Entwicklung und Anwendung thermisch schaltbarer
Polymere auf Oberflächen zur Beeinflussung der
Zelladhäsion
vorgelegt von
Diplom-Ingenieur
Oliver Ernst
Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Ingenieurwissenschaften
- Dr.-Ing. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. U. Stahl
Berichter: Prof. Dr. R. Lauster
Berichter: PD Dr. C. Duschl
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 23.06.2008
Berlin 2008
D 83
3
Inhaltsverzeichnis
Vorwort 6
Veröffentlichungen 7
Abkürzungsverzeichnis 8
Abbildungsverzeichnis 9
Tabellenverzeichnis 11
Zusammenfassung 12
1. Einführung 13
2. Grundlagen 17
2.1 Thermoresponsive Polymere und ihre Anwendungen ................. 17
2.1.1 Funktionsprinzip von thermoresponsiven Polymeren ........ 17
2.1.2 Oberflächenfunktionalisierungsmöglichkeiten ................... 20
2.2 Funktionalisierung und Charakterisierung von Goldoberflächen . 21
2.2.1 Selbstorganisierende Monolagen (SAM) an
Goldoberflächen ................................................................ 21
2.2.2 Kontaktwinkelmessung ...................................................... 25
2.2.3 Röntgenelektronenspektroskopie (XPS) ........................... 27
2.3 Zellbiologischer Hintergrund ........................................................ 29
2.3.1 Zelladhäsion auf Substrat ................................................. 29
2.3.2 Beeinflussung der Zelladhäsion ........................................ 31
2.3.3 Zellverhalten auf mikrostrukturierten Oberflächen ............ 32
2.4 Mikrofluidische Systeme für zelluläre Anwendungen .................. 33
INHALTSVERZEICHNIS
4
3. Material und Methoden 37
3.1 Zellkultur ....................................................................................... 37
3.2 Zellfixierung und Färbung mit Fluoreszenzstoffen ....................... 37
3.3 Oberflächenpräparation und Oberflächenanalytik ........................ 38
3.3.1 Oberflächenpräparation ..................................................... 38
3.3.1.1 Reinigung von Glas- und
PDMS-Oberflächen ...................................... 38
3.3.1.2 Reinigung von Goldoberflächen ................... 39
3.3.1.3 Mikrostrukturierung von Oberflächen ........... 39
3.3.1.4 Chemisorption von Thiolen auf
Goldoberflächen ........................................... 43
3.3.2 Kontaktwinkelmessung ...................................................... 44
3.4 Mikrofluidik ................................................................................... 45
3.4.1 PDMS-Abformung ............................................................. 45
3.4.2 Zusammenbau des mikrofluidischen Systems .................. 45
3.4.3 Zellkultivierung und Zellablösung im
mikrofluidischen System .................................................... 46
3.4.4 Berechnung der Zellumströmungsgeschwindigkeit im
rechteckigen mikrofluidischen Kanal ................................. 47
3.5 Mikroskopie .................................................................................. 48
3.5.1 Durchlichtmikroskopie und Auswertung ............................ 48
3.5.2 Konfokale Laserscanning- Mikroskopie (CLSM) ............... 49
4. Ergebnisse 50
4.1 Funktion und Zellverträglichkeit von P15-Au ............................... 50
4.2 Einfluss von P15-Au auf das Einzelzellverhalten von L929 ......... 54
4.3 Kontrollierte Einzelzellablösung im mikrofluidischen System ...... 55
4.4 Oberflächenstabilität .................................................................... 58
4.4.1 Haltbarkeit von P15-Au ..................................................... 58
4.4.2 Wiederverwendbarkeit von P15-Au .................................. 60
4.5 Anpassung schaltbarer Oberflächen für eine
zelltypspezifische Adhäsionskontrolle ........................................ 61
4.5.1 Charakterisierung von P15-Au und P19-Au ...................... 61
INHALTSVERZEICHNIS
5
4.5.2 Modifikation von P19-Au für stark adhärente Zelltypen ..... 66
4.5.3 Modifikation von P19-Au für schwach
adhärente Zelltypen ........................................................... 69
4.6 Mikrostrukturierung von Oberflächen ........................................... 72
4.6.1 Mikrostrukturierte Biotin-Streptavidin Oberflächen ............ 73
4.6.2 Mikrostrukturierte, schaltbare Polymeroberflächen ........... 76
4.6.2.1 Verhalten von 3T3-Zellen auf
mikrostrukturierten Polymeroberflächen ...... 76
4.6.2.2 Mikrostrukturierung von P15-Au mit
Fibronektin ................................................... 77
5. Diskussion 79
5.1 Gold-Thiol-Chemie als Methode zur Herstellung von
Polymeroberflächen ..................................................................... 79
5.2 Funktion und Zellverträglichkeit von P15-Au ............................... 80
5.3 Anpassung schaltbarer Oberflächen für eine
zelltypspezifische Adhäsionskontrolle ......................................... 84
6. Ausblick 89
Literaturverzeichnis 91
Anhang 99
Lebenslauf 104
6
Vorwort
Ich möchte mich ganz herzlich bei allen Personen bedanken, die zum erfolgreichen
Erreichen dieser Arbeit beigetragen haben. Besonders bedanken möchte ich bei
Prof. Dr. Günther Fuhr, der mir eine interessante und anwendungsbezogene
Fragestellung zur Bearbeitung übertragen hat.
Dr. Claus Duschl für seine hervorragende Betreuung meiner Arbeit. Seine äußerst
zugängige und freundliche Art trugen neben den konstruktiven und offenen
Gesprächen wesentlich zu dieser Arbeit bei.
Dr. Andreas Lankenau für seine Unterstützung, wertvollen Diskussionen sowie
hilfreichen Anregungen während meiner Promotionszeit.
Prof. Dr. Roland Lauster (Technische Universität Berlin) für die hervorragende,
externe Betreuung dieser Arbeit. Die wissenschaftlichen Gespräche mit Ihm
erweiterten meinen Blick für neue wissenschaftliche Ansätze.
Dr. Antje Lieske (Fraunhofer-Institut für Angewandte Polymerforschung, Potsdam
(IAP)) für die Synthese und Charakterisierung der Polymere. Durch ihre offene und
unkomplizierte Art ermöglichte sie im Rahmen dieser Arbeit wesentliche
Optimierungsschritte an den schaltbaren Oberflächen. Die Gespräche mit Ihr
bereicherten mein Wissen und Verständnis über die komplexe „Welt der Polymere“.
Dr. Hans Börner (Max-Planck-Institut für Kolloid- und Grenzflächenforschung,
Potsdam) für die Synthese und Charakterisierung des RGD-Peptids sowie für den
wissenschaftlichen Austausch während meiner Promotionszeit.
Dr. Magnus Jäger, der mir stets hilfsbereit zur Seite stand und mich mit leckeren
„Spezialitäten“ aus Nürnberg versorgte.
Beate Morgenstern, die immer ein offenes Ohr für die „kleinen Probleme“ im Labor
hatte und für einen reibungslosen Ablauf in der Zellkultur sorgte.
Ines Westphal, die mir Denkanstösse für neue Ansätze gab und ein angenehmer
Gesprächspartner war.
meiner Arbeitsgruppe Armin, Katja, Christine, Björn sowie allen weiteren
Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des IBMT für eine angenehme und bereichernde
Zeit.
Ganz besonderem Dank geht an meine Eltern sowie an Linda für Ihre große
Unterstützung, ihr Verständnis und Interesse an meiner Arbeit.
Dieses Projekt wurde finanziert durch das MAVO-Programm der Fraunhofer-
Gesellschaft.
7
Veröffentlichungen
Poster
Renner A, Westphal I, Kirchhof V, Ernst O, Lankenau A, Duschl C.
A lab-on-chip device for the guidance of cell migration and the analysis of cell traces.
Cell Migration Meeting 2006, Heidelberg
Publikation
Joos U, Biskup T, Ernst O, Westphal I, Gherasim C, Schmidt R, Edinger K,
Pilarczyk G, Duschl C. Investigation of cell adhesion to structured surfaces using
total internal reflection fluorescence and confocal laser scanning microscopy. Eur J
Cell Biol 2006 85(3-4):225-8.
Ernst O, Lieske A, Jäger M, Lankenau A, Duschl C. Control of cell detachment in a
microfluidic device using a thermoresponsive copolymer on a gold substrate. Lab
Chip. 2007, 7(10):1322-9.
J. Hentschel, K. Bleek, O. Ernst, J.-F. Lutz, H.G. Börner: "Easy Access to
Bioactive Peptide-polymer Conjugates via RAFT", Macromolecules (2008), 41: 1073.
Ernst O, Lieske A, Holländer A, Lankenau A, Duschl C. Tuning of thermo-
responsive self-assembly monolayers on gold for cell type specific control of
adhesion. submitted 02.04.2008, Langmuir.
8
Abkürzungsverzeichnis
3T3 Mausfibroblast
Au Gold
CLSM confocal laser scanning microscope
ConA Concanavalin A
dH2O deionisiertes Wasser
DMEM Dulbecco`s Modifiziertes Eagle Medium
EDTA Ethylendiamintetracetat
EZM extrazelluläre Matrix
FKS fötales Kälberserum
KD Gleichgewichtsdissoziationskonstante
L929 Mausfibroblast
LCST lower critical solution temperature
MG63 humanes Osteosarkom
P15 PNIPAAm-PEG(15%)-SH
P19 PNIPAAm-PEG(19%)-SH
PBS phosphate buffered saline
PDMS Polydimethylsiloxan
PDEAAm Poly(N-diethylacrylamid)
PEGMA Polyethylenglykolmethacrylat
PEG Polyethylenglykol
PG PEG
PMMA Polymethylmethacrylat
PNIPAAm Poly(N-isopropylacrylamid)
PTFE Polytetrafluorethylen
RGD CGGRGDS-Peptid
RT Raumtemperatur
SAM self-assembling monolayer
Die Abkürzungen für die Aminosäuren entsprechen dem internationalen Ein- bzw.
Dreibuchstaben-Code.
9
Abbildungsverzeichnis
2.1 Struktur des thermoresponsiven Copolymers PNIPAAm-PEG .............. 18
2.2 Strukturverhalten von PNIPAAm-PEG in Lösung sowie
immobilisiert an Oberflächen mit Zellverhalten bei
unterschiedlichen Temperaturen ........................................................... 19
2.3 Aufbau und Organisation von SAM auf Goldoberflächen ...................... 23
2.4 Kontaktwinkelbildung auf einer Festkörperoberfläche nach YOUNG .... 25
2.5 Messprinzip der dynamischen Wasserkontaktwinkelmessung an
Festkörpern ........................................................................................... 26
2.6 Energieschema eines XPS-Prozesses ................................................. 28
2.7 MicCell™-System (Gesim GmbH, Deutschland) als mikrofluidisches
System .................................................................................................. 36
3.1 Prinzip der Mikrostrukturierung von Oberflächen mittels
Stempelvorrichtung ............................................................................... 41
3.2 Aufbau und Funktionsprinzip des mikrofluidischen Systems
MicCell™ .............................................................................................. 46
3.3 Flussprofil in einem mikrofluidischen Kanal im Bezug auf
unterschiedliche Zellmorphologien ....................................................... 47
4.1 Ermittlung der charakteristischen LCST (lower critical solution
temperature) des PNIPAAm-PEG15%-COOH Copolymers ................. 51
4.2 Fortschreitkontaktwinkel von Wasser auf P15-Au und gereinigtem
Gold als Funktion der Temperatur ........................................................ 52
4.3 Zellverträglichkeit und Schaltbarkeit von P15-Au. L929-Zellablösung
auf P15-Au ausgelöst durch Temperaturänderung von 37°C auf
25°C zu unterschiedlichen Zeitpunkten ................................................ 53
4.4 L929-Einzelzellabrundung auf P15-Au ausgelöst durch
Temperaturänderung von 37°C auf 25°C nach unterschiedlichen
Zeiten ................................................................................................... 54
4.5 Auswirkung von laminarer Strömung auf L929 Fibroblasten auf
P15-Au in einem mikrofluidischen PDMS-Kanal .................................. 57
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
10
4.6 Oberflächenstabilität von P15-Au bei unterschiedlichen
Lagerungszeiten und- bedingungen ..................................................... 59
4.7 Wiederverwendbarkeit von P15-Au Oberflächen bei
unterschiedlichen Lagerungszeiten für den Gebrauch als
Zellkultursubstrat .................................................................................. 61
4.8 Vergleich der charakteristischen LCST (lower critical solution
temperature) der PNIPAAm-PEG Copolymere mit
unterschiedlichem PEG-Gehalt ............................................................ 62
4.9 Fortschreitkontaktwinkel von Wasser auf P15-Au, P19-Au und
gereinigtem Gold als Funktion der Temperatur .................................... 63
4.10 Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) von P19-Au ................. 64
4.11 Zellabrundung auf P15-Au und P19-Au über die Zeit .......................... 66
4.12 Fortschreitkontaktwinkel von Wasser auf P19-Au,
P19/PG(1:6)-Au, PG-Au und gereinigtem Gold als Funktion der
Temperatur .......................................................................................... 67
4.13 Adhäsionsverhalten von MG63 auf P19/PG-Au mit
unterschiedlichen Mischungsverhältnissen .......................................... 69
4.14 Fortschreitkontaktwinkel von Wasser auf P19-Au, P19/RGD(1:8)-Au,
RGD-Au und gereinigtem Gold als Funktion der Temperatur .............. 70
4.15 Adhäsionsverhalten von L929 auf P19/RGD-Au mit
unterschiedlichen Mischungsverhältnissen ......................................... 72
4.16 PDMS-16Pin-Stempel für die Mikrostrukturierung von Oberflächen ... 74
4.17 Mikrostrukturierung von BSA-Biotin-Oberflächen mit
Streptavidin488 mit Hilfe eines PDMS-16Pin-Stempel bei
unterschiedlichem Anpressdruck ........................................................ 75
4.18 Mikrostrukturierung von BSA-Biotin-Oberflächen über
Streptavidin488 mit Hilfe eines PDMS-16Pin-Stempel bei 43,1 kPa ... 75
4.19 Verhalten von 3T3-Zellen auf mikrostrukturiertem P15-Au bei
Temperaturänderung ........................................................................... 77
4.20 Verhalten von L929-Zellen auf mikrostrukturiertem
Fibronektin-P15-Au Substrat ............................................................... 78
11
Tabellenverzeichnis
3.1 Verwendete Zelllinien mit deren charakteristischen
Trypsinierungsbedingungen ................................................................... 37
3.2 Verwendete Substanzen für die Strukturierung von Glasoberflächen ... 41
3.3 Verwendete Thiole und deren optimierte Arbeitskonzentration
für die Funktionalisierung von Goldoberflächen .................................... 43
A1 Kontaktwinkeldaten funktionalisierter / unfunktionalisierter
Goldoberflächen im Temperaturbereich von 20 – 45 °C ....................... 100
A2 Zellablösungsanteil von L929 Fibroblasten auf P15-Au in
einem mikrofluidischen Kanal bei unterschiedlichen Flussraten ........... 101
A3 Zellabrundungsanteil von L929 Fibroblasten auf P15-Au und
P19-Au nach Temperaturänderung (37 °C- 25 °C) über die Zeit .......... 102
A4 Zellabrundungsanteil von L929 Fibroblasten auf P15-Au bei
unterschiedlichen Lagerungszeiten und mehreren Schaltzyklen .......... 102
A5 Zellabrundungsanteil von L929 Fibroblasten auf P15-Au bei
unterschiedlichen Lagerungszeiten und- bedingungen ........................ 102
A6 Zellabrundungsanteil von MG63 Osteoblasten auf P19/PG(1:6)-Au .... 102
A7 Zellabrundungsanteil von L929 Fibroblasten auf P19/RGD-Au
mit unterschiedlichen molaren Mischungsverhältnissen ...................... 103
A8 Zellabrundungsanteil von L929 Fibroblasten auf P19/RGD(1:8)-Au ... 103
12
Zusammenfassung
In der zellulären Biotechnologie besteht eine große Nachfrage nach Methoden für
eine möglichst schonende Handhabung von Zellen. Ein wichtiger Ansatz hierfür ist
die kontrollierte und schonende Ablösung adhärenter Zellen von Oberflächen, um
zelluläre Veränderungen zu vermeiden.
Die vorliegende Arbeit erweitert bisherige Ansätze thermoresponsiver
Polymeroberflächen hinsichtlich der Erzeugung und Anwendung mit besonderem
Blick auf die Einzelzellablösung. Im Fokus dieser Arbeit stand, die Erzeugung
thermoresponsiver Polymeroberflächen zu erleichtern und eine exakte Kontrolle über
Zellen mit unterschiedlichem Adhäsionsverhalten durch einstellbare
Oberflächeneigenschaften zu ermöglichen. Das thermoresponsive Copolymer
Poly(N-isopropylacrylamid)-poly(ethylenglykol) PNIPAAm-PEG(15%)-SH (P15)
wurde an Goldoberflächen (P15-Au) gebunden, um eine Kontrolle über die
Zelladhäsion zu gewährleisten. Die Kontaktwinkeldaten von P15-Au lassen eine
Änderung der Oberflächenbenetzbarkeit erkennen, welche dem Übergang von einem
hydratisierten (bei 20 °C) zu einem dehydratisierten Polymerzustand (bei 45 °C)
entspricht. L929 Fibroblasten konnten gut auf P15-Au bei 37 °C kultiviert werden und
rundeten sich bei Temperaturänderung auf 25 °C innerhalb von 30 Minuten von der
Oberfläche ab. Durch die Integration von P15-Au in ein mikrofluidisches System
konnte die für eine komplette Zellablösung notwendige Kraft kontrolliert werden. Auf
P15-Au wurde Fibronektin strukturiert aufgebracht, um ein Substrat mit einem
zellattraktiven und einem schaltbaren Bereich herzustellen. Dadurch konnten die
Zellen, die auf die zellattraktiven Fibronektinbereiche migrierten, von den Zellen
getrennt werden, die auf den schaltbaren Polymerbereich verweilten.
Für die Optimierung der Schaltkinetik und der Schalteffizienz von schaltbaren
Polymeroberflächen wurde ein neues Copolymer mit einem intramolekularen PEG-
Gehalt von 19%wt an Goldoberflächen gebunden (P19-Au). Bei 25 °C war die
Ablösung adhärenter Fibroblasten bei gleich bleibendem Zellabrundungsanteil
doppelt so schnell wie auf P15-Au. Da stark adhärente Zellen (z.B. Osteoblasten) auf
P19-Au bei Temperaturwechsel (37 °C ! 25 °C) sich nicht abrundeten bzw.
ablösten, wurde P19-Au mit dem zellrepellierendem Polymer CH3O-PEG-SH (PG)
modifiziert (P19/PG-Au). Die Daten der Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS)
bestätigten die erwartete Oberflächenzusammensetzung von P19-Au und der
modifizierten P19/PG-Au. Der Vergleich der Kontaktwinkeldaten beider
Polymeroberflächen zeigte, dass die Schaltbarkeit von P19/PG-Au durch die
Modifikation mit PG nicht verändert wurde. Ca. 74 % der stark adhärenten MG63
Zellen lösten sich nach Temperaturänderung innerhalb von 30 Minuten von der
Oberfläche. Um die Kultivierungsdauer für schwach adhärente Zellen auf P19-Au zu
verkürzen, wurde P19-Au mit dem Fibroblasten-attraktiven Peptidmotiv CGGRGDS
(RGD) modifiziert (P19/RGD-Au). Bei Temperaturänderung war der
Abrundungsanteil adhärenter Zellen auf dieser Oberfläche vergleichbar mit dem
Zellabrundungsanteil auf P19-Au.
13
1. Einführung
In der zellulären Biotechnologie ist es von großer Relevanz, neue Methoden zu
entwickeln, die eine Nachbildung der in vivo Umgebung von Zellen ermöglichen.
Damit kann das teilweise heterogene Verhalten von Zellen besser kontrolliert und
analysiert werden. Ein nach wie vor kritischer Punkt ist das Ernten von adhärenten
Zellen auf Oberflächen, welcher einen großen Einfluss auf das morphologische
Erscheinungsbild von Zellen haben kann. Dies kann weit reichende Auswirkungen
auf die Zellvitalität, Zellproliferation sowie auf zelluläre Differenzierungsprozesse
haben.
Bis heute existiert eine Reihe von Methoden, um adhärente Zellen von Oberflächen
zu lösen und zu ernten. Das wohl am meisten eingesetzte Verfahren in der
Zellbiologie ist die enzymatische Behandlung von adhärenten Zellen. Dabei werden
Zellen mit einem Enzym (Trypsin) in Kombination mit einem Komplexbildner
(Ethylendiamintetracetat: EDTA) für eine definierte Zeit inkubiert und anschließend
geerntet. Über den Komplexbildner werden der Zelle für die Adhäsion nötige Ca2+-/
Mg2+ -Ionen entzogen. Das Enzym zerstört sowohl die Verbindung zwischen
Membranprotein und der zellulären Umgebung (extrazelluläre Matrix: EZM) als auch
die Zell-Zell-Verbindung. In der anschließenden Kultivierung müssen Zellen erst
wieder ihre ursprünglichen Oberflächenproteine aufbauen, um ihre volle Aktivität
entwickeln zu können, was die Signifikanz von Experimenten beeinflussen kann.
Besonders im „Tissue Engineering“, wo Gewebe aufgebaut werden soll, kann eine
solche Methode von großem Nachteil sein.
Die vollständige Entfernung adhärenter Einzelzellen aus mikrofluidischen Kanälen
stellt ein weiteres Problem in der Zellbiologie dar, da Zellen bisher nur mittels
enzymatischer Komponenten oder mit hohen Strömungskräften aus den Kanälen
entfernt werden können. Dadurch werden Zellen geschädigt und für nachfolgende
Experimente in ihrer Funktion beeinträchtigt.
Eine zweite Methode neben der enzymatischen Behandlung ist das Ablösen der
Zellen mittels mechanischer Kräfte. Dabei werden die adhärenten Zellen mittels
eines so genannten „Zellschabers“ von der Oberfläche gekratzt und anschließend
geerntet.
EINFÜHRUNG
14
Canavan et al., 2005 verglich den Einfluss unterschiedlicher Zellablösungsmethoden
auf Zellmorphologie und EZM. Hierbei zeigte sich, dass Zellen und EZM durch die
enzymatische und mechanische Zellablösung enorm beschädigt werden, was eine
ungünstige Voraussetzung für nachfolgende Kultivierungen ist. Als eine
zellschonende Ablösungsmethode stellte sich in dieser Studie die Verwendung von
thermoresponsiven Polymeroberflächen als Zellkultursubstrat dar. Diese Oberflächen
wechseln über eine Temperaturänderung ihre Konformation und können dadurch
zwischen einem zellattraktiven und einem zellrepellierenden Zustand schalten. Die
Zellen können schonend von der Oberfläche entfernt werden, ohne jegliche
enzymatische oder mechanische Behandlung. Darüber hinaus kann mit dieser
Methode die unter der Zellschicht liegende EZM komplett vom Substrat gelöst
werden, wodurch sich die physiologische Umgebung der Zellen kaum verändert. In
einer anschließenden Kultivierung wurden die abgetrennten Zellen und ihre EZM
weiterkultiviert, wobei eine Schädigung der Zellmorphologie, der
Zelloberflächenproteine sowie der EZM nicht beobachtet werden konnte.
Die Anwendung von temperaturschaltbaren Oberflächen zur Ablösung von
Zellschichten wurde von Takezawa et al., 1990 erstmals berichtet. Seitdem zeigen
temperaturschaltbare Oberflächen ihr Potential besonders in der Anwendung für die
regenerative Medizin. Beispiele hierfür sind die Arbeiten von der Gruppe um Dr. T.
Okano, die Zellschichten auf temperaturschaltbaren Oberflächen generierten und in
einen Organismus transferierten. Unter Temperaturänderung konnte die Zellschicht
komplett erhalten von der Oberfläche abgelöst werden und in ein funktionell inaktives
Gewebe erfolgreich transplantiert werden konnten. Dadurch konnte die
Funktionsfähigkeit des inaktiven Gewebes wiederhergestellt werden, ohne dabei
Entzündungsreaktionen auszulösen (Hirose et al., 2000; Akiyama et al., 2004; Ide et
al., 2006).
Neben diesen Polymeroberflächen wurden Copolymeroberflächen als
Zellkultursubstrat etabliert. Diese Copolymersysteme unterscheiden sich in ihrem
Polymeraufbau von reinen Polymeroberflächen. Sie setzen sich aus einem
Grundpolymer sowie daran gekoppelte Einheiten eines zweiten Polymers
zusammen. Durch die Kopplung zweier Polymere können die Schalteigenschaften
hinsichtlich der Ablösung adhärenter Zellen optimiert werden. Schmaljohann et al.,
2003 konnte durch den Einsatz solcher thermoresponsiver Copolymeroberflächen als
EINFÜHRUNG
15
Zellkultursubstrat die Ablösungsrate adhärenter Fibroblasten nach
Temperaturreduktion deutlich erhöhen.
Nachteilig an den vorgestellten thermoresponsiven Zellkultursubstraten ist die
zeitintensive und kostenaufwendige Erzeugung solcher Oberflächen. Zu dem sind
die Oberflächeneigenschaften mit den bisher verwendeten Präparationsmethoden
auf molekularer Ebene schwer kontrollierbar. Da Zellen unterschiedliche
Adhäsionseigenschaften besitzen, sind diese bisherigen thermoresponsiven
Systeme für eine individuelle Kontrolle von Zellen eher unzureichend. Ein möglicher
Ansatz wäre ein einfaches und flexibles „Baukastenprinzip“, in welchem die
erforderlichen Oberflächeneigenschaften mit Hilfe unterschiedlicher Moleküle
zelltypspezifisch eingestellt werden können. Diese individuell entwickelten,
thermoresponsiven Oberflächen können dann beispielsweise für die Untersuchung
und Manipulation von Einzelzellen angewendet werden, die eine präzisere
Information über die Zellheterogenität innerhalb einer Zellpopulation geben als ein
Zellverband (Svahn und van den Berg, 2007).
Das Ziel und die Motivation der vorliegenden Arbeit liegen darin, die Erzeugung
thermoresponsiver Oberflächen zu erleichtern und mittels kontrollierbarer
Oberflächeneigenschaften eine schonende Handhabung von Zellen mit
unterschiedlichen Adhäsionseigenschaften zu erreichen. Dabei steht die
Einzelzellablösung im Vordergrund dieser Arbeit, um die Handhabung von Zellen für
die Einzelzellanalytik zu vereinfachen. Über die Integration schaltbarer Oberflächen
in mikrofluidische Kanäle soll eine schonende und kontrollierte Entfernung von Zellen
aus Mikrokanälen umgesetzt werden. Basierend auf diesen Zielsetzungen sollen
eine Reihe von Fragen beantwortet werden:
• Eignet sich die ausgewählte Oberflächenfunktionalisierungsmethode als eine
einfache und effiziente Methode für die funktionelle Anbindung
thermoresponsiver Polymere?
• Sind die ausgewählten, thermoresponsiven Polymere zellverträglich und
funktionell, um eine schonende Kontrolle der Einzelzelladhäsion zu
ermöglichen?
• Eignen sich diese Polymeroberflächen für die Integration in ein
mikrofluidisches System, um darin Einzelzelladhäsion zu kontrollieren?
EINFÜHRUNG
16
• Sind die thermoresponsiven Polymeroberflächen für eine effiziente Nutzung
mehrmals einsetzbar?
• Über welchen Zeitraum und unter welchen Bedingungen können
thermoresponsive Polymeroberflächen gelagert werden, ohne dabei ihre
Schaltbarkeit zu verändern?
• Können aus einem „Sortiment von Molekülen“ individuelle,
temperaturschaltbare Polymeroberflächen entwickelt werden, durch die eine
Kontrolle über das Adhäsionsverhalten unterschiedlicher Zelltypen ermöglicht
wird?
• Kann durch die Mikrostrukturierung von schaltbaren Polymeroberflächen das
Zellverhalten zweidimensional kontrolliert werden?
17
2. Grundlagen
In den heutigen Materialwissenschaften, der Biotechnologie sowie in der Medizin
sind Polymere bzw. Hydrogele von Relevanz, die ihre Eigenschaften über
physikalische oder chemische Stimuli ändern können. Sie finden u.a. Anwendung als
Drug-Delivery-Systeme, Biosensoren, Molekülseparationssysteme oder als
implantierbare Materialien (Kopecek, 2007). Ferner werden Hydrogele nach
stimuliresponsiven oder nichtresponsiven Gelen eingeteilt (Nayak und Lyon, 2005).
Nichtresponsive Gele sind Materialien, die durch Adsorption von Wasser quellen.
Stimuliresponsive Gele werden als „schaltbare Polymere“ oder auch als „intelligente
Polymere“ bezeichnet, da sie mit einem unterschiedlichen Quellverhalten auf diverse
Stimuli wie beispielsweise pH-Wert (Lee und Shieh, 1999), Ionenstärke (Duracher et
al., 1998), elektrische Felder (Tanaka et al., 1982), Biomoleküle (Miyata et al., 2002),
Licht (Suzuki und Tanaka, 1990) oder Temperatur (Li und Tanaka, 1990) reagieren
können. Die Reaktivität des jeweiligen Polymers hängt von der Herstellungsart und
der Modifikation ab, die nach der Polymerisation vorgenommen werden (Nayak und
Lyon, 2005). Da der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf thermoresponsiven
Polymeren liegt, wird im Nachfolgenden auf deren Funktionsprinzip und
Anbindungsmöglichkeiten näher eingegangen.
2.1 Thermoresponsive Polymere und ihre Anwendungen
2.1.1 Funktionsprinzip von thermoresponsiven Polymeren
Thermoresponsive Polymere stellen für pharmazeutische sowie biomedizinische
Anwendungen ein attraktives System dar, da einige Vertreter dieser Polymere
Phasenübergangstemperaturen von 30 – 34 °C aufweisen, was nahe dem Bereich
der menschlichen Körpertemperatur ist (Schmaljohann, 2006).
Sinnvolle Anwendungen finden thermoresponsive Polymere beispielsweise in der
Kontrolle der Oberflächenbenetzbarkeit für die kontrollierte Proteinadsorption in
mikrofluidischen Kanälen (Huber et al., 2003) sowie in der Kontrolle der Zelladhäsion
an Oberflächen (Yamada et al., 1990). Basierend hierauf wurden schaltbare
Polymere für die Anwendung in der Zellkultur sowie im Tissue Engineering näher
untersucht (Bae et al., 1990, Yoshida et al., 1993, Okano et al., 1990).
GRUNDLAGEN
18
Eukaryotische Zellen konnten auf diesen Substraten adhärieren, ausbreiten und eine
Zellschicht bilden. Nach Temperaturveränderung lösten sich diese schonend von der
Oberfläche ab, ohne dabei eine Schädigung zu erfahren. Canavan et al., 2005
konnte im Rahmen einer großen Studie über Methoden zur Zellablösung adhärenter
Zellen zeigen, dass durch die Trypsinbehandlung die Zellvitalität, die extrazelluläre
Matrix sowie die Zell-Zell-Verbindung durch die Zerstörung von
Zelloberflächenproteinen beeinflusst werden. Als Folge können zudem intrazelluläre
Signaltransduktionswege funktionell beeinträchtigt sein.
Eine der bekanntesten Vertreter der thermoresponsiven Polymere ist das
wasserlösliche, nicht-ionische Polymere Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm).
Dieses gehört zur Gruppe der N-Alkylacrylamide und wurde auf seine
thermoresponsiven Eigenschaften untersucht (Heskin und Guillet, 1968). Aufgrund
von Temperaturänderungen zeigt dieses Polymer thermisch reversible
Phasenübergänge entlang der Löslichkeitsgrenze, welche als LCST (lower critical
solution temperature = untere kritische Löslichkeitstemperatur) bezeichnet wird. Die
LCST ist für jedes Polymer charakteristisch und liegt im Falle von reinem PNIPAAm
bei ~32 °C.
Der Aufbau des PNIPAAm-Moleküls, welches in der vorliegenden Arbeit verwendet
wurde, ist in Abbildung 2.1 dargestellt. An das PNIPAAm-Molekül (n) wurde in der
Synthese ein jeweilig definierter Anteil PEGMA (m) gekoppelt. Im Rahmen dieser
Arbeit wurden insgesamt zwei Copolymere mit unterschiedlichen PEG-Anteilen
synthetisiert. Der detaillierte Syntheseweg ist in Ernst et al., 2007 beschrieben.
Abbildung 2.1: Struktur des thermoresponsiven Copolymers PNIPAAm-PEG. n definiert den
PNIPAAm-Anteil, m definiert den PEGMA-Anteil. Es wurden in dieser Arbeit zwei Copolymere
basierend auf dem dargestellten Copolymer synthesiert. Im Falle von PNIPAAm-PEG(15%) beträgt
die molare Zusammensetzung ein Verhältnis von 95:5 (n:m), bei PNIPAAm-PEG(19%) 93:7 (n:m).
GRUNDLAGEN
19
Als Vorlage für die dargestellte Copolymerstruktur dienten die Copolymere aus der
Arbeit von Schmaljohann et al., 2003. Darin wurden an PTFE-Oberflächen
thermoresponsive PNIPAAm-PEG-Copolymere polymerisiert, die eine LCST nahe
der Zellkultivierungstemperatur bei 37°C aufweisen und durch den PEG-Anteil einen
stärkeren Zellablösungseffekt bei Temperaturänderung erzielen können. Das
Copolymer PNIPAAm-PEG mit einem PEG-Gehalt von 15 wt. % zeigte eine LCST im
Bereich von 35 – 36 °C. Durch Erhöhung des intramolekularen PEG-Gehalts auf 19
wt. % ergab sich eine LCST für das Copolymer von 36 – 37 °C, wodurch die
Zellablösung im Vergleich zu PNIPAAm-PEG(15%) beschleunigt und erhöht werden
konnte. Dieser Effekt wurde auf die bekannten protein –und zellrepellierenden
Eigenschaften von PEG sowie auf die Erhöhung des intramolekularen PEG-Gehalts
zurückgeführt (Harris, 1992).
Basierend hierauf wird in Abbildung 2.2 das Funktionsprinzip eines solchen
Copolymers in Lösung sowie immobilisiert an einer Oberfläche näher erläutert (Takei
et al., 1994).
Abbildung 2.2: Strukturverhalten von PNIPAAm-PEG in Lösung sowie immobilisiert an
Oberflächen mit Zellverhalten bei unterschiedlichen Temperaturen. (A) Mit steigender
Temperatur reduziert sich der Hydratisierungsgrad des Polymers in Lösung. Als Folge reduziert sich
das Molekülvolumen, die Aggregation der Moleküle nimmt zu. (B) Bei hoher Temperatur (37 °C) zeigt
das Polymer einen kollabierten, dehydratisierten Zustand an der Oberfläche. Es ist mehr PNIPAAm
als PEG an der Oberfläche exponiert, wodurch die Zellen an die Oberfläche adhärieren und sich
ausbreiten können. Bei Temperaturreduktion (25 °C) wird das Copolymer hydratisiert, wodurch mehr
PEG als PNIPAAm an der Oberfläche exponiert wird. Als Folge runden sich die Zellen von der
Oberfläche ab und können entfernt werden.
GRUNDLAGEN
20
Oberhalb der charakteristischen LCST kommt es zu einem dehydratisierten,
kollabierten Zustand des Copolymers (Abbildung 2.2 A). Dies ist auf die Zerstörung
der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Isopropylamidgruppen des
Polymers und den Wassermolekülen zurückzuführen, wodurch im Polymer die intra-
und intermolekularen hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den
Isopropylamidgruppen zunehmen (Plate et al., 1999). Darüber hinaus kommt es zu
einer erhöhten intramolekularen Wechselwirkung zwischen PEG und PNIPAAm-
Einheiten. Der exponierte PEG-Anteil ist in diesem Zustand relativ gering, wodurch
Zellen an die Copolymeroberfläche adhärieren und sich ausbreiten können
(Abbildung 2.2 B). Bei Temperaturen unterhalb der LCST löst sich das Copolymer in
dem jeweiligen Lösungsmittel, was durch die Hydratisierung der
Isopropylamidgruppen im Copolymer induziert wird. Das Copolymer befindet sich in
einen hydratisierten, gequollen Zustand, in welchem ein größerer PEG-Anteil
aufgrund der Hydratisierung an der Oberfläche exponiert wird (Abbildung 2.2 A).
Sowohl durch den Quellungseffekt von PNIPAAm als auch durch den hohen
exponierten, zellrepellierenden PEG-Anteil werden adhärente Zellen von der
Polymeroberfläche abgelöst (Abbildung 2.2 B) (Kwon et al., 2000).
2.1.2 Oberflächenfunktionalisierungsmöglichkeiten
In bisherigen Studien wurden unterschiedliche thermoresponsive Polymere auf ihre
Anwendbarkeit für die Kontrolle der Zell-Substrat-Adhäsion untersucht. Hierbei
wurden unterschiedliche Funktionalisierungsmöglichkeiten von Oberflächen mit
thermoresponsiven Polymeren beschrieben (da Silva et al., 2007).
Im Zusammenhang mit PNIPAAm-Oberflächen ist die Elektronenstrahlpolymerisation
die am häufigsten beschriebene Methode, in welcher an kommerziell erhältlichen
Polystyrensubstraten über einen Elektronenstrahlverdampfer thermoresponsives
PNIPAAm polymerisiert und kovalent gebunden werden konnte (Yamada et al.,
1990; Akiyama et al., 2004; Kwon et al., 2000). Hierüber konnten zur Zellablösung
funktionelle Polymerschichtdicken bis 20 nm erzeugt werden (Yamato et al., 2001).
Schichtdicken oberhalb dieses Bereichs erwiesen sich als zellunverträglich
hinsichtlich der Zelladhäsion.
Eine zweite Möglichkeit, thermoresponsive Zellkultursubstrate zu erzeugen, ist die
GRUNDLAGEN
21
UV-Bestrahlung von Oberflächen. Hierfür werden unter UV-Bestrahlung Polymere
wie bspw. PNIPAAm mit photoreaktiven Gruppen an der Oberfläche polymerisiert
und gebunden. Dieses Verfahren wurde mit photolithographischen Masken
kombiniert, um mikrostrukturierte Oberflächen mit thermoresponsiven Bereichen zu
entwickeln (Ito et al., 1997; Chen et al., 1998). Adhärente Fibroblasten konnten nach
Temperaturänderung von den thermoresponsiven Bereichen abgelöst werden.
Die dritte Möglichkeit für die Erzeugung thermoresponsiver Zellkultursubstrate zeigte
die Gruppe um Schmaljohann (Schmaljohann et al., 2003). Sie polymerisierten
thermoresponsive PEG (Polyethylenglycol)-basierende Copolymere von PNIPAAm
und Poly (N-diethylacrylamid) PDEAAm und immobilisierten es auf PTFE
(Polytetrafluoretylen) -Substraten mittels eines Niederdruckargonplasmas. Diese
Methode ist limitiert durch die erzeugten Schichtdicken im Bereich von 10-20 nm.
2.2 Funktionalisierung und Charakterisierung von
Goldoberflächen
Die in Kapitel 2.1.2 vorgestellten Funktionalisierungsmethoden haben alle die
Nachteile, dass die Verfahren einen hohen Geräteaufwand, teuer und teilweise
schlecht kontrollierbare Parameter im Bezug auf die Oberflächeneigenschaften
aufweisen.
Deshalb soll in dieser Arbeit eine leicht handhabbare Funktionalisierungsmethode
eingesetzt werden, die eine flexiblere Kontrolle über die Oberflächeneigenschaften
erlaubt. Als geeignete Methode für diese Anforderung hat sich die Thiol-Goldchemie
herausgestellt, die im Bezug auf PNIPAAm-Oberflächen erstmalig von Cho et al.,
2004 im Rahmen von Proteinadsorptionsstudien vorgestellt wurde. In der
vorliegenden Arbeit sollen Thiol-terminierte Copolymere an Goldoberflächen kovalent
gebunden werden und als thermoresponsive Zellkultursubstrate getestet werden.
2.2.1 Selbstorganisierende Monolagen (SAM) an Goldoberflächen
Die Funktionalisierung von Goldoberflächen mit Thiolmolekülen findet in der heutigen
in der Biochemie und Biotechnologie breite Anwendung (Ostuni et al., 1999).
Darüber hinaus wird diese Methode für die pharmakologische Dosierung, die
Entwicklung von Biosensoren und speziell benetzbaren Oberflächen sowie in der
GRUNDLAGEN
22
Entwicklung von Nanosystemen für die Elektronik eingesetzt (Vericat et al., 2005).
Es konnte gezeigt werden, dass die Oberflächeneigenschaften auf molekularer
Ebene durch Variation der molekularen Packungsdichte sowie der funktionellen
Gruppen entsprechend angepasst werden können (Delamarche et al., 1996). Damit
konnte dann beispielsweise die Proteinadsorption an Oberflächen (Prime und
Whitesides, 1993) bzw. Zelladhäsion an Oberflächen (Mrksich, 2000) kontrolliert
werden.
Aufgrund der selbstablaufenden, spontanen Adsorption der Thiole zu einer
Einzelmolekülschicht auf Goldoberflächen werden solche Oberflächen als
selbstorganisierende Monoschichten (SAM: Self-Assembling Monolayer) bezeichnet.
SAM sind ultradünne, organische Schichten, deren Dicke einer Moleküllage
entspricht. Ein Thiol-Molekül besteht in der Regel aus drei Bereichen (Abbildung 2.3
A), welche ausschlaggebend für die physikalischen und chemischen Eigenschaften
von Oberflächen sind. Die terminale Thiolgruppe wird für die kovalente Anbindung
von Thiolen an Goldoberflächen benötigt. Diese ist eine wichtige Voraussetzung für
die thermische Stabilität von SAMs. Die Methylgruppen können in ihrer Länge
variieren und stabilisieren die aneinander gereihten Thiole über van der Waalsche
Wechselwirkung. Die funktionelle Kopfgruppe verleiht der Goldoberfläche die
physikalischen und chemischen Eigenschaften, wodurch bspw. die Benetzbarkeit
gesteuert werden kann. Ist die Kopfgruppe z.B. eine OH-Gruppe, so wird eine
Oberfläche mit hydrophilen Eigenschaften erzeugt. Wird hingegen als Kopfgruppe
eine CH3–Gruppe eingesetzt, so wird die Hydrophobizität der Oberfläche erhöht.
Die Bildung einer Monolage basiert zum einen auf der Physisorption der Thiole, zum
anderen auf der Chemisorption von Thiol-Molekülen auf Goldoberflächen unter
Abspaltung des Wasserstoffsatom aus der terminalen Thiolgruppe (Kang und
Rowntree, 2007):
HS(CH2)nX + Au Au-S- (CH2)nX + ! H2
Die Adsorptionskinetik hängt von unterschiedlichen Faktoren ab, wie z.B. Thiollänge,
Temperatur, Konzentration und Lösungsmittel. Porier und Pylant, 1996 zeigten in
Ihren Studien einen zweistufigen Adsorptionsmechanismus der
selbstorganisierenden Alkanthiole auf Goldoberflächen (Abbildung 2.3 B).
GRUNDLAGEN
23
Abbildung 2.3: Aufbau und Organisation von SAM auf Goldoberflächen. (A) Schematischer
Aufbau eines Alkanthiols. (B) Mechanismus der Selbstorganisierung von Thiolen an Goldoberflächen.
In der ersten Phase erfolgt die Thioladsorption und Oberflächenabsättigung. In der zweiten Phase
werden zur Maximierung der van der Waalschen Kräfte zwischen den Methylgruppen die Thiol-Ketten
in einem Winkel von 30 ° zur Oberflächennormalen ausgerichtet, um eine noch höhere
Packungsdichte zu erreichen. Die Adsorptionsdauer (2 - 24 h) hängt von der jeweiligen Molekülgröße
und Konzentration ab. (nach Porier und Pylant, 1996)
In der ersten Phase adsorbieren Thiol-Moleküle an der Oberfläche und bilden
aufgrund ihrer parallelen Ausrichtung zur Oberfläche eine Schicht mit geringer
Dichte. Dichte und Ordnungsgrad der Schicht hängen vom Substrat, der
Alkankettenlänge sowie vom Typ und der Größe der funktionellen Gruppen ab. Nach
Oberflächenabsättigung werden in der zweiten Phase zur Maximierung der van der
Waalschen Kräfte zwischen den Methylgruppen die Thiol-Ketten in einem Winkel von
30° zur Oberflächennormalen ausgerichtet, um eine noch höhere Packungsdichte zu
erreichen. Die Wechselwirkung von Schwefelatomen untereinander wird als sehr
gering angenommen (Dubois und Nuzzo, 1992). Monoschichten auf Goldoberflächen
sind nach Präparation stabil, d.h. sie sind hydrolyseunempfindlich, sie polymerisieren
nicht, im Gegensatz zu SAM von Silanen, welche hydrolysieren und Polymere
ausbilden, die dann die Oberfläche kontamieren können. Die Eigenschaften der
Thiol-Monoschicht auf Goldoberflächen werden durch drei Faktoren bestimmt (Xu
und Li, 1995):
GRUNDLAGEN
24
1. Die Adsorption von oberflächenaktiven Thiol-Gruppen auf dem Substrat
2. Die disperse Wechselwirkung zwischen den Alkyl-Ketten
3. Die Wechselwirkung zwischen den terminalen funktionellen Gruppen und
deren Umgebung.
Neben Thiol-Molekülen können auch Moleküle mit einer Disulfidgruppe für die
Funktionalisierung an Goldoberflächen verwendet werden, die jedoch eine
langsamere Adsorptionskinetik als Thiolmoleküle aufweisen (Jung et al., 1998).
Coadsorptive SAM`s bieten die Möglichkeit, die Oberflächeneigenschaften mittels
Konzentrationsvariation der unterschiedlichen Thiol-Moleküle exakt für die jeweiligen
Anforderungen einzustellen. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Adsorption
von Biomolekülen, da diese mit einer höheren Affinität an coadsorptive Oberflächen
binden können als an adsorptive Oberflächen (Fujita et al., 2004). Für die
Zellbiologie wird die Coadsorption eingesetzt, um Zellen in ihrer Migration und
Adhäsion an Oberflächen räumlich zu kontrollieren (Veiseh et al., 2007). Als
kritischer Faktor während der Coadsorption hat sich die Entmischung der Thiole
erwiesen, welche zu Oberflächendefekten führen können. Dies kann durch die
richtige Wahl des Lösungsmittels für beide Thiole sowie durch nicht zu große
Unterschiede in der Thiolkettengröße verhindert werden.
Für den Nachweis von SAM an Goldoberflächen existieren unterschiedliche
Methoden. Durch die Anwendung von AFM (atomic force microscopy) erhält man
Information über die 2D-Struktur der Oberfläche. Mittels Raman Spektroskopie lässt
sich auf die molekulare Anordnung sowie funktionelle Gruppen schließen. Die
dynamische Kontaktwinkelmessung gibt Aussage über die Benetzbarkeit der
Oberfläche, wodurch auf die Verteilung funktioneller Gruppen geschlossen werden
kann. Der Einsatz von Photoelektronenspektroskopie (XPS) ist eine
oberflächensensitive Methode, die erlaubt, chemische Elemente zu identifizieren und
zu quantifizieren. Damit sind Aussagen über die Oberflächenzusammensetzung bis
zu einer Tiefe von 10 nm möglich (Vericat et al., 2005).
GRUNDLAGEN
25
2.2.2 Kontaktwinkelmessung
Die Kontaktwinkelmessung findet als Methode zur Oberflächencharakterisierung eine
breite Anwendung, wie z.B. bei der Bestimmung der Oberflächenspannung von
Flüssigkeiten an Festkörpern oder bei der Optimierung von Beschichtungsverfahren
(Lackieren, Kleben, Drucken, etc.) an Oberflächen.
Die Kontaktwinkelmessung wurde in dieser Arbeit als Charakterisierungsmethode an
funktionalisierten Goldoberflächen durchgeführt. Sie bietet die Möglichkeit, eine
Information über die Benetzbarkeit der Oberfläche zu erhalten. Daraus kann dann
auf die Verteilung funktioneller Gruppen an der Oberfläche geschlossen werden.
Das Prinzip dieser Methode basiert darauf, den Kontaktwinkel zwischen einer
Flüssigkeit (Wassertropfen) und einem Festkörper (Substrat) zu messen und darüber
eine Aussage über die energetische Wechselwirkung zwischen dem Festkörper und
der Flüssigkeit zu treffen. Die Spreitung des Tropfens gibt eine Information über die
Oberflächenbenetzbarkeit an. Aufgrund des Kontakts des Wassertropfens mit dem
Festkörper ergeben sich drei Phasen mit drei Oberflächenspannungstypen
(Abbildung 2.4). Die Oberflächenspannung " entspricht der Oberflächenenergie pro
Fläche, d.h. die zur Vergrößerung der Oberfläche definierte Arbeit bezogen auf die
Fläche.
Abbildung 2.4: Kontaktwinkelbildung auf einer Festkörperoberfläche nach YOUNG. Der
Kontaktwinkel # ist der Winkel, den eine Tangente im drei-Phasen-Punkt bildet. Aus dem Kontakt des
Wassertropfens mit dem Festkörper ergeben sich drei Oberflächenspannungen entlang der
Phasengrenzen: !l: Oberflächenspannung der Flüssigkeit an der Phasengrenze flüssig/gasförmig, !s:
Oberflächenspannung des Festkörpers an der Phasengrenze fest/gasförmig, !sl:
Oberflächenspannung der Flüssigkeit an der Phasengrenze fest/flüssig. (nach Dörfler, 2002)
Das Gleichgewicht an dem drei-Phasen-Punkt bestimmt den Kontaktwinkelwert #,
welcher sich bei dem Kontakt zwischen der Grenzfläche flüssig/ gasförmig und dem
Festkörper ergibt. Er wird über Young`s Gleichung definiert:
GRUNDLAGEN
26
cos # = ("s-"sl )/ "l (1)
Neben der Messmethode des „sitzenden Tropfens“, bei dem der Randwinkel des
ruhenden Tropfens auf dem Festkörper gemessen wird, existiert die dynamische
Kontaktwinkelmessung. Diese hat den Vorteil, neben dem Kontaktwinkel eine
zusätzliche Information über Rauheit bzw. chemische Homogenität der
Festkörperoberfläche zu erhalten, welche über die so genannte
Kontaktwinkelhysterese bestimmt wird. Diese ergibt sich aus der Differenz von
Vorzugs- zu Rückzugswinkel. Bei Vergrößerung des Wassertropfens auf der
Festkörperoberfläche misst man den Vorzugswinkel. Durch die Verkleinerung des
Tropfens wird der Rückzugswinkels bestimmt (Abbildung 2.5).
Aufgrund der Änderung des Kontaktwinkels bei unterschiedlichen Temperaturen
können darüber hinaus Rückschlüsse auf die Schaltkinetik von thermoresponsiven
Oberflächen gezogen werden, die aus der Änderung der Benetzungseigenschaften
bei solchen Oberflächen resultiert.
Abbildung 2.5: Messprinzip der dynamischen Wasserkontaktwinkelmessung an Festkörpern.
(A) Ermittlung des Vorzugswinkels bei maximaler Vergrößerung des Wassertropfens. (B) Ermittlung
des Rückzugswinkels bei maximaler Verkleinerung des Wassertropfens. (nach Dörfler, 2002)
GRUNDLAGEN
27
2.2.3 Röntgenelektronenspektroskopie (XPS)
Die XPS-Methode (X-ray photoelectron spectroscopy) ist eine der am häufigsten
eingesetzten Analytikmethoden zur quantitativen Untersuchung der molekularen
Zusammensetzung an Oberflächen. XPS findet Anwendung in vielen Bereichen der
Materialwissenschaften (Polymerchemie, Keramik –und Metallverarbeitung) (Seah,
1980; Ebberink et al. 1984). Sie bietet die Identifikation chemischer Elemente auf
Oberflächen und gibt eine Information über Bindungszustände dieser Elemente,
deren Oxidationsgrad bzw. funktionelle Gruppen. Außer Wasserstoff und Helium
können alle Elemente mit dieser Methode untersucht werden.
Das Prinzip dieser Methode basiert auf der Wechselwirkung von Röntgenstrahlung
mit atomaren Orbitalen aus Atomen, Molekülen, wobei Elektronen emittiert werden,
deren kinetische Energie gemessen wird (Abbildung 2.6). Während der Bestrahlung
eines Festkörpers mit Röntgenstrahlung kann es zu zwei
Wechselwirkungsphänomenen kommen. Zum einen läuft eine Absorption der
Röntgenstrahlung sowie Emission mittels Röntgenfluoreszenz ab. Diese kann über
separate Verfahren untersucht werden, auf die in dieser Arbeit nicht weiter
eingegangen wird.
Zum zweiten wird aufgrund der energiereichen Röntgenstrahlung ein Elektron aus
dem Atomverband herausgeschlagen. Dadurch kommt es zum Austritt eines
Photoelektrons und ein Elektron fällt aus einer energetisch höheren Lage in das
entstandene Loch zurück (XPS-Elektron). Durch die Energieabgabe wird ein drittes
Elektron aus dem Atomverband herausgelöst (Auger-Elektron), welches innerhalb
dieser Arbeit nicht untersucht wurde. Das XPS-Elektron wird auf seine kinetische
Energie analysiert und mit Standardwerten verglichen. Daraus kann dann auf die
Elementzusammensetzung an der Oberfläche geschlossen werden. Der
Zusammenhang zwischen der eingestrahlten Photonenenergie und der kinetischen
Energie der emittierten Elektronen wird über das photochemische Quanten-
Äquivalenzgesetz dargestellt:
EKin = EPhoton - EB - e! (2)
Ausgehend von der bekannten Photonenenergie EPhoton kann dann die
Bindungsenergie EB aus der kinetischen Energie der Photoelektronen EKin bestimmt
werden. EB ist charakteristisch für das jeweilige Orbital eines Atoms.
GRUNDLAGEN
28
Ein Elektron kann nur den Festkörper verlassen, wenn die Photonenergie größer ist
als die Elektronenbindungsenergie und das Elektron ausreichend Energie besitzt um
die Austrittsarbeit e$ des Festkörpers zu überwinden. Deshalb muss in die
Bestimmung der kinetischen Energie die Austrittsarbeit e$ an der Oberfläche
miteinbezogen werden.
Abbildung 2.6: Energieschema eines XPS-Prozesses. Die Photonen der Röntgenstrahlung (h")
werden am Festkörper (Probe) absorbiert, worauf die Elektronen in einen angeregten Zustand
überführt werden und aus der Probe austreten können. Dieser Elektronenaustritt ist möglich, da die
Photonenenergie größer ist als Elektronenbindungsenergie (EB), wodurch die Austrittsarbeit (e$) an
der Oberfläche überwunden werden kann. Die kinetische Energie sowie die Austrittsarbeit können
dann vom Analysator des Spektrometers detektiert werden. (nach Moulder et al., 1995)
Die quantitative Auswertung der Messung erfolgt über die Intensität dieser
Messungen, die proportional zur Häufigkeit des Auftretens der verschiedenen
Elemente in der Probe ist. Die Tiefeninformation einer Oberfläche bei dieser
Messung hängt von der mittleren freien Weglänge der emittierten Elektronen ab,
welche wiederum von der kinetischen Energie abhängig ist. Diese können je nach
Material der untersuchten Probe aus einer Oberflächentiefe bis zu 10 nm emittieren
und damit detektiert werden. Mit zunehmender Tiefe reduziert sich der
Intensitätsbeitrag zum Spektrum exponentiell. Die Tiefensensitivität einer XPS-
Messung kann durch die winkelabhängige Photoelektronenspektroskopie erhöht
werden.
GRUNDLAGEN
29
2.3 Zellbiologischer Hintergrund
Die Kontrolle über das Adhärenzverhalten von Zellen an Oberflächen spielt in der
heutigen Entwicklung von biokompatiblen Oberflächen eine entscheidende Rolle. Die
Zelladhäsion wird über die Wechselwirkung zwischen Proteinen an der jeweiligen
Oberfläche und den Zelloberflächenrezeptoren vermittelt. Dabei treten sowohl
spezifische Wechselwirkungen (Rezeptor-Ligand) als auch unspezifische
Wechselwirkungen auf. Letztere können von der Oberflächentopographie,
Oberflächenbenetzbarkeit, Oberflächenladung sowie von der
Oberflächenzusammensetzung beeinflusst werden (Wei et al., 2007).
2.3.1 Zelladhäsion auf Substrat
Bevor die Zelle in unmittelbaren Kontakt mit der jeweiligen Oberfläche tritt, kommt es
zu einer passiven Adhäsion mit unspezifischen, physikochemischen
Wechselwirkungen. Diese beinhalten sterische, hydrophobe, elektrostatische und
van der Waal`sche Wechselwirkungen. Der Einfluss der Oberflächenbenetzbarkeit
auf die initiale Zelladhäsion ist noch ein ungeklärter Mechanismus. Diverse Studien
konnten zeigen, dass eine Oberflächenbenetzbarkeit mit Kontaktwinkeln zwischen
0 ° bis 80 ° eine optimale Zelladhäsion ermöglichen (Brunett, 2001; Wei et al., 2006).
Dies wurde damit begründet, dass an solchen Oberflächen die adsorbierten Proteine
in einer Konformation angeordnet sind, dass für die Zellen passende Bindungsmotive
präsentiert werden. Proteinadsorptionsstudien an stark hydrophoben Oberflächen
zeigen, dass aufgrund der Maximierung hydrophober Wechselwirkung der
Oberflächen mit den hydrophoben Aminosäureseitenketten Proteine in eine
veränderte Konformation überführt werden, wodurch den Zellen andere Peptidmotive
präsentiert werden als auf hydrophileren Oberflächen (Grinell und Feld, 1982;
Horbett und Lew, 1994). Dies kann zu einem schwächeren Zelladhäsionsverhalten
führen.
Bei unmittelbarem Kontakt der Zelle mit der Oberfläche nehmen die spezifischen
Wechselwirkungen zwischen Zellmembran und Proteinen an der Materialoberfläche
zu. Über die zellspezifischen Integrinrezeptoren erkennt die Zelle bestimmte Proteine
der extrazellulären Matrix (EZM) aus ihrer Umgebung und bindet daran. Danach
erfolgt ein Ausbreiten des adhärenten Zellkörpers mittels der ATP-abhängigen
Reorganisation des Zytoskeletts, um die Zelle mechanisch an der Oberfläche (EZM)
GRUNDLAGEN
30
zu stabilisieren (Hersel et al., 2003). Die EZM kann von der Zelle entweder selbst
generiert oder in Form von adsorbierten Serumproteinen an der Oberfläche gebildet
werden. Die Integrine fungieren in der Zelle als Ca2+-abhängige heterodimere
Transmembranproteine mit großen Liganden-bindenden extrazellulären Domänen
und einem kurzen intrazellulären Anteil (Horwitz und Parson, 1998). Die intrazelluläre
Domänen der Integrinrezeptoren sind über diverse Adapterproteine an die
Aktinfilamente (Zytoskelett) gekoppelt. Über die Integinrezeptoren können
Signaltransduktions-kaskaden induziert werden, welche Prozesse wie
Zellproliferation bzw. Apotose steuern. Wird ein Signal von der EZM auf die Integrine
übertragen, kann dies zu einer Reorganisation des Cytoskeletts führen, worüber
Zellmigration und Zellproliferation gesteuert wird. Signale aus der Zelle zur EZM
führen in der Regel zur Aktivierung der Integrinrezeptoren für eine mögliche
Ligandenbindung (Hynes, 1992).
Die Ligandenspezifität des Integrinrezeptors wird durch die Kombination der 18
alpha/ 8 beta-Untereinheiten bestimmt. Als Liganden existieren unterschiedliche
EZM-Proteine (Fibronektin, Kollagen, etc.), die von den Zelltypen mit der jeweiligen
Integrinrezeptorkombination unterschiedlich stark gebunden werden. Pierschbacher
und Rouslathi, 1984 identifizierten innerhalb des Fibronektins das für die
Zelladhäsion nötige Tripeptid „RGD“ (Arginin-Glycin-Aspartat). In weiteren Studien
wurde herausgefunden, dass RGD ebenso in anderen EZM-Proteinen (Fibrinogen,
Vitronektin, Laminin, etc.) ein für die Zelladhäsion notwendiges Motiv ist (Pfaff,
1997). Dabei zeigt sich, dass gelöstes RGD die Zelladhäsion an Fibronektin inhibiert.
Dagegen steigert immobilisiertes RGD die Zelladhäsion. Neben RGD exisitieren für
die Zelladhäsion eine Reihe weiterer Zellerkennungsmotive, wie z.B „GFOGER“ in
Kollagen (Knight et al., 2000), die jedoch in der vorliegenden Arbeit nicht näher
betrachtet werden.
GRUNDLAGEN
31
2.3.2 Beeinflussung der Zelladhäsion
In der Zellbiologie werden häufig Oberflächen mit EZM-Proteinen beschichtet, um die
Zelladhäsion zu verstärken und Zellwachstum sowie Differenzierung zu
beschleunigen (Vohra et al., 1991; Kaehler et al., 1989).
Jedoch bringt die Verwendung von EZM-Proteinen etliche Nachteile mit sich (Hersel
et al., 2003; Weiß et al., 2001). Die EZM-Proteine müssen für den Gebrauch aus
anderen Organismen isoliert und aufgereinigt werden. Aufgrund dessen kann es zu
ungewünschten Immunantworten sowie zu einem erhöhten Infektionsrisiko kommen.
Darüber hinaus sind die EZM-Proteine durch ihren proteolytischen Abbau relativ
instabil und müssen somit für die Zellen immer wieder an der Oberfläche erneuert
werden. Des Weiteren ergeben sich Schwierigkeiten in der Proteinanbindung an
Oberflächen, da auf hydrophoben Oberflächen Proteine dazu neigen, die
Wechselwirkung mit hydrophoben Seitenketten zu maximieren, wodurch Proteine
teilweise denaturiert werden können und es somit zu einer undefinierten Präsentation
von Bindungsmotiven an der Oberfläche kommt. EZM-Proteine enthalten eine
Vielzahl von unterschiedlichen Zellerkennungsmotiven, wodurch eine selektive
Bindung eines bestimmten Zelladhäsionsrezeptors nicht gegeben ist. Dies kann für
viele Anwendungen von Nachteil sein. Aus den genannten Gründen sind EZM-
Proteine für eine Langzeitanwendung ungeeignet (Elbert und Hubbell, 1996).
Für viele zellbiologische Anwendungen eignen sich immobilisierte
Zellerkennungsmotive in Form von Peptiden besser als EZM-Proteine. Sie
gewährleisten eine höhere Stabilität bzgl. Sterilisation, Hitzebehandlung, pH-
Änderung sowie Lagerung. Die Charakterisierung solcher Peptide ist einfacher und
kostengünstiger. Über die Präsentation eines Zellerkennungsmotivs an der
Oberfläche kann selektiv ein bestimmter Zelltyp mit einem bestimmten
Zelladhäsionsrezeptor gebunden werden. Dabei kann die Peptidpackungsdichte an
der Oberfläche entsprechend dem jeweiligen Zelltyp eingestellt werden. Aufgrund der
geringen Peptidgröße können nahezu homogene Oberflächen mit einer hohen
Peptidpackungsdichte erzeugt werden. Zur Steigerung der Stabilität können
sogenannte Cyclo-Peptide an Oberflächen gekoppelt werden, die aufgrund Ihrer
Struktur eine noch längere Anwendung ermöglichen als lineare Peptide (Weiß et al.,
2001).
GRUNDLAGEN
32
Damit eine Zelle ein Zellerkennungsmotiv wie RGD als Ligand an seine
Integrinrezeptoren binden und damit die Adhäsion steigern kann, mussten im
Rahmen dieser Arbeit einige Faktoren für das Design eines linearen Peptids
beachtet werden. Pierschbacher und Rouslathi, 1984 entdeckten, dass das alleinige
RGD-Motiv für eine zellaffine und –spezifische Bindung nicht ausreichend ist,
sondern eine Flankierung des RGD-Motivs mit anderen Aminosäuren nötig ist. Als
geeignetes Zellerkennungsmotiv für Fibroblasten konnte aus der Literatur die
Sequenz CGGRGDS identifiziert werden (Hersel et al., 2003). Durch die im Cystein
vorhandene SH-Gruppe konnte das Peptid an Gold direkt immobilisiert werden.
Eine effiziente Methode, Zelladhäsion zu minimieren bzw. zu verhindern wird durch
die Oberflächenfunktionalisierung mit Polyethylenglykol (PEG) erreicht. Die protein –
und zellrepellenten Eigenschaften von PEG richten sich nach dessen
Molekulargewicht, der Polymerlänge und dem Polymerverzweigungsgrad. PEG ist in
seiner Eigenschaft wasserlöslich, inert, nicht immunogen oder toxisch. In wässriger
Lösung exponiert PEG die ungeladenen, hydrophilen Gruppen nach außen mit einer
hohen Beweglichkeit. Durch das annähernde Protein wird diese Beweglichkeit
deutlich reduziert. Das Protein erfährt dabei an der Polymerschicht eine osmotische
Abstoßung sowie eine konformationsbedingte repulsive Kraft, um die Beweglichkeit
der PEG-Ketten wiederherzustellen. Dadurch ist eine Proteinadsorption an PEG-
Oberflächen stark reduziert, wodurch auch Zellen an ihrer Adhäsion gehindert
werden können (Harris, 1992; Siegers et al., 2004).
2.3.3 Zellverhalten auf mikrostrukturierten Oberflächen
In der heutigen Zellbiologie werden mikrostrukturierte Oberflächen häufig für die
Untersuchung des zellulären Verhaltens an Oberflächen eingesetzt, da
mikrostrukturierte Oberflächen den zellulären Gegebenheiten in vivo eher
entsprechen als beschichtete Oberflächen (Xia und Whitesides, 1998). Mittels
mikrostrukturierten Oberflächen erhält man eine zweidimensionale Information über
zelluläres Verhalten. So beschrieb Mrksich et al., 1997 das strukturierte Aufbringen
von hydrophoben und hydrophilen Alkanthiolen auf Gold- und Silberoberflächen
unter Anwendung des so genannten „microcontact-printing“-Verfahrens (%CP). An
GRUNDLAGEN
33
diese Oberflächen wurde das EZM-Protein Fibronektin adsorbiert, welches
ausschließlich auf den hydrophoben Alkanthiolbereichen gebunden hat, da die
hydrophilen Bereiche proteinrepellierend waren. Dadurch konnte ein Kontrast
zwischen zelladhäsiven und zellrepellierenden Bereichen erzeugt werden. Die auf
diesem strukturierten Substrat kultivierten Zellen adhärierten ausschließlich auf den
Fibronektinbereichen und passten deren Zellkörper der unterschiedlichen
Mikrostruktur an.
Neben Kontrolle der Zellgröße und Zellform zeigte Jungbauer et al., 2004, dass über
mikrostrukturierte Oberflächen genetisch modifizierte Zellen in ihre ursprüngliche
Morphologie (wildtyp) zurückgeführt werden können.
Das %CP-Verfahren stellt ein nicht-photolithographisches Verfahren dar, bei dem ein
strukturiertes Elastomer (Stempel) mit einer Substanz benetzt wird und dessen
Struktur als Negativ auf eine Oberfläche durch Andrücken des Stempels übertragen
wird (Kumar und Whitesides, 1993). Die Strukturierung des Elastomer erfolgt über
einen strukturierten Silizium-Wafer, welcher vorher lithographisch strukturiert wurde.
Dieses Verfahren ist im Vergleich zu photolithografischen Verfahren einfach in der
Durchführung, kostengünstig und kann auf unterschiedlichen Substraten (Glas,
Silber, Silizium, Gold) durchgeführt werden. Als elastomeres Material kommt
Polydimethylsiloxan (PDMS) zum Einsatz, welches sich durch Stabilität, optische
Transparenz, Elastizität und hohe geometrische Genauigkeit bis in den sub-%m-
Bereich auszeichnet (Xia und Whitesides, 1998).
Im Rahmen dieser Arbeit sollen strukturierte, thermoresponsive Oberflächen mittels
%CP hergestellt werden, um über die Oberflächenschaltbarkeit das zelluläre
Adhäsions- und Migrationsverhalten zu kontrollieren.
2.4 Mikrofluidische Systeme für zelluläre Anwendungen
Mikrofluidische Systeme bieten in der heutigen biomedizinischen Forschung ein
breites Anwendungsspektrum, um mit kleinen Reaktionsvolumina (10-9 bis 10-18 Liter)
schnellere Analysezeiten sowie höhere Effizienz für parallelablaufende Reaktionen
zu erzielen (Beebe et al., 2002). Aufgrund der Miniaturisierung können ganze
Laboratorien in einen Einzelchip „Lab on a chip“ integriert werden, wodurch eine
GRUNDLAGEN
34
kostengünstige Anwendung möglich wird (Figeys und Pinto, 2000). Typische
Kanalgeometrien mikrofluidischer Systeme liegen in einem Größenbereich von 10 –
100 %m (Whitesides, 2006). Einen Einsatz finden diese Systeme als DNA-Chip für
PCR-Reaktionen (Shoffner et al., 1996; Cheng et al., 1996), als
Kapillarelektrophorese-Chip zur Auftrennung von Proteinen und DNA (Duffy et al.,
1998), als Enzymchip für Enzymkinetikuntersuchungen (Moser et al., 1997) sowie als
Immunoassay-System für high-troughput screening (HTS) mittels Antikörper-Antigen-
Detektion (Bernard et al., 2001).
Die zelluläre Analyse in mikrofluidischen Systemen hat an großer Bedeutung
gewonnen, da neben der Systemminiaturisierung auch eine geringere mechanische
Belastung von Zellen aufgrund der laminaren Strömung in mikrofluidischen
Systemen gegeben ist (Sia und Whitesides, 2003). Von besonderem Interesse sind
mikrofluidische Zytometriesysteme, welche Partikelquantifizierungen bis zu 1 %m
Durchmesser ermöglichen (Schrum et al., 1999). Zell-basierte Biosensoren sind für
toxikologische Fragestellungen relevant, bei denen prokaryotische und eukaryotische
Zellen als Sensor für Toxindetektion sowie physiologische Analysen eingesetzt
werden (Vo-Dinh et al., 2001). Des Weiteren finden mikrofluidische Systeme
häufigen Einsatz in der Kultivierung eukaryotischer Zellen. In solchen Systemen kann
die Mikroumgebung von Zellen sowie die entsprechende Zellzahl eingestellt werden,
wodurch die Untersuchung des individuellen Einzelzellverhaltens erleichtert wird
(Inoue et al., 2001). Li Jeon et al., 2002 erzeugten in einem mikrofluidischen System
stabile Cytokin-Gradienten, mit denen die gerichtete Migration von Neutrophilen
induziert wurde. Neben der Miniaturisierung dieser Systeme ist ein großer Vorteil,
dass kultivierte Zellen in der Mikroumgebung eine andere Wachstumscharakteristik
zeigen als in der Makroumgebung (Zellkulturschale) und schon bei viel geringeren
Zellzahlen proliferieren können (Raty et al., 2001; Walker et al., 2002).
Als Materialien für mikrofluidische Systeme werden in der heutigen Zeit Glas und
Silizium eingesetzt. Diese stellen sich aber häufig als ungeeignet heraus, da die
Herstellung von mikrofluidischen Systemen mit solchen Materialien für eine
Laboranwendung aufwendig und teuer ist. Deshalb kommen nun seit mehreren
Jahren polymere Materialien wie z.B. PMMA (Polymethylmethacyrlat), PTFE
(Polytetrafluorethylen) oder PDMS (Polydimethylsiloxan) zum Einsatz, die etliche
Vorteile gegenüber Glas und Silizium für biologische Untersuchungen bieten
GRUNDLAGEN
35
(Ng et al., 2002; Becker und Locascio, 2002). Besonders PDMS findet als polymeres
Material häufigen Einsatz in mikrofluidischen Systemen. Es ist ein kostengünstiges
Material, flexibel und optisch transparent (bis 230 nm), wodurch die Mikroskopie
deutlich erleichtert wird. Zudem ist es gasdurchlässig, nicht toxisch für Zellen und
wasserundurchlässig (Sia und Whitesides, 2003). PDMS setzt sich aus
wiederholenden Einheiten von –OSi(CH3)2- zusammen. Die hydrophobe Eigenschaft
von PDMS ist auf die CH3-Gruppen zurückzuführen. Diese Eigenschaft hat für
protein– oder zellbasierende Untersuchungen den Vorteil, dass eine unspezifische
Protein –und Zelladsorption an PDMS auf ein Minimum reduziert ist, wodurch eine
mögliche Fehlerquelle bei vielen Untersuchungen vermieden werden kann.
Ein besonderer Vorteil von PDMS liegt in der einfachen Herstellung, welche unter
Standardlaborbedingungen durchgeführt werden kann. Voraussetzung für die
Abformung eines PDMS-Mikrokanals ist der Silizium-Master (Si-Master). Dieser wird
über ein Standard-Photolithographie-Verfahren erzeugt, welches als kommerzielle
Dienstleistung angeboten wird. Die gewünschte Mikrokanalstruktur wird über ein
CAD-Programm (computer aided design) gezeichnet und auf ein Transparent
gedruckt, welches als Photomaske auf einen mit Photolack beschichtetem
Siliziumwafer aufgebracht wird. Mittels UV-Photolitographie wird dann die
Mikrostruktur entwickelt und nicht ausgehärtete Komponenten entfernt. Der
strukturierte Si-Master kann nun für vielfache Abformung eines PDMS-Mikrokanals
verwendet werden. Dabei werden die flüssigen PDMS-Komponenten gemischt, auf
den strukturierten Si-Master gegossen und über Nacht in einem Ofen
auspolymerisiert. Die abgeformte, elastomere Mikrokanalstruktur zeichnet sich durch
eine hohe geometrische Genauigkeit aus (Sia und Whitesides, 2003).
Für eine mikrofluidische Nutzung muss der PDMS-Kanal mit einem Substrat
abgedeckt werden. Prinzipiell bieten sich hierfür zwei Möglichkeiten an. In dem
hydrophoben Zustand kann das PDMS adhäsiv und reversibel an Substrate wie
bspw. Goldoberflächen unter Ausnutzung der van-der-Waals-Kräfte gekoppelt
werden. Durch Austausch des jeweiligen Substrats kann die PDMS-Kanalstruktur
mehrmals verwendet werden. Für eine irreversible Kopplung des PDMS an ein
Substrat muss das zweite Substrat ein Si-basiertes Material wie bspw. Glas sein und
das PDMS oberflächenaktiviert werden. Die Oberflächenaktivierung wird
üblicherweise in einem Sauerstoffplasma durchgeführt, wodurch es zu einer
kurzzeitigen Hydrophilizitätszunahme aufgrund der Bildung von Silanolgruppen
GRUNDLAGEN
36
(Si-OH) an der PDMS-Oberfläche kommt. An das Si-basierte Material wird das
oberflächenaktivierte PDMS kontaktiert und durch Ausbildung von O-Si-O-Gruppen
irreversibel gekoppelt (Sia und Whitesides, 2003).
In der vorliegenden Arbeit wurde mit dem mikrofluidischen PDMS-Systems MicCell™
(Gesim GmbH, Deutschland) gearbeitet, da es einige Vorteile gegenüber anderen
mikrofluidischen Systemen bietet. Beispielsweise ermöglicht es ein individuelles
Kanaldesign, beschichtbare und austauschbare Substrate, eine mehrmalige
Verwendbarkeit des Mikrokanals und ist zudem für die hochauflösende Mikroskopie
geeignet. Abbildung 2.7 soll den Aufbau eines solchen mikrofluidischen Systems
veranschaulichen. Der experimentelle Aufbau dazu ist in dem Kapitel „Material und
Methoden“ näher beschrieben.
Abbildung 2.7: MicCell™-System (Gesim GmbH, Deutschland) als mikrofluidisches System. Auf
einer PMMA-Trägerplatte ist das PDMS-Substrat mit der mikrofluidischen Kanalstruktur aufgebracht.
Der mikrofluidische Kanal wird über ein 22 x 22 mm Deckglas abgedeckt. Das Deckglas ist
austauschbar und kann beliebig durch andere Substrate ausgetauscht werden.
Diverse Anwendungen wie bspw. die mikrofluidische Integration eines optischen
„Zellstretchers“ zur Zellcharakterisierung, Einzelmolekülanalyse mittels FCS
(Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie) sowie die Erzeugung von
Konzentrationsgradienten verdeutlichen die vielfältigen Einsatzbereiche des
MicCell™-Systems (Gast et al., 2006).
37
3. Material und Methoden
3.1 Zellkultur
Die in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien wurden in DMEM/ HEPES ohne Pyruvat
(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland), 10% FKS, 2 mM L-Glutamin, 1%
Penicillin/ Streptomycin (alles Biochrom, Berlin, Deutschland) bei 37°C und 5% CO2
in einem Brutschrank (Binder, Tuttlingen, Deutschland) kultiviert. Die 80-90%ige
konfluente Zellschicht wurde alle zwei Tage umgesetzt. Dazu wurden die Zellen
zweimal mittels PBS ohne Ca2+/Mg2+ gewaschen und anschließend mittels Trypsin /
EDTA (Biochrom, Berlin, Deutschland) bei 25°C passagiert. Hierbei variierten die
Trypsinierungsbedingungen entsprechend der Substrathaftungsstärke der jeweiligen
Zelllinien (Tabelle 3.1). Für die Einzelzellexperimente wurden die Zellen auf 22x22
mm Goldsubstraten soweit nicht anders angegeben in einer Konzentration von 2x104
Zellen/cm2 ausgesät. Alle Zelllinien wurden ausschließlich von Passage 1 – 30 für
Versuche kultiviert, um eine mögliche, signifikante Änderung im Adhäsionsverhalten
bei älteren Passagen zu verhindern.
Tabelle 3.1: Verwendete Zelllinien mit deren charakteristischen Trypsinierungsbedingungen.
3.2 Zellfixierung und Färbung mit Fluoreszenzstoffen
Durch die Fixierung werden die intrazellulären Proteine immobilisiert und somit die
Proteinanordnung erhalten. Für die Fixierung der Zellen in dem Kulturgefäß wurden
die Zellen in ein Eisbad gestellt, das Medium entfernt und die Zellen jeweils zweimal
5 Minuten mit 4 °C kaltem PBS (Ca2+/ Mg2+) (Biochrom, Berlin, Deutschland)
gewaschen. Ausgehend von einer 8 %-igen Paraformaldehyd-Stammlösung (Sigma,
Taufkirchen, Deutschland) in PBS (Ca2+/ Mg2+) wurde mit 2 ml einer vorgekühlten
4 %-igen Paraformaldehyd-Lösung 20 Minuten auf Eis fixiert.
MATERIAL UND METHODEN
38
Anschließend wurden die Zellen jeweils zweimal 5 Minuten mit 4 °C kaltem PBS auf
Eis gewaschen, um vorhandenes Paraformaldehyd zu entfernen.
Bei Concanavalin A (ConA) handelt es sich um ein Lektin aus der Schwertbohne mit
104 kDa, welches in neutralen und alkalischen Lösungen vier Bindungsstellen für
Saccharide besitzt. ConA kann an die äußere Zellmembran (Glykokalix) sowie an
extrazelluläre Matrixkomponenten (Fibronektin, Kollagen, etc.) binden, welche
Kohlenhydratanteile beinhalten (Derewenda et al., 1989). Als fluorophore Gruppe
besitzt das verwendete ConA eine Alexa Fluor 594 Markierung. Dieser Farbstoff
adsorbiert bei 590 nm maximal, wobei die maximale Emission im roten Bereich bei
617 nm liegt. Die entsprechende Probe wurde mit einer Arbeitskonzentration von 15
µg / ml für 30 Minuten bei 4 °C angefärbt. Danach wurde die Färbelösung entfernt
und zweimal mit PBS (Ca2+/ Mg2+) gewaschen.
3.3 Oberflächenpräparation und Oberflächenanalytik
3.3.1 Oberflächenpräparation
3.3.1.1 Reinigung von Glas- und PDMS-Oberflächen
Für die Reinigung der Glas- und PDMS-Oberflächen wurden für die jeweilige
Waschlösung separate Glasgefäße gereinigt. Die Reinigung dieser Gefäße und
Oberflächen wurde wie folgt duchgeführt: In einer 2 %-igen Hellmanex® II-Lösung
(Hellma, Müllheim, Deutschland) wurden entsprechende Gegenstände für 20
Minuten in einem Ultraschallbad gereinigt. Danach erfolgte eine 20x Waschung der
Gegenstände mit dH2O (Millipore, Deutschland), um Hellmanex®-Rückstände zu
entfernen. Anschließend wurden die gereinigten Gegenstände in dH2O für weitere 20
Minuten im Ultraschallbad behandelt. Es folgte eine weitere 20x Waschung der
Gegenstände in dH2O. Abschließend wurden die Gegenstände in 100 % EtOH
(LiChrosolv®, Merck, Darmstadt, Deutschland) für 10 Minuten im Ultraschallbad
behandelt und für den weiteren Gebrauch in N2 getrocknet.
MATERIAL UND METHODEN
39
3.3.1.2 Reinigung von Goldoberflächen
Die hier verwendeten Goldoberflächen wurden von der Firma GeSiM (Dresden,
Deutschland) bezogen. Auf ein 22 x 22 x 0,17 mm Dünnglas wurde 20 nm Titan als
Haftvermittler für die 80 nm Goldschicht aufgebracht. Um eine hohe makroskopische
Sauberkeit der Goldoberfläche zu gewährleisten, wurden diese vor jeder Adsorption
in N2 von Staubpartikeln befreit und anschließend in ein gereinigtes Becherglas mit
10 ml Piranha-Lösung überführt. Das Becherglas wurde in einem Eisbad positioniert,
um mögliche Wärmeentwicklung während des Ansetzens der Piranha-Lösung zu
puffern. Die Piranha-Lösung setzt sich aus einem Teil H2O2 (pro analysis 30 %,
Merck, Darmstadt, Deutschland) und zwei Teilen konzentrierter Schwefelsäure (95-
98 %) zusammen. Die Reinigung der Goldoberflächen in Piranha erfolgte für 30
Minuten bei RT. Piranha wurde nach der täglichen Verwendung mit NaOH (Sigma-
Aldrich, Deutschland) neutralisiert. Für die Neutralisierung von 10 ml Piranha wurden
ca. 10 g NaOH (fest) durch langsame Zugabe eingesetzt. Hierbei war auf zu rasche
Gasentwicklung und Aufschäumen der Lösung zu achten. Die gereinigten
Goldoberflächen wurden von der Piranha-Lösung zügig in ein Becherglas mit dH2O.
Zur Entfernung der Piranha-Rückstände von der Goldoberfläche wurde diese 10x mit
dH2O gespült. Für den weiteren Gebrauch der gereinigten Goldoberflächen wurde
darauf geachtet, diese immer in Lösung zu lagern, um ungewollte Adsorbate aus der
Luft zu vermeiden.
3.3.1.3 Mikrostrukturierung von Oberflächen
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Mikrostrukturierung von Oberflächen
basiert auf dem sogenannten „microcontact printing“ (!CP) nach Xia und Whitesides,
1998.
PDMS-Abformung
Die zur Mikrostrukturierung benötigten strukturierten PDMS-Stempel wurden nach
folgendem Protokoll abgeformt (Abbildung 3.1 A):
PDMS (Sylgard 184, Dow Corning, Michigan, USA) wurde entsprechend der Her-
stellerangaben im Verhätltnis 10:1 gemischt und 2 g pro Stempel angesetzt. Hierbei
wurde auf eine intensive Durchmischung beider Komponenten für eine spätere
optimale Polymerisation geachtet. Aufgrund der bei der Durchmischung auftretenden
MATERIAL UND METHODEN
40
Luftblasen im flüssigen PDMS, wurde dieses in einen Exicator überführt und die
Luftblasen über ein Vakuum für 40 Minuten entfernt.
Der strukturierte Master (Gesim GmbH, Deutschland) wurde in die aus Messing
gefertigte Abgußform gelegt und das luftblasenfreie PDMS in die Abgußform
überführt. Zur einfachen Handhabung des PDMS-Stempels wurde von einem
Objektträger (Roth, Deutschland) ein Glasstück in der Größe 30 x 30 mm
zugeschnitten und im O2-Plasma bei Stufe „High“ für 2 Minuten (Harrick Plasma
Cleaner, PDC-002, Laseranalytik Starus GmbH, Pfungstadt, Germany) aktiviert, um
die Adhäsion zwischen PDMS und Glasoberfläche zu erhöhen. Anschließend wurde
das Glas oben auf die Abgußform aufgelegt, so dass das Glas Kontakt mit der
Rückseite dem flüssigen PDMS hat. Die Abgussform (Gesim GmbH Deutschland) mit
Si-Master, PDMS und Objektträger wurde bei 60°C über Nacht im Trockenschrank
auspolymerisiert. Nach der Polymerisation wurde der PDMS-Stempel vorsichtig aus
der Form gelöst. Der abgeformte Stempel in 100 % EtOH gelagert und vor jeder
Benutzung entsprechend gereinigt (siehe Kapitel 3.3.1.1).
Strukturierung von Glasoberflächen
Der gereinigte Stempel wurde mittels O2-Plasma oberflächenaktiviert, um die
Hydrophilizität des hydrophoben PDMS für die Benetzung von Proteinen in wässriger
Lösung zu steigern (Abbildung 3.1 A). Hierbei greift das O2-Plasma die Si-C-
Bindungen im PDMS an, die Methylgruppen trennen sich und erhöhen so den Anteil
von Sauerstoffgruppen an der PDMS-Oberfläche. Die erzeugte Hydrophilizität nimmt
u.a. aufgrund der Diffusion der polarisierten Gruppen in die Hauptmasse des
Polymers (Morra et al., 1990) über die Zeit ab.
MATERIAL UND METHODEN
41
Abbildung 3.1: Prinzip der Mikrostrukturierung von Oberflächen mittels Stempelvorrichtung.
(A) Ablauf der Strukturierung von Oberflächen: Auf den mikrostrukturierten Si-Master wird flüssiges
PDMS auspolymerisiert. Der mikrostrukturierte PDMS-Stempel wird mittels O2-Plasma hydrophilisiert,
um eine gleichmäßige Benetzung der zu stempelnden Substanz zu ermöglichen. Die Substanz wird
nach erfolgter Benetzung abgenommen und der Stempel in N2 getrocknet. Danach wird auf die
entsprechende Oberfläche die jeweilige Substanz mittels einer Stempelvorrichtung gestempelt. (B)
Prinzip der Stempelvorrichtung: An variable Gewichtsplatten wird über ein doppelseitiges Klebeband
der Glas/PDMS-Stempel befestigt. Der PDMS-Stempel wird dann über zwei parallele Stege in Kontakt
mit dem Substrat gebracht, wodurch ein Verrutschen des Stempels auf dem Substrat verhindert wird.
Ein mögliches Verrutschen des Substrates konnte durch Klebebandfixierung der Substratenden mit
dem Aluminiumblock vermieden werden.
Der oberflächenaktivierte Stempel wurde dann mit 200 !l entsprechender
Substanzen (Tabelle 3.2) benetzt und für 30 Minuten in einer Feuchtigkeitsbox
inkubiert, um ein Austrocknen des PDMS-Substrats zu vermeiden.
Tabelle 3.2: Verwendete Substanzen für die Strukturierung von Glasoberflächen.
MATERIAL UND METHODEN
42
Anschließend wurde die Stempel-Lösung wieder abgenommen, die Stempel mit N2
getrocknet und umgehend auf gereinigte Glasoberflächen mittels einer konstruierten
Stempelvorrichtung (Abbildung 3.1 B) für 30 Minuten aufgebracht. Die
überstehenden Enden des Glassubstrates wurden mittels Klebeband auf dem
Aluminiumblock der Stempelvorrichtung fixiert, um ein Verrutschen während des
Stempelprozesses zu vermeiden. Die Stempelvorrichtung wurde hinsichtlich eines
geeigneten Anpressdruck durch Variation der austauschbaren Aluminiumgewichte
optimiert, um einen möglichst homogenen Übertrag von dem PDMS-Stempel auf das
Substrat zu erreichen.
Die Berechnung des Anpressdrucks erfolgte nach folgender Formel:
Anpressdruck = (eingesetztes Gewicht * 9,81 m/s") / Stempelfläche (3)
In dieser Berechnung wurde das Stempeleigengewicht sowie die geringe Kraft beim
Aufsetzen des Stempels auf das Substrat vernachlässigt.
Als Kontrolle für den jeweiligen Anpressdruck diente das mikroskopische
Fluoreszenzbild der Stempelstruktur, in welchen ungewollte Stempelstrukturen
erkannt werden konnten. Abschließend wurde der Stempel von der Goldoberfläche
vorsichtig nach oben hin entfernt, um ein weiteres Verrutschen der gestempelten
Struktur auf dem Substrat zu vermeiden.
Strukturierung von Goldoberflächen
Die Strukturierung von Goldoberflächen wurde nach selbigem Protokoll durchgeführt
wie die Strukturierung von Glasoberflächen. Es wurde darauf geachtet, dass die
gereinigte bzw. funktionalisierte Goldoberfläche erst kurz vor der Stempelung aus
dem Wassergefäß entnommen und getrocknet wurde, um eine zu lange Exposition
an Luft mit daraus resultierender Oberflächenverschmutzung zu vermeiden. Die
Stempelverweildauer auf der Oberfläche betrug ebenfalls 30 Minuten. Für einen
möglichst sauberen Stempelübertrag wurde der Stempel wie schon erwähnt
vorsichtig von der Goldoberfläche entfernt.
MATERIAL UND METHODEN
43
3.3.1.4 Chemisorption von Thiolen auf Goldoberflächen
Die gereinigte Goldoberfläche (siehe Kapitel 3.3.1.2) wurde aus dH2O entnommen
und unmittelbar in die jeweilige Thiollösung (Tabelle 3.3) überführt. Hierbei wurden
ausschließlich Glasgefäße verwendet, um die Adsorption von Weichmacheranteilen
aus Plastikgefäßen an der Goldoberfläche zu vermeiden, welche die spezifische
Thioladsorption verhindern können.
Für die Coadsorption (P19/PG, P19/RGD) wurden die Thiole separat eingewogen
und gelöst. Anschließend wurden die jeweiligen Thiollösungen zusammengeführt
und die gereinigte Goldoberfläche in die Thiollösung überführt. Die Adsorptionszeit
betrug soweit nicht anders angegeben 3h bei RT ohne Schütteln. Während der
Adsorption wurde der jeweilige Adsorptionsansatz in einer Box mit Tüchern gelagert,
welche mit dem reinen Lösungsmittel des gelösten Thiols benetzt wurden, um ein
Austrocknen der Thiollösung zu vermeiden. Bis auf das Peptid CGGRGDS wurden
alle verwendeten Polymere (Tabelle 1.3) in 100% EtOH gelöst. Das Peptid wurde in
2 : 1 dH2O : EtOH gelöst, da dieses Mischungsverhältnis die optimale Löslichkeit des
Peptids gewährleistete.
Tabelle 3.3: Verwendete Thiole und deren optimierte Arbeitskonzentration für die
Funktionalisierung von Goldoberflächen.
Nach der dreistündigen Adsorption wurde die Thiollösung entfernt und die
Oberfläche mit dem eingesetzten Lösungsmittel dreimal gewaschen. Abschließend
wurde das Lösungsmittel für eine 1h auf der Oberfläche belassen, um unspezifische
Molekülbindungen zu entfernen. Für den weiteren Gebrauch wurde die
funktionalisierte Goldoberfläche aus der jeweiligen Lösung entnommen und mittels
N2 getrocknet.
MATERIAL UND METHODEN
44
3.3.2 Kontaktwinkelmessung
Der dynamische Kontaktwinkel wurde mittels des Kontaktwinkelmessgeräts G10 der
Firma Krüss (Krüss Surface Science, Deutschland) auf einem unbehandelten
Goldsubstrat, auf einem gereinigten Goldsubstrat sowie auf beschichtetem
Goldsubstrat in einem Temperaturbereich von 20 °C bis 45 °C ermittelt. Die
Temperatur am Substrat wurde über eine Mikroskopheizplatte MS 100 der Firma
Linkam (Linkam Scientific Instruments, Großbritannien) eingestellt. Zur Vermeidung
der Substratverunreinigung aufgrund von Luftzirkulation wurde ein Kunststoffgestell
aus Makrolon (Bayer Material Science AG, Deutschland) an dem Probentisch
aufgestellt. Die Messung des dynamischen Kontaktwinkels erfolgte wie folgt:
Bei der Kontaktwinkelmessung des Vorzugswinkels wurde mittels einer
Mikroliterspritze ein Tropfen von dH20 auf das entsprechende Substrat aufgebracht.
Dabei verbleibt die Kanüle der Mikroliterspritze im Tropfen. Es wurde darauf
geachtet, dass sich die Kanüle immer in der Mitte des Tropfens befindet, da bei
ungleichmäßiger Tropfenausbreitung die Messwerte nicht repräsentativ sind. Durch
Erhöhung des Tropfenvolumens breitet sich der Tropfen auf der Oberfläche aus.
Während seiner fortschreitenden Bewegung wurde der Vorzugswinkel bestimmt,
welcher über ein Okular am Mikroskop betrachtet wurde. In dem Okular befindet sich
ein bewegliches Fadenkreuz mit einstellbarem Winkel. Ein Schenkel des
Fadenkreuzes wurde mit der Grenzfläche Substrat/Tropfen zur Deckung gebracht,
der andere Schenkel wurde als Tangente an das Tropfenprofil angelegt. Der Winkel
zwischen den beiden Schenkeln wurde als Vorzugswinkel abgelesen.
Auf jedem Substrat wurden fünf Messungen an unterschiedlichen Stellen gemessen
und die Ergebnisse gemittelt. Als Fehlerindikator wurde die Standardabweichung des
Mittelwerts (SEM) eingeführt, welcher Auskunft über die Reproduzierbarkeit der
Messungen gibt. Dieser wurde für jede Probe berechnet und ist definiert als:
SEM = s / (n)1/2 (4)
wobei s die Standardabweichung angibt, n definiert den Stichprobenumfang.
MATERIAL UND METHODEN
45
3.4. Mikrofluidik
In dieser Arbeit wurde mit dem mikrofluidischen System „MicCell™“ (GeSiM GmbH,
Deutschland) kontrollierte Einzelzellablösungsversuche auf schaltbaren Oberflächen
durchgeführt. Dieses System zeichnet sich durch die austauschbaren Substrate aus,
welche in das mikrofluidische System der Anforderung entsprechend integriert
werden können.
3.4.1 PDMS-Abformung
Der mikrofluidische Kanal wird bei diesem System über PDMS-Abformung erzeugt.
Hierbei wurde das PDMS wie in Kapitel 3.3.1.3 beschrieben angesetzt. Der
strukturierte Si-Master des Längskanals wurde in eine Teflonabgussstation (GeSiM
GmbH, Deutschland) eingelegt, welche mit der PMMA-Kanalträgerplatte über zwei
Halteschrauben fixiert wurde. Zudem wurden alle vier Zugänge in der PMMA-Platte
separat verschraubt, um ein Verstopfen des PDMS in den benötigten Zugängen zu
vermeiden. Das blasenfreie PDMS (2ml) wurde in eine Spritze mit spezieller
Injektionskanüle überführt, welche in eine separate Öffnung in der PMMA-Platte
eingeführt und das PDMS zwischen PMMA und Si-Master injiziert wurde. Dabei
wurde auf einen gleichmäßigen Druck an der Injektionsspritze geachtet, um eine
eventuelle Luftblasenbildung zu vermeiden, welche zu einer verminderten Adhäsion
zwischen PDMS und Substrat führen kann. Das PDMS wurde in dieser Vorrichtung
bei 60°C über Nacht auspolymerisiert und am nächsten Tag für weitere 2 Stunden
bei 80°C inkubiert, um eine vollständige Polymerisation zu gewährleisten.
Abschließend wurden die vier Schrauben der Zugänge sowie die zwei
Haltungsschrauben von der PMMA-Platte entfernt und die PMMA-Platte mit dem
PDMS-Längskanale aus der Vorrichtung vorsichtig entnommen.
3.4.2 Zusammenbau des mikrofluidischen Systems
Die funktionalisierte Goldoberfläche wurde durch vorsichtigen manuellen Druck direkt
mit dem PDMS-Längskanal kontaktiert (Abbildung 3.2 A). Der Ein –und Ausgang des
Kanals wurde über Schrauben verschlossen, in welche die PTFE-Schläuche mit
entsprechenden Dichtungen (Upchurch Scientific, USA) eingebracht wurden. Der
Kanalausgang wurde über einen Schlauch, Schrauben und Dichtungen mit einem
Abfallbehälter verbunden, um überschüssiges Kanalvolumen zu sammeln (Abbildung
MATERIAL UND METHODEN
46
3.2 B). Der Schlauch am Kanaleingang verläuft zu einem manuell-justierbaren Ventil,
welches über entsprechende Schraube und Dichtung abgedichtet ist. Von diesem
Ventil läuft eine weitere Verbindung zu einem Abfallbehälter. Diese Verbindung dient
dazu, das mikrofluidische System frei von Luftblasen zu bekommen. Eine dritte
Verbindung verläuft von dem Ventil zu der Injektionsspritze (ILS GmbH, Stützerbach)
mit der jeweiligen Flüssigkeit. Die Kontrolle der Flußgeschwindigkeit in dem
mikrofluidischen System wurde über eine Spritzenpumpe SP 230WZ (World
Precision Instruments, Deutschland) realisiert.
Abbildung 3.2: Aufbau und Funktionsprinzip des mikrofluidischen Systems MicCell™. (A) Die
funktionalisierte Goldoberfläche wird in Kontakt mit dem PDMS-Kanal gebracht. Die Fixierung des
Kanals auf dem Substrat erfolgt über die Adhäsionskraft des PDMS. Dieses System wird dann in einer
Vorrichtung verschraubt, welche ein planares Aufliegen des mikrofluidischen Systems auf dem
Mikroskoptisch ermöglicht. (B) Das blasenfreie Befüllen des mikrofluidischen Längskanals erfolgt über
ein Ventil, welches die Zellsuspension in PTFE-Schläuchen zu dem Abfallbehälter umleitet. In einem
zweiten Schritt wird die Zellsuspension über das Ventil in den Längskanal eingeleitet. Überschüssiges
Suspensionsvolumen wird dann von dem Kanalausgang in einen Abfallbehälter gesammelt.
3.4.3 Zellkultivierung und Zellablösung im mikrofluidischen
System
Im mikrofluidischen System wurden für die Einzelzellablösungsexperimente auf den
schaltbaren Oberflächen L929 Mausfibroblasten als Modellsystem kultiviert.
Abweichend von der Medienzusammensetzung aus Tabelle 3.1 wurden diese Zellen
in RPMI 1640-Medium mit 25 mM HEPES, 10% FCS, 3.6 mM L-Glutamin und 1%
Gentamycin bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Hierbei betrug die Zellkonzentration
5x105 Zellen/cm2, da diese eine passende Zelldichte gewährleistete. Die
Passagierung der Zellen wurde wie in Kapitel 3.1 beschrieben durchgeführt.
MATERIAL UND METHODEN
47
Die Zellen wurden für 20 Stunden bei 37°C und 5% CO2 in dem mikrofluidischen
Kanal kultiviert. Für die Einzelzellablösungsexperimente wurde die Zellablösung über
die Temperaturreduktion auf 25°C für 30 Minuten induziert. Anschließend wurden die
abgerundeten Zellen unter definierten Flußgeschwindigkeiten aus dem Kanal
entfernt. Als Kontrollexperiment wurden kultivierte Zellen in dem mikrofluidischen
System mittels einer Mikroskoptischheizplatte Linkam MS100 (Linkam Scientific
Instruments, UK) auf 37°C gehalten, um die Funktionalität der schaltbaren
Oberfläche zu testen. Die Dokumentation und Auswertung erfolgte wie in Kapitel
3.5.1 beschrieben.
3.4.4 Berechnung der Zellumströmungsgeschwindigkeit im
rechteckigen mikrofluidischen Kanal
Alle Berechnungen der Zellumströmungsgeschwindigkeit wurden über das
Programm Mathematica 5.2 (Wolfram Research, Europa) durchgeführt. Für die
Berechnung wurden Parameter wie Kanalgeometrie, Zellmorphologie sowie
Zellgröße miteinbezogen. Die aus dem Ablöseversuch resultierenden
Zellmorphologien (ausgebreitet und abgerundet) wurden mittels geometrischen
Objekten für die Berechnung modeliert (Abbildung 3.3).
Abbildung 3.3: Flussprofil in einem mikrofluidischen Kanal im Bezug auf unterschiedliche
Zellmorphologien. Für die Berechnung der Zellumströmungs-geschwindigkeit in dem
mikrofluidischen Kanal wurden zwei Zellmorphologien (ausgebreitet, rund) mathematisch angenähert,
welche aus den Experimenten resultierten. Die geometrischen Parameter (Zellhöhe, Zellbreite)
wurden über 3D-Aufnahmen im Konfokalen Laser Scanning Mikroskop abgeleitet.
Dabei wurde die Morphologie der ausgebreiteten Zellen über eine Gaußsche
Querschnittsfläche (Höhe h = 4,5 !m, Breite 2r = 2! = 35 !m) als
rotationssysmmetrisch angenommen. Dagegen wurden runde Zellen über ein
MATERIAL UND METHODEN
48
spherisches Modell mit h = 15 !m, 2r = 20 !m abzüglich einer Segmenthöhe von r/2
betrachtet. Die geometrischen Parameter wurden aus Aufnahmen mit dem
Konfokalen Laser Scanning Mikroskop über einen 3D Stack in z-Richtung abgeleitet.
Zuerst wurde für die Berechnung der Zellumströmungsgeschwindigkeit uZelle die
mittlere Fließgeschwindigkeit
u
berechnet, welche über
AVu /
&
=
(5)
definiert ist (Spurk, 2003).
V
&
steht für die angelegte Flußrate über die Spritzenpumpe
und A bezeichnet die Querschnittsfläche des rechteckigen mikrofluidischen Kanals.
Darüber hinaus wurde in die Berechnung von uZelle ein Formfaktor
a
miteinbezogen,
welcher die lokale Fließgeschwindigkeit in x und y Richtung auf
u
bezieht.
urh
dxdyyxu
a
h r
r
*2
),(
0
! !
+
"
=
(6)
wobei h für die Zellhöhe und r für den Zellradius steht.
Abschließend wurde uZelle aus den bisher berechneten Faktoren wie folgt berechnet:
UZelle
ua *=
(7)
3.5 Mikroskopie
3.5.1 Durchlichtmikroskopie und Auswertung
Die Zellablösung auf den Polymeroberflächen wurde durch Temperaturschaltung von
37°C auf 25°C für 30 Minuten induziert und mittels Lichtmikroskop Leica DMIL
(Leica, Deutschland) über ein 10x/0,25 Objektiv im Phasenkontrastmodus
beobachtet. Die Dokumentation des Zellverhaltens über die Zeit erfolgte mittels
Kamera Nikon Digital Sight DS-L1 (Nikon, Deutschland), welche an das
Lichtmikroskop angeschlossen war. Die dokumentierten Bilder wurden mittels
Grauabgleich nachbearbeitet und der Kontrast für eine optimale Auswertung
angepasst. Die Zahl adhärenter und abgerundeter Zellen wurde manuell ausgezählt,
wobei Zellen mit uneindeutiger Morphologie und abgerundete Zellen bei 37°C nicht
berücksichtigt wurden. Als abgerundete Zellen bei 25°C wurden ausschließlich Zellen
mit einem Durchmesser bis zu 20 !m identifiziert und gezählt. Zellen, die oberhalb
dieses Größenbereichs lagen wurden als ausgebreitet betrachtet und gezählt.
MATERIAL UND METHODEN
49
3.5.2 Konfokale Laserscanning- Mikroskopie (CLSM)
Die fluoreszenzmarkierten Zellen auf dem angefärbten Substrat wurden mittels des
Konfokalen Laser Scanning Mikroskops LSM 510 (Zeiss, Jena, Deutschland)
mikroskopiert. Da die CLSM inzwischen zu den Standardtechniken gehört, wird die
Funktionsweise nicht näher beschrieben.
Als Objektiv wurde das 10x/ 0,3 Objektiv sowie das 40x/1,3 Öl DIC eingesetzt und
der Scanzoom nach Bedarf variiert. Die spezifische Anregung von 488 nm für
Streptavidin Alexa Fluor 488 sowie für die fluoreszenten Biotin-Beads erfolgte über
den Argonlaser (488 nm). Als Hauptfarbteiler (HFT) wurde 488 mit dem
Nebenfarbteiler (NFT) 490 eingesetzt.
Die spezifische Anregung von ConA erfolgte mittels eines Helium-Neon-Lasers bei
einer Anregungswellenlänge von 543 nm. Dabei wurde der Hauptfarbteiler HFT 405 /
488 / 543 mit dem NFT 545 verwendet. Die Pixelverweilzeit betrug 12 µs. Die Zellen
wurden übersteuert aufgenommen, um das strukturiert aufgebrachte Fibronektin
sowie die Migrationsrichtung der Zellen in Form von Zellspuren deutlich darstellen zu
können. Darüber hinaus wurden Aufnahmen im Reflexionsmodus mittels des
Argonlasers bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm durchgeführt, um eine
höhere strukturelle Auflösung der Zellmorphologie im Bezug auf das
Adhäsionsverhalten zu erhalten. Dabei wurde der Hauptfarbteiler HFT 488 mit dem
Nebenfarbteiler NFT 490 verwendet.
50
4. Ergebnisse
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von temperaturschaltbaren
Polymeroberflächen zur Kontrolle der Zell-Substrat-Adhäsion. Dazu wurden
PNIPAAm-basierte Copolymere mit Thiolfunktionalisierung an Goldoberflächen
gebunden. Die entwickelten Polymeroberflächen erwiesen sich als zellverträglich und
ermöglichten eine kontrollierte Ablösung adhärenter, lebender Zellen durch milde
Temperaturänderung. Modifikationen an diesen schaltbaren Oberflächen
ermöglichten eine Anpassung an das stark unterschiedliche Adhäsionsverhalten
verschiedener Zellarten. Die Anwendbarkeit der schaltbaren Polymeroberflächen
konnte sowohl in mikrofluidischen Systemen als auch auf mikrostrukturierten
Oberflächen gezeigt werden.
4.1 Funktion und Zellverträglichkeit von P15-Au
LCST-Bestimmung von PNIPAAm-PEG15%-COOH
Die LCST (lower critical solution temperature) gibt die Temperatur an, bei der ein
Polymer von einem hydratisierten Zustand (<LCST, geringe Partikelgröße) in einen
dehydratisierten Zustand (>LCST, große Partikelgröße) wechselt. Während der
Synthese von PNIPAAm-PEG15%-SH (P15) entstand die Polymervorstufe
PNIPAAm-PEG15%-COOH, die sich lediglich durch die Endgruppe von P15
unterscheidet. Da man davon ausgehen konnte, dass die Endgruppe keinen Einfluss
auf die LCST des jeweiligen Polymers hat, konnte über die Vorstufe die LCST von
P15 bestimmt werden, ohne einen Einfluss der chemisch labilen SH-Gruppe auf die
Messung befürchten zu müssen. Abbildung 4.1 zeigt die Daten der LCST-
Bestimmung für PNIPAAm-PEG15%-COOH. Die LCST lag zwischen 35 und 36 °C,
was sich anhand der signifikanten Partikelvergrößerung von PNIPAAm-PEG15%-
COOH in Lösung bei Temperaturänderung von 35 °C auf 36 °C erkennen lässt.
Diese Messungen sowie die Synthese wurde von unserem Projektpartner Fraunhofer
IAP, Potsdam (Dr. A.Lieske) durchgeführt.
ERGEBNISSE
51
Abbildung 4.1: Ermittlung der charakteristischen LCST (lower critical solution temperature) des
PNIPAAm-PEG15%-COOH Copolymers. PNIPAAm-PEG(15%)-COOH (!) zeigt eine LCST
zwischen 35°C und 36°C.
Kontaktwinkelmessung auf P15-Au
P15 wurde adsorptiv an eine Goldfläche angebunden (siehe Kapitel 3.3.1.4), woraus
die schaltbare Polymeroberfläche P15-Au entstand. Ihre Schaltbarkeit wurde
zunächst über Kontaktwinkelmessungen charakterisiert (Abbildung 4.2). Die Daten
dieser Messung zeigten eine Kontaktwinkeländerung mit der Temperatur von 54° bei
20 °C bis 65° bei 45 °C. Die Änderung der Benetzungseigenschaften von P15-Au
entspricht dem Übergang von einem hydratisierten Zustand unterhalb der LCST bei
20 °C hin zu einem dehydratisierten Zustand oberhalb der LCST bei 45 °C (vgl.
Abbildung 4.1). Auf unbehandelter Goldoberfläche blieb der Kontaktwinkel bei
Temperaturänderung nahezu konstant bei ca. 70°.
ERGEBNISSE
52
Abbildung 4.2: Fortschreitkontaktwinkel von Wasser auf P15-Au (!) und gereinigtem Gold (!)
als Funktion der Temperatur. Die Änderung des Kontaktwinkels bei P15-Au über die Temperatur
basiert auf dem Wechsel von einem hydratisierten Zustand bei 20 °C zu einem dehydratisierten
Zustand bei 37 °C. Eine gereinigte, nicht beschichtete Goldoberfläche zeigt keine Änderung der
Benetzungseigenschaften bei Temperaturänderung. Die Daten geben einen Mittelwert von jeweils fünf
Messungen an. Die Standardabweichungen des Mittelwerts wurden nicht grafisch dargestellt, da sie
nie die Symbolgröße überschritten. Rohdaten: siehe Tabelle A1 im Anhang.
Zellkultivierung und Zellablösung auf P15-Au
Zur Charakterisierung der Zellverträglichkeit sowie der Schaltbarkeit
(Schaltverhalten) der Polymeroberfläche wurden darauf L929 Mausfibroblasten
kultiviert (Abbildung 4.3). Das Schaltverhalten der Polymeroberfläche wurde mit dem
damit verbundenen Zellverhalten korreliert.
Die Zellen zeigten auf P15-Au nach einer Kultivierungszeit von 2 Tagen bei 37 °C ein
Adhäsions- und Ausbreitungsverhalten vergleichbar zu kommerziell erhältlichen
Polystyren-Zellkultursubstraten (Abbildung 4.3 A). Auch ein beobachtbarer
Unterschied in der Zellmorphologie konnte nicht festgestellt werden. Auf beiden
Oberflächen ließen sich L929 Zellen gut kultivieren. Dabei zeigten sich sowohl
vereinzelte Zellen wie auch größere Zellgruppierungen.
ERGEBNISSE
53
Abbildung 4.3: Zellverträglichkeit und Schaltbarkeit von P15-Au. L929-Zellablösung auf P15-Au
ausgelöst durch Temperaturänderung von 37°C auf 25°C zu unterschiedlichen Zeitpunkten. (A)
Zelladhäsion und Zellausbreitung bei 37°C auf der Polymeroberfläche. (B) Nach 15 minütiger
Inkubation bei 25°C beginnen sich die Zellgruppierungen (gepunktete und gestrichelte Bereiche) und
die Einzelzellen (schwarze Pfeile) zusammenzuziehen und sich abzurunden. (C) Nach 25 minütiger
Inkubation bei 25°C wird die Zellgruppierung (gepunkteter Bereich) mit der benachbarten
Zellgruppierung (gestrichelter Bereich) von der Polymeroberfläche gezogen. (D) Nach 35 Minuten bei
25°C sind die Zellgruppierungen komplett von der Polymeroberfläche gelöst. Abgerundete
Einzelzellen verbleiben auf der Polymeroberfläche. Maßstab: 100 "m.
Nach Temperaturänderung von 37 °C auf 25 °C zeigten sowohl die
Zellgruppierungen (gepunktete, gestrichelte Linie - Abbildung 4.3 B) als auch die
Einzelzellen (schwarze Pfeile - Abbildung 4.3 B) eine langsame Kontraktion der
Zellkörper nach 15 Minuten. Dieses Zellverhalten deutet auf die erwartete
Konformationsänderung der Polymeroberfläche hin. Nach 25 Minuten begannen
beide Zellgruppierungen sich vom Substrat abzulösen, wobei Zell-Zellverbindungen
erhalten blieben (Abbildung 4.3 C). Nach weiteren 10 Minuten lösten sich die
Zellgruppierungen vom Substrat komplett ab, lediglich einzelne Zellen verblieben
abgerundet auf der Oberfläche (Abbildung 4.3 D).
ERGEBNISSE
54
4.2 Einfluss von P15-Au auf das Einzelzellverhalten von
L929
Da der Fokus dieser Arbeit auf der Kontrolle der Einzelzellablösung von schaltbaren
Substraten lag, wurden L929-Zellen vereinzelt auf der Polymeroberfläche kultiviert.
Anhand des Einzelzellverhaltens (Zellausbreitung / Zellabrundung) bei
Temperaturänderung ließen sich dann Rückschlüsse auf die Schaltkinetik sowie die
Polymerbelegungsdichte an der Goldoberfläche ziehen (Abbildung 4.4).
Abbildung 4.4: L929-Einzelzellabrundung auf P15-Au ausgelöst durch Temperaturänderung
von 37°C auf 25°C nach unterschiedlichen Zeiten. (A) Zelladhäsion und Zellausbreitung bei 37°C
auf der Polymeroberfläche. (B) Nach 14 minütiger Inkubation bei 25°C beginnen sich die Einzelzellen
zusammenzuziehen und sich abzurunden. (C) Nach 28 minütiger Inkubation ist der
Zellabrundungsprozess abgeschlossen. Wenige Zellen verbleiben ausgebreitet auf der
Polymeroberfläche. Maßstab: 100 "m. (D) Prozentuale Einzelzellabrundung von L929 auf P15-Au
nach der Temperaturänderung zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Zellzahl wurde pro Gesichtsfeld
ausgezählt und entsprechend der jeweiligen Zeitpunkte prozentual auf die Gesamtzellzahl pro
Gesichtsfeld bezogen. Der Hintergrund (Zahl abgerundeter Zellen bei 37°C) wurde hierbei nicht
berücksichtigt. Die Daten stellen Durchschnittswerte dreier unabhängiger Experimente dar. Als
Fehlerindikator ist die Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. Nach 14 minütiger Inkubation
bei 25°C sind 29 % der Zellen abgerundet, nach 28 Minuten bei 25°C sind es 79%. Rohdaten: siehe
Tabelle A3 im Anhang.
ERGEBNISSE
55
Nach 2 Tagen Kultivierung waren die Zellen adhärent und ausgebreitet auf der
Polymeroberfläche (Abbildung 4.4 A). Bei einer Temperaturabsenkung auf 25 °C
begannen die Einzelzellen sich abzurunden. Nach 14 Minuten bei 25 °C waren
ca. 29 % der Zellen abgerundet (Abbildung 4.4 B, D). Der Einzelzellabrundungsanteil
lag nach 28 Minuten bei 79 % (Abbildung 4.4 C, D). Ein weiterer Anstieg des
Zellabrundungsanteils mit zunehmender Zeit konnte nicht beobachtet werden. Ca. 90
% aller abgerundeten Zellen verblieben auf der Polymeroberfläche, wohingegen sich
10 % von der Oberfläche komplett ablösten und aufschwammen. Die abgerundeten
Zellen konnten mittels einer Pipette von der Oberfläche abgelöst und für weitere
Kultivierungen eingesetzt werden. Als Kontrolle wurden L929 aus der jeweils selben
Zellpassage auf herkömmlichen Polystyrenoberflächen für 2 Tage bei 37 °C kultiviert
und anschließend bei 25°C für 30 Minuten beobachtet. Während dieses
Beobachtungszeitraums konnten weder Zellabrundung noch Zellablösung der
ausgebreiteten L929 festgestellt werden (Daten nicht abgebildet).
4.3 Kontrollierte Einzelzellablösung im mikrofluidischen
System
Die in Kapitel 4.2 beschriebene Einzelzellabrundung mittels temperaturschaltbaren
Oberflächen wurde auf ein mikrofluidisches System übertragen, um die notwendige
Kraft für eine komplette Ablösung abgerundeter Zellen auf temperaturschaltbaren
Oberflächen besser kontrollieren zu können.
Hierzu wurde die temperaturschaltbare Polymeroberfläche P15-Au in ein
mikrofluidisches System integriert (siehe Kapitel 3.4.2) und L929 Fibroblasten in dem
mikrofluidischen Kanal (Breite=1000 "m, Höhe= 100 "m) kultiviert (Abbildung 4.5). In
diesem Kanal herrschte ausschließlich laminare Strömung, da aufgrund der
verwendeten Kanalgeometrie eine Reynoldszahl von Re ! 1 angenommen werden
konnte. Die eingespülten Zellen waren nach 20 h - 24 h Kultivierung bei 37 °C
adhärent und ausgebreitet (Abbildung 4.5 A). Das Zellverhalten (Adhäsion/
Ausbreitung) sowie die Zellmorphologie auf P15-Au in dem mikrofluidischen Kanal
glichen dem Zellverhalten auf P15-Au. Anschließend wurde das mikrofluidische
System mit den auf P15-Au kultivierten Zellen bei 25 °C inkubiert, um eine
Zellabrundung auf der temperaturschaltbaren Polymeroberfläche zu induzieren. Nach
ERGEBNISSE
56
30 Minuten bei 25 °C rundeten sich 80 – 90 % aller ausgebreiteten Zellen ab
(Abbildung 4.5 B).
Durch Anlegen eines Flusses in dem mikrofluidischen Kanal wurden die
abgerundeten Zellen laminar von Medium umströmt. Die Kontrolle der
Flussgeschwindigkeit in dem mikrofluidischen System wurde über eine
Spritzenpumpe erreicht (siehe Kapitel 3.4.2). Die abgerundeten Zellen wurden unter
definierten Flussgeschwindigkeiten aus dem Kanal entfernt. Als
Zellumströmungsdauer wurde für jede Flussgeschwindigkeit ein Zeitbereich von 30
Sekunden festgelegt. Basierend auf den resultierenden Zellmorphologien
(ausgebreitet und abgerundet) wurde für jede Flussgeschwindigkeit die
Zellumströmungsgeschwindigkeit über ein geometrisches Modell berechnet (siehe
Kapitel 3.4.4) und mit dem jeweiligen Zellabrundungsanteil korreliert (Abbildung 4.5
E).
ERGEBNISSE
57
Abbildung 4.5: Auswirkung von laminarer Strömung auf L929 Fibroblasten auf P15-Au in einem
mikrofluidischen PDMS-Kanal. (A) Fibroblasten adhärieren und breiten sich auf der
Polymeroberfläche bei 37 °C aus. (B) Vollständige Zellabrundung in Folge der Temperaturänderung
von 37 °C auf 25 °C nach 30 Minuten. (C) Einzelzellablösung abgerundeter Zellen in Folge des
angelegten laminaren Flusses bei einer Zellumströmungsgeschwindigkeit von 560 "m/s (Berechnung
siehe Kapitel 4.4). (D) Bei 37 °C und einer angelegten Zellumströmungsgeschwindigkeit von 700 "m/s
können die ausgebreiteten Zellen von der Polymeroberfläche nicht abgelöst werden (dieses Bild
wurde an einer anderen Position aufgenommen). Nur eine geringfügige morphologische Veränderung
konnte aufgrund des laminaren Flusses beobachtet werden. Maßstab: 100 "m. (E) Prozentuale
Einzelzellablösung der L929 Fibroblasten auf P15-Au in einem mikrofluidischen System als Funktion
der Zellumströmungsgeschwindigkeit. Bei 25 °C (!) runden sich die Zellen ab und lösen sich
aufgrund des angelegten laminaren Flusses ab. Ungefähr 80 % aller abgerundeten Zellen lösen sich
von der Polymeroberfläche bei einer Zellumströmungsgeschwindigkeit von 560 "m/s. Bei 37 °C (!)
ERGEBNISSE
58
bleiben die Zellen adhärent und ausgebreitet bei allen angelegten Flussgeschwindigkeiten. Die Daten
stellen Durchschnittswerte dreier unabhängiger Experimente dar. Als Fehlerindikator ist die
Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. Rohdaten: siehe Tabelle A2 im Anhang.
Bei einer Zellumströmungsgeschwindigkeit uCell von 560 "m/s konnten ca. 80 % aller
abgerundeten Zellen aus dem mikrofluidischen Kanal entfernt werden (Abbildungen
4.5 C, E). Die Vitalität der ausgespülten Zellen wurde nicht beeinflusst. Die Zellen
konnten für weitere Kultivierungen verwendet werden.
Zur Überprüfung der Schaltbarkeit der Polymeroberfläche bei unterschiedlichen
Temperaturen wurden L929 auf P15-Au in dem mikrofluidischen Kanal bei 37°C einer
laminaren Strömung ausgesetzt. Die Zellen zeigten bei allen angewandten
Flussgeschwindigkeiten keine Zellabrundung oder Zellablösung (Abbildung 4.5 D, E).
Nur geringfügige morphologische Veränderungen, die auf die angewandten
Flussgeschwindigkeiten zurückzuführen sind, konnten beobachtet werden.
4.4 Oberflächenstabilität
Für eine mögliche kommerzielle Nutzung der entwickelten temperaturschaltbaren
Polymeroberfläche wurde deren Stabilität untersucht.
4.4.1 Haltbarkeit von P15-Au
In diesem Ansatz wurde geklärt, welche Langzeitstabilität die temperaturschaltbare
Polymeroberfläche P15-Au hinsichtlich ihrer Schaltbarkeit aufweist. Hierzu wurden
zwei unabhängige Versuche über einen Zeitraum von jeweils 6 Wochen
durchgeführt. Als Bewertungsparameter für die Oberflächenschaltbarkeit wurde die
prozentuale Zellabrundung nach Schaltung definiert (Abbildung 4.6). Ein erster
Einfluss der Lagerung auf die Oberflächenschaltbarkeit konnte nach Woche 2
beobachtet werden. Hier reduzierte sich der Zellabrundungsanteil von 80 – 90 % auf
60 – 70 %.
ERGEBNISSE
59
Abbildung 4.6: Oberflächenstabilität von P15-Au bei unterschiedlichen Lagerungszeiten und
-bedingungen. RT: 25 °C , Ex: Exsikator. Es wurden 8 x P15-Au Präparate zeitgleich hergestellt und
zu unterschiedlichen Zeitpunkten für die Kultivierung von L929 Fibroblasten eingesetzt. Die Zellen
wurden über 2 Tage bei 37 °C kultiviert und bei 25 °C für 30 Minuten abgerundet. Die jeweilige
prozentuale Zellabrundung wurde als Funktion der entsprechenden Lagerungsdauer aufgetragen. Die
Lagerung von temperaturschaltbaren Oberflächen ist bis 6 Wochen unkritisch. Bei der Lagerung der
Polymeroberfläche bei 40 °C zeigen sich nach Woche 2 und Woche 6 signifikant niedrigere
Zellabrundungsanteile. Für die Lagerung der Polymeroberfläche an Umgebungsluft ergibt sich eine
prozentuale Zellabrundung zwischen 60 – 70 %. Die Zellabrundungsanteile in Woche 6 des
2.Versuchs konnten aufgrund einer Kontamination während der Zellkultivierung nicht ermittelt werden.
Rohdaten: siehe Tabelle A5 im Anhang.
Nach Woche 4 konnte eine weitere Absenkung des Zellabrundungsanteils um 10 %
verzeichnet werden. Die Oberflächenschaltbarkeit nach Woche 6 zeigte ein ähnliches
Niveau wie ein 2 Wochen altes Präparat. Die Simulation einer Alterung der
Polymeroberfläche bei 40 °C im Vakuum zeigte in Woche 2 und Woche 6 eine
Reduktion des Zellabrundungsanteils auf 10 -20 %.
Der Vergleich der Lagerungsbedingungen (Vakuum, Umgebungsluft) zeigte, dass die
Lagerung bei Vakuum eine größere Langzeitstabilität gewährleistete als die
Lagerung bei Umgebungsluft.
ERGEBNISSE
60
4.4.2 Wiederverwendbarkeit von P15-Au
Eine interessante Fragestellung bei der Anwendung temperaturschaltbarer
Oberflächen in der Zellkultur betrifft deren Wiederverwendbarkeit. Für eine effiziente
Nutzung solcher Polymeroberflächen wäre eine mehrmalige Anwendung vorteilhaft.
Deshalb wurde die Reproduzierbarkeit des Schaltvorgangs auf
temperaturschaltbaren Oberflächen P15-Au bei mehrmaliger Verwendung
(Schaltzyklen) untersucht (Abbildung 4.7). Ein Schaltzyklus verläuft von 37 °C
(adhärenter Zellzustand) auf 25 °C (abgerundeter Zellzustand) und wurde
anschließend auf 37 °C zurückgeführt (Abbildung 4.7 A).
Auf zwei P15-Au-Präparaten mit unterschiedlichem Alter (Tag 0, Woche 1) wurde der
Zellabrundungsanteil pro Schaltzyklus untersucht (Abbildung 4.7 B). Vor dem ersten
Schaltzyklus wurden die Zellen auf den Oberflächen für 48 h kultiviert. Danach wurde
die Temperatur von 37 °C auf 25 °C für 30 Minuten gesenkt, wodurch die Zellen sich
abrundeten und durch vorsichtiges Pipettieren vollständig von der Oberfläche
entfernt werden konnten. Vor jeder erneuten Zellkultivierung wurden die Oberflächen
bei 25 °C in PBS gewaschen, um vermutlich adsorbierte Proteine von der Oberfläche
zu entfernen, welche die Schalteffizienz der Polymeroberfläche beeinflussen
könnten. Die abgelösten Zellen wurden auf die gewaschenen Oberflächen erneut
ausgesät und für 48 h kultiviert. Danach wurde ein erneuter Schaltzyklus vollzogen.
Auf beiden präparierten Polymeroberflächen konnte über einen Zeitbereich von zwei
Schaltzyklen ein ähnliches Zellabrundungsniveau beobachtet werden. Die
Unterschiede des Zellabrundungsanteils zwischen den beiden Polymeroberflächen
waren gering und vermutlich nicht signifikant. Nach dem dritten Schaltzyklus zeigte
sich eine Reduktion des Zellabrundungsanteils auf 50 %.
ERGEBNISSE
61
Abbildung 4.7: Wiederverwendbarkeit von P15-Au Oberflächen bei unterschiedlichen
Lagerungszeiten für den Gebrauch als Zellkultursubstrat. (A) Schaltzyklus von L929 auf P15-Au.
Zelladhäsion bei 37 °C, Zellabrundung nach 30 Minuten bei 25 °C, erneute Zelladhäsion nach 1h bei
37 °C. Maßstab: 50 "m. (B) Tag 0 ("): P15-Au wurde am Tag der Präparation für eine mehrmalige
Kultivierung eingesetzt. Woche 1 ("): P15-Au wurde für eine Woche bei RT unter Vakuum gelagert
und dann für eine mehrmalige Kultivierung eingesetzt. Die ausgebreiteten Zellen auf P15-Au wurden
über Temperaturschaltung von 37 °C auf 25 °C abgerundet und anschließend mittels einer Pipette von
der Oberfläche gespült. Die Oberfläche wurde in PBS gewaschen und für eine erneute Zellkultivierung
mit den vorher weggespülten Zellen eingesetzt. Vor jeder Schaltung wurden die Zellen für 2 Tage
kultiviert. Der Zellabrundungsanteil wurde nach einer Temperaturänderung (37 °C " 25 °C) bestimmt.
Rohdaten: siehe Tabelle A4 im Anhang.
4.5 Anpassung schaltbarer Oberflächen für eine
zelltypspezifische Adhäsionskontrolle
Da unterschiedliche Zelltypen in ihrem Adhäsionsverhalten stark variieren, wurden
über Oberflächenmodifikationen die dem jeweiligen Zelltyp entsprechenden
Oberflächeneigenschaft eingestellt.
4.5.1 Charakterisierung von P15-Au und P19-Au
Ein möglicher Ansatz zur Optimierung der Schaltkinetik und der Schalteffizienz ist die
Erhöhung des intramolekularen PEG-Gehalts im Copolymer. Dadurch ergeben sich
ERGEBNISSE
62
für die Schaltkinetik und Schalteffizienz der Polymeroberfläche zwei nützliche
Effekte. Zum einen wird die LCST des Copolymers in Richtung der
Kultivierungstemperatur von Zellen (37 °C) verschoben, wodurch es zu einem
früheren Schalten der Polymeroberfläche kommt. Zum anderen gewährleistet der
höhere PEG-Gehalt im Copolymer eine stärkere Hydratisierung der Polymerschicht.
Beide Effekte können zu einer schnelleren und höheren Zellabrundung auf
schaltbaren Polymeroberflächen beitragen (Schmaljohann et al., 2003).
LCST-Vergleich von PNIPAAm-PEG15%-COOH und PNIPAAm-PEG19%-COOH
Entsprechend der LCST-Charakterisierung von P15 (Kapitel 4.1) wurde für das neu
erhaltene Copolymer PNIPAAm-PEG19%-SH (P19) die LCST anhand der
Polymervorstufe PNIPAAm-PEG19%-COOH ermittelt. Während P15-Au eine LCST
bei 35 – 36 °C aufwies, zeigte P19 seine LCST zwischen 36 – 37 °C (Abbildung 4.8).
Dies ließ sich anhand der signifikanten Partikelvergrößerung von PNIPAAm-
PEG19%-COOH in Lösung bei Temperaturänderung von 36 °C auf 37 °C erkennen.
Diese Messungen sowie die Synthese wurde von unserem Projektpartner Fraunhofer
IAP, Potsdam (Dr. A. Lieske) durchgeführt.
Abbildung 4.8: Vergleich der charakteristischen LCST (lower critical solution temperature) der
PNIPAAm-PEG Copolymere mit unterschiedlichem PEG-Gehalt. PNIPAAm-PEG(15%)-COOH (!)
zeigt eine LCST zwischen 35°C - 36°C. PNIPAAm-PEG(19%)-COOH (#) weist eine LCST im Bereich
von 36°C - 37°C auf.
ERGEBNISSE
63
Vergleich der Kontaktwinkeldaten von P15-Au und P19-Au
P19 wurde wie P15 adsorptiv an eine Goldoberfläche gebunden. Daraus entstand die
schaltbare Polymeroberfläche P19-Au, welche über Kontaktwinkelmessung bei
unterschiedlichen Temperaturen charakterisiert wurde. Die Kontaktwinkeldaten von
P19-Au wurden mit denen von P15-Au bei den jeweiligen Temperaturen
gegenübergestellt (Abbildung 4.9). P19-Au zeigte im untersuchten
Temperaturbereich von 20 °C – 45 °C eine höhere Hydrophilie als P15-Au. Bei 20 °C
ergab sich auf P19-Au ein Kontaktwinkel von 48 °, auf P15-Au ein Kontaktwinkel von
54 °. Bei 45 °C auf P19-Au zeigte sich Kontaktwinkel von 61 °, auf P15-Au ein
Kontaktwinkel von 65 °, was mit dem höheren PEG-Gehalt von P19 im Einklang
steht. An beiden Oberflächen wurde ein nahezu paralleler
Temperaturabhängigkeitsverlauf festgestellt.
Abbildung 4.9: Fortschreitkontaktwinkel von Wasser auf P15-Au (•), P19-Au (") und
gereinigtem Gold (!) als Funktion der Temperatur. Der Temperaturabhängigkeitsverlauf von P15-
Au (54 ° - 65 °) und P19-Au (48 ° - 61 °) zeigt im Bereich von 20 °C – 45 °C ein ähnliches
Schaltverhalten. P19-Au ist aufgrund des höheren PEG-Gehalts hydrophiler als P15-Au. Die
gereinigte, unfunktionalisierte Goldoberfläche zeigt keine Änderung der Benetzungseigenschaften. Die
Daten geben einen Mittelwert von jeweils fünf Messungen an. Die Standardabweichungen des
Mittelwerts wurden nicht grafisch dargestellt, da sie nie die Symbolgröße überschritten. Rohdaten:
siehe Tabelle A1 im Anhang.
ERGEBNISSE
64
Untersuchung der Oberflächenzusammensetzung von P19-Au
Die Oberflächenzusammensetzung von P19-Au wurde qualitativ und quantitativ
untersucht, um Information über chemische Strukturen an der Oberfläche zu
erhalten. Hierzu wurde die Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) eingesetzt.
Die Oberfläche wurde in einem Bereich von 0,3 mm x 0,7 mm bis zu einer Tiefe von
ca. 7 nm erfasst. Die elementare Analyse ergab von dem Substrat einen Goldanteil
von 30 at%. Unter der Annahme, dass die Polymerschicht eine homogene Belegung
aufwies sowie unter Vernachlässigung der Oberflächenrauhigkeiten, konnte anhand
der relativen Intensitätssignale eine Schichtdicke von P19-Au im Bereich von 3 – 4
nm angenommen werden. Das charakteristische Kohlenstoff C1s Spektrum von P19-
Au ergab fünf Typen von Kohlenstoffsignalen mit unterschiedlichen
Bindungsenergien (BE) (graue Linie, Abbildung 4.10).
Drei dieser Typen konnten PNIPAAm zugeordnet werden: Die C-C-Verbindung mit
einer BE = 285,0 eV, C-N-Verbindungen mit einer BE = 285,7 eV und die O=C-N mit
einer BE = 287,8 eV. Das Kohlenstoffsignal C-O mit einer BE = 286,4 eV konnte dem
intramolekularen PEGMA zugeordnet werden. Das schwache Signal der O=C-O
Verbindung mit einer BE = 289,0 eV konnte nicht mit der Zusammensetzung von
P19-Au korreliert werden. Es stammt vermutlich von einer unspezifischen
Adsorbatschicht auf P19-Au. Die XPS-Messung wurden von unserem Projektpartner
Fraunhofer IAP, Potsdam (Dr. A. Holländer) durchgeführt und ausgewertet.
Abbildung 4.10: Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) von P19-Au. Dargestellt ist ein
repräsentatives Kohlenstoff C1s-Spektrum von P19 (graue Linie) und ein simuliertes Spektrum für eine
molare PEGMA-Fraktion von 12 mol%. Die Daten dieser Messung konnten durch eine zweite
Messung bestätigt werden.
ERGEBNISSE
65
Auf der Grundlage dieser Signale wurde über ein simuliertes Spektrum (schwarze
Linie, Abbildung 10) der molare Monomeranteil beider Teile des Copolymers
ermittelt. Hieraus ergab sich eine Zusammensetzung von 88 mol% PNIPAAm zu 12
mol% PEGMA für P19. Das charakteristische O1s-Spektrum wurde auf dieselbe
Weise angenähert und bestätigte die Ergebnisse des C1s-Spektrums bzgl. der
Oberflächenzusammensetzung von P19. Insgesamt spricht die Reinheit der XPS-
Signale für eine nahezu saubere, unkontaminierte Oberfläche.
Vergleich des Zellverhaltens auf P15-Au und P19-Au
Der intramolekulare PEG-Gehalt von P15-Au und P19-Au hat einen signifikanten
Einfluss auf die Zellabrundungszeit nach Temperaturänderung (Abbildung 4.11).
Abbildung 4.11 A stellt das Zellverhalten auf beiden Oberflächen zu bestimmten
Zeitpunkten gegenüber. Hierbei zeigte sich, dass bei 37 °C nach 3 Tagen
Kultivierung die Zellen auf beiden Oberflächen adhärent und ausgebreitet waren.
Beide Oberflächen erwiesen sich als zellverträglich.
Der Zellabrundungsanteil ist als Funktion der Zeit in Abbildung 11B aufgetragen.
Nach 14 Minuten bei 25 °C wurde der Unterschied im Zellverhalten auf beiden
Oberflächen deutlich (Abbildung 4.11 A, mittig). Während auf P19-Au bis zu 74 % der
ausgebreiteten Zellen abgerundet waren, rundeten sich auf P15-Au lediglich 23 %
ab. Nach 28 Minuten erreichte der Zellabrundungsanteil auf P15-Au ein ähnliches
Niveau wie nach 14 Minuten auf P19 (Abbildung 4.11 A, rechts). Auf P19-Au konnte
nach 28 Minuten ein Zellabrundungsanteil von mehr als 90 % beobachtet werden.
Somit ermöglicht P19-Au im Vergleich zu P15-Au eine doppelt so schnelle
Zellablösung.
ERGEBNISSE
66
Abbildung 4.11: Zellabrundung auf P15-Au und P19-Au über die Zeit. (A) Zellabrundung von
adhärenten, ausgebreiteten L929 auf P15-Au und P19-Au im Vergleich nach Temperaturänderung von
37 °C auf 25 °C (Kultivierungsdauer war 3 Tage). Es wurden Bilder zu den Zeitpunkten 0, 14 und 28
Minuten nach Temperaturänderung aufgenommen. Maßstab: 100 "m. (B) Abgerundete Zellen auf
P15-Au (weißer Balken) und P19-Au (grauer Balken) wurden pro Gesichtsfeld ausgezählt und als
prozentuale Zellabrundung über die jeweiligen Zeitpunkte aufgetragen. Die Daten wurden bzgl. des
Hintergrunds (abgerundete Zellen bei 37 °C) korrigiert und als Mittelwert dreier unabhängiger
Versuche mit der Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. Rohdaten: siehe Tabelle A3 im
Anhang.
4.5.2 Modifikation von P19-Au für stark adhärente Zelltypen
Die kontrollierte Zellabrundung auf P19-Au wurde unter anderem mit stark
adhärenten Zellen (Osteoblasten, Chrondrozyten) getestet. Dabei wurde deutlich,
dass stark adhärente Zellen auf P19-Au bei Temperaturwechsel nicht oder kaum
reagierten, sondern adhärent und ausgebreitet auf der Polymeroberfläche verblieben.
Um solch stark adhärente Zellen von schaltbaren Oberflächen kontrolliert ablösen zu
können, mussten schaltbare Polymeroberflächen mit größeren protein- bzw.
zellrepellierenden Eigenschaften entwickelt werden.
ERGEBNISSE
67
Die Erhöhung des intramolekularen PEG-Anteils von P19 scheidet dabei als
Möglichkeit aus, da dies die LCST des Copolymers über die Kultivierungstemperatur
von 37 °C verschieben würde, also kein Schalten in einem Temperaturbereich
unterhalb von 37 °C erlauben würde. Es wurde stattdessen ein Vorteil der Thiol-
Chemie auf Goldoberflächen genutzt, nämlich die Möglichkeit, Moleküle kontrolliert
als vermischte Coadsorbate anzubinden. Hierzu wurde P19 mit dem
zellrepellierendem Polymer CH3O-PEG-SH („PG“) gemischt und auf der
Goldoberfläche adsorbiert. Die LCST der modifizierten Polymeroberfläche P19/PG-
Au wurde dabei nicht verändert.
Kontaktwinkelmessung auf modifizierten Polymeroberflächen
Als eine passende Oberfläche hat sich die modifizierte Polymeroberfläche P19/PG
mit einem molaren Mischungsverhältnis von 1:6 (P19/PG(1:6)-Au) erwiesen. Deren
Charakterisierung wurde über Kontaktwinkelmessungen bei unterschiedlichen
Temperaturen durchgeführt (Abbildung 4.12). Zum Vergleich wurden
Kontaktwinkeldaten von P19-Au, einer reinen PEG-Oberfläche (PG-Au) sowie von
einer unfunktionalisierten Goldoberfläche bei unterschiedlichen Temperaturen
gegenübergestellt.
Abbildung 4.12: Fortschreitkontaktwinkel von Wasser auf P19-Au ("), P19/PG(1:6)-Au (x),
PG-Au (!) und gereinigtem Gold (!) als Funktion der Temperatur. Der
Temperaturabhängigkeitsverlauf von P19-Au und P19/PG(1:6)-Au zeigt ein ähnliches Schaltverhalten.
Aufgrund des zusätzlichen hygroskopischen PEG-Anteils bei P19/PG(1:6)-Au wird im Vergleich zu
P19-Au eine hydrophilere Oberfläche erzeugt. Gereinigte, unfunktionalisierte Goldoberflächen und
PG-Au zeigen keine Änderung der Benetzungseigenschaften. Die Daten geben einen Mittelwert von
jeweils fünf Messungen an. Die Standardabweichungen des Mittelwerts wurden nicht grafisch
dargestellt, da sie nie die Symbolgröße überschritten. Rohdaten: siehe Tabelle A1 im Anhang.
ERGEBNISSE
68
P19/PG(1:6)-Au ist eine vergleichsweise hydrophile Oberfläche mit Kontaktwinkeln
von 37 ° bei 20 °C bis hin zu 46 ° bei 45 °C. Der Temperaturabhängigkeitsverlauf von
P19/PG(1:6)-Au ist im Vergleich zu P19-Au flacher. Die Kontaktwinkel auf PG-Au und
auf unfunktionalisierten Goldoberflächen änderten sich bei Temperaturänderung
praktisch nicht.
Untersuchung der Oberflächenzusammensetzung von P19/PG(1:6)-Au
Neben der XPS-Messung von P19-Au (siehe Kapitel 4.5.1) wurde zudem eine XPS-
Messung der Polymeroberfläche P19/PG(1:6)-Au durchgeführt. Diese Messung gab
anhand der Oberflächenzusammensetzung eine Information darüber, ob die Thiol-
Moleküle in Lösung (P19:PG(1:6)) auch in einem ähnlichen Konzentrationsverhältnis
an der Goldoberfläche gebunden werden können. Die XPS-Untersuchung der
P19/PG(1:6)-Au ergab ein molares Mischungsverhältnis von 1:6,8 (P19:PG), welches
im Bereich der molaren Zusammensetzung der eingesetzten Thiollösung von 1:6
(P19:PG) liegt.
Zellabrundung stark adhärenter Zellen auf modifizierten Polymeroberflächen
Als Modellzelllinie wurde MG63 (humanes Osteosarkom) für die
Zellabrundungsversuche auf modifizierten Polymeroberflächen eingesetzt (Abbildung
4.13). In Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass adhärente MG63 sich weder
von P15-Au (Daten nicht dargestellt) noch von P19-Au (Abbildung 4.13 A) bei
Temperaturänderung abrunden bzw. ablösen. Die Anpassung der schaltbaren
Polymeroberfläche an das Adhäsions- bzw. Ablösungsverhalten der MG63 erfolgte
über eine Adsorption von P19 und PG in unterschiedlichen Mischungsverhältnissen
an Goldoberflächen. Dabei zeigte sich, dass auf einer Polymeroberfläche aus einer
Mischung von 1:9 (P19:PG) MG63 nicht adhärieren können, was sehr wahrscheinlich
an dem zu hohen PG-Anteil liegt (Abbildung 4.13 C). Folglich konnten auf diesen
Oberflächen keine Ablöseversuche durchgeführt werden.
ERGEBNISSE
69
Abbildung 4.13: Adhäsionsverhalten von MG63 auf P19/PG-Au mit unterschiedlichen
Mischungsverhältnissen. Zellen wurden für 36h auf der jeweiligen Oberfläche kultiviert.
Anschließend wurde die Temperatur von 37 °C auf 25 °C reduziert und das Zellverhalten für 30
Minuten dokumentiert. (A) Auf P19-Au sind die Zellen adhärent und ausgebreitet. Nach 30 Minuten bei
25 °C ist keine signifikante Zellabrundung zu beobachten. (B) P19/PG(1:6)-Au ermöglicht
Zelladhäsion und Zellausbreitung. 74% der adhärenten Zellen runden sich bei 25 °C ab. (C)
P19/PG(1:9)-Au verhindert Zelladhäsion vollständig. Maßstab: 100 "m. Rohdaten: siehe Tabelle A6 im
Anhang.
Dagegen adhärierten und breiteten sich die Zellen nach 36 h Kultivierung bei
37 °C auf der Polymeroberfläche P19/PG(1:6)-Au aus (Abbildung 4.13 B). Nach
Temperaturänderung auf 25 °C für 30 Minuten rundeten sich 74 % aller
ausgebreiteten Zellen ab und konnten durch vorsichtiges Pipettieren von der
Oberfläche entfernt werden.
4.5.3 Modifikation von P19-Au für schwach adhärente Zelltypen
In Kapitel 4.5.1 konnte gezeigt werden, dass L929 Fibroblasten für Adhäsion und
Ausbreitung auf P19-Au 3 Tage Kultivierung benötigen. Da dies für die praktische
Verwendung eine sehr lange Zeit ist, wurde versucht, die Oberfläche derart zu
modifizieren, dass sie für L929 Zellen eine bessere und schnellere Adhäsion
ermöglicht.
ERGEBNISSE
70
Es wurde eine Coadsorption von P19 mit einem zellattraktiven Peptid in
unterschiedlichen Mischungsverhältnissen an Goldoberflächen durchgeführt. Aus der
Literatur konnte ein Fibroblasten-attraktives Peptidmotiv CGGRGDS (RGD)
identifiziert werden, welches von Dr. H. Börner (MPI für Kolloid- und
Grenzflächenforschung, Potsdam) synthetisiert und mittels Massenspektrometrie
charakterisiert wurde (Hersel et al., 2003). Aufgrund des Cysteins in der
Peptidsequenz lag eine SH-Gruppe vor, welche eine Anbindung des RGDs an die
Goldoberfläche ermöglichte.
Kontaktwinkelmessung auf modifizierten Polymeroberflächen
Als eine passende Oberfläche hat sich die modifizierte Polymeroberfläche P19/RGD
mit einem molaren Mischungsverhältnis von 1:8 (P19/RGD(1:8)-Au) erwiesen. Deren
Charakterisierung wurde über Kontaktwinkelmessungen bei unterschiedlichen
Temperaturen durchgeführt (Abbildung 4.14). Zum Vergleich wurden
Kontaktwinkeldaten von P19-Au, einer unfunktionalisierten Goldoberfläche sowie von
einer reinen RGD-Oberfläche (RGD-Au) bei unterschiedlichen Temperaturen
gegenübergestellt.
Abbildung 4.14: Fortschreitkontaktwinkel von Wasser auf P19-Au ("), P19/RGD(1:8)-Au (+),
RGD-Au (#) und gereinigtem Gold (!) als Funktion der Temperatur. Das Schaltverhalten von
P19-Au und P19/RGD(1:8)-Au zeigt eine ähnliche Temperaturabhängigkeit. Aufgrund des hydrophilen
RGD-Anteils verhält sich P19/RGD(1:8)-Au hydrophiler als P19-Au. Es ergeben sich keine Änderung
der Benetzungseigenschaften auf RGD-Au sowie auf der unfunktionalisierten Goldoberfläche. Die
Daten geben einen Mittelwert von jeweils fünf Messungen an. Die Standardabweichungen des
Mittelwerts wurden nicht grafisch dargestellt, da sie nie die Symbolgröße überschritten. Rohdaten:
siehe Tabelle A1 im Anhang.
ERGEBNISSE
71
Die Änderung des Kontaktwinkels auf P19/RGD(1:8)-Au verläuft von 43 ° bei 20 °C
bis 52 ° bei 45 °C. Verglichen zu P19-Au ist der Temperaturabhängigkeitsverlauf von
P19/RGD(1:8)-Au nur geringfügig flacher. Die Hydrophilie von P19/RGD(1:8)-Au ist
höher als die von P19-Au, was konsistent mit der Hydrophilie des RGDs ist. Eine
Änderung der Benetzbarkeit bei Temperaturänderung ist auf RGD-Au nicht zu
beobachten.
Erhöhung der Zelladhäsion auf modifizierter P19-Au
Ziel der Mischung von P19 und RGD auf einer Goldoberfläche war es, das
Mischungsverhältnis der beiden Thiole so einzustellen, dass die Schalteffizienz von
P19 wirksam bleibt und die Zellen eine schnellere Adhäsion und Ausbreitung auf der
Polymeroberfläche vollziehen können. Aus diesem Grund wurden unterschiedliche
molare Mischungsverhältnisse von P19 und RGD auf Goldoberflächen erzeugt. Die
Schaltbarkeit der erzeugten Oberflächen wurde über den Zellabrundungsanteil bei
Temperaturänderung untersucht (Abbildung 4.15).
Die Polymeroberfläche P19/RGD(1:8)-Au ermöglichte einen Zellabrundungsanteil
von 91 % (Abbildung 4.15 A, rechtes Bild), was dem Zellabrundungsanteil auf P19-
Au entspricht (siehe Kapitel 4.5.1). Die Polymeroberfläche mit einer noch höheren
RGD-Konzentration P19/RGD(1:17)-Au brachte keine weitere Verstärkung des
Adhäsions- bzw. Ausbreitungsverhaltens (Abbildung 4.15 A, linkes Bild). Zudem
reduzierte sich der Zellabrundungsanteil auf 74 % (Abbildung 4.15 A, rechtes Bild).
Jede weitere Erhöhung des intermolekularen RGD-Anteils führte auf der
Polymeroberfläche zu einer weiteren Absenkung des Zellabrundungsanteils (Daten
nicht abgebildet).
Es zeigte sich, dass auf der Polymeroberfläche P19/RGD(1:8)-Au die Zellen nur 36 h
kultiviert werden mussten, bis sie adhärent und ausgebreitet waren (Abbildung 4.15
B, linkes Bild). Auf P19-Au dagegen mussten die Zellen für eine Adhäsion und
vollständige Ausbreitung 72 h kultiviert werden (Abbildung 4.15 B, rechtes Bild).
ERGEBNISSE
72
Abbildung 4.15: Adhäsionsverhalten von L929 auf P19/RGD-Au mit unterschiedlichen
Mischungsverhältnissen. Zellen wurden für 36 h auf der jeweiligen Oberfläche kultiviert und das
Adhäsions- und Ausbreitungsverhalten beobachtet. Anschließend wurde die Temperatur von 37 °C
auf 25 °C geändert und das Zellverhalten für 30 Minuten dokumentiert. (A) Bei einem P19/RGD-
Mischungsverhältnis von 1:8 sind die Zellen nach 36 h adhärent und ausgebreitet (linkes Bild). Nach
30 Minuten bei 25 °C ergibt sich ein Zellabrundungsanteil von 91 % (rechtes Bild). Durch Erhöhung
der RGD-Konzentration auf ein Mischungsverhältnis von 1:17 kann das Adhäsions– und
Ausbreitungsverhalten nicht erhöht werden (linkes Bild). Nach 30 Minuten bei 25 °C beträgt der
Zellabrundungsanteil nur 74 % (rechtes Bild). (B) Zelladhäsion von L929 auf P19-Au (linkes Bild) und
P19/RGD(1:8)-Au (rechtes Bild) nach 36 h Kultivierung im Vergleich. Auf P19-Au sind die Zellen
adhärent, jedoch nicht ausgebreitet. Dagegen sind sie auf P19/RGD(1:8)-Au adhärent und
ausgebreitet. Maßstab: 100 "m. Rohdaten: siehe Tabelle A7, A8 im Anhang.
4.6 Mikrostrukturierung von Oberflächen
Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Oberflächen können über die Anwendung
als flächige, schaltbare Kultursubstrate hinaus eine Komponente in zukünftigen,
komplexen Systemen sein. Eine interessante Anwendung könnte die
oberflächenbasierte Trennung von Zellen aufgrund ihres Migrationsverhalten sein,
um migrationsaktive Zellen für weiterführende Arbeiten wie Analyse oder
Manipulation in einer Population anzureichern. In Vorarbeiten wurden
ERGEBNISSE
73
mikrostrukturierte Oberflächen mit zellattraktiven (Fibronektin) und zellabstoßenden
Bereichen (PEG) entwickelt (nicht veröffentlichte Daten, Ines Westphal, Fraunhofer
IBMT). Mittels dieser Oberflächen konnte gezeigt werden, dass viele Zellen von den
zellabstoßenden auf die zellattraktiven Bereiche migrieren. Dieser Ansatz wurde im
Rahmen der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt. Durch die Mikrostrukturierung von
Goldoberflächen mit temperaturschaltbarem Polymer und Fibronektin migrierten
darauf kultivierte Zellen von dem Copolymerbereich auf das Fibronektin.
Migrationsnegative Zellen verweilten auf dem Copolymerbereich und konnten mit
Hilfe der Temperaturschaltung von der Oberfläche abgelöst werden. Dadurch
verblieb eine Zellpopulation mit angereicherten migrationspositiven Zellen auf dem
Fibronektin.
4.6.1 Mikrostrukturierte Biotin-Streptavidin Oberflächen
Zunächst wurde die Methodik der Oberflächenstrukturierung für spätere
Anwendungen (gezielte Ausrichtung und Wanderung von Zellen) weiterentwickelt.
Die bisher angewandte Methode des sogenannten „microcontact printing“ ("CP)
basiert auf manuellem Druck des PDMS-Stempels auf das jeweilige Substrat (siehe
Kapitel 3.3.1.3). Da dies zu Inhomogenitäten im Übertrag sowie zum Verwischen der
gestempelten Struktur führen kann, wurde die Mikrostrukturierung von
Goldoberflächen in dieser Arbeit mittels einer einfachen Stempelvorrichtung realisiert.
Dabei war das Ziel, eine Oberflächenstrukturierung mit hoher Homogenität über
einen Bereich von mehreren 100 "m, eine hohe Strukturschärfe sowie eine gute
Handhabbarkeit zu erreichen.
Als Modellsystem zur Optimierung dieses Stempelverfahrens wurde das Biotin-
Streptavidin-System ausgewählt. Hierbei wurde ein Biotin-Molekül, welches mit BSA
(bovines Serumalbumin) gekoppelt ist, auf eine Glasoberfläche adsorbiert. BSA ist
dafür bekannt, aufgrund hydrophober Wechselwirkung sehr gut an Glasoberflächen
zu adsorbieren (Larsericsdotter et al., 2005). Aufgrund der Kopplung des BSA an das
Biotin wurde eine starke Oberflächenhaftung des Biotins auf der Glasoberfläche
erreicht, was zur Herstellung homogener Biotin-Oberflächen beitrug. Für die
Strukturierung von BSA-Biotin-Oberflächen eignet sich Streptavidin, da es mit vier
Biotin-Bindungsstellen eine hohe Bindungsaffinität zu Biotin (KD ~10-15 M-1) aufweist.
Um die gestempelte Struktur am CLSM zu visualisieren, wurde
fluoreszenzmarkiertes Streptavidin (Streptavidin488) verwendet. In Vorversuchen
ERGEBNISSE
74
konnte gezeigt werden, dass Streptavidin488 ausschließlich an Biotin-Oberflächen
und nicht an freie Glasoberflächen bindet. Basierend hierauf wurde auf BSA-Biotin-
Oberflächen mit Hilfe eines 16-Pin-Stempels (Abbildung 4.16) das Streptavidin488
strukturiert aufgebracht.
Abbildung 4.16: PDMS-16Pin-Stempel für die Mikrostrukturierung von Oberflächen. Die
Stempelgröße beträgt 10 x 10 mm mit einer Pinhöhe von 1 mm und einer Fläche pro Pin von 1,2 mm$.
In jedem Pin befindet sich eine 5 "m erhabene Mikrostruktur mit 29 Kleinquadraten, die jeweils eine
Abmessung von 100 x 100 "m aufweisen. (Die Stempelstruktur wurde freundlicherweise von Dr.
Christian Albrecht, Lehrstuhl für Angewandte Physik, LMU München zur Verfügung gestellt).
In einem ersten Schritt wurden unterschiedliche Biotin-Beschichtungen
getestet, um einen möglichst hohen Stempelübertrag des fluoreszenzmarkierten
Streptavidins (Streptavidin488) zu ermöglichen. Über die Gewichte auf dem PDMS-
Stempel wurde ein reproduzierbarer Anpressdruck in der Stempelmaschine
hergestellt. Dies half, eine hohe Homogenität und Strukturschärfe der gestempelten
Kleinquadrate zu erreichen. Bei einem eingesetzten Gewicht von 32 g ergibt sich bei
einer Stempelfläche von 18 mm$ ein Anpressdruck von 17,2 kPa. Der Übertrag des
Stempels bei diesem Anpressdruck war inhomogen, da eine planare Auflage der
16-Pins auf dem Substrat nicht gegeben war (Abbildung 4.17 A). Wurde hingegen
der Anpressdruck durch ein Gewicht von 100 g auf 54,5 kPa erhöht, wurde der
PDMS-Stempel so deformiert, dass Bereiche zwischen den Kleinquadrate
unerwünschterweise auf das Substrat übertragen wurden (Abbildung 4.17 B).
ERGEBNISSE
75
Abbildung 4.17: Mikrostrukturierung von BSA-Biotin-Oberflächen mit Streptavidin488 mit Hilfe
eines PDMS-16Pin-Stempel bei unterschiedlichem Anpressdruck. (A) CLSM-Aufnahme des
Streptavidin488-Stempelübertrags (1 Pin mit 29 Kleinquadraten). Der Stempelübertrag erfolgte bei
17,2 kPa. Der Stempelübertrag ist inhomogen, da der PDMS-Stempel bei diesem Anpressdruck nicht
plan auf dem Substrat aufliegt. (B) Stempelübertrag bei 54,5 kPa, wodurch in den Bereichen zwischen
den Quadraten unerwünschte Strukturen übertragen wurden. Maßstab: 100 "m.
Ein homogener Stempelübertrag mit hoher Strukturschärfe war bei einem
Anpressdruck von 43,1 kPa (eingesetztes Gewicht: 79 g) gegeben (Abbildung 4.18).
Um die Homogenität im Stempelübertrag zu bewerten, wurde der Stempelübertrag
mittels eines CLSM visualisiert und als kalibriertes TIFF-Bild dokumentiert.
Abbildung 4.18: Mikrostrukturierung von BSA-Biotin-Oberflächen über Streptavidin488 mit
Hilfe eines PDMS-16Pin-Stempel bei 43,1 kPa. Links: CLSM-Aufnahme des Streptavidin488-
Stempelübertrags (1 Pin mit 29 Kleinquadraten). Weiße, gestrichelte Linie markiert den angelegten
Linienplot zur Untersuchung der Homogenität und Strukturschärfe der Stempelung. Rechts:
Linienplot-Profil der Stempelstruktur. Die jeweilige Peakschärfe ist konsistent mit der
Kleinquadratbreite. Die nahezu konstante Signalstärke der Peaks lässt eine hohe Homogenität in den
gestempelten Streptavidin488-Kleinquadraten erkennen. Maßstab: 100 "m.
ERGEBNISSE
76
Über die Mitte des TIFF-Bildes wurde in dem Bildbearbeitungsprogramm ImageJ
(National Institutes of Health, USA) ein horizontaler Linienplot angelegt (Abbildung
4.18 A; weiße, gestrichelte Linie) und als Linienplot-Profil dargestellt (Abbildung 4.18
B). Das Linienplot-Profil der gestempelten Mikrostruktur lässt eine gute
Strukturschärfe anhand der jeweiligen Peakschärfe erkennen, welche konsistent zu
der Breite eines Kleinquadrats (100 "m) ist. Die nahezu gleichbleibende Signalstärke
der jeweiligen Peaks deutet auf eine hohe Homogenität innerhalb der jeweiligen
Kleinquadrate hin.
4.6.2 Mikrostrukturierte, schaltbare Polymeroberflächen
4.6.2.1 Verhalten von 3T3-Zellen auf mikrostrukturierten Polymeroberflächen
Es wurde untersucht, ob das Polymer P15 auf Goldoberflächen gestempelt werden
kann, ohne dabei das Schaltverhalten zu beeinflussen. Hierzu wurden 35 "m breite
Linien mit schaltbarem Polymer erzeugt. 50 "m breite Zwischenräume stellten den
unfunktionalisierten Bereich der Goldoberfläche dar.
Auf diese Oberfläche wurden 3T3 Fibroblasten ausgesät und beobachtet (Abbildung
4.19). Zellen auf einem unstrukturierten Bereich der Goldoberfläche zeigten innerhalb
von 4 h Kultivierung Adhärenz und Ausbreitung (Abbildung 4.19 A). Durch
Temperaturänderung konnte weder Zellabrundung noch Zellablösung in diesem
Bereich beobachtet werden (Abbildung 4.19 B). Auf dem strukturierten Bereich der
Goldoberfläche hingegen ordneten sich die Zellen nach 4 h Kultivierung in Linienform
auf der Oberfläche an (Abbildung 4.19 C). Dieses Muster entspricht der Anordnung
der gestempelten P15-Linien. Bemerkenswert ist, dass zwischen den Linien kaum
Zellen zu finden waren, obwohl diese zunächst gleichmäßig verteilt ausgesät worden
waren.
30 Minuten nach Änderung der Temperatur von 37 °C auf 25 °C waren ca. 70 - 80 %
der Zellen pro Gesichtsfeld rund und konnten dann durch vorsichtiges Spülen mit
einer Pipette von der Oberfläche entfernt werden (Abbildung 4.19 D).
ERGEBNISSE
77
Abbildung 4.19: Verhalten von 3T3-Zellen auf mikrostrukturiertem P15-Au bei
Temperaturänderung. Es wurde P15 in 35x50 "m Linien strukturiert auf einem Goldsubstrat
aufgebracht. 3T3 Fibroblasten wurden auf der strukturierten Polymeroberfläche für 4 h bei 37 °C
kultiviert. (A) Zelladhäsion und Zellausbreitung auf einem unstrukturiertem Bereich des Goldsubstrats.
(B) Nach Temperaturänderung auf 25 °C runden sich die Zellen in diesem Bereich weder ab noch
können sie durch vorsichtiges Wegspülen von dem Substrat abgelöst werden. (C) Die Zellen sind
nach 4 h Kultivierung bei 37 °C auf der strukturierten Polymeroberfläche adhärent und ausgebreitet.
(D) Nach Temperaturänderung auf 25 °C für 30 Minuten runden sich die Zellen ab und können
anschließend durch vorsichtiges Wegspülen vom Substrat entfernt werden. Maßstab: 100 "m.
4.6.2.2 Mikrostrukturierung von P15-Au mit Fibronektin
Es wurde das Zellverhalten auf mikrostrukturierten Oberflächen mit einem
zellattraktiven Bereich (extrazelluläre Matrixkomponente) und einem schaltbaren
Adhäsionsbereich (P15) beobachtet. Hierzu wurde auf P15-Au das extrazelluläre
Matrixprotein Fibronektin strukturiert in Form von 100 x 100 "m Linien gestempelt.
L929 wurden auf dieser strukturierten Oberfläche kultiviert und bei
Temperaturänderung beobachtet. Anschließend wurden die Zellen auf der
strukturierten Oberfläche über fluoreszenzmarkiertes Concanavalin (ConA) angefärbt
(siehe Kapitel 3.2). Mittels der ConA-Färbung können Zellen, Fibronektin sowie
migrationsbedingte Zellproteinreste (Zellspuren) auf der Oberfläche identifiziert
werden (Abbildung 4.20). Bei den Zellspuren handelt es sich um membranumhüllte
ERGEBNISSE
78
Strukturen, welche aus der Vor- und Rückzugsbewegung der Membran mit dem
Zytoskelett resultieren. Während der Rückzugsbewegung bleiben Aktinfilamente
aufgrund deren größeren Widerstands zurück, wodurch es zur Zellspurbildung auf
dem Substrat kommt (Fuhr et al., 1998). Die Zellspuren sind ein nützliches
Werkzeug, um die von der Zelle vollzogene Migrationsbewegung nachverfolgen zu
können.
Pro Gesichtsfeld sind etwa 80 – 90 % der Zellen auf den Fibronektin-Linien adhärent
und ausgebreitet (Abbildung 4.20 A). Bemerkenswert ist, dass trotz
Temperaturänderung (37 °C " 25 °C) in den auf P15-Au gestempelten Fibronektin-
Bereichen keine signfikante Protein- bzw. Zellablösung beobachtet werden konnte.
Offensichtlich sind die gestempelten Fibronektinschichten auf P15-Au zu dick, um
durch ein Schalten der Oberfläche bei Temperaturänderung abgelöst zu werden.
Abbildung 4.20: Verhalten von L929-Zellen auf mikrostrukturiertem Fibronektin-P15-Au
Substrat. Gestempeltes Fibronektin und L929 wurden über ConA angefärbt, um die
Mikrostrukturierung und das Wanderungsverhalten von Zellen sichtbar zu machen. (A) 80 - 90 % der
Zellen sind auf den Fibronektin-Linien (rot) adhärent und ausgebreitet. Zellen, die auf den P15-Au-
Bereichen (schwarz) sich befinden, sind aufgrund der Temperaturschaltung abgerundet. Maßstab: 100
"m. (B) Es gab Zellen, die von P15-Au (schwarz) auf Fibronektin (rot) migriert waren (weißer,
gestichelter Pfeil). Diese konnten anhand der angefärbten Zellspuren (Definition: siehe Text)
identifiziert werden. Maßstab: 50 "m.
Darüber hinaus wurden Zellen anhand der angefärbten Zellspuren beobachtet, die
von P15-Au auf Fibronektinbereiche migriert waren (Abbildung 4.20 B). Zellen, die
auf P15-Au verblieben, wurden aufgrund der Temperaturschaltung abgerundet bzw.
abgelöst.
79
5. Diskussion
Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung temperaturschaltbarer
Polymeroberflächen zur Kontrolle der Einzelzelladhäsion an Oberflächen. Neben
Funktionalität und Zellverträglichkeit wurden Haltbarkeit sowie Wiederverwendbarkeit
solcher Oberflächen näher untersucht. Durch die Integration dieser
Polymeroberflächen in mikrofluidische Systeme konnten adhärente Zellen kontrolliert
aus Mikrokanälen entfernt werden. Die Modifikation der schaltbaren
Polymeroberfläche erlaubte eine exakte Kontrolle über die Adhäsion
unterschiedlicher Zelladhäsionstypen (Fibroblasten, Osteoblasten). Mit Hilfe
mikrostrukturierter, temperaturschaltbarer Polymeroberflächen wurde der Ansatz
einer oberflächenbasierten Trennung migrationsaktiver und -inaktiver Zellen
weiterentwickelt.
5.1 Gold-Thiol-Chemie als Methode zur Herstellung von
Polymeroberflächen
Die Motivation der in dieser Arbeit eingesetzten
Oberflächenfunktionalisierungsmethode liegt in der Kontrollierbarkeit der
Oberflächeneigenschaften auf molekularer Ebene, um die Anwendungsmöglichkeiten
thermoresponsiver Polymeroberflächen zu verbessern und zu erweitern. Die
Kontrolle über die Eigenschaften thermoresponsiver Polymeroberflächen auf
molekularer Ebene ist mit den bisher beschriebenen Funktionalisierungsmethoden
nicht möglich (Yamada et al., 1990; Schmaljohann, 2005; Akiyama et al., 2004). Mit
Hilfe der Gold-Thiol-Chemie konnte im Rahmen dieser Arbeit reproduzierbare,
thermoresponsive Polymeroberflächen entwickelt werden, die sich sowohl durch eine
gute Kontrollierbarkeit der Oberflächeneigenschaften als auch durch eine hohe
Stabilität auszeichneten. Besonders die leichte Handhabbarkeit verbunden mit einem
geringen Material- und Geräteaufwand vereinfachten die Präparation solcher
Oberflächen. Der Grund für diese robusten Polymeroberflächen liegt an den
gebildeten, stabilen SAMs Thiol-terminierter, thermoresponsiver Copolymere (Vericat
et al., 2005). Durch die Untermischung unterschiedlicher Thiol-Moleküle an der
Goldoberfläche konnten thermoresponsive Polymeroberflächen individuell an
unterschiedliche Zelltypen angepasst werden.
DISKUSSION
80
5.2 Funktion und Zellverträglichkeit von P15-Au
Als Vorlage für die in dieser Arbeit verwendeten Copolymere dienten die PNIPAAm-
PEG-basierten Copolymere aus der Arbeit von Schmaljohann et al., 2003. Darin
wurden an PTFE-Oberflächen thermoresponsive PNIPAAm-PEG-Copolymere mit
unterschiedlichen, intramolekularen PEG-Gehalten polymerisiert, die eine LCST
nahe der Zellkultivierungstemperatur bei 37°C aufwiesen und aufgrund des PEG-
Anteils einen starken Zellablösungseffekt bei Temperaturänderung erzielen konnten.
Das Copolymer PNIPAAm-PEG(15%) wurde in der vorliegenden Arbeit als Thiol-
terminiertes Polymer (P15) an Goldoberflächen gebunden. Die Kontaktwinkelwerte
auf P15-Au waren etwas größer als die Kontaktwinkelwerte auf vergleichbaren
Polymeroberflächen (Schmaljohann et al., 2003). Aufgrund des geringeren PEG-
Gehalts von P15-Au ergeben sich größere Kontaktwinkelwerte, was auf eine
hydrophobere Oberfläche schließen lässt. L929 Fibroblasten konnten gut auf P15-Au
kultiviert werden und organisierten sich sowohl als Einzelzelle als auch als
Zellgruppen, was auf eine gute Zellverträglichkeit von P15-Au schließen lässt
(Abbildung 4.3 A, 4.4 A). Nach Temperaturänderung betrug die Zeit für eine
vollständige Ablösung eines adhärenten Zellverbands ca. 35 Minuten (Abbildung
4.3). Im Vergleich dazu berichtete Schmaljohann, 2005 eine Ablösung eines
adhärenten L929-Zellverbands auf einer PNIPAAm-PEG(23%)-Oberfläche nach 20
Minuten bei Temperaturänderung. Dieses Ergebnis kann darauf zurückgeführt
werden, dass die Polymeroberfläche von Schmaljohann, 2005 einen höheren
intramolekularen PEG-Gehalt als P15-Au aufweist. Da PEG eine hygroskopische
Eigenschaft besitzt, erhöht sich mit steigendem PEG-Gehalt die Hydratisierung der
gesamten Polymerschicht (Harris, 1992), wodurch sich Zellen schneller von der
Oberfläche ablösen. Andere Studien über die Zellablösung an PNIPAAm-PEG-
Oberflächen berichten, dass deren hergestellten Copolymeroberflächen einen
maximalen intramolekularen PEG-Gehalt von 0,5 wt%. aufweisen, damit die LCST
noch unterhalb von 37 °C liegt und somit Zellen auf der Oberfläche adhärieren
können (Kwon et al., 2003). Dies steht im Widerspruch zu den Daten der
vorliegenden Arbeit sowie der Arbeit von Schmaljohann, 2005. Gründe hierfür
könnten andere Polymerisations- oder Funktionalisierungsmethoden (z.B.
Elektronenstrahlverdampfer) sein, welche zu einer anderen Polymerstruktur bzw. -
verhalten an der Oberfläche führen. Dadurch können sich auch Änderungen im
Zelladhäsionsverhalten ergeben.
DISKUSSION
81
Die Ablösung von Einzelzellen auf P15-Au konnte mit nahezu gleich bleibendem
Zellabrundungsanteil (ca. 79 %) und Zellablösungszeiten reproduziert werden
(Abbildung 4E). Die gute Reproduzierbarkeit und hohe Stabilität von P15-Au
bestätigte sich durch die Untersuchung von Haltbarkeit und Wiederverwendbarkeit
solcher Oberflächen (Kapitel 4.4). Bisherige Studien auf PNIPAAm-PEG-basierten
Oberflächen haben diese Parameter bisher nicht näher betrachtet. Die Haltbarkeit
von P15-Au wurde im Bezug auf unterschiedliche Lagerungsbedingung (Vakuum,
Umgebungsluft, Temperatur) über einen Zeitraum von 6 Wochen näher untersucht
(Abbildung 4.6). Eine effiziente Zellablösung (70 – 90 %) war auf 2 Woche alten P15-
Au-Oberflächen, die bei Raumtemperatur unter Vakuum gelagert wurden, gegeben.
Eine längere Lagerung der Oberflächen ergab Schwankungen in der
Zellablösungsrate. Ursache hierfür könnten strukturelle Veränderungen oder
Kontaminationen an der Oberfläche während der Lagerung sein. Möglicherweise
könnten auch Inhomogenitäten an der Goldoberfläche während der
Oberflächenpräparation aufgetreten sein, die sich erst bei längerer Lagerung auf die
Oberflächenschaltbarkeit auswirkten. Anhand der Daten des 1.Versuchs nach 6
Wochen Lagerung lässt sich erkennen, dass die bis zu 6 Wochen alten P15-Au-
Oberflächen eine effiziente Oberflächenschaltbarkeit gewährleisteten. Für eine
genauere Aussage müssten hierzu noch mehrere Versuche durchgeführt werden.
Eine Lagerung bei Umgebungsluft ist aufgrund der undefinierten Luftbedingung nicht
zu empfehlen. Die Oberflächenschaltbarkeit der bei 40 °C gelagerten Oberflächen
reduzierte sich bei der Zellablösung deutlich, so dass diese für eine effiziente
Nutzung nicht einsetzbar sind.
Die Wiederverwendbarkeit von P15-Au wurde an einer frisch präparierten Oberfläche
(Tag 0) sowie an einer 1 Woche alten Oberfläche (Woche 1) untersucht. Auf beiden
Polymeroberflächen waren bei zweimaliger Nutzung hohe Zellablösungsraten (79 %
- 97 %) gegeben. Nach dreimaliger Nutzung war die Wiederverwendbarkeit der
Polymeroberfläche stark beeinträchtigt. Für beide Oberflächen sank die
Zellablösungsrate auf unter 50 %. Eine mögliche Ursache könnte die
Proteinadsorption auf P15-Au bei mehrmaliger Kultivierung sein. Durch PBS-
Behandlung der Oberflächen zwischen der jeweiligen Kultivierung sollten die
adsorbierten Proteine entfernt werden. Es wäre denkbar, dass die Proteine in die
Zwischenräume der einzelnen Polymere an die Goldoberfläche adsorbieren und
damit die Flexibilität der Polymerketten während des Schaltens beeinflussen.
DISKUSSION
82
Dadurch wäre das Hydratisierungsvermögen der Polymeroberfläche so vermindert,
dass für jeden weiteren Schaltzyklus die Oberflächenschaltbarkeit weiter abnimmt.
Die Anwendung schaltbarer Oberflächen soll die Handhabung adhärenter Zellen für
zellbiologische Fragestellungen erleichtern. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei
Anwendungen für die schaltbare Polymeroberfläche P15-Au aufgezeigt werden,
welche einen Beitrag zu einer einfacheren Handhabung adhärenter Zellen liefern
soll.
Die erste Anwendung ermöglicht eine definierte Kontrolle über das
Zelladhäsionsverhalten in mikrofluidischen Systemen. Durch die Integration der
schaltbaren Oberfläche P15-Au in ein mikrofluidisches System wurde ein System
entwickelt, welches zwei wesentliche Vorteile gegenüber bisherigen Methoden bietet.
Ein erster Vorteil dieses Systems liegt in der kontrollierten Zellablösung. Durch die in
mikrofluidischen Kanälen üblicherweise vorherrschenden laminaren Strömungen
konnten abgerundete bzw. abgelöste Zellen schonend und kontrolliert aus dem
Kanal transportiert werden. Mit der angelegten Strömung im Kanal konnte die zur
kompletten Zellablösung nötige Zellumströmungsgeschwindigkeit bestimmt werden.
Ein zweiter Vorteil dieses Systems liegt in der schonenden Zellablösung in dem
mikrofluidischen Kanal (Abbildung 4.5). Darin wurden Zellen auf P15-Au kultiviert und
durch Temperaturänderung schonend und effizient von der Polymeroberfläche
abgelöst, ohne dabei eine enzymatische Behandlung durchführen zu müssen.
Bisherige Untersuchungen über schonende Methoden zur Ablösung von Zellen
konnten zeigen, dass durch diese Art der Behandlung Zellen weniger geschädigt
bzw. weniger in Ihrem Verhalten beeinflusst werden als bei enzymatischen oder
mechanischen Ablösemethoden (Canavan et al., 2005). Die enzymatische Ablösung
von Zellen wird häufig in mikrofluidischen Kanälen eingesetzt (Weibel et al., 2005;
Takayama et al., 1999). Dadurch können nachfolgende Kultivierungen aufgrund von
enzymatischen Rückständen in den mikrofluidischen Kanälen erschwert werden.
Die Korrelation des Zellablösungsanteils mit der jeweils angelegten
Zellumströmungsgeschwindigkeit zeigte, dass 20 % aller abgerundeten Zellen von
der Polymeroberfläche nicht abgelöst werden konnten (Abbildung 4.5 E). Hierfür
können zwei Ursachen verantwortlich sein. Zum einen könnten sich während der
Oberflächenpräparation Inhomogenitäten ergeben haben, wodurch die verbliebenen
Zellen stärker auf der Oberfläche adhärieren konnten. Zum anderen ist es eine
DISKUSSION
83
Tatsache, dass nicht jede Zelle innerhalb einer Zellpopulation mit derselben
Adhäsionskraft auf der Oberfläche verweilt. Dies zeigt sich beispielsweise bei der
üblichen Zellkultivierung in Zellkulturschalen. Dort benötigen Zellen innerhalb einer
Population für Adhäsion und Ausbreitung unterschiedlich lange. Zudem können
enzymatische Behandlungen von Zellen dieses unterschiedliche Zellverhalten
verstärken, was wiederum zu einer Änderung des Zellteilungszyklus beitragen kann.
Die zweite Anwendung temperaturschaltbarer Oberflächen erweitert den Ansatz für
eine oberflächenbasierte Trennung von Zellen mit unterschiedlicher
Migrationsaktivität. Ziel der oberflächenbasierten Zelltrennung ist es, Zellen aufgrund
ihrer eigenen Aktivität zu trennen und diese dann für weiterführende Untersuchungen
verwenden zu können. Die oberflächenbasierte Zelltrennung erfolgt mit Hilfe von
mikrostrukturierten, schaltbaren Oberflächen. Hierfür wurde im Rahmen dieser Arbeit
zuerst die Methode der Mikrostrukturierung mittels einer Stempelvorrichtung an
Biotin-Streptavidin-Oberflächen optimiert, um Oberflächen mit einer höheren
Strukturschärfe, Homogenität und Reproduzierbarkeit zu erzeugen. An der
Stempelvorrichtung konnte mit Hilfe von Gewichten der Anpressdruck des Stempels
auf dem Substrat optimal eingestellt werden. Durch einen Anpressdruck von 43,1
kPa konnten mikrostrukturierte Biotin-Streptavidin-Oberflächen mit einem
reproduzierbaren, homogenen und strukturscharfen Stempelübertrag erzielt werden
(Abbildung 4.17, 4.18).
Mit dieser optimierten Oberflächenstrukturierungsmethode wurde nun versucht,
schaltbare, mikrostrukturierte Oberflächen für eine oberflächenbasierte Zelltrennung
zu entwickeln. Es konnte gezeigt werden, dass das temperaturschaltbare Polymer
P15 funktionell auf Goldoberflächen gestempelt werden konnte und darauf kultivierte
Fibroblasten sich entlang der P15-Linienstruktur anordneten (Abbildung 4.19 C, D).
Interessant dabei war, dass sich die Zellen auf den Polymerbereichen anordnen
und nicht auf der unfunktionalisierten Goldoberfläche. Auf unstrukturierten
Goldoberflächen adhärierten und breiteten sich die Zellen nach 4 h Kultivierung aus
(Abbildung 4.19 A). Hingegen auf unstrukturierter Polymeroberfläche betrug die
Kultivierungsdauer für Adhärenz und vollständige Zellausbreitung ca. 48 h. Dieser
Sachverhalt verhielt sich auf der strukturierten P15-Au-Oberfläche genau umgekehrt.
Deshalb liegt der Schluss nahe, dass für die Zelladhäsion nicht nur das Substrat
entscheidend ist, sondern auch die Oberflächentopographie (Tan und Saltzman,
2002; Liliensiek et al., 2006).
DISKUSSION
84
In einem zweiten Experiment wurde untersucht, ob auf P15-Au Fibronektin
mikrostruktiert aufgebracht werden konnte, um ein Substrat mit einem zellattraktiven
und einem schaltbaren Bereich herzustellen. Auf dieser strukturierten, schaltbaren
Oberfläche adhärierten und migrierten Zellen auf die Fibronektinbereiche (Abbildung
4.20). Zellen, die auf den Polymerbereichen adhärierten und keine Migration auf
Fibronektin vollzogen haben, konnten durch Temperaturänderung von der
Oberfläche abgerundet bzw. abgelöst werden. Dabei ist anzumerken, dass die
gestempelte Fibronektinschicht von der Polymeroberfläche bei Temperaturänderung
nicht abgelöst wird. Im Gegensatz dazu zeigt eine bisherige Studie, dass sich bei
Temperaturänderung kultivierte Zellschichten zusammen mit der EZM von der
thermoresponsiven Polymeroberfläche ablösen (Cheng et al., 2006). Vermutlich ist
die gestempelte Fibronektinschicht auf thermoresponsiver Polymeroberfläche bei
Temperaturänderung stabiler als aus Lösung adsorbierte Proteine.
Der in dieser Arbeit vorgestellte Ansatz der oberflächenbasierten Trennung von
Zellen ist bisher durch die Positionierung der Zellen auf dem Substrat limitiert. Für
eine effizientere Trennung von migrationspositiven und –negativen Zellen müssten
die Zellen zu Beginn der Kultivierung ausschließlich auf dem schaltbaren
Polymerbereich adhärieren, um deren Migrationsaktivität auf die Fibronektinbereiche
besser untersuchen zu können. Für dieses technische Problem konnte im zeitlichen
Rahmen dieser Arbeit keine Lösung gefunden werden.
5.3 Anpassung schaltbarer Oberflächen für eine
zelltypspezifische Adhäsionskontrolle
Die in dieser Arbeit entwickelten, thermoresponsiven Polymeroberflächen wurden
speziell für die Adhäsionskontrolle von Einzelzellen entwickelt, um die Untersuchung
von Einzelzellen zu erleichtern. Durch die Einzelzellanalytik kann eine präzisere
Information über die Zellheterogenität innerhalb einer Zellpopulation erhalten werden
als bei der Untersuchung eines Zellverbands (Svahn und van den Berg, 2007).
Aufgrund der unterschiedlichen Zelltypen (Fibroblasten, Osteoblasten) mit den
verschiedenen Adhäsionseigenschaften war eine Modifikation der Polymeroberfläche
nötig, um eine zelltypspezifische, effiziente und schonende Zellablösung zu
ermöglichen. Für die Optimierung der Schaltkinetik und der Schalteffizienz von
schaltbaren Polymeroberflächen wurde der PEG-Gehalt der Polymeroberfläche
DISKUSSION
85
erhöht, da PEG dafür bekannt ist, die Proteinadsorption bzw. Zelladhäsion an
Oberflächen zu reduzieren (Harris, 1992). Für die Erhöhung des PEG-Gehalts
wurden zwei Ansätze verfolgt. Zuerst wurde ein neues Copolymer mit einem
intramolekularen PEG-Gehalt von 19% wt. (P19) eingesetzt, da dieses Copolymer
eine LCST aufwies, welche noch unterhalb der optimalen Kultivierungstemperatur
von 37 °C lag (Abbildung 4.8). Dieses Ergebnis ist konsistent zu den bisherigen
LCST-Daten vergleichbarer Polymeroberflächen (Schmaljohann, 2005). Aus den
Kontaktwinkeldaten der hergestellten Polymeroberflächen P15-Au und P19-Au kann
man erkennen, dass P19-Au im Vergleich zu P15-Au niedrigere Kontaktwinkelwerte
im untersuchten Temperaturbereich aufweist (Abbildung 4.9). Dies deutet auf eine
höhere Hydrophilie von P19-Au hin. Aufgrund dessen, dass PEG eine
hygroskopische Eigenschaft besitzt (Harris, 1992), ist es nahe liegend, dass auf P19-
Au durch den höheren intramolekularen PEG-Gehalt eine höhere Hydrophilie
gegeben ist, als auf P15-Au. Der Temperaturabhängigkeitsverlauf der
Kontaktwinkeldaten von P15-Au und P19-Au war nahezu parallel. Das lässt auf eine
ähnliche Polymerstruktur und Schaltverhalten beider Polymeroberflächen schliessen.
In einem zweiten Ansatz wurde die leichte Handhabbarkeit und Flexibilität der Gold-
Thiol-Chemie ausgenutzt. Mit Hilfe dieser Methode können Oberflächen mit
unterschiedlicher molarer Zusammensetzung und Funktionalität hergestellt werden.
Dazu wurde der intermolekulare PEG-Gehalt an der Polymeroberfläche P19-Au
erhöht (P19/PG-Au). Aufgrund des höheren, intermolekularen PEG-Gehalts ergaben
sich auf P19/PG(1:6)-Au niedrigere Kontaktwinkelwerte als auf P19-Au. Dies lässt
eine höhere Hydrophilie von P19/PG(1:6)-Au erkennen. Der
Temperaturabhängigkeitsverlauf der Kontaktwinkeldaten von P19-Au und
P19/PG(1:6)-Au war nahezu parallel (Abbildung 4.12). Daraus lässt sich schließen,
dass das Verhalten der modifizierten, schaltbaren Polymeroberfläche ähnlich zu
dem Verhalten der unmodifizierten Polymeroberfläche ist. Die geringfügigen
Abweichungen des Temperaturabhängigkeitsverlaufs im Temperaturbereich
unterhalb der LCST (20 °C - 30 °C) zwischen P19-Au und P19/PG(1:6)-Au könnte
auf intermolekulare und intramolekulare, hydrophobe Wechselwirkungen
zurückzuführen sein. Auf P19-Au existieren theoretisch intramolekulare, hydrophobe
Wechselwirkungen innerhalb von P19 und intermolekulare, hydrophobe
Wechselwirkungen zwischen P19 und Goldoberfläche. Dagegen wäre auf
P19/PG(1:6)-Au denkbar, dass die intermolekulare, hydrophobe Wechselwirkungen
DISKUSSION
86
zwischen P19 und Goldoberfläche aufgrund des PG minimiert werden, wodurch
überwiegend intramolekulare, hydrophobe Wechselwirkungen innerhalb von P19
auftreten. Dieser Umstand könnte dazu führen, dass auf P19/PG(1:6)-Au für eine
vollständige Entfaltung des Polymers unterhalb der LCST (Hydratisierung) nur
intramolekulare hydrophobe Wechselwirkungen überwunden werden müssen, was
wiederum zu niedrigeren Kontaktwinkeln und einem flacheren Verlauf der
Kontaktwinkel im Temperaturbereich von 20 °C – 30 °C auf P19/RGD(1:8)-Au
beitragen könnte.
Ergänzend zu den Kontaktwinkeldaten wurde von P19-Au sowie von P19/PG(1:6)-Au
die Oberflächenzusammensetzung mittels XPS näher charakterisiert. Über einen
Abgleich des ermittelten Spektrums mit einem simulierten Spektrum konnte die
erwartete Oberflächenzusammensetzung von P19-Au bestätigt werden (Abbildung
4.10). Basierend auf den erhobenen Daten konnte eine Schichtdicke von ca. 3-4 nm
für P19-Au abgeleitet werden, was mit bisherigen Untersuchungsergebnissen von
Schichtdicken auf PNIPAAm-Au konsistent ist (Cho et al., 2004). Die XPS-Daten von
P19/PG(1:6)-Au deuteten daraufhin, dass das in Lösung eingestellte Thiol-Verhältnis
in einem nahezu ähnlichen Verhältnis an der Goldoberfläche gebunden wurde.
Die Zellverträglichkeit und die Schaltbarkeit der in dieser Arbeit entwickelten,
thermoresponsiven Polymeroberflächen wurden über das Zelladhäsionsverhalten
getestet. Nach 3-tägiger Kultivierung von L929 Fibroblasten auf P15-Au und P19-Au
wurde im Vergleich deutlich, dass die adhärenten Zellen auf P19-Au nach 3 Tagen
geringfügig weniger ausgebreitet waren als auf P15-Au (Abbildung 4.11). Dies kann
möglicherweise aus dem höheren intramolekularen PEG-Gehalt von P19-Au
resultieren, der auf einer dehydratisierten Polymeroberfläche (37 °C) zu einer
langsameren Zellausbreitung beitragen kann. Die Zellablösung bei 25 °C war auf
P19-Au bei gleich bleibendem Zellabrundungsanteil doppelt so schnell. Dieser
erwartete Effekt ergibt sich aus dem höheren intramolekularen PEG-Gehalt, welcher
zu einer stärkeren Hydratisierung der Oberfläche beiträgt.
Die Schaltbarkeit von der modifizierten Polymeroberfläche P19/PG(1:6)-Au wurde
über das Zelladhäsionsverhalten von MG63 Zellen getestet (Abbildung 4.13B), die
als stark adhärente Zellen bekannt sind (Kieswetter et al., 1996). MG63 konnten gut
auf P19/PG(1:6)-Au kultiviert werden, was auf eine gute Zellverträglichkeit schließen
lässt. Nach Temperaturänderung lösten sich ca. 74 % der Zellen innerhalb von 30
DISKUSSION
87
Minuten ab. Auf Polymeroberflächen mit einem höheren oder niedrigeren
intermolekularen PEG-Gehalt konnten die Zellen entweder nicht adhärieren oder sich
bei Temperaturänderung nicht ablösen.
Die Betrachtung der Ergebnisse der Zellablösung sowie der Kontaktwinkelmessung
auf P19-Au und P19/PG(1:6)-Au zeigen, dass durch Modifikation von P19-Au mit PG
die Oberflächenbenetzbarkeit zwar verändert wurde, aber der Schaltmechanismus
der Polymeroberfläche dadurch nicht beeinflusst wurde.
Ein Grund für die relativ langandauernde Zelladhäsion und –ausbreitung (3 Tage) auf
unmodifizierter P19-Au war vermutlich der zu hohe intramolekulare PEG Anteil. Da
dies für die praktische Verwendung eine sehr lange Zeit ist, wurde versucht, die
Oberfläche derart zu modifizieren, dass sie für L929 Zellen eine bessere und
schnellere Adhäsion ermöglicht. Es wurde eine Coadsorption von P19 mit dem aus
der Literatur bekannten Fibroblasten-attraktiven CGGRGDS-Peptid in
unterschiedlichen Mischungsverhältnissen an Goldoberflächen durchgeführt (Hersel
et al., 2003). Die Modifikation von P19-Au für schwach adhärente Zelltypen
ermöglichte eine Verkürzung der Kultivierungsdauer auf diesen Oberflächen, was für
weiterführende Experimente einen großen zeitlichen Gewinn bot. Es wurden
modifizierte Polymeroberflächen mit unterschiedlichen Anteilen von P19 und RGD
hergestellt. Der Vergleich der Kontaktwinkeldaten zwischen P19-Au und
P19/RGD(1:8)-Au zeigte, dass der Temperaturabhängigkeitsverlauf von
P19/RGD(1:8)-Au gegenüber P19-Au flacher war (Abbildung 4.14). Dies könnte auf
intermolekulare und intramolekulare, hydrophobe Wechselwirkungen zurückzuführen
sein. Auf P19-Au existieren vermutlich intramolekulare, hydrophobe
Wechselwirkungen innerhalb von P19 und intermolekulare, hydrophobe
Wechselwirkungen zwischen P19 und Goldoberfläche. Dagegen wäre auf
P19/RGD(1:8)-Au denkbar, dass die intermolekulare, hydrophobe Wechselwirkungen
zwischen P19 und Goldoberfläche aufgrund des RGD minimiert werden, wodurch
überwiegend intramolekulare, hydrophobe Wechselwirkungen innerhalb von P19
auftreten. Dieser Umstand könnte dazu führen, dass auf P19/RGD(1:8)-Au für eine
vollständige Entfaltung des Polymers unterhalb der LCST (Hydratisierung) nur
intramolekulare hydrophobe Wechselwirkungen überwunden werden müssen, was
wiederum zu niedrigeren Kontaktwinkeln und einem flacheren Verlauf der
Kontaktwinkel im Temperaturbereich von 20 °C – 30 °C auf P19/RGD(1:8)-Au
DISKUSSION
88
beitragen könnte. Die Schaltbarkeit von P19/RGD(1:8)-Au wurde über das
Zelladhäsionsverhalten von L929 Zellen getestet (Abbildung 4.15). Auf
P19/RGD(1:8)-Au war die Zelladhäsion und Zellausbreitung deutlich schneller als auf
P19-Au (Abbildung 4.15 B). Dieses Zellverhalten ist auf das RGD-Peptid
zurückzuführen, wodurch die Affinität der Zelle zum Substrat verstärkt wird. Dies ist
konsistent zu bisherigen Zelladhäsionsstudien an RGD-funktionalisierten
Oberflächen (Hersel et al., 2003; Ebara et al., 2004). Der Zellabrundungsanteil auf
P19/RGD(1:8)-Au blieb im Vergleich zu P19-Au auf einem gleich hohen Niveau.
Die Anwendung der Gold-Thiol-Chemie zur Modifikation temperaturschaltbarer
Polymeroberflächen hat gezeigt, dass mit Hilfe dieser Methode schaltbare
Oberflächen hergestellt werden können, die der komplexen Anforderung an eine
individuelle Zelladhäsionskontrolle gerecht werden. Durch die bisherig
beschriebenen Oberflächenfunktionalisierungsmethoden (Schmaljohann et al., 2003;
Yamada et al., 1990) wäre die Herstellung solcher Oberflächen für eine individuelle
Zelladhäsionskontrolle ein äußerst schwierig kontrollierbarer Prozess.
89
6. Ausblick
Die im Rahmen dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse bieten einen Ansatz für
weiterführende Entwicklungen und Anwendungen im Hinblick auf eine effiziente,
kontrollierte und schonende Ablösung adhärenter Zellen.
Die Gold-Thiol-Chemie hat sich als eine einfache und effiziente
Oberflächenfunktionalisierungsmethode für die funktionelle Anbindung
thermoresponsiver Polymere herausgestellt. Sie gewährleistet eine große
Oberflächenstabilität und gute Reproduzierbarkeit. Mit Hilfe dieser Methode konnten
schaltbare Oberflächen für eine zelltypspezifische Kontrolle des Adhäsionsverhaltens
entwickelt werden. Die individuell-angepaßten Polymeroberflächen für
unterschiedliche Zelltypen (Osteoblasten, Fibroblasten) können für Einzelzell-
basierte Analysen eingesetzt werden. Diese haben zum Ziel, die Wechselwirkung
einzelner Zellen mit ihrer Umgebung zu untersuchen, um eine präzisere Information
über die Heterogenität einer Zellpopulation zu erhalten. Eine wichtige Voraussetzung
für diese Untersuchungen ist, Zellen so wenig wie nur möglich in ihrem Verhalten zu
beeinflussen, um eine Verfälschung der Information bzgl. der Zellheterogenität zu
vermeiden. Hierzu werden die in dieser Arbeit entwickelten Oberflächen einen
wesentlichen Beitrag leisten können.
Um das Potential schaltbarer Oberflächen zu erweitern, könnte die
Oberflächeneigenschaft für eine beschleunigte Adhäsion schwach adhärenter Zellen
(z.B. HEK293) noch individueller angepasst werden. Hierzu wären für die
Modifikation von Polymeroberflächen statt RGD-Peptide auch andere zellattraktive
Peptidmotive (z.B. GFOGER (Kollagen), NRDKETKV (Cadherin)) denkbar. Damit
würde das „Sortiment an Molekülen“ für die Modifikation schaltbarer Oberflächen
erweitert werden, wodurch dieses System für eine Vielzahl unterschiedlicher
Zelltypen einsetzbar wäre.
Für eine beschleunigte Zellablösung stark adhärenter Zelltypen (z.B. Chondrozyten)
wäre es sinnvoll, eine noch genauere Charakterisierung thermoresponsiver
Polymeroberflächen im Bezug auf deren Schalteigenschaft (Schaltkinetik /
Schalteffizienz) durchzuführen.
Ein möglicher Ansatz hierzu wäre die Messung der Abrisskraft von Zellen an
thermoresponsiven Oberflächen bei unterschiedlichen Temperaturen. Daraus könnte
AUSBLICK
90
man eine Information über die jeweilige Zelladhäsionskraft an diesen Oberflächen
ableiten und die Kontrolle über die Adhäsion unterschiedlicher Zelltypen durch
entsprechende Oberflächenmodifikation optimieren. Im Rahmen einer Kooperation
mit der TU Dresden konnten erste, viel versprechende Ergebnisse hinsichtlich der
Oberflächencharakterisierung erzielt werden, die künftig weiterverfolgt werden sollte.
In der Untersuchung wurde eine Zelle an einen Kantilever eines AFM (engl. atomic
force microscope) fixiert und die thermoresponsive Oberfläche mit der Zelle in
Kontakt gebracht. Danach wurde der Kantilever mit der Zelle wieder von der
Oberfläche entfernt und die Abrisskraft der Zelle an der Oberfläche gemessen. Dies
wurde bei unterschiedlichen Temperaturen (37 °C, 25 °C) durchgeführt. Die ersten
Ergebnisse deuten auf ein schwächeres Adhäsionsverhalten bei 25 °C als bei 37 °C
hin.
Die Untersuchung der Stabilität von P15-Au zeigte, dass diese Oberfläche eine lange
Haltbarkeit sowie eine häufige Wiederverwendbarkeit für Zellablösungsversuche
ermöglicht. Aufgrund des zeitlichen Rahmens dieser Arbeit konnten die modifizierten
Polymeroberflächen (P19/PG-Au, P19/RGD-Au) hinsichtlich ihrer Stabilität
(Haltbarkeit, Wiederverwendbarkeit) nicht näher untersucht werden. Für eine
zukünftige, kommerzielle Nutzung solcher Oberflächen ist dies jedoch ein wichtiger
Parameter, der künftig näher betrachtet werden sollte.
Der Ansatz mikrostrukturierter, schaltbarer Oberflächen für eine oberflächenbasierte
Trennung ist eine interessante Anwendung für die Separation migrationsaktiver und
–inaktiver Zellen. Dieses Prinzip bietet den wesentlichen Vorteil gegenüber anderen
Systemen wie z.B. der FACS-Messung (engl. fluorescence activated cell sorter),
dass für eine Separation von Zellen keine Antikörper oder Färbungen nötig sind, die
ein weiteres Arbeiten mit separierten Zellen unmöglich machen. Für eine
Weiterentwicklung dieses Ansatzes müsste das technische Problem der
Zellpositionierung auf den schaltbereichen Bereichen des mikrostrukturierten
Substrats gelöst werden.
Alle aus dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse könnten auf andere
gebräuchlichere Oberflächenmaterialien übertragen werden, um eine effizientere
Nutzung sowie eine Erweiterung der Anwendbarkeit solcher Systeme zu erreichen.
91
Literaturverzeichnis
Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M. & Okano, T. (2004) Ultrathin poly(N-
isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell
adhesion/detachment control. Langmuir 20, 5506-5511.
Bae, Y., Okano, T. & Kim, S. (1990) Temperature dependence of swelling of
crosslinked poly(N,N-alkyl substituted acrylamides) in water. Journal of
Polymer Science Part B: Polymer Physics 28, 923-936.
Becker, H. & Locascio, L. E. (2002) Polymer microfluidic devices. Talanta 56, 267.
Beebe, D. J., Mensing, G. A. & Walker, G. M. (2002) Physics and applications of
microfluidics in biology. Annual Review of Biomedical Engineering 4, 261-286.
Bernard, A., Michel, B. & Delamarche, E. (2001) Micromosaic immunoassays. Anal.
Chem. 73, 8-12.
Brunette, D. (2001) Principles of cell behaviour on titanium surfaces and their
application to implanted devices; Titanium in medicine. Springer-Verlag,
Heidelberg, 485-512.
Canavan, H. E., Cheng, X., Graham, D. J., Ratner, B. D. & Castner, D. G. (2005) Cell
sheet detachment affects the extracellular matrix: a surface science study
comparing thermal liftoff, enzymatic, and mechanical methods. J Biomed
Mater Res A 75, 1-13.
Chen, G., Imanishi, Y. & Ito, Y. (1998) Effect of protein and cell behavior on pattern-
grafted thermoresponsive polymer. Journal of Biomedical Materials Research
42, 38-44.
Cheng, J., Shoffner, M. A., Hvichia, G. E., Kricka, L. J. & Wilding, P. (1996) Chip
PCR. II. Investigation of different PCR amplification systems in
microbabricated silicon-glass chips. Nucl. Acids Res. 24, 380-385.
Cheng, X., Canavan, H. E., Graham, D. J., Castner, D. G. & Ratner, B. D. (2006)
Temperature dependent activity and structure of adsorbed proteins on plasma
polymerized N-isopropyl acrylamide. Biointerphases 1, 61-72.
Cho, E. C., Kim, Y. D. & Cho, K. (2004) Thermally responsive poly(N-
isopropylacrylamide) monolayer on gold: synthesis, surface characterization,
and protein interaction/adsorption studies. Polymer 45, 3195.
da Silva, R. M. P., Mano, J. F. & Reis, R. L. (2007) Smart thermoresponsive coatings
and surfaces for tissue engineering: switching cell-material boundaries. Trends
in Biotechnology 25, 577-583.
Delamarche, E., Michel, B., Biebuyck, H. & Gerber, C. (1996) Golden interfaces: The
surface of self-assembled monolayers. Advanced Materials 8, 719-729.
LITERATURVERZEICHNIS
92
Derewenda, Z., Yariv, J., Helliwell, J., Kalb, A., Dodson, E., Papiz, M. & Wan, T.
(1989) The structure of the saccharide-binding site of concanavalin A. Embo J
8, 2189-2193.
Dörfler, H. (2002) Grenzflächen und kolloid-disperse Systeme. Physik und Chemie.
Springer-Verlag, Berlin.
Dubois, L. H. & Nuzzo, R. G. (1992) Synthesis, Structure, and Properties of Model
Organic Surfaces. Annual Review of Physical Chemistry 43, 437-463.
Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A. & Whitesides, G. M. (1998) Rapid
Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70,
4974-4984.
Duracher, D., Sauzedde, F., Elaissari, A., Perrin, A. & Pichot, C. (1998) Cationic
amino-containing N -isopropyl- acrylamide–styrene copolymer latex particles:
1-Particle size and morphology vs. polymerization process. Colloid & Polymer
Science 276, 219.
Ebara, M., Yamato, M., Aoyagi, T., Kikuchi, A., Sakai, K. & Okano, T. (2004)
Temperature-responsive cell culture surfaces enable "on-off" affinity control
between cell integrins and RGDS ligands. Biomacromolecules 5, 505-510.
Ebberink, J., Ehrmann, R. & Menken, G. (1984) Anwenderbezogene ESCA-
Oberflächenuntersuchungen in der industriellen Technik. Fresenius' Journal of
Analytical Chemistry 319, 809-811.
Elbert, D. L. & Hubbell, J. A. (1996) Surface treatments of polymers for
biocompatibility. Annual Review of Materials Science 26, 365-294.
Ernst, O., Lieske, A., Jager, M., Lankenau, A. & Duschl, C. (2007) Control of cell
detachment in a microfluidic device using a thermo-responsive copolymer on a
gold substrate. Lab on a Chip 7, 1322-1329.
Figeys, D. & Pinto, D. (2000) Lab-on-a-chip: a revolution in biological and medical
sciences. Anal.Chem. 72, 330A-335A.
Fuhr, G., Richter, E., Zimmermann, H., Hitzler, H., Niehus, H. & Hagedorn, R. (1998)
Cell traces- footprints of individual cells during locomotion and adhesion. Biol.
Chem 379, 1161-1173.
Fujita, K., Nakamura, N., Ohno, H., Leigh, B. S., Niki, K., Gray, H. B. & Richards, J.
H. (2004) Mimicking Protein-Protein Electron Transfer: Voltammetry of
pseudomonas aeruginosa azurin and the thermus thermophilus CuA Domain
at w-derivatized Self-Assembled-Monolayer Gold Electrodes. J. Am. Chem.
Soc. 126, 13954-13961.
LITERATURVERZEICHNIS
93
Gast, F. U., Dittrich, P. S., Schwille, P., Weigel, M., Mertig, M., Opitz, J., Queitsch, U.,
Diez, S., Lincoln, B., Wottawah, F., Schinkinger, S., Guck, J., Käs, J.,
Smolinski, J., Salchert, K., Werner, C., Duschl, C., Jäger, M. S., Uhlig, K.,
Geggier, P. & Howitz, S. (2006) The microscopy cell (MicCell), a versatile
modular flowthrough system for cell biology, biomaterial research, and
nanotechnology. Microfluidics and Nanofluidics 2, 21.
Grinell, F. & Feld, M. (1982) Fibronectin adsorption on hydrophilic and hydrophobic
surfaces detected by antibody binding and analyzed during cell adhesion in
serum-containing medium. J. Biol. Chem. 257, 4888-4893.
Harris, J. M. (1992) Introduction to biotechnical and biomedical application of
poly(ethylene glycol). In: Harris JM, editor. Poly(ethylene glycol) chemistry.
New York: Plenum Press.
Hersel, U., Dahmen, C. & Kessler, H. (2003) RGD modified polymers: biomaterials
for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials 24, 4385.
Heskins, M. & Guillet, J. E. (1968) Solution properties of poly(N-isopropylacrylamide).
J. Macromol. Sci. Chem. A2, 1441-1455.
Hirose, M., Yamato, M., Kwon, O. H., Harimoto, M., Kushida, A., Shimizu, T., Kikuchi,
A. & Okano, T. (2000) Temperature-responsive surface for novel co-culture
systems of hepatocytes with endothelial cells: 2-D patterned and double
layered co-cultures. Yonsei Med J 41, 803-813.
Horbett, T. & Lew, K. (1994) Residence time effects on monoclonal antibody binding
to adsorbed fibrinogen. J Biomater Sci Polym Ed 6, 15-33.
Horwitz, A. R. & Parsons, J. T. (1999) Cell biology: cell migration- movin' on. Science
286, 1102-1103.
Huber, D. L., Manginell, R. P., Samara, M. A., Kim, B.-I. & Bunker, B. C. (2003)
Programmed adsorption and release of proteins in a microfluidic device.
Science 301, 352-354.
Hynes, R. (1992) Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell
69, 11-25.
Ide, T., Nishida, K., Yamato, M., Sumide, T., Utsumi, M., Nozaki, T., Kikuchi, A.,
Okano, T. & Tano, Y. (2006) Structural characterization of bioengineered
human corneal endothelial cell sheets fabricated on temperature-responsive
culture dishes. Biomaterials 27, 607-614.
Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okanob, K. & Yasuda, K. (2001) On-chip
culture system for observation of isolated individual cells. Lab Chip 1, 50-55.
Ito, Y., Chen, G., Guan, Y. & Imanishi, Y. (1997) Patterned immobilization of
thermoresponsive polymer. Langmuir 13, 2756-2759.
LITERATURVERZEICHNIS
94
Jung, C., Dannenberger, O., Xu, Y., Buck, M. & Grunze, M. (1998) Self-assembled
monolayers from organosulfur compounds: A comparison between sulfides,
disulfides, and thiols. Langmuir 14, 1103-1107.
Jungbauer, S., Kemkemer, R., Gruler, H., Kaufmann, D. & Spatz, J. (2004) Cell
shape normalization, dendrite orientation, and melanin production of normal
and genetically altered (haploinsufficient NF1)-melanocytes by microstructured
substrate interactions. Chemphyschem 5, 85-92.
Kaehler, J., Zilla, P., Fasol, R., Deutsch, M. & Kadletz, M. (1989) Precoating
substrate and surface configuration determine adherence and spreading of
seeded endothelial cells on polytetrafluoroethylene grafts. J Vasc. Surg. 9,
535-541.
Kang, J. & Rowntree, P. A. (2007) Gold film surface preparation for self-assembled
Monolayer Studies. Langmuir 23, 509-516.
Kieswetter, K., Schwartz, Z., Hummert, T.W., Chochran, D.L., Simpson, J., Dean,
D.D., Boyan, B.D. (1996) Surface roughness modulates the local production of
growth factors and cytokines by osteoblast-like MG63 cell. J Biomed Mater
Res 32, 55-63.
Knight, C., Morton, L., Reachey, A., Tuckwell, D., Farndale, R. & Barnes, M. (2000)
The collagen-binding A-domains of integrins a1b1 and a2b1 recognize the same
specific amino acid sequence, GFOGER, in native (triple-helical) collagens.
Journal of Biological Chemistry 275, 35-40.
Kopecek, J. (2007) Hydrogel biomaterials: A smart future? Biomaterials 28, 5185-
5192.
Kumar, A. & Whitesides, G. M. (1993) Features of gold having micrometer to
centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with
an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink'' followed by chemical etching.
Applied Physics Letters 63, 2002-2004.
Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Sakurai, Y. & Okano, T. (2000) Rapid cell
sheet detachment from Poly(N-isopropylacrylamide)-grafted porous cell
culture membranes. Journal of Biomedical Materials Research 50, 82-89.
Larsericsdotter, H., Oscarsson, S. & Buijs, J. (2005) Structure, stability, and
orientation of BSA adsorbed to silica. Journal of Colloid and Interface Science
289, 26-35.
Lee, W.-F. & Shieh, C.-H. (1999) pH-thermoreversible hydrogels. I. Synthesis and
swelling behaviors of the (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide-co-2-
hydroxyethyl methacrylate) copolymeric hydrogels. Journal of Applied Polymer
Science 71, 221-231.
Li Jeon, N., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van De Water, L. &
Toner, M. (2002) Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of
interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat Biotech 20, 826-830.
LITERATURVERZEICHNIS
95
Li, Y. & Tanaka, T. (1992) Phase transitions of gels. Annual Review of Materials
Science 22, 243-277.
Liliensiek, S., Campbell, S., Nealey, P. & Murphy, C. (2006) The scale of substratum
topographic features modulates proliferation of corneal epithelial cells and
corneal fibroblasts. Journal of Biomedical Materials Research Part A 79A,
185-192.
Miyata, T., Uragami, T. & Nakamae, K. (2002) Biomolecule-sensitive hydrogels.
Advanced Drug Delivery Reviews 54, 79-98.
Morra, M., Occhiello, E., Marola, R., Garbassi, F., Humphrey, P. & Johnson, D.
(1990) On the aging of oxygen plasma-treated polydimethylsiloxane surfaces.
Journal of Colloid and Interface Science 137, 11-24.
Moser, I., Jobst, G., Svasek, P., Varahram, M. & Urban, G. (1997) Rapid liver
enzyme assay with miniaturized liquid handling system comprising thin film
biosensor array. Sensors and Actuators B: Chemical 44, 377.
Moulder, J., Stickle, W., Sobol, P. & Bomben, K. (1995) Handbook of X Ray
Photoelectron Spectroscopy: A Reference Book of Standard Spectra for
Identification and Interpretation of Xps Data. Physical Electronics.
Mrksich, M. (2000) A surface chemistry approach to studying cell adhesion. Chemical
Society Reviews 29, 267-273.
Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D. & Whitesides, G. M. (1997) Using
microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-
assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and
silver. Experimental Cell Research 235, 305-313.
Nayak, S. & Lyon, L. A. (2005) Weiche Nanotechnologie mit weichen Nanopartikeln.
Angewandte Chemie 117, 7862-7886.
Ng, J., Gitlin, I., Stroock, A. & Whitesides, G. (2002) Components for integrated
poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. ELECTROPHORESIS 23, 3461-
3473.
Okano, T., Bae, Y. H. & Kim, S. W. (1990) Temperature responsive controlled drug.
In: Kost J (editor). Pulsed and self-regulated drug delivery. Bac Ration,
FL:CRC Press, 17-46.
Ostuni, E., Yan, L. & Whitesides, G. (1999) The interaction of proteins and cells with
self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold and silver. Colloids and
Surfaces B: Biointerfaces 15, 3-30.
Pfaff, M. (1997) Recognition sites of RGD-dependent integrins; Integrin-ligand
interaction. Springer-Verlag, Heidelberg, 101-121.
LITERATURVERZEICHNIS
96
Pierschbacher, M. D. & Ruoslahti, E. (1984) Cell attachment activity of fibronectin
can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature 309,
30.
Platé, N. A., Lebedeva, T. L. & Valuev, L. I. (1999) Lower critical solution temperature
in aqueous solutions of N-alkyl-substituted polyacrylamides. Polymer Journal
31, 21-27.
Poirier, G. E. & Pylant, E. D. (1996) The self-assembly mechanism of alkanethiols on
Au(111). Science 272, 1145-1148.
Prime, K. & Whitesides, G. M. (1993) Adsorption of proteins onto surfaces containing
end-attached oligo(ethylene oxide): a model system using self-assembled
monolayers. J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721.
Raty, S., Davis, J., Beebe, D., Rodriguez-Zas, S. & Wheeler, M. (2001) Culture in
microchannels enhances in vitro embryonic development of preimplantation
mouse embryos. Theriogenology 55, 241.
Schmaljohann, D. (2005) Thermo-responsive polymers and hydrogels in tissue
engineering. e-polymers no.21., 1-17.
Schmaljohann, D. (2006) Thermo- and pH-responsive polymers in drug delivery. Adv
Drug Deliv Rev 58, 1655-1670.
Schmaljohann, D., Oswald, J., Jorgensen, B., Nitschke, M., Beyerlein, D. & Werner,
C. (2003) Thermo-responsive PNiPAAm-g-PEG films for controlled cell
detachment. Biomacromolecules 4, 1733-1739.
Schrum, D. P., Culbertson, C. T., Jacobson, S. C. & Ramsey, J. M. (1999) Microchip
flow cytometry using electrokinetic focusing. Anal. Chem. 71, 4173-4177.
Seah, M. (1980) The quantitative analysis of surfaces by XPS: A Review. Surface
and Interface Analysis 2, 222-239.
Shoffner, M. A., Cheng, J., Hvichia, G. E., Kricka, L. J. & Wilding, P. (1996) Chip
PCR. I. Surface passivation of microfabricated silicon-glass chips for PCR.
Nucl. Acids Res. 24, 375-379.
Sia, S. & Whitesides, G. (2003) Microfluidic devices fabricated in
Poly(dimethylsiloxane) for biological studies. ELECTROPHORESIS 24, 3563-
3576.
Siegers, C., Biesalski, M. & Haag, R. (2004) Self-assembled monolayers of dendritic
polyglycerol derivatives on gold that resist the adsorption of proteins. Chem.
Eur. J 10, 2831-2838.
Spurk, J. H. (2003) Strömungslehre. Eine Einführung in die Theorie der Strömungen.
Springer-Verlag, Berlin.
LITERATURVERZEICHNIS
97
Suzuki, A. & Tanaka, T. (1990) Phase transition in polymer gels induced by visible
light. Nature 346, 345.
Svahn, H. A. & van den Berg, A. (2007) Single cells or large populations? Lab Chip
7, 544-546.
Takayama, S., McDonald, J. C., Ostuni, E., Liang, M., Kenis, P., Ismagilov, R. &
Whitesides, G. M. (1999) Patterning cells and their environments using
multiple laminar fluid flows in capillary networks. Cell Biology 96, 5545-5548.
Takei, Y. G., Aoki, T., Sanui, K., Ogata, N., Sakurai, Y. & Okano, T. (1994) Dynamic
contact angle measurement of temperature-responsive surface properties for
poly(N-isopropylacrylamide) grafted surfaces. Macromolecules 27, 6163-6166.
Takezawa, T., Mori, Y. & Yoshizato, K. (1990) Cell culture on a thermo-responsive
polymer surface. Biotechnology (N Y) 8, 854-856.
Tan, J. & Saltzman, W. (2002) Topographical control of human neutrophil motility on
micropatterned materials with various surface chemistry. Biomaterials 23,
3215-3225.
Tanaka, T., Nishio, I., Sun, S.-T. & Ueno-Nishio, S. (1982) Collapse of gels in an
electric field. Science 218, 467-469.
Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M., Bertozzi, C. & Zhang, M. (2007) Single-cell-based
sensors and synchrotron FTIR spectroscopy: A hybrid system towards
bacterial detection. Biosensors and Bioelectronics
23, 253-260.
Vericat, C., Vela, M. E. & Salvarezza, R. C. (2005) Self-assembled monolayers of
alkanethiols on Au(111): surface structures, defects and dynamics. Phys
Chem Chem Phys 7, 3258-3268.
Vo-Dinh, T., Cullum, B. M. & Stokes, D. L. (2001) Nanosensors and biochips:
frontiers in biomolecular diagnostics. Sensors and Actuators B: Chemical 74,
1-3, 2-11.
Vohra, R., Thomson, G., Carr, H., Sharma, H. & Walker, M. (1991) Comparison of
different vascular prostheses and matrices in relation to endothelial seeding.
Br J Surg 78, 417-420.
Walker, G. M., Ozers, M. S. & Beebe, D. J. (2002) Insect cell culture in microfluidic
channels. Biomedical Microdevices 4, 161-166.
Wei, J., Yoshinari, M., Takemoto, S., Hattori, M., Kawada, E., Liu, B. & Oda, Y.
(2007) Adhesion of mouse fibroblasts on hexamethyldisiloxane surfaces with
wide range of wettability. Journal of Biomedical Materials Research Part
B:Applied Biomaterials 81 B, 66-75.
Weibel, D. B., Garstecki, P. & Whitesides, G. M. (2005) Combining microscience and
neurobiology. Current Opinion in Neurobiology 15, 560-567.
LITERATURVERZEICHNIS
98
Weiß, N., Klee, D. & Höcker, H. (2001) Konzept zur bioaktiven Ausrüstung von
Metallimplantatoberflächen. Biomaterialien 2, 81-86.
Whitesides, G. M. (2006) The origins and the future of microfluidics. Nature 442, 368-
373.
Xia, Y. & Whitesides, G. M. (1998) Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-
184.
Xu, J. & Li, H. (1995) The chemistry of self-assembled long-Chain alkanethiol
monolayers on gold. Journal of Colloid and Interface Science 176, 138-149.
Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y. & Sakurai, Y. (1990)
Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment
of cultured cells. Die Makromolekulare Chemie, Rapid Communications 11,
571-576.
Yamato, M., Utsumi, M., Kushida, A., Konno, C., Kikuchi, A. & Okano, T. (2001)
Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered
keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng 7,
473-480.
Yoshida, R., Sakai, K., Okano, T. & Sakurai, Y. (1993) Pulsatile drug delivery
systems using hydrogels. Advanced Drug Delivery Reviews 11, 85-108.
99
Anhang
ANHANG
100
A1: Kontaktwinkeldaten funktionalisierter / unfunktionalisierter Goldoberflächen im
Temperaturbereich von 20 – 45 °C. Die Nummerierungen 1-5 stellen die jeweilige Messung dar.
stat.: statisch ermittelter Kontaktwinkelwinkel; fw.: Fortschreitwinkel; rev.: Rückzugswinkel; MW:
Mittelwert; Stabw: Standardabweichung; SEM: Standardabweichung des Mittelwerts.
ANHANG
101
A2: Zellablösunganteil von L929 Fibroblasten auf P15-Au in einem mikrofluidischen Kanal bei unterschiedlichen Flussraten. MW: Mittelwert; Stabw:
Standardabweichung; SEM: Standardabweichung des Mittelwerts.
ANHANG
102
A3: Zellabrundungsanteil von L929 Fibroblasten auf P15-Au und P19-Au nach
Temperaturänderung (37 °C - 25 °C) über die Zeit. Nummerierung 1-3: jeweiliger Versuch; MW:
Mittelwert; Stabw: Standardabweichung; SEM: Standardabweichung des Mittelwerts.
A4: Zellabrundungsanteil von L929 Fibroblasten auf P15-Au bei unterschiedlichen
Lagerungszeiten und mehreren Schaltzyklen. Nummerierung 1-3: jeweiliger Schaltzyklus;
Lagerzeiten: Tag 0, Woche 1.
A5: Zellabrundungsanteil von L929 Fibroblasten auf P15-Au bei unterschiedlichen
Lagerungszeiten und- bedingungen. RT: 25 °C, Ex: Exsikator; kA: Daten konnten aufgrund einer
Kontamination nicht erhoben werden.
A6: Zellabrundungsanteil von MG63 Osteoblasten auf P19/PG(1:6)-Au. MW: Mittelwert.
ANHANG
103
A7: Zellabrundungsanteil von L929 Fibroblasten auf P19/RGD-Au mit unterschiedlichen
molaren Mischungsverhältnissen.
A8: Zellabrundungsanteil von L929 Fibroblasten auf P19/RGD(1:8)-Au. MW: Mittelwert
104
Lebenslauf
Name Dipl.-Ing. Oliver Ernst
Geburtstag 25.10.1978
Geburtsort Augsburg
Akademische Ausbildung
06/2005 - 05/2008 Promotion
Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik (IBMT),
Potsdam-Golm, AG Zell-Assay-Entwicklung, Dr. Claus Duschl
“Entwicklung und Anwendung temperaturschaltbarer
Oberflächen zur Kontrolle der Zell-Substrat-Adhäsion”
05/2005 Diplom in medizinischer Biotechnologie (Dipl.-Ing.)
Technische Universität Berlin
“Mikroskopische Analyse der Zell-Substrat-Adhäsion
und Lokalisation daran beteiligter Proteine”
06/2002 Vordiplom in medizinischer Biotechnologie
Technische Universität Berlin
10/1999 Studium der Biotechnologie
Technische Universität Berlin
Schulische Ausbildung
06/1998 Abitur
Pater-Rupert-Mayer-Gymnasium,
München
