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[en] (orig)
Aufnahme und Abgabe des
Retinalliganden durch den retinalen
Photorezeptor Opsin
vorgelegt von
Diplom-Ingenieur für medizinische Biotechnologie
Ronny Piechnick
von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Ingenieurswissenschaften
— Dr.-Ing. —
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Roland Lauster
Gutachter: Prof. Dr. Peter Neubauer
Prof. Dr. Jens Kurreck
Prof. Dr. Klaus Peter Hofmann
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 14. September 2012
Berlin 2012
D 83
3
Die vorliegende Dissertation wurde in der Charité Universitätsmedizin Berlin, im
Institut für medizinische Physik und Biophysik (IMPB), im Fachbereich
Funktionsmodule der Signaltransduktion unter der Leitung von
Prof. Dr. Klaus Peter Hofmann und unter der Betreuung von Dr. Martin Heck
durchgeführt und angefertigt.
Die Betreuung seitens der Technischen Universität Berlin erfolgte durch die
Fakultät III-Prozesswissenschaften, im Fachbereich Bioverfahrenstechnik des Instituts
für Biotechnologie durch Prof. Dr. Peter Neubauer.
5
Danksagung
Mein Dank gilt an erster Stelle Herrn Prof. Dr. Peter Neubauer, der meine Arbeit
seitens der Technischen Universität Berlin betreut hat und in den Vorgesprächen
wertvolle Tipps zur Strukturierung der Promotionsphase sowie zur Anfertigung der
Dissertationsschrift gegeben hat.
Mein besonderer Dank geht an Prof. Dr. Klaus Peter Hofmann, der mir durch
die Übertragung des Forschungsthemas die Möglichkeit bot am Institut für
medizinische Physik und Biophysik der Charité meine Promotion durchführen zu
können. Des Weiteren danke ich ihm für die Hilfe bei der globalen Interpretation
meiner Daten. Durch sein umfassendes Wissen im Bereich der G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren konnte er mir helfen die Ergebnisse dieser Arbeit um einiges besser zu
verstehen.
Mein größtes Dankeschön geht an Dr. Martin Heck, der stets bereit war mit mir
meine Ergebnisse zu diskutieren und mir immer neue Anregungen für neue
Experimente gab um diese Dissertation zum Erfolg zu bringen. Ich danke ihm auch
dafür, dass er sich immer die Zeit nahm um mir neue Sachverhalte darzustellen und zu
erklären. Ich konnte während meiner Promotionsphase viel von ihm lernen. Durch
seine stetige Unterstützung hat er sehr zum Erfolg dieser Arbeit beigetragen.
Ein Dankeschön geht auch an Dr. Martha Sommer, die mich durch ihre
Bereitschaft zur Diskussion auf neue Ideen gebracht hat und mir mit ihren Anregungen
sehr weiterhelfen konnte.
Für die wissenschaftliche Kommunikation danke ich vor allem Dr. Peter
Hildebrand, Patrick Scheerer, Bilal Qureshi, Eglof Ritter, Matthias Elgeti, Alexander
Rose und Florent Beyriere.
Für die Unterstützung im Labor und die tatkräftige Hilfe bei der Herstellung der
Rhodopsinmutanten bedanke ich mich sehr bei Anja Koch, Brian Bauer und Jana
Engelmann, ohne deren starke Einsatzbereitschaft wäre ein derartiges Ausmaß an
durchgeführten Experimenten nicht möglich gewesen. Des Weiteren danke ich Frau
Ingrid Semjonow für die Präparation der nativen Proben und Birgit Schroeer für die
intensive Unterstützung bei der Organisation zahlreicher Aufgaben. Ein weiteres
Dankeschön geht an Frau Gabriele Chusainow, die sich immer mit voller
Hilfsbereitschaft meinen Anliegen gewidmet hat.
Irene Meister danke ich ganz besonders für die aufopferungsvolle Hilfe bei der
Korrektur meiner Dissertationsschrift und die guten Anregungen, die diese Arbeit
verbessert haben.
6
Mein allergrößtes Dankeschön geht an meine Familie und Freundin Alexandra,
die mir immer eine moralische Unterstützung während der Promotionsphase und bei
der Verfassung der Dissertationsschrift waren. Ohne ihre liebevolle Hingabe und die
ständige Bereitschaft sich meine Probleme anzuhören, wäre diese Dissertation um
einiges schwerer gewesen.
Darüber hinaus danke ich allen, die mir auf vielfältige Weise während der
Promotionsphase geholfen haben.
7
Eidesstattliche Erklärung
Name: Ronny Piechnick
Matrikelnummer: 201507
Hiermit versichere ich an Eides Statt, dass die vorliegende Arbeit, bis auf die
offizielle Betreuung, selbstständig und ohne fremde Hilfe durch mich angefertigt
wurde und benutzte Quellen und Hilfsmittel vollständig angegeben sind.
Berlin, September 2012
Ronny Piechnick
9
Zusammenfassung
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Gruppe der
Zelloberflächenrezeptoren in Vertebraten. Rhodopsin ist der am besten untersuchte
GPCR und diente lange als Vorlage für das Verständnis anderer GPCRs. Rhodopsin
besteht aus dem Apoprotein Opsin und dem inversen Agonisten 11-cis-Retinal, der
über eine Schiff’sche Base kovalente mit der Lys296-Seitenkette des Opsins verknüpft
ist. Die lichtinduzierte Isomerisierung des 11-cis-Retinals zum Agonisten
all-trans-Retinal führt zur Aktivierung des Rhodopsins. Nach der Entstehung der
aktiven Konformation (Meta II) wird die Schiff’sche Base zwischen all-trans-Retinal
und Opsin hydrolysiert und all-trans-Retinal verlässt das Protein. Anschließend kann
11-cis-Retinal aufgenommen werden, wodurch sich wiederum Rhodopsin bildet. Um
die zugrunde liegenden Mechanismen der Rhodopsinregeneration und des Meta II-
Zerfalls besser zu verstehen, wurde in dieser Arbeit die Interaktion von Opsin mit
seinen Retinalliganden untersucht.
Ein Teil dieser Arbeit beschreibt die Aufnahme und Abgabe des Retinals durch
Opsin. Die Kristallstrukturen des Meta II und aktiven Opsins ließen zwei Öffnungen
eines mutmaßlichen Ligandenkanals erkennen, der die Retinalbindungstasche mit der
hydrophoben Membranumgebung verbindet. Die Existenz dieses Kanals und die Rolle
der zwei Öffnungen bei der Aufnahme und Abgabe des Retinals wurden durch die
ortsgerichtete Mutagenese experimentell überprüft. Die Ergebnisse
zusammengenommen zeigten, dass die Mutationen nicht lokal auf die
Kanaldurchlässigkeit wirken, sondern weitreichende Effekte auf die Struktur des
gesamten Rezeptors haben. In dieser Arbeit wurde ein Modell für die Rezeptor-
Retinal-Interaktion entwickelt, in dem die aktive Rezeptorkonformation (Opsin*) für das
Öffnen des Retinalkanals notwendig ist. Darüber hinaus kann gesagt werden, dass der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Bildung des Rhodopsins oder beim
Zerfall des Meta II die richtige Positionierung des Liganden innerhalb der
Bindungstasche am Lys296 ist.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschreibt die Rolle des Opsin* bei der
Retinalaufnahme. Die Bindung des C-terminalen Endes des Gtα-Proteins führt zur
Verschiebung des Opsin/Opsin*-Gleichgewichts und stabilisiert Opsin*. Die
Untersuchungen zeigten, dass die Opsin*-Konformation all-trans-Retinal reversibel
aufnehmen und es über eine Schiff’sche Base kovalent an Lys296 binden kann.
Basierend auf diesen Untersuchungen kann Opsin auch als ein Rezeptor für
diffusionsfähige Liganden aufgefasst werden.
10
Ein letzter Teil dieser Arbeit beschreibt die Untersuchung der Hydrolyse der
Schiff’schen Base durch die Verwendung von Hydroxylamin (HA) und seinen
Derivaten. Die Ergebnisse zeigten, dass HA den Zerfall der lichtaktivierten
Metarhodopsinspezies beschleunigte, während größere Derivate keinen signifikanten
Einfluss hatten. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass ein Wasserkanal
existiert, der sich nach der Lichtaktivierung des Rhodopsins öffnet und extrem
stringent in Bezug auf die Größe und Polarität der einströmenden Substanzen ist.
Zusammenfassend demonstrieren diese Ergebnisse, dass die aktive
Konformation des Rezeptors eine zentrale Rolle bei der Aufnahme und Abgabe des
Retinalliganden spielt. Während die Hydrolyse und Abgabe des all-trans-Retinals
durch die aktive Rezeptorkonformation induziert wird, folgt die Aufnahme des 11-cis-
und all-trans-Retinals verschiedenen Mechanismen. Diese Arbeit gibt Aufschluss über
die komplexen kinetischen und strukturellen Mechanismen, die den Aufnahme- und
Abgabeprozess des Retinalliganden steuern.
11
Abstract
G protein-coupled receptors (GPCRs) are one of the largest groups of cell
surface receptors in vertebrates. Rhodopsin is the best investigated GPCR and has
long stood as a model for understanding other GPCRs. Rhodopsin consists of the
apoprotein opsin and the inverse agonist 11-cis-retinal, which is Schiff base-linked to
residue Lys296. Light-induced isomerisation of 11-cis-retinal to the agonist
all-trans-retinal leads to activation of rhodopsin. After formation of the active
conformation (Meta II), the retinylidene Schiff base is hydrolysed and all-trans-retinal is
released from opsin. 11-cis-retinal is then taken up, which reforms rhodopsin. In this
thesis the interaction of opsin with its retinal ligands was investigated to better
understand the underlying mechanisms of rhodopsin regeneration and Meta II decay.
A first part of this thesis explores the uptake and release of retinal from opsin.
The crystal structures of Meta II and active opsin revealed two openings of a
presumable ligand channel which connects the retinal binding pocket with the
hydrophobic membrane environment. The existence of this ligand channel and the
role of the openings in the uptake and release of retinal were experimentally tested by
site-directed mutagenesis. Overall the results showed that the mutations did not have
local effects on channel permeability, but rather had long ranging effects on the entire
receptor structure. This study developed a model of receptor-ligand interactions, in
which the active receptor conformation (Opsin*) is necessary for the retinal channel to
be open. Furthermore, the rate limiting step for either the formation of rhodopsin or
Meta II decay is the correct positioning of ligand within the binding pocket relative to
Lys296.
In a second presented part of this thesis, the role of Opsin* in retinal uptake
was further explored. Binding of the c-terminal end of G
tα protein was found to
stabilize Opsin* relative to inactive opsin. Opsin* was observed to take up
all-trans-retinal and form a retinylidene Schiff base with Lys296. Based on these
observations, opsin can be understood as a receptor for diffusible ligands.
In a final presented part of this thesis, retinal Schiff base hydrolysis was
investigated using hydroxylamine (HA) and its alkylated derivatives. Briefly, HA
accelerated the decay of light-activated metarhodopsin species, while the larger
derivatives had little influence. The results imply the existence of a water channel,
which is opened in light-activated rhodopsin and is extremely stringent with regard to
size and polarity of inflowing substances.
In summary, these results demonstrate that the active conformation of the
receptor plays a central role in the uptake and release of retinal. While the hydrolysis
12
and release of all-trans-retinal is induced by the active receptor conformation, the
uptake of 11-cis- and all-trans-retinal follows different mechanisms. The work
presented in this thesis sheds light on the complex kinetic and structural mechanisms
governing the uptake and release process of the retinal ligand.
13
Liste der Publikationen
!
Hildebrand P.W., Scheerer P., Park J.H., Choe H.W., Piechnick R., Ernst O.P., . . .
Heck M. (2009) A ligand channel through the G protein coupled receptor opsin. PLoS
One 4, e4382.
Piechnick R., Heck M. und Sommer M.E. (2011) Alkylated hydroxylamine derivatives
eliminate peripheral retinylidene Schiff bases but cannot enter the retinal binding
pocket of light-activated rhodopsin. Biochemistry 50, 7168-7176.
Piechnick R., Ritter E., Hildebrand P.W., Ernst O.E., Scheerer P., Hofmann K.P. and
Heck M. (2012) Effect of channel mutations on uptake and release of the retinal ligand
in opsin. Proceedings of the National Academy of Sciences, published ahead of print
March 19, 2012, doi:10.1073/pnas.1117268109.
Liste der Posterpräsentationen
!
Hildebrand P.W., Scheerer P., Park J.H., Choe H.W., Piechnick R., Ernst O.P.,
Hofmann K.P. and Heck M. A ligand channel through the G protein coupled receptor
opsin. German Biophysical Society Meeting (2008) September 28 – October 1, Berlin.
Hildebrand P.W., Scheerer P., Park J.H., Choe H.W., Piechnick R., Ernst O.P.,
Hofmann K.P. and Heck M. A ligand channel through the G protein coupled receptor
opsin. Membranes and Modules – International Symposium of
Sonderforschungsbereiche 449 and 740 (2009) December 10 – 13, Berlin.
Piechnick R., Hildebrand P.W., Scheerer P., Ernst O.P., Hofmann K.P. and Heck M. A
ligand channel through the G protein coupled receptor opsin. Keystone Symposia –
G Protein-Coupled Receptors (2010) April 7 – 12, Breckenridge, Colorado, USA.
14
Inhaltsverzeichnis
Danksagung 5
Eidesstattliche Erklärung 7
Zusammenfassung 9
Abstract 11
Liste der Publikationen 13
Liste der Posterpräsentationen 13
Inhaltsverzeichnis 14
1 EINLEITUNG 19
1.1 Rhodopsin als G-Protein-gekoppelter Rezeptor 19
1.2 Die vertebrate Photorezeptorzelle 21
1.2.1 Aufbau der Netzhaut (Retina) 21
1.2.2 Aufbau und Funktion der Photorezeptorzelle 22
1.2.3 Aufbau der Schnittstelle zwischen Photorezeptor und Retinal-
pigmentepithelium 24
1.3 Funktionelle Module der vertebraten Photorezeptorzelle 25
1.3.1 Lichtinduzierte Signaltransduktion 26
1.3.2 Lichtinduzierte Translokation von Signalproteinen 28
1.3.3 Regeneration des 11-cis-Retinals durch den Retinoidzyklus 29
1.4 Interaktion des Rhodopsins mit seinem Retinalliganden 31
1.4.1 Strukturelle Eigenschaften des Rhodopsins, seines Meta II-Zustands und
des Opsins 31
1.4.2 Lichtsensitiver Retinalligand 36
1.4.3 Induzierung der aktiven Konformation des Rhodopsins durch
Photoisomerisierung des Retinalliganden 39
1.4.4 Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden durch Opsin und
Metarhodopsin II 41
1.4.4.1 Zerfall des Metarhodopsin II – Hydrolyse der Schiff’schen Base und
Dissoziation des all-trans-Retinals 41
1.4.4.2 Regeneration des Rhodopsins – Aufnahme des 11-cis-Retinals und
Bildung der Schiff’schen Base 42
1.4.4.3 Strukturelle Eigenschaften des Rezeptors, die die Funktion der Aufnahme
und Abgabe des Retinalliganden erklären könnten 43
1.4.4.4 Wechselwirkungen des Opsins mit dem Gt-Protein bei der Aufnahme und
Abgabe des Agonisten all-trans-Retinal 45
1.5 Ziel der Arbeit 47
15
2 MATERIALIEN UND METHODEN 51
2.1 Materialien 51
2.1.1 Escherichia coli (E. coli) 51
2.1.2 COS-1 Zellen 51
2.1.3 pMT4-Plamid 51
2.1.4 Oligonukleotide 52
2.1.5 Retinoide 52
2.2 Methoden zur Probengewinnung 53
2.2.1 Mutagenese des Opsingens, Expression der Opsinmutanten und
Präparation der Rhodopsin- und Opsinmutanten 53
2.2.1.1 Basenaustausch mittels Polymerase-Kettenreaktion 53
2.2.1.2 DpnI-Restriktionsverdau 54
2.2.1.3 Transformation der kompetenten XL1-Blue-E. coli-Bakterien 55
2.2.1.4 Kultivierung der E. coli-Bakterien 55
2.2.1.5 Plasmid-Aufreinigung 55
2.2.1.6 Analytischer und präparativer Restriktionsverdau von Plasmid-DNA 55
2.2.1.7 Dephosphorylierung der verdauten Plasmid-DNA 56
2.2.1.8 Isolierung und Reinigung der DNA-Fragmente aus Agarosegelen 56
2.2.1.9 Ligation des kompletten Opsingens oder Teile dessen in den pMT4-Vektor 56
2.2.1.10 Kultivierung der COS-1 Zellen 57
2.2.1.11 Transfektion der COS-1 Zellen 57
2.2.1.12 Ernte der transfizierten COS-1 Zellen 57
2.2.1.13 Rekonstitution von COS-1 Zellen (Nur für die Rhodopsinproben) 58
2.2.1.14 Herstellung des 1D4-Immuno-Affinitätsgels 58
2.2.1.15 Aufreinigung des Pigments 59
2.2.1.16 Klonierungsstrategie 60
2.2.2 Gewinnung der Proben aus den Stäbchenzellen boviner Retinae 61
2.2.2.1 Präparation gereinigter Diskmembranen 61
2.2.2.2 Präparation des Apoproteins Opsin 62
2.2.2.3 Präparation des G-Proteins Transducin 62
2.2.3 Erzeugung von Metarhodopsin III 64
2.3 Allgemeine Detektionsmethoden 64
2.3.1 Konzentrationsbestimmung der DNA 64
2.3.2 DNA-Sequenzierung 65
2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese 65
16
2.4 Methoden zur funktionalen Charakterisierung von Opsin und Rhodopsin
sowie deren Mutanten 65
2.4.1 Absorptionsspektroskopie 65
2.4.1.1 Regenerationsmessung mittels Absorptionsspektroskopie 66
2.4.2 Fluoreszenzspektroskopie 66
2.4.2.1 Meta II-Zerfallsmessung mittels Fluoreszenzspektroskopie 67
2.4.2.2 Gt-Proteinaktivierungsmessungen mittels Fluoreszenzspektroskopie 68
2.5 Datenanalyse 68
2.6 Geräte 71
3 ERGEBNISSE 73
3.1 Hydroxylamin und seine alkylierten Derivate als Mittel zur
Charakterisierung biochemischer und struktureller Eigenschaften in
Rhodopsin 73
3.1.1 Einfluss von Hydroxylamin und seiner alkylierten Derivate auf die peripheren
Retinyliden-Schiff’schen Basen 74
3.1.2 Absorptionseigenschaften von Rhodopsin und Meta II in Anwesenheit der
alkylierten Hydroxylaminderivate 75
3.1.3 Meta II-Zerfall in Anwesenheit der alkylierten Hydroxylamin-derivate 76
3.1.4 Meta III-Stabilität in Anwesenheit von t-BHA 78
3.2 Der Effekt der Kanalmutationen auf die Aufnahme und Abgabe des
Retinalliganden durch das Opsinmolekül 80
3.2.1 Charakterisierung der Rhodopsinmutanten 81
3.2.2 Effekt der Mutationen auf die Aufnahme des 11-cis-Retinals in das Opsin
und auf die Abgabe des all-trans-Retinals aus dem
lichtaktivierten Rhodopsin 91
3.2.3 Effekt der K296G-Mutation auf die Aufnahme und Abgabe des Retinal-PrSB 98
3.3 Reversible Aufnahme des all-trans-Retinals durch aktives Opsin 102
4 DISKUSSION 111
4.1 Hydroxylamin und seine alkylierten Derivate als molekulares Werkzeug
zur Untersuchung von Rhodopsin und seinen Metazuständen 111
4.1.1 Die Metarhodopsin-Spezies sind HA-sensitiv 112
4.1.2 Meta II und Meta III sind nicht t-BHA-sensitiv 113
4.1.3 Alkylierte Hydroxylaminderivate als molekulares Werkzeug zur
Untersuchung der visuellen Signaltransduktion 114
4.2 Indizien für einen Wasserkanal im aktivierten Rhodopsin 116
17
4.3 Die Aufnahme und Abgabe des Retinals durch einen hypothetischen
Ligandenkanal im aktivierten Rhodopsin 117
4.3.1 Effekte der Mutationen im Retinalligandenkanal auf die Struktur und
Funktion des Rezeptors 117
4.3.2 Mutationen der Aminosäureseitenketten entlang des Retinalligandenkanals
haben einen weitreichenden Einfluss auf die gesamte Funktion der
Bindungstasche 119
4.3.3 Die Retinalpassage ist unidirektional 120
4.3.4 Die Aufnahme des inversen Agonisten 11-cis-Retinal benötigt die aktive
Rezeptorkonformation 121
4.3.5 Die Abgabe des Agonisten all-trans-Retinal wird durch die Hydrolyse der
Retinyliden-Schiff’schen Base bestimmt 123
4.3.6 Ein hypothetischer Wasserkanal könnte mit dem Ligandenkanal funktionell
gekoppelt sein 126
4.3.7 Detailliertes Schema der Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden 128
4.4 Aktiviertes Opsin als Rezeptor für diffusible Liganden 130
4.4.1 Das Gleichgewicht zwischen aktivem und inaktivem Opsin steuert die
reversible Aufnahme des Agonisten all-trans-Retinal 131
4.4.2 Das kubisch-ternäre Komplexmodell beschreibt die reversible Aufnahme
des Agonisten in Abhängigkeit vom Opsin*/Opsin-Gleichgewicht und vom
CTα-Peptid 132
4.5 Die Aufnahme von 11-cis- und all-trans-Retinal könnte über zwei
verschiedene Mechanismen verlaufen 134
4.6 Vergleich der Ligandenaufnahme und -abgabe des Rhodopsins mit
anderen GPCRs 135
4.7 Abschließendes Fazit und Ausblick 138
5 ANHANG 143
Verzeichnis der Abkürzungen 143
Verzeichnis der Abbildungen 145
Literaturverzeichnis 148
Anlage 163
Oligonukleotide 163
Gt-Proteinaktivierungsraten 166
Geschwindigkeiten der Retinalaufnahme und –abgabe 167
1 EINLEITUNG
19
1 EINLEITUNG
1.1 Rhodopsin als G-Protein-gekoppelter Rezeptor
Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (G Protein-Coupled Receptors, GPCRs)
bilden die größte Gruppe der Zelloberflächenrezeptoren in Säugetieren. Im humanen
Genom kodieren näherungsweise 800 verschiedene Gene funktionale GPCRs, was
mehr als 1 % des gesamten humanen Genoms ausmacht (Lander et al. 2001,
Venter et al. 2001). Durch alternatives Splicing könnten schätzungsweise 1000 bis 2000
verschiedene Rezeptorproteine exprimiert werden. Diese evolutionäre Diversität
ermöglichte es, dass GPCRs ein außergewöhnliches Aufgebot an extrazellulären
Reizen (Neurotransmitter, Peptidhormone, Geruchsstoffe und Photonen) aufnehmen
und weiterleiten können. Demnach spielen GPCRs unter anderem eine Rolle bei der
Neurotransmission, Regulation der Hämodynamik und haben Einfluss auf das
Wachstum, die Proliferation, die Differenzierung und die Apoptose von Zellen. Im
Großen und Ganzen sehen, riechen und schmecken die Menschen die Welt durch die
vielfältige Gruppe der GPCRs.
Als die Genomdaten von zahlreichen Spezies verfügbar waren, bestand die
Möglichkeit, die Phylogenie der GPCRs detaillierter zu untersuchen. Die Analyse der
chromosomalen Position und der Gensequenzen führte zur Klassifizierung der GPCRs
in fünf Gruppen. Diese sogenannte GRAFS-Klassifizierung ordnet die humanen
Rezeptoren in Glutamatrezeptoren, rhodopsinähnliche Rezeptoren,
Adhäsionsrezeptoren, Frizzled/Taste2-Rezeptoren (Geschmacksrezeptoren) und
Sekretinrezeptoren (Fredriksson et al. 2003, Perez 2003). Die GPCRs der Gruppe der
rhodopsinähnlichen Rezeptoren besitzen als charakteristische Merkmale konservierte
Bereiche in der Aminosäuresequenz (Motive), die funktionelle Wechselwirkungen
miteinander eingehen. Die Gruppe der rhodopsinähnlichen GPCRs wurde in vier
weitere Untergruppen (α, β, γ, δ) unterteilt. Zur α-Untergruppe gehören unter anderem
die Opsinrezeptoren, die Prostaglandinrezeptoren und die Aminrezeptoren (z.B.
β2-adrenerger Rezeptor). Zur β-Untergruppe gehören alle Rezeptoren, die Peptide als
Liganden binden, wie z.B. Neurotensinrezeptoren. Die γ-Untergruppe beinhaltet unter
anderen Chemokinrezeptoren und zur δ-Untergruppe gehören Glycoproteinrezeptoren
und olfaktorische Rezeptoren (Fredriksson et al. 2003).
Die GPCRs bestehen aus sieben membrandurchspannenden α-Helices
(Transmembranhelix 1-7, TM1 - TM7), welche durch drei intrazelluläre und
1 EINLEITUNG
20
extrazelluläre Peptidschleifen (Loops, IL1 - 3, EL1 - 3) miteinander verbunden sind.
Der Transmembranbereich der GPCRs zeigt den höchsten Grad an
Sequenzkonservierung auf, während die intrazellulären und extrazellulären Domänen
erheblich in ihrer Größe und Komplexität variieren. Die extrazellulären Domänen und
Transmembranregionen der Rezeptoren sind in die Ligandenbindung involviert,
wohingegen die intrazellulären Domänen sehr wichtig für die Signaltransduktion und
die Regulierung der Rezeptoraktivität sind. Die Röntgenstrukturkristallographie
ermöglichte die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur einiger GPCRs, z.B. vom
Rhodopsin und β2-adrenergen Rezeptor, was die heptahelikale Struktur bestätigte
und die Lage der konservierten funktionellen Motive innerhalb der Kristallstruktur
darstellte (Palczewski et al. 2000, Rasmussen et al. 2007).
Im vereinfachten Modell der durch G-Protein vermittelten Signaltransduktion
agieren die GPCRs als ligandenaktivierte Guanosin-Austauschfaktoren (Guanosine
Exchange Factor, GEF) für das heterotrimere Guanosin-Bindungsprotein (G-Protein),
welches das Signal intrazellulär durch die Aktivierung der Effektorenzyme oder durch
Ionenkanäle überträgt. Die Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne oder
im Transmembranbereich des GPCR induziert konformationelle Änderungen, welche
die Bindung des heterotrimeren G-Proteins an die intrazelluläre Domäne ermöglichen.
Der Rezeptor stimuliert die G-Proteinaktivierung durch die Katalyse des Austausches
von GDP durch GTP in der α-Untereinheit. Die α-Untereinheit des G-Proteins
dissoziiert anschließend von der βγ-Untereinheit. Beide Untereinheiten regulieren die
Aktivität von enzymatischen Effektoren, wie die Adenylatcyclase, Phospholipase C
und Phosphodiesterase, welche wiederum dafür sorgen, dass die Konzentration von
sogenannten Second Messengers geändert wird. Diese Second Messengers
kontrollieren z.B. die Aktivität der Ionenkanäle in der Plasmamembran der
Stäbchenzellen, welche dadurch die biologische Antwort in den Stäbchenzellen
erzeugen.
Das Rhodopsin ist einer der wenigen GPCRs, die eine kovalente Verknüpfung
ihres Liganden an das Apoprotein aufweisen. Durch die kovalente Bindung des
11-cis-Retinals wird Rhodopsin inaktiviert. Die lichtinduzierte Isomerisierung des
11-cis-Retinals zum all-trans-Retinal führt zu einer Konformationsänderung im
Opsinmolekül und aktiviert den Rezeptor.
1 EINLEITUNG
21
1.2 Die vertebrate Photorezeptorzelle
1.2.1 Aufbau der Netzhaut (Retina)
Die humane Retina ist eine neuronale Gewebeschicht, die ca. 0,4 mm dick ist.
Die Retina kleidet die hintere Oberfläche der Innenseite des Auges aus und dehnt sich
bis zur optischen Einheit (Kornea, Iris und Linse) des menschlichen Auges aus. Die
Retina besitzt neben den fünf Neuronenklassen, d.h. Photorezeptorzellen,
Bipolarzellen, Ganglienzellen, Horizontalzellen und Amakrinzellen, zwei
Faserschichten, welche diese in drei deutlich getrennte Bereiche gliedert (Abb. 1.1a
und b). Eine Retina besteht aus ungefähr 100 Millionen Photorezeptoren, 10 Millionen
Horizontal-, Bipolar- und Amakrinzellen sowie ungefähr 1,25 Millionen Ganglienzellen.
Das neuronale Signal, welches nach der lichtinduzierten Aktivierung des
Rhodopsins im Photorezeptor generiert wird, gelangt über die Bipolarzellen in der
äußeren synaptischen Schicht zu den Ganglienzellen (Abb. 1.1b) und wird über den
Sehnerv zum Gehirn weitergeleitet. Die Horizontalzellen verschalten die
Photorezeptoren und Bipolarzellen lateral (Abb 1.1b). Sie haben eine Feedback-
Wirkung auf die Photorezeptoren und können somit die Intensität des neuronalen
Abbildung 1.1: Anatomischer Aufbau der vertebraten Netzhaut. (a) Querschnitt durch die Retina
eines Primaten (300-fache Vergrößerung, Boycott 1969). Das einfallende Licht betritt die Retina durch die
innere abschließende Membran (unten) und muss alle Gewebeschichten der Retina durchqueren, um das
in der Photorezeptorzelle lokalisierte Rhodopsin aktivieren zu können (oben). (b) Der Aufbau der
neuronalen Schicht (Retina) lässt bei vereinfachter Darstellung die fünf Neuronenklassen
(Photorezeptorzellen, Bipolarzellen, Ganglienzellen, Horizontalzellen und Amakrinzellen) sowie die
Stäbchen- und Zapfenzellen erkennen. Das Licht aktiviert die Photorezeptorzelle, diese wandelt das
Lichtsignal in ein neuronales Signal um und gibt dieses an die Bipolarzellen weiter. Diese wiederum leiten
das Signal über die Ganglienzellen weiter ans Gehirn. Die Horizontalzellen und die Amakrinzellen sorgen
für eine Verschaltung der einzelnen Neuronen und regulieren die Signalweiterleitung. Quelle der
Abbildung (b): (www.skidmore.edu), leicht modifiziert.
1 EINLEITUNG
22
Signals beeinflussen. Die Amakrinzellen liegen in der inneren synaptischen Schicht der
Netzhaut (Abb. 1.1a und b). Sie schaffen synaptische Kontakte zu Bipolarzellen und
Ganglienzellen und regulieren die neuronale Signalweiterleitung zum Gehirn. Die
Photorezeptoren befinden sich in der Retina am weitesten vom einstrahlenden Licht
entfernt. Das Licht muss also die anderen Zellen der Retina und die
Photorezeptorzellen bis zu deren äußerem Segment passieren, um das dort liegende
Rhodopsin zu aktivieren. Diese vermeintlich „falsche“ Anatomie der Retina hat den
Vorteil, dass das sehr aktive Photorezeptoraußensegment nahe dem
Retinalpigmentepithelium (RPE) und den kapillaren Blutgefäßen liegt und somit ein
effektiver Austausch von Sauerstoff und Nährstoffen gewährleistet wird
(Übersicht: Rodieck 1998). Des Weiteren reduziert diese Lage der Photorezeptorzellen in
der Retina die Absorption von Streulicht, welches an anderen Stellen durch die Retina
reflektiert werden kann und somit die Auflösung des betrachteten Bildes verringern
könnte.
1.2.2 Aufbau und Funktion der Photorezeptorzelle
In vielen vertebraten Retinae existieren zwei Typen von Photorezeptorzellen.
Diese werden nach ihrer Form des Außensegments mit Stäbchen- und Zapfenzellen
bezeichnet (Abb. 1.1). Beide Arten bestehen aus einem Außensegment (in
Stäbchenzellen: Rod Outer Segment, ROS), einem Innensegment (IS) und einer
synaptischen Endregion (Abb. 1.2). Die Stäbchenzellen sind daran angepasst im
Dämmerungslicht zu arbeiten, während die Zapfenzellen optimal unter Bedingungen
operieren, die im Bereich der Lichtsättigung der Stäbchenzellen liegen. Die
100 Millionen Stäbchenzellen existieren in der humanen Retina nur in einer
Ausführung, wobei es bei den insgesamt 3 - 5 Millionen Zapfenzellen drei
verschiedene Typen gibt (Übersichten: Müller und Kaupp 1998, Rodieck 1998). Die
Zapfenzellen befinden sich in der Retina mehrheitlich im Bereich des schärfsten
Sehens (beim Menschen: Fovea centralis) und ermöglichen durch die drei verschieden
Typen (L, M und S) das Farbsehen. Die Dichte der Stäbchenzellen dagegen ist im
Bereich des schärfsten Sehens gleich null und erreicht ihr Maximum 5 - 7 mm um
diesen Punkt herum. Die Stäbchenzellen besitzen die Fähigkeit, mit nur einem Photon
die Signaltransduktion in Gang zu setzen und sind somit 300-mal sensitiver als die
Zapfenzellen (Rodieck 1998).
Die synaptische Endregion gewährleistet die Kommunikation der
Photorezeptorzellen mit nachgeschalteten Neuronen. Im Innensegment der
Photorezeptorzellen befinden sich nahezu alle Komponenten, die für den
1 EINLEITUNG
23
Metabolismus der Zellen notwendig sind (Zellkern, Mitochondrien, Golgi-Apparat,
endoplasmatisches Retikulum usw.). Das Außensegment der Photorezeptorzellen
beinhaltet alle notwendigen Komponenten für die Umwandlung des Lichts in ein
elektrochemisches Signal. Die Außensegmente beider Photorezeptortypen (Stäbchen-
und Zapfenzellen) besitzen einen ähnlichen Mechanismus für die Umwandlung der
Photonen in ein neuronales Signal. Das dafür verantwortliche Molekül ist das
Rhodopsin, das in Stäbchenzellen in so genannten Diskmembranen organisiert ist und
in Zapfenzellen in der eingestülpten Plasmamembran zu finden ist. Im Außensegment
der humanen Stäbchenzelle stapeln sich bis zu 1000 Disks übereinander und nehmen
in etwa die Hälfte des Volumens dieses Außensegments ein. Eine einzelne humane
Diskmembran enthält ungefähr 50 000 Rhodopsinmoleküle, die jeweils ein
Lichtphoton für ihre Aktivierung absorbieren können, was die hohe Leistungsfähigkeit
und Sensitivität der Stäbchenzelle widerspiegelt (Abb. 1.2). Das Außensegment beider
Photorezeptorzelltypen ist mit dem Innensegment durch das Zilium verbunden und
ermöglicht dadurch den Transport von Molekülen, die im Innensegment synthetisiert
werden.
Abbildung 1.2: Aufbau einer vertebraten Stäbchenzelle. Diese besteht aus einer synaptischen
Endregion, in der die Kontakte zu den nachgeschalteten Neuronen gewährleistet wird, einem
Innensegment, in dem sich der Zellkern (Nukleus) und nahezu alle notwendigen Komponenten des
Zellmetabolismus befinden, und einem durch das Zilium verbundenen Außensegment, in dem sich alle
für die Umwandlung des Lichtsignals notwendigen Komponenten befinden. In den Membranen der bis
zu 1000 Disks des humanen Stäbchenzellenaußensegments befinden sich bis zu 50 Millionen Moleküle
des Sehpigments Rhodopsin. Diese Disks werden von der Plasmamembran des Außensegments
umgeben. Jedes einzelne Rhodopsinmolekül besitzt einen lichtsensitiven Liganden (11-cis-Retinal), der
kovalent mit dem Apoprotein verknüpft ist. Die Abbildung der Stäbchenzelle stammt von der Seite
(www.vetmed.vt.edu) und wurde leicht modifiziert. ER, endoplasmatisches Retikulum.
1 EINLEITUNG
24
Der Unterschied zwischen den Stäbchen- und Zapfenzellen bezieht sich neben
der Form des Außensegments und dem Cocktail der Proteine auch auf den
Proteinanteil des Rhodopsins (Opsin). Die unterschiedliche Aminosäuresequenz führt
zu einer leicht veränderten Opsinstruktur (für Details siehe: Hargrave und McDowell 1992),
was bei gleich bleibenden Liganden zu einer unterschiedlichen Sensitivität für die
verschiedenen Bereiche des einstrahlenden sichtbaren Lichts führt.
1.2.3 Aufbau der Schnittstelle zwischen Photorezeptor und Retinal-
pigmentepithelium
Der anatomische Zusammenhang zwischen dem Photorezeptor und dem
Retinalpigmentepithelium (RPE) ist in Abbildung 1.3 dargestellt. Die mikroskopische
Darstellung einer Primatenretina (Abb. 1.3b, Boycott 1969) und die schematische
Darstellung des Querschnitts dieser (Abb. 1.3c) zeigt das Retinalpigmentepithelium als
eine einzelne Schicht an Endothelzellen (Abb. 1.3, RPE), das
Stäbchenzellenaußensegment (OS) und die Interphotorezeptormatrix (IPM) als eine
dünne extrazelluläre Lücke zwischen dem OS und dem RPE (Abb. 1.3, IPM).
Das RPE ist eine Art Blut-Hirn-Schranke, in diesem Fall genauer gesagt eine
Blut-Retina-Schranke. Das RPE besteht aus einer einzelnen Schicht von
Abbildung 1.3: Anatomische Eigenschaften der äußeren Retina, des Retinalpigmentepitheliums
und des Photorezeptors. (a) Schematische Darstellung eines Stäbchenzellenphotorezeptors von
Säugetieren in Relation zu (b). (b) Lichtmikroskopische Darstellung der parafovealen Region einer
Rhesusaffenchoroidea (Aderhaut), RPE und distalen Retina. (c) Schematischer Querschnitt durch das
Retinalpigmentepithelium (RPE) und die Spitzen des Stäbchenzellenaußensegments (OS)
(Übersicht: Lamb und Pugh 2004).
1 EINLEITUNG
25
Endothelzellen, die eine hexagonale Form besitzen und symmetrisch gepackt sind. In
humanen Augen haben diese Endothelzellen eine Größe von 10 – 16 µm im
Durchmesser und sind 7 – 8 µm dick (Garron 1963, Sakuragawa und Kuwabara 1976,
Ts'o und Friedman 1968). Neben der Aufgabe die Retina vom kapillaren Blutsystem zu
trennen und die Retinoide zu recyceln, hat das RPE mit dem aktiven Transport von
zum Beispiel Vitamin A, der Phagozytose von alten, abgestoßenen
Stäbchenaußensegmenten, der Absorption von Streulicht durch Melaningranulate, der
Adhäsion der Retina an die darunter liegende Aderhaut (Choroidea) und der
Aufrechterhaltung des Milieus der Interphotorezeptormatrix (IPM) weitere wichtige
Funktionen (Lamb und Pugh 2004).
Als Interphotorezeptormatrix wird der extrazelluläre Raum zwischen dem
Stäbchenzellenaußensegment und der apikalen Oberfläche des RPE’s bezeichnet. Die
IPM ist gefüllt mit extrazellulärem Matrixmaterial (z.B. Proteoglycane). Außerdem
beinhaltet die IPM Proteine wie das interphotorezeptorretinoidbindende Protein (IRBP)
sowie Enzyme wie Metalloproteinasen und Mucine (Lamb und Pugh 2004).
1.3 Funktionelle Module der vertebraten Photorezeptorzelle
Funktionelle Module sind per Definition ein molekulares Ensemble mit einer
weitgehend autonomen Funktion in den Zellen von Organismen (Hofmann et al. 2006).
Diese funktionellen Module schließen die Lücke zwischen den einzelnen Molekülen
und den biologischen Systemen. Jedes Modul ist wiederum in funktionalen Ebenen
(molekulare Funktion, modulare Subfunktion und modulare Funktion) organisiert. In
den Photorezeptorzellen sind drei verschiedene Module bekannt: die
Signaltransduktion, die Proteintranslokation und die Rezeptorregeneration
(Retinoidzyklus). Der GPCR Rhodopsin spielt in allen drei funktionellen Modulen eine
Schlüsselrolle und agiert in seiner aktiven Form als Schrittmacher, der den
übergreifenden Takt kontrolliert. Die Struktur der Modularisierung des Retinoidzyklus
beschreibt auf molekularer Ebene die Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden
durch den Rezeptor. Auf submodularer Ebene wird der Einfluss der
Membranumgebung, der Rezeptoroligomerisierung und der Interaktion mit
Signalproteinen (z.B. Arrestin) auf den Retinalaustausch im Opsinmolekül beschrieben.
Die modulare Ebene zeigt das Zusammenspiel aller Proteine des Retinoidzyklus auf.
1 EINLEITUNG
26
1.3.1 Lichtinduzierte Signaltransduktion
Die visuelle Signaltransduktion beschreibt die Umwandlung eines einfallenden
Lichtreizes (Photons) in ein bioelektrisches Signal in der Photorezeptorzelle. Diese
Aktivierungskaskade kann in fünf Schritten zusammengefasst werden. Die ersten drei
Schritte finden assoziiert an der Diskmembran und die letzten beiden Schritte im
Cytoplasma und an der Plasmamembran statt (Abb. 1.4).
Der erste Schritt in der visuellen Phototransduktionskaskade ist die Aktivierung
des Rhodopsins durch ein Photon (Abb. 1.4). Rhodopsin besteht aus dem Apoprotein
Opsin und dem lichtsensitiven Liganden 11-cis-Retinal, der kovalent mit dem
Apoprotein verknüpft ist. Die Absorption eines einzelnen Photons erzeugt im
Retinalliganden die all-trans-Konfiguration, was wiederum zur aktiven Konformation
des Rhodopsins (R* oder Metarhodopsin II, Meta II) führt. Eine detaillierte
Beschreibung der Aktivierung des Rezeptors ist in Abschnitt 1.4.3 zu finden. Meta II
präsentiert cytoplasmatisch Bindungsstellen, mit denen das membranassoziierte
heterotrimere Gt-Protein (Transducin) interagieren kann. Die katalytische Aktivierung
des Gt-Proteins beschreibt den zweiten Schritt der Phototransduktionkaskade
(Abb. 1.4). Das Gt-Protein besteht aus drei Untereinheiten (Gtα, Gtβ und Gtγ), wobei die
Gtα-Untereinheit die GDP/GTP-Bindungstasche besitzt und katalytisch durch Meta II
aktiviert wird. Im inaktiven Zustand des Gt-Proteins ist GDP an der Gtα-Untereinheit
gebunden, wodurch die drei Untereinheiten miteinander assoziiert sind. Meta II
katalysiert den Austausch von GDP zu GTP im heterotrimeren Gt-Protein.
Anschließend dissoziiert das aktivierte Gt-Protein vom Meta II und zerfällt in die Gtα-
und Gtβγ-Untereinheiten. Im dritten Schritt der Phototransduktionkaskade übermittelt
die Gtα-Untereinheit das Signal an das nächste Element, die cGMP-spezifische
Phosphodiesterase (PDE) (Abb. 1.4). Die PDE ist ein Enzym, das cGMP in biologisch
inaktives 5’-GMP umwandelt. Im Dunkelzustand wird die PDE inhibiert. Diese
Inhibierung wird durch Bindung der Gtα-Untereinheit an die PDE aufgehoben. Die um
mehrere Größenordnungen erhöhte Aktivität des Enzyms sorgt im vierten Schritt der
Phototransduktionskaskade für eine drastische Verringerung der cGMP-Konzentration
im Außensegment (Abb. 1.4). Die Abnahme der cGMP-Konzentration im Cytosol
bewirkt eine Schließung von cGMP-gesteuerten Ca2+- und Na
+-Kanälen, was den
Einstrom von Ca2+ und Na
+ verhindert. Durch diesen fünften Schritt der
Phototransduktionskaskade findet an der Plasmamembran des Außensegments eine
Reduzierung der zirkulierenden elektrischen Spannung statt, die bis zur Synapse
weitergeleitet wird (Abb. 1.4). Im synaptischen Spalt wird das Signal durch die
1 EINLEITUNG
27
Reduzierung der Glutamatausschüttung an die Bipolarzellen weitergeleitet
(Lamb und Pugh 2006, Nelson 2001, Rodieck 1998).
Da eine permanente Aktivierung weiterer G
t-Proteinmoleküle durch Meta II
erfolgt und eine Abschaltung des aktivierten Rezeptors durch die lichtinduzierte
Reisomerisierung von 11-cis-Retinal minimal ist, erfordert dies eine Inaktivierung des
Rezeptors auf anderen Wegen bzw. eine Unterbrechung der Signaltransduktion. Die
Terminierung des visuellen Signals erfolgt auf zwei Ebenen. Die erste Ebene erfolgt am
Meta II. Da ein Molekül Meta II bei Raumtemperatur mehr als 400 Gt-Proteine pro
Sekunde aktivieren kann (Heck und Hofmann 2001) und der Zerfall des Meta II unter
physiologischen Bedingungen eine Halbwertszeit von circa zwei Minuten hat
(Heck et al. 2003a), muss die Signalübertragung vom aktivierten Rhodopsin zum
Gt-Protein unterbrochen werden. Dies wird durch die Bindung von Arrestin an das
Meta II erreicht. Diese Bindung setzt aber die Phosphorylierung C-terminaler Serin-
und Threoninreste voraus. Die Phosphorylierung wird durch die serin-
/threoninspezifische Rhodopsinkinase (G-Protein-Rezeptorkinase, GRK1) katalysiert
(Wilden et al. 1986). Nach dem Zerfall des Meta II in das Apoprotein Opsin und den
Abbildung 1.4: Die visuelle Phototransduktionskaskade. Nach der Absorption eines Photons (hν)
kontaktiert das aktivierte Rhodopsin (R*) wiederholt Moleküle des heterotrimeren Gt-Proteins (G),
katalysiert den Austausch von GDP zu GTP und produziert dadurch die aktive Konformation des
Gtα-GTP (G*). Zwei G* binden an die inhibitorischen γ-Untereinheiten der Phosphodiesterase (PDE),
wodurch eine oder beide der korrespondierenden α- und β-Untereinheiten aktiviert werden und die
Hydrolyse des zyklischen GMPs (cG) katalysieren. Die Abnahme der cytoplasmatischen Konzentration
des cGMPs führt zur Schließung der cGMP-gesteuerten Ionenkanäle (CNGC, Cyclic Nucleotide Gated
Channel) und dadurch zur Blockade des Na+- und Ca2+-Einstroms, was wiederum zur Reduzierung der
zirkulierenden elektrischen Spannung führt. Der Na+/Ca2+,K+-Austauscher ist nicht direkt in diesen
Prozess involviert, er pumpt aber während der Lichtantwort Ca2+ aus der Photorezeptorzelle heraus, so
dass die cytoplasmatische Ca2+-Konzentration abnimmt, was wiederum die Guanylylcyklaseaktivität
(GC) und andere Calcium-Feedback-Mechanismen stimuliert. Abbildung aus Lamb und Pugh 2006,
leicht modifiziert.
1 EINLEITUNG
28
Liganden all-trans-Retinal erfolgt die Dephosphorylierung des Opsins durch die
Proteinphosphatase 2A (Palczewski et al. 1989). Die zweite Ebene der Signalterminierung
erfolgt über die intrinsische GTPase-Aktivität der Gtα-Untereinheit. Diese hydrolysiert
das GTP zu GDP und erreicht damit die Dissoziation der Gtα-Untereinheit von der
PDE. Dies wiederum führt zur Inhibition der PDE, wodurch die cGMP-Hydrolyse
gehemmt wird. Der cGMP-Spiegel in der Photorezeptorzelle steigt wieder an, die
Ionenkanäle öffnen sich, und die zirkulierende elektrische Spannung der Zelle erhöht
sich. Eine endgültige Abschaltung des Signalflusses wird durch die Aufnahme des
reisomerisierten inversen Agonisten 11-cis-Retinal und die Bildung des lichtsensitiven
Rhodopsins erreicht. Eine detaillierte Beschreibung dieser Reaktion ist in
Abschnitt 1.4.4 zu finden.
1.3.2 Lichtinduzierte Translokation von Signalproteinen
Die Photorezeptorzellen können ihre Sensitivität auf umgebene
Lichtintensitäten über verschiedene Mechanismen regulieren (Burns und Baylor 2001,
Fain et al. 2001, Pugh et al. 1999). Die lichtinduzierte Translokation des cytoplasmatischen
Gt-Proteins und Arrestins zwischen den subzellulären Kompartimenten der
Photorezeptorzelle ist ein Regulationsmechanismus zur Steuerung der
Signaltransduktion. In belichteten Stäbchenzellen bewegt sich das Gt-Protein vom
Außensegment in das Innensegment und akkumuliert dort (Brann und Cohen 1987,
Philp et al. 1987, Whelan und McGinnis 1988), wobei Arrestin in die entgegengesetzte
Richtung wandert (Broekhuyse et al. 1985) (Abb. 1.5).
1 EINLEITUNG
29
1.3.3 Regeneration des 11-cis-Retinals durch den Retinoidzyklus
Das Sehen wird durch die lichtinduzierte Isomerisierung des 11-cis-Retinals im
Opsinmolekül zu all-trans-Retinal iniziiert. In einigen invertebraten Photorezeptoren
(z.B. bei Insekten und Cephalopoden) erfolgt anschließend die Rekonversion von
all-trans- zu 11-cis-Retinal durch Photoisomerisierung, wobei das Retinal kovalent am
Opsinmolekül verknüpft bleibt (Hamdorf 1973, Stavenga 1996). Das aktivierte
Rezeptormolekül in den Photorezeptoren der Vertebraten ist nicht in der Lage,
Rhodopsin durch Lichtabsorption zurückzubilden (Bartl et al. 2001, Ritter et al. 2008,
Ritter et al. 2004). In diesen Zellen wird die kovalente Verknüpfung zwischen
all-trans-Retinal und Opsin nach der Aktivierung des Rezeptors hydrolysiert.
Anschließend verlässt all-trans-Retinal das Molekül, um für ein neues 11-cis-Retinal in
der Bindungstasche des Opsinmoleküls Platz zu machen.
Der Rezeptor wird erst dann vollständig abgeschaltet, wenn 11-cis-Retinal den
inaktiven Rhodopsinzustand hergestellt hat. Aus diesem Grund ist eine enzymatische
Reisomerisierung des Chromophors von all-trans- zu 11-cis-Retinal notwendig. Diese
Aufgabe übernimmt der Retinoidzyklus. Dieser Zyklus wird als eine lange Serie an
Reaktionen bezeichnet, die dafür sorgen, dass das all-trans- zu 11-cis-Retinal
isomerisiert wird und ausreichend 11-cis-Retinal zur Regeneration von Rhodopsin zur
Verfügung steht. Das vom Opsinmolekül hydrolysierte all-trans-Retinal wird zunächst
durch eine Retinoldehydrogenase (RDH) zu all-trans-Retinol (Vitamin A) reduziert
(Abb. 1.6). Ein weiteres Protein im retinalen Metabolismus, das nahe am Rand der
Stäbchenzellendisk lokalisiert ist und dessen Aufgabe bis heute umstritten ist, ist der
ABCR Transporter (Abb. 1.6). Dieser Transporter könnte als eine Phospholipid-
Flippase agieren und dafür sorgen (Sun et al. 1999, Weng et al. 1999), dass die gebildeten
N-Retinyliden-Phosphatidylethanolamine in der Membran abgebaut werden. Dieser
ABCR Transporter könnte somit der Bildung der A2-PE (N-Retinyliden-N-
Retinylidenphosphatidylethanolamin) und A2-E (N-Retinyliden-N-Retinyliden-
ethanolamin) vorbeugen, welche sich in der Membran ansammeln, weil diese nicht
abgebaut werden können. A2-E und A2-PE sind mit ausschlaggebend für die
Retinadegeneration (Sparrow et al. 2003). Der Transport des all-trans-Retinols durch das
Cytoplasma und die Plasmamembran des Stäbchenzellenaußensegments erfolgt
durch einen noch unbekannten Prozess. Hat aber all-trans-Retinol die
Plasmamembran erreicht, assistieren eine Reihe von Proteinen beim Übergang vom
Außensegment über die IPM zum RPE. Eines der wichtigsten ist das IRBP
(Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein), welches in hohen Mengen in den
Photorezeptor/RPE-Schichten zu finden ist (Gonzalez-Fernandez 2002, Liou et al. 1991)
1 EINLEITUNG
30
(Abb. 1.6). Das IRBP hat vier Bindestellen für Retinoide, zwei davon binden
ausschließlich all-trans-Retinol und die beiden anderen 11-cis-Retinal
(Chen und Noy 1994).
All-trans-Retinol wird beim Eintritt in die RPE-Zelle durch das Chaperon CRBP
(Cellular Retinol Binding Protein) gebunden (Abb. 1.6). Dieses CRBP bindet
all-trans-Retinol mit hoher Spezifität im Vergleich zu anderen Isomeren, 11-cis-Retinol
eingeschlossen (Übersicht: Saari 2000). Im RPE wird all-trans-Retinol durch das Enzym
Lecithinretinolacyltransferase (LRAT) verestert (Übersicht: Ruiz et al. 1999, Saari 2000)
(Abb. 1.6). Diese Veresterung von Vitamin A zu all-trans-Retinylester erfolgt durch den
Transfer einer Fettsäure vom Phosphatidylcholin zum Retinol. Das gebildete
Abbildung 1.6: Retinoidzyklus – Lange Serie an Reaktionen zur Reisomerisierung des
11-cis-Retinals. Vereinfachte Darstellung der Photorezeptor/Retinalpigmentepithelium-Schnittstelle mit
der Lokalisation der Enzyme und Chaperone des Zyklus. Nach der lichtinduzierten (hν) Aktivierung des
Rhodopsins (weiße hantelförmige Struktur) erfolgt der Zerfall des aktivierten Rezeptors zu Opsin und
all-trans-Retinal. Letzteres wird durch die Retinoldehydrogenase (RDH) zu all-trans-Retinol reduziert und
aus dem Stäbchenzellenaußensegment (OS) über Interphotorezeptormatrix (IPM) in das glatte
Endothelretikulum (SER) des Retinalpigmentepitheliums (RPE) transportiert. Dort wird das
all-trans-Retinoid durch das Enzym RPE65 zu 11-cis-Retinoid reisomerisiert und als 11-cis-Retinylester
gespeichert. Nach der Reisomierisierung des 11-cis-Retinoids erfolgt über die Alkoholstufe die Oxidation
zu 11-cis-Retinal. Das 11-cis-Retinal wird gebunden und wieder zurück in das OS transportiert. Danach
folgt die Regeneration des Rhodopsins mit dem 11-cis-Retinal. In dieser Abbildung wurde die Synthese
und Translokation des 11-cis-Retinoids vom Abtransport, der Weiterverarbeitung und der Speicherung
des 11-cis-Retinoids durch gestrichelte und durchgezogene Pfeile getrennt. Die Abkürzungen RAL, ROL
und E beziehen sich auf die Aldehyd- Alkohol- und Estergruppen, die an der Retinoidkette angefügt sind.
Weitere Abkürzungen der Enzyme: LRAT, Lecithin-Retinyl-Acyl-Transferase; RDH5,
11-cis-Retinoldehydrogenase; IRBP, Interphotorezeptorretinoidbindendes Protein; CRBP, zelluläres
Retinolbindungsprotein; CRALBP, zelluläres Retinaldahydbindungsprotein. Abbildung aus Lamb und
Pugh (2006).
1 EINLEITUNG
31
all-trans-Retinylester wird anschließend durch RPE65 gebunden (Abb. 1.6). Das
RPE65 ist ein Enzym mit einer Isomerohydrolaseaktivität d.h. es katalysiert die
Konversion von all-trans-Retinylester zu 11-cis-Retinylester und die anschließende
Hydrolyse zum 11-cis-Retinol (Jin et al. 2005, Moiseyev et al. 2005, Redmond et al. 2005). Nach
der Abgabe des 11-cis-Retinols durch das RPE65 sind zwei Wege möglich. Der
primäre Weg ist die Weitergabe des 11-cis-Retinols an die 11-cis-RDH, um den
Retinoidzyklus zu schließen (Abb. 1.6). Ein weiterer Weg ist die Veresterung des
11-cis-Retinols durch LRAT mit anschließender Speicherung des Esters (Abb. 1.6)
(Übersicht: Lamb und Pugh 2004). Die Oxidation des 11-cis-Retinols zu 11-cis-Retinal
erfolgt durch die 11-cis-RDH. In humanen Augen wurde gezeigt, dass die 11-cis-RDH
essenziell für eine normale Dunkeladaptation ist (Cideciyan et al. 2000). 11-cis-Retinal
wird direkt an das CRAL-Bindeprotein (Cellular Retinal Binding Protein) weitergegeben
und gelangt mit Hilfe des IRBP vom RPE über die IPM zum
Stäbchenzellenaußensegment (Abb. 1.6). In den Zapfenzellen erreicht 11-cis-Retinal
das Opsinmolekül sehr leicht, da hier die Opsinmoleküle direkt in der Plasmamembran
liegen und 11-cis-Retinal durch die Membran zum Molekül diffundieren kann. In
Stäbchenzellen ist die Situation eine andere. Hier befinden sich die Opsinmoleküle in
den Membranen der Disks, die separat im Außensegment angeordnet sind und keinen
direkten Kontakt zur Plasmamembran haben. Da bis jetzt kein Protein bekannt ist, das
im Cytoplasma des Stäbchenzellenaußensegments 11-cis-Retinal binden kann,
können bezüglich des 11-cis-Retinal-Transfers nur Vermutungen angestellt werden. Es
wäre möglich, dass ein Lipidaustausch zwischen dem Rand der Diskmembranen und
der Plasmamembran stattfindet, der das über eine Schiff’schen Base an
Phosphatidylethanolaminen (Anderson und Maude 1970, Poincelot et al. 1969) oder
Phosphatidylserinen (Sommer et al. 2006) gebundene 11-cis-Retinal überträgt.
Anschließend kann das 11-cis-Retinal selektiv durch Opsin aufgenommen und
kovalent verknüpft werden, was dann wiederum zu einem lichtsensitiven Rhodopsin
führt.
1.4 Interaktion des Rhodopsins mit seinem Retinalliganden
1.4.1 Strukturelle Eigenschaften des Rhodopsins, seines Meta II-
Zustands und des Opsins
Im Jahr 2000 war Rhodopsin der erste GPCR, dessen Struktur mittels
Röntgenstrukturanalyse hochauflösend (2,8 Å) ermittelt werden konnte
1 EINLEITUNG
32
(Palczewski et al. 2000). Danach folgten weitere Strukturaufklärungen des Rhodopsins in
noch höherer Auflösung (2,2 Å) (Okada et al. 2004), des Apoproteins Opsin (in diesem Fall
ist es aufgrund der Kristallisationsbedingungen bei pH 5 – 5,8 eine aktivierte Form des
Opsins, Opsin*) (Park et al. 2008) und des aktivierten Zustands des Rhodopsins (Meta II)
(Choe et al. 2011). Die Architektur der sieben Transmembranhelices des Rhodopsins
spiegelt sich auch in den anderen GPCRs wider, was die hohe Strukturhomologie in
der Transmembranregion der bis jetzt aufgeklärten Kristallstrukturen bestätigt
(Cherezov et al. 2007, Jaakola et al. 2008, Rasmussen et al. 2007, Warne et al. 2008).
Rhodopsin besteht aus einer Polypeptidkette von 348 Aminosäuren, die mit
sieben Helices (TM1 – TM7) die Diskmembran durchspannen (Abb. 1.7). Eine achte
Helix (Lys311 – Leu321) folgt der TM7 und ist parallel zur Membranoberfläche auf der
cytoplasmatischen Seite der Diskmembran angeordnet (Abb. 1.7). Das C-terminale
Ende der Polypeptidkette ist an der Membran durch die Palmitoylierung der
Aminosäurereste Cys322CT und Cys323
CT unmittelbar nach der Helix 8 verankert
(Abb. 1.7). Wie das Gt-Protein bindet auch Arrestin an die cytoplasmatische Region
des Rezeptors. Die Bindung von Arrestin erfordert die Phosphorylierung der
wichtigsten C-terminalen Phosphorylierungsstellen Ser334CT, Ser338CT und Ser343CT
(Ohguro et al. 1996) (Abb. 1.7). Die drei flexiblen Peptidschleifen auf der
cytoplasmatischen Seite des Rhodopsins (Cytoplasmatic Loops, CL1-3) verbinden die
TM1 mit der TM2, die TM3 mit der TM4 und die TM5 mit der TM6 (Abb. 1.7).
Die extrazelluläre (interdiskale) Region des Rhodopsins beinhaltet das N-
terminale Ende und die drei extrazellulären Peptidschleifen (Extracellular Loops, EL1-3)
(Abb. 1.7). Der N-Terminus ist am Asn2NT und Asn15
NT mit einer
Hexasaccharidsequenz glycolysiert (Abb. 1.7) (Shichi et al. 1980). Es wurde durch
ortsspezifische Mutagenese gezeigt, dass nur die Glycosylierung am Asn15NT für die
korrekte Faltung und den Transport des Opsinmoleküls wichtig ist (Kaushal et al. 1994).
Im Vergleich zu den flexiblen cytoplasmatischen Peptidschleifen sind die
extrazellulären Schleifen, die die TM2 mit der TM3, die TM4 mit der TM5 und die TM6
mit der TM7 verbinden, deutlich mehr strukturiert. Insbesondere EL2 ist in Rhodopsin
zu einem hochgeordneten „Deckel“ gefaltet, der die Retinalbindungstasche vom
extrazellulären Raum abtrennt (Janz und Farrens 2004, Okada et al. 2004). Neben der
Disulfidbrückenbindung zwischen Cys1103.25 1 (TM3) und Cys187EL2 (Mitte EL2) wird
die EL2 durch ein Wasserstoffbrückennetzwerk stabilisiert, das um die Aminosäure
Glu181EL2 angeordnet ist (Abb. 1.7). Glu181EL2 besitzt im Rhodopsin (Grundzustand) je
eine Wasserstoffbrückenbindung zu Tyr192EL2 und Tyr268
6.51. Außerdem besteht im
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
1 Nummerierungen entsprechen der Ballesteros-Weinstein-Nomenklatur (Ballesteros 1995).
1 EINLEITUNG
33
Rhodopsin eine wasservermittelte Wasserstoffbrückenbindung vom Glu181EL2 zu
Ser186EL2 und Glu113
3.28. Glu1133.28 ist das Gegenion der protonierten Retinyliden-
Schiff’schen Base am Lys2967.43 (Okada et al. 2004). Dieses ist über eine
Wasserstoffbrücke mit dem Rückgrat des Cys187
EL2 durch ein Wassermolekül
verbunden und liegt in Reichweite zur Hydroxylgruppe des Thr942.65 (Okada et al. 2004).
Dieses stabile Wasserstoffbrückennetzwerk um den Liganden herum könnte sehr
wichtig für die Aufrechterhaltung des hohen pKa der protonierten Retinyliden-
Schiff’schen Base des lichtsensitiven Rhodopsins sein.
Zusätzlich zur Retinalbindungstasche existieren weitere funktionelle
Mikrodomänen, durch die die inaktiven und aktiven GPCR-Konformationen stabilisiert
werden können und die als molekulare Schalter die Konformationsänderungen
innerhalb des Rezeptors steuern können (Ballesteros et al. 1998, Visiers et al. 2002). TM3 und
TM5 werden im Rhodopsin durch ein weiteres Wasserstoffbrückennetzwerk
zusammengehalten, an dem die Aminosäurereste der Glu1223.37, Trp1263.41 und
His2115.46 beteiligt sind (Abb. 1.8) (Li et al. 2004, Vogel et al. 2007). Diese Reste könnten die
Veränderung der Lage des Retinals bei der Aufnahme und Abgabe sowie die
Retinalisomerisierung wahrnehmen, da das Glu1223.37 zum Beispiel direkten Kontakt
Abbildung 1.7: Aminosäuresequenz des Rhodopsins in zweidimensionaler Repräsentation. Der
Rezeptor hat sieben Transmembranhelizes (TM1 – TM7) und eine kurze amphipathische Helix (H8), die
auf der cytoplasmatischen Oberfläche der Diskmembran liegt. Die Aminosäuren werden im
Einzelbuchstabencode gezeigt. Die grauunterlegten Kreise repräsentieren die hochkonservierten
Aminosäuren der Klasse der rhodopsinähnlichen GPCRs. Die gezackten Linien an den C322- und
C223-Resten deuten die Palmitoylierungen dieser Reste an. Eine Disulfidbrückenbindung ist zwischen
dem C110- und C187 zu sehen. CL, cytoplasmatische Peptidschleife; EL, extrazelluläre Peptidschleife.
1 EINLEITUNG
34
zum β-Iononring des Retinals hat. Neben der TM3-TM5-Mikrodomäne existiert am
β-Iononring des Retinals eine weitere funktionelle Region um die Aminosäurereste
Phe2125.47, Phe2616.44 und Trp2656.48 (Abb. 1.8) (Okada et al. 2004), die die Isomerisierung
des Retinals auf die TM6 übertragen könnten und dadurch die Gt-Proteinbindestellen
generiert werden können.
Neben den hier genannten rhodopsinspezifischen Mikrodomänen gibt es vier
weitere Domänen, die in den GPCRs der Klasse der rhodopsinähnlichen Rezeptoren
zu finden sind. Eine dieser vier Mikrodomänen ist das E(D)R3.50Y-Motiv. Dieses Motiv
ist Teil des Wasserstoffbrückennetzwerkes zwischen TM3 und TM6 und wird auch
TM3-TM6-Ionic-Lock (ionisches Schloss) genannt (Abb. 1.8), weil es den inaktiven
Zustand des Rhodopsins, des Adrenorezeptors und anderer GPCRs stabilisiert
(Ballesteros et al. 2001, Dror et al. 2009). Das NP7.50xxY(x)5,6F-Motiv in TM7-H8 ist in zwei
funktionelle Subdomänen geteilt (Abb. 1.8). Die erste Subdomäne spiegelt das
Abbildung 1.8: Funktionale Mikrodomänen und konservierte Aminosäurereste in GPCRs.
Rhodopsin (PDB: 1GZM) mit gebundenem inversen Agonisten 11-cis-Retinal. Die Grundstruktur der
GPCRs besteht aus 7TM-Helizes, die durch cytoplasmatische (C1-C3 oder CL1-CL3, oben) und
extrazelluläre (E1-E3 oder EL1-EL3, unten) Peptidschleifen verbunden sind. Oligosaccharidketten binden
am N-Terminus an Asn2NT und Asn15NT. Eine konservierte Disulfidbrücke verbindet das extrazelluläre
Ende der TM3 (Cys1103.25) mit der Mitte der EL2 (Cys187
EL2). Die am höchsten konservierten
Aminosäurereste in jeder TM sind in blau gezeigt. Diese Reste sind mit x.50 gekennzeichnet, wobei x die
TM-Nummer definiert und alle anderen Aminosäurereste dieser TM in Bezug zu diesem Rest nummeriert
werden (Ballesteros 1995). Die farbig hinterlegten Bereiche und die farbigen Reste entsprechen den
farbigen Logos, welche die GPCR-Sequenzen widerspiegeln, die für die α-Gruppen der
rhodopsinähnlichen GPCRs konserviert sind. Vergrößerte Struktur: Rhodopsinspezifische Mikrodomänen
(Rhodopsinnummerierung). Diese schließen das TM3-TM5-Netzwerk (blau) und das Schiff’sche Base-
Netzwerk (violett) mit der protonierten Schiff’schen Base-Verknüpfung zwischen dem Lys2967.43 an der
TM7 und dem inversen Agonisten 11-cis-Retinal ein. Abbildung adaptiert aus Hofmann et al. (2009) und
leicht verändert.
1 EINLEITUNG
35
TM1-TM2-TM7-Wasserstoffbrückennetzwerk wider, wobei die zweite Subdomäne
durch die hydrophobe Interaktion des Tyr3067.53 an TM7 mit Phe3137.60 an H8 definiert
wird (Übersicht: (Hofmann et al. 2009)). Beide Subdomänen stabilisieren sowohl den
inaktiven als auch den aktiven Zustand des Rhodopsins. Eine weitere konservierte
Mikrodomäne in vielen GPCRs ist das CWxP6.50-Motiv (Abb. 1.8), in dem Pro2676.50 die
Helixstruktur in TM6 unterbricht und mit Hilfe von Trp2656.48 und Phe6.52 eine Rotation
der TM6 bei Rezeptoraktivierung ermöglicht (Rotamer-Toggle-Switch-Hypothese)
(Shi et al. 2002). In Rhodopsin steht der β-Iononring in direktem Kontakt zum Trp2656.48
und übernimmt mit Hilfe von Ala2696.52 die Aufgabe des in anderen GPCRs
vorhandenen Phe6.52 (Nygaard et al. 2009, Shi et al. 2002). Eine weitere wichtige
Mikrodomäne ist die Y5.58(x)7K(R)5.66-Sequenz in der TM5 (Abb. 1.8). Die zwei daran
beteiligten Aminosäurereste, Tyr2235.58 und Lys2315.66 gehen spezifische Interaktionen
mit den Aminosäureresten aus dem TM3-TM6-Ionic-Lock-Motiv nach
Rezeptoraktivierung ein (Elgeti et al. 2011).
In Rhodopsin (Grundzustand) werden beide Enden des Retinalliganden durch
Aminosäurereste stabilisiert. Glu1133.28 in TM3 und Glu181EL2 in der EL2-Peptidschleife
bilden den Gegenionkomplex der protonierten Retinyliden-Schiff’schen Base. Der
β-Iononring des Retinals ist umgeben von His2115.46, Trp1263.41 und Glu122
3.37 des
TM3-TM5-Wasserstoffbrückennetzwerks und Trp2656.48 des CWxP6.50-Motives.
Der Vergleich der Opsinstruktur mit 11-cis-Retinal-gebundenem Rhodopsin
zeigt (Palczewski et al. 2000, Park et al. 2008), dass eine aus TM1-TM4 bestehende
Kernstruktur existiert, die zwischen Rhodopsin und Opsin nahezu unverändert ist. In
der extrazellulären Domäne mit dem N-Terminus und dem „Deckel“ zur
Retinalbindungstasche (EL2) sind die geringsten Änderungen zu sehen. Starke
Änderungen sind dagegen innerhalb der Retinalbindungstasche sichtbar, wie z.B. in
der Region der Bindungsstelle am Lys2967.43 sowie in den Regionen, wo sich im
Rhodopsin die C19-Methylgruppe und der β-Iononring des Retinals befinden. Die
Seitenkette des Lys2967.43 könnte sehr flexibel sein, da hier bei der
Röntgenstrukturanalyse keine definierte Elektronendichte gemessen wurde
(Park et al. 2008). Auch die Salzbrücke zwischen dem Lys2967.43 und dem Glu1133.28, die
in Rhodopsin vorhanden ist, ist in der Opsinstruktur nicht sichtbar. Stattdessen ist der
Aminosäurerest der Glu181EL2 näher am Lys296
7.43, was auf eine Verlagerung der
Interaktion vom Glu1133.28 auf das Glu181
EL2 hindeutet. Die beiden voluminösen
hydrophoben Reste Phe2616.44 und Trp2656.48 an TM6 sind mit der Auswärtsbewegung
dieser Helix ebenfalls anders ausgerichtet. Die Trp2656.48-Seitenkette hat sich in die
Position verlagert, die vorher durch den β-Iononring des 11-cis-Retinals in Rhodopsin
1 EINLEITUNG
36
besetzt war. Zusätzlich sind in der aktivierten Opsinstruktur zwei Öffnungen im
hydrophoben Membranbereich des Rezeptors zu sehen, die einen Zugang bzw.
Ausgang des Retinalliganden ermöglichen könnten (siehe Abschnitt 1.4.4.3)
(Park et al. 2008, Scheerer et al. 2008).
Die bedeutenden strukturellen Änderungen für TM5 und TM6 spiegeln sich
auch in der Verlängerung der Helixstruktur der TM5 um 1,5 – 2,5 Helixwindungen auf
der cytoplasmatischen Seite des Rezeptors wider. Durch die Verlängerung der TM5
und die Auswärtsbewegung der TM6 rückt die TM5 auf der cytoplasmatischen Seite
2 – 3 Å näher an TM6 heran. Außerdem gehen die Aminosäurereste der
Mikrodomänen TM3-TM6-Ionic-Lock und NPxxY(x)
5,6F neue Interaktionen ein. Diese
neuen Interaktionen finden mit Aminosäureresten des Y5.58(x)7K(R)5.66-Motivs in TM5
statt, wodurch die Opsin-Konformation stabilisiert wird. Diese Opsinstruktur entspricht
eher einer aktiven Konformation (Opsin*), da gezeigt wurde, dass die Cokristallisation
aus Opsin und CTα-Peptid (C-terminales hochaffines Gtα-Analog) die gleichen
strukturellen Eigenschaften in der cytoplasmatischen Domäne besitzt (aktive Gt-
Protein-bindende Konformation) (Park et al. 2008, Scheerer et al. 2008).
Meta II zeigt eine zu Opsin* nahezu identische Konformation (Choe et al. 2011,
Park et al. 2008, Scheerer et al. 2008). Diese übereinstimmenden strukturellen Eigenschaften
spiegeln sich in den zwei vorhandenen Öffnungen, in der Bewegung der TM5 in
Richtung TM6 durch Elongation der TM5, in der Rotation der TM6 (cytoplasmatische
Entfernung der TM6 von der TM3, TM3-TM6-Ionic-Lock wird geöffnet) und in der
Neuausrichtung des TM3-TM5-Wasserstoffbrückennetzwerkes wider (Choe et al. 2011).
Die cytoplasmatische Gt-Proteininteraktionsdomäne des Meta II trägt die selben
Eigenschaften eines aktiven Zustands wie das Opsin*. All-trans-Retinal ist in der
reversibel gebildeten Meta II-Struktur von Choe et al. (2011) im Vergleich zum
11-cis-Retinal des Rhodopsins um seine Längsachse rotiert (Okada et al. 2004,
Palczewski et al. 2000).
1.4.2 Lichtsensitiver Retinalligand
Die lichtsensitive Verbindung ist in allen visuellen Rezeptoren das Retinal. In
der Natur wird dieses durch die Spaltung des mit der Nahrung aufgenommenen
Isoprens β-Carotin und anschließende Oxidation des Spaltproduktes all-trans-Retinol
(Vitamin A) hergestellt (Übersicht: Nelson 2001). Neben all-trans-Retinal existieren
mehreren isomere Formen (9-cis-, 11-cis- und 13-cis-Retinal), wovon das kovalent am
Opsinmolekül gebundene 11-cis-Retinal das lichtsensitive Rhodopsin bildet.
Ergebnisse aus computergestützten Untersuchungen zeigten, dass die
1 EINLEITUNG
37
elektrostatischen Interaktionen zwischen dem Retinal und Opsin zur natürlichen
Selektion von 11-cis-Retinal gegenüber den anderen cis-Isomeren führen
(Sekharan und Morokuma 2011). Im Rhodopsin ist das 11-cis-Retinal mit dem Protein über
eine protonierte Schiff’sche Base am Lys2967.43 verbunden. Die positive Ladung der
protonierten Schiff’schen Base erhöht die Elektronendelokalisation entlang der
konjugierten Retinylidenkette und führt mit der Konformation des Opsins zu einer
Verschiebung des Absorptionsmaximums von kurzwelligen 380 nm auf sichtbare
500 nm. Die Interaktion des Gegenions Glu1133.28 mit der protonierten
Schiff’schen Base reguliert nicht nur die Wellenlänge, sondern ist auch essentiell für
die Aufrechterhaltung der inaktiven Konformation des Rezeptors.
Die Absorption von Licht durch das Retinal induziert eine cistrans-
Isomerisierung der C11=C12-Doppelbindung (Abb. 1.9). Im Opsinmolekül sorgt
sowohl die Polyenkette als auch die assoziierten Methylgruppen des Retinals für eine
Übertragung der Lichtenergie auf das Protein. Durch die Fixierung des Retinals, zum
einen über die kovalente Verknüpfung am Lys2967.43 und zum anderen durch
hydrophobe Wechselwirkungen des β-Iononrings in der Bindungstasche (z.B. durch
Trp2656.48 (Abb. 1.10)), ist die Übertragung der Lichtenergie auf das Protein sehr
effektiv. Die größte lichtinduzierte Änderung innerhalb des Retinals ist die Rotation der
C20-Methylgruppe in Richtung EL2 (Abb. 1.10) (Nakamichi und Okada 2006a,
Schreiber et al. 2006). Dieser Mechanismus könnte der Kontrolle des
Protonierungszustands der Schiff’schen Base dienen, da das Entfernen der C20-
Abbildung 1.9: Isomerisierung der C11=C12-Doppelbindung des 11-cis-Retinals zur trans-
Konformation nach Absorption eines Photons (h
ν
). Das blaue Kästchen symbolisiert den inaktiven
Zustand (Rhodopsin) und das rote Kästchen den aktiven Zustand (Meta II) des Rezeptors. Das Retinal ist
kovalent an das Lys2967.43 gebunden und bildet die Schiff’sche Base, welche im Rhodopsin protoniert
und im Meta II deprotoniert ist. Beide Spezies lassen sich UV/Vis-spektroskopisch durch die Wellenlänge
ihrer maximalen Absorption unterscheiden. Die Zahlen am Retinal definieren die durchnummerierten
Kohlenstoffatome.
1 EINLEITUNG
38
Methylgruppe des Retinals zu einer verlangsamten Photoreaktion und reduzierten
Quantenausbeute führt (Kochendoerfer et al. 1996).
Die C19-Methylgruppe des Retinals ist im Rhodopsinmolekül durch die
Aminosäurereste Thr1183.33, Ile189EL2, Tyr191EL2 und Tyr2686.51 stark fixiert und für die
Aktivierung des Rhodopsins essentiell, da diese das Wasserstoffnetzwerk zwischen
Glu1133.28 und EL2 beeinflusst (Corson et al. 1994, Nakayama und Khorana 1991). Durch die
Interaktion des β-Iononrings mit dem Trp2656.48 an TM6 und der Fixierung des Retinals
durch die restlichen Aminosäurereste der Bindungstasche könnte das Retinal als eine
Klammer fungieren, die die Bewegung der TM6 im Rhodopsin verhindert und eine
Rotation der TM6 nach Photoaktivierung induziert (Crocker et al. 2006). Die schnelle
Photochemie und die hohe Quantenausbeute sind auf zwei Besonderheiten der
Bindungstasche zurückzuführen. Zum einen entsteht durch die longitudinale
Beschränkung des Retinals in der Bindungstasche eine Verdrehung der C11=C12-
Doppelbindung (Okada et al. 2004, Struts et al. 2007, Sugihara et al. 2006), und zum anderen
liegt die negative Ladung des Glu181EL2 nahe dem C12-Kohlenstoff am Retinal, was
die Isomerisierung durch Verringerung des C11=C12-Bindungsgrades fördert
(Smith 2010).
Die Photoisomerisierung des Retinals führt in den ersten
Reaktionsintermediaten (Photo-, Batho- und Lumirhodopsin) zu einem hochverzerrten
Abbildung 1.10: Fixierung des Retinals durch die Aminosäurenseitenketten innerhalb der
Bindungstasche. Die cytoplasmatische Sicht auf die Retinalbindungstasche im Rhodopsin und Meta II
spiegelt die verschiedenen Interaktionen des 11-cis- (Rhodopsin) und all-trans-Retinals (Meta II) mit den
Aminosäureseitenketten der Bindungstasche wider. Die Fixierung beider Retinale erfolgt durch die
kovalente Verknüpfung an das Lys2967.43 und durch die hydrophoben Wechselwirkungen des retinalen
β-Iononrings mit dem Trp2656.48. Des Weiteren haben die Aminosäureseitenketten des Met2075.34 und
Phe2125.39 eine das Retinal fixierende Funktion. Die größte lichtinduzierte Änderung innerhalb des
Retinals beschreibt die Rotation der C20-Methylgruppe. Die C19-Methylgruppe des Retinals ist im
Rhodopsinmolekül durch die Aminosäurereste Thr1183.33, Ile189EL2, Tyr191EL2 (unterhalb des Retinals
und deshalb nicht dargestellt) und Tyr2686.51 stark fixiert und ist für die Aktivierung des Rhodopsins
essentiell.
1 EINLEITUNG
39
all-trans-Retinal, da die Zeitspanne der Isomerisierung für die Neuausrichtung der
Proteinstruktur zu kurz ist. Theoretische und experimentelle Studien argumentierten,
dass die Interaktion zwischen dem C10-Wasserstoffatom und der C13-Methylgruppe
des Retinals die effiziente, sehr schnelle und stereoselektive Isomerisierung des
11-cis-Isomers zum all-trans-Isomer fördern kann (Schoenlein et al. 1991, Warshel 1976).
Das könnte erklären, warum diese beiden Retinalisomere eine essentielle Rolle in der
Phototransduktion spielen.
1.4.3 Induzierung der aktiven Konformation des Rhodopsins durch
Photoisomerisierung des Retinalliganden
In den ersten Nanosekunden nach der lichtinduzierten Isomerisierung des
Retinals entstehen Photointermediate, die den Übergang vom Rhodopsin zu den
Metastadien bilden. Diese Photointermediate weisen die gestreckte Form des
all-trans-Retinals auf, ohne dabei große strukturelle Änderungen außerhalb der
Retinalbindungstasche im Protein zu zeigen (Nakamichi und Okada 2006a, b,
Ruprecht et al. 2004). Die frühen Photointermediate können UV/Vis-spektroskopisch in
Photorhodopsin (570 nm), Bathorhodopsin (540 nm), BSI (Blue-Shifted Intermediate,
477 nm) und Lumirhodopsin (497 nm) unterschieden werden (Abb. 1.11) (Übersicht:
(Lewis und Kliger 1992)). Die erste Metastufe wird innerhalb von Mikrosekunden erreicht
und wird als Metarhodopsin I (Meta I) bezeichnet (Übersicht: Lewis und Kliger 1992). Im
Meta I finden mit der Verlagerung des primären Gegenions der protonierten
Schiff’schen Base von Glu1133.28 auf Glu181
EL2 die ersten komplexeren Änderungen
statt (Lüdeke et al. 2005, Yan et al. 2003). Die TM6 ist in Rhodopsin durch die feste
Interaktion zwischen dem 11-cis-Retinal und Trp2686.48 in der geschlossenen
Konformation fixiert. Durch die Retinalisomerisierung wird schon im Meta I eine kleine
Rotationsbewegung der TM6 induziert (Ye et al. 2010). Des Weiteren wurde in solid-
state-NMR-Experimenten gezeigt, dass das Retinal durch die cistrans-
Isomerisierung während der Rhodopsinaktivierung in Richtung TM5 translatiert und
sich die EL2 leicht von der Retinalbindungsstelle entfernt (Ahuja et al. 2009a,
Ahuja et al. 2009b, Brown et al. 2010
). Die Retinaltranslation erlaubt dem β-Iononring, das
TM3-TM5-Wasserstoffbrückennetzwerk zu stören und induziert somit eine
cytoplasmatische Neuausrichtung der TM5, wodurch sich diese cytoplasmatisch von
der TM3 entfernt (Li et al. 2004, Vogel et al. 2007, Ye et al. 2010).
1 EINLEITUNG
40
Mit dem Meta I tritt der Aktivierungsprozess in ein System gekoppelter
Gleichgewichte zwischen den Metaintermediaten ein (Abb. 1.11). Die deprotonierte
all-trans-Retinyliden-Lys2967.43-Verbindung definiert das Meta II (Okada et al. 2001). Das
Meta II ist die Konformation des Rezeptors, die den GDP/GTP-Austausch im
Gt-Protein effektiv katalysieren kann, denn es konnte gezeigt werden, dass die
Meta II-Bildung auf Kosten des Meta I durch die Interaktion mit dem Gt-Protein erhöht
werden konnte (Bennett et al. 1982, Emeis et al. 1982) und somit das Gleichgewicht Richtung
Meta II verschoben ist. Heute sind drei verschiedene Meta II-Substadien bekannt
(Meta IIa, IIb und IIbH+) (Abb. 1.11). Der Übergang vom Meta I zu Meta IIa erfolgt durch
die Protonierung des Gegenions (Glu1133.28) der Retinyliden-Schiff’schen Base, was
dazu führt, dass diese deprotoniert wird (Arnis et al. 1994, Arnis und Hofmann 1993). Durch
die Deprotonierung der Retinyliden-Schiff’schen Base finden erste strukturelle
Änderungen im interhelikalen wasservermittelten Wasserstoffbrückennetzwerk um
Asp832.50 an TM2 statt und damit Änderungen im gesamten TM1-TM2-TM7-Netzwerk.
Während andere Mikrodomänen des Rezeptors im Meta I-ähnlichen inaktiven Zustand
vorliegen, zeigt das TM1-TM2-TM7-Netzwerk schon beim Übergang von Meta I auf
Meta IIa aktivierende konformationelle Änderungen (Zaitseva et al. 2010). Der Übergang
von Meta IIa zu Meta IIb wird durch die TM6-Auswärtsbewegung definiert
(Knierim et al. 2007). Diese Auswärtsbewegung der TM6 resultiert aus einer verzögerten
Reaktion auf die Deprotonierung der Schiff’schen Base (Übersicht: Okada et al. 2001)
Abbildung 1.11: Rhodopsin und seine lichtaktivierten Photoprodukte. Die frühen Photoprodukte des
Rhodopsins, bei denen die Reaktionen nur im photosensorischen Kern ohne strukturelle Änderungen in
der Proteinstruktur stattfinden, sind rot unterlegt. Die späten Meta-Zustände sind blau unterlegt. (1)
Übergang von Meta I auf Meta IIa durch Deprotonierung der Schiff’schen Base und Protonierung des
Gegenions Glu1133.28, (2) Übergang von Meta IIa auf Meta IIb durch die TM6-Auswärtsbewegung, (3)
Übergang von Meta IIb auf Meta IIbH+ durch H+-Aufnahme am ERY-Motiv (TM3-TM6-Ionic-Lock) und
Fixierung der offenen Konformation des Motivs. Diese Übergänge (1 – 3) werden in der
Rhodopsinstruktur nochmals verdeutlicht (rechts). Abbildung ist aus Hofmann et al. (2009) und wurde
leicht verändert.
1 EINLEITUNG
41
und führt zu einem Aufbrechen des TM3-TM6-Ionic-Lock-Netzwerkes (Vogel et al. 2008).
Die Bewegung der TM6 wird durch die Interaktion zwischen dem retinalen β-Iononring
und dem Trp2656.48 des CWxP-Motivs unterstützt. Die C19-Methylgruppe des Retinals
spielt bei der TM6-Bewegung ebenfalls eine entscheidende Rolle (Knierim et al. 2008). In
Meta IIb wird die TM6 durch die Neuausrichtung der NPxxY(x)5,6F-Mikrodomäne und
durch die Fixierung des offenen TM3-TM6-Ionic-Lock in der Auswärtsposition
stabilisiert. Die komplette strukturelle Umwandlung zum aktiven Rezeptor ist durch die
Protonierung von Glu1343.49, durch die neue Stabilisierung von Arg1353.50 durch
Tyr2235.58 und die daraus resultierende Einwärtsbewegung der TM5 abgeschlossen
und wird Meta IIbH+ genannt (Elgeti et al. 2011). Die anschließende Hydrolyse der
Retinyliden-Schiff’schen Base und die darauffolgende Abgabe des all-trans-Retinals
hinterlässt das ligandenfreie Apoprotein Opsin (Abb. 1.11)
(Übersicht: Hofmann et al. 2009).
Als eine weitere Metaform des Rhodopsins ist die sogenannte
Retinalspeicherform, das Metarhodopsin III (Meta III) bekannt (Abb. 1.11). Im Meta III
befindet sich die all-trans-Retinyliden-Lys2967.43-Bindung in der syn-Konfiguration,
während im Gegensatz dazu beim Meta II die Schiff’sche Base-Bindung zwischen
dem Retinal und Apoprotein in der anti-Konfiguration vorliegt (Heck et al. 2003a,
Ritter et al. 2004). Meta III wird als Speicherform bezeichnet, weil das all-trans-Retinal
dem Retinoidzyklus zur Reisomerisierung entzogen ist und es somit nicht mehr der
Signaltransduktion zur Verfügung steht (Zimmermann et al. 2004).
1.4.4 Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden durch Opsin und
Metarhodopsin II
Der lichtinduzierten Isomerisierung des 11-cis-Retinylidens folgt die Hydrolyse
des all-trans-Retinylidens und die anschließende Dissoziation des all-trans-Retinals
von der Bindungstasche des Apoproteins. Das vom Meta II dissoziierte
all-trans-Retinal durchläuft den Retinoidzyklus und wird reisomierisiert als
11-cis-Retinal zur Aufnahme ins Opsinmolekül bereitgestellt (siehe Abschnitt 1.3.3).
1.4.4.1 Zerfall des Metarhodopsin II – Hydrolyse der Schiff’schen Base und
Dissoziation des all-trans-Retinals
Die protonierte Schiff’sche Base-Bindung wird durch die Salzbrücke mit
seinem Gegenion Glu113
3.28 und durch Reste an der „Deckel“-ähnlichen
extrazellulären Peptidschleife 2 (EL2) stabilisiert. Die Hydrolyse der Schiff’schen Base
im lichtsensitiven Rhodopsin ist sehr langsam (t½ liegt unter physiologischen
1 EINLEITUNG
42
Bedingungen in der Größenordnung von Tagen). Die strukturellen Faktoren in
Rhodopsin spielen eine große Rolle bei der Kontrolle der Stabilität der Retinyliden-
Lys2967.43-Bindung: Zum ersten durch den außerordentlich hohen pKa-Wert von mehr
als 16 (Steinberg et al. 1993), zum zweiten durch die Unzugänglichkeit der
Schiff’schen Base für Wasser und zum dritten durch das Agieren des EL2 als „Kinetic
Trap“ (kinetische Mausefalle), welche den Verlust an transient hydrolysiertem Retinal
verhindert (Janz et al. 2003).
Durch die konformationellen Änderungen hat das umgebende Wasser im
Meta II Zugang zur Schiff’schen Base (Jastrzebska et al. 2011) und sorgt somit unter
physiologischen Bedingungen für die Hydrolyse der Schiff’schen Base innerhalb von
wenigen Minuten (t½ ca. 2 min) (Heck et al. 2003a). Der pKa der Schiff’schen Base der
Modellsubstanz N-Retinyliden-n-Buthylamin liegt in neutralem Detergenz bei 6,1
(Cooper 1987).
Die Kinetik der Hydrolysereaktion wurde über Jahre hinweg durch die Messung
des Zerfalls der Metarhodopsinphotoprodukte zu Opsin und all-trans-Retinal
untersucht (Blazynski und Ostroy 1981, 1984). Dichroismus-Messungen zeigen, dass
all-trans-Retinal nach dem Zerfall von Meta II rechtwinklig zur Membranoberfläche
orientiert ist (Chabre und Breton 1979). Weitere Untersuchungen mittels Fluoreszenz- und
UV/Vis-Spektroskopie zeigten ebenfalls, dass die Abnahme der Schiff’schen Base-
Verknüpfung mit dem Zerfall des Meta II korreliert (Farrens und Khorana 1995). Es bleibt
aber weiterhin offen, ob die Zugänglichkeit der Schiff’schen Base für Wasser, die
Hydrolyse der Schiff’schen Base oder die Abgabe des all-trans-Retinals der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt beim Zerfall von Meta II ist.
1.4.4.2 Regeneration des Rhodopsins – Aufnahme des 11-cis-Retinals und
Bildung der Schiff’schen Base
Der genaue Mechanismus der Aufnahme des 11-cis-Retinals ist bis heute nicht
vollständig verstanden. 11-cis-Retinal besetzt zunächst die hydrophobe
Retinalbindungstasche des Opsins und wird dann kovalent an das Lys2967.43
gebunden. Für die Bildung der Schiff’schen Base müssen einige Voraussetzungen
gegeben sein: Das Lys2967.43 muss deprotoniert sein, die Carbonylgruppe des
Retinals muss polarisiert sein und das entstehende Wasser ausgeschlossen oder in
der Retinalbindungstasche organisiert werden (Palczewski 2006). Unmittelbar nach der
Verknüpfung des 11-cis-Retinals mit dem Lys2967.43 wird die Bindung durch die
Translokation eines H+ vom Glu113
3.28 protoniert. Durch die Protonierung entsteht
zwischen der positiven Ladung des Retinyliden-Lys2967.43 und dem negativ geladenen
Glu1133.28-Gegenion eine Salzbrücke, die die Protonierung der Schiff’schen Base
1 EINLEITUNG
43
stabilisiert. Zusätzlich bewegen sich weitere negativ geladene und polare
Aminosäurereste näher an die protonierte Bindung heran (Palczewski et al. 2000).
Die Bildung der Schiff’schen Base verläuft über eine
Carbinolaminzwischenstufe mit anschließender Dehydratisierung und zeigt bei
Modellsubstanzen eine pH-Wert-Abhängigkeit in Form einer Glockenkurve
(Jencks 1969). Diese pH-Wert-Abhängigkeit zeigte auch die Retinyliden-
Schiff’sche Base-Bildung von Rhodopsin in Membranen (Henselman und Cusanovich 1976).
Im Gegensatz dazu zeigte die Bildung der Retinyliden-Schiff’schen Base in
detergenzsolubilisiertem Rhodopsin keine pH-Wert-Abhängigkeit zwischen pH 5 und
10 (Matsumoto und Yoshizawa 2008).
1.4.4.3 Strukturelle Eigenschaften des Rezeptors, die die Funktion der
Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden erklären könnten
Die strukturellen Änderungen durch die Photoaktivierung des Rhodopsins
betreffen auch die Domäne der Bindungstasche (Choe et al. 2011, Park et al. 2008). In der
aktiven Opsin- (Opsin*) sowie in der Meta II-Struktur werden zwei Öffnungen deutlich,
die die Retinalbindungstasche mit der hydrophoben Membran verbinden (Abb. 1.12)
(Choe et al. 2011, Park et al. 2008). Diese Öffnungen befinden sich zwischen TM1 und TM7
(Öffnung A) und zwischen TM5 und TM6 (Öffnung B) in der Membranregion des
Rezeptors (Choe et al. 2011, Park et al. 2008, Scheerer et al. 2008, Standfuss et al. 2011) und
könnten die Aufnahme und Abgabe des hydrophoben Retinalliganden in den bzw. aus
dem Photorezeptor ermöglichen (Wang und Duan 2011). Beide Öffnungen sind
trichterartig geformt und besitzen einen Ring aus aromatischen Aminosäuren
(Öffnung A: Tyr43 und Phe293; Öffnung B: Phe208, Phe273 und Phe276)
(Choe et al. 2011, Park et al. 2008).
In der Opsin*-Struktur konnte durch computergestützte Methoden (Skeleton
Search und Flexible Docking Analysis) ein kontinuierlicher, 70 Å langer Kanal durch
das Protein identifiziert werden (Hildebrand et al. 2009). Dieser Kanal verbindet die beiden
nichtpolaren Öffnungen und bezieht in seinem zentralen Bereich die polare
Retinalbindungstasche mit ein (Abb. 1.12), wodurch er als potentieller Ligandenkanal
fungieren könnte. In diesem hypothetischen Ligandenkanal konnten vier verschiedene
Engstellen identifiziert werden (Hildebrand et al. 2009). Es wurde vermutet, dass diese
Stellen so eng sind, dass diese gedehnt werden müssen, damit der β-Iononring des
Retinals diese passieren kann (Hildebrand et al. 2009). Eine dieser Engstellen befindet sich
am aktiven Lys2967.43 und könnte eine regulatorische Rolle spielen (Abb. 1.13).
1 EINLEITUNG
44
In der Konformation, die Lys296
7.43 im Opsin als ein Teil des Ser186
EL2-
Glu181EL2-Netzwerkes einnimmt, ist der Kanal blockiert. Ein kontinuierlicher
Ligandenkanal ist nur möglich, wenn die Rotamerstellung der Lys2967.43-Seitenkette
eine Wasserstoffbrückenbindung zum Tyr2686.51 zulässt (Hildebrand et al. 2009). In diesem
Fall kann das Retinal durch das Opsin aufgenommen werden, um es anschließend
kovalent zu verknüpfen. Die Interaktion der Lys2967.43-Seitenkette mit der Tyr2686.51-
Seitenkette könnte als eine Schranke dienen und somit den Mechanismus des
Rezeptors für die selektive Aufnahme von 11-cis-Retinal erklären.
Neben dem Ligandenkanal, der den Rezeptor parallel zur Membranoberfläche
durchquert, wurde ein weiterer Kanal postuliert, der die cytoplasmatische Oberfläche
des Rezeptors mit der Retinalbindungstasche verbindet und senkrecht zur
Membranoberfläche verläuft (Angel et al. 2009, Choe et al. 2011, Park et al. 2008). Dieser Kanal
im Meta II könnte den Zugang des umgebenden Wassers zur Retinyliden-
Schiff’schen Base und damit die Hydrolyse des all-trans-Retinylidens ermöglichen
(Jastrzebska et al. 2011).
Abbildung 1.12: Vergleich der Kristallstrukturen des inaktiven Rhodopsins und aktiven Meta II.
Dieser Vergleich verdeutlicht den hypothetischen Ligandenkanal im aktiven Zustand des Rezeptors. (a)
Longitudinaler und (b) koplanarer Schnitt (intrazelluläre Sicht) durch Meta II (oben; PDB: 3PXO) und
Rhodospin (unten; PDB: 1U19). In beiden Strukturen sind die Öffnung A (A) zwischen TM1 und TM7
(Meta II), die Retinalbindungstasche (BP) und die Öffnung B (B) zwischen TM5 und TM6 (Meta II)
definiert. Die elektrostatischen Oberflächenpotentiale der Strukturen sind mit ±30 kT/e negativ (rot) und
positiv (blau) geladenen Oberflächenarealen konturangepasst und verdeutlichen die polaren und
unpolaren Regionen des Ligandenkanals. Abbildungen wurden mit der PyMol-Software (www.pymol.org)
erstellt.
1 EINLEITUNG
45
1.4.4.4 Wechselwirkungen des Opsins mit dem Gt-Protein bei der Aufnahme
und Abgabe des Agonisten all-trans-Retinal
Agonisten sind als Liganden definiert, die den Rezeptor maximal aktivieren,
wohingegen partielle Agonisten eine submaximale Aktivierung des G-Proteins
induzieren. Inverse Agonisten inhibieren die basale (konstitutive) Aktivität eines
ligandenfreien Rezeptors. Antagonisten haben keinen Effekt auf die Basalaktivität,
blockieren aber den Zugang für andere Liganden.
Während die strukturellen Änderungen, die bei der Aktivierung des Rhodopsins
auftreten, vermutlich ähnlich zu anderen GPCRs sind, ist der Mechanismus, der diese
Änderungen induziert, von diesen sehr verschieden. Im Rhodopsin ist der inverse
Agonist (11-cis-Retinal) kovalent mit dem Protein verknüpft, der durch Lichtabsorption
zum vollen Agonisten (all-trans-Retinal) konvertiert werden kann. All-trans-Retinal
kann nur in der Bindungstasche am Lys296 gebunden als voller Agonist wirken. Es
Abbildung 1.13: Kanalengstelle am Lys296. Diese Engstelle wird durch die Rotamerstellung des
Lys296 beeinflusst. (a) Gruppen (1 – 3) der berechneten Lys296-Rotamere. Gruppe 2 (orangefarben)
beschreibt die Rotamere des Lys2967.43, welche auch in der Kristallstruktur des Opsin*-CTα-Peptids
(PDB: 3DQB) gefunden wurden. Gruppe 3 (grün) zeigt die Konformation des Lys296, welche zur
computergestützten Untersuchung der Retinalpassage genutzt wurde. (b) Überlagerung der beiden
plausibelsten Konformere des Lys296 in der Umgebung der Aminosäureseitenketten innerhalb der
Bindungstasche (cytoplasmatische Sicht) mit potentiellen Wasserstoffbrücken (gestrichelte Linien). (c)
Darstellung des Ligandenkanals mit der geschlossenen Konformation des Lys296 (Gruppe 2), welches
über eine Wasserstoffbrücke mit Ser186
EL2 und Glu181
EL2 verbunden ist. (d) Darstellung des
Ligandenkanals mit der geöffneten Konformation des Lys296 (Gruppe 3), welches an Tyr2686.51 über eine
Wasserstoffbrücke verbunden ist. Die elektrostatischen Oberflächenpotentiale sind mit ±20 kT/e negativ
(rot) und positiv (blau) geladenen Oberflächenarealen konturangepasst. Abbildung aus Hildebrand et al.
(2009) leicht modifiziert.
1 EINLEITUNG
46
wurde gezeigt, dass das freie all-trans-Retinal nur maximal 14 % der Opsinaktivität
zum Gt-Protein im Vergleich zum lichtaktivierten Rhodopsin induziert (Han et al. 1996,
Jäger et al. 1996). All-trans-Retinal könnte daher an einer sekundären Bindungsstelle des
Opsinmoleküls als partieller Agonist wirken. Im Vergleich zum Rhodopsin wird die
große Mehrheit der anderen GPCRs durch die Diffusion eines Agonisten in den
Rezeptor aktiviert. Der β2-adrenerge Rezeptor wird zum Beispiel durch die Bindung
von Adrenalin aktiviert.
Eines der einfachsten Modelle zur Erklärung der Rezeptor-Ligand-Interaktion
ist das „Two-State-Model“, welches voraussetzt, dass der Rezeptor nur in zwei
Zuständen existiert (inaktiv (R) und aktiv (R*)) (Birnbaumer et al. 1980, Heidenreich et al. 1980,
Iyengar et al. 1980, Karlin 1967, Podleski et al. 1970). In Abwesenheit eines Liganden wird die
basale Aktivität durch das Gleichgewicht zwischen R und R* definiert. Die Wirksamkeit
eines Liganden reflektiert seine Fähigkeit, das Gleichgewicht zwischen den beiden
Zuständen zu verschieben. Die vollen Agonisten binden an R* und stabilisieren ihn,
wohingegen die inversen Agonisten an R binden und diesen Zustand stabilisieren.
Partielle Agonisten haben eine Affinität für beide Zustände. In den meisten anderen
GPCRs existiert jeweils eine chemische Verbindung für einen vollen, inversen und
partiellen Agonisten sowie für einen Antagonisten, beim Rhodopsin existiert dagegen
nur eine Verbindung in zwei verschiedenen Konfigurationen (11-cis-Retinal und
all-trans-Retinal). 11-cis-Retinal stabilisiert als inverser Agonist den inaktiven Zustand
und das all-trans-Retinal als voller Agonist den aktiven Zustand des Rhodopsins.
Da nicht nur der Ligand selbst definierte Zustände des Rezeptors stabilisieren
kann, sondern auch das G-Protein, die Rhodopsinkinase oder das Arrestin, kann
dieses Modell der zwei Zustände die Interaktionen nicht vollständig beschreiben. Aus
diesem Grund wurde ein erweitertes Modell entwickelt. Das „Cubic-Ternary-Complex-
Model“ (Kubisch-ternäre Komplexmodell) beschreibt die kooperative Interaktion
zwischen dem aktiven bzw. inaktiven Rezeptor, dem G-Protein und dem Agonisten
(Abb. 1.14) (Weiss et al. 1996). Das kubisch-ternäre Komplexmodell fordert einige
Annahmen: 1. Der Rezeptor hat zwei getrennte Bindungstellen (eine extrazelluläre
Bindestelle für den Agonisten und Antagonisten und eine cytoplasmatische
Bindestelle für das G-Protein). 2. Die extrazellulären Liganden und das
cytoplasmatische G-Protein existieren in zwei separaten Phasen und beeinflussen sich
nicht gegenseitig. 3. Der Rezeptor existiert in zwei Zuständen bzgl. der Aktivierung
des G-Proteins (aktiv und inaktiv). 4. Die Interaktionen zwischen Ligand, G-Protein und
Rezeptoraktivierungszuständen unterliegen dem Massenwirkungsgesetz. 5. Alle
möglichen Zweiwege- und Dreiwegeinteraktionen zwischen Ligand, G-Protein und
1 EINLEITUNG
47
Rezeptoraktivierungszuständen sind potentiell signifikant und können durch
Koeffizienten im Modell repräsentiert werden.
In diesem Modell ist es nicht obligatorisch, dass die Bindung des Liganden zur
Aktivierung des Rezeptors führt. Der Ligand kann zum Beispiel an den Rezeptor
binden ohne diesen zu aktivieren. Erlaubte Transformationen sind: 1. eine Änderung
des Rezeptorzustandes (aktiv zu inaktiv und umgekehrt), 2. eine Bindung und
Dissoziation des G-Proteins und 3. eine Bindung und Dissoziation des Liganden. Mit
diesem Modell kann zum Beispiel der unterschiedliche Einfluss des Gt-Proteins auf die
Opsinaktivierung oder auf die Retinalbindung untersucht werden.
1.5 Ziel der Arbeit
Der Prozess des Meta II-Zerfalls zu Opsin und all-trans-Retinal sowie die
Regeneration des Rhodopsins aus Opsin und 11-cis-Retinal konnte bis heute nicht im
Detail aufgeklärt werden. Deshalb liegt der Fokus dieser Arbeit auf noch offenen
Abbildung 1.14: Kubisch-ternäres Komplexmodell zur Charakterisierung der Rezeptor-Liganden-
G-Protein-Interaktion in GPCRs. In diesem Modell existieren drei Ebenen des Rezeptorzustands. Die
erste Ebene zeigt von links (inaktiv(i)) nach rechts (aktiv(a)) die Rezeptoraktivierung mit jeweils vier
Zuständen (Rezeptor allein (R), Rezeptor mit Ligand (R-L), Rezeptor mit G-Protein (R-G) und Rezeptor mit
Ligand und G-Protein (R-L-G)). Die zweite Ebene zeigt die Ligandenbindung mit ebenfalls vier Zuständen
(R-L, R*-L, R-L-G und R*-L-G). Die dritte Ebene beschreibt die G-Proteinbindung mit den vier
verschiedenen Zuständen (R-G, R*-G, R-L-G und R*-L-G). Ka ist als die Gleichgewichtskonstante für die
Aktivierung des Rezeptors, KL für die Bindung des Liganden an den inaktiven Rezeptor und KG für die
Bindung des G-Proteins an den inaktiven Rezeptor definiert. Der Faktor α beschreibt den Effekt der
Ligandenbindung auf die Aktivierung des Rezeptors, β definiert den Effekt der Rezeptoraktivierung auf
die G-Proteinbindung, γ erklärt den Effekt der Ligandenbindung auf die G-Proteinbindung und δ ist eine
Größe, die den Effekt von zwei Rezeptorebenen auf die dritte Ebene beschreibt (z.B. Effekte der
Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung auf die G-Proteinbindung). Die Abbildung stammt aus Weiss
et al. (1996) und wurde leicht verändert.
1 EINLEITUNG
48
Fragen bezüglich des Abgabe- und Aufnahmemechanismus des Retinalliganden, der
Direktionalität der Abgabe und Aufnahme, der Rolle der kovalenten Retinyliden-
Lys296-Verknüpfung, des Hydrolysemechanismus bzw. der Bildung der Retinyliden-
Schiff’schen Base und der Existenz des Retinalligandenkanals in den
unterschiedlichen Rhodopsinzuständen (Meta I/II/III, aktives Opsin, inaktives Opsin
und Rhodopsin).
Die Untersuchungen von Schädel et al. (2003) ergaben erste Hinweise dafür,
dass die Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden nicht durch die selbe Öffnung
erfolgen und der Mechanismus der Retinalpassage unidirektional ist (Schädel et al. 2003).
In dieser Arbeit werden weitere Beweise für diesen Aspekt dargelegt. Die
Untersuchungen von Schädel et al. (2003) wurden in Stäbchenzellendiskmembranen
durchgeführt, in denen das Retinal in Wechselwirkung mit den Phospholipiden der
Membran tritt. Deshalb wurde in dieser Arbeit der überwiegende Teil der Ergebnisse
mit einem Ansatz ohne Membran produziert, der diese Nebeneffekte ausschließt.
Diese Arbeit basiert generell auf der Identifizierung des Retinalligandenkanals
in der Opsinstruktur mittels computergestützter Methoden (Skeleton Search und
Flexible Docking Analysis) (Hildebrand et al. 2009). In Übereinstimmung mit
molekulardynamischen Simulationen (Wang und Duan 2011) konnten im Verlauf des
Ligandenkanals vier Engstellen für das Retinal identifiziert werden (Abb. 1.15)
(Hildebrand et al. 2009). Diese Engstellen werden vor allem durch große Aminosäurereste
an den Öffnungen A und B sowie durch das Lys296 und das Tyr268 in der
Retinalbindungstasche definiert (Hildebrand et al. 2009). Mittels ortsspezifischer
Mutagenese an diesen Engstellen in Kombination mit spektroskopischen
Messmethoden soll der Einfluss der Rezeptorstruktur auf die Retinalabgabe und –
aufnahme untersucht werden. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, eine Aussage
darüber zu treffen, welche Rolle einzelne Aminosäuren in der Retinalbindungstasche
(z.B.: Tyr268) beim Photoaktivierungsprozess bzw. beim Retinalaustausch spielen
können.
Durch den Austausch von Aminosäureresten soll der Mechanismus der Bildung
der Retinyliden-Schiff’schen Base und ihrer Spaltung besser verstanden werden.
Durch die Kombination aus ortsspezifischer Mutagenese und der Verwendung des
Nukleophils Hydroxylamin soll in dieser Arbeit auch der Einfluss des Ligandenkanals
beim Retinalabgabe- bzw. beim Retinalaufnahmeprozess spezifiziert werden.
1 EINLEITUNG
49
Um die Rolle der Spaltung und Bildung der Schiff’schen Base zu verstehen,
muss verstanden werden, welche Rolle die kovalente Verknüpfung zwischen dem
Apoprotein und seinem Retinalliganden spielt. Was würde geschehen, wenn im
Opsinmolekül keine kovalente Verknüpfung zum Retinalliganden möglich ist? Es
wurde bereits gezeigt, dass ein rhodopsinähnlicher Zustand durch das
Retinalanalogon 11-cis-PrSB in der Lys296Gly-Rhodopsinmutante erreicht werden
kann (Zhukovsky et al. 1991). In dieser Arbeit soll gezeigt werden, ob neben dem
rhodopsinähnlichen Zustand auch die Metazustände existieren, welchen Einfluss die
fehlende kovalente Verknüpfung auf die Aufnahme und Abgabe des Retinalanalogons
hat und welchen Einfluss all-trans-Retinal auf die Gt-Proteinaktivität des Opsins hat.
Ein weiterer Ansatz zum Verständnis der Rezeptor-Ligand-Interaktion ist die
Untersuchung der Aufnahme und Abgabe des Agonisten all-trans-Retinal durch ein
Opsinmolekül, das im aktiven Zustand gehalten wird. Dadurch ist es möglich, Opsin
als Rezeptor mit diffusionsfähigem agonistischen Liganden untersuchen zu können,
was den besseren Vergleich zu anderen ligandengesteuerten GPCRs ermöglicht.
Diese Untersuchung soll mit dem kubisch-ternären Komplexmodell beschrieben
werden.
Des Weiteren soll neben dem Ligandenkanal der Wasserkanal als ein weiteres
strukturelles Merkmal des aktivierten Rezeptors untersucht werden (Angel et al. 2009,
Abbildung 1.15: Engstellen innerhalb des hypothetischen Ligandenkanals mit den in dieser Arbeit
verwendeten Mutationsstellen. Die minimale innere Weite des Kanals (d
min) wurde alle 0.6 Å
gemessen, ausgehend von der Öffnung A hin zur Öffnung B. Die Aminosäureseitenketten definieren die
Engstellen (C1 – C4) und spiegeln die Mutationsstellen zur Identifizierung des Ligandenkanals wider. Die
maximale und minimale Ausdehnung des retinalen β-Iononrings ist rechts dargestellt. Abbildung aus
Hildebrand et al. (2009) leicht modifiziert.
1 EINLEITUNG
50
Choe et al. 2011, Park et al. 2008). Dieser Kanal ermöglicht es dem exogenen Wasser, die
Retinalbindungsstelle zu erreichen, um die Schiff’sche Base zu hydrolysieren
(Jastrzebska et al. 2011). Durch die Verwendung von Hydroxylamin (HA) und seinen
Derivaten soll gezeigt werden, für welche Moleküle dieser Kanal durchlässig ist.
Ziel dieser Arbeit ist es, die Wechselwirkungen zwischen dem Rezeptor (Opsin)
und seinem Liganden (all-trans- und 11-cis--Retinal) beim Prozess der Retinalabgabe
und –aufnahme besser zu verstehen. Die Erkenntnisse aus dieser Studie könnten in
die Untersuchungen anderer GPCRs und ligandgesteuerter Transmembranrezeptoren
einfließen.
2 MATERIALIEN UND METHODEN
51
2 MATERIALIEN UND METHODEN
2.1 Materialien
2.1.1 Escherichia coli (E. coli)
Der E. coli-Stamm XL1Blue (Stratagene, USA) wurde verwendet, um die Plasmid-
DNA zu gewinnen, die zur Expression der Opsin- und Rhodopsinmutanten in
COS-1 Zellen benötigt wurde.
2.1.2 COS-1 Zellen
Die COS-1 Zellen (ATCC #: CRL-1650, American Type Cell Collection, USA; Gluzman 1981)
wurden für die Expression der in dieser Dissertation verwendeten Opsin- und
Rhodopsinmutanten eingesetzt. Diese COS-1 Zellen wurden transient mit dem pMT4-
Plasmid transfiziert.
2.1.3 pMT4-Plamid
Für die Vervielfältigung der synthetisch hergestellten Opsin-DNA in E. coli
sowie für die Expression des modifizierten Opsins in COS-1 Zellen wurde das pMT4-
Plasmid verwendet. Dieses Plasmid basiert auf dem pMT3-Vektor (Abb. 2.1), in dem
das Opsingen über eine EcoRI/NotI-Restriktionsschnittstelle eingebaut wurde (Ferretti et
al. 1986, Franke et al. 1988
). Der pMT3-Vektor wiederum setzt sich aus dem SV40-
Replikationsursprung und Verstärker (SV40 Ori + Enhancer) für die COS-1 Zellen, dem
Adenovirus-Major-Late-Promotor (AdMLP) mit Tripartite Leader (dient als
Translationsverstärker), dem Dihydrofolat-Reduktase-Gen (DHFR, unentbehrlich für
die Nukleotid-Synthese), dem Polyadenylierungssignal (PolyA, unentbehrlich für die
Translation der mRNA zum Protein), dem virusassoziierten Gen (VAI), dem PBR322-
Replikationsursprung (PBR322 Ori) für die Vervielfältigung der Plasmid-DNA in E. coli
und dem β-Lactamase-Gen zur Unterscheidung von plasmidenthaltenen E. coli-
Bakterien (Antibiotikaresistenz) zusammen.
2 MATERIALIEN UND METHODEN
52
2.1.4 Oligonukleotide
Die Oligonukleotide wurden mit Hilfe des Programms Lasergene (DNASTAR, USA)
entworfen und anschließend durch die Firma Sigma-Aldrich synthetisiert
(Oligonukleotidsequenzen, siehe Tab. 5.1). Als erstes wurde die N2C-Mutation mit
Hilfe der spezifisch synthetisierten Oligonukleotide über die Polymerase-
Kettenreaktion in das Opsingen eingefügt. Dieses Opsingen wurde wiederum in den
pMT3-Vektor ligiert. Nach der Replikation des Plasmids in E. coli wurde das Plasmid
aufgereinigt und das EcoRI/SpeI-Fragment aus der N2C-Mutante ausgeschnitten.
Dieses Fragment wurde anschließend in den Vektor mit der D282C-Mutation ligiert.
Alle weiteren Mutationen wurden auf dem Hintergrund der N2C/D282C Mutation
durchgeführt.
2.1.5 Retinoide
All-trans-Retinal in Pulverform (Sigma-Aldrich) wurde in Ethanol gelöst, so dass
Konzentrationen zwischen 20 mM und 30 mM entstanden. Die Konzentrationen
wurden UV/Vis-spektroskopisch bestimmt (λmax 383 nm, ε = 42 900 M-1 cm-1 (Wald und
Brown 1953).
Abbildung 2.1: Eukaryotischer Expressionsvektor pMT4. Das pMT4-Plasmid besteht aus dem
abgebildeten pMT3-Plasmid und einem, mittels EcoRI/NotI-Schnittstellen eingefügten synthetischen
Opsingen (Ferretti et al. 1986, Franke et al. 1988). Ori: Replikationsursprung, DHFR: Dihydrofolat-
Reduktase-Gen, AdMLP: Adenovirus-Major-Late-Promotor, PolyA: Polyadenylierungssignal, VAI:
virusassoziiertes Gen. Plasmid aus Khorana (1993).
2 MATERIALIEN UND METHODEN
53
11-cis-Retinal wurde durch die Illumination von all-trans-Retinal mit gelbem
Licht (λ > 420 nm) isomerisiert. Die Aufreinigung und Separation des entstandenen
11-cis-Retinals (Anteil von 11-cis-Retinal an der gesamten Retinalmenge ist 25 %)
erfolgte durch eine preparative HPLC (HPLC-Säule – siehe Abbschnitt 2.3). Die
Messung der Konzentration wurde mittels UV/Vis-Spektroskopie durchgeführt (λmax
382 nm, ε = 25 000 M-1 cm-1 (Hubbard et al. 1971). Die Messung der Reinheit der
11-cis-Retinalprobe erfolgte durch eine analytische HPLC mit 5 % Diethylether (Merck,
Deutschland) in Heptan (Sigma-Aldrich).
Die Herstellung des 11-cis- und all-trans-PrSB erfolgte in Ethanol durch
Zugabe von n-Propylamin (Sigma-Aldrich) in zehnfacher Menge des Retinals und durch
anschließende Inkubation über Nacht bei 4 °C (Zhukovsky et al. 1991).
2.2 Methoden zur Probengewinnung
2.2.1 Mutagenese des Opsingens, Expression der Opsinmutanten und
Präparation der Rhodopsin- und Opsinmutanten
Vorraussetzung für die Klonierung der Opsinmutanten ist ein synthetisch
hergestelltes Opsingen mit EcoRI/NotI-Restriktionsschnittstellen (Ferretti et al. 1986),
welches in den pMT3-Vektor ligiert wurde.
2.2.1.1 Basenaustausch mittels Polymerase-Kettenreaktion
Mit Hilfe des QuikChange-Site-Directed-Mutagenesis-Kit (Stratagene, USA) und
unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden kann eine Punktmutation auf
das replizierte Plasmid mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR, Polymerase Chain
Reaction) übertragen werden.
2 MATERIALIEN UND METHODEN
54
Folgender PCR-Ansatz zur Amplifikation des pMT4-Vektors wurde verwendet:
Menge
Reagenz
2,5 µl
10 x Reaktionspuffer
X µl (25 ng)
doppelsträngige DNA-Matrize
X µl (125 ng)
Forward-Oligonukleotidprimer
X µl (125 ng)
Reverse-Oligonukleotidprimer
0,6 µl
25 mM dNTP-Gemisch
mit destilliertem Wasser auf 24,5 µl auffüllen
0,5 µl
PfuTurbo-DNA-Polymerase (2,5U/µl)
Für die Polymerase-Kettenreaktion wurde folgendes Programm verwendet:
Zyklus
Temperatur
Zyklusdauer
1
95 °C
2 Minuten
2-X
95 °C
30 Sekunden
60 °C
1 Minute (Anlagerung der Oligonukleotide)
64 °C
12 Minuten (Extension)
X+1
10 °C
bis zur Probenentnahme
Die maximale Zyklenanzahl X und die Anlagerungstemperatur
(Hybridisierungstemperatur) variieren bei unterschiedlichen Oligonukleotiden. Die
Extensionszeit der PCR hängt von der Länge des jeweilig verwendeten Gens ab
(1 Minute je kb Genlänge). Detaillierte Informationen sind in der Benutzeranleitung des
QuikChange-Site-Directed-Mutagenesis-Kits (Stratagene, USA) zu finden. Nach jeder
PCR wurde das amplifizierte Produkt über ein einprozentiges Agarosegel gereinigt und
mittels Sequenzierung auf eventuelle Fehler bei der PCR untersucht.
2.2.1.2 DpnI-Restriktionsverdau
Die methylierte Matrizen-DNA wurde mittels Restriktionsenzym DpnI verdaut
und damit zerstört. Für diesen Ansatz wurde 1 µl DpnI direkt zum PCR-Ansatz
gegeben und eine Stunde bei 37 °C inkubiert.
2 MATERIALIEN UND METHODEN
55
2.2.1.3 Transformation der kompetenten XL1-Blue-E. coli-Bakterien
Um die E. coli-Bakterien mit dem modifizierten pMT4-Plasmid zu
transformieren, wurden 2 µl des mit DpnI-behandelten PCR-Ansatzes zu 50 µl
chemisch kompetenter Bakterien (XL1-Blue-Stamm) gegeben und 15 Minuten bei 4 °C
inkubiert. Die Aufnahme des Plasmids durch E. coli erfolgte durch einen
zweiminütigen Hitzeschock bei 42 °C. Anschließend wurde der Transformationsansatz
für zwei Minuten auf 4 °C abgekühlt und mit 500 µl des auf 37 °C vortemperierten LB-
Mediums (Miller Becton-Dickinson, USA) versetzt. Nach einstündiger Inkubation wurden die
E. coli auf LB-Medium-Agar-Platten mit Zusatz von 100 µl/ml Ampicillin (Roche)
ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
2.2.1.4 Kultivierung der E. coli-Bakterien
Während der Inkubation über Nacht wuchsen nur E. coli-Kolonien, die das
pMT4-Plasmid mit dem Antibiotikaresistenzgen enthielten. Diese E. coli-Kolonien
wurden am darauffolgenden Tag ausgewählt und in 5 ml flüssiges LB-Medium (Miller
Becton-Dickinson, USA) überführt. Diese E. coli-Minikulturen wurden über Nacht auf dem
Schüttler bei 37 °C inkubiert. Danach wurden diese in 400 ml flüssiges LB-Medium
überführt und nochmals über Nacht bei 37 °C kultiviert (Maxikulturen).
2.2.1.5 Plasmid-Aufreinigung
Die Plasmid-Aufreinigung aus den Minikulturen der E. coli-Bakterien erfolgte
mittels GeneJet-Plasmid-Miniprep-Kit (Fermentas, USA). Detaillierte Informationen sind in
der Benutzeranleitung für das GeneJet-Plasmid-Miniprep-Kit zu finden.
Die Plasmid-Aufreinigung aus den Maxikulturen der E. coli-Bakterien wurde
mittels NucleoBond-Xtra-Maxi-Kit (Macherey-Nagel, Deutschland) durchgeführt. Das
Protokoll ist analog zu dem des GeneJet-Plasmid-Miniprep-Kits (Fermentas, USA), nur
mit der Ausnahme, dass die DNA nach der Elution nochmals mit Isopropanol
präzipitiert, getrocknet und in Tris-HCl-Puffer resuspendiert wurde. Für detaillierte
Informationen steht die Benutzeranleitung des NucleoBond-Xtra-Maxi-Kits zur
Verfügung
2.2.1.6 Analytischer und präparativer Restriktionsverdau von Plasmid-DNA
Mit der spezifischen Restriktion der Plasmid-DNA und der anschließenden
Auftrennung der verdauten Fragmente mittels Agarosegelelektrophorese konnte das in
das Plasmid klonierte Opsingen nachgewiesen werden. Der analytische
Restriktionsverdau erfolgte mit 2 µl aufgereinigter Plasmid-DNA (400 ng). Zu einem
Probenvolumen von 20 µl wurden 2 µl 10 x Puffer (New England Biolabs und Fermentas,
2 MATERIALIEN UND METHODEN
56
USA), 0,2 µl 100 x BSA-Lösung (Sigma-Aldrich) und 0,5 µl Restriktionsenzym (New England
Biolabs, USA) gegeben und eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 5 –
15 µl auf ein Agarosegel aufgetragen.
Der präparative Restriktionsverdau der Plasmid- und Fragment-DNA erfolgte
mit 3 – 4 µg aufgereinigter Plasmid-DNA in einem Probenvolumen von 300 µl. Zu
dieser Probe wurden 30 µl 10 x Puffer, 3 µl 100 x BSA und 5 µl Restriktionsenzym
gegeben. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37 °C wurde der Restriktionsansatz
dephosphoryliert.
2.2.1.7 Dephosphorylierung der verdauten Plasmid-DNA
Als Vorbereitung der Ligation wurde die verdaute Plasmid-DNA am 5’-Ende der
DNA dephosphoryliert. Dies erfolgte durch die Zugabe von 1 µl alkalischer
Phosphatase (5 Units (Roche)) zu den 30 µl der Probe. Anschließend wurde 10 µl 10 x
Puffer (New England Biolabs, USA) dazugegeben und mit deionisiertem Wasser auf 100 µl
aufgefüllt. Nach einer Inkubation von 10 Minuten bei 37 °C wurde der komplette
Ansatz über ein einprozentiges Agarosegel aufgetrennt und die Plasmid-DNA aus dem
Gel ausgeschnitten und aufgereinigt.
2.2.1.8 Isolierung und Reinigung der DNA-Fragmente aus Agarosegelen
Die Isolierung und Reinigung der DNA-Fragmente, die für weitere Schritte
genutzt werden sollen, erfolgte mit Hilfe des GeneJET-Gel-Extraction-Kits (Fermentas,
USA). Dazu wurden die Fragmente des restringierten Plasmids mittels
Agarosegelelektrophorese getrennt und das entsprechende DNA-Fragment aus dem
Agarosegel ausgeschnitten und aufgereinigt. Für weitere Informationen steht die
Benutzeranleitung des GeneJET-Gel-Extraction-Kits zur Verfügung.
2.2.1.9 Ligation des kompletten Opsingens oder Teile dessen in den pMT4-
Vektor
Zur Ligation des aufgereinigten Opsin-DNA-Fragments in den pMT4-Vektor
wurde das Quick-Ligation-Kit (New England Biolabs, USA) verwendet. Hierzu wurden 50 ng
Plasmid-DNA mit dreifach molarem Überschuss an Opsin-DNA-Fragment in 10 µl
deionisiertem Wasser verdünnt und 10 µl 2 x Quick-Ligation-Reaction-Puffer
dazugegeben. Mit der Zugabe von 1 µl Quick-T4-DNA-Ligase wurde die Reaktion
gestartet. Nach einer Inkubation von 5 Minuten bei Raumtemperatur konnte der
Ligationsansatz für die Transformation in E. coli weiterverwendet werden. Die
detaillierten Informationen sind in der Benutzeranleitung des Quick-Ligation-Kits zu
finden.
2 MATERIALIEN UND METHODEN
57
2.2.1.10 Kultivierung der COS-1 Zellen
Die COS-1 Zellen wurden in Rollerflaschen mit einer Oberfläche von 850 cm2
unter 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchte bei 37 °C kultiviert. Nach drei Tagen der
Kultivierung in 250 ml DMEM-Medium (Gibco Invitrogen, USA) mit 1 % L-Glutamin (Gibco
Invitrogen, USA), 1 % Penicillin/Streptomycin (Gibco Invitrogen, USA) und 10 % FCS (fötales
Kälberserum (Gibco Invitrogen, USA)) und bei einer Konfluenz von 80 % wurden die Zellen
auf neue mediumbefüllte Rollerflaschen aufgeteilt. Die Aufteilung erfolgte so, dass sich
∼21 000 Zellen pro cm2 Rollerflaschenoberfläche in frischem Medium befanden.
2.2.1.11 Transfektion der COS-1 Zellen
Die Transfektion der COS-1 Zellen mit den entsprechenden Plasmiden wurde
mittels DEAE-Dextran-Methode durchgeführt (Schenborn und Goiffon 2000). Für diese
Transfektion wurde 150 µg Plasmid-DNA pro Rollerflasche verwendet. Zuerst wurde
der Transfektionsansatz in einem separaten, sterilen Gefäß hergestellt. Dazu wurden
48 ml DMEM-Medium (Gibco Invitrogen, USA) ohne FCS (fötales Kälberserum, Gibco
Invitrogen, USA) mit 6 ml 1 M Tris-HCl-Lösung und 6 ml DEAE-Dextran (2,5 mg/ml DEAE in
DMEM (Sigma-Aldrich)) gemischt. Anschließend wurden die 150 µg DNA dazugegeben.
Diese insgesamt 60 ml Transfektionsansatz wurden auf 37 °C vorgewärmt. Nachdem
das alte Medium entfernt wurde und die Zellen mikroskopisch überprüft wurden,
konnte der vorgewärmte Transfektionsansatz auf die adhärenten COS-1 Zellen
gegeben werden. Nach einer fünfstündigen Inkubation wurde der Transfektionsansatz
verworfen und 10 µM Chloroquin (Sigma-Aldrich) in 75 ml Vollmedium (DMEM, 1 % L-
Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin und 10 % FCS) auf die Zellen gegeben. Nach
nochmaliger Inkubation für 1 ½ Stunden im Brutschrank bei 37 °C wurde der
Chloroquin-Ansatz abgegossen und die transfizierten COS-1 Zellen zweimal mit PBS
(Gibco Invitrogen, USA) gewaschen. Nachdem 250 ml Vollmedium zu den Zellen gegeben
wurde, wurden diese für drei Tage im Inkubator kultiviert. Die Prozedur der
Transfektion wurde durch Oprian et al. (1987) beschrieben und durch Meyer et al.
(2000) modifiziert.
2.2.1.12 Ernte der transfizierten COS-1 Zellen
Zum Ernten der COS-1 Zellen wurde das alte Medium entfernt, die
transfizierten Zellen zweimal mit PBS (Gibco Invitrogen, USA) gewaschen und
anschließend für 10 Minuten mit 1 mM EDTA (Sigma-Aldrich) in PBS inkubiert. Nachdem
die adhärenten Zellen in Suspension gebracht wurden, wurde eine halbe Tablette
Complete™-Proteaseinhibitor (Roche) in 5 ml PBS gelöst und zu den COS-1 Zellen in
die Suspension gegeben. Anschließend wurde die Zellsuspension in 50 ml Falcon-
2 MATERIALIEN UND METHODEN
58
Röhrchen überführt und für zwei Minuten bei 1800 x g zentrifugiert. Danach wurde das
Zellpellet in 15 ml PBS resuspendiert.
2.2.1.13 Rekonstitution von COS-1 Zellen (Nur für die Rhodopsinproben)
Da die COS-1 Zellen nur das Opsin exprimierten (ohne den Retinalliganden),
mussten die Zellen für die Untersuchung am Rhodopsin und dessen Mutanten mit
11-cis-Retinal bzw. mit 11-cis-PrSB (n-Propylamin (Sigma-Aldrich) ist über eine
Schiff’sche Base mit dem Retinal verknüpft) rekonstituiert werden. Zur Rekonstitution
der Opsinmoleküle wurde ein dreifacher Überschuss an 11-cis-Retinal bzw.
11-cis-PrSB verwendet. Da das Retinal lichtempfindlich ist, musste es bei Rotlicht
zugegeben werden. Die Inkubation des Rekonstitutionsansatzes erfolgte über Nacht
bei 4 °C im Dunkeln. Die Weiterverarbeitung der rekonstituierten Rhodopsinmoleküle
musste ab diesem Zeitpunkt bei Rotlicht durchgeführt werden.
2.2.1.14 Herstellung des 1D4-Immuno-Affinitätsgels
Das 1D4-Immuno-Affinitätsgel diente der Aufreinigung des exprimierten Opsins
und Rhodopsins in Detergenz. Bei der Herstellung des 1D4-Immuno-Affinitätsgels
wurde der monoklonale rho-1D4-Antikörper ((Molday und MacKenzie 1983), The University of
British Columbia, Vancouver, Canada) kovalent an eine CNBr-aktivierte Sepharose™-4-Fast-
Flow (
Amersham Pharmacia Biotech, Deutschland) gebunden (Verfahren modifiziert nach
Oprian et al. (1987)).
Vor der Kopplung des rho-1D4-Antikörpers an die CNBr-aktivierte
Sepharose™-4-Fast-Flow-Trägermatrix musste diese fünfmal mit 1 mM HCl
gewaschen werden (50 ml Volumen; Zentrifugation: 30 s, 1800 x g). Bevor die
Antikörperlösung auf die Sepharose gegeben werden konnte, musste diese einmal mit
dem Kopplungspuffer (100 mM NaHCO3, 500 mM NaCl, pH 8,3) gewaschen werden. Nach
der Zentrifugation (30 s, 1800 x g) wurde der Überstand verworfen und 80 mg rho-
1D4-Antikörper, gelöst in 40 ml Kopplungspuffer, auf 3 g CNBr-aktivierte
Sepharose™-4-Fast-Flow gegeben. Nach einer Inkubation von 1 ½ Stunden bei
Raumtemperatur wurde das mit dem Antikörper gekoppelte Gel zweimal gewaschen.
Nachdem der Überstand des letzten Zentrifugationsschritts verworfen wurde, wurden
40 ml des 100 mM Tris-HCl-Puffers (pH 8,3) auf das Gel gegeben und zwei Stunden
inkubiert. Anschließend wurde das 1D4-Immuno-Affinitätsgel fünfmal abwechselnd mit
Acetat-Puffer (100 mM Na-Acetat, 500 mM NaCl, pH 4) und Tris-HCl-Puffer (100 mM Tris-HCl,
1 mM MgCl2, pH 6,8) gewaschen. Da das 1D4-Immuno-Affinitätsgel in BTP-Puffer (20 mM
BTP (Sigma-Aldrich), 130 mM NaCl, 1 mM MgCl2, pH 6,8) verwendet werden sollte, wurde es
zweimal in diesem Puffer gewaschen. Anschließend wurde das 1D4-Immuno-
2 MATERIALIEN UND METHODEN
59
Affinitätsgel im Verhältnis 1:1 mit dem gleichen BTP-Puffer aufgefüllt und bei 4 °C bis
zur Verwendung gelagert.
Die Ermittlung der Kopplungseffizienz erfolgte durch die Messung der
Proteinkonzentration in der Kopplungslösung vor und nach der Verknüpfung des
Antikörpers mit der Sepharoseträgermatrix. Die Bindungskapazität wurde durch die
Zugabe einer spezifischen Menge an nativem Rhodopsin in Detergenz zu einer
definierten Menge an 1D4-Immuno-Affinitätsgel bestimmt. Nach der anschließenden
affinitätschromatographischen Aufreinigung wurde aus der Menge des aufgereinigten
Rhodopsins die Bindungskapazität berechnet.
2.2.1.15 Aufreinigung des Pigments
Die Aufreinigung der Pigmente erfolgte durch die spezifische Bindung des C-
Terminus der Opsin- oder Rhodopsinmoleküle an den an die Sepharoseträgermatrix
gekoppelten 1D4-Antikörper (Oprian et al. 1987). Um die Opsin- und Rhodopsinmoleküle
aufreinigen zu können, wurden diese in einprozentigem DDM (n-Dodecyl-β-D-Maltosid
(Biomol, Deutschland)) solubilisiert. Dazu wurde die entsprechende Menge an
zehnprozentigem DDM direkt zur Zellsuspension gegeben und drei Stunden bei 4 °C
inkubiert. Danach wurde die Zellsuspension drei Minuten bei 1800 x g zentrifugiert
und der Überstand auf das vorbereitete 1D4-Immuno-Affinitätsgel in die Säule
gegeben. Die Menge des verwendeten Gels ist abhängig von dessen
Bindungskapazität (Bindungskapazität: 0,7 – 1 µg Rhodopsin / µl Gel). Die Bindung
der Opsin- oder Rhodopsinmoleküle an den Antikörper erfolgte über Nacht bei 4 °C.
Am nächsten Tag wurde der gesamte Ansatz in eine 5 ml Zentrifugationssäule (Thermo
Scientific, USA) überführt und 30 s bei 500 x g zentrifugiert. Das 1D4-Immuno-
Affinitätsgel mit gebundenem Pigment wurde zweimal mit PBS (
Gibco Invitrogen, USA)
und einmal mit 10 mM BTP (pH 6) (Sigma-Aldrich) gewaschen, bevor 500 – 800 µl des
Elutionspuffers in die am Ausfluss geschlossenen Säulen gegeben wurde. Der
Elutionspuffer (10 mM BTP, 0,03 % DDM, pH 6) enthielt 100 µM des Rhodopsin-1D4-
Peptids (331DEASTTVSKTETSQVAPA348, Dr. Petra Henklein, Charité, Deutschland), welches
aus den letzten 18 C-terminalen Aminosäuren des Rhodopsins bestand. Nach einer
5 – 7-stündigen Inkubation der geschlossenen Säule bei 4 °C wurden die Säule am
Ausfluss wieder geöffnet und der Durchfluss mit dem Pigment aufgefangen. Die
Elutionsprozedur wurde zweimal wiederholt, um die komplette Menge an Pigment
vom Antikörper lösen zu können. Nach der spektroskopischen Bestimmung der
Konzentration des Opsins (λmax 280 nm, ε280nm = 81 200 M-1 cm-1, Surya et al. 1995) oder
Rhodopsins (λmax 500 nm, ε500nm = 40 600 M-1 cm-1, Surya et al. 1995) wurde die Probe in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -40 °C gelagert. Im Fall einer zu niedrigen
2 MATERIALIEN UND METHODEN
60
Opsin- oder Rhodopsinkonzentration wurden die drei Elutionen einer Probe vereint
und mittels Centricon YM-30 (Merck Millipore, Deutschland) aufkonzentriert.
Das Wachsen und Ernten der COS-1 Zellen, die Rekonstitution der
COS-1 Zellmembranen und die Aufreinigung des Pigments basieren auf einer
Prozedur, die durch Meyer et al. (2000) beschrieben wurde.
2.2.1.16 Klonierungsstrategie
Schritt der
Klonierungs-
prozedur
Verwendete Methode
1.
Polymerase-Kettenreaktion
2.
DpnI-Restriktionsverdau
3.
Transformation des modifizierten Vektors in kompetente E. coli-
Bakterien
4.
Kultivierung der E. coli-Bakterien auf LB-Agar-Platten und in
Minikulturen
5.
Plasmidaufreinigung aus den Minikulturen
6.
Sequenzierung des Opsingens
7.
Restriktion des Plasmids (Ausschneiden des Opsingens)
8.
Isolierung des Opsin-DNA-Fragments mittels Agarosegel und
Exzision der entsprechenden Bande aus dem Gel
9.
Dephosphorylierung des Opsin-DNA-Fragments
10.
Ligation des Opsin-DNA-Fragments in einen neuen pMT3-Vektor
11.
erneute Transformation in E. coli-Bakterien
12.
Kultivierung der E. coli-Bakterien auf LB-Agar-Platten in Mini- und
Maxikulturen
13.
Plasmidaufreinigung aus Minikulturen und Sequenzierung
14.
Plasmidaufreinigung aus Maxikulturen
15.
Transfektion von COS-1 Zellen
16.
Kultivierung von COS-1 Zellen
17.
Präparation von COS-1 Zellen
18.
Rekonstitution von COS-1 Zellen (Nur für die Rhodopsinproben)
19.
Aufreinigung des Pigments (Opsin oder Rhodopsin)
2 MATERIALIEN UND METHODEN
61
2.2.2 Gewinnung der Proben aus den Stäbchenzellen boviner Retinae
2.2.2.1 Präparation gereinigter Diskmembranen
Die Retinae wurden aus den Augen geschlachteter Rinder extrahiert. Dazu
mussten diese Augen durch einen Schnitt in die Cornea geöffnet und Linse und
Glaskörper entfernt werden. Die lose aufliegende Retina konnte durch Umstülpen des
Auges vom hinteren Teil des Bulbus, durch Zusammenschieben in Richtung des
Nervus opticus und anschließendem Abschneiden entfernt werden. Danach wurden
die Retinae in einer 45 %igen Saccharoselösung (1 ml / Retina, Puffer (40 mM K2HPO4,
26 mM KH2PO4, 1 mM Mg(CH3COO)2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 10 mM Glucose), pH 7)
bei -80 °C gelagert.
Der nächste Schritt der Präparationsprozedur ist die Aufreinigung der
Stäbchenaußensegmente (Rod Outer Segment, ROS) nach einer Methode von
Papermaster (1982). Das zweiminütige Schütteln der aufgetauten Retinae führte dazu,
dass das verbindende Zilium zwischen Außen- und Innensegment der Stäbchenzelle
brach. Die anschließende Zentrifugation (2500 x g, 5 min, 4 °C) und das Filtrieren des
Überstandes durch eine Baumwollgaze (Porengröße: 100 µm) trennte das
Außensegment von den restlichen Zellbestandteilen. Nach einer erneuten
Zentrifugation (9000 x g, 10 min, 4 °C) des Filtrats wurde der Überstand verworfen und
das Pellet in einer 45 %igen Saccharoselösung in Puffer (40 mM K2HPO4, 26 mM KH2PO4,
1 mM Mg(CH3COO)2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 10 mM Glucose), pH 7)
resuspendiert. Diese Suspension wurde dann auf einen diskontinuierlichen
Saccharose-Dichtegradienten (ρ = 1,11 g/cm3; 1,13 g/cm3; 1,15 g/cm3) aufgetragen
und zentrifugiert (15 000 x g, 20 min, 4 °C). Die ROS, welche zwischen der oberen und
mittleren Schicht des Dichtegradienten zu finden waren, wurden abgesaugt und mit
Puffer (40 mM K2HPO4, 26 mM KH2PO4, 1 mM Mg(CH3COO)2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mM
PMSF, 10 mM Glucose), pH 7) durch Zentrifugation (4500 x g, 7 min, 4 °C) gewaschen. Die
Ausbeute an Rhodopsin in den ROS betrug 50 – 80 mg / 100 Retinae. Das Pellet
konnte mit 1 – 2 ml Überstand bei -40 °C gelagert werden oder zur Gewinnung der
gereinigten Diskmembranen (WMs, Washed Membranes) weiterverarbeitet werden.
Der letzte Schritt dieser Präparationsprozedur war die Extraktion der
gereinigten Diskmembranen aus den ROS. Die Extraktion erfolgte im Dunkeln durch
Resuspension der ROS in hypotonischem Puffer (5 mM PIPES (Sigma-Aldrich), 1 mM
EDTA (Sigma-Aldrich), 1 mM DTT (Sigma-Aldrich), pH 7). Die peripheren Membranproteine
dissoziierten unter diesen Bedingungen von der Diskmembran (Kühn 1982). Das
2 MATERIALIEN UND METHODEN
62
membranintegrale Rhodopsin blieb dagegen in den Diskmembranen und konnte mit
diesen abzentrifugiert (35 000 x g, 20 min, 4 °C) werden. Anschließend wurde das
Pellet durch wiederholte Resuspension in hypotonischem Puffer (5 mM PIPES, 1 mM
EDTA, 1 mM DTT, pH 7) und Zentrifugation gewaschen. Dies sicherte das weitere Ablösen
membrangebundener Proteine. Abschließend wurde das Pellet in isotonischem Puffer
(20 mM BTP, 130 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,5) resuspendiert und bei -40 °C
gelagert. Die gereinigten Diskmembranen enthielten neben den Lipiden der Membran
fast ausschließlich Rhodopsin. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte UV/Vis-
spektroskopisch bei λmax 500 nm.
2.2.2.2 Präparation des Apoproteins Opsin
Die gereinigten Diskmembranen (WMs, Washed Membranes) wurden in
isotonischem Puffer (20 mM BTP, 130 mM NaCl, 1 mM MgCl2, pH 7,5) resuspendiert und
mittels Ultraschall homogenisiert. Anschließend wurden die WMs in Anwesenheit von
25 mM Hydroxylamin (Sigma-Aldrich) belichtet. Die Belichtung in Anwesenheit von
Hydroxylamin führte zur Aktivierung des Rezeptors und zu dessen sofortigem Zerfall in
Opsin und all-trans-Retinaloxim. Das störende all-trans-Retinaloxim wurde in
Anwesenheit von BSA (Sigma-Aldrich) durch drei- bis viermalige Zentrifugation
(48 000 x g, 30 min) und Resuspension des WM-Pellets entfernt. Ein
Absorptionsspektrum gibt Aufschluss über den Retinaloximgehalt in den
Opsinmembranen (Retinaloxim, λmax 360 nm) und damit darüber, wie häufig der
Waschschritt wiederholt werden musste.
2.2.2.3 Präparation des G-Proteins Transducin
Die Aufreinigung der Transducinuntereinheiten (Gtα und Gtβγ) erfolgte in zwei
Schritten. Als erstes wurde das Gt-Holoenzym aus den Stäbchenaußensegmenten
extrahiert (Heck und Hofmann 1993, Kühn et al. 1981), und anschließend erfolgte die
Trennung der Gt-Untereinheiten (Heck und Hofmann 2001).
Für die Präparation des Gt-Proteins wurden Stäbchenaußensegmente, die aus
200 – 300 Retinae gewonnen wurden, in isotonischem BTP-Puffer A (20 mM BTP,
120 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 6,9) resuspendiert (4 mg
Rhodopsin / ml), homogenisiert (Glas/Glas-Homogenisator) und anschließend
zentrifugiert (37 000 x g, 20 Minuten, 4 °C). Diese Prozedur wurde ein weiteres Mal
wiederholt, bevor das Pellet in hypotonischem BTP-Puffer B (5 mM BTP, 5 mM DTT,
pH 6,9) resuspendiert werden konnte. Die Endkonzentration betrug nach dem
Resuspendieren 1 mg Rhodopsin / ml. Danach wurde MgCl2 zur Suspension gegeben
(Endkonzentration: 5 mM) und 10 Minuten bei 4 °C mit orangefarbenem Licht
2 MATERIALIEN UND METHODEN
63
(λ > 480 nm, Schott GG495) bestrahlt. Die Belichtung der Probe führte zur Bindung
des Gt-Proteins an die aktive Rezeptorkonformation Meta II und konnte dadurch mit
dem membranintegralen Meta II durch Zentrifugation (90 000 x g, 30 Minuten, 4 °C)
von den löslichen und zuvor membranassoziierten Proteinen getrennt werden. Das
Pellet wurde erneut in hypotonischem BTP-Puffer B resuspendiert, damit
anschließend 150 µM GTP (Sigma-Aldrich) und 50 µM MgCl2 dazu geben werden
konnten. Das GTP sorgte für eine Dissoziation des gesamten Gt-Proteins von der
Diskmembran. Nach anschließender Zentrifugation (90 000 x g, 30 Minuten, 4 °C)
befanden sich die Gt-Proteinuntereinheiten (Gtα und G
tβγ) im Überstand. Zur
Steigerung der Ausbeute wurde das Pellet nochmals in hypotonischem BTP-Puffer B
mit GTP und MgCl2 resuspendiert und zentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt
und mit einer Ultrazentrifugationszelle (Centricon YM 10, Merck Millipore, Deutschland) im
Volumen verringert. Während die Gt-Proteinprobe aufkonzentriert wurde, wurde diese
zweimal mit BTP-Puffer B und BTP-Puffer C (10 mM BTP, 100 mM NaCl, 0,5 mM MgCl2,
0,2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,5) gewaschen, um die freien Nukleotide aus der Lösung zu
entfernen. Durch eine abschließende Ultrazentrifugation (190 000 x g, 30 Minuten,
4 °C) wurden restliche Membranbestandteile vom Transducin getrennt.
Die Gt-Untereinheiten mussten mittels Affinitätschromatographie getrennt
werden. Dies geschah mit einer FPLC-Anlage (Fast Performance Liquid
Chromatography, Amersham Pharmacia Biotech, Deutschland), in der die Blue-Sepharose
(HiTrap-Blue-Sepharose, Amersham Pharmacia Biotech, Deutschland; 1 ml Bettvolumen,
1,2 ml / h Flussrate) das Transducin assoziieren konnte. Die Elution der beiden Gt-
Untereinheiten erfolgte durch BTP-Puffer D (20 mM BTP, 1 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7,5) mit
steigender Konzentration an NaCl. Eine Konzentration von 0 – 0,3 M NaCl führte zur
Elution der Gtβγ-Untereinheit. Eine Konzentration von 1 M NaCl im BTP-Puffer D
ermöglichte die abschließende Elution der Gtα-Untereinheit.
Die anschließende Dialyse (Dialyseschlauch: Durchlässigkeit bis 12,4 kDa,
Sigma-Aldrich) der separierten Transducin-Untereinheiten gegen BTP-Puffer E (20 mM
BTP, 1 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7,5) sorgte für eine Verminderung der hohen
Konzentration an NaCl.
Die Gt-Proteinfraktionen wurden aufkonzentriert, aliquotiert und abschließend
bei -40 °C in BTP-Puffer F (20 mM BTP, 130 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,1)
gelagert. Die Methode der Aufreinigung der Transducin-α/βγ-Untereinheiten aus
bovinen Retinae erfolgte nach einem Protokoll von Heck und Hofmann (1993). Die
Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte nach der von Bradford (1976)
beschriebenen Methode.
2 MATERIALIEN UND METHODEN
64
2.2.3 Erzeugung von Metarhodopsin III
Metarhodopsin III resultiert aus der antisyn-Isomerisierung der Retinyliden-
Schiff’schen Base-Bindung zwischen dem all-trans-Retinal und dem Lys296 des
Opsinmoleküls. Meta III kann spontan aus Meta I (Vogel et al. 2003, Vogel et al. 2004) oder
durch blaues Licht aus Meta II (Ritter et al. 2004) gebildet werden.
Zur Erzeugung von Meta III wurden gereinigte Diskmembranen mit 50 µM
Rhodopsin verwendet (Heck et al. 2003a). Diese Suspension wurde kurz mit Ultraschall
behandelt, um eine homogene Membranlösung zu erhalten. Anschließend wurde der
pH-Wert mit 1 N HCl auf pH 5,7 eingestellt, um das Gleichgewicht nach der
Belichtung auf die Bildung der aktiven Rezeptorkonformation Meta II zu verschieben.
Dadurch wurde der Anteil an Isorhodopsin (Opsin mit gebundenem 9-cis-Retinal)
minimiert. Unmittelbar nach der Belichtung (10 s, λ > 480 nm Schott GG495) wurde
die Probe mit 1 N NaOH auf pH 8 eingestellt. Dadurch entstand eine neue
Gleichgewichtsreaktion zwischen Meta I und Meta II mit Schwerpunkt auf der Seite
des Meta I. Während der einstündigen Inkubation der Probe bei 20 °C entstand durch
thermische Umwandlung bis zu 40 % Meta III. Das restliche Rhodopsin war zu Opsin
und all-trans-Retinal zerfallen. Die anschließende Lagerung bei 4 °C ermöglichte eine
Nutzung des Meta III über einen ganzen Tag hinweg. Dies war möglich, da der Zerfall
von Meta III eine Halbwertszeit von t½ = 460 Stunden bei 0 °C hat (Zimmermann et al.
2004). Die Quantifizierung des Meta III erfolgte durch die CTα-Peptid-induzierte
Abnahme der Absorption bei 470 nm unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten
ε470nm = 40 600 M-1 cm-1 (Kolesnikov et al. 2003).
2.3 Allgemeine Detektionsmethoden
2.3.1 Konzentrationsbestimmung der DNA
Die Konzentration der Plasmid-DNA wurde mit Hilfe des NanoDrop ND-1000
Spektrometers bestimmt. Durch dieses Spektrometer war es möglich, die
Konzentration von 1 µl unverdünnter DNA-Probe (2 – 3700 ng / µl doppelsträngige
DNA; Minipräparationen: 200 – 500 ng / µl; Gigapräparatien: 1000 – 1400 ng / µl) ohne
Küvette oder Kapillare ermitteln zu können. Die DNA-Lösung wurde auf die untere
optische Oberfläche pipettiert. Durch das Schließen des oberen Gerätearms wurde die
obere optische Oberfläche auf den DNA-Tropfen gedrückt. Durch das anschließende
Einstellen der Passierlänge des Lichtstrahls wurde der Tropfen auseinandergezogen,
ohne dass er reißen konnte. Das Aussenden des Messlichts und die Messung der
2 MATERIALIEN UND METHODEN
65
Absorption der DNA bei 260 nm und 280 nm wurden mittels optischleitfähiger Kabel
gewährleistet. Für weitere Instruktionen kann in der Bedienungsanleitung der Firma
Thermo Scientific nachgeschlagen werden.
2.3.2 DNA-Sequenzierung
2 µg Plasmid-DNA wurden zur Kontrolle durch die Firma BigDye-Terminator-
Chemie (Dr. Martin Meixner, Raum 347 Genetik, Chausseestraße 117, 10115 Berlin) sequenziert.
Die Sequenzierung des Opsingens im pMT4-Vektor erfolgte über T7- oder SP6-
Promotor-Oligonukleotide binden.
2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese
Für alle Gelelektrophoresen wurden einprozentige Agarose-Minigele verwendet
(1 g Agarose in 100 ml 1 x TBE-Puffer). Die Minigele enthielten pro 100 ml Agarosegel 2 µl
Ethidiumbromid. Als Laufpuffer wurde 0,5 x TBE-Puffer in die Apparatur gefüllt. Die
angelegte Spannung betrug 100 V.
Zur analytischen Kontrolle der DNA wurden jeweils 3 µl aus dem PCR-Ansatz
mit 2 µl Ladepuffer und 3 µl RNase/DNase freiem Wasser verdünnt. Für die
präparative Gelelektrophorese wurden bis zu 100 µl aus dem
Dephosphorylierungsansatz in die Geltaschen gegeben.
2.4 Methoden zur funktionalen Charakterisierung von Opsin
und Rhodopsin sowie deren Mutanten
2.4.1 Absorptionsspektroskopie
Ein Teil der Untersuchungen von Rhodopsin und seinen Meta-Spezies konnte
durch die Absorptionsspektroskopie gewährleistet werden, da diese Pigmente
charakteristische Spektren besitzen. Rhodopsin besitzt ein Absorptionsspektrum, das
mit einem Maximum bei 280 nm die Absorption des Proteins selbst widerspiegelt, und
mit einem Maximum bei 500 nm die protonierte Schiff’sche Base-Bindung im
unbelichteten Rhodopsin zwischen 11-cis-Retinal und dem Lys296 des Moleküls
darstellt. Nach Belichtung des Rhodopsins verschiebt sich die Absorption von 500 nm
zu 380 nm. Dieses Spektrum ist charakteristisch für Meta II. Opsin besitzt nur ein
Absorptionsmaximum bei 280 nm, Meta I und Meta III absorbieren neben 280 nm
auch bei 470 nm und Isorhodopsin (9-cis-Retinyliden-Opsin), was zu einem kleinen
2 MATERIALIEN UND METHODEN
66
Teil bei jeder Belichtung des Rhodopsin entsteht, besitzt ein zusätzliches Maximum
bei 490 nm.
Durch die bekannten Extinktionskoeffizienten bei 500 nm (ε = 40 600 M-1 cm-1,
Wald und Brown 1953) und bei 280 nm (ε = 81 200 M-1 cm
-1, Surya et al. 1995) konnten
sowohl die Konzentration des Pigments als auch die Quantität der Besetzung des
Pigments mit seinem Liganden 11-cis-Retinal bestimmt werden (optimales Verhältnis
von 280 nm zu 500 nm ist 1,7).
Alle Spektren wurden mit dem Varian Cary 50 UV/Vis-Spektrometer (Auflösung:
2 nm) detektiert. Die Zeit für die Aufnahme eines Spektrums (270 nm bis 600 nm)
betrug 30 s. Alle Messungen wurden mit einem Probenvolumen von 90 µl bei 20 °C
durchgeführt. Alle Belichtungen des Rhodopsins und dessen Mutanten dauerten 15 s
und wurden mit einer Kaltlichtquelle mit Langpassfilter (λ > 480 nm, Schott GG495)
durchgeführt.
2.4.1.1 Regenerationsmessung mittels Absorptionsspektroskopie
Die Verschiebung der maximalen Absorption des 11-cis-Retinals (380 nm) auf
die maximale Absorption der protonierten Schiff’schen Base im Rhodopsin (500 nm)
beschreibt die Aufnahme des 11-cis-Retinals durch das Opsinmolekül und die
anschließende Bildung der protonierten Schiff’schen Base. Die Untersuchung der
Regeneration des Rhodopsins basiert auf der Zunahme der Absorption bei 500 nm
nach Zugabe des 11-cis-Retinals (1 µM) zum Opsinansatz (0,5 µM) in der Küvette
(Hellma Analytics, Deutschland). Die Konzentrationen der Reaktionspartner wurden für die
Messung der Regeneration aller Opsinmutanten eingesetzt, außer es wird anders
beschrieben. Die Zunahme der Absorption bei 500 nm konnte nur mit einer zeitlichen
Auflösung von 30 s gemessen werden, da die Aufnahme eines Absorptionsspektrums
diese Zeit in Anspruch nahm. Zur Untersuchung der Regenerationsgeschwindigkeit
wurde die Absorption bei 500 nm über die Zeit aufgetragen und mittels bimolekularer
Reaktionskinetik ausgewertet. Für die Untersuchungen wurde 10 mM BTP-Puffer G
(0,03 % DDM, pH 6) verwendet. Die Temperatur lag bei 20 °C, mit Ausnahme der
Untersuchung der K296G-Mutante, welche aufgrund einer schnelleren Regeneration
bei 10 °C gemessen wurde.
2.4.2 Fluoreszenzspektroskopie
Die Fluoreszenzmessung basiert auf der Absorption von Licht einer definierten
Wellenlänge (295 nm) durch Fluorophore in Biomolekülen. Diese Fluorophore sind zum
Beispiel Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten (Phenylalanin, Tyrosin und
2 MATERIALIEN UND METHODEN
67
Tryptophan), die das absorbierte Licht emittieren können (Tryptophan emittiert zum
Beispiel Licht mit einer Wellenlänge von 330 nm.). Das Opsinmolekül besitzt fünf
Tryptophanseitenketten (Trp35, Trp126, Trp161, Trp175 und Trp265), welche das
Fluoreszenzsignal dieses Moleküls dominieren. Im inaktiven Rhodopsinzustand ist die
Intensität der emittierten Fluoreszenz deutlich geringer als im Opsinzustand (Farrens und
Khorana 1995). Dies beruht auf der fluoreszenzlöschenden Wirkung des β-Iononrings
vom 11-cis-Retinal. Die Energieübertragung von den Fluorophoren auf das
Löschermolekül (Quencher: 11-cis-Retinal) erfolgt strahlungslos. Den Hauptanteil der
Fluoreszenz von Rhodopsin und Opsin trägt das Trp265, welches mit seiner
aromatischen Seitenkette parallel zum β-Iononring des 11-cis-Retinals im Rhodopsin
ausgerichtet ist (Okada et al. 2004). Die Fluoreszenzmessung ermöglicht somit die
Untersuchung der Aufnahme des 11-cis-Retinals durch das Opsinmolekül und des
Zerfalls des aktivierten Rezeptors (Meta II) zu Opsin und all-trans-Retinal. Die
fluoreszenzspektroskopischen Messungen wurden im SPEX Fluorolog 2
Spektrofluorometer durchgeführt, das mit einer 450 W Xenon-Bogenlampe bestückt
ist.
2.4.2.1 Meta II-Zerfallsmessung mittels Fluoreszenzspektroskopie
Die Messung des zeitabhängigen Anstiegs des Fluoreszenzsignals nach
Belichtung des Rhodopsins korreliert mit dem zeitlichen Verlauf des Zerfalls von
Meta II (Farrens und Khorana 1995, Heck et al. 2003a). Der monoexponentielle Anstieg der
Fluoreszenz beschreibt die Freisetzung des isomerisierten all-trans-Retinals. Erst
nachdem die Schiff’schen Base hydrolysiert ist und all-trans-Retinal das Opsinmolekül
verlassen hat, ist die maximale Emission des Trp265 im Opsin bei einer Wellenlänge
von 330 nm messbar. Konformationsänderungen des Proteins oder eine Umlagerung
des Retinals innerhalb des Proteins können aber schon vor der Hydrolysereaktion die
Emission der Fluoreszenz des Trp265 beeinflussen.
Die Untersuchung des Meta II-Zerfalls der Rhodopsinmutanten wurde in
10 mM BTP-Puffer G (0,03 % DDM, pH 6), bei 20 °C durchgeführt, mit Außnahme der
K296G-Mutante, die bei 10 °C gemessen wurde. Die verwendeten Konzentrationen
(0,5 µM Rhodopsin oder Opsin) und Volumina (90 µl) entsprachen denen der UV/Vis-
spektroskopischen Untersuchungen. Die Messung der Konzentrationen erfolgte
mittels UV/Vis-Spektroskopie. Die Zugabe weiterer Reagenzien vor oder während der
Messung erfolgte direkt in die Messküvette (Hellma Analytics, Deutschland). Zur
Lichtaktivierung des Rhodopsins und seiner Mutanten wurden die Proben 15 s mit
orangefarbenem Licht einer faseroptischen Kaltlichtquelle (λ > 480 nm, Schott GG495)
belichtet. Die Tryptophanfluoreszenzemission bei 330 nm wurde in 2 s- oder 30 s-
2 MATERIALIEN UND METHODEN
68
Intervallen für 2 – 3 Stunden aufgenommen. Um die Isomerisierung des Retinals durch
das Messlicht zu verhindern, wurde dessen Zugang zwischen den
Aufnahmeintervallen geschlossen. Die Schlitzweite für das Anregungslicht betrug
0,1 nm und die für das Emmisionslicht 4 nm.
2.4.2.2 Gt-Proteinaktivierungsmessungen mittels Fluoreszenzspektroskopie
Die Messung der Gt-Proteinaktivierung wurde mittels
Fluoreszenzspektroskopie durchgeführt. Diese Messung basiert auf der Änderung der
intrinsischen Tryptophanfluoreszenz der Gtα-Untereinheit nach dem durch Meta II
katalysierten Austausch von GDP durch GTP. Da nach dem Nukleotidaustausch das
GTP wieder hydrolysieren würde, wurde ein nicht hydrolysierbares GTP-Analogon
verwendet (GTPγS, Roche). Die Prozedur der Messung wurde bereits in der Literatur
beschrieben (Fahmy und Sakmar 1993, Meyer et al. 2000), musste aber den
Messbedingungen dieser Arbeit angepasst werden.
Die Messungen der Gt-Proteinaktivierung wurden unter folgenden
Pufferbedingungen durchgeführt: 20 mM BTP, 130 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.01 %
DDM, und 1 mM DTT, pH6 oder pH7. Die 750 µl Probenvolumen enthielten 2,5 nM
Rhodopsin oder 2,5 – 25 nM Opsin, 0,6 µM Gtα, 0,6 µM Gtβγ und 25 mM GTPγS. Die
Experimente wurden bei 20 °C durchgeführt. Die Transducinfluoreszenz wurde bei λem
340 nm (λex 300 nm) mit einer Integrationszeit von 1 s und einer Schlitzgröße für das
Anregungslicht von 1 nm und für das Emissionslicht von 4 nm aufgenommen. Zur
Messung der Gt-Proteinaktivierung durch Meta II wurde das GTPγS vor der Messung
zum Reaktionsansatz gegeben und die Reaktion mit Licht einer faseroptischen
Kaltlichtquelle (λ > 480 nm, Schott GG495) gestartet. Zur Messung der basalen Gt-
Proteinaktivierung durch Opsin wurde die Reaktion der Gt-Proteinaktivierung mit
GTPγS gestartet.
2.5 Datenanalyse
Der Meta II-Zerfall wird in folgender Gleichung vereinfacht dargestellt:
€
P→
k
A+B
(Gl. 2.1)
In dieser Gleichung repräsentiert P das Meta II, A das Opsin, B das
all-trans-Retinal, und k definiert die Geschwindigkeitskonstante für den Zerfall des
Meta II zu Opsin und all-trans-Retinal.
2 MATERIALIEN UND METHODEN
69
Der Zeitverlauf der lichtinduzierten Fluoreszenzänderung während des Meta II-
Zerfalls (A(t)) konnte mit einer einfachen monoexponentiellen Funktion beschrieben
werden (Gl. 2.2):
€
A(t)=Atot ⋅(1 −e−k⋅t)
(Gl. 2.2)
In dieser Gleichung repräsentiert A die Tryptophanfluoreszenz des Opsins, Atot
beinhaltet die Tryptophanfluoreszenz der gesamten Menge an Opsin, und k definiert
die Geschwindigkeitskonstante des Anstiegs der Tryptophanfluoreszenz während des
Reaktionsverlaufs (Hydrolyse und Abgabe des all-trans-Retinals). Aufgrund dessen,
dass die Isomerisierung des Liganden 11-cis-Retinal zu all-trans-Retinal sehr schnell
verläuft, kann dieser Prozess vernachlässigt werden.
Die Aufnahme von 11-cis-Retinal durch das Opsin und die daraus resultierende
Bildung des Rhodopsins kann durch die Gleichung 2.3 vereinfacht beschrieben
werden:
€
A+B→
k
P
(Gl. 2.3)
In dieser Gleichung steht A für Opsin, B für 11-cis-Retinal, P für Rhodopsin,
und k repräsentiert die Geschwindigkeitskonstante der Retinyliden-Schiff’schen Base-
Bildung, welche durch die Absorption bei λmax (Rhodopsin λmax = 500 nm) detektiert
werden konnte. Diese Reaktion folgt einem bimolekularen Verlauf und wird durch die
folgende Gleichung (Gl. 2.4) repräsentiert:
€
P t
( )
=
A
0
B
0
1−e
−k A0−B0
( )
t
( )
A
0
−B
0
e
−k A0−B0
( )
t
( )
(Gl. 2.4)
In dieser Gleichung repräsentiert P(t) den Anstieg der Absorption bei λmax
(Bildung des Rhodopsins), A0 und B0 spiegeln die Menge an Opsin und 11-cis-Retinal
zu Beginn der Messung wider, und k beschreibt die bimolekulare
Geschwindigkeitskonstante der Rhodopsinregeneration.
Zur Untersuchung der Affinität des Opsins für all-trans-Retinal bzw. CTα-Peptid
wurde folgendes Reaktionsschema angenommen:
(S. 2.1)
Dieses Reaktionsschema beschreibt die Aufnahme von all-trans-Retinal (C) und
die Bindung des CTα-Peptids (B) durch das Opsin (A). P steht für den Komplex aus
Opsin, CTα-Peptid und all-trans-Retinal. K1 beschreibt die Assoziation von Opsin und
CTα-Peptid, und K2 definiert die Aufnahme von all-trans-Retinal durch Opsin. Der
2 MATERIALIEN UND METHODEN
70
Faktor α beschreibt den Effekt der Bindung des all-trans-Retinals auf die Bindung des
CTα-Peptids und umgekehrt.
Das Maß der Affinität des Opsins für sein Subtrat (all-trans-Retinal, CTα-Peptid)
bei einem im Überschuss gegebenen Reaktionspartner kann mit einem
hyperbolischen Zusammenhang beschrieben werden. Für die Untersuchung der
Assoziation von CTα-Peptid und Opsin muss all-trans-Retinal in Sättigung vorliegen,
und für die Bindung von all-trans-Retinal an das Opsinmolekül muss CTα-Peptid im
Überschuss vorhanden sein. Unter diesen Bedingungen kann folgende Gleichung zur
Beschreibung der Reaktion verwendet werden:
€
P([S]) =P
max
⋅S
[ ]
K
d
+S
[ ]
(Gl. 2.5)
In dieser Gleichung beschreibt P die Menge an gebildetem Opsin-CTα-Peptid-
all-trans-Retinal-Komplex in Abhängigkeit von der Konzentration an S (CTα-Peptid
oder all-trans-Retinal). Pmax definiert die maximale Bindung von CTα-Peptid oder
all-trans-Retinal an das Opsin unter sättigenden Bedingungen des jeweils anderen
Reaktionspartners, und Kd beschreibt die Gleichgewichtskonstante, welche K1 oder K2
im Schema 2.1 entspricht.
Die hyperbolische Funktion zur Bestimmung der Affinität eines
Reaktionspartners zu Opsin ist nur dann richtig, wenn die erwartete
Gleichgewichtskonstante Kd nicht im Bereich der Konzentration des eingesetzten
Opsins liegt. Ist das der Fall, dann muss die Gleichung 2.6 zur Analyse der
Bindungseigenschaften eingesetzt werden. Diese Gleichung (Gl. 2.6) basiert auf dem
Reaktionsschema aus Gleichung 2.3, berücksichtigt aber die Verarmung beider
Reaktionspartner bei der Bildung des Produkts (Heck und Hofmann 1993).
€
P B
[ ]
( )
=
K
d
+A
[ ]
+B
[ ]
( )
−K
d
+A
[ ]
+B
[ ]
( )
2
−4⋅A
[ ]
⋅B
[ ]
( )
2
(Gl. 2.6)
In dieser Gleichung entspricht P dem Opsin-all-trans-Retinal-Komplex, B steht
für das all-trans-Retinal, und A beschreibt die Konzentration an Opsin, die maximal
gebunden wird. Die Gleichgewichtskonstante Kd definiert die Affinität des
all-trans-Retinals zu Opsin.
2 MATERIALIEN UND METHODEN
71
2.6 Geräte
Gerät
Modell (Hersteller, Land)
• Agarosegel-Laufapparatur
HE33 (Amersham, GE Healthcare, GB)
• HPLC (analytisch)
Shimadzu UFLC (LC-20AD, CTO-10ASvp, CBM-
20A/20-lite, SPD-M20A) (Shimadzu, Japan)
• HPLC (präparativ)
Beckmann, System Gold (USA)
• FPLC (präparativ)
Fast Performance Liquid Chromatography (Amersham
Pharmacia Biotech, GB)
• Fluoreszenzspektrometer
SPEX, 1680 Fluorolog II (Horiba, USA)
• Kaltlichtquelle
LQ1600 (Fiberoptics-Heim, Schweiz)
• Nanodrop
ND1000 (Thermo Scientific, USA)
• PCR-Thermocycler
FlexCycler (Analytik Jena, Deutschland)
• Tisch-Zentrifuge
Eppendorf, Modell 5417C / 5415D / 5415C
(Deutschland)
• Ultraschallbad
Bandelin Sonorex TK20 (Bandelin Electronics,
Deutschland)
• UV/Vis Spektrometer
Cary 50 Bio (Varian, Australien)
• Zentrifuge
Biofuge 28RS (Heraeus Instruments, Deutschland)
• Zentrifuge
Biofuge 15R (Heraeus Instruments, Deutschland)
• Zentrifuge
Centra CL2 (International Equipment Company, USA)
• Zentrifuge
Rotorfix 32A (Hettich Zentrifugen, Deutschland)
3 ERGEBNISSE
73
3 ERGEBNISSE
In diesem Kapitel wird gezeigt, wie Hydroxylamin und seine alkylierten Derivate
der Charakterisierung biochemischer und struktureller Eigenschaften des Rhodopsins
dienen, wie die Kanalmutationen auf die Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden
durch das Opsinmolekül wirken und wie all-trans-Retinal reversibel durch aktives
Opsin aufgenommen wird.
Die Untersuchung der Interaktion des Retinalliganden mit Opsin erfolgte mit
spektroskopischen Methoden. Die UV/Vis- und fluoreszenzspektroskopischen
Methoden ermöglichen es, die Kinetik der Aufnahme und Abgabe des Retinals durch
das Opsinmolekül untersuchen zu können. Bei der UV/Vis-Spektroskopie wurde die
Eigenschaft des Rhodopsins genutzt, definierte Wellenlängen des UV- und sichtbaren
Lichts zu absorbieren. Diese Detektionsmethode ermöglicht die Unterscheidung des
lichtsensitiven Rhodopsins (λmax 500 nm und 280 nm) von Meta II (λmax 280 nm und
382 nm) und Opsin (λmax 280 nm) (siehe Abschnitt 2.3.3.1). Die
Fluoreszenzspektroskopie basiert auf der Auslöschung der Fluoreszenz des Trp265
durch den β-Iononring des Schiff’sche Base-gebundenen 11-cis-Retinals, die nach
Aktivierung des Rhodopsin und dessen Zerfall zu Opsin und all-trans-Retinal wieder
aufgehoben wird (siehe Abbschnitt 2.3.3.2) (Farrens und Khorana 1995).
Wie die meisten Untersuchungen an Rhodopsin in der Vergangenheit, wurden
in dieser Arbeit die Untersuchungen mit Hydroxylamin in gewaschenen
Diskmembranen (WMs) durchgeführt (siehe Abschnitt 3.1), wohingegen die
Untersuchungen der Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden in Detergenzlösung
erfolgten (siehe Abschnitt 3.2 und 3.3). Die Untersuchung in Detergenzlösung hat den
Vorteil, dass ausschließlich die Interaktion von Rezeptor und Ligand untersucht
werden kann und keine Nebeneffekte durch die Interaktion des Retinalliganden mit der
Diskmembran auftreten (z.B.: Bildung von Schiff’schen Basen mit Phospholipiden).
3.1 Hydroxylamin und seine alkylierten Derivate als Mittel
zur Charakterisierung biochemischer und struktureller
Eigenschaften in Rhodopsin
Die Untersuchung der Rhodopsinaktivierung und des Meta II-Zerfalls wird
durch die hohe Reaktivität des Retinals beeinträchtigt. Die Bildung der
nichtspezifischen Schiff’schen Basen des Retinals sowohl mit den Phospholipiden als
3 ERGEBNISSE
74
auch mit den cytoplasmatisch ausgerichteten Lysinresten werden bei
physiologischem pH-Wert im Absorptionsbereich von 440 nm gemessen. In diesem
Bereich absorbieren auch einige Metarhodopsinspezies (z.B. Meta I, 478 nm und
Meta III, 470 nm) (Kolesnikov et al. 2003, Matthews et al. 1963), was zu einer
Missinterpretation der Absorptionsspektren führen kann.
Der Zerfall der aktiven Rezeptorspezies Meta II erfolgt über die Hydrolyse der
Retinyliden-Schiff’schen Base. Dazu gelangt exogenes Wasser in das Meta II, welches
die Spaltung der Retinyliden-Schiff’schen Base-Bindung ermöglicht (Janz und Farrens
2004, Jastrzebska et al. 2011
). Die Zugänglichkeit des Meta II für kleine Moleküle wie
Wasser, Hydroxylamin und Borhydrid ist bekannt (Bownds und Wald 1965, Janz und Farrens
2004, Jastrzebska et al. 2011), aber die Beschreibung des Kanals für ihre Aufnahme ist bis
heute unvollständig.
Das starke Nucleophil Hydroxylamin (HA) wird seit langem genutzt, um die
Retinyliden-Schiff’sche Base in Meta II schnell zu spalten und um Retinal zu
Retinaloxim umzuwandeln. Die alkylierten Hydroxylaminderivate o-Methyl-
Hydroxylamin (MHA) und o-Ethyl-Hydroxylamin (EHA) wurden dagegen bisher nur zur
HPLC-Analyse der Retinale verwendet (Buczylko et al. 1996, Rattner et al. 2000, van Kuijk et al.
1985).
In diesem Abschnitt soll gezeigt werden, wie die alkylierten
Hydroxylaminderivate zur Aufklärung einiger offener Aspekte des Wasserkanals
beitragen könnten und wie das HA/t-BHA-System als Werkzeug zur Unterscheidung
von Meta II, Meta III und Opsin in situ und vielleicht auch in vivo dienen könnte.
3.1.1 Einfluss von Hydroxylamin und seiner alkylierten Derivate auf die
peripheren Retinyliden-Schiff’schen Basen
Die exogene Zugabe von all-trans-Retinal (2 µM) zu Opsin (1 µM) in
aufgereinigten und isolierten Diskmembranen (λmax 280 nm) führte zu einem
Absorptionsspektrum mit einem Maximum bei 380 nm, welches freiem
all-trans-Retinal zugeordnet werden konnte. Die Zunahme der Absorption bei ca.
460 nm konnte durch die Reaktion von Retinal mit Phospholipiden und/oder
Proteinkomponenten der Membran erklärt werden. Diese Reaktion spiegelte die
Bildung peripherer, protonierter Schiff’sche Basen (SBH+) wider und zeigte nach 5 min
keine Änderungen mehr. Durch den zweifachen Überschuss an all-trans-Retinal sowie
durch die Abnahme der Absorption bei 380 nm war die Absorption der SBH
+ (λmax
440 nm) mit λmax 460 nm rotverschoben (Abb. 3.1a). Die anschließende Zugabe von
25 mM HA, MHA, EHA oder t-BHA eliminierte bei 20 °C innerhalb von 30 s nahezu die
3 ERGEBNISSE
75
gesamte SBH+-Absorption und zeigte die charakteristische Retinaloximabsorption bei
360 nm (Abb. 3.1b, c, d und e). Die Zugabe von 25 mM CMHA führte, im Gegensatz
zu den anderen Hydroxylaminverbindungen, zu einer deutlich langsameren
Umwandlung der SBH+ zu o-Carboxy-Methyl-Retinaloxim (t½ = 1 min) (Abb. 3.1f). Das
könnte mit der Carboxylgruppe im CMHA zusammenhängen, die der Aminogruppe die
Elektronen entzieht, wodurch die Verbindung weniger nukleophil ist.
3.1.2 Absorptionseigenschaften von Rhodopsin und Meta II in
Anwesenheit der alkylierten Hydroxylaminderivate
Die charakteristischen Absorptionsspektren von Rhodopsin und dessen
lichtaktivierter Form Meta II in gereinigten und isolierten Diskmembranen zeigten ein
Absorptionsmaximum für Rhodopsin bei einer Wellenlänge von 500 nm und für Meta II
von 382 nm (Abb. 3.2). Durch die Reaktion des Retinals mit Hydroxylamin (HA) oder
mit dessen Derivaten entstand Retinaloxim, welches ein charakteristisches
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 360 nm darstellte (Abb. 3.2) und sich
somit in Übereinstimmung mit der Literatur befand (Garwin und Saari 2000, Groenendijk et al.
1979).
Abbildung 3.1: Reaktionen von HA und seinen Derivaten mit peripheren Schiff’schen Basen. (a) Zu
1 µM Opsin in Membranen wurden 2 µM all-trans-Retinal gegeben. Die Bildung der peripheren
Schiff’schen Basen konnte durch die Zunahme des 460 nm Peaks und die Abnahme des 380 nm Peaks
über die Zeit verfolgt werden. (b) Durch die Zugabe von 25 mM HA zum Opsin/all-trans-Retinal-Gemisch
(durchgezogene Linie) wurde die Absorption bei 460 nm innerhalb von Sekunden eliminiert und
resultierte in einem 360 nm Peak (gestrichelte Linie). Die Kontrolle nach 3 min (gepunktete Linie) zeigte
keine weiteren Änderungen im Spektrum. (c), (d) und (e) Analog zu (b) führte die Zugabe der alkylierten
Hydroxylaminderivate MHA, EHA oder t-BHA ebenfalls zu einer schnellen Elimination der Absorption bei
460 nm. (f) Die Zugabe von CMHA zum Opsin/all-trans-Retinal-Gemisch führte ebenso zu einer Abnahme
der Absorption bei 460 nm, die aber viel langsamer als bei den anderen HA-Verbindungen erfolgte.
Eingefügte Darstellung: zeitliche Abnahme der Absorption bei 460 nm nach Zugabe von CMHA.
Messbedingungen: BTP-Puffer (pH 7,5), 130 mM NaCl und 1 mM MgCl2 bei 20 °C.
3 ERGEBNISSE
76
Das Absorptionsspektrum des inaktiven unbelichteten Rhodopsins (1 µM) blieb
in Anwesenheit von 25 mM HA, MHA, EHA, t-BHA oder CMHA bei 20 °C unverändert
(Abb. 3.2). Nach der fünfminütigen Inkubation der Rhodopsinprobe mit HA oder einem
seiner Derivate wurde diese belichtet. Die lichtinduzierte Aktivierung des Rezeptors
führte innerhalb der apparativen Zeitkonstante (30 s) zur Bildung von Meta II. In
Anwesenheit von MHA, EHA, t-BHA oder CMHA zeigten die Spektren die für Meta II
charakteristische Absorption bei 382 nm, was nahelegte, dass die modifizierten
Hydroxylaminverbindungen die Bildung von Meta II nicht beeinflussten (Abb. 3.2). Im
Gegensatz dazu führte die Anwesenheit von HA nach der Belichtung von Rhodopsin
sofort zur Bildung von Retinaloxim (λmax 360 nm).
3.1.3 Meta II-Zerfall in Anwesenheit der alkylierten Hydroxylamin-
derivate
Der Meta II-Zerfall wurde anhand der Zunahme der intrinsischen
Tryptophanfluoreszenz des Opsinmoleküls gemessen (Farrens und Khorana 1995). Die
Fluoreszenzmessung der gewaschenen Diskmembranen mit 1 µM Rhodopsin ergab in
Abbildung 3.2: Einfluss von HA und seiner Derivate auf die Absorptionseigenschaften von
Rhodopsin und Meta II. Absorptionsspektren von gewaschenen Diskmembranen mit 1 µM Rhodopsin
wurden ohne (schwarz) und mit 25 mM HA (blau), MHA (orangefarben), EHA (grün), t-BHA (rot) oder
CMHA (magenta) aufgenommen. Die Belichtung von Rhodopsin in Abwesenheit von HA führte zu einem
charakteristischen Meta II-Absorptionsspektrum (λmax 380 nm). Die Anwesenheit von MHA, EHA, t-BHA
und CMHA zeigte keinen Effekt auf die Meta II-Bildung. Die Belichtung von Rhodopsin in Anwesenheit
von HA zeigte dagegen sofort ein Spektrum mit λmax 360 nm, welches der Bildung von Retinaloxim
zugeordnet werden konnte. Die Absorptionsspektren wurden, wie in den Methoden beschrieben,
aufgenommen (BTP-Puffer (pH 7,5), 130 mM NaCl und 1 mM MgCl2 bei 20°C). Rhodopsin wurde in
Anwesenheit von 300 µM CTα-Peptid belichtet, um die Meta I-Bildung zu minimieren.
3 ERGEBNISSE
77
Abwesenheit von HA eine Zerfallsrate von 1,6 x 10-3 s-1 (t
½ = 7,2 min) (Abb. 3.3;
Kontrolle), was mit der Literatur übereinstimmt (Heck et al. 2003a).
Die Anwesenheit von 25 mM MHA, EHA oder t-BHA erhöhte die
Zerfallsgeschwindigkeit des Meta II um die Faktoren 3,6 (MHA), 2,2 (EHA) und 1,6 (t-
BHA) nur leicht (Abb. 3.3, MHA, EHA und t-BHA). CMHA (25mM) zeigte keine Effekte
auf die Rate des Meta II-Zerfalls (Abb. 3.3, CMHA). Im Gegensatz dazu erhöhte sich
die Zerfallsrate des Meta II in Anwesenheit von 25 mM HA um nahezu das 90-fache
(Abb. 3.3, HA). Die Lichtaktivierung des Rhodopsins in Anwesenheit von HA führte zu
einer anfangs starken Erhöhung der Fluoreszenz (0,4-fache relative Änderung), gefolgt
von einer sehr viel kleineren Erhöhung dieser (0,08-fache relative Änderung) (Abb. 3.3,
eingefügte Grafik, blaue Kurve). Die Ursache für die langsame Komponente des
Meta II-Zerfalls in Anwesenheit von HA kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht erklärt
werden. Die etwas geringere Fluoreszenzamplitude in den Proben ohne oder mit den
Derivaten des HA (Kontrolle, MHA, EHA, t-BHA und CMHA) im Vergleich zur
Fluoreszenzmessung des Meta II-Zerfalls in Anwesenheit von HA könnte mit der
Bildung von Meta III zu erklären sein (vgl. Abschnitt 3.1.4).
Abbildung 3.3: Einfluss von HA und seiner Derivate auf den Zerfall von Meta II. Gewaschene
Diskmembranen mit 1 µM Rhodopsin wurden ohne (schwarz) oder mit 25 mM HA (blau), MHA
(orangefarben), EHA (grün) oder t-BHA (rot) belichtet (Pfeil, hν = 10 s). Die Abgabe des all-trans-Retinals
durch das lichtaktivierte Rhodopsin (Meta II) wurde mittels Tryptophanfluoreszenz detektiert (eingefügte
Darstellung). Die Reaktionsgeschwindigkeiten des Meta II-Zerfalls (Anfangssteigung pro Endamplitude)
wurden für die Kontrolle mit 1,6 x 10-3 s-1 (n = 3, SD = 0,11 x 10-3 s-1), für die HA-Messung mit
140 x 10-3 s-1 (n = 3, SD = 33 x 10-3 s-1), für die MHA-Messung mit 5,8 x 10-3 s-1 (n = 2), für die EHA-
Messung mit 3,5 x 10-3 s-1 (n = 2), für die t-BHA-Messung mit 2,6 x 10-3 s-1 (n = 3, SD = 0,19 x 10-3 s-1)
und für die CMHA-Messung mit 1,8 x 10-3 s-1 (n = 2) ermittelt. Die Fluoreszenzsignale wurden bei 20 °C
in BTP-Puffer (pH 7,5), 130 mM NaCl und 1 mM MgCl2 aufgenommen.
3 ERGEBNISSE
78
Die Untersuchung des Meta II-Zerfalls mit steigender Konzentration von HA
oder t-BHA spiegelte den unterschiedlichen Einfluss dieser Hydroxylamine auf den
Meta II-Zerfall wider. In Anwesenheit steigender Konzentrationen von HA erhöhte sich
die Meta II-Zerfallsgeschwindigkeit (Abb. 3.4). Der Zusammenhang zwischen der HA-
Konzentration und der Zerfallsrate konnte mit einer hyperbolischen Funktion
beschrieben werden. Eine Anpassung der Datenpunkte an diese Funktion ergab eine
Sättigungsrate des Meta II-Zerfalls von 0,5 s-1 und eine apparente Affinität (Kd) des HA
für Meta II von 60 mM (Abb. 3.4). Im Vergleich zu HA hatte t-BHA minimale Effekte auf
den Meta II-Zerfall. Die Auftragung des Meta II-Zerfalls in Abhängigkeit von der t-BHA-
Konzentration auf einer größer skalierten Y-Achse ergab einen linearen
Zusammenhang (Abb. 3.4, eingefügte Grafik).
3.1.4 Meta III-Stabilität in Anwesenheit von t-BHA
Das Photoprodukt Meta III resultiert aus der anti→syn-Isomerisierung der
Retinyliden-Schiff’schen Base und entsteht spontan aus Meta I (Vogel et al. 2003, Vogel et
al. 2004
) oder durch blaues Licht aus Meta II (Ritter et al. 2004). In gewaschenen
Diskmembranen zerfällt Meta III sehr langsam zu Opsin und freiem all-trans-Retinal
(Heck et al. 2003a, Zimmermann et al. 2004). In Detergenz solubilisiertes Meta III (3 µM aller
Rezeptorspezies, wovon herstellungsbedingt nur 40 % Meta III ist), welches für diese
Messungen verwendet wurde, zeigte bei 20 °C annähernd die gleiche Zerfallskinetik
Abbildung 3.4: Einfluss der Konzentrationen von HA und t-BHA auf den Zerfall von Meta II. Der
Meta II-Zerfall wurde mittels Tryptophanfluoreszenz in Anwesenheit einer steigenden Konzentration von
HA oder t-BHA gemessen. Die hyperbolische Funktion der HA-Titrationsdaten führte zu einer
Sättigungsrate von 0,5 s-1 und einer apparenten Affinität (Kd) von 60 mM. Für die t-BHA-Titrationsdaten
konnte ein linearer Zusammenhang bestimmt werden. Eingefügte Grafik: t-BHA-Daten an einer größer
skalierten Y-Achse. Die Fluoreszenzsignale wurden bei 20 °C in BTP-Puffer (pH 7,5), 130 mM NaCl und
1 mM MgCl2 aufgenommen.
3 ERGEBNISSE
79
wie Meta III in gereinigten Diskmembranen (Abb. 3.5, Kontrolle ()). Die Zugabe von
0,5 mM CTα-Peptid (hochaffines Analog des C-terminalen Endes der Gtα-Untereinheit)
führte zu einem Zerfall des in Detergenz solubilisierten Meta III (Abb. 3.5, CTα-Peptid
()), was bereits für Meta III in Diskmembranen beschrieben wurde (Zimmermann et al.
2004). Die Kinetik des Zerfalls von Meta III in Anwesenheit von 25 mM HA zeigte einen
ähnlichen monoexponentiellen Reaktionsverlauf (k = 0,015 s-1) wie in Anwesenheit des
CTα-Peptids (k = 0,019 s-1) (Abb. 3.5, HA ()). Das Hydroxylaminderivat t-BHA
(25 mM) konnte den Meta III-Zerfall nicht beschleunigen (Abb. 3.5, t-BHA ()).
Die eingefügte Darstellung in Abbildung 3.5 zeigt die Differenzspektren, die fünf
Minuten nach der Zugabe des CTα-Peptids, HA und t-BHA aufgenommen wurden. In
Anwesenheit des CTα-Peptids war nach fünf Minuten das bei 470 nm absorbierende
Meta III vollständig in eine 380 nm absorbierende Meta II-ähnliche Spezies
umgewandelt worden (Abb. 3.5, eingefügte Grafik, Peptid) (Ritter et al. 2007, Zimmermann
et al. 2004
). Die Anwesenheit von HA führte ebenfalls zur Umwandlung des 470 nm
absorbierenden Meta III zum 360 nm absorbierenden Retinaloxim (Abb. 3.5,
eingefügte Grafik, HA). Die negative Schulter im Bereich von ca. 440 nm spiegelte den
Abbau der peripheren protonierten Retinyliden-Schiff’schen Basen wider (diese
Abbildung 3.5: Einfluss von HA und t-BHA auf den Zerfall von Meta III. Die Absorption von Meta III
(3 µM Rezeptor), mit Detergenz solubilisiert, wurde bei 470 nm über die Zeit gemessen (). Durch die
Zugabe von 500 µM CTα-Peptid () wurde ein schneller Meta III-Zerfall beobachtet. Die Anwesenheit
von 25 mM HA () führte zu einem annähernd gleich schnellen Meta III-Zerfall. Beide Datensätze
konnten durch eine monoexponentielle Funktion beschrieben werden (gestrichelte Linien; k = 0,019 s-1 in
Anwesenheit von CTα-Peptid und k = 0,015 s-1 in Anwesenheit von HA). Der Zerfall von Meta III in
Anwesenheit von t-BHA () trat mit der gleichen Rate auf wie bei der Kontrolle (). Der Pfeil indiziert den
Zeitpunkt der Zugabe von CTα-Peptid, HA und t-BHA. Die Absorptionswerte wurden korrigiert, um
Verdünnungseffekte zu minimieren. Die eingefügte Graphik zeigt die ermittelten Differenzspektren vor
und fünf Minuten nach Zugabe der verschiedenen Reagenzien. Die Differenzspektren sind nicht normiert.
Die Absorptionsspektren wurden bei 20 °C in BTP-Puffer (pH 8), 130 mM NaCl, 1 mM MgCl2 und
0,1 % DDM aufgenommen.
3 ERGEBNISSE
80
enstanden bei der Herstellung von Meta III). Es konnte kein Einfluss von t-BHA auf den
langsamen Meta III-Zerfall beobachtet werden, es zeigte sich aber eine Abnahme der
Absorption bei ca. 440 nm und eine Zunahme bei 360 nm (Abb. 3.5, eingefügte Grafik,
t-BHA). Das spiegelt die Umwandlung peripherer protonierter Retinyliden-
Schiff’scher Basen in das entsprechende Oxim wider (vgl. Abb. 3.1).
3.2 Der Effekt der Kanalmutationen auf die Aufnahme und
Abgabe des Retinalliganden durch das Opsinmolekül
Die computergestützte Identifizierung eines Kanals in der Kristallstruktur des
aktivierten Opsins (Hildebrand et al. 2009, Park et al. 2008, Wang und Duan 2011) ermöglichte
eine gezielte Auswahl an Mutationsstellen, um den Kanal biochemisch als
Ligandenkanal verifizieren bzw. charakterisieren zu können. Die kinetischen
Untersuchungen der Aufnahme und Abgabe des Liganden durch das Opsinmolekül in
Kombination mit der ortsgerichteten Mutagenese von ausgewählten Aminosäuren, die
entlang des hypothetischen Ligandenkanals lokalisiert sind, sollen weitere Hinweise
auf den Mechanismus der Ligandenaufnahme und -abgabe liefern.
Der Vergleich der Kristallstruktur des Meta II mit der des lichtsensitiven
Rhodopsins zeigt, dass sich die Retinalbindungstasche im Meta II-Zustand in zwei
Richtungen ausdehnt (Abb. 3.6a). Durch die Rotation der Aminosäurereste des Leu40,
Tyr43 und Phe293 entsteht zwischen der TM1 und TM7 eine Verbindung zwischen der
Retinalbindungstasche und der hydrophoben Diskmembran, die in dieser Arbeit als
Öffnung A definiert wurde (Abb. 3.6b). Der Vergleich der Retinalbindungstasche des
Meta II- mit der des Rhodopsinzustands zeigt, dass eine Neuausrichtung der
Aminosäurereste zueinander stattgefunden hat. Die größten Änderungen in diesem
Bereich weist das Tyr268 auf, das als Regulator für die Lys296-Schranke bei der
Aufnahme des Retinals dienen könnte (Abb. 3.6b, Abschnitt 1.4.4.3)
(Hildebrand et al. 2009).
Die zweite Verbindung von Retinalbindungstasche und hydrophober
Diskmembran wird zwischen der TM5 und TM6 im Meta II-Zustand sichtbar und wird
als Öffnung B bezeichnet (Abb. 3.6b). Die Öffnung B wird zum einen durch eine
Rotation der gesamten TM6 und zum anderen durch die Rotation einzelner
Aminosäurereste erzeugt. Durch die TM6-Rotation werden die Aminosäurereste
Ala272, Phe273 und Phe276 in Richtung Diskmembran bewegt (Abb. 3.6b). Auf der
anderen Seite der Öffnung B an der TM5 rotieren die Aminosäurereste Met207 und
Phe208 auswärts.
3 ERGEBNISSE
81
In dieser Arbeit wurden die Seitenketten von 20 Aminosäuren an den vier
Engstellen in den drei Regionen des Retinalligandenkanals (Öffnung A, B und
Bindungstasche) individuell durch Seitenketten ausgetauscht, die sich in der Größe
und Polarität von der ursprünglichen Seitenkette unterschieden (Abb. 3.6). Durch
diesen Austausch sollten die Öffnungen verkleinert oder erweitert werden, um die
Kinetik der Aufnahme und Abgabe des Retinals zu beeinflussen. Dadurch sollte der
hypothetische Ligandenkanal bestätigt werden und die Zuordnung der Öffnungen A
und B zur Aufnahme bzw. Abgabe des Retinals erfolgen.
3.2.1 Charakterisierung der Rhodopsinmutanten
Die in dieser Arbeit untersuchten 35 Rhodopsinmutanten wurden auf dem
Hintergrund einer Mutation konstruiert, die diese auch im ligandenfreien Opsinzustand
vor der schnellen Denaturierung in Detergenz schützt. Die Mutation zu Cystein an den
Stellen Asn2 und Asp282 führte während der Expression der Mutante zu einer
Disulfidbrückenbildung zwischen dem N-Terminus (NT) und der extrazellulären
Abbildung 3.6: Vergleich der Strukturen vom aktiven Meta II und inaktiven Rhodopsin und
Darstellung der Lage der in dieser Arbeit mutierten Aminosäurereste. (a) Koplanarer Schnitt durch
Meta II (oben; PDB: 3PXO) und Rhodopsin (unten; PDB: 1U19) aus cytoplasmatischer Sicht. Die Öffnung
A (A) zwischen TM1 und TM7, die Bindungstasche (BP) und die Öffnung B (B) zwischen TM5 und TM6
wurden als diese markiert. Die elektrostatischen Oberflächenpotentiale der Strukturen sind mit ±30 kT/e
negativ (rot) und positiv (blau) geladenen Oberflächenarealen konturangepasst. (b) Die Ausschnitte
zeigen die Lokalisation der Aminosäurereste, die in dieser Arbeit durch Mutation ausgetauscht wurden.
Die Öffnungen A und B sind in der Seitenansicht dargestellt (oben: Cytoplasma) und die
Retinalbindungstasche aus cytoplasmatischer Sicht. In der Mitte befinden sich die Mutanten der
Aminosäuren, die den jeweiligen Bereichen im Ligandenkanal zugeordnet sind. Abbildungen wurden mit
der PyMol-Software (www.pymol.org) erstellt.
3 ERGEBNISSE
82
Peptidschleife 3 (EL3) (Abb. 3.7a). Diese Disulfidbrücke stabilisiert das Opsin und
verlangsamt die thermische Denaturierung (Xie et al. 2003). Dadurch wird die
Untersuchung der Regeneration des Rhodopsins in Detergenzlösung ermöglicht. Die
N2C/D282C-Rhodopsinmutante in COS-1 Zellmembranen wurde in früheren FTIR-
Studien untersucht (Standfuss et al. 2008) und zeigte keine Unterschiede zum Wildtyp. In
dieser Arbeit wurde der Vergleich der N2C/D282C-Rhodopsinmutante mit dem
Wildtyp in Detergenz (N-Dodecyl-β-D-Maltosid, DDM) mittels Fluoreszenz- und
UV/Vis-Spektroskopie durchgeführt.
Die Untersuchung der Kinetik des lichtinduzierten Meta II-Zerfalls bei der
thermostabilen Rhodopsinmutante (N2C/D282C) im Vergleich zum Wildtyp mittels
intrinsischer Tryptophanfluoreszenzmessung ergab keinen signifikanten Unterschied
(Abb. 3.7b). Die Zerfallsraten beider Rhodopsinspezies (0,5 µM) folgten einer
monoexponentiellen Funktion mit einer Halbwertszeit von t = 13,9 min in DDM.
Abbildung 3.7: Vergleich der spektroskopischen Eigenschaften des Wildtyp- und N2C/D282C-
Rhodopsins. (a) Ausschnitt des extrazellulären Bereichs der Kristallstruktur der thermostabilen
N2C/D282C-Rhodopsinmutante (PDB: 2Y4J, Standfuss et al. (2007)). Die Disulfidbrücke zwischen Cys2
und Cys282 (rot) stabilisiert das Rhodopsin, indem es den N-Terminus (NT, grün) an der extrazellulären
Peptidschleife 3 (EL3, orange) fixiert. (b) Fluoreszenzspektroskopische Messung des lichtinduzierten
(Pfeil) Meta II-Zerfalls des Wildtyp- und N2C/D282C-Rhodopsins. (c) Darstellung der UV/Vis-
spektroskopischen Eigenschaften des Wildtyp- und N2C/D282C-Rhodopsins. Die spektralen Merkmale
vor und nach der Belichtung sind wie folgt dargestellt: lichtsensitiver Zustand (Spektrum 1), unmittelbar
nach der 15-sekündigen Belichtung (Spektrum 2), nach dem kompletten Zerfall des Meta II-Zustands
(Spektrum 3) und unmittelbar nach der folgenden Zugabe von 25 mM Hydroxylamin in Kombination mit
einer zweiten Belichtung (Spektrum 4). Eingefügte Grafiken: Die Zugabe von 1 N HCl unmittelbar nach
der Belichtung des Rhodopsins (schwarzes Spektrum) zerstört das Protein und erzeugt eine protonierte
Schiff’sche Base (SBH+) (blaues Spektrum). Die Bildung der SBH+ wird durch die Verschiebung des
Absorptionsmaximums von 380 nm (Meta II, rotes Spektrum) auf 440 nm (blaues Spektrum) angezeigt.
Messbedingungen: 0,5 µM Rhodopsin (-mutante) in BTP-Puffer (pH 6) und 0,03 % DDM bei 20°C.
3 ERGEBNISSE
83
Der UV/Vis-spektroskopische Vergleich der N2C/D282C-Mutante mit dem
Wildtyp zeigte für beide ein Absorptionsmaximum von λmax 500 nm im lichtsensitiven
Rhodopsinzustand (Abb. 3.7c, Spektrum 1). Das Meta II-Spektrum unmittelbar nach
15-sekündiger Belichtung spiegelte für beide Proben das charakteristische
Absorptionsmaximum von λmax 382 nm wider (Abb. 3.7c, Spektrum 2). Das Spektrum
des zerfallenen Meta II ergab für beide Proben ein leicht verschobenes
Absorptionsmaximum von λmax 385 nm, welches durch das all-trans-Retinal in der
0,03 %igen DDM-Lösung definiert wurde (Abb. 3.7c, Spektrum 3). Die Zugabe von
25 mM Hydroxylamin (HA) in Kombination mit einer zweiten Belichtung ergab ein
Absorptionsspektrum mit einem Maximum bei 360 nm (Abb. 3.7c, Spektrum 4), das
ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Wildtyp und der
thermostabilen Rhodopsinmutante aufwies. Die Bildung von Retinaloxim (λmax 360 nm)
durch die Zugabe von HA und die zweite Belichtung diente als Kontrolle für einen
vollständigen Zerfall des Rhodopsins und ermöglichte zudem die
Konzentrationsbestimmung der Proben bei λmax 500 nm.
Als einziger Unterschied zwischen der N2C/D282C-Mutante und dem Wildtyp
ist die 100-mal höhere Konzentration an HCl-Lösung (1 N) zu nennen, die benötigt
wurde, um die N2C/D282C-Mutante zu denaturieren und so die Retinyliden-
Schiff’sche Base aus dem Kern des Opsinmoleküls freizusetzen und zu protonieren.
Die Zugabe von HCl zur Probe erfolgte unmittelbar nach der Belichtung des
lichtsensitiven Rhodopsins (Abb. 3.7c, eingefügte Grafiken, schwarze Spektren) und
führte zur Rotverschiebung des Meta II-Absorptionsmaximums (λmax 382 nm) zu
λmax 440 nm, was der Absorption der protonierten Retinyliden-Schiff’schen Base
entspricht (Abb. 3.7c, eingefügte Grafiken, blaue Spektren). Die roten Spektren in den
eingefügten Grafiken der Abbildung 3.7c spiegeln die Meta II-Spektren (λmax 382 nm)
unmittelbar nach der Belichtung des Rhodopsin und kurz vor der Zugabe der HCl-
Lösung wider. Da die N2C/D282C-Rhodopsinmutante im Methodenspektrum dieser
Arbeit keinen Unterschied zum Wildtyp aufwies, wurden die Effekte durch den
Austausch der Aminosäureseitenketten innerhalb des Kanals auf dem Hintergrund
dieser Mutation gemessen.
Nach jeder Expression und Aufreinigung einer Rhodopsinmutante erfolgte die
UV/Vis-spektroskopische Charakterisierung der Mutante und Bestimmung der
Konzentration. Die Abbildungen 3.8a und 3.8b zeigen die UV/Vis-Spektren aller in
dieser Arbeit untersuchten Mutanten, die entsprechend ihrer Lokalisation entlang des
Kanals angeordnet sind, beginnend von Öffnung A über die Bindungstasche zu
3 ERGEBNISSE
84
Öffnung B (erste Reihe von links nach rechts, dann zweite Reihe von links nach rechts
u.s.w.).
Abbildung 3.8a: UV/Vis-Absorptionsspektren der Mutanten im Bereich der Öffnung A des
hypothetischen Retinalligandenkanals. Die spektralen Merkmale jeder Mutante vor und nach der
Belichtung sind wie folgt dargestellt: lichtsensitiver Zustand (Spektrum 1), unmittelbar nach der 15-
sekündigen Belichtung (Spektrum 2), nach dem kompletten Zerfall des Meta II-Zustandes (Spektrum 3)
und unmittelbar nach der Zugabe von 25 mM Hydroxylamin in Kombination mit einer zweiten Belichtung
(Spektrum 4). Für ausgewählte Mutanten wird das Spektrum unmittelbar nach einer 15-sekündigen
Belichtung in Anwesenheit von 50 µM CTα-Peptid gezeigt (Spektrum 5, rot). Messbedingungen: 0,5 µM
aufgereinigte Rhodopsinmutante in BTP-Puffer (pH 6,0) und 0,03 % DDM.
3 ERGEBNISSE
85
Abbildung 3.8b: UV/Vis-Absorptionsspektren der Mutanten im Bereich der Bindungstasche und
der Öffnung B des hypothetischen Retinalligandenkanals. Die spektralen Merkmale jeder Mutante
vor und nach der Belichtung sind wie folgt dargestellt: lichtsensitiver Zustand (Spektrum 1), unmittelbar
nach der 15-sekündigen Belichtung (Spektrum 2), nach dem kompletten Zerfall des Meta II-Zustandes
(Spektrum 3) und unmittelbar nach der Zugabe von 25 mM Hydroxylamin in Kombination mit einer
zweiten Belichtung (Spektrum 4). Für ausgewählte Mutanten wird das Spektrum unmittelbar nach einer
15-sekündigen Belichtung in Anwesenheit von 50 µM CTα-Peptid gezeigt (Spektrum 5, rot).
Messbedingungen: 0,5 µM aufgereinigte Rhodopsinmutante in BTP-Puffer (pH 6,0) und 0,03 % DDM.
3 ERGEBNISSE
86
Die Abbildungen 3.8a und 3.8b zeigen die Absorptionsspektren des
lichtsensitiven Rhodopsinzustands (Spektrum 1), des Zustands unmittelbar nach der
15-sekündigen Belichtung (Meta I/II/III, Isorhodopsin) (Spektrum 2), des zerfallenen
Pigments (Spektrum 3) und des ligandenfreien Opsins in Anwesenheit von Retinaloxim
(Spektrum 4) für jede einzelne Mutante. Aus den Absorptionsspektren der
Abbildungen 3.8a und 3.8b resultierten die in Abbildung 3.9 dargestellten Daten. Die
Absorption der protonierten 11-cis-Retinyliden-Schiff’schen Base im N2C/D282C-
Kontrollrhodopsin wies ein Maximum bei 500 nm auf (Abb. 3.9a). Die
Absorptionsmaxima der Rhodopsinmutanten lagen in einem Wellenlängenbereich von
λmax 475 nm bis 510 nm (Abb. 3.9a). Die Abweichungen der λmax-Werte der Mutanten
von der Kontrolle werden im Allgemeinen mit zunehmender Nähe zur Lys296-
Retinyliden-Schiff’schen Base größer (Abb. 3.9a). Die Abweichungen der λmax-Werte
durch eine Mutation der Aminosäurereste könnten allgemein durch einen direkten
Effekt auf die Schiff’sche Base-Verknüpfung oder durch die Änderung der Form der
Bindungstasche erklärt werden. Die verschobenen λmax-Werte der Rhodopsinmutanten
könnten durch einen zusätzlichen Einfluss der Reste auf das Wassernetzwerk oder
durch Ladungsverschiebungen innerhalb der Tasche erklärt werden (A292V/F, E181Q,
S186A und Y268E; Abb. 3.9a). Im inneren Bereich der Öffnung B könnten
Veränderungen des λmax-Wertes durch zusätzliche Effekte der Reste auf den β-
Iononring des Retinals und somit auf die Lage des gesamten Liganden innerhalb der
Bindungstasche erklärbar sein (M207A, A272V/I/F, V204F und F208L/Q; Abb. 3.9a).
Rhodopsinmutanten, die keine signifikanten Veränderungen aufwiesen, waren M39W,
F293L, L40D, T289A/D/R, Y268F, F273L/Q und F276L/Q (Abb. 3.9a).
Die Berechnung des Absorptionsquotienten der Rhodopsinmutanten bei
280 nm und beim λmax-Wert ermöglichte die Überprüfung der Qualität der
Rhodopsinregeneration in den COS-1 Zellmembranen vor der Aufreinigung des
Pigments 2. Der Quotient aus der Höhe der Absorption des Proteinpeaks (λmax 280 nm)
und des λmax beim Kontrollrhodopsin (500 nm) ergab einen Wert von 1,7, d.h. er lag
nahe dem theoretisch möglichen Wert von 1,6 (Hargrave 1982).
Die Einteilung der Mutanten in vier Gruppen ergab folgendes Bild: Die
Mutanten der erste Gruppe zeigten keine Abweichungen vom Quotienten des
Kontrollrhodopsins (F293A/L, T289D/F, T94A, A292V, S186A, Y268F, A272V/I, V204F,
I205Q, F273L/Q und F276L/Q), die der zweiten Gruppe zeigten mit Quotienten von
über 2,2 eine sehr große Abweichung (M44F, Y268E und M207A), wobei die dritte
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
2 Die mutationsbedingte Änderung des Extinktionskoeffizienten kann ebenfalls einen kleinen
Einfluss auf den 280 nm / λmax-Quotienten haben.
3 ERGEBNISSE
87
Mutantengruppe die gleichen Effekte bei der selben Mutationsstelle (Phe293, Tyr43,
Phe208, Phe273 und Phe276) und die vierte Gruppe die verschiedenen Effekte bei der
selben Mutationsstelle (Leu40, Thr289, Thr94, Ala292, Tyr268 und Ala272) beschreibt.
Die zusätzlichen roten Spektren (Spektren 5) in Abbildung 3.8a und 3.8b
resultierten aus einem Parallelansatz, in dem die lichtsensitiven Rhodopsinmutanten in
Anwesenheit von 50 µM CTα-Peptid einer 15-sekündigen Belichtung mit
orangefarbenem Licht (λ > 480 nm) ausgesetzt wurden (Abb. 3.8a und b). Dieser
Parallelansatz wurde bei Rhodopsinmutanten durchgeführt, die nach der Belichtung
neben der erwarteten 382 nm-Absorption für Meta II eine weitere Absoprtion bei
ca. 480 nm aufwiesen, die Meta I, Meta III oder Isorhodopsin (9-cis-Retinyliden-Opsin)
zugeordnet werden kann (z.B. Y43A, T289D). Durch die Zugabe des CTα-Peptids
wurde das Gleichgewicht zwischen Meta I und Meta II in Richtung Meta II verschoben
Abbildung 3.9: Spektroskopische Eigenschaften der Rhodopsinmutanten des hypothetischen
Retinalligandenkanals. Die Absorptionsmaxima (λmax) des lichtsensitiven Rhodopsins (a) und das
spektrale Verhältnis von A280/A(λmax) der aufgereinigten Mutanten (b) resultieren aus den Messungen, die
in Abbildung 3.8a und 3.8b dargestellt werden.
3 ERGEBNISSE
88
(Heck et al. 2003a), wodurch die 480 nm-Absorption des Meta I verschwand. Durch die
Belichtung der Rhodopsinmutanten in Anwesenheit des CTα-Peptids konnte zum
einen der Anteil an Meta I und zum anderen der Anteil an Isorhodopsin bestimmt
werden. Die prozentualen Anteile an Meta I wurden durch die Berechnung der
Konzentration der protonierten Schiff’schen Base (SBH+) in Bezug zur
Gesamtkonzentration an Rhodopsin bestimmt. Die Berechnung der
Rhodopsinkonzentration erfolgte durch die Bestimmung der Absorptionsdifferenz
zwischen Spektrum 1 und Spektrum 4 bei λmax (475 nm bis 510 nm) mit Hilfe des
Extinktionskoeffizenten (ε = 40 600 M-1 cm-1, Wald und Brown 1953) (Abb. 3.8a und b). Die
SBH+-Konzentration wurde anhand der Aborptionsdifferenz bei 480 nm zwischen dem
Spektrum 2 (ohne CTα-Peptid) und Spektrum 5 (mit 50 µM CTα-Peptid) und auf
Grundlage des Extinktionskoeffizienten für Meta I bestimmt (ε = 45 000 M-1 cm-1,
Matthews et al. 1963) (Abb. 3.8a und b). Die Berechnung der Anteile an Isorhodopsin
erfolgte durch die Bestimmung der Absorptionsdifferenz bei 490 nm zwischen
Spektrum 4 und Spektrum 5 mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten von
ε = 43 000 M-1 cm-1 (Cooper 1979) (Abb. 3.8a und b).
Das Gleichgewicht zwischen Meta I und Meta II liegt für das Kontrollrhodopsin
unter den in dieser Arbeit genutzten Bedingungen auf der Seite des Meta II
(Abb. 3.7c). Die Rhodopsinmutanten, die eine Verschiebung des Gleichgewichts in
Richtung Meta I (SBH+) aufwiesen, sind im ganzen Ligandenkanal verteilt (M39W,
F293A, Y43A/W, T289D, T94A, F91L A292V/F, Y268E/F, A272V/I/F und V204F;
Abb. 3.10, schwarze Balken). Auffällig ist, dass die äußeren Aminosäurereste der
Abbildung 3.10: Anteile an Meta I und an Isorhodopsin nach der lichtinduzierten Aktivierung der
Mutanten des hypothetischen Retinalligandenkanals. Die schwarzen Balken stellen den prozentualen
Anteil an Meta I (λmax ~480 nm) und die grauen Balken den prozentualen Anteil an Isorhodopsin
(Opsin-9-cis-Retinal; λmax 490 nm) nach einer 15-sekündigen Belichtung der Mutanten dar. Daten
resultieren aus den Messungen, die in Abbildung 3.8a und 3.8b dargestellt sind.
3 ERGEBNISSE
89
Öffnung B (I205Q, F208L/Q, F273L/Q und F276L/Q; Abb. 3.10, schwarze Balken)
keinen Einfluss auf das Gleichgewicht hatten. Das könnte mit der weit von der
Retinyliden-Schiff’schen Base entfernten Lage im Protein zu tun haben. Im
Ligandenkanal existieren aber auch Mutationsstellen, die durch den Austausch zu
einer Aminosäure einen Effekt auf das Meta I/Meta II-Gleichgewicht aufwiesen, wobei
der Austausch zu einer anderen Aminosäure keine Auswirkungen auf das
Gleichgewicht hatte (Phe293, Thr289, Thr94 und Ala292). Neben diesen
Mutationsstellen sind aber auch andere vorhanden, wo jeder Austausch zu einer
Verschiebung des Meta I/Meta II-Gleichgewichts führte (Tyr43, Tyr268 und Ala272).
Die Bildung von Isorhodopsin (9-cis-Retinyliden-Opsin) trat mehr bei den
Mutanten auf, die in der Umgebung des Lys296 lokalisiert waren (L40D, T289D/R,
F91L A292V/F und Y268F; Abb. 3.10, graue Balken). Alle Mutanten, die eine Bildung
von Meta I aufwiesen, zeigten mit einer Ausnahme (L40D) auch die Bildung von
Isorodopsin. Die Bildung von Isorhodopsin resultiert aus der Verschiebung des
Meta I/Meta II-Gleichgewichts in Richtung Meta I und könnte den zuvor genannten
Zusammenhang erklären. Die Unterschiede in der Ausrichtung des Meta I/Meta II-
Gleichgewichts könnten auf eine Ladungsverschiebung innerhalb der Bindungstasche
zurückzuführen sein, die durch die eingesetzte Mutation induziert wurde.
Neben der spektroskopischen Charakterisierung der Rhodopsinkanalmutanten
wurde auch ihr Einfluss auf die Interaktion des Rezeptors mit dem Gt-Protein
untersucht. Für 15 ausgewählte Rhodopsin- und Opsinmutanten wurde mittels
Änderung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz durch die Aufnahme von GTPγS
(Higashijima et al. 1987) die G
t-Proteinaktivierungsgeschwindigkeit gemessen
(Anfangssteigung auf die Amplitude normiert) (Abb. 3.11). Die lichtinduzierte
Gt-Proteinaktivierung der Rhodopsinmutanten wurde auf die Kontrolle (100 %
Aktivierung) bezogen und zeigte nur kleine Abweichungen von der des
Kontrollrhodopsins, ausgenommen die K296G-Mutante, die eine deutlich verringerte
Aktivierung des Gt-Proteins induzierte (50 %) (Abb. 3.11a). Die Ergebnisse für die
Mutanten T94I, E181Q und S186A stimmen mit früheren Befunden überein (Janz und
Farrens 2004), wohingegen die Aktivität der Rhodopsinmutante Y268F (80 %) im
Vergleich zu einer früheren Veröffentlichung höher ist (20 %; Ref.: Janz und Farrens 2004).
Da aber diese früheren Untersuchungen an Rhodopsinmutanten in
COS-1 Zellmembranen durchgeführt wurden, können diese Daten unter Umständen
abweichen.
Die niedrige Gt-Proteinaktivierung durch die K296G-Mutante kann auf den
schnellen lichtinduzierten Zerfall zu K296G-Opsin und all-trans-Retinal-Analogon
3 ERGEBNISSE
90
zurückgeführt werden (siehe Abschnitt 3.2.3). Die verminderte Aktivierung des
Gt-Proteins durch die Y268F- und die M207A-Mutante kann durch das verschobene
Meta I/Meta II-Gleichgewicht in Richtung Meta I erklärt werden (Abb. 3.10).
Die Untersuchung der basalen Aktivität der Opsinmutanten führte zu drei
Gruppen mit unterschiedlicher Wirkung auf die Aktivierung des Gt-Proteins
(Abb. 3.11b). Die erste Gruppe der Opsinmutanten hatte keine Effekte auf die
Gt-Proteinaktivierung (E181Q, S186A, Y268F, A272I und F273Q; Abb. 3.11b) und wies
ungefähr 1 % Aktivität des lichtinduzierten Kontrollrhodopsins auf (analog zum
Kontrollopsin). Die zweite Gruppe wies eine verminderte basale Aktivität im Vergleich
zur Kontrolle auf (Y43A und T94I; Abb. 3.11b), und die dritte Gruppe zeigte eine
Abbildung 3.11: Lichtinduzierte und basale Gt-Proteinaktivierung durch ausgewählte Mutanten
des hypothetischen Ligandenkanals. Vergleich der Anfangsgeschwindigkeiten der
Gt-Proteinaktivierung durch eine mit 11-cis-Retinal regenerierte Mutante (K296G mit 11-cis-PrSB
regeneriert) nach der Belichtung dieser (a) und durch eine Opsinmutante in Abwesenheit eines Retinals
(b). Die Aktivitäten sind in prozentualer Relation zur N2C/D282C-Kontrolle dargestellt, die als 100 %
definiert wurde (gestrichelte Linie). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von neun
(N2C/D282C-Kontrolle) oder drei (andere Mutanten) unabhängigen Messungen. Messbedingungen: 5 nM
aufgereinigte Rhodopsin- oder Opsinmutante in BTP-Puffer (pH 6,0), 130 mM NaCl,1 mM MgCl2,
2 mM DTT und 0,01 % DDM bei 20°C.
3 ERGEBNISSE
91
erhöhte basale Aktivität zum Gt-Protein (M44F, T289F, A292F, K296G, M207A, V204F,
F208Q und F276Q; Abb. 3.11b). Die verminderte Basalaktivität der Opsinmutanten
Y43A und T94I könnte auf Verschiebung des partiell aktiven Zustand des Opsins in
Richtung inaktiver Zustand als Folge der Messung in Detergenzlösung zurückzuführen
sein, da das in früheren Befunden für die T94I-Mutante in COS-1 Zellmembranen nicht
beobachtet werden konnte (Gross et al. 2003a). Die erhöhte basale Gt-Proteinaktivierung
der restlichen Mutanten könnte auf eine durch die Mutationen hervorgerufene
Verschiebung des Gleichgewichts zwischen dem inaktiven und aktiven Opsin in
Richtung der aktiven Opsinspezies zurückgeführt werden.
Die größeren basalen Effekte der ligandenfreien Opsinmutanten auf die
Aktivierung des Gt-Proteins (Abb. 3.11b) und die verglichen damit relativ geringen
Effekte durch die lichtinduzierten Rhodopsinmutanten (Meta II) (Abb. 3.11a) könnten
durch die all-trans-Retinal-vermittelte Stabilisierung der Meta II-Konformation erklärt
werden (Meyer et al. 2000). Das bedeutet, dass Meta II durch das kovalent verknüpfte
all-trans-Retinal in einer definierten Konformation stabilisiert wird, wohingegen
ligandenfreies Opsin relativ flexibel ist. Dadurch haben kleinere mutationsbedingte
Änderungen in der Struktur des ligandenfreien Opsins größere Auswirkungen auf die
basale Gt-Proteinaktivierung.
3.2.2 Effekt der Mutationen auf die Aufnahme des 11-cis-Retinals in
das Opsin und auf die Abgabe des all-trans-Retinals aus dem
lichtaktivierten Rhodopsin
Die Aufnahme des 11-cis-Retinals durch das Opsinmolekül wurde in dieser
Arbeit durch die Zunahme der Absorption bei λmax 500 nm (oder den entsprechenden
λmax der Mutanten) mittels UV/Vis-Spektroskopie gemessen (Abb. 3.12a). In
Abbildung 3.12a wird entsprechend der Region innerhalb des Ligandenkanals jeweils
die Regeneration einer Beispielmutante gezeigt. Der Start der Regeneration der
Rhodopsinmutanten erfolgte durch die Zugabe von 1 µM 11-cis-Retinal zu 0,5 µM
aufgereinigter, in Detergenz solubilisierter Opsinmutante (Abb. 3.12a; Spektren 1 und
2). Die Regenerationskinetik der Mutanten konnte unter diesen Bedingungen mit der
Funktion einer bimolekularen Reaktion beschrieben werden (siehe Abschnitt 2.3.4).
Die Regenerationsgeschwindigkeit der N2C/D282C-Kontrollmutante betrug
0,074 ± 0,014 µM-1 s-1 und stimmt mit früheren Ergebnissen unter ähnlichen
Bedingungen überein (Gross et al. 2003b). Die Regenerationsgeschwindigkeiten der
T289F-, Y268F- und A272I-Mutante lagen mit 0,0031 ± 0,0013 µM-1 s-1,
0,0049 ± 0,0026 µM-1 s-1 und 0,0124 ± 0,0066 µM-1 s-1 signifikant unter der des
3 ERGEBNISSE
92
Kontrollopsins (Abb. 3.12a). Die Zugabe von 25 mM Hydroxylamin (HA) und eine
anschließende 15-sekündige Belichtung diente der Bestimmung der Grundabsorption
bei λmax und somit der Definition des exakten Startpunktes der Regeneration
(Abb. 3.12a).
Die Abgabe des all-trans-Retinals durch das lichtaktivierte Rhodopsin konnte in
dieser Arbeit durch Messung der steigenden intrinsischen Tryptophanfluoreszenz des
Opsinmoleküls verfolgt werden (Abb. 3.12b) (Farrens und Khorana 1995). Die Abgabe des
all-trans-Retinals folgte einem monoexponentiellen Verlauf mit einer Halbwertszeit von
t = 13,9 min in DDM (Abb. 3.12b; siehe auch Abb. 3.7b). Die lichtinduzierte Abgabe
des all-trans-Retinals durch die T289F-Mutante ergab mit t = 21 min eine deutlich
verlangsamte Reaktion, wobei die Abgabe des Retinals bei der Y268-Mutante mit
t = 8,9 min leicht schneller und bei der A272I-Mutante mit t = 0,86 min sehr viel
schneller verlief (Abb. 3.12b). Die Zugabe von 25 mM HA und eine zweite 15-
Abbildung 3.12: Kinetik der Retinalaufnahme und –abgabe durch ausgewählte
Rhodopsinmutanten. (a) Die Regeneration der N2C/D282C-Opsinkontrolle (Kontrolle) und der
Opsinmutanten T289F, Y268F und A272I mit 11-cis-Retinal wurde mittels UV/Vis-Spektroskopie
gemessen. Die Spektren von 0,5 µM Opsin (Spektrum 1), 30 s nach der Zugabe von 1 µM 11-cis-Retinal
(Spektrum 2) und alle 60 s folgenden (Spektren 3-8) wurden aufgenommen. Das Spektrum 9 wurde nach
der Zugabe von 25 mM Hydroxylamin mit anschließender Belichtung der Probe detektiert. Eingefügte
Grafik: Änderung in der Absorption bei λmax als eine Funktion der Zeit (Nummerierungen entsprechen
den der Spektren), beschrieben durch eine bimolekulare Reaktionsgleichung (durchgezogenen Linie;
siehe Abschnitt 2.3.4). (b) Fluoreszenzspektroskopische Analyse des lichtinduzierten Meta II-Zerfalls der
N2C/D282C-Rhodopsinkontrolle und der Rhodopsinmutanten T289F, Y268F und A272I. Die Reaktion
wird durch eine 15-sekündige Belichtung gestartet. Die Zugabe von 25 mM Hydroxylamin mit
anschließender Belichtung dient als Kontrolle für einen vollständigen Meta II-Zerfall. Die
Reaktionsgeschwindigkeiten werden durch die Anpassung einer monoexponentiellen Gleichung an die
Datenpunkte ermittelt. Messbedingungen: BTP-Puffer (pH 6,0) und 0,03 % DDM bei 20°C.
3 ERGEBNISSE
93
sekündige Belichtung dienten der Kontrolle eines vollständigen Meta II-Zerfalls
(Abb. 3.12b).
Die entsprechenden Geschwindigkeitskonstanten für die Regeneration und den
lichtinduzierten Meta II-Zerfall aller Rhodopsinmutanten sind zusammenfassend in
Abbildung 3.13 dargestellt. Die Mutanten sind entsprechend ihrer Lokalisation entlang
des Ligandenkanals, beginnend von der Öffnung A über die Bindungstasche zu
Öffnung B, angeordnet.
Der Vergleich der Regenerationsgeschwindigkeiten aller Mutanten ergab, dass
der Hauptanteil der Kanalmutanten sowohl an beiden Öffnungen als auch in der
Bindungstasche eine verlangsamte Regeneration zeigte (Abb. 3.13a). Einige wenige
Mutanten zeigten keinen Unterschied zum Kontrollopsin (F293A/L, L40D, V204F und
F273L; Abb. 3.13a), und nur eine Mutante zeigte eine leichte, aber signifikant
schnellere Regeneration als das N2C/D282C-Kontrollopsin (F91L, Abb. 3.13a). Die
F91L-Mutante ist an der Verengung nahe dem Lys296 lokalisiert und könnte durch
das Entfernen des Aromatenrings eine schnellere Aufnahme des 11-cis-Retinals
ermöglichen (Abb. 3.13a). In der Öffnung A zeigten die Mutationen der Aminosäuren
Tyr43, Thr289 und Thr94 die ausgeprägtesten Effekte auf die Ausbildung des
lichtsensitiven Zustands des Rezeptors (Abb. 3.13a). Die verlangsamte Aufnahme des
11-cis-Retinals durch die T94I-Mutante, die für die Ausbildung einer angeborenen
Nachtblindheit verantwortlich ist, wurde in früheren Arbeiten nicht beobachtet
(Gross et al. 2003b). Die Opsinmutante T94I regenerierte in diesen früheren Arbeiten mit
der gleichen Geschwindigkeit wie das Kontrollrhodopsin, wobei diese Daten nicht
vergleichbar mit den Daten aus dieser vorliegenden Arbeit sind, da in den früheren
Untersuchungen eine niedrigere Konzentration an Detergenz verwendet wurde und die
Regeneration stark von der Detergenzkonzentration abhängig ist (Gross et al. 2003b).
Generell könnte diese Mutationsstelle (Thr94) durch ihre dichte Lage zum Gegenion
der Schiff’schen Base (Glu113) eine entscheidene Rolle bei der Bildung der
Schiff’schen Base spielen. Alle Mutationen innerhalb der Retinalbindungstasche
zeigten eine langsamere Regenerationsgeschwindigkeit im Vergleich zum
Kontrollopsin (Ala292, Glu181, Ser186 und Tyr268; Abb. 3.13a). Die Mutationen der
Aminosäure Ala292, die in dieser Arbeit untersucht wurden, zeigten eine dramatische
Verlangsamung der Retinalaufnahme, während die Mutante A292E, die ebenfalls die
Nachtblindheit verursacht, die Regeneration unter den selben Bedingungen
beschleunigte (Gross et al. 2003b). In dieser Arbeit wurde Ala292 ausschließlich zu
größeren hydrophoben Aminosäuren mutiert, wohingegen durch die Mutation zu
Glutaminsäure (E) eine Ladung eingefügt wurde, die das Wassernetzwerk innerhalb
3 ERGEBNISSE
94
der Bindungstasche beeinflussen könnte. Die Aminosäureseitenketten Glu181 und
Ser186 könnten über die Wasserstoffbrückenbindung zum Lys296 an der Steuerung
der Lys296-Schranke bei der Aufnahme des 11-cis-Retinals beteiligt sein. Durch die
Mutation des Glu181 zu Glutamin oder des Ser186 zu Alanin wird die Ladung an
dieser Stelle in der Bindungstasche entfernt und somit könnte keine Bindung zum
Lys296 erfolgen.
Die Effekte einzelner Mutationen auf die lichtinduzierte Abgabe von
all-trans-Retinal zeigten zum Teil extreme Abweichungen vom Kontrollrhodopsin. Es
wurden sowohl sehr langsame (Ala292, S186A, T94I; Abb. 3.13b) als auch sehr
Abbildung 3.13: Reaktionsgeschwindigkeiten der Retinalaufnahme und –abgabe durch die
Rhodopsinmutanten. (a) Regenerationsgeschwindigkeiten der Opsinmutanten (Messung siehe
Abbildung 3.12a). Die Geschwindigkeiten spiegeln eine bimolekulare Reaktion wider.
(b) Fluoreszenzabhängige Messung der Geschwindigkeit des lichtinduzierten Meta II-Zerfalls (Messung
siehe Abbildung 3.12b). Die Geschwindigkeiten wurden mittel einer monoexponentiellen Gleichung
ermittelt. (a und b) Die gestrichelte Linie beruft sich auf den Wert für die N2C/D282C-Kontrolle und die
Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von fünf (Kontrolle) oder drei (alle anderen Mutanten)
unabhängigen Messungen. Messbedingungen: BTP-Puffer (pH 6,0) und 0,03 % DDM bei 20 °C.
3 ERGEBNISSE
95
schnelle Reaktionen (M44F, T94A, Y268E und A272V/I; Abb. 3.13b) beobachtet. Der
stark verlangsamte Meta II-Zerfall der Mutationen von Ala292 und Ser186 könnte sich
mit der dichten Lage dieser zum Lys296 erklären lassen, wobei die Mutationen an der
Stelle Ala272 durch eine Beeinflussung der Lage des Retinals innerhalb der
Bindungstasche erklärbar wären.
Der Austausch der Aminosäurereste, die im äußeren Bereich der Öffnungen A
und B lokalisiert sind (Met39, Tyr43; Phe293 an der Öffnung A und Ile205, Phe208,
Phe273 und Phe276 an Öffnung B), hatten nur kleine oder überhaupt keine Effekte auf
die Abgabe des all-trans-Retinals (Abb. 3.13b). Im Gegensatz dazu beeinflussten die
meisten ausgetauschten Reste innerhalb der Retinalbindungstasche oder innerhalb
des angrenzenden inneren Teils der Öffnungen die Reaktionsgeschwindigkeit stark
(Abb. 3.13b). In einigen Fällen (z.B. Thr289 und Thr94) ergab die Substitution der
Aminosäurereste entweder eine beschleunigte (T289D/R und T94A) oder eine
verlangsamte (T289A/F und T94I) Retinalabgabe.
Die Effekte der Mutanten T94I, Y268F, E181Q und S186A auf die
all-trans-Retinal-Abgabe befinden sich in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten
(Janz und Farrens 2004). Der langsame Meta II-Zerfall der T94I- und S186A-Mutante
könnte mit der dichten Lage zur Retinalbindungsstelle und durch die Interaktion mit
Wassermolekülen innerhalb der Bindungstasche erklärt werden (Janz und Farrens 2004,
Ramon et al. 2003). Das könnte bedeuten, dass diese beiden Aminosäureseitenketten am
chemischen Prozess der Schiff’schen Base-Hydrolyse beteiligt sind. Die Mutation des
Glu181 zu Glutamin könnte Einfluss auf den Protonierungszustand der
Schiff’schen Base haben und den lichtinduzierten Übergang des Protons von der
Schiff’sche Base auf das Glu113 stören (Lüdeke et al. 2005), wodurch ein schnellerer
Zerfall dieser Mutante erklärbar wäre. Der schnellere Zerfall der Y268F-Mutante kann
durch destabilisierende Effekte innerhalb der Bindungstasche erklärt werden, da eine
Beteiligung dieses Aminosäurerests bei der Hydrolyse der Schiff’schen Base
ausgeschlossen wird (Janz und Farrens 2004). Eventuelle Abweichungen der Daten dieser
Arbeit von den Daten früherer Arbeiten kann durch die hohe Detergenzkonzentration in
den früheren Arbeiten erklärt werden (Janz und Farrens 2004).
Die Abgabe des all-trans-Retinals durch das lichtaktivierte Rhodopsin wird zum
einen durch die Hydrolyse der Retinyliden-Schiff’schen Base und zum anderen durch
die strukturelle Beschaffenheit des Ligandenkanals innerhalb des Proteins
determiniert. Um den unterschiedlichen Einfluss der Mutationen auf diese zwei
Faktoren herauszuarbeiten, wurde ein Parallelansatz in Anwesenheit von
Hydroxylamin (HA) belichtet. Da seit langem bekannt ist, dass die Zugabe von HA die
3 ERGEBNISSE
96
Spaltung der Retinyliden-Schiff’schen Base beschleunigt, konnte der Einfluss der
Mutation auf die ligandenkanaldeterminierte Retinalabgabe untersucht werden. Die
Geschwindigkeit des lichtlinduzierten Meta II-Zerfalls des N2C/D282C-
Kontrollrhodopsins in Anwesenheit von 25 mM HA hatte um das 80-fache
zugenommen (Abb. 3.14a). Der Vergleich des Meta II-Zerfalls der Mutanten mit der
Kontrolle zeigte in Anwesenheit von HA den gleichen relativen Effekt auf die Abgabe
des all-trans-Retinals (Abb. 3.14a; dunkelgraue Balken) wie in Abwesenheit des HA
(Abb. 3.14a; hellgraue Balken), die gesamte Zerfallsreaktion war nur beschleunigt. Ein
Beispiel ist die Mutationsstelle Thr94, die durch den Austausch zu Isoleucin oder
Alanin den gleichen gegenteiligen Effekt in Anwesenheit und Abwesenheit von HA
aufwies (Abb. 3.14a). Aus diesem Ensemble fallen zwei Mutationen heraus (M44F und
A292V), die in Anwesenheit von HA langsamer (M44F) bzw. schneller (A292V) zerfallen
als die Kontrolle, sich in Abwesenheit des Nukleophils aber umgekehrt zur Kontrolle
verhielten (Abb. 3.14a).
Die Untersuchung des Meta II-Zerfalls der Kanalmutanten in Anwesenheit von
HA kann Änderungen in der Zugänglichkeit der Retinalbindungstasche für das
Nukleophil (Wasser oder HA) nicht eindeutig abbilden (vor allem eine Verbesserung
der Zugänglichkeit), da HA im Volumen klein genug ist, um die Schiff’sche Base im
Meta II-Wildtyp zu erreichen (Abschnitt 3.1.3). Aus diesem Grund wurde der Meta II-
Zerfall in Anwesenheit des größeren Hydroxylaminderivats o-Methyl-HA (MHA)
untersucht (Abb. 3.14b). Dieses MHA kann die Schiff’sche Base in der
Retinalbindungstasche unter normalen Umständen nicht erreichen (Abschnitt 3.1.3).
Treten nun durch die Mutationen im Rhodopsin Änderungen in der Zugänglichkeit für
das Nukleophil auf, insbesondere eine Verbesserung dieser, dann könnte die
Anwesenheit von MHA die Hydrolyse der Schiff’schen Base stark beschleunigen.
Der Meta II-Zerfall des N2C/D282C-Kontrollrhodopsins wurde durch die
Anwesenheit von 25 mM MHA um das 2,4-fache beschleunigt. Der Vergleich des
Meta II-Zerfalls der Mutanten zeigte in Anwesenheit von MHA (Abb. 3.14b;
dunkelgraue Balken) das gleiche Wirkungsspektrum für die Abgabe des
all-trans-Retinals, wie in Abwesenheit des MHA (Abb. 3.14a; hellgraue Balken), wobei
die gesamte Zerfallsreaktion in Anwesenheit des MHA leicht beschleunigt war.
3 ERGEBNISSE
97
Die Mutationen T289D/R, Y268E/F, A272V/I/F, V204F und F273L/Q zeigten
zwar die gleiche beschleunigte Abgabe des all-trans-Retinals in Bezug zur Kontrolle,
wiesen aber einen größeren Effekt der Beschleunigung in Bezug zur Kontrolle in
Anwesenheit von MHA auf (Abb. 3.14b). Die Mutante M44F beschleunigte die Abgabe
des all-trans-Retinals mit und ohne MHA, zeigte aber in Anwesenheit von MHA einen
geringeren Effekt in Bezug zur Kontrolle (Abb. 3.14b). Annähernd gleiche Effekte auf
den Meta II-Zerfall in Abwesenheit des MHA zeigten die Mutationen Tyr43 zu Alanin
Abbildung 3.14: Reaktionsgeschwindigkeiten der Retinalaufnahme und –abgabe durch die
Rhodopsinmutanten in Anwesenheit von Hydroxylamin (HA) und seinem Derivat o-Methyl-
Hydroxylamin (MHA). (a) Fluoreszenzmessung der Meta II-Zerfallsgeschwindigkeit in Anwesenheit von
25 mM HA. Die Fehlerbalken definieren die Standardabweichung aus drei unabhängigen Messungen. (b)
Fluoreszenzmessung der Meta II-Zerfallsgeschwindigkeit in Anwesenheit von 25 mM MHA. (a und b) Die
Reaktionsgeschwindigkeiten wurden durch die Normierung der Anfangssteigung der
Fluoreszenzänderung auf die maximalen Amplituden ermittelt. Die hellgrauen Balken im Hintergrund
zeigen die Zerfallsgeschwindigkeiten des Meta II in Abwesenheit von HA und MHA (rechte Y-Achse) und
entsprechen der Darstellung in Abbildung 3.13b ohne Fehlerbalken. Die gestrichelte Linie spiegelt den
Wert der Kontrolle wider. Messbedingungen: 0,5 µM Rhodopsinmutante in BTP-Puffer (pH 6,0),
0,03 % DDM bei 20 °C.
3 ERGEBNISSE
98
und Tryptophan, was sich aber nicht im Meta II-Zerfall in Anwesenheit von MHA
widerspiegelte – Y43A war 15,5-fach und Y43W war nur 3,5-fach schneller als die
Kontrolle (Abb. 3.14b).
Die Mutationen Ala292 zu Valin und Phenylalanin zeigten in Anwesenheit des
MHA einen beschleunigten Meta II-Zerfall und in Abwesenheit von MHA einen
verlangsamten Zerfall von Meta II in Bezug zur Kontrolle (Abb. 3.14b). Diese
Ergebnisse deuten an, dass die Hydrolyse der Retinyliden-Schiff’sche Base der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Abgabe des all-trans-Retinals durch das
Meta II ist, wobei die Zugänglichkeit der Schiff’schen Base für Wasser wiederum die
Geschwindigkeit der Hydrolyse beeinflussen könnte.
3.2.3 Effekt der K296G-Mutation auf die Aufnahme und Abgabe des
Retinal-PrSB
Um die Rolle der Retinyliden-Schiff’schen Base im Rhodopsinmolekül besser
verstehen zu können, wurde in dieser Arbeit die Mutante K296G untersucht, bei der
das retinalbindende Lys296 durch ein Glycin ausgetauscht wurde. Eine Bindung des
Liganden 11-cis-Retinal ist nicht mehr möglich, aber die K296G-Mutante kann mit
dem 11-cis-PrSB einen stabilen rhodopsinähnlichen Zustand bilden. Das 11-cis-PrSB
ist ein Retinoid, das eine Schiff’sche Base zwischen n-Propylamin und dem
11-cis-Retinal ausgebildet hat (Robinson et al. 1992, Zhukovsky et al. 1991) und somit den
fehlenden Aminosäurerest des Lysins ausgleicht.
Die Untersuchung der Regeneration von 0,5 µM K296G-Opsinmutante
(Abb. 3.15a, Spektrum 1) mit 1 µM 11-cis-PrSB mittels UV/Vis-Spektroskopie zeigte
bei 10 °C nach 90 s eine vollständige Regeneration (Abb. 3.15a, Spektrum 2). Die
15-sekündige Belichtung der regenerierten Probe führte zu einer Verschiebung des
Absorptionsmaximums von λmax 488 nm auf λmax 440 nm (Abb. 3.15a, Spektrum 3) und
die anschließende Zugabe von 25 mM HA wiederum zu einer Verschiebung des
Maximums auf λmax 360 nm (Abb. 3.15a, Spektrum 4). Um den Startpunkt der
Regeneration zu erhalten, wurde die Probe nochmals mit 15 s belichtet (Abb. 3.15a,
Spektrum 5). Da die zeitliche Auflösung bei der UV/Vis-spektroskopischen
Untersuchung auf 30 s begrenzt war, die Regeneration der K296G-Mutante aber sehr
schnell erfolgte, wurde die Aufnahme des 11-cis-PrSB zusätzlich
fluoreszenzspektroskopisch untersucht (Abb. 3.15a, eingefügte Grafik).
Als erstes erfolgte die fluoreszenzspektroskopische Untersuchung der
Aufnahme von 11-cis- oder all-trans-Retinal (1 µM) durch das N2C/D282C-
Kontrollopsin (0,5 µM). Die Zugabe der Retinale zum Kontrollopsin führte zu einer
3 ERGEBNISSE
99
rapiden Abnahme der anfänglichen Fluoreszenz (Abb. 3.15a, eingefügte Grafik). Eine
weitere Abnahme der Fluoreszenz in Anwesenheit von all-trans-Retinal konnte nicht
beobachtet werden (nicht gezeigt). Nach der anfänglichen schnellen Abnahme der
Fluoreszenz in Anwesenheit von 11-cis-Retinal folgte eine weitere langsame
Komponente, die die Retinalaufnahme durch die Bindungstasche des Kontrollopsins
reflektieren könnte (Abb. 3.15a, eingefügte Grafik, grünes Spektrum). Diese langsame
Komponente entspricht der bimolekularen Geschwindigkeitskonstante der
Regeneration des Kontrollopsins bei 10 °C (k = 0,014 µM-1 s-1), die UV/Vis-
spektroskopisch ermittelt wurde (nicht gezeigt).
Die Zugabe von all-trans-PrSB zu K296G-Opsin zeigte, analog zur Zugabe von
all-trans-Retinal, ausschließlich die anfängliche schnelle Abnahme der Fluoreszenz
(Abb. 3.15a, eingefügte Grafik, orangefarbenes Spektrum), wohingegen die Zugabe
Abbildung 3.15: Charakterisierung der K296G-Mutante. (a) UV/Vis-Spektren der K296G-
Opsinmutante (0,5 µM; Spektrum 1), 90 s nach Zugabe von 1 µM 11-cis-PrSB (Spektrum 2), 30 s nach
Belichtung der Probe (Spektrum 3), 5 min nach Zugabe von 25 mM Hydroxylamin (HA) (Spektrum 4) und
30 s nach zweiter Belichtung der Probe (Spektrum 5). Eingefügte Grafik: Fluoreszenzänderung, induziert
durch Zugabe von 1 µM 11-cis-PrSB (schwarz) oder all-trans-PrSB (orangefarben) zu 0,5 µM K296G-
Opsin. Zugabe von 11-cis-Retinal zu Kontrollopsin (N2C/D282C) (grüne Kurve). (b) UV/Vis-Spektren der
mit 11-cis-PrSB regenerierten K296G-Opsinmutante im Dunkelzustand (Spektrum 1), 30 s (Spektrum 2)
und 160 min (Spektrum 3) nach der Belichtung der Probe. Spektren 4 und 5 wurden 30 s nach der
Belichtung der Probe in Anwesenheit von 25 mM HA (Spektrum 4) oder o-tert-Buthyl-HA (t-BHA)
(Spektrum 5) aufgenommen. Eingefügte Grafik: Fluoreszenzspektroskopische Messung der
lichtinduzierten Retinalabgabe durch die K296G-Rhodopsinmutante in Abwesenheit eines HA (schwarz)
oder in Anwesenheit von 25 mM HA (rot) bzw. t-BHA (blau). Messbedingungen: BTP-Puffer (pH 6,0),
0,03 % DDM, 10 °C.
3 ERGEBNISSE
100
von 11-cis-PrSB zum K296G-Opsin, ähnlich der Regeneration der Opsinkontrolle, in
einer biphasischen Abnahme der Fluoreszenz resultierte (Abb. 3.15a, eingefügte
Grafik, schwarzes Spektrum). Die Analyse der langsamen Komponente
(k = 0,375 µM-1 s-1) zeigte, dass die Regeneration der K296G-Mutante im Vergleich zur
Kontrolle um das 30-fache beschleunigt war.
Die 15-sekündige Belichtung der K296G-Rhodopsinmutante führte innerhalb
von 30 s zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums des rhodopsinähnlichen
Zustands (λmax 488 nm (Abb. 3.15b, Spektrum 1)) zu λmax 440 nm (Abb. 3.15b,
Spektrum 2). Die 440 nm-Spezies entspricht der Absorption eines protonierten
all-trans-PrSB, welches langsam zu all-trans-Retinal (λmax 380 nm) und n-Propylamin
zerfällt (Abb. 3.15b, Spektrum 3). Die 15-sekündige Belichtung des K296G-
Rhodopsins in Anwesenheit von Hydroxylamin (HA) oder o-tert-Buthyl-Hydroxylamin
(t-BHA) führte innerhalb von 30 s zur Bildung von Retinaloxim (λmax 360 nm
(Abb. 3.15b, Spektren 4 und 5). Da das t-BHA nicht in die Bindungstasche eindringen
kann (siehe Abschnitt 3.1), unterstützt dieser Befund die Hypothese, dass die
Hydrolyse der Schiff’schen Base erst nach der schnellen lichtinduzierten Abgabe der
all-trans-PrSB durch K296G außerhalb des Rezeptors stattfindet.
Die Untersuchung der Abgabe des all-trans-Retinals durch K296G mittels
Fluoreszenzspektroskopie ergab eine 100-fach schnellere Zunahme der
Fluoreszenzintensität verglichen mit dem 11-cis-Retinal regenerierten
Kontrollrhodopsin (Abb. 3.15b, eingefügte Grafik, schwarze Spur). Um die
Interpretation der schnellen Abgabe des all-trans-PrSB zu bestätigen
(Matsuyama et al. 2010), wurde jeweils ein Parallelansatz in Anwesenheit von HA oder t-
BHA belichtet (Abb. 3.15b, eingefügte Grafik, rote (HA) und blaue (t-BHA) Spur). Da
die Anwesenheit von HA die Zunahme der Fluoreszenz nach Belichtung der K296G-
Mutante nicht beschleunigen konnte und t-BHA ebenfalls keinen Effekt auf den
Anstieg der Fluoreszenz hatte 3, wird gezeigt, dass all-trans-PrSB die K296G-Mutante
innerhalb von fünf Sekunden verlässt und die Spaltung der Schiff’schen Base durch
die Oximbildung außerhalb des Proteins erfolgt.
Die lichtinduzierte Gt-Proteinaktivierung durch die K296G-Rhodopsinmutante
(Abb. 3.16, rote Spur) war im Vergleich zum Kontrollrhodopsin um 50 % reduziert
(Abb. 3.16, schwarze Spur; siehe auch Abb. 3.11a). Dagegen war die basale Aktivität
des K296G-Opsins für das Gt-Protein annähernd viermal so hoch (Abb. 3.16, grüne
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
3 Der Fluoreszenzanstieg wird in Anwesenheit von HA nach Belichtung des Kontrollrhodopsins durch die
schnelle Spaltung der Schiff’schen Base im Protein beschleunigt. Die Anwesenheit von t-BHA hat keinen
Einfluss auf die Hydrolyse-Reaktion der Schiff’schen Base, da dieses nicht in das Protein eindringen kann
(siehe Abschnitt 3.1).
3 ERGEBNISSE
101
Spur) wie die basale Aktivität der Opsinkontrolle (Abb. 3.16, graue Spur; siehe auch
Abb. 3.11b).
Die lichtinduzierten Gt-Proteinaktivierung der K296G-Rhodopsinmutante
(Abb. 3.16, rote Spur) übersteigt über einen Zeitraum von mehr als 60 s signifikant die
des ligandenfreien K296G-Opsins (Abb. 3.16, grüne Spur). Diese Ergebnisse würden
den Aspekt der schnellen lichtinduzierten all-trans-PrSB-Abgabe durch die K296G-
Mutante widerlegen, da im Fall eines schnellen Meta II-Zerfalls die lichtinduzierte
Gt-Proteinaktivierung der basalen Aktivierung entsprechen würde. Die Anwesenheit
eines Überschusses 11-cis-PrSB führte während der zehnsekündigen Belichtung zu
einer Aktivierung des Gt-Proteins, die nach Beendigung der Belichtung aber wieder
durch das 11-cis-PrSB inhibiert wurde (Abb. 3.16, orangefarbene Spur). Dieses
Ergebnis demonstriert, dass das 11-cis-PrSB nach der lichtinduzierten Aktivierung der
K296G-Rhodopsinmutante einen sofortigen Zugang zur Bindungstasche hat, und es
bestätigt die schnelle Aufnahme und Abgabe des Retinoidliganden durch diese
Mutante. Die lichtinduzierte Aktivität, die nach der Abgabe des all-trans-PrSB durch
Abbildung 3.16: Gt-Proteinaktivierung durch die N2C/D282C-Kontrolle und die K296G-Mutante.
Die Gt-Proteinaktivierung durch das N2C/D282C-Kontrollrhodopsin (5 nM) wurde durch eine
zehnsekündige Belichtung (schwarzer Pfeil) induziert (schwarze Spur). Die Gt-Proteinaktivierung durch
das N2C/D282C-Kontrollopsin (5 nM) wurde durch die Zugabe von GTPγS gestartet (graue Spur). Der
Pfeil (+R*) markiert die weitere Zugabe eines lichtaktivierten N2C/D282C-Rhodopsins (R*) um das
gesamte Gt-Protein in der Probe zu aktivieren. Die Gt-Proteinaktivierung durch die mit 11-cis-PrSB
regenerierte K296G-Mutante wird ebenfalls durch eine zehnsekündige Belichtung (schwarzer Pfeil)
induziert (rote Spur). Die Gt-Proteinaktivierung durch das K296G-Opsin wird wiederum durch die Zugabe
von GTPγS gestartet (grüne Spur). Die Gt-Proteinaktivierung durch das K296G-Opsin, in Anwesenheit
von 11-cis-PrSB im Überschuss (0,5 µM), wird durch eine kontinuierliche Belichtung (Startpunkt:
schwarzer Pfeil) induziert (blaue Spur). Der zehnsekündigen Belichtung (schwarzer Pfeil) des K296G-
Opsin, in Anwesenheit von 11-cis-PrSB im Überschuss (0,5 µM), folgt eine weitere zehnsekündige
Belichtung (orangefarbene Spur, erster Pfeil) und abschließend eine kontinuierliche Belichtung
(orangefarbene Spur, zweiter Pfeil). Messbedingungen BTP-Puffer (pH 6,0), 130 mM NaCl,1 mM MgCl2,
2 mM DTT und 0,01 % DDM bei 20°C.!
3 ERGEBNISSE
102
den Rezeptor entsteht, könnte aus der Interaktion des Liganden mit einer möglichen
zweiten Bindungsstelle resultieren, die die Gt-Proteinaktivierung fördert
(Heck et al. 2003b, Jäger et al. 1994, Kono et al. 2008).
3.3 Reversible Aufnahme des all-trans-Retinals durch
aktives Opsin
Im Rhodopsin ist der 11-cis-Retinalligand mit dem Apoprotein über eine
Schiff’sche Base kovalent verknüpft, und erst die Isomerisierung zu all-trans-Retinal
erzeugt die aktive Meta II-Konformation des Rezeptors. Die exogene Zugabe des
all-trans-Retinals zu Opsin führt zu einer Aktivität für das Gt-Protein von 14 % des
lichtinduzierten Rhodopsins (Han et al. 1996, Jäger et al. 1996). Die Frage ist nun, wie diese
aktive Spezies des Opsins entsteht: Wird all-trans-Retinal kovalent in der
Bindungstasche des Rezeptors gebunden oder existiert eine sekundäre Bindestelle für
all-trans-Retinal, wodurch der Rezeptor partiell aktiviert wird?
Die lichtinduzierte Aktivierung des Rhodopsins (0,5 µM N2C/D282C-
Kontrollrhodopsin) führte zu einem Anstieg der intrinischen Tryptophanfluoreszenz, die
die Hydrolyse und Abgabe des all-trans-Retinals widerspiegelt (Abb. 3.17a, schwarze
Spur). Die Belichtung in Anwesenheit von 50 µM CTα-Peptid (modifizierte C-terminale
Oligopeptidsequenz der α-Untereinheit des Gt-Proteins) führte zu einem
unvollständigen Zerfall des Meta II (Abb. 3.17a, rote und grüne Spur). Die Zugabe von
Hydroxylamin (HA) in der stationären Phase der Zerfallsreaktion sorgte für eine
schnelle Bildung des Retinaloxims. Dies führte zur vollständigen Abgabe des
all-trans-Retinaloxims durch das Opsin und somit zu einem Anstieg der gemessenen
Fluoreszenz (Abb. 3.17a, rote Spur). Die Zugabe des Hydroxylaminderivats t-BHA in
der stationären Phase der Reaktion zeigte die gleiche Abgabekinetik des
all-trans-Retinals (Abb. 3.17a, grüne Spur) wie die Messung des normalen
Meta II-Zerfalls in Abwesenheit des CTα-Peptids (Abb. 3.17a, schwarze Spur). Durch
die Bildung des Retinaloxims, die mit t-BHA nur außerhalb des Proteins möglich ist,
wurde das freie all-trans-Retinal dem Gleichgewicht entzogen, wodurch sich ein neues
Gleichgewicht zwischen freiem und proteingebundenem all-trans-Retinal einstellte.
Die Kinetik der Abgabe des all-trans-Retinals in Anwesenheit des CTα-Peptids und
des t-BHA (Abb. 3.17a, grüne Spur) war identisch mit der normalen Abgabekinetik in
Abwesenheit des CTα-Peptids und t-BHA (Abb. 3.17a, schwarze Spur).
3 ERGEBNISSE
103
Die Zugabe verschiedener Mengen des CTα-Peptids vor der lichtinduzierten
Aktivierung des N2C/D282C-Rhodopsins zeigte, dass die Fluoreszenzänderung bis
zum Erreichen der stationären Phase mit steigender Konzentration (Abb. 3.17b, 10 µM
(blaue Spur) bis 500 µM (violette Spur)) an CTα-Peptid abnahm. Die Zugabe des CTα-
Peptids zu zerfallenem Rhodopsin führte zu einer Abnahme der intrinsischen
Tryptophanfluoreszenz des Opsins, die abhängig von der Menge an zugegebenem
CTα-Peptid war (Abb. 3.17c). Je höher die Konzentration an CTα-Peptid, desto stärker
war die Änderung der Fluoreszenz (Abb. 3.17c, 10 µM (blaue Spur) und 500 µM
(violette Spur)). Die stationäre Phase der CTα-Peptid-induzierten Fluoreszenzänderung
aus Abbildung 3.17c entsprach annähernd der Höhe der entsprechenden stationären
Phase der lichtinduzierten Fluoreszenzänderung aus Abbildung 3.17b. Die Zugabe von
Abbildung 3.17: Einfluss des CT
α
-Peptids auf den lichtinduzierten Zerfall von Meta II bzw. auf
zerfallenes Rhodopsin. (a) Die Untersuchung des lichtinduzierten Meta II-Zerfalls der N2C/D282C-
Kontrollrhodopsinmutante erfolgte fluoreszenzspektroskopisch (schwarze Spur). Die Zugabe von 25 mM
Hydroxylamin (HA) in der stationären Phase der Messung dient der Bestimmung des
Fluoreszenzauslöschungseffekts dieser Verbindung. Der Meta II-Zerfall in Anwesenheit von 50 µM CTα-
Peptid ist in der roten und grünen Spur dargestellt. Die Effekte durch die Zugabe von HA nach Erreichen
der stationären Phase sind in der roten Spur (+HA) und die durch die Zugabe von o-tert-Buthyl-HA in der
grünen Spur (+t-BHA) gezeigt. (b) Abhängigkeit des lichtinduzierten Meta II-Zerfalls von der CTα-Peptid-
Konzentration. Dargestellt ist der Meta II-Zerfall in Abwesenheit des CTα-Peptids (schwarze Spur) und in
Anwesenheit von 10 µM (blaue Spur), 50 µM (rote Spur), 100 µM (grüne Spur) und 500 µM (violette Spur)
CTα-Peptid. Zugabe von 25 mM HA nach Erreichen der stationären Phase (+HA). (c) Einfluss des CTα-
Peptids auf das zerfallene Rhodopsin. Zugabe der unter (b) erwähnten Konzentrationen des CTα-Peptids
(gleicher Farbcode) zum zerfallenen Rhodopsin (Zerfallszeit: 1 h). Nach dem Erreichen der stationären
Phase wurde 25 mM HA zugegeben. Messbedingungen: 0,5 µM Rhodopsin in BTP-Puffer (pH 6,0),
0,03 % DDM, 20°C.
3 ERGEBNISSE
104
HA diente der Kontrolle des Einflusses des CTα-Peptids auf die gemessene
Fluoreszenz (Abb. 3.17b und c, +HA).
Die Ergebnisse aus der Abbildung 3.17 sprechen für eine reversible Aufnahme
des all-trans-Retinals durch Opsin, das durch die Bindung des CTα-Peptids in eine
aktive Konformation gebracht werden kann (Scheerer et al. 2008). Diese Ergebnisse
werfen eine weitere Frage auf: Ist das durch das aktive Opsin reversibel
aufgenommene all-trans-Retinal kovalent mit dem Protein verknüpft?
Die Untersuchung der Bindung des all-trans-Retinals an das Opsin erfolgte
durch die Säuredenaturierung des Proteins und anschließende UV/Vis-
spektroskopische Analyse. Die Säuredenaturierung mittels 1 N HCl-Lösung führte zur
Protonierung der Lys296-Retinyliden-Schiff’schen Base, die dann durch die
Verschiebung des Absorptionsmaximums von λmax 382 nm auf 440 nm nachgewiesen
werden konnte (Abb. 3.7c, eingefügte Grafiken). Die Untersuchung der kovalenten
Verknüpfung im zerfallenen Rhodopsin (0,5 µM) in Abwesenheit des CTα-Peptids
zeigte im Differenzspektrum („nach Zugabe von HCl“ minus „vor Zugabe von HCl“)
keine Änderungen des bestehenden Absorptionsmaximums bei λmax 382 nm
(Abb. 3.18a, gestricheltes Spektrum). Dagegen wies das Differenzspektrum der
Säuredenaturierung der Probe des zerfallenen Rhodopsins nach der Zugabe von
500 µM CTα-Peptid und einer 30-minütigen Inkubation eine Verschiebung des λmax von
382 nm auf 440 nm auf (Abb. 3.18a, Spektrum mit durchgezogener Linie). Der Ansatz
mit 0,5 µM Opsin und 0,5 µM exogen zugegebenem all-trans-Retinal führte zum
gleichen Ergebnis der Säuredenaturierung in An- und Abwesenheit des CTα-Peptids
(Abb. 3.18a). Das all-trans-Retinal kann reversibel durch das aktivierte Opsin
aufgenommen werden und bildet eine kovalente Verknüpfung mit dem Apoprotein. Die
Untersuchungen der Affinität des CTα-Peptids in Anwesenheit von all-trans-Retinal im
Überschuss (40-fach) bzw. der Affinität des all-trans-Retinals in Anwesenheit des CTα-
Peptids im Überschuss (1000-fach) zum Opsin basierten auf der Bestimmung der
Konzentration der protonierten Schiff’schen Base (SBH+). Die Bestimmung der
Konzentration erfolgte mit einem Extinktionskoeffizienten für die SBH+ (Daten aus
Abbildung 3.7c, eingefügte Grafiken) von 38 000 M-1 cm-1. Der Zusammenhang
zwischen dem proteingebunden all-trans-Retinal (Konz. SBH+) und der Menge an CTα-
Peptid in Anwesenheit von freiem all-trans-Retinal im Überschuss (20 µM) konnte mit
einer hyperbolischen Funktion beschrieben werden und ergab eine Affinität von
Kd = 3,25 µM für 0,5 µM Opsin (Abb. 3.18b, linke Grafik, ). Der Zusammenhang
zwischen dem proteingebundenen all-trans-Retinal (Konz. SBH+) und der Menge an
exogen zugegebenem all-trans-Retinal in Anwesenheit des CTα-Peptids im
3 ERGEBNISSE
105
Überschuss (500 µM) konnte ebenfalls mit einer hyperbolischen Funktion beschrieben
werden und ergab eine Affinität von Kd = 0,922 µM für 0,5 µM aktiviertes Opsin
(Abb. 3.18b, rechte Grafik, ). Da das all-trans-Retinal an das im CTα-Peptid
befindliche Lysin binden kann, wurde eine Bestimmung dieser Bindung ohne Opsin
durchgeführt (Abb. 3.18b, beide Grafiken, ). Diese Bindung zeigte einen linearen
Zusammenhang und kann von der Gesamtkonzentration an gebundenem
all-trans-Retinal abgezogen werden. Eine weitere Frage stellt sich wie folgt: Befindet
sich die kovalente Verknüpfung des all-trans-Retinals mit dem aktivierten Apoprotein,
genauso wie die des 11-cis-Retinals, am Lys296? Wenn das der Fall ist, müsste
all-trans-Retinal die Regeneration des Rhodopsins beeinflussen.
Die Aufnahme von 1 µM 11-cis-Retinal in das N2C/D282C-Opsin
(Abb. 3.19a, ) wurde durch eine Zugabe von 10 µM all-trans-Retinal in Abwesenheit
Abbildung 3.18: Untersuchung der Bildung der protonierten Schiff’schen Base (SBH+) zwischen
Opsin und all-trans-Retinal in Anwesenheit des CT
α
-Peptids. (a) Spektren repräsentieren die
Ergebnisse nach der Zugabe von HCl. Die Zugabe von HCl zu zerfallendem Rhodopsin oder Opsin mit
equimolarer Konzentration an all-trans-Retinal führt in Anwesenheit von 500 µM CTα-Peptid zur Bildung
einer SBH+ (λmax 440 nm; durchgezogene Linie). Die Spektren der Proben nach HCl-Denaturierung und
SB-Protonierung in Abwesenheit des CTα-Peptids zeigen kein Maximum bei 440 nm (gestrichelte Linie).
(b) Abhängigkeit der Bildung der all-trans-Retinyliden-SBH+ in Opsin von den Konzentrationen des
CTα-Peptids und des all-trans-Retinals. Linke Grafik: Korrelation zwischen den Konzentrationen der
gebildeten SBH+ und des CTα-Peptids in Anwesenheit von 40-fachem Überschuss an all-trans-Retinal in
einer Probe mit 0,5 µM Opsin () und ohne Opsin (). Rechte Grafik: Korrelation zwischen den
Konzentrationen der gebildeten SBH+ und all-trans-Retinal in Anwesenheit von 500 µM CTα-Peptid in
einer Probe mit 0,5 µM Opsin () und ohne Opsin (). Der Zusammenhang der Datenpunkte wurde mit
einer Kombination aus hyperbolischer und linearer () oder einer linearen () Funktion beschrieben. Die
Fehlerbalken beschreiben die Standardabweichung dreier unabhängiger Messungen. Messbedingungen:
BTP-Puffer (pH 6,0), 0,03 % DDM, 20°C.
3 ERGEBNISSE
106
des CTα-Peptids nur leicht verlangsamt und konnte mit einer bimolekularen Funktion
beschrieben werden (Abb. 3.19a, ). Die Zugabe von 50 µM CTα-Peptid hatte nahezu
keinen Effekt auf die Regeneration des Opsins und zeigte ebenfalls einen
bimolekularen Zusammenhang der Datenpunkte (Abb. 3.19a, ). Die Kombination von
50 µM CTα-Peptid und 10 µM all-trans-Retinal führte im Gegensatz zu den
Einzelzugaben zu einer drastischen Reduzierung der Regenerationsrate und konnte
durch eine monoexponentielle Funktion beschrieben werden (Abb. 3.19a, ).
Die Untersuchung der kompetitiven Inhibition der Regeneration durch
all-trans-Retinal in Anwesenheit von 50 µM CTα-Peptid wies eine initiale schnelle und
eine späte langsame Komponente auf (Abb. 3.19b). Die Geschwindigkeit der schnellen
Abbildung 3.19: Beeinflussung der Regeneration des Rhodopsins durch all-trans-Retinal in
Anwesenheit des CT
α
-Peptids. Untersuchung der Aufnahme des 11-cis-Retinals (1 µM) durch Opsin
(0,5 µM) erfolgte durch die UV/Vis-spektroskopische Messung bei λmax 500 nm. Die Zugabe des
11-cis-Retinals wird durch den Pfeil gekennzeichnet. (a) Geschlossene Symbole beschreiben die
Regeneration des Rhodopsins in Anwesenheit von 50 µM CTα-Peptid und offene Symbole in
Abwesenheit des CTα-Peptids. Kreise repräsentieren die Regeneration des Rhodopsins in Abwesenheit
des all-trans-Retinals. Dreiecke beschreiben die Regeneration in Anwesenheit von 20-fachem
Überschuss an all-trans-Retinal. Der Zusammenhang der Datenpunkte wurde mit einer bimolekularen
Funktion beschrieben, ausgenommen die Datenpunkte der geschlossenen Dreiecke, die mit einer
monoexponentiellen Funktion beschrieben wurden. (b) Rhodopsinregeneration in Anwesenheit von
50 µM CTα-Peptid und den angegebenen all-trans-Retinal-Konzentrationen (10 µM = 20-facher
Überschuss von all-trans-Retinal zu Rhodopsin). (c) Regeneration des Rhodopsins (0,5 µM) in
Anwesenheit von 50 µM CTα-Peptid und 10 µM all-trans-Retinal. () beschreiben die Regeneration mit
1 µM 11-cis-Retinal (Analog zu (a) und (b) ) und () die Regeneration mit 10 µM 11-cis-Retinal.
Messbedingungen: BTP-Puffer (pH 6,0), 0,03 % DDM, 20 °C.
3 ERGEBNISSE
107
Phase änderte sich mit zunehmender Konzentration an all-trans-Retinal nicht, der
Anteil dieser Phase wurde aber mit zunehmender Konzentration an all-trans-Retinal
kleiner (Abb. 3.19b). Die späte langsame Phase zeigte keine Abhängigkeit von der
Konzentration des all-trans-Retinals, der Beginn dieser wurde nur mit steigender
Konzentration an all-trans-Retinal vorgezogen (Abb. 3.19b). Das bedeutet, dass die
schnelle initiale Komponente der Aufnahme von 11-cis-Retinal in ein leeres
Opsinmolekül entspricht und die langsame Komponente den Austausch des am
Lys296 gebundenen all-trans-Retinals durch das 11-cis-Retinal beschreibt
(Abb. 3.19b). Das zeigt auch, dass die Aufnahme von all-trans-Retinal reversibel ist,
während die Aufnahme von 11-cis-Retinal durch die Bildung des Rhodopsins
irreversibel ist (Abb. 3.19b). Der Anteil der initialen schnellen Phase war schon bei
einer equimolaren Menge beider Retinale (1 µM) um nahezu die Hälfte reduziert
(Abb. 3.19b, ), was für eine halbmaximale Besetzung der Bindungstasche des
aktivierten Opsins mit all-trans-Retinal sprechen würde.
Die erhöhte Konzentration an zugegebenem 11-cis-Retinal (10 µM anstatt 1 µM
(Abb. 3.19c, (10 µM) und (1 µM))) zum Ansatz mit 0,5 µM Opsin,
50 µM CTα-Peptid und 10 µM all-trans-Retinal zeigte eine Beschleunigung der
langsamen Komponente, jedoch keine initiale schnelle Komponente, was für eine volle
Besetzung der Bindungstasche mit all-trans-Retinal unter diesen Bedingungen
sprechen würde. Diese Daten bestätigen die Daten aus Abbildung 3.18b (rechte
Grafik).
Da die exogene Zugabe des all-trans-Retinals zu Opsin, die zu einer partiellen
Aktivität für das Gt-Protein führte, in aufgereinigten Diskmembranen durchgeführt
wurde (Han et al. 1996, Jäger et al. 1996), soll nun geklärt werden, ob dieser Effekt auch in
Detergenzlösung beobachtet werden kann. Dadurch könnte die Frage über die
Existenz einer sekundären Bindestelle für all-trans-Retinal am Opsinmolekül
beantwortet werden.
Die Untersuchung der all-trans-Retinal induzierten partiellen
Gt-Proteinaktivierung durch Opsin erfolgte durch die Zugabe der verschiedenen
Mengen an Retinal direkt in die Messküvette fünf Minuten bevor die lichtunabhängige
Aktivierung des Gt-Proteins mit GTPγS gestartet wurde. Die Messung selbst wurde
fluoreszenzspektroskopisch durchgeführt (Abschnitt 2.4.2.2). Die Auswertung der
Gt-Proteinaktivität erfolgte durch die Ermittlung der Anfangssteigung normiert auf die
Endamplitude. Die Endamplitude wurde durch die direkte Zugabe von Meta II in die
Küvette circa fünf Minuten nach dem Start der Messung ermittelt. Die in
3 ERGEBNISSE
108
Abbildung 3.20 dargestellten Daten zeigen eine relative Gt-Proteinaktivierung, die sich
auf die lichtinduzierte Aktivierung des Gt-Proteins durch Meta II (100 %) bezieht.
Die basale Aktivierung des Gt-Proteins durch das Opsin (2,5 nM) in
Abwesenheit des all-trans-Retinals betrug unter diesen Messbedingungen weniger als
ein Prozent der lichtinduzierten Meta II-Aktivität. Mit steigender Menge an
all-trans-Retinal im Ansatz erhöhte sich die Aktivität des Opsins auf maximal 25 % der
lichtinduzierten Meta II-Aktivität. Die Anpassung der Datenpunkte an Gleichung 2.6
(siehe Abschnitt 2.5) ergab eine Affinität des all-trans-Retinals für Opsin von
Kd = 1,57 nM. Die höhere partielle Gt-Proteinaktivität in diesem Ansatz im Vergleich zu
den 14 % des in der Literatur beschriebenen Wertes (Han et al. 1996, Jäger et al. 1996) kann
durch die Messung des Opsins in Detergenz erklärt werden.
Da durch all-trans-Retinal nur eine Gt-Proteinaktivität von maximal 25 % der
Meta II-Aktivität erreicht wurde, kann die entstandene Spezies kein reversibel
gebildetes Meta II sein. Durch die Erhöhung der Konzentration an all-trans-Retinal
außerhalb des Opsins müsste die reversibel gebildete Meta II-Spezies mit steigender
Abbildung 3.20: Titration der all-trans-Retinal-induzierten partiellen Gt-Proteinaktivierung von
Opsin. Die partielle G
t-Proteinaktivierung durch Opsin und all-trans-Retinal wurde relativ zur
lichtinduzierten Gt-Proteinaktivierung durch Meta II dargestellt. Die basale Opsinaktivität in Abwesenheit
von all-trans-Retinal betrug unter diesen Bedingungen weniger als ein Prozent der lichtinduzierten
Meta II-Aktivität. In Anwesenheit von 100 nM all-trans-Retinal erreichte das Opsin eine
Gt-Proteinaktivierung von ca. 25 % der lichtinduzierten Aktivität von Meta II (maximal mögliche
Gt-Proteinaktivierung durch Opsin und all-trans-Retinal). Die Datenpunkte konnten an die Gleichung 2.6
angepasst werden und ergaben eine Affinität von all-trans-Retinal für Opsin von Kd = 1,57 nM. Die
Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von 3 unabhängigen Messungen. Messbedingungen:
2,5 nM N2C/D282C-Opsin in BTP-Puffer (pH 7), 130 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 2 mM DTT und
0,01 % DDM bei 20 °C.
3 ERGEBNISSE
109
all-trans-Retinal-Konzentration zunehmen. Das ist aber aus den Daten in
Abbildung 3.20 nicht ersichtlich, zudem ist unter diesen Bedingungen keine kovalente
Schiff’sche Base-Verknüpfung vorhanden (siehe Abb. 3.18a, rechte Grafik).
Demzufolge muss eine sekundäre Bindestelle für all-trans-Retinal existieren, die es
dem Retinal erlaubt, das Opsin ohne kovalente Verknüpfung partiell zu aktivieren.
4 DISKUSSION
111
4 DISKUSSION
4.1 Hydroxylamin und seine alkylierten Derivate als
molekulares Werkzeug zur Untersuchung von
Rhodopsin und seinen Metazuständen
Das starke Nukleophil Hydroxylamin (HA) (Abb. 4.1) wird seit langem zur
Spaltung Retinyliden-Schiff’scher Basen genutzt, unter anderem, um dadurch Meta II
zu Opsin und Retinaloxim umzuwandeln oder um die relative Stabilität von
Rhodopsinmutanten zu bestimmen. Die alkylierten Hydroxylaminderivate o-Methyl-
Hydroxylamin (MHA) und o-Ethyl-Hydroxylamin (EHA) (Abb. 4.1) wurden bisher nur zur
Umwandlung von Retinal zu alkyliertem Retinaloxim für die HPLC-Analyse verwendet
(Buczylko et al. 1996, Rattner et al. 2000, van Kuijk et al. 1985). O-tert-Buthyl-Hydroxylamin
(t-BHA) wurde bisher zur Herstellung von antibakteriellen Agenzien eingesetzt
(Tran et al. 2004) oder um den Mechanismus der Schwefeloxidsynthase zu verstehen
(Huang et al. 2001). Im Zusammenhang mit Rhodopsin wurde t-BHA bisher noch nicht
beschrieben.
Neben der Nutzung von HA und dessen Derivaten bei der Untersuchung des
Rezeptors selbst ist ihr Einsatz zur Eliminierung peripherer Retinyliden-
Schiff’scher Basen von großer Bedeutung, da diese die Untersuchung der Aktivierung
Abbildung 4.1: Molekulare Strukturen von Wasser (Kontrolle), Hydroxylamin (HA), o-Methyl-
Hydroxylamin (MHA), o-Ethyl-Hydroxylamin (EHA), o-tert-Buthyl-Hydroxylamin (t-BHA) und o-
(Carboxymethyl)-Hydroxylamin (CMHA). Das platzfüllende Modell wurde dargestellt in Jmol
(www.jmol.org) mit Hilfe von publizierten Van-der-Waals-Radien (Mantina et al. 2009). Atome sind farbig
als grau (Kohlenstoff), rot (Sauerstoff), blau (Stickstoff) und weiß (Wasserstoff) dargestellt.
4 DISKUSSION
112
des Rhodopsins und des Meta II-Zerfallsprozesses erschweren. Das Retinal reagiert
mit Aminen und bildet unter anderem eine Schiff’sche Base-Verbindung mit
Phosphatidylethanolaminen (Anderson und Maude 1970, Poincelot et al. 1969),
Phosphatidylserinen (Sommer et al. 2006) und zytoplasmatisch ausgerichteten
Lysinresten des Opsinmoleküls (Fishkin et al. 2003, Sparrow et al. 2003). Basierend auf den
beschriebenen pKa von 6,1 bzw. von 7,5 für Retinyliden-Schiff’sche Basen in Lösung
(Cooper 1987, Steinberg et al. 1993), würde etwa die Hälfte dieser nichtspezifischen,
peripheren Schiff’schen Basen bei physiologischem pH-Wert protoniert sein. Die
protonierten Schiff’schen Basen haben eine Absorption bei λmax = 440 nm
(Ball und Morton 1949) und überlagern somit die Absorption vieler Metarhodopsinspezies,
so dass Photoprodukte des Rhodopsins als nichtspezifische Schiff’sche Basen
missverstanden werden. Diese nichtspezifischen Schiff’schen Basen werden auch als
Pseudophotoprodukte bezeichnet. Ein Beispiel für diese Missinterpretation ist Meta III,
das immer wieder als Pseudophotoprodukt bezeichnet wurde (Übersicht:
Kolesnikov et al. 2003).
Die Ergebnisse der Untersuchung des Einflusses der alkylierten
Hydroxylaminderivate MHA, EHA und t-BHA zeigten, dass diese schnell und effizient
mit den peripheren Retinyliden-Schiff’schen Basen reagierten, aber keinen
signifikanten Einfluss auf das Rhodopsin und seine lichtaktivierten Spezies
(Meta II / III) hatten. Diese Resultate sind eine große Hilfe für das Verständnis der
Rhodopsinstruktur und –funktion und können als Basis für zukünftige Untersuchungen
sehr gut genutzt werden.
4.1.1 Die Metarhodopsin-Spezies sind HA-sensitiv
Die Retinyliden-Schiff’sche Base im lichtsensitiven Rhodopsin wird durch HA
nicht beeinflusst (Abb. 3.2), weil in Lösung befindliche Substanzen in dieser
Konformation keinen Zugang zur Retinalbindungstasche haben (Janz und Farrens 2003,
Rath et al. 1998
). Die aktive Form des Rezeptors (Meta II) kann Transducin und, nach
Phosphorylierung durch die Rhodopsinkinase, Arrestin binden. Diese Form des
Rezeptors ist, wie schon lange bekannt, zugänglich für HA (Akhtar et al. 1968,
Jastrzebska et al. 2011, Matthews et al. 1963, Vogel et al. 2003). Es stellt sich nun die Frage: An
welcher Stelle der Photoaktivierungssequenz bekommt HA einen Zugang zur
Retinyliden-Schiff’schen Base?
Der Einfluss auf die Retinyliden-Schiff’sche Base im Meta I wird kontrovers
diskutiert (Katayama et al. 2010, Ratner et al. 1981). Die Zugänglichkeit für HA im Meta I ist
durch das schnelle Meta I/Meta II-Gleichgewicht experimentell schwierig
4 DISKUSSION
113
nachzuweisen, da eine detektierbare Anhäufung von Meta I nur bei niedrigen
Temperaturen möglich ist, was aber die HA-Reaktivität inhibieren könnte. Diese
Vermutung wird dadurch gestützt, dass bei pH 8 und 2 °C, wo ca. 8 % des
lichtaktivierten Rhodopsins in Meta II-Form existiert (Parkes und Liebman 1984), auch bei
hohen Mengen an HA (500 mM) keine Retinaloximbildung beobachtet werden konnte.
Deshalb ist eine Schussfolgerung über die HA-Sensitivität des Meta I schwierig.
Es wurde gezeigt, dass das HA im Meta II-Zustand des Rezeptors die
Möglichkeit besitzt, die Retinalbindungsstelle zu erreichen (Abb. 3.2) (Akhtar et al. 1968,
Jastrzebska et al. 2011, Matthews et al. 1963, Vogel et al. 2003). Die Bindung von Transducin
oder Arrestin an Meta II behindert diesen Zugang zur Retinyliden-Schiff’schen Base,
was durch die langsame HA-induzierte Dissoziation von Arrestin und Transducin
gezeigt wurde (Hofmann et al. 1983, Hofmann et al. 1992, Piechnick et al. 2011 (Abb. 5, B und C)).
Diese Beobachtungen sind konsitent mit der Aussage, dass HA von der
zytoplamatischen Seite, über das helikale Gerüst in den Rezeptor gelangen kann
(Jastrzebska et al. 2011).
Die Zugänglichkeit des membrangebundenem Meta III für HA ist schon lange
bekannt (Chabre und Breton 1979). Die Zugänglichkeit des in Detergenz solubilisierten
Meta III für HA konnte in dieser Arbeit gezeigt werden (Abb. 3.5). Die Rate des HA-
induzierten Meta III-Zerfalls war signifikant langsamer als die des HA-induzierten
Meta II-Zerfalls (Abb. 3.3 und 3.5). Diese Ergebnisse belegen, dass die Retinyliden-
Schiff’sche Base in Meta III weniger gut für HA zugänglich ist. Das könnte bedeuten,
dass entweder die Proteinstruktur des Rezeptors HA besser ausschließen kann oder
die Reaktion mit HA durch die Isomerisierung und/oder durch den
Protonierungszustand der Schiff’schen Base beeinflusst wird (Ritter et al. 2008). Der
langsamere HA-induzierte Meta III-Zerfall im Vergleich zum HA-induzierten Meta II-
Zerfall würde mit der Auffassung übereinstimmen, dass Meta III dem unbelichteten
Rhodopsin ähnlicher ist als dem Meta II (Bartl und Vogel 2007).
4.1.2 Meta II und Meta III sind nicht t-BHA-sensitiv
Die Untersuchungen des Einflusses von t-BHA auf die Meta II- und Meta III-
Spezies ergaben, dass Meta III komplett unempfindlich gegenüber t-BHA war
(Abb. 3.5) und sich die Rate des Meta II-Zerfalls in Anwesenheit von 25 mM t-BHA bei
20 °C lediglich verdoppelte (Abb. 3.3). Die relative Unempfindlichkeit von Meta II und
Meta III gegenüber t-BHA lässt sich durch die sperrige tert-Buthyl-Gruppe erklären,
die verhindert, dass das t-BHA die Retinalbindungstasche im Opsin erreichen kann.
Es wurde gezeigt, dass HA destabilisierend auf die Sekundärstruktur des Opsins wirkt
4 DISKUSSION
114
und die Struktur der extrazellulären Peptidschleife 2 (EL2) beeinflusst
(Katayama et al. 2010), die den „Deckel“ der Retinalbindungstasche ausbildet
(Janz et al. 2003). Die Hydroxylamingruppe des t-BHA könnte ebenfalls die EL2 im Opsin
beeinflussen, wodurch die verdoppelte Meta II-Zerfallsgeschwindigkeit in Anwesenheit
von t-BHA erklärt werden könnte. Aufgrund dessen, dass die tert-Buthyl-Gruppe das
Molekül im Übergangsbereich vom hydrophilen und hydrophoben Anteil der Membran
verteilt und es dadurch zu einer Erniedrigung der effektiven Konzentration von t-BHA
kommt, könnte seine Wirkung geringer ausfallen. Da aber die aufgereinigten
Diskmembranen experimentell bedingt in niedriger Konzentration vorliegen, können
sie nicht die gesamte Menge des t-BHA aufnehmen, wodurch die noch in Lösung
befindlichen t-BHA-Verbindungen die Verdoppelung der Meta II-Zerfallsrate induzieren
könnten. Dafür, dass sich t-BHA in der Membran und in Lösung befinden kann, spricht
auch, dass alle Hydroxylaminderivate, einschließlich t-BHA, in Wasser löslich waren.
Die alkylierten Hydroxylaminderivate hätten theoretisch die Möglichkeit, über
die relativ großen Öffnungen zwischen den Transmembranhelices in das Opsinmolekül
zu gelangen (d.h. durch den postulierten, kontinuierlichen Kanal für die Aufnahme und
Abgabe des Retinals in und aus der Bindungstasche, Hildebrand et al. 2009). Die
Ergebnisse aus Abbildung 3.3 zeigten aber, dass keines der alkylierten
Hydroxylaminderivate hydrophob genug ist, um komlett durch die Membran
aufgenommen werden zu können und über den Ligandenkanal in das Opsinmolekül zu
gelangen. Wäre das der Fall gewesen, dann wäre der Meta II-Zerfall stärker
beschleunigt worden, weil die HA-Derivate die Retinyliden-Schiff’sche Base über den
Ligandenkanal ungehindert hätten erreichen können.
Generell kann gesagt werden, dass der Einfluss von t-BHA und der anderen
alkylierten Hydroxylamine auf Meta II und Meta III klein genug ist, um sie zur
Unterscheidung des Meta II oder Meta III von Pseudophotoprodukten brauchbar
einsetzen zu können (siehe Abschnitt 4.1.3).
4.1.3 Alkylierte Hydroxylaminderivate als molekulares Werkzeug zur
Untersuchung der visuellen Signaltransduktion
Während die peripheren Retinyliden-Schiff’schen Basen
(Pseudophotoprodukte) sehr schnell durch HA und t-BHA gespalten werden können,
haben Meta II und Meta III verschiedene Abhängigkeiten von HA und t-BHA. Meta II in
aufgereinigten Diskmembranen zerfällt in Anwesenheit von HA 50-mal schneller als in
Anwesenheit von t-BHA (Abb. 3.3). Der Meta III-Zerfall ist in Anwesenheit von HA sehr
4 DISKUSSION
115
viel langsamer als der HA-induzierte Meta II-Zerfall, und Meta III ist komplett beständig
gegen t-BHA (Abb. 3.3 und 3.5).
Unter Berücksichtigung dieser Unterschiede repräsentieren HA und t-BHA ein
Werkzeug, das sehr einfach genutzt werden kann, um zwischen peripheren
Retinyliden-Schiff’schen Basen und den Meta-Spezies sowie zwischen Meta II und
Meta III unterscheiden zu können. Die Möglichkeit der Unterscheidung zwischen
peripheren Retinyliden-Schiff’schen Basen und Meta III mit Hilfe von t-BHA
repräsentiert einen enormen Fortschritt gegenüber vorher verwendeten Methoden.
Zum Beispiel identifizierten verschiedene Gruppen Meta III anhand der Orientierung
des Chromophors in Bezug zur Membran, was magnetisch orientierte Diskmembranen
(Chabre und Breton 1979) oder immobilisierte Einzelzellen (Kolesnikov et al. 2003) notwenig
machte, um diese mittels dichroistischer Absorptionsspektroskopie messen zu
können. Während solche Techniken für die meisten Laboratorien unerreichbar sind, ist
die Anwendung von t-BHA eine einfache biochemische Methode zur Identifizierung
von Meta III und anderen Photozerfallsprodukten des Rhodopsins. Die Untersuchung
der Photozerfallsprodukte des Rhodopsins bei der Bindung von Transducin oder
Arrestin wird im Folgenden als ein Beispiel beschrieben.
Da die Bindung von Transducin oder Arrestin durch t-BHA nicht beeinflusst
wurde (Piechnick et al. 2011), kann nun unter Verwendung des t-BHA folgende Frage
geklärt werden: Welche Spezies des Rhodopsins wird durch die Bindung des
Arrestins stabilisiert bzw. welche Spezies des Rhodopsins stabilisiert die Bindung des
Arrestins? Denn es konnte beobachtet werden, dass ein Teil des Arrestins auch noch
lange nach dem Meta II-Zerfall am Opsin gebunden blieb (Piechnick et al. 2011 (Abb. 6B,
schwarze Kurve), Gurevich und Benovic 1993, Hofmann et al. 1992, Sommer et al. 2005). Ist t-BHA
vorhanden, bevor das Rhodopsin belichtet wird, dann wird die Bildung dieses
Komplexes verhindert (Piechnick et al. 2011 (Abb. 6B, rote Kurve)). Bei einer Zugabe von t-
BHA oder HA nach dem Meta II-Zerfall dissoziierten beide Verbindungen diesen
Komplex, t-BHA tat dies deutlich langsamer als HA (Piechnick et al. 2011 (Abb. 6B)). Da
aber dieses an Arrestin gebundene Photozerfallsprodukt sensitiver auf t-BHA
reagierte, ist diese unbekannte Spezies nicht Meta III, wie es vorher vermutet wurde
(Sommer et al. 2005). Diese Spezies ist höchstwahrscheinlich reversibel gebildetes
Meta II, das durch die Bindung von Arrestin stabilisiert wird. Die Zugabe von HA oder
t-BHA führte zu einer all-trans-Retinaloxim-Bildung, welche durch das kleinere HA
schneller erfolgte als durch das größere t-BHA. Demzufolge verlief die Dissoziation
von Arrestin in Anwesenheit von t-BHA deutlich langsamer als in Anwesenheit von HA.
4 DISKUSSION
116
Diese Methode kann nicht nur für aufgereinigte Komponenten verwendet
werden, sondern z.B. auch für die in der Elektrophysiologie genutzen isolierten
Stäbchenzellen (Fain et al. 2001, Leibrock und Lamb 1997). Es wurde zum Beispiel gezeigt,
dass der Meta III-Zerfall in Abwesenheit von Arrestin die Geschwindigkeit der
Ruhepotentialbildung von Mausstäbchenzellen nach Belichtung beeinflusst
(Imai et al. 2007). Außerdem wurde beschrieben, dass HA einen minimalen Effekt auf die
Ruhepotentialbildung von Wildtypstäbchenzellen hat (Leibrock und Lamb 1997,
Ripps und Pepperberg 1987). Deshalb wäre es sehr interessant, die Effekte von HA und
t-BHA auf die Ruhepotentialbildung von Stäbchenzellen zu testen, die eine
verminderte Menge an Arrestin exprimieren. Hier würde man erwarten, dass HA den
Meta III-Zerfall induziert und somit die Geschwindigkeit der Ruhepotentialbildung in
den Stäbchenzellen beschleunigt, während t-BHA keinen Effekt auf den Meta III-
Zerfall hätte und dadurch eine gute Kontrolle wäre.
4.2 Indizien für einen Wasserkanal im aktivierten Rhodopsin
Die Öffnung des helikalen Gerüsts bei der Meta II-Bildung (Choe et al. 2011,
Standfuss et al. 2011
) ermöglicht den Einstrom gelöster Moleküle von der
zytoplasmatischen Seite des Rezeptors in die Bindungstasche zur Retinyliden-
Schiff’sche Base (Janz und Farrens 2004, Jastrzebska et al. 2011, Rath et al. 1998). Obwohl
bereits fest gebundene, strukturelle Wassermoleküle im helikalen Gerüst des
unbelichteten Rhodopsins vorhanden sind (Okada et al. 2002), sind Wassermoleküle der
umgebenen Flüssigkeit notwendig, um die Retinyliden-Schiff’sche Base hydrolysieren
zu können (Janz und Farrens 2004, Jastrzebska et al. 2011). Nur kleine Moleküle wie Wasser,
Hydroxylamin oder Borhydrid haben die Möglichkeit, das helikale Gerüst im Meta II-
Zustand zu passieren und zur Retinalbindungstasche zu gelangen
(Bownds und Wald 1965, Janz und Farrens 2004, Jastrzebska et al. 2011). Dieser Wasserkanal
muss sehr selektiv für die Größe und/oder Polarität eines Moleküls sein, da das
Hinzufügen einer Methylgruppe zum Hydroxylaminmolekül das Eindringen dieser
Verbindung in das helikale Gerüst verhindert (Abb. 3.2 und 3.3). Dieser beschränkte
Zugang über den Wasserkanal wird auch durch den hyperbolischen Verlauf der
Hydroxylamintitrationskurve widergespiegelt (Abb. 3.4). Die Reaktion von
Hydroxylamin mit der Retinyliden-Schiff’schen Base ist ein Prozess in zwei Schritten –
Ein Vorgleichgewicht, in dem Hydroxylamin die Retinalbindungstasche erreicht,
gefolgt durch die Aminolyse der Retinyliden-Schiff’schen Base. Die hohe apparente
Kd von 60 mM (Abb. 3.4) deutet an, dass auch Hydroxylamin nicht einfach das helikale
Gerüst passieren kann. Dieses könnte dementsprechend die obere Grenze der Größe
4 DISKUSSION
117
repräsentieren, die Moleküle maximal haben dürfen, um die Retinalbindungstasche im
Meta II erreichen zu können. Die geringere Größe könnte erklären, warum ein
kontinuierlicher Wasserkanal in der Meta II-Kristallstruktur nicht sichtbar ist
(Choe et al. 2011, Standfuss et al. 2011).
4.3 Die Aufnahme und Abgabe des Retinals durch einen
hypothetischen Ligandenkanal im aktivierten Rhodopsin
Durch die Strukturaufklärung des aktiven Opsins (Opsin*) (Park et al. 2008,
Scheerer et al. 2008) in Kombination mit computergestützten Methoden konnte ein Kanal
identifiziert werden, der die Retinalbindungstasche mit der hydrophoben
Membranumgebung verbindet (Hildebrand et al. 2009). Dieser Kanal ist ebenfalls in der
Struktur der aktiven Meta II-Konformation des Rezeptors geöffnet (Choe et al. 2011,
Standfuss et al. 2011
), wohingegen der Kanal im 11-cis-Retinal-gebundenen inaktiven
Rhodopsinzustand geschlossen ist (Palczewski et al. 2000). Für die inaktive
Opsinkonformation, die vorwiegend unter neutralem pH-Wert und in nativen
Membranen existiert (Vogel und Siebert 2001), konnte bis heute keine Kristallstruktur
ermittelt werden. In dieser Arbeit gewonnene Ergebnisse deuten aber auf eine
geschlossene, mehr dem Dunkelzustand entsprechende Opsinkonformation hin (siehe
Abbschnitt 4.3.7).
In diesem Teil der Arbeit wurde untersucht, wie die Aufnahme und Abgabe des
Retinals durch einen Austausch von Aminosäuren an den Engstellen entlang des
Retinalkanals im Opsinmolekül beeinflusst wurde und welche Faktoren für die Bildung
des Rhodopsins (Aufnahme des 11-cis-Retinals) bzw. für den Zerfall des Meta II
(Abgabe des all-trans-Retinals) verantwortlich sind.
4.3.1 Effekte der Mutationen im Retinalligandenkanal auf die Struktur
und Funktion des Rezeptors
Der Austausch der Aminosäuren entlang des Retinalligandenkanals führte zu
veränderten UV/Vis-spektroskopischen Absorptionseigenschaften, wie die Rot- oder
Blauverschiebung des λmax der protonierten Schiff’schen Base (SBH+) im
lichtsensitiven Rhodopsinzustand (Abb. 3.9). Die Rot- oder Blauverschiebung der
Absorption der SBH+ im lichtsensitiven Rezeptorzustand zeigt, dass
Wechselwirkungen mit der SBH+, die Form der Bindungstasche oder das interne
Wassernetzwerk durch die Mutationen der Aminosäuren verändert werden. Des
Weiteren könnten ausgetauschte Aminosäureseitenketten die Lage des Retinals
4 DISKUSSION
118
innerhalb der Bindungstasche verändern (Crocker et al. 2006) und somit über die
Polyenkette des Retinals wiederum einen Effekt auf die SBH+ haben (z.B. M207A und
A272V/I/F).
Neben den Veränderungen der Absorptionseigenschaften im lichtsensitiven
Rhodopsin zeigten einige Rezeptormutanten nach Lichtaktivierung eine Verschiebung
des Meta I/Meta II-Gleichgewichts (Abb. 3.10). Diese Verschiebung macht deutlich,
dass nach Belichtung bei einigen Mutanten durch den Aminosäureaustausch der
Mechanismus des Übergangs von Meta I (protonierte Schiff’sche Base, SBH+) zu
Meta II (deprotonierte Schiff’sche Base, SB) gestört ist. Das all-trans-Retinal und seine
C9-Methylgruppe sorgen innerhalb der Bindungstasche dafür, dass die Donor- und
Akzeptorseitenketten für die Protontransferreaktion optimal zueinander arrangiert sind
und stabilisieren somit die aktive Meta II-Konformation (Meyer et al. 2000). Eine
Beeinflussung der Lage des Retinals durch Mutationen im Ligandenkanal könnte diese
optimale Ausrichtung der Seitenketten stören und somit den Protonentransfer
behindern. Die Mutanten, die einen signifikanten Anteil Meta I aufwiesen, erstrecken
sich über die gesamte Länge des Ligandenkanals, was den Schluss zulässt, dass eine
Mutation der Aminosäuren innerhalb des Ligandenkanals einen Effekt auf das
gesamte Netzwerk in der Bindungstasche haben könnte.
Die katalytische Funktion des lichtaktivierten Rhodopsins auf das Gt-Protein
wurde durch die Mutationen im Ligandenkanal, mit Ausnahme der K296G-Mutante
(nähere Details dazu, siehe Abschnitt 4.3.6), nur wenig beeinflusst (Abb. 3.11a). Das
bedeutet, dass die Mutationen im Bereich des Ligandenkanals generell einen geringen
Effekt auf die Ausbildung der Gt-Proteinbindungsdomäne haben. Überraschend ist
jedoch, dass bei den Rhodopsinmutanten keine Korrelation zwischen der Bildung von
Meta I (Abb. 3.10) und der Gt-Proteinaktivierung erkennbar war. Da gezeigt wurde,
dass die Gt-Proteinbindung am Meta II erfolgt (Bennett et al. 1982, Emeis et al. 1982,
Hofmann 1985), hätte sich die Gt-Proteinaktivierung, durch die mutationsbedingte
Verschiebung des Meta I/Meta II-Gleichgewichts auf Meta I verlangsamen müssen.
Die Ergebnisse aus den Abbildungen 3.10 und 3.11a würden dafür sprechen, dass die
hier bestimmte Meta I-Spezies strukturelle Eigenschaften von Meta II besitzen muss,
die es dem Gt-Protein ermöglichen, an den Rezeptor zu binden. Die basale Aktivität
des ligandenfreien Opsins wurde durch einige Mutationen stark erhöht (Abb. 3.11b).
Das zeigt, dass einige Mutationen im ligandenfreien Opsin eine partiell aktive Struktur
induzieren können, die es dem Gt-Protein ermöglicht, an das Opsin zu binden. Die
größeren Abweichungen der basalen Opsinaktivität der Mutanten im Vergleich zu
relativ geringen Abweichungen der lichtaktivierten Rhodopsinmutanten (Meta II)
4 DISKUSSION
119
könnten durch die all-trans-Retinal-vermittelte Stabilisierung der Meta II-Konformation
erklärt werden (Meyer et al. 2000).
4.3.2 Mutationen der Aminosäureseitenketten entlang des
Retinalligandenkanals haben einen weitreichenden Einfluss auf
die gesamte Funktion der Bindungstasche
Basierend auf der computergestützten Identifizierung des Ligandenkanals mit
seinen vier Engstellen im Opsin* (Abb. 1.15) sollte die ortsgerichtete Mutagenese an
diesen Engstellen durch den Einbau größerer, kleiner oder geladener
Aminosäureseitenketten Aufschluss über den Einfluss des Kanals bei der Aufnahme
und Abgabe des Retinalliganden sowie über die Zuordnung der Öffnungen zur
Aufnahme und Abgabe geben.
Die Annahme, dass die Mutationen an den Engstellen im Ligandenkanal als
lokale Sonden für die Untersuchung der Retinalpassage dienen könnten, würde z.B.
die Mutation der Thr289-Aminosäure bestätigen, die Teil der Engstelle 1 an TM7 ist
(siehe Abb. 1.15). Die Mutation von Thr289 zum größeren Phenylalanin führte zu einer
sehr langsamen Aufnahme des 11-cis-Retinals und einer nur wenig veränderten
Abgabegeschwindigkeit des all-trans-Retinals (Abb. 3.13). Die Mutation von Thr289
zur kleinen Aminosäure Alanin hatte dagegen nur einen sehr kleinen Effekt auf die
Aufnahmegeschwindigkeit des 11-cis-Retinals und zeigte ebenso wie die Thr289Phe-
Mutation keinen ausgeprägten Effekt auf die Abgabe des all-trans-Retinals (Abb. 3.13).
Der Austausch des Thr289 durch ein Phenylalanin könnte im Bereich der Öffnung A zu
einem Hindernis führen, das die Aufnahme des 11-cis-Retinals in die Bindungstasche
erschwert. Diese Ergebnisse würden für eine Aufnahme des 11-cis-Retinals über die
Öffnung A sprechen, was mit früheren Zuordnungen übereinstimmen würde (Hildebrand
et al. 2009, Wang und Duan 2011). Dagegen sprechen aber die Ergebnisse der Mutationen
der Phenylalanin-Seitenketten (Phe208, Phe273 und Phe276) an der Öffnung B. Die
Mutationen zum hydrophoben Leucin oder neutralen Glutamin zeigten, dass die
Aufnahme des 11-cis-Retinals ebenso wie bei den Thr289-Mutationen verlangsamt
war und die erwartete beschleunigte Abgabe des all-trans-Retinals nicht auftrat
(Abb. 3.13).
Die Mutanten der Phe293 (Öffnung A) zeigten weder einen Einfluss auf die
Aufnahme noch auf die Abgabe des Liganden. Diese Aminosäureseitenkette zeigt
zwar die größten konformationellen Änderungen zwischen der Rhodopsin- und aktiven
Opsinstruktur (Park et al. 2008), könnte aber durch seine auswärts gerichtete Lage in
4 DISKUSSION
120
Detergenz sehr flexibel sein, wodurch Mutationen an dieser Stelle die Rezeptorstruktur
und –funktion nicht beeinflussen.
Dadurch, dass Mutationen am Phe293 (Öffnung A) keine Effekte auf die
Retinalaufnahme und –abgabe hatten, Mutationen am Thr289 (Öffnung A)
ausschließlich Effekte auf die Retinalaufnahme zeigten und Mutationen am
Phenylalaninring (Phe208, Phe273 und Phe276), die die Öffnung B erweitern sollten,
keine Effekte auf die Abgabe des Retinals hatten, aber die Aufnahme verlangsamten,
können die einzelnen Mutationen nicht als lokale Sonden interpretiert werden, und
daher kann auch keine Aussage über die Richtung der Retinalpassage gemachen
werden.
Die Retinalaufnahme- und –abgabekinetiken aller Mutanten dieser
Untersuchung zeigten, dass die Mutationen nicht begrenzt auf ihre lokale Umgebung
im Protein wirken. Die Mutationen der Seitenketten des Ligandenkanals stören eher
ein Netzwerk innerhalb des Proteins, was weitreichende Effekte auf die gesamte
Funktion und Struktur des Rezeptors hat. Aufgrund dessen, dass die Effekte mit
zunehmender Nähe zur Bindungstasche immer größer werden, könnte hier der
Mittelpunkt dieses Netzwerks angenommen werden.
4.3.3 Die Retinalpassage ist unidirektional
In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass die Aufnahme des 11-cis-Retinals
durch Opsin (Bildung von Rhodopsin) nahezu irreversibel ist, da das intramolekulare
Wasserstoffbrückennetzwerk die thermische Retinalisomerisierung sowie die
Schiff’sche Base-Hydrolyse verhindert und demzufolge den lichtsensitiven Zustand
des Rhodopsins stabilisiert (Liu et al. 2011a, Liu et al. 2011b). Mit anderen Worten, wenn
nach der Bildung der 11-cis-Retinyliden-Schiff’schen Base die strukturellen
Änderungen zum Rhodopsin erfolgen und der Rezeptor sich wie eine „Mausefalle“
schließt, ist die Abgabe von 11-cis-Retinal bzw. der Austausch durch ein anderes
Retinal extrem langsam (in Froschstäbchenzellen ca. 10
-7 s-1 pro Rhodopsin,
Defoe und Bok 1983).
Für einen unidirektionalen Weg der Retinalpassage (Heck et al. 2003b,
Hildebrand et al. 2009, Schädel et al. 2003) spricht, dass die meisten Mutationen (Öffnung A
und B) dieser Studie unterschiedlich starke Effekte auf die Aufnahme und Abgabe des
Retinalliganden haben. Würden beide Retinale nur durch eine der beiden Öffnungen
aufgenommen und abgegeben werden, dann wären Effekte der Mutationen
mehrheitlich auf einer Seite des Ligandenkanals zu erwarten (Öffnung A oder B). In
einigen Fällen war außerdem die Aufnahme verlangsamt, die Abgabe aber
4 DISKUSSION
121
beschleunigt (Abb. 3.13, T94A (Öffnung A) und V204F (Öffnung B)), was zeigt, dass
eine einzelne Mutation die Aufnahme des 11-cis-Retinals anders beeinflusst als die
Abgabe des all-trans-Retinals. Alles zusammen spricht also dafür, dass die Aufnahme
und Abgabe des Retinals nicht durch die selbe Öffnung erfolgt und deshalb ein
unidirektionaler Weg für die Retinalpassage angenommen werden kann.
4.3.4 Die Aufnahme des inversen Agonisten 11-cis-Retinal benötigt die
aktive Rezeptorkonformation
Die Regeneration des Rhodopsins beinhaltet die Aufnahme und richtige
Positionierung des 11-cis-Retinals in der Bindungstasche, die Protonierung der
Schiff’schen Base und wird durch die konformationelle Änderung der Rezeptorstruktur
zum lichtsensitiven Zustand abgeschlossen.
Die Untersuchung der Bindung des CTα-Peptids (hochaffines C-terminales
Ende des Gtα-Proteins) an Opsin zeigte, dass Opsin durch die Bindung in einer
aktiven Konformation gehalten werden kann (Opsin*) (Abschnitt 4.4)
(Vogel und Siebert 2001). Des Weiteren wurde gezeigt, dass durch einen niedrigen pH-
Wert eine höhere Menge Opsin* vorliegt (Vogel und Siebert 2001). Damit ist nachgewiesen,
dass mindestens zwei Opsinspezies (Opsin und Opsin*) existieren und im
Gleichgewicht vorliegen. Dieses Gleichgewicht kann durch die Bindung des CTα-
Peptids, den pH-Wert und weitere Faktoren beeinflusst werden. Der Vergleich der
Strukturen von Rhodopsin und Opsin* legt nahe (Palczewski et al. 2000, Park et al. 2008),
dass durch die Neuausrichtung der TM5 und TM6 im aktiven Zustand (Opsin*) die
Rotation der Seitenketten hervorgerufen wird, wodurch die Öffnung B des
Retinalkanals entsteht (Abb. 3.6). Die Öffnung A muss dagegen ausschließlich durch
Rotation der Aminosäureseitenketten entstehen, weil keine Bewegung der TM1 und
TM7 erkennbar ist (Abb. 3.6). In dieser Arbeit wird nun vermutet, dass der
Ligandenkanal nur in der aktiven Konformation des Rezeptors existiert, was bedeuten
würde, dass sich die beiden Opsinspezies strukturell unterscheiden. Die aktive
Opsinkonformation weist den geöffneten Ligandenkanal auf, wohingegen die inaktive
Konformation mehr der des Rhodopsins entspricht und eine von der
Rezeptorumgebung abgeschlossene Bindungstasche besitzt.
Die Regeneration im Wildtyp des Rhodopsins ist langsam, kann aber durch die
Erhöhung der Menge an 11-cis-Retinal bis zur hyperbolischen Sättigung beschleunigt
werden. Das bedeutet, dass das Retinal in einem Vorgleichgewicht an Opsin bindet
und anschließend ein nahezu irreversibler Übergang in den Rhodopsindunkelzustand
4 DISKUSSION
122
erfolgt (Matsumoto und Yoshizawa 1975, 2008). Die einfachste Erklärung dieses
Mechanismus wäre, dass der Ligandenkanal sowohl im inaktiven (Opsin) als auch im
aktiven Opsin (Opsin*) geöffnet ist und ein Vorgleichgewicht die Menge des Retinals
innerhalb und außerhalb der Bindungstasche bestimmt. Andererseits ergaben die
Untersuchungen an intakten Stäbchenzellen, dass die exogene Zugabe von
11-cis-Retinal zu einer transienten Aktivierung der Phototransduktionskaskade führt
(Kefalov et al. 2001). Diese Ergebnisse werden durch Kefalov und Kollegen so
interpretiert, dass, bevor Rhodopsin gebildet wird, 11-cis-Retinal nichtkovalent mit
ligandenfreiem Opsin interagiert und es dadurch aktiviert. Die Aufnahme des
11-cis-Retinals zur Regeneration des Rhodopsins setzt also die aktive
Opsinkonformation voraus.
Es stellt sich die Frage, ob 11-cis-Retinal den im Gleichgewicht vorliegenden
Anteil an aktiviertem Opsin benötigt, um aufgenommen werden zu können
(Conformational-Selection) oder ob es die aktive Opsinkonformation selbst induziert
(Induced-Fit) (vgl. Hammes et al. 2009). Da aber unter physiologischen Bedingungen nur
ca. 0,1 % des Opsins in aktivem Zustand vorliegt (Vogel und Siebert 2001) und dadurch
die Regeneration über den Conformational-Selection-Mechanismus extrem langsam
wäre, kann von einem Induced-Fit-Mechanismus ausgegangen werden.
Die Aufnahme des 11-cis-Retinals kann aber nicht ausschließlich über das
11-cis-Retinal-induzierte Opsin*/Opsin-Gleichgewicht gesteuert werden, da die
Verschiebung des Gleichgewichts zu Opsin* durch die Anwesenheit des CTα-Peptids
zu keiner Beschleunigung der Regeneration führte (Abb. 3.19a). Das würde bedeuten,
dass ein weiterer regulatorischer Mechanismus existieren muss, der neben der
benötigten aktiven Opsinkonformation die Aufnahme des 11-cis-Retinals steuert.
Diese Rolle könnte die Kanalengstelle am Lys2967.43 spielen (nahe der Öffnung A), die
durch die Aminosäureseitenkette des Tyr2686.51 gesteuert werden könnte. Die
Mutation des Tyr2686.51 zu Phenylalanin, bei dem die Hydroxylgruppe an der
aromatischen Seitenkette fehlt, führte zu einer stark verlangsamten Aufnahme des
11-cis-Retinals (Abb. 3.13). Der gleiche Effekt konnte beim Austausch des Tyr2686.51
durch Glutaminsäure beobachtet werden, die zwar eine Hydroxylgruppe besitzt, aber
über keinen Benzolring verfügt (Abb. 3.13). Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Kombination aus Hydroxylgruppe und Benzolring (Tyrosinseitenkette) bei der
regulatorischen Aufgabe des Tyr2686.51 während der Regeneration entscheidend ist.
Durch das Entfernen eines der beiden wird eine Interaktion zwischen Lys2967.43 und
Tyr2686.51 nicht mehr möglich. Kann Lys2967.43 keine Wasserstoffbrückenbindung zum
Tyr2686.51 aufbauen, bleibt Lys296
7.43 ein Teil des Ser186
EL2-Glu181EL2-Netzwerkes,
4 DISKUSSION
123
wodurch diese Engstelle den Ligandenkanal blockiert und das Retinal seine
Bindungsstelle nicht erreicht. Ausschließlich die Rotamerstellung des Lys2967.43, die
eine Wasserstoffbrückenbindung zum Tyr2686.51 zulässt, öffnet einen kontinuierlichen
Kanal (Hildebrand et al. 2009). Die Änderung der Rotamerstellung des Lys2967.43 und somit
die Erweiterung der Engstelle 1 könnte durch 11-cis-Retinal induziert werden,
wodurch dieses seine eigene Aufnahme steuern würde.
Die durch 11-cis-Retinal induzierte Gleichgewichtsverschiebung auf Opsin*
könnte die erste Stufe des Aufnahmeprozesses sein, gefolgt von dem, durch
11-cis-Retinal induzierten, Öffnen der sogenannten Lys296-Schranke. Da bei diesem
Prozess keine Kompetition mit all-trans-Retinal auftritt, muss davon ausgegangen
werden, dass die Affinität des 11-cis-Retinals für die Lys2967.43-Bindungsstelle um ein
Vielfaches höher ist als die des all-trans-Retinals oder dass all-trans-Retinal durch die
Öffnung B entweicht, ohne eine kovalente Verknüpfung im Protein auszubilden.
4.3.5 Die Abgabe des Agonisten all-trans-Retinal wird durch die
Hydrolyse der Retinyliden-Schiff’schen Base bestimmt
Die Geschwindigkeit des lichtinduzierten Meta II-Zerfalls wird durch die
Hydrolyse der Retinyliden-Schiff’schen Base und die Abgabe des all-trans-Retinals
durch das Opsinmolekül bestimmt (Farrens und Khorana 1995). Die anfängliche Annahme,
dass die Mutationen der im Ligandenkanal lokalisierten Aminosäuren entweder zu
einer Verengung oder Aufweitung des Kanals und demnach zu einer veränderten
Meta II-Zerfallsgeschwindigkeit führen könnten, konnte durch diese Arbeit nicht
bestätigt werden. Wie können also die verschiedenen Meta II-Zerfallsraten durch die
Mutationen erklärt werden?
Hydroxylamin ersetzt Wasser in der Spaltungsreaktion der Schiff’schen Base
und beschleunigt den Meta II-Zerfall. Die Aminolyse der Schiff’schen Base folgt einem
bimolekularen Reaktionsschema (Hofmann et al. 1983) mit einer hyperbolischen
Sättigungskurve (Abb. 3.4). Die Zerfallsreaktion in Anwesenheit von HA wird um das
bis zu 300-fache beschleunigt (Abb. 3.4), was zeigt, dass die Abgabe des gebildeten
Retinaloxims sehr schnell erfolgt, sobald die Schiff’sche Base gespalten ist. Das wird
durch die Mutation der Lys296 zu Glycin und die Verwendung eines n-Propyl-
Retinylidens (PrSB) anstelle des Retinals bestätigt. Da in diesem Fall keine kovalente
Verknüpfung des n-Propyl-Retinylidens zum Apoprotein besteht, muss auch keine
Hydrolyse stattfinden, damit das n-Propyl-Retinyliden das Protein verlassen kann. Die
Abgabe des n-Propyl-Retinylidens durch die K296G-Mutante ist um das 400-fache
beschleunigt (Abb. 3.15) (Matsuyama et al. 2010), was dem Meta II-Zerfall des Wildtyps
4 DISKUSSION
124
unter sättigenden HA-Bedingungen entspricht. Diese Ergebnisse unterstützen die
Annahme, dass im Wildtyp die Hydrolyse der Schiff’schen Base der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt des Meta II-Zerfalls ist (Janz und Farrens 2001).
In der definierten Umgebung der Schiff’schen Base führen Änderung in der
Bindungstasche zu Störungen der Lage des Retinals und Lys296, was Effekte auf die
Hydrolysereaktion hat. Diese Änderungen in der Bindungstasche durch den Austausch
einer Aminosäure können über die Proteinstruktur oder über den Liganden selbst die
Umgebung der Schiff’schen Base stören.
Die Ergebnisse der Untersuchung des Meta II-Zerfalls der Mutanten in An- und
Abwesenheit des HA zeigen, dass das Wirkungsprofil des Meta II-Zerfalls der
Mutanten erhalten bleibt, wobei in Anwesenheit des HA die Gesamtreaktion schneller
abläuft (Abb. 3.14a). Diese Beobachtung führt zu dem Schluss, dass der initiale
bimolekulare Schritt durch die Mutationen beeinflusst wird. Dieser initiale bimolekulare
Schritt führt zur Bildung der Carbinolaminzwischenstufe im Meta II, gefolgt von der
Spaltung der all-trans-Retinyliden-Bindung (im Fall des HA als Nukleophil ist Aminal
die entsprechende Zwischenstufe bei der Aminolyse mit Oxim als Produkt) (Abb. 4.2).
Die Schiff’sche Base und das Nukleophil (Wasser oder Hydroxylamin) nehmen als
Reaktionspartner an dieser bimolekularen Reaktion teil. Das Hydroxylamin erhöht die
Wirksamkeit des nukleophilen Angriffs, worin die beschleunigte Abgabe des Retinals
begründet liegt (Abb. 3.14). Durch mutationsbedingte Änderungen der Proteinstruktur
kann es zu einer Änderung der Umgebung der Schiff’schen Base kommen. Dadurch
wird der nukleophile Angriff beeinflusst, was sich im gleichen Wirkungsprofil des
Meta II-Zerfalls der Kanalmutanten mit und ohne HA widerspiegelt.
Die Lage des Meta I/Meta II-Gleichgewichts liegt auf der Seite des Meta II. Die
im Meta II deprotonierte Schiff’sche Base wird in der Bindungstasche durch die
Protonierung des Gegenions (Glu1133.28) stabilisiert. Die Aufnahme des Nukleophils
Abbildung 4.2: Hydrolyse der deprotonierten Retinyliden-Schiff’schen Base (deprot. SB). Die
deprotonierte SB liegt im Meta II vor und ist Voraussetzung für die Hydrolyse der SB. Die Hydrolyse der
deprot. SB erfolgt über die Bildung der Carbinolaminzwischenstufe durch Bindung von Wasser (H2O) aus
der SB-Umgebung, gefolgt von der Spaltung der Retinyliden-Bindung, wodurch Retinal sich zwar noch
in der Bindungstasche befindet, aber nicht mehr kovalent mit dem Lys2967.43 im Opsin verknüpft ist.
Danach verlässt das Retinal das Opsin.
4 DISKUSSION
125
(Wasser oder Hydroxylamin) führt zu einer instabilen Carbinolaminzwischenstufe der
Retinyliden-Bindung, die durch die Spaltung der Retinyliden-Bindung ins
Opsin*all-trans-Retinal-Addukt übergeht (Abb. 4.2). Da die
Carbinolaminzwischenstufe instabil ist, existiert sie im Gegensatz zur stabilisierten,
deprotonierten Schiff’schen Base des Meta II in einer sehr niedrigen Konzentration.
Weil die Hydrolyse der Schiff’schen Base diese Zwischestufe überwinden muss, wird
die Gesamtgeschwindigkeit des Meta II-Zerfalls durch die Menge an Carbinolamin
bestimmt.
Es stellt sich aber noch die Frage, warum der Austausch einer
Aminosäureseitenkette in der Nähe der Öffnungen, relativ weit entfernt von der
Schiff’schen Base, Effekte auf ihre Bildung und Hydrolyse hat. Ein Beispiel für eine
solche Aminosäure ist Ala272, die sich an der TM6 in der Nähe des retinalen
β-Iononrings innerhalb der Bindungstasche befindet. Der Austausch dieser
Aminosäure durch Aminosäuren mit größeren Seitenketten sollte den Ligandenkanal
im Bereich der Öffnung B verengen und somit die Abgabegeschwindigkeit des
all-trans-Retinals verlangsamen. Der Austausch durch ein leicht größeres Valin führte
aber zu einer schnelleren Abgabe des Retinals (4,2-fach), das noch größere Isoleucin
zeigte eine um das 14-fache beschleunigte Abgabe, wohingegen das große und starre
Phenylalanin keinen Effekt auf die Retinalabgabe hatte. Die Aufnahme des
11-cis-Retinals durch diese drei Mutanten war dagegen generell verlangsamt und
zeigte mit zunehmender Größe der ausgetauschten Seitenkette eine stärkere
Reduzierung der Regenerationsgeschwindigkeit (Abb. 3.13a). Die Aminosäure befindet
sich in unmittelbarer Nähe zum β-Iononring des Retinals. Das könnte bedeuten, dass
der Einbau einer größeren Aminosäureseitenkette die Lage des Retinals innerhalb der
Bindungstasche stört. Das spiegelt sich auch in der Regenerationsgeschwindigkeit
dieser Mutanten wider. Je größer die Seitenkette ist, desto langsamer ist die
Regeneration, weil es schwieriger für das Retinal ist, seine richtige Position in der
Bindungstasche zu finden, um die Bildung der Schiff’schen Base zu ermöglichen. Die
beschleunigte Abgabe des Retinals durch die A272-Mutanten lässt sich ebenfalls
durch die gestörte Positionierung des Retinals erklären. Das Retinal überträgt über
seine Polyenkette die gestörte Positionierung seines β-Iononrings auf die Umgebung
der Schiff’schen Base (Gegenion und gesamtes Wassernetzwerk innerhalb der
Bindungstasche) und könnte somit Einfluss auf die Hydrolysereaktion haben. Ähnliche
Ergebnisse zeigten auch die Untersuchungen der Glu122Gln- und Ile189Pro-Mutanten
(Imai et al. 1997, Kuwayama et al. 2002). Die beiden Seitenketten Glu122 und Ile189 im Opsin
der Stäbchenzellen sind in den grünen Pigmenten der Zapfenzellen durch Glutamin
4 DISKUSSION
126
und Prolin ersetzt und bestimmen die Unterschiede in der Geschwindigkeit der
Regeneration und des Meta II-Zerfalls zwischen Rhodopsin und dem
Zapfenzellenpigment. Der Austausch von Glu122 durch das im Pigment der grünen
Zapfenzellen zu findende korrespondierende Glutamin führte zu einem 20-fach
schnelleren Meta II-Zerfall (Imai et al. 1997). Der Austausch von Ile189 durch das
ebenfalls im Pigment der grünen Zapfenzellen zu findende korrespondierende Prolin
führte zu einem zweifach schnelleren Meta II-Zerfall (Kuwayama et al. 2002). Diese beiden
Seitenketten befinden sich wie die Ala272-Seitenkette in der Nähe des retinalen β-
Iononrings und bestätigen, dass die Positionierung des Retinals innerhalb der
Bindungstasche Einfluss auf die Hydrolysereaktion hat.
Diese sehr komplexen Anforderungen an die Positionierung der Seitenketten
und Reaktionspartner zur Bildung oder Hydrolyse der Schiff’schen Base sind
vermutlich auch bei anderen Kanalmutanten gestört und zeigen, dass die Aufnahme
und Abgabe des Retinalliganden ein sehr fein abgestimmtes Wechselspiel zwischen
Rezeptor und Ligand benötigt.
4.3.6 Ein hypothetischer Wasserkanal könnte mit dem Ligandenkanal
funktionell gekoppelt sein
Es konnte gezeigt werden, dass die Hydrolysereaktion exogenes Wasser
benötigt und dass das Nukleophil von der cytoplasmatischen Seite in den Rezeptor
eindringen kann (Jastrzebska et al. 2011). Es wird daher vermutet, dass ein Wasserkanal
existiert, der die cytoplasmatische Umgebung des Rezeptors mit der
Retinalbindungstasche im aktiven Opsinmolekül (Opsin*) verbindet und den Zugang
der Nukleophile vermittelt (Abb. 4.3 und Abschnitt 4.2) (Angel et al. 2009,
Jastrzebska et al. 2011, Piechnick et al. 2011
). Die Ergebnisse dieser Dissertation lassen
vermuten, dass dieser Wasserkanal funktionell mit dem Ligandenkanal gekoppelt ist,
da Mutationen im Ligandenkanal die Geschwindigkeit der wasserinduzierten
Hydrolyse der Schiff’schen Base und die darauffolgende Abgabe des Retinals
beeinträchtigen können.
Indizien für einen Wasserkanal sind in den unterschiedlichen Wirkungsprofilen
des Meta II-Zerfalls einiger Kanalmutanten (M44F, S186A und A292V/F) in An- und
Abwesenheit von Hydroxylamin (HA) oder o-Methyl-Hydroxylamin (MHA) zu finden.
Diese Mutationsstellen befinden sich in unmittelbarer Nähe zur Schiff’schen Base.
4 DISKUSSION
127
Die Mutation der Met44 zu Phenylalanin zeigte eine beschleunigte Hydrolyse in
Abwesenheit eines Hydroxylamins. Die Anwesenheit von HA oder MHA führte aber zu
einem weniger starken (MHA) oder überhaupt keinem (HA) Effekt auf den Meta II-
Zerfall der Mutante im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 3.14). Das bedeutet, dass die
beschleunigte Hydrolyse mit Wasser durch eine bessere Zugänglichkeit der
Retinyliden-Schiff’schen Base für Wasser erklärt werden kann. Der aufgehobene
Effekt gegenüber der Kontrolle in Anwesenheit von HA zeigt, dass die Zugänglichkeit
für HA nicht der geschwindigkeitsbestimmende Schritt war. Der weniger starke Effekt
auf die Hydrolyse der Schiff’schen Base in Bezug zur Kontrolle in Anwesenheit von
MHA bestätigt diese Aussage. Das bedeutet, dass die Aminosäure Met44 Teil des
hypothetischen Wasserkanals sein könnte und Änderungen an dieser die
Zugänglichkeit für Wasser erhöhen, wodurch die Hydrolyse der Schiff’schen Base
beschleunigt wird.
Das Zusammenspiel aller Faktoren des Meta II-Zerfalls ist sehr komplex.
Allgemein kann aber gesagt werden, dass die Zugänglichkeit der Bindungstasche für
Wasser oder HA mitbestimmend für die Geschwindigkeit der Hydrolyse ist. Verändern
Mutationen diese Zugänglichkeit, dann hat das Einfluss auf die durch das Nukleophil
induzierte Spaltung der Schiff’schen Base.
Abbildung 4.3: Hypothetischer Liganden- (links) und Wasserkanal (rechts). Die computergestützte
Berechnung der Oberfläche der Meta II-Kristallstruktur (PDB: 3PXO) verdeutlichte den Ligandenkanal
(links), den hypothetischen Wasserkanal (rechts), sowie die Verknüpfung beider Kanäle im Bereich der
Bindungstasche. Die rechte Meta II-Struktur (Wasserkanal) ist um ca. 90 ° in ihrer Längsachse gedreht.
Die elektrostatischen Oberflächenpotentiale der Meta II-Struktur sind mit ±30 kT/e negativ (rot) und
positiv (blau) geladenen Oberflächenarealen konturangepasst und verdeutlichen die polaren und
unpolaren Regionen des Proteins. Die Abbildung wurde mit der PyMol-Software (www.pymol.org)
erstellt.
4 DISKUSSION
128
4.3.7 Detailliertes Schema der Aufnahme und Abgabe des
Retinalliganden
In dieser Arbeit wird postuliert, dass der inaktive Opsinzustand (Opsin) mit
einem geschlossenen Retinalkanal korreliert, während die aktive Opsinkonformation
(Opsin*) den geöffneten Retinalkanal präsentiert. In diesem Zusammenhang ist der
Kanal ausschließlich im Rhodopsin (11-cis-Retinyliden-Opsin) und in der inaktiven
ligandenfreien Konformation des Opsins geschlossen. Die anderen Zustände des
Opsins weisen als aktive Konformation den geöffneten Retinalkanal auf. Der Prozess
des Öffnens und Schließens des Kanals wird durch das Umschalten zwischen der
Opsin- und Opsin*-Konformation gesteuert. Zu welchem Zeitpunkt nach der
Lichtaktivierung der Rhodopsinstruktur der Ligandenkanal geöffnet wird, kann nicht
gesagt werden. Es ist aber bekannt, dass der Ligandenkanal im Meta II-Zustand
existiert (Choe et al. 2011). Sobald der Kanal durch die Bildung der aktiven Konformation
geöffnet ist, bestimmt die Bildung und Hydrolyse der Schiff’schen Base die
Geschwindigkeit der Regeneration des Rhodopsins und des Meta II-Zerfalls. Die
lokalen Eigenschaften der Öffnungen spielen bei diesen beiden Prozessen
(Regeneration und Meta II-Zerfall) eine untergeordnete Rolle. Um diese
Beobachtungen beschreiben zu können, wurde ein detailliertes Schema erstellt, in
dem postuliert wird, dass ausschließlich die Opsin- und Opsin*-Konformation des
Apoproteins existieren. Das lichtsensitive Rhodopsin und das aktive Meta II
beschreiben die durch 11-cis- und all-trans-Retinal stabilisierten Formen des inaktiven
und des aktiven Opsins.
Beide Prozesswege (Regeneration und Meta II-Zerfall) basieren auf einem
Umschalten zwischen der Opsin- und Opsin*-Konformation und ihren
ligandenstabilisierten Formen (Rhodopsin und Meta II). Die Regeneration des
Rhodopsins verläuft über eine Sequenz von zwei Schaltern. Der erste Schalter
beschreibt die Konformationsänderung von Opsin zu Opsin*, wodurch der
Ligandenkanal geöffnet wird. Der zweite Schalter beschreibt die Bildung der inaktiven
Rhodopsinkonformation durch die Aufnahme von 11-cis-Retinal über den
Ligandenkanal des Opsin* (Opsin* zu Opsin-11-cis-Retinal). Der Meta II-Zerfall
hingegen erfolgt nur über einen Schalter, der das Umschalten von
Opsin*-all-trans-Retinal zum inaktiven Opsin beschreibt.
4 DISKUSSION
129
Die Absorption eines Photons durch das Rhodopsin (Opsin-11-cis-Retinal)
führt zur Bildung von Meta II (Opsin*-all-trans-Retinal), wodurch der
Aktivierungs-/Deaktivierungskreislauf geschlossen wird. In diesem Fall wird die aktive
Opsin-Konformation durch die Isomerisierung des 11-cis-Retinals zu all-trans-Retinal
induziert. Durch diese Retinalisomerisierung wird ein Teil der Lichtenergie in der
verdrehten Konformation des all-trans-Retinyliden-Lys2967.43 gespeichert und
anschließend über die Retinaltranslation in Richtung TM5 auf das Apoprotein
übertragen (Li et al. 2004, Vogel et al. 2007, Ye et al. 2010). Durch das Umschalten diverser
Schalter (Motive) innerhalb des Proteins wird die aktive Konformation des Apoproteins
erzeugt und stabilisiert (Übersicht: Hofmann et al. 2009). Die Deprotonierung der
Schiff’schen Base durch die Verlagerung einen H+ auf das Gegenion Glu113
3.28
(Arnis et al. 1994, Arnis und Hofmann 1993, Okada et al. 2001) sorgt für eine Stabilisierung der
Meta II-Konformation, bevor die Schiff’sche Base im Meta II langsam hydrolysiert wird
und das all-trans-Retinal das aktive Apoprotein verlässt.
Beide Isomere (11-cis- und all-trans-Retinal) können über den Kanal der
Opsin*-Konformation in den Rezeptor eindringen und eine kovalente Verknüpfung mit
Abbildung 4.4: Aktivierungs-/Deaktivierungskreislauf des Rhodopsins. Im Meta II ist der Ligand
all-trans-Retinal kovalent an das Lys296 (K) des Opsinapoproteins durch eine deprotonierte
Schiff’sche Base (SB) gebunden. Der Zerfall von Meta II (oben) umfasst die Hydrolyse der
Schiff’schen Base über eine Carbinolaminzwischenstufe (CA), was zur Bildung eines nichtkovalenten
Opsin*all-trans-Retinal-Addukts und zu einer mögliche Abgabe des Retinals aus der Bindungstasche
führt. Die Regeneration des Rhodopsins (unten) startet mit der Aufnahme des 11-cis-Retinals durch das
Opsin*, entweder durch die Bindung an ein bereits existierendes Opsin* (Conformational-Selection) oder
durch die Interaktion mit Opsin (Induced-Fit). Die Rezeptor-Ligand-Interaktion innerhalb des
nichtkovalenten Opsin*11-cis-Retinal-Addukts steuert die Bildung der deprotonierten
11-cis-Retinyliden-Schiff’schen Base des lichtsensitiven Rhodopsins. Die Bildung der Schiff’schen Base
erfolgt über eine Carbinolaminzwischenstufe und die Abgabe von Wasser. Beide Prozesswege sind vom
Umschalten zwischen der aktiven (rot) und inaktiven (blau) Rezeptorkonformation abhängig. Die
Absorption eines Lichtphotons (hν) schließt den Kreislauf durch Bildung des Meta II aus Rhodopsin.
4 DISKUSSION
130
dem Lys2967.43 eingehen (Choe et al. 2011), aber nur 11-cis-Retinal kann in der
Bindungstasche eine Konformationsänderung auslösen („Mausefalle“). Das heißt, dass
unmittelbar nach der Verknüpfung des 11-cis-Retinals mit dem Lys2967.43 die
Translokation eines H+ vom Glu1133.28 zur Schiff’schen Base erfolgt. Dadurch wird die
Schiff’sche Base protoniert und bildet zum jetzt negativ geladenen Glu1133.28 eine
Salzbrücke aus. Die zusätzliche Bewegung weiterer negativ geladener und polarer
Aminosäurereste näher an die protonierte Bindung heran (Palczewski et al. 2000), zwingt
das Molekül zur Bildung des lichtsensitiven Rhodopsins. Dieses Betätigen der
„Mausefalle“ verhindert durch die Stabilisierung der protonierten Schiff’schen Base
den Verlust an transient hydrolysierbarem 11-cis-Retinal (Janz und Farrens 2003) und
macht dadurch die Bildung des Rhodopsins irreversibel.
Der Ligandenkanal hat also die Aufgabe, die Bildung der Carbinolamine
(11-cis- und all-trans-Carbinolamin) und somit die Bildung der zwei Addukte
Opsin*11-cis-Retinal und Opsin*all-trans-Retinal zu kontrollieren (Abb. 4.4). Bei
beiden Addukten kann davon ausgegangen werden, dass sich das Retinal noch nicht
oder nicht mehr in seiner vorgesehenen Lage in der Bindungstasche befindet.
4.4 Aktiviertes Opsin als Rezeptor für diffusible Liganden
Die strukturellen Änderungen, die bei der Aktivierung des Rhodopsins
auftreten, sind ähnlich zu anderen GPCRs seiner Klasse (Hofmann et al. 2009). Der
Mechanismus, der diese Änderungen induziert, unterscheidet aber das Rhodopsin von
den vielen anderen GPCRs. Die Isomerisierung des kovalent mit dem Rezeptorprotein
verknüpften 11-cis-Retinalliganden durch die Absorption eines Photons führt zur
all-trans-Retinal-vermittelten Stabilisierung der aktiven Konformation (Meta II) des
Rhodopsins. Das Rhodopsin wird ausschließlich über die Isomerisierung des kovalent
gebundenen 11-cis-Retinals aktiviert. Die große Mehrheit der anderen GPCRs wird
durch die Diffusion eines Liganden in den ligandenfreien Rezeptor aktiviert, wobei
keine kovalente Verknüpfung zwischen Ligand und Rezeptor auftritt.
In diesem Abschnitt soll gezeigt werden, dass das Opsinmolekül unter
bestimmten Bedingungen den Agonisten, der die aktive Konformation stabilisiert
(all-trans-Retinal), reversibel aufnehmen kann und dass eine kovalente Verknüpfung
zwischen Ligand und Apoprotein ausgebildet wird.
4 DISKUSSION
131
4.4.1 Das Gleichgewicht zwischen aktivem und inaktivem Opsin
steuert die reversible Aufnahme des Agonisten all-trans-Retinal
Ligandenfreies Opsin existiert, wie alle GPCRs, in einer aktiven (Opsin*) und
einer inaktiven (Opsin) Konformation. Das Gleichgewicht zwischen Opsin* und Opsin
kann unter anderem durch die Verringerung des pH-Wertes und durch die
Anwesenheit von Detergenz in Richtung Opsin* verschoben werden (Scheerer et al. 2008,
Vogel und Siebert 2001). Es ist bekannt, dass bei Opsin in Diskmembranen unter
physiologischem pH-Wert die Zugabe von all-trans-Retinal zu keiner Behinderung der
Regeneration führt (Heck et al. 2003b). Das heißt, dass die Aufnahme von 11-cis-Retinal
und Bildung des lichtsensitiven Rhodopsins durch die Anwesenheit von
all-trans-Retinal nicht beeinträchtigt wird. Aus diesem Grund kann gesagt werden,
dass keine reversible Aufnahme des all-trans-Retinals mit Ausbildung einer kovalenten
Verknüpfung erfolgt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass all-trans-Retinal die
Regeneration auch dann nicht beeinträchtigt, wenn die Untersuchung in
membranfreier Detergenzlösung durchgeführt wird (Abb. 3.19a). Die Verschiebung des
Opsin*/Opsin-Gleichgewichts in Richtung der aktiven Opsin*-Konformation durch das
CTα-Peptid (Vogel und Siebert 2001) führte zu einer Blockierung der Regeneration eines
Teils der Rhodopsinmoleküle durch das all-trans-Retinal (Abb. 3.19a). In Kombination
mit den Ergebnissen aus den Abbildungen 3.17 und 3.18a kann gesagt werden, dass
all-trans-Retinal reversibel durch das aktive Opsin aufgenommen werden kann und in
der Retinalbindungstasche mit dem Lys2967.43 eine Schiff’sche Base ausbildet. Die
Aufnahme des all-trans-Retinals könnte ebenso wie die Aufnahme des 11-cis-Retinals
durch den hypothetischen Ligandenkanal erfolgen.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Opsin im inaktiven Zustand
hochspezifisch für 11-cis-Retinal ist, sobald aber Opsin im aktiven Zustand gehalten
wird, besteht auch für all-trans-Retinal die Möglichkeit, eine kovalente Retinyliden-
Lys296-Verknüpfung mit dem Apoprotein auszubilden. Die all-trans-Retinyliden-
Lys296-Verknüpfung ist im Vergleich zur 11-cis-Retinyliden-Lys296-Verknüpfung
reversibel, da all-trans-Retinal die „Mausefalle“ zur irreversiblen Bildung von
Rhodopsin nicht auslösen kann (Janz und Farrens 2003, Palczewski et al. 2000).
4 DISKUSSION
132
4.4.2 Das kubisch-ternäre Komplexmodell beschreibt die reversible
Aufnahme des Agonisten in Abhängigkeit vom Opsin*/Opsin-
Gleichgewicht und vom CTα-Peptid
Die kooperative Interaktion zwischen dem aktiven bzw. inaktiven Rezeptor,
dem G-Protein und dem Agonisten wird durch das kubisch-ternäre Komplexmodell
beschrieben (Weiss et al. 1996). In diesem spezifischen Fall soll die Interaktion zwischen
aktivem Opsin (bzw. inaktivem Opsin), CTα-Peptid und all-trans-Retinal durch das
Modell beschrieben werden. Dieses Modell ist für die Untersuchung der Interaktion
von Opsin mit all-trans-Retinal und CTα-Peptid anwendbar, da das Opsin zwei
getrennte Bindungsstellen für all-trans-Retinal und CTα-Peptid besitzt, das Opsin in
aktivem und inaktivem Zustand existiert und die Interaktionen zwischen den
Opsinzuständen, all-trans-Retinal und CTα-Peptid dem Massenwirkungsgesetz
unterliegen.
Um im System der gekoppelten Gleichgewichte einzelne Bindungskonstanten
bestimmen zu können, wurde einer der beiden Reaktionspartner in hoher
Konzentration vorgelegt und mit dem anderen titriert (Abb. 3.18b). Mit der Annahme,
dass eine der Reaktionen gesättigt ist, konnte die Konstante der anderen Reaktion
des Gleichgewichts isoliert werden. Es konnte nur das Produkt
Opsin*-all-trans-Retinal-CTα-Peptid experimentell nachgewiesen werden, was die
Abschätzung der einzelnen Gleichgewichtskonstanten erschwerte.
In dieser Arbeit konnten zwei Konstanten des gekoppelten
Gleichgewichtssystems abgeschätzt werden. Die erste (K
aβKG) beschreibt das
Gleichgewicht zwischen Opsin, Opsin* und Opsin*-CTα-Peptid und definiert die
Bindung des CTα-Peptids an Opsin* (βKG), wodurch das Gleichgewicht zwischen
Opsin und Opsin* (Ka) in Richtung Opsin* gezogen wird. Das Produkt der beiden
einzelnen Gleichgewichtskonstanten Ka und βKG zeigt, dass 3,25 µM CTα-Peptid
ausreichen, um die Hälfte des Opsins in die Opsin*-Konformation zu bringen
(Abb. 4.5). Die zweite Gleichgewichtskonstante (δαγKL) beschreibt das Gleichgewicht
zwischen Opsin*-CTα-Peptid und Opsin*-all-trans-Retinal-CTα-Peptid und zeigt, dass
0,922 µM all-trans-Retinal ausreichen, um die Bindungstasche in 0,5 µM
Opsin*-CTα-Peptid halbmaximal zu besetzen (Abb. 4.5b). Weil davon ausgegangen
werden kann, dass die Konformation des Opsin* in CTα-Peptid-gebundenem Zustand
dem Opsin* ohne CTα-Peptid entspricht (Park et al. 2008, Scheerer et al. 2008), kann die
Gleichgewichtskonstante δαγKL auch die Reaktion von Opsin* zu
4 DISKUSSION
133
Opsin*-all-trans-Retinal (αKL) beschreiben und somit die reversiblen Aufnahme des
Liganden.
Für alle Spezies der Ebene des aktiven Opsins (Opsin*) existieren
Kristallstrukturen (Opsin* (PDB: 3CAP), Opsin*-atR (PDB: 3PXO), Opsin*-CTα-Peptid
(PDB: 3DQB) und Opsin*-atR-CTα-Peptid (PDB: 3PQR)) (Abb. 4.5a), was dafür spricht,
dass diese Opsinkonformationen existieren und eine entscheidende Rolle im
Aktivierungsprozess des Rezeptors spielen. Des Weiteren wird die inaktive
Opsinkonformation in der Diskmembran der Photorezeptorzellen vorkommen. Die nur
in unmessbar geringer Konzentration vorliegenden Opsinkonformationen
Opsin-all-trans-Retinal, Opsin-CTα-Peptid und Opsin-all-trans-Retinal-CTα-Peptid
sind dennoch thermodynamisch möglich (Abb. 4.5a). Die reversible Aufnahme des
all-trans--Retinals durch das Opsin ermöglicht die Beschreibung der
Abbildung 4.5: Kubisch-ternäres Komplexmodell für Opsin. (a) In diesem Modell existieren drei
Ebenen des Opsinzustands. Die erste Ebene zeigt von links (inaktiv(i)) nach rechts (aktiv(a)) die
Opsinaktivierung mit jeweils vier Zuständen (Opsin allein (Opsin), Opsin mit all-trans-Retinal (Opsin-atR),
Opsin mit CTα-Peptid (Opsin-CTα-Peptid) und Opsin mit all-trans-Retinal und CTα-Peptid (Opsin-atR-
CTα-Peptid)). Die zweite Ebene zeigt die all-trans-Retinal-Bindung mit ebenfalls vier Zuständen
(Opsin-atR, Opsin*-atR, Opsin-atR-CTα-Peptid und Opsin*-atR-CTα-Peptid). Die dritte Ebene beschreibt
die CTα-Peptid-Bindung mit den vier verschiedenen Zuständen (Opsin-CTα-Peptid, Opsin*-CTα-Peptid,
Opsin-atR-CTα-Peptid und Opsin*-atR-CTα-Peptid). Ka ist als Gleichgewichtskonstante für die
Aktivierung des Opsins, KL als Gleichgewichtskonstante für die Bindung des all-trans-Retinals an das
inaktive Opsin und KG als Gleichgewichtskonstante für die Bindung des CTα-Peptids an das inaktive
Opsin definiert. Der Faktor α beschreibt den Effekt der all-trans-Retinal-Bindung auf die Aktivierung des
Opsins, der Faktor β definiert den Effekt der Opsinaktivierung auf die CTα-Peptid-Bindung, der Faktor γ
erklärt den Effekt der all-trans-Retinal-Bindung auf die CTα-Peptid-Bindung, und der Faktor δ ist eine
Größe, die den Effekt von zwei Opsinebenen zusammen auf die dritte Ebene beschreibt. Die Abbildung
stammt aus (Weiss et al. 1996) und wurde für die Untersuchung an Opsin angepasst. (b) Aus dem
kubisch-ternären Komplexmodell extrahiertes Reaktionsschema für die in dieser Arbeit untersuchten
Gleichgewichte.
4 DISKUSSION
134
Opsin*-all-trans-Retinal-Interaktionen durch das kubisch-ternäre Komplexmodell und
somit den Vergleich zu anderen GPCRs.
4.5 Die Aufnahme von 11-cis- und all-trans-Retinal könnte
über zwei verschiedene Mechanismen verlaufen
Wie schon in Abschnitt 4.3.4 beschrieben wurde, könnte das 11-cis-Retinal
seine eigene Aufnahme in das inaktive Opsinmolekül durch die Induzierung der aktiven
Opsinkonformation und durch die Änderung der Lys2967.43-Rotamerstellung steuern
(Induced-Fit). 11-cis-Retinal zeigt in Anwesenheit des CTα-Peptids keine
Beschleunigung der Regeneration (Abb. 3.19a), was auf einen mehrstufigen
sequenziellen Aufnahmeprozess hindeutet, der nicht ausschließlich von der bereits
vorhandenen Opsin*-Konformation abhängig ist. Die Steuerung der regulatorischen
Lys2967.43-Schranke durch das 11-cis-Retinal könnte die zweite Stufe des
Aufnahmeprozesses beschreiben und würde die selektive Aufnahme des
11-cis-Retinals erklären. Zur Induzierung der Opsin*-Konformation und Steuerung der
Lys296-Rotamerstellung wäre eine sekundäre Bindestelle für 11-cis-Retinal am
Opsinmolekül notwendig. Die Aufnahme des 11-cis-Retinals in die Bindungstasche
des Opsins könnte über die Öffnung A erfolgen, da in diesem Bereich des
Ligandenkanals die regulatorische Lys2967.43-Schranke lokalisiert ist. Da die Bindung
des CTα-Peptids hauptsächlich strukturelle Änderungen an der Öffnung B induziert,
die Änderungen im Bereich der Öffnung A aber minimal sind, könnte das die nicht-
beschleunigte Regeneration des Rhodopsins in Anwesenheit des CTα-Peptids
erklären, wenn die Aufnahme des 11-cis-Retinals über die Öffnung A erfolgt. Die
Aufnahme des 11-cis-Retinals endet in der irreversiblen Bildung des lichtsensitiven
Rhodopsins.
Im Gegensatz zum 11-cis-Retinal muss all-trans-Retinal auf die aktive Opsin*-
Konformation „warten“, um den geöffneten Kanal zu nutzen und eine kovalente
Retinyliden-Lys296-Schiff’sche Base-Bindung ausbilden zu können (Conformational-
Selection). Den Conformational-Selection-Mechanismus können die Messungen aus
Abbildung 3.18b (rechts) bestätigen. Je mehr Opsin* vorhanden ist, desto mehr
all-trans-Retinal kann in der Bindungstasche am Lys296 gebunden werden. Die
Aufnahme des all-trans-Retinals in equimolarer Menge Opsin* folgt einem
monoexponentiellen Verlauf (Abb. 3.17c), was für eine Reaktionsgeschwindigkeit
sprechen würde, die ausschließlich durch die Bildung der Schiff’schen Base bestimmt
wird. Die Bindung von all-trans-Retinal ist reversibel, da die Zugabe von 11-cis-Retinal
4 DISKUSSION
135
durch die irreversible Bildung des Rhodopsins zu einer Verdrängung des
all-trans-Retinals führt (Abb 3.19c). Dies spricht dafür, dass die Aufnahme des
all-trans-Retinals in das aktive Opsinmolekül über die Öffnung B erfolgt. Das könnte
die Kristallstruktur des reversibel gebildeten Meta II erklären. In dieser Struktur zeigt
das all-trans-Retinal eine Ausrichtung der Methylgruppen C16 und C17 am β-
Iononring in Richtung der cytoplasmatischen Seite (Choe et al. 2011), wohingegen das
11-cis-Retinal in der Rhodopsinstruktur diese Methylgruppen in Richtung
extrazellulärer Seite präsentiert (Okada et al. 2004, Palczewski et al. 2000). Da für die
Signalübertragung vom Retinal zum Protein das Retinal relativ fixiert in der
Bindungstasche liegen muss, ist es wahrscheinlich, dass eine Drehung des Retinals
innerhalb der Bindungstasche nicht möglich ist. Deshalb ist die Aufnahme des
all-trans-Retinals in das Opsin* über die Öffnung B wahrscheinlicher. Außerdem würde
die hypothetische Lys2967.43-Schranke in geschlossener und geöffneter Stellung die
Aufnahme des all-trans-Retinals über die Öffnung A verhindern (Hildebrand et al. 2009).
Untersuchungen der Gt-Proteinaktivierung haben gezeigt, dass all-trans-Retinal
das Opsin partiell aktivieren kann (Abb. 3.20) (Han et al. 1996, Jäger et al. 1996). Das würde
dafür sprechen, dass eine sekundäre Bindestelle für all-trans-Retinal am Opsin
existiert, wodurch ein partiell aktiviertes Opsin (Opsin+) entsteht. Dieses Opsin+ besitzt
aber nicht die Möglichkeit, all-trans-Retinal in die Bindungstasche aufzunehmen und
kovalent mit dem Lys2967.43 zu verknüpfen (Abb. 3.18a). Es könnte aber die Bindung
des CTα-Peptids begünstigen, was dann zur vollen Aktivierung des Opsins (Opsin*)
führt. Diese Aussage steht nicht im Widerspruch zur Hypothese, dass die Aufnahme
von all-trans-Retinal durch Opsin* über den Conformational-Selection-Mechanismus
verläuft. Die genauen Aufnahmemechanismen für 11-cis- und all-trans-Retinal können
anhand der aktuellen Ergebnisse aus der Literatur und aus dieser Arbeit nicht erklärt
werden. Dazu sind weitere Untersuchungen notwendig.
4.6 Vergleich der Ligandenaufnahme und -abgabe des
Rhodopsins mit anderen GPCRs
Im Rhodopsinmolekül wird die Retinalbindungstasche im Kern der 7TM-
Struktur durch die extrazelluläre Peptidschleife 2 (EL2) vom extrazellulären Raum
getrennt. Diese EL2 besteht aus zwei β-Peptidsträngen, die durch eine
Disulfidbrückenbindung zur TM3 und durch das Glu181EL2-
Wasserstoffbrückennetzwerk stabilisiert werden (Okada et al. 2004). Da dieser
sogenannte hochgeordnete „Deckel“ im ligandenfreien Opsinzustand sowie im durch
4 DISKUSSION
136
den Agonisten gebundenen Meta II-Zustand seine Struktur nicht verliert
(Choe et al. 2011, Park et al. 2008), ist eine Aufnahme des hydrophoben Retinalliganden
über die extrazelluläre Domäne unwahrscheinlich, was wiederum für die Aufnahme
über die in der Membran exponierten Öffnungen spricht (Hildebrand et al. 2009). Der
Vergleich der rhodopsinähnlichen GPCRs macht eine außergewöhnliche Variabilität
der extrazellulären Domäne sichtbar, was auch die große Diversität der
Ligandenerkennung erklärt. Die Klasse der rhodopsinähnlichen GPCRs macht aber
deutlich, dass trotz unterschiedlicher Struktur der EL2 die meisten Liganden innerhalb
einer Kavität zwischen den TMs binden. Die ECL2 des β2-adrenergen Rezeptors
(analog zur EL2 im Rhodopsin) besitzt ein helikales Segment und existiert in drei
verschiedenen Konformationen, deren Bildung vom gebundenen Liganden im TM-
Kern des Moleküls abhängt (Antagonist, Agonist oder inverser Agonist)
(Bokoch et al. 2010, Wang und Duan 2009). Da die Bindungstasche im β2-adrenergen
Rezeptor relativ gut zur extrazellulären Umgebung exponiert ist und die Liganden
mehr hydrophile Eigenschaften besitzen, könnte ihre Aufnahme über zwei extrazellulär
ausgerichtete Kanäle erfolgen (Gonzalez et al. 2011). Dieser Weg der Ligandenaufnahme
ist für GPCRs anzunehmen, die meist hydrophile Agonisten binden, um aktiviert zu
werden. Der Weg durch membranständige Öffnungen, wie im Fall des Rhodopsins,
könnte bei der Aufnahme von hydrophoben Liganden verwirklicht sein. Ein Beispiel für
einen solchen Rezeptor ist der olfaktorische GPCR hOR2AG1, der als hydrophober
Ligand das Amylbutyrat bindet (Gelis et al. 2011, Neuhaus et al. 2006).
Rhodopsin ist einer der wenigen GPCRs, die ihren Liganden kovalent an das
Apoprotein binden, und nimmt deshalb unter den GPCRs eine besondere Stellung ein.
Des Weiteren wird in Rhodopsin nur die Form des Liganden (11-cis-Retinal)
gebunden, die die basale Aktivität des Rezeptors stoppt (inverser Agonist). Die zweite
Form wird durch eine lichtinduzierte Isomerisierung innerhalb der Bindungstasche
erzeugt (all-trans-Retinal) und aktiviert den Rezeptor. Dennoch ist es möglich, das
Rhodopsin bezüglich der ligandeninduzierten Rezeptoraktivierung mit z.B. dem β2-
adrenergen Rezeptor zu vergleichen. Zur vollen Aktivierung benötigen die Rezeptoren
einen Agonisten. Beim β2-adrenergen Rezeptor ist dieser Agonist das Adrenalin, und
beim Rhodopsin ist es das durch Licht isomerisierte kovalent verknüpfte
all-trans-Retinal. Neben der agonistischen Wirkung des all-trans-Retinals in
Schiff’sche Base-gebundener Form kann das all-trans-Retinal, das sich an einer
sekundären Bindestelle befindet, als partieller Agonist angesehen werden. Dies zeigt
die exogene Zugabe von all-trans-Retinal, durch die eine Aktivierung von nur 14 % im
Vergleich zur lichtinduzierten Gt-Proteinaktivierung erreicht wird (Han et al. 1996,
4 DISKUSSION
137
Jäger et al. 1996). Beim β2-adrenergen Rezeptor sorgen Substanzen wie das Catechol
und Dopamin, die von der agonistischen Struktur abweichen, für eine partielle
Aktivierung. Die Verbindungen, die die basale Aktivität des ligandenfreien Rezeptors
inhibieren, werden als inverse Agonisten bezeichnet. Ein inverser Agonist beim
β2-adrenergen Rezeptor ist z.B. ICI118,551. Beim Rhodopsin ist 11-cis-Retinal der
inverse Agonist. Als Antagonisten bezeichnet man Verbindungen, die keinen Effekt auf
die basale Rezeptoraktivität haben, aber den Zugang für andere Liganden kompetitiv
blockieren. Beim β2-adrenergen Rezeptor ist diese Verbindung z.B. Butoxamin, beim
Rhodopsin ist die antagonistische Blockierung der Bindungstasche nicht möglich, da
der Agonist (all-trans-Retinal) bereits kovalent in der Bindungstasche des Rezeptors
gebunden ist. Da die irreversible Bildung von Rhodopsin durch 11-cis-Retinal auf die
Hydrolyse der all-trans-Retinyliden-Schiff’schen Base nach der lichtinduzierten
Aktivierung des Rezeptors „warten“ muss, kann 11-cis-Retinal nicht antagonistisch
wirken.
Ligandenklasse
Rhodopsin
β2-adrenerger Rezeptor
Agonist
all-trans-Retinyliden-Lys296
Adrenalin
Partieller Agonist
all-trans-Retinal
Catechol und Dopamin
Inverser Agonist
11-cis-Retinyliden-Lys296
ICI118,551
Antagonist
—
Butoxamin
Durch die Verschiebung des Gleichgewichts vom inaktiven zum aktiven Opsin
wird eine reversible Aufnahme des Agonisten all-trans-Retinal ermöglicht. Dadurch
kann Opsin mit Hilfe der Modelle für die reversible Liganden-Rezeptor-Interaktionen
anderer GPCRs charakterisiert werden (z.B. kubisch-ternäres Komplexmodell). Der für
die Aufnahme von all-trans-Retinal favorisierte Conformational-Selection-
Mechanismus wird auch als ein möglicher Aufnahmemechanismus des Catecholamins
in den β2-adrenergen Rezeptor angenommen (Übersicht: Gether und Kobilka 1998). Eine
kovalente Verknüpfung des all-trans-Retinals nach der Aufnahme durch das aktive
Opsin (Opsin*) wurde in dieser Arbeit bestätigt (Abb. 3.18a). Die Wirkung des
all-trans-Retinals als partieller Agonist konnte ebenfalls in dieser Arbeit gezeigt werden
(Abb. 3.20). Es muss aber noch geklärt werden, inwieweit der Mechanismus der
Aufnahme des all-trans-Retinals mit dem Mechanismus der Aufnahme
Tabelle 4.1: Vergleich der Ligandenklassen von Rhodopsin und
β
2-adrenergen Rezeptor.
Anmerkung: Die Liganden des β2-adrenergen Rezeptors repräsentieren nur eine Auswahl.
4 DISKUSSION
138
diffusionsfähiger Liganden wie z.B. des β2-adrenergen Rezeptors übereinstimmen
(Induced-Fit oder Conformational-Selection).
4.7 Abschließendes Fazit und Ausblick
In dieser Arbeit konnte durch die Untersuchung des Einflusses der alkylierten
Hydroxylaminderivate gezeigt werden, wie diese als molekulares Werkzeug zur
Untersuchung der visuellen Signaltransduktion verwendet werden können. Des
Weiteren konnten mit Hilfe der alkylierten Hydroxyalaminderivate Indizien für einen
hypothetischen Wasserkanal im aktivierten Rhodopsin bestätigt werden, und es
konnte gezeigt werden, dass nur kleine Moleküle wie Wasser und Hydroxylamin
diesen Kanal passieren können, um zur Retinalbindungstasche zu gelangen.
Die Untersuchungen der Aufnahme und Abgabe des Retinals durch den
hypothetischen Ligandenkanal im aktivierten Rhodopsin erfolgten durch den
ortsspezifischen Austausch von Aminosäuren entlang des Kanals. Diese
Untersuchungen ergaben, dass Mutationen der Aminosäureseitenketten entlang des
Retinalligandenkanals weitreichende Effekte innerhalb des gesamten Rezeptors haben
können und somit die Aufnahme und Abgabe des Retinalliganden beeinflussen. Des
Weiteren konnte bestätigt werden, dass der Mechanismus der Retinalpassage
unidirektional ist. Die Aufnahme des inversen Agonisten 11-cis-Retinal und Agonisten
all-trans-Retinal erfolgt über die aktive Rezeptorkonformation. Durch die richtige
Positionierung des 11-cis-Retinals in der Bindungstasche sorgt das ionische Schloss
(Ionic-Lock) zwischen der Schiff’schen Base und dem Gegenion dafür, dass das
Protein in seine inaktive, aber lichtsensitive Rhodopsinkonformation überführt wird.
Nach der lichtinduzierten Bildung von Meta II erfolgt die durch die Hydrolyse der
Retinyliden-Schiff’schen Base bestimmte Abgabe des Agonisten all-trans-Retinal über
die aktive Rezeptorkonformation. Die Geschwindigkeit der Hydrolyse der Retinyliden-
Schiff’schen Base wird wiederum durch die Menge an Carbinolamin bestimmt.
Außerdem wird die Hydrolyse oder Bildung der Schiff’schen Base durch die
Positionierung der Aminosäureseitenketten und ihrer Reaktionspartner beeinflusst.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der hypothetische Wasserkanal mit dem
Ligandenkanal im Bereich der Retinalbindungstasche gekoppelt ist.
Es wurde ein detailliertes Schema für die Aufnahme und Abgabe des
Retinalliganden entwickelt, welches darauf basiert, dass nur zwei Opsinzustände
existieren, die im aktiven Zustand einen offenen Wasser- und Ligandenkanal und im
inaktiven Zustand geschlossene Kanäle aufweisen.
4 DISKUSSION
139
In dieser Arbeit konnte weiter gezeigt werden, dass aktiviertes Opsin ähnlich zu
anderen GPCRs als Rezeptor für diffusionsfähige Liganden fungieren kann. Das
Gleichgewicht zwischen aktiver und inaktiver Konformation kann die reversible
Aufnahme des Agonisten all-trans-Retinal steuern, was durch das kubisch-
ternäre Komplexmodell in Abhängigkeit vom CTα-Peptid charakterisiert werden kann.
Aufgrund dieser Daten kann postuliert werden, dass die Aufnahme des Agonisten
all-trans-Retinal und des inversen Agonisten 11-cis-Retinal über zwei verschiedene
Mechanismen verläuft. All-trans-Retinal nutzt die seltene Gelegenheit der aktiven
Opsinkonformation, um in das Protein zu gelangen (Conformational-Selection),
während 11-cis-Retinal selbst die aktive Konformation des Opsins induziert, um die
Bindungstasche zu erreichen (Induced-Fit). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass
eine sekundäre Bindestelle für all-trans-Retinal am Opsinmolekül existiert, wodurch
das Protein partiell aktiviert wird. Auch wenn bei anderen GPCRs die Liganden nicht
kovalent mit dem Apoprotein verknüpft sind, könnte die Aufnahme des Liganden und
dessen Positionierung innerhalb der Bindungstasche ähnlichen Schemata folgen, wie
es hier für Rhodopsin beschrieben wurde.
Für das Verständnis der Mechanismen der Rezeptor-Ligand-Interaktion am
Beispiel des Rhodopsins sind aber weitere Untersuchungen notwendig, da die in
dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen noch folgende Fragestellungen
unbeantwortet ließen.
1) Wie können die zwei Öffnungen des Ligandenkanals zur Aufnahme oder
Abgabe des Liganden zugeordnet werden?
Dazu wurden schon erste Versuche durchgeführt, in denen die Öffnungen
getrennt von einander geblockt werden sollten. Der Austausch von zwei Aminosäuren
am Ausgang oder Eingang durch Cystein in Kombination mit dem oxidativen Reagenz
Kupfer-1,10-Phenantrolin sollte dazu führen, dass Disulfidbrücken zwischen den zwei
mutierten Cysteinen an einer Öffnung entstehen. Diese Disulfidbrücken sollten die
entsprechende Kanalöffnung unpassierbar für das Retinal machen. Diese Prozedur
brachte aber keinen Erfolg. Der Durchmesser der Öffnungen liegt zwischen 4 und
10 Å, deshalb wurden größere bifunktionale Reagenzien wie Bis-Maleimide verwendet,
um den Kanal an den Öffnungen verschließen können. Diese Bis-Maleimide gehen
kovalente Verbindungen mit den SH-Gruppen der Cysteine ein. Da sich aber die
Öffnungen des Ligandenkanals im hydrophoben Bereich des Rhodopsins befinden
und sich das Detergenz in diesem Bereich um den Rezeptor legt, war eine
Verknüpfungsreaktion mit den verschiedenen Bis-Maleimiden nicht erfolgreich.
4 DISKUSSION
140
Weitere Möglichkeiten, die Öffnungen zu verschließen, bietet entweder HgCl2, das mit
intramembranen Cysteinen reagiert, oder hydrophobe Crosslinker, wie
1,3-Dibromopropan. Außerdem bestünde noch die Möglichkeit, zwei
Rhodopsinmoleküle im extra- und/oder intrazellulären Bereich so über Disulfidbrücken
zu verbinden, dass der Ligandenkanal eines der beiden Rhodopsinmoleküle
verschlossen wird. Diese Verknüpfung könnte so durchgeführt werden, dass zum
einen Rhodopsin (Opsin-11-cis-Retinal) zur Untersuchung der Abgabe des Liganden
und zum anderen Opsin zur Untersuchung der Aufnahme des Liganden genutzt
werden kann.
2) Welche Rolle spielt die Struktur des Ligandenkanals bei der Aufnahme und
Abgabe des Retinals durch das Rhodopsin?
Um die Effekte von sterischen Behinderungen durch den Einbau von großen
Aminosäureseitenketten im Ligandenkanal besser hervorheben zu können, sollen
Mutationen von ausgesuchten Aminosäuren auf dem K296G-Hintergrund untersucht
werden. Durch die K296G-Mutation ist nicht mehr die Bildung und Hydrolyse der
Schiff’schen Base der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Regeneration
und dem Meta II-Zerfall, sondern es können Effekte der Mutationen auf die
Wechselwirkungen von Retinal und Ligandenkanal sichbar gemacht werden. Die
weitere Untersuchung der Interaktion des Liganden mit den Aminosäuren innerhalb
des Kanals ist durch das Verwenden eines Spin-markierten Retinals möglich.
3) Welche Affinitäten können die Aufnahme des 11-cis-Retinals durch das Opsin
und die Bildung der Schiff’schen Base beschreiben?
Da die Regeneration in Detergenz mit hoher Konzentration an 11-cis-Retinal so
beschleunigt wird, dass sie nicht mehr unter normalen Detektionsbedingungen
gemessen werden kann, muss die Zugabe des 11-cis-Retinals beschleunigt und die
Auflösung erhöht werden. Zur Quantifizierung der Affinitäten bei der Regeneration des
lichtsensitiven Rhodopsins soll die 11-cis-Retinal-Titration mittels Stopped-Flow-
UV/Vis-Spektrometer durchgeführt werden.
4) Welchem Mechanismus folgt die Hydrolyse der Schiff’schen Base?
Zur Analyse des Mechanismus der Schiff’schen Base-Hydrolyse könnte die
reduktive Methylierung (Jäger et al. 1996) genutzt werden, um Rhodopsin herzustellen, in
dem der Stickstoff der Schiff’schen Base methyliert und somit positiv geladen ist.
4 DISKUSSION
141
5) Welche Rolle spielt das Lys296 während der Regeneration und des Meta II-
Zerfalls?
Um die Rolle des Lys296 aufklären zu können, könnte die ortsgerichtete
Mutagenese mit einem chemischen Ansatz kombiniert werden, wodurch unnatürliche
Aminosäureseitenketten an der Position 296 eingefügt werden können (z.B. durch
Aminoalkylierung der K296S-Mutante).
6) Können durch die Untersuchung der reversiblen Aufnahme des
all-trans-Retinals durch das aktive Opsin weitere Erkenntnisse gewonnen werden?
Da all-trans-Retinal eine Steigerung der Gt-Proteinaktivität von 14 % bis 25 %
induziert (Abb. 3.20) (Han et al. 1996, Jäger et al. 1996), könnte, basierend auf einigen
früheren Ergebnissen (Heck et al. 2003b, Schädel et al. 2003), untersucht werden, wo sich
eine sekundäre Bindungsstelle für all-trans-Retinal am Opsinmolekül befindet. Dazu
müssen weitere quantitative Untersuchungen zur reversiblen Aufnahme des
all-trans-Retinals und zum Mechanismus der partiellen Aktivierung durch
all-trans-Retinal gemacht werden.
5 ANHANG
143
5 ANHANG
Verzeichnis der Abkürzungen
11-cis- & all-trans-PrSB
11-cis- & all-trans-Propyl-Schiff’sche Base
A2-(P)E
N-Retinyliden-N-Retinyliden(phosphatityl)ethanolamin
BSA
Bovine Serum Albumine (Bovines Serumalbumin)
BSI
Blue-Shifted Intermediate (Blauverschobene
Zwischenstufe)
CMHA
O-(Carboxymethyl)-Hydroxylamin
CRBP
Cellular Retinol Binding Protein
CTα-Peptid
C-terminales hochaffines Gtα-Proteinanalogon
DDM
N-Dodecyl-β-D-Maltosid
DTT
Dithiothreitol
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EHA
O-Ethyl-Hydroxylamin
EL
Extracellular Loop (extrazelluläre Peptidschleife)
FTIR
Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie
GDP / GTP
Guanosindi(tri)phosphat
GEF
Guanosin Exchange Factor (Guanosin-Austausch-Faktor)
cGMP
Cyclic Guanosinmonophosphat (zyklisches)
GPCR
G Protein-coupled Receptor (G-Protein-gekoppelter
Rezeptor)
GRK1
G-Protein-Rezeptor-Kinase 1
Gt-Protein
Guanosinbindeprotein (Transducin)
Gtα / Gtβγ-Protein
α/βγ-Untereinheit des Gt-Proteins
GTPγS
Guanosin-γ-[35S]thio-triphosphat
HA
Hydroxylamin
hν
Licht
5 ANHANG
144
IL
Intracellular Loop (intrazelluläre Peptidschleife)
IPM
Interphotorezeptormatrix
IRBP
Interphotorezeptorretinoidbindendes Protein
LRAT
Lecithinretinolacetyltransferase
Meta I/II/III
Metarhodopsin I/II/III
MHA
O-Methyl-Hydroxylamin
NT / CT
N-Terminus / C-Terminus
PDE
Phosphodiesterase
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
RDH
Retinoldehydrogenase
(R)OS
(Rod) Outer Segment (Stäbchenzellen (Außensegment))
RPE
Retinalpigmentepithelium
RPE65
Retinalpigmentepitheliumprotein 65
SB / SBH+
Schiff’sche Base / protonierte Schiff’sch Base
SER
Smooth Endothelial Reticulum (glattes endotheliales
Retikulum)
t-BHA
O-tert-Buthyl-Hydroxylamin
TM
Transmembranhelix
UV/Vis
Ultraviolett/Visible (sichtbar)
WMs
Washed Membranes (aufgereinigte Diskmembranen)
5 ANHANG
145
Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1.1
Anatomischer Aufbau der vertebraten Netzhaut.
S. 21
Abb. 1.2
Aufbau einer vertebraten Stäbchenzelle.
S. 23
Abb. 1.3
Anatomische Eigenschaften der äußeren Retina, des
Retinalpigmentepitheliums und des Photorezeptors.
S. 24
Abb. 1.4
Die visuelle Phototransduktionskaskade.
S. 27
Abb. 1.5
Lichtinduzierte Translokation von Gt-Protein und Arrestin im
Dunkelzustand und unter Lichtbedingungen.
S. 28
Abb. 1.6
Retinoidzyklus – Lange Serie an Reaktionen zur
Reisomerisierung des 11-cis-Retinals.
S. 30
Abb. 1.7
Aminosäuresequenz des Rhodopsins in zweidimensionaler
Repräsentation.
S. 33
Abb. 1.8
Funktionale Mikrodomänen und konservierte Aminosäurereste
in GPCRs.
S. 34
Abb. 1.9
Isomerisierung der C11=C12-Doppelbindung des
11-cis-Retinals zur trans-Konformation nach Absorption eines
Photons (hν).
S. 37
Abb. 1.10
Fixierung des Retinals durch die Aminosäurenseitenketten
innerhalb der Bindungstasche.
S. 38
Abb. 1.11
Rhodopsin und seine lichtaktivierten Photoprodukte.
S. 40
Abb. 1.12
Der Vergleich der Kristallstrukturen des inaktiven Rhodopsins
und aktiven Meta II.
S. 44
Abb. 1.13
Kanalengstelle am Lys296.
S. 45
Abb. 1.14
Kubisch-ternäres Komplexmodell zur Charakterisierung der
Rezeptor-Liganden-G-Protein-Interaktion in GPCRs.
S. 47
Abb. 1.15
Engstellen innerhalb des hypothetischen Ligandenkanals mit
den in dieser Arbeit verwendeten Mutationsstellen.
S. 49
Abb. 2.1
Eukaryotischer Expressionsvektor pMT4.
S. 52
5 ANHANG
146
!
Abb. 3.1
Reaktionen von HA und seinen Derivaten mit peripheren
Schiff’schen Basen.
S. 75
Abb. 3.2
Einfluss von HA und seiner Derivate auf die
Absorptionseigenschaften von Rhodopsin und Meta II.
S. 76
Abb. 3.3
Einfluss von HA und seiner Derivate auf den Zerfall von
Meta II.
S. 77
Abb. 3.4
Einfluss der Konzentrationen von HA und t-BHA auf den
Zerfall von Meta II.
S. 78
Abb. 3.5
Einfluss von HA und t-BHA auf den Zerfall von Meta III.
S. 79
Abb. 3.6
Vergleich der Strukturen vom aktiven Meta II und inaktiven
Rhodopsin und Darstellung der Lage der in dieser Arbeit
mutierten Aminosäurereste.
S. 81
Abb. 3.7
Vergleich der spektroskopischen Eigenschaften des Wildtyp-
und N2C/D282C-Rhodopsins.
S. 82
Abb. 3.8a
UV/Vis-Absorptionsspektren der Mutanten im Bereich der
Öffnung A des hypothetischen Retinalligandenkanals.
S. 84
Abb. 3.8b
UV/Vis-Absorptionsspektren der Mutanten im Bereich der
Bindungstasche und der Öffnung B des hypothetischen
Retinalligandenkanals.
S. 85
Abb. 3.9
Spektroskopische Eigenschaften der Rhodopsinmutanten des
hypothetischen Retinalligandenkanals.
S. 87
Abb. 3.10
Anteile an Meta I und an Isorhodopsin nach lichtinduzierter
Aktivierung der Mutanten des hypothetische Retinal-
ligandenkanals.
S. 88
Abb. 3.11
Lichtinduzierte und basale Gt-Proteinaktivierung durch
ausgewählte Mutanten des hypothetischen Ligandenkanals.
S. 90
Abb. 3.12
Kinetik der Retinalaufnahme und –abgabe durch ausgewählte
Rhodopsinmutanten.
S. 92
Abb. 3.13
Reaktionsgeschwindigkeiten der Retinalaufnahme und –
abgabe durch die Rhodopsinmutanten.
S. 94
Abb. 3.14
Reaktionsgeschwindigkeiten der Retinalaufnahme und –
abgabe durch die Rhodopsinmutanten in Anwesenheit von
Hydroxylamin (HA) und seinem Derivat o-Methyl-
Hydroxylamin (MHA).
S. 97
Abb. 3.15
Charakterisierung der K296G-Mutante.
S. 99
Abb. 3.16
Gt-Proteinaktivierung durch die N2C/D282C-Kontrolle und die
K296G-Mutante.
S. 101
5 ANHANG
147
Abb. 3.17
Einfluss des CTα-Peptids auf den lichtinduzierten Zerfall von
Meta II bzw. auf zerfallenes Rhodopsin.
S. 103
Abb. 3.18
Untersuchung der Bildung der protonierten Schiff’schen Base
(SBH+) zwischen Opsin und all-trans-Retinal in Anwesenheit
des CTα-Peptids.
S. 105
Abb. 3.19
Beeinflussung der Regeneration des Rhodopsins durch
all-trans-Retinal in Anwesenheit des CTα-Peptids.
S. 106
Abb. 3.20
Titration der all-trans-Retinal-induzierten partiellen
Gt-Proteinaktivierung von Opsin.
S. 108
Abb. 4.1
Molekulare Strukturen von Wasser (Kontrolle), Hydroxylamin
(HA), o-Methyl-Hydroxylamin (MHA), o-Ethyl-Hydroxylamin
(EHA), o-tert-Buthyl-Hydroxylamin (t-BHA) und o-
(Carboxymethyl)-Hydroxylamin (CMHA).
S. 111
Abb. 4.2
Hydrolyse der deprotonierten Retinyliden-Schiff’schen Base
(deprot. SB).
S. 124
Abb. 4.3
Hypothetischer Liganden- (links) und Wasserkanal (rechts).
S. 127
Abb. 4.4
Aktivierungs-/Deaktivierungskreislauf des Rhodopsins.
S. 129
Abb. 4.5
Kubisch-ternäres Komplexmodell für Opsin.
S. 133
5 ANHANG
148
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5 ANHANG
162
Literatur und Software aus dem Internet
http://www.skidmore.edu/~hfoley/Perc3.htm
http://www.vetmed.vt.edu/education/curriculum/vm8054/eye/ROD.HTM
http://www.pymol.org
5 ANHANG
163
Anlage
Oligonukleotide
Mutation
Oligonukleotide (Primer) 5’ 3’
N2C/D282C
D282C Forward: CACCCATCAGGGCTCTTGTTTTGGGCCCATCTTC
D282C Reverse: GAAGATGGGCCCAAAACAAGAGCCCTGATGGGTG
N2C Forward: P – ATTCCACCATGTGCGGTAC
N2C Reverse: P – CGCACATGGTGG
M39W
Forward: CTGGCAGTTCTCCTGGCTGGCCGCCTAC
Reverse: GTAGGCGGCCAGCCAGGAGAACTGCCAG
L40D
Forward: CTGGCAGTTCTCCATGGATGCCGCCTACATGTTC
Reverse: GAACATGTAGGCGGCATCCATGGAGAACTGCCAG
L40F
Forward: CTGGCAGTTCTCCATGTTCGCCGCCTACATGTTC
Reverse: GAACATGTAGGCGGCGAACATGGAGAACTGCCAG
Y43A
Forward: GTTCTCCATGCTGGCCGCCGCCATGTTCCTGCTGATCATG
Reverse: CATGATCAGCAGGAACATGGCGGCGGCCAGCATGGAGAAC
Y43W
Forward: CTCCATGCTGGCCGCCTGGATGTTCCTGCTGATCATG
Reverse: CATGATCAGCAGGAACATCCAGGCGGCCAGCATGGAG
M44F
Forward: CATGCTGGCCGCCTACTTTTTCCTGCTGATCATGC
Reverse: GCATGATCAGCAGGAAAAAGTAGGCGGCCAGCATG
F293A
Forward: ATCTTCATGACCATCCCGGCTGCGTTTGCCAAGACGTCT
Reverse: AGACGTCTTGGCAAACGCAGCCGGGATGGTCATGAAGAT
F293L
Forward: P – CATCTTCATGACCATCCCGGCTTTGTTTGCCAAGACGT 3
Reverse: P – CTTGGCAAACAAAGCCGGGATGGTCATGAAGATGGGCC 3
T289A
Forward: GGGCCCATCTTCATGGCCATCCCGGCTTTCTTTG
Reverse: CAAAGAAAGCCGGGATGGCCATGAAGATGGGCCC
T289D
Forward: GGCCCATCTTCATGGACATCCCGGCTTTC
Reverse: GAAAGCCGGGATGTCCATGAAGATGGGCC
Tabelle 5.1: Aufstellung der in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide zur Herstellung der
Rhodopsinmutanten. Die Reihenfolge der DNA-Basen Cytosin (C), Guanin (G), Adenin (A) und Thymin
(T) ist in 5’ zu 3’-Richtung dargestellt und sind komplimentär zur Plasmid-DNA. (P) steht für die
Verwendung phosphorylierter Oligonukleotide, da diese an der DpnI-Schnittstelle binden.
5 ANHANG
164
T289R
Forward: GGCCCATCTTCATGAGAATCCCGGCTTTCTTTG
Reverse: CAAAGAAAGCCGGGATTCTCATGAAGATGGGCC
T289F
Forward: CCCATCTTCATGTTTATCCCGGCTTTCTTT
Reverse: AAAGAAAGCCGGGATAAACATGAAGATGGG
T94A
Forward: GGCTTCACCACCGCCCTCTACACCTC
Reverse: GAGGTGTAGAGGGCGGTGGTGAAGCC
T94I
Forward: GTGGCTTCACCACCATTCTCTACACCTCTCTC
Reverse: GAGAGAGGTGTAGAGAATGGTGGTGAAGCCAC
F91L
Forward: P – GATCTCTTCATGGTCTTCGGTGGCTTG
Reverse: P – ATGGAGAGAGGTGTAGAGGGTGGTGGT
A292L
Forward: CTTCATGACCATCCCGTTGTTCTTTGCCAAGACGTC
Reverse: GACGTCTTGGCAAAGAACAACGGGATGGTCATGAAG
A292V
Forward: CATGACCATCCCGGTCTTCTTTGCCAAGACG
Reverse: CGTCTTGGCAAAGAAGACCGGGATGGTCATG
A292F
Forward: TTCATGACCATCCCGTTTTTCTTTGCCAAG
Reverse: CTTGGCAAAGAAAAACGGGATGGTCATGAA
E181Q
Forward: GGCTGCAACCTCGAGGGCTTCTTT
Reverse: GTAGTAATCGATCCCGCACGAGCACTGCATGCCCTGCGGGA
S186A
Forward: GAGGGCATGCAGTGCGCGTGCGGGATCGATTAC
Reverse: GTAATCGATCCCGCACGCGCACTGCATGCCCTC
Y268E
Forward: CTAATCTGCTGGCTGCCAGAAGCTGGTGTGGCGTTCTAC
Reverse: GTAGAACGCCACACCAGCTTCTGGCAGCCAGCAGATTAG
Y268F
Forward: CTAATCTGCTGGCTGCCATTTGCTGGTGTGGCGTTCTAC
Reverse: GTAGAACGCCACACCAGCAAATGGCAGCCAGCAGATTAG
M207A
Forward: GTCGTTCGTCATCTACGCGTTCGTGGTCCACTTC
Reverse: GAAGTGGACCACGAACGCGTAGATGACGAACGAC
A272V
Forward: GCCATATGCTGGTGTGGTTTTCTACATCTTCACCC
Reverse: GGGTGAAGATGTAGAAAACCACACCAGCATATGGC
A272I
Forward: CCATATGCTGGTGTGATCTTCTACATCTTCACC
Reverse: GTGAAGATGTAGAAGATCACACCAGCATATGG
5 ANHANG
165
!
A272F
Forward: CTGCCATATGCTGGTGTGTTTTTCTACATCTTCACCCATC
Reverse: GATGGGTGAAGATGTAGAAAAACACACCAGCATATGGCAG
V204F
Forward: CAACAATGAGTCGTTCTTCATCTACATGTTCGTG
Reverse: CACGAACATGTAGATGAAGAACGACTCATTGTTG
I205Q
Forward: CAACAATGAGTCGTTCGTCCAATACATGTTCGTGGTCCAC
Reverse: GTGGACCACGAACATGTATTGGACGAACGACTCATTGTTG
F208L
Forward: GTCATCTACATGTTGGTGGTCCACTTCATC
Reverse: GATGAAGTGGACCACCAACATGTAGATGAC
F208Q
Forward: CGTTCGTCATCTACATGCAAGTGGTCCACTTCATCATC
Reverse: GATGATGAAGTGGACCACTTGCATGTAGATGACGAACG
F273L
Forward: CTGGTGTGGCGTTGTACATCTTCACCC
Reverse: GGGTGAAGATGTACAACGCCACACCAG
F273Q
Forward: CATATGCTGGTGTGGCGCAATACATCTTCACCCATC
Reverse: GATGGGTGAAGATGTATTGCGCCACACCAGCATATG
F276L
Forward: CGTTCTACATCTTGACCCATCAGGGCTC
Reverse: GAGCCCTGATGGGTCAAGATGTAGAACG
F276Q
Forward: GTGGCGTTCTACATCCAAACCCATCAGGGCT
Reverse: AGCCCTGATGGGTTTGGATGTAGAACGCCAC
K296G
Forward: CCGGCTTTCTTTGCCGGGACGTCTGCCGTCTAC
Reverse: GTAGACGGCAGACGTCCCGGCAAAGAAAGCCGG
5 ANHANG
166
Gt-Proteinaktivierungsraten
Mutante
Lichtinduzierte Gt-
Proteinaktivierung
Anfangssteigung auf Amplitude
normiert ± SD (s-1)
Basale Gt-
Proteinaktivierung
Anfangssteigung auf Amplitude
normiert ± SD (s-1)
N2C/D282C-Kontrolle
1,82x10-2 ± 0,27x10-2
0,82x10-3 ± 0,2x10-3
Y43A
1,83x10-2 ± 0,03x10-2
0,43x10-3 ± 0,06x10-3
M44F
1,5x10-2 ± 0,16x10-2
2,2x10-3 ± 0,29x10-3
T289F
2 x10-2 ± 0,22x10-2
2,1x10-3 ± 0,06x10-3
T94I
2,1x10-2 ± 0,18x10-2
0,21x10-3 ± 0,06x10-3
A292F
1,67x10-2 ± 0,03x10-2
2,6x10-3 ± 0,7x10-3
K296G
0,93x10-2 ± 0,17x10-2
3,3x10-3 ± 0,5x10-3
E181Q
1,67x10-2 ± 0,09x10-2
1x10-3 ± 0,15x10-3
S186A
2x10-2 ± 0,06x10-2
0,6x10-3 ± 0,06x10-3
Y268F
1,46x10-2 ± 0,08x10-2
1x10-3 ± 0,2x10-3
M207A
1,26x10-2 ± 0,09x10-2
1,64x10-3 ± 0,3x10-3
A272I
1,53x10-2 ± 0,09x10-2
1,1x10-3 ± 0,3x10-3
V204F
1,6x10-2 ± 0,19x10-2
1,53x10-3 ± 0,06x10-3
F208Q
1,64x10-2 ± 0,13x10-2
1,5x10-3 ± 0,3x10-3
F273Q
1,9x10-2 ± 0,07x10-2
0,82x10-3 ± 0,1x10-3
F276Q
1,83x10-2 ± 0,17x10-2
3,1x10-3 ± 0,1x10-3
Tabelle 5.2: Aufstellung der in dieser Arbeit bestimmten Gt-Proteinaktivierung der
Rhodopsinmutanten. Für 15 ausgewählte Rhodopsinmutanten wurde die lichtinduzierte und basale Gt-
Proteinaktivierung gemessen. Die dargestellten Daten präsentieren die Mittelwerte der auf die
Endamplitude normierten Anfangssteigung aus neun (N2C/D282C-Kontrolle) bzw. drei (alle anderen
Mutanten) Messungen mit der entsprechenden Standardabweichung (SD).
5 ANHANG
167
Geschwindigkeiten der Retinalaufnahme und –abgabe
Mutante
Regeneration
k ± SD ((µM*s)-1)
Meta II-Zerfall
k ± SD (s-1)
Meta II-Zerfall
in Anwesenheit
von HA
k ± SD (s-1)
Meta II-Zerfall in
Anwesenheit
von MHA
k ± SD (s-1)
N2C/D282C-
Kontrolle
0,074 ± 0,0136
0,83x10-3 ± 0,062x10-3
0,065 ± 0,0207
0,22x10-2
M39W
0,053 ± 0,0185
0,87x10-3 ± 0,064x10-3
0,078
0,38x10-2
F293A
0,075 ± 0,0123
1,23x10-3 ± 0,048x10-3
0,24 ± 0,17
0,26x10-2
F293L
0,077 ± 0,0083
0,52x10-3 ± 0,028x10-3
0,041 ± 0,0004
0,077x10-2
Y43A
0,005 ± 0,003
1,4x10-3 ± 0,045x10-3
0,249 ± 0,064
3,06x10-2
Y43W
0,041 ± 0,0005
1,3x10-3 ± 0,051x10-3
0,103 ± 0,034
0,79x10-2
L40D
0,1 ± 0,034
1,5x10-3 ± 0,14x10-3
0,189 ± 0,125
0,69x10-2
L40F
0,041 ± 0,014
0,67x10-3 ± 0,06x10-3
0,064 ± 0,019
0,22x10-2
M44F
0,052 ± 0,0112
4,1x10-3
0,048 ± 0,005
0,40x10-2
T289A
0,054 ± 0,0036
0,64x10-3 ± 0,03x10-3
0,074 ± 0,009
0,19x10-2
T289D
0,005 ± 0,0015
2x10-3 ± 0,145x10-3
0,25 ± 0,13
1,27x10-2
T289R
0,004 ± 0,0008
1,6x10-3 ± 0,045x10-3
0,13 ± 0,062
0,88x10-2
T289F
0,003 ± 0,0013
0,55x10-3 ± 0,02x10-3
0,028 ± 0,004
0,077x10-2
T94A
0,028 ± 0,0135
2,4x10-3 ± 0,12x10-3
0,148 ± 0,051
0,47x10-2
T94I
0,024 ± 0,0064
0,17x10-3 ± 0,025x10-3
0,005 ± 0,0027
0,032x10-2
F91L
0,119 ± 0,0163
0,46x10-3 ± 0,05x10-3
0,037 ± 0,0072
0,13x10-2
A292L
0,003 ± 0,0019
0,17x10-3 ± 0,021x10-3
0,039 ± 0,0139
0,12x10-2
A292V
0,0007 ± 0,0001
0,24x10-3 ± 0,029x10-3
0,1 ± 0,0137
0,4x10-2
A292F
0,0009 ± 0,0002
0,49x10-3 ± 0,02x10-3
0,068 ± 0,0131
0,58x10-2
E181Q
0,013 ± 0,0052
1,7x10-3 ± 0,085x10-3
0,113 ± 0,0082
0,44x10-2
S186A
0,04 ± 0,0015
0,31x10-3
0,03 ± 0,0017
0,36x10-2
Y268E
0,0005 ± 0,0003
2,7x10-3 ± 0,23x10-3
0,234 ± 0,059
4,66x10-2
Y268F
0,005 ± 0,003
0,13x10-3 ± 0,1x10-3
0,288 ± 0,094
4,88x10-2
Tabelle 5.3: Aufstellung der in dieser Arbeit bestimmten Geschwindigkeiten der Retinalaufnahme
und -abgabe durch die Rhodopsinmutanten. Für 35 ausgewählte Rhodopsinmutanten wurde die
Regeneration mit 11-cis-Retinal sowie der Meta II-Zerfall in An- und Abwesenheit von Hydroxylaminen
(HA und MHA) gemessen. Die dargestellten Daten präsentieren die Mittelwerte der Geschwindigkeit
einer bimolekularen Reaktion (Regeneration) und einer monoexponentiellen Funktion (Meta II-Zerfall
±HA) aus drei Messungen mit der entsprechenden Standardabweichung (SD).
5 ANHANG
168
M207A
0,01 ± 0,0067
1,8x10-3 ± 0,061x10-3
0,303 ± 0,088
0,94x10-2
A272V
0,041 ± 0,0017
3,5x10-3 ± 0,379x10-3
0,42 ± 0,35
6,28x10-2
A272I
0,012 ± 0,0066
13x10-3 ± 1,3x10-3
0,367 ± 0,047
8,75x10-2
A272F
0,011 ± 0,0029
0,92x10-3 ± 0,035x10-3
0,155 ± 0,057
1,35x10-2
V204
0,062 ± 0,0056
1,37x10-3 ± 0,15x10-3
0,222 ± 0,051
1,22x10-2
I205
0,028 ± 0,0017
0,77x10-3
0,094
0,32x10-2
F208L
0,015 ± 0,0059
0,94x10-3 ± 0,029x10-3
0,078 ± 0,032
0,49x10-2
F208Q
0,003 ± 0,0013
0,94x10-3 ± 0,056x10-3
0,081 ± 0,021
0,28x10-2
F273L
0,074 ± 0,0293
0,94x10-3 ± 0,046x10-3
0,094 ± 0,074
0,59x10-2
F273Q
0,018 ± 0,009
0,76x10-3
0,073
0,63x10-2
F276L
0,034 ± 0,0061
1,2x10-3 ± 0,046x10-3
0,087 ± 0,018
0,43x10-2
F276Q
0,02 ± 0,0114
0,903x10-3
0,072
0,22 x10-2