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Untersuchungen zum Verhalten von

Veterinärpharmaka im Boden

Von der Fakultät für Naturwissenschaften

Department Chemie

der Universität Paderborn

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

Dr. rer. nat.

genehmigte Dissertation

von Diplom-Chemiker

Henning Stevens

Paderborn 2009

Die vorliegende Arbeit basiert auf Untersuchungen, die in der Zeit von Januar 2004 bis

Januar 2007 an der Universität Paderborn im Fach Anorganische und Analytische Chemie

des Departments Chemie der Fakultät für Naturwissenschaften unter der Leitung von Herrn

Prof. Dr. M. Grote durchgeführt worden sind.

Veröffentlichungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit:

M. Grote, B. Kuhlmann, G. Preuß, U. Schulte-Ebbert, H. Stevens und N. Zullei-Seibert;

Tierarzneimittel in der Umwelt: Bewertung von Eintrag, Verlagerung und

Resistenzentwicklung unter Gesichtspunkten des Verbraucherschutzes; Dortmunder

Beiträge zur Wasserforschung Nr. 66, 2007

M. Grote, C. Schwake-Anduschus, R. Michel, H. Stevens, W. Heyser, G. Langenkämper, T.

Betsche and M. Freitag; Incorporation of veterinary antibiotics into crops from manured soil;

Landbauforschung Völkenrode - FAL Agricultural Research 57, 2007, 25-32

U. Schulte-Ebbert, N. Büchner, B. Kuhlmann, G. Preuß, N. Zullei-Seibert, H. Stevens, M.

Grote; Partikelmediierte Verlagerung und biologische Auswirkungen von güllebürtigem

Chlortetracyclin und Sulfadiazin im Boden und Sickerwasser; Tagungsband: 72.

Jahrestagung Wasserchemische Gesellschaft, Fachgruppe in der GDCh, 22.-24. Mai 2006,

Celle (S. 86 - 91) (ISBN 3-936028-39-7)

M. Grote, C. Schwake-Anduschus, H. Stevens, R. Michel, T. Betsche, M. Freitag; Antibiotika-

Aufnahme von Nutzpflanzen aus Gülle-gedüngten Böden - Ergebnisse eines

Modellversuchs; Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 1, 2006, 38 – 50

M. Grote, C. Schwake-Anduschus, H. Stevens, R. Michel, H. Korste, W. Heyser, T. Betsche,

M. Freitag; Antibiotikaeinträge aus der Tierhaltung in Boden und Nutzpflanzen - Ergebnisse

eines Modellversuches; VDLUFA-Schriftenreihe, Kongressband 2005, VDLUFA-Verlag,

LUFA Speyer Kreislaufwirtschaft mit der Landwirtschaft– quo vadis? 27. – 30.09.2005, Bonn,

S. 228 – 232 (ISBN 3-922712-92-4)

M. Freitag, H. Stevens, R. Michel, C. Schwake-Anduschus, T. Betsche, M. Grote; Transfer of

Antibiotics Used in Animal Husbandry from Slurry into Food; Vitamine und Zusatzstoffe in der

Ernährung von Mensch und Tier, 10. Symposium 28./29. September 2005, Jena,

Tagungsband: Seite 174

1. Referent: Prof. Dr. M. Grote

2. Referent: Prof. Dr. H. C. Marsmann

Eingereicht am 04.11.2009

Tag der mündlichen Prüfung: 18.12.2009

Danksagung

Herrn Prof. Dr. M. Grote danke ich sehr herzlich für die überaus interessante

Themenstellung dieser Arbeit und seine engagierte Betreuung.

Herrn Prof. Dr. H.C. Marsmann danke ich für die freundliche Übernahme des Koreferats.

Mein weiterer Dank gilt Herrn Dipl.-Geogr. U. Schulte-Ebbert (Institut für Wasserforschung

GmbH), Frau Prof. Dr. M. Freitag (Fachhochschule Südwestfalen), Frau Dipl.-Ing. N. Zullei-

Seibert (Institut für Wasserforschung GmbH) und allen weiteren Mitwirkenden an den beiden

interdisziplinären Forschungsprojekten.

Weiterhin gilt mein besonderer Dank allen jetzigen und ehemaligen Mitarbeiterinnen und

Mitarbeitern des Arbeitskreises an der Universität Paderborn für ihre kollegiale

Zusammenarbeit und das angenehme Arbeitsklima, insbesondere den Damen und Herren R.

Knaup, Dipl.-Chem.-Ing. D.H. Meriç, Dipl.-Chem.-Ing. R. Michel, Dipl.-Chem.-Ing. H. Korste,

Dr. A. Vockel und Dr. M. Borges. Frau R. Jackisch danke ich darüber hinaus für die

durchgeführten UV/Vis-Messungen.

Ferner möchte ich mich bei meinen Eltern und meiner Freundin Stefanie Blome für ihre

jahrelange Geduld und Unterstützung sehr herzlich bedanken.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Problemstellung.......................................................................................1

2 Zielsetzung..........................................................................................................................4

3 Grundlagen - Stand der Forschung -................................................................................6

3.1 Antimikrobielle Wirkstoffe in Veterinärmedizin und Tierproduktion.......................6

3.1.1 Verwendungspraxis in der Tierproduktion.............................................................6

3.1.2 Einsatz von antimikrobiellen Wirkstoffen als Futtermittelzusatzstoffe...................6

3.1.3 Antibiotikaverbrauch in der Landwirtschaft............................................................8

3.2 Antibiotikaresistenzen und Verbrauchergefährdung..............................................10

3.2.1 Resistenzentwicklung..........................................................................................10

3.2.2 Resistenzproblematik..........................................................................................12

3.2.3 Verbraucherschutz ..............................................................................................14

3.2.4 Risiken durch den Antibiotikaeintrag in Böden....................................................15

3.2.5 Gefährdungspotential resistenter Mikroorganismen............................................17

3.3 Tetracycline und Sulfonamide..................................................................................20

3.3.1 Tetracycline.........................................................................................................20

3.3.2 Sulfonamide.........................................................................................................27

3.3.3 Trimethoprim .......................................................................................................29

3.4 Arzneistoffe im Boden...............................................................................................29

3.4.1 Verhalten von Schadstoffen im Boden................................................................30

3.4.2 Tetracycline und Sulfonamide in der Umwelt – Eintrag, Vorkommen und

Verhalten .............................................................................................................43

3.4.2.1 Tetracycline .............................................................................................43

3.4.2.2 Sulfonamide.............................................................................................49

4 Stand der Analytik zur Bestimmung von Antibiotika im Boden ..................................54

4.1 Bestimmungsmethoden für Tetracycline und Sulfonamide...................................55

4.2 Vorbereitung von Bodenproben ...............................................................................56

4.2.1 Extraktion.............................................................................................................57

4.2.2 Anreicherung der Analyte und Aufreinigung der Bodenextrakte .........................57

5 Ergebnisse und Diskussion............................................................................................59

5.1 Untersuchung auf Antibiotikarückstände in einem gülle-beaufschlagten

Boden ..........................................................................................................................59

5.1.1 Ausgangssituation – Projektverlauf.....................................................................59

5.1.2 Methodenentwicklung zur Bestimmung von CTC, SFD und TMP in

Bodenproben.......................................................................................................60

5.1.2.1 Entwicklung der HPLC-UV-MS/MS-Methode ..........................................60

5.1.2.2 Entwicklung der Probenaufbereitung.......................................................71

5.1.3 Methodenvalidierung...........................................................................................78

5.1.3.1 Externe Kalibrierung................................................................................78

5.1.3.2 Signalsuppression durch Matrixbestandteile...........................................80

5.1.3.3 Wiederfindung..........................................................................................83

5.1.4 Analyse der Bodenproben aus dem „Antiinfektiva-Projekt“.................................84

5.1.5 Diskussion der Ergebnisse..................................................................................86

5.1.6 Schlussfolgerungen.............................................................................................88

5.2 Untersuchungen zum Transportverhalten von Tetracyclin- und

Sulfonamidrückständen im Boden...........................................................................89

5.2.1 Voruntersuchungen zum Sorptionsverhalten und zur Komplexierung ................89

5.2.1.1 Sorption von CTC, iso-CTC und SFD an Modellpartikeln........................90

5.2.1.1.1 Ergebnisse der Sorptionsuntersuchungen.........................................90

5.2.1.2 Untersuchungen zum Komplexierungsverhalten von CTC und

iso-CTC....................................................................................................95

5.2.1.2.1 Eigenschaften von Chlortetracyclinen und

Untersuchungsmethodik ....................................................................95

5.2.1.2.2 Spektrophotometrische Untersuchung der Reaktionen von

Chlortetracyclinen mit Metallionen.....................................................97

5.2.1.2.3 Ergebnisse aus den Untersuchungen zum

Komplexierungsverhalten ..................................................................98

5.2.1.3 Zusammenfassung und Schlussfolgerungen aus den

Voruntersuchungen................................................................................106

5.2.2 Modellversuche zum Transportverhalten von SFD, CTC und

iso-CTC im Boden .............................................................................................107

5.2.2.1 Verlagerung von SFD, CTC und iso-CTC in einem sandigen

Ackerboden nach Gülleapplikation ........................................................109

5.2.2.1.1 Versuchsansatz im Labormaßstab..................................................112

5.2.2.1.2 Naturnaher Versuchsansatz im halbtechnischen Maßstab .............117

5.2.2.2 Zusammenfassung: Ergebnisse der Säulenversuche und

Schlussfolgerungen ...............................................................................124

5.2.3 Ergänzende Untersuchungen zur Rückstandsanalytik......................................125

5.2.3.1 Ergebnisse.............................................................................................127

5.2.3.2 Schlussfolgerungen...............................................................................128

5.2.4 Fluoreszenzuntersuchungen an partikelgebundenem CTC und iso-CTC.........132

5.2.4.1 Qualitative Fluoreszenzanalyse.............................................................132

5.2.4.2 Quantitative Fluoreszenzanalyse...........................................................137

5.2.4.3 Diskussion .............................................................................................143

6 Zusammenfassung und Ausblick.................................................................................145

7 Literatur...........................................................................................................................149

A Anhang ............................................................................................................................ A1

Abkürzungsverzeichnis

AMG: Arzneimittelgesetz

CTC: Chlortetracyclin

DAD: Dioden-Array-Detektor

DIN: Deutsches Institut für Normung

DOM: Dissolved Organic Matter

e-CTC: 4-Epichlortetracyclin

e-iso-CTC: 4-Epiisochlortetracyclin

EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure

ESI: Electrospray-Ionisation

EU: Europäische Union

FAL: Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft

FEDESA: Fédération Européenne de la Santé Animale

FLI: Friedrich-Loeffler-Institut

FMG: Futtermittelgesetz

HPLC: High-Performance-Liquid-Chromatography

(Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie)

iso-CTC: Isochlortetracyclin

IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry

KD: Verteilungskoeffizient (hier: Boden/Wasser)

KOC: Verteilungskoeffizient organischer Kohlenstoff/Wasser

KOW: Verteilungskoeffizient Oktanol/Wasser

λex: Anregungswellenlänge

λem: Emissionswellenlänge

MRL: Maximum Residue Limit

MS: Massenspektrometrie

MS/MS: Tandem Massenspektrometrie

MUNLV: Ministerium für Umwelt, Naturschutz, Landwirtschaft und Verbraucherschutz

des Landes Nordrhein-Westfalens

n.n.: nicht nachweisbar

n.b.: nicht bestimmt

N-SFD: N4-Acetylsulfadiazin

p.a.: pro analysi

PAK: Polycyclische Aromatische Kohlenwasserstoffe

PEC: Predicted Environmental Concentration

pKa: Säuredissoziationskonstante

Rt: Retentionszeit

RFU: Relative Fluorescence Unit

SFD: Sulfadiazin

SOM: Soil Organic Matter

SPE: Solid Phase Extraction (Festphasenextraktion)

SRM: Selective Reaction Monitoring

TIC: Total Ion Current

TM: Trockenmasse

TNT: Trinitrotoluol

1 Einleitung und Problemstellung 1

1 Einleitung und Problemstellung

Antibiotika gehören zu den bedeutendsten und am häufigsten eingesetzten human- und

veterinärmedizinischen Arzneistoffen [1]. Auch wenn aktuelle Daten nicht vorliegen, ist allein

für den Bereich der Nutztierhaltung von einem europaweiten Antibiotikaverbrauch in einer

Größenordnung von mehreren tausend Tonnen pro Jahr auszugehen [2,3,75,78].

Im Gegensatz zur Anwendung bei Heimtieren, wo normalerweise nur einzelne Tiere zu

therapeutischen Zwecken behandelt werden, ist in der Tiermast eine Bestandsbehandlung,

also die Verabreichung von Antibiotika an eine größere Anzahl von Tieren, üblich [4].

Diese Praxis kann zu hohen und ökotoxisch relevanten Rückstandskonzentrationen von

antimikrobiellen Wirkstoffen in Gülle und Mist führen, da die Antibiotika oder deren teilweise

pharmakologisch aktiven Metabolite zum überwiegenden Anteil über Urin und Kot

ausgeschieden werden [5,6]. Organische Wirtschaftsdünger (Gülle, Mist) können auch noch

nach längerer Lagerung erhebliche Rückstandsmengen enthalten [7].

Mit einer organischen Düngung gelangen so auch Antibiotika sowie deren Metabolite auf

landwirtschaftliche Nutzflächen [8], wo sie Abbau- und Sorptionsvorgängen als

konzentrationsbestimmende Prozesse unterliegen [9]. Von dort aus ist ein Transport der

Antibiotika und ihrer Metabolite in Abhängigkeit von ihren physiko-chemischen

Eigenschaften, den Bodeneigenschaften und den Wetterbedingungen ins Grundwasser und

in Oberflächengewässer möglich [4,9,10]. Über kontaminierte Klärschlämme können

Humanpharmaka-Rückstände ebenfalls auf landwirtschaftliche Nutzflächen ebenfalls

gelangen [4,10].

Gegenwärtig sind allerdings keine gesicherten Aussagen über das Gefährdungspotential

durch Veterinärantibiotika für Mensch und Umwelt möglich, was auch für in die Umwelt

eingetragene Humanantibiotika und für Arzneistoffe im Allgemeinen gilt. Ausreichende

Erkenntnisse über Rückstandsmengen und Verhalten von Antibiotika in der Umwelt fehlen.

Ergebnisse verschiedener Studien sind aufgrund einer hohen Komplexität der

Zusammenhänge z.T. widersprüchlich [351-353]. Von zentraler Bedeutung sind daher

folgende Fragestellungen:

- Welche Antibiotika (und relevante Metabolite) gelangen in welcher Menge auf

landwirtschaftliche Nutzflächen?

- Wie persistent sind die einzelnen Antibiotika in den verschiedenen

Umweltkompartimenten (Boden, Wasser, Sediment)?

- Werden Antibiotikarückstände im Boden von lebensmittel- oder futtermittelliefernde

Pflanzen aufgenommen?

- Wie wirken sich die Rückstände im Boden auf Mikrobiologie und Fauna aus?

1 Einleitung und Problemstellung 2

- Welche Bedeutung kommt dem Pfad Boden-Sickerwasser-Grundwasser oder dem

Eintrag in Oberflächengewässer (Runoff, Abwasserpfad) zu?

- Wie mobil sind verschiedene Antibiotika in Böden (Verlagerungsmöglichkeit)?

- Welche Faktoren beeinflussen die Mobilität?

- Werden Antibiotika, welche im Boden als immobil eingestuft werden, ins

Grundwasser eingetragen?

- Sind Auswirkungen auf die Qualität des Trinkwassers möglich und wie sind diese

einzuschätzen?

- Welchen Einfluss haben Antibiotikarückstände im Boden auf die Bildung und

Verbreitung von antibiotika-resistenten Mikroorganismen (Resistenzproblematik)?

Für ein effektives Risikomanagement ist es daher erforderlich, die u.a. oben genannten

Erkenntnisdefizite zu schließen, um damit zu einer verbesserten Risikoeinschätzung für

Mensch und Umwelt zu gelangen.

Der wissenschaftliche Beirat für Tierarzneimittel (CVMP) der Europäischen

Arzneimittelagentur (EMEA) verabschiedete 1997 einen Leitfaden [11] für die

Umweltbewertung von Tierarzneimitteln. In diesem 2-phasigen Konzept steht in Phase I die

Abschätzung des Umweltgefährdungspotentials eines Arzneistoffes auf Basis seiner

physiko-chemischen Stoffeigenschaften sowie der Anwendungsmengen und

Anwendungsmuster im Vordergrund. Bei Überschreitung bestimmter Schwellen- bzw.

Triggerwerte (PECsoil > 100µg/kg; PECwater > 1µg/L) wird ein Wirkstoff als relevant für eine

mögliche Umweltgefährdung eingestuft [12,13].

Für einen als derartigen Wirkstoff sind in Phase II detaillierte Untersuchungen bezüglich

seines Umweltverhaltens und seiner Umweltauswirkungen vorgeschrieben, um die Risiken

für die Umwelt beurteilen zu können [13,14].

Nach Richtlinie 2004/27/EG [15] ist für die Zulassung von Humanarzneimitteln eine

Umweltprüfung vorgeschrieben. Gleiches gilt nach Richtlinie 2004/28/EG [16] für

Tierarzneimittel. Beide Richtlinien unterscheiden sich aber in einem wesentlichen Punkt,

denn im Gegensatz zu den Humanarzneimitteln kann die Zulassung aufgrund der

Feststellung eines schweren Umweltrisikos nur bei den Tierarzneimitteln versagt werden.

Für die Zulassung von neuen Tierarzneimitteln ist schon seit 1998 eine Umweltbewertung

nach dem EMEA-Konzept erforderlich. Sogenannte „Altstoffe“, also Tierarzneimittel, die vor

1998 zugelassen worden sind, unterlagen somit keiner geregelten ökotoxikologischen

Prüfung [6].

Eine Bewertung der von den „Altstoffen“ ausgehenden Risiken im Sinne von Umwelt- und

Verbraucherschutz ist aber angebracht, da sie noch in beträchtlichen Mengen eingesetzt

werden [17]. Für die Arzneimittelklasse der Antibiotika kommt die damit verbundene

1 Einleitung und Problemstellung 3

Resistenzproblematik noch erschwerend hinzu. Neben den durch „Alt-Antibiotika“-

Rückständen ausgehenden möglichen Gefahren für Mensch und Umwelt, sind wirtschaftliche

Schäden infolge von Störungen im Fermentationsprozess und verminderter Biogasausbeute

im Bereich der zur Energieerzeugung immer wichtiger werdenden Biogasproduktion möglich

[18,19].

Aus diesen Gründen ist es erforderlich, detaillierte Erkenntnisse über Eintragsquellen von

Antibiotika in die Umwelt und deren Verbreitungspfade zu gewinnen.

Diese Arbeit soll dazu beitragen, Erkenntnisse über das Transportverhalten im Boden und

den Transportpfad Gülle-Boden-Sickerwasser-Grundwasser der beiden „Alt-Antibiotika“

Chlortetracyclin und Sulfadiazin zu gewinnen, welche in der Veterinärmedizin zu den

einsatzstärksten Antibiotikaklassen der Tetracycline und der Sulfonamide gehören [20].

Diese Erkenntnisse sind dabei unter dem Gesichtspunkt eines nachhaltigen

Verbraucherschutzes von wesentlicher Bedeutung, da gesicherte Risikoabschätzungen nur

durch fundierte Kenntnisse über die komplexen Zusammenhänge zwischen „Gülledüngung,

Antibiotikaverlagerung und Auswirkungen auf die Ressourcen Boden und Grundwasser“

möglich sind.

2 Zielsetzung 4

2 Zielsetzung

Zu Beginn der experimentellen Untersuchungen zu dieser Arbeit lagen nur wenige Daten

über Einträge und Verhalten von Tetracyclinen und Sulfonamiden in landwirtschaftlich

genutzten Böden vor. Es war unklar, ob bzw. in welchem Umfang die in den Boden über

Güllebeaufschlagung eingetragenen Stoffe in zur Trinkwassergewinnung genutzte Grund-

und Oberflächengewässer eingetragen werden und über die Aufnahme durch Nutzpflanzen

in die Nahrungskette gelangen können. Ferner waren die Auswirkungen (z.B.

Resistenzentstehung und -verbreitung) von Antibiotikarückständen und mit den

Wirtschaftsdüngern in den Boden eingetragene resistente Mikroorganismen auf die

natürliche mikrobielle Besiedlung noch wenig untersucht und daher nicht abschätzbar.

Folglich waren keine gesicherten Aussagen über eine Gefährdung von Mensch und Umwelt

möglich.

Um nähere Kenntnisse über die o.g. Zusammenhänge zu erlangen, wurden die vom MUNLV

(Ministerium für Umwelt und Naturschutz, Landwirtschaft und Verbraucherschutz NRW)

geförderten Projekte „Antiinfektivaeinträge aus der Tierproduktion in terrestrische und

aquatische Kompartimente“ [476] und „Tierarzneimittel in der Umwelt: Bewertung von

Eintrag, Verlagerung und Resistenzentwicklung unter Gesichtspunkten des

Verbraucherschutzes“ [477] durchgeführt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit, welche mit

den beiden Projekten in Verbindung steht, sollten Antibiotikarückstände (inkl. ausgewählter

Hauptmetabolite und Umwandlungsprodukte) in Böden mittels LC-MS/MS ermittelt und

schwerpunktmäßig Erkenntnisse über deren Abbau- und Transportverhalten gewonnen

werden. Aufgrund der hohen Sorptionsaffinität von Tetracyclinen zur Bodenmatrix war die

Untersuchung des partikelgebundenen Transports, bei dem Metallkomplexbildungs- und

Ionenaustauschreaktionen sowie das Verhalten mobiler Festphasen bei Immobilisierungs-

und Mobilisierungsprozessen relevant sein können, von zentraler Bedeutung. Das Verhalten

der Antibiotika sollte in unterschiedlich dimensionierten Versuchsanlagen (Labor-, Säulen-

und Freilandversuche) untersucht werden.

Aus den Zielen dieser Arbeit ergaben sich im Einzelnen folgende Aufgabenstellungen:

• Entwicklung einer LC-MS/MS-basierten Methode zur Bestimmung von

Antibiotikarückständen in Böden,

• Identifizierung und Quantifizierung von Chlortetracyclin und Sulfadiazin sowie einiger

ausgewählter Metabolite/Umwandlungsprodukte in Bodenproben anhand der

entwickelten Methode,

2 Zielsetzung 5

• Untersuchung der Sorptionsaffinität von Tetracyclinen und Sulfadiazin gegenüber

Böden und ausgewählten Modellpartikeln,

• Untersuchung des Einflusses von Metallkationen auf das Sorptionsverhalten von

Tetracyclinen,

• Identifizierung und Quantifizierung von Chlortetracyclin und Sulfadiazin in Boden- und

Sickerwasserproben aus Lysimeterversuchen, um das Transportverhalten und einen

möglichen Eintrag ins Grundwasser abschätzen zu können,

• Entwicklung einer Fluoreszenz-basierten Methode zur Bestimmung von

partikelgebundenen Tetracyclinen,

• Methodische Vorarbeiten zur Überprüfung der Möglichkeit eines

Fluoreszenzscreenings für Tetracycline in Böden.

Detailliertere Angaben zu den Zielen und Aufgabenstellungen der einzelnen Teilbereiche

werden in den entsprechenden Kapiteln gegeben.

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 6

3 Grundlagen - Stand der Forschung -

3.1 Antimikrobielle Wirkstoffe in Veterinärmedizin und

Tierproduktion

3.1.1 Verwendungspraxis in der Tierproduktion

Die Einsatzgebiete antimikrobieller Wirkstoffe in der Veterinärmedizin und der Tierproduktion

lassen sich bezüglich ihres Anwendungszweckes in vier Bereiche unterteilen: Therapie,

Prophylaxe, Metaphylaxe und Leistungsförderung [52,53].

Antimikrobielle Wirkstoffe dienen bei ihrer therapeutischen Anwendung einer gezielten

Behandlung bestehender Infektionskrankheiten, welche durch Bakterien bedingt sind [77].

Bei der prophylaktischen Anwendung erfolgt eine Antibiotikagabe aus medizinisch

notwendigen Gründen im Rahmen einer Einzeltier- oder Tiergruppenbehandlung, ohne dass

irgendwelche klinischen Symptome einer bakteriellen Infektion vorliegen. So werden

Antibiotika bei einer Einzeltierbehandlung z.B. perioperativ oder bei bevorstehenden

Geburten („Trockenstellen“ von Milchkühen vor dem Abkalben) verabreicht. Ein Einsatz von

Antibiotika bei ganzen Tiergruppen findet in Form der „Einstallprophylaxe“ im Rahmen der

Tiermast (z.B. Schweine, Rinder) statt, wo nach dem Zusammenstellen von Ferkeln und

Kälbern aus mehreren kleineren Zuchtbeständen in einen großen Mastbestand die gesamte

Tiergruppe antimikrobiell behandelt wird [77].

Eine metaphylaktische Anwendung von Antibiotika erfolgt im Unterschied zur

prophylaktischen Anwendung an ganzen Tiergruppen, bei denen bereits einzelne Tiere des

Bestandes Krankheitssymptome zeigen und eine Ausbreitung der Erkrankung in Kürze zu

erwarten ist. Durch die Applikation von Antibiotika an alle Tiere des Bestandes sollen sowohl

mögliche nachfolgende Tierverluste vermindert, als auch die zu einen späteren Zeitpunkt

erforderliche Antibiotikamenge und die damit verbundenen Kosten für die Behandlung einer

großen Zahl klinisch erkrankter Tiere reduziert werden [52,53,77].

3.1.2 Einsatz von antimikrobiellen Wirkstoffen als Futtermittelzusatzstoff

In der Tierproduktion werden weltweit verschiedene antimikrobielle Wirkstoffe als

Leistungsförderer eingesetzt. Für eine Anwendung von antibiotischen Substanzen zur

Leistungsförderung bestehen im Gegensatz zu Therapie, Prophylaxe und Metaphylaxe keine

medizinisch notwendigen Gründe. Das Ziel des Einsatzes dieser Stoffe als Leistungsförderer

besteht darin, beim Tier die Nährstoffaufnahme in Pansen oder Darm zu optimieren,

beispielsweise um in der Schweinemast den Futterverbrauch pro Kilogramm

Gewichtszuwachs zu senken. Leistungsförderer mit antibakterieller Wirkung werden ebenso

wie Kokzidiostatika als Futtermittelzusatzstoffe eingesetzt [54].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 7

Trotz ihrer pharmokologischen Wirkung fallen antibiotische Leistungsförderer nicht unter das

Arzneimittelgesetz (§1 Abs. 3 Satz 5 AMG), sondern sind ausschließlich im Futtermittelrecht

geregelt (§ 2 FMG) [55]. Sie bedürfen innerhalb der EU, wie alle anderen

Futtermittelzusatzstoffe auch, der Zulassung gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1831/2003

über Zusatzstoffe zur Verwendung in der Tierernährung, welche die bis dahin gültige

Zusatzstoffrichtlinie 70/524/EWG ablöste [56,57].

Da viele der als Leistungsförderer verwendeten antimikrobiellen Wirkstoffe auch als

Antibiotika in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt werden, wurden aufgrund der sich

daraus ergebenen Resistenzproblematik (siehe Kapitel 2.2.2) immer mehr Wirkstoffe für

diese Anwendung verboten: Als erste Wirkstoffgruppe bereits 1974 in der EU die

Tetracycline [58], welche aber z.B. in den USA immer noch verwendet werden [59]. 1996

erfolgte ein Verbot für Avoparcin als Futtermittelzusatzstoff für die Bundesrepublik

Deutschland [60], welches 1997 auf die ganze Europäische Union ausgeweitet wurde [61].

Mit der Verordnung (EG) Nr.2821/98 folgte das Verbot für die Wirkstoffe Zink-Bacitracin,

Virginiamycin, Tylosin und Spiramycin [62], woraufhin nach einer Studie der FEDESA der

Verbrauch an Leistungsförderern (bezogen auf das Jahr 1997) bis 1999 um 50% zurückging

[63]. Bis 2006 waren noch die antimikrobiellen Wirkstoffe Monensin-Natrium, Salinomycin-

Natrium, Flavophospholipol und Avilamycin zur Verwendung als Leistungsförderer

zugelassen. Durch die Verordnung (EG) Nr. 1831/2003 gilt seit dem 1/2006 innerhalb der EU

ein generelles Verbot für die Verwendung von antibimikrobiellen Wirkstoffen als

Leistungsförderer. Als Futtermittelzusatzstoffe sind „Antibiotika“ zum Einsatz als

Kokzidiostatika oder Histomonostatika weiterhin erlaubt [56]. Kokzidiostatika und

Histomonostatika sind Stoffe, die zur Abtötung oder Wachstumshemmung von Protozoen

dienen. Kokzidien sind einzellige Parasiten aus der Gruppe der Protozoen, die zu schweren

Darmerkrankungen und hohem (Tier-)Verlustrisiko führen können. Besonders in der

Geflügelhaltung stellen Kokzidien ein Problem dar, und in der Kaninchenhaltung gehört die

Kokzidiose zu den bedeutendsten parasitären Erkrankungen [64].

Von den ehemals als Leistungsförderer zugelassenen antimikrobiellen Wirkstoffen sind

Monensin-Natrium und Salinomycin-Natrium als Kokzidiostatika und damit als

Futtermittelzusatzstoffe weiterhin erlaubt bzw. neu zugelassen worden. Der Einsatz von

Monensin-Natrium als Futtermittelzusatzstoff ist nach der aktuellen Gesetzeslage innerhalb

der EU bei Geflügel zulässig [65,66], ebenso wie die Verwendung von Salinomycin-Natrium

bei Geflügel [67-73] und Kaninchen [70,74]. Sulfonamide werden zwar ebenfalls gegen

Kokzidien eingesetzt, sind aber nicht als Futtermittelzusatzstoffe zugelassen [354].

Antibiotisch wirksame Futtermittelzusatzstoffe (nach FMG) wie Kokzidiostatika sind von

Gesetzes wegen von Fütterungsarzneimitteln (nach AMG) zu unterscheiden [355].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 8

Fütterungsarzneimittel müssen aufgrund der unterschiedlichen Gesetzeszugehörigkeit, im

Gegensatz zu den Futtermittelzusatzstoffen, von einem Tierarzt verschrieben werden,

wodurch ihre Verwendung einer zusätzlichen Kontrolle unterliegt.

3.1.3 Antibiotikaverbrauch in der Landwirtschaft

Da es bezüglich der Produktion oder des Verbrauchs von Veterinärantibiotika in Deutschland

und der Europäischen Union keine Dokumentationspflicht gibt, sind Angaben hierüber nur für

einzelne Jahre in einigen Studien zu finden.

Für das Jahr 1997 veröffentlichte die FEDESA (Federation Européenne de la Santé Animale)

Daten über das europaweite Verkaufsvolumen (EU und Schweiz) von Antibiotika (Abb. 1)

[75,76,77 (korrigierte Daten, ursprünglich Humanmedizin: 5400 t)]. Danach wurden

insgesamt 12752 t Antibiotika eingesetzt, davon entfielen 7659 t (60%) auf den

humanmedizinischen Einsatz, 3494 t (27%) auf die veterinärmedizinische Verwendung und

1599 t (13%) auf den Einsatz als Leistungsförderer (Futtermittelzusatzstoffe).

7659 t 3494 t

1599 t

Antibiotische Leistungsfördere

Veterinärmedizin

Humanmedizin

Abb. 1: Verbrauchsmenge von Antibiotika in der EU (inkl. Schweiz) im Jahre 1997

(in Tonnen), FEDESA [75]

Der mit Abstand größte Anteil von den in der Veterinärmedizin eingesetzten Antibiotika

entfällt auf die Tetracycline. Im Bereich der europäischen Union (inkl. Schweiz) betrug im

Jahre 1997 der Anteil der Tetracycline mit 2294 t 66% der Gesamtumsatzmenge für

veterinärmedizinische Antibiotika (Abb. 2) [75-77].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 9

Tetracycline 2294 t

Macrolide 424 t

Penicilline 322 t

minoglycoside 154 t

Sulfonamide/Trimethoprim 75 t

Fluorchinolone 43 t

Sonstige 182 t

Abb. 2: Verbrauchsmengen der EU-weit in der Tiermedizin eingesetzten Wirkstoffgruppen

im Jahre 1997 (in Tonnen), FEDESA [75]

Die Einsatzmengen an Veterinärantibiotika für die Bundesrepublik Deutschland, welche auf

einer Schätzung der Verbrauchsmengen des Veterinärpanels der Gesellschaft für

Konsumforschung (GfK) in Nürnberg beruhen, beliefen sich für 2003 auf 724,2 t und für 2005

auf 784,4 t [78]. Insgesamt nahm der Verbrauch von Veterinärantibiotika dabei von 2003 auf

2005 um 8,3% (60,2 t) zu (Tab. 1).

Eine deutliche Änderung ergab sich dabei für die Tetracycline, dessen Verbrauchsmenge um

9,2% (35,5 t) abnahm. Dennoch blieben im Jahr 2005 die Tetracycline mit einem Anteil von

44,6% am Gesamtantibiotikaverbrauch die in der Veterinärmedizin mengenmäßig am

stärksten eingesetzte Antibiotikaklasse. Der Rückgang bei den Tetracyclinen korrelierte

dabei mit dem Auslaufen von Zulassungen von mehreren oralen Tetracyclin-Präparaten im

Niedrigpreissegment. Mit 44 t nahm demgegenüber der Verbrauch an ß-Lactamen im

gleichen Zeitraum stark zu, was wahrscheinlich auf den Preisverfall bei den Amoxicillinen

zurückzuführen ist [78].

Tab. 1: Verbrauchsmengen an Veterinärantibiotika in Deutschland [78]

2003 2005

Veränderungen

2003-2005

t t %

Antibiotika gesamt 724,2 784,4 +8,3

Aminoglycoside 27,3 36,3 +33,0

ß-Lactame 155,2 199,2 +28,4

Chinolone 3,5 3,7 +5,7

Lincosamide 7,5 12,1 +61,3

Makrolide 38,6 52,6 +36,3

Phenicole 4,7 4,8 +2,1

Pleuromutiline 6,8 6,4 -5,9

Polypeptide 23,4 21,8 -6,8

Sulfonamide 71,7 97,5 +36,0

Tetracycline 385,5 350,0 -9,2

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 10

Winckler und Grafe ermittelten anhand einer Datenbasis aus dem Jahr 1997 für die Gruppe

der Tetracycline mit 39,832 t einen ca. 52%igen Anteil an der Gesamtmenge der in sechs

Landkreisen der niedersächsischen Weser-Ems-Region abgesetzten Veterinärarzneimittel,

wovon wiederum Chlortetracyclin mit 24,130 t (ca. 33% der Gesamtmenge) den größten

Anteil ausmachte [79]. Für das Land Brandenburg betrug der Anteil von Tetracyclinen nach

Linke und Gratz 1998/1999 etwa 50% [80].

Nach Erhebungen der FEDESA lagen im Jahr 1997 die Sulfonamide bei einem relativen

Gesamtverkaufsvolumen von 2,1 % (75 t, inkl. Trimethoprim) innerhalb der europäischen

Union (EU) [75]. In wie weit die Erhebungen der FEDESA den wirklichen Verbrauch an

Sulfonamiden innerhalb der Europäischen Union widerspiegeln ist fraglich, da aus anderen

Quellen ermittelte Verkaufszahlen auf einen deutlich höheren Verbrauch zu schließen ist.

Allein in sechs Landkreisen der niedersächsischen Weser-Ems-Region sind 1997 nach

Winkler und Grafe ca. 14 t Sulfonamide verwendet worden, was einem Anteil von 19% (inkl.

Trimethoprim 2%) der dort abgesetzten Veterinärarzneimittel entspricht [79]. Nach Thiele-

Bruhn [81] wurden 2000 allein für Großbritannien 98 t (Anteil: 22%) Sulfonamide verwendet.

Die relativen Verbrauchsmengen für Frankreich, Schweden, Dänemark, Schweiz und

Großbritannien liegen nach dieser Quelle zwischen 11 und 23%.

3.2 Antibiotikaresistenzen und Verbrauchergefährdung

3.2.1 Resistenzentwicklung

Wenn die native Population einer Spezies von Bakterien unempfindlich gegenüber einem

oder mehreren Antibiotika ist, spricht man von natürlicher (synonym: intrinsischer) Resistenz

oder auch primärer Resistenz. Diese Spezies liegen dann außerhalb des

Wirkungsspektrums dieser Antibiotika [181].

Bei erworbenen (synonym: extrinsischen) Resistenzen oder auch sekundären Resistenzen

sind einzelne Stämme von ursprünglich gegenüber einem oder mehreren Antibiotika

empfindlichen Bakterien gegen dieses bzw. diese antibiotischen Wirkstoffe unempfindlich

geworden. Die sekundäre Resistenz entsteht aufgrund der Behandlung mit einem

Antibiotikum, worauf es infolge eines Selektionsdruckes auf die Bakterienspezies durch

spontane Mutation zur Resistenzbildung kommt, oder sie wird durch horizontalen

Gentransfer erworben [181].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 11

Kreuz- und Ko-Resistenz

Unter Kreuzresistenz wird die gleichzeitige Unempfindlichkeit einer Bakterienspezies gegen

zwei oder mehr Antibiotika der gleichen Wirkstofffamilie, also gegen strukturell eng

verwandte Substanzen, verstanden, welche nach der Definition von Shah auf einem

gemeinsamen Resistenzmechanismus basieren [182].

So wird u.a. durch den Einsatz des Glykopeptid-Antibiotikums Avoparcin, welches 1997

europaweit zur Anwendung als Leistungsförderer verboten wurde [61], eine

Vancomycinresistenz bei Enterokokken induziert [158,183]. Eine vollständige Kreuzresistenz

besteht z.B. zwischen den strukturell sehr ähnlichen klassischen Tetracyclinen (Tetracyclin,

Oxytetracyclin, Chlortetracyclin und Demethylchlortetracyclin) [7,122,149,184].

Treten bei einzelnen Bakterienspezies gleichzeitig Resistenzen gegenüber Antibiotika aus

verschiedenen Wirkstofffamilien auf, wird dies als Ko-Resistenz bezeichnet. Im Allgemeinen

bilden Resistenzgene, welche gemeinsam auf der gleichen mobilen genetischen Gruppe

(Transponsons, Plasmide) gelegen sind, die Grundlage der Ko-Resistenz [185,186]. So

ermittelten z.B. Deflaun und Levy bei Pseudomonas spp. ein Plasmid, das die

Resistenzinformationen gegen drei unterschiedliche Antibiotika (Spectinomycin, Tetracyclin,

Chloramphenicol) trägt [187].

Einen Sonderfall der Ko-Resistenz stellen „Multidrug-Transporter“ dar. Efflux-Pumpen sind in

der Lage, unterschiedliche Stoffe wie Antibiotika (z. B. Chloramphenicol, Tetracycline,

Fluorchinolone, Trimethoprim, Fosfomycin), Chemotherapeutika, Antiseptika, Detergentien,

Schwermetalle oder kationische Farbstoffe aus der Bakterienzelle auszuschleusen

[188,189].

Resistenzstrategien von Bakterien am Beispiel der Tetracycline

Tetracycline besitzen eine sehr hohe Affinität zum ribosomalen Protein S7 der 30S-

Untereinheit prokaryontischer Ribosomen. Durch die reversible Bindung von Tetracyclinen in

diesem Bereich des Ribosoms wird die Anlagerung der Aminoacyl-tRNA und damit die

Proteinbiosynthese gehemmt [190,191].

Für die Resistenzbildung wurden unterschiedliche bakterielle Strategien identifiziert, welche

einer antibiotischen Wirkung von Tetracyclinen entgegenwirken [190]:

(1) Schutz der Ribosomen als Angriffsort der Tetracycline

(2) Reduzierung der intrazellulären Tetracyclinkonzentration

(3) Inaktivierung des Antibiotikums durch modifizierte Enzyme

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 12

Im Jahr 2005 waren 38 Tetracyclin-Resistenzgene bekannt, wovon 11 der Strategie (1), 23

der Strategie (2) und 3 der Strategie (3) zuzuordnen sind. Ein Resistenzgen konnte keiner

der aufgeführten Strategien zugeordnet werden [192].

3.2.2 Resistenzproblematik

Antibiotika sind die wichtigsten Medikamente zur Therapie bakterieller Infektionen. Ihre

Wirksamkeit ist heute und in Zukunft durch das zunehmende Vorkommen resistenter und

multiresistenter Erreger stark gefährdet [150, 356, 357]. Durch den Einsatz antimikrobieller

Substanzen in Human- und Veterinärmedizin wird ein hoher Selektionsdruck und die

Möglichkeit zur Bildung von Resistenzreservoirs in therapierten Individuen generiert [151].

So wird für die weite Verbreitung antibiotikaresistenter Bakterien und der daraus

resultierenden Problematik der seit ca. 60 Jahren bestehende Einsatz von Antibiotika zu

therapeutischen und prophylaktischen Zwecken verantwortlich gemacht [152].

Der übermäßige Antibiotika-Einsatz führt dazu, dass immer mehr Bakterienstämme, die bei

Mensch und Tieren zu Infektionen führen, gegen Antibiotika resistent sind. Das könnte im

schlimmsten Fall dazu führen, dass gegen bestimmte Stämme kein Antibiotikum mehr wirkt

und Infektionen nicht mehr effektiv behandelbar sind. Um dieser Entwicklung

entgegenzuwirken gibt es zwei Möglichkeiten:

Zum einen die Entwicklung und Einführung neuer antibiotischer Substanzen [150], was

jedoch in den letzten Jahren kaum noch geschehen ist [153], und zum anderen die

Umsetzung von Maßnahmen und Strategien, um die Verbreitung von Resistenzen zu

minimieren [150], welche auch bei neu zugelassenen Antibiotika anzuwenden wären.

Resistente Mikroorganismen entstehen immer dort, wo antibiotische Wirkstoffe in großen

Mengen eingesetzt werden und die Bakterien somit einem hohen Selektionsdruck

ausgesetzt sind [154-158]. Der Vorgang der Entstehung von Resistenzen ist dabei sowohl

von der Konzentration der Antibiotika, als auch von der Dauer der Einwirkung auf die

Mikroorganismen abhängig [159,160]. Der wichtigste Faktor bei der Entstehung, Selektion

und Verbreitung resistenter Mikroorganismen ist somit der Einsatz von antibiotischen

Substanzen [158,161]. Es werden dadurch nicht nur resistente pathogene Keime sondern

auch antibiotikaresistente Stämme der Standortflora selektiert [162,163], welche ihrerseits

Resistenzeigenschaften an andere Bakterienspezies weitergeben können. Von Relevanz ist

zudem, das auch subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen zur Entstehung und Selektion

von Resistenzen beitragen [358,359].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 13

Seit der Entdeckung des Penicillins sind zahlreiche antibiotisch wirksame Substanzen

entwickelt und als Antibiotika auf den Arzneimittelmarkt eingeführt worden. Nach

unterschiedlich langer Zeit des Einsatzes sind aber gegen jeden dieser Wirkstoffe

Resistenzentwicklungen bekannt geworden. Selbst gegen Linezolid, eine Substanz aus der

Stoffgruppe der Oxazolidinone, die seit mehreren Jahrzehnten die erste neue Gruppe von

Antibiotika darstellte, wurde nach kurzer Zeit die Entstehung von Resistenzen beobachtet

[164,165]. Die Einschätzung, dass eine Resistenzentwicklung gegen diesen Wirkstoff,

welcher sehr früh den Prozess der Proteinbiosynthese von Bakterien stört, äußerst

unwahrscheinlich ist, wurde damit widerlegt.

Allgemein kann beobachtet werden, dass die Zunahme der gegenüber einem Antibiotikum

resistenten Bakterien eng mit den Einsatzmengen dieser Substanz korreliert und die

Resistenzraten nach Verminderung des Einsatzes wieder zurückgehen können [166-169].

Die Selektion, Anreicherung und Ausbreitung von resistenten Bakterien erfolgt dabei generell

umso schneller, je öfter ein Antibiotikum in einer Region eingesetzt wird [170]. Im

Unterschied dazu erfolgt ein Rückgang der Resistenzhäufigkeit sehr viel langsamer als die

Resistenzentstehung [171].

Häufig werden in der Veterinärmedizin Bestandsbehandlungen durchgeführt, wobei den

Tieren die Antibiotika mit dem Trinkwasser oder dem Futter verabreicht werden. Diese Praxis

führt zu einer Verabreichung subtherapeutischer Dosen, häufig über lange Zeiträume, und

somit zu einem hohen Selektionsdruck auf die Mikroorganismen [157,173-176].

Eine Verwendung gleicher Antibiotikaklassen in human- und veterinärmedizinischen

Bereichen [177,178] trägt zusätzlich zu der Resistenzproblematik für humanmedizinische

Antibiotika bei, da die Gefahr zur Bildung von Kreuzresistenzen besteht [179]. So wurden in

vielen Untersuchungen die Resistenzen gegenüber Fluorchinolonen dem Selektionsdruck

durch deren veterinärmedizinische Verwendung zugeschrieben [155,166,173]. Die

Verwendung von Avoparcin in der Tiermast wird mit dem Auftreten von Vancomycin-

resistenten Enterokokken (VRE) in Verbindung gebracht [360]. Shea et al. berichten über

eine Zunahme der Tetracyclin-Resistenz von ca. 10% auf 90% bei Bakterien nach einem

Anwendungszeitraum von 2 Wochen, welche von Oxytetracyclin medikamentiertem Geflügel

stammen. Innerhalb von 6 Monaten nahm dabei auch die Tetracyclin-Resistenzrate bei den

von Farmbewohnern stammenden Bakterien signifikant zu [175].

Antibiotika, die sowohl human- als auch in der veterinärmedizinische Verwendung finden,

sind u.a. Aminoglykoside, Cephalosporine, Chloramphenicole, Fluorchinolone, Lincosamide,

Makrolide, Nitrofurane, Nitroimidazole, Penicilline, Polimyxine, Spectinomycin, Sulfonamide,

Tetracycline und Trimethoprim [180].

Der Eintrag von resistenten Bakterien und Antibiotika mit Wirtschaftsdüngern (z.B. Gülle) in

den Boden landwirtschaftlicher Nutzflächen führt zu einer weiteren Verbreitung von

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 14

Resistenzen [361]. Nach Schmitt et al. scheint diesbezüglich der Eintrag von resistenten

Bakterien oder Resistenzgenen mit der Gülle wichtiger zu sein als der Eintrag von

Antibiotikarückständen und einer damit verbundenen Resistenzentwicklung im Boden [362].

Dantas et al. legen nahe, dass Bodenbakterien einen unbeachteten Resistenzpool

darstellen, welcher zur Entstehung höherer Level multi-resistenter pathogener Bakterien

beitragen kann [363].

3.2.3 Verbraucherschutz

Um das Gefährdungspotential für den Menschen durch die in der landwirtschaftlichen

Tierhaltung eingesetzten Antibiotika abschätzen zu können, ist es notwendig, die

verschiedenen Möglichkeiten der Beeinflussung und Interaktion zwischen Mensch, Tier und

Umwelt zu berücksichtigen [7]. Das größte Risiko für den Menschen geht dabei von

resistenten Mikroorganismen aus. Zum einen kann es infolge der Aufnahme von

Antibiotikarückständen beim Menschen zu einer Resistenzbildung kommen, zum anderen

besteht die Möglichkeit einer direkten Übertragung resistenter Mikroorganismen.

Generell birgt jeder Einsatz von antimikrobiellen Wirkstoffen das Risiko einer

Resistenzselektion in sich [193,194]. Das Resistenzrisiko steigt dabei besonders bei

ungezieltem Einsatz, niedriger Dosierung und längerer Anwendungsdauer [194,364].

Ungemach führt als begünstigende Faktoren für die Resistenzentwicklung die Dosishöhe, die

Anzahl der behandelten Individuen, die Behandlungsdauer und die Art des verwendeten

Wirkstoffs an [76]. Als wichtige Faktoren, die zur Selektion und Ausbreitung resistenter

Bakterien im Tier führen, ergeben sich damit:

• subtherapeutische Dosierung

• subinhibitorische Konzentration im Zielgewebe der Tiere (Infektionsort)

• Massenmedikation

• lang anhaltende Behandlung

• Einsatz von Antibiotika mit breitem Wirkspektrum bzw. ihrer Kombinationen

• prophylaktischer und metaphylaktischer Einsatz

• Einsatz als Leistungsförderer

Lebensmittelüberwachung - Höchstmenge

Prinzipiell ist eine Aufnahme von Antibiotikarückständen über Nahrungsmittel tierischer und

pflanzlicher Herkunft möglich. Tierische Nahrungsmittel wurden dabei schon vor längerer

Zeit als potentielle Quelle der Einnahme von Antibiotikarückständen in Betracht gezogen

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 15

[195]. Nicht nur die von den Tieren stammenden Fleischprodukte können

Antibiotikarückstände enthalten, sondern auch tierische Produkte wie Milch und Eier.

Zurhelle konnte z.B. bei mit Tetracyclinen medikamentierten Legehennen

Tetracyclinrückstände in den Eiern nachweisen [114].

Neben der Antibiotika-Belastung der Lebensmittel an sich, spielt auch die Temperatur der

Verarbeitung bzw. Zubereitung von Lebensmitteln in Bezug auf die Höhe der aufgenommen

Rückstandsmengen eine Rolle, da Antibiotikarückstände bei ungenügender Erhitzung im

Fleisch erhalten bleiben [7]. Nach Kühne et al. bleiben z.B. noch 50% der Antibiotika

(Tetracycline in Knochen- und Fleischmehl) nach Erhitzung bei 133 °C über einen Zeitraum

von 45 min erhalten, gleichzeitig nehmen die Gehalte an Abbauprodukten zu, die toxischer

sein können als der Ausgangswirkstoff, wie z.B. Anhydro-Tetracycline [196].

Durch die Aufnahme von Lebensmitteln, die mit Antibiotikarückständen belastet sind, besteht

die Gefahr der Resistenzbildung und somit ein Risiko für den Verbraucher. So stellten

Großklaus et al. nach dem Verzehr penicillinhaltiger Milch bei sensibilisierten Personen eine

plasmidbedingte Resistenzbildung fest [197].

Zum Schutz der Verbraucher ist es die Aufgabe des Gesetzgebers und der für die

Lebensmittelüberwachung zuständigen Behörden zu gewährleisten, dass Lebensmittel keine

gesundheitsbeeinträchtigenden Rückstandskonzentrationen enthalten [7,57,198].

Rückstände sind nach § 4 des Fleischhygienegesetzes (FlHG) und Artikel 2 Richtlinie

96/23/EG wie folgt definiert: „Rückstand: Rückstand von pharmakologisch wirkenden Stoffen

und deren Umwandlungsprodukten sowie von anderen Stoffen, die auf tierische Erzeugnisse

übergehen und für den Menschen gesundheitsschädlich sein können“ [199,200].

Die Höchstmengen (Maximum Residue Limits = MRL) für Tierarzneimittelrückstände in

Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs, sofern eine Höchstmenge im Interesse des Schutzes

der öffentlichen Gesundheit notwendig ist, werden im Anhang I der Verordnung (EWG) Nr.

2377/90 festgesetzt [195]. Die MRL-Werte dienen zum einen als Beurteilungsgrenze im

Rahmen der chemisch-analytischen Untersuchung und Rückstandskontrolle von

Lebensmitteln tierischen Ursprungs. Zum anderen werden in den Zulassungsverfahren für

Tierarzneimittel auf Basis der MRL-Werte „Wartezeiten“ festgelegt, d.h. diejenige Zeitspanne

in der nach Behandlung eines Tieres keine Lebensmittel von diesem Tier gewonnen werden

dürfen.

3.2.4 Risiken durch den Antibiotikaeintrag in Böden

Aufgrund des Eintrages von Antibiotikarückständen in Umweltkompartimente bestehen

neben Nahrungsmitteln tierischer Herkunft weitere Aufnahme- und damit

Gefährdungsquellen für den Menschen.

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 16

Da die in der Tiermast verabreichten Antibiotika über Urin und Faeces wieder ausgeschieden

werden, gelangen die Wirkstoffe und deren Metabolite in den Wirtschaftsdünger Gülle. Durch

den Austrag von Gülle auf landwirtschaftlich genutzte Felder ist so eine Belastung von

aquatischen und terrestrischen Kompartimenten möglich. Ob Antibiotika-Rückstände, wie

z.B. Tetracyclin-Rückstände, im Boden bioverfügbar sind und durch Nutzpflanzen

aufgenommen werden können, war bis vor wenigen Jahren noch unbekannt. Die Aufnahme

von Antibiotika (Chlortetracyclin, Sulfadiazin) über die Wurzel von Winterweizen und

Feldsalat wurde von Grote et al. erst kürzlich nachgewiesen. Die Pflanzen wurden in dieser

Untersuchung auf Felder (Freilandbedingungen) angebaut, welche zuvor mit belasteter Gülle

gedüngt worden waren [96,201]. Kumar et al. berichteten von der Aufnahme von

Chlortetracyclin durch Mais, Kohl und Zwiebeln in einer Gewächshausstudie [202]. In

Screeninguntersuchungen an Getreide, das aus viehstarken Gebieten stammte, wurden von

Freitag et al. ebenfalls Tetracyclin-Rückstände nachgewiesen [203].

Diese Ergebnisse belegen eine Bioverfügbarkeit von Antibiotikarückständen im Boden und

folglich einen Kontaminationspfad für Nutzpflanzen. Letztendlich besteht dadurch die

Möglichkeit eines Eintrags von Antibiotika in die Nahrungskette und somit ein potentielles

Verbraucherrisiko. Eine gesicherte Risikoabschätzung ist zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht

möglich, da erst wenige Untersuchungsergebnisse vorliegen.

Neben der potentiellen Verbrauchergefährdung durch Resistenzentstehungen bestehen

zudem Risiken durch die Antibiotikarückstände selbst. In erster Linie ist hier das Risiko einer

Auslösung von Allergien zu nennen [204]. Durch eine dauerhafte Aufnahme von

Tetracyclinspuren sind z.B. Allergien, Lichtdermatosen, Schwindel, Gleichgewichtsstörungen

und die Unwirksamkeit oraler Kontrazeptiva möglich [7].

Das Verhalten der verschiedenen Antibiotika in der Umwelt ist höchst komplex und hängt

von zahlreichen Faktoren ab, was die Einschätzung eines Gefährdungspotentials durch die

einzelnen Antibiotika in der Umwelt erschwert. So spielen z.B. bei der Verlagerung im Boden

u.a. der vorherrschende pH-Wert, Regenereignisse und die Bodenzusammensetzung eine

Rolle. Zudem sind Vorkommen, Ausbreitung und Abbau der in die Umwelt eingebrachten

Antibiotika von deren chemo-physikalischen Eigenschaften abhängig [172] und damit für die

verschiedenen Antibiotika unterschiedlich. So wurde bei einigen der bisher untersuchten

antibiotischen Wirkstoffe eine biologische Abbaubarkeit bzw. Photodegration beobachtet,

andere Antibiotika scheinen demgegenüber wiederum schwer abbaubar zu sein [205,206].

Schwer abbaubare Antibiotika sind z.B. Tetracyclin, Sulfamethoxazol, Amoxicillin, Cefotiam

und Ciproflaxin [7, 205].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 17

Alexy et al. untersuchten die biologische Abbaubarkeit von 18 verschiedenen Antibiotika

(u.a. Tetracyclin, Chlortetracyclin, Sulfamethoxazol, Trimethoprim) im geschlossenen

Flaschentest (nach OECD 301 D) und konnten keines der Antibiotika als leicht biologisch

abbaubar klassifizieren [207]. Von diesen Antibiotika geht damit die Gefahr einer

Akkumulation in der aquatischen und terrestrischen Umwelt aus. In Anbetracht der hohen

Verbrauchszahlen (Kap. 3.1.3) besteht daher ein potentielles Gefährdungsrisiko für den

Menschen.

3.2.5 Gefährdungspotential resistenter Mikroorganismen

Eine Übertragung von resistenten Mikroorganismen aus der Landwirtschaft auf den

Menschen ist über eine Vielzahl von Wegen möglich. Mögliche Übertragungswege sind

kontaminierte Lebensmittel tierischer Herkunft, der Kontakt mit Nutztieren, der luftgetragene

Transport von Stäuben aus landwirtschaftlichen Betrieben, sowie infolge von

Gülleausbringung und Umwelteintrag belastetes Trinkwasser und pflanzliche Nahrungsmittel

[172,208,209, 361].

Die Übertragung resistenter Bakterien der tierischen Flora auf den Menschen wurde in vielen

Studien belegt. Eine Aufnahmemöglichkeit von resistenten Mikroorganismen besteht hierbei

neben den tierischen Lebensmitteln [156,210-218] auch durch direkten Tierkontakt [156,

216-220]. Insbesondere rohes Fleisch bzw. Fleischerzeugnisse und Rohmilch können von

Tieren stammende resistente Bakterien enthalten [151,221], welche nach oraler Aufnahme

die Magendarmpassage überleben können und im Stuhl der Konsumenten nachweisbar

bleiben [222,223]. Die Gefährdung des Verbrauchers durch Aufnahme resistenter Bakterien

liegt dabei in der Schwierigkeit der Therapierbarkeit der durch ihnen direkt ausgelösten

Infektionen und der Resistenzübertragung an Bakterien der Standortflora oder andere

humanpathogene Bakterien [156,177,213,224]. So berichteten z.B. Teuber et al. über die

Resistenzübertragung Vancomycin-resistenter Enterokokken (VRE) aus Fleisch- und

Käseprodukten, was durch deren genetischer Übereinstimmung mit klinischen Isolaten

gezeigt wurde [217].

Ein Risiko für den Menschen geht insbesondere von Infektionen mit multiresistenten

Erregern, wie z.B. Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), aus. MRSA bzw.

ORSA (Oxacillin-resistente Staphylococcus aureus) stellt bei Nosokomialinfektionen weltweit

ein besonderes Problem dar [356,357]. MRSA wird in hospital acquired MRSA (ha-MRSA)

und community acquired MRSA (ca-MRSA) unterschieden, wobei ha-MRSA auf in

Krankenhäuser erworbene klononale Linien von MRSA zurückzuführen ist [527]. Die Daten

mehrerer niederländischer Untersuchungen legen einen Zusammenhang zwischen

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 18

Antibiotikaeinsatz und des damit verbundenen Auftretens von Resistenzen in der Tiermast

(z.B. Schweinemast) mit der Folge einer erhöhten Gefährdung für Kontaktpersonen der Tiere

(z.B. Masttierzüchter, Schlachter) bezüglich einer Infektion mit ca-MRSA nahe [365-368].

Zudem können MRSA-Stämme auch gegenüber weiteren Antibiotikagruppen, wie z.B.

Tetracycline, Glykopeptide (z.B. Vancomicyn) und/oder ß-Lactame resistent sein, was eine

Therapierbarkeit erkrankter Personen erschwert und zu steigender Mortalität führt [369]. Die

Anzahl der durch ca-MRSA (ca-ORSA) verursachten Infektionen nimmt zu und wird mit einer

signifikanten Morbität und Mortalität ansonsten gesunder Individuen assoziiert [356]. Allein in

den USA sterben jährlich mehr als 18.000 Menschen durch MRSA-Infektionen und damit

mehr als durch AIDS [370]. Welchen Anteil ca-MRSA daran besitzt bleibt offen, aber unter

der Berücksichtigung, dass 25 - 39% Prozent amerikanischer Schweine MRSA tragen, ist

von einem ernsthaften Risiko für den Menschen auszugehen. In einer kanadischen

Untersuchung betrug MRSA bei Schweinen ca. 25% und bei Schweinezüchtern 20% [371].

In den Niederlanden wurden MRSA-Raten von 39% bei Schweinen und >20% bei

Schweinezüchtern ermittelt [366, 372]. Ein Risiko, sich mit MRSA infizieren zu können,

besteht neben dem Tierkontakt auch durch Lebensmittel tierischen Ursprungs, da in

Lebensmitteln wie Fleisch, Milch und Käse ebenfalls MRSA nachgewiesen werden konnte

[370, 372-375]. Kluytmans et al. beschrieben die Übertragung von MRSA durch

kontaminierte Lebensmittel [376]. In diesem Fall wurden die Lebensmittel zwar durch einen

mit MRSA-infizierten Menschen kontaminiert, es zeigt aber die grundsätzliche Möglichkeit

einer Übertragung durch kontaminierte Lebensmittel.

Einen zusammenfassenden Überblick über den aktuellen (Daten-)Stand der

Resistenzverbreitung in Human- und Veterinärmedizin in Deutschland liefert der

Resistenzatlas GERMAP 2008 [357].

Da resistente Bakterien tierischer Herkunft über Wirtschaftsdünger auf Anbauflächen für

Gemüse oder Getreide gelangen, ist auf diese Weise eine Kontamination pflanzlicher

Lebensmittel möglich [151,225,226]. Wie hoch die in Wirtschaftsdünger eingetragenen

Resistenzraten von Bakterien mitunter sein können, zeigen die Untersuchungen von Lim et

al. anhand von Escherichia coli –Stämmen, welche aus den Stuhlproben koreanischer

Nutztiere isoliert worden sind. Während die Tetracyclin-Resistenz der aus Rinderkot

isolierten E.coli-Stämme bei 30,5% (102 von 334) lag, ermittelten sie dagegen bei den aus

Kot von Schweinen isolierten Stämmen eine Tetracyclin-Resistenz von 96,3% (395 von 410)

[227].

Der Eintragspfad über Wirtschaftsdünger ist insofern von Bedeutung, da der Verzehr von

unbehandelten pflanzlichen Nahrungsmitteln generell als Quelle von Infektionskrankheiten in

Frage kommt [225,228,229] und somit auf diesem Wege ebenso eine Aufnahme von

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 19

resistenten Bakterien durch den Genuss roher und unbehandelter Lebensmittel wie Gemüse,

Salat oder Obst möglich ist. In Untersuchungen von Boehme et al. an 20 verschiedenen

pflanzlichen Lebensmitteln (Gemüse), welche auf Wochenmärkten und in Supermärkten

gekauft wurden, betrug die Resistenzrate bei den isolierten Bakterienstämmen z.B.

gegenüber Tetracyclin 43% [230].

Auch in aquatischen Systemen konnte ein Vorkommen resistenter Bakterien mehrfach

nachgewiesen werden [231-233]. Zum einen werden Antibiotikarückstände und resistente

Mikroorganismen aus anderen Umweltbereichen wie z.B. der Landwirtschaft eingetragen,

zum anderen kommt es durch den Antibiotikaeinsatz in Aquakulturen zur Resistenzbildung.

In entwickelten Ländern ist eine Aufnahme von resistenten Bakterien aufgrund der

Wasseraufbereitung über das Trinkwasser unwahrscheinlich. Dagegen ist ein Aufnahme von

resistenten Bakterien über nicht aufbereitetes Wasser aus Seen und Flüssen möglich [151].

Eine Resistenzbildung ist nicht allein auf die Entstehungsorte Mensch und Tier beschränkt.

Es besteht zudem die Möglichkeit der Resistenzentstehung und –ausbreitung in den

verschiedenen Umweltkompartimenten allein durch den Selektionsdruck, den

Antibiotikarückstände auf die jeweiligen Bakterienpopulationen ausüben. In der Literatur wird

beispielsweise die Möglichkeit einer in situ-Resistenzentwicklung in aquatischen Systemen

beschrieben [172]. Nach Chander et al. sind auch fest an Bodenpartikel adsorbierte

Tetracycline noch biologisch aktiv und können damit die Selektion Antibiotika-resistenter

Bakterien in der Umwelt beeinflussen [234].

Der Eintrag von resistenten Mikroorganismen aus der Tiermast in die Umwelt kommt als ein

Hauptfaktor der Resistenzverbreitung zusätzlich hinzu. Aus Tests an Boden-, Abwasser und

Gülleproben konnten nach Smalla mobile genetische Elemente isoliert werden, die in der

Lage sind, nicht-selbsttransferable DNA zu übertragen [185]. Diese genmobilisierende

Aktivität war dabei unter Feldbedingungen im begüllten aber nicht im unbegüllten Boden

nachweisbar. Nach Smalla konnten übertragbare Resistenzgene gegen Streptomycin,

Gentamycin und Tetracyclin in Boden, Rhizosphäre (Wurzelbereich von Pflanzen),

Belebtschlamm, Gülle und Meerwasserproben nachgewiesen werden [185]. Untersuchungen

von Pote et al. zeigten, dass ein Transport von biologisch aktiver DNA, welche in der Lage

ist, Resistenzen auf Bakterien zu übertragen, im wassergesättigten Boden und Grundwasser

über beachtliche Distanzen möglich ist [235].

Aufgrund der dargestellten Komplexität und der vielfältigen Risikofaktoren für den

Verbraucher, kann heute noch keine gesicherte Risikoanalyse über die Auswirkungen des

veterinärmedizinischen und landwirtschaftlichen Einsatzes von Antibiotika und der damit

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 20

verbundenen Resistenzbildung beim Menschen gemacht werden. Der Erkenntnisstand hat

sich in den letzten Jahren zwar punktuell vertieft, aber viele Zusammenhänge sind immer

noch im Unklaren oder nicht eindeutig nachgewiesen. Das gilt sowohl für die

Resistenzentstehung und -Verbreitung durch Antibiotika-Rückstände in der Umwelt, als auch

für Vorkommen und Verbreitungspfade von Antibiotika in den verschiedenen

Umweltkompartimenten.

3.3 Tetracycline und Sulfonamide

3.3.1 Tetracycline

Benjamin Mingo Duggar entdeckte 1947 in den Lederle Laboratories (Pearl River, USA) eine

von Streptomyces aureofaciens (Strahlenpilz, Bodenbakterie) erzeugte antibiotische

Substanz, die er Aureomycin nannte. Diese Substanz ist heute unter der Bezeichnung

Chlortetracyclin bekannt [108]. In den darauf folgenden Jahren wurden Oxytetracyclin (1949)

und Tetracyclin (1953) entdeckt. Durch chemische Modifikationen der klassischen

Tetracycline, welche ihre pharmakologischen Eigenschaften verbessern, wurden

verschiedene Tetracyclinderivate wie Rolitetracyclin, Doxycyclin und Minocyclin entwickelt

[7].

Tetracyclin wurde zunächst partialsynthetisch durch katalytische Hydrierung von

Chlortetracyclin hergestellt. 1968 gelang Muxfeldt die Synthese von Tetracyclin. 1973

veröffentlichten Muxfeldt et al. die Totalsynthese von Anhydro-Chlortetracyclin. Die

Herstellung von Tetracyclinen durch Totalsynthesen konnte sich aber aufgrund des

vergleichsmäßig hohen Aufwandes in der Industrie nicht durchsetzen. Daher werden die

meisten Tetracyclinderivate partialsynthetisch aus den fermentativ gewonnenen

Tetracyclinen erzeugt [7,109,110].

Das Wirkspektrum der bakteriostatisch wirkenden Tetracycline umfasst den größten Teil der

grampositiven und –negativen Bakterien, sowie Mykobakterien, Mykoplasmen, Chlamydien,

Rickettsien und große Viren [377].

Physikalische und chemische Eigenschaften

Tetracycline sind gelbe, geruchlose und lichtempfindliche Verbindungen, welche im

kristallinen Zustand stabil sind. Sie sind starke Komplexbildner (Chelatbildung mit

mehrwertigen Metallkationen) und besitzen eine hohe Affinität zu Silanolgruppen [59,378].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 21

Die chemische Grundstruktur der Tetracycline besteht aus vier linear kondensierten

Sechserringen, wobei sich die verschiedenen Derivate lediglich in ihren Substituenten

unterscheiden (Tab. 2).

Tab. 2: Struktur von Tetracyclin-Wirkstoffen [7,121,133]

OH OOH O

D C B A

910 10a 11 11a 12 12a

Substanz Abkürzung R1R2

A-Chromophor

BCD-Chromophor

R3R4

Tetracyclin TC H OH CH3H

Oxytetracyclin OTC H OH CH3OH

Chlortetracyclin CTC Cl OH CH3H

Doxycyclin DC H H CH3OH

Rolitetracyclin RTC H OH CH3

Minocyclin MC N(CH3)2H H H

Tetracycline besitzen charakteristische UV-Spektren, welche allerdings pH-Wert abhängig

sind. Der A-Chromophor (s. Tab. 2) absorbiert bei 260 nm. Der BCD-Chromophor besitzt

Absorptionsmaxima bei 225, 285, 320 und 360 nm [108,111].

Bei Anhydrotetracyclinen ist die Absorptionsintensität im Wellenlängenbereich von 320-380

nm, aufgrund der durch die Dehydratation hervorgerufenen Veränderung des BCD-

Ringsystems, jedoch deutlich vermindert. Da die Absorptionsprofile der Anhydrotetracycline

von den gewählten Bedingungen abhängig sind, erfolgt eine Quantifizierung mittels UV-

Detektion bei unterschiedlichen Wellenlängen [112-115].

Durch alkalische Behandlung werden viele Tetracycline in iso-Tetracycline umgewandelt. Die

Umwandlung geht dabei mit einer pH-abhängigen Änderung der UV-Absorption bei 320-380

nm einher. Nur im alkalischen Mileu besitzen die iso-Tetracycline eine UV-Absorption im

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 22

Bereich 320-380 nm [116,117]. Die natürliche Fluoreszenz der Tetracycline wird durch die

Isomerisierung deutlich verstärkt, was zur analytischen Bestimmung der Tetracycline

ausgenutzt werden kann [118-120].

Tetracycline bilden mit Säuren und Basen in Wasser lösliche, stabile Salze. Sowohl die

freien Basen, als auch die Hydrochloride sind in Alkoholen gut löslich. In anderen

organischen Lösungsmitteln sind sie hingegen weniger gut löslich [108,111,122]. In

wässriger Lösung (innerhalb des physiologischen pH-Bereichs) besitzen die freien Basen der

Tetracycline mit ca. 1mg/ml lediglich eine geringe Löslichkeit [108,111,121]. Die

Wasserlöslichkeit der Tetracyclin-Hydrochloride ist hingegen größer, so geben Sattelberger

et al. für Tetracyclin-Hydrochlorid eine Löslichkeit von 50-100 mg/ml in wässriger Lösung an

[4].

Während die Tetracycline, insbesondere deren Hydrochloride, im festen Zustand stabil sind,

verlieren sie in wässrigen Lösungen schnell einen Teil oder ihre gesamte antibiotische

Wirksamkeit. Für die einzelnen Tetracycline ist die Stabilität in wässriger Lösung sehr

unterschiedlich und wird zudem durch verschiedene Faktoren wie z.B. Temperatur und pH-

Wert beeinflusst. So sind TC und OTC im sauren bis neutralen pH-Bereich deutlich stabiler

als CTC. Im alkalischen Medium zeigt OTC die höchste Stabilität, während CTC besonders

alkaliempfindlich ist und zum iso-CTC isomerisiert [7,123-126].

Tetracycline besitzen durch ihre sauren Gruppen und den basischen Dimethylamino-Restes

einen amphoteren Charakter. Für Tetracycline sind vier Säurekonstanten bekannt. Sie

reagieren aufgrund der OH-Gruppe an Position C-3 als Säuren mit einem pKa1-Wert von 3,3

[121,127]. An der OH-Gruppe der vinylogen Carbonsäurestruktur (pKa2-Wert = 7,6) an

Position C-12 erfolgt eine zweite Deprotonierung. Die basischen Eigenschaften der

Tetracycline beruhen auf dem Dimethylamino-Rest an Position C-4. Der dritte pKa3-Wert von

9,7 wird dabei dem protonierten Stickstoffatom des Restes zugeordnet [128,129], ein vierter

pKa4-Wert von 12 wird nach Duarte et al. der phenolischen OH-Gruppe an Position C-10

zugeordnet [130].

Tetracycline können in Abhängigkeit von den Substituenten, der Koordinierung von Metall-

Ionen und dem Lösungsmittel, insbesondere dem pH-Wert des Lösungsmittels, in zwei

unterschiedlichen Konformationen vorliegen. Tetracyclin nimmt dabei in sauren und

neutralen Melieu eine „twisted“ Konformation an, bei der die protonierte

Dimethylaminogruppe aus sterischen Gründen oberhalb des BCD-Ringsystems liegt. Im

basischen Medium oder in nichtwäßrigen Lösungsmitteln verschiebt sich das Gleichgewicht

zu einer „extended“ Konformation, wobei die Dimethylaminogruppe unterhalb des planaren

BCD-Ringsystems liegt [131]. Die Konformation der Tetracycline hat möglicherweise einen

Einfluss auf die pharmakokinetischen Eigenschaften [128,132].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 23

Umwandlungs- und Abbaureaktionen

In Abhängigkeit vom Lösungsmittel, von der Temperatur, der Lichteinstrahlung und

insbesondere vom pH-Wert kommt es bei den verschiedenen Tetracyclinen (in Lösung) zu

einer Vielzahl von Umwandlungs- und Abbaureaktionen. Die verschiedenen Tetracycline

zeigen dabei jedoch deutliche Unterschiede in der Art und der Geschwindigkeit dieser

Reaktionen [108,122].

Unter Umwandlungsreaktionen werden in dieser Arbeit Reaktionen verstanden, die zu einer

Konfigurationsänderung bei gleich bleibender Summenformel führen. Der Begriff der

Isomerisierung wird auf die alkalische Umwandlung der Tetracycline in ihre iso-Form

verwendet. Bei den verschiedenen Umwandlungsreaktionen wird dabei in Isomerisierung,

Epimerisierung und Keto-Enol-Tautomerie unterschieden. Die verschiedenen Tetracycline

können zudem einer Dehydratation unterliegen. Die Dehydratation wird dabei aufgrund der

Veränderung der Summenformel als eine Abbaureaktion angesehen.

Epimerisierung

Tetracycline unterliegen in schwach saurer Lösung (pH 2 - 6) einer Konfigurationsänderung

am asymmetrischen C-Atom in Position 4 (Abb. 3).

OH OOH O

N(CH

)

OH OOH O

N(CH

)

HO H

pH 2-6

Chlortetrac

clin

(

CTC

)

4-e

i-Chlortetrac

clin

(

e-CTC

)

+ H+

- H+

Abb. 3: Epimerisierung von Chlortetracyclin in schwach saurer Lösung [7,118]

Diese Epimerisierung, welche nach einer Reaktion 1. Ordnung verläuft, ist reversibel und

wird z.B. durch Harnstoff, Citrat, Phosphat oder mehrwertige Kationen katalysiert [111,116].

Die Reaktionsgeschwindigkeit und die Gleichgewichtslage der Epimerisierung sind im hohen

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 24

Maß vom pH-Wert abhängig. Die Geschwindigkeit der Epimerisierung nimmt mit steigendem

pH-Wert zu, wobei sich je nach den gewählten Bedingungen das Gleichgewicht bei einem

Epimerisierungsgrad von 40-68% einstellt. Unterhalb von pH 1,5 findet jedoch keine

Epimerisierung mehr statt [134-136].

Im Vergleich zu ihren jeweiligen Muttersubstanzen besitzen die epimeren Tetracycline eine

bessere Löslichkeit in den meisten Lösungsmitteln und eine erhöhte Stabilität gegenüber

saurer oder alkalischer Einwirkung [108]. Eine Konfigurationsänderung wie z.B. bei den 4-

Epi-Tetracyclinen wirkt sich zudem auf die antibiotische Aktivität aus. Die antibiotische

Wirksamkeit der Epimere ist nach verschiedenen Autoren gegenüber der Muttersubstanz um

90-100% vermindert. Es ist dabei aber unklar, ob die Epimere überhaupt eine antibiotische

Wirksamkeit besitzen oder da die Epimerisierung reversibel ist, die antibiotische Aktivität

auch auf Rückepimerisierung zurückzuführen ist [7,134].

Isomerisierung

Bei Tetracyclinen mit einer Hydroxygruppe an Position C-6 führt eine alkalische Behandlung

zum Aufbrechen des Ringes C zu den entsprechenden iso-Tetracyclinen (Abb. 4)

[108,111,126]. TC und OTC isomerisieren oberhalb eines pH-wertes von 9-10, CTC

hingegen ist besonders labil und isomerisiert schon ab pH 7 zum iso-CTC.

Analog zu den Tetracyclinen epimerisieren im schwach sauren Bereich (pH 2-6) auch die

iso-Tetracycline zu 4-epi-iso-Tetracyclinen [137]. Im Gegensatz zur Epimerisierung ist die

Isomerisierung der Tetracycline durch alkalische Behandlung eine irreversible Reaktion. Die

in ihre iso-Form umgewandelten Tetracycline besitzen keine oder nur noch sehr geringe

antibiotische Aktivität [7,117,138-140].

Cl N(CH

)

HO CH

OH O OH O

OH OOH O

N(CH

)

H > 7

Isochlortetrac

clin

(

iso-CTC

)

Chlortetrac

clin

(

CTC

)

OH OOH

OCH

OH O O

OH OOH

+ OH- - H20

+ H20

- OH-

Abb. 4: Isomerisierung von Chlortetracyclin im alkalischen Milieu [7,118]

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 25

Keto-Enol-Tautomerie

Die unterschiedlichen Tetracycline können in Abhängigkeit von Polarität und pH-Wert des

Lösungsmittels verschiedene tautomere Formen annehmen. Duarte et al. [130] beschreiben

für vollständig protonierte Tetracycline neun verschiedene Tautomere. Die tatsächliche

Struktur des Tetracyclins lässt sich hierbei als Gleichgewicht aus allen möglichen Keto-Enol-

Tautomeren auffassen. In Abhängigkeit vom Dissoziationsgrad der Tetracycline sind unter

Einbeziehung von vier den pKa-Werten entsprechenden Protonierungs- und

Deprotonierungszuständen 64 tautomere Formen möglich [7].

Die chromatographische Trennung von Tautomeren des CTC und DC ist erstmalig Naidong

et al. an Polymerphasen gelungen. Mittels NMR konnte die Keto-Enol-Tautomerie im Bereich

von Position C11, C11a und C12 nachgewiesen werden [141,142].

Das H-Atom an Position C11a kann durch Ausbildung der Ketoform cis- oder transständig

zum H-Atom an Position C5a sein, woraus sich eine cis-Ketoform und eine trans-Ketoform

ableiten lässt. Die Keto-Enol-Tautomerie (Abb. 5) kann grundsätzlich säuren- oder

basenkatalysiert sein. Für CTC ist aufgrund seiner leichten Isomerisierung zum iso-CTC bei

alkalischer Behandlung nur der säurekatalysierte Prozess von Bedeutung, da beim iso-CTC

eine Tautomerie an Position C11, C11a und C12 nicht mehr möglich ist.

Cl N(CH

)

HO CH

OH OOH O

OH OOO

N(CH

)

Enolform von CTC Ketoform von CTC

OOH

CH3

OOH

+ H+

- H+

Carbeniumion

Abb. 5: Keto-Enol-Tautomerie von Chlortetracyclin [7,118]

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 26

Dehydratisierung

Als eine Abbaureaktion (Eliminierungsreaktion) ist bei den Tetracyclinen die

Dehydratisierung von Bedeutung. Unterhalb von pH 1,5 spaltet sich bei Tetracyclinen mit

einer Hydroxygruppe an Position C-6 (z.B. bei CTC) leicht Wasser ab, und es entstehen

unter Aromatisierung vom Ring C die entsprechenden Anhydrotetracycline (Abb. 6).

Bei der Dehydratsierung handelt es sich um eine irreversible Reaktion 2. Ordnung. Die

Eliminierung von Wasser wird hierbei durch die trans-Stellung der tertiären Hydroxylgruppe

an Position C-6 zum H-Atom an C-5a ermöglicht [111,118,126]. Die Anhydrotetracycline

unterliegen ebenfalls der Epimerisierung und der Keto-Enol-Tautomerie. Die Epimerisierung

der Anhydrotetracycline verläuft dabei schneller und die Deydrierung der 4-epi-Tetracycline

langsamer als die entsprechende Reaktion der unveränderten Tetracycline [126]. Die

antibiotische Aktivität ist bei den Anhydrotetracyclinen um ca. 70% gegenüber ihren

Ausgangsverbindungen reduziert und sie besitzen zudem deutlich toxischere Eigenschaften

aufgrund dessen sie keine klinische Anwendung finden. Die Anwendung von

Anhydrotetracyclinen ruft schwere Nebenwirkungen hervor, welche auf ihrer nicht selektiven

Wirkung auf alle Zellmembranen, also auch auf die von eukaryontischen Zellen, beruht [112,

128]. Die toxischen Effekte von Anhydrotetracyclinen werden der relativen Position der

Dimethylamino-Gruppe zugeschrieben [143].

Cl N(CH

)

Cl CH

N(CH

)

HO CH

OH O OH O

OH OH O O

pH < 1,5

- H2O

Chlortetracyclin (CTC) Anhydrochlortetracyclin (Anhydro-CTC)

OH OOH

HH +

OH OOH

+ H+

- H+

- H2O

Abb. 6: Dehydratisierung von Chlortetracyclin in stark saurem Medium [7,118]

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 27

3.3.2 Sulfonamide

1932 wurde der Azofarbstoff Prontosil (Sulfamidochrysoidin) synthetisiert, welcher 1935

erstmals als Sulfanilamid therapeutisch eingesetzt wurde [144,145]. Das Sulfanilamid

entstand dabei durch die Metabolisierung von Sulfamidochrysoidin durch den Organismus.

Auf der strukturellen Basis des Sulfanilamids (para-Aminobenzolsulfonamid) wurde in den

nachfolgenden Jahren durch Variation der Substituenten eine große Vielzahl von Derivaten

entwickelt (Tab. 3), welche sich in ihren pharmakokinetischen und toxikologischen

Eigenschaften stark unterscheiden. Die größte Wirksamkeit konnte dabei durch Substitution

mit Acylderivaten oder heterocyclischen Derivaten erzielt werden. Die Sulfonamide werden in

der therapeutischen Anwendung häufig in Kombination mit anderen Antibiotika verwendet

[144,146].

Sulfonamide wirken bakteriostatisch, da die kompetitive Hemmung der Dihydropteroinsäure-

Synthetase durch das Sulfonamid zu einer Hemmung der Folsäuresynthese führt [147]. Sie

besitzen eine Breitbandwirksamkeit gegenüber grampositiven und viele gramnegativen

Bakterien, sowie gegen einige Protozoenen (Kokzidien) [377].

Tab. 3: Struktur von Sulfonamid-Wirkstoffen [148]

Grundstruktur

N S

Name Struktur R Name Struktur R

Sulfanilamid

Sulfamethoxy-pyridazin

OMe

Sulfacetanid

Sulfadoxin

OMeMeO

Sulfadiazin

Sulfamethoxazol

Sulfisomidin

Sulfisoxazol

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 28

Sulfamethazin

Sulfaquinoxalin

Sulfamerazin

Sulfadimethoxin

OMe

Sulfathiazol

Sulfaphenazol

Sulfamethizol

Sulfonamide sind in Wasser relativ schwerlöslich (7,5-1500 mg/l) und verhalten sich

amphoter. Sie reagieren als schwache Säuren und bilden Salze in stark sauren oder

basischen Lösungen. Für Sulfonamide sind zwei Säurekonstanten bekannt, welche bei pKa1=

2-3 und pka2= 4,5-10,6 liegen (Sulfanilamid, Sulfadiazin, Sulfadimidin, Sulfadimethoxin,

Sulfapyridin, Sulfamethoxazol). Der pKa1 wird der Protonierung der Aminogruppe und der

pKa2 der Deprotonierung des R1SO2NHR2-Teils zugeordnet [81]. Sulfonamide können daher

in Lösung abhängig vom pH-Wert als kationische, neutrale bzw. zwitterionische und/oder

anionische Spezies vorliegen [379,380].

Die Sulfonamide werden in der Leber metabolisiert. Durch Acetylierung am primären N4-

Anillinstickstoff bildet sich dabei als wichtiger Metabolit ein N4-Acetyl-Sulfonamid [145].

Wooley et al. ermittelten bei Ratten N4-Acetyl-Sulfadiazin (siehe Abb. 7) und N4-Glucuronid-

Sulfadiazin als Hauptmetaboliten von Sulfadiazin [381].

NHH

Abb. 7: N4-Acetyl-Sulfadiazin

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 29

2.3.3 Trimethoprim

In der Veterinärmedizin wird oft eine Kombination von Sulfonamiden mit Trimethoprim (TMP)

eingesetzt, wodurch sich ihre Wirkstärke potenziert. Als Monopräparat fand Trimethoprim

jedoch keine wesentliche Anwendung in der Veterinärmedizin.

Trimethoprim, als Vertreter der Antimetaboliten, unterdrückt bakterielle Reduktasen und führt

zu einer zweistufigen Hemmung des Folsäuremetabolismus der Bakterien (Sequentialeffekt)

[146,149].

MeO

NNH

OMe

Abb. 8: Struktur von Trimethoprim

3.4 Arzneistoffe im Boden

In den letzten 10 Jahren wurden zahlreiche Human- und Veterinärarzneistoffe in Abwässern,

Kläranlagenabflüssen, Oberflächengewässern, Wirtschaftsdüngern und Böden

nachgewiesen [81,351]. Dabei lag der Schwerpunkt der Untersuchungen auf Eintrag und

Vorkommen von Humanarzneimitteln in aquatischen und terrestrischen

Umweltkompartimenten. Demgegenüber waren Tierarzneimittel, obwohl diese in erheblichen

Umfang eingesetzt werden, selten Gegenstand von Untersuchungen. Aus diesem Grund

liegen bis heute nur wenige Ergebnisse zu Vorkommen und Verhalten von Tierarzneistoffen

in der Umwelt vor. Insbesondere bei den Verlagerungswegen/-mechanismen im Boden und

dem damit verbundenen möglichen Eintrag von Tierarzneimittel ins Grundwasser ist der

gegenwärtige Kenntnisstand unzureichend.

Neben den spezifischen physiko-chemischen Eigenschaften der einzelnen Arzneistoffe ist

das Umweltverhalten von dem hoch komplexen System Boden sowie von verschiedenen

Umwelteinflüssen abhängig. Daraus ergibt sich eine unüberschaubare Anzahl von Faktoren,

welche das Umweltverhalten von Arzneistoffen beeinflussen. In den einzelnen

Untersuchungen werden daher nur wenige Faktoren berücksichtigt und letztendlich sind die

Ergebnisse dieser Untersuchungen somit immer nur eingeschränkt untereinander

vergleichbar. Zusätzlich kommt hinzu, dass bei den verschiedenen Untersuchungen in der

Regel nur die aus dem jeweiligen Boden extrahierbaren Arzneimittelrückstände analytisch

ermittelt werden können. Um das Verhalten dieser Umweltschadstoffe [382] im Boden und

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 30

deren Verbreitungstendenz verlässlich einschätzen zu können, sind gesicherte Daten über

deren Vorkommen im Boden, Oberflächen- und Grundwasser nötig. Des Weiteren müssen

die einzelnen Beeinflussungsfaktoren identifiziert und deren Einflussgröße auf das Verhalten

der einzelnen Arzneistoffe im Boden ermittelt werden.

3.4.1 Verhalten von Schadstoffen (Arzneimittelrückständen) im Boden

Für das Verhalten von Arzneistoffen im Boden gelten grundsätzlich die gleichen

Beeinflussungsfaktoren wie für andere Bodenschadstoffe. In wieweit ihr Verhalten

untereinander vergleichbar ist, hängt u.a. vom Übereinstimmungsgrad ihrer physiko-

chemischen Eigenschaften ab.

Die verschiedenen Schadstoffe können dabei vereinfacht in zwei Gruppen eingeteilt werden:

- anorganische Stoffe (z.B. Schwermetalle, Metalloide und Radionuklide)

- organische Schadstoffe (z.B. Chlorkohlenwasserstoffe (CKW), Nitro- und

Aminoaromaten, Polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffen (PAK),

Polychlorierte Biphenyle (PCB), Herbizide, Pestizide, Arzneistoffe)

Die Anzahl der möglichen Eintragspfade in Böden ist für die verschiedenen Schadstoffe

vielfältig, daher wird nur auf die im Zusammenhang mit Arzneimitteleinträgen wichtigsten

eingegangen.

Die Belastung von Böden mit den verschiedenen Schadstoffen ist abhängig von ihrer

geographischen Lage (z.B. Nähe zur Schadstoffquelle) und Nutzung. Für Tierarzneimittel

verläuft der wesentliche Eintragspfad, da der Hauptteil an Tierarzneimitteln in der Tiermast

verwendet wird, über die Ausscheidungsprodukte der Tiere. Diese gelangen entweder direkt

beim Weidegang der Tiere oder indirekt in Form von Gülle oder Festmist auf

landwirtschaftliche Nutzflächen (Weide- oder Ackerflächen) [23,24,383].

Für Humanarzneimittel erfolgt dagegen der Haupteintrag über die menschlichen

Ausscheidungen und den Abwasserpfad in die Oberflächengewässer. Die Eintragsmenge

der einzelnen Arzneistoffe in die Oberflachengewässer wird dabei insbesondere durch den

Grad der Elimination (Abbau, Sorption) in den Kläranlagen bestimmt [24]. Durch die

Verwendung von Klärschlamm als Düngemittel ist ebenfalls –neben Gülle- ein Eintrag von

Arzneistoffen in den Boden landwirtschaftlicher Nutzflächen (Ackerflächen) möglich.

Schadstoffe (z.B. Arzneistoffe) unterliegen dabei stark vernetzten Kreisläufen, in denen

natürliche biogeochemische Vorgänge mit anthropogenen Materialflüssen gekoppelt sind (s.

Abb. 9) [384].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 31

photochemischer

Abbau

Eintrag in

Oberflächengewässer

Adsorption an

Bodenmatrix

Aufnahme durch

Pflanzen

Auswaschung/Versickerung

Mineralisation

Oberflächenabfluss

Arzneistoffe

Kontamination von

Grundwasser

Bodenlösung

chemischer und

mikrobieller Abbau

Abb. 9: Potentielles Verhalten in Böden eingetragener Arzneistoffe (geändert nach [384])

Die Verbreitung der Schadstoffe im Boden wird durch ihre physikalisch-chemischen

Eigenschaften, durch Transportprozesse und biogeochemische Mechanismen bestimmt.

Folgende Faktoren stehen dabei im Zusammenhang mit der Konzentration und der

Verbreitung dieser Stoffe in der Umwelt [384]:

• Quellen, Eintragsmenge und –charakteristik

• physikalisch-chemische Stoffeigenschaften (molekulare Struktur, Dampfdruck,

Hydro-/Lipophilie, Adsorptionsfähigkeit, Abbaubarkeit)

• physikalisch-chemische und biologische Eigenschaften (Temperatur, pH-Wert,

Sedimentationsrate, Nährstoffkreisläufe, Redox- und Mischungsverhältnisse)

• Transformationsprozesse (Photolyse, Hydrolyse, Redoxreaktionen und biotischer

Abbau)

Allgemein gelten für alle auf den Boden gelangten organischen Schadstoffe der

biochemische Abbau (Mineralisierung), die Sorption der Substanzen bzw. deren

Abbauprodukte an Bodenbestandteile und der Verbleib in bioverfügbarer Form

(Bodenlösung) als Abhängigkeitsfaktoren für deren Verbreitungsverhalten. Die Sorption an

Bodenbestandteile beinhaltet dabei die beiden Prozesse der Anlagerung (Adsorption) an

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 32

Bodenpartikeln und der Aufnahme (Absorption) in (organische) Bestandteile des Bodens

[385]. Eine isolierte Betrachtung einzelner Bodenbestandteile bezüglich ihres

Sorptionsverhaltens gegenüber einzelnen Schadstoffen kann nicht grundsätzlich auf

natürliche Böden übertragen werden, da Wechselwirkungen der verschiedenen

Bodenbestandteile untereinander in der Lage sind, sich auf das Sorptionsverhalten

auszuwirken. So können bespielsweise überwiegend hydrophobe Huminstoffe an

mineralische Partikel wie Tonminerale adsorbieren und somit zu einer gesteigerten

Hydrophobizität führen [386]. Neben den von Natur aus im Boden vorkommenden

Huminstoffen wirken sich daher auch anthropogene Einflüsse in Form eines Eintrags

huminstoffreicher Düngemittel wie Kompost oder Gülle auf die Hydrophobizität eines Bodens

aus.

Eine Sorption an Bodenbestandteile kann z.B. über Van-der-Waals-Kräfte, Dipol-Dipol-

Wechselwirkungen, hydrophobe Bindung, Wasserstoffbrückenbindung, kovalente Bindung,

koordinative Bindung oder Ionenaustausch erfolgen [387]. Die auf physikalischen Kräften

beruhenden Bindungstypen der Physisorption sind meist schwach und reversibel,

demgegenüber sind die starken chemischen Bindungstypen der Chemisorption teilweise

irreversibel. Für an der Bodenoberfläche befindliche Schadstoffe ist infolge von

Sonneneinstrahlung ein photochemischer Abbau möglich. Durch eindringendes

Regenwasser können die Bodenschadstoffe mit dem Sickerwasser in tiefere Bodenregionen

transportiert werden und bis ins Grundwasser gelangen. Der Transport ist dabei auf zwei

verschiedene Wege möglich. Ein Transport der Schadstoffe ist zum einen in gelöster Form

und zum anderen in an Bodenpartikel sorbierter Form über den partikulären Transport

(mobile Partikel oder Kolloide) im Boden möglich.

Durch Fällungsreaktionen (einschließlich Mitfällung) können gelöste Kontaminanten selbst

Festphasen bilden oder Bestandteil dieser sein. Ein erneuter Übergang von zuvor gefällten

oder sorbierten Stoffen durch Auflösungs- und Desorptionsvorgänge in die Bodenlösung ist

infolge natürlicher oder anthropogener Umwelteinflüsse / Prozesse möglich.

In welcher Form ein Transport in tiefere Bodenschichten möglich ist, hängt zum einen von

den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Schadstoffe und zum anderen von der

jeweiligen Umwelt (Bodenzusammensetzung, Korngrößenverteilung, pH-Wert des Bodens,

Redoxpotential u.a.) ab. Der Sorptionsprozess kann dabei für Schadstoffe, welche an der

festen Bodenmatrix sorbiert werden, auch eine Retardation und damit eine zeitweise

Immobilisierung beinhalten. Partikuläre Stoffe können dabei in Abhängigkeit der

Filtereigenschaften des jeweiligen Bodens zurückgehalten werden. Die Stoffmenge, welche

durch den Boden bis ins Grundwasser transportiert werden kann, ist von der Verweilzeit der

Kontaminanten im Boden abhängig, welche durch die Verlagerungsgeschwindigkeit

bestimmt wird [385].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 33

Bei Starkregenfällen ist zudem eine teilweise Ausschwemmung der Schadstoffe mit dem

Oberflächenwasser in angrenzende Gewässer (Entwässerungskanäle, Bäche, Flüsse, Seen)

möglich, wo sie dann weiter abtransportiert oder in Sedimenten abgelagert werden. Über den

Boden können verschiedene Schadstoffe, sofern sie in einer pflanzenverfügbaren Form

vorliegen, zudem durch Pflanzen aufgenommen werden.

Bildung nicht-extrahierbarer Rückstände und Sequestrierung

Untersuchungen aus Feldstudien und Bodensanierungsprojekten zeigen, dass Schadstoffe

in Böden und Sedimenten länger persistieren als anhand ihres physikalischen und

chemischen Verhaltens abgeschätzt werden kann [388,389]. Solche Beobachtungen, welche

sich signifikant von den herkömmlichen Theorien zum Verhalten und Transport von

Kontaminanten im Boden unterscheiden, deuten auf eine Fraktion von Schadstoffen im

Boden hin, welche eine geringere Verfügbarkeit gegenüber mikrobiellem Abbau und

chemischen Reaktionen besitzt [390]. Generell wird angenommen, dass adsorbierte

Schadstoffe zuerst in eine wässrige Phase (Bodenwasser) desorbieren müssen, um

gegenüber biologischem Abbau und chemischen Reaktionen zugänglich zu sein [390]. So

gelten beispielsweise auch Antibiotika, welche durch Wechselwirkungen mit der Bodenmatrix

festgelegt (sequestriert) werden, als nicht mehr verfügbar [391]. Die Entstehung von

gebundenen Rückständen „Bound Residues“ bzw. nicht-extrahierbaren Rückständen ist ein

aus agrarwissenschaftlichen Untersuchungen bekanntes Phänomen [392]. Die Bildung von

nicht-extrahierbaren Rückständen ist ein generelles Phänomen, welches bei

unterschiedlichen Kontaminanten wie z.B. PAK, Trinitrotuluol (TNT) und auch Substanzen

aus der heterogenen Stoffgruppe der Pestizide auftritt. Wechselwirkungen zwischen

Bodenmatrix und Schadstoffen, auf welche eine Bildung von nicht-extrahierbaren

Rückständen beruhen kann, sind:

- sorptive Wechselwirkungen

- kovalente Bindungen

- physikalischer Einschluss (Sequestrierung, Entrapment)

Die einzelnen Bindungsprozesse unterscheiden sich dabei, sowohl hinsichtlich der

benötigten Zeiträume als auch bezüglich des Chemismus, deutlich voneinander.

Unter „Sequestrierung“ sowie „Entrapment“ wird ein unspezifischer Bindungsmechanismus

verstanden, welcher einen über die reine Adsorption hinausgehenden physikalischen

Einschluss von Schadstoffen in Poren oder Hohlräumen von makromolekularen

Huminstoffen darstellt [392]. Des Weiteren wird auch die langsame Diffusion von

Schadstoffen in nicht-zugängliche Mikroporen der Bodenmatrix, in denen diese

zurückgehalten werden, als Sequestrierung beschrieben [393]. Nach Förster et al. ist

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 34

Sequestrierung ein Mechanismus, welcher mit zunehmender Kontaktzeit mit dem Boden, zu

einer abnehmenden bioverfügbaren Konzentration führt [394]. Der zugehörige Prozess,

welcher die biphasische Abnahme der chemischen und biologischen Verfügbarkeit

(organischer) Schadstoffe in Abhängigkeit von der Kontaktzeit mit dem Boden beinhaltet,

wird als „Alterung“ bezeichnet [395]. Die Alterung führt zur Bildung von Schadstoffanteilen im

Boden, welche gar nicht oder nur mit aggressiven Methoden extrahiert werden können.

Ein Nachweis von sequestrierten und kovalent gebundenen Rückständen kann durch

Silylierung des Bodenmaterials erfolgen. Werden die Schadstoffe durch die Silylierung in

gelöster Form freigesetzt, waren sie sequestriert. Demgegenüber erfolgt eine Freisetzung

kovalent gebundener Schadstoffrückstände mit den an ihnen gebundenen Humuspolymer-

Bruchstücken. Zur Unterscheidung von sequestrierten und kovalent gebundenen

Rückständen müssen diese daher identifiziert (Molekulare Masse, Chromatographie) werden

[392].

Begriffsdefinitionen von gebundenen Rückständen und nicht-extrahierbaren Rückständen

Um zwischen extrahierbaren und nicht-extrahierbaren Rückständen zu differenzieren, muss

zuvor definiert werden, was unter gebundenen sowie nicht-extrahierbaren Rückständen

verstanden wird, da sich die Fraktion von nicht-extrahierbaren Rückständen immer auf das

jeweilig angewendete Extraktionsverfahren bezieht. In der Umweltanalytik von Pestiziden

(Pflanzenschutzmittel, Biozide) ist die Bildung von gebundenen Rückständen schon lange

Zeit bekannt [392]. Viele der ursprünglichen Definitionen gehen daher auf diesen Bereich

zurück. Im Laufe der Zeit wurden diese Definitionen mit der Entwicklung neuer

Analyseverfahren und im Rahmen von Begriffs-Harmonisierungen für andere Stoffgruppen

immer wieder geändert/modifiziert und allgemeiner gehalten. Gebundene Rückstände

wurden 1975 auf einem Symposium der American Chemical Society wie folgt definiert:

„Ein bodengebundener Rückstand ist der nicht-extrahierbare und chemisch nicht-

identifizierbare Wirkstoffrückstand, der in Fulvosäuren, Huminsäuren und Huminfraktionen

nach intensiver sequentieller Extraktion mit nicht-polaren organischen und polaren

Lösungsmitteln verbleibt" (Übersetzung durch Eschenbach et al.: [392,396]).

Bereits 1982 wurde diese Definition durch Khan [397] novelliert, da es zwischenzeitlich

gelungen war, einen Teil dieser nicht-extrahierbaren oder gebundenen Rückstände auf

chemischem Wege zu identifizieren. Khan definiert und unterscheidet demgegenüber

zwischen biologisch verfügbaren und biologisch nicht verfügbaren gebundenen

Rückständen. Biologisch verfügbar sind dabei jene Rückstände, welche durch Pflanzen

und/oder Bodentiere aufgenommen werden können.

In einem von der FAO (Food and Agriculture Organisation of the United Nations)

koordinierten Forschungsprogramm wurde folgende Definition gegeben: „Nicht-extrahierbare

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 35

(oder gebundene) Rückstände von Xenobiotika werden als aus der Anwendung von

Xenobiotika stammende chemische Spezies definiert, welche nicht durch gebräuchliche

Methoden der Rückstandsanalytik und Metabolismusuntersuchung extrahiert werden

können“ (Übersetzung aus dem Englischen aus: [398]).

Mit der IUPAC-Definition (International Union of Pure and Applied Chemistry) [399,400],

welche den Begriff der nicht-extrahierbaren Rückstände von Pestiziden in Böden und

Pflanzen definiert, wurde die Grundlage für spätere allgemeine Definitionen gelegt. In dieser

(ersten) Definition wurde zudem darauf hingewiesen, dass anstelle des Begriffs der „nicht-

extrahierbaren Rückstände“ manchmal auch die Begriffe „gebundene“ oder „nicht-extrahierte

Rückstände“ verwendet werden. Bei den verwendeten Extraktionsprozeduren, wie z.B.

Solvent-Extraktion oder Destillation, wird dabei vorausgesetzt, dass diese erschöpfend

(exhaustiv) eingesetzt werden. Die IUPAC-Definition wurde z.B. in der Richtlinie

91/414/EWG [401] und in der schweizerischen Pflanzenschutzmittelverordnung [402]

wörtlich bzw. sinngemäß übernommen. In der Richtlinie 91/414/EWG [401] heißt es:

„Unter nicht extrahierbaren Rückständen sind chemische Stoffe zu verstehen, die aus

der Anwendung eines Pflanzenschutzmittels gemäß guter landwirtschaftlicher Praxis

stammen und durch Verfahren, welche die chemische Natur dieser Rückstände nicht

bedeutend verändern, nicht extrahiert werden können. Durch Stoffwechselprozesse

entstandene Bruchstücke, die zu natürlichen Produkten führen, gelten nicht als nicht

extrahierbare Rückstände.“

Die IUPAC-Kommission überarbeitete später diese Definition in Hinblick auf eine Definition

für gebundene Rückstände von Xenobiotika in Nahrungsmitteln pflanzlicher und tierischer

Herkunft [398]. Zum einen wurde berücksichtigt, dass beispielsweise Enzymsysteme durch

eine Auflösung der umgebenen Matrix Xenobiotika freisetzen können und zum anderen,

dass die Begriffe „nicht-extrahierbare“ und „gebundene Rückstände“ keine gänzlich

synonyme (übereinstimmende) Bedeutung besitzen. Nach dieser Definition ist der

„gebundene Rückstand“ eines Xenobiotikums ein Rückstand, welcher mit einer oder

mehreren Klassen von endogenen Makromolekülen verbunden ist. Dieser Rückstand kann

nicht vom natürlichen Makromolekül unter Verwendung einer vollständigen (exhaustiven)

Extraktion oder Verdauung getrennt werden, ohne die Beschaffenheit (Struktur) des

Xenobiotikums oder der damit verbundenen endogenen Makromoleküle wesentlich zu

verändern. Wo die Rückstände nicht im vollen Umfang als „gebunden“ bestimmt werden

können, sollen sie als „nicht-extrahierbar“ bezeichnet und das Extraktionsverfahren genannt

werden. Die Bezeichnung eines Rückstandes als „gebunden“ soll dabei nur aus

Untersuchungen mit radiomarkierten Stoffen abgeleitet werden.

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 36

Die überarbeitete IUPAC-Definition wurde z.B. vom Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)

[403] und W. Bodenschatz [404] übernommen. Weiterhin wird in diesen Literaturstellen der

Begriff „bioverfügbarer Rückstand“ definiert. Diese Definition lautet [403,404]:

„Ein bioverfügbarer Rückstand: z.B. ein Konjugat eines Wirkstoffes oder Metaboliten

oder ein anderer gebundener Rückstand, der durch die im Magen vorhandene Säure

gespalten werden kann, so dass Wirkstoff oder Metabolit freigesetzt und für den

Organismus verfügbar werden.“

Unter Konjugate wird dabei verstanden:

„Konjugate: z.B. Verbindungen des Wirkstoffes oder von Metaboliten mit

Zuckern/Kohlenhydraten, die in der Pflanze oder im Tier gebildet wurden und in der Regel

extrahierbar sind (extrahierbare "gebundene" Rückstände).“

Modifizierte Definitionen auf Grundlage der überarbeiteten IUPAC-Definition, welche

untereinander nahezu identisch sind, finden sich bei Führ et. al [404] und in der Verordnung

(EG) Nr. 440/2008 [406]. In der Verordnung (EG) Nr. 440/2008, welche sich u.a. mit der

Festlegung von Prüfmethoden zur Bewertung chemischer Stoffe befasst, heißt es [406]:

„Gebundene Rückstände: „Gebundene Rückstände“ sind Verbindungen in Boden,

Pflanzen oder Tieren, die nach einer Extraktion in der Matrix in Form der

Ausgangssubstanz oder deren Metaboliten/Transformationsprodukte(n) verbleiben. Die

Extraktionsmethode darf die Verbindungen selbst oder die Matrixstruktur nicht wesentlich

verändern. Durch matrixverändernde Extraktionsmethoden und hochentwickelte

Analysenverfahren kann die Art der Bindung zum Teil geklärt werden. Bislang werden z.B.

kovalente Ionen- und Sorptionsbindungen sowie Einschlüsse auf diese Weise

nachgewiesen. In aller Regel bedeutet die Bildung von gebundenen Rückständen eine

deutliche Verminderung der Bioverfügbarkeit.“

Für Transformationsprodukte gilt in dieser Definition:

„Transformationsprodukte: alle Substanzen, die durch biotische oder abiotische

Transformationsreaktionen der Testsubstanz entstehen, einschließlich CO2 und

Reaktionsprodukte in gebundenen Rückständen.“

Transport von Schadstoffen im Boden

Der Boden bildet aufgrund der Vielzahl an seinem Aufbau beteiligten anorganischen und

organischen Komponenten ein hochkomplexes heterogenes System. In welchem Umfang

und über welche Transferprozesse Umweltschadstoffe im Boden transportiert werden, ist

von dem jeweiligen Boden und den vorherrschenden Umweltbedingungen abhängig. Durch

chemische und biologische Transformationsprozesse kann es zudem zu einer Änderung der

Struktur der Schadstoffe und damit zu einem anderen Transportverhalten kommen.

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 37

In Bezug auf die möglichen Stofftransportprozesse ist zwischen der „gesättigten“ und

„ungesättigten Bodenzone“ zu unterscheiden. Im Regelfall erfolgt der Stofftransport in der

ungesättigten Zone des Bodens durch die gravitativ bedingte vertikale Bewegung des

Sickerwassers [407].

Im Unterschied zur ungesättigten Bodenzone ist in der gesättigten Bodenzone, wie sie ab

der Tiefe des Grundwasserstandes anzutreffen ist, die Bodenluft in den Hohlräumen des

Bodens bzw. der einzelnen Bodenpartikel vollständig durch Wasser verdrängt. Dies hat für

die ungesättigte Bodenzone zur Folge, dass die Durchlässigkeit des Bodens nicht wie bei

der gesättigten Bodenzone konstant, sondern von der variablen Wassersättigung in der

Sickerstrecke abhängig ist [26].

Der Wassergehalt und die Sickerwasserrate ändern sich in der Realität in Abhängigkeit der

Witterungsbedingungen („Instationarität“), also im ständigen Wechsel zwischen

Niederschlagsereignissen und Trockenphasen. Aufgrund dieser Witterungseinflüsse

unterliegt die Sickerwassergeschwindigkeit und infolge dessen auch die advektive

Transportgeschwindigkeit von Schadstoffen ständigen Veränderungen. In welchem Umfang

sich dann das in den Boden eingedrungene Regenwasser frei als Sickerwasser in den

Porenräumen bewegen kann oder an der Bodenmatrix adsorbiert wird, hängt von dem dort

vorherrschenden Wassergehalt und den jeweiligen Bodeneigenschaften ab.

Zur Beurteilung der Verlagerung von Schadstoffen mit dem Sickerwasser sind folgende

Prozesse von Relevanz [407]:

- Advektion (Transport mit der Sickerwasserströmung)

- Dispersion (Vermischung im Porenraum infolge unterschiedlicher

Fließgeschwindigkeiten)

- Diffusion (Ausgleichprozess von Konzentrationsunterschieden durch

Konzentrationsgradienten)

Eine Verzögerung oder Verminderung des Stofftransports und damit der transportierten

Menge von Schadstoffen ist dabei durch folgende Prozesse möglich:

- Sorption (Ad-, Ab- und Desorptionsverhalten) / Ionenaustausch / Komplexierung

- Abbau / Umbau

- Übergang in die Gasphase (und Vermischung mit der Bodenluft)

Der klassische Ansatz zum Transport von Schadstoffen setzt sich aus einer konvektiven und

einer diffusiv-dispersiven Komponente zusammen und geht davon aus, dass das gesamte

Wasser im Boden homogen verteilt und am Transport beteiligt ist [408].

Eine alleinige Betrachtung eines homogenen Wasser- und Substanzflusses durch den

Boden (Matrixfluss) führt nach heutigen Erkenntnissen allerdings zu falschen Prognosen bei

der Einschätzung der Verlagerung von Schadstoffen, da der klassische Ansatz einen

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 38

schnellen Transport über präferenzielle Fließwege, welche in der heterogenen Porenstruktur

von natürlichem Boden begründet sind, nicht berücksichtigt. Beim präferenziellen Transport

wird ein Teil des Gesamtporenvolumens eines Bodens über bevorzugte Leitungsbahnen mit

Wasser durchströmt, woraus ein Wasserfluss resultiert, welcher der Wasserbewegung in der

(feinporigeren) Matrix vorauseilt [409].

Durch präferenzielle Transportwege können daher auch Bodenschadstoffe in gelöster oder

partikulärer Form wesentlich schneller in tiefere Bodenschichten oder das Grundwasser

verlagert werden [385,407-410]. Nach Lennartz liegt in Böden unter Wasserteilsättigung

praktisch immer ein beschleunigter Stofftransport vor [408]. Die bedeutendsten

Einflussfaktoren zur Initialisierung von präferentiellem Stofftransport sind

Niederschlagsintensität, Infiltrationskapazität, Bodenwassergehalt, Hydrophobizität

(hydrophobe Bereiche im Boden), Porenstruktur und relevante Stoffcharakteristika [409].

Im Wesentlichen lassen sich die Mechanismen präferenziellen Fließens anhand

verschiedener Entstehungsursachen in Fingerfluss („Fingering“), Trichterfluss („Funneling“)

und Makroporenfluss unterteilen [385,408,409].

Fingerfluss:

Ein Fingerfluss entsteht durch Instabilitäten in der Befeuchtungsfront bei denen sich ein

fingerförmiger Wasserfluss ausbildet. Als Ursache für die Instabilitäten kommen

Hydrophobizitätsunterschiede im Boden in Betracht, welche zu einer schlechteren

Benetzbarkeit/Wasserdurchlässigkeit einzelner Bereiche und damit zu einem heterogenen

Wasserfluss führen. Eine weitere Ursache für eine fingerförmige Versickerung sind abrupte

Texturwechsel im Boden bei denen feinkörnigeres Material über grobkörnigerem Material

liegt.

Trichterfluss:

Der Trichterfluss beruht auf einer Kapillarsperre, welche durch geneigte Einlagerungen oder

Verdichtungen hervorgerufen wird. So wird z.B. durch Steine oder Tonlinsen die vertikale

Bewegung des Wassers eingeschränkt, infolge dessen der Wasserabfluss trichterförmig

entlang der eingebetteten Grenzflächen verläuft.

Makroporenfluss:

Der Makroporenfluss ist auf zwei in ihrer Porosität unterschiedlichen Porensystemen (dual-

poröses Medium), welche im Boden einerseits von Makroporen und andererseits von

feinporigerer Matrix gebildet werden, zurückzuführen. Die Bildung von Makroporensystemen

kann verschiedene Ursachen haben [407-409,411]. Quell- und Schrumpfprozesse im Boden

führen zum einen zur Bildung von Bodenaggregaten, wobei das Makroporensystem als

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 39

Nebenprodukt entsteht, und zum anderen zur Entstehung von Rissen und Spalten. Eine

Riss- und Spaltenbildung kann aber auch durch andere Prozesse wie Kryoturbation oder

Verwitterung hervorgerufen werden. Des Weiteren können Makroporensysteme durch

biologische Aktivität von Bodenflora und -fauna z.B. in Form von Wurzelkanälen oder

Regenwurmgrabröhren gebildet werden.

Für eine Beurteilung des Verhaltens von Umweltschadstoffen auf Ackerböden kommt noch

die Art der Bodenbearbeitung als ein entscheidender Einflussfaktor, welcher hier nur kurz

dargestellt wird, hinzu. Die verschiedenen Bodenbearbeitsungsverfahren haben zum einen

Einfluss auf die Bodenstruktur (Gefüge und Porensysteme), aber auch auf andere

Bodeneigenschaften wie Biosystem oder Gehalt und Verteilung von organischem Material

[409]. Durch das Pflügen von Ackerböden werden einerseits die (biogenen)

Makroporensysteme (Wurmgänge, Wurzelkanäle) zerstört bzw. unterbrochen, andererseits

wird der Boden bei diesem Verfahren aber aufgelockert. So weisen pfluglose

Bearbeitungsverfahren wie Direktsaat oder Mulchsaat einen etwa 2,5 höheren Durchsatz an

(biogenen) Makroporen im Boden auf [411]. Bei einem gepflügten Boden setzt die

Oberflächenverschlämmung schneller ein, was insbesondere bei Starkregenfällen zu einer

geringeren Wasserinfiltration und einem damit verbundenen stärkeren Oberflächenabfluss

führt. Durch einen erhöhten Oberflächenabfluss können daher auch Schadstoffe verstärkt

über diesen Pfad transportiert werden. Ein mit Makroporen gut durchsetzter Boden führt aber

nicht zwangsläufig zu einer verstärkten Verlagerung von Schadstoffen mit dem

Sickerwasserstrom. Makroporen stellen so genannte biologische „hot-spots“ dar, wobei der

Boden der Makroporenwände durch im Vergleich zur „normalen“ Bodenmatrix höhere

Gehalte an organischen und mikrobiell gebundenen Kohlenstoff, sowie eine hohe mikrobielle

Aktivität und Diversität charakterisiert ist [411]. Über den mikrobiologisch bedingten Abbau

von organischen Schadstoffen in Makroporen ist noch wenig bekannt, dennoch zeigen

Untersuchungen, dass organische Schadstoffe in den Makroporen beschleunigt abgebaut

bzw. mineralisiert werden können [411]. Zudem werden die Makroporenoberflächen und der

angrenzende Boden im Laufe der Zeit mit Humus und Tonmineralien angereichert, wodurch

sich ihre chemische Reaktivität und ihr Sorptionsverhalten gegenüber Schadstoffen

verändern können. Die Wände der Mikroporen können beispielsweise durch die Bildung von

biologischen Mikrofilmen oder durch Absonderung von Schleimsekreten einen hydrophoben

Charakter besitzen, was sich auf ebenfalls auf die Sorptionseigenschaften der

Makroporenwände gegenüber Schadstoffen auswirken und zu einer geringeren Schadstoff-

Diffusion in die Bodenmatrix führen kann [409,411].

Eine detailliertere Darstellung der Zusammenhänge zwischen Bodenbearbeitung und

Stofftransport wird beispielsweise bei Machulla et al. [411] und A. Michels [409] gegeben.

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 40

Partikulärer Transport

Die Pfade des Lösungstransports, des Transports von Schadstoffen in Festphase und der

diffusiven Ausbreitung von leichtflüchtigen Schadstoffen in der Bodenluft, sowohl in der

gesättigten, als auch in der ungesättigten Bodenzone sind meist gut untersucht.

Dem gegenüber wird die potenzielle Verlagerung von an mobilen Partikeln gebundenen

Schadstoffen im Sickerwasser oft vernachlässigt, obwohl zahlreiche anorganische und

organische Schadstoffe sowohl gegenüber der immobilen Bodenmatrix als auch gegenüber

mobilen Partikeln im Sickerwasser, eine starke Sorptionstendenz aufweisen [27]. Diese

Transportsituation wird nicht von 2-phasigen Transportmodellen, welche traditionell von einer

mobilen flüssigen Phase und einer immobilen festen Phase ausgehen, beschrieben. Der

Boden sollte daher als 3-phasiges (dual-)poröses Medium mit zwei festen Phasen, also einer

mobilen partikulären Phase und einer stationären festen Phase, aufgefasst werden [412].

Der Einfluss von Partikeln auf den Schadstoffstransport aus dem Bereich des Grundwassers,

also der gesättigten Bodenzone, ist in zahlreichen Studien untersucht worden [28-32]. Die

Prozesse im Bereich des partikelgebundenen Schadstofftransports in der ungesättigten

Bodenzone sind der gegenwärtigen Kenntnislage nach jedoch unzureichend erforscht, was

insbesondere für den Bereich der Arzneistoffe gilt.

Um zwischen gelösten und partikulären Transport von Schadstoffen unterscheiden zu

können, ist zuvor zu definieren, was unter Partikel und partikulärem Transport zu verstehen

ist. In der Literatur findet sich hierzu keine einheitliche Definition. Kolloidale Teilchen sind

nach Definition von Sposito Feststoffteilchen mit einer sehr geringen Wasserlöslichkeit und

einem Durchmesser von 0,01 - 10 µm [33]. Kolloide sind demgegenüber nach Stumm und

Morgan kleine Partikel in einer Größenordnung von 1 nm bis 1 µm [25]. Der Begriff „Kolloid“

wird von der International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) für Feststoffteilchen

verwendet, bei denen mindestens eine Dimension im Bereich von 1 nm bis 1 µm liegt [34].

Sigg und Stumm nehmen eine Unterteilung nach Teilchengröße vor und unterscheiden

zwischen kleineren Kolloiden (1 – 1000 nm) und größeren suspendierten Partikeln (1 – 5µm)

[35].

In der Wasserchemie wird klassisch eine Trenngrenze bei 0,45 μm zwischen gelöstem und

partikulärem Zustand festgelegt, wobei die so definierte Trenngrenze mitten durch den

Größenbereich der Kolloide (siehe Abb. 10) schneidet [36].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 41

Abb. 10: Größenverteilung von Bodenbestandteilen (geändert nach [36])

In dieser Arbeit werden unter dem partikulären Transportweg mit dem Sickerwasser

transportierte Feststoffphasen in der Größenordnung von wenigen Nanometern bis mehreren

Mikrometern verstanden. Transportierte Schadstoffe können dabei an Feststoffphasen

gebunden (sorbiert/sequestriert) oder selbst die transportierten Partikel sein.

Partikel besitzen aufgrund ihrer großen spezifischen Oberfläche gegenüber Schadstoffen

eine hohe Sorptionskapazität [37,38]. Hierbei kann der Anteil der Intrapartikeloberfläche an

der Gesamtoberfläche deutlich höher als der Anteil der äußeren Partikeloberfläche sein. So

beträgt z.B. bei quellfähigen Tonmineralien der intrapartikuläre Anteil an der

Gesamtoberfläche 90% [26]. Über den partikulären Transportweg können daher Schadstoffe,

die aufgrund ihres starken Sorptionsverhaltens gegenüber der Bodenmatrix als immobil

eingeschätzt werden, in tiefere Bodenschichten gelangen und bis ins Grundwasser

transportiert werden [27]. Neben den verschiedenen anorganischen Partikeln und gelösten

Stoffen wird mit dem Sickerwasser auch organisches Material (Huminstoffe) transportiert.

Diese Stoffe können entweder gelöst (Dissolved Organic Matter = DOM) oder partikulär

weitertransportiert werden. Huminstoffe werden in Huminsäuren, Fulvosäuren und Humine

unterteilt, welche bei Abbauprozessen (Humifizierung) organischen Materials im Boden

entstehen. Der Einfluss von organischem Material auf den Transport von Schadstoffen

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 42

wurde in zahlreichen Untersuchungen dargelegt [31,39-41]. Untersuchungen von Schulte-

Ebbert et al. und Johnson et al. zeigten einen verstärkten Transport von polyzyklischen

aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) durch den Einfluss von organischem Material

[44,45]. Im Gegensatz dazu ist nach Fetter der Anteil von an reinen Mineraloberflächen

sorbierten organischen Schadstoffen eher gering [46]. Gerade für den Transport von

hydrophoben Schadstoffen ist der Gehalt an organischem Material im Boden von großer

Bedeutung. So hängt u.a. die Sorption/Sequestration dieser Schadstoffe an innere und

äußere Partikeloberflächen vom Gehalt des organischen Materials in der Bodenmatrix und

der Partikel ab. McCarthy et al. und Georgi untersuchten den Einfluss von (gelösten)

Huminstoffen auf die Sorption von hydrophoben Schadstoffen [42,43].

Die Migration von Partikel-sorbierten bzw. sequestrierten Schadstoffen oder partikulären

Schadstoffen hängt von der Partikelmobilität im Boden ab. Diese wird in der ungesättigten

Bodenzone, welche durch ein hohes Maß an Instationarität gekennzeichnet ist, von

verschiedenen hydraulischen und hydrochemischen Parametern gesteuert. Gerade durch

eine Änderung des Wassergehaltes in der Bodenzone variierten diese Parameter, welche

auf die Partikel im Sickerwasser einwirken, zeitlich sehr stark [27,47-49]. Eine Änderung des

Wassergehaltes im Boden wird dabei insbesondere durch Regenereignisse hervorgerufen.

Zuvor festgelegte Partikel können durch diese instationären Verhältnisse mobilisiert und mit

dem Sickerwasser in tiefere Bodenschichten bis hin zum Grundwasser transportiert werden.

Über diesen Transportpfad können die an diesen mobilen Partikeln sorbierten Schadstoffe

mit verlagert werden. Es ist dabei davon auszugehen, dass dieser Transportweg mit

steigender Sorptionstendenz der Schadstoffe an Bodenpartikel einen zunehmenden Anteil

an der transportierten Gesamtmasse besitzt. In Hinblick auf einen partikulären Ko-Transport

von Umweltschadstoffen im Boden ist zudem der Faktor Gülleausbringung von Bedeutung.

So muss aufgrund einer im Vergleich zu Boden- und Regenwasser höheren Ionenstärke von

Wirtschaftsdüngern mit einer erhöhten Verlagerungswahrscheinlichkeit für Partikel und

Mikroorganismen gerechnet werden [409].

Sprague et al. konnten in Lysimeter-Versuchen einen mit durchschnittlich 15% der

transportierten Gesamtmasse stark von Partikeln beeinflussten Transport von Atrazin

nachweisen [50]. Die Anwesenheit von Betonitpartikeln erhöhte nach Untersuchungen von

Möri et al. den Anteil von transportiertem Americium und Plutonium von 20-30% (in

Abwesenheit von Partikeln) auf 60-80%. Neben dem favorisierten Transportweg über

Bentonit-Trägerpartikel wurde dabei auch der Transport dieser Radionuklide über partikuläre

Feststoffphasen nachgewiesen [51]. Inwieweit ein partikulärer Stofftransport in Böden

eingetragener Arzneistoffe zu ihrer Verbreitung in terrestrischen (und aquatischen)

Umweltkompartimenten beträgt, kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht sicher abgeschätzt

werden, da die Transportpfade bzw. das Umweltverhalten für Arzneimittel unzureichend

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 43

untersucht sind. In Anbetracht der Zusammenhänge zwischen Antibiotikaeinsatz in der

Landwirtschaft und einer damit zusammenhängenden Resistenzentwicklung (s. Kap. 3.2)

besteht gerade für diese Arzneimittelgruppe ein dringender Forschungsbedarf bezüglich

ihres Verhaltens im Boden und der weiteren Verbreitung in andere Umweltkompartimente.

3.4.2 Tetracycline und Sulfonamide in aquatischen und terrestrischen

Kompartimenten – Eintrag, Vorkommen und Verhalten

3.4.2.1 Tetracycline

Der Haupteintragsweg für Tetracycline in die Umwelt resultiert aus der Aufbringung von

kontaminierten Wirtschaftsdüngern (Gülle, Mist) auf landwirtschaftliche Nutzflächen. Bis 80%

der verabreichten Tetracyclinmenge werden nach Kroker über den Kot wieder

ausgeschieden [82]. Nach Vockel [7] wurde eine vergleichbare relative

Ausscheidungsmenge für Chlortetracyclin bei Schweinen ermittelt. Diese betrug hier 1-4%

über Urin und 55-83% über Kot. Winckler und Grafe geben bei Schweinen für Tetracyclin

eine Ausscheidungsgrad von bis zu 72% über Urin und Faeces an [83].

Über diesen Weg gelangen die Tetracycline schließlich in Wirtschaftsdünger wie Gülle oder

Mist. Insbesondere in Wirtschaftdüngern aus der Schweine- und Geflügelproduktion, wo die

dortigen Tierbestände mit Tetracyclinen behandelt worden sind, wurden mit bis zu 203,3

mg/kg Chlortetracyclin erhebliche Rückstandsmengen festgestellt [4,84]. Nach Hamscher et

al. können nach Modellrechnungen bei Bestandsbehandlungen von 10 Tagen Tetracyclin-

Rückstände von maximal 52 g/m3 für Schweinegülle und bis zu 878 g/t für Putenmist erreicht

werden [85]. Durch Ausbringung belasteter Wirtschaftsdünger auf landwirtschaftliche

Nutzflächen gelangen die Tetracycline in den Boden, wo Gehalte bis zu 810 µg/kg

(Chlortetracyclin) nachgewiesen wurden [4,86,87]. In an der Bodenoberfläche getrockneten

Güllekruste wurde von Hamscher et al. ein Chlortetracyclingehalt von 1,435 mg/kg ermittelt

[92]. Tetracycline wurden im Boden bis zu einer Tiefe von 40 cm nachgewiesen [413,414].

Durch Ausschwämmungen (Oberflächenabfluss/Runoff) kontaminierter Böden können

Tetracyclinrückstände ins Oberflächenwasser und in Kläranlagen gelangen [341]. So stellten

Kay et al. Oxytetracyclin-Rückstände im Drainagewasser landwirtschaftlicher Flächen fest

[88]. Heberer und Stan konnten in Oberflächengewässern maximale Tetracyclin-

Konzentrationen von 1 μg/l nachweisen [89]. Tetracyclinkonzentrationen von max. 0,26 µg/L

wurden von Yang et al. in deutschen und von max. 0,977 µg/L von Göbel in kanadischen

Kläranlagenab- bzw. zuläufen nachgewiesen [90,91]. Batt et al. fanden in den Abläufen

verschiedener amerikanischer Kläranlagen Tetracyclinkonzentrationen von 0,061-1,1 µg/L

[415].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 44

Eine Eliminierung der Tetracycline in Kläranlagen erfolgt im Wesentlichen durch die Sorption

an Klärschlamm oder sich im Wasser befindlicher Partikel (Biomasse, anorganische und

organische Stoffe) [332].

Tetracycline adsorbieren stark an der Bodenmatrix (Tonminerale, organische Bestandteile)

und werden daher in Böden als immobil eingestuft [416]. Nach einer Untersuchung von

Hamscher et al. sind Tetracycline unter Feldbedingungen als persistent zu klassifizieren und

neigen in Böden zur Akkumulation [92]. Untersuchungen zum Sorptionsverhalten von

Chlortetracyclin von Sassman et al. und Allaire et al. zeigten eine schnelle Sorption an der

Bodenmatrix, mehr als 95% wurden innerhalb der ersten 10 min adsorbiert [94,95]. Der

Adsorptionsgrad war dabei mit steigendem pH-Wert geringer. Tolls weist auf die Möglichkeit

der Verlagerung von Tetracyclinen durch dispersiven als auch konvektiven Fluss (inkl.

Makroporenfluss) im Boden hin [95]. Die Tetracycline könnten dabei durch gelöste

organische Substanz, wie sie z.B. dem Boden über Gülle zugeführt wird, mit verlagert

werden. Thiele-Bruhn vermutet, dass ein signifikanter Transport von Tetracyclinen auf

schnelle präferenzielle Fließwege und Makroporenfluss, sowie Ko-Transport mit mobilen

Kolloiden (z.B. DOM) begrenzt ist [81]. Nach Henkelmann et al. kann es für CTC lediglich

durch Makroporenfluss oder Dränagen zu einem schnellen Eintrag in oberflächennahes

Grundwasser kommen [417,418]. Untersuchungen von Aust et al. ergaben Hinweise auf eine

horizontale Verlagerung („Runoff“) von CTC infolge von Makroporenfluss und partikulärem

Ko-Transport im Boden [419]. Ein Eintrag von Tetracyclinen in Oberflächen- und

Grundwasser ist diesen Autoren zufolge möglich, allerdings wären noch weitere

Untersuchungen erforderlich.

Nach neueren Untersuchungen können Tetracyclinrückstände über güllebeaufschlagte

Böden auch bis ins Grundwasser gelangen. So wiesen Hamscher et al. nach einem fast 4-

jährigen Untersuchungszeitraum Tetracyclinkonzentrationen von max. 0,13 µg/L in

oberflächennahen Grundwasserproben (Proben-Tiefe: 1,4 m) nach [85]. Über den

Transportweg bzw. die beteiligten Transportprozesse gibt es keine Erkenntnisse. Den

Autoren zufolge ist ein Eintrag von Tetracyclinen durch Runoff (Oberflächenabfluss) in

Oberflächengewässer aber wahrscheinlicher als ein Eintrag ins Grundwasser. Für das

Trinkwasser sind jedoch keine positiven Tetracyclinbefunde bekannt.

Neben ihrer Verwendung in der (Land-)Tierzucht werden Tetracycline auch in Aquakulturen,

also bei der Fisch- und sonstigen Meeresfrüchteproduktion, eingesetzt [97]. Tetracycline

wurden in hohen Konzentrationen in Sedimenten unterhalb von Fischfarmen nachgewiesen

[98,99].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 45

Transfer Boden-Pflanze

Im Sinne des Verbraucherschutzes ist die Aufnahme der im Boden eingetragenen

Tetracycline durch Nutzpflanzen (Winterweizen, Feldsalat) von großer Relevanz. Grote et al.

stellten diesbezüglich erstmalig die Aufnahme von Chlortetracyclin durch Nutzpflanzen unter

Freilandbedingungen fest [96].

Pflanzen ihrerseits können nach Farkas et al. mit einer signifikant erhöhten Aktivität

pflanzlicher Stressproteine wie Glutathion-S-Transferase und Peroxidase reagieren, wenn

sie auf CTC-behandelte Böden wachsen. Infolge enzymatischer Reaktionen werden dadurch

Chlortetracyclin-Glutathion-Konjugate gebildet. Dieses Verhalten ist aber von der Pflanzenart

abhängig. So zeigte Mais ein solches Verhalten, Pintobohnen aber nicht [420].

Mobilität von Tetracyclinen im Boden

Als Kenndaten zur Beurteilung der Mobilität von Schadstoffen im Boden dienen

verschiedene Verteilungs-/Sorptionskoeffizienten wie KOW (Verteilungskoeffizient

Oktanol/Wasser), KOC (Sorptionskoeffizient Organischer Kohlenstoff) und KD

(Verteilungskoeffizient Boden/Wasser). Die aus der Literatur bekannten Koeffizienten für

Tetracycline sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Tab. 4: Verteilungs- und Sorptionkoeffizienten von Tetracyclinen

Log KOW KOC

[L/kg]

Literatur

Tetracyclin -1,19 4206-6059

1) 12,8-312447

1140-1620 2)

[2 I 93 I 421]

Chlortetracyclin -0,41 - 17,1-352911 [93 I 421]

Oxytetracyclin -1,22 27790-93320 417-1026 [2 I 81 I 93 I 421]

13,5-269097

1) Adsorption an gelöstem organischen Kohlenstoff

2) Adsorption an Torf

Es ist aber zu beachten, dass zum einen der KOW kein verlässlicher Parameter für die

Einschätzung der Mobilität von Tetracyclinen in Böden ist [259,421,422] und zum anderen

das KOC-Konzept auf polare Arzneistoffe nicht anwendbar ist [59,423], da diese nicht die

Wechselwirkungen mit dem anorganischen Bodenmaterial berücksichtigen. Wie an den

Sorptionskoeffizienten ( KD ) der Tetracycline an Böden zu sehen ist (Tab. 4), umfassen die

ermittelten KD-Werte einen Bereich von mehr als vier Dekaden, was u.a. auf die

Abhängigkeit der Tetracyclin-Sorption von der Bodenzusammensetzung und dem

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 46

vorliegenden pH-Wert zurückzuführen ist. So zeigt z.B. eine Untersuchung von Allaire et al.,

dass an ein schwerer Tonboden etwa die doppelte Menge an Chlortetracyclin im Vergleich

zu einem sandigen Lehmboden sorbiert [94]. Die Sorption von Tetracyclinen an die

Bodenmatrix ist abhängig von der Spezies (kationisch, zwitterionisch, anionisch), in welcher

das Tetracyclin vorliegt. So ermittelten Laak et al. unterschiedliche KD-Werte für die

verschiedenen Spezies [424]. In dieser Untersuchung mit verschiedenen Böden war der

Sorptiongrad an die Bodenmatrix für die kationischen und zwitterionischen Tetracylinspezies

höher als für die anionischen Spezies. Weiterhin ist zu beachten, dass sich die Adsorption

der Metabolite und Abbauprodukte von der des ursprünglichen Tetracyclins unterscheiden

kann [81].

Die Sorption von Tetracyclinen an die hochkomplexe Boden-Matrix und damit die Mobilität in

Böden ist von einer Vielzahl von Faktoren abhängig. Die Sorption der Tetracycline an Böden

bzw. Bodenbestandteilen wird u.a. durch den pH-Wert, die Ionenstärke, der

Kationenaustauschkapazität und den Gehalt an multivalenten Metallkationen beeinflusst

[93,81,421,425-429]. Turku et al. ermittelten zudem einen (geringen) Einfluss der

Temperatur auf die Sorption von Tetracyclin an mesoporösem Siliziumdioxid [430].

Böden können in ihrer Zusammensetzung stark variieren, wobei die Anteile an den

verschiedenen Bodenbestandteile wie Tonminerale, organischem Material (z.B. Huminstoffe,

DOM (Dissolved Organic Matter)) und Metalloxide wesentliche Einflussfaktoren für das

Sorptions-Verhalten von Tetracyclinen darstellen [81,426,427,429,431-436]. Die einzelnen

Einflussfaktoren können zur Charakterisierung des Sorptions-Verhaltens von Tetracyclinen

im Boden nicht isoliert betrachtet werden, da untereinander Abhängigkeiten bestehen,

welche die einzelnen Faktoren selbst beeinflussen. So ist beispielsweise die Sorption von

Tetracyclinen sowohl an organischem Material als auch an Tonmineralen vom Gehalt an

Metallkationen abhängig [426,437]. Wang et al. zeigten einen durch die Gegenwart von

Cu(II)-Ionen stark erhöhten Freundlich-Sorptionskoeffizienten (Kf) für die

Absorptionsisotherme von Tetracyclin an dem Tonmineral Montmorillonit. Der Kf-Wert

erhöhte sich in der Gegenwart von Cu(II)-Ionen (0,25 mmol/L) von 5230 auf 36200 [437].

Andererseits vermindert gelöstes organisches Material (DOM) die Sorption von Tetracyclinen

an Tonmineralien. DOM könnte somit nach Kulshresta et al. zu einer erhöhten Mobilität von

Tetracyclinen in natürlichen Umgebungen führen [427], wohingegen nach MacKay et al. die

gemeinsame Gegenwart von polyvalenten Metallkationen (Al, Fe(III)) und organischen

Bodenmaterial eine verringerte Mobilität bewirken kann [426].

Die Sorption von Tetracyclinen an Boden kann durch zwei Prozesse unterschiedlicher

Kinetik charakterisiert werden. Nach einer anfänglich schnellen Sorption an äußere

Oberflächen folgt eine Einlagerung in die Zwischenschichten von Tonmineralien und

Mikroporen [81].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 47

Neben dem Anteil an einzelnen Bodenbestandteilen spielen auch dessen Eigenschaften eine

Rolle. So müssen die Abstände der Tonmineralzwischenschichten und Mikroporen über

ausreichend räumliche Abmessungen verfügen um ein Eindringen der Tetracycline

zuzulassen. Ein Tetracyclin-Molekül besitzt im vollständig protonierten Zustand eine

Abmessung von 12,9Ǻ (Länge), 6,2Ǻ (Höhe) und 7,5Ǻ (Breite) [438]. Für Tonminerale mit

entsprechend großen räumlichen Abmessungen der Zwischenschichten, wie z.B.

Montmorillonit (Struktur siehe Abb. 11) wurde die Einlagerung von Tetracyclin nachgewiesen

[440-443].

Abb. 11: Struktureller Aufbau von Montmorillonit [439]

Für Tonminerale, welche die räumliche Vorraussetzungen nicht besitzen, ist nur die Sorption

an den äußeren Oberflächen von Bedeutung. Laborversuche von Henkelmann et al.

machten deutlich, dass die Sorption der Tetracycline im Boden vorwiegend an Tonminerale

und Ton-Humuskomplexe erfolgt [417]. Auch nach Pils et al. werden Tetracycline in Böden

bevorzugt an Tonmineralien gebunden, wobei Huminstoffe die Sorptionsplätze der

Tonoberflächen maskieren oder die Diffusion von Tetracyclin in die Zwischenschichten

behindern [440]. In der Untersuchung von Pils et al. nahm der Sorptionsgrad von

Tetracyclinen (TC, CTC) in folgender Reihenfolge ab: Tonmineralien > Huminstoffe > Ton-

Humin-Komplexe.

Als weitere Faktoren, welche die Verlagerbarkeit (Mobilität) von Tetracyclinen in Böden

beeinflussen, wurden die Bodentextur und der anthropogene Prozess der Bodenbearbeitung

(z.B. Pflügen) ermittelt [2,88,340-342,428]. Welche Auswirkungen die Bodenbearbeitung auf

die Verlagerbarkeit von Tetracyclinen im Boden hat, bleibt allerdings unklar. Nach Kay et al.

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 48

wird das Auswaschen von Oxytetracyclin durch die Bodenbearbeitung vor dem OTC-Eintrag

mit Gülle vermindert, was auf die Zerstörung von Makroporen zurückgeführt wurde [340].

Winckler et al. konnten in Lysimeterversuchen mit Bodenbearbeitung vereinzelt Tetracyclin-

Spuren in den Sickerwasserproben detektieren [2]. In den Sickerwasserproben von

Lysimetern ohne Bodenbearbeitung konnte kein Tetracyclin nachgewiesen werden. Die

Bodenbearbeitung wurde in dieser Studie durch das Ziehen von Furchen mit einem

Pikierstab vor der Gülleaufbringung simuliert.

Abbau von Tetracyclinen in Böden

In den verschiedenen Umweltkompartimenten vorkommende Tetracycline unterliegen

biotischen und abiotischen Abbauprozessen, welche deren Gehalt bzw. Konzentration im

Laufe der Zeit vermindern.

Biotischer Abbau:

Tetracycline werden zwar biologisch abgebaut [444,445], doch sind sie nach Alexy et al.

(geschlossener Flaschentest, OECD 301 D) als nicht leicht biologisch abbaubar einzustufen

[207].

Abiotischer Abbau:

Verschiedene Untersuchungen zeigen einen Abbau bzw. eine Umwandlung von

Tetracyclinen durch chemische Reaktionen [446-448]. Es wurde gezeigt, dass natürlich im

Boden vorkommende Oxidantien wie z.B. Mangan(IV)oxid in der Lage sind, Tetracycline

abzubauen [446,447]. In welchem Umfang Tetracycline durch chemische Reaktionen

abgebaut werden, ist noch nicht untersucht worden.

Da Tetracycline insbesondere in Lösungen Photoabbau zeigen ist dieser Abbaupfad für

Oberflächengewässer von Relevanz. An der direkten Bodenoberfläche findet zwar ein

Photoabbau statt [382], doch sobald die Tetracycline in den Boden (z.B. durch Regen oder

mit Gülle) gelangen, kann das Sonnenlicht sie nicht mehr erreichen. Dem Photoabbau ist

daher keine große Bedeutung zuzumessen.

In welchem Umfang Tetracycline im Boden (biotisch und abiotisch) abgebaut werden können

ist anhand der Literatur nicht eindeutig abzuschätzen. Thiele-Bruhn gibt in einer

Übersichtsarbeit u.a. zwei Literaturstellen an in denen nach 180 Tagen noch kein Abbau von

Tetracyclinen (Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Tetracyclin) im Boden festgestellt wurde [81].

Demgegenüber geben Kay et al. für Oxytetracyclin eine Halbwertszeit von 18,2 Tagen im

Boden an [88]. Halling-Sørensen et al. ermittelten Halbwertszeiten von 20 bis 42 Tagen für

Chlortetracyclin in Böden [449].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 49

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass das Verhalten von Tetracyclinen in

Böden von einer Vielzahl von Faktoren abhängt. Der gegenwärtige Kenntnisstand ist dabei

noch unzureichend. Insbesondere fehlen Untersuchungen und Erkenntnisse über die

Verlagerung von Tetracyclinen und relevanter Metabolite ins Grundwasser. Dies betrifft

sowohl die möglichen Verlagerungswege (partikulärer Ko-Transport, präferenzieller Fluss

usw.) im Boden, als auch eine Einschätzung über die Menge der ins Grundwasser

verlagerbaren Tetracycline.

3.4.2.2 Sulfonamide

Der Haupteintragsweg für Sulfonamide in die Umwelt ist wie bei den Tetracyclinen der

Eintrag über belastete Wirtschaftsdünger (Gülle, Mist).

Sulfonamide werden überwiegend mit dem Harn ausgeschieden. Die Ausscheidungsrate

von Sulfonamiden beträgt bis zu 90% [100]. Für das Sulfonamid Sulfadiazin liegt die

Ausscheidungsrate nach Halling-Sörensen et al. bei Schweinen und Rindern ebenfalls bei

90% (inkl. Metaboliten) [101]. Neben Sulfadiazin werden nach Lamshöft et al. 4-Acetyl- und

4-Hydroxysulfadiazin als Hauptmetabolite ausgeschieden [450], wobei das Acetylsulfadiazin

während der Güllelagerung wieder mit der Zeit deacetyliert wird und es so zu einer Zunahme

der Sulfadiazinkonzentration kommt [294]. Für die Ausscheidung (Harn) von nicht-

metabolisierten Sulfadiazin ermittelten Sattelberger et al. eine Rate von 50% [4].

Sulfonamid-Rückstände wurden in verschiedenen Untersuchungen mit einem Gehalt von bis

zu 40 mg/kg FS in Wirtschaftsdüngern nachgewiesen [84,102], z.B. Sulfadiazin mehr als 10

mg/kg [4,84]. Martinez-Carballo et al. konnten maximale Gehalte von 91 mg/kg für

Sulfadiazin und 17 mg/kg für den Synergisten Trimethoprim in Geflügelmist nachweisen

[103]. In Geflügelmist-gedüngten Feldern wurde kein Sulfadiazin und Trimethoprim nur

zweimal unterhalb der Bestimmungsgrenze (0,1 mg/kg) nachgewiesen. Nach Höper et al.

wurden in Ackerböden mit regelmäßiger Gülledüngung nur Sulfonamidgehalte im unteren

µg/kg-Bereich gefunden [104]. In einem mit kontaminierter Gülle beaufschlagten Boden

konnten Stoob et al. nach 3 Monaten noch Sulfonamidkonzentrationen von über 100 µg/kg

nachweisen [451]. Nach Danisch EPA wurden für Sulfadiazin allerdings auch in Oberböden

Konzentrationen von etwa 9,5 mg/kg gemessen, wobei der Zeitpunkt der Probennahme aber

unmittelbar nach der Ausbringung von Wirtschaftsdüngern lag [105].

Über die belasten Böden können die Sulfonamide durch horizontale und vertikale

Transportvorgänge weiter ins Oberflächen- und ins Grundwasser transportiert werden

[9,10,312,414,452,453]. Durch Abfluss aus drainierten landwirtschaftlichen Nutzflächen und

durch Oberflächenabfluss an geneigten Flächen wird dabei das Kontaminationsrisiko von

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 50

Oberflachengewässern mit Sulfonamiden erhöht [341,454]. In Oberflächengewässern

wurden Sulfonamidkonzentrationen von max. 0,22 µg/L und in Kläranlagenzu- und abläufen

von max. 0,68 µg/L ermittelt [90,106]. Sulfadiazin wurde in Kläranlagenabläufen in

Konzentrationen von bis zu 0,019 µg/L gefunden [91], in Grundwasserproben Sulfonamid-

Rückstände von maximal 0,47 µg/L [106,107].

Ebenso wie die Tetracycline können auch Sulfonamide durch Pflanzen aufgenommen

werden, wie Untersuchungen in Hydrokultur und unter Freilandbedingungen zeigen

[201,455,456].

Das Verhalten der Sulfonamide in den verschiedenen Umweltkompartimenten ist von einer

Vielzahl von Einflussfaktoren abhängig, bei denen es sich in der Regel um die gleichen

Faktoren handelt, welche bei den Tetracyclinen genannt wurden. Die physiko-chemischen

Eigenschaften der Sulfonamide unterscheiden sich aber von denen der Tetracycline und

daher wirken sich die einzelnen Faktoren in Bezug auf ihre Einflussgröße bzw. das Verhalten

auch unterschiedlich aus. Über das Umweltverhalten von Sulfonamiden liegen in der

Literatur nur wenige Informationen vor, welche im Folgenden dargelegt werden.

Sulfonamide besitzen gegenüber der Bodenmatrix eine geringe Sorptionsaffinität (s. Tab. 5)

und gelten daher im Boden als sehr mobil, weshalb sie in hören Maße als Tetracycline ins

Grundwasser ausgewaschen zu werden können [451,457-461].

Tab. 5: Verteilungs- und Sorptionkoeffizienten von Sulfonamiden

Log KOW KOC

[L/kg]

Literatur

Sulfonamide -0,1-1,7 48-323 0,9-10 [81]

Sulfadiazin -0,1 18,9-837,9

1301,9-4698,41)

0,1-24,3

6,9-40,21)

[453 I 462 I463]

N4-Acetylsulfadiazin 0,5 [462 I 463]

1) in zusätzlicher Gegenwart von Gülle

Ebenso wie für die Tetracycline ist das KOC-Konzept basierend auf linearen

Sorptionsisothermen zur Beurteilung der Sorption und Mobilität von Sulfonamiden in Böden

ungeeignet [423,464,465]. Für die Sulfonamidmetabolite können die Mobilitäten im Boden

abweichen. So besitzen beispielsweise die Acetylsulfonamide höhere KOW-Werte als ihre

Ausgangswirkstoffe [462,463].

Das Sorptionsverhalten und damit auch das Transportverhalten von Sulfonamiden in Böden

hängen stark vom pH-Wert und der Bodenzusammensetzung ab. Ter Laak et al. ermittelten

eine mit zunehmendem pH-Wert abnehmende Sorption von Sulfachloropyridazin an

verschiedene Böden [425]. Für die Sorption von Sulfonamiden an Tonmineralien und

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 51

organischem Material (Huminsäure, Kompost, Gülle) kamen Gao et al. [466] bzw. Kahle et

al. [467] zu der gleichen Abhängigkeit. In beiden Untersuchungen wurde folgende

Affinitätsreihe für die Sulfonamitspezies gegenüber den Sorbentien ermittelt: kationisches

Sulfonamid >> neutrales Sulfonamid > anionisches Sulfonamid.

Die Sorption der kationischen Sulfonamidspezies folgte in beiden Fällen der

Kationenaustauschkapazität der anorganischen und organischen Sorbentien. Im Gegensatz

zu Ter Laak et al. stellten diese aber auch eine Abhängigkeit der Sorption von der

Ionenstärke fest. Für natürliche Böden wird nahegelegt, dass die kationische

Sulfonamidspezies an organisches Bodenmaterial sorbiert [467], während die Sorption der

anionischen Sulfonamidspezies überwiegend an die positiv geladenen Oberflächen

pedogener Oxide stattfindet [423].

Die Sorption von Sulfonamiden an anorganische Sorbentien (Tonminerale, pedogene Oxide)

ist nach Kahle et al. -unabhängig vom pH-Wert- mehr als eine Größenordnung geringer als

an organische Sorbentien, was den Autoren zufolge eine geringere Einflussgröße für

anorganische Bodenbestandteile (Sorbentien) impliziert [468].

Die Sorption von Sulfonamiden an Böden wird nicht nur vom Gehalt an organischem Material

beeinflusst, sondern hängt auch von dessen Qualität (z.B. Art und Anzahl funktioneller

Gruppen) ab [423,469].

In Batchversuchen wurde gezeigt, dass die Wiederfindung von Sulfonamiden in Böden mit

der Kontaktzeit abnimmt [414,462]. Gleiches Verhalten wurde sowohl für organisches

Material wie Kompost und Huminsäure [467] als auch für anorganisches Material wie

Tonminerale und Eisenhydroxide (pedogene Oxide) nachgewiesen [468].

Ein zeitabhängiger Rückgang der Wiederfindung bzw. des extrahierbaren Anteils von

Sulfonamiden in Böden ist von folgenden Faktoren abhängig [9,10,452,470]:

- Abbau der Wirkstoffe

- Transformation bzw. Metabolitenbildung

- Zunahme des Anteils nicht extrahierbarer Sulfonamidrückstände

Die einzelnen Faktoren sind allerdings nicht einzeln voneinander abgrenzbar, da jeder

Abbau Transformationsprozesse beinhaltet und der Anteil nicht extrahierbarer Rückstände

entstandene Transformationsprodukte teilweise mit einschließt.

Nicht extrahierbare Rückstände von Sulfonamiden werden z.B. durch kovalente Bindung an

organisches Bodenmaterial gebildet. Eine Bildung dieser nicht extrahierbaren

Transformationsprodukte ist durch mikrobiologische, enzymatische oder rein chemische

Prozesse möglich [471-473].

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 52

Kreuzig et al. konnten in Untersuchungen mit verschiedenen radiomarkierten Sulfonamiden

(14C-Sulfonamide) eine nach dem Eintrag in Böden sofortige Bildung nicht zu extrahierender

Rückstände feststellen [9,10,452,470,474]. Die Extrahierbarkeit (mit Ethylacetat) der

Sulfonamide aus den beregneten Versuchsböden nahm mit zunehmender Kontaktzeit

schnell ab. Unter Freilandbedingungen waren bereits nach 28 Tagen keine Sulfonamide

(Sulfadiazin, Sulfaimidin, Sulfamethoxazol) oberhalb der Bestimmungsgrenze nachweisbar.

Kreuzig et al. schlossen auf eine schnelle Bildung nicht extrahierbarer Rückstände

(duchschnittlich 96% der applizierten Radioaktivität), da die Mineralisationsrate

vernachlässigbar war und keine oder nur ein geringer Teil der applizierten Sulfonamide

(keine Verlagerung im Freilandversuch; im Lysimeterversuch ca. 5% der Radioaktivität im

Perkolat) mit dem Sickerwasser transportiert wurden. Da es sich bei der Extraktion mittels

Ethylacetat aber nicht um eine erschöpfende (exhaustive) Extraktionsmethode handelt

können die ermittelten Rückstandswerte nicht eindeutig bzw. vollständig den „nicht

extrahierbaren Rückständen“ im Sinne der IUPAC-Definition (siehe Kapitel 3.4.1) zugeordnet

werden. Durch weitere Behandlung mit saurem Methanol und Silylierung mit

Chlortrimethylsilan konnten Kreuzig et al. bis zu 30% der applizierten Radioaktivität

extrahieren, wobei der Anteil des unveränderten Sulfonamids (Sulfadiazin) lediglich bis zu

3% betrug [9]. Um welche Art von Rückständen es sich bei der verbleibenden extrahierten

Radioaktivität handelt blieb unklar. Wahrscheinlich handelt es sich dabei teilweise um

verschiedene Transformationsprodukte/Metabolite, da in den Bodenproben auch N4-Acetyl-

Sulfonamide und weitere nicht identifizierte Transformationsprodukte nachgewiesen werden

konnten. Nach Kreuzig et al. ist davon auszugehen, dass die nach der Silylierung nicht

freigesetzen Sulfonamide kovalent an die Bodenmatrix gebunden sind. Es ist ergänzend

anzumerken, dass es sich aber bei der nicht zugeordneten extrahierten Radioaktivität

(teilweise) auch um an Humuspolymer-Brüchstücke kovalent gebundene

Sulfonamidrückstände handeln kann (siehe Kap. 3.4.1).

Neueste Untersuchungen von Förster et al. zeigten dagegen, dass Sulfonamide (Sulfadiazin)

im Boden zu einem großen Teil sequestriert vorliegen [353]. In diesen Untersuchungen

wurde ein exhaustives Extraktionsverfahren durch sequentielle Extraktion mit CaCl2-Lösung,

Methanol und Acetonitril/Wasser (mit Mikrowellenunterstützung, Temperatur: 150°C)

verwendet. Während die Extrahierbarkeit mit CaCl2-Lösung und Methanol in

Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Kreuzig et al. schnell abnahm und sehr gering

wurde, konnten aus den Bodenproben durch die mikrowellenunterstützte Extraktion mit

Acetonitril/Wasser auch noch nach über 200 Tagen mit ca. 45% noch bedeutende Anteile

von Sulfonamiden (Summe: Sulfadiazin und N4-OH-Sulfadiazin) extrahiert werden. Der

Anteil der durch Acetonitril/Wasser extrahierbaren Sulfonamide nahm mit der Zeit ab, wobei

der Rückgang in der Extrahierbarkeit zum Großteil innerhalb der ersten Tage stattfand und

3 Grundlagen - Stand der Forschung - 53

sich danach langsam ein annähernd konstantes Extraktionsniveau einstellte. Anhand dieser

und weiterer Daten der Untersuchungen ist abzuschätzen, dass Sulfonamide über Jahre in

Böden persistieren und auch die Möglichkeit einer langsamen Freisetzung von

sequestrierten Sulfonamiden besteht.

Alexy et al. stuften das Sulfonamid Sulfamethoxazol als nicht leicht biologisch abbaubar ein

[207] und Kreuzig et al. ermittelten für Sulfonamide (Sulfamethoxazol, Sulfadiazin) für einen

Zeitraum von 102 Tagen eine vernachlässigbare Mineralisationsrate von 2% [9,10,470]. Ein

Photoabbau ist für Sulfonamide zwar möglich, wobei dieser aber nur an der direkten

Bodenoberfläche bzw. bei der Gülleausbringung von Relevanz ist [382,475].

In welchem Umfang Sulfonamide im Boden tatsächlich abgebaut werden geht aus der

Literatur nicht eindeutig hervor. Blackwell et al. ermittelten Halbwertszeiten von 2,8 Tage und

3,5 Tage für das Sulfonamid Sulfachloropyridazin in einem sandigen Lehmboden bzw. einem

lehmigen Tonboden [343]. Für Sulfadiazin im Boden ermittelten Kreuzig et al. eine

Halbwertszeit von 3 Tagen [474]. Demgegenüber wurden nach Thiele-Bruhn für Sulfaimidin

(lehmiger Sand- und toniger Schluffboden) Abbauraten von nur 0,2-0,7% innerhalb von 64

Tagen ermittelt [81]. Diese großen Unterschiede in den Abbauraten der Sulfonamide in

Böden sind auch durch weitere Untersuchungen belegt [81,351]. Eine Erklärung für diese

deutlichen Unterschiede in den Abbauraten liefern die Untersuchungen Förster et al., welche

für Sulfadiazin in verschiedenen Böden Halbwertszeiten zwischen 10 und 490 Tagen

ermittelten [353]. Die Unterschiede in den Halbwertszeiten sind dabei maßgeblich auf das

verwendete Extraktionsverfahren zurückzuführen. Bei milden Extraktionsverfahren betrugen

die ermittelten Halbwertszeiten 10-24 Tage, während sie bei der mikrowellenunterstützten

Extraktion mit Acetonitril/Wasser zwischen 290 und 490 Tagen lagen.

Werden sequestrierte Sulfonamide analytisch nicht mit erfasst, wie es bei milden

Extraktionsverfahren z.B. bei Blackwell et al. und Kreuzig et al. der Fall ist, können

zwangsläufig nur niedrige Halbwertszeiten ermittelt werden. Diese Halbwertzeiten sind daher

nicht mit einem Abbau gleichzusetzen.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in Böden eingetragene Sulfonamide zwar in

Oberflächengewässer und ins Grundwasser verlagert werden, aber es bezüglich ihres

Abbau-Verhaltens in der Literatur keine einheitliche Auffassung/Datenlage gibt. Da die

Extrahierbarkeit von Sulfonamiden (und ihrer Metabolite) von dem eingesetzten

Extraktionsverfahren abhängig ist und ältere Untersuchungen in der Regel auf milden

Extraktionsverfahren beruhen, sind keine gesicherten Aussagen über das mengenmäßige

Vorkommen von Sulfonamiden in Böden möglich. Es ist davon auszugehen, dass der Gehalt

von Sulfonamiden (und ihrer Metabolite) in der Vergangenheit unterschätzt wurde.

4 Stand der Analytik zur Bestimmung von Antibiotika im Boden 54

4 Stand der Analytik zur Bestimmung von Antibiotika im

Boden

Zum Nachweis und zur Bestimmung von Tetracyclinen und Sulfonamiden existieren eine

Vielzahl von Methoden und Verfahren. Für die Bestimmung dieser Antibiotika in

Umweltmatrices sind im Gegensatz zur Analytik von Lebensmitteln nur wenige

leistungsfähige Analysemethoden beschrieben worden [81,482]. Dies gilt insbesondere für

komplexere Matrices wie Boden und Gülle, welche im Vergleich zu wässrigen Matrices meist

einer aufwendigeren Probenvorbereitung und LC/MS-Analytik bedürfen. Grote et al.

entwickelten diesbezüglich schon eine auf LC-MS/MS basierende Methode zur Bestimmung

von Chlortetracyclin und Sulfadiazin in Gülle [478].

Ein wesentlicher Punkt für die Effektivität und Effizienz der einzelnen Methoden und

Verfahren in Bezug auf einen bestimmten Analyten liegt darin begründet, ob nur ein Analyt

oder gleichzeitig mehrere z.T. völlig verschiedene Analyte nachgewiesen bzw. quantifiziert

werden sollen. Tetracycline und Sulfonamide unterscheiden sich in ihren physiko-

chemischen Eigenschaften, so dass bei einer gleichzeitigen Bestimmung von Analyten aus

diesen beiden Gruppen die Optimierung der Methoden und Verfahren für alle Einzelanalyte

einen Kompromiss darstellt. Gleiches gilt, zwar in geringerem Ausmaß, für die Methoden und

Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von verschiedenen Tetracyclinen bzw.

Sulfonamiden. Der Vorteil einer Methode bzw. Verfahrens für Einzelanalyte liegt damit bei

der Möglichkeit der maximalen Optimierung von Nachweisfähigkeit und Wiederfindung dieser

in einer bestimmten Matrix. Demgegenüber bieten Multimethoden bzw. –verfahren den

Vorteil einer Zeit- und Kostenersparnis durch ganz oder zumindest teilweise gleichzeitige

Arbeitsschritte für die zu untersuchenden Analyte und führen damit zu einem höheren

Probendurchsatz bei gleicher Zeit. Des Weiteren müssen die Probenvorbereitung

(Extraktion, Anreicherung, Aufreinigung) und die Bestimmungsmethode auf die Matrix, in der

die Analyte vorliegen, abgestimmt werden.

Im Folgenden werden einzelne Bestimmungsmethoden für die Tetracyclin- und

Sulfonamidanalytik aufgeführt und im Anschluss wird eine Übersicht der angewendeten

Probenvorbereitung zur Spurenanalyse dieser Antibiotika im Boden gegeben.

4 Stand der Analytik zur Bestimmung von Antibiotika im Boden 55

4.1 Bestimmungsmethoden für Tetracycline und Sulfonamide

Die überwiegende Anzahl der Bestimmungsmethoden für Tetracycline und Sulfonamide

beruht auf einer chromatographischen Trennung mit anschließender Detektion, da auf diese

Weise in einem Analysengang mehrere Analyte bestimmt werden können. Die am häufigsten

in der Tetracyclin- und Sulfonamidanalytik eingesetzte chromatographische Methode ist die

Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), welche mit einer Vielzahl von Detektoren

koppelbar ist. Die Trennleistung der HPLC wird dabei von den instrumentellen Einstellungen

(z.B. Flussrate) und der Wahl der HPLC-Säule (Material, Durchmesser, Länge,

Partikelgröße) beeinflusst. Für die Analytik dieser Antibiotikagruppen sind mit der HPLC

gekoppelte optische Detektoren (UV, UV/vis, DAD) weit verbreitet [137,236-259]. Als

Bestimmungsmethode werden diese HPLC-Systeme für Messproben, welche aus

verschiedenen Matrices wie z.B. Blutplasma [248], Knochen [249], Fleisch [250], Milch

[251], Shrimps [251], Fisch [252,253], Honig [254-256], Abwasser [257] oder Gülle/Mist

[258,259] stammen, eingesetzt.

Aufgrund der Fluoreszenzeigenschaften der Tetracycline wird bei der Tetracyclinanalytik

auch der Fluoreszenzdetektor (FLD) eingesetzt, da die Eigenfluoreszenz der Tetracycline

allerdings nur schwach ist, erfolgt eine Nachsäulenderivatisierung zu den iso-Tetracyclinen

oder zu stark fluoreszierenden Tetracyclin-Metall-Komplexen [119,143,260-266].

Sulfonamide werden durch entsprechende Nachsäulenderivatisierung ebenfalls mittels FLD

bestimmt [267-269]. Für die Bestimmung von Tetracyclinen sind neben der nach Anregung

mittels elektromagnetischer Strahlung (im UV-Bereich) ermittelten Fluoreszenz auch

Verfahren bekannt, die auf Chemilumineszenzmethoden aufbauen [270-273]. Des Weiteren

werden elektrochemische Detektoren zur Tetracyclin- und Sulfonamidanalytik verwendet

[274-278].

Neben der HPLC finden noch Kapillarelektrophorese (CE) [314-320],

Dünnschichtchromatographie (TLC) [321,322] und Gaschromatographie (GC) [323-326] als

weitere Trenntechniken in der Tetracyclin- und Sulfonamidanalytik Anwendung. Für eine

Bestimmung mittels Gaschromatographie ist allerdings eine Derivatisierung der Analyte

nötig. Eine Derivatisierung der Tetracycline zu den Trimethylsilyl-Derivaten ist zwar möglich,

hat aber wegen der hohen Siedepunkte dieser Derivate im Unterschied zu den Sulfonamiden

keine praktische Bedeutung [327]. Tetracycline und Sulfonamide können zudem durch

mikrobiologische Tests wie Eclipse 100® [328] oder Rezeptortests wie Tetrasensor® [329]

nachgewiesen werden. Auch immumologische Verfahren wie ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay) [258,330-335] werden aufgrund ihrer einfachen und schnellen

Durchführbarkeit zunehmend als Screening-Tests eingesetzt. Die Kopplung von HPLC mit

einem mikrobiologischen Assay stellt ein besonders selektives Verfahren dar, welches zur

Identifizierung von aktiven Metaboliten geeignet ist [336].

4 Stand der Analytik zur Bestimmung von Antibiotika im Boden 56

Im zunehmenden Umfang werden Massenspektrometrische Detektoren (MS, MS/MS)

eingesetzt [279-311], da bei diesen Methoden, dies gilt insbesondere für Tandem-Systeme,

eine große Selektivität und Empfindlichkeit bei gleichzeitiger Möglichkeit einer

Strukturabsicherung erreicht werden kann. Da insbesondere bei der Extraktion von

Bodenproben oftmals hohe Anteile von störenden Matrix-Komponenten ko-extrahiert werden,

sind hier vor allem HPLC-MS/MS-Methoden im Einsatz.

HPLC-MS-Methoden werden ebenso wie die zuvor genannten HPLC-UV (-UV/vis, -DAD)-

Methoden für die Tetracyclin- und Sulfonamid-Bestimmung in einer großen Anzahl

verschiedener Matrices wie Wasser (Ab-, Oberflächen- und Grundwasser) [279-289], Urin

[290-291], Gülle [292-294], Boden [295-296], tierisches Gewebe [297-299], Pflanzen

[96,201,203] und Nahrungsmittel tierischen Ursprungs (Eier [138,300], Milch [301-303],

Fleisch [304-306], Shrimps [307], Fisch [308], Honig [309-311]) angewendet.

Die HPLC bietet neben einer großen Auswahl der verschiedenen mit ihr gekoppelten

Detektionsmethoden auch die Möglichkeit, eine online-SPE für die Sulfonamid- und

Tetracyclinanalytik zu integrieren [312,313]. Durch den Einsatz einer mit einem HPLC-

System gekoppelten online-SPE kann im Vergleich zu einer herkömmlichen (manuellen bzw.

externen) SPE die Reproduzierbarkeit erhöht, die Wiederfindung verbessert und Analysezeit

eingespart werden [313].

Im Rahmen dieser Arbeit wird daher die LC-MS/MS zur Bestimmung von

Arzneimittelrückständen in Böden eingesetzt.

4.2 Vorbereitung von Bodenproben

Die bekannten leistungsfähigen Analyseverfahren für die Bestimmung von Tetracyclinen und

Sulfonamiden in Böden beinhalten einen Extraktionsschritt, die Reinigung und

Aufkonzentrierung der Extrakte mittels SPE (Solid Phase Extraction) und eine

Bestimmungsmethode für die Analyte. Für die Bestimmung von Rückstandsspuren dieser

Arzneistoffe im Boden sind HPLC-MS/MS-Verfahren [103,296,337-339] oder nach

entsprechender Probenreinigung (Cleanup) auch HPLC-UV-Verfahren [340-344] im Einsatz.

Raich-Montiu et al. bestimmten Spurenkonzentrationen von Sulfonamiden mittels HPLC-FLD

unter Verwendung einer Nachsäulenderivation mittels Fluorescamin [479].

Für die Probenvorbereitung sind vor allem die physiko-chemischen Eigenschaften der

unterschiedlichen Tetracycline und Sulfonamide zu berücksichtigen (s. Kap. 3.3).

4 Stand der Analytik zur Bestimmung von Antibiotika im Boden 57

4.2.1 Extraktion

Aufgrund der physiko-chemischen Eigenschaften der Analyte werden meist schwach saure

Puffer in Kombination mit einem organischen Lösungsmittel eingesetzt. Eine Komplexbildung

soll dabei durch eine Zugabe von Agenzien wie EDTA, Citrat oder Oxalsäure unterbunden

werden. Zur Extraktion von Tetracyclinen und Sulfonamiden wurde hauptsächlich die

Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) eingesetzt. Lösungsgemische, die zur Extraktion von

Tetracyclinen und Sulfonamiden aus Bodenproben mittels LLE eingesetzt wurden, sind

Gemische aus Zitronensäure/Aceton/Ameisensäure [331], Methanol/McIlvaine-Puffer [345],

Methanol/EDTA/McIlvaine-Puffer [103,344], Citrat-Puffer/Ethylacetat [92], Methanol/Citrat-

Puffer [339], EDTA/Zitronensäure/Phosphat-Puffer [340] und NaCl/Oxalsäure/Wasser [93].

In einigen Fällen wurde auch eine Pressurized Liquid Extraktion (PLE) [337,339,346,462],

eine Soxhlet-Extraktion (mit Methanol) [338] oder eine Mikrowellen-unterstützte Extraktion

(mit Acetonitril) [479] für Tetracyclin- und/oder Sulfonamid-Antibiotika verwendet. Durch

sequentielle Extraktion, wie z.B. mit CaCl2-Lösung, Methanol und Acetonitril/Wasser (mit

Mikrowellenunterstützung, Temperatur: 150°C), ist eine bewertende Einteilung in eine (bio-

)verfügbare, potentiell bioverfügbare und eine nicht verfügbare Rückstandsfraktion von

Sulfonamiden möglich [353,480].

4.2.2 Anreicherung der Analyte und Aufreinigung der Bodenextrakte

Nach der Extraktion erfolgten eine Anreicherung der Analyte und eine Aufreinigung (Clean-

Up) der extrahierten Lösungen mittels Festphasenextraktion (SPE). Als Sorbens werden

dabei häufig relativ unspezifische Polymerphasen wie z.B. bei der Oasis-HLB (Hydrophilic–

Lipophilic-Balanced) [331,338-344,347,348] eingesetzt, aber auch für die jeweiligen

Antibiotika finden spezifische Sorbensmaterialien Anwendung. Dazu zählt für Tetracycline

die Metall-Chelat-Affinitäts-Chromatographie (MCAC), welche die Komplexbildungs-

eigenschaften der Tetracycline ausnutzt [345]. Für Sulfonamide ist die Aminopropyl-SPE

eine geeignete Methode [349].

Um Huminstoffe, welche Matrixbestandteile der Bodenextrakte sind, besser entfernen zu

können, werden Polymerphasen wie die HLB auch mit Anionenaustauscherharzen (SAX)

gekoppelt [331,339-344].

Erst durch eine Kopplung von HLB- und SAX-SPE-Kartuschen ist es Blackwell et al. möglich

gewesen, die HPLC-UV als leistungsfähige Bestimmungsmethode von Antibiotikaspuren in

komplexen Umweltmatrices wie Gülle und Boden einzusetzen [344].

4 Stand der Analytik zur Bestimmung von Antibiotika im Boden 58

Auch spezielle Methoden wie die Solid-Phase-Immuno-Extraction (SPIE) wurden schon

durch Grant et al. für die weitere Aufreinigung von Sulfamethazine and N4-

Acetylsulfamethazine aus Bodenextrakten eingesetzt. Bei dieser Methode wurde eine

herkömmliche HLB-SPE mit einer Immuno-Affinitäts-Chromatography (IAC) gekoppelt [350].

5 Ergebnisse und Diskussion 59

5 Ergebnisse und Diskussion

5.1 Untersuchung auf Antibiotikarückstände in einem gülle-

beaufschlagten Boden

Zum Zeitpunkt des Projektbeginns war keine sichere Aussage über Vorkommen und

Verhalten von Antibiotika in den Böden landwirtschaftlicher Nutzflächen, sowie ihrer

Exposition in andere Umweltkompartimente wie Oberflächen- und Grundwasser, möglich.

Als Konsequenz konnten auch keine Prognosen über den denkbaren Transfer Boden –

Pflanze und einer davon abhängigen Risikoeinschätzung für den Menschen gemacht

werden. Das Projekt „Antiinfektivaeinträge aus der Tierproduktion in terrestrische und

aquatische Kompartimente“ [476] (kurz: „Antiinfektiva-Projekt“) sollte daher einen Beitrag zur

Aufklärung dieser Zusammenhänge und zur Abschätzung der Umweltbelastung liefern.

Um realistische Aussagen über den Verbleib der durch organische Düngung in den Boden

eingetragenen Antibiotika treffen zu können, wurden unter praxisnahen landwirtschaftlichen

Bedingungen arzneimittelfrei aufgezogene Ferkel mit Sulfadiazin (SFD), Trimethoprim (TMP)

und Chlortetracyclin (CTC) kontrolliert medikamentiert, die erhaltene Arzneistoff-belastete

Schweinegülle (nach 8-monatiger Lagerung) auf Versuchsparzellen ausgebracht,

Nutzpflanzen (Feldsalat und Winterweizen) ausgesät und beerntet.

Diese Arbeit befasst sich im Rahmen des oben geschilderten Projektes nur mit dem Bereich

des Rückstands- und Transportverhaltens der Arzneistoffe bzw. ihrer Metabolite und

Umwandlungsprodukte im Gülle-beaufschlagten Boden.

Zu Beginn dieser Arbeit waren schon Teilbereiche des Projekts abgeschlossen, deren

Ergebnisse für die Interpretation und Schlussfolgerungen in dieser Arbeit von wesentlicher

Bedeutung sind. Daher soll der damit im Zusammenhang stehende Projektverlauf mit den

dazu nötigen Teilergebnissen in einer Beschreibung der Ausgangssituation im Vorfeld

dargestellt werden.

5.1.1 Ausgangssituation - Projektverlauf

Zu Beginn des Projektes war Arzneistoff-belastete Gülle aus einer Ferkelaufzucht unter

kontrollierter Fütterung und Medikation (CTC, SFD, TMP) an der FAL Braunschweig (heute:

FLI Braunschweig) gewonnen worden. Diese wurde über einen Zeitraum von 7-8 Monaten

entsprechend landwirtschaftlich üblicher Praxis gelagert und monatlich beprobt (FH

Südwestfalen, Abteilung Soest). Während der 8-monatigen Lagerung wurden in der Gülle

CTC und SFD nur bis zu 50 - 60 % abgebaut, TMP war dagegen schon nach 1-monatiger

Lagerung nicht mehr nachweisbar. Nach 8-monatiger Lagerung enthielt die Gülle noch hohe

Rückstandsmengen der eingesetzten Antibiotika von 181,3 mg/kg für SFD und 16,2 mg/kg

5 Ergebnisse und Diskussion 60

CTC (inkl. e-CTC). Als Metaboliten bzw. Umwandlungsprodukte waren noch 10,9 mg/kg N4-

SFD, 39,8 mg/kg iso-CTC (inkl. e-iso-CTC) und 1,4 mg/kg anhydro-CTC in der Gülle

enthalten [476].

Diese Gülle wurde zur organischen Düngung von Versuchsfeldern ausgebracht. Mit der

Gülle wurden auch erhebliche Antibiotikafrachten in den Boden eingetragen. Die

Untersuchung der Bodenproben, welche über einen mehrmonatigen Zeitraum von diesen

Feldern aus unterschiedlichen Bodentiefen genommen wurden, stand noch aus. Erste

Versuche zur Bestimmung der Rückstandskonzentrationen in den Bodenproben waren zu

Beginn dieser Arbeit schon unternommen worden.

5.1.2 Methodenentwicklung zur Bestimmung von CTC, SFD und TMP in

Bodenproben

5.1.2.1 Entwicklung der HPLC-UV-MS/MS-Methode

Außer e-iso-CTC und N4-SFD waren alle zur Methodenentwicklung eingesetzten

Standardsubstanzen kommerziell erhältlich. N4-SFD wurde im Arbeitskreis durch

Acetylierung von SFD an N-4 und e-iso-CTC durch Epimerisierung von iso-CTC in schwach

saurer Lösung hergestellt (siehe Anhang A.1.3.4).

Die nachfolgend aufgeführten Untersuchungen wurden im Rahmen der

Methodenentwicklung durchgeführt:

- Entwicklung der MS/MS-Detektion durch Aufnahme von Vorläufer- und Produkt-

Ionen-Scans aller Substanzen

- Optimierung der Trennleistung des chromatographischen Systems

- Optimierung der UV-Detektion

- Anwendbarkeit der UV- und MS/MS-Detektion auf Bodenproben

Entwicklung der MS/MS-Detektion

Zur Entwicklung der MS/MS-Detektion mittels Ion-Trap-Massenspektometer wurden die

Fragmentierungsmuster aller Substanzen (ß=10 mg/L, in Laufmittel A) im positiven ESI-

Modus (ESI+) ermittelt und die sich daraus ergebenen (Fragment-)Ionen anhand des

gemessenen Masse/Ladungs-Verhältnisses einzelnen Vorläufer- und Produkt-Ionen

zugeordnet. Die in Tab. 6 aufgeführte Zuordnung der Fragment-Ionen aufgrund ihres m/z-

Verhältnisses wurde anhand der Literaturdaten von Hirsch et al. [481], Hamscher et al. [482],

Zhu et al. [483], Sacher et al. [484], Hartig et al. [485], A. Vockel [7], Petrovic et al. [486] und

Eichhorn et al. [487] erstellt.

5 Ergebnisse und Diskussion 61

Tab. 6: MS/MS-Detektion, Fragmentierung der Analyte

Analyt Vorläufer-Ion

[m/z]

Produkt-Ion 1

[m/z]

Produkt-Ion 2

[m/z]

Produkt-Ion 3

[m/z]

SFD 251

[M+H]+

156

[H2NPhSO2]+

174

[H2NPhSO2NH+H]+

N4-SFD 293

[M+H]+

198

[CH3COHNPhSO2]+

136

[CH3COHNPh+H]+

227

TMP 291

[M+H]+

123

[M-C6H3-3CH3O+H]+

230

[M+H-CH2O-CH3O]+

258

[M+H-CH3O-3H]+

iso-CTC 479

[M+H]+

462

[M-NH3+H]+

- -

CTC 479

[M+H]+

462

[M-NH3+H]+

444

[M-H2O-NH3+H]+

anhydro-

CTC

461

[M+H]+

444

[M-NH3+H]+

- -

Durch Änderung der Stoßenergien für die einzelnen Analyte im Ion-Trap-

Massenspektrometer wurden gegenüber der ursprünglichen Methode intensitätsstärkere MS-

Signale erhalten. Anhand der ermittelten Fragmentierungsmuster, insbesondere unter

Einbeziehung der relativen Intensitäten der Fragmentionen, wurden in den Messproben die

einzelnen Substanzen im SRM-Modus (Selected Reaction Monitoring) des Ion-Trap-

Massenspektrometers identifiziert und quantifiziert (Tab. 7).

5 Ergebnisse und Diskussion 62

Tab. 7: Kenndaten der Analyte für die MS/MS-Detektion

Analyt Mr

[g/mol]

Vorläufer-Ion

[m/z]

Stoßenergie

[%]

Produkt-Ionen

[m/z]

Peakintensitäten

[%]

SFD 251,06 251 38 156

173

80-100

N4-SFD 292,31 293 38

136

198

227

60-85

100

20-50

TMP 290,32 291 45

123

230

258

40-70

100

40-70

e-iso-CTC 478,89 479 28 462 100

iso-CTC 478,89 479 28 462 100

e-CTC 478,89 479 28 444

462

40-70

100

CTC 478,89 479 28 444

462

40-70

100

e-anhydro-

CTC 460,87 461 35 444 100

anhydro-CTC 460,87 461 35 444 100

Trennleistung des chromatographischen Systems

Für die chromatographische Trennung der Analyte aus den Güllemessproben wurde eine

YMC-Säule (ODS-AM, 150 x 3,0 mm, 5µm) eingesetzt [7].

Wie in Abb. 12 zu sehen ist, sind alle Substanzen mit Ausnahme von SFD und TMP im

chromatographischen Lauf getrennt worden.

5 Ergebnisse und Diskussion 63

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

Intensität [µAU]

Zeit [min]

1/2

Abb. 12: Trennung der Arzneistoffe im Laufmittelgradienten (s. Anhang A.1.2.1), UV-

Detektion (HPLC-DAD-MS/MS, YMC, Total Scan: 190-800 nm)

1: SFD, 2: TMP, 3: N4-SFD, 4: e-iso-CTC, 5: iso-CTC, 6: e-CTC, 7: CTC, 8: e-anhydro-CTC,

9: anhydro-CTC (ß=10 mg/L)

Die Retentionszeiten (Rt) für SFD und TMP lagen lediglich 4 Sekunden (MS/MS-Detektion,

Abb. 13) auseinander, daher war nur ein gemeinsamer Peak der beiden Analyten im HPLC-

DAD-Chromatogramm zu erkennen. Da bei SFD und TMP das UV-Maximum bei 268 nm

liegt, war eine Unterscheidung durch UV-Detektion nicht möglich. SFD und TMP

unterscheiden sich aber in ihrer Molekülmasse bzw. in ihren m/z-Verhältnissen, und somit

kann auch bei nicht getrennten Peaks eine Bestimmung beider Substanzen mittels LC-MS

erfolgen. Die chromatographische Trennung von e-iso-CTC, iso-CTC, e-CTC und CTC bleibt

sehr wichtig, da diese Substanzen alle die gleiche Molekülmasse (Vorläufer-Ionen) besitzen.

Die dafür erforderliche Trennleistung gewährleistet das chromatographische Verfahren.

Entsprechendes gilt für die Trennung von e-anhydro-CTC und anhydro-CTC. Um aber alle

Analyte mittels HPLC-UV bestimmen zu können, musste die Trennleistung des

chromatographischen Systems weiter optimiert werden.

5 Ergebnisse und Diskussion 64

02468101214

100

relative Intensität [%]

Zeit [min]

Abb. 13: Chromatogramme von SFD (schwarz) und TMP (rot), HPLC-MS/MS (YMC, TIC-

SRM MS2, ß=10 mg/L)

Optimierung der HPLC-Methode

Die Trennung der Analyte mittels HPLC ist zum einen von der Laufmittelzusammensetzung

und zum anderen von der HPLC-Säule abhängig. Eine Verbesserung der Trennung (Abb.

14) von SFD und TMP bei gleicher Trennleistung für die übrigen Substanzen brachte die

Verwendung einer Phenomenex-Säule (Synergi 4µ Hydro-RP, 250 x 2,00 mm). Somit war

eine Bestimmung dieser beiden Komponenten auch mittels UV-Detektion möglich. Um die

analytische Säule vor Verunreinigungen durch Matrixbestandteile der Bodenproben zu

schützen, wurde dieser eine Vorsäule (Phenomenex C18-ODS, 4 x 2 mm) vorgeschaltet.

Ein weiterer Peak (Abb. 14; 6a) konnte neben e-CTC (Enolstruktur) dem durch Keto-Enol-

Tautomerie gebildeten e-CTC (Ketostruktur) mittels Spektrenvergleich zugeordnet werden.

Die ermittelten Retentionszeiten der einzelnen Substanzen, welche als Merkmal zur

Identifizierung dienen, sind in Tab. 8 aufgeführt.

5 Ergebnisse und Diskussion 65

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

10000

20000

Intensität [µAU]

Zeit [min]

Abb. 14:Trennung der Analyte, UV-Detektion (HPLC-DAD-MS/MS, Phenomenex, Total

Scan: 190-800 nm)

1: SFD, 2: TMP, 3: N4-SFD, 4: e-iso-CTC, 5: iso-CTC, 6a: e-CTC (Keto), 6b: e-CTC

(Enol), 7: CTC (ß=2 mg/L)

Entwicklung der UV-Detektion

Zur Entwicklung der UV-Detektion mittels Dioden-Array-Detektor wurden die UV/vis-Spektren

(Abb. 15) während des chromatographischen Laufes aufgenommen und die

Messwellenlängen anhand der Absorptionsmaxima ermittelt. Das Absorptionsmaximum bei

232 nm stammt dabei vom chromatographischen Laufmittel

(Acetonitril/Wasser/Ameisensäure). Die Absorptionsmaxima der einzelnen Analyte und ihre

Retentionszeiten sind in Tabelle 8 aufgeführt.

5 Ergebnisse und Diskussion 66

SFD, N4-SFD

200 250 300 350 400 450 500

50000

100000

150000

200000

250000

300000 SFD

N4-SFD

Intensität [µAU]

Wellenlänge [nm]

TMP

200 250 300 350 400 450 500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

Intensität [µAU]

Wellenlänge [nm]

TMP

e-iso-CTC, iso-CTC

200 250 300 350 400 450 500

50000

100000

150000

Intensität [µAU]

Wellenlänge [nm]

e-iso-CTC

iso-CTC

e-CTC (Enol), CTC

200 250 300 350 400 450 500

50000

100000

150000

200000

250000 e-CTC (Enol)

CTC

Intensität [µAU]

Wellenlänge [nm]

e-CTC (Keto)

200 250 300 350 400 450 500

25000

50000

75000

100000 e-CTC (Keto)

Intensität [µAU]

Wellenlänge [nm]

e-anhydro-CTC, anhydro-CTC

200 250 300 350 400 450 500

50000

100000

150000

200000

250000

Intensität [µAU]

Wellenlänge [nm]

e-anhydro-CTC

anhydro-CTC

A Aus dem chromatographischen Lauf ermittelte UV/vis-Spektren (HPLC-DAD- bb. 15: nm, ß = 10 mg/L, Laufmittelgradient:

Acetonitril/Wasser/Ameisensäure)

MS/MS, Phenomenex, Total Scan: 190-800

5 Ergebnisse und Diskussion 67

Tab. 8: UV-Absorptionsmaxima und Retentionszeiten der einzelnen Analyte (HPLC-DAD-

MS/MS, Phenomenex, Total Scan: 190-800 nm, ß = 10 mg/L, Laufmittelgradient:

Acetonitril/Wasser/Ameisensäure)

Substanz Rt

[min]

Absorptionsmaximum

[nm]

SFD 5,1 266

N4-SFD 5,9 263

TMP 6,4 270

e-iso-CTC 7,1 270

308

iso-CTC 8,6 270

308

e-CTC (Keto) 7,3 265

357

e-CTC (Enol) 9,2 265

370

CTC 11,1 265

370

e-anhydro-CTC 17,9 273

444

anhydro-CTC 19,7 273

444

Zur Quantifizierung wurden anhand der ermittelten Absorptionsmaxima die Wellenlängen

270 nm und 370 nm als Messwellenlängen festgelegt.

Die Bestimmung von e-CTC (Keto), e-CTC (Enol) und CTC mittels UV-Detektion erfolgte bei

370 nm, da hier die iso-CTC´s keine UV-Adsorption zeigten (Abb. 16). Alle übrigen

Substanzen sollten bei 270 nm bestimmt werden.

5 Ergebnisse und Diskussion 68

6 7 8 9 10 11 12

20000

40000

60000

80000

Intensität [µAU]

Zeit [min]

270nm

370nm

Abb. 16: Identifizierung der CTC’s durch Variation der Messwellenlänge, UV-Detektion bei

270 und 370 nm (HPLC-DAD-MS/MS, Phenomenex, Total Scan: 190-800 nm, ß =

10 mg/L, Laufmittelgradient: Acetonitril/Wasser/Ameisensäure), 1: e-iso-CTC,

2: e-CTC (Keto), 3: iso-CTC, 4: e-CTC (Enol), 5: CTC

Überprüfung der Anwendbarkeit von UV- und MS/MS-Detektion bei Bodenproben

Matrixkomponenten dürfen die Bestimmungsverfahren nur bis zu einem gewissen Grad

störend beeinflussen [81]. Es war daher zu überprüfen, in welchem Maße ko-extrahierte

Matrixbestandteile der Bodenproben die Bestimmungsverfahren mit UV- und MS/MS-

Detektion beeinflussen. Zu diesem Zeitpunkt waren Verfahren zur Extraktion und SPE

entwickelt bzw. überprüft worden (s. Kap. 5.1.2.2), so dass zwei aufgearbeitete unbelastete

Bodenproben („Nullprobe“, Anhang A.1.4.2) zur Verfügung standen.

Der Vergleich der Chromatogramme bei UV-Detektion (270 und 370 nm) zwischen der

aufgearbeiteten Bodenprobe und dem reinen Laufmittel zeigt, dass Matrixbestandteile in

diesen Messbereichen Absorption zeigen (Abb.17). Die Intensität der Peaks der

Bodenextrakte liegt dabei um ein Vielfaches über der des Laufmittels, was einen hohen

Anteil mitextrahierter Bodenmatrix anzeigt. Zusätzlich fallen die Retentionszeiten einiger

Peaks im Chromatogramm der extrahierten Bodenmatrix mit denen der zu detektierenden

Substanzen zusammen. Eine Bodenmatrixlösung mit je 250 µg/L SFD, e-iso-CTC, iso-CTC,

e-CTC und CTC zeigte keine erkennbaren Peaks im Chromatogramm, da die Bodenmatrix

hier die entsprechenden Peaks überlagerte (Abb. 18).

5 Ergebnisse und Diskussion 69

0 5 10 15 20 25 30 35

5000

10000

15000

20000

270nm

370nm

Intensität [µAU]

Zeit [min]

0 5 10 15 20 25 30 35

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000 270nm

370nm

Intensität [µAU]

Zeit [min]

Abb. 17: Einfluss der Bodenmatrix auf die UV-Detektion, HPLC-UV (Wellenlänge: 270 und

370 nm) A: Laufmittel, B: Bodenmatrix

4 6 8 10 12 14

200000

400000

600000

800000

Intensität [µAU]

Zeit [min]

Abb. 18: Vergleich HPLC-UV (270 nm) zwischen extrahierter Bodenmatrix (rot) und SFD,

e-iso-CTC, iso-CTC, e-CTC, CTC (ß= 250 µg/L, in Bodenmatrix, schwarz)

Eine quantitative Bestimmung der Substanzen im Boden mittels UV-Detektion war somit bei

niedriger Analytkonzentration nicht möglich gewesen.

Bei der MS/MS-Detektion war hingegen das Rauschen in dem Chromatogramm der

aufgearbeiteten Bodenprobe, welche mit einer Kalibrierlösung einer Konzentration von 250

µg/L aufgenommen wurde, gering. Die maximale Intensität des Rauschens sowohl für SFD

(Abb. 19), als auch die CTC’s (e-iso-CTC, iso-CTC, e-CTC, CTC, (Abb. 20)) lagen jeweils

unter 10% (relative Intensität) bzw. es lag ein Signal/Rausch Verhältnis von größer 10:1 vor.

Die MS/MS-Detektion wurde daher zur quantitativen Analyse der güllebeaufschlagten

Bodenproben eingesetzt.

5 Ergebnisse und Diskussion 70

0 5 10 15 20 25 30 35

100

relative Intensität [%]

Zeit [min]

Abb. 19: HPLC-ESI-MS/MS-Chromatogramm, SFD (m/z 251 > 156, 174; TIC-SRM MS2,

ß=250 µg/L in (Boden-)Matrix)

0 5 10 15 20 25 30 35

100

relative Intensität [%]

Zeit [min]

Abb. 20: HPLC-ESI-MS/MS-Chromatogramm (m/z 479 > 462, 444; TIC-SRM MS2,

ß=250 µg/L in (Boden-)Matrix) 1: e-iso-CTC, 2: iso-CTC, 3: e-CTC, 4: CTC

Die Fragmentierungsmuster und relativen Peakintensitäten der Analyte in Matrix

entsprachen dabei denen in Laufmittel A. Das war insofern von Bedeutung, da nur bei

Übereinstimmung der Fragmentierungsmuster und zugehörigen prozentualen Intensitäten,

das größte Signal oder der Mittelwert aus allen Signalen quantitativ ausgewertet werden darf

[488,489].

Die Quantifizierung erfolgte über den Totalionenstrom (TIC) der einzelnen Fragmentionen

(MS2), da dieser eine höhere Intensität aufwies.

5 Ergebnisse und Diskussion 71

5.1.2.2 Entwicklung der Probenaufbereitung

Ausgangs-Problematik des Analyseverfahrens für die Bodenproben

Ein im Arbeitskreis entwickeltes Verfahren (Extraktion, SPE, HPLC-UV-MS/MS) zur

Bestimmung von SFD, N4-SFD, CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, anhydro-CTC und TMP

in Gülle [478] sollte auf die Analyse von Bodenproben übertragen werden.

Zur Extraktion der Analyte wurde ein wässriger McIlvain-Puffer (0,1 mol/L EDTA, pH 4)

eingesetzt. In den aus den Bodenextrakten gewonnen Messproben ließen sich damit aber

aufgrund zu geringer Konzentrationen keine Analytspuren quantifizieren. Auch andere

Extraktionsmittel/-methoden wurden daraufhin erfolglos erprobt:

• Citratpuffer verschiedener pH-Werte; ohne und mit EDTA-Zusatz, ohne und mit

Mikrowellenunterstützung,

• verdünnte Salzsäure (10-3 – 1,0 mol/L HCl), mit und ohne Methanolzusatz, bei

Raumtemperatur und unter Erwärmen,

• Essigsäureethylester zur ergänzenden Solventextraktion organisch gebundener

Tetracycline.

Die abgeschätzten Konzentrationen für die daraus gewonnenen Messproben hätten mit der

verwendeten HPLC-UV-MS/MS-Methode jedenfalls sicher zu erfassen sein sollen. Darauf

folgende Sorptionsuntersuchungen (s. Abb. 21) kamen zu dem Ergebnis, dass SFD und N4-

SFD nur geringfügig vom Boden sorbiert werden, die anderen dotierten Komponenten, TMP

und die Tetracyclinderivate (CTC, iso-CTC, Anhydro-CTC), aber in hohem Maße. Fast

unmittelbar nach Vereinigung von Bodenphase und Arzneistofflösung stellten sich die

Sorptionsgleichgewichte ein. Die Auswaschbarkeit (simulierter Regen) der Adsorbate verhielt

sich dabei erwartungsgemäß reziprok zum Sorptionsgrad [476].

Aufgrund dieser Ergebnisse war zu erwarten, dass die in der Gülle vorliegenden

Chlortetracyclin-Komponenten und Trimethoprim nach der Güllebeaufschlagung in den

oberen Bodenhorizonten angereichert wurden. Dagegen könnten die Sulfonamid-Einträge,

obwohl diese in erheblich höherer Konzentration in vorlagen, durch Starkregen, der nach

Gülleausbringung aufgetreten ist, in tiefere Bodenschichten verlagert worden sein.

5 Ergebnisse und Diskussion 72

020406080100120

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 SFD

N4-SFD

TMP

iso-CTC

CTC

anhydro-CTC

sgra

Adsorption d

t [min]

Abb. 21: Sorption von Antibiotika (Wirkstoffe/Metabolite) an Boden (Batch-Versuche: 5 g

Boden, 20 mL wässrige Lösung (CTC, iso-CTC, anhydro-CTC, SFD, N4-SFD,

TMP; ß= 10 mol/L)) [476]

In Wiederfindungsstudien wurden danach die verschiedenen Extraktionsmittel auf ihr

Extraktionsvermögen bezüglich der Analyte in diesem Boden untersucht. Es zeigte sich

dabei, dass die verwendeten Extraktionsmittel nur ein sehr geringes Extraktionsvermögen

aufwiesen (Tab. 9).

Tab. 9: Wiederfindung (%) von Antibiotika aus dotiertem Boden (CTC, SFD und TMP; ß =

10 mg/L; Einwaage Boden = 5 g, Einwirkzeit = 30 min, Mittelwerte N=2)

Extraktionsmittel SFD TMP CTC

Citrat-Puffer pH 4,7 6 ~ 0 ~ 0

Methanol / Eisessig 5 % (v/v) /

pH 1,8 14 ~ 0 ~ 0

McIlvain-Puffer / 0,1 moL/L EDTA,

pH 4 ~ 0 ~ 0 7

Salzsäure (1 mol/L HCl) ~ 0 ~ 0 6

Methanol / Citrat-Puffer pH 4,7

(20/80, v/v) 38 ~0 ~ 0

Zweistufige Extraktion

1.) Methanol / Eisessig

5 % (v/v) /, pH 1,8

2.) Citrat-Puffer pH 4,7/

0,1 mol/L EDTA (20/80, v/v)

5 Ergebnisse und Diskussion 73

Entwicklung der Probenaufbereitung

Ziel der Probenvorbereitung war, eine Extraktionsmethode zu entwickeln, die einen

möglichst hohen Anteil der Tetracyclin- und Sulfonamid-Analyten aus der Bodenmatrix zu

extrahieren, damit dieser auch quantitativ bestimmbar ist.

Aus der Literatur war die unbefriedigende Situation der Tetracyclinbestimmung in

Bodenproben bekannt [81,482]. Die Problematik basiert auf der schwierigen Extrahierbarkeit

dieses Antibiotikums einschließlich seiner Derivate und Metabolite. Teilweise

koordinationschemisch begründbar, resultieren daraus – in Abhängigkeit von der jeweiligen

Bodenzusammensetzung – sehr niedrige Wiederfindungswerte (teilweise << 30 %) [81,482].

Die bei den Wiederfindungsstudien (s. Ausgangsproblematik) eingesetzten Extraktionsmittel

enthielten Reagenzien, die bei der Analyse von Pharmakarückständen im Boden vielfach

eingesetzt wurden, wie Zitronensäure, Salzsäure und EDTA [81]. In diesen Untersuchungen

wurde der pH-Wert variiert, Methanol zugesetzt und auch zweistufig mit verschiedenen

Mitteln extrahiert. Ausgehend von komplexchemischen Überlegungen wurde daraufhin

erstmalig ein ammoniakalischer EDTA-haltiger Extraktand (pH 10) eingesetzt (siehe Anhang

Experimentelles), um Chlortetracylin-Derivate effektiver von Bodenpartikeln zu desorbieren,

an denen sie u.a. über Koordinination von Metallionen (z.B. Ca2+, Mg 2+, Fe 3+) und an

Humusfraktionen gebunden sein können.

Zur Überprüfung der Wirksamkeit wurde der ammoniakalische EDTA-haltige Extraktand in

einen ersten Extraktionsversuch an einer dotierten Bodenprobe (SFD, TMP, CTC)

eingesetzt. Die nach der SPE erhaltene Messprobe zeigte deutliche Analytsignale (Abb. 22).

5 Ergebnisse und Diskussion 74

RT: 0,00 - 34,99

0 5 10 15 20 25 30

Time (min)

100

Relative Abundance

100 4,22

4,66

5,74 6,66 9,03 12,95 16,42 29,3725,453,77 18,33 33,5721,80

4,32

4,86 5,76 12,60 15,25 17,07 32,6729,0225,7423,462,23

7,44

5,98

7,90 10,18 20,39 24,5918,4816,014,89

NL: 7,15E5

TIC F: + c ESI SRM ms2

251,10@38,00 [

155,00-157,00;

172,90-174,90] MS

120104-5b

SFD

NL: 9,13E5

TIC F: + c ESI SRM ms2

291,10@45,00 [

122,00-124,00;

229,10-231,10;

257,00-259,00] MS

120104-5b

TMP

NL: 8,24E5

TIC F: + c ESI SRM ms2

479,10@28,00 [

443,00-445,00;

460,90-462,90] MS

120104-5b

e-iso-CTC

iso-CTC

Abb. 22: HPLC-MS/MS mit YMC-Säule, dotierte Bodenproben (500 µL SFD, TMP, CTC in

Methanol (ß=10 mg/L); Bodeneinwaage: 5 g)

schwarz: SFD, rot: TMP, grün: CTC

Im nächsten Schritt wurde die Extraktionsmethode an einer aus dem MUNLV-Projekt

stammenden Bodenprobe angewendet, um die Anwendbarkeit der NH3/NH4Cl/EDTA-

Mischung auf die Bodenproben zu überprüfen und einen ersten Eindruck von der

Bodenbelastung zu bekommen. In der gewonnen Messproben konnten dann SFD (Abb. 23),

sowie e-iso-CTC (Abb. 24) und iso-CTC (Abb. 25) nachgewiesen werden. TMP, N-4-SFD,

sowie die anhydro-CTC’s konnten nicht nachgewiesen werden, wobei dies für TMP auch zu

erwarten war, da es schon in der eingesetzten Gülle nicht mehr nachgewiesen werden

konnte. Eventuell vorhandenes CTC und e-CTC werden bei der ammoniakalischen

Extraktion zu iso-CTC und e-iso-CTC umgewandelt.

5 Ergebnisse und Diskussion 75

RT: 0,00 - 35,02

0246810 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Time (min)

100

Relative Abundance

5,14

5,59

9,42 9,61 33,78

7,14 14,44 30,68

1,58 17,27

8,60

NL: 1,36E4

TIC F: + c ESI SRM

ms2 251,10@38,00

[ 155,00-157,00;

172,90-174,90] MS

200404-3-02

SFD 251 > 156, 174

200404-3-02 #277 RT: 5,04 AV: 1NL: 1,50E3

F: + c ESI SRM ms2 251,10@38,00 [ 155,00-157,00; 172,90-174,90]

Abb. 23: HPLC-MS/MS (TIC-SRM MS2, Fragmentierung von SFD (m/z 251) > 156, 174;

Bodenprobe: W2-1-25)

Abb. 24: HPLC-MS/MS (TIC-SRM MS2, Fragmentierung von e-iso-CTC (m/z 479) > 462;

Bodenprobe: W2-1-25)

156 158 160 162 164 166 168 170 172 174

m/z

100

Relative Abundance

156 174

RT: 0,00 - 35,02

0246810 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Time (min)

100

Relative Abundance

9,57

7,84

10,21 12,22

4,92

4,46 12,67 21,06

3,27 5,74 14,95 16,50 24,26 28,27

NL: 9,25E4

TIC F: + c ESI SRM

ms2 479,10@28,00

[ 443,00-445,00;

460,90-462,90] MS

200404-3-02

200404-3-02 #430 RT: 7,84 AV: 1NL: 3,90E4

F: + c ESI SRM ms2 479,10@28,00 [ 443,00-445,00; 460,90-462,90]

444 446 448 450 452 454 456 458 460 462

m/z

100

Relative Abundance

462,0

e-iso-CTC 479 > 462

5 Ergebnisse und Diskussion 76

RT: 0,00 - 35,02

0246810 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Time (min)

100

Relative Abundance

9,57

7,84

10,21 12,22

4,92

4,46 12,67 21,06

3,27 5,74 14,95 16,50 24,26 28,27

NL: 9,25E4

TIC F: + c ESI SRM

ms2 479,10@28,00

[ 443,00-445,00;

460,90-462,90] MS

200404-3-02

200404-3-02 #525 RT: 9,57 AV: 1NL: 9,25E4

F: + c ESI SRM ms2 479,10@28,00 [ 443,00-445,00; 460,90-462,90]

Abb. 25: HPLC-MS/MS (TIC-SRM MS2, Fragmentierung von iso-CTC (m/z 479) > 462;

Bodenprobe: W2-1-25)

Um die Leistungsfähigkeit der entwickelten Probenvorbereitung zu ermitteln wurde eine

Wiederfindungsstudie (für SFD, TMP, CTC) durchgeführt, welche gleichzeitig dazu dienen

sollte, den Arbeitschritt der zur Probenaufreinigung und –aufkonzentration eingesetzten

SPE-Methode mittels dotiertem Extraktionsmittel zu überprüfen (Tab. 10).

Tab. 10: Wiederfindung (%) von Arzneistoffen aus dotiertem Boden (5 g Boden, 500 µL

Mischstandardlösung (SFD, TMP, CTC; ß=10 mg/L; Lösungsmittel: Methanol);

suspensiert; Einwirkzeit: 30min)

EDTA/Ammoniak-

Puffer, pH 10 SFD TMP

*e-iso-

CTC *iso-

CTC *e-

CTC CTC Summe

CTC

dotierte Bodenprobe

(N=6) 59±7% 41±4% 24±3% 47±4% ~0 ~0 71±7%

dotiertes

Extraktionsmittel (N=10) 91±10% 81±9% 34±5% 75±7% ~0 ~0 109±12%

(* bezogen auf dotiertes CTC )

Die Ergebnisse der Wiederfindungsuntersuchung zeigen, dass Sulfadiazin und TMP nur in

mäßigen Ausbeuten von 59% bzw. 41% von dem dotierten Boden extrahierbar war.

Erwartungsgemäß wird das CTC bei der Extraktion im alkalischen Mileu vollständig

444 446 448 450 452 454 456 458 460 462

m/z

100

Relative Abundance

462,0

iso-CTC 479 > 462

5 Ergebnisse und Diskussion 77

isomerisiert [487], so dass das gebildete Epimerenpaar iso-CTC und e-iso-CTC als CTC-

Summenparameter quantifizierbar ist. Eine Erfassung der orginären Konzentration war daher

mit dieser Extraktionsmethode nicht möglich.

Besonders bemerkenswert waren die Ergebnisse für das dotierte CTC, denn im alkalischen

Milieu (pH 10) wird eine relativ hohe Wiederfindung erreicht (Summe CTC 71%).

Möglicherweise wird unter diesen Bedingungen das Komplexierungsvermögen der EDTA

gesteigert, so dass im Kontakt mit der Bodenphase partikelgebundene Chlortetracyclin-

Komponenten leichter desorbiert werden. Zusätzlich kommt hinzu, dass die Sorption von

Anionen aufgrund der überwiegend negativen Oberflächenladung im Boden wesentlich

geringer und stärker vom pH-Wert abhängig ist, als die Kationensorption [490]. Bei pH 10

liegen die CTC’s bzw. iso-CTC’s fast ausschließlich anionisch vor (s. Kap. 5.2.1.1, Abb. 33,

34 und 38).

Nach Parolo et al. [441] erreicht Tetracyclin unterhalb von pH 4, also wenn es in seiner

kationischen Form vorliegt (Ladungszustand: + 0 0), nahezu die Kationenaustauschkapazität

von Montmorillonit. In dieser Form ist die Affinität von Tetracyclin gegenüber diesem

Tonmineral viel größer als die von Natriumionen. Die Adsorptionskapazität ist aber auch im

pH-Bereich 5-7 hoch. Für pH 11 wird dagegen nur noch eine geringfügige Absorption von

Tetracyclin erwartet. Diese Untersuchung liefert damit einen weiteren Anhaltspunkt für die

relativ hohe Wiederfindung von CTC im Boden mittels der NH3/NH4Cl-EDTA-Mischung und

Erklärungsansätze für die sehr niedrige Wiederfindung der übrigen für diesen Boden

ausprobierten Extraktionsmittel. Denn nach Pils et al. scheinen Tonminerale in Hinblick auf

die Sorption von Tetracyclinen der dominierende Bodenbestandteil zu sein [440]. Aber auch

andere Bodensubstanzen wie Huminstoffe, Eisen- und Aluminiumoxide besitzen im

alkalischen Milieu (pH 10) nur noch eine geringe Adsorptionsaffinität für Tetracycline [429,

435]. Eigene Untersuchungen (siehe Kapitel 5.2.1.1) zeigten für iso-CTC schon bei pH 9,5

einen im Gegensatz zu CTC sehr geringen Adsorptionsgrad an Montmorillonit. Vor dem

Hindergrund, dass CTC unter den verwendeten Extraktionsbedingungen vollständig in iso-

CTC umgewandelt wird, erklärt sich u.a. daraus die relativ gute Wiederfindungsrate für die

CTC-Bestimmung nach der NH3/NH4Cl-EDTA-Methode.

Ein Vergleich mit den Wiederfindungen anderer publizierter Extraktionsmethoden gestaltet

sich schwierig, da diese von der jeweiligen Bodenzusammensetzung abhängig sind. So

ermittelten beispielsweise Blackwell et al. für Oxytetracyclin eine Wiederfindung von 65±7%

für einem sandigen Lehmboden und 38±4% für einen tonigen Lehmboden. Für das ebenfalls

untersuchte Sulfonamid Sulfachloropyridazin betrug die Wiederfindung 80±1% im sandigen

und 68±10% im tonigen Lehmboden [343].

5 Ergebnisse und Diskussion 78

Die Bodenkenndaten werden aber oftmals nur unvollständig angegeben, so dass ein direkter

Vergleich der Wiederfindung nicht möglich ist. Hamscher et al. geben 57-76% für die

Wiederfindung von CTC in einem Sandboden an [482].

Nach der NH3/NH4Cl/EDTA-Methode ist der Extrakt vor der Festphasenextraktion mit

Salzsäure auf pH 4 einzustellen. Die bei dem dotierten Extraktionsmittel erreichten

Wiederfindungen (Tab. 10) lassen weiteren Optimierungsbedarf für SFD und insbesondere

für TMP in diesem Teilschritt erkennen.

Die relativen Standardabweichungen aller Analyten für das dotierte Extraktionsmittel

(gesamte Probenvorbereitung) liegen um 10% und sind damit deutlich über den relativen

Standardabweichungen der jeweiligen Messmethode (siehe Kapitel 5.1.3.1; Anhang A.2).

Eine Verbesserung der Präzision könnte hier z.B. durch eine automatisierte SPE erfolgen.

Eine online-SPE könnte demgegenüber noch zu einer besseren Wiederfindung führen, da

Analytverluste durch Transferprozesse zwischen SPE und Messung reduziert würden [491].

Diese stand für die geplanten Untersuchungen aber nicht zu Verfügung.

Zur weiteren Methodenvalidierung (Kapitel 5.1.3) wurden der Einfluss der Matrix auf das

Messverfahren und die Konzentrationsabhängigkeit der Wiederfindung, als Einflussgrößen

für die Methodenpräzision, Richtigkeit und Robustheit, untersucht. Ohne Zweifel stellte aber

die ammoniakalische Extraktion die bisher effektivste Methode für CTC in diesem Boden dar.

Daher wurde Sie auf die Analysen der Bodenkerne aus den güllebeaufschlagten

Versuchsparzellen angewendet.

5.1.3 Methodenvalidierung

5.1.3.1 Externe Kalibrierung

Anhand der mittels HPLC-MS2 erhaltenen Peakflächen verschieden konzentrierter

Kalibrierlösungen von SFD, e-iso-CTC und iso-CTC (Konzentrationsbereiche von 0,05 bis 10

mg/L; siehe Anhang A.2) wurden Kalibriergeraden erstellt. Die linearen Kalibrationsbereiche

(Linearitätstest nach Mandel) wurden dabei nach DIN 38402-Teil 51 [520] ermittelt und zur

Minimierung der Varianzinhomogenität eingeschränkt (siehe Anhang A.2.5). Als

Verfahrenskenndaten für die einzelnen Messbereiche wurden die

Verfahrensstandardabweichung sx0 und relative Verfahrenstandardabweichung Vx0

berechnet (Tab. 11).

5 Ergebnisse und Diskussion 79

Tab. 11: Funktioneller Zusammenhang zwischen Messsignal (y: Mittelwert der Peakflächen)

und Analytkonzentration (x) sowie Angabe von Verfahrenskenndaten

(Verfahrensstandardabweichung sx0 und rel. Verfahrenstandardabweichung Vx0 )

Lineare Kalibration xbay

⋅

Analyt Konzentrations-

Bereich

[µg/L]

a b Reststandard-

abweichung

Bestimmtheits-

maß

sx0

[µg/L]

Vx0

[%]

SFD 100-1000 142868 4585 73730 0,9986 16,08 3,15

e-iso-

CTC 100-1000 224387 11575 167486 0,9988 14,47 2,83

e-iso-

CTC 1000-10000 175032 12952 1400178 0,9994 108,11 2,12

iso-

CTC 78-1170 306225 16651 208044 0,9994 12,49 2,50

iso-

CTC 1170-11707 -4368538 20984 1406152 0,9998 67,01 1,32

Die nach DIN 32645 [521] ermittelten Nachweis- (xNG), Erfassungs- (xEG) und

Bestimmungsgrenzen (xBG) für die externe Kalibrierung sind in Tabelle 12 aufgeführt.

Tab. 12: Nachweis- (xNG), Erfassungs- (xEG) und Bestimmungsgrenzen (xBG) für die externe

Kalibrierung

Analyt Arbeitsbereich

[µg/L]

xNG

[µg/L]

xEG

[µg/L]

xBG

[µg/L]

SFD 100-1000 48,81 97,62 184,00

e-iso-CTC 100-1000 43,92 87,84 166,68

iso-CTC 78-1170 35,90 71,79 140,10

Unter der Voraussetzung einer Wiederfindung von 100% und keiner Beeinflussung der

Signalintensitäten der Messproben durch koeluierte Matrixbestandteile, ergeben sich bei

aufgearbeiteten Bodenproben für SFD eine Nachweisgrenze von 4,88 µg/kg und eine

Bestimmungsgrenze von 18,4 µg/kg. Für CTC (als Summenwert von e-iso-CTC und iso-

CTC) in Bodenproben beträgt die Nachweisgrenze 7,98 µg/kg und die Bestimmungrenze

30,7 µg/kg.

5 Ergebnisse und Diskussion 80

5.1.3.2 Signalsuppression durch Matrixbestandteile

Koeluierte Matrixbestandteile, insbesondere aus Umweltproben, können die Ergebnisse

einer quantitativen Bestimmung mittels LC-ESI-MS verfälschen, da es zu einer

Beeinflussung der Ionisierung in der ESI-Quelle kommen kann. Matrixbestandteile können

dabei zu einer Signalsuppression oder einer Erhöhung der Signalflächen führen

[285,486,522-524] . Müller et al. [312] ermittelten eine Signalsuppression von 20% für SFD

durch Flusswasser. Schwake-Anduschuss [455] beobachtete eine Signalsupression für SFD

sowie für höhere iso-CTC-Konzentrationen (≥ 5 mg/L) durch Pflanzenmatrix. Da diese

Effekte bei einer externen Kalibrierung nicht mit erfasst werden, wurde der Einfluss der

koeluierten Bodenmatrix auf das entwickelte LC-ESI-MS/MS-Verfahren überprüft. Hierzu

wurden unbelastete Bodenproben (Nullprobe) aufgearbeitet, um die koeluierenden

Matrixbestandteile zu erhalten. Der Einfluss der Matrixbestandteile auf die Bestimmung von

SFD, e-iso-CTC und iso-CTC wurde durch Vergleich der Signalflächen von Kalibrierlösungen

mit Bodenmatrix und ohne (reines Lösemittel) ermittelt.

Für SFD ist eine deutliche Suppression des Signals durch Matrixbestandteile über den

gesamten Kalibrationsbereich festzustellen (Abb. 26). Folglich liefern die durch externe

Kalibrierung ermittelten Messwerte der Bodenproben einen kalibrierungsbedingten

Minderfund.

0 1000 2000 3000 4000 5000

5,0x106

1,0x107

1,5x107

2,0x107

Kalibrationslösung

Kalibrationslösung + extrahierte Matrix

Signalfläche [willk. Einh.]

Konzentration von SFD [µg/L]

Abb. 26: Matrixeinflüsse für SFD, Vergleich der Signalflächen der SFD-Peaks (SRM-Modus),

3 Wiederholproben für Kalibrierlösungen mit Bodenmatrix und ohne (reines

Lösungsmittel), je dargestellten Messpunkt Mittelwert (N=2) der Signalflächen

5 Ergebnisse und Diskussion 81

Für e-iso-CTC scheint es eine geringe Erhöhung (Abb. 27) und für iso-CTC eine sehr leichte

Suppression des Messsignals durch Matrixbestandteile (Abb. 28) zu geben. Allerdings ist

auch eine Verschiebung des Epimerisierungsgleichgewichts zwischen e-iso-CTC und iso-

CTC durch Matrixbestandteile möglich.

0 1000 2000 3000 4000 5000

1,0x107

2,0x107

3,0x107

4,0x107

5,0x107

6,0x107

7,0x107

8,0x107

Signalfläche [willk. Einh.]

Konzentration von e-iso-CTC [µg/L]

Kalibrationslösung

Kalibrationslösung + extrahierte Matrix

Abb. 27: Matrixeinflüsse für e-iso-CTC, Vergleich der Signalflächen der e-iso-CTC-Peaks

(SRM-Modus), 3 Wiederholproben für Kalibrierlösungen mit Bodenmatrix und ohne

(reines Lösungsmittel), je dargestellten Messpunkt Mittelwert (N=2) der

Signalflächen

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

2,0x107

4,0x107

6,0x107

8,0x107

1,0x108

1,2x108

1,4x108

1,6x108

1,8x108

Signalfläche [willk. Einh.]

Konzentration von iso-CTC [µg/L]

Kalibrationslösung

Kalibrationslösung + extrahierte Matrix

Abb. 28: Matrixeinflüsse für iso-CTC, Vergleich der Signalflächen der iso-CTC-Peaks (SRM-

Modus), 3 Wiederholproben für Kalibrierlösungen mit Bodenmatrix und ohne (reines

Lösungsmittel), je dargestellten Messpunkt Mittelwert (N=2) der Signalflächen

5 Ergebnisse und Diskussion 82

Setzt man eine durch Matrixbestandteile verursachte Verschiebung im

Epimerisierungsgleichgewicht von e-iso-CTC und iso-CTC voraus, liefert eine

Summenbestimmung beider Signale, unter der Annahme eines annähernd identischen

Ionisierungsverhaltens der beiden Epimere, den besseren Bezug, da hier eventuelle

Gleichgewichtsverschiebungen der beiden Epimere durch Matrixbestandteile mit

berücksichtigt werden. Ein Einfluss der Matrix auf die Bestimmung von e-iso-CTC und iso-

CTC als Summengehalt ist nicht erkennbar und somit vernachlässigbar (Abb. 29). Die

externe Kalibrierung ist daher für die Bestimmung von CTC als Summengehalt von e-iso-

CTC und iso-CTC eine akzeptable Methode. Eine Signalsupression bei der höchsten

Konzentration ist zwar erkennbar, allerdings liegt dieser Kalibrationswert nicht mehr im

Konzentrationsbereich, der für Bodenproben relevant ist.

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

5,0x107

1,0x108

1,5x108

2,0x108

2,5x108

Signalfläche [willk. Einh.]

Konzentration von CTC (Σ e-iso-CTC + iso-CTC) [µg/L]

Kalibrationslösung

Kalibrationslösung + extrahierte Matrix

Abb. 29: Matrixeinflüsse auf die Summenbestimmung von CTC (Σ e-iso-CTC + iso-CTC),

Vergleich der Signalflächen der e-iso-CTC + iso-CTC-Peaks (SRM-Modus),

3 Wiederholproben für Kalibrierlösungen mit Bodenmatrix und ohne (reines

Lösungsmittel), je dargestellten Messpunkt Mittelwert (N=2) der Signalflächen

Fazit: Die externe Kalibrierung ist für die Bestimmung von CTC im Boden eine geeignete

Methode. Für die Bestimmung von SFD liefert sie aber Minderbefunde, so dass hier die

Verwendung eines internen Standards oder die Bestimmung mittels Standardaddition

angebracht wäre. Da diese aber wesentlich zeit- und kostenintensiver sind, wurden die

Gehalte der Bodenproben mittels externer Kalibrierung bestimmt.

Das Verfahren der Standardaddition nach DIN 32633 [525] hätte im vorliegenden Fall

(Anwendung auf Bodenproben) für SFD und CTC auch nur unter Vorbehalt angewendet

werden dürfen. So heißt es in der DIN 32633:

5 Ergebnisse und Diskussion 83

„Die Empfindlichkeit der Analysenmethode (Steigung b der Kalibriergeraden) muss

unabhängig sein von der Bindungsform des Analyten und des Standardzusatzes und darf

nicht durch sonstige Einflüsse (z.B. Absorption) gestört werden.“

5.1.3.3 Wiederfindung

Zu 5 g unbelasteter Bodenprobe (Nullprobe) wurden definierte Mengen an CTC und SFD

zugegeben und suspensiert. Nach einer Einwirkzeit von 15 Minuten erfolgten die Extraktion

nach der entwickelten Probenaufbereitungsvorschrift und die Bestimmung des Gehaltes an

CTC und SFD. Die ermittelten konzentrationsabhängigen Wiederfindungen sind für SFD und

für CTC (als Summe von e-iso-CTC und iso-CTC; Einzelergebnisse siehe Anhang A.4.1) in

Tabelle 13 aufgeführt.

Tab. 13: Wiederfindung aus Bodenproben (Für CTC Summenbestimmung aus e-iso-CTC

und iso-CTC)

Analyt Anzahl der

Wiederholproben zugesetzte

Menge [µg/5g] gefundene

Menge [µg/5g] Wiederfindung

[%]

SFD 4 5,000 2,525±0,421 51±8

SFD 4 0,500 0,196±0,069 39±14

SFD 4 0,125 0,035±0,004 28±3

CTC 4 5,000 2,954±0,515 59±10

CTC 4 0,500 0,312±0,052 62±10

CTC 4 0,125 0,095±0,002 76±2

Die Wiederfindungen für CTC in Bodenproben liegen mit 59-76% im akzeptablen Bereich für

den gesamten Konzentrationsbereich. Demgegenüber wird SFD in Bodenproben schon nach

kurzer Kontaktzeit mit dem Boden nur zu 28-51% wiedergefunden. Eine Ursache für die

vergleichsweise niedrige Wiederfindung für SFD sind die in Kap. 5.1.3.2 gezeigten

Suppressionseffekte durch Matrixbestandteile bei der massenspektrometrischen

Bestimmung. Aber auch eine schnelle Bildung von nicht-extrahierbaren bzw. nicht zu

extrahierenden Anteilen kann zu einer insgesamt geringeren Wiederfindung beigetragen

haben [492]. Dies gilt sowohl für SFD als auch für CTC.

5 Ergebnisse und Diskussion 84

5.1.4 Analyse der Bodenproben aus dem „Antiinfektiva-Projekt“

Bodencharakterisierung

Die Freilandversuche wurden in der Soester Börde (Niederbörde) Flurstück 27, Bezeichnung

Tünnerkamp bei einer Höhenlage von ca. 80 m über NN in Merklingsen durchgeführt. Die

Bodenentwicklung wurde durch stark schwankenden Grundwasserstand (Pseudogley-

Parabraunerde) mit einem Humusgehalt meist unter 2% beeinflusst. Die Wasserkapazität

des Bodens ist hoch. Weitere Daten von Bodenuntersuchungen liegen vor (siehe Anhang

A.3.1).

Von den entnommenen Bodenproben wurde nach DIN ISO 11465 der Trockenrückstand

bzw. Wassergehalt bestimmt (siehe Anhang A.3.1). Die Wassergehalte der feldfeuchten

Proben lagen nach der Güllebeaufschlagung jeweils zwischen ~15 % (Bodenhorizonte 25 –

50 cm) und maximal 25 % (Horizonte 0 – 25 cm). Die pH-Werte liegen im Bereich zwischen

6,5 und 7,0.

Gülleausbringung und Probennahmen

Die Beaufschlagung von Versuchsparzellen mit Antibiotika-belasteter Gülle, welche nach 8-

monatiger Lagerung noch erhebliche Rückstandskonzentrationen aufwies, war mit der

Aussaat von Feldsalat und Winterweizen zu koordinieren. Daraus resultierte der zeitliche

Ablauf zur Entnahme von Bodenproben (siehe [96,476]).

Ergebnisse der Rückstandsuntersuchung der Bodenproben

Zur Ermittlung der Bodenbelastung wurden exemplarisch die Bodenprobenreihen von 2

Versuchsparzellen, auf denen Winterweizen angebaut worden war, nach der

NH3/NH4Cl/EDTA-Methode und anschließender SPE (Probenaufbereitung s. Anhang

A.1.5.2) mittels LC-MS/MS untersucht. Um die Auswirkungen auf den Rückstandsgehalt

infolge einer wiederholten Düngung abschätzen zu können wurden Versuchsparzellen 1

(zweimalige Düngung mit Antibiotika-belasteter Gülle) und 4 (einmalige Düngung mit

Antibiotika-belasteter Gülle, zweite Düngung mit Mineraldünger) ausgewählt. Zusätzlich

wurden die Bodenmischproben der feiner unterteilten Bodenhorizonte aus Versuchsparzelle

1, auf der Feldsalat angebaut worden war, untersucht, da dadurch ein detailierterer Einblick

in die Verlagerungstendenz der Rückstände in tiefere Bodenschichten erwartet wurde.

Aus jeder Bodenmischprobe wurden zwei Stichproben (Doppelbestimmung) genommen und

pro Stichprobe der Gehalt von SFD, iso-CTC und e-iso-CTC dreimal mittels HPLC-MS/MS

bestimmt. Korrekturfaktoren (z.B. auf Grundlage der Wiederfindung oder Signalsuppression)

wurden nicht verwendet.

5 Ergebnisse und Diskussion 85

Die im Anhang A.4.2 (Tabellen A21-A28) zusammengefassten und beispielhaft graphisch

ausgewerteten Analysendaten (Abb. 30 und 31) lassen folgende Erkenntnisse zu:

► SFD und CTC (quantifiziert als Summenparameter iso-CTC/e-iso-CTC) wurden in

den oberen Bodenschichten (0 – 10 cm bzw. 0 – 25 cm (Pflugbereich)) eindeutig

identifiziert und quantitativ bestimmt.

► Die Massenkonzentrationen sind für CTC deutlich höher (maximal bis zu 240 μg/kg

Trockenmasse, TM) als für SFD (maximal 90 μg/kg TM). Dabei treten die höchsten

Werte jeweils nach der 2. Begüllung auf (Aufstockeffekt), wie in Abb. 30A und 31A

gezeigt.

► Innerhalb von 3 Monaten nach der 2. Gülleaufbringung nehmen die Konzentrationen

der (extrahierbaren) Arzneistoffrückstände deutlich bis in den Bereich der Nachweis-

bzw. Bestimmungsgrenzen ab.

► Der Aufstockeffekt tritt nicht ein, wenn die 2. Düngung mineralisch ist (Abb. 30B und

31B).

► In den tieferen Bodenschichten konnten SFD und CTC nicht nachgewiesen werden.

► Trimethoprim und der N4-Acetyl-Metabolit des Sulfadiazins waren in keiner

Bodenprobe nachweisbar.

►

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

1. Gülleaufbringung (Tag 1)

2. Gülleaufbringung (Tag 35)

Konzentration [µg/kg]

im Boden (Trockenmasse)

Zeit [Tage]

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

1. Gülleaufbringung (Tag 1)

2. Aufbringung von Mineraldünger

(Tag 35)

Konzentration [µg/kg]

im Boden (Trockenmasse)

Zeit [Tage]

A) B)

Abb. 30: SFD-Gehalte in Bodenproben („Winterweizen“, Bodentiefe 0 cm – 25 cm),

A: Parzelle 1, B: Parzelle 4, pro dargestellten Messpunkt eine Bodenprobe (N=3),

zwei Probenaufarbeitungen pro Bodenmischprobe (schwarz, rot)

5 Ergebnisse und Diskussion 86

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

100

120

140

160

180

200

220

240

260

1. Gülleaufbringung (Tag 1)

2. Gülleaufbringung (Tag 35)

Konzentration [µg/kg]

im Boden (Trockenmasse)

Zeit [Tage]

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

100

120

140

160

180

1. Gülleaufbringung (Tag 1)

2. Aufbringung von Mineraldünger

(Tag 35)

Konzentration [µg/kg]

im Boden (Trockenmasse)

Zeit [Tage]

A) B)

Abb. 31: CTC-Gehalte (Summe iso-CTC/e-iso-CTC) in Bodenproben („Winterweizen“,

Bodentiefe 0 cm – 25 cm), A: Parzelle 1, B: Parzelle 4, pro dargestellten Messpunkt

eine Bodenprobe (N=3), zwei Probenaufarbeitungen pro Bodenmischprobe

(schwarz, rot)

5.1.5 Diskussion der Ergebnisse

Die gefundenen unterschiedlichen Bodenbelastungen sind u.a. durch die unterschiedliche

Adsorbierbarkeit von CTC (hoch) und SFD / N4-SFD (gering) plausibel und stimmen

tendenziell mit publizierten Ergebnissen vergleichbarer Bodenuntersuchungen überein [81].

Hamscher et al. untersuchten mit belasteter Gülle gedüngten Boden und fanden ebenfalls

nur in einer Bodentiefe von 0 cm – 30 cm (Pflugtiefe) Tetracycline, in tieferen

Bodenschichten und im Grundwasser aber nicht [482]. Anhand der sehr starken Adsorption

der CTC’s an die Matrix „Boden“ ist ein Transport über die flüssige Phase in tiefere

Bodenschichten sehr unwahrscheinlich - abgesehen vom partikelgebundenen Transport, der

speziell im Rahmen des MUNLV-Projekts „Tierarzneimittel in der Umwelt: Bewertung von

Eintrag, Verlagerung und Resistenzentwicklung unter Gesichtspunkten des

Verbraucherschutzes“ [477] untersucht wurde (siehe Kap. 5.2). Zu berücksichtigen ist

weiterhin, dass Tetracycline überwiegend partikelgebunden mit Kotbestandteilen der Gülle

auf den Boden gelangen. Entsprechend wurden Tetracycline hauptsächlich an der

Bodenoberfläche in getrockneter Gülle gefunden [482].

Der im Boden wiedergefundene Gehalt an Sulfadiazin ist verglichen mit dem sehr hohen

Gehalt in der Gülle, wo es überwiegend in der flüssigen Phase vorliegt, relativ gering.

Offensichtlich ist nur ein geringer Anteil des SFD nach der Gülleausbringung vom Boden

adsorbiert worden und unmittelbar ins Bodenwasser (Porenwasser) gelangt. Aus den

vorliegenden Wetterdaten [476] geht hervor, dass es während und nach der

5 Ergebnisse und Diskussion 87

Gülleausbringung starke Niederschläge gab, wodurch vermutlich ein Teil des SFD in

Bodenschichten unterhalb der Beprobungstiefe und dadurch Richtung Grundwassersohle

ausgetragen wurde. Aquifier-Experimente im Rahmen des o.a. Projektes sollten hierüber zu

genaueren Aussagen über Verlagerungstendenzen führen.

Jedenfalls ist ein sehr schneller bzw. vollständiger (mikrobiologischer) Abbau von SFD

während der Bodenpassage unwahrscheinlich, und auch andere Austragspfade (z.B.

(Überland-)Abschwemmungen mit Regenwasser, Luftverwehungen) können sich nicht so

stark auswirken. Allgemein ist die Mobilität von Sulfonamiden im Boden durch andere

Studien belegt und eine Ursache für das Auftreten in Oberflächen- und Grundwässern

[107,457]. Demgegenüber kommen Martinez-Carballo et al. zu dem Schluss, dass SFD

schon während der Lagerung von Geflügelmist schnell abgebaut wird, da sie trotz

erheblicher Rückstande von SFD (max. 91 mg/kg) in Bodenproben mit Geflügelmist

gedüngten Feldern kein SFD nachweisen konnten [103]. Als eine weitere Ursache für die im

Verhältnis zur Gülle geringen wiedergefundenen Gehalte an SFD im Boden kommt auch

eine Bildung von sequestrierten und nicht-extrahierbaren SFD-Anteilen in Betracht, welche

mit dem angewendeten Extraktionsverfahren analytisch nicht erfassbar sind. Kreuzig et al.

ermittelten für SFD (14C-Radiotracer) bei einem güllebeaufschlagten Boden innerhalb eines

Zeitraums von 3 Tagen einen schnellen Transfer vom extrahierbaren zum nicht-

extrahierbaren SFD-Anteil (93%), während bei der untersuchten Rindergülle der

extrahierbare Anteil überwiegte [492]. Wogegen beim Boden ohne Güllezusatz der nicht-

extrahierbare Anteil erst nach 28 Tagen 90% betrug. Nach Untersuchungen von Bialk et al.

kann eine chemische Bindung (kovalente Bindung) von Sulfonamiden an organisches

Bodenmaterial der Grund für die Bildung nicht-extrahierbarer Anteile im Boden sein [473].

Die 2009 veröffentlichten Ergebnisse von Förster et al. [353] lassen darauf schließen, dass

auch die Bildung von sequestrierten SFD-Anteilen zu den verhältnismäßig niedrigen

nachgewiesenen SFD-Befunden beigetragen hat. Auch besteht die Möglichkeit, dass sich

weitere Metabolite (z.B. 4-OH-SFD) und Abbauprodukte gebildet haben [353], welche bei der

Analytik nicht berücksichtigt wurden.

Den beobachteten Effekt der Akkumulation von Antibiotika im Boden infolge einer

wiederholten Düngung mit Antibiotika-belasteter Gülle, sowie die Abnahme der

Konzentration durch Regenereignisse, zeigten ebenfalls Untersuchungsergebnisse von

Stoob et al. für das Sulfonamid Sulfamethazin [493].

5 Ergebnisse und Diskussion 88

5.1.6 Schlussfolgerungen

Die Ergebnisse belegen, dass bereits eine einmalige Düngung eines unbelasteten Bodens

mit Antibiotika-haltiger Gülle zu einer mehrmonatig nachweisbaren Kontamination der oberen

Bodenschichten führt. Daraus kann u.a. eine signifikante Zunahme Tetracyclin-resistenter

Bodenbakterien resultieren [494]. Die Verwendung (stark) Antibiotika belasteter Gülle als

Wirtschaftsdünger birgt also ein zusätzliches Risiko zur Verbreitung von Resistenzen in

terrestrischen Kompartimenten.

Von besonderer Relevanz für den Verbraucherschutz ist dabei, dass durch Grote et al. in

Kornproben des auf diesen Feldern gewachsenen Winterweizens CTC nachgewiesen

werden konnten [96]. Die Aufnahme von Sulfonamiden und Tetracyclinen durch

Nutzpflanzen bestätigten Grote et al. durch Versuche in Hydrokultur mit 3H-Sulfamethazin

und 3H-Tetracyclin [495].

Dies zeigt, dass CTC-Rückstände im Boden pflanzenverfügbar sind und damit auch ein

Transportpfad in die Nahrungskette besteht. Um eine Belastung von pflanzlichen Nahrungs-

und Futtermitteln abschätzen zu können, sind daher ausreichende Erkenntnisse über das

Vorkommen von Antibiotikarückständen im Boden und die möglichen Verlagerungspfade

nötig.

5 Ergebnisse und Diskussion 89

5.2 Untersuchungen zum Transportverhalten von Tetracyclin- und

Sulfonamidrückständen im Boden

Nach der Untersuchung der Bodenproben aus den Freilandversuchen blieb die Frage einer

möglichen Verlagerung von Antibiotikarückständen mit dem Sickerwasser ungeklärt, da

diese in tieferen Bodenschichten nicht nachgewiesen werden konnten. Die ermittelten

Abnahmen der Rückstände mit der Verweildauer im Boden konnten weder einer Verlagerung

noch einem Abbau eindeutig zugeordnet werden. Durch Starkregenereignisse unmittelbar

nach der Güllung könnten insbesondere Anteile der als im Boden mobil eingeschätzten

Sulfonamide mit dem Sickerwasser verlagert worden sein. Vor dem Hintergrund, dass

sowohl Sulfonamide als auch die im Boden als immobil eingeschätzten Tetracycline im

Grundwasser nachgewiesen wurden (s. Kap. 3.4), stellte sich generell die Frage nach deren

Transport-Verhalten und ihres Eintrags ins Grundwasser. Über das Transport-Verhalten von

Tetracyclin- und Sulfonamidrückständen im Boden waren zu Beginn der Untersuchungen

keine gesicherten Aussagen möglich. Da in Böden eine Verlagerung von eingetragenen

Arzneistoffen gelöst oder an Partikel gebunden stattfinden kann, sollten beide

Transportmöglichkeiten in den Untersuchungen berücksichtigt werden. Ziel war es dabei,

Aussagen über das Transport- und Abbauverhalten von Tetracyclin- und

Sulfonamidrückständen im System Boden-Wasser zu treffen und Aufschluss über die

Bedeutung des partikulären Transports und der Verlagerungsprozesse mit mobilen

Festphasen (Modellpartikel) zu gewinnen. Die durchgeführten Untersuchungen waren

Bestandteil des MUNLV-Projekts „Tierarzneimittel in der Umwelt: Bewertung von Eintrag,

Verlagerung und Resistenzentwicklung unter Gesichtspunkten des Verbraucherschutzes“

[477].

5.2.1 Voruntersuchungen zum Sorptionsverhalten und zur Komplexierung

Da organische Komponenten (Xenobiotika) sowohl in der Bodenlösung in freier oder

Metallionen-gebundener, komplexierter Form, als auch in partikulär gebundener Form

transportiert werden können, wurden mit ausgewählten Arzneistoffen exemplarische

Untersuchungen zum Sorptionsverhalten und zur Komplexierung durchgeführt. Die

Ergebnisse waren Grundlage für die Methodik der Säulenexperimente und dienten zur

Interpretation der Schlussfolgerungen, die aus diesen Versuchen abgeleitet wurden. Ferner

waren die Sorptionsuntersuchungen die Grundlage zur Charakterisierung der

Fluoreszenzeigenschaften CTC- und iso-CTC-beladener Partikel (Kap. 5.2.4).

5 Ergebnisse und Diskussion 90

5.2.1.1 Sorption von CTC, iso-CTC und SFD an Modellpartikel

Unter statischen Bedingungen wurden als Modellpartikel verschiedene Adsorbentien mit

zunehmender Komplexität der sorptionsaktiven Gruppen und Sorptionsmechanismen. Hierzu

wurden Kieselgel, Sand (Quarz- und Rheinsand), Aluminiumoxide, Tonminerale

(Montmorillonit (Bentonit) und Kaolinit (Ton1550)), und Ackerboden mit Lösungen, die

verschiedene Tetracycline oder Sulfadiazin enthielten, äquilibriert (Durchführung und

Kenndaten der Adsorbentien s. Anhang A.1.5.5).

5.2.1.1.1 Ergebnisse der Sorptionsuntersuchungen

In allen Versuchen war das Sorptionsgleichgewicht zwischen den Antibiotika und den

Modellpartikeln spätestens nach 3 Stunden erreicht, in einigen Fällen bereits nach wenigen

Minuten. Dabei spielen für die Kinetik zwei Vorgänge eine wesentliche Rolle:

• zum einen die schnelle Sorption an der äußeren Oberfläche der Partikel, die z.B. bei

Kieselgel dominiert,

• und zum anderen die langsamere Diffusion in Makroporen und Zwischenschichten

von Tonmineralien, die den verzögerten Verlauf der Sorption an die Partikel des

Oberbodens erklären können.

Tetracycline

In Abb. 32 ist der nach 3-stündiger Beladungszeit erreichte Sorptionsgrad [%] von CTC- und

iso-CTC-beladenen Modellpartikeln graphisch dargestellt. Tabelle 14 zeigt die den

Sorptionsgraden entsprechenden Beladungskapazitäten für CTC- und iso-CTC. Wie

erkennbar ist, liegen die Werte für die eingesetzten Modellpartikel zwischen 0,6 (Quarz) und

19 µmol/g (Aluminiumoxid).

5 Ergebnisse und Diskussion 91

Abb. 32: Sorptionsgrade von CTC und iso-CTC an Modellpartikel (Alox = Aluminiumoxid)

Tab. 14: Beladungskapazität der Modellpartikel für CTC und iso-CTC

CTC iso-CTC

Modellpartikel [mg/g] [µmol/g] [mg/g] [µmol/g]

Aluminiumoxid

(basisch) 9,7 18,8 9,1 17,7

Aluminiumoxid

(sauer) 9,8 19,0 9,8 19,0

Bentonit 9,7 18,8 1,5 2,9

Kieselgel 6,5 12,6 8,2 15,9

Oberboden 6,8 13,2 7,7 14,9

Quarz 0,6 1,2 2,2 4,3

Rheinsand 3,4 6,6 4,8 9,3

Ton 1550 7,3 14,2 7,9 15,3

Aus diesen Ergebnissen ergeben sich folgende Affinitätsreihen:

CTC:

Aluminiumoxid (sauer) ≈ Aluminiumoxid (basisch) ≈ Bentonit > Ton 1550 > Oberboden >

Kieselgel >> Rheinsand >> Quarz.

iso-CTC:

Aluminiumoxid (sauer) > Aluminiumoxid (basisch) > Kieselgel ≈ Ton 1550 ≈ Oberboden >>

Rheinsand >> Quarz ≈ Bentonit.

5 Ergebnisse und Diskussion 92

Neben strukturellen bzw. morphologischen Unterschieden der Partikel (z.B. spezifische

Oberfläche, funktionelle Gruppen, Poren etc.) spielt der pH-Wert der Umgebung eine

wichtige Rolle für die Sorption. Mit der Änderung des Milieus ändert sich der

Protolysezustand des Arzneistoffes (protoniert, deprotoniert) und auch der Protolysezustand

funktioneller, sorptionsaktiver Gruppen an der Oberfläche der Modellpartikel. Die Struktur der

protonierten Chlortetracycline ist in Abb. 33 und 34 dargestellt. Die angegebenen

Säurekonstanten (pka-Werte) geben Aufschluss über den Protonierungsgrad bei

verschiedenen pH-Werten. So liegt iso-CTC bei pH 9,5 fast ausschließlich anionisch vor, ein

Teil des CTC aber in einer nach außen elektrisch neutralen (zwitterionischen) Form, was u.a.

die großen Unterschiede der Sorptionsgrade an Bentonitpartikel erklärt (Abb. 32).

Abb. 33: Struktur von protonierten CTC und pKa-Werte [496] (Zuordnung der pKa-Werte s.

Kap. 3.3.1)

Abb. 34: Struktur von protonierten iso-CTC und pKa-Werte [496]

Da die Oberflächen des Bentonits negativ teilgeladen sind, wirkt sich die elektrostatische

Abstoßung infolge der unterschiedlichen Coulombschen Wechselwirkungen zwischen

Bentonit und dem Ladungszustand der verschiedenen Chlortetracycline unterschiedlich aus.

Dieses Verhalten zeigen tendenziell auch die verschiedenen Aluminiumoxide

(unterschiedlicher pH-Wert). Da bei einem pH-Wert von 8,0 aber nur ein kleinerer Teil des

iso-CTC negativ geladen vorliegt, ist der Effekt hier gering.

Solvent pKa1

pKa2

pKa3

OH OOH O

HO H

CCH

Wasser

3,33

±0,30

7,55

±0,02

9,33

±0,30

Wasser:Methanol

50 : 50 (w/w)

4,26

7,61

9,36

Solvent

pKa1

pKa2

pKa3

OH OOH O

N H

CCH

Wasser:Methanol

50 : 50 (w/w)

4,19

7,23

7,83

5 Ergebnisse und Diskussion 93

Wie in Tab. 15 zu sehen ist, zeigen die anderen eingesetzten Tetracycline gegenüber

Kieselgel ein sehr ähnliches Sorptionsverhalten, was auch anhand ihrer fast identischen

Struktur und den damit fast gleichen pka-Werten zu erwarten ist. Einzig iso-CTC weist einen

signifikant höheren Beladungsgrad auf. Dieser könnte in einer größeren räumlichen

Strukturflexibilität des nicht-planaren Ringsystems im Gegensatz zu den anderen

Tetracyclinen begründet sein, die es ermöglicht, eine größere Anzahl von verfügbaren

Sorptionsplätzen zu erreichen. Iso-CTC (Abb. 34) besitzt nicht das relativ unflexible

strukturtypische Tetracyclin-Vierring-System ABCD (s. Abb. 37) und es kann sich daher der

D-Ring (zumindest teilweise) um das AB-Ringsystem drehen.

Tab. 15: Beladungsgrad verschiedener Tetracycline an Kieselgel (ßTetacyclin=100 mg/L,

Volumen der Lösung: 100 mL (bidest. Wasser), Menge an Kieselgel: 1 g, pH=3,

Zeit:3h)

Tetracyclin-Derivat Beladungsgrad nach

3h [%]

CTC 65

e-CTC 64

anhydro-CTC 66

TC 65

OTC 66

DoxyC 63

DemecloC 67

iso-CTC 82

Sulfadiazin

Für SFD sind die Sorptionsgrade (Abb. 35) und Beladungskapazitäten (Tab. 16) im Vergleich

zu den Chlortetracyclinen relativ gering, was den Ergebnissen des „Antiinfektiva-Projekts“

[476] entspricht.

Folgende Affinitätsreihenfolge wurde für SFD ermittelt:

Oberboden > Aluminiumoxid > Ton 1550 ≈ Kieselgel ≈ Glaspartikel (Trisopor micro) >

Rheinsand ≈ Bentonit.

5 Ergebnisse und Diskussion 94

Abb. 35: Sorptionsgrade von Sulfadiazin an Modellpartikel

Tab. 16: Beladungskapazität der Modellpartikel für SFD

Modellpartikel [mg/g] [µmol/g]

Aluminiumoxid 2,2 8,6

Bentonit 0,1 0,4

Glaspartikel 0,9 3,8

Kieselgel 1,1 4,5

Oberboden 2,7 10,8

Rheinsand 0,1 0,4

Ton 1550 1,1 4,5

Abb. 36 zeigt die Struktur und die pka-Werte von SFD. Der pKa1 korrespondiert mit der

Protonierung der basischen Aminogruppe (-NH2) und der pka2 mit der Deprotonierung der

relativ sauren Amidgruppe (-NH-). Bei einem pH-Wert oberhalb des pka2-Wertes liegt das

Sulfadiazin also in einem überwiegend negativ geladenen Protolysezustand vor. Da die

Modellpartikel - abhängig vom pH-Wert - an ihren Oberflächen negative Teilladungen tragen,

ist die schlechtere Sorbierbarkeit unter den Versuchsbedingungen im Vergleich zu den

Chlortetracyclinen erklärbar. So zeigt SFD an Bentonit eine geringe Sorptionskapazität, die

mit der des iso-CTC an Bentonit vergleichbar ist, da es bei pH 9,5 ebenfalls anionisch

vorliegt. Die unterschiedlichen Affinitätsreihen lassen sich somit überwiegend auf die

unterschiedlichen pKa-Werte zurückführen.

5 Ergebnisse und Diskussion 95

S N

Abb. 36: Struktur von SFD und pKa-Werte [497]

5.2.1.2 Untersuchungen zum Komplexierungsverhalten von CTC und iso-CTC

Im Vorfeld der Transportuntersuchungen mit freien und partikelgebundenen Arzneistoffen in

Laborsäulen wurde das koordinationschemische Verhalten der Chlortetracyclin-

Komponenten CTC und iso-CTC gegenüber ausgewählten bodentypischen Metallionen (z.B.

Fe3+, Al3+, Ca2+) in Lösung UV-Vis-spektrophotometrisch charakterisiert. Die bekannte

ausgeprägte Tendenz der Tetracycline, Metallionen zu koordinieren [7], könnte bei den

beabsichtigten Transportuntersuchungen zu analytisch „maskierten“

Verlagerungsmöglichkeiten führen. Ein gelöster Transport wäre durch die Bildung von CTC-

bzw. iso-CTC-Komplexen, z.B. in Form von Huminsäure-Metallkation-Tetracyclin-Komplexen

[429], durchaus möglich. Zudem ist die Metallkomplexbildung von Tetracyclinen als

Sorptionsmechanismus von Bedeutung (siehe Kapitel 3.4). Daher ist mit einer Beeinflussung

der aus der Analyse von ammoniakalischen Bodenextrakten gewonnenen

Bilanzierungsdaten (s. Kap. 5.2.2: Ermittlung gelöster und partikulärer Anteile) durch

Sorptionseffekte an oxidisch/hydroxidischen Bodenkomponenten (z.B. pedogene

Metalloxide) zu rechnen.

Die folgenden Versuche sollten eine Einschätzung der zu erwartenden Effekte erlauben.

5.2.1.2.1 Eigenschaften von Chlortetracyclinen und Untersuchungsmethodik

Der Chlortetracyclinstruktur in Abb. 37 sind die möglichen Koordinationsstellen des CTC für

Metallkationen zu entnehmen. Die Koordinationstendenz der einzelnen Donoratome ist

abhängig vom Metallkation, Lösungsmittel und pH-Wert. Nach Sharma findet die

Chelatbildung von Tetracyclinen mit Metallkationen im Bereich O10 bis O12 statt [498], was

in Abb. 37 den Positionen I und II entspricht. Bei höheren Metallkonzentrationen ist eine

gleichzeitige Koordinierung mehrer Kationen an verschiedenen Positionen möglich.

Solvent

pKa1

pKa2

Wasser

2,10

6,28

O H

5 Ergebnisse und Diskussion 96

OH OOH O

CH3N

HO H

H3CCH3

NH2

II-A/II-B IV-A

III-A/III-B

D C B A

I II III IV

VII

910

10a 11 11a 12 12a

Abb. 37: Koordinationsstellen für Metallkationen an CTC (Unterscheidung der

Koordinationsstellen durch römische Ziffern nach Dos Santos [499])

In wässrigen Lösungen ist z.B. für Fe3+, Al3+ und Mg2+ das ß-Diketonsystem in Position II

eine bevorzugte Koordinationsstelle. Dos Santos [499] zeigte dies am Beispiel der Reaktion

von Al3+ mit Anhydro-Tetracyclin und Schneider [500] für Mg2+ mit Tetracyclin.

Für divalente 1:1 Tetracyclin-Metallkomplexe wurde die folgende Rangfolge nach der Größe

ihrer Stabilitätskonstanten aufgestellt:

Cd2+ < Mn2+ < Pb2+ < Zn2+ < Fe2+ < Co2+ < Ni2+ < Ca2+ < Cu2+ < Mg2+

Die Komplexbildungskonstanten für CTC-Metallkomplexe können recht hoch sein, was ein

Vergleich mit Komplexbildungskonstanten anderer organischer und anorganischer Liganden

verdeutlicht (Tab. 17).

Tab. 17: Komplexbildungskonstanten (log K) nach Gu [435]

Metallkomplex log K

Fe(III)-CTC 12,5

Al-CTC 13,4

Al-EDTA 19,07

Fe(III)-EDTA 25

Fe(III)-Zitronensäure 11,4

[Cu(NH3)4]2+ 13,3

Infolge der pH-Abhängigkeit der Metallkomplexbildung des Chlortetracyclins waren bei den

durchgeführten Messreihen die Versuchslösungen entsprechend zu konditionieren. So

5 Ergebnisse und Diskussion 97

wurden die pH-Werte 3, 5,5 und 8,7 ausgewählt, um in Lösung jeweils einen möglichst

einheitlichen Ladungszustand zu gewährleisten Bei pH 3 liegen Tetracycline (s. Abb. 38)

überwiegend als protonierte kationische Spezies und ein größerer zwitterionischer Anteil vor.

Ein niedrigerer pH-Wert wurde nicht gewählt, da dann mit einer Umwandlung in anhydro-

CTC zu rechnen wäre. Bei pH 5,5 bildet CTC fast ausschließlich ein ladungsneutrales

Zwitterion und bei pH 8,7 überwiegend eine anionische Spezies mit einer positiven und zwei

negativen Ladungen.

Ab pH>7 ist aber mit der Bildung von iso-CTC zu rechnen, was bei der Interpretation der

UV/vis-Spektren der Metall-Ligandgemische mit zu berücksichtigen ist (s.u.).

Abb. 38: Protolysegleichgewichte von Tetracyclin-Spezies in Abhängigkeit vom

pH-Wert nach Sassman [93] mit:

+: positive Ladung (protonierte funktionelle Gruppe)

0: keine Ladung (nicht protonierte und nicht deprotonierte funktionelle Gruppe)

-: negative Ladung (deprotonierte funktionelle Gruppe)

Bsp.: + 0 - bedeutet protonierte Dimethylamingruppe (C4), keine Ladung im

ß-Diketonsystem (C10-C12) und negative Ladung im Tricarbonylsystem (C1-C3)

(s. Abb. 37)

5.2.1.2.2 Spektrophotometrische Untersuchung der Reaktionen von Chlortetracyclinen

mit Metallionen

Zur Durchführung der Versuche wurden Aliquote einer CTC- bzw. iso-CTC Stammlösung

(0,1 mmol/L) mit verd. Salzsäure oder Ammoniakpuffer auf die pH-Werte 3, 5,5 oder 8,7

eingestellt und mit Metallsalzlösung versetzt, so dass definierte Metall-Ligand-Verhältnisse

vorlagen. Diese Lösungen wurden nach der Vereinigung entweder unmittelbar oder nach

Zeitintervallen (mit und ohne Einfluss von Tageslicht) gegen entsprechende

5 Ergebnisse und Diskussion 98

Referenzlösungen spektrophotometrisch vermessen. Die allgemeine Vorgehensweise ist in

Anhang A.1.5.6 näher beschrieben.

Nach dieser Versuchsdurchführung konnten neben Hinweisen auf die Bildung von

Metallkomplexen und der Isomerisierung des CTC auch Erkenntnisse über die Sorbierbarkeit

der Arzneistoffe an frisch gefällte, kolloidale Metallhydroxide gewonnen werden.

5.2.1.2.3 Ergebnisse aus den Untersuchungen zum Komplexierungsverhalten

Alterungseffekte metallfreier CTC-Lösungen

Der Einfluss von pH, Tageslicht und Lagerungszeit auf CTC- und iso-CTC-Lösungen wird

aus den Spektrenprofilen in Abb. 39 erkennbar. Bei pH 3 und pH 5,5 können nur geringe

Veränderungen der Spektren unter dem Einfluss von Zeit und Licht festgestellt werden. Eine

deutliche Veränderung zeigt sich nach 4 Tagen bei pH 8,7, was auf die Bildung von iso-CTC

zurückgeführt werden kann. Indizien für die Isomerisierung sind die Verschiebung des

Maximums von 277 nm (CTC-typisch) nach 290 nm (iso-CTC-typisch) und die leichte

Verschiebung des Maximums bei 369 nm (CTC-typisch) sowie die Abnahme der

Intensitäten.

250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

-frisch -pH3

-frisch -pH5,5

-frisch -pH8,7

-4d -dunkel -pH3

-4d -hell -pH3

-4d -dunkel -pH5,5

-4d -hell -pH5,5

-4d -dunkel -pH8,7

-4d -hell -pH8,7

Absorption [willk. Einheit]

Wellenlänge [nm]

Abb. 39: Alterungseffekte von CTC (ß=0,1 mmol/L) bei verschiedenen pH-Werten mit und

ohne Einfluss von Tageslicht

Um die Unterschiede genauer zu erkennen, wurden in Abb. 40 die Spektren einer

alkalischen Lösung von iso-CTC und CTC dargestellt.

5 Ergebnisse und Diskussion 99

250 275 300 325 350 375 400 425 450

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

CTC -frisch

CTC -dunkel -4d

CTC -hell -4d

iso-CTC -dunkel -4d

iso-CTC -hell -4d

iso-CTC -frisch

Absorption [willk. Einheit]

Wellenlänge [nm]

Abb. 40: Vergleich der Alterung von CTC und iso-CTC (jeweils ß= 0,1 mmol/L) mit und

ohne Einfluss von Tageslicht bei pH 8,7

Das Absorptionsprofil der frischen CTC-Lösung zeigt additiv die Spektren von CTC mit

partiellen Anteilen des unter den alkalischen Bedingungen zu erwartenden

Umwandlungsprodukts iso-CTC.

Nach vier Tagen gleicht das Spektrum des dunkel gelagerten CTC dem der frischen und der

vier Tage alten, dunkel gelagerten iso-CTC-Lösung. Das bei Tageslicht gelagerte CTC hat

sich aber vollständig in eine spektrenidentische Spezies umgewandelt, die iso-CTC unter

Lichteinwirkung bildet. Das ursprüngliche Maximum bei 348 nm ist völlig eliminiert.

Offensichtlich hat eine Umwandlung zu einem oder mehreren Photo(oxidations)produkten

stattgefunden. Nach D.L.J. Clive bildet sich Anhydro-Tetracycline durch Einwirkung von

Sauerstoff und Licht aus der Hydroxygruppe an C6 ein Hydroperoxid [501].

Die Spektren einer iso-CTC-Lösung zeigten bei pH 3 und pH 5,5 nur geringfügige

Abweichungen durch Alterung und Lichteinwirkung (ohne Abb.), im alkalischen Milieu führt

aber Lichteinwirkung ebenfalls zu den bereits erwähnten Photo(oxidations)produkten.

Die nähere Betrachtung des Mechanismus der Isomerisierung von CTC zum iso-CTC (Abb.

41) lässt eine Beeinflussung dieser Reaktion durch Metallionen erwarten:

Im ersten Schritt erfolgt eine Deprotonierung der Hydroxygruppe an C6 und eine

anschließenden –C-O-C- Brückenbildung zwischen C6 und C11. Im zweiten Schritt wird die

C-C-Bindung zwischen C11 und C11a gespalten, wobei das bindende Elektronenpaar eine

C=C-Doppelbindung zwischen C11a und C12 bildet. Der zweite Schritt ist dabei irreversibel.

5 Ergebnisse und Diskussion 100

OH OOH O

CCH

OH OOO

N H

CCH

OH OOH O

N H

CCH

Abb. 41: Isomerisierungsmechanismus von CTC zu iso-CTC nach D.L.J. Clive [501]

Die Koordination von Metallkationen an Position II führt nun zu einer Stabilisierung des CTC

bzw. seines reversiblen Produktes aus Reaktionsschritt 1, da sie sich auf die elektronischen

Eigenschaften des ß-Diketonsystems auswirken und somit den Bindungsbruch zwischen

C11 und C11a entgegen wirken. Bei der Komplexbildung handelt es sich jedoch um einen

reversiblen Prozess, wobei die Konzentration der gebildeten Metallkomplexe im zeitlichen

Mittel u.a. von der Konzentration an Metallkationen abhängt. Dies hat zur Folge, dass die

Isomerisierung durch Komplexbildung nicht völlig verhindert wird, sondern dass die

Isomerisierungsgeschwindigkeit mit steigender Metallkationenkonzentration abnimmt.

Einige der im Folgenden beschriebenen Untersuchungsergebnisse lassen auf derartige

Effekte schließen.

Reaktionen von CTC und iso-CTC mit Fe3+-Ionen

Bei diesen spektrophotometrischen Untersuchungen wurde die jeweilige „Reaktionslösung“

(Metallsalz- und CTC-/iso-CTC-Lösung, pH-konditioniert) gegen eine „Blindlösung“

(Metallsalzlösung, pH-konditioniert) gemessen.

Blind- und Reaktionslösungen, bei denen Fällungen erkennbar waren, wurden entweder

nach Homogenisierung durch Schütteln, direkt oder nach Zentrifugation photometriert.

5 Ergebnisse und Diskussion 101

Reaktion mit Fe3+

Bei Zugabe von gelöstem CTC zu einer Fe3+ Lösung tritt sofort eine intensive Farbvertiefung

der zunächst hellgelben Lösung auf, die sich mit steigendem pH-Wert vertieft.

Im schwach sauren Milieu (pH=3) sind die Maxima der 3:1 (Ligand:Metall-Verhältnis) und

2:1- Ansätze nur geringfügig vom Maximum des CTC-Spektrums bei 372 nm verschoben.

Die Lösungen mit höherer Metallkonzentration lassen, weitgehend lage- und Intensitäts-

konstant ein Maximum bei 378 nm erkennen (Abb. 42). Dies lässt darauf schließen, dass

sich nach Erreichung eines 1:1-Ligand-Verhältnisses die Komplexstöchiometrie nicht mehr

nachweisbar ändert.

225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

CTC

CTC:Fe (mol. Verhältnis)

1:3

1:2

1:1

2:1

3:1

Absorption [willk. Einheit]

Wellenlänge [nm]

Abb. 42: Veränderung der Spektrenprofile frischer CTC-Fe-Lösungen (CTC; ß=0,1 mmol/L)

bei pH 3 in Abhängigkeit vom molaren Ligand-Metall-Verhältnis

Der Fällungsbeginn für Eisen(III)oxid-Hydrate liegt – je nach Bedingungen - bei pH 2,2 bis

7,0 [502]. Erwartungsgemäß traten in der Blindlösung bei pH=5,5 Eisenhydroxidfällungen

auf.

In den frischen, noch klaren (bei 3:1, und 2:1 CTC-Fe-Verhältnis) bis leicht getrübten (bei

1:3, und 1:2-Verhältnis) „Blindlösungen“ (reine Eisenlösung, pH-konditioniert) und (bei 1:10

Verhältnis) „Messlösung“ (Eisen- und CTC-Lösung, pH-konditioniert) hatte sich nach 24

Stunden ein Eisenhydroxid-Niederschlag gebildet. Die Spektren der frischen, zentrifugierten

Messlösungen (ohne Abb.) weisen allgemein eine geringere Absorptionsintensität auf als

nach 24 h Standzeit (s. Abb. 43). Mit zunehmender Eisen-Konzentration zeigten die

Spektren der zentrifugierten CTC-Fe-Lösungen eine höher werdende Absorptionsintensität,

weil Eisenhydroxid in Form größerer kolloidaler, aggregierbarer Partikel aus den zugehörigen

5 Ergebnisse und Diskussion 102

Blindlösungen abgeschieden und der partikuläre Streulichtanteil bei der Differenzbildung

zwischen Blind- und Messlösung nicht mit erfasst wurde.

275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

CTC

CTC:Fe (mol. Verhältnis)

3:1

1:1

1:1-zentrifugiert

1:3

1:3-zentrifugiert

Absorption [willk. Einheit]

Wellenlänge [nm]

Abb. 43: Veränderung der Spektrenprofile von CTC-Fe-Lösungen (CTC; ß=0,1 mmol/L)

nach 24 h bei pH 5,5 nach Zentrifugation

Auffällige Änderungen des Absorptionsverlaufes in diesen Spektren – im Vergleich zum CTC

– sind ebenfalls auf Streueffekte zurückzuführen, wobei nicht-zentrifugierbare kolloidale

Anteile des in der Lösungsphase verbliebenen Eisenhydroxids adsorptiv CTC bzw. CTC-Fe-

Komplexe gebunden haben können (Abb. 44).

Abb. 44: Zentrifugierte Blind- (links, ohne CTC) und Messlösung (rechts, mit CTC (ß= 0,1

mmol/L)) der CTC-Fe Reihe bei pH 5,5; mol. CTC-Fe-Verhältnis: 1:10

Im alkalischen Milieu der bei pH 8,7 aufgenommenen Spektren sind durch die Bildung von

Fe-CTC-Komplexen und den oben beschriebenen Streueffekten geprägt, aber zusätzlich

durch die Bildung von iso-CTC (Abb. 45). CTC hat sich nach 7 Tagen nahezu vollständig in

iso-CTC umgewandelt.

5 Ergebnisse und Diskussion 103

250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

CTC -fr.

CTC:Fe (mol. Verhältnis)

1:3 -fr.

1:3 -fr. -zentrifugiert

CTC -24h

1:3 -24h -zentrifugiert

1:3 -24h

CTC -7d

1:3 -7d -zentrifugiert

1:3 -7d

iso-CTC

Absorption [willk. Einheit]

Wellenlänge [nm]

Abb. 45: Veränderung des CTC-Spektrenprofils (CTC; ß=0,1 mmol/L) in Abhängigkeit von

der Zeit (fr.: frisch, 24h: 24 Stunden, 7d: 7 Tage) und der Fe-Konzentration bei pH

8,7; schnelle Sorption an Eisenhydroxid (zentrifugierte Lösungen)

Vergleicht man die Spektren zentrifugierter CTC-Fe- und iso-CTC-Fe–Lösungen bei pH 8,7

nach einer Alterungszeit von 7 Tagen (ohne Abbildung), so finden sich spektrale Hinweise

(UV-Banden im Bereich von 306 – 500 nm) auf die Bildung von Fe-Komplexen des CTC, die

zumindest über diesen Zeitraum stabil sind. Tetracyclinkomplexe mit Metallkationen zeigen

charakteristische UV-Spektren mit Maxima bei 275 nm und - in Abhängigkeit von der

Konzentration und Spezies des Metallkations - zwischen 370-390 nm [7,128].

In den Zentrifugaten scheint nur noch ein geringer Teil des CTC bzw. iso-CTC verblieben zu

sein, da die Absorptionsintensität der Spektren stark abnahm. Offensichtlich werden

merkliche Anteile der Arzneistoffe vom Eisenhydroxid gebunden. Durch die

Untersuchungsreihen ergaben sich somit im pH-Bereich von 3 - 8,7 spektrometrische

Befunde für die Bildung von CTC-Fe-Komplexen und im Alkalischen von iso-CTC. Auch die

Verhinderung der Fällung von Eisenhydroxid bei pH 5,5 in Gegenwart des Antibiotikums

kann auf die Bildung von löslichen CTC-Fe-Komplexen zurückgeführt werden. CTC wird bei

pH 8,7 an ausgefälltem Eisenhydroxid effektiv sorbiert, iso-CTC zu einem geringeren Anteil

(Abb. 46).

5 Ergebnisse und Diskussion 104

275 300 325 350 375 400 425 450 475

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Absorption [willk. Einheit]

Wellenlänge [nm]

1:3 CTC:Fe

1:3 CTC:Fe - zentrifugiert

1:3 iso-CTC:Fe

1:3 iso-CTC:Fe - zentrifugiert

Abb. 46: Vergleich der Spektrenprofile von iso-CTC- und CTC-Fe(III)-Lösungen (iso-CTC

bzw. CTC mit ß=0,1 mmol/L) bei pH 8,7 nach Zentrifugation frischer Fällungen;

unterschiedliches Sorptionsverhalten der CTC´s

Hier spielen die unterschiedlichen Protolyseeigenschaften und damit der Ladungszustand

der im alkalischen Bereich dominierenden CTC- und iso-CTC-Spezies eine entscheidende

Rolle (siehe auch Kapitel 5.2.1.1). Entsprechend wird bei pH 8,7 durch die negative

Oberflächenladung des Eisenhydroxids bevorzugt CTC sorbiert.

Die Deutung der Messergebnisse korreliert mit Literaturdaten: Gu et al. fanden, dass die

Sorbierbarkeit von Tetracyclin an Eisenhydroxid bis pH 6 steigt, dann aber sinkt, wobei

gleichzeitig die Konzentration an gelöstem Eisen zunimmt [435]. Als plausible Ursache für

diesen Effekt wäre die Bildung von löslichen CTC-Fe-Komplexen anzunehmen.

Oxytetracyclin wird bei pH 8 von verschiedenen Eisenoxiden maximal sorbiert, wie Figueroa

et al. herausfanden [436].

Somit bieten die koordinativen Eigenschaften der Tetracycline Voraussetzungen, die im

Boden sowohl einen Transport in fluider Phase als auch partikulär prinzipiell ermöglichen.

Reaktionen mit weiteren Metallionen

Die Untersuchungen wurden ihn analoger Art und Weise wie mit Eisen-(III)-Salzen zusätzlich

mit anderen Schwermetall-, bzw. Übergangsmetall- und Erdalkalimetallionen durchgeführt.

Dazu zählen Al3+, Ca2+, Cu2+, Fe2+, Mg2+, Ni2+, Pb2+ und Zn2+.

Da sich die erzielten Ergebnisse und Beobachtungen im Vergleich zu den Versuchsreihen

mit Fe3+ recht ähneln, werden im Folgenden nur Auffälligkeiten bzw. Besonderheiten

angeführt.

5 Ergebnisse und Diskussion 105

Auch in Gegenwart anderer Metallionen verläuft die Isomerisierung des CTC zum iso-CTC

bei pH 8,7 verlangsamt. Die Geschwindigkeit der Isomerisierung nimmt dabei mit steigender

Metallionenkonzentration ab. Dies ist in Abb. 47 am Beispiel des Einflusses von Al3+ deutlich

zu erkennen.

275 300 325 350 375 400 425 450

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

CTC -fr.

CTC:Al (mol. Verhältnis)

1:3 -fr.

1:1 -fr.

3:1 -fr.

CTC -24h

1:3 -24h

1:1 -24h

3:1 -24h

CTC -7d

1:3 -7d

1:1 -7d

3:1 -7d

Absorption [willk. Einheit]

Wellenlänge [nm]

Abb. 47: Einfluss von Al3+ auf die Isomerisierung des CTC (CTC; ß=0,1 mmol/L) bei pH 8,7

in Abhängigkeit von der Zeit (fr.: frisch, 24h: 24 Stunden, 7d: 7 Tage) und dem

CTC:Metallverhältnis

Infolge der teilweise hohen Stabilitätskonstanten von CTC-Metallkomplexen (s. Tab. 17),

kann die Fällung von Schwermetallhydroxiden unterdrückt werden [477], aber auch die

Bildung konkurrierender Komplexe, wie es am Beispiel des Kupfers beobachtet wurde (Abb.

48). So kann die als qualitative Nachweisreaktion bekannte Bildung des tiefblauen

[Cu(NH3)4]2+-Komplexes durch den Zusatz von CTC ebenfalls unterdrückt werden. Auch die

Bildung des bläulich- bräunlichen Niederschlags aus Kupferhydroxid und Kupferoxid, der

sich bei pH 8,7 in der Kupferlösung (ohne CTC) bildet, zeigt einen anderen Verlauf durch

den Einfluss des Arzneistoffes.

Abb. 48: Einfluss von CTC auf die [Cu(NH3)4]2+-Komplexbildung

links: mit NH3 versetzte Cu-Lösung links: suspendierte CTC-Cu-Fällung

(ohne CTC) versetzt mit Überschuss NH3

rechts: Fällung in der Cu-Lösung rechts: gelb-grün-bräunliche Fällung in

(ohne CTC) der CTC-Cu-Lösung

5 Ergebnisse und Diskussion 106

5.2.1.3 Zusammenfassung und Schlussfolgerungen aus den Voruntersuchungen

Die wichtigsten Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:

Die unter Batchbedingungen ermittelten Sorptionsdaten stimmen tendenziell mit den

bekannten Literaturdaten überein [427,431,432,435,436,441]. Sowohl CTC als auch iso-CTC

zeigten eine hohe Sorptionsaffinität gegenüber anorganischem Material (Partikel oder

Metallhydroxidfällungen). Die unterschiedlichen CTC-Isomere zeigten dabei ein vom pH-

Wert abhängiges unterschiedliches Sorptionsverhalten. Insbesondere ein alkalisches Mileu

führte bei iso-CTC zu einer geringeren Sorption. Es konnte gezeigt werden, dass CTC und

iso-CTC in Metallhydroxidlösungen mitgefällt werden und auch als CTC-Metallkomplexe in

Lösung bleiben können.

Konkurrenzeffekte zwischen natürlich vorkommenden Komplexbildnern,

koordinationsfähigen Arzneistoffen (bzw. Antibiotikaeinträgen und Metallionen) können im

Boden bei Transportvorgängen eine Rolle spielen, wie auch in dem 2009 veröffentlichten

Review von Pan et al. deutlich wird [503]. Aber auch in der Aufbereitung von Bodenproben

sind derartige Reaktionen von Bedeutung, da an Bodenpartikel adsorbierte

Antibiotikarückstände mit starken Metallkomplexbildnern extrahiert werden, wie z.B. das in

dieser Arbeit verwendete Gemisch aus NH3/NH4Cl-Puffer und EDTA (s. Kap. 5.2.2).

Die spektrophotometrisch erhaltenen Ergebnisse bieten zusätzliche Informationen, um

Analysendaten der Säulenversuche („Bilanzierungsversuche“) kritisch zu interpretieren (Kap.

5.2.2/5.2.3).

Anhand der Sorptionsdaten wurden schließlich Montmorillonit, Kaolinit, Aluminiumoxid sowie

ein Montmorillonit-Huminsäurekomplex im zugrunde liegenden Projekt für den Einsatz in

Laborsäulen ausgewählt (Modellversuche zum partikelgebundenen Transport [477]). Die

Verlagerung in Form von Metallkomplexen bleibt dabei vorerst unberücksichtigt.

Über die Fluoreszenzeigenschaften Tetracyclin-beladener Modellpartikel wird in Kap. 5.2.4

berichtet.

5 Ergebnisse und Diskussion 107

5.2.2 Modellversuche zum Transportverhalten von SFD, CTC und

iso-CTC im Boden

Ein Ziel des Projektes „Tierarzneimittel in der Umwelt: Bewertung von Eintrag, Verlagerung

und Resistenzentwicklung unter Gesichtspunkten des Verbraucherschutzes“ [477] war

Erkenntnisse über das Transportverhalten von Arzneistoffen am Beispiel von SFD und CTC

(inkl. iso-CTC) im Boden zu gewinnen. Hierzu wurden u.a. auf Grundlage der Ergebnisse der

vorherigen Kapitel vom Institut für Wasserforschung (IfW, Dortmund) Versuche mit

unterschiedlichen Säulensystemen durchgeführt. Dabei sollte aufgrund der starken Sorption

von CTC´s an mineralische Partikel (Kap. 5.2.1.1) insbesondere die Rolle einer

Verlagerungsmöglichkeit durch partikelgebundenen Transport untersucht werden.

Die bei diesen Versuchen anfallenden Säuleneluate (Sickerwasserproben), sowie Boden-

und Gülle-Extrakte wurden an der Universität Paderborn auf ihre Antibiotika-Gehalte

analysiert.

Vom IfW zuvor durchgeführte Modellversuche mit Laborsäulen (Modellfilterkörper:

Glasperlen, Quarzsand, sandiger Ackerboden; Modellpartikel (als Suspension im „Regen“):

Aluminiumoxid, Kaolinit, Montmorillonit, Montmorillonit-Huminsäure-Komplex;

Randbedingung: starke Beregnung) zeigten, dass sowohl CTC als auch SFD

partikelgebunden und „gelöst“ (gelöst: freie Arzneistoffe, nicht sorbierte Arzneistoff-

Komplexe, nicht durch Zentrifugation abtrennbare partikelgebundene Arzneistoffe) mit dem

Sickerwasser verlagert werden können [477]. Da diese Säulenversuche eine wichtige

Grundlage zur Ergebnisinterpretation darstellen, sollen die wichtigsten Ergebnisse hier kurz

dargelegt werden.

SFD und CTC zeigten, wie zu erwarten war (siehe Kapitel 5.1 und 5.2.1.1), ein

unterschiedliches Transportverhalten. SFD wurde in Gegenwart rein anorganischer Partikel

(Aluminiumoxid, Kaolinit, Montmorillonit) nur „gelöst“ transportiert, aber bei den Versuchen

mit Montmorillonit-Huminsäure-Komplex-Partikeln wurden auch signifikante Anteile (11-33%)

des SFD partikelgebunden verlagert [477]. Der partikelgebundene Anteil vom verlagerten

CTC betrug bis zu 100% (Modellfilterkörper: sandiger Ackerboden). Auffällig war allerdings,

dass bei Verwendung von Montmorillonit-Huminsäure-Komplexen als Trägerpartikel in den

Versuchssäulen mit den „einfachen“ Filtermaterialen Glas und Quarzsand CTC zu 99% bzw.

100% gelöst mit den Sickerwasser ausgetragen wurde, während beim „komplexen“

Filtermaterial Ackerboden CTC zu 100% partikelgebunden eluiert wurden. Dem damaligen

Kenntnisstand nach, waren die bei diesen Versuchen gemachten Beobachtungen nur zum

Teil erklärbar. Neuere Erkenntnisse liefern aber weitere Erklärungsansätze für die

geschilderten Beobachtungen. Der beobachtete partikelgebundene Anteil am Transport von

SFD in Gegenwart von Montmorillonit-Huminsäure-Komplexen als Trägerpartikel ist vor dem

5 Ergebnisse und Diskussion 108

Hintergrund, dass Sulfonamide weitaus stärker an organischem als an anorganischem

(Boden-)Material sorbieren, plausibel [468].

Die Beobachtung, dass CTC bei den Filtermaterialien Glas und Quarz nur bis zu max. 8%

partikelgebunden ko-eluiert wurde, ist aufgrund der geringeren Sorption von CTC´s an

mineralische Partikel in alkalischer Umgebung (pH-Werte der Eluate: 8-9) erklärbar (siehe

Kapitel 5.2.1). Eine zumindest teilweise Umwandlung von CTC in das unter diesen

Bedingungen schlechter sorbierende iso-CTC hat sicherlich auch dazu beigetragen. Ein

wesentlich geringerer partikulärer Transportanteil (max. 1%) bei den Ton-Huminsäure-

Komplexen ist auf die Sorption von Huminsäuren an die mineralischen Partikel

zurückzuführen [503]. Hierdurch werden die Sorptionsplätze für CTC blockiert, sowie ein

Eindringen in die Zwischenschichten von Montmorillonit verhindert [440]. Im Ackerboden

wurde CTC dagegen bis zu 100% partikelgebunden transportiert. Ausschlaggebend hierfür

sind vermutlich die niedrigeren pH-Werte (pH=6,5-7,2) und ein dadurch bedingter höherer

Sorptionsgrad von gelösten CTC´s an die immobile Bodenmatrix und mobile Bodenpartikel.

Die Versuche zeigten für CTC einen von den Filtereigenschaften der Bodenkörper

(spezifische Oberfläche, Korngrößenverteilung, Sorption an die immobile Filtermatrix)

abhängigen Rückhalt in den Modellfilterkörpern. SFD wurde demgegenüber von den rein

anorganischen Filtermaterialen (Glas, Quarz; pH=8-9) nur gering bis gar nicht

zurückgehalten. Einzig im Ackerboden erfolgte ein etwa 30-40%iger Rückhalt von SFD,

welcher auf die Sorption an die (organische) Bodenmatrix (pH=6,6-7,4) zurückzuführen ist.

Versuche zur Remobilisierung von CTC durch simulierten Regen zeigten, dass CTC´s

infolge von Niederschlagsereignissen remobilisiert werden und sowohl gelöst als auch

partikelgebunden mit dem Sickerwasser transportiert werden.

Um Erkenntnisse über das Transportverhalten von Arzneistoffen in (natürlichen) Böden unter

natur- und praxisnahen Bedingungen (Niederschlagsbedingungen, Eintrag mit Gülle) zu

erlangen, wurden vom IfW Versuche mit zwei unterschiedlichen Säulensystemen

durchgeführt. Die bei diesen Versuchen anfallenden Messproben (Boden, Eluate, Gülle)

wurden im Rahmen dieser Arbeit mittels LC-MS untersucht und hinsichtlich der in Tabelle 18

aufgeführten Fragestellungen bewertet. Für eine Beurteilung des Verhaltens der Arzneistoffe

im Boden wurden vom IfW ermittelte bedeutsame Parameter wie pH-Wert, Leitfähigkeit (als

Summenparameter für den Gehalt an gelösten Ionen), Partikelkonzentration, gelöstes Eisen

(Fe2+) und mikrobielle Aktivität (Esterase) in die Ergebnisdarstellung und –Diskussion mit

einbezogen (Messung und Einzelheiten siehe [477]).

5 Ergebnisse und Diskussion 109

Tab. 18: Zusammenfassung der Versuchsansätze des IfW zur Untersuchung des Transports

von CTC, iso-CTC und SFD im Boden

Säulensystem Untersuchungsansatz Fragestellungen

Säule im Labormaßstab starke Beregnung

Ackerboden

Gülle + CTC+ iso-CTC +

SFD

unter Gesichtspunkten des

Labormaßstabs und extremer

Randbedingungen:

Verlagerung der Antibiotika-

Wirkstoffe mit dem

Sickerwasser

Rolle des partikelgebundenen

Transports von Antibiotika-

Wirkstoffen

Matrixeinfluss von Boden und

Gülle

Bilanzierung des Verbleibs

der Antibiotika-Wirkstoffe

Säule im halbtechnischen

Maßstab naturnahe Beregnung

Ackerboden

Gülle + CTC + iso-CTC +

SFD

Wie im Labormaßstab jedoch

unter Gesichtspunkten des

halbtechnischen Versuchs

und naturnaher

Randbedingungen

5.2.2.1 Verlagerung von SFD, CTC und iso-CTC in einem sandigen Ackerboden

nach Gülleapplikation

Die Verlagerung von SFD, CTC und iso-CTC wurde mit zwei Säulensystemen in

unterschiedlichen Maßstäben untersucht. Der Versuch im Labormaßstab erfolgte unter

extremen Niederschlagsbedingungen, um eine schnelle Sickerwasserströmung und hohe

Mobilisierung von Partikeln zu erreichen. Um das Verhalten der Arzneistoffe unter

realitätsnahen Bedingungen untersuchen zu können, wurden bei der Konzeption und

Durchführung des Versuchs im halbtechnischen Maßstab die Randbedingungen den

natürlichen Bedingungen auf dem Feld so weit wie möglich angepasst. Die wichtigsten

Randbedingungen der beiden Säulensysteme sind in Tabelle 19 gegenübergestellt.

5 Ergebnisse und Diskussion 110

Tab. 19: Kenngrößen der vom IfW eingesetzten Säulensysteme

Labormaßstab halbtechnischer

Maßstab

Säulenmaterial Borosilikatglas Borosilikatglas

Durchmesser der Säule 16 cm 45 cm

Mächtigkeit der

Ackerbodenschicht

12 cm 60 cm

Applizierte Güllemenge flächenbezogen

landwirtschaftsüblich

flächenbezogen

landwirtschaftsüblich

Einarbeitungstiefe der Gülle 2 cm 30 cm (Pflugtiefe)

Mit der Gülle applizierte

Arzneistoffe

CTC, iso-CTC, SFD CTC, iso-CTC, SFD

Strömungsverhältnisse in der

Säule

ungesättigt + transient ungesättigt + transient

Druckverhältnisse am

Säulenauslauf

max. 10 hPa Unterdruck offener Abfluss

Art der Beregnung Abfolge von extremen

Niederschlagsereignissen

gleicher Intensität und

Dauer

Abfolge naturnaher

Niederschlagsereignisse

unterschiedlicher

Intensität und Dauer

Versuchsdauer 42 Tage 98 Tage

Untersuchungsmethodik

Um zwischen partikelgebundenen und gelöstem CTC- und SFD-Anteil unterscheiden zu

können, wurde vom IfW die für die Analyse von Bodenproben entwickelte

Probenaufbereitung (Anhang A.1.5.2) für die wässrigen Proben der Säuleneluate modifiziert

(s. Abb. 49).

Hierzu wurde ein Probenaliquot des Säuleneluates vor der Extraktion mit EDTA-Ammoniak-

Puffer zentrifugiert, um Partikel und die daran gebundenen Arzneistoffe abzutrennen. Aus

der im Idealfall nahezu partikelfreien Lösung wurde die Konzentration von CTC und SFD

bestimmt. Ein zweites Probenaliquot wurde vor der Extraktion nicht zentrifugiert und enthielt

daher sowohl die „gelösten“ als auch partikelgebunden SFD- und CTC-Anteile. Durch diese

5 Ergebnisse und Diskussion 111

Vorgehensweise ergibt sich eine „Gesamtkonzentration“ und eine „gelöste Konzentration“,

sowie durch Differenzbildung der partikelgebundene Anteil.

Säuleneluat

Probenaliquot Probenaliquot

"gelöste Konzentration"

"Gesamtkonzentration"

Abb. 49: Probenaufbereitung zur Ermittlung gelöster und partikelgebundener CTC- und SFD-

Anteile [nach 477]

Aufgrund der eingesetzten Probenvorbereitung und der sich dadurch einstellenden pH-Werte

konnten in den aufbereiteten Proben überwiegend nur iso-CTC und e-iso-CTC vorliegen. Alle

Angaben zu CTC-Konzentrationen sind als Summe aller in der Originalprobe vorliegenden

Isomere und Epimere des CTC zu verstehen [477].

Die besondere Problematik bei der Bewertung der Modellversuche

Eine quantitativ-analytische Erfassung Festphasen (Partikel-) gebundenen CTC und SFD ist

nicht ohne weiteres möglich. Deshalb wurde vom IfW mit Hilfe des EDTA-Ammoniak-Puffers

eine Verdrängung der Antibiotika von den Festphasen-Oberflächen vorgenommen. Alle

bekannten leistungsfähigen Verfahren zur Bestimmung von Arzneistoffen in Böden beruhen

auf einer vorherigen Extraktion der Analyte (s. Kap. 4). Direkte Bestimmungsmethoden (für

Zugabe von EDTA-

Ammoniakpuffe

Zentrifugation und

Dekantieren des Überstands

Zentrifugation und

Dekantieren des Überstands

Zugabe von EDTA-

mmoniakpuffe

SPE, HPLC, LC-MS/MS SPE, HPLC, LC-MS/MS

5 Ergebnisse und Diskussion 112

nicht radioaktiv markierte Analyte) sind diesbezüglich nicht bekannt und konnten auch im

Rahmen dieser Arbeit nicht erfolgreich entwickelt werden (siehe Kap. 5.2.4). Jedenfalls kam

es, insbesondere in der „Gesamtprobe“, zu erheblichen Minderbefunden, die u.a. mit den in

Kapitel 5.2.3 beschriebenen Gründen erklärbar sind. Da dadurch eine Berechnung der

partikelgebundenen Anteile nicht möglich war, werden die Ergebnisse der Analysen der

jeweiligen Probenaliquote angegeben („vor-Probe“ = Pufferzugabe vor der Zentrifugation =

„Gesamtkonzentration“; „nach-Probe“ = Pufferzugabe nach der Zentrifugation = „gelöste

Probe“). Bei der Interpretation der dargestellten Daten ist zu berücksichtigen, dass es sich

bei der genutzten Trenngrenze zwischen gelösten und partikelgebundenen CTC sowie SFD

um eine operationelle Grenze handelt. Die „gelöste“ Fraktion („nach-Probe“) enthält noch

Partikel mit gegebenenfalls anhaftendem CTC und SFD. Dies gilt insbesondere für Partikel <

100 nm und Partikel mit spezifischen Gewichten nahe 1 g/cm3 (z.B. organische Stoffe) [477].

Ferner werden bei der Abtrennung komplexiertes CTC und SFD (z.B. Huminstoff- oder

Metall-Komplexe) zur gelösten Fraktion gerechnet. Weiterhin ist zu keinem Zeitpunkt eine

analytische Unterscheidung zwischen CTC und iso-CTC möglich. Aufgrund des in Kap. 5.2.1

beschriebenem teilweise sehr unterschiedlichen Sorptionsverhaltens (pH- und

Sorbensabhängig) der CTC-Isomere und der Komplexität der beteiligen Faktoren im Boden,

sind keine differenzierenden Aussagen bezüglich des Verhaltens der jeweils dotierten CTC-

Verbindungen möglich. Es könnte, wenn auch unwahrscheinlich, sowohl nur CTC als auch

nur iso-CTC verlagert worden sein.

Faktoren die sich auf die Sorptions- und Desorptionsprozesse auswirken, z.B. Ionenstärke

und pH-Wert, könnten sich im Sickerwasser (während des Transports) und im Eluat (im

Probensammelgefäß, nach Bodenpassage) unterschieden haben. Eine Bildung von Partikeln

(z.B. Eisenhydroxid) war daher auch im Eluat möglich. Der Nachweis von

partikelgebundenen CTC- bzw. SFD-Anteilen in den Eluatproben ist somit nicht

gleichbedeutend mit den tatsächlich mit der Sickerwasserströmung transportierten

partikelgebundenen Anteilen.

Alle Proben wurden zudem auf N4-SFD als mögliches Metabolisierungsprodukt von SFD hin

untersucht, welches aber in keiner der Proben nachweisbar war.

5.2.2.1.1 Versuchsansatz im Labormaßstab

Versuchsaufbau und Durchführung

Für die Untersuchung im Labormaßstab wurde der in Abbildung 50 dargestellte

Versuchsaufbau (Dimensionen: siehe Tabelle 19) mit einem seit mehr als 10 Jahre

5 Ergebnisse und Diskussion 113

brachliegenden stark humosen Ackerboden verwendet. Der Boden ist ein feinsandiger

Podsol mit einem hohen Schluffanteil (genauere Charakterisierung siehe Anhang A.3.2), in

welchem keine SFD- und CTC-Rückstände nachgewiesen werden konnten. Es wurden 65 ml

Gülle (siehe [477]), welche 17 Tage zuvor mit 6,51 mg CTC, 6,50 mg iso-CTC und 6,51 mg

SFD dotiert wurde, in die oberen 2 cm der Säulenfüllung eingearbeitet. In einen Zeitraum

von 42 Tagen wurden 13 Beregnungsereignisse (B1-B13) durchgeführt, welche sich aus

einer 10-stündigen Abfolge von 14 Beregnungen mit jeweils 170 ml künstlichem Regen

(siehe [477]) in 15 Minuten und 30 Minuten Trockenheit zusammensetzten. Die Abstände

zwischen den Beregnungsereignissen lagen zwischen 1 und 6 Tagen, wobei die zeitlichen

Abstände zum Ende hin zunahmen. Auf der Seite des Eluataustritts aus der Versuchssäule

wurde ein Unterdruck von maximal 10 hPa angelegt, um eine ausreichende Belüftung des

Bodens zur Verhinderung anaerober Milieubedingungen zu erreichen.

Das gesamte Säuleneluat aus je einem Beregnungsereignis ergab eine Sammelprobe,

wovon jeweils ein Probenaliquot zur Ermittlung der „Gesamtkonzentration“ und „gelösten

Konzentration“ entnommen wurde.

10 cm

Beregnungsanlage

sandiger Ackerboden (h = 12 cm)

Stützschicht (h = 3,5 cm)

Stützschicht (h = 1 cm)

Perkolat

Peristaltik-

Pumpe

Überlauf-

behälter Unterdruck-

apparatur

künstliches

Regenwasser

Kolben-

pumpe

Abb. 50: Schematischer Aufbau des Laborsäulensystems mit Ackerboden und Gülle nach

IfW [477]

Partikelkonzentration

Voraussetzung für die Untersuchung eines partikelgebundenen Transports der Arzneistoffe

ist, dass ausreichend Partikel mit dem Sickerwasser während des Säulenversuchs

transportiert werden. Weiterhin müssen die transportierten Partikel nahezu vollständig vom

den Säuleneluaten abtrennbar sein, um die Bedeutung des partikelgebundenen

Transportweges für die Arzneistoffe einschätzen zu können. Die Bestimmung der

5 Ergebnisse und Diskussion 114

Partikelkonzentration in den Säuleneluaten (unzentrifugiert/zentrifugiert) lieferte die in

Abbildung 51 dargestellten Ergebnisse [477].

0,001

0,010

0,100

1,000

10,000

100,000

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13

Beregnung

[mg/L]

Partikelkonzentration vor

Zentrifugation [mg/L]

Partikelkonzentration nach

Zentrifugation [mg/L]

Abb. 51: Entwicklung der Partikelkonzentration im Eluat des Laborsäulensystems [IfW, 477]

Die Partikelkonzentration fiel im Eluat der einzelnen Beregnungsereignisse von anfänglich

1,94 mg/L kontinuierlich ab und stagnierte schließlich bei etwa 0,3 mg/L. Somit stand bis

zum Versuchende ein Partikelkollektiv für einen partikelgebundenen Transport der

Arzneistoffe zur Verfügung. In den einzelnen Bodeneluaten konnten ca. 99% der

Partikelmasse durch Zentrifugation abgetrennt werden.

Ergebnisse des Versuchs im Labormaßstab

Bereits in den Eluaten der ersten drei Beregnungen erfolgte ein Durchbruch von CTC (Abb.

52) und SFD (Abb. 53). Die höchsten Konzentrationen von CTC (660 ng/L) und SFD (2100

ng/L) wurden im Eluat der zweiten Beregnung (Probe B2) ermittelt. Diese hohen

Konzentrationen gingen mit einem erheblichen Anstieg des pH-Wertes um 1 Einheit einher,

welcher auf einen niedrigeren pH-Wert des „Regenwassers“ von B1 zurückzuführen ist.

Beim Regenwasser des Regenereignisses B1 betrug bei pH-Wert 5,81. Bei alle anderen

Regenereignisse lag dieser um pH = 6,5.

Im Rahmen mikrobiologischer Untersuchungen des IfW wurde zudem eine Zunahme der

Esterase-Aktivitäten beobachtet, welches auf einen vermehrten Stoffwechsel der

Mikroorganismen im begüllten Bereich des Ackerbodens hindeutet [477].

In den darauffolgenden vier Eluaten konnte bei (leicht) fallender Tendenz der pH-Werte und

gleich bleibender Leitfähigkeit weder CTC noch SFD nachgewiesen werden. Mit den Eluaten

der Proben B8 und B9 erfolgte ein zweiter Durchbruch von CTC mit einer Konzentration von

bis 450 ng/L. Dieser Durchbruch ging einher mit einer nahezu doppelt so hohen Leitfähigkeit

der Eluate wie in den Proben zuvor. Mit Probe B10 ging die Leitfähigkeit wieder auf das

vorherige Niveau zurück und bis Versuchsende konnte in den Eluaten kein CTC

nachgewiesen werden. Für SFD konnte kein zweiter Durchbruch festgestellt werden. Eine

5 Ergebnisse und Diskussion 115

Berechnung des partikelgebundenen transportierten Anteils der Arzneistoffe war nicht

möglich, dennoch kann die höhere Konzentration von CTC in der „vor-Probe“

(Gesamtkonzentration) der Eluate B1 und B8 auf einen partikelgebundenen Ko-Transport

von CTC hindeuten. Gleiches gilt für SFD in der Probe B1, allerdings in einem geringeren

Ausmaß. Allerdings könnten auch organische Bestandteile, insbesondere aus der Gülle,

welche mit ins Sammelgefäß gelangt waren, zu einer erhöhten Sorption von SFD geführt

haben.

100

200

300

400

500

600

700

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13

Beregnung

CTC-Konzentration [ng/L]

Leitfähigkeit [µS/cm]

5,4

5,6

5,8

6,2

6,4

6,6

6,8

pH-Wert

nach-Probe [ng/L]

vor-Probe [ng/L]

Leitfähigkeit [µS/cm]

pH-Wert

Abb. 52: CTC-Konzentrationen, pH-Werte und Leitfähigkeiten im Eluat des

Laborsäulensystems (geändert nach [477])

500

1000

1500

2000

2500

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13

Beregnung

SFD-Konzentration [ng/L]

Leitfähigkeit [µS/cm]

5,4

5,6

5,8

6,2

6,4

6,6

6,8

pH-Wert

nach-Probe [ng/L]

vor-Probe [ng/L]

Leitfähigkeit [µS/cm]

pH-Wert

Abb. 53: SFD-Konzentrationen, pH-Werte und Leitfähigkeiten im Eluat des

Laborsäulensystems (geändert nach [477])

5 Ergebnisse und Diskussion 116

Nach Beendigung des Versuchs wurden Bodenproben als tiefengestufte Mischproben aus

der Säule entnommen. In der begüllten Bodenschicht (0-2 cm) wurden höhere Gehalte an

CTC gefunden als in der darunter liegenden unbegüllten Bodenschicht (Tab. 20). In

geringem Umfang fand mit dem Sickerwasser eine Verlagerung von CTC in tiefere

Bodenschichten statt, was auf einen retardierten Transport und/oder partikulären Ko-

Transport von CTC hinweist. SFD konnte in den Bodenproben nicht nachgewiesen werden.

Tab. 20: Antibiotika-Wirkstoffe im Boden am Ende des Säulenversuchs im Labormaßstab

Gehalt [µg/kg TM] Probe aus Bodentiefe [cm]

Summe CTC SFD

0-2 78,38 n.n.

2-10 23,52 n.n.

Auf Grundlage der in den Messproben ermittelten CTC- und SFD-Konzentrationen ist in

Tabelle 21 eine vom IfW erstellte Bilanz der wiedergefundenen Gehalte bzw.

Konzentrationen von CTC- und SFD zusammengefasst. Von den dotierten CTC-

Verbindungen konnten nur 0,01 % im Sickerwasser gefunden werden. Auch im Boden waren

die wiedergefundenen CTC-Gehalte mit 0,7 % sehr niedrig. SFD war im Sickerwasser nur zu

0,06 % der dotierten Menge nachweisbar und konnte im Boden nicht nachgewiesen werden.

In der Gülle wurden 35 Tage nach der Dotierung nur 3,67 % der dotierten CTC-

Verbindungen und 1,62 % des dotierten SFD wiedergefunden.

Tab. 21: Wiederfindung der Antibiotika-Wirkstoffe im Versuch in der Säule im Labormaßstab

Dotierte Wirkstoffmenge = 100%

(bezogen auf dotierte Gülle)

Summe CTC

[%]

SFD

[%]

im Boden 0,70 0

im Eluat 0,01 0,06

Wiederfindung

der dotierten

Wirkstoffmengen im Boden + Eluat 0,71 0,06

Alle Messproben (Eluate, Boden, Gülle) wurden zudem auf den SFD-Metaboliten N4-Acetyl-

SFD untersucht, welcher aber in keiner der Proben nachweisbar war.

Eine Zusammenstellung der Messwerte des Versuchs im Laborsäulensystem befindet sich in

Anhang A.4.3.

5 Ergebnisse und Diskussion 117

5.2.2.1.2 Naturnaher Versuchsansatz im halbtechnischen Maßstab

Versuchsaufbau und Durchführung

Für das Säulensystem im halbtechnischen Maßstab wurde vom IfW eine 1 m lange Säule mit

einem Innendurchmesser von 45 cm eingesetzt. Der Versuchsaufbau ist in den Abbildungen

54 und 55 dargestellt. Die Unterschiede zum Versuch im Labormaßstab sind in Tabelle 19

zusammengefasst.

Über einer Filterstützschicht wurde ein sandiger Ackerboden mit 60 cm Mächtigkeit gestört

und trocken eingebaut. Als Ackerboden wurde ein humoser Sandboden mit über 70 %

Feinsand eingesetzt. Er wurde einem Acker entnommen, der seit mehr als 10 Jahren brach

lag und nur sporadisch als Kuhweide genutzt wurde. Es konnten weder CTC noch SFD

nachgewiesen werden. In die oberen 30 cm des Bodens wurde, in Anlehnung an den

Pflughorizont eines Ackers, Gülle eingearbeitet. Entsprechend der landwirtschaftlichen

Praxis wurde mit 500 ml Gülle die Güllemenge eingearbeitet, die der maximal zulässigen

jährlichen Nährstoffzufuhr entspricht. 9 Tage vor der Einarbeitung wurden zu der

ursprünglich unbelasteten Gülle 49,98 mg CTC, 48,25 mg iso-CTC und 50,25 mg SFD

dotiert [477].

Onlinemessung

Trübung

Durchfluss

Leitfähigkeit

Sauerstoff

Filterstützschicht

aus Kies und Glaskugeln

Probensammelgefäß

Vorratsgefäß

Peristaltik-Pumpe

Beregnungseinheit

Steuer-PC

Datenerfassungs-PC

0,5

1,5

2,5

020 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

Zeit [mi n]

mm*m i n

Sommer-Starkregen

46 mm in 24 8 Min uten

Niederschlagsdaten

Glassäule 1 m x 0,45 m

mit humosem

Sandboden

Abb. 54: Bodensäule des

halbtechnischen Säulenversuchs

(für das Foto wurde die

Lichtschutzverkleidung

abgenommen) [IfW, 477]

Abb. 55: Schematischer Aufbau des halbtechnischen

Säulenversuchs [IfW, 477]

5 Ergebnisse und Diskussion 118

Die Beregnung erfolgte über eine PC-gesteuerte Beregnungsanlage. Verschiedene

naturnahe Beregnungsszenarien mit Trockenphasen zwischen den

Niederschlagsereignissen wurden nachgefahren (Abb. 56). Für eine naturnahe Beregnung

wurden typische Regenereignisse von einer realen Niederschlagsmessreihe abgeleitet [477]:

- Landregen: 27 mm Niederschlagshöhe in einem Zeitraum von 80h (ca. 4 L auf der

Säule)

- Starkregen: 46 mm Niederschlagshöhe in einem Zeitraum von 248 Minuten (ca. 7 L

auf der Säule)

- Platzregen: 16 mm Niederschlaghöhe in einem Zeitraum von 16 Minuten (ca. 2 L auf

der Säule)

Vom IfW wurden im Ablauf der Säule Durchfluss, Trübung (zur Berechnung der

Partikelkonzentration), elektrische Leitfähigkeit, Sauerstoffgehalt und Temperatur

kontinuierlich aufgenommen. Teilweise erfolgte zudem in den Eluaten eine Bestimmung der

Eisen(II)-Konzentration und des Gehalts an organischen Material (Summenparameter: SAK-

254 nm). Die vom IfW ermittelten Versuchsparameter werden, sofern ihnen eine relevante

Bedeutung zukommt, in die Ergebnisdarstellung und Diskussion mit einbezogen. Für nähere

Erläuterungen zu den Niederschlagsereignissen und den ermittelten Versuchsparametern

sei auf den Projektbericht [477] verwiesen.

Das Sickerwasser wurde in einem Glasbehälter als Sammelprobe für jedes

Beregnungsszenario aufgefangen und zur Analyse von CTC und SFD aufbereitet.

Abb. 56: Abfolge und Dauer der Beregnungs- und Trockenphasen des naturnahen

Konditionierung

11 d

Trocken-

phase

11 d

Eintrag de

CTC/SFD-belasteten

Gülle

Landregen 1

80 h

Trocken-

phase

3,5 d

Starkregen 1

248 min

Trocken-

phase

2 d

Platzregen 1

16 min

Trocken-

phase

5 d

Landregen 2

80 h

Trocken-

phase

3,5 d

Starkregen 2

248 min

Trocken-

phase

2 d

Platzregen 2

16 min

Trocken-

phase

5 d

Landregen 3

80 h

Trocken-

phase

3,5 d

Starkregen 3

248 min

Trocken-

phase

2 d

Platzregen 3

16 min

Trocken-

phase

5 d

Landregen 4

80 h

Trocken-

phase

3,5 d

Starkregen 4

248 min

Trocken-

phase

2 d

Platzregen 4

16 min

Trocken-

phase

5 d

Ausbau des Bodens

Trockenphase

10 d

Versuchsansatzes im halbtechnischen Maßstab [IfW, 477]

5 Ergebnisse und Diskussion 119

Partikelkonzentration

Durch eine hohe Aufzeichnungsdichte der am Säulenauslauf erfassten Daten (publiziert in

[477]) war es möglich, sehr detaillierte Informationen über das zeitliche Auftreten von

Sickerwasser und die Elution von Partikeln zu erhalten. Mit dem Sickerwasser wurden dabei

kontinuierlich Partikel transportiert, wobei deren Konzentration auch bei niedrigen

Sickerwasserabflüssen nicht unter 2 mg/L gefallen ist. Bei hohen Sickerwasserabflüssen

traten häufig Spitzenkonzentrationen von über 50 mg/L auf. Mit einem erhöhten

Sickerwasserabfluss wurde auch eine erhöhte Partikelkonzentration eluiert. Nach

Berechnungen des IfW stand bis zum Versuchende ein Partikelkollektiv für einen

partikelgebundenen Transport von Stoffen zur Verfügung. Die vom IfW ermittelten Daten zu

Partikelfracht und -Konzentration sind in Tabelle 22 zusammengefasst. Wie bei den Eluaten

aus der Säule im Labormaßstab, konnte durch Zentrifugation der größte Teil der

Partikelmasse abgetrennt werden.

Tab. 22: Partikelfracht und Partikelkonzentration im Eluat der im halbtechnischen Maßstab

durchgeführten Säulenversuche (erstellt nach [477])

Eluat

Regenereignis Partikelfracht [mg]

Partikelkonzentration

vor Zentrifugation

[mg/L]

Partikelkonzentration

nach Zentrifugation

[mg/L]

Landregen 1 7,1 2,4 0,5

Starkregen 1 29,9 4,7 2,2

Platzregen 1 40,2 5,9 6,4

Landregen 2 20,0 28,5 3,5

Starkregen 2 20,8 660,5 5,5

Platzregen 2 59,5 279,3 3,1

Landregen 3 111,4 43,2 1,9

Starkregen 3 39,6 1219,2 40,3

Platzregen 3 15,5 1219,2 3,3

Landregen 4 32,7 1219,2 4,4

Starkregen 4 23,0 1219,2 5,5

Platzregen 4 8,3 438,8 7,5

5 Ergebnisse und Diskussion 120

Besonderheiten während der Versuchsdurchführung

Nach IfW stellten sich zwischen Platzregen 1 und Landregen 2 infolge vermehrter

mikrobieller Aktivitäten und mangelnder Sauerstoffzufuhr über die Bodenluft im Boden

anaerobe hydrochemische Milieubedingungen ein, wodurch erhebliche Mengen von Fe(II)

aus den Mineralien des Bodens gelöst wurden. Dieses führte wahrscheinlich auch zur

Bildung von CTC-Fe-Komplexen (s. Kap. 5.2.1.2). Durch den Zutritt von Sauerstoff im

Probensammelgefäß wurde das gelöste Fe(II) oxidiert und als Eisen(III)-(hydr)oxid gefällt.

Dieser Vorgang hatte einen erheblichen Einfluss auf die Aufbereitung der Proben und die

anschließende analytische Bestimmung der Antibiotikawirkstoffe (siehe auch Kap. 5.2.3).

Ergebnisse des Versuchs im halbtechnischen Maßstab

Das erste Auftreten von CTC im Sickerwasser wurde in den Proben der dritten Beregnung

festgestellt (Abb. 57 und 58). Gleichzeit nahm der pH-Wert der Eluatprobe leicht zu. In dieser

Probe lag trotz der zu erwartenden Minderbefunde durch die Probenaufbereitung mit über

400 ng/L eine deutlich höhere „Gesamtkonzentration“ als die „gelöste“ Konzentration vor.

Dies ist möglicherweise ein Hinweis auf einen partikelgebundenen Transport von CTC zu

diesem Zeitpunkt des Versuchs. In der anschließenden Probe konnte CTC nur noch im

Probenaliquot zur Bestimmung der „gelösten“ Konzentration ermittelt werden.

In den beiden sich weiter anschließenden Eluaten konnte kein CTC nachgewiesen werden.

Ein erneuter CTC-Durchbruch erfolgt mit Landregen 3. In der „gelösten“ Fraktion wurde mit

etwa 580 ng/L die höchste im Eluat der Säule gemessene CTC-Konzentration bestimmt. Das

Auftreten des zweiten CTC-Durchbruchs ging mit einem deutlichen Anstieg in der

Partikelfracht (Tab. 22) einher, gleichzeitig nahm auch der pH-Wert des Säuleneluates

wieder zu. Ein dritter CTC-Durchbruch erfolgte mit Platzregen 3, welcher auch hier wieder

mit einem Anstieg des pH-Wertes einherging. Bereits im Eluat davor war der pH-Wert um

mehr als eine Einheit abgefallen und es pendelte bis Versuchsende ein insgesamt

niedrigeres pH-Niveau ein. Mit dem niedrigen pH-Werten nahm gleichzeitig die

Partikelkonzentration in den Säuleneluaten enorm zu und blieb bis Versuchsende auf einem

sehr hohen Niveau (siehe Tab. 22). Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass mit

Starkregen 3 die Pufferkapazität des Versuchsbodens durch die ständige Beregnung

(Regenwasser: ca. pH 6,5) erreicht wurde und es infolge der sich neu eingestellten

niedrigeren pH-Bedindungen zu einem erhöhten Eisenaustrag (insbesondere Fe2+) mit dem

Sickerwasser gekommen. Eine erhöhte mikrobielle Aktivität kommt allerdings auch in

Betracht. Aufgrund der komplexen Vorgänge in Böden lässt sich der Hintergrund anhand der

vorhandenen Daten nicht klären. Jedenfalls wurde das Fe(II) in den Sammelproben durch

5 Ergebnisse und Diskussion 121

den Zutritt von Sauerstoff im Probensammelgefäß oxidiert und als Eisen(hydr)oxid gefällt.

Dies erklärt auch die Beobachtung einer stark erhöhten Partikelkonzentration in

Sammelproben dieser Eluate.

Ein Nachweis von SFD war im Gegensatz zum Versuch im Labormaßstab in keinem der

Eluate nachweisbar. Hier spielt möglicherweise die extreme Beregnung im Versuch des

Labormaßstabes und die damit verbundene relativ schnelle Ausspülung von flüssigen

Güllebestandteilen eine Rolle. Im Versuch des halbtechnischen Maßstabs bestanden

jedenfalls deutlich längere Kontaktzeiten der Antibiotika-Wirkstoffe mit der Bodenmatrix.

100

200

300

400

500

600

Landregen 1

Starkregen 1

Platzregen 1

Landregen 2

Starkregen 2

Platzregen 2

Landregen 3

Starkregen 3

Platzregen 3

Landregen 4

Starkregen 4

Platzregen 4

[ng/L]

CTC nach-Probe [ng/L]

CTC vor-Probe [ng/L]

Wechsel zu anaeroben Bedingungen

Abb. 57: CTC-Konzentrationen im Eluat des halbtechnischen Säulensystems (geändert nach

[477])

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Landregen 1

Starkregen 1

Platzregen 1

Landregen 2

Starkregen 2

Platzregen 2

Landregen 3

Starkregen 3

Platzregen 3

Landregen 4

Starkregen 4

Platzregen 4

CTC [ng/L], Leitfähigkeit [µS/cm]

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

pH [-]

CTC nach-Probe [ng/L]

CTC vor-Probe [ng/L]

Leitfähigkeit [µS/cm]

pH-Wert

Wechsel zu anaeroben Bedingungen

Abb. 58: CTC-Konzentrationen, pH-Werte und Leitfähigkeiten und pH-Werte im Eluat des

halbtechnischen Säulensystems (geändert nach [477])

5 Ergebnisse und Diskussion 122

Nach Versuchsende wurden Bodenproben als tiefengestufte Mischproben aus der Säule

entnommen. CTC konnte ausschließlich in den begüllten Bodenschichten nachgewiesen

werden (Abb. 59). Innerhalb des begüllten Bodenbereichs steigen die Gehalte mit

zunehmender Bodentiefe an. Unter der Annahme einer gleichmäßigen Einarbeitung der

Gülle betrugen die CTC-Gehalte, bezogen auf die der Gülle zudotierten CTC-Menge, im

begüllten Bodenbereich etwa 1500 µg/kg TM.

Die Gehalte in der untersten begüllten Bodenschicht lagen bei 820 μg/kg TM. In den darüber

liegenden Bodenschichten hatten die CTC-Gehalte dagegen deutlich abgenommen. Als

mögliche Ursachen hierfür kommen sowohl Verlagerungsprozesse als auch eine biotische

oder abiotische Umsetzung von CTC-Verbindungen in Frage. Eine Verlagerung von CTC-

Verbindungen in die Bodenschichten unterhalb des begüllten Bereichs konnte nicht

nachgewiesen werden. Im Sickerwasser konnten nur geringe Anteile der dotierten CTC-

Verbindungen gefunden werden. Vor dem Hintergrund der Entwicklung anaerober

hydrochemischer Milieubedingungen im Boden der Säule war mit zunehmender Bodentiefe

mit abnehmenden Sauerstoffgehalten der Bodenluft zu rechnen. Dies könnte eine Erklärung

für eine geringere Umsetzung von CTC-Verbindungen mit zunehmender Bodentiefe sein.

Auch SFD konnte nur in den begüllten Bodenschichten nachgewiesen werden (Abb. 59).

Mit zunehmender Bodentiefe im begüllten Bereich des Bodens wurden leicht ansteigende

SFD-Gehalte ermittelt. Unter der Annahme einer gleichmäßigen Einarbeitung der Gülle und

auf Basis der zudotierten SFD-Menge betrugen SFD-Gehalte bei Versuchsstart etwa 1500

µg/kg TM.

Die im begüllten Bereich ermittelten SFD-Gehalte lagen weit unter dieser Größe. Es konnten

nur SFD-Gehalte von maximal 43 μg/kg TM nachgewiesen werden. Hierfür kommen

dieselben Ursachen wie für das Verhalten der CTC-Verbindungen in Frage. Teilweise könnte

SFD auch als 4-OH-SFD vorgelegen haben [353]. Dieser Metabolit wurde aber bei der

Analyse nicht mit untersucht.

Insbesondere wird aber vermutet, dass die niedrigen Gehalte von SFD im begüllten

Bodenbereich auf die Bildung von sequestrierten und nicht-extrahierbaren SFD-Anteilen

zurückzuführen sind (siehe Diskussion Kap. 5.1.5). Auch das SFD nicht im Sickerwasser des

halbtechnischen Maßstabes nicht nachgewiesen werden konnte, kann ein Indiz hierfür sein,

da diese Bindungsprozesse mit zunehmender Kontaktzeit ein größeres Gewicht besitzen

[9,10,452,470,474].

5 Ergebnisse und Diskussion 123

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0-5 cm 5-10 cm 10-20 cm 20-30 cm 30-40 cm 40-50 cm 50-60 cm

Filterkies

Wirkstoffgehalte im Boden [µg/kg TM]

CTC-Gehalt

SFD-Gehalt

Abb. 59: Gehalte von CTC und SFD im Boden des halbtechnischen Säulensystems nach

Abschluss der Beregnung (geändert nach [477])

Eine berechnete Bilanz der wiedergefundenen CTC- und SFD-Gehalte bzw. Konzentrationen

ist in Tabelle 23 zusammengefasst. Es konnten nur 0,002 % der dotierten CTC-

Verbindungen im Sickerwasser gefunden werden. Im Boden (nur begüllter Bereich) betrug

die wiedergefundene Menge an dotierten CTC insgesamt 28 %. SFD war im Sickerwasser

nicht nachweisbar, und im Boden konnten nur 2,9 % des zur Gülle dotierten SFD analytisch

nachgewiesen werden.

In der Gülle wurden 3 Monate nach der Dotierung 28,15 % der zugesetzten CTC-

Verbindungen und nur 0,02 % des SFD wiedergefunden.

Tab. 23: Wiederfindung von CTC und SFD im Versuch des halbtechnischen Maßstabs

Dotierte Wirkstoffmenge = 100%

(bezogen auf dotierte Gülle)

Summe CTC

[%]

SFD

[%]

im Boden 28,0 2,9

im Eluat 0,002 0

Wiederfindung

der dotierten

Wirkstoffmengen im Boden + Eluat 28,0 2,9

Wie es zu den geringen wiedergefundenen Gehalten von SFD und CTC in der Gülle

gekommen ist, kann aufgrund der komplexen Zusammenhänge nicht gesagt werden.

Gleiches gilt im Übrigen auch für die im Labormaßstab eingesetzten Gülle. Hier spielen auch

wieder abiotischer und biotischer Abbau, sowie die Bildung von nicht-extrahierbaren und

sequestrierten Anteilen eine Rolle.

5 Ergebnisse und Diskussion 124

Eine Zusammenstellung der Messwerte der Versuche im halbtechnischen Maßstab befindet

sich in Anhang A.4.3.

5.2.2.2 Zusammenfassung: Ergebnisse der Säulenversuche und

Schlussfolgerungen

Die wichtigsten Ergebnisse aus den Säulenversuchen lassen sich wie folgt zusammenfassen

und interpretieren:

Die Ergebnisse der Sickerwasserproben vom Säulenversuch im halbtechnischen Maßstab

zeigen, dass CTC auch durch Bodenschichten von 60 cm Tiefe verlagert werden kann.

Daher besteht die Möglichkeit einer Verlagerung bis in Grundwasser. Auch SFD kann, wie

der Versuch im Labormaßstab zeigt, bei einem extremen Niederschlagsereignis im Boden

potentiell verlagert werden. Hamscher et al. konnten bei einer Feldstudie nach vier Jahren

ein erstmaliges auftreten von CTC im Grundwasser nachweisen [85]. In Lysimeterversuchen

fanden Henkelmann et al. im Sickerwasser Spuren von CTC und SFD unterhalb einer

Bestimmungsgrenze von 3 µg/L [418]. Boxall et. al wiesen in Lysimeterversuchen einen

Transport des Sulfonamids Sulfachloropyridazine mit dem Sickerwasser auch schon unter

typischen Niederschlagsbedingungen nach [504].

Da der in den Versuchen verwendete Boden vor den Einbau in die Säule manuell zerkleinert

und homogenisiert wurde, ist ein Transport von SFD und CTC auch in Böden ohne

ausgeprägte Makroporensysteme (z.B. Wurmgänge, Wurzelkanäle) möglich.

Auffällig war, dass die CTC-Durchbrüche mit einer steigenden pH-Tendenz oder Leitfähigkeit

in der Sammelprobe einhergingen. Der Einfluss von pH und Ionenstärke auf Sorptions- und

Desorptionsprozesse bei Tetracyclinen ist bekannt (siehe Kap. 3.4), doch wie diese sich auf

den Transportweg ausgewirkt haben, kann anhand der Analysen und der vom IFW

ermittelten Parameter nicht gesagt werden.

Hinsichtlich der Tiefenverlagerung und Immobilisierung der Antibiotika-Wirkstoffe im Boden

ergaben die durchgeführten Versuche unterschiedliche Ergebnisse. So konnte im Boden des

Laborsäulensystems eine Verlagerung von SFD und CTC unterhalb des begüllten Bereichs

festgestellt werden. Im Boden des Säulenversuchs im halbtechnischen Maßstab wurde

dagegen keine Verlagerung über den begüllten Bodenbereich hinaus festgestellt. Ursache

hierfür ist eventuell die starke Beregnung der Säule im Labormaßstab bei einer Bodentiefe

von nur 2 cm für den begüllten Bereich. Möglicherweise spielen hier aber auch die

unterschiedlichen hydrochemischen Randbedingungen (z.B. pH-Wert) in den

Säulensystemen eine Rolle.

Eine Bilanzierung des Verbleibs der mit der Gülle in den Boden eingebrachten Antibiotika-

Wirkstoffe war in keinem der untersuchten Systeme möglich. Es wurde grundsätzlich nur ein

5 Ergebnisse und Diskussion 125

Teil der dotierten Wirkstoffe wiedergefunden. Doch die niedrigen Werte, die von SFD in der

Gülle und Boden wiedergefunden wurden, stimmen tendenziell mit vergleichbaren

Untersuchungen überein. Für Sulfadiazin im Boden ermittelten z.B. Kreuzig et al. eine

Halbwertszeit von 3 Tagen [474].

Der in den Böden wiedergefundene SFD-Gehalt ist im Vergleich zu der dotierten

Güllemenge sehr gering. Demgegenüber ist der wiedergefundene CTC-Gehalt in den Böden

um ein vielfaches höher. Dies stimmt tendenziell mit den Ergebnissen des „Antiinfektiva-

Projekts“ [476] überein (siehe Kap. 5.1).

Es gibt Hinweise auf einen partikulären Transport von CTC, es ist aber nicht abzuschätzen,

in welchem Umfang dieser zum Transport von CTC mit dem Sickerwasser beigetragen hat.

5.2.3 Ergänzende Untersuchungen zur Rückstandsanalytik

„Differenzierung gelöster und partikelgebundener Spezies“

Wie zu Beginn von Kap. 5.2.2 erwähnt, gab es Probleme bei der analytischen

Differenzierung zwischen gelösten (eluierten) und partikelgebundenen (eluierten) Antibiotika-

Wirkstoffen. Durch Analyse zentrifugierter und nicht-zentrifugierter Probenaliquote wurde

eine „Gesamtkonzentration“ und eine „gelöste Konzentration“ erhalten, und durch

Differenzbildung schließlich der „partikelgebundene Anteil“. Da mit der angewandten

rückstandsanalytischen Methode (Desorption, HPLC-UV-MS/MS-Bestimmung) eine direkte

Bestimmung von Festphasen-gebundenem CTC und SFD nicht möglich ist, wurden mit dem

schon erwähnten EDTA-Ammoniak-Puffer die Antibiotika von den Festphasen-Oberflächen

desorbiert. Mit dieser Methode gab es bei „natürlichen“ Ackerboden-Proben – aber nicht bei

den Modellfilterkörpern und Modellpartikeln - erhebliche Minderbefunde, vor allem in der

„Gesamtprobe“. Auffällig war, dass diese Minderbefunde mit ansteigender Eisen-

konzentration korrelieren. Deshalb wurden sowohl Modellversuche auf der Basis der in Kap.

5.2.1.2 beschriebenen Metallkomplexierungsstudien durchgeführt, um die Ursachen der

beschriebenen Effekte aufzuklären, als auch Voruntersuchungen zur Anwendbarkeit einer

alternativer (Screening-) Methoden mit Hilfe der Fluoreszenzspektrometrie (s. Kap. 5.2.4).

Einfluss der Eisen(III)hydroxid-Fällung auf die Wiederfindung

Bei diesen Modellversuchen wurden die experimentellen Bedingungen bei den

entscheidenden (analytischen) Stadien der Laborexperimente näherungsweise simuliert.

Untersuchungsmethodik

In zwei getrennten Ansätzen (Version I und II, s. Abb. 60) wurde aus schwach salzsaurer

FeCl3 –Lösung Eisen(III)-hydroxid mit NH3/NH4Cl-Puffer (pH 10) ausgefällt und dann die

5 Ergebnisse und Diskussion 126

erhaltene Suspension mit Salzsäure auf pH 7 eingestellt. Bei der Version I der

Versuchsdurchführung wurde CTC nach der Fällung der Suspension zudotiert, bei der

Version II vor der Fällung zu der Fe3+- Lösung, wie den Schemata der Abb. 60a und b zu

entnehmen ist. Die erhaltenen Reaktionsgemische wurden jeweils parallel nach zwei

unterschiedlichen Varianten aufgearbeitet, analog zu der Probenvorbereitung der Boden-

und Modellpartikelproben:

- Direkte „Extraktion“ des Hydroxid-sorbierten CTC durch Zusatz von

NH3/NH4Cl/EDTA-Puffer (pH 10), anschließend Zentrifugation und nachfolgend

Analyse des Zentrifugates.

- Sofortige Zentrifugation, anschließende Extraktion des Zentrifugates mit dem Puffer

und nachfolgende Analyse.

Die genaue Versuchsdurchführung ist in Anhang A.1.5.8 beschrieben. Die Analyse der

Extrakt-Proben erfolgte nach SPE-Aufarbeitung mittels HPLC-DAD-MS2.

CTC

(100 µg/L)

Zentrifugation

Extraktion:

Ammoniak-EDTA-Puffer

pH 10

Zentrifugation

Probe A Probe B

SPE und Analyse (HPLC-DAD-MS

)

Extraktion:

Ammoniak-EDTA-Puffer

pH 10

Hydroxidfällung

pH = 7

+-Lösung (50 mg/L)

NH3/NH4Cl-Puffer, HCl

Abb. 60a: Versuchsschema zur Untersuchung des Einflusses der Eisenhydroxidfällung auf

die Sorption und Extrahierbarkeit von CTC; Version I: CTC-Dotierung nach der

Fällung

5 Ergebnisse und Diskussion 127

Zentrifugation

Probe C

SPE und Analyse (HPLC-DAD-MS

)

Zentrifugation

NH3/NH4Cl-Puffer, HCl

pH = 7

Hydroxidfällung

+-Lösung (50 mg/L)

CTC

(100 µg/L)

Extraktion:

Ammoniak-EDTA-Puffer

pH 10

Probe D

Extraktion:

Ammoniak-EDTA-Puffer

H 10

Abb. 60b: Versuchsschema zur Untersuchung des Einflusses der Eisenhydroxidfällung auf

die Sorption und Extrahierbarkeit von CTC; Version II: CTC-Dotierung vor der

Fällung

Es wurde erwartet, dass nach Version I der Fällungsabläufe das zugegebene CTC bevorzugt

adsorptiv an die Oberflächen des Hydroxidgelkörpers gebunden wird, während nach der

Version II mit Einschluss- bzw. Okklusionseffekten („Mitfällung“ von CTC) zu rechnen wäre.

5.2.3.1 Ergebnisse

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 24 aufgeführt. Daraus ergibt sich ein

deutlicher Zusammenhang zwischen der Reihenfolge von Fällung und CTC-Dotierung und

der Extrahierbarkeit bzw. Wiederfindung von CTC (während der Extraktion zum iso-CTC

umgewandelt).

In der Probe B der Versuchversion I (CTC-Dotierung nach der Fällung) ist die Wiederfindung

mit 91,7% CTC am höchsten (Tab. 24), in der analogen Probe der Version II (Dotierung vor

der Fällung) mit 26,3% aber erheblich niedriger. Daraus ist der Schluss zu ziehen, dass die

desorbierende Wirkung des Extraktionspuffers überwiegend auf die zugänglichen äußeren

(und inneren) Oberflächen des Eisenhydroxidgels bzw. Kolloids beschränkt ist, während

mitgefällte, teilweise okkludierte Anteile des Chlortetracyclins nur zu einem geringen Teil

erfassbar sind. Um CTC/iso-CTC vollständig extrahieren zu können, müsste das

Eisenhydroxid vollständig in Lösung gebracht werden.

5 Ergebnisse und Diskussion 128

Wie aus den Ergebnissen der Sorption an Modellpartikeln zu erwarten war, ist der gelöste

Anteil an CTC in den Proben sehr gering. Die Wiederfindungen von Probe A (0,4%) und

die Wiederfindung von CTC

(HPLC-MS/MS, 3-fach Injektion) (s. Schemata in Abb. 60a und b; 100%

Wiederfindung bei 10000 µg/L)

P[µg/L] [µg/L] [%]

Probe C (3,3%) belegen dies eindeutig. In Probe C ist der gelöste Anteil des Antibiotikums

höher als in Probe A. Wahrscheinlich wurde bei der Dotierung vor der Fällung (Version II)

eine relativ höhere Konzentration an gelösten CTC-Fe-Komplexen gebildet als bei der

Versuchsversion I. Diese gelösten Anteile werden offenbar bei der anschließenden

Eisenhydroxidfällung nur teilweise mitgefällt (s. Kap. 5.2.1.2).

Tab. 24: Ergebnisse zum Einfluss der Eisen(III)-Fällung auf

robe e-iso-CTC

[µg/L]

iso-CTC Summe CTC Wiederfindung

Version I llung) (CTC-D achotierung n Fä

(Zentrifugat) 0,4±0,1

15±2 29±4 44±6

(direkte Extraktion) 2032±117 7141±541 9173±658 91,7±6,6

Version II (CTC-Dotierung vor Fällung)

(Zentrifugat) 155±17 171±23 326±40 3,3±0,4

(direkte Extraktion) 17 26 26,3±2,0

837±98 95±102 32±200

*enthält noch Spuren von CTC

aus den Modellversuchen bieten einen Erklärungsansatz für

ie beschriebene Diskrepanz bei den Analysendaten der Proben aus den Bodensäulen

ie Zusammensetzung der einzelnen Proben der Säulenversuche waren höchst

rschiedlichen pH-Werten, Leitfähigkeitswerten und

5.2.3.2 Schlussfolgerungen

Die beschriebenen Ergebnisse

zwischen „Gesamtkonzentration“ und „gelöster Konzentration“. Dabei sind jedoch

verschiedene Einflussgrößen zu unterscheiden:

Zusammensetzung der Bodenproben

unterschiedlich, was u.a. aus den unte

Partikelkonzentrationen sowie Gehalten an Eisen und anderen Metallionen (nicht bestimmt)

resultiert, die alle einen Einfluss auf das Sorptionsmilieu für die Antibiotika ausüben.

5 Ergebnisse und Diskussion 129

Denkbar ist, dass bei den Säuleneluaten ein Teil der dotierten Antibiotika in dem

Zentrifugationsrückstand als eine Art „bound residue“ vorlag, d.h. durch Okklusion für das

ufgelösten Zentrifugationsrückständen aus "Vor-

Proben" nach Zugabe von EDTA-Ammoniak-Puffer (Mittelwerte aus 3-fach

Injektion; HPLC-MS/MS; Konzentrationen bezogen auf das zentrifugierte

Extraktionsmittel nur schwer zugänglich war. Nach Auflösung des Rückstandes vom

„Landregen 2“ mit Salzsäure und anschließender Extraktion, wurde jedenfalls CTC, bedingt

durch die Extraktionsbedingungen, als iso-CTC und e-iso-CTC, nachgewiesen (siehe Tab.

25). Der Einfluss anderer bodenrelevanter Metallionen, die ebenfalls schwerlösliche

Hydroxide bilden, kann hierbei eine zusätzliche Rolle spielen. Im Rückstand von „Platzregen

3“ konnte kein CTC nachgewiesen werden, daher sind die Minderbefunde nicht allein auf

diesen Zusammenhang zurückzuführen.

Tab. 25: Konzentration in den mit HCl a

Probenvolumen der Säuleneluate)

Probe e-iso-CTC

[ng/L]

iso-CTC

[ng/L]

Summe CTC

[ng/L]

SFD

[ng/L]

Rückstand Landregen 2 115±7 201±4 315±11 n.n

Rückstand Platzregen 3 n.n. n.n. n.n. n.n.

Wie in Kap s ähre Sä che in mikrobieller

ktivität unter anaeroben Bedingungen im Boden zu Eisen(II) reduziert und zusammen mit

nn (nach J. Strähle

[502]) von Eisenhydroxiden

. 5.2.2 berichtet, wurde Ei en(III) w nd der ulenversu folge

dem künstlichen Regenwasser und mobilem CTC transportiert. Abgesehen davon, dass

Fe(III)-Hydroxid im Vergleich zu Fe(II)-Hydroxid ein kleineres Löslichkeitsprodukt besitzt und

die Fällung bei einem anderen pH-Wert eintritt (siehe Tab. 26), sind Sorptions- und

Okklusionsmechanismen auch bei der Fällung von Fe(OH)2-Gelen zu erwarten,

entsprechend den Ergebnissen der Modellversuche (siehe Kap. 5.2.1). Der Übergang zu

aeroben Bedingungen führt darüber hinaus zu einer (partiellen) Reoxidation der Fe(II)-

Anteile mit u.U. lokalen pH-Änderungen, so dass während der Säulenversuche kein

homogenes Sorptions- und Desorptionsmilieu vorgelegen haben kann.

Tab. 26: Löslichkeitsprodukte (nach ChemDat© [505]) und Fällungsbegi

Substanz Löslichkeitsprodukt bei 18 °C

[mol/L]

Fällungsbeginn

Fe(II)-Hydroxid 1,64 x 10-14 pH 5,8-8,5

1,10 x 10-36 pH 2,2-7,0 Fe(III)-Hydroxid

Die Komp nge wird du enden, in der Fa eschriebenen

eobachtungen ebenfalls deutlich: Figueroa et al. untersuchten die Sorption von

lexität der Vorgä rch die folg chliteratur b

Oxytetracyclin (OTC) an oxidische Eisenerze und eisenreichen Böden und die Wirkung

verschiedener Extraktionsmittel, wie z.B. 0,25 mol/L EDTA bei pH 8,9 [436]. Aus den

5 Ergebnisse und Diskussion 130

oxidischen Eisenerzen konnten damit 36-40% des OTC extrahiert werden, aus den

eisenreichen Böden war aber keine Extraktion nachweisbar. OTC zeigte in den Versuchen

mit oxidischen Eisenerzen ein Sorptionsmaximum bei pH 8. Gu et al. untersuchten die

Interaktion von Tetracyclin mit Eisen(III)- und Aluminiumhydroxid. Sie ermittelten für

Eisenhydroxid eine Abnahme der Sorption ab pH 6 und für Aluminiumhydroxid ein

Sorptionsmaximum bei pH 7 [435].

Aufgrund dieser und der eigenen Untersuchungsergebnisse wird erkennbar, dass die

desorbierende Wirkung von EDTA in (alkalischen/ammoniakalischen) Extraktionsmitteln im

erten (ab pH 4)

ten (SOM) von der Konzentration an Metallkationen

ie Okklusion von CTC in Metallhydroxidfällungen während

ie uneinheitliche Extraktionseffektivität von EDTA-Ammoniak-Puffer in Abhängigkeit der

zung wurde bereits erwähnt. Die daraus resultierende Variationsbreite

hohen Maße von der mineralischen Zusammensetzung der (Boden-) Proben abhängt – aber

auch organische Komponenten können einen markanten Einfluss ausüben:

So zeigen Untersuchungen von Sithole et al. [431,432], dass der Sorptionsgrad von

Tetracyclin an Tonmineralien, Torf und Huminsäuren mit steigenden pH-W

unterschiedlich stark abnimmt und bei allen Sorbentien im alkalischen pH-Bereich ein

annähernd konstantes Minimum erreicht. Neben dem Einfluss des pH-Werts auf die

Sorptionsgrade zeigen diese Untersuchungen auch die Abhängigkeit der Sorption von der

Ionenstärke. Kulshrestha et al. fanden heraus, dass sich durch Gülle und Huminsäuren

(gelöstes organisches Material) die Sorbierbarkeit von Oxytetracyclin an Ton im pH-Bereich

von 1,5 - 11 erheblich verringert [427].

Die Komplexität der Zusammenhänge im Boden wird dadurch deutlich, dass die Sorption von

Arzneistoffen an organische Komponen

abhängt und die Sorption an mineralischen Komponenten vom Gehalt an gelöstem

organischem Material (DOM). Der Einfluss der Bildung von ternären Komplexen (z.B.

Arzneistoff-Metallkation-SOM) auf die Sorption von Arzneistoffen in Böden ist jedoch

unzureichend untersucht [503].

Aufgrund der Komplexen Zusammensetzung der Proben in den Säuleneluaten sind die

Minderbefunde nicht allein auf d

der Probenaufarbeitung zurückzuführen. Denn sonst hätte auch im Rückstand der Probe von

„Platzregen 3“ CTC nachweisbar gewesen sein müssen. In wie weit auch organische

Komponenten oder die Komplexbildung Einfluss auf die Probenaufarbeitung und

Bestimmung von SFD und CTC hatten, bleibt offen.

Analysenmethodik

Probenzusammenset

der Extraktzusammensetzung kann ein kritischer Faktor bei der anschließenden

Festphasenextraktion (SPE) sein, zumal bei den Wiederfindungsstudien nicht alle Faktoren

berücksichtigt werden konnten. Dazu zählen sicherlich – neben den „echt“ gelösten

5 Ergebnisse und Diskussion 131

Antibiotikarückständen - die partikelgebundenen Anteile in den unterschiedlichen Extrakten

der Zentrifugate und Rückstände, bzw. den Fraktionen der „gelösten Konzentration“ und der

„Gesamtkonzentration“.

Da durch die Zentrifugation Partikel oberhalb eines bestimmten Dichtebereiches

sedimentieren, blieben neben den „gelösten“ CTC’s auch partikulär gebundene im

“

uf Antibiotikarückstände analysiert. Besonders bei Sulfonamiden - im

enerell ist der verwendete Ammoniak-EDTA-Extraktionspuffer auf Tetracyclin-beladene

xide und –hydroxide anwendbar, wie die Untersuchungen des Vorgängerprojektes

Zentrifugat zurück. Man kann davon ausgehen, dass in den Messproben der „gelösten

Konzentration“ - also in den Eluaten der Festphasenextraktion - im Vergleich zu den

Messproben der „Gesamtkonzentration“ - eine erheblich geringere Partikelkonzentration

vorlag, aber vermutlich eine ähnliche Konzentration an gelösten organischen Substanzen.

Jedenfalls sind Beeinträchtigungen bei Anwendung der SPE-Methode möglich, die

vermutlich mit dazu beigetragen haben, dass in einigen Proben der „Gesamtkonzentration

kein CTC nachzuweisen war, wohl aber in Proben der „gelösten Konzentration“. Derartige

Effekte sind sowohl bei Bestimmung der Rückstände an Chlortetracyclin als auch an

Sulfadiazin möglich.

Wie beschrieben, wurden die jeweiligen Eluate der Festphasenextraktion als Messprobe mit

dem LC-MS-System a

Unterschied zu Tetracyclinen – können Matrixeffekte zu einer Unterdrückung der MS-Signale

führen. Derartige Suppressionseffekte leisten ebenfalls einen Beitrag zu Minderbefunde, die

mit zusätzlichem Aufwand, z.B. durch das Standardadditionsverfahren, kompensierbar sind,

sofern ausreichend Probenmaterial verfügbar ist (s. Kap. 5.1.3.2).

Eine ausführlichere Untersuchung derartiger Effekte war im Rahmen dieser Arbeit nicht

möglich.

Fazit

Metallo

„Antiinfektivaeinträge“ und die Rückstandsuntersuchungen an den Säulenböden zeigen.

Dabei ermöglicht der Puffer die Analyse extrahierbarer Anteile von bestimmten Antibiotika-

Wirkstoffgruppen in Böden, versagt aber - wie andere Puffersysteme – bei der Erfassung

gebundener Anteile („bound residues“). Der im Rahmen des Projekts angestrebten

Bestimmung des partikelgebundenen und gelösten Anteils von CTC und SFD sind daher

Grenzen gesetzt, die chemisch und analytisch- methodisch ansatzweise erklärbar sind.

5 Ergebnisse und Diskussion 132

5.2.4 Fluoreszenzuntersuchungen an partikelgebundenem CTC und iso-CTC

rzneistoffrückständen in Bodenproben (partikelgebundene und gelöste Anteile) und die

rschiedliche

methodische Defizit der indirekten

ethode durch Ausnutzung der Fluoreszenzeigenschaften von Tetracyclinen (Abb. 61)

.2.4.1 Qualitative Fluoreszenzanalyse

CTC- und iso-CTC-beladenen Modellpartikeln

urchgeführt, die im Kap. 5.2.1.1 beschrieben sind.

latte (Thermo Microtiter 96-well plate)

ima sehr unterschiedlich sind.

Die in Kap. 5.2.2 beschriebenen Analysenverfahren zur Bestimmung v

kritische Ergebnisdiskussion ließen die Grenzen der angewandten indirekten Methode –

Fest-Flüssig-Extraktion, Festphasenextraktion, Eluatanalyse – deutlich werden.

Allgemein sind mit den einsetzbaren Extraktionsmitteln (verschiedene Puffergemische, z.T.

mit Lösemittelzusätzen) in Abhängigkeit von Bodentyp und -beschaffenheit unte

Extraktionsgrade bzw. Wiederfindungen erreichbar, woraus ebenso unterschiedliche Anteile

nicht-extrahierbarer, gebundener Rückstände resultieren.

Alternativ wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, das

auszugleichen, indem Rückstände dieser Wirkstoffklasse fluoreszenzspektrometrisch direkt

in fester Phase bestimmt werden, u.U. mit der Erfassung gebundener Rückstände.

Untersuchungen zeigten, dass Tetracycline in Knochen fluoreszenzspektrometrisch

quantifizierbar sind [7,506]. Ob Fluoreszenzmethoden auch bei Bestimmung von

Tetracyclinen in der komplexen Bodenmatrix anwendbar sind, war nicht bekannt. In der

Literatur ist beschrieben, dass fluoreszierende Tracer (z.B. Brilliant Sulfaflavine,

Sulforhodamine B, Oxazine 170) bei der Identifikation von Transportprozessen in Böden

eingesetzt werden [507-510]. Versuche sollten Aufschluss darüber geben, ob prinzipiell

fluorometrische Screeningmethoden LC-UV-MS-Methoden sinnvoll ergänzen oder – je nach

Zielsetzung der geplanten Untersuchungen - sogar ersetzen könnten.

Zunächst wurden Vorversuche mit

Ein Mikrolöffel der unbeladenen Modell-Partikel, beladenen Partikel (lyophilisiert) und „freien“

Tetracycline (Feststoffe) wurden in eine Mikrotiterp

gegeben. Die Fluoreszenz wurde im Reflexionsmodus (spitzer Winkel) gemessen

(Varioskan, Spektrofluorometer und Spectrophotometer (Thermo Electron), siehe Anhang

A.1.2.3). Die Aluminiumoxidpartikel wurden zusätzlich mit einer UV-Lampe (CAMAG UV-

Lampen und UV-Betrachter) qualitativ untersucht.

Alle eingesetzten Tetracyclin-Derivate zeigen als Feststoff eine deutliche Fluoreszenz (Abb.

61), wobei Lage und Intensität der Fluoreszenzmax

5 Ergebnisse und Diskussion 133

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850

100

120

140

160

180

Fluoreszenz [RFU]

Wellenlänge [nm]

CTC

iso-CTC

epi-CTC

anhydro-CTC

OTC

DoxyC

DemecloC

Abb. 61: Fluoreszenzspektren der „freien“ Tetracycline (Feststoff; λex= 314 nm)

Die deutliche Fluoreszenz von Aluminiumoxid, das mit Chlortracyclinen beladen wurde, ist

-beladenes

luminiumoxid zeigt gelbe (λmax=520 nm) und iso-CTC-beladenes Aluminiumoxid blaue

bereits mit bloßem Auge unter einer UV-Lampe erkennbar (Abb. 62). CTC

Fluoreszenz (λmax=398 nm), so dass auch eine qualitative Unterscheidung möglich ist.

Abb. 62: Fluoreszenz CTC- und iso-CTC-beladener Aluminiumoxide

(von oben nach unten: ohne Anregung, λex = 254 nm, λex = 366 nm)

Die intensivsten Fluoreszenzeffekte wurden beim beladenen Aluminiumoxid (sauer) und

Aluminiumoxid 19 µmol/g CTC 19 µmol/g iso-CTC

unbeladenes Beladung: Beladung:

Alumini mu oxid (basisch) beobachtet (Abb. 63 und 64).

5 Ergebnisse und Diskussion 134

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850

100

150

200

250

300

350

400

Fluoreszenz [RFU]

Wellenlänge [nm]

Alox (basisch)

CTC-Alox (basisch)

Alox (sauer)

CTC-Alox (sauer)

Abb. 63: Fluoreszenzspektren CTC-beladener und unbeladener

Aluminiumoxide (λex= 314 nm)

(schwarze und grüne Basislinie: keine Eigenfluoreszenz); Al2O3 sauer 19,0 µmol/g,

Al2O3 basisch 18,8 µmol/g CTC)

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

Fluoreszenz [RFU]

Wellenlänge [nm]

Alox (basisch)

iso-CTC-Alox (basisch)

Alox (sauer)

iso-CTC-Alox (sauer)

Abb. 64: Fluoreszenzspektren iso-CTC-beladener und unbeladener

Aluminiumoxide (λex= 314 nm)

(schwarze und grüne Basislinie: keine Eigenfluoreszenz); Al2O3 sauer: 19,0 µmol/g,

Al2O3 basisch: 17,7 µmol/g CTC)

ur schwache Fluoreszenz (vergl. Abb. 65 und 66).

Hier spie

wischenschichten des Montmorillonits (Bentonit), geringe Sorptionskapazität, pH-

Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität u.a. Faktoren eine Rolle.

Die übrigen beladenen Partikel zeigen n

len Quenchingeffekte durch das Sorptionsmittel, Einlagerung der Antibiotika in

5 Ergebnisse und Diskussion 135

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850

Fluoreszenz [RFU]

Wellenlänge [nm]

Bentonit

CTC-Bentonit

Ton1550

CTC-Ton1550

Abb. 65: Fluoreszenzspektren CTC-beladener und unbeladener Tonminerale

(Bentonit: 18,8 µmol/g, Ton1550: 14,2 µmol/g CTC, λ= 314 nm)

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850

Fluoreszenz [RFU]

Wellenlänge [nm]

Bentonit

iso-CTC-Bentonit

Ton1550

iso-CTC-Ton1550

Abb. 66: Fluoreszenzspektren iso-CTC-beladener und unbeladener Tonminerale

(Bentonit : 2,9 µmol/g, Ton1550: 15,3 µmol/g, λex= 314 nm)

Die Lage und Intensität der Fluoreszenzmaxima wird in hohem Maße von der Partikelart

bzw. Trägermatrix beeinflusst. Somit wäre eine einfache Kalibrierung des

möglich.

Durch manuelle oder automatisierte Bearbeitung der Spektren kann aber die Lage der

Fluores ti rtikel-Paarezenzspektrometers nur für festgelegte Antibio ka-Modellpa

Fluoreszenzmaxima korrigiert werden, was allerdings die Messung über einen größeren

Wellenlängenbereich voraussetzt.

5 Ergebnisse und Diskussion 136

Die starke Matrix-Abhängigkeit der Fluoreszenz von Chlortetracyclinen wird bei der Messung

an Realproben deutlich. Ein CTC-beladener Oberboden (Nullprobe) zeigte keinen

eindeutigen und auswertbaren Verlauf des Fluoreszenzspektrums (Abb. 67) und der mit iso-

TC beladene Oberboden eine mit 1,3 RFU (Relative Fluorescence Unit) nur relativ niedrige

Intensität des Fluoreszenzmaximums (Abb. 68).

0,8

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Oberboden

CTC-Oberboden

Fluoreszenz [RFU]

Wellenlänge [nm]

Abb. 67: Fluoreszenzspektren von CTC-beladenem (13,2 µmol/g) und unbeladenem

Oberboden (λ= 314 nm)

1,4

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Fluoreszenz [RFU

Wellenlänge [nm]

Oberboden

iso-CTC-Oberboden

]

Abb. 68: Fluoreszenzspektren von iso-CTC-beladenem (14,9 µmol/g) und unbeladenem

Oberboden (λex= 314 nm)

5 Ergebnisse und Diskussion 137

5.2.4.2 Quantitative Fluoreszenzanalyse

Zur Vorbereitung einer quantitativen fluoreszenzspektrometrischen Bestimmung von

partikelgebundenem CTC bzw. iso-CTC wurden Aluminiumoxidpartikel (sauer) bei pH 7 mit

steigenden Mengen an CTC bzw. iso-CTC nach der allgemeinen Sorptionsvorschrift in

Anhang A.1.5.5 belegt. Die sorbierten CTC-Mengen wurden indirekt durch Analyse der

wässrigen Phasen mit HPLC-DAD-MS2 bestimmt.

Die Beladungen mit CTC bzw. iso-CTC betrugen etwa 0,1, 1, 10, 100, 500, 1000 und 2000

µg/g. Die Proben wurden bis zur Analyse bei -30°C gelagert.

Die Analyse der beladenen Partikel erfolgte mittels des „Luminescence spectrometer Perkin-

Elmer LS50B“ in Mikrotiterplatten. Hierzu wurden die Partikel in die Probenbehälter der

Mikrotiterplatte gefüllt und die optimale Anregungswellenlänge ermittelt. Für CTC betrug

diese 410 nm und für iso-CTC 342 nm. Jede Probe wurde dreimal vermessen.

er Zu und Lichtemission (Gleichung 1) ist bei der

luoreszenz aus dem Lambert-Beer‘schen Gesetz ableitbar und gilt streng genommen für

ssung der Fluoreszenz von Festkörpern wird am

nde des Kapitels eingegangen.

alibrierfunktion für CTC-beladenes Aluminumoxid

quantitativen

nalysenmethode treffen zu können, wurde die Intensität beim Maximum der Fluoreszenz

D sammenhang zwischen Konzentration

Lösungen [511]; auf Besonderheiten zur Me

Gleichung 1:

If = ΦI0(1-10-εcx)

If : Intensität der Fluoreszenz (in [W m-2])

I0 : Intensität der einfallenden Strahlung (in [W m-2])

Φ : Quantenausbeute

ε : Extinktionskoeffizient (in [mol-1 L cm-1])

c : Konzentration (in [mol L-1])

x : optische Weglänge (in [cm])

Abb. 69 zeigt die Einzelspektren der mit CTC beladenen Aluminiumoxide bei einer

Anregungswellenlänge von 410 nm. Die Fluoreszenzintensität steigt dabei mit zunehmender

CTC-Konzentration an und die Messungen derselben Probe zeigen keine signifikanten

Abweichungen. Um Aussagen über die Möglichkeit zur Entwicklung einer

(490 nm) ausgewählt.

5 Ergebnisse und Diskussion 138

400 450 500 550 600 650 700 750 800 850

200

400

600

800

1000

Fluoreszenz [w

Einheit]

Wellenlänge [nm]

Abb. 69: Fluoreszenzspektren von CTC-beladenen Aluminiumoxidpartikeln (λex= 410 nm):

Steigende Intensität mit steigender Konzentration im Bereich von 0,1-2000 µg/g

Wenn die oben erwähnte Konzentrationsabhängigkeit der Fluoreszenzintensität gilt, wird in

halblogarithmischer Darstellung in einem gewissen Konzentrationsbereich Linearität

vorausgesetzt. Dieser Bereich wird visuell zwischen 100 und 2000 µg/g lokalisiert (Abb. 70).

illk.

0,1 1 10 100 1000

200

400

600

800

1000

Fluore z [willk. Einheit]

Konzentration [µg/g]

Abb. 70: Halblogarithmische Darstellung der Fluoreszenzintensität als Funktion der

Konzentration von CTC-beladenen Aluminiumoxidpartikeln (λex= 410 nm,

λem= 490 nm)

Ob eine Exponentialfunktion 1. Ordnung vorliegt, wurde mit dem Programm Origin 7.0

überprüft (Abb. 71). Die Parameter der Exponentialfunktion wurden dabei mittels Levenberg-

szen

5 Ergebnisse und Diskussion 139

Marquardt-Algorithmus ermittelt [512,513]. Der R2-Wert liegt hier bei 0,9858. Die relative

Standardabweichung der Messpunkte liegt zwischen 0,01 und 1,67% was zeigt, dass eine

hohe Präzision des Messverfahrens vorliegt.

0 500 1000 1500 2000

200

400

600

800

1000

1200

ExpDec1 fit of Data2_B

Data: Data2_B

Model: ExpDec1

Equation: y = A1*exp(-x/t1) + y0

Weighting:

y No weighting

Chi^2/DoF = 1996.72313

R^2 = 0.98583

y0 890.25092 ±20.94618

A1 -811.15791 ±23.35076

t1 292.7002 ±31.5096

Fluoreszenz [willk. Einheit]

Konzentration [µg/g]

Abb. 71: Funktionaler Zusammenhang zwischen Konzentration und Fluoreszenzintensität bei

Aluminiumoxid-sorbiertem CTC (λex= 410 nm, λem= 490 nm)

Nachdem der funktionelle Zusammenhang zwischen Fluoreszenzintensität und

Konzentration ermittelt worden ist, wurde der Bereich von 100-2000 µg/g hinsichtlich eines

linearen Zusammenhanges überprüft. Besitzt das Lambert-Beer‘sche Gesetz im

vorliegenden Fall Gültigkeit, ist die Fluoreszenz direkt proportional zum Logarithmus der

Fluorophorkonzentration und damit ein linearer Zusammenhang gegeben. Wie in Abb. 72 zu

sehen ist, zeigt sich dieser lineare Zusammenhang im untersuchten Konzentrationsbereich.

Hier ist somit eine lineare Kalibrierung möglich.

5 Ergebnisse und Diskussion 140

2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4

300

400

500

600

700

800

900

1000

eszenz [willk. Einheit]

Geradengleichung:

axby +⋅

Fluor

log10 (Konzentration [µg/g])

a = -472

b = 431

R = 0,9995

sy= 7,35

Abb. 72: Kalibrierfunktion zur fluorometrischen Bestimmung von Alumi

sorbiertem CTC (λex= 410 nm, λem= 490 nm)

Kalibrierfunktion für iso-CTC-beladenes Aluminumoxid

Abb. 73 zeigt die Einzelspektren der mit iso-CTC beladenen Aluminiumoxide bei einer

Anregungswellenlänge von 342 nm. Die Spektren verhalten sich hier analog zu dem CTC-

beladenen Aluminiumoxid. Für die Messung mit iso-CTC mussten allerdings die

tlich höher

iner Überlastung des Detektors, was

uf eine deutlich höhere Quantenausbeute und/oder einen größeren Extinktionskoeffizienten

r iso-CTC hinweist. Das Fluoreszenzmaximum liegt hier bei 410 nm. Die gemessenen

in Abb. 74 dargestellt.

niumoxid-

Geräteeinstellung etwas modifiziert werden, da die Fluoreszenzintensitäten deu

waren. Bei gleicher Geräteeinstellung führte dies zu e

fü

Intensitäten sind in Abhängigkeit von der Konzentration

5 Ergebnisse und Diskussion 141

300 400 500 600 700 800

200

400

600

800

1000

Fluoreszenz [willk. Einheit]

Wellenlänge [nm]

Abb. 73: Fluoreszenzspektren von iso-CTC-beladenen Aluminiumoxidpartikeln

(λex= 342 nm):

Steigende Intensität bei steigender Konzentration im Bereich von 0,1-2000 µg/g

In halblogarithmischer Darstellung ist ein linearer Bereich im Konzentrationsbereich

zwischen 100 und 2000 µg/g erkennbar (Abb. 74). Die zugehörige Exponentialfunktion 1.

Ordnung, dargestellt in Abb. 75, belegt die Güte der Korrelation mit einem R2-Wert von

0,9983 bei einer relativen Standardabweichung der Messpunkte von 0,05% bis 3,95%.

0,1 1 10 100 1000

200

400

600

800

1000

1200

Fluoreszenz [willk. Einheit]

Konzentration [µg/g]

Abb. 74: Halblogarithmische Darstellung der Fluoreszenzintensität als Funktion der

Konzentration von iso-CTC-beladenen Aluminiumoxidpartikeln (λex= 342 nm,

λem= 410 nm)

5 Ergebnisse und Diskussion 142

0 500 1000 1500 2000 2500

200

400

600

800

1000

1200

ExpDec1 fit of Data4_B

Data: Data4_B

Model: ExpDec1

Equation: y = A1*exp(-x/t1) + y0

Weighting:

y No weighting

Chi^2/DoF = 281.04426

R^2 = 0.99834

y0 1042.24417 ±11.42661

A1 -987.14969 ±11.76465

t1 530.60638 ±18.35562

Fluoreszenz [willk. Einheit]

Konzentration [µg/g]

Abb. 75: Funktionaler Zusammenhang zwischen Konzentration und Fluoreszenzintensität bei

Aluminiumoxid-sorbiertem iso-CTC (λex= 342 nm, λem= 410 nm)

Wie Abb. 76 zeigt wird, ist im untersuchten Konzentrationsbereich auch für an

Aluminiumoxid-sorbiertes iso-CTC eine lineare Kalibrierung möglich.

2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

Fluoreszenz [willk. Einheit]

log10 (Konzentration [µg/g])

Geradengleichung:

axby +⋅

a = -945

b = 600

R = 0,9965

sy= 26,57

Abb. 76: Kalibrierfunktion zur fluorometrischen Bestimmung von Aluminiumoxid-

sorbiertem iso-CTC (λex= 342 nm, λem= 410 nm)

5 Ergebnisse und Diskussion 143

5.2.4.3 Diskussion

Die fluoreszenzspektrometrischen Messungen an Modellpartikeln – Chlortetracyclin- und iso-

Chlortetracyclin belegtes Aluminiumoxid - zeigen, dass prinzipiell eine direkte, quantitative

Analyse von Partikeln auf Tetracyclinrückstände möglich ist. Aluminiumoxid wurde

ausgewählt, da es die Fluoreszenzintensität von CTC und iso-CTC im Vergleich zum nicht

adsorbierten, d.h. reinem Feststoff noch verstärkt. Hierdurch wären Bestimmungsbereiche

erfassbar, die dem Triggerwert für Boden (100 µg/kg) [12,13] für Tetracycline entsprächen.

Jedoch waren die Messungen von CTC-beladenem Ackerboden durch erhebliche

Quenchingeffekte gekennzeichnet, so dass eine Quantifizierung von

Tetracyclinkonzentrationen im benötigten Konzentrationsbereich nicht möglich war.

Ob zusätzliche Probenvorbereitungstechniken zu einer Empfindlichkeitssteigerung führen

würden, bleibt vorerst offen. Auch die Anwendung chemometrischer Methoden zur optimalen

Ausnutzung geringer Unterschiede in den Spektrenprofilen wäre denkbar. Bei

unterschiedlichen Korngrößenverteilungen von Proben, wie es bei Bodenproben der Fall

wäre, ist die unterschiedliche Lichtstreuung aufgrund sich in der Korngrößenverteilung

unterscheidenden Proben zu berücksichtigen. Dies könnte z.B. durch Anwendung von

chemometrischen Methoden oder der Kubelka-Munk-Funktion [514] erreicht werden. So

konnten z.B. S. Ebel und H. Kußmaul unter Anwendung der Kubelka-Munk-Funktion die

Genauigkeit bei der Auswertung von Dünnschichtchromatogrammen verbessern [515].

Fluoreszenzuntersuchungen von Tetracyclinen in Knochen zeigen, wie stark die Einflüsse

der Lichtstreuung sind und wie diese durch chemometrische Verfahren – bei entsprechend

großer Anzahl von Messdaten - „gefiltert“ werden können [506]. In Knochen sind

Streuungszentren inhomogen verteilt, so dass lokal unterschiedliche Streuerkonzentrationen

auftreten, die eine Korrektur nötig machen. Dies gilt ebenfalls für die komplexe Bodenmatrix.

Auch hier liegt keine homogene Korngrößenverteilung, bedingt durch Sandpartikel,

Tonmineralien etc., vor. Zudem weisen verschiedene Bodenbestandteile unterschiedliche

Sorptionsaffinitäten gegenüber Tetracyclinen auf (Kap. 5.2.1.1), was zwangsläufig zu

inhomogener Fluoreszenzintensität an der Messoberfläche führt.

Weiterführende Untersuchungen sind erforderlich, um die Realisierung fluorometrischer

Screening-Tests für Tetracyclin-belastete Böden weiter zu entwickeln. So könnte z.B. direkt

nach der Extraktion den abgetrennten Extraktionslösungen Aluminiumoxid zugegeben

werden, an welches sich unter den einzustellenden Bedingungen die Tetracycline sorbieren.

Dieses könnte im Anschluss fluorometrisch untersucht werden. Ein solches Verfahren wäre

generell nicht nur auf Bodenproben beschränkt und würde im Rahmen von

Grenzwertkontrollen oder Screenings eine Proben-Selektierung ermöglichen, so dass nur

noch relevante Proben eingehender untersucht werden müssten. Chen et al. entwickelten in

5 Ergebnisse und Diskussion 144

dieser Richtung schon ein Verfahren, in dem Tetracyclin mittels der Sorption an einer C-18

modifizierten Silicagel-Festphase aus dotierter Milch extrahiert wurde und danach

semiquantitativ durch zeitaufgelöste Lumineszenz der Festphase bestimmt wurde [516,517].

Eine Möglichkeit für eine direkte Bestimmung von Tetracyclinen in Böden bietet, in

Anlehnung an Methoden zur direkten Bestimmung von PAH´s in Böden [518,519], eventuell

der Einsatz von Laserinduzierter Fluoreszenz (LIF) in Kombination mit chemometrischen

Methoden.

6 Zusammenfassung und Ausblick 145

6 Zusammenfassung und Ausblick

Veterinärarzneistoffe, vor allem Tetracycline und Sulfonamide, werden über die

Wirtschaftsdünger Gülle und Mist in erheblichen Mengen in die Böden landwirtschaftlicher

Nutzflächen eingetragen, doch ihrem Vorkommen und Verhalten ist in der Vergangenheit

wenig Beachtung geschenkt worden. Eine besondere Bedeutung kommt dabei dem Eintrag

von Antibiotika zu, da ein Zusammenhang mit der Verbreitung und dem Erhalt von

Antibiotikaresistenzen nicht ausgeschlossen werden kann. Dies ist insofern besonders

problematisch, da Antibiotikaklassen wie z.B. die Tetracycline und Sulfonamide auch in der

Humanmedizin zur Behandlung von Infektionskrankheiten eingesetzt werden. Der Mangel an

Informationen zum Verhalten von Tetracyclinen und Sulfonamiden in der Umwelt ist vor

allem darauf zurückzuführen, dass erst seit 1998 für neu zugelassene Arzneimittel eine

Umweltverträglichkeitsprüfung vorgeschrieben ist. Für sogenannte „Altpräparate“ wie

Tetracycline und Sulfonamide ist dies nicht der Fall, obwohl diese im großen Umfang in der

Nutztierhaltung eingesetzt werden. So wurden 2005 allein in Deutschland 350 t Tetracycline

und 97,5 t Sulfonamide in der Veterinärmedizin verbraucht.

Ziel dieser Arbeit war es daher, das Verhalten (Persistenz, Mobilität) von

Antibiotikarückständen im Boden am Beispiel von Chlortetracyclin und Sulfadiazin zu

untersuchen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Bodenprobe von Feldern untersucht,

welche mit Antibiotika-belasteter Gülle beaufschlagt worden waren, um einen Beitrag zur

Abschätzung der möglichen Antibiotikabelastung von Ackerflächen zu leisten. Im zweiten

Teil dieser Arbeit wurde das Transportverhalten von Chlortetracyclin und Sulfadiazin unter

Modellbedingungen in Bodenlysimetern untersucht, um so einen Beitrag zur

Risikoabschätzung einer möglichen Grundwassergefährdung zu leisten.

Zu Beginn der Arbeit wurde eine LC-MS/MS basierte Methode zur Bestimmung von SFD und

CTC sowie ausgewählter Umwandlungsprodukte, in Böden entwickelt. Dabei wurde

erstmalig ein ammoniakalischer Puffer zur Extraktion von Arzneistoffen aus Böden

eingesetzt. Die Probenaufarbeitung basiert dabei auf einer Extraktion mittels

ammoniakalischen EDTA-Puffer mit anschließender Festphasenextraktion (SPE). Der

Nachweis und die quantitative Bestimmung der Antibiotika erfolgten dann mittels LC-MS/MS.

Während der Extraktion werden allerdings CTC und e-CTC vollständig in die Isomere iso-

CTC und e-iso-CTC umgewandelt. So das CTC als Summe aus e-iso-CTC und iso-CTC

bestimmt wird. Die Wiederfindung betrug bei dieser Methode 71±7% für CTC-dotierte

Bodenproben und 59±7% für SFD.

6 Zusammenfassung und Ausblick 146

Das entwickelte Verfahren wurde danach angewandt um Bodenproben aus dem

Forschungsprojekt „Antiinfektivaeinträge aus der Tierproduktion in terrestrische und

aquatische Kompartimente“ [476] zu untersuchen. Dazu waren Felder nach einmaliger und

zweimaliger Düngung mit Antibiotika-haltiger Gülle beprobt worden. Um eine mögliche

Verlagerung der Antibiotika ermitteln zu können, waren die Proben tiefengestuft entnommen

worden.

Die Analysen der Bodenextrakte belegen, dass bereits eine einmalige Düngung eines

unbelasteten Bodens mit Antibiotika-haltiger Gülle zu einer mehrmonatig nachweisbaren

Kontamination der oberen Bodenschichten führt. Eine wiederholte Düngung führt dabei

insbesondere zur Akkumulation von CTC im Boden, da die Massenkonzentrationen dabei für

CTC deutlich höher (bis zu 240 µg/kg TM) als für SFD (bis zu 90 µg/kg TM) waren. Eine

Verlagerung von CTC oder SFD in tiefere Bodenschichten konnte nicht festgestellt werden.

Die Bodenproben wurden zudem alle auf N4-SFD, einem Hauptmetaboliten des SFD,

untersucht. Dieser konnte aber in keiner Probe nachgewiesen werden.

Da in der eingesetzten Gülle der Gehalt an SFD deutlich über dem von CTC lag wurde eine

Verlagerung von SFD in Bodentiefen unterhalb der Beprobungstiefe angenommen, zumal es

während und nach der Güllung starke Niederschläge gab. SFD gilt im Boden als mobil und

CTC als immobil. Von daher lag dieser Zusammenhang nahe.

Folglich wurde im zweiten Teil dieser Arbeit das Transportverhalten von CTC und SFD

untersucht. Hierbei sollte insbesondere die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass

das wegen seiner starken Sorption an die Bodenmatrix als immobil geltende CTC über den

partikulären Ko-Transport mit dem Sickerwasser verlagert werden könnte. Diese

Untersuchungen wurden im Rahmen des Projekts „Tierarzneimittel in der Umwelt:

Bewertung von Eintrag, Verlagerung und Resistenzentwicklung unter Gesichtspunkten des

Verbraucherschutzes“ [477] durchgeführt.

In Vorversuchen wurden das Sorptionsverhalten von CTC, iso-CTC und SFD gegenüber

mineralischen Partikeln, sowie das koordinationschemische Verhalten von CTC und iso-CTC

gegenüber ausgewählten bodentypischen Metallionen untersucht. Die hierbei in

Batchversuchen unter statischen Bedingungen ermittelten Sorptionskapazitäten zeigen, das

CTC und iso-CTC in hohem Maße an mineralische Partikel sorbieren, während die Sorption

von SFD vergleichsweise gering ist. Ferner werden CTC und iso-CTC bei verschiedenen pH-

Werten in unterschiedlichen Maß an die Partikel sorbiert. Während die Unterschiede im

Sauren noch gering sind, zeigte iso-CTC im Gegensatz zu CTC bei pH 9,5 nur noch eine

sehr geringe Sorption an dem Tonmineral Montmorillonit.

In photometrischen Untersuchungen zum koordinationschemischen Verhalten von CTC und

iso-CTC konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung von CTC im alkalischen Mileu (pH

8,7) durch die die Bildung von CTC-Metallkomplexen verlangsamt abläuft. Weiterhin zeigte

6 Zusammenfassung und Ausblick 147

sich, dass die CTC´s in hohem Maße von frisch gefällten Metallhydroxiden sorbiert bzw.

mitgefällt werden. Dabei gab es auch eindeutige Hinweise, dass ein Teil der CTC´s als

Metallkomplexe in Lösung bleiben. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass beim

Transportverhalten von CTC im Boden nicht nur die Sorption, sondern auch die

Komplexbildung zu berücksichtigen ist, wobei noch der Einfluss von organischen

Bodenkomponenten zu untersuchen bleibt.

Im Rahmen des obigen Projekts wurden vom Institut für Wasserforschung (IfW) zwei

Versuche mit Bodensäulen durchgeführt, die Aufschluss darüber geben sollten ob und in

welchem Umfang durch mit gülle-eingetragenes SFD und CTC im Boden verlagert wird und

ob mit einem Eintrag ins Grundwasser zu rechnen ist. Der eine Säulenversuch mit einer

Bodenhöhe von 10 cm wurde dabei unter extremen Niederschlagsbedingungen und der

andere mit einer Bodenhöhe von 60 cm unter naturnahen Niederschlagsbedingungen

durchgeführt. Die bei diesen Untersuchungen anfallenden Messproben von Gülle, Boden

und Sickerwasser wurden mittels HPLC-MS/MS analysiert.

Die Ergebnisse belegen, dass CTC auch unter naturnahen Niederschlagsbedingungen durch

Bodenschichten von 60 cm Tiefe verlagert werden kann, und somit eine potentielle

Möglichkeit eines Grundwassereintrages besteht. Von der dabei in die Gülle dotierten CTC-

Menge wurden allerdings nur 0,002% mit dem Sickerwasser ausgetragen. Ferner gab es

Hinweise, dass CTC auch partikelgebunden verlagert wird. Unter extremen

Niederschlagsbedingungen (Starkregen) wurde auch SFD in den Sickerwasserproben

nachgewiesen, allerdings nur bei der Säule mit einer Bodenhöhe von 10 cm. In den am Ende

der Versuche entnommen tiefengestuften Bodenproben der Säule mit 60 cm Bodenhöhe war

weder CTC noch SFD unterhalb des begüllten Bereichs nachweisbar. Dagegen waren CTC

und SFD bei der Säule mit 10 cm Bodenhöhe (extreme Beregnung) auch im Boden

unterhalb des begüllten Bereichs nachweisbar. Tendenziell stimmen die Ergebnisse mit

denen aus der Untersuchung im ersten Teil dieser Arbeit („Antiinfektiva-Projekt“ [476])

überein.

Bei den Säulenversuchen kam es infolge sich einstellender anaerober Mileubedingungen

allerdings zu erheblichen Minderbefunden für CTC in den Sickerwasserproben. Als Ursache

wurden dabei hohe Eisen(II)-Konzentrationen in Betracht gezogen, welches durch Einfluss

von Luftsauerstoff zu Fe(III) oxidierte und im Säuleneluat als Hydroxid gefällt wurde. In

diesem Zusammenhang wurden die einzelnen Stufen der Probenaufarbeitung mit

ammoniakalischem Puffer in Modell-Lösungen überprüft. Es zeigte sich dabei, dass CTC

infolge von Okklusioneffekten größtenteils nicht mehr extrahiert werden kann. Der Extraktion

mit ammonikalischem Puffer sind somit von der Probenzusammensetzung abhängige

Grenzen gesetzt, welche zu erheblichen Minderbefunden an CTC führen können. Daher

sollten die Extraktionsbedingungen weiterentwickelt werden (evtl. mehrstufig). Zur Ermittlung

6 Zusammenfassung und Ausblick 148

der tatsächlichen Belastung (alle durch physikalische, chemische und biologische Prozesse

wieder freisetzbaren Antibiotika bzw. deren Metabolite) von landwirtschaftlich genutzten

Böden sollten in weiterführenden Untersuchungen die in die Bodenmatrix eingeschlossenen

CTC-Anteile (Sequestrierung, Entrapment, Okklusion) berücksichtigt werden. Auch in

Hinblick auf eine Risikobewertung von Einträgen ins Grundwasser und Nutzpflanzen und

damit in die Nahrungskette ist das (Langzeit-)Verhalten von eingeschlossenen CTC-Anteilen

zu berücksichtigen.

Um eine direkte Bestimmung von Tetracyclinrückständen im Boden mittels Fluoreszenz zu

ermöglichen, wurden Voruntersuchungen an CTC und iso-CTC beladenen Modellpartikeln

(Aluminiumoxid, Sand, Tonminerale, Boden) durchgeführt. Die Ergebnisse belegen, dass

prinzipiell partikelgebundenes CTC quantifizierbar ist. Ob ein Fluoreszenzscreening auf

Realböden anwendbar sein wird bleibt noch offen, da bei CTC-belasteten Böden nur sehr

geringe, durch Quenchingeffekte bedingte, Fluoreszenzintensitäten auftraten. Weitere

methodische Untersuchungen sind daher notwendig, wobei zur Datenanalyse die

Anwendung chemometrischer Methoden mit einzubeziehen wäre.

7 Literatur 149

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[16] RICHTLINIE 2004/28/EG DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND DES RATES vom 31. März 2004 zur

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[55] Futtermittelgesetz in der Fassung vom 16. Juli 1998, BGBl. I S. 1850, 1998

[56] VERORDNUNG (EG) Nr. 1831/2003 DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND DES RATES vom 22.

September 2003 über Zusatzstoffe zur Verwendung in der Tierernährung; ABl. L 268 vom 18.10.2003

[57] Richtlinie 70/524/EWG des Rates vom 23. November 1970 über Zusatzstoffe in der Tierernährung; Amtsblatt

Nr. L 270 vom 14.12.1970

[58] BGVV – BUNDESINSTITUT FÜR GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND

VETERINÄRMEDIZIN; BgVV fordert zu zurückhaltendem und sorgsamem Umgang mit Tierarzneimitteln und

Futterzusatzstoffen auf; Pressemitteilung 07/1997 (14.4.1997)

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[60] BGVV – BUNDESINSTITUT FÜR GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND

VETERINÄRMEDIZIN; Avoparcin als Futterzusatzstoff in der Tierernährung vorläufig verboten; Pressemitteilung

1/1996 (29.01.1996)

[61] BGVV – BUNDESINSTITUT FÜR GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND

VETERINÄRMEDIZIN; Einsatz des Futtermittelzusatzstoffes Avoparcin wird europaweit verboten;

Pressemitteilung 24/1996 (20.12.1996)

[62] VERORDNUNG (EG) Nr.2821/98 DES RATES vom 17. Dezember 1998 zur Änderung der Richtlinie

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[65] Verordnung (EG) Nr. 108/2007 der Kommission vom 5. Februar 2007 zur Änderung der Verordnung (EG) Nr.

1356/2004 hinsichtlich der Bedingungen für die Zulassung des zur Gruppe Kokzidiostatika und andere

Arzneimittel zählenden Futtermittelzusatzstoffes Elancoban; ABl. L 31 vom 6.2.2007

[66] Verordnung (EG) Nr. 109/2007 der Kommission vom 5. Februar 2007 zur Zulassung von Monensin-Natrium

(Coxidin) als Futtermittelzusatzstoff; ABl. L 31 vom 6.2.2007

[67] Verordnung (EG) Nr. 1852/2003 der Kommission vom 21. Oktober 2003 zur Zulassung eines

Kokzidiostatikums in Futtermitteln für zehn Jahre; ABl. L 271 vom 22.10.2003

[68] Verordnung (EG) Nr. 1463/2004 der Kommission vom 17. August 2004 über die Zulassung des zur Gruppe

der Kokzidiostatika und andere Arzneimittel gehörenden Zusatzstoffes «Sacox 120 microGranulat» in

Futtermitteln für zehn Jahre; ABl. L 270 vom 18.8.2004

[69] Verordnung (EG) Nr. 600/2005 der Kommission vom 18. April 2005 über die Neuzulassung eines

Kokzidiostatikums als Zusatzstoff in Futtermitteln für zehn Jahre, die vorläufige Zulassung eines Zusatzstoffes

und die Zulassung bestimmter Zusatzstoffe in Futtermitteln für unbefristete Zeit; ABl. L 99 vom 19.4.2005

[70] Verordnung (EG) Nr. 249/2006 der Kommission vom 13. Februar 2006 zur Änderung der Verordnungen (EG)

Nr. 2430/1999, (EG) Nr. 937/2001, (EG) Nr. 1852/2003 und (EG) Nr. 1463/2004 hinsichtlich der Bedingungen für

die Zulassung bestimmter Futtermittel-Zusatzstoffe der Gruppe Kokzidiostatika und andere Arzneimittel; ABl. L 42

vom 14.2.2006

[71] Verordnung (EG) Nr. 496/2007 der Kommission vom 4. Mai 2007 zur Änderung der Verordnung (EG) Nr.

600/2005 hinsichtlich der Einführung eines Rückstandshöchstgehalts für den zur Gruppe Kokzidiostatika und

andere Arzneimittel zählenden Futtermittelzusatzstoff Salinomax 120G; ABl. L 117 vom 5.5.2007

[72] Verordnung (EG) Nr. 500/2007 der Kommission vom 7. Mai 2007 zur Änderung der Verordnung (EG) Nr.

1463/2004 hinsichtlich der Einführung eines Rückstandshöchstgehalts für den zur Gruppe Kokzidiostatika und

andere Arzneimittel zählenden Futtermittelzusatzstoff Sacox 120 microGranulat; ABl. L 118 vom 8.5.2007

[73] Verordnung (EG) Nr. 167/2008 der Kommission vom 22. Februar 2008 über die Neuzulassung eines

Kokzidiostatikums als Zusatzstoff in Futtermitteln für zehn Jahre; ABl. L 50 vom 23.2.2008

[74] Verordnung (EG) Nr. 937/2001 der Kommission vom 11. Mai 2001 zur Zulassung neuer

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Anhang A 1

A Anhang

Inhaltsverzeichnis

A.1 Experimentelles ................................................................................................................4

A.1.1 Chemikalien .............................................................................................................4

A.1.2 Geräte ......................................................................................................................5

A.1.2.1 HPLC-DAD-MS/MS.........................................................................................5

A.1.2.2 HPLC-UV ........................................................................................................6

A.1.2.3 Spektrometer...................................................................................................7

A.1.2.4 UV-Lampe.......................................................................................................7

A.1.2.5 Probenhomogenisierung.................................................................................7

A.1.2.6 Zentrifuge........................................................................................................7

A.1.2.7 SPE-Extraktionseinheit ...................................................................................8

A.1.2.8 Probentrocknung/-einengung..........................................................................8

A.1.2.9 pH-Meter .........................................................................................................8

A.1.3 Lösungen und Reagenzien......................................................................................8

A.1.3.1 Mobile Phasen ................................................................................................8

A.1.3.2 Herstellung des NH3/NH4Cl/EDTA-Extraktanten (pH 10)................................9

A.1.3.3 Antibiotika-Stammlösungen ............................................................................9

A.1.3.4 Herstellung der e-iso-CTC/iso-CTC-Stammlösung.........................................9

A.1.3.5 Kalibrierlösungen ............................................................................................9

A.1.3.6 Mischstandardlösungen ..................................................................................9

A.1.3.7 Antibiotikalösungen für die Sorptionsversuche .............................................10

A.1.3.8 Herstellung des Ammoniak-Puffers...............................................................10

A.1.3.9 Metallstandardlösungen................................................................................10

A.1.4 Proben ...................................................................................................................10

A.1.4.1 Bodenproben des Feldversuchs ...................................................................10

A.1.4.2 Nullprobe.......................................................................................................10

A.1.4.3 Proben der Säulenversuche..........................................................................11

A.1.5 Durchführungen .....................................................................................................11

A.1.5.1 HPLC-DAD-MS2-Methodenentwicklung........................................................11

A.1.5.2 Probenaufarbeitung für Bodenproben...........................................................11

A.1.5.2.1 Extraktionsmethode..............................................................................11

A.1.5.2.2 Festphasenextraktion (SPE) ................................................................12

A.1.5.2.3 Wiederholbarkeit der Probenaufarbeitung............................................12

A.1.5.3 Methodenvalidierung.....................................................................................13

Anhang A 2

A.1.5.3.1 Externe Kalibrierung.............................................................................13

A.1.5.3.2 Signalsuppression durch Matrixbestandteile........................................13

A.1.5.3.3 Wiederfindung ......................................................................................13

A.1.5.4 Rückstandsuntersuchung von Bodenproben ................................................14

A.1.5.5 Sorptionsversuche ........................................................................................14

A.1.5.5.1 Sorptionsbedingungen .........................................................................15

A.1.5.5.2 Herstellung von CTC- und iso-CTC-belandenen

Aluminiumoxidpartikeln........................................................................15

A.1.5.6 Photometrische Untersuchung von Metall-CTC bzw. –iso-CTC-

Komplexen....................................................................................................16

A.1.5.7 Rückstandsuntersuchung aufgearbeiteter Boden-, Gülle- und

Sickerwasserproben der Säulenversuche ....................................................17

A.1.5.8 Versuchsdurchführung zur Extrahierbarkeit von Eisenhydroxid-

gebundenem CTC ........................................................................................17

A.1.5.9 Fluoreszenzuntersuchungen an partikelgebundenem CTC und

iso-CTC.........................................................................................................19

A.1.5.9.1 Qualitative Fluoreszenzuntersuchung..................................................19

A.1.5.9.2 Quantitative Fluoreszenzuntersuchung................................................19

A.2 Validierung......................................................................................................................19

A.2.1 Ausreißertest nach Grubbs ....................................................................................19

A.2.2 Kalibrierdaten.........................................................................................................20

A.2.3 Kalibrierung und Regressionsanalyse....................................................................22

A.2.4 Korrelationskoeffizient............................................................................................26

A.2.5 Überprüfung der Linearität .....................................................................................26

A.2.5.1 Visueller Linearitätstest nach Funk ...............................................................27

A.2.5.2 Anpassungstest nach Mandel.......................................................................28

A.2.5.3 Varianzenhomogenität ..................................................................................29

A.2.5.4 Residualanalyse............................................................................................32

A.2.6 Verfahrenskenndaten.............................................................................................34

A.2.7 Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze ................................................35

A.2.7.1 Nachweisgrenze............................................................................................35

A.2.7.2 Erfassungsgrenze .........................................................................................35

A.2.7.3 Bestimmungsgrenze .....................................................................................35

A.2.8 Wiederfindungsrate ...............................................................................................37

A.3 Kennwerte zu den untersuchten Böden..........................................................................38

A.3.1 Boden „Soest“ ........................................................................................................38

A.3.2 Boden „Hamm“.......................................................................................................40

Anhang A 3

A.4 Ergebnisse......................................................................................................................42

A.4.1 Ergebnisse der Wiederfindung...............................................................................42

A.4.2 Ergebnisse der Rückstandsuntersuchung der Bodenproben der Feldversuche....43

A.4.3 Ergebnisse zu den Messproben der Säulenversuche............................................47

A.4.3.1 Gülle..............................................................................................................47

A.4.3.2 Säulenelutate ................................................................................................48

A.4.3.3 Boden............................................................................................................49

Anhang A 4

A.1 Experimentelles

A.1.1 Chemikalien

Acetonitril (HPLC Grade; Merck)

Ameisensäure reinst, 98-100 % (Merck)

Ammoniaklösung, 25% (w/w; p.a.; Merck)

Ammoniumchlorid (NH4Cl p.a.; Merck)

Anhydrochlortetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros)

Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2 · 2 H2O; p.a.; Merck)

Chlortetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros)

Demeclocyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros)

Doxycyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros)

Eisen-II-sulfat Heptahydrat (FeSO4 · 7 H2O; p.a.; Merck)

Epichlortetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros)

Ethylendiamintetraessigsäure Dihydrat Dinatriumsalz, EDTA (Triplex III:

C10H14N2Na2O6*2H2O; p.a.; Merck)

Isochlortetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros)

Methanol (p.a.; Merck)

N4-Acetylsulfadiazin (im Arbeitskreis hergestellt)

Oxytetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros)

Pufferlösungen, pH 2 und pH 7 (gebrauchsfertig; Merck)

Salzsäure, 25 % (w/w; p.a.; Merck)

Sulfadiazin min. 99 % (Sigma-Aldrich)

Tetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros)

Titrisol- Aluminium-Standard (Merck)

Titrisol- Blei-Standard (Merck)

Titrisol- Eisen(III)-Standard (Merck)

Titrisol- Kupfer-Standard (Merck)

Titrisol- Magnesium-Standard (Merck)

Titrisol- Nickel-Standard (Merck)

Titrisol- Zink-Standard (Merck)

Trimethoprim (Sigma-Aldrich)

Wasser (bidestilliert über Quarzglas mit Destamat Bidest von Heraeus/Hanau)

Anhang A 5

A.1.2 Geräte

A.1.2.1 HPLC-DAD-MS2 (HPLC-MS/MS)

Für die Methodenentwicklung (Kap. 5.1.2), die Analyse der Bodenproben (Kap. 5.1.4), die

Antibiotikabestimmung in den aufgearbeiteten Proben aus den Säulenversuchen (Kap. 5.2.2)

sowie der Untersuchungen zur Extrahierbarkeit von an Eisenhydroxid gebundenem CTC

wurde ein HPLC-Komplettsystem (Thermo Finnigan/Thermo Electron) mit dem

massenselektivem Detektor LCQ-Advantage ESI-Ion Trap verwendet. Die Datenauswertung

erfolgte mit Xcalibur-Software (Version 1.3). Die detektierten Analyten und die zur

massenspektrometrischen Bestimmung erforderlichen Kenngrößen der Analyte sowie deren

Retentionszeiten sind in Kap. 5.1.2 (Tab. 6-8) aufgeführt.

Die aus dem Signal zu Rauschverhältnissen abgeschätzten Nachweisgrenzen (NWG: S/N =

3:1) im Boden liegen für SFD bei 10 µg/kg TM und für CTC bei 10 µg/kg TM. Die

abgeschätzten Bestimmungsgrenzen (BG: S/N = 10:1) im Boden liegen für SFD bei 40 µg/kg

TM und für CTC bei 25 µg/kg TM. Für die Säuleneluate liegen die abgeschätzten

Nachweisgrenzen (NWG: S/N = 3:1) für SFD bei 20 ng/L und für CTC bei 10 ng/L. Die

abgeschätzten Bestimmungsgrenzen (BG: S/N = 10:1) für die Säuleneluate liegen für SFD

bei 50 ng/L und für CTC bei 20 ng/L.

HPLC-System (Spectra): Degasser: SCM 1000 Vakuum Membrane Degasser; Pumpe: P

4000 Gradient Pumpe; Injektionsautomat: AS 3000, Autosampler (gekühlt: 10 ºC) mit

integriertem Säulenofen (temperiert: 30 ºC); UV-Detektor: UV 6000 LP; Messbereich: 190 –

800 nm, Detektionswellenlänge: 267 nm; Injektionsvolumen: 20-40 µL; Fluss: 0,4 mL/min;

Vorsäule: Phenomenex C18-ODS, 4 mm Länge, 2 mm i.D., Analytische Säule: Phenomenex

250 x 2,0 mm, Synergi 4µ Hydro-RP;

Gradientenelution: Laufmittel A: 89,9% bidest. Wasser, 0,1% Ameisensäure,

10% Acetonitril (v/v/v)

Laufmittel B: 39,9% bidest. Wasser, 0,1% Ameisensäure,

60% Acetonitril (v/v/v)

Gradient: ist in Abbildung A1 dargestellt.

Ionisierungsmethode: Electrospray Ionization (ESI), positiv-Mode [M+H]+, MS/MS-

Stoßexperimente (He), Precursor- und Produkt-Ionen.

Tune-Page-Parameter: Mass Range: 80 – 2000 [m/z]; Sheat Gas Flow Rate: 47 [arb];

Auxillary Gas Flow Rate: 0 [arb]; Ion Spray Voltage: 5 kV; Capillary Temperature: 250 ºC;

Capillary Voltage: 9 V; Tube Lens Offset: - 5,0 V; Multipole 1 Offset: - 1,5 V; Lens Voltage: -

32 V; Multipole 2 Offset: - 5,5 V.

Anhang A 6

0 5 10 15 20 25 30 35 40

100

Laufmittel A

Laufmittel B

Zusammensetzung [%]

Zeit [min]

Gradient

Abb. A1: Gradient der HPLC-DAD-MS2-Bestimmung

A.1.2.2 HPLC-UV

Für die Analyse der Proben aus den Sorptionsexperimenten (Kap. 5.2.1.1) wurde die HPLC-

UV eingesetzt, da hier keine Matrix in den Proben mit Ausnahme des Oberbodens zu

erwarten war, welche die Bestimmung von Tetracyclinen oder SFD mittels UV-Detektion

beeinträchtigte. Für den Oberboden wurden die Proben zusätzlich mit der HPLC-DAD-MS2

analysiert.

HPLC-UV-System

Degasser : Knauer WellChrom Degasser K-5004

Autosampler : Gynkotek GINA 50

HPLC-Säule : Synergi 4µ Hydro-RP, 250 x 2,00 mm (Phenomenex)

HPLC-Pumpe : Gynkotek P580 Pump

Säulenofen : Gynkotek STH Column Oven

Detektor : Gynkotek UVD 340S DAD

Gradientenelution: Laufmittel A: 89,9% bidest. Wasser, 0,1% Ameisensäure,

10% Acetonitril (v/v/v)

Laufmittel B: 39,9% bidest. Wasser, 0,1% Ameisensäure,

60% Acetonitril (v/v/v)

Gradient: siehe Abb. A1

Anhang A 7

A.1.2.3 Spektrometer

UV/VIS:

Für die photometrischen Messungen in Kapitel 5.2.1.2 wurde ein Lambda 11 UV/Vis

Spektrometer von Perkin-Elmer benutzt. Als Strahlungsquelle diente für den UV-Bereich von

200-326 nm eine Deuterium-Gasentladungslampe und für den Vis- und nahen Infrarot-

Bereich von 326-900 nm eine Halogenlampe.

CTC und iso-CTC, sowie die entsprechenden Komplexe absorbieren ab ca. 225 nm bis 600

nm. Es wurde somit ein Messbereich von 200 – 700 nm gewählt ihren gesamten

Absorptionsbereich abzudecken.

Fluoreszenz:

Zur qualitativen Fluoreszenzanalyse Tetracyclin-beladener Partikel (Kap. 5.2.4.1) wurde das

Varioskan (Spectrofluorometer und Spectrophotometer) der Firma Thermo Electron

verwendet. Als Probenbehälter dienten Mikrotiterplatten.

Einstellungen: Anregungswellenlänge (λex): 314 nm; Emissionswellenlänge (λem): 580 nm;

Excitation bandwidth: 5 nm; Step size: 1 nm; Measurement time: 100 ms; Automatische

Mittelung von 10 Einzelspektren (Measurement time: 10ms / Spektrum)

Die quantitative Fluoreszenzanalyse von CTC- und iso-CTC-beladenen

Aluminiumoxidpartikeln (Kap. 5.2.4.2) erfolgte mittels eines Spektrometers der Firma Perkin

Elmer (Luminescence spectrometer LS50B). Für CTC betrug die Anregungswellenlänge 410

nm und für iso-CTC 342 nm. Als Probenbehälter dienten Mikrotiterplatten.

A1.2.4 UV-Lampe

Zur Untersuchung der Fluoreszenz Tetracyclin-beladener Partikel wurde eine UV-Lampe der

Firma Camag (REPROSTAR II) mit zwei wählbaren Wellenlängen (λex = 254 nm, λex = 366

nm) benutzt.

A1.2.5 Probenhomogenisierung

Horizontalschüttler (IKA Labortechnik)

Vortex-Rüttler, IKA Vibrax VXR basic (IKA Labortechnik)

A1.2.6 Zentrifuge

Rotofix 32 (Hettich)

Bei diesem Zentrifugentyp entsprechen 4000 U/min einer RZB (relativen

Zentrifugalbeschleunigung) von 2325 g.

Anhang A 8

A1.2.7 SPE-Extraktionseinheit

Zur Festphasenextraktion wurde eine Absaugeinheit (LiChrolut) der Firma Merck eingesetzt.

Das für die SPE erforderliche Vakuum wurde mittels einer Wasserstrahlpumpe erzeugt und

durch einen Regler an der Absaugeinheit eingestellt. Die Durchflussgeschwindigkeit durch

die SPE-Kartuschen erfolgte objektiv anhand der Tropfenanzahl pro Zeiteinheit und wurde

anhand von zwischen Absaugeinheit und Kartusche liegenden Kunststoffhähnen reguliert.

A.1.2.8 Probentrocknung/-einengung

Bei der Probenaufarbeitung wurde ein Metallblockthermostat mit Vaporisationsvorrichtung

(RSC/Reinhardshagen) zum Abblasen des Lösungsmittels (Methanol) im Druckluftstrom

verwendet.

Zur Trocknung partikulärer Proben wurde eine Gefriertrocknungsanlage der Firma Christ

(Alpha 1-4) eingesetzt.

A.1.2.9 pH-Meter

Zur Bestimmung und Einstellung von pH-Werten wurde ein Digital-Mikroprozessor-pH-Meter

(pH-Meter 766, Calimatic) der Firma Knick verwendet.

Zu Beginn jeder pH-Bestimmung wurde das Gerät mittels gebrauchsfertiger Pufferlösungen

(pH 2 und pH 7) kalibriert.

A.1.3 Lösungen und Reagenzien

A.1.3.1 Mobile Phasen

Laufmittel A: In einem 3000 mL-Becherglas wurden 1800 mL bidest. H2O vorgelegt und 2 mL

konz. Ameisensäure (reinst) sowie 200 mL Acetonitril (HPLC Grade) zugegeben. Die Lösung

wurde durch Rühren (Magnetrührer) gut gemischt und im Anschluss filtriert (Phenomenex

Filter Membranes: Nylon66 0,2μ, 47 mm).

Laufmittel B: In einem 3000 mL-Becherglas wurden 800 mL bidest. H2O vorgelegt und 2 mL

konz. Ameisensäure (reinst) sowie 1200 mL Acetonitril (HPLC Grade) zugegeben. Die

Lösung wurde durch Rühren (Magnetrührer) gut gemischt und im Anschluss filtriert

(Phenomenex Filter Membranes: Nylon66 0,2μ, 47 mm).

Anhang A 9

A.1.3.2 Herstellung des NH3/NH4Cl/EDTA-Extraktanten (pH 10) „Ammoniak-EDTA-

Puffer“

54,0 g Ammoniumchlorid wurden in einen 1000 mL Messkolben eingewogen und in 200 mL

bidest. Wasser gelöst. Danach wurden 37,224 g EDTA Dinatriumsalz und 350 mL konz.

Ammoniaklösung (25% w/w) zugesetzt. Im Anschluss wurde mit bidest. Wasser auf 1000 mL

aufgefüllt. Der pH-Wert des Extraktionspuffers betrug 10,0.

A.1.3.3 Antibiotika-Stammlösungen

Die Stammlösungen aller eingesetzten Analyt-Substanzen (mit Ausnahme von e-iso-CTC)

wurden als Einzellösungen hergestellt. Hiezu wurden 10,0 mg des Feststoffes (Pulver) in

einen 10 mL-Messkolben eingewogen, welcher im Anschluss mit Methanol (p.a.) aufgefüllt

und gut gemischt wurde. Die Stammlösungen (ß=1000 mg/L) wurden danach bei -30°C

gelagert.

A.1.3.4 Herstellung der e-iso-CTC/iso-CTC-Stammlösung

Da e-iso-CTC nicht erhältlich ist wurde eine e-iso-CTC/iso-CTC Mischstammlösung durch

Epimerisierung einer iso-CTC-Stammlösung hergestellt. Dazu wurden in einen 10 mL-

Messkolben 3 mL Methanol mittels einer Eppendorf-Pipette vorgelegt und 2 mL aus einer

iso-CTC-Stammlösung (ß=1000 mg/L) zugegeben. Des Weiteren wurden ca. 4,5 mL

Laufmittel A zugegeben. Die Lösung wurde durch 10maliges Umdrehen des Messkolbens

durchmischt und im Anschluss mit Laufmittel A auf 10 mL Gesamtvolumen aufgefüllt und die

Lösung erneut durchmischt. Der Messkolben wurde im Anschluss für 60min mittels eines

Wasserbades (60°C) erwärmt. Die iso-CTC-Konzentration dieser Lösung wurde mittels

HPLC-UV bestimmt. Die Differenz zur Ausgangskonzentration (200 mg/L) entsprach der e-

iso-Konzentration dieser Lösung. Die so erhaltene Stammlösung wurde bei -30°C gelagert.

A.1.3.5 Kalibrierlösungen

Die Kalbrierlösungen wurden durch Verdünnung der Stammlösungen mit Laufmittel A

hergestellt.

A.1.3.6 Mischstandardlösungen

Die Mischstandardlösung I (CTC, SFD, TMP) wurde bei der Ermittlung der Wiederfindungen

in Kap. 5.1.2.2 eingesetzt und durch Verdünnung der Stammlösungen von CTC, SFD und

TMP mit Methanol hergestellt. Die Mischstandardlösung II (CTC, SFD) wurde bei der

Ermittlung der Wiederfindungen in Kap. 5.1.3.3 eingesetzt und durch Verdünnung der

Stammlösungen von CTC und SFD mit bidest. H2O hergestellt.

Anhang A10

A.1.3.7 Antibiotikalösungen für die Sorptionsversuche

Die Antibiotikalösungen aller in den Sorptionsversuchen (Kap. 5.2.1.1) eingesetzten Analyt-

Substanzen wurden als Einzellösungen hergestellt. Hiezu wurden 100 mg des Feststoffes

(Pulver) in einen 1000 mL-Messkolben eingewogen, welcher im Anschluss mit bidest. H2O

aufgefüllt und gut gemischt wurde.

A.1.3.8 Herstellung des Ammoniak-Puffers

54,0 g Ammoniumchlorid wurden in einen 1000 mL Messkolben eingewogen und in 200 mL

bidest. Wasser gelöst. Danach wurden 350 mL konz. Ammoniaklösung (25% w/w) zugesetzt

und im Anschluss mit bidest. Wasser auf 1000 mL aufgefüllt. Der pH-Wert des

Ammoniakpuffers betrug 10,0.

A.1.3.9 Metallstandardlösungen (Me+-Standardlösungen)

Aus Metallsalzstammlösungen (ß=1000 mg/L; Titrisol- Aluminium-Standard; Titrisol- Blei-

Standard; Titrisol- Eisen(III)-Standard; Titrisol- Kupfer-Standard; Titrisol- Magnesium-

Standard; Titrisol- Nickel-Standard; Titrisol- Zink-Standard; Calcium-Standard (aus

Calciumchlorid-Dihydrat in bidest. H2O) und Eisen(II)-Standard (aus Eisen-II-sulfat

Heptahydrat in bidest. H2O)) wurden durch Verdünnung mit bidest. Wasser Me+-

Standardlösungen der Konzentration 0,01 mol/L hergestellt.

A.1.4 Proben

Die zu untersuchenden Proben wurden im Rahmen der zugrunde liegenden

Forschungsprojekte durch die jeweils beteiligten Kooperationspartner entnommen.

A.1.4.1 Bodenproben des Feldversuchs

Die Güllebeaufschlagungen (Eintrag der Antibiotika in den Boden) und Probennahmen der in

Kapitel 5.1.4 untersuchten Bodenproben wurden vom Fachbereich Agrarwirtschaft der

Fachhochschule Südwestfalen (Abtl. Soest) durchgeführt und im entsprechenden

Projektbericht [476] sowie in Grote et al. [96] beschrieben.

A.1.4.2 Nullprobe

Für alle Versuche (Wiederfindung, Matrixextraktion, Sorption) wurde die Bodenprobe vom

12.03.2002 („Winterweizen“, Probenahme vor der ersten Gülledüngung am 12.03.,

Bodenhorizont: 0-25 cm) als Nullprobe eingesetzt. In dieser Bodenprobe konnten keine

Antibiotikarückstände (SFD, N4-SFD, e-iso-CTC, iso-CTC, e-CTC, CTC, anhydro-CTC,

TMP) nachgewiesen werden.

Anhang A11

A.1.4.3 Proben der Säulenversuche

Die Probennahme und die Probenaufarbeitung von Gülle- und Bodenproben sowie der

Säuleneluate (Kap. 5.2.2) wurden vom Institut für Wasserforschung durchgeführt und im

entsprechenden Projektbericht [477] publiziert.

A.1.5 Durchführungen

A.1.5.1 HPLC-DAD-MS2-Methodenentwicklung

Zur Methodenentwicklung der massenspektrometrischen Detektion wurden die

Fragmentierungsmuster der Antibiotika (Analyte) durch Direktinjektion von Kalibrierlösungen

der einzelnen Antibiotika (ß=20 mg/L) in das Massenspektrometer durch Aufnahme von

Vorläufer- und Produkt-Ionen-Scans ermittelt. Zur weiteren Methodenentwicklung wurden

Misch-Kalibrierlösungen (ohne und mit extrahierter Bodenmatrix) mit verschiedenen

Antibiotikakonzentrationen (ß=0,005 bis 10 mg/L) eingesetzt anhand derer die jeweiligen

Massen- und UV-Spektren aus dem chromatographischen Lauf aufgenommen sowie die

Retentionszeiten ermittelt wurden.

A.1.5.2 Probenaufarbeitung für Bodenproben

Die Probenaufarbeitung für Bodenproben beinhaltete eine fest/flüssig Extraktion mittels

NH3/NH4Cl/EDTA-Puffer (pH 10) und eine anschließende Festphasenextraktion des

Bodenextraktes.

A.1.5.2.1 Extraktionsmethode

Einwaagen von 5,00 g des feuchten Bodens wurden in einem 50 mL Zentrifugenglas

eingewogen, mit 10 mL NH3/NH4Cl/EDTA-Extraktant (pH 10) versetzt und 30 min. auf einem

Horizontalschüttler (275 U/min) äquilibriert und dann bei 4000 U/min für 10 min. zentrifugiert.

Die Überstände wurden in ein weiteres 50 mL Zentrifugenglas überführt. Die Bodenprobe

wurden erneut mit 10 mL NH3/NH4Cl/EDTA-Extraktant versetzt, mit einem Glasstab

aufgeschlämmt und wieder für 30 min geschüttelt. Anschließend wurde 10 min bei 4000

U/min zentrifugiert und der Überstand zur ersten Charge gegeben. Die vereinigte

Extraktionslösung wurde mit Salzsäure (25% (w/w)) auf pH 4,0 eingestellt und ein weiteres

Mal bei 4000 U/min 10 min lang zentrifugiert. Dieser Extrakt wurde zur SPE eingesetzt.

Anhang A12

A.1.5.2.2 Festphasenextraktion (SPE)

Zur Anreicherung und Aufreinigung der Bodenextrakte wurden in der SPE-Extraktionseinheit

Festphasenkartuschen (Waters Oasis® HLB 6cc (200 mg)) nach dem in Abbildung A2

dargestellten Schema eingesetzt. Das Einengen der Extrakte erfolgte mittels eines

Metallblockthermostates (Sauerbrey Chromatographie (RSC)) bei 30°C im Druckluftstrom.

Abb. A2: SPE-Schema zur Bestimmung von CTC und SFD in Bodenproben

Die erhaltenen Messproben wurden bis zur Analyse mittels HPLC-DAD-MS2 bei -30°C

tiefgefroren. Der Umrechnungsfaktor von den in den Messproben ermittelten Antibiotika-

Konzentrationen (µg/L) zum Gehalt in den Bodenproben (µg/kg) beträgt 0,1.

A.1.5.2.3 Wiederholbarkeit der Probenaufarbeitung

Um die Leistungsfähigkeit der entwickelten Probenvorbereitung zu ermitteln wurde eine

Wiederfingsstudie (für SFD, TMP, CTC) durchgeführt, welche gleichzeitig dazu dienen sollte,

den Arbeitschritt der zur Probenaufreinigung und –aufkonzentration eingesetzten SPE-

Methode mittels dotiertem Extraktionsmittel zu überprüfen. Hierzu wurden 6mal je 5,00 g

Boden (Nullprobe) in ein Zentrifugenglas eingewogen, mit 500 µL Mischstandardlösung I

(CTC, SFD und TMP; ß=10 mg/L; Lösungsmittel: Methanol) dotiert und suspensiert sowie

10mal je 10 mL NH3/NH4Cl/EDTA -EDTA-Extraktant. Nach 30 min. Einwirkzeit wurden die

Proben nach der oben beschriebenen Probenaufarbeitung aufgearbeitet und mittels HPLC-

Anhang A13

DAD-MS2 analysiert. CTC wurde dabei als Summe der e-iso-CTC- und iso-CTC-

Konzentration bestimmt.

A.1.5.3 Methodenvalidierung

A.1.5.3.1 Externe Kalibrierung

Zur Validierung der HPLC-MS/MS-Methode wurden Kalibrierlösungen aus SFD, e-iso-CTC

und iso-CTC der Konzentrationen 50 µg/L; 100 µg/L; 200 µg/L; 500 µg/L; 750 µg/L; 1000

µg/L; 2000 µg/L; 5000 µg/L; 7500 µg/L und 10000 µg/L hergestellt und 10fach analysiert.

Aufgrund der Epimerisierung e-iso-CTC/iso-CTC betrug die tatsächliche Konzentration von

e-iso-CTC in den Kalibrierlösungen 50,055 µg/L; 100,11 µg/L; 200,22 µg/L; 500,55 µg/L;

750,825 µg/L; 1001,1 µg/L; 2002,2 µg/L; 5005,5 µg/L; 7508,25 µg/L; 10011 µg/L und die

Konzentrationen von iso-CTC 78,05 µg/L; 156,1 µg/L; 312,2 µg/L; 780,5 µg/L; 1170,75 µg/L;

1561 µg/L; 3122 µg/L; 7805 µg/L; 11707,5 µg/L; 15610 µg/L.

A.1.5.3.2 Signalsuppression durch Matrixbestandteile

Zur Untersuchung von Suppressionseffekten durch koeluierte Matrixbestandteile auf die

massenspektrometrische Detektion wurde aus 5,00 g unbelasteten Boden (Nullboden) nach

der Probenaufarbeitungsvorschrift (Anhang A.1.5.2.1) je eine Matrixprobe (koeluierte

Bodenmatrix) gewonnen. Anstelle mit 500 µL Laufmittel A wurden die extrahierten und nach

der SPE bis zur trockene eingeengten Matrixbestandteile aber mit 500 µL Kalibrierlösungen

aus SFD, e-iso-CTC und iso-CTC aufgenommen. Jeweils drei Matrixproben wurden mit

Kalibrierlösungen (SFD, e-iso-CTC und iso-CTC) der Konzentrationen 100 µg/L; 200 µg/L;

500 µg/L; 750 µg/L; 1000 µg/L; 2000 µg/L und 5000 µg/L (exakte e-iso-CTC und iso-CTC

Konzentration siehe Kap. 8.5.3.1) aufgenommen. Als Vergleichsproben dienten die

jeweiligen Kalibrierungslösungen der jeweiligen Konzentrationen. Jede Probe (mit und ohne

Matrix) wurde zweimal mittels HPLC-MS/MS analysiert und der Mittelwert der erhaltenen

Messsignale (Peakflächen) pro Analyt und Konzentration gebildet.

A.1.5.3.3 Wiederfindung

Zur Untersuchung der konzentrationsabhängigen Wiederfindung wurden 12mal je 5,00 g

Boden (Nullprobe) in ein Zentrifugenglas eingewogen. Je 4 Proben wurden 500 µL

Mischstandardlösung II (CTC, SFD; Lösungsmittel: bidest. H2O) der Konzentrationen 0,25

mg/L; 1 mg/L und 10 mg/L zugegeben und suspensiert (geschüttelt). Nach 15 Minuten

Einwirkzeit wurden die Proben nach der Probenaufarbeitungsvorschrift aufgearbeitet und

mittels HPLC-DAD-MS2 (3-fach Injektion) analysiert. CTC wurde dabei als Summe von e-iso-

CTC und iso-CTC bestimmt. Bei dieser Vorgehensweise entsprechen die Konzentrationen in

Anhang A14

den Messproben bei 100%iger Wiederfindung (und ohne Berücksichtigung von

Suppressionseffekten) den Konzentrationen der zugegebenen Mischstandardlösung.

A.1.5.4 Rückstandsuntersuchung von Bodenproben

Zur Untersuchung der Bodenproben (Kapitel 5.1.4) wurden aus jeder Bodenmischprobe

zwei Stichproben (Doppelbestimmung) von je 5,00 g feuchten Boden entnommen und

separat nach der Aufarbeitungsvorschrift aufgearbeitet. Pro aufgearbeitete Bodenprobe

(Messprobe) wurde der Gehalt von SFD, iso-CTC und e-iso-CTC mittels HPLC-MS/MS (3-

fach Injektion jeder Messprobe) bestimmt. Anhand vorliegender Daten der nach DIN ISO

11465 bestimmten Trockenrückstände bzw. Wassergehalte (siehe Anhang A.3.1) wurden die

Gehalte im Boden auf die Trockenmasse (TM), als aussagekräftigere (konstantere)

Bezugsgröße, umgerechnet. Die Messproben wurden zudem auf Rückstände von N4-SFD,

TMP und anhydro-CTC sowie durch die Probenaufarbeitung möglicherweise nicht-

isomerisiertes e-CTC und CTC untersucht. Zusätzlich wurden bei jeder Doppelbestimmung

zwei Blindproben (leere Zentrifugengläser) aufgearbeitet, um mögliche Kontaminationen bei

der Probenaufarbeitung ausschließen zu können.

A.1.5.5 Sorptionsversuche

Als Modellpartikel (Adsorbentien) wurden eingesetzt:

- Kieselgel 60 0,063-0,200 mm (Merck), säuregewaschen nach Orth

- Aluminiumoxid 90 basisch (Aktivitätsstufe I), 0,063-0,200 mm (Merck)

- Aluminiumoxid 90 sauer (Aktivitätsstufe I), 0,063-0,200 mm (Merck)

- Quarz feinkörnig, gewaschen und geglüht (Merck)

- Oberboden Hamm Kennwerte siehe Tab. A17 Anhang A.3.2

(Tiefe 10-37 cm)

- Rheinsand 0-2mm

- Bentonit mit 75% Montmorillonit (Süd-Chemie)

- Ton 1550 mit ca. 30% Kaolinit (Georg&Schneider GmbH, Siershan)

- Trisopor micro Korngrößenverteilung (d10:2,88 µm, d50:5,92 µm, d97:11,82 µm),

(poröses Glas) Porengröße: 100 nm, Porenvolumen: 841,39 mm3/g,

spezifische Oberfläche: 40,12 m2/g (VitraBio GmbH)

- Trisoperl Partikeldurchmesser: 80 µm, Porengröße: 100,6 nm,

(poröses Glas) Porenvolumen: 1053,09 mm3/g, spezifische Oberfläche:

42,04 m2/g (VitraBio GmbH)

Anhang A15

Folgende Antibiotika (Wirkstoffe und Umwandlungsprodukte) wurden eingesetzt:

Tetracycline: Chlortetracyclin (CTC), Iso-Chlortetracyclin (iso-CTC), 4-Epi-Chlortetracyclin (e-

CTC), Anhydro-Chlortetracyclin (anhydro-CTC), Tetracyclin (TC), Oxytetracyclin (OTC),

Doxycyclin (DoxyC), Demeclocyclin (DemecloC)

Sulfonamid: Sulfadiazin (SFD)

Die Adsorbierbarkeit der Verbindungen CTC, iso-CTC und SFD wurde mit allen

Modellpartikeln getestet, die anderen Tetracycline zu Vergleichszwecken nur mit Kieselgel.

A.1.5.5.1 Sorptionsbedingungen

Jeweils 1 g Sorbens wurden in 100 mL einer Antibiotikalösung (ß=100 mg/L; Lösungsmittel:

bidest. Wasser) unter Rühren (~ 400 U/min) bei Raumtemperatur suspensiert. Nach 5, 10,

15, 30, 45, 60 120 und 180 min wurden 500 µL Aliquot entnommen und in ein 1,5 mL

Eppendorff-Hütchen überführt. Die Feststoffe wurden durch einen Membranfilter

(Phenomenex Filter Membranes: Nylon66 0,2µ; 47 mm) filtriert. Beim Bentonit und Ton1550

war eine vorhergehende Zentrifugation (10 min bei 4000 U/min = 2325 g) erforderlich, da sie

die Durchflussrate des Filters stark einschränkten. Von dem Filtrat wurde ebenfalls eine 500

µL-Probe entnommen und der pH-Wert bestimmt. Der Filterrückstand wurde mit 10 mL

bidest. Wasser gewaschen, das Waschwasser separat aufgefangen und eine 500 µL Probe

entnommen. Die sorbierten CTC-Mengen wurden indirekt durch Analyse der wässrigen

Phasen mit HPLC-UV bestimmt.

Die restfeuchten Antibiotika-beladenen Partikel wurden in ein braunes 10 mL

Rollrandgläschen überführt, mit einer Filtermembran versehen und verschlossen. Die

Lyophilisation der Partikel erfolgte in einer Gefriertrocknungsanlage (Christ Alpha 1-4) über

einen Zeitraum von 8 Stunden (0,220 mbar). Die Antibiotika-beladenen Partikel wurden bis

zur qualitativen Fluoreszenzanalyse (Kap. 5.2.4.1) bei -30°C gelagert.

A.1.5.5.2 Herstellung von CTC- und iso-CTC-belandenen Aluminiumoxidpartikeln

Zur Vorbereitung einer quantitativen fluoreszenzspektrometrischen Bestimmung von

partikelgebundenem CTC bzw. iso-CTC wurden 5,00 g Aluminiumoxidpartikel (sauer) bei pH

7 mit verschiedenen Mengen an CTC bzw. iso-CTC (500 mL Antibiotikalösung (CTC bzw.

iso-CTC): ß= 1 µg/L; 10 µg/L; 100 µg/L; 1000 µg/L; 5000 µg/L; 10000 µg/L; 20000 µg/L;

Lösungsmittel: bidest. Wasser) nach der allgemeinen Sorptionsvorschrift (Anhang A.1.5.5.1)

belegt und lyophilisiert. Die sorbierten CTC-Mengen wurden indirekt durch Analyse der

wässrigen Phasen mit HPLC-DAD-MS2 bestimmt.

Die Beladungen mit CTC bzw. iso-CTC betrugen etwa 0,1, 1, 10, 100, 500, 1000 und 2000

µg/g (99-100% der CTC´s wurden sorbiert). Die Partikelproben wurden bis zur quantitativen

Fluoreszenzanalyse (Kap. 5.2.4.2) bei -30°C gelagert.

Anhang A16

A.1.5.6 Photometrische Untersuchung von Metall-CTC bzw. –iso-CTC-Komplexen

Zur photometrischen Untersuchung von Metall-CTC bzw. –iso-CTC-Komplexen wurden je

eine CTC und iso-CTC-Lösung der Konzentration 1,25 x 10-4 mol/L durch lösen der

Feststoffe in bidest. Wasser hergestellt. Dazu wurde 64,4 mg (1,25 x 10-4 mol) des jeweiligen

Hydrochlorids eingewogen und in je einen 1000 mL Messkolben gegeben. Nach Auffüllen

des Messkolbens mit bidest. Wasser auf 1000 mL wurde die Lösung gut durchmischt. Die

Messlösungen (CTC bzw. iso-CTC; ß= 0,1 mmol/L) mit definierten CTC-Metallverhältnissen

wurden aus den CTC-Lösungen, den jeweiligen Me+-Standardlösungen (ß= 0,01 mol/L) und

bidest. Wasser mit den in Tab. A1 dargestellten Volumenanteilen der Lösungen hergestellt.

Die benötigten Blindlösungen wurden ohne Zugabe von CTC-Lösungen hergestellt.

Tab. A1 Volumenanteile zur Herstellung von Mess- und Blindlösungen

Blindlösung Messlösung

Molares Verhältnis

CTC/iso-CTC-Me+

(CTC/iso-CTC;

ß=0,1 mmol/L)

H2O

[ml]

Metall-

Standardlösung

[µl]

(ß= 0,01mol/L)

CTC/iso-CTC

[ml]

(ß=0,125mmol/L)

H2O

[ml]

Metall-

Standardlösung

[µl]

(ß= 0,01mol/L)

CTC/iso-CTC

(ß=0,1 mmol/L)

20,0 16,0 4,0

1:3 19,4 600 16,0 3,4 600

1:2 19,6 400 16,0 3,6 400

1:1 19,8 200 16,0 3,8 200

2:1 19,9 100 16,0 3,9 100

3:1 29,9 100 24,0 5,9 100

Die pH-Wert Einstellung auf 3, 5,5 und 8,7 erfolgte im Vorfeld der Messung mit Salzsäure

oder Ammoniak-Puffer und wurde mittels einer pH-Elektrode vorgenommen. Der pH-Wert

wurde sowohl für die Blind- als auch für die Messlösung eingestellt.

Die Mess- und Blindlösungen wurden dunkel gelagert (Probengefäße (50 mL Messkolben) in

Aluminiumfolie eingewickelt). Über einen Zeitraum von 7 Tagen wurde täglich ein Aliquot aus

den Lösungen entnommen, in eine UV-Küvette gefüllt und photometrisch vermessen.

Um den Einfluss von Tageslicht auf die Alterung von CTC- und iso-CTC-Lösungen (ß=0,1

mmol/L; ohne Me+-Standardzugabe) zu untersuchen, wurde diese Lösungen zweifach

hergestellt und einmal dunkel und einmal bei Tageslicht (ohne Aluminiumfolie) gelagert.

Anhang A17

Die Mess- und Blindlösungen wurden grundsätzlich jeweils vor der Aliquotentnahme und der

Photometrie geschüttelt, um auch im Fall einer Niederschlagsbildung (Hydroxidfällung)

homogenisiert zu sein.

Proben, die als zentrifugiert gekennzeichnet wurden, sind vor ihrer Messung zusammen mit

ihrer Blindlösung für 10 Minuten bei 4000 U/min zentrifugiert worden. Als Mess- und

Blindlösung diente bei diesen Proben die überstehende Lösung (Zentrifugat).

Die Aufnahme eines UV/Vis-Spektrums mittels der Software UV-WinLab (Perkin – Elmer

Corporation / USA, Version: Nov. 1996) erforderte zwei Schritte.

Zunächst wurde eine Küvette mit einer Vergleichslösung „Blindlösung“ – in diesem Fall

bidest. Wasser und die entsprechende Metallsalzlösung in definierter Konzentration (gleiche

Metallkonzentration und pH-Wert wie die CTC enthaltene Probelösung) spektroskopisch

analysiert. Die Intensität des monochromatischen Lichts wurde in Abhängigkeit von der

Wellenlänge im Absorptionsmodus gemessen und vom Messcomputer gespeichert.

Anschließend wurde eine Messung bei gleichen Geräteeinstellungen mit der Probelösung

(„Messlösung“) durchgeführt. Dabei erfolgte durch die Gerätesoftware automatisch die

Differenzbildung mit dem Spektrum der Blindlösung. Dieser Prozess lieferte die Information

über die Lichtabsorption der Probelösung und damit das Absorptionsspektrum des Analyten

bzw. seiner Metallkomplexe.

A.1.5.7 Rückstandsuntersuchung aufgearbeiteter Boden-, Gülle- und

Sickerwasserproben der Säulenversuche

In den vom Institut für Wasserforschung nach der Ammoniak-EDTA-Methode

aufgearbeiteten Boden-, Gülle- und Sickerwasserproben (Aufarbeitungen siehe [477])

wurden die Gehalte von e-iso-CTC, iso-CTC und SFD jeweils 3mal mittels HPLC-DAD-MS2

bestimmt. Die Messproben wurden zudem auf Rückstände von N4-SFD, e-CTC und CTC

untersucht.

A.1.5.8 Versuchsdurchführung zur Extrahierbarkeit von Eisenhydroxid-gebundenem

CTC

Herstellung der 100 mL gepufferten Fe3+-Lösung (ß=50 mg/L)

5 mL der Eisen(III)-Stammlösung (ß=1000 mg/L) wurde in einen 200 mL-Messzylinder

vorgelegt und 80 mL bidest. Wasser sowie 2 mL Ammoniakpuffer hinzugefügt. Der pH-Wert

wurde anschließend mit Salzsäure auf pH=7 eingestellt. Im Anschluss wurde auf 100 mL mit

bidest. Wasser aufgefüllt.

Herstellung der CTC-Lösung (ß=10 mg/L)

Die CTC-Lösung wurde durch Verdünnung einer CTC-Stammlösung (ß=1000 mg/L; in

Methanol) mit bidest. Wasser hergestellt.

Anhang A18

„Gesamtkonzentration“

100 mL gepufferte Fe3+-Lösung (ß=50 mg/L) wurden mit 1000 µL CTC-Lösung (ß=10 mg/L)

versetzt. Die Lösung wurde anschließend 15 Minuten bei 275 U/min (Horizontalschüttler)

geschüttelt. Danach wurde 20 mL Ammoniak-EDTA-Puffer zugegeben und wiederum 15

Minuten geschüttelt. Im Anschluss wurde 30 min. stehen gelassen damit sich ausgefallenes

Eisenhydroxid absetzten konnte und die Probe bei 4000 U/min (=2325 g) für 10 min.

zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde dekantiert und mit 25%iger HCl auf pH=4 gebracht. Der

Rückstand wurde mit etwas Ammoniak-Puffer versetzt und ebenfalls mit HCl auf pH=4

gebracht, dabei sollte sich der Rückstand wieder vollständig lösen. Beide Proben wurden

getrennt mittels SPE (Anhang A.1.5.2.2) aufgearbeitet.

„gelöste Konzentration“

100 mL gepufferte Fe3+-Lösung (ß=50 mg/L) wurde mit 1000 µL CTC-Lösung (ß=10 mg/L)

versetzt. Die Lösung wurde anschließend 15 min. bei 275 U/min (Horizontalschüttler)

geschüttelt und zentrifugiert. Danach wurde 20 mL Ammoniak-EDTA-Puffer zum Zentrifugat

zugegeben und wiederum 15 min. geschüttelt. Im Anschluss wurde 30 min. stehen gelassen

damit sich ausgefallenes Eisenhydroxid absetzten konnte. Die Probe wurde mit 25%iger HCl

auf pH=4 gebracht, dabei sollte sich der Rückstand wieder vollständig lösen. Die Probe

wurde anschließend mittels SPE (Anhang A.1.5.2.2) aufgearbeitet.

Tabelle A.2 zeigt den Versuchsablauf nochmals in komprimierter Form.

Tab. A.2: Kurzubersicht der Vorgehensweise zur Sorption von CTC an Eisenhydroxid

Ablaufreihenfolge Probe B

„Gesamtkonzentration“

Probe A

„gelöste Konzentration“

Fe3+-Lösung (ß=1000 mg/L) 5 mL 5 mL

Ammoniakpuffer 2 mL 2 mL

HCl (25%) auf pH=7, auf 100 mL mit

bidest. Wasser

auf pH=7, auf 100 mL mit

bidest. Wasser

CTC-Lösung (ß=10 mg/L) 1000 µL 1000 µL

Zentrifugation/Trennung nein ja

Ammoniak-EDTA-Puffer 20 mL 20 mL

Zentrifugation/Trennung ja nein

HCl (25%) auf pH=4 auf pH=4

SPE ja ja

Die zu erwartende Gesamtkonzentration für CTC als Summe von iso-CTC und e-iso-CTC

betrug 100 µg/L vor der SPE. Nach der SPE waren bis zu 10 mg/L (Wiederfindung = 100%)

zu erwarten. Die Analyse der Proben erfolgte mittels HPLC-DAD-MS2 (Anhang A.1.2.1). Für

Probe C entsprach die Vorgehensweise der von Probe A und für Probe D der von Probe B

mit dem Unterschied, das in beiden Fällen erst die CTC-Lösung zugegeben wurde und

danach die Einstellung auf pH 7 erfolgte.

Anhang A19

A.1.5.9 Fluoreszenzuntersuchungen an partikelgebundenem CTC und iso-CTC

A.1.5.9.1 Qualitative Fluoreszenzuntersuchung

Ein Mikrolöffel der unbeladenen Modell-Partikel, beladenen Partikel (lyophilisiert) und „freien“

Tetracycline (Feststoffe) wurden in eine Mikrotiterplatte (Thermo Microtiter 96-well plate)

gegeben. Die Fluoreszenz wurde im Reflexionsmodus (spitzer Winkel) gemessen

(Varioskan, Spektrofluorometer und Spectrophotometer (Thermo Electron), siehe Anhang

A.1.2.3). Die Aluminiumoxidpartikel wurden zusätzlich mit einer UV-Lampe bei

Anregungswellenlängen von 254 nm und 366 nm qualitativ auf ihre Fluoreszenz untersucht.

A.1.5.9.2 Quantitative Fluoreszenzuntersuchung

Die Analyse der beladenen Aluminiumoxidpartikel erfolgte mittels des „Luminescence

spectrometer Perkin-Elmer LS50B“ in Mikrotiterplatten. Hierzu wurden die Partikel in die

Probenbehälter der Mikrotiterplatte gefüllt und die optimale Anregungswellenlänge ermittelt.

Für CTC betrug diese 410 nm und für iso-CTC 342 nm. Für die quantitative Analyse war

darauf zu achten, dass die Einfüllhöhe für alle Proben gleich war. Dies wurde dadurch

erreicht, dass die Probenbehälter der Mikrotiterplatte jeweils bis zum Rand mit den Partikeln

aufgefüllt und anschließend die Oberflächen der Füllung glatt gestrichen wurden. Jede Probe

wurde dreimal vermessen.

A.2 Validierung

A.2.1 Ausreißertest nach Grubbs

Durch den Grubbs-Test können Ausreißer, die auf systematische Fehler zurückzuführen

sind, identifiziert werden [7,511,526]. Man berechnet hierzu den Mittelwert x und den

Schätzwert der Standardabweichung s.

Gleichung 1: ∑

⋅= n

Gleichung 2: 1n

)xx(

−

=∑

Ein ausreißerverdächtiger Wert xar, also der Messwert mit der größten Differenz zum

Mittelwert, wird durch die Berechnung des Prüfwertes PW getestet.

Gleichung 3: s

PW ar −

Anhang A20

Der Prüfwert PW wird mit tabellierten Werten rM für den Grubbs-Test verglichen [7,511,526].

Das Testergebnis ist wie folgt zu bewerten:

PW ≤ rM (f, P = 90 %): kein Ausreißer; Mittelung erlaubt

rM (f, P = 90 %) < PW ≤ rM (f, P = 95 %): wahrscheinlich Ausreißer; Mittelung noch möglich

PW > rM (f, P = 95 %): Ausreißer; keine Mittelung erlaubt

Sofern der Test einen Ausreißer entdeckt, werden die Daten dieses Messwertes entfernt und

ein neuer Grubbs-Test mit n-1 Daten durchgeführt. Dies geschieht solange, bis mit Hilfe des

Tests keine Ausreißer mehr entdeckt werden.

A.2.2 Kalibrierdaten

Zur Validierung der HPLC-MS/MS-Methode wurden 10 Kalibrierlösungen im

Konzentrationsbereich von 50 µg/L – 10 mg/L für SFD, 55,055 µg/L -10,011 mg/L für e-iso-

CTC und 78,05 µg/L – 15,61 mg/L für iso-CTC hergestellt. Aus diesen Lösungen wurde

10mal pro Konzentration und Analyt die Fläche des MS-Signals im TIC der einzelnen

Fragmentionen mittels HPLC-MS/MS bestimmt. (Die ungeraden Konzentrationen der

Kalibrierlösungen für e-iso-CTC und iso-CTC sind bedingt durch Konzentrationen der

Epimere in der e-iso-CTC/iso-CTC Stammlösung (ß(e-iso-CTC)=100,11 mg/L; ß(iso-

CTC)=156,10 mg/L) aus denen die Kalibrierlösungen hergestellt wurden.)

Die Mittelwerte y der jeweiligen Peakflächen der einzelnen Kalibrierpunkte (Konzentration)

wurden nach Gleichung 4 berechnet. Jeder Kalibrierpunkt wird dabei 10-fach bestimmt

(n=10).

Gleichung 4: ∑

⋅= n

Die Standardabweichung s und die relative Standardabweichung srel für den jeweiligen

Kalibrierpunkt wurden durch die Gleichungen 5 und 6 ermittelt.

Gleichung 5: 1n

)yy(

−

=∑

Gleichung 6: %100

srel ⋅=

Anhang A21

Die relativen Standardabweichungen für die einzelnen Messpunkte sind für die einzelnen

Analyte in Tabelle A3-A5 aufgeführt.

Tab. A3: Kalibrierdaten und relative Standardabweichungen srel für SFD

Konzentration von SFD

[µg/L]

Mittelwert der Peakfläche

y (n=10)

srel

[%]

50 222968 17,5

100 543715 14,2

200 1142795 9,3

500 2380479 6,3

750 3632598 5,2

1000 4705592 1,7

2000 8745652 1,4

5000 17810819 1,8

7500 26567909 0,7

10000 34521104 0,9

Tab. A4: Kalibrierdaten und relative Standardabweichungen srel für e-iso-CTC

Konzentration von e-iso-CTC

[µg/L]

Mittelwert der Peakfläche

y (n=10)

srel

[%]

50,055 512119 14,8

100,11 1235960 10,4

200,22 2766782 10,8

500,55 5960387 3,8

750,825 8840043 3,2

1001,1 11866293 3,4

2002,2 26354558 3,3

5005,5 66758161 2,4

7508,25 97715846 2,1

10011 128818025 1,2

Anhang A22

Tab. A5: Kalibrierdaten und relative Standardabweichungen srel für iso-CTC

Konzentration von iso-CTC

[µg/L]

Mittelwert der Peakfläche

y (n=10)

srel

[%]

78,05 1429455 13,9

156,1 2862747 2,9

312,2 5808802 4,6

780,5 13239156 1,6

1170,75 19779745 4,1

1561 28098668 3,7

3122 62735307 2,1

7805 157800669 3,5

11707,5 242039353 2,0

15610 302460732 2,8

A.2.3 Kalibrierung und Regressionsanalyse

Für die Erstellung und Beurteilung einer Kalibration sind im Vorfeld einige Berechnungen

nötig, deren Grundlagen [511,520,526] kurz dargestellt werden sollen. In der Regel wird

diese Berechnung mittels geeigneter Auswerte- bzw. Statistiksoftware durchgeführt.

Ermittlung der Kalibrierfunktion ersten Grades

Für eine Funktion 1. Grades gilt:

Gleichung 7: xbay

⋅

mit: Mittelwert der Konzentrationen ∑

⋅= N

Mittelwert der Peakflächen (Detektorsignal) ∑

⋅= N

Die Steigung b der Kalibriergeraden ist ein Maß für die Empfindlichkeit:

Gleichung 8:

∑

−

−−

)xx(

)]yy)(xx[(

Anhang A23

Der Ordinatenabschnitt a stellt den errechneten Blindwert dar:

Gleichung 9: xbya

⋅

−=

Die Präzision der linearen Regression wird durch die Reststandardabweichung

ausgedrückt. Darunter versteht man das Maß für die Streuung der Messwerte y

si in y-

Richtung um die Regressionsgerade.

Die Reststandardabweichung für die lineare Regression wird wie folgt berechnet:

Gleichung 10: 2N

y1−

−

=∑

mit (ermittelte Peakfläche aus der Regressionsfunktion)

ii xbay

ˆ⋅+=

yMittelwert der experimentell ermittelten Peakfläche

Ermittlung der Kalibrierfunktion zweiten Grades

Für eine Funktion 2. Grades gilt:

Gleichung 11: 2

xcxbay ⋅+⋅+=

Für die Berechnung der Funktionskoeffizienten a, b und c der quadratischen Bezugsfunktion

werden zunächst einige Quadratsummen eingeführt:

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−=

∑

∑=

ixx ;

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

⋅

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−⋅=

∑∑

∑==

)yx(Q

iixy

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

⋅

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−=

∑∑

∑==

x3;

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−=

∑

∑=

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

⋅

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−⋅=

∑∑

∑==

)yx(Q

yx2

Anhang A24

Unter Verwendung dieser Quadratsummen, die lediglich der Vereinfachung der Formeln für

die Funktionskoeffizienten a, b und c dienen, lassen sich die jeweiligen

Funktionskoeffizienten nun wie folgt berechnen [511]:

Gleichung 12: N

xcxby

iii ⎟

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛−−

∑∑∑

===

Gleichung 13:

QcQ

⋅−

Gleichung 14:

yxx

QQQ

QQQQ

c⋅−

⋅−⋅

Für die Berechnung der Reststandardabweichung für die quadratische Regression gilt:

Gleichung 15: 3N

y2−

−

=∑

mit (ermittelte Peakfläche aus der Regressionsfunktion)

iii xcxbay

ˆ⋅+⋅+=

yMittelwert der experimentell ermittelten Peakfläche

Tabelle A6 und A7 zeigen die aus den Kalibrierdaten ermittelten Regressionsfunktionen für

die verschiedenen Kalibrationsbereiche (Arbeitsbereiche).

Anhang A25

Tab. A6: Lineares Kalibrationsmodell

Lineare Kalibration xbay

⋅

Analyt Konzentrations-

Bereich

[µg/L]

a b 1

s R R2

SFD 50-10000 772907 3415 592892 0,9989 0,9978

SFD 100-1000 142868 4585 73730 0,9993 0,9986

e-iso-CTC 50,055-10011 -176309 12996 927777 0,9998 0,9996

e-iso-CTC 100,11-1001,1 224387 11575 167486 0,9994 0,9988

e-iso-CTC 1001,1-10011 175032 12952 1400178 0,9997 0,9994

iso-CTC 78,05-15610 -749408 19945 4723354 0,9992 0,9984

iso-CTC 78,05-1170,75 306225 16651 208044 0,9997 0,9994

iso-CTC 1170,75-11707,5 -4368538 20984 1406152 0,9999 0,9998

Tab. A7: Quadratisches Kalibrationsmodell (Nur für Mandel-Test in A.2.5.2 von Bedeutung)

Quadratische Kalibration 2

xcxbay ⋅+⋅+=

Analyt Konzentrations-

Bereich

[µg/L]

a b c 2

s R2

SFD 50-10000 512750 3796 -0,0413 501316 0,9987

SFD 100-1000 121470 4715 -0,1206 88946 0,9987

e-iso-CTC 50,055-10011 -647271 13685 -0,0745 700559 0,9998

e-iso-CTC 100,11-1001,1 254606 11391 0,1699 203944 0,9989

e-iso-CTC 1001,1-10011 -2047108 14301 -0,1250 568197 0,9999

iso-CTC 78,05-15610 -2983549 22041 -0,1454 3795261 0,9991

iso-CTC 78,05-1170,75 175572 17478 -0,6694 226796 0,9996

iso-CTC 1170,75-11707,5 -3699898 20594 0,0310 1647136 0,9999

Anhang A26

A.2.4 Korrelationskoeffizient

Um die Güte der Anpassung durch die Regressionsgerade zu beurteilen werden häufig der

Korrelationskoeffizient R oder das Bestimmtheitsmaß R2 herangezogen, da diese

Indexzahlen als wichtige Kriterien für Linearität eine hohe Akzeptanz besitzen [526]. Der

Korrelationskoeffizient vergleicht die Streuung der Punkte von der Regressionsgeraden mit

der Gesamtstreuung des Verfahrens. Der Korrelationskoeffizient ist eine Indexzahl, die

angibt, ob und wie ein Variablenpaar (x;y) miteinander verknüpft ist (korreliert). Die Werte

des Korrelationskoeffizienten liegen zwischen –1 und +1 (negatives Vorzeichen für fallende

Gerade, positives Vorzeichen für aufsteigende Gerade). Die Berechnung des

Korrelationskoeffizienten erfolgt gemäß:

Gleichung 16:

[]

∑∑

∑

−⋅−

)yy()xx(

Ist der Korrelationskoeffizient in der Nähe von Null, ist ein funktionaler Zusammenhang

zwischen x und y nicht erkennbar. Nimmt der Korrelationskoeffizient Werte in der Nähe von

Eins ein, ist ein linearer Zusammenhang zwischen den Konzentrationswerten x und den

Messwerten y wahrscheinlich. Ein hoher Absolutbetrag für den Korrelationskoeffizienten ist

ein notwendiges, aber nicht hinreichendes Maß für die Linearität.

Das Quadrat des Korrelationskoeffizienten nennt man Bestimmtheitsmaß R2. Der Vorteil des

Bestimmtheitsmaßes als Indexzahl ist, dass durch eine Quadrierung von R Unterschiede

stärker sichtbar werden, da der Indexwert „schärfer“ wird (z. B. ergibt sich für R=0,99 ein

Wert von R2=0,9801).

Der Korrelationskoeffizient bzw. das Bestimmtheitsmaß sind jedoch nur bedingt tauglich, um

die Güte einer Anpassung zu beurteilen. Es kann aus diesen Indexzahlen z.B. nicht

entnommen werden, ob eine lineare oder eine quadratische Anpassung günstiger wäre. Um

zu entscheiden ob eine lineare oder quadratische Anpassung günstiger ist werden z.B. der

Anpassungstest nach Mandel und die Residualanalyse angewendet.

A.2.5 Überprüfung der Linearität

Zur Überprüfung der Linearität eines Kalibrierfunktionstyps gibt es verschiedene

Möglichkeiten [526]:

- Visueller Linearitätstest nach Funk (A.2.5.1)

- Mandel-Test (A.2.5.2)

- Residualanalyse (A.2.5.4)

Anhang A27

A.2.5.1 Visueller Linearitätstest nach Funk

Eine Überprüfung des Kalibrierfunktionstyps (Abbildung A3-A5) erfolgt im einfachsten Fall

durch eine subjektive Beurteilung der graphischen Darstellung der Kalibrierdaten

(einschließlich der Regressionsgeraden).

0 2000 4000 6000 8000 10000

5,0x106

1,0x107

1,5x107

2,0x107

2,5x107

3,0x107

3,5x107

Fläche [I min]

Konzentration [µg/L]

Abb. A3: Visueller Linearitätstest für SFD (Messbereich 50 µg/L – 10 mg/L; N=10)

0 2000 4000 6000 8000 10000

2,0x107

4,0x107

6,0x107

8,0x107

1,0x108

1,2x108

1,4x108

Fläche [I min]

Konzentration [µg/L]

Abb. A4: Visueller Linearitätstest für e-iso-CTC (Messbereich 50,055 µg/L –

10,011 mg/L; N=10)

Anhang A28

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000

5,0x107

1,0x108

1,5x108

2,0x108

2,5x108

3,0x108

3,5x108

Fläche [I min]

Konzentration [µg/L]

Abb. A5: Visueller Linearitätstest für iso-CTC (Messbereich 78,05 µg/L – 15,61 mg/L; N=10)

A.2.5.2 Anpassungstest nach Mandel

Der Anpassungstest nach Mandel (DIN 38402 Teil 51) wird zur Überprüfung der Linearität

herangezogen [520,526]. Dies geschieht durch einen Vergleich der Reststandard-

abweichungen der Kalibrierfunktionen 1. und 2. Grades (s. Tab. A6 und A7).

Zunächst wird aus den zwei Reststandardabweichungen die Differenz der

Abweichungsvarianzen DS2 berechnet:

Gleichung 17:

21 s)3N(s)2N(DS −−⋅−=

Für die Berechnung des Prüfwertes PW gilt:

Gleichung 18: 2

PW =

Der ermittelte Prüfwert wird dann mit dem Tabellenwert aus der F-Tabelle (f1=1, f2=N-3,

P=99%) verglichen [520,526]. Hierbei gilt:

PW ≤ F : Die Kalibrierfunktion ist linear, da durch eine Kalibrierfunktion 2. Grades keine

signifikant bessere Anpassung erreicht wird.

PW>F : Die Kalibrierfunktion ist in diesem Arbeitsbereich nicht linear.

Für den Fall PW>F kann durch wiederholte Durchführung dieses Testverfahrens mit immer

weiter eingeschränktem Arbeitsbereich die obere Arbeitsbereichsgrenze festgestellt werden.

Diese Vorgehensweise ist durch die DIN 38402 Teil 51 vorgeschrieben. Nach DIN 38402 Teil

51 ist es aber auch möglich die Kalibrierfunktion nach einem Regressionsmodell höherer

Anhang A29

Ordnung zu berechnen. Zur Festlegung der oberen Arbeitsgrenze für die quadratische

Regression gibt es allerdings noch keine einheitlichen Grundsätze.

Die Ergebnisse des Linearitätstests nach Mandel in Tabelle A8 zeigen, das die

Kalibrierfunktion im gesamten Arbeitsbereich linear ist. Um die in A.2.5.3 festgestellte

Varianzinhomogenität im gesamten Arbeitsbereicht zu vermindern wurden die

Arbeitsbereiche allerdings verkleinert bzw. aufgeteilt.

Tab. A8: Prüfung auf Linearität mittels Mandel-Test

Analyt Konzentrations-

Bereich

[µg/L]

N PW F-Wert (f1=1,

f2=N-3, P=99%)

SFD 50-10000 10 4,19 12,25

SFD 100-1000 5 0,06 98,50

e-iso-CTC 50,055-10011 10 7,03 12,25

e-iso-CTC 100,11-1001,1 5 0,02 98,50

e-iso-CTC 1001,1-10011 5 16,22 98,50

iso-CTC 78,05-15610 10 5,39 12,25

iso-CTC 78,05-1170,75 5 0,52 98,50

iso-CTC 1170,75-11707,5 5 0,19 98,50

A.2.5.3 Varianzenhomogenität

Ein Analysenverfahren muss für den ganzen gewählten Arbeitsbereich gleich präzise sein,

da die lineare Regressionsrechung von einer konstanten (homogenen) Varianz der

Messwerte (Unpräzision) ausgeht [7,520,526].

Eine Inhomogenität der Varianzen führt über eine höhere Unpräzision hinaus zu einer

möglichen Veränderung der Geradensteigung und damit zu einer höheren Ungenauigkeit.

Es wird dabei zur Absicherung des gewählten Arbeitsbereiches mittels eines F-Testes

geprüft, ob sich die Varianz s1 der Messreihe (Mehrfachbestimmung) mit der niedrigsten

Analyt-Konzentration (i=1) signifikant von der Varianz sN der Messreihe mit der höchsten

Analyt-Konzentration (i=N) unterscheidet.

Anhang A30

Für die Berechnung der Varianzen gilt:

Gleichung 19: 1n

)yy(

ij,i

i−

−

∑

mit: n

j,i

∑

yMittelwert der Peakflächen (Detektorsignal) der i-ten Messreihe (i=1 bis N)

j,i

yermittelte Peakfläche (Detektorsignal) des j-ten Einzelmesswertes (j=1 bis n) der i-

ten Messreihe

=i Laufzahl der Messreihen

=jLaufzahl der Einzelmesswerte innerhalb der Messreihen

=NAnzahl der Konzentrationsstufen (Kalibrierpunkte)

=nAnzahl der Messungen je Konzentrationsstufe

Aus den Varianzen des niedrigsten und des höchsten Kalibrierpunktes wird als Prüfwert PW

ein Quotient gebildet, der größer als eins ist. Der Prüfwert PW wird wie folgt berechnet:

Gleichung 20: 2

PW = für

1ss >

PW = für

1ss <

Der ermittelte Prüfwert wird mit dem tabellierten F-Wert (f1=n-1, f2=n-1, P=99%) verglichen.

Varianzenhomogenität liegt vor, wenn PW<F. Ist der Prüfwert kleiner als der tabellierte F-

Wert für P=99% besteht kein signifikanter Unterschied zwischen den Varianzen s1 und SN.

Ein signifikanter Unterschied der Varianzen und somit eine Inhomogenität der Varianzen liegt

bei PW>F vor. In diesem Fall ist der Arbeitsbereich soweit einzuschränken bis

Varianzenhomogenität hergestellt ist oder es können gewichtete Regressionsmodelle

angewendet werden.

Für e-iso-CTC und iso-CTC wurde trotz Einschränkung des Arbeitsbereichs eine

Varianzinhomogenität festgestellt (Tab. A9). Durch eine weitere Einschränkung der

gewählten Arbeitsbereiche oder eine Anwendung gewichteter Regressionsmodelle kann

auch hier möglicherweise eine Varianzhomogenität erreicht werden. Diese Möglichkeiten

würden im Rahmen dieser Arbeit aber nicht weiter verfolgt, da die Residualanalyse (siehe

A.2.5.4) das Vorliegen einer Normalverteilung in den eingeschränkten Arbeitsbereichen

Anhang A31

zeigte. Auch in der Routineanalytik wird nach Vockel [7] oft eine Inhomogenität der

Varianzen bei linearem Regressionsansatz in Kauf genommen.

Tab. A9: Test auf Homogenität der Varianzen

Analyt Konzentrations-

Bereich

[µg/L]

n PW F-Wert (f1=n-1,

f2=n-1, P=99%)

SFD 50-10000 10 66,81 5,35

SFD 100-1000 10 1,07 5,35

e-iso-CTC 50,055-10011 10 381,46 5,35

e-iso-CTC 100,11-1001,1 10 9,91 5,35

e-iso-CTC 1001,1-10011 10 13,47 5,35

iso-CTC 78,05-15610 10 1874,09 5,35

iso-CTC 78,05-1170,75 10 16,84 5,35

iso-CTC 1170,75-11707,5 10 36,19 5,35

Anhang A32

A.2.5.4 Residualanalyse

Die Residualanalyse ist eine weitere Möglichkeit, die Qualität des linearen Ansatzes zu

bewerten [7,526].

Unter den Residuen (Restfehler) versteht man die Differenz in vertikaler Richtung zwischen

Messpunkt und zugehörigen Punkt auf der Regressionskurve.

Um normierte Residuen ui zu erhalten dividiert man die Residuen aller Messpunkte durch die

Standardabweichung aller Residuen, also durch sy. Man erhält die normierten Residuen ui

nach:

Gleichung 21:

u−

= für i= 1 bis N

mit = Messwert

= zu gehöriger Schätzwert aus der Regressfunktion

ˆi

( für lineares Modell)

ii xbay

ˆ⋅+=

Ist der gewählte Modellansatz richtig, dann müssen die normierten Größen ui normalverteilt

sein und es ergibt sich eine Gleichverteilung unter- und oberhalb der Nulllinie.

Ist jedoch ein Trend festzustellen, so ist der zugrunde gelegte Regressionsansatz zu

überprüfen und gegebenenfalls der Arbeitsbereich einzuschränken, ein anderes

Regressionsmodell zu verwenden oder beim bestehenden Regressionsmodell eine

Gewichtung vorzunehmen [526].

Wie in Abbildung A6 zu sehen ist, zeigen die Residualanalysen der eingeschränkten

Arbeitsbereiche eine Normalverteilung. Daher werden die Arbeitsbereiche für e-iso-CTC und

iso-CTC trotz ermittelter Varianzinhomogenität (A.2.5.3) nicht weiter eingeschränkt.

Anhang A33

SFD

Arbeitsbereich von 100-1000 µg/L

0 200 400 600 800 1000

-1,50

-1,25

-1,00

-0,75

-0,50

-0,25

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

Residuen ui

Konzentration [µg/L]

SFD

e-iso-CTC

Arbeitsbereich von 100,11-1001,1 µg/L

0 200 400 600 800 1000

-1,50

-1,25

-1,00

-0,75

-0,50

-0,25

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

Residuen ui

Konzentration [µg/L]

e-iso-CTC

Arbeitsbereich von 1001,1-10011 µg/L

0 2000 4000 6000 8000 10000

-1,50

-1,25

-1,00

-0,75

-0,50

-0,25

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

Residuen ui

Konzentration [µg/L]

e-iso-CTC

iso-CTC

Arbeitsbereich von 78,05-1170,75 µg/L

0 200 400 600 800 1000 1200

-1,50

-1,25

-1,00

-0,75

-0,50

-0,25

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

Residuen ui

Konzentration [µg/L]

iso-CTC

Arbeitsbereich von 1170,75-11707,5 µg/L

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

-1,50

-1,25

-1,00

-0,75

-0,50

-0,25

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

Residuen ui

Konzentration [µg/L]

iso-CTC

Abb. A6: Residualanalysen der eingeschränkten Arbeitsbereiche

Anhang A34

A.2.6 Verfahrenskenndaten

Ein Maß für die Empfindlichkeit der linearen Kalibrierfunktion ist die Steigung b der

Regressionsgeraden und die Reststandardabweichung stellt ein Präzisionsmaß für die

Messung dar (siehe Anhang A.2.3) [7,511,520,526].

Durch Division der Reststandardabweichung mit der Geradensteigung b wird diese auf die

Mitte des Arbeitsbereichs normiert und man erhält die Verfahrensstandardabweichung sx0,

welche ein Maß für die Leistungsfähigkeit einer Methode ist.

Gleichung 22: b

0x =

Durch Division der Verfahrensstandardabweichung durch die Konzentration in der Mitte des

Konzentrationsbereichs ( xc) und anschließender Multiplikation mit 100 erhält man als

weitere Normierungsgröße die relative Verfahrenstandardabweichung Vx0.

Gleichung 23: 100%•

Mit Hilfe der relativen Verfahrensstandardabweichung können unterschiedliche Verfahren

unter der Voraussetzung, dass die Messwerte sich auf gleiche Konzentrationen beziehen,

miteinander verglichen werden. Tabelle A10 zeigt die Verfahrenskenndaten der in dieser

Arbeit zur Bestimmung von SFD, e-iso-CTC und iso-CTC eingesetzten HPLC-MS/MS-

Methode.

Tab. A10: Übersicht der Verfahrenskenndaten der einzelnen Arbeitsbereiche

Analyt Arbeitsbereich

[µg/L]

sx0

[µg/L]

Vx0

[%]

SFD 100-1000 16,08 3,15

e-iso-CTC 100,11-1001,1 14,47 2,83

e-iso-CTC 1001,1-10011 108,11 2,12

iso-CTC 78,05-1170,75 12,49 2,50

iso-CTC 1170,75-11707,5 67,01 1,32

Anhang A35

A.2.7 Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze

A.2.7.1 Nachweisgrenze

Die Nachweisgrenze xNG ist nach DIN 32645 eine Entscheidungsgrenze. Sie gibt diejenige

Analytkonzentration an, bei welcher der Analyt mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 50%

vorhanden ist [521,526].

Gleichung 24:

∑

−

++⋅= n

;f0xNG

)xx(

tsx

α;f

tQuantil der t-Verteilung (einseitiges Prognoseintervall)

−= (mit f = Anzahl der Freiheitsgrade)

m = Anzahl der Messungen an der Analysenprobe

n = Anzahl der Proben

=α Signifikanzniveau (Wahrscheinlichkeit für den Fehler 1. Art)

A.2.7.2 Erfassungsgrenze

Die Erfassungsgrenze xEG ist der kleinste Gehalt eines Analyten in einer Probe, bei dem mit

einer Wahrscheinlichkeit 1- ein Nachweis möglich ist [521,526].

Gleichung 25:

∑

−

++⋅+= n

;f0xNGEG

)xx(

tsxx

β;f

tQuantil der t-Verteilung (einseitiges Prognoseintervall)

=β Wahrscheinlichkeit für den Fehler 2. Art

Der Wert für die Nachweisgrenze wird im Falle

mit dem Faktor 2 multipliziert.

Gleichung 26: NGEG x2x

⋅

A.2.7.3 Bestimmungsgrenze

Die Bestimmungsgrenze xBG ist eine quantitative Grenze. Sie ist jene Analytmenge die mit

einer vorgegebenen Richtigkeit und Präzision quantifiziert werden kann [521,526]. Da ein

Analyt nur bestimmt werden kann, wenn er auch nachweisbar ist (Analytkonzentration xA ≥

xEG), muss die Bestimmungsgrenze größer als die Erfassungsgrenze sein. Die Parameter

(α,1/k) zur Berechnung der Bestimmungsgrenze sind deshalb so zu wählen, dass xBG>xEG

gilt.

Das Prognoseintervall wird bestimmt nach:

Anhang A36

Gleichung 27:

∑

−

++⋅=Δ n

;f0xBG

)xx(

tsx

α;f

tQuantil der t-Verteilung (zweiseitiges Prognoseintervall)

Aus der Definition für die Bestimmungsgrenze ergibt sich:

Gleichung 28: BGBG xkx Δ

⋅

Man erhält eine gute Näherung für die Bestimmungsgrenze durch xBG ≈ k · xNG. Mit x = xBG

kann die die Bestimmungsgrenze nun wie folgt berechnet werden:

Gleichung 29:

∑

−

−⋅

++⋅⋅= n

;f0xBG

)xx(

)xxk(

tskx

Bei der Bestimmung eines Analyten (Analytkonzentration xA) in einer Probe mit sehr

geringem Gehalt, gibt es nach DIN 32645 (β=0,05) sechs Grenzfälle:

- xA < xNG ► Nachweis in weniger als 50% der Fälle erfolgreich*).

- xA ≈ xNG ► Nachweis in 50% der Fälle erfolgreich*).

- xNG <xA < xEG ► Nachweis in 50% bis 95% der Fälle erfolgreich*).

- xA ≈ xEG ► Nachweis in 95% der Fälle erfolgreich*).

- xEG <xA < xBG ► Nachweis erfolgreich*), Quantifizierung mit der notwendigen

statistischen Sicherheit P ist unsicher.

- xA ≈ xBG ► Nachweis erfolgreich*), Quantifizierung mit der notwendigen

statistischen Sicherheit P ist möglich. Die Ergebnisunsicherheit

wurde hier mit k = 3 festgelegt.

*)erfolgreicher Nachweis: Die getroffenen Aussage z.B. Analyt vorhanden, ist wahr

Tabelle A11 zeigt die ermittelten Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenzen der

HPLC-MS/MS-Methode.

Tab. A11: Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenzen der unteren Arbeitsbereiche

Anhang A37

der HPLC-MS/MS-Methode (externe Kalibrierung)

Analyt Arbeitsbereich

[µg/L]

xNG

[µg/L]

xEG

[µg/L]

xBG

[µg/L]

SFD 100-1000 48,81 97,62 184,00

e-iso-CTC 100,11-1001,1 43,92 87,84 166,68

iso-CTC 78,05-1170,75 35,90 71,79 140,10

A.2.8 Wiederfindungsrate

Die Wiederfindungsrate (WFR) ist ein Beurteilungskriterium von Analysenverfahren. Beträgt

die Wiederfindungsrate 100% ist die Selektivität, Richtigkeit und Robustheit eines Verfahrens

bewiesen [526].

Die Wiederfindungsrate ist das Verhältnis des unter Wiederholbedingungen gemessenen

Mittelwertes zum richtigen Wert des Analyten in der Probe und lässt sich nach folgender

Formel berechnen:

Gleichung 30: %100

WFR

⋅=

mit =xgemessener Mittelwert

x richtiger Wert, entspricht der zugesetzten Konzentration/Menge

Anhang A38

A.3 Kenngrößen der untersuchten Böden

A.3.1 Boden „Soest“

Zu den Versuchsparzellen, die im „Antiinfektiva-Projekt“ für Feldversuche eingesetzt wurden

(Versuchsgut des Fachbereichs 9 - Landbau – Abt. Soest, FH Südwestfalen, in Welver-

Merklingsen), liegen folgende Bodendaten vor [476]:

Standort: Naturraum: Soester Börde (Niederbörde)

Höhenlage: ca. 80 m über NN

Klima: ca. 750 mm Niederschlag, durchschnittliche Jahrestemperatur: 9,0 °C

Bonität: überwiegend 70-75 BP, Zustandstufe: L4 Lö

Bodentyp: Bodenentwicklung durch stark schwankenden Grundwasserstand

beeinflusst, (Pseudogley-Parabraunerde), Humusgehalte meist

unter 2%

Bodenart: uL / sL, Schluffanteil ca. 70%

Eigenschaften: druckempfindlich, verschlämmungsgefährdet

Wasserspeicherkapazität hoch

Erosionsgefährdung gering bis mittel, bei schwacher Hangneigung mittel bis

stark, in windoffenen Lagen gefährdet durch Winderosion

Tab. A12: Profilaufbau [476]

Bodenzone

[cm] Beschreibung

Ap0-30 braungrauer, mittel toniger Schluff, schwach humos,

Subpolyedergefüge

Als 30-42 ockerbrauner, mittel toniger Schluff, schwach humos,

Subpolyedergefüge, mit leichten Staunässeerscheinungen

BBtSw42-78 rötlich brauner, stark toniger Schluff, Polyedergefüge, Rostflecken,

einige Bleichflecken

BBtSd78-135 rötlich brauner, stark toniger Schluff, Prismen- und Polyedergefüge,

dicht und wasserstauend, Lößverwitterung

Anhang A39

Tab. A13: Allgemeine bodenchemische und –physikalische Bodeneigenschaften [476]

C/N-Verhältnis

Gesamt-N (0-30)

13/1 – 15/1

0,98 – 1,61

Luft- und Wasserdurchlässigkeit

Gesamtporenvolumen

„Luftporen“ (Grobporen)

Rohdichte

mittel – gering

43 – 46

9 – 12

1,4 – 1,6

Vol. %

g/cm3

nutzbare Feldkapazität (0-100cm)

Totwasser, pf>4,2 (0-100cm)

Feldkapazität (0-100cm)

220

315

Tab. A14: Nährstoffe nach VDLUFA [476]

Nährstoff Gehalt

[mg/100g Boden]

Bestimmung nach

VDLUFA Methodenbuch I

P2O512,1 A 6.2.1.1

K2O 24,4 A 6.2.1.1

Mg 11,2 A 6.2.4.1

Tab. A15: Schwermetalle (DIN 38406) und adsorbierbare organisch gebundene Halogene

(AOX, DIN 38414-18) aus Königswasseraufschluss (DIN 38414-7) [476]

Gehalt [mg/kg Boden]

Blei 33,4

Cadmium 0,42

Chrom 33,9

Kupfer 6,96

Nickel 11,7

Quecksilber 0,09

Zink 57,0

AOX 31,8

Anhang A40

Tab. A16: Trockenrückstand und des Wassergehalt auf Grundlage der Masse (DIN ISO

11465) der Bodenproben (Probenbezeichnung siehe Anhang A.3.2)

Probenbezeichnung Trockenrückstand

(wdm) [%] Wassergehalt (wH2O)

[%]

W1-1-25 81,2 23,2

W2-1-25 79,9 25,2

W3-1-25 83,3 20,2

W4-1-25 81,5 22,8

W5-1-25 81,2 23,2

W6-1-25 81,9 22,1

W7-1-25 82,4 21,4

W8-1-25 82,4 21,4

W1-4-25 80,8 23,8

W2-4-25 80,5 24,3

W3-4-25 83,0 20,5

W4-4-25 81,5 22,8

W5-4-25 81,5 22,8

W6-4-25 82,5 21,3

W7-4-25 83,1 20,4

W8-4-25 82,2 21,8

A.3.2 Boden „Hamm“

Der für die Säulenversuche (Kapitel 5.2.2) verwendete sandige Ackerboden wurde von einer

landwirtschaftlichen Fläche aus der Nähe von Hamm bezogen [477]. Die seit mehr als zehn

Jahren brachliegende Fläche wurde nur sporadisch als Kuhweide genutzt. In Abbildung A7

ist das Profil des Bodens bis zu einer Tiefe von 50 cm zu sehen. In den Versuchen wurde

nur der Oberboden (10 bis 40 cm Tiefe) eingesetzt. Der Boden ist ein Feinsand mit hohem

Schluffanteil und sehr stark humos. Im Bereich von 10-40 cm ist er teilweise durchwurzelt.

Dieser Boden ist ein Podsol. Der pH-Wert des Bodens betrug 6,5. In den Versuchen wurde

nur der Oberboden (10 bis 40 cm Tiefe) eingesetzt. Tabelle A17 und A18 zeigen die

Charakteristika des Oberbodens. In diesem Boden konnten keine Antibiotikarückstände

(SFD, N4-SFD, e-iso-CTC, iso-CTC, e-CTC, CTC, anhydro-CTC) nachgewiesen werden.

Der Boden wurde vor dem Einbau in die Säulen manuell zerkleinert und an der Luft

getrocknet [477]. Um Wurzelreste im Boden hatten sich deutliche Eisenkonkretionen

gebildet.

Nach dem Trocknen wurde der Boden homogenisiert und trocken in die Säule eingebaut.

Eine Schichtung war nach dem Einbau nicht erkennbar. Neben sehr fein zerkleinerten Teilen

waren zum Teil einige Millimeter große Konglomerate zu erkennen.

Anhang A41

Oberboden für

Säulenversuch

Abb. A7: Profil des verwendeten Ackerbodens [477]

Tab. A17: Kennwerte des Ackerbodens [477]

Kenngröße/ Charakterisierung Abkürzung

und Einheit Wert

Massenanteil Tonfraktion [%] 7

Massenanteil Schlufffraktion [%] 12

Massenanteil Sandfraktion [%] 81

Massenanteil Kiesfraktion [%] 0

Korngröße bei 10 % Siebdurchgang d10 [mm] 0,0075

Korngröße bei 60 % Siebdurchgang d60 [mm] 0,18

Ungleichförmigkeitsgrad U [-] 24

Durchlässigkeitsbeiwert nach Beyer kf [m/s] 3,4E-07

Durchlässigkeitsbeiwert aus

Permeabilitätstest kf [m/s] 9,6E-06

Anhang A42

Tab. A18: Schwermetallgehalte des Ackerbodens [477]

Element Konzentration bei

Elution nach DIN 38414-4

[µg/l]

Gehalte bei Elution nach

DIN ISO 11466

[µg/kg TM]

Aluminium 196 4751

Blei 2 33,2

Cadmium < 0,3 0,35

Chrom < 2 17,6

Kupfer 14 12,4

Eisen 212 6664

Mangan 12 217

Nickel 3 5,6

Zink 34 53,8

A.4 Ergebnisse

A.4.1 Ergebnisse der Wiederfindung

Tab. A19: Daten zur Wiederfindung von SFD in Bodenproben (dotierter Nullboden;

Wiederfindung = 100% bei zudotierter Konzentration = wiedergefundener

Konzentration)

Analyt zudotierte

Konzentration

[µg/L]

zugesetzte Menge

[µg/5g] wiedergefundene Konzentration

[µg/L]

(Mittelwerte aus 3 Messinjektionen)

SFD 250 0,125 69±14

SFD 250 0,125 74±9

SFD 250 0,125 77±6

SFD 250 0,125 59±15

SFD 1000 0,500 330±24

SFD 1000 0,500 233±9

SFD 1000 0,500 548±20

SFD 1000 0,500 455±33

SFD 10000 5,000 4472±192

SFD 10000 5,000 4192±133

SFD 10000 5,000 5880±313

SFD 10000 5,000 5656±111

Anhang A43

Tab. A20: Daten zur Wiederfindung von CTC in Bodenproben (dotierter Nullboden;

Wiederfindung = 100% bei zudotierter Konzentration = wiedergefundener

Summenkonzentration)

wiedergefundene Konzentration [µg/L]

(Mittelwerte aus 3 Messinjektionen)

Analyt zudotierte

Konzentration

[µg/L]

zugesetzte

Menge

[µg/5g] *e-iso-CTC *iso-CTC *e-CTC *CTC Summe

CTC

CTC 250 0,125 66±14 123±10 ~0 ~0 189±24

CTC 250 0,125 69±12 118±15 ~0 ~0 187±27

CTC 250 0,125 75±16 121±19 ~0 ~0 196±35

CTC 250 0,125 70±2 117±4 ~0 ~0 187±6

CTC 1000 0,500 185±7 368±21 ~0 ~0 553±28

CTC 1000 0,500 177±1 340±9 ~0 ~0 517±10

CTC 1000 0,500 254±2 477±28 ~0 ~0 731±30

CTC 1000 0,500 267±6 431±22 ~0 ~0 698±28

CTC 10000 5,000 1495±36 3417±109 ~0 ~0 4912±145

CTC 10000 5,000 1580±56 3545±55 ~0 ~0 5425±111

CTC 10000 5,000 2138±24 4603±72 ~0 ~0 6741±96

CTC 10000 5,000 2151±12 4700±252 ~0 ~0 6851±264

(* bezogen auf dotiertes CTC )

A.4.2 Ergebnisse der Rückstandsuntersuchung der Bodenproben der

Feldversuche

Bei allen genannten Gehalten handelt es sich um Mittelwerte (N=3; 3-fach Injektion einer

Messprobe) der Gehaltsbestimmung mittels HPLC-MS/MS. Aus jeder Bodenmischprobe

(Probennahme und Details siehe [476]) wurden 2 Stichproben separat aufgearbeitet

(Doppelbestimmung).

Erklärung der Probenbezeichnung:

Wx-x-xx gibt an das Winterweizen auf dem Feld angepflanzt worden ist, ein „F“ steht für

Feldsalat.

x1-x-xx gibt die laufende Probenahmenummer (zeitliche Probennahmenfolge) an.

xx-1-xx gibt an von welcher Parzelle die Probe stammt.

xx-x-25 gibt das Bodensegment an aus der die Probe entnommen worden ist:

10 = 0cm - 10cm; 20 = 10cm - 20cm; 25 = 0cm - 25cm; 30 = 20cm - 30cm; 50 = 25cm -

50cm; 60 = 30cm - 60cm

Anhang A44

Tab. A21: Gehalt an SFD und CTC in den Bodenproben

„Winterweizen, Parzelle 1, Bodentiefe 0 cm – 25 cm“

Datum der

Probennahme Probenbezeichnung Gehalt SFD TM

[µg/kg] Summengehalt CTC’s*

[µg/kg]

12.03. W1-1-25 n.n. n.n.

1. Gülleaufbringung

19.03. W2-1-25 30,6±2,5 59,6±3,1

19.03. W2-1-25 43,6±3,3 138,8±4,4

15.04. W3-1-25 13,6±0,4 68,8±3,3

15.04. W3-1-25 14,4±4,2 93,9±5,9

2. Gülleaufbringung

22.04. W4-1-25 87,7±9,0 172,7±8,9

22.04. W4-1-25 65,0±6,9 241,0±6,0

15.05. W5-1-25 28,5±3,2 145,0±0,1

15.05. W5-1-25 32,2±1,9 193,7±2,6

17.06. W6-1-25 17,5±0,3 78,7±2,7

17.06. W6-1-25 20,3±1,1 55,3±4,1

17.07. W7-1-25 12,4±2,3 22,2±1,5

17.07. W7-1-25 3,8±2,8 25,7±2,0

20.08. W8-1-25 14,3±1,8 27,0±0,5

20.08. W8-1-25 12,9±0,6 21,5±0,6

* Summe von iso-CTC und e-iso-CTC

n.n. = nicht nachweisbar

TM = bezogen auf Trockenmasse (Boden)

Tab. A22: Gehalt an SFD und CTC in den Bodenproben

„Winterweizen, Parzelle 1, Bodentiefe 25 cm – 50 cm“

Datum der

Probennahme Probenbezeichnung Gehalt SFD TM

[µg/kg] Summengehalt CTC’s*

[µg/kg]

12.03. W1-1-50 n.n. n.n.

1. Gülleaufbringung

19.03. W2-1-50 n.n. n.n.

15.04. W3-1-50 n.n. n.n.

2. Gülleaufbringung

22.04. W4-1-50 n.n. n.n.

15.05. W5-1-50 n.n. n.n.

17.06. W6-1-50 n.n. n.n.

17.07. W7-1-50 n.n. n.n.

20.08. W8-1-50 n.n. n.n.

Anhang A45

Tab. A23: Gehalt an SFD und CTC in den Bodenproben

„Winterweizen, Parzelle 4, Bodentiefe 0 cm – 25 cm“

Datum der

Probennahme Probenbezeichnung Gehalt SFD TM

[µg/kg] Summengehalt CTC’s*

[µg/kg]

12.03. W1-4-25 n.n. n.n.

1. Gülleaufbringung

19.03. W2-4-25 14,4±5,9 171,4±5,5

19.03. W2-4-25 32,4±3,0 161,9±4,6

15.04. W3-4-25 17,6±1,2 106,8±3,7

15.04. W3-4-25 17,5±1,9 66,3±5,1

2. Aufbringung von

Mineraldünger

22.04. W4-4-25 39,8±2,4 141,6±0,9

22.04. W4-4-25 15,7±6,4 87,5±2,6

15.05. W5-4-25 10,9±4,3 45,8±1,1

15.05. W5-4-25 4,2±1,8 48,5±3,5

17.06. W6-4-25 0,9±1,6 44,4±2,3

17.06. W6-4-25 20,2±2,8 36,1±0,8

17.07. W7-4-25 2,9±2,6 32,4±1,9

17.07. W7-4-25 8,8±3,9 42,6±2,0

20.08. W8-4-25 6,0±0,9 31,3±0,6

20.08. W8-4-25 10,6±3,1 28,0±1,4

Tab. A24: Gehalt an SFD und CTC in den Bodenproben

„Winterweizen, Parzelle 4, Bodentiefe 25 cm – 50 cm“

Datum der

Probennahme Probenbezeichnung Gehalt SFD TM

[µg/kg] Summengehalt CTC’s*

[µg/kg]

12.03. W1-4-50 n.n. n.n.

1. Gülleaufbringung

19.03. W2-4-50 n.n. n.n.

15.04. W3-4-50 n.n. n.n.

2. Aufbringung von

Mineraldünger

22.04. W4-4-50 n.n. n.n.

15.05. W5-4-50 n.n. n.n.

17.06. W6-4-50 n.n. n.n.

17.07. W7-4-50 n.n. n.n.

20.08. W8-4-50 n.n. n.n.

Anhang A46

Tab. A25: Gehalt an SFD und CTC in den Bodenproben

„Feldsalat, Parzelle 1, Bodentiefe 0 cm – 10 cm“

Datum der

Probennahme Probenbezeichnung Gehalt SFD FM

[µg/kg] Summengehalt

CTC’s* FM

[µg/kg]

05.10. F1-1-10 n.n. n.n.

1. Gülleaufbringung

09.10. F2-1-10 35,3±3,8 230,3±3,5

09.10. F2-1-10 1,1±0,7 41,8±1,9

20.11. F3-1-10 17,6±1,9 95,2±2,4

20.11. F3-1-10 9,2±2,8 69,4±5,7

2. Gülleaufbringung

05.12. F4-1-10 15,3±3,8 133,4±5,3

05.12. F4-1-10 19,2±7,5 81,2±6,2

FM = bezogen auf Feuchtmasse (Boden)

Tab. A26: Gehalt an SFD und CTC in den Bodenproben

„Feldsalat, Parzelle 1, Bodentiefe 10 cm – 20 cm“

Datum der

Probennahme Probenbezeichnung Gehalt SFD FM

[µg/kg] Summengehalt

CTC’s* FM

[µg/kg]

05.10. F1-1-20 n.n. n.n.

05.10. F1-1-10 n.n. n.n.

1. Gülleaufbringung

09.10. F2-1-20 n.n. n.n.

20.11. F3-1-20 n.n. n.n.

2. Gülleaufbringung

05.12. F4-1-20 n.n. n.n.

Tab. A27: Gehalt an SFD und CTC in den Bodenproben

„Feldsalat, Parzelle 1, Bodentiefe 20 cm – 30 cm“

Datum der

Probennahme Probenbezeichnung Gehalt SFD FM

[µg/kg] Summengehalt

CTC’s* FM

[µg/kg]

05.10. F1-1-30 n.n. n.n.

1. Gülleaufbringung

09.10. F2-1-30 n.n. n.n.

20.11. F3-1-30 n.n. n.n.

2. Gülleaufbringung

05.12. F4-1-30 n.n. n.n.

Anhang A47

Tab. A28: Gehalt an SFD und CTC in den Bodenproben

„Feldsalat, Parzelle 1, Bodentiefe 30 cm – 60 cm“

Datum der

Probennahme Probenbezeichnung Gehalt SFD FM

[µg/kg] Summengehalt

CTC’s* FM

[µg/kg]

05.10. F1-1-60 n.n. n.n.

1. Gülleaufbringung

09.10. F2-1-60 n.n. n.n.

20.11. F3-1-60 n.n. n.n.

2. Gülleaufbringung

05.12. F4-1-60 n.n. n.n.

Weitere Antibiotika und Metaboliten:

Sowohl TMP, als auch der SFD-Metabolit N4-SFD sowie Anhydro-CTC konnten in keiner

Bodenprobe nachgewiesen werden.

A.4.3 Ergebnisse zu den Messproben der Säulenversuche

A.4.3.1 Gülle

In die oberen 2 cm des Bodens des Säulenversuchs im Labormaßstab und in die oberen 30

cm des Bodens des Säulenversuchs im halbtechnischen Maßstab wurde mit SFD, iso-CTC

und CTC dotierte Gülle eingearbeitet (Tabelle A29).

Tab. A29: Gehalt an CTC, iso-CTC und SFD der in den Versuchen eingesetzten dotierten

Gülle

Versuchsmaßstab Labormaßstab halbtechnischer Maßstab

Eingesetzte Güllemenge [mL] 65 650

zudotierte Menge an CTC [mg] 6,51 49,98

zudotierte Menge iso-CTC [mg] 6,50 48,25

zudotierte Menge an SFD [mg] 6,51 50,23

Tab. A30: Gehalt an CTC und SFD in gelagerter Gülle (Mittelwerte aus 3-fach Injektion;

HPLC-MS/MS)

Versuchsmaßstab Lagerungszeit

nach Dotierung

[Wochen]

e-iso-CTC

[mg/L]

iso-CTC

[mg/L]

Summe

CTC

[mg/L]

SFD

[mg/L]

Labormaßstab 4 1,88±0,13 1,79±0,08 3,67±0,21 0,81±0,03

halbtechnischer

Maßstab 12 12,02±0,31 16,13±0,53 28,15±0,84 0,02±0,002

Anhang A48

A.4.3.2 Säulenelutate

Tab. A31: Konzentrationen von SFD und CTC im Eluat der Säule im Labormaßstab

(Mittelwerte aus 3-fach Injektion; HPLC-MS/MS)

Konzentration [ng/L]

Probenbezeichnung SFD e-iso-CTC iso-CTC Summe

CTC

B1-nach 322±21 8±4 33±6 41±10

B1-vor 348±17 18±3 57±4 75±7

B2-nach 2104±48 290±7 371±10 661±17

B2-vor n.n. 85±1 155±11 240±12

B3-nach 1614±35 110±16 152±1 262±17

B3-vor n.n. 26±6 53±6 79±12

B4-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

B4-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

B5-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

B5-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

B6-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

B6-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

B7-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

B7-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

B8-nach n.n. 267±9 168±13 435±22

B8-vor n.n. 265±14 190±12 455±26

B9-nach n.n. 120±5 134±11 254±16

B9-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

B10-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

B10-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

B11-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

B11-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

B12-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

B12-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

B13-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

B13-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

n.n. = nicht nachweisbar

nach = Pufferzugabe nach der Zentrifugation

vor = Pufferzugabe vor der Zentrifugation

Anhang A49

Tab. A32: Konzentrationen von SFD und CTC im Eluat der Säule im halbtechnischen

Maßstab (Mittelwerte aus 3-fach Injektion; HPLC-MS/MS)

Konzentration [ng/L]

Probenbezeichnung SFD e-iso-CTC iso-CTC Summe

CTC

Landregen1-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

Landregen1-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

Starkregen1-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

Starkregen1-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

Platzregen1-nach n.n. 54±1 100±4 154±5

Platzregen1-vor n.n. 170±20 246±12 416±32

Landregen2-nach n.n. 62±13 93±1 155±14

Landregen2-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

Starkregen2-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

Starkregen2-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

Platzregen2-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

Platzregen2-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

Landregen3-nach n.n. 231±23 352±11 583±34

Landregen3-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

Starkregen3-nach n.n. 47±3 54±5 101±8

Starkregen3-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

Platzregen3-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

Platzregen3-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

Landregen4-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

Landregen4-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

Starkregen4-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

Starkregen4-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

Platzregen4-nach n.n. n.n. n.n. n.n.

Platzregen4-vor n.n. n.n. n.n. n.n.

Tab. A33: Konzentration in den mit HCl aufgelösten Zentrifugenrückständen aus

zentrifugierten "vor-Proben" nach Zugabe von EDTA-Ammoniak-Puffer / bezogen

auf das zentrifugierte Probenvolumen (Mittelwerte aus 3-fach Injektion; HPLC-

MS/MS)

Probe e-iso-CTC

[ng/L]

iso-CTC

[ng/L]

Summe CTC

[ng/L]

SFD

[ng/L]

Rückstand Landregen 2 115±7 201±4 315±11 n.n

Rückstand Platzregen 3 n.n. n.n. n.n. n.n.

A.4.3.3 Boden

Tab. A34: Gehalt von SFD und CTC im Boden des Versuchs im Labormaßstab (Mittelwerte

aus 3-fach Injektion; HPLC-MS/MS)

Gehalt [µg/kg TM]

Probe aus Bodentiefe Summe CTC SFD

0-2 cm 78±3 n.n.

2-10 cm 24±2 n.n.

Dotierte Wirkstoffmenge = 100%

(bezogen auf dotierte Gülle) Summe CTC

[%] SFD

[%]

im Boden 0,70 0

im Eluat 0,01 0,06

Wiederfindung der

dotierten Wirkstoffmengen im Boden + Eluat 0,71 0,06

Anhang A50

Tab. A35: Gehalt von SFD und CTC im Boden des Versuchs im halbtechnischen Maßstab

(Mittelwerte aus 3-fach Injektion; HPLC-MS/MS)

Gehalt [µg/kg TM]

Probe aus Bodentiefe Summe CTC SFD

0-5 cm 127±3 n.n.

5-10 cm 396±22 10±1

10-20 cm 195±3 13±6

20-30 cm 824±4 48±5

30-40 cm n.n. n.n.

40-50 cm n.n. n.n.

50-60 cm n.n. n.n.

Filterkies n.n. n.n.

Dotierte Wirkstoffmenge = 100%

(bezogen auf dotierte Gülle) Summe CTC

[%] SFD

[%]

im Boden 28,0 2,9

im Eluat 0,002 0

Wiederfindung der

dotierten Wirkstoffmengen im Boden + Eluat 28,0 2,9