Präparation spezieller Biokatalysatoren für die chemisch-
technische Nutzung zur Bereitstellung von Aromaten und chiralen
α-Hydroxyketonen
vorgelegt von
Diplom-Biologin
Nora Christiane Bieler
aus Düsseldorf
von der Fakultät II – Mathematik und Naturwissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktorin der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Peter Hildebrandt (TU Berlin)
Berichterin/Gutachterin: Prof. Dr. Marion Ansorge-Schumacher (TU Berlin)
Berichterin/Gutachterin: Prof. Dr. Antje Spieß (RWTH Aachen)
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 10. Februar 2011
Berlin 2011
D 83
Danksagung
Diese Arbeit entstand im Rahmen meiner Zeit als wissenschaftliche Mitarbeiterin an der TU
Berlin am Lehrstuhl für Technische Chemie in der AG Enzymtechnologie.
Ich bedanke mich ganz herzlich bei Frau Prof. Dr. Antje Spieß von der RWTH Aachen für Ihr
Interesse an meiner Arbeit und die Übernahme des Koreferats.
Bei Dr. Lasse Greiner möchte ich mich ganz herzlich für die ausgezeichnete und sehr
fruchtbare Zusammenarbeit bedanken.
Ganz besonders großer Dank gilt meinen drei Diplomandinnen Neha Garg, Alida Nooke und
Lisa Schumacher, die maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Auch bei
Anna Clemens, die ich während ihres Forschungspraktikums betreuen durfte, möchte ich
mich aufs aller Herzlichste bedanken.
Darüber hinaus bedanke ich mich bei Frau Astrid Müller-Klauke für ihre Unterstützung bei
IR- und NMR-Messungen. Herrn Jörg Nissen vom ZELMI Berlin danke ich für die
Durchführung der REM-Messungen.
Zudem danke ich meinen lieben Kollegen für die sehr nette Arbeitsatmosphäre. Besonderer
Dank für zahlreiche fachliche Diskussionen und vor allem für seelische Unterstützung gilt
Andy Maraite, Valantina Yazbik, Juliane Ratzka und Anja Wilming.
Meinen Eltern schulde ich tiefen Dank für die fortwährende moralische und finanzielle
Unterstützung während meiner gesamten naturwissenschaftlichen Ausbildung. Auch meinen
Freunden und meinem Freund gegenüber bin ich zu großem Dank verpflichtet. Es tut gut zu
wissen, dass mich viele Menschen auch in schweren Zeiten unterstützen und an meiner Seite
bleiben.
Inhalt I
Inhaltsverzeichnis
TEIL 1 BEREITSTELLUNG DER BIOKATALYSATOREN LAC, LiP UND MnP FÜR
DEREN CHEMISCH-TECHNISCHE NUTZUNG 1
1. EINLEITUNG 1
1.1
Lignin als nachwachsender Rohstoff 1
1.2
Ligninstruktur 2
1.3
Ligninabbau 4
1.3.1
Chemischer Abbau 5
1.3.2
Enzymatischer Abbau 7
1.4
Expressionssysteme Lignin abbauender Enzyme 11
1.5
Zielsetzung 16
2. MATERIAL UND METHODEN 18
2.1
Materialien 18
2.1.1
Chemikalien und Enzyme 18
2.1.2
Stämme und Plasmide 19
2.1.3
Primer 20
2.2
Methoden 22
2.2.1
Langzeitlagerung der Pilze Cyathus bulleri und Phanerochaete chrysosporium 22
2.2.2
Kultivierung der Pilze unter ligninolytischen Bedingungen 23
2.2.3
RNA Isolation 24
2.2.4
Amplifikation der Zielgensequenzen 24
2.2.5
Klonierung der Zielgene in den Replikationsvektor pCR4-TOPO 28
2.2.6
Klonierung der Zielgene in die entsprechenden Hefe-Shuttle-Vektoren und deren Trans-
formation in E. coli bzw. die entsprechenden Hefeexpressionsstämme 28
2.2.7
Expression der Zielenzyme 31
2.2.8
Aktivitätstests 34
2.2.9
Laccasecharakterisierung 36
2.2.10
Sonstige Methoden 37
3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 39
3.1
Expression der Laccase aus Cyathus bulleri in Pichia pastoris 39
3.1.1
Ermittlung der Laccasesequenz 40
3.1.2
Klonierung des Laccasegens 41
3.1.3
Expression der Laccase in Pichia pastoris 42
3.1.4
Charakterisierung der rekombinanten Laccase 44
3.1.5
Zusammenfassung 59
3.2
Expression der Ligninperoxidase aus Phanerochaete chrysosporium in Pichia methanolica und
Pichia pastoris 61
3.2.1
Klonierung und Expression der Ligninperoxidase in Pichia methanolica 61
3.2.2
Klonierung und Expression der Ligninperoxidase in Pichia pastoris 65
3.2.3
Zusammenfassung 68
Inhalt I
3.3
Expression der Manganperoxidase aus Phanerochaete chrysosporium in Kluyveromyces lactis 71
3.3.1
Klonierung des Manganperoxidasegens in K. lactis 72
3.3.2
Expression der Manganperoxidase in K. lactis 73
3.3.3
Zusammenfassung 75
3.4
Ausblick 77
4. ANHANG 79
5. LITERATURVERZEICHNIS 84
TEIL 2 PRÄPARATION DER BAL FÜR DEREN CHEMISCH-TECHNISCHE
NUTZUNG 96
1. EINLEITUNG 96
1.1
Bedeutung enantiomerenreiner α-Hydroxyketone 96
1.2
Synthese chiraler α-Hydroxyketone 97
1.2.1
Chemische Synthese 97
1.2.2
Biokatalytische Synthese 100
1.3
Reaktionssysteme für den Einsatz organischer Lösungsmittel 104
1.3.1
Einphasensystem 105
1.3.2
Zweiphasensystem 106
1.3.3
Gelstabilisiertes Zweiphasensystem 107
1.4
Zielsetzung 108
2. MATERIAL UND METHODEN 110
2.1
Materialien 110
2.1.1
Chemikalien 110
2.1.2
Katalysatoren 111
2.1.3
Geräte 113
2.2
Methoden 113
2.2.1
Herstellung der PVA/PEG-Immobilisate 113
2.2.2
Analyse der PVA/PEG-Immobilisate 114
2.2.3
BAL-Aktivitätstests 116
2.2.4
Bestimmung der Verteilungskoeffizienten 117
2.2.5
Reaktionsansätze der (R)-2,2’-Furoinsynthese im kontinuierlichen Wirbelschichtreaktor 118
2.2.6
Berechnung der Reaktionsparameter im kontinuierlichen Wirbelschichtreaktor 119
2.2.7
Synthese von 4,4’-Dibrombenzoin für die Suzuki-Kupplung 120
2.2.8
Reaktionsansätze der Suzuki-Kupplung 120
2.2.9
Charakterisierung der BAL-katalysierten Carboligation für die Eintopfsynthese 121
2.2.10
Einfluss der Phenylboronsäure auf die BAL-Aktivität 122
2.2.11
Reaktionsansätze der Eintopfsynthese von (R)-4,4’-Biphenylbenzoin 123
2.2.12
Analytik 123
3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 127
3.1
Automatisierte Produktion von PVA/PEG-Immobilisaten im Labormaßstab 127
Inhalt I
3.1.1
Aufbau der Apparatur und Produktion der PVA/PEG-Immobilisate 129
3.1.2
Größe und Form der PVA/PEG-Immobilisate 130
3.1.3
Gelmorphologie 133
3.1.4
Diffusionsverhalten des Additivs PEG 1000 134
3.1.5
Zusammenfassung 136
3.2
Optimierung der BAL-katalysierten (R)-2,2’-Furoinsynthese 137
3.2.1
Lösungsmittelwechsel 138
3.2.2
BAL-Variante 146
3.2.3
Zusammenfassung 150
3.3
Chemoenzymatische Eintopfsynthese von (R)-4,4’-Biphenylbenzoin durch Kombination Pd-
katalysierter Kreuzkupplung und BAL-katalysierter Carboligation 152
3.3.1
Suzuki-Kupplung 152
3.3.2
Charakterisierung der BAL-katalysierten Carboligation 154
3.3.3
Einfluss der Phenylboronsäure auf die BAL-Aktivität 156
3.3.4
Kombination der Pd-katalysierten Suzuki-Kupplung und der BAL-katalysierten
Carboligation 158
3.3.5
Zusammenfassung 159
3.4
Ausblick 162
4. LITERATURVERZEICHNIS 164
Verzeichnisse II
Abbildungsverzeichnis
Teil 1 Bereitstellung der Biokatalysatoren LAC, LiP und MnP für deren chemisch-
technische Nutzung
Abbildung 1.1. Monomere Phenylpropanoidstruktureinheiten des Lignins. 3
Abbildung 1.2. Strukturmodell von Weichholzlignin aus Fichten. 4
Abbildung 1.3. Schema des Katalysezyklus der Ligninperoxidase (LiP). 9
Abbildung 1.4. Schema des Katalysezyklus der Manganperoxidase (MnP). 10
Abbildung 1.5. Schema des Katalysezyklus der Laccase. 11
Abbildung 3.1. Verlauf der volumetrischen Laccaseaktivität, der optischen Dichte (OD) und der
Gesamtproteinkonzentration im Medium während der heterologen Expression der Laccase aus Cyathus bulleri
in P. pastoris. 43
Abbildung 3.2. SDS-Gelelektrophorese der über Gelfiltration partiell aufgereinigten rekombinanten Laccas 45
Abbildung 3.3. pH-Optimumskurve der rekombinant in P. pastoris exprimierten Laccase aus C. bulleri. 47
Abbildung 3.4. Relative Aktivität der rekombinanten Laccase in Abhängigkeit von der Ionenstärke der NaCl-
Lösung. 53
Abbildung 3.5. Relative Restaktivität der rekombinant in P. pastoris exprimierten Laccase aus C. bulleri in
Abhängigkeit von der Zeit bei Inkubation in reinem Wasser (Rauten), 50% (v/v) Wasser/DMSO (Quadrate),
50% (v/v) Wasser/Ethanol (Dreiecke), 50% (v/v) Wasser/Aceton (Kreise) bzw. 50% (v/v) Wasser/THF
(Balken) bei 4 °C. 56
Abbildung 3.6. Agarosegelelektrophorese der PCR–Produkte aus der Colony-PCR mit ausgewählten Pichia
pastoris Klonen. 67
Abbildung 3.7. Agarosegelelektrophorese der PCR–Produkte aus der Colony-PCR mit ausgewählten K. lactis
Klonen. 73
Abbildung 3.8. SDS-Gel Analyse der Zellaufschlüsse von K. lactis Klonen und Negativkontrollen und von
den jeweiligen Kulturüberständen nach Kultivierung unter Expressionsbedingungen. 74
Abbildung 4.1. Identifizierte Nukleotidsequenz (GenBank Database accession number EU195884) der
Laccase aus Cyathus bulleri. 79
Abbildung 4.2. Vektorkarte der Pichia pastoris Hefeexpressionsvektoren pPICZA, B und C und pPICZαA,
B und C (Invitrogen). 80
Abbildung 4.3. Vektorkarte des Hefeexpressionsvektors pMETαA, B und C (Invitrogen). 80
Abbildung 4.4. Nukleotidsequenz des LipH8-Gens kloniert in den pMETαA Hefeexpressionsvektor. 81
Abbildung 4.5. Nukleotidsequenz des LipH8-Gens kloniert in den pPICZαA Hefeexpressionsvektor. 81
Abbildung 4.6
.
Vektorkarte des pKLAC1 Hefe-Shuttle-Vektors (NewEngland BioLabs). 82
Abbildung 4.7. Sequenzierung des pKLAC1/MnP Plasmids vom Startcodon des α-Mating Sekretionssignals
bis zum natürlichen Stoppcodon des Gens. 83
Teil 2 Präparation der BAL für deren chemisch-technische Nutzung
Abbildung 1.1. Schematischer Überblick über chemische Synthesemöglichkeiten von α–Hydroxyketonen. 97
Abbildung 1.2. Benzaldehydlyase (BAL)-katalysierte Spaltung und Bildung von (R)-Benzoin. 104
Abbildung 2.1. Reaktionsschema des gekoppelten Aktivitätstest der BAL. 116
Abbildung 3.1. Aufbau der Apparatur zur automatisierten Produktion von PVA/PEG-Immobilisaten. 130
Abbildung 3.2. Größenverteilung der automatisch produzierten PVA/PEG-Immobilisate in Abhängigkeit 131
von der Öffnungszeit der Düse.
Abbildung 3.3. REM-Aufnahmen der automatisch produzierten PVA/PEG-Kugeln. 133
Abbildung 3.4. IR-Spektrum von reinem Wasser (blau) und der wässrigen Phase nach 2-stündiger 135
Inkubation von PVA/PEG-Immobilisaten darin (pink).
Abbildung 3.5. Reaktionsschema der BAL-katalysierten Carboligation von 2-Furaldehyd zu (R)-2,2’-Furoin.137
Verzeichnisse II
Abbildung 3.6. Kontinuierlich betriebener Wirbelschichtreaktor mit PVA/PEG-BAL-Immobilisaten. 141
Abbildung 3.7. Prozentuale Umsätze der BAL-katalysierten (R)-2,2’-Furoinsynthese im gelstabilisierten
Zweiphasensystem mit n-Hexan, MTBE, MIBK und 2-Methyl-THF als Lösungsmittelphase in Abhängigkeit
von der Zeit. 142
Abbildung 3.8. Prozentuale Umsätze der (R)-2,2’-Furoinsynthese im gelstabilisierten Zweiphasensystem mit
MTBE als Lösungsmittelphase und der nativen BAL (Rauten) bzw. der BAL-Variante(V175N, I176D, I177T)
(Quadrate) als Katalysator in Abhängigkeit von der Reaktionsdauer. 148
Abbildung 3.9. Reaktionsschema der chemoenzymatischen Eintopfsynthese von (R)-4,4’-Biphenylbenzoin
durch Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kupplung und der anschließenden BAL-katalysierten
Carboligation. 152
Abbildung 3.10. Strukturformel des Bis-(triphenylphosphin)-palladiumdichloridkatalysators. 153
Abbildung 3.11. Mechanismus der Disproportionierung arylischer Aldehyde bei hoher Temperatur und in
Gegenwart starker Basen nach Cannizzaro [1853]. 154
Abbildung 3.12. Reaktionsschema der chemoenzymatischen Eintopfsynthese von (R)-4,4’-Biphenylbenzoin
mit der BAL-katalysierten Carboligation im ersten Schritt und nachfolgender Pd-katalysierten Suzuki-
Kupplung. 156
Abbildung 3.13. Relative Aktivität der BAL in Abhängigkeit verschiedener Phenylboronsäurekonzen-
trationen (19,0 mmol L
-1
; 37,0 mmol L
-1
; 75,0 mmol L
-1
und 150 mmol L
-1
). 157
Verzeichnisse II
Tabellenverzeichnis
Teil 1 Bereitstellung der Biokatalysatoren LAC, LiP und MnP für deren chemisch-
technische Nutzung
Tabelle 2.1. Bezeichnung und Nukleotidsequenzen aller Primer, die bei der Laccaseklonierung eingesetzt
wurden. 20
Tabelle 2.2. Bezeichnung und Nukleotidsequenzen aller Primer, die bei der LiP-Klonierung eingesetzt
wurden. 21
Tabelle 2.3. Bezeichnung und Nukleotidsequenzen aller Primer, die bei der MnP-Klonierung eingesetzt
wurden. 21
Tabelle 2.4. Temperaturprogramm der Touchdown PCR zur Identifizierung der 5´- und 3´-Enden des
Laccasegens aus Cyathus bulleri. 26
Tabelle 2.5. Temperaturprogramm der PCR zur Amplifikation des Laccasegens aus C. bulleri. 27
Tabelle 2.6. Temperaturprogramm der Amplifikation des LiP- und des MnP-Gens aus P. chrysosporium. 28
Tabelle 2.7. Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels für die SDS-Page Gelelektrophorese. 38
Tabelle 3.1. Halbwertszeiten der in P. pastoris rekombinant produzierten Laccase aus C. bulleri. 49
Tabelle 3.2. Vergleich der Halbwertszeiten (t
1/2
) der in P. pastoris rekombinant exprimierten und der nativen
Laccase aus C. bulleri bei Temperaturen zwischen 25 und 80 °C. 51
Tabelle 3.3. Halbwertszeiten der rekombinanten Laccase bei Inkubation in NaCl-Lösungen verschiedener
Ionenstärke bei 4 °C. 54
Tabelle 3.4. Halbwertszeiten der rekombinanten Laccase bei Inkubation in reinem Wasser, 50% (v/v)
Wasser/DMSO, 50% (v/v) Wasser/Aceton, 50% (v/v) Wasser/Ethanol Gemischen bei 4 °C. 58
Teil 2 Präparation der BAL für die chemisch-technische Nutzung
Tabelle 2.1. Parameter der GC-Benzoin-Analyse. 124
Tabelle 2.2. Parameter der HPLC-Analyse zur Bestimmung des Umsatzes der 2,2’-Furoinsynthese. 124
Tabelle 2.3. Parameter der HPLC-Analyse zur Bestimmung des Enantiomerenüberschuss der 2,2’-Furoin-
synthese. 125
Tabelle 2.4. Parameter der HPLC-Analyse zur Bestimmung der Ausbeuten bei der Eintopfsynthese von
4,4’-Biphenylbenzoin. 125
Tabelle 2.5. Parameter der HPLC-Analytik zur Bestimmung des ees der Eintopfsynthese von
(R)-4,4’-Biphenylbenzoin. 126
Tabelle 3.1. Verteilungskoeffizienten P des Substrats 2-Furaldehyd in wässrig/organischen Zweiphasen-
systemen mit n-Hexan, MTBE bzw. MIBK als Lösungsmittelphase. 139
Tabelle 3.2. Verteilungskoeffizienten P des Produktes 2,2’-Furoin in wässrig/organischen Zweiphasen-
systemen mit n-Hexan, MTBE bzw. MIBK als Lösungsmittelphase. 140
Tabelle 3.3. Halbwertszeiten der BAL beim Einsatz im gelstabilisierten Zweiphasensystem mit n-Hexan,
MTBE, MIBK und 2-Methyl-THF als Lösungsmittel im kontinuierlichen Wirbelschichtreaktor. 145
Verzeichnisse II
Abkürzungsverzeichnis
AAO Aryl-Alkoholoxidase
ABTS 2,2’-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonat)
ADH Alkoholdehydrogenase
Amp Ampicillin
A. niger Aspergillus niger
APS Ammoniumpersulfat
BAL Benzaldehydlyase
BFD Benzoylformiatdecarboxylase
BMDY Buffered Dextrose-complex Medium
BMGY Buffered Glycerol-complex Medium
BMMY Buffered Methanol-complex Medium
bp basepair
CAI Codon Adaptation Index
C. bulleri Cyathus bulleri
CDH Cellobiosedehydrogenase
cDNA copy DNA
CIP Calf Intestinal Phosphatase
DCM Dichlormethan
DH Dehydrogenase
DKR Dynamisch kinetische Racematspaltung
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleic Acid
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
E. coli Escherichia coli
EC Enzyme Commission
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ee enantiomeric excess (Enantiomerenüberschuss)
FPLC Fast protein liquid chromatography
FTIR Fourier-Transformations-Infrarotspektrometrie
Verzeichnisse II
G Guaiacylrest
g Erdschwerebeschleunigung
GC Gas chromatography
GLOX Glyoxaloxidase
h Stunde (engl. hour)
H p-Hydroxyphenylrest
HBT Hydroxybenzotriazol
HL-ADH Horse Liver-Alcohol Dehydrogenase
HPLC High preformance liquid chromatography
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
k Inaktivierungskoeffizient [1/h]
Kan Kanamycin
kb Kilobasen
kDa Kilodalton
L Liter
LAC Laccase
LB Luria Bertani
LiP Ligninperoxidase
MD Minimal Dextrose Medium
MDH Minimal Dextrose Histidin Medium
MG Molekulargewicht
MIBK Methylisobutylketon
min Minute
mL Milliliter
mM Millimolar
MM Minimal Methanol Medium
MMH Minimal Methanol Histidin Medium
MnP Manganperoxidase
ms Millisekunde
NMR Kernspinresonanz (nuclear magnetic resonance)
OD Optische Dichte
OX Oxidase
Verzeichnisse II
PCB Polychlorierte Biphenyle
PCR Polymerase Chain Reaction
Pd Palladium
PDC Pyruvatdecarboxylase
PEG Polyethylenglycol
P. chrysosporium Phanerochaete chrysosporium
P. pastoris Pichia pastoris
P. methanolica Pichia methanolica
Ppm parts per million
PVA Polyvinylalkohol
RACE-PCR Rapid Amplification of cDNA ends with Polymerase Chain Reaction
REM Rasterlektronenmikroskopie
RNA Ribonucleic Acid
rRNA ribosomal ribonucleic Acid
mRNA messenger ribonucleic acid
Rpm Rounds per minute
RT Reverse Transkriptase
s Sekunde
S Syringylrest
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
T Temperatur
t
1/2
Halbwertszeit [h]
TAE Tris-Acetat-EDTA
TAP Tobacco Acid Pyrophosphatase
TEMED Tetramethyletylendiamin
THF Tetrahydrofuran
Tris Tris(hydroxymethyl-)aminomethan
T. versicolor Trametes versicolor
T. reesei Trichoderma reesei
U Unit (Einheit)
V Volumen
Verzeichnisse II
V Volt
Vol. Aktivität volumetrische Aktivität [U/mL]
v/v volume/volume
w/v weight/volume
YPD Yeast Extract Peptone Dextrose Medium
YPGal Yeast Peptone Galaktose Medium
Formelzeichen
A Aktivität [U]
c Konzentration [mol L
-1
]
d Schichtdicke der Küvette [cm]
ee Enantiomerenüberschuss [%]
∆E Extinktionsänderung [min
-1
]
ε molarer Extinktionskoeffizient [M
-1
cm
-1
]
c Umsatz (conversion) [%]
d Schichtdicke [cm]
F Flussrate [L h
-1
]
V
Reaktor
Volumen des Reaktors [L]
P Verteilungskoeffizient
[R] Konzentration des (R)-Enantiomers [mol L
-1
]
[S] Konzentration des (S)-Enantiomers [mol L
-1
]
τ Verweilzeit [h]
Einleitung Teil 1
1
Teil 1 Bereitstellung der Biokatalysatoren LAC, LiP und MnP für
deren chemisch-technische Nutzung
1. Einleitung
1.1 Lignin als nachwachsender Rohstoff
Wälder repräsentieren ungefähr 27% der Erdoberfläche und Holz ist das vorherrschende
daraus kommerziell genutzte Produkt. Der weltweite Holzverbrauch stieg von 1960 bis 1995
insgesamt um 60% auf über 3,3 Milliarden m
3
an und belief sich im Jahr 2002 bereits auf 4,4
Milliarden m
3
pro Jahr. Heute, im Jahr 2010, werden jährlich weltweit 5,3 Milliarden m
3
Holz
geerntet, was einer erneuten Steigerung der Holznachfrage um 60% in nur 15 Jahren
entspricht. Bisher werden mehr als 50% des geernteten Rohstoffs lediglich als Brennstoff
genutzt. Die verbleibenden ~50% der jährlichen Holzernte werden überwiegend für die
Herstellung von Papierprodukten und als Baumaterial verwendet [Martinez, Speranza et al.,
2005].
Cellulose, ein lineares, hoch strukturiertes, oft kristallines Polymer aus Cellobiose, ist der
Hauptbestandteil von Holz und macht insgesamt über 50% des Holzgewichtes aus. Der zweite
Holzhauptbestandteil ist das sehr komplexe, nicht-lineare Polymer Lignin, welches bei
Weichhölzern ~30% und bei Harthölzern ~20% des Trockengewichts ausmacht [Lanzalunga,
Bietti, 2000]. Die dritte strukturelle Komponente im Holz ist Hemicellulose, ein Polymer
mittlerer Komplexität aus verschiedenen, oftmals acetylierten Pentose- und
Hexosemonomeren. Des Weiteren finden sich nicht-strukturelle Komponenten im Holz, die
entweder mit organischen Lösungsmitteln extrahiert werden können (Extrakte) oder die
wasserlöslich sind, wie z. B. Zucker und Stärke. Zu den Extrakten gehören polare Substanzen,
wie Phenole und Tannine, und apolare Substanzen, wie Fette und Sterole. Weitere
Bestandteile sind Proteine und Asche. Die Summe der nicht-strukturellen Komponenten
machen durchschnittlich jedoch weniger als 5% des Holztrockengewichtes aus [Martinez,
Speranza et al., 2005].
Einleitung Teil 1
2
Lignin ist ein äußerst wichtiger nachwachsender Rohstoff, da es nach Cellulose die zweit
häufigste organische Substanz der Erde ist [Reale, Di Tullio et al., 2004]. Auch in der
Industrie fallen jährlich 30-50 Millionen Tonnen Lignin bei der Papierproduktion als
Abfallprodukt an
[
Reale, Di Tullio et al., 2004; Glasser, Kelley, 1987]. Somit stehen große
Mengen dieses kostengünstigen Rohstoffs für einen Prozess zur Verfügung, in dem es gelingt,
Lignin zu einem technisch wertvollen Produkt aufzuarbeiten. Im Gegensatz zur lang
bekannten und etablierten Hydrolyse isolierter Cellulosen und Hemicellulosen durch
Hydrolasen aus cellulolytischen und ligninolytischen Pilzen [Leonowicz, Matuszewska et al.,
1999] gibt es bisher jedoch kaum einen industriell etablierten Ligninabbauprozess. Der
ungleich kompliziertere Ligninaufschluss ist mit der hoch komplexen, im Unterschied zu
Cellulosen und Hemicellulosen unregelmäßigen Struktur des Polymers zu begründen.
1.2 Ligninstruktur
Obwohl seit den 40er Jahren intensiv an der Strukturaufklärung von Lignin gearbeitet wird,
ist es bis heute nicht gelungen diese vollständig aufzuklären [Holtman, Chang et al., 2003].
Dies liegt daran, dass es nicht möglich ist, Lignin von den übrigen Holzkomponenten zu
isolieren, ohne dabei dessen Struktur zu verändern [Reale, Di Tullio et al., 2004]. Bewiesen
ist jedoch, dass Lignin in situ ein amorphes Polymer ist, das aus dimethoxylierten (Syringyl,
S), monomethoxylierten (Guaiacyl, G) und nicht-methoxylierten (p-Hydroxyphenyl, H)
Phenylpropanoidvorstufen (s. Abb. 1.1), die über verschiedene Kohlenstoff-Kohlenstoff und
Etherbindungen miteinander verknüpft sind, besteht [Lewis, Yamamoto, 1990; Lanzalunga,
Bietti, 2000; Reale, Di Tullio et al., 2004].
Einleitung Teil 1
3
2
3
2
1
2
3
4
5
6
α
β
γ
3
3
2
Abbildung 1.1. Monomere Phenylpropanoidstruktureinheiten des Lignins.
Von links nach rechts: p-Hydroxyphenylrest (H), Guaiacylrest (G), Syringylrest (S) und ein Modell für die
Nummerierung des Kohlenstoffgerüsts.
Das Lignin-typische heterogene Bindungsmuster der drei Phenylpropanoidmonomere ist in
Abbildung 1.2 dargestellt. Das gezeigte Ligninstrukturmodell wurde 1968 von Freudenberg
und Neish erstellt und ist bis heute fast allgemein akzeptiert.
Trotz der starken Heterogenität des Ligninpolymers lässt es sich aufgrund typischer H:G:S
Verhältnisse in die drei Hauptgruppen Weichholzlignin, Hartholzlignin und Graslignin
einteilen [Higuchi, 1990]. Weichhölzer bestehen überwiegend aus Guaiacyl, Harthölzer aus
Guaiacyl und Syringyl. Grashölzer bestehen ebenfalls überwiegend aus Guaiacyl und
Syringyl, allerdings kann hier auch ein geringer Gehalt an p-Hydroxyphenylen detektiert
werden [Reale, Di Tullio et al., 2004].
Einleitung Teil 1
4
Abbildung 1.2.
Strukturmodell von Weichholzlignin aus Fichten.
Mit freundlicher Genehmigung des Springer Verlags aus Freudenberg und Neish [1968] übernommen.
1.3 Ligninabbau
Aufgrund des heterogenen Bindungsmusters des Ligninpolymers (s. 1.2), ist dieses gegenüber
mikrobiellem Abbau sehr resistent. Auch die Spaltung des Polymers in seine Phenyl-
propanoidmonomere auf chemischem Wege ist schwierig, da vor allem die verschiedenen
Etherbindungen chemisch resistent sind [Reale, Di Tullio et al., 2004]. Dennoch gibt es
sowohl Möglichkeiten Lignin auf mikrobiologischem als auch auf chemischem Wege
abzubauen bzw. zu modifizieren.
Einleitung Teil 1
5
1.3.1 Chemischer Abbau
Der technische Ligninabbau spielt vor allem bei der Papier- und Zellstoffproduktion eine
wichtige Rolle. Die chemische Separation des Lignins von Cellulose, die anschließend weiter
verarbeitet wird, ist einer der komplexesten Prozesse in der Pulp- und Papierindustrie.
Aufschlussprozesse des Lignocellulosekomplexes lassen sich generell in zwei Hauptklassen
aufteilen, die mechanische und die chemische Methode. Während es beim mechanischen
Aufschluss zu keiner Abtrennung des Lignins kommt, werden dagegen im chemischen
Aufschluss durch teilweisen Abbau und Lösung des Lignins von der Holzzellwand
Cellulosefasern frei gesetzt. Allerdings ist hier die Ausbeute mit 40 bis 50% generell niedrig
und es werden umweltschädliche Chemikalien und hohe Prozessdrücke und -temperaturen
eingesetzt [Lanzalunga, Bietti, 2000]. Der chemische Ligninabbau lässt sich grundsätzlich in
vier Hauptverfahren, das Sulfit- und Sulfatverfahren, das Sodaaufschlussverfahren und das
Solventverfahren (Organosolv), einteilen [Blechschmidt, 2009].
Sulfitaufschlussverfahren
Der Sulfitaufschluss ist das historisch älteste Verfahren nach dem aus Holz Zellstoff
gewonnen wird. Das wirksame Agens aller Sulfitverfahren ist Schwefeldioxid (SO
2
), das in
Wasser als Schwefelsäure (H
2
SO
3
) vorliegt und mit den dissoziierten Anionen HSO
31-
und
SO
32-
in einem pH-Wert abhängigen Gleichgewicht steht. Der pH-Wert des Aufschlusses
kann durch das Mengen-Verhältnis Säure zu Base zwischen stark sauer bis stark basisch
eingestellt werden. Daher lassen sich Sulfitaufschlussverfahren je nach pH-Bereich in den
sauren, den neutralen und den alkalischen Aufschluss einteilen. Beim sauren Aufschluss-
verfahren wird Calcium (CaO bzw. Ca(OH)
2
), beim neutralen Aufschluss Magnesium oder
Ammonium (NH
3
bzw. NH
4
OH) und beim alkalischen Prozess Natrium (NaOH) als Base
eingesetzt. Der Sulfitaufschluss führt zur Sulfonierung von Ligninbausteinen, wobei das
Bisulfition am α-C-Atom angreift. Dadurch kommt es sowohl zur Einführung hydrophiler
Gruppen als auch zur Fragmentierung der Ligninmakromoleküle über Lösung der
Etherbindungen am α-C-Atom [Blechschmidt, 2009].
Einleitung Teil 1
6
Sodaaufschlussverfahren
Der Sodaaufschluss gehört zu den chemischen Teilaufschlüssen, weil es nicht gelingt, Holz
vollständig zu delignifizieren. Heute wird trotz der Bezeichnung als Sodaverfahren meist die
stärkere Base Natronlauge anstelle von Natriumcarbonat (Soda) als Aufschlussreagenz
eingesetzt. Das Pflanzenmaterial wird zunächst mit Natronlauge imprägniert und
anschließend einige Stunden bei 160-170 °C unter dem sich im Reaktionsgefäß einstellenden
Druck gekocht. Unter diesen Bedingungen werden Protonen der phenolischen
Hydroxylgruppen der Phenylpropanoidmonomere abgespalten, so dass Phenolatgruppen
entstehen. Durch diese Ionisierung der phenolischen OH-Gruppen wird ein Teil der
Vernetzung im Lignin gelöst. Neben den Hydroxylgruppen können auch Methoxylgruppen
der Ligninmonomere zu Phenolatgruppen gespalten werden. Dabei entsteht Methanol als
Abbauprodukt, welches ein relativ gutes Lösungsmittel für Lignin ist und somit das
Herauslösen des Lignins aus dem Lignocellulosekomplex unterstützt. Zusätzlich werden
während dieses Prozesses Etherbindungen am α-C-Atom der Phenylpropanoideinheiten
teilweise hydrolytisch gespalten. Der Sodaaufschluss gelingt jedoch nur bei wenig verholzten
Pflanzengeweben, wie sie z. B. in Einjahrespflanzen vorkommen [Blechschmidt, 2009].
Sulfataufschlussverfahren
Das Sulfatverfahren wird auch Kraftverfahren genannt, weil hierbei besonders fester Zellstoff,
der sogenannte Kraftzellstoff, entsteht. Dieser findet vor allem in Papier als Verstärkungsfaser
Anwendung. Dieses Aufschlussverfahren findet analog zum Sodaaufschlussverfahren unter
Verwendung von Natronlauge bei einem stark basischen pH-Wert und einer Temperatur von
170 °C statt. Im Gegensatz zum reinen Sodaverfahren wird jedoch neben der Natronlauge
Natriumsulfid als Aufschlussreagenz eingesetzt, wobei die durch Hydrolyse entstehenden
Hydrogensulfidionen das eigentliche Aufschlussagens darstellen. Der Name Sulfataufschluss
ist daher irreführend, weil als Aufschlusschemikalie Sulfid und nicht Sulfat wirkt. Im
Vergleich zum reinen Sodaprozess verläuft bei Anwesenheit der sehr nukleophilen
Hydrogensulfidionen die Spaltungsreaktion am Lignin wesentlich schneller und effektiver. Es
findet eine bedeutend bessere Delignifizierung statt. Neben der Spaltung von Etherbindungen
am α-C-Atom, können im Sulfatverfahren zusätzlich Etherbindungen am β-C-Atom gespalten
werden. Sogar Methoxylgruppen können unter Bildung von Methylmercaptan abgespalten
werden, was allerdings eine unerwünschte Nebenreaktion ist, weil sie auch zur Bildung der
Einleitung Teil 1
7
sehr intensiv nach Schwefelwasserstoff riechenden und giftigen Verbindungen Dimethylsulfid
und Dimethyldisulfid führen kann [Blechschmidt, 2009].
Lösungsmittelaufschlussverfahren (Organosolv-Verfahren)
Als Lösungsmittel- oder Organosolv-Verfahren bezeichnet man Holzaufschluss-Prozesse, bei
denen organische Lösungsmittel eingesetzt werden, die bevorzugt Lignin lösen. Im
einfachsten und ökologisch unbedenklichsten Verfahren werden Alkohole (Methanol und
Ethanol) (50%) als Lösungsmittel eingesetzt. Durch Kochen in den niedrig siedenden
Alkoholen wird das Ligninpolymer geringfügig hydrolysiert und zumindest teilweise im
Alkohol gelöst. Das Organosolv-Verfahren eignet sich besonders zum Aufschluss von
Laubhölzern. Nadelhölzer können dagegen kaum aufgeschlossen werden [Blechschmidt,
2009].
1.3.2 Enzymatischer Abbau
Der Abbau von Lignocellulose ist ein zentraler Schritt in der Rückgewinnung des
Kohlenstoffs im terrestrischen Ökosystem und im Gegensatz zu chemischen Abbaumethoden
kann Lignin auf biokatalytischem Wege vollständig zu CO
2
assimiliert werden. Hierbei sind
Weißfäulepilze mit Abstand die schnellsten und effektivsten delignifizierenden
Mikroorganismen. Sie können Lignin unter optimalen Bedingungen mit einer Ausbeute von
50-70% zu CO
2
assimilieren [Tuomela, Vikman et al., 2000]. Die meisten Weißfäulepilze
gehören zu den Basidiomyceten und können sowohl Hartholz als auch Weichholz abbauen
[Kirk, Farrell, 1987]. Die ligninolytische Aktivität der Weißfäulepilze tritt im Sekundär-
metabolismus als Folge von Stickstoff- und Kohlenstofflimitierung auf [Brown, 1985; Kirk,
Farrell, 1987]. Generell muss zwischen selektiver und nicht-selektiver Delignifikation
unterschieden werden. Bei der selektiven Delignifikation kommt es zum Abbau von Lignin
ohne erheblichen Celluloseabbau, während bei der nicht-selektiven Delignifikation alle
Hauptkomponenten der Zellwand abgebaut werden [Eriksson, Blanchette et al., 1990;
Blanchette, 1995]. Zu den am besten untersuchten Weißfäulepilzen gehören Phanerochaete
chrysosporium, der Lignin selektiv abbaut und Trametes versicolor, der Lignin nicht-selektiv
abbaut [Hatakka, 1994].
Einleitung Teil 1
8
Neben den Weißfäulepilzen spielen auch Braunfäulepilze bei der Holzmineralisierung eine
Rolle. Diese können zwar Cellulosen und Hemicellulosen vollständig abbauen, der
Ligninabbau ist jedoch stark limitiert [Buswell, Odier, 1987; Kirk, Farrell, 1987]. Insgesamt
machen Braunfäulepilze, die hauptsächlich Weichhölzer befallen, nur 6% aller
ligninolytischen Basidiomyceten aus [Rayner, Boddy, 1988]. Eine weitere Gruppe
ligninabbauender Pilze sind die Knollennassfäulepilze, die zu den Ascomyceten oder
Deuteromyceten gehören. Sie können sowohl Weichhölzer als auch Harthölzer assimilieren,
allerdings im Vergleich zu Weiß- und Braunfäulepilzen nur zu einem minimalen Grad
[Eriksson, Blanchette et al., 1990]. Auch einige wenige Bakterien, die zu den Actinomyceten
oder Myxobakterien gehören wie z. B. Streptomyces und Pseudomonas, können Lignin aus
dem Lignocellulosekomplex herauslösen und zumindest teilweise langsam verstoffwechseln.
Im Gegensatz zu den Weißfäulepilzen bauen sie Lignin nicht im Sekundär-, sondern im
Primärmetabolismus ab [Eriksson, Blanchette et al., 1990; Godden, Ball et al., 1992].
Alle ligninolytischen Mikroorganismen bauen Lignin mithilfe von oxidativen Enzymen
(Oxidoreduktasen) ab. Aufgrund der Beschaffenheit und Größe des Ligninmoleküls müssen
die Oxidoreduktasen extrazellulär vorliegen und eine relativ unspezifische Aktivität
vorweisen [Kirk, Farrell, 1987; Hatakka, 1994]. Die drei am besten untersuchten und
wichtigsten extrazellulären Enzyme, die an der Delignifikation beteiligt sind, sind die
Ligninperoxidase (LiP; EC 1.11.1.14), die Manganperoxidase (MnP; EC 1.11.1.13) und die
Laccase (LAC; EC 1.10.3.2). Im Folgenden werden diese drei Oxidoreduktasen genauer
betrachtet.
Ligninperoxidase und Manganperoxidase
Die Ligninperoxidase und die Manganperoxidase wurden Anfang der 80er Jahre erstmals in
P. chrysosporium identifiziert [Tien, Kirk, 1983; Glenn, Morgan et al., 1983]. Beide
Glykoproteine gehören zu den Hämperoxidasen, sind zwischen 40-50 kDa groß und
benötigen Wasserstoffperoxid (H
2
O
2
) als Elektronenakzeptor. Zwischen beiden Peroxidasen
liegt eine Sequenzsimilarität von ~57% vor und auch die Reaktionsmechanismen sind sehr
ähnlich.
Einleitung Teil 1
9
Da die LiP ein höheres Redoxpotential als die MnP aufweist [Vares, 1996], katalysiert sie
sowohl die Oxidation phenolischer als auch nicht-phenolischer Phenylpropanoideinheiten,
wobei letztere ~90% des Lignins ausmachen und ein sehr hohes Redoxpotential von 1,4 V
aufweisen [Martinez, Speranza et al., 2005; Blodig, Smith et al., 2001]. Der
Katalysemechanismus der Häm enthaltenden LiP beginnt mit der Oxidation des Enzyms
durch H
2
O
2
zur Enzymkomponente I, die ein Zwei-Elektronen oxidiertes Intermediat darstellt.
In dieser Enzymkomponente I wird ein Oxidationsäquivalent als Oxo-Ferryl Spezies
[Fe(IV) = O]
2+
und das zweite Äquivalent entweder als Porphyrin π-Radikal (P
•
) oder als
Protein basiertes radikalisches Kation gespeichert [Choinowski, Blodig et al., 1999]. Das so
oxidierte Enzymintermediat I wird anschließend durch ein Substratmolekül zum zweiten
Enzymintermediat, der Ein-Elektronen oxidierten Komponente II, reduziert. Eine weitere
Reduktion der Enzymkomponente II in die Enzymausgangsform kann entweder durch
dasselbe oder aber ein weiteres Substratmolekül erfolgen. Die arylischen Substrate werden
dabei zu arylischen Kation-Radikalen (Ar
•
) oxidiert (s. Abb. 1.3) [Gold, Alic, 1993].
LiP-Fe(III)P + H
2
O
2
→ LiP-Fe(IV)=OP
•+
+ H
2
O (Komponente I)
LiP-Fe(IV)=OP
•+
+ ArH → LiP-Fe(IV)=OP + H
+
+ Ar
•
(Komponente II)
LiP-Fe(IV)=OP + H
+
+ ArH → LiP-Fe(III)P + H
2
O + Ar
•
Abbildung 1.3.
Schema des Katalysezyklus der Ligninperoxidase (LiP).
Die Abkürzungen P und Ar stehen für Porphyrin bzw. für das arylische Substrat.
Der Katalysemechanismus der zweiten Hämperoxidase, der MnP, verläuft analog zu dem der
LiP. Da die MnP jedoch ein niedrigeres Redoxpotential aufweist, oxidiert sie vornehmlich
phenolische Ligninbausteine, die niedrigere Redoxpotentiale als nicht-phenolische Lignin-
bestandteile haben. Nicht-phenolische Komponenten kann die MnP lediglich mithilfe
geeigneter Cooxidantien (Mediatoren), wie z. B. ungesättigten Fettsäuren und deren Derivate,
oxidieren. Es gibt Hinweise, dass sich ungesättigte Fettsäuren tatsächlich in der
Mikroumgebung von ligninolytischen Pilzen befinden [Enoki, Watanabe et al., 1999] und
dass solche Substanzen sogar im Holz selbst vorkommen [Hofrichter, Lundell et al., 2001].
Der Hauptunterschied zwischen den beiden Hämperoxidasen ist die Natur des reduzierenden
Substrates [Gold, Wariishi et al., 1989; Kirk, Farrell, 1987; Schoemaker, 1990]. Während die
LiP Lignineinheiten direkt oxidiert, oxidiert die MnP diese lediglich indirekt über freie
Einleitung Teil 1
10
Manganionen (Mn) [Gold, Wariishi et al., 1989; Paszczynski, Huynh et al., 1986]. Analog
zum LiP-Katalysemechanismus wird die MnP zunächst durch H
2
O
2
in einer Zwei-Elektronen-
Reaktion zur Enzymkomponente I (MnP I) oxidiert. Mn(II)-Ionen reduzieren anschließend
sowohl die Enzymkomponente I zu der Ein-Elektronen oxidierten Komponente II (MnPII) als
auch diese Enzymkomponente II (MnPII) zur Ausgangsform der MnP (s. Abb. 1.4).
MnP + H
2
O
2
→ MnPI + H
2
O Komponente I
MnPI + Mn(II) → MnPII + Mn(III) Komponente II
MnPII + Mn(II) → MnP + Mn(III) + H
2
O
Abbildung 1.4. Schema des Katalysezyklus der Manganperoxidase (MnP).
Die im Katalysezyklus der MnP zu Mn(III) oxidierten Manganionen oxidieren anschließend
wiederum die phenolischen Substrate zu Phenoxy-Radikalen und werden dabei selbst zurück
zu Mn(II)-Ionen reduziert. Organische Säuren wie Malonat und Oxalat, die von
Weißfäulepilzen sekretiert werden, stimulieren die MnP Reaktion, in dem sie die
entstehenden Mn(III) Ionen stabilisieren. Dadurch können sich diese von der
Enzymoberfläche lösen [Gold, Alic, 1993]. Im Ligninabbau kommt der MnP aufgrund dessen
eine wichtige Sonderrolle zu, da die freien Mn(III)-Ionen in das Makromolekül Lignin hinein
diffundieren können und es somit durch erste Modifikationen für die weiteren Peroxidasen
LiP und LAC zugänglich machen [Tuomela, Vikman et al., 2000].
Laccase
Im Gegensatz zur Li- und MnP ist die Laccase (MG 50-70 kDa) keine Hämperoxidase,
sondern eine Kupfer enthaltende Phenoloxidase. Ein weiterer Unterschied ist, dass die
Laccase anstelle von H
2
O
2
molekularen Sauerstoff als Elektronenakzeptor nutzt [Thurston,
1994]. Laccasen haben wesentlich niedrigere Redoxpotentiale (~0,5-0,8 V) als die LiP und
können daher, wie auch die MnP, lediglich Ligninkomponenten mit freien Phenolgruppen zu
Phenoxy-Radikalen oxidieren. Dies geschieht nicht, wie bei der Li- und MnP, über eine Zwei-
Elektronen, sondern über eine Ein-Elektronen Reaktion (s. Abb. 1.5).
Einleitung Teil 1
11
O
2
LAC(CuI) PhO
•
+ H
+
H
2
O LAC(CuII) PhOH
Abbildung 1.5. Schema des Katalysezyklus der Laccase.
PhOH steht für phenolisches Substrat, PhO•
.
für Phenoxyradikal.
In Gegenwart passender Mediatoren wie z. B. ABTS (2,2’-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-
sulfonat)) oder HBT (Hydroxybenzotriazol) können Laccasen auch einige nicht-phenolische
Komponenten oxidieren [Bourbonnais, Paice, 1990].
Allen beschriebenen Katalysemechanismen der drei Oxidoreduktasen ist gemeinsam, dass die
arylischen Reste im Ligninpolymer zu arylischen Kation-Radikalen oxidiert werden. Diese
Kation-Radikale führen im Ligninpolymer anschließend über nicht-enzymatisch kontrollierte
Reaktionen zur Spaltung verschiedener C-C- und Etherbindungen, wobei auch Ringöffnungen
stattfinden.
Weitere Enzyme
Weitere extrazelluläre Enzyme, die an der Delignifikation beteiligt sind, sind H
2
O
2
-
generierende Oxidasen und Myzelium assoziierte Dehydrogenasen, die aus Lignin gewonnene
Komponenten weiter reduzieren [Levasseur, Piumi et al., 2008]. Zu den H
2
O
2
-generierenden
Oxidasen gehören die Aryl-Alkoholoxidase (AAO; EC1.1.3.7), die aus Pleurotus eryngii und
anderen Pilzen isoliert wurde [Guillen, Martinez et al., 1992], und die Glyoxaloxidase
(GLOX; EC 1.2.3.5) aus P. chrysosporium [Kersten, 1990]. Eine typische Dehydrogenase, die
an der Lignin-mineralisierung beteiligt ist, ist die Aryl-Alkoholdehydrogenase (AAD; EC
1.1.190) [Gutierrez, Caramelo et al., 1994].
1.4 Expressionssysteme Lignin abbauender Enzyme
Die drei ligninolytischen Oxidoreduktasen LiP, MnP und LAC sind relativ
substratunspezifisch und bauen daher, neben dem interessanten nachwachsenden Rohstoff
Lignin, viele verschiedene chemische Substanzen wie chlorierte Phenole, Pestizide,
polychlorierte Biphenyle (PCBs), Dioxine, phosphoorganische Substrate, Nitrotoluole,
Chloraniline, Farbstoffe und weitere wichtige umweltschädliche Stoffe ab [Barr, Aust, 1994;
Einleitung Teil 1
12
Pointing, 2001; Reddy, 1995]. Obwohl die ligninolytischen Oxidoreduktasen daher von
großem biotechnologischen Interesse sind, sind technische Anwendungen bis heute
hauptsächlich aufgrund der mangelnden Verfügbarkeit der Enzyme stark limitiert.
Die kostenintensive Bereitstellung der Oxidoreduktasen aus Pilzen ist auf die schwierigen
Kultivierungs- und Expressionsbedingungen der Weißfäulepilze zurückzuführen [Ayala,
Pickard et al., 2008]. Weißfäulepilze exprimieren ligninolytische Enzyme generell im
Sekundärmetabolismus in der späten Tropho- und frühen Idiophase als Antwort auf
Kohlenstoff- und/oder Stickstoff- und/oder Schwefellimitierung. Die Wachstumsphase dauert
nach Inokulation der Kulturen 6 bis 10 Tage. Erst danach kann erste Enzymaktivität im
Medium nachgewiesen werden. Die Expressionsrate kann durch hohe Sauerstoff-
konzentrationen im Medium gesteigert werden. Da Weißfäulepilze in geschüttelten,
submersen Kulturen jedoch nur schwer zu kultivieren sind, müssen statische Kulturen täglich
mit reinem Sauerstoff begast werden [Kirk, Schultz et al., 1978; Faison, Kirk, 1985; Kirk,
Croan et al., 1986; Brown, Glenn et al., 1990]. Erschwerend kommt hinzu, dass die
extrazellulären ligninolytsichen Enzyme oft schon kurze Zeit nach Erreichen der maximalen
Proteinkonzentration durch pilzeigene Proteasen abgebaut werden. Zudem liegen alle drei
Oxidoreduktasen in ligninolytischen Pilzen als Serie mehrerer Isoenzyme vor, deren
Expressionsmuster nicht von deren genomischer Organisation abhängt, sondern in
Abhängigkeit vom Stamm, den Kultivierungsbedingungen, den Substraten und dem
Zeitverlauf der Kultivierung stark variiert und damit schwer kontrollierbar ist [Conesa, Punt
et al., 2002]. Die Simplifizierung der Produktion und eine damit verbundene Senkung der
Kosten sind Grundvorrausetzung für alle technischen Anwendungen der ligninolytischen
Enzyme.
Beim Versuch die homologe Expression zu optimieren, wurden verschiedene
Kultivierungsaspekte wie geschüttelte oder stationäre Kultivierung, die Verwendung von
freien oder immobilisierten Myzelien, kontinuierliche oder diskontinuierliche
Reaktorführung, Nährstofflimitierung oder Überschuss und die Verwendung verschiedenster
Inducer untersucht [Kirk, Schultz et al., 1978; Faison, Kirk, 1985; Kirk, Croan et al., 1986;
Brown, Glenn et al., 1990; Ayala, Pickard et al., 2008]. Generell ließen sich auf diese Weise
jedoch nur geringe Steigerungen der Expressionsrate erzielen. Daher scheint die
Einleitung Teil 1
13
rekombinante Expression die einzige Option für höhere Proteinausbeuten und die
Vereinfachung von Fermentation und Proteinaufreinigung zu sein.
Rekombinante Expression von Laccasen aus verschiedenen Pilzen wurde bereits mehrfach in
der Literatur beschrieben. So wurden Laccasegensequenzen sowohl in verschiedene
Hefestämme [Bulter, Alcalde et al., 2003; Cassland, Jönsson, 1999; Colao, Lupino, 2006;
Hong, Xiao et al., 2006; Jönsson, Saloheimo et al., 1997; Li, Hong et al., 2007; Liu, Chao
et al., 2003; Otterbein, Record et al., 2000; Soden, O’Callaghan et al., 2002] als auch in
unterschiedliche filamentöse Pilze [Hoshida, Fujita et al., 2005; Record, Punt et al., 2002;
Yaver, Overjero et al., 1999] kloniert und erfolgreich exprimiert. Rekombinante Laccasen
unterscheiden sich in ihren biochemischen Eigenschaften oft nicht signifikant von denen
nativer Enzyme. In den beiden erfolgreichsten Laccase Expressionssystemen, der Expression
einer Laccase aus Coprinus cinereus in Aspergillus oryzae [Yaver, Overjero et al., 1999] und
einer Laccase aus Trametes versicolor in Pichia pastoris [Hong, Meinander et al., 2002],
wurden Proteinkonzentrationen von bis zu 100 mg L
-1
erzielt.
Die heterologe Expression der beiden Hämperoxidasen LiP und MnP ist dagegen bis heute
trotz intensiver Forschung deutlich weniger erfolgreich. Da Hämperoxidasen aus Pilzen einer
posttranslationalen Modifikation unterliegen, müssen in Frage kommende Expressions-
systeme diese ebenfalls ermöglichen. Hierzu gehören die korrekte Proteinfaltung, inklusive
einer erfolgreichen Koordination der prosthetischen Hämgruppe, die Bildung von
Disulfidbrücken und die Einbringung struktureller Ca-Ionen [Conesa, Punt et al., 2002a].
Auch ein pilzähnliches Glykosilierungsmuster der Oxidoreduktasen ist bezüglich der
Enzymstabilität wünschenswert [Nie, Reading et al., 1999]. Aufgrund der genannten
Schwierigkeiten scheint eine homologe Produktion der Hämperoxidasen in genetisch
manipulierten ligninolytischen Pilzen eine Alternative zur heterologen Expression zu sein.
Allein Tsukihara et al. [2006] gelang jedoch bisher eine Überproduktion einer MnP in einem
genetisch modifizierten Pleurotus ostreatus Weißfäulepilz. Hierbei konnte immerhin eine
Steigerung der durchschnittlich erreichten Enzymkonzentration um den Faktor 10 auf
20 mg L
-1
erzielt werden [Conesa, Punt et al., 2002a]. Da dies nach dem gegenwärtigen
Wissensstand das einzige veröffentlichte Positivbeispiel ist, erscheint die rekombinante
Produktion der Hämperoxidasen erfolgversprechender.
Einleitung Teil 1
14
Aufgrund der hohen Ansprüche an das Expressionssystem kommen prokaryotische Bakterien
wie Escherichia coli nicht in Frage, da hier posttranslationale Modifikationen nicht möglich
sind. Aufgrund dessen konnte bis heute in E. coli lediglich das inaktive Apoprotein in
Einschlusskörpern exprimiert werden [Doyle, Smith, 1996; Dongho, Dong-Hyun, 1999; Miki,
Morales et al., 2009]. Die zum Erhalt eines aktiven Proteins anschließend durchgeführte in
vitro Rückfaltung des Enzyms verursacht hohe Kosten und ist zudem uneffizient. Im
Baculovirus-Insekten-Zellexpressionssystem konnten sowohl die LiP [Johnson, Li, 1991] als
auch die MnP [Pease, Aust et al., 1991] aktiv exprimiert werden. Die hohen Kosten dieses
Expressionssystems lassen jedoch keine Enzymproduktion im industriellen Maßstab zu.
Besser geeignete Expressionssysteme sind daher Hefen und filamentöse Pilze.
Bis heute ist keine zufriedenstellende Expression der LiP in filamentösen Pilzen gelungen.
Die Klonierung der LiP in Aspergillus niger führte bei Verwendung eines Protease
defizienten Stammes unter der Kontrolle eines induzierbaren Glucoamylase Promotors
lediglich zur Expression von inaktivem Protein [Conesa, van den Hondel et al., 2000] und
unter Kontrolle eines konstitutiven Nopalinsynthase Promotors lediglich zur Expression des
aktiven Enzyms in Spuren [Aifa, Sayadi et al., 1999]. Die heterologe Expression einer LiP
aus dem Weißfäulepilz Phlebia radiata in dem Pilz Trichoderma reesei unter Kontrolle eines
induzierbaren Cellobiohydrolase Promotors gelang ebenfalls nicht. Es wurde keine LiP
produziert [Saloheimo, Barajas et al., 1989]. Die heterologe Expression der LiP in Hefen
gelang lediglich in Pichia methanolica, wo mithilfe eines Protease defizienten Stammes unter
Kontrolle eines induzierbaren Alkoholoxidase Promotors eine Expression von 100 mg L
-1
erzielt wurde [Wang, Lu et al., 2004].
Die Expression der MnP ist dagegen in filamentösen Pilzen erfolgreicher als in Hefen. Die
niedrigsten Proteinkonzentrationen wurden mit 3-7 mg L
-1
in Aspergillus nidulans und mit
5 mg L
-1
in Aspergillus oryzae jeweils unter Kontrolle eines induzierbaren TAKA Amylase
Promotors erzielt [Larrondo, Lobos et al., 2001; Stewart, Whitwam et al., 1996]. In
Aspergillus niger konnte eine ungleich höhere Expression von 70 mg L
-1
, bei Verwendung
eines Protease defizienten Stammes und bei Überexpression von Chaperonen unter Kontrolle
eines konstitutiven Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase Promotors, erzielt werden
[Conesa, Jeenes et al., 2002b]. Bei Expression der MnP im selben Stamm, unter Kontrolle
Einleitung Teil 1
15
eines induzierbaren Glucoamylase Promotors, konnte sogar eine noch höhere Expression von
100 mg L
-1
erreicht werden [Conesa, van den Hondel et al., 2000]. In der Hefe Pichia pastoris
konnte dagegen bisher unter der Kontrolle des konstitutiven Glyceraldehyd-3-
phosphatdehydrogenase Promotors lediglich eine Expression von ~1 mg L
-1
detektiert werden
[Gu, Lajoie et al., 2003].
Einleitung Teil 1
16
1.5
Zielsetzung
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, Möglichkeiten zur Bereitstellung der
Biokatalysatoren LiP, MnP und LAC zu überprüfen. Da neben der niedrigen Prozessstabilität
dieser Oxidoreduktasen vor allem deren zeitaufwändige und teure Produktion in den
ligninolytischen Organismen industrielle Anwendungen limitieren, ist es notwendig diese drei
Enzyme durch rekombinante Expression preisgünstig im Labormaßstab zur Verfügung zu
stellen.
Der Weißfäulepilz Cyathus bulleri wächst auf Baumstämmen krautiger Pflanzen, Holzpellets,
Dung, Reisig unter anderen hölzernen Nährstoffquellen und kann zur selektiven
Delignifizierung eingesetzt werden [Wicklow, Langie et al., 1984; Vasdev, Dhawan et al.,
2005; Salony, Mishra, 2006; Chhabra, Mishra et al., 2008]. C. bulleri exprimiert eine
Laccase, die verschiedene Methoxyphenole, phenolische Aldehyde und Säuren, hydroxy-
substituierte Phenole und aromatische Amine oxidiert und somit ein breites Substratspektrum
aufweist [Vasdev, Dhawan et al., 2005]. Auch bei der Entfärbung verschiedener reaktiver
Farbstoffe stellte sich diese Laccase als besonders effektiv heraus [Salony, Mishra et al.,
2006]. Zudem ist die LAC aus C. bulleri als eine der wenigen Laccasen gegenüber der
chelatierenden Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) resistent. Auch gegen verschiedene
zweiwertige Kationen ist die LAC sehr stabil und viele einwertige Kationen beeinflussen die
Proteinaktivität überhaupt nicht [Vasdev, Dhawan et al., 2005]. Daher wurde auch eine
erhöhte Stabilität gegen andere Parameter erwartet. pH- und Temperaturstabilität des Enzyms
sind mit anderen Laccasen zu vergleichen [Vasdev, Dhawan et al., 2005].
Da diese LAC also einige technische Vorteile aufweist, ist die heterologe Expression dieses
Proteins von großem Interesse. Die anschließende Charakterisierung des rekombinanten
Enzyms fand mit besonderem Fokus auf dessen Stabilität statt. Da die Nukleotidsequenz der
LAC aus C. bulleri noch nicht bekannt war, musste diese vor der Klonierung des Gens in
einen geeigneten Wirtsorganismus zunächst identifiziert werden. Als Expressionssystem
wurde die Hefe P. pastoris ausgewählt, da diese Hefe speziell für Fermentationen im
industriellen Maßstab entwickelt wurde [Gu, Lajoie et al., 2003] und da die Expression vieler
Einleitung Teil 1
17
eukaryotischer Proteine, wie z. B. auch der LAC aus Trametes versicolor, bereits erfolgreich
gelang [Hong, Meinander et al., 2002].
Bei der LiP fiel die Wahl auf die bereits sehr gut untersuchte und sehr reaktive LiPH8 (lipA)
aus dem Weißfäulepilz Phanerochaete chrysosporium [Tien, Kirk, 1984; Kirk, Croan et al.,
1986; Hammel, Kalyanaraman et al., 1986; Andrawis, Johnson et al., 1988; Smith, Schalch
et al., 1988; Hammel, Moen, 1991; Blodig, Smith et al., 2001]. Hier wurde zunächst die
Reproduktion der Ergebnisse von Wang et al. [2004], dem erstmalig die Expression dieser
LiP in der Hefe Pichia methanolica gelang, angestrebt. Als weiteres Hefeexpressionssystem
wurde zudem die Hefe Pichia pastoris untersucht.
Bei der MnP-Klonierung wurde ebenfalls die bereits umfassend untersuchte MnP (mnp1) aus
P. chrysosporium ausgewählt. Die Expression der MnP im Fadenpilz Aspergillus niger gelang
bereits erfolgreich [Conesa, van den Hondel et al., 2000; Conesa, Jeenes et al., 2002b]. Ziel in
der vorliegenden Arbeit war es jedoch die MnP, analog zur LiP, in einem
Hefeexpressionssystem zu produzieren. Da die Expression der MnP in der Hefe P. pastoris zu
keiner zufriedenstellenden Expressionsrate führte [Gu, Lajoie et al., 2003], wurde hier auf das
gut untersuchte Hefeexpressionssystem Kluyveromyces lactis zurückgegriffen. Im Vergleich
zu anderen Hefen, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae, produziert K. lactis im Allgemeinen
rekombinante Produkte in besserer Qualität und höherer Ausbeute [Gellissen, Hollenberg,
1997].
Gelingt die Bereitstellung dieser drei delignifizierenden Enzyme, so könnten langfristig
technische Anwendungen mit Ziel der vollständigen Nutzung des wertvollen Rohstoffes Holz
entwickelt werden. Beim Einsatz delignifizierender Mikroorganismen wird Lignin meist
vollständig zu CO
2
und Wasser verstoffwechselt. Durch den Einsatz der isolierten
Oxidoreduktasen wäre es dagegen möglich die aromatischen Phenylpropanoidmonomere aus
Lignin zu isolieren. Diese sind von großem kommerziellem Wert, da sie in der chemischen
Industrie als Vorstufen vielseitig Anwendung finden. Durch die Isolation phenolischer und
nicht-phenolischer aromatischer Ausgangsstoffe aus dem nachwachsenden, leicht und
preiswert verfügbaren Rohstoff Lignin, könnte die Abhängigkeit der Industriestaaten vom
Rohstoff Öl gemindert werden.
Material und Methoden Teil 1
18
2. Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien und Enzyme
Chemikalien
Agar Sigma Aldrich (Steinheim)
Agarose Peqlab (Erlangen)
Acrylamid-Mix 40 % Carl Roth (Karlsruhe)
Bacto Agar Becton Dickinson (Heidelberg)
dATPs Fermentas (St. Leon-Rot)
dNTPs Fermentas (St. Leon-Rot)
DNA Loading Dye Fermentas (St. Leon-Rot)
DNA-Marker Fermentas (St. Leon-Rot)
Hefeextrakt Merck (Darmstadt)
Malzextrakt Merck (Darmstadt)
Protein Marker Fermentas (St. Leon-Rot)
Page BlueProtein Staining Solution Fermentas (St. Leon-Rot)
Protein Roti Load1 Carl Roth (Karlsruhe)
RNA-Marker Fermentas (St. Leon-Rot)
Sojapepton Carl Roth (Karlsruhe)
Trypton Carl Roth (Karlsruhe)
Veratrylalkohol Sigma Aldrich (Steinheim)
Yeast Nitrogen Base Sigma Aldrich (Steinheim)
Yeast Carbon Base Sigma Aldrich (Steinheim)
Alle nicht gesondert aufgeführten Chemikalien wurden mindestens analysenrein (p.a.) von
den Firmen AppliChem (Darmstadt), Merck (Darmstadt), Carl Roth (Karlsruhe) oder Sigma-
Aldrich (Steinheim) bezogen.
Material und Methoden Teil 1
19
Enzyme
FastDigest AscI Fermentas (St. Leon-Rot)
FastDigest BglII Fermentas (St. Leon-Rot)
FastDigest EcoRI Fermentas (St. Leon-Rot)
FastDigest BamHI Fermentas (St. Leon-Rot)
Reverse Transkriptase New England BioLabs (Frankfurt a. Main)
Pfu DNA Polymerase Promega (Mannheim)
PmeI New Englang BioLabs (Frankfurt a. Main)
PstI Fermentas (St. Leon-Rot)
SacII New England BioLabs (Frankfurt a. Main)
Taq Polymerase Promega (Mannheim)
Topoisomerase I Invitrogen (Karlsruhe)
T4 DNA Ligase Fermentas (St. Leon-Rot)
2.1.2 Stämme und Plasmide
Pilzstämme
Cyathus bulleri (Brodie) 195062; (Canadian type culture collection; erhalten von Prof. R. C.
Kuhad, University of Delhi).
Phanerochaete chrysosporium 6909 (ATCC 24725); (Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ)
E. coli Stämme
TOP10 [F
-
mcrA ∆ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 lacX74recA1 araD139 ∆(ara-
leu)7697galU galK rpsL (Str
R
) endA1 nupG] (Invitrogen)
DH5α [supE44 ∆lacU169 (θ80 lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1]
(Pharmacia)
Hefestämme
Pichia pastoris X-33 (Invitrogen) Wildtyp
Pichia methanolica PMAD16 (Invitrogen) [ade2-11 pep4∆prb1∆]
Kluyveromyces lactis GG799 (New England BioLabs) Wildtyp
Material und Methoden Teil 1
20
Plasmide
pCR4-TOPO, (Invitrogen) 3956 bp, pUC
ori
, P
lac
,, Amp
R
, Kan
R
pCR4-TOPO/LAC 5446 bp, pUC
ori
, P
lac
, Amp
R
, Kan
R
pCR4-TOPO/LiP 4991 bp, pUC
ori
, P
lac
, Amp
R
, Kan
R
pCR4-TOPO/MnP 5116 bp, pUC
ori
, P
lac
, Amp
R
, Kan
R
pPICZαB, (Invitrogen) 3600 bp, pUC
ori
, P
AOX1
, α-factor signal sequence, Zeocin
R
pPICZαB/LAC 5090 bp, pUC
ori
, P
AOX1
, α-factor signal sequence, Zeocin
R
pMETαA, (Invitrogen) 8000 bp, pUC
ori
, P
AUG1
, α-factor signal sequence, Amp
R
, ADE2
pMETαA/LiP 9035 bp, P
AUG1
, α-factor signal sequence, Amp
R
, ADE2
pPICZαA, (Invitrogen) 3600 bp, pUC
ori
, P
AOX1
, α-factor signal sequence, Zeocin
R
pPICZαA/LiP 4635 bp, pUC
ori
, P
AOX1
, α-factor signal sequence, Zeocin
R
pKLAC1, (NEB) 9091 bp, pMB1
ori
, P
LAC4-PBI
, P
ADH1,
amdS, Amp
R
, α-MF
pKLAC1/MnP 10227 bp, pMB1
ori
, P
LAC4-PBI
, P
ADH1,
amdS, Amp
R
, α-MF
2.1.3 Primer
Tabelle 2.1. Bezeichnung und Nukleotidsequenzen aller Primer, die bei der Laccaseklonierung eingesetzt
wurden.
Primerbezeichnung Nukleotidsequenz
GeneRacer-RNA-Oligo 5’- CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGAC
UGAAGGAGUAGAAA -3’
GeneRacer-Oligo-dT-Primer 5’-
GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACA
GTG(T)
24
- 3’
GeneRacer-5’-Primer 5’- CGACTGGAGCACGAGGACACTGA -3’
GeneRacer-3’-Primer 5’- GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC G -5’
genspez. downstream Primer 5’- GGTGTCTGGTGCACCGGCATATC -3’
genspez. upstream Primer 5’- TAGCGCCGGAAGCAGCGTGTACAACTA -3’
5’-RACE-genspez.-Primer 5’- AGGGGCGGGTGTGTGATACCAAT -3’
3’-RACE-genspez.-Primer 5’- GGGCAGCGGTACTCGTTTGTTCTG -3’
Oligo 1 5’- ATTTCCCCGCGGTCAGGTGCCGGTTGG- 3’
Oligo 2 5’- CCGCTGCAGCCATTGGCCCAGTTTCGGA -3’
Material und Methoden Teil 1
21
Tabelle 2.2. Bezeichnung und Nukleotidsequenzen aller Primer, die bei der LiP-Klonierung eingesetzt wurden.
Primerbezeichnung Nukleotidsequenz
Oligo-dT-Primer 5´- TTTTTTTTTTTTTTTTTT –3´
P. methanolica genspez. upstream
Primer
5´- CCGGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCA -3´
P. methanolica genspez. downstream
Primer
5´- TTCGGATCCTTAAGCACCCGGAGGCGGA -3´
P. pastoris genspez. upstream Primer
5´- GAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCA -3´
P. pastoris genspez. downstream
Primer
5´- CCGCGGTTAAGCACCCGGAGGCGGAGG -3´
AUG1 Forward Primer 5´- CAATTTACATCTTTATTTATTAACG -3´
AUG1 Reverse Primer 5´- GAAGAGAAAAACATTAGTTGGC -3´
5´AOX1-Primer 5´- GACTGGTTCCAATTGACAAGC -3´
3´AOX1-Primer 5´- GCAAATGGCATTCTGACATCC -3´
Tabelle 2.3. Bezeichnung und Nukleotidsequenzen aller Primer, die bei der MnP-Klonierung eingesetzt wurden.
Primerbezeichnung Nukleotidsequenz
Oligo-dT-Primer 5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTT –3’
genspez. upstream Primer 5’- CGAGATCTGCAGTCTGTCCAGACGGTAC -3’
genspez. downstream Primer 5’- GCGGCGCGCCGAATCGACATCTACTAAAG -3’
Integrationprimer 1 5’– TACCGACGTATATCAAGCCCA –3’
Integrationprimer 2 5’– ATCATCCTTGTCAGCGAAAGC –3’
Sequenzierungsprimer upstream 5’– GCGGATAACAAGCTCAAC –3’
Sequenzierungsprimer downstream
5’- TTATCGCACAAGACAATC –3’
2.1.4 Geräte
FPLC Pump P-920, Monitor UPC-900, Valve INV-907, Mixer
M-925, Fractioner Frac-920, Äkta (Freiburg), GE
Healthcare (Freiburg)
Geldokumentation Alpha Innotech (Hessisch Oldendorf)
Material und Methoden Teil 1
22
Inkubator Carl Roth (Karlsruhe)
Lyophile Alpha 1-2 LD plus, Christ (Riedstadt)
Mikrotiterplattenlesegerät Infinite M200, Tecan (Crailsheim)
PCR Thermal Cycler Mastercycler personal, Eppendorf (Hamburg)
pH-Meter 691, Metrohm
Rührelement UV/Vis Photometer Variomag
Schüttler Vibramax 110, Heidolph Instruments (Schwabach)
SDS-Gelkammer Novex Mini Cell, Invitrogen (Darmstadt)
Thermoblock Peqlab (Erlangen)
Ultraschallgerät Labsonic M, Sartorius (Göttingen)
Ultrafiltration Vivaspin 500, Sartorius (Göttingen)
Viva Flow 50, Sartorius (Göttingen)
UV-Vis-Photometer Cary 50 Scan, Varian (Darmstadt)
Vakuumzentrifuge RC1010, Jouan, Thermo Scientific (Karlsruhe)
Zentrifuge Mini Spin, Eppendorf (Hamburg)
Biofuge Stratos, Heraeus (Hanau)
2.2 Methoden
2.2.1 Langzeitlagerung der Pilze Cyathus bulleri und Phanerochaete
chrysosporium
C. bulleri wurde auf Malzextraktmedium (pH 5,2) folgender Zusammensetzung 7 Tage lang
bei 25 °C kultiviert: 20,0 g L
-1
Malzextrakt, 0,5 g L
-1
KH
2
PO
4
, 0,5 g L
-1
MgSO
4
, 0,5 g L
-1
Ca(NO
3
)
2
, 20,0 g L
-1
Agar. Anschließend wurde der Pilz bei 4 °C gelagert und alle 2-3
Monate neu ausgestrichen.
P. chrysosporium wurde auf Malzagar (pH 5,6) folgender Zusammensetzung bei 35 °C
mehrere Tage lang kultiviert: 30 g L
-1
Malzextrakt, 3 g L
-1
Sojapepton, 15 g L
-1
Agar.
Anschließend wurde auch dieser Pilz bei 4 °C gelagert und alle 2-3 Monate umplattiert.
Material und Methoden Teil 1
23
2.2.2 Kultivierung der Pilze unter ligninolytischen Bedingungen
Kultivierung von C. bulleri unter ligninolytischen Bedingungen
C. bulleri wurde in Basalmedium (pH 5,2) folgender Zusammensetzung (pro Liter) kultiviert:
10 g Glucose, 18,1 g Ammoniumtartrat, 14,6 g 2,2-Dimethylsuccinat, 20 g KH
2
PO
4
,
5 g MgSO
4
, 1 g CaCl
2
, 0,5 g MnSO
4
*4H
2
O, 1 g NaCl, 0,1 g FeSO
4
*7H
2
O,
0,1 g CoCl
2
*6H
2
O, 0,1 g ZnSO
4
*7H
2
O, 0,1 g CuSO
4
, 0,01 g AlKSO
4
*12H
2
O, 0,01 g H
3
BO
3
,
0,01 g Natriummolybdat, 1,5 g Nitrilotriacetat und 10 mL folgender Vitaminlösung 2 mg L
-1
Biotin, 2 mg L
-1
Folsäure, 5 mg L
-1
Thiaminhydrochlorid, 5 mg L
-1
Riboflavin, 10 mg L
-1
Pyridoxinhydrochlorid, 0.1 mg L
-1
Cyanocobalamin, 5 mg L
-1
Nikotinsäure, 5 mg L
-1
D/L Calciumpantothenat, 5 mg L
-1
p-Aminobenzoesäure und 5 mg L
-1
Thiocticsäure. Jeweils
30 mL dieses Kultivierungsmediums wurden in 250 mL Erlenmeyerkolben mit Pilzmyzelium
(1 cm ∅), das zuvor auf Malzagar kultiviert wurde (s. 2.2.1), angeimpft. Die Kulturen wurden
8 Tage unter statischen Bedingungen bei 26 °C kultiviert, bevor die Laccaseproduktion durch
Zugabe von 2,6-Dimethylanilin in einer Endkonzentration von 100 µM induziert wurde
[Eggert, Temp et al., 1996]. Einen Tag später wurde das Myzelium durch Filtration
abgeerntet, mehrmals mit sterilem Phosphatpuffer (20 mM; pH 7,0) gewaschen, mit flüssigem
Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -80 °C gelagert.
Kultivierung von P. chrysosporium unter ligninolytischen Bedingungen
1 L des stickstofflimitierten Kultivierungsmediums bestand aus jeweils 100 mL Basalmedium
(10x konz.), 100 mL Glukoselösung (10x konz., 560 mM), 0,5 mL Vitaminlösung, 5 mL
Spurenelementlösung und 780 mL 2,2-Dimethylsuccinatpuffer (10 mM, pH 4,5). Das
zehnfach konzentrierte Basalmedium bestand aus 2 g L
-1
KH
2
PO
4
, 0,5 g L
-1
MgSO
4
*7 H
2
O,
0,1 g L
-1
CaCl
2
, 0,5 g L
-1
NH
4
NO
3
und 0,8 g L
-1
L-Asparagin in 2,2-Dimethylsuccinatpuffer
(10 mM; pH 4,5). Die Vitaminlösung bestand pro Liter aus 2 mg Biotin, 2 mg Folsäure,
5 mg Thiamin HCl, 5 mg Riboflavin, 10 mg Pyridoxin, 0,1 mg Cyanocobalmin, 5 mg
Nikotinsäure, 5 mg Calciumpantothenat, 5 mg p-Aminobenzolsäure und 5 mg α-Liponsäure.
Die Spurenelementlösung bestand pro Liter aus 15 g Nitriloacetat, 20 g MgSO
4
*7H
2
O,
3,4g MnSO
4
*H
2
O, 0,7 g NaCl, 0,7 g FeSO
4
*7H
2
O, 0,7 g CoSO
4
, 0,7 g CaCl
2
,
0,7 g ZnSO
4
*7H
2
O, 0,07 g CuSO
4
*5H
2
O, 0,07 g KAl(SO
4
)
2
, 0,07 g Borsäure und
0,07 g Natriummolybdat [Kirk, Schultz et al., 1978]. 20 mL des so zusammengesetzten
Material und Methoden Teil 1
24
Kultivierungsmediums wurden in 200 mL Erlenmeyerkolben mit einem Zweihals-
kolbenaufsatz, welcher an beiden Ausgängen mit Sterilfiltern versehen war, gegeben. Für die
LiP-Produktion wurde steril filtrierter Veratrylalkohol in einer Endkonzentration von 0,4 mM
als Inducer hinzugegeben. Für die MnP-Produktion wurde MnSO
4
in einer Endkonzentration
von 30 mg L
-1
als Inducer hinzugegeben. Angeimpft wurden die Kulturen mit jeweils 1 mL
Konidiensuspension, die so mit sterilem dest. Wasser verdünnt wurde, dass die OD
650nm
0,5
betrug. Der Pilz wurde bei 37-40 °C unter statischen Bedingungen 5-7 Tage inkubiert und
jeden Tag 10-15 min über den Zweihalskolbenaufsatz mit reinem Sauerstoff begast. Nach
Erreichen der maximalen Enzymaktivität wurde das Myzel vom Medium abgetrennt und nach
mehrmaligem Waschen mit dest. Wasser in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die
Lagerung des Pilzmyzels erfolgte bei -80 °C.
2.2.3 RNA Isolation
Die Gesamt-RNA beider Pilze wurde mithilfe des RNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden)
isoliert. Hierzu wurde das gefrorene Myzel zunächst unter flüssigem Stickstoff gemörsert.
100 g gemörsertes Myzel wurden anschließend nach Anleitung des Kits behandelt, bevor es
auftauen konnte. Die Extraktion und die Integrität der RNA wurden durch Agarose-
gelelektrophorese überprüft.
2.2.4 Amplifikation der Zielgensequenzen
Aus der isolierten Gesamt-RNA beider Pilze wurde anschließend lediglich die mRNA in einer
Reverse Transkriptase (RT) Reaktion in cDNA transkribiert. Im Falle der LiP und der MnP
geschah dies mithilfe des ProtoScript® II RT-PCR Kits (New England BioLabs, Frankfurt
a. M.) unter Verwendung der Oligo-dT-Primer (s. 2.1.3). Anschließend wurde das jeweilige
Zielgen mit genspezifischen Primern (s. 2.1.3) mittels PCR amplifiziert.
Bei der Amplifikation des Laccasegens musste zuvor die Gesamtsequenz des Gens,
ausgehend von einem mit degenerierten Primern bereits amplifizierten Teilfragment, über
eine RACE-PCR ermittelt werden. Die RT Reaktion und die RACE-PCR wurden in diesem
Fall mit dem GeneRACER
TM
RLM-Race Kit (Invitrogen, Darmstadt) durchgeführt.
Material und Methoden Teil 1
25
Amplifikation des Laccasegens
Die isolierte Gesamt-RNA des Pilzes wurde zunächst mit Calf Intestinal Phosphatase (CIP)
behandelt, um Phosphatreste am 5´-Ende verkürzter mRNAs ohne 5´-Schutzkappe und von
nicht-mRNAs abzubauen. Durch diesen Schritt wurden verkürzte mRNAs und andere RNA-
Arten eliminiert, da sie an der nachfolgenden Ligation des GeneRacer-RNA-Oligos an freie
5´-Phosphatenden nicht mehr teilnehmen konnten. Anschließend wurde dieses RNA-Gemisch
mit Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP) behandelt, um die 5´-Schutzkappe intakter
mRNAs zu entfernen. Hierdurch entstanden freie 5´-Phosphatenden, die für die Ligation des
GeneRacer-RNA-Oligos benötigt wurden. Der GeneRacer-RNA-Oligo (s. 2.1.3) wurde an die
so behandelte mRNA ligiert und anschließend unter Verwendung der Superscript III RT und
des GeneRacer-Oligo-dTs (s. 2.1.3) in cDNA mit bekannten Primersequenzen am 5´- und
3´-Ende umgeschrieben.
Um bei der folgenden RACE-PCR das 5´-Ende des LAC-Gens zu amplifizieren, wurde der
GeneRacer-5´-Primer (s. 2.1.3), der homolog zum GeneRacer-RNA-Oligo ist, als
Forwardprimer eingesetzt. Der genspezifische downstream Primer (s. 2.1.3), der auf Basis des
bereits mit degenerierten Primern amplifizierten und sequenzierten Teilfragments designt
worden war, wurde als Reverseprimer eingesetzt. Das 3´-Ende des LAC-Gens wurde dagegen
mithilfe des genspezifischen upstream Primers, der ebenfalls auf Basis des bereits
sequenzierten Teilfragments des Laccasegens designt worden war, und dem GeneRacer-
3´-Primer, der homolog zum GeneRacer-Oligo-dT Primer ist, amplifiziert (s. 2.1.3). Zur
Minimierung der Hintergrund-Amplifikation wurde eine Touchdown-PCR (s. Tabelle 2.4)
durchgeführt.
Die Größe der so erhaltenen 5´- und 3´-Enden-PCR-Produkte wurde mittels Agarose-
gelelektrophorese überprüft, mit dem QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden)
wurden die PCR-Produkte aus dem Agaraosegel aufgereinigt und zur Sequenzierung
eingeschickt (Eurofins MWG Operon, Ebersberg).
Material und Methoden Teil 1
26
Tabelle 2.4. Temperaturprogramm der Touchdown-PCR zur Identifizierung der 5´- und 3´-Enden des
Laccasegens aus Cyathus bulleri.
Schritt Temperatur [°C] Zeit [min] Zyklenanzahl
Initiale Denaturierung
95 2 1
Denaturierung 95 0,75 5
Annealing 70 0,75 5
Elongation 72 2 5
Denaturierung 95 0,75 5
Annealing 69 0,75 5
Elongation 72 2 5
Denaturierung 95 0,75 20
Annealing 68 0,75 20
Elongation 72 2 20
Finale Elongation 72 8 1
Für die Ermittlung der kompletten Nukleotidsequenz des Laccasegens wurde nachfolgend mit
dem 5´-Ende-PCR-Produkt als Template die Primer Walking Technik angewandt. Hierfür
wurde der 5´-RACE-genspezifische-Primer (s. 2.1.3) auf der Basis der zuvor erhaltenen
Sequenz des 5´-Ende-PCR-Produktes designt und zusammen mit dem GeneRacer-5´-Primer
(s. 2.1.3) für die PCR eingesetzt. Das PCR-Produkt wurde erneut zur Sequenzierung
eingeschickt. Für die Überprüfung der Sequenz der 3´-Enden wurde ein weiterer Primer, der
3´-RACE-genspezifische-Primer (s. 2.1.3), komplementär zu dieser neu ermittelten Sequenz
entwickelt. Dieser Primer wurde zusammen mit dem GeneRacer-3´-Primer in der PCR
eingesetzt. Auch dieses PCR Produkt wurde zur Sequenzierung eingeschickt. Alle
beschriebenen Schritte wurden nach Anleitung des Kits durchgeführt. Aus der Summe aller
sequenzierten Teilfragmente wurde die vollständige LAC-Sequenz ermittelt.
Für die geplante extrazelluläre Expression der LAC in P. pastoris unter Kontrolle des auf dem
pPICZαB-Plasmid integrierten α-Sekretionssignals aus S. cerevisiae, wurde anschließend das
LAC-Gen ohne natürliches Sekretionssignal des Pilzes amplifiziert. Zur Identifikation des
natürlichen Sekretionssignals wurde die „von Heijne Signal Sequence Prediction Methode“
[von Heijne, 1986] angewandt und entsprechende Primer designt (Oligo 1 und 2; s. 2.1.3), die
Material und Methoden Teil 1
27
nur das Laccasegen ohne dessen natürlichem Sekretionssignal amplifizieren und gleichzeitig
SacII und PstI Schnittstellen regenerieren. Die PCR Reaktion wurde mit folgendem
Temperaturprogramm durchgeführt:
Tabelle 2.5. Temperaturprogramm der PCR zur Amplifikation des Laccasegens aus C. bulleri.
Schritt Temperatur [°C] Zeit [min] Zyklenanzahl
Initiale Denaturierung
95 2 1
Denaturierung 95 1 29
Annealing 55 1 29
Elongation 72 2 29
Finale Elongation 72 10 1
Amplifikation des LiP bzw. MnP Gens
Für die Amplifikation dieser beiden Gene wurde zunächst die Taq Polymerase und
anschließend die Pfu Polymerase, die über eine Proof Reading Funktion verfügt, verwendet.
Da beide Proteine mithilfe der auf dem jeweiligen Plasmid integrierten Sekretionssignale
sekretiert werden sollten, wurden die genspezifischen Primer in beiden Fällen so gewählt,
dass das Sekretionssignal des Pilzes nicht amplifiziert wurde. Das natürliche Stoppcodon lag
dagegen im jeweils amplifizierten Bereich.
Bei der Klonierung der LiP in P. methanolica wurden mithilfe des P. methanolica genspez.
upstream und downstream Primers (s. 2.1.3) die Schnittstellen EcoRI und BamHI an die
Genenden kloniert. Bei der Klonierung der LiP in P. pastoris wurden dagegen über die
P. pastoris genspez. upstream bzw. downstream Primer (s. 2.1.3) die Schnittstellen EcoRI und
SacII an die Genenden angefügt. Bei der Klonierung der MnP in K. lactis wurden über die
verwendeten genspez. upstream bzw. downstream Primer (s. 2.1.3) die Schnittstellen AscI und
BglII zugefügt. Bei der Amplifikation beider Gene wurden die Primer jeweils in einer
Endkonzentration von 0,5 µM eingesetzt. Das Temperaturprogramm ist in Tabelle 2.6 zu
sehen.
Material und Methoden Teil 1
28
Tabelle 2.6. Temperaturprogramm der Amplifikation des LiP- und des MnP-Gens aus P. chrysosporium.
Schritt Temperatur [°C] Zeit [min] Zyklenanzahl
Initiale Denaturierung
95 2 1
Denaturierung 94 0,5 30
Annealing 52 0,5 30
Elongation 68 1 30
Finale Elongation 68 10 1
Zur Überprüfung der spezifischen Genamplifikation wurde das jeweilige PCR-Produkt mittels
Agarosegelelektrophorese untersucht. Bei erfolgreicher Amplifikation wurde das PCR-
Produkt aus dem Agaraosegel aufgereinigt und die Korrektheit der Nukleotidsequenz durch
Sequenzierung verifiziert.
2.2.5 Klonierung der Zielgene in den Replikationsvektor pCR4-TOPO
Die PCR Produkte aller drei Gene wurden mithilfe des TOPO TA Cloning
®
Kits (Invitrogen)
nach Anleitung in den pCR4-TOPO Vektor geklont. Die rekombinanten pCR4-TOPO
Vektoren wurden anschließend gemäß Anleitung in kompetente One Shot
®
E. coli TOP10
Zellen (s. 2.1.2) transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf LB-Amp-Agarplatten
(100 µg Amp mL
-1
) selektiert. Die entstandenen Kolonien wurden mittels Colony-PCR unter
Einsatz der jeweils genszpezifischen Primer (s. 2.1.3) auf die Aufnahme rekombinanter
Plasmide überprüft. Bei ausgewählten positiven Klonen wurde das Plasmid mithilfe des
QIAprep® Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hilden) isoliert und zur Sequenzierung eingeschickt.
Positive Klone wurden als Glycerolstocks zur Langzeitaufbewahrung angelegt.
2.2.6 Klonierung der Zielgene in die entsprechenden Hefe-Shuttle-Vektoren und
deren Transformation in E. coli bzw. die entsprechenden Hefeexpressionsstämme
Klonierung des LAC-Gens in pPICZαB und dessen Transformation in E. coli und P. pastoris
Zunächst wurde die Plasmid-DNA aus einem positiven pCR4-TOPO/LAC Klon (s. 2.2.5)
isoliert. Anschließend wurden sowohl der Hefe-Shuttle-Vektor pPICZαB (s. 2.1.2) als auch
Material und Methoden Teil 1
29
die isolierte Plasmid-DNA mit den Restriktionsenzymen SacII und PstI (s. 2.1.1) nach
Anleitung geschnitten. Die Restriktionsreaktionen wurden über ein Agarosegel aufgetrennt,
aufgereinigt und mithilfe der T4 DNA Ligase ligiert. Nach Überprüfung der Ligation mittels
Agarosegelelektrophorese wurde der rekombinante pPICZαB/LAC Vektor nach Anleitung des
EasySelect
TM
Pichia Expression Kits (Invitrogen) in kompetente E. coli DH5α Zellen
(s. 2.1.2) transformiert. Die Selektion positiver Klone fand über Low Salt LB Platten
(1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, pH 7,0) mit 25 µg mL
-1
Zeocin statt. Bei
ausgewählten positiven Klonen wurde das Plasmid isoliert und sequenziert, um die
Nukleotidsequenz des LAC-Gens und dessen Orientierung im Vektor zu überprüfen. Für die
nachfolgende Transformation des pPICZαB/LAC Vektors in P. pastoris X33 Zellen (s. 2.1.2)
wurde der Vektor mit SacI linearisiert. Gemäß Anleitung des EasySelect
TM
Pichia Expression
Kits wurden chemisch kompetente P. pastoris X33 Zellen hergestellt. Die Transformation
erfolgte ebenfalls nach Protokoll. Als Negativkontrolle wurde neben dem rekombinanten
pPICZαB/LAC Vektors auch ein leerer pPICZαB Vektor transformiert. Die Selektion der
positiven Klone erfolgte über Ausplattieren auf Yeast Extract Peptone Dextrose Medium
(YPD; 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glukose), das 100 µg Zeocin mL
-1
enthielt.
Für die Selektion von Hefetransformanten, die aktive Laccase exprimieren, wurde ein
Agarplatten-Test auf Minimal Methanol (MM) Platten mit 0,2 mmol L
-1
ABTS durchgeführt.
Die ausgestrichenen Hefen wurden 3 Tage lang bei 30 °C inkubiert und auf die Entwicklung
einer grünen Färbung untersucht. P. pastoris Zellen, die mit einem leeren pPICZαB Vektor
transformiert wurden, dienten als Negativkontrolle.
Klonierung des LiP-Gens in pMETαA bzw. in pPICZαA und deren Transformation in E. coli
und P. methanolica bzw. P. pastoris
Für die Klonierung des LiP-Gens mit EcoRI und BamHI Schnittstellen in den Hefe-Shuttle-
Vektor pMETαA (s. 2.1.2) wurden sowohl das Genfragment als auch der Vektor mit den
Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI (s. 2.1.1) nach Anleitung verdaut. Die Ligation des
Gens in den Vektor erfolgte nach Anleitung mithilfe der T4 DNA Ligase (s. 2.1.1). Nach
Überprüfung der Ligation mittels Agarosegelelektrophorese erfolgte die Transformation des
rekombinanten pMETαA/LiP Plasmids nach Anleitung des P. methanolica Expression Kits
(Invitrogen) in chemisch kompetente E. coli DH5α Zellen. Die Selektion positiver Klone
Material und Methoden Teil 1
30
erfolgte über LB-Amp Platten. Um Klone mit dem rekombinanten Plasmid pMETαA/LiP zu
selektieren und um die korrekte Nukleotidsequenz des Gens und dessen korrekte Klonierung
im Leseraster des Sekretionssignals zu überprüfen, wurde das pMETαA/LiP Plasmid eines
ausgewählten Klons zur Sequenzierung eingeschickt. Als Primer wurden dabei der AUG1
Forward Primer, der upstream des α-Faktorsignals ansetzt, und der AUG1 Reverse Primer
(s. 2.1.3), der nach der Multiple Cloning Site ansetzt, verwendet.
Das rekombinante Plasmid aus diesem positiv getesteten E. coli Klon wurde anschließend
isoliert und mithilfe des Restriktionsenzyms AscI (s. 2.1.1) linearisiert. Die so entstandene
Expressionskassette wurde in P. methanolica PMAD16 Hefezellen (s. 2.1.2), die zuvor nach
Anleitung des EasySelect
TM
Pichia Expression
Kits chemisch kompetent gemacht wurden,
transformiert. Als Negativkontrolle wurde zusätzlich ein leerer pMETαA Vektor, der
ebenfalls vor der Transformation mit AscI linearisiert worden war, in P. methanolica Zellen
transformiert. Die Selektion positiver Klone erfolgte über viertägige Inkubation bei 29 °C auf
Minimal Dextrose (MD; 1,34% Yeast Nitrogen Base, 4*10
-5
% Biotin, 2% Dextrose,
15% Agar) Platten ohne Adeninzugabe. Hefekolonien, die auf diesem Selektionsmedium
gewachsen waren, wurden einer Colony-PCR mit den P. methanolica genspezifischen
Primern (s. 2.1.3) unterzogen. Hierdurch wurde überprüft, ob die Expressionskassette mitsamt
des LiP-Gens in das Hefegenom integriert wurde.
Für die Klonierung des LiP-Gens mit EcoRI und SacII Schnittstellen in den Hefe-Shuttle-
Vektor pPICZαA (s. 2.1.2) wurden sowohl das Genfragment als auch der Vektor mit den
Restriktionsenzymen EcoRI und SacII (s. 2.1.1) nach Anleitung verdaut, anschließend ligiert
und in E. coli DH5α Zellen transformiert. Per Colony-PCR mit P. pastoris genspezifischen
Primern (s. 2.1.3) wurde überprüft, ob die entstandenen Klone ein rekombinantes Plasmid
aufgenommen hatten. Zur Überprüfung der Nukleotidsequenz des LiP-Gens und dessen
Klonierung innerhalb des Leserasters des α-Faktorsekretionssignals
aus S. cerevisiae wurde
der pPICZαA/LiP Vektor mit den Primern 5´AOX1, der vor dem Sekretionssignal ansetzt, und
3´AOX1 (s. 2.1.3), der hinter der Multiple Cloning Site ansetzt, zur Sequenzierung
eingeschickt.
Material und Methoden Teil 1
31
Aus einem positiv getesteten Klon wurde das pPICZαA/LiP Plasmid isoliert, mit dem
Restriktionsenzym PmeI (s. 2.1.1) linearisiert und anschließend nach Anleitung in chemisch
kompetente P. pastoris X33 Zellen transformiert. Als Negativkontrolle wurde ein leerer,
linearisierter pPICZαA Vektor in P. pastoris Zellen transformiert. Die Selektion erfolgte auf
YPD Medium, das 100 µg Zeocin mL
-1
enthielt.
Klonierung des MnP-Gens in pKLAC1 und dessen Transformation in E. coli und K. lactis
Das pCR4-TOPO/MnP Plasmidkonstrukt und der Hefe-Shuttle-Vektor pKLAC1 wurden mit
den Restriktionsenzymen AscI und BglII geschnitten. Anschließend wurde das MnP-Gen in
den Hefevektor ligiert und dieser in chemisch kompetente E. coli DH5α Zellen transformiert.
Die Selektion erfolgte über Ampicillinresistenz und Colony-PCR mit genspezifischen
Primern (s. 2.1.3). Zusätzlich wurde die Nukleotidsequenz des MnP-Gens und dessen
korrekte Klonierung in den pKLAC1-Vektor innerhalb des Leserasters des Sekretionssignals
durch Sequenzierung mit den Sequenzierungsprimern (s. 2.1.3) überprüft.
Positiv getestete pKLAC1/MnP Vektoren wurden isoliert und mit dem Restriktionsenzym
SacII linearisiert, bevor die so entstandene Expressionskassette nach Anleitung des K. lactis
Protein Expression Kits (New England BioLabs) in chemisch kompetente K. lactis GG799
Zellen (s. 2.1.2) transformiert wurde. Als Negativkontrolle wurde zusätzlich ein leerer,
ebenfalls linearisierter pKLAC1 Vektor in K. lactis Zellen transformiert. Als
Selektionsmedium diente Yeast Carbon Base Agar (0,03% 1 M Tris/HCl (pH 7,0),
0,0117% Yeast Carbon Base, 0,02% Bacto Agar), der 5 mM Acetamid enthielt. Die
transformierten Hefen wurden auf den Selektionsplatten bei 30 °C inkubiert.
2.2.7 Expression der Zielenzyme
Expression der LAC in P. pastoris
Die LAC-Expression wurde in 250 mL Schikanekolben untersucht. Die Hefeklone wurden bei
30 °C und 250 rpm in 50 mL YPD Medium kultiviert bis eine OD
600
von 2-6 erreicht war. Die
Zellen wurden durch Zentrifugation bei 2000 g über 5 min geerntet und anschließend in
gepuffertem Komplex-Methanol-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 100 mM KPO
4
-
Puffer (pH 6,0), 1,34% Yeast Nitrogen Base, 4*10
-5
% Biotin, 0,5% Methanol) auf eine OD
600
Material und Methoden Teil 1
32
von 1 in 1 L Schikanekolben resuspendiert. Die Kultivierung erfolgte mit einem Füllvolumen
von 100 mL bei 30 °C und 250 rpm. Zu den Kulturen wurde täglich 1% (v/v) Methanol hinzu-
gegeben, um die induzierenden Bedingungen für den AOX1 Promotor aufrecht zu erhalten.
Alle 24 Stunden wurde die LAC-Aktivität im extrazellulären Medium gemessen (s. 2.2.8).
Um zu überprüfen, ob durch die Zugabe von Kupfer zum Medium die Expression der LAC in
P. pastoris gesteigert werden kann, wurde der Hefeklon mit der höchsten Expressionsrate in
gepuffertem Komplex-Methanol-Medium inklusive CuSO
4
kultiviert. CuSO
4
wurde dabei in
den Konzentrationen 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 und 0,5 mmol L
-1
eingesetzt. Die Kultivierung erfolgte
3 Tage bei 30 °C in 1 L Schikanekolben mit einem Füllvolumen von 100 mL. Die LAC-
aktivität im Medium wurde täglich gemessen (s. 2.2.8).
Expression der LiP in P. methanolica und P. pastoris
Zur Überprüfung der LiP-Expression in P. methanolica wurden einzelne positiv getestete
Hefeklone in 10-50 mL Buffered Dextrose-complex Medium (BMDY; 1% Hefeextrakt,
2% Pepton, 100 mM KPO
4
-Puffer (pH 6,0), 1,34% Yeast Nitrogen Base, 4*10
-5
% Biotin,
2% Dextrose) bei 30 °C und 300 rpm in 250 mL Schikanekolben kultiviert bis eine OD
600
von
10 erreicht war. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 g geerntet und
in 50 mL Buffered Methanol-complex Medium (BMMY; 1% Hefeextrakt, 2% Pepton,
100 mM KPO
4
-Puffer (pH 6,0), 1,34% Yeast Nitrogen Base, 4*10
-5
% Biotin, 0,5% Methanol)
resuspendiert, um die Expression zu induzieren. Die Kulturen wurden bei 30 °C in 250 mL
Schikanekolben mit einem Füllvolumen von 25 mL bei 300 rpm kultiviert. Um die
induzierenden Bedingungen für den Promotor P
AUG
aufrecht zu erhalten, wurde täglich
Methanol in einer Endkonzentration von 0,5% hinzugegeben. Zudem wurde der
Kulturüberstand täglich auf LiP-Aktivität hin geprüft (s. 2.2.8).
Neben dem Kulturüberstand wurde auch der Überstand nach Zellaufschluss auf LiP-Aktivität
hin untersucht. Hierzu wurde aus den Kulturen täglich ein Aliquot von 1 mL entnommen. Der
Zellaufschluss wurde mittels Ultraschall auf Eis durchgeführt. Zusätzlich wurde die
Expression mittels SDS-Page-Gelelektrophorese analysiert. Neben den Kulturüberständen der
Hefeklone wurde auch der Kulturüberstand der Negativkontrolle P. methanolica pMETαA
Material und Methoden Teil 1
33
aufgetragen. Zudem wurden die Überstände der Zellaufschlüsse der Hefeklone aufgetragen
(s. 2.2.10).
Zur Überprüfung der LiP-Expression in P. pastoris wurden positiv getestete Hefeklone
zunächst solange in Buffered Glycerol-complex Medium (BMGY; 1% Hefeextrakt,
2% Pepton, 100 mM KPO
4
-Puffer (pH 6,0), 1,34% Yeast Nitrogen Base, 4*10
-5
% Biotin,
1% Glycerol) bei 30 °C und 300 rpm kultiviert bis eine OD
600
von 2 erreicht wurde. Dann
wurden die Kulturen abzentrifugiert (2000 g, 5 min) und das Pellet anschließend im
Expressionsmedium BMMY so aufgenommen, dass die OD
600
1 betrug. Alle Kulturen
(25 mL) wurden bei 30 °C und 300 rpm in 250 mL Schikanekolben kultiviert. Jeden Tag
wurden 0,5% des Inducers Methanol zugegeben und der Kulturüberstand wurde täglich auf
LiP-Aktivität überprüft (s. 2.2.8). Als Negativkontrolle wurde ein X-33 Klon, der mit einem
leeren pPICZαA-Plasmid transformiert worden war, mitgeführt.
Neben dem Kulturüberstand wurde auch der Überstand nach Zellaufschluss mittels
Ultraschall auf LiP-Aktivität untersucht. Die Kulturüberstände und auch die Zellaufschlüsse
der Hefeklone und der Negativkontrollen wurden des Weiteren per SDS-Gel analysiert
(s. 2.2.10).
Expression der MnP in K. lactis
Zur Überprüfung der MnP-Expression in K. lactis wurden einzelne positiv getestete
Hefeklone und die Negativkontrolle zur Induktion des P
LAC4
Promoters in 25 mL Yeast
Peptone Galaktose Flüssigmedium (YPGal; 0,01% Hefeextrakt, 0,02% Pepton,
2% Galaktose) bei 30 °C und 250 rpm in 250 mL Schikanekolben mit einem Füllvolumen von
25 mL kultiviert. Der erste MnP-Aktivitätstest (s. 2.2.8) wurde 2 Tage nach Erreichen einer
gesättigten Kultur mit einer OD
600
von >30 durchgeführt. Von diesem Zeitpunkt an wurde der
Kulturüberstand 7 Tage lang täglich auf MnP-Aktivität hin überprüft. Zusätzlich wurde
täglich ein Aliquot aus den Kulturen entnommen, um einen Zellaufschluss mittels Ultraschall
durchzuführen. Der Überstand des Zellaufschlusses wurde ebenfalls auf MnP-Aktivität
überprüft.
Material und Methoden Teil 1
34
Des Weiteren wurde die Expression mittels SDS-Gelelektrophorese (s. 2.2.10) analysiert.
Hier wurden sowohl die Kulturüberstände verschiedener Hefeklone und der Negativkontrolle
als auch die Überstände des Zellaufschlusses verschiedener Hefeklone und der
Negativkontrolle aufgetragen.
In allen Hefeexpressionssystemen wurde der jeweilige Codon Adaptation Index (CAI)
mithilfe einer Software der Firma GenScript ermittelt. Ein CAI von 1,0 zeigt eine ideale
Übereinstimmung der Codon Usage von Fremdgen und Wirtsorganismus an. Je niedriger der
CAI, desto unpassender ist die Codon Usage von Fremdgen und Wirtsorganismus.
2.2.8 Aktivitätstests
Laccaseaktivitätstests
Zur Bestimmung der LAC-Aktivität im Kulturüberstand mit ABTS (ɛ
420nm
36000 M
-1
cm
-1
)
als Substrat wurden 100 µL Kulturüberstand zu 900 µL 100 mM Natriumtartrat Puffer
(pH 4,5), der 0,5 mM ABTS enthielt, gegeben und die Änderung der Absorption bei 420 nm
und 25 °C über mindestens 5 min unter ständigem Rühren am UV/Vis Photometer verfolgt.
Für die LAC-Charakterisierung wurde derselbe ABTS-Aktivitätstest, allerdings im kleineren
Maßstab, in Mikrotiterplatten (Carl Roth, Karlsruhe) angewendet. In der Mikrotiterplatte
wurden 180 µL Puffer und 20 µL in dest. Wasser gelöstes Laccaselyophilisat gemischt. Die
Absorption wurde im Mikrotiterplattenlesegerät gemessen.
LiP-Aktivitätstest
Zur Ermittlung der LiP-Aktivität im Kulturüberstand wurde die Oxidation von Veratryl-
alkohol zum entsprechenden Aldehyd genutzt. Die Entstehung des Veratrylaldehyds kann bei
310 nm (ɛ
310nm
9300 M
-1
cm
-1
) photometrisch verfolgt werden. In einer Küvette aus Quarzglas
(Hellma, Müllheim) wurden in der Regel 550 µL abzentrifugierter Kulturüberstand, 442,4 µL
0,1 M Natriumtartratpuffer (pH 3,0) und 2,9 µL Veratrylalkohol (1:10 verdünnt) gemischt.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4,7 µL 0,35%iger H
2
O
2
-Lösung gestartet. Letztendlich
lag Veratrylalkohol in einer Endkonzentration von 2 mM und H
2
O
2
in einer Endkonzentration
Material und Methoden Teil 1
35
von 0,54 mM vor. Der Aktivitätstest wurde bei 35 °C unter kontinuierlichem Rühren
durchgeführt.
MnP-Aktivitätstest
Zur Bestimmung der MnP-Aktivität im Kulturüberstand wurde die Oxidation von Mangan(II)
zu Mangan (III) (ɛ
270nm
11590 M
-1
cm
-1
) photometrisch bei 270 nm verfolgt. 200 µL
Kulturüberstand wurden hierfür mit 100 µL 20 mM MnCl
2
-Lösung und 690 µL 50 mM
Natriummalonatpuffer (pH 4,0) in einer 1 mL Quarzglasküvette gemischt. Die Reaktion
wurde durch Zugabe von 10 µL H
2
O
2
(20 mM) gestartet und die Absorption unter ständigem
Rühren bei Raumtemperatur über 1 min aufgenommen.
Als Grundlage für die Berechnung der Aktivität aller drei Enzyme dient das Lambert-
Beersche-Gesetz:
dcE
⋅
⋅
=
ε
,
wobei E = Extinktion der Lösung
ε = Extinktionskoeffizient der gemessenen Substanz [M
-1
cm
-1
]
c = Konzentration der Lösung [mol L
-1
]
d = Schichtdicke der Küvette [cm] ist.
Damit gilt für die Reaktionsgeschwindigkeit bzw. die Enzymaktivität:
ε
⋅⋅
∆
=
∆
d
t
E
t
c
,
wobei ∆E/t die Anfangssteigung (m) der Absorptionsänderung ist und die Schichtdicke der
verwendeten Küvette immer 1 cm betrug.
Material und Methoden Teil 1
36
Für die Berechnung der volumetrischen Aktivität wurde folgende Formel angewendet:
f
Vd
VE
mL
U
Akt
Ges
vol
∗
⋅⋅
∗
∆
=
ε
Enzymprobe
.
min ,
wobei V
Gesamt
das Gesamtvolumen in der Küvette ist, V
Enzymprobe
das Volumen der Enzymprobe
ist und f der jeweilige Verdünnungsfaktor ist.
2.2.9 Laccasecharakterisierung
Die Charakterisierung der rekombinanten LAC wurde mit partiell aufgereinigter LAC
durchgeführt. Hierzu wurde der Kulturüberstand der Kultivierung von transformierter
P. pastoris in gepuffertem Methanol-Komplex-Medium (s. 2.2.7) auf 1/5 des Ausgangs-
volumens mittels Ultrafiltration reduziert. Dieses Konzentrat wurde anschließend einer
Gelfiltration (Superdex 75; 30 cm x 1 cm; Pharmacia) mit 100 mM Natriumtartratpuffer
(pH 5,0) als mobiler Phase unterzogen. Die Fraktionen, die LAC-Aktivität aufwiesen, wurden
gepoolt, gegen dest. Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Die Reinheit des
Laccaselyophilisats wurde mittels SDS-Gelelektrophorese (s. 2.2.10) überprüft.
Die LAC-Aktivität wurde in der gesamten LAC-Charakterisierung mit dem ABTS-
Aktivitätstest (s. 2.2.8) bestimmt. Zur Bestimmung des pH-Optimums wurde die LAC-
Aktivität bei pH-Werten von 2,0; 3,0; 3,2; 3,3; 3,4; 3,5; 3,6; 3,8; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 und 9,0
gemessen. Statt des sonst verwendeten Natriumtartratpuffers wurde für die pH-Werte 2,0-3,3
ein 300 mM Glycin HCl Puffer, für die pH-Werte 3,4-6,0 ein 300 mM Natriumcitratpuffer,
für die pH-Werte 7,0-8,0 ein 300 mM Phosphatpuffer und für den pH-Werte 9,0 ein 300 mM
TrisHCl Puffer verwendet.
Die pH-Stabilität wurde bei den pH-Werten 2,0; 3,0; 3,5; 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 7,0, 8,0, 9,0, 10,0
und 11,0 untersucht. 500 µL des in dest. Wasser gelösten Laccaselyophilisats wurden in 1 mL
des entsprechenden Puffers gegeben und bei 4 °C gelagert. Für die pH-Werte 2,0-7,0 wurde
ein 100 mM Natriumtartratpuffer und für die pH-Werte zwischen 8,0 und 11,0 ein 300 mM
TrisHCl Puffer verwendet.
Material und Methoden Teil 1
37
Die Temperaturstabilität wurde bei Temperaturen von 25, 30, 40, 50, 55, 60, 70, 80 und 90 °C
gemessen. Das Lyophilisat der LAC wurde in Natriumtartratpuffer (pH 7,0) gelöst und bei
den angegebenen Temperaturen inkubiert.
Die Stabilität gegenüber Cl
-
-Ionen wurde gegen folgende Ionenkonz. untersucht: 20, 40, 60,
80, 100, 200, 300, 400 und 500 mol L
-1
. Hierzu wurde Laccaselyophilisat in NaCl-Lösungen
der jeweiligen Ionenstärke gelöst. Der pH-Wert wurde mit konz. HCl auf 8,0 eingestellt und
die Ansätze wurden bei 4 °C gelagert.
Die Stabilität gegenüber wassermischbaren organischen Lösungsmitteln wurde gegen Aceton,
DMSO, Ethanol und THF getestet. Das Lyophilisat der LAC wurde in einem Gemisch, das zu
50% (v/v) aus Wasser und zu 50% (v/v) aus dem entsprechenden Lösungsmittel bestand, bei
4 °C inkubiert.
Bei allen Stabilitätsmessungen wurde die Restaktivität unter Standardbedingungen (s. 2.2.8)
im Mikrotiterplattenlesegerät ermittelt. Aus der Abnahme der Aktivität über die Zeit wurden,
bei Annahme einer Reaktion erster Ordnung, die Inaktivierungskoeffizienten und die daraus
resultierenden Halbwertszeiten bestimmt.
2.2.10 Sonstige Methoden
Agarosegelelektrophorese
Für die Herstellung der Agarosegele wurden in der Regel 1,2% Agarose in Tris-Acetat-EDTA
(TAE)-Puffer gelöst und mit 3 µL Ethidiumbromidstammlösung (10 mg ml
-1
) je 100 mL
versetzt. Das Gel wurde mit 5-25 µL Probe, welche mit 20% (v/v) Loading Dye versehen
wurde und 5 µL des entsprechenden Markers beladen. RNA-Proben wurden über
Agarosegele, welche mit RNAse freiem Puffer hergestellt wurden, analysiert. Die Laufzeit
betrug zwischen 30 und 45 min bei 90 V. Die Banden wurden abschließend in der
Geldokumentation fotografiert.
Material und Methoden Teil 1
38
SDS-PAGE Gelelektrophorese
Tabelle 2.7. Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels für die SDS-Page Gelelektrophorese.
Reagenz V im Sammelgel [mL] V im Trenngel [mL]
Acrylamidmix 40% 0,75 2,250
1,5 M Tris/HCl Puffer pH 8,8 1,875
1 M Tris/HCl Puffer pH 6,8 0,75
dest. Wasser 4,35 3,225
10% (w/v) SDS 0,06 0,75
10% (w/v) APS 0,06 0,75
TEMED 0,006 0,003
Die Proben wurden mit einem Ultrafiltrationsgefäß Vivaspin 500 (s. 2.1.3) aufkonzentriert,
1:1 mit dem Probenpuffer Roti
®
-Load1 (Carl Roth, Karlsruhe) versetzt und bei 95 °C 5 min
denaturiert. Anschließend wurden 10-25 µL in die Probetaschen des Gels aufgetragen. Die
Laufzeit betrug 1,5 h bei 180 V. Das Gel wurde anschließend mit dest. Wasser gespült und
über Nacht in PageBlue Protein Staining Solution eingelegt. Anschließend wurde der
Farbstoff mit dest. Wasser entfernt und die Banden in der Geldokumentation fotografiert.
Bradfordtest
Proteinkonzentrationen wurden durch die Reaktion mit Coomassie Brilliant Blue
spektrophotometrisch quantifiziert. Die Kalibrierung erfolgte unter Verwendung von
Rinderserumalbumin in einem Konzentrationsbereich von 5-25 µg mL
-1
. Jeweils 800 µL der
entsprechenden Proben wurden mit 200 µL Bradfordreagenz versetzt und nach 10-minütiger
Inkubation bei Raumtemperatur bei 595 nm vermessen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
39
3. Ergebnisse und Diskussion
3.1 Expression der Laccase aus Cyathus bulleri in Pichia pastoris
Obwohl die sehr reaktive und scheinbar sehr stabile LAC aus dem Weißfäulepilz C. bulleri
eine äußerst erfolgversprechende LAC ist [Wicklow, Langie et al., 1984; Vasdev, Dhawan
et al., 2005; Salony, Mishra et al., 2006; Chhabra, Mishra et al., 2008], ist die industrielle
Anwendung dieses Biokatalysators aufgrund der zeitintensiven homologen Produktion
limitiert. Bei der homologen LAC-Produktion wird der Pilz C. bulleri 7-8 Tage kultiviert,
bevor die Kulturen geerntet und die LAC isoliert wird. Abhängig vom verwendeten Inducer,
der verwendeten C- und N-Quelle und dem C/N Quotienten im Medium werden LAC-
Aktivitäten zwischen 1,35 und maximal 98 U mL
-1
erzielt [Vasdev, Kuhad, 1994; Salony,
Mishra et al., 2006]. Zudem wächst C. bulleri vornehmlich in statischen Kulturen [Vasdev,
Kuhad, 1994
]
. Eine Kultivierung ist somit fast ausschließlich in Emersverfahren, die generell
eine schlechte Raum-Zeit-Ausbeute bieten, möglich. Des Weiteren produziert der Pilz
Pigmente, die eine Aufreinigung der LAC erschweren [Vasdev, Dhawan et al., 2005; Salony,
Mishra et al., 2006]. Aus diesen Gründen war es Ziel die LAC-Produktion durch heterologe
Expression zu vereinfachen.
Da die vollständige Nukleotidsequenz der LAC aus C. bulleri bisher nicht bekannt war,
musste diese vor der Klonierung des LAC-Gens in einen geeigneten Expressionsorganismus
zunächst ermittelt werden. Da der natürliche Wirt C. bulleri ein eukaryotischer Weißfäulepilz
ist, ist es sinnvoll ein ebenfalls eukaryotisches Expressionssystem zu benutzen. Hierdurch
sollten posttranslationale Modifikationen gewährleistet werden. Die Wahl fiel auf das
Hefeexpressionssystem Pichia pastoris, da diese Hefe gut charakterisiert und auch im
größeren Maßstab leicht zu kultivieren ist. Zudem wurden weitere Laccasen, wie z. B. die
LAC aus Trametes versicolor bereits sehr erfolgreich in P. pastoris exprimiert [Hong,
Meinander et al., 2002]. Im Anschluss an die heterologe Expression wurde die rekombinante
LAC charakterisiert.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
40
3.1.1 Ermittlung der Laccasesequenz
Die Laccaseregionen, die an der Bindung von Kupferionen beteiligt sind, sind bei allen
Laccasen aus Pilzen stark konserviert. Daher konnten auf Basis dieser großen Sequenz-
homologien degenerierte Primer für die LAC aus C. bulleri designt werden. Unter
Verwendung der degenerierten Primer gelang die Amplifikation eines 435 bp großen
Laccaseteilfragments [Salony, Mishra et al., 2006]. Ausgehend von diesem sequenzierten
Teilfragment wurde in der vorliegenden Arbeit mithilfe der RACE-PCR-Technik die
vollständige Laccasenukleotidsequenz aufgeklärt.
Da der Weißfäulepilz C. bulleri zu den Eukaryoten gehört, befinden sich nicht codierende
DNA-Abschnitte, die sogenannten Introns, innerhalb der Laccasegensequenz. Die Introns
werden zwar transkribiert, anschließend jedoch aus der prä-mRNA herausgespleißt bevor
diese zur Translation aus dem Zellkern herausgeschleust wird. Aufgrund dessen wurde die
Laccasesequenz ausgehend von der gespleißten mRNA ermittelt. Hierzu wurde zunächst die
Gesamt-RNA aus C. bulleri isoliert (s. 2.2.3) und der Erfolg der Isolation mittels
Agarosegelelektrophorese (s. 2.2.10) überprüft. Hierbei wurden zwei diskrete Banden, die der
28s und 18s rRNA entsprechen und die Integrität der RNA bestätigen, sichtbar.
Da für die Sequenzanalyse der LAC ausschließlich intakte mRNA in cDNA transkribiert
werden sollte, wurde die isolierte Gesamt-RNA des Pilzes zunächst mit Calf Intestinal
Phosphatase (CIP) behandelt. Die CIP baut frei liegende Phosphatreste am 5´-Ende ab, wie
sie zum Einen bei verkürzten mRNAs ohne 5´-Schutzkappe und zum Anderen bei allen
anderen RNA-Arten, die keine 5´-Schutzkappe tragen, vorkommen. Somit wurden verkürzte
mRNAs und andere RNA-Arten eliminiert, da sie an der später folgenden Ligation des
GeneRacer-RNA-Oligos an freie 5´-Phosphatenden nicht teilnehmen konnten. Die durch die
CIP dephosphorylierte RNA wurde anschließend mit Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)
behandelt, um die 5´-Schutzkappe intakter mRNAs zu entfernen. Hierdurch entstanden freie
5´-Phosphatenden, die für die Ligation des GeneRacer-RNA-Oligos benötigt wurden. Der
GeneRacer-RNA-Oligo (s. 2.1.3) wurde an die so behandelte mRNA ligiert und diese
anschließend in einer Reverse Transkriptase (RT) Reaktion unter Verwendung des
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
41
GeneRacer-Oligo-dTs (s. 2.1.3) in cDNA mit bekannten Primersequenzen am 5´- und 3´-Ende
transkribiert.
Für die Amplifikation des 5´-Ende des LAC-Gens wurde in der folgenden RACE-PCR der
GeneRacer-5´-Primer (s. 2.1.3), der homolog zum GeneRacer-RNA-Oligo ist, als
Forwardprimer eingesetzt. Als Reverseprimer wurde der genspezifische downstream Primer
(s. 2.1.3), der auf Basis des bereits mit degenerierten Primern amplifizierten und
sequenzierten Teilfragments designt worden war, verwendet. Für die Amplifikation des
3´-Ende des LAC-Gens wurde der genspezifische upstream Primer (s. 2.1.3), der ebenfalls auf
Basis des bereits sequenzierten Teilfragments des LAC-Gens designt worden war, benutzt.
Als zweiter Primer diente der GeneRacer-3´-Primer, der homolog zum GeneRacer-Oligo-dT
Primer ist (s. 2.1.3). Als 5´-RACE-PCR-Produkt wurde ein ca. 900 bp großes, als 3´-RACE-
PCR-Produkt ein ca. 500 bp großes Fragment vervielfältigt. Beide PCR-Produkte wurden
sequenziert und mit bereits veröffentlichten Laccasesequenzen mithilfe der Software
BLASTN verglichen. Hohe Homologien zu anderen Laccasen bestätigten, dass es sich bei den
amplifizierten Teilfragmenten tatsächlich um die Sequenz einer LAC handelt.
Ausgehend von diesen beiden sequenzierten Teilfragmenten wurden nun erneut
genspezifische Primer designt, um mithilfe der Primer Walking Technik weitere
Teilfragmente des Gens zu amplifizieren und zu sequenzieren (s. 2.2.4). Aus der Summe aller
sequenzierten Teilfragmente wurde letztendlich die vollständige Basenfolge der LAC aus
C. bulleri zusammengesetzt (s. Anhang, Abb. 4.1) und unter der Nummer EU195884 in
Gendatenbanken veröffentlicht.
3.1.2 Klonierung des Laccasegens
Für die geplante Expression der LAC in P. pastoris wurde nun das vollständig sequenzierte
LAC-Gen ohne natürliches Sekretionssignal des Pilzes amplifiziert (s. 2.2.4). Für die
Identifikation des natürlichen Sekretionssignals wurde die „von Heijne Signal Sequence
Prediction Methode“ [von Heijne, 1986] angewandt und entsprechende Primer designt (Oligo
1 und 2; s. 2.1.3). Gemäß den Erwartungen wurde in der PCR ein 1,49 kb großes DNA-
Fragment amplifiziert, welches zur Replikation in einen pCR4-TOPO Vektor kloniert und in
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
42
kompetente Top10 E. coli Zellen transformiert wurde (s. 2.2.5). Ausgewählte Klone, die auf
dem LB-Amp-Selektionsagar gewachsen waren, wurden mittels Colony-PCR unter
Verwendung von LAC-genspezifischen Primern analysiert (s. 2.2.5). Die Amplifikation des
1,49 kb großen LAC-Gens bestätigte die erfolgreiche Transformation des rekombinanten
Plasmidkonstruktes.
Anschließend wurde das amplifizierte LAC-Gen unter Kontrolle des starken, durch Methanol
induzierbaren P
AOX1
Promoter in den Hefe-Shuttle-Vektor pPICZαB (s. Anhang, Abb. 4.2)
kloniert. Der ausgewählte Expressionsvektor pPICZαB ermöglicht die extrazelluläre
Expression des Proteins, da das Gen im Leserahmen des Saccharomyces cerevisiae
α-Faktorsekretionssignals kloniert wurde. Zur Vervielfältigung wurde das rekombinante
Plasmid zunächst in E. coli DH5α Zellen und erst anschließend in P. pastoris X33 Zellen
transformiert (s. 2.2.6). Die Selektion positiver Klone erfolgte jeweils über die durch den
Hefe-Shuttle-Vektor vermittelte Zeocinresistenz.
Vor der Transformation des pPICZαB/LAC wurde dieser sequenziert. Die Nukleotidsequenz
des LAC-Gens entsprach der ermittelten Nukleotidsequenz und das Gen befand sich im
Leserahmen des Sekretionssignals. Nach der Transformation wurde mittels Colony-PCR unter
Verwendung von LAC-genspezifischen Primern (s. 2.2.6) untersucht, ob die Hefeklone ein
rekombinantes pPICZαB/LAC Plasmid aufgenommen hatten. Dies wurde durch die
Amplifikation des 1,49 kb großen LAC-PCR-Produktes bewiesen.
3.1.3 Expression der Laccase in Pichia pastoris
Die in der Colony-PCR positiv getesteten Hefeklone wurden auf Minimalmethanol (MM)
Agarplatten, die das LAC-Substrat ABTS enthielten, ausgestrichen (s. 2.2.6). Als
Negativkontrolle wurden P. pastoris Zellen, die mit einem leeren pPICZαB Vektor
transformiert wurden, mitgeführt. Nach 2 Tagen Inkubation hatte sich das Medium um alle
Kolonien der Klone herum grünlich verfärbt, wohingegen um die Kolonien der
Negativkontrollen keine grüne Verfärbung beobachtet wurde. Die grünliche Färbung war ein
Indiz für LAC-Aktivität, da oxidiertes ABTS grün wird.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
43
Einige dieser Hefeklone wurden nachfolgend in geschüttelten Flüssigkulturen in Komplex-
Methanol Medium auf LAC-Produktion hin untersucht (s. 2.2.7). Durch tägliche Zugabe von
Methanol wurden die induzierenden Bedingungen für den P
AOX1
Promotor aufrecht erhalten.
Um eine möglichst optimale Sauerstoffversorgung zu garantieren, wurde die Hefe in
Schikanekolben mit einem Füllvolumen von 10% kultiviert. Der Verlauf der optischen Dichte
(OD), der volumetrischen LAC-Aktivität und der Gesamtproteinkonzentration im
Expressionsmedium während der Kultivierung des Klons mit der maximalen LAC-Aktivität
ist in Abbildung 3.1 gezeigt.
0
5
10
15
20
25
30
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Kultivierungszeit [Tage]
Vol. Aktivität [U mL-1]; OD600
0
20
40
60
80
100
120
Gesamtproteinkonz. [µg mL-1]
Abbildung 3.1.
Verlauf der volumetrischen Laccaseaktivität, der optischen Dichte (OD) und der Gesamtprotein-
konzentration im Medium während der heterologen Expression der Laccase aus Cyathus bulleri in P. pastoris.
Der Hefeklon wurde in 100 mL gepuffertem Komplex-Methanol Medium (pH 6,0) in 1L Schikanekolben bei
30
0
C und 250 rpm kultiviert. OD
600
(Quadrate), volumetrische Laccaseaktivität (Rauten), Gesamt-
proteinkonzentration (Dreiecke).
Am dritten Tag der Kultivierung wurde eine maximale volumetrische LAC-Aktivität von
25±2,8 U mL
-1
gemessen. Die maximale Zelldichte wurde am zweiten Tag mit einem OD
600
-
Wert von ~17 erreicht und fiel danach langsam ab. Die maximale Gesamtprotein-
konzentration betrug 110 mg L
-1
. Der erzielte Proteingehalt liegt damit sogar leicht überhalb
der erzielten Proteingehalte der beiden bisher erfolgreichsten Laccase Expressionssysteme.
Bei der Expression einer Laccase aus Coprinus cinereus in Aspergillus oryzae [Yaver,
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
44
Overjero et al., 1999] und einer Laccase aus Trametes versicolor in Pichia pastoris [Hong,
Meinander et al., 2002] wurden in beiden Fällen Proteinkonzentrationen von bis zu 100 mg
L
-1
detektiert.
Die Aktivität heterolog exprimierter Laccasen kann oftmals durch die Zugabe von
Kupferionen, die im aktiven Zentrum der Laccasen gebunden sind und für deren Aktivität
essentiell sind, zum Expressionsmedium gesteigert werden [Guo, Lu et al., 2005]. Auch im
vorliegenden Fall konnte die vol. LAC-Aktivität von 25 U mL
-1
durch Zugabe von
Kupfersulfat (0 mM; 0,1 mM; 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM) weiter gesteigert werden,
wobei die optimale Kupfersulfatkonzentration zwischen 0,3 und 0,4 mmol L
-1
lag. Bei
Kupfersulfatkonzentrationen in diesem Bereich wurde am dritten Tag der Kultivierung mit
125±20 U mL
-1
die höchste vol. LAC-Aktivität ermittelt. Eine weitere Erhöhung der
Kupfersulfatkonzentration führte dagegen nicht zu einer weiteren Aktivitätssteigerung,
sondern gegenteilig zu einem Abfall der LAC-Aktivität.
Zusammenfassend wurde die Bereitstellung der LAC aus dem Pilz C. bulleri durch die
heterologe Expression im Hefeexpressionssystem P. pastoris stark vereinfacht. Bei der
homologen Produktion beträgt die Kultivierungszeit des Pilzes 7-8 Tage und es konnte bisher
beim Einsatz kostengünstiger C-Quellen wie Glukose eine maximale vol. Aktivität von
85 U mL
-1
erzielt werden [Salony, Mishra et al., 2006]. Bei der heterologen Expression in
P. pastoris beträgt die Kultivierungszeit dagegen nur 3 Tage und unter Zugabe von
Kupfersulfat wird eine deutlich höhere maximale vol. Aktivität von 125±20 U mL
-1
detektiert.
Die maximale vol. LAC-Aktivität liegt damit sogar leicht oberhalb der vol. Aktivitäten (50-
100 U mL
-1
) ebenfalls rekombinant in P. pastoris exprimierter Laccasen aus Trametes sp.
AH28-2 [Hong, Xiao et al., 2006] und Fome lignosus [Liu, Chao et al., 2003].
3.1.4 Charakterisierung der rekombinanten Laccase
Bei der Charakterisierung der rekombinanten LAC stand neben dem pH-Optimum und der
Temperatur- und pH-Stabilität der Einfluss von Haliden und organischen Lösungsmitteln auf
das Enzym im Vordergrund. Die Stabilität gegen diese beiden Parameter ist für mögliche
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
45
industrielle Anwendungen der LAC von großer Bedeutung [Couto, Toca-Herrera, 2006;
Singh, Sharma et al., 2009].
Für die Charakterisierung der rekombinanten LAC wurde diese partiell aufgereinigt. Hierzu
wurde der Kulturüberstand der Hefen nach erfolgreicher Expression auf 1/5 des Ausgangs-
volumens konzentriert. Dieses Konzentrat wurde anschließend einer Größenausschluss-
gelfiltration unterzogen und lyophilisiert (s. 2.2.9). In dem Lyophilisat wurde ein
Aufreinigungsfaktor von 2,6 und eine spezifische Aktivität von 5340 mU mg
-1
erreicht. Nach
der Gelfiltration betrug die Ausbeute noch 25%. Die nachfolgende Lyophilisation führte
jedoch zu hohen Verlusten, so dass lediglich eine Endausbeute von 3% gelang. Dennoch
wurde die Aufreinigung nicht weiter optimiert, da dies nicht Gegenstand der vorliegenden
Arbeit war. Die Reinheit des Laccaselyophilisats wurde mittels SDS-Gelelektrophorese
überprüft (s. Abb. 3.2). Die Fraktionen mit LAC-Aktivität enthielten kaum weitere Proteine,
so dass diese partielle Aufreinigung für die Charakterisierung der rekombinanten LAC als
ausreichend befunden wurde.
1 2 3 4 5 6 7
Abbildung 3.2. SDS-Gelelektrophorese der über Gelfiltration partiell aufgereinigten rekombinanten Laccase.
Reihe 1: Fraktion, die keine Laccaseaktivität zeigt; Reihe 2-4: Fraktionen, die Laccaseaktivität zeigen;
Reihe 5: Proteinmarker; Reihe 6: Ultrafiltrat des Kulturüberstandes; Reihe 7: Kulturüberstand.
Die SDS-Gelelektrophorese zeigte zudem, dass die rekombinante LAC ein MG von ca.
60±5 kDa aufweist. Dies stimmt mit den Angaben von Vasdev und Mitarbeitern [2005]
überein, die für die native LAC aus C. bulleri ebenfalls ein MG von 60±1 kDa ermittelten.
Salony und Mitarbeiter [2006] publizierten dagegen für die native LAC ein etwas geringeres
MG von 58±5 kDa [Salony, Mishra et al., 2006]. Vasdev und Mitarbeiter bestimmten die
Größe der nativen LAC nach Aufreinigung des Proteins über eine SDS-PAGE
70
kDa
55
kDa
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
46
Gelelektrophorese anhand eines Vergleichs mit Proteinmarkern. Salony und Mitarbeiter
schätzten das MG der aufgereinigten nativen LAC über eine Gelfiltrationssäule (1×30 cm,
Sephacryl S-200, superfine) ab. Durch die Ungenauigkeiten der Abschätzung sind die
geringen Unterschiede in den angegebenen Proteingrößen sehr wahrscheinlich zu erklären.
Fest steht jedoch, dass das MG der nativen und der rekombinanten LAC nahezu identisch ist.
Daraus kann geschlussfolgert werden, dass die rekombinante LAC aus C. bulleri im
Gegensatz zu vielen anderen bisher in P. pastoris exprimierten Laccasen nicht
hyperglykosiliert wird [Otterbein, Record et al., 2000; Colao, Lupino et al., 2006; Li, Hong
et al., 2007; Lu, Zhao et al., 2009].
Die rekombinante LAC wurde im Folgenden sowohl bezüglich ihres pH-Optimums als auch
auf ihre pH- und thermische Stabilität untersucht. Die ermittelten Werte wurden mit den
Werten der nativen LAC verglichen.
pH-Optimum und pH- und Temperaturstabilität
Zur Bestimmung des pH-Optimums der rekombinanten LAC wurde die LAC-Aktivität bei
pH-Werten von 2,0-9,0 gemessen (s. 2.2.9). Um das pH-Optimum der rekombinanten LAC
mit dem der nativen LAC vergleichen zu können, wurde dieses analog zu Salony und
Mitarbeitern [2006] bestimmt. Als Substrat wurde dementsprechend ABTS verwendet. Auch
die von Salony et al. [2006] für den jeweiligen pH-Bereich eingesetzten Puffer wurden analog
in dieser Arbeit verwendet. So wurde für den pH-Bereich von 2,0-3,3 ein GlycinHCl Puffer,
für den pH-Bereich von 3,4-6,0 ein Natriumcitratpuffer, für den pH-Bereich von 7,0-8,0 ein
Phosphatpuffer und für den pH-Wert 9,0 ein TrisHCl Puffer eingesetzt. Lediglich die
Temperatur bei der der Aktivitätstest durchgeführt wurde, unterschied sich mit 25 °C von der
bei Salony et al. [2006] bei 30 °C, eingestellten Temperatur. Es ist jedoch nicht zu erwarten,
dass dieser geringfügige Temperaturunterschied das pH-Optimum der LAC beeinflusst.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
47
0
20
40
60
80
100
123456789
pH-Wert
Relative Aktivität [%]
Abbildung 3.3. pH-Optimumskurve der rekombinant in P. pastoris exprimierten Laccase aus C. bulleri.
Als Substrat für den Aktivitätstest diente ABTS. Die Reaktionstemperatur betrug 25 °C. Folgende pH-Werte
wurden untersucht: 2,0; 3,0; 3,2; 3,3; 3,4; 3,5; 3,6; 3,8; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 und 9,0. Für den pH-Bereich
zwischen 2,0 und 3,3 wurde ein 300 mM GlycinHCl Puffer, für den pH-Bereich von 3,4-6,0 ein 300 mM
Natriumcitratpuffer, für den pH-Bereich von 7,0-8,0 ein 300 mM Phosphatpuffer und für den pH-Wert von 9,0
ein 300 mM TrisHCl Puffer verwendet.
Als pH-Optimum wurde für die rekombinante LAC ein pH-Wert von 3,4 ermittelt (s. Abb.
3.3). Bei Betrachtung der ermittelten pH-Optimumskuve fällt jedoch auf, dass diese keine
typische pH-Optimumsglockenkurve zeigt. Das gemessene pH-Profil der rekombinanten LAC
weist deutliche Unstetigkeiten auf. So fällt z. B. der plötzliche und sehr rasante
Aktivitätsanstieg zwischen pH 3,3 und pH 3,4 ins Auge. Hierbei muss beachtet werden, dass
wie bereits erwähnt analog zu Salony et al. [2006] für verschiedene pH-Bereiche sehr
unterschiedliche Puffersysteme verwendet wurden. Es ist gut denkbar, dass die verschiedenen
Ionen der verwendeten Puffer sehr unterschiedlich mit der LAC interagieren. Es ist nicht
auszuschließen, dass die verwendeten Ionen teilweise inhibierend auf die LAC wirken. Auch
eine unterschiedlich starke Inhibierung der LAC ist anzunehmen. Aufgrund dessen ist das in
Abb. 3.3 dargestellte pH-Profil der rekombinanten LAC mit Vorsicht zu interpretieren. Ob
das von Salony und Mitarbeitern [2006] ermittelte pH-Profil der nativen LAC ähnliche
Unstetigkeiten aufwies ist nicht bekannt, da lediglich das pH-Optimum ohne Abbildung der
pH-Optimumskurve publiziert wurde. Da das pH-Optimum der nativen LAC jedoch unter
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
48
denselben Bedingungen gemessen wurde [Salony, Mishra et al., 2006], kann als gesichert
angesehen werden, dass das pH-Optimum der rekombinanten LAC mit 3,4 geringfügig vom
pH-Optimum der nativen LAC, welches zwischen 3,5-4,0 liegt, abweicht. Auch Hong und
Mitarbeiter [2006] beobachteten bei der Expression einer LAC aus Trametes sp. AH28-2 in
P. pastoris eine leichte Verschiebung des pH-Optimums. Die rekombinante LAC aus
Trametes sp. AH28-2 hatte im Vergleich zur nativen LAC ebenfalls ein niedrigeres pH-
Optimum. Im Fall der rekombinanten LAC aus C. bulleri könnten vier zusätzliche
Aminosäurereste (Glutamat, Alanin, Glutamat, Alanin), die aufgrund der Verwendung des
α-Faktorsekretionssignals aus S. cerevisiae an den N-Terminus des rekombinanten Enzyms
gehangen wurden, die Ursache für die Verschiebung des pH-Optimums sein. Auch
posttranslationale Modifikationen, wie vor allem das Glykosilierungsmuster und die
Proteinfaltung, sind bei filamentösen Pilzen und P. pastoris leicht unterschiedlich [Han, Lei,
1999] und können den enzymatischen Charakter verändern. So beobachteten Li und
Mitarbeiter [2007] bei der Expression der Laccase B aus Trametes sp. in P. pastoris sogar ein
verändertes pH-Optimum und eine signifikant unterschiedliche pH- und thermische Stabilität
von nativem und rekombinantem Enzym.
Die pH-Stabilität der rekombinanten LAC wurde bei einer Inkubationstemperatur von 4 °C in
einem pH-Bereich zwischen 2,0 und 11,0 ermittelt (s. 2.2.9). Tabelle 3.1 listet die
Halbwertszeiten (t
1/2
) auf, die aus der Aktivitätsabnahme über die Zeit bei Annahme einer
Reaktion erster Ordnung ermittelt wurden.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
49
Tabelle 3.1. Halbwertszeiten der in P. pastoris rekombinant produzierten Laccase aus C. bulleri. Das
Lyophilisat wurde in verschiedenen Puffern bei pH-Werten von 2,0-11,0 gelöst und bei 4 °C gelagert. Für den
pH-Bereich von 2,0-7,0 wurde ein Natriumtartratpuffer, im pH-Bereich zwischen 8,0 und 11,0 ein TrisHCl
Puffer verwendet. Die Restaktivität wurde mit ABTS als Substrat gemessen.
pH-Wert Halbwertszeit t
1/2
[h]
2,0 2,7
3,0 11,5
4,0 34,6
5,0 69,3
6,0 99,0
7,0 99,0
8,0 173,0
9,0 139,0
10,0 34,6
11,0 3,5
Die rekombinante LAC ist bei einem pH-Wert von 8,0 mit einer Halbwertszeit von 173 h am
stabilsten. Generell ist die rekombinante LAC in einem pH-Bereich von 6,0-9,0 mit
Halbwertszeiten zwischen 99-173 h sehr stabil. Auch im sauren pH-Bereich kann die LAC
mit einer Halbwertszeit von immerhin 34,6 h bei pH 4,0 noch als stabil bezeichnet werden.
Allerdings muss bei den hier getroffenen Angaben zur pH-Stabilität der rekombinanten LAC
beachtet werden, dass bei den Messungen zwei verschiedene Puffersysteme eingesetzt
wurden. Im pH-Bereich zwischen 2,0 und 7,0 wurde ein Natriumtartratpuffer, im pH-Bereich
zwischen 8,0 und 11,0 ein TrisHCl Puffer verwendet. Wie bereits beim pH-Optimum
diskutiert, sind auch bei der Messung der pH-Stabilität unterschiedliche Wirkungen der
Tartrat-Ionen und der Tris- bzw. Cl
-
-Ionen auf die LAC nicht auszuschließen. Auch hier sind
unterschiedlich starke Inhibierungseinflüsse denkbar. Zudem könnte es gerade beim Einsatz
des TrisHCl Puffers zu einer Temperatur-abhängigen Verschiebung des eingestellten pH-
Wertes gekommen sein. Zumindest kann jedoch die Aussage getroffen werden, dass sich die
ermittelte pH-Stabilität der rekombinant produzierten LAC mit den Angaben der pH-Stabilität
der nativen LAC deckt. Diese wurde ebenfalls im pH-Bereich von 3,5 bis 9,0, allerdings ohne
nähere Angaben der verwendeten Puffer und der gemessenen Halbwertszeiten, als stabil
beschrieben [Salony, Mishra et al., 2006].
Die pH-Stabilität der rekombinanten LAC aus C. bulleri ist damit niedriger als die sehr hohe
pH-Stabilität der LAC aus dem Weißfäulepilz Panus tigrinus, die bei pH-Werten zwischen
3,0 und 5,0 Halbwertszeiten von 131-372 h und bei pH 6,0 eine Halbwertszeit von 632 h
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
50
aufweist [Quaratino, Federici et al., 2007]. Im Vergleich zu vielen anderen Laccasen aus
Weißfäulepilzen ist die pH-Stabilität der rekombinanten LAC aus C. bulleri jedoch zufrieden-
stellend. So ist die LAC aus Coriolus versicolor z. B. lediglich in einem engen Bereich
zwischen pH 7,0-8,0 stabil [Sugiura, Sakaino et al., 1987]. Auch die LAC aus Perenniporia
tephropora ist erst ab einem alkalischen pH-Wert von 8,0 stabil [Ben Younes, Mechichi et al.,
2007]. Die LAC aus Trametes versicolor ist dagegen lediglich im sauren pH-Bereich
zwischen pH 2,5-4,0 stabil [Han, Choi et al., 2005]. Die pH-Stabilität der LAC aus C. bulleri
ist mit der pH-Stabilität der LAC aus Coriolus hirsutus, die ebenfalls die höchste Stabilität im
pH-Bereich zwischen 6,0 und 9,0 aufweist, vergleichbar [Kojima, Tsukuda et al., 1990]. Es
sei abschließend jedoch nochmals darauf hingewiesen, dass sich die pH-Stabilitäten
verschiedener Laccasen aufgrund unterschiedlicher Messbedingungen nur bedingt
miteinander vergleichen lassen. Es können lediglich Tendenzen festgehalten werden.
Die Temperaturstabilität der rekombinanten LAC wurde bei Temperaturen zwischen 25-80 °C
gemessen. Das Lyophilisat der LAC wurde hierfür in Puffer (pH 7,0) gelöst und anschließend
bei den angegebenen Temperaturen inkubiert (s. 2.2.9). Da die LAC bei einem pH-Wert von
7,0 mit 99 h eine sehr hohe Halbwertszeit hat (s. Tabelle 3.1), ist davon auszugehen, dass der
inaktivierende Effekt der Temperatur für die Aktivitätsverluste ausschlaggebend ist.
Allerdings ist auch hier eine Temperatur-bedingte pH-Wert Verschiebung nicht
auszuschließen. Die gemessenen Halbwertszeiten der rekombinanten LAC werden in Tabelle
3.2 mit den jeweiligen Werten der nativen LAC, die von Salony übernommen wurden
[Salony, Mishra et al., 2006], verglichen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
51
Tabelle 3.2. Vergleich der Halbwertszeiten (t
1/2
) der in P. pastoris rekombinant exprimierten und der nativen
Laccase aus C. bulleri bei Temperaturen zwischen 25 und 80 °C. Die Werte der nativen Laccase wurden von
Salony, Mishra et al. [2006] übernommen, die die Temperaturstabilität anhand des Guaiacol-Aktivitätstests in
Citrat Puffer bei pH 5 ermittelten. Das Lyophilisat der rekombinanten Laccase wurde dagegen in Na-Tartrat
Puffer (pH 7,0) gelöst und bei den entsprechenden Temperaturen inkubiert. Die Restaktivität wurde mit ABTS
als Substrat gemessen. Aus der Abnahme der Aktivität über die Zeit wurden die Halbwertszeiten bei Annahme
einer Reaktion erster Ordnung ermittelt.
T [°C]
t
1/2
rekombinante LAC
[h]
t
1/2
native LAC
[h]
25 35,00 -
30 23,00 -
35 8,70 1,05
40 7,70 0,80
50 2,30 0,30
55 0,80 0,20
60 0,60 0,07
70 0,30 -
80 0,06 -
Der Vergleich der Halbwertszeiten legt nahe, dass die rekombinante LAC um ein Vielfaches
thermostabiler ist als die native LAC. So weist die rekombinante LAC bei 35 °C eine
Halbwertszeit von 8,7 h auf, die native LAC zeigt bei derselben Temperatur nur eine
Halbwertszeit von 1,05 h. Bei 35 °C ist das rekombinante Protein also 8mal stabiler als das
native. Dies trifft auch auf den Temperaturbereich zwischen 50 und 60 °C zu. Bei einer
Temperatur von 40 °C ist die Halbwertszeit des rekombinanten Enzyms sogar über 9mal
größer als die des nativen Enzyms. Allerdings muss hier beachtet werden, dass Salony und
Mitarbeiter [2006] die Temperaturstabilität nicht bei einem pH-Wert von 7,0 in Natriumtartrat
Puffer, sondern sehr wahrscheinlich bei einem pH-Wert von 5,0 in einem Citrat Puffer
ermittelten. Zudem verwendeten sie sehr wahrscheinlich den Guaiacol- anstatt des hier
verwendeten ABTS-Aktivitätstests. Leider geht weder die Verwendung des Puffers noch des
Aktivitätstests ganz eindeutig aus der Publikation hervor. Ob ABTS oder Guaiacol als
Substrat bei Ermittlung der LAC-Restaktivität nach Inkubation bei entsprechenden
Temperaturen verwendet wurde, dürfte die pH-Stabilität des Enzyms kaum beeinflussen. Der
bei der Inkubation des Proteins verwendete Puffer und vor allem der eingestellte pH-Wert
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
52
spielen dagegen eine entscheidende Rolle. Zumindest für die rekombinante LAC wurde für
einen pH-Wert von 5,0 eine Halbwertszeit von 69,3 h und bei einem pH-Wert von 7,0 eine
signifikant höhere Halbwertszeit von 99 h berechnet. Daher könnte die geringere pH-Stabilität
bei einem pH-Wert von 5,0 die Ergebnisse der thermischen Stabilität beeinflussen. Auch eine
unterschiedliche Interaktion der Tartrat- und Citrat-Ionen mit der LAC ist nicht
auszuschließen. Einflüsse des veränderten N-Terminus, eines eventuell veränderten
Glykosilierungsmusters und einer eventuell veränderten Proteinfaltung des rekombinanten
Proteins, wie sie beim pH-Optimum bereits besprochen wurden, sind ebenfalls nicht
auszuschließen.
Die thermische Stabilität der rekombinanten LAC aus C. bulleri liegt im selben Bereich wie
die vieler weiterer Laccasen aus Weißfäulepilzen. So sind die Temperaturstabilitäten der
Laccasen aus Coriolus hirsutus, Coriolus versicolor, Trametes versicolor, Perenniporia
tephropora und dem Basidiomyceten PM1 mit der Temperaturstabilität der LAC aus
C. bulleri vergleichbar [Kojima, Tsukuda et al., 1990; Sugiura, Sakaino et al., 1987; Han,
Choi et al., 2005; Ben Younes, Mechichi et al., 2007; Coll, Fernandez-Abalos et al., 1993].
Die Thermostabilität der rekombinanten LAC aus Cyathus bulleri ist jedoch deutlich höher
als die Thermostabilität der LAC aus Cyathus stercoreus, die lediglich bei Temperaturen
unter 25 °C stabil ist [Sethuraman, Akin et al., 1999]. So beträgt die Halbwertszeit dieser
LAC bei 40 °C lediglich 1 h, während die Halbwertszeit der LAC aus C. bulleri bei dieser
Temperatur 7,7 h beträgt.
Die LAC aus Panus tigrinus ist zwar bei Temperaturen bis einschließlich 50 °C stabiler als
die rekombinante LAC, die dafür wiederum bei Temperaturen ab 60 °C die höhere
Thermostabilität zeigt [Quaratino, Federici et al., 2007]. Insgesamt ist die Thermostabilität
der rekombinanten LAC aus C. bulleri als sehr zufriedenstellend zu betrachten. Wie beim
Vergleich der pH-Stabilität muss jedoch auch hier beachtet werden, dass Thermostabilitäten
aufgrund unterschiedlicher Messbedingungen nur begrenzt miteinander vergleichbar sind.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
53
Einfluss der Ionenstärke (NaCl) auf Aktivität und Stabilität
Es ist bekannt, dass viele Laccasen von Chloridionen stark inhibiert werden, da Halide mit
dem Elektronenakzeptor Sauerstoff um die Bindung an den Kupferzentren der Laccasen
konkurrieren [Singh, Sharma et al., 2009]. Diese Inhibierung ist bei industriellen
Anwendungen von Laccasen, wie z. B. der Entfärbung von Textilfarbstoffen und beim
Biobleichen von Pulp, sehr hinderlich [Farnet, Gil et al., 2008; Singh, Sharma et al., 2009].
Aufgrund dessen wurde der Einfluss von Chloridionen auf die Aktivität und Stabilität der
rekombinanten LAC untersucht.
Hierzu wurde Laccaselyophilisat in NaCl-Lösungen verschiedener Ionenstärke gelöst. Der
pH-Wert wurde auf 8,0 eingestellt und die Ansätze wurden bei 4 °C gelagert. Da die LAC bei
diesen Bedingungen sehr stabil ist (s. Tabelle 3.2), konnte der inaktivierende Effekt dieser
beiden Parameter minimiert werden. Auch ein Effekt der Na
+
-Ionen konnte aufgrund der
Ergebnisse von Vasdev und Mitarbeitern [2005] ausgeschlossen werden. In Abbildung 3.4 ist
die Restaktivität der LAC in Abhängigkeit von der Ionenstärke der NaCl-Lösung aufgetragen.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Ionenstärke der NaCl-Lösung [mmol L-1]
Relative Aktivität [%]
Abbildung 3.4. Relative Aktivität der rekombinanten Laccase in Abhängigkeit von der Ionenstärke der NaCl-
Lösung. Die Laccase wurde in NaCl-Lösungen mit Ionenstärken zwischen 0 und 500 mM bei einem pH-Wert
von 8,0 und einer Temperatur von 4 °C inkubiert. Die Laccaseaktivität wurde direkt nach Zugabe des Salzes
mithilfe des ABTS-Aktivitätstest ermittelt.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
54
Es ist eindeutig zu erkennen, dass die rekombinante LAC von Ionenstärken der NaCl-Lösung
zwischen 20 und 500 mmol L
-1
stark inhibiert wird. Selbst bei einer geringen Ionenstärke von
20 mmol L
-1
ist nur noch eine relative Restaktivität von 50,9% zu messen. Bis zu einer
Ionenstärke von 300 mmol L
-1
sinkt die relative Restaktivität weiter drastisch auf ~9,5% ab
und stabilisiert sich um diesen Wert herum bis zu einer Ionenstärke von 500 mmol L
-1
. In
Tabelle 3.3 sind Halbwertszeiten der LAC bei Inkubation in NaCl-Lösungen verschiedener
Ionenstärken dargestellt.
Tabelle 3.3. Halbwertszeiten der rekombinanten Laccase bei Inkubation in NaCl-Lösungen verschiedener
Ionenstärke bei 4 °C. Die Inaktivierungskoeffizienten und die daraus resultierenden Halbwertszeiten wurden
unter Annahme einer Reaktion erster Ordnung graphisch aus der Abnahme der Laccaseaktivität über die Zeit
ermittelt. Als Aktivitätstest wurde der ABTS-Test eingesetzt.
Ionenstärke (NaCl) [mM]
Halbwertszeit [h]
0 126
20 9,9
40 5,8
60 4,3
80 4,1
100 3,8
200 3,5
300 3,5
400 3,3
Die berechneten Halbwertszeiten belegen deutlich, dass schon eine geringe Ionenstärke der
NaCl-Lösung von 20 mmol L
-1
zu einer starken Herabsetzung der LAC-Stabilität führt, denn
t
1/2
sinkt von 126 h (I = 0 mM) auf gerade einmal 9,9 h (I = 20 mM) ab. Die Halbwertszeiten
sinken mit steigenden Ionenstärken immer weiter auf bis zu 3,3 h ab.
Ein direkter Vergleich des Einflusses von Chloridionen auf die native und rekombinante LAC
aus C. bulleri war aufgrund fehlender Daten des nativen Enzyms nicht möglich. Auch ein
Vergleich mit anderen Laccasen aus Pilzen ist schwierig, da hierzu bisher wenig
veröffentlicht wurde.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
55
Die LAC aus dem Basidiomyceten Trametes versicolor wird von Chloridionen jedoch in
einem ähnlichen Maße inhibiert wie die rekombinante LAC aus C. bulleri [Kim, Nicell,
2006]. Die LAC aus dem Basidiomyceten Marasmius quercophilus wird dagegen wesentlich
stärker von Chloridionen inhibiert. Bereits bei einer Ionenstärke der NaCl-Lösung von
7,5 mmol L
-1
beträgt die Restaktivität nur noch 50% [Farnet, Gil et al., 2008]. Eine LAC aus
dem Basidiomyceten Chalara paradoxa wird kaum von Chloridionen inhibiert. Diese LAC
zeigt selbst bei einer Ionenstärke der NaCl-Lösung von 300 mmol L
-1
noch 100%
Restaktivität [Robles, Lucas et al., 2002].
Im Vergleich mit Laccasen aus anderen Organismen als Pilzen erweist sich nach dem
gegenwärtigen Stand der Literatur lediglich die LAC aus dem γ-Proteobacterium JB als
halotoleranter. Diese LAC wird bis zu Ionenstärken der NaCl-Lösung von 80 mmol L
-1
nicht
in ihrer Aktivität beeinflusst und weist selbst bei einer Ionenstärke von 500 mmol L
-1
noch
eine Restaktivität von 60% auf [Singh, Sharma et al., 2009]. Die LAC aus dem
Proteobacterium Sinorhizobium meliloti wird dagegen in ähnlicher Weise von Chloridionen
beeinflusst wie die rekombinante LAC aus C. bulleri [Rosconi, Franco Fraguas et al., 2005].
Eine pflanzliche LAC aus dem Lackbaum Rhus vernicifera wird wesentlich stärker inhibiert
als die rekombinante LAC, da hier schon bei einer Ionenstärke der NaCl-Lösung von
20 mmol L
-1
nur noch eine Restaktivität von 10% detektiert wird [Mateescu, Agostinelli et
al., 1990]. Die LAC aus C. bulleri wies bei derselben Ionenstärke noch eine Restaktivität von
50,9% auf (s. Abb. 3.4).
Halbwertszeiten der Laccasen wurden in keinem der genannten Beispiele angegeben, was
Fragen bezüglich der Proteinstabilität aufwirft. Insgesamt ist die Stabilität der rekombinanten
LAC aus C. bulleri sehr zufriedenstellend.
Einfluss von Lösungsmitteln auf Aktivität und Stabilität
Für die industrielle Anwendung von Laccasen ist deren Lösungsmittelstabilität oft
entscheidend, da diese Phenoloxidasen überwiegend Anwendung beim Abbau schwer
löslicher Substanzen, wie z. B. Lignin oder aromatischer Schadstoffe, finden [Farnet, Gil
et al., 2008]. Daher wurde der Einfluss ausgewählter Lösungsmittel auf die Aktivität und
Stabilität der rekombinanten LAC untersucht (s. Abb. 3.5). Aus praktischen Gründen wurden
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
56
ausschließlich wassermischbare Cosolventien und keine Zweiphasensysteme betrachtet, um
den Einfluss der Phasengrenzfläche auf das Enzym zu umgehen. Um die ermittelte
Lösungsmittelstabilität der rekombinanten LAC aus C.bulleri mit Lösungsmittelstabilitäten
anderer Laccasen vergleichen zu können, wurden die bisher am häufigsten verwendeten
wassermischbaren Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO), Aceton und Ethanol ausgewählt
[Luterek, Gianfreda et al., 1998; Rodakiewicz-Nowak, Kasture et al., 2000; Cambria,
Cambria et al., 2000; Robles, Lucas et al., 2002; Colao, Lupino et al., 2006; Kim, Nicell,
2006; Farnet, Gil et al., 2008; Singh, Sharma et al., 2009]. Als weiteres, bisher nicht
getestetes Lösungsmittel wurde Tetrahydrofuran (THF) in die Experimente mit einbezogen.
Wegen der bei möglichen industriellen Anwendungen der LAC eingesetzten sehr schwer
löslichen Substrate, wurden diese Cosolventien in einer hohen Konzentration von 50% (v/v)
eingesetzt. Das Lyophilisat der LAC wurde in dem entsprechenden wässrigen Gemisch bei
4 °C inkubiert.
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25
Zeit [h]
Relative Aktivität [%]
Abbildung 3.5. Relative Restaktivität der rekombinant in P. pastoris exprimierten Laccase aus C. bulleri in
Abhängigkeit von der Zeit bei Inkubation in reinem Wasser (Rauten), 50% (v/v) Wasser/DMSO (Dreiecke),
50% (v/v) Wasser/Ethanol (Kreise), 50% (v/v) Wasser/Aceton (Balken) bzw. 50% (v/v) Wasser/THF (Quadrate)
bei 4 °C. Die Laccaseaktivität wurde mittels ABTS-Aktivitätstest bestimmt.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
57
Durch alle getesteten Lösungsmittel sinkt die Anfangsaktivität, im Vergleich zur
Anfangsaktivität in reinem Wasser, um ca. 40% ab. Dies ist sehr wahrscheinlich auf eine
Inhibierung der LAC durch die verwendeten Cosolventien zurückzuführen. Da die Bindungs-
stelle der organischen Substrate nah an der Enzymoberfläche der Laccasen liegt [Solomon,
Sundaram et al., 1996] und für Cosolventien somit frei zugänglich ist, könnten diese mit den
Substraten um die Bindungsstelle konkurrieren. In diesem Fall würden die Cosolventien als
kompetitive oder gemischte Inhibitoren fungieren [Rodakiewicz-Nowak, Kasture et al.,
2000]. Ursache und Mechanismus der Lösungsmittelinhibierung sind jedoch bisher ungeklärt.
Eine Vielzahl an Erklärungen bishin zur durch Cosolventien intiierten
Konformationsänderung der LAC sind denkbar.
Die rekombinante LAC zeigt gegenüber dem wässrigen DMSO-Gemisch die höchste
Stabilität. Die LAC-Aktivität bleibt über den gemessenen Zeitraum von 26 h nahezu konstant
und sinkt lediglich auf eine relative Restaktivität von ~44,6% ab. Gegen das wässrige
Acetongemisch zeigt die rekombinante LAC die zweithöchste Stabilität. Innerhalb von 1 h
sinkt die Aktivität hier auf einen Restwert von ~38,1% ab und fällt innerhalb von 7 h langsam
weiter auf 18,3% ab. Nach 26 h Inkubation ist hier immerhin noch eine relative Restaktivität
von 7,5% zu messen. Bei Inkubation in dem wässrigen Ethanolgemisch sinkt die LAC-
Aktivität innerhalb der ersten Stunde auf einen Wert von 34% ab und fällt innerhalb der
folgenden 6 h langsam weiter auf ~9,8% ab. Nach 26 h Inkubationszeit konnte nur noch eine
relative Restaktivität von lediglich 2,4% ermittelt werden. In einem wässrigen THF-Gemisch
konnte überhaupt keine LAC-Aktivität detektiert werden. Direkt nach Zugabe der LAC zum
Lösungsmittelgemisch sank die Aktivität hier auf Null, weshalb die Stabilitätsmessung bereits
nach 2 h aufgegeben wurde.
In Tabelle 3.4 sind Halbwertszeiten der LAC bei Inkubation in den verschiedenen
Cosolventien (50%) dargestellt.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
58
Tabelle 3.4. Halbwertszeiten der rekombinanten Laccase bei Inkubation in reinem Wasser, 50% (v/v)
Wasser/DMSO, 50% (v/v) Wasser/Aceton, 50% (v/v) Wasser/Ethanol Gemischen bei 4 °C. Als Aktivitätstest
wurde der ABTS-Test eingesetzt.
Lösungsmittel Halbwertszeit [h]
Reines Wasser 91,2
50% DMSO/Wasser 88,8
50% Aceton/Wasser 4,7
50% Ethanol/Wasser 3,0
Die Halbwertszeit bei Inkubation in 50% DMSO liegt mit 88,8 h nur wenig unter der
Halbwertszeit von 91,2 h des Proteins bei Inkubation in reinem Wasser. Die Halbwertszeiten
bei Inkubation in wässrigem Aceton bzw. Ethanol liegen mit 4,7 und 3,0 h deutlich unterhalb
der hohen Halbwertszeit in DMSO.
Wie bereits erwähnt können Laccasen durch Cosolventien kompetitiv oder gemischt inhibiert
werden, weshalb der Grad der Inhibierung stark vom verwendeten Substrat abhängig ist
[Rodakiewicz-Nowak, Kasture et al., 2000; Farnet, Gil et al., 2008
]
. Daher werden im
Folgenden lediglich Daten zum Vergleich herangezogen, die ebenfalls mit ABTS als Substrat
ermittelt wurden.
Die LAC aus dem Basidiomyceten Marasmius quercophilus, die von Chloridionen wesentlich
stärker inhibiert wird als die rekombinante LAC aus C. bulleri, wird von Cosolventien
dagegen in einem ähnlichen Maße inhibiert. Diese LAC zeigt bei Ethanolgehalten von 45
bzw. 65% Restaktivitäten von 70 bzw. 46% [Farnet, Gil et al., 2008]. Die hier untersuchte
rekombinante LAC zeigt bei einem Ethanolgehalt von 50% eine Restaktivität von 61%.
Die LAC aus dem Basidiomyceten Chalara paradoxa wird dagegen wesentlich stärker durch
Cosolventien inhibiert als die LAC aus C. bulleri. Schon bei Konzentrationen von lediglich
25% Cosolvens ist bei dieser LAC ein deutlicher Verlust der Aktivität zu beobachten [Robles,
Lucas et al., 2002]. So wurde bei 25% Ethanol zwar eine hohe Restaktivität von 73%
detektiert, die LAC aus C. bulleri weist bei einer Konzentration von 50% jedoch noch eine
ähnlich hohe relative Aktivität von 60,5% auf (s. Abb. 3.5). Bei einem Gehalt von 25%
Aceton bzw. DMSO wurden Restaktivitäten von 29,5 bzw. 37,4% ermittelt, während bei der
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
59
LAC aus C. bulleri bei Gehalten von 50% Cosolvens noch Restaktivitäten von 59,8 bzw.
55,9% gemessen wurden (s. Abb. 3.5).
Weniger stark inhibiert wird dagegen die LAC aus dem Basidiomyceten Rigidoporus lignosus
[Cambria, Cambria et al., 2000]. Hier wurde bei einem Gehalt von 50% Aceton bzw. DMSO
in beiden Fällen eine Aktivität von 100% gemessen. Bei Inkubation in DMSO konnte des
Weiteren kein Stabilitätsverlust detektiert werden. Für Aceton wurde jedoch eine
Halbwertszeit von 2,67 h angegeben, die damit unterhalb der Halbwertszeit der LAC aus
C. bulleri mit 4,7 h (s. Tabelle 3.4) liegt. Bei allen anderen aufgeführten Beispielen wurden
keine Halbwertszeiten angegeben.
Trotz des nachgewiesenen Effekts von Cosolventien auf die Aktivität und Stabilität der
rekombinanten LAC aus C. bulleri ist diese für den technischen Einsatz mit Löslichkeits-
vermittlern sehr vielversprechend. Bei sehr hohen Konzentrationen der Cosolventien von 50%
wird immer noch eine sehr zufriedenstellende Restaktivität von ca. 60% detektiert. Besonders
im wässrigen DMSO-Einphasensystem zeigt die LAC zudem eine sehr hohe Halbwertszeit,
die nur geringfügig unterhalb der Halbwertszeit bei Inkubation in reinem Wasser liegt. Neben
der Aktivität ist also auch die Stabilität zumindest bei Verwendung von DMSO für einen
technischen Einsatz hoch genug. Für die Identifikation eines optimalen Lösungsmittels wäre
es in weiteren Forschungsarbeiten interessant, ein umfassendes Lösungsmittelscreening mit
der rekombinanten LAC durchzuführen.
3.1.5 Zusammenfassung
Die Nukleotidsequenz der LAC aus dem Weißfäulepilz Cyathus bulleri wurde mittels RACE-
PCR und Primer Walking erfolgreich aufgeklärt und veröffentlicht. Die heterologe
Expression dieser LAC gelang im Hefeexpressionssystem Pichia pastoris. Nach Optimierung
der Expressionsbedingungen durch Zugabe von Kupfersulfat zum Medium, konnte eine
exzellente maximale volumetrische Aktivität von 125 U mL
-1
erzielt werden. Die
rekombinante LAC ist mit 60±5 kDa nicht größer als die native LAC, womit eine
Hyperglykosilierung durch die Hefe ausgeschlossen werden kann.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
60
Bei der Charakterisierung der rekombinanten LAC stellte sich heraus, dass die pH-Optima der
rekombinanten (pH 3,4) und der nativen LAC (pH 3,5-4,0) leicht voneinander abweichen.
Bezüglich der pH-Stabilität sind die Unterschiede nicht gravierend. Beide Enzyme sind in
einem breiten pH-Bereich zwischen 5,0-9,0 sehr stabil, womit die pH-Stabilität größer ist als
bei einigen anderen Laccasen. Die Thermostabilität der rekombinanten LAC ist im Bereich
zwischen 35-60 °C 8-9mal höher als die der nativen LAC, wobei hier unterschiedliche
Umgebungsbedingungen während der Experimente berücksichtigt werden müssen. Insgesamt
nimmt die Thermostabilität der LAC aus C. bulleri bei Temperaturen oberhalb 50 °C stark ab,
womit die Temperaturstabilität vergleichbar mit vielen anderen Laccasen ist. Die
Unterschiede bezüglich des pH-Optimums sind sehr wahrscheinlich auf leicht
unterschiedliche posttranslationale Modifikationen zwischen filamentösen Pilzen und
P. pastoris zurückzuführen. Auch durch die Verwendung des α-Faktorsekretionssignals an
den N-Terminus des rekombinanten Proteins angehangene Aminosäurereste könnten hierfür
eine Erklärung sein. Auch für die unterschiedliche Thermostabilität der nativen und
rekombinanten LAC könnten diese Argumente, neben den unterschiedlichen
Messbedingungen, zusätzlich als mögliche Ursache herangezogen werden.
Chloridionen beeinflussen Aktivität und Stabilität der rekombinanten LAC aus C. bulleri
stark. Schon bei einer geringen Ionenstärke der NaCl-Lösung von 20 mmol L
-1
ist nur noch
eine relative Restaktivität von 50,9% zu messen und die Halbwertszeit wird drastisch von
126 h auf 9,9 h verringert. Bei Erhöhung der Ionenstärke bis auf 500 mmol L
-1
, sinkt die
Halbwertszeit bis auf 3,3 h weiter ab. Im Vergleich zu anderen Laccasen liegt der Einfluss der
Ionenstärke der NaCl-Lösung damit im durchschnittlichen Bereich.
Bei Untersuchung der Lösungsmittelstabilität konnte besonders die LAC-Stabilität gegenüber
dem DMSO/Wasser-Gemisch (50%, v/v) mit einer Halbwertszeit von 88,8 h überzeugen. Die
Halbwertszeiten der rekombinanten LAC in wässrigen Aceton- bzw. Ethanolgemischen waren
mit 4,7 h und 3,0 h deutlich niedriger. Alle getesteten Lösungsmittel beeinflussten die
Laccaseanfangsaktivität stark. Im Vergleich zur Anfangsaktivität in reinem Wasser fiel sie um
~40% ab. Die Cosolventien könnten also als kompetitive oder gemischte Inhibitoren auf die
LAC wirken. In Anbetracht der getesteten sehr hohen Gehalte an Cosolventien von 50% (v/v)
sind jedoch sowohl die Restaktivität als auch die Stabilität der LAC bemerkenswert.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
61
3.2 Expression der Ligninperoxidase aus Phanerochaete chrysosporium in
Pichia methanolica und Pichia pastoris
Weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die am längsten bekannte, teilweise bereits gut untersuchte
und sehr reaktive LiPH8 (lipA) aus P. chrysosporium [Tien, Kirk, 1984; Kirk, Croan et al.,
1986; Hammel, Kalyanaraman et al., 1986; Andrawis, Johnson et al., 1988; Smith, Schalch et
al., 1988; Hammel, Moen, 1991; Blodig, Smith et al., 2001] analog zu Wang et al. [2004] in
der Hefe Pichia methanolica heterolog zu exprimieren. Wang und seinen Mitarbeitern gelang
in dem Protease defizienten Hefestamm die Expression der LiPH8 aus P. chrysosporium unter
dem induzierbaren Alkoholoxidase Promotor P
AUG1
mit einer Proteinkonzentration von
100 mg L
-1
und einer vol. Aktivität von 1933 U L
-1
. Dieses vielversprechende
Hefeexpressionssystem sollte reproduziert werden, damit die rekombinante LiP in weiteren
Forschungsarbeiten im Hinblick auf ihre Prozessstabilität charakterisiert werden kann und
Untersuchungen bezüglich der Einsatzmöglichkeiten bei der Nutzung des Rohstoffes Lignin
durchgeführt werden können.
3.2.1
Klonierung und Expression der Ligninperoxidase in Pichia methanolica
Der Pilz P. chrysosporium wurde unter ligninolytsichen Bedingungen kultiviert (s. 2.2.2), um
nach Erreichen der maximalen LiP-Aktivität im Medium die Gesamt-RNA aus dem
Myzelium zu isolieren (s. 2.2.3). Lediglich die mRNA wurde anschließend in einer RT-PCR
unter Einsatz eines Oligo-dT Primers (s. 2.1.3) in cDNA transkribiert, welche als Template
für eine PCR mit LiP-genspezifischen Primern diente (s. 2.2.4). Da der Weißfäulepilz
P. chrysosporium ebenso wie C. bulleri zu den Eukaryoten zählt, wurde das LiP-Gen analog
zum LAC-Gen ausgehend von der gespleißten mRNA, die keine Introns mehr enthält,
amplifiziert. Die Sekretion der LiP durch das α-Faktorsignalpeptid aus S. cerevisiae hatte sich
bei Wang et al. [2004] als erfolgreicher herausgestellt als die Sekretion des Enzyms durch das
natürliche Sekretionssignal aus P. chrysosporium. Daher wurde das LipH8-Gen in den
Hefeexpressionsvektor pMETαA (s. Anhang, Abb. 4.3), welcher das α-Faktorsekretionssignal
aus S. cerevisiae trägt, kloniert. Folglich wurde der genspezifische upstream Primer in der
PCR so gewählt, dass das Sekretionssignal von P. chrysosporium nicht amplifiziert wurde.
Gemäß den Erwartungen wurde ein 1035 bp großes DNA-Fragment vervielfältigt, welches
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
62
anschließend in den Vektor pCR4-TOPO kloniert und in E. coli Top10 Zellen repliziert wurde
(s. 2.2.5).
Nach Selektion über Ampicillinresistenz und Überprüfung der Aufnahme eines pCR4-
TOPO/LiP Plasmids über Colony-PCR wurde das rekombinante Plasmid aus positiv
getesteten Klonen isoliert, das LiP-Gen aus diesem herausgeschnitten und in den Hefe-
Shuttle-Vektor pMETαA ligiert. Der pMETαA/LiP Vektor wurde nachfolgend zur
Replikation in E. coli DH5α Zellen transformiert (s. 2.2.6). Einige der Kolonien, die auf dem
Amp-Selektionsagar gewachsen waren, wurden abermals einer Colony-PCR mit
genspezifischen Primern unterzogen. Alle getesteten Klone hatten das pMETαA/LiP Plasmid
aufgenommen, denn bei allen Klonen wurde ein 1035 bp großes DNA-Fragment amplifiziert.
Zur Überprüfung der Nukleotidsequenz des Gens und der Klonierung innerhalb des
Leserahmens des Sekretionssignals wurde das Plasmid eines ausgewählten Klons sequenziert.
Als Primer wurden dabei der AUG1-Forward Primer, der upstream des α-Faktorsignals
ansetzt, und der AUG1-Reverse Primer, der hinter der Multiple Cloning Site ansetzt,
eingesetzt. Ein Sequenzvergleich über die Software BLASTN zeigte, dass die
Nukleotidsequenz des klonierten Gens zu 100% mit der publizierten Sequenz des LiPH8-
Gens (EMBL Accession Number X06689) übereinstimmt. Zudem zeigte sich, dass das Gen
innerhalb des Leserahmens des Sekretionssignals des Vektors kloniert wurde (s. Anhang,
Abb. 4.4).
Aus diesem positiv getesteten Klon wurde das Plasmidkonstrukt pMETαA/LiP isoliert und
anschließend mithilfe des Restriktionsenzyms AscI linearisiert. Die so entstandene
Expressionskassette bestand aus dem AUG1 Promotor, dem α-Faktorsekretionssignal, dem
LiP-Gen, der AUG1 Transkriptions Terminations Region, dem ADE2 Gen aus S. cerevisiae
und den downstream 3´AUG1 Sequenzen. Das ADE2 Gen aus dem Wildtypstamm
S. cerevisiae codiert eine Phosphoribosylaminoimidazolcarboxylase und komplementiert den
P. methanolica PMAD16 ade2 Stamm. Somit wird die Selektion von P. methanolica Klonen
auf Minimalmedien ohne Adeninzusatz ermöglicht. Durch das Herausschneiden der
Expressionskassette aus dem Expressionsvektor wird die Transformationseffizienz erheblich
gesteigert und die Rekombination in P. methanolica vereinfacht. In P. methanolica sind nicht-
homologe Rekombinationsereignisse wesentlich wahrscheinlicher (>90%) als homologe
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
63
Rekombination. Daher kann die Expressionskassette an vielen Loci im Hefegenom integriert
werden.
Die transformierten Hefen wurden auf Minimal Dextrose (MD) Platten ohne Adeninzusatz
ausgestrichen und nach 4 Tagen Inkubation bei 29 °C bildeten sich kleine Hefekolonien.
Diese wurden einer Colony-PCR mit genspezifischen Primern unterzogen, um zu überprüfen
ob die Expressionskassette inklusive des LiP-Gens in das Hefegenom integriert wurde. Bei
der Colony-PCR wurde gemäß den Erwartungen ein 1035 bp großes DNA-Fragment
amplifiziert. In allen untersuchten Hefeklonen wurde die Expressionskassette demnach durch
Rekombination in das Hefegenom integriert.
Zur Überprüfung der Expression wurden die positiv getesteten Hefeklone in BMDY-Medium
kultiviert (2.2.7). Jeden Tag wurde der Kulturüberstand auf LiP-Aktivität hin geprüft, jedoch
konnte selbst nach 8 Tagen Kultivierung keine Aktivität detektiert werden. Eine zusätzliche
Analyse der Expression wurde mithilfe einer SDS-Page-Gelelektrophorese durchgeführt.
Neben den Kulturüberständen der Hefeklone wurde auch der Kulturüberstand der
Negativkontrolle P. methanolica pMETαA aufgetragen. Auch die SDS-Gelanalyse zeigte,
dass kein Protein in der Größe der LiP von 38-42 kDa exprimiert wurde. Um auszuschließen,
dass lediglich die Sekretion des Enzyms nicht funktioniert hatte, wurden die Zellen der
Hefeklone und auch die der Negativkontrolle nach Kultivierung in BMDY-Medium
aufgeschlossen. Der Zellaufschluss wurde ebenfalls ohne Erfolg auf LiP-Aktivität hin
untersucht.
Es bleibt festzuhalten, dass die Expression der LiP in P. methanolica nicht gelang, obwohl sie
analog zu Wang und Mitarbeitern [2004] durchgeführt wurde. Eine mögliche Ursache hierfür
könnte die mangelnde genetische Stabilität des käuflich erworbenen Hefeexpressionssystems
sein. Ein Hinweis darauf ist, dass das Selektionssystem über Komplementierung des
PMAD16 ade2 Hefestammes durch Integration der Expressionskassette im Hefegenom zum
Genotypen ADE2 nicht funktionierte. Die untransformierten Hefestämme PMAD11 und
PMAD16, die beide den Genotypen ade2 tragen, wuchsen auf Minimalmedien ohne
Adeninzusatz genauso schnell wie die vermeintlich transformierten rekombinanten Stämme
und vor allem wie der im Kit mitgelieferte Kontrollstamm PMAD16/pMETαB/HSA. Die
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
64
genetische Stabilität des mutierten Expressionsstamm P. methanolica kann daher in Frage
gestellt werden und es erscheint gut vorstellbar, dass auch die Rekombination im Hefestamm
nach Transformation der Expressionskassette nicht stattfand.
Im vorliegenden Fall konnte die Integration der Expressionskassette in das Genom des
Hefestammes P. methanolica jedenfalls nicht eindeutig nachgewiesen werden. Da die
Hefeklone nach der Transformation auf den Selektions-MD-Platten schlecht wuchsen und
sehr klein blieben wurden einige Kolonien, die zuvor per Colony-PCR positiv auf die
Aufnahme der Expressionskassette getestet wurden, auf YPD-Platten umplattiert. Mit diesen
umplattierten Hefeklonen wurde zur erneuten Kontrolle abermals eine Colony-PCR mit LiP-
spezifischen Primern durchgeführt. Zwar wurde wieder gemäß den Erwartungen ein
Teilfragment (1035 bp) in der Größe des LiP-Gens amplifiziert, jedoch fiel die Amplifikation
diesmal deutlich schwächer aus. Die Colony-PCR wurde mehrmals wiederholt. Jedes Mal
konnte jedoch nur eine sehr schwache Amplifikation des LiP-Gens detektiert werden. Die
Klone wurden in flüssigem BMDY-Medium kultiviert und nochmals einer Colony-PCR
unterzogen. Diesmal war selbst nach mehrmaligen Wiederholungen keine Amplifikation des
LiP-Gens zu detektieren.
Dies legt die Vermutung nah, dass nach der Transformation der Expressionskassette in
P. methanolica keine Rekombination erfolgt war, so dass diese sehr wahrscheinlich nicht in
das Hefegenom integriert wurde. Werden folglich Kolonien untersucht, die direkt nach der
Transformation ausgestrichen wurden, wird in der Colony-PCR mit LiP-spezifischen Primern
eine sehr hohe Amplifikation erzielt, weil die Expressionskassette sich noch in den Hefezellen
befindet oder an diesen haftet. Das Problem des Verschleppens des Inserts aus der
Ligationsreaktion und der daraus resultierenden Identifikation falsch positiver Klone wurde
z. B. von Vineet und Nilanjan [2008] und von Dallas-Yang et al. [1998] beschrieben. Nach
dem Umplattieren vermeintlich positiv getesteter Klone wird in der Colony-PCR nur noch
eine wesentlich schwächere Amplifikation des LiP-Gens erreicht, da nun schon ein Großteil
der nicht integrierten Expressionskassette abgebaut wurde. Nach Inokulation der Klone in
Flüssigmedium wird keine Amplifikation des Zielgens mehr erreicht, da die
Expressionskassette bereits vollständig degradiert wurde. Zur Vermeidung der Selektion
falsch positiver Klone durch Colony-PCR wird empfohlen, die PCR nicht mit zwei
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
65
genspezifischen Primern, sondern mit einem genspezifischen und einem zielgenom-
spezifischen Primer durchzuführen. Aufgrund der nicht-homologen Rekombination war dies
im vorliegenden Fall jedoch nicht möglich.
Auch Wang und seine Mitarbeiter überprüften die Integration der Expressionskassette im
Hefegenom lediglich mit zwei LiP-Gen-spezifischen Primern und das auch nur einmal direkt
nach der Transformation der Hefen. Zudem geht aus der Veröffentlichung von Wang et al.
[2004] nicht hervor, über welche Zeitspanne sich ihre Experimente mit dem
Hefeexpressionssystem P. methanolica erstreckten. Es erscheint gut möglich, dass diese
Arbeitsgruppe lediglich anfangs keine Probleme mit der genetischen Stabilität des
Hefestammes und der transformierten Hefeklone hatte und diese erst mit der Zeit auftraten.
Da sich das P. methanolica Expressionssystem also als fehlerhaft und ungeeignet erwiesen
hatte, wurde ein weiteres Hefeexpressionssystem, die P. pastoris, getestet. Diese Hefe wurde
bereits erfolgreich für die rekombinante Produktion mehrerer eukaryotischer Proteine
eingesetzt [Cereghino, Cregg, 2000; Gellissen, 2000] und auch die LAC aus C. bulleri konnte
in P. pastoris mit hervorragender Ausbeute exprimiert werden (s. 3.1). Auch ein
Hämflavoenzym, die Cellobiosedehydrogenase (CDH) aus P. chrysosporium, wurde bereits
heterolog unter der Kontrolle des Alkoholoxidase Promotors P
AUG1
in dieser Hefe exprimiert
[Yoshida, Ohira et al., 2001]. Die Enzymeigenschaften der rekombinanten CDH
unterschieden sich dabei kaum von denen des nativen Proteins. P. pastoris wurde ebenfalls
erfolgreich für die heterologe Expression weiterer Häm enthaltender Proteine wie der
Stickstoffmonoxidsynthase und der Nitratreduktase herangezogen [Gachhui, Presta et al.,
1996; Leber, Hemmens et al., 1999; Mertens, Shiraishi et al., 2000; Skipper, Campbell et al.,
2001]. Es kann also vorausgesetzt werden, dass die Hefe P. pastoris aktive Enzyme mit einer
prosthetischen Hämgruppe produzieren kann. Aus diesen Gründen wurde das Hefe-
expressionssystem P. pastoris für die Produktion der LiP ausgewählt.
3.2.2 Klonierung und Expression der Ligninperoxidase in Pichia pastoris
Für die Klonierung des LiP-Gens in das Hefeexpressionssystem P. pastoris wurde dieses
abermals mit genspezifischen Primern ohne das natürliche Sekretionssignal des Pilzes
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
66
amplifiziert, jedoch wurden diesmal passend zum Hefe-Shuttle-Vektor pPICZαA (s. Anhang,
Abb. 4.2) die Schnittstellen EcoRI und SacII über die Primer an die Genenden angefügt. Nach
Klonierung des amplifizierten LiP-Gens in den pCR4TOPO Vektor, dessen Transformation in
E. coli Top10 Zellen, Umklonierung des Gens in den Hefeexpressionsvektor pPICZαA und
dessen Transformation und Replikation in E. coli DH5α Zellen, wurde das pPICZαA/LiP
Plasmid isoliert und sequenziert. Dabei wurde bestätigt, dass die Nukleotidsequenz des LiP-
Gens korrekt ist und dass es in den Leserahmen des α-Faktorsekretionssignals aus
S. cerevisiae kloniert wurde (s. Anhang, Abb. 4.5).
Das pPICZαA/LiP Plasmidkonstrukt aus dem sequenzierten Klon wurde isoliert und mit dem
Restriktionsenzym PmeI linearisiert. Durch diese Linearisierung des Plasmids wird die
Frequenz der homologen Rekombination am AOX1 Locus gegenüber der nicht-homologen
Rekombination in der Hefe deutlich erhöht. Die lineare pPICZαA/LiP Expressionskassette
wurde in P. pastoris X-33 Zellen transformiert und diese anschließend auf YPDS/Zeocin
Platten selektiert. Um die Integration der Expressionskassette in das Pichia Genom zu
überprüfen, wurde mit ausgewählten Klonen eine Colony-PCR durchgeführt. Hierbei wurden
der 5´AOX1 Primer, der vor dem α-Faktorsekretionssignal am 5´-AOX1 Locus ansetzt und der
3´AOX1 Primer (s. 2.1.3), der hinter der Multiple Cloning Site ansetzt, eingesetzt. Bei
erfolgreicher Integration des linearisierten Plasmids in das Hefegenom müssten bei der
Colony-PCR zwei DNA-Fragmente amplifiziert werden. Ein Fragment müsste der Größe des
LiP-Gens entsprechen, das Andere müsste der Größe des AOX1-Gens (ca. 2,2 kb)
entsprechen. Tatsächlich wurden bei der Agarosegelelektrophorese der PCR-Produkte zwei
Banden sichtbar (s. Abb. 3.6). Die größere Bande entsprach mit ca. 2,2 kb dem AOX1-Gen,
die kleinere Bande war ca. 1600 bp groß und entsprach somit der Summe des LiP-Gens
(1035 bp) und dem Fragment, das das pPICZαA Plasmid produziert (588 bp). Somit war
eindeutig bewiesen, dass die Expressionskassette inklusive LiP-Gen in das Genom der Pichia
pastoris integriert wurde.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
67
Abbildung 3.6. Agarosegelelektrophorese der PCR–Produkte aus der Colony-PCR mit ausgewählten Pichia
pastoris Klonen. Als Primer wurden der 5´AOX1- und der 3´AOX1-Primers eingesetzt.
Die positiv getesteten Hefeklone wurden anschließend auf Expression der LiP im
Expressionsmedium BMMY überprüft (s. 2.2.8). Als Negativkontrolle wurde ein X-33 Klon,
der mit einem leeren pPICZαA Plasmid transformiert worden war, kultiviert. Bei keinem der
Klone konnte LiP-Aktivität detektiert werden. Um sicher zu gehen, dass lediglich nur die
Sekretion der LiP nicht funktioniert und das Enzym intrazellulär vorliegt, wurde auch der
Zellaufschluss an mehreren Tagen auf LiP-Aktivität untersucht. Auch hier konnte selbst fünf
Tage nach Induktion keine LiP-Aktivität gemessen werden.
Die Kulturüberstände und auch die Zellaufschlüsse wurden aufkonzentriert und per SDS-
Gelelektrophorese analysiert. Auch hier wurde bestätigt, dass keine LiP exprimiert wurde,
denn im Größenbereich der LiP von 39-42 kDa war bei keinem Klon eine Proteinbande im
SDS-Gel zu erkennen. Generell exprimierte die Negativkontrolle dieselben Proteine wie die
Klone. Ein ähnliches Bild ergab sich bei der SDS-Gelanalyse der Zellaufschlüsse. Auch hier
war kein Unterschied zwischen den Klonen und der Negativkontrolle zu erkennen. Eine
intrazelluläre Expression der LiP konnte somit ausgeschlossen werden.
Ein weiterer Grund für die fehlende Expression der LiP könnte eine unpassende Codon Usage
des Wirtsorganismus P. pastoris sein, die zur starken Verlangsamung und zum Abbruch der
Translation führen kann. Um dies auszuschließen wurde der Codon Adaptation Index (CAI)
des LiP-Gens und der P. pastoris mithilfe einer Software der Firma GeneScript analysiert. Für
die Expression der LiPH8 aus P. chrysosporium in P. pastoris ergab sich ein CAI von 0,62.
Ein CAI von 1 ist ideal, ein CAI von 0,62 noch sehr zufriedenstellend. Innerhalb der
Gensequenz gibt es kein Basentriplett, das nicht vom Wirtsorganismus translatiert werden
1000
bp
1500
bp
2000
bp
3000
bp
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
68
kann. Zwar könnte die Nukleotidsequenz für eine Expression in P. pastoris im Hinblick auf
die Codon Usage optimiert werden, eine Erklärung für die gänzlich fehlende Expression
bietet sie aber nicht. Die LAC aus C. bulleri wurde z. B. sehr erfolgreich im selben
Wirtsorganismus exprimiert (s. 3.1), obwohl hier nur ein geringfügig höherer CAI von 0,66
ermittelt wurde. Auch für die ausbleibende Expression der LiP im Hefeexpressionssystem
P. methanolica kann eine nicht passende Codon Usage nicht als Ursache herangeführt
werden, denn in diesem Fall wurde ein CAI von 0,60 ermittelt.
3.2.3 Zusammenfassung
Es kann festgehalten werden, dass die Expression der LiPH8 aus P. chrysosporium im
Hefeexpressionssystem P. methanolica nicht erfolgreich war. Obwohl die Klonierung im
P. methanolica Expressionssystem und auch die Expression analog zu Wang et al. [2004]
durchgeführt wurden, konnte keinerlei LiP Produktion beobachtet werden. Das
Selektionssystem der P. methanolica erwies sich als fehlerhaft und die Integration des LiP-
Gens in das Hefegenom konnte nicht nachgewiesen werden, weshalb die genetische Stabilität
des Hefestammes P. methanolica angezweifelt wurde.
Als weiteres Hefeexpressionssystem für die LiP wurde P. pastoris getestet. Die Integration
des LiP-Gens in das Hefegenom konnte zwar eindeutig nachgewiesen werden, doch auch hier
konnte weder intrazelluläre noch extrazelluläre LiP-Aktivität bzw. ein Protein der Größe der
LiP nachgewiesen werden.
Es zeigte sich, dass die heterologe Expression der LiP sehr schwierig ist. Dies steht im
Einklang mit Literaturdaten. Die heterologe Expression der LiP wurde bereits ohne Erfolg in
dem filamentösen Pilz A. niger unter zwei verschiedenen Promotoren untersucht, wobei
lediglich Spuren aktiver LiP bzw. lediglich inaktives Enzym exprimiert wurde [Aifa, Sayadi
et al., 1999; Conesa, van den Hondel et al., 2000]. Bei der Klonierung einer LiP aus Phlebia
radiata im Pilz Trichoderma reesei konnte gar keine Produktion des Proteins detektiert
werden [Saloheimo, Barajas et al., 1989]. Nach dem gegenwärtigen Stand der Literatur sind
die bisher einzig erfolgreichen heterologen Expressionen einer LiP im Pilz Amylomyces rouxii
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
69
[Montiel-González, Fernández et al., 2009] und in der Hefe P. methanolica [Wang, Lu et al.,
2004] gelungen.
Im vorliegenden Fall wäre es interessant über eine „Reverse Transcription quantitative PCR“
(RT-qPCR) oder über Northern Blotting das Level an gebildeter mRNA in beiden
transformierten Hefeexpressionssystemen zu überprüfen. Hierdurch könnte analysiert werden,
ob das Fremdgen überhaupt transkribiert wird. Hohe Konzentrationen an transkribierter
mRNA des Hämperoxidasegens führen jedoch nicht zwangsläufig zur Produktion des
Enzyms. Im Falle der heterologen Expression der LiP aus P. radiata in T. reesei konnte z. B.
trotz eines hohen mRNAs Levels des Fremdgens, keinerlei Produktion der LiP festgestellt
werden [Saloheimo, Barajas et al., 1989]. Auch bei der Expression der LiP aus
P. chrysosporium in A. niger konnten, trotz hoher Konzentrationen des Transkripts, nur
Spuren des Enzyms detektiert werden [Aifa, Sayadi et al., 1999].
Neben der Transkription gibt es demnach noch zahlreiche weitere Faktoren, die die
Translation und erfolgreiche Produktion von Fremdproteinen behindern. Die Translation der
mRNA kann durch eine nicht passende Codon Usage des Expressionsstammes limitiert
werden. Eine nicht Übereinstimmung der Codon Usage konnte jedoch im vorliegenden Fall
für beide Hefeexpressionssysteme ausgeschlossen werden. Für P. methanolica wurde ein CAI
von 0,60, für P. pastoris ein CAI von 0,62 ermittelt. Beide CAIs sind zufriedenstellend und
können keine Erklärung für die gänzlich ausbleibende LiP-Produktion sein.
Speziell bei der heterologen Expression von Hämproteinen kann die mangelnde Verfügbarkeit
der prosthetischen Hämgruppe im Wirtsorganismus limitierend für deren Produktion sein
[Conesa, van den Hondel et al., 2000]. Gerade bei der heterologen Expression von
Hämproteinen in filamentösen Pilzen, aber auch bei der Expression in P. pastoris, konnte die
Enzymproduktion oftmals durch Zugabe von Hämoglobin oder anderen Hämverbindungen
gesteigert werden [Stewart, Whitwam et al., 1996; Conesa, van den Hondel et al., 2000;
Larrondo, Lobos et al., 2001; Gu, Lajoie et al., 2003]. Es handelt sich hierbei jedoch lediglich
um eine Steigerung einer bereits ohne Hämzugabe detektierbaren Enzymproduktion. Die
spezifische Enzymaktivität wird dabei oftmals nicht erhöht, was vermuten lässt, dass
Apoformen der rekombinanten Hämperoxidase während oder nach der Sekretion instabil sind,
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
70
und dass nur das Holoenzym im extrazellulären Medium akkumuliert wird [Conesa, van den
Hondel et al., 2000]. Als Ursache für die im vorliegenden Fall vollständig ausbleibende
heterologe Produktion der Hämperoxidase kann eine mangelnde Verfügbarkeit der
prosthetischen Gruppe jedoch kaum herangezogen werden.
Als weitere Ursache für die schwierige heterologe Expression der LiP werden Limitierungen
während der Proteinfaltung in Betracht gezogen. Während der Passage sekretorischer Proteine
durch das endoplasmatische Retikulum spielen vor allem Chaperone und Foldasen bei der
Proteinfaltung- und Maturation eine große Rolle. Wenn im Wirtsorganismus nicht genügend
Chaperone exprimiert werden, kann es zu Fehlfaltungen der Peroxidase kommen. So gelang
Conesa und Mitarbeitern [2002b] z. B. die Steigerung der Produktion einer MnP aus
P. chrysosporium in Aspergillus niger durch gleichzeitige Überexpression eines Chaperons,
das wahrscheinlich die richtige Faltung und Orientierung der Hämgruppe im Protein
unterstützt.
Für die eindeutige Klärung der Ursache für die erfolglose heterologe Expression der LiP aus
P. chrysosporium in den Hefen P. methanolica und P. pastoris wären weitere umfassende
Untersuchungen nötig gewesen. Da jedoch aufgrund der erzielten Ergebnisse wenig Potential
in der Expression der LiP in Hefen gesehen wurde, wurde stattdessen die heterologe
Expression einer weiteren ligninolytischen Hämperoxidase, der MnP aus P. chrysosporium,
untersucht. Da diese Peroxidase im Gegensatz zur LiP zumindest schon erfolgreich in
verschiedenen Fadenpilzen exprimiert wurde [Larrondo, Lobos et al., 2001; Stewart,
Whitwam et al., 1996; Conesa, Jeenes et al., 2002b], erschien die Expression der MnP in
einem geeigneten Hefeexpressionssystem als vielversprechend.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
71
3.3 Expression der Manganperoxidase aus Phanerochaete chrysosporium
in Kluyveromyces lactis
Auch für die MnPH4 (mnp1) aus P. chrysosporium war es Ziel, diese durch heterologe
Expression für technische Anwendungen kostengünstig zur Verfügung zu stellen. Die
Expression dieses Proteins gelang bisher in den Fadenpilzen A. nidulans, A. niger sowie A.
oryzae und in Amylomyces rouxii [Larrondo, Lobos et al., 2001; Stewart, Whitwam et al.,
1996; Conesa, Jeenes et al., 2002b; Montiel-González, Fernández et al., 2009]. Da Hefen im
Vergleich zu Pilzen jedoch genetisch leichter zu manipulieren und besser im industriellen
Maßstab kultivierbar sind und sie zudem wesentlich kosteneffektivere Wirte darstellen
[Piscitelli, Giardina et al., 2005], sollte hier analog zur Expression der LAC auf ein gut
charakterisiertes Hefeexpressionssystem zurückgegriffen werden. In P. pastoris wurde MnP
bereits exprimiert, allerdings mit einem geringen Expressionslevel (1 mg L
-1
) und einer
starken Hyper-glykosilierung des Proteins [Gu, Lajoie et al., 2003]. Ein Pichia
Expressionssystem kam daher für die heterologe MnP-Produktion nicht in Frage.
Kluyveromyces lactis (früher: Saccharomyces lactis) ist eine Milchhefe, die in der Lage ist
Laktose als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle zu nutzen. Sie wird unter Anderem zur
Produktion von Chymosin, einem Enzym für die Käseherstellung, im großtechnischen
Maßstab eingesetzt und ist daher gut charakterisiert [van den Berg, van der Laken et al.,
1990]. Im Vergleich zur Hefe S. cerevisiae produziert K. lactis rekombinante Produkte oft in
besserer Qualität, da eine niedrige Tendenz zur Hyperglykosilierung vorliegt. Zudem ist die
Ausbeute an rekombinanten Proteinen oft größer [Gellissen, Hollenberg, 1997; Hsieh, Da
Silva, 1998; Dominguez, 2003]. Die LAC aus Pleurotus ostreatus konnte im K. lactis
Expressionssystem z. B. bereits in aktiver Form ohne Hyperglykosilierung exprimiert werden
[Piscitelli, Giardina et al., 2005]. Auch eine Vielzahl weiterer eukaryotischer Proteine, wie
die Inulinase aus Kluyveromyces cicerisporus, das Mytilus californianus Fußprotein und eine
Domäne der Endoxylanase aus Neocallimastix frontalis, konnten bereits in aktiver Form in
der Hefe K. lactis produziert werden [Yu, Jiang et al., 2010; Platko, Deeg et al., 2008;
Durand, Rascle et al., 1999]. Aus diesen Gründen wurde diese Hefe als Expressionssystem
ausgewählt.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
72
3.3.1 Klonierung des Manganperoxidasegens in K. lactis
P. chrysosporium wurde unter ligninolytischen Bedingungen kultiviert, die Gesamt-RNA
isoliert, die mRNA in einer RT-Reaktion in cDNA transkribiert und diese als Template für
eine PCR mit genspezifischen Primern eingesetzt (s. 2.2.4). Das MnP-Gen wurde ohne das
natürliche Sekretionssignal des Pilzes amplifiziert und so entstand gemäß den Erwartungen
ein 1160 bp großes DNA-Fragment, welches anschließend in den pCR4-TOPO Vektor
kloniert wurde. Nach Replikation des pCR4-TOPO/MnP Plasmids in E. coli Top10 Zellen
wurde das Gen in den Hefeexpressionsvektor pKLAC1 (s. Anhang, Abb. 4.6) umkloniert. Das
MnP-Gen wurde hierbei downstream des K. lactis α-Matingsekretionssignals innerhalb
dessen Leserahmens kloniert. Die Expression des resultierenden α-Matingfaktor-
Fusionsproteins wird durch den starken K. lactis LAC4 Promotor (P
LAC4-PBI
) gesteuert. Die 5´-
und 3´-Enden dieses Promotors sind auf dem pKLAC1 Plasmid durch ein β-Lactamasegen,
welches die Ampicillinresistenz für die Selektion von E. coli Klonen vermittelt, getrennt. Der
pKLAC1/MnP Vektor wurde zur Replikation in E. coli DH5α Zellen transformiert.
Vor der anschließenden Transformation des pKLAC1/MnP-Plasmids in die Hefe K. lactis,
wurde dieses sequenziert. Der Vergleich der Sequenzierung des pKLAC1/MnP Vektors und
der Sequenz des MnP (mnp1) Gens (EMBL Accession Number J04980) ergab, dass von 649
Nukleotiden 646 übereinstimmten. Bei Vergleich der Aminosäuresequenz erscheint jedoch
lediglich an Position 116 der MnP-Sequenz eine Nichtübereinstimmung. Anstelle von Serin
befindet sich in der ermittelten MnP-Sequenz Asparagin. Diese Differenz fiel bereits bei der
vorherigen Sequenzierung des Gens im pCR4TOPO/MnP Vektor bei zwei verschiedenen
Klonen auf. Da die Differenz der Aminosäuresequenz somit in insgesamt drei
Sequenzierungen nachgewiesen wurde ist es wahrscheinlich, dass entweder schon im
Ausgangsorganismus oder in einem der ersten PCR-Zyklen eine Punktmutation stattgefunden
hat. Beide Aminosäuren gehören zur Gruppe der polaren, ungeladenen Aminosäuren. Bei
Asparagin befindet sich eine primäre Carbonsäureamidbindung im Aminosäurerest,
wohingegen im Serin eine primäre Alkoholgruppe gebunden ist. Aufgrund der ähnlichen
Eigenschaften wurde eine Fehlfaltung durch den Austausch von Serin gegen Asparagin für
unwahrscheinlich gehalten. Die Aminosäure Serin spielt zudem keine Rolle im aktiven
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
73
Zentrum der MnP [Sundaramoorthy, Kishi et al., 1994], weshalb auch eine Auswirkung auf
die katalytischen Eigenschaften des Enzyms als äußerst unwahrscheinlich erachtet wurde.
Daher wurde der sequenzierte pKLAC1/MnP Vektor mithilfe des Restriktionsenzyms SacII
linearisiert und nachfolgend in kompetente K. lactis GG799 Zellen transformiert. Durch die
Linearisierung der Expressionskassette wird deren Integration in das Hefegenom am LAC4
Locus durch homologe Rekombination ermöglicht. Ein Acetamidasegen (amdS) auf dem
pKLAC1 Vektor ermöglicht die Selektion von Hefezellen mit integrierter Expressionskassette
über deren Fähigkeit auf Minimalmedium mit Acetamid als einziger Stickstoffquelle zu
wachsen. Schon nach einem Tag Inkubationszeit auf dem Selektionsmedium bildete sich ein
dichter Zellrasen. Einige Klone wurden auf weiteren Selektionsmedien vereinzelt.
Ausgewählte Kolonien wurden einer Colony-PCR mit den Integrationprimern 1 und 2
(s. 2.1.3) unterzogen, wobei der Integrationprimer 1 am LAC4 Promotor im Hefegenom
ansetzt und der Integrationprimer 2 auf dem ersten Teil des pKLAC1-Plasmids. Im Falle einer
erfolgreichen Single-copy-Integration der linearisierten Expressionskassette in den Promotor
am LAC4 Locus müsste somit in der Colony-PCR ein 1,9 kb großes Fragment amplifiziert
werden. Da dies der Fall war (s. Abb. 3.7), konnte die Integration des linearisierten Vektors in
das Hefegenom eindeutig nachgewiesen werden.
Abbildung 3.7. Agarosegelelektrophorese der PCR–Produkte aus der Colony-PCR mit ausgewählten K. lactis
Klonen. Es wurden die Integrationprimer 1 und 2 verwendet. In der dritten Reihe von rechts wurde ein 1 kb
DNA Ladder aufgetragen; alle anderen Reihen zeigen Produkte der Colony-PCR.
3.3.2 Expression der Manganperoxidase in K. lactis
Ausgewählte positiv getestete Klone wurden in YPGal Flüssigmedium inokuliert, da
Galaktose sowie Laktose den P
LAC4
Promoter induzieren und so eine bis zu 100-fach höhere
2000
bp
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
74
Expression erreicht werden kann als in einem glukosehaltigen Nährmedium. Es konnte jedoch
selbst nach mehrtägiger Kultivierung keine MnP-Aktivität im Expressionsmedium detektiert
werden. Um zu überprüfen, ob das Enzym lediglich in inaktiver Form sekretiert wird oder
intrazellulär verbleibt, wurde eine SDS-Gelanalyse durchgeführt (s. Abb. 3.8). Hierbei
wurden sowohl der Zellaufschluss als auch das abzentrifugierte Expressionsmedium jeweils
nach Kultivierung unter Expressionsbedingungen aufgetragen. Als Negativkontrolle wurde
ein Hefeklon, der mit einem leeren pKLAC1 Vektor transformiert wurde, mitgeführt.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Abbildung 3.8. SDS-Gel Analyse der Zellaufschlüsse von K. lactis Klonen und Negativkontrollen und von den
jeweiligen Kulturüberständen nach Kultivierung unter Expressionsbedingungen. Reihe 1-3: Zellaufschlüsse
verschiedener Hefeklone; Reihe 4-5: Zellaufschlüsse der Negativkontrolle; Reihe 6-9: Kulturüberstand
verschiedener Hefeklone; Reihe 10-11: Kulturüberstand der Negativkontrolle; Reihe 12: Proteinmarker.
Sowohl bei der Negativkontrolle als auch bei der transformierten Hefe sind im Überstand des
Expressionsmediums kaum sekretierte Proteine zu detektieren. Ein Protein in der Größe der
MnP zwischen 40-50 kDa ist nicht sichtbar. Nach Zellaufschluss sind zwar mehrere Proteine
auf dem SDS-Gel sichtbar, allerdings ist kein Unterschied zwischen Negativkontrolle und
Klonen zu erkennen. Demnach hat keine Überproduktion eines Proteins statt gefunden.
Zwischen 40 und 50 kDa ist bei den Hefeklonen, im Vergleich zur Negativkontrolle, keine
Überexpression eines Enzyms zu erkennen. Auch zusätzlich durchgeführte Untersuchungen
des Zellaufschlusses auf MnP-Aktivität bestätigten, dass die MnP nicht intrazellulär
produziert wurde, denn es konnte keinerlei MnP-Aktivität nachgewiesen werden.
70 kDa
55 kDa
40 kDa
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
75
Wie bei der Expression der LiP in P. pastoris kann auch hier eine nicht-passende Codon
Usage des Wirtsorganismus als Ursache für die ausbleibende Expression des Fremdgens
ausgeschlossen werden, denn es wurde ein zufriedenstellender CAI von 0,60 ermittelt.
3.3.3 Zusammenfassung
Es bleibt fest zuhalten, dass das Enzym MnP aus P. chrysosporium in der Hefe K. lactis nicht
exprimiert wird. Es konnte eindeutig bewiesen werden, dass die Expressionskassette inklusive
MnP-Gen erfolgreich durch homologe Rekombination in das Hefegenom am LAC4 Locus
integriert wurde. Dennoch konnte weder intra- noch extrazellulär MnP-Aktivität oder ein
Protein der Größe der MnP nachgewiesen werden.
Die Expression der MnP aus P. chrysosporium gelang bisher in den Fadenpilzen A. nidulans,
A. niger sowie A. oryzae [Larrondo, Lobos et al., 2001; Stewart, Whitwam et al., 1996;
Conesa, Jeenes et al., 2002b]. In A. niger wurden dabei gute Produktionslevel zwischen 70-
100 mg L
-1
erzielt, in A. nidulans und A. oryzae waren die erreichten Produktionslevel an
MnP mit 3-7 mg L
-1
bedeutend niedriger. In der Hefe P. pastoris konnte die MnP aus
P. chrysosporium zwar exprimiert werden, allerdings mit einem sehr niedrigen
Produktionslevel von ~1 mg L
-1
. Die Expression in der Hefe K. lactis gelang nicht. Für die
MnP scheinen Fadenpilze daher die geeigneteren Expressionssysteme zu sein.
Ein möglicher Grund hier für könnte sein, dass filamentöse Pilze posttranslationale
Modifikationen wie die korrekte Einbringung der Hämgruppe, Glykosilierung, Proteinfaltung
und Sekretion im Falle der MnP besser gewährleisten können als Hefen. Dass Chaperone eine
wichtige Rolle bei der Produktion der MnP spielen, belegen Ergebnisse von Conesa und
Mitarbeitern [2002b]. Ihnen gelang die Steigerung der Produktion der MnP aus
P. chrysosporium in Aspergillus niger durch gleichzeitige Überexpression eines Chaperons.
Bei allen aufgeführten erfolgreichen heterologen Expressionen der MnP konnte das
Produktionslevel durch Zugabe von Häm gesteigert werden. Wie auch bei der LiP handelte es
sich dabei jedoch lediglich um eine Steigerung einer auch ohne Zugabe von Häm
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
76
vorhandenen Expression. Als Ursache für die vollkommen ausbleibende MnP-Produktion in
K. lactis kann dies also kaum als Grund angeführt werden.
Eine unpassende Codon Usage der verwendeten Hefe K. lactis für das klonierte MnP-Gen aus
P. chrysosporium konnte als Ursache für die gänzlich ausbleibende Expression ebenfalls
ausgeschlossen werden.
In weiteren Experimenten wäre eine Überprüfung der Transkription interessant gewesen.
Dabei hätte geprüft werden können, ob das in das Hefegenom integrierte MnP-Gen überhaupt
in mRNA transkribiert wird. Wird das MnP-Gen transkribiert, so könnten mangelnde
posttranslationale Modifikationen der Hefe eindeutig als Ursache für die gescheiterte
Expression der MnP herangeführt werden. Da jedoch aufgrund der erzielten Ergebnisse wenig
Potential in Hefen als Expressionssysteme für Hämperoxidasen gesehen wurde, wurde auf die
Durchführung weiterer aufwändiger Untersuchungen verzichtet.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
77
3.4 Ausblick
Die heterologe Expression der LAC aus C. bulleri gelang im Hefeexpressionssystem
P. pastoris mit einer exzellenten maximalen vol. Laccaseaktivität. Dies steht im Einklang mit
Literaturdaten, da die Gene vieler verschiedener Laccasen aus verschiedenen Pilzen bereits
erfolgreich in Hefen exprimiert wurden [Bulter, Alcalde et al., 2003; Jönsson, Saloheimo
et al., 1997; Li, Hong et al., 2006; Soden, O’Callaghan et al., 2002]. Die Klonierung und
Expression von Laccasen ist also weitaus weniger problematisch als die heterologe
Expression der Li- und MnP.
Die Stabilität der rekombinanten LAC gegenüber Chloridionen ist im Vergleich zu anderen
Laccasen zufriedenstellend. Für industrielle Anwendungen des Proteins müsste dessen
Stabilität gegen Chloridionen jedoch z. B. durch gerichtete Mutagenese noch weiter gesteigert
werden. Unter den untersuchten Cosolventien fiel besonders die sehr hohe Halbwertszeit von
88,8 h der LAC bei Inkubation in einem Gemisch aus 50% DMSO und Wasser (v/v) auf.
Nachteilig ist, dass alle getesteten Lösungsmittel die LAC inhibieren. Die Inhibierung der
LAC durch die verwendeten Cosolventien könnte durch den Einsatz von Zweiphasen-
systemen wahrscheinlich verringert werden. Durch passende Immobilisierungen der LAC,
wie z. B. den Einsatz eines gelstabilisierten Zweiphasensystems, könnte zudem der Einfluss
auf die Stabilität der LAC wahrscheinlich minimiert werden. Weitere Forschungen zur
Stabilisierung der LAC sind notwendig, bevor diese industriell eingesetzt werden kann.
Für die heterologe Expression der Li- und MnP stellten sich die ausgewählten Hefe-
expressionssysteme als ungeeignet heraus. Generell war die heterologe Expression dieser
beiden Hämperoxidasen nach dem gegenwärtigen Stand der Literatur bisher kaum
erfolgreich. Noch immer ist die umständliche und teure Produktion dieser Biokatalysatoren
damit das entscheidende Hindernis für industrielle Anwendungen.
In Zukunft muss es durch weitere Grundlagenforschung gelingen die Ursachen für die großen
Probleme der heterologen Expression dieser beiden Hämproteine genau aufzuklären, um
leistungsstarke, einfach kultivierbare Expressionssysteme herzustellen. Erst dann können
diese wertvollen Oxidoreduktasen im industriellen Maßstab eingesetzt werden und
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
78
zukunftsweisende Anwendungen wie die effiziente Nutzung des nachwachsenden Rohstoffes
Lignin durch Zerlegung in dessen Phenylpropanoidmonomere erforscht werden.
Aufgrund der komplexen Problematik erscheint es jedoch sinnvoller weitere Grundlagen-
forschung in Kooperationen zu betreiben. So wird aktuell in Deutschland beispielsweise eine
Kooperation der FH Lausitz mit Novozyme A/S, JenaBios und weiteren Industriepartnern von
der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (DBU) gefördert. Dieses Projekt hat zur Aufgabe die
industrielle Gewinnung der Hämperoxidasen aus Weißfäulepilzen und deren vielfältige
industrielle Anwendungen wie vor allem die Ligninmodifizierung zu erforschen. Die
Ergebnisse dieser vielversprechenden Kooperation sind mit Spannung zu erwarten.
Anhang Teil 1
79
4. Anhang
Expression der Laccase aus C. bulleri in P. pastoris
ATGTTCAAGACACTCTACATCTTTACTTTGCTGTCTATCGCCTATGGAGCCATTGGCCCAGTTTTGGATATGCAC
ATAGTGAATAAGGTCATCTCTCCAGATGGCTTTAATCGCTCAGCGGTTCTCGCTGGTGGTACAGCGGATAACGCA
GATTTCCCTGGTCCTCTTGTAACTGGGAATAAGGGTGATCACTTCCAACTAAATGTTATCGACTCCTTAACGGAC
ACTACCATGTTACGGGGCACTAGCATTCATTGGCATGGCTTGTTCCAACATGGCACCACCTGGGCCGATGGTCCT
GTCGGCGTAAACCAATGTCCCATCTCTCCCGGAAACTCGTTCCTGTACGATTTCAGTGTCCCAGACCAGGCCGGA
ACGTTCTGGTATCACTCTCATCACTCTACACAATACTGCGACGGCTTACGAGGACCATTGGTGGTCTACGACCCC
AACGACCCACACAAATCACTGTATGATGTTGACGATGAGTCAACTGTGATCACCCTTGCCGATTGGTATCACACA
CCCGCCCCTTCAGCAGGTTTAGTTCCAACTACTGATGCCGTTCTCATCAACGGTAAAGGTCGTTTCCCAACTGGA
CCCACTTCACCTCTATCTGTAATCAACGTAACCCCGGGCACCAAATACCGCTTCCGCCTGGTTTCAATTTCGTGC
GATCCCAACTTTGTATTCTCTATCGATGGCCACACATTTACCATCATAGAAGTAGATGGTGTGAATGTTACGCCA
GTCGAAGTTGATTCCATCCAAATCTTCGCTGGGCAGCGGTACTCGTTTGTTCTGAACGCCAATCAACCAGTGGAT
AACTACTGGATACGTGCTAAACCTAACATCGCCAAAGGTGTAACCTTCGATGGCGGTATCAACTCGGCTATCCTC
CGATATGCCGGTGCACCAGACACCGATCCAACCACCAGCCAAACTCCCAACAGTGCCCCAATGGTTGAGACCGAT
TTGCACCCGCTAGAGAACCCTGGTGCCCCAGGGGGAAGTAACCCTGCTGATGTACCTCTCAACTTGGCTATCGCA
TTTGGTTCCAACCTCAAGTTCACTGTCAATGGAGCAACGTTCGCACCCCCTAATGTTCCCGTCCTTCTTCAGATT
CTCAGTGGCGCGCAGACTGCCCAGGATCTTCTCCCAACCGGAAGCGTATATACGCTGCCAGCAAACAAGGTCATC
GAAATTTCTATCCCCGGCGGCACGACCGGATTCCCCCATCCTTTCCATCTTCATGGGCATACATTCGATGTAGTT
CGTAGCGCCGGAAGCAGCGTGTACAACTACGACAACCCCGTTCGACGTGATGCTGTCAACACAGGAGGGGCGGGT
GATAATGTTACCATTCGGTTCCTGACGGACAATGCTGGACCGTGGATTCTTCACTGTCATATTGATTGGCATTTG
GAACTTGGTCTTGCCATTGTATTTGCAGAAGATGTCCCAACTATTGCAGCATCGAATCCTCCCGATGCCTGGGAT
AATTTGTGTCCAGCCTATGCTACACAGCCAACCGGCACCTGA
Abbildung 4.1. Identifizierte Nukleotidsequenz (GenBank Database Accession Number EU195884) der Laccase
aus Cyathus bulleri.
Anhang Teil 1
80
Abbildung 4.2. Vektorkarte der Pichia pastoris Hefeexpressionsvektoren pPICZA, B und C und pPICZαA, B
und C (Invitrogen).
Expression der LiP aus P. chrysosporium in P. methanolica und P. pastoris
Abbildung 4.3. Vektorkarte des Hefeexpressionsvektors pMETαA, B und C (Invitrogen).
Anhang Teil 1
81
1 ATGAGATTTC CTTCAATTTT TACTGCTGTT TTATTCGCAG CATCCTCCGC
51 ATTAGCTGCT CCAGTCAACA CTACAACAGA AGATGAAACG GCACAAATTC
101 CGGCTGAAGC TGTCATCGGT TACTCAGATT TAGAAGGGGA TTTCGATGTT
151 GCTGTTTTGC CATTTTCCAA CAGCACAAAT AACGGGTTAT TGTTTATAAA
201 TACTACTATT GCCAGCATTG CTGCTAAAGA AGAAGGGGTA TCTCTCGAGA
251 AAAGAGAGGC TGAAGCTGAA TTCGCCACCT GTTCCAACGG CAAGACCGTC
301 GGCGATGCGT CGTGCTGCGC TTGGTTCGAC GTCCTGGATG ATATCCAGCA
351 GAACCTGTTC CACGGCGGCC AGTGCGGCGC TGAGGCGCAC GAGTCGATTC
401 GTCTCGTCTT CCACGACTCC ATCGCAATTT CGCCCGCCAT GGAGGCACAG
451 GGCAAGTTCG GCGGCGGTGG TGCTGACGGC TCCATCATGA TCTTCGACGA
501 TATCGAGACT GCGTTCCACC CTAACATCGG TCTCGACGAG ATCGTCAAGC
551 TCCAGAAGCC ATTCGTTCAG AAGCACGGTG TCACCCCTGG TGACTTCATC
601 GCCTTCGCTG GTGCTGTCGC GCTCAGCAAC TGCCCTGGTG CCCCGCAGAT
651 GAACTTCTTC ACTGGTCGTG CACCTGCTAC CCAGCCCGCT CCTGATGGCC
701 TTGTCCCCGA GCCCTTCCAC ACTGTCGACC AAATCATCAA CCGTGTCAAC
751 GACGCAGGCG AGTTCGATGA GCTCGAGCTT GTCTGGATGC TCTCCGCGCA
801 CTCCGTCGCA GCGGTGAACG ACGTCGACCC GACCGTCCAG GGTCTGCCCT
851 TTGACTCGAC CCCCGGAATC TTCGACTCCC AGTTCTTCGT CGAGACTCAG
901 CTTCGTGGTA CCGCCTTCCC CGGCTCTGGC GGCAACCAAG GCGAGGTCGA
951 GTCGCCGCTC CCTGGCGAAA TTCGCATCCA GTCCGACCAC ACTATCGCCC
1001 GCGACTCACG CACGGCGTGT GAATGGCAGT CCTTCGTCAA CAACCAGTCC
1051 AAGCTCGTCG ATGACTTCCA ATTCATTTTC CTCGCCCTCA CCCAGCTCGG
1101 CCAGGACCCG AACGCGATGA CCGACTGCTC GGATGTTATC CCGCAGTCCA
1151 AGCCCATCCC TGGCAACCTC CCATTCTCGT TCTTCCCCGC TGGCAAGACC
1201 ATCAAAGACG TTGAGCAGGC GTGTGCGGAG ACCCCCTTCC CGACTCTCAC
1251 CACTCTCCCG GGCCCCGAGA CGTCCGTCCA GCGCATCCCT CCGCCTCCGG
1301 GTGCTTAA
Abbildung 4.4. Nukleotidsequenz des LipH8-Gens kloniert in den pMETαA Hefeexpressionsvektor.
Dargestellt ist die Sequenz vom Startcodon des Sekretionssignal bis zum natürlichen Stoppcodon des Gens.
Schwarz unterstrichen ist die Sequenz des α-Faktorsignals.
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACA
ACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTT
GCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCT
AAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC
GGCGATGCGTCGTGCTGCGCTTGGTTCGACGTCCTGGATGATATCCAGCAGAACCTGTTCCACGGCGGCCAGTGC
GGCGCTGAGGCGCACGAGTCGATTCGTCTCGTCTTCCACGACTCCATCGCAATTTCGCCCGCCATGGAGGCACAG
GGCAAGTTCGGCGGCGGTGGTGCTGACGGCTCCATCATGATCTTCGACGATATCGAGACTGCGTTCCACCCTAAC
ATCGGTCTCGACGAGATCGTCAAGCTCCAGAAGCCATTCGTTCAGAAGCACGGTGTCACCCCTGGTGACTTCATC
GCCTTCGCTGGTGCTGTCGCGCTCAGCAACTGCCCTGGTGCCCCGCAGATGAACTTCTTCACTGGTCGTGCACCT
GCTACCCAGCCCGCTCCTGATGGCCTTGTCCCCGAGCCCTTCCACACTGTCGACCAAATCATCAACCGTGTCAAC
GACGCAGGCGAGTTCGATGAGCTCGAGCTTGTCTGGATGCTCTCCGCGCACTCCGTCGCAGCGGTGAACGACGTC
GACCCGACCGTCCAGGGTCTGCCCTTTGACTCGACCCCCGGAATCTTCGACTCCCAGTTCTTCGTCGAGACTCAG
CTTCGTGGTACCGCCTTCCCCGGCTCTGGCGGCAACCAAGGCGAGGTCGAGTCGCCGCTCCCTGGCGAAATTCGC
ATCCAGTCCGACCACACTATCGCCCGCGACTCACGCACGGCGTGTGAATGGCAGTCCTTCGTCAACAACCAGTCC
AAGCTCGTCGATGACTTCCAATTCATTTTCCTCGCCCTCACCCAGCTCGGCCAGGACCCGAACGCGATGACCGAC
TGCTCGGATGTTATCCCGCAGTCCAAGCCCATCCCTGGCAACCTCCCATTCTCGTTCTTCCCCGCTGGCAAGACC
ATCAAAGACGTTGAGCAGGCGTGTGCGGAGACCCCCTTCCCGACTCTCACCACTCTCCCGGGCCCCGAGACGTCC
GTCCAGCGCATCCCTCCGCCTCCGGGTGCTTAA
Abbildung 4.5. Nukleotidsequenz des LipH8-Gens kloniert in den pPICZαA Hefeexpressionsvektor.
Dargestellt ist die Sequenz vom Startcodon des Sekretionssignal bis zum natürlichen Stoppcodon des Gens.
Schwarz unterstrichen ist die Sequenz des α-Faktorsignals.
Anhang Teil 1
82
Expression der MnP aus P. chrysosporium in K. lactis
Abbildung 4.6
.
Vektorkarte des pKLAC1 Hefe-Shuttle-Vektors (New England BioLabs).
Anhang Teil 1
83
atgaaattctctactatattagccgcatctactgctttaatttccgttgttatggctgct
M K F S T I L A A S T A L I S V V M A A
ccagtttctaccgaaactgacatcgacgatcttccaatatcggttccagaagaagccttg
P V S T E T D I D D L P I S V P E E A L
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I G F I D L T G D E V S L L P V N N G T
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H T G I L F L N T T I A E A A F A D K D
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D L E K R E A E A R R A R S A V C P D G
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T R V T N A A C C A F I P L A Q D L Q E
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T L F Q G D C G E D A H E V I R L T F H
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D A I A I S Q S L G P Q A G G G A D G S
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M L H F P T I E P N F S A N N G I D D S
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V N N L L P F M Q K H D T I S A A D L V
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A G R P N T T I P A V E G L I P E P Q D
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V S L L A S H T V A R A D K V D E T I D
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L K G T G F P G S N N N T G E V M S P L
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P L G S G S D T G E M R L Q S D F A L A
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R D E R T A C F W Q S F V N E Q E F M A
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A S F K A A M A K L A I L G H S R S S L
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I D C S D V V P V P K P A V N K P A T F
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P A T K G P K D L D T L T C K A L K F P
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T L T S D P G A T E T L I P H C S N G G
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M S C P G V Q F D G P A -
Abbildung 4.7. Sequenzierung des pKLAC1/MnP Plasmids vom Startcodon des α-Matingsekretionssignals bis
zum natürlichen Stoppcodon des Gens. Die obere Reihe zeigt die Nukleotidsequenz, die untere Reihe zeigt die
Aminosäuresequenz.
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Einleitung Teil 2
96
Teil 2 Präparation der BAL für deren chemisch-technische Nutzung
1. Einleitung
1.1 Bedeutung enantiomerenreiner α-Hydroxyketone
Enantiomere unterscheiden sich in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften nur in
der Wechselwirkung mit linear polarisiertem Licht. Besonders in der pharmazeutischen
Industrie sind enantiomerenreine Substanzen jedoch von großer Bedeutung, denn die
Enantiomere desselben Wirkstoffes können im Organismus sehr unterschiedliche Wirkungen
haben. Vor der Zulassung neuer chiraler Wirkstoffe wird zunächst die Wirkung beider
Enantiomere im Organismus untersucht. Generell werden Medikamente vorzugsweise
enantiomerenrein auf den Markt gebracht.
Enantiomerenreine α-Hydroxyketone sind wichtige Ausgangssubstrate für viele verschiedene
asymmetrische Synthesen und sie sind Struktureinheiten in vielen biologisch aktiven
Substanzen [Demir, Hamamci et al., 2002]. Besonders in der chemischen und
pharmazeutischen Industrie gelten sie daher als vielseitig einsetzbare Intermediate. So dienen
sie z. B. als Vorstufen bei den Synthesen von Vitamin E, L-Ephedrin (bronchienerweiterndes
Medikament), Cytoxazon (Inhibitor der Cytokinproduktion), Nitidanin (Behandlung von
Leberkrankheiten), Bupropion und dessen Metaboliten (Wirkstoffe in Antidepressiva),
Indinavir (HIV Protease Inhibitor) und Amyloid-β-Protein-Inhibitoren (Wirkstoffe gegen
Alzheimer) [Janzen, 2002; Stillger, 2004]. Des Weiteren besteht Interesse an der Nutzung von
α-Hydroxyketonen als Ausgangsmaterial für die Herstellung biologisch aktiver Substanzen
mit Wirkung gegen Pilzbefall [Demir, Sesenoglu et al., 2002] und als Vorstufen bei der
Synthese einiger antitumoraler Antibiotika wie Olivomycin A und Chromomycin A
3
eingesetzt [Hoyos, Fernandez et al., 2006].
Einleitung Teil 2
97
1.2 Synthese chiraler α-Hydroxyketone
Aufgrund der vielfältigen Verwendungsmöglichkeiten von α-Hydroxyketonen wurden
sowohl chemische als auch biologische Synthesemöglichkeiten intensiv erforscht.
1.2.1 Chemische Synthese
Abbildung 1.1 gibt einen Überblick über chemische Herstellungsmethoden von Acyloinen.
α-Hydroxyketon
Asymmetrische
Kondensation von Aldehyden
Oxidative kinetische
Racematspaltung
Stereoselektive
Reduktion von
Diketonen
Asymmetrische
Oxidation von Diolen
Ketohydroxylierung
von Olefinen
α-Hydroxylierung
von Ketonen
R2
R1
O
R2
R1 O
R2
O
R1
O
R2
R1
O
O
R2
O
R1
H R1
O
R2
O
H
O
R2
R1
O
H
H
H
H
+
Abbildung 1.1. Schematischer Überblick über chemische Synthesemöglichkeiten von α–Hydroxyketonen. Die
Abbildung wurde in Anlehnung an Hoyos, Sinisterra et al. [2010] erstellt.
Eine lang bekannte Syntheseroute ist die Verknüpfung von Aldehyden durch Umpolung mit
Cyaniden im Sinne der Benzoinkondensation, deren Mechanismus bereits 1903 von Lapworth
vorgeschlagen wurde [Lapworth, 1903]. Anstelle der ursprünglich verwendeten Cyanidionen
Einleitung Teil 2
98
können Thiazoliumsalze als Katalysatoren verwendet werden, was eine Reaktionsführung
unter milderen Bedingungen ermöglicht [Breslow, 1958]. In beiden Fällen entsteht jedoch
lediglich ein racemisches Gemisch. Erst 1966 gelang Sheehan et al. durch Verwendung eines
chiralen Thiazoliumsalzes als Katalysator eine asymmetrische Variante der Benzoin-
kondensation [Sheehan, Hunneman, 1966], wobei jedoch lediglich moderate Enantio-
selektivitäten erreicht werden [Knight, Leeper, 1997]. Beim Einsatz chiraler bicyclischer
Triazoliumsalze können signifikant höhere Enantiomerenüberschüsse erzielt werden [Knight,
Leeper, 1998; Enders, Kallfass, 2002; Enders, Grossmann et al., 2010].
Eine weitere Möglichkeit der chemischen Synthese optisch aktiver α-Hydroxyketone stellt die
oxidative kinetische Racematspaltung dar, wobei bereits chirale Eisen- und Kobalt-Komplexe
als Katalysatoren eingesetzt wurden [Muthupandi, Alamsetti et al., 2009; Alamsetti,
Muthupandi et al., 2009].
Auch die regio- und enantioselektive Reduktion von Diketonen führt zu chiralen
2-Hydroxyketonen. Hierfür wurden bereits modifizierte Platinkatalysatoren als auch chirale
Rutheniumkatalysatoren erfolgreich eingesetzt [Toukoniitty, Maeki-Arvela et al., 2001;
Koike, Murata et al., 2000].
Eine weitere Syntheseroute bietet die asymmetrische Oxidation von Diolen durch Dioxyrane
[Curci, D'Accolti et al., 1996; Adam, Saha-Möller et al., 1998].
Onomura et al. [2007] gelang
zudem die asymmetrische Oxidation von 1,2-Diolen bei Verwendung von N-Bromsuccinimid
in Anwesenheit chiraler Kupferkatalysatoren.
In den letzten Jahren hat sich die Oxidation von Carbonylverbindungen (α-Hydroxylierung)
zur Hauptsyntheseroute von α-Hydroxyketonen entwickelt. Hierbei wird eine Carbonyl-
komponente zunächst in das entsprechende Enolat oder Enamin überführt bevor anschließend
die Oxidation der C-C-Doppelbindung erfolgt. Stereoselektive α-Hydroxylierungen begannen
mit der Entdeckung chiraler Oxidantien. So wurden für die chirale Oxidation von Enolethern
z. B. Osmiumtetraoxid in Gegenwart chiraler Auxilliare [Hashiyama, Morikawa et al., 1992],
Mangan-(III)-Salen-Komplexe [Adam, Fell et al., 1996; Adam, Fell et al., 1998a],
Dioxiranderivate der Fruktose [Adam, Fell et al., 1998b] oder N-Sulfonyloxaziridine [Davis,
Einleitung Teil 2
99
Chen, 1992] eingesetzt. Ein Durchbruch stellte 1993 die asymmetrische Sharpless-
Dihydroxylierung von Silylenolethern dar. Diese Methode ist auf ein breites Substratspektrum
anwendbar und so können viele verschiedene enantiomerenangereicherte Acyloine
synthetisiert werden [Morikawa, Park et al., 1993]. Marcune und Mitarbeiter [2003] haben
diese Methode weiter entwickelt und zeigten, dass lange unverzweigte aliphatische
Substituenten am Sauerstoffatom des Enolethers die Enantioselektivität erhöhen.
Ein alternativer katalytischer Ansatz ist die Oxidation von Zinnenolaten an der α-Position
mithilfe eines enantiomerenreinen Ag(I)-BINAP-Katalysators, wobei Nitrosobenzen als
Sauerstoffdonor genutzt wird. Auf diese Weise können eine Vielzahl neuer α-Hydroxyketone
mit moderaten bis exzellenten Enantiomerenüberschüssen gewonnen werden [Momiyama,
Yamamoto, 2003].
Sowohl die α-Hydroxylierung als auch die Oxidation von Zinnenolaten sind Multi-Schritt-
Synthesen, da zunächst isomerenreine Enolether als Vorstufen gebildet werden müssen. Eine
neue Strategie ist daher die direkte asymmetrische α-Oxygenierung von Ketonen z. B. in
Gegenwart von L-Prolin. Die Kombination der in situ Bildung chiraler Enamide und des
Nitrosobenzens von Momiyama als Sauerstoffdonor erlaubt die Herstellung vieler Acyloine in
einem Schritt [Brown, Brochu et al., 2003; Bogevig, Sunden et al., 2004; Hayashi,
Yamaguchi et al., 2004]. Unter Verwendung von Alanin als Katalysator kann die
α-Oxygenierung von Ketonen sogar mit molekularem Sauerstoff erfolgen, wobei jedoch
lediglich moderate Enantiomerenüberschüsse erzielt werden [Sunden, Engqvist et al., 2004].
Neben der α-Hydroxylierung von Carbonylverbindungen stellt die Oxidation von Olefinen,
welche als Ketohydroxylierung bezeichnet wird, eine weitere Synthesemöglichkeit von
Acyloinen dar. Ketohydroxylierungen gelangen bereits unter Verwendung von KMnO
4
[Baskaran, Das et al., 1989], einem bimetallischen System aus OsO
4
und einem Ni-
Katalysator [Takai, Yamada et al., 1991], einer Ru(V)-Oxo-Spezies [Murahashi, Saito et al.,
1993], von RuO
4
[Plietker, 2005] und eines 12-Tungstophosphorsäure/Cetylpyridinium-
chlorid Systems als Katalysator [Zhang, Shen et al., 2006]. Stereoselektive Ein-Schritt
Ketohydroxylierungen gelangen bisher jedoch nicht.
Einleitung Teil 2
100
1.2.2 Biokatalytische Synthese
Es gibt also eine Vielzahl verschiedener Möglichkeiten asymmetrische α-Hydroxyketone
chemisch zu synthetisieren. Abgesehen von einigen erfolgreichen Beispielen sind chemische
Syntheserouten chiraler Acyloine jedoch generell Multi-Schritt-Synthesen, wodurch die
Gesamtausbeute verringert wird und die Abfallproduktion steigt. Zudem werden meist
lediglich moderate Enantioselektivitäten erzielt.
Aufgrund der genannten Nachteile der chemischen Synthese wurde in der Vergangenheit
verstärkt nach biokatalytischen Synthesemöglichkeiten enantiomerenreiner α-Hydroxyketone
gesucht. Im Allgemeinen verlaufen enzymkatalysierte Reaktionen hoch regio-, chemo- und
stereoselektiv, so dass oft Enantiomerenüberschüsse von über 99% erreicht werden können.
Darüber hinaus können die exzellenten Selektivitäten von Biokatalysatoren oft mit
ökonomischen und umweltfreundlichen Reaktionsbedingungen kombiniert werden. Optisch
aktive α-Hydroxyketone können biokatalytisch mithilfe von Oxidoreduktasen, durch
dynamisch kinetische Racematspaltungen (DKR) mithilfe von Hydrolasen und durch die
Carboligation mithilfe von Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängigen Lyasen synthetisiert
werden.
Die Herstellung enantiomerenangereicherter α-Hydroxyketone durch den Einsatz von
Oxidoreduktasen lässt sich prinzipiell in 3 Strategien aufteilen: Dehydrogenase (DH)-
katalysierte Reduktion von α-Diketonen, Dehydrogenase- oder Oxidase (Ox)-katalysierte
Oxidation von vic-Diolen und die Deracemisierung racemischer α-Hydroxyketone.
Stereoselektive Reduktionen von α-Diketonen durch Verwendung verschiedener
Mikroorganismen als Katalysatoren wurden bereits vielfach veröffentlicht. So wurden
aliphatische α-Diketone z. B. mithilfe von Saccharomyces cerevisiae und Beauveria
sulfurescens mit Enantiomerenüberschüssen von bis zu 92% zu α-Hydroxyketonen reduziert
[Bel-Rhlid, Fauve et al., 1989]. Besonders zur Synthese beider Benzoinenantiomere durch
Reduktion des korrespondierenden α-Diketons wurde viel publiziert. So kann der Pilz
Rhizopus oryzae beispielsweise abhängig vom pH-Wert sowohl die Reduktion von Benzil zu
(R)- (ee 99%) als auch zu (S)-Benzoin (ee 80%) katalysieren [Demir, Hamamci et al., 2004].
Einleitung Teil 2
101
Zellen des Pilzes Xanthomonas oryzae reduzieren Benzil mit einem ee von 99% zu
(R)-Benzoin [Konishi, Ohta et al., 1985]. Bacillus cereus, Pichia glucozyma, Aspergillus
oryzae und Fusarium roseum katalysieren die Reduktion von Benzil zum (S)-Enantiomer mit
Enantiomerenüberschüssen von bis zu 99% [Saito, Maruyama et al., 2003; Hoyos, Sansottera
et al., 2008; Demir, Ayhan et al., 2008].
Im Vergleich zur DH-katalysierten Reduktion von Diketonen ist die DH- oder Ox-katalysierte
Oxidation von vic-Diolen zu chiralen α-Hydroxyketonen bisher weniger erfolgreich. So
gelingt die Oxidation verschiedener aliphatischer vic-Diole zum entsprechenden
(S)-Enantiomer mithilfe ganzer Zellen des Stammes Bacilus stearothermophilus bisher zwar
mit hohen Enantiomerenüberschüssen von bis zu 99%, allerdings bei sehr niedrigen Umsätzen
von unter 20% [Bortolini, Casanova et al., 1998].
Neben der Reduktion von Diketonen und der Oxidation von vic-Diolen ist die enzym-
katalysierte Deracemisierung racemischer α-Hydroxyketone eine effektive Methode zur
Enantiomerenanreicherung. So katalysiert z. B. das Enzymsystem des Pilzes Rhizopus oryzae
die chirale Inversion des Benzoins und bildet in Abhängigkeit vom pH-Wert jeweils ein
Enantiomer. Für das (R)-Enantiomer konnten Enantiomerenüberschüsse bis 99% und für das
(S)-Enantiomer bis zu 85% erzielt werden [Demir, Hamamci et al., 2002]. Nestl und
Mitarbeiter publizierten Racemisierungen mithilfe lyophilisierter ganzer Zellen verschiedener
Bakterien, Pilzen und Hefen. Mithilfe dieser Methode können Racemisierungen
unerwünschter Enantiomere aus kinetischen Racematspaltungen durchgeführt werden, was
sich als hilfreich bei der Synthese vieler strukturell unterschiedlicher α-Hydroxyketone
herausstellte [Nestl, Bodlenner et al., 2007; Nestl, Voss et al., 2007].
Die Synthese optisch aktiver Acyloine durch Hydrolase-katalysierte kinetische
Racematspaltungen wurde schon oft beschrieben. So konnte eine Vielzahl strukturell sehr
unterschiedlicher α-Hydroxyketone, was cyclische und aliphatische Produkte [Silva, Kahne
et al., 1994; Tanyeli, Demir et al., 1996; Kajiro, Mitamura et al., 1998; Demir, Findik et al.,
2004; Tanyeli, Ozdemirhan et al., 2005; Tanyeli, Akhmedov et al., 2006; Adam, Diaz et al.,
1998; Scheid, Ruijter et al., 2004; Scheid, Kuit et al., 2004], Alkyl-Aryl- [Ohta, Ikemoto
et al., 1986; Gala, DiBenedetto et al., 1996; Demir, Hamamci et al., 1998; Demir, Hamamci
Einleitung Teil 2
102
et al., 2001; Jeon, Ko et al., 2007] und Diaryl-α-Hydroxyketone [Aoyagi, Agata et al., 2000;
Aoyagi, Iijima et al., 2001] beinhaltet, bereits unter Verwendung verschiedener Lipasen und
Esterasen als Biokatalysatoren produziert werden.
Der generelle Nachteil kinetischer Racematspaltungen ist, dass die maximale theoretische
Ausbeute auf 50% limitiert ist. In dynamisch kinetischen Racematspaltungen kann diese
Limitation umgangen werden, in dem das verbleibende Substrat racemisiert wird und somit
theoretische Ausbeuten von 100% erzielt werden können. Ein Beispiel für eine erfolgreiche
DKR ist die Kombination des Biokatalysators Candida antarctica Lipase B, der die
enantioselektive Umesterung der Substrate katalysiert, und des Amberlysts 15, der die
Racemisierung des nicht umgesetzten Substrates katalysiert [Ödman, Wessjohann et al.,
2005]. Am häufigsten ist die Kombination einer enzymatisch-katalysierten kinetischen
Racematspaltung mit einer Übergangsmetall-katalysierten Substratracemisierung. Gängige
Übergangsmetallkatalysatoren sind verschiedene Rutheniumkomplexe wie z. B. der
Shvokatalysator [Ahn, Ko et al., 2008]. Diese Art der DKR scheitert jedoch, wenn das zu
racemisierende Substrat ein nicht-symmetrisches α-Hydroxyketon ist. Aufgrund der
Racemisierung über Wasserstofftransfer kommt es zur Bildung eines intermediären Diketons
und bei asymmetrischen Substraten letztendlich zur Bildung von Regioisomeren.
Bogar und Mitarbeiter [2007] entwickelten daher eine neue Strategie für eine DKR allylischer
Alkohole. Sie kombinierten ebenfalls eine Candida antarctica Lipase B-katalysierte
enantioselektive Racematspaltung mit einer Rutheniumkomplex-katalysierten Racemisierung
des übrig bleibenden Substrates. Anschließend oxidierten sie die enantiomerenreinen
acylierten allylischen Alkohole, die in der DKR gebildet wurden, um so optisch aktive nicht-
symmetrische Acyloine zu erhalten. Werden dagegen symmetrische Benzoine als Substrat
eingesetzt, so ist die Kombination einer Pseudomans stutzeri Lipase-katalysierten
enantioselektiven Acylierung des Substrates mit einer Shvo-katalysierten Racemisierung des
verbleibenden Alkohols eine besonders effektive DKR. Es konnten hohe Umsätze und
exzellente Enantioselektivitäten für ein breites Spektrum symmetrischer Benzoine erzielt
werden [Hoyos, Fernandez et al., 2006].
Einleitung Teil 2
103
Ein generelles Problem solcher DKRs ist, dass die Biokatalysatoren bei den oftmals harschen
Reaktionsbedingungen, die die Übergangsmetallkatalysatoren für die Racemisierung
benötigen, nicht stabil sind. Hoyos und Mitarbeiter [Hoyos, Buthe et al., 2008] milderten
dieses Problem beispielsweise durch Immobilisierung des verwendeten Biokatalysators, der
Lipase aus P. stutzeri, in Silikonkugeln.
Ein sehr vielversprechender Syntheseweg für chirale α-Hydroxyketone ist die Biokatalyse mit
ThDP-abhängigen Enzymen wie der Benzaldehydlyase (BAL, EC 4.1.2.38), der
Pyruvatdecarboxylase (PDC, EC 4.1.1.1) und der Benzoylformiatdecarboxylase (BFD,
EC 4.1.1.7). Diese ThDP-abhängigen Proteine katalysieren sowohl die Bildung von
Acyloinbindungen als auch deren Spaltung nicht-hydrolytisch und nicht-oxidativ.
Von den drei genannten Lyasen zeichnet sich die BAL aus Pseudomonas fluorescens Biovar I
durch ein besonders breites Substratspektrum aus. Neben diversen aliphatischen Aldehyden
[Dominguez de Maria, Pohl et al., 2007] akzeptiert die BAL sowohl verschiedene
aromatische und heterozyklische Aldehyde mit Substituenten in ortho-, meta- und para-
Stellung als auch mehrfach substituierte Aldehyde. Hierdurch ist eine Vielzahl an hoch
stereospezifischen Carboligationen möglich [Demir, Pohl et al., 2001; Demir, Hamaci et al.,
2002]. Durch die Kombination zweier aromatischer Aldehyde bzw. die Verknüpfung eines
solchen Aldehyds mit einem aliphatischen Aldehyd wird das Produktspektrum um viele
weitere asymmetrisch substituierte (R)-Benzoine erweitert. Anstelle der aromatischen
Aldehyde können hier auch heterozyklische Aldehyde eingesetzt werden. Der aliphatische
Aldehyd dient jeweils als Akzeptor und kann auch längerkettig und ungesättigt vorliegen
[Dünkelmann, Kolter-Jung et al., 2002; Demir, Findik et al., 2003; Demir, Sesenoglu et al.,
2003; Demir, Ayhan et al., 2004].
Als Beispielreaktion der BAL ist in Abbildung 1.2 die Bildung bzw. Spaltung von
(R)-Benzoin gezeigt. Die BAL ist ein Homotetramer mit jeweils 563 Aminosäureresten pro
Untereinheit (MG 58.919 Da), wobei jede Untereinheit mithilfe eines Mg
2+
-Ions jeweils ein
Cofaktormolekül ThDP bindet. Das Proteingerüst des aktiven Zentrums gibt während der
Carboligation die Stereoinformation, sprich die Bildung des (R)-Enantiomers, vor. ThDP
ermöglicht dagegen die Umpolung am Kohlenstoff der Carbonylfunktion und somit die
Einleitung Teil 2
104
Reaktion zum α-Hydroxyketon [Mosbacher, Müller et al., 2005;
Maraite, Schmidt et al.,
2007].
(
R
)-Benzoin
Benzaldehyd
BAL
2
Abbildung 1.2. Benzaldehydlyase (BAL)-katalysierte Spaltung und Bildung von (R)-Benzoin.
1.3 Reaktionssysteme für den Einsatz organischer Lösungsmittel
In der Entwicklung von biokatalytischen Prozessen wurde lange darauf geachtet, die
natürlichen Reaktionsbedingungen der Proteine in der lebenden Zelle nach zu empfinden. Es
wurde also hauptsächlich Wasser als Lösungsmittel eingesetzt. Der entscheidende Nachteil
der milden wässrigen Reaktionsbedingungen ist jedoch die geringe Löslichkeit hydrophober
Reaktanden, was im Vergleich zu klassisch chemischen Verfahren zu erheblich geringeren
Substratkonzentrationen bei biokatalytischen Prozessen führt. Dies hat schlechtere Raum-
Zeit-Ausbeuten, begrenzte maximale Zyklenzahlen und eine erschwerte Produktaufarbeitung
zur Folge.
Eine Alternative zum wässrigen Lösungsmittelsystem stellt der Einsatz nicht-konventioneller
Reaktionsmedien wie organischen Lösungsmitteln, überkritischen Fluiden, ionischen
Flüssigkeiten oder einer Gasphase dar. Diese unkonventionellen Reaktionsmedien besitzen
meist bessere Lösungseigenschaften für hydrophobe Reaktanden und vermeiden zudem
hydrolytische Neben- bzw. Folgereaktionen [Adlercreutz, 2000; Kim, Pollard et al., 2007].
Auch die Produktaufarbeitung aus nicht-wässrigen Medien ist häufig mit weniger
Aufarbeitungsschritten verbunden [Pollard, Kosjek, 2008]. Zum Teil verändert sich in nicht-
wässrigen Medien auch das chemische Gleichgewicht einer Reaktion, so dass sich erhöhte
Produktausbeuten ergeben bzw. ganz andere Reaktionen durchgeführt werden können
[Halling, 1990; Vermue, Tramper, 1995; Adlercreutz, 2008]. Letztendlich konnten durch die
Einleitung Teil 2
105
Verwendung nicht-konventioneller Reaktionsmedien die Einsatzmöglichkeiten vieler Enzyme
enorm erweitert werden [Ballesteros, Bornscheuer et al., 1995; Vermue, Tramper, 1995],
wobei der Einsatz organischer Lösungsmittel am weitesten verbreitet ist [Carrea, Riva, 2000].
1.3.1 Einphasensystem
Eine Variante organisch/wässriger Reaktionssysteme ist ein Einphasensystem, das aus einer
rein organischen Phase besteht. Bei diesem Reaktionssystem wird das Enzym als Lyophilisat
oder immobilisiert auf einem Träger in der organischen Phase suspendiert. Die wässrige
Phase ist bei solchen Systemen reduziert auf das „Strukturwasser“, das auf der
Enzymoberfläche gebunden vorliegt. In diesen Einphasensystemen kann oft eine gesteigerte
Proteinstabilität beobachtet werden. Dies ist auf die geringe Solvatisierung der Enzyme in der
organischen Phase zurückzuführen, was eine starre Konformation der Proteinmoleküle und
eine Einschränkung der konformativen Proteinbeweglichkeit mit sich zieht. Zudem bleiben
Reaktionen der Proteinmoleküle mit Wasser wie z. B. die Hydrolyse von Peptidbindungen,
die zu einer irreversiblen Desaktivierung der Enzyme führen können, aus [Zaks, Klibanov,
1988]. Entscheidende Nachteile dieses Reaktionssystem sind jedoch, dass die Enzymaktivität
aufgrund der starren Proteinkonformation oft herab gesetzt wird oder gar nicht vorhanden ist.
Außerdem muss für jede Enzym/Lösungsmittelkombination die optimale Wasseraktivität
ermittelt werden und diese durch Zugabe von Additiven eingestellt werden, was zusätzlichen
apparativen Aufwand und oftmals eine erschwerte Produktaufreinigung bedeutet.
Aufgrund dessen stellen Einphasensysteme, bestehend aus Wasser und wassermischbaren
Löslichkeitsvermittlern, eine bedeutende Alternative dar. Als löslichkeitssteigernde Additive
kommen unter anderem Cyclodextrine [Zelinski, Kula, 1997; Zelinski, Liese et al., 1999],
wasserlösliche Polymere wie z. B. Polyethylenglycol [Demir, Pohl et al., 2001] sowie
wassermischbare organische Lösungsmittel (Cosolventien) wie beispielsweise Dimethyl-
sulfoxid (DMSO) oder Dimethylformamid (DMF) [Batra, Gupta, 1994; Demir, Sesenoglu
et al., 2002; Demir, Sesenoglu et al., 2003; Janzen, Müller et al., 2006] zum Einsatz. Die
breiteste Anwendung finden Cosolventien.
Einleitung Teil 2
106
Cosolventien vermögen zwar die Löslichkeit hydrophober Substrate und Produkte zu
erhöhen, dafür werden jedoch oft eine enzymhemmende Wirkung und eine Herabsetzung der
Enzymstabilität beobachtet. Ein weiterer Nachteil ist die oftmals erschwerte Produkt-
aufarbeitung, verursacht durch die schwere Abtrennung des Cosolvens. Bei kontinuierlichen
Reaktionsführungen in Einphasensystemen muss zudem generell eine effiziente
Enzymrückhaltung, wie sie z. B. in Enzymmembranreaktoren stattfindet, gewährleistet sein.
Aufgrund der genannten Nachteile von Einphasensystemen bieten wässrig/organische
Zweiphasensysteme eine reizvolle Alternative.
1.3.2 Zweiphasensystem
Zweiphasensysteme aus einer wässrigen und einer Lösungsmittelphase finden häufig
Anwendung [Fernandes, Cabral, 2008]. Der Vorteil gegenüber nicht-wässrigen
Einphasensystemen besteht darin, dass das Enzym in der oft gepufferten wässrigen Phase
vorliegt, während in der nicht-wassermischbaren Lösungsmittelphase die hydrophoben
Substrate vorgelegt werden. Im Idealfall erlaubt die organische Lösungsmittelphase zusätzlich
eine effektive Extraktion des Produktes aus der wässrigen Phase. Somit liegen Substrate und
Produkte in der wässrigen Phase immer nur in geringen Konzentrationen vor, was zur
Vermeidung von Substrat- und Produktinhibierungen führt [Vermue, Tramper, 1995; Spiess,
Eberhard et al., 2008]. Nicht umgesetztes Substrat diffundiert fortlaufend aus der organischen
in die wässrige Phase und bereits umgesetztes Substrat wird in die organische Phase
extrahiert. Durch die kontinuierliche Produktextraktion aus der reaktiven Phase können
thermodynamische Limitationen der Reaktion überwunden und der Umsatz gesteigert werden
[Martinek, Semenov et al., 1981; Eggers, Blanch et al., 1989; Eckstein, Peters et al., 2006;
Spiess, Eberhard et al., 2008]. Zudem erleichtert die Aufkonzentrierung des Produkts in der
organischen Phase die weitere Produktaufarbeitung [Eckstein, Peters et al., 2006; Ansorge-
Schumacher, 2007]. Auch die Integration der enzymatischen Reaktionen in bestehende
Prozesse, die häufig in organischen Lösungsmitteln stattfinden, kann unter Umständen durch
die kontinuierliche Extraktion sowie die räumliche Trennung von Produkt und Enzym
erleichtert werden [Halling, 2002; Spiess, Eberhard et al., 2008; Pollard, Kosjek, 2008].
Einleitung Teil 2
107
Zweiphasensysteme können entweder als getrennt voneinander vorliegende Phasen oder als
Emulsionen eingesetzt werden. Im erst genannten Fall können aufgrund des ungünstigen
Verhältnisses der Phasenvolumina zur Grenzfläche nur geringe Produktivitäten erreicht
werden, womit der Einsatz dieses Systems in technischen Prozessen ausgeschlossen ist. In
Emulsionssystemen ist die spezifische Grenzfläche sehr viel größer, was einen effektiven
Stofftransport zwischen den Phasen gewährleistet und höhere Produktivitäten erlaubt
[Ballesteros, Bornscheuer et al., 1995]. Nachteilig ist jedoch, dass für die Aufrechterhaltung
der Emulsion ein hoher Energieeintrag nötig ist, weshalb häufig Tenside zur Stabilisierung
der Emulsion eingesetzt werden. Die eingesetzten Tenside können sich allerdings nachteilig
auf die Enzymstabilität auswirken. Zudem werden die Produktaufarbeitung und
Enzymwiedergewinnung durch Tenside behindert [Carvalho, Cabral, 2000]. Auch die
Etablierung eines kontinuierlichen Reaktionssystems ist aufgrund der makroskopischen
Homogenität der Mikroemulsionen schwierig. Aufgrund der genannten Nachteile werden
oftmals gelstabilisierte Zweiphasensysteme eingesetzt.
1.3.3 Gelstabilisiertes Zweiphasensystem
In gelstabilisierten Zweiphasensystemen wird das lösliche Enzym in einer Polymermatrix
immobilisiert. Hierbei werden Hydrogele bevorzugt, da sie dem Enzym seine natürliche
wässrige Umgebung bieten. In dieser Form können selbst sensible Enzyme für eine Synthese
in Lösungsmitteln eingesetzt werden [Ansorge-Schumacher, 2007]. Hydrogel-Immobilisate
werden als feste wässrige Phase in organischen Lösungsmitteln suspendiert und ermöglichen
eine effektive Abtrennung bzw. Rückhaltung des Katalysators vom Reaktionsmedium.
Dadurch wird die Produktaufarbeitung vereinfacht, da das Enzym die produkthaltige
organische Phase nicht verunreinigt. Zudem werden der wiederholte Einsatz des
Biokatalysators und eine kontinuierliche Reaktionsführung erleichtert. Oftmals kann durch
eine Immobilisierung der Biokatalysatoren zudem deren Stabilität gegen technische
Anforderungen wie organische Lösungsmittel, Reaktionstemperatur usw. stark gesteigert
werden [Ansorge-Schumacher, 2007]. Als nachteilig kann sich bei einem gelstabilisierten
Zweiphasensystem jedoch ein verminderter Stofftransport zwischen der wässrigen und der
organischen Phase auswirken. Auch der Stofftransport innerhalb der Einhüllungsmatrix kann
problematisch sein [Fernandes, Cabral, 2008] und muss im Einzelfall untersucht werden.
Einleitung Teil 2
108
1.4 Zielsetzung
Zunächst war es Ziel der vorliegenden Arbeit ein Verfahren zur automatisierten Produktion
der sehr aussichtsreichen PVA/PEG-Immobilisate zu entwickeln. PVA/PEG-Hydrogele
werden zur Einhüllung vieler verschiedener chemischer und biologischer Katalysatoren
genutzt [Lozinsky, Plieva, 1998; Leidig, Prüsse et al., 1999; Szczesna, Galas, 2001; Prüsse,
Hörold, 1997; Hischer, Steinsiek et al., 2006; Metrangolo-Ruiz De Temiño, Hartmeier et al.,
2005; Plieva, Kochetkov et al., 2000]. Bisher ist die Produktion jedoch ausschließlich manuell
im kleinen Maßstab möglich. Aufgrund der hohen Viskosität der PVA/PEG-Lösung ist die
manuelle Herstellung problematisch und es entstehen nicht standardisierte Immobilisate.
Diese Gründe verhindern bis heute industrielle Anwendungen von PVA/PEG-Immobilisaten.
In der vorliegenden Arbeit war es daher Ziel, durch den Entwurf einer geeigneten Apparatur
eine automatisierte Produktion von im Hinblick auf Größenverteilung, Form und
Gelmorphologie genau definierten PVA/PEG-Polymermatrices im Labormaßstab zu
ermöglichen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Möglichkeiten der Optimierung für die
technische Anwendung der BAL aus Pseudomonas fluorescens Biovar I zur Bereitstellung
enantiomerenreiner α-Hydroxyketone zu untersuchen. Die technische Anwendung dieser
interessanten Lyase ist bis heute aufgrund der sehr hydrophoben Reaktanden und der daraus
resultierenden geringen Löslichkeit in wässrigen Medien limitiert. Demir und Mitarbeiter
konnten die Löslichkeit der Reaktanden durch den Einsatz von Löslichkeitsvermittlern wie
DMSO (20%, v/v) zumindest teilweise erhöhen [Demir, Sesenoglu et al., 2002]. Die meist
niedrigen Produktivitäten und die aufgrund des schwer abtrennbaren Cosolvens komplizierte
Produktaufarbeitung verhindern jedoch industrielle Anwendungen eines solchen
Einphasensystems.
Hischer und Mitarbeiter [2005] zeigten, dass im Fall der BAL ein gelstabilisiertes Zwei-
phasensystem mit PVA/PEG-Hydrogelen eine effektive Alternative ist. Im Vergleich zum
Einphasensystem mit 20% DMSO (v/v) als Cosolvens konnte für die BAL-katalysierte
Synthese des α-Hydroxyketons (R)-2,2’-Furoin im PVA/PEG-gelstabilisierten Zwei-
phasensystem eine 3fach höhere Produktivität erzielt werden [Hischer, Gocke et al., 2005].
Einleitung Teil 2
109
Ansorge-Schumacher und Mitarbeiter [2006] erweiterten dieses Reaktionskonzept zu einem
kontinuierlich betriebenen Wirbelschichtreaktor, wobei als technisch relevante
Modellreaktion ebenfalls die Synthese von (R)-Furoin diente.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Möglichkeiten der Optimierung dieses Prozesses anhand
eines Lösungsmittelwechsels ermittelt. Der Lösungsmittelwechsel erfolgte vom bisher stets
verwendeten sehr apolaren n-Hexan [Ansorge-Schumacher, Greiner et al., 2006] hin zu
polareren Lösungsmitteln, die das Produkt besser lösen und eine höhere Extraktionskraft für
dieses besitzen. Hierdurch sollte der Umsatz gesteigert und gleichzeitig hohe
Enantiomerenüberschüsse erzielt werden. Als zusätzliche Optimierungsoption wurde im
Wirbelschichtreaktor eine Variante der BAL eingesetzt, die eine erhöhte Lagerstabilität gegen
verschiedene organische Lösungsmittel aufweist [van den Wittenboer, 2009].
Des Weiteren wurde zum ersten Mal das sterisch sehr anspruchsvolle chirale α-Hydroxyketon
(R)-4,4’-Biphenylbenzoin durch Kombination einer Palladium (Pd)-katalysierten Kreuz-
kupplung und einer BAL-katalysierten Carboligation synthetisiert. Der Plan war, dass die
BAL hierbei die Carboligation zweier 4-Biphenylcarboxaldehyde zu (R)-4,4’-Biphenyl-
benzoin stereoselektiv katalysiert. Das Substrat 4-Biphenylcarboxaldehyd sollte zuvor aus der
einfachen Vorstufe 4-Brombenzaldehyd durch Pd-katalysierte Suzuki-Kupplung aufgebaut
werden. Zunächst wurde die Suzuki-Kupplung mit dem verwendeten Bis-
(triphenylphosphin)-palladiumchlorid Katalysator und anschließend die BAL-katalysierte
Carboligation hinsichtlich Ausbeute und ee charakterisiert und optimiert. Hierbei war es Ziel,
beide Reaktionen nach Möglichkeit ohne Zwischenaufreinigung als Eintopfsynthese
durchzuführen. Hierdurch sollten Zeit, Geld- und Energieressourcen eingespart werden,
wobei letzteres besonders im Hinblick auf „green chemistry“ von Interesse ist.
Material und Methoden Teil 2
110
2. Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien
Benzoin 99%, Fluka, (Neu-Ulm)
Benzaldehyd 99%, Sigma Aldrich (Steinheim)
4-Biphenylcarboxaldehyd 99%, Sigma Aldrich (Steinheim)
4-Brombenzaldehyd 99%, Sigma Aldrich (Steinheim)
Chloroform-D1 99,8%, Merck (Darmstadt)
Chloroform Rotisolv, Carl Roth (Karlsruhe)
Dimethylformamid 99,8%, Carl Roth (Karlsruhe)
Dimethylsulfoxid 99,5%, Riedel-de-Häen (Seelze)
Ethylacetat 99,8% Merck (Darmstadt)
2-Furaldehyd 99%, Sigma Aldrich (Steinheim)
2,2’-Furoin 98%, Sigma Aldrich (Steinheim)
Imidazol 99%, Carl Roth (Karlsruhe)
IPTG 99%, Carl Roth (Karlsruhe)
Isopropanol Rotisolv, Carl Roth (Karlsruhe)
Kieselgel 60 Merck (Darmstadt)
2-Methyltetrahydrofuran 99%, Sigma Aldrich (Steinheim)
Nicotinamidandenindinucleotid 95%, Fluka (Neu-Ulm)
Natriumcarbonat 99,5%, Fluka (Neu-Ulm)
n-Hexan Rotisolv, Carl Roth (Karlsruhe)
Polyethylenglycol 1000 Fluka (Neu-Ulm)
PVA Mowiol 10–98 (Polymerisationsgrad: 1400) Fluka (Neu-Ulm)
Phenylboronsäure 95%, Sigma Aldrich (Steinheim)
Thiamindiphosphat 95%, Fluka (Neu-Ulm)
tert-Butylmethylether Rotisolv, Carl Roth (Karlsruhe)
Tetrahydrofuran Rotisolv, Carl Roth (Karlsruhe)
Material und Methoden Teil 2
111
Triphenylphosphin 99%, Sigma Aldrich (Steinheim)
Alle nicht gesondert aufgeführten Chemikalien wurden von den Firmen AppliChem
(Darmstadt), Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Carl Roth (Karlsruhe) oder Sigma-
Aldrich (Steinheim) bezogen, alle mindestens analysenrein (p.a.).
2.1.2 Katalysatoren
Bereitstellung der nativen BAL und der BAL-Variante(V175N, I176D, I177T)
Die native BAL wurde in dem rekombinanten Stamm E. coli SG13009 (pBAL-His6)
exprimiert, aufgereinigt und lyophilisiert. Der rekombinante Stamm wurde freundlicherweise
vom Lehrstuhl für Biotechnologie der RWTH Aachen zur Verfügung gestellt.
Für die Fermentation dieses rekombinanten Stammes wurden zunächst Vorkulturen in
250 mL Schüttelkolben in LB-Medium angesetzt und über Nacht bei 125 rpm und 37 °C
inkubiert. Die Selektion erfolgte über Zusatz von 25 µg mL
-1
Kanamycin und 100 µg mL
-1
Ampicillin. Anschließend wurde ein 5 L-Reaktor 1:50 mit den Vorkulturen inokuliert. Das
Medium setzte sich aus 40 g L
-1
Glycerin, 40 g L
-1
Hefeextrakt, 3,1 g L
-1
KH
2
PO
4
, 6,7 g L
-1
Na
2
HPO
4
, 0,5 g L
-1
NaCl und 1,5 g L
-1
MgSO
4
*7H
2
O zusammen. Auch hier wurde über die
Zugabe von Kanamycin und Ampicillin selektiert. Die Hauptfermentation wurde zunächst bei
37 °C durchgeführt. Der pH-Wert wurde durch 1 M Phosphorsäure bzw. 12,5%-iges
Ammoniumhydroxid ausgeglichen und konstant bei 7,0 geregelt. Der Sauerstoffpartialdruck
wurde auf einen Sättigungspartialdruck von 30% eingestellt, indem die Rührerdrehzahl
kaskadisch geregelt wurde. Der Verlauf der Fermentation wurde durch Bestimmung der
optischen Dichte (OD) bei 600 nm verfolgt. Nachdem die OD einen Wert von 10 erreichte,
wurde die Enzymexpression durch Zugabe von 0,8 mM IPTG induziert. Anschließend wurde
die Temperatur auf 32 °C erniedrigt, um die Bildung von Einschlusskörpern zu verhindern.
Die Fermentation wurde 5 h nach der Induktion abgebrochen. Anschließend wurde die
Fermentationsbrühe 20 min bei 20.000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Das Zellpellet wurde gelöst, mit 1 mg mL
-1
Lysozym 30 min lang behandelt und per
Ultraschall aufgeschlossen. Nach dem Aufschluss wurde das lösliche Enzym durch
Material und Methoden Teil 2
112
Zentrifugation (10.000 g, 30 min) vom Rohextrakt abgetrennt. Als Hexahistidin-
Fusionsprotein wurde die BAL mit einer IMAC-Matrix (NTA Superflow) von
Fremdproteinen aufgereinigt. Für die chromatographische Trennung wurde das Standard-
protokoll des Herstellers (Qiagen, Hilden) verwandt. Um die hohen Imidazolkonzentrationen
aus den BAL enthaltenden Fraktionen zu entfernen, wurde die Enzymlösung anschließend
gegen 2 L Puffer über einen Zeitraum von 24 h dialysiert. Die Ausschlussgröße des
Dialyseschlauchs betrug 20 kDa. Als Puffer wurde 10 mM KPi, pH 7,0 benutzt, der während
der Dialyse zweimal erneuert wurde. Für die Stabilisierung der BAL wurden jeweils 0,25 mM
ThDP und MgSO
4
hinzugegeben. Alle Schritte, mit Ausnahme der Chromatographie, wurden
bei 4 °C durchgeführt.
Zuletzt wurde die erhaltene Lösung eingefroren (-20 °C) und lyophilisiert. Das BAL-
Lyophilisat wurde bei -20 °C gelagert. Die erfolgreiche Aufreinigung der BAL mittels SDS-
PAGE Gelelektrophorese nachgewiesen. Da keine anderen Banden als die der BAL auf dem
Gel ausgeprägt waren, wurde angenommen, dass das Lyophilisat vollständig aus diesem
Enzym bestand.
Die Expression der BAL-Variante(V175N, I176D, I177T) erfolgte mittels der entsprechenden
E. coli Zellen (erhalten von Dr. A. van den Wittenboer, RWTH Aachen) in Schüttelkolben in
einem Maßstab von 0,2-1 L. Als Medium wurde LB-Amp/Kan Medium verwendet. Die
Hauptkulturen wurden 1:50 mit einer Übernacht-Vorkultur inokuliert und bei 37 °C und
120 rpm bis zu einer OD
600
von 0,8-1 inkubiert. Die Expression wurde durch 1 mM IPTG
induziert und erfolgte für 6 h bei 28 °C und 90 rpm. Im Anschluss wurden die Zellen durch
Zentrifugation geerntet (30 min, 10.000 g, 4 °C), in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) resuspendiert
und erneut zentrifugiert (25 min, 15.000 g, 4 °C). Zellaufschluss und Proteinaufreinigung
fanden analog zur Aufreinigung der nativen BAL statt.
HL-ADH Evocatal (Düsseldorf)
Bis-(triphenylphosphin)-palladium(II)chlorid 98%, Sigma Aldrich (Steinheim)
Material und Methoden Teil 2
113
2.1.3 Geräte
Technischer Aufbau für die automatisierte Produktion von PVA/PEG-Immobilisaten
Der Mikro-Flüssigkeits-Dispenser SMLD 300G wurde bei der Fritz Gyger AG (Thun-Gwatt,
Schweiz) gekauft. Das gesamte elektronische Equipment wurde von den Universitäts-
werkstätten der RWTH Aachen und der TU Berlin gebaut. Wacker AP 100 Silikonöl (Wacker
Chemie AG, Burghausen) wurde als Aushärtungsflüssigkeit für die PVA/PEG-Lösung
verwendet. Für die Temperierung der Aushärtungsflüssigkeit wurde ein Thermostat (RE300,
Ecoline Staredition) mit einem externen Temperatursensor der Firma Lauda (Lauda-
Königshofen) mit Silikonöl M10 (Carl Roth, Karlsruhe) als Kühlflüssigkeit verwendet. Der
doppelwandige Probenbehälter wurde durch einen angeschlossenen Wasserbadthermostaten
temperiert (MgW Thermo-star C3, Lauda, Lauda-Königshofen).
Sonstige Geräte
Fermenter Biostat B Plus, Sartorius (Göttingen)
GC GC2010, Shimadzu (Duisburg)
Glovebox GS Glovebox Systemtechnik GmbH (Malsch)
HPLC Smartline Manager 5000, Smartline Pump 1000,
Smartline UV Detector 2600, Knauer (Berlin)
NMR-Spektrometer 400 MHz, Brucker
Rotationsverdampfer Büchi (Zürich, Schweiz)
Überkopfschüttler REAX 2, Heidolph Instruments (Schwabach)
2.2 Methoden
2.2.1 Herstellung der PVA/PEG-Immobilisate
Herstellung der PVA/PEG-Lösung
PVA Mowiol 10–98 (Polymerisationsgrad: 1400) und PEG 1000 wurden jeweils zu 10%
(w/v) in destilliertem Wasser bei 90 °C gelöst. Nach Abkühlung der Lösung auf Raum-
temperatur wurden 30 mg NaOH pro g PVA hinzugegeben und die Lösung 30 min gerührt,
Material und Methoden Teil 2
114
um eine vollständige Saponifikation zu ermöglichen. Anschließend wurde der pH-Wert mit
konzentrierter Salzsäure auf 8,0 eingestellt.
Für die Herstellung von PVA/PEG-BAL-Immobilisaten wurden neun Teile dieser Lösung und
ein Teil destilliertes Wasser, welches die gelösten Cofaktoren Mg
2+
und ThDP und BAL-
Lyophilisat enthielt, vermischt. Hierdurch ergaben sich folgende Endkonzentrationen:
9% (w/v) PVA/PEG, 2,5 mmol L
-1
Mg
2+
, 0,1 mmol L
-1
ThDP und 5 U mL
-1
BAL.
Für die
Herstellung von PVA/PEG-Kugeln ohne Enzym wurde analog verfahren, nur dass in diesem Fall
neun Teile der PVA/PEG-Lösung mit einem Teil destilliertem Wasser ohne Enzym und
Cofaktoren gemischt wurden.
Wurden die PVA/PEG-Immobilisate manuell produziert, so wurde diese Lösung mithilfe
einer Multipette (Eppendorf, Hamburg) in -25 °C kaltes Wacker AP 100 Silikonöl (Wacker
Chemie AG, Burghausen), das sich in einem Becherglas befand, getropft. Das Becherglas
wurde in einen Styroporbehälter platziert, um ein Erwärmen des Silikonöls hinauszuzögern.
In der Regel wurde ein Eintropfvolumen von 20 µL gewählt. Abschließend wurden die
Kugeln bei 4 °C über Nacht langsam aufgetaut und am nächsten Tag nach kurzem Abwaschen
des Silikonöls mit n-Hexan unmittelbar eingesetzt. So manuell produzierte PVA/PEG-Kugeln
hatten einen Durchmesser von 2,8 mm. Der Faktor für die Rundheit lag zwischen 0,83-0,87
und der für die Kompaktheit zwischen 0,97-0,98 (s. 2.2.2).
Wurden die PVA/PEG-Immobilisate automatisch produziert, so wurde die PVA/PEG-Lösung
in den Probenbehälter eingefüllt. Mit Stickstoff wurde ein Druck von 5 bar beaufschlagt und
die Lösung in das -25 °C Silikonölauffangbad dosiert. Das Tropfenvolumen war dabei frei
wählbar. Nach Beendigung der Dosierung wurde das Silikonölbad schrittweise auf 20 °C
erwärmt.
2.2.2 Analyse der PVA/PEG-Immobilisate
Für die Analyse der Größenverteilung der PVA/PEG-Kugeln wurden diese aus dem
Silikonölbad entnommen, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend gesiebt
Material und Methoden Teil 2
115
(ISO 3310/1, Retsch, Haan). Die Ausschlussgrößen beim Sieben betrugen 5,00, 4,00, 3,55,
3,15, 2,50, 2,00, 1,40, 1,00, 0,80, 0,60, 0,50, 0,40, 0,30 und 0,10 mm.
Für die Formanalyse der PVA/PEG-Kugeln wurden diese in einer wässrigen Ethanollösung
(20%, v/v) mit 0,1% (w/v) Bromkresolgrün für 30 Sekunden angefärbt. Anschließend wurde
ein digitales Foto aufgenommen (SP-500UZ, Olympus), welches mit der Software GIMP
(Version 2,0) in ein Graustufenbild mit maximalem Kontrast konvertiert wurde. Die Form der
Kugeln wurde danach mithilfe der Software Image Tool (Version 3,0) analysiert, wobei die
Form mithilfe der Rundheit und der Kompaktheit beschrieben wurde. Die Rundheit ist
definiert als (4*π*Fläche/Umfang
2
), wobei der Umfang die Länge der Außengrenze des
untersuchten Objekts ist. Die Kompaktheit ist definiert als (4*Fläche/π)
1/2
/Hauptachsenlänge.
Beide Parameter streben umso stärker auf einen Wert von 1 zu, je näher das Objekt einer
idealen runden Form ist.
Für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurden die PVA/PEG-Kugeln durch
Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff und anschließendem Gefriertrocknen vorbereitet. Die
Rasterelektronenmikroskopie wurde in einem S-2700 Instrument (Hitachi) bei einer
Akzelerationsspannung von 20 kV durchgeführt. Die Proben wurden auf einer doppelseitigen
Adhesivklebefolie fixiert und mit einem dünnen Goldfilm gesputtert.
Für die Untersuchung des Diffusionsverhaltens des PEG 1000 zwischen der PVA-Matrix und
der umgebenden Flüssigkeitsphase wurden jeweils 2 g manuell produzierter PVA/PEG-
Immobilisate (s. 2.2.1) in 8 mL destilliertem Wasser, Silikonöl, n-Hexan, MTBE bzw. MIBK
3 Tage lang bei Raumtemperatur in verschlossenen Glasgefäßen (CS Chromatographie,
Langerwehe) inkubiert. Am ersten Tag wurde nach 2, 4 und 6 h Inkubation sowohl eine
PVA/PEG-Kugel als auch das jeweilige Lösungsmittel mittels FT-IR Spektroskopie
(Spectrum One, Universal ATR Sampling Accessory, Perkin Elmer) analysiert. An Tag 2 und
3 wurde jeweils nur eine Probe der Immobilisate und des Lösungsmittels analysiert.
Material und Methoden Teil 2
116
2.2.3 BAL-Aktivitätstests
Aktivitätsvergleich zwischen manuell und automatisch produzierten PVA/PEG-BAL-Kugeln
Lyophilisierte BAL (s. 2.1.2) wurde mit einer Beladung von 0,5 U mL
-1
manuell und
automatisch in PVA/PEG-Kugeln immobilisiert (s. 2.2.1). Die BAL-Aktivität beider
Immobilisatchargen wurde über die Enzym-katalysierte Carboligation zweier Benzaldehyde
zu Benzoin via Gaschromatographie (s. 2.2.12) verfolgt. Die Reaktionen wurden bei 30 °C in
geschlossenen Glasgefäßen mit 17 g der jeweiligen PVA/PEG-BAL-Kugeln und 10 mL einer
200 mM Benzaldehydlösung in MTBE durchgeführt.
Gekoppelter Aktivitätstest der BAL
Zur Bestimmung der volumetrischen BAL-Aktivität wurde der gekoppelte Aktivitätstest
verwendet. Hierbei wird die Alkoholdehydrogenase aus der Pferdeleber (HL-ADH) als
Hilfsenzym eingesetzt. Die BAL setzt zunächst das Substrat Benzoin zu zwei Benz-
aldehydmolekülen um, die anschließend von der HL-ADH zu Benzylalkohol reduziert
werden. Bei der Reduktion wird Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH
2
) äquimolar zu
NAD
+
oxidiert (s. Abb. 2.1).
O
OH
O
2
Mg
2+
, ThDP
BAL
NADH
2
NAD
+
HL-ADH
OH
2
1 2 3
Abbildung 2.1. Reaktionsschema des gekoppelten Aktivitätstest der BAL.
1: racemisches Benzoin; 2: Benzaldehyd; 3: Benzylalkohol.
Die Abnahme des Cofaktors NADH
2
kann photometrisch bei 340 nm verfolgt werden.
Die
HL-ADH wird bei diesem BAL-Aktivitätstest im Überschuss zugesetzt, um eine quantitative
Reduktion zu gewährleisten. Für die Berechnung der volumetrischen BAL-Aktivität ergibt
sich folgende Formel:
Akt.
vol.
[U mL
-1
] = f
dV
VE
NADHobe
ges
∗∗
∗∗
∗∆
2
1
Pr
.
ε
,
Material und Methoden Teil 2
117
wobei
E
∆
die gemessene Extinktionsabnahme pro Minute, V
ges.
das Gesamtvolumen in der
Küvette (1 mL), V
Probe
das Volumen der Enzymlösung in der Küvette (0,05 mL),
NADH
ε
der
molare Extinktionskoeffizient des NADH
2
bei 340 nm (ε
340 nm
= 6,3 L·mmol
-1
·cm
-1
) und d die
Schichtdicke der Küvette (1 cm) ist. Die Multiplikation mit dem Faktor ½ ergibt sich aus der
Stöchiometrie der Reaktionsgleichung (s. Abb. 2.1). Gegebenenfalls muss mit dem
entsprechendem Verdünnungsfaktor f multipliziert werden.
Der Aktivitätstest wurde bei 30 °C unter ständigem Rühren in einer 1 mL Quarzglasküvette
(Hellma, Müllheim) durchgeführt. Benzoin wurde in einer Endkonzentration von 1,5 mM in
8,5 mL 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 8,0), der 15% (v/v) PEG 400, 2,5 mM MgSO
4
und
0,1 mM ThDP enthielt, gelöst. 850 µL dieser Lösung wurden in der Küvette mit 50 µL einer
HL-ADH-Lösung (5 U mL
-1
) und 50 µL einer 7 mM NADH
2
-Lösung gemischt. Die Reaktion
wurde durch Zugabe von 50 µL BAL-Enzymlösung gestartet und die Abnahme der
Extinktion über mindestens 2 min verfolgt.
2.2.4 Bestimmung der Verteilungskoeffizienten
Der Verteilungskoeffizient eines Stoffes in einem Zweiphasensystem, bestehend aus einer
organischen Phase und einer wässrigen Phase, ist definiert als
P
org/wässrig
=
wässrig
org
c
c
.
,
wobei c
org.
die Konzentration des Stoffes in der organischen Phase und c
wässrig
die
Stoffkonzentration in der wässrigen Phase ist.
Zur Bestimmung des Verteilungskoeffizienten des Eduktes 2-Furaldehyd wurde dieses in
folgenden Konzentrationen in dem jeweiligen Lösungsmittel (n-Hexan, MIBK oder MTBE)
vorgelegt: 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM und 60 mM. 2 mL dieser
2-Furaldehydlösungen wurden mit jeweils 2 mL destilliertem Wasser in ein verschließbares
Glasgefäß (CS Chromatographie Service GmbH, Langerwehe) gefüllt und bei 30 °C auf
Material und Methoden Teil 2
118
einem Überkopfschüttler mindestens 96 h inkubiert bevor Proben beider Phasen entnommen,
geeignet verdünnt und über HPLC analysiert wurden (s. 2.2.12).
Zur Bestimmung des Verteilungskoeffizienten des Produktes im jeweiligen
Zweiphasensystem wurde 2,2’-Furoin in folgenden Konzentrationen in destilliertem Wasser
vorgelegt: 2 mM, 5 mM und 12 mM. Ansonsten war die Vorgehensweise analog zur
Bestimmung des Verteilungskoeffizienten von 2-Furaldehyd.
2.2.5 Reaktionsansätze der (R)-2,2’-Furoinsynthese im kontinuierlichen
Wirbelschichtreaktor
Der Reaktionsraum des Wirbelschichtreaktors bestand aus einem 50 mL Falcon Tube, das in
eine 250 mL Glasflasche (Schott, Mainz) eingefasst wurde. Die Glasflasche wurde durch
einen Edelstahldeckel (Werkstatt der TU Berlin) gasdicht verschlossen. Im Edelstahldeckel
befanden sich 5 Bohrungen, die das Umpumpen der Reaktionslösung, die Substratversorgung,
den Produktablauf und den Aufbau eines leichten Überdrucks ermöglichten.
Im Regelfall wurden 5 g PVA/PEG-BAL-Immobilisate (5 U mL
-1
) als Schüttung im
Wirbelschichtreaktor eingesetzt, so dass eine Gesamtaktivität von 25 U BAL vorlag. Die
Ausbildung einer Wirbelschicht und eine ideale Durchmischung wurden durch eine
Umlaufpumpe (Verdergear S096, Verder, Haan)
,
die 60 L h
-1
förderte, gewährleistet. Die
Temperatur im Reaktor wurde über einen Wärmetauscher, der in den Umkreislauf integriert
wurde, konstant auf 20 °C geregelt. Der Wärmetauscher war an einen Kryostaten (MgWC3,
Lauda, Lauda-Königshofen) angeschlossen, wobei Wasser als Kühlmittel diente. Die
Zudosierung der Substratlösung erfolgte durch eine Feindosierpumpe (PTFE Minidosierer,
Telab, Solingen) mit deren Hilfe die Flussrate F geregelt werden konnte. Im Regelfall betrug
die 2-Furaldehydkonzentration in der Substratlösung 30 mmol L
-1
und die Flussrate wurde auf
24 mL h
-1
eingestellt. 35 mL Substratlösung wurden eingesetzt. Das Gesamtreaktionsvolumen
betrug jedoch 48 mL, da sich 13 mL Substratlösung in den Schläuchen des Umlaufs befanden.
Alle Schläuche wurden vor dem Ansetzen der Reaktion mit Substratlösung gespült. Durch
einen Überlauf bei 35 mL konnte das Reaktionsmedium ebenfalls durch eine Fein-
dosierpumpe (PTFE Minidosierer, Telab, Solingen) abgepumpt und über HPLC (s. 2.2.12)
Material und Methoden Teil 2
119
analysiert werden. Durch Zuleitung von Stickstoff durch eine Gaswaschflasche mit Silikonöl
wurde eine konstante Schutzgasatmosphäre im Reaktor erzeugt.
Alle verwendeten Leitungen bestanden aus 1/8" und 1/16" Rohrleitungen (CS Chromato-
graphie Service GmbH, Langerwehe). Je nach Einsatzstelle wurden Rohrleitungen aus Poly-
tetraflourethylen, Flourethylenpropylen oder aus gasdichtem Polyetheretherketon verwendet.
Kupplungen und T-Stücke wurden ausschließlich in der Polyetheretherketon Ausführung
verbaut (UpChurch Scientific, CS Chromatographie Service GmbH, Langerwehe).
2.2.6 Berechnung der Reaktionsparameter im kontinuierlichen
Wirbelschichtreaktor
Der ee-Wert wurde wie folgt berechnet:
ee =
[
]
[
]
[ ] [ ]
%100∗
+
−
SR
SR ,
wobei [R] die Konzentration des (R)-Enantiomers und [S] die Konzentration des
(S)-Enantiomers in der Lösungsmittelphase ist.
Die Verweilzeit wurde nach folgender Formel berechnet:
F
V
tVerweilzei
Reaktor
)( =
τ
,
wobei V
Reaktor
das Gesamtreaktionsvolumen im Reaktor (48 mL) und F die eingestellte
Flussrate ist.
Der Umsatz wurde wie folgt berechnet:
%100
c
2
)(
0
Substrat
t
Produkt
∗
∗
=c
cUmsatz ,
Material und Methoden Teil 2
120
wobei
t
Produkt
c die 2,2’-Furoinkonzentration zum Zeitpunkt t und
0
Substrat
c die Anfangs-
konzentration an 2-Furaldehyd in der Lösungsmittelphase ist. Der Faktor 2 wird aufgrund der
Stöchiometrie der Carboligation einbezogen.
2.2.7 Synthese von 4,4’-Dibrombenzoin für die Suzuki-Kupplung
Für die Synthese des Zwischenprodukts 4,4’-Dibrombenzoin, das für die Charakterisierung
der Palladium-katalysierten Kreuzkupplung zweier 4,4’-Dibrombenzoine zu 4,4’-Biphenyl-
benzoin benötigt wurde (s. 2.2.8), wurden in einem 50 mL Reaktionsgefäß 50 mg des
Substrats 4-Brombenzaldehyd in 12 mL Phosphat-Puffer (50 mM, pH 8,0) suspendiert und
3,6 mg MgSO
4
(2,5*10
-2
mmol) sowie 0,48 mg ThDP (1,0*10
-3
mmol) zugegeben. Im
Anschluss wurden 25 U (s. 2.2.3) der BAL zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde für 48 h
bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde mit Dichlormethan (3*30 mL) extrahiert
und mit einem Gemisch aus n-Hexan/Ethylacetat (5:1) über Kieselgel (15 cm*5 cm)
aufgereinigt. Die vereinigte organische Phase wurde über MgSO
4
getrocknet. Mittels
1
H-NMR wurde das Produkt eindeutig als 4,4’-Dibrombenzoin identifiziert.
1
H-NMR (400MHz, CDCl
3
):
δ
/ppm = 7,76-7,72 (2 H); 7,57-7,53 (2 H); 7,45-7,43 (2 H);
7,20-7,16 (2 H); 5,84-5,86 (1 H); 4,48-4,45 (1 H)
2.2.8 Reaktionsansätze der Suzuki-Kupplung
Suzuki-Kupplung mit 4-Brombenzaldehyd als Substrat
Für die Suzuki-Kupplung zwischen 4-Brombenzaldehyd und Phenylboronsäure mit dem
Standardpalladiumkatalysator (PPh
3
)
2
PdCl
2
wurden in der Regel in einem 25 mL
Zweihalskolben 33,5 mg Phenylboronsäure (0,275 mmol; 1,1eq) in 7,5 mL destilliertem
Wasser gelöst und anschließend 53,0 mg Na
2
CO
3
(0,5 mmol; 2eq) zugegeben. Nachdem sich
die beobachtete Gasentwicklung gelegt hatte, wurden 45,6 mg 4-Brombenzaldehyd
(0,25 mmol; 1eq) zugegeben und weitere 2,5 mL dest. Wasser hinzugefügt. Im Anschluss
wurden 3,5 mg (PPh
3
)
2
PdCl
2
(0,02eq) in der Reaktionslösung suspendiert. Die Reaktion
Material und Methoden Teil 2
121
wurde bei 55 °C über 17 h durchgeführt. Hiernach wurde der Reaktionsansatz mit
Dichlormethan (DCM, 3*15 mL) extrahiert, über MgSO
4
getrocknet, in 10 mL THF
aufgenommen und mittels HPLC analysiert (s. 2.2.12). Zusätzlich wurde das Produkt mittels
1
H-NMR eindeutig als 4-Biphenylcarboxaldehyd identifiziert:
1
H-NMR (400MHz, CDCl
3
):
δ
/ppm = 10,06 (s, 1 H); 7,96 (d, 2 H); 7,76 (d, 2 H);
7,64 (d, 2 H); 7,52-7,44 (m, 3 H)
Suzuki-Kupplung mit 4,4’-Dibrombenzoin als Substrat
Für die Suzuki-Kupplung von 4,4’-Dibrombenzoin mit Phenylboronsäure wurden in einem
25 mL Zweihalskolben 16,0 mg Phenylboronsäure (0,132 mmol; 2,2eq) in 7,5 mL dest.
Wasser gelöst und anschließend 26,0 mg Na
2
CO
3
zugegeben. Nachdem die Gasentwicklung
nachließ, wurden 23,0 mg 4,4’-Dibrombenzoin (0,06 mmol; 1eq) und weitere 2,5 mL dest.
Wasser zugegeben. Darauf folgend wurden 1,7 mg des Katalysators (PPh
3
)
2
PdCl
2
(0,02eq)
hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei 55 °C über 17 h durchgeführt. Hiernach wurde der
Reaktionsansatz mit Dichlormethan (DCM, 3*15 mL) extrahiert, über MgSO
4
getrocknet, in
10 mL THF aufgenommen und mittels HPLC analysiert (s. 2.2.12).
2.2.9 Charakterisierung der BAL-katalysierten Carboligation für die
Eintopfsynthese
Zur Bestimmung von Ausbeute und Enantiomerenüberschuss wurde die BAL-katalysierte
Carboligation zweier 4-Biphenylcarboxaldehyde bzw. zweier 4-Brombenzaldehyde bei 30 °C
und 130 rpm durchgeführt. Hierzu wurden in 2 mL Reaktionsgefäßen je 5 mg des jeweiligen
Substrats in 1 mL Phosphatpuffer (50 mM, pH 8,0) gelöst. Von den Cofaktoren wurden
0,05 mg ThDP (1,0*10
-4
mmol) und 0,36 mg MgSO
4
(2,5*10
-3
mmol) zugegeben. Die
resultierenden Endkonzentrationen betrugen 2,5 mM MgSO
4
und 0,1 mM ThDP. Da die
Edukte im wässrigen Medium nicht vollständig löslich waren, wurde zur Bestimmung der
Ausbeute und des ees zu einem bestimmten Zeitpunkt jeweils ein kompletter Ansatz
analysiert. Es wurden mindestens vier gleiche Ansätze hergestellt und jeweils die gleiche
Material und Methoden Teil 2
122
Menge derselben Enzymlösung zupipettiert. Für die Analyse wurde der Phosphatpuffer durch
Zentrifugation abgetrennt, die verbleibenden Feststoffe in 1 mL THF aufgenommen und
mittels HPLC analysiert (s. 2.2.12).
Die Ausbeute und der ee der BAL-katalysierten Carboligationen bei Verwendung der
Cosolventien DMSO und DMF wurden analog hierzu durchgeführt. In 2 mL
Reaktionsgefäßen wurden je 5 mg des Substrats 4-Biphenylcarboxaldehyd oder 4-Brom-
benzaldehyd in einer 4:1 Mischung aus Phosphatpuffer (50 mM, pH 8,0) und Löslichkeits-
vermittler gelöst. Hierbei wurde darauf geachtet, dass die Konzentration des Puffers und der
Anteil an Löslichkeitsvermittler nach der Zugabe von Enzymlösung den gewünschten Werten
entsprachen. Es wurden 0,05 mg ThDP (1,0*10
-4
mmol) und 0,36 mg MgSO
4
(2,5*10
-3
mmol) zugegeben. Da die Edukte jedoch auch mit dem Zusatz von Löslichkeits-
vermittlern nicht vollständig in Wasser gelöst werden konnten, wurde zur Bestimmung der
Ausbeute zu einem bestimmten Zeitpunkt ebenfalls jeweils ein kompletter Ansatz analysiert.
Der Reaktionsansatz wurde hierfür zentrifugiert, die Feststoffe anschließend in je 1 mL THF
aufgenommen und Ausbeute und ee mittels HPLC bestimmt (s. 2.2.12).
2.2.10 Einfluss der Phenylboronsäure auf die BAL-Aktivität
Der Einfluss von Phenylboronsäure auf die BAL-Aktivität wurde mittels des gekoppelten
Aktivitätstest (s. 2.2.3) untersucht. Für den Aktivitätstest wurde ein 50 mM Phosphatpuffer
(pH 8,0) mit 15% PEG 400 gemischt. 2,7 mg Benzoin (1,5 mM) wurden in 8,5 mL dieses
Puffers gelöst und 2,5 mg MgSO
4
(2,5 mM
)
und 0,36 mg ThDP (0,1 mM), sowie 0,5 mL
einer HL-ADH Lösung (5 U mL
-1
) und 0,5 mL einer 7 mM NADH
2
Lösung zugegeben.
Anschließend wurden verschiedene Konzentrationen an Phenylboronsäure in jeweils 3 mL
dieses Assaypuffers gelöst. Es entstanden Lösungen mit folgenden Phenylboronsäure-
endkonzentrationen: 19,0 mmol L
-1
, 37,0 mmol L
-1
, 75,0 mmol L
-1
sowie 150 mmol L
-1
. In
drei Messungen wurden 950 µL der jeweiligen Lösung mit 50 µL Enzymlösung versetzt und
die Abnahme der NADH
2
Konzentration bei 340 nm über 2 min detektiert.
Material und Methoden Teil 2
123
2.2.11 Reaktionsansätze der Eintopfsynthese von (R)-4,4’-Biphenylbenzoin
Bei der Eintopfsynthese von 4,4’-Biphenylbenzoin mit der BAL-Reaktion im zweiten Schritt
wurde zunächst die Pd-katalysierte Suzuki-Kupplung durchgeführt. Dazu wurden wie in 2.2.8
beschrieben in einem 25 mL Zweihalskolben zunächst 33,5 mg Phenylboronsäure
(0,275 mmol; 1,1eq) in 7,5 mL dest. Wasser gelöst und anschließend 53,0 mg Na
2
CO
3
(0,5 mmol; 2eq) zugegeben. Nachdem sich die beobachtete Gasentwicklung gelegt hatte,
wurden 45,6 mg 4-Brombenzaldehyd (0,25 mmol; 1eq) zugegeben und weitere 2,5 mL dest.
Wasser hinzugefügt. Im Anschluss wurden 3,5 mg (PPh
3
)
2
PdCl
2
(0,02eq) in der
Reaktionslösung suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde über 17 h auf 55 °C erhitzt.
Nach Abschluss der Reaktion wurde der pH-Wert mit Salzsäure auf einen Wert von 8,0
eingestellt. Als Cofaktoren wurden 3,6 mg MgSO
4
(2,5*10
-2
mmol) und 0,46 mg ThDP
(1,0*10
-3
mmol) zugegeben. Im Anschluss wurde der pH-Wert erneut kontrolliert und
gegebenenfalls auf einen Wert von 8,0 korrigiert. Die BAL wurde in großem Überschuss
zugegeben, um eine vollständige Umsetzung zu erreichen. Die Reaktion fand bei 30 °C statt
und die Mindestlaufzeit betrug 3 Tage. Die Extraktion des kompletten Reaktionsansatzes
erfolgte mit DCM (3*20 mL), über MgSO
4
wurde das Extrakt getrocknet, in THF
aufgenommen und mittels HPLC analysiert (s. 2.2.12). Über
1
H-NMR Analyse konnte das
Endprodukt eindeutig als 4,4’-Biphenylbenzoin identifiziert werden:
1
H-NMR (400MHz, CDCl
3
):
δ
/ppm = 8,28 (m, 2 H); 7,75-7,42 (m, 16 H); 5,45 (s, 1 H)
2.2.12 Analytik
Gaschromatographie
Der Aktivitätsvergleich zwischen manuell und automatisch produzierten PVA/PEG-BAL-
Immobilisaten wurde über die Carboligation zweier Benzaldehyde zu Benzoin
gaschromatographisch verfolgt. Hierbei wurde eine BTX Säule (SGE) mit einer Länge von
25 m, einem Innendurchmesser von 0,22 mm und einer Filmdicke von 0,25 µm verwendet.
Material und Methoden Teil 2
124
Tabelle 2.1. Parameter der GC-Benzoin-Analyse.
Detektor
Trägergas
Injektionsvolumen
Injektortemperatur
Säulentemperatur
Anfangshaltezeit
Säulenaufheizrate
Detektortemperatur
Retentionszeit Benzoin
Flammenionisationsdetektor (FID)
Stickstoff
1 µL (Split Modell)
275 °C
60-260 °C
0,5 min
20 °C min
-1
300 °C
9,56 min
Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Die Proben der BAL-katalysierten 2,2’-Furoinsynthese wurden mit dem entsprechendem
Lösungsmittel geeignet verdünnt (Verdünnungsfaktor 2 bis 50) und mittels HPLC analysiert.
Für die Bestimmung der Umsatzes und des Enantiomerenüberschusses wurden 2 verschiedene
HPLC-Säulen benutzt.
Tabelle 2.2. Parameter der HPLC-Analyse zur Bestimmung des Umsatzes der 2,2’-Furoinsynthese.
Säule
Detektor
Eingestellte Wellenlänge
Injektionsvolumen
Säulentemperatur
Mobile Phase
Flussrate
Retentionszeit 2-Furaldehyd
Retentionszeit 2,2’-Furoin
Eurospher 100-5, C
18
(Knauer, Berlin)
UV, Typ 2600 (Knauer, Berlin)
254 nm
20 µL
25 °C
85% dest. Wasser : 15% THF
0,3 mL min
-1
12,8 min
18,9 min
Material und Methoden Teil 2
125
Tabelle 2.3. Parameter der HPLC-Analyse zur Bestimmung des Enantiomerenüberschuss der
2,2’-Furoinsynthese.
Säule Chiralpak IA (Daicel Chemical Industries,
USA)
Detektor
Eingestellte Wellenlänge
UV, Typ 2600 (Knauer, Berlin)
274 nm
Injektionsvolumen 20 µL
Säulentemperatur 20 °C
Mobile Phase 80% n-Hexan : 20% Isopropanol
Flussrate 0,8 mL min
-
1
Retentionszeit (R)-2,2’-Furoin
Retentionszeit (S)-2,2’-Furoin
Retentionszeit (1,2-Di(furan-2-yl)ethan-1,2-dion)
15,5 min
13 min
10 min
Für die Bestimmung der Produktausbeute und des ees bei der Eintopfsynthese von (R)-4,4’-
Biphenylbenzoin mittels HPLC-Analytik wurden ebenfalls 2 verschiedene Säulen verwendet.
Tabelle 2.4. Parameter der HPLC-Analyse zur Bestimmung der Ausbeuten bei der Eintopfsynthese von
4,4’-Biphenylbenzoin.
Säule Eurospher 100-5, C
18
(Knauer, Berlin)
Detektor
Eingestellte Wellenlänge
UV, Typ 2600 (Knauer, Berlin)
254 nm
Injektionsvolumen 20 µL
Säulentemperatur 25 °C
Mobile Phase 50% dest. Wasser : 50% THF
Flussrate 1 mL min
-
1
Retentionszeit 4-Brombenzaldehyd
Retentionszeit 4-Biphenylcarboxaldehyd
Retentionszeit 4,4’-Dibrombenzoin
Retentionszeit 4,4’-Biphenylbenzoin
5,5 min
7,5 min
9,7 min
12,3 min
Material und Methoden Teil 2
126
Tabelle 2.5. Parameter der HPLC-Analytik zur Bestimmung des ees der Eintopfsynthese von
(R)-4,4’-Biphenylbenzoin.
Säule Chiralpak IA (Daicel Chemical Industries, USA)
Detektor
Eingestellte Wellenlänge
UV, Typ 2600 (Knauer, Berlin)
300 nm
Injektionsvolumen 20 µL
Säulentemperatur 30 °C
Mobile Phase 50% n-Hexan : 50% Isopropanol
Flussrate 0,8 ml min
-
1
Retentionszeit 4-Brombenzaldehyd
Retentionszeit 4-Biphenylcarboxaldehyd
Retentionszeit (R)-4,4’-Dibrombenzoin
Retentionszeit (R)-4,4’-Biphenylbenzoin
7,5 min
7,5 min
7,9 min
11,5 min
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
127
3. Ergebnisse und Diskussion
3.1 Automatisierte Produktion von PVA/PEG-Immobilisaten im
Labormaßstab
Die Vorteile von gelstabilisierten Zweiphasensystemen wurden in Kapitel 1.3.3 bereits
ausführlich erörtert. Im Kapitel 3.1 steht die Produktion der besonders vielversprechenden
Polyvinylalkohol (PVA)/Polyethylenglycol (PEG)-Kryogele im Fokus. Diese Hydrogele
zeichnen sich durch hohe Mikro- und Makroporösitäten aus, wodurch hohe
Massentransferraten gewährleistet werden. Zudem zeigen sie eine hohe Stabilität gegenüber
vielen Verbindungen auf [Lozinsky, Plieva, 1998]. Ihre hohe Resistenz gegenüber
Scherkräften erlaubt zusätzlich den Einsatz in vielen verschiedenen Reaktortypen, womit
PVA/PEG-Kryogele anderen oft genutzten thermoreversiblen Gelen überlegen sind. Des
Weiteren sind die Matrixmaterialien frei zugänglich, kostengünstig und ungiftig.
Die Einhüllung in solche PVA-Kryogele ist eine häufig angewendete Methode für die
Immobilisierung ganzer Zellen und auch für die Immobilisierung von Palladium-
Katalysatoren wurde diese Methode bereits beschrieben [Lozinsky, Plieva, 1998; Leidig,
Prüsse et al., 1999; Szczesna, Galas, 2001; Prüsse, Hörold, 1997]. Als isolierte Enzyme
wurden bereits die BAL aus Pseudomonas fluorescens, die Carbonylreduktase aus Candida
parapsilosis (EC 1.1.1.1), die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (EC 1.1.1.2) und
die Schweine Pankreaslipase (EC 3.1.1.3) in PVA/PEG-Matrices eingehüllt und erfolgreich in
Synthesen in puren organischen Lösungsmitteln eingesetzt [Hischer, Steinsiek et al., 2006;
Metrangolo-Ruiz De Temiño, Hartmeier et al., 2005; Plieva, Kochetkov et al., 2000].
Aufgrund der sehr milden Bedingungen während der Einhüllung ist die Aktivitätsausbeute
sogar bei sehr sensitiven Proteinen hoch. Generell wurde die Stabilität aller Enzyme
gegenüber organischen Lösungsmitteln mindestens um eine Zehnerpotenz gesteigert.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
128
PVA/PEG-Kryogele werden aufgrund der günstigen Hydrodynamiken und Abriebsstabilität
in Reaktoren gewöhnlich in Kugelform eingesetzt. Sie werden produziert über Kryogelierung
[Lozinsky, Damshkaln et al., 2008; Lozinsky, Solodova et al., 1995; Lozinsky, 1998] z. B.
durch Eintropfen einer PVA/PEG-Lösung in -20 bis -25 °C kaltes Silikonöl und
anschließendes Induzieren der Gelierung durch schrittweises Erhöhen der Temperatur auf
Raumtemperatur [Prüsse, 2000]. Alle Produktionsschritte werden manuell durchgeführt,
wobei die hohe Viskosität der PVA/PEG-Lösung die Handhabung erschwert und eine
Produktion im großen Maßstab unmöglich macht.
Vorlop und Mitarbeiter entwickelten daher einen Aufbau für eine automatisierte Produktion
von Immobilisaten, den sogenannten JetCutter. Dieser Aufbau eignet sich jedoch nur für
Lösungen mit niedriger Viskosität wie Ca-Pektinate, Ca-Alginate, Chitosan und Gelatin für
die Produktion sehr kleiner Kugeln, typischerweise mit einem Durchmesser von unter 1 mm
[Prüsse, Dalluhn et al., 2000]. Zudem sind bei dieser Methode Materialverluste zwischen
5-20% unvermeidlich [Prüsse, Bruske et al., 1998]. Lozinsky et al. [1995] meldeten einen
Druck betriebenen, automatisierten Aufbau als russisches Patent an. In der gegenwärtigen
Literatur sind zu diesem Aufbau jedoch keine quantitativen Daten zu finden, was Fragen
bezüglich der Reproduzierbarkeit aufwirft.
In dieser Arbeit wird eine Apparatur für die automatisierte Produktion von PVA/PEG-
Kryogelen für die Einhüllung von Enzymen vorgestellt. Ausgewertet wurden hierbei die
Durchführung der Immobilisierung, die Reproduzierbarkeit, die Kugelgröße, die Kugelform
und die Gelmorphologie des Endproduktes. Ziel war es sphärische Immobilisate mit einer
möglichst geringen Größenverteilung und unter möglichst geringem thermischem Stress für
das Enzym zu produzieren. Darüber hinaus war der Einfluss der Temperatur auf den
Kryogelierungsprozess Gegenstand von Untersuchungen. Sowohl die Aufbewahrungs-
temperatur als auch die Temperatur des Auffangbades wurden variiert. Auch das
Diffusionsverhalten des PEGs wurde analysiert.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
129
3.1.1 Aufbau der Apparatur und Produktion der PVA/PEG-Immobilisate
Der Aufbau besteht aus einer Dosierungseinheit und aus einem temperierbaren Auffangbad,
welches mit Silikonöl gefüllt ist. Die Dosiereinheit ist ein doppelwandiges Gewinderohr
(50 mL Innenvolumen), welches am oberen Ende mit einer Stickstoffgasleitung verbunden
ist. Über eine kommerziell erhältliche Mikrodüse erfolgt die Dosierung der PVA/PEG-
Lösung. Die Mikrodüse ist in einen beheizbaren Thermoblock eingebaut, um die Dosierung
der hochviskosen Flüssigkeit bei niedrigen Drücken zu ermöglichen. Sowohl die Temperatur
als auch alle Parameter der Düse werden elektronisch kontrolliert.
Normalerweise wurde die PVA/PEG-Enzymlösung in den Vorratsbehälter vorgelegt und mit
Stickstoff ein Druck von 5 bar beaufschlagt. Bei diesen Bedingungen kann die
Injektionstemperatur bei Raumtemperatur belassen werden, so dass das zu immobilisierende
Enzym nur minimalem Temperaturstress ausgesetzt wird. Der Auslass des Dosierungsventils
wurde in ein doppelwandiges isoliertes Silikonölbad gerichtet. Das Silikonöl im Auffangbad
wurde fortwährend mithilfe eines Rührers um einen Stromstörer zirkuliert, wodurch die
Agglomeration der PVA/PEG-Kugeln durch Koaleszenz der Tropfen verhindert wird. Für den
Erhalt möglichst runder Immobilisate wurde eine optimale Distanz der Düse zur
Silikonöloberfläche von 20 cm ermittelt. Im Regelfall wurde die PVA/PEG-Enzymlösung in
-25 °C kaltes, kontinuierlich zirkulierendes Silikonöl injiziert (s. Abb. 3.1). Nach dem
Injektionsprozess wurde die Temperatur im Einklang mit Literaturdaten schrittweise über
500 min auf 20 °C erhöht [Lozinsky, 2002; Mikhalev, Sierpinski et al., 1991].
Eine Verkürzung des Auftauprogramms auf 180 min führte jedoch zu PVA/PEG-
Immobilisaten, die keine offensichtlichen Unterschiede in der Stabilität und Flexibilität
erkennen ließen. Höhere Starttemperaturen des Auffangbades von -20 °C wurden analog zu
Literaturangaben untersucht [Lozinsky, Solodova, 1995; Prüsse, 2000]. Sie führten jedoch zu
nicht sphärischen Immobilisaten. Dies ist wahrscheinlich mit der verlängerten Gefrierungszeit
der PVA/PEG-Lösung im Silikonöl zu begründen, wodurch Verformungen der Tropfen durch
den Rührer begünstigt werden.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
130
Abbildung 3.1. Aufbau der Apparatur zur automatisierten Produktion von PVA/PEG-Immobilisaten.
Rechts: Dosiereinheit und elektronisches Ventil (EV) und der thermostatische Aufbewahrungsbehälter für die
Enzymlösung (EL); oben links: Fotografie des Injektionsmodul; unten links: Aufsicht von oben auf das
Auffangbad inklusive der Flussrichtung und des Eintropfpunktes (EP). Alle Dimensionen sind in mm
angegeben. KF: Flansch mit O-Ring, P: Manometer, R: Rührer, TD: thermostatisch temperierte Doppelwand,
TB: Thermoblock. Mit freundlicher Genehmigung des Wiley-VCH-Verlags übernommen aus Bieler, Ansorge-
Schumacher et al., 2010.
3.1.2 Größe und Form der PVA/PEG-Immobilisate
Die Größe der PVA/PEG-Immobilisate ist direkt abhängig vom Öffnungs- und
Schließzeitfenster des Ventils. In der vorliegenden Arbeit wurden 3 Zeitprogramme mit 20,
40 und 60 ms Öffnungszeit und 20, 25 und 30 ms Pause vor der nächsten Öffnung der Düse
untersucht (s. Abb. 3.2). Theoretisch erlauben die gewählten Zeitprogramme eine
Produktionsrate von 25, 15 und 11 Kugeln pro Sekunde. Durch diese hohen Produktionsraten
kann die Menge an PVA/PEG-Immobilisaten, die typischerweise für die Betreibung eines
kontinuierlich betriebenen Wirbelschichtreaktors im Labormaßstab benötigt wird [Ansorge-
Schumacher, Greiner et al., 2006], innerhalb von Minuten hergestellt werden.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
131
Abbildung 3.2. Größenverteilung der automatisch produzierten PVA/PEG-Immobilisate in Abhängigkeit von
der Öffnungszeit der Düse: 60 ms (nicht ausgefüllte Kreise), 40 ms (ausgefüllte Rauten) und 20 ms (nicht
ausgefüllte Dreiecke). Mit freundlicher Genehmigung des Wiley-VCH-Verlags übernommen aus Bieler,
Ansorge-Schumacher et al., 2010.
Bei einer Ventilöffnungszeit von 60 ms weisen 47% aller erhaltenen Kugeln einen
Durchmesser zwischen 2,50 und 3,15 mm auf. Die Gesamtmasse aller Kugeln in diesem
Größenfenster macht immerhin 73% der Gesamtmasse aus. Erweitert man den Größenbereich
auf 2,50 bis 3,55 mm Kugeldurchmesser, so macht die Masse dieser Kugeln sogar 83% der
Gesamtmasse aus. Bei einer Ventilöffnungszeit von lediglich 40 ms werden erwartungsgemäß
kleinere Kugeln produziert und so weisen 80% aller hergestellten PVA-Kugeln einen
Durchmesser zwischen 2,00 und 2,50 mm auf. 72% aller Immobilisate haben einen
Durchmesser von 2,50 mm. Die kürzeste getestete Impulslänge von 20 ms führt zu einer
Größenverteilung bei der 83% der PVA-Immobilisate einen Durchmesser zwischen 1,40 und
2,00 mm haben. 88% aller unter diesen Umständen produzierten Kugeln sind zwischen 1,00
und 2,00 mm groß.
Bei allen drei gewählten Ventilöffnungszeiten liegt die durchschnittliche Ausbeute an Kugeln
pro Masse PVA/PEG-Lösung bei ~75%. Ungefähr 25% Material gehen im Vorratsbehälter
und durch Polymerisation auf der Düse verloren. Diese in unregelmäßigen Zeitabständen
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
132
auftretende spontane Gelierung der PVA/PEG-Lösung direkt auf dem Ventil führt zum
Verstopfen der Düse, wodurch die PVA/PEG-Kugel Produktion limitiert wird.
Der Mechanismus der Gelbildung ist bis heute nicht in allen Einzelheiten aufgeklärt. Es wird
jedoch angenommen, dass es während des Einfrierens der wässrigen PVA/PEG-Lösung durch
die Bildung von Eiskristallen zu einer Phasentrennung kommt. In der flüssig gebliebenen
wasserarmen Phase ist die PVA-Konzentration stark erhöht, so dass sich während des
langsamen Auftauens Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den PVA-Polymerketten über
freie Hydroxylgruppen bilden können [Lozinsky, 1998]. Induziert wird die Polymerisation
also durch lokal hohe PVA-Konzentrationen während des Auftauprozesses und daher ist der
Grund für die spontane Gelierung der PVA/PEG-Lösung auf der Düse unklar. Denkbar ist,
dass der plötzliche Kontakt mit Luft beim Austreten der Lösung aus dem Ventil die
Polymerisation auslöst. Auch Materialien in der Düse könnten eventuell als Induzierer
fungieren. Bevor hier eine endgültige Erklärung gegeben werden kann und nötige
Verbesserungen des Produktionssystems vorgenommen werden können, bedarf es eines
tieferen Verständnisses des Gelierungsprozess.
Neben der Größenverteilung ist die Rundheit der Immobilisate von großer Bedeutung, da sie
sowohl den Massentransfer als auch die Robustheit der Kugeln beeinflusst [Buthe, Hartmeier
et al., 2004]. Die Form der Immobilisate wurde daher mit der Software Image Tool
exemplarisch in vier der hergestellten Chargen untersucht. Als Indikator für eine perfekt
runde Form können sowohl die Rundheit, definiert als (4π*Fläche/Umfang
2
), als auch die
Kompaktheit, definiert als ((4*Fläche/π)
1/2
/Hauptachsenlänge), angewendet werden. Beide
Parameter ergeben einen Wert von 1, wenn das untersuchte Objekt eine perfekt zirkuläre
Form zeigt. Bei den untersuchten PVA/PEG-Immobilisaten wurden eine durchschnittliche
Rundheit von 0,85±0,03 und eine durchschnittliche Kompaktheit von 0,95±0,02 berechnet.
Damit zeigen beide Indikatoren eine nahezu perfekt runde Form der automatisch produzierten
Immobilisate an.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
133
3.1.3 Gelmorphologie
Des Weiteren wurde die Struktur und Porengröße der produzierten PVA/PEG-Kryogele
mithilfe von Rasterelektronenmikroskopie (REM) analysiert (s. Abb. 3.3).
Abbildung 3.3. REM-Aufnahmen der automatisch produzierten PVA/PEG-Kugeln. (A) Oberflächenaufnahme,
(B-D)
Querschnitte der Kugeln mit steigender Vergrößerung, (E und F) Oberfläche und Querschnitt einer Kugel
mit Gaseinschluss. Mit freundlicher Genehmigung des Wiley-VCH-Verlags übernommen aus Bieler, Ansorge-
Schumacher et al., 2010.
Die typische Schwammstruktur und Porengrößen um 1 µm stimmen mit bereits publizierten
Ergebnissen überein [Lozinsky, Vainerman et al., 1986]. Allerdings wurden im Innern der
automatisch produzierten PVA-Kugeln im Gegensatz zu manuell produzierten Kryogelen
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
134
Gaseinschlüsse beobachtet. Die Löcher, die aufgrund des Gaseinschlusses in der
Polymermatrix entstehen, variieren stark in der Größe und waren in ca. 80% aller untersuchter
Kugeln zu finden. Um zu untersuchen, ob die Gaseinschlüsse die Aktivität immobilisierter
Enzyme entscheidend beeinflussen, wurde exemplarisch die sehr sensitive BAL sowohl in
automatisch als auch in manuell produzierte Kugeln eingeschlossen und die Aktivitäten der
Immobilisate miteinander verglichen (s. 2.2.3). Die Unterschiede der ermittelten Aktivitäten
lagen innerhalb der Standardabweichung. In beiden Fällen konnten typische Produktivitäten
von 40 µmol h
-1
U
-1
erreicht werden. Da die Gaseinschlüsse innerhalb der Kryogele die
Aktivität der empfindlichen und relativ instabilen BAL nicht beeinflussen, ist davon
auszugehen, dass weniger sensitive Enzyme ebenso wenig beeinflusst werden.
3.1.4 Diffusionsverhalten des Additivs PEG 1000
Weiterhin wurde untersucht, ob das Additiv PEG 1000, welches die Stabilität der PVA-
Immobilisate erhöht [Prüsse, 2000], in die umgebende Lösung der Kugeln diffundiert.
Untersuchungen durch Fourier-Transformations-Infrarotspektrometrie (FT-IR) zeigten, dass
PEG bei Inkubation der PVA-Kugeln in einem wässrigen Einphasensystem in die umgebende
Wasserphase diffundiert. Selbst nach 3 Tagen Inkubation lässt sich PEG jedoch auch in der
PVA-Matrix noch nachweisen. D.h. es stellt sich entweder ein Verteilungsgleichgewicht ein
oder das Additiv wird aufgrund unterschiedlicher Porengrößen und unterschiedlich langer
Diffusionsstrecken in der Matrix teilweise strukturbedingt zurückgehalten.
In Abbildung 3.4 sind die IR-Spektren von reinem Wasser und der wässrigen Phase nach
2-stündiger Inkubation von PVA/PEG-Kugeln darin miteinander verglichen. Zwischen 3200
und 3760 cm
-1
ist eine große Transmissionsbande zu erkennen, die auf symmetrische und
asymmetrische Valenzschwingungen der Bindungen zwischen Sauerstoff und Wasserstoff im
Wasser zurückzuführen ist. Auch die Transmission bei einer Wellenzahl von 1630 cm
-1
ist
eindeutig dem Wassermolekül durch sogenannte Scissoring-Vibration der beiden
Wasserstoffatome zu zuordnen [Shriver, Atkins et al., 1994]. Der Nachweis von PEG in der
Wasserphase gelingt jedoch deutlich anhand eines PEG-typischen Transmissionspeaks bei
ungefähr 1080 cm
-1
, welcher durch asymmetrisches C-O stretching ausgelöst wird [Belleville,
Robert et al., 1995]. Derselbe PEG-typische Peak im sogenannten Fingerprint Bereich ließ
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
135
sich auch in der PVA-Matrix eindeutig nachweisen. Eine quantitative Aussage über die
Diffusion des PEGs ließ sich mit der verwendeten Analysemethode nicht treffen.
40
50
60
70
80
90
100
650115016502150265031503650
Wellenzahl [cm-1]
Transmission [%]
Abbildung 3.4. IR-Spektrum von reinem Wasser (grau) und der wässrigen Phase nach 2-stündiger Inkubation
von PVA/PEG-Immobilisaten darin (schwarz).
Werden die PVA-Kugeln dagegen in apolaren Lösungsmitteln wie beispielsweise n-Hexan,
Methylisobutylketon (MIBK) oder tert-Butylmethylether (MTBE) inkubiert, so diffundiert
PEG nicht in die umgebende Phase. Selbst nach drei Tagen Inkubation ließ sich in keiner der
drei organischen Phasen PEG nachweisen. Dasselbe Bild ergab sich bei der Analyse des
Silikonöls, in dem die PVA-Kugeln ebenfalls 3 Tage inkubiert wurden. Auch hier lässt sich
kein PEG im Silikonöl nachweisen. D.h., dass sich die Zusammensetzung der PVA/PEG-
Polymermatrix während der Herstellung der Immobilisate, die eine Inkubation in Silikonöl
umfasst, nicht verändert. Auch beim Einsatz der Immobilisate in einem Zweiphasensystem
mit apolaren Lösungsmitteln ist keine Veränderung der Zusammensetzung der
Einhüllungsmatrix zu erwarten. Lediglich beim Einsatz der PVA/PEG-Kugeln im wässrigen
Einphasensystem verändert sich die Zusammensetzung durch Diffusion des PEGs in die
umgebende Wasserphase.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
136
3.1.5 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen Aufbau für die automatisierte Produktion
standardisierter PVA/PEG-Immobilisate im Labormaßstab zu entwickeln. Hierbei wird eine
sehr hohe Produktivität von bis zu 1500 Kugeln pro min erreicht. Die erzielte
Größenverteilung der PVA-Kugeln ist eng und der Kugeldurchmesser kann über das Ventil-
Impuls-Intervall exakt bestimmt und variiert werden. Die produzierten Kryogele haben eine
annähernd perfekt runde Form, sind stabil und können daher in vielen verschiedenen
Reaktortypen problemlos eingesetzt werden. Bezüglich der Gelmorphologie unterscheiden
sich automatisch produzierte Kugeln nicht von manuell produzierten. Lediglich
Gaseinschlüsse, die jedoch nicht die Enzymaktivität beeinflussen, konnten als Differenz
beobachtet werden. Das Additiv PEG 1000 diffundiert nur aus der Polymermatrix heraus,
wenn es von hydrophilen Lösungen wie Wasser umgeben ist. Beim Einsatz in einem wässrig
organischen Zweiphasensystem ist keine Diffusion des PEGs zu erwarten. Der
Temperaturstress, der während der Produktion der PVA/PEG-Immobilisate auf das jeweilige
Enzym ausgeübt wird, ist gering, da lediglich bei Raumtemperatur oder sogar unterhalb davon
gearbeitet wird. Darüber hinaus ist der präsentierte Aufbau sehr einfach, so dass zusätzliche
Kosten gering sind. Das vorliegende Design zur Routine Produktion von PVA-Kugeln im
Labormaßstab ermöglicht somit die Anwendung dieser vielversprechenden Immobilisate im
industriellen Maßstab.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
137
3.2 Optimierung der BAL-katalysierten (R)-2,2’-Furoinsynthese
In voran gegangenen Arbeiten wurde als Reaktionskonzept für die BAL-katalysierte Synthese
chiraler α-Hydroxyketone erfolgreich ein kontinuierlich betriebener Wirbelschichtreaktor
untersucht [Ansorge-Schumacher, Greiner et al., 2006]. Als Modellreaktion wurde dabei die
Synthese von (R)-Furoin ausgewählt (s. Abb. 3.5), da dieses Produkt in wässrigen Lösungen
sowohl einer Racemisierung als auch einer Oxidation zum korrespondierenden Diketon
unterliegt und somit bezüglich des Reaktionskonzepts ein großes Optimierungspotential
bietet. Beide Nebenreaktionen konnten durch den gewählten Reaktionsaufbau unterbunden
werden. Die Racemisierung, die im satzweisen Betrieb des gelstabilisierten Zweiphasen-
systems mit zunehmender Zeit auftritt [Hischer, Gocke et al., 2005], konnte bei einer
Verweilzeit unter 2,8 h durch die kontinuierliche Extraktion des (R)-Enantiomers aus der
wässrigen in die Lösungsmittelphase verhindert werden. Die Oxidation des Furoins konnte
durch inerte Reaktionsbedingungen unter einer Argon-Schutzgasatmosphäre unterbunden
werden.
2
BAL
2-Furaldehyd
(
R
)-2,2'-Furoin
Abbildung 3.5. Reaktionsschema der BAL-katalysierten Carboligation von 2-Furaldehyd zu (R)-2,2
’
-Furoin.
In der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel der (R)-Furoinsynthese untersucht, ob die
BAL-katalysierte Synthese chiraler α-Hydroxyketone im kontinuierlichen Wirbelschicht-
reaktor durch einen Lösungsmittelwechsel optimiert werden kann. Es wurden Lösungsmittel
eingesetzt, welche das Produkt besser lösen als das bisher ausschließlich verwendete
n-Hexan. Nach Möglichkeit sollten die untersuchten Lösungsmittel also eine höhere
Extraktionskraft für das Produkt besitzen und dadurch höhere Umsätze bei gleichzeitig hohen
Enantiomerenüberschüssen erlauben.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
138
3.2.1 Lösungsmittelwechsel
Anstelle des bisher verwendeten sehr apolaren n-Hexans wurden die polareren Lösungsmittel
tert-Butylmethylether (MTBE), Methylisobutylketon (MIBK) und 2-Methyltetrahydrofuran
(2-Methyl-THF) für die BAL-katalysierte Furoinsynthese im kontinuierlichen Wirbelschicht-
reaktor getestet.
MTBE wurde aufgrund voran gegangener Arbeiten von Stillger [2004] ausgewählt. Stillger
zeigte, dass MTBE bei BAL-katalysierten Carboligationen sowohl als Cosolvens im
Einphasensystem als auch als Lösungsmittelphase im Zweiphasensystem eingesetzt werden
kann. Die Enzymstabilität der nicht-immobilisierten BAL wird bei Inkubation in einem
Einphasensystem mit MTBE gesättigtem Puffer, im Vergleich zur Inkubation in reinem
Puffer, um den Faktor 75 gesteigert. Eine Inaktivierung der BAL aufgrund gelöster
Lösungsmittelmoleküle in der wässrigen Phase (molekulare Toxizität) ist demnach
ausgeschlossen. Auch die Lagerstabilität der nicht-immobilisierten BAL in einem fein
emulgierten Zweiphasensystem mit MTBE als Lösungsmittelphase (t
1/2
=815 h) konnte, im
Vergleich zur Lagerstabilität der BAL in einem gepufferten wässrigen Einphasensystem
(t
1/2
=15 h), signifikant gesteigert werden. Zusätzlich konnte Stillger eine Inhibierung der BAL
durch MTBE ausschließen.
MIBK wurde aufgrund ähnlich positiver Ergebnisse von Schmidt [2008], der sowohl den
Einfluss der molekularen Toxizität als auch der Phasentoxizität von MIBK auf die BAL
ausschloss, ausgesucht. Insgesamt konnte Schmidt keinen negativen Einfluss von MIBK auf
die Lagerstabilität der BAL detektieren.
Sowohl MTBE als auch MIBK sind jedoch petrochemischen Ursprungs und zudem sehr
schwer abbaubar, was zu ökologischen Bedenken hinsichtlich ihres großtechnischen Einsatzes
führt. Daher wurde zusätzlich 2-Methyl-THF, das aus biologischen Ressourcen wie z. B.
Lävulinsäure gewonnen wird und abiotisch durch Luft abgebaut werden kann
[Shanmuganathan, Natalia et al., 2010], als Lösungsmittelphase getestet. Zudem zeigten
Shanmuganathan und Mitarbeiter, dass die BAL in einem mit 2-Methyl-THF gesättigtem
wässrigen Einphasensystem eine höhere Lagerstabilität aufweist als in einem rein wässrigen
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
139
Einphasensystem. Sowohl im Einphasensystem als auch im Zweiphasensystem mit 2-Methyl-
THF als Cosolvens bzw. Lösungsmittelphase wurden hohe Produktivitäten und
Enantiomerenüberschüsse in der Benzoinsynthese erzielt.
Um in einem wässrig/organischen Zweiphasensystem hohe Umsätze zu erzielen, muss das
organische Lösungsmittel im Idealfall die Substrate kontinuierlich in die reaktive wässrige
Phase abgeben und die Produkte möglichst effektiv aus der wässrigen Phase extrahieren. So
kann das thermodynamische Gleichgewicht zur Seite der Produkte hin verschoben werden.
Ein wichtiger Parameter für diesen Idealfall ist der Verteilungskoeffizient der Substrate und
des Produktes zwischen den beiden Phasen. Daher wurden die Verteilungskoeffizienten des
Substrates 2-Furaldehyd als auch des Produktes 2,2’-Furoin in den Zweiphasensystemen mit
n-Hexan, MIBK und MTBE bestimmt und miteinander verglichen (s. Tabellen 3.1 und 3.2).
2-Methyl-THF wurde in diese Untersuchungen zunächst nicht mit einbezogen, da die
Ergebnisse von Shanmuganathan und Mitarbeitern [2010] erst später veröffentlicht wurden.
Tabelle 3.1. Verteilungskoeffizienten P des Substrats 2-Furaldehyd in wässrig/organischen Zweiphasensystemen
mit n-Hexan, MTBE bzw. MIBK als Lösungsmittelphase. Alle Verteilungskoeffizienten gelten für einen
Anfangskonzentrationsbereich von 2-Furaldehyd zwischen 5-60 mM in der jeweiligen organischen Phase.
Zweiphasensystem P
org. Phase/wässrige Phase
Hexan/Wasser 0,45±0,15
MTBE/Wasser 2,7±0,13
MIBK/Wasser 5,4±0,4
Tabelle 3.1 verdeutlicht, dass die Verteilungskoeffizienten des Substrates 2-Furaldehyd in den
Zweiphasensystemen mit MIBK und MTBE deutlich höher sind als der Verteilungs-
koeffizient im Zweiphasensystem mit n-Hexan als Lösungsmittelphase. D.h., dass sich im
Verteilungsgleichgewicht im Zweiphasensystem mit MTBE bzw. MIBK als organischer
Phase eine niedrigere Substratkonzentration in der wässrigen Phase einstellt als im
Zweiphasensystem mit n-Hexan. MTBE und MIBK „drängen“ 2-Furaldehyd also tendenziell
weniger stark in die wässrige Phase als n-Hexan, was eine schlechtere Substratversorgung des
Enzyms in der wässrigen Phase zur Folge haben könnte. Dieser vermeintliche Nachteil könnte
im Falle der BAL jedoch in einen Vorteil umgekehrt werden, denn van den Wittenboer [2009;
2010] zeigte, dass das Protein von seinen eigenen Substraten stark inaktiviert wird. D.h. die
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
140
langsamere Substratversorgung des Enzyms könnte sich sogar positiv auf den Umsatz
auswirken.
Für die Bestimmung des Verteilungskoeffizienten des Produktes 2,2’-Furoin wurde dieses
analog zu den Gegebenheiten im Zweiphasensystem in der wässrigen Phase vorgelegt,
wodurch lediglich maximale Anfangskonzentrationen von 12 mM untersucht werden konnten.
Tabelle 3.2. Verteilungskoeffizienten P des Produktes 2,2’-Furoin in wässrig/organischen Zweiphasensystemen
mit n-Hexan, MTBE bzw. MIBK als Lösungsmittelphase. Alle Verteilungskoeffizienten gelten für einen
Anfangskonzentrationsbereich des 2,2’-Furoins zwischen 2-12 mM in der wässrigen Phase.
Zweiphasensystem P
wässrige Phase/org. Phase
Wasser/Hexan 4,88±0,35
Wasser/MTBE 0,18±0,004
Wasser/MIBK 0,05±0,01
Wie in Tabelle 3.2 gezeigt, sind die Verteilungskoeffizienten des 2,2’-Furoins im
Zweiphasensystem mit MTBE bzw. MIBK als organischer Phase mit 0,18±0,004 bzw.
0,05±0,01 deutlich niedriger als in einem Zweiphasensystem mit n-Hexan als Lösungs-
mittelphase (4,88±0,
35).
Bei Erreichen des Verteilungsgleichgewichts wird sich
in MTBE
und MIBK demnach eine deutlich höhere 2,2’-Furoinkonzentration
einstellen als
in n-Hexan.
D
ie Extraktionskraft von MTBE und MIBK für das gebildete Produkt wird demnach deutlich
größer sein als die des n-Hexans, wodurch der Umsatz gesteigert werden könnte.
Sowohl bei der Substratversorgung des Enzyms in der wässrigen Phase als auch bei der
Produktextraktion aus der wässrigen Phase in die organische Phase muss jedoch beachtet
werden, dass neben dem Verteilungskoeffizienten der Stofftransportkoeffizient und die
Phasengrenzfläche den Stofftransport entscheidend beeinflussen. Die Verteilungs-
koeffizienten bilden lediglich das treibende Gefälle für den Stofftransport. Im Falle von
gelstabilisierten Zweiphasensystemen, wie sie im kontinuierlichen Wirbelschichtreaktor
eingesetzt werden sollen, kommt erschwerend hinzu, dass die Polymermatrices den
Stofftransport behindern können. Die Bestimmung des Stofftransports ist ungleich
komplizierter als die Bestimmung der Verteilungskoeffizienten und war nicht Ziel dieser
Arbeit. So wurde über die Verteilungskoeffizienten des Substrates und des Produktes
lediglich eine grundsätzliche Tendenz des Stofftransports in den jeweiligen
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
141
Zweiphasensystemen abgeschätzt. Ob und inwiefern die Verteilungskoeffizienten der
Reaktanden zwischen der wässrigen Phase und der jeweiligen Lösungsmittelphase die
erreichbaren Umsätze im kontinuierlichen Wirbelschichtreaktor beeinflussen, wurde im
Folgenden genau untersucht.
In Anlehnung an Ansorge-Schumacher et al. [2006] bestand der Reaktionsraum des Wirbel-
schichtreaktors aus einem herkömmlichen Falcon Tube mit einem Fassungsvermögen von
50 mL, das sich in einer verschließbaren Glasflasche befand. Der Reaktionsraum wurde durch
einen Edelstahldeckel luftdicht verschlossen. Der Deckel enthielt Bohrungen durch die die
organische Phase zur Aufrechterhaltung der Wirbelschicht mithilfe einer Umlaufpumpe
fortwährend zirkuliert wurde. Durch eine weitere Bohrung im Deckel wurde der
Reaktionsraum mit Stickstoff abgesättigt. Das Gas wurde zuvor durch eine Gaswaschflasche
mit Silikonöl geleitet, so dass konstant ein leichter Überdruck im Reaktionsgefäß garantiert
war. Zwei weitere Bohrungen ermöglichten die Substratversorgung mithilfe einer Feindosier-
pumpe und das Abpumpen des Reaktionsmediums. Mithilfe eines Wärmetauschers wurde die
Reaktionstemperatur konstant bei 20 °C gehalten (s. Abb. 3.6).
Abbildung 3.6. Kontinuierlich betriebener Wirbelschichtreaktor mit PVA/PEG-BAL-Immobilisaten.
Links: Schematischer Aufbau; rechts: Foto des Reaktionsgefäßes.
Ansorge-Schumacher et al. [2006] untersuchten im kontinuierlichen Wirbelschichtreaktor die
3,3’-Furoinsynthese. Da 3,3’-Furoin jedoch nicht kommerziell erhältlich ist, wurde in der
vorliegenden Arbeit die 2,2’-Furoinsynthese als Modellreaktion verwendet. Daher wurden für
einen möglichst exakten Vergleich der unterschiedlichen Lösungsmittelphasen, die
Umlaufpumpe
Wärmetauscher Substratlösung
Produktabführung
Dosierpumpen
N
2
Gaswaschflasche
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
142
Vergleichswerte beim Einsatz von n-Hexan neu ermittelt. Somit wurden alle Lösungsmittel
unter identischen Bedingungen als organische Phase im gelstabilisierten Zweiphasensystem
eingesetzt. Um eine Racemisierung und Oxidation des Produktes (R)-2,2’-Furoin zu
verhindern, wurde im Einklang mit Ansorge-Schumacher et al. [2006] eine kurze Verweilzeit
von 2 h ausgewählt. Die 2-Furaldehydkonzentration betrug jeweils 30 mmol L
-1
und
insgesamt wurden immer 25 U BAL eingesetzt.
Die ermittelten prozentualen Umsätze der BAL-katalysierten (R)-2,2’-Furoinsynthese im
gelstabilisierten Zweiphasensystem bei Verwendung der vier unterschiedlichen Lösungsmittel
sind in Abbildung 3.7 in Abhängigkeit der Reaktionszeit dargestellt. Die zum Teil sehr
großen Standardabweichungen sind auf eine nicht ganz gleichmäßige Flussrate und dadurch
bedingte leicht schwankende Verweilzeiten zurückzuführen. Zudem schwankte die
Außentemperatur zeitweise stark, so dass im Reaktionsgefäß nicht immer exakt 20 °C
garantiert werden konnten.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Zeit [h]
Umsatz [%]
Abbildung 3.7. Prozentuale Umsätze der BAL-katalysierten (R)-2,2’-Furoinsynthese im gelstabilisierten
Zweiphasensystem mit n-Hexan (Rauten), MTBE (Quadrate), MIBK (Dreiecke) und 2-Methyl-THF (Kreise) als
Lösungsmittelphase in Abhängigkeit von der Zeit. Die Reaktion wurde mit 25 U BAL bei 20 °C, einer
2-Furaldehydkonzentration von 30 mmol L
-1
und einer Verweilzeit von 2 h durchgeführt.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
143
Bei Betrachtung der Ergebnisse fällt zunächst auf, dass im Gegensatz zu den
Zweiphasensystemen mit MTBE, MIBK und 2-Methyl-THF für n-Hexan eine sehr lange
Laufzeit erzielt wurde. Die Laufzeit des Hexan/PVA-Systems lag mit über 36 h deutlich über
den Laufzeiten der anderen Zweiphasensysteme, die unter 20 h lagen. Zudem konnte lediglich
im Zweiphasensystem mit n-Hexan überhaupt ein stabiler Betriebspunkt erzielt werden. In
allen anderen getesteten Zweiphasensystemen wurde der maximale Umsatz spätestens nach
2,5 h erreicht und fiel danach stetig ab. Ein stabiler Betriebspunkt konnte nicht erzielt werden.
Generell waren die erzielten maximalen prozentualen Umsätze zwischen 4,3% (MIBK) und
knappen 8% (2-Methyl-THF) in allen 4 Zweiphasensystemen sehr niedrig.
Lediglich im Bezug auf die Nebenproduktbildung konnten durch den Lösungsmittelwechsel
Vorteile erzielt werden. Die Oxidation des Furoins konnte analog zu Ansorge-Schumacher
et al. [2006] aufgrund der konstant gehaltenen Schutzgasatmosphäre in allen untersuchten
Zweiphasensystemen vollständig verhindert werden. Im Bezug auf die Racemisierung des
Furoins konnte bei Verwendung von n-Hexan als Lösungsmittelphase allerdings zeitweise das
(S)-Enantiomer detektiert werden. Insgesamt wurden in diesem Zweiphasensystem
unkonstante ees zwischen 61 und 99,99% gemessen. Bei Verwendung der Lösungsmittel
MTBE, MIBK und 2-Methyl-THF als Lösungsmittelphase konnte dagegen zu keinem
Zeitpunkt (S)-Furoin im Produktablauf detektiert werden. Die ees lagen hier konstant bei über
99,99%. Die Racemisierung des Furoins findet ausschließlich in der wässrigen Phase statt
[Jäntges, 2009] und kann daher durch die verbesserte Produktextraktion aus der wässrigen in
die Lösungsmittelphase vollständig verhindert werden. Im Bezug auf die Racemisierung hat
sich der Lösungsmittelwechsel also als erfolgreich herausgestellt.
Bei Verwendung der Lösungsmittel MTBE, 2-Methyl-THF und MIBK konnte in allen drei
Fällen eine konstante Wirbelschicht der PVA/PEG-Immobilisate aufgebaut werden. Bei
Ausbildung einer Wirbelschicht ist die Substratdiffusion außerhalb der Kugeln
wahrscheinlich nicht limitiert. Es ist also davon auszugehen, dass die Substratkonzentrationen
in den Kugeln annähernd den Verteilungsgleichgewichtskonzentrationen entsprechen. Es
kann demnach angenommen werden, dass dort in der wässrigen Phase immer
Aldehydkonzentrationen im mM-Bereich vorliegen. D.h., dass bei den Lösungsmitteln
MTBE, MIBK und 2-Methyl-THF die bekannte Inaktivierung der BAL durch ihre eigenen
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
144
Substrate [van den Wittenboer, 2009; van den Wittenboer, Niemeijer et al., 2010] sehr
wahrscheinlich stark zum Tragen kommt. Durch die Substratinaktivierung der BAL wird die
Laufzeit der Zweiphasensysteme mit MTBE, MIBK bzw. 2-Methyl-THF als
Lösungsmittelphase deutlich verringert.
Die Substratinaktivierung der Lyase scheint zudem sehr schnell einzutreten, denn in keinem
der drei genannten Zweiphasensysteme konnte ein stabiler Betriebspunkt erreicht werden.
Unterschiedlich starke inaktivierende Effekte der Lösungsmittel (molekulare und
Phasentoxizität) auf die BAL scheinen durch den inaktivierenden Effekt des Substrates
2-Furaldehyd nahezu vollständig überlagert zu werden. Somit können durch einen
Lösungsmittelwechsel kaum erhöhte Umsätze erzielt werden.
Tabelle 3.3 zeigt zudem, dass die BAL unter genannten Prozessbedingungen in den
Zweiphasensystemen mit den drei neu getesteten Lösungsmitteln sehr ähnliche
Halbwertszeiten aufweist. So liegen die Halbwertszeiten der BAL in Zweiphasensystemen
mit MTBE, MIBK bzw. 2-Methyl-THF als Lösungsmittelphase alle zwischen 2-3 h. Bei
Verwendung von MTBE als Lösungsmittelphase kann die ermittelte Halbwertszeit der BAL
von 2,4±0,26 h mit Ergebnissen von van den Wittenboer [2009] verglichen werden, die für
die nicht-immobilisierte BAL bei einer 2-Furaldehydkonzentration von 100 mmol L
-1
eine
ähnliche Halbwertszeit von 1,5±0,1 h ermittelte. Die kaum variierenden Halbwertszeiten der
BAL beim Einsatz der drei unterschiedlichen Lösungsmittelphasen zeigen, dass die
Inaktivierung des Enzyms durch das gewählte Lösungsmittel die BAL-Prozessstabilität
letztlich kaum beeinflusst. Die sehr niedrigen Halbwertszeiten der BAL unter
Prozessbedingungen im jeweiligen Zweiphasensystem mit MTBE, MIBK und 2-Methyl-THF
als organischer Phase stehen nicht im Einklang mit Ergebnissen von Stillger [2004], Schmidt
[2008] und Shanmuganathan [2010]. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Lagerstabilität der
BAL in den aufgeführten Zweiphasensystemen im Vergleich zu einem rein wässrigen System,
nicht verringert sondern gegenteilig teilweise sogar gesteigert wird. Die sehr niedrige
Prozessstabilität der BAL in den genannten Zweiphasensystemen kann also sehr
wahrscheinlich auf die Substratinaktivierung zurückgeführt werden. Dies bestätigt die
Annahme, dass inaktivierende Effekte des Substrates Lösungsmitteleffekte stark überwiegen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
145
Tabelle 3.3. Halbwertszeiten der BAL beim Einsatz im gelstabilisierten Zweiphasensystem mit n-Hexan,
MTBE, MIBK bzw. 2-Methyl-THF als Lösungsmittel im kontinuierlichen Wirbelschichtreaktor. Die
Halbwertszeiten wurden graphisch aus der Abnahme der Umsätze der 2,2’-Furoinsynthese, unter Annahme einer
Reaktion erster Ordnung, ermittelt. Die Reaktion wurde mit 25 U BAL bei 20 °C, einer 2-Furaldehyd-
konzentration von 30 mmol L
-1
und einer Verweilzeit von 2 h durchgeführt.
Lösungsmittel Halbwertszeit [h]
n-Hexan 23,3±6,6
MTBE 2,4±0,26
MIBK 3±0,27
2-Methyl-THF 2±0,37
Bei Interpretation der erzielten Ergebnisse im wässrigen/Hexan Zweiphasensystem muss
beachtet werden, dass hier im Gegensatz zu den weiteren Zweiphasensystemen keine
Wirbelschicht der PVA/PEG-BAL-Immobilisate aufgebaut werden konnte. Die PVA/PEG-
Kugeln bildeten ein Agglomerat, welches sich am Boden des Reaktionsgefäßes befand. Eine
Durchmischung und Aufwirbelung der PVA-Kugeln war zu keinem Zeitpunkt der Synthese
zu beobachten. Dies ist mit der, im Vergleich zu den Wasserlöslichkeiten von MTBE (26 g
L
-1
), 2-Methyl-THF (16 g L
-1
) und MIBK (12 g L
-1
), geringen Wasserlöslichkeit des n-Hexans
von lediglich 0,016 g L
-1
, zu begründen. In n-Hexan sind nur Spuren von Wasser gelöst und
es findet kaum Diffusion des Wassers aus der Polymermatrix in die umgebende
Lösungsmittelphase statt. Aufgrund dessen agglomerieren die hydrophilen PVA/PEG/Wasser-
Immobilisate, um die Oberfläche zur umgebenden hydrophoben Phase zu minimieren. Eine
Aufwirbelung der Kugeln ist somit nur sehr schwer zu erreichen. Bei allen anderen
eingesetzten Lösungsmitteln konnte dagegen eine stabile Wirbelschicht über die gesamte
Reaktionsdauer hinweg aufrecht gehalten werden. Die Verklumpung der PVA/PEG-BAL-
Immobilisate im wässrigen/Hexan Zweiphasensystem führt zur Limitierung der
Substratdiffusion außerhalb der Kugeln. Es kann also davon ausgegangen werden, dass im
wässrigen/Hexan Zweiphasensystem in der wässrigen Phase eine deutlich niedrigere
Substratkonzentration vorliegt als in den übrigen Zweiphasensystemen. Dies hat zur
Konsequenz, dass im wässrigen/Hexan Zweiphasensystem die Substratinkativierung der BAL
deutlich schwächer ausfällt als in den übrigen Zweiphasensystemen. Hierdurch kommt es bei
Verwendung von n-Hexan als Lösungsmittelphase zu einer, im Vergleich bei Verwendung
von MTBE, 2-Methyl-THF und MIBK als Lösungsmittelphase, signifikant höheren
Reaktionslaufzeit von über 36 h. Auch der stabile Betriebspunkt im Wirbelschichtreaktor, der
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
146
ausschließlich beim Einsatz von n-Hexan als Lösungsmittelphase beobachtet wurde, lässt sich
druch die geringere Substratkonzentration in der wässrigen Phase und dadurch bedingte
schwächere Inaktivierung des Enzyms durch seine eigenen Substrate, erklären. Auch hier
wird demnach deutlich, dass die Substratinaktivierung der BAL mögliche Inaktivierungen
durch die gewählten Lösungsmittel zu überlagern scheint.
Die, im Vergleich zu den BAL-Halbwertszeiten im wässrigen/MTBE, MIBK bzw. 2-Methyl-
THF Zweiphasensystem, signifikant höhere BAL-Halbwertszeit im wässrigen/Hexan
Zweiphasensystem von 23,3±6,6 h (s. Tab. 3.3) unterstützt diese Annahme zusätzlich. Da im
letzt genannteren Zweiphasensystem eine deutlich niedrigere Aldehydkonzentration in der
wässrigen Phase angenommen wird, ist die Substratinaktivierung der BAL sehr
wahrscheinlich geringer und es kann eine längere Halbwertszeit erzielt werden.
Zur Verifizierung der Vermutung, dass die Substratinaktivierung der BAL mögliche
Inaktivierungseffekte des Lösungsmittels vollständig überlagert, wurde im Folgenden eine
BAL-Variante im kontinuierlich betriebenen Wirbelschichtreaktor eingesetzt. Diese BAL-
Variante wurde im Hinblick auf erhöhte Lösungsmittelstabilität entwickelt [van den
Wittenboer, 2009].
3.2.2 BAL-Variante
Zur Untersuchung der inaktivierenden Effekte, die im kontinuierlich betriebenen
Zweiphasensystem auf die BAL einwirken, wurde eine BAL-Variante im
Wirbelschichtreaktor eingesetzt. Die verwendete Variante(BAL-V175N, I176D, I177T) war
von van den Wittenboer [2009] durch gerichtete Mutagenese oberflächenständiger
Aminosäuren im Hinblick auf erhöhte Lösungsmittelstabilität entwickelt worden. Die
Hydrophilie der BAL-Oberfläche wurde hierfür gesteigert, um durch mögliche neue nicht-
kovalente Interaktionen (z. B. ionische Wechselwirkungen) die Wahrscheinlichkeit von
partiellen Entfaltungsvorgängen, die der Ansatzpunkt für die irreversible Inaktivierung von
Enzymen durch Lösungsmittel sind, zu verringern. Die Stabilisierung gegenüber dem Substrat
war und konnte dagegen nicht Ziel der gerichteten Mutagenese sein, da der
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
147
Inaktivierungsmechanismus bis heute nicht aufgeklärt ist. Eine Stabilisierung gegenüber dem
Substrat war daher nicht zu erwarten.
Van den Wittenboer [2009] konnte für die BAL-Variante(V175N, I176D, I177T), im
Vergleich zum nativen Enzym, in MTBE eine signifikant höhere Lagerstabilität nachweisen.
Der Effekt der molekularen Toxizität wurde in einem Einphasensystem mit MTBE
gesättigtem Puffer ermittelt. Die Phasentoxizität wurde dagegen in einem Wasser/MTBE
Zweiphasensystem gemessen. Im Einphasensystem konnte für die BAL-Variante eine fast
doppelt so hohe Lagerstabilität gemessen werden, im Zweiphasensystem war die
Lagerstabilität 1,8mal größer als die des nativen Proteins.
Die BAL-Variante wurde exemplarisch im MTBE/Wasser Zweiphasensystem unter
Reaktionsbedingungen eingesetzt. Wenn im Wirbelschichtreaktor der inaktivierende Effekt
der Lösungsmittel andere inaktivierende Effekte, wie vor allem die Substratinaktivierung
überwiegt, dann sollten sich beim Einsatz der BAL-Variante eine deutlich höhere
Reaktionslauf- und Halbwertszeit und höhere Umsätze ergeben als beim Einsatz der nativen
BAL. Ändern sich die genannten Parameter beim Einsatz der BAL-Variante nicht, so ist
davon auszugehen, dass die Substratinaktivierung Lösungsmitteleffekte überlagert.
In Abbildung 3.8 sind die erzielten Umsätze der Furoinsynthese bei Verwendung der nativen
BAL und der BAL-Variante als Biokatalysator dargestellt.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
148
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25
Zeit [h]
Umsatz [%]
Abbildung 3.8. Prozentuale Umsätze der (R)-2,2’-Furoinsynthese im gelstabilisierten Zweiphasensystem mit
MTBE als Lösungsmittelphase und der nativen BAL (Rauten) bzw. der BAL-Variante(V175N, I176D, I177T)
(Quadrate) als Katalysator in Abhängigkeit von der Reaktionsdauer. Die Reaktion wurde mit 25 U BAL bei
20 °C, einer 2-Furaldehydkonzentration von 30 mmol L
-1
und einer Verweilzeit von 2 h durchgeführt.
Es ist deutlich zu erkennen, dass sich beim Einsatz der BAL-Variante(V175N, I176D, I177T)
keine längere Laufzeit der Synthese im Wirbelschichtreaktor ergibt. Unter Verwendung
beider Biokatalysatoren liegt die Laufzeit zwischen 13 und 23 h. Auch bei den ermittelten
Halbwertszeiten ergeben sich keine signifikanten Unterschiede. Für die BAL-Variante wurde
eine Halbwertszeit von 2,3±0,46 h ermittelt. Die Halbwertszeit der nativen BAL im
MTBE/Wasser Zweiphasensystem liegt bei 2,4±0,26 h. Die gemessenen prozentualen
Umsätze liegen beim Einsatz der BAL-Variante zwar etwas höher (maximaler Umsatz =
6,98%±1,92) als beim Einsatz der nativen BAL (maximaler Umsatz = 5,05%±0,92), unter
Berücksichtigung der großen Standardabweichungen ergeben sich jedoch auch hier keine
signifikanten Unterschiede. Die im Vergleich zum Wildtyp ca. doppelt so hohe Lagerstabilität
der BAL-Variante in MTBE korreliert also nicht mit einer erhöhten Prozessstabilität. Die
Inaktivierung der BAL durch das Substrat 2-Furaldehyd scheint demnach so stark zu sein,
dass Lösungsmitteleffekte in den Hintergrund treten. Allein eine verbesserte Stabilität
gegenüber den verwendeten Lösungsmitteln kann daher nicht zu einer signifikanten
Steigerung der Reaktionslaufzeit oder gar zu erhöhten Umsätzen führen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
149
Dieses Ergebnis steht mit Messungen von van den Wittenboer [2009] im Einklang, die unter
ähnlichen reaktiven Bedingungen im Zweiphasensystem für die nicht-immobilisierte BAL-
Variante(V175N, I176D, I177T) ebenfalls eine lediglich minimal erhöhte Prozessstabilität
beobachtete. Für die BAL-Variante ermittelte van den Wittenboer eine Halbwertszeit von
1,9±0,2 h, für das native Enzym eine Halbwertszeit von 1,5±0,1 h.
Die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen also, dass durch eine
Immobilisierung der BAL in einer Polymermatrix aus PVA die Prozessstabilität des Enzyms
nicht gesteigert werden kann. Da die Substratinaktivierung der BAL Lösungsmitteleffekte
ganz offensichtlich stark überlagert, stellt das gewählte kontinuierliche Reaktionssystem
aufgrund der kontrollierbaren Substratkonzentration eine gute Wahl dar und es erscheint
sinnvoll, eine sehr niedrige Substratkonzentration einzustellen. Die Inaktivierung der BAL
durch ihre eigenen Substrate scheint jedoch so stark zu sein, dass selbst geringe
Aldehydkonzentrationen noch zu einer raschen Inaktivierung führen. Van den Wittenboer
[2009] hatte die Prozessstabilität der BAL-Variante im reaktiven MTBE/Wasser
Zweiphasensystem bei einer 2-Furaldehydkonzentration von 100 mmol L
-1
gemessen. In der
vorliegenden Arbeit wurde die BAL-Variante bei einer 2-Furaldehydkonzentration von
lediglich 30 mmol L
-1
im Wirbelschichtreaktor eingesetzt und dennoch ist die
Substratinaktivierung so stark, dass weder hohe Umsätze noch hohe Halbwerts- und
Laufzeiten erzielt werden können. Selbst eine weitere drastische Reduzierung der
Substratkonzentration auf lediglich 5 mmol L
-1
brachte keine signifikante Verbesserung der
Parameter mit sich.
Bevor die BAL daher in großtechnischen Synthesen erfolgreich eingesetzt werden kann, ist es
unerlässlich den Inaktivierungsmechanismus der Substrate genau aufzuklären. So wäre es
z. B. hilfreich die kritische Substratkonzentration für die BAL zu ermitteln, um die
Reaktionsführung genau anzupassen. Aufgrund der Kontrollierbarkeit der Substrat-
konzentration sind kontinuierliche und semikontinuierliche (FedBatch) gegenüber satzweisen
Reaktionsführungen zu bevorzugen. Da die Substratinaktivierung der BAL jedoch sehr stark
zu sein scheint und schon bei sehr niedrigen Substratkonzentrationen auftritt, erscheint es als
unerlässlich, eine BAL-Variante mit erhöhter Stabilität gegen die eigenen Substrate
herzustellen. Für den gezielten Austausch von Aminosäuren im Protein durch gerichteten
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
150
Mutagenese müsste jedoch zunächst der Inaktivierungsmechanismus aufgeklärt werden. Die
Herstellung von BAL-Varianten mit gesteigerter Substratstabilität über gerichtete Evolution
stellt eine Alternative dar. Allerdings müsste hierfür zunächst ein geeignetes
Screeningverfahren der Enzymvarianten etabliert werden und so bedarf es auf diesem Feld
weitere intensive Forschung.
3.2.3 Zusammenfassung
Die Untersuchungen zeigen, dass ein Lösungsmittelwechsel keine Möglichkeit der
Optimierung der BAL-katalysierten (R)-2,2’-Furoinsynthese im kontinuierlich betriebenen
Wirbelschichtreaktor bietet. Obwohl die Verteilungskoeffizienten des Produktes zwischen der
wässrigen und der jeweiligen Lösungsmittelphase auf eine höhere Produktextraktionskraft der
ausgewählten Lösungsmittel schließen lassen, konnte hierdurch das thermodynamische
Gleichgewicht scheinbar nicht zur Produktseite hin verschoben werden. Es wurden keine
signifikant höheren Umsätze als in n-Hexan gemessen. Lediglich die Racemisierung des
gebildeten (R)-2,2’-Furoins in der wässrigen Phase konnte durch den Lösungsmittelwechsel
vollständig unterbunden werden.
Im wässrigen/Hexan Zweiphasensystem konnte aufgrund der geringen Wasserlöslichkeit des
n-Hexans, im Gegensatz zu den weiteren untersuchten Zweiphasensystemen, keine
Wirbelschicht der PVA-Immobilisate aufgebaut werden. Das Agglomerat der Hydrogele
korrelierte mit einer signifikant längeren Reaktionslaufzeit. Da aufgrund der Agglomerat-
bildung der Stofftransport wahrscheinlich stark gemindert wurde, ist die
Substratkonzentration in der Wasserphase dieses Zweiphasensystems wahrscheinlich
bedeutend geringer als in den übrigen Zweiphasensystemen. Es war also anzunehmen, dass
die Substratinaktivierung der BAL inaktivierende Effekte der Lösungsmittel überlagert. Diese
Annahme wurde durch die sehr ähnlichen Halbwertszeiten der BAL in reaktiven
Zweiphasensystemen mit MTBE, MIBK bzw. 2-Methyl-THF als organischer Phase bestätigt.
Die Wahl des Lösungsmittels schien die Prozessstabilität der BAL kaum zu beeinflussen.
Zur Verifizierung dieser Annahme wurde eine BAL-Variante, die eine ca. doppelt so hohe
Lagerstabilität in MTBE aufweist wie die native BAL, im reaktiven wässrigen/MTBE
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
151
Zweiphasensystem im Wirbelschichtreaktor eingesetzt. Da sich dabei für die BAL-Variante
keine höhere Lauf- und Halbwertszeit ergab und auch keine höheren Umsätze erzielt wurden,
muss die Inaktivierung der BAL durch ihre eigenen Substrate die Inaktivierung durch
Lösungsmittel deutlich überwiegen.
Auch eine Immobilisierung der BAL in PVA steigert demnach die Stabilität des Enzyms
gegen seine eigenen Substrate nicht. Die Substratinaktivierung scheint so stark zu sein, dass
selbst niedrig gehaltene Substratkonzentrationen von 5 mmol L
-1
im kontinuierlichen
Reaktionssystem noch zu einer raschen Inaktivierung des Proteins führen. Die erfolgreiche
Synthese chiraler α-Hydroxyketone mithilfe der BAL wird demnach voraussichtlich erst
gelingen, wenn BAL-Varianten mit erhöhter Stabilität gegenüber ihrer Substrate hergestellt
werden. Hierfür ist die vollständige Aufklärung des Inaktivierungsmechanismus von großer
Bedeutung.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
152
3.3 Chemoenzymatische Eintopfsynthese von (R)-4,4’-Biphenylbenzoin
durch Kombination Pd-katalysierter Kreuzkupplung und BAL-
katalysierter Carboligation
Ein weiters Ziel dieser Arbeit war die Synthese des sterisch sehr anspruchsvollen
α-Hydroxyketons 4,4’-Biphenylbenzoin durch Kombination einer Palladium-katalysierten
Suzuki-Kupplung mit einer BAL-katalysierten Carboligation (s. Abb. 3.9). In der Suzuki-
Kupplung sollte das sterisch anspruchsvolle Substrat der anschließenden Carboligation,
4-Biphenylcarboxaldehyd, aus der einfachen Vorstufe 4-Brombenzaldehyd aufgebaut werden.
In der nachfolgenden Enzymreaktion sollten zwei 4-Biphenylcarbox-aldehyde stereoselektiv
zu (R)-4,4’-Biphenylbenzoin verknüpft werden.
H
2
O
ThDP
Mg
2+
1
2
3
4
Pd-Kat
BAL
Abbildung 3.9. Reaktionsschema der chemoenzymatischen Eintopfsynthese von (R)-4,4’-Biphenylbenzoin
durch Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kupplung und der anschließenden BAL-katalysierten
Carboligation. 1: 4-Brombenzaldehyd; 2: Phenylboronsäure; 3: 4-Biphenylcarboxaldehyd, 4: (R)-4,4’-Biphenyl-
benzoin.
Sowohl die Suzuki-Kupplung als auch die enzymkatalysierte Carboligation wurden, bevor sie
miteinander kombiniert wurden, einzeln charakterisiert und optimiert.
3.3.1 Suzuki-Kupplung
Für die Suzuki-Kupplung von 4-Brombenzaldehyd und Phenylboronsäure wurde analog zu
Burda et al. [2008], der Standardkatalysator Bis-(triphenylphosphin)-palladiumdichlorid
(PPh
3
)
2
PdCl
2
(s. Abb. 3.10) in Kombination mit der Base Natriumcarbonat (Na
2
CO
3
)
eingesetzt.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
153
Abbildung 3.10. Strukturformel des Bis-(triphenylphosphin)-palladiumdichloridkatalysators.
Burda et al. [2008] kombinierten ebenfalls eine Pd-katalysierte Kreuzkupplung mit einer
enzymatisch katalysierten Reaktion, allerdings mit anderen Substraten und einem anderen
Biokatalysator. In der Suzuki-Reaktion wurde Phenylboronsäure mit 1-(4-Bromphenyl)-
ethanon zu 4-Phenylacetophenon gekuppelt, welches nachfolgend mithilfe einer Alkohol-
dehydrogenase zum entsprechenden chiralen Alkohol reduziert wurde. Für die Kreuz-
kupplung wurde beim Einsatz von 1,1 Äquivalenten Phenylboronsäure und 40 Äquivalenten
der Base Na
2
CO
3
eine optimale Reaktionstemperatur von 70 °C ermittelt und eine Ausbeute
von 95% erzielt.
Diese optimierten Reaktionsbedingungen wurden auf die (PPh
3
)
2
PdCl
2
-katalysierte
Kreuzkupplung von Phenylboronsäure mit 4-Brombenzaldehyd übertragen. Entgegen den
Erwartungen konnte so jedoch lediglich eine Ausbeute von 15% erreicht werden. Eine
H
1
-NMR-Analyse der Produkte aus der Suzuki-Reaktion zeigte, dass neben dem eigentlichen
Hauptprodukt 4-Biphenylcarboxaldehyd zusätzlich eine Carbonsäure entstanden war. Im
H
1
-NMR-Spektrum war deutlich ein für Carboxylgruppen charakteristischer Peak bei
11,64 ppm zu erkennen. Auch die Bildung eines Alkohols wurde durch einen sehr schwachen
Peak bei 4,4 ppm angedeutet. Dies legt die Vermutung nahe, dass das Substrat 4-Brom-
benzaldehyd bei einer Reaktionstemperatur von 70 °C und 40 Äquivalenten der Base
Natriumcarbonat zu 4-Brombenzoesäure und 4-Brombenzylalkohol disproportioniert ist.
Diese Annahme steht im Einklang mit der bereits 1853 von Cannizzaro beschriebenen
Cannizzaro-Reaktion, bei der arylische Aldehyde unter Temperaturerhöhung und in
Gegenwart starker Basen zu Derivaten der Benzoesäure und des Benzylalkohols
disproportionieren (s. Abb. 3.11).
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
154
Abbildung 3.11. Mechanismus der Disproportionierung arylischer Aldehyde bei hoher Temperatur und in
Gegenwart starker Basen nach Cannizzaro [1853]. R
1
steht für arylischer Rest.
Aufgrund der festgestellten Disproportionierung des Substrates 4-Brombenzaldehyd mussten
die Reaktionsbedingungen der Suzuki-Kreuzkupplung im Bezug auf die Reaktionstemperatur
und den zugegebenen Basenäquivalenten optimiert werden. Bei niedrigen Reaktions-
temperaturen verläuft die Bildung von Hydroxidionen aus der Reaktion von Carbonationen
mit Wasser langsamer ab und durch die Reduktion der zugegebenen Basenäquivalente liegen
generell weniger Hydroxidionen im Reaktionsansatz vor. Da Hydroxidionen die
Disproportionierung arylischer Aldehyde nach Cannizzaro initiieren, wurden eine geringere
Disproportionierung des Substrates und dadurch eine höhere Produktausbeute bei
Herabsetzung der Temperatur und der Basenkonzentration erwartet.
Zunächst wurden nur die zugegebenen Basenäquivalente von 40 auf 20 halbiert und die
Reaktionstemperatur bei 70 °C belassen. Unter diesen Bedingungen konnte die
Substratdisproportionierung jedoch lediglich gemildert und die Ausbeute nur leicht von 15
auf 25% gesteigert werden. Erst beim Herabsetzen der Reaktionstemperatur auf 55 °C und
einer weiteren drastischen Reduzierung der eingesetzten Basenäquivalente auf einen Wert von
2, konnte eine zufriedenstellende Ausbeute von 56±13% erzielt werden. Schon kleine
Erhöhungen der Basenäquivalente führten zu deutlichen Verlusten der Ausbeute.
Die maximal erzielbare Ausbeute von 56±13% entspricht damit nicht dem Wert von 95%
nach Burda et al. [2008]. In Anbetracht der höheren Empfindlichkeit der Aldehyde im
Vergleich zu Ketonen, die bei Burda et al. als Substrate eingesetzt wurden, ist dies jedoch ein
sehr zufriedenstellendes Ergebnis.
3.3.2 Charakterisierung der BAL-katalysierten Carboligation
Die BAL-katalysierte Carboligation sollte im Hinblick auf Ausbeute und Enantiomeren-
überschuss charakterisiert werden. Da das Substrat 4-Biphenylcarboxaldehyd und auch das
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
155
Produkt schlecht wasserlöslich ist, wurde zusätzlich die Verwendung der Cosolventien
DMSO und DMF untersucht. Die Durchmischung der wässrigen Phase mit 20% (v/v) dieser
Cosolventien hatte sich bereits in der Benzoinsynthese bewährt [Demir, Sesenoglu et al.,
2002; Schmidt, 2008].
Die Verwendung von DMF als Löslichkeitsvermittler erwies sich als nachteilig, da mittels
HPLC-Analytik neben dem eigentlichen Produkt 4,4’-Biphenylbenzoin nicht weiter
spezifizierte Nebenprodukte detektiert wurden. Eine Möglichkeit der unerwünschten
Nebenproduktbildung ist die Reaktion zwischen der Carbonylgruppe des Substrates und der
Amidfunktion des DMFs. Auch eine BAL-katalysierte Carboligation zwischen DMF und dem
Substrat 4-Biphenylcarboxaldehyd ist nicht auszuschließen. In diesem Fall würde ein weiteres
nicht erwünschtes α-Hydroxyketon entstehen. Nach 7 Tagen Reaktionszeit konnte das
gewünschte Produkt 4,4’-Biphenylbenzoin zwar detektiert werden, jedoch lediglich mit einer
geringen Ausbeute von 32%. DMF kommt demnach nicht als Löslichkeitsvermittler in Frage.
Der Einsatz von 20% DMSO als Löslichkeitsvermittler erwies sich dagegen als vorteilhaft,
denn im Vergleich zur Synthese im gepufferten wässrigen System ohne Cosolvens konnte die
Reaktionsgeschwindigkeit stark erhöht werden. Nach 4 Tagen Reaktionszeit lag die Ausbeute
bei Verwendung von DMSO bei 96%, während sie im rein wässrigen System erst bei 69%
lag. Die ees lagen in beiden Einphasensystemen bei über 99,99%. Da zudem bekannt ist, dass
DMSO in einer Konzentration von 20% (v/v) die Stabilität der BAL nicht negativ beeinflusst,
sondern sogar stabilisierend auf das Protein wirkt [Stillger, 2004], eignet sich DMSO bei der
stereoselektiven BAL-katalysierten Carboligation von 4-Biphenylcarboxaldehyd hervor-
ragend als Löslichkeitsvermittler.
Da die erzielbare Gesamtausbeute der enzymatischen Reaktion mit 99% wesentlich höher ist
als die erzielte maximale Ausbeute der chemisch katalysierten Suzuki-Kupplung von 56%,
wurde in Betracht gezogen, die Reihenfolge der beiden Reaktionen zu vertauschen. Wird die
BAL-katalysierte Carboligation mit hohem Umsatz der Pd-katalysierten Kreuzkupplung mit
niedrigerem Umsatz vorgeschaltet, so kann letztendlich die Gesamtausbeute an
4,4’-Biphenylbenzoin in der Eintopfsynthese erhöht werden. Die Umkehrung der Reaktions-
reihenfolge hätte zur Konsequenz, dass die BAL anstelle der Carboligation von
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
156
4-Biphenylcarboxaldehyd die Carboligation von 4-Brombenzaldehyd katalysieren müsste.
Das dabei entstehende (R)-4,4’-Dibrombenzoin würde in der anschließenden Pd-katalysierten
Kreuzkupplung mit Phenylboronsäure zu (R)-4,4’-Biphenylbenzoin umgesetzt werden
(s. Abb. 3.12).
2
ThDP
Mg
2+
1
2
3
4
H
2
O
Pd-Kat
BAL
Abbildung 3.12. Reaktionsschema der chemoenzymatischen Eintopfsynthese von (R)-4,4’-Biphenylbenzoin mit
der BAL-katalysierten Carboligation im ersten Schritt und nachfolgender Pd-katalysierten Suzuki-Kupplung.
1: 4-Brombenzaldehyd; 2: (R)-4,4’-Dibrombenzoin; 3: Phenylboronsäure; 4: (R)-4,4’-Biphenylbenzoin.
Aufgrund dessen wurde auch die BAL-katalysierte Carboligation zweier 4-Brom-
benzaldehyde hinsichtlich Ausbeute und ee charakterisiert. Da sich DMSO zuvor bereits als
geeignetes Cosolvens herausgestellt hatte, wurde es bei dieser Charakterisierung ebenfalls in
einer Konzentration von 20% eingesetzt. Für die Carboligation von 4-Brombenzaldehyd
konnte analog zur Carboligation von 4-Biphenylcarboxaldehyd unter Verwendung von
DMSO eine Ausbeute von über 99% und ein ee von über 99,99% erreicht werden. Allerdings
war die Reaktionsgeschwindigkeit ca. um den Faktor 100 größer. Eine Umkehrung der
Reaktionsreihenfolge in der chemoenzymatischen Eintopfsynthese von (R)-4,4’-
Biphenylbenzoin erscheint demnach sehr erfolgversprechend.
3.3.3 Einfluss der Phenylboronsäure auf die BAL-Aktivität
Da die Reaktionsbedingungen der Suzuki-Kupplung mit einer Reaktionstemperatur von 55 °C
und einem stark alkalischen pH-Wert von über 12 zu harsch für die BAL sind, sollte die
Eintopfsynthese ohne Zwischenaufreinigung in einem Reaktionsgefäß, jedoch mit
nacheinander ablaufenden Reaktionen durchgeführt werden. Zwischen der enzymatisch und
der chemisch katalysierten Reaktion sollten Reaktionstemperatur und pH-Wert an den
jeweiligen Katalysator angepasst werden. Wird erst die Suzuki-Kupplung durchgeführt, so
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
157
muss die BAL trotz Gegenwart nicht abreagierter Phenylboronsäure im Reaktionsgemisch
eine genügend hohe Restaktivität zeigen, um die nachfolgende Carboligation mit hohen
Ausbeuten zu katalysieren. Wird dagegen die BAL-katalysierte Reaktion der Pd-katalysierten
Reaktion vorangestellt, so könnten die möglicherweise inaktivierenden Effekte der Suzuki-
Kupplungs Komponenten auf das Protein umgangen werden.
Um beide Optionen offen zu halten, wurde der Effekt der Organoboronsäure auf die BAL
untersucht. Hierfür wurde der gekoppelte BAL-Aktivitätstest herangezogen, bei dem die
NADH
2
-Abnahme spektrometrisch verfolgt werden kann (s. 2.2.10). Die gemessenen
Enzymaktivitäten wurden dabei mit der Aktivität der Enzymlösung ohne Zusatz von
Phenylboronsäure ins Verhältnis gesetzt (s. Abb. 3.13).
0
10
20
30
40
50
60
70
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Konzentration [mmol/L]
Relative Aktivität [%]
Abbildung 3.13. Relative Aktivität der BAL in Abhängigkeit verschiedener Phenylboronsäurekonzentrationen
(19,0 mmol L
-1
; 37,0 mmol L
-1
; 75,0 mmol L
-1
und 150 mmol L
-1
). Für die Ermittlung der BAL-Aktivität wurde
die Benzoinspaltung in Kombination mit der Alkoholdehydrogenase-katalysierten Aldehydreduktion verwendet.
Aus Abbildung 3.13 geht hervor, dass die BAL-Restaktivität schon bei einer geringen
Phenylboronsäurekonzentration von 19 mmol L
-1
auf knapp 70% absinkt. Die Abnahme der
BAL-Aktivität in Abhängigkeit von der Phenylboronsäurekonzentration verläuft nicht linear,
nimmt jedoch mit zunehmender Organoboronsäurekonzentration stetig zu. So führt eine
Erhöhung der Phenylboronsäurekonzentration von 19 mmol L
-1
auf 37 mmol L
-1
lediglich zu
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
158
einer geringen weiteren Abnahme der BAL-Restaktivität von 70 auf ca. 63%. Bei weiter
steigenden Phenylboronsäurekonzentrationen von 75 und schließlich 150 mmol L
-1
sinkt die
BAL-Restaktivität jedoch rapide auf einen Wert von 51% bzw. 12% ab. Entscheidend ist
jedoch, dass bei einer Phenylboronsäurekonzentration von 27,5 mmol L
-1
, die zu Beginn der
Suzuki-Kupplung eingesetzt wird, eine ausreichende BAL-Restaktivität von ca. 65%
vorhanden ist.
Auch wenn der inaktivierende Effekt der Phenylboronsäure im verwendeten
Konzentrationsbereich relativ gering ist, ist es wichtig die Organoboronsäure nicht im großen
Überschuss einzusetzen, damit möglichst geringe Säurerestkonzentrationen im
Reaktionsgemisch der Suzuki-Kupplung zurückbleiben. Zudem wird durch den gemessenen
inaktivierenden Effekt der Säure bestätigt, dass es sinnvoll scheint die enzymkatalysierte
Carboligation der Pd-katalysierten Kreuzkupplung voranzustellen.
3.3.4 Kombination der Pd-katalysierten Suzuki-Kupplung und der BAL-
katalysierten Carboligation
BAL-katalysierte Carboligation im ersten Schritt der Eintopfsynthese
Aufgrund der höheren Ausbeute der Carboligation im Vergleich zur Suzuki-Kupplung
(s. 3.3.1) und aufgrund der leichten Inaktivierung der BAL durch die in der Kreuzkupplung
eingesetzte Phenylboronsäure (s. 3.3.3), wurde die Eintopfsynthese von (R)-4,4’-Biphenyl-
benzoin zunächst mit der Carboligation als ersten Schritt getestet. Hierfür musste jedoch
zuvor untersucht werden, ob die Suzuki-Kupplung mit dem dann entstehenden
Zwischenprodukt (R)-4,4’-Dibrombenzoin (s. Abb. 3.12) durchführbar ist. Da 4,4’-Dibrom-
benzoin käuflich nicht zu erwerben ist, wurde es mithilfe der BAL synthetisiert und
anschließend aufgereinigt (s. 2.2.7). Hierbei zeigte sich, dass 4,4’-Dibrombenzoin wie auch
2,2’-Furoin (s. 3.2.) sehr oxidationsempfindlich ist. Während des Aufreinigungsprozesses
durch Extraktion und Säulen über Kieselgel trat eine immer stärker werdende Gelbfärbung
auf, die auf die Bildung des Diketons 4,4’-Dibrombenzil hindeutet. Dennoch wurde die
(PPh
3
)
2
PdCl
2
-katalysierte Suzuki-Kupplung mit 4,4’-Dibrombenzoin als Substrat unter den in
Kapitel 3.3.1 ermittelten optimalen Reaktionsbedingungen durchgeführt. Es konnte eine mit
zunehmender Reaktionsdauer immer stärkere Gelbfärbung des Reaktionsansatzes beobachtet
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
159
werden und die ermittelte maximale Ausbeute betrug aufgrund der Oxidation des Substrates
letztendlich nur 24%.
Die so erzielte maximale Ausbeute von 24% ist, verglichen mit der maximalen Ausbeute der
Suzuki-Kupplung von 56±13% beim Einsatz von 4-Brombenzaldehyd als Substrat, sehr
gering. Daher wurde auf die Durchführung der Eintopfsynthese mit der Carboligation als
ersten Reaktionsschritt verzichtet. Stattdessen wurde die Eintopfsynthese in der ursprünglich
geplanten Reaktionsreihenfolge untersucht.
BAL-katalysierte Carboligation im zweiten Reaktionsschritt der Eintopfsynthese
Bei der Durchführung der chemoenzymatischen Eintopfsynthese von (R)-4,4’-Biphenyl-
benzoin mit der Pd-katalysierten Kreuzkupplung im ersten Reaktionsschritt und der
nachfolgenden enzymkatalysierten Carboligation wurde zunächst die Suzuki-Kupplung
abgeschlossen. Phenylboronsäure, Natriumcarbonat, 4-Brombenzaldehyd und der Palladium-
katalysator wurden hierfür in Wasser vorgelegt und das Reaktionsgemisch wurde für 17 h auf
55 °C erhitzt. Anschließend wurde der Reaktionsansatz auf Raumtemperatur abgekühlt, der
pH-Wert auf 8,0 eingestellt und die Cofaktoren der BAL ThDP und Mg
2+
sowie das Enzym
selbst hinzugegeben. Die Reaktionszeit betrug 48 h und bereits nach wenigen Minuten
kristallisierte 4,4’-Biphenylbenzoin aus. Die maximal erzielte Gesamtausbeute der
Eintopfsynthese lag bei 60%. Der ee lag bei über 99,99; es konnte kein (S)-Enantiomer
detektiert werden. Damit gelang erstmals die enantioselektive Synthese des sterisch sehr
anspruchsvollen α-Hydroxyketons (R)-4,4’-Biphenylbenzoin mit einer zufriedenstellenden
Gesamtausbeute und einem exzellenten ee.
3.3.5 Zusammenfassung
Bei der Charakterisierung der Suzuki-Kupplung von 4-Brombenzaldehyd und
Phenylboronsäure wurde bei den ursprünglich gewählten Reaktionsbedingungen von 70 °C
als Reaktionstemperatur und 40 eingesetzten Äquivalenten der Base Natriumcarbonat eine
Disproportionierung des Substrates beobachtet. Daher musste die Suzuki-Kupplung
hinsichtlich Reaktionstemperatur und eingesetzter Basenäquivalente optimiert werden. Bei
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
160
einer Temperatur von 55 °C und lediglich 2 Äquivalenten Natriumcarbonat konnte eine hohe
Ausbeute von 56±13% erzielt werden.
In der anschließenden Charakterisierung der BAL-katalysierten Carboligation zweier
4-Biphenylcarboxaldehyde zu (R)-4,4’-Biphenylbenzoin konnten sowohl im rein wässrigen
als auch im Einphasensystem mit 20% (v/v) DMSO als Cosolvens Ausbeuten von über 99%
und ebenso hohe ees gemessen werden. Die Reaktionsgeschwindigkeit war beim Einsatz des
Löslichkeitsvermittlers jedoch höher. DMF erwies sich im Gegensatz zu DMSO aufgrund
unerwünschter Nebenreaktionen als ungeeigneter Löslichkeitsvermittler.
Anschließend wurde untersucht, ob die Suzuki-Kupplungs Komponenten einen
inaktivierenden Effekt auf die BAL haben. Hierbei stand Phenylboronsäure im Mittelpunkt
und es konnte ein inaktivierender Effekt nachgewiesen werden. Dieser war im Säure-
konzentrationsbereich, der in der Suzuki-Kupplung eingesetzt wird, jedoch gering.
Um diese, wenn auch schwache Inaktivierung zu umgehen und aufgrund des höheren
Umsatzes der enzymkatalysierten Reaktion, wurde eine Umkehrung der Reaktionsreihenfolge
der chemoenzymatischen Eintopfsynthese in Erwägung gezogen. Untersuchungen zeigten,
dass BAL die Carboligation zweier 4-Brombenzaldehyde mit Umsätzen und ees von über
99% und einer um den Faktor 100 höheren Reaktionsgeschwindigkeit als die Carboligation
von 4-Biphenylcarboxaldehyd katalysiert. Die anschließende Pd-katalysierte Kreuzkupplung
des dann entstehenden Zwischenprodukts 4,4’-Dibrombenzoin gelang aufgrund dessen
raschen Oxidation zum Diketon jedoch nur mit einer sehr geringen Ausbeute von 24%. Daher
wurde die ursprünglich geplante Reaktionsreihenfolge der Eintopfsynthese beibehalten.
Wurde die Suzuki-Kupplung zwischen 4-Brombenzaldehyd und Phenylboronsäure im ersten
Schritt und die BAL-katalysierte Carboligation zweier 4-Biphenylcarboxaldehydmoleküle
zum Endprodukt (R)-4,4’-Biphenylbenzoin im zweiten Reaktionsschritt durchgeführt, so lag
die erzielte Gesamtausbeute bei ~60% und der ee bei über 99,99%.
Dies ist insgesamt ein sehr zufriedenstellendes Ergebnis, denn es gelang somit erstmals das
sterisch anspruchsvolle α-Hydroxyketon (R)-4,4’-Biphenylbenzoin enantiomerenrein in einer
chemoenzymatischen Eintopfsynthese ohne Zwischenaufreinigung herzustellen. Die
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
161
erfolgreiche Optimierung und Kombination der chemo- und enzymkatalysierten Reaktion
führt zu hohen Ausbeuten und Enantiomerenüberschüssen, bei gleichzeitiger Einsparung von
Zeit, Ressourcen und schädlicher Abfallprodukte. Die Eintopfsynthese chiraler
α-Hydroxyketone ist also eine umweltfreundliche und kostengünstige Alternative zur rein
chemischen Synthese.
Um in Zukunft noch höhere Gesamtausbeuten erzielen zu können, muss die Suzuki-Kupplung
weiter optimiert werden. Zudem bleibt zu überlegen, ob für die chemoenzymatische Synthese
im industriellen Maßstab ein verbessertes Reaktionskonzept eingesetzt werden kann. Um die
chemo- und enzymkatalysierte Reaktion nicht nur nacheinander in einem Reaktionsgefäß
ohne Zwischenaufreinigung, sondern sogar zeitgleich ablaufen zu lassen, würde sich die
Immobilisierung und die damit eventuell einhergehende Stabilisierung des Biokatalysators
gegenüber den harschen Reaktionsbedingungen der Suzuki-Kupplung anbieten. So wäre es
z. B. denkbar die BAL in PVA/PEG-Kugeln zu immobilisieren und die Eintopfsynthese
kontinuierlich zu betreiben. Das Problem der Zurückhaltung des Palladiumkatalysators könnte
beispielsweise durch den Einsatz eines dendrimeren Palladiumkatalysators [Meise, Haag,
2008], der aufgrund seiner molekularen Größe z. B. durch eine Membran zurückgehalten
werden kann, gelöst werden. Zudem zeigten Prüsse et al. [1997], dass auch die
Immobilisierung des Palladiumkatalysators in PVA/PEG-Matrices möglich ist.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
162
3.4 Ausblick
Nachdem es gelungen ist, standardisierte PVA/PEG-Kugeln im Labormaßstab automatisch zu
produzieren, können diese vielversprechenden Immobilisate nun im großtechnischen Maßstab
in verschiedensten Reaktortypen eingesetzt werden. Da in der PVA-Matrix sowohl chemische
als auch viele Biokatalysatoren sowie ganze Zellen eingehüllt werden können, können diese
Immobilisate für die vielfältigsten Synthesen eingesetzt werden.
Ein sehr erfolgversprechender Einsatz dieser Hydrogele ist die BAL-katalysierte Herstellung
unterschiedlicher chiraler α-Hydroxyketone. Da die Substrate und auch die α-Hydroxyketone
schwer wasserlöslich sind, erscheint es sinnvoll, die Synthese in einem Zweiphasensystem
mit einer organischen Lösungsmittelphase durchzuführen. Durch die Einhüllung der BAL in
die Polymermatrix kann das Enzym in einem solchen Zweiphasensystem erfolgreich
eingesetzt werden. Auch die Etablierung eines kontinuierlichen Reaktionskonzepts wird durch
die Zurückhaltung des Biokatalysators und die Extraktion des Produkts in die
Lösungsmittelphase ermöglicht.
In der vorliegenden Arbeit wurde die (R)-2,2’-Furoinsynthese, katalysiert durch in PVA-
Kugeln immobilisierte BAL, in einem kontinuierlich betriebenen Wirbelschichtreaktor
untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass eine Optimierung der Synthese durch einen
Lösungsmittelwechsel nicht erreicht werden kann, da die Substratinaktivierung inaktivierende
Effekte der Lösungsmittel vollständig überlagert. Diese Schlussfolgerung wurde durch den
Einsatz einer BAL-Variante, die gegen Lösungsmittel wie MTBE eine wesentlich höhere
Lagerstabilität zeigt als das native Protein, verifiziert. Auch beim Einsatz der BAL-Variante
ergaben sich im Wirbelschichtreaktor weder eine erhöhte Halbwertszeit der BAL noch
gesteigerte Umsätze. Somit sind auf diesem Gebiet weitere Optimierungen notwendig bevor
es zu einer großtechnischen Produktion kommen kann. Vor allem die Herstellung einer BAL-
Variante mit gesteigerter Stabilität gegen die eigenen Substrate erscheint als unerlässlich.
Des Weiteren ist es erstmals gelungen, das sterisch sehr anspruchsvolle α-Hydroxyketon
(R)-4,4’-Biphenylbenzoin enantiomerenrein durch Kombination einer Palladium-katalysierten
Kreuzkupplung mit einer BAL-katalysierten Carboligation in einer Eintopfsynthese zu
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
163
produzieren. Dies gelang ohne Zwischenaufreinigung, was die entwickelte Eintopfsynthese
im Hinblick auf „green chemistry“ zukunftsweisend macht. Auch hier gibt es jedoch noch
ausreichendes Optimierungspotential. Als besonders vielversprechend erscheint die
Möglichkeit, die sensitive BAL in PVA/PEG-Kugeln zu immobilisieren und ähnlich wie in
der 2,2’-Furoinsynthese ein kontinuierliches Reaktionssystem zu etablieren.
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