Untersuchungen zur Aufnahme und zum
Transport antibiotisch wirksamer Stoffe in
Getreide- und Gemüsepflanzen
Von der Fakultät für Naturwissenschaften
Department Chemie
der Universität Paderborn
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.
genehmigte Dissertation
von Dipl.-Ing. Umwelttechnik, Dipl.-Chem.-Ing.
Didem Hanım Meriç (geb. Yolcu)
aus Adıyaman
Paderborn 2010
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von August 2006 bis Dezember 2009 an der
Universität Paderborn im Fach Anorganische und Analytische Chemie des Departments
Chemie der Fakultät für Naturwissenschaften unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. M. Grote
angefertigt.
Veröffentlichungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit:
D. H. Meriç, M. Grote, H. Hayen, M. Freitag; Untersuchungen zum Antibiotikatransfer aus
dem Boden in Nutzpflanzen; Jahrestagung 2009 der Fachgruppe Umweltchemie und
Ökotoxikologie der GDCh: Stoffverhalten und -wirkungen in Umweltkompartimenten, 23 - 25
September 2009, Trier; Tagungsband, 2009, S. 50
M. Grote, D. H. Meriç, G. Langenkämper, H. Hayen, T. Betsche, M. Freitag; Untersuchungen
zum Transfer pharmakologisch wirksamer Substanzen aus der Nutztierhaltung in Porree und
Weißkohl [Investigation on the transfer of pharmacologiacally active substances used in
animal husbandary into leek and cabbage]; Journal für Verbraucherschutz und
Lebensmittelsicherheit, 4, 2009, 287-304, Online im Internet (10.09.2009):
http://www.springerlink.com/content/897l3532jk8n6618/
D. H. Yolcu, M. Grote, H. Hayen, M. Freitag; Antibiotika-Rückstände in Getreide aus
viehstarken Gebieten – Methodenentwicklung und Ergebnisse einer Screening-Studie;
Lebensmittelchemie, 3, 70, 2009
M. Freitag, M. Grote, D.H. Yolcu, T. Betsche; Untersuchungen zum Antibiotikatransfer aus
dem Boden in Getreide in der landwirtschaftlichen Praxis; Forum angewandte Forschung in
der Rinder- und Schweinefütterung, 9. – 10.April 2008, Fulda; Tagungsband, 2008, 194-198.
D. H. Yolcu, H. Hayen, M. Grote; Bestimmung von Antibiotika-Rückständen in Getreide;
LaborPraxis, März 2008, 28–30, Online im Internet (17.03.2008):
http://www.laborpraxis.vogel.de/analytik/chromatographie/hplc/articles/113847/?ACMP=DMC
-beleg
M. Freitag, D. H. Yolcu, H. Hayen, T. Betsche, M. Grote; Screening zum Antibiotika-Transfer
aus dem Boden in Getreide in Regionen Nordrhein-Westfalens mit großen Viehbeständen;
Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 3, 2008; 174-184, Online im
Internet (15.03.2008): http://www.springerlink.com/content/588w26444155w406/
D. H. Meriç, M. Grote, H. Hayen, M. Freitag; Untersuchungen zum Antibiotikatransfer aus
dem Boden in Nutzpflanzen; Jahrestagung 2009 der Fachgruppe Umweltchemie und
Ökotoxikologie der GDCh: Stoffverhalten und -wirkungen in Umweltkomportimenten, 23. -
25.09.2009, Trier; Vortrag
D. H. Meriç, M. Grote, H. Hayen, M. Freitag; Antibiotika-Rückstände in Getreide aus
viehstarken Gebieten – Methodenentwicklung und Ergebnisse einer Screening-Studie
(Yogun olarak Gübrelenmis Tarim Alanlarindaki Tahil ürünlerinde görülen Antibiyotik
Kalintilar - Metod Gelistirme ve Screening-Arastirmasi Sonuclari); Mersin Symposium -
Landwirtschaft und Lebensmittel, 19.-22. November 2008, Mersin/Türkei; Vortrag
D. H. Meriç, M. Grote, H. Hayen, M. Freitag; Antibiotika-Rückstände in Getreide aus
viehstarken Gebieten – Methodenentwicklung und Ergebnisse einer Screening-Studie; 37.
Deutscher Lebensmittelchemikertag. 8.-10. September 2008, Kaiserslautern; Poster-
präsentation.
D. H. Yolcu, C. Schwake-Anduschus., R. Michel, H. Hayen, T. Betsche, M. Freitag, M. Grote;
Uptake of veterinary antibiotics into cereals and vegetables from manured soil; Third
German-Hungarian Workshop: Synthesis, Isolation and Biological Activity of Natural
Products, 15.-17. May 2008, Paderborn; Posterpräsentation/Kurzvortrag
1. Referent: Herr Prof. Dr. M. Grote
(Department Chemie, Anorganische und Analytische Chemie)
2. Referent: Herr Prof. Dr. med. M. Weiß
(Department Sport und Gesundheit, Sportmedizin)
Eingereicht am: 31.08.2010
Tag der mündlichen Prüfung:01.10.2010
DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. M. Grote für die interessante Themenstellung,
stete Diskussionsbereitschaft und die Betreuung dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. med. M. Weiß danke ich für die freundliche Übernahme des Korreferates.
Mein weiterer Dank gilt Herrn Dr. Heiko Hayen (Universität Wuppertal/Wuppertal), Frau Prof.
Dr. M. Freitag (Fachhochschule Südwestfalen/Soest), Herrn. Dr. Georg Langenkämper (Max
Rubner Institut/Detmold) und allen weiteren Mitwirkenden an interdisziplinären
Forschungsprojekten.
Herzlich möchte ich mich bei allen jetzigen und ehemaligen Mitarbeitern des Arbeitskreises,
insbesondere bei TA R. Knaup, A. Sitzer, Dr. H. Stevens, Dr. R. Michel, Dipl.-Chem. M.
Busse, Dipl.-Chem. M. Ewe, Dr. C. Schwake-Anduschuss, Dr. C. Heine, Staatl. gepr. LM.
Chem. F. Chowdhury, A. Demir für die angenehme Arbeitsatmosphäre und die stete
Hilfsbereitschaft bedanken.
Ferner möchte ich mich bei meiner Familie und insbesondere meinem Ehemann Tamay
Meriç für ihre jahrelange Geduld und Unterstützung sehr herzlich bedanken.
INHALTVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG .......................................................................................1
2 WIRTSCHAFTSDÜNGER.......................................................................................................3
2.1 Begriffsbestimmungen ....................................................................................................3
2.2 Bedeutung von Wirtschaftsdünger für Getreide- und Gemüseanbau.......................4
3 TIERARZNEIMITTEL IN DER LANDWIRTSCHAFT .............................................................5
3.1 Begriffsbestimmung ........................................................................................................5
3.2 Antibiotika in der landwirtschaftlichen Nutztierhaltung..............................................6
3.3 Verbrauchsmengen von Veterinärantibiotika ...............................................................9
3.4 Eigenschaften von Antibiotika .....................................................................................11
3.4.1 Tetracycline......................................................................................................................11
3.4.2 Sulfonamide .....................................................................................................................15
3.4.3 Fluorchinolone .................................................................................................................18
3.4.4 Ionophore .........................................................................................................................20
3.5 Antibiotika in der Umwelt - Eintrag und Verhalten ....................................................22
4 VERBRAUCHERGEFÄHRDUNG DURCH DEN ANTIBIOTIKA-EINSATZ IN DER
LANDWIRTSCHAFT.............................................................................................................27
4.1 Rückstandsproblematik ................................................................................................27
4.1.1 Begriffsbestimmungen .....................................................................................................27
4.1.2 Antibiotikarückstände in Lebensmitteln tierischer Herkunft ............................................28
4.1.3 Lebensmittelrechtliche Aspekte zu Antibiotikarückständen ............................................29
4.2 Resistenzproblematik ....................................................................................................32
4.2.1 Begriffsbestimmungen und Resistenzentstehung ..........................................................32
4.2.2 Resistenzmechanismen ..................................................................................................34
4.3 Verbrauchergefährdung ................................................................................................35
5 AUFNAHME VON TIERARZNEISTOFFEN IN PFLANZEN................................................40
5.1 Eintrag von Xenobiotika in Pflanzen............................................................................40
5.1.1 Physiologie der pflanzlichen Wurzelzelle ........................................................................42
5.1.2 Stoffaufnahme über die Wurzel aus dem Boden ............................................................43
5.1.3 Pflanzenverfügbarkeit ......................................................................................................45
5.2 Metabolismus in Pflanzen .............................................................................................47
5.3 Stand der Forschung zur Aufnahme von Antibiotika in Pflanzen............................49
6 ERGEBNISSE UND DISKUSSION ......................................................................................52
6.1 Ausgangssituation .........................................................................................................52
6.2 Verlauf der Projekte - Untersuchungsmethodik.........................................................52
6.3 Methodenentwicklung ...................................................................................................53
6.3.1 Rückstandsanalytik ..........................................................................................................53
6.3.2 Erweiterung und Anwendung des Analysensverfahrens ................................................54
6.3.2.1 LCQ, Niedrigauflösendes MS-System (Low Resolution-MS, LR-MS)......................54
6.3.2.2 FTICR-MS, Hochauflösendes MS-System (High Resolution-MS, HR-MS) .............60
6.3.3 Optimierung der Probenvorbereitung ..............................................................................62
6.3.3.1 Homogenisierung.......................................................................................................63
6.3.3.2 Fest-Flüssig-Extraktion ..............................................................................................64
6.3.3.3 Festphasenextraktion (SPE) .....................................................................................66
6.3.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der Methodenentwicklung......................................69
6.4 Validierung ......................................................................................................................71
6.4.1 Wiederfindung..................................................................................................................71
6.4.2 Präzision ..........................................................................................................................71
6.4.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze...............................................................................74
6.4.4 Selektivität........................................................................................................................75
6.4.5 Matrixeffekte ....................................................................................................................77
6.4.6 Zusammenfassung der Validierungsergebnisse.............................................................80
7 UNTERSUCHUNG ZUM ANTIBIOTIKATRANSFER AUS DEM BODEN IN GETREIDE..82
7.1 Screening-Studie............................................................................................................82
7.1.1 Probennahme ..................................................................................................................83
7.1.2 Ergebnisse der Screening-Studie....................................................................................84
7.1.2.1 Positiver Demeclocyclin-Befund ................................................................................88
7.1.2.2 Positiver Doxycyclin-Befund ......................................................................................97
7.1.3 Proben aus der besonderen Ernteermittlung des Bundessortenamtes .......................101
7.2 Erkennung falsch positiver Befunde mit hochauflösender MS .............................101
7.2.1 Koelution von Peptiden bei der LC/MS-Analyse ...........................................................105
7.2.2 Protease-Behandlung ....................................................................................................107
7.3 Zusammenfassung der Ergebnisse der Screening-Studie .....................................109
7.4 Untersuchung von handelsüblichen Weizenproben aus Niedersachsen .............110
7.4.1 Probengewinnung ..........................................................................................................111
7.4.2 Ergebnisse der Analysen von handelsüblichen Weizenproben ...................................112
7.4.3 Positiver Enrofloxacin-Befund .......................................................................................113
7.5 Zeitliche Veränderung der Antibiotika-Gehalte in belastetem Getreide................118
8 UNTERSUCHUNG ZUR AUFNAHME VON VETERINÄRANTIBIOTIKA IN GEMÜSE ...121
8.1 Aufnahmeexperimente in Hydrokultur ......................................................................121
8.1.1 Anzucht der Pflanzen.....................................................................................................122
8.1.2 Zudotierung der Antibiotika............................................................................................123
8.1.3 Ernte und Lagerung .......................................................................................................123
8.2 Ergebnisse der Aufnahmeexperimente in Hydrokultur...........................................125
8.2.1 Porree ............................................................................................................................126
8.2.1.1 Aufnahme von Sulfadiazin .......................................................................................126
8.2.1.2 Aufnahme von Chlortetracyclin ...............................................................................127
8.2.1.3 Aufnahme von Tetracyclin .......................................................................................130
8.2.1.4 Aufnahme von Enrofloxacin.....................................................................................131
8.2.1.5 Aufnahme von Monensin .........................................................................................133
8.2.2 Weißkohl ........................................................................................................................135
8.2.2.1 Aufnahme von Sulfadiazin .......................................................................................135
8.2.2.2 Aufnahme von Chlortetracyclin ...............................................................................137
8.2.2.3 Aufnahme von Tetracyclin .......................................................................................138
8.2.2.4 Aufnahme von Enrofloxacin.....................................................................................140
8.2.2.5 Aufnahme von Monensin .........................................................................................141
8.2.3 Zusammenfassung der Ergebnisse der Aufnahmeexperimente ..................................143
8.3 Analyse von Gemüse aus landwirtschaftlichen Betrieben .....................................151
9 ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................................................159
10 LITERATURVERZEICHNIS .............................................................................................164
A ANHANG ……………………………………………………………...……………………….…A1
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AMG Arzneimittelgesetz
Anhydo-CTC Anhydrochlortetracyclin
ADI Aceptable daily intake
ATC Anhydrotetracyclin
BEE Besonderen Ernte- und Qualitätsermittlung
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung
BG Bestimmungsgrenze
CIP Ciprofloxacin
CTC Chlortetracyclin
Da Dalton, Masseneinheit
DAN Danofloxacin
DC Doxycyclin
DIF Difloxacin
DIN Deutsche Industrie Norm
DNA Desoxyribonukleinsäure
DMC Demeclocyclin
ECD Electrochemical Detection
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EG Europäische Gemeinschaft
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EMEA European Medicines Agency
ENR Enrofloxacin
e-CTC Epi-Chlortetracyclin
e-DC Epi-Doxycyclin
e-DMC Epi-Demeclocyclin
e-Iso-CTC Epi-Isochlortetracyclin
e-TC Epi-Tetracyclin
ERY Erythromycin
ESI Electrospray Ionisation
EU Europäische Union
eV Elektronenvolt
FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (Heute FLI)
FEDESA Fédération Européenne de la Santé Animale
FG Frischgewicht
FMG Futtermittelgesetz
FLU Flumequin
HLB Hydrophilic-Lipophilic-Balanced
HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie (High Performance Liquid
Chromatography)
IS Interner Standard
Iso-CTC Isochlortetracyclin
KOW Verteilungskoeffizient Oktanol/Wasser
LC Liquid Chromatography
LC-MS Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie
LOD Limit of Detection
LOQ Limit of Quantification
MAR Marbofloxacin
MIN Minocyclin
MHK Minimale Hemmkonzentration
MON Monensin
MRL Maximum Residue Limit
MRSA Methicillin resistente Stapylococcus aureus Stämme
MS Massenspektrometrie
MUNLV Ministerium für Umwelt, Naturschutz, Landwirtschaft und Verbraucherschutz
des Landes Nordrhein-Westfalen
m/z Masse-zu-Ladung-Verhältnis
n Anzahl der Messwerte (HPLC-Injektionen pro Probe)
n.b. nicht bestimmt
n.n. nicht nachweisbar
NOEL No Observed Effect Level
NOR Norfloxacin
NRK Nationaler Rückstandskontrollplan
N-SFD N4-Acetylsulfadiazin
NWG Nachweisgrenze
PAK Polycyclische Aromatische Kohlenwasserstoffe
PEG Paul-Ehrlich-Gesellschaft
pKa Säuredissoziationskonstante
R2 Bestimmtheitsmaß
RP Reversed Phase (Umkehrphase)
RT Raumtemperatur
Srel Relative Standardabweichung
SDD Sulfadimidin
SDM Sulfadimethoxin
SFD Sulfadiazin
SMOAZ Sulfamethoxazol
SMTZ Sulfamethizol
SMZ Sulfamerazin
S/N Signal-zu-Rauschverhältnis (Signal to Noise Ratio)
SPE Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction)
SRM Selective Reaction Monitoring
STR Streptomycin
STZ Sulfathiazol
TC Tetracyclin
TG Trockengewicht
TIC Total Ion Current
TM Trockenmasse
TMP Trimethoprim
TYL Tylosin A
t Zeit
tR Retentionszeit
(v/v) Volumenanteil
1 Einleitung und Zielsetzung 1
1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG
Antibiotika zählen sowohl in der Veterinärmedizin als auch in der Humanmedizin zu den
verordnungsstärksten Indikationsgruppen. Das weltweit steigende Risiko der
Resistenzbildung bei humanpathogenen Mikroorganismen wird auch mit dem extensiven
Antibiotika-Einsatz in der Tiermast in Verbindung gebracht. Infolge der zunehmenden
Resistenzentwicklung wurde die subtherapeutische Anwendung von Antibiotika zum Zwecke
der Leistungsförderung über das Futter EU-weit gestoppt (BGVV 1997). Ab 2006 dürfen
Antibiotika gemäß VO 1831/2003/EEC nur noch nach tierärztlicher Verschreibung auf
Grundlage des Arzneimittelrechtes zur Therapie angewendet werden.
In der landwirtschaftlichen Tierhaltung fallen in Deutschland jährlich ca. 30 Mill. Tonnen Gülle
an, die regional auf viehstarke Gebiete konzentriert sind [1, 2, 3]. Mit der Gülle, die als
Wirtschaftsdünger verwendet wird, gelangen die von den Tieren nach Anwendung
ausgeschiedenen Antibiotika-Wirkstoffe und Metaboliten auf landwirtschaftlich genutzte
Flächen, aber auch auf Mikroorganismen, die Antibiotika-Resistenz entwickeln können. Für
das Jahr 2005 wurde der veterinärmedizinische Antibiotikaeinsatz auf mindestens 784
Tonnen geschätzt, wobei besonders intensiv Tetracycline mit einem Anteil von ca. 45 % für
Schwein, Rind und Geflügel angewandt wurden. Zu den verordnungsstarken
Veterinärpharmaka zählen auch ß-Lactame, Sulfonamide und Makrolide. Deutlich niedriger
sind die Verbrauchsmengen an Fluorchinolonen und Kokzidiostatika [4].
Der Eintrag humanpathogener Keime und (subinhibitorischer) Spurenkonzentrationen
antibiotisch aktiver Stoffe in die Nahrungsmittelkette über Lebensmittel tierischer Herkunft ist
seit längerer Zeit bekannt [5, 6, 7]. Auch die Aufnahme von Antibiotika-Wirkstoffen über die
Pflanzenwurzeln wurde bereits vor über 50 Jahren experimentell erkannt [8]: Weizen, Mais
und Feldsalat „assimilierten“ Penicillin und Streptomycin, wobei phytotoxische und
bakterizide Effekte beobachtet wurden. Eine Modellstudie unter praxisnahen Bedingungen
der konventionellen Landwirtschaft zeigte erstmalig, dass antibiotisch wirksame Stoffe aus
Gülle-beaufschlagten Böden von Nutzpflanzen aufgenommen werden. Dabei wurden
Chlortetracyclin (CTC), Sulfadiazin (SFD) und Trimethoprim (TMP) als repräsentative
Veterinärwirkstoffe eingesetzt, die intensiv in der landwirtschaftlichen Schweine- und
Geflügelhaltung Anwendung finden [9, 10]. Diese Ergebnisse waren als Hinweis auf einen
möglichen Eintragspfad von Antibiotika-Rückständen aus der landwirtschaftlichen
Tierhaltung in pflanzliche Lebens- und Futtermittel zu werten. Da in der Regel die
Antibiotikagehalte in Güllen aus der landwirtschaftlichen Praxis geringer sind als die Gehalte,
die im Rahmen der beschriebenen Studie erreicht wurden, blieb zu klären, ob der
Antibiotikatransfer Boden-Getreide auch in der Praxis der konventionellen Landwirtschaft von
Bedeutung ist.
1 Einleitung und Zielsetzung 2
Inzwischen wurden auch aus der internationalen Fachliteratur Untersuchungen bekannt, die
in Töpfen im Gewächshaus durchgeführt wurden [10, 11, 12]. Diese Ergebnisse bestätigen,
dass Veterinärpharmaka von Nutzpflanzen über die Wurzel aufgenommen und in der Pflanze
transportiert werden können. Jedoch bleiben genauere bzw. allgemeingültige Informationen
über Aufnahmepotenzial nach Pflanzenart und welche mögliche Metabolite sowie anderen
Umwandlungsprodukte entstehen, ungeklärt.
Daraus resultierende Verbraucherrisiken sind noch nicht abschätzbar, da die Anzahl
systematischer Untersuchungen gering und die Datenbasis zu schmal ist.
Aus dieser Situation ergaben sich im Rahmen der vorliegenden Arbeit folgende Ziele:
Entwicklung von Extraktions- und Bestimmungsmethoden zum Nachweis von
Antibiotika in Nutzpflanzen mittels LC-MSn,
Durchführung eines Screenings der Antibiotikagehalte in Getreide, das in Regionen
mit intensiver Schweinehaltung auf langjährig mit Gülle gedüngten Böden angebaut
wurde,
Analyse von handelsüblichen Weizenproben, um die Rückstandssituation von
Antibiotika sowohl in Getreide als auch in Getreidemahlerzeugnissen aus
niedersächsischen Mühlen zu überprüfen,
Durchführung von Aufnahmeexperimenten in Hydrokultur: Bestimmung des
Aufnahmepotentials von Weißkohl und Porree für verordnungsstarke Wirkstoffe und
ihrer Hauptmetabolite aus der Nutztierhaltung,
Gewinnung rückstandsanalytischer Daten über die Belastungssituation von Gemüse,
das in landwirtschaftlicher Praxis angebaut wurde.
Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen einen Beitrag zur Durchführung dieser grundlegenden
Aufgaben leisten. Denn wenn Nutzpflanzen Antibiotika über die Gülle und den Boden
aufnehmen, so können diese Antibiotika und ihre Metabolite auch wieder in die
Nahrungsmittelkette von Mensch und Futtermittel von Tier gelangen und somit letztendlich
die Ausbreitung resistenter Bakterienstämme fördern. Diese Erkenntnisse sind dabei unter
dem Gesichtspunkt eines nachhaltigen Verbraucherschutzes von wesentlicher Bedeutung,
da gesicherte Risikoabschätzungen nur durch fundierte Kenntnisse über die komplexen
Zusammenhänge zwischen Gülledüngung und Aufnahme von Pflanzen möglich sind.
2 Wirtschaftsdünger 3
2 WIRTSCHAFTSDÜNGER
2.1 Begriffsbestimmungen
Der Begriff „Düngemittel“ wird laut dem Düngemittelgesetz vom 17. Dezember 1999 (BGBI. I
S. 245) folgendermaßen definiert:
„Düngemittel sind Stoffe, die dazu bestimmt sind, unmittelbar oder mittelbar Nutzpflanzen
zugeführt zu werden, um ihr Wachstum zu fördern, ihren Ertrag zu erhöhen oder ihre Qualität
zu verbessern; ausgenommen sind Stoffe, die überwiegend dazu bestimmt sind, Pflanzen
vor Schadorganismen und Krankheiten zu schützen oder, ohne zur Ernährung von Pflanzen
bestimmt zu sein, die Lebensvorgänge von Pflanzen zu beeinflussen, sowie Bodenhilfsstoffe,
Kultursubstrate, Pflanzenhilfsmittel, Kohlendioxid, Torf und Wasser“.
Die Ziele der Düngemittel-Ausbringung in intensiv landwirtschaftlichen Systemen sind zum
einem der Ersatz verbrauchter Nährstoffe und zum anderen die Erhöhung des
Nährstoffangebotes selbst an ertragsärmeren Standorten, so dass höhere Ernteerträge
erzielt werden können. Neben dem Begriff „Düngemittel“ wird auch der Begriff
„Wirtschaftsdünger“ im Düngemittelgesetz vom 17. Dezember 1999 (BGBI. I S. 425) wie folgt
definiert:
„Wirtschaftsdünger sind tierische Ausscheidungen, Gülle, Jauche, Stallmist, Stroh sowie
ähnliche Nebenerzeugnisse aus der landwirtschaftlichen Produktion, auch weiterbehandelt,
die dazu bestimmt sind, zu einem der in Nummer 1 erster Teilsatz genannten Zwecke
angewandt zu werden“.
Gülle wird auch als Flüssig-, Treib- oder Schwemmmist bezeichnet. Sie ist ein Gemisch aus
Kot und Harn von Nutztieren sowie mit einem geringen Anteil von Einstreu- und Futterresten,
die ggf. mit Wasser verdünnt sind [13, 14]. Der Harn der Tiere, welcher gesondert von Kot
und Einstreu aufgefangen wird, ist die sogenannte Jauche. Jauche wird auch häufig mit
Wasser verdünnt. In Deutschland fiellen 155 Mio. t Gülle und 45 Mio.t Festmist (eine
Mischung aus Harn, Kot, Einstreu und Futterreste) als Wirtschaftsdünger nach den
Tierbestandszahlen von 1997 an [15].
Neben Gülle (Schweine- oder Rindergülle) werden als Wirtschaftsdünger in der
landwirtschaftlichen Praxis auch tierische Ausscheidungen aus der Geflügelhaltung z.B.
Hühner- und Putenmist, Hühnertrockenkot sowie Flüssigdünger angewendet. Je nach Tierart
werden Düngemittel unterschiedlich zusammengesetzt (Tab. 1). Der Gehalt an Inhaltstoffe in
Gülle und Mist innerhalb einer Tierart variieren je nach Konsistenzgrad,
Trockensubstanzgehalt, Fütterung und Haltungsform beträchtlich [14].
2 Wirtschaftsdünger 4
Tab. 1: Gehalte an Inhaltstoffen verschiedener Wirtschaftsdünger; angegeben in kg/t FG [16]
Düngart
Menge je
GV [t/a]
TS
[%]
N
P
K
Mg
Rindergülle,Milchvieh
23
10
3,8
1,0
4,7
0,6
Schweinegülle
21
6
4,0
1,0
1,7
0,7
Geflügelmist
10
45
17,0
5,6
8,5
2,3
Rindermist,Milchvieh
11
25
5,9
1,5
4,7
0,8
Schweinemist
5
25
11,0
3,6
6,6
1,3
FG: Frischgewicht GV:Großvieheinheit TS:Grad der Entwässerung bzw. Trocknung
Die unterschiedliche chemische Zusammensetzung der Wirtschaftsdünger beeinflusst die
Bodeneigenschaften differenziell. Die Wirksamkeit der Wirtschaftsdünger hängt nicht nur von
ihrer Zusammensetzung sondern auch von Art und Zeitpunkt der Ausbringung ab.
2.2 Bedeutung von Wirtschaftsdünger für Getreide- und Gemüseanbau
Landwirtschaftlich genutzte Fläche ist der Oberbegriff für alle bewirtschafteten Flächen wie
Ackerland, Dauergrünland und Dauerkulturen. Im Jahr 2008 bewirtschafteten
landwirtschaftliche Betriebe in Deutschland ca.17 Mio. ha Fläche (davon entfielen 11,9 Mio.
ha (70,5 %) auf Ackerland) [17]. Deutschland befand sich im Vergleich der
landwirtschaftlichen Flächen mit den anderen Ländern der Europäischen Union im oberen
Drittel. Als Anbaufrucht ist Getreide im deutschen Ackerbau am bedeutendsten, was sich
auch darin zeigt, dass es nach der Haupterhebung über die Bodennutzung 2008 mit 7,038
Millionen ha rund 59 % der Fläche des Ackerlandes ausmacht. Der Anbau von Weizen
wuchs im Jahr 2008 von 3,2 Mio. ha auf 26,9 % der Ackerflächen und 45,7 % der
Getreideflächen in Deutschland. Dementsprechend fiel die Getreideernte mit 50,1 Mio.
Tonnen desselben Jahres überdurchschnittlich aus. Im Jahr 2007 wurden in Niedersachsen
960723 ha Getreide angebaut, davon 399995 ha Winterweizen. Somit ist es das Bundesland
mit dem größten Getreideertrag [17, 18].
Die Anbaufläche von Gemüse, Erdbeeren und anderen Gartengewächsen nahm in den
letzten zehn Jahren ebenfalls um 24,2 % zu (131000 ha im Jahr 2008). Auf 22600 ha Fläche
in Deutschland werden die gesamten Kohlarten angebaut und belegen damit die größte
Anbaufläche im Jahr 2008. Davon zählt Weißkohl zu den meisten angebauten Kohlarten
(6800 ha) in Deutschland. Es folgt Blumenkohl mit 4800 ha, Rotkohl mit 2400 ha, Kohlrabi
mit 2300 ha und Brokkoli mit 2200 ha. Die Erntemengen für die wichtigsten Gemüsearten in
Deutschland sind Weißkohl mit 482700 t (davon 219877 dt aus Niedersachsen), 547100 t
Möhren (davon 1304902 dt) sowie 99300 t Porree (davon 186166 dt Porree aus
Niedersachsen) [17,18].
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 5
Laut Düngeverordnung wurde das Ziel der Düngung wie folgt beschrieben [19]:
„Ziel der Düngung ist die zeitlich und mengenmäßig bedarfsgerechte Ernährung der Pflanzen
bei möglichst geringen Nährstoffverlusten.“
Aufgrund des Entzuges von Nährstoffen durch die pflanzliche Biomasse führt die
landwirtschaftliche Nutzung von Böden zur Öffnung von Stoffkreisläufen. Durch Düngung
sollen diese Nährstoffkreisläufe geschlossen werden. Der Landwirt muss Art und Menge der
Düngemittel festlegen unter Berücksichtigung des Nährstoffbedarfs der angebauten Kulturen
sowie der im Boden verfügbaren Nährstoffe. Die Düngeverordnung schränkt jedoch ein, die
Gesamtstickstoffmenge der Wirtschaftsdünger aus tierischer Haltung im betrieblichen
Durchschnitt auf 170 kg N/ha für Ackerland und 210 kg N/ha für Grünland [19, 20].
Sowohl die Ertragsleistung als auch die Qualität von Winterweizen sind in ihrer Ausprägung
durch die Faktoren Bodenart, Jahreswitterung, Vorfrucht sowie N-Düngung stark beeinflusst
[20, 21]. Deshalb spielen Wirtschaftsdünger eine wichtige Rolle beim Getreideanbau.
Untersuchungen zeigen, dass Gülle die höchsten Ertragsleistungen beim Einsatz von ca. 20
m3/ha je Gabe brachte [22]. Im Herbst ist für das Wintergetreide auch eine Kopfdüngung
(Düngung in der Wachstumsphase) möglich, wobei eine exakte und gleichmäßig feine
Ausbringung bis zu 200 dt/ha erforderlich ist [23].
Die Ausbringung der Gülle sollte generell im Frühjahr erfolgen. Für Wintergerste und
Winterroggen ist eine Herbstgabe in Höhe von 10-12 m³/ha sinnvoll. Dabei sollte man eine
Gesamtmenge von 30-35 m³/ha nicht überschreiten. Für die Sommerung (Pflanzen, die im
Frühjahr ausgesät werden) ist eine Gesamtmenge von 25-30 m³/ha empfehlenswert, wobei
die Düngung möglichst vor der Anpflanzung erfolgen muss. Die Düngebedürftigkeit der
Gemüsekulturen ist sehr unterschiedlich und schwankt je nach Gemüseart im Bereich
zwischen 250 und 400 dt/ha (organische Düngemittel). Kohlpflanzen zum Beispiel wird eine
Güllegabe von 30 m3/ha auf das Feld vor der Pflanzung empfohlen [20, 24].
3 TIERARZNEIMITTEL IN DER LANDWIRTSCHAFT
3.1 Begriffsbestimmung
Der Oberbegriff “Arzneimittel“ wird laut Richtlinie 65/65EWG folgendermaßen definiert:
„Arzneimittel sind alle Stoffzusammensetzungen, die als Mittel zur Heilung oder zur
Verhütung menschlicher oder tierischer Krankheiten bezeichnet werden, alle Stoffe oder
Stoffzusammensetzungen, die dazu bestimmt sind, im oder am menschlichen oder tierischen
Körper zur Erstellung einer ärztlichen Diagnose oder zur Wiederherstellung, Besserung oder
Beeinflussung der menschlichen oder tierischen Körperfunktionen angewandt zu werden“.
In der Landwirtschaft sind Tierarzneimittel verschreibungspflichtige Medikamente, die durch
den Tierarzt verordnet und in der Veterinärmedizin in therapeutisch wirksamen Dosierungen
appliziert werden. Tierarzneimittel unterliegen auch dem Arzneimittelgesetz (AMG) und
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 6
werden durch § 1 AMG Mensch und Tier bezüglich der Anforderungen an Arzneimittel auf
die gleiche Stufe gestellt. Antibiotika sind mit einem Anteil von 30% die am häufigsten
eingesetzten Tierarzneimittel [25, 26]. Laut Verordnung (EG) Nr. 1831/2003 werden
Antibiotika wie folgt definiert:
„Antibiotika sind antimikrobielle Stoffe, die durch einen Mikroorganismus erzeugt bzw. aus
diesem gewonnen werden und andere Mikroorganismen zerstören bzw. deren Wachstum
hemmen“.
3.2 Antibiotika in der landwirtschaftlichen Nutztierhaltung
In der landwirtschaftlichen Tierhaltung dient der Einsatz von Antibiotika dazu,
Tierkrankheiten und Seuchen -besonders in der Massentierhaltung- zu bekämpfen und auch
von vorne herein entgegenzuwirken. Für die Tiermedizin lässt sich der Gebrauch von
Antibiotika in drei Einsatzgebiete unterteilen. Hier sind die Prophylaxe und Therapie zur
Behandlung von Infektionskrankheiten sowie auch der Einsatz zur Leistungsförderung zu
nennen [27].
Therapeutischer Einsatz
Beim Einsatz von Antibiotika zu Therapiezwecken werden bereits erkrankte oder infizierte
Einzeltiere behandelt. Die Behandlung erfolgt oral oder parenteral als Injektion. Die am
häufigsten auftretenden bakteriellen Infektionen bei landwirtschaftlichen Nutztieren sind
Atemwegs-, Harnwegs-, Geschlechtsorgan-, Haut- und Wundinfektionen sowie Magen-
Darm-Trakt- und Gebärmutterentzündungen. Beispielsweise werden Fluorchinolone beim
Einzeltier im Bestand zur Behandlung von Atemwegserkrankungen sowie Erkrankungen des
Magen- und Darmtraktes eingesetzt [28]. Für den therapeutischen Einsatz in der
Veterinärmedizin werden die gleichen Antibiotikaklassen verwendet, die auch in der
Humanmedizin eingesetzt werden. So wird z.B. von den Fluorochinolonen in der
Veterinärmedizin Enrofloxacin und im Humanbereich Ciprofloxacin angewendet. Die
Dosierung der Antibiotika zur therapeutischen Behandlung von Tieren sind ähnlich wie beim
Menschen in mg/kg Körpergewicht (KG) angegeben, so dass die Dosierung auf jedes Tier
individuell abgestimmt werden kann. Erfolgt eine Dosierung über die Einmischung ins Futter
oder in das Trinkwasser, so muss zunächst die Futter- oder Trinkwasser-Aufnahme des
Tieres bestimmt werden, um die erforderliche Dosierung zu gewährleisten.
Prophylaktischer Einsatz
Ziel des prophylaktischen Einsatzes von Antibiotika ist es, eine vermutete Gefahr für die
Gesundheit der Tiere abzuwenden. Die Applikation erfolgt, wenn einzelne Tiere schon
erkrankt sind und die Krankheit auch weitere Tiere zu ergreifen droht. Die prophylaktische
Anwendung an ganzen Tiergruppen, bei denen bereits einzelne Tiere des Bestandes
Krankheitssymptome zeigen und eine Ausbreitung der Erkrankung in Kürze zu erwarten ist,
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 7
wird als metaphylaktischer Einsatz bezeichnet [29]. Somit werden sowohl mögliche
nachfolgende Tierverluste vermindert, als auch die zu einem späteren Zeitpunkt erforderliche
Antibiotikamenge und ebenfalls die Kosten für die Behandlung einer großen Zahl klinisch
erkrankter Tiere reduziert. Die Prophylaxe kommt häufig im Fall von Darminfektionen bei
Hühnern oder bei der Einstallung von Ferkeln aus unterschiedlichen Beständen zum Einsatz.
Die Verabreichung erfolgt meistens über das Futter oder Trinkwasser, während dagegen bei
lokalen Infektionen das Antibiotikum direkt oberflächig auf die betroffene Stelle aufgetragen
wird [30].
Kokzidien, welche Durchfall verursachende intestinale Parasiten sind, stellen ein besonderes
Problem in Geflügelbeständen dar. Sie sind nur durch die prophylaktischen Gabe Kokzidien-
wirksamer Medikamente, sog. Kokzidiostatika, über das Futter in Kombination mit
gewissenhafter Anwendung geeigneter hygienischer Maßnahmen zu beherrschen [31, 32].
Nachteil der Anwendung von Kokzidiostatika ist jedoch, dass die meisten dieser Arzneimittel
bedeutende Nebenwirkungen (z.B. kanzerogene Wirkung) zeigen können. Deshalb wurden
bereits einige kokzidiostatische Wirkstoffe als Leistungsförderer bei Nutztieren EU-weit
verboten jedoch als Futterzusatzstoffe zur Prophylaxe weiterhin erlaubt [33, 34].
Einsatz als Leistungsförderer
Antibiotika werden als Leistungsförderer in der Tierzucht eingesetzt, um eine höhere
Nährstoffverfügbarkeit sowie eine bessere Nährstoffdurchlässigkeit der Darmwand zu
erzielen. Dadurch wird die Futterverwertung verbessert, die Tiere wachsen schneller und
setzen mehr Fleisch an [28, 35]. Um diesen Effekt zu erzielen, werden Antibiotika in
subtherapeutischen (nutritiven) Dosen eingesetzt. Diese subtherapeutischen Dosen sind
nicht für eine generelle Prophylaxe gegen bestimmte Krankheitserreger geeignet und wirken
nicht keimabtötend. Stattdessen verschieben sie das Keimspektrum im Verdauungstrakt, um
ein günstigeres Keimmilieu zu schaffen. Das bedeutet eine verbesserte Kontrolle von
subklinischen, inapparenten und unspezifischen Infektionen, die wiederum zu einer
verminderten Infektionsanfälligkeit führt [28, 36, 37]. Aus diesen Gründen wurden Antibiotika
bis zum Jahre 2006 im Bereich der Veterinärmedizin zur Leistungsförderung eingesetzt. Es
besteht die Annahme, dass die Problematik der zunehmenden Bildung resistenter
pathogener Bakterienstämme (s. Kap.4.2) sowohl im tiermedizinischen als auch im
humanmedizinischen Bereich u.a. auf den vermehrten Einsatz von Leistungsförderen
zurückzuführen ist. Aufgrund der sich daraus ergebenden Resistenzproblematik wurde der
Einsatz von Arzneimitteln zum alleinigen Zweck der Leistungsförderung seit 2006 EU-weit
verboten (Tab. 2).
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 8
Tab. 2: Wirkstoffe, die innerhalb der EU nicht mehr als Leistungsförderer angewendet
werden dürfen und Begründung des Verbots (modifiziert nach [38])
Leistungsförderer
(Gruppe)
Verbot seit
Begründung der Rücknahme der Zulassung
Avoparcin
(Glycopeptid)
04/1997
Kreuzresistenz zu Glycopeptid-Antibiotika
Spiramycin
(Makrolid)
07/1998
Resistenz gegen Spiramycin und Kreuzresistenz
zu Makrolid-Antibiotika
Tylosin
(Makrolid)
07/1998
Resistenz gegen Tylosin und Kreuzresistenz zu
Makrolid-Antibiotika
Virginiamycin
(Streptogramin)
07/1999
Kreuzresistenz zu Quinupristin/Dalfopristin
Zink-Bacitracin
(Bacitracin)
07/1998
Resistenz gegen Bacitracin
Carbadox / Olaquindox
(Chinoxaline)
09/1999
Toxisch (mutagen, kanzerogen, photoallergen)
Monensin
(Ionophere)
01/2006
Risiko für Kreuzresistenzen zu therapeutisch
eingesetzten Antibiotika, Toxisch (kanzerogen)
Avilamycin
(Glykopeptide)
01/2006
Kreuzresistenz zu Everninomycine
Salinomycin
(Ionophere)
01/2006
Resistenz gegen Salinomycin, Toxisch
(kanzerogen)
Flavophospholipol
(Phosphoglykopeptide)
01/2006
Resistenz gegen Flavophospholipol
Anwendung als Kokzidiostatikum
Tab. 2 gibt einen Überblick über Wirkstoffe, die in der EU nicht mehr als Leistungsförderer
eingesetzt werden dürfen und die spezifische Begründung für das Verbot. 1974 wurde in der
EU erstmals das Verbot erlassen, Tetracycline als Leistungsförderer einzusetzen [39]. Ab
1997 wurden dann zusätzlich die Wirkstoffe Avoparcin, Zink-Bacitracin, Virginiamycin,
Tylosin und Spiramycin in der EU verboten [40]. Bis 1999 wurde dadurch der Verbrauch an
Leistungsförderern um 50% reduziert. Die letzten vier in der EU zugelassenen Wirkstoffe
Avilamycin, Flavophospholipol, Monensin und Salinomycin dürfen seit dem 1/2006 gemäß
EG-Verordnung Nr. 1831/2003 nicht mehr als Leistungsförderer in der Tierernährung
eingesetzt werden. Jedoch ist der Einsatz von antibiotischen Wirkstoffen als
Futtermittelzusatzstoff im Anwendungsbereich der Kokzidiostatika oder Histomonostatika
weiterhin zugelassen, da diese parasitären Erkrankungen mit einem hohen (Tier-)
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 9
Verlustrisiko behaftet sind und somit eine große Gefahr, besonders für die Kaninchen- und
Geflügelzucht, darstellen [34].
3.3 Verbrauchsmengen von Veterinärantibiotika
Durch die Intensivierung der Tierproduktion, d.h. mehr Tiere pro Fläche und Betrieb,
entstehen Probleme, die einen vermehrten Antibiotikaeinsatz erforderlich machen.
In Deutschland werden jährlich 40 Mio. t Mastschweine und über 1,19 Mio. t Geflügel
produziert, wobei die Dosierung der Wirkstoffe bei 10-100 µg/kg KG der Tiere beträgt. Eines
der wichtigsten Produktionsgebiete in Deutschland ist dabei Niedersachsen mit einem Anteil
von 34% an der Schweine- und 48% an der Putenproduktion [41].
Wie bereits in Kap. 3.2 beschrieben, wurden seit 1974 schrittweise verschiedene Antibiotika
für die Anwendung als Leistungsförderer im Bereich der Tierhaltung verboten. Seit dem
Verbot im Jahre 2006 liegen keine genauen Angaben über die Entwicklung des
Antibiotikaverbrauchs vor. Jedoch gibt es Hinweise, dass der Antibiotikaeinsatz
zurückgegangen ist [4]. In Deutschland liegen ausschließlich geschätzte Daten über den
tatsächlichen Verbrauch an Antibiotika vor, die durch das Veterinärpanel von der
Gesellschaft für Konsumforschung (GFK) für den Bereich der Veterinärtherapie ermittelt
wurden. Beim Veterinärpanel, welches auf einer Stichprobenuntersuchung des
Einkaufsverhaltens der niedergelassenen Tierärzten beruht, wurde aus den verkauften
Einheiten über die angegebenen Konzentrationen auf die Wirkstoffmenge zurückgerechnet.
Damit kein Rückschluss auf ein einzelnes Produkt möglich ist, wurden die Einzelwirkstoffe zu
Wirkstoffklassen zusammengeführt.
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 10
Abb. 1: Einsatz von Veterinärantibiotika in Deutschland im Jahr 2005 [4]
Nach diesen Daten (Abb. 1) stieg die Verbrauchsmenge an Antibiotika in Deutschland im
Jahr 2005 im Vergleich zu 2003 mit 784 t um 8,3 % an. Jedoch wurde der Tetracyclin-
Einsatz um 35 t reduziert. Dieses hängt mit dem Auslaufen von Zulassungen mehrerer
günstiger oraler Tetracyclinpräparate in der gegenwärtigen Zeit zusammen. Trotzdem stellen
Tetracycline mit 45 % den Hauptanteil an der Gesamtverbrauchsmenge von Antibiotika dar.
Mit 44 t stieg demgegenüber der Verbrauch an ß-Lactamen im gleichen Zeitraum stark an,
was möglicherweise auf die Preisentwicklung bei Amoxicillinen zurückzuführen ist. Auch die
Einsatzmengen an Sulfonamiden nahmen erkennbar zu. Im Jahr 2003 lag innerhalb
Deutschlands die Verbrauchsmenge an Sulfonamiden bei 71,7 t (inkl. Trimethoprim) für den
veterinärmedizinischen Bereich. Im Jahr 2005 wurden etwa 27 t an Sulfonamiden mehr
verbraucht als im Vergleichsjahr 2003.
Fluorchinolone haben in der Praxis in den vergangenen Jahren stark an Bedeutung
gewonnen. Die Verbrauchsmenge an Fluorchinolonen in Deutschland verzeichnet im Jahr
2005 (3,7 t) gegenüber dem Jahr 2003 (3,5 t) einen leichten anstieg (5,7 %). Bei einer
durchgeführten Umfrage gaben 90 % der bayerischen Rinderzüchter an, Chinolone in der
Praxis einzusetzen [42]. Die große Bedeutung der Fluorchinolone wird deutlich, wenn man
sich die Gesamtverbrauchsmengen für die gesamte EU und die Schweiz vor Augen hält.
Diese lagen im Jahr 1997 in der EU bei 42 t mit einem Anteil von 1,2 % aller eingesetzten
antimikrobiell wirksamen Stoffen. Auffällig ist der hohe Verbrauch von Fluorchinolonen in den
Tetracycline
45%
ß-Lactame
25%
Sulfonamide
12%
Makrolide
7%
Aminoglykoside 4,6%
Polypeptide 2,8%
Lincosamide 1,5%
Pleuromutuline 0,8%
Fluorchinolone 1,0%
Andere
11%
Gesamtverbrauch = 784,4 Tonnen im Jahr 2005
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 11
Niederlanden, der mehr als 20 % über dem Durchschnitt der in der EU eingesetzten
Fluorchinolone liegt [43]. Der Fluorchinolonverbrauch im veterinärmedizinischen-Bereich
macht in Deutschland nur ca. 1 % ( 3,7 t) aus. Trotzdem wird seit etwa 10 Jahren in
Deutschland ein Anstieg der Resistenzen gegenüber Fluorchinolonen beobachtet d.h. eine
relativ hohe Resistenzlage mit ca. 40% bei Geflügel und beim Menschen. Der hohe
Verbrauch an Fluorchinolonen, die als Reservemittel bei schweren, sonst nicht
beherrschbaren Infektionen eingesetzt werden, ist in Bezug auf die Förderung einer
Resistenzselektion kritisch zu sehen [44].
Zusammenfassend lässt sich der Anstieg des Antibiotikaeinsatzes in Deutschland durch die
Ausweitung der Tierproduktion, die Änderung der Produktionsweise und durch das relativ
niedrige Preisniveau der Wirkstoffe erklären.
Nach einer Studie von Boatman im Jahre 1996 wurden in der EU etwa 50 % (3375 t) der
Antibiotika als Futtermittel (Wachstumsförderer, Kokzidiostatika) eingesetzt, was 25 % des
weltweiten Bedarfs entspricht [45]. Jedoch rechnen die Autoren seit Anfang 1999 mit einer
verstärkten Verwendung von Ionophoren bei Schweinen, Rindern und Geflügel aufgrund des
Anwendungsverbotes von Kokzidiostatika als Leistungsförderer. In Schweden und
Dänemark werden Kokzidiostatika in den meisten Geflügelfarmen genutzt, während der
sonstige Antibiotikaverbrauch für Geflügel gering ist. Im Jahr 2001 wurden Kokzidiostatika in
Dänemark 17739 kg in der Geflügelproduktion eingesetzt [31, 32].
Laut des Bundesverbandes für Tiergesundheit wurden für die europäischen Länder folgende
Einsatzmengen an Antibiotika angegeben: Dänemark: 110 Tonnen, Niederlande: 450
Tonnen, Großbritannien: 480 Tonnen und Frankreich: 1260 Tonnen. Die Zahlen sind
dennoch nicht unmittelbar vergleichbar, weil sie aus unterschiedlichen Erhebungsjahren (von
2003 bis 2005) stammen [7].
3.4 Eigenschaften von Antibiotika
3.4.1 Tetracycline
Chlortetracyclin, ein Vertreter der Wirkstofffamilie der Tetracycline, wurde im Jahr 1947 bei
einer Bodenuntersuchung erstmals entdeckt [46]. Etwa 1 Jahr später isolierte Duggar
Chlortetracyclin aus einem Kulturfiltrat des Bakterienstammes von Streptomyces
aureofaciens. Im Folgenden wurde z.B. mit der Isolierung von Oxytetracyclin aus einer
Nährlösung von Streptomyces rimosus-Bakterien isoliert. Es folgten im Jahr 1953
Isolierungen von Tetracyclin aus Nährlösungen von verschiedenen Streptomycesarten und
im Jahr 1962 die Entdeckung des Doxycyclins [47].
Der Name der Tetracycline leitet sich von ihrem isocyclischen Grundkörper ab, welcher aus
vier linear-kondensierten Cyclohexanringen (Naphtacen-Grundgerüst) besteht. Aus diesem
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 12
Grundgerüst ergeben sich die Strukturen der unterschiedlichen Vertreter der Tetracycline
durch die Position der unterschiedlichen Substituenten (Tab. 3) [48] .
Tab. 3: Struktur von Tetracyclin-Wirkstoffen [49]
Name
R1
R2
R3
R4
Tetracyclin
-H
-CH3
-OH
-H
Doxycyclin
-H
-CH3
-OH
-OH
Oxytetracyclin
-H
-CH3
-OH
-H
*Demeclocyclin
-Cl
-H
-OH
-H
Chlortetracyclin
-Cl
-CH3
-OH
-H
* Demeclocyclin ist als Wirkstoff in Human- und Veterinärmedizin nicht mehr zugelassen
Die Wirkstoffe unterscheiden sich durch ihre Substituenten an C5, C6, C7 und C2. Die
Derivate zeigen vergleichbare physiko-chemische Eigenschaften.
Physikalische und chemische Eigenschaften
Oxytetracyclin, Tetracyclin und Chlortetracyclin sind kristalline, gelb bis braun gefärbte,
pulverige Substanzen. In neutraler und saurer Lösung zeigen sie charakteristische UV-
Spektren bei 260 nm. Im alkalischen Mileu besitzen die Tetracycline ein Absorptionsmaxima
bei 320-380 nm [50, 51].
Die Wasserlöslichkeit der Tetracycline ist im physiologischen pH-Bereich recht gering (ca. 1
mg/ml), wobei sie als Hydrochloride jedoch meist gut löslich sind. Tetracycline sind in
Säuren, Basen, Alkoholen sowie polaren organischen Lösemitteln sehr gut löslich (50-100
mg/ml) und lassen sich gut damit extrahieren [51].
Durch ihre sauren Gruppen und dem basischen Dimethylamino-Rest besitzen Tetracycline
einen amphoteren Charakter und vier Säurekonstanten. Aufgrund der OH-Gruppe an
Position C-3 reagieren Tetracycline als Säuren mit einem pKa-Wert von 3,3 bis 3,4. Eine
zweite Deprotonierung resultiert an der enolischen OH-Gruppe an Position C-12 aus der
Struktur einer vinylogen Carbonsäure (pKa= 7,6). Die basischen Eigenschaften beruhen auf
der Dimethylaminostruktur. So ist der pKa-Wert von 9,7 einem protonierten N-4-Atom
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 13
zuzuordnen. Der vierte pKa-Wert von 12 wird dabei der phenolischen OH-Gruppe am C10-
Atom zugeordnet [52, 53, 54].
Tetracycline weisen eine große Tendenz zur reversiblen Bildung schwerlöslicher Komplexe
mit Kationen (Al3+, Mg2+, Ca2+, Fe2+ und Zn2+) und Anionen (Phosphat, Citrat, Salicylat, ß-
Hydroxybenzoat ) [55, 56].
Umwandlungs- und Abbaureaktionen
In Abhängigkeit vom Lösungsmittel, von der Temperatur, der Lichteinstrahlung und
insbesondere vom pH-Wert kommt es bei den verschiedenen Tetracyclinen (in Lösung) zu
einer Vielzahl von Umwandlungs- und Abbaureaktionen [46, 57].
Epimerisierung
Tetracycline sind in saurer Lösung relativ stabil, aber in basischer nicht beständig [58].
Hieraus wird deutlich, dass die Epimerisierungen pH-Wert abhängig sind. Zwischen pH 2
und 6 epimerisieren die Tetracycline (Abb. 2).
Abb. 2: Epimerisierung von Chlortetracyclin [60]
Nach einer Reaktion erster Ordnung verläuft die Epimerisierung reversibel und wird z.B.
durch Citrat katalysiert [59]. Andererseits können Tetracycline in Abhängigkeit vom pH-Wert
und der Polarität des Lösungsmittels verschiedene tautomere Formen annehmen (Abb. 3).
Abb. 3: Keto-Enol-Tautomerie von Chlortetracyclin [60]
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 14
Epimere besitzen eine bessere Löslichkeit in den meisten Lösungsmitteln als ihre
Muttersubstanz. Gegenüber saurer oder alkalischer Einwirkung haben sie eine erhöhte
Stabilität [46].
Durch die Epimerisierung der Tetracycline wird die antibiotische Wirksamkeit gegenüber der
Muttersubstanz um 90-100 % vermindert. Ob die Epimere überhaupt eine antibiotische
Wirksamkeit besitzen oder die antibiotische Aktivität auf Rückepimerisierung zurückzuführen
ist [60, 61], da die Epimerisierung reversibel ist, ist unklar.
Isomerisierung
Ab pH 6 sind Tetracycline instabil. Durch eine alkalische Behandlung führt die
Hydroxygruppe an Position C6 zum Aufbrechen des C-Ringes und somit zur Bildung der iso-
Tetracycline (irreversible Reaktion). Beispielweise bildet Chlortetracyclin bei pH 7,5 unter
Erwärmen iso-Chlortetracyclin aus (Abb. 4) [46].
Abb. 4: Isomerisierung der Tetracycline, Beispiel Chlortetracyclin [60]
Diese Isomeren besitzen keine oder nur noch sehr geringe antibiotische Aktivität [62].Auch
epimerisieren Iso-Tetracycline bei pH 2-6 zu 4-epi-iso-Tetracyclinen [63].
Dehydratisierung
Bei pH<2 spalten die Tetracycline mit einer Hydroxygruppe an C6 Wasser ab. Dabei
entstehen unter Aromatisierung vom C-Ring die entsprechenden Anhydrotetracycline (Abb.
5) [51].
Abb. 5: Dehydratisierung von Chlortetracyclinen [60]
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 15
Die Anhydrotetracycline unterliegen ebenfalls der Epimerisierung und der Keto-Enol-
Tautomerie. Anhydro-Verbindungen sind ebenfalls antimikrobiell wirksam. Jedoch finden sie
keine klinische Anwendung, da sie toxischer als ihre Muttersubstanz sind [63].
Wirkmechanismen und Wirkungsspektren
Die Wirkung der Tetracycline beruht auf der Hemmung der Proteinsynthese. Dazu binden
sich die funktionalen Stellen der Tetracycline in der Bakterienzelle an die 30 S
Untereinheiten des 70 S Ribosoms und blockieren diese dadurch. Die Elongationsphase der
Proteinsynthese ist unterbrochen durch die Blockade der Bindung von Aminoacyl-tRNA an
die Akzeptoren des mRNA-Ribosomenkomplexes [64, 65]..
Die Wirkung der Tetracycline ist bakteriostatisch, was bedeutet, dass diese Wirkstoffe zwar
das Bakterienwachstum einschränken, die Bakterien jedoch nicht abtöten. Sie sind wirksam
gegen viele grampositive (Streptokokken, Pneumokokken) und gramnegative Erreger
(Neisseria, Bordetella pert., Campylobacter). Ihr Wirkungsspektrum erfaßt außerdem noch
intrazelluläre Keime (Mykoplasmen, Rickettsien, Chlamydien) und Spirochäten [66].
Anwendung in der Tierhaltung
Tetracycline besitzen durch ihren Molekülbau stark lipophile Eigenschaften. Dadurch kann
sich der Wirkstoff leicht im Körpergewebe verteilen und so auch intrazellulär
Krankheitserreger erreichen [38]. Infektionen des Urogenialsystems und des Magen-Darm-
Traktes, der Haut sowie der Atemwege sind Indikationsgebiete von Tetracyclinen. Zusätzlich
zu diesen breitgefächerten Anwendungsmöglichkeiten tragen auch die niedrigen
Therapiekosten für Tetracyclin-Präparate gerade in der veterinären Anwendung (z.B. mit
Therapiekosten von 7,5 € für Oxytetracyclinpräparate) bei. Die Dosierungsmengen für
Tetracycline liegen bei Schweinen etwa im Bereich von 20-50 mg/kg und für Hühner bei 50-
100 mg/kg pro Tag [28]. Ein Teil der verabreichten Tetracyclinen wird in aktiver Form renal
durch die Nieren oder auch durch die Faeces ausgeschieden. Die Ausscheidungsrate von
Tetracyclinen beträgt bis zu 90 % [60].
3.4.2 Sulfonamide
Die Stoffklasse der Sulfonamide leitet sich vom Sulfanilamid (para-Aminobenzolsulfonamid)
ab. Dieses wurde erstmalig 1908 synthetisiert, dessen antibiotische Wirkung jedoch erst
1932 Domagk erkannte [67].
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 16
Tab. 4: Struktur von Sulfonamid-Wirkstoffen [68]
Name
R-Struktur
Name
R-Struktur
Sulfanilamid
Sulfamethoxazol
Sulfadiazin
Sulfamerazin
Sulfamethazin
Sulfathiazol
Durch die Veränderung der Substituenten an der N1-Position verändern sich die
pharmakokinetischen Eigenschaften des Wirkstoffes [69]. Diese Tatsache ermöglicht, dass
sich ausgehend vom Sulfonilamid eine ganze Stoffklasse durch eben diese Veränderung
eines einzigen Substituenten ableiten lässt.
Physikalische und chemische Eigenschaften
Sulfonamide sind weiße, kristalline Pulver. In neutraler und saurer Lösung zeigen sie eine
charakteristische UV-Absorption bei 270 und 320 nm. Sie besitzen amphoteren Charakter,
was bedeutet, dass ihre Löslichkeit in wässriger Lösung pH-Wert abhängig ist. Sie können
daher in Lösung als kationische, neutrale bzw. zwitterionische und/oder anionische Spezies
vorliegen. Das Löslichkeitsminimum in wässriger Lösung liegt etwa bei einem pH-Wert
zwischen drei und fünf. Es sind zwei Säurekonstanten für Sulfonamide bekannt. Der erste
pKa-Wert liegt bei 2-3 und wird der Protonierung der Aminogruppe zugeordnet. Der zweite
pKa-Wert liegt bei 4,5-10,6 und ist der Deprotonierung des R1SO2NHR2-Teils zuzuordnen
[70, 71].
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 17
Metabolisierung
Die Sulfonamide metabolisieren in der Leber von tierischen z.B. von Schweinen oder auch
menschlichen Organismus. Als Hauptmetabolite werden dort N4-Acetyl-Sulfonamide durch
die Acetylierung des primär-gebundenen 4-Anilinstickstoffes gebildet [72].
Abb. 6: Struktur von N4-Acetyl-Sulfadiazin
Studien wiesen bei Schweinen eine Ausscheidungsgrade von 50 % des eingesetzten
Sulfadiazin nach. Jedoch sind N4-Acetyl-Sulfonamide nicht antibakteriell wirksam, wobei z.B.
das N4-Acetyl-Sulfadiazin mit der Zeit wieder deacetyliert wird [73, 74, 75, [76].
Wirkmechanismen und Wirkungsspektren
Sulfonamide wirken ebenfalls wie Tetracycline bakteriostatisch. Sie können bei hohen
Konzentrationen jedoch auch bakterizid wirken. Sulfonamide haben eine ähnliche Struktur
wie die p-Aminobenzoesäure (p-ABS), die sich in der bakteriellen Zelle befindet und dort zur
Synthese der Folsäure beiträgt. Sulfonamide greifen damit in die bakteriellen Synthesewege
der Folsäure ein, verbleiben hier als Antimetabolit und binden die Dihydropteroinsäure-
Synthetase an Stelle der p-Aminobenzosäure. Dadurch kann Hydropteroinsäure nicht mehr
gebildet werden, die eine Vorstufe der Dihydrofolsäure (DHF) ist. Diese wird wiederum von
Bakterien benötigt, um daraus die zur DNA und RNA-Synthese und somit auch für die
Proteinsynthese benötigte Tetrahydrofolsäure zu synthetisieren [77].
Sulfonamide besitzen eine Breitbandwirksamkeit gegenüber grampositiven und
gramnegativen Bakterien sowie Chlamydien und einigen Kokzidien. Zwischen pH 5,5 und 7,5
erreichen Sulfonamide ihr Wirkungsoptimum und haben sowohl in vitro als auch in vivo ein
sehr breites Wirkungsspektrum [28, 33].
Anwendung in der Tierhaltung
Sulfonamide werden bei Harnwegsinfektionen, Infektionen im Hals-Nasen-Ohren-Bereich
und des Magen-Darm-Traktes sowie Infektionen der Atemwege oral angewendet. Neben
diesem breiten Anwendungsspektrum trägt zur großen Bedeutung der Sulfonamide
gleichermaßen bei, dass es relativ kostengünstige Medikamente sind. Die
Dosierungsmengen für Sulfonamide bei Tieren sind mit denen der Tetracycline vergleichbar.
Beispielweise wird Sulfamethazin bei Schweinen in Dosen von 50-100 mg/kg KG pro Tag
verabreicht [28, 30].
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 18
3.4.3 Fluorchinolone
Die Fluorchinolone sind wie die Sulfonamide synthetisch hergestellte Substanzen und
werden daher als Chemotherapeutika bezeichnet. Die Synthese von Nalidixinsäure
(Grundgerüst der Fluorchinolone) (Tab. 5) wurde im Jahr 1962 als erste Substanz der
Chinolone patentiert. Zur ersten Generation der Chinolone werden zusammen mit der
Gruppe der Napthyridine, Cinnoline und Pyridopyrimidine gezählt. Als erster Vertreter der
Gruppe von Fluorchinolonen wurde Norfloxacin synthetisiert, welches 1984 auf den Markt
kam [78, 79].
Tab. 5: Struktur der Fluorchinolone [80]
Name
R1
R2
Enrofloxacin
Ciprofloxacin
Danofloxacin
Norfloxacin
-CH2CH3
In Tab. 5 sind die Strukturen der Fluorchinolone wie Enrofloxacin, Danofloxacin, Norfloxacin
sowie Marbofloxacin, die in der Veterinärmedizin am häufigsten verwendet werden [81],
dargestellt. Der bedeutendste Vertreter der Stoffklasse ist Enrofloxacin (ENR), das nur für
die Veterinärmedizin zugelassen ist. Dieses ist für die Geflügelmast von Bedeutung. Dabei
ist die Anwendung im Bereich der Legehennen wiederum ausgenommen, um Rückstände in
Eiern zu vermeiden [82].
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 19
Physikalische und chemische Eigenschaften
Fluorchinolone sind schwach gelbe, kristalline Pulver, thermostabil und schwach
lichtempfindlich. Sie absorbieren UV-Strahlung im Bereich von 285-335 nm. Die Löslichkeit
der Fluorchinolone in Wasser ist auf Grund ihrer Struktur pH-Wert-abhängig. Die bessere
Löslichkeit in alkalischen wässrigen Lösemitteln beruht auf der Deprotonierung der
Säurefunktion (pKs ≈ 5) [83]. Im neutralen Bereich führt das ungeladene bzw. als Zwitterion
vorliegende Molekül dagegen zu einer schlechteren Löslichkeit, während sich dann im
Sauren durch die Protonierung des tertiären Stickstoffs am Piperazinring die Löslichkeit
wiederum erhöht (pKs ≈ 8-9) [84].
Fluorchinolone besitzen auch wie Tetracycline unterschiedliche pKa-Werte. ENR besitzt
beispielweise einen pKa-Wert von 6,27 bis 8,3 und CIP von 5,9 bis 8,89 [85].
Metabolisierung
Strukturell sind die Fluorchinolone als Derivate der Chinolin-4-on-3-carbonsäure
aufzufassen. Durch die Einführung eines Piperazins an die C7-Position der Carbonsäure
entsteht die Pipemidsäure. Und durch die Fluorierung an Position sechs des Grundgerüstes
werden die Fluorchinolone dargestellt. So wird eine erhebliche Aktivitätssteigerung der
Chinolone erreicht. Ebenfalls bewirkt eine Cyclopropylsubstitution eine Steigerung der
antibakteriellen Aktivität [79].
Durch Abspaltung der Ethylgruppe vom Piperazinylring entsteht der Hauptmetabolit
Ciprofloxacin (CIP) (Abb. 7).
Abb. 7: Metabolisierung von Enrofloxacin zu Ciprofloxacin [79]
Das veterinärmedizinisch eingesetzte ENR wird in der Leber bei Schweinen bis zu 52 % zum
CIP abgebaut (Abb. 7) [86]. Das CIP wird zwischen 44 und 62 % mit Harn und zwischen 15
und 25 % mit Faeces von menschlichem Körper ausgeschieden [87]. Der Metabolit CIP, der
ebenfalls antimikrobiell wirkt, ist als Wirkstoff nur in der Humanmedizin zugelassen.
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 20
Wirkmechanismen und Wirkungspektren
Fluorchinolone hemmen die bakterielle DNA-Gyrase. Um die DNA richtig zu strukturieren,
benötigt die Bakterienzelle Gyrase. Die Gyrase bildet mit Fluorochinolonen stabile Komplexe,
so dass die Torsion der DNA aufgehoben wird. Fluorchinolone wirken daher bakterizid und
haben ein breites Wirkungsspektrum gegen grampositive und gramnegative Keime [64, 76].
Anwendung in der Tierhaltung
Die Fluorchinolone werden seit den 80er-Jahren in der Veterinärmedizin insbesondere zur
weitverbreiteten Behandlung ganzer Geflügelbestände verwendet. Fluorchinolone werden
bei Atemwegsinfektionen, bei bakteriellen Darmerkrankungen, bei Harnwegsinfektionen,
Infektionen des Hals-Nasen-Ohrenbereiches und des Genitalbereiches sowie auch der
Knochen eingesetzt. Enrofloxacin, ein wichtiger Vertreter dieser Klasse im Veterinärbereich,
wird z.B. bei Respirations-, Digestionstrakt, bakterielle Sekundärinfektionen und
Mischinfektionen bei Puten, Hühnern, Kälbern, Ferkeln, Schweinen u.a. angewandt [28, 81].
Die Applikation erfolgt meistens oral. Preislich liegen die Präparate deutlich über den
meisten anderen Antibiotika. Die Richtdosierung an Fluorchinolonen für Schweine liegt bei
2,5-10 mg/kg KGW [28]. Nach 3-12 Stunden werden die Fluorchinolone überwiegend über
die Nieren ausgeschieden [81].
3.4.4 Ionophore
Polyether-Antibiotika können Ionen über biologische Membranen transportieren, weshalb sie
auch als Ionophore bezeichnet werden. Die Carboxylgruppe, polyketidische Einheiten sowie
mehrere Tetrahydrofuran- oder Tetrahydropyranringsysteme sind die charakteristischen
Elemente der Polyether [88, 89].
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 21
Monensin (MON) Salinomycin (SAL)
Abb. 8: Strukturen von Monensin (MON) und Salinomycin (SAL) [90]
Aus Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 isoliertes Monensin ist einer der wichtigen
Vertreter dieser Klasse [88].
Physikalische und chemische Eigenschaften
Ionophore sind hellgelb gefärbte Pulver [91]. Zusätzlich sind sie nicht oder nur in geringem
Maße wasserlöslich, schlecht löslich in Methanol, aber dagegen gut löslich in Wasser oder in
organischen Lösungsmitteln nach Zugabe von Natriumsalzen [88]. Ionophore sind in der
Lage Alkalimetallionen z.B. Cd2+ und Zn2+ reversibel zu Chelaten zu binden, um damit deren
Transport in biologischen Systemen durch Membrane zu ermöglichen [92].
Metabolisierung
Ionophore können an unterschiedlichen Positionen der verschiedenen Ringe des Moleküls
metabolisieren. Nach Donoho et al. wurden z.B. für Monensin in Hühnern unterschiedliche
Metabolite nachgewiesen. Die Metabolite enstanden entweder durch Demethylierung,
Decarboxylierung oder durch Hydroxylierung. Die Metabolite besitzen eine viel geringere
biologische Aktivität als die Muttersubstanz, welche weniger als 10 % der gesamten
Rückstände ausmachten [93, 94].
Wirkmechanismen und Wirkungsspektren
Polyetherantibiotika sind wirksam gegen alle Kokzidien, wie z.B die Sporozoiten sowie gegen
parasitische Amöben, insbesondere Eimeria und Plasmodium. Diese Antibiotika vermitteln
den Einstrom von Kationen in die Zelle. Durch Monensin werden insbesondere Natrium-
Ionen (Na+) im Austausch gegen Protonen (H+) in die Zelle transportiert. Dieses führt zu
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 22
einem Zusammenbruch des natürlichen transmembranen Ionengradienten und zu einer pH-
Verschiebung sowie zum Wassereintritt in die Zelle. Die damit verbundene Druckerhöhung
bewirkt eine Zerstörung intrazellulärer Strukturen und damit den Zelltod. Das Wachstum der
grampositiven Bakterien wird durch die Ionophore gehemmt [95].
Anwendung in der Tierhaltung
Seit der Zulassung im Jahre 1971 findet Monensin einen weltweiten veterinärmedizinischen
Einsatz. Aufgrund seiner kokzidiostatischen Eigenschaften wurde es zunächst in der
Geflügelzucht als Futtermittelzusatz seit 1977 bei der Rindfleischproduktion eingesetzt. Seit
2000 wird es zudem auch an Milchvieh zur Ertragssteigerung angewendet. Die
therapeutische Anwendung der Ionophore Monensin, Lasalocid, Salinomycin, Narasin und
Maduramycin ist in der EU (VO 1831/2003/EEC) aufgrund ihrer genotoxischen bzw.
kanzerogenen Wirkpotentiale seit Februar 2006 verboten. Jedoch sind sie aufgrund Ihrer
guten Wirksamkeit gegen Kokzidien und Kryptosporidien bei Geflügel, kleinen Wiederkäuern,
Kälbern und Kaninchen zum Einsatz als Kokzidiostatika oder Histomonostatika weiterhin
erlaubt.
Sie besitzen eine starke Wirkung gegen grampositive Bakterien, Viren und Kokzidien. Bei
Wiederkäuern ist die Anwendung z.B. gegen Clostridium welchii oder bei Geflügelbeständen
gegen die Kokzidien EimeriaTenella möglich [96]. Die Dosierung an Kokzidiostatika beträgt
für Masthühner von 100-125 mg/kg KG, für Junghennen von 100-120 mg/kg KG und für
Truthühner von 60-100 mg/kg KG [97]. Monensin wird von Monogastriern zu einem hohen
Prozentsatz enteral absorbiert und metabolisiert. Im Hühnerkot wurden nicht mehr als 10 %
der Muttersubstanz nachgewiesen [98].
3.5 Antibiotika in der Umwelt - Eintrag und Verhalten
In der Landwirtschaft eingesetzte Antibiotika können auf mehreren Eintragspfaden in die
Umwelt gelangen, deren wichtigste in Abb. 9 dargestellt sind.
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 23
Abb. 9: Eintrag von Antibiotika aus der Landwirtschaft in die Umwelt
(modifiziert nach [99, 100, 101])
Nach der Verabreichung von Tierarzneimitteln erfolgen während der Tierpassage
Abbaureaktionen (z.B. in Leber, Niere) wie enzymatische Spaltung, Glycosylierung,
Acetylierung oder Hydrolyse. Antibiotika, insbesondere Tetracycline, werden im Tier nur
geringfügig metabolisiert und in hohen Anteilen (bis 90%) wieder ausgeschieden [60]. Die
Ausscheidungen, Festmist oder Gülle, werden aus der Stallhaltung gesammelt und als
Wirtschaftsdünger verwendet.
Die Gehalte an Antibiotika in den Wirtschaftsdüngern sind von vielen Einflussfaktoren
abhängig. Dazu zählen u.a. der Verdünnungseffekt und die Lagerungsbedingungen
(Temperatur, Belüftung etc.) sowie die physiko-chemischen Eigenschaften der Matrix. In den
Untersuchungen wurde festgestellt, dass Antibiotika je nach Gülleart und Wirkstoff im mg/kg-
Bereich in der Gülle hinterlassen werden können (s. Tab. 6).
Im Veterinärbereich gibt es zwei dominierende Pfade, die zum Eintrag von Antibiotika in den
Boden führen können. Es ist entweder der Eintrag durch Weidevieh oder durch die
Gülleausbringung. Wenn die mit Antibiotika behandelten Tiere auf Weiden gehalten werden,
gelangen die Ausscheidungen direkt auf den Boden und verursachen an dieser lokalen
Stelle hohe Antibiotikakonzentrationen. Die Ausbringung von Antibiotika-belasteten
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 24
Wirtschaftsdüngern auf landwirtschaftlich genutzte Flächen ist der Haupteintragsweg für
Veterinärantibiotika in die Umwelt. Stallmist wird direkt auf den Boden und Gülle entweder
mit Schleppschläuchen oder mit Streutellern auf landwirtschaftlich genutzte Flächen
ausgebracht. Durch die Gülleausbringung können im Boden Antibiotikakonzentrationen im
µg/kg-Bereich erreicht werden (s.Tab.7).
Antibiotika, die über Wirtschaftdünger in den Boden gelangen, können dort akkumulieren.
Hamscher et al. [3] und Grote et al. [102] konnten Tetracycline und Sulfonamide und ihre
Metabolite in der oberen Bodenschicht (0-30 cm) nachweisen. Trotz hoher
Tetracyclinkonzentrationen war eine Verlagerung der Substanzen in tiefere Bodenschichten
nicht nachweisbar. Grund dafür kann es sein, dass durch das Unterpflügen von Gülle die
Substanzen offensichtlich stark in der Ackerkrume (Pflugbereich) festgehalten werden. So
werden Tetracycline unter Feldbedingungen als persistent klassifiziert und neigen in Böden
zur Akkumulation. Auch Fluorchinolone bilden im Boden persistente Rückstände [85, 103].
Antibiotika und ihre Metabolite können an der Bodenmatrix z.B an Huminstoffen sowie an
Tonmineralen festgelegt werden, wobei die Bindungsformen zwischen reversibler Sorption
und irreversibler Festlegung variieren [104]. Diese Bindungsformen werden in der
Agrarwissenschaft als nicht extrahierbare Rückstände bezeichnet und laut der EU-Richtlinie
91/141/EWG folgendermaßen definiert:
„Unter nicht extrahierbaren Rückständen sind chemische Stoffe zu verstehen, die aus der
Anwendung eines Pflanzenschutzmittels gemäß guter landwirtschaftlicher Praxis stammen
und durch Verfahren, welche die chemische Natur dieser Rückstände nicht bedeutend
verändern, nicht extrahiert werden können. Durch Stoffwechselprozesse entstandene
Bruchstücke, die zu natürlichen Produkten führen, gelten nicht als nicht extrahierbare
Rückstände."
Die nicht extrahierbaren Rückständen bzw. gebundenen Rückstände wurden schon in den
1970er Jahren besonders in den Studien über Pestizide und PAK (Polycyclische
aromatische Kohlenwasserstoffe) untersucht [105, 106].
Generell lässt sich vermuten, dass die Entstehung nicht-extrahierbarer Rückstände auf
adsorptive Prozesse, die durch Ausbildung kovalenter Bindungen an Huminstoffe oder auch
durch weniger starke Bindungen wie van der Waals-Kräfte, Wasserstoff-Brücken oder
hydrophobe Wechselwirkungen beruhen können [107]. Dieses führt zu einer Sequestrierung
von Schadstoffen bzw. Xenobiotika (Abb. 10).
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 25
Abb. 10: Mögliche Bindungsformen/Wechselwirkungen von Xenobiotika an der Bodenmatrix
[107]
Als Sequestrierung wird der langsame Einschluss bzw. die Diffusion der Schadstoffe in nicht-
zugängliche Mikroporen oder molekulare Hohl- und Zwischenräume der Bodenmatrix
beschrieben, in denen die Xenobiotika zurückgehalten werden. Dieses beruht darauf, dass
organische Bodensubstanzen Hohlräume mit adsorptiv wirksamen inneren Oberflächen
aufweisen, in denen Xenobiotika eingeschlossen werden können. Der Verlauf einer
möglichen Sequestrierung in hydrophoben Regionen von Huminstoffen wurde schon für viele
Pflanzenschutzmittel beschrieben [105, 106, 107]. Es ist auch nachgewiesen worden, dass
Tetracycline durch Wechselwirkungen mit der Bodenmatrix sequestriert werden können
[108]. Xenobiotika können im Boden nicht nur sequestriert werden, sondern es sind auch
zahlreiche Ab- und Umbauprozesse wie chemische Zerfallprozesse (abiotischer Abbau) und
mikrobielle Abbauprozesse (biotischer Abbau) möglich [107]. Gelangt z.B. Monensin auf
landwirtschaftlich genutzte Flächen, so erfolgt offensichtlich ein abiotischer Abbau im Boden
[109]. Jedoch spielen Polarität sowie Molekülgröße bei diesen Prozessen eine große Rolle.
Ebenfalls sind diese Prozesse und Gehalte der Substanzen im Boden von der Bodenart
abhängig (lehmiger Schluff > humoser Sand). Tetracyclin z.B. weist in sandigen und
lehmigen Böden eine hohe Stabilität und eine geringe Verlagerungsneigung auf [110, 111,
112].
Die Wasserlöslichkeit der Antibiotikawirkstoffe bestimmt wesentlich ihre Mobilität.
Wasserlösliche Stoffe werden leichter mit dem Bodenwasser in tiefere Bodenschichten
verlagert. Tetracycline und Chinolone weisen eine starke Sorptionsneigung an feste
Bodenbestandteile auf. Die Adsorptionskoeffizienten an die Bodenmatrix (Kf) liegen für
Tetracycline bei bis zu 1620 ml/g an Torf und für Enrofloxacin bei bis 6300 ml/g an
Tonminerale. Aufgrund dieser Werte gelten diese Wirkstoffe als immobil. Im Vergleich dazu
liegt der Adsorptionskoeffizient Kf für Sulfamethazin zwischen 0,6 und 3,1 ml/g. Somit hat
3 Tierarzneimittel in der Landwirtschaft 26
Sulfamethazin nur eine geringe Sorptionsaffinität an die feste Bodenmatrix und kann daher
im Boden als sehr mobil angesehen werden [82, 113, 114]. Sie werden ausgewaschen und
gelangen somit in höheren Konzentrationen als Tetracycline oder Enrofloxacin ins
Grundwasser.
Durch Oberflächenabfluss „Runoff“ können Antibiotikarückstände von kontaminierten Böden
ins Oberflächenwasser gelangen. Heberer wies in Oberflächengewässern maximale
Tetracyclin-Konzentrationen von 1 μg/l nach, trotz der sehr geringen Bodenbelastung (<2
µg/kg) (Tab. 6) [115].
Tab. 6: Nachgewiesene Antibiotika-Konzentrationen in Wirtschaftsdüngern,
landwirtschaftlich genutzten güllegedüngten Böden und in Oberflächenwasser
Wirkstoff
in Wirtschaftsdünger
[mg/kg TM]
in Boden
[µg/kg TM]
in
Oberflächenwasser
[µg/l]
Schweingülle
Hühnermist
TC
23,0 [26]
n.n. [26]
199, 0 [116]
1,0 [116]
OTC
29,0 [26]
1,1 [26]
322,0 [116]
71,7 [116]
CTC
46,0 [26]
1,7 [26]
810,0 [116]
0,16 [117]
SFD
>10,0 [118]
51,0 [26]
<100,0 [116]
0,09 [117]
ENR
0,75 [26]
2,8 [26]
200,0 [26]
0,10 [119]
CIP
0,18 [26]
1,2 [26]
370,0 [26]
0,018 [117]
MON
-
-
1,08 [117]
0,036 [120]
- : keine Daten, n.n.: nicht nachweisbar
Ein weiterer Eintrag von Antibiotika in die Umwelt erfolgt über luftgetragene Stallstäube in
der Intensivtierhaltung. Stallstaub besteht aus Partikeln von Futtermittel, Einstreu und
Faeces, die Antibiotika-belastet sein können. Die landwirtschaftliche Produktion,
insbesondere die Schweine- und Geflügelmast ermöglichen die Entstehung enormer
Mengen an Gülle bzw. Geflügelmist. Hinzu kommt, dass über die Abluft der Ställe hohe
Mengen an Stäuben austreten und letztendlich die Antibiotika auf diesem Wege in die
Umwelt gelangen [121, 122, 123, 124, 125]. Untersuchungen ergaben für Tylosin in Staub
eine maximale Konzentration von 12,18 mg/kg, für Sulfamethazin von 2,90 mg/kg und für
Tetracycline von 5,18 mg/kg [126].
Durch Sorptions- oder Bindungsvorgänge an die Bodenmatrix gebundene antibiotisch
wirksame Stoffe und ihrer Metabolite führen zu geringeren Konzentrationen im
Bodenwasser. Daher sind ihre Extrahierbarkeit durch organische Lösungsmittel, ihre
biologische Wirksamkeit, ihr mikrobieller Abbau und ihre Aufnahme durch Pflanzen bzw. ihre
Bioverfügbarkeit, stark eingeschränkt. Dieses lässt sich dadurch erklären, dass die
Wirkstoffe oder ihre Metabolite in unzugänglichere Mikroporen der Huminstoffe oder
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 27
Tonminerale eingekapselt werden, wodurch sie sich nur geringfügig in tiefere
Bodenschichten verlagern und somit in den oberen Bodenschichten verbleiben [107, 127].
Mittlerweile wurde gezeigt, dass an Bodenpartikel gebundene Antibiotika biologisch aktiv
bleiben. Unter bestimmten Umständen, beispielsweise beim Abbau der Huminstoffe, sind die
adsorbierten Substanzen jedoch wieder remobilisierbar [128].
Zusammenfassend ist festzustellen, dass ein Potential der Aufnahme von Antibiotika aus
kontaminierten Böden durch Pflanzen besteht (s. Kap.5.3).
4 VERBRAUCHERGEFÄHRDUNG DURCH DEN ANTIBIOTIKA-EINSATZ IN DER
LANDWIRTSCHAFT
Die Gefährdungen des Verbrauchers, welche durch den Einsatz von Antibiotika in der
Tiermast entstehen können, lassen sich in zwei Kategorien einteilen [60],
die direkte Wirkung stellt die toxikologische Wirkung eines antibiotisch wirksamen
Rückstands dar,
die indirekte Wirkung stellt die Entwicklung von Antibiotikaresistenzen spezifisch für jedes
einzelne Antibiotikum dar.
Die Problematik von Rückständen und Resistenzen wird in nächstem Kapitel zum besseren
Verständnis dargestellt.
4.1 Rückstandsproblematik
4.1.1 Begriffsbestimmungen
Im Interesse einer besseren Übersichtlichkeit wird bei Fremdstoffen in Lebensmitteln (je
nach Art des Stoffes) zwischen Rückständen und Kontaminationen bzw. Verunreinigungen
unterschieden. Diese Begriffe sind wie folgt definiert.
Rückstände
Nach § 4 des Fleischhygienegesetzes (FlHG) und Artikel 2 Richtlinie 96/23/EG wurde die
folgende Definition für Rückstände formuliert:
„Rückstand von pharmakologisch wirkenden Stoffen und deren Umwandlungsprodukten
sowie von anderen Stoffen, die auf tierische Erzeugnisse übergehen und für den Menschen
gesundheitsschädlich sein können.“
Kontamination - Kontaminant
Die Verordnung (EWG) Nr. 315/93 regelt das Verfahren zur Kontrolle von Kontaminanten in
Lebensmitteln, wobei Artikel 1 Kontaminanten wie folgt definiert:
“Als Kontaminant gilt jeder Stoff, der dem Lebensmittel nicht absichtlich hinzugefügt wird,
jedoch als Rückstand der Gewinnung (einschließlich der Behandlungsmethoden in
Ackerbau, Viehzucht und Veterinärmedizin), Fertigung, Verarbeitung, Zubereitung,
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 28
Behandlung, Aufmachung, Verpackung, Beförderung oder Lagerung des betreffenden
Lebensmittels oder infolge einer Verunreinigung durch die Umwelt im Lebensmittel
vorhanden ist.“
So könnte man DDT (Dichlordiphenyltrichlorethan) sowohl den Rückständen (wenn es aus
der landwirtschaftlichen Anwendung stammt) als auch den Kontaminationen (wenn es aus
der Malariabekämpfung stammt) zuordnen [129]. Nach der gleichen Definition müssen die
Antibiotika in Nahrungsmitteln tierischer- und pflanzlicher Herkunft, die aus
landwirtschaftlichen Anwendungen stammen, den Rückständen zugeordnet werden.
4.1.2 Antibiotikarückstände in Lebensmitteln tierischer Herkunft
Abgesehen vom Austrag antibiotikahaltiger Wirtschaftsdünger auf landwirtschaftlich genutzte
Felder besteht für den Menschen eine weitere Aufnahmequelle durch Nahrungsmittel
tierischer (Fleisch, Milch, Ei) und pflanzlicher (Getreide, Gemüse, Obst) Herkunft.
Rückstände von Antibiotika in Fleischproben wurden in vielen Untersuchungen bei Puten,
Hühnern, Kälbern und Schweinen gefunden [130, 131]. Die bedeutendsten Substanzklassen
waren hierbei Tetracycline, Sulfonamide und Aminoglykoside. Auch Rückstände von
Kokzidiostatika (Ionophore) sind in Geflügelfleisch relativ häufig zu finden [132]. Die von
Grote et al. durchgeführten Untersuchungen belegen, dass nach bestimmungsgemäßer
Anwendung von CTC bei Schweinen Rückstände in den aus diesen Tieren erzeugten
Lebensmitteln nachweisbar sind [133]. Tetracycline weisen aufgrund ihrer Struktur eine hohe
Affinität zu metallischen Kationen auf. Deshalb können sie mit Calcium stabile Chelate bilden
und werden auf diese Weise bevorzugt in die Mineralisierungszonen von knochenbildenden
Geweben eingelagert. Das erklärte, dass Tetracycline auch in Knochengewebe in z.T. hoher
Konzentration nachweisbar sind [133]. Nicht nur die Fleischprodukte können
Antibiotikarückstände enthalten, sondern auch andere tierische Produkte wie Milch und Eier.
Zurhelle wies z.B. bei mit Tetracyclinen medikamentierten Legehennen
Tetracyclinrückstände in den Eiern nach [134]. Auch in Honig wurden Rückstände von
Antibiotika gefunden [135], obwohl für dieses Lebensmittel eine Nulltoleranz für Antibiotika-
Rückstände gefordert wird [136]. Es wurden in vier von 34 aus Südamerika stammenden
Honigproben Umwandlungsprodukte von Nitrofuranen sowie Streptomycin und Tetracyclinen
nachgewiesen. Auch in Bio-Honig waren Nitrofurane und Streptomycin nachweisbar [137],
obwohl Nitrofurane in der EU 1995 verboten wurden, da sie das Erbgut schädigen und Krebs
erzeugen können [135, 137, 138]. Ein illegaler Einsatz oder eine Mischung verschiedener
Rohhonige sowie eine Kontamination können zu positiven Befunden von Antibiotika in
Bioprodukten führen. Ebenfalls wurden im Rahmen des Nationalen
Rückstandskontrollplanes (2001-2005) im Honig Sulfonamide und Aminoglykoside
nachgewiesen [139].
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 29
Es lässt sich deshalb zusammenfassen, dass Lebensmittel tierischer Herkunft ein
Eintragspfad von Antibiotika-Rückständen in die Nahrungskette sind. Falls Antibiotika aus
Gülle-beaufschlagten Böden von Nutzpflanzen aufgenommen würden, wäre ein weiterer
Eintragspfad über pflanzliche Lebensmittel gegeben (s. Kap.5.3). Die grundsätzliche
Aufnahme dieser Wirkstoffe über die Pflanzenwurzeln wurde bereits vor über 50 Jahren
experimentell erkannt [8]. Bei der Selektion gentechnisch veränderter Pflanzen (GVPs)
werden Antibiotika eingesetzt, was zeigt, dass zumindest unter in vitro-Bedingungen eine
Aufnahme in die pflanzliche Zelle erfolgen kann [140, 141, 142]. Es gibt somit eine Reihe
experimenteller Befunde, die auf Wechselwirkungen von Antibiotika mit Pflanzenwurzeln in
homogener und heterogener Phase schließen lassen, was zur Aufnahme sowie zur
Translokation in Nutzpflanzen bzw. pflanzlichen Lebensmitteln führen kann.
4.1.3 Lebensmittelrechtliche Aspekte zu Antibiotikarückständen
Wie auch schon in den vorherigen Kapiteln deutlich gemacht wurde, ist das Problem der
Antibiotikarückstände in Lebensmitteln durchaus nicht mehr unbekannt und Behörden sowie
Gesetzgeber sehen sich gezwungen, darauf zu reagieren. Aus diesem Grund gibt es
zahlreiche Verbote und Regulierungen zum Einsatz von Arzneimitteln in der
landwirtschaftlichen Produktion, aus denen Grenzwerte wie z.B. der NOEL, ADI und MRL
hervorgebracht wurden.
NOEL (non observed effect level)
Der sogenannte NOEL wird definiert als diejenige Dosis, die keine adversen Effekte mehr mit
sich bringt. Anhand von Tierversuchen wird NOEL und somit die Dosis-Wirkungsbeziehung
von Arzneimitteln für den in Frage stehenden Wirkstoff ermittelt. Der ermittelte Wert wird
durch den Sicherheitsfaktor 100 dividiert, weil davon ausgegangen wird, dass der Mensch
10-fach empfindlicher als das Tier ist. Zusätzlich können individuelle Schwankungen
auftreten, die in einem weiteren Faktor berücksichtig werden [143].
ADI (Acceptable Daily Intake)
Der ADI wird definiert als diejenige Menge einer Substanz, die lebenslang täglich
aufgenommen werden kann, ohne dass mit einer Gesundheitsgefährdung des Menschen
gerechnet werden muss. Um den ADI-Wert zu bestimmen, werden Parameter wie Toxizität,
Reproduktionstoxizität, Mutagenität, Kanzerogenität und Immunotoxizität überprüft.
Zusätzlich sind bei Antibiotika experimentell die Auswirkungen auf die menschliche
Darmflora zu prüfen [144].
MRL (Maximum Residue Limit)
Durch die Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 wird die Höchstmenge, der sogenannte MRL-Wert
(Maximum Residue Limit) wie folgt definiert:
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 30
„Der MRL-Wert ist in Anlehnung an das Arzneimittelgesetz die maximal zugelassene
Höchstmenge eines Stoffes, die nach wissenschaftlichen Erkenntnissen bei
durchschnittlichen Essgewohnheiten keine Gefährdung der menschlichen Gesundheit
darstellt.“
Im Rahmen des Zulassungsverfahrens von Tierarzneimitteln werden die Wirkstoffe
hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die Gesundheit von Mensch und Tier und auf die Umwelt
geprüft. Bereits seit 1990 gibt es in der EU ein einheitliches Verfahren für die Festlegung von
Rückstandshöchstmengen für Tierarzneimittel in Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs, das
auf der Verordnung Nr. 2377/90 vom 26. Juni 1990 beruht (zuletzt geändert durch die VO
(EG) Nr. 712/2005). Darin sind MRL-Werte für die verschiedenen tierischen Lebensmittel
(Fleisch, Leber, Niere, Fett, Milch, Eier, Honig) auf der Basis des ADI festgelegt. Diese MRL-
Werte sind so festgelegt, dass auch bei täglicher Aufnahme von Tierarzneimittelrückständen
bis zu dieser Konzentration keine Gefahr für den Verbraucher zu erwarten ist [145]. Aufgrund
dieser Verordnung werden seit dem 1. Januar 1992 Arzneimittel, die neue Wirkstoffe
enthalten, zur Anwendung bei Lebensmittel-liefernden Tieren nur noch zugelassen, wenn für
diese MRL-Werte in essbaren Geweben und tierischen Produkten festgelegt sind. Die
Wirkstoffe, die für Lebensmittel-liefernde Tiere zugelassen sind, werden in den Anhängen I
bis III der Verordnung zusammengefasst (Tab. 7). Weiterhin werden in Anhang IV für
Lebensmittel-liefernde Tiere nicht zugelassene Wirkstoffe erfasst. Der Wirkstoff Enrofloxacin
z.B. ist in Europa nicht für die Behandlung von Legehennen zugelassen [146].
Tab. 7: Anhänge I bis IV von der Verordnung (EWG) Nr. 2377/90
Anhang
Beschreibung
Beispiele
Anhang I
endgültiger MRL-Wert
(ohne Zeitbeschränkung)
Benzylpenicillin
Chlortetracyclin
Oxytetracyclin
Tetracyclin
Trimethoprim
Anhang II
kein MRL-Wert
(Rückstände in allen Konzentrationen für den
Verbraucher unbedenklich)
Apramycin
Anhang III
vorläufiger MRL-Wert
(Geltungsdauer von maximal fünf Jahren. Nach Ablauf
der Frist ist eine Anwendung bei Lebensmittel liefernden
Tieren nur noch möglich, wenn eine Umgruppierung des
Stoffes in Anhang I oder II erfolgt ist.)
Kanamycin
Tulathromycin
Anhang IV
keine Festlegung von MRL-Werten
(Aufgrund ihrer Toxizität oder wegen des Fehlens von
Daten, ihre Anwendung bei Lebensmittel liefernden
Tieren ist in der gesamten EU verboten.)
Chloramphenicol
Nitrofurane
Enrofloxacin
In Studien wurde als wesentliche Wirkung von OTC die Induktion von Resistenzen bei
Enterobacteriaceae beobachtet und deshalb ein NOEL von 2 mg/Person/Tag festgelegt.
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 31
Dieser Wert wird unter Berücksichtigung eines Sicherheitsfaktors von 10, d.h., ein ADI von 0-
3 µg OTC/kg KG festgestellt [146, 147]. Außerdem wurde auch Doxycyclin hinsichtlich seiner
Wirksamkeit auf die humane Darmflora überprüft und ebenfalls ein ADI-Wert von 0-3 µg/kg
KGW empfohlen [148]. Diese in der EWG-Verordnung Nr. 2377/90 festgesetzten ADI-Werte
dürfen nicht überschritten werden. Um dieses zu sichern, werden MRL-Werte
vorgeschrieben, die für einen Wirkstoff und ein bestimmtes Gewebe gelten und in den
Anlagen I und III der EWG-Verordnung Nr. 2377/90 aufgelistet sind.
Tab. 8: MRL-Werte für Tetracycline in Gewebe (nach Verordnung (EWG) 2377/90)
Wirkstoff
Rückstand
Tierart
MRL [µg/kg]
Zielgewebe
CTC
CTC
e-CTC
Alle zur
Lebensmittelerzeugung
genutzten Arten
100/300/
600/100/200
Muskel/Leber/
Nieren/Milch/Eier
OTC
OTC
e-OTC
TC
TC e-TC
DC
DC
Rinder
100/300/600
Muskel/Leber/Nieren
Schweine
100
Muskel
Geflügel
300/300/600
Haut+Fett/Leber/Nieren
Nicht anwenden bei Tieren, von denen Milch für den menschlichen Verzehr gewonnen wird
Nicht anwenden bei Tieren, von denen Eier für den menschlichen Verzehr gewonnen werden
Wie in der Tab. 8 aufgeführt ist, sind Rückstände von CTC in Lebensmitteln tierischen
Ursprungs gemäß gesetzlicher Vorschriften als Summe der Gehalte an CTC und des
Epimeren e-CTC zu ermitteln. CTC ist in der Lage, weitere Umwandlungs- und
Abbauprodukte wie iso-CTC (nicht antibiotisch wirksam) und Anhydrochlortetracyclin zu
bilden, welche toxikologisch relevant sind und die ebenfalls epimerisieren können. Diese
Produkte wurden trotz zuverlässig-analytischer Erfassbarkeit nicht bei der Festlegung der
MRL-Werte berücksichtigt.
Das Arzneimittelgesetz, welches bezüglich der Wartezeiten auf die tierärtzliche
Hausapothekenverordnung (TÄHAV) verweist, spielt bei der Vermeidung von Rückständen
in Lebensmitteln tierischen Ursprung eine zentrale Rolle. In der Verordnung legt Paragraph
12a fest, dass im Falle des sogenannten Therapienotstandes zur Behandlung von
lebensmittelliefernden Tieren Wartezeiten bei der Verabreichung eingehalten werden
müssen, um zu gewährleisten, dass die festgesetzten ADI- bzw. auch MRL-Werte nicht
überschritten werden [149].
Die Relevanz der Wartezeiten zwischen Antibiotikaanwendung und Schlachtung für die
Einhaltung der MRL-Werte wurde auch von Grote et al. bestätigt [6, 60, 133]. Dabei wurden
Untersuchungen zum Gehalt von Chlortetracyclin in Fleisch durchgeführt. In der Tab. 9
werden diese CTC-Gehalte für unterschiedliche Schlachtungszeiten dargestellt.
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 32
Tab. 9: CTC-Gehalte im Schlachtkörper der Tiere [133]
Zielgewebe
CTC-Gehalte [µg/kg]
Schlachtung direkt nach Medikation
Schlachtung 14 Tage nach Medikation
Muskel
210,4
4,0
Leber
392,2
7,4
Niere
659,0
19,7
Die durchgeführten Untersuchungen belegen, dass auch bei bestimmungsgemäßer
Anwendung von Antibiotika bei Nutztieren Rückstände in den aus diesen Tieren erzeugten
Lebensmitteln unvermeidbar sind. Im nächsten Abschnitt wird beschrieben, dass die den
Tieren verabreichten Wirkstoffe als ursprünglicher Wirkstoff oder als Metabolit mit
antibiotisch wirksamer, resistenzfördernder oder toxischer Wirkung in die Nahrungskette und
die Umwelt gelangen können.
4.2 Resistenzproblematik
4.2.1 Begriffsbestimmungen und Resistenzentstehung
Die Resistenz wird als eine Entstehung einer verminderten Empfindlichkeit pathogener
Mikroorganismen gegen Pharmaka bzw. antimikrobiell wirksame Substanzen definiert [150].
Flindell hat den Begriff „Resistenz“ für pathogene Mikroorganismen folgendermaßen definiert
[151]:
„Ein pathogener Mikroorganismus muss dann als resistent bezeichnet werden, wenn die in
vitro ermittelte minimale Hemmkonzentration (MHK) eines Antibiotikums oder
Chemotherapeutikums höher ist als die in vivo am Infektionsort erreichbare Serum- bzw.
Gewebekonzentration“.
Die MHK wird als in vivo gemessene geringste Konzentration bezeihnet, welche in vitro das
Wachstum des zu testenden Bakterienisolates bzw. des Erregers in einem flüssigen oder
festen Medium hemmt [152]. Während der Antibiotikabehandlung hängt die Wirksamkeit
einer Substanz auch von einem Konzentrationsgradienten zwischen
Interzellulärflüssigkeit/Gewebe und Mikroorganismen ab. Nur in einem bestimmten
selektiven Bereich werden sensitive Bakterien abgetötet bzw. gehemmt. In subinhibitorischer
Konzentration, welcher die als minimale Hemmkonzentration (MHK) definiert ist, finden
Mikroorganismen ideale Bedingungen vor, um verschiedene Resistenzmechanismen zu
entwickeln [60]. Wenn Genkomplexe vorhanden sind, die eine Resistenzsteigerung bewirken
oder wenn Organismen Fremdgene aufnehmen und exprimieren, können sich dadurch
Resistenzen entwickeln. Die resistenten Krankheitserreger können sich durch einen
Selektionsdruck Wachstumsvorteile verschaffen und sich dementsprechend ausprägen.
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 33
Dieser Selektionsdruck wird durch die Anwendung von Antibiotika bei Mensch und Tier
ausgeübt, sodass jede Anwendung die Resistenzentwicklung fördert [153, 154].
Ein Resistenzniveau ist abhängig vom Bakterium selbst, vom Resistenzmechanismus und
von der Art des Antibiotikums. Man unterscheidet zwischen natürlicher (primärer) Resistenz
und erworbener (sekundärer) Resistenz. Man spricht von natürlicher Resistenz, wenn die
native Population einer Spezies von Bakterien unempfindlich gegenüber einem oder
mehreren Antibiotika ist. Als Beispiel für die natürliche ist z.B. zu erwähnen, dass E.coli
Bakterien gegenüber den Markoliden oder auch die Spezies Pseudomonas gegenüber
Benzylpenicillin resistent sind [155]. Demgegenüber erwerben Mikroorganismen Resistenzen
entsprechend zweier verschiedener genetischer Veränderungsmechanismen. Zum einen
erfolgt der Erwerb durch Mutation und zum anderen durch den Transfer von
Resistenzgenen. Zu den erworbenen Resistenzen gehört auch die infektiöse übertragbare
Resistenz. Die übertragbare Resistenz basiert auf der Übertragung genetischen Materials
von einer Bakterienzelle auf eine andere, wobei dieser Transfer zur Weitergabe der multiplen
Resistenz führt [156].
Der multiplen Resistenz wird in der praktischen Anwendung von Antibiotika sowohl in der
Veterinärmedizin als auch in der Humanmedizin große Bedeutung zugemessen. Durch eine
verminderte intrazelluläre Wirkstoffkonzentration oder einen verstärkten Efflux durch die
Zytoplasmamembran können Resistenzen entstehen [60]. Dieser Effekt führte insbesondere
hier zum Verbot von Leistungsförderern in Form von subtherapeutischen Dosen in der
Veterinärmedizin.
Wenn Keime gleichzeitig gegen ein oder mehrere andere Antibiotika resistent sind, wird
dieses als Kreuzresistenz bezeichnet [157]. Häufig zeigen dementsprechend die Substanzen
Kreuzresistenzen, die eine ähnliche chemische Struktur oder einen gleichen
Wirkungsmechanismus haben. Deshalb trägt eine Anwendung gleicher Antibiotikaklassen in
human- und veterinärmedizinischen Bereichen zusätzlich zur Resistenzproblematik für
humanmedizinische Antibiotika bei. So bestehen Kreuzresistenzen zwischen den
Tetracyclinen, wie Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin und Demeclochlortetracyclin
sowie auch zwischen Fluorchinolonen und Virginiamycin, wodurch die Verwendung von
Antibiotika in der Geflügelhaltung zur Zunahme der Infektionen der Menschen mit
Fluorochinolon-resistenten Campylobacter jejuni und Salmonella sp. geführt hat [158].
Als Ko-Resistenz wird das Auftreten einzelner Bakterienspezies bezeichnet, die gleichzeitig
Resistenzen gegenüber Antibiotika aus verschiedenen Wirkstoffgruppen aufweisen. Die
Resistenzgene (Transponsons, Plasmide), welche gemeinsam aus der gleichen genetischen
Gruppe stammen, bilden im Allgemeinen die Grundlage der Ko-Resistenz [159].
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 34
4.2.2 Resistenzmechanismen
Mikroorganismen haben folgende wesentliche Resistenzmechanismen entwickelt [160]:
eine Veränderung im Zielbereich des Wirkstoffs,
eine enzymatische Inaktivierung des Antibiotikums,
eine verminderte Aufnahme des Wirkstoffs oder Transport des Wirkstoffes in den
extrazellularen Raum.
Die oben genannten Resistenzmechanismen entwickeln sich in Abhängigkeit von der
Wirkungsweise der Antibiotika. Dabei besteht keine unmittelbare Wechselwirkung zwischen
der Stoffklasse eines Antibiotikums und der durch das Bakterium ausgebildeten
Resistenzmechanismen.
Den effektivsten bakteriellen Resistenzmechanismus gegen Tetracycline stellt die aktive
Ausschleusung der Tetracyclinmoleküle aus der Zelle dar. Hinzu kommt, dass die
Veränderung der Porinproteine in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien sowie in
der cytoplasmatischen Membran eine Reduzierung der Penetrationsgeschwindigkeit der
Tetracyclinmoleküle erreicht. Im Cytoplasma befinden sich weitere Resistenzproteine der
Bakterien. Diese Schutzproteine, die nicht-kovalent mit dem Ribosom assoziiert sind, können
auch in Gegenwart von Tetracyclin die Aminoacyl-t-RNA an das Ribosom binden. Dadurch
kommt es zu einer ungehinderten Fortführung der Proteinbiosynthese [48, 161].
Weiterhin existieren auch Resistenzmechanismen, die die Wirkung der Sulfonamide
abschwächen können. Eine Möglichkeit ist, die Bindungsstelle der
Dihydropteroinsäuresynthetase so zu verändern, dass eine niedrigere Affinität für
Sulfonamide hervorgerufen wird und p-ABS (p-Aminobenzoesäure) vermehrt gebunden wird.
Die zweite Möglichkeit ist, in der Bakterienzelle die Produktion von p-ABS zu erhöhen. Um
eine verstärkte Metabolisierung der Substanzen zu erreichen, können außerdem
Mechanismen zur Inaktivierung von Sulfonamiden entwickelt werden [162].
Resistenzen gegen Sulfonamide sind recht weit verbreitet, besonders wenn Sulfonamide
nicht in Kombination mit Trimethoprim, sondern als Einzelsubstanzen angewandt werden.
Allerdings kann die Veränderung der Bindungsstelle des betreffenden Enzyms auf die
Ausbildung von Resistenzen gegen Trimethoprim beruhen [163].
Die Fluorchinolon-Resistenz beruht auf einer Veränderung der Bindungsstelle am
Topoisomerase II Enzym, das in allen Organismen vorkommt. Diese Enyzme können Helix-
Windungen von doppelsträngigen DNA-Strängen auflockern und lösen. Eine bakterielle
Topoisomerase kann auch zusätzliche Windungen in einem DNA-Strang einführen. Auf der
anderen Seite können Resistenzenmechanismen aktive Ausschleusungen störender
Substanzen aus der Zelle beinhalten [162, 164].
Trotz jahrelang massiver Anwendung von Ionophoren ergab sich ein sehr günstiges Bild
hinsichtlich der Resistenzentwicklung. Wirkungsverluste entwickelten sich, wenn auch
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 35
langsam, über Membranveränderungen, welche die Penetration der Ionophoren in die
Parasiten verhindern [162].
4.3 Verbrauchergefährdung
Durch den Eintrag von Antibiotikarückständen in Umweltkompartimente bestehen neben
Nahrungsmitteln tierischer- und pflanzlicher Herkunft weitere Aufnahme- und damit
Gefährdungsquellen für den Menschen. Abb. 9 zeigt, dass eine Verbrauchergefährdung
durch in der Tiermast eingesetzte Antibiotika auf mehreren Wegen möglich ist.
Abb. 11: Mögliche Eintragspfade und Effekte von Veterinärantibiotika (modifiziert nach [60])
Veterinärpharmaka
Lebensmittel tierischen
Ursprungs
Pflanze
Exkretion
Gülle
Boden
Landwirtschaftliche
Tierproduktion
Lebensmittelkette
Tierkontakt
resistente Keime
Lebensmittel pflanzlichen
Ursprungs
Schlachtung
Antibiotikarückstände
Mensch
Futtermittel
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 36
Zum Einen kann eine Gefährdung durch die Aufnahme von Antibiotikarückständen
stattfinden, zum anderen können auch direkt resistente (pathogene) Keime mit den
Rückständen übertragen werden, die dann auch eine Resistenz beim Menschen ausüben.
In Kap.4.1.2 wurde schon beschrieben, dass Antibiotikarückstände in Lebensmitteln
tierischer Herkunft (Fleisch, Milch, Ei) nachweisbar sind. Bei der Aufnahme von
Antibiotikarückständen durch tierische Lebensmittel ist eine direkte Übertragung von
Rückständen möglich, wodurch eine Resistenzproblematik resultieren kann. Deshalb ist das
Tier bei der sogenannten direkten Gefährdung das Übertragungsmedium von
Antibiotikarückständen und der Körper des Menschen selbst ist der Entstehungsort für eine
mögliche Resistenz. Beispielweise können Antibiotikarückstände oder Metabolite, die noch
Aktivität besitzen, bei ungenügender Erhitzung im Fleisch und den Fleischprodukten in
unveränderter Form verbleiben und somit vom Menschen aufgenommen werden [165].
Deshalb wurden Richtlinien eingeführt, wie z.B. die Richtlinie 94/65/EG von Dezember/1994
zur Festlegung von Vorschriften für die Herstellung und das Inverkehrbringen von
Hackfleisch/Faschiertem und Fleischzubereitungen, die Verordnung über die hygienischen
Anforderungen an das Behandeln und Inverkehrbringen von Hühnereiern und roheihaltigen
Lebensmitteln oder die Verordnung zum Schutz gegen bestimmte Salmonelleninfektionen
beim Haushuhn [166].
Durch die dauerhafte Aufnahme von Antibiotikarückständen (z.B. Tetracycline) können für
den Menschen mögliche Risiken entstehen, wie ein erhöhtes allergisches Potential,
Lichtempfindlichkeit und Photosensibilisierung, Schwindel und Gleichgewichtsstörungen.
Weiterhin kann es bei Medikamenten zu Interaktionen kommen wie z.B. Unwirksamkeit von
oralen Kontrazeptiva [60].
Eine weitere Verbrauchergefährdung stellt den resistenten (pathogene) Keimen mit den
Rückständen dar, was als eine indirekte Gefährdung definiert ist. Einige Antibiotika sind
schwer biologisch abbaubar (z.B. Cefotiam, Ciproflaxin, Sulfamethoxazole und Tetracycline).
Deshalb potenzieren sich nicht nur die in der Umwelt verbleibenden Rückstände bei
vermehrtem Eintrag in die Natur, sondern auch die Gefahr des Beitrags an der
zunehmenden Resistenzentwicklung. Neben diesem Aspekt muss jedoch noch
berücksichtigt werden, dass auch in den Umweltkompartimenten schon resistente Keime
ausgebildet werden, die dann ebenfalls wieder in die Nahrungskette und somit zum
Menschen gelangen, wo sie dann als resistente Infektionserreger Schaden anrichten
können.
Die Resistenzentwicklung kann entweder auf der Übertragung resistenter Mikroorganismen
aus der Nahrung oder auf dem Transfer von Resistenzgenen im Menschen zwischen für den
Menschen apathogenen, vom Tier stammenden Erregern und humanpathogenen Bakterien
beruhen. Eine Übertragung von resistenten Mikroorganismen sowie auch resistenten Genen
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 37
aus der Landwirtschaft auf den Menschen ist über kontaminierte tierische Lebensmittel, den
Kontakt mit Nutztieren, den luftgetragenen Transport von Stallstäuben aus
landwirtschaftlichen Betrieben, die Gülleausbringung sowie die damit verbundene Belastung
von Trinkwasser und pflanzlichen Nahrungsmitteln möglich [167].
Gefährdungspotential durch resistente Mikroorganismen
Zoonosen werden als Krankheiten definiert, die von Tier auf Mensch übertragen werden.
Eine Aufnahme von Zoonoseerregern kann zu ungünstigen Krankheitsverläufen infolge der
schlechteren Therapierbarkeit und sogar zu Todesfällen durch vom Nutztier stammende
resistente Erreger führen [168, 169]. So wurde durch eine Studie belegt, dass Patienten, die
sich mit resistenten Erregern z. B. Salmonellen- und Campylobacter-Stämme infiziert hatten,
ein höheres Risiko hatten, innerhalb der nächsten zwei Jahre an Infektionen zu sterben, als
Patienten, die mit Antibiotika-empfindlichen Erregern infiziert wurden [169]. Eine
Forschungsarbeit zeigte, dass multiresistente Bakterien aus Rohwürsten ihre Resistenzen
auf menschliche Krankheitserreger übertragen können wie z.B die zu Darminfektionen
führenden Salmonellen aus Lebensmitteln. Das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)
berichtete, dass in Deutschland jährlich etwa 250 Fälle von Salmonellosen auftreten. Weil
bei solchen Salmonellose-Fällen eine notwendige antibiotische Behandlung oftmals nicht
mehr anschlägt, führt diese höchstwahrscheinlich zu Todesfällen [168]. Bywater und
Casewell konnten belegen, dass ca. 4% der bei humanmedizinischen Infektionen
auftretenden Resistenzprobleme ihren Ursprung in der Anwendung antibiotischer Wirkstoffe
bei Tieren haben [170]. Zusammenfassend wird vermutet, dass der übermäßige
Fluorchinolon-Einsatz besonders in der Geflügelhaltung dazu führt, dass immer mehr
Bakterienstämme, die bei Mensch und Tieren zu Salmonellen-Infektionen führen, gegen
Antibiotika resistent sind. Auch Großklaus et al. zeigten, dass durch orale Aufnahme von
penicilinhaltiger Milch bei Menschen eine plasmidbedingte Resistenz entstehen kann [171].
Jedoch sind es nicht nur Zoonoseerreger bzw. resistente Krankheitserreger sondern auch
nicht pathogene resistente Bakterien in der Darmflora des Menschen, die Resistenzgene an
Krankheitserreger weitergeben [172].
Methicillin-resistente Staphylococcus aureus, MRSA
Insbesondere stellt Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA-Stämme) als
multiresistenter Erreger ein großes Risiko für den Menschen dar [173]. MRSA-Bakterien sind
nicht nur gegen das Antibiotikum Methicillin resistent, sondern auch gegen ß-Lactam-
Antibiotika, Tetracycline und gegen Glykopeptide. MRSA-Bakterien sind bei vielen
Infektionen (Wundinfektionen, nosokomialen und ambulant erworbenen Infektionen) schwer
zu behandeln. Deshalb haben MRSA-Infektionen oft einen längeren Krankheitsverlauf mit
u.a. tödlichem Verlauf zur Folge. Heute nur noch mit dem Reserveantibiotikum Vancomycin
therapierbare MRSA-Erreger sind weltweit verbreitet. Sollten einmal auch diese
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 38
Reserveantibiotika nicht mehr wirken, bedeutet dieses das Ende für jede Therapie. Zum
Beispiel starben in den USA im Jahr 2006 ca 19.000 Menschen an den Folgen einer MRSA
Infektion [174]. Nach einer Studie der Paul-Ehrlich-Gesellschaft im Jahr 2001 lag der Anteil
an Erkrankungen durch MRSA-Erregern in Deutschland bei 20,7 %, demgegenüber in den
Niederlanden und den skandinavischen Ländern <1 % [175].
MRSA-Stämme können zwischen Tier und Mensch übertragen werden. So ist die
Wahrscheinlichkeit des Auftretens von MRSA bei den Personen, die Umgang mit Schweinen
haben (z.B. Schweinehalter, Tierärzte, Schlachter) größer als bei anderen Menschen. Als
Beispiel kann genannt werden, dass in Kanada MRSA-Stämme in 9 von 20 (45 %)
schweinehaltenden Betrieben gefunden wurden [176]. In einer anderen Untersuchung in
Kanada wurde festgestellt, dass die Anteile an MRSA-Erregern bei Schweinen ca. 25 % und
bei Schweinezüchtern bei 20 % lagen. In den Niederlanden wurden MRSA-Raten von 39 %
bei Schweinen und >20 % bei Schweinezüchtern verzeichnet [177]. Diese Untersuchungen
zeigen, dass das genetische Material der aus den Tieren entnommenen Erreger identisch ist
mit dem Genmaterial der MRSA-Stämme der Personals landwirtschaftlichen Betriebe, was
einen eindeutigen Hinweis auf die Übertragung zwischen Menschen und Tieren darstellt.
Außerdem besteht neben dem Tierkontakt (wie oben beschrieben) auch durch Lebensmittel
tierischen Ursprungs ein Risiko, sich mit MRSA-Bakterien infizieren zu können, da in
Lebensmitteln (Fleisch, Milch und Käse) ebenfalls MRSA-Erreger enthalten sind. Im Rahmen
einer Studie aus den Niederlanden wurden 1300 verschiedene rohe Fleichprodukte (Puten-,
Hühner-, Kalb- und Schweinefleisch) untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass etwa in 11 %
der rohen Fleischprodukte MRSA-Erreger gefunden wurden [178]. Daher ist grundsätzlich
auch über MRSA kontaminierte Lebensmittel eine Übertragung auf den Menschen möglich.
Risiken durch den Antibiotikaeintrag in Böden
Weiterhin wurde für zahlreiche Wirkstoffe nachgewiesen, dass antibiotische Wirkstoffe im
Boden zu Umwandlungs- und Abbauprodukten reagieren können, was wiederum zu
unterschiedlichen Wechselwirkungen dieser Produkte mit den Bakterien führen kann.
Hinzukommend wurde von Chander et al. belegt, dass die fest an Bodenmatrix adsorbierten
Tetracycline noch biologisch aktiv sind und damit die Selektion Antibiotika-resistenter
Bakterien in der Umwelt beeinflussen können [179]. Infolgedessen kann also weiterhin
gezeigt werden, dass sich das Auftreten von Resistenzgenen und die Übertragungsraten von
Resistenzen erhöht.
Auch in aquatischen Systemen treten resistente Bakterien häufig auf [180]. Hier verbreiten
sich die resistenten Bakterien auf zwei Wegen. Diese Wege gehen entweder über die
Antibiotikarückstände und resistente Mikroorganismen aus anderen Umweltbereichen oder
sie gehen über den Antibiotikaeinsatz in Aquakulturen, der dann Resistenzbildung auslöst.
4 Verbrauchergefährdung durch den Antibiotika-Einsatz in der Landwirtschaft 39
In einigen Studien wurde belegt, dass resistente Keime aus den Fäkalien der Tiere über
Wirtschaftsdünger auch auf die Nutzpflanzen gelangen [168, 181, 182, 183]. Das UV-Licht
der Sonne, welches sehr stark bakterizid wirkt, führt zu einer Keimreduktion. Wenn diese
Nutzpflanzen direkt nach der Düngung, ohne sorgfältig gewaschen worden zu sein, verspeist
werden, werden Keime von Menschen aufgenommen. In den Jahren 2004–2005 wurden
beispielsweise pathogene Keime (Salmonellen- und Campylobacter) in Rucola
nachgewiesen. Genauso wurden in den USA 2006 gefährliche E.coli-O121:H19-Stämme in
Spinat gefunden, die zum Tode führten. Daraufhin wurde spinathaltige Babynahrung
untersucht, die ebenfalls mehrfach resistente Bakterien enthielt [168].
Gene, die für bestimmte Antibiotika-Resistenz verantwortlich sind, wurden jedoch in der
frühen Pflanzengentechnik gezielt zur Selektion eingesetzt [183]. Bezanson et al. wiesen in
gentechnisch veränderten Pflanzen (Spinat und Salat) zahlreiche resistente Keime nach, die
auch durch den Verzehr auf Menschen transferierbar sind [184]. Festzuhalten bleibt in
diesem Zusammenhang, dass die Freisetzung gentechnisch veränderter Pflanzen, die
bestimmte Antibiotikaresistenzgene als Marker tragen, gemäß EU-Freisetzungs-Richtlinie
(2001/18/EG) vom Oktober 2002 eingeschränkt wurde, da die Möglichkeit eines horizontalen
Gentransfers (Gentransfer außerhalb der geschlechtlichen Fortpflanzung) von
Pflanzenzellen auf Bakterien in der Umwelt und Darmbakterien nicht ausgeschlossen
werden konnte.
Ebenfalls führt eine Verabreichung subtherapeutischer Dosen über das Futter zu einem
hohen Selektionsdruck auf die Mikroorganismen [185]. Das bedeutet, dass die Gefahr der
Bildung neuer Resistenzgene bei der Aufnahme von Antibiotika in subinhibitorischer Dosis
über lange Zeit besteht, weil die resistenten Keime bevorzugt durch den Einsatz
subinhibitorischer Mengen von Antibiotika im Intestinaltrakt des Tieres gebildet werden, sich
dann im tierischen Gewebe verteilen und somit über die Aufnahme der tierischen
Lebensmittel auf den Menschen übertragbar sind. Jedoch besteht der langfristige Einfluss
subtinhibitorischer Antibiotikamengen in der Nahrung auf die Resistenzentstehung und
Resistenzausbreitung in der menschlichen Darmflora auf dieser Datenbasis noch
Forchungsbedarf.
In welchem Ausmaß sich die Antibiotikabelastung für den Verbraucher über den Pfad Boden-
Pflanze verstärkt, ist aufgrund der noch schmalen Datenbasis nicht sicher abschätzbar. Die
publizierten Ergebnisse verschiedener Wissenschaftler bestärken aber die Annahme, dass
allgemein mit einem Transfer antibiotisch aktiver und nicht aktiver Antibiotikarückstände in
Nutzpflanzen aus güllebeaufschlagten Böden zu rechnen ist (s. Seite 49, Kap.5.3).
Letztendlich entsteht dadurch die Möglichkeit eines Eintrags von Antibiotika in die
Nahrungskette und somit ein potentielles Verbraucherrisiko. Darüber hinaus besteht auch die
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 40
Möglichkeit der Aufnahme von resistenten Bakterien durch den Verzehr roher pflanzlicher
Lebensmittel wie Gemüse, Salat oder Obst.
5 AUFNAHME VON TIERARZNEISTOFFEN IN PFLANZEN
Antibiotika werden in der Pflanzenphysiologie bzw. für die Pflanze als pharmazeutisch
organische Xenobiotika bezeichnet [186, 187, 188]. Deshalb sollen hier zunächst die
fakultativen Aufnahme- und Transportwege für Xenobiotika beschrieben werden.
5.1 Eintrag von Xenobiotika in Pflanzen
Die Aufnahme von Xenobiotika kann prinzipiell auf folgenden Eintragspfaden erfolgen [189],
dem Luftpfad (über die bodennahe Luft in oberirdische Pflanzenteile)
dem Verschmutzungspfad (durch Anlagern von Bodenpartikeln an
Pflanzenoberflächen)
dem systemischen Pfad (über die Bodenlösung oder Bodenluft in die Wurzeln)
Abb. 10 zeigt eine schematische Darstellung dieser Eintragspfade der Schadstoffaufnahme
in Pflanzen.
Abb. 10: Schematische Darstellung der Eintragspfade von Xenobiotika in Pflanzen
(modifiziert nach [190])
Xenobiotika-Aufnahme über...
das Wurzelsystem die Blätter die Pflanzenoberfläche
(systemischer Pfad) (Luftpfad) (Verschmutzungspfad)
Weizen
Weißkohl
Porree
Hauptdurchwurzelungsbereich
tieferliegende Bodenschichten
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 41
Luftpfad
Durch Bodenluft und Atmosphärenluft werden die leichtflüchtigen Substanzen über die
Kutikula (Schutzschicht, auf der äußersten Oberfläche der Epidermis aufliegend) und/oder
Stomata (Spaltöffnung) der Blätter aufgenommen und im pflanzlichen Gewebe verteilt.
Verschmutzungspfad
Substanzen aus der Luft werden durch verschiedene Transportmedien auf Futter- und
Nahrungspflanzen eingetragen. Die Medien können sein: Staub oder trockene Depositionen
sowie nasse Depositionen wie Niederschlag und Nebel. Der Eintrag erfolgt über die
Pflanzenoberfläche oder durch die Ablagerung aus der bodennahen Schicht bei der Ernte,
wobei die Substanzen über die äußeren Gewebe der Pflanze aufgenommen werden können.
Konkret nachgewiesen werden konnte beispielsweise, dass Antibitiotika wie z.B.
Streptomycin bei der Verwendung als Pflanzenschutzmittel über die Luft in die
Pflanzenoberfläche gelangen kann. Das von Trapp und Matthies entwickelte Modell
verdeutlicht, dass nur die Vegetationsschichten zwischen 2 und 5 cm Höhe von der
Ausgasung betroffen sind (Tab. 10), die darüber liegenden Pflanzenteile werden nur von der
Hintergrund-Luftbelastung beeinflusst [191, 192]. Jedoch kann eine Pflanze auch bereits als
Jungpflanze kontaminiert werden [191].
Tab. 10: Schätzwerte von ausgasenden Stoffen z.B PCB (polychlorierten Biphenyle) [191]
Ernteprodukt
Bodennah
Kontaminationsgefahr durch Ausgasung
Blattsalat
2-5 cm
10 %
Spinat
2-5 cm
10 %
Grünkohl
>5 cm
0 %
Winterweizen (Korn)
>5 cm
0 %
Winterweizen (Stroh)
>5 cm
3 %
Die Tab. 10 zeigt, dass die Anteile des Ernteprodukts, die näher als 5 cm am Boden
wachsen, stark von den ausgasenden Stoffen betroffen sind. Deshalb ist eine
Kontaminationsgefahr durch die Ausgasung aus dem Boden bei Salat und Spinat hoch und
bei Weizenstroh entsprechend niedriger. Bei Grünkohl und Weizenkorn hat dieser Anteil
praktisch keinen Einfluss auf die Fremdstoffkonzentration im Ernteprodukt.
Andererseits ist das Eindringen in das äußere Gewebe der Pflanzen dann gegeben, wenn
die Substanzen einen Dampfdruck von mindestens 10-6 Pa haben und somit aus dem Boden
ausgasen und in das äußere Gewebe der Pflanzen eindringen [104]. Antibiotika sind nicht
flüchtige Stoffe, deshalb können sie keine Kontaminationen durch Gasphasentransport bzw.
Ausgasung verursachen. Jedoch sind Kontaminationen durch anhaftende Bodenpartikel kurz
vor der Ernte möglich. Es ist deshalb anzunehmen, dass eine Oberflächenkontamination von
Antibiotika durch Bodenpartikel -insbesondere für bodennah wachsende Pflanzen- nicht
auszuschließen ist [191].
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 42
Außerdem können Stoffe zusammen mit anderen Verschmutzungen, wie z.B. Partikeln aus
dem Boden oder aus der Luft auf die Blätter gelangen. Für die Aufnahme über die Blätter
müssen einige Voraussetzungen erfüllt sein, die von der Pflanzenspezies und vor allem von
der Behaarung der Pflanzenblätter abhängig sind. Auch die meteorologischen Einflüsse
spielen hier eine nicht zu vernachlässigende Rolle. Hierbei ist jedoch zu beachten, dass
Kontaminationen anders als die Partikel selbst in die Gasphase übergehen und verdampfen
können oder auch direkt in die Pflanzenkutikula übergehen und dort verbleiben können [193].
Systemischer Pfad
Durch die Transportmedien (Bodenwasser und Transpirationsstrom) werden Xenobiotika aus
dem Boden bzw. Bodenwasser über die Wurzeln aufgenommen und in der Pflanze verteilt
[194]. Das setzt jedoch voraus, dass eine systemische Stoffaufnahme nur gelingt, wenn die
Substanz durch Bodenwasser bzw. umgebendes Wasser in direktem Kontakt mit der Wurzel
steht, wie Antibiotika, die über den Wirtschaftsdünger in den Boden sowie in das
Bodenwasser gelangen.
Grundsätzlich wäre die Aufnahme über die Blätter zu beachten, da diese durch die
Begüllung mit den Wirkstoffen kontaminiert werden können. Antibiotika sind sehr wenig
flüchtig, weshalb eine Aufnahme der Stoffe über die Blätter vernachlässigt werden kann.
Daher ist für Antibiotika nur die Aufnahme über die Pflanzenwurzeln von Bedeutung.
5.1.1 Physiologie der pflanzlichen Wurzelzelle
Im Boden nehmen Wurzeln Wasser und Nährstoffe auf und verteilen sie über ihr
Transportsystem weiter (Blätter, Fruchtkörper). Sie bilden für die Pflanze ein enormes
Netzwerk, welches je nach Pflanzenspezies oder Standort unterschiedlich ausgeprägt sein
kann. Mit Hilfe zunächst gebildeter schleimiger Zellwände, die das Wachstum der Wurzeln
einleiten, kann die Pflanze tief in den Boden eindringen. Anschließend werden diese Zellen
beim Wachstumsprozess abgestreift. Im weiteren Verlauf des Prozesses befinden sich
innerhalb der sogenannten Wurzelhaube, die schleimige Zellwände besitzen, weitere Zellen,
die für das Fortschreiten des Wurzelwachstums verantwortlich sind. Im Innenbereich der
Wurzel befinden sich mehrere Zellarten z.B. die Zellen der Rhizodermis, Wurzelrinde und –
haarezellen, sowie der Endodermis mit eingelagertem Casparischem Streifen und die der
Leitelemente im Zentralzylinder. Als Rhizosphäre bezeichnet man den Teil des Bodens, der
die Pflanzenwurzeln etwa 3 mm umgibt. Dieser Bereich wird in drei Zonen eingeteilt [195,
196]:
Ectorhizosphäre, die einen beträchtlichen Abstand von der Wurzel einnimmt
Rhizoplane, die als Wurzeloberfläche bezeichnet wird
Endorhizosphäre, die sich innerhalb der Wurzelhaube befindet und auch von
Bakterien besiedelt wird
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 43
Abb. 12 zeigt eine Wurzeloberfläche, die so genannte Rhizoplane, in schematischer
Darstellung.
Abb. 12: Aufbau der Rhizosphäre in schematischer Darstellung [197]
Die Bedingungen in der Rhizosphäre beeinflussen die Wechselwirkungen. Gerade für die
Bioverfügbarkeit der im Boden enthaltenen Xenobiotika spielt die Rhizosphäre eine
entscheidende Rolle.
5.1.2 Stoffaufnahme über die Wurzel aus dem Boden
Die Aufnahme von Xenobiotika über die Wurzeln (systemische Pfad) erfolgt ähnlich der
Aufnahme von Nährstoffen aus dem umgebenden System (Boden und Wasser). Wirkstoffe
können entweder als Ionen frei in der Bodenlösung enthalten sein und somit durch die
Pflanze absorbiert werden oder an Bodenpartikeln sorbieren und durch Austauschabsorption
von den Wurzeln aufgenommen werden [191, 198].
Die Pflanzen haben durch die Wurzelhaare bzw. Feinwurzeln eine große Oberfläche für eine
Stoffaufnahme. Die Aufnahme von Xenobiotika in die Pflanze erfolgt auf unterschiedlichen
Wegen über die Pflanzenwurzel. Die Abb. 13 zeigt die prinzipiellen Stoffaufnahmewege über
die Wurzel.
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 44
Abb. 13: Stoffaufnahme über die Wurzel in schematischer Darstellung [199]
Die Xenobiotika werden, je nach ihren physiko-chemischen Eigenschaften, meist durch
einfache Diffusion aufgenommen. Die Zellwände der Wurzelhaare und die
Wurzelrindenzellen werden als Apoplast bezeichnet. In ihnen erfolgt eine passive Aufnahme
von Xenobiotika mit niedriger Hydrophobizität. Um eine passive Aufnahme über die
Pflanzenwurzel zu ermöglichen, müssen die Substanzen in einer mobilen oder
mobilisierbaren Form vorliegen. Durch die Konzentrationsdifferenz der Substanz zwischen
Bodenlösung und Apoplast bzw. der Lösung im Apoplast wird ein Einströmen von Stoffen
ermöglicht. So treten Substanzen durch das Symplast -dem so genannten Übergang- vom
Apoplast in den pflanzlichen Metabolismus ein. Der Stoff wird schließlich an den
Zentralzylinder bzw. das Xylem enthaltende Leitgewebe übergeben. Xylem besteht aus
Elementen mit stabilen, verholzten Zellwänden, die kein Protoplasma enthalten. Schließlich
sind die Assimilatbahnen (Phloem) zu nennen, die im Gegensatz zum Xylem aus lebenden,
spezialisierten Zellen bestehen. Wenn eine Substanz im Phloem wandert, befindet sie sich
im Symplasten. Das Phloem spielt eine Rolle im Transport bzw. bei der basipetalen (von der
Spitze in Richtung auf die Wurzel) Verteilung der über das Blatt aufgenommenen
Substanzen in den pflanzlichen Organismus, d.h., dass das Phloem einen Transport vom
Blatt in Richtung Sproß und Wurzel ermöglicht. Die Translokation der aufgenommenen
Stoffe von der Wurzel zum Spross macht zunächst einen Membrantransportschritt vom
Symplasten der Wurzel in den Apoplast des Xylems notwendig. Die impermeable
Suberinschicht in der Zellwand der Wurzelendodermis (Casparistreifen) hindert gelöste
Stoffe daran, direkt in das Xylem aufgenommen zu werden [199].
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 45
5.1.3 Pflanzenverfügbarkeit
Die Pflanzenverfügbarkeit, welche als Aufnahme und Transpiration von Pflanzen bezeichnet
wird, spielt für ein hydrologisches System eine bedeutende Rolle. Die Pflanzenverfügbarkeit
für ein Antibiotikum im Boden hängt von den bodenbedingten (pH-Wert, Belastungsausmaß,
Anteil an Humus und Tonmineralien), substanz- (Adsorption in Boden und Mikroorganismen
im Boden) und pflanzenbedingten Einflussfaktoren (Pflanzenart) sowie von den
Umweltbedingungen (Niederschlag, Temperatur) ab [191].
Durch Sorptions- oder Bindungvorgänge von Antibiotika an die Bodenmatrix wird ihre
Aufnahme durch Pflanzen stark beeinflusst. Unter bestimmten Umständen, beispielsweise
beim Abbau der Huminstoffe, können die adsorbierten Wirkstoffe jedoch wieder remobilisiert
und für Pflanzen verfügbar werden [128]. Daher ist die Adsorption ein weitgehend reversibler
Prozess und ein Teil der Wirkstoffe bleibt trotzdem verfügbar.
Eine theoretische Abschätzung einer möglichen Aufnahme von Tierarzneimitteln in die
Pflanze ist mit Hilfe physikalisch chemischer Parameter wie Lipophilie (Oktanol-Wasser-
Verteilungskoeffizient (log KOW)), Verdampfungstendenz (Luft-Wasser-Verteilungskoeffizient
(log KAW)), Säurekonstante (pKa) und pH-Wert möglich [191].
Die Mobilität der Wirkstoffe im Bodenwasser spielt eine wichtige Rolle für die
Pflanzenverfügbarkeit. Die Wirkstoffe werden besser von der Pflanze aufgenommen, wenn
sie beweglich sind. Für die Mobilität ist die Hydrophobie der Wirkstoffe von Bedeutung.
Hydrophile bzw. polare Stoffe sind kaum bioverfügbar, da sie die Zellmembranen der
Wurzelzellen nicht oder nur mit Hilfe von speziellen Transportproteinen passieren können
[200]. Aber auch stark lipophile Substanzen gelten als nicht pflanzenverfügbar, weil sie zu
stark an die organischen Partikel sorbieren. Ein maximales Aufnahmepotenzial in Pflanzen
sollte deshalb für Substanzen mit mittlerer Lipophilie bestehen [201]. Es handelt sich bei der
Aufnahme von Antibiotika über die Wurzeln also um Verteilungsprozesse zwischen den
Systemen Luft, Wasser und natürlichen organischen Phasen. Verteilungskoeffizienten wie
z.B. für das System Oktanol/Wasser (KOW-Werte) werden in der englischsprachigen Literatur
als P-Wert bezeichnet. Diese können das Verhalten näherungsweise beschrieben [202].
Der dekadische Logarithmus von KOW (log KOW) wird auch als log P bezeichnet. Das
bedeutet, „log P“- ist hierbei synonym zum „log KOW“-Wert.
Außerdem können log KOW- bzw. log P-Werte als pKOW-Wert wie unten formuliert werden:
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 46
Die log KOW-Werte beruhen dabei auf strukturellen und physiochemischen Parametern wie
z.B. der Polarität eines Stoffes. So lassen die berechneten oder gemessenen log KOW-Werte
eine Aussage über die Lipophilie und somit eine abschätzende Vorhersage über die
Pflanzenverfügbarkeit von Antibiotika zu. Briggs konnte für die Pflanzenaufnahme von
Herbiziden sogar eine Beziehung zwischen den KOW-Werten und der optimalen
Pflanzenaufnahme in Form einer Gaus’schen Normalverteilung feststellen. Des Weiteren
erkannte Briggs, dass sein Maximalwert nicht universell auf jedes System zu übertragen ist.
Gerade im System Boden-Wurzel werden lipophile Verbindungen stärker an die organischen
Bodenpartikel gebunden, sodass für dieses System der KOW-Wert für eine maximale
Aufnahmefähigkeit deutlich geringer sein wird, als der von Briggs ermittelte Wert [203].
Tab. 11 zeigt eine Zusammenstellung der berechneten log KOW/log P-Werte für verschiedene
Antibiotika. Die Berechnungen hierzu wurden mit der Software „ACD/LogP v.8.02“ [204]
durchgeführt.
Tab. 11: Berechnete log KOW-Werte (log P) für verschiedene Antibiotika
Wirkstoff
log KOW (log P)
Standardabweichung, abs
Tetracyclin
-1,47
0,81
epi-Tetracyclin
-1,47
0,81
Doxycyclin
0,54
0,80
epi-Doxycyclin
0,54
0,80
Oxytetracyclin
1,50
0,83
epi-Oxytetracyclin
1,50
0,83
Demeclocyclin
0,87
0,81
epi-Demeclocyclin
0,87
0,81
Chlortetracyclin
-0,33
0,82
e-keto-Chlortetracyclin
0,93
0,75
e-enol-Chlortetracyclin
-0,33
0,82
Iso-Chlortetracyclin
- 0,74
0,76
e-iso-Chlortetracyclin
-0,74
0,76
Sulfadiazin
-0,12
0,26
Enrofloxacin
2,54
0,77
Ciprofloxacin
1,31
0,78
Monensin
3,72
0,74
abs: Absolutbetrag
Aus der Tabelle lässt sich ablesen, dass fast alle kalkulierten log KOW-Werte im sehr
niedrigen Bereich von -2 bis +2 sind. Beispielweise lag der log KOW-Wert für Tetracyclin bei -
1,47, wobei in der Literatur 1,19 angegeben wird [26]. Aufgrund dieser Werte kann
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 47
grundsätzlich eine Aufnahme dieser Wirkstoffe von Pflanzen über die Wurzel erwartet
werden. Abweichungen lassen sich vor allem für ENR und MON feststellen. ENR hat mit
2,54 einen günstigen Wert für das Aufnahmepotenzial und sollte, verglichen mit den anderen
Wirkstoffen, deutlich besser aufgenommen werden können. MON hat mit 3,72 einen noch
höheren log KOW-Wert und könnte eventuell etwas zu lipophil sein.
5.2 Metabolismus in Pflanzen
Wie verhalten sich Xenobiotika, wenn sie von der Pflanze aufgenommen werden? In der
Literatur wird der Metabolismus der Xenobiotika in der Pflanze in drei Phasen unterteilt
[205].Die Phase-I beginnt mit einer Aktivierung der Xenobiotika. Es folgt die Konjugation in
Phase-II. Anschließend enden die Kompartimentierungs- oder Speicherprozesse bei Phase-
III. Zum Verständnis der Entgiftungsmechanismen wurde ein dreiphasiges Reaktionsschema
der Xenobiotika in pflanzlichen Zellen vereinfacht dargestellt (Abb. 14).
Abb. 14: Metabolismus von Xenobiotika in pflanzlichen Zellen [206]
In Phase-I (Transformasyon) werden funktionelle Gruppen wie -OH, –NH2, –SH oder –COOH
durch Reaktionen wie z.B. Hydrolyse, Oxidation, Reduktion oder Isomerisierung zu einer
Aktivierung geführt. Durch die Aktivierung enthalten die Xenobiotika eine höhere Polarität
und geringere Phytotoxizität. Daher spielen die Phase-I-Reaktionen eine wichtige Rolle bei
der Entgiftung von Xenobiotika. Anschließend erfolgen die Phase-II-Reaktionen, um den
Fremdstoff weiter zu metabolisieren. In der Phase-I im Cytosol gebildete Primärmetaboliten
mit zelleigenen niedermolekularen Verbindungen werden in Pflanzen entweder glycosyliert
oder an die reduzierte Form des Tripeptides Glutathion (γ-Glutamylcysteinylglycin, GSH)
gebunden [207]. Bei der Glutathion-Konjugation handelt es sich bei Pflanzen um einen weit
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 48
verbreiteten Entgiftungsmechanismus für Xenobiotika. Zu diesen Entgiftungs- bzw.
Abbaumechanismen, die durch GST (Glutathion-S-Transferasen) konjugiert werden, zählen
auch Antibiotikawirkstoffe. Batchfelder et al. konnten dieses mit Chlortetracyclin in Mais- und
Bohnenpflanzen belegen [208]. CTC enthält harte und weiche Nucleophile (Abb.14). Deshalb
ist die Möglichkeit der GSH Konjugation von CTC in Pflanzen groß [117]. In Abb. 15 sind
verschiedene enzymatische Reaktionen der GSH Konjugation von CTC dargestellt.
Abb. 15: Mögliche Positionen der Glutathion-Konjugation von CTC [117]
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 49
Die reaktiven Stellen im CTC-Molekül können in Phase II mit dem Glutathion umgesetzt und
die resultierenden Verbindungen dann in Phase III in die Vakuolen transportiert werden.
Diese Metabolite aus Phase I oder II können als nicht extrahierbare Rückstände
eingebunden werden, z.B. in Zellwände.
Zur Phase-III des pflanzlichen Metabolismus zählen Kompartimentierungs- und
Speicherprozesse. Die Kompartimentierung in die Vakuole dient zur Kurzzeit-, Langzeit- und
Endspeicherung von Stoffwechselprodukten, wobei komplexe Transport- und
Speicherprozesse ablaufen, die sowohl aktive als auch passive, diffusive Transporte und
reversible Fixierungen beinhalten.
5.3 Stand der Forschung zur Aufnahme von Antibiotika in Pflanzen
Publikationen zum Antibiotikarückständen in Pflanzen ist in Tab. 12 zusammengefaßt. Schon
im Jahr 1958 belegte Krasilnikov experimentell, dass Penicillin und Streptomycin von
Weizen, Mais und Feldsalat über die Wurzeln aufgenommen werden und das
Pflanzenwachstum beeinflussen [8]. Migliore et al. untersuchten den Effekt von
Sulfamethazin (SFM) auf verschiedene Pflanzen, wobei SFM in den Blättern der Maispflanze
und in den Wurzeln der Rispen-Hirse bioakkumulierte [209]. Migliore et al. beschäftigten sich
weiterhin mit den Effekten von SFM auf Pflanzen, die auf kontaminierten Böden wuchsen
[210]. Sie konnten einen verminderten Pflanzenwuchs und eine SFM-Aufnahme in Wurzeln
und den Blättern feststellen. Dabei war die aufgenommene SFM-Menge in den Wurzeln stets
höher als in den Blättern. Migliore et al. zeigten, dass ENR (Enrofloxacin) von verschiedenen
Gemüsepflanzen (s. Tab. 12) bei einer Konzentration von 5 mg/L im Substrat aufgenommen
wird [211]. Kumar et al. konnten die Aufnahme von CTC und TYS (Tylosin) in Weißkohl,
Frühlingszwiebeln und Getreide in Gewächshausversuchen nachweisen [212]. Auch Boxall
et al. bestätigten die Aufnahme von Trimethoprim und Sulfadiazin in Salatblättern [213].
Langhammer et al. wiesen Sulfadimidin in den Wurzeln von Mais nach [214].
Im Rahmen einer Studie von Grote et al. [9] wurden unter praxisnahen landwirtschaftlichen
Bedingungen antibiotikafrei aufgezogene Ferkel mit SFD (Sulfadiazin), TMP (Trimethoprim)
und CTC (Chlortetracyclin) kontrolliert medikamentiert, die erhaltene Antibiotika-belastete
Schweinegülle auf praxisnah bewirtschafteten Versuchsparzellen ausgebracht, anschließend
Nutzpflanzen (Winterweizen, Feldsalat) ausgesät und beerntet. Dabei wurde ein Transfer
von Antibiotika aus güllebeaufschlagtem Boden in den als Nahrungs- und Futtermittel
genutzten Teil des Getreides, das Korn, nachgewiesen. Des Weiteren haben Grote et al.
Aufnahmeexperimente für Feldsalat, Winterweizen und Möhren mit SFD und CTC dotierten
Nährlösungen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl CTC als auch SFD und
ihre Metabolite von allen Pflanzenarten aufgenommen und innerhalb der Pflanzen weiter
transportiert wurden. Außerdem lassen die Experimente in Hydrokultur einschließlich
Tracerstudien mit Tritium-markiertem SFM und TC erkennen, in welchem Maße Aufnahme,
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 50
Transport und Verteilung in Pflanzenorganen von der Konzentration dotierter Antibiotika und
der Wachstumszeit abhängen. Mikroautoradiographische Untersuchungen an
Wurzelquerschnitten von Weizenpflanzen zeigten dabei deutlich die Haupteinlagerungsorte
der Antibiotika, welche im Apoplast der Rhizodermis und der ersten Rindenlage lokalisiert
wurden. Auch im Mesophyll der Blätter zeigten sich apoplastische Einlagerungen [75, 215].
Weitere Studien belegen das hohe Aufnahme- und Transportpotenzial zahlreicher
Nutzpflanzen, die in der Lage sind, Veterinärpharmaka unterschiedlicher Wirkstoffgruppen
über die Wurzel aufzunehmen: z.B. wurden unter Gewächshausbedingungen MON in Mais
[216], SFM in Mais, Feldsalat und Kartoffeln [217] sowie OTC in Tomaten [218]
aufgenommen. Die bisher vorliegenden Ergebnisse der Untersuchungen zur Aufnahme von
Antibiotika in Pflanzen sind in der folgenden Tab. 12 zusammengefasst.
Tab. 12: Literaturübersicht der Untersuchungen zur Aufnahme von Antibiotika in Pflanzen
Wirkstoff
Pflanzenart
Medium
Effekt /Aufnahme
Referenz
CTC
Mais
Boden
kein Effekt
[208]
Weizen,
Rettich, Mais,
Gartenbohne
Hydrokultur/
Boden
Wuchs gesteigert,
nicht beeinflusst oder
vermindert
[208, 219]
Mais,Bohnen
Boden
kein Effekt
[219]
Mais,
Zwiebel, Kohl
Boden / 1µg
pro Topf
Aufnahme von 10 bis
14,4 ng/g
[212]
Möhre,Weize
n, Feldsalat
Hydrokultur/
5-20 µmol/L
Aufnahme von 0,9 mg/kg
bis 338 mg/kg
[75, 220]
OTC
Mais
Boden
kein Effekt
[208]
Weizen,
Rettich,Mais,
Gartenbohne
Hydrokultur/
Boden
Wuchs gesteigert,
nicht beeinflusst oder
vermindert
[208, 75]
Luzerne
Hydrokultur /
< 0,33 mM/L
phototoxische Effekt,
Wuchs vermindert /
Aufn. 0,35 µmol/g,
[221]
Tomato
Boden/
200 g/kg
Aufnahme von 420
bis 450 µg/kg
[218]
SFD
Möhre,Weize
n, Feldsalat
Hydrokultur/
5-20 µmol/L
Aufnahme von 0,01 mg/kg
bis 18 mg/kg
[186]
SFM
Mais, Hirse,
Erbse,Gerste
Agar/
300mg/L
Wuchs vermindert /
Aufnahme < 254 µg/g
[209, 210]
Mais, Salat,
Kartoffel
Boden
Aufnahme von 0,1 bis
1,2 mg/kg TM
[217]
SDM
Mais
Boden
-
[209, 210]
5 Aufnahme von Tierarzneistoffen in Pflanzen 51
Fortsetzung von Tab. 12
Wirkstoff
Pflanzenart
Medium
Effekt /Aufnahme
Referenz
ENR
Gurke,
Rettich
Gartensalat,
Gartenbohne
Agar /
50,100,
5000 µg/L
Wuchs gesteigert
oder vermindert
Aufnahme < 8,1µg/g
[211]
Salat
Boden
1mg/kg
Aufnahme von
2,8 µg/kg
[213]
Tylosin
Mais,
Zwiebel,Kohl
Boden /
1µgpro Topf
keine Aufnahme
[212]
MON
Mais
Boden
Wuchs gesteigert
[117]
Lasalocid
Mais
Boden
Wuchs gesteigert
[117]
Florfenicol
Salat, Möhre
Boden/
1mg/kg
Aufnahme von
15 bzw. 5 µg/kg
[213]
TMP
Salat, Möhre
Boden/
1mg/kg
Aufnahme von
6 bzw. 5,3 µg/kg
[213]
Levamisol
Salat
Boden/
1mg/kg
Aufnahme von
170 µg/kg
[213]
Diazinon
Möhre
Boden/
1mg/kg
Aufnahme von
13 µg/kg
[213]
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass Veterinärpharmaka in den
Aufnahmeexperimenten/Hydrokultur sowie Feldbedingungen von Nutzpflanzen z.T. in sehr
hohen Konzentrationen aufgenommen und in der Pflanze transportiert werden können.
6 Ergebnisse und Diskussion 52
6 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
6.1 Ausgangssituation
Die in der Fachliteratur publizierten Ergebnisse (s. Kap.5.3) von Aufnahmeversuchen unter
Gewächshausbedingungen zeigen, dass grundsätzlich mit Arzneiwirkstoffen, Metaboliten
und anderen Umwandlungsprodukten belastete Wirtschaftsdünger durch den Transfer dieser
Stoffe in Nutzpflanzen eine Eintragsquelle für antibiotisch wirksame Substanzen in
Futtermittel und in die Nahrungskette darstellen können, was unter der zunehmenden
Rückstands- und Resistenzproblematik als sehr kritisch zu bewerten ist.
In einem Forschungsprojekt [75] wurde ein Transfer von Antibiotika aus güllebeaufschlagtem
Boden in den als Nahrungs- und Futtermittel genutzten Teil des Getreides, das Korn,
nachgewiesen. Unklar ist jedoch, ob dieser Transfer auch in der Praxis der konventionellen
Landwirtschaft von Bedeutung ist, da in der Regel die Antibiotikagehalte in Güllen aus der
landwirtschaftlichen Praxis geringer sind als die Gehalte, die unter den Bedingungen des o.a.
Projektes erreicht wurden.
Anderseits stand Schweinegülle in vielen Studien im Vordergrund, die in Feldversuchen als
Wirtschaftsdünger eingesetzt wurde und die (exemplarisch) mit Sulfadiazin, Chlortetracyclin
und Metaboliten bzw. Umwandlungsprodukten belastet war. Neben den hauptsächlich in der
Schweinegülle vorkommenden Wirkstoffen der Tetracycline und Sulfonamide sollen nun
auch weitere Wirkstoffgruppen mit in die Analyse einbezogen werden, z.B. Fluorchinolone
und die hauptsächlich in der Geflügelmast (z.B. Hühner- und Putenmist, Hühnertrockenkot,
Flüssigdünger) eingesetzten Kokzidiostatika (Monensin), da auch aus diesem Bereich
Wirtschaftsdünger gewonnen wird. Ein wichtiger Anwendungsbereich dieser
Wirtschaftsdünger ist dabei sowohl der Getreide- als auch der Gemüseanbau insbesondere
von Weißkohl und Porree (s. Kap.2.2).
6.2 Verlauf der Projekte - Untersuchungsmethodik
Diese Arbeit beruht auf der Mitarbeit im folgenden Forschungsprojekte:
Zu Beginn des Projektes in Kooperation mit der FH Südwestfalen/FB Agrarwirtschaft
(Soest) und dem Max Rubner-Institut (Detmold) mit dem Titel „Screening zum
Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide in viehstarken Regionen Nordrhein-
Westfalens“ (MUNLV) wurden in der Erntezeit 2005 Felder mit Winterweizen sowie im Jahr
2006 Winterweizen, Gerste und Triticale in viehstarken Regionen beprobt und auf mögliche
Antibiotikarückstände analysiert.
Zusätzlich wurden Getreideproben aus der jährlichen "Besonderen Ernte- und
Qualitätsermittlung" (BEE) des Bundes und der Länder sowie aus Flächen verschiedener
Prüfstellen angezogen sind, die mindestens 10 Jahre nicht mit Gülle gedüngt wurden,
6 Ergebnisse und Diskussion 53
analysiert. Zudem wurde im Rahmen des Projektes „Monitoring“ eine Untersuchung von
Antibiotika in handelsüblichen Winterweizen aus Niedersachsen durchgeführt.
Im Projekt in Kooperation mit der FH Südwestfalen/FB Agrarwirtschaft (Soest) und
dem Max Rubner-Institut (Detmold) mit dem Titel „Untersuchungen zum Transfer
pharmakologisch wirksamer Substanzen aus der Nutztierhaltung in Gemüse - Porree und
Weißkohl“ (MUNLV) wurde eine Hydrokultur-Versuchsreihe durchgeführt. Anschließend
wurden Weißkohl und Porree in landwirtschaftlichen Hauptanbaugebieten beprobt und auf
Antibitiokarückstände analysiert.
6.3 Methodenentwicklung
6.3.1 Rückstandsanalytik
Zur Analyse möglicher Antibiotikarückstände in Pflanzen wurde die schon entwickelte,
ursprünglich auf den Nachweis von SFD, TMP und CTC-Komponenten aus Getreideproben
beschränkte Methode [102] erweitert. Die Getreide- und Gemüseproben wurden auf die
Gehalte an Antibiotika auf Basis der angegebenen Medikationen sowie auf weitere
veterinärmedizinisch relevante verordnungsstarke Wirkstoffe und, sofern bekannt, auf ihre
Umwandlungsprodukte bzw. pflanzliche Metabolite analysiert. Es handelte sich um die
folgenden Stoffe (Analyte) die in der Tab. 13 (s. Seite 56) zusammengestellt sind: SFD,
AMO, CIP, ENR, TC, DC, OTC, DMC, CTC. Neben den Wirkstoffen TC, DC, OTC, DMC und
CTC wurden auch die i.d.R. chromatographisch unterscheidbaren Epimere und die Keto-
Enol-Tautomere des Epimers vom CTC (epi-CTC) mit in die Analyse eingeschlossen.
Zusätzlich wurden in die entwickelten HPLC-MS-Methoden auch iso-CTC (ein
Umlagerungsprodukt des CTC) und sein Epimer e-iso-CTC aufgenommen. Das zwar
antibiotisch nicht aktive iso-CTC ist dennoch relevant, da es bereits in vorherigen
Medikationsstudien in Gülle nachgewiesen wurde [60]. Es konnte auch bei der extraktiven
Probenaufbereitung mit einem ammonikalischen Puffer aus CTC-haltigen Böden extrahiert
werden, wobei iso-CTC gebildet wird. Ebenfalls zeigten einige Untersuchungen, dass
Winterweizen und Feldsalat in der Lage sind, dieses aufzunehmen und auch innerzellulär zu
transportieren [102].
Schließlich wurden die Pflanzenproben auch auf extrahierbares DMC (DMC und e-DMC;
beide als Standards erhältlich) analysiert. Bis 1989 wurde dieses Antibiotikum in der
Humanmedizin eingesetzt, aber dann wegen seiner toxischen, teratogenen und
fotosensibilisierenden Wirkungen vom Markt genommen [222]. Auch in der Veterinärmedizin
ist DMC nicht mehr zugelassen. Neben der unwahrscheinlichen veterinärmedizinischen
Anwendung in der Tierproduktion sind aber prinzipiell andere Eintragspfade bzw. Quellen in
Boden und Pflanzen möglich, da sich DMC durch Abspaltung einer Methylgruppe vom CTC-
6 Ergebnisse und Diskussion 54
Molekül (C6-Demethylierung, s. Seite 88, Abb. 26) bilden kann. Demethylierungsreaktionen
sind im Boden und der Rhizospäre der Pflanze durchaus denkbar, worauf eigene
Untersuchungen und Literaturdaten hinweisen [205, 223, 224]. So wurden in Winterweizen-
Wurzeln und -Blättern aus Hydrokultur verschiedene Metabolisierungsprodukte des
Chlortetracyclins identifiziert. CTC kann auch am Stickstoff der Aminogruppe des A-Ringes
demethyliert werden. Es würde draus N-Monodesmethyl-CTC entstehen [223, 225]. Weitere
Demethylierungen könnten zu N-Monodesmethyl-Demeclocyclin oder N-Didesmethyl-CTC
führen. Diese können ebenso wie andere Tetracycline unter NH3- und H2O-Abspaltung
fragmentieren (s. Seite 58, Abb. 17). Diese Stoffe sind als Standards kommerziell nicht
erhältlich. Jedoch ist eine Identifizierung mit hochauflösender FTICR-MS möglich (s.
Kap.6.3.2.2).
6.3.2 Erweiterung und Anwendung des Analysensverfahrens
Ziel war es, ein chromatographisches Verfahren mit HPLC-MS/MS für die quantitative
Bestimmung von Antibiotikawirkstoffen in Getreide und Gemüse (Weißkohl und Porree) zu
optimieren.
Zur Identifizierung und Quantifizierung ausgewählter Antibiotikawirkstoffe und ihrer
Metaboliten bzw. Umwandlungsprodukte in Getreide- und Gemüseproben wurden LC-
MS/MS-Bestimmungsmethoden erweitert und angewendet. Diese LC-MS/MS-Analyse der
SPE-Eluate erfolgte niedrigauflösend mit einem Ion-Trap-System. Bestätigungsanalysen
wurden an ausgewählten Messproben mit dem hochauflösenden FTICR-MS-System (Fourier
Transform Ionen Cyclotron Resonanz Massenanalysator) durchgeführt.
6.3.2.1 LCQ, Niedrigauflösendes MS-System (Low Resolution-MS, LR-MS)
HPLC-System
Tetracycline sind entweder isokratisch oder mit einer Gradientenmethode chromatographisch
zu trennen. Jedoch kann die isokratische Methode wegen der ähnlichen
chromatographischen Eigenschaften der Analyten für die in dieser Arbeit durchgeführte
Analyse ausgeschlossen werden. Deshalb wurde für die Bestimmung der Antibiotika und
ihrer Metabolite eine Acetonitril/bidest.Wasser/MeOH-Gradientenmethode entwickelt, mit der
eine chromatographische Trennung aller Verbindungen, insbesondere der schwer
trennbaren Verbindungen e-CTC und iso-CTC, möglich ist. Als stationäre Phase werden
hierbei modifizierte Umkehrphasen (RP) benutzt (YMC-Pack ODS-AM, 150 x 3,0 mm ID., S
5μm). Bereits von Oka et al. wurde beschrieben, dass die YMC-ODS-AM-Säule für die
Bestimmung von Tetracyclinen besonders gut geeignet ist [226]. Diese Säule zeichnet sich
sowohl durch ein besonders gutes End-capping als auch einen sehr geringen Metallionen-
Gehalt aus. Die stätionäre Phase besteht aus polaren Trägerteilchen (Kieselgel), welche mit
unpolaren Alkylgruppen modifiziert wurden. Die ursprünglich polare Oberfläche erhält
6 Ergebnisse und Diskussion 55
dadurch einen lipophilen Charakter. Deshalb werden polare Substanzen, wie z.B.
Tetracycline, schwächer retardiert als unpolarere Moleküle, wie z.B. Monensin. Auch ist die
Elutionsstärke der unpolaren Lösemittel wesentlich größer als die der polaren Lösemittel.
Aus diesem Grunde wurde die Chromatographie mit hohem Anteil an wässriger Phase
gestartet und während der Analyse der Anteil an lipophilerer Phase gesteigert.
MS-Detektion
Es wurde ein HPLC-Komplettsystem (Thermo Finnigan/Thermo Electron) mit dem
massenselektiven Detektor LCQ-Advantage ESI-Ion-Trap verwendet. Die Identifizierung der
Analyten erfolgt über die Massenspuren der Quasimolekül-Ionen und Fragmentionen
(MS/MS-Stoßexperimente (He), MS1, MS2), ihre relativen Intensitäten und Retentionszeiten
(Ionisierungsmethode: Electrospray Ionization (ESI), Positiv-Modus). In Tab. 13 sind die im
SRM-Modus (Selected Reaction Monitoring) gemessenen Übergänge (Vorläufer- und
Produkt-Ionen) aufgeführt. Die allgemeinen Parameter sind im Anh. 1.3.1 aufgelistet.
Zur Quantifizierung wurde die Summe der MS²-Signalintensitäten korrespondierender
Produkt-Ionen verwendet. Die Datenauswertung erfolgt mit der Xcalibur-Software 2.0 SR2.
Die zur Identifizierung und Quantifizierung herangezogenen Retentionszeiten und Fragment-
Intensitäten sind für alle Substanzen in Tab. 13 zusammengefaßt.
6 Ergebnisse und Diskussion 56
Tab. 13: LCQ-Daten: gemessene massenspektrometrische Daten und Retentionszeiten (tR),
ß=1 mg/L, chromatographische Bedingungen s. Anh.1.3.1
Analyt
MS1
[m/z]
Stoßenergie
[%]
MS2
tR
[min]
m/z
Relative
Intensität [%]
SFD
251,1
35
156,0
173,9
84-100
80-100
5,8
ENR
360,2
42
245,2
316,2
342,2
<5
100
10-20
7,7
CIP
332,1
44
288,1,
314,1
100
<5
8,7
MON
693,4
45
675,4
479,2
100
<5
22,6
TC
445,0
34
410,1
427,0
40-50
100
7,9
e-TC
445,0
34
427,1
410,1
100
25
6,6
DC
445,0
34
428,1
100
13,3
e-DC
445,0
34
428,1
100
12,6
OTC
461,1
44
443,0
426,0
444,0
100
30
15
6,7
e-OTC
461,1
44
444,1
426,0
100
55
6,3
DMC
465,0
40
448,0
430,0
100
10-20
9,6
e-DMC
465,0
40
448,0
430,0
100
10
8,3
CTC
479,1
40
461,9
444,0
100
68-84
12,5
e-keto-
CTC
479,1
40
461,9
444,0
100
<5
8,6
e-enol-
CTC
479,1
40
461,9
444,0
84-100
80-100
10,6
iso-CTC
479,1
40
461,9
100
9,8
e-iso-CTC
479,1
40
461,0
100
8,2
6 Ergebnisse und Diskussion 57
Fragmentierungsreaktionen
Als Fragmentierung für SFD ist eine Aufspaltung in die Fragmente mit den m/z-Verhältnissen
156,0 und 173,9 zu beobachten. In Abb. 16 sind für das Quasimolekülion [M+H]+ von SFD
die Produkt-Ionen angegeben.
Abb. 16: Fragmentierung von Sulfadiazin im positiven ESI-Modus [227]
6 Ergebnisse und Diskussion 58
Bei der Fragmentierung der Tetracycline werden unspezifische Moleküle wie Wasser und
Ammoniak abgespaltet. In Abb. 17 sind die Produkt-Ionen von Tetracyclin beispielhaft
dargestellt.
Abb. 17: Abgangsgruppen bei der Fragmentierung von Tetracyclin im positiven ESI-Modus
[227]
Die Fragmentierungsreaktionen der jeweiligen Epimere lassen erkennen, dass beide
Substanzen zwar dieselben Produkt-Ionen bilden, sich aber in ihrem Intensitätsverhältnis
unterscheiden, was zur Identifizierung der Epimere der Tetracycline genutzt wird.
In Abb. 18 ist das Fragmentierungsmuster der Fluorchinolone am Beispiel des Enrofloxacin
dargestellt. Die Fluorchinolone bilden auch ein typisches Fragmentierungsmuster im ESI-
Positiv-Modus, welches durch Abspaltung von Kohlendioxid oder Wasser charakterisiert ist.
Nach Verlust der Carboxylfunktion kann ein Molekül HF abgespalten werden oder der
Piperazin-Heterocyclus durch Abstraktion von C2H5N zum Aziridin erfolgen [228].
6 Ergebnisse und Diskussion 59
Abb. 18: Fragmentierung von Enrofloxacin im positiven ESI-Modus [228]
In Abb. 19 sind Massenchromatogramme einer Mischstandardlösung von ausgewählten
Antibiotikawirkstoffen dargestellt.
6 Ergebnisse und Diskussion 60
E:\DIDEM\Messung061109\1-2 20.11.2009 14:05:59
RT: 0,00 - 35,03
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 5,74
1,27 4,17
2,87
7,39
7,99 9,08 11,63 16,237,02 15,14
8,58
16,09
9,06
7,01 9,79 12,58
3,21
3,63
2,88 4,28 22,53
21,34 22,87
20,83 24,6417,26
NL: 1,25E5
TIC F: + c ESI SRM
ms2 251,10@cid35,00
[155,00-157,00;
172,90-174,90] MS 1-2
NL: 1,64E6
TIC F: + c ESI SRM
ms2 332,10@cid44,00
[287,10-289,10;
313,10-315,10] MS 1-2
NL: 3,54E6
TIC F: + c ESI SRM
ms2 360,20@cid42,00
[244,20-246,20;
315,20-317,20;
341,20-343,20] MS 1-2
NL: 2,93E6
TIC F: + c ESI SRM
ms2 365,80@cid45,00
[206,90-208,90;
347,80-349,80] MS
amo-1-2
NL: 1,11E7
TIC F: + c ESI SRM
ms2 693,40@cid45,00
[460,20-462,20;
478,20-480,20;
674,40-676,40] MS 1-2
Abb. 19: Massenchromatogramme einer Mischstandardlösung (ß=1 mg/L): LC-MS/MS (LR-
MS), SRM-Modus
6.3.2.2 FTICR-MS, Hochauflösendes MS-System (High Resolution-MS, HR-MS)
Die FTICR-MS ist die effizienteste MS-Technik in Bezug auf Auflösungsvermögen
(>1,000.000) und Massengenauigkeit. Die relative Massenabweichung zum theoretisch
berechneten Wert kann weniger als 1 ppm betragen. Demnach erfolgt die Messung eines
Ions mit 1000 Masseneinheiten bis auf die 3. Nachkommastelle genau. Im Gegensatz dazu
E:\DIDEM\Messung061109\1-2 20.11.2009 14:05:59
RT: 0,00 - 35,01
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 12,89
8,16
6,83
13,49
12,16
11,07 14,10
6,46 21,20
15,55 17,63
3,37 25,8621,97
6,92
6,68
6,17 8,01 9,59 10,80 12,25
4,20 14,43
2,58 16,13
8,56 9,89
10,99 13,53 24,29
20,487,59 17,75 22,51 24,9715,836,01 9,51
12,18
8,30 10,24
7,94
12,78 14,96 19,6917,56
1,89 20,973,61 7,334,36 23,68 24,69
NL: 3,96E6
TIC F: + c ESI SRM
ms2
445,00@cid34,00
[409,00-411,00;
425,50-428,50] MS
1-2
NL: 2,02E6
TIC F: + c ESI SRM
ms2
461,10@cid44,00
[425,00-427,00;
441,50-444,50] MS
1-2
NL: 2,77E6
TIC F: + c ESI SRM
ms2
465,00@cid40,00
[429,00-431,00;
447,00-449,00] MS
1-2
NL: 4,52E6
TIC F: + c ESI SRM
ms2
479,10@cid40,00
[443,00-445,00;
460,90-462,90] MS
1-2
e-TC
TC
e-DC
DC
SFD
e-OTC
CIP
OTC
ENR
e-DMC
DMC
AMO
MON
iso-CTC
e-keto-CTC
e-iso-CTC
e-enol-CTC
CTC
6 Ergebnisse und Diskussion 61
sind bei niedrigauflösenden MS Auflösungen LCQ, Ionenfalle von 2000 und eine
Massengenauigkeit von 0,2 Masseneinheiten üblich. Dagegen ermöglicht die hohe
Auflösung der FTICR-MS-Technik sehr geringe Unterschiede in der Masse bzw. m/z-Werten
zu detektieren.
HPLC-System
Im Rahmen der Analysen mittels FTICR-MS wurde ein HPLC-System von Thermo Electron
(San Jose, CA, USA) verwendet und der Gradient gehalten. Als Säulenmaterialen wurden
wiederum modifizierte Umkehrphasen (RP) benutzt (YMC-Pack ODS-AM, 150 x 1,0 mm ID.,
S 5 μm). Als mobile Phase wurden Acetonitril und Methanol verwendet (s. Anh.1.3.2)
MS-Detektion
Die Überprüfung der Tetracyclin-Befunde in den Pflanzenproben (s. Kap.7.1.2) wurde mit
einem Hybrid-Massenspektrometer durchgeführt, welches aus einer linearen Quadrupol-
Ionenfalle und einem FTICR-MS besteht (LTQ FT der Fa. Thermo Fisher Scientific, Bremen).
Während der HPLC-Trennung wurden zeitlich parallel verschiedene MS-Experimente in
beiden Massenanalysatoren durchgeführt. Übersichtsmassenspektren im Bereich m/z = 400-
500 wurden im FTICR-MS mit einer Auflösung von R = 25 000 aufgenommen. Die zwei
intensivsten Ionen wurden dann nacheinander für exakte Massenbestimmungen mit einem
FTICR-SIM-Scan gemessen. Zeitgleich erfolgte die stoßinduzierte Fragmentierung (MS2,
MS3, MS4) in der linearen Ionenfalle. Die Absicherung der Tetracyclin-Befunde basiert
demzufolge nicht nur auf dem Retentionszeitvergleich mit Standardsubstanzen (sofern
verfügbar), sondern stützt sich sowohl auf die exakte Masse des Vorläuferions (relative
Massenabweichung zum theoretischen Wert nur wenige ppm) als auch auf die
Übereinstimmung der MSn-Fragmentspektren (Tab. 14)
Die allgemeinen Parameter sind im Anh. 1.3.2 aufgelistet.
6 Ergebnisse und Diskussion 62
Tab. 14: Berechnete exakte m/z-Werte der Analyten mit hochauflösender MS
(* niedrigauflösend, hochauflösend)
Analyt
Summenformel
MS1
[M+H]+
*MS2
[M-NH3+H]+
*MS3
[M-NH3-H2O+H]+
TC
C22H23N2O8
445,16054
428,1
410,1
e-TC
C22H23N2O8
445,16054
428,1
410,1
DC
C22H23N2O8
445,16054
428,1
410,1
e-DC
C22H23N2O8
445,16054
428,1
410,1
OTC
C22H23N2O9
461,15546
444,1
426,1
e-OTC
C22H23N2O9
461,15546
444,1
426,1
DMC
C22H23ClN2O8
465,10592
448,1
430,1
e-DMC
C22H23ClN2O8
465,10592
448,1
430,1
CTC
C22H23ClN2O8
479,12157
462,1
444,1
e-keto-CTC
C22H23ClN2O8
479,12157
462,1
444,1
e-enol-CTC
C22H23ClN2O8
479,12157
462,1
444,1
iso-CTC
C22H23ClN2O8
479,12157
462,1
444,1
e-iso-CTC
C22H23ClN2O8
479,12157
462,1
444,1
CIP
C17H18FN3O3
332,14050
288,1
270,1
6.3.3 Optimierung der Probenvorbereitung
Ziel der Probenvorbereitung war es, die Analyten aus den pflanzlichen Matrices möglichst
quantitativ zu extrahieren. Da hierbei Matrixbestandteile mitextrahiert werden, welche sich
auf die MS/MS-Detektion auswirken können, ist zur Reduzierung von Matrixeffekten eine
Aufreinigung der erhaltenen Extrakte notwendig. Nach der Extraktion der Analyten aus der
homogenisierten Probe mit EDTA/Citratpuffer pH 4,1 erfolgte die Aufreinigung und
Aufkonzentrierung des Extraktes mit Festphasenextraktion (SPE, Solid-Phase-Extraction).
Das hierbei erhaltene Eluat wurde zur weiteren Aufkonzentrierung in einem
Metallblockthermostat unter Luft-Strom eingeengt. Zur Aufnahme des Rückstandes nach
Einengen des Eluates erwies sich Fließmittel A als geeignet. In Abb. 20 ist der allgemeine
Analysenablauf schematisch dargestellt.
6 Ergebnisse und Diskussion 63
Abb. 20: Allgemeiner Analysenablauf zur Bestimmung von Antibiotikawirkstoffen in
Pflanzenproben
Für die Wiederfindungsstudien sowie auch für die Erkennung von Verschleppungen bei den
Getreideproben wurden unbelasteter Bundessortenamt-Weizen (BSA) und Futterweizen,
welche nach Analyse als “unbelastet“ eingestuft wurden, aufgearbeitet. Bei den
Gemüseproben wurden die Hydrokultur-Kontrollproben angewendet Die als optimal
beurteilten Bedingungen wurden schließlich auf die Analyse der Pflanzenproben übertragen.
6.3.3.1 Homogenisierung
Es wurden verschiedene Zerkleinerungstechniken zur Gewinnung eines
Pflanzenhomogenats getestet. Durch den Zerkleinerungsprozess werden Zellorganellen
(Gewebe) bei der Behandlung mit Ultraschall zerstört. Somit werden die nicht an Zellwände
gebundenen, freien Antibiotikarückstände extrahierbar [186].
Getreide
Die Kornproben wurden mit Hilfe einer automatischen Mörsermühle gemahlen. Es wurden
die Mahldauer sowie Einstellungen der Mörsermühle (Hauptzustellungsrichtung in
Achsrichtung des Pistills) optimiert. Die Korngrößen-Fraktionierung des Mahlgutes erfolgte in
Extraktion mit EDTA-Citrat-Puffer pH 4,1
Extraktion der Analyten aus der Pflanzenmatrix
Homogenisierung der Pflanzenprobe
Mahlen, Sieben, Zerkleinern
SPE
Aufreinigung und Aufkonzentrierung mit Festphasenextraktion (SPE)
Herstellung der Messprobe
Einengen des Eluates bis fast zur Trockene
LC-MSn und FTICR-MSn
Identifizierung und Quantifizierung
6 Ergebnisse und Diskussion 64
einer analytischen Siebmaschine. Die Fraktion mit einer Korngröße von d <0,106 mm wurde
zur Analyse verwendet.
Gemüse
Zur Aufbereitung von Gemüseproben wurden Küchenmixer, Küchenmesser, Mörsermühle
und Schwingmühle erprobt. Als geeignet erwiesen sich die Schwing- und Mörsermühle.
Zerkleinerte, tiefgekühlte (-80 oC) Pflanzen aus den Hydrokultur-Versuchen wurden mit einer
Schwingmühle homogenisiert. Tiefgekühlte ganze Pflanzen aus den Freilandversuchen
wurden aber nach manueller Zerkleinerung mit einer für größere Mengen geeigneter
Mörsermühle homogenisiert.
6.3.3.2 Fest-Flüssig-Extraktion
In der Literatur sind einige Extraktionsverfahren für Pflanzenproben beschrieben. Neben der
Hochdruck-Extraktion (Accelerated Solvent Extraction, ASE) [229] kommen Mikrowellen-
unterstützte (Microwave-Assisted Solvent Extraction, MAE) [230, 231, 232] und Ultraschall-
unterstützte (Ultrasound-Assisted Extraction, UAE) [102, 233, 234] Extraktionen zum
Einsatz.
Beim ASE-Verfahren senkt die erhöhte Temperatur des Extraktionsmittels (50 - 200 oC)
dessen Oberflächenspannung und Viskosität. Damit wird das Eindringen der Flüssigkeit in
die feste Probe erleichtert, wodurch gleichzeitig auch der Stoffaustausch erleichtert wird.
Jacobsen et al. beschrieben, dass verschiedene Antibiotika mit der ASE-Methode aus Boden
und Getreide extrahiert werden können [229]. Dafür haben Jacobsen et al. als
Extraktionsmittel ein Gemisch von Citronensäure und Methanol (1:1 v/v) verwendet. Die
Wiederfindungen für OTC und CTC betrugen bei Bodenproben 50-80 % und bei Kornproben
34-60 %.
Andererseits liegt der Hauptvorteil der MAE im Einsatz geschlossener Druckgefäße, die
Extraktionstemperaturen weit über dem Siedepunkt der eingesetzten Lösemittel erlauben
wodurch die Extraktionsgeschwindigkeit stark erhöht wird. In diesen druckstabilen Gefäßen
wird die Extraktion bei Drücken zwischen 0,5 und 20 MPa durchgeführt [235]. Wollersen
ermittelte eine Wiederfindung von ca. 95 % für Flavonoide in Getreide mittels der
Mikrowellen-unterstützten Extraktion [232].
Bei der UAE liegen die Frequenzen der eingesetzten Ultraschallwellen oberhalb von 20 kHz.
Die Ultraschallübertragung, welche wellenförmige Expansionen und Kompressionen der
Stoffe verursacht, führt zu lokalen Erwärmungen und Blasenbildungen. Grote et al.
extrahierten mit UAE Tetracycline aus Boden- und Pflanzenproben. Es wurden
Wiederfindungen bei Pflanzen für iso-CTC von 31-39 % und für CTC von 56-67 % ermittelt
[222].
6 Ergebnisse und Diskussion 65
Bei dem ASE-Versuch wurde als Probe Vollkornmehl Typ 1050 verwendet, da die BSA-
Weizenprobe für den Filter im Druckbehälter zu fein gemahlen war. An die Extraktion mit
Hilfe von Ultraschall, Hochdruck und Mikrowelle schloss sich jeweils eine
Festphasenextraktion mit einer Oasis HLB-Kartusche zur Aufreinigung und Anreicherung an.
Anschließend wurden die aufgearbeiteten Extrakte mittels LC-MS/MS analysiert. In Tab. 15
sind die Wiederfindungen mit den verschiedenen Extraktionsmethoden aufgeführt.
Tab. 15: Wiederfindungen mit verschiedene Extraktionsmethoden mit EDTA/Citratpuffer
(Dotierung 5 mg/kg FG, BSA-Winterweizen, Futterweizen und Vollkornmehl, n = 3)
[236]
Extraktionsmethode
Probe
Wiederfindung [%]
TC
e-TC
CTC
e-CTC
DMC
e-DMC
ASE
Vollkornmehl-Type 1050
240,0
201,0
154,0
MAE
Mehl-Futterweizen
52,0
47,0
41,0
UAE
Mehl-BSA-Winterweizen
85,1
88,5
82,4
Das Vollkornmehl – Typ 1050 beinhaltet im Vergleich zum BSA-Weizenmehl einen höheren
Anteil an Schalenbestandteilen, weshalb sich beide Mehle in ihrer Zusammensetzung
(Kohlenhydrate, Proteine, Mineralien, Vitamine) unterscheiden
Mitextrahierte Matrixkomponenten können Koelutionen von Peptiden (s. Kap.7.2.1)
verursachen. Diese Matrixbestandteile können die Analytsignale überlagern und zu einer
Verringerung der Wiederfindung führen oder diese scheinbar erhöhen, wie es bei den ASE-
Probenextrakten der Fall ist (154-240 %). Bei der Extraktion mit Hilfe einer Mikrowelle
wurden Wiederfindungen von 41-52 % ermittelt, bei der ultraschallunterstützten Extraktion für
Tetracycline zwischen 82,4 und 88,5 %.
Extraktionsmittel
Aufgrund der physiko-chemischen Eigenschaften der Analyte werden meist schwach saure
Puffer in Kombination mit einem organischen Lösungsmittel eingesetzt. Eine Komplexbildung
soll dabei durch Zugabe von Agenzien wie EDTA, Citrat oder Oxalsäure unterbunden
werden [237].
Bei den in der Literatur beschriebenen Verfahren werden zur Extraktion von Antibiotika
insbesondere Tetracyclinen aus verschiedenen Matrices wie z.B. für Gülle-, Muskulatur- und
Urinproben sowie auch für Bodenproben Gemische aus Citronensäure
/Aceton/Ameisensäure [238, 239], Methanol/McIlvaine-Puffer [240] oder auch
Methanol/EDTA/McIlvaine-Puffer [241, 242] verwendet. Grote et al. extrahierten Tetracycline
aus Pflanzen mit EDTA/Citratpuffer pH 4,1 [9].
6 Ergebnisse und Diskussion 66
Ein Zusatz von MeOH könnte einen vorteilhaften Einfluß auf die Pflanzen-Extraktion
ausüben. Deshalb wurden Antibiotika-dotierte EDTA/Citratpuffer mit einem MeOH-Zusatz
von 5, 10,15 und 20 % v/v eingesetzt, mit SPE aufgearbeitet und analysiert. In der Tab. 16
sind die Wiederfindungsergebnisse aufgeführt.
Tab. 16: Wiederfindung in Abhängigkeit vom MeOH-Zusatz des EDTA-Citrat-Puffers (Oasis
HLB-60 mg-Kartusche), Dotierung: 250 µg/kg FG, BSA-Winterweizen und Porree-
Blatt-Kontrollproben/Hydrokultur, n = 3
Anteil an MeOH im
Extraktionsmittel
(v/v) [%]
Wiederfindung[%]
Winterweizen
Porree
SFD
TC+e-TC
CTC+e-CTC
SFD
TC+e-TC
CTC+e-CTC
0
53,4
90,7
82,5
50,8
61,8
85,9
5
51,5
93,4
89,5
50,1
60,4
82,9
10
44,8
84,3
70,5
52,7
66,4
76,8
15
45,7
62,1
74,6
49,6
68,9
76,4
20
33,1
60,3
69,8
43,5
57,5
62,6
Die Ergebnisse zeigen, dass die höchsten Wiederfindungen für TC und CTC in Winterweizen
mit einem MeOH-Zusatz von 5 % (v/v) erreicht werden (93,4 und 89,5 %). Ohne MeOH-
Zusatz zeigte sich jedoch eine bereits leicht verringerte Wiederfindung (90,7 und 82,5 %).
Man kann ebenfalls sehen, dass ein zu hoher MeOH-Zusatz (>5 % v/v) niedrigere
Wiederfindungen im Winterweizen zur Folge hat, wobei es wahrscheinlich ist, dass die
Analyten durch den zu hohen MeOH-Zusatz von der SPE-Phase unvollständig sorbiert
werden – zumal MeOH als Elutionsmittel verwendet wird.
6.3.3.3 Festphasenextraktion (SPE)
Nach der Fest-Flüssig-Extraktion erfolgte eine Anreicherung der Analyte und eine
Aufreinigung (Clean-Up) der extrahierten Lösungen mittels Festphasenextraktion (SPE). Von
den zahlreichen Probenvorbereitungstechniken ist die Festphasenextraktion die am
häufigsten eingesetzte Methode [243], wobei häufig relativ unspezifische Polymerphasen,
wie z.B. die Oasis-HLB (Hydrophilic-Lipophilic-Balanced) verwendet werden [244, 245]. Das
Festphasenmaterial besteht aus zwei Monomeren: dem polaren N-Vinylpyrrolidon und dem
unpolaren Di-Vinylbenzen, so dass das Verhältnis zwischen hydrophilen und lipophilen
Anteilen ausgewogen ist. Dieses SPE-Material wurde zur Aufarbeitung der Getreide- und
Gemüse-Extrakte verwendet.
Anwendung des halbautomatisierten SPE-Systems: OPi-SPE
Für die Festphasenextraktion wurde sowohl eine klassische manuelle SPE-Einheit als auch
der Prototyp einer OPi-SPE-Einheit (Over Pressure inline Solid Phase Extraction) (Abb.A2)
6 Ergebnisse und Diskussion 67
eingesetzt, die von der Fa. RSC (Richard Sauerbrey Chromatographie, Reinhardshagen)
entwickelt und im Arbeitskreis von Prof. Grote (Universität Paderborn) optimiert wurde. Die
OPi-Einheit ermöglicht die automatisierte simultane Aufgabe von Extrakten über SPE-
Kartuschen. Dabei wird - im Unterschied zum manuellen System - ein kontinuierlicher
Durchfluss durch ein Pumpen-Hydraulik-System gewährleistet, was zu einer besseren
Reproduzierbarkeit der Wiederfindungen führen sollte. Bei den klassischen manuellen
Systemen hängt der Durchfluss stark von den individuellen Durchfluss-Widerständen der
SPE-Kartuschen ab. Deshalb sind manuelle Ventilregulierungen nötig, um ein Austrocknen
einzelner Festphasen zu verhindern. Der unterschiedliche Widerstand der einzelnen SPE-
Kartuschen wird ausgeglichen, in dem ein gleichbleibender Durchfluss für alle simultan
betriebenen SPE-Kartuschen eingestellt wird. Unterschiedliche Durchflussgeschwindigkeiten
können über die Pumpensteuerung eingestellt werden. Ein weiterer Vorteil ist die klar
definierte Durchflusszeit, die bei den klassischen Systemen starken Schwankungen
unterliegen kann.
Vergleichsanalysen mit dem OPi-SPE- und SPE-Block-System
Es wurden drei dotierte Citratpuffer-Proben in gleicher Weise mit der manuellen SPE-Einheit
und dem OPi-SPE-System parallel aufgearbeitet (Anh. 1.5.3) und die Eluate mit der im Anh.
1.3.1 beschriebenen LC-MS/MS-Methode analysiert.
Tab. 17: Vergleichsanalysen mit manuellem SPE- und OPi-SPE-System (dotierte
Citratpuffer, Dotierung: 50 µg/kg, LC/MS-Methode, Doppelbestimmung n=3)
Analyt
Manuell SPE
OPi-SPE
Wiederfindung
[%]
Standardabweichung
[%]
Wiederfindung
[%]
Standardabweichung
[%]
SFD
55,1
3,5
49,1
2,9
51,2
48,5
58,2
53,9
ENR
73,4
3,6
69,9
2,3
70,1
66,7
77,3
71,2
TC+
e-TC
100,7
1,9
96,9
1,7
98,5
99,3
102,3
95,9
MON
49,5
4,6
50,5
2,0
56,9
47,9
48,5
51,9
Die Ergebnisse in Tab. 17 zeigen, dass die Wiederfindungen bei allen Wirkstoffen mit beiden
Systemen sehr ähnlich ausgefallen sind. Aus dieser Aufstellung kann des Weiteren die
Standardabweichung um die Mittelwerte der Ergebnisse der drei Messungen einer Probe
abgelesen werden. Es zeigt sich hier, dass die Standardabweichung für MON bei manueller
SPE wesentlich höher ist (4,6 %), als bei OPi-SPE (2,0 %).
6 Ergebnisse und Diskussion 68
Es ist festzustellen, dass in der Tat mit dem OPI-SPE-Sytem wesentlich bessere
Wiederholbarkeiten erreicht wurden als mit der manuellen SPE-Einheit. Daher ist das OPi-
SPE-System routinemäßig für die weitere Aufarbeitung von Pflanzenproben eingesetzt
worden.
Auswahl der Filtermaterialen
Ein weiteres Problem war, dass die Extrakte der Gemüseproben trotz Zentrifugation immer
noch kleinste Partikel bzw. Schwebstoffe enthielten, wodurch die SPE-Kartuschen
verstopften. Daher war es notwendig einen Filtrationsschritt in die Probenvorbereitung zu
integrieren. Verschiedene Filtrationsmaterialen wurden getestet: Papierfilter, Glasswatte und
verschiedene Aufsatzfilter (Tab. 18). Papierfilter und Glaswatte ließen sich direkt in die SPE-
Kartusche einsetzen und die Extrakte direkt aufgeben. Der Filtrationsschritt erfolgte somit vor
der SPE. Demgegenüber erfolgte die Filtration mittels Aufsatzfilter nach der SPE. Hierbei
wurden die aufgearbeiteten SPE-Eluate (Messprobe, s. Anh.1.5.3.6) über eine Spritze,
welche mit einem Aufsatzfilter versehen war, filtriert.
Tab. 18: Wiederfindungen an Wirkstoffen bei verschiedenen Filtermaterialen (Dotierung: 500
µg/kg FG, Porree/Blatt- und Weißkohl/Blatt-Kontrollproben aus Hydokultur, SPE,
LC/MS-Methode, n=3)
Filtration
Filter-
Material
Filter-
Durchmesser
Filter-
Porengröße
Firma
Wiederfindung für
TC (TC+e-TC) [%]
Weißkohl
Porree
ohne
Filtration
-
-
-
-
75,2
71,7
Glasswatte
Glasfaser
(silanisiert)
-
-
Serva
72,4
69,4
Filterpapier
Blauband,
589
70 mm
-
Whatmann
59,3
59,9
Aufsatzfilter
RC
Cellulose
4 mm
0,45 µm
Phenomenex
54,0
56,7
PTFE
Polytetra-
fluorethylen
4 mm
0,45 µm
Phenomenex
44,4
44,2
NY
Nylon
4 mm
0,45 µm
Phenomenex
34,3
26,6
GHP
Poly-
propylene
13 mm
0,45 µm
Pall
(Acrodisc)
66,7
53,8
Bei Verwendung von alkyl- oder phenylmodifizierten Umkehrphasen kann wegen des
möglichen Metallionengehaltes durch die ausgeprägten Komplexbildungseigenschaften mit
Metallkationen die chromatographische Trennung der Tetracycline gestört werden.
Zusätzlich wird die Bildung von π-π-Komplexen zwischen den Phenylresten bzw. dem
Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymer und den Tetracyclinen bei den Phenyl- und organischen
Polymermaterialien angenommen [60]. Diese können der Grund niedriger
Wiederfindungswerte (<66,7 %) mit Aufsatzfiltern sein.
6 Ergebnisse und Diskussion 69
Auch nach Einsatz des Papierfilters zeigten sich sehr niedrige Wiederfindungswerte (<59,9
%). Dies könnte ein aufgrund des Cellulosematerials und daran sorbierten Analyt-Wirkstoffen
verursachter Analytenverlust sein. Da die Glaswatte erst nach dem Eluieren aus der
Kartusche entfernt wird, ist damit ein Analytenverlust bei der Glaswatte-Aufarbeitung
ausgeschlossen (Wiederfindung >69,4). Daher wurde silanisierte Glaswatte für die weitere
Aufarbeitung der Gemüseproben verwendet.
6.3.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der Methodenentwicklung
Es wurden erweiterte LC-MS/MS-Verfahren entwickelt, welche für die Bestimmung
relevanter Antibiotikawirkstoffe und ihrer Metaboliten in Getreide- und Gemüseproben
geeignet sind. Zur chromatographischen Bestimmung erwies sich die YMC-ODS-AM (150 x
3 mm, 3 µm) als analytische Säule in Verbindung mit einem Ameisensäure-Acetonitril-
Gradienten (H2O/CH3CN/HCOOH, 1 % HCOOH, (v/v)) als optimal. Die zur Kalibrierung
eingesetzten Standardlösungen wurden in Fließmittel A (s. Anh. 1.3.1) angesetzt. Um
Abbau- und Umwandlungsreaktionen zu minimieren, empfiehlt es sich für die Routineanalytik
in jedem Fall, Kalibrierlösungen zu aliquotieren und einzufrieren, um häufiges Auftauen und
Einfrieren der Stammlösungen zu vermeiden (s. Anh. 1.4).
Die hier beschriebene Methode zur Optimierung der Probenvorbereitung konzentrierte sich
auf die Fest-Flüssig-Extraktion des gemahlenen Korns bzw. homogenisierten Gemüses. Der
Einsatz der Mikrowellentechnik führte bei 20-40 °C zu einer vergleichsweise niedrigen
Wiederfindung. Andererseits wurde bei der Accelerated-Solvent-Extraction (ASE) in den MS-
Chromatogrammen eine Intensitätssteigerung der Untergrundsignale beobachtet, was für
Tetracycline zu Wiederfindungen von 154-240 % führte. Dieser Effekt wurde bei der
Ultraschall-gestützten Extraktion nicht beobachtet. Daher wurde diese Extraktionsmethode in
die Probenaufarbeitung übernommen.
Ursprünglich wurde ein rein wässriger EDTA/Citratpuffer als Extraktionsmittel für
Gemüseproben verwendet. Ein geringer Zusatz an MeOH (5 % v/v) bewirkte bei Getreide
eine Maximierung der Wiederfindungen.
Bei der Festphasenextraktion wurde zur Konditionierung der SPE-Kartusche (Oasis HLB)
schließlich MeOH und anschließend bidest.H2O oder EDTA/Citratpuffer/MeOH verwendet.
Nach der Extraktaufgabe erfolgte ein erster Waschschritt der beladenen Festphase mit
MeOH/Wasser (5/95 v/v) und bidest.H2O sowie EDTA/Citratpuffer/MeOH. Die Elution der
Analyte erfolgte mit MeOH. Die Eluate der Extrakte wurden vereinigt und unter leichtem
Luftstrom bis fast zur Trockne eingeengt. Ein Einengen der Eluate im inerten N2-Strom war
nicht notwendig, da dieses im Vergleich zum Einengen im Luftstrom keinen signifikanten
Einfluss auf die Wiederfindungen (Stabilität) der Analyte zeigte. Die eingeengten Eluate
wurden anschließend mit Fließmittel A aufgenommen und mittels LC-MS/MS analysiert. Der
6 Ergebnisse und Diskussion 70
schematische Ablauf der Verfahren ist in Abb. 21 dargestellt. Das für Getreide und Gemüse
optimierte Analysenverfahren wurde anschließend validiert.
Abb. 21: Schematische Darstellung der Analysenverfahren zur Bestimmung von Antibiotika
in Pflanzen
Gemüseextrakt
Gemüse
Porree, Weißkohl
Mahlen und Sieben
Zerkleinern und Homogenisieren
Extraktion mit
MeOH/EDTA-Citratpuffer
pH 4,1 5/95,(v/v)
Extraktion mit
EDTA/Citratpuffer pH 4,1
Getreideextrakt
Konditionierung
der SPE-Kartusche
(Oasis HLB,3 cc, 60 mg)
Probenaufgabe
Getreidekorn
Weizen, Gerste, Triticale
Zentrifugieren,
Ultraschall-gestützte-Extraktion
Getreide
a) 3 mL EDTA-Citratpuffer/MeOH
5/95 (v/v)
b) 3 mL MeOH/bidest.H2O
Gemüse
a) 3 mL MeOH
b) 3 mL bidest.H2O
Getreide
a) 3 mL bidest. H2O
b) 3 mL EDTA-Citratpuffer/MeOH
5/95 (v/v)
a) Einengen des Eluates bis zur Trockene
b) Aufnahme des Rückstandes in Fließmittel
Chromatographie
Analytische Säule: YMC-Pack
ODS-AM, 150×3,0 mm und
150×1,0 mm
Fließmittel : H2O/CH3CN/ HCOOH
Quantifizierung
MSn (n=2-3), ESI+,
TIC und SRM-Modus
Identifizierung und Quantifizierung
LC-MSn
Waschen
Elution mit 3 mL MeOH
Herstellung der Messprobe
Gemüse
a) 3 mL bidest.H2O
b) 3 mL MeOH/bidest.H2O
5/95 (v/v)
6 Ergebnisse und Diskussion 71
6.4 Validierung
Nachfolgend ist die Validierung für die Bestimmung ausgewählter Wirkstoffe für Getreide,
Weißkohl und Porree mit LC-MS/MS beschrieben.
6.4.1 Wiederfindung
Zur Bestimmung der Wiederfindungen wurden die BSA-Winterweizen- und Kontrollproben
von Porree- und Weißkohlpflanzen aus Hydrokultur mit Mischstandard dotiert (50 µg/kg FG),
aufgearbeitet und die erhaltenen Messproben jeweils sechsfach injiziert. In Tab. 19 sind die
ermittelten Wiederfindungen aufgelistet.
Tab. 19: Wiederfindungen für die Bestimmung von Antibiotika in Winterweizen (BSA),
Porree/Blatt-und Weißkohl/Blatt-Kontrollproben aus Hydrokultur (Dotierung 50
μg/kg FG, Matrixkalibrierung, LC-MS-Methode, n=6)
Analyt
Wiederfindung [%]
Winterweizen
Porree
Weißkohl
SFD
50,3
49,1
38,3
AMO
61,2
56,5
55,9
ENR
71,2
63,9
65,3
CIP
73,4
68,1
62,4
TC+e-TC
92,1
62,4
60,0
DC+e-DC
61,8
54,5
57,9
OTC+e-OTC
107,0
65,9
64,3
DMC+e-DMC
96,4
67,6
65,2
CTC+e-CTC
91,5
88,0
91,3
iso-CTC+e-iso-CTC
87,6
71,1
61,6
MON
54,9
56,0
49,0
Bei den Tetracyclinen wurde die Summe von Muttersubstanz und Epimer ermittelt. Die
Wiederfindungen der Tetracycline für das Winterweizenkorn lagen zwischen 61,8 % und
107,0 % und für Gemüse zwischen 54,5 % und 91,3 %.
Da diese Werte (mit Ausnahme der für DC) alle oberhalb von 60 % liegen (70-110 %), kann
man schließen, dass sie nach der EU-Richtlinie 2002/657/EG im akzeptablen Bereich liegen
und die Methode somit hinsichtlich der Wiederfindbarkeit geeignet erscheint. Demgegenüber
wird SFD in Pflanzenproben nur zu 38,3-50,3 % wiedergefunden. Als Ursache für niedrige
Wiederfindungen können Suppressionseffekte durch Matrixbestandteile bei der
massenspektrometrischen Bestimmung vermutet werden (s. Kap.6.4.5). Auch MON lieferte
niedrigere Wiederfindungswerte (49,0-54,9 %).
6.4.2 Präzision
Unter der Präzision wird die Übereinstimmung unabhängiger Analysenergebnisse
verstanden. Sie gibt die Streuung einzelner Ergebnisse als Folge von zufälligen Fehlern an.
Als Maß für zufällige Fehler gilt die Mess- und Methodenpräzision, wobei sich die
6 Ergebnisse und Diskussion 72
Messpräzision auf zufällige Fehler, die durch das Analysegerät selbst evoziert sind, bezieht,
während sich die Methodenpräzision auf zufällige Fehler bei der Durchführung des gesamten
Analysenverfahrens bezieht. Die Präzision wird meistens in Form der relativen
Standardabweichung (srel) ausgedrückt.
Messpräzision
Zur Ermittlung der Messpräzision wurden Weizenproben aus BSA und Porree- sowie
Weißkohl-Kontrollpflanzen aus der Hydrokultur-Anzuchtreihe mit Standard dotiert,
aufgearbeitet und mittels HPLC-MS/MS sechsfach analysiert. Die erhaltenen Mittelwerte der
Konzentrationen sowie die relativen Standardabweichungen für die Antibiotika sind in Tab.
20 dargestellt.
Tab. 20: Messpräzision für die Bestimmung von Antibiotika in BSA-Winterweizen und
Porree/Blatt- sowie Weißkohl/Blatt-Kontrollpflanzen aus Hydrokultur (Dotierung:
50 µg/kg FG, Doppelbestimmung, LC-MS-Methode, n=6)
Analyt
Relative Standardabweichung (srel) [%]
Getreide
Gemüse
Winterweizenkorn
Porree
Weißkohl
SFD
4,8
5,2
4,9
AMO
3,8
5,1
4,1
ENR
2,1
1,3
2,9
CIP
1,8
1,1
1,3
TC+ e-TC
1,1
1,8
1,0
DC+ e-DC
4,5
1,3
4,5
OTC + e-OTC
6,7
6,0
4,9
DMC + e-DMC
3,3
2,1
4,4
CTC + e-CTC
1,0
1,9
3,4
iso-CTC + e-iso-CTC
9,1
7,4
9,8
MON
5,1
4,9
3,6
*Indirekte Bestimmung der Tautomere (Schätzwert), instabiles Gleichgewicht
**e-iso-CTC kein kommerzieller Standard: instabiles Gleichgewicht der Epimere
Die relativen Standardabweichungen belegen mit Werten für Weizen zwischen 1,0 % und 9,1
% und für Gemüse zwischen 1,0 % und 9,8 % die hohe Präzision des LC-MS/MS-
Verfahrens. Die ermittelten Messpräzisionen liegen damit unter der in der EU-Richtlinie
2002/657/EG akzeptierten Grenze von 20 %.
Methodenpräzision
Zur Bestimmung der Methodenpräzision wurden BSA-Winterweizen und Blindproben von
Porree- und Weißkohlpflanzen (Kontrolle) mit Mischstandard dotiert (50 µg/kg), aufgearbeitet
und die erhaltenen Messproben jeweils sechsfach injiziert. Die Aufarbeitung der
Getreideproben erfolgte nach zwei Varianten. Die Aufarbeitung (Citrat-Puffer-Extraktion,
6 Ergebnisse und Diskussion 73
SPE) und Analyse einer gemahlenen 1-g-Einwaage erfolgte sowohl einzeln als auch mit zwei
parallel aufgearbeiteten Proben, deren SPE-Extrakte vereinigt wurden. In Tab. 21 sind die
relativen Standardabweichungen aufgelistet.
Tab. 21: Methodenpräzision bei unterschiedlichen Aufarbeitungsvarianten von Getreide und
Gemüse (Dotierung: 50 µg/kg FG, BSA-Winterweizen und Porree/Blatt- sowie
Weißkohl/Blatt-Kontrollpflanzen aus Hydrokultur, Doppelbestimmung, LC-MS-
Methode, n=6)
Analyt
Relative Standardabweichung [%]
Getreide
Gemüse
Winterweizenkorn
Weißkohl
Porree
1 Einwaage
(1 SPE-
Eluat)
2 Einwaagen
(kombinierte SPE-
Eluate)
SFD
11,4
11,9
10,6
12,3
AMO
5,9
6,1
6,2
4,1
ENR
7,5
7,4
8,3
7,1
CIP
6,9
6,3
11,4
9,4
TC + e-TC
8,2
2,3
4,4
4,9
DC + e-DC
7,5
7,5
4,6
4,8
OTC + e-OTC
6,7
3,5
9,3
7,4
DMC + e-DMC
8,4
2,7
6,4
2,9
CTC + e-CTC
7,3
5,6
4,7
7,5
iso-CTC + e-iso-CTC
9,6
4,2
5,3
5,4
MON
3,8
3,5
1,2
3,0
Die in Tab. 21 aufgeführten relativen Standardabweichungen zeigen, dass die parallele
Aufarbeitung zu einer deutlich besseren Präzision führt. Daher wurde diese Methode auch
zur Analyse der Getreideproben eingesetzt.
Die Methodenpräzisionen sind mit Werten zwischen 1,2 % und 12,3 % nur geringfügig
größer als die Messpräzisionen. Damit liegen die Werte unterhalb der Angaben in
Literaturverfahren, bei denen Methodenpräzisionen bis zu 40 % beschrieben werden [246,
247]. Tetracycline können in vitro Umwandlungs- bzw. Epimerisierungsprodukte bilden,
wobei die Epimerisierungsgrade in Abhängigkeit von der Temperatur und der Dauer der
Probenvorbereitung zwischen 10 % und 20 % differieren kann [60].
Dies könnte bei der Aufarbeitung der Proben an unterschiedlichen Tagen beispielsweise zu
deutlich schlechteren Methodenpräzisionen führen. Deshalb beziehen sich einerseits der
Analyten-Gehalt sowie andererseits auch die Methodenpräzision auf die der jeweiligen
Epimerenpaare.
6 Ergebnisse und Diskussion 74
6.4.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze
Nach Kromidas und Funk ist die Nachweisgrenze die kleinste qualitativ noch nachweisbare
Konzentration ohne Forderung einer bestimmten Präzision [248]. Die Bestimmungsgrenze
wiederum ist nach Funk definiert als kleinste Konzentration einer Substanz, die mit einer
vorgegebenen Richtigkeit und Präzision bestimmt werden kann [249].
Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach DIN 32645 wurden mit
Antibiotika dotierte BSA-Winterweizen sowie Kontrollproben von Porree- und
Weißkohlpflanzen aus Hydrokultur jeweils sechsfach analysiert und mit Matrixkalibrierung
quantifiziert. Die Dotierungen lagen im Bereich von 1 bis 80 μg/kg FG. Die Auswertung der
Messergebnisse wurde unter Zuhilfenahme des Softwareprogramms “Valoo“ [250]
durchgeführt. In Tab. 22 sind die ermittelten Nachweisgrenzen (NWG) und
Bestimmungsgrenzen (BG) aufgelistet.
Tab. 22: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen von Analyten in verschiedenen Matrices
(Dotierter BSA-Winterweizen und Porree/Blatt- sowie Weißkohl/Blatt-
Kontrollpflanzen aus Hydrokultur, Einfachbestimmung, LC-MS-Methode, n = 6)
Analyt
NWG
BG
[μg/kg FG]
Winterweizen
Porree
Weißkohl
Winterweizen
Porree
Weißkohl
SFD
8,0
8,3
7,1
40,8
41,0
32,5
AMO
6,9
7,9
6,6
24,5
25,5
24,3
ENR
6,3
6,1
3,9
20,8
23,4
12,7
CIP
6,3
7,4
7,2
21,4
27,8
25,0
TC
3,5
4,8
3,6
14,1
16,8
11,2
e-TC
4,1
6,6
5,7
17,4
28,1
21,9
DC
3,3
6,3
6,1
12,4
25,9
24,6
e-DC
4,2
4,7
5,8
18,6
16,7
22,8
OTC
5,3
4,4
3,5
19,0
14,8
8,1
e-OTC
3,9
5,5
3,8
11,7
20,8
9,6
DMC
2,9
4,5
4,0
10,5
15,6
13,4
e-DMC
2,8
5,0
5,1
10,0
17,9
18,6
CTC
2,7
4,5
4,2
9,5
15,6
13,4
*e-keto-CTC
7,3
7,9
7,5
54,3
30,5
35,9
*e-enol-CTC
4,4
5,4
7,3
21,2
20,2
34,6
iso-CTC
2,4
5,8
7,4
8,3
22,9
34,7
**e-iso-CTC
6,6
7,1
8,7
42,2
32,3
47,8
MON
7,5
9,6
6,8
29,9
32,1
30,0
*Indirekte Bestimmung der Tautomere (Schätzwert), instabiles Gleichgewicht
**e-iso-CTC kein kommerzieller Standard: instabiles Gleichgewicht der Epimere
Auffällig ist, dass die ermittelten Bestimmungsgrenzen für die Epimerprodukte (e-keto-CTC,
e-enol-CTC, e-iso-CTC) höher sind als die für die anderen Analyten, welches am instabilen
Gleichgewicht der Epimere liegen kann.
6 Ergebnisse und Diskussion 75
6.4.4 Selektivität
Die Selektivität als Validierungsparameter wird bestimmt, um Aussagen darüber treffen zu
können, ob eine Analysenmethode fähig ist, bestimmte Analyten aus einer komplexen Matrix
ohne Interferenzen zu identifizieren [251]. Laut der EU-Richtlinie 657 ist die Selektivität durch
einen Vergleich der Retentionszeiten und durch Übereinstimmung der Spektren der Analyt-
Peaks in Standardlösungen mit denen in der Probe zu ermitteln [252]. Dafür wurden die
Messergebnisse der Validierproben mit denen eines entsprechenden Standards der Weizen,
Porree- und Weißkohlproben unter den gleichen Versuchsbedingungen ermittelt und
verglichen. Dabei darf eine Retentionszeittoleranz von 5 % und Höchsttoleranz für die
relativen Ionenintensitäten ± 50 % nicht überschreiten. Weiterhin gilt für alle
massenspektrometrische Verfahren, bei denen Fragmente nicht im Full-Scan-Modus
gemessen werden, zur Identifizierung ein Punktesystem, wobei zur sicheren
Charakterisierung zu bestimmten Analyten mindestens drei Identifizierungspunkte (ein
Precursor-Ion und zwei Produkt-Ionen) benötigt werden [268].
Selektivitätstest durch Vergleich der Retentionszeit
Die erste Selektivitätsprüfung des LC-MS/MS-Verfahrens erfolgte durch einen Vergleich der
Retentionszeiten von Analyten aus einer Pflanzenprobe mit denen einer
Mischstandardlösung. Hierzu wurden sowohl eine Winterweizenproben (BSA-Proben) als
auch Kontrollpflanzen aus Hydrokultur aufgearbeitet und vergleichend mit einer
Mischstandardlösung der Wirkstoffe vermessen.
Tab. 23: Selektivitätstest durch Vergleich der Retentionszeiten (Dotierung: 250 µg/kg FG,
Mischstandard ß=1mg/L, BSA-Winterweizen und Porree/Blatt- sowie
Weißkohl/Blatt-Kontrollproben aus Hydrokultur, Doppelbestimmung, LC-MS, n=3)
Analyt
Retentionszeit-Standard
[min]
Retentionszeit-Matrix [min]
Winterweizen
Porree
Weißkohl
SFD
5,87
5,85
5,91
5,92
AMO
3,21
3,18
3,24
3,22
ENR
9,28
9,25
9,26
9,16
CIP
8,09
8,06
8,09
7,98
TC
7,29
7,27
8,61
7,20
e-TC
8,74
8,72
7,60
8,63
DC
14,43
14,42
14,46
14,53
e-DC
13,71
13,69
13,74
13,81
OTC
7,50
7,48
7,51
7,53
e-OTC
7,14
7,12
7,16
7,05
DMC
10,59
10,57
10,56
10,57
e-DMC
9,14
9,12
9,01
9,02
CTC
13,00
12,98
13,01
13,00
e-keto-CTC
9,00
8,98
8,87
8,89
e-enol-CTC
11,05
10,92
11,01
10,91
iso-CTC
10,33
10,19
10,18
10,20
e-iso-CTC
8,52
8,49
8,39
8,41
MON
23,02
22,28
22,92
22,92
6 Ergebnisse und Diskussion 76
E:\Didem\Messung020209\Std-Ext-1-2
250 300
m/z
0
50
100
Relative Abundance
316,15
342,03
245,99
250 300
m/z
0
50
100
Relative Abundance
316,16
342,10
Die Tab. 23 zeigt, dass die Retentionszeiten von den Analyten in der Pflanzenprobe nahezu
mit denen im Standard übereinstimmen (maximale Differenz 3,8 % bei MON) und damit das
Richtigkeitskriterium aufgrund der Retentionszeiten mit einer maximalen Toleranz von 5 %
erfüllt ist.
Selektivitätstest durch Vergleich der MS-Spektren
Als weiteres Kriterium für die Selektivität eines Verfahrens gilt die Übereinstimmung der
Spektren der Analyt-Peaks in Standardlösungen mit denen der Spektren aus der Probe.
Dazu wurden die MS-Spektren von ENR und TC aus der Standardlösung mit denen der
Analyten aus den Getreide- und Gemüseproben verglichen (Abb. 22).
Abb. 22: Selektivitätstest durch Vergleich der MS-Spektren: Produkt-Ionen-Scan des
Vorläuferions von TC (m/z 445,0) und von ENR (m/z 360,1) in Standardlösung
(β = 1 mg/L) und in dotierter BSA-Winterweizen (Dotierung:100 µg/kg FG,
LC/MS-Methode, SRM-Modus)
Die durchgeführten Vergleiche der Spektren der Analyten zeigen für die
massenspektrometrische Detektion eine gute Übereinstimmung zwischen Standardlösung
und Probe und geben damit deutliche Hinweise auf die Selektivität des Verfahrens. Unter
Zugrundelegung der gültigen zulässigen Höchsttoleranz von 50 % sind auch die
E:\Didem\Messung020209\Std-Ext-1-2
410 415 420 425
m/z
0
50
100
Relative Abundance
426,96
409,95
426,30
410 415 420 425
m/z
0
50
100
Relative Abundance
426,96
409,97
ENR
Standard
TC
Standard
ENR
Matrix
TC
Matrix
6 Ergebnisse und Diskussion 77
Fragmentmuster der Analyte in der Standardlösung und in den Winterweizenproben als
identisch zu betrachten.
Zusammenfassend kann mit den erhaltenen Ergebnissen die Selektivität des HPLC-MS/MS-
Verfahrens für die Bestimmung von Antibiotika in Getreide und Gemüse als gesichert
angesehen werden.
6.4.5 Matrixeffekte
Matrixeffekte resultieren aus der Veränderung der Ionisationseffizienz der Analytmoleküle
durch die Anwesenheit koeluierender Substanzen. Koeluierte Matrixbestandteile
insbesondere aus Umweltproben können bei der Quantifizierung der Analyte mittels LC-ESI-
MS durch eine Beeinflussung der Ionisierung in der ESI-Quelle Fehler verursachen, wobei
Matrixbestandteile zu einer Unterdrückung- (Signalsuppression) oder einer Erhöhung der
Signalflächen führen können [60, 253, 254, 255]. Stevens beobachtete eine
Signalsuppression für SFD durch eine Bodenmatrix [165]. Ebenfalls weist Vockel eine
Signalsuppression für CTC durch Muskulaturproben hin [60]. Schwake-Anduschuss
ermittellte auch eine Signalsupression für SFD sowie für iso-CTC bei Konzentrationen
oberhalb 5 mg/L durch eine Pflanzenmatrix [186]. Da diese Einflüsse bei einer externen
Kalibrierung nicht festgestellt werden können, wurde der Einfluss der koeluierten
Pflanzenmatrix auf das entwickelte LC-MS/MS-Verfahren überprüft. Hierzu wurden
unbelastete BSA-Winterweizenproben mit Standard dotiert, aufgearbeitet und entsprechende
Kalibrierfunktionen verglichen. Der Einfluss der Matrixbestandteile auf die Bestimmung von
SFD, ENR und TC sowie die Summe von TC (e-TC TC) wurde durch Vergleich der
Signalflächen der Kalibrierlösungen mit und ohne der Pflanzenmatrix (Winterweizen) ermittelt
und die entsprechenden Kalibrierfunktionen verglichen (Abb. 23, Abb. 24).
6 Ergebnisse und Diskussion 78
a)
b)
Abb. 23: Vergleich der Signalflächen der Analytpeaks
(BSA-Winterweizen, Doppelbestimmung, n=3, LC-MS- Methode, SRM-Modus)
a) Matrixeinflüsse auf die Bestimmung von SFD
b) Matrixeinflüsse auf die Bestimmung von ENR
0,E+00
1,E+06
2,E+06
3,E+06
4,E+06
5,E+06
6,E+06
01000 2000 3000 4000 5000 6000
Signalfläche
Konzentration von SFD [µg/L]
Kalibrierlösung
Kalibrierlösung+extrahierte Matrix
0,E+00
2,E+06
4,E+06
6,E+06
8,E+06
1,E+07
1,E+07
01000 2000 3000 4000 5000 6000
Signalfläche
Konzentration von ENR [µg/L]
Kalibrierlösung
Kalibrierlösung+extrahierte Matrix
6 Ergebnisse und Diskussion 79
c)
d)
Abb. 24: Vergleich der Signalflächen der Analytpeaks
(BSA-Winterweizen, Doppelbestimmung, n=3, LC-MS-Methode, SRM-Modus)
c) Matrixeinflüsse auf die Bestimmung von TC
d) Matrixeinflüsse auf die Summenbestimmung von TC (e-TC TC)
0,E+00
2,E+06
4,E+06
6,E+06
8,E+06
1,E+07
1,E+07
01000 2000 3000 4000 5000 6000
Signalfläche
Konzentration von TC [µg/L]
Kalibrierlösung
Kalibrierlösung+extrahierte Matrix
0,E+00
5,E+06
1,E+07
2,E+07
2,E+07
3,E+07
01000 2000 3000 4000 5000 6000
Signalfläche
Konzentration von TC+e-TC [µg/L]
Kalibrierlösung
Kalibrierlösung+extrahierte Matrix
6 Ergebnisse und Diskussion 80
Abb. 23a) zeigt, dass für SFD eine deutliche Suppression des Signals durch Matrixbestandteile
über den gesamten Kalibrationsbereich festzustellen ist. Folglich liefern die durch externe
Kalibrierung ermittelten Messwerte der Pflanzenproben einen kalibrierungsbedingten
Minderfund.
Ein Einfluss der Matrix auf die Bestimmung von TC ist erst bei der höchsten Konzentration
erkennbar (Abb. 24c). Dieses ist jedoch vernachlässigbar, da dieser Kalibrationswert nicht mehr
im Konzentrationsbereich liegt, der für die Pflanzenproben relevant ist. Es gilt auch für den
Einfluss der Matrix auf die Summenbestimmung von TC (TC e-TC) (Abb. 24d). Daher ist die
externe Kalibrierung für die Bestimmung von TC als Summengehalt von TC und e-TC eine
akzeptable Methode.
Wie bei TC ist auch ein Einfluss der Matrix auf die Bestimmung von ENR bei der höchsten
Konzentration erkennbar (Abb. 24b). Matrixeinflüsse auf die Bestimmung der Fluorchinolone
werden auch in der Literatur beschrieben. Beispielweise zeigen Fluorchinolone eine deutliche
Ion-Suppression durch eine Wassermatrix [256].
6.4.6 Zusammenfassung der Validierungsergebnisse
Für die Getreide- und Gemüseproben wurden als Validierungsparameter die Wiederfindung, die
Präzision sowie die Nachweis- und Bestimmungsgrenze ermittelt. Zusätzlich wurden Selektivität
und auch Matrixeffekte überprüft. Als Probenmaterial für diese Validierungsuntersuchungen
dienten die Kontroll- bzw. Blindproben. Dafür stellte das Bundessortenamt Hannover (BSA) die
Getreideproben, die auf Flächen verschiedener Prüfstellen erwachsen, die mindestens 10 Jahre
nicht mit Gülle gedüngt wurden, bereit. Ebenfalls wurden für die Validierung Kontrollproben von
Porree- und Weißkohlpflanzen aus eigenen Hydrokultur-Anzuchtreihen verwendet.
Zur Beurteilung der Richtigkeit der Analysenergebnisse wurden die Wiederfindungen ermittelt.
Diese liegen für Tetracycline mit 54,5 %-107,0 % größtenteils (außer für DC) in dem in der EU-
Richtlinie 2002/657/EG angegebenen akzeptierten Bereich von 70 % bis 110 %.
Demgegenüber wird SFD in Pflanzenproben nur zu 38,3-50,3 % wiedergefunden. Die Ursache
niedriger Wiederfindungen für SFD kann an Bildung nicht extrahierbare Anteile nach der
Dotierung der homogenisierten Pflanzenprobe und an Suppressionseffekten liegen.
Die Überprüfung der Präzision erfolgte durch Ermittlung der Mess- und Methodenpräzision mit
der MS/MS-Detektion. Dabei wurden für die Messpräzision Werte zwischen 1,0-9,8 % ermittelt.
Für die Methodenpräzision unter Wiederholbedingungen ergaben sich Höchstwerte von 11,9 %
für SFD und Minimalwerte von 2,3 % für TC, welche damit größer sind als die Messpräzisionen.
Somit zeichnet sich das angewendete Analysenverfahren im Vergleich mit den in der Literatur
gemachten Angaben für die Methodenpräzision in den unterschiedlichen Matrices durch eine
hohe Präzision aus (<20 %) [257].
6 Ergebnisse und Diskussion 81
Die mit der MS/MS-Detektion ermittelten Nachweisgrenzen für die Getreideproben betrugen
2,4-8,0 µg/kg und die Bestimmungsgrenzen 8,3-54,3 µg/kg. Für die Gemüseproben wurden die
Nachweisgrenzen im Bereich von 8,1-47,8 µg/kg und die Bestimmungsgrenzen von 8,1-41,0
µg/kg ermittelt. Boxall berechnete eine Nachweisgrenze für OTC in Möhren von 23 µg/kg [213].
Somit lagen die Nachweisgrenzen für OTC bei 3,5 µg/kg in Weißkohlproben und 4,4 µg/kg in
Porreeproben deutlich niedriger im Vergleich zu den in der Literatur angegebenen Werten.
Der Selektivitätsnachweis des HPLC-MS/MS-Verfahrens erfolgte nach den in der EU-Richtlinie
2002/657/EG geforderten Kriterien durch einen Vergleich der Retentionszeiten, der MS-
Spektren sowie der Produkt-Ionen-Intensitäten der Analyten in einer Standardlösung und in
einer Pflanzenprobe. Die dargestellten Chromatogramme für die MS/MS-Detektion zeigen, dass
die Retentionszeiten von den Analyten in der Pflanzenprobe fast exakt mit denen im Standard
übereinstimmen und damit das Richtigkeitskriterium aufgrund der Retentionszeiten mit einer
maximalen Toleranz von 5 % erfüllt ist. Anderseits zeigen die durchgeführten Vergleiche der
Spektren der Analyten für die massenspektrometrische Detektion eine gute Übereinstimmung
zwischen Standardlösung und Probe und belegen damit die Selektivität des Verfahrens.
Um den Einfluss der Matrixbestandteile auf die Bestimmung von Antibiotika zu ermitteln, wurde
ein Vergleich der Signalflächen der Kalibrierlösungen mit und ohne Pflanzenmatrix angestellt.
Für SFD ist eine deutliche Suppression des Signals durch Matrixbestandteile über den
gesamten Kalibrationsbereich festzustellen. Für TC, ENR scheint es eine nur geringfügige
Suppression des Messsignals durch Matrixbestandteile zu geben. Somit ist die externe
Kalibrierung für die Bestimmung von TC und ENR in Pflanzen geeignet. Für die Bestimmung
von SFD wäre die Verwendung eines internen Standards oder die Bestimmung mittels
Standardaddition angebracht. In der vorliegenden Arbeit wurden die Gehalte an ausgewählten
Antibiotika in den Pflanzenproben zur Absicherung mittels Matrixkalibrierung bestimmt.
Die hier vorgestellten LC-MS/MS-Verfahren sind gleichermaßen auf die Analyse von Getreide
und Gemüse (Weißkohl, Porree) anwendbar. Diese Analysenverfahren wurden nachfolgend auf
Pflanzenproben der durchgeführten Screening- und Hydrokulturstudien sowie bei der Analyse
der handelsüblichen Weizenproben angewendet.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 82
7 UNTERSUCHUNG ZUM ANTIBIOTIKATRANSFER AUS DEM BODEN IN GETREIDE
Im Rahmen der Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide wurde eine
Screening Studie durchgeführt. Anschließend erfolgte eine Untersuchung von handelsüblichen
Weizenproben aus Niedersachsen.
7.1 Screening-Studie
In NRW ist die landwirtschaftliche Tierproduktion ein bedeutender Wirtschaftsfaktor. Derzeit
werden in NRW etwa 2,6 Millionen Großvieheinheiten (GVE) gehalten, das entspricht etwa 19
Millionen Tieren, vorrangig Rinder, Schweine und Geflügel [258] (Abb. 25).
Abb. 25: NRW-Karte [259] mit viehstarken Gebieten in NRW [258]
Die in der Karte mit großen Punkten ausgewiesenen Regionen weisen in Nordrhein-Westfalen
die höchste Schweinedichte auf, sodass von einer intensiven Gülleausbringung der
landwirtschaftlich genutzten Flächen auszugehen ist. Deshalb wurden mit Unterstützung der
Landwirtschaftskammern Nordrhein-Westfalen und Niedersachsen in den Jahren 2005 und
2006 in den Kreisen Borken, Coesfeld und Warendorf (nur 2005) sowie der Grafschaft
Bentheim (nur 2006) aus der laufenden Ernte Getreideproben gezogen. Die Betriebe wurden so
ausgewählt, dass eine größtmögliche Variation der Anbaubedingungen gewährleistet war, um
Einflüsse der Bodenqualität und der Bodenbearbeitung auf den möglichen Antibiotikatransfer
erkennen zu können. Im Anhang 2 sind die von den jeweiligen Betrieben angegebenen
Informationen zu den Produktionsbedingungen, zu Viehbestand, Medikation und
Gülleausbringung aufgeführt.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 83
Zusätzlich stand eine geringe Zahl von Getreideproben aus der jährlichen "Besonderen Ernte-
und Qualitätsermittlung" (BEE) des Bundes und der Länder zur Verfügung, die nach
Agrarstatistikgesetz gezogen und von der BfEL Detmold zugeleitet wurden.
Das Bundessortenamt Hannover (BSA) stellte ebenfalls Getreideproben bereit, u.a.
Winterweichweizen, Winter- und Sommergerste sowie Winterroggen. Diese Proben sind auf
Flächen verschiedener Prüfstellen gewachsen, die mindestens 10 Jahre nicht mit Gülle gedüngt
wurden.
Erntereifes Getreide wurde auf die Gehalte an Antibiotika entsprechend der angegebenen
Medikationen sowie auf die Gehalte weiterer veterinärmedizinisch relevanter,
verordnungsstarker Wirkstoffe und, sofern bekannt, ihre Umwandlungsprodukte bzw.
(pflanzliche) Metabolite analysiert.
7.1.1 Probennahme
Erntezeit 2005
Die erste Beprobung des Getreides wurde vom Fachbereich Agrarwirtschaft der FH
Südwestfalen/Soest im Münsterland in den Landkreisen Borken, Coesfeld und Warendorf
durchgeführt (s. Tab. 24).
Tab. 24: Erntezeit 2005 - Probennahmegebiete und Probenbezeichnung
Getreideart
Probennahmegebiete
Kreis Coesfeld
Kreis Borken
Kreis Warendorf
Probenbezeichnung
Weizen
K-S-1, K-S-2
K-S-3, K-S-4
K-S-5
K-H-1, K-H-2
K-H-3, K-H-4
K-H-5, K-H-6
K-B-1, K-M-1
K-M-2
Erntezeit 2006
In den folgenden Bereichen Nordrhein-Westfalens und Niedersachsens wurden Getreideproben
genommen:
Kreis Borken (Winterweizen, Gerste, Triticale)
Heek, Ahaus, Schöppingen, Velen, Reken
Kreis Coesfeld (Winterweizen):
Coesfeld, Senden, Havixbeck, Dülmen
Kreis Grafschaft Bentheim (Winterweizen, Gerste)
Nordhorn, Neuenhaus, Gölenkamp, Uelsen, Halle
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 84
Die Bezeichnungen der entnommenen Proben sind in Tab. 25 aufgeführt.
Tab. 25: Erntezeit 2006 - Probenahmegebiete und Probenbezeichnung
Getreideart
Probennahmegebiete
Kreis
Borken
Kreis
Coesfeld
Kreis
Grafschaft Bentheim
Probenbezeichnung
Weizen
B2 W, B3 W
B4 W, B5 W
B6 W
Coe1 W, Coe2 W
Coe3 W, Coe4 W
Coe5 W, Coe6 W
Coe7 W, Coe8 W
Coe9 W, Coe10 W
NS1 W, NS2 W
NS3 W, NS4 W
NS5 W, NS6 W
NS7 W, NS8 W
Gerste
B1 G, B2 G
B3 G, B4 G
B6 G
-
-
Triticale
B1 T, B5 T
-
-
Von erntereifem Getreide wurden an ebenfalls vier unterschiedlichen Stellen des Ackerschlags
ganze Ähren vom Halm getrennt, in beschriftete Gefrierbeutel verpackt und in einem
Kühlbehälter zum Fachbereich Agrarwirtschaft der FH Südwestfalen in Soest transportiert. Im
Labor wurden die Körner mechanisch aus den Ähren gelöst und alle Körner eines Schlages in
einem Beutel vereinigt. Dieser wurde bis zur Analyse tiefgekühlt gelagert.
Im Erntejahr 2006 war aufgrund der extrem hohen Juni Temperaturen in einigen Betrieben eine
vorzeitige Ernte notwendig geworden. In diesem Fall wurde während des Dreschprozesses vom
Betriebsleiter aus dem Korntank eine Getreideprobe gewonnen und sofort eingefroren. Die
Proben wurden in gefrorenem Zustand für die Durchführung der Analysen zur Universität
Paderborn transportiert.
7.1.2 Ergebnisse der Screening-Studie
Ernte 2005
Die Befunde zu dem in der Erntezeit 2005 beprobten erntereifen Winterweizen sind in Tab. 26
aufgeführt.
Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 85
Tab. 26: Ernte 2005 - Ergebnisse der Getreideanalysen (Winterweizen)
- negativer Befund + positiver Befund (> BG) mit LC/MS² niedrig auflösend ‡ Bestätigung durch hochauflösende MS
(+) und (+‡) positiver Befund (< BG)
Probe
TC
e-TC
DC
e-DC
OTC
e-OTC
DMC
e-DMC
CTC
e-keto-
CTC
e-enol-
CTC
iso-
CTC
e-iso-
CTC
Coesfeld
K-S-1
(+‡)
(+‡)
-
-
-
-
+‡
(+‡)
+
(+)
(+)
+
+
K-S-2
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
K-S-3
-
-
-
-
-
-
(+)
(+)
-
-
-
-
-
K-S-4
-
-
-
-
-
-
(+)
(+)
-
-
-
-
-
K-S-5
-
-
-
-
-
-
(+)
(+)
-
-
-
-
-
Borken
K-H-1
-
-
-
-
-
-
-
-
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
K-H-2
-
-
-
-
-
-
-
-
(+)
(+)
(+)
+
+
K-H-3
-
-
-
-
-
-
-
-
(+)
(+)
(+)
+
+
K-H-4
-
-
-
-
-
-
-
-
(+)
(+)
(+)
(+)
+
K-H-5
-
-
-
-
-
-
-
-
(+)
(+)
(+‡)
+
+‡
K-H-6
-
-
-
-
-
-
-
-
(+)
(+)
(+)
(+)
+
Warendorf
K-B-1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
K-M-1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
K-M-2
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
(+)
-
(+)
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 85
_____________________________________________________________________________
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 86
Insgesamt wurden in 9 von 14 verschiedenen Weizenproben Tetracycline nachgewiesen.
Insbesondere waren alle Weizenproben aus dem Kreis Borken mit Antibiotikarückständen
belastet. Zur Absicherung der positiven Befunde wurden einige ausgewählte Weizenproben
mit hochauflösender MS gemessen (s. Kap.7.1.2).
Ebenfalls wurden Bodenproben aus dem Pflugbereich analysiert. Zur Extraktion der
Arzneistoffe aus den Bodenproben wurde ein im Vorprojekt entwickelter ammoniakalischer
EDTA-Puffer eingesetzt [9]. CTC ist besonders alkaliempfindlich und isomerisiert schon ab
pH 7 zum iso-CTC. Im Boden vorhandenes CTC ist daher infolge der
Extraktionsbedingungen bei der Analyse mittels LC-MS/MS nur als iso-CTC nachweisbar. So
konnte Beispielsweise iso-CTC in der K-S-1-Bodenprobe aus dem Kreis Coesfeld gefunden
werden [9, 222]. Von den aus der Erntezeit 2005 entnommenen Boden- und
Winterweizenproben wurden die Antibiotika-Gehalte mittels LC-MS/MS ermittelt. Die
erhaltenen Ergebnisse sind in Tab. 27 zusammengefaßt.
Tab. 27: Gehalte an Tetracyclinen in Boden und Korn aus der Ernte 2005
– : kleiner Nachweisgrenze (<NWG), k.A.: keine Angaben
Kreis
Probe
a)Einsatz von
TC und CTC
Boden [µg/kg TM]
Korn [µg/kg FG]
TC
b)ΣCTC
TC
CTC
c)iso-
CTC
Coesfeld
K-S-1
CTC
–
51,2
<BG
58,3
(+DMC 68,4)
53,4
K-S-2
k.A.
–
–
–
–
–
K-S-3
TC
30,2
23,1
–
–
–
K-S-4
TC
10,3
–
–
–
–
K-S-5
TC
120,4
22,6
–
–
–
Borken
K-H-1
TC
26,3
31,2
–
–
<BG
K-H-2
k.A.
–
–
–
–
71,5
K-H-3
k.A.
–
–
–
–
95,9
K-H-4
TC
–
–
–
–
29,5
K-H-5
k.A.
–
–
–
–
42,3
K-H-6
CTC
–
–
–
–
37,7
Warendorf
K-B-1
CTC
17,7
13,9
–
–
–
K-M-1
CTC
–
33,7
–
–
–
K-M-2
CTC
10,5
<BG
–
–
<BG
a) Angaben der Betriebsleiter
b) ∑CTC: Summenparameter, bestimmt aus iso-CTC- und epi-iso-CTC-Gehalte (entsteht während der
ammoniakalischen Extraktion des Bodens aus CTC)
c) Summe iso-CTC und epi-iso-CTC
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 87
Die extrahierbaren Gehalte an CTC und TC liegen maximal im Bereich von 120 µg/kg TM
(Probe K-S-5). Dagegen enthiel eine Bodenprobe aus dem Kreis Coesfeld (K-S-2), auf dem
nach Angaben des Betriebsleiters keine Tetracycline eingesetzt worden waren, enthielt keine
nachweisbaren Pharmakarückstände. Bei fünf Proben aus dem Kreis Borken (K-H-2 bis K-H-
6) wurden in den LC-MS-Chromatogrammen der Extrakte im Bereich der Nachweisgrenze
schwache, nicht mehr quantifizierbare CTC- und TC-Signale detektiert. DC, OTC und DMC
waren in keiner Bodenprobe nachweisbar.
In den Getreideproben sind positive Befunde besonders auffällig im Weizen K-S-1. In dem
Getreide fanden sich CTC- und iso-CTC-Komponenten (58 und 53 µg/kg FG) sowie TC-
Komponenten (<BG). Chlortetracyclinspuren wurden auch in Proben aus dem Kreis Borken
gefunden, sowie in einer Probe aus dem Kreis Warendorf (K-M-2).
Auffällig ist, dass TC von Betrieben nicht angegeben wurde, aber trotzdem in einer
Coesfelder Weizenprobe (K-S-1) nachgewiesen worden war. Vermutlich ist CTC über einen
Dehalogenierungsprozess zu TC umgebildet worden (s. Abb. 26).
In der Probe K-M-2 konnten CTC-Gehalte (<BG) festgestellt werden. Der höchste CTC-
Gehalt (iso-CTC+e-iso-CTC) von 95,9 µg/kg wurde im Kreis Coesfeld gefunden. Die
ermittelten Gehalte für Winterweizen im Kreis Borken betrugen durchschnittlich 55,4 µg/kg.
Auch im Kreis Warendorf wurde CTC nachgewiesen. Dagegen wurde in den Kontrollproben
(Futterweizen) kein CTC gefunden.
Einen besonderen Befund stellt das in der Weizenprobe K-S-1 sicher qualitativ
nachgewiesene und quantitativ bestimmte DMC dar (68 µg/kg FG). Mit hochauflösender
Massenspektrometrie wurde DMC in weiteren Proben des Kreises Borken eindeutig
identifiziert. Bis 1989 wurde dieses Antibiotikum in der Humanmedizin eingesetzt, aber dann
wegen seiner toxischen, teratogenen und fotosensibilisierenden Wirkungen vom Markt
genommen [75]. Auch in der Veterinärmedizin ist DMC nicht mehr zugelassen. Hier hatte
nach eigenen Angaben keiner der am Screening beteiligten Betriebe DMC angewandt,
sondern CTC. Neben der unwahrscheinlichen veterinärmedizinischen Anwendung in der
Tierproduktion sind aber prinzipiell andere Eintragspfade bzw. Quellen in Boden und
Pflanzen möglich, da sich DMC durch Abspaltung einer Methylgruppe vom CTC-Molekül (C6-
Demethylierung, s. Abb. 26) bilden kann.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 88
Abb. 26: Mögliche Reaktionswege der Metabolisierung von Chlortetracyclin
Im CTC-Molekül sind mehrere Methylgruppen vorhanden, deshalb könnten auch mehrere
demethylierte Metabolite auftreten. Demethylierte Produkte von CTC zeigen eine
vergleichsweise hohe Stabilität hinsichtlich der Bildung von Epimeren, die während der
Probenvorbereitung entstehen können. Demethylierungsreaktionen sind im Boden und der
Rhizospäre der Pflanze durchaus denkbar, worauf eigene Untersuchungen und
Literaturdaten (s. Kap.5.3) hinweisen.
Im nächsten Abschnitt werden exemplarisch positive Befunde auf DMC in Weizen im Detail
beschrieben.
7.1.2.1 Positiver Demeclocyclin-Befund
Identifizierung und Quantifizierung mit niedrig auflösender MS (LC-MS)
In der Weizenprobe K-S-1 wurde DMC über den Vergleich mit dem Standard im niedrig
auflösenden LC-MS2 identifiziert. Die Analyse der K-S-1-Weizenprobe lieferte die in den
folgenden Abbildungen dargestellten Massenchromatogramme und MS-Spektren.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 89
Abb. 27: Vergleich der Massenchromatogramme und -spektren der K-S-1-Weizenprobe
(oben) mit dem DMC-Standard (unten): LC-MS/MS (LR-MS), SRM-Modus
e:\daten\...\messung230707\0,1-1 25.07.2007 14:23:58
RT: 0.00 - 35.06
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
8.33
9.69
11.94
12.37
8.39 9.80
10.50
1.10 12.70
5.76 17.88 23.22 24.71
2.33 21.73
NL: 3.84E4
TIC F: + c ESI SRM
ms2
465.00@cid40.00
[429.00-431.00;
447.00-449.00] MS
Steg-1-3
NL: 7.59E5
TIC F: + c ESI SRM
ms2
465.00@cid40.00
[429.00-431.00;
447.00-449.00] MS
0,1-1
Steg-1-3 #539 RT: 9.69 AV: 1NL: 1.90E4
F: + c ESI SRM ms2 465.00@cid40.00 [429.00-431.00; 447.00-449.00]
430 432 434 436 438 440 442 444 446 448
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
447.76
430.19
0,1-1 #559 RT: 9.80 AV: 1NL: 5.13E5
F: + c ESI SRM ms2 465.00@cid40.00 [429.00-431.00; 447.00-449.00]
430 432 434 436 438 440 442 444 446 448
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
447.93
429.92
447.30
e:\daten\...\messung230707\0,1-1 25.07.2007 14:23:58
RT: 0.00 - 35.06
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
8.33
9.69
11.94
12.37
8.39 9.80
10.50
1.10 12.70
5.76 17.88 23.22 24.71
2.33 21.73
NL: 3.84E4
TIC F: + c ESI SRM
ms2
465.00@cid40.00
[429.00-431.00;
447.00-449.00] MS
Steg-1-3
NL: 7.59E5
TIC F: + c ESI SRM
ms2
465.00@cid40.00
[429.00-431.00;
447.00-449.00] MS
0,1-1
Steg-1-3 #539 RT: 9.69 AV: 1NL: 1.90E4
F: + c ESI SRM ms2 465.00@cid40.00 [429.00-431.00; 447.00-449.00]
430 432 434 436 438 440 442 444 446 448
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
447.76
430.19
0,1-1 #559 RT: 9.80 AV: 1NL: 5.13E5
F: + c ESI SRM ms2 465.00@cid40.00 [429.00-431.00; 447.00-449.00]
430 432 434 436 438 440 442 444 446 448
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
447.93
429.92
447.30
Probe
DMC?
DMC
e-DMC
e-DMC?
Standard
Standard
Probe
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 90
Im ersten Schritt wurden die Retentionszeiten von DMC in der Probe und in einem Standard
verglichen. Die Abweichung der Retentionzeiten war <5% (Toleranz 5 %). In einem zweiten
Schritt wurden die relativen Intensitäten der Produkt-Ionen miteinander verglichen. Die
relative Skala der Intensität bezieht sich auf das intensivste MS-Signal. Die Abweichung der
relativen Intensitäten war 8 % (Toleranz 50 %). Zur Bestätigung von Befunden mittels LC-
MS/MS werden mindestens 1 Precursor- und 2 Produkt-Ionen benötigt [260]. DMC besitzt in
der Weizenprobe im positiven ESI-Modus ein Precursor-Ion mit dem m/z-Verhältnis 465,1.
Der MS2-Scan liefert zwei Produkt-Ionen: 448,0 m/z und 430,0 m/z.
Aus der Übereinstimmung der Retentionszeiten sowie MS-Spektren mit dem Standard und
den charakteristischen Fragmentierungen (Verlust von NH3 und Verlust von H2O aus dem
[M+H]+, s. Kap.6.3.2.1) von DMC kann angenommen werden, dass es sich um die
angegebenen Verbindungen handelt.
So wurde die eindeutige Identifizierung mittels niedrigauflösender MS unter Beachtung
europäischer Richtlinien durchgeführt. Eine weitere Absicherung der Identifizierung ist über
den Vergleich der berechneten exakten Massen mit den gemessenen Massen im
hochauflösenden FTICR-MS möglich.
Bestätigung positiver Befunde mit hochauflösendem MS (FTICR-MS)
Bei der K-S-1-Weizenprobe wurden zur Absicherung der positiven DMC-Befunden MSn
Experimente mit einem hochauflösenden FTICR-MS des ISAS (Institute of Analytical
Science), Dortmund durchgeführt. Dabei wurde die Übereinstimmung der Retentionszeiten,
der exakten Massen, der Isotopenmuster und Fragmentierungen von DMC beobachtet.
Die Abb. 28 zeigt die Massenchromatogramme und MS-Spektren der K-S-1-Weizenprobe.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 91
Abb. 28: Vergleich der Massenchromatogramme und –spektren der K-S-1-Weizenprobe
(oben) und mit den e-DMC- und DMC-Standard (unten): FTICR-MS (HR-MS),
Full Scan
Die Retentionzeiten von e-DMC (11,9 min) und DMC (16,9 min) in der Probe stimmen fast
mit der Retenzionzeit im Standard (12,5 und 17,7 min) überein sowie auch die exakte Masse
von DMC in der Probe (465,10532) und im Standard (465,10547).
Zur Unterscheidung der massengleichen Verbindungen von DMC wurden die MSn-Spektren
der jeweils intensivsten Vorläuferionen bis zu den MS4-Experimenten miteinander verglichen
(Abb. 29).
Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 92
Abb. 29: Vergleich der Massenspektren der K-S-1-Weizenprobe mit dem DMC-Standard: FTICR-MS (HR-MS), Full Scan
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 92
_____________________________________________________________________________
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 93
Die FTICR-MSn-Spektren von DMC in der Probe stimmen mit den Spektren vom DMC-
Standard sehr gut überein. Bei einer Retentionszeit von 16,9 min wurden die Fragmente im
MS1 m/z=465,1, im MS2 m/z=448,0, im MS3 m/z=430,1 und im MS4 m/z=367,2 registriert. Bei
dem Standard tauchen dieselben Fragmente auf. So lässt sich daraus auf die Anwesenheit
von DMC sowie auch e-DMC schließen.
Mit dem zugehörigen Kalkulationsprogramm des FTICR-MS-Gerätes können exakte Massen
des DMC-Wirkstoffes berechnet werden. Die exakte Masse (monoisotopische Masse) eines
Ions ist berechnet aus den häufigsten Isotope der im Ion vorhandenen Elemente. Für jeden
Peak aus dem Chromatogramm lassen sich die gemessen exakten Massen der Fragmente
mit den berechneten Werten vergleichen. Eine Massenabweichung zwischen berechneter
und gemessener Masse von ≤ 2ppm lässt eine eindeutige Identifizierung der Substanz zu.
Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 94
Abb. 30: Vergleich des gemessenen Massenspektrums der K-S-1-Winterweizenprobe bei 11,87 min (oben) mit dem berechneten
Massenspektrum von DMC mit m/z = 465,010592 (unten): FTICR-MS (HR-MS)
465.0 465.5 466.0 466.5 467.0 467.5 468.0
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
465.10532
466.22888 467.26257
467.10205
466.10861
465.25604 468.10571
467.43964
466.27252
465.34424
467.01465
465.10592
467.10400
466.10912
468.10674
NL:
5.67E3
070807-41#865 RT: 11.87
AV: 1 T: FTMS + p ESI d SIM
ms [461.00-471.00]
NL:
1.38E4
C21 H22 N2O8Cl:
C21 H22 N2O8Cl1
p (gss, s/p:40) Chrg 1
R: 50000 Res .Pwr . @FWHM
berechnet
Probe
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 94
______________________________________________________________________________
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 95
Wie in Abb. 30 zu sehen ist, wurde DMC über die exakte Masse wie auch über die
Isotopenübereinstimmung identifiziert. Die berechneten Massendaten der Isotopenpeaks
(465,10592, 466,10912, 467,10400 und 468,10874) stimmen mit den gemessenen sehr gut
überein, wobei die maximale Massenabweichung <2 ppm war. So ließ sich mit dem
hochauflösenden MS-System in der Weizenprobe K-S-1 DMC sowie e-DMC sicher
identifizieren.
Ernte 2006
Die Ergebnisse der Analysen des im Jahr 2006 in den Kreisen Borken und Coesfeld
beprobten Getreides unterscheiden sich erheblich von den Ergebnissen der Erntezeit 2005
(Tab. 28). Im Winterweizen waren keine Tetracycline nachweisbar und auch nicht in Gerste
und Triticale. In einigen LC-MS-Chromatogrammen der Getreideextrakte wurden im
Intensitätsbereich des Matrixuntergrundes sehr schwache Peaks detektiert, die im MS²-
Modus auf TC/CTC-Spuren hinweisen, aber letztendlich keine sichere Identifizierung
erlauben.
Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 96
Tab. 28: Ernte 2006 - Ergebnisse der Getreideanalysen
- negativer Befund + positiver Befund (> BG)mit LC/MS² niedrig auflösend
‡ Bestätigung durch hochauflösende MS (+) und(+‡): positiver Befund (< BG)
Probe
TC
e-TC
DC
e-DC
OTC
e-OTC
DMC
e-DMC
CTC
e-keto-
CTC
e-enol-
CTC
iso-
CTC
e-iso-
CTC
Niedersachsen
NS1 W a)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
NS1 W b)
-
-
+‡
+‡
-
-
-
-
-
-
-
-
-
NS2 W
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
NS3 W
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
NS4 W
-
-
(+)
(+)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
NS5 W
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
NS6 W
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
NS7 W
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
NS8 W
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Borken kein positiver Befund
Coesfeld kein positiver Befund
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 96
_____________________________________________________________________________
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 97
In den Proben NS1 W b) und NS2 W wurde ein DC-Gehalt von ca. 30 mg/kg FG ermittelt, in
Probe NS4 W lag er unter der Bestimmungsgrenze. Keiner der niedersächsischen Betriebe
hatte aber nach eigenen Angaben DC angewandt (s. Anh.2, Tab. A6c), sondern CTC, TC
(Betriebe NS1 und NS2) und Oxytetracyclin (OTC, Terramycin). Wie schon bei der
Abhandlung der möglichen Bildung des Demeclocyclins (Ernte 2005, Kreis Borken)
angedeutet, wären neben einem Eintrag über OTC-haltige Gülle auch die Bildung über
metabolische reduktive / oxidative Prozesse in Boden oder Pflanze und die Bildung des DC
aus OTC (Dehydroxylierung), TC (Hydroxylierung) oder CTC (Dehalogenierung und
Hydroxylierung) chemisch möglich (s. Seite 88, Abb. 26). Die Interpretationen der DC-
Befunde müssen bei der gegenwärtigen Datenlage als spekulativ angesehen werden.
Ergänzend ist darauf hinzuweisen, dass in der Weizenprobe NS1-W a) im Unterschied zur
Probe NS1-W b) keine Tetracycline nachgewiesen wurden, obwohl die jeweiligen Felder mit
der gleichen Gülle in vergleichbarer Menge gedüngt worden waren. Unterschiede zwischen
den Proben ergaben sich lediglich in der Bodenart: lehmiger Sand bei Probe NS1-W a) und
Sand bei Probe NS1-W b). Ob dies die Ursache für den unterschiedlichen Tetracyclintransfer
darstellt, ist zurzeit ungewiss.
Ein weiterer Einflussfaktor auf das Ausmaß des Eintrags in Getreide ist wahrscheinlich auch
in der Antibiotikakonzentration der Gülle gegeben. Aus früheren Untersuchungen in der
landwirtschaftlichen Praxis [6] ist bekannt, dass diese stark variiert und zum Teil ein
erhebliches Ausmaß erreichen kann ( 45 mg/kg TC bzw. 30 mg/kg CTC). Die
vorhergehenden Studien lassen vermuten, dass die Aufnahme in Getreide von der Höhe der
Bodenbelastung während des Pflanzenwachstums mitbestimmt wird. Die
Antibiotikakonzentration in den Güllen zum Zeitpunkt der Ausbringung der am Screening
beteiligten Betriebe konnte jedoch nicht ermittelt werden.
7.1.2.2 Positiver Doxycyclin-Befund
Identifizierung und Quantifizierung mit niedrig auflösender MS (LC-MS)
Eine auffällige Singularität wurde in drei Weizenproben aus Niedersachsen entdeckt, in
denen Doxycyclin identifiziert wurde. In der Abb.31 werden die Massenchromatogramme und
MS-Spektren der NS1 b)-Winterweizenprobe dargestellt.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 98
Abb.31: Vergleich der Massenchromatogramme und -spektren der NS1 b)-Weizenprobe
(oben) mit dem DC-Standard (unten): LC-MS/MS (LR-MS), SRM-Modus
e:\daten\...\messung090807\0,1-1 10.08.2007 09:49:18
RT: 0.00 - 35.02
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
13.21
12.50 23.16
5.99 11.20
1.23 8.00 23.77
15.13 18.76 20.195.28
12.45
13.15
24.31
7.73 12.10
6.42 13.76 22.37
16.82
1.34 25.29
18.84
4.85
NL: 9.61E4
m/z= 427.50-428.50 F: +
c ESI Full ms2
445.00@cid34.00
[120.00-500.00] MS
NS1b)W-110607-02
NL: 1.39E6
m/z= 427.50-428.50 F: +
c ESI SRM ms2
445.00@cid34.00
[409.00-411.00;
425.50-428.50] MS
0,1-1
NS1b)W-110607-02 #657 RT: 13.21 AV: 1NL: 9.61E4
F: + c ESI Full ms2 445.00@cid34.00 [120.00-500.00]
150 200 250 300 350 400 450 500
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
428.00
0,1-1 #752 RT: 13.15 AV: 1NL: 5.69E5
F: + c ESI SRM ms2 445.00@cid34.00 [409.00-411.00; 425.50-428.50]
410 412 414 416 418 420 422 424 426 428
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
427.99
427.23
DC?
e-DC?
DC
e-DC
Probe
Standard
Probe
Standard
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 99
DC und e-DC wurden in dieser Weizenprobe eindeutig detektiert. Sowohl Retentionszeit,
m/z-Bereich sowie Fragmentierungen im Fullscan stimmen überein.
Bestätigung positiver Befunde mit hochauflösender MS (FTICR-MS)
Die erhaltenen Massenspuren mittels hochauflösender MS für DC und e-DC sind in der Abb.
32 dargestellt.
Abb. 32: Vergleich der Massenchromatogramme der N-S-1b)-Weizenprobe (oben) mit dem
DC-Standard (unten): FTICR MS (HR-MS), Full Scan
RT: 17.75 - 39.66 SM: 3B
18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
Time (min)
20
40
60
80
100
Relative Abundance
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
20
40
60
80
100
Relative Abundance
25.23 26.11 32.18
23.45 27.81
21.25 24.01 30.31
29.74
21.93
18.76 33.80
19.88
34.54
35.38
38.32
37.42
27.61
25.78 30.94
24.58
23.79
22.53
21.45 29.27
20.26 38.6931.57 34.89
28.06
26.37
23.46
22.10 30.07
20.19
18.41 31.09 32.85 34.74 35.47 36.97 39.22
NL: 2.10E6
TIC F: FTMS + p ESI
Full ms [400.00-500.00]
MS 070807-25
NL: 5.03E4
m/z=
445.15386-445.16722
F: FTMS + p ESI Full
ms [400.00-500.00]
MS 070807-25
NL: 1.79E5
m/z=
445.15386-445.16722
F: FTMS + p ESI Full
ms [400.00-500.00]
MS
070807-
05_070807192139
DC
DC
Probe
Standard
e-DC
e-DC
Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 100
Abb. 33: Vergleich des gemessenen Massenspektrums der N-S-1 b)-Winterweizenprobe bei 27,32 min (oben) mit dem
berechneten Massenspektrum von DC mit m/z = 445,16054 (unten): FTICR-MS (HR-MS)
445.0 445.2 445.4 445.6 445.8 446.0 446.2 446.4 446.6 446.8 447.0 447.2
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
445.15985
446.16327
446.74429
446.49350
445.30151 446.99432
445.98529 447.24478
446.30368
445.75720
445.42255
445.16054
446.16376
447.16620
NL:
1.28E4
070807-25#1961 RT: 27.32
AV: 1 T: FTMS + p ESI d SIM
ms [441.00-451.00]
NL:
8.99E4
C22 H25 O8N2:
C22 H25 O8N2
p (gss, s/p:8) Chrg 1
R: 45000 Res .Pwr . @FWHM
berechnet
Probe
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 100
______________________________________________________________________________
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 101
Für jeden einzelnen Peak lassen sich die gemessenen exakten Massen (hochauflösend) mit
den berechneten Massen vergleichen. Die Abbildungen zeigen, dass bei DC und e-DC
Retentionszeit, SIM-Scan und Isotopenmuster im Fullscan übereinstimmen. Somit konnten
DC und e-DC mit hochauflösender MS sicher identifiziert werden.
7.1.3 Proben aus der besonderen Ernteermittlung des Bundessortenamtes
In zwei Weizenproben aus der besonderen Ernte- und Qualitätsermittlung (BEE) nach
Agrarstatistikgesetz (Max Rubner-Institut, Detmold) wurden keine Rückstände von
Tetracyclinen nachgewiesen. Negativbefunde ergaben auch Proben von Winterweichweizen
und Wintergerste des Bundessortenamtes der Prüfstelle Rethmar. Dieser Befund ist von
Bedeutung für die Verlässlichkeit der angewandten Analytik, denn diese Proben entstammen
BSA- Flächen, die mindestens 10 Jahre nicht mit Gülle gedüngt worden waren. Die Analytik
hat folgerichtig keine (falsch) positiven Befunde ergeben, die durch die bekannte Neigung
der Tetracyline zu Verschleppungseffekten verursacht werden kann.
Auffällige Peaks in Chromatogrammen der BEE- und BSA-Proben (und auch anderer
Kornproben), die im Retentions- und Massenbereich der in Weizenwurzeln (Hydrokultur)
identifizierten N-Desmethyl-Tetracycline lagen, konnten im hochauflösenden Modus nicht
diesen Demethylierungsprodukten zugeordnet werden. Diese Signale wurden wohl von
Matrixbestandteilen hervorgerufen; es handelt sich also um Artefakte, die als solche erkannt
wurden.
7.2 Erkennung falsch positiver Befunde mit hochauflösender MS
Der offensichtlich hohe Matrixanteil in den Messproben von Getreide und Gemüse
beeinflusst die Selektivität der LC/MS-Technik. Dieses gilt besonders für Matrices mit hohem
Proteinanteil. Proteine sowie Peptide werden koextrahiert und somit durch die
Probenaufarbeitung mit SPE nicht vollständig entfernt. Dieses kann bei der LC/MS-Analyse
zur Koelution von störenden Matrixbestandteilen bzw. zu falsch positiven Ergebnissen
führen. Bei diesen hochkomplexen Proben reicht die Selektivität der niedrigauflösenden MS
nicht immer aus, um trotz der chromatographischen Vortrennung falsch positive Befunde zu
vermeiden. Das folgende Beispiel (Abb. 34) zeigt die vermeindliche Detektion von DMC in
einer Weizenprobe aus Ernte 2006 (Coe7W) mit der niedrigauflösenden LC-MS/MS-
Methode. Zur Vermeidung falsch positiver Befunde wurde die hochauflösende MS
eingesetzt. Diese liefert gesteigerte Selektivität aufgrund der wesentlich höheren Auflösung
und der exakten Masse.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 102
Abb. 34: Vergleich der Massenchromatogramme und -spektren der Coe 7W-Weizenprobe
(oben) mit dem DMC-Standard (unten): LC-MS/MS (LR-MS), SRM-Modus
f:\didem\messung210908\mit-1-2 9/24/2008 3:22:59 PM
RT: 0.00 - 35.04
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
12.05
9.71
7.43
8.82 12.96 15.38 17.37 26.85
18.36 27.19
22.51 23.11
9.86
8.43
5.34 10.347.11 20.46
5.10 15.841.51 24.97
22.8812.37 18.14
NL: 9.43E4
TIC F: + c ESI SRM
ms2 465.00@cid40.00
[429.00-431.00,
447.00-449.00] MS
P2-Brue-B-220108-02
NL: 6.99E5
TIC F: + c ESI SRM
ms2 465.10@cid40.00
[429.00-431.00,
447.00-449.00] MS
mit-1-2
P2-Brue-B-220108-02 #534 RT: 9.71 AV: 1NL: 7.51E4
F: + c ESI SRM ms2 465.00@cid40.00 [429.00-431.00, 447.00-449.00]
430 432 434 436 438 440 442 444 446 448
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
448.07
429.90
mit-1-2 #578 RT: 9.86 AV: 1NL: 5.94E5
F: + c ESI SRM ms2 465.10@cid40.00 [429.00-431.00, 447.00-449.00]
430 432 434 436 438 440 442 444 446 448
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
447.92
429.96
f:\didem\messung210908\mit-1-2 9/24/2008 3:22:59 PM
RT: 0.00 - 35.04
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
12.05
9.71
7.43
8.82 12.96 15.38 17.37 26.85
18.36 27.19
22.51 23.11
9.86
8.43
5.34 10.347.11 20.46
5.10 15.841.51 24.97
22.8812.37 18.14
NL: 9.43E4
TIC F: + c ESI SRM
ms2 465.00@cid40.00
[429.00-431.00,
447.00-449.00] MS
P2-Brue-B-220108-02
NL: 6.99E5
TIC F: + c ESI SRM
ms2 465.10@cid40.00
[429.00-431.00,
447.00-449.00] MS
mit-1-2
P2-Brue-B-220108-02 #534 RT: 9.71 AV: 1NL: 7.51E4
F: + c ESI SRM ms2 [email protected] [429.00-431.00, 447.00-449.00]
430 432 434 436 438 440 442 444 446 448
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
448.07
429.90
mit-1-2 #578 RT: 9.86 AV: 1NL: 5.94E5
F: + c ESI SRM ms2 [email protected] [429.00-431.00, 447.00-449.00]
430 432 434 436 438 440 442 444 446 448
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
447.92
429.96
DMC?
DMC
Probe
Standard
Probe
Standard
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 103
Wie in Abb. 34 zu sehen, wurden in einigen LC-MS-Chromatogrammen der Getreideextrakte
im Intensitätsbereich des Matrixuntergrundes sehr schwache Peaks detektiert, die im
MS/MS-Modus auf DMC-Spuren hinweisen. Diese Peaks in den Chromatogrammen der
Getreideprobe aus der Erntezeit 2006 lagen im Retentionszeits- und m/z-Bereich von DMC.
Um Matrixeffekte auszugleichen, wurde die zu analysierende Messprobe mit bestimmten
Mengen an DMC-Standardlösung versetzt. Die Ergebnisse lieferten eine Übereinstimmung
der Retentionszeit und MS-Spektren von dotierten und undotierten Getreideproben.
Zur Absicherung des positiven DMC-Befunds wurde die Weizenprobe (Coe-7W, Ernte 2006),
zusätzlich mit hochauflösender MS gemessen. In Abb. 35 ist das Massenchromatogramm für
DMC mit FTICR-MS aufgeführt.
Bei Elektrospray-Ionisation (ESI)-Massenspektrometrie treten nicht nur einfach geladene
Molekül-Ionen auf, sondern es entstehen bei Proteinen und Peptiden bevorzugt mehrfach
geladene Molekül-Ionen vom Typ (M+nH)n [261]. Die Peptid-Ionen zeigen meist weniger
Ladungen, je nach Größe des Peptids und nach Anzahl und Position von basischen
Aminosäuren. Wenn man nur eine geladene Spezies im Spektrum detektiert, kann die
Ladung und damit die Masse eines Peptids bestimmt werden, indem man die jeweilige
Differenz der m/z-Werte der Isotopenpeaks verwendet (Abb. 36).
Der Abstand beträgt bei einfach geladenen Ionen zwischen den Isotopen 1 Da
(Masseneinheit, 1 Da=1,6605*10-27 kg), bei doppelt geladenen (wegen m/z) 0,5 Da und bei
dreifach geladenen 0,33 Da. Bei größeren Molekülen kann die Auflösung der
niedrigauflösenden MS nicht mehr ausreichen, um die Isotopen von hochgeladenen Ionen zu
unterscheiden [262]. Zuordnungen der Signale der Massenchromatogramme, die
ursprünglich dem DMC zugeordnet worden sind, ließen sich in der Hochauflösung (FTICR-
MS) nicht bestätigen. Dabei stellte sich heraus, dass die m/z-Werte mehrfach geladener
Peptidfragmente, [M+H]n+ (n=3, Abstand zwischen den Isotopen 0,33 Da) in den Quasi-
Molekülionenbereich von DMC fallen, was zu falsch positiven Befunden mit der
niedrigauflösenden LC-MS-Methode führen kann (s. Abb. 36). Dieser Sachverhalt wird im
folgenden Kapitel näher erläutert.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 104
EIC: Extracted Ion Chromatogram
Abb. 35: Vergleich der Massenchromatogramme der Coe-7W-Weizenprobe (oben) mit dem
DMC-Standard (unten): FTICR MS (HR-MS), Full Scan
Abb. 36: Vergleich des gemessenen Massenspektrums der Coe7W-Weizenprobe bei 17,06
min (oben) mit dem berechneten Massenspektrum für DMC (unten): FTICR-MS
(HR-MS), Full Scan
Koeluierende Verbindung mit fast identischem m/z-Wert?
3-fach positiv geladene Peptidfragmente
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 105
7.2.1 Koelution von Peptiden bei der LC/MS-Analyse
Die Koelution bedeutet für die LC-MS mit einem ESI-Interface, dass diese auch gleichzeitig
ionisiert und detektiert werden. Diese bilden im Spektrum eine Reihe von Signalen mit m/z =
(M + nH+)/n und können ähnliche m/z-Werte aufweisen wie die Analytmoleküle. Des
Weiteren kann es zu Matrixeffekten kommen (Ionensuppression).
Proteine bzw. Polypeptide sind im Getreide enthalten, etwa 80 % der Proteine des
Getreidekorns im Mehlkörper. Diese Proteine sind durch Hydrolyse der Peptidverbindungen
spaltbar (Abb. 37).
Abb. 37: Spaltung einer Peptidbindung (Amidbindung) durch enzymatische Hydrolyse [263]
Die Proteinhydrolyse erfolgt entweder chemisch oder enzymatisch. Insbesondere findet
diese enzymatische Hydrolyse in saurer Lösung statt. Dabei liegt das pH-Optimum der
enzymatischen Proteolyse im sauren Bereich. Daher ist anzunehmen, dass sich Peptide
durch enzymatische Proteolyse während der Extraktion mit Citratpuffer (pH 4,1) bilden, die
bei der anschließenden Festphasenextraktion (SPE) nicht vollständig entfernt werden.
Peptid-Fragmentierung
Die Fragmentierung der Peptide (Abb. 37) kann an drei verschiedenen Bindungspositionen
erfolgen:
– an der vom Carbonyl-Kohlenstoff ausgehenden C-C-Bindung,
– an der vom Carbonyl-Kohlenstoff ausgehenden C-N-Bindung,
– an der vom Amid-Stickstoff ausgehenden N-C-Bindung.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 106
Abb. 38: Fragmentierung der Peptide [263]
(a, b, c: N-terminalen Fragmente x, y, z: C-terminalen Fragmente)
Falls die Ladung bei der Spaltung am N-terminalen Fragment verbleibt, entstehen die N-
terminalen Sequenzionen a, b, c, wohingegen sich die C-terminalen Sequenzionen x, y, z,
bilden, wenn das C-terminale Fragment die Ladung trägt. Zudem kann es neben diesen drei
Fragmentierungsmöglichkeiten der Peptide zu Abspaltungen von H2O, NH3 und CO und an
den Seitenketten der Aminosäuren kommen [263].
Peptide fragmentieren recht fragmentreich, so dass es auch bei selektiven SRM-Methoden
zu falsch positiven Resultaten kommen kann. Dies liegt bei den Tetracyclinen eben an dem
recht unselektiven Massenverlusten von H2O und NH3, die ebenfalls bei Peptiden auftreten.
In Abb. 39 ist ein Fragmentierungbeispiel in einem Positiv-Ion MS-(ESI)-Spektrum des
Peptids PFGK (Prolin-Phenylalanin-Glycin-Lysin) dargestellt.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 107
Abb. 39: MS/MS Spektrum des Peptids PFGK [264]
In der Abb. 39 sind die kompletten y- und b- Fragmentionenserien und das a2-Fragmention
sowie das protonierte intakte Peptid PFGK (m/z 448,2) dargestellt. Das a2-Fragmention (m/z
217,5) wird durch die Abspaltung von Kohlenmonoxid aus dem b2-Fragmention (m/z 245,2)
gebildet.
Abschließend ließ sich zusammenfassen, dass Peptide recht fragmentreich fragmentieren,
so dass es auch mit selektiven SRM-Methoden zu falsch positiven Resultaten kommen kann.
Dies liegt bei den Tetracyclinen eben an dem recht unselektiven Massenverlusten von H2O
und NH3, die ebenfalls bei Peptiden auftreten.
7.2.2 Protease-Behandlung
Die mehrfach geladenen Peptid-Spezies, die in den Massenchromatogrammen in dem m/z-
Bereich von TC (400-500) fallen, können in der niedrigauflösenden MS positive TC-Befunde
vortäuschen. Deshalb ergab sich der methodische Ansatz, im Verlauf der
Probenaufarbeitung die Bildung der Peptide weitgehend zu unterdrücken. Dies könnte durch
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 108
Zusatz von Protease-Inhibitoren erreicht werden, die eine Hemmung der Peptidasen bzw.
der proteolytischen “Verdauung“ im Extrakt vor der LC/MS-Analyse bewirken.
Der in dieser Arbeit verwendete Protease-Inhibitor-Cocktail (Protease Inhibitor Cocktail for
plant cell and tissue extracts, Sigma) ist eine Mischung mit breiter Spezifität für die
Hemmung von Serin-, Cystein-, Asparaginsäure- und Metalloproteasen sowie
Aminopeptidasen. Zur Vermeidung des Protein-Abbaus in biologischen Proben ist die
Behandlung mit Protease-Inhibitoren bekannt [265, 266, 267]. Die Behandlung erfolgt
meistens durch Zugabe des Protease-Inhibitors in das Extraktionsmittel.
Im Rahmen der durchgeführten Voruntersuchungen wurden verschiedene Varianten dieser
Inkubationsmethode erprobt. Die Wiederfindungen wurden nach verschiedenen
Inkubationszeiten von 10, 20, 30 min bei Raumtemperatur (RT) ermittelt (Tab. 29).
Tab. 29: Wiederfindungen für verschiedene Inkubationsverfahren mit Protease-Inhibitor
Cocktail bei RT (BSA-Winterweizen, Dotierung 250 µg/kg FG, LC-MS/MS, n = 3)
Analyt
Wiederfindung [%]
ohne
Protease-Inhibitor
mit Protease-Inhibitor
Inkubationszeit
10 min
20 min
30 min
SFD
57,3
25,3
32,8
49,6
ENR
76,9
56,1
63,5
81,9
CIP
74,5
70,1
73,2
76,8
TC+e-TC
90,1
*
*
*
DC+e-DC
66,2
*
*
*
OTC+e-OTC
98,6
97,5
101,9
103,5
DMC+e-DMC
88,9
84,5
94,3
96,1
CTC+e-CTC
98,6
100,3
102,4
103,0
iso-CTC+e-iso-CTC
85,6
80,1
89,6
87,5
MON
51,4
50,5
62,6
51,9
* Peaküberlagerungen durch Protease-Inhibitor
Wie in der Tab. 29 zu sehen ist, schwanken die Wiederfindungen mit Ausnahme von SFD
nicht stark. Jedoch konnte nicht für alle Analyte ein Wiederfindungswert ermittelt werden, da
auch in den Chromatogrammen der mit Protease-Inhibitor dotierten Extrakte Zusatzpeaks
auftraten. Insbesondere im m/z-Bereich der Tetracycline überlagerten diese zusätzlichen
Peaks die eigentlichen TC-Peaks (Abb. 40).
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 109
Abb. 40: Überlagerung der Tetracyclin-Peaks durch Bestandteile des Protease-Inhibitors:
Aufarbeitung Standard-dotierte Weizenprobe mit Protease Inhibitor (oben) und
Aufarbeitung Standard-dotierte Weizenprobe ohne Protease Inhibitor (unten): LC-
MS/MS (LR-MS)
Daher wurden die Getreideextrakte bei weiteren Probenaufarbeitungen nicht mit Protease-
Inhibitor-Cocktail behandelt, weil sich diese Methode nicht bewährt hat.
7.3 Zusammenfassung der Ergebnisse der Screening-Studie
Die Analyse vom Getreide der Erntezeiten 2005 und 2006, das viehstarken Gebieten
entstammt, führte zu sicher identifizierten positiven Befunden über das Vorkommen von
Tetracyclinen (TC, CTC einschließlich Epimeren und Tautomeren, iso-CTC sowie DC und
DMC) - überwiegend in Winterweizen aus dem Jahre 2005. Die ermittelten Gehalte lagen
vielfach unter der jeweiligen Bestimmungsgrenze (~ 8 - 18 µg/kg FG) oder, in seltenen Fällen
im Bereich zwischen ~ 30 (iso-CTC, DC), ~ 60 (DMC, CTC) und maximal 95 µg/kg FG (iso-
CTC). Es ist anzunehmen, dass eine äußere Kontamination des Getreides durch Staub-
bzw. Bodenpartikel vernachlässigbar ist, so dass die nachgewiesenen Spuren an TC, CTC
und auch iso-CTC weitgehend auf einen Transfer von Tetracyclinen aus güllebeaufschlagten
Böden in die Pflanze zurückzuführen sind.
Es wurde festgestellt, dass nur in der Ernte 2005 (Kreise Borken, Coesfeld und Warendorf)
ein Zusammenhang zwischen angegebener Medikamentierung an Tetracyclinen (s. Anh.2)
ohne-protease-3 04.07.2008 18:42:01
RT: 0,00 - 35,05
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
9,14
8,70
7,54 10,35 13,106,83 26,0721,1518,8315,975,872,891,82 23,99
8,15
13,16
6,84
13,88
18,79
10,30 21,12
16,78
5,76 12,57
4,09 19,04
2,89
1,58 23,13 23,71 25,97
NL: 8,11E7
TIC F: + c ESI SRM
ms2 445,00@cid34,00
[409,00-411,00;
425,50-428,50] MS
Protease-3-2
NL: 5,72E5
TIC F: + c ESI SRM
ms2 445,00@cid34,00
[409,00-411,00;
425,50-428,50] MS
ohne-protease-3
DC
e-DC
Dotierte Weizenprobe mit
Protease-Inhibitor
Dotierte Weizenprobe ohne
Protease-Inhibitor
Überlagerung der
Tetracyclinpeaks durch
Bestandteile des Protease-
Inhibitors
TC
e-TC
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 110
und nachgewiesenen Tetracyclin-Gehalten (s.Tab. 26) in Boden und Korn erkennbar ist. Im
Getreide der Erntezeit 2006, das den Kreisen Borken und Coesfeld entstammt
(Winterweizen, Gerste und Triticale), wurden keine positiven Tetracyclin-Befunde festgestellt.
Ungeklärt bleiben sowohl die relativ hohen Gehalte an DMC im Winterweizen der Erntezeit
2005 aus dem Kreis Borken als auch die Befunde an DC in drei Proben aus Niedersachsen.
Ob Metabolisierung in Boden und/oder in Pflanze stattfinden kann, ist in weiteren
Untersuchungen zu klären. Die ermittelte, sehr heterogene Kontamination des Getreides der
beiden Erntezeiten könnte möglicherweise besser erklärt werden, falls mehr Informationen
über Kenngrößen und Daten, wie z.B. zu Güllebelastung und Witterungseinflüssen zur
Verfügung gestanden hätten.
Insgesamt ergab sich für die Entezeiten 2005 und 2006 ein heterogenes Belastungsprofil. Es
wurden Punktbelastungen festgestellt, d.h., dass keine flächendeckende Belastung an
Tetracyclinen vorlag. Die Negativbefunde im Kreis Borken könnten zu einem Großteil darauf
zurückgeführt werden, dass diese Betriebe in 2006 - im Unterschied zu 2005 – nach eigenen
Angaben weniger Tetracycline angewendet hatten (s. Anh.2), was aber nicht für den Kreis
Coesfeld zutrifft (s. Tab. 28). Ob besondere Bodenverhältnisse sowie Wetterbedingungen
den Transfer Boden-Pflanze und/oder den Transport in den Getreidepflanzen bis ins Korn
verhindert haben, bleibt ungeklärt.
In der vorangegangenen Antiinfektiva-Modellstudie war ein Transfer von CTC und iso-CTC in
die Getreidepflanze auf den Versuchsflächen nachweisbar, die zweimal organisch (mit
definiert Antibiotika-haltiger Gülle) gedüngt worden waren [75]. Daraus wurde gefolgert, dass
auch in der landwirtschaftlichen Praxis ein Antibiotikatransfer möglich ist. Die Ergebnisse der
Screening-Studie bestätigen, dass auch unter der Bedingungen der konventionellen
Landwirtschaft CTC-Rückstände im Boden pflanzenverfügbar sind und damit auch ein
Transportpfad in die Nahrungskette besteht. Jedoch tritt ein derartiger Transfereffekt unter
bestimmten, noch nicht definierbaren Bedingungen auf.
7.4 Untersuchung von handelsüblichen Weizenproben aus Niedersachsen
Im Rahmen eines Monitorings der niedersächsischen Mühlen wurden handelsübliche
Getreide und Getreidemahlerzeugnisse auf Antibiotikarückstände analysiert.
Handelsübliche Weizenmehle sind Produkte aus Auszugsmehl. Sie werden zur Herstellung
von Back- und Teigwaren, die im täglichen Alltag genutzt werden, verwendet. Die
Typenangabe der Mehle richtet sich nach der Mehltypenregelung der DIN 10355. Die
Typenzahl gibt dabei den Mineralstoffgehalt in Milligramm pro 100 Gramm der
Trockenmasse des Mehls an. Die Mineralstoffgehalte dürfen sich dabei in bestimmten
Bandbreiten bewegen. Das hier untersuchte Weizenmehl vom Typ 550 darf z.B. einen
Mineralstoffgehalt von 500 bis 630 mg pro 100 g Trockenmasse aufweisen.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 111
Die Analyse von handelsüblichen Weizenproben dient dazu, die Rückstandssituation im
Getreidewirtschaftsjahr 2008-2009 sowohl in Getreide als auch Getreidemahlerzeugnissen
zu überprüfen. Die aus der Screening-Studie gewonnenen Erkenntnisse wurden dabei auf
die rückstandsanalytischen Untersuchungen der unter Freilandbedingungen gewachsenen
Getreidepflanzen angewendet.
7.4.1 Probengewinnung
Die analysierten handelsüblichen Weizenproben entstammen fünf verschiedenen Mühlen
aus Niedersachsen. Insgesamt wurden 46 Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten
innerhalb des Jahres 2008 (Herbst 2008, Winter und Frühsommer 2009) auf Antibiotika-
Rückstände untersucht. Es standen Weizenproben in Form von Korn, Kleie oder Mehl zur
Verfügung. Dabei handelte es sich um:
Weizengetreide, gereinigt (Probenanzahl= 36)
Weizenmehl vom Typ 550 (Probenanzahl= 6)
Weizenkleie (Probenanzahl= 4)
Zusätzlich wurden 4 Weizenproben außerhalb des Monitoringsprogramms untersucht. Diese
Proben stammten aus Anbaugebieten mit Gülleausbringung und flossen als sogenannte
„Verdachtsproben“ in die Untersuchungen ein. Die entsprechenden Weizenpartien sind von
den im Monitoring teilnehmenden Mühlen nicht verarbeitet worden.
Die Weizenproben (Korn, Kleie, Mehl) wurden bis zur Analyse bei Raumtemperatur bis zu 9
Monate gelagert.
Mahlen und Sieben
Die bei RT gelagerten Weizenproben (Korn, Mehl, Kleie) wurden zuerst in verschiedenen
Schritten (Mahlen und Sieben) homogenisiert.
Weizenkorn
Die handelsüblichen Weizenproben wurden mit der in Anh.1.5.2.2 beschriebenen Methode
(Mahlen und Sieben) homogenisiert und zur Extraktion eingesetzt.
Weizenmehl
Makroskopisch war zu erkennen, dass die Weizenmehle viel feiner als die nach der
Hausmethode (mit der Labor-Mörsermühle) gemahlenen und gesiebten Weizenmehle
(Partikelgröße: d ≤ 0,106 mm) waren. Diese Mehle wurden daher ohne weitere
Homogenisierung direkt zur Extraktion eingesetzt.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 112
Weizenkleie
Die Kleieproben wurden nach der in Anh.1.5.2.2 beschriebenen Methode zuerst gesiebt
(ohne Mahlen). Anschließend wurde das gesiebte Mehl (d≤0,106 mm) zur Extraktion
eingesetzt.
Des Weiteren wurde die aus der Screening-Studie abgeleitete Analysenmethode (s.
Anh.1.5.2) auf die rückstandsanalytischen Untersuchungen der handelsüblichen
Weizenproben angewendet.
7.4.2 Ergebnisse der Analysen von handelsüblichen Weizenproben
Von den insgesamt 46 Getreideproben wurden in drei Weizenproben (Korn) ENR und in
einer Weizenprobe (Korn) OTC oberhalb der Nachweisgrenze detektiert. Die detektierten
massenchromatographischen Signale sind zwar von geringer Intensität, geben aber im
niedrig- und insbesondere im hochauflösenden MS quantitative Hinweise auf ENR (BG>20,8
µg/kg für ENR, s. Tab. 22). Demgegenüber waren keine Antibiotikarückstände in
Weizenmehl und Weizenkleie nachweisbar. Die positiven Befunde sind in der Tab. 30
aufgeführt.
Tab. 30: Gehalte an Antibiotikarückständen in handelsüblichen Weizenproben
Probenbezeichnung
Analyt
Gehalt [µg/kg]
HW-12
ENR
30,1
HW-14
32,7
HW-04
<BG
HW-36
OTC
<BG
Die Quantifizierung wurde anhand von matrixkalibrierten Referenzstandards vorgenommen.
In drei analysierten Weizengetreideproben (HW-12, HW-14, HW-04) war das Antibiotikum
ENR nachweisbar: In der Probe HW-14 ein Gehalt von 32,7 µg/kg und in HW-12 ein Gehalt
von 30,1 µg/kg. In der Probe HW-04 lag der ENR-Gehalt unter der Bestimmungsgrenze wie
auch für OTC in der Probe HW-36.
Weiterhin ist festzuhalten, dass in Kleie verschiedener Weizenproben HW-12, HW-14, HW-
04, HW-36 keine Antibiotika-Rückstände gefunden wurden, obwohl ENR in dem Mehl
nachweisbar war, das mit der Labormühle gemahlen worden war. Verschleppungen bzw.
Kontaminationen sind auszuschließen.
Schon visuell war zu erkennen, dass die konventionellen Weizenmehle (Typ 550) viel feiner
und heller waren als die selbst gemahlenen Weizenmehle (mit Labormühle). Das
Weizenmehl vom Typ 550 wird erheblich stärker ausgemahlen, somit ist möglicherweise die
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 113
Extrahierbarkeit von Matrixbestandteilen beim Mehl Typ 550 besser als bei selbst
gemahlenem Mehl. Wie im Kap. 7.2 beschrieben, können die Matrixbestandteile bei der
Analyse mit LC-MS zu negativen Befunde führen, z.B. durch Unterdrückung der Signale
(Suppression). In der Literatur lagen die Werte der Ionenunterdrückung in Wasserextrakten
für ENR bei 23-31 %, für SFM betrugen diese 12-27 % [28]. Auch in dieser Arbeit wurde für
ENR eine deutliche Suppression des Signals (SFD>ENR>TC) durch Matrixbestandteile
festgestellt. Daher wären Suppression-Effekte als mögliche Ursachen der negativen Befunde
in den Kleieproben denkbar.
7.4.3 Positiver Enrofloxacin-Befund
Identifizierung und Quantifizierung mit niedrig auflösender MS (LC-MS)
In der Abb. 41 sind als Beispiel die Massenchromatogramme und MS-Spektren der
Weizenprobe (HW-14) dargestellt, wobei ENR nachweisbar war: Die Identifizierung von ENR
mit niedrig auflösender MS (LC-MS/MS) erfolgte durch Vergleich der Retentionszeiten und
der MS-Spektren sowie der Produkt-Ionen-Intensitäten mit Standard nach Anhang I der
Richtlinie 96/23/EG [268].
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 114
Abb. 41: Vergleich der Massenchromatogramme und -spektren der HW-14-Weizenprobe
(oben) mit dem ENR-Standard (unten): LC-MS/MS (LR-MS), SRM-Modus
f:\didem\messung020209\std-ext-0,5-2 2/10/2009 5:21:33 AM
RT: 0.00 - 35.01
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
9.26
7.83 16.06
11.05 12.96 16.42
9.28
9.89 12.31 16.32
8.92
NL: 1.97E5
TIC F: + c ESI SRM ms2
360.20@cid42.00
[244.20-246.20,
315.20-317.20,
341.20-343.20] MS
W-200900714-1-1
NL: 1.91E6
TIC F: + c ESI SRM ms2
360.20@cid42.00
[244.20-246.20,
315.20-317.20,
341.20-343.20] MS
std-ext-0,5-2
W-200900714-1-1 #542 RT: 9.26 AV: 1NL: 1.47E5
F: + c ESI SRM ms2 360.20@cid42.00 [244.20-246.20, 315.20-317.20, 341.20-343.20]
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
316.12
341.67
245.04
316.94
std-ext-0,5-2 #537 RT: 9.28 AV: 1NL: 1.69E6
F: + c ESI SRM ms2 360.20@cid42.00 [244.20-246.20, 315.20-317.20, 341.20-343.20]
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
316.14
317.00
245.09 342.16
f:\didem\messung020209\std-ext-0,5-2 2/10/2009 5:21:33 AM
RT: 0.00 - 35.01
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
9.26
7.83 16.06
11.05 12.96 16.42
9.28
9.89 12.31 16.32
8.92
NL: 1.97E5
TIC F: + c ESI SRM ms2
360.20@cid42.00
[244.20-246.20,
315.20-317.20,
341.20-343.20] MS
W-200900714-1-1
NL: 1.91E6
TIC F: + c ESI SRM ms2
360.20@cid42.00
[244.20-246.20,
315.20-317.20,
341.20-343.20] MS
std-ext-0,5-2
W-200900714-1-1 #542 RT: 9.26 AV: 1NL: 1.47E5
F: + c ESI SRM ms2 [email protected] [244.20-246.20, 315.20-317.20, 341.20-343.20]
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
316.12
341.67
245.04
316.94
std-ext-0,5-2 #537 RT: 9.28 AV: 1NL: 1.69E6
F: + c ESI SRM ms2 [email protected] [244.20-246.20, 315.20-317.20, 341.20-343.20]
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
316.14
317.00
245.09 342.16
ENR
ENR?
Probe
Standard
Probe
Standard
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 115
ENR besitzt im positiven ESI-Modus ein Precursor-Ion mit dem m/z-Verhältnis 360,2 (s.Tab.
13). Der MS2-Scan liefert drei Produkt-Ionen: 316,1 m/z und 342,0 m/z und 245,0 m/z. Wenn
man die relativen Intensitäten der Produkt-Ionen in der Weizenprobe (21 % für 341,67 m/z)
und im Standard (<2 % für 342,16 m/z) miteinander vergleicht, stellt man fest, dass die
Abweichung der relativen Intensitäten bei 20 % liegt und damit unter dem Toleranzwert von
50 % (s. Kap.6.4.4). Jedoch stimmen die m/z-Verhältnisse der Produkt-Ionen dieses
Probenbestandteils nicht mit denen der Standardsubstanz überein. Die Massenabweichung
von ENR in der Weizenprobe (341,67 m/z) und im Standard (342,16 m/z) ist 0,14. Somit ist
die Identifizierung von ENR in Probe HW-14 des handelsüblichen Weizens mit dem niedrig
auflösenden LC-MS-Verfahren nicht hinreichend gesichert. Zur Absicherung war eine
zusätzliche Analyse von dieser Weizenprobe mit hochauflösender MS nötig.
Bestätigung positiver Befunde mit hochauflösender MS (FTICR-MS)
In Abb. 42 sind die Massenchromatogramme von ENR in der Probe und im Standard sowie
die MS-Spektren des ENR-Signals in der Probe und die berechneten MS-Werte für ENR
dargestellt.
Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 116
RT: 0.00 - 35.28
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
0
20
40
60
80
100 20.49
4.28
2.14
22.05
19.43
17.71
33.04
9.57 31.24
15.55 24.42
12.87 25.96
9.19
9.00
8.90
1.66
2.14 14.57
14.76
8.16 28.33
14.98 30.78 32.83
9.52 27.36
2.72 18.23
11.02 20.21
5.72
14.55
16.24 17.77 22.0513.45 24.28 30.5226.371.82 32.1110.528.022.84
NL: 9.16E5
TIC F: FTMS + p
ESI Full ms
[358.00-368.00] MS
090617-45
NL: 7.08E3
m/z=
360.16460-
360.17900 F: FTMS
+ p ESI Full ms
[358.00-368.00] MS
090617-45
NL: 4.92E5
m/z=
360.16460-
360.17900 F: FTMS
+ p ESI Full ms
[358.00-368.00] MS
090617-09
ENR?
Standard
ENR
Probe
Abb. 42: Vergleich der Massenchromatogramme der HW-14-Weizenprobe (oben) mit dem ENR-Standard (unten):
FTICR MS (HR-MS), Full Scan
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 116
______________________________________________________________________________
Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 117
Abb. 43: Vergleich des gemessenen Massenspektrums der HW-14-Weizenprobe bei 14,42 min (unten) mit dem berechneten
Massenspektrum von ENR mit m/z = 360,17126 (oben): FTICR MS (HR-MS), Full Scan
360.0 360.2 360.4 360.6 360.8 361.0 361.2
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
360.17126
361.17484
360.15491
360.67319 361.14029
360.20490 360.37143 360.98257
360.21246
361.10260
360.17136
361.21530
361.07016
360.23520 360.92813
NL: 4.84E5
090617-09#503
RT: 14.55 AV: 1
F: FTMS + p ESI
Full ms
[358.00-368.00]
NL: 4.46E3
090617-45#1089
RT: 14.42 AV: 1
F: FTMS + p ESI
Full ms
[358.00-368.00]
Probe
berechnet
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 117
______________________________________________________________________________
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 118
Die Abb. 43 zeigt, dass die Retentionszeit, die exakte Masse sowie die MS/MS Fragmente
übereinstimmen. Zusätzliche Signale resultieren aus der in der Ionenfalle ko-isolierten
Substanz mit m/z=316,21246. Somit wurde der positive Befund an ENR in der
handelsüblichen Weizenprobe (HW-14) bestätigt.
7.5 Zeitliche Veränderung der Antibiotika-Gehalte in belastetem Getreide
Folgende Faktoren können eine Konzentrationsabnahme von Antibiotikawirkstoffen mit der
Zeit in Pflanzenproben verursachen [269]:
• chemischer Abbau
• Sorption an Matrixbestandteile
Tetracycline unterliegen in den verschiedenen Umweltkompartimenten (z.B. Gülle, Boden)
vorkommenden biotischen und abiotischen Abbauprozessen. Neben diesem Abbau der
Wirkstoffe kann zusätzlich auch eine Adsorption an Matrixpartikeln (z.B. an Bodenpartikeln)
erfolgen. Dies kann deren nachweisbaren Gehalt im Laufe der Zeit vermindern.
In welchem Umfang Antibiotikawirkstoffe in Getreide (biotisch und abiotisch) abgebaut
und/oder an der Matrix sorbiert werden können, ist anhand der Literatur nicht abzuschätzen,
da keine Daten vorliegen. Es ist aber bekannt, dass Xenobiotika durch Photolyse und
Hydrolyse in der Pflanze abgebaut werden [191, 270, 271]. Abbauprozesse während der
Probenlagerung führen zur Bildung weiterer Produkte, was sich im Auftreten neuer Peaks mit
anderen Retentionszeiten äußerte. Andererseits können Pflanzenschutzmittel nach der
Aufnahme von Pflanzen in der Vakuole gespeichert oder an schwerlösliche Zellbestandteile,
insbesondere Lignin, gebunden werden. Dies kann zu gebundenen Rückständen in der
Pflanze führen, die nur schwer zu extrahieren und dadurch schwer direkt nachzuweisen sind
[272].
Wiederholversuche
Um zu klären, ob die oben aufgeführten Effekte auch bei den bereits analysierten
Getreideproben aufgetreten waren, wurden ausgewählte Proben mit Positiv-Befunden erneut
untersucht.
Stabilität von Doxycyclin in Weizenproben
Hierzu wurde die Analyse der NS1 b)- und NS2-Winterweizenproben aus der Ernte 2006
nach 24 monatiger Lagerung bei RT entsprechend der Arbeitvorschrift (s. Anh.1.5.2)
wiederholt. Bei diesen zwei Winterweizenproben handelt es sich um Proben, in denen DC
nachgewiesen wurde (s. Kap.7.1.2.2). In Tab. 31 sind die Ergebnisse dargestellt.
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 119
Tab. 31: Untersuchung zur Langzeit-Stabilität von Tetracyclinen in NS1 b)- und NS2
Winterweizenproben aus der Ernte 2006
(Lagerung bei RT, Lagerungszeit: 24 Monate)
Die erste Analyse der Proben NS1 b)-1-W und NS2-1-W zeigte einen positiven DC-Befund.
Der Gehalt an DC in der Weizenprobe NS1 b)-1-W liegt bei 31 µg/kg. Demgegenüber sind in
dieser Probe nach einer 24-monatigen Lagerung bei Raumtemperatur kein DC und e-DC
mehr nachweisbar (<NWG).
Stabilität von Enrofloxacin in Weizenproben
Im Rahmen dieser Wiederholanalysen wurden vier Kleieproben aus handelsüblichem
Winterweizen analysiert. Bei diesen Kleieproben handelt es sich um die Proben mit
positivem ENR-Befund (s. Seite 112, Tab. 30).
Tab. 32: Untersuchung zur Langzeit-Stabilität von ENR in Winterweizenproben aus
handelsüblichen Weizenproben (Lagerung bei RT, Lagerungszeit ca. 5 Woche)
Probe
gemahlen, gesiebt und
gemessen am
Befunde an ENR
HW-14
Weizen-1
10.05.09
32,7 µg/kg
Weizen-2
04.07.09
<BG
HW-12
Weizen-1
10.05.09
30,1 µg/kg
Weizen-2
04.07.09
<NWG
HW-04
Weizen-1
10.05.09
<BG
Weizen-2
04.07.09
<NWG
HW-09
Weizen-1
10.05.09
<BG
Weizen-2
04.07.09
<NWG
Die in Tab. 32 aufgeführten Ergebnisse lassen erkennen, dass ENR bei der ersten Analyse
quantifizierbar war (32,7 µg/kg und 30,1 µg/kg). Demgegenüber lag der Gehalt an ENR
Probe
Bezeichnung
gemahlen und
gesiebt am
aufgearbeitet
am
gemessen
am
Befunde
DC+e-DC
NS1 b)
NS1 b)-1-W
10.06.07
13.06.07
13.06.07
31 µg/kg
NS1 b)-2-W
10.06.07
28.04.09
28.04.09
< NWG
NS1 b)-3-W
11.05.09
11.05.09
11.05.09
< NWG
NS2
NS2-1-W
10.06.07
13.06.07
13.06.07
<BG
NS2-2-W
10.06.07
28.04.09
28.04.09
< NWG
NS2-3-W
11.05.09
11.05.09
11.05.09
< NWG
7 Untersuchung zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide 120
bereits nach fünf Wochen unterhalb der Bestimmungsgrenze (15 µg/kg). Eine
Konzentrationsabnahme war auch bei den anderen Weizenproben zu beobachten.
Ob die Konzentrationsabnahme der Substanzen DC und ENR in diesen Getreidematrices
auf Abbau- und/oder auf Sorptionsprozesse zurückzuführen ist, bleibt zurzeit jedoch
ungeklärt.
Fazit
Aus den Analyseergebnissen der handelsüblichen Weizenproben kann vorerst abgeleitet
werden, dass ENR und OTC (OTC wurde mit hochauflösender MS nicht bestätigt) bei
Getreide nur vereinzelt in geringsten Spuren nachgewiesen wurden. Das zeigt erneut, dass
ein Transfer von Tierarzneimittelrückständen über den Pfad Wirtschaftsdünger-Boden in die
Nutzpflanze möglich ist. Offensichtlich haben die Lagerungsbedingungen (Dauer,
Temperatur) einen Einfluß auf die ursprünglichen Antibiotika-Gehalte des Getreides. So lag
der Antibiotika-Gehalt nach fünf Wochen unterhalb der Bestimmungsgrenze im Rahmen des
Monitorings. Belastetes Getreide aus der Screening-Studie zeigte nach 24 Monaten auch ein
Gehalt unterhalb der Bestimmungsgrenze (s. Tab. 31). Ursächlich zu diskutieren sind
zeitabhängige Effekte, wie der chemische Abbau der Antibiotikaspuren und Sorption an die
Korn-Matrix.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 121
8 UNTERSUCHUNG ZUR AUFNAHME VON VETERINÄRANTIBIOTIKA IN GEMÜSE
Bei der Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse wurde im Sinne des
vorsorgenden Verbraucherschutzes im Rahmen dieses „Gemüse-Projektes’’ (MUNLV) [220]
das Aufnahmepotential von Weißkohl und Porree für verordnungsstarke Wirkstoffe (und ihre
Hauptmetabolite) aus der Nutztierhaltung über Dotierungsexperimente in Hydrokultur
untersucht. Weiterhin war geplant, rückstandsanalytische Daten über die Belastungssituation
von Gemüse zu ermitteln, das in landwirtschaftlicher Praxis angebaut wird.
8.1 Aufnahmeexperimente in Hydrokultur
Bei der Durchführung des Antiinfektiva-Vorprojektes [75] hatten sich Experimente in
Hydrokultur als methodisch äußerst vorteilhaft erwiesen. Denn dieses relativ einfache
System „Hydrokultur“ ist ohne Wechselwirkung mit Bodenpartikeln geeignet, das Potential
von Pflanzen zur Aufnahme von Veterinärpharmaka zu zeigen. Andererseits steht mit der
Anzucht von Gemüse auf Hydrokultur geeignetes Probenmaterial zur Verfügung, um die
Rückstandsanalytik zu entwickeln, zu optimieren und in der Pflanze gebildete Metabolite zu
identifizieren. Schließlich sollten die aus den Aufnahmeversuchen in Hydrokultur
gewonnenen Erkenntnisse auf die rückstandsanalytischen Untersuchungen der unter
Freilandbedingungen gewachsenen Gemüsepflanzen angewendet werden.
Um die Aufnahme von Antibiotika in Pflanzen analysieren zu können, mussten zuerst
geeignete Pflanzen herangezogen werden. Ausgewählt wurden dazu Porree und Weißkohl.
Diese Pflanzen entstammen unterschiedlichen Nutzpflanzenarten und decken damit
stellvertretend einen großen Teil unserer landwirtschaftlichen Nutzpflanzen ab, die mit Gülle
gedüngt werden (s. Kap.2.2).
Bei den Hydrokulturen wurden der Nährlösung verschiedene Antibiotikawirkstoffe in einer
Konzentration von 5 µmol/L zugesetzt. Exemplarisch wurden dazu die Wirkstoffe Sulfadiazin
(SFD), Enrofloxacin (ENR), Tetracyclin (TC), Chlortetracyclin (CTC) und Monensin (MON)
ausgewählt. Außerdem wurden in jeder Versuchsreihe auch Pflanzen angezogen, die keinen
Antibiotika-Zusatz in der Nährlösung erhielten. Diese Kontrollproben wurden bei der
Rückstandsanalytik, insbesondere bei den Matrixkalibrierungen und bei den Versuchen zu
Wiederfindung benötigt. Nach der Ernte wurden diese Pflanzen analysiert und die
aufgenommenen Mengen an Antibiotika ermittelt. Jedoch können die Wirkstoffe, die an die
Zellwände der Pflanzenzellen gebunden und damit immobilisiert sind, nicht erfasst werden.
Die Anzucht dieser Versuchspflanzen sowie die Dotierung für diese Aufnahmeexperimente
fanden an der Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel BfEL, Karlsruhe im
Institut für Biochemie von Getreide und Kartoffeln am Standort Detmold (seit Januar 2008:
Max Rubner-Institut, Institut für Sicherheit und Qualität bei Getreide) unter Leitung von Dr.
Langenkämper statt.
*in Hydrokultur
zudotiert
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 122
Die Entwicklung der Pflanzen wurde visuell und anhand der Biomassen verfolgt. In beiden
Aufnahmeexperimenten wurden nach ein- bis zweiwöchigem Wachstum der Pflanzen auf
antibiotikahaltiger Nährlösung die Pflanzenproben gewonnen. Diese wurden mit der im Anh.
1.5.3 beschriebenen Methode aufgearbeitet und mittels LC-MS (ESI-Ion Trap an der
Universität Paderborn) analysiert. Die Bestätigungsanalysen mittels FTICR-MS wurden am
ISAS - Dortmund durchgeführt.
8.1.1 Anzucht der Pflanzen
Keimung und Wachstumbedingungen
Die Porree- und Weißkohlsamen wurden zur Steigerung der Keimungsrate für 5 bis 10 Tage
inkubiert. Die Auskeimung der Samen erfolgte in so genannten „Sandwiches“, die aus zwei
äußeren Schaumstoffschichten und zwei inneren Filterpapierschichten bestanden, zwischen
denen die Samen in einzelnen Lagen aufgebracht wurden. Bei der Keimung der Samen
wurde besonders darauf geachtet, dass sich die bildenden Wurzeln ohne Beschädigungen
entwickeln und möglichst nicht verschimmeln können. Keimlinge von Sprosslänge wurden
auf Nährlösung in die Pflanzenwuchskammer transferiert. Es wurde sichergestellt, dass die
Wurzeln in die Nährlösung eintauchen. Die so größer gewordenen Pflanzen wurden später in
einem Pflanzenwuchsschrank angezogen. Diese Nährlösung wurde mit Hilfe von
Aquarienpumpen und Silikonschläuchen belüftet. Nähere experimentelle Angaben zur
Anzucht und Entwicklung finden sich im Anhang1.5.3.1.
Anzucht von Porree
Die Wuchszeit des gekeimten Porrees (Allium porrum L., cv. Shelton, F1, Hild Samen
GmbH, Marbach) betrug 50 Tage. Während dieser Zeit wurde die Nährlösung zweimal
vollständig gewechselt, ansonsten wurde verbrauchte Nährlösung nachgefüllt. Die
Nährlösung und die Wurzeln wurden regelmäßig visuell auf Kontamination durch
Pilzbewuchs kontrolliert. Pflanzen mit pilzbefallenen Wurzeln wurden entfernt. Nach 50
Wachstumstagen in der Pflanzenwuchskammer schlossen sich die Dotierungsexperimente
mit Antibiotika an.
Anzucht von Weißkohl
Gekeimter Weißkohl (Brassica oleracea, L., cv. Lennox, F1, Bejo Saaten, Niederlande)
wurde über einen Zeitraum von 21 Tagen angezogen. Zu diesem Zeitpunkt hatten die
äußeren Blätter die maximale Größe erreicht, die Kohlkopfbildung hatte jedoch noch nicht
eingesetzt. Während der Aufzuchtphase wurde die Nährlösung einmal vollständig
gewechselt, ansonsten wurde verbrauchte Nährlösung nachgefüllt. Eine Kontrolle der
Wurzeln auf Pilzbefall wurde wie bei der Porreeaufzucht durchgeführt. Die
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 123
Dotierungsexperimente mit Antibiotika erfolgten nach 21 Wachstumstagen in der
Pflanzenwuchskammer.
8.1.2 Zudotierung der Antibiotika
Die Dotierung der Pflanzen erfolgte nach den oben angegebenen Wachstumszeiten bei
mittlerem Wachstumsstand durch die Zugabe von Antibiotikum-Stammlösungen zur
Nährlösung (s. Anh.1.4). Alle ausgewählten Wirkstoffe wurden einzeln den Nährlösungen
zugesetzt. Ab diesem Zeitpunkt wurden die Nährlösungen alle zwei Tage gewechselt, wobei
regelmäßig wieder die entsprechende Menge in die Nährlösung pipettiert wurde. Die
Pflanzen wuchsen also bis zur Probennahme in dotierter Nährlösung mit bekannter
Antibiotikakonzentration. Es wurden immer parallel Pflanzen mit Antibiotikazusatz und
Kontrollpflanzen ohne Antibiotikazusatz herangezogen. Die Zusammenstellung der
zugesetzten Mengen an Antibiotika in die Nährlösung findet sich im Anhang 1.5.3.1.
8.1.3 Ernte und Lagerung
Nach ein- bis zweiwöchigem Wuchs auf dotierter Nährlösung wurden die Pflanzen
entnommen und alle Teile, die vorher direkten Kontakt mit der dotierten Nährlösung hatten
(vor allem die Wurzeln und unteren Stammbereiche) mittels K2SO4-Lösung gründlich
abgespült sowie mit Haushaltspapier getrocknet. Die Pflanzen wurden in Blätter und Wurzeln
getrennt, wobei der Bereich des Überganges zwischen Wurzeln und Blättern verworfen
wurde, um sicherzustellen, dass kein Wurzelmaterial ins Blattmaterial gelangt. Das
Pflanzenmaterial wurde in Stücke zerschnitten und sofort in flüssigem Stickstoff
schockgefroren, um die weitere Bioaktivität und somit einen möglichen Abbau sowie
mögliche Umwandlungsprozesse der Wirkstoffe zu verhindern. Bis zur weiteren Analyse
wurden die Proben bei -80°C gelagert.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 124
Porree
Abb. 44 zeigt die Pflanzenteile von Porree, die beprobt wurden.
Abb. 44: Porreepflanzenteile, die als separate Proben genommen und analysiert wurden
(Foto [273])
Zur Unterscheidung von jüngeren und älteren Blattabschnitten sowie Wurzeln wurden diese
separat analysiert. Die direkte Übergangszone von ca. 1 cm Stärke zwischen Wurzeln und
jungem Blattabschnitt wurde verworfen, um eine Kontamination dieser Blattabschnitte durch
die Antibiotika-haltige Nährlösung auszuschließen.
alter
Blattabschnitte
junger
Blattabschnitte
Wurzeln
alter Blattabschnitte
junger Blattabschnitte
Wurzeln
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 125
Weißkohl
Die Pflanzenteile von Weißkohl, die separat beprobt wurden, sind in Abb. 45 gezeigt.
Abb. 45: Weißkohlpflanzenteile, die als separate Proben genommen und analysiert wurden
(Foto [273])
Eine Übergangszone von ca. 3 cm Stärke zwischen Wurzeln und Spross wurde verworfen,
um eine Kontamination dieser Blattabschnitte durch die Antibiotika-haltige Nährlösung
auszuschließen.
8.2 Ergebnisse der Aufnahmeexperimente in Hydrokultur
Der jeweilige Verbrauch an Antibiotika-dotierter und undotierter Nährlösung (Kontroll- bzw.
Blindprobe) bei der Anzucht der Pflanzen ist im Anhang 4 als Funktion der Zeit graphisch
dargestellt. Dabei handelt es sich um den Nährlösungsverbrauch durch die pflanzliche
Transpiration. Über einen Kontrolltopf ohne Pflanze wurde die Transpiration von Nährlösung
in die Umgebung berücksichtigt. Die Abb. A4 (s. Anh. 4) zeigt, dass die Weißkohlpflanzen
mehr Nährlösung verbraucht haben als die Porreepflanzen. Ebenso sind im Anhang 3 die
zum Erntezeitpunkt ermittelten Erntegewichte von Weißkohl und Porree aufgeführt.
Blätter jung
Stängel
Wurzeln
Blätter alt
Blätter jung
Stängel
Blätter alt
Wurzeln
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 126
8.2.1 Porree
8.2.1.1 Aufnahme von Sulfadiazin
Entwicklung
Die Kontrollpflanzen sahen vital aus, bildeten viele Wurzeln und die Blattabschnitte wuchsen
weiter. Demgegenüber bildeten die Porreepflanzen, welche auf SFD-haltiger Nährlösung
weitergezogen wurden, relativ wenig Wurzeln aus. Die Wurzeln waren verschleimt und
bekamen eine leicht rosa gefärbte Oberfläche.
Abb. 46: Porree 7 Tage nach 50 Wachstumstagen in Nährlösung angezogen
A) Porree-Kontrollversuch, ohne SFD-Dotierung;
B) Porree in 5 µmol/L SFD-haltiger Nährlösung
Wie in Abb. 46 zu sehen ist, schienen die Pflanzen, welche mit SFD dotiert wurden, leicht zu
„verkümmern“. Dies machte sich besonders daran bemerkbar, dass sowohl das
Pflanzenvolumen, als auch in noch stärkerem Maße der Umfang der Wurzeln stark abnahm
und Verfärbungen aufwies. Die hier miteinander verglichenen Pflanzen (Kontrollpflanze und
SFD-dotierte Pflanze) zeigen deutliche Unterschiede in Größe und Farbe ihrer Biomasse.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 127
SFD-Gehalte im Porree
Die in Porreeproben, welche in dotierter Nährlösung aufwuchsen, gefundenen SFD-Gehalte
sind in Tab. 33 angegebenen.
Tab. 33: SFD-Gehalte im Porree (Hydrokultur)
5 µmol/L Dotierung, Einwaagen: 5 g FG-Homogenat (Blattabschnitte alt und jung),
3 g FG-Homogenat ( Wurzel); Doppelbestimmung, n=3, Matrixkalibrierung
Nährlösung dotiert:
Pflanzenteile
Gehalt an SFD [µg/kg]
SFD
Blattabschnitte alt
85,1
Blattabschnitte jung
57,7
Wurzel
263,6
Es ist festzustellen, dass der Anteil an SFD bezogen auf die verschiedenen Pflanzenteile
lediglich in den Wurzeln hoch ist. Scheinbar wurde SFD in den Apoplasten des Porrees
festgehalten [186]. Auch dieses lässt sich anhand von Modellrechnungen erklären, da SFD
einen logKOW-Wert von -0,12 hat (s. Seite 46, Tab. 11).
8.2.1.2 Aufnahme von Chlortetracyclin
Entwicklung
Bemerkenswert ist, dass die Porreepflanzen auf CTC-haltiger Nährlösung fast genauso wie
die Kontrollpflanzen aussahen. Das heißt, die Porreepflanzen wuchsen auf der CTC-
dotierten Nährlösung ebenso in die Länge und bildeten viele Wurzeln. Jedoch war ein
schwach ausgeprägter Effekt auf den dotierten Porreepflanzen zu beobachten (Abb. 47).
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 128
Abb. 47: Porree 7 Tage nach 50 Wachstumstagen in Nährlösung angezogen
A) Porree-Kontrollversuch, ohne CTC-Dotierung;
B) Porree in 5 µmol/L CTC-haltiger Nährlösung
Schwake-Anduschuss beobachtete eine bakterielle Infektion bei Möhrenpflanzen, die auf
CTC-dotierter Nährlösung (5 µmol/L) angezogen wurden [186]. Dieser Effekt war bei den
Porreepflanzen nicht zu erkennen.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 129
CTC-Gehalte im Porree
In der Tab. 34 sind die ermittelten Gehalte an CTC in den Porreepflanzen aufgeführt.
Tab. 34: CTC-Gehalte im Porree (Hydrokultur)
5 µmol/L CTC-Dotierung, Einwaagen: 5 g FG-Homogenat (Blattabschnitte alt und
jung), 3 g FG-Homogenat (Wurzel); Doppelbestimmung, n=3, Matrixkalibrierung.
Ergebnisse in µg/kg, kursiv/fett: mg/kg FG-Homogenat
Nährlösung
dotiert:
Pflanzenteile
Gehalt an CTC`s
CTC
e-keto-
CTC
e-enol-
CTC
iso-
CTC
e-iso-
CTC
DMC
e-
DMC
CTC
Blattabschnitte
alt
125,8
30,1
32,6
38,1
<BG
<BG
<BG
Blattabschnitte
jung
66,2
<BG
<BG
26,7
<BG
<BG
<BG
Wurzel
14,8
1,9
1,9
1,0
117,8
147,4
39,1
In den Wurzeln des Porrees sind die CTC-Gehalte extrem hoch. In den alten
Blattabschnitten sind sie dagegen um Größenordnungen geringer, wobei hier eine
„Ablagerung“ in den Apoplastenbereichen (Zellwände) zu vermuten ist (s. Seite 44, Abb. 13)
[186].
In den jungen Blattabschnitten wurde noch weniger CTC gefunden als in den alten
Blattabschnitten. Grote et al. berichteten, dass bei einer Konzentration von 5 µmol/L CTC in
der Nährlösung in Stängeln und Blättern von Winterweizen annähernd gleiche Gehalte
vorlagen [75]. Dies wurde hier nicht beobachtet.
In den CTC-dotierten Porreepflanzen sind deutlich Anteile von Epimeren und iso-
Komponenten sowie Demethylierungsprodukten (DMC, e-DMC) nachweisbar. Der DMC-
Gehalt liegt bis auf eine Ausnahme der Wurzelproben immer unter der Bestimmungsgrenze,
während CTC im Vergleich zum iso-CTC überwiegt.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 130
8.2.1.3 Aufnahme von Tetracyclin
Entwicklung
Die Dotierung mit dem TC-Antibiotikum führte nicht zu stark sichtbaren Effekten an den
Porreepflanzen (Abb. 48).
Abb. 48: Porree 7 Tage nach 50 Wachstumstagen in Nährlösung angezogen
A) Porree-Kontrollversuch, ohne TC-Dotierung;
B) Porree in 5 µmol/L TC-haltiger Nährlösung
Es ist allerdings zu beobachten, dass die Blätter der Pflanzen, welche auf TC-haltiger
Nährlösung aufwuchsen, verglichen mit den Kontrollpflanzen, einige dunkler grün gefärbte
Abschnitte besaßen und auch die Wurzeln sich leicht verfärbt hatten. Ebenfalls waren sie
insgesamt in ihrem Wuchs kleiner und bildeten mehr braune Blattspitzen aus als die
Kontrollpflanzen.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 131
TC-Gehalt im Porree
In den Porreeproben, die mit TC-dotierter Lösung gegossen wurden, wurden die in Tab. 35
angegebenen TC-Gehalte gefunden.
Tab. 35: TC-Gehalte im Porree (Hydrokultur)
5 µmol/L TC-Dotierung, Einwaagen: 5 g FG-Homogenat (Blattabschnitte alt und
jung), 3 g FG-Homogenat (Wurzel); Doppelbestimmung, n=3, Matrixkalibrierung
Ergebnisse in µg/kg, kursiv/fett: mg/kg FG Homogenat
Nährlösung dotiert:
Pflanzenteile
Gehalt an TC`s
TC
e-TC
TC
Blattabschnitte alt
47,2
<BG
Blattabschnitte jung
18,1
<BG
Wurzel
11,9
3,7
Es ist festzuhalten, dass die TC-Gehalte in den Porreewurzeln höher sind als in den
Blattabschnitten. Vermutlich wurde TC im Porree im Apoplasten festgehalten [186].
8.2.1.4 Aufnahme von Enrofloxacin
Entwicklung
Die mit ENR dotierten Pflanzen wuchsen zunächst wesentlich stärker als die
Kontrollpflanzen und auch als die anderen mit Antibiotika dotierten Pflanzen. Bei den
Pflanzen, die mit ENR dotiert wurden, war des Weiteren (vor allem gegen Ende der
Dotierphase) eine deutliche Aufhellung der Stängel und unteren Blattbestandteile zu
beobachten (Abb. 49).
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 132
Abb. 49: Porree 7 Tage nach 50 Wachstumstagen in Nährlösung angezogen
A) Porree-Kontrollversuch, ohne ENR-Dotierung;
B) Porree in 5 µmol/L ENR-haltiger Nährlösung
Bemerkenswert ist, dass bei den ENR-haltigen Pflanzen ein makroskopisch deutlich
sichtbarer Ausbleichungseffekt vor allem bei den jungen Porree-Blattabschnitten zu
erkennen war. Auffällig ist bei diesen Pflanzen, dass auch die Pflanzenstängel ausbleichen.
In Abb. 49 wird dieses durch die hellgrünen jungen Blattabschnitte im Vergleich zu den nicht
dotierten Kontrollpflanzen deutlich.
Worauf diese Beobachtungen aus pflanzenphysiologischer Sicht begründet werden können,
ist letztendlich nicht ganz zu klären. In einer Studie über die Phytotoxizität und die Aufnahme
von ENR in Nutzpflanzen wie z.B. Gurken, Gartensalat, Bohnen und Rettich konnten
ähnliche Beobachtungen gemacht werden [211]. Die Autoren berichten hier ebenfalls von
einem bei geringer Konzentration zunächst gesteigertem Wachstum der Pflanzen, während
bei höheren Konzentrationen ein offenbar toxischer Effekt auf die Pflanzenzellen beobachtet
wurde. Diese phytotoxischen Effekte können auch die Ursachen der eigenen Beobachtungen
sein. So wird ein Effekt bei hohen Konzentrationen auch auf das Enzym Topoisomerase II,
welches dem bakteriellen Enzym Gyrase analog ist, angenommen. Dies bewirkt, dass die
Zellwände der Pflanzenzellen instabil werden und die Zellen schließlich gänzlich aufplatzen.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 133
ENR-Gehalte im Porree
Die höchsten Konzentrationen für ENR (und CIP als Hauptmetabolit) ergaben sich in den
Porreewurzeln. In allen Pflanzenbestandteilen der mit ENR dotierten Pflanzen konnte auch
CIP nachgewiesen werden. ENR wird in extremem Ausmaß in der Porreepflanze
transportiert, so dass alte Blattabschnitte ähnlich hohe Gehalte dieses Fluorchinolons
aufwiesen, wie die Wurzeln.
Tab. 36: ENR-Gehalte im Porree (Hydrokultur)
5 µmol/L ENR-Dotierung, Einwaagen: 5 g FG-Homogenat (Blattabschnitte alt und
jung), 3 g FG-Homogenat (Wurzel); Doppelbestimmung, n=3, Matrixkalibrierung,
Ergebnisse in µg/kg, kursiv/fett: mg/kg FG-Homogenat
Nährlösung dotiert:
Pflanzenteile
Gehalte an:
ENR
CIP
ENR
Blattabschnitte alt
1,0
53,1
Blattabschnitte jung
358,8
<BG
Wurzel
7,3
60,6
Interessant scheint in diesem Zusammenhang, dass bei den mit ENR dotierten Pflanzen
zwar insgesamt ein wesentlich größerer Rückstand an Wirkstoff in den Blättern gefunden
wurde, jedoch die Gehalte in den Wurzeln anderer Antibiotika wie z.B. Tetracyclin, niedriger
waren. Vermutlich ist der Transport des ENR-Wirkstoffs mit einer für die Aufnahme in
Pflanzen fast „idealen“ Lipophilie wesentlich höher (s. Seite 46, Tab. 11)
8.2.1.5 Aufnahme von Monensin
Entwicklung
Die MON-dotierten Pflanzen erschienen stärker zu „verkümmern“, was sich besonders daran
bemerkbar machte, dass sowohl das Pflanzenvolumen, als auch in noch stärkerem Maße
der Umfang der Wurzeln stark abnahm und Verfärbungen aufwies. Die Wurzeln verfärbten
sich über den Zeitraum der Dotierung zunehmend gelblich. Vermutlich wurde die mit MON-
dotierte Nährlösung stark von Mikroorganismen besiedelt. Des Weiteren verschleimten vor
allen bei den Pflanzen, die mit MON behandelt wurden, die Wurzeln und die Nährlösung.
Diese beobachteten Phänomene zeigt Abb. 50.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 134
Abb. 50: Porree 7 Tage nach 50 Wachstumstagen in Nährlösung angezogen
A) Porree-Kontrollversuch, ohne MON-Dotierung;
B) Porree in 5 µmol/L MON-haltiger Nährlösung
In der Literatur werden ähnliche Beobachtungen dokumentiert, z.B. konnte Brain bei MON-
Konzentrationen oberhalb 1 mg/kg einen ähnlichen negativen Effekt festhalten [274]. Auch
Gomez und Chrispeels haben beobachtet, dass MON auch in Pflanzenzellen die Sortierung
von vacuolären Proteinen hemmt, was wahrscheinlich durch Änderung des pH-Wertes im
Golgi-Komplex zur partiellen Sekretion von Proteinen führt und anschließend eine
Ausbleichung der Blätter verursacht [275].
MON-Gehalte im Porree
Während bei allen anderen Wirkstoffen ein deutlicher Unterschied zwischen den
Konzentrationen in den jungen und alten Blattabschnitten erfasst wurde, sind bei MON die
Gehalte in diesen beiden Pflanzenbestandteilen fast gleich. Im Gegensatz dazu konnten
jedoch in den Wurzeln vergleichsweise sehr hohe Gehalte festgestellt werden.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 135
Tab. 37: MON-Gehalte im Porree (Hydrokultur)
5 µmol/L Dotierung, Einwaagen: 5 g FG-Homogenat (Blattabschnitte alt und jung),
3 g FG-Homogenat (Wurzel), n=3, Matrixkalibrierung, Ergebnisse in mg/kg
Nährlösung dotiert:
Pflanzenteile
Gehalt an MON [mg/kg]
MON
Blattabschnitte alt
<BG
Blattabschnitte jung
<BG
Wurzel
1,1
Dieses Phänomen kann ansatzsweise so gedeutet werden, dass MON zwar von den
Wurzeln aufgenommen wurde, aber der Transport in die äußeren Pflanzenbestandteile im
Unterschied zu den anderen Wirkstoffen erst wesentlich später (während der
Wachstumsphase) begonnen hat. Somit wäre die Konzentration der Wirkstoffe in den
Blattabschnitten „noch“ ungefähr vergleichbar hoch, da noch keine Anlagerung stattfinden
konnte.
8.2.2 Weißkohl
8.2.2.1 Aufnahme von Sulfadiazin
Entwicklung
Die Weißkohlpflanzen bildeten nach der 1. Wachstumswoche ebenso viele Blattpaare und
dieselbe Blattfarbe aus wie die Weißkohlpflanzen, welche auf nicht-dotierter Nährlösung
aufwuchsen.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 136
Abb. 51: Weißkohl 7 Tage nach 21 Wachstumstagen in Nährlösung angezogen
A) Weißkohl-Kontrollversuch, ohne SFD-Dotierung;
B) Weißkohl in 5 µmol/L SFD-haltiger Nährlösung
Auch bei Weißkohl wurde kein Einfluss von SFD auf die Pflanzenentwicklung festgestellt.
SFD-Gehalte im Weißkohl
In den Weißkohlproben, die in SFD-dotierter Nährlösung aufwuchsen, wurden die in Tab. 38
angegebenen SFD-Gehalte gefunden.
Tab. 38: SFD-Gehalte im Weißkohl (Hydrokultur)
5 µmol/L Dotierung, Einwaagen: 5 g FG-Homogenat (Blatt alt und jung), 3 g FG-
Homogenat (Wurzel), n=3, Matrixkalibrierung, Ergebnisse in µg/kg
Nährlösung dotiert:
Pflanzenteile
Gehalt an SFD [µg/kg]
SFD
Blatt jung
<BG
Blatt alt
33,8
Stängel
<BG
Wurzel
147,4
In den analysierten Weißkohlwurzeln wurden höhere Gehalte nachgewiesen. In den
analysierten Blättern und Stengeln waren Spuren von SFD nachweisbar, so dass
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 137
angenommen werden muss, dass ein Transport von SFD von der Wurzel in die Blätter
stattfand.
8.2.2.2 Aufnahme von Chlortetracyclin
Entwicklung
Wie in Abb. 52 zu sehen ist, zeigte der mit CTC dotierte Weißkohl gelbliche Verfärbungen
der Leitbahnen.
Abb. 52: Weißkohl 7 Tage nach 21 Wachstumstagen in Nährlösung angezogen
A) Weißkohl-Kontrollversuch, ohne CTC-Dotierung;
B) Weißkohl in 5 µmol/L CTC-haltiger Nährlösung
CTC-Gehalte im Weißkohl
Die in den Weißkohlproben gefundenen Gehalte an den unterschiedlichen Chlortetracyclinen
sind in Tab. 39 zusammengefasst. In den Wurzeln finden sich erheblich höhere CTC-Gehalte
als in den Blättern. Bemerkenswert ist, dass die CTC-Gehalte in den jungen und alten
Blattabschnitten nicht so unterschiedlich waren.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 138
Tab. 39: CTC-Gehalte im Weißkohl (Hydrokultur)
5 µmol/L CTC-Dotierung, Einwaagen: 5 g FG-Homogenat (Blatt alt und jung),
3 g FG-Homogenat (Wurzel); Doppelbestimmung, n=3, Matrixkalibrierung
Ergebnisse in µg/kg, kursiv/fett: mg/kg FG-Homogenat
Nährlösung
dotiert:
Pflanzenteile
Gehalt an CTC`s
CTC
e-keto-
CTC
e-enol-
CTC
iso-
CTC
e-iso-
CTC
DMC
e-
DMC
CTC
Blatt alt
86,3
<BG
<BG
<BG
<BG
<BG
<BG
Blatt jung
98,6
<BG
<BG
<BG
<BG
<BG
<BG
Stängel
71,8
<BG
<BG
<BG
<BG
<BG
<BG
Wurzel
6,7
1,0
1,0
675,6
107,9
209,8
70,1
Besonders auffällig sind die Gehalte an iso-CTC in den Wurzeln der Weißkohlpflanzen. Für
iso-CTC wurde der höchste log KOW-Wert (-0,74) der Chlortetracycline berechnet (s. Seite
46, Tab. 11). Die größere Lipophilie erleichtert den symplasmatischen Transport, wodurch
diese Komponente über die Endodermis in höhere Pflanzenteile transportiert werden kann.
Deshalb stimmen die Befunde mit den Erwartungen aus den Berechnungen des Oktanol-
Verteilungskoeffizienten überein.
Hinzu kommt eine mögliche Isomerisierungs-, Epimerisierungs- sowie
Demethylisierungstendenz von CTC. Um zu prüfen, ob diese Umwandlungs- und
Metabolisierungsprodukte von CTC in der Pflanze und/oder in der Nährlösung entstanden
sind, wurde die CTC-haltige Nährlösung 2 Tage nach der Dotierung auf Metabolite
analysiert. Umwandlungs- sowie Metabolisierungsprodukte (DMC, e-DMC) wurden in den
Nährlösungen nachgewiesen.
8.2.2.3 Aufnahme von Tetracyclin
Entwicklung
Die wuchsen auf TC-haltiger Nährlösung ohne Unterschied zu der nicht-dotierten
Nährlösung. Das gilt auch für die Blätter, die grün und vital aussahen.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 139
Abb. 53: Weißkohl 7 Tage nach 21 Wachstumstagen in Nährlösung angezogen
A) Weißkohl-Kontrollversuch, ohne TC-Dotierung;
B) Weißkohl in 5 µmol/L TC-haltiger Nährlösung
TC-Gehalte im Weißkohl
Die TC-Gehalte in den Weißkohlpflanzen sind in Tab. 40 aufgeführt.
Tab. 40: TC-Gehalte im Weißkohl (Hydrokultur)
5 µmol/L TC-Dotierung, Einwaagen: 5 g FG-Homogenat (Blatt alt und jung), 3 g FG-
Homogenat (Wurzel); Doppelbestimmung, n=3, Matrixkalibrierung,
Ergebnisse in µg/kg, kursiv/fett: mg/kg FG-Homogenat
Nährlösung dotiert:
Pflanzenteile
Gehalt an TC`s
TC
e-TC
TC
Blatt alt
91,9
25,0
Blatt jung
112,5
28,9
Stängel
34,2
<BG
Wurzel
6,53
2,5
TC und e-TC wurden in allen Pflanzenbestandteilen nachgewiesen. Auffällig war, dass mehr
TC im Bestandteil “Blatt jung“ zu finden war als im “Blatt alt“. Dies war bei anderen
Antibiotika nicht der Fall.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 140
Gerade für die Tetracycline bleibt zu sagen, dass hier die Konzentrationen in den Wurzeln
extrem hoch waren. Ein Transport in die weiteren Pflanzenbestandteile scheint jedoch nur
mäßig stattzufinden. Wenn man die Ergebnisse für TC und CTC vergleicht, so sieht man,
dass die CTC-Gehalte gerade in den Blättern und Stängel etwas höher sind als diejenigen
von TC. Dies war ebenfalls anhand der Höhe der log KOW-Werte zu erwarten, denn diese
zeigen, dass TC (log KOW-Wert = -1,47) hydrophiler als CTC (log KOW-Wert= -0,33) ist (s.
Seite 46, Tab. 11).
8.2.2.4 Aufnahme von Enrofloxacin
Entwicklung
Die Weißkohlpflanzen, die auf ENR-dotierter Nährlösung wuchsen, bildeten im Vergleich zu
den Kontrollproben mehr Wurzeln. Dagegen waren die (phytotoxischen) Wirkungen von ENR
auf die Weißkohlpflanzen wesentlich ausgeprägter.
In den Weißkohlpflanzen wurden durch den Einfluss von ENR starke Ausbleichungseffekte in
allen Blattabschnitten beobachtet.
Abb.54: Weißkohl 7 Tage nach 21 Wachstumstagen in Nährlösung angezogen
A) Weißkohl-Kontrollversuch, ohne ENR-Dotierung;
B) Weißkohl in 5 µmol/L ENR-haltiger Nährlösung
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 141
ENR-Gehalte im Weißkohl
Die in den Weißkohlproben gefundenen ENR-Gehalte sind in Tab. 41 zusammengefasst.
Tab. 41: ENR-Gehalte im Weißkohl (Hydrokultur)
5 µmol/L ENR-Dotierung, Einwaagen: 5 g FG-Homogenat (Blatt alt und jung),
3 g FG-Homogenat (Wurzel); Doppelbestimmung, n=3, Matrixkalibrierung,
Ergebnisse in µg/kg, kursiv/fett: mg/kg FG-Homogenat
Nährlösung dotiert:
Pflanzenteile
Gehalte an:
ENR
CIP
ENR
Blatt alt
7,1
62,5
Blatt jung
6,0
48,3
Stängel
2,5
<BG
Wurzel
12,0
59,1
In den Wurzeln sowie in den Stängeln und Blättern (jung und alt) des Weißkohls wurden
ENR und der Metabolit CIP nachgewiesen. Die höchsten Konzentrationen von ENR wurden
in den Wurzeln erreicht, wobei dieses in geringen Anteilen zum CIP metabolisierte. ENR
wurde in extremem Ausmaß in der Weißkohlpflanze transportiert, so dass alte
Weißkohlblätter ähnlich hohe ENR-Gehalte aufwiesen wie die Wurzeln.
Insgesamt dominiert ENR in den Wurzeln, da sowohl von MON als auch SFD zwar in diesem
Bereich hohe Anteile (< 100 µg/kg) gefunden wurden, diese jedoch längst nicht an den Anteil
von ENR in den Wurzeln herankamen.
8.2.2.5 Aufnahme von Monensin
Entwicklung
Nach 2 wöchigem Wachstum auf dotierter Nährlösung setzte eine Verschleimung der
Wurzeln ein und die Blätter bildeten braune Blattränder. Die Weißkohlpflanzen bildeten nicht
mehr so viele neue Blattpaare wie die Kontrollpflanzen und die Blätter verkümmerten. Nach
dreiwöchigem Wachstum auf MON-haltiger Nährlösung sahen die Weißkohlflanzen
geschädigt aus (Abb. 55).
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 142
Abb. 55: Weißkohl 7 Tage nach 21 Wachstumstagen in Nährlösung angezogen
A) Weißkohl-Kontrollversuch, ohne MON-Dotierung;
B) Weißkohl in 5 µmol/L MON-haltiger Nährlösung
MON-Gehalte im Weißkohl
MON wurde im Vergleich zu den anderen Wirkstoffen in deutlich niedrigeren
Konzentrationen in den Weißkohlpflanzen vorgefunden (Tab. 42).
Tab. 42: MON-Gehalte im Weißkohl (Hydrokultur)
5 µmol/L Dotierung, Einwaagen: 5 g FG-Homogenat (Blattabschnitte alt und jung),
3 g FG-Homogenat (Wurzel); Doppelbestimmung, n=3, Matrixkalibrierung,
Ergebnisse in µg/kg
Nährlösung dotiert:
Pflanzenteile
Gehalt an MON [µg/kg]
MON
Blatt alt
158,9
Blatt jung
53,7
Stängel
<BG
Wurzel
567,2
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 143
In den alten Weißkohlblättern wurde aber erheblich mehr MON (158 µg/kg) vorgefunden als
in den alten Blattabschnitten des Porrees (<BG).
8.2.3 Zusammenfassung der Ergebnisse der Aufnahmeexperimente
Entwicklung
Die makroskopischen Wirkungen der Antibiotika auf die in Hydrokultur angezogenen
Gemüsepflanzen waren sehr unterschiedlich: Sie reichten beim Porree von nicht
erkennbaren Effekten (MON, SFD), schwach ausgeprägten Ausbleichungseffekten in jungen
Blattabschnitten (CTC), bis zu starken Effekten durch den Einfluss von ENR. In Abb. 46-49
wird dieses durch die hellgrünen jungen Blattabschnitte der Porreepflanzen im Vergleich zu
den nicht-dotierten Kontrollpflanzen deutlich. Ein ähnlicher, aber insgesamt schwächer
ausgeprägter Effekt war bei der Dotierung von CTC zu beobachten.
Die (phytotoxischen) Wirkungen der Antibiotika auf die Weißkohlpflanzen waren wesentlich
ausgeprägter. Im Vergleich zu den Kontrollpflanzen (Abb. 56 A) zeigte der mit CTC dotierte
Weißkohl gelbliche Verfärbungen der Leitbahnen (Abb. 56 B). Bei Dotierung mit ENR war
eine fast vollständige Ausbleichung der jungen Blätter festzustellen (Abb. 56 C). MON führte
an einigen Blättern zu Läsionen und schließlich zum Welken (Abb. 56 D).
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 144
Bei der Dotierung mit ENR war eine fast vollständige Ausbleichung der jungen Blätter
festzustellen. Auch bei Gurken, Feldsalat, Bohnen und Rettich wurden phytotoxische
Wirkungen von ENR in einer Studie beschrieben. Die Autoren berichten, dass eine geringe
ENR-Konzentration (50-100 µg/L) das Wachstum der Pflanzen positiv beeinflußte, während
bei hohen Konzentrationen (5 mg/L) verminderter Pflanzenwuchs auftrat [211]. Wie der
Literaturauswahl (Tab. 12) zu entnehmen ist, sind zahlreiche Nutzpflanzen in der Lage,
Veterinärpharmaka unterschiedlicher Wirkstoffgruppen über die Wurzel aufzunehmen, was
zu Wachstumsstörungen u.a. toxischen Effekten führen kann [211].
Ähnliche Tendenzen ließen sich auch in dieser Studie insbesondere bei den Pflanzen
erkennen, die mit den Wirkstoffen ENR, MON und SFD dotiert wurden. Während die mit
ENR dotierten Pflanzen zunächst wesentlich stärker wuchsen als die anderen Pflanzen,
schienen besonders die mit SFD und MON dotierten Pflanzen stärker zu „verkümmern“, was
besonders daran bemerkbar machte, dass sowohl das Pflanzenvolumen, als auch in noch
A
B
C
D
Abb. 56: Weißkohl: 27 Tage in Nährlösung angezogen,
(Dotierung jeweils für 8 Tage mit 5 µmol/L Antibiotikum)
A) Kontrollpflanzen B) Dotierung mit CTC,
C) Dotierung mit ENR D) Dotierung mit MON
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 145
stärkerem Maße der Umfang der Wurzeln stark abnahm und Verfärbungen der Wurzeln
aufwies.
Gehalte an Antibiotika in Pflanzen
Die dotierten Antibiotikawirkstoffe sowie Umwandlungsprodukte und Metaboliten wurden
separat in den Pflanzenteilen von Porree (Wurzel, junge und alte Blattabschnitte) sowie
Weißkohl (Wurzel, Stängel, junge und alte Blätter) identifiziert und quantifiziert. Je nach
Wirkstoff, Gemüseart und Pflanzenteil umfassten die ermittelten Arzneistoffrückstände
mehrere Größenordnungen (µg/kg bis mg/kg-Bereich). Die höchsten Konzentrationen
wurden in den Wurzeln beider Gemüsearten mit Chlortetracyclin, Tetracyclin (Weißkohl: ca.
10 mg/kg FG, Porree: ca. 20 mg/kg) und ENR (Weißkohl: ca. 12 mg/kg) erreicht, das in
geringen Anteilen zum CIP metabolisierte. ENR wurde in extremem Ausmaß in der
Weißkohlpflanze transportiert, so dass alte Weißkohlblätter ähnlich hohe ENR-Gehalte (ca. 7
mg/kg FG) enthielten wie die Wurzeln. In den Stängeln und Blättern (jung und alt) des
Weißkohls sowie den jungen und alten Blattabschnitten des Porrees wurden alle dotierten
Wirkstoffe nachgewiesen. Dabei dominieren ENR und CTC (einschließlich seiner
Umwandlungsprodukte wie z.B. DMC und TC), während SFD und MON in deutlich
niedrigeren Konzentrationen vorgefunden wurden (< 100 µg/kg). SFD wurde von den
Pflanzen im Vergleich mit den anderen Wirkstoffen am wenigsten aufgenommen. Trotzdem
wird aber ein relativ großer Anteil der aufgenommenen Wirkstoffe bis in die Blätter weiter
transportiert. Das Verhältnis zwischen den Gehalten in Wurzeln und Blättern beträgt ca. 3:1
während es z.B. bei TC ca. 230:1 oder bei ENR 7:1 ist. Auch dieses lässt sich Anhand der
Tab. 11 begründen, da SFD einen log KOW–Wert (s. Seite 46, Tab. 11) kleiner als 0,5 hat (-
0,12). Das bedeutet, dass SFD wasserlöslich und nur über Carriersysteme durch die
Wurzelmembran transportabel ist.
Zusammenfassend ist festzustellen:
Blatt
In den alten Blättern des Weißkohls werden die höchsten Konzentrationen an ENR (~7
mg/kg FG) nachgewiesen. Anders war dieses jedoch in den alten Blattabschnitten des
Porrees, wo deutlich weniger ENR nachgewiesen werden konnte (~1 mg/kg), jeweils
begleitet von geringen Anteilen des Metaboliten CIP. Die Summengehalte an CTC-
Komponenten liegen im Porree mit 250 µg/kg im Vergleich zu den Weißkohlblättern höher (~
100 µg/kg), die der anderen Wirkstoffe (TC, SFD, MON) darunter. In den alten
Weißkohlblättern wurde aber deutlich mehr MON (150 µg/kg) vorgefunden als in den alten
Blattabschnitten des Porrees, die wiederum relativ betrachtet mehr SFD enthalten.
Vergleicht man die Rückstandsgehalte an Veterinärpharmaka zwischen den älteren
Blattbereichen und den jungen Blattabschnitten (Porree) und Blättern (Weißkohl), dargestellt
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 146
in Abb. 57 und Abb. 58, fallen Ähnlichkeiten aber auch einige markante Unterschiede auf. So
sind die Konzentrationsverhältnisse für ENR in den jungen Blättern bzw. Blattabschnitten im
Vergleich zu den älteren sehr ähnlich. Die jungen Blattabschnitte des Porrees enthalten aber
nur etwa halb so viel an ∑CTC-Komponenten (~100 µg/kg) wie die alten Blätter. Dagegen
sind bei jungen und alten Weißkohlblättern die Summengehalte an Chlortetracyclinen in etwa
gleich. Auffällig sind die doppelt so hohen Tetracyclin–Gehalte in den jungen
Blattabschnitten des Porrees im Vergleich zu den älteren. Die jungen und alten
Blattabschnitte des Porrees enthalten im Vergleich zu den Blättern des Weißkohls ca.
doppelt so hohe Mengen an SFD (~ 58– 85 µg/kg). Ältere Weißkohlblättern lagerten
dagegen dreifach so viel MON (~ 160 µg/kg) ein wie die jüngeren. Die Werte sind dabei
deutlich höher als in den entsprechenden Blattabschnitten des Porrees.
Stängel
Die Antibiotika-Gehalte in den Stängeln des Weißkohls sind erheblich niedriger als in den
Wurzeln und liegen unterhalb des in den Blättern erreichten Konzentrationsniveaus.
Extremwerte wurden mit 2,5 mg/kg bei ENR erreicht (zum Vergleich: Wurzel: 12 mg/kg, altes
Blatt: 7 mg/kg).
Wurzel
In den Wurzeln der Gemüsepflanzen liegt CTC mit ca. 20 mg/kg (∑CTC beim Porree) in der
höchsten Konzentration vor (Weißkohl: ca. 10 mg/kg). Dabei ist zu berücksichtigen, dass
trotz intensiven Spülens der Wurzelmasse nicht ausgeschlossen werden kann, dass ein
Anteil der nachgewiesenen Antibiotika an den Wurzeln bzw. der Rhizodermis haftete.
Im Vergleich zu den CTC-Gehalten in den Wurzeln von Porree und Weißkohl wurden die
anderen Wirkstoffe bzw. „Metabolite“ in folgender Abstufung nachgewiesen:
Porree: ∑CTC > TC + e-TC > ENR + CIP > MON > SFD
Weißkohl: ENR + CIP > ∑CTC > TC + eTC > MON > SFD
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 147
Abb. 57: Gehalte an Antibiotikawirkstoffe in alten Blättern von Porree und Weißkohl
ENR
CIP
SFD
MON
TC
e-TC
ΣCTC
0
2.000
4.000
6.000
8.000
Alte Blätter
Porree: alte Blattabschnitte - Weißkohl: alte Blätter
CIP
SFD
MON
TC
e-TC
ΣCTC
0
50
100
150
200
250
300
CTC
e-keto-
CTC
e-enol-
CTC
iso-CTC
e-iso-CTC
DMC
e-DMC
TC
e-TC
0
3.000
6.000
9.000
12.000
15.000
18.000
ΣCTC-Gehalte in Wurzeln
5a
5b
5c
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 148
Abb. 58: Gehalte an Antibiotikawirkstoffe in jungen Blättern von Porree und Weißkohl
ENR
CIP
SFD
MON
TC
e-TC
ΣCTC
0
2.000
4.000
6.000
8.000
Junge Blätter
Porree: junge Blattabschnitte - Weißkohl: junge Blätter
CIP
SFD
MON
TC
e-TC
ΣCTC
0
25
50
75
100
125
150
CTC
e-keto-CTC
e-enol-CTC
iso-CTC
e-iso-CTC
DMC
e-DMC
TC
e-TC
0
25
50
75
100
125
ΣCTC-Gehalte in jungeren Blättern
6b
6c
6a
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 149
Abb. 59: Gehalte an Antibiotikawirkstoffe in Wurzeln von Porree und Weißkohl
ENR
CIP
SFD
MON
TC
e-TC
ΣCTC
0
6.000
12.000
18.000
24.000
Wurzeln
CIP
SFD
MON
0
300
600
900
1.200
CTC
e-keto-CTC
e-enol-CTC
iso-CTC
e-iso-CTC
DMC
e-DMC
TC
e-TC
0
3.000
6.000
9.000
12.000
15.000
18.000
ΣCTC-Gehalte in Wurzeln
7c
7b
7a
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 150
Nach der Aufnahme über die Wurzel dominiert schließlich in den Gemüsepflanzen bei dem
Transport in die Blattbereiche das ENR, insbesondere beim Weißkohl. Dagegen werden
Tetracycline (TC, CTC) in einem erheblich geringeren Maße transportiert, so dass sich das
ursprüngliche Massenverhältnis in den Wurzeln an aufgenommenen und metabolisierten
Fluorchinolen und Tetracyclinen nach dem Transport in die Blätter bzw. Blattabschnitte (BA)
umgekehrt hat:
Porree (BA jung und alt): ENR + CIP >>> ∑CTC > SFD > TC + e-TC > MON
Weißkohl (Blatt alt): ENR + CIP > MON > TC + eTC > ∑CTC > SFD
Weißkohl (Blatt jung): ENR + CIP > TC + eTC > ∑CTC > MON > SFD
Die konkreten Ergebnisse konnten die Annahmen zur Lipophilie und somit zum
Aufnahmepotenzial der Pflanzen bezüglich der Wirkstoffe über die Berechnungen der log
KOW-Werte bestätigen und auch dementsprechend gedeutet werden. Ebenfalls konnten
Metabolite der eigentlich eingesetzten Wirkstoffe in den Pflanzen festgestellt werden, sodass
davon ausgegangen werden kann, dass diese im Pflanzenorganismus gebildet wurden.
Eine weitere Auswertung der Ergebnisse bezog sich auf mögliche Metabolite in den
Pflanzen. Die Ergebnisse zeigen, dass neben den dotierten Wirkstoffen einige Metabolite
qualitativ nachgewiesen wurden. In allen Pflanzenbestandteilen der mit ENR dotierten
Pflanzen konnte so z.B. auch CIP nachgewiesen werden. Genauso konnte in allen
Bestandteilen der mit CTC-dotierten Pflanzen auch DMC nachgewiesen werden. Des
Weiteren konnte gerade in diesen mit CTC-dotierten Pflanzen in einigen Teilen auch
dechloriertes CTC (also TC) nachgewiesen werden. Dieses gilt jedoch nicht für die Stängel.
Weitere Metabolite wie z.B. DC oder OTC bei den Tetracyclinen oder auch Metabolite von
SFD konnten nicht detektiert werden. Diese Ergebnisse geben einen ersten Überblick über
die Metabolisierungsreaktionen innerhalb der Pflanzen. Wie und vor allem in welchen
Pflanzenbestandteilen bzw. Zellkompartimente diese Reaktionen ablaufen oder in welche
Pflanzenbestandteile auch die Metaboliten dann wieder transportiert werden, kann jedoch
anhand dieser Ergebnisse nicht gedeutet werden.
Aus den oben beschriebenen Ergebnissen wird deutlich, dass alle Wirkstoffe in allen
Pflanzenbestandteilen der jeweils dotierten Pflanzen enthalten waren und nachgewiesen
werden konnten. Dieses Ergebnis bestätigt also, dass Pflanzen Antibiotika nicht nur
aufnehmen, sondern auch bis in ihre äußersten Bestandteile (die Blätter) transportieren
können. Des Weiteren wird sofort deutlich, dass die ermittelten Gehalte der einzelnen
Wirkstoffe sehr unterschiedlich sind, aber dennoch Tendenzen erkennen lassen. So muss
z.B. festgehalten werden, dass in den Wurzeln, wie schon bemerkt wurde, wesentlich höhere
Gehalte von allen Wirkstoffen erzielt werden konnten, als in den anderen
Pflanzenbestandteilen. Ebenfalls ist der Rückstand der Wirkstoffe in den Blättern höher als in
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 151
den Stängeln der Pflanzen. Dieses Ergebnis könnte darauf hindeuten, dass die Wurzeln
sowohl Aufnahme als auch Ablagerungsort für die Wirkstoffe zugleich sein können, während
die Stängel scheinbar nur als „Transportweg“ dienen, um die Wirkstoffe schließlich in den
Blättern abzulagern. Die Ergebnisse stimmen mit anderen Studien z.B. Hydrokulturversuche
mit Weizen- und Möhrenpflanzen [75] überein und wurden auch hier dementsprechend
gedeutet.
Zweifelsfrei belegen die Ergebnisse der Aufnahmeexperimente in Hydrokultur ein enormes
Aufnahmepotential von Weißkohl und Porree für einige Veterinärpharmaka, insbesondere für
Tetracycline und Enrofloxacin. Die Dringlichkeit ist offenkundig, Feldpflanzen systematisch
auf Versuchsflächen und (langjährig) Gülle-gedüngten Verdachtsflächen zu beproben und
rückstandsanalytisch zu untersuchen.
8.3 Analyse von Gemüse aus landwirtschaftlichen Betrieben
Die relativ langen Wachstumszeiten einiger Gemüsearten können den möglichen Transfer
eines breiten Spektrums von Veterinärpharmaka aus dem güllebeaufschlagten Boden über
die Wurzel in die Gemüsepflanzen begünstigen. Jedoch konnten durch die
Hydrokulturversuche nur theoretische Aufnahmepotenziale unter optimalen Bedingungen
untersucht werden aber letzendlich keinerlei Rückschlüsse auf vielleicht in handelsüblichem
Gemüse enthaltene Konzentrationen an Wirkstoffen gezogen werden. Hinweise
diesbezüglich könnten nur durch Analysen von Feldproben erhalten werden.
Daher wurden Porree und Weißkohl in der mit dieser Arbeit verknüpften Beprobung aus
landwirtschaftlichen Betrieben durchgeführt. Anschließend wurden die aus den
Aufnahmeversuchen in Hydrokultur gewonnenen Erkenntnisse auf die
rückstandsanalytischen Untersuchungen der unter Freilandbedingungen gewachsenen
Gemüsepflanzen angewendet.
Probenahme
Es war geplant, Weißkohl und Porree in Hauptanbaugebieten zu beproben. Leider wurde
von fast allen der angesprochenen Betriebe und mit Gemüsebau befassten Organisationen
eine Probenahme abgelehnt. Daher standen nur wenige Weißkohlköpfe von einem Feld im
Raum Krefeld sowie Porreestangen und Chinakohl aus dem Raum Brüggen zur Verfügung.
Tab. 43: Feldproben: Probenahmegebiete und Probenbezeichnung
Probenart
Probenbezeichnung
Probenahmegebiet
Probenmenge
Düngung
Weißkohl
WK-Kre
Krefeld
2 Köpfe
keine Angaben
Porree
P-Brü
Brüggen
3 Stangen
Schweinegülle
Chinakohl
CK-Brü
Brüggen
3 Köpfe
Putenmist
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 152
Wie oben erwähnt, konnten nur wenige Weißkohlköpfe sowie Porreestangen und ergänzend
Chinakohlköpfe beprobt und analysiert werden. Es lagen so gut wie keine Informationen über
die Produktionsbedingungen, wie z.B. Bodenart und Gülleausbringung vor.
Ergebnisse der Analysen von Feldproben
Im Weißkohl aus dem Raum Krefeld wurden keine Veterinärpharmaka-Spuren entdeckt. Wie
den Angaben in Tab. 44 zu entnehmen ist, liegen Verdachtsbefunde für Porree und
Chinakohl aus dem Raum Brüggen vor, in dem Schweinegülle und Putenmist zur Düngung
verwendet worden ist.
Mit dem LC-MS/MS (LCQ) konnten die Antibiotikarückstände in den Feldpflanzen jedoch
nicht eindeutig nachgewiesen werden.
Es war keine weitere Absicherung der Identifizierung mittels hochauflösenden FTICR-MS
möglich, da die Intensitäten der Signale sehr gering waren. Fragmentierungsexperimente
bzw. MS-Experimente, welche zur Bestätigung der positiven Befunde notwendig wären,
konnten daher nicht durchgeführt werden.
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 153
Tab. 44: Verdachtsbefunde in Feldproben: Porree (P), Weißkohl (WK) und Chinakohl (CK)
- negativer Befund (+) und (+‡) positiver Verdachtsbefund mit niedrigauflösender und hochauflösender MS
Probe
TC
e-TC
DC
OTC
N-DDM-
OTC
DMC
CTC
e-
CTC
iso-
CTC
SFD
ENR
CIP
MON
Brüggen
P-Brü-Blatt
-
(+‡)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
(+‡)
-
P-Brü-Stengel
(+‡)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
(+‡)
-
CK-Brü-Blatt
(+‡)
-
-
-
(+‡)
-
-
-
-
-
-
-
-
CK-Brü-Stengel
-
-
-
-
(+‡)
-
-
-
-
-
-
-
-
Krefeld
WK-Kre-Blatt
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
WK-Kre-Stengel
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 153
_____________________________________________________________________________
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 154
Verdachtsbefund auf Tetracyclin
Identifizierung mit niedrigauflösender MS
Die Analysenergebnisse mit niedrigauflösender MS haben gezeigt, dass die Peaks
(entsprechend ihrer m/z-Werte und Retentionszeiten) von TC in der Porreeprobe (P-Brü-
Blatt) eine gute Übereinstimmung im Vergleich mit dem TC-Standard besitzen (Abb. 60).
Mit dem LC-MS/MS konnte das TC in der Feldpflanze (P-Brü-Blatt) jedoch nicht eindeutig
nachgewiesen werden, da die detektierten massenchromatographischen TC-Signale von
geringer Intensität (im Bereich der Nachweisgrenzen) sind. Deshalb war eine weitere
Absicherung der Identifizierung mittels hochauflösenden FTICR-MS nötig.
Abb. 60a: Vergleich der Massenchromatogramme der P-Brü-Blatt-Porreeprobe (oben) mit
dem TC-Standard (unten): LC-MS/MS (LR-MS), SRM-Modus
f:\didem\messung040708\std-0,1-2 7/5/2008 6:07:33 AM
RT: 0.00 - 35.05
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
8.35
9.64 11.67 13.22
7.39
6.45
3.00
2.05 21.37
16.89
13.82 17.31
1.70 22.96 25.75
13.35
8.37
7.03 14.08
21.24
12.87
9.46 14.69
3.03 17.14 22.92
6.30
1.82 26.01
NL: 3.36E5
TIC F: + c ESI SRM
ms2 445.[email protected]
[409.00-411.00,
425.50-428.50] MS
P-Brue1-B1-02
NL: 4.90E5
TIC F: + c ESI SRM
ms2 445.[email protected]
[409.00-411.00,
425.50-428.50] MS
std-0,1-2
P-Brue1-B1-02 #492 RT: 8.35 AV: 1NL: 2.90E5
F: + c ESI SRM ms2 445.00@cid34.00 [409.00-411.00, 425.50-428.50]
410 412 414 416 418 420 422 424 426 428
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
427.01
409.23 410.54 426.17 427.95
std-0,1-2 #485 RT: 8.37 AV: 1NL: 2.39E5
F: + c ESI SRM ms2 445.00@cid34.00 [409.00-411.00, 425.50-428.50]
410 412 414 416 418 420 422 424 426 428
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
427.04
409.90
427.93
426.30
410.73
TC?
TC
Standard
Probe
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 155
Abb. 60b: Vergleich der Massenspektren der P-Brü-Blatt-Porreeprobe (oben) mit dem TC-
Standard (unten): LC-MS/MS (LR-MS), SRM-Modus
Bestätigung mit hochauflösender MS
Die Abb. 61 zeigt die mit FTICR-MS gemessenen Massenchromatogramme der P-Brü-Blatt-
Probe und des TC-Standard.
f:\didem\messung040708\std-0,1-2 7/5/2008 6:07:33 AM
RT: 0.00 - 35.05
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
8.35
9.64 11.67 13.22
7.39
6.45
3.00
2.05 21.37
16.89
13.82 17.31
1.70 22.96 25.75
13.35
8.37
7.03 14.08
21.24
12.87
9.46 14.69
3.03 17.14 22.92
6.30
1.82 26.01
NL: 3.36E5
TIC F: + c ESI SRM
ms2 445.00@cid34.00
[409.00-411.00,
425.50-428.50] MS
P-Brue1-B1-02
NL: 4.90E5
TIC F: + c ESI SRM
ms2 445.00@cid34.00
[409.00-411.00,
425.50-428.50] MS
std-0,1-2
P-Brue1-B1-02 #492 RT: 8.35 AV: 1NL: 2.90E5
F: + c ESI SRM ms2 [email protected] [409.00-411.00, 425.50-428.50]
410 412 414 416 418 420 422 424 426 428
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
427.01
409.23 410.54 426.17 427.95
std-0,1-2 #485 RT: 8.37 AV: 1NL: 2.39E5
F: + c ESI SRM ms2 [email protected] [409.00-411.00, 425.50-428.50]
410 412 414 416 418 420 422 424 426 428
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
427.04
409.90
427.93
426.30
410.73
Standard
Probe
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 156
Abb. 61: Vergleich der Massenchromatogramme der P-Brü-Blatt-Porreprobe (oben) mit dem TC-Standard (unten):
FTICR MS (HR-MS), Full Scan
RT: 0.0 - 35.0
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
0
20
40
60
80
100 22.8
22.4
16.4
1.5 1.9 19.8
18.8
9.6 14.8 26.5
2.5 30.8 31.8
25.4
21.9
11.5 29.5
8.2
5.1 14.0 32.9
28.1
3.1
10.4
1.5 31.4
1.8 20.0 26.3 34.4
22.9
11.7 15.9 30.6
24.8
11.7
7.3 26.7
23.5 29.2
21.7
14.3 31.0
17.0
2.0 5.6
3.0
NL: 9.02E6
TIC F: FTMS + p
ESI Full ms
[200.00-500.00] MS
080415-89
NL: 1.81E4
m/z=
445.15386-
445.16722 F: FTMS
+ p ESI Full ms
[200.00-500.00] MS
080415-89
NL: 5.19E5
m/z=
445.15386-
445.16722 F: FTMS
+ p ESI Full ms
[200.00-500.00] MS
080415-05
TC
TC?
Standard
Probe
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 156
______________________________________________________________________________
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 157
Abb. 62: Vergleich des gemessenen Massenspektrums der P-Brü-Blatt-Porreeprobe bei 10,37 min (oben) mit dem berechneten
Massenspektrum von TC mit m/z = 445,16054 (unten): FTICR-MS (HR-MS), Full Scan
445.0 445.5 446.0 446.5 447.0 447.5 448.0
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative Abundance
445.16415
444.89532
445.22995
446.16800
445.56329 447.25894 447.59262
445.89713 447.15628
446.24948
445.16054
446.16376
447.16620
NL:
1.76E4
080415-89#851 RT: 10.37
AV: 1 F: FTMS + p ESI Full
ms [200.00-500.00]
NL:
1.80E4
C22 H25 N2O8:
C22 H25 N2O8
p (gss, s/p:40) Chrg 1
R: 20000 Res .Pwr . @FWHM
Probe
berechnet
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 157
__________________________________________________________________________
8 Untersuchung zur Aufnahme von Veterinärantibiotika in Gemüse 158
In der Abb. 62 ist zu sehen, dass die Retentionszeit im Vergleich zum Standard
übereinstimmt. Jedoch liegt die Abweichung der exakten Masse im Full Scan im Vergleich
zum Standard im Grenzbereich (Abweichung 10,3 ppm, Toleranz <1 ppm, s. Seite 60,
Kap.6.3.2.2). Es wurden keine weiteren MS-Experimente durchgeführt. Daher konnte eine
abschließende Zuordnung aufgrund der Daten nicht erfolgen.
Fazit
Aufgrund der niedrigen Probenanzahl ist der Aussagewert der Analysenergebnisse gering.
Jedoch geben die detektierten massenchromatographischen Signale im niedrig- und
insbesondere im hochauflösenden MS-Modus qualitative Hinweise auf Tetracyclin, sowie
einem Didesmethyl-Derivat des Oxytetracyclins (N-DDM-OC) und Ciprofloxacin in
Gemüseproben. Dabei stellte sich heraus, dass für weitere Untersuchungsreihen noch
Optimierungsbedarf besteht, insbesondere beim Weißkohl.
9 Zusammenfassung 159
9 ZUSAMMENFASSUNG
Viele Studien belegen das hohe Aufnahme- und Transportpotenzial zahlreicher
Nutzpflanzen, die in der Lage sind, Veterinärpharmaka unterschiedlicher Wirkstoffgruppen
über die Wurzel aufzunehmen. Weiterhin wurde ein Transfer von Antibiotika aus
güllebeaufschlagtem Boden in den als Nahrungs- und Futtermittel genutzten Teil des
Getreides, das Korn, nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass allgemein mit einem
Transfer antibiotisch aktiver Pharmaka-Rückständen aus Wirtschaftsdüngern in pflanzliche
Lebens- und Futtermittel zu rechnen ist. Unklar ist jedoch, ob dieser Transfer auch in der
Praxis der konventionellen Landwirtschaft von Bedeutung ist. Daher wurde im Rahmen eines
Screenings überprüft, ob Antibiotika in Getreide nachgewiesen werden, wenn der Anbau in
einer Region mit intensiver Schweinehaltung auf langjährig mit Gülle gedüngten Böden
erfolgt. Des Weiteren wurden handelsübliche Weizenproben aus Niedersachsen untersucht,
um sowohl in Getreide als auch Getreidemahlerzeugnissen die Rückstandssituation von
Antibiotika zu überprüfen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Aufnahmeexperimente durchgeführt, um nähere
Erkenntnisse über die Aufnahme der Antibiotika von Gemüse zu gewinnen. Die zentrale
Zielsetzung dieser Experimente bestand darin, das Aufnahmepotential von Weißkohl und
Porree für verordnungsstarke Wirkstoffe aus der Nutztierhaltung über
Dotierungsexperimente in Hydrokultur zu erkennen. Anschließend sollten Feldpflanzen
beprobt und analysiert werden, um rückstandsanalytische Daten über die
Belastungssituation von Gemüse aus landwirtschaftlicher Praxis zu gewinnen.
Zu Beginn der Arbeit wurde eine LC-MS/MS basierte Methode zur Bestimmung von
Antibiotikawirkstoffen und ihrer Umwandlungsprodukte in Pflanzen entwickelt. Dabei wurde
die im Vorprojekt entwickelte Methode auf zusätzliche Wirkstoffgruppen und (pflanzliche)
Metabolite erweitert und optimiert. Die Vorgehensweise zur Optimierung der
Probenvorbereitung konzentrierte sich auf die Extraktion des gemahlenen Korns und des
homogenisierten Gemüses mit Citratpuffer und die nachfolgende Festphasenextraktion
(SPE, Solid Phase Extraction).
Bei der Optimierung der Fest-Flüssig-Extraktion wurden verschiedene Extraktionsverfahren
getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass der Einsatz der Mikrowellentechnik zu einer
niedrigeren Wiederfindung führte. Bei der Accelerated-Solvent-Extraction (ASE) war die
Wiederfindung höher als bei der Mikrowellentechnik. Allerdings wurde in den MS-
Chromatogrammen eine Intensitätssteigerung der Untergrundsignale beobachtet. Daher
wurde die ursprüngliche Ultraschall-gestützte Extraktion bei Raumtemperatur beibehalten.
Zur Identifizierung und Quantifizierung der Stoffe wurde ein HPLC-Komplettsystem (Thermo
Finnigan/Thermo Electron) mit dem massenselektiven Detektor LCQ-Advantage ESI-Ion-
9 Zusammenfassung 160
Trap verwendet. Zur Bestätigung der Stoffidentifizierung wurden bei den Pflanzenproben mit
positiven Befunden weitere Analysen mittels hochauflösender Massenspektrometrie (FTICR-
MS Fourier Transform Ionencyclotron Resonanz-Massenspektrometrie) durchgeführt.
Die umfassende Validierung der LC-MSn-Verfahren erfolgte nach EU-Richtlinien. Es wurden
die Validierungsparameter Wiederfindung, Nachweis- und Bestimmungsgrenze, Selektivität,
Präzision und Matrixeffekte bestimmt. Die ermittelten Wiederfindungen liegen beispielsweise
für Tetracycline bei 54,5-107,0 % und für SFD bei 38,3-50,3 %. Für die Methodenpräzision
unter Wiederholbedingungen ergaben sich Höchstwerte von 11,9 % für SFD und
Minimalwerte von 2,3 % für TC. Die mit der MS/MS-Detektion ermittelten Nachweisgrenzen
für Getreide betrugen 2,4-8,0 µg/kg und die Bestimmungsgrenzen 8,3-54,3 µg/kg. Für
Gemüse wurden Nachweisgrenzen im Bereich von 8,1-47,8 µg/kg und Bestimmungsgrenzen
von 8,1-41,0 µg/kg ermittelt. Die Untersuchungen auf Matrixeffekte zeigten für SFD eine
deutliche Suppression der Signale durch Matrixbestandteile über den gesamten
Kalibrationsbereich. Für TC und ENR war nur eine sehr leichte Suppression des Messsignals
durch Matrixbestandteile festzustellen.
Die Analyse von Getreideproben der Ernten aus den Jahren 2005 und 2006, die Gebieten
mit hohem Viehbesatz entstammen, führte zu sicher identifizierten positiven Befunden über
das Vorkommen von Tetracyclinen (TC, CTC einschließlich Epimeren und Tautomeren, iso-
CTC sowie DC und DMC) überwiegend im Winterweizen aus dem Jahre 2005. Die er-
mittelten Gehalte lagen vielfach unter der jeweiligen Bestimmungsgrenze (~8-18mg/kg FG)
oder, in seltenen Fällen im Bereich zwischen ~30 (iso-CTC, DC), ~60 (DMC, CTC) und
maximal ~95 mg/kg FG (iso-CTC). Ein deutlicher Zusammenhang zwischen angegebener
Medikamentierung der Viehbestände mit Tetracyclinen und nachgewiesenen Tetracyclin-
Gehalten in Boden und Korn war nicht erkennbar. Im Getreide der Ernte des Jahres 2006,
das den Kreisen Borken und Coesfeld entstammt, wurden keine positiven Tetracyclin-
Befunde festgestellt. Dies ist möglicherweise auf der Wurzelung des Getreides in tieferen
Bodenschichten aufgrund der extremen Trockenheit während der Wachstumsperiode
zurückzuführen. Ungeklärt bleiben sowohl die relativ hohen Gehalte an DMC im
Winterweizen der Ernte des Jahres 2005 aus dem Kreis Borken als auch die Gehalte an DC
in drei Proben aus Niedersachsen. Ob Metabolisierung in Boden und Pflanze die Ursache
sein kann, ist in weiteren Untersuchungen zu klären. Die ermittelte, sehr heterogene
Kontamination des Getreides der beiden Getreide-Ernten aus den Jahren 2005 und 2006
kann möglicherweise besser erklärt werden, sobald mehr Informationen über nicht bekannte
Kenngrößen und Daten, wie z.B. zu Güllebelastung und Witterungseinflüssen, zur Verfügung
stehen. Ein hoher und langfristiger Einsatz von Tetracyclinen wird zweifellos diesen Transfer
begünstigen. Anzeichen für eine flächendeckende Belastung des Getreides durch
Antibiotika-haltige Gülle in Gebieten mit hohem Viehbesatz ergaben sich bislang nicht.
9 Zusammenfassung 161
Nach den Ergebnissen der Screeningstudie ist offensichtlich, dass auch in der
landwirtschaftlichen Praxis in viehstarken Gebieten ein Antibiotikatransfer aus dem Boden
bis in das Getreidekorn möglich ist. In der Tat kann ein derartiger Transfereffekt unter
bestimmten, noch nicht definierbaren Bedingungen auftreten. Zweifellos wird ein hoher und
langjähriger Einsatz von Tetracyclinen der dominierende Faktor sein. Es besteht nach der
jetzigen, noch sehr schmalen Datenbasis aber kein Grund zur Annahme, dass in viehstarken
Gebieten mit einer flächendeckenden Belastung des Getreides mit Antibiotika aus Gülle zu
rechnen ist.
Andererseits wurden bestimmte Signale der Massenchromatogramme (MS1 und MS2-Modus)
des LCQ-Systems zunächst dem Tetracyclin zugeordnet, was sich aber in der
Hochauflösung (FTICR-MS) nicht bestätigen ließ. Offensichtlich überlagern mehrfach
geladene Peptidfragmente [M+H]n+ (n=1-7) den Quasi-Molekülionenbereich des Tetracylins,
was die Ursache falsch positiver Befunde mit der niedrigauflösenden LC-MS-Methode sein
kann. Peptide könnten durch enzymatische Proteolyse während der Extraktion des Getreides
mit Citratpuffer gebildet werden. Deshalb wurden verschiedene Varianten der
Inkubationsmethode (mit Protease-inhibitor-Cocktail) erprobt und anschließend die
Wiederfindungen ermittelt. Jedoch konnten Wiederfindungswerte nicht für alle Analyte
ermittelt werden, da in den Chromatogrammen der mit Protease-Inhibitor dotierten Extrakte
Zusatzpeaks auftraten. Insbesondere im m/z-Bereich der Tetracycline überlagerten diese
zusätzlichen Peaks die eigentlichen TC-Peaks. Daher wurden die Getreideextrakte bei noch
folgenden Probenaufarbeitungen nicht mit Protease-Inhibitor-Cocktail behandelt. Deshalb
sind weitere Untersuchungen notwendig, um die Extraktion selektiver zu gestalten. Als
Alternative ist der Einsatz einer multidimensionalen Festphasenextraktion (MD-SPE)
denkbar, um eine Störung durch die Peptide als Matrixbestandteil in Pflanzen zu reduzieren.
Im weiteren Teil dieser Arbeit wurden handelsübliche Weizenproben aus Niedersachsen
untersucht. Von den insgesamt 46 der analysierten handelsüblichen Getreideproben (Korn,
Mehl, Kleie) wurden in drei Weizenproben (Korn) ENR (max. 32,7 µg/kg) und in einer
Weizenprobe (Korn) OTC oberhalb der Nachweisgrenze detektiert. Die detektierten
massenchromatographischen Signale sind zwar von geringer Intensität, geben aber im
niedrig- und insbesondere im hochauflösenden MS quantitative Hinweise auf ENR.
Um die Zeiteffekte bezogen auf die Stabilität der Antibiotikawirkstoffe in Getreide
festzustellen, wurde die Analyse der Getreideproben wiederholt. Zuerst wurden die
Weizenproben aus der Ernte 2006 nach 24 monatiger Lagerung bei Raumtemperatur
entsprechend der Arbeitvorschrift analysiert. Bei diesen zwei Winterweizenproben handelte
es sich um Proben, in denen DC nachgewiesen wurde. Demgegenüber ist in diesen Proben
nach einer 24-monatigen Lagerung bei Raumtemperatur kein DC und e-DC mehr
nachweisbar. Ebenfalls wurden zusätzlich vier Weizenproben der handelsüblichen
9 Zusammenfassung 162
Winterweizen analysiert. Bei diesen Proben handelt es sich um die Weizenproben mit
positivem ENR-Befund (32,7 µg/kg und 30,1µg/kg). Demgegenüber lag der Gehalt an ENR
bereits nach fünf Wochen unterhalb der Bestimmungsgrenze (15 µg/kg). Diese Ergebnisse
lassen auf Abbaureaktionen und/oder Sorptionvorgänge schließen, welche zu einer
verminderten Extrahierbarkeit und somit zur Reduzierung der nachweisbaren
Analytengehalte in Getreideproben führen.
Für die Aufnahmeexperimente wurden im ersten Schritt Weißkohl, die in Deutschland am
meisten verzehrte Kohlart, und Porree kontrolliert angezogen und anschließend auf
Hydrokultur umgesetzt. Den Nährlösungen wurden verschiedene Antibiotika (SFD, ENR, TC,
CTC und MON) zugesetzt. Nach ein bis dreiwöchigem Wuchs auf den dotierten
Nährlösungen wurden Pflanzenproben genommen und dann jeweils analysiert.
Die Ergebnisse der Aufnahmeexperimente zeigen, dass die makroskopischen Wirkungen der
Antibiotika auf die in Hydrokultur angezogenen Gemüsepflanzen (Dotierungskonzentration
der Nährlösung: 5 µmol/L je Antibiotikum) sehr unterschiedlich waren. Sie reichten beim
Porree von nicht erkennbaren Effekten (MON, SFD) und schwach ausgeprägten
Ausbleichungseffekten in jungen Blattabschnitten (CTC), bis zu starken Effekten durch den
Einfluss von ENR. Die (phytotoxischen) Wirkungen der Antibiotika auf die Weißkohlpflanzen
waren wesentlich ausgeprägter. So zeigte der mit CTC dotierte Weißkohl gelbliche
Verfärbungen der Leitbahnen. MON führte an einigen Blättern zu Läsionen und schließlich
zum Welken. Bei Dotierung mit ENR war eine fast vollständige Ausbleichung der jungen
Blätter festzustellen.
Mit LC-MS/MS-Methoden (niedrig- und hochauflösende MS) wurden die dotierten Antibiotika-
wirkstoffe sowie Umwandlungsprodukte und Metaboliten separat in den Pflanzenteilen von
Porree (Wurzel, junge und alte Blattabschnitte) sowie Weißkohl (Wurzel, Stängel, junge und
alte Blätter) identifiziert und quantifiziert. Je nach Wirkstoff, Gemüseart und Pflanzenteil
umfassten die ermittelten Arzneistoffrückstände mehrere Größenordnungen (µg/kg bis
mg/kg-Bereich). Die höchsten Konzentrationen wurden in den Wurzeln bei den
Gemüsepflanzen mit CTC, TC (Weißkohl: ca. 10 mg/kg FG, Porree: ca. 20 mg/kg) und ENR
(Weißkohl: ca. 12 mg/kg) erreicht, das in geringen Anteilen zum CIP metabolisiert. ENR
wurde in extremem Ausmaß in der Weißkohlpflanze transportiert, so dass alte
Weißkohlblätter ähnlich hohe ENR-Gehalte (ca. 7 mg/kg FG) enthielten wie die Wurzeln. In
den Stängeln und Blättern (jung und alt) des Weißkohls sowie den jungen und alten
Blattabschnitten des Porrees wurden alle dotierten Wirkstoffe nachgewiesen. Dabei
dominieren ENR und CTC (einschließlich seiner Umwandlungsprodukte wie z.B. DMC und
TC), während SFD und MON in deutlich niedrigeren Konzentrationen vorgefunden wurden (<
100 µg/kg).
9 Zusammenfassung 163
Im Rahmen des Gemüse-Projektes war geplant, Weißkohl und Porree aus
landwirtschaftlicher Praxis zu beproben und auf mögliche Antibiotikarückstände zu
analysieren. Da von fast allen der angesprochenen Betriebe und mit Gemüsebau befassten
Organisationen eine Probenahme abgelehnt worden war, konnten leider nur wenige
Feldpflanzen (Weißkohlköpfe, Porreestangen, Chinakohlköpfe) beprobt und analysiert
werden, bei denen sich einige Verdachtsbefunde (TC, CTC-Metabolite, CIP) ergaben.
Zweifelsfrei belegen aber die Ergebnisse der Aufnahmeexperimente in Hydrokultur ein
enormes Aufnahmepotential von Weißkohl und Porree für einige Veterinärpharmaka,
insbesondere für TC und ENR.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der o.g. Studien (Screeningstudien in
konventioneller Landwirtschaft, Hydrokulturversuche), dass neben Lebensmitteln tierischen
Ursprungs, ein weiterer Eintragspfad für Antibiotika in die Lebensmittelkette über
Nutzpflanzen möglich ist, da Antibiotika aus Gülle-beaufschlagten Böden von Nutzpflanzen
(Getreide, Gemüse) aufgenommen werden. Diese Nutzpflanzen können antibiotisch
wirksame Substanzen über die Wurzel aufnehmen, diese einlagern, innerhalb der Pflanze in
verschiedene Kompartimente transportieren und metabolisieren. Die Metabolisierung der
Substanzen in Pflanzen kann zum Auftreten anderer Metabolite führen. Das Verhalten der
Wirkstoffe in einer Pflanzenart ist nicht direkt af das Verhalten in anderen Pflanzenarten
übertragbar. Zudem stellen die Güllebelastung, Bodenparameter sowie
Witterungsverhältnisse weitere Einflussfaktoren dar.
In der Fachliteratur publizierte Ergebnisse von Aufnahmeversuchen unter
Gewächshausbedingungen bestärken die aus den o.g. Studien gefolgerten Ergebnisse. Um
weitere Abschätzungen vornehmen zu können, müssen Feldversuchen durchgeführt werden.
Daher ist die Dringlichkeit offenkundig, Feldpflanzen systematisch auf Versuchsflächen und
(langjährig) Gülle-gedüngten Verdachtsflächen zu beproben und rückstandsanalytisch zu
untersuchen.
Außerdem kann bislang keine Aussage darüber getroffen werden, welcher Anteil der im
begüllten Boden enthaltenen Tierarzneimittelrückstände tatsächlich durch die Pflanze
aufgenommen wird. Des Weiteren liegen keine Erkenntnisse darüber vor, in welchem Maße
die in der Pflanze vorhandenen Rückstände nach Aufnahme durch den Menschen
bioverfügbar sind. Daher sind weitere Untersuchungen notwendig. Erst dann wäre das
Verbraucherrisiko durch den möglichen Antibiotika-Eintragspfad „Nutzpflanze“ in die
Nahrungsmittelkette abschätzbar.
10 Literaturverzeichnis 164
10 LITERATURVERZEICHNIS
[1] J. Bauer; Schweinegülle – Quelle für potentiell unerwünschte Stoffe (Boden, Wasser, Pflanze)?;
Einführung Tagungsband, 5. Kulturlandschaftstag, 4. Mai 2006, Freising-Weihenstephan,
Schriftenreihe der Bayrischen Landesanstalt für Landwirtschaft; ISSN 1611-4159, 2006, 12-15
[2] B. Halling-Sørensen, S.N. Nielsen, P.F. Lanzky, F. Ingerslev, H.C. Holten Lützhoft, S.E. Jorgensen;
Occurence, Fate and Effects of Pharmaceutical Substances in the Environment – A Review;
Chemosphere 36, 1998, 357-393
[3] G. Hamscher, H.T. Pawelzick, H. Höper, H. Nau; Different Behavior of Tetracyclines and
Sulfonamides in Sandy Soils after Repeated Fertilization with Liquid Manure; Environ. Toxicol. Chem.
24, 2005, 861-868
[4] M. Schneidereit; Antibiotikaeinsatz in der Veterinärmedizin: Situation in Deutschland und anderen
europäischen Veredelungsregionen; Bundesverband für Tiergesundheit (BfT), Vortrag, Bonn, 14.
September 2006
http://www.bft-
online.de/fileadmin/bft/schwerpunktthemen/antibiotikaeinsatz_in_der_veterinaermedizin_folien.pdf
[5] K. Kümmerer; Antibiotics in the aquatic environment; A review - Part 1, Chemosphere 75, 2009 a,
417-434.
[6] M. Grote, A. Vockel, D. Schwarze, A. Mehlich, M. Freitag, Fresenius Environmental Bulletin – FEB,
2004, 13: 1216-1224.
[7] GSF - Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit (Hrsg.), Kommunikation FLUGS-
Fachinformationsdienst. Antibiotika und Antibiotikaresistenzen. Neuherberg, 2007, 1-14.
[8] N.A. Krasilnikov, Soil, microorganisms and higher plants, in: Academy of Sciences of the USSR
(Hrsg); Interaction between soil microorganisms and plants, Part IV, Moskau; 1958, Übersetzung von
1961. Washington .D.C.: The national science foundation.
[9] M. Grote, C. Schwake-Anduschus, H. Stevens, R. Michel, T. Betsche, M. Freitag; Antibiotika-
Aufnahme von Nutzpflanzen aus Gülle-gedüngten Böden - Ergebnisse eines Modellversuchs; Journal
für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit 1, 2006, 38 – 50
[10] A.B.A. Boxall, P. Johnson, E.J. Smith, C.J. Sinclair, E. Sturr, L.S. Levy; Uptake of Veterinary
Medicines from Soils into Plants; J. Agric. Food Chem. 54, 2006, 2288-2297
[11] N. P. Gujarathi, J. B. Haney, J. C. Linden; Phytoremediation potential of Myriophyllum aquaticum
and Pistia stratiotes to modify antibiotic growth promoters, tetracycline and oxytetracycline, in aqueous
wastewater systems; Internat J Phytoremed 7, 2007, 99–112.
[12] K. Kumar, S.C. Gupta, S.K. Baidoo, Y. Chander, C. Rosen; Antibiotics uptake by plants from soil
fertilised with animal manure; J. Environ. Qual. 34, 2005, 2082-2085
[13] Agrarstrukturerhebung 2005, Heft 4, Viehhaltung Wirtschaftsdünger tierischer Herkunft, C IV 9.4 –
j / 05, Statistische Berichte Niedersachsen Landesbetrieb für Statistik und Kommunikationstechnologie
Niedersachsen, 2009
[14] Gülle-Festmist-Jauche-Silagesickersaft-Gärreste Gewässerschutz (JGS-Anlagen),
Umweltministerium Ministerium für Ernährung und Ländlichen Raum, Merkblatt, Baden-Württenberg,
2008
[15] ATV-DVWK; Beeinflussung der Grundwasserqualität durch Wirtschaftsdünger und Sekundärstoffe
unter besonderer Berücksichtigung problematischer Stoffgruppen. Teilprojekt: Bestandsaufnahme des
derzeitigen Kenntnisstandes und Bewertung unter besonderer Berücksichtigung des
Grundwasserschutzes. ATV-DVWK - Deutsche Vereinigung für Wasserwirtschaft, Abwasser und
Abfall e.V., Arbeitsgruppe GB-6.2, Arbeitsbericht, ISBN 3-935669-71-2, 2001
[16] Wirtschaftsdünger und Gewässerschutz Lagerung und Ausbringung von Wirtschaftsdüngern in
der Landwirtschaft, Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft (LfL), 2009
10 Literaturverzeichnis 165
[17] P. Gurrath; Landwirtschaft in Deutschland und der Europäischen Union; Statistisches Bundesamt,
Wiesbaden, Online-Dokument, www.destatis.de, letzter Zugriff am 05.05.2010, 2009
[18] Bodennutzung und Ernte 2007, Statistische Berichte Niedersachsen, Landesbetrieb für Statistik
und Kommunikationstechnologie Niedersachsen (LSKN); online Dokument,
http://www.lskn.niedersachsen.de, 2007
[19] Merkblatt zur Düngeverordnung, Verordnung über die Anwendung von Düngemitteln,
Bodenhilfsstoffen, Kultursubstraten und Pflanzenhilfsmitteln nach den Grundsätzen der gut en
fachlichen Praxis beim Düngen (Düngeverordnung-DüV) vom 10. Januar 2006, BGBl. I 2006, Nr. 2, S.
20 - 29, Neufassung der Düngeverordnung vom 27. Februar 2007, BGBl. I 2007, Nr. 7, S. 221 - 240
[20] O. Rühlmann; Wirtschaftsdünger, effektiv und umweltschonend lagern und einsetzen; LUFA
Sachsen-Anhalt, 2000
[21] D. Fritz, J.Habben; Der Einfluß von ökologischen Faktoren, Düngung und Anbautechnik auf die
Qualität von Gemüse für die Konserven-industrie; in Einfluß von Standart, Düngung und Anbautechnik
auf die Qualität von Gemüse,Technischen Universität Münschen, 1972
[22] O. Hördemann; Untersuchungen zur Gülleverträglichkeit von Grünlandgräsern, dargestellt am
Beispiel des Deutschen Weidelgrases (Lolium perenne). Jahrestagung AG Grünland und Futterbau,
Kleve, 108 – 125, 1987, letzter Zugriff am 05.05.2010
http://www.landwirtschaft-mlr.baden-wuerttemberg.de/servlet/PB/menu/1174997_l3/index.html
[23] Nährstoffvergleich und Humusbilanzierung im Ökologischen Landbau,
http://www.mugv.brandenburg.de/cms/detail.php/lbm1.c.211496.de, letzter Zugriff am 05.05.2010
[24] Ökolandbau–Portal, Online-Dokument, http://orgprints.org/2925/9/lichtenhahn-koller-2004-
gemuese-kohl.pdf, letzter Zugriff am 05.05.2010
[25] R. Sattelberger; Arzneimittelrückstände in der Umwelt - Bestandsaufnahme und
Problemdarstellung; Bericht des Umweltbundesamtes; Wien; 1999
[26] R. Sattelberger, O. Gans, E. Martínez; Veterinärantibiotika in Wirtschaftsdünger und Boden;
Umweltbundesamt, Bericht, ISBN 3-85457-775-3, 2005
[27] S. Schwarz, E. Chaslus-Dancla; Use of antimicrobials in veterinary medicine and mechanisms of
resistance; Vet. Res. 32, 2001, 201-225
[28] T. Christian; Antibiotika in Oberflächengewässern Nordrhein-Westfalens; Dissertation, Rheinische
Friedrich-Wilhelms-Universtität Bonn, 2004; http://hss.ulb.uni-
bonn.de/diss_online/math_nat_fak/2004/christian_thorsten/0476.pdf, Zugegriffen am 05.05.2010
[29] S. Schwarz, C. Kehrenberg, T.R. Walsh; Use of antimicrobial agents in veterinary medicine and
food animal production; Int. J. Antimicrob. Agents 17, 2001, 431-437
[30] S. Schwarz, C. Werckenthin; Risiken des Antibiotika-Einsatzes in Veterinärmedizin und
landwirtschaftlicher Tierproduktion; Chemotherapie Journal 6, 2001, 197-202
[31] H. Bentz; Veterinärmedizinische Pharmakologie. Antibiotika. Antiparasitika; 1. Aufl. VEB Gustav
Fischer Verlag Jena, 461-503 und 524-534, 1982
[32] F. Bager; Danmap 2000 – Consumption of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial
resistance in bacteria from food animals, food and humans in Dänemark ; Danish Veterinary&Food
Administration, Danish Medicines Agency, Danish Veterinary Laboratory, Copenhagen,Denmark,
ISSN 1600-2032, 2001
[33] R. Kroker, R. Scherkl, F.R. Ungemach;: Chemotherapie bakterieller Infektionen; in Lehrbuch der
Pharmakologie und Toxikologie für die Veterinärmedizin, 2. Aufl. Enke Berlin, 353-394, 2002
[34] VERORDNUNG (EG) Nr. 1831/2003 DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND DES RATES
vom 22. September 2003 über Zusatzstoffe zur Verwendung in der Tierernährung; ABl. L 268 vom
18.10.2003
[35] A. Richter, W. Löscher; Zusatzstoffe mit pharmakologischer Wirkung; In: Lehrbuch der
Pharmakologie und Toxikologie für die Veterinärmedizin. H.H. Frey, W. Löscher (Hrsg.), 2. Aufl. Enke
Berlin, 2002, 592-597
10 Literaturverzeichnis 166
[36] A. Richter, W. Löscher, W. Witte, W; Leistungsförderer mit antimikrobieller Wirkung: Probleme
aus pharmakologisch-toxikologischer und mikrobiologischer Sicht; Praktischer Tierarzt, 7, 603-622,
1996
[37] R. Helmuth; Einsatz antimikrobiell wirksamer Substanzen in der Veterinärmedizin - Zum Stand
der Diskussion; Bundesgesundheitsbl. - Gesundheitsforsch.- Gesundheitsschutz 42, 1999, 26-34.
[38] D. Müller-Bahrdt; Entwicklung des Einsatzes antimikrobiell wirksamer Tierarzneimittel in
Fütterungsarzneimitteln in Sachsen-Anhalt in den Quartalen 03/2000, 01/2001, 03/2001 und 01/2002
und einer ausgewählten Großtierpraxis im 1.Quartal 2002; Dissertation, Universität Leipzig, 2004
[39] BGVV – Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin; BgVV
fordert zu zurückhaltendem und sorgsamem Umgang mit Tierarzneimitteln und Futterzusatzstoffen
auf; Pressemitteilung 07/1997 (14.4.1997)
[40] Verordnung (EG) Nr.2821/98 des Rates vom 17. Dezember 1998 zur Änderung der Richtlinie
70/524/EWG über Zusatzstoffe in der Tierernährung; ABl. L 351 vom 29.12.1998
[41] Germap 2008; Bericht über den Antibiotikaverbrauch und die Verbreitung von
Antibiotikaresistenzen in der Human- und Veterinärmedizin in Deutschland; Bundesamt für
Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 2008, ISBN 978-3-00-025097-2
[42] K. S. Lauen; Erhebungen zum Arzneimitteleinsatz durch bayerische Tierärzte bei Lebensmittel
liefernden Tieren; Dissertation, Ludwig-Maximillians-Universität München, 2006
[43] EMEA: Antibiotic Resistance in the European Union Associated with Therapeutic use of
Veterinary Medicines Report and Qualitative Risk Assessment. Report and Qualitative Risk
Assessement by the Committeefor Veterinary Medicinal Products. www.emea.eu.intcare: blinded,
randomised controlled trial of patient information leaflet. BMJ 324, 1999, 91-94; Medizinisches
Wissensnetzwerk der Universität Witten/Herdecke
[44] F. Ungemach; Figures on quantities of antibacterials used for different purposes in the EU
countries and interpretation; Acta agriculturæ scandinavica supply 93, 2000, 89–97
[45] M. Boatman; Survey of antimicrobial usage in animal health in the Europian Union 1998; Boatman
Consulting by order of Fedesa, 1998
[46] R. Brunner, A. Rank, K. Riedl; in: Die Antibiotica, Band 1 (Die großen Antibiotika), Teil 2
(Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracycline); Verlag Hans Carl, Nürnberg, 1962, 311-625
[47] H. Muxfeldt; Synthesen in der Tetracyclin-Reihe; Angew Chem 1962; 74: 443-78.
[48] H. Auterhoff, J. Knabe, H.-D. Höltje; in: Lehrbuch der pharmazeutischen Chemie;
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart; 13. Aufl., 1994, 741-795
[49] R.A. Fernandez, S. A. Dassie; Transfer of tetracyclines across the H2OI1,2-dichloroethane
interface: Analysis of degraded products in strong acid and alkaline solutions, Journal of
electroanalytical chemistry 585, 2005, 240-249
[50] L.A. Syed; Tetracycline Hydrochloride, Analytical profiles of drugs, 13, 597-653, 1984
[51] W. Dürckheimer; Tetracycline: Chemie, Biochemie und Struktur-Wirkungsbeziehungen; Angew.
Chem. 87, 1975, 751-784
[52] C.R. Stephens, K. Murai, K.J. Brunings, R.B. Woodward; Acidity Constants of the Tetracycline
Antibiotics; J. Am. Chem. Soc. 78, 1956, 4155-4158
[53] J.M. Wessels, W.E. Ford, W. Szymczak, S. Schneider; The Complexation of Tetracycline and
Anhydrotetracycline with Mg2+ and Ca2+: A Spectroscopic Study; J. Phys. Chem. B 102, 1998, 9323
9331
[54] H.A. Duarte, S. Carvalho, E.B. Paniago, A.M. Simas; Importance of Tautomers in the Chemical
Behavior of Tetracyclines; J. Pharm. Sci. 88, 1999, 111-120
[55] .O. G. Othersen, H. Lanig, and T. Clark; Systematic surface scan of the mostfavorable interaction
sites of magnesium ions with tetracycline. J. Med. Chem., 46, 2003, 5571-5574.
10 Literaturverzeichnis 167
[56] J. M. Wessels, W. E. Ford, W. Szymczak, S. Schneider; The complexation oftetracycline and
anhydrotetracycline with Mg2+ and Ca2+: A spectroscopic Study; J.Phys. Chem. B, 102, 1998, 9323-
9331.
[57] Y. Liang, B. Denton, R.B. Baters, Stabilty studies of tetracycline in methanol solution; journal of
Chromatography A, 827, 1998, 45-55
[58] J: Zhu, D.D. Snow, D.A. Cassada., S.J. Monson, R.F. Spalding, Analysis of oxytetracycline,
tetracycline, and chlortetracycline in water using solid-phase extraction and liquid cgromatography-
tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 928, 2001, 177-186
[59] J.R.D. McCormick, S.M. Fox, L.L. Smith, B.A. Bitler, J. Reichenthal, V.E. Origoni, W.H. Muller, R.
Winterbottom, A.P.Doerschuk; Studies of the Reversible Epimerization Occurring in the Tetracycline
Family. The Preparation, Properties and Proof of Structure of Some 4-epi-Tetracyclines; J. Am. Chem.
Soc. 79, 1957, 2849-2858
[60] A. Vockel; Bestimmung von Chlortetracyclinrückständen in biologischen Proben aus der
landwirtschaftlichen Tierhaltung mit HPLC-UV-MS/MS – Methodenentwicklung und Anwendung in
Medikationsstudien; Dissertation, Universität Paderborn, 2005
[61] D.A. Hussar, P.J. Niedergall, E.T. Sugita, J.T.Doluisio; Aspects of the epimerization of certain
tetracycline derivatives; J. Pharm. Pharmac, 20, 1968, 539-546
[62] D.G. Kennedy, R.J. McCracken, S.A. Hewitt, J.D.G. McEvoy; Metabolism of chlortetracycline:
drug accumulation and excretion in the hen`s egg; Analyst 123, 1998, 2443-2447
[63] J. Diana, L. Vandenbosch, B. De Spiegeleer, J. Hoogmartens, E. Adams; Evaluation of the
stability of chlortetracycline in granular premixes by monitoring its conversion into degradation
products; J. Pharm. Biomed. Anal. 36, 2005, 523-530
[64] H. J. Roth, H. Fenner; Pharmazeutische Chemie III: Arzneistoffe Struktur -Bioreaktivität -
Wirkungsbezogene Eigenschaften. Georg Thieme Verlag Stuttgart-New York, 1988, 39-90.
[65] D. Schnappinger, W. Hillen; Tetracyclines: antibiotic action, uptake, and resistance mechanisms;
Arch. Microbiol. 165, 1996, 359–369
[66] H. Pawelzick; Tierarzneimittel aus der Intensivtierhaltung als neue Umweltkontaminanten –
Untersuchungen von Eintrag und Verhalten verschiedener Antibiotika in der Umwelt mittels
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandemmassenspektrometrie; Dissertation, Universität
Hannover, 2005
[67] G. Domagk; Ein Beitrag zur Chemotherapie der bakteriellen Infektionen; Dtsch. Med. Wschr. 7,
1935, 250-256
[68] C. Hartig; Analytik, Vorkommen und Verhalten aromatischer Sulfonamide in der aquatischen
Umwelt; Dissertation, Technische Universität Berlin, 2000
[69] J.W. Spoo, J.E. Riviere; Sulfonamides; in: H.R. Adams (Hrsg.), Veterinary Pharmacology and
Therapeutics, Iowa State University Press, Ames (USA), 8. Edition, 796-817, 2001
[70] S. Thiele-Bruhn; Pharmaceutical antibiotic compounds in soils - A review; J. Plant Nutr. Soil Sci.
166, 2003, 145-167
[71] W. Tappe, C. Zarfl, S. Kummer, P. Burauel, H. Vereecken, J. Groeneweg; Growth-inhibitory
effects of sulfonamides at different pH: Dissimilar susceptibility patterns of a soil bacterium and a test
bacterium used for antibiotic assays; Chemosphere 72, 2008, 836–843
[72] J.L. Woolley, C.W. Sigel; Metabolism and disposition by the rat of sulfadiazine-S-35 alone and in
the presence of trimethoprim; Drug Metabolism and Disposition 7, 1979, 94–99
[73] P. Duelli; Untersuchungen zum Vorkommen von Antiinfektiva in bayerischer Konsum- und
Tankmilch, Universität München, 2008
[74] M. Clara, O. Gans, F. Humer, S. Weiß, I. Zieritz; Antibiotika Im Grundwasser;
Sondermessprogramm im Rahmen der Gewässerzustandsüberwachungsverordnung, Report
REP-0258, ISBN 978-3-99004-059-1, Wien, 2010
10 Literaturverzeichnis 168
[75] M. Grote, T. Betsche, M. Freitag; Antiinfektivaeinträge aus der Tierproduktion in terrestrische und
aquatische Kompartimente; Abschlußbericht vom 14.01.2005 des Forschungsauftrages IIA5 –
2038.06.06.01 – B/T /01“; Ministerium für Verbraucherschutz des Landes NRW, 2005
[76] H.-H. Frey, W. Löscher; Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie für die Veterinärmedizin; 1.
Aufl., Enke Verlag, 1995, Stuttgart
[77] F. R. Althaus; Antimikrobielle Wirkstoffe und Entzündungshemmer, Universität Zürich, 2004,
http://www.vetpharm.unizh.ch/script/pdf_data/abcs.pdf
[78] W. Löscher; Pharmakotherapie bei Haus- und Nutztieren Parey, 2006 zitiert in Literatur [71]
[79] Europan Agency for the Evaluation of Medical Products, Committee for veterinary medical
products Summary report, 2002, http//:www.emea.eu.int, letzter Zugriff am 05.05.2010
[80] Bakterielle Resistenz gegenüber Chinolonen (Ciprofloxacin); Wissenschaftliche
Verlagsgesellschaft, Stuttgart, Chemotheraphie Journal H, 3, 8, 1999, 89-109; http://www.p-e-
g.org/publikationen/ctj/0399/UEBER.PDF; letzter Zugriff am 05.05.2010.
[81] O. Robak, W. Graninger; Chinolone in der Veterinärmedizin; Antibiotika Monitor, tom. XXII, 6,
2006, 91-96; http://www.antibiotikamonitor.at/06_6/pdf/06_6_03.pdf; letzter Zugriff am 05.05.2010
[82] G. Hamscher; Entwicklung und Einsatz neuer rückstandsanalytischer Nachweisverfahren für
Antibiotika und Antiparasitika in Umwelt- und Lebensmittelproben, Tierärztlichen Hochschule
Hannover, Habilitation, 2003
[83] J. E. Renew, C.-H. Huang; Simultaneous determination of fluorchinolone, sulfonamide, and
trimethoprim antibiotics in wastewater using tandem solid phase extraction and liquid chromatography-
electrospray mas spectrometry; Journal of Chromatography A, 1042, 2004, 113-121
[84] R. M. Evans; The chemistry of the antibiotics used in medicine; Pergamon Press Ltd., Oxford,
1965
[85] Tolls, J.; Sorptions of veterinary Pharmaceuticals in Soils: A Review; Environmental
Science&Technology, 35, 17, 2001, 3397-3406
[86] Z. H. Yuan, J. H. Duan, S. X. Fan, K. Kong; Comparison of an ELISA and a HPLC for
determination of ciprofloxacin residues in pork; Food Agric. Immun. 13(3), 2001, 199-204
[87] Online Dokument, http://www.gifte.de/Antidote/ciprobay.htm, letzter Zugriff am 05.05.2010
[88] T. Köhler, Untersuchungen zum Einfluß von antibiotischen Leistungsförderern und ionophoren
Antikokzidia auf die Inzidenz der Clostridium perfringens-Enterotoxämie des Huhnes nach
experimenteller Infektion, Dissertation, Universität Leipzig, 2000
[89] J. W. Westley; Polyether Antibiotics; Biology, Marcel Dekker Inc.,1, 1982.
[90] LC-Technik, Applikationsnote, Polyetherantibiotika; 2008, Online-Dokument,
www.lctech.de/.../264-LCTech-Applikation-Polyetherantibiotika.html, letzter Zugriff am 05.05.2010
[91] A.J. Ferdous , S. D. Bennefield, M. Singh; A modified HPLC method for monensin analysis in
liposomes and nanocapsules and its comparison with spectrophotometric and radioactive methods, J
Pharm Biomed Anal. Jul;15(11), 1997; 1775-80
[92] J. W. Westley: Polyether Antibiotics Vol. I: Biology, Marcel Dekker Inc., New York 1982.
[93] A.L. Donoho; Biochemical studies on the fate of monensin in animals and the environment. J.
Anim. Sci. 58, 1984, 1528-1539
[94] EFSA, Zusammenfassung des Gutachtens des Wissenschaftlichen Gremiums für Zusatzstoffe,
Erzeugnisse und Stoffe in der Tiernährung über die erneute Beurteilung des Kokzidiostatikums
Elancoban auf Ersuchen der Kommision entsprechend Artikel 9G der Richtlinie 70/524/EWG des
Rates, EFSA-Q-2003-0045; 2003
[95] F. Gerlach, Kokzidiose beim Dromedar (Camelus dromedarius); Dissertation, Universität Berlin,
2008
[96] F.D. Todd., N.R. Bagg; Use of ionopheres in lactating dairy cattle: a rewiew, Can Vet j: 41, 2000,
388-394.
10 Literaturverzeichnis 169
[97] M. Hinrichs; Auswirkungen von Enterococcus faecium als Futterzusatzstoff auf die Keimflora und
Zusammensetzung des Darminhalts sowie auf die Leistung von Broilern bei gleichzeitigem Einsatz
eines Kokzidiostatikums; Dissertation, Tierärztliche Hochschule Hannover, 2005
[98] U. Gräfe, R. Schlegel, M. Bergholz; Polyether-Antibiotika, Pharmazie 10, 1984, 661-670
[99] Regierung von Unterfranken-Wasser für Unterfranken; Broschüre der Regierung von
Unterfranken, Aktion Grundwasserschutz, 2006
http://www.aktiongrundwasserschutz.de/informationen/loesungswege/landwirtschaft/index.htm#,
letzter Zugriff am 05.05.2010
[100] A. Grudzinski; Umweltrelevanz von Antibiotika in der Landwirtschaft; Christian-Albrecht-
Universität Kiel, 2006
[101] J. Lewandowski, S. Leitschuh, V. Koß: Schadstoffe im Boden; ISBN: 3-540-62643-3, 1997
[102] M. Grote, C. Schwake-Anduschus, R. Michel, H. Stevens, W. Heyser, G. Langenkämper, T.
Betsche, M. Freitag; Incorporation of veterinary antibiotics into crops from manured soil.,
Landbauforschung Völkenrode - FAL Agricultural Research 57, 2007, 25-32
[103] O. Gans; Veterinärantibiotika in Wirtschaftsdünger und Boden in Österreich, Online-Dokument,
http://www.umweltbundesamt.at/fileadmin/site/leistungen/Umweltanalytik/Veterin_rantibiotika_in_Wirts
chaftsd_nger.pdf, letzte Zugriff am 05.05.2010
[104] G. Henkelmann, K. Mosandl; Sorption und Abbau von Tetracyclinen und Sulfonamiden im
Boden; Online-Dokument, 2006
http://www.stmugv.bayern.de/umwelt/boden/download/doc/mbodentage2006/seite112.pdf ,
letzter Zugriff am 05.05.2010
[105] A. Eschenbach, H. Mescher, R. Wienberg, B. Mahro; Humifizierung von Schadstoffen; in J.
Michels, T. Track, U. Gehrke, D. Sell (Fachredaktion), Umweltbundesamt (Hrsg.): Leitfaden
Biologische Verfahren zur Bodensanierung, Grün-Weiße Reihe des BMBF, 2001, 147-190,
[106] U. Schulte-Ebbert, U. Schöttler; Transport polycyclischer aromatischer Kohlenwasserstoffe
(PAK) bei der Untergrundpassage. Einfluss organischer und anorganischer mobiler Festphasen auf
die Mobilität von PAK; Veröffentlichungen des Instituts für Wasserforschung GmbH, Dortmunder
Beiträge zur Wasserforschung Nr. 62, 2003
[107] Leitfaden Biologische Verfahren zur Bodensanierung, Grundlagen der biologischen
Bodensanierung, Umweltbundesamt Projektträger Abfallwirtschaft und Altlastensanierung des BMBF.
[108] K. Smalla, C.T.T. Binh, C. Kopmann, H. Heuer; Effekte von Veterinärantibiotika auf mikrobielle
Gemeinschaften im Boden; Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 60, 2008, 236
[109] C. Pfeiffer, C. Emmerling, D. Schröder, J. Niemeyer; Antibiotika (Ivermectin, Monensin) und
Endokrine Umweltchemikalien (Nonylphenol, Ethinylöstradiol) im Boden, UWSF-Umweltchem.Ökotox.
10, 1998, 3
[110] M. Grote, B. Kuhlmann, G. Preuß, U. Schulte-Ebbert, H. Stevens und N. Zullei-Seibert;
Tierarzneimittel in der Umwelt: Bewertung von Eintrag, Verlagerung und Resistenzentwicklung unter
Gesichtspunkten des Verbraucherschutzes; Veröffentlichungen des Instituts für Wasserforschung
GmbH Dortmund, Dortmunder Beiträge zur Wasserforschung Nr. 66, 2007
[111] H. Stevens; Untersuchungen zum Verhalten von Veterinärpharmaka im Boden; Dissertation,
Universität Paderborn, 2009
[112] S.E. Allaire, J.D. Castillo, V. Juneau; Sorption kinetics of chlortetracycline and tylosin on sandy
loam and heavy clay soils; J. Environm. Qual. 35, 2006, 969-972
[113] C. Winckler, H. Engels, K. Hund-Rinke, T. Luckow, M. Simon, G. Steffens; Verhalten von
Tetrazyklinen und anderen Veterinärantibiotika in Wirtschaftsdünger und Boden (Wirkung von
Tetrazyklinen und anderen Tierarzneimitteln auf die Bodenfunktion); Umweltbundesamt,
Forschungsbericht 200 73 248, UBA-FB 000630, 2004
[114] M. Burkhardt, C. Stamm; Depth Distribution of Sulfonamide Antibiotics in Pore Water of an
Undisturbed Loamy Grassland Soil; J. Environ. Qual. 36, 2007, 588–596
10 Literaturverzeichnis 170
[115] T. Heberer, H.-J. Stan; Arzneimittelrückstände im aquatischen System; Wasser & Boden 50,
1998, 20-25
[116] Eintrag von Arzneimitteln und deren Verhalten und Verbleib in der Umwelt – Literaturstudie,
LANUV-Fachbericht 2, Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen
Recklinghausen 2007, ISSN: 1864-3930 Fachberichte
[117] S.D Aga.; Fate of pharmaceuticals in the environment and in water treatment systems; ISBN:
978-1-4200-5232-9, 2008
[118] C. Winckler, A. Grafe A.; Use of veterinary drugs in intensive animal production - Evidence for
persistence of tetracyclines in pig slurry; Journal of Soils and Sediments 2, 2001, 66-70
[119] A. Batt, D.S. Aga; Simultaneous Analysis of multiple classes of Antibiotics by ion trap LC/MS/MS
for assessing surface water and graoundwater contamination, Analytical chemistry, 2005
[120] S.-C. Kim, K. Carlson; Occurrence of ionophore antibiotics in water and sediments of a mixed-
landscape watershed; Water Research, 40, 2006, 2549-2560
[121] J. Hartung; Staubbelastung in der Nutztierhaltung;. Zentralblatt für Arbeitsmedizin, Arbeitsschutz
und Ergonomie,47, 2, 1997, 65-72
[122] S. Pedersen, M. Nonnenmann, R. Rautiainen, T.G. Demmers, T. Banhazi, M. Lyngbye; Dust in
pig buildings; J Agric Saf Health 6, 2000, 261–274.
[123] J. Seedorf, J. Hartung; Dust and micro-organisms in animal housing; KTBL Schrift 393,
Landwirtschaftsverlag GmbH, Münster, 2002
[124] J. Hartung; Gas- und partikelförmige Emissionen aus Ställen der Tierproduktion; DtschTierärztl
Wochenschr 102, 1995, 283–288
[125] G. Hamscher; Tierarzneimittel in der Umwelt unter besonderer Berücksichtigung von
Stallstäuben, Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 3, 2 / Mai 2008
[126] H. Pawelzick; Tierarzneimittel aus der Intensivtierhaltung als neue Umweltkontaminanten –
Untersuchungen zu Eintrag und Verhalten verschiedener Antibiotika in der Umwelt mittels
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandemmassenspektrometrie, Dissertation, 2005
[127] K. Smalla, C.T.T. Binh, C. Kopmann, H. Heuer; Effekte von Veterinärantibiotika auf mikrobielle
Gemeinschaften im Boden; Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 60, 2008, 236
[128] Y. Chander, K. Kumar, S.M. Goyal, S.C. Gupta; Antibacterial Activity of Soil-Bound Antibiotics; J.
Environm. Qual. 34, 2005, 1952-1957
[129] O. Mikes, P. Cupr, S. Trapp, J. Klanova; Uptake of polychlorinated biphenyls and organochlorine
pesticidesfrom soil and air into radishes (Raphanus sativus); Environmental Pollution 157, 2009, 488-
496
[130] Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 des Rates vom 26. Juni 1990 zur Schaffung eines
Gemeinschaftsverfahrens für die Festsetzung von Höchstmengen für Tierarzneimittelrückstände in
Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs; ABl. L 224 vom 18.8.1990
[131] M. Grote, A. Vockel, D. Schwarze, A. Mehlich, M. Freitag; Investigation on the fate of antibiotics
used in Pig farming in food chain and environment (Part 1); Fresenius Environmental Bulletin - FEB
13, 2004, 1216-1224
[132] B. Zierenberg; Ausgewählte Ergebnisse im Verbraucherschutz und in der Tiergesundheit,
Verbraucherschutz und Tiergesundheit, Online-Dokument,
http://cdl.niedersachsen.de/blob/images/C47830161_L20.pdf, letzter Zugriff am 05.05.2010
[133] A. Vockel, M. Grote, A. Mehlich;Bestimmung von Chlortetracyclin in Schlachtproben:
Methodenentwicklung und Validierung; Laborpraxis, Juli/August, 2005, 19-21
[134] G. Zurhelle; Entwicklung und Anwendung einer automatisierten HPLC-Methode mit gekoppelter
on-line Dialyse: Metabolismus, Verteilung und Elimination dreier Tetracycline bei Legehennen;
Dissertation, Bergische Universität-Gesamt-hochschule Wuppertal, 2000
[135] R. Michel; Entwicklung eines Monitoring-Systems zur Identifizierung und Quantifizierung von
Antibiotika und ihrer Umwandlungsprodukte in Honig; Universität Paderborn, Dissertation, 2010
10 Literaturverzeichnis 171
[136] V. Potthast; Nulltoleranz-Realität oder Wunschdenken; 2. DVT-Jahrestagung,Futtermittel in
Lebensmittelqualität - zwischen Theorie und Praxis, 2002, Online-Dokument,
www.dvtiernahrung .de/img/medien/Lang-Potthast.pdf, letzter Zugriff am 05.05.2010
[137] M. Dettenkoffer, M. Ackermann, M. Eikenberg, H. Merkel; Auswirkungen des Einsatzes von
Antibiotika und Substanzen mit antibiotischer Wirkung in der Landwirtschaft und im
Lebensmittelsektor; Ein Literatur-Review. Institut für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene am
Universitätsklinikum Freiburg, 2004
[138] A. Leitner, P. Zöllner, W. Lindner; Determination of the metabolites of nitrofuran antibiotics in
animal tissue by high-performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry; Journal of
Chromatography A, 939, 2001, 49-58
[139] BfR: Jahresbericht 2008 zum Nationalen Rückstandskontrollplan. Online-Dokument,
http://www.bvl.bund.de/cln_027/nn_493680/DE/01__Lebensmittel/01__Sicherheit__Kontrollen/04__N
RKP/01__berichte__nrkp/03__NRKP__ErgaenzendeDokumente__2008/nrkp__bericht__2008.html#d
oc1330186bodyText15; letzter Zugriff am 05.05.2010.
[140] Richtlinie 2001/18/EG des Europäischen Parlaments und des Rates vom 12. März 2001 über die
absichtliche Freisetzung genetisch veränderter Organismen in die Umwelt und zur Aufhebung der
Richtlinie 90/220/EWG des Rates - Erklärung der Kommission, ABl. L 106 vom 17.4.2001, S. 1–39
[141] M. Grote; Antibiotika in der Umwelt und in Nahrungsmittel. Ein Risiko für Konsumenten?;
internist.prax. 47, 2007, 919-926
[142] K.J. Netter, J.E.Bueld-Kleiner; Lebensmittel und Gesundheit; Deutsche
Forschungsgemeinschaft, ISBN: 3-527-27581-9, 1998
[143] EMEA/CVMP/234/01; Revised guideline on the safety evaluation of antimicrobial substances
regarding the effects on human gut flora, 2002
[144] H.-H. Frey, W. Löscher; Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie für die Veterinärmedizin;
1. Aufl., Verlag Enke, Stuttgart, 1996, 681-696
[145] Rückstände von Tierarzneimitteln in Lebensmitteln pflanzlicher Herkunft; Information Nr.
019/2010 des BfR vom 15. Februar 2010
[146] Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 des Rates vom 26. Juni 1990 zur Schaffung eines
Gemeinschaftsverfahrens für die Festsetzung von Höchstmengen für Tierarzneimittelrückstände in
Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs. Amtsbl. der EG Nr. L 224/1
[147] F. Schulze; Verbleib in Knochen gebundener Rückstände von Tetracyclinen während der
Herstellung von Gelatine mit dem sauren Aufschlussverfahren; Dissertation, Tierärztliche Hochschule
Hannover, 2003
[148] CVMP (COMMITTEE FOR VETERINARY MEDICINAL PRODUCTS ) (1996): Doxycycline
Hyclate, Summary Report in: EMEA (Hrsg.)/MRL/101/96-FINAL, http://www.eudra.org, letzter Zugriff
am 05.05.2010
[149] Verordnung über Tierärtzliche Hausapotheken–TÄHAV, in der Fassung vom 20. Dezember
2006; Bundesgesetzblatt I.S. 3456
[150] W. Witte, I. Klare; Antibiotikaresistenz bei bakteriellen Infektionserregern; Bundesgesundhbl. -
Gesundheitsforsch. - Gesundheitsschutz 42, 1999, 8-16
[151] G. Flindell; Genetische und molekularbiologische Untersuchungen zur Antibiotikaresistenz bei
Salmonella Enteritidis Isolaten der Jahre 1986-1995; Dissertation, Universität Berlin, 1998
[152] W. Forth, D. Henschler, W. Rummel; Allgemeine und spezielle Phamakologie und Toxikologie;
Wissenschaftsverlag, Mannheim; 5. Aufl.; 1988; 580-715
[153] H.-G. Classen, H.-J. Hapke; Fremdstoffe in Lebensmittel: Zusätze, Verunreinigungen und
Rückstände; ISBN: 3-7776-0774-6, 1997
[154] I. Stock, B. W. Wiedemann; Die Bestimmung der natürlichen Antibiotikaempfindlichkeit;
Chemotherapie Journal 7, 1998, 127-135
[155] M.F. DeFlaun, S.B. Levy; Genes and their varied hosts; In: S.B. Levy, R.V. Miller: Gene Transfer
in the Environment, New York, Donneley and Sons, 1989
10 Literaturverzeichnis 172
[156] W. Forth, D. Henschler, W. Rummel; in: Allgemeine und spezielle Phamakologie und
Toxikologie; Wissenschaftsverlag, Mannheim; 5. Aufl.; 1988; 580-715
[157] P.M. Shah; The need for new therapeutic agents: what is in the pipeline?; Clinical Microbiology
and Infection 11, 2005, 36–42
[158] U. Gräfe; Biochemie der Antibiotika; 1. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Berlin, New York, 1992
[159] A. Alonso, E. Campanario, J.L. Martinez; Environmental selection of antibiotic resistance genes;
Environmental Microbiology 3, 2001, 1-10
[160] B. Berger-Bächi; Mechanismen der Antibiotika-Resistenzbildung in Bakterien; Mitt. Lebensm.
Hyg. 92, 2001, 3–9
[161] D. Schnappinger, W. Hillen; Tetracyclines: antibiotic action, uptake, and resistance mechanisms;
Arch. Microbiol. 165, 1996, 359–369
[162] A. Brakhage; , Antibiotika; Angewandte Mikrobiologie, 2005, .409-425, ISBN: 978-3-540-24083-9
[163] M.J.B. Mengelers, E.R. van Gogh, M.B.M Huveneers, P.E. Hougee, H.A. Kuiper, A. Pijpers,
J.H.M. Verheijden, A.S.J.P.A.M. van Miert; Pharmacokinetics of Sulfadimethoxine and
Sulfamethoxazole in Combination with Trimethoprim after Oral Single- and Multiple-Dose
Administration to Healthy Pigs; Veterinary Research Communications 25, 2001, 461-481
[164] R. M. Evans; The chemistry of the antibiotics used in medicine; Pergamon Press Ltd., Oxford,
1965
[165] M. Kühne, G. Hamscher, U. Körner, D. Schedl, S. Wenzel; Formation of anhydrotetracycline
during a high-temperature treatment of animal-derived feed contaminated with tetracycline; Food
Chemistry 75, 2001, 423–429
[166] RICHTLINIE 94/65/EG DES RATES vom 14. Dezember 1994, zur Festlegung von Vorschriften
für die Herstellung und das Inverkehrbringen von Hackfleisch/Faschiertem und Fleischzubereitungen,
1994
[167] M.A. Schouten, A. Voss, J.A. Hoogkamp-Korstanje; VRE and meat; The Lancet 349, 1997, 1258
[168] Helmholtzzentrum München; Antibiotika und Antibiotikaresistenzen. FLUGS
Fachinformationsdienst, Neuherberg, 2007, Online-Dokument,
http://www.helmholtz-muenchen.de/flugs
[169] A. Abbott; Medics braced for fresh superbug; Nature 436, 2005, 758
[170] R.J. Bywater, M. Casewell; An assessment of the impact of antibiotic resistance in different
bacterial species and of the contribution of animal sources to resistance in human infections; Journal
of Antimicrobial Chemotherapy, 46, 2000, 643-645
[171] D. Großklaus; Rückstände in von Tieren stammenden Lebensmitteln; Verlag Paul Parey Berlin,
1. Aufl., 1989, 35-39
[172] L.J. Piddock; Does the use of antimicrobial agents in veterinary medicine and animal husbandry
select antibiotic-resistant bacteria that infect man and compromise antimicrobial chemotherapy?; J.
Antimicrob. Chemother. 38, 1996, 1-3
[173] GERMAP 2008; Antibiotika-Resistenz und –Verbrauch; Bericht über den Antibiotikaverbrauch
und die Verbreitung von Antibiotikaresistenzen in der Human- und Veterinärmedizin in Deutschland;
Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (Hrsg.), 1. Auflage, 2008
[174] N.D. Kristof; Pathogens in Our Pork; The New York Times, 15.März 2009, Online-Dokument,
http://www.nytimes.com/2009/03/15/opinion/15kristof.html, Zuletzt zugegriffen am 05.05.2009
[175] Wie oft MRSA Vorkommt; Online-Dokument,
http://www.mrsa-net.nl/de/answers.php?type=1&answer_id=65, letzter Zugriff Am 05.05.2010
[176] T. Khanna; Methicillin resistant Staphylococcus aureus colonization in pigs and pig farmers. Vet.
Microbiol. In Press, Accepted Manuscript, Available online 16 October 2007
doi:10.1016/j.vetmic.2007.10.006
10 Literaturverzeichnis 173
[177] P. Much; MRSA–eine neue Gefahr?; Vortrag-Präsentation, Online-Dokument,
http://www.ages.at/uploads/media/16_Much.pdf, letzter Zugriff am 05.05.2010
[178] M. Corrente, G. Normanno, V. Martella, A.L. Bellacicco, N.C. Quaglia, A. Dambrosio, D.
Buonavoglia, M. D’Abramo, C. Buonavoglia; Comparison of methods for the detection of methicillin
resistance in Staphylococcus aureus isolates from food products; Letters in Applied Microbiology 45,
2007, 535–539
[179] Y. Chander, K. Kumar, S.M. Goyal, S.C. Gupta; Antibacterial Activity of Soil-Bound Antibiotics; J.
Environm. Qual. 34, 2005, 1952-1957
[180] R.L. Mach, A.H. Farnleitner; Antibiotika und Resistenzproblematik; in: H. Kroiß (Hrsg.),
Arzneimittel in der aquatischen Umwelt, Wiener Mitteilungen 178, 2002, 151-178
[181] M.T. Brandl; Fitness of human enteric pathogens on plants and implications for food safety;
Annual Review of Phytopathology, 44, 2006, 367-392
[182] S. Boehme, G. Werner, I. Klare, R. Reissbrodt and W. Witte; Occurrence of antibiotic-resistant
enterobacteria in agricultural foodstuffs; Mol. Nutr. Food Res. 48, 2004, 522 – 531
[183] J. De Vries, W. Wachernagel; Detection of nptII (kanamycin genes) in genomes of transgenic
plants by marker-rescue transformation; Mol. Gen. Genet. 257, 1998, 606-613
[184] Bezanson, G.S., Khakhria, R. and Bollegraaf, E.; Nosocomial outbreak caused by antibiotic
resistant strain of Salmonella typhimurium acquired from dairy cattle. Can. Med. Assoc. J., 128, 1983,
426–427.
[185] K.M. Shea; Nontherapeutic Use of Antimicrobial Agents in Animal Agriculture: Implications for
Pediatrics; Pediatrics, 114, 2004, 862-868
[186] C. Schwake-Anduschus; Untersuchungen zur Aufnahme von Antibiotika durch Nutzpflanzen;
Dissertation, Universität Paderborn, 2008
[187] Dekant W., S. Vamvakas; Toxikologie; ISBN:3-86025-218-6, 1995
[188] Bewertung von Rückständen in Getreide; Deutsche Forschungsgemeinschaft, ISBN:3-7646-
1801-9, 1980
[189] S. Trapp, M. Larsen, H. Christiansen; Experimente zum Verbleib von Cyanid nach Aufnahme in
Pflanzen; Umweltchem. Ökotox 13 (1), 2001, 29-37.
[190] N. Feldwisch; Handlungsempfehlungen zur Gefahrenabwehr bei schädlichen
Bodenveränderungen in der Landwirtschaft; Vortrag auf dem BEW-Seminar „Bodenschutz in der
Landwirtschaft“ am 23.03.2006 in Essen, 2006
[191] S. Trapp, M. Matthies, B. Reiter; Überprüfung und Fortentwicklung der Bodenwerte für den
Boden-Pflanze-Pfad, Transferfaktoren Boden-Pflanze; Forschungsbericht 296 71 005, UBA-FB, 2001,
98-114, ISSN0722-186X
[192] S. Trapp, M. Matthies; Modeling Volatilisation of PCDD/F from Soil and Uptake into Vegetation;
Environmental Science and Technology 31 (1), 1997, 71-74.
[193] S. Trapp; Model für Uptake for Xenobiotika into Plants, Plant Contamination modeling und
simulation of organic chemical processes; 1995, ISBN:0-56670-078-7.
[194] Y. Gao, L. Zhu, W. Ling; Application of the partition-limited model for plant uptake of organic
chemicals from soil and water; Science of the total environment 336, 2005, 171-182
[195] R. Danova-Alt; Die Wirkung von xenobiotischem Phosphit auf die Phosphatmangelantwort und
den Stoffwechsel von Pflanzen; 2008
[196] U. Lüttge; Stofftransport der Pflanzen; ISBN:3-540-06230-0, 1973
[197] A. Hüser; Untersuchungen zum Stoffwechsel der Aminosäuren Aspartat und Glutamat, sowie
ihrer Amide in Pseudomonas: Klonierung und Charakterisierung von Amidohydrolase-Genen.
Konstruktion und Analyse von Transposon-Mutanten; Dissertation, Universität Marburg, 1999
[198] H. Parlar, D. Angerhöfer; Chemische Ökotoxikologie; Springer Verlag, ISBN: 3-540-53625-6,
1991
10 Literaturverzeichnis 174
[199] E. Steudle; Aufnahme und Transport des Wassers in Pflanzen; Nova Acta Leopoldina NF, 2002.
85 (323), 2002, 251-278.
[200] U. Lüttge, M. Kluge, G. Bauer G.; Botanik; ein grundlegendes Lehrbuch. VCH, Weinheim, 1998
[201] G. Briggs, G. Geoffrey; Theoretical and experimental relationships between soil adsorption,
octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor;
Journal of Agricultural and Food Chemistr: 29(5), 1981, 1050-1059.
[202] S. Trapp; Plant uptake and transport models for neutral und ionic Chemicals; Environ.
Sci.&Pollut.Res 11, 2004, 33-39
[203] G. Briggs, G. Geoffrey, Bromilow, H. Richard, A. Evans, A. Avis; M. Williams; Relationships
between lipophilicity and the distribution of non-ionised chemicals in barley shoots following uptake by
the roots; Pesticide Sci. 14, 1983, 492 - 500
[204] ACD/I-Lab service; ACD/pKa v6.0 und ACD/Log P v6.0, www.acdlabs.com
[205] D. Coupland; Detoxification of herbicides in plants; in Caseley J.C.,Cussan G.W., Atkin R.K.
(Herausgeber): Herbicide resistance in weeds and crops. Wiley, New York, 1991, 263-278.
[206] J. Breuer; Aufnahme, Metabolismus und Bildung nicht extrahierbare Rückstände aus 4-
Nitrophenol in Soja und Weizen; Dissertation, Ein Vergleich verschiedener In-vitro-Systeme,
Rheinisch-Westfälischen Hochschule Aachen, 2001
[207] K. Levsen., H.-M. Schiebel, B. Behnke., R. Dötzer, W. Dreher, M. Elend, H. Thiele; Structure
elucidation of phase II metabolites by tandem mass spectrometry: an overview; Journal of
Chromatography A, 1067, 2005, 55-72
[208] A.R. Batchelder; Chlortetracycline and oxytetracycline effects on plant growth and development
in soil systems. Journal of environmental quality:11 (4), 1982, 675-678.
[209] L. Migliore, G. Brambilla, S. Cozzolino, L. Gaudio; Effect on plants of sulphadimethoxine used in
intensive farming ( Panicum miliaceum, Pisum sativum and Zea mays); Agriculture, Ecosystems and
Environment: 52, 1995, 103-110.
[210] L. Migliore, C. Civitareale, S. Cozzolino, P. Casoria, G. Brambilla, L. Gaudio; Laboratory models
to evaluate phytotoxicity of sulphadimethoxine on terrestrial plants; Chemosphere 37, 1998, 2957-
2961.
[211] L. Migliore, S. Cozzolino, M. Fiori; Phytotoxicity to and uptake of enrofloxacin in crop plants;.
Chemosphere 52, 2003, 1233–1244.
[212] K. Kumar, S.C. Gupta, S.K. Baidoo, Y. Chander, C.J. Rosen; Antibiotic uptake by plants from
soil fertilized with animal manure; J. Environ. Qual. 34, 2005, 2082 – 2085
[213] A.B.A. Boxall, P. Johnson, E.J. Smith, C.J. Sinclair, E. Stutt, L.S. Levy; Uptake of veterinary
medicines from soils into plants; J. Agric. Food Chem.: 54, 2006, 2288-2297.
[214] J.P. Langhammer, F. Führ, H. Büning-Pfaue; Verbleib von Sulfonamid-Rückständen aus der
Gülle in Boden und Nutzpflanze; Lebensmittelchem. Gerichtl Chem 44, 93, 1990
[215] M. Grote, C. Schwake-Anduschus, R. Michel, W. Heyser, H. Hayen, G. Langenkämper, T.
Betsche, M. Freitag Aufnahme und Transport von Tierarzneistoffen in Nutzpflanzen; In Münchener
Beiträge zur Abwasser-, Fischerei- und Flussbiologie, Band 58, Vorträge der 58. Fachtagung
"Tierarzneimittel in der Umwelt", Hrsg. Bayrisches Landesamt für Umwelt, Oldenbourg Industrieverlag
GmbH, ISBN 978-3-8356-3135-9, 161-173, 2007
[216] D. Larry, L.M. King, J. Safley, W.S. Jerry; A greenhouse study on the response of corn (Zea
mays L.) to manure from beef cattle fed antibiotics; Agricultural Wastes, 8 (3), 1983, 185-190
[217] H. Dolliver, K. Kumar, S. Gupta; Sulfamethazine uptake by plants from manure amended soil; J
Environ Qual 36, 2007,1224– 1230
[218] P.P. Maia, E. Clarete da Silva, S. Rath, F. Guillermo Reyes; Residue content of oxytetracycline
applied on tomatoes grown in open field and greenhouse. Food Control 20, 2009, 11–16
[219] M.H. Farkas, J.O. Berry, D.S. Aga; Chlortetracycline Detoxification in Maize via Induction of
Glutathione S-Transferase after Antibiotic Exposure; Environmental Science and Technology, 41 (4),
2007, 1450-1456.
10 Literaturverzeichnis 175
[220] M. Grote, T. Betsche, M. Freitag; Untersuchungen zum Transfer pharmakologisch wirksamer
Substanzen aus der Nutztierhaltung in Gemüse – Porree und Weißkohl; Abschlußbericht vom
11.06.2008 des Forschungsauftrages ZV-2.1 – 07/080, Vergabe-Nr. 07/080, MUNLV, Ministerium für
Verbraucherschutz des Landes NRW, 2008
[221] W.D. Kong, Y.G. Zhu, Y.C. Liang, J. Zhang, F.A. Smith, M. Yang M.; Uptake of oxytetracycline
and its phytotoxicity to alfalfa (medicago sativa L.); Environmental Pollution 147, 2007, 187-193
[222] M. Grote, T. Betsche, M. Freitag; Screening zum Antibiotikatransfer aus dem Boden in Getreide
in viehstarken Regionen in Nordrhein-Westfalen; Abschlußbericht des Zuweisungserlasses II 1–
F60.2006.01 vom 12.03./29.06.2006. Ministerium für Verbraucherschutz des Landes NRW, 2007
[223] T. Fujisawa, M. Kurosawa, T. Katagi; Uptake and Transformation of Pesticide Metabolites by
Duckweed (Lemna gibba); J. Agric. Food Chem., 54 (17), 2006, 6286–6293
[224] G. Zurhelle, E. Müller-Seitz, M. Petz; Automated residue analysis of tetracyclines and their
metabolites in whole egg, egg white, egg yolk and hen’s plasma utilizing a modified ASTED system;
Journal of Chromatography B 739, 2000, 191-203.
[225] B. Halling-Sørensen, A. Lykkberg, F. Ingerslev, P. Blackwell, J. Tjornelund; Charaktierisation of
the abiotic degradation pathways of oxytetracyclines in soil interstitial water using LC-MS-MS;
Chemosphere, 50, 2003, 1331-1342,
[226] H. Oka, Y. Ito, H. Matsumoto; Chromatographic analysis of tetracycline antibiotics in foods; J.
Chromatogr. A 882, 2000, 109–133
[227] A. Gentili, D. Perret, S. Marchese; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for
performing confirmatory analysis of veterinary drugs in animal-food products; Trends in Analytical
Chemistry, 24 (7), 2005, 704-733.
[228] O. Ballesteros, V. Sanz-Nebot,, A. Navalón, J. L. Vílchez, J. Barbosa; Determination of a series
of quinolone antibiotic using liquid chromatography-mass-spectrometry; Chromatographia, 59(9/10),
2004, 543-550.
[229] A. M. Jacobsen, , B. Halling-Sørensen, F. Ingerslev, S. Honoré Hansen; Simultaneous extraction
of tetracycline, macrolide and sulfonamide antibiotics from agricultural soils using pressurised liquid
extraction, followed by solid-phase extraction and liquid chromatography–tandem mass spectrometry;
Journal of Chromatography A, 1038 (1-2), 2004, 157-170
[230] V. Camel; Microwave-assisted solvent extraction of environmental samples; TrAC Trends in
Analytical Chemistry, 19 (4), 2000, 229-248
[231] M.A. Rostagnoa, M. Palma, C.G. Barrosoa; Microwave assisted extraction of soy isoflavones;
Analytica Chimica Acta, 588 (2), 2007, 274-282
[232] H. Wollersen; Bestimmung und Identifizierung von Flavonoiden in Gerste mit HPLC-DAD-
MS/MS; Dissertation, Universität Paderborn, 2004
[233] M.D. Luque de Castro, F. Priego-Capote; Ultrasound-assisted preparation of liquid samples;
Talanta, 72 (2), 2007, 321-334
[234] F. Priego-Capote, M.D. Luque de Castro, Ultrasound-assisted digestion: A useful alternative in
sample preparation, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 70 (2), 2007, 299-310
[235] M. H. Gey; Instrumentelle Analytik und Bioanalytik; ISBN:978-3-540-73803-9, 2008
[236] K. Gückel; Untersuchungen zur Extrahierbarkeit von Antibiotikarückständen aus Getreide;
Bachelor-Arbeit, Universität Paderborn, 2007
[237] J.H. Knox, J. Jurand; Mechanism of reversed-phase separation of tetracyclines by high-
performance liquid chromatography;; J. Chromatogr.; 186, 1979, 763-782
[238] C.M. Lock, L. Chen, D.A. Volmer; Rapid Analysis of Tetracycline Antibiotics by Combined Solid
Phase Microextraction/High Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry; Rapid.
Commun. Mass. Spectrom.; 13, 1999, 1744-1754
[239] A.M. Kamel, P.R. Brown, B. Munson; Electrospray Ionization Mass Spectrometry of Tetracycline,
Oxytetracycline, Chlorotetracycline, Minocycline, and Methacycline; Anal. Chem., 71, 1999, 968-977
10 Literaturverzeichnis 176
[240] H.Oka, Y. Ikai, N. Kawamura, K. Uno, M. Yamada, K.-I. Harada, M. Uchiyama, H. Asukabe, M.
Suzuki; Determination of eight tetracyclines using thin-layer and high-performance liquid
chromatography; J. Chromatogr.; 393, 1987, 285-296
[241] S. Horii; Liquid chromatographic Determination of Oxytetracycline and Chlortetracycline;
Residues in Animal Tissues; J. Liquid Chromatogr.; 17 (1), 1994, 213-221
[242] P. Kay, P.A. Blackwell, A.B.A. Boxall; Column studies to investigate the fate of veterinary
antibiotics in clay soils following slurry application to agricultural land; Chemosphere 60, 2005, 497–
507
[243] P.A. Blackwell, H. Holten Lützhøft, H. Ma, B. Halling-Sørensen, A.B.A. Boxall, P. Kay; Ultrasonic
extraction of veterinary antibiotics from soils and pig slurry with SPE clean-up and LC–UV and
fluorescence detection; Talanta 64, 2004, 1058–1064
[244] D.S. Aga, S. O’Connor, S. Ensley, J.O Payero, D. Snow, D. Tarkalson; Determination of the
Persistence of Tetracycline Antibiotics and their Degradates in Manure-Amended Soil Using Enzyme-
Linked Immunosorbent Assay and Liquid Chromatography-Mass Spectrometry; J. Agric. Food Chem.
53, 2005, 7165-7171
[245] S. Boleas, C. Alonso, J. Pro, C. Fernandez, G. Carbonell, J.V. Tarazona; Toxicity of the
antimicrobial oxytetracycline to soil organisms in a multi-species-soil system (MS·3) and influence of
manure co-addition; Journal of Hazardous Materials 122, 2005, 233–241
[246] N. Van Eeckhout, J. Castro Perez, J. Cllaereboudt, R. Vandeputte, C. Van Peteghem;
Determination of tetracyclines in bovine kidney by liquid chromatography/tandem mass spectrometry
with on-line extraction and clean-up; Rapid. Commun. Mass. Spectrom.; 14, 2000, 280-285
[247] H. Oka, Y. Ito, Y. Ikai, T. Kagami, K. Harada; Mass spectrometric analysis of tetracycline
antibiotics in foods; J. Chromatogr. A; 812, 1998, 309-319
[248] S. Kromidas; Validierung in der Analytik; WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim; 1. Aufl.; 1999
[249] W. Funk, V. Dammann, G. Donnevert; Qualitätssicherung in der Analytischen Chemie; VCH-
Verlagsgesellschaft GmbH, Weinheim; 1. Aufl.; 1992
[250] Valoo Software Programm, www.analytik-software.de/valoo.html, letzter Zugriff am 05.05.2010
[251] S. Kromidas; Qualität im analytischen Labor. 1. Auflage, VCH Verlagsgesellschaft Weinheim,
1995
[252] Official Journal of the European Union; amending Decision 2002/657/EC as regards the setting
of minimum required performance limits (MRPLs) for certain residues in food of animal origin
(2004/25/EC); 2004
[253] R. Lindberg, P. Jarnheimer, B. Olsen, M. Johansson, M. Tysklind; Determination of antibiotic
substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography/mass
spectrometry and group analogue internal standards; Chemosphere 57, 2004, 1479–1488
[254] M. Stüber, T. Reemtsma; Evaluation of three calibration methods to compensate matrix effects
in environmental analysis with LC-ESI-MS; Anal. Bioanal. Chem. 378, 2004, 910–916
[255] A. Kloepfer, J.B. Quintana, T. Reemtsma; Operational options to reduce matrix effects in liquid
chromatography–electrospray ionization-mass spectrometry analysis of aqueous environmental
samples; Journal of Chromatography A 1067, 2005, 153–160
[256] R. Lindberg, P.-A. Jarnheimer, B. Olsen, M. Hohansson, M. Tysklind; Determination of
antibiotics substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid
chromatography/mass spectrometry and group analogue internal standards, Chemosphere 57, 2004,
1479-1488,
[257] EU-Richtlinie 2002/657/EG; Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 221; Umsetzung der
Richtlinie 96/23/EG des Rates betreffend die Durchführung von Analysemethoden und die
Auswertung von Ergebnissen; 2002
[258] Viehstarke Gebiete in NRW, Online-Dokument,
http://www.lanuv.nrw.de/landwirtschaft/tierhaltung/tierhaltung.htm, letzter Zugriff am 05.05.2010
[259] NRW-Karte, Online-Dokument,
10 Literaturverzeichnis 177
http://www2.fh-gelsenkirchen.de/FH-Sites/FH-Main/index.php?id=468, letzter Zugriff am 05.05.2010
[260] Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften; Entscheidung der Kommission vom 12.August
2002 zur Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG des Rates betreffend die Durchführung von
Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen, (2002/657/EG),12. August 2002
[261] M. Wehovsky; Struktureinflüsse auf das Fragmentierungsverhalten von Peptiden bei PSD-
MALDI-Massenspektometrie; Dissertation, Universität Justus-Liebig Gießen, 2001
[262] U. Bahr, M. Karas; Massenspektrometrie Tutorial; Universität Frankfurt, Online-Dokument,
http://www.google.de/#hl=de&q=peptid+fragmentierung+fticr&aq=f&aqi=&aql=&oq=&gs_rfai=&fp=48b
b631c7c314f0c
[263] W.D. Lehmann; Massenspektrometrie in der Biochemie; Spektrum Verlag, ISBN: 3-86025-094-9,
1996
[264] C. Schley; Mehrdimensionale chromatographische Trenntechniken für die Proteomanalyse;
Dissertation Universität Saarland, 2006
[265] K. Hyun-Seok, Kerry C. Huber; Channels within soft wheat starch A- and B-type granules;
Journal of Cereal Science 48, 2008, 159–172
[266] R.F. Tester, R. Yousuf, J. Karkalas, B. Kettlitz, H. Röper; Properties of protease-treated maize
starches; Food Chemistry 109, 2008, 257–263
[267] Z.L. Liu, S.H. Ho, S. H. Goh; Effect of fraxinellone on growth and digestive physiology of Asian
corn borer, Ostrinia furnacalis Guenee; Pesticide Biochemistry and Physiology 91, 2008, 122–127
[268] Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften; Entscheidung der Kommission, Umsetzung der
Richtlinie 96/23/EG des Rates betreffend die Durchführung von Analysemethoden und die
Auswertung von Ergebnissen; (2002/657/EG),12. August 2002
[269] R. Kreuzig, S. Höltge, J. Heise, M. Kolb, N. Berenzen, T. Hahn, St. Jergentz, J. Wogram, R.
Schulz; Untersuchungen zum Abflussverhalten von Veterinärpharmaka bei Ausbringung von Gülle auf
Ackerland und Weide; UBA-Texte 24/07, Forschungsbericht 202 67 435, Umweltbundesamt, 2007
[270] C. Sens; Metabolisierung und Lokalisierung von 14C-TNT in Phaseolus vulgaris und Triticum
aestivum; Dissertation, Philipps-Universität Marburg, 1998
[271] S. Thiele-Bruhn, D. Peters, B. Halling-Sørensen, P. Leinweber; Photodegradation and ageing of
antibiotic Pharmaceuticals on soil surfaces;
Posterpräsentation, Lebensmittelchemikertag,Kaiserslautern, 2008
[272] K. Haider, A. Schäffer; Umwandlung und Abbau von Pflanzenschutztmittel in Böden; ISBN: 3-13-
125441-6, 2000
[273] G. Langenkämper, Fotos von Hyrokulturpflanzen, Max Rubner-Institut, Institut für Sicherheit und
Qualität bei Getreide, Detmold
[274] R. A. Brain, D. J. Johnson, S. M. Richards, M. L. Hanson, H. Sanderson, M. W. Lam, C. Young,
S. A. Mabury, P. K. Sibley, K. R Solomon;, Microcosm evaluation of the effects of an eight
pharmaceutical mixture to the aquatic macrophytes Lemna gibba and Myriophyllum sibiricum; Aquatic
Toxicology 70, 1, 2004, 23-40
[275] L. Gomez, M. J. Chrispeels; Tonoplast and Soluble Vacuolar Proteins Are Targeted by Different
Mechanisms; The Plant Cell, 5, 9, 1993, 1113-1124.
Anhang A 1
ANHANGVERZEICHNIS
A.1 EXPERIMENTELLER TEIL............................................................................................... 2
A.1.1 Chemikalien ................................................................................................................... 2
A.1.2 Verbrauchsmaterialen .................................................................................................. 2
A.1.3 Geräte ............................................................................................................................. 3
A.1.3.1 HPLC-MS/MS-System (LCQ dreidimensionale Iontrap) ........................................... 3
A.1.3.2 FTICR-MS-System (LTQ, Linear Trap Quadrupole).................................................. 4
A.1.3.3 Sonstige Laborgeräte ................................................................................................. 6
A.1.4 Lösungen ....................................................................................................................... 6
A.1.5 Durchführung ................................................................................................................ 9
A.1.5.1 Vorbehandlung der Labor-und Glasgeräte, Einmalmaterialien.................................. 9
A.1.5.2 Aufarbeitung der Getreideproben ............................................................................... 9
A.1.5.2.1 Probenahme.............................................................................................................. 9
A.1.5.2.2 Mahlen und Sieben ................................................................................................. 10
A.1.5.2.3 Fest-Flüssig-Extraktion ........................................................................................... 10
A.1.5.2.4 Festphasenextraktion (SPE)................................................................................... 10
A.1.5.2.5 Messprobe .............................................................................................................. 11
A.1.5.3 Aufarbeitung der Gemüseproben ............................................................................. 11
A.1.5.3.1 Anzucht von Nutzpflanzen auf Hydrokultur ............................................................ 11
A.1.5.3.2 Probenahme............................................................................................................ 12
A.1.5.3.3 Homogenisierung .................................................................................................... 13
A.1.5.3.4 Fest-Flüssig-Extraktion ........................................................................................... 13
A.1.5.3.5 Festphasenextraktion.............................................................................................. 14
A.1.5.3.6 Messprobe .............................................................................................................. 16
A.1.6 Protease-Inhibitor-Cocktail Behandlung ................................................................. 16
A.1.7 Methodenvalidierung ................................................................................................. 17
A.2 ANGABEN ZU DEN PRODUKTIONSBEDINGUNGEN DER BEPROBTEN
LANDWIRTSCHAFTLICHEN BETRIEBE, ERNTE 2005, 2006 ................................... 20
A.3 ERMITTELTE ERNTEGEWICHTE VON WEIßKOHL UND PORREE .......................... 25
A.4 VERBRAUCH AN NÄHRLÖSUNG IN HYDROKULTUR .............................................. 26
Anhang A 2
A.1 EXPERIMENTELLER TEIL
A.1.1 Chemikalien
Aceton (p.a.; Merck/Darmstadt)
Acetonitril (HPLC Grade; Merck)
Ameisensäure reinst. 98-100 % (Merck)
Chlortetracyclin Hydrochlorid ≥ 97 % (Acros)
Ciprofloxacin (Sigma-Aldrich/Steinheim)
Citronensäure-Monohydrat (p.a.; Merck/Darmstadt)
Demeclocyclin Hydrochlorid ≥ 97 % (Acros)
Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (p.a.; Merck/Darmstadt)
Doxycyclin Hydrochlorid ≥ 97 % (Acros)
Enrofloxacin (Sigma-Aldrich/Steinheim)
4-Epichlortetracyclin Hydrochlorid (Acros Organics/Geel (Belgien))
4-Epidemeclocyclin Hydrochlorid CRS (European Pharmacopeia/Strasbourg (France))
Epichlortetracyclin Hydrochlorid ≥ 97 % (Acros)
6-Epidoxycyclin Hydrochlorid CRS (European Pharmacopeia/Strasbourg (France))
4-Epioxytetracyclin (Acros Organics/Geel (Belgien))
4-Epitetracyclin Hydrochlorid (Acros Organics/Geel (Belgien))
Titriplex III, Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz-Dihydrat EDTA (p.a.) Merck)
Flüssiger Stickstoff
Isochlortetracyclin Hydrochlorid ≥ 97 % (Acros)
Koffein (Sigma-Aldrich/Steinheim)
Methanol (Chromasolv; Sigma-Aldrich/Steinheim)
Natriumcarbonat (wasserfrei; Merck/Darmstadt)
Natriumhydroxid (p.a.; Merck/Darmstadt) Methanol (p.a.; Merck)
Oxytetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros)
Protease Inhibitor Cocktail for plant cell and tissue extracts (Sigma)
Salzsäure, 25 % (w/w; p.a.; Merck)
Sulfadiazin min. 99 % (Sigma-Aldrich)
Tetracyclin Hydrochlorid ≥ 97 % (Acros)
Ultramark (Alfa Aesar Lancaster/Pelham (Great Britain))
Wasser (bidestilliert über Quarzglas mit Destamat Bidest von Heraeus/Hanau)
A.1.2 Verbrauchsmaterialen
Polymerphasen-Kartuschen: Oasis HLB 3cc (Waters, Art.Nr.: WAT094226)
Analytische Trennsäule, YMC ODS-AM 5 µm 150 x 3 mm und YMC ODS-AM 5 µm 150 x 1
mm (YMC Europe GmbH/Dinslaken)
Analytische Vorsäule, YMC ODS-AM 5 µm 20 x 3 mm (YMC Europe GmbH/Dinslaken)
Anhang A 3
Glaswatte (reinst, silanisiert) (Serva Feinbiochemica)
Messkolben 10 mL, Duran-Glas (VWR, Brand)
Probenbeutel 540 mL (VWR, Twist-Seal)
Probenröhrchen 50 mL (VWR, Falcon Tubes)
Zentrifugengläser 50 mL (VWR, Duran-Glas)
Einweg Spritzen 20 mL (VWR, ONCE-Spritze - Luer 1)
Pasteurpipetten (VWR, Brand)
Deckel für Probenvials (RSC)
Pasteurpipetten, (VWR)
Probenvials, (VWR)
Reagenzgläser, (RSC)
A.1.3 Geräte
A.1.3.1 HPLC-MS/MS-System (LCQ dreidimensionale Iontrap)
HPLC (Spectra)
Degasser: SCM 1000 Vakuum Membrane Degasser
Pumpe: P 4000 Gradient Pumpe
Injektionseinheit: AS 3000, Autosampler gekühlt (10°C) mit integriertem
Säulenofen (temperiert auf 30°C)
Trennsäule: YMC-Pack ODS-AM, 150 x 3,0 i.d., S 5µm
Injektionsvolumen: 20 µL
Säulenschaltventil: STUW-Trapping
Bei der HPLC wurde ein Gradientenprogramm verwendet.
Flussrate: 0,4 mL/min
Fließmittel: A: Acetonitril / Wasser / Ameisensäure 10/89,9/0,1 % (v/v/v)
B: Acetonitril / Wasser / Ameisensäure 59,9/40/0,1 % (v/v/v)
C: Methanol
Tab. A 1: Verwendetes HPLC-Gradientenprogramm (HPLC-LCQ-System)
Zeit [min]
Fließmittel A [%]
Fließmittel B [%]
Fließmittel C [%]
0,0
90
10
0
1,5
80
20
0
10,0
60
40
0
12,0
0
100
0
12,5
0
0
100
25,0
0
0
100
26,0
90
10
0
35,0
90
10
0
Anhang A 4
Massenspektrometer
LCQ-Advantage Ionenfallen-Massenspektrometer (Fa. Thermo Finnigan/Egelsbach)
Abb. A 1: LCQ-Advantage: Dreidimensionale Ionenfalle (Iontrap)
Ionisierungsmethode: Electrospray Ionization (ESI), positiv-Mode [M+H]+, Bestätigung durch
MS/MS-Stoßexperimente (He), Precursor- und Produkt-Ionen
Tune-Page-Parameter:
Mass Range: 80 – 2000 [m/z]
Sheat Gas Flow Rate: 47 [arb]
Auxillary Gas Flow Rate: 0 [arb]
Ion Spray Voltage: 5 [kV]
Capillary Temperature: 250 [ºC]
Capillary Voltage: 9 [V]
Tube Lens Offset: - 5,0 [V]
Multipole 1 Offset: - 1,5 [V]
Lens Voltage: - 32 [V]
Multipole 2 Offset: - 5,5 [V]
A.1.3.2 FTICR-MS-System (LTQ, Linear Trap Quadrupole)
FTICR-MS:Fourier-Transformations-Ionen-Cyclotron-Resonance-Hybrid-
Massenspektrometer (Thermo Electron)
ISAS –Institute for Analytical Sciences- Dortmund
Anhang A 5
HPLC
HPLC-Sytem (Thermo Electron, San Jose, CA, USA)
Degasser: Surveyor Entgaser
Pumpe: Surveyor MS Pumpe
Injektionsautomat: Surveyor Autosampler
Trennsäule: YMC-Pack ODS-AM, 150 x 1,0 mm ID., S 5µm
Vorsäule: YMC-Pack ODS-AM, 10 x 1,0 mm ID., S 5µm
Injektionsvolumen: 5 µL
Flussrate: 0,1 mL/min
Fließmittel A: Wasser / Acetonitril / Ameisensäure 95/5 /0,1 (v/v)
Fließmittel B: Acetonitril / Ameisensäure 100/0,1 (v/v)
Tab. A 2: Verwendetes HPLC-Gradientenprogramm (HPLC-FTICR-MS)
Massenspektrometer
Ionisierungsmethode: ESI, positiv Mode [M+H]+ und MSn Experimente
Spray Voltage: 3.8 [kV]
Sheath Gas Flow Rate: 38 [arb]
Auxiliary Gas Flow Rate: 4 [arb]
Sweep Gas Flow Rate: 2 [arb]
Ionen Transfer Tube Temperatur: 300°C
Collision Energy: 35%
Das FTICR-MS ist mit einem 7,0 Tesla aktiv geschirmten supraleitenden Magneten und einer
Electrospray-Ionenquelle ausgestattet. Das Gerät wurde im positiven Ionisationsmodus mit
datenabhängiger Aquisition verwendet: Dabei wechselt das LTQ-FT automatisch zwischen
MS- und MSn-Experimenten. Übersichtsmassenspektren im Bereich m/z 400–500 wurden im
FTICR mit einer Auflösung von r = 25.000 (bei m/z 400) aufgenommen. Die zwei intensivsten
Ionen wurden dann nacheinander für exakte Massenbestimmungen mit einem FTICR-SIM-
Scan (Scan im kleinen m/z-Bereích von 5 amu, r = 50,000) verwendet. Stoßinduzierte
Fragmentierung (MS2, MS3; optional MS4) wurde in der linearen Ionenfalle durchgeführt.
Zeit [min]
Fließmittel A [%]
Fließmittel B [%]
0,01
100
0
2
100
0
45
70
30
50
5
95
60
5
95
Anhang A 6
Ausgewählte Vorläuferionen für MSn wurden für einen Zeitraum von 45 Sekunden
ausgeschlossen, um von möglichst vielen Ionen-Fragmentspektren zu erhalten. Somit dauert
ein Zyklus etwa 7 s.
A.1.3.3 Sonstige Laborgeräte
Handelsübliche Labor- und GlasgeräteZentrifuge, Hettich Rotofix 32
SPE-Vakuumblock, Merck LiChrolut
Ultraschallbad, Bandelin Sonorex
Thermostat, VLM EC 1
Analytische Siebmaschine, Retsch
Schüttler, IKA Vibrax VXE basic
Gefriertrocknungsanlage, Christ alpha 1-4
Labor-Mörsermühle, Pulverisette 2 Fritsch
Trockenschrank, Heraeus T 5042
Magnetrührer, IKA RH basic 2
Opi (Overpressure-Injection), RSC Chromatographie
Analysenwaage, CP 622 Sartorius undHandy Sartorius
Schwingmühle Retsch MM 200
A.1.4 Lösungen
Mobile Phasen
Fließmittel A (Acetonitril / Wasser / Ameisensäure 10/89,9/0,1 (v/v/v))
In einem Becherglas werden 200 mL Acetonitril, 1,8 L bidestilliertes Wasser und 2 mL
Ameisensäure (98-100%) zusammen gegeben und mit Hilfe eines Magnetrührers gerührt.
Fließmittel B (Acetonitril / Wasser / Ameisensäure 60/39,9/,01 (v/v/v))
In einem Becherglas werden 1,2 L Acetonitril, 800 mL bidestilliertes Wasser und 2 mL
Ameisensäure (98-100%) zusammen gegeben und mit Hilfe eines Magnetrührers gerührt.
Antibiotika-Stammlösungen
Stammlösungen
Es werden 10 mg des entsprechenden Antibiotikums in einen 10 mL-Messkolben
eingewogen, mit Methanol (für Ciprofloxazin mit 2 % Ameisensäure in Acetonitril) aufgefüllt
und bis zur weiteren Verwendung tiefgekühlt gelagert (-32°C). Die Stammlösungen dürfen
nicht häufig aufgetaut und eingefroren werden. Maximale Lagerzeit bei -32 0C ist 6 Monate.
Da das e-iso-CTC nicht kommerziell erhältlich ist, wird es in Lösung durch Epimerisierung
von iso-CTC hergestellt. Dazu werden 2 mL iso-CTC-Stammlösung (1000 mg/L), 3 mL
Methanol und 5 mL Laufmittel A im Reagenzglas über 1 h bei 60 C erwärmt. Die
Anhang A 7
Konzentration der Epimere wird indirekt durch Differenzbildung (iso-CTC-Konzentration vor
und nach der Erwärmung) bestimmt (LC-MS).
Standardlösungen (Mischstandard / Kalibrierlösungen)
Zur Methodenoptimierung wurde in der Anfangsphase des Projektes das LC-MS-System
extern kalibriert. Dazu wurden Mischstandards im Konzentrationsbereich von 0,05 mg/L bis 5
mg/L verwendet, zum Tunen des MS-Systems 10 mg/L. Diese Mischstandards erhält man,
indem entsprechende Aliquote der jeweiligen Stammlösung in einen 10 mL- Messkolben
pipettiert und mit Fließmittel A bis zur Kalibriermarke aufgefüllt werden.
Für die externe Matrixkalibration des LC-MS-Systems werden die nach der beschriebenen
Methode erhaltenen, bis fast zur Trockne eingeengten SPE-Eluate der Hydrokultur-
Blindproben mit 1000 µL Fließmittel A versetzt und Aliquote der jeweiligen
Mischstandardlösung dotiert, so dass ein Konzentrationsbereich von 1 bis 100 µg/kg FG
erreicht wird.
Indirekte Quantifizierung der Keto-Enol-Tautomere des epi-Chlortetracyclins (e-CTC)
Der e-CTC Standard liegt als Gemisch der beiden Tautomere e-keto-CTC und e-enol-CTC
vor. Unter der (vereinfachenden) Annahme gleicher Ionenausbeute und Response-Faktoren
dieser Spezies, wird zur Quantifizierung die Fläche der beiden Tautomerenpeaks addiert.
Die erhaltene Fläche entspricht der Gesamtfläche des e-CTC (Gleichung 1). Die Gehalte der
einzelnen Tautomere werden über deren prozentualen Anteil an der Gesamtfläche des e-
CTC bestimmt (Gleichung 2). Man kann nun wie bei den übrigen Analyten die Flächen der
Signale der Tautomere mit der ermittelten Konzentration (Gleichung 3) der Tautomere
korrelieren, um die zugehörige lineare Kalibrierfunktion (Gleichung 4) zu erhalten.
Die Gleichungen sind beispielhaft für das Enol-Tautomer formuliert; die Kalibrierfunktion für
das Keto-Tautomer wird analog ermittelt.
gesEnKet aaa
(Gleichung 1)
En
ges
En x
a
a
(Gleichung 2)
EnEnSt cxc *
(Gleichung 3)
xcma EnEn *
(Gleichung 4)
aEn = Peakfläche des Enols (e-enol-CTC)
cEn = Konzentration des Enols
xEn = Anteil an der Gesamtfläche entspricht dem Konzentrationsanteil
ages = Gesamtfläche e- CTC (Summe der Flächen der Tautomerensignale)
cSt = Konzentration des e-CTC-Standards
m = Steigung
x = x-Achsenabschnitt
(Index En: e-enol-CTC, Ket: e-keto-CTC)
Anhang A 8
Hinweis: Infolge der instabilen Gleichgewichtslage der Keto-Enol-Tautomere (u.a. sind
Änderungen der Tautomeren-Konzentrationen während der Aufarbeitung und des
chromatographischen Laufs möglich) ist die Bestimmung der Keto-Enol-Epimere
semiquantitativ.
Pufferlösung
EDTA/Citratpuffer (pH 4,1)
In einem Becherglas werden 620 mL 0,1 mol/L Citronensäure mit 380 mL einer 0,2 mol/L
Natriumhydrogenphosphatlösung gemischt. In dieser Lösung wird 37,244 g
Ethylendiamintetraessigsäure-di-Natriumsalz Dihydrat (0,1 mol/L) gelöst.
0,1 mol/L Citronensäure: 21,014 g Citronensäure Monohydrat wird in 1000 mL bidestilliertem
Wasser gelöst.
0,2 mol/L Natriumhydrogenphosphat: 35,6 g Di-Natriumhydrogenphosphat-2-Hydrat wird in
1000 mL bidestilliertem Wasser gelöst.
Hoagland-Nährlösung
Die Versuchspflanzen werden in einer modifizierten Hoagland-Nährlösung in Hydrokultur
angezogen.
Die Nährlösung für Porree hat die folgende Zusammensetzung an Makronährstoffen:
0,5 mmol/L MgSO4, 2,55 mmol/L KNO3, 1 mmol/L NH4H2PO4, 1,5 mmol/L K2HPO4, 2 mmol/L
Ca(NO3)2 und an Mikronährstoffen: 100 µmol/L Fe-EDTA, 46,2 µmol/L H3BO3, 9,1 µmol/L
MnCl2, 0,9 µmol/L ZnSO4, 0,3 µmol/L CuSO4, 0,1 µmol/L CoCl2, 0,1 µmol/L KAl(SO4)2, 1
µmol/L Na2MoO4 und ca. 0,2 µmol/L Na2Si3O7. Der pH-Wert der Nährlösung wurde mit HNO3
auf 6,8 eingestellt.
Die Nährlösung für den Weißkohl hat die folgende Zusammensetzung an Makronährstoffen:
1 mmol/L MgSO4, 5,1 mmol/L KNO3, 2 mmol/L NH4H2PO4, 1,5 mmol/L K2HPO4, 4 mmol/L
Ca(NO3)2 und an Mikronährstoffen: 100 µmol/L Fe-EDTA, 46,2 µmol/L H3BO3, 9,1 µmol/L
MnCl2, 0,9 µmol/L ZnSO4, 0,3 µmol/L CuSO4, 0,1 µmol/L CoCl2, 0,1 µmol/L KAl(SO4)2, 1
µmol/L Na2MoO4 und ca. 0,2 µmol/L Na2Si3O7. Der pH-Wert der Nährlösung beträgt ca. 6,6
und wird nicht eingestellt.
Dotierlösungen für die Hydrokulturversuche
Chlortetracyclin (CTC) - Stammlösung:
0,3006 g Chlortetracyclinhydrochlorid werden in ca. 10 mL Methanol gelöst (Ultraschallbad)
und mit destilliertem Wasser auf 200 mL aufgefüllt. Die Lösung enthält 1,3967 g/L CTC und
zur Lagerung wird sie in den Kühlschrank (5-8 oC) gestellt.
Anhang A 9
Tetracyclin (TC) Stammlösung:
0,2806 g Tetracyclin hydrochlorid werden in ca. 10 mL Methanol gelöst (Ultraschallbad) und
mit destilliertem Wasser auf 200 mL aufgefüllt. Die Lösung enthält 1,2962 g/L TC und zur
Lagerung wird sie in den Kühlschrank (5-8 oC) gestellt.
Sulfadiazin (SFD) Stammlösung:
0,1460 g Sulfadiazin werden in Methanol gelöst (Ultraschallbad) und mit destilliertem Wasser
auf 200 mL aufgefüllt(50/150mL, v/v bidest. Wasser/Methanol). Die Lösung enthält 0,7299
g/L SFD und zur Lagerung wird sie in den Kühlschrank (5-8 oC) gestellt.
Enrofloxacin (ENR) Stammlösung:
0,2096 g Enrofloxacin werden in 50 mL Methanol gelöst (Ultraschallbad) und mit Methanol
auf 200 mL aufgefüllt. Die Lösung enthält 1,0482 g/L ENR und zur Lagerung wird sie in den
Kühlschrank (5-8 oC) gestellt.
Monensin (MON) Stammlösung:
0,3468 g Monensin Natriumsalz werden in ca. 100 mL Methanol gelöst (Ultraschallbad) und
mit Methanol auf 250 mL aufgefüllt. Die Lösung enthält 1,3045 g/L MON und zur Lagerung
wird sie in den Kühlschrank (5-8 oC) gestellt.
A.1.5 Durchführung
Alle verwendeten Glasgeräte, die direkt mit dem Probenmaterial in Kontakt getreten sind
(z.B. Zentrifugengläser, 10 mL-Messkolben, Glasstäbe), werden zunächst mit Methanol und
bidest. Wasser gereinigt, anschließend über Nacht im Königswasserbad (konz. HCL: konz.
HNO3 = 3:1 v/v, 60°C) behandelt, gründlich mit bidest. Wasser gespült und im
Trockenschrank (40°C) getrocknet.
Bei der Festphasenextraktion werden Pasteurpipetten, 10 mL-Reagenzgläser und SPE-
Kartuschen als Einmalmaterialien verwendet. Besonders sorgfältig sind die Kanülen des
SPE-Blocks zu reinigen (Ultraschallbad, bidest. Wasser und Methanol).
A.1.5.2.1 Probenahme
Von erntereifem Getreide wurden an vier unterschiedlichen Stellen des Ackerschlags ganze
Ähren vom Halm getrennt, in beschriftete Gefrierbeutel verpackt und in einem Kühlbehälter
zum Fachbereich Agrarwirtschaft, Soest transportiert. Im Labor wurden die Körner
mechanisch aus den Ähren gelöst und alle Körner eines Schlages in einem Beutel vereinigt.
Dieser wurde bis zur Analyse bei -18°C gelagert.
Im Erntejahr 2006 war aufgrund der extrem hohen Junitemperaturen in einigen Betrieben
eine vorzeitige Ernte notwendig geworden. In diesem Fall wurde während des
A.1.5.1 Vorbehandlung der Labor-und Glasgeräte, Einmalmaterialien
A.1.5.2 Aufarbeitung der Getreideproben
Anhang A 10
Dreschprozesses vom Betriebsleiter aus dem Korntank eine Getreideprobe gewonnen und
sofort eingefroren. Die Proben wurden in gefrorenem Zustand zunächst nach Soest
transportiert und schließlich für die Durchführung der Analysen zur Universität Paderborn.
A.1.5.2.2 Mahlen und Sieben
Die Kornproben (ca. 100 g) werden mit Hilfe einer automatischen Mörsermühle gemahlen
(für 10 min bei 3 mm Hauptzustellungsrichtung in Achsrichtung des Pistills und 2. Ring
sichtbar (entspricht ~27,3 daN (kg)) bei Zustellung des Pistills gegen die Mörserwand). Die
Korngrößen-Fraktionierung des Mahlgutes erfolgt in einer analytischen Siebmaschine. Die
Fraktion mit einer Korngröße von d <0,106 mm wird zur Analyse verwendet.
A.1.5.2.3 Fest-Flüssig-Extraktion
1. Extraktionsstufe
Es werden jeweils zwei Einwaagen a’ 1 g parallel aufgearbeitet. Das Probenmaterial wird im
50 mL-Zentrifugenglas mit 20 mL MeOH/Citrat-EDTA-Pufferlösung versetzt und mit einem
Glasstab aufgeschlämmt. Die Suspension wird 5 min im Ultraschallbad homogenisiert und
danach 10 min bei 4000 U/min (entsprechend einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von
2325 g) zentrifugiert. Der Überstand wird in ein weiteres 50 mL-Zentrifugenglas überführt.
2. Extraktionsstufe
Der verbleibende Rückstand wird mit 10 mL Pufferlösung erneut aufgeschlämmt, 5 min im
Ultraschallbad behandelt und danach 10 min zentrifugiert (4000 U/min). Der Überstand der
2. Stufe wird mit dem Überstand der 1. Stufe zum Gesamtüberstand vereinigt. Dieser
Gesamtextrakt wird zur Festphasenextraktion eingesetzt.
A.1.5.2.4 Festphasenextraktion (SPE)
Konditionierung
Die SPE-Kartusche wird mit 3 mL Methanol und anschließend mit 3 mL MeOH/Citrat-EDTA-
Pufferlösung konditioniert. Die Kartusche darf nicht trockengesaugt werden.
Extraktaufgabe
Der Extrakt wird mit einer Pasteurpipette auf die Kartusche gegeben und sofort nach der
Konditionierung langsam (35-40 Tropfen pro Minute) durch die Festphasenkartusche
gesaugt. Danach wird die Kartusche einmal mit 3 mL MeOH/Wasser (5/95 v/v) und einmal
mit 3 mL MeOH/Citrat-EDTA-Pufferlösungnachgespült und anschließend kurz
trockengezogen.
Elution
Die langsame, tropfenweise Elution der Analyten erfolgt pro Kartusche mit 3 mL Methanol.
Die Eluate der Extrakte aus beiden Einwaagen werden nacheinander in einem 10 mL-
Anhang A 11
Einmalreagenzglas als Gesamteluat (~6 mL) aufgefangen bis die Kartusche trocken gesaugt
ist.
A.1.5.2.5 Messprobe
Das Gesamteluat wird im Reagenzglas bei 30°C Badtemperatur unter leichtem Luftstrom bis
fast zur Trockene eingeengt (Metallblock-Thermostat). Dieser Extraktrückstand wird in 500
µL Fließmittel A aufgenommen, in Autosamplervials (braune Rollrandflaschen mit
integriertem Glaseinsatz, 500 µL Volumen) umgefüllt, mit einer Aluminiumkappe (integriertes
Septum) verschlossen und chromatographiert. Erfolgt keine sofortige Analyse, wird die
Messprobe bei -32°C in Eppendorf-Vials gelagert. Zur Messung werden die Proben bei
Raumtemperatur aufgetaut, auf einem Schüttler homogenisiert und wie oben beschrieben,
zur LC-MS-Analyse vorbereitet.
A.1.5.3.1 Anzucht von Nutzpflanzen auf Hydrokultur
Keimung und Wachstumsbedingungen
Die Porree- und Weißkohlsamen werden zur Steigerung der Keimungsrate für 5 bis 10 Tage
bei 4-6°C in 1 mmol/L CaSO4-Lösung inkubiert. Die Auskeimung der Samen erfolgt bei
Raumtemperatur (17 bis 20°C) in so genannten „Sandwiches“, die mit 1 mmol/L CaSO4-
Lösung getränkt waren. Die „Sandwiches“ bestehen aus zwei äußeren Schaumstoffschichten
und zwei inneren Filterpapierschichten, auf denen die Samen lagen. Keimlinge von
mindestens 3 cm Sprosslänge werden auf Nährlösung in die Pflanzenwuchskammer
transferiert. Dazu werden die Sprosse mit Hilfe einer Schaumstoffumwicklung in
Lochschablonen fixiert. Die Lochschablonen dienen gleichzeitig als Deckel für die
Pflanztöpfe, die mit ca. 3,75 L Nährlösung gefüllt waren. Es wird sichergestellt, dass die
Wurzeln in die Nährlösung eintauchten. Die Nährlösung wird mit Hilfe von Aquarienpumpen
und Silikonschläuchen belüftet. Jeder Pflanztopf wird mit 4 Pflanzen bestückt.
Die Pflanzen werden in einem Pflanzenwuchsschrank (Modell VB1514, Vötsch) bei einer 17-
stündigen Fotoperiode pro 24 Stunden angezogen. Während der Fotoperiode beträgt die
Temperatur 20°C und die relativ Luftfeuchte 65% und während der Dunkelheit wird die
Temperatur auf 16°C und die relative Luftfeuchte auf 55% eingestellt.
Anzucht von Porree (Sorte Shelton)
Die Wuchszeit des gekeimten Porrees (Allium porrum L., cv. Shelton, F1, Hild Samen
GmbH, Marbach) beträgt 50 Tage bis zu Pflanzen mit einem Durchmesser der jüngeren
Blattabschnitte zwischen 0,5 und 1,5 cm. Während dieser Zeit wird die Nährlösung zweimal
vollständig gewechselt, ansonsten wird verbrauchte Nährlösung nachgefüllt. Die Nährlösung
und die Wurzeln werden regelmäßig auf Kontamination durch Pilzbewuchs visuell
A.1.5.3 Aufarbeitung der Gemüseproben
Anhang A 12
kontrolliert. Pflanzen mit pilzbefallenen Wurzeln werden entfernt. Die Dotierungsexperimente
mit Antibiotika erfolgen nach 50 Wachstumstagen in der Pflanzenwuchskammer.
Anzucht von Weißkohl (Sorte Lennox)
Gekeimter Weißkohl (Brassica oleracea, L., cv. Lennox, F1, Bejo Saaten, Niederlande)
werden über einen Zeitraum von 21 Tagen angezogen. Zu diesem Zeitpunkt haben die
äußeren Blätter die maximale Größe erreicht, die Kohlkopfbildung hat jedoch noch nicht
eingesetzt. Während der Aufzuchtphase wird die Nährlösung einmal vollständig gewechselt,
ansonsten wird verbrauchte Nährlösung nachgefüllt. Kontrolle der Wurzeln auf Pilzbefall
erfolgt wie bei der Porreeaufzucht. Die Dotierungsexperimente mit Antibiotika erfolgen nach
21 Wachstumstagen in der Pflanzenwuchskammer.
Zudotierung der Antibiotika
Als die Pflanzen einen gewissen mittleren Wachstumsstand erreichen, werden die Hoagland-
Lösungen durch Zugabe von Antibiotikum-Stammlösung dotiert (Tab. A 3).
Tab. A 3: Zugabe von Antibiotikum-Stammlösung
Antibiotikum
(Bruttoformel)
Bezugs-
firma
MW
[g/mol]
Reinheit
[%]
Konzentration
Stammlösung
[g/L]
Zusatz zur
Stammlösung
[mL]
Konzentration
Nährlösung
[mg/L]
(entspr. 5 µmol/L)
CTC
(C22H23ClN2O8.HCl)
Acros
515,34
≥99
1,3967
6
2,3944
TC
(C22H24N2O8.HCl)
Acros
480,90
≥99
1,2962
6
2,2222
SFD
(C10H10N4O2S)
Sigma
250,28
≥99
0,7299
6
1,2514
ENR
(C19H22FN3O3)
Sigma
359,39
≥99
1,0482
6
1,7970
MON
(C36H61O11Na)
Dr.Ehrens
torfer
692.85
≥98
1,3045
9
3,3543
Die Pflanzen wachsen bis zur Probenahme in dotierter Nährlösung bekannter Antibiotika-
Konzentration, die alle zwei Tage gewechselt wird.
A.1.5.3.2 Probenahme
Pflanzen aus Hydrokultur
Porree
Nach 10 Tagen Zudotierung werden die Pflanzen in alte Blattabschnitte, junge
Blattabschnitte und Wurzeln getrennt. Etwa 1 cm des Bereiches des Wurzel-Blattabschnitt-
Überganges wird verworfen, um sicherzustellen, dass kein Wurzelmaterial in die
Anhang A 13
Blattabschnittsproben gelangt. Die Wurzeln werden gründlich mit K2SO4 (0,1 mmol/L) gespült
und trockengetupft. Das Pflanzenmaterial wird mit Hilfe eines Messers in ca. 0,5 cm lange
Stücke geschnitten. Jeweils 10-15 g des zerschnittenen Materials werden in flüssigem
Stickstoff schockgefroren.
Weißkohl
Nach 8 Tagen Zudotierung werden die Pflanzen in Blatt (Blatt-jung und Blatt-alt), Stängel
und Wurzeln getrennt, wobei der ca. 1 cm Übergang zwischen Wurzel und Stängel
verworfen wird. Weil die Wurzeln des Weißkohls viel feiner als die des Porrees sind, wird
eine effektivere Art des Spülens gewählt. Die Wurzeln des Weißkohls werden in K2SO4 (0,1
mmol/L)-Lösung eingetaucht und eine Minute lang vorsichtig geschwenkt und trockengetupft.
Das Pflanzenmaterial wird mit Hilfe eines Messers in ca. 0,5 cm lange Stücke geschnitten.
Jeweils 10-15 g des zerschnittenen Materials werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
Pflanzen aus Freilandversuchen
Nach der Ernte werden Weißkohl, Chinakohl und Porree tiefgefroren. Da die Pflanzen nach
der Ernte nicht sofort gewaschen worden sind, werden sie vor dem Zerkleinern abgeschält,
um Bodenreste und andere Verunreinigungen zu entfernen.
A.1.5.3.3 Homogenisierung
Pflanzen aus Hydrokulturpflanzen
Das gelagerte tiefgekühlte (-80 oC) Probenmaterial wird vor der Extraktion mit Hilfe einer
Schwingmühle (~5 g Einwaage FG, für 10 min bei 25 Hz) homogenisiert.
Pflanzen aus Freilandversuchen
Das gelagerte tiefgekühlte (-80 oC) Probenmaterial wird vor der Extraktion manuell
zerkleinert und mit Hilfe einer Mörsermühle (~30 g Einwaage FG, für 5 min bei 1,5 mm
Hauptzustellungsrichtung in Achsrichtung des Pistills und 2. Ring sichtbar (entspricht ~20
daN (kg)) bei Zustellung des Pistills gegen die Mörserwand) homogenisiert.
A.1.5.3.4 Fest-Flüssig-Extraktion
1. Extraktionsstufe
Es werden jeweils zwei Einwaagen à 5 g (Blatt und Stängel) und 3 g (Wurzel) parallel
aufgearbeitet. Das Probenmaterial wird im 50 mL-Zentrifugenglas mit 20 mL Citrat-EDTA-
Pufferlösung versetzt und mit einem Glasstab aufgeschlämmt. Die Suspension wird 5 min im
Ultraschallbad homogenisiert und danach 10 min bei 4000 U/min (entsprechend einer
relativen Zentrifugalbeschleunigung von 2325 g) zentrifugiert. Der Überstand wird in ein
weiteres 50 mL-Zentrifugenglas überführt.
Anhang A 14
2. Extraktionsstufe
Der verbleibende Rückstand wird mit 10 mL Pufferlösung erneut aufgeschlämmt, 5 min im
Ultraschallbad behandelt und danach 10 min zentrifugiert (4000 U/min). Der Überstand der
2. Stufe wird mit dem Überstand der 1. Stufe zum Gesamtüberstand vereinigt und für 10 min
zentrifugiert. Dieser Gesamtextrakt wird zur Festphasenextraktion eingesetzt.
A.1.5.3.5 Festphasenextraktion
Für die Festphasenextraktion wird sowohl eine klassische manuelle SPE-Einheit verwendet
als auch – für einige Pflanzenextrakte - der Prototyp eines OPi-SPE (Over Pressure inline
Solid Phase Extraction)-Systems.
Manuelle SPE - Einheit
Konditionierung
Die SPE-Kartusche wird mit 3 mL Methanol und anschließend mit 3 mL bidest.Wasser
konditioniert. Die Kartusche darf nicht trockengesaugt werden.
Extraktaufgabe
Der Extrakt wird mit einer Pasteurpipette auf die Kartusche gegeben und sofort nach der
Konditionierung langsam (35-40 Tropfen pro Minute) durch die Festphasenkartusche
gesaugt. Danach wird die Kartusche einmal mit 3 mL MeOH und einmal mit 3 mL
MeOH/bidest.Wasser (5/95 v/v) nachgespült und anschließend kurz trockengezogen.
Elution
Die langsame, tropfenweise Elution der Analyten erfolgt pro Kartusche mit 3 mL Methanol.
Bei den Hydrokulturpflanzen werden die Eluate der Extrakte in jeweils einem 10 mL-
Einmalreagenzglas als Gesamteluat (~3 mL), bei den Freilandpflanzen aus beiden
Einwaagen nacheinander in einem 10 mL-Einmalreagenzglas als Gesamteluat (~6 mL)
aufgefangen bis die Kartusche trocken gesaugt ist.
Anhang A 15
OPi-SPE-System (Over Pressure inline Solid Phase Extraction)
Abb. A 2: OPi-SPE-System
Durch einen Kompressor und eine Pumpe wird ein hydraulisches System betrieben, das
dafür sorgt, dass ein Kolben mit konstanter Geschwindigkeit nach unten gefahren wird. Des
Weiteren besteht das System aus Halterungen, in die man die Kartuschen, die mit 30 mL
Einwegspritzen verbunden sind, einhängen kann. Der Kolben drückt nun von oben auf die
Spritzkolben und fährt diese somit mit ebenfalls konstanter Geschwindigkeit nach unten.
Durch ein hydraulisches Polster von 5 mL Luft, was bei jeder Probeneingabe in die Spritzen
zusätzlich aufgezogen wird, wird sichergestellt, dass sich auch in den Spritzen, bzw.
Kartuschen ein hydraulisches System ausbildet, sodass die Proben parallel mit der gleichen
Tropfgeschwindigkeit durch die Kartuschen laufen können und keine der Kartuschen voll-
oder sogar überlaufen kann. In den Kartuschen baut sich schließlich ein Überdruck auf,
sodass die Probenflüssigkeit durch die Kartuschen gedrückt wird. Durch die Schalter II und
III kann die Arretierung der Spritzkolben in den Kolbentellern ein- bzw. ausgestellt werden
sowie nach einem Durchlauf der Druck vom hydraulischen System wieder abgelassen
werden. Die gesamte Probenaufgabe auf die Kartuschen läuft nach der Vorbereitung
automatisch. Des Weiteren ist natürlich durch die Einstellung der Pumpe eine exakte
Frequenz und damit ein gleichmäßiger Druck einstellbar.
Die Einstellung der Tropfgeschwindigkeit durch die Kartuschen erfolgt beim OPi-SPE-
System indirekt über die Einstellung der Pumpe und somit über den Druck, den der Kolben
Anhang A 16
auf die Spritzenkolben überträgt. Die Tropfgeschwindigkeit wurde dabei so eingestellt, dass
sie mit ca. 38 Tropfen pro Minute der idealen Tropfgeschwindigkeit des SPE-Block-Systems
entspricht, da angenommen werden durfte, dass so eine maximale Vergleichbarkeit der
beiden Systeme erzielt würde.
A.1.5.3.6 Messprobe
Das Gesamteluat wird im Reagenzglas bei 30°C Badtemperatur unter leichtem Luftstrom bis
fast zur Trockne eingeengt (Metallblock-Thermostat). Dieser Extraktrückstand wird in 1000
µL Fließmittel A aufgenommen, in Autosamplervials (braune Rollrandflaschen ohne
Glaseinsatz, 1000 µL Volumen) umgefüllt, mit einer Aluminiumkappe (integriertes Septum)
verschlossen und chromatographiert. Erfolgt keine sofortige Analyse, wird die Messprobe bei
-32°C in Eppendorf-Vials gelagert. Zur Messung werden die Proben bei Raumtemperatur
aufgetaut, auf einem Schüttler homogenisiert und wie oben beschrieben, zur LC-MS-Analyse
vorbereitet.
A.1.6 Protease-Inhibitor-Cocktail Behandlung
Das Probenmaterial wird im 50 mL-Zentrifugenglas eingewogen, mit 20 mL Extraktionsmittel
versetzt und mit einem Glasstab aufgeschlämmt. Als Extraktionsmittel wird MeOH/Citrat-
EDTA-Puffer pH 4,1 (5/95 v/v) / Protease-Cocktail-Inhibitor im Verhältnis von 100/1 v/v
verwendet (100 mL MeOH/Citrat-EDTA-Puffer mit 1 mL Protease-Cocktail-Inhibitor versetz).
Danach wird die Suspension mit Hilfe einem Schüttler (Schüttler IKA Vibrax VXE basic)
inkubiert. Die Inkubationsparameter sind in der Tab. A 4 dargestellt.
Tab. A 4: Versuchsparameter für die Optimierung der Inkubation
Versuch Nr.
Inkubationsbedingungen
Probenbehandlung
Temperatur [Co]
Zeit [min]
1
25
10
5 min schütteln, 5 min stehen lassen
2
20
10 min schütteln, 10 min stehen lassen
3
30
10 min schütteln, 10 min stehen lassen
danach wieder 10 min schütteln
Nach der Inkubation wird die Suspension 5 min im Ultraschallbad homogenisiert und danach
10 min bei 4000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird in ein weiteres 50 mL-
Zentrifugenglas überführt. Der verbleibende Rückstand wird mit 10 mL Extraktionsmittel 2
erneut aufgeschlämmt, 5 min im Ultraschallbad behandelt und danach 10 min zentrifugiert
(4000 U/min). Der Überstand wird mit dem Überstand der 1. Stufe zum Gesamtüberstand
vereinigt. Dieser Gesamtextrakt wird zur Festphasenextraktion eingesetzt und weiter
aufgearbeitet.
Anhang A 17
A.1.7 Methodenvalidierung
Wiederfindung
Zur Bestimmung der Wiederfindungen werden BSA-Winterweizen und Kontrollproben von
Porree- und Weißkohlpflanzen-Hydrokultur mit Mischstandard dotiert (50 µg/kg FG). Nach 15
Minuten Einwirkzeit werden die Proben nach der Probenaufarbeitungsvorschrift aufgearbeitet
und mittels LC-MS/MS analysiert. Die erhaltenen Messproben werden jeweils sechsfach
injiziert. Die Auswertung erfolgt mit Matrixkalibrierung. Alle Tetracycline werden als Summe
von Epimeren ermittelt. CTC wird dabei als Summe von e-iso-CTC und iso-CTC bestimmt.
Die Wiederfindung lässt sich nach folgender Formel berechnen:
W= Wiederfindung, %
= gemessener Mittelwert
XR= richtiger Wert, entspricht der zugesetzten Konzentration/Menge
Präzision
Zur Bestimmung der Präzision wird Winterweizen (BSA) und Kontrollproben von Porree- und
Weißkohlpflanzen-Hydrokultur mit Mischstandard dotiert (50 µg/kg), nach 15 Minuten
Einwirkzeit werden die Proben nach der Probenaufarbeitungsvorschrift aufgearbeitet und die
erhaltenen Messproben jeweils sechsfach injiziert. Die Aufarbeitung (Citrat-Puffer-Extraktion,
SPE) und Analyse einer gemahlenen 1-g-Einwaage erfolgt sowohl einzeln als auch mit zwei
parallel aufgearbeiteten Proben, deren SPE-Extrakte vereinigt worden sind.
Anschließend werden die relativen Standardabweichungen wie folgt berechnet:
s= Standardabweichung
srel= relative Standardabweichung
yi= Mittelwert der experimentell ermittelten Peakfläche
y= Peakfläche
= Mittelwert der Peakflächen (Detektorsignal)
Nachweis- und Bestimmungsgrenze
Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach DIN 32645 werden mit
Antibiotika dotierter Winterweizen (BSA) sowie Kontrollproben von Porree- und
Anhang A 18
Weißkohlpflanzen-Hydrokultur jeweils sechsfach analysiert (Matrixkalibrierung). Die
Dotierungen liegen im Bereich von 1 bis 80 μg/kg. Die Auswertung der Messergebnisse wird
unter Zuhilfenahme des Softwareprogramms “Valoo“ durchgeführt.
Die Nachweis- und Bestimmungsgrenze lassen sich nach folgender berechnen:
Sxo= Verfahrensstandardabweichung
Sy1= Reststandardabweichung
Xi= Mittelwert der experimentell ermittelten Konzentration
a= Ordinatenabschnitt
b= Geradensteigung
yi= Mittelwert der experimentell ermittelten Peakfläche
= zu yi gehöriger Schätzwert aus der Regressfunktion
XNWG= Nachweisgrenze
XBG= Bestimmungsgrenze
tf;α= Quantil der t-Verteilung (einseitiges Prognoseintervall)
f= n-2 (mit f = Anzahl der Freiheitsgrade)
α= Signifikanzniveau
m= Anzahl der Messungen an der Analysenprobe
n= Anzahl der Proben
Selektivität
Hierzu werden sowohl eine Winterweizenproben (BSA-Proben) als auch Kontrollpflanzen
(Porree und Weißkohl) aus Hydrokultur aufgearbeitet und 250 µg/kg mit
Mischstandardlösung dotiert. Anschließend wird vergleichend mit einer Mischstandardlösung
(ß=1mg/L) der Wirkstoffe vermessen (n=3).
Anhang A 19
Matrixeffekte
Zur Untersuchung von Matrixeffekten auf die massenspektrometrische Detektion wird aus
1,00 g unbelasteten Getreide (BSA-Weizenprobe) nach der Probenaufarbeitungsvorschrift je
eine Matrixprobe gewonnen. Jeweils drei Matrixproben werden mit Kalibrierlösungen der
Konzentrationen 100 µg/L; 200 µg/L; 500 µg/L; 750 µg/L; 1000 µg/L; 2000 µg/L und 5000
µg/L aufgenommen. Als Vergleichsproben dienen die jeweiligen Kalibrierungslösungen der
jeweiligen Konzentrationen. Jede Probe (mit und ohne Matrix) wird dreimal mittels HPLC-
MS/MS analysiert und der Mittelwert der erhaltenen Messsignale (Peakflächen) pro Analyt
und Konzentration gebildet.
Anhang A 20
A.2 ANGABEN ZU DEN PRODUKTIONSBEDINGUNGEN DER BEPROBTEN LANDWIRTSCHAFTLICHEN BETRIEBE, ERNTE 2005, 2006
Tab. A 5a: Ernte 2005 (Winterweizen) - Angaben zu den Produktionsbedingungen
Probe
Produktionssystem
Viehbestand
*Medikation
Gülleausbringung
Schweinehaltung
Mastplätze
Sauen
Ferkel/Jahr
Antibiotika
Bodenart
m3/ha
Einarbeitung
Kreis Coesfeld
K-S-1
Ferkelaufzucht,
Schweinemast
900
600
**Chlortetracyclin,
Lincomycin
sandiger Lehm
22
(Januar 05)
Kopfdüngung,
Schleppschlauch
K-S-2
Schweinemast
680
Amoxicillin,
Lincomycin,
Penicillin
Sand
20
(März 05)
Kopfdüngung,
Schleppschlauch
K-S-3
Ferkelaufzucht,
Schweinemast
250
1000
Tetracyclin,
Amoxicillin,
Neomycin
sandiger Lehm
20 + 20
(vor Saat,
Frühjahr 05)
Schleppschlauch
K-S-4
Ferkelaufzucht,
Schweinemast
1000
750
Tetracyclin,
Amoxicillin,
Lincomycin
Lehm
15,5
(März 05)
Kopfdüngung,
Schleppschlauch
K-S-5
Ferkelaufzucht
7000
Tetracyclin,
Amoxicillin,
Colistin
sandiger Lehm
30
(Januar 05)
Kopfdüngung,
Schleppschlauch
Kreis Warendorf
K-B-1
Ferkelaufzucht,
Schweinemast
1200
1000
Chlortetracyclin,
Amoxicillin, Colistin
sandiger Lehm,
lehmiger Ton
20
(Februar 05)
Schleppschlauch
K-M-1
Schweinemast
2200
Chlortetracyclin
lehmiger Ton,
Ton
25
(Februar 05)
Schleppschlauch
K-M-2
Schweinemast
1200
Chlortetracyclin
sandiger Lehm
18
(März 05)
Querverteiler
Anhang A20
________________________________________________________________________________
Anhang A 21
Tab. A 5b: Ernte 2005 (Winterweizen) - Angaben zu den Produktionsbedingungen
Probe
Produktionssystem
Viehbestand
Medikation
Gülleausbringung
Schweinehaltung
Mastplätze
Sauen
Ferkel/Jahr
Antibiotika
Bodenart
m3/ha
Einarbeitung
Kreis Borken
K-H-1
Ferkelaufzucht
4000
Tetracyclin,
Amoxicillin,
Sand,
lehmiger Sand
60 kg N
(Februar 05)
Kopfdüngung
K-H-2
Ferkelaufzucht,
Schweinemast
700
200
Ampicillin
humoser
Sand
24
(Februar 05)
Schleppschlauch
K-H-3
geschlossenes System
Schweinemast
1200
150
Procylin, Tylan
sandiger
Lehm
20
(Februar 05)
Schleppschlauch
K-H-4
Schweinemast
(60 Bullen)
1450
Tetracyclin
sandiger
Lehm
12 + 15
(März 05)
Schleppschlauch
K-H-5
geschlossenes System
300
135
450
Ampicillin, Colistin
Sand
24
(März 05)
Prallteller
K-H-6
Ferkelproduktion
900
Chlortetracyclin,
Amoxicillin
sandiger
Lehm
30
(Februar 05)
Schleppschlauch
Anhang A21
____________________________________________________________________________
Anhang A 22
Kreis Borken
Tab. A 6a: Ernte 2006 (Triticale, Gerste, Weizen) - Angaben zu den Produktionsbedingungen
Probe
Produktionssystem
Viehbestand
Medikation
Gülleausbringung
Schweinehaltung
Mastplätze
Sauen
Ferkel/Jahr
Verfahren
Antibiotika
Bodenart
m3/ha
B1 T
geschlossenes Syst.
400
170
4000
Einzeltier,
Tränke,
Futter
Oxytetracyclin,
Amoxicillin
Sand
10
(Frühjahr 06)
B1 G
Sand
16 + 16
(Herbst 05, Frühjahr 06)
B2 G
Sauenbestand mit
Ferkelaufzucht
230
5800
Einzeltier,
Tränke,
Futter
Amoxicillin, Colistin,
Baytril
(Enrofloxacin)
Sand
28
(Frühjahr 06)
B2 W
Sand
B3 G
Sauenhaltung,
Jungsauenvermehrung
×2400
517
Einzeltier,
Futter
Tetracyclin,
Trimethoprim
(Grippe), Amoxicillin
Sand-Lehm
30 + 25
(Herbst 05, Frühjahr 06)
B3 W
Sand
B4 G
geschlossenes Syst.
550
85
1750
Einzeltier,
Futter
Amoxicillin, Colistin,
Baytril
Draxxin (Prophylaxe)
lehmiger Sand
20 + 30
(Herbst 05, Frühjahr 06)
B 4 W
lehmiger Sand
B5 T
Sauenhaltung, Ferkel
260
6000
Einzeltier
Hostamox
(Amoxicillin),
Langzeitpenicillin
(keine Prophylaxe)
Sand
20 + 20
(Frühjahr 06)
B5 W
Sand
B6 G
geschlossenes Syst.
(ca. 40 Kühe, Rinder,
Bullen
700
200
4200
Baytril
(keine Prophylaxe)
humoser Sand
10 + 25
(Herbst 05, Frühjahr 06)
B6 W
humoser Sand
B6 T
humoser Sand
Anhang A22
_________________________________________________________________________
Anhang A 23
Kreis Coesfeld
Tab. A 6b: Ernte 2006 - Angaben zu den Produktionsbedingungen
Probe
Produktionssystem
Viehbestand
Medikation
Gülleausbringung
Schweinehaltung
Mastplätze
Sauen
Ferkel/Jahr
Verfahren
Antibiotika (Auswahl)
Bodenart
m3/ha
Coe1 W
Babyferkelaufzucht,
Schweinemast
1050
4200
Einzeltier,
Tränke, Futter
(Einstallprophylaxe)
Tetracyclin, ×Amoxicillin,
Sulfonamide/Trimethoprim
(×Medikam.-Aufwand hoch)
schluffiger
Lehm
14 + 15
(Frühjahr 06)
Coe2 W
Sauenhaltung,
Ferkelaufzucht
500
10.000
keine Ang.
keine Angaben
lehmiger
Sand
20
(Frühjahr 06)
Coe3 W
Sauenhaltung,
Ferkelaufzucht
500
12000
Einzeltier
Amoxicillin, Baytril
sandiger
Lehm
10 + 25 + 20
(Herbst 05,
2xFrühjahr
06)
Coe4 W
Babyferkelaufzucht,
Schweinemast
(100 Mastbullen)
1000
4000
oral:
Einstallprophylaxe
Abteilbehandlung
Tetracyclin, Amoxicillin,
Colistin
sandiger
Lehm
35
(Frühjahr 06)
Coe5 W
geschlossenes Syst.
2000
500
12000
Einzeltier, Futter
Tetracyclin, Amoxicillin
Lehm
28
(Frühjahr 06)
Coe7 W
geschlossenes Syst.
1800
200
4800
Einzeltier,
Tränke,
×Futter
Terramycin
(Oxytetracyclin),
×Tetracyclin,
sandiger
Lehm
25
(Frühjahr 06)
Coe8 W
geschlossenes Syst.
400
120
2640
Tränke
Amoxicillin, Colistin
sandiger
Lehm
24
(Frühjahr 06)
Coe9 W
geschlossenes Syst.
300
140
2800
Flüssigfütterung
(×Absetzprophylaxe)
×Chlortetracyclin,
Amoxicillin
lehmiger
Sand
18
(Frühjahr 06)
Coe10 W
Babyferkelaufzucht,
Vormast
2500
(Aufzucht)
Futter
Tetracyclin, Amoxicillin
k. A.
20 + 30
(Herbst 05,
Frühjahr 06)
Anhang A23
____________________________________________________________________________
Anhang A 24
Niedersachsen / Emsland
Tab. A 6c: Ernte 2006 - Angaben zu den Produktionsbedingungen
Probe
Produktionssystem
Viehbestand
*Medikation
Gülleausbringung
Schweinehaltung
Mastplätze
Sauen
Ferkel/Jahr
Verfahren
Antibiotika
Bodenart
m3/ha
NS1 W a)
Ferkelerzeugung
250
5400
Einzeltier
(keine Absetzprophylaxe)
Chlortetracyclin
Langzeitpenicillin
lehmiger
Sand
35
(Herbst 05)
NS1 W b)
Sand
NS2 W
geschlossenes Syst.
700
120
Einzeltier,×Tränke
(keine Absetzprophylaxe)
×Tetracyclin,
×Amoxicillin
Sand
20 + 20
(Herbst 05,
Frühjahr 06)
NS3 W
Ferkelerzeugung,
Aufzucht
170
3800
Einzeltier, (Futter)
Terramycin
(Oxytetracyclin),
Penicillin
humoser
Sand
18 + 20
(Herbst 05,
Frühjahr 06)
NS4 W
geschlossenes Syst.
700
100
2000
Futter
(keine Absetzprophylaxe)
Chlortetracyclin,
Terramycin,
Penicillin
Sand
25 (Frühjahr
06)
NS5 W
geschlossenes Syst.
650
110
12000
Einzeltier
(keine Absetzprophylaxe)
Penicillin, Baytril
humoser
Sand
25
(Frühjahr 06)
NS6 W
Sauenhaltung
230
5000
Einzeltier,
(Tränke)
Amoxicillin,
Colistin,
Penicillin
schwach
hum.
Sand
35
(Herbst 05)
NS7 W
geschlossenes Syst.
950
160
3500
Einzeltier
(Absetzprophylaxe)
Langzeitpenicillin
Sand
20 + 15
(Herbst 05,
Frühjahr 06)
NS8 W
Ferkelerzeugung
30
220
4500
Einzeltier
(Absetzprophylaxe)
Chlortetracyclin,
Amoxicillin
Sand
20
(Herbst 05)
Anhang A24
____________________________________________________________________________
Anhang A 25
A.3 ERMITTELTE ERNTEGEWICHTE VON WEIßKOHL UND PORREE
a)
b)
Abb. A 3 : Erntegewichte von Weißkohl und Porree zum Erntezeitpunkt in Antibiotika-dotierter
Nährlösung
0
50
100
150
200
250
300
Blind
CTC
TC
SFD
ENR
MON
Biomasse /Topf a
0
50
100
150
200
250
300
Blind
CTC
TC
SFD
ENR
MON
Biomasse /Topf c
Gewicht [g]
Gewicht [g]
Gewicht [g]
Anhang A 26
A.4 VERBRAUCH AN NÄHRLÖSUNG IN HYDROKULTUR
*Datenverlust
a)
b)
0
100
200
300
400
500
1234
Gewichtsverlust [g]
Dotierung
Verbrauch an Nährlösung -Porree / Topf a
Blind-a*
CTC-a
TC-a
SFD-a
ENR-a
MON-a
0
100
200
300
400
500
600
700
1234
Gewichtsverlust [g]
Dotierung
Verbrauch an Nährlösung - Porree / Topf c
Blind-c
CTC-c
TC-c
SFD-c
ENR-c
MON-c
Anhang A 27
c)
d)
Abb. A 4 : Verbrauch an Nährlösung bei der Anzucht von Porree und Weißkohl als Funktion
der Zeit und Antibiotika-Dotierung (Dotierungsintervalle: 2 Tage)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1 2 3 4
Gewichtsverlust [g]
Dotierung
Verbrauch an Nährlösung-Weißkohl / Topf a
Blind-a
CTC-a
TC-a
SFD-a
ENR-a
MON-a
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1 2 3 4
Gewichtsverlust [g]
Dotierung
Verbrauch an Nährlösung-Weißkohl / Topf c
Blind-c
CTC-c
TC-c
SFD-c
ENR-c
MON-c
