplex mit kovalenter Bindung 1VXR, 1VXO, 1SOM, 1CFJ, 2DFP,
1OCE, 1AMN
Enzym-Protein-Komplex 1FSS
Das monomere Enzym besitzt eine elipsoide Form mit den ungefähren Ausdehnungen 45 Å,
60 Å und 65 Å und gehört zur Familie der Serin-Proteasen. Die Seitenketten der Aminosäuren
Serin, Glutaminsäure und Histidin (Serin 200, Glutaminsäure 327 und Histidin 440 bei
TcAChE) bewirken die Substratumsetzung und bilden die sog. katalytische Triade. Die be-
merkenswert hohe Substratspezifität der AChE ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß sich
das aktive Zentrum des Enzyms ca. 20 Å tief unterhalb der Enzymoberfläche befindet, mit der
es über einen engen Schlauch verbunden ist. Dieser Schlauch besitzt einen hydrophoben Cha-
rakter, da er im wesentlichen aus Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten gebildet wird.
Obwohl das katalytische Zentrum der AChE tief im Molekül verborgen ist, operiert das
Enzym mit einer außergewöhnlich hohen Aktivität, nahe der einer diffusionskontrollierten
Reaktion.[85]
29
4.1.2 Analyse der konformativen Flexibilität der TcAChE
Aus biochemischen Untersuchungen geht hervor, daß es sich bei Galanthamin um einen re-
versiblen, kompetitiven Inhibitor der AChE handelt.[25] Als Arbeitshypothese wurde daher an-
genommen, daß das Alkaloid seine Bindung über nicht-kovalente Wechselwirkungen im Be-
reich des aktiven Zentrums bzw. in dessen unmittelbarer Nähe innerhalb des dorthin führen-
den Schlauchs ausübt. Demzufolge erschien eine Einschränkung der Betrachtungen zur kon-
formativen Flexibilität des Enzyms auf die Aminosäuren sinnvoll, aus denen diese Region
aufgebaut ist (Tabelle A2, Anhang). Für die weiteren Betrachtungen wurden nur solche Rönt-
genstrukturen mit eingelagerten organischen Verbindungen berücksichtigt, bei denen sich
Teile des Moleküls im Bereich des aktiven Zentrums bzw. im Schlauch befinden (1ACJ,
1ACL, 1AX9, 2ACK, 1EVE, 1VOT, 1DX6, 1QTI, 1OCE und 1AMN).
Tablle 4: RMSD-Werte der Enzymkonformationen zur Templatstruktur 2ACE
PDB-ID RMSD1 [Å] RMSD2 [Å] PDB-ID RMSD1 [Å] RMSD2 [Å]
1DX6 0.37 0.43 1OCE 0.44 0.45
1ACL 0.62 0.66 1VOT 0.50 0.43
1ACJ 0.53 0.63 1QTI 0.39 0.43
1AMN 0.66 0.66 2ACK 0.48 0.54
1AX9 0.52 0.58 1EVE 0.51 0.55
1ohne Phenylalanin 330, 2mit Phenylalanin 330
Die Konformationsanalyse erfolgte durch Übereinanderlegen der einzelnen TcAChE-Kristall-
strukturen anhand des gemeinsamen Peptidgerüsts der ausgewählten Aminosäuren. Eine visu-
elle Inspektion der übereinandergelegten Strukturen zeigte dabei, daß die Lagen der Seiten-
ketten in den Komplexen der TcAChE trotz der Einlagerung der chemisch sehr unterschied-
lichen „kleinen“ organischen Verbindungen weitgehend konserviert sind. Die gravierendste
Ausnahme bildet das Phenylalanin 330, dessen aromatischer Ring seine Position sehr stark in
Abhängigkeit von der jeweils co-kristallisierten Verbindung ändert. Um die Ähnlichkeit der
Enzymkonformationen zu quantifizieren, wurden die RMSD-Werte (Glossar) der Seitenketten
der ausgewählten Aminosäuren einmal ohne und einmal mit Berücksichtigung von Phenylala-
nin 330 berechnet (Tabelle 4). Dabei diente die Struktur des reinen Proteins 2ACE als
Templat. Alle RMS-Abweichungen liegen im Bereich von etwa 0.5 Å, was im Einklang mit
30
der vorangegangenen visuellen Inspektion steht. Bei fast allen Strukturen verschlechtert sich
der Wert, wenn Phenylalanin 330 mit einbezogen wird.
Die konformative Flexibilität von Phenylalanin 330 läßt eine Differenzierung der einzelnen
Strukturen in drei Gruppen zu. Zur Verdeutlichung dieser Klassifizierung wurde eine
Connolly-Oberfläche (in oranger Farbe dargestellt, Glossar) um je einen Repräsentanten der
drei Konformationsklassen generiert und entlang einer gedachten Achse vom Fuß des aktiven
Zentrums zur Öffnung des Schlauchs (etwa in der Mitte der Grafiken) aufgeschnitten
(Abbildung 5).
N
NH2
OH
N
+
N
O
O
O
I: 1ACJ (Tacrin) II: 2ACK (Edrophonium) III: 1EVE (E2020, Donapecil)
Abbildung 5: Klassifizierung der Enzymkonformationen über die Lage von
Phenylalanin 330
Die Aminosäure Tyrosin 121 (jeweils linke Abbildungsseite) bildet zusammen mit Phenyl-
alanin 330 (jeweils rechte Abbildungsseite) ein Portal, welches sich am unteren Ende des
Schlauchs direkt oberhalb des aktiven Zentrums befindet. In Konformationsklasse I (1ACJ)
ist dieses Portal geschlossen, was an der dortigen Einschnürung der Conolly-Oberfläche deut-
lich zu erkennen ist. Dadurch wird der Inhibitor Tacrin im aktiven Zentrum praktisch einge-
schlossen. Demgegenüber ist das Portal in Konformationsklasse III (1EVE, 1ACL, 1DX6,
1QTI, 1OCE) weit geöffnet. Bei der co-kristallisierten Verbindung handelt es sich in diesem
Beispiel (1EVE) um E2020 (Donapecil). Molekülteile dieses Inhibitors treten mit verschiede-
nen Aminosäuren im Bereich des Schlauchs in Wechselwirkung, so daß dieser nicht von der
31
Seitenkette des Phenylalanin 330 verschlossen werden kann. Im Repräsentant der Konforma-
tionsklasse II (2ACK) bewirkt das Edrophonium, daß der Schlauch teilweise geöffnet bleibt,
d.h. die Lage von Phenylalanin 330 befindet sich hier zwischen den beiden Extrempunkten
(weitere Strukturen dieser Klasse: 1AX9, 1VOT, 1AMN).
4.1.3 Beschreibung der Arbeitsweise von AutoDock
Für die Bestimmung potentieller Bindungsmöglichkeiten von Galanthamin innerhalb der
TcAChE wurde das Programm AutoDock (Version 2.4) verwendet.[83]
Zur Berechnung der Wechselwirkungsenergie zwischen dem Enzym und einer Inhibitorkon-
formation nutzt AutoDock vorab generierte Affinitätspotentiale. Bei der TcAChE definieren
die ausgewählten 43 Aminosäuren (Tabelle A2, Anhang) den Bereich, der auf Bindungsmög-
lichkeiten für Galanthamin untersucht werden soll. Um diese Region weiträumig einzufassen,
wurde der Mittelpunkt eines Gitternetzes mit den äußeren Abmessungen 22.5 Å x 22.5 Å x
22.5 Å und einer Maschenweite von 0.375 Å in das Zentrum dieser Gruppe von Aminosäuren
gelegt (Abbildung 6).
Gesamtansicht Aufsicht Seitenansicht
Abbildung 6: Definition des interessierenden Enzymbereichs (Würfel)
Innerhalb dieser Abgrenzungen werden über das Lennard-Jones-Potential die van-der-Waals-
Wechselwirkungsenergien zwischen dem gesamten Enzym und den im Galanthamin vorkom-
menden Atomtypen Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Wasserstoff separat an jedem Git-
terpunkt berechnet. Zur Erfassung der elektrostatischen Eigenschaften des Enzyms wird nach-
einander an jeden Gitterpunkt eine positive Punktladung gesetzt und die resultierende Wech-
selwirkungsenergie gemäß dem Coulomb-Potential berechnet. Auf diese Weise erzeugt man
32
ein Abbild des Teils des Enzyms, welches für das eigentliche Docken verwendet wird. Als
Konsequenz dieses Ansatzes wird das Protein in seiner Konformation eingefroren.
Das eigentliche Docken erfolgt durch inkrementelle Translation und Rotation der Galantha-
min-Struktur innerhalb des Gitters. Die Größen zuvor spezifizierter Torsionswinkel des Inhi-
bitors werden dabei ebenfalls geändert. Dadurch erhält man einen neuen Enzym/Inhibitor-
Komplex, der sich in seiner Struktur vom vorangegangenen unterscheidet. AutoDock stellt bei
dieser Prozedur sicher, daß alle Atome des Inhibitors innerhalb der Grenzen des Gitternetzes
bleiben. Die Verwendung von Affinitätspotentialen erlaubt die sehr schnelle Berechnung der
intermolekularen Energie einer neuen Anordung beider Moleküle. Ist die Energie der neuen
(E2) kleiner als die der alten (E1), so wird der neue Komplex beibehalten. Im umgekehrten
Fall kommt bei Programmversion 2.4 der Prozeß des Monte Carlo Simulated Annealing zum
Einsatz. Dazu wird zunächst der Boltzmann-Faktor P(
∆
E) gemäß folgender Beziehung
berechnet (kb: Boltzmann-Konstante, T: Temperatur):
Tk
EE
b
eEP ⋅
−
=∆
21
)(
Der Boltzmann-Faktor P(
∆
E) wird mit einer Zufallszahl zwischen 0 und 1 verglichen. Ist
P(
∆
E) größer als die Zufallszahl, so wird der neue Enzym/Inhibitor-Komplex trotz seiner hö-
heren Energie beibehalten, anderenfalls wird er verworfen. Beim Simulated Annealing ist die
Temperatur zunächst hoch und wird im Verlauf der Simulation reduziert. Da sich der Wert
des Boltzmann-Faktors mit abnehmender Temperatur dem unteren Grenzwert annähert, die
Zufallszahl hingegen eine gleichmäßige Verteilung zwischen 0 und 1 hat, nimmt im Verlauf
der Simulation die Wahrscheinlichkeit ab, daß ein Komplex mit höherer Energie beibehalten
wird. Der Hintergrund dieser Strategie ist, daß dem System aus Enzym und Inhibitor zu
Beginn des Dockens mehr Möglichkeiten zur Überschreitung von hohen Energiebarrieren
gegeben werden soll, als im späteren Verlauf der Simulation. Zu Beginn führt man eine eher
globale Suche durch, bei der der Inhibitor seine Position relativ zum Protein stark verändern
kann. Im weiteren Verlauf geht die globale immer mehr in eine lokale Suche über, bei der das
zu dockende Molekül seine grobe Lage innerhalb des Enzyms beibehält und sich immer
besser anpaßt.
In der Regel führt man mehrere Simulationen unabhängig voneinander durch und erhält so am
Ende jedes Laufs eine günstigste Inhibitor-Konformation. Bei einer großen Anzahl von
Läufen ist es sehr wahrscheinlich, daß das Programm bestimmte Enzym/Inhibitor-Komplexe
mehrfach findet. Daher wird auf die Ergebnisse mehrerer Läufe eine Cluster-Analyse ange-
33
wendet, die die aufgefundenen Inhibitor-Konformationen unter Berücksichtigung von
Energie- und Strukturkriterien gruppiert und für jede Gruppe einen Repräsentanten liefert.
Die Repräsentanten werden abschließend nach steigender Energie geordnet. Das Ergebnis
einer AutoDock-Rechnung besteht also in mehreren Vorschlägen für mögliche Bindungsmodi
des Inhibitors.
4.1.4 Vorbereitung des Dockens von Galanthamin in TcAChE
Zu Beginn dieser Arbeit standen die Koordinaten des TcAChE/Galanthamin-Komplexes noch
nicht zur Verfügung, so daß sich zu diesem Zeitpunkt keine Aussagen über die Lage von Phe-
nylalanin 330 treffen ließen. Da AutoDock keinerlei Flexibilität in der Enzymstruktur berück-
sichtigt, war es wegen der beobachteten Beweglichkeit von Phenylalanin 330 notwendig, die
nachfolgenden Untersuchungen an Vertretern aller Konformationsklassen des Enzyms unab-
hängig voneinander durchzuführen (Klasse I: 1ACL, Klasse II; 2ACK, Klasse III: 1ACL).
Aus jeder der drei Enzymstrukturen wurden zunächst alle Atome außer dem Peptidgerüst und
den Seitenketten entfernt. Dies schließt die kristallographisch erfaßten Wassermoleküle ein.
Wassermoleküle können in Wasserstoffbrücken-Bindungen als Donatoren und Akzeptoren
agieren und somit in vielen Fällen die Wechselwirkungen zwischen Enzym und Inhibitor
stark beeinflussen. Trotzdem erschien es nicht sinnvoll, Wassermoleküle bei der Docking-
Studie mit einzubeziehen, da sich a priori keine genauen Aussagen über deren Lagen treffen
lassen, wenn keine Röntgenstruktur des entsprechenden Komplexes bekannt ist. Es kann auch
nicht davon ausgegangen werden, daß die Positionen des Wassers innerhalb des Proteins bei
unterschiedlichen Inhibitoren erhalten bleiben.
Im nächsten Schritt werden unvollständig erfaßte Aminosäuren unter Beibehaltung der be-
kannten Seitenkettentorsionswinkel ersetzt. Die Proteine werden anschließend mit Wasser-
stoffatomen versehen und jeweils in einer dreistufigen Geometrieoptimierung unter schritt-
weiser Erhöhung des Flexibilitätsgrads relaxiert. Die resultierenden Strukturen bilden die
Grundlage für das Docken mit AutoDock.
Das tetracyclische Grundgerüst von Galanthamin weist im Bereich des Cyclohexenol-Teils
und des Siebenrings konformative Flexibilitäten auf, die nicht vernachlässigt werden dürfen.
Die Variationsmöglichkeiten, die AutoDock im Hinblick auf den Inhibitor bietet, sind jedoch
auf frei drehbare Torsionswinkel beschränkt. Deshalb wurden für das Docken die Ringkonfor-
mationen aus der Röntgenstruktur des Alkaloids herangezogen.[86]
34
Abbildung 7: Axiale und equatoriale Stellung der N-Methylgruppe in Galanthamin
Die N-Methylgruppe des Siebenrings kann eine axiale oder eine equatoriale Stellung einneh-
men (Abbildung 7). Aufgrund der bei Raumtemperatur schnell stattfindenden Inversion von
Aminen lassen sich diese beiden Konformationen normalerweise nicht unterscheiden.
AutoDock bietet jedoch keine Möglichkeit zur Änderung von Ringkonformationen, so daß
das Programm während des Dockens zwischen axialer und equatorialer Stellung der Methyl-
gruppe differenziert. Daher ist es notwendig, zwei sich in der Stellung der Methylgruppe un-
terscheidende Galanthamin-Konformationen unabhängig voneinander zu betrachten.
4.1.5 Durchführung
In jede der drei Enzymstrukturen wurden jeweils beide Galanthamin-Konformationen gedockt
(500 AutoDock-Läufe). Die Ausgangslage des Alkaloids spielt dabei prinzipiell keine Rolle,
da AutoDock den Inhibitor vor dem ersten Docken an eine zufällig gewählte Position
innerhalb des Gitters bewegt.
Nach dem Docken wurden die vorgeschlagenen TcAChE/Galanthamin-Komplexe einer wei-
teren Energieoptimierung mit dem Tripos-Kraftfeld (SYBYL 6.6[87]) unterzogen. Dabei gibt
man den 43 zuvor definierten Aminosäuren die Möglichkeit, sich unter dem Einfluß des Inhi-
bitors zu bewegen, wohingegen der übrige Teil des Enzyms starr gehalten wird. Dieser
zusätzliche Schritt ist sinnvoll, da sich die beiden Moleküle so interaktiv aneinander anpassen
können (verfeinerte lokale Suche, Induced Fit). Ein weiterer Grund für diese Vorgehensweise
liegt in der stark eingeschränkten Parameterisierung von AutoDock. Während das Programm
für Kohlenstoff, Stickstoff und Sauerstoff jeweils nur einen Parametersatz bereithält, ist das
Tripos-Kraftfeld in der Lage, beispielsweise beim Kohlenstoff je nach Hybridisierung und
funktioneller Gruppe zwischen vier verschiedenen Atomtypen zu unterscheiden. Daher ist zu
erwarten, daß die Qualität der so berechneten Wechselwirkungsenergien die der aus
AutoDock stammenden übertrifft. Die verschiedenen, von AutoDock vorgeschlagenen
Enzym/Inhibitor-Komplexe wurden anhand der nach der Feinoptimierung mit SYBYL erhal-
35
tenen Energien neu sortiert. Dazu wurde die Bindungsenthalpie
∆
H nach folgender Gleichung
berechnet, worin sich E(Enzym/Inhibitor) auf die Gesamtenergie des Enzym/ Inhibitor-
Komplexes, E(Enzym) und E(Inhibitor) auf das isolierte Enzym bzw. auf den isolierten
Inhibitor bezieht:
[]
)()()/( InhibitorEEnzymEInhibitorEnzymEH +−=∆
4.1.6 Beschreibung der Röntgenstruktur des TcAChE/Galanthamin-Komplexes
Im Verlauf dieser Studie ist die Struktur des TcAChE/Galanthamin-Komplexes röntgenogra-
phisch aufgeklärt worden (PDB-Einträge 1QTI und 1DX6). Der TcAChE/Galanthamin-
Komplex gehört zur Konformationsklasse III (Abbildung m1), da in beiden Röntgenstruktu-
ren übereinstimmend gefunden wird, daß das Portal geöffnet ist. Die Lagen der übrigen
42 Aminosäuren sind konform mit der eingangs durchgeführten Konformationsanalyse
(Tabelle 3).
Die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Galanthamin und der AChE zeigt, daß es zur
Ausbildung einer starken Wasserstoff-Brückenbindung zwischen der Hydroxylgruppe des In-
hibitors und der Carboxylgruppe von Glutaminsäure 199 (2.7 Å) kommt (Abbildung 8).
Glutaminsäure 199
Serin 200
Alanin 201
Glycin 119
Glycin 118
Wasser
2.7 Å
3.1 Å
Abbildung 8: Bindung des Galanthamins in TcAChE (Wasserstoffbrücken)
Eine weitere Wasserstoffbrücke befindet sich zwischen dem Sauerstoffatom des B-Rings von
Galanthamin und einem Wassermolekül (3.1 Å), welches durch die Hydroxylgruppe von
36
Serin 200 und den drei NH-Gruppen von Glycin 118 (2.5 Å), Glycin 119 (3.2 Å) und Alanin
201 (3.1 Å) an seiner Position fixiert wird. Hier zeigt sich eine Schwäche bei der Vorberei-
tung der Enzymstrukturen zum Docken, da alle Wassermoleküle zu Beginn entfernt werden
mußten.
Phenylalanin 290 Phenylalanin 331
Phenylalanin 288
Tryptophan 84
3.5 Å
3.2 Å 3.7 Å
3.5 Å
Abbildung 9: Bindung des Galanthamins in TcAChE (hydrophobe Kontakte)
Der Cyclohexenring und die beiden benachbarten Methylengruppen des D-Rings liegen paral-
lel zum Indolring von Tryptophan 84. Die Doppelbindung kann dabei in π-π Wechselwirkun-
gen mit dem aromatischen System dieser Aminosäure treten (dichtester Abstand: 3.5 Å). Die
Methylgruppe des Galanthamins befindet sich in unmittelbarer Nähe der aromatischen Ringe
von Phenylalanin 288 (dichtester Abstand: 3.2 Å), Phenylalanin 290 (dichtester Abstand:
3.5 Å) und Phenylalanin 331 (dichtester Abstand: 3.7 Å), was auf nicht-kovalente σ-π
Wechselwirkungen hindeutet (Abbildung 9).[88]
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß der Galanthamin-Grundkörper im Bereich der
katalytischen Triade verankert ist. Die N-Methylgruppe des Siebenrings weist zur Öffnung
des Schlauchs.
Die Kenntnis dieser Struktur erlaubte einen direkten Vergleich der Ergebnisse der Docking-
Simulation mit der Realität. Die Abweichungen der einzelnen AutoDock-Ergebnisse zur Lage
des Galanthamins im TcAChE/Galanthamin-Komplex können durch Berechnung der RMSD-
Werte quantifiziert werden.
37
4.1.7 Ergebnisse und Diskussion
Die unabhängig für jede Konformationsklasse der TcAChE durchgeführten Simulationen er-
gaben ein ähnliches Bild bezüglich der ermittelten Bindungsmodi für Galanthamin. AutoDock
plazierte den Inhibitor häufig im oberen Bereich des Schlauchs. In einem Teil der vorge-
schlagenen Komplexe hingegen befand sich das Alkaloid im unteren Teil in der Nähe der
katalytischen Triade (Abbildung 10).
Bindung im oberen Schlauchbereich Bindung im unteren Schlauchbereich
Abbildung 10: Bindungsmodi von Galanthamin in der TcAChE
Auf der Grundlage der eingangs gemachten Einschränkung, daß Galanthamin im Bereich der
katalytischen Triade des Enzyms binden soll, wurden die im oberen Schlauchbereich gefunde-
nen Vorschläge nicht weiter betrachtet. Die Röntgenstruktur des TcAChE/Galanthamin-Kom-
plexes bestätigt die Richtigkeit dieser Arbeitshypothese. Es zeigt sich auch, daß die zum
Docken genutzte Galanthamin-Struktur konformativ (Cylclohexenol-Teil und Siebenring)
weitgehend mit der im Komplex übereinstimmt.
Die Ergebnisse der Berechnungen für Enzym-Konformationsklasse I (Portal geschlossen) sind
in Tabelle 5 zusammengefaßt (Originaldaten: Tabellen A3 und A4, Anhang). Aus je 500
AutoDock-Läufen resultierten für die axiale und die equatoriale Galanthamin-Konformation
insgesamt 137 Vorschläge, bei denen das Alkaloid im Bereich des aktiven Zentrums bindet.
Die Cluster-Analyse faßt diese zu 7 unterschiedlichen Bindungsmodi für die equatoriale und 8
38
für die axiale Stellung der N-Methylgruppe zusammen. Die RMSD-Werte zeigen, daß
AutoDock in der Lage ist, für die equatoriale Stellung der N-Methylgruppe des Galanthamins
die Röntgenstruktur korrekt vorherzusagen (Gal_eq1ACJ_clu04, RMSD 0.93 Å).
Tabelle 5: Ergebnisse für Enzym-Konformationsklasse I (Portal geschlossen)
RMSD AutoDock-Energie Tripos-Enthalpie
Name Anzahl [Å] (relativ) [kcal/mol] (relativ) [kcal/mol]
Gal_eq1ACJ_clu01 4 3.32 0 6.72
Gal_eq1ACJ_clu03 9 2.87 0.11 17.65
Gal_eq1ACJ_clu04 44 0.93 1.26 0.00
Gal_eq1ACJ_clu05 7 2.47 2.84 10.46
Gal_eq1ACJ_clu06 4 4.13 3.69 17.09
Gal_eq1ACJ_clu08 3 2.91 4.34 11.85
Gal_eq1ACJ_clu09 4 1.93 4.53 0.70
Gal_eq1ACJ_clu19 4 4.13 13.36 17.15
Gal_ax1ACJ_clu05 3 3.52 0 6.20
Gal_ax1ACJ_clu06 2 3.49 0.27 1.32
Gal_ax1ACJ_clu08 11 3.84 1.77 10.28
Gal_ax1ACJ_clu09 3 4.22 1.88 7.39
Gal_ax1ACJ_clu10 3 3.18 2.11 13.36
Gal_ax1ACJ_clu12 6 3.62 2.52 8.47
Gal_ax1ACJ_clu14 5 2.91 3.46 11.20
Gal_ax1ACJ_clu17 2 3.13 6.4 0.00
Gal_ax1ACJ_clu18 23 2.02 7.98 9.66
Vergleicht man die Energiewerte für die einzelnen Bindungsmodi, so setzt AutoDock diesen
Komplex auf den dritten Rang, wohingegen das Tripos-Kraftfeld die korrekte Aussage liefert
(Rang 1). Für die axiale Konformation der Metyhlgruppe kann kein Analogon zum TcAChE/
Galanthamin-Komplex gefunden werden.
Die Ergebnisse der Berechnungen für Enzym-Konformationsklasse II (Portal teilweise
geöffnet) sind aus Tabelle 6 zu ersehen (Originaldaten: Tabellen A5 und A6, Anhang). Die
insgesamt 212 Vorschläge im Bereich der katalytischen Triade werden durch die Cluster-
39
Analyse zu 6 bzw. 9 unterschiedlichen Bindungsmöglichkeiten für die equatoriale bzw. axiale
Galanthamin-Konformation gruppiert.
Tabelle 6: Ergebnisse für Enzym-Konformationsklasse II (Portal teilweise geöffnet)
RMSD AutoDock-Energie Tripos-Enthalpie
Name Anzahl [Å] (relativ) [kcal/mol] (relativ) [kcal/mol]
Gal_eq2ACK_clu01 21 2.41 0 5.14
Gal_eq2ACK_clu02 68 0.90 2.44 0
Gal_eq2ACK_clu14 5 3.33 16.79 0.96
Gal_eq2ACK_clu15 4 3.69 19.85 6.95
Gal_eq2ACK_clu16 8 3.06 20.02 9.71
Gal_eq2ACK_clu17 3 3.24 21.16 19.88
Gal_ax2ACK_clu02 14 3.23 0 3.22
Gal_ax2ACK_clu03 14 2.80 0.47 6.64
Gal_ax2ACK_clu08 14 2.98 0.8 7.96
Gal_ax2ACK_clu17 2 3.27 7.45 4.65
Gal_ax2ACK_clu18 9 2.61 13.63 9.04
Gal_ax2ACK_clu19 6 2.75 14.61 13.59
Gal_ax2ACK_clu20 39 1.48 17.49 4.03
Gal_ax2ACK_clu21 4 3.21 21.99 0
Gal_ax2ACK_clu22 1 3.54 28.77 4.80
Die RMSD-Werte zeigen, daß AutoDock auch hier für die equatoriale Stellung der N-Methyl-
gruppe im Galanthamin die Röntgenstruktur korrekt vorhersagt (Gal_eq2ACK_clu02, RMSD:
0.90 Å). Der entsprechende Komplex ist gemäß dem Tripos-Kraftfeld der energetisch günstig-
ste, wohingegen er nach den AutoDock-Energien den zweiten Platz belegt. Für die axiale
Konformation des Galanthamins wird auch hier kein Bindungsmodus gefunden, der der
TcAChE/Galanthamin-Röntgenstruktur entspricht.
Bei Enzym-Konformationsklasse III (Portal geöffnet, Tabellen 7a und 7b; Originaldaten:
Tabellen A7 und A8, Anhang) sagt AutoDock sowohl für die axiale als auch für die equato-
riale Stellung der N-Methylgruppe die Struktur des TcAChE/Galanthamin-Komplexes korrekt
vorher (Gal_eq1ACL_clu09, RMSD: 1.02 Å; Gal_ax1ACL_clu15, RMSD: 0.88 Å). Die über
40
das Tripos-Kraftfeld ermittelten Bindungsenthalpien setzen diese Komplexe in beiden Fällen
jeweils auf den ersten Rang. AutoDock hingegen versagt wiederum bei der Vorhersage der
energetischen Abfolge.
Tabelle 7a: Ergebnisse für Enzym-Konformationsklasse III (Portal geöffnet)
RMSD AutoDock-Energie Tripos-Enthalpie
Name Anzahl [Å] (relativ) [kcal/mol] (relativ) [kcal/mol]
Gal_eq1ACL_clu01 22 2.23 0 3.79
Gal_eq1ACL_clu03 34 3.57 3.62 22.84
Gal_eq1ACL_clu04 12 3.07 3.83 16.40
Gal_eq1ACL_clu05 32 3.27 3.89 13.48
Gal_eq1ACL_clu06 6 3.67 6.15 18.16
Gal_eq1ACL_clu08 3 4.13 6.35 10.24
Gal_eq1ACL_clu09 3 1.02 6.78 0.00
Gal_eq1ACL_clu10 12 3.57 7.97 16.66
Gal_eq1ACL_clu12 1 3.25 8.77 26.69
Gal_eq1ACL_clu14 2 4.01 8.98 15.22
Gal_eq1ACL_clu15 4 3.85 9.01 21.87
Gal_eq1ACL_clu17 4 3.58 9.38 15.56
Gal_eq1ACL_clu21 11 3.18 9.77 20.07
Gal_eq1ACL_clu22 2 3.30 9.91 15.88
Gal_eq1ACL_clu23 1 4.29 9.92 19.32
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß bei allen drei betrachteten Enzym-Konforma-
tionsklassen Orientierungen für Galanthamin innerhalb des Proteins gefunden werden
konnten, die der röntgenographisch ermittelten TcAChE/Galanthamin-Struktur entsprechen.
Dies ist insofern bemerkenswert, da das für die Bindung wichtige Wassermolekül (s.o.) nicht
in den für das Docken verwendeten Strukturen berücksichtigt wurde.
41
Tabelle 7b: Ergebnisse für Enzym-Konformationsklasse III (Portal geöffnet)
RMSD AutoDock-Energie Tripos-Enthalpie
Name Anzahl [Å] (relativ) [kcal/mol] (relativ) [kcal/mol]
Gal_ax1ACL_clu01 19 2.07 0 5.72
Gal_ax1ACL_clu02 6 2.32 1.51 13.66
Gal_ax1ACL_clu03 10 3.26 2.29 14.93
Gal_ax1ACL_clu04 8 2.89 2.89 19.67
Gal_ax1ACL_clu05 3 2.35 3.17 14.84
Gal_ax1ACL_clu06 54 3.51 3.45 21.78
Gal_ax1ACL_clu08 2 4.13 5.88 8.17
Gal_ax1ACL_clu09 3 4.24 6.37 20.94
Gal_ax1ACL_clu15 5 0.88 8.37 0.00
Gal_ax1ACL_clu16 1 4.40 8.51 13.52
Gal_ax1ACL_clu18 9 3.14 8.85 22.52
Gal_ax1ACL_clu25 1 3.62 10.18 13.59
Es zeigte sich die Notwendigkeit einer nachfolgenden Geometrieoptimierung der
vorgeschlagenen Komplexe mit einem eingehender parametrisierten Kraftfeld (hier: Tripos-
Kraftfeld), da AutoDock den der Realität entsprechenden Komplex in den meisten Fällen
nicht auf den ersten Rang gesetzt hat.
equatoriale Konformation axiale Konformation
Abbildung 11: Ergebnisse des Dockens bei geöffnetem Portal
42
Bei geöffnetem Portal, wie es in der Röntgenstruktur gefunden wird, läßt sich Galanthamin
sowohl bei axialer als auch bei equatorialer Stellung der N-Methylgruppe in das Protein ein-
passen. In Abbildung 11 sind die Ergebnisse des Dockens mit geöffnetem Portal im Vergleich
zur Röntgenstruktur (aus PDB-Eintrag 1QTI, in grüner Farbe dargestellt) wiedergegeben.
Experimentell findet man, daß Galanthamin innerhalb des Enzyms in der equatorialen Kon-
formation vorliegt. Die Kombination aus AutoDock und nachfolgender Optimierung mit dem
Tripos-Kraftfeld hat sich somit als geeignete Methodik zur richtigen Vorhersage der
TcAChE/Galanthamin-Röntgenstruktur erwiesen.
4.1.8 Reproduktion der TcAChE/Galanthamin-Struktur mit AutoDock
Im Verlauf dieses Projekts wurde eine neue Version von AutoDock veröffentlicht.[84] Auch
die neue Version nutzt zuvor generierte Affinitätspotentiale, wobei bei der Parameterisierung
zusätzlich Desolvatations-Effekte gesondert berücksichtigt wurden. Wie bei der älteren Pro-
grammversion bleibt auch bei AutoDock 3.0 während des Dockens die konformative Flexibi-
lität der Enzymstruktur sowie die der Ringe des Inhibitors unberücksichtigt. Im Unterschied
zu dem in Version 2.4 verwendeten Simulated Annealing Verfahren basiert AutoDock 3.0 auf
einem genetischen Algorithmus. Die Suche nach günstigen Bindungsmöglichkeiten für den
Inhibitor wird dabei durch Simulation der Vorgänge bei der natürlichen Evolution durch-
geführt.
Lage und Orientierung des Inhibitors innerhalb des den interessierenden Teil des Proteins um-
gebenden Gitternetzes werden durch drei Translations- und vier Rotations-Gene beschrieben.
Für jeden frei drehbaren Torsionswinkel der Inhibitorstruktur wird ein weiteres Gen hinzuge-
fügt. Die Summe der Gene bildet das Chromosom (Genotyp), daß eine Enzym/Inhibitor-
Anordnung repräsentiert. Zu Beginn der Simulation generiert das Programm eine Anfangspo-
pulation aus einer benutzerdefinierten Anzahl von Individuen, indem es den Genen zufällige
Werte innerhalb bestimmter Grenzwerte zuweist. Die Erzeugung einer neuen Generation er-
folgt durch Kreuzung und Mutation. Zuvor werden aus der Ausgangspopulation alle Individu-
en mit einer überdurchschnittlich guten Protein/Inhibitor-Wechselwirkungsenergie selektiert.
Von diesen wird eine zufällig ausgewählte Untergruppe paarweisen Kreuzungen unterzogen.
Dabei bleibt die Reihenfolge der Gene erhalten, d.h. Translations-Gene werden beispielsweise
nicht mit Rotations- oder Torsions-Genen vermischt. Damit die Population eine konstante
Größe beibehält, ersetzen die aus dem Kreuzungsprozeß resultierenden Individuen diejenigen,
43
aus denen sie erzeugt wurden. In den Chromosomen liegen reelle Zahlenwerte vor, was eine
Mutation auf klassische Art durch Inversion einzelner Gene verhindert. Der Entwicklungs-
sprung findet indes statt, indem ausgehend vom Originalwert eines Gens eine Zufallszahl
generiert wird, die mit der Cauchy-Verteilung (Glossar) konform ist. Diese Zufallszahl ersetzt
den Originalwert, so daß ein neues Chromosom und damit ein neues Individuum entsteht.
Eine benutzerdefinierte Anzahl der besten Individuen verbleibt, was zur Bildung der Tochter-
generation führt. Der genetische Algorithmus kann zu drastischen Veränderungen der Lage
des Inhibitors im Gitternetz führen und entspricht somit einer globalen Suche von Bindungs-
möglichkeiten innerhalb der Proteinstruktur, ähnlich dem Simulated Annealing Verfahren bei
hohen Temperaturen (s.o.). Zur lokalen Suche, d.h. zur Optimierung eines gefundenen Bin-
dungsmodus, transformiert man das betrachtete Chromosom in die kartesischen Koordinaten
des Inhibitors (Phänotyp). Während seine grobe Lage erhalten bleibt, paßt sich der Inhibitor
durch inkrementelle Translations- und Rotationsbewegungen sowie Variation der spezifizier-
ten Torsionswinkel der Enzymstruktur an. Anschließend erfolgt die Rücktransformation des
Phänotyps in den Genotyp und der genetische Algorithmus beginnt von neuem.
Diese Vorgehensweise wird solange wiederholt, bis die benutzerdefinierte Anzahl von Evolu-
tionsschritten erreicht ist. Im Unterschied zu AutoDock 2.4 ist die neue Programmversion in
der Lage, über eine implementierte empirische Funktion die freie Bindungsenergie für die
vorgeschlagenen Enzym/Inhibitor-Komplexe in Form der Bindungskonstanten abzuschätzen
(vgl. Erläuterungen unten, Abschnitt 4.1.9). Üblicherweise führt man auch bei AutoDock 3.0
mehrere Docking-Läufe unabhängig voneinander durch. Die erhaltenen Ergebnisse werden
abschließend in einer Cluster-Analyse zu Gruppen zusammengefaßt.
Die in AutoDock 3.0 vorgenommenen Programmänderungen lassen eine verbesserte Struktur-
vorhersage gegenüber der älteren Version 2.4 erwarten. Daher wurden beide Versionen einem
direkten Vergleich bezüglich ihrer Fähigkeit zur Reproduktion der Röntgenstruktur des
TcAChE/Galanthamin-Komplexes unterzogen.
Die Enzymstruktur (PDB-Eintrag: 1QTI) wurde vom Inhibitor und den co-kristallisierten
Wassermolekülen getrennt, mit Wasserstoffatomen versehen und anschließend durch Geome-
trieoptimierung relaxiert (s.o.). Mit beiden Programmen wurden für die axiale und die equato-
riale Galanthamin-Konformation je 500 Läufe durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8
zusammengefaßt.
44
Tabelle 8: Vergleich der Ergebnisse von AutoDock 2.4 und AutoDock 3.0 bei der
Reproduktion der TcAChE/Galanthamin-Röntgenstruktur 1QTI
AutoDock 2.4 AutoDock 3.0
Name Anzahl RMS1Energie2Name Anzahl RMS1Energie2
Gal_eq1QTI_01 23 2.148 0 Gala_eq1QTI_01 432 0.401 0
Gal_eq1QTI_02 24 3.972 4.23 Gala_eq1QTI_02 42 2.036 0.12
Gal_eq1QTI_03 12 3.444 4.29 Gala_eq1QTI_03 17 3.06 0.13
Gal_eq1QTI_04 10 3.964 5.94 Gala_eq1QTI_04 1 4.739 0.17
Gal_eq1QTI_05 4 3.326 7.16 Gala_eq1QTI_05 1 3.642 0.31
Gal_eq1QTI_07 13 0.674 8.45 Gala_eq1QTI_06 5 3.27 0.43
Gal_eq1QTI_19 1 4.249 14.3 Gala_eq1QTI_07 2 4.571 0.57
Gal_eq1QTI_20 2 4.655 15.97
Gal_eq1QTI_21 1 3.309 19.02
Gal_ax1QTI_01 14 2.097 0 Gala_ax1QTI_01 468 0.415 0
Gal_ax1QTI_02 18 4.069 5.8 Gala_ax1QTI_02 6 4.749 0.04
Gal_ax1QTI_03 17 0.716 8.87 Gala_ax1QTI_03 12 1.961 0.26
Gal_ax1QTI_19 4 4.215 13.64 Gala_ax1QTI_04 9 2.805 0.29
Gal_ax1QTI_21 1 4.534 15.27 Gala_ax1QTI_05 4 3.258 0.38
Gal_ax1QTI_22 1 3.402 16.05 Gala_ax1QTI_06 1 6.154 1.91
1RMS-Abweichung in Å; 2Energie in kcal/mol, relativ zum jeweils besten Wert
Beide Programmversionen sind in der Lage, die Röntgenstruktur sowohl für die axiale als
auch für die equatoriale Galanthamin-Konformation zu reproduzieren. AutoDock 2.4 liefert
RMS-Abweichungen im Bereich von 0.7 Å, wohingegen die RMSD-Werte von AutoDock 3.0
in einer Größenordnung von 0.4 Å liegen. Die neue Programmversion setzt die Röntgenstruk-
tur für beide Galanthamin-Konformationen auf den ersten Rang, wohingegen sie bei
AutoDock 2.4 auf den Rängen sieben (equatorial) bzw. drei (axial) mit einer Energiedifferenz
von ca. 8 kcal/mol zur besten gefundenen Enzym/Inhibitor-Anordnung vorhergesagt wird.
AutoDock 2.4 findet mit insgesamt 43 eine wesentlich höhere Anzahl potentieller Bindungs-
modi als die neue Programmversion (13 Möglichkeiten). Dabei plaziert die ältere Version
allerdings in fast zwei Dritteln der Fälle den Inhibitor am äußeren Ende des Schlauchs (28
Cluster, 355 Strukturen).
45
Bei AutoDock 3.0 hingegen liegen alle 500 vorhergesagten Möglichkeiten in unmittelbarer
Nähe des aktiven Zentrums. Besonders auffällig bei diesem Ergebnis ist, daß AutoDock 3.0
die Röntgenstruktur in ca. 90% der Läufe reproduziert. Bei der alten Programmversion beträgt
die Wiederfindungsrate lediglich 6%.
Daraus kann geschlossen werden, daß AutoDock 3.0 der älteren Programmversion überlegen
ist. Dies betrifft einerseits die Genauigkeit, mit der der TcAChE/Galanthamin-Komplex repro-
duziert wird, was sich an der geringeren RMS-Abweichung zeigt. Andererseits wird die rich-
tige Struktur nicht nur auf den ersten Rang gesetzt, sondern darüber hinaus noch in fast 90%
der Fälle wiedergefunden, was die statistische Sicherheit der Ergebnisse untermauert.
Um die Auswirkungen einer Reduktion der Anzahl der Simulationen mit AutoDock 3.0 auf
das Ergebnis festzustellen, wurde der Versuch zur Reproduktion des TcAChE-Komplexes
1QTI mit 100 Läufen wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefaßt (Origi-
naldaten: Tabelle A9, Anhang).
Tabelle 9: Docken mit AutoDock 3.0
RMSD AutoDock 3.0 Tripos-Enthalpie
Name Anzahl [Å] Energie1pKi2(relativ) [kcal/mol]
Gal_eq1QTI_clu01 91 0.41 0 8.60 1.04
Gal_eq1QTI_clu02 3 3.07 0.13 8.11 13.86
Gal_eq1QTI_clu03 6 2.04 0.13 8.25 0.00
Gal_ax1QTI_clu01 96 0.39 0 8.55 0.00
Gal_ax1QTI_clu02 1 4.67 0.14 8.23 11.46
Gal_ax1QTI_clu03 2 2.10 0.27 7.95 4.60
Gal_ax1QTI_clu04 1 2.70 0.31 7.94 9.54
1relativ [kcal/mol]; 2Bindungskonstante pKi = –log(Ki)
Auch hier werden wiederum ausschließlich Bindungsmodi in der Nähe der katalytischen
Triade vorgeschlagen. Die Gesamtzahl der Vorschläge ist bei 100 Läufen geringfügig kleiner
als bei 500 Läufen. Die Röntgenstruktur wird sowohl für die axiale als auch für die equato-
riale Galanthamin-Konformation auf Platz 1 reproduziert (Gal_eq1QTI_clu01, RMSD:
0.41 Å; Gal_ax1QTI_clu01, RMSD: 0.39 Å). Dieser Bindungsmodus dominiert ebenfalls in
der Gesamtzahl der Vorhersagen. Die mit Hilfe der implementierten empirischen Funktion für
46
die beiden besten Komplexe prognostizierten Bindungskonstanten sind sehr ähnlich. Die
equatoriale Stellung der N-Methylgruppe, wie sie im TcAChE/Galanthamin-Komplex vor-
liegt, wird dabei bevorzugt. Zum Vergleich wurden die von AutoDock 3.0 vorgeschlagenen
Komplexe einer Optimierung mit dem Tripos-Kraftfeld unterzogen, wobei sich Teile des
Enzyms unter dem Einfluß des Inhibitors bewegen können (s.o.). Die Geometrieoptimierung
verifiziert die AutoDock-Ergebnisse jedoch nur für die axiale Stellung der N-Methylgruppe.
Bei equatorialer Stellung wird die Röntgenstruktur mit einer Energiedifferenz von
1.04 kcal/mol auf den zweiten Platz gesetzt.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die korrekten Strukturen aus energetischer Sicht
durch AutoDock 3.0 auf den 1. Platz gesetzt werden. Die über die implementierte empirische
Funktion berechneten Bindungskonstanten bestätigen das und sind bei den besten Komplexen
beider Galanthamin-Konformationen fast identisch. Die Gesamtzahl der vorgeschlagenen
Bindungsmodi ist bei 100 Läufen geringer als bei 500 Läufen. Tendenziell stimmen die Er-
gebnisse jedoch überein, was eine Reduktion der Anzahl der Läufe bei weiteren Simulationen
rechtfertigt. Die nachfolgende Optimierung der vorgeschlagenen Komplexe mit dem Tripos-
Kraftfeld ergibt bei axialer Stellung der N-Methylgruppe das gleiche Ergebnis wie AutoDock.
Bei der equatorialen Konformation des Galanthamins wird die Röntgenstruktur hingegen auf
dem zweiten Rang wiedergefunden.
4.1.9 Alternative Methoden zur Berechnung von Bindungsenergien
Bei einem Protein/Inhibitor-Komplex ist die Bindung der organischen Verbindung häufig auf
relativ schwache, nicht-kovalente Wechselwirkungen zurückzuführen. Aufgrund der Kom-
plexität der zugrundeliegenden physikalischen Effekte besteht derzeit ein generelles Problem
in der akkuraten Berechnung der intermolekularen Energie und damit der Affinität des
Inhibitors.[89]
Beschränkt man sich, wie im obigen Beispiel, auf die Berechnung der Bildungsenthalpie, so
stellt man fest, daß bereits hier Probleme auftreten, die auf die unterschiedliche Parameterisie-
rung der Kraftfelder zurückzuführen sind. Obwohl das erzielte Ergebnis im Einklang mit den
experimentellen Daten steht, muß die Frage gestellt werden, ob das Tripos-Kraftfeld generell
zur Reproduktion von Wechselwirkungsenergien zwischen Protein und organischem Molekül
geeignet ist, obwohl es nicht explizit für diese Aufgabe parameterisiert wurde.
47
Es gibt eine Reihe von Kraftfeldern, die speziell für Berechnungen an Proteinen genutzt wer-
den (z.B. AMBER[90,91], CHARMM[92], GROMOS[93]). Allerdings enthalten diese in der Re-
gel keine Parameter für die breite Palette der Atomtypen organischer Verbindungen, sondern
sind explizit auf Aminosäuren ausgerichtet.
Durch den Einsatz von semi-empirischen, DFT- oder ab initio Methoden kann die Bildungs-
enthalpie auf einem höheren theoretischen Niveau berechnet werden. Man kann hier bei-
spielsweise einen Hybridansatz verwenden, bei dem nur der interessierende Teil des Protein/
Inhibitor-Komplexes mit den rechenintensiven quantenchemischen Methoden erfaßt und der
Rest des Proteins mit Kraftfeld-Methoden behandelt wird.[94,95,96] Diese Berechnungen sind
jedoch zu aufwendig, um für einen größeren Datensatz in einem angemessenen Zeitrahmen
Ergebnisse liefern zu können.
Ein grundsätzlicher Nachteil der alleinigen Betrachtung der Bindungsethalpie besteht in der
Vernachlässigung entropischer Einflüsse. Da es bei der Bindung zur Vereinigung von zwei
Molekülen kommt, wird die konformative Freiheit beider Partner eingeschränkt. Dies wirkt
sich besonders dann aus, wenn der Inhibitor eine hohe konformative Flexibilität besitzt. Hinzu
kommt, daß bei der Bildung des Protein/Inhibitor-Komplexes Wassermoleküle von beiden
Partnern abgelöst werden, was ebenfalls mit Entropieänderungen verbunden ist (Desolvata-
tionseffekte). Es gibt Methoden, entropische Einflüsse über molekular-dynamische Simulatio-
nen einzubeziehen.[97] Derartige Rechnungen sind allerdings sehr zeitaufwendig und erfordern
viel Erfahrung.
Einen ganz anderen Ansatz zur Abschätzung von Bindungsaffinitäten verfolgen empirische
Funktionen, die auf der Aufspaltung der freien Bindungsenergie in einzelne Terme basie-
ren.[98,99,100,101,102,103,104,105] Diese Terme beschreiben Wasserstoffbrücken-Bindungen, ionische
Wechselwirkungen sowie hydrophobe Kontakte. Entropische Effekte, die aus dem Verlust
von konformativer Flexibilität und Desolvatation herrühren, werden ebenfalls explizit berück-
sichtigt. Die Analyse der Röntgenstrukturen von Protein/Inhibitor-Komplexen bildet die
Grundlage für die Parameterisierung derartiger Funktionen. Strukturelle Eigenschaften, die
für die Bindung von Inhibitoren wichtig sind, werden einzeln analysiert und über statistische
Methoden mit experimentell bestimmten Bindungskonstanten korreliert. Dies führt zu einer
universellen Funktion, die eine sehr schnelle Abschätzung der Affinitäten von Protein/Inhibi-
tor-Komplexen erlaubt. Bei der Nutzung derartiger Funktionen darf man allerdings einige
Punkte nicht außer Acht lassen. So spielt die Auswahl der in die Analyse einbezogenen
Protein/Inhibitor-Komplexe eine entscheidende Rolle. Ferner muß berücksichtigt werden, daß
48
die zur Korrelation benutzten experimentell bestimmten Bindungskonstanten mit Fehlern
behaftet sein können und häufig nicht unter vergleichbaren Bedingungen ermittelt wurden.
Trotz dieser Einschränkungen bietet diese Methodik einen Kompromiß zwischen rechneri-
schem Aufwand und zu erwartender Akkuratesse bei der Berechnung von Bindungsaffinitä-
ten. In der neuen Version von AutoDock ist eine derartige Funktion implementiert.
4.2 Docken des Galanthamin-Datensatzes
In den Arbeitskreisen von Prof. Dr. J. Fröhlich und Prof. Dr. U. Jordis (TU Wien) wurde eine
Vielzahl von Galanthamin-Derivaten synthetisiert. Die Aktivitätsdaten dieser Verbindungen
wurden von Frau Dr. K. Czollner unter Verwendung des von Ellman et al.[106] entwickelten
Tests an rekombinanter AChE der Spezies Mensch gemessen.[107] Bei den Messungen wurden
parallel für jede Verbindung 5 Küvetten, die identische Mengen an AChE, Indikatorsubstanz
und Hilfsstoffen enthielten, mit unterschiedlichen Mengen an Inhibitor inkubiert. Eine weitere
Küvette wurde nur mit AChE und Indikatorsubstanz befüllt. Danach erfolgte die Substratzu-
gabe, wobei die Aktivität des Enzym bei der jeweiligen Inhibitorkonzentration aus der Ge-
schwindigkeit der Absorptionsänderung im Vergleich zur Referenzküvette ohne Inhibitor
abgeleitet wurde. Die Aktivitäten sind als IC50-Werte zu verstehen, wobei es sich um den ne-
gativen dekadischen Logarithmus der Inhibitorkonzentration handelt, bei der das Enzym noch
50% seiner ursprünglichen Aktivität hatte.
Die Ergebnisse wurden uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt und bilden die Grund-
lage für den in dieser Promotionsarbeit behandelten Datensatz.
Da die biologischen Aktivitäten der Galanthamin-Derivate an menschlicher AChE gemessen
wurden, ist es wünschenswert, auch die Docking-Studien an der AChE-Struktur dieser
Spezies (HuAChE) durchzuführen und nicht wie bisher die Struktur der TcAChE zu verwen-
den. Die Koordinaten der Enzymstruktur von HuAChE (PDB-Eintrag 1B41) sind offiziell
noch nicht freigegeben, wurden uns aber freundlicherweise von der Arbeitsgruppe von Prof.
Dr. J. Sussman (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) zur Verfügung gestellt.[108]
4.2.1 Vorbereitung der Strukturen
Ein Vergleich der menschlichen AChE-Struktur mit der von Torpedo Californica zeigt trotz
teilweise unterschiedlicher Primärsequenz sehr viele Parallelen. So ist die katalytische Triade
49
bei HuAChE ebenfalls tief im Inneren des Enzyms verborgen und wird durch einen Schlauch
mit der Oberfläche verbunden. Die Lagen der Seitenketten von Tyrosin 124 und Tyrosin 337
(entsprechen Tyrosin 121 und Phenylalanin 330 bei Torpedo Californica) legen den Schluß
nahe, daß sich auch bei menschlicher AChE am unteren Ende des Schlauchs ein Portal
befindet, welches je nach Inhibitor geöffnet oder geschlossen sein kann.
In Analogie zur zuvor geschilderten Arbeitsweise wurde daher für die nachfolgenden
Docking-Experimente in der HuAChE-Enzymstruktur die Region für das Docken durch die
Aminosäuren definiert, die das aktive Zentrum und den Schlauch bilden (siehe Tabelle A2,
Anhang). Die Seitenkettentorsionswinkel der Aminosäure Tyrosin 337 wurden so angepaßt,
daß sie mit denen von Phenylalanin 330 in der Struktur 1QTI übereinstimmen (Portal
geöffnet). Die weitere Vorbereitung des Enzyms erfolgte wie für die TcAChE-Strukturen
beschrieben (s.o.).
Bei dem verwendeten Datensatz handelt es sich um 62 Derivate des Galanthamins. Die
meisten dieser Derivate unterscheiden sich von der Leitstruktur durch Substituenten am Stick-
stoffatom des Siebenrings. In Abbildung 12 sind zwei Beispiele wiedergegeben, an denen die
Vorbereitung der Datensatzstrukturen exemplarisch beschrieben wird.
O
N
O
OH
N
OO
N
O
OH
OCl
SPH1117 SPH1246
Abbildung 12: Beispiele für Galanthamin-Derivate
Bei Verbindung SPH1117 ist ein Morpholinring über zwei Methylengruppen mit dem Grund-
körper des Galanthamins verknüpft. Da AutoDock 3.0 nicht in der Lage ist, Ringkonformatio-
nen während der Simulation zu variieren, müssen für beide Stickstoffatome je zwei Konfor-
mationen betrachtet werden, so daß hier insgesamt vier Strukturen unabhängig voneinander
zu docken sind. Der Morpholin-Sechsring wird in einer Sesselkonformation eingefroren.
In Verbindung SPH1246 ist das Stickstoffatom des Siebenrings Teil eines Carbonsäureamids.
Amidbindungen besitzen einen partiellen Doppelbindungscharakter, was bei Raumtemperatur
50
die Rotationsmöglichkeiten einschränkt. Für Derivate dieses Typs werden jeweils zwei Kon-
formationen mit einem Torsionswinkel von 0° bzw. 180° separat betrachtet.
Unter den Derivaten befinden sich auch einige, die einen relativ ausgedehnten Substituenten
am Stickstoffatom tragen, dessen Länge z.T. die des Schlauchs der AChE übertrifft. Es wird
vorausgesetzt, daß der allen Verbindungen des Datensatzes gemeinsame Galanthamin-Grund-
körper ähnlich wie bei der Leitstruktur im Bereich des aktiven Zentrums verankert ist (s.o.).
Demzufolge ist anzunehmen, daß bei einigen Derivaten Molekülteile mit den Aminosäuren
des Schlauchs in Wechselwirkung treten oder sogar an seinem oberen Ende auf der Enzym-
oberfläche plaziert werden. Um zu gewährleisten, daß AutoDock auch in diesen Fällen
sinnvolle Ergebnisse produziert, wurden die Abmessungen des Gitternetzes entsprechend
vergrößert.
4.2.2 Ergebnisse und Diskussion
Die Interpretation der für den Datensatz erhaltenen Ergebnisse erforderte es, einen hypotheti-
schen Komplex aus HuAChE und Galanthamin zu erzeugen, indem die Struktur des TcAChE/
Galanthamin-Komplexes (1QTI) anhand des Peptidgerüsts der jeweils ausgewählten 43
Aminosäuren auf die zum Docken verwendete HuAChE gelegt wurde. Dies führt zu neuen
Werten für Koordinaten der Atome des Galanthamins im Komplex mit HuAChE. Da das
Galanthamin-Ringsystem in allen Verbindungen des Datensatzes vorkommt, ist somit ein
Vergleich der Docking-Ergebnisse des Datensatzes mit der Lage der Leitstruktur in der
HuAChE durch Berechnung der RMSD-Werte der korrespondierenden Atome zu den neuen
Referenzkoordinaten möglich.
Es zeigt sich, daß AutoDock 3.0 für jede der gedockten Strukturen mindestens einen Vor-
schlag liefert, bei dem sich das Galanthamin-Ringsystem der betrachteten Struktur positionell
in guter Übereinstimmung mit der Modellstruktur befindet (RMSD < 1 Å). Um keinen poten-
tiell wichtigen Enzym/Inhibitor-Komplex auszulassen, wurden alle AutoDock-Vorschläge mit
einer RMS-Abweichung von bis zu 3 Å (insgesamt 233 Strukturen) einer Optimierung mit
dem Tripos-Kraftfeld unterzogen. Bei den Derivaten, die am Stickstoffatom des Siebenrings
durch flexible Reste substituiert sind, ergab sich häufig eine vergleichsweise große Anzahl
von Clustern mit Enzym/Inhibitor-Anordnungen, deren Galanthamin-Kerne mit der Modell-
struktur des Komplexes im Einklang standen (Originaldaten: Tabelle A10, Anhang).
QSAR-Untersuchungen erfordern für jede Verbindung des Datensatzes die Einschränkung auf
eine einzige repräsentative Konformation, was durch die Betrachtung der berechneten Wech-
51
selwirkungsenergien erfolgen soll. Ein Vergleich der Bindungsenthalpien (Tripos-Kraftfeld)
mit den durch die in AutoDock 3.0 implementierte empirische Funktion vorhergesagten Bin-
dungsaffinitäten führte jedoch nicht immer zu einem eindeutigen Ergebnis. Bis jetzt sind noch
keine Strukturen von AChE-Komplexen mit co-kristallisierten Galanthamin-Derivaten be-
kannt, so daß die Entscheidung, welcher der beiden Energiewerte der „richtigere“ ist an dieser
Stelle nicht zweifelsfrei getroffen werden kann. Da die Bindungsenthalpien jedoch keine en-
tropischen Effekte berücksichtigen, erfolgte die Auswahl der Repräsentanten für die nachfol-
genden QSAR-Untersuchungen auf der Grundlage der Bindungsaffinitäten. Obwohl die
Tripos-Energiewerte nicht verwendet wurden, ist die Optimierung der einzelnen AutoDock-
Vorschläge unter dem Einfluß des Enzyms dennoch sinnvoll, da sich die Inhibitor-
Konformation so optimal anpassen kann (Tabelle A11, Anhang).
4.3 QSAR-Studien – Vorbemerkungen zur Theorie
Die Größen molekularer Eigenschaften können häufig intuitiv durch Analyse der Struktur der
betrachteten Verbindung abgeschätzt werden (z.B. Acidität oder Basizität). Allerdings reicht
diese qualitative Bewertung in vielen naturwissenschaftlichen Bereichen nicht aus. Zur Quan-
tifizierung von Vorhersagen bedient man sich daher z.B. empirischer Inkrementverfahren
(z.B. chemische Verschiebung bei der Kernresonanzspektroskopie[109,110]), die auf Verglei-
chen mit Datenmaterial aus Datenbanken beruhen. Quantenchemische Berechnungsmethoden
stellen eine weitere Möglichkeit dar, die sich besonders bei der Vorausberechnung thermo-
chemischer Größen bewährt hat. Ein Ansatz, der besonders häufig im Bereich der Pharmazie
genutzt wird, ist die Aufstellung quantitativer Struktur-Wirkungs-Beziehungen (QSAR). Da-
bei werden meßbare biologische Eigenschaften durch Entwicklung mathematischer Modelle
mit substanzspezifischen Parametern korreliert. Grundlage für quantitative Zusammenhänge
zwischen chemischer Struktur und biologischer Wirkung ist dabei die Annahme, daß die Un-
terschiede in den physikochemischen Eigenschaften der Substanzen für die relative Stärke
ihrer Wechselwirkungen mit einem biologischen Makromolekül verantwortlich sind. Dabei
muß die Voraussetzung erfüllt sein, daß alle betrachteten Verbindungen in ähnlicher Weise
mit diesem in Wechselwirkung treten.[75]
Durch Anwendung von QSAR-Techniken besteht die Möglichkeit, die Entwicklungsrichtung
für die chemische Modifizierung eines Wirkstoffs festzulegen. QSAR-Methoden können auch
wichtige Informationen liefern, zu welchem Zeitpunkt man ein Forschungsprojekt besser ein-
stellen sollte. Laufen z.B. gewünschte Wirkung und Toxizität parallel, so ist möglicherweise
52
die weitere Bearbeitung der Substanzklasse vergeblich. Rationales Wirkstoffdesign auf
Grundlage von QSAR kann auch unter diesen Gesichtspunkten zur Kostenreduktion bei der
Entwicklung neuer Medikamente beitragen.
Der erste Schritt bei einer QSAR-Analyse besteht in der Auswahl geeigneter Deskriptoren zur
Beschreibung der chemischen Verbindungen. Dabei handelt es sich letztendlich um Zahlen,
die in ihrer Gesamtheit jede Verbindung des betrachteten Datensatzes eindeutig charakterisie-
ren und von den übrigen differenzieren.
Die Deskriptortypen unterscheiden sich in ihrem Informationsgehalt. So können physikoche-
misch meßbare Größen wie Schmelzpunkt, Siedepunkt, Brechnungsindex etc. als Deskripto-
ren verwendet werden, was zu einer indirekten Beschreibung der Strukturen führt.
Eine weitere Klasse basiert auf den Konnektivitäten der betrachteten Moleküle.[111] Die Struk-
turen werden dabei unter Anwendung mathematischer Transformationen durch sog. Moleku-
lare Graphen beschrieben. Obwohl dieser Deskriptortyp zwar in der Lage ist, die Konstitution
eines Moleküls zu beschreiben, lassen sich für die Bindung essentielle stereochemische
Aspekte, wie z.B. die absolute Konfiguration von asymmetrischen Zentren, meistens nicht
erfassen.
Beide Arten von Deskriptoren sind nicht dazu befähigt, die konformative Flexibilität der
betrachteten Verbindungen zu berücksichtigen. Daher werden sie häufig verwendet, wenn die
räumliche Struktur des biologischen Zielmoleküls (z.B. Enzym) nicht bekannt ist.
4.3.1 3D-QSAR – Comparative Molecular Field Analysis
Die volle Erfassung der konstitutionellen, konformativen und stereochemischen Charakteristi-
ka von Inhibitorstrukturen gelingt mit Hilfe von sog. 3D-Deskriptoren. Eine der am häufig-
sten verwendeten Methoden ist die molekulare Feldanalyse (engl. Comparative Molecular
Field Analysis, CoMFA).[112]
Jede Verbindung des Datensatzes muß dabei durch eine einzelne Konformation repräsentiert
werden, in der der Inhibitor vorliegt, wenn er mit dem Protein in Wechselwirkung tritt. Han-
delt es sich bei den betrachteten Verbindungen um starre Moleküle, so können Hypothesen
für diese aktiven Konformationen häufig leicht aufgestellt werden. Bei konformativ flexiblen
Verbindungen stellt diese Aufgabe ein großes Problem dar. In diesem Zusammenhang können
z.B. Vergleiche von Molekülvolumina und Substrukturen sowie elektrostatische Potentiale
wertvolle Informationen liefern. Einen anderen Ausweg bilden Docking-Methoden, die aller-
dings nur dann angewendet werden können, wenn die räumliche Struktur des Proteins wie im
53
vorliegenden Fall (s.o.) bekannt ist. Die Konformationen der betrachteten Verbindungen wer-
den in ein Gitternetz eingefaßt, das sie alle weiträumig umfaßt (Abbildung 13). Die Punkte
des Gitternetzes sind in einem regelmäßigen Abstand in der Größenordnung von üblicher-
weise 1 bis 2 Å angeordnet. An jeden Gitterpunkt setzt man üblicherweise nacheinander
mehrere Sonden (z.B. Methylgruppe oder positiv geladenes Wasserstoffatom) und berechnet
separat die Wechselwirkungsenergien zwischen diesen Sonden und jedem einzelnen Molekül
des Datensatzes. Sterische Wechselwirkungen (S) lassen sich durch das Lennard-Jones-Poten-
tial erfassen, während zur Berechnung der elektrostatischen Wechselwirkungen (E) häufig das
Coulomb-Potential herangezogen wird.
↓
↓↓
↓molekulare Felder
Verb. -log(IC50)S
1S2S3... SnE1E2E3... En...
4.15
5.74
.
.
.
3.89
8.83
6.74
↓
↓↓
↓PLS-Statistk
-log(IC50) = y + a S1+ b S2 + c S3 + ... + h Sn + k E1 + m E2 + n E3 + ... + z En + ...
Abbildung 13: Schritte bei der CoMFA-Methode
54
Die an den Gitterpunkten für die Sonden erzeugten Energiewerte stellen die Deskriptoren dar,
deren Gesamtheit als molekulares Feld bezeichnet wird. Bei Annäherung der Sonde an die
Moleküloberfläche liefern beide Potentiale dem Betrag nach extrem hohe Werte.
Überschreiten die berechneten Energien festgelegte Grenzwerte, so werden die entsprechen-
den Gitterpunkte nicht weiter betrachtet. Bei einer Kantenlänge von 15 bis 25 Å und einer
Maschenweite des Gitters von 1 bis 2 Å sind pro Molekül des Datensatzes mehrere tausend
Feldpunkte zu behandeln. Die Feldbeiträge an jedem der n Gitterpunkte (S1, S2 ... Sn, E1, E2 ...
En) werden für alle Verbindungen in eine Tabelle eingetragen.
Die Tabelle in Abbildung 13 besitzt einen für QSAR-Analysen typischen Aufbau. Jede Zeile
beschreibt die Struktur eines Moleküls des Datensatzes. Um die Signifikanz herauszufinden,
die den einzelnen Feldpunkten, d.h. Deskriptoren, bei der Beschreibung der biologischen
Aktivität zukommt, bedient man sich statistischer Methoden.
4.3.2 Statistische Methoden: Principal Component Analysis (PCA)
Bei 3D-QSAR-Studien hat man es üblicherweise mit Datensätzen aus weniger als einhundert
Verbindungen zu tun, deren Beschreibung durch mehrere tausend Deskriptoren (Gitterpunkte
bei CoMFA) erfolgt. Aus mathematischer Sicht werden alle Strukturen durch je einen Zeilen-
vektor beschrieben. Fügt man diese Zeilenvektoren zu einer Tabelle zusammen (Abbildung
13), so bilden sie eine Matrix. Diese Deskriptormatrix wird häufig als X-Matrix bezeichnet,
wohingegen die experimentell bestimmten biologischen Aktivitäten (IC50-Wert) die sog. Y-
Matrix bilden. Prinzipiell können mehrere Aktivitätswerte simultan in die Analyse eingehen,
was zu einer höher dimensionierten Y-Matrix führt.
Die große Anzahl von Deskriptoren macht es bei 3D-QSAR Studien unmöglich, durch bloße
visuelle Inspektion der X-Matrix Muster oder gemeinsame Trends zwischen den einzelnen
Variablen auszumachen. Zur Reduzierung der Dimensionalität der X-Matrix unter möglichst
vollständiger Konservierung des ursprünglichen Informationsgehalts bedient man sich der
Principal Component Analysis (PCA).[113]
Zur Erklärung des Prinzips der PCA soll das nachfolgende Beispiel dienen. Die Größe einer
Variablen Y (biologische Aktivität) wird als Funktion zweier davon unabhängiger Variablen
X1 und X2 (Deskriptoren) dargestellt (Abbildung 14a).
55
Y
X2
X1
X2
X
1
a. Darstellung der abhängigen Variablen
Y als Funktion von X1 und X2
b. Projektion von Y in die X1/X2-Ebene
Abbildung 14: Zur Erklärung der Hauptkomponentenanalyse
Durch Projektion von Y in die X1/X2-Ebene erhält man die Darstellung 2b. Die Größen der
einzelnen Ellipsen repräsentieren die Werte der abhängigen Variablen Y (Isolinien). Die
äußerste Ellipse umfaßt alle Datenpunkte. Der Mittelpunkt der Ellipsen fällt mit dem Schnitt-
punkt der Mittelwerte
µ
1 und
µ
2 der beiden
unabhängigen Variablen zusammen. Die län-
gere Achse der Ellipse korrespondiert mit der
Variablen mit der größeren Varianz (hier
σ
1),
d.h. X1 erstreckt sich über einen weiteren Be-
reich als X2 und besitzt somit den größten In-
formationsgehalt. Beide Ellipsenachsen ver-
laufen parallel zu den Koordinatenachsen,
d.h. X1 und X2 sind nicht miteinander assozi-
iert. Besteht jedoch zwischen den Variablen
X1 und X2 eine Korrelation, so ist die Ellipse
gedreht (Abbildung 15). Eine Transformation (X1´ und X2´) wird durch Translation des Koor-
dinatenursprungs ins Zentrum der Ellipse (d.h. in den Schnittpunkt der Mittelwerte
µ
1 und
µ
2)
erzielt. Das Koordinatensystem X1´´/X2´´ entsteht aus X1´/X2´ durch Rotation um den Winkel
α, so daß die Koordinatenachsen mit den Ellipsenachsen zusammenfallen. Dieser Prozeß aus
Translation und Rotation des ursprünglichen Koordinatensystems X1/X2 ist der eigentliche
Schritt der PCA und die Achsen des neuen Koordinatensystems repräsentieren die Principal
µ
1
µ
2
X1
X
2X2'' X2'
X1''
X1'
Abbildung 15: PCA
56
Components (PC). Bei höherdimensionalen Problemen werden alle Achsen der gleichen
Translation und Rotation unterzogen. Die durch diese Transformationen erhaltenen PCs sind
Linearkombinationen, die die ursprünglichen Variablen X1 und X2 gemäß gemeinsamer
Trends zusammenfassen. Im Unterschied zu diesen sind sie jedoch orthogonal, d.h. die PCs
besitzen untereinander keinerlei Kollinearität. Die erste PC erklärt den größten Teil der
Varianz innerhalb der X-Matrix. Bei den weitereren PCs nimmt der darin enthaltene
Informationsgehalt kontinuierlich ab. Prinzipiell läßt sich die gesamte in der X-Matrix
vorhandene Information durch Extraktion vieler PCs erfassen. Die Anzahl wird allerdings in
der Praxis auf einige wenige beschränkt, da ansonsten eine Interpretation nicht möglich ist.
Mathematisch wird der folgende Zusammenhang aufgestellt:
X = T ∗ P + E
Aus der X-Matrix, die aus n Zeilen (Verbindungen) und m Spalten (Deskriptoren) aufgebaut
ist, werden unter Berücksichtigung dieses Zusammenhangs k PCs extrahiert. Dabei ist P die
sog. Loading-Matrix, die aus m Zeilen und k Spalten besteht. Sie beinhaltet Informationen
über die ursprünglichen Deskriptoren in Form der Koeffizienten der Linearkombinationen.
Die sog. Score-Matrix T beschreibt die einzelnen Verbindungen des Datensatzes und besteht
aus n Zeilen und k Spalten. Die Matrix E enthält die Information, die nicht in den extrahierten
PCs erfaßt ist und besitzt dieselbe Dimensionalität wie die ursprüngliche X-Matrix. Durch die
Analyse von Score-Plots der wichtigsten PCs lassen sich Aussagen über die strukturelle
Homogenität des Datensatzes ableiten. So können Cluster von Verbindungen und auch
Außenseiter identifiziert werden. Anhand von Loading-Plots hingegen läßt sich die Bedeu-
tung einzelner Deskriptoren für die betrachteten PCs ermessen. Je näher sich ein Deskriptor
am Mittelpunkt befindet, desto geringer ist sein Einfluß.
Die PCA ist in der Lage, aus einer großen Datenmenge relevante und erklärende Faktoren zu
extrahieren, wobei hingegen die Struktur der Y-Matrix unberücksichtigt bleibt.
4.3.3 Statistische Methoden: Partial Least Squares (PLS)
Ziel von QSAR-Untersuchungen ist es, die biologische Aktivität mit den Deskriptoren zu ver-
knüpfen. Unter der Annahme, daß der Zusammenhang zwischen der biologischen Aktivität
und den Deskriptoren linearer Natur ist, kann zu diesem Zweck z.B. die Multiple Lineare Re-
gression (MLR) eingesetzt werden, die eine Erweiterung der einfachen Linearen Regression
57
ist.[113] Bei der MLR werden alle unabhängigen Variablen (Deskriptoren) in einer Linearkom-
bination direkt zur QSAR-Gleichung zusammengefaßt, die den Wert der abhängigen Varia-
blen ergibt (biologische Aktivität). Die Anwendung von MLR ist jedoch in zweierlei Hinsicht
beschränkt. Einerseits kann diese Methode nur dann sinnvoll angewendet werden, wenn die
Anzahl der Verbindungen etwa dreimal so hoch ist wie die Anzahl der Deskriptoren. Anderer-
seits setzt MLR voraus, daß die Deskriptoren untereinander nicht korreliert sind. Beide
Voraussetzungen sind bei 3D-QSAR Untersuchungen häufig nicht erfüllt. Bei CoMFA bei-
spielsweise ist die Anzahl der unabhängigen Einflußgrößen im Verhältnis zu den abhängigen
Variablen sehr groß. Aufgrund der Kontinuität der molekularen Felder ist darüber hinaus zu
erwarten, daß Kollinearitäten zwischen einzelnen Deskriptoren (z.B. unmittelbar benachbarte
Gitterpunkte) auftreten.
Die Regressionsmethode der Wahl für derartige Probleme ist die Partial Least Squares-
Statistik (PLS).[114] Ähnlich wie die PCA beschreibt die PLS-Statistik die Struktur der X-
Matrix durch Extraktion sog. Latenter Variablen (LV). Der wichtigste Unterschied zwischen
LVs und PCs ist aber, daß bei der Erzeugung der LVs simultan die inneren Strukturen von X-
und Y-Matrix erfaßt werden. Das geschieht bei gleichzeitiger Maximierung der Korrelation
beider Matrices.
Bei diesem Ansatz darf jedoch nicht übersehen werden, daß die biologischen Aktivitäten wie
alle experimentell gemessenen Größen mit Fehlern behaftet sind. Ziel der PLS-Statistik ist es,
eine optimale Korrelation zwischen X- und Y-Matrix aufzustellen. Dabei wird dieses
„Rauschen“ weder berücksichtigt noch herausgefiltert.
Die Qualität, mit der das PLS-Modell den Datensatz erfaßt, läßt sich anhand des Korrelations-
koeffizienten r abschätzen. Die Beschreibung ist um so besser, je näher r an 1 liegt.
2
,
2
,,
)(
)(
1
actiact
icalciact
yy
yy
r−Σ
−Σ
−=
act
icalc
iact
y
y
y
,
,gemessene Aktivität von Verbindung i
berechnete Aktivität der Verbindung i
Mittelwert der gemessenen Aktivitäten
Die Anwendung der PLS-Statistik auf molekulare Felder liefert eine QSAR-Gleichung, die
angibt, in welchem Ausmaß bestimmte Gitterpunkte der einzelnen Felder zur biologischen
Aktivität beitragen, d.h. welche Bereiche der molekularen Felder am besten mit den experi-
mentell bestimmten Daten korrelieren. Durch Verwendung einer ausreichend großen Menge
von Deskriptoren läßt sich mit statistischen Methoden fast immer eine Korrelation finden.
Eine zu große Anzahl von Deskriptoren kann zur künstlichen Konstruktion eines funktionalen
58
Zusammenhangs zwischen diesen Variablen und der biologischen Aktivität führen. Bedingt
durch die vielen Einflußgrößen (Feldpunkte bzw. Deskriptoren), die in der Analyse auszuwer-
ten sind, ist eine strenge Kontrolle der statistischen Signifikanz der abgeleiteten Ergebnisse
erforderlich. Diese Signifikanz wird durch Anwendung eines besonderen Tests, der Kreuz-
validierung, überprüft. Dazu entnimmt man dem Datensatz zufällig Verbindungen und erstellt
mit den verbleibenden Derivaten ein Modell für die biologische Aktivität. Mit diesem Modell
wird dann die Aktivität der zuvor herausgenommenen Verbindungen vorhergesagt. Üblicher-
weise wird in jedem Schritt ein einzelnes Derivat herausgelassen (LOO, Leave One Out). Der
Prozeß wird solange wiederholt, bis jede Verbindung des Datensatzes einmal eliminiert wor-
den ist. Diese Technik dient einer inneren Validierung des aufgestellten Modells. Die Güte
der Vorhersagen im Vergleich zu den experimentellen Werten stellt ein Maß für die Qualität
des Modells dar. Die Zuverlässigkeit und Signifikanz des aufgestellten Modells wird durch
den kreuzvalidierten Korrelationskoeffizienten q2 quantifiziert.
qyy
yy
act i pred i
act i act
2
2
2
1=− −
−
Σ
Σ
()
()
,,
,
y
y
y
act i
pred i
act
,
,
gemessene Aktivität von Verbindung i
vorhergesagte Aktivität der Verbindung i
Mittelwert der gemessenen Aktivitäten
Ist der Wert von q2 negativ, so ist die Signifikanz dieses Modells nicht besser als die eines
zufällig aufgestellten. Je mehr sich der Qualitätsparameter dem Wert 1 annähert, um so besser
ist das erzeugte Modell zur Vorhersage geeignet. Ganz allgemein ist einem Modell nur dann
Vertrauen zu schenken, wenn der zugehörige q2-Wert oberhalb von 0.4 bis 0.5 liegt.[75] Es ist
nicht ungewöhnlich, daß Gruppen von Verbindungen des Datensatzes besondere strukturelle
Charakteristika gemeinsam haben. Wird bei der Kreuzvalidierung lediglich eine Struktur eli-
miniert (LOO-Methode), so ist häufig immer noch ein gewisser Informationsgrad über diesen
Repräsentanten in der X-Matrix enthalten. Dies kann zu einer allzu optimistischen Bewertung,
d.h. zu einem zu hohen q2-Wert führen. Demgegenüber bietet die simultane Eliminierung
mehrerer Verbindungen (LSO, Leave Several Out) während der Kreuzvalidierung zumindest
prinzipiell die Möglichkeit, die gesamte Information über eine Gruppe von Strukturen inner-
halb des Datensatzes aus der X-Matrix zu entfernen. Die erhaltenen q2-Werte sind dann zwar
oftmals kleiner als bei LOO, die Aussagekraft des Modells für externe Vorhersagen kann hin-
gegen unvoreingenommener interpretiert werden.
59
Ein weiterer Qualitätsparameter ist SDEP (engl. Standard Deviation Error of Prediction). Je
kleiner der Wert von SDEP ist, desto besser stimmen die aus der Kreuzvalidierung resultie-
renden Aktivitäten mit den tatsächlichen überein.
N
yy
SDEP ipred
iact
2
,
,)( −
=∑
N
y
y
ipred
iact
,
,gemessene Aktivität von Verbindung i
vorhergesagte Aktivität der Verbindung i
Anzahl der Aktivitäten
Eine andere Methode zur Überprüfung der Signifikanz des gefundenen Modells besteht in der
Durchführung von Permutationstests.[115] Dazu werden die biologischen Aktivitäten der Ver-
bindungen willkürlich vertauscht, wodurch neue Datensätze entstehen. Für diese Datensätze
werden QSAR-Modelle aufgestellt. Ergibt die Anwendung der Kreuzvalidierung auf die per-
mutierten Datensätze ausschließlich niedrige q2-Werte, so ist die Wahrscheinlichkeit hoch,
daß es sich bei dem Originalmodell nicht um eine zufällige Korrelation handelt. Die Gesamt-
zahl möglicher Aktivitäts-Permutationen beträgt Fakultät der Anzahl der Verbindungen des
Datensatzes. Üblicherweise werden Permutationstests aber nur für einen geringen Teil aller
möglichen Permutationen durchgeführt, so daß die Ergebnisse dieses Tests nicht überbewertet
werden dürfen.
Die beste Art, das Ergebnis einer QSAR-Untersuchung zu validieren, besteht in der Vorher-
sage von Aktivitäten externer Verbindungen, die nicht in die Erzeugung des Modells einge-
gangen sind. Ein Vergleich der vorhergesagten mit den gemessenen Aktivitäten läßt Aussagen
zu, ob das gewonnene QSAR-Modell wirklich signifikant ist.
4.3.4 Variablenselektion – die GOLPE-Methode
3D-QSAR Studien liegt das Konzept zugrunde, daß durch die große Anzahl der Variablen der
X-Matrix die strukturellen Eigenheiten der Verbindungen des Datensatzes erfaßt und somit
die unterschiedlichen Aktivitäten erklärt werden können. Dabei darf man allerdings nicht
außer Acht lassen, daß nicht alle Deskriptoren mit der biologischen Wirkung korreliert sein
müssen. Obwohl diese Deskriptoren für die Struktur der Y-Matrix nicht wichtig sind, beein-
flussen sie doch die Struktur der X-Matrix und verursachen Rauschen. Ähnlich wie bei der Y-
Matrix ist die PLS-Statistik nicht in der Lage, dieses Rauschen zu berücksichtigen, was in der
Praxis zu schlechten Modellen führen kann.
60
Um aus der Vielzahl der Deskriptoren diejenigen herauszufiltern, die für die behandelte Pro-
blemstellung wirklich signifikant sind, wird eine sog. Variablenselektion durchgeführt.
Zu diesem Zweck gibt es eine Reihe von Verfahren, die z.B. auf genetischen Algorithmen
(MUSEUM[116,117], GA-PLS[118], GARGS[119]), Erweiterungen der PLS-Statistik (IVS-
PLS[120,121], VIP[122]) oder der Auswahl von Regionen (q2-GRS[123], SRD[124]) beruhen.
In der vorliegenden Promotionsarbeit wurde die GOLPE-Methode (engl. Generating Optimal
Linear PLS Estimations) verwendet.[125,126] Das Verfahren wird nachfolgend genauer
beschrieben.
Der erste Schritt einer QSAR-Analyse besteht in der Aufstellung und Validierung eines
QSAR-Modells mit allen Deskriptoren durch PLS-Statistik und Kreuzvalidierung. Die
GOLPE-Prozedur sollte auf dieses Modell nur dann angewendet werden, wenn es eine gewis-
se statistische Signifikanz besitzt, d.h. der q2-Wert beispielsweise über 0.2 liegt. Im zweiten
Schritt werden durch ein sog. D-optimal Design redundante Deskriptoren eliminiert, die nur
einen sehr geringen Einfluß auf die Latenten Variablen haben. Anschließend wird für die ver-
bleibenden Deskriptoren ein PLS-Modell erstellt. Bei diesem iterativen Prozeß wird die
Größe der X-Matrix solange um jeweils 50% verringert, bis sich eine signifikante Änderung
des PLS-Modells einstellt. Nach dieser Vorauswahl beginnt die eigentliche Variablenselek-
tion durch FFD (Fractional Factorial Design). Dabei wird der Einfluß der verbleibenden Des-
kriptoren auf die Vorhersagequalität evaluiert. GOLPE erzeugt und validiert eine große An-
zahl neuer Modelle, die sich vom Originalmodell dadurch unterscheiden, daß verschiedene
Deskriptoren eliminiert oder beibehalten werden. Die unterschiedlichen Variablenkombinatio-
nen ergeben nach Kreuzvalidierung verschiedene Werte für SDEP, was die Bestimmung des
Einflusses jedes einzelnen Deskriptors auf diesen Qualitätsparameter erlaubt. Um nun die
Deskriptoren auswählen zu können, die sich positiv auf die Vorhersagekraft auswirken (d.h.
den Wert von SDEP verringern), werden Zufallsvariablen eingeführt, die per Definition kei-
nen realen Effekt auf das Modell haben können. Rein rechnerisch wirken sich die Zufallsva-
riablen jedoch auf das Modell aus. Über einen Student t-Test werden die Einflüsse der
einzelnen Originaldeskriptoren mit dem mittleren Einfluß der Zufallsvariablen bei einem Ver-
trauensbereich von 95% verglichen. Deskriptoren, die einen signifikant geringeren Effekt als
die Zufallsvariablen haben, werden eliminiert. Die Variablenselektion durch FFD wird so
lange wiederholt, bis die Anzahl der ausgewählten Deskriptoren konstant bleibt. Auf Basis
der so erhaltenen reduzierten X-Matrix wird dann ein neues QSAR-Modell erzeugt, dessen
Vorhersagequalität in der Regel wesentlich besser ist als die des Originalmodells.
61
Zwei Punkte müssen bei der Variablenselektion beachtet werden. Eliminiert man zu wenig
Deskriptoren, so besteht die Gefahr, daß das Rauschen nicht ausreichend aus der X-Matrix
entfernt wird. Eliminiert man hingegen zu viele Deskriptoren, so besteht die Gefahr, daß die
innere Struktur der X-Matrix zerstört wird. Das erhaltene Modell ist zwar in der Lage, die
Aktivitäten des Datensatzes optimal vorherzusagen (Kreuzvalidierung), versagt aber bei der
Anwendung auf datensatzfremde Verbindungen.
4.3.5 3D-QSAR Untersuchungen zur anti-AChE-Aktivität der Galanthamin-Derivate
Zur Erzeugung der molekularen Felder für die aus der Docking-Studie resultierenden
hypothetischen aktiven Konformationen der behandelten Galanthamin-Derivate wurde das
Programm GRID (Version 16)[127] verwendet. Bei diesem Programm handelt es sich um ein
Kraftfeld, das u.a. für derartige 3D-QSAR Untersuchungen parameterisiert wurde. Aus der
Vielzahl von Sonden, die GRID bereitstellt, wurden solche ausgewählt, die die nicht-kova-
lenten Wechselwirkungen zwischen einem Protein und einem Inhibitormolekül simulieren
können (Tabelle 10). Für die Dielektrizitätskonstante wurde ein konstanter Wert von 20 ver-
wendet, um so der relativ unpolaren Umgebung innerhalb des Schlauchs Rechnung zu tragen.
Tabelle 10: Primär ausgewählte Sonden
Sonde Beschreibung
C3 Methylgruppe, sterische Wechselwirkungen
DRY hydrophobe Sonde, hydrophobe Wechselwirkungen
LI+ Natriumkation, elektrostatische Wechselwirkungen
O:: Sauerstoffatom der Carbonylgruppe, Wasserstoffbrücken-Akzeptor
Es wurde ein Gitternetz erzeugt, das alle aktiven Konformationen weiträumig umgibt. Die
Auflösung dieses Gitternetzes bestimmt die Gesamtzahl der Punkte und damit die Anzahl der
Deskriptoren. Üblicherweise wählt man eine Auflösung im Bereich von 1.0 Å bis 2.0 Å. Um
die Abhängigkeit des Ergebnisses der QSAR-Studie von der Gitterauflösung zu untersuchen,
wurden zunächst drei Gitternetze mit einem Punktabstand von 1.0 Å, 1.5 Å und 2.0 Å unab-
hängig voneinander verwendet. Für die vier primär ausgewählten Sonden wurden die moleku-
laren Felder bei jeder Gitterauflösung erzeugt. Ziel war es zunächst, Sonden auszuwählen, die
gut zwischen den Verbindungen des Datensatzes differenzieren können.
62
4.3.5.1 Auswahl der Sonden
Eine unter Berücksichtigung aller primär ausgewählten Sonden parallel für die drei
Gitterauflösungen durchgeführte PCA zeigt, daß in allen Fällen bereits die beiden ersten PCs
über 50% der Varianz innerhalb der X-Matrix erklären. In Abbildung 16 ist ein Score-Plot
dieser beiden PCs für die verschiedenen Sonden bei 1.0 Å Gitterauflösung wiedergegeben
(die Score-Plot bei den anderen Gitterauflösungen ergeben ein sehr ähnliches Bild). Die
Symbole entsprechen den einzelnen Verbindungen des Datensatzes.
- 600 - 400 - 200 0 200
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
PC 2
PC 1
DRY
LI+
O::
C3
Abbildung 16: Ergebnis der PCA für alle Sonden bei 1.0 Å Gitterauflösung (Score-Plot)
Bei der Analyse des Score-Plots zeigt sich, daß die DRY-Sonde praktisch nicht in der Lage
ist, zwischen den Verbindungen des Datensatzes zu differenzieren, wenn man die Score-Wer-
te der übrigen Sonden als Maßstab zugrunde legt. Die C3-Sonde und die O::-Sonde besitzen
einen redundanten Informationsgehalt, da ihre Wertebereiche eine vergleichbare vertikale
Spannbreite haben und sie die Verbindungen im Score-Plot jeweils an sehr ähnliche Posi-
tionen setzen. Die LI+-Sonde kann zwar im Vergleich zur C3- und zur O::-Sonde nicht so gut
zwischen den Verbindungen unterscheiden (geringere vertikale Spannbreite der Score-Werte),
ist aber deutlich von diesen abgesetzt. Allgemein ergibt sich ein homogenes Bild, d.h. für
keine der Sonden sind extreme Ausreißer festzustellen.
Zum weiteren Vergleich wurden für alle Felder unabhängig voneinander PLS-Analysen
durchgeführt (5 LVs). Die gemessenen biologischen Aktivitäten werden gegen die mit dem
PLS-Modell berechneten aufgetragen (Abbildung 17).
63
45678
4
5
6
7
8
DRY
LI+
O::
C3
berechnete Aktivitäten (IC
50
)
experimentell bestimmte Aktivitäten (IC
50
)
Abbildung 17: Ergebnis der PLS-Analyse
Das für die DRY-Sonde aufgestellte PLS-Modell ist nicht in der Lage, die biologischen Akti-
vitäten auch nur annähernd zu reproduzieren; alle Punkte liegen praktisch auf einer waage-
rechten Linie. Dies ist nicht überraschend, da bereits bei der Betrachtung des Score-Plot fest-
gestellt wurde, daß diese Sonde nicht ausreichend zwischen den einzelnen Verbindungen dif-
ferenzieren kann. Die übrigen Sonden ergeben zumindest tendenziell richtige Ergebnisse. Die
DRY-Sonde wurde daher an dieser Stelle ausgeschlossen. Augrund des redundanten Informa-
tionsgehalts der O::-Sonde und der C3-Sonde erscheint es sinnvoll, nur eines dieser beiden
molekularen Felder für die weiteren Untersuchungen zu verwenden. Die Wahl fiel dabei auf
die C3-Sonde für sterische Wechselwirkungen, die sich in „klassischer“ Kombination mit der
LI+-Sonde (Elektrostatik) in der Praxis bewährt hat.[112]
4.3.5.2 Bestimmung der optimalen Gitterauflösung
Mit jeder der drei Gitterauflösungen wurden für jede Sonde unabhängige QSAR-Modelle
durch Anwendung der PLS-Statistik aufgestellt. Die optimale Anzahl von LVs ist erreicht,
wenn sich die Vorhersagequaliät bei Extraktion weiterer LVs verschlechtert, d.h. wenn SDEP
zunimmt bzw. q2 sich verringert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gegenübergestellt.
64
Tabelle 11: Ergebnisse der Kreuzvalidierung der einzelnen Sonden
1.0 Å Gitterauflösung 1.5 Å Gitterauflösung 2.0 Å Gitterauflösung
C3 (r = 0.777) C3 (r = 0.765) C3 (r = 0.486)
LV SDEP q2LV SDEP q 2 LV SDEP q2
1 0.758 0.086 1 0.763 0.073 1 0.763 0.073
2 0.704 0.210 2 0.722 0.168 2 0.739 0.130
3 0.698 0.224 3 0.717 0.181
4 0.670 0.285 4 0.694 0.232
LI+ (r = 0.8433) LI+ (r = 0.7927) LI+ (r = 0.3125)
LV SDEP q2LV SDEP q 2 LV SDEP q2
1 0.747 0.117 1 0.742 0.124 1 0.753 0.096
2 0.742 0.123 2 0.728 0.155
3 0.705 0.209 3 0.699 0.222
4 0.698 0.223
5 0.696 0.228
C3, LI+: Sonden aus GRID; r: Korrelationskoeffizient; LV: Latente Variable;
SDEP: Standard Error of Prediction; q2: kreuzvalidierter Korrelationskoeffizient
Legt man für den Vergleich die r-Werte aus der PLS-Rechnung sowie die q2- und die SDEP-
Werte aus der Kreuzvalidierung zugrunde, so ist zu beobachten, daß sich diese Qualitätspara-
meter mit zunehmender Gitterauflösung verschlechtern. In allen Fällen ist die Gitterauflösung
von 1.0 Å den anderen überlegen.
Tabelle 12: Ergebnisse der Kreuzvalidierung der beiden Sonden
1.0 Å Gitterauflösung 1.5 Å Gitterauflösung 2.0 Å Gitterauflösung
C3, LI+ (r =0.817)
25203 Deskriptoren
C3, LI+ (r =0.623)
13797 Deskriptoren
C3, LI+ (r =0.596)
6317 Deskriptoren
LV SDEP q2LV SDEP q2LV SDEP q2
1 0.746 0.113 1 0.747 0.112 1 0.753 0.097
2 0.704 0.211 2 0.709 0.199 2 0.738 0.132
3 0.704 0.201
4 0.667 0.292
65
Betrachtet man die Kombination beider Sonden, so zeigt sich, daß auch hier das Gitternetz
mit der geringsten Maschenweite die besten Ergebnisse liefert (Tabelle 12).
Bei der Zielsetzung, eine QSAR-Gleichung durch Variablenselektion zu verbessern, muß man
darauf achten, daß bereits das Ausgangsmodell, bei dem alle Variablen berücksichtigt werden,
eine gewisse Mindestvorhersagequalität hat. Liegt der Wert von q2 sehr nahe bei Null oder
sogar darunter, ist eine nachfolgende Variablenselektion nicht empfehlenswert, da es anson-
sten zur rein rechnerischen Optimierung eines nur schwach ausgeprägten bzw. gar nicht vor-
handenen Zusammenhangs zwischen Deskriptoren und biologischer Aktivität kommt. Der zur
geringsten Gitterauflösung gehörende Wert für q2 ist mit 0.2923 bei mehr als 25000 einbezo-
genen Deskriptoren zwar nicht besonders hoch, liegt aber dennoch in einem Bereich, in dem
eine nachfolgende Variablenselektion sinnvoll erscheint.
Bevor jedoch damit begonnen wird, ist es sinnvoll, zu untersuchen, wie die gewählten Des-
kriptoren den Datensatz beschreiben. Dies geschieht zunächst auf Basis einer PCA, d.h. ohne
Berücksichtigung der biologischen Aktivität.
-600 -400 -200 0 200
-400
-200
0
200
400
PC1
PC2
-600 -400 -200 0 200
-400
-300
-200
-100
0
100
200
P
C1
PC3
- 400 - 200 0 200 400
-400
-300
-200
-100
0
100
200
PC2
PC3
Abbildung 18: Ergebnis der PCA – Verteilung der Verbindungen (Score-Plot)
Die ersten drei PCs erklären 43% der Varianz innerhalb der X-Matrix. Die Verbindungen des
Datensatzes sind zwar nicht so gleichmäßig im Hauptkomponentenraum verteilt, wie es
66
wünschenswert wäre, jedoch zeigt die visuelle Inspektion der drei Score-Plots weder extreme
Ausreißer noch ein augeprägtes Clustering (Abbildung 18). Die Strukturbeschreibung durch
die gewählten Sonden ist also akzeptabel.
Um die inneren Beziehungen zwischen X- und Y-Matrix bei dieser Maschenweite erfassen zu
können, erstellt man für die ersten beiden LVs (PLS-Statistik) t/u-Plots.
-300 -200 -100 0 100 200 300 400
-
2
-
1
0
1
2
u1 (Y-Score)
t1 (X-Score)
-
300 -200 -100 0 100 200 300 400
0
5
0
5
0
5
0
5
0
u2 (Y-Score 2. LV)
t2 (X-Score 2. LV)
1. Latente Variable (r = 0.620) 2. Latente Variable (r = 0.634)
Abbildung 19: Innere Beziehungen zwischen X- und Y-Matrix, Ausgangsmodell
Die in Abbildung 19 dargestellten Plots lassen erkennen, daß eine Korrelation zwischen der
X- und der Y-Matrix besteht. Nach Extraktion der ersten LV können moderate Ausreißer
identifiziert werden, die sich in einiger Entfernung zur eingezeichneten Geraden befinden. Bei
Berücksichtigung der zweiten LV ergibt sich ein homogeneres Bild. Diese Plots lassen
ebenfalls keine ausgeprägte Cluster von Verbindungen erkennen.
Mit Hilfe der Permutationstests (s.o.) kann untersucht werden, wie sich das zufällige Vertau-
schen der biologischen Aktivitäten auf die Modellqualität auswirkt. Dazu wurden 50 Daten-
sätze generiert, die dieselbe X-Matrix wie der Originaldatensatz besitzen, sich von diesem je-
doch durch willkürliche Umordnung ihrer jeweiligen Y-Matrix unterscheiden. Auf diese Da-
tensätze wurde die PLS-Statistik in Kombination mit der Kreuzvalidierung angewendet, so
daß man für jeden einen r- und einen q2-Wert erhält. Als Maß für die Abweichung zwischen
einem permutierten Datensatz und der original Y-Matrix dient der Korrelationskoeffizient R,
der sich jeweils aus einer linearen Regression zwischen beiden Aktivitätsreihenfolgen ergibt.
Die Reihenfolgen stimmen umso besser überein, je größer R ist. Die Ergebnisse sind in
Abbildung 20 graphisch dargestellt.
67
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 q2 und r (PLS)
R (Abweichung vom Originaldatensatz)
Originaldatensatz
r-Werte
q2-Werte
Abildung 20: Ergebnisse des Permutationstests
In den r- und q2-Werten der permutierten Modelle zeigt sich, daß das Originalmodell (R = 1)
diesen überlegen ist. In einigen Fällen liegt der r-Wert zwar in einer ähnlichen Größenord-
nung wie bei der original Y-Matrix, die q2-Werte sind jedoch durchweg schlechter. In keinem
Fall wird gefunden, daß gleichzeitig beide Qualitätsparameter dem Originalmodell nahe kom-
men. Über eine lineare Regession errechnen sich die Achsenabschnitte für r und q2 zu 0.290
(gestrichelte Linie) bzw. –0.195 (durchgezogene Linie). Die Achsenabschnitte entsprechen
Permutationen, bei denen keinerlei Korrelation zwischen ursprünglichem und vertauschtem
Datensatz vorhanden ist (R = 0). Der hier aufgefundene Wert für r ist zwar positiv, liegt aber
mit einer Differenz von 0.548 deutlich unterhalb des r-Wertes vom Originalmodell. Der q2-
Wert ist negativ, was bedeutet, daß das zugehörige Modell einer Zufallskorrelation entspricht.
Die gewählten Deskriptoren erlauben also eine adäquate Beschreibung des Datensatzes, da
sich weder extreme Ausreißer noch Cluster von Verbindungen identifizieren lassen (Score-
Plots, PCA). Zwischen der biologischen Aktivität und den Deskritporen besteht ein innerer
Zusammenhang, was aus den t/u-Plots (PLS) ersichtlich ist. Darüber hinaus übertrifft die
Qualität des Originalmodells die der permutierten Modelle.
68
4.3.5.3 Variablenselektion
Da eine Variablenselektion durch FFD sehr rechenintensiv ist, kann in GOLPE eine
Vorauswahl auf der Grundlage des weniger aufwendigen D-optimal Design durchgeführt
werden. Die Zahl von mehr als 25000 Deskriptoren, die die Basis des Ausgangsmodells bil-
den, ließ sich so in drei Schritten auf 3150 reduzieren, wobei jeweils etwa 50% der Variablen
eliminiert wurden. Dabei war keine signifikante Änderung des Modells zu beobachten
(Abbildung 21).
25000 20000 15000 10000 5000
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
FFD
D-optimal Design
r, SDEP, q2
B
C
D
B
Anzahl der Variablen
Abbildung 21: Qualität des QSAR-Modells in Abhängigkeit der Variablenanzahl
(D-optimal Design und FFD)
Der erste FFD-Schritt bringt eine drastische Verbesserung des Modells mit sich, was sich be-
sonders an den aus der Kreuzvalidierung stammenden Qualitätsparametern zeigt. So erhöht
sich der Wert von q2 von 0.304 bei 3150 Deskritporen auf 0.587 (2352 Deskriptoren), wäh-
rend der SDEP-Wert gleichzeitig von 0.509 auf 0.456 sinkt. Das FFD wird solange durchge-
führt, bis sich die Qualität des Modells sowie die Anzahl der Variablen stabilisiert (Abbildung
22).
69
3000 2500 2000 1500
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9 r, SDEP, q
2
r-Wert
SDEP-Wert
q
2
-Wert
Anzahl der Variablen
Abbildung 22: Entwicklung des QSAR-Modells während der FFD-Schritte
Die Qualität verbessert sich mit jedem FFD-Schritt. Dabei kann man beobachten, daß sich die
Werte von r, SDEP und q2 jeweils einem Grenzwert annähern. Aus den in Abbildung 23 dar-
gestellten t/u-Plots lassen sich die inneren Beziehungen zwischen X- und Y-Matrix des opti-
mierten Modells ablesen.
-150 -100 -50 0 50 100 150 200
-
2
-
1
0
1
2
u1 (Y-Score, 1. LV)
t1 (X-Score, 1. LV)
-
200 -100 0 100 200
0
5
0
5
0
5
0
5
u2 (Y-Score, 2. LV)
t2 (X-Score, 2. LV)
1. Latente Variable (r = 0.662) 2. Latente Variable (r = 0.784)
Abbildung 23: Innere Beziehungen zwischen X- und Y-Matrix, optimiertes Modell
Die Entfernung des Rauschens durch Variablenselektion hat sich positiv ausgewirkt, was sich
in den gegenüber dem Originalmodell verbesserten Korrelationen zwischen X- und Y-Matrix
widerspiegelt. Die r-Werte haben sich von 0.620 bzw. 0.634 für die erste und zweite LV auf
0.662 und 0.784 verbessert.
70
Die Ergebnisse der LSO-Kreuzvalidierung für das beste Modell sind in Abbildung 24 darge-
stellt. Zur Visualisierung wurden die vorhergesagten IC50-Werte gegen die experimentell be-
stimmten aufgetragen. Dabei zeigt sich eine ausgeprägte Korrelation. Das Modell besitzt eine
hohe innere Vorhersagekraft, was sich in den exzellenten Werten für r, SDEP und q2 zeigt.
C3, LI+ (r = 0.934)
1473 Deskriptoren
LV SDEP q2
1 0.701 0.217
2 0.526 0.556
3 0.483 0.628
4 0.392 0.755
5 0.373 0.778
Abbildung 24: Ergebnisse der Variablenselektion
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß sich die Gitterauflösung von 1.0 Å im Vergleich zu
den anderen untersuchten Maschenweiten durchgesetzt hat. Mit den „klassischen“ CoMFA-
Sonden (C3 für sterische und LI+ für elektostatische Wechselwirkungen) konnte ein signifi-
kantes Ausgangsmodell erstellt werden, das sich im Verlauf der GOLPE-Variablenselektion
weiter verbessern ließ.
45678
4
5
6
7
8
IC
50
(berechnet, Kreuzvaliderung)
IC
50
(experimentell)
71
4.3.6 Quasi-externe Vorhersagen
Im vorangegangenen Abschnitt konnte durch die Erzeugung eines QSAR-Modell mit hoher
interner Vorhersagekraft ein grundsätzlicher Zusammenhang zwischen den verwendeten mo-
lekularen Feldern und der biologischen Aktivität nachgewiesen werden. Der nächste Schritt
besteht in der Evaluierung der externen Vorhersagekraft des Modells. Dazu wird üblicherwei-
se der komplette Datensatz in einen Trainings- und einen Validierungsdatensatz aufgespalten.
Mit dem Trainingsdatensatz erstellt man ein neues QSAR-Modell, dessen Qualität intern
durch Kreuzvalidierung und extern durch Vorhersage der Aktivitäten des Validierungs-
datensatzes bestimmt wird.
Bei der Aufspaltung des Originaldatensatzes hängt das Ergebnis sehr stark davon ab, wie
viele und welche Verbindungen man für Trainings- und Validierungsdatensatz auswählt. Eine
Vorgehensweise dazu beruht auf der Analyse der Score-Plots (PCA). Durch die Extraktion
von N PCs aus der X-Matrix werden die Strukturen vom ursprünglichen Deskriptorraum in
den N-dimensionalen Hauptkomponentenraum projiziert. Die Gesamtheit der Punkte in die-
sem N-dimensionalen Raum kann als Hyperkörper aufgefaßt werden, an dessen Abgrenzun-
gen sich die für den Datensatz repräsentativen Verbindungen befinden. Theoretisch lassen
sich diese Verbindungen durch zwei Techniken, das D-optimal Design und das Factorial
Design (FD), ermitteln. Die zur Durchführung eines D-optimal Design notwendige Software
steht uns derzeit noch nicht zur Verfügung so daß in der vorliegenden Arbeit ausschließlich
das FD zur Aufspaltung des Datensatzes verwendet wurde. Da der erste Schritt in der Durch-
führung einer PCA mit allen Verbindungen besteht und somit bei der Auswahl Informationen
über den späteren Validierungsdatensatz eingehen, ist es korrekter, an dieser Stelle von quasi-
externen Vorhersagen zu sprechen.
Das Prinzip der FD soll in Abbildung 25 für einen dreidimensionalen Hauptkomponenten-
raum erläutert werden. Idealerweise liegen alle Verbindungen des Datensaztes nach der PCA
homogen verteilt innerhalb eines regelmäßigen Würfels, dessen Kanten parallel zu den PC-
Achsen verlaufen. Diese Voraussetzung kann jedoch in der Praxis meist nicht erfüllt werden
(vgl. dazu auch die Score-Plots, Abbildung 18). Als Repräsentanten werden dann die Verbin-
dungen ausgewählt, die sich nahe an den Eckpunkten befinden (P1 bis P8).
72
P1+++
P2 + + –
P3 + – +
P4 + – –
P5 – + +
P6 – + –
P7 – – +
P8–––
Abbildung 25: FD zur Aufspaltung des Datensatzes
Die dargestellte FD-Methode wurde für die Aufspaltung des Datensatzes auf der Basis der
ersten 3 PCs, der ersten 4 PCs und der ersten 5 PCs verwendet, wobei sich je ein Trainings-
sowie ein Validierungsdatensatz ergibt (Tabelle 12).
Tabelle 12: Vertreter der Validierungsdatensätze nach FD
Validierungsdatensatz 1
(3 PCs – 23 Verbindungen)
Validierungsdatensatz 2
(4 PCs – 24 Verbindungen)
Validierungsdatensatz 3
(5 PCs – 25 Verbindungen)1
Sph1070 Sph1217 Sph1058 Sph1216 Sph1058 Sph1216
Sph1107 Sph1290 Sph1060 Sph1227 Sph1060 Sph1217
Sph1185 Sph1329 Sph1070 Sph1262 Sph1070 Sph1227
Sph1216 Sph1335 Sph1107 Sph1277 Sph1103 Sph1262
Sph1166 Sph1288 Sph1107 Sph1277
Sph1185 Sph1290 Sph1117 Sph1288
Sph1187 Sph1329 Sph1146 Sph1290
Sph1193 Sph1335 Sph1166 Sph1302
Sph1185 Sph1329
Sph1186 Sph1335
Sph1187
1nicht alle Ecken des Hyperkörpers (25 = 32) konnten durch Verbindungen besetzt werden
P1
P2
P6
P3
P1P7 P8
P5
P4
73
Die verbleibenden Verbindungen wurden unabhängig voneinander zur Erstellung und Vali-
dierung von QSAR-Modellen herangezogen (einschließlich Variablenselektion mit GOLPE).
Die für die optimierten Modelle erhaltenen Ergebnisse sind in Tabellen 13 zusammengestellt.
Tabelle 13: QSAR-Modelle für die Trainingsdatensätze
Datensatz 1 (3 PCs, 54 Verbindungen)
C3, LI+ (r = 0.841)
Originalmodell (24913 Deskriptoren)
C3, LI+ (r = 0.902)
nach Variablenselektion (2545 Deskriptoren)
LV SDEP q2LV SDEP q2
1 0.669 0.204 1 0.650 0.250
2 0.635 0.285 2 0.581 0.400
3 0.611 0.338 3 0.524 0.512
4 0.584 0.395 4 0.469 0.610
5 0.459 0.626
Datensatz 2 (4 PCs, 46 Verbindungen)
C3, LI+ (r = 0.880)
Originalmodell (246134 Deskriptoren)
C3, LI+ (r = 0.930)
nach Variablenselektion (2587 Deskriptoren)
LV SDEP q2LV SDEP q2
1 0.776 0.151 1 0.675 0.202
2 0.697 0.279 2 0.559 0.455
3 0.642 0.406 3 0.488 0.584
4 0.582 0.450 4 0.429 0.678
5 0.425 0.683
Datensatz 3 (5 PCs, 41 Verbindungen)
C3, LI+ (r = 0.919)
Originalmodell (24614 Deskriptoren)
C3, LI+ (r = 0.942)
nach Variablenselektion (2545 Deskriptoren)
LV SDEP q2LV SDEP q2
1 0.714 0.108 1 0.678 0.194
2 0.702 0.136 2 0.618 0.332
3 0.655 0.249 3 0.537 0.495
4 0.645 0.272 4 0.492 0.576
5 0.640 0.283 5 0.462 0.627
74
Für alle drei Trainingssätze wird beobachtet, daß GOLPE in jeweils drei D-optimal Design-
und einem FFD-Schritt die Anzahl der Deskriptoren auf etwa 10% der ursprünglichen Menge
reduziert. Die interne Vorhersagequalität steigt dabei für alle Trainingsdatensätze sehr stark
an. Zum Vergleich wurden ähnliche Versuche unter Verwendung der ersten 4 PCs (46
Verbindungen) und der ersten 5 PCs (41 Verbindungen, hier konnten nicht für alle Ecken des
Hyperkörpers Repräsentanten gefunden werden) durchgeführt (Tabellen 13).
Die Tendenz ist bei allen FD-selektierten Trainingsdatensätzen gleich. Die Ausgangsmodelle
besitzen bereits eine gewisse interne Vorhersagequalität, die sich durch Variablenselektion
stark verbessern. Mit den drei Modellen wurden die Aktivitäten der zuvor jeweils eliminierten
Verbindungen vorhergesagt und mit den experimentell bestimmten verglichen (Abbildung
26).
45678
4
5
6
7
8
IC50 (vorhergesagt)
IC50 (experimentell)
Validierungsdatensatz 3 PCs
45678
4
5
6
7
8
IC50 (vorhergesagt)
IC50 (experimentell)
Validierungsdatensatz 4 PCs
45678
4
5
6
7
8
IC50 (vorhergesagt)
IC50 (experimientell)
Validierungsdatensatz 5 PCs
Abbildung 26: Ergebnisse der quasi-externen Vorhersagen
Bei den quasi-externen Vorhersagen treten Differenzen im Bereich einer Zehnerpotenz, in
Einzelfällen von bis zu zwei Zehnerpotenzen auf. Abweichungen in dieser Größenordnung
75
sind akzeptabel, wenn sich der Aktivitätsbereich des Datensatzes über viele Zehnerpotenzen
erstreckt. Im vorliegenden Fall liegen die IC50-Werte zwischen 7.55 bis 4.11, was
Konzentrationen im Bereich von 0.03 mmol bis 77.00 mmol entspricht. Daher ist es nicht
empfehlenswert, die mit den bisher verwendeten Trainingsdatensätzen aufgestellten Modelle
für externe Vorhersagen zu verwenden.
Die geringe Qualität der auf der Basis der reduzierten Datensätze aufgestellten QSAR-Glei-
chungen ist vermutlich auf die unzulängliche Auswahl der Trainingsdatensätze zurückzufüh-
ren. Die FD-Methode setzt voraus, das der PC-Raum homogen besetzt ist, wodurch ein regel-
mäßiger Hyperkörper entsteht. Diese Bedingung ist beim vorliegenden Datensatz nicht ausrei-
chend erfüllt, was sich besonders an dem dritten Trainingsdatensatz zeigt, bei dem 11 Ecken
nicht besetzt werden konnten. Das D-optimal Design ist in der Lage, auch stark verzerrte
Hyperkörper zu analysieren, so daß hier weitere Untersuchungen vorgenommen werden
müssen.
4.4 Zusammenfassung – Molecular Modelling Teil
Mit Hilfe von Docking-Studien ließen sich Lage und Orientierung des Galanthamins
innerhalb der TcAChE-Struktur korrekt vorhersagen, was durch die im Verlauf dieser Promo-
tionsarbeit veröffentlichte Röntgenstruktur des Komplexes verifiziert werden konnte. Die
Übertragung der dabei genutzten Arbeitsweise auf eine Datenbank von Derivaten der Leit-
struktur führte zu einer Hypothese für die jeweilige aktive Konformation, in der jede einzelne
Verbindung des Datensatzes mit dem Enzym in Wechselwirkung tritt. Mit diesen aktiven
Konformationen wurde anschließend eine CoMFA-Studie durchgeführt, wobei die GOLPE-
Variablenselektionsmethode zum Einsatz kam. Das Ergebnis ist ein QSAR-Modell, das einem
Permutationstest mit 50 vertauschten Datensätzen standhält und sich durch einen hohen Wert
für den kreuzvalidierten Korrelationkoeffizienten auszeichnet. Versuche zu quasi-externen
Vorhersagen lieferten zwar tendenziell ein richtiges Bild, jedoch traten zwischen den
vorhergesagten und den experimentell bestimmten Aktivitäten z.T. große Differenzen auf.
76
5 Ausblick
Rechnerbasiertes Wirkstoffdesign basiert auf der Idee, durch Computer-Simulationen Anstöße
für die Synthese neuer Derivate einer Leitstruktur geben zu können. QSAR-Methoden dienen
dabei der Aktivitätsvorhersage.
Der nächste Schritt muß in einer Verbesserung des Ergebnisses der externen Vorhersage
bestehen. Konkret soll dieses Ziel durch Nutzung der D-optimal Design Technik bei der Er-
zeugung von Trainings- und Validierungsdatensatz geschehen. Danach kann auf der
Grundlage der Docking-Studien und QSAR-Rechnungen rationales Wirkstoffdesign betrieben
werden.
Ein denkbarer Ansatz besteht im Entwurf neuer Derivate des Galanthamins, deren Aktivität
sich über die genannten Molecular Modeling Techniken abschätzen lassen. Die im Rahmen
dieser Promotionsarbeit entwickelten präparativen Werkzeuge erweitern die Möglichkeiten
der „traditionellen“ Methoden zur Derivat-Herstellung, was die Palette zugänglicher
Kandidaten vergrößert. Aus dieser Kombination sollten sich somit in der Zukunft neue
Impulse für die Entwicklung von AChE-Hemmern der nächsten Generation auf Basis des
Galanthamins ergeben.
Ein weiterer Ansatz besteht in der Suche nach neuen Leitstrukturen in 3D-Strukturdaten-
banken. So sind z.B. DOCK und CAVEAT in der Lage, einen großen Bestand von 3D-
Strukturen in eine Enzymstruktur zu docken bzw. mit einer Referenzstruktur zu vergleichen.
Lassen sich dabei der Leitstruktur ähnliche Verbindungen identifizieren, so können deren
anti-AChE Aktivitäten mit dem gewonnenen Modell vorhergesagt werden. Das Ziel ist es,
neue Leitstrukturen aufzufinden.
77
6 Experimenteller Teil
6.1 Synthesen
Allgemein verwendete Methoden und Meßverfahren:
Schmelzpunkte (nicht korrigiert): Gallenkamp Melting Point Apparatur, offene
Kapillaren
Dünnschichtchromatographie: Kieselgel-Fertigfolien Kieselgel 60 F254 (Firma E.
Merck, Darmstadt)
Säulenchromatographie: Kieselgel 60 (0.063 bis 0.2 mm, 70 - 230 mesh ASTM)
NMR-Spektroskopie: Bruker ARX-200 (200 MHz)
Massenspektrometrie: Fiso MD 800 (GC-MS)
Elementaranalyse (CHN): Perkin Elmer Universalverbrennungsautomat PE 240
Röntgenstrukturanalyse: Nicolet Diffraktometer R3m/V
Alle verwendeten Chemikalien wurden aus dem Fachhandel bezogen (Fluka, Sigma-Aldrich,
Acros). Die Lösungsmittel wurden gemäß Literaturvorschriften[51] gereinigt und bei Bedarf
entsprechend absolutiert. Das Dess-Martin Reagenz wurde gemäß Ref.[65] hergestellt.
Mein besonderer Dank gilt Christine Durst, Andrea Reschwamm, Kerstin Abel, Heike Risse,
Edgar Luttmann, Christiane Gloger, Klaus Steingröver, Dr. Ulrich Flörke und Elmar Jonk.
78
Darstellung von 2-Bromisovanillin[50]
Br
OH
O
O
8
Zu einer Lösung aus tert.-Butylamin (30 ml, 284.2 mmol) in Dichlormethan (350 ml) wird bei
–25°C Brom (7.3 ml, 142.1 mmol) getropft. Der Ansatz wird auf –70°C abgekühlt und unter
mechanischem Rühren tropfenweise mit einer Lösung aus 10 (21.6 g, 142.1 mmol) in
Dichlormethan (270 ml) und Methanol (30 ml) versetzt. Die Reaktionsmischung wird über
Nacht auf Raumtemperatur erwärmt, wobei sich eine rote Lösung bildet. Diese wird im Vaku-
um soweit eingeengt, bis sich Feststoff abzuscheiden beginnt und mit Wasser (200 ml) ver-
setzt. Der Feststoff wird anschließend abfiltriert und aus Methanol/Wasser umkristallisiert.
Das Produkt wird in Form eines farblosen Pulvers erhalten.–
Ausbeute 29.2 g (89%).–
Schmelzpunkt 209°C (Lit.: 211°C[48]).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 4.04 (s, 3H, CH3), 6.13 (s, 1H, OH), 6.96 (d, J = 8.5 Hz, 1H, CH, aromat.), 7.62 (d,
J = 8.5 Hz, 1H, CH, aromat.), 10.25 (s, 1H, CHO).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 57.03 (CH3), 109.68 (CH, arom.), 113.29 (C, arom.), 123.18 (CH, arom), 127.60
(C, arom.), 143.59 (C, arom.), 152.11 (C, arom.), 191.35 (CHO).
Darstellung von (R)-/(S)-2-Bromo-3-(cyclohex-2-enyloxy)-4-methoxy-benzaldehyd[51]
O
Br
O
O
14
Zu einer Suspension von Kaliumcarbonat (1.7 g, 12.3 mmol) in abs. Aceton (75 ml) werden 8
(2.0 g, 8.7 mmol) und 2-Bromcyclohexen (13, 2.5 ml, 21.7 mmol) gegeben. Der Ansatz wird
79
für 6 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen setzt man Wasser (100 ml) zu
und extrahiert mit Dichlormethan. Die vereinigten organischen Phasen werden mit ges.
Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im
Vakuum eingeengt. Säulenchromatographische Reinigung (Laufmittel: Petrolether/Ethylace-
tat 9:1) liefert das gewünschte Produkt in Form eines gelben Feststoffs.–
Rf-Wert 0.35.–
Ausbeute 2.6 g (95%).–
Schmelzpunkt 81°C (Lit.: 82–83°C[128]).–
Elementaranalyse C14H15BrO3 (311.18) berechnet: C 54.04% H 4.86%
gefunden: C 54.79% H 4.96%.–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.59–2.23 (m, 6H, 3 x CH2), 3.97 (s, 3H, CH3), 4.79 (bs, 1H, CH), 5.89–6.03 (m,
2H, 2 x CH, olefin.), 6.98 (d, J = 8.6 Hz, 1H, aromat.), 7.74 (d, J = 8.6 Hz, 1H, aromat.),
10.31 (s, 1H, CHO).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 19.32 (CH2), 25.55 (CH2), 29.49 (CH2), 56.66 (CH3), 77.31 (CH), 111.21 (CH,
aromat.), 124.13 (C, aromat.), 126.24 (CH, olefin.), 127.103 (CH, olefin.), 127.97 (C, arom.),
132.68 (CH), 145.40 (C, arom.), 159.10 (C, arom.), 191.76 (CHO).
Darstellung von (5aS,9aS)-/(5aR,9aR)-4-Methoxy-5a,6,7,9a-tetrahydro-dibenzofuran-1-
carbaldehyd (15a) und (5aS,9aR)-/(5aR,9aS)-4-Methoxy-5a,6,7,9a-tetrahydro-dibenzo-
furan-1-carbaldehyd (15b)[41]
O
O
H
O
O
O
H
O
15a 15b
Palladium(II)-acetat (90 mg, 0.4 mmol), Tri(o-tolyl)phosphin (0.25 g, 0.81 mmol) und 14
(1.87 g, 6.0 mmol) werden in abs. Triethylamin (10 ml) suspendiert und für 6 Stunden auf
90°C erwärmt. Nach dem Abkühlen wird der Ansatz mit Diethylether (50 ml) verdünnt, über
Celite filtriert und sukzessive mit 5%-iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, Wasser und
ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen sowie anschließend über wasserfreiem Magnesium-
80
sulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der verbleibende Rück-
stand im Hochvakuum destilliert. Man erhält das gewünschte Produkt in Form eines blaß-
gelben Öls als chromatographisch nicht trennbares Diastereomerengemisch.–
Ausbeute 1.2 g ( 87%).–
Siedepunkt 130°C (0.1 mbar).–
Elementaranalyse C14H14O3 (230.27) berechnet: C 73.03% H 6.13%
gefunden: C 73.04% H 6.22%.–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.73–2.74 (m, 4H, 2xCH2), 3.95 (s, 3H, CH3, diast.), 3.96 (s, 3H, CH3, diast.), 5.01
(s, 1H, OCH, diast.), 5.13 (s, 1H, OCH, diast.), 5.84 (bs, 2H, 2 x CH, olefin), 6.87 (d,
J = 8.39 Hz, 1H, CH, aromat., diast.), 6.88 (d, J = 8.35 Hz, 1H, aromat., diast.), 7.32 (d,
J = 8.39 Hz, 1H, aromat., diast.), 7.33 (d, J = 8.35 Hz, 1H, aromat., diast.), 9.90 (s, 1H, CHO,
diast.), 9.91 (s, 1H, CHO, diast.).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 19.11 (CH2), 24.75 (CH2), 27.41 (CH2, diast.), 28.16 (CH2, diast.), 40.67 (CH,
diast.), 41.48 (CH, diast.), 56.43 (CH3), 83.89 (OCH, diast.), 84.39 (CH2, diast.), 110.77 (CH,
aromat., diast.), 110.92 (CH, aromat., diast.), 125.45 (CH, aromat., diast.), 125.65 (CH,
aromat., diast.), 126.72 (C, aromat.), 128.51 (CH, olefin.), 128.58 (CH, olefin.), 132.96 (C,
aromat., diast.), 134.23 (C, aromt., diast.), 149.11 (C, aromat., diast.), 149.44 (C, aromat.,
diast.), 191.22 (CHO, diast.), 191.30 (CHO, diast.).
Allgemeine Arbeitsvorschrift für die alkylierende Birch-Reduktion[52,53]
Eine Lösung aus 12 (13.3 g, 87.4 mmol) in abs. THF (40 ml) wird unter Rühren zu flüssigem
Ammoniak (200 ml) gegeben und auf –60°C abgekühlt. Zu der Reaktionsmischung gibt man
Natrium (5 g, 217.5 mmol), wobei die Temperatur –50°C nicht überschreitet. Nachdem der
Ansatz für etwa drei Stunden bei –60°C gerührt wurde, fügt man das Elektrophil (2.0 Equiva-
lente) zu. Die Reaktionsmischung wird über Nacht auf Raumtemperatur erwärmt und das ver-
bleibende Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in ges. Natriumchlorid-
Lösung aufgenommen, mit 10%-iger Salzsäure angesäuert und mit Chloroform extrahiert. Die
organische Phase wird mit 25%-iger Schwefelsäure (50 ml) versetzt und anschließend für 4
Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Reaktionsmischung wird mit Dichlormethan extrahiert.
Die organische Phase wird sukzessive mit Wasser, 10%-iger Natronlauge, Wasser, 5%-iger
81
Salzsäure und abschließend mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen sowie über Magne-
siumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der verbleibende
Rückstand mittels Kugelrohrdestillation gereinigt.–
Darstellung von (6-Oxo-cyclohex-1-enyl)-essigsäuremethylester
O
O
O
11
Gemäß der AAV für die alkylierende Birch-Reduktion setzt man Bromessigsäuremethylester
(16 ml, 174.8 mmol) ein. Das gewünschte Produkt wird als farblose Flüssigkeit erhalten.–
Ausbeute 3.5 g (24 %).–
Siedepunkt 50°C (0.08 mbar).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.94 (m, 2H, CH2, cycl.), 2.32–2.47 (m, 4H, 2 x CH2, cycl.), 3.10 (s, 2H, CH2),
3.57 (s, 3H, CH3), 6.80 (bs, 1H, CH).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 23.22 (CH2), 26.34 (CH2), 35.47 (CH2), 38.22 (CH2), 52.16 (CH3), 133.68 (C,
olef.), 148.93 (CH), 172.10 (COO), 199.59 (CO).
Darstellung von 3-(6-Oxo-cyclohex-1-enyl)-propionsäureethylester
O
O
O
23
Gemäß der AAV für die alkylierende Birch-Reduktion setzt man 2-Brompropionsäureethyl-
ester (16 ml, 175.0 mmol) ein. Das gewünschte Produkt wird als farblose Flüssigkeit
erhalten.–
Ausbeute 5.1 g (30 %).–
Siedepunkt 57°C (0.07 mbar).–
82
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.20 (t, J = 7.00 Hz, 3H, CH3), 1.94 (m, 2H, CH2), 2.28-2.50 (m, 8H, 4 x CH2),
4.04 (q, J = 7.00 Hz, 2H, OCH2), 6.76 (bs, 1H, CH, olef.).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 14.63 (CH3), 23.38 (CH2), 25.88 (CH2), 26.39 (CH2), 33.60 (CH2), 38.80 (CH2),
60.59 (OCH2), 138.42 (C, olef.), 146.71 (CH), 173.46 (COO), 199.49 (CO).
Allgemeine Arbeitsvorschrift für die 1,2-Reduktion α
αα
α,β
ββ
β-ungesättigter Ketone[54]
Zu einer Lösung aus Cer(III)-chlorid-Heptahydrat (1.1 Equivalente) in THF (120 ml) und
Methanol (60 ml) gibt man das α,β-ungesättigte Keton (1.0 Equivalente). Der Ansatz wird auf
0°C abgekühlt und portionsweise mit Natriumborhydrid (2.0 Equivalente) versetzt. Nach 3-
stündigem Rühren bei dieser Temperatur wird Wasser zugegeben (150 ml) und tropfenweise
10%-iger Salzsäure zugesetzt, bis ein pH-Wert von etwa 3 erreicht ist. Die Reaktionsmi-
schung wird anschließend im Vakuum auf etwa die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens
eingeengt und mehrfach mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
werden mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen sowie über wasserfreiem Magnesiumsul-
fat getrocknet. Nach Filtration wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.–
Darstellung von (R)-/(S)-(6-Hydroxy-cyclohex-1-enyl)-essigsäuremethylester
OH
O
O
9
Gemäß der AAV zur Reduktion α,β-ungesättigter Ketone setzt man 11 (3.33 g, 19.8 mmol)
ein. Das gewünschte Produkt wird in Form einer farblosen Flüssigkeit erhalten und nicht
weiter aufgereinigt.–
Ausbeute 3.01 g (89%).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.52–1.75 (m, 4H, 2 x CH2, cycl.), 1.90–2.23 (m, 2H, CH2, cycl.), 3.02 (d,
J = 16.0 Hz, 1H, CH, aliph.), 3.25 (d, J = 16.0 Hz, 1H, CH, aliph.), 3.68 (s, 3H, OCH3), 4.11
(bs, 1H, CH), 5.68 (bs, 1H, CH, olef).–
83
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 18.42 (CH2), 25.94 (CH2), 32.23 (CH2), 40.60 (CH2), 52.41 (CH3), 67.60 (CH3),
130.51 (CH, olef.), 133.10 (CH, olef.), 174.22 (CO).
Darstellung von (R)-/(S)-3-(6-Hydroxy-cyclohex-1-enyl)-propionsäuremethylester
OH
O
O
23a
Gemäß der AAV zur Reduktion α,β-ungesättigter Ketone setzt man 23 (2.51 g, 12.8 mmol)
ein. Das gewünschte Produkt wird in Form einer farblosen Flüssigkeit erhalten und nicht
weiter aufgereinigt.–
Ausbeute 2.36 g (93%).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3), 1.54-1.78 (m, 4H, 2 x CH2), 2.23-2.61 (m, 6H, 3 x
CH2,), 4.07 (bs, 1H, OCH), 4.17 (q, J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 5.55 (bs, 1H, CH, olef.).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 14.63 (CH3), 18.45 (CH2), 25.80 (CH2), 29.68 (CH2), 32.45 (CH2), 33.62 (CH2),
60.79 (OCH2), 67.17 (OCH), 126.17 (C, olef.), 138.32 (CH, olef.), 174.30 (COO).
Allgemeine Arbeitsvorschrift für die Mitsunobu-Reaktion[55,56]
Triphenylphosphin (1 Equivalent), 2-Bromisovanillin (8) (1 Equivalent) und der Allylalkohol
(1 Equivalent) werden in abs. Toluol (40 ml) suspendiert und bei 0°C tropfenweise mit
Azodicarbonsäurediethylester (DEAD, 1 Equivalent) versetzt. Der Ansatz wird langsam auf
Raumtemperatur erwärmt und für 240 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Die Reaktions-
mischung wird im Vakuum eingengt und säulenchromatographisch gereinigt.–
84
Darstellung von (R)-/(S)-[6-(2-Bromo-3-formyl-6-methoxy-phenoxy)-cyclohex-1-enyl]-
essigsäuremethylester
O
OBr
O
O
O
7
Gemäß der AAV für die Mitsunobu-Reaktion setzt man 9 (3.01 g, 17.6 mmol) ein. Das
gewünschte Produkt wird nach säulenchromatographischer Reinigung (Laufmittel:
Petrolether/Ethylacetat 9:1) und Umkristallisation aus Petrolether/Ethylacetat in Form eines
farblosen, kristallinen Feststoffs erhalten.–
Rf-Wert 0.2.–
Ausbeute 2.7 g (40%).–
Schmelzpunkt 108°C.–
Elementaranalyse C17H19BrO5 (383.24) berechnet: C 53.28% H 5.00%
gefunden: C 53.22% H 5.01%.–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.60 (m, 2H, CH2, cycl.), 1.92–2.15 (m, 4H, 2 x CH2, cycl.), 3.15 (d, J = 16.5 Hz,
1H, CH, aliph.), 3.71 (d, J = 16.5 Hz, 1H, CH, aliph.), 3.73 (s, 3H, OCH3), 3.91 (s, 3H,
OCH3), 4.89 (bs, 1H, OCH), 5.94 (bs, 1H, CH, olefin.), 6.96 (d, J = 8.6 Hz, 1H, CH, aromat.),
7.78 (d, J = 8.6 Hz, 1H, CH, aromat.), 10.28 (s, 1H, CHO).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 18.11 (CH2), 25.91 (CH2), 28.39 (CH2), 39.39 (CH2), 52.08 (CH3), 56.35 (CH3),
77.27 (CH), 111.27 (CH, aromat.), 124.09 (C, aromat.), 126.39 (CH, aromat.), 127.88 (C,
aromat.), 130.64 (C, aromat.), 133.03 (CH, olefin.), 144.84 (C, aromat.), 158.87 (C, aromat.),
173.33 (COO), 191.75 (CHO).
85
Darstellung von (R)-/(S)-3-[6-(2-Bromo-3-formyl-6-methoxy-phenoxy)-cyclohex-1-enyl]-
propionsäureethylester
O
OBr
O
O
O
23b
Gemäß der AAV für die Mitsunobu-Reaktion setzt man 23a (4.32 g, 21.8 mmol) ein. Das
gewünschte Produkt wird nach säulenchromatographischer Reinigung (Laufmittel:
Petrolether/Ethylacetat 9:1) in Form eines farblosen Öls erhalten.–
Rf-Wert 0.2.–
Ausbeute 3.9 g (43%).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.25 (t, J = 6.9 Hz, 3H, CH3), 1.53-2.14 (m, 6H, 3 x CH2), 2.45-2.70 (m, 4H, 2 x
CH2), 3.96 (s, 3H, OCH3), 4.14 (q, J = 6.9 Hz, 2H, OCH2), 4.83 (bs, 1H, OCH), 5.78 (bs, 1H,
CH, olefin.), 6.95 (d, J = 8.1 Hz, 1H, aromat.), 7.72 (d, J = 8.1 Hz, 1H, aromat.), 10.28 (s, 1H,
CHO).
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 14.60 (CH3), 18.51 (CH2), 25.86 (CH2), 28.61 (CH2), 30.13 (CH2), 34.06 (CH2),
56.44 (OCH3), 60.60 (OCH2), 77.44 (OCH), 111.26 (CH, aromat.), 126.20 (CH, olefin.),
127.96 (C, aromat.), 128.97 (CH, aromat.), 135.71 (C, aromat.), 138.35 (C, olefin.), 144.84
(C, aromat.), 158.93 (C, aromat.), 173.97 (COO), 191.78 (CHO).
Allgemeine Arbeitsvorschrift für die Heck-Reaktion mit Tetrakis-(triphenylphosphin)-
palladium
Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium (0.1 Equivalente) und Kaliumcarbonat (4 Equiva-
lente) werden zusammen mit der umzusetzenden Verbindung (1 Equivalent) in abs. Toluol
(10 ml) suspendiert und für 12 Stunden auf 107°C erhitzt. Nach dem Erkalten wird die
Reaktionsmischung über Celite filtriert und im Vakuum eingeengt.–
86
Darstellung von (5aR,9aR)-/(5aS,9aS)-(1-Formyl-4-methoxy-6,7-dihydro-5aH-dibenzo-
furan-9a-yl)-essigsäuremethylester
O
O
O
O
O
6
Gemäß der AAV für die intramolekulare Heck-Reaktion setzt man 7 (0.80 g, 2.09 mmol) ein.
Nach säulenchromatographischer Reinigung (Petroether/Ethylacetat 7:3) wird das Produkt in
Form eines gelben Öls erhalten, das aus Chloroform/Pentan kristallisiert werden kann.–
Rf-Wert 0.4.–
Ausbeute 0.53 g (84%).–
Schmelzpunkt 73°C.–
Elementaranalyse C17H18O5 (302.33) berechnet: C 67.54% H 6.00%
gefunden: C 66.81% H 6.32%.–
GC-MS (80 eV) m/z = 302 [M+].–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.73–2.18 (m, 4H, 2xCH2), 2.90 (d, J = 14.4 Hz, 1H, CH), 3.41 (d, J = 14.4 Hz,
1H, CH), 3.55 (s, 3H, CH3), 3.81 (s, 3H, CH3), 5.14 (bs, 1H, OCH), 5.80–5.89 (m, 1H, CH,
olefin.), 6.06 (d, J = 9.3 Hz, 1H, CH, olefin.), 6.86 (d, J = 8.3 Hz, 1H, aromat.), 7.32 (d,
J = 8.3 Hz, 1H, aromat.), 9.81 (s, 1H, CHO).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 19.33 (CH2), 24.09 (CH2), 41.22 (CH2), 48.10 (C), 51.80 (CH3), 56.45 (CH3),
86.44 (OCH), 110.60 (CH, aromat.), 127.14 (C, aromat.), 128.50 (CH, olef.), 128.97 (CH,
olef.), 130.97 (CH, aromat.), 133.20 (C, aromat.), 148.83 (C, aromat.), 150.10 (C, aromat.),
171.76 (COO), 191.59 (CHO).–
Kristallographische Daten
Farbloser Kristall (0.55 x 0.50 x 0.30 mm³), monoklin, Raumgruppe P 21/n, T = 293(2) K, a =
15.777(2), b = 7.750(1), c = 25.032(2) Å, β = 90.79(1)°, V = 3060.4(6) ų, Z = 8, λ(Mo Kα)
= 0.71073 Å, Dc = 1.312 g/cm³, µ = 0.097 mm-1; 7724 Intensitäten 5 > 2Θ > 52°, 6021 einzig-
artige Reflexe, Strukturlösung (SHELXS) durch direkte und konventionelle Fourier Metho-
den, full-matrix least-squares Verfeinerung (SHELXL) basierend auf F² und 398, zwei
unabhängige Moleküle pro asymmetrischer Einheit, R1(I>2σ(I)) = 0.059, wR2(all data) =
87
0.199, Goof = 1.074, min/max Höhe in ∆F map –0.53/0.76 e/ų. Cambridge Crystallographic
Data Centre (CCDC-143304).
Darstellung von (5aR,9aR)-/(5aS,9aS)-3-(1-Formyl-4-methoxy-6,7-dihydro-5aH-diben-
zofuran-9a-yl)-propionsäureethylester
O
O
O
O
O
24
Gemäß der AAV für die intramolekulare Heck-Reaktion setzt man 23b (1.00 g, 2.43 mmol)
ein. Nach säulenchromatographischer Reinigung (Petroether/Ethylacetat 7:3) wird das
Produkt in Form eines farblosen Öls erhalten.–
Rf-Wert 0.4.–
Ausbeute 0.53 g (84%).–
GC-MS (80 eV) m/z = 330 [M+].–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.23 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3), 1.75-2.67 (m, 8H, 4 x CH2), 3.97 (s, 3H, OCH3), 4.09
(q, J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 4.81 (bs, 1H, OCH), 5.83-5.91 (m, 1H, CH, olefin.), 6.11 (d,
J = 10.2 Hz, CH, olefin.), 6.99 (d, J = 8.4 Hz, CH, aromat.), 7.37 (d, J = 8.4 Hz, CH, aromat.),
9.91 (s, 1H, CHO).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 14.56 (CH3), 19.66 (CH2), 25.07 (CH2), 30.76 (CH2), 32.70 (CH2), 50.44 (C), 56.46
(OCH3), 60.86 (OCH2), 86.46 (OCH), 110.73 (CH, aromat.), 127.32 (C, aromat.), 128.80
(CH, olefin.), 129.69 (CH, olefin.), 130.11 (CH, aromat.), 133.60 (C, aromat.), 149.00 (C,
aromat.), 150.27 (C, aromat.), 173.53 (COO), 190.96 (CHO).
88
Allgemeine Arbeitsvorschrift für die reduktive Aminierung
Die umzusetzende Verbindung (1 Equivalent) wird in Methanol gelöst, tropfenweise mit einer
8-molaren Lösung von Methylamin in Ethanol versetzt (2 Equivalente) und für 1 Stunde bei
Raumtemperatur gerührt. Danach setzt man portionsweise Natriumborhydrid zu, bis sich
dünnschichtchromatographisch (Laufmittel Petrolether/Ethylacetat 7:3) kein Edukt mehr
nachweisen läßt. Mit 10%-iger Natronlauge wird der pH-Wert auf 11 eingestellt.
Anschließend wird die Lösung mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinten organischen
Phasen werden mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen und über wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet.–
Darstellung von (5aR,9aR)-/(5aS,9aS)-(4-Methoxy-1-methylaminomethyl-6,7-dihydro-
5aH-dibenzofuran-9a-yl)-essigsäuremethylester
O
N
O
O
O
H
17
Gemäß der AAV für die reduktive Aminierung setzt man 6 (0.50 g, 1.58 mmol) ein. Nach
Entfernung des Lösungsmittels erhält man einen blaßgelben, glasartigen Feststoff, der nicht
weiter gereinigt wird.–
Ausbeute 0.41 g (98%).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.82–2.22 (m, 4H, 2 x CH2, cycl.), 2.46 (s, 3H, NCH3), 2.91 (m, 2H, CH2), 3.59 (s,
3H, OCH3), 3.73 (s, 2H, NCH2), 3.83 (s, 3H, OCH3), 5.10 (bs, 1H, OCH), 5.84–5.98 (m, 2H,
2 x CH, olefin.), 6.69 (d, J = 8.3 Hz, 1H, CH, aromat.), 6.77 (d, J = 8.3 Hz, 1H, aromat.).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 20.42 (CH2), 24.62 (CH2), 36.61 (NCH3), 42.75 (CH2), 49.33 (C), 51.90 (OCH3),
53.19 (NCH2), 56.20 (OCH3), 85.11 (OCH), 111.44 (CH, aromat.), 122.56 (CH, aromat.),
128.64 (CH, olefin.), 128.87 (C, aromat.), 129.04 (CH, olefin.), 131.88 (C, aromat.), 144.56
(C, aromat.), 147.48 (C, aromat.), 171.49 (COO).
89
Darstellung von (5aR,9aR)-/(5aS,9aS)-3-(4-Methoxy-1-methylaminomethyl-6,7-dihydro-
5aH-dibenzofuran-9a-yl)-propionsäureethylester
25
O
NO
O
Gemäß der AAV für die reduktive Aminierung setzt man 24 (0.30 g, 0.91 mmol) ein. Im
Anschluß an die Reaktion wird der Ansatz mit 10-%iger Salzsäure für 2 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt, danach erfolgt die Aufarbeitung wie beschrieben. Nach Entfernung
des Lösungsmittels erhält man einen gelben, glasartigen Feststoff, der nicht weiter gereinigt
wird.–
Ausbeute 0.16 g (53%).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.74–2.43 (m, 8H, 4 x CH2), 2.50 (s, 3H, NCH3), 3.65 (s, 2H, NCH2), 3.86 (s, 3H,
OCH3), 4,67 (bs, 1H, OCH), 5.89 (m, 2H, 2 x CH, olefin.), 6.75 (d, J = 8.4 Hz, 1H, CH,
aromat.), 6.84 (d, J = 8.4 Hz, 1H, aromat.).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 20.36 (CH2), 25.14 (CH2), 30.39 (CH2), 33.61 (CH2), 36.64 (NCH3), 50.35 (C),
52.65 (NCH2), 56.23 (OCH3), 85.15 (OCH), 111.50 (CH, aromat.), 122.26 (CH, aromat.) ,
128.77 (CH, olefin.), 128.77 (C, aromat.), 129.90 (CH, olefin.), 131.58 (C, aromat.), 144.56
(C, aromat.), 147.70 (C, aromat.), 174.20 (COO).
Darstellung von (4aS,9S)-/(4aR,9R)-3-Methoxy-11-methyl-4a,5,9,10,11,12-hexahydro-
6H-benzofuro[3a,3,2-ef][2]benzazepin-10-on
O
O
N
O
5
Eine Lösung von 17 (0.40 g, 1.26 mmol) in Toluol wird mit Kieselgel (0.50 mg) versetzt. Die
Reaktionsmischung wird für 4 Stunden unter Rückfluß gekocht und anschließend am
Rotationsverdampfer eingeengt. Nach der Trocknung wird das Rohprodukt chroma-
90
tographisch gereinigt (Laufmittel: Essigester). Das gewünschte Produkt fällt in Form eines
farblosen Feststoffs an.
Ausbeute 0.29 g (84%).–
Schmelzpunkt 169°C.–
Elementaranalyse C17H19NO3 (285.35) ber.: C 71.56% H 6.71% N 4.91%
gef.: C 70.87% H 6.58% N 5.09%.–
GC-MS (80 eV) m/z = 285 [M+].–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.89–2.15 (m, 2H, CH2, cycl.), 2.39–2.53 (m, 2H, CH2, cycl.), 2.85 (s, 2H, NCH2),
3.02 (s, 3H, NCH3), 3.88 (s, 3H, OCH3), 4.29 (d, J = 15.9 Hz, 1H, CH), 4.51 (d, J = 15.9 Hz,
1H, CH), 4.73 (bs, 1H, OCH), 5.43 (d, J = 9.3 Hz, 1H, CH, olefin.), 5.85 (m, 1H, CH, olefin.),
6.64 (m, 2H, 2 x CH, aromat.).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 19.77 (CH2), 21.42 (CH2), 36.17 (NCH3), 43.57 (C), 43.80 (CH2), 52.46 (NCH2),
56.42 (OCH3), 88.73 (OCH), 111.77 (CH, aromat.), 119.50 (CH, aromat.), 125.70 (C,
aromat.), 127.87 (CH, olefin.), 128.45 (CH, olefin.), 132.74 (C, aromat.), 145.01 (C, aromat.),
148.09 (C, aromat.), 171.94 (CON).
Darstellung von (5aS,9aS)-/(5aR,9aR)-2-(1-Formyl-4-methoxy-6,7-dihydro-5aH-diben-
zofuran-9a-yl)-N-methyl-acetamid[58]
O
O
N
O
H
O
18
Zu einer Suspension von Chromtrioxid (0.79 g, 7.9 mmol) in abs. Dichlormethan (10 ml) wird
bei –20°C eine Lösung von 3,5-Dimethylpyrazol (0.76 g, 7.9 mmol) in abs. Dichlormethan
(5 ml) getropft. Nachdem der Ansatz für 20 Minuten bei dieser Temperatur gerührt wurde,
setzt man 5 (0.15 g, 0.53 mmol) gelöst in abs. Dichlormethan (5 ml) zu und rührt für 2
Stunden bei –20°C. Der Ansatz wird mit Dichlormethan verdünnt und sukzessive mit 10%-
iger Salzsäure, Wasser sowie gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Nach Trocknung
der organischen Phase über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Entfernung des Lösungsmit-
91
tels erhält man einen dunkelbraunen Feststoff, der säulenchromatographisch gereinigt wird
(Laufmittel: Petrolether/Ethylacetat 7:3). Das Produkt fällt in Form eines gelben Öls an.–
Rf-Wert 0.4.–
Ausbeute 0.09 g (30%).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.92–1.99 (m, 2H, CH2), 2.13–2.32 (m, 2H, CH2), 2.66 (s, 3H, NCH3), 2.85 (d,
J = 13.0 Hz, 1H, CH), 3.08 (d, J = 13.0 Hz, 1H, CH), 3.96 (s, 3H, OCH3), 5.51 (bs, 1H,
OCH), 5.84–5.90 (m, 1H, CH, olefin.), 6.00 (d, J = 9.7 Hz, 1H, CH, olefin.), 6.88 (d, 1H,
J = 7.4 Hz, CH, aromat.), 7.32 (d, 1H, J = 7.4 Hz, CH, aromat.), 9.81 (s, 1H, CHO).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 19.30 (CH2), 23.67 (CH2), 26.43 (NCH3), 43.71 (CH2), 49.32 (C), 56.47 (OCH3),
86.64 (OCH), 110.70 (CH, aromat.), 126.90 (C, aromat.), 128.38 (CH, olefin.), 129.26 (CH,
olefin.), 131.99 (CH, aromat.), 133.38 (C, aromat.), 149.37 (C, aromat.), 150.64 (C, aromat.),
171.42 (CON), 192.76 (CHO).
Darstellung von (5aR,9aR)-/(5aS,9aS)-(1-Formyl-7-hydroxy-4-methoxy-6,7-dihydro-
5aH-dibenzofuran-9a-yl)-essigsäuremethylester und (5aR,9aS)-/(5aS,9aR)-(-1-Formyl-9-
hydroxy-4-methoxy-6,9-dihydro-5aH-dibenzofuran-9a-yl)-essigsäuremethylester[60]
O
O
O
O
O
OH
O
O
O
ROH
R = CH2COOCH3
19 20
Eine Suspension aus 6 (0.86 g, 2.8 mmol), N-Bromsuccinimid (0.60 g, 3.4 mmol) und
Azobisisobutyronitril (130 mg, 0.8 mmol) werden in abs. Tetrachlorkohlenstoff (20 ml) für 1
Stunde unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Erkalten wird das Lösungsmittel entfernt. Der
Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt (Laufmittel: Petrolether/Ethylacetat 7:3).
Das Rohprodukt wird anschließend in Aceton gelöst und mit Silberacetat (0.50 g, 3.0 mmol)
versetzt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel entfernt und das
erhaltene Produkt säulenchromatographisch gereinigt (Laufmittel: Petrolether/Ethylacetat
3:7). Es lassen sich drei Fraktionen auffangen.
92
Fraktion 1 (Rf-Wert: 0.8): nicht-umgesetztes 6 (0.15 g, 18%).–
Fraktion 2 (Rf-Wert: 0.6): 20 (0.22 g, 25%).–
Fraktion 3 (Rf-Wert: 0.3): 19 (0.16 g, 18%).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3) – 19 (Diastereomere)
δ [ppm] = 2.15–2.27 (m, 1H, CH, cycl.), 2.42–2.56 (m, 1H, CH, cycl.), 2.79 (m, 1H, CH,
diast.), 3.23-3.38 (m, 1H, CH, diast.), 3.57 (s, 3H, CH3), 3.98 (s, 3H, CH3), 4.22–4.44 (m, 1H,
OCH, diast.), 5.18–5.29 (m, 1H, OCH, diast.), 5.92–6.05 (m, 1H, CH, olefin., diast.), 6.20–
6.27 (m, 1H, CH, olefin., diast.), 6.91–7.01 (m, 1H, CH, aromat., diast.), 7.30–7.49 (m, 1H,
CH, aromat., diast.), 9.84 (s, 1H, CHO).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3) – 19 (Diastereomere)
δ [ppm] = 32.01 (CH2, diast.), 34.24 (CH2, diast.), 39.78 (CH2, diast.), 40.59 (CH2, diast.),
49.00 (C, diast.), 49.11 (C, diast.), 51.93 (CH3), 56.50 (CH3), 62.64 (OCH), 85.15 (OCH,
diast.), 85.74 (OCH, diast.), 110.914 (CH, aromat.), 127.14 (C, aromat.), 128.75 (CH, olefin.,
diast.), 128.92 (CH, olefin., diast.), 130.05 (CH, aromat.), 131.63 (CH, olefin., diast.), 131.85
(CH, olefin., diast.), 132.16 (C, aromat., diast.), 132.96 (C, aromat., diast.), 147.95 (C,
aromat.), 150.57 (C, aromat.), 171, 40 (COO, diast.), 171.99 (COO, diast.), 191.70 (CHO).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3) – 20
δ [ppm] = 2.48–2.72 (m, 1H, CH, cycl.), 2.78–2.88 (m, 1H, CH, cycl.), 2.93 (d, J = 15.2 Hz,
1H, CH), 3.36 (d, J = 15.2 Hz, 1H, CH), 3.53 (s, 3H, CH3), 3.95 (s, 3H, CH3), 4.59 (bs, 1H,
OCH), 5.20 (bs, 1H, OCH), 5.95 (bs, 2H, 2 x CH, olefin.), 6.92 (d, J = 8.4 Hz, 1H, CH,
aromat.), 7.41 (d, J = 8.4 Hz, 1H, CH, aromat.), 9.84 (s, 1H, CHO).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3) – 20
δ [ppm] = 28.18 (CH2), 40.95 (CH2), 51.99 (CH3), 56.45 (CH3), 56.65 (C), 70.69 (OCH),
87.14 (OCH), 111.00 (CH, aromat.), 127.01 (CH, aromat.), 128.22 (C, aromat.), 128.92 (C,
aromat.), 131.17 (CH, olefin.), 132.84 (CH, olefin.), 150.12 (C, aromat.), 150.86 (C, aromat.),
171.44 (COO), 193.72 (CHO).
93
Allgemeine Arbeitsvorschrift für Oxidation von sekundären Alkoholen zu Ketonen nach
Dess-Martin[65]
Die umzusetzende Verbindung (1 Equivalent) wird in abs. Dichlormethan gelöst und
tropfenweise zu einer Suspension des Dess-Martin Periodinans (1.2 Equivalente) gegeben.
Nach einer Stunde setzt man 1%-ige Natronlauge zu und extrahiert mit Dichlormethan. Die
vereinigten organischen Phasen werden mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
Darstellung von (5aR,9aR)-/(5aS,9aS)-(1-Formyl-4-methoxy-7-oxo-6,7-dihydro-5aH-
dibenzofuran-9a-yl)-essigsäuremethylester
O
O
O
O
O
O
21
Gemäß der AAV für die Dess-Martin Oxidation setzt man 19 (0.20 g, 0.63 mmol) ein. Nach
Entfernung des Lösungsmittels erhält man ein gelbes Öl, das säulenchromatographisch
gereinigt wird (Laufmittel: Petrolether/Ethylacetat 7:3). Das gewünschte Produkt wird in
Form eines farblosen Öls erhalten.–
Rf-Wert 0.4.–
Ausbeute 0.17 g (90%).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 3.00 (dd, J = 17.6 Hz, J = 1.5 Hz, 1H, CH, cylc.), 3.14 (d, J = 17.6 Hz, 1H, CH,
cycl.), 3.34 (d, J = 16.0 Hz, 1H, CH), 3.45 (d, J = 16.0 Hz, 1H, CH), 3.62 (s, 3H, CH3), 3.98
(s, 3H, CH3), 5.25 (d, J = 1.5 Hz, 1H, OCH), 6.06 (d, J = 10.3 Hz, 1H, CH, olefin.), 6.98 (d, J
= 8.3 Hz, 1H, CH, aromat.), 7.10 (d, J = 10.3 Hz, 1H, CH, olefin.), 7.46 (d, J = 8.3 Hz, 1H,
CH, aromat.), 9.85 (s, 1H, CHO).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 38.65 (CH2), 39.03 (CH2), 49.25 (C), 52.20 (CH3), 56.67 (CH3), 85.76 (CH),
111.50 (CH, aromat.), 126.86 (C, aromat.), 128.47 (CH, olefin.), 129.59 (C, aromat.), 132.49
94
(CH, aromat.), 145.49 (CH, olefin.), 148.95 (C, aromat.), 150.60 (C, aromat.), 170.98 (COO),
191.87 (CHO), 195.17 (CO).
Darstellung von (5aR,9aR)-/(5aS,9aS)-(1-Formyl-4-methoxy-9-oxo-6,9-dihydro-5aH-
dibenzofuran-9a-yl)-essigsäuremethylester
O
R
O
O
O
R = CH2COOCH3
22
Gemäß der AAV für die Dess-Martin Oxidation setzt man 20 (0.20 g, 0.63 mmol) ein. Nach
Entfernung des Lösungsmittels erhält man ein gelbes Öl, das säulenchromatographisch
gereinigt wird (Laufmittel: Petrolether/Ethylacetat 7:3). Das gewünschte Produkt wird in
Form eines farblosen Öls erhalten.–
Rf-Wert 0.4.–
Ausbeute 0.18 g (93%).–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 3.06 (bs, 2H, CH2, cylc.), 3.12 (d, J = 16.8 Hz, 1H, CH), 3.67 (s, 3H, CH3), 3.78 (d,
J = 16.8 Hz, 1H, CH), 3.96 (s, 3H, CH3), 5.25 (bs, 1H, OCH), 6.26 (d, J = 10.3 Hz, 1H, CH,
olefin), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, 1H, CH, aromat.), 6.95–7.05 (m, 1H, CH, olefin.), 7.60 (d, J = 8.5
Hz, 1H, CH, aromat.), 10.50 (s, 1H, CHO).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 28.87 (CH2), 43.14 (CH2), 52.53 (CH3), 56.57 (CH3), 58.33 (C), 86.66 (CH),
112.17 (CH, aromat.), 124.28 (CH, aromat.), 128.10 (C, aromat.), 129.66 (C, aromat.), 130.53
(CH, olefin.), 146.90 (CH, olefin.), 148.96 (C, aromat.), 149.31 (C, aromat.), 170.96 (COO),
190.11 (CHO), 194.22 (CO).
95
Darstellung von (2-Hydroxy-6-oxo-cyclohex-1-enyl)-essigsäuremethylester[74]
O
OH
O
O
27
Man legt Natrium (7.18 g, 312.2 mmol) vor und tropft unter Eiskühlung Methanol (250 ml)
zu. Die so hergestellte Natriummethanolat-Lösung wird auf 60°C erwärmt und mit einer Lö-
sung von 26 (35.00 g, 312.2 mmol) in Methanol (50 ml) versetzt. Danach gibt man Bromme-
thylacetat (30 ml, 327.8 mmol) zu und kocht 3 Stunden unter Rückfluß. Nach dem Erkalten
wird die Reaktionsmischung auf etwa 25% ihres ursprünglichen Volumens eingeengt und mit
Wasser (500 ml) versetzt. Man extrahiert mit Dichlormethan. Die vereinigten organischen
Phasen werden dreimal mit 20%-iger Natronlauge ausgeschüttelt. Beim Ansäuern des alkali-
schen Extrakts fällt das gewünschte Produkt in Form eines farblosen Feststoffs aus.–
Ausbeute 21.85 g (38%).–
Schmelzpunkt 112°C
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.95–2.01 (m, 2H, CH2, cycl.), 2.34–2.52 (m, 4H, 2 x CH2, cycl.), 3.37 (s, 2H,
CH2), 3.67 (s, 3H, CH3), 10.05 (s, 1H, OH).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 20.93 (CH2), 28.00 (CH2), 33.01 (CH2), 52.54 (CH3), 109.62 (C, olefin.), 174.36
(COO), 188.07 (C–O), 192.34 (C=O).
Darstellung von (2-Methoxy-6-oxo-cyclohex-1-enyl)-essigsäuremethylester[51]
O
O
O
O
28
Zu einer Suspension von 27 (2.50 g, 13.6 mmol) in Diethylether tropft man eine in situ aus
Diazogen (5.00 g, 23.0 mmol) und ethanolischer Kalilauge hergestellte Lösung von Diazome-
than in Diethylether. Die Reaktion wird abgebrochen, wenn sich die Suspension vollständig
aufgelöst hat. Die Reaktionsmischung wird mit ges. Natriumcarbonat-Lösung, Wasser und
ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
Nach Entfernung des Lösungsmittels verbleibt ein gelbes Öl, das sich aus Petrolether/
Ethylactet kristallisieren läßt.–
96
Ausbeute 2.1 g (80%).–
Schmelzpunkt 93°C
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.98–2.11 (m, 2H, CH2, cycl.), 2.39 (t, J = 6.5 Hz, CH2, cycl.), 2.63 (t, J = 6.1 Hz,
CH2, cycl.), 3.31 (s, 2H, CH2), 3.65 (s, 3H, CH3), 3.83 (s, 3H, CH3).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 21.00 (CH2), 25.11 (CH2), 27.94 (CH2), 36.19 (CH2), 52.16 (CH3), 55.88 (CH3)
113.29 (C), 172.88 (C–O), 174.18 (COO), 197.75 (C=O).
Darstellung von (2-Methyl-6-oxo-cyclohex-1-enyl)-essigsäuremethylester
O
O
O
29
Eine Lösung von 28 (0.54 mg, 2.73 mmol) in abs. THF (30 ml) wird bei –78°C tropfenweise
mit einer 3-molaren Methylmagnesiumbromid-Lösung (1 ml, 3.0 mmol) versetzt und über
einen Zeitraum von 2 Stunden auf –50°C erwärmt. Die Reaktion wird bei dieser Temperatur
durch Zugabe von Methanol (2 ml) beendet. Nachdem der Ansatz Raumtemperatur erreicht
hat, setzt man Wasser zu und extrahiert mit Dichlormethan. Die vereinigten organischen Pha-
sen werden mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesium-
sulfat getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels wird der Rückstand säulenchromato-
graphisch gereinigt (Laufmittel: Ethylacetat). Das gewünschte Produkt fällt in Form eines
farblosen Öls an.–
Rf-Wert 0.6.–
Ausbeute 0.26 g (53%).–
GC-MS (80 eV) m/z = 182 [M+].–
1H-NMR (200 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 1.98 (s, 3H, CH3), 2.01–2.07 (m, 2H, CH2, cycl.), 2.42–2.49 (m, 4H, 2 x CH2,
cycl.), 3.39 (s, 2H, CH2), 3.69 (s, 3H, OCH3).–
13C-NMR (50 MHz, CDCl3)
δ [ppm] = 22.05 (CH3), 22.38 (CH2), 30.95 (CH2), 33.21 (CH2), 37.53 (CH2), 52.25 (OCH3)
129.70 (C), 158.95 (C), 172.25 (COO), 198.14 (CO).
97
6.2 Molecular Modeling
6.2.1 Enzymvorbereitung/Inhibitorvorbereitung (SYBYL 6.6)
Allgemeine Arbeitsvorschrift für die Enzymvorbereitung
Zur Enzymvorbereitung werden alle Atome außer den Seitenketten und dem Peptidgerüst aus
der jeweiligen Röntgenstruktur entfernt. Im nächsten Schritt werden unvollständig erfaßte
Aminosäuren unter Beibehaltung der bekannten Seitenkettentorsionswinkel ersetzt. Die C-
und N-Termini des Peptidgerüsts werden mit N-Methylgruppen bzw. Acetylgruppen verkappt.
Die Proteine werden anschließend mit Wasserstoffatomen versehen, wobei die Seitenketten
der Aminosäuren Glutaminsäure und Asparaginsäure negative und die Seitenketten der
Aminosäuren Arginin und Lysin positive Formalladungen erhalten. Die so erhaltenen Struktu-
ren werden einer dreistufigen Geometrieoptimierung mit dem Tripos-Kraftfeld unter Verwen-
dung von Gasteiger-Hückel Ladungen unterzogen (Powell-Minimierer, jeweils maximal 500
Schritte, Konvergenz-Kriterium: 0.05 kcal/(mol∗Å)). In der ersten Stufe werden nur die
addierten Wasserstoffatome flexibel gehalten, während alle anderen Enzymatome an ihren
Positionen fixiert bleiben. In der zweiten Stufe werden die Seitenketten relaxiert (Ausnahme:
Portal). In der dritten Stufe werden alle Atome des Enzyms mit Ausnahme der das Portal
bildenden Seitenketten und der Endgruppen relaxiert. Die erhaltene Enzymstruktur wird für
das Docking verwendet.
Allgemeine Arbeitsvorschrift für die Inhibitorvorbereitung
Es werden jeweils zwei Galanthamin-Konformationen unabhängig voneinander betrachtet, bei
denen sich die N-Methylgruppe im Bezug zum Siebenring des Galanthamins einmal in axialer
und einmal in equatorialer Stellung befindet. Bei den Versuchen zur Vorhersage werden die
Konformationen des Cyclohexenol-Teils und des Siebenrings aus der Röntgenstruktur des
Alkaloids verwendet. Bei der Reproduktion des TcAChE/Galanthamin-Komplexes hingegen
werden die dort für Galanthamin gefundenen Ringkonformationen beibehalten. Die
Galanthamin-Strukturen werden mit Wasserstoffatomen versehen und für das Docking
verwendet.
98
6.2.2 Docking/SYBYL-Optimierung
Mit Hilfe von AutoGrid werden unter Verwendung der standardmäßig vorgegebenen Parame-
ter für alle im Inhibitor vorkommenden Atomtypen Affinitätspotentiale innerhalb eines Gitter-
netzes erzeugt, das den ausgewählten Enzymbereich (vgl. Tabelle A2, Anhang) umfaßt.
Das Docking erfolgt ebenfalls mit den in der jeweiligen Programmversion von AutoDock
standardmäßig vorgegebenen Parametern. Als einzige Ausnahme wurde die Anzahl der Läufe
gegebenenfalls auf 500 gesetzt. Die Auswertung erfolgt mit selbstgeschriebenen C-
Programmen bzw. PYTHON-Scripts.
Die nach Anwendung der jeweiligen RMSD-Grenzwerte erhaltenen Ezym/Inhibitor-Kom-
plexe werden einer Optimierung mit dem Tripos-Kraftfeld unterzogen, wobei die zuvor aus-
gewählten Aminosäuren (vgl. Tabelle A2, Anhang) flexibel bleiben, wohingegen das übrige
Enzym starr gehalten wird (Powell-Minimierer, jeweils maximal 500 Schritte, Konvergenz-
Kriterium: Gradient 0.05 kcal/(mol∗Å)).
6.2.3 QSAR-Rechnungen
Für die hypothetischen aktiven Konformationen der Verbindungen des Datensatzes (vgl.
Tabelle A11, Anhang) werden mit Hilfe von GRID molekulare Felder mit den implementier-
ten Sonden DRY, C3, LI+ und O:: erzeugt. Als Parameter werden die standardmäßig vorgege-
benen verwendet. Ausnahmen sind die Dielektrizitätskonstante, für die ein Wert von 20 ange-
setzt wird und der obere Grenzwert für die Wechselwirkungsenergien (30 kcal/mol).
Die Verwendung der PLS-Statistik erfordert eine Vorbehandlung der aus GRID stammenden
Rohdaten. Um das darin enthaltene „Rauschen“ möglichst weitgehend zu entfernen, wurden
die Zahlenwerte der Deskriptoren, deren Beträge nahe bei Null liegen, auf Null gesetzt. Der
Grenzwert wird dabei so gewählt, daß etwa 20% der Variablen davon betroffen sind. Danach
eliminiert man die Deskriptoren, die eine sehr geringe Varianz und damit einen nur margi-
nalen Informationsgehalt besitzen (die unteren 20%). Schließlich werden die Deskriptoren
ausgeschlossen, die innerhalb einer Spalte nur einen oder zwei unterschiedliche Werte
annehmen.
Bei der Kombination unterschiedlicher Deskriptortypen kann der Fall auftreten, daß ein Des-
kriptortyp im Vergleich zu den übrigen einen sehr großen Bereich von Werten umfaßt. Bei
99
Anwendung der PLS-Statistik dominiert dann dieser Deskriptortyp, während die Einflüsse der
anderen auf das Modell nur sehr gering sind. Um allen Deskriptoren eine vergleichbare Ge-
wichtung zu geben, zentriert und skaliert man die Deskriptoren üblicherweise zur Einheitsva-
rianz. Dazu werden innerhalb jeder Deskriptorspalte Mittelwert und Standardabweichung be-
rechnet. Danach bildet man die Differenz zwischen dem Mittelwert und jeder Variablen der
Spalte und dividiert den erhaltenen Wert durch die Standardabweichung. Das Ergebnis dieser
Vorgehensweise ist, daß alle Deskriptoren unabhängig von ihrem ursprünglichem Wertebe-
reich auf denselben Maßstab gebracht werden.
Im vorliegenden Fall wird keine Skalierung angewendet, da die beiden verwendeten Felder in
einem vergleichbaren Wertebereich liegen.
Für alle Kreuzvalidierungen wurde die in GOLPE implementierte Leave-Several-Out
Methode verwendet (Standardparameter).
100
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112
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113
8 Glossar und Abkürzungsverzeichnis
RMSD-Wert/RMS-Abweichung: Root Mean Squared Deviation, mittlerer Abstand der in
zwei übereinandergelegten Strukturen korrespondierenden Atome; dient der Quan-
tifizierung der Ähnlichkeit dieser Strukturen; bei einer relativ starren Struktur wie der des
Galanthamins ist als Obergrenze ein RMSD-Wert von 1 Å akzeptabel; bei den Strukturen
des Datensatzes bezieht sich der RMSD-Wert nur auf den Galanthamin-Kern; eine
Erhöhung des RMSD-Grenzwerts auf 3 Å an dieser Stelle schien angemessen, um substi-
tuentenbedingte Translationen des Galanthamin-Kerns zu kompensieren.
Connolly-Oberfläche: Oberfläche um ein Molekül, die durch simuliertes Rollen einer Kugel
mit dem Durchmesser von 1.4 Å über dessen van-der-Waals-Oberfläche entsteht; mit
dieser Kugel soll ein Wassermolekül simuliert werden; die Connolly-Oberfläche glättet
somit die van-der-Waals-Oberfläche und zeigt gleichzeitig die Solvenszugänglichkeit der
Oberfläche an.
Cauchy-Verteilung: eine der Gauß-Verteilung ähnliche Funktion.
δchemische Verschiebung im NMR, relativ zu Tetramethylsilan
d Dublet
tTriplet
qQuartet
m Multiplet
diast. Kennzeichnung der NMR-Signale bei Diastereomerengemischen
olefin. olefinisch
aromat. aromatisch
cycl. zugeordnetes Strukturelement befindet sich in einem Ring
114
9 Anhang
Tabelle A1: AChE-Strukturen aus der Protein Datenbank (http://www.rcsb.org)[129]
PBD-ID Jahr Auflösung [Å] Spezies Bemerkungen Ref.
1MAA 1999 2.90 Mus Musculus Tetramer [130]
1MAH 1996 3.10 Mus Musculus Fasciculin1 [131]
1EEA 1999 4.50 Electrophorus Electricus –[132]
1C2B 1999 4.50 Electrophorus Electricus –[133]
1C2O 2000 4.20 Electrophorus Electricus Tetramer [133]
2ACE 1996 2.50 Torpedo Californica –[134]
1FSS 1996 3.00 Torpedo Californica Fasciculin1 [135]
1ACJ 1994 2.80 Torpedo Californica Tacrin1 [136]
1ACL 1994 2.80 Torpedo Californica Decamethonium1 [136]
1AX9 1998 2.80 Torpedo Californica Edrophonium1 [137]
2ACK 1998 2.40 Torpedo Californica Edrophonium1 [137]
1EVE 1999 2.50 Torpedo Californica E20201 [138]
1VOT 1997 2.50 Torpedo Californica Huperzin1 [139]
1DX6 2000 2.30 Torpedo Californica Galanthamin1 [140]
1QTI 1999 2.50 Torpedo Californica Galanthamin1 [88]
1OCE 1999 2.70 Torpedo Californica Carbamat2 [141]
1AMN 1996 2.80 Torpedo Californica Trifluor2 [142]
1VXR 1999 2.20 Torpedo Californica VX2 [143]
1VXO 1999 2.40 Torpedo Californica VX2 [143]
1SOM 1999 2.20 Torpedo Californica Soman2 [144]
1CFJ 1999 2.60 Torpedo Californica VX2 [144]
2DFP 1999 2.30 Torpedo Californica Organophosphat2 [144]
1QID 2000 2.05 Torpedo Californica Serie (insges. 9)3 [145]
1 nicht-kovalent gebunden
2 kovalent gebunden an SER200
3 Vertreter einer Serie aus 9 Strukturen (zeitabhängige Aufnahmen)
115
Tabelle A2: Ausgewählte Aminosäuren im Bereich des Schlauchs und des aktiven Zentrums
(Unterschiede in den Primärsequenzen beider Spezies sind hervorgehoben)
Torpedo Californica Mensch Torpedo Californica Mensch
Tyrosin 70 Tyrosin 72 Valin 281 Valin 288
Valin 71 Valin 73 Leucin 282 Leucin 289
Asparaginsäure 72 Asparaginsäure 74 Prolin 283 Prolin 290
Glutaminsäure 73 Threonin 75 Phenylalanin 284 Glutamin 291
Glutamin 74 Leucin 76 Asparaginsäure 285 Glutaminsäure 292
Glycin 80 Glycin 82 Serin 286 Serin 293
Serin 81 Threonin 83 Isoleucin 287 Valin 294
Tryptophan 84 Tryptophan 86 Phenylalanin 288 Phenylalanin 295
Glycin 117 Glycin 120 Arginin 289 Arginin 296
Glycin 118 Glycin 121 Phenylalanin 290 Phenylalanin 297
Glycin 119 Glycin 122 Phenylalanin 330 Tyrosin 337
Tyrosin 121 Tyrosin 124 Phenylalanin 331 Phenylalanin 338
Serin 122 Serin 125 Leucin 333 Valin 340
Serin 124 Alanin 127 Tyrosin 334 Tyrosin 341
Leucin 127 Leucin 130 Glycin 335 Glycin 342
Tyrosin 130 Tyrosin 133 Tryptophan 432 Tryptophan 439
Glutaminsäure 199 Glutaminsäure 202 Histidin 440 Histidin 447
Serin 200 Serin 203 Glycin 441 Glycin 448
Alanin 201 Alanin 204 Tyrosin 442 Tyrosin 449
Tryptophan 233 Tryptophan 236 Glutaminsäure 443 Glutaminsäure 450
Tryptophan 279 Tryptophan 286 Isoleucin 444 Isoleucin 451
Asparagin 280 Histidin 287
116
Tabelle A3: Ergebnisse Docking: Portal geschlossen, N-Methylgruppe equatorial
AutoDock 2.4 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD Energie gesamt Inhibitor Enzym
Gal_eq1ACJ_clu01 4 3.322 -43.79 -3820.93 22.49 -3790.72
Gal_eq1ACJ_clu02 84 7.548 -43.68 -3809.08 23.85 -3794.27
Gal_eq1ACJ_clu03 9 2.873 -43.68 -3815.68 20.54 -3794.46
Gal_eq1ACJ_clu04 44 0.927 -42.53 -3827.72 21.88 -3790.20
Gal_eq1ACJ_clu05 7 2.466 -40.95 -3819.83 22.27 -3793.15
Gal_eq1ACJ_clu06 4 4.132 -40.1 -3806.87 24.53 -3789.08
Gal_eq1ACJ_clu07 202 7.705 -39.89 -3803.88 22.61 -3792.53
Gal_eq1ACJ_clu08 3 2.914 -39.45 -3811.13 24.65 -3788.23
Gal_eq1ACJ_clu09 4 1.93 -39.26 -3826.94 23.01 -3791.24
Gal_eq1ACJ_clu10 53 9.185 -39.16 -3807.11 22.15 -3793.70
Gal_eq1ACJ_clu11 14 8.412 -38.27 -3798.98 22.83 -3792.41
Gal_eq1ACJ_clu12 4 8.668 -37.95 -3801.19 24.11 -3792.00
Gal_eq1ACJ_clu13 1 8.801 -36.33 -3804.82 24.21 -3794.09
Gal_eq1ACJ_clu14 28 7.65 -36.19 -3797.57 23.83 -3792.98
Gal_eq1ACJ_clu15 10 9.035 -36.16 -3798.32 23.14 -3793.74
Gal_eq1ACJ_clu16 18 8.461 -34.46 -3795.37 22.52 -3792.89
Gal_eq1ACJ_clu17 2 8.592 -34.43 -3802.77 22.87 -3793.07
Gal_eq1ACJ_clu18 1 7.952 -33.4 -3804.26 21.16 -3795.71
Gal_eq1ACJ_clu19 4 4.127 -30.43 -3802.40 26.15 -3786.29
Gal_eq1ACJ_clu20 1 8.713 -29.55 -3799.25 24.78 -3795.10
Gal_eq1ACJ_clu21 3 9.254 -29.41 -3798.26 22.06 -3794.41
RMSD in Å; Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
117
Tabelle A4: Ergebnisse Docking: Portal geschlossen, N-Methylgruppe axial
AutoDock 2.4 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD Energie gesamt Inhibitor Enzym
Gal_ax1ACJ_clu01 129 7.221 -42.12 -3807.82 21.64 -3793.04
Gal_ax1ACJ_clu02 70 8.773 -39.59 -3811.75 20.00 -3795.61
Gal_ax1ACJ_clu03 2 7.346 -39.26 -3809.72 22.30 -3791.75
Gal_ax1ACJ_clu04 85 7.072 -39.01 -3811.02 16.04 -3795.77
Gal_ax1ACJ_clu05 3 3.521 -38.16 -3818.27 19.92 -3791.92
Gal_ax1ACJ_clu06 2 3.491 -37.89 -3822.20 20.34 -3791.41
Gal_ax1ACJ_clu07 116 8.147 -37.8 -3809.12 16.66 -3794.07
Gal_ax1ACJ_clu08 11 3.837 -36.39 -3812.86 20.06 -3790.75
Gal_ax1ACJ_clu09 3 4.219 -36.28 -3808.89 21.34 -3785.16
Gal_ax1ACJ_clu10 3 3.181 -36.05 -3809.86 19.00 -3789.76
Gal_ax1ACJ_clu11 5 8.506 -35.78 -3809.98 16.50 -3791.91
Gal_ax1ACJ_clu12 6 3.621 -35.64 -3812.48 21.31 -3789.81
Gal_ax1ACJ_clu13 1 8.436 -35.43 -3808.78 20.74 -3794.54
Gal_ax1ACJ_clu14 5 2.905 -34.7 -3811.18 21.79 -3791.72
Gal_ax1ACJ_clu15 32 8.708 -34.68 -3805.49 16.45 -3793.02
Gal_ax1ACJ_clu16 2 8.897 -32.18 -3804.63 15.67 -3793.43
Gal_ax1ACJ_clu17 2 3.132 -31.76 -3820.91 21.59 -3790.05
Gal_ax1ACJ_clu18 23 2.018 -30.18 -3814.71 19.92 -3791.83
RMSD in Å; Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
118
Tabelle A5: Ergebnisse Docking: Portal teilweise geöffnet, N-Methylgruppe equatorial
AutoDock 2.4 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD Energie gesamt Inhibitor Enzym
Gal_eq2ACK_clu01 21 2.41 -49.84 -3968.55 22.50 -3941.51
Gal_eq2ACK_clu02 68 0.90 -47.40 -3968.78 23.27 -3937.37
Gal_eq2ACK_clu03 113 9.04 -40.89 -3952.12 23.10 -3942.63
Gal_eq2ACK_clu04 62 8.16 -40.01 -3952.64 21.09 -3941.18
Gal_eq2ACK_clu05 10 8.80 -39.45 -3954.11 18.82 -3942.19
Gal_eq2ACK_clu06 106 8.59 -39.20 -3951.81 20.69 -3940.86
Gal_eq2ACK_clu07 1 7.84 -39.09 -3949.31 27.86 -3942.08
Gal_eq2ACK_clu08 1 8.14 -38.48 -3947.14 23.51 -3941.42
Gal_eq2ACK_clu09 73 7.95 -38.46 -3947.63 22.97 -3940.68
Gal_eq2ACK_clu10 3 8.58 -37.49 -3954.40 18.35 -3943.81
Gal_eq2ACK_clu11 4 8.10 -37.24 -3952.40 20.96 -3940.31
Gal_eq2ACK_clu12 15 9.25 -37.04 -3954.40 22.06 -3942.63
Gal_eq2ACK_clu13 2 7.53 -36.96 -3947.54 19.10 -3939.41
Gal_eq2ACK_clu14 5 3.33 -33.05 -3963.66 25.57 -3935.51
Gal_eq2ACK_clu15 4 3.69 -29.99 -3960.94 25.16 -3938.38
Gal_eq2ACK_clu16 8 3.06 -29.82 -3961.02 25.56 -3941.61
Gal_eq2ACK_clu17 3 3.24 -28.68 -3943.66 24.72 -3933.58
RMSD in Å; Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
119
Tabelle A6: Ergebnisse Docking: Portal teilweise geöffnet, N-Methylgruppe axial
AutoDock 2.4 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD Energie gesamt Inhibitor Enzym
Gal_ax2ACK_clu01 184 8.31 -40.58 -3957.15 19.11 -3942.41
Gal_ax2ACK_clu02 14 3.23 -39.39 -3969.95 20.99 -3942.30
Gal_ax2ACK_clu03 14 2.80 -38.92 -3966.94 19.12 -3940.83
Gal_ax2ACK_clu04 15 7.90 -38.74 -3947.02 20.16 -3941.47
Gal_ax2ACK_clu05 4 7.94 -38.70 -3950.33 19.17 -3941.28
Gal_ax2ACK_clu06 50 8.83 -38.69 -3954.63 20.51 -3942.40
Gal_ax2ACK_clu07 39 8.73 -38.66 -3951.61 18.32 -3942.45
Gal_ax2ACK_clu08 14 2.98 -38.59 -3963.56 22.04 -3941.69
Gal_ax2ACK_clu09 74 8.85 -38.18 -3956.87 16.33 -3941.54
Gal_ax2ACK_clu10 1 8.47 -37.99 -3955.08 19.76 -3942.35
Gal_ax2ACK_clu11 11 9.32 -37.96 -3951.39 21.26 -3942.67
Gal_ax2ACK_clu12 3 8.95 -37.80 -3957.24 19.30 -3942.36
Gal_ax2ACK_clu13 9 9.13 -37.34 -3955.90 18.40 -3942.80
Gal_ax2ACK_clu14 5 8.73 -36.91 -3952.48 19.52 -3941.85
Gal_ax2ACK_clu15 1 9.04 -36.59 -3957.99 16.09 -3941.98
Gal_ax2ACK_clu16 1 7.40 -36.14 -3953.32 19.57 -3942.31
Gal_ax2ACK_clu17 2 3.27 -31.94 -3960.54 23.56 -3936.87
Gal_ax2ACK_clu18 9 2.61 -25.76 -3957.45 22.18 -3936.80
Gal_ax2ACK_clu19 6 2.75 -24.78 -3959.13 19.24 -3940.08
Gal_ax2ACK_clu20 39 1.48 -21.90 -3959.32 23.72 -3935.20
Gal_ax2ACK_clu21 4 3.21 -17.40 -3961.75 25.25 -3935.13
Gal_ax2ACK_clu22 1 3.54 -10.62 -3959.24 23.37 -3935.53
RMSD in Å; Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
120
Tabelle A7: Ergebnisse Docking: Portal geöffnet, N-Methylgruppe equatorial
AutoDock 2.4 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD Energie gesamt Inhibitor Enzym
Gal_eq1ACL_clu01 22 2.23 -48.60 -3550.49 22.72 -3519.08
Gal_eq1ACL_clu02 48 7.12 -45.44 -3537.17 23.24 -3521.75
Gal_eq1ACL_clu03 34 3.57 -44.98 -3535.66 20.17 -3520.74
Gal_eq1ACL_clu04 12 3.07 -44.77 -3536.79 22.60 -3517.86
Gal_eq1ACL_clu05 32 3.27 -44.71 -3546.40 18.49 -3520.44
Gal_eq1ACL_clu06 6 3.67 -42.45 -3538.56 23.27 -3522.06
Gal_eq1ACL_clu07 77 7.23 -42.34 -3524.92 24.36 -3516.18
Gal_eq1ACL_clu08 3 4.13 -42.25 -3542.04 24.40 -3518.75
Gal_eq1ACL_clu09 3 1.02 -41.82 -3553.62 22.56 -3518.25
Gal_eq1ACL_clu10 12 3.57 -40.63 -3537.61 22.53 -3518.87
Gal_eq1ACL_clu11 40 8.00 -40.56 -3527.39 24.05 -3518.35
Gal_eq1ACL_clu12 1 3.25 -39.83 -3527.28 21.44 -3517.48
Gal_eq1ACL_clu13 77 7.88 -39.75 -3527.50 21.32 -3518.69
Gal_eq1ACL_clu14 2 4.01 -39.62 -3532.70 27.12 -3517.11
Gal_eq1ACL_clu15 4 3.85 -39.59 -3533.38 21.36 -3518.68
Gal_eq1ACL_clu16 11 8.15 -39.55 -3533.77 19.26 -3519.62
Gal_eq1ACL_clu17 4 3.58 -39.22 -3537.78 22.67 -3518.08
Gal_eq1ACL_clu18 37 8.27 -39.14 -3536.71 18.22 -3522.25
Gal_eq1ACL_clu19 13 8.89 -39.08 -3526.27 22.42 -3518.53
Gal_eq1ACL_clu20 14 7.69 -38.96 -3530.76 18.95 -3519.61
Gal_eq1ACL_clu21 11 3.18 -38.83 -3537.80 23.85 -3523.78
Gal_eq1ACL_clu22 2 3.30 -38.69 -3539.41 21.04 -3518.40
Gal_eq1ACL_clu23 1 4.29 -38.68 -3539.84 19.28 -3520.51
Gal_eq1ACL_clu24 10 8.77 -38.62 -3528.77 23.13 -3519.02
Gal_eq1ACL_clu25 2 8.81 -38.09 -3519.49 24.30 -3516.48
Gal_eq1ACL_clu26 2 7.18 -37.88 -3526.88 22.37 -3518.63
Gal_eq1ACL_clu27 2 7.54 -37.81 -3529.89 22.32 -3520.10
Gal_eq1ACL_clu28 1 8.27 -36.46 -3528.11 21.87 -3519.65
Gal_eq1ACL_clu29 7 8.25 -35.99 -3527.51 22.17 -3519.85
Gal_eq1ACL_clu30 10 8.29 -35.69 -3527.25 20.71 -3520.16
RMSD in Å; Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
121
Tabelle A8: Ergebnisse Docking: Portal geöffnet, N-Methylgruppe axial
AutoDock 2.4 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD Energie gesamt Inhibitor Enzym
Gal_ax1ACL_clu01 19 2.07 -46.19 -3550.13 20.64 -3519.28
Gal_ax1ACL_clu02 6 2.32 -44.68 -3544.12 18.32 -3518.90
Gal_ax1ACL_clu03 10 3.26 -43.90 -3542.80 19.80 -3520.33
Gal_ax1ACL_clu04 8 2.89 -43.30 -3539.69 16.16 -3518.31
Gal_ax1ACL_clu05 3 2.35 -43.02 -3540.67 20.71 -3519.01
Gal_ax1ACL_clu06 54 3.51 -42.74 -3539.84 16.01 -3520.42
Gal_ax1ACL_clu07 36 6.42 -41.65 -3536.32 21.39 -3518.00
Gal_ax1ACL_clu08 2 4.13 -40.31 -3547.18 21.50 -3519.64
Gal_ax1ACL_clu09 3 4.24 -39.82 -3535.41 20.22 -3519.36
Gal_ax1ACL_clu10 134 8.71 -39.73 -3531.43 19.60 -3519.89
Gal_ax1ACL_clu11 54 7.85 -39.29 -3533.00 19.15 -3520.37
Gal_ax1ACL_clu12 30 8.62 -38.72 -3531.40 19.36 -3518.91
Gal_ax1ACL_clu13 22 8.43 -38.29 -3531.58 19.58 -3518.14
Gal_ax1ACL_clu14 23 8.09 -38.22 -3528.74 20.28 -3519.59
Gal_ax1ACL_clu15 5 0.88 -37.82 -3555.37 19.43 -3517.59
Gal_ax1ACL_clu16 1 4.40 -37.68 -3542.38 20.65 -3519.34
Gal_ax1ACL_clu17 4 8.77 -37.67 -3531.11 20.35 -3519.37
Gal_ax1ACL_clu18 9 3.14 -37.34 -3532.95 20.67 -3518.93
Gal_ax1ACL_clu19 14 8.01 -36.93 -3528.25 19.09 -3518.54
Gal_ax1ACL_clu20 3 8.95 -36.76 -3529.64 18.97 -3519.51
Gal_ax1ACL_clu21 16 8.90 -36.67 -3532.13 16.48 -3521.09
Gal_ax1ACL_clu22 5 7.80 -36.59 -3523.41 21.10 -3518.17
Gal_ax1ACL_clu23 27 9.01 -36.29 -3533.82 19.31 -3520.83
Gal_ax1ACL_clu24 6 9.23 -36.27 -3530.75 20.46 -3520.85
Gal_ax1ACL_clu25 1 3.62 -36.01 -3537.43 22.87 -3516.68
Gal_ax1ACL_clu26 2 8.08 -35.77 -3531.72 19.58 -3519.45
Gal_ax1ACL_clu27 2 8.29 -35.74 -3530.27 18.18 -3520.44
Gal_ax1ACL_clu28 1 8.04 -34.83 -3531.92 15.84 -3520.32
RMSD in Å; Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
122
Tabelle A9: Ergebnisse der Reproduktion von 1QTI mit AutoDock 3.0
AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD Energie pKigesamt Inhibitor Enzym
Gal_eq1QTI_clu01 91 0.41 -12.04 2.54 -4685.50 25.39 -4656.63
Gal_eq1QTI_clu02 3 3.07 -11.91 7.84 -4679.28 20.37 -4658.21
Gal_eq1QTI_clu03 6 2.04 -11.91 5.56 -4691.49 24.03 -4660.22
Gal_ax1QTI_clu01 96 0.39 -12.01 2.81 -4686.09 22.74 -4656.54
Gal_ax1QTI_clu02 1 4.67 -11.87 5.87 -4674.34 24.01 -4657.51
Gal_ax1QTI_clu03 2 2.10 -11.74 1.12 -4692.25 17.39 -4661.94
Gal_ax1QTI_clu04 1 2.70 -11.70 1.14 -4688.19 17.99 -4663.43
RMSD in Å; Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
Tabelle A10: Ergebnisse der Docking-Studie am Galanthamin-Datensatz
AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD pKigesamt Inhibitor Enzym
Sph1000ax_clu001-1 375 0.87 2.28 -4280.16 25.04 -4258.53
Sph1000eq_clu001-1 332 0.43 2.32 -4282.37 26.53 -4257.58
Sph1058ax_clu001-1 12 0.89 3.99 -4303.77 46.66 -4255.93
Sph1058eq_clu001-1 13 0.80 4.16 -4301.77 47.00 -4257.48
Sph1059ax_clu001-1 15 0.87 3.61 -4300.02 47.52 -4255.97
Sph1059ax_clu009-1 1 0.94 2.16 -4275.84 44.29 -4256.28
Sph1059eq_clu001-1 12 0.87 3.75 -4300.17 48.05 -4257.59
Sph1059eq_clu005-1 1 0.58 2.52 -4291.33 47.35 -4256.99
Sph1060ax_clu001-1 7 0.88 3.90 -4300.33 51.11 -4255.68
Sph1060eq_clu001-1 7 0.81 3.94 -4299.10 50.54 -4256.59
Sph1070b_clu022-1 1 1.51 0.48 -4290.34 49.83 -4248.08
Sph1070b_clu023-1 1 2.57 0.18 -4276.67 50.16 -4254.24
Sph1085ax_clu003-1 58 1.29 2.33 -4295.19 22.16 -4259.62
Sph1085ax_clu003-2 13 1.32 2.35 -4295.68 22.24 -4259.75
Sph1085eq_clu009-1 2 1.33 1.99 -4293.33 25.17 -4259.43
RMSD[Å] < 3 Å (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
123
Tabelle A10: Ergebnisse der Docking-Studie am Galanthamin-Datensatz (fortgesetzt)
AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD pKigesamt Inhibitor Enzym
Sph1088ax_clu002-1 36 0.46 1.96 -4292.36 19.19 -4259.84
Sph1088eq_clu003-1 21 0.48 1.98 -4291.02 22.21 -4259.40
Sph1095ax_clu009-1 2 1.38 1.79 -4294.38 26.46 -4259.42
Sph1095ax_clu014-1 4 1.05 1.77 -4294.69 26.71 -4260.66
Sph1095ax_clu015-1 1 1.05 1.59 -4296.59 27.13 -4260.56
Sph1095ax_clu024-1 1 1.21 1.78 -4289.88 28.15 -4259.83
Sph1095ax_clu026-1 1 2.76 1.14 -4268.08 29.50 -4251.61
Sph1095eq_clu019-1 3 1.30 1.67 -4294.18 29.78 -4258.79
Sph1096ax_clu001-1 4 1.07 2.21 -4296.01 26.51 -4258.25
Sph1096ax_clu004-1 6 0.20 2.07 -4291.78 26.92 -4258.58
Sph1096eq_clu001-1 7 0.85 2.86 -4293.08 30.94 -4256.03
Sph1096eq_clu006-1 1 0.41 1.98 -4277.86 31.65 -4251.25
Sph1103ax_clu003-1 4 0.18 3.67 -4289.72 20.88 -4258.35
Sph1103eq_clu002-1 1 0.92 4.43 -4282.83 30.46 -4254.92
Sph1107ax_clu006-1 2 0.53 3.71 -4285.16 30.46 -4253.42
Sph1107ax_clu035-1 2 1.12 2.38 -4266.20 35.35 -4243.28
Sph1107ax_clu041-1 1 1.22 2.83 -4284.77 31.58 -4255.76
Sph1107eq_clu003-1 1 0.93 3.58 -4285.14 33.65 -4253.55
Sph1115ax_clu001-1 10 1.14 2.16 -4297.06 21.89 -4260.28
Sph1115ax_clu001-2 10 1.17 2.16 -4296.81 21.83 -4260.46
Sph1115eq_clu006-1 4 1.23 1.87 -4293.64 24.51 -4259.40
Sph1116ax_clu001-1 3 0.80 2.24 -4297.68 26.44 -4258.28
Sph1116ax_clu003-1 4 0.39 2.13 -4284.35 28.01 -4255.76
Sph1116eq_clu001-1 3 0.82 2.63 -4293.69 29.54 -4256.26
Sph1116eq_clu002-1 3 0.40 2.25 -4277.23 30.92 -4251.17
Sph1116eq_clu008-1 2 0.34 2.34 -4284.31 28.01 -4254.56
Sph1116eq_clu011-1 1 0.30 1.86 -4278.13 29.57 -4250.96
RMSD[Å] < 3 Å (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
124
Tabelle A10: Ergebnisse der Docking-Studie am Galanthamin-Datensatz (fortgesetzt)
AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD pKigesamt Inhibitor Enzym
Sph1117ax_clu002-1 7 0.16 3.71 -4286.71 29.89 -4252.56
Sph1117ax_clu003-1 2 1.12 3.47 -4284.14 30.44 -4255.68
Sph1117eq_clu002-1 4 0.45 3.59 -4287.87 33.12 -4253.10
Sph1117eq_clu007-1 1 0.49 2.27 -4288.50 36.46 -4254.83
Sph1140ax_clu001-1 3 0.83 3.65 -4296.44 76.18 -4256.34
Sph1140eq_clu001-1 5 0.96 4.27 -4325.46 77.22 -4245.03
Sph1140eq_clu002-1 9 0.20 4.01 -4314.62 72.15 -4251.39
Sph1140eq_clu005-1 1 0.17 3.10 -4297.82 74.03 -4253.12
Sph1142ax_clu001-1 13 0.75 3.63 -4301.11 9.26 -4256.08
Sph1142eq_clu001-1 7 0.85 3.84 -4300.79 9.20 -4257.55
Sph1144ax_clu002-1 1 0.25 4.66 -4293.07 55.27 -4255.00
Sph1144eq_clu005-1 1 0.56 4.10 -4278.04 60.76 -4243.84
Sph1144eq_clu040-1 1 0.24 3.26 -4278.80 63.81 -4251.05
Sph1145ax_clu001-1 15 0.83 3.30 -4297.34 54.10 -4255.87
Sph1145ax_clu003-1 1 0.46 2.21 -4285.98 52.91 -4256.71
Sph1145eq_clu001-1 9 0.30 3.57 -4285.51 54.38 -4249.26
Sph1145eq_clu002-1 3 0.29 3.55 -4283.53 55.48 -4251.81
Sph1145eq_clu003-1 2 0.35 2.97 -4291.57 51.84 -4256.93
Sph1145eq_clu009-1 1 0.93 2.56 -4274.56 57.43 -4254.25
Sph1146ax_clu001-1 4 0.88 4.07 -4200.67 154.38 -4256.75
Sph1146ax_clu004-1 1 0.47 3.02 -4189.29 151.49 -4256.13
Sph1146eq_clu002-1 7 0.34 3.76 -4178.65 160.12 -4254.27
Sph1146eq_clu004-1 1 0.86 3.88 -4177.39 161.00 -4250.04
Sph1148ax_clu001-1 12 0.75 3.69 -4302.22 51.49 -4257.52
Sph1148eq_clu001-1 2 0.91 3.75 -4283.29 48.92 -4252.04
Sph1148eq_clu004-1 3 0.47 2.98 -4287.21 53.22 -4255.98
Sph1149ax_clu002-1 2 0.20 4.24 -4295.19 50.36 -4256.18
Sph1149eq_clu001-1 2 0.50 4.66 -4289.13 50.06 -4253.57
RMSD[Å] < 3 Å (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
125
Tabelle A10: Ergebnisse der Docking-Studie am Galanthamin-Datensatz (fortgesetzt)
AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD pKigesamt Inhibitor Enzym
Sph1166axeqeq_clu028-1 1 0.81 2.64 -4286.14 33.94 -4252.38
Sph1184ax_clu003-1 5 0.31 5.28 -4296.33 58.65 -4256.95
Sph1185ax_clu003-1 7 0.59 5.19 -4306.02 54.65 -4256.42
Sph1185eq_clu001-1 3 0.34 5.42 -4284.40 55.79 -4249.49
Sph1186ax_clu003-1 6 0.40 5.64 -4295.86 62.71 -4256.02
Sph1186ax_clu005-1 1 1.26 4.50 -4300.97 57.63 -4253.94
Sph1187ax_clu003-1 3 0.66 5.35 -4301.41 58.96 -4257.25
Sph1187eq_clu001-1 7 0.28 6.14 -4295.98 48.88 -4252.82
Sph1188ax_clu003-1 3 0.49 4.79 -4300.35 57.63 -4250.67
Sph1188eq_clu001-1 1 0.23 5.07 -4299.76 48.88 -4252.11
Sph1189ax_clu001-1 8 0.79 3.77 -4299.75 49.24 -4255.89
Sph1189ax_clu003-1 1 0.45 2.70 -4284.07 52.09 -4255.09
Sph1189eq_clu001-1 14 0.85 4.01 -4299.22 50.25 -4257.66
Sph1192ax_clu001-1 4 0.66 3.55 -4304.03 50.83 -4257.23
Sph1192eq_clu001-1 3 0.91 3.89 -4288.59 56.67 -4254.40
Sph1192eq_clu002-1 2 0.25 3.91 -4291.03 51.18 -4254.45
Sph1192eq_clu004-1 1 0.93 3.34 -4288.32 52.22 -4255.63
Sph1193ax_clu003-1 4 0.80 3.97 -4297.78 55.58 -4257.44
Sph1193ax_clu004-1 3 0.56 3.32 -4278.38 57.50 -4253.33
Sph1193eq_clu002-1 2 0.19 3.76 -4287.75 49.68 -4250.27
Sph1193eq_clu003-1 1 1.01 3.73 -4284.07 56.43 -4248.07
Sph1193eq_clu012-1 1 1.26 2.59 -4280.00 52.00 -4254.53
Sph1197ax_clu001-1 15 0.87 3.57 -4299.56 50.42 -4257.44
Sph1197eq_clu001-1 14 0.94 3.67 -4296.25 50.45 -4256.03
Sph1206ax_clu002-1 3 1.04 3.63 -4297.94 50.06 -4255.75
Sph1206eq_clu002-1 3 0.97 3.59 -4301.35 49.13 -4257.41
Sph1207ax_clu016-1 1 0.55 3.71 -4286.05 64.35 -4255.65
Sph1207eq_clu007-1 1 0.47 3.95 -4292.97 51.81 -4252.11
RMSD[Å] < 3 Å (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
126
Tabelle A10: Ergebnisse der Docking-Studie am Galanthamin-Datensatz (fortgesetzt)
AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD pKigesamt Inhibitor Enzym
Sph1211a_clu003-1 2 0.57 2.26 -4283.50 25.40 -4252.65
Sph1211c_clu001-1 9 0.40 3.16 -4282.16 31.64 -4256.60
Sph1211d_clu002-1 9 0.32 2.88 -4276.33 33.81 -4252.42
Sph1216ax_clu001-1 4 0.71 2.97 -4301.64 25.09 -4257.98
Sph1216ax_clu004-1 1 0.54 2.55 -4289.73 24.76 -4254.99
Sph1216eq_clu003-1 2 0.22 2.66 -4289.94 27.18 -4256.72
Sph1216eq_clu005-1 2 0.82 3.32 -4297.47 25.63 -4256.26
Sph1217ax_clu001-1 3 0.84 2.94 -4293.64 24.79 -4257.63
Sph1217eq_clu005-1 1 0.86 3.31 -4298.77 25.82 -4252.89
Sph1217eq_clu006-1 2 0.53 2.63 -4284.87 30.67 -4252.38
Sph1217eq_clu008-1 1 0.25 2.54 -4291.88 25.98 -4255.14
Sph1225ax_clu001-1 6 1.18 2.95 -4283.98 23.08 -4256.07
Sph1225ax_clu002-1 4 0.80 2.72 -4283.72 21.19 -4253.18
Sph1225eq_clu001-1 5 0.89 2.92 -4279.29 25.14 -4252.89
Sph1225eq_clu002-1 3 1.12 2.75 -4281.07 26.32 -4255.22
Sph1227ax_clu001-1 18 1.11 2.53 -4286.55 21.71 -4257.67
Sph1227eq_clu001-1 21 0.84 2.46 -4285.84 22.96 -4257.98
Sph1227eq_clu001-2 21 1.08 2.46 -4284.51 24.00 -4257.25
Sph1229ax_clu006-1 2 0.63 3.09 -4301.12 20.67 -4256.61
Sph1231a_clu002-1 2 0.84 2.31 -4301.93 21.07 -4257.24
Sph1231b_clu002-1 3 2.47 2.84 -4281.22 29.03 -4249.15
Sph1231c_clu002-1 5 0.36 2.98 -4275.19 33.94 -4252.45
Sph1231c_clu008-1 1 1.07 1.49 -4270.31 37.75 -4247.30
Sph1231d_clu001-1 12 0.25 3.04 -4280.35 29.99 -4253.42
Sph1231d_clu002-1 5 1.50 2.83 -4282.54 30.50 -4256.11
Sph1246a_clu002-1 4 0.31 2.76 -4290.14 22.55 -4256.41
Sph1246b_clu001-1 14 0.19 2.98 -4289.72 23.13 -4254.46
RMSD[Å] < 3 Å (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
127
Tabelle A10: Ergebnisse der Docking-Studie am Galanthamin-Datensatz (fortgesetzt)
AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD pKigesamt Inhibitor Enzym
Sph1247ax_clu004-1 14 0.89 1.91 -4292.91 23.69 -4259.45
Sph1247eq_clu005-1 3 0.83 1.69 -4282.30 23.06 -4259.48
Sph1248ax_clu002-1 3 0.16 2.34 -4291.28 24.85 -4256.57
Sph1248eq_clu002-1 1 0.82 2.84 -4291.37 27.80 -4249.50
Sph1248eq_clu008-1 1 0.97 2.66 -4287.59 29.10 -4254.29
Sph1248eq_clu013-1 1 0.61 1.68 -4288.10 28.01 -4257.84
Sph1251ax_clu001-1 5 1.11 4.23 -4290.99 45.69 -4253.82
Sph1251eq_clu001-1 8 1.12 4.28 -4292.76 46.00 -4256.97
Sph1262axa_clu001-1 2 0.74 3.79 -4302.50 23.37 -4254.73
Sph1262axa_clu005-1 1 1.23 3.55 -4293.60 23.10 -4256.02
Sph1262axa_clu007-1 2 0.20 3.51 -4299.16 23.61 -4253.76
Sph1262axa_clu036-1 1 0.99 2.58 -4300.52 20.99 -4257.74
Sph1262axb_clu001-1 2 0.77 3.81 -4299.07 21.39 -4257.89
Sph1262axb_clu008-1 2 0.47 2.64 -4288.60 30.45 -4255.20
Sph1262axb_clu028-1 1 0.49 2.85 -4289.63 30.13 -4255.83
Sph1262eqa_clu003-1 3 0.31 3.36 -4293.13 25.83 -4253.31
Sph1262eqa_clu005-1 1 0.66 3.02 -4308.97 22.16 -4256.42
Sph1262eqb_clu006-1 2 0.15 3.57 -4293.06 26.85 -4256.79
Sph1262eqb_clu007-1 1 0.49 3.40 -4293.53 28.99 -4250.51
Sph1262eqb_clu008-1 2 0.62 2.63 -4291.63 24.14 -4253.46
Sph1262eqb_clu013-1 2 0.50 2.76 -4302.05 28.33 -4256.36
Sph1268a_clu002-1 12 0.25 2.46 -4293.39 15.36 -4255.46
Sph1268a_clu004-1 2 1.23 2.12 -4302.45 14.64 -4259.09
Sph1268b_clu001-1 10 0.25 2.64 -4295.40 14.88 -4257.75
Sph1269b_clu006-1 1 0.54 1.55 -4287.94 21.10 -4253.99
Sph1269c_clu001-1 9 0.64 3.73 -4291.75 31.63 -4251.15
Sph1269d_clu003-1 7 0.50 3.19 -4267.38 43.31 -4248.19
Sph1274ax_clu001-1 6 0.82 2.76 -4299.64 23.24 -4258.39
RMSD[Å] < 3 Å (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
128
Tabelle A10: Ergebnisse der Docking-Studie am Galanthamin-Datensatz (fortgesetzt)
AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD pKigesamt Inhibitor Enzym
Sph1274eq_clu002-1 3 0.88 3.04 -4290.83 28.01 -4254.23
Sph1277ax_clu003-1 1 0.16 3.10 -4286.03 24.02 -4255.21
Sph1281ax_clu005-1 3 0.80 2.22 -4296.40 22.40 -4260.15
Sph1281ax_clu015-1 1 1.15 1.66 -4294.58 24.49 -4260.17
Sph1281eq_clu004-1 8 0.49 2.32 -4289.27 23.19 -4255.60
Sph1288a_clu005-1 1 0.60 1.17 -4292.94 18.00 -4254.41
Sph1288b_clu001-1 11 2.34 2.96 -4290.47 19.70 -4247.55
Sph1288c_clu005-1 1 0.62 2.64 -4277.38 45.01 -4254.79
Sph1288d_clu001-1 23 0.61 3.29 -4288.76 28.62 -4251.90
Sph1289ax_clu002-1 3 1.04 3.06 -4199.18 127.35 -4257.88
Sph1289ax_clu004-1 1 0.23 2.47 -4181.28 130.21 -4255.47
Sph1289eq_clu009-1 1 0.98 2.48 -4184.17 131.77 -4248.39
Sph1290ax_clu001-1 37 0.78 3.02 -4296.46 25.83 -4258.52
Sph1290eq_clu001-1 21 0.75 3.11 -4296.20 28.24 -4258.55
Sph1295ax_clu002-1 2 1.10 2.45 -4297.33 22.53 -4260.28
Sph1295ax_clu005-1 1 0.19 2.27 -4291.38 22.93 -4259.44
Sph1295eq_clu004-1 3 0.77 2.45 -4291.29 26.74 -4255.09
Sph1295eq_clu008-1 1 0.26 1.75 -4280.60 24.55 -4258.66
Sph1302a_clu032-1 1 1.13 0.22 -4280.60 22.73 -4244.92
Sph1302b_clu013-1 1 0.70 1.16 -4296.01 19.19 -4250.27
Sph1304ax_clu002-1 24 0.92 2.44 -4291.26 19.75 -4259.94
Sph1304eq_clu001-1 9 0.82 2.38 -4290.71 22.40 -4260.80
Sph1304eq_clu001-2 9 0.79 2.40 -4290.77 22.43 -4260.85
RMSD[Å] < 3 Å (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
129
Tabelle A10: Ergebnisse der Docking-Studie am Galanthamin-Datensatz (fortgesetzt)
AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD pKigesamt Inhibitor Enzym
Sph1312axaxeq_clu026-1 1 0.41 5.17 -4284.66 43.14 -4255.28
Sph1312axeqax_clu013-1 1 0.80 4.66 -4266.81 41.61 -4251.72
Sph1312axeqeq_clu021-1 1 0.86 4.84 -4277.85 42.44 -4250.93
Sph1312axeqeq_clu082-1 2 1.39 4.79 -4271.37 39.28 -4249.93
Sph1312eqaxeq_clu033-1 1 1.13 4.59 -4285.57 46.57 -4253.04
Sph1312eqaxeq_clu082-1 1 0.34 5.26 -4278.66 45.29 -4249.63
Sph1312eqaxeq_clu095-1 1 0.64 3.82 -4280.20 45.61 -4254.12
Sph1312eqeqax_clu002-1 1 0.66 5.87 -4275.60 41.27 -4247.30
Sph1312eqeqeq_clu010-1 1 0.28 5.82 -4282.82 43.77 -4252.93
Sph1312eqeqeq_clu065-1 1 0.77 4.43 -4269.30 48.43 -4254.34
Sph1315ax_clu001-1 3 0.77 2.49 -4297.16 27.52 -4257.71
Sph1315ax_clu007-1 1 1.20 1.99 -4292.21 28.57 -4259.62
Sph1315ax_clu008-1 1 0.33 1.86 -4288.79 26.87 -4258.01
Sph1315eq_clu006-1 3 0.43 2.42 -4275.49 35.52 -4249.47
Sph1315eq_clu012-1 1 0.32 1.44 -4282.95 27.76 -4253.62
Sph1329axaxax_clu029-1 1 0.90 4.12 -4267.94 44.06 -4254.39
Sph1329axeqax_clu013-1 1 0.41 4.11 -4263.64 49.27 -4253.30
Sph1329axeqeq_clu008-1 1 0.77 5.69 -4271.46 49.73 -4251.86
Sph1329eqaxeq_clu019-1 2 0.34 4.05 -4279.54 44.65 -4252.35
Sph1329eqeqax_clu023-1 1 0.39 5.22 -4269.18 49.42 -4246.39
RMSD[Å] < 3 Å (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
130
Tabelle A10: Ergebnisse der Docking-Studie am Galanthamin-Datensatz (fortgesetzt)
AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld-Energie
Bezeichnung Anzahl RMSD pKigesamt Inhibitor Enzym
Sph1335axr_clu002-1 3 0.39 5.91 -4299.70 44.05 -4256.66
Sph1335axr_clu005-1 1 0.73 4.83 -4280.14 48.67 -4252.55
Sph1335axr_clu006-1 1 0.31 5.68 -4285.10 46.99 -4255.54
Sph1335axr_clu012-1 1 0.44 4.84 -4270.95 45.62 -4250.96
Sph1335axr_clu013-1 1 0.39 4.69 -4279.42 47.98 -4253.19
Sph1335axr_clu014-1 2 1.01 4.94 -4279.22 43.94 -4252.64
Sph1335axr_clu027-1 1 0.73 5.15 -4268.08 51.13 -4253.08
Sph1335axs_clu002-1 2 1.00 5.11 -4282.19 45.76 -4254.96
Sph1335axs_clu003-1 1 1.29 5.61 -4271.74 47.67 -4250.64
Sph1335axs_clu004-1 2 0.18 5.49 -4274.89 46.49 -4252.43
Sph1335axs_clu009-1 1 1.37 4.11 -4280.44 48.25 -4252.12
Sph1335axs_clu013-1 2 0.77 4.59 -4283.23 50.64 -4256.75
Sph1335axs_clu014-1 1 0.87 4.34 -4284.39 51.11 -4256.56
Sph1335eqr_clu005-1 1 0.50 5.35 -4280.74 50.55 -4254.89
Sph1335eqs_clu008-1 1 0.35 4.52 -4281.80 49.94 -4254.48
Sph1339ax_clu002-1 4 0.98 2.52 -4286.83 25.92 -4257.95
Sph1339ax_clu003-1 1 0.20 2.40 -4287.20 26.76 -4257.55
Sph1339eq_clu003-1 1 0.66 2.31 -4287.61 29.55 -4252.03
Sph1355axaxeq_clu008-1 1 0.42 4.35 -4286.65 37.79 -4253.75
Sph1355axeqax_clu151-1 1 1.36 4.85 -4281.88 39.37 -4244.58
Sph1355axeqeq_clu016-1 1 1.09 5.54 -4301.35 32.27 -4251.35
Sph1355axeqeq_clu102-1 1 0.46 4.07 -4304.85 26.75 -4256.15
Sph1355axeqeq_clu148-1 1 1.12 2.68 -4265.65 36.46 -4246.32
Sph1355axeqeq_clu315-1 1 2.77 2.74 -4281.75 30.05 -4249.43
Sph1355eqaxax_clu121-1 1 0.64 3.34 -4286.48 36.59 -4252.47
Sph1355eqaxeq_clu019-1 1 0.56 4.34 -4276.48 38.83 -4248.00
Sph1355eqaxeq_clu208-1 1 2.36 2.90 -4292.76 28.60 -4252.77
Sph1355eqeqeq_clu003-1 1 0.42 5.96 -4299.83 29.41 -4254.26
RMSD[Å] < 3 Å (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
131
Tabelle A11: Auswahl der Repräsentanten für die QSAR-Studien
anti-AChE Aktivität AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld
Bezeichnung Anzahl RMSD IC50 pKi
∆
H
Sph1000eq_clu001-1 332 0.43 5.69 2.32 -51.32
Sph1058eq_clu001-1 13 0.80 5.91 4.16 -91.29
Sph1059eq_clu001-1 12 0.87 6.00 3.75 -90.63
Sph1060eq_clu001-1 7 0.81 6.16 3.94 -93.04
Sph1070b_clu022-1 1 1.51 4.79 0.48 -92.10
Sph1085ax_clu003-2 13 1.32 4.48 2.35 -58.18
Sph1088eq_clu003-1 21 0.48 6.54 1.98 -53.83
Sph1095ax_clu009-1 2 1.38 4.77 1.79 -61.42
Sph1096eq_clu001-1 7 0.85 5.20 2.86 -67.99
Sph1103eq_clu002-1 1 0.92 6.48 4.43 -58.36
Sph1107ax_clu006-1 2 0.53 6.55 3.71 -62.21
Sph1115ax_clu001-1 10 1.14 4.11 2.16 -58.67
Sph1116eq_clu001-1 3 0.82 4.72 2.63 -66.97
Sph1117ax_clu002-1 7 0.16 5.35 3.71 -64.03
Sph1140eq_clu001-1 5 0.96 5.51 4.27 -157.65
Sph1142eq_clu001-1 7 0.85 5.91 3.84 -52.45
Sph1144ax_clu002-1 1 0.25 5.21 4.66 -93.34
Sph1145eq_clu001-1 9 0.30 5.60 3.57 -90.63
Sph1146ax_clu001-1 4 0.88 5.89 4.07 -98.29
Sph1148eq_clu001-1 2 0.91 5.85 3.75 -80.17
Sph1149eq_clu001-1 2 0.50 6.60 4.66 -85.63
Sph1166axeqeq_clu028-1 1 0.81 4.35 2.64 -67.69
Sph1184ax_clu003-1 5 0.31 6.64 5.28 -98.02
Sph1185eq_clu001-1 3 0.34 6.37 5.42 -90.70
Sph1186ax_clu003-1 6 0.40 6.46 5.64 -102.55
Sph1187eq_clu001-1 7 0.28 5.83 6.14 -92.04
Sph1188eq_clu001-1 1 0.23 6.37 5.07 -96.54
RMSD[Å] (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
132
Tabelle A11: Auswahl der Repräsentanten für die QSAR-Studien
anti-AChE Aktivität AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld
Bezeichnung Anzahl RMSD IC50 pKi
∆
H
Sph1189eq_clu001-1 14 0.85 5.77 4.01 -91.81
Sph1192eq_clu002-1 2 0.25 6.33 3.91 -87.76
Sph1193ax_clu003-1 4 0.80 5.82 3.97 -95.91
Sph1197eq_clu001-1 14 0.94 5.99 3.67 -90.67
Sph1206ax_clu002-1 3 1.04 4.41 3.63 -92.25
Sph1207eq_clu007-1 1 0.47 4.63 3.95 -92.67
Sph1211c_clu001-1 9 0.40 5.03 3.16 -57.20
Sph1216eq_clu005-1 2 0.82 4.35 3.32 -66.84
Sph1217eq_clu005-1 1 0.86 5.32 3.31 -71.70
Sph1225ax_clu001-1 6 1.18 4.74 2.95 -50.99
Sph1227ax_clu001-1 18 1.11 4.70 2.53 -50.60
Sph1229ax_clu006-1 2 0.63 4.73 3.09 -65.18
Sph1231d_clu001-1 12 0.25 4.78 3.04 -56.92
Sph1246b_clu001-1 14 0.19 5.06 2.98 -58.39
Sph1247ax_clu004-1 14 0.89 5.61 1.91 -57.15
Sph1248eq_clu002-1 1 0.82 4.70 2.84 -69.67
Sph1251eq_clu001-1 8 1.12 4.53 4.28 -81.79
Sph1262axb_clu001-1 2 0.77 4.56 3.81 -62.58
Sph1268b_clu001-1 10 0.25 4.36 2.64 -52.54
Sph1269c_clu001-1 9 0.64 5.59 3.73 -72.24
Sph1274eq_clu002-1 3 0.88 5.80 3.04 -64.61
Sph1277ax_clu003-1 1 0.16 4.78 3.10 -54.84
Sph1281eq_clu004-1 8 0.49 7.18 2.32 -56.86
Sph1288d_clu001-1 23 0.61 5.01 3.29 -65.48
Sph1289ax_clu002-1 3 1.04 6.07 3.06 -68.65
Sph1290eq_clu001-1 21 0.75 6.04 3.11 -65.90
RMSD[Å] (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
133
Tabelle A11: Auswahl der Repräsentanten für die QSAR-Studien (fortgesetzt)
anti-AChE Aktivität AutoDock 3.0 Tripos-Kraftfeld
Bezeichnung Anzahl RMSD IC50 pKi
∆
H
Sph1295eq_clu004-1 3 0.77 4.82 2.45 -62.94
Sph1302b_clu013-1 1 0.70 4.64 1.16 -64.93
Sph1304ax_clu002-1 24 0.92 4.18 2.44 -51.07
Sph1312eqeqax_clu002-1 1 0.66 5.56 5.87 -69.57
Sph1315ax_clu001-1 3 0.77 5.55 2.49 -66.97
Sph1329axeqeq_clu008-1 1 0.77 5.53 5.69 -69.33
Sph1335axr_clu002-1 3 0.39 7.55 5.91 -87.10
Sph1339ax_clu002-1 4 0.98 6.48 2.52 -54.80
Sph1355eqeqeq_clu003-1 1 0.42 5.44 5.96 -74.98
RMSD[Å] (bezogen auf den Galanthamin-Kern); Energie in kcal/mol (Absolutwerte)
Aus patentrechtlichen Gründen können die biologischen Aktivitätsdaten der Galanthamin-
Derivate derzeit nicht zusammen mit den Strukturen veröffentlicht werden.
