Herstellung und Charakterisierung von antimykotisch wirksamen Peptiden aus der
AFP-Familie der Ascomycota
vorgelegt von
Dipl.-Ing.
Norman Paege
von der Fakultät III - Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Ingenieurwissenschaften
- Dr.-Ing. –
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender:
Prof. Dr. Jens Kurreck
Gutachterinnen:
Prof. Dr.- Ing. Vera Meyer (TU Berlin)
Prof. Dr. Maria Andrea Mroginski (TU Berlin)
Prof. Dr. Claudia Steinem (Uni Göttingen)
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 06.12.2019
Berlin, 2020
1
Danksagung
Die vorliegende Arbeit beinhaltet Daten die in meiner sechsjährigen Tätigkeit (2013-2019) am
Fachgebiet Angewandte und Molekulare Mikrobiologie (AMM), unter der Leitung von Frau Prof.
Dr.-Ing. Vera Meyer, erstellt wurden. Ich möchte daher Vera zum einen für das interessante Thema
und die fachliche Hilfe in dieser Zeit danken, zum anderen für ihre Unterstützung und ihr
Verständnis in Bezug auf persönliche Belange wie z.B. meine Elternzeiten und meine familiäre
Situation mit zwei kleinen Kindern. Mein großer Dank gilt darüber hinaus Herrn PD Dr. Sascha Jung.
Durch seine Unterstützung, andauernd positive Einstellung und dem jederzeit offenen Ohr brachte
er meine Arbeit ein großes Stück voran. Er sorgte manchmal dafür, dass das „Licht am Ende des
Tunnels“ kein entgegenkommender Zug war…. Lieber Sascha, danke für die freundschaftliche
Betreuung und Zusammenarbeit! Eine weitere sehr große Unterstützung war Frau Dr.-Ing. Tabea
Schütze. Dank ihrer großen Hilfsbereitschaft und auch dem Zugriff auf ihre sehr gute Organisation
und ihr außergewöhnliches Gedächtnis und Fachwissen ging vieles flotter als es sonst möglich
gewesen wäre. Liebe Tabea, ich hoffe du zählst nie die Stunden zusammen die du mir zugehört
hast, oder die Male, die ich dich erschreckt habe.
Im AFP-Team arbeitete außerdem Fr. Birgit Baumann emsig mit, dank deren Hilfe ich oft entlastet
wurde. Zusammen mit Fr. Susanne Engelhardt und Fr. Birgit Bernhardt sorgte sie durch gute
Labororganisation, langjährige Erfahrung und stetige Hilfsbereitschaft für einen reibungslosen
Arbeitsablauf. Ein besonderer Dank gilt hier auch Fr. Rita Waggad, ohne deren Unterstützung
meine Laborarbeit in dieser Form nicht möglich gewesen wäre.
In der Lehre wurde ich neben den oben genannten Personen besonders von Fr. Dr. Ulrike Gebhardt
und Herrn PD Dr. Udo Schmidt immer tatkräftig unterstützt. Besonders die aufwendigen
Verwaltungsaufgaben der Lehrtätigkeit wurden mir von Ihnen abgenommen. Beim Überwinden
der bürokratischen Hürden an der TU Berlin war auch Fr. Roslin Goldberg eine zuverlässige Hilfe.
Ich möchte mich außerdem insbesondere für ihre Unterstützung und Aufmunterungen bei Franzi
und Markus (Doktorgeschwister der ersten Stunde), Paul und Lars (Doktorbrüder der letzten
Stunde) bedanken. Außerdem möchte ich Fr. Jutta Gerber-Nolte und Fr. Prof. Dr. Claudia Steinem
von der Universität Göttingen und Herrn Dr. Dirk Warnecke und Fr. Dr. Melanie Thieß von der
Universität Hamburg für die lehrreiche und angenehme Zusammenarbeit in Ihren Einrichtungen
danken. Weiterhin bei allen anderen Mitgliedern des Fachgebiets AMM, mit denen ich in dieser
Zeit zusammenarbeiten durfte. Ich kann leider nicht jeden namentlich nennen, auch wenn viele mit
Sicherheit direkt oder indirekt einen Einfluss auf diese Arbeit hatten. Zuletzt gilt mein besonderer
Dank den Studenten deren Arbeiten ich betreuen konnte und denen, die mir als Tutoren in der
Lehre zur Seite gestanden haben.
Vielen Dank und Allen von ganzem Herzen alles Gute,
Norman
2
Publikationen
Die Ergebnisse der Arbeit sind zum Teil in folgenden Publikationen veröffentlicht:
„Species-specific differences in the susceptibility of fungi towards the antifungal protein
AFP depend on C3 saturation of glycosylceramides“, Norman Paege, Dirk Warnecke, Simone
Zäuner, Silke Hagen, Ana Rodrigues, Birgit Baumann, Melanie Thiess, Sascha Jung and Vera
Meyer, mSphere. 2019 Dec 11;4(6). pii: e00741-19. doi: 10.1128/mSphere.00741-19.
PMID:31826973
„A transcriptome meta-analysis proposes novel biological roles for the antifungal protein
AnAFP in Aspergillus niger.“, Paege N, Jung S, Schäpe P, Müller-Hagen D, Ouedraogo JP,
Heiderich C, Jedamzick J, Nitsche BM, van den Hondel CA, Ram AF, Meyer V., PLoS One.
2016 Nov 11;11(11):e0165755. doi: 10.1371/journal.pone.0165755. eCollection 2016.
PMID: 27835655
„A computational modeling approach predicts interaction of the antifungal protein AFP
from Aspergillus giganteus with fungal membranes via its γ-core motif.“, Utesch T, de
Miguel Catalina A, Schattenberg C, Paege N, Schmieder P, Krause E, Miao Y, McCammon JA,
Meyer V, Jung S, Mroginski MA., mSphere. 2018 Oct 3;3(5). pii: e00377-18. doi:
10.1128/mSphere.00377-18. PMID: 30282755
„Updating genome annotation for the microbial cell factory Aspergillus niger using gene co-
expression networks.“, Schäpe P, Kwon MJ, Baumann B, Gutschmann B, Jung S, Lenz S,
Nitsche B, Paege N, Schütze T, Cairns TC, Meyer V., Nucleic Acids Res. 2019 Jan
25;47(2):559-569. doi: 10.1093/nar/gky1183. PMID: 30496528
3
Im Zuge der Promotion wurden folgende Abschlussarbeiten betreut, von denen teilweise
Ergebnisse in diese Arbeit eingegangen sind. Die übernommenen Daten wurden an den
entsprechenden Stellen kenntlich gemacht.
Bachelorarbeiten:
„Cloning and expression of the His-tagged AFP in Aspergillus niger“, Dorothee Günther,
2015
„Bioreaktorkultivierung von Aspergillus giganteus und Sekretionsanalyse des
Antifungalproteins AFP“, Samuel Samuleit, 2014
„Heterologe Expression und Sekretion eines fluoreszenzmarkierten antifungalen Proteins in
Aspergillus niger”, Marianne Buschke, 2015
„Klonierung und Charakterisierung von Chitinsynthase-cDNA aus Aspergillus niger“,
Alexander Richter, 2017
„Heterologe Expression des antifungalen Proteins AFP aus Aspergillus giganteus in Pichia
pastoris“, Lena Lisa Heber, 2018
„Heterologe Expression des antifungalen Proteins AnAFP aus Aspergillus niger in Pichia
pastoris“, Jessica Becker, 2018
„Investigating the susceptibility of chitin synthase knockout mutants of Aspergillus niger
towards the antifungal peptide AFP“, Anne Gries, 2019
Masterarbeiten:
„SPR based binding experiments with 6×His-tagged Aspergillus giganteus antifungal
protein“, Tobias Wörner, 2014
„The production and purification of the AFP of Aspergillus giganteus“, Jessica Elferink, 2014
„Testing of the antifungal protein AFP of A. giganteus against food safety and human health
affecting filamentous fungi“, Eric Hinzpeter, 2015
„Cloning and expression of 2-hydroxy fatty n-acyl-Δ3(E)-desaturase in S. cerevisieae and A.
niger“, Ana Rodrigues, 2015
„Untersuchungen zum Wirkmechanismus des antifungalen Proteins AFP aus Aspergillus
giganteus“, Artur Miller, 2016
„Optimierung der Kultivierungsbedingungen von Aspergillus giganteus in batch-Reaktoren
zur Produktion von antifungalen Proteinen“, Fabian Töppke, 2017
„The role of the cell wall integrity pathway in the response to AFP in Aspergillus niger“,
Pepijn Teunisse, 2018
„Klonierung und Transformation eines konditionalen Expressionssystems in Aspergillus
niger zur Synthese eines antifungalen Peptids“, Bertal Tufan, 2019
4
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung
Bedeutung
AFP
"Antifugal protein", dt. antimykotisches Protein
Amp
Ampicillin
AnAFP
"A. niger antifungal protein", dt. A. niger antimykotisches Protein
AOX
Alkoholoxidase
APS
Ammoniumpersulfat
AS
Aminosäure
BMGY
Biotin Minimal Glycerin
bp
Basenpaare
BSA
"Bovine serum albumin", dt. Rinderserumalbumin
cDNA
"Complementary DNA", dt. Komplementäre DNA
CM
"Complete medium", dt. Komplexmedium
cps
"Counts per second", dt. Anzahl pro Sekunde
CS
Chitinsynthase
CTP
Cytidin-Triphosphat
DIG
Digoxigenin
DNA
"Desoxyribonucleic acid", dt. Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxyribose-Nucleosid-Tri-Phosphat
DO
"Dissolved oxygen", dt. Gelöstsauerstoff
D-PDMP
D-Threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol
eYFP
"Enhanced yellow fluorescent protein", dt. verstärktes gelb fluoreszierendes
Protein
FPLC
"Fast protein liquid chromatography ", dt. Schnelle
Proteinflüssigkeitschromatographie
GluCer
Glucosylceramid
GlyCer
Glycosylceramid
GTP
Guanosin-Tri-Phosphat
HPLC
"High performance liquid chromatography", dt.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
hyg
Hygromycin
kb
Kilobasen
LB
Lysogeny Broth/Luria Bertani Broth
MES
4-Morpholinethansulfonsäure
MIC
"Minimal inhibitory concentration", dt. minimale Hemmkonzentration
MM
Minimal Medium
MS
Massenspektrometer
NAF
"N. fischerii antifungal protein", dt. N. fischerii antimykotisches Protein
NMR
"Nuclear magnetic resonance", dt. Kernspinresonanz
OD
optische Dichte
ORF
"Open reading frame", dt. offener Leserahmen
5
PAF
"P. chrysogenum antifungal protein", dt. P. chrysogenum antimykotisches
Protein
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PCR
"Polymerase chain reaction", dt. Polymerase Kettenreaktion
PEG
Polyethylenglykol
RDB
Regenerations-Dextrose-Medium
RNA
Ribonukleinsäure
SDS
"Sodium dodecyl sulfate", dt. Natriumdodecylsulfat
TAE
Tris Acetate EDTA
Taq
Thermus aquaticus
Temed
Tetramethylethylendiamin
Tris
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
TTP
Thymidin-Triphosphat
UpM
Umdrehungen pro Minute
Wt
Wildtyp
6
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................................................... 4
1. Zusammenfassung ...................................................................................................................... 10
2. Einleitung .................................................................................................................................... 11
2.1. Das Bedrohungspotential von Pilzen für Mensch und Umwelt .......................................... 11
2.2. Antimikrobielle Peptide ....................................................................................................... 16
2.3. Antimykotische Peptide ....................................................................................................... 20
Die AFP-Familie ..................................................................................................................... 21 2.3.1.
2.4. AFP ....................................................................................................................................... 22
Antifungale Aktivität und Regulation der Genexpression von AFP aus A. giganteus ......... 23 2.4.1.
2.5. Die Zellwand und Plasmamembranen von Pilzen als antimykotischer Wirkort ................. 24
Glycosylceramide .................................................................................................................. 27 2.5.1.
2-Hydroxy Fettsäure N-Acyl-3(E)-Desaturase .................................................................... 29
2.5.2.
3. Ziele dieser Arbeit ....................................................................................................................... 30
3.1. Optimierung der Herstellung und Reinigung von AFP in homologen und heterologen
Expressionssystemen ............................................................................................................. 30
3.2. Charakterisierung der Wirkweise von AFP .......................................................................... 30
3.3. Genom- und Transkriptomanalysen für Funktionsanalysen der AFP-Familie ..................... 31
4. Material und Methoden ............................................................................................................. 32
4.1. Chemikalien ......................................................................................................................... 32
4.2. Enzyme ................................................................................................................................. 33
4.3. Größenmarker ..................................................................................................................... 33
4.4. Antikörper ............................................................................................................................ 33
4.5. Puffer und Lösungen ............................................................................................................ 34
4.6. Medien ................................................................................................................................. 44
7
4.7. Antibiotika / Supplemente .................................................................................................. 47
4.8. Geräte, Labormaterialien, Verbrauchsmaterialien ............................................................. 47
4.9. Stämme, Primer, Sonden ..................................................................................................... 51
4.10. Kits ....................................................................................................................................... 55
4.11. Plasmide............................................................................................................................... 56
4.12. Verwendete Software .......................................................................................................... 56
4.13. Kultivierungen ...................................................................................................................... 56
4.14. Gentechnische Methoden .................................................................................................... 56
DNA-Extraktion (SOP 17, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin) ............................................. 56 4.14.1.
Gibson Klonierung (SOP 13, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin) ........................................ 57 4.14.2.
RNA-Isolation (SOP 11, 3. Version, des FG AMM, TU Berlin) ............................................... 57 4.14.3.
Split-Marker-Ansatz zur Gendeletion ................................................................................... 58 4.14.4.
Transformation von Aspergillus niger (SOP 3, 9. Version, des FG AMM, TU Berlin) ............ 58 4.14.5.
PCR ........................................................................................................................................ 59 4.14.6.
qRT-PCR (SOP 11, 3. Version, des FG AMM, TU Berlin) ........................................................ 60 4.14.7.
Southern Blot (SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin) ............................................... 60 4.14.8.
Transformation von Pichia pastoris ...................................................................................... 61 4.14.9.
4.15. Herstellung chemisch kompetenter E. coli (SOP 4, 2. Version, des FG AMM, TU Berlin) ... 62
4.16. Luciferase-Messung (SOP 15, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin) .................................... 62
4.17. Glucan-Messung (SOP 22, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin) ......................................... 62
4.18. MIC90-Messung (SOP 19, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin) ........................................... 63
4.19. Chitin-Messung (SOP 23, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin) ........................................... 63
4.20. eYFP-Messung...................................................................................................................... 64
4.21. Tris-Tricine-SDS-PAGE .......................................................................................................... 64
4.22. Antikörperbasierte Proteindetektion .................................................................................. 64
4.23. Kationenaustauschchromatographie .................................................................................. 65
4.24. RP-HPLC ............................................................................................................................... 65
4.25. Identifizierung von AFP/AnAFP-Orthologen ........................................................................ 66
4.26. Bioprozesstechnik ................................................................................................................ 66
Bioreaktorkultivierung von Aspergillus giganteus ................................................................ 66
4.26.1.
8
Bioreaktorkultivierung von Pichia pastoris ........................................................................... 67 4.26.2.
4.27. Präparative Methoden ........................................................................................................ 67
AFP-Reinigung ....................................................................................................................... 67 4.27.1.
Fällung der AFP-Antikörper aus Kaninchenserum ................................................................ 68 4.27.2.
5. Ergebnisse ................................................................................................................................... 69
5.1. Optimierung der AFP-Produktion ........................................................................................ 69
5.2. Gewinnung und Reinigung eines AFP-Antikörpers .............................................................. 79
5.3. Test der Lipidbindung von AFP ............................................................................................ 81
5.4. Bestimmung der AFP-Aktivität mittels MIC90 Messungen .................................................. 82
5.5. Einfluss der Δ3 (E)-Desaturase auf die AFP-Empfindlichkeit ............................................... 83
Enzymatische Bildung der C3-ungesättigten Fettsäuren in pilzlichen GlyCer ..................... 83 5.5.1.
Enzymatische Schritte der GlyCer Synthese in A. niger ........................................................ 84 5.5.2.
Bedeutung der pilzlichen GluCer für die antimykotische Wirkung des AFPs ....................... 86 5.5.3.
3(E)-Sättigung der Glycosylceramide reduziert die Sensitivität gegenüber AFP ............... 87 5.5.4.
3(E)-ungesättigte Glycosylceramide erhöhen die AFP-Empfindlichkeit ............................ 90 5.5.5.
Test der dtdA-Expression mit qRT-PCR ................................................................................. 92 5.5.6.
Überprüfung der Substratspezifität der Δ3 (E)-Desaturase von A. niger ............................. 94 5.5.7.
Einfluss der dtdA-Deletion auf A. niger .............................................................................. 100 5.5.8.
Auswirkung der Reduzierung des GluCer-Gehaltes auf den dtdA-Deletionsstamm NP1.15 .. 5.5.9.
104
5.6. Intrazelluläre Funktionen von AnAFP ................................................................................ 105
Auswertung der A. niger Transkriptomdatenbank ............................................................. 105 5.6.1.
Bedeutung der Transkriptionsfaktoren FlbA/BrlA für die anafp-Expression ..................... 108 5.6.2.
Der Transkriptionsfaktor CreA ............................................................................................ 109 5.6.3.
Southern Blots der creA, brlA und flbA knock-out Stämme ............................................... 110 5.6.4.
5.7. Die AFP-Familie .................................................................................................................. 117
Identifizierung der AFP Orthologe/ AFP-Familienmitglieder .............................................. 117 5.7.1.
6. Diskussion ................................................................................................................................. 122
9
6.1. AFP-Produktion .................................................................................................................. 122
6.2. Wirkweise von AFP ............................................................................................................ 126
6.3. Intrazelluläre Aktivität von AnAFP ..................................................................................... 134
6.4. AFP-Familie ........................................................................................................................ 136
7. Schlussfolgerungen und Ausblick.............................................................................................. 137
8. Anhang ...................................................................................................................................... 139
10
1. Zusammenfassung
Die sehr variable und große Gruppe der antimikrobiellen Peptide, von der mehr als 10.000
Vertreter in der Datenbank „Collection of anti-microbial peptids“ CAMPR3 [1] gelistet sind, steht
schon lange als potenzielle Basis für Wirkstoffe im Fokus der Forschung. Es gibt auf Grund
steigender Zahlen von Pilzinfektionen und Resistenzen gegen antimykotische Wirkstoffe ein großes
Bedürfnis diese Quelle zu erschließen. Die Mitglieder der AFP-Familie sind auf Grund ihrer Spezies-
Spezifität, besonders auch für bekannte human- und pflanzenpathogene Pilze mit hohem
Bedrohungspotential, ohne bekannte Nebenwirkungen von Interesse. In dieser Arbeit wurden
daher Grundlagen zur Etablierung des antimykotischen Proteins AFP aus A. giganteus
ausgearbeitet. Dazu gehören (i) verbesserte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung, (ii)
die Charakterisierung des Wirk-Mechanismus und (iii) in silico Analysen zur Identifizierung der
Mitglieder der AFP-Familie.
Die Etablierung der Bioreaktorkultivierung, mit standardisierter Ausbeute von 10 mg/L
Kulturmedium des AFPs, bildet den Anfang der Arbeit. Vom nativen Produzenten A. giganteus
werden mehrere AFP-Varianten sekretiert, welche schwer voreinander zu trennen sind. Aus NMR
Versuchen ergab sich, dass durch die sequenzielle Prozession zusätzlich zur längeren AFP Variante
„lf“-AFP eine kürzere Variante, das „sf“-AFP (-Alanin), gebildet wird. Die heterologe Expression in P.
pastoris ist daher der geeignetste Ansatz für die AFP Produktion, die homologe Herstellung in A.
giganteus ermöglicht die Funktion anderer AFP-Varianten aufzuklären.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der C3-Sättigung von Glycosylceramiden auf die
Wirksamkeit des AFPs untersucht. Die für Pilze eigenen Strukturmerkmale dieser
Membranbestandteile können das spezifische Wirkspektrum des AFPs erklären. Es zeigte sich, dass
die 2-Hydroxy Fettsäure N-Acyl-Δ3(E)-Desaturase für die Bildung der Doppelbindung zwischen dem
dritten und vierten Kohlenstoffatom des Fettsäurerestes verantwortlich ist. Die Deletion dieses
Enzyms führte zur Verringerung der Empfindlichkeit von A. niger oder F. graminearum gegen AFP.
Die Expression des Enzyms in P. pastoris lässt einen AFP-sensitiven Stamm entstehen. Es konnte
daher die Interaktion von AFP mit den Glycosylceramiden der pilzlichen Membran gezeigt werden.
Im dritten Teil der Arbeit wurden Transkriptomdaten von A. niger, der ein anderes Mitglied der
AFP-Familie, das AnAFP, sekretiert ausgewertet. Die Erstellung eines anafp-Ko-
Expressionsnetzwerks ermöglichte die Zuordnung des AnAFP zu metabolischen Prozessen. Die in
silico vorhergesagte Beteiligung des anafp wurde in Laborexperimenten überprüft, wodurch sie
bestätigt werden konnte. Es fanden sich deutliche Hinweise für eine zellinterne Rolle des AnAFPs.
Im letzten Teil der Arbeit konnten durch in silico Analysen über 50 AnAFP Orthologe in Ascomycota
identifiziert werden. Hochkonserviert sind die Anzahl und Positionen der Cysteine sowie des „γ-
cores“. Dabei handelt es sich um ein evolutionsbiologisch konserviertes dreidimensionales
Strukturmotiv, welches Wechselwirkungen mit Membranen eingeht.
11
2. Einleitung
2.1. Das Bedrohungspotential von Pilzen für Mensch und Umwelt
Filamentöse Pilze sind ubiquitär [2, 3]. Man findet neben Generalisten, wie zum Beispiel Aspergillus
spp. und Fusarium spp., auch an extreme Umweltbedingungen angepasste Arten in Wüsten [4], auf
Bergen [5], in den Polarregionen [6] und in der Tiefsee [7]. Einige Arten könnten sogar unter
extraterrestrischen Bedingungen überleben [8]. Eine gute Übersicht liefert unter anderem das
„Special Issue of Fungal Ecology - Fungi in Extreme Environments“ [9]. Durch den Menschen gelang
ihre globale Verbreitung [2] und darüber hinaus sogar bis in den Weltraum [10]. Pilze erfüllen in
Ökosystemen eine wichtige Rolle als Destruenten, die durch die Vielzahl an sekretierten Enzymen
in der Lage sind, auch schwer abbaubare Polymere wie Cellulose, Lignin und Keratin als
Kohlenstoffquelle zu nutzen [11]. Sie tragen damit zu einem großen Teil des biologischen Kreislaufs
bei. Filamentöse Pilze werden in einer Vielzahl von Prozessen genutzt. Am ursprünglichsten ist die
Herstellung von Lebensmitteln mit filamentösen Pilzen, wie z.B. getrocknete Wurst [12], Käse [13],
oder regionalen Nahrungsmitteln wie Shoyu, eine aus Sojabohnen mit A. oryzae hergestellte
Sojasoße und Tempeh, mit Rhizopus oligosporus fermentierte gekochte Sojabohnen. Dazu kommen
in neuere Zeit die Produktion von Enzymen, für z.B. Waschmittel [14], und Zusatzstoffen für die
Nahrungsmittelindustrie, wie z.B. Farbstoffen [15]. Der Einsatz von gentechnischen Methoden
ermöglicht außerdem die heterologe Produktion einer Vielzahl von Substanzen [16], die auch im
medizinischen Bereich genutzt werden können. Außerdem können Pilze zur Schädlingsbekämpfung
eingesetzt werden [17]. Die Herausforderungen in der weiteren Erforschung und Entwicklung
filamentöser Pilze zum Nutzen für den Menschen und im Umgang mit der Bedrohung für den
globalen Wohlstand durch filamentöse Pilze sind sehr gut in dem white paper des EUROFUNG
Netzwerkes zusammengefasst [18].
12
Abbildung 1 – Verlauf der Anzahl an Publikationen zu den Schlagwörtern „antibiotics“
(blaue Punkte), "antifungal peptide" (orange Punkte), "antimicrobial peptide" (graue
Punkte), „fungal infection“ (dunkelblaue Punkte) in der PubMed –Datenbank, Stand
21.02.2019 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/).
Pilze stellen jedoch auch ein hohes Bedrohungspotential dar [19]. Obwohl die Anzahl der
Publikationen zu den Themen antimikrobielle und antimykotische Proteine, sowie Antibiotika und
Pilzinfektionen über die Jahre zunehmen (Abb. 1), kommt die Entwicklung antimikrobieller Peptide
zur Marktreife nur langsam voran. In Abb. 2 sieht man die Anzahl an Meldungen für Infektionen
mit pflanzen- und tierpathogenen Pilzen über einen Zeitraum von 20 Jahren (1995 bis 2015) in der
„Program for Monitoring Emerging Diseases“ (ProMed) Datenbank der Internationalen
Gemeinschaft für Infektionskrankheiten. Der prozentuale Anteil der Fälle gemeldeter Infektionen
von Tieren und Pflanzen mit Pilzen versiebenfacht sich in diesem Zeitraum auf bis zu 3,5 % aller
Meldungen. Es existieren geschätzt zwischen 2,2 bis 3,8 Millionen Pilzarten [20], von denen jedoch
nur ein kleiner Teil von 20 – 25 Arten, hauptsächlich aus dem Reich der Ascomycota [21], tier- und
pflanzenpathogen ist [22]. Allerdings sind diese vergleichsweise wenigen Arten für 20 % [23] bis 27
% [22] der weltweiten Ernteverluste und einer zusätzlichen Reduzierung des Ertrages um ca. 10 %
während der Lagerung verantwortlich [23]. Der Verlust entspricht einer Menge von 125 Millionen
Tonnen Reis, Weizen, Mais, Kartoffeln und Sojabohnen jährlich [22]. Die Hauptpathogene bezogen
auf den ökonomischen Schaden sind die Schimmelpilzarten Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea
und Puccinia spp. Außerdem Zymoseptoria tritici in Europa [18]. Die Verluste durch Schimmelpilze
13
bei der weltweiten Ernte würden zur zusätzlichen Ernährung von 8,5 % der Weltbevölkerung (ca.
600 Mio. Menschen) reichen [24]. Von den geschätzt 300 Pilzarten, die in Menschen bisher
Krankheiten ausgelöst haben, treten nur 20 – 25 Arten regelmäßig als humanpathogen in
Erscheinung [25]. Beispielhafte Fallzahlen für die häufigsten Mykosen sind in Tab. 1 aufgelistet.
Zusammengenommen fordern Pilzinfektionen ähnlich viele Todesopfer wie Tuberkulose und HIV,
ungefähr 1,5 Millionen jährlich und damit mehr als z.B. Malaria oder Brustkrebs [26]. Diese Zahl
wird durch die Zunahme von (z.B. durch HIV, Diabetes mellitus und Chemotherapien)
immunsupprimierten Menschen und von Personen in intensivmedizinischer Betreuung in Zukunft
noch steigen. Für solche Patienten werden auch opportunistische Pilze zu einer Gefahr. Die
Vorbelastung der betroffenen Personen erklärt auch die hohe Sterberate bei den meisten
Pilzinfektionen von über 50 % [27].
Abbildung 2 - Meldungen in der ProMED Datenbank (http://www.promedmail.org/) für
pflanzen- und tierpathogene Pilze [28]. Die Zahlen sind weltweit steigend, zum einen auf
Grund einer besseren Datenerfassung, zum anderen auf Grund der Verbreitung von
Resistenzen gegen genutzte Antimykotika und Pestizide [28].
Darüber hinaus leiden ca. 1 Milliarde Menschen an chronischen Pilzerkrankungen, wie Infektionen
der Haut, Nägel und (vaginalen) Schleimhäute, was zu einer deutlichen Einschränkung ihrer
Lebensqualität führt [27, 29]. Es handelt sich hierbei aber auch um einen ökonomischen Faktor, da
diese Menschen in der Ausübung einer Arbeit und der Versorgung ihrer Familie eingeschränkt sind.
14
Tab. 1 - Daten zu den 10 wichtigsten invasiven Pilzinfektionen weltweit aus dem Jahr
2012. (Tab. nach Brown et al. , 2012 [27])
Krankheit
Organismus
Geschätzte Zahl
lebensgefährlicher
Infektionen jährlich (in
Tausend)
Sterberate
(in % der
infizierten
Personen)
Opportunistische Invasive
Mykosen
Aspergillose
A. fumigatus
> 200
30 - 95
Candidiasis
C. albicans
> 400
46 - 75
Kryptokokkose
C. neoformans
> 1000
20 - 70
Mukormykose
R. oryzae
> 10
30 - 90
Pneumocystis
P. jirovecii
> 400
20 - 80
Endemische dimorphe
Mykosen
Blastomykose
B. dermatitis
~ 3
< 2 - 68
Kokzidioidomykose
C. immitis
~ 25
< 1 - 70
Histoplasmose
H. capsulatum
~ 25
28 - 50
Paracoccidioidomykose
P. brasiliensis
~ 4
5 - 27
Penicilliose
P. marneffei
> 8
2 - 75
Ein weiteres großes indirektes Problem stellt auch die Eigenschaft von Schimmelpilzen dar,
Allergien [30] auszulösen und Mykotoxine zu sekretieren [31]. Sie produzieren zum Beispiel
Aflatoxin, Trichothecen, Fumonisin, Ochratoxin A und Patulin [31], die z. B. Leberkrebs auslösen
können [32]. Der Verzehr von mit Mykotoxinen stark belasteten Nahrungsmittel löst, vor allem bei
andauernder Aufnahme, eine Reihe gesundheitlicher Probleme aus [31].
Die beschriebenen Verluste an Menschenleben, Lebensqualität und Nahrungsmitteln treten trotz
des Einsatzes von einer Vielzahl verschiedener Fungizide in der Landwirtschaft (Abb. 3) und
Antimykotika in der Medizin auf [25, 33]. Es existieren fünf Hauptklassen von antimykotischen
Substanzen: Polyene, Pyrimidine, Azole, Allylamine und Echinocandine. Alle Substanzen die heute
im Einsatz sind basieren auf diesen Wirkstoffen [33]. Die möglichen Angriffsziele für Antipilzmittel
sind, gerade bei der Anwendung im Menschen, beschränkt, da sich die pilzliche und tierische Zelle
in ihrem Aufbau sehr ähneln. Daher wirken Antimykotika nur an wenigen pilzspezifischen
Zellbestandteilen, die z.B. in der Zellwand (Aminocandine), Plasmamembran (Azole, Polyene), dem
endoplasmatischen Retikulum (Sordarine) und den Mitochondrien (Pentamidine) lokalisiert sind
[25]. Außerdem wirken Antimykotika in Signalwegen der pilzlichen Zelle auf Moleküle, die ebenfalls
einzigartige Angriffsziele bieten. Dazu zählen z.B. die Hemmung der DNA-Synthese (5-Flucytosin)
und von metabolischen Prozessen (Pyrimidinanaloga). Die Blockade der Signalkaskade bei
Stressreaktion (Calcineurin oder HOG- Inhibitoren) wird auch in Kombination mit anderen
15
Substanzstoffen zur Verminderung einer möglicherweise deren Wirkung abschwächenden
Zellantwort eingesetzt. Eine gute Übersicht findet sich in Perfect JR. et al, 2017 [25].
Beim Einsatz von Pestiziden zum Schutz von Pflanzen ist zwar theoretisch ein größeres Spektrum
an antimykotischen Substanzen nutzbar, er richtet sich letztendlich aber auch nach der Giftigkeit
für den Menschen und die Umwelt. Es wurden 2017 in Deutschland 13.271 t Fungizide verkauft
und höchstwahrscheinlich auch eingesetzt (Abb. 3). Diese Masse verdeutlicht den Anteil der
Landwirtschaft bei der Entstehung und Verbreitung von Resistenzen gegen Fungizide und damit
auch Antimykotika.
Abbildung 3 – Inlandsabsatz einzelner Wirkstoffgruppen in Pflanzenschutzmitteln. Der
Anteil an Fungiziden lag 1995 mit 9652 t von 30.467 t Pflanzenschutzmittel insgesamt bei
31,6 % und stieg bis 2017 mit 13.271 t von 34.583 t insgesamt auf 38,4 % an. (Quelle: UBA)
Man beobachtet also eine steigende Anzahl von Resistenzen gegen die etablierten Pestizide und
Antimykotika [23] mit zeitgleichem Nachholbedarf bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe [34].
Antimykotische Peptide, als Untergruppe der antimikrobiellen Proteine, können eine dringend
nötige Ergänzung und Erweiterung der Wirkstoffpalette im Kampf gegen Pilzinfektionen sein [35]
[36]. Dafür ist jedoch die Optimierung ihrer Produktion sowie eine Verbesserung des
Verständnisses ihrer Wirkweise und die Erforschung ihrer Anwendungsmöglichkeiten nötig [37].
16
2.2. Antimikrobielle Peptide
Antimikrobielle Proteine (AMPs) findet man in allen Lebewesen (Abb. 4), beginnend bei Archaeen
[38] über Prokaryoten (z.B. Iturine, Surfactine, Lichensine aus Bacillus spp., das kommerziell
angewendete Lantibiotikum Nisin hergestellt von Lactococcus lactis) bis zu den höheren Tieren. Die
in der APD eingetragenen AMPs stammen zu 75 % aus Tieren (Abb. 4). Danach folgen mit 13 % die
Pflanzen, mit 8 % die Bakterien und mit nur 0,47 % AMPs aus Pilzen. Ca. 1,5 % der Einträge
beschreiben synthetisch hergestellte AMPs, die oft auf den Eigenschaften bekannter natürlicher
Peptide basieren [39, 40].
Abbildung 4 – Verteilung der AMPs in den Reichen des Lebens. Statistische Auswertung
der Einträge in der „The antimicrobial peptid database“ APD [41]
(http://aps.unmc.edu/AP/facts.php) Stand 2012 (abgerufen 22.05.2019).
In Tab. 2 sind ist die Anzahl von AMPs in verschiedenen Datenbanken aufgelistet. Je populärer und
besser gepflegt diese Datenbanken sind, umso mehr Einträge kommen zu Stande. Der große
Unterschied in der Anzahl von AMPs zwischen der CAMPR3 und ADP ist in ihrer Reichweite und
Pflege begründet. Während die CAMPR3 am „Biomedical informatics center“ (BIC) des „National
institute for research in reproductive Health“ (NIRRH) von einem Team gepflegt wird, ist es bei der
ADP das „Department of Pathology and Microbiology“ der Universität von Nebraska. Die Einträge
der PhytAMP werden von der Abteilung „Functional Proteomics & Alimentary Bio-preservation“ am
Institut „Applied Biological Sciences Tunis“ (ISSBAT) in Kollaboration mit dem „Nutraceuticals and
Functional Foods Institute“ (INAF) der Laval Universität in Kanada verwaltet. Die unterschiedlichen
Ressourcen und Ansätze in der Gewinnung und Verwaltung der Daten machen sich im Aufbau,
Fokus und der Aktualität der Datenbanken bemerkbar.
17
Tab. 2 – Gesamtanzahl der gelisteten antimikrobiellen Peptide und Einteilung je nach der
beschriebenen Wirkung. Die Angaben sind aus der „Collection of antimicrobial peptids“
CAMPR3 [1], der „The antimicrobial peptid database“ APD [41] (beide abgerufen
22.05.2019) und PhytAMP [42] (http://phytamp.pfba-lab-tun.org/statistics.php) (abgerufen
22.06.2019) entnommen. Die in der CAMPR3 und PhytAMP zur Gesamtsumme fehlenden
Peptide haben eine andere Wirkung oder wirken auf mehrere Organismengruppen. In der
Liste aus der APD sind die Peptide teilweise mehrfach (für jedes ihrer Wirkspektren)
eingetragen. (abgerufen am 22.05.2019)
CAMPR3
[%]
APD
[%]
PhytAMP
[%]
Gesamt
10247
3085
271
Antibakteriell
2915
28,4
2587
83,85
89
33
Antimykotisch
1144
11,2
1112
36,0
138
51
Antiviral
117
1,1
188
6,1
27
10
Die Anzahl an AMPs (Tab. 2) und ihre Komplexität nimmt mit der Höhe der Entwicklungsstufe des
jeweiligen Organismus zu [43]. Eine Vielzahl von AMPs schützen zum Beispiel Pflanzen (Abb. 5) vor
bakteriellen, pilzlichen, viralen Infektionen und auch Nematoden [44, 45]. Die 271 in der PhytAMP
[42] gelisteten pflanzlichen AMPs lassen sich sieben Proteinfamilien zuordnen (Abb. 5). Man findet
nicht alle der beschriebenen AMPs in einer Pflanze, jedoch eine Vielzahl davon. Das hebt ihre
Bedeutung für die pflanzliche Entwicklung und Gesundheit hervor. Je nach Entwicklungsstadium
der Pflanze und der jeweiligen Organelle können andere Peptide aktiv sein [46].
18
Abbildung 5 – Stammbaum der AMPs aus Pflanzen. Pflanzliche AMPs lassen sich im
Wesentlichen sieben Proteinfamilien zuordnen, deren Strukturen beispielhaft dargestellt
sind. Die Daten stammen aus der Datenbank für pflanzliche AMPs, PhytAMP [42]
(http://phytamp.pfba-lab-tun.org/statistics.php). (abgerufen am 22.06.2019)
AMPs sind Teil des angeborenen Immunsystems. Neben den Pflanzen haben sie auch eine große
Bedeutung in der Abwehr von Krankheitserregern bei Tier und Mensch. Mit am besten erforscht
sind AMPs beim Menschen [47]. Die Peptide haben dabei teilweise eine erstaunlich spezifische
Wirkung (Anhang, Tab. 45, Seite 143), die sich auch in evolutionsbiologisch jüngeren Organismen
wiederfindet [48]. Interessant ist die Spezifität mit der sie, wie z.B. bei Hautläsionen das Psoriasin
[49], aktiv sind. Es wirkt gezielt an Orten mit veränderter Hautoberfläche, z.B. bei Schuppenflechte,
und ist dort in großen Konzentrationen zu finden. Die Konzentration von Psoriasin steigt im Serum
abhängig von der Stärke des Krankheitsschubes an und kann als Marker für eine erfolgreiche
Therapie eingesetzt werden [49]. Das Protein wird also bedarfsgerecht gebildet und wirkt lokal.
19
Die umfangreiche Familie der AMPs beinhaltet Moleküle mit jeder für Peptide bekannten
Sekundärstruktur [50]. Von 413 der 3085 AMPs (Tab. 2), die in der „The Antimicrobial Peptid
Database“ [41] (http://aps.unmc.edu/AP/facts.php) (abgerufen am 20.06.2019) gelistet sind, sind
die Tertiärstrukturen bekannt. Von einer größeren Anzahl gibt es jedoch
Sekundärstrukturvorhersagen. Einen Überblick über die gefunden Strukturmotive ist in Tab. 3 zu
sehen. Neben Peptiden, die eine einfache Tertiärstruktur aus einer α-Helix oder einem β-Faltblatt
haben, können diese Strukturmotive auch kombiniert sein (Tab. 3). Es fällt auf, dass die größte
Gruppe der antimikrobiellen Peptide eine helikale Struktur hat (Tab. 3). Das gilt insbesondere für
relativ kurze Peptidketten und für Peptide die keine Disulfidbrücken ausbilden.
Tab. 3 - Verteilung der möglichen Sekundärstrukturen in der Datenbank „The antimicrobial
peptid database“ [41] (http://aps.unmc.edu/AP/facts.php) (abgerufen am 28.05.2019). Der
Farbverlauf folgt der Proteinstruktur von N-Terminus (Rot) zum C-Terminus (blau).
Struktur
Anzahl
Anzahl
(%)
Ø Länge
(AS)
Beispiel
(Uniprot-
Nr./Name)
Bändermodell
Globuläre
Struktur
α-Helix
471
15,33
30,14
P31107/
Adenoregulin
β-Faltblatt
82
2,66
35,85
P46170/
Beta-
defensin 12
α-Helix
und β-
Faltblatt
getrennt
4
0,13
57,25
P34034/
Bacteriocin
leucocin-A
α-Helix
und β-
Faltblatt
kompakt
108
3,51
59,25
P81544/
Heliomicin
In den meisten Fällen wirken AMPs antibakteriell [51]. Die Erforschung der AMPs wird vor allem
durch die Suche nach neuen Wirkstoffen für die Medizin vorangetrieben [52-54]. Auch erhofft man
20
sich auch einen Nutzen für die Bekämpfung von Pflanzenerkrankungen und zur Konservierung vor
allem von Lebensmitteln [55, 56]. Dafür werden natürlicherweise AMPs genutzt. Ihre
Wirkmechanismen sind sehr unterschiedlich, zielen entweder auf die Zellwand oder
Plasmamembran (Abb. 6) und verursachen die Veränderung der Permeabilität und/ oder
behindern metabolische Prozesse [57].
Abbildung 6 - Wirkweisen von AMPs. Abb. nach [58]. Dargestellt sind die verschiedenen
Einflüsse der AMPs auf die Zellmembran, die letztendlich zur Permeabilisierung führen.
Häufig verfügt ein AMP über mehrere Wirkorte, da z.B. eine Inhibition von Ionenpumpen, oder der
unkontrollierte Ausfluss von Ionen durch Porenbildung, den gesamten Zellmetabolismus
beeinflusst. Einen ausführlichen Überblick zum Thema AMPs gibt neben anderen das 2019
erschienene Buch „Antimicrobial Peptids” [59].
2.3. Antimykotische Peptide
Antimykotische Peptide, als Untergruppe der AMPs, werden ebenfalls von Prokaryoten [60] und
Eukaryoten gebildet [42, 61]. Im Anhang sind alle bis dato bekannten Gruppen der in der APD
gelisteten antimykotischen Peptide nach ihrer Zuordnung in eines der Reiche (Bakterien, Pilze,
21
Krebstiere, Insekten, Pflanzen, Amphibien, Wirbellose, Säugetiere, Fische) aufgeführt. Es wird
deutlich, dass die meisten Gruppen im Reich der Insekten (77 Peptide), gefolgt von den Amphibien
(68 Peptide) und Pflanzen (45 Peptide) zu finden sind (Anhang, Tab. 45, Seite 143). Das liegt auch
an der willkürlichen Zuordnung und Benennung der Gruppen. Gerade bei den Insekten und
Amphibien geht man bei der Namensgebung oft vom lateinischen Namen der Art aus, von der das
Peptid stammt und nimmt wenig Rücksicht auf vorhandene Analogien. Zum anderen liegt die
Ursache in der Funktion der AMPs als angeborenes Immunsystem den Organismus vor
mikrobiellen Infektionen zu schützen. Das scheint insbesondere bei den stammesgeschichtlich
älteren Lebewesen, wie den Insekten [62] und Amphibien [63], die noch dazu in mikrobiologisch
sehr reichhaltigen Umgebungen leben, weit entwickelt zu sein. Höhere Organismen profitieren
hingegen von dem Wechselspiel [64] zwischen adaptivem [65, 66] und angeborenem [67]
Immunsystem.
Interessant ist, dass die meisten antimykotischen Peptide auch gegen andere Zelltypen wirken. Ihre
Funktion ist anscheinend nicht von einem arttypischen Angriffspunkt abhängig, sondern eher
genereller Natur. Nur wenige sind nicht gegen Bakterien oder Viren aktiv (Anhang, Tab. 45, Seite
143). Zytotoxische Peptide scheiden für eine Anwendung beim Menschen aus. Jedoch kann das
Verständnis ihrer Wirkweise neue Ansatzpunkte für die Herstellung effizienterer antimykotischer
Wirkstoffe liefern [53].
Die AFP-Familie 2.3.1.
Es gibt generell verschiedene Möglichkeiten AMPs zu kategorisieren. Anhand ihrer Wirkweise, ihrer
Größe, anhand von Strukturmerkmalen, oder der Ursprungsorganismen (Anhang, Tab. 45, Seite
143). Eine besondere Gruppe von antimykotischen Peptiden stellt die AFP-Familie (Tab. 4) [68] da.
Ihr werden alle Peptide zugeordnet, die eine hohe Ähnlichkeit zum Ursprungspeptid AFP haben
(Abb. 7) [69]. AFP wurde 1965 erstmals aus A. giganteus isoliert und beschrieben [70, 71]. Es ist ein
kompaktes kationisches Peptid mit antimykotischen Eigenschaften. Allgemein betrachtet handelt
es sich bei Mitgliedern der AFP-Familie um Cystein-stabilisierte Peptide, die eine fassförmige
Faltung, bestehend aus antiparallelen β-Faltblättern, aufweisen. Weitere Mitglieder der AFP-
Familie sind z.B. das „Penicillium chrysogenum antifungal peptid“ PAF [72], oder „Aspergillus niger
antifungal peptide“ AnAFP von A. niger [73].
Tab. 4 – Mitglieder der AFP Familie die bisher in Veröffentlichungen beschrieben wurden.
Protein
Art
Referenz
AFP
A. giganteus
[69]
PAF
P. chrysogenum
[72]
AnAFP
A. niger
[73]
NFAP
N. fischeri
[74]
22
Ein wichtiges Merkmal der Peptide der AFP-Familie ist das „γ-core“ Motiv [75]. Diese
Tertiärstruktur wird durch zwei antiparallele β-Stränge, die durch eine Drehung der
Aminosäurekette verbunden sind, erzeugt. Typisch für das „γ-core“ ist das
Aminosäuresequenzmotiv GXC(X3–9)C. Peptide werden dadurch als membranaktiv gekennzeichnet
[76]. Die zunehmende Sequenzierung von Genomen ermöglicht auch bei filamentösen Pilzen
immer weiterreichende Analysen auf genetischer Ebene. So ist es mittels pBLAST [77] möglich auch
bisher nicht beschriebene, zu AFP homologe, Peptide in verschiedenen Ascomyceten zu finden.
2.4. AFP
Das antimykotische Peptid, sekretiert vom filamentösen Pilz A. giganteus (UniProtKB - P17737
(AFP_ASPGI)), ist das erste beschriebene Mitglied der AFP-Familie. Es wurde 1965 von Olsen et al.
im Zusammenhang mit Forschungen zum ebenfalls von A. giganteus sekretierten toxischen Lektin
alpha-Sarcin beschrieben [70, 71]. Es handelt sich um ein 5,8 kDa großes und 51 Aminosäuren (AS)
langes Peptid, welches über acht Cysteine verfügt [78] und dadurch eine mit vier Cysteinbrücken
stabilisierte fassförmige Tertiärstruktur mit amphipathischer Oberfläche aufweist (Abb. 7) [79].
Durch die enthaltenen 12 Lysine ergibt sich eine positive Ladung mit einem pI von 8.8.
Abbildung 7 – Struktur des antimykotischen Peptids AFP. Die linke Darstellung zeigt die
globuläre Peptidstruktur mit positiv geladenen Bereichen in Rot, negativ geladenen
Bereichen in Blau und hydrophoben Bereichen in Grau. Rechts daneben das Model der
Tertiärstruktur mit eingezeichneten β-Strängen als blaue Pfeile, dem γ-core in Rot und den
Cysteinbrücken in Gelb. Erstellt mit PyMOL [80].
Die Tertiärstruktur besteht aus fünf antiparallelen Beta Strängen (Abb. 7) [81] und ist sehr
widerstandsfähig gegenüber hohen Temperaturen [82], Kälte, pH-Werten (2-10) und Proteasen
[79]. Als weitere Besonderheit findet man im prozessierten Peptid zwei γ-core Motive (Abb. 8) [76],
die deutlich auf eine Interaktion mit Membranen hinweisen. Der erste γ-core entspricht der
„dextromeric isoform“ mit dem Sequenzmotif NH2***[X1-3]- [GXC]-[X3-9]-[C]***COOH. Der zweite γ-
core folgt dabei dem beschriebenen Motiv „levomeric isoform 2“ NH2***[C]-[X3-9]-[GXC]-[X1-
3]***COOH (Abb. 8).
23
Abbildung 8 - Primärstruktur von AFP. Signalpeptid blau unterlegt, Propeptid grün
unterlegt, prozessiertes Peptid gelb unterlegt und γ-core in roten Boxen.
Nach der ribosomalen Synthese besteht das 94 AS lange Peptid aus einem 21 AS langen
Signalpeptid, gefolgt von einem 22 AS langem Propeptid, auf dass das eigentliche reife Peptid folgt
(Abb. 8) [69]. Das Signalpeptid dient dem gerichteten Transport des AFPs durch die
Sekretionsmaschinerie. Die Funktion des Propeptides ist vermutlich die Steuerung der
Peptidaktivität. Es wird in einem mehrstufigen Prozess von teilweise noch unbekannten Enzymen
proteolytisch abgespalten. Dabei entsteht zunächst, durch die N-terminale Abspaltung von 16 AS
eine schwach aktive Form des AFP, das large form AFP (lf-AFP) [83]. In einem weiteren Schritt
werden die restlichen sechs AS des Propeptides abgespalten und das aktive AFP entsteht. Bei
Versuchen zur rekombinanten Herstellung des AFP in P. pastoris konnte ebenfalls die Reduzierung
der Aktivität durch verbleibende AS vor dem N-terminus des prozessierten Peptids gezeigt werden
[84]. AFP wurde unter anderem bereits erfolgreich als Pestizid gegen Fusarien spp. getestet [85].
Interessanterweise gibt es in verschiedenen A. giganteus Stämmen leicht unterschiedliche AFP
Varianten mit unterschiedliche starker antimikrobieller Aktivität [86]. Diese hohe Varianz des afp
Gens zwischen verschiedenen A. giganteus Isolaten lässt auf die Existenz von für die Funktionalität
konservierten und von weniger wichtigen Bereichen in der Primärstruktur schließen, wie es auch
für andere AMPs beschrieben ist [87]. Die Ergebnisse früherer Studien ließen die Schlussfolgerung
zu, dass sich die Disulfidbrücken im AFP zwischen verschiedenen Cysteinen bilden können und
daher Isomere des Proteins entstehen [79].
Antifungale Aktivität und Regulation der Genexpression von AFP aus A. giganteus 2.4.1.
Es wurde in mehreren Versuchsreihen bestätigt, dass AFP nur gegen filamentöse Pilze wirkt [69,
82]. Es verursacht keine Schäden bei pflanzlichen, tierischen oder bakteriellen Zellen [69]. Auch
Hefen sind weitgehend resistent gegen die, je nach Konzentration, fungistatische oder fungizide
Wirkung [88]. Der Promotor des afp ist im älteren Myzel einer A. giganteus Kolonie aktiv [89] und
seine Aktivität kann durch die Wahl der Stickstoff- und Kohlenstoffquelle beeinflusst werden [89].
Neben anderen wurden Pepton als Stickstoffquelle und Saccharose als Kohlenstoffquelle als stark
afp-induzierend identifiziert [89]. Medium mit neutralem bis basischen pH (pH 7-8) ist ebenfalls für
die Bildung des AFPs nötig [89]. Zusätzlich fördert eine Temperaturerhöhung um 37 °C die Aktivität
des AFP Promotors stark. Hier ist der Zeitpunkt des Temperaturstresses wichtig. Er sollte in der
eigentliche Produktionsphase des AFPs liegen, nach ca. 46 Stunden Kultivierung bei 28 °C [89].
Auch andere Stressbedingungen wie 1 M NaCl, 10 % Ethanol und Kohlenstofflimitierung induzieren
den AFP-Promotor. Hingegen wirken die Zugabe von Wasserstoffperoxid oder eine
Stickstofflimitierung unterdrückend auf die Promotoraktivität [89]. Die Anwesenheit von 100 mM
Natriumphosphat verringert die AFP Ausbeute stark, wobei hier der Grund entweder eine
24
Repression des Promotors oder eine Inhibierung nach der Transkription der DNA sein kann. Auch
durch die Ko-Kultivierung von A. giganteus mit anderen Organismen kann die Aktivität des AFP-
Promotors beeinflusst werden. Hier ergibt sich jedoch kein eindeutiges Bild, da filamentöse Pilze
sowohl zur Inhibierung (A. niger), als auch zur Induktion (F. oxysporum) führen können [90]. Das
gleiche gilt für die getesteten Hefen und Bakterien. Teilweise kann der Effekt durch die von den ko-
kultivierten Pilzen ausgelösten pH-Wert-Veränderungen im Medium erklärt werden. Weiterhin ist
er vom gewählten Medium, vor allem der Stickstoffquelle, abhängig [86].
Trotz theoretisch vorhandener Glycosylierungsstellen handelt es sich beim AFP um ein nicht
glycolysiertes Peptid [88]. Die antimykotische Wirkung von AFP wird durch Kationen negativ
beeinflusst und erhöht z.B. die zur Wachstumshemmung von A. niger nötigen Konzentrationen um
das 40- (100 mM NaCl) bis 400-fache (100 mM MgCl2) [82]. Zweiwertige Kationen wirken hier
stärker als einwertige. Der Einfluss kann mit der Konkurrenz des kationischen AFPs mit den
Kationen an seinem Wirkungsort, der Zelloberfläche [69], erklärt werden. AFP wirkt bei sensitiven
Schimmelpilzen wie A. niger mittels Membranpermeabilisierung [69] und letztendlich durch die
Zerstörung der Zellstrukturen. Morphologische Änderungen, wie das Anschwellen der
Hyphenspitzen und Veränderungen der Zellmembran, besonders in der Region der Hyphenspitze,
[69] sind zu beobachten. Interessanterweise kommt es bei resistenten Pilzen auch zur Anlagerung
von AFP an die Zellwand und -membran [88]. Es hat dort aber keinen permeabilisierenden Effekt
und wird später sogar in die Zelle aufgenommen, ohne sich negativ auf das Wachstum
auszuwirken. Die Bindung von AFP an Phosphatidylserin (DMPS) haltige Vesikel, jedoch nicht an
zwitterionische Phosphatidylcholin (DMPC) Vesikel, [81] zeigt den Einfluss von elektrostatischen
Wechselwirkungen für die Bindung an Membranen.
Bei der Untersuchung von verschiedenen AFP Formen [91] wurde gezeigt, dass die acetylierte AFP-
Variante das Zellwandpolymer Chitin schlechter bindet als die natürliche Form. Die Aktivität des
AFPs wird jedoch von allen getesteten Varianten am stärksten durch die Acetylierung (120-fach
erhöht) [91]. Die nitrierte Form (Tyrosine) und die verkürzte Form des AFP (AS 1-33) zeigen eine
50-fach reduzierte antimykotische Aktivität [92]. Da bekannt ist, dass die Cysteinbrücken für die
Sekundärstruktur und Stabilität des AFPs wichtig sind, ist bei diesen Ergebnissen eher von einer
unzureichenden Blockierung der Cysteine, als von einem wirklichen Effekt auszugehen.
2.5. Die Zellwand und Plasmamembranen von Pilzen als antimykotischer Wirkort
Die Bildung eines Myzels beginnt bei Aspergillus spp. mit dem Auskeimen der Konidiosporen [3].
Diese zu tausenden an Konidiophoren asexuell gebildeten Sporen sind auf Grund ihres Aufbaus und
ihrer hydrophoben und stark gefärbten Oberfläche perfekt an die Verbreitung in der Luft angepasst
[93]. Bei geeigneten Umweltbedingungen beginnen die Sporen zu keimen [94]. Das ist ein
komplexer Vorgang, der die Rückbildung der stabilen Sporenzellwand beinhaltet und den Start
vieler metabolischer Prozesse. Die aus der Spore sprießende Hyphe verzweigt sich zunehmend und
25
bildet über die Zeit ein komplexes Mycel mit unterschiedlichen Bereichen [95]. Einem
physiologisch wenig aktiven zentralen Bereich und dem hochaktiven peripheren Bereich. Eines der
aktivsten und interessantesten Hyphenkompartimente stellt der Spitzenkörper dar [96], ein
Bereich an der Hyphenspitze, in den ein Großteil des intrazellulären Proteintransportes mittels
Vesikeln entlang des Zytoskeletts fließt [96], und aus dem die amorphen Struktur die
hochkomplexe Zellwand und Zellmembran gebildet wird (Abb. 9). Der Innendruck einer Hyphe ist
hoch (3 - 80 bar [97]) und treibt neben anderen Prozessen das apikale Wachstum voran [98]. Die
Zellwand filamentöser Pilze ist strukturiert und mehrschichtig aufgebaut (Abb. 9) [99]. Direkt auf
der Plasmamembran liegt das Exoskelett aus dem Polymer Chitin, β-1,4 verbundenem N-
Acetylglucosamin. Damit verbunden und hauptsächlich darüber liegt ein Bereich bestehend aus β-
1,3-Glucan, das mit α-1,3-Glucan verbunden ist. Die äußere Schicht auf der Zellwand sind die mit
Glucan verknüpften Mannoproteine (Abb. 9).
Abbildung 9 - Aufbau der pilzlichen Zellwand nach Yoshimi A. et al. ,2017 [100]. Von oben
nach unten: hellblaue Linien = Extrazelluläre Matrix, Orangene Linien = α-1,3-Glucan;
dunkelblaue Linien = β-1,3/ β-1,6-Glucan, gelbe Linien = Chitin, graue Linien = andere
Polysaccharide wie z.B. Galactosaminogalaktan, Galactomannan.
Eine mögliche Unterteilung der Zellwandbestandteile ergibt sich durch den Aufschluss mit heißer
Alkali-Lösung. Man spricht von einer alkali-löslichen Fraktion [101] , die aus linearen α-1,3-Glucan
Ketten besteht, die alle 100 Einheiten mit α-1-4 verlinkter Glucose verbunden sind, Galaktomannan
and Galaktosaminogalaktan umfasst und das Verbundmaterial zwischen den Fasern der Zellwand
bildet [101]. Die alkali-unlösliche Fraktion [102], die aus verzweigtem β-1,3-Glucan besteht, ist mit
Chitin, β-1,3/ β-1,4-Glucan und β-1,5-Galacto-α-1-2/ α-1-6-Mannan kovalent verbunden und bildet
den Faserkern der Zellwand [101, 103]. Interessanterweise ist der Aufbau der amorphen alkali-
löslichen Fraktion artspezifisch [101]. Leider ist nur wenig über die Prozesse beim Auf- und Umbau
der Zellwand bekannt. Die Prozesse zum Aufbau des nötigen Gleichgewichts zwischen
hydrolytischen und synthetisierenden Prozessen sowie für den Anstieg des osmotischen Drucks,
nötig für Plastifizierung der Zellwand, sind Großteils noch nicht verstanden [101]. Die Regulation
von Prozessen, die für die Keimung von Konidien und Hyphenverzweigung nötig sind, ist ebenfalls
noch Bestandteil der Forschung [101]. Bei genauerer Betrachtung erscheint die Zellwand jedoch
26
wesentlich plastischer als erwartet [99]. Sie kann bei Änderungen der Umweltbedingungen
spezifisch angepasst werden. So bildet z.B. A. fumigatus unter Glucoselimitierung weniger β-1,3-
Glucan, was ihn auch unempfindlicher gegenüber Echinocandinen macht [104]. Ein anderes
Beispiel ist die Lokalisierung des α-1,3-Glucans. In Flüssigkultivierungen findet man es vor allem im
mittleren Bereich der Zellwand, wohingegen es bei Feststoffkultivierungen vor allem im äußeren
Bereich der Zellwand zu finden ist [105, 106]. Diese Plastizität verursacht auch unterschiedliche
Empfindlichkeiten gegenüber antimykotischen Medikamenten [101, 107, 108]. Die zugrunde
liegenden Regulationsmechanismen werden über verschiedene Signaltransduktionswege
sichergestellt. Dazu gehören der cell wall integrity (CWI)-Weg, der Hog-Weg oder der Calzineurin-
Weg [100]. Als Reaktion auf die Blockade eines Teils der Synthesemaschinerie der Zellwand erfolgt
entweder i) eine Neuregulation von Enzymen der gleichen Familie (z.B. agsA für die β-1,3-
Glucansynthese) [109], ii) eine Kompensation durch Zellwandpolymersynthasen einer anderen
Familie (z.B. Hemmung der Glucansynthese durch Steigerung der Chitinsynthese) [104], oder iii) die
Aktivierung eines komplett anderen metabolischen Weges (z.B. Bildung einer Polysaccharidschicht
auf der Oberfläche von Konidien nach Deletion von Chitin- und Glucansynthasen) [110, 111]. Es
kann natürlich auch zur Aktivierung mehrerer kompensatorischer Wege kommen.
Die Plasmamembran besteht bei filamentösen Pilzen hauptsächlich aus einer Phospholipid-
Doppelschicht, die aus Glycerolphospholipiden mit darin eingebetteten Sphingolipiden, Sterolen
und Membranproteinen besteht [112]. Eine Besonderheit in pilzlichen Zellen, die auch als
Angriffsziel von antimykotischen Substanzen (Imidazole, Triazole) genutzt wird, ist das
Vorhandensein von Ergosterol [113], anstatt von Cholesterol wie bei tierischen Zellen. Bei Pilzen,
wie auch bei anderen Lebewesen, hat die Plasmamembran keinen statischen Aufbau. Die
Plastizität der Zellmembran, in der sich Orte verschiedener Konzentration von z.B.
Glycosylceramiden (GlyCer) bilden können, wird mit der Theorie der lipid rafts [114] beschrieben.
Dort kommt es zu einer lokalen Konzentration von hauptsächlich Transportproteinen, ATPasen,
Proteinen für die Signalweiterleitung und die Zellwand- und Zellskelettsynthese [112]. Die lokale
Struktur der Plasmamembran beeinflusst dabei die Aktivität der enthaltenen Proteine und kann
sich über die Zeit auch verändern [115]. Die genaue Zusammensetzung der Zellmembran ist, wie
bei der Zellwand (Abb. 9), je nach Art [116] und Entwicklungsstatus des Mycels unterschiedlich
[112]. Das filamentöse Wachstum von Schimmelpilzen führt zu unterschiedlich aufgebauten
Zellwänden und Zellmembranen innerhalb einer Kolonie, die eine höhere Flexibilität und
Widerstandsfähigkeit gegenüber Umwelteinflüssen bewirken. Die im Zusammenhang mit AFP
interessanten Chitin- und Glucansynthasen sind als membranständige Enzyme ebenfalls in die
Plasmamembran der Zelle eingebettet (Abb.9). Es wird vermutet, das auch diese
Membranproteine in „lipid rafts“ akkumulieren und diese spezifische Membranumgebung für eine
korrekte Funktion benötigen [117, 118].
27
Glycosylceramide 2.5.1.
Ein wichtiger Bestandteil von eukaryotischen Plasmamembranen sind Sphingolipide [119], eine
Untergruppe der Ceramide [120]. Sie bestehen aus einem ungesättigten Aminoalkohol, dem
Sphingosin, das über eine Amidbindung mit einer Fettsäure verbunden ist. Sie kommen in allen
Eukaryoten vor Sphingolipide sind als Rezeptor- und Botenmoleküle in eine Vielzahl
physiologischer Prozesse eingebunden. Sie sammeln sich in sterolreichen Umgebungen an und
beeinflussen die Funktion von Membranproteinen [121]. Es wurde gezeigt, dass sie bei der
Vermittlung von Zell-Zell Interaktionen, der Seneszenz, der Differenzierung von Zellen, der
Apoptose, dem Zellzyklus und der Proliferation, der Mitogenese, bei Entzündungsreaktionen, der
Migration von Zellen und der Angiogenese eine Rolle spielen [122]. Sie sind außerdem wichtig für
das polare Wachstum in Pilzen und Pflanzen [123, 124]. Wenn die der Amidbindung nächste
Hydroxylgruppe mit einem Zucker durch eine glykosidische Bindung verbunden ist, handelt es sich
um ein Glycosylceramid (GlyCer) (Abb. 10).
Abbildung 10 - Grundstruktur der Ceramide. Der Buchstabe R bezeichnet den
Fettsäurerest, der je nach Organismus eine andere Kettenlänge haben kann [120].
Pilzmembranen besitzen GlyCer, die entweder ein Glucose- oder Galaktosemolekül als
Zuckereinheit haben (Abb. 11) [125]. Weiterhin unterscheiden sie sich von denen in Tieren und
Pflanzen durch die C9-Methylierung, unterschiedliches Vorkommen von Doppelbindungen und die
Länge des Fettsäurerestes. Ihre Synthese findet im ER statt [125]. Eine Besonderheit innerhalb der
filamentösen Pilze ist die C3-Doppelbindung des Fettsäurerestes, ausgelöst durch das Enzym 2-
Hydroxy-Fettsäure-N-Acyl-Δ3(E)-Desaturase. Sie kommt nicht bei allen filamentösen Pilzen vor
[125]. In Abbildung 11 ist die Struktur eines GlyCer mit rot markierter Doppelbindung am C3-Atom
Fettsäure dargestellt.
28
Abbildung 11 – Pilzliche Glycosylceramide haben ein Glucose- oder Galaktosemolekül als
Zuckergruppe, das mittels glykosidischer Bindung an die Sphingobase gekoppelt ist. An
diese ist auch mittels Amidbindung der Fettsäurerest gekoppelt. Die vom Enzym 2-Hydroxy
Fettsäure N-Acyl-3(E)-Desaturase katalysierte Doppelbindung ist rot markiert [126].
Die GlyCer von Pilzen (Abb. 11) spielen auch in entwicklungsgeschichtlich voreinander entfernten
Gattungen allgemein eine wichtige Rolle, z.B. bei der Pathogenese von z.B. Candida, Aspergillus
[127], Cryptococcus, Penicillium [128] und Fusarium [129].
29
Abbildung 12 - Syntheseweg der Glycosphingolipidstruktur (GSL) nach [124]. Die
enzymatischen Schritte Nr. 3.x führen häufig zur Synthese von sauren (GIPCs) und neutralen
(GlyCer) GSL. Die Syntheseschritte danach mit Nummer 4.x ergeben in der Regel neutrale
GSL und die unter Nummer 5.x. saure GSL.
2-Hydroxy Fettsäure N-Acyl-3(E)-Desaturase 2.5.2.
Alle Syntheseschritte von funktionellen Gruppen am Ceramidgerüst (Abb. 12), außer das Binden
der C9-Methylgruppe, werden von Desaturasen bzw. Hydroxylasen durchgeführt. Dabei handelt es
sich um membrangebundene Proteine mit vier Transmembrandomänen. Mitglieder dieser
Enzymfamilie lassen sich durch das Vorhandensein von drei Histidinboxen HX3-4HH, HX2-3HH und
(H/Q)X2-3HH [130] identifizieren. Sie sind im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert und hier
findet daher auch die Bildung der Glycosylceramide statt. Ihr aktives Zentrum besteht aus zwei
Eisenatomen, die während der katalytischen Reaktion mehrere Oxidationsstufen unter Bindung
von zwei Sauerstoffatomen durchlaufen [131]. Die Bildung von Δ3(E)-ungesättigten Fettsäuren
30
findet durch Fettsäure-Δ3(E)-Desaturasen statt. Sie bilden einen eigenen Ast im phylogenetischen
Baum der Desaturasen [125] und kommen in vielen Organsimen vor. Obwohl diese Position der
Doppelbindung in Fettsäuren an sich nicht ungewöhnlich ist und zum Beispiel in
Phosphatidylglycerol (PG) aus pflanzlichen Plastiden gefunden werden kann, ist sie in
Sphingolipiden einmalig für die Gruppe der Euascomyceten [126]. Somit lässt sich die Subfamilie
der Δ3(E)-Desaturasen weiter eingrenzen. Die zugehörigen Enzyme weisen drei hochkonservierte
Histidinboxen auf. Weiterhin ist der Abstand zwischen den ersten beiden Histidinboxen 33 AS lang
und es ist keine Cytochromb5-Domäne vorhanden. Der experimentelle Nachweis gelang Zäuner et
al. 2008 [125].
3. Ziele dieser Arbeit
Diese Arbeit soll Erkenntnisse aus vorherigen Untersuchungen zum AFP vertiefen und erweitern.
Das Verständnis der Wirkweise des antifungalen Peptides ist grundlegend für dessen Anwendung
als Fungizid oder auch Antimykotikum. Die zunehmende Anzahl an Resistenzen gegen etablierte
Wirkstoffe macht die Entwicklung neuer Wirkstoffklassen zur Erhaltung der ausreichenden
Versorgung einer wachsenden Weltbevölkerung mit Nahrungsmitteln und zur Behandlung von
Mykosen notwendig. Die antifungalen Peptide mit den an den besten erforschten Mitgliedern der
AFP-Familie, können hier einen wichtigen Beitrag leisten. Sie sind als natürliche, selektive und
evolutionsbiologisch entwickelte Wirkstoffe sehr gut umweltverträglich und eine schnelle
Resistenzentwicklung ist unwahrscheinlich.
3.1. Optimierung der Herstellung und Reinigung von AFP in homologen und heterologen
Expressionssystemen
Eine grundlegende Voraussetzung für das Erreichen dieser Ziele ist die Herstellung und Reinigung,
sowie das Überprüfen der Reinheit und Trennung möglicher AFP-Varianten. Die Bildung von lf-AFP
und sf-AFP kann mittels Nutzung heterologer Expressionssysteme verhindert werden. Daher sollte
die Synthese des AFPs mit der Hefe P. pastoris etabliert werden. Das erhaltene AFP sollte dann
weiter per Kationenaustauscher gereinigt und dann mittels HPLC und Wirksamkeitsstudien anhand
geeigneter Teststämme überprüft werden.
3.2. Charakterisierung der Wirkweise von AFP
Neuere Erkenntnisse zum Aufbau der Pilzmembranen und der Bedeutung der Glycosylceramide für
die Wirkung von antimikrobiellen Peptiden legten Versuche nahe, um einen möglichen
Zusammenhang zwischen AFP-Wirkweise und GlyCer abhängiger Zusammensetzung pilzlicher
Plasmamembranen zu untersuchen. Daher sollte das für die spezifische Δ3-Desaturierung in
pilzlichen GlyCer verantwortlichen Enzym in A. niger identifiziert werden. Es wurde die Deletion
dieses Gens in A. niger und die Expression des Gens in P. pastoris und S. cerevisiae durchgeführt. Es
31
sollte gezeigt werden, dass die C3-C4 Doppelbindung in den GlyCer durch das Enzym und nicht das
Enzym selbst für die Änderung der AFP-Empfindlichkeit verantwortlich ist. Es sollte auch die
chemische Inhibierung der GluCer Synthese auf ihren Einfluss auf die Wirkung von AFP überprüft
werden.
3.3. Genom- und Transkriptomanalysen für Funktionsanalysen der AFP-Familie
Durch eine pBLAST-Suche zur Identifizierung von AFP-Orthologen und der Abgleich der Struktur der
erhaltenen Peptide wurden über 50 Mitglieder der AFP-Familie identifiziert und ein allgemeines
Schema zum Aufbau der Peptide abgeleitet. Durch die Auswertung der fachgebietseigenen
Transkriptomdatenbank bezüglich anafp aus A. niger unter 155 verschiedenen Kulturbedingungen
sollten Erkenntnisse über intrazelluläre Prozesse, in denen AnAFP eine Rolle spielt, generiert
werden. Für ausgewählte Prozesse sollten die Vorhersagen in vivo überprüft und dafür die
Auswirkung auf die anafp-Promotor Aktivität mit Reporterstämmen untersucht werden.
32
4. Material und Methoden
4.1. Chemikalien
Wenn nicht anders erwähnt wurden die in der Arbeit verwendeten Chemikalien von den Firmen
Merck KGaA, Fluka, VWR International, Carl Roth GmbH+Co, KG, Sigma Aldrich, Serva, Roche oder
Biozyme genutzt. Sie entsprachen den gängigen Laborstandards und der für den Versuch nötigen
Reinheit von über 99 %. In Tabelle sind die Chemikalien aller anderen Hersteller/ Zulieferer
aufgeführt.
Chemikalie
Hersteller
Artikelnr.
6x DNA Ladepuffer
Thermo Fisher Scientifc
R0611
Ampicilliun Natriumsalz
Applichem
A0839.0025
Bromphenolblau
Amersham Biosciences
17-1329-01
BSA
Pharmacia
27-8915-01
Casaminosäuren
BD Biosciences
223050
Chitin
Fluka
dNTPs
Thermo Fisher Scientifc
R0181
Midorigreen
Nippon Genetics Europe
MG04
Natriumsulfat
Merck-Schuchardt
822286
Superdex 75 pg
GE Healthcare Life Sciences
28989334
TRIzol
Invitrogen
15596026
Hefeextrakt
Ohly
10901006
33
4.2. Enzyme
Enzym
Hersteller
Artikelnummer
DNAse
Invitrogen
AM2222
Lyseenzym von Trichoderma
Sigma Aldrich
L1412-25G
Phusion DNA Polymerase
Thermo Fisher Scientific
F530L
Q5 DNA polymerase
NEB
M0491S
Restriktionsenzyme
Thermo Fisher Scientific
RNAse I
Carl Roth GmbH+Co. KG
7164,2
T4 DNA Ligase
Thermo Fisher Scientific
EL0012
T5 Exonuklease
epicentre
T5E4111K
Taq DNA Ligase
NEB
M0208L
4.3. Größenmarker
Marker
Hersteller
Artikelnr.
Gene ruler DNA ladder mix
Thermo Fisher Scientifc
SM0331
Low range unstained protein marker
Fermentas
SM0431
4.4. Antikörper
Tab. 5 - Antikörper
Name
Tier
Art
Target
Firma
AFP-Antikörper
Kaninchen
polyklonal
natives AFP
IPK Gatersleben
Anti-Kaninchen-
HRP
Ziege
polyklonal
Kaninchen-
AK
Dako
Anti-DIG
Maus
monoklonal
DIG
Invitrogen
34
4.5. Puffer und Lösungen
Alle Lösungen und Puffer wurden mit Reinstwasser aus einer PURELAB® Classic Anlage der Firma
ELGA LabWater hergestellt.
Tab. 6 – DNA-Puffer
DNA-Extraktionspuffer, 50 ml
SOP 17, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,5 %
SDS
10 %
2,5 ml
0,2 M
Tris HCl, pH 8,0
1 M
10 ml
0,025 M
EDTA, pH 8,0
0,5 M
2,5 ml
0,25 M
NaCl
2 M
6,25 ml
Auffüllen auf 50 ml
Wasser
28,75 ml
50x TAE-Puffer, 1000 ml
SOP 6, 2. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
2 M
Tris
121,14 g/mol
242 g
100 mM
EDTA
0,5 M pH 8,0
200 ml
1 M
Natriumacetat
82,03 g/mol
82,03g
Auffüllen auf 700 ml
Einstellen des pH auf 8,3 mit
Essigsäure.
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser
10x Ladepuffer, 100 ml
SOP 6, 2. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
50 % (w/v)
Glycerin
100 %
50 ml
50 mM
EDTA
0,5 M, pH 8,0
10 ml
0,1 %
Bromphenol blue
100 %
0,1 g
Auffüllen auf 100 ml
Wasser
Tab. 7 – Gibson-Klonierung
5x Isopuffer
SOP 13, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
Tris-HCl pH 7,5
1 M
3 ml
MgCl2
2 M
150 µl
dGTP
100 mM
60 µl
dATP
100 mM
60 µl
35
dTTP
100 mM
60 µl
dCTP
100 mM
60 µl
DTT
1 M
300 µl
31,25 mM
PEG-8000
1,5 g
NAD
100 mM
300 µl
Auf 6 ml auffüllen
Wasser
Ligationsmix
SOP 13, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
5x Isopuffer
320 µl
T5 Exonuklease
10 U/µl
0,64 µl
Phusion DNA Polymerase
2 U/µl
20 µl
Taq-Ligase
40 U/µl
160 µl
Auf 1,2 ml auffüllen
Wasser
Tab. 8 – RNA-Isolation
100mM Natriumphosphatpuffer pH 7,
1000ml
SOP 11, 3. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1 M
NaH2PO4
107 g/mol
39 ml
1 M
Na2HPO4
127 g/mol
61 ml
Wasser
900 ml
Einstellen des pH auf 7,0 mit
NaH2PO4/Na2HPO4
Glyoxalladepuffer, 100 ml
SOP 11, 3. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Anteil für 100 ml
50 %
Glycerin
50 ml
10 mM
Natriumphosphatpuffer
10 ml des 100 mM
Natriumphosphatpuffers pH 7
0,25 %
Bromphenolblau
0,25 g
0,25 %
Xylencyanol FF
0,25 g
Tab. 9 - Transformation Aspergillus niger
SMC, 1000 ml
SOP 3, 8. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1,33 M
Sorbitol
182 g/mol
242,32 g
50 mM
CaCl2
5 M
10 ml
36
20 mM
MES Puffer, pH 5,8
200 mM
100 ml
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser
TC, 1000 ml
SOP 3, 8. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
50 mM
CaCl2
5 M
10 ml
10 mM
Tris/HCl, pH 7,5
1 M
10 ml
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser
STC, 1000 ml
SOP 3, 8. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1,33 M
Sorbitol
182,2 g/mol
242,32 g
Auffüllen auf 1000
ml
TC
PEG-6000 Puffer, 30 ml
SOP 3, 8. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
25 %
PEG-6000
250 g/L
7,5 g
Auffüllen auf 30 ml
TC
Protoplastierungslösung, 10 ml
SOP 3, 8. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,2 %
Lyseenzym
200 mg
Auffüllen auf 10 ml
SMC
pH auf 5,6 mit 1 M NaOH ,
filtersterilisieren
Tab. 10 – Southern-Blot
Neutralisationspuffer, 2000 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1,5 M
NaCl
58,44 g/mol
175,32 g
0,5 M
Tris
121,14 g/mol
121,14 g
Auffüllen auf 1700
ml
Einstellen des pH auf 7,0 mit
rauchender HCl
Auffüllen auf 2000
ml
Wasser
37
20x SSC, 2000 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
3 M
NaCl
58,44 g/mol
350,64 g
300 mM
Trinatriumcitrat
258,06 g/mol
154,83 g
Auffüllen auf 1700
ml
Einstellen des pH auf 7,0 mit
HCl
Auffüllen auf 2000
ml
Wasser
Hybridisierungspuffer, 250 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1 M
NaCl
58,44 g/mol
14,66 g
1 % (w/v)
SDS
100 %
2,5 g
10 %
Dextransulfat
100 %
25 g
Auffüllen auf 250 ml
Wasser
Puffer mit hoher Stringenz, 1000 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,5x
SSC
20x
25 ml
0,1 % (w/v)
SDS
10 %
10 ml
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser
Puffer mit niedriger Stringenz, 1000 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
2x
SSC
20x
100 ml
0,1 % (w/v)
SDS
10 %
10 ml
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser
Waschpuffer, 1000 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,3 %
Tween 20
100 %
3 ml
Auffüllen auf 1000
ml
Maleinsäurepuffer
Maleinsäurepuffer, 2000 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
38
100 mM
Maleinsäure
116,07 g/mol
23,2 g
150 mM
NaCl
58,44 g/mol
17,53 g
Auffüllen auf 1700
ml
Wasser und Einstellen des pH
auf 7,5 mit NaOH
Auffüllen auf 2000
ml
Wasser
10x Blockierungspuffer, 100 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
10 %
Blocking Reagenz (Roche)
100 %
10 g
Auffüllen auf 80 ml
Maleinsäurepuffer (vorsichtig
erhitzen bis gelöst)
Auffüllen auf 100 ml
Maleinsäurepuffer (vorsichtig
erhitzen bis zur Lösung)
1x Blockierungspuffer, 50 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1x
Blockierungspuffer
10x
5 ml
Auffüllen auf 50 ml
Maleinsäurepuffer
Antikörperlösung, 10 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
Auffüllen auf 10 ml
Blockierungspuffer
Anti-DIG-AP
100 %
1 µl
Detektionspuffer, 1000 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
100 mM
Tris-HCl, pH 9,5
1 M
100 ml
100 mM
NaCl
5 M
20 ml
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser
CDP-star Lösung, 0,5 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
Detektionspuffer
495 µl
CDP-star
5 µl
Entfernungslösung, 500 ml
SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
39
200 mM
NaOH
2 M
0,1 %
SDS
Auffüllen auf 500 ml
Wasser
Tab. 11 - Herstellung chemisch kompetenter E. coli
Tfb I, 200 ml
SOP 4, 2. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
30 mM
Kaliumacetat
98,15 g/mol
0,58 g
100 mM
RbCl2
120,92 g/mol
2,42 g
10 mM
CaCl2
147,02 g/mol
0,29 g
50 mM
MnCl2*4H2O
197,91 g/mol
1,97 g
15 %
Glycerin
100 %
30 ml
Einstellen des pH auf 5,8 mit
Essigsäure
Auffüllen auf 200 ml
Wasser, filtersterilisieren
Tfb II, 100 ml
SOP 4, 2. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
10 mM
MOPS
209,26 g/mol
0,21 g
10 mM
RbCl2
120,92 g/mol
0,12 g
75 mM
CaCl2
147,02 g/mol
1,1 g
15 %
Glycerin
100 %
15 ml
Einstellen des pH auf 6,5 mit
NaOH
Auffüllen auf 100 ml
Wasser, filtersterilisieren
Tab. 12 – Luciferase-Messung
Luciferin, 10 ml
SOP 15, 1, Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
25 mM
Wasser, filtersterilisieren
318,4 g/mol
79,6 mg in
10ml Wasser
Tab. 13 – Glucan-Messung
Anillinblaulösung, 50 ml
SOP 22, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,067 %
Anillinblau
6,7 mg/ml in MQ
50 µl
0,98 M
Glycin
3,678 g
40
0,35 M
HCl
6 M
2,92 ml
Erst 3,678 g Glycin in 40 ml Wasser lösen, dann Einstellen des pH 9,8 mit NaOH, HCl
zugeben, mixen vor Zugabe des Anillinblaus, auffüllen auf 50 ml mit Wasser,
Curdlan Stock, 1 ml
SOP 22, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1 mg/ml
Curdlan
1 mg
Auffüllen auf 1ml
1M NaOH
Tab. 14 – Chitin-Messung
1M NaCl, 100ml
SOP 23, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1 M
NaCl
5,884 g
Auffüllen auf 100 ml
Wasser
6M HCl, 100ml
SOP 23, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
6 M
HCl
12,019 mol/L
50 ml
Auffüllen auf 100 ml
Wasser
Zellwandextraktionspuffer, 10ml
SOP 23, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,2 %
SDS
10 %
0,2 ml
5 mM
EDTA
0,5 M
0,1 ml
100 mM
β-Mercapthoethanol
1 M
1 ml
Auffüllen auf 10 ml
Wasser
8,7 ml
Lösung A, 1 ml
SOP 23, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,75 M
Na2CO3
3,75 M
0,2 ml
4 % (v/v)
Acetylaceton
100 %
0,04 ml
Auffüllen auf 1 ml
Wasser
0,76 ml
Lösung B, 20 ml
SOP 23, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
p-
0,53 g
41
Dimethylaminobenzaldehyd
6 M
HCl
Konz. HCl (12 M)
10 ml
48 %
Ethanol
96 % Ethanol
10 ml
Glucosamin Stock
SOP 23, 1, Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1 mg/ml
Glucosamin
1 mg
Auffüllen auf 1 ml
Wasser
Tab. 15 - FPLC Kationenaustauscher
TE pH7, 1000 ml
SOP 23, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
10 mM
Tris/HCl
121,14 g/mol
1,2 g
1 mM
EDTA
1 M
1 ml
Auffüllen auf 800 ml
Wasser, pH 7einstellen mit
HCl
Auffüllen auf 1000
ml
Reinstwasser
10x PBS pH 7,4 ,1000 ml
SOP 1, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1.37 M
NaCl
58,44 g/mol
80 g
27 mM
KCl
74,55 g/mol
2 g
100 mM
Na2HPO4
141,96 g/mol
14,2 g
20 mM
KH2PO4
136,09 g/mol
2,7 g
Auffüllen auf 800 ml
Wasser, pH 7.4 einstellen mit
HCl/NaOH
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser
Eluent A ,1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
50 mM
Natriumacetat
82,03 g/mol
4,1 g
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser, pH 5
Eluent B ,1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
42
50 mM
Natriumacetat
82,03 g/mol
4,1 g
1,5 M
NaCl
58,44 g/mol
87,66 g
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser, pH 5
Tab. 16 - Tris-Tricin-SDS-PAGE
3x Gelpuffer, 100 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
3 M
Tris
121,14 g/mol
36,34 g
1 M
HCl
12 M
8,3 ml
0,3 %
SDS
10 %
3 ml
Auffüllen auf 100 ml
Wasser, pH 8,45 einstellen
Coomassiefärbelösung 1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1 %
Coomassie Blue R250
10 g
25 %
Methanol
250 ml
65 %
Wasser
650 ml
10 %
Essigsäure
100 ml
Entfärbelösung, 1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
25 %
Methanol
250 ml
65 %
Destilliertes Wasser
650 ml
10 %
Essigsäure
100 ml
Kathodenpuffer, 100 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1 M
Tris
121,14 g/mol
12,114 g
1 M
Tricin
179,17 g/mol
17,917 g
1 %
SDS
10 %
10 ml
Auffüllen auf 100 ml
Wasser, pH 8,25 einstellen
Anodenpuffer, 100 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1 M
Tris
121,14 g/mol
12,114 g
0,225 M
HCl
1 M
25,5 ml
43
Auffüllen auf 800 ml
Wasser, pH 8,9 einstellen
Ladepuffer, 10 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
300 mM
Tris/ HCl pH 6,8
5 M
0,6 ml
50 %
Glycerin
100 %
5 ml
10 %
SDS
288,4 g/mol
1 g
1 %
Bromphenolblau
0,1 g
25 %
Mercaptoethanol
2,5 ml
Auf 10 ml auffüllen
Wasser
Tab. 17 - Proteindetektion mit Antikörpern
Waschpuffer PBS-T, 1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
10 mM
Na2HPO4
100 mM
100 ml
2 mM
KH2PO4
20 mM
100 ml
137 mM
NaCl
1,5 M
91,3 ml
0,1 % (v/v)
Tween 20
Auf 1000 ml
auffüllen
Wasser, pH 7,4 einstellen
Blockierungspuffer, 1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
10 mM
Na2HPO4
100 mM
100 ml
2 mM
KH2PO4
20 mM
100 ml
137 mM
NaCl
1,5 M
91,3 ml
0,1 % (v/v)
Tween 20
1 ml
5 % (w/v)
Magermilchpulver
50 g
Auf 1000 ml
auffüllen
Wasser, pH 7,4 einstellen
Tab. 18 - Test der Lipid strips
TBS-T, 1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
10 mM
Tris-HCl pH 7,4
100 mM
100 ml
150 mM
NaCl
1,5 M
100 ml
0,1 % (v/v)
Tween 20
1 ml
44
Auf 1000 ml
auffüllen
Wasser
Blockierungspuffer, 1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
10 mM
Tris-HCl pH 7,4
100 mM
100 ml
150 mM
NaCl
1,5 M
100 ml
0,1 % (v/v)
Tween 20
1 ml
3 % (w/v)
BSA
30 g
Auf 1000 ml
auffüllen
Wasser
4.6. Medien
Falls nicht anders angegeben, wurde zur Herstellung fester Nährmedien 1,5 % Agar-Agar
hinzugegeben. Supplemente wurden in der Regel einzeln autoklaviert und danach hinzugegeben.
Falls sie filtersterilisiert werden müssen, ist es extra angegeben.
Transformationsplatten (10 Stück)
SOP 3, 8. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,95 M
Saccharose
342,3 g/mol
162,6 g
1,2 %
Agar
12 g/L
6 g
Auffüllen auf 490 ml
Wasser
1x
ASP+N
50x
10 ml
1x
Spurenelemente
1000x
0,5 ml
2 mM
MgSO4
1 M
1 ml
Top-Agar, 250 ml
SOP 3, 8. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,95 M
Saccharose
342,3 g/mol
81,3 g
0,6 %
Agar
12 g/L
1,5 g
Auffüllen auf 240 ml
Wasser
1x
ASP+N
50x
5 ml
1x
Spurenelemente
1000x
0,25 ml
2 mM
MgSO4
1 M
0,5 ml
Psi Brühe, 1000 ml
SOP 4, 2. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
45
0,5 %
Hefeextrakt
5 g
2 %
Pepton
20 g
0,5 %
MgSO4*7H20
246,48 g/mol
5 g
Einstellen von pH 7,6 mit
KOH
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser, filtersterilisieren
LB, 1000 ml
SOP 5, 2. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,5 %
Hefeextrakt
5 g
1 %
Peptone
10 g
0,5 %
MgSO4*7H20
246,48 g/mol
5 g
Einstellen des pH auf 7 mit
NaOH
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser, filtersterilisieren
2x YPG, 100ml
SOP 19, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,6 %
Hefeextrakt
0,6 g
2 %
Pepton
2 g
4 %
Glucose
4 g
Auffüllen auf 100 ml
Wasser
Einstellen des pH 4,5 für filamentöse Pilze und pH 6 für Hefen.
BMMY, 1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1 %
Hefeextrakt
10 g
2 %
Pepton
20 g
100 mM
Kaliumphosphat, pH 6
1 M
100 ml
1,34 %
YNB
134 g/L
100 ml
4*10-5 %
Biotin
200 g/L
2 ml
0,5 %
Methanol
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser
BMGY, 1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1 %
Hefeextrakt
10 g
46
2 %
Pepton
20 g
100 mM
Kaliumphosphat, pH 6
1 M
100 ml
1,34 %
YNB
134 g/L
100 ml
4*10-5 %
Biotin
200 mg/L
2 ml
1 %
Glycerin
100 ml/L
100 ml
Auffüllen auf 1000
ml
Wasser
CM Agar, 100 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
ASP+N
50x
2 ml
1 %
Glucose
50 %
2 ml
2 mM
MgSO4
1 M
0,2 ml
Spurenelementelösung
1000x
0,1 ml
0,1 %
Casaminosäuren
10 %
1 ml
0,5 %
Hefeextrakt
10 %
5 ml
Auffüllen auf 100ml
Wasser
MM Agar, 100 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
ASP+N
50x
2 ml
1 %
Glucose
50 %
2 ml
2 mM
MgSO4
1 M
0,2 ml
Spurenelementelösung
1000x
0,1 ml
Auffüllen auf 100 ml
Wasser
50 x Asp+N, 100 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
0,35 mM
KCl
2,61 g
550 mM
KH2PO4
7,48 g
3,5 M
NaNO3
29,75 g
Auffüllen auf 100ml,
pH 5,5 mit KOH
Wasser
1000x Spurenelementelösung, 1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
EDTA
10 g
ZnSO4 x 7 H2O
4,4 g
MnCl2 x 4 H2O
1,0 g
CoCl2 x 6 H2O
0,32 g
47
CuSO4 x 5 H2O
0,32 g
(NH4)6Mo7O24 x 4 H20
0,22 g
CaCl2 x 2 H2O
1,47 g
FeSO4 x 7 H2O
1,0 g
Auffüllen auf 100 ml,
pH 5,5 mit KOH
Wasser
MD (P. pastoris), 1000 ml
Finale Konzentration
Chemikalie
Stammlösung
Anteil
1,34 %
YNB
134 g/l
100 ml
4*10-5 %
Biotin
200 mg/l
2 ml
2 %
Dextrose
200 g/l
100 ml
Auffüllen auf 100 ml,
pH 5,5 mit KOH
Wasser
4.7. Antibiotika/ Supplemente
Die Lösungen wurden steril-filtriert und nach dem Autoklavieren zugegeben.
Name
Stammlösung
Endkonzentration
Ampicillin
50 mg/ml
50 µg/ml
Koffein
50 mg/ml
500 µg/ml
Doxycyclin
100 mg/ml
20 µg/ml
Hygromycin Trafoagar
100 mg/ml
200 µg/ml
Hygromycin
100 mg/ml
100 µg/ml, 200 µg/ml
Uridin
1 M
1 mM
4.8. Geräte, Labormaterialien, Verbrauchsmaterialien
Geräteart
Name
Hersteller
Autoklav
Timo
international pbi
Autoklav
VX150
Systec
Bioreaktor
BIOSTAT®Aplus
Satorius stedim biotech
Bioreaktor
BioFlo/CelliGen 115
Eppendorf
Detektionsgerät
ChemiDoc MP Imaging System
Biorad GmbH
Eismaschine
SPR-80L
NordCap
Elektroporationsgerät
BioRAD
Feinwaage
Entris124-1S
Sartorius
Fotometer
BioSpectrometer
Eppendorf
FPLC
Äkta Explorer
Amersham Pharmacia Biotech
Gefriertrocknungsanlage
Freezone 2.5
Labconco
48
Geldokumentation
Gel logic 212pro
Carestream
Gelelektrophorese
DNA Gelelektrophoresekammer
mit Biorad Power Pac HC
Biorad GmbH
HPLC
Prominence
Shimadzu
Hybridisierungsofen
OV1
Biometra
Inkubator
HERATherm
Thermo Fisher Scientifc
Inkubator
Multitron II
Infors HT
MALDI-MS
Ultraflex IIITM
Bruker
Mikroskop
Leica
Mikroskop
DM5000CS
Leica Scientifc
Multikanalpipette
Eppendorf
Multiplattenlesegerät
VictorX
PerkinElmer
Multiplattenlesegerät
Glomax
Promega
Multiplattenlesegerät
SpektraMax
Molecular Devices
Nanodrop
Thermo Fisher Scientifc
O2-Sonde
InPro 6860
Mettler Toledo
PCR Gerät
T-1 Thermoblock
Biometra
pH-Meter
Hi3220
Hanna Instruments
pH-Sonde
EasyFerm K8 325
Hamilton
Pipetten
G10, G20, G200, G1000
Gilson
Pipettierhilfe
Pipetus
Hirschmann
Reinstwasseranlage
PURELAB Classic
Elga LabWater
RNA
Gelelektrophoresesystem
SEA2000 with GEPS 200/2000
power supply
Elchrom Scientifc
SDS-PAGE System
Mini-PROTEAN Tetra handcast
systems
Biorad GmbH
Sterilbank
LaminAir- HBB2448
Heraeus instruments
Sterilbank
LaminAir- LB-72 C
Heraeus instruments
Thermoblock
ThermoMixcer C
Eppendorf
Thomakammer
Carl Roth GmbH + Co. KG
Ultraschallbad
142-6045
VWR
UV-Crosslinker
Stratalinker
Stratagene
Vortexer
VV3
VWR
Waage
Entris3202-1S
Satorius
Zentrifunge
Biofuge primo R
Heraeus instruments
Zentrifunge
5427R
Eppendorf
Zentrifunge
RC5C
Sorvall Instruments
Zentrifunge
Rotina 38 R
Hettich-Zentrifugen
Tab. 19 - Labormaterialien
Name
Hersteller
1 l Erlenmeyerkolben
VWR
49
1 l Laborflasche
Schott Duran
100 ml Erlenmeyerkolben
VWR
20 l Medienflasche
Carl Roth GmbH & Co. KG
250 ml Erlenmeyerkolben
VWR
250 ml Laborflasche
Schott Duran
300 ml Erlenmeyerkolben
VWR
5 l Erlenmeyerkolben
VWR
50 ml Erlenmeyerkolben
VWR
50 ml Laborflasche
Schott Duran
500 ml Erlenmeyerkolben
VWR
500 ml Laborflasche
Schott Duran
Büchnertrichter
VWR
diverse Stopfen
Carl Roth GmbH & Co. KG
Filtrationsanlage
VWR
Keramiksieb
VWR
Löffel
VWR
Rührfische
VWR
Spatel
VWR
Trichter
VWR
Tab. 20 - Verbrauchsmaterialien
Name
Hersteller
Handschuhe
Ansell® GmbH
1 ml Filterspitzen
Sarstedt
1 ml Pipettenspitzen
Sarstedt
1,5 ml Versuchsgefäß
Sarstedt
10 µl Filterspitzen
Sarstedt
10 µl Pipettenspitzen
Sarstedt
15 ml Röhrchen
Greiner Bio-One
2 ml Versuchsgefäß
Sarstedt
20 µl Filterspitzen
Sarstedt
200 µl Filterspitzen
Sarstedt
20-200 µl Pipettenspitzen
Sarstedt
50 ml Röhrchen
Greiner Bio-One
95 Loch Platte klar aus PS
VWR
96 Loch Platte klar
Perkin Elmer
96 Loch Platte weiß
Greiner Bio-One
Aluminiumfolie
Carl Roth GmbH+Co. KG
Amicon Ultra-15, 3 kDa Porengöße
UFC
Cellophanmembran
BioRad
50
Deckglas
Carl Roth GmbH+Co. KG
Elektroporationsküvetten
BioRad
Filterpapier (3hw)
VWR
Filterpapier 24cm
Machery-Nagel
Frischhaltefolie
Carl Roth GmbH+Co. KG
Glasperlen (0.75 mm - 1 mm)
Carl Roth GmbH+Co. KG
Kationentauschersäule Sulfate 650F
ToyoScreen
Kryoröhrchen
Greiner Bio-One
Luftfilter 0,2µm PTFE
Satorius
Luftfilter Acro 50, 0,2µm PTFE
PALL Corporation
Membrane Lipid strips
Echelon Biosience
Miracloth
VWR
Nylonmembrane
Carl Roth GmbH+Co. KG
Objektträger
Carl Roth GmbH+Co. KG
PCR Streifen
Biozym
Petrischalen (150x20mm)
Sarstedt
Petrischalen (92x16mm)
Sarstedt
PVDF Membran
Carl Roth GmbH+Co. KG
Röntgenfilm RF12
A. Hartenstein GmbH
Schläuche
Masterflex
Schläuche
VWR
Serologische Pipetten (10 ml)
Sarstedt
Serologische Pipetten (2 ml)
Sarstedt
Serologische Pipetten (25 ml)
Sarstedt
Serologische Pipetten (5 ml)
Sarstedt
Sphingo Strips
Echelon Biosience
Sterilfilter (0.2 µm)
Sarstedt
visking Dialysekassette, MWCO 12-14 kDa
Medicell Membranes Ltd
Wattestäbchen
Carl Roth GmbH+Co. KG
Whatman Papier
VWR
51
4.9. Stämme, Primer, Sonden
Tab. 21 - Stämme
Art
Stammname
Beschreibung
Quelle
A. fumigatus
ATCC 9197
Wt
[132]
A. giganteus
IfGB 0902
Wt
[133]
A. nidulans
DSM 969
Wt
DSMZ
A. niger
AB4.1
cspA1, pyrG-
[134]
A. niger
BN26.1
cspA1, ΔflbA::hygB, N402 derivative
[135]
A. niger
BN34.2
cspA1, ΔbrlA::hygB, N402 derivative
[135]
A. niger
MA169.4
cspA1, kusA::DR-amdS-DR, pyrG-
[136]
A. niger
MA70.15
cspA1, ΔkusA, pyrG-, AB4.1 derivative
[137]
A. niger
MA78.6
cspA1,ΔkusA, pyrG+, MA70.15 derivative
A. niger
N402
cspA1
[134]
A. niger
NP1.15
cspA1, ΔAn01g09800::AopyrG , N402
derivative
This work
A. niger
NP2.8
cspA1, Panafp::eyfp, Δanafp, ΔcreA, pyrG+,
hygR, AB4.1 derivative
[68]
A. niger
NP3.2
cspA1, Panafp::eyfp, Δanafp, ΔflbA, pyrG+,
hygR, AB4.1 derivative
[68]
A. niger
NP4.1
cspA1, Panafp::eyfp, Δanafp, ΔbrlA, pyrG+,
hygR, AB4.1 derivative
[68]
A. niger
NP6.4
cspA1, Panafp::mluc, Δanafp, ΔcreA, pyrG+,
hygR, AB4.1 derivative
[68]
A. niger
PK2.9
cspA1, Panafp::mluc, Δanafp, pyrG+, AB4.1
derivative
[68]
A. niger
PK1.22
Panafp::eyfp, delta-anafp, delta-stuA,
hygB+
[68]
A. niger
PK2.9
cspA1, Panafp::mluc, Δanafp, pyrG+, ΔstuA,
hygB+
[68]
A. niger
PK1.22
Panafp::eyfp, delta-anafp, delta-velC, hygB+
[68]
A. niger
PK2.9
cspA1, Panafp::mluc, Δanafp, pyrG+, ΔvelC,
hygB
[68]
E. coli
Top10
F- mcrA Δ( mrr-hsdRMS-mcrBC)
Φ80lacZΔM15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ(
araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1
nupG
F.
graminearum
8/1
Wt
[138]
F.
graminearum
Δ3FgKO
ΔFJ176923
[125]
P. pastoris
BBA21.3
GS115 transformiert mit pNP1.13
This work
52
P. pastoris
GS115
his4-
[139]
P. pastoris
NP7.1
GS115 transformiert mit pPIC3.5
This work
P. pastoris
SZ51
pGAPZ/C+ FJ176923
[125]
S. cerevisiae
BBA20.2
BY4741 transformiert mit pBBA 5.1
This work
S. cerevisiae
BY4741
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
V. dahliae
JR2
Wt
[140]
Tab. Primer
Datenbank
-Nr.
Name
Richtung
Sequenz
459
5`end pyrG region
fw
aagccgctgctggaattgTGTAAAACGACGGCCAGT
460
3`end pyrG region
rev
CGATGGATAATTGTGCCGTGT
461
5`end pyrG
fw
ATTGACCTACAGCGCACGC
462
In pyrG
rev
CCGGTAGCCAAAGATCCCTT
678
Upstream
An01g09800 with
AopyrG start
rev
tcactggccgtcgttttacaCATGTTATCCGACCCATCCC
679
Downstream
An01g09800 with
AopyrG end
fw
acacggcacaattatccatcgTCTCACTAGCAGACGAGGTT
936
pYip5 with 5` site tef
fw
gctgatgagctttaccgcagCAAAATGTTTCTACTCCTTT
937
3`site tef with 5`site
Kozak sequence
Yeast and
An01g09800
gggtccatggtggcggcgggCTTAGATTAGATTGCTATGC
938
An01g09800 with
3`end tef Kozak
sequence yeast
fw
aatctaagcccgccgccaccATGGACCCTTCCACCTTTATexo
n
939
3`site An01g09800
with 5`end cyc
rev
tgacataactaattacatgaCTAAACTTCCGCTTGATTTC
940
5`end cyc with 3`end
An01g09800
fw
gaaatcaagcggaagtttagTCATGTAATTAGTTATGTCA
941
3` end cyc with
pYIp5
rev
caccgaaacgcgcgaggcagAGCGTCCCAAAACCTTCTCA
1436
5`end An01g09800
with BamHI site
fw
gatccacataATGGACCCTTCCACCTTTAT
1439
5`An01g09800
fw
ATGGACCCTTCCACCTTTAT
1440
3`An01g09800
rev
TCAGCTAAACTTCCGCTTGA
1443
3`An01g09800 with
EcoRI site
rev
aattcTCAGCTAAACTTCCGCTTG
53
1529
3`An01g09800 with
NotI site
rev
gcgaattaattcgcggccgcTCAGCTAAACTTCCGCTTGA
1530
5`An01g09800 with
EcoRI
fw
gatcctacgtagaattcattATGGACCCTTCCACCTTTAT
1716
Pp_act_fw
fw
AGTGTTCCCATCGGTCGTAG
1717
Pp_act_rev
rev
TCTCTTGGATTGAGCCTCGT
1718
Sc_act_fw
fw
GCCTTCTACGTTTCCATCCA
1719
Sc_act_rev
rev
ATTCTCAAAATGGCGTGAGG
1720
Desa_qPCR_fw
fw
GTCACTGCTGGCTCTTTGAC
1721
Desa_qPCR_rev
rev
AGACAAATCATCCGGTCCGT
677
Upstream
An01g09800
fw
ACACATGGGAGGGGTAATGA
680
Downstream
An01g09800
rev
ACCCATCGATTAGGGAGAGG
716
Downstream 680
rev
TCACCACCACAATCTACCCC
793
pJet+hygP9r
rev
ttgtaggagatcttctagaaagatGGCGTCGGTTTCCACTATC
794
pJetflbAupfw
fw
ctcgagtttttcagcaagatCAACGAGAAGGGAAGCATGG
795
pJetflbAdorv
rev
ttgtaggagatcttctagaaagatACACTCGCTGTACCCTGAAA
796
pJetcreAupfw
fw
ctcgagtttttcagcaagatGAGACACCCGTTTGCCATTT
797
pJetcreAdorv
rev
ttgtaggagatcttctagaaagatACACAGTGGGAGAGGAAGT
G
798
pJetbrlAupfw
fw
ctcgagtttttcagcaagatGTCCCCAATTATCGCCATCG
799
pJetbrlAdorv
rev
ttgtaggagatcttctagaaagatCGTGCGAGGAAACATCAAC
T
Tab. Southern-Blot Sonden
Gen
Sequenz
flbA
u
p
s
t
r
e
a
m
AGCGCGATCTGATTGAAACCCTCCCCAGGCGTAGATTTCGCTGATCATCCGACGCCAGCGGTTTTGGAAACCGGCCCA
CTTTGGAGGTGGTTGAGACGGAGCAAGCAATGTATCTCTGAGAACGATACGGTATGTGACACAGGTTACCATACACA
GGGATACGGACCGGGAAAGTAAGATGGCCCTGGTTAAGTTACCTTCACCGTTCGGGGATCTCCTTGCATCAAACCATG
ACAGGGAAGGGATAAATTCTGGCAGGAAGAGGGAGAATTAACTCATAACTCAATTCTACATATTATATATGGCCCCTT
TCTTAATGTCAGACGCGGAGAAGGGCCCCCATCCCGCTTAAAGGACAAAAAGAAAGTAATCAACGAGAAGGGAAGC
ATGGCTAAGAAAAGGCCTGCAGGTTCGGGCGGTCGCCTGTAGGAACCTTACCTTACCCAAGGTAGCCTTTCCGGAGG
GCAATACCCGTACCATCCCATCCTATCCCACCCATCCCACCCTGCCGGACTCTGCAGGGAAGCCGACCTCTGATCGCCC
CAAAGGACGATCCGTCCACCTTTGCCCTTGGCCCACGTTGTCTGGTGCATGAAACCGTCCGCGTGCACAGTGGGTCAA
GAATGACAGGCCTGATTCTTCACGCCCCTGGAGACCCTCTTGAGCAGCCGCTGCTCACTTGGCTTTCTGCTCATCTTTTC
CCTCTTTTCCCTTCCCTTCCCTTCTCATTCTTTCCGCTACCTCTGCTCCTCTCTCTCTATCTCTCGCTCTCTCTCGCTCGCTC
GCTCGCTCGCTGTAAGGGATCCATCCGGTAGCATCCACCCTGTACCAAAAAGCCACTTCAGATCGTACTCCAACTTCTG
GGAAGTAAAACAGTTTGTTAAGTCACTTACTGTTTGTATAAATACCTGACTAACACTCTACCCAAATTCCCCGCTTGCTC
TTTTCGTCATTGAGTTTGAATTTATTCCATTTTCCATTTTCTTACAATTTTTTTTTCCCTGAATTTTTTTTTCTTCCCATTTTC
TGCCGTTGCCCTTTCCCAATCTTTCCTGGGTCTGTTTCCAAACCGACTTTGAATTTTGGGTCAAGACTTTCCTTCACTCAA
AGTGGAATTTTACCTCGTGTTTTATTTCATTATTATTTTATTTTCCCTTCTCTGCTTTCCCTTATCCATACATACACCCACC
CCTCCACCTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTGACCCTCTTTCTCCCTTTTGGAAATATTTTTTTTT
54
TACCCATTTTTTTTTCTGCCCATACCCATACCCATA
brlA
u
p
s
t
r
e
a
m
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AATTAAAAATGACGGAGACCAGACCATTCCCCCCCCGGGGTCGGAGTCGGCACGCAGTCGGGGTACTTTACTTACGT
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CCCTCCGTATCTCGGAATGGGCCCACATCATCAACTGCAGCATTCTCCCTGGTGAGGGTATCGTCGAGGCTCTCGCTCA
GACGGCGTCTGCACCGGACTTCGCCTACGGCCCCGAACGCGGTCTGTTGATCTTGGCAGAGATGACCTCTAAGGGCTC
CTTGGCTACCGGCCAGTACACTACTTCCTCGGTCGATTATGCCCGGAAATACAAGAACTTCGTTATGGGATTCGTGTCG
ACGCGCGCGTTGGGTGAGGTGCAGTCGGAAGTCAGCTCTCCTTCGGATGAGGAGGACTTTGTGGTCTTCACGACTGG
TGTGAACATTTCTTCCAAGGGAGATAAGCTTGGTCAGCAGTACCAGACGCCCGGATCGGCTATCGGCCGGGGTGCTG
ACTTCATTATCGCGGGTCGCGGTATCTACGCCGCGCCGGATCCGGTGCAGGCTGC
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TCTCACTAGCAGACGAGGTTGTATATATAGAGTTGCATGGGCTAACAGATGTAATATATAATATATTGCATAAACATA
CACATCTTACCAACACACCTTCACTCTACTACGTATAAACAGCGGCAGCAGAAGTACTCCGACCAACCCACCTTCCCAA
CAGCGGCACCCTCCGCACCATCCTGGGCACAATTCTCGACCCATGCACAATCAACGGCACAACAGCCACCATCCACAT
CACATACACCACCGCAACAGCAACCCCCAACCTGACCCTCTCTCCAAACGACACCTCCCCTCTATTCCCACCCAACAACG
CCCTCTCCTCGTCCCCTTCCCCATTTCCCCTCTCCACAATCGCATCCGCCATCCTCCCCACCACCCTCCGATTAATCTTCTC
CCAGGTCATATCCTCCGCAAACAACCTCGCCCCTTTCCCCAAACGCCCCCTCAACCTCCCATCCCTCAACATCTCCCCCA
CAAGCCCACTAAACACGCCCACTTCCCCCTCCGCCACCGAAACCAAGTACCCCGTCTCCTGATTCCTCACAATATCCGAC
GGACCACCTTGATCCCTTGCGATGACTGGCAACCCGCTCGCCATAGCCTCCAGCACGACCAGCCCGAACGTCTCTGTG
ATAGAGCAGTGCAGGAATATGTCCGCTGAGGCGTAGATGCTCGCTAACTCTTCGCCGGTTCTGAAGCCAAGGAAGAT
GACGTGTGAGGAGATGTGGTGGAAGAGGGACTGAATGCGTGATGTCACGGCGGGGTTGGCGTTCCCGCCGACTATT
ACCAGCTTGAAGGGGATTTTAGTACTAGAGAGAAGGTGTGTGACAGCCTCAGCGAGGAACTCAAACCCCTTCTCAGG
CGCGATCCGACAAACTGTTAGCAGGATAGCTTCGCCGTTTGGAGCTAACGTATCCCGTAAGGACTGAGACCGGCGGG
ATGGATTAAAGAGAGACGTATCGACTCCTCTCCCTAATCGATGGGT
4.10. Kits
Tab. 22 - Kits
Anwendung
Name
Firma
cDNA
MEGAscript T7 Kit
Thermo Fisher Scientifc
Isolation PCR Produkte
innuPREP PCRpure Kit
analytikjena
Isolation PCR Produkte
innuPREP Gel Extraction Kit
analytikjena
Plasmidisolation Midi
Pure Yield Plasmid Midiprep System
Promega
Plasmidisolation Mini
Accu Prep plasmid mini extraction kit
BioNEER
qPCR
Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2X)
Thermo Fisher Scientifc
56
4.11. Plasmide
Tabelle Plasmide
Datenbank-Nr.
Name
Beschreibung
4
pAB4.1
A. niger pyrG
62
pDG1.1
A. niger Tet-on 6xHIS-AFP
176
pNP1.13
P. pastoris dtdA
202
pPIC9
P. pastoris Sekretion
203
pLH2.1
P. pastoris AFP
305
pPIC3.5
P. pastoris intrazellulär
pDG2.4
A. niger Tet-on AFP-6xHIS
4.12. Verwendete Software
Tab. 23 - Software
Software
Hersteller
Verwendung
MFCS/win 3.0
SartoriusStedim
Parameter-Profile BR
MIC90ro DCU Rev.
0.7
SartoriusStedim
Steuerung BR
Unicorn
5.11 (Build 407) GE Healthcare
Software fur FPLC
LasX
Leica
Mikroskopie
Unicorn
GE Healtcare
FPLC
LabSolutions
Shimadzu
HPLC
4.13. Kultivierungen
Alle filamentösen Pilze wurden in der Regel bei 28 °C in CM inkubiert. Flüssigkulturen wurden bei
200 UpM für 48 h geschüttelt. Zur Gewinnung von Sporen wurde ein Gitterausstrich auf CM
durchgeführt. Für V. dahliae war eine Kultivierung in YPG Medium zur Sporengewinnung nötig. Zur
Überprüfung von Auxotrophien, oder zur Selektion, wurde MM genutzt. Die nötigen Zusätze sind
im Materialteil aufgeführt. E. coli wurde in LB-Medium kultiviert, wenn nötig in Gegenwart von
Ampicillin. Hefen wuchsen in der Regel im YPG-Medium. P. pastoris wurde zur Proteinproduktion
in BMMY kultiviert. Wenn nicht anders nötig, bei 30 °C, 200 UpM und für 48 h.
4.14. Gentechnische Methoden
DNA-Extraktion (SOP 17, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin) 4.14.1.
Die Methode folgt der Beschreibung in [141]. Gefriergetrocknete Biomasse wurde zu feinem Pulver
zerstoßen. Dann wurden ca. 0,5 ml davon mit 0,5 ml DNA-Extraktionspuffer vermischt, für 15 min
57
bei 65 °C erhitzt. Danach wurde das Gemisch auf Eis für 5 min abgekühlt, 0,1 ml 8 M Kaliumacetat
zugegeben und durch mehrmaliges Schwenken des Eppis gemischt. Folgend wurden die festen
Bestandteile durch Zentrifugation (19090 g, 15 min) abgetrennt, der Überstand in ein neues Eppis
überführt, mit 0,3 ml Isopropanol gemischt und wieder zentrifugiert (19090 g, 15 min). Folgend
wurde der Überstand abgekippt das Pellet mit 1 ml 70 % Ethanol vermengt. Die Zentrifugation
wurde wiederholt, das Ethanol abgegossen und das DNA-Pellet bei bis zu 65 °C getrocknet. Nach
dem Lösen der DNA in 50 µl Reinstwasser und Zugabe von 2 µl 10 mg/ml RNAse A wurde bei 65 °C,
30 min inkubiert. Es folgte ein Agarosegel (1 % Agarose in 0,5x TAE Puffer, 120 V, 40 min) mit 2-3 µl
der DNA-Lösung zur Kontrolle der Reinigung und des Verdaus der RNA.
Gibson Klonierung (SOP 13, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin) 4.14.2.
PCR-Produkte mit mindestens 20 bp komplementären Enden können mit dieser Methode
enzymatisch ligiert werden. Dafür werden 5 µl der zu ligierenden DNA (12 ng je 1 kb
Plasmidrückgrat) und in einem molaren Verhältnis von 4:1 Fragmente mit minimal ¼ der Größe des
längsten Fragmentes und 8:1 für Fragmente mit weniger als ¼ der Größe des längsten Fragmentes
mit 15 µl des Ligationsmixes gemischt und bei 50 °C für 60 min inkubiert. Nach 3 min bei RT wird
der Mix 3 min auf Eis gekühlt, bevor 5 µl mit 25 µl chemisch kompetenten E. coli Zellen vermischt
werden.
Formel zur Berechnung der nötigen DNA-Mengen:
Größe Plasmidrückgrat [kbp] x 12 = Masse Plasmidrückgrat [ng]
Masse Plasmidrückgrat [ng] x Größe des Inserts [kbp] / Größe Plasmidrückgrat [kbp] x (8 oder 4)=
Masse des Inserts [ng]
RNA-Isolation (SOP 11, 3. Version, des FG AMM, TU Berlin) 4.14.3.
Frische Biomasse wird mit flüssigem Stickstoff schockgefroren, gefriergetrocknet und gefroren zu
feinem Pulver zerstoßen. Zu 200 µl des Pulvers wird mit 800 µl Trizol auf dem Vortex gemischt.
Nach 5 min Inkubation bei RT wurden 150 µl Chloroform hinzugefügt und alles für 3 min bei RT
stehen gelassen. Nach der Zentrifugation (19090 g, 5 min, 4 °C) wurde die farblose obere Phase in
ein neues Reaktionsgefäß pipettiert, 500 µl Isopropanol zugegeben und für 10 min bei RT inkubiert.
Nach erneutem Mischen (Vortex) und Zentrifugation (19090 g, 10 min, 4 °C) nahm man den
Überstand mit einer Pipette ab, gab 150 µl 75 % Ethanol dazu, zentrifugierte erneut (19090 g, 5
min, 4 °C), verwarf den Überstand und ließ das Pellet bei RT trocknen. Folgend löste man die RNA
in 100 µl Reinstwasser bei 60 °C für 10 min und maß die Konzentration im Fotometer bei 260 nm.
Die extrahierte RNA wurde bei -80 °C gelagert.
58
Split-Marker-Ansatz zur Gendeletion 4.14.4.
Zur Deletion der Gene wurden die jeweiligen offenen Leserahmen gegen eine
Selektionsmarkerkassette ausgetauscht [142]. Die Linkersequenz zwischen dem Gen und den
Selektionsmarker waren immer gleich, um den Austausch der Selektionsmarker zu erleichtern. Die
nötigen Primer, die ca. 1000 Basen oberhalb bzw. unterhalb des ORF amplifizieren, wurden unter
Verwendung von Primer3 [143] konstruiert, unter folgenden Einstellungen: Produktlänge 800-1000
bp, 20-60 % GC, Schmelztemperatur 55- 60 °C. Zusätzlich wurde ein Primer außerhalb der
amplifizierten Teile erstellt, um die Deletion durch eine PCR zu verifizieren. Es wurden die Gene
AopyrG (A. oryzae Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylase, Uridin-Auxotrophie) [144] und hph (E. coli
Hygromycin-phosphotransferase, Hygromycin-Resistenz) [145] als Selektionsmarker verwendet.
Transformation von Aspergillus niger (SOP 3, 9. Version, des FG AMM, TU Berlin) 4.14.5.
Die Veränderung der DNA von Aspergillus niger erfolgte mittels PEG-vermittelter
Protoplastentransformation [141]. Zur Herstellung der Protoplasten wurden 2,5*108 Sporen des
Ausgangsstammes in 250 ml CM in einem 1 l Erlenmeyerkolben für 16 Stunden bei 28 °C und 75
UpM inkubiert. Die Ernte und darauffolgend das Waschen des gewachsenen Mycels mit SMC
erfolgte mittels Filtration durch einen Miracloth-filter (Miracloth eingeschlagen in Aluminiumfolie).
Danach hat man einen Teil des Mycels zur sterilfiltrierten Protoplastierungslösung gegeben und
danach bei 37 °C, 75 UpM für 2 Stunden inkubiert. Zur Isolation der Protoplasten wurden 10 ml STC
zur Protoplastierungslösung zugegeben, alles mit der Pipette gemischt und die Suspension über
einen Miracloth-filter gegeben. Durch Zentrifugation (2000 g, 10 min, 10 °C) sedimentierten die
Protoplasten, der Überstand konnte abgekippt und 1 ml STC hinzugegeben werden. Die
Protoplastensuspension konnte nun in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt werden und wurde
wiederholt zentrifugiert (3000 g, 5 min, 10 °C) Der Waschschritt mit STC wurde zweimal wiederholt
und die Protoplasten dann auf Eis gelagert. Für die Transformation wurde zu 100 µl Protoplasten
10 µl DNA (ca. 500 ng je Split-marker oder 5 µg Plasmid) und 25 µl PEG-Puffer pipettiert. Folgend
wurde 1 ml PEG-Puffer zu jedem Ansatz gegeben, alles durch antippen des 50 ml
Reaktionsröhrchens gemischt und dann nach 5 min Inkubation bei RT 30 ml handwarmer Top-Agar
auf den Transformationsansatz gegeben und alles vermischt, bevor es auf eine vorbereitete Trafo-
Agarplatte gegossen wurde. Die Platten wurden nach dem Abkühlen und Verfestigen bei 30 °C für
3 bis 7 Tage bebrütet. Entstandene Kolonien wurden dann auf MM-Agarplatten mit
Selektionsdruck mittels Wattestäbchen zweimal vereinzelt bevor eine Analyse der DNA
Veränderung durch PCR und Southern Blot erfolgte.
59
PCR 4.14.6.
Die Polymerasekettenreaktion erfolgte zur gezielten Vervielfältigung von DNA-Fragmenten. Es
wurden die für die jeweilige Polymerase nötigen Reagenzien entsprechend der folgenden
Pipettierschema genutzt.
Tab. 24 - Pipettierschema Taq-Polymerase
Reagenz
Stammlösung
Volumen [µl] / Menge [ng]
Dream Taq Green buffer
10x
2,5
dNTP
10 mM je
0,5
Primer
10 µM
0,5
DNA
1 (genomische DNA) / 10 (Plasmide)
Taq Polymerase
Ca. 5 U/µl
Reinstwasser
Auffüllen auf 25
Tab. 25 - Pipettierschema Q5-Polymerase
Reagenz
Stammlösung
Volumen [µl] / Menge [ng]
Q5 Puffer
5x
5
dNTP
10 mM je
0,5
Primer
10 µM
1,25
DNA
1 (genomische DNA) / 10 (Plasmide)
Q5
2 U/µl
0,25
GC enhancer
5x
5
Reinstwasser
Auffüllen auf 25
Tab. 26 - Pipettierschema Phusion-Polymerase
Reagenz
Stammlösung
Volumen [µl] / Menge [ng]
Phusion HF Puffer
5x
4
dNTP
10 mM je
0,4
Primer
10 µM
1
DNA
1 (genomische DNA) / 10 (Plasmide)
Phusion Polymerase
2 U/µl
0,2
DMSO optional
100 %
0,6
Reinstwasser
Auffüllen auf 20
60
Tab. 27 - Programm Taq-Polymerase
Schritt
Temperatur
Dauer
Denaturierung
94 °C
3 min
25–35 Zyklen
94 °C
20 sek.
50 °C – 72 °C
20 sek.
72 °C
60 sek./kb
Final Verlängerung
72 °C
5 min
Lagerung
4 °C
Tab. 28 - Programm Q5-Polymerase / Phusion-Polymerase
Schritt
Temperatur
Dauer
Denaturierung
98 °C
30 sek.
25–35 Zyklen
98 °C
50–72 °C
72 °C
10 sek.
20 sek.
20–30 sek./kb
Final Verlängerung
72 °C
2 min.
Lagerung
4 °C
Southern-Blot-Sonden wurden unter Verwendung von DIG-markierten dNTPs hergestellt.
qRT-PCR (SOP 11, 3. Version, des FG AMM, TU Berlin) 4.14.7.
Die Messung der Transkriptionsraten von Genen erfolgte mit der quantitativen Echtzeit-PCR. Dafür
wurde die RNA der Organsimen aus Kultivierungen und Zeitpunkten der zu bestimmenden
Transkriptmenge gereinigt und mit dem Oligo(dt)18 Primer des Thermo Fisher RevertAid First
Strand cDNA Synthesis Kits in cDNA transkribiert. Dafür wurden je Probe mit 3,5 µg der RNA
genutzt und gemäß den Vorgaben des Herstellers vorgegangen. Es folgte die qRT-PRC mit dem
Maxima Sybr Green Kit und Primern, die für die Vervielfältigung eines Abschnittes der
entsprechenden cDNA geeignet sind. Ihre Konzentration wurde im Verhältnis zur Aktin-Referenz
bestimmt. Die qRT-PCR erfolgte gemäß den Vorgaben des Herstellers.
Southern-Blot (SOP 10, 5. Version, des FG AMM, TU Berlin) 4.14.8.
Die Bindung von DNA an eine Nylonmembran mit anschließender Detektion der zu einer DIG-
markierten Sonde komplementären DNA-Stränge beginnt mit der Isolation und dem Schneiden der
genomischen DNA der zu untersuchenden Organismen. Im Laufe dieser Arbeit wurde der Southern
Blot zur Bestätigung der korrekten Integration oder Deletion von Genen im Genom von A. niger,
N402 und Derivaten davon, genutzt. Dafür wurde die genomische DNA mit Restriktionsenzymen
geschnitten, so dass der Bereich der komplementären Sonde auf einem DNA-Stück mit für den
61
jeweiligen Genotyp charakteristischer Länge liegt. Die Restriktion erfolgte nach den Vorgaben der
Hersteller, in der Regel bei 37 °C über Nacht, mindestens 2 Stunden lang. Die geschnittene DNA
wurde dann auf ein 0,7 prozentiges Agarosegel aufgetragen und in 0,5x TAE Puffer bei 80 V für 3 h
aufgetrennt. Danach wurde das im Gel enthaltene und in die DNA interkalierende „midori green“
unter UV-Licht sichtbar gemacht und das Gel für 5 min belichtet. Vor dem Transfer der DNA auf die
Nylonmembran hat man das Agarosegel zweimal für 10 min in Denaturierungspuffer gewaschen,
es danach mit destilliertem Wasser gespült bevor es zweimal für je 10 min in Neutralisationslösung
geschwenkt wurde. Mit 10x SSC getränktem Whatman Papier als Flüssigkeitsreservoir wurde nun
auf ein Stück Frischhaltefolie auf den Tisch gelegt, darauf dann das Gel und darauf die
Nylonmembran. Über der Membran dann wieder nasses Whatman Papier und darauf trockene
Papiertücher. Der Sandwichaufbau wurde oben mit einer vollen 0,5 l Laborflasche beschwert. Der
Transfer der DNA mittels Kapillarkräften lief 16 Stunden, danach wurde die DNA mit der Membran
mittels UV-Licht kovalent verbunden. Es folgte die Hybridisierung und Detektion der DNA-Sonde im
Hybridisierungsofen. Die Membran inkubierte mit 25 ml 65 °C warmen Hybridisierungspuffer 1,5
Stunden bei 65 °C und danach mit 200 ng der in 20 ml Hybridisierungspuffer gelösten Sonde bei 65
°C über Nacht. Für die Detektion wurde die Membran mit 20 ml 65 °C warmen Puffer mit hoher
Stringenz kurz abgespült bevor in frischen 20 ml des Puffers für 20 min bei 65 °C gewaschen wurde.
Es folgte das Gleiche mit 20 ml 65 °C warmen Puffer mit niedriger Stringenz bevor 2 min mit
Waschpuffer bei RT inkubiert wurde. Nachdem 1 Stunde mit 10 ml Blockierungslösung inkubiert
wurde, wurde diese gegen 10 ml Antikörperlösung getauscht und inkubierte weitere 30 min bei RT.
Überschüssiger Antikörper wurde durch zweimaliges Waschen für 15 min mit Waschpuffer
entfernt, gefolgt von Detektionspuffer (3 min, RT) und der Detektion durch die Aufnahme der
Lichtreaktion der auf der Membran verteilten CDP-star Lösung im ChemiDoc je nach
Signalintensität für bis zu 5 min.
Transformation von Pichia pastoris 4.14.9.
Linearisierte Plasmid-DNA wurde in kompetente, für Histidin auxotrophe, P. pastoris Zellen des
Stammes GS115 mittels Elektroporation eingebracht. Mit 0,5 ml einer GS115 Vorkultur wurden 500
ml YPG in einem 2 l Erlenmeyerkolben angeimpft und bei 30 °C und 150 UpM bis zum Erreichen
einer OD600nm von 1,35 inkubiert. Die Zellen wurden dann geerntet (1500 g, 5 min, 4 °C) und in 500
ml eiskaltem sterilem Reinstwasser aufgenommen. Bei der Wiederholung des Wachschrittes
erfolgt die Aufnahme in 250 ml eiskaltem Wasser und dann in 20 ml eiskalter 1 M Sorbitollösung
und zuletzt in 1 ml eiskalter Sorbitollösung. 80 µl der kompetenten Zellen wurden mit 10 µg
linearisiertem Plasmid in 10 µl TE Puffer für 5 min in einer 0,2 ml Elektroporationsküvette auf Eis
inkubiert. Danach erfolgte der Puls von 1,5 kV, 200 Ω, 25 µF und die anschließende Zugabe von 1
ml eiskalter 1 M Sorbitollösung, und das ausplattieren von 600 µl der Zellen auf MD-Agar die bei 30
°C für 3 bis 7 Tage inkubiert wurden.
62
Tab. 29 - Durchgeführte P. pastoris Transformationen
Transformation
Plasmid
Enzym
Stamm
afp
pLH1.1
StuI
LH6.6
pPIC9
StuI
dtdA
pNP1.13
SacI
BBA20.3
pPIC3.5
SacI
NP7.1
4.15. Herstellung chemisch kompetenter E. coli (SOP 4, 2. Version, des FG AMM, TU
Berlin)
Aus einer Vorkultur der E. coli Top 10 Zellen wird 100 ml Psi-Brühe in einem 500 ml
Erlenmeyerkolben 1 %ig angeimpft und bei 37 °C, 250 UpM bis OD600nm 0,48 inkubiert. Die Zellen
werden nach 15 min ruhen auf Eis geerntet (5000 UpM, 5 min, 4 °C), in 40 ml eiskaltem Tfb I
aufgenommen und wieder 15 min auf Eis gestellt. Es folgt eine erneute Zentrifugation und die
Aufnahme in 40 ml eiskaltes Tfb II, bevor 150 µl Aliquots hergestellt und bei -80 °C gelagert
werden.
4.16. Luciferase-Messung (SOP 15, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin)
Die Expression und Aktivität des Enzyms Luciferase in der Zelle wurde durch Zugabe des für die
Lichtreaktion nötigen Substrates Luciferin getestet. In einer weißen 96-Loch Mikrotiterplatte mit
klarem Boden wurden 200 µl CM mit 2,7 µl Luziferin gemischt und mit 10 µl einer 1*106
Konidiosporen/ml Suspension beimpft. Die Messung der Lichtsignale (cps = Messungen pro
Sekunde) und der OD595nm im Multiplattenlesegerät fand während des Wachstums bei RT alle 10
min statt.
4.17. Glucan-Messung (SOP 22, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin)
Zur Bestimmung des Glucangehaltes der pilzlichen Zellwand wurden 50 ml Medium (CM oder YPG)
in einem 250 ml Erlenmeyerkolben bei mit 1*106 Konidiosporen/ml, oder 1%ig mit einer
Hefekultur, angeimpft und inkubiert (200 UpM, 30 °C, 24 h filamentöse Pilze (mit AFP 48 h), 48 h
Hefen). Die gewachsene Biomasse wurde abfiltriert, oder für Hefen zentrifugiert (1500 g, 5 min, 4
°C), und gefriergetrocknet. Folgend wurde die Biomasse zu feinem Pulver zerstoßen, 5 mg im
Triplikat eingewogen und 1 ml 0,1 M NaOH zu den Proben gegeben. Sie wurden zentrifugiert
(19090 g, 5 min), das Pellet in 250 µl 1 M NaOH gelöst und im Ultraschallbad für 1 h inkubiert. Nach
erneuter Zentrifugation (19090 g, 10 min) wurde der Überstand in ein frisches Reaktionsgefäß
überführt und in einer den Ergebnissen der Curdlan-Kalibriergeraden entsprechenden Verdünnung
in einer Mischung von 50 µl Überstand mit 185 µl Anillinblaulösung in der Mikrotiterplatte im
63
Triplikat im SpektraMax Multiplattenlesegerät (Emission von 392 nm, Absorption von 502 nm)
gemessen.
4.18. MIC90-Messung (SOP 19, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin)
Für den Test der Minimalen Hemmkonzentration einer Substanz, in der Regel AFP [82], gegenüber
filamentösen Pilzen und Hefen wurde die MIC90-Messung wie folgt durchgeführt. Für einen Ansatz
in einer klaren 96-well Mikrotiterplatte wurden zu 100 µl zweifachem YPG 10 µl Sporensuspension,
oder Zellsuspension, in PS, entsprechend 1000 Sporen oder Zellen, gegeben. Dazu 90 µl der
nötigen Konzentration des AFPs (in 0,01 % TFA). Die Mikrotiterplatte wurde bei 30 °C für 48 h in
einer Plastikbox mit feuchtem Papiertuch inkubiert, bevor im Multiplattenlesegerät die OD595nm
gemessen wurde. Zur Auswertung wurde der OD Wert der Kontrolle = 100 % gesetzt und die Werte
der Versuchsansätze prozentual darauf bezogen. Der erste Wert mit einer OD595nm ≥ 10 % wurde
als MIC90 angenommen.
4.19. Chitin-Messung (SOP 23, 1. Version, des FG AMM, TU Berlin)
Zur Bestimmung des Chitingehaltes der pilzlichen Zellwand [146] wurden 50 ml Medium (CM oder
YPG) in einem 250 ml Erlenmeyerkolben bei mit 1*106 Konidiosporen/ml oder 1%ig mit einer
Hefevorkultur angeimpft und inkubiert (200 UpM, 30 °C, 24 h filamentöse Pilze (mit AFP 48 h), 48 h
Hefen). Die gewachsene Biomasse wurde filtriert, oder für Hefen zentrifugiert (1500 g, 5 min, 4 °C),
und gefriergetrocknet. Folgend wurde die Biomasse zu feinem Pulver zerstoßen, 50 mg im Triplikat
eingewogen und zweimal 1 ml 1 M NaCl zu den Proben gegeben, dann einmal 1 ml Reinstwasser
gewaschen. Die Flüssigkeiten wurde nach dem Mischen jeweils durch Zentrifugation (19090 g, 5
min) entfernt. Das Pellet wurde nun in 1 ml Zellwandextraktionspuffer aufgenommen, bei 95 °C für
5 min inkubiert, zentrifugiert (19090 g, 10 min) und gefriergetrocknet. Nach dem zerstoßen
wurden 4 mg der extrahierten Zellwand im Triplikat eingewogen, je 1 ml 6 M HCl zugefügt, und die
Reaktionsgefäße autoklavierte (121 °C, 20 min), bevor die Flüssigkeit unter dem Abzug verdampft
wurde (75 °C Heizblock, Luftstrom) und der entstandene Niederschlag in 0,5 ml Reinstwasser
gelöst wurde. Durch die Zugabe von 0,1 ml Glasperlen und Inkubation bei 50°C und 5000 UpM im
Heizblock wurde das Pellet gelöst. Nach erneuter Zentrifugation (5000 g, 10 min) konnte der
glucosaminhaltige Überstand abgenommen und davon 20 µl (in Verdünnungen entsprechend den
Werten der Kalibriergeraden) mit 20 µl Lösung A in einer 96-well Mikrotiterplatte aus Polystyrol
gemischt werden. Es folgte eine Inkubation bei 100 °C für 20 min, nach der je Ansatz 140 µl 96 %
Ethanol und 20 µl Lösung B zugegeben wurde und der Ansatz für 1 Stunde bei RT stand. Die
Messung der OD520nm erfolgte im Multiplattenlesegerät.
64
4.20. eYFP-Messung
CM-Agarplatten wurden mit sterilen Cellophanmembranen bedeckt, mit 5–10 μl einer Sporen-
oder Zellsuspension der Stämme PK1.22, NP2.8, NP3.2, NP4.1, N402, BN26.1, BN34.2 bzw. XY1.1
beimpft und für 72 Stunden bei 30 °C inkubiert. Die gewachsene Biomasse wurde von der
Membran abgezogen, gefriergetrocknet, gewogen, gemahlen und in 50 mM Natrium-
Phosphatpuffer (pH 7) auf eine Endkonzentration von 50 μg/ml resuspendiert. Nach 10 min
Ultraschall bei Raumtemperatur wurden die Partikel bei 19100 g für 10 min abgetrennt. Schließlich
wurden 100 µl Überstand in eine weiße Mikrotiterplatte umgefüllt und die Fluoreszenzintensität
nach Anregung bei 490 nm bei 510–570 nm gemessen. Die ΔflbA und ΔbrlA Stämme haben ein
Autofluoreszenzsignal, das es unmöglich machte, die Fluoreszenz zu messen.
4.21. Tris-Tricine-SDS-PAGE
Die Tricin-Acrylamidgele eigenen sich zur Trennung von kleinen Proteinen und Peptiden (>30 kDa),
da durch das langsamere Laufen der SDS-Proteinkomplexe ein Abstand zu den SDS-Micellen
gehalten wird. Die Gele wurden nach dem Lauf mit destilliertem Wasser gewaschen, mit
Coomassie Brilliantblau-Färbelösung in der Mikrowelle für 1 min bei 600 W gefärbt und nach dem
Abkühlen mit Entfärber in der Mikrowelle bei 600 W für 1 min entfärbt. Es wurden in der Regel 20
µl der Probe aufgetragen und die Gele für ca. 20 min bei 200 V laufen gelassen.
Tab. 30 - Pipettierschema für vier Tris-Tricin-SDS-Gele
Reagenz
4 % Sammelgel
16 % Trenngel
Acrylamid-Bisacrylamid (29:1), 40%-ige
Lösung
0,83 ml
6,53 ml
Tris-Tricine 3x Gel Buffer
2 ml
5,33 ml
Wasser
5,07 ml
0,80 ml
Glycerol 50 %
3,20 ml
APS 10 %
80 µl
80 µl
TEMED
20 µl
40 µl
4.22. Antikörperbasierte Proteindetektion
Zur Detektion von Proteinen mittels Antikörper werden die Proteine auf eine
Polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) aufgetragen. Zuerst wird die Membran 5 s in Methanol
geschwenkt und anschießend jeweils 3 min in Reinstwasser und danach in Blockierungspuffer
equilibriert. Die zu testenden Proteine werden auf die Membran aufgetragen und nach Zugabe der
Antikörper in entsprechender Konzentration in Blockierungspuffer und 1 Stunde schwenken bei
Raumtemperatur wird die Membran dreimal je 5 min mit PBS-T gewaschen. Die folgende Zugabe
vom Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) markierten Zweitantikörpern (anti-
65
Kaninchen) erfolgte 1:7500 in Blockierungspuffer verdünnt. Die Membran wurde wieder für 1
Stunde bei RT geschwenkt, in PBS-T gewaschen und mit dem gemischten ECL-Kit überschichtet.
Das Lichtsignal entstand aus der Reaktion des Luminols mit Wasserstoffperoxid in Anwesenheit
von HRP zu 3-Aminophthalat und wurde im ChemiDoc detektiert.
4.23. Kationenaustauschchromatographie
Mittels „fast protein liquid chromatography“ in Form einer Größenausschlusschromatografie mit
einer Äkta Explorer 100 auf einer selbstgepackten Hiload 16/600 superdex 75 pg konnte von Chitin
eluiertes AFP von anderen Proteinen getrennt werden [147]. Die Säule wurde mit einem Mix aus
BSA (66 kDa), Chymotrypsin (25,8 kDa), RNAse (13,7 kDa) und Aprotinin (6.5 kDa) und PBS pH 7,4
als Laufpuffer auf ihre Trenneigenschaften getestet. Es wurden bis zu 5 ml des im AMICON Ultra-
15, 3 kDa cutoff ca. 20-fach konzentrierten Chitineluates auf die Säule geladen. Die Trennung nach
Größe erfolgte bei einer Flussrate von 1 ml/min in PBS pH 7,4. Die Elution wurde mittels UV-
Detektor bei 214 nm, 260 nm und 280 nm und untersucht. Bei 214 nm absorbiert die
Peptidbindung, bei 280 nm die aromatischen Aminosäurereste Tryptophan, Tyrosin und Histidin,
und bei 260 nm zusätzlich zu den AS der Proteine die Basen der DNA. Somit ist für bekannte
Proben eine Zuordnung eines Peaks zur Stoffklasse Proteine möglich und die Reinheit abschätzbar.
Eine Trennung in 1 ml bis 5 ml Schritten fand mittels Fraktionssammler statt. Ein besseres
Trennergebnis wurde durch die Verwendung einer säulengepackten Kationentauschermatrix
erzielt. Die von Chitin eluierte und eingeengte Probe wurde in einer Dialysekassette vom NaCl
befreit. Dafür füllt man dreimal einen 5 l Messbecher mit Reinstwasser (+0,01 % TFA) und lies die
Kassette unter leichtem Rühren über Nacht und danach zweimal 2 Stunden schwimmen. Das
dialysierte Eluat lief nun in der Äkta Explorer über den Kationentauscher (bis zu 25 ml) zum Binden
der Kationen, die dann mittels Gradienten eluiert wurden.
4.24. RP-HPLC
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie („high performance liquid chromatography“) wurde
analytisch zur Bestimmung der Reinheit des hergestellten AFPs und präparativ zur Trennung von
AFP-Varianten genutzt. Die unpolare stationäre Phase (RP) der Säule wurde mit einer AFP-Probe
beladen und dann mittels Lösemittelgradienten steigender Polarität eluiert. Die polare mobile
Phase bestand aus HPLC-Wasser mit 0,01 % TFA, die unpolare mobile Phase aus Acetonitril mit
0,01 % TFA. Der Anteil an Acetonitril stieg von 2 % bei 2,5 min auf 95 % bei 11 min an. Die
Überwachung erfolgte mit einem Photodiodenarray-Detektor mit thermostatisierter Zelle bei 280
nm. Die Laufmittel waren Acetonitril und Reinstwasser versetzt mit 0,01 % TFA.
66
4.25. Identifizierung von AFP/AnAFP-Orthologen
Das prozessierte Peptid des AFP oder AnAFP wurde als Matrize für eine pBLAST [77] gegen alle
annotierten Genome verwendet. Die erhaltenen Treffer wurden als FASTA-Datei heruntergeladen
und mit dem „Multiple Sequence Alignment by ClustalW“ (www.genome.jp/tools/clustalw) [148]
gegeneinander abgeglichen und geordnet. Für die Berechnung wurden die Voreinstellungen für
Proteine genutzt.
4.26. Bioprozesstechnik
Bioreaktorkultivierung von Aspergillus giganteus 4.26.1.
Der Reaktor wurde mit allen Einbauten (Rührer, Temperaturfühler, Probennahme, Sparger, ph-
Sonde, Sauerstoffsonde, Septum und Port mit vier Öffnungen) autoklaviert, danach das Medium
zugeführt und alles steril angeschlossen. Für die kontrollierte AFP-Produktion wurden 4 l CM (pH
5,8) mit 1*106 Konidiosporen/ml A. giganteus IfGB 0902 im Bioreaktor bei 28 °C, 250 UpM, 2 lpm
Begasung mit Luft im Kopfraum angeimpft. Zur Regulation des pH-Wertes wurden über Pumpen 1
M HCl und 2 M NaOH-Lösung angeschlossen. Vier Stunden nach dem Animpfen wurden die
Rührerdrehzahl auf 800 UpM erhöht und die Begasung mit 2 l/min über den Sparger geleitet. Da
AFP ein Produkt des Sekundärmetabolismus ist, sollte A. giganteus im Wachstum seinem
ursprünglichen pH-Profil folgen. Dieses wurde in mehreren Läufen gemessen und dann zur
Vereinheitlichung der Kultivierungen in einem programmierten Profil nachgestellt. Nach 72
Stunden wurde die Biomasse durch Filtration abgetrennt und ca. 3,5 l Kulturüberstand erhalten.
Das Biomassetrockengewicht wird mittels Filtration und Gefriertrocknung bestimmt.
Tab. 31 - Gegenüberstellung der Parameterprofile der Bioreaktorläufe.
Parameter
Altes Profil
Neues Profil
Vorkultur
15 h
-
pH
5,8 (24 h) ; 8 (24 h)
Profil (5,8- 8,25) (72 h)
Begasung
2 lpm
2 lpm
Temperatur
28 °C (24 h), 37°C (24 h)
28 °C
Rührerdrehzahl
300 UpM
800 UpM
67
Tab. 32 -pH-Profil der Bioreaktorkultivierung von A. giganteus
Zeit [h]
pH
0
5,8
14
5,8
20
5,75
22
5,7
24
5,9
36
6,8
38
7,0
42
7,4
46
7,6
50
7,8
60
8,0
65
8,1
72
8,25
Bioreaktorkultivierung von Pichia pastoris 4.26.2.
Der Reaktor wurde mit allen Einbauten (Rührer, Temperaturfühler, Probennahme, Sparger, ph-
Sonde, Sauerstoffsonde, Septum und Port mit vier Öffnungen) autoklaviert, danach das Medium
zugeführt und alles steril angeschlossen. Für die kontrollierte AFP-Produktion wurden 4 l BMGY
medium pH 5,4 mit 39 ml einer mit 100 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschener und durch
Zentrifugation (2000 g, 15 min, 4 °C) aus 300 ml BMGY auf OD600nm 285 konzentrierten P. pastoris
Vorkultur im Bioreaktor bei 30 °C, 500 UpM, 2 l/min Begasung mit Luft angeimpft. Die
Methanolzufuhr für die Induktion des afp genregulierenden AOX1-Promotors wurde 5 h nach
Kultivierungsbeginn und kühlen des Mediums auf 20 °C mit einer Flussrate von 13,2 ml/h gestartet.
Der Bioreaktorlauf dauerte 50 Stunden, danach wurden die Zellen vom Medium mittel
Zentrifugation (2000 g, 15 min, 4 °C) getrennt. Die Zelldichte wurde mittels OD600nm Messungen
bestimmt.
4.27. Präparative Methoden
AFP-Reinigung 4.27.1.
Das im Laufe dieser Arbeit verwendete AFP wurde selbst durch Bioreaktorkultivierungen von A.
giganteus hergestellt. Es wurde in das Medium sekretiert und konnte durch
Affinitätschromatografie daraus isoliert werden. Nach Ende der Kultivierung wird manuell über die
Software der pH des Bioreaktorinhaltes auf 7 eingestellt. Die pilzliche Biomasse wird durch
Filtration mit Membranpumpe über Filterpapier auf einem Büchnertrichter vom Überstand
abgetrennt. Der Überstand wird danach in den Bioreaktor zurückgegossen und mit 70 g Chitin bei
RT und 500 UpM eine Stunde gerührt. Folgend wird das Chitin, wie zuvor die Biomasse, abfiltriert
und das Filtrat entsorgt. Das gebundene AFP wird von der Biomasse durch 1 Stunde rühren in 100
68
ml 1,5 M NaCl in TE-Puffer pH 7 und dem Chitin durch 1 h Rühren in 200 ml 1,5 M NaCl in TE-Puffer
pH 7 eluiert, nachdem mit 400 ml TE-Puffer pH 7 gewaschen wurde. Die Elution des Chitins wir
zweimal wiederholt. Aus den erhaltenen Lösungen wird das AFP mittels
Kationenaustauschchromatografie gewonnen und mit Tris-Tricin-SDS-PAGE und HPLC analysiert.
Für weitere Anwendungen wurde eine Konzentration von 1 mg/ml mit einem
Extinktionskoeffizienten von 1,4 bei OD280nm eingestellt. Die Reinigung ist schematisch in Abb. 13
dargestellt.
Abbildung 13 - Schema der Reinigung des AFPs aus der Bioreaktorkultivierung (Abb. Nach
Projektarbeit von Fabian Töppke)
Fällung der AFP-Antikörper aus Kaninchenserum 4.27.2.
Die im Serum gelösten Antikörper konnten mittels fraktionierter Fällung mit Ammoniumsulfat
präzipitiert werden. Durch die zugesetzten Salzionen wird den Proteinen die Hydrathülle entzogen,
so dass diese ausfallen. Die Fällung der AFP-Antikörper erfolgte unter konstantem Rühren aus 10
ml auf Eis gekühltem Serum immunisierter Kaninchen. Die erste Fällung (28 % Ammoniumsulfat)
erfolgte innerhalb von 30 min durch die Zugabe von 3,9 ml einer gesättigten 4,1 M (NH₄)₂SO₄-
Lösung. Nach der anschließenden Zentrifugation (13 000 UpM, 4 °C, 20 min) konnte das Präzipitat
69
verworfen werden und die zweite Fällung (40 % Ammoniumsulfat) mit 2,8 ml der gesättigten
Lösung fand wie oben beschrieben statt. Das Sediment wurde in insgesamt 2 ml PBS-Puffer pH 7,4
rekonstituiert.
5. Ergebnisse
5.1. Optimierung der AFP-Produktion
Die Sekretion des AFPs erfolgt im Wesentlichen in der post-exponentiellen Wachstumsphase von
A. giganteus [82]. Es handelt sich somit um einen Sekundärmetaboliten [149], der nicht für das
Wachstum und Überleben der Zelle benötigt wird [150]. Je nach Art der Kultivierung und dem
gewählten Medium erhält man unterschiedliche Ausbeuten an AFP von 3 mg/l bis 10 mg/l
Kulturvolumen [82]. Ein Problem stellt die Sekretion des lf-AFPs [83], vor der proteolytischen
Spaltung der N-terminalen Aminosäuren und somit Bildung des prozessierten Peptids, dar. Es kann
bei der Wahl ungeeigneter Kultivierungsmethoden zu einer Anreicherung des lf-AFPs kommen,
welches dann auf Grund der sehr ähnlichen Eigenschaften zum AFP nur schwer abgetrennt werden
kann. Die Produktion in Schüttelkolben [82] erfordert am wenigsten technisches Können, bringt
aber auch die geringsten Ausbeuten. Die Kultivierung im Bioreaktor geht mit einer wesentlich
besseren Belüftung des Mediums von statten. Daher werden wesentlich höhere
Biomassetrockengewichte pro Liter Medium und daraus resultierend wesentlich bessere
Produktausbeuten an AFP erreicht [151]. Ein weiterer Vorteil in der Nutzung eines Bioreaktors liegt
in der Steuerung der Prozessführung [152] bezogen auf die Parameter pH, Temperatur im Medium,
Sauerstoffsättigung, Rührerdrehzahl und in der Möglichkeit der Probennahme zur
Prozessüberwachung. Es gab in der Vergangenheit einige Optimierungen in der Produktion des
AFPs im Bioreaktor. Versuche mit verschiedenen Medien und Kultivierungsbedingungen führten zu
einer finalen Ausbeute von ca. 17 mg/L Medium AFP mit einer Reinheit von 99,9 % nach der
Reinigung [88]. Es stellte sich jedoch heraus, dass die Konzentrationsabschätzungen ungenau
waren, da sie an Hand von Proteingelen erfolgten sowie die Reinheit des erhaltenen AFPs
unzureichend war. Die in alten Arbeiten beschriebenen Methoden und Ausbeuten konnten
teilweise auch nicht reproduziert werden. Zum Beispiel schlugen alle Versuche AFP mit, der in
früheren Publikationen beschriebenen, Kationentauschermatrix Cellulosephosphat zu binden, fehl.
Daher wurden im Zuge der vorliegenden Arbeit zahlreiche Optimierungsversuche zur
Bioreaktorproduktion und Reinigung des AFPs vorgenommen. Das antimykotische Protein AFP
sollte aus dem Kulturüberstand von 4 l A. giganteus Batch-Bioreaktorkultivierungen isoliert
werden, die in 5 l Satorius Stedim Biostat Bioreaktoren durchgeführt wurden (Abb. 13, Seite 68).
Daher stand die Etablierung eines wiederholbaren Kultivierungs- und Reinigungsprotokolls für das
AFP am Beginn der Arbeit. Die bisherigen Kultivierungsbedingungen (Tab. 31, Seite 66) wurden in
der Erwartung besserer Ausbeuten dem Vorgehen bei A. niger Kultivierungen [153] und dem
natürlichen pH-Wachstumsprofil (Tab. 32, Seite 67) angepasst. In Abb. 14 ist die Biomassezunahme
von A. giganteus über die Zeit während einer Bioreaktorkultivierung nach dem Protokoll mit
70
konstantem pH-Wert von 5,8 und anschließendem pH-Sprung auf pH 8 und 37 °C, gezeigt. Das
Kultivierungsprotokoll ergab sich aus Studien zur AFP-Promotoraktivität [89], die einen basischen
pH-Wert und einen Temperatursprung auf 37 °C als stimulierend für die afp-Expression zeigten. Es
wurden die Werte von zwei Kultivierungen zusammengelegt, um Proben für die gesamte
Zeitspanne der Kultivierung zu haben. Die Lag-phase der Kultivierung beträgt fast 10 Stunden (h),
die exponentielle Phase 15 h, die stationäre Phase 5 h und die Absterbephase hält vom Zeitpunkt
30 Stunden bis zum Ende der Kultivierung an.
Abbildung 14 -- Biomasseprofil der A. giganteus Bioreaktorkultivierung mit konstantem
pH-Wert von 5,8. Es wurden die Daten von 2 Läufen (BSC 3, BSC 4) zusammengefasst, um
für alle Zeitpunkte im Abstand von 2 Stunden Werte zu erhalten. Das Profil ist repräsentativ
ausgewählt und entspricht den in anderen Läufen aufgezeichneten Daten. (Abbildung aus
Bachelorarbeit Samuel Samuleit, 2014)
Proben des Kulturüberstands wurden auf ihren AFP Gehalt untersucht. Es ergab sich daraus ein
Verlauf der AFP-Sekretion wie er beispielhaft in Abb. 15 dargestellt ist. Schon nach 24 Stunden
Kultivierungszeit (Abb. 15, Spur 2) ist AFP mit der SDS-PAGE nachweisbar. Die maximale
Konzentration wird jedoch nach ungefähr 50 Stunden (Abb. 15, Spur 7) erreicht. Das Signal behält
bis zum Ende ungefähr die gleiche Intensität.
71
Abbildung 15 - 16% Tris-Tricine SDS-PAGE mit dem Zeitverlauf der AFP Produktion
während der Bioreaktorkultivierung mit konstantem pH-Wert von 5,8. Es wurden 20 ml
Kulturüberstand mit 3 g Chitin inkubiert und von den 2 ml Elution 20 µl aufgetragen.
Beladungsschema: M: Page ruler low range unstained Marker. Es wurden jeweils 20 µl der
mit Mercaptoethanol reduzierten Probe aufgetragen. (Abbildung aus Masterarbeit Jessica
Elferink, 2014)
In weiteren Versuchen wurde getestet, ob eine Bioreaktorkultivierung ohne pH-Kontrolle (Tab. 31,
Seite 66) eine Verbesserung der Biomasseentwicklung und AFP Ausbeute bringen könnte. In Tab.
33 ist die Messung des Biomassetrockengewichts für eine Bioreaktorkultivierung mit pH- Profil zu
sehen. Die maximale Biomasse wird beim Zeitpunkt 27,5 Stunden mit 4,6 g erreicht und liegt damit
unter den Werten die in der pH-konstanten Kultivierung erreicht werden konnten. Interessant ist
jedoch, dass die Biomassekonzentration in der Absterbephase wesentlich höher ist als im Profil
Abb. 14. Zum Zeitpunkt 50,9 Stunden sind hier noch 3,9 g Biomassetrockengewicht gewogen
worden, im pH-konstanten Lauf nur ca. 2 g. Durch den Temperatursprung kommt es also zur Lyse
der Biomasse, wohingegen in der Kultivierung mit pH-Profil über einen längeren Zeitraum
metabolisch aktives Mycel vorliegt.
72
Tab. 33 - Verlauf der Biomasseentwicklung über die Zeit während der
Bioreaktorkultivierung von A. giganteus mit pH-Profil.
Zeit [h]
Konstanter pH-Wert
Biomassentrockengewicht [g/kg]
pH-Profil
Biomassentrockengewicht [g/kg]
5,5
0,6679
0,1754
21,5
4,3506
2,7696
23,5
3,6724
3,4490
25,35
5,9649
4,3171
27,5
6,3967
4,6313
44,9
3,0504
4,2877
46,9
3,0005
4,3106
48,9
1,8446
3,9833
50,9
1,8973
3,8753
70
1,1469
3,6467
Die Bioreaktorkultivierungen werden auch durch die Aufzeichnung des Sauerstoffpartialdruckes
pO2 begleitet. In Abb. 16 sieht man die Entwicklung des gesteuerten pH- Profils (Tab. 32, Seite 67)
als rote Kurve. Als grüne Punkte sind die Biomassewerte aus Tab. 33 eingetragen. Die blaue Kurve
zeigt denn Verlauf des Sauerstoffpartialdrucks. An Hand dessen ist es möglich hier auch für
Zeitpunkte, von denen keine Biomassedaten vorliegen, die Wachstumsphasen zu bestimmen. Man
geht davon aus, dass bei konstanter Begasung die Abnahme des Sauerstoffgehaltes im
Kulturmedium dem Verbrauch durch die Biomasse entspricht. Von 0 Stunden bis 10 Stunden ist
die Lag-phase, von 10 Stunden bis ca. 22 Stunden die exponentielle Phase, von 22 Stunden bis 31
Stunden die stationäre Phase und von ca. 31 Stunden bis zum Ende der Aufzeichnung die
Absterbephase zu sehen. Die Dauer der Kultivierungsphase deckt sich damit mit der pH-konstanten
Kultivierung (Abb. 15). Das trotz der höheren Biomassewerte in der Absterbephase auch hier viel
metabolisch inaktives Mycel vorhanden ist, sieht man am Anstieg der Sauerstoffkonzentration im
Medium. Zum Zeitpunkt 70 Stunden entspricht der pO2 einem Wert von ca. 97 %, wie ungefähr
beim Zeitpunkt 18 Stunden, wo mehr als 1 g weniger Biomasse, jedoch im Wachstum mit
maximalem Metabolismus vorhanden war. Darauf aufbauend konnten Wachstumskurven von A.
giganteus im Bioreaktor erstellt werden, von denen in Abb. 13 und 15 eine exemplarisch gezeigt
ist. Man kann die einzelnen Wachstumsphasen gut erkennen. AFP lässt sich mittel Tris-Tricine SDS-
PAGE zwar schon 24 Stunden nach Start der Kultivierung nachweisen (Abb. 15), die Konzentration
steigt jedoch mit zunehmender Zeit und ist ab dem Zeitpunkt 54 Stunden stabil. In anderen
Experimenten zeigte sich, dass das Fortführen der Kultivierung bis zum Zeitpunkt 70 Stunden nach
dem Animpfen zu einer höheren AFP Ausbeute führen kann. Es konnte gezeigt werden, das durch
die induzierte Erhöhung des pH-Wertes auf 8 und der Temperatur auf 37 °C in der post-
exponentiellen Phase die Ausbeute des AFPs nicht stieg (Daten nicht gezeigt), obwohl das in
Schüttelkolbenkultivierungen der Fall war [89].
73
Abbildung 16 - Profil einer A. giganteus Bioreaktorkultivierung mit natürlichem pH- Profil. Es sind
die Entwicklung der Sauerstoffsättigung des Medium (blaue Kurve), des pH-Werts (rote Kurve) und
der Biomasse (grüne Punkte) dargestellt. Anhand der Parameter Sauerstoffsättigung und Biomasse
lassen sich die Wachstumsphasen festlegen. Von 0 h bis 6 h ist die Lag-phase, von 6 h bis ca. 20 h
die Exponentielle Phase, von 20 h bis 30 h die stationäre Phase und von ca. 30 h bis zum Ende der
Aufzeichnung die Absterbephase zu sehen. Das Profil ist repräsentativ ausgewählt und entspricht
den in anderen Läufen aufgezeichneten Daten. (Abbildung aus Projektarbeit Fabian Töppke, 2017)
Das AFP wurde mittels Chitinaffinitätschromatographie aus den Kulturüberständen der
Bioreaktorkultivierungen gereinigt (Abb. 15, Seite 71). In Abb. 17 ist die Trennungen der Proben
vom Reinigungsprozess auf einer 16 % SDS-PAGE abgebildet. Man sieht deutlich die hohe
Konzentration an AFP in Spur 1, direkt im Eluat vom Chitin. Die Konzentration nimmt mit folgenden
Elutionsschritten ab, es kann jedoch immer noch genug AFP gewonnen werden, um ein Signal in
der SDS-PAGE zu erhalten. Erst die vierte Chitinelution (Abb. 17, Spur 5) ergibt kaum noch AFP. Das
Protein wurde ebenfalls durch die Elution der chitin-haltigen Biomasse isoliert (Abb. 17, Spur 6).
Dabei konnte in kleinerem Volumen fast eine genauso hohe Konzentration an AFP im Eluat
festgestellt werden wie in der ersten Elution des Chitins (Abb. 17, Spur 1). Man sieht jedoch auch
die Vielzahl anderer Proteine, die hier in hoher Konzentration vorliegen und abgetrennt werden
müssen. Im Kulturüberstand nach der Inkubation mit Chitin (Abb. 17, Spur 9) sieht man noch eine
leichte Bande des AFPs. Daraus wird deutlich, dass nur ein Teil des AFPs aus dem Kulturüberstand
gewonnen werden kann. Eventuell könnte das aber von Vorteil sein, da es sich hier auch anteilig
um AFP-Varianten handeln könnte, die andere Eigenschaften haben. Die Ausbeuten konnten durch
74
die Wiederholung der Inkubation des Kulturüberstandes mit Chitin (Abb. 13, Seite 68) verbessert
werden.
Abbildung 17 – 16 % Tris-Tricine SDS-PAGE zum Test der Elution des AFPs vom zur
Reinigung eingesetzten Chitin. Beladungsschema: 1: Page ruler low range unstained
Marker, 2: BSC42 Chitinelution 1, 3: Chitinelution 2, 4: Chitinelution 3, 5: Chitinelution 4, 6:
Biomasseelution 1, 7: Biomasseelution 2, 8: Chitinelution 5, 9: Überstand nach Inkubation
mit Chitin. Es wurden jeweils 20 µl der reduzierten Probe aufgetragen. (Abbildung aus
Bachelorarbeit Samuel Samuleit, 2014)
Ein Vergleich der erhaltenen Ausbeuten mit alten Publikationen und Arbeiten ist schwierig, da sich
in Analysen der noch vorhandenen alten AFP Proben deutliche Verunreinigungen in der reverse
phase-HPLC (RP-HPLC) zeigten. Des Weiteren erhält man je nach Kultivierung andere Verhältnisse
der verschiedenen AFP Varianten, die sich in der SDS-PAGE (Abb. 15, Seite 71) schwer, oder gar
nicht unterscheiden lassen. Zum einen gibt es eine N-terminal 6 AS längere AFP Variante, das lf-
AFP [83], zum anderen konnte im Laufe dieser Arbeit eine Variante mit einem N-terminalen
fehlenden Alanin short form (sf-) AFP identifiziert werden [154]. Zusammenfassend lässt sich
jedoch sagen, dass aus beiden Varianten der Bioreaktorkultivierung ungefähr gleich AFP gereinigt
werden konnte, ca. 10 mg je Liter Kulturüberstand.
Der nächste Schritt in der Reinigung des AFPs ist die Isolation des Proteins aus der Chitinelution.
Das kann mit der Größenausschlusschromatografie, oder mit einem Kationenaustauscher,
passieren. Da die Ergebnisse und die Handhabbarkeit der Größenausschlusschromatografie
(geringes Belandungsvolumen, keine vollständige Trennung) nicht zufriedenstellend waren, wurde
der Kationenaustauscher genutzt. Die Kationenaustauschersäule wurde mit ca. 34 ml
konzentrierter und dialysierter Chitinelution beladen (Abb. 18; 4 ml bis 38 ml). Danach wurde die
Säule mit ungefähr 20 ml Puffer gespült (Abb. 18; 38 ml bis 58 ml) bevor die Elution durch die
Zumischung des Puffers B mit hohem Salzgehalt bei einem Volumen von 58 ml startete und bei ca.
103 ml nur noch Puffer B über die Säule gepumpt wurde. Der prozentuale Anteil des Puffers B ist in
75
der grünen Kurve in Abb. 18 dargestellt, der daraus resultierende Anstieg der Leitfähigkeit des
Säulen-Eluats in der roten Kurve. Die schwarze Kurve zeigt die Messung der Absorption des Eluates
der Kationentauschersäule bei 280 nm. Sie steigt bei einer Leitfähigkeit von 75 mS*cm stark an,
hier eluiert das gebundenen AFP mit einem Maximum bei 76,1 mS*cm. Der Verlauf der
Absorptionskurve zeigt, dass auch andere Proteine gebunden wurden, die vom AFP abgetrennt
werden konnten.
Abbildung 18 - Profil der Reinigung von AFP durch eine Kationentauschersäule. In schwarz
ist die Messung der Absorption bei 280 nm des UV Detektors dargestellt. Bei dieser
Wellenlänge absorbieren vor allem die aromatischen Aminosäurereste des Proteins
Tryptophan, Tyrosine und Histidin. Das prozessierte AFP besteht hat unter anderem sechs
Tyrosine in seiner Aminosäuresequenz und ist daher gut detektierbar. In Rot ist die
Leitfähigkeit, die mit zunehmendem Salzgehalt steigt, angezeigt und in Grün der Anteil des
Eluenten B. Von 0 ml bis 38 ml wird die Säule beladen. Ab ca. 58 ml beginnt der Gradient
von Eluat B für die Elution durch den steigenden Salzgehalt. Der AFP-Peak hat sein
Maximum bei 85,48 ml. (Abbildung aus Bachelorarbeit Lena Heber, 2018)
Das AFP aus der FPLC-Reinigung wurde nach der finalen Konzentration und vor dem ersten Einsatz
in Aktivitätstests mit der RP-HPLC auf seine Reinheit überprüft. Dafür wurde das gesammelte Eluat
auf eine Konzentration von 1 mg/ml AFP eingestellt und eine Probe aufgetragen. In Abb. 19, Seite
76, kann man die Erhöhung der Reinheit des AFPs durch die einzelnen Reinigungsschritte und die
Reinheit der finalen AFP Probe sehen. Die blaue Kurve ist eine Probe des Kulturüberstands der
Bioreaktorkultivierung. Der AFP Peak bei ca. 8,2 min hebt sich aus der Grundlinie kaum ab. Die rote
Kurve ist eine Probe der ersten Chitinelution, auch hier sind neben dem AFP, z.B. bei 7 min, noch
anderen Proteine zu erkennen. Erst die finale Probe (gelbe Kurve) hat keine anderen Signale über
den Elutionszeitraum. Zusätzlich zur Retentionszeit dient ein Wellenlängenscan des Proteins im
jeweiligen Peak zur Bestätigung der Identität des Proteins sowie anschließende MIC90 Versuche.
AFP eluiert von der RP-HPLC Säule (Abb. 19, Seite 76) bei einem Verhältnis 68:32 von
76
Acetonitril:HPLC-Wasser. Im gewählten Programm entspricht das dem Gradienten der mobilen
Phase beim Zeitpunkt 8,2 min (Abb. 19, Seite 76). Die Signalintensität ist für die Proben aus der
Chitinelution und dem reinen Kulturüberstand deutlich geringer als bei der AFP Probe mit einer
eingestellten Konzentration von 1 mg/ml. Die Proben sind auch wesentlich stärker verunreinigt,
wobei die Verunreinigungen zum Teil (z.B. bei 2 min) durch die Chitinbindung und anschließende
Elution stark verringert werden. Der AFP-Peak wird erst nach der Chitinelution bei ca. 8,2 min
deutlich sichtbar. Die Chitinelution enthält, gemessen an den Absorptionseinheiten, ungefähr 1/6
der Konzentration an AFP im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 19, Seite 76). Also ca. 0,16 mg/ml.
Abbildung 19 - Überlagerung von Elutionsprofilen verschiedener AFP-haltiger Proben von
der RP-HPLC bei gleichen Bedingungen. Die blaue Kurve entspricht einer Probe des
unkonzentrierten Bioreaktorkulturüberstandes am Ende des Laufes nach ca. 70 Stunden.
Die rote Kurve einer Probe der Chitinelution. Die entsprechenden Absorptionseinheiten
sind auf der linken y-Achse eingetragen. Die gelbe Kurve entspricht der AFP Probe mit einer
Konzentration von 1 mg/ml und bezieht sich auf die Absorptionseinheiten der rechten y-
Achse. AFP eluiert bei dem verwendeten Laufmittelprofil von der RP-HPLC-Säule bei ca. 8,2
min und wird wie die anderen Proteine von einem Photoarraydetektor bei 280 nm
gemessen.
Durch die Programmierung eines flachen Acetonitril-Gradienten wurde die Elution des gereinigten
AFPs von 8,2 min (Abb. 19) auf ca. 26 min (Abb. 20 A) verschoben und eine zweite Peptidvariante
wurde nach 28 min detektiert (Abb. 20 A). Durch ihr Absorptionsspektrum wurden beide Peptide
als AFP identifiziert. Nach der getrennten Fraktionierung wurden die Peptide jeweils nochmal
77
eluiert, um zu prüfen ob AFP2 ein Abbauprodukt von AFP1 ist. Da sich keine erneute Auftrennung
der Peaks ergab (Abb. 20 A blaue, bzw. rote Kurve), ist eine klare Trennung in zwei AFP Varianten
nachgewiesen. Beide Peptide wurden in der „nuclear magnetic resonance“ NMR (Dr. Peter
Schmieder, AG Solution NMR, Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie (FMP)) verglichen,
wobei man nur sehr geringe Unterschiede feststellen konnte. Fast alle Signale von AFP1 (Abb. 20 B,
schwarze Punkte) überlagern sich mit denen des AFP2 (Abb. 20 B rote Punkte). Erst eine folgende
Massenspektrometrie (MS) Analyse (Dr. Peter Schmieder, AG Solution NMR, Leibniz-Institut für
Molekulare Pharmakologie (FMP)) zeigte, dass es sich bei AFP2 um eine Variante mit N-terminal
einem Alanin weniger handelt. Das Peptid wurde sf-AFP genannt und auf seine antimykotische
Aktivität im MIC90-Versuch überprüft. Während das AFP die gewohnte Reduzierung des
Wachstums des Kontrollstammes A. niger N402 ab 1 µg/ml zeigt (Abb. 20 C), hat das sf-AFP eine
geringere Wirkung und hemmt das Wachstum bei einer Konzentration von 4 µg/ml zu nur ca. 50 %
(Abb. 20 C).
Abbildung 20 – Identifizierung der sf-AFP Variante. RP-HPLC Profil der Trennung von AFP
Varianten und ihr Muster in der NMR Spektroskopie. A: Aus einer gereinigten AFP Probe
werden die AFP Varianten durch die Nutzung eines sehr flachen Acetonitril Gradienten
getrennt und vom UV-Detektor aufgenommen. Die schwarze Kurve ist die getrennte AFP
Probe, die blaue Kurve das nach der Trennung im gleichen Profil wiederholt eluierte AFP1
Wachstum %
Wachstum %
78
und die rote Kurve das nach der Trennung im gleichen Profil wiederholt eluierte AFP2. B:
Die den Peaks entsprechenden Peptide wurden separat gesammelt und in einer 1H,15N-
SOFAST-HMQC NMR analysiert. Die schwarzen Signale entsprechen dem AFP1, die roten
dem AFP2. Dargestellt ist das Ergebnis des Zusammenlegens der NMR Spektren mit den
detektierten natürlich vorkommenden 15N-Atomen. C: Die getrennten AFP Varianten
wurden in MIC90 Messungen gegen A. niger N402 auf ihre antimykotische Aktivität getestet.
Die Kontrolle ohne AFP ist mit -/- gekennzeichnet. (Abb. aus [154]. Die HPLC und NMR
erfolgte durch Dr. Sacha Jung und Dr. Peter Schmieder)
Die Erklärung das die Reduzierung der N-terminalen AFP Primärstruktur zur Beeinträchtigung der
antimykotischen Aktivität führt deckt sich mit dem Ergebnis, das eine N- oder C-terminale
Erweiterung des AFPs ebenfalls seine antimykotische Aktivität reduziert. Eine zur Reinigung über
Nickelaffinität in A. niger hergestellte AFP-Variante mit zusätzlichem 6xHis-tag am C-Terminus hat
einen berechneten MIC90 von ca. 31 µg/ml, eine AFP-Variante mit zusätzlichem 6xHis-tag am N-
Terminus sogar von ca. 86 µg/ml im Vergleich zur Kontrolle A. niger N402 mit einem MIC90 von 5
µg/ml in diesem Versuch. (Proteinvarianten aus Bachelorarbeit von Dorothee Günther (2015),
Daten aus Masterarbeit von Tobias Wörner (2014)).
Um die Bildung der alternativen AFP-Formen völlig auszuschließen, wurde die heterologe
Produktion des afp-Gens in P. pastoris etabliert. Statt dem ursprünglichen Propeptid, aus dessen
Abbau die verschiedenen AFP Varianten resultieren, wurde in P. pastoris Stamm LH6.6 die α-
Faktor-Signalsequenz mit bekannter Restriktionsstelle [84] verwendet. Es konnten je nach Wahl
des Mediums Ausbeuten vergleichbar mit den A. giganteus Fermentationen im Bioreaktor von ca.
10 mg/L Kulturbrühe gewonnen werden (siehe 4.26.2 Bioreaktorkultivierung von P. pastoris). Das
RP-HPLC Ergebnis des aus der Bioreaktorkultivierung des P. pastoris Stammes LH6.6 gereinigten
AFPs ist in Abb. 21 zu sehen. Die blaue Kurve ist das AFP von A. giganteus, die rosa Kurve das AFP
aus P. pastoris und die schwarze Kurve das AFP1 (Abb. 20 A). Im Ausschnitt wird klar, dass der
hintere Teil des Signals des A. giganteus AFPs fehlt. Im Vergleich mit Abb. 20 A sieht man, das in P.
pastoris nur das AFP1, jedoch nicht das AFP2 gebildet wurde. Das bedeutet, die sf-AFP-Variante
entsteht hier nicht, und auch nicht das lf-AFP, sondern nur das reife, aktive Peptid.
79
Abbildung 21 – Vergleich des AFPs aus A. giganteus und P. pastoris. RP-HPLC Elutionsprofil
von homolog und heterolog hergestelltem AFP. Die blaue Kurve entspricht dem gereinigten
AFP aus A. giganteus Kultivierungen, die pinke Kurve dem AFP aus P. pastoris LH6.6. Beide
Proben wurden auf eine Konzentration von ca. 1 mg/ml eingestellt. (Abbildung aus
Bachelorarbeit Lena Heber)
5.2. Gewinnung und Reinigung eines AFP-Antikörpers
Für viele Experimente werden zur Identifizierung eines Proteins spezifische Antikörper genutzt. In
der Arbeitsgruppe „Phytoantikörper“ des Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und
Kulturpflanzenforschung in Gatersleben wurden durch AFP Injektionen (Proben aus A. giganteus
Bioreaktorkultivierungen, wie z.B. Abb. 21 blaue Kurve) in Kaninchen polyklonale Antikörper gegen
AFP gewonnen, die aus dem Kaninchenserum mittels sequenzieller Ammoniumsulfatfällung und
anschließender FPLC Größenausschlusschromatografie gereinigt wurden. In Abb. 22 ist das
Elutionsprofil der size exclusion chromatografie (SEC) der gefällten anti-AFP Kaninchenantikörper
von der Gelfiltrationssäule der FPLC zu sehen. Das Elutions-Maximum liegt bei 47,36 min, was
ungefähr dem Totvolumen der Säule entspricht. Proteine mit einer Größe von 150ka fließen an der
genutzten Sephadex-Matrix vorbei und werden bei diesem Durchflussvolumen im Detektor
gemessen. BSA mit einem Gewicht von 66 KDa passiert die Säulenmatrix ebenfalls fast ungebremst
und eluiert bei 52 ml ungefähr 5 min später (Abb. 22, pinke Kurve).
80
Abbildung 22 - SEC-Chromatogramm der Reinigung der AFP-Antikörper. Absorption der
Probe (blaue Linie) und von BSA (pinke Linie) bei 280 nm. Retentionszeiten sind oben in
blau und Fraktionen unten in Rot dargestellt. Die Antikörper eluierten nach 47,36 min von
der Säule. Fraktionen A12 bis B9 wurden vereint. (Abb. aus Masterarbeit Artur Miller)
Die FPLC-Fraktionen A12 bis B9 (Abb. 22), mit den von anderen Serumbestandteilen getrennten
Antikörpern, wurden vereinigt und ihre Konzentration durch die Messung der OD280nm unter
Einberechnung des für Antikörper typischen Extinktionskoeffizienten von ca. εAB=1,35 mit 1,19
mg/ml bestimmt. Die Bindung der gereinigten Antikörper an das AFP wurde durch die Inkubation
von an eine Western Blot-Membran gebundenem AFP mit verschiedenen Verdünnungen der
Antikörper getestet (Abb. 23). Selbst eine Verdünnung von 1:10.000, was einer Konzentration von
119 ng/ml Antikörper entspricht, ermöglichte noch eine Detektion der auf die Membran
getropften AFP-Probe (Abb. 23, Spur 5).
81
Abbildung 23 - Aktivitätstest der gereinigten AFP-Antikörper. AFP wurde auf den oberen
Teil und Reinstwassser als Negativkontrolle (Neg. Ktr.) auf dem unteren Teil der
Membranen aufgetragen. Membranen 1 und 2 wurden mit Kaninchenserum
(1:500/1:5.000), Membranen 3, 4 und 5 mit vereinten SEC-Fraktionen (1:3.000 /1:5.000
/1:10.000) inkubiert. Die Detektion erfolgte mit HRP-konjugierten anti-Kaninchen-
Zweitantikörpern. (Abb. aus Masterarbeit Artur Miller, 2016)
5.3. Test der Lipidbindung von AFP
Die gereinigten AFP Antikörper (Abb. 23) wurden unter anderem für den Versuch der Detektion
von an Lipid- und Sphingosin-Proben gebundenem AFP genutzt. Auf die kommerziell erhältlichen
Lipid-Streifen (Abb. 24 A) und Sphingo-Streifen (Abb. 24 B) wurde AFP gegeben und anschließend
detektiert (Abb. 24 C). Es konnte jedoch nur die Bindung der Positivkontrolle und der auf die
Membran getropften AFP-Kontrolle nachgewiesen werden. Unter den experimentellen
Bedingungen fand keine Bindung des AFPs an eines der getesteten Lipide oder Sphingosine statt.
Eventuell ist dafür eine membranähnliche Umgebung nötig.
82
Abbildung 24 – Test der Affinität von AFP an verschiedene Lipide und Sphingosine. A)
Probenschema des Enchelon Lipid Strip. B) Probenschema des Enchelon Sphingo Strip. C)
Der AFP-Lipid Bindungstest wurde mit den Membran Lipid Strips (1 und 2) und dem Sphingo
Strip (3) durchgeführt. Zusätzlich zum AFP wurde in 2 mit der GST-getagten PLC-δ1 PH
Proteindomäne (Positivkontrolle) inkubiert. In 3 wurde mit AFP als Positivkontrolle in der
rechten oberen Ecke aufgetragen. Strip 1 und 3 wurden mit den gereinigten AFP-
Antikörpern und Strip 2 zusätzlich mit anti-GST Antikörpern inkubiert. Anschließend
erfolgte die Bindung der HRP-konjugierten Zweitantikörper, gefolgt von der Detektion mit
ECL. (Abb. aus Masterarbeit Artur Miller, 2016)
5.4. Bestimmung der AFP-Aktivität mittels MIC90 Messungen
Die minimale Hemmkonzentration MIC90 des AFPs gegen verschiedene Hyphenpilze wurde
bestimmt. Der MIC90 definiert sich als die AFP-Konzentration, ab der nur noch ≤ 10% des
Wachstums der Kontrolle ohne AFP gemessen werden können. Die Ergebnisse sind in Tab. 34
aufgelistet. Die Auswahl der Stämme ergab sich aus Kooperationsprojekten mit der Bundesanstalt
für Materialprüfung (BAM) und anderen Forschergruppen. Es handelt sich um wichtige
83
Schadorganismen für organisches Material, wie z.B. Holz, und wichtige human- und
pflanzenpathogene Pilze.
Tab. 34 - Im Laufe der Arbeit ermittelte Minimale Hemmkonzentrationen (MIC90) des
AFPs.
Spezies
MIC90 [µg/ml]
Aspergillus fumigatus
12
Aspergillus nidulans
10
Aureobasidium pullulans
DSM 2404
resistent
Fusarium moniliforme
IfGB Nr. 39/1402
400
Hormoconis resinae
DSM 1203
220
Lecanicillium fungicola
DSM2353
400
Sydowia polyspora
DSM 3498
140
Ulocladium atrum
DSM 63068
140
V. dahliae
0,6
Es zeigt sich, dass die zur Wachstumshemmung nötige AFP-Konzentration nicht nur von der Art,
sondern auch dem jeweiligen Isolat abhängig ist. In Theis et al. wurde für A. nidulans DSM 969 und
A. nidulans G191 ein MIC90 von 200 µg/ml gemessen, wohingegen hier für den hier getesteten A.
nidulans nur 10 µg/ml AFP zur Hemmung des Wachstums notwendig waren. Die gute Wirkung auf
humanpathogene (z.B. A. fumigatus) und pflanzenpathogene (z.B. V. dahliae) Schimmelpilzarten
hat sich in den Messungen bestätigt.
5.5. Einfluss der Δ3 (E)-Desaturase auf die AFP-Empfindlichkeit
Enzymatische Bildung der C3-ungesättigten Fettsäuren in pilzlichen GlyCer 5.5.1.
In verschiedenen Studien konnte ein Zusammenhang zwischen GlyCer und der Aktivität von
antimykotischen Peptiden gezeigt werden, siehe Tab. 41 Seite 129. So führte eine Blockade der
GluCer in P. pastoris durch Antikörper oder die Deletion der Glucosylceramidsynthase gcs in P.
pastoris und C. albicans zu einer geringeren Empfindlichkeit gegenüber dem Pflanzendefensin
RsAFP2 [155]. Es konnte außerdem gezeigt werden, das RsAFP2 direkt an pilzliche
Glucosylceramiden (GluCer) bindet [156]. Wenn man die vorhandenen Daten zur Struktur von
GlyCer in filamentösen Pilzen [126] mit den Daten zur Empfindlichkeit gegenüber AFP vergleicht
fällt auf, dass Pilze mit C3-ungesättigten Fettsäuren in ihren GlyCer [125] stärker sensitiv gegenüber
AFP sind als Pilze, denen diese Doppelbindung in den GlyCer fehlt.
84
Tabelle 35 - GlyCer-Zusammensetzung von Pilzmembranen [126] und zugehörige MIC90-
Werte [82]. - = kein Effekt
Pilzart
GlyCer
Δ3-ungesättigt
MIC90 (µg/ml)
Aspergillus niger
GlcCer
Ja
1
GalCer
Ja
Aspergillus fumigatus
GlcCer
Ja
10
GalCer
Ja
Fusarium graminearum
GlcCer
Ja
10
Fusarium solani
GlcCer
Ja
120
Aspergillus nidulans
GlcCer
Nein
200
Saccharomyces cerevisiae
GalCer
Nein
-
Candida albicans
GlcCer
Nein
-
Enzymatische Schritte der GlyCer Synthese in A. niger 5.5.2.
Die Enzyme des Syntheseweges der GlyCer sind bekannt, die dafür kodierenden Gene sind in
verschiedenen Organismen, vor allem S. cerevisiae und A. nidulans vorhergesagt (Abb. 12, Seite
29). Durch einen pBLAST [77] der beschriebenen Gene gegen das Proteom von A. niger CBS 513.88
konnten die entsprechenden Orthologe für A. niger identifiziert (Tab. 44) werden. Bisherige
Studien beschränken sich auf Analysen von Gendeletionen der GlyCer-Synthese in anderen
Aspergillus spp. [124, 157]. Die gewonnen Daten können jedoch nur teilweise übertragen werden,
da sich vergleichbare Gendeletionen, wie im Abschnitt 2.9 beschrieben, je nach Art unterschiedlich
auswirken können. Das Auffinden der Orthologe zeigt jedoch, dass der Syntheseweg in A. niger
ähnlich zu den beschriebenen für GlyCer vorhanden ist. Weiterhin sind die Zuordnungen eindeutig
und es gibt nicht mehrere Orthologe zu einem Gen, wie es teilweise in anderen Pilzen der Fall ist.
85
Tab. 36 - A. niger CBS513.88 Genorthologe zu bekannten Genen des GlyCer
Syntheseweges (siehe Abb. 11). Die Genorthologe wurden anhand beschriebener Gene aus
anderen Pilzen, angegeben in der Spalte Organismus, per pBLAST Analyse identifiziert. Die
Referenzen entsprechen den Publikationen, in denen die A. niger Orthologe beschrieben
sind.
Annotation
Genortholog
Organismus
Beschreibung
Quelle
An07g03380
gcs
A. niger
2-Hydroxyacylsphingosin 1-beta-
glucosyltransferase
[158]
An11g00990
lac1
S. cerevisiae
Sphingosin N-Acyltransferase
[159]
An04g10300
lac1
S. cerevisiae
Sphingosin N-Acyltransferase
,“longevity-assurance“ Protein
[160]
An08g03450
tsc10
S. cerevisiae
3-Ketodihydrosphingosinreduktase
[161]
An08g04100
spt
S. cerevisiae
Serine Palmitoyltransferase 2
[160]
An06g01540
lcbA
A. nidulans
Serine Palmitoyl CoAtransferase
Untereinheit
[160]
An18g03820
lcb2
S. cerevisiae
Serine Palmitoyltransferase 2
[160]
An04g01320
Delta 4
Desaturase
A. nidulans
Dihydroceramid delta(4)-Desaturase
[162]
An13g00740
Ceramide
synthase
A. nidulans
Zyklopropane-Fettsäurerest-
Phospholipid Synthase
[163]
An02g04530
Ceramide
synnthase
A. nidulans
Zyklopropane- Fettsäurerest-
Phospholipid Synthase
[160]
An07g06770
Delta 8
Desaturase
A. nidulans
Fettsäuredesaturase
[160]
An16g06350
Delta 8
Desaturase
A. nidulans
Fettsäuredesaturase
[160]
An01g14200
SCS7
S. cerevisiae
Ceramide „very long chain“
Fettsäurehydroxylase
[164]
An04g04210
smt_1
A. fumigatus
S-Adenosyl-Methionine-Sterol-C-
Methyltransferase
[160]
In anderen Studien wurden gezielte Gendeletionen zur Charakterisierung der daraus entstandenen
Phänotypen durchgeführt. Gerade in Verbindung mit AFP könnte das für A. niger von Interesse
sein. Die Liste der Gene des GlyCer Syntheseweges (Tab. 36) wurde auch zur Untersuchung auf
gemeinsame Transkriptionsfaktoren (TF) oder Signalwege der Gene genutzt. Die Analysen führten
aber zu keinem Ergebnis (Daten nicht gezeigt). Es ließ sich kein Subnetzwerk der Gene aus den
Transkriptomdaten erstellen, bzw. eine Beziehung der Gene zueinander anhand ihres
Expressionsmusters und auch die Suche nach einem globalen Transkriptionsfaktor führte zu
keinem Erfolg.
86
Bedeutung der pilzlichen GluCer für die antimykotische Wirkung des AFPs 5.5.3.
Durch die Zugabe von D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (D-PDMP
gelöst in Reinstwasser) zum Medium wird die Synthese von Glucosylceramiden (GluCer) im letzten
Schritt unterbrochen. Dadurch kann die Verbindung von GluCer-Präsenz mit der Aktivität des AFPs
untersucht werden. Durch seine Analogie zu Ceramiden bindet D-PDMP an die
Glucosylceramidsynthase und inhibiert ihre Aktivität, wodurch die Bindung des Glucosemoleküls an
das Ceramidgerüst [165] verhindert wird (Abb. 12, Seite 29). Die Entfernung der GluCer aus der
Zellmembran hat unterschiedlichen Auswirkungen je nach Pilzart [166]. Die Effektivität der
Methode wurde für A. nidulans [167] und A. fumigatus [92] gezeigt. Wir haben die Auswirkungen
der Zugabe von D-PDMP und damit Reduzierung der GluCer Level auf die Empfindlichkeit
gegenüber AFP für A. niger (Abb. 25 A) und A. fumigatus (Abb. 25 B) untersucht. Die Reduzierung
der GluCer-Konzentration führt zu einer reduzierten AFP Empfindlichkeit, wodurch die Bedeutung
der GluCer für die antimykotische Aktivität des AFPs deutlich wird.
87
Abbildung 25 – Wachstum von A) A. niger Wt N402 und B) A. fumigatus Wt ATCC 9197 bei
unterschiedlichen AFP-Konzentrationen in Gegenwart (weiße Balken) oder Abwesenheit (graue
Balken) des GluCer-Synthese-Inhibitors D-PDMP. Die Messwerte wurden auf die nicht mit AFP
behandelten Kontrollen normalisiert. Alle Daten sind Mittelwerte, die aus zwei Experimenten mit je
Bedingung technischen Triplikaten errechnet wurden. (Die Daten für A. fumigatus stammen von Dr.
Silke Hagen)
3(E)-Sättigung der Glycosylceramide reduziert die Sensitivität gegenüber AFP 5.5.4.
Basierend auf den Daten zum Gehalt und der Struktur der GlyCer in pilzlichen Membranen (Tab. 5)
ergab sich die Arbeitshypothese, dass nicht nur das Vorhandensein der GluCer, sondern auch ihre
Eigenschaften für die Sensitivität eines Pilzes gegenüber AFP von Bedeutung sind und die
Doppelbindung zwischen dem dritten und vierten Kohlenstoffatom der Fettsäure des GlyCer (Abb.
11, Seite 28) den filamentösen Pilz (z.B. A. niger, F. graminearum) empfindlicher gegenüber AFP
macht. Mittels pBLAST Analyse wurde, basierend auf der Identifikation der Δ3(E)-Desaturase in F.
88
graminearum [125] (ORF code FJ176922.1), das für die Doppelbindung verantwortliche Enzym
identifiziert. Ein Teil der Grundlagen für diese Arbeit wurden daher im Fachbereich Biologie des
Instituts für Pflanzenwissenschaften und Mikrobiologie in der Abteilung Pflanzenbiochemie und
Infektionsbiologie der Universität Hamburg gelegt und auch spätere Versuche in Zusammenarbeit
mit den dortigen Kollegen (Dr. Dirk Warnecke, Dr. Melanie Thiess) durchgeführt. Das Ortholog zur
FJ176922.1 in A. niger (ORF code An01g09800) hat auf Proteinebene 61 % Sequenzidentität. Das
identifizierte Gen wurde „delta three desaturase“ (dtdA) genannt. Die Analyse der
Expressionsdaten einer internen A. niger Transkriptomdatenbank mit 155 verschiedenen
Kultivierungsbedingungen ergab, dass dtdA unter nahezu allen Kultivierungsbedingungen in
geringem Ausmaß exprimiert wird (Abb. 26).
Abbildung 26 – dtdA (An01g09800) Expressionsniveaus in 155 verschiedenen
Kultivierungsbedingungen von A. niger. Die mittleren Transkriptionswerte für An01g09800
basieren auf den Transkriptomdaten, die in Schäpe et al. [168] publiziert wurden. Das
Expressionsniveau ist ins Verhältnis zum Expressionslevel des Aktin-Gens in der
exponentiellen Wachstumsphase gesetzt.
Durch die Herstellung von Δ3(E)-Desaturase Deletionsstämmen in F. graminearum und A. niger
konnte der Einfluss der GlyCer-Struktur auf die AFP Empfindlichkeit geprüft werden. Alle Stämme
mit der F. graminearum Δ3(E)-Desaturase wurden von Dr. Simone Zäuner hergestellt. Die Deletion
der dtdA in A. niger wurde im Southern Blot (Anhang Abb. 49, Seite 139) überprüft. Die
Auswertung des Southern Blot gestaltete sich auf Grund der unspezifischen Bindungen der Sonde
schwierig. Neben dem downstream Bereich des dtdA Gens werden auch der Marker und
anscheinend andere DNA Fragmente markiert. Jedoch ist ein Vergleich der Bandenmuster
89
untereinander möglich und das gesuchte Fragment (Tab. 42, Seite 139) sticht als starkes Signal
heraus. Der Vergleich mit dem Wt zeigt NP1.15 und NP1.16 als erfolgreich transformierte Stämme.
Die Δ3(E)-Desaturase Deletionsstämme wurden zum Test der Arbeitshypothese über den Einfluss
der Doppelbindung in der Fettsäure auf die AFP-Empfindlichkeit im MIC90-Versuch getestet (Abb.
27). Für die 3 (E)-Desaturase Deletionsstämme in Fusarium graminearum (Abb. 27 B) und
Aspergillus niger (Abb. 27 A) sinkt die AFP Empfindlichkeit im Vergleich zum Wt, besonders für
geringe AFP-Konzentrationen.
Abbildung 27 - Einfluss der Expression der 3 (E) -Desaturase auf die AFP-Empfindlichkeit.
A) Wachstum von A. niger Wt Stamm N402 (graue Balken) und ΔdtdA Stamm NP1.15
(weiße Balken) bei verschiedenen AFP-Konzentrationen. B) Wachstum des F. graminearum
Wt (graue Balken) und des Δ3 (E)-Desaturase Deletionsstammes (D3KO; weiße Balken). Die
Messwerte wurden auf die nicht mit AFP behandelten Kontrollen normalisiert. Alle Daten
sind Mittelwerte, die aus zwei Experimenten mit je Bedingung technischen Triplikaten
90
errechnet wurden. (Die Daten zu F. graminearum (B) stammen von Dr. Simone Zäuner,
2009)
Die Arbeitshypothese über den Einfluss der C3-Entsättigung des GlyCer konnte also bestätigt
werden. Liegt GlyCer gesättigt vor, ergibt sich eine Reduzierung der AFP-Empfindlichkeit des
Teststamms von A. niger und F. graminearum.
3(E)-ungesättigte Glycosylceramide erhöhen die AFP-Empfindlichkeit 5.5.5.
Durch die Expression der 3(E)-Desaturase aus A. niger (ORF code An01g09800) und F.
graminearum (ORF code FJ176922.1) in der Hefe P. pastoris soll jeweils überprüft werden,
inwieweit das Einfügen der Doppelbindung in der Fettsäure der GlyCer zu einer AFP-Sensitivität
führt. Grundsätzlich ist P. pastoris kaum AFP-sensitiv. Das genutzte Expressionssystem basiert auf
einer Ligation der dtdA hinter den mit Methanol induzierbaren AOX1-Promotor. Die erstellten P.
pastoris Stämme zeigen nach Induktion mit Methanol, also Expression der dtdA, BBA21.3
(An01g09800 = dtdA) (Abb. 28), oder durch konstitutive Expression SZ51 (FJ176922.1 = dtdA-
Ortholog) (Daten nicht gezeigt), eine größere AFP Empfindlichkeit als der jeweilige
Vergleichsstamm.
Abbildung 28 – Empfindlichkeitsmessung des P. pastoris Stammes BBA21.3 (dtdA) bei
verschiedenen AFP Konzentrationen. Die OD600nm Werte der Kontrolle (BBA21.3 nicht
induziert) wurden jeweils auf 100 % gesetzt (graue Balken.)
Die Expression der Δ3-Desaturasen in Pichia bewirkt im Fall des A. niger Gens dtdA eine
Wachstumsreduzierung von ca. 40 % bei 50 µg/ml AFP (Abb. 28) und im Fall des F. graminearum
Gens FJ176923 eine Wachstumsreduzierung von ca. 25 % für 200 µg/ml AFP. Interessant ist die
91
Steigerung des Wachstums um 80 % bei 0 µg/ml AFP im induzierten Zustand (Abb. 28). Das
stärkere Wachstum wird durch die Zugabe des induzierenden Methanols, das gleichzeitig eine
zusätzliche Kohlenstoffquelle ist, ausgelöst. Das man in den anderen Ansätzen trotzdem einen
Effekt durch die Expression der dtdA sieht, zeigt das die Hemmung stärker sein muss als in den
Ergebnissen ablesbar. Eine Kontrolle durch den Wt GS115 mit Methanol im Medium wäre hier
sinnvoll gewesen, allerdings hätte man dann mit Histidin komplementieren müssen.
92
Test der dtdA-Expression mit qRT-PCR 5.5.6.
Die Funktion der transformierten Expressionskonstrukte wurde durch die Messung der mRNA Level
mit einer qRT-PCR überprüft. Es sollte sichergestellt werden, dass die Deletionen und vor allem die
heterologen Expressionskonstrukte die gewünschten Phänotypen ergeben. In Abb. 29 sind die
Ergebnisse des Nachweises der Transkriptmengen es dtdA-Gens im Verhältnis zum Aktin-Gen
dargestellt. Für alle Deletions- und Kontrollstämme ließ sich, wie zu erwarten war, keine mRNA für
das dtdA-Gen nachweisen, jedoch für alle induzierten „knock-in“ Stämme (Abb. 29 A). Daher kann
in den späteren Experimenten vom Vorhandensein der DtdA ausgegangen werden, auch wenn
keine Unterschiede zur Kontrolle sichtbar sind. Die Überprüfung der Temperaturabhängigkeit
zeigte, dass die Expression der dtdA nicht wie bei F. graminearum ab 28 °C stark abnimmt. Die
Proteinmenge der Δ3-Desaturase und sinkt dort bei 30 °C auf 20 % [125] des Ursprungswertes. In
A. niger ist nur eine geringe Reduktion der mRNA Konzentration bei 37 °C sichtbar (Abb. 29 B).
93
Abbildung 29 - A. niger dtdA Transkriptniveaus in Wt und Δ3(E)-Desaturase
Mutantenstämmen von Hyphenpilzen und Hefen. Die Ct-Werte sind als Maß für die
Transkriptlevel der dtdA gezeigt, die auf die des Aktin Gens (An15g00560) normalisiert sind.
Das Vorhandensein von der entsprechender mRNA wird durch (Ct) Werte im Bereich von
etwa 1–1,5 gezeigt. Die Abwesenheit durch Ct-Werte im Bereich von 2–2,6. Die Daten
wurden aus zwei unabhängigen Experimenten gewonnen. Die Proben von A) stammten aus
bei 30 °C inkubierten Kulturen, während B) Proben von A. niger Wt N402 zeigt, der bei
verschiedenen Temperaturen kultiviert wurde um die Temperaturabhängigkeit der dtdA
Expression zu analysieren. Desaturase (+) = dtdA exprimiert; Desaturase (-) = dtdA nicht
exprimiert.
94
Die gentechnisch hergestellten Stämme von NP1.15, BBA21.3 und BBA20.2 konnten also für die
Analysen verwendet werden. Der Nachweis der Funktionalität der ins Genom integrierten
Genkassetten zur Expression der dtdA bei P. pastoris und S. cerevisiae wurde erbracht.
Überprüfung der Substratspezifität der Δ3(E)-Desaturase von A. niger 5.5.7.
Die Entsättigung der GlyCer durch die Δ3(E)-Desaturase von A. niger wurde in A. niger und P.
pastoris mittels MS/MS vermessen (Abb. 30). Dafür wurden an der Universität Hamburg mit Dr.
Dirk Warnecke und Dr. Sascha Jung aus den Biomassen gereinigte GlyCer Proben mit Dr. Melanie
Thiess und Dr. Sascha Jung in der MALDI MS/MS gemessen und der erhaltene Peak von 778 m/z
(Abb. 30 B) für das gesättigte GlyCer (GlyCer, N-(R)-2´-hydroxy-(3E)-octadecanoyl-1-O-β-D-hexosyl-
(4E,8E)-9-methyl-sphinga-4,8-dienin (C43H81O9N) (M + Na+)) , bzw. 776 m/z (Abb. 30 A) für das
ungesättigte GlyCer (N-(R)-2´-hydroxy-(3E)-octadec-3-enoyl-1-O-β-D-hexosyl-(4E,8E)-9-methl-
sphinga-4,8-dienin (C43H79O9N) (M + Na+)), fragmentiert. Als detektierbare Fragmente entstanden
das Hexosyl-sphingobasenfragment (M + Na+) mit 496 m/z und das Dimer des
Sphingobasenfragments mit 587 m/z (M – 2H2O + H+). Die bei diesem Fragment fehlende Fettsäure
konnte mit der vorhandenen MS/MS-Methode nicht detektiert werden. Die Masse von Glucose
und Galaktose unterscheidet sich nicht, daher kann hier keine Unterscheidung zwischen GluCer
und GalCer stattfinden. Deshalb wurde der Nachweis der C3-Sättigung über den Vergleich der
Massen des Parentalions und seinen Fragmenten erbracht. Wenn die Fragmente immer die
gleichen Massen besitzen, muss sich der Masseunterschied von 2 m/z im zum Parentalion in dem
fehlenden Teil, der Fettsäure, befinden. Für alle Stämme mit dtdA konnte das ungesättigtes GlyCer
mit einer m/z von 796 nachgewiesen werden und die dazu passenden Fragmente. Für alle Stämme
ohne dtdA das gesättigte GlyCer mit 778 m/z mit den gleichen Fragmenten wie beim ungesättigten
GlyCer.
1
2
95
1
2
96
97
98
99
Abbildung 30 – MS/MS-Analyse von aus der Biomasse isolierten Glycosylceramiden. Die
MS-Spektren zum Nachweis der GlyCer-Ionen für A. niger N402 C) 18 °C und E) 37 °C, P.
pastoris BBA21.3 G) nicht induziert und I) induziert. Die Überlagerungen der Massen der
GlyCer-Ionen und ihrer Fragmente sind in: B) NP1.15 (ΔdtdA), A) N402 30 °C, D) 18 °C und F)
37 °C, H) BBA21.3 nicht induziert und J) induziert gezeigt. R. int. (%) = Relative Intensität in
%;. Hex = Hexose (Die GlyCer wurden an der Universität Hamburg mit Dr. Dirk Warnecke
und Dr. Sascha Jung, die MS/MS Experimente wurden gemeinsam mit Dr. Sascha Jung und
Dr. Melanie Thies durchgeführt.)
Wie in den Abb. 30 H und 30 J zu sehen ist, erreicht die Entsättigung in den P. pastoris Stämmen
für die dtdA nur ca. 20 %, wohingegen sie für das F. graminearum Ortholog bei 50-100 % liegt
[125]. Wie schon aus den RT-PCR-Daten abgeleitet werden konnte, nimmt die Aktivität der dtdA im
A. niger Wt temperaturabhängig kaum ab (Abb. 29 B, Seite 93). Das Gleiche zeigt sich in den
MS/MS Messungen. Der Anteil an ungesättigten GlyCer liegt bei einem Wachstum bei 37 °C immer
noch bei ca. 80 % (Abb. 30 E). Die Ergebnisse der Fragmentierungen aus Abb. 30 sind in Tab. 37
zusammengefasst.
Tab. 37 - Zusammenfassung der GlyCer MS/MS Ergebnisse
Stamm
3(E)-
Desaturase
m/z GlyCer
m/z Hex-
sphingobase
P. pastoris BBA21.3 (induziert)
Aktiv
778 (20 %)
776 (80 %)
496
496
P. pastoris BBA21.3
Inaktiv
778
496
P. pastoris NP7.1
Inaktiv
778
496
P. pastoris NP7.1 (induziert)
Inaktiv
778
496
A. niger NP1.15 (ΔdtdA)
Inaktiv
778
496
A. niger N402 (18 °C)
Aktiv
776
496
A. niger N402 (30 °C)
Aktiv
776
496
A. niger N402 (37 °C)
Aktiv
776 (80 %)
778 (20 %
496
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Deletion oder heterologe Expression der dtdA in den
getesteten Stämmen die erwartete Form der gesättigten oder ungesättigten Fettsäurereste der
GlyCer ergeben hat. Um zu testen ob die Expression der Desaturase selbst einen Effekt auf die AFP
Empfindlichkeit hat, bzw. noch andere Substrate in der Zelle von ihr entsprechend verändert
werden wurde die Hefe S. cerevisiae mit einer dtdA Expressionskassette transformiert. Die
Überprüfung mittels qRT-PCR (Abb. 29 A, Seite 93) zeigte, dass die dtdA tatsächlich in S. cerevisiae
unter dem konstitutiv aktiven TEF-Promotor exprimiert wurde. S. cerevisiae hat keine GlyCer in
ihren Membranen, dafür Inositol haltige Ceramide. Die Expression der dtdA veränderte die
Empfindlichkeit der resistenten Hefe gegenüber AFP nicht (Abb. 31). Daher ist eindeutig nicht das
100
Vorhandensein der DtdA, sondern die enzymatische Entsättigung der GlyCer durch die DtdA für die
Beeinflussung der AFP-Sensitivität verantwortlich.
Abbildung 31 - AFP Empfindlichkeitsmessung von S. cerevisiae mit Δ3 (E) -Desaturase-
Expression. Das Wachstum der S. cerevisiae BY4741 (Wt) und BBA20.2 (dtdA) wurde gemäß
Ouedraogo JP et al. [169] in Gegenwart von 400 μg / ml AFP oder ohne das Peptid getestet.
Die Daten entsprechen Mittelwerten aus 3 Experimenten. Desaturase (+) = dtdA exprimiert;
Desaturase (-) = dtdA nicht exprimiert.
Einfluss der dtdA-Deletion auf A. niger 5.5.8.
Interessanterweise ließen sich keine Veränderungen im Phänotyp des dtdA-Deletionsstammes
NP1.15 feststellen. Die Bildung von Biomasse wurde bei den Temperaturen von 18°C, 28°C und
37°C im Vergleich zum Wt nicht beeinflusst. Auch im makroskopischen und mikroskopischen Bild
zeigten sich auf Minimalmedium (MM) und complete medium (CM), dt. Komplexmedium, keine
Unterschiede. Für F. graminearum zeigte die Deletionsmutante auch keine phänotypischen
Veränderungen gegenüber dem Wt [125].
Da aus vorhergehenden Studien ein Zusammenhang der AFP Empfindlichkeit mit den Verhältnissen
der Zellwandpolymere Chitin und Glucan [169] bekannt war, wurde der Zellwandaufbau der dtdA
Deletions- und Expressionstämme von A. niger (Abb. 32 und 33) und P. pastoris untersucht (Abb.
33). Der Vergleich der relativen Chitin- und Glucankonzentration in der Biomasse des dtdA-
Deletionsstamms NP1.15 und des Wt N402 zeigte keinen signifikanten Unterschied (Abb. 32).
101
Abbildung 32 -Relativer Chitin- und β-1,3-Glucangehalt des A. niger Wt (N402) und ΔdtdA-
Stammes (NP1.15). Die relativen Mengen an Chitin und β-1,3-Glucan in % ist bezogen auf
Kontrollstämme, die auf 100 % eingestellt wurden. Die Daten entsprechen den
Mittelwerten aus 2 Experimenten. Desaturase (+) = dtdA exprimiert; Desaturase (-) = dtdA
nicht exprimiert
Damit der Einfluss der Δ3-Desaturierung auf die Konzentration der Zellwandpolymere deutlich
wird, wurden die Stämme nach ihrem Wachstum mit und ohne AFP aufgearbeitet. Es zeigt sich, das
C3-gesättigte GlyCer zu einer anderen Zusammensetzung der Zellwand nach AFP Kontakt führen als
C3-ungesättigte GlyCer. In A. niger führt die Deletion der dtdA zu einer Zellwandverstärkung mit
Chitin und Glucan als Reaktion auf AFP (Abb. 33 A). Im Wt wird die Konzentration an Chitin durch
AFP reduziert. Der Glucangehalt steigt weniger stark an. (Abb. 33 A). Die Zugabe von Methanol und
die damit induzierte dtdA Expression verändern in Pichia den Gehalt an Glucan und Chitin nicht
(Abb. 33 B). Sobald jedoch AFP zugegeben wird, steigt durch die Expression der dtdA der
Chitingehalt und Glucangehalt in der Zellwand von P. pastoris an (Abb. 33 C). Ohne Expression der
dtdA jedoch nur der Glucangehalt, der Chitingehalt sinkt sogar leicht.
102
103
Abbildung 33 – Veränderungen im Chitin- und β-1,3-Glucan ausgelöst durch AFP. Die
relativen Mengen an Chitin und β-1,3-Glucan in % sind bezogen auf die jeweiligen
Kontrollstämme (100 %). A) A. niger N402 (Wt) und NP1.15 (ΔdtdA) in Gegenwart oder
Abwesenheit von 20 µg/ml AFP. B) P. pastoris GS115 (Wt) BBA21.3 (dtdA) in Gegenwart
oder Abwesenheit von Methanol als Induktor der dtdA Expression. Dieses Experiment
diente als Kontrolle des Einflusses von Methanol auf die Synthese der Zellwandpolymere. C)
P. pastoris BBA21.3 (dtdA) in Gegenwart und Abwesenheit von 20 µg/ml AFP und Methanol
als Induktor der dtdA-Expression. Die Daten sind als Mittelwert von zwei unabhängigen
biologischen Replikaten berechnet, die jeweils als technisches Triplikat durchgeführt
wurden. Desaturase (+) = dtdA exprimiert; Desaturase (-) = dtdA nicht exprimiert
In Tab. 38 ist sind die Veränderungen aus Abb. 33 zusammengefasst.
Tab. 38 - Veränderungen im Chitin- und β-1,3-Glucan ausgelöst durch AFP. Die Wildtyp-
und Desaturase-Mutantenstämmen von P. pastoris und A. niger reagieren mit
unterschiedlichen Veränderungen ihrer Zellwandpolymerzusammensetzung. Die Daten sind
entnommen aus den Ergebnissen dargestellt in Abb. 34.
+ dtdA
- dtdA
P. pastoris
Chitin
~
~
β-1,3-Glucan
+ 20%
+ 46%
A. niger
Chitin
~
+ 26%
β-1,3-Glucan
+ 26%
+ 78%
Konfrontiert man den P. pastoris Stamm BBA21.3 nicht induziert, also als Wt-Kontrolle, mit AFP,
erhöht sich der Glucangehalt der Zellwand um 46 %, der Chitingehalt sinkt jedoch um 10 % (Abb.
33 C). Nach Induktion der dtdA mit Methanol, bezogen auf die Kontrolle BBA21.3 mit Methanol
und ohne AFP, erhöht sich der Chitingehalt der Zelle um 6 %, aber der β-1,3-Glucan Gehalt um 26%
weniger als beim der AFP resistenten Wt. In A. niger folgt die Veränderung des Chitin- und
Glucangehaltes den Beschreibungen aus Studien zu AFP resistenteren Mutanten [91, 169]. Im
Wildtyp N402 bewirkt AFP eine Erhöhung des β-1,3-Glucan Gehaltes um 26 %, und ein Sinken des
Chitingehaltes um 13 % (Abb. 33 A). Die Anwesenheit gesättigter GlyCer sorgt für eine Zunahme
des Chitingehaltes in der Zellwand des Deletionsstammes um 16 % und des Glucangehaltes um 78
% (Abb. 33 A). Die beiden Spezies reagieren also beide mit einer Erhöhung des β-1,3-Glucan
Gehaltes der Zellwand, wenn die dtdA exprimiert wird und AFP vorhanden ist. Wenn sie die dtdA
nicht exprimieren, tritt die Erhöhung des Glucangehaltes der Zellwand durch die Konfrontation mit
AFP mehr als doppelt so stark auf. Unterschiedlich ist die Reaktion auf das AFP bezogen auf Chitin.
Während die Zellwand von A. niger in Abwesenheit der dtdA mit Chitin verstärkt wird, um AFP
entgegen zu wirken, ist das bei P. pastoris nur in Anwesenheit der dtdA der Fall. Das im Fall von
Chitin genau entgegengesetzte Verhalten lässt auf unterschiedliche zu Grunde liegende
Reaktionsprozesse als Folge des AFP-Wirkens schließen.
104
Auswirkung der Reduzierung des GluCer-Gehaltes auf den MIC90 Wert des dtdA-5.5.9.
Deletionsstamm NP1.15
Wie in Abschnitt 6.4.2 beschrieben wurde auch im ΔdtdA Stamm NP1.15 der GluCer Gehalt der
Zellmembranen durch die Zugabe von D-PDMP zum Medium vermindert (Abb. 34). Es zeigt sich
eine deutliche Zunahme der Resistenz gegenüber AFP, insbesondere bei den höheren
Konzentrationen (ab 2 µg/ml AFP). Das Wachstum bleibt bei ungefähr 70 % des Wertes der
Kontrolle, unabhängig von steigenden AFP-Konzentrationen. Die Verminderung des GluCer Anteils
der Membran durch D-PDMP führt im dtdA-Deletionsstamm zu einer mit dem Wt (Abb. 25 A, Seite
87) vergleichbaren Entwicklung der OD-Abnahme mit steigenden AFP-Konzentrationen. Das ist
zum einen logisch, da der Unterschied zwischen Wt und dtdA-Deletionsstamm, die unterschiedlich
gesättigten Fettsäurereste der GluCer, durch das D-PDMP aufgehoben wird- Zum anderen zeigt es,
das der Einfluss der Galactosylceramide (GalCer) nicht messbar ins Gewicht fällt. Der Einfluss der
GluCer auf die AFP-Empfindlichkeit von A. niger wurde hier jedoch bestätigt.
Abbildung 34 – Empfindlichkeit NP1.15 (ΔdtdA) gegenüber AFP nach D-PDMP ausgelöster
Reduzierung der GluCer Konzentration. Das Wachstum des A. niger NP1.15 (ΔdtdA) bei
verschiedenen AFP-Konzentrationen und in Gegenwart (weiße Balken) oder Abwesenheit
(graue Balken) des D-PDMP. Die Daten wurden auf das Wachstum (100 %) der Ansätze
ohne AFP normalisiert. Die Daten sind als Mittelwert aus zwei unabhängigen biologischen
Experimenten, die in technischer Dreifachausführung durchgeführt wurden, berechnet.
Die Deletion der dtdA führte zu einer höheren Resistenz bei niedrigen AFP Konzentrationen, die ab
4 µg/ml AFP aufgehoben war (Abb. 27 A, Seite 90). Die Doppelbindung zwischen dem dritten und
vierten Kohlenstoffatom hat also eher einen Einfluss auf die Feinabstimmung der AFP-Reaktion
und erhöht den MIC90 um das ca. vierfache. Bei höheren AFP-Konzentrationen greifen dann
wahrscheinlich noch andere Wirkmechanismen des AFPs bei der Destabilisierung der Zellwand-
und Plasmamembranintegrität.
105
5.6. Intrazelluläre Funktionen von AnAFP
Auswertung der A. niger Transkriptomdatenbank 5.6.1.
Um tiefere Einblicke in die, vor allem intrazelluläre, Funktion von AFP zu gewinnen sind „-omics“
Daten aus verschiedenen Kultivierungsbedingungen notwendig. Diese stehen für A. giganteus nicht
zur Verfügung, jedoch für den gut erforschten und als Modell viel genutzten A. niger. Da dieser
Spezies ebenfalls ein zur AFP-Familie gehörendes antimykotisches Protein sekretiert, das AnAFP,
wurde dieser Datenschatz genutzt, um vorhersagen für die Funktion des AnAFP zu treffen, die als
Hinweise für weitere Funktionen der anderen Mitglieder der AFP-Familie genutzt werden können.
Auf der Grundlage der A. niger Transkriptomdatenbank des Fachgebiets „Angewandte und
Molekulare Mikrobiologie“ der TU Berlin, die Transkriptionsdaten des A. niger Genoms aus 155
verschiedenen Kultivierungsbedingungen umfasst, wurden das Expressionsmuster sämtlicher ORFs
unter all diesen Bedingungen in Beziehung zueinander gesetzt [168]. Das Vorgehen bei der
Erstellung des Netzwerkes ist in Abb. 35 dargestellt.
106
Abbildung 35 - Erstellung und Auswertung der Koexpressionsnetzwerke aus der A. niger RNA-
Mikromatrix Datenbank. A). Mit paarweise berechneten Rangkorrelationskoeffizienten nach
Spearman wurden in den Transkriptionssignaturen von A. niger alle vorhergesagten Gene des A.
niger-Genoms auf ihre Korrelation zueinander überprüft. Es ergaben sich daraus über 96 Millionen
(Mio) nicht koexprimierte Genpaare (schwarze und orangene Linien), 2,7 Mio positiv-korrelierte
Genpaare (schwarze und grüne Linien) und 1,8 Mio negativ-korrelierte Genpaare (schwarze und
rote Linie). In B) sind die über 4,5 Mio sich daraus ergebende Koexpressionsbeziehungen als
Netzwerk grafisch dargestellt. Die Linien zwischen den grauen Quadraten (Gene) stellen die
jeweilige Korrelation dar, wobei ihre Länge proportional zur errechneten Spearman Korrelation ist.
Blaue Kästchen stehen für Gene die TFs kodieren. Die Zuordnung von Genen unbekannter Funktion
zu einem biologischen Prozess erfolgt in Subnetzwerken, die genauer werden, je höher der für die
Berechnung genutzte Spearmankorrelationsfaktor ist. Die Zusammengehörigkeit von Genen in
einem Subnetzwerk lässt die Ableitung des bekannten biologischen Prozesses einiger Gene auf die
anderen zu. Die Abbildung stammt aus Schäpe et al. [168] und wurde von T. Cairns erstellt.
Dabei macht man sich den Ansatz das Gene, die in gleichen biologischen Prozessen wirken gleiche
Expressionsmuster aufweisen, zu Nutze. Aus dem Netzwerk lassen sich dann Gene den
107
metabolischen Prozessen zuordnen, in die sie involviert sind (Abb. 35). Der Abgleich von anafp mit
den anderen ORFs in der Transkriptomdatenbank von A. niger ergab ca. 1000 zu anafp ko-
exprimierte Gene. Mit einem Spearman Koeffizienten von 0,5 wurden 381 Gene identifiziert, die
mit anafp negativ korrelieren und 605 Gene mit einer positiven Korrelation zu anafp. Von diesen
knapp 1000 Genen sind nur 58 in ihrer Funktion verifiziert. Mit diesen wurde eine gene ontology
enrichment Analyse („GO enrichment“) durchgeführt, um die zugehörigen metabolischen Prozesse
zu identifizieren. Für AnAFP (An07g01320) ergibt sich neben der bekannten antimykotischen
Aktivität gegenüber fremden Zellen eine Rolle in hauptsächlich katabolischen Prozessen innerhalb
der Zelle (Abb. 36). Die Aktivität in einem späten Wachstumsstadium, bzw. alten
Myzelkompartimenten in Zusammenhang mit den Ergebnissen des Netzwerkes (Abb. 36) deutet
auf eine Rolle in der Bereitstellung von Energie durch autolytische Stoffwechselabläufe hin. Gene,
deren Funktion aus anderen Ascomycota oder Aspergillus spp. bekannt ist, wurden als Beispiele
aus der GO-Analyse den Prozessen zugeordnet.
Abbildung 36 – Ausgewählte Gene die mit anafp ko-exprimiert werden und die
zugehörigen Metabolischen Prozesse. Die Ergebnisse aus der A. niger Transkriptom-
Netzwerkanalyse, durch die sich aus der Koexpression des anafp mit Genen bekannter
Funktion eine Beteiligung an metabolischen Prozessen ableiten lässt.
Zur experimentellen Bestätigung der Verbindung von AnAFP mit den vorhergesagten
Stoffwechselwegen wurden bekannte zentrale Gene, globale Transkriptionsfaktoren dieser Wege
gewählt und ihr Einfluss auf die AnAFP Expression durch Untersuchungen an den zugehörigen
Deletionsstämmen durchgeführt.
108
Bedeutung der Transkriptionsfaktoren FlbA/BrlA für die anafp-Expression 5.6.2.
Die Transkriptionsfaktoren FlbA und BrlA wurden zur Überprüfung der Vorhersagen aus der GO
enrichment Analyse für anafp genutzt, da sie zentrale Regulatoren von Prozessen der Entwicklung
des Mycels sind. Eine Deletion dieser Transkriptionsfaktoren sollte sich also auch auf die
Promotoraktivität des AnAFP auswirken, falls das Protein wirklich an den in Abb. 36 gezeigten
Prozessen beteiligt ist Der Transkriptionsfaktor FlbA wirkt auch aktivierend auf den zentralen
Transkriptionsfaktor für die asexuelle Entwicklung, BrlA. Beide Transkriptionsfaktoren sind in ein
aus A. nidulans bekanntes Regulationsnetzwerk mit Auswirkung auf das vegetative Wachstum, die
Autolyse und die asexuelle Entwicklung eingebunden (Abb. 37) [94]. Eine Deletion von brlA hat
Kolonien zur Folge,die frei von Konidiosporen sind, jedoch ein verstärktes Wachstum von Luftmyzel
zeigen (Abb. 40, Seite 111) [135]. Die Erstellung und der Phänotyp von A. niger flbA (An02g03160)
und brlA (An01g10540) Mutanten wurden bereits in van Munster et al. [170] ausführlich
beschrieben. Der A. niger ΔflbA Stamm hat eine geringere spezifische Wachstumsrate, einen
erhöhten Chitingehalt in der Zellwand und höhere Transkriptionsraten von Genen, die durch
Zellwandstress induziert werden. Passend zu der beschriebenen Funktion von flbA für die Bildung
von Konidiosporen ist die Kolonie des Deletionsstammes frei von Konidiophoren und
Konidiosporen (Abb. 39, Seite 111) [135]. In A. nidulans ist flbA auch für die sexuelle Sporenbildung
wichtig [171].
Experimente in A. nidulans haben zur Entdeckung der Signalwege für die asexuelle Sporenbildung
und das vegetative Wachstum geführt (Abb. 37, Seite 109). Extrazelluläre Signale werden sowohl
durch FluG als auch zwei heterotrimere G-Protein-Komplexe, wahrgenommen. Letztere bestehen
aus den Gβγ-Untereinheiten SfaD und GpgA und den Gα-Untereinheiten FadA bzw. GanB. Nach der
Aktivierung eines Rezeptors durch FluG wird SfgA inhibiert, wodurch die Transkription der flb Gene
aktiviert wird. BrlA wird durch einen FlbB/FlbE-Komplex und einen FlbB/FlbD-Komplex in
Zusammenwirkung mit FlbC aktiviert. Damit beginnt die asexuelle Vermehrung. Der TF FlbC
aktiviert ebenfalls FluG und Gene, die dem TF BrlA in der Regulationskaskade folgen. Die Hemmung
von FadA durch FlbA wirkt ebenfalls aktivierend auf BrlA. Im Gegenzug wirken GTP-gebundenes
FadA und das GanB über den cAMP-PkaA-Weg fördernd auf das vegetative Wachstum und
repressiv auf BrlA. Weiterhin wird durch das SfaD-GpgA-Dimer unter der Regulation durch PhnA
das vegetative Wachstum gefördert. Es gibt also eine Rückkopplung der Regulation des vegetativen
Wachstums und der asexuellen Entwicklung, die dann durch die Hydrolyse des FadA bzw. GanB
gebundenen GTPs aufgehoben wird. Die hierfür verantwortlichen RGS-Proteine FlbA und RgsA
unterdrücken damit wieder das vegetative Wachstum zu Gunsten der asexuellen Sporenbildung
[94].
109
Abbildung 37 - Signalwege der asexuellen Reproduktion oder vegetativen Entwicklung in
A. nidulans. Abbildung nach Krijgsheld et al. [94].
Der Transkriptionsfaktor CreA 5.6.3.
Die Deletion des zentralen Kohlenstoffkatabolit-Repressors CreA [172] hebt die Repression von
Kohlenstoffkataboliten für die meisten Promotoren auf. In creA (An02g03830) Deletionsstämmen
sind auch in Anwesenheit von einfachen Kohlenhydraten wie Glucose Gene aktiv die Enzyme
kodieren, die für den Abbau von komplexeren Substraten benötigt werden. Dazu gehören z. B. die
Cellobiohydrolase CbhA und die Arabinofuranosidase AfbB [173]. Die Co-
expressionsgennetzwerkanalyse des AnAFP zeigte auch einen Zusammenhang mit Genen, die
durch Kohlenstofflimitierung aktiviert werden. Daher wurde die Regulation des anafp durch CreA
untersucht.
110
Zur Bestimmung des Einflusses der Transkriptionsfaktoren wurden zwei Reporterstämme genutzt,
die die Messung der anafp-Promotoraktivität über die Luciferaseaktivität oder eYFP-Fluoreszenz
ermöglichten (Abb. 38).
Abbildung 38 - Schematische Dartellung des anafp-Genlokus der Reporterstämme (erstellt
im Studienprojekt von Pim Kuizenga unter der Betreuung von Vera Meyer, 2010, Leiden
Universität) . Panafp: Promotor anafp, Ttrpc: Terminator trpc, sAopyrG: short A. oryzae
pyrG, Tanafp: Terminator anafp.
So konnte man nach der Deletion des jeweiligen Transkriptionsfaktors die Aktivität des anafp
Promotors durch Messung des Signalmoleküls eYFP oder Luciferase bestimmen.
Southern Blots der creA, brlA und flbA knock-out Stämme 5.6.4.
Der knockout des creA, brlA und flbA wurde in den Rezipientenstämmen Pk2.9 und Pk1.22 mittels
der split marker-Methode durchgeführt. Zur Selektion wurde die Hygromycinresistenzkassette
verwendet. Die Southern Blot Analyse der Gendeletion der erhaltenen Transformanten ist im
Anhang Abb. 50 (Seite 140) für die Sonde komplementär zur DNA oberhalb (upstream) des
jeweiligen Gens und im Anhang Abb. 51 (Seite 140) für die Sonde komplementär zur DNA
unterhalb (downstream) des jeweiligen Gens gezeigt.
Die Ergebnisse des Southern Blot sind für den Stamm NP4.1 schwer zu interpretieren (Anhang Abb.
50 und 51, Seite 140), da die Sonde nicht spezifisch genug nur für den „up“- oder „downstream“
Bereich des flbA Gens war. Daher wurde als Referenz der beschriebene Stamm BN26.1
herangezogen und die Vereinzelung des Stammes NP4.1, mit dazu passendem Bandenmuster
gewählt. Für die anderen Deletionsstämme war die Zuordnung eindeutig. NP2.8, NP3.2 und NP4.1-
3 wurden für die weiteren Versuche ausgewählt. Im Reporterstamm PK1.22 (Panafp:mluc) wurde
nur der Transkriptionsfaktor creA deletiert. Die Southern Blot Analyse der creA-Gendeletion der
erhaltenen Transformanden ist im Anhang Abb. 52 (Seite 141) für die Sonde komplementär zur
DNA oberhalb („upstream“) des creA Gens und im Anhang Abb. 53 (Seite 142) für die Sonde
komplementär zur DNA unterhalb („downstream“) des creA Gens gezeigt
Von den auf Grund des Southern Blot-Bandenmusters als wie erwartet transformiert getesteten
Stämmen wurde NP6.4 für die weiteren Arbeiten gewählt. Die erhaltenen Transformanten (Anhang
Tab. 43 und Tab. 44, Seite 141, 142) wurden auch phänotypisch untersucht. Ihr Erscheinungsbild
passt zu den in A. niger und A. nidulans bisher beschriebenen Phänotypen. Die Deletion von flbA
111
führt zum Fehlen vom Luftmycel und damit auch Konidiosporen, wohingegen die Deletion des brlA
das Fehlen der asexuellen Sporenbildung zur Folge hat (Abb. 39 und Abb. 40). Der ΔcreA Stamm
sporuliert, im Vergleich zu den Ausgangsstämmen, etwas schwächer (Abb. 39).
Abbildung 39 - Vergleich der Morphologie der A. niger Stämme (PK1.22, PK2.9) mit den
daraus hergestellten Derivaten (NP2.8, NP3.2, NP4.1) und anderen Deletionsstämmen auf
CM-Agar nach 72 h Inkubation bei 30 °C. Es wurde von den sporenbildenden Stämmen
Sporenlösungen mit 100.000 Sporen/ml ausgestrichen, von den nicht sporenbildenden
Stämmen (ΔbrlA, ΔflbA) wurde mit abgeschwemmter Biomasse angeimpft.
Die fehlende Ausbildung des Luftmyzels in NP4.1 und BN26.1 (ΔflbA), sowie die starke Bildung von
Luftmyzel ohne die Bildung von Sporen bei NP3.2 und BN34.2 (ΔbrlA), wird in Abb. 40 deutlich.
Abbildung 40 - Querschnitt der A. niger ΔbrlA (BN34.2, NP3.2) und ΔflbA (BN26.1, NP4.1)
Stämme. Sichtbar ist das Fehlen von Luftmyzel bei den ΔflbA Stämmen, wohingegen bei
den ΔbrlA Stämmen mehr Luftmyzel als beim Wt gebildet wird, viele Konidiophore
vorhanden sind aber keine Bildung von Konidiosporen stattfindet [94].
Die Untersuchung der pH-Werte der Transkriptionsfaktor-Deletionsstämme in Flüssigkultur zeigte,
dass die ΔflbA-Stämme das Medium nicht ansäuern, wie das für A. niger üblich ist [174]. Der Wert
steigt von pH 5,8 zu pH 6,9. Die Deletion von flbA scheint damit auch Auswirkungen auf die
Herstellung der organischen Säuren zu haben. Die pH-Werte sind für die ΔbrlA-Stämme nicht
übereinstimmend. Der Stamm BN34.1 verändert den pH-Wert des Mediums nicht, wohingegen der
NP3.2 es stärker ansäuert als der Wt N402. Der Vergleich im Southern Blot zeigt, dass der Stamm
BN34.2 eine Vielzahl von Signalen für die brlA upstream und brlA „downstream“ Sonde hat. Das
Problem könnte hier also ein Stamm mit weiteren, ungerichteten Integrationen der „split marker“
112
im Genom sein. Somit wäre die stärkere Bildung von Säuren als im Wt der Phänotyp für ΔbrlA in A.
niger. Der ΔcreA Stamm NP2.8 säuert ungefähr gleich stark an wie der Wt und die verwendeten
Reporterstamm Pk1.22. Die schwächere Bildung organischer Säuren kann für den ΔflbA Stamm mit
seinem Phänotyp erklärt werden. Das kompakte Wachstum in einem großen Biomasseklumpen
führt zur Sauerstofflimitierung in der Mitte der Kolonie [175] und somit zu einem vergleichsweise
gering metabolisch aktivem Mycel. Dieser Phänotyp wurde als ungünstig für die Sekretion von z.B.
Zitronensäure beschrieben [176]. Da die pH-Werte erst nach 10 Tagen gemessen wurden kann es
auch an einer starken Zelllyse liegen, dass das Medium in Richtung eines neutralen pH-Wertes
verschoben wurde. Das bei einem ähnlichen Phänotyp eine starke Ansäuerung beim ΔbrlA-Stamm
stattfindet zeigt, dass auch andere Faktoren eine Rolle spielen. In der Untersuchung der
Proteaseaktivität von A. niger Wt, ΔflbA und ΔbrlA konnte für den ΔbrlA-Stamm noch 62,5 % und
für den ΔflbA-Stamm nur noch 37,5 % der Proteaseaktivität des Wt im Kulturüberstand gemessen
werden [170]. Auch die hydrolytische Aktivität war beim ΔflbA-Stamm am geringsten [170].
Interessanterweise sekretiert der ΔflbA-Stamm bezogen auf die Biomasse mehr Proteine in das
Medium [170]. Auch das könnte die pH-Wert Veränderung erklären.
Die erhaltenen Deletionsstämme wurden im Vergleich zum jeweiligen Rezipientenstamm auf die
Aktivität ihres Reportergenkonstrukts getestet werden. Die Deletion des Transkriptionsfaktors (TF)
creA führt zu einer Verstärkung und leichten Verzögerung der Aktivität des AnAFP-Promotors (Abb.
41), die deutlich in der Luciferase-Messung (Abb. 41 A) und auch in der eYFP Extraktion (Abb. 41 B)
gemessen werden konnte.
113
Abbildung 41 - Analyse der anafp Promotoraktivität unter Verwendung eines
fluoreszierenden Reportersystems. A) Die Luciferaseexpression unter Kontrolle des Anafp-
Promotors zwischen dem ΔcreA Stamm (NP6.4) und dem dazu gehörigen
Rezipientenstamm (PK2.9) verglichen. Die Proteinhäufigkeit wird aus der auf die optische
Dichte OD600nm der Kultur normierten Lichtsignalanzahl pro Sekunde geschlossen. Die Daten
sind repräsentativ für vier andere Experimente. In B) ist die Expression des nachfolgend
isolierten eYFP gebildet unter der Kontrolle des anafp-Promotors im einem ΔcreA Stamm
(NP2.8, grau) und dem entsprechende Rezipientenstamm (PK1.22, schwarz) gezeigt. Die
Expressionsniveaus wurden auf die des Kontrollstammes normalisiert und sind als
Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten dargestellt, die jeweils als Duplikat
durchgeführt wurden. *, p <0,03. (Abb. entnommen aus Paege et al, 2016 [68])
Aus dem in Abb. 35 Seite 106, vorgestellten genomischen Koexpressionsnetzwerks lassen sich für
einzelne Gene Subnetzwerke extrahieren. In Abb. 42 (Seite 114) ist das Subnetzwerk für AnAFP
gezeigt, in dem nur Transkriptionsfaktoren (blau) berücksichtigt wurden. Zur in vivo Überprüfung
dieses Netzwerks wurde exemplarisch stuA (An05g00480) und velC (An04g07320) ausgewählt. Für
stuA ist bekannt das es Gene, die an der Konidiophorentwicklung beteiligt sind, reguliert und z.B.
abaA und andere entwicklungsregulierende Gene unterdrückt [94]. Für velC weiß man das es bei A.
nidulans in der sexuellen Entwicklung eine Rolle spielt [177], außerdem in P. chrysogenum bei der
Expression von Penicillin und der PR-toxin Biosynthese [178].
114
Abbildung 42 - Transkriptionsfaktoren aus dem AnAFP Subnetzwerk. Die Darstellung folgt
den Erläuterungen unter Abb. 35. Die Abb. wurde von Paul Schäpe erstellt und ist aus [168]
entnommen.
Beide Transkriptionsfaktoren wurden in den schon bei flbA, brlA und creA genutzten
Reporterstämmen PK1.22 und PK2.9 von Birgit Baumann deletiert. Die folgende Analyse der
Aktivität des anafp Promotors wurde wieder in Mikrotiterplatten durchgeführt. In Abb. 43 (VelC)
und Abb. 44 (StuA) sind die Ergebnisse gezeigt. Die Messungen der Fluoreszenz in den
Reporterstämmen in Mikrotiterplatten über die Zeit führten leider zu keinen auswertbaren
Ergebnissen. Zwar gibt es keine Sporulation in den Deletionsstämmen, jedoch im zum Vergleich
gemessenen Ausgangsstamm PK1.22, die durch die starke Absorption des Melanins sowohl die
Anregung als auch die Messung der Emission des YFP verhindert. Die Deletion von Velc führt zu
einer Verringerung und Verzögerung der Aktivität des anafp-Promotors. Die Luciferaseaktivität ist
im Vergleich zum Wt Pk2.9 schwächer (ca. 20 %) und erreicht ihr Maximum ca. 7 h später (Abb.
43). Daraus ergibt sich, das VelC anafp positiv reguliert, ein Aktivator des anafp ist.
115
Abbildung 43 - Aktivität des anafp Promotors nach der Deletion des Transkriptionsfaktors
VelC und im zugehörigen Kontrollstamm (PK2.9) über die Zeit. Die Proteinhäufigkeit wird
aus der auf die optische Dichte OD600nm der Kultur normierten Lichtsignalanzahl pro
Sekunde geschlossen. Es sind die Daten eines Versuches als Beispiel für zwei weitere
Experimente repräsentativ gezeigt.
Die Deletion des TFs stuA führt zu einer Verstärkung und Verzögerung der Aktivität des AnAFP-
Promotors. Die Luciferaseaktivität ist im Vergleich zum Wt Pk2.9 ca. 30-fach verstärkt und erreicht
ihr Maximum ca. 36 h später (Abb. 44). Daher kann StuA als Repressor der anafp-Transkription
gesehen werden.
116
Abbildung 44 - Aktivität des anafp Promotors nach der Deletion des Transkriptionsfaktors
StuA und im zugehörigen Kontrollstamm (PK2.9) über die Zeit. Die Proteinhäufigkeit wird
aus der auf die optische Dichte OD600nm der Kultur normierten Lichtsignalanzahl pro
Sekunde geschlossen. Die rechte y-Achse zeigt die Werte des Deletionsstamms BBA17.6. Es
sind die Daten eines Versuches als Beispiel für zwei weitere Experimente repräsentativ
gezeigt.
Zur Aufnahme und Vergleichbarkeit der Verläufe der LCPS ist das Animpfen mit frisch geernteten
Konidiosporen vorgesehen. Da die Stämme ΔflbA und ΔbrlA keine Konidiosporen bilden, war die
Versuchsdurchführung hier nicht möglich. Daher konnten die erhaltenen Daten zur Fluoreszenz des
extrahierten eYFP auch nicht mit Daten zur Luciferaseaktivität verglichen werden und wurden nicht
für eine Aussage genutzt. In späteren Versuchen wurde für die Messung der Luciferaseaktivität im
stuA Deletionsstamm mit abgeschwemmter Biomasse angeimpft. Die Versuche könnten so auch
für die Stämme ΔbrlA und ΔflbA wiederholt werden. Die Deletion von velC verschiebt die maximale
Aktivität des AnAFP-Promotors um etwa 8 h und reduziert sie um 20 %. Die Deletion von stuA
verschiebt die maximale AnAFP-Promotoraktivität um ca. 40 h und erhöht sie um das 31-fache. Die
hohen LCPS-Messwerte des ΔstuA-Stammes BBA17.6 resultieren jedoch auch aus der fehlenden
Konidiosporenbildung. Hier wird das Lichtsignal nicht, wie im Wt PK2.9, durch das Melanin der
Sporen auf der Oberfläche der Kolonie abgeschwächt [179-181]. Das zum Schutz vor UV-Strahlung
gebildete Pigment [180] absorbiert das Luciferaselichtsignal im Bereich von 450 nm bis 600 nm
stark [182]. Interessant ist auch der in Abb. 44 sichtbare zweite Peak des Luciferasesignals bei ca.
84 h für den Wt. Hier kommt es zu einer weiteren Aktivität des AnAFP-Promotors mit geringerer
Intensität zu einem späteren Zeitpunkt. Die Transkription des anafp ist also zeitlich gesteuert. Das
Peptid wird in der stationären Wachstumsphase gebildet, in den verwendeten
Versuchsbedingungen beginnend nach ca. 36 h Kultivierungszeit mit einem Maximum nach ca. 50 h
und einem zweiten Maximum nach ca. 84 h bevor die Aktivität nach ca. 100 h wieder abnimmt. Es
konnte also auch hier die aus den Bioreaktorversuchen abgeleitete post-exponentielle Produktion
117
des AnAFP aufgenommen werden. Die erneute Aktivität des Panafp im Wt PK2.9 ist in den
Messungen der ΔvelC und ΔcreA nicht zu sehen, da hier an einem Gerät mit geringerer
Empfindlichkeit gemessen wurde. Das Maximum von 80.000 LCPS im stuA-Versuch entspricht dort
nur einem Wert von 5000 LCPS. Daher sind die späteren Werte zur Aktivität des anafp-Promotors
aus den stuA-Stamm-Messungen dort nicht sichtbar geworden. Die Empfindlichkeit der Detektion
ist nicht linear, die schwachen Signale liegen daher im Hintergrundsignal des Gerätes. Die
Vorhersagen des Genkoexpressionsnetzwerks für AnAFP konnten in den Versuchen bestätigt
werden. Die Transkriptionsfaktoren StuA und VelC wirken regulierend auf die Aktivität des anafp-
Promotors
5.7. Die AFP-Familie
Identifizierung der AFP Orthologe / AFP-Familienmitglieder 5.7.1.
Aus den Erkenntnissen durch die Analysen der Transkriptomdatenbank von A. niger zum AnAFP
lassen sich Rückschlüsse auf das AFP ziehen. Die Nutzung der guten Datenlage eines anderen AFP-
Familienmitglieds für Analysen ergibt Sinn, um ein umfassenderes Bild von der Wirkweise und dem
Potential der AFPs zu bekommen. Daher wurde nach weiterenn Mitgliedern der AFP-Familie
gesucht, um das Informationsspektrum zu erweitern und vergleichende Analysen durchführen zu
können. Die Ähnlichkeiten der bekannten antimykotischen Peptide AFP, ANAFP, PAF und NAFP
(Tab. 4, Seite 21) deuten darauf hin, dass sich weitere Orthologe dieser Peptide in anderen Arten
filamentöser Pilze finden lassen. Basierend auf der Sequenzierung von Genomen ist die
Identifikation auf Genebene, aber auch auf Proteinebene durch die Vorhersage der
Transkriptionsprodukte, möglich. Der Abgleich von der Proteinsequenzen ergibt auf Grund der sehr
variablen Codonnutzung zwischen den Spezies validere Ergebnisse. So lassen sich durch einen
pBLAST [77] mit der prozessierten AnAFP Sequenz (Tab. 39) 51 orthologe Peptide identifizieren und
mit der Sequenz des prozessierten AFP (Tab. 39) 53 Orthologe Peptide (Stand 18.07.2019). Von den
identifizierten Peptiden wurden 2016 49 Peptide näher untersucht [68]. Sie weisen alle eine
ähnliche Verteilung der mindestens 6 Cysteine in ihrer Primärstruktur auf: CX(6)CX(11–12)CX(4–
9)CX(6)CX(10–13)C [68]. Es gehören 35 der identifizierten Peptide zu Pilzarten aus dem Reich der
Ascomyceten, der Rest bis auf ein Peptid zu anderen Pilzabteilungen. Die Ausnahme bildet ein
endogenes AFP homolog aus der Perlhirse, dass weniger eine antimykotische [68] , als eher eine
zellinterne Funktion bei Trockenstress zu haben scheint [183].
Tab. 39 - Primärstruktur von AFP und AnAFP.
Gennr.
Sequenz des prozessierten Peptids
Uniprot-
Nr.
AFP
CAA43181.1
ATYNGKCYKKDNICKYKAQSGKTAICKCYVKKCPRDGAKCEFDSY
KGKCYC
P17737.2
AnAFP
An07g01320
KYGGECSVEHNTCTYLKGGKDHIVSCPSAANLRCKTERHHCEYD
EHHKTVDCQTPV
A2QM98
118
Beide Peptide aus Tab. 39 werden der „Conserved Protein Domain Family: Antifungal_prot
pfam11402 “ zugeordnet. Aus den identifizierten Orthologen können Sequenzabgleiche und darauf
aufbauend Stammbäume erstellet werden. In Abb. 45 sind die Übereinstimmung der NMR-
basierten Lokalisation des Strukturmotivs β-Faltblatt mit in silico vorhersagen für AFP und PAF
gezeigt. Das Verfahren kann also auf andere AFPs wie AnAFP angewendet werden (Abb. 45, oben).
In der Tabelle (Abb. 45, unten) sind die gefundenen Orthologe zum prozessierten AFP aufgelistet.
Interessant ist der hohe Grad der Konservierung der Cysteinreste und das Vorhandensein eines γ-
cores in allen gefundenen Peptiden (Abb. 45), das auf einen gemeinsamen Vorfahren und/oder die
parallele Entwicklung derselben Strukturen hindeutet. Trotz der Ähnlichkeit der in ihrem Genom
kodierten Proteine, die zur AFP-Familie gehören, wirkt z.B. das AFP von A. giganteus
wachstumshemmend auf A. niger oder F. graminearum. Die antimykotische Wirkspezifität hängt
also von den geringen Unterschieden, wieder der vielen Gemeinsamkeiten, ab.
119
120
Abbildung 45 – Abgleich der Primär- und Sekundärstrukturen von AnAFP-Orthologen. In der
oberen Abbildung ist die Vorhersage der Sekundärstrukturen von AFP und PAF mit dem
„PredictProtein Server“ [184] gezeigt. Man sieht eine übereinstimmende Anordnung der β-
Faltblätter zum bekannten NMR Ergebnis darüber. Die blauen Pfeile, bzw. großen E stehen für die
Positionen der β-Faltblätter, Linien markieren die Position von Schleifen oder Kurven im Peptid und
Lücken werden durch Punkte dargestellt. Die Lücken ergeben sich aus der Ausrichtung der
Sequenzen zueinander. In der unteren Tabelle wurden die Aminosäuresequenzen von den
prozessierten Peptiden der AFP-Familie mit CLUSTAL W zueinander ausgerichtet. Die Namen der
entsprechenden Organismen, die das jeweilige AFP Ortholog besitzen, sind unter Verwendung des
ersten Buchstabens des Gattungsnamens, gefolgt von den ersten drei Buchstaben des
Speziesnamens abgekürzt. Die Protein- / GenBank-Nummern von UniProtKB, AspGD bzw. NCBI sind
in Klammern angegeben. Mit Sternchen markierte Aminosäuresequenzen sind aus einer Sequenz-
Datenbankanalyse entnommen. Obwohl einige der aufgeführten prozessierten Peptide identisch
sind (markiert mit eckigen Klammern) unterscheiden sich alle mindestens in einer Aminosäure,
wenn man auch die Prä-Pro-Regionen berücksichtigt. In den Kästchen sind die konservierten
Cysteinreste, vorausgesagte oder bekannte γ-core Bereiche werden durch schattierte Kästchen
markiert. (Die Abb. wurde von Dr. Sascha Jung erstellt und aus [68] entnommen)
Die Verteilung der AFP Orthologe über drei Superklassen des pilzlichen Stammbaumes (Abb. 46)
lässt auf einen gemeinsamen Vorläufer und/ oder parallele Evolution der Gene schließen. Es finden
sich 16 Vertreter der AFP-Familie jeweils in der Klasse der Sordariomycetes und Eurotiomycetes
und drei in der Klasse der Dothideomycetes. Es handelt sich also um ein verbreitetes und damit
anscheinend um eine Peptidstruktur mit wichtiger Funktion, da sie im Laufe der Evolution vielfach
adaptiert und beibehalten wurde.
121
Abbildung 46 – Hyphenpilzarten die AnAFP-Orthologen in ihrem Genom haben (siehe Abb. 45) und
ihre Verteilung im Ascomycota Stammbaum. Dargestellt ist ein Auszug aus dem Ascomyota-
Stammbaum nach Schoch et al., 2009 [185]. Die Arten mit AnAFP-Orthologen werden nach ihrer
Klasse aufgelistet. Die Superklassen sind mit den Nummern 1 bis 3 gekennzeichnet. 1,
Sordariomyceta; 2, Leotiomyceta; 3, Dothideomyceta. Die Arten-/Gattungsnummern sind in
Klammern neben den Namen der Superklassen angegeben. Die gestrichelte Linie repräsentiert den
letzten gemeinsamen Vorfahren der drei Oberklassen. (Die Abb. wurde von Dr. Sascha Jung erstellt
und aus [68]entnommen)
122
6. Diskussion
Das Ziel dieser Arbeit war das bessere Verständnis und die Aufdeckung neuer Aspekte der
Wirkweise des antimykotischen Peptids AFP. Dafür grundlegend war eine etablierte Produktion
und Reinigung des AFPs. Durch Versuche mit dem hergestellten, reinen Protein wurde dann die
Bedeutung der C3-unngesättigten GlyCer für die wachstumshemmende Wirkung des AFPs
untersucht und bestätigt. Außerdem wurden zur Nutzung einer größeren Datengrundlage andere
AFP-Familienmitglieder identifiziert, von denen das AnAFP mittels der Transkriptomdaten von A.
niger neue Erkenntnisse über die intrazelluläre Rolle des AnAFP, und somit auch die mögliche
Bedeutung des AFP im Metabolismus, aufzeigte.
6.1. AFP-Produktion
Die Herstellung von reinen und intakten Peptiden aus den Kulturüberständen von filamentösen
Pilzen ist anspruchsvoll, da diese eine Vielzahl verschiedener Proteine, inklusive vieler Proteasen, in
großen Mengen sekretieren [186]. Die Abtrennung der Biomasse vom flüssigen Teil der Kultur
stellt, auch im Labormaßstab, ebenfalls ein Problem dar. Filamentöse Pilze lassen sich nur im stark
lysierten Zustand gut durch Zentrifugation konzentrieren. In der Regel filtriert man deshalb die
Pilzkulturen, was je nach Menge und Zustand der Kultur sehr lange dauern kann.
Die Etablierung einer verbesserten Produktionsmethode für das AFP fand daher nicht nur unter
dem Aspekt der Maximierung der Ausbeute, sondern auch der effektiveren Handhabung des
Prozesses statt. Die bisherige Kultivierung von A. giganteus im Schüttelkolben [82] liefert relativ
geringe Ausbeuten und erlaubte nur eine eingeschränkte Kontrolle und Steuerung des Prozesses,
wie es die Bioreaktorkultivierung möglich macht [152]. Das ursprünglich von Dr. Jean-Paul
Ouedraogo [169] entwickelte Protokoll für die Bioreaktorkultivierung von A. giganteus wurde im
Laufe dieser Arbeit weiterentwickelt, ebenso dessen Protokoll für die Reinigung des AFPs aus dem
Kulturüberstand. Der bisher durchgeführte Temperatursprung auf 37 °C brachte eine verstärkte
Lyse der Biomasse mit sich, die sich sehr nachteilig auf den downstream-Prozess bezüglich der
Reinigung des AFPs auswirkte. Die ursprüngliche Gewinnung des AFPs durch die Zugabe der
Kationentauschermatrix zum Kulturüberstand [82] brachte nur geringe AFP Ausbeuten, daher
wurde die Affinität zum Zellwandpolymer Chitin für die Reinigung genutzt. Die Elution erfolgte mit
1,5 M NaCl in PBS Puffer pH 7,4, gelang aber nur partiell. Ein Teil des AFPs konnte nicht eluiert
werden. In kleinem Maßstab wurden Versuche mit selbst hergestelltem Chitosan [187] und
zerkleinertem Chitin durchgeführt (Daten nicht gezeigt). Die Ausbeuten waren jedoch ähnlich. Eine
Verbesserung der Methode wäre mit Sicherheit durch die Nutzung einer Chitosan-FPLC Säule
möglich [187], da hier der Kulturüberstand mehrfach zum Beladen über die Säule gegeben werden
und eine stufenweise Elution erfolgen kann.
123
Während der Kultivierung von A. giganteus ohne pH-Kontrolle kommt es zum Anstieg des pH-
Wertes von 5,8 auf ein basisches Level von ca. 8,2. Wodurch dieser Anstieg zu Stande kommt ist
unklar. Es zeigte sich in anderen Arbeiten, dass der pH-Anstieg typisch für die späte
Wachstumsphase des Pilzes ist und auch in Verbindung mit der Produktion des AFPs steht [150].
Ein künstlicher pH-Wechsel von 5,8 zu 8 fördert die Sekretion des AFPs [89]. Deshalb wurde der
natürliche pH-Verlauf der A. giganteus Kultivierung nachgestellt. Ein entsprechendes pH-Profil
wurde aus mehreren, nicht pH-regulierten Läufen erstellt und die AFP Ausbeuten mit den
vorherigen Kultivierungen verglichen. Interessanterweise wird in diesen Ansätzen deutlich weniger
Biomasse gebildet (4,6 g/kg statt 6,8 g/kg), als in den Bioreaktorläufen mit konstantem pH 5,8.
Man könnte vermuten, dass bei gleicher Biomassebildung der AFP-Gewinn bezogen auf den
gesamten Bioreaktor größer wäre. Insgesamt wird so jedoch die Säure zur Regulation des pH-
Wertes gespart und es kommt am Ende der Kultivierung nicht zu einer Lyse der Biomasse. Die
effektivste Verbesserung der AFP-Produktion entstand durch das Waschen der Biomasse mit
Elutionspuffer. So lässt sich ungefähr die gleiche AFP-Menge wie aus dem Kulturüberstand
zusätzlich gewinnen. Das vom Chitin und der Biomasse eluierte AFP muss weiter gereinigt werden,
da sich noch andere Proteine im Eluat befinden. Durch Gelfiltration lässt sich das AFP von
Proteinen anderer Größe trennen, aber es finden sich jedoch noch geringe Mengen anderer
Proteine in derselben Fraktion und man kann nur geringe Mengen des Chitin-Eluates auftragen
(max. 5 % des Säulenvolumens = ca. 5 ml). Eine Verbesserung diesbezüglich brachte die Nutzung
einer Kationentauschersäule in der FPLC, anstelle der Größenausschlusschromatographie [82].
Zwar muss für die Bindung an den Kationentauscher das vom Chitin eluierte AFP durch einen
Dialyseschritt wieder von Natriumchlorid befreit werden, jedoch ist ein mehrfaches Beladen mit
einem größeren Volumen möglich und eine durch einen Salzgradienten gesteuerte Elution. Die
finale Ausbeute reinen AFPs lag jeweils bei ca. 10 mg/l Reaktorvolumen, zusammengerechnet 40
mg pro Reaktorlauf.
124
Tabelle 40 - Beschriebene AFP-Varianten mit den jeweiligen Änderungen zum
ursprünglichen, reifen Peptid und MIC90-Konzentrationen
AFP-
Variante
Organismus
Sequenz
MIC90
Referenz
AFP
A. giganteus/
P. pastoris
ATYNGKCYKKDNICKYKAQSGKTAIC
KCYVKKCPRDGAKCEFDSYKGKCYC
A. niger N402
= 1 µg/ml;
F. verticilloides
= 0,5 µM
[82, 84]
lf-AFP
A. giganteus
DESAVL-ATY…
Nicht
bestimmt
[83]
pro-AFP 1
P. pastoris
EAEAEF-ATY…
F. verticilloides
= 0,5 µM<x
µM<2 µM
[84]
pro-AFP 2
P. pastoris
EAEF-ATY…
Nicht
bestimmt
[84]
sf-AFP
A. giganteus
0902
-TYN…
A. niger N402
= x > 4 µg/ml
[154]
N-term
_6xHis
A. niger
HHHHHHGSG-ATY…
A. niger N402
= 86 µg/ml
Bachelorarb
eit D.
Günther,
2015
C-term
_6xHis
A. niger
…CYC-GSGHHHHHH
A. niger N402
= 31 µg/ml
Bachelorarb
eit D.
Günther,
2015
125
C-term
_eGFP-
6xHIS
A. niger
…CYC-GGSGSGSSVSKGEELFT
GVVPILVELDGDVNGHKFSV
SGEGEGDATYGKLTLKFICT
TGKLPVPWPTLVTTLTYGVQ
CFSRYPDHMKQHDFFKSAMP
EGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGID
FKEDGNILGHKLEYNYNSHN
VYIMADKQKNGIKVNFKIRH
NIEDGSVQLADHYQQNTPIG
DGPVLLPDNHYLSTQSALSK
DPNEKRDHMVLLEFVTAAGI
TLGMDELYKGSGHHHHHH
Nicht
bestimmt
Bachelorarb
eit M.
Buschke,
2015
Mittels RP-HPLC konnte die Identität und Reinheit des gereinigten AFPs überprüft werden. Wenn
man den Laufmittelgradienten abflacht, das heißt die Konzentration an Acetonitril langsamer
steigen lässt, kann man den ursprünglichen AFP Peak weiter auftrennen. Das Ziel war die Trennung
von möglichen AFP Varianten. Die Auftrennung führte zu einer Fraktion AFP1, die sich in der
MS/MS als das erwartete prozessierte Peptid identifizieren lies. Es wurde auch ein NMR-Spektrum
und MIC90-Messung durchgeführt. Das AFP2 ist jedoch wider Erwarten kein früher beschriebenes
Disulfiddbrückenisomer des AFPs [79], sondern eine Variante mit fehlendem Alanin am N-Terminus
des Peptids (Tab. 40). Durchgeführte MIC90-Messungen zeigten, dass diese Form mehr als 4x
weniger antimykotisch aktiv ist. AFP2 entsteht auch nicht aus AFP1, da keine erneute Trennung des
AFP1 Signals bei der zweiten Elution in der RP-HPLC zu erkennen ist. Das Ergebnis passt zu den
erhaltenen MIC90-Messungen mit anderen AFP-Formen, die N- oder C-terminal verändert wurden
(Tab. 40). Während das als Kontrolle gestestete AFP in den MIC90-Messungen einen
prognostizierten MIC90 von 5 µg/ml hat, liegt er bei der C-terminal 6xHis-getaggten Variante bei 31
µg/ml und der N-terminal 6xHis-getaggten Variante sogar bei 86 µg/ml. Die MIC90-Werte sind
errechnet, abgeleitet aus der Wachstumshemmung bei den getesteten Konzentrationen.
Offensichtlich wird die Beeinflussung der Aktivität durch ein N-terminales Pre-protein auch
beibehalten, wenn dieses nur eine Größe von sechs AS, wie beim lf-AFP, oder weniger, hat. Ein
fehlendes Alanin am N-terminus reicht zur Reduzierung der antimykotischen Aktivität ebenfalls
aus. Dies kann an seiner Eigenschaft als Helixbildner [188] liegen. Auch eine von Lopez-Garcia et al
2009 in P. pastoris erzeugte AFP Variante mit N-terminal zusätzlich vier oder sechs AS [84]
entstand durch unvollständigen proteolytischen Abbau durch die Kex2- und Ste13-Protease. Beide
Varianten (Tab. 40), pro-AFP genannt, unterscheiden sich in der Sequenz der zusätzlichen Reste
vom lf-AFP, sind jedoch trotzdem wesentlich geringer antimykotisch aktiv [84]. Eine Überprüfung
mittels CD-Spektroskopie zeigt jedoch, dass die grundsätzliche Struktur des Peptids erhalten bleibt.
126
Die Idee der Veränderung der Konformation durch zusätzliche Aminosäuren an den Enden des
AFPs wird auch durch die ungewöhnliche Stabilität des His-tags in den AFP-Varianten bestärkt.
Sowohl das C- als auch das N-terminal 6xHis-getaggte AFP wurden in A. niger heterolog hergestellt.
Üblicherweise kommt es im Kulturüberstand von A. niger zu einer starken Degradation von His-
tags an Proteinen (persönliche Kommunikation mit Prof. Arthur Ram, Leiden Universität). Beim
AFP, und auch AnAFP, scheint die Struktur den Tag vor proteolytischer Spaltung zu schützen, so
dass nach Induktion der AFP Produktion im Tet-On-System in A. niger ca. 4,2 mg/l Kulturvolumen C-
terminal 6xHis getaggtes AFP und 3,3 mg/l Kulturvolumen N-terminal 6xHis getaggtes AFP mittels
Nickel-Affinitäts-Chromatografie gewonnen werden konnten. Eventuell schützt die Struktur des
AFPs vor dem proteolytischen Abbau N-terminaler Reste und verursacht damit die hohe
Konzentration von AFP-Derivaten zu verschiedenen Zeitpunkten der Kultivierung.
Um der Problematik unterschiedlicher AFP-Derivate zu entgehen, bietet sich unter anderem die
heterologe Expression in P. pastoris an [84]. Zum einen wird durch das Fehlen des Pro- und Pre-
proteins die proteolytischen Erzeugung von AFP-Isomeren während des Abbaus des N-terminalen
Pre-proteins verhindert. Zum anderen ist P. pastoris ein für die Proteinproduktion etabliertes
System. Die Ausbeuten an AFP waren leicht geringer als in A. giganteus Kultivierungen (Gelbilder
nicht gezeigt), was jedoch durch die leichtere Trennung des Kulturüberstandes von den Zellen
mittels Zentrifugation, die kürzere Kultivierungszeit (50 h), die geringere Verunreinigung des
Kulturüberstandes mit Fremdproteinen und die leichtere Handhabung von Vorkultur und
Hauptkultur im Bioreaktor ausgeglichen wird. Zudem ist die Übertragung der heterologen
Produktion von Proteinen in große Maßstäbe vergleichsweise einfach und etabliert [189]. Die
verbesserte Reinheit des aus P. pastoris Stamm LH6.6 gewonnenen AFPs ist im RP-HPLC Profil der
AFP Elution zu sehen (Abb. 20, Seite 77). Die „Schulter“ des Peaks auf der rechten Seite, aus der
sich bei langsamer ansteigendem Acetonitrilgradienten das AFP2 isolieren lies, ist verschwunden.
Die antimykotische Aktivität des P. pastoris AFPs ist gleich dem A. giganteus AFP (Abb. 21, Seite
79).
6.2. Wirkweise von AFP
Bisherige Untersuchungen haben gezeigt, dass AFP einen Einfluss auf die Chitinsynthese in
sensitiven Pilzen hat. Durch frühere Versuche der Arbeitsgruppe an S. cerevisiae knock-out
Stämmen konnten Gene und die dahinterstehenden biologischen Regelkreise identifiziert werden,
die die eigentlich resistente Hefe AFP-sensitiv machen [169]. Die daraus abgeleiteten Signalwege
sind der Kalzium-Signalweg, der TOR-Signalweg, der cAMP-Proteinkinase-Signalweg und der cell
wall integrity (CWI)-Signalweg. Sobald Gene, die für Proteine dieser Signalwege kodieren deletiert
sind, wird S. cerevisiae empfindlich gegenüber AFP. Daraus lassen sich letztendlich die Bedeutung
der Wahrnehmung des durch AFP ausgelösten Zellwandstresses und die Aktivierung der richtigen
Gegenmaßnahmen für das Überleben der Zelle ableiten. Es zeigte sich, dass die Fähigkeit der
127
Hefezelle durch eine Verstärkung ihrer Chitinsynthese auf AFP zu reagieren, der Schlüssel für ihre
Resistenz ist [169]. Sobald die dazugehörigen Signalwege, wie z.B. der Calzineurin-Weg, blockiert
sind, oder die den Zellwandstress registrierenden und weiterleitenden Signalkaskaden (z.B. Wsc1p
und Wsc2p des CWI) die zu einer entsprechenden Antwort führen, wird S cerevisiae AFP sensitiv
[169]. Die Zellen teilen sich dann nicht mehr, sondern bleiben nach der Bildung der Tochterzelle
verbunden [169]. Es wird angenommen, dass von den drei in S. cerevisiae beschriebenen
Chitinsynthasen besonders die Chs3 in die Antwort auf AFP involviert ist. Die Relevanz der
Erhöhung des Chitingehaltes zum Überstehen einer AFP-Attacke konnte experimentell auch für
filamentöse Pilze wie F. oxysporum (ΔchsV) [91] , A. niger (ΔchsB, ΔcsmB) [169] und A. oryzae
(ΔchsB, ΔcsmB) [169] bestätigt werden. Interessanterweise findet hier auch eine weniger starke bis
keine Membranpermeabilisierung [169] statt. Die Bedeutung des Proteinkinase C (Pkc/Mitogen-
aktiviertem Proteinkinase (MpK)) Signalweges, der Aktivität der α-Glucansynthase A (agsA) und
somit eine Verbindung zum cell wall integrity pathway wurde auch durch Studien an AFP-
hypersensitiven A. nidulans- und A. niger-Mutanten gezeigt [190]. Eine Pilzzelle muss als Reaktion
auf die Schwächung der Zellwandintegrität durch die AFP-ausgelöste Hemmung der
Chitinsynthase-Aktivität [169] mit einer Verstärkung der Chitinsynthese über den Kalzium-
Signalweg reagieren. AFP-sensitive Pilze wie A. niger reagieren jedoch mittels Aktivierung der
Glucansynthese durch den CWI-Signalweg, was letztendlich zum Platzen der Hyphe führt. Auf
Grund von Vergleichen der GlyCer-Zusammensetzung der Membranen sensitiver und resistenter
filamentöser Pilze wurden Δ3-ungesättigte GlyCer als mögliche AFP-Angriffspunkte identifiziert. Die
Relevanz der Glucosylceramide für die antimykotische Wirkung von AFP konnte mittels Blockierung
der Glucosylceramidsynthese gezeigt werden.
Die Sensitivität von Pilzen bezgl. AFP lässt sich jedoch nicht nur durch die Wahl der
Abwehrstrategien erklären. Die Unterschiede in der Auswirkung auf sensitive und nicht-sensitive
Pilze lassen Rückschlüsse auf das Vorhandensein eines AFP-spezifischen Ziels an der Zelloberfläche
zu [88, 92, 191]. Basierend auf den Untersuchungen von S. Zäuner et al. [125] wurde die Hypothese
aufgestellt, das die Sättigung der Fettsäure in den GlyCer der Membran filamentöser Pilze eine
Auswirkung auf die Empfindlichkeit gegenüber AFP hat. Es fand sich ein Zusammenhang zwischen
der Empfindlichkeit von A. niger und A. fumigatus mit dem Vorhandensein von GluCer in D-PDMP
Messungen [92]. Weitere Versuche in der vorliegenden Arbeit bestätigten die Ergebnisse.
Interessant ist das in der D-PDMP Messung keine Wachstumsunterschiede (OD595nm) zwischen den
mit D-PDMP und nicht mit D-PDMP behandelten Stämmen gemessen werden konnten, die
Deletion von gcsA in A. nidulans jedoch zu einem Phänotyp mit geringerem Wachstum führt [166].
Daher lässt sich vermuten, dass die chemische Reduzierung der GluCer durch D-PDMP zwar stark
[192] , aber nicht 100%ig ist. Weiterhin könnte das Enzym noch eine weitere Funktion haben, die
von nicht-blockierten Molekülen ausgeübt werden kann. Ergebnisse, die auf einen Zusammenhang
von der GlyCer Desaturierung mit der Empfindlichkeit gegenüber AMPs, auch dem AFP von A.
giganteus, hinweisen wurden in [193] beschrieben. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden das
128
(i) das Vorhandensein von GluCer und (ii) das Vorhandensein der Δ3(E)-Desaturierung zwischen
dem dritten und vierten Kohlenstoffatom der Fettsäure der GlyCer wichtig für die Empfindlichkeit
gegenüber AFP ist sowie das (iii) die Sättigung der ursprünglichen Δ3(E)-Desaturierung als Reaktion
auf das AFP eine Verstärkung der Zellwand bewirkt, wodurch die Zelle unempfindlicher wird. Die
Versuche an P. pastoris, S. cerevisiae, A. fumigatus, A. niger und F. graminearum zeigen die
Gültigkeit des aufgedeckten Mechanismus über die Speziesgrenze hinaus. Sowohl Hinweise für die
Wechselwirkung der GlyCer mit AFP, als auch den folgenden Einfluss auf die Synthese der
Zellwandpolymere Chitin und β-Glucan, konnten durch die Nutzung von den N-acyl-Δ3(E)-
Desaturase Enzymorthologen aus F. graminearum und A. niger und deren gleiche Wirkung in
verschiedenen Pilzarten gezeigt werden. Die N-acyl-Δ3(E)-Desaturase aus A. niger wurde nach
Bestätigung ihrer Funktion DtdA genannt. Die gewonnenen Daten lassen Rückschlüsse auf
mechanistische Effekte zu, die sich in einen Zusammenhang mit dem „damage-response
framework“ [194] einordnen lassen. Das ursprüngliche Model von Casadevall et al (1999) wurde
2011 von Ouedraogo et al. für AMPs, inklusive AFPs (Abb. 47), adaptiert [169]. In Tab. 41 sind alle
acht AMPs aufgelistet, für die ein Zusammenhang ihrer antimikrobiellen Wirkung mit dem
Vorhandensein von GlyCer in der Membran der sensiblen Organismen beschrieben ist. Es handelt
sich also nicht nur um einen für AFP gültigen Bestandteil des Wirkmechanismus.
129
Tab. 41 - AMPs für die eine Wechselwirkung mit GlyCer beschrieben ist (Stand 21.07.2019)
Die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit legen nahe, das GlyCer mit einer C3-ungesättigten
Fettsäure direkte oder indirekte Angriffspunkte des AFPs sein könnten. Wahrscheinlicher ist
jedoch, dass die von Ihnen beeinflusste Umgebung in den lipid rafts [118] ausschlaggebend ist.
Außerdem wurde gezeigt, dass C3-gesättigte GlyCer in filamentösen Pilzen wichtig für Erhöhung
130
der Aktivität der Chitin- und Glucansynthasen zum Widerstehen der Wachstumshemmung durch
das AFP sind.
Abbildung 47 – Zusammenhang der antimykotischen Aktivitäten eines AMPs und der
Reaktion der Zellen nach Ouedraogo et al. [169]. A) Der Bezug zwischen Schädigung und
Reaktion eines Mikroorganismus darauf wird durch eine parabolische Kurve [200]
wiedergegeben. Wenn dieses Konzept auf die AMP-Mikroorganismus-Wechselwirkung
übertragen wird, wird auf der y-Achse die mikrobielle Schädigung, die als Störung der
Zellhomöostase definiert ist, abgetragen. Die mikrobielle Schädigung hängt auch von der
mikrobiellen Reaktion, die in Bezug auf Qualität und Quantität als schwach, angemessen
oder (zu) stark eingestuft werden kann, ab. Sowohl eine zu schwache als auch eine zu
starke Reaktion kann den Mikroorganismus schädigen oder töten. B) Die csmB-Deletion, die
chsV-Deletion, die dtdA-Deletion und die GluCer-Reduzierung durch D-PDMP schützen
jeweils A. niger, F. oxysporum und F. graminearum gegen die Wirkung des AFPs, wobei
letztere F. oxysporum komplett unempfindlich gegen AFP machen.
Die Synthese der GlyCer findet im ER und Golgiapparat [201, 202] durch dort i.d.R.
membrangebundene Enzyme statt. Die fertigen GlyCer werden durch Vesikel zur
Plasmamembranen der pilzlichen Zelle transportiert [201]. Durch pBLAST-Analysen [203] ließen
sich die entsprechenden Gene in A. niger identifizieren (Tab. 36, Seite 86). Die Untersuchung einer
Stammsammlung mit Deletionen der entsprechenden Gene könnte weitere Einblicke in die
Bedeutung der GlyCer für A. niger und die Wirkung des AFPs liefern [204]. Die Synthese der GlyCer
ist in Säugetieren für zahlreiche Prozesse, wie z.B. die Zell-Zell-Kommunikation, den Kalzium-
Signalweg und die Endozytose [205] wichtig. Im Reich der Pilze lässt sich die Bedeutung der GlyCer
nicht genau festlegen, da sich je nach Spezies Deletionen im GlyCer-Syntheseweg unterschiedlich
auswirken [124, 206-208] können. Außerdem finden sich zahlreiche Unterschiede in der
Plasmamembranzusammensetzung zwischen den Pilzspezies [126], die eine eindeutig Ursache-
131
Wirkungs-Beziehung erschweren. Die Deletion der Ceramidsynthase bar1 in F. graminearum
resultiert in einer atypischen Morphologie, gestörter Ausbildung des Spitzenkörpers, verstärkter
Bildung von Vakuolen, es werden weniger und kleinere Makrokonidien gebildet und keine
Perithezien [121]. Die Deletion des Genorthologs barA in A. nidulans führt hingegen zu Defekten in
der Hyphenpolarität [121]. Die Deletion der UDP-Glucose:Ceramid Glucosyltransferase (=
Glucosylceramid Synthase) in A. nidulans und A. fumigatus resultiert in einem Wachstumsstopp
der Keimlinge, geschwollenen, unförmigen sowie vielen mitotischen Zellkernen [157]. Auf der
anderen Seite führt die Deletion von Glucosylceramiden in den Hefen P. pastoris und C. albicans
nicht zu phänotypischen Defekten [165]. Hefen synthetisieren hauptsächlich
Inositolphosphorylceramide in ihren Membranen, wie z.B. Mannosyl-diinositolphosphoceramid
und Mannosyl-inositolphosphoceramid. Die Hefe S. cerevisiae hat ausschließlich Inositol-haltige
Ceramide. Die Ergebnisse der Deletionsstudien für verschiedenen Gene in unterschiedlichen
Organismen sind teilweise widersprüchlich. Das kann daran liegen, dass Sphingosine selbst als
antimikrobielle Substanzen beschrieben sind [209] und die Deletion eines Gens in der
Herstellungskaskade des Glycosylceramides (Abb. 12, Seite 29) zur Anreicherung einer Vorstufe
führen kann, die dann zelltoxisch wirkt. GlyCer sind aber allgemein in Pilzen für Prozesse wie das
polarisierte Wachstum [204], die Konidienbildung [121] und Stressresistenz [210] wichtig. Es wurde
gezeigt, dass GlyCer Bestandteile von lipid rafts, in den Zellmembranen sind. Diese lokale
Konzentration [211] von GlyCer und Plasmamembranproteinen, und die daraus resultierende
Schaffung eines Bereiches mit veränderten biophysikalischen Eigenschaften [211], erklärt ihren
Einfluss auf viele metabolische Prozesse. Es gibt nur wenige Erkenntnisse zu den lipid rafts
pilzlicher Membranen. In den Membranen des Oomycceten Saprolegnia monoica wurden pilzliche
Glucan- und Chitinsynthasen in lipid rafts nachgewiesen [212]. Ob sich diese Erkenntnisse auf
andere Pilze übertragen lassen ist wahrscheinlich, aber nicht zwangsläufig. Die Chitin- und
Glucansynthasen müssten an die Unterschiede in der Ceramidzusammensetzung in den jeweiligen
Plasmamembranen angepasst sein. Trotzdem lässt sich aus den Erkenntnissen der Versuche in
dieser Arbeit zusammen mit den Ergebnissen vorheriger Arbeiten der Gruppe ein Modell herleiten,
das in Abb. 48 Seite 133, dargestellt ist: AFP reichert sich nach der Sekretion in die Umgebung
durch seine hohe Chitin-Affinität an der fungalen Zellwand an [82, 213]. Das geschieht auch bei A.
giganteus selbst. In AFP-sensitiven Pilzen folgt auf die lokale Konzentration des AFPs an der
pilzlichen Zellwand eine Interaktion mit der Plasmamembran. Das schon beschriebene γ-core
Motiv, von dem AFP sogar zwei besitzt, wird als Interaktionspunkt mit der Membran gesehen. In in
silico molekulardynamischen Simulationen des Fachgebiets „Modellierung biomolekularer
Systeme“ der TU Berlin von Frau Prof. Dr. Mroginski konnte die Bedeutung des γ-core Motivs
nachgewiesen werden [154]. Der γ-core Bereich [76] des AFPs hat sich hierbei klar als
Plasmamembraninteraktionsstelle gezeigt (Abb. 48, oben links). Die Interaktion von AFP mit der
Plasmamembran konnte auch in licht- und elektronenmikroskopischen Bildern gezeigt werden [82,
91, 213]. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit lässt sich ableiten das AFP mit den GlyCer der
132
Zellmembran direkt oder indirekt wechselwirkt. Folglich wird die Aktivität der dort lokalisierten
Chitinsynthasen beeinflusst [101]. Die Chitinsynthasen der Klasse III und Klasse V findet man
exklusiv in Pilzen die zu einem Mycel wachsen [214]. Andere Arbeiten dieser Gruppe haben
gezeigt, dass diese Chitinsynthaseklassen eine Bedeutung für die Wirkung des AFP haben [91]. Aus
den Ergebnissen dieser Arbeit lässt sich das Model (Abb. 48, Seite 133) folgendermaßen erweitern.
Die Δ3-ungesättigten GlyCer schaffen eine Plasmamembranumgebung, die für die korrekte
Integration und damit Funktion der Chitinsynthasen in die Lipidflöße der Plasmamembran wichtig
sind. Die Deletion der dtdA wird verändert diese Plasmamembranbereiche und es sind werden
weniger Chitinsynthasen der Klasse III und V dort integriert, bzw. sind funktional. Damit ist die
Plasmamembran der Pilzzelle weniger durch AFP beeinflussbar, wodurch der Pilz unempfindlicher
gegenüber AFP wird. Der Vergleich der Zellwandpolymerkonzentration von A. niger Wt N402 und
dtdA-Deletionsstamm NP1.15 zeigt ohne AFP-Zugabe keinen Unterschied in der Konzentration von
Chitin und Glucan in der Zellwand. Auch für die vierfach Chitinsynthasen (ΔcsmA / csmB / csmF und
csmD) Deletionsmutante von A. fumigatus [215] wurden nur geringe Abweichungen im
Chitingehalt der Zellwand gefunden, was für kompensatorische Reaktionen spricht, ebenso wie die
beobachteten Veränderungen in der Zellwandstruktur [215]. Es ist daher anzunehmen, dass im A.
niger ΔdtdA Stamm NP1.15 die Funktion der gestörten Chitinsynthasen Klasse III und Klasse VI von
den Chitinsynthasen anderer Klassen, die nicht auf eine Umgebung mit Δ3-ungesättigten GlyCer
angewiesen sind, bei Zellwandstress übernommen wurde. Für diese Theorie spricht auch die
geringere AFP-Empfindlichkeit von Chitinsynthasen Klasse V Deletionsstämmen der Arten A. niger
(ΔcsmB) und F. oxysporum (ΔchsV) [169] sowie von dem A. niger Chitinsynthase der Klasse III
(chsD) überexprimierenden Stamm [169]. Die Aktivität und Anzahl der kompensierenden
Chitinsynthasen kann nach der Wahrnehmung des durch AFP ausgelösten Zellwandstresses über
den Kalzium-Signalweg erhöht werden, was zu einer Festigung der Zellwand mit Chitin führt. Der
CWI-Signalweg bewirkt zusätzlich eine Aktivierung der Glucansynthasen, was zur Erhöhung der
Glucankonzentration führt. Im Gerüst der Zellwand ist Chitin mit β-1,6- und β-1,3-Glucan über eine
β-1,4-glycosidische Bindung verknüpft [103]. Die Bildung von mehr Chitin ermöglicht auch die
Erhöhung des Glucananteils, wodurch die Zunahme an β-Glucan in der Zellwand des NP1.15 nach
Inkubation mit AFP erklärt werden kann.
133
Abbildung 48 – Vorgeschlagenes Modell für die Wirkungsweise von AFP. Das obere linke
Bild stammt aus Utesch et al. [154] und zeigt die MD-simulierte Wechselwirkung von AFP
mit der Pilzmembran, einschließlich der molekularen räumlichen Dimensionen von AFP. Das
AFP ist gelb und der N-terminale “γ-core“ in orange markiert. Blau sind die Lysin- und
Arginin-Reste des AFPs dargestellt. Die Pilzmodellmembran wird als weiße Wolke
dargestellt und der rote Pfeil zeigt das Dipolmoment von AFP.
Das Fehlen von vier Chitinsynthasen-Klassen in P. pastoris könnte eine Erklärung für das vom A.
niger dtdA Deletionsstamm unterschiedliche Ergebnis im Zellwandaufbau nach Wachstum mit AFP
sein. Wie in Tab. 38 (Seite 103) zusammengefasst ist, bildet der AFP resistente P. pastoris Wt 46 %
mehr β-1,3-Glucan nach der konfrontation mit AFP. Der AFP empfindliche dtdA knock-in Stamm
bildet mit nach der Kultivierung mit AFP gleich viel Chitin und vergleichsweise weniger β-1,3-
Glucan als der Wt (20 %). In P. pastoris ist die Festigung der Zellwand mit Glucan also ausreichend,
um AFP zu wiederstehen und eine zusätzliche Chitinsynthese hat keinen positiven Effekt. Man
könnte spekulieren, das die Ursache hierfür in dem unizellulären Wachstum der Zellen, bei dem im
Gegensatz zum filamentösen Wachstum nur in der Region der Zellteilung eine lokale Veränderung
von Zellwand und -membran stattfindet, liegt. In Hefen ist Chitinsynthase 3 für die Synthese von
Chitin im Bereich der Knospung der Tochterzelle [216] und für die Synthese von Chitosan in
Sporenzellwänden verantwortlich [217]. Die Deletion von Chs 3 in S. cerevisiae zeigt, dass das Gen
nicht-essenziell ist [216]. Zusammen mit dem Fehlen von Chitinsynthasen Klasse V kann hier der
Unterschied in der Reaktion auf das AFP liegen. Die direkte Wechselwirkung der GlyCer wurde für
Zellwand
134
AFP noch nicht gezeigt, jedoch für Psd2 (Tab. 49) [218]. Hier kann neben der Hemmung von
einzelnen Membranproteinen auch ein anderer Effekt für die Störung der Zellintegrität
verantwortlich sein. Interessanterweise bindet AFP nicht an eines der auf dem Lipid Strip
aufgetragenen Lipide oder der auf dem Sphingo Strip aufgetragenen Ceramide (Abb. 23, Abb. 24,
Seite 81, 82). Aus Surface Plasmon Resonance (SPR) Versuchen ist jedoch bekannt, dass zumindest
eine ionische Bindung an Vesikel aus POPC/POPG und POPC/POPS stattfindet (unveröffentlichte
Ergebnisse, gewonnen im Labor und mit Hilfe von Prof. Dr. Claudia Steinem, Universität Göttingen).
Falls Bindungen stattgefunden haben waren sie nicht stark genug um in der gewählten Strip-
Versuchsdurchführung bis zur Detektion bestehen zu bleiben. Die Bedeutung intakter lipid rafts
wird auch durch das künstlich hergestellte AMP cWFW gezeigt. Es wirkt durch die Entmischung der
Membran und folgenden Störung der Membranfluidität, die zu einer Trennung von peripheren und
integralen Membranproteinen führt [219]. Trotz einiger offener Fragen konnte in der vorliegenden
Arbeit klar die Bedeutung und der Einfluss der GluCer und Δ3-ungesättigten GlyCer auf die
Empfindlichkeit von filamentösen Pilzen gegenüber AFP gezeigt werden. Wobei die Erhöhung der
AFP-Resistenz durch die Verminderung der GluCer-Konzentrationen in der Plasmamembran für
höhere AFP-Konzentrationen deutlich stärker ausfällt. Zukünftige Arbeiten mit anderen AMPs, z.B.
AnAFP, und den vorgestellten Stämmen, mit GlyCer in künstlichen Vesikeln und weiteren
Deletionsstämmen werden das Verständnis des Zusammenspiels von GlyCer, Zellwandstress und
Chitinsynthasen vertiefen.
6.3. Intrazelluläre Aktivität von AnAFP
Für ein besseres Verständnis der Funktionen des AFPs wurde die fachgebietsinterne
Transkriptomdatenbank von A. niger nach den Expressionsmustern des für das AFP-Ortholog
AnAFP kodierenden Gens ausgewertet. Diese konnten dann zur Vorhersage der metabolischen
Prozesse herangezogen werden, an denen AnAFP in der Zelle beteiligt sein könnte. Dazu gehören
die Kohlenstofflimitierung, die Selbst- und Fremderkennung, die Sekundärmetabolitsynthese, die
Entwicklung, die Zellwandbiosynthese, der Membranlipidmetabolismus und die Wahrnehmung von
Umweltreizen. Um diese in silico Vorhersagen zu bestätigen wurden fünf Transkriptionsfaktoren,
die ebenfalls in diesen Prozessen aktiv sind, ausgewählt, um die Auswirkung ihrer Deletion in den
entsprechenden Reporterstämmen zu überprüfen. Die Deletion der Transkriptionsfaktoren creA,
brlA, flbA, stuA und velC in den Reporterstämmen PK1.22 und PK2.9 sollte den Einfluss der
jeweiligen Regulationen auf die Aktivität des AnAFP-Promotors messbar machen. Alle Versuche,
einen Vergleich der Fluoreszenz des eYFP zwischen Ausgangsstamm PK1.22 und seinen Derivaten
mikroskopisch zu bestimmen, scheiterten an der späten Aktivität des AnAFP-Promotors und der
dann starken Eigenfluoreszenzen der Kolonien (Daten nicht gezeigt). Um optimale Ergebnisse zu
erhalten ist ein Versuchskonzept in retentostater Bioreaktorkultivierung, wie in Paege et al. [68]
beschrieben, nötig. Die Auswertung der Fluoreszenz von Mycel aus einer Retentostat-
Bioreaktorkultivierung macht unter Kohlenstofflimitierung die Aktivität des Promotors in älterem,
135
stark vakuolisiertem Mycel sichtbar [68]. Letztendlich war die Extraktion des eYFP aus dem Mycel
zielführend und die Fluoreszenz konnte in vitro gemessen werden. In Übereinstimmung mit den
Ergebnissen der Luciferasemessungen mit NP6.4 ergab sich für Stamm BBA13.2 (ΔcreA) eine
stärkere Aktivität des anafp-Promotors im Vergleich zum Wt PK2.9. Die Messungen der
Luciferaseaktivität fanden in Mikrotiterplatten statt.
Die Deletion aller getesteten Transkriptionsfaktoren konnte den postulierten Einfluss auf die
anafp-Expression bestätigen. Die gemessenen Effekte können direkt oder indirekt sein. Der APSES
Transkriptionsfaktor StuA [220], der Katabolitrepressor CreA [221], der NF-χB ähnliche
Transkriptionsfaktor VelC [177] und auch die Entwicklungsregulatoren FlbA [222, 223] und BrlA
[224] wirken als globale Transkriptionsfaktoren, die eine Vielzahl von nachgeordneten
Signalkaskaden beeinflussen. Die gemessenen Effekte können also auch aus sich ergebenden
Änderungen von Transkriptraten anderer Gene herrühren. Aus den Ergebnissen lässt sich jedoch
der Zusammenhang von AnAFP mit den aus der Genkoexpressionsanalyse vorhergesagten
metabolischen Prozessen: der Sekundärmetabolite (StuA), Entwicklungsprozesse (StuA, VelC, CreA)
und Kohlenstofflimitierung (CreA) bestätigen. Um die Regulation des AnAFP Promotors genauer zu
verstehen könnten die FlbA und BrlA Deletionsstämme, ähnlich dem ΔstuA -Stamm, in der
Luciferasemessung getestet werden. Hier ist insbesondere der sich aus dem
Transkriptionsnetzwerk ergebende Fakt, das brlA erst nach der anafp-Expression aktiv ist und
daher kein Regulator des AnAFP sein kann, zu überprüfen. Außerdem könnte die Auswirkungen der
Änderungen anderer Genregulatoren, die den getesteten Transkriptionsfaktoren nachgeschaltet
sind, wie z.B. PkaA, oder von anderen Genen, oder deren Syntheseprodukten, aus der
Netzwerkanalyse überprüft werden. Die Ergebnisse der Analyse der Transkriptomdaten zeigen das
AnAFP eine wichtige Funktion für das Überleben unter Kohlenstofflimitierung hat. Das anafp-
Expressionsprofil ähnelt dem von nagA, atg1, ctcB, cfcI, den Atg4-, Atg8- und Pho85-Orthologen
und anderen Genen, die eine Rolle in der Autophagie, dem N-Acetylglucosemetabolismus und dem
Kohlenstofftransport spielen [68]. Daraus folgt als mögliche Funktion das AnAFPs unter
Kohlenstofflimitierung die Freisetzung von in alten, metabolisch inaktiven Myzelkompartimenten
gebundenem Kohlenstoff durch Autophagie und die Hemmung von möglichen
Nahrungskonkurrenten außerhalb der Zelle. Die vom AnAFP verursachte Zelllyse sensibler
filamentöser Pilze kann ebenfalls der Erschließung einer neuen Nahrungsquelle dienen. Weiterhin
wurde für das AFP-Ortholog PAF ebenfalls eine Rolle in Autophagieprozessen in P. chrysogenum
gezeigt [225]. Eine Kohlenstofflimitierung ist ein wesentlicher Auslöser der Sporenbildung in A.
niger [94], einhergehend mit der Mobilisierung von zelleigenen Reserven [226]. Die Ko-expression
mit im Prozess der Heterokaryon-Inkompatibilität aktiven Genenorthologen von z.B. tol, het-6 oder
het-e1 macht die Rolle des AnAFP in der Selbst- und Fremderkennung während der Hyphenfusion
wahrscheinlich. Fusionierte genetisch unterschiedliche Hyphen sterben als Folge ab. Die
Koexpression mit Genen, die für Synthesewege von Sekundärmetaboliten, wie die Orthologe der
lov Gene, und Gene die ortholog zu bekannten Genen der Zellwandsynthese, wie chsB und csmB ist
136
zum Teil der stuA-vermittelten Regulation dieser Gene zuzuordnen [227, 228]. Interessanterweise
hat der anafp-Deletionsstamm keinen Phänotyp unter den bisher getesteten Bedingungen [68].
Die Daten deuten auf eine Rolle des AnAFPs in der Zelle und zusätzlich zur beschriebenen
antimykotischen Aktivität hin. Dies könnte auf ein „moonlight protein“ hinweisen, das je nach
seinem Wirkort eine andere Funktion hat. Bisher sind ca. 200 Proteine mit mehr als einer Funktion
derselben Peptidkette beschrieben [228] und zukünftige Studien bzgl. des AnAFPs könnten diese
Hypothese untermauern.
6.4. AFP-Familie
Durch pBLAST [77] Analysen mit den bisher sequenzierten Genomen lassen sich in Pilzen
interessanterweise zahlreiche AFP-Orthologe finden. Die bisher 51 identifizierten und dem AFP in
ihrer Primärstruktur (Anordnung der Cysteine) ähnlichen Peptide sind über drei Superklassen des
Ascomycota-Stammbaumes verteilt. Unabhängig vom Ursprung der AFP-Familie scheint die Rolle
der AFPs für die Entwicklung der filamentösen Pilze so wichtig zu sein, dass eine Konservierung der
Grundstruktur zu einem relativ frühen Entwicklungszeitpunkt in ihrem Stammbaum stattgefunden
hat. Die Verbreitung von antimykotischen Peptiden in allen Reichen des Lebens, wie in Tab. 45 (im
Anhang, Seite 143) zu sehen, zeigt die Relevanz der Bekämpfung pilzlicher Fressfeine,
Konkurrenten und Krankheisterreger für das Überleben der einzelnen Arten. Die Ableitung von
Stoffwechselwegen aus Genen mit denen anafp ein paralleles Expressionsmuster hat zeigt jedoch,
dass diese Peptide wahrscheinlich auch in der Zelle andere Funktionen haben. Mit Sicherheit lässt
sich dieser Ansatz auf andere Mitglieder der AFP-Familie übertragen, möglicherweise sogar auf
andere antimykotische Peptide. Die Erkenntnisse bezgl. AFP lassen sich möglicherweise auch
teilweise auf die Funktionsweise dieser Peptide übertragen. Die entstandene Liste aus Peptid-
orthologen macht Vergleichsstudien zwischen den Proteinen möglich, wodurch Rückschlüsse auf
die Funktionalität bestimmter Proteinbereiche gezogen werden könnte. Auch Struktur-Funktions-
Beziehungen für die antimykotische Wirkspezifität der einzelnen Proteine könnten aufgedeckt
werden. Letztendlich ist die Herstellung von chimären Peptiden aus Bestandteilen der einzelnen
AFPs und ihre Untersuchung auf intra- und extrazelluläre Aktivität denkbar. Man muss jedoch beim
Ableiten von Hypothesen vorsichtig sein, da sich die Peptide in einigen Charakteristika auch
unterscheiden. Während AFP stark sekretiert wird und sich aus dem Kulturüberstand leicht
reinigen lässt, gilt das für AnAFP nicht [170]. Hier scheint eine intrazelluläre Funktion im
Vordergrund zu stehen [68].
Die Identifizierung der AFP-Familie ist ein wichtiger Schritt für die Erforschung der antimykotischen
Peptide. Wie in Tab. 45 (im Anhang, Seite 143) zu sehen ist, sind Untersuchungen zur Wirkweise
dieser Proteine selten. In der Regel werden nach der Entdeckung eines neuen Vertreters die
Aktivität gegenüber typischen pathogenen Vertretern der Hefen (Candida spp.), der filamentösen
Pilze (A. fumigatus) und Bakterien (E. coli, S. aureus, EHEC, MRSA) durchgeführt. Mit dem Wissen
137
über deren antimikrobielle Aktivität und Strukturanalysen endet in der Regel die Erforschung eines
AMPs. Nur weniger Vertreter haben es bisher überhaupt in klinische Versuche geschafft [229].
Daher können die Verallgemeinerung und Zusammenlegung in Familien zur schnelleren und
effizienteren Anwendung des generierten Wissens beitragen. AFP wurde bereits heterolog in
Pflanzen, wie z.B. Gerste, Hirse, Reis [230] und Oliven [231], zum Schutz vor Pilzinfektionen
exprimiert. Sollten Lebensmittel aus gentechnisch veränderten (GMO) Pflanzen in der Zukunft eine
bessere Akzeptanz als auch Zulassungsverfahren finden, wäre der Einsatz von antimykotischen
Peptiden eine Möglichkeit die weltweite Getreideernte einer wachsenden Weltbevölkerung
anzupassen.
7. Schlussfolgerungen und Ausblick
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur Wirkweise des AFPs und Erkenntnisse zur
intrazellulären Rolle des AnAFPs vorgestellt. Das Wissen über beide antimykotische Peptide lässt
sich mit dem Wissen zu anderen Mitgliedern der AFP-Familie zusammenführen. Es ist zu
überprüfen, ob es auch auf andere, nicht näher beschriebene Mitglieder dieser Familie anwendbar
ist. Eine vorschnelle Verallgemeinerung sollte dabei vermieden werden, da man aus Studien von
AFP, AnAFP, PAF und NAFP weiß, dass es neben vielen strukturellen Ähnlichkeiten auch funktionale
Unterschiede gibt.
Aus den hier beschriebenen Versuchen und Ergebnissen ergeben sich neue Experimente, deren
Daten zum weiteren Verständnis der Wirkweise und Funktion des AFPs beitragen können. Die
vermuteten Wechselwirkungen der GlyCer mit verschiedenen Chitinsynthasen könnten durch
MIC90-Versuche mit D-PDMP und Chitinsynthase-Deletionsstämmen belegt werden. Außerdem
kann das Konzept der Inhibierung der GluCer-Synthase auch für andere AFPs wie PAF oder AnAFP
überprüft werden. Die Lokalisierung des Wirkortes des AFPs könnte mittels
elektronenmikroskopischer Bilder spezifiziert werden, die die vorhandenen von Theiss et al (2005)
[213] ergänzen. Dabei müsste eine Markierung von potenziellen Bindungs- und
Interaktionspartnern (Chitinsynthasen, GlyCer und lipid rafts) erfolgen, um eine räumliche
Zuordnung möglich zu machen. Die Herstellung eines hoch affinen AFP-Antikörpers in Kaninchen in
dieser Arbeit macht eine Vielzahl von Versuchen möglich. In Ergänzung zu den strip-Versuchen
wären ELISA-Versuche denkbar. Auch die Verwendung eines Rasterelektronen-Mikroskops mit
immobilisiertem AFP oder AFP-Antikörpern an der Messspitze ist denkbar, um die lokale Verteilung
von AFP-Interaktionspartnern auf der Hyphenmembranoberfläche zu messen. Für Analysen der in
der Arbeit beschriebenen Interaktionen muss mit zellwandfreien Hyphenkompartimenten
gearbeitet werden. Vorarbeiten an Protoplasten führten zu keinem eindeutigen Ergebnis (Daten
nicht gezeigt), was die Lokalisation von AFP-Bindungsstellen betrifft. Hier kann die Bildung
künstlicher Membranoberflächen in Vesikeln, z. B. die SMALP Methode, zur Nutzung natürlicher
Membranbestandteile, oder eine andere Methode aus der Vielzahl der inzwischen etablierten
138
Membranuntersuchungen interessante Erkenntnisse liefern [232-234]. Die Arbeit mit
molekulardynamischen Simulationen kann die Theorien zu lipid rafts und Chitinsynthasen ebenfalls
bestätigen und ergänzen.
139
8. Anhang
Abbildung 49 – Southern Blot der geschnittenen DNA der Transformanten aus der
Deletion des Gens dtdA in A. niger AB 4.1. Beladungsschema: 1: Gene Ruler DNA Ladder
Mix, 2: NP1.1, 3: NP1.2, 4:NP1.5, 5: NP1.7, 6: NP1.8, 7: NP1.9, 8: NP1.15, 9: NP1.16, 10:
AB4.1
Tabelle 42 - Erwartetet DNA-Fragmentgrößen für die Detektion de Deletion der dtdA in A.
niger (Abb. 49).
Gen
Enzym
Sonde
Fragmentgröße [Bp]
Stämme
dtdA
(An01g09800)
SalI
Desaturase
Wt: 3357
ΔdtdA: 5012
NP1.15,
NP1.16
140
Abbildung 50 - Southern Blot der flbA, brlA und creA Deletionsstämme mit den jeweiligen
upstream Sonden. Spur 1 bis 6 Sonde upstream flbA; Spur 6-12 Sonde upstream brlA, Spur
12-20 Sonde upstream creA. Beladungsschema: 1: BN26.1, 2: PK1.22, 3:NP4.1-3, 4: NP4.1-2,
5: NP4.1-3, 6: Gene ruler DNA Ladder Mix, 7: BN 34.2, 8: PK1.22, 9: NP3.2-3, 10: NP3.2-2,
11: NP3.2-1, 12: Gene ruler DNA Ladder Mix, 13: PK1.22, 14: NP2.8, 15: NP2.7, 16: NP2.6,
17: NP2.5, 18: NP2.3, 19: NP2.2, 20: NP2.1
Abbildung 51 - Southern Blot der flbA, brlA und creA Deletionsstämme mit den jeweiligen
downstream Sonden. Spur 1 bis 6 Sonde downstream flbA; Spur 6-12 Sonde downstream
141
brlA, Spur 12-20 Sonde downstream creA. Beladungsschema: 1: BN26.1, 2: PK1.22, 3:NP4.1-
3, 4: NP4.1-2, 5: NP4.1-3, 6: Gene ruler DNA Ladder Mix, 7: BN 34.2, 8: PK1.22, 9: NP3.2-3,
10: NP3.2-2, 11: NP3.2-1, 12: Gene ruler DNA Ladder Mix, 13: PK1.22, 14: NP2.8, 15: NP2.7,
16: NP2.6, 17: NP2.5, 18: NP2.3, 19: NP2.2, 20: NP2.1
In der Tabelle 51 sind die Ergebnisse aus Abb. 50 und Abb. 51 zusammengefasst.
Tabelle 43 – Erwartete detektierte DNA-Fragmentgrößen für die erfolgreiche Deletion der
Transkriptionsfaktoren creA, brlA und flbA in A. niger und passsende Stämme.
Gen
Enzym
Sonde
Fragmentgröße [Bp]
Stämme
flbA
HpaI
upstream
Wt: 3452
ΔflbA: 7923
NP4.1-3
downstream
Wt: 3747
ΔflbA: 11997
NP4.1-3
brlA
ScaI
upstream
Wt: 4256
ΔbrlA: 2613
NP3.2-1,
NP3.2-2,
NP3.2-3
downstream
Wt: 4256
ΔbrlA: 1635
NP3.2-1,
NP3.2-2,
NP3.2-3
creA
NcoI
upstream
Wt: 2832
ΔcreA: 3352
NP2.8
downstream
Wt: 2081
ΔcreA: 3219
NP2.8
Abbildung 52 - Southern Blot mit der creA upstream Sonde. Beladungsschema: 1: Gene
ruler DNA Ladder Mix 2: NP6.1, 3: NP6.2, 4: NP6.3, 5: NP6.4, 6: NP6.5, 7. NP6.6, 8: NP6.7, 9:
NP6.8, 10: NP6.9, 11: NP6.10, 12: NP6.11, 13: NP6.12, 13: NP6.12, 14: Gene ruler DNA
Ladder Mix, 15: NP6.13, 16: NP6.14, 17: NP6.15, 18: NP6.16, 19: NP6.17, 20: NP6.18, 21:
NP6.19, 22: NP6.20, 23: NP6.21, 24: NP6.22, 25. AB4.1
142
Abbildung 53 - Southern Blot mit der ΔcreA downstream Sonde. Gene ruler DNA Ladder
Mix 2: NP6.1, 3: NP6.2, 4: NP6.3, 5: NP6.4, 6: NP6.5, 7. NP6.6, 8: NP6.7, 9: NP6.8, 10: NP6.9,
11: NP6.10, 12: NP6.11, 13: NP6.12, 13: NP6.12, 14: Gene ruler DNA Ladder Mix, 15:
NP6.13, 16: NP6.14, 17: NP6.15, 18: NP6.16, 19: NP6.17, 20: NP6.18, 21: NP6.19, 22:
NP6.20, 23: NP6.21, 24: NP6.22, 25. AB4.1
Die Ergebnisse des „Southern Blot“ aus Abb. 52 und Abb. 53 sind in der Tab. 44 zusammengefasst.
Tabelle 44 - Erwartete DNA-Fragmentgrößen bei der Detektion im „Southern Blot“ nach
der creA Deletion mit den dazu passenden Stämmen.
Gen
Enzym
Sonde
Erwartete
Fragmentgröße
[Bp]
Passende
Stämme
creA
NcoI
upstream
Wt: 2832
ΔcreA: 3352
NP6.1, NP6.3,
NP6.4, NP6.16
downstream
Wt: 2081
ΔcreA: 3219
NP6.1, NP6.3,
NP6.4, NP6.16
143
Tab. 45 - Gruppen antimykotisch aktiver Peptide, die in der AMP Datenbank „The Antimicrobial Peptid Database“ APD [41]
(http://aps.unmc.edu/AP/facts.php) eingetragen sind. Die Auswahl der Vertreter ergab sich aus der ersten Nennung der Gruppe
in der Datenbank. Die Sortierung nach Gruppen erfolgte auf der Grundlage der Zuordnungen in der Datenbank. Falls keine
Zuordnung genannt war wurden die Peptide nach ihrer Beschreibung zugeordnet und die Gruppennamen aus dem Namen des
Vertreters abgeleitet. (abgerufen 06.06.2019)
Antimykotische
Gruppe
Beispiel
Produzent
Wirkung
Struktur
Eigenschaften und
Wirkweise
Quelle
Bakterien
1
Iturine
Bacillomycin F,
Iturin A
Bacillus subtilis
strain I 164
Anti-Gram+ & Gram-
, A. niger, B. cinerea,
F: oxysporum,
Mycosphaerella
pinodes, N. crassa,
P. chrysogenum,
Pleospora herbarum,
Rhodotorula
pilimanae,
Sclerotinia spp.,
Stemphylium
radicinum,
Treichophyton
mentagrophytes, C.
albicans, C.
tropicalis, S.
cerevisiae;
hämolytisch
Kombination aus
Peptid und Lipid
Iturin A:
Hörnchenform
Zerstört Membranen
durch direkte
Interaktionen
Iturin A: Penetriert
die Membran durch
Interaktionen mit den
Membranlipiden und
Cholesterol, führt
zum Verlust von
Ionen, aktiviert
Phospholipasen, löst
Zellkernmembran auf
[235]
[236]
[237]
2
Surfactine
[Ala4] surfactin
Bacillus subtilis
Hämolytisch,
antiviral, gegen
Mycoplasmen;
Heptapeptid, chiral
Sequenz LLDLLDL
verbunden mit β-
hydroxy Fettsäure
Oberflächenaktiv und
Chelat
Aktivität pH abhängig;
bildet 3D Strukturen,
bindet Calcium
[236]
[238]
144
Penetriert
Membranen durch
hydrophobe
Interaktionen, formt
Poren
3
Lichenysine
[Ile4] lichenysin
Bacillus
licheniformis
Inhibiert Enzyme,
anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
Heptapeptid, chirale
Sequenz LLDLLDL
verbunden mit β-
hydroxy Fettsäuren
Bindet 2-wertige
Kationen
[236,
239,
240]
4
Syringomycine
Syringomycin-E
Pseudomonas
syringae
A. flavus, A.
fumigatus, A. niger,
F. moniliforme, F.
oxysporum
Kleines
Lipodepsipeptid
Detergens und
Porenbildung
[241]
5
Syringostatine
Syringostatin A
Pseudomonas
syringae
C. albicans; A.
fumigatus
Lipodepsipeptid
Detergens und
Porenbildung
[242]
6
Syringotoxine
Syringotoxin B
Pseudomonas
syringae
C. albicans; A.
fumigatus
Lipodepsipeptid
[243,
244]
7
Cepacidine
Cepacidin A
Pseudomonas
cepacia
Cundida spp., A.
niger, Cryptococcus
neoformans, F.
oxysporum
Glycopeptid
[245]
8
Antifungal Protein
1 (AFP1)
Streptomyces
tendae
Paecilomyces variotii
9.8 kDa
Chitin-bindendes
Protein
[246]
9
Nikkomycine
Nikkomycins X
Streptomyces
tendae
Coccidiodes immitis;
Blastomyces
dermatitidis;
Histoplasma
capsulatum
Peptidylnukleosid
Inhibiert
Chitinsynthese
[247]
10
Bacteriocine
Acidocin LCHV
Lactobacillus
acidophilus n.v.
Er 317/402
strain Narine
Anti-Gram+ & Gram-
, A. solani, F.
moniliforme, F.
oxysporum, H.
11 AS
[248]
145
sativum
11
Lantibiotika
Cinnamycin
Streptomyces
cinnamoneus
DSM 40005
Anti-Gram+,
hämolytisch
19 AS
Verhindert die
Aktivität der
Phospholipase A2
durch binden an
Phosphatidylethanola
mine
[249]
12
Laterosporuline
Laterosporulin
Brevibacillus
laterosporus
Strain GI-9
Anti-Gram+ & Gram-
,
49 AS, 4 β-Stränge
bilden eine verdrillte
Struktur
Thermisch stabil, pH-
tolerant, Protease
tolerant
[250]
13
Plantaricine
Plantaricin149
(Pln149)
Lactobacillus
plantarum NRIC
149
Anti-Gram+, S.
cerevisiae
22 AS, Helix
Bindung an negativ
geladene Oberflächen
verursacht eine
Änderung der
Konformation zu
einer Helix
[251]
14
Fusaricidine
Fusaricidin A
Bacillus
polymyxa KT-8
F. oxysporum, A.
niger, A. oryzae, P.
thomii
Lipodepsipeptid, 6
AS, N-terminales
Lipid
NRPS
[252]
15
PEs
PE1
Paenibacillus
ehimensis B7
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
Lipodepsipeptid, 9
AS, N-terminales
Lipid, zyklische
Ringstruktur
[253]
16
GraMIC90idine
GraMIC90idin S
Bacillus brevis
Anti-Gram+ & Gram-
, spermizid,
hämolytisch, Anti-
Biofilm
10 AS, zyklisch
NRPS
[254]
146
17
Brevifactine
Brevifactin
Brevibacterium
aureum MSA13
Anti-Gram+ & Gram-
, Antioxidant, C.
albicans
Lipopeptid, 4 AS, C-
terminales Lipid
[255]
18
Champacycline
Champacyclin
Streptomyces
champavatii
Anti-Gram-, C.
glabrata, E.
amylovora
8 AS, zyklisch
NRPS
[256]
19
Fengycine
Fengycin B
Bacillus
thuringiensis
C. albicans, A. niger
Lipopeptid, 10 AS, C-
terminales Lipid
[257]
20
Gageostatine
Gageostatin A
Bacillus subtilis
Anti-Gram+ & Gram-
, zytostatisch
Lipopeptid, 7 AS, N-
terminales Lipid
[258]
21
Gageotetrine
Gageotetrins A-C
Bacillus subtilis
Phytophthora capsici
Lipopeptid, 4 AS, N-
terminales Lipid
NRPS
[259]
22
RLIDs
RLID 12.1
Bacillus subtilis
RLID 12.1
Anti-Gram+ & Gram-
Nur 5 AS der N-
terminalen Sequenz
TPPQSXLXXG
bekannt
[260]
23
Polymyxine
Polymyxin B
Bacillus
aerosporus
Greer
Anti-Gram-, anti-
Biofilm
Lipopeptid, 10 AS,
zyklisch, multiple
Dab (2,4-
Diaminobutanoinsäu
re)
NRPS
[261,
262]
24
VLLs
VLL-28
Sulfolobus
islundicus
Anti-Gram+ & Gram-
, anti-Biofilm,
zytostatisch, C.
albicans
28 AS, Helix
[263,
264]
Pilze
1
Echinocandine
Echinocundin B
A. nidulans;
A. rugulosus
C. albicans;
hämolytisch
Lipopeptid, zyklisch
Behindern die
Zellwundsynthese
[265]
2
Pneumocundine
Pneumocundin
B0
Zalerion
arboicola
Pneumocystis
carinii; hämolytisch
Lipopeptid,
modifizierter
Echinocundin B
Peptidteil
[266]
147
3
Aculeacine
Aculeacin
A. aculeatus
C. albicans
Lipopeptid,
modifizierter
Echinocandin B
Peptidteil
[267]
4
WF11899
WF11899 A
Coleophoma
empetri
Lipopeptid,
modifizierter
Echinocundin B
Peptidteil
[268]
5
Mulundocundine
Mulundocundin
A. syndowi var.
mulundensis
A. niger; hämolytisch
Lipopeptid,
modifizierter
Echinocundin B
Peptidteil
6
Aureobasidine
Aureobasidin A
Aureobasidium
pullulans
Candida spp., S.
cerevisiae,
Cryptococcus
neoformans,
Aspergillus spp.
Zyklopeptid,
Depsipeptid
Delokalisiert Chitin in
Pilzzellwänden durch
Änderungen der
Aktinstrukturen
[269]
7
Leucinostatine
Leucinostatin A
Purpureocillium
lilacinum
Zytotoxisch,
hämolytisch, P.
infestans, P. capsici
9 AS,
Peptidantibiotika
[270-
272]
8
Helioferine
Helioferin
Mycogone rosea
Zytotoxisch,
hämolytisch
Lipoaminopeptid,
Helix,
[273,
274]
9
AFPs
AFP
A. giganteus
filamentöse Pilze
5,8kDa,
amphipathisch, β-
Stränge bilden
Faßstruktur, 4
Cysteinbrücken
Kationisch,
membranaktiv, stört
die Chitinsynthese,
geschwächte
Zellwand führt zur
Porenbildung und
zum Platzen der
Hyphe
[69]
10
RIPs
𝛼-Sarcin
A. giganteus
Eukaryotische Zellen
Lektin, 65 kDa, 150
AS
Inaktiviert Ribosomen
[275]
148
11
Killerproteine
(Killertoxine)
Hefen; z.B.: S.
cerevisiae,
Ustilago maydis,
Hanseniaspora
uvarum,
Zygosaccharomy
ces bailii, Phaffia
rhodozyma,
Kluveromyces
lactis, Pichia spp.
Pneumocystis carinii
10.7 bis 156.5 kDa
Bindet an spezifische
Rezeptoren auf der
Zelloberfläche, wird
aufgenommen und
stört die
Zellwandsynthese,
DNA Synthese und
den Zellzyklus
12
MiAMP1
Macadamia
integrifolia
Anti-Gram+, A.
heliarzthi, C.
gloeosporioides, F.
oxysporum, L.
maculans, P.
grunzinicolu, S.
sclerotiorum, V.
dahlia, S. cerevisiae
76 AS, Beta Strang, 3
Disulfidbrücken
[276]
13
AcAMP
anti-Gram+ &
Gram-,
A. clavatus ES1
Anti-Gram+ & Gram-
51 AS, cysteinreich
basisch
[277]
14
Alamethicine
Alamethicin
Treichoderma
viride
Anti-Gram+,
antiparasitisch,
hämolytisch
18, AS Helix
Formt Ionenkanäle
[278]
Krebstiere
1
Tachystatine
Tachystatin B1
Tachypleus
tridentatus
Anti-Gram+
42 AS; Beta Strang
Bindet Chitin
[279]
2
Penaeidine
Penaeidin-1
Penaeus
vannamei
Anti-Gram+
50 AS
[280]
3
Dolabellanine
Dolabellanin B2
Dolabella
auricularia
Anti-Gram+ & Gram-
, S. aureus B. subtilis,
S. marcescens, E.
coli, K. pneumoniae,
[281]
149
P. aeruginosa, P.
mirabilis
4
Arasine
Arasin 1
Hyas araneus
Anti-Gram+ & Gram-
37 AS, N-terminus
viele Pro und Arg, 2
Disulfidbrücken im
C-terminus
[282]
5
Tachycitine
Tachycitin
Tachypleus
tridentatus
Anti-Gram+ & Gram-
62 AS, Beta Strang
[283]
6
Ls-Stylicine
Ls-Stylicin1
Litopenaeus
stylirostris
Anti-Gram-, F.
oxysporum
82 AS; N-terminus
Pro-reich C-terminus
Cys-reich, 13
Cysteine, Monomer
und Dimer ähnlich
aktiv
[284]
7
Myticine
Myticin B
Mytilus
galloprovincialis
anti-Gram+ & Gram-
, F. oxysporum
40 AS
[285]
8
Anti-
lipopolysaccharid
faktor
ALFpm3
Penaeus
monodon
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral, F.
oxysporum, B.
cinerea, P.
crustosum
98 AS, Helix und
Beta Strang
[286]
9
Armadillidine
Armadillidin H
Armadillidium
vulgare
Anti-Gram+ & Gram-
53 AS, Gly-reich
[287]
10
Hyastatine
Hyastatin
Hyas araneus
Anti-Gram+ & Gram-
, S. cerevisiae C.
albicans
114 AS, Gly-reich
[288]
11
His-reich
PvHCt
Litopenaeus
vannamei
F. oxysporum
23 AS, Helix, C-
terminales Fragment
des Hemocyanins, 3
Phe auf Oberfläche
Hydrophobe
Oberfläche
[289]
12
Fc-SWDs
Fc-SWD
Fenneropenaeus
chinensis
anti-Gram+ & Gram-
, Enzym Inhibitor, C.
66 AS
[290]
150
albicans, V. dahliae,
Fusarium spp., G.
cingulata, C.
orbiculare
13
Sphyastatine
SpHyastatin
Scylla
paramamosain
Anti-Gram+ & Gram-
, P. pastoris
131 AS,
Disulfidbrücke
[291]
Pflanzen
1
Zeamatine
Zea mays
C. albicans; N. crassa
22KDa
Permeabilisiert
Pilzmembranen
[37,
292,
293]
2
Cyclopeptid
Alkaloide
Amphibine H
A. niger
Zyklopeptid,
Alkaloid
[37,
294]
3
PR-1 Proteine
Reis, Weizen,
Mais, Tabak,
Arabidopsis
thaliana, Gerste,
und viele andere
Uromyces fabae,
Phytophthora
infestans, Erysiphe
graminis
15 kDa bis
17 kDa;
Superfamilie der Cys-
reichen Proteine,
vermutlich
Interaktion mit
Membranproteinen,
Verhinderung der
Calciumfreisetzung
[293]
4
PR-2 Proteine
β-1,3-
endoglucanases
Tabak, A.
thaliana, Erbsen,
Getreide,
Früchte
R. solani; P.
hyoscyami f. sp.
tabacina; P.
nicotianae;
Peronospora
parasitic; F. sp.,
Cercospora
arachidicola, A.
flavus; Rhizoctonia
solani, C. albicans, A.
fumigatus
Klasse I Glucanasen,
intrazelluläre
basische Proteine,
33 kDa. Klasse II und
Klasse III Glucanasen
sind saure,
extrazelluläre
Proteine ,36 kDa
Zerstören direkt die
Zellwand, setzen β-
Glucan frei und
aktivieren damit
pflanzliche
Immunabwehr
[293,
295]
151
5
PR-3 Proteine
Endochitinases
Tabak, Gurken,
Bohnen, Erbsen,
Getreide
T. reesei, Alternaria
solani, A. radicina, F.
oxysporum, R.
solani, Guignardia
bidwellii, B. cinerea,
Coprinus comatus
zwischen 26
und 43 kDa, 5
Gruppen
Schwächt die
Zellwand, macht Zelle
osmotisch sensitiv
[293]
6
PR-4 Proteine
Endochitinases;
Chitin-bindende
Proteine
Kartoffel, Tabak,
Gerste, Tomate,
andere Pflanzen
Treichoderma
harzianum, F.
culmorum, F.
graminearum, B.
cinerea
13-14.5 kDa
Protein bindet an
Chitin der
Pilzzellwand und
führt zu Störung der
Zellpolarität und des
Wachstums
[293]
7
PR-5 thaumatin-
ähnliche (TL)
Proteine
Zeamatin
A. thaliana,
Mais, Soja, Reis,
Weizen, Tabak,
Tomate, Kürbis,
Bohnen, Gerste,
andere Pflanzen
C. albicans
22 kDa; 8
Disulfidbrücken
Verändert die
Permeabilität von
Pilzzellen mit
Zellwand, nicht bei
Protoplasten, Lyse in
subapikalen
Bereichen, bindet
(1,3) β-Glucan, hat
(1,3)β-Glucanase
Aktivität
[293]
8
Defensine
Rs-AFP2;
DMAMP1
Radieschen,
Dahlie
B. cinerea, Alternaria
brassicola, F.
culmorum, F.
oxysporum, F. solani,
C. albicans
45 bis 54 AS, Cys-
reich, positiv
geladen, 4
Disulfidbrücken
Gruppe I:
morphologische
Veränderungen,
Gruppe II: inhibieren
Wachstum; Gruppe
III: inhibiert α-
Amylasen in
Vitro, Gruppe IV:
[293]
152
binden spezifische
Zellrezeptoren und
bewirken Kalium
Efflux und Calcium
Aufnahme.
9
Thionine
NeThio2
(gamma-thionin)
Nicotiana
excelsior
47 AS;
Disulfidbrücke
[296]
10
Thionin-ähnliche
antimikrobielle
Peptid
Tu-AMP 2
Tulipa
gesneriana L.
Anti-Gram+ & Gram-
20 AS,; Heterodimer
verbunden durch 4
Disulfidbrücken
Bindet Chitin
[297]
11
Cyclophilin-
ähnliche Proteine
Mungin
Phaseolus
mungo
R. solani, F.
oxysporum, B.
cinerea, Coprinus
comatus
18 kDa Protein
Inhibiert α-und β-
Glucosidasen in vitro
[37]
12
RIPs
Mirabilis
expansa, Pisum
sativum,
Momordica
charantia,
Ricinus
communis,
Viscum album,
andere Pflanzen
Inhibiert
Proteinsynthese,
zytotoxisch
11 – 120 kDa
RNA N-Glycosidasen
depurinieren rRNA,
führt zu Schäden an
Ribosomen, Typ 2
RIPs: zellbindende B-
Kette formt Kanal der
A Kette Eintritt in
Zelle ermöglicht, N-
Glycosidase Aktivität
führt zu RNA Schäden
[37]
13
Protease
Inhibitoren
Phytocystatine
Mais; Eleusine
coracana,
Weizen, Gerste
F. solani; T. reesei
10 - 12 kDa
Inhibieren
Cysteinproteasen,
Serinproteasen, Pilz-
und
Insektenwachstum
[37]
14
Snakine
Snakin-1
Solanum
tuberosum
Anti-Gram+ & Gram-
63 AS; 6.9 kDa, Helix
[37,
298]
15
Knottin-type Peptid
Antifungal
Phytolacca
38 AS, 3
Hydrophobe
[299]
153
protein 1
americana
antiparallele Beta
Stränge; 3
Disulfidbrücken
Oberfläche
16
Ginkbilobin
Ginkgo biloba
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral, anti-HIV,
B. cinerea, M.
arachidicola, F.
oxysporum, R.
solani, C. comatus
13 kDa
Aktiviert den
aktinabhängigen
Zelltod
[300,
301]
17
Hevein-ähnliche
Peptid
Pseudo-hevein
Kautschukbaum
45 AS; 4
Disulfidbrücken
[302]
18
Shepherine
Shepherin I
Capsella bursa-
pastoris
Anti-Gram-
28 AS; Gly-reich
[303]
19
Ib antimikrobielle
Peptid (Ib-AMPs)
Ib-AMP3
Impatiens
balsamina
Anti-Gram+
20 AS; 2
Disulfidbrücken,
[304]
20
Lunatusine
Lunatusin
Phaseolus
lunatus L.
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral, anti-HIV,
zytostatisch
20 AS
[305]
21
Cyclotide
Kalata B2
Viola
betonicifolia
Anti-Gram+,
antiviral,
antiparasitisch,
insektizid,
hämolytisch
29 AS, Helix und
Beta Strang
[306]
22
EAFPs
EAFP2
Eucommia
ulmoides Oliver
41 AS, Helix und
Beta Strang, N-
terminal
Pyroglutamat, 5
Disulfidbrücken
[307]
23
Cy-AMPs
Cy-AMP1
Cycas revoluta
44 AS
Chitin bindend
[308]
24
Cn-AMPs
Cn-AMP1
Cocos nucifera
Anti-Gram+ & Gram-
, zytostatisch
9 AS, Helix
[309]
25
Lipid transfer
Cc-LTP1
Coffea
Enzym Inhibitor,
23 AS, 9 kDa
[310]
154
Proteine
canephora
Candida spp.
26
hairpin-ähnliche
Peptid
EcAMP1
Echinochloa crus
galli
Anti-Protisten, A.
alternata, A. solani,
F. solani, F.
verticillioides, P.
Betae, P. infestans,
P. debaryanum, P.
ultimum
37 AS, Helix
[311]
27
Piceaine
Piceain 1
Picea sitchensis
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
20 AS
Wirkt an
Zellmembranen,
Zellwand
[312]
28
Trapa natans
Peptid
Tn-AFP
Trapa natans
C. tropicalis
11 AS
[313]
29
H. coronopifolia
Peptid
Hc-AFP1
Heliophila
coronopifolia
50 AS,
Disulfidbrücke
[314]
30
ToAMPs
ToAMP1
Taraxacum
officinale, Wigg.
flowers
Anti-Gram+ & Gram-
38 AS,
Disulfidbrücke
[315]
31
Beta-purothionine
Beta-purothionin
Triticum
aestivum
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
45 AS, Helix und
Beta Strang
[316]
32
Datucine
Datucin
Datura
stramonium
Anti-Biofilm, C.
albicans
31 AS, 3
hydroxylierte
Proline, C-terminal
N-
acetylglucosaminyla
sparagin
[317]
155
33
Pm-AMPs
Pm-AMP1
Pinus monitcola
Cronartium ribicola,
Phellinus
sulphurascens,
Ophiostoma
montium , und
Ophiostoma
clavigerum
79 AS,
Disulfidbrücke
[318,
319]
34
Cc-GRPs
Cc-GRP
Coffea
canephora
F. oxysporum, C.
lindemuthianu
35 AS, Gly-reich, 7
kDa
Nachgewiesen in
Zelloberfläche,
Zellwand und Zellkern
von F. oxysporum
[320]
35
Peptid-G2
Sanum
tuberosum L cv.
Gogu Valley
Anti-Gram+, R.
solani, C. albicans
29 AS
[321]
36
Potamine
Potamin-1
Solanum
tuberosum L cv.
Gogu
Anti-Gram+, Enzym
Inhibitor, C. albicans,
R. solani, C.
MIC90higanense
subsp.
MIC90higaninse
46 AS
[322]
37
Hispidaline
Hispidalin
Benincasa
hispida
Anti-Gram+ & Gram-
, Antioxidant
49 AS
[323]
38
Aracine
ARACIN1
Arabidopsis
thaliana
B. cinerea, A.
brassicicola, F.
graminearum, S.
sclerotiorum, S.
cerevisiae
40 AS
[323]
39
Tk-AMP-Xs
Tk-AMP-X1
Triticum kiharae
Dorof. et Migush
F. graminearum, F.
verticillioides, D.
maydis
31 AS,
[324]
40
BnPRPs
BnPRP1
Brassica napus
Anti-Gram+ & Gram-
35 AS
[325]
156
, P. pastoris, S.
sclerotiorum, Mucor
sp., M. oryzae, B.
cinerea
41
Jaburetoxe
Jaburetox
Canavalia
ensiformi
Insektizid, S.
cerevisiae, C.
parapsilosis, P.
membranisfaciens,
C. tropicalis, K.
marxiannus, C.
albicans
93 AS, Helix
10 kDa Peptid durch
Hydrolyse mit
Cathepsin
freigesetzte,
Membranpermeabilis
ierung
[326]
42
AtPDFs
AtPDF2.3
Arabidopsis
thaliana
S. cerevisiae
47 AS,
Disulfidbrücke
[327]
43
OsDEFs
OsDEF7
Oryza sativa L
Anti-Gram+ & Gram-
49 AS, Dimer,
Disulfidbrücke
[328]
44
Ps-AFPs
Ps-AFP1
Pisum sativum
A. niger, A. terreus,
F. solani F.
oxysporum, Pythium
spp., C.
gloeosporioides, C.
albicans, Glomerella
spp.
38 AS,
Disulfidbrücke
[329]
45
MCh-AMPs
MCh-AMP1
Matricaria
chamomilla L
C. albicans, C.
glabrata C. kruseii,
A. flavus, A. niger, A.
fumigatus
23 AS
[330]
Insekten
1
Cecropine
Cecropin A
Hyalopora
cecropia
F. oxysporum; A.
fumigatus
Lineare Peptide
Lytisch; C-terminus
penetriert Membran
[37,
331]
2
Gm cecropin D-
ähnliche Peptid
Gm cecropin D-
ähnliche pept
Galleria
mellonella
Anti-Gram+ & Gram-
39 AS
[332]
3
Drosomycine
Drosophila
F. oxysporum
Cysteinreich, 44 AS,
Induzierbar
[37,
157
melanogaster
3 verdrehte Beta
Stränge, 3
Disulfidbrücken
333]
4
Thanatine
Podisus
maculiveris
F. oxysporum, A.
fumigatus
21 AS, cysteinreich,
antiparallele Beta
Stränge,
Disulfidbrücke
[334]
5
Glycine/Histidin-
reiche Proteine
Holotreichin;
AFP;
Tenecin
Holotreichia
diomphalia
larvae; Tenebrio
molitor
C. albicans
84 AS, 67 AS; 49 AS;
mehr als 80% der AS
Gly or His
[335]
6
Gomesine
Gomesin
Acanthoscurria
gomesiana
[336]
7
Acanthoscurrine
Acanthoscurrin 1
Acanthoscurria
gomesiana
Anti-Gram-
133 AS, Gly-reich
[337]
8
Metchnikowine
Metchnikowin
Drosophila
melanogaster
Hemmt
Enzymaktivität
Inhibiert die Aktivität
der Succinat-
Coenzym Q
Reduktase
[338]
9
Opistoporine
Opistoporin 1
Opistophtalmus
carinatus
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
[339]
10
Ponericine
Ponericin G1
Pachycondyla
goeldii
Anti-Gram+ & Gram-
, insektizid
Helix, amphipathisch
[340]
11
Parabutoporine
Parabutoporin
Parabuthus
schlechteri
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
45 AS, Helix
[339]
12
Spinigerine
Spinigerin
Pseudacanthoter
mes spiniger
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral, anti-HIV
25 AS; Helix
[341]
13
Holotricine
Holotricin
Holotreichia
diomphalia
84 AS
[335]
14
Charybdotoxine
Charybdotoxin
37 AS, Helix und
Beta Strang;
gamma-core Motiv
Wirkt auf
Kaliumkanäle
[76]
158
15
Mastoparane
Mastoparan M
Vespa
mundarinia; in
multiple vespa
species
Anti-Gram+ & Gram;
C. albicans, C.
parapsilosis
14 AS
[342,
343]
16
Stomoxyne
Stomoxyn
Stomoxys
calcitrans
Anti-Gram+ & Gram-
42 AS, Helix
[344]
17
Lycotoxine
Lycotoxin I
Lycosa
carolinensis
Anti-Gram+ & Gram-
, insektizid, Enzym
Inhibitor, C.
glabrata; C. albicans
25 AS;
vorhergesagte
amphipathische
Helix
[345]
18
Pilosuline
Pilosulin 1 (Myr b
I)
Myrmecia
pilosula
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
56 AS; Helix
N-terminale 20 AS
antimikrobielle
Aktivität
[346]
19
Delta-Myrtoxine
Delta-Myrtoxin-
Mp1a
Myrmecia
pilosula
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
27 AS, antiparalleles
Heterodimer, Helix
[346]
20
Polybia-MPI
Polybia-MPI
Polybia paulista
Anti-Gram+ & Gram-
, zytostatisch; anti-
Biofilm, C. albicans,
C. glabrata
14 AS; Helix
Mastzellen-lytisches
Peptid
[347]
21
Pundinine
Pundinus
imperator
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
24 AS, Helix
[348]
22
Cryptonine
Cryptonin
Cryptotympana
dubia
Anti-Gram+ & Gram-
24 AS; Helix
[349]
23
Decoraline
Decoralin
Oreumenes
decoratus
Anti-Gram+ & Gram-
, antiparasitisch,
zytostatisch, C.
albicans
11 AS; Helix
[350]
24
Gm pro-reiche
Peptide
Gm pro-reich
pept1
Galleria
mellonella
Anti-Gram+
37 AS
[332]
25
Gm anionische
Peptide
Gm anionisches
pept 1
Galleria
mellonella
Anti-Gram+
42 AS
[351]
26
MIC90roplusine
MIC90roplusin
Rhipicephalus
Anti-Gram+ & Gram-
90 AS, Helix
Bindet Metallionen
[352]
159
(Boophilus)
MIC90roplus
(Cu2+, Fe2+)
27
Moricin-ähnliche
Peptide
G. mellonella
Moricin-
ähnliches Peptid
A (Gm-mlpA)
Galleria
mellonella
Anti-Gram+ & Gram-
39 AS
[353]
28
Ixosine
Ixosin-B
Ixodes sinensis
Anti-Gram+ & Gram-
32 AS
[354]
29
Latarcine
Latarcin 1
Lachesana
tarabaevi
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral,
hämolytisch
25 AS, Helix
[355]
30
Scarabaecine
Scarabaecin
Oryctes
rhinoceros
36 AS, Helix und
Beta Strang
[356]
31
ARDs
ARD1
Archaeoprepona
demophoon
A. fumigatus, C.
albicans
41 AS, Helix und
Beta Strang
Antimykotische
Aktivität durch Alpha-
Patch
[357]
32
Diapause-
spezifisches Peptid
Diapause-
spezifisches
Peptid
Gastrophysa
atrocyanea
441 AS, Helix und
Beta Strang, 3
Disulfidbrücken
Blockiert
Calciumkanäle
[358]
33
Jelleine
Jelleine-I
Apis mellifera
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
8 AS
[359]
34
VESP-VBs
VESP-VB1
Vespa bicolor
Fabricius
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
13 AS
[360]
35
Rinder Hämoglobin
Peptid (BHPs)
BHP
Boophilus
MIC90roplus
Anti-Gram+, C.
albicans, S.
cerevisiae, A.
nidulans
29 AS, AS 33-61 des
Rinderhämoglobins
[361]
36
Bactrocerine
Bactrocerin-1
Bactrocera
dorsalis
Anti-Gram+ & Gram-
20 AS, Helix
[362]
37
Meucine
Meucin-13
Mesobuthus
eupeus
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch;
Beauveria spp., N.
crassa, S. cerevisiae,
13 AS, Helix
[363]
160
C. albicans
38
Defensin-ähnliche
LongiMaissin
Haemaphysalis
longi Maisis
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
47 AS
[364]
39
O. drewseni venom
Peptid
OdVP1
Orancistrocerus
drewseni
C. albicans, B.
cinerea
14 AS
[365]
40
Lycocitine
Lycocitin 1
Lycosa
singoriensis
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
18 AS
[366]
41
Ctriporine
Ctriporin
Chaerilus
tricostatus
Anti-Gram+, Anti-
MRSA, C. albicans
19 AS, Helix
Wirkt auf
Bakterienmembranen
[367]
42
Halictine
Halictine 1
Halictus
sexcinctus
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch,
zytostatisch, C.
albicans
12 AS, Helix
[368]
43
Macropine
Macropin 1
Macropis
fulvipes
Anti-Gram+ & Gram-
, zytostatisch
13 AS, Helix
[369]
44
Lasiocepsins
Lasiocepsin
Lasioglossum
laticeps
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
27 AS, Helix, 2
Disulfidbrücken
[370]
45
IsCTs
IsCT2
Opisthacanthus
madagascariensi
s
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
13 AS, Helix
[371]
46
HsAps
HsAp
Heterometrus
spinifer
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch, C.
tropicalis
29 AS
[372]
47
Nabaecine
Nabaecin-3
Nasonia
vitripennis
Anti-Gram+ & Gram-
98 AS, N-terminus
Pro-reiche, C-
terminus Gly-reich
[373]
48
Juruine
Juruin
Avicularia
juruensis
C. albicans, A. niger
38 AS
hemmendes Cystin-
Knoten-Motiv
[374]
49
Bicarinaline
Bicarinalin
Tetramorium
bicarinatu
Anti-Gram+ & Gram-
, antiparasitisch,
Anti-MRSA, A. niger,
C. albicans, G.
20 AS, Helix
Permeabilisiert
Membranen
[375]
161
cundidum, S.
cerevisiae spp.
50
Panurgine
Panurgine 1
Panurgus
calcaratu
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch, C.
albicans
12 AS
[376]
51
Sarcotoxine
Sarcotoxin Pd
Paederus
dermatitis
Anti-Gram+ & Gram-
, spermizid, C.
albicans, A. niger, A.
fumigatus
34 AS
[377]
52
Pantinine
Pantinin-1
Pundinus
imperator
Anti-Gram+ & Gram-
, Anti-MRSA, C.
tropicalis
14 AS
[378]
53
Lycosine
Lycosin-1
Lycosa
singorensis
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch,
zytostatisch,
Penicillium, A.
flavus, B. bassiana,
C. albicans, S.
cerevisiae
24 AS
Wirkt auf
Bakterienmembranen
[379]
54
TsAPs
TsAP-2
Tityus serrulatus,
Turrilites
costatus
Anti-Gram+, anti-
Biofilm, zytostatisch,
Candida spp., C.
neoformans
17 AS
[380]
55
ASmAPs
ASmAP1
Undroctonus
amoreuxi
Anti-Gram+,
hämolytisch
18 AS
[381]
56
Bradykinin-
potentiating Peptid
BmKbpp
Mesobuthus
martensi
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch, N.
crassa, B. cinerea, F.
culmorum
47 AS
[382]
57
VCT-VTs
VCT-VT1
Vespa tropica
anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans, C.
parapsilosis
13 AS,
[342]
162
58
ASeAPS
ASeAP1
Undroctonus
aeneas
Anti-Gram+,
zytostatisch, C.
albicans
19 AS,
[383]
59
Stigmurins
Stigmurin
Tityus stigmurus
Anti-Gram+, Anti-
MRSA, hämolytisch,
zytostatisch, C.
albicans, C. krusei, C.
glabrata
17 AS, Helix
[384]
60
Opiscorpine
Opiscorpine
Opistophthalmus
carinatus
Anti-Gram-, F.
culmorum, F.
oxysporum
76 AS,
Disulfidbrücke
[385]
61
LyeTxs
LyeTx I
Lycosa
erythrognatha
anti-Gram+ & Gram-
, C. neoformans, C.
krusei
25 AS, Helix
[386]
62
Rondonine
Rondonin
Eurypelma
californicum,
Acanthoscurria
gomesiana
Treichosporon spp.,
C. albicans, C. krusei,
C glabrata., C.
parapsilosis C.
tropicalis C.
guilliermondii
10 AS,
Hergestellt durch
Proteolyse eines
sauerstofftransportier
enden Proteins
[387]
63
VpAmps
VpAmp1.0
Vaejovis
punctatus
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch, C.
albicans
19 AS, Helix
[388]
64
Termicine
Es-termicin
Eupolyphaga
sinensis
C. albicans
35 AS,
Disulfidbrücke
[389]
65
HYLs
HYL
Hylaeus signatus
C. albicans, anti-
Gram+ & Gram-
16 AS, Helix
[390]
66
ISGCocks
ISGCock_Contig1
6_2060
Periplaneta
americana
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
26 AS
[391]
67
Diapausine
Diapausin-1
Munduca sexta
S. cerevisiae
45 AS,
Disulfidbrücke
[392]
68
Smps
Smp24
Scorpio maurus
Anti-Gram+ & Gram-
24 AS, Helix
Entfernen der 4 N-
[392]
163
palmatus
, C. albicans
terminalen AS erhöht
Aktivität
69
ToAPs
ToAP1
Tityus obscurus
Anti-Biofilm, C.
albicans, C.
tropicalis, C.
parapsilosis, C.
neoformans, C.
neoformans
17 AS, 94.1%
Ähnlichkeit mit
TsAP-2
[393]
70
Cons
Con10
Opisthacanthus
cayaporum
C. albicans, C.
tropicalis, C.
parapsilosis, C.
glabrata, C.
neoformans,
27 AS, 64.3%
Ähnlichkeit mit
VpAmp2.0
[393]
71
NDBPs
NDBP-5.8
Opisthacanthus
cayaporum
C. albicans, C.
tropicalis, C.
parapsilosis, C.
neoformans
14 AS
[393]
72
Longipine
Longipin
Acutisoma
longipes
C. albicans, C.
guilliermondii, C.
tropicalis
18 AS
[394]
73
Osmine
Osmin
Osmia rufa
Anti-Gram+ & Gram-
, F. oxysporum
17 AS, Helix
[395]
74
Codesane
Codesane
Colletes
daviesanus
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
18 AS, Helix
[396]
75
AMPs
AMP17
Musca
domestica
C. albicans
143 AS
[397]
76
Marmelittine
Marmelittin
Mesobuthus
eupeus
Anti-Gram+ & Gram-
, insektizid
26 AS, Helix, 69.2%
Ähnlichkeit zu
Bmkb1
[398]
77
MeuFSPLs
MeuFSPL-2
Mesobuthus
eupeus
Anti-Gram+ & Gram-
, insektizid
18 AS, Helix
MeuFSPL-1 gleiche AS
Sequenz wie Bmkb1
[398]
Amphibien
164
1
Dermaseptine
Dermaseptin
Phyllomedusa
sauvagii
A. flavus, A.
fumigatus, F.
oxysporum
linear, kationisch,
Lysin-reich
[399]
2
Phylloseptine
Phylloseptin-L1
Hylomantis
lemur,
Agalychnis
callidryas
Anti-Gram+,
hämolytisch,
zytostatisch
18 AS
[400]
3
Skin-PYY
(SPYY)
Phyllomedusa
bicolor
Anti-Gram+ & Gram-
, C. neoformans, C.
albicans, A.
fumigatus
durchdringt
Phospholipidmembra
nen
[401]
[402]
4
Magainine
Xenopus laevis
C. albicans
36 AS; Helix
Affinität für
mikrobielle
Membranen, führt
zur Auflösung von
Ionengradienten
[403]
5
Aureine
[41]
6
Bombinin-ähnliche
Peptid
Bombinin-
ähnliche Peptid 7
[404]
7
Bombinine
Bombinin H2
Bombina
variegata
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
20 AS, Helix
[404]
8
Maximine 1
Maximin H1
Bombina
maxima
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral,
zytostatisch, C.
albicans
20 AS
[405]
9
Brevinine
Brevinin-1SA
Rana
sphenocephala
Anti-Gram-
24 AS
[406]
10
Esculentine
Esculentin-2PLa
Rana palustris
Anti-Gram+ & Gram-
37 AS,
[407]
11
Gaegurine
Gaegurin-1
Rugosa rugosa
33 AS
[408]
12
Temporine
Temporin-1CSd
Rana cascadae
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch,
14 AS
[409]
13
Ranatuerine
Ranatuerin-2PLc
Rana palustris
Anti-Gram-
28 AS
[407]
165
14
Melittin-ähnliche
Peptide (MRPs)
AR-23
Rana tagoi
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch,
23 AS
[410]
15
Peptid PGQ
Xenopus laevis
[411]
16
Caerine
Caerin 1.8
Litoria chloris
Anti-Gram+ & Gram-
, antiparasitisch,
zytostatisch
25 AS, N-terminal
Leucinamid
[412]
17
Maculatine
Maculatin 1.1
Litoria eucnemis
Anti-Gram+ & Gram-
, anti-HIV,
zytostatisch
21 AS, N-terminal
Phenylalaninamid
[413]
18
Citropine
Citropin 1.1
Litoria citropa
Anti-Gram+, Anti-
MRSA, Anti-Biofilm,
zytostatisch
16 AS,
amphipathisch,
Helix, definierte
hydrophobe und
hydrophile Bereiche
[414]
19
CPFs
CPF-ST3
Silurana
tropicalis
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch,
zytostatisch
18 AS, Helix
[415]
20
Pseudine
Pseudin 1
Pseudis
paradoxa
Anti-Gram+ & Gram-
,hämolytisch
24 AS, Helix;
amphipathisch
[416]
21
Nigrocine
Nigrocin-2
Rana
nigromaculata
Anti-Gram+ & Gram-
, M. luteus, S.
dysenteriae, K.
pneumoniae, P.
aeruginosa, S.
typhimurium, C.
albicans
21 AS;
amphipathisch, Helix
[417]
22
Ranalexine
Ranalexin
Rana
catesbeiana
Anti-Gram+ & Gram-
, antiparasitisch,
Anti-MRSA,
zytostatisch; S.
aureus, S. pyogenes,
E. coli
20 AS, AS 8-15
bilden Helix
[418]
166
23
Fallaxine
Ocellatin-F1
Leptodactylus
fallax
Anti-Gram-, A.
actinomycetemcomit
ans, S. aureus, C.
lusitaniae
25 AS, Helix; C-
terminal alpha-
amidiert
N- or C-terminale
Verkürzung
verursachte einen
Verlust der
antimikrobiellen
Aktivität
[419]
24
Kassinatuerine
Kassinatuerin-1
Kassina
senegalensis
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
21 AS;
amphipathisch
alpha-helikal
[420]
25
Dybowskine
Dybowskin-4
Rana dybowskii
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
15 AS;
[421]
26
Pleuraine
Pleurain-A2
Rana pleuraden
Anti-Gram+ & Gram-
26 AS
[422]
27
Odorranaine
Odorranain-HP
Odorrana
grahami
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
23 AS
[423]
28
Nigroaine
Nigroain-K1
Rana
nigrovittata
Anti-Gram+ & Gram-
21 AS
[424]
29
Plasticine
Plasticin-B1
Phyllomedusa
bicolor
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
26 AS, Helix
[425]
30
Ascaphine
Ascaphin-8
Ascaphus truei
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral, anti-HIV,
anti-MRSA,
hämolytisch,
zytostatisch
19 AS, Helix
[426]
31
Hylaseptine
Hylaseptin P1
Hyla punctata
Anti-Gram+ & Gram-
14 AS, Helix; ähnlich
der N-terminalen
Region von Brevinin-
2
[427]
32
Ranacycline
Ranacyclin T
Rana esculenta
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
17 AS, 1
Disulfidbrücke
[428]
33
pLRs
pLR
Rana pipiens
Anti-Gram+,
hämolytisch
18 AS, 1
Disulfidbrücke
Nicht lytisches
Histamin
freisetzendes Peptid
[429]
167
34
RVs
RV-23
Rana aurora
draytonii
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
23 AS
[430]
35
Hyline
Hylin a1
Hypsiboas
albopunctatus
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch,
18 AS, Helix
[431]
36
Parkerine
Parkerin
Nanorana
parkeri
Anti-Gram+ & Gram-
, Antioxidant, C.
albicans
20 AS, Helix
[432]
37
Caerulein Vorläufer
Fragmente (CPFs)
CPF-B1
Xenopus borealis
Anti-Gram+ & Gram-
, anti-MRSA, C.
albicans
28 AS
[433]
38
Shuchine
Shuchin 1
Rana shuchinae
Anti-Gram+ & Gram-
18 AS
[434]
39
Palustrine
Palustrin-2ISa
Odorrana
ishikawae
Anti-Gram+ & Gram-
, anti-MRSA, C.
albicans
29 AS
[435]
40
Papiliocine
Papiliocin
Papilio xuthus
Anti-Gram+ & Gram-
37 AS, Helix, Helix-
Scharnier-Helix-
Konformation
Bildet Poren (2.3-3.3
nm) in
Pilzmembranen,
induziert Apoptose
bei Hefen
[436]
41
Jindongenine
Jindongenin
Amolops
jingdongensis
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
24 AS
[437]
42
Undersonine
Undersonin-Y1
Odorrana
undersonii
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
18 AS, Helix
[438]
43
Odoranaine
Odoranain-F-
OW1
Odorrana
wuchuanensis
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
29 AS
[438]
44
Hejiangine
Hejiangin-A1
Odorrana
hejiangensis
Anti-Gram+ & Gram-
16 AS
[438]
45
Schmackerine
Schmackerin-C1
Odorrana
schmackeri
Anti-Gram+ & Gram-
17 AS
[438]
46
Peptid VRs
Peptid VR-23
Rana sakuraii
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
23 AS
[439]
47
Rugosine
Rugosin-RN1
Rana
Anti-Gram+ & Gram-
33 AS
[424]
168
nigrovittata
, hämolytisch
48
Hainanenine
Hainanenin 1
Amolops
hainanensis
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
21 AS
[440]
49
Hymenochirine
Hymenochirin
Hymenochirus
boettgeri
Anti-Gram+ & Gram-
29 AS
[441]
50
Jingdongine
Jingdongin-1
Amolops
jingdongensis
Anti-Gram+ & Gram-
17 AS
[442]
51
Ceratoxine
Ceratoxin
Ceratophrys
calcarata,
Anti-Gram+ & Gram-
63 AS,
Disulfidbrücke
[443]
52
UyCTs
UyCT3
Urodacus
yaschenkoi,
Opisthacanthus
cayaporum
Anti-Gram+ & Gram-
, anti-Biofilm, C.
albicans, C.
tropicalis, C.
neoformans
13 AS
[393]
53
Coleoptericine
Haxy_Col1
Harmonia
axyridis
Anti-Gram-
75 AS
[444]
54
Senegaline
Senegalin
Kassina
senegalensis
Anti-Gram+, C.
albicans
16 AS
[445]
55
Medusine
Medusin-PH
Agalychnis
callidryas
Anti-Gram+, C.
albicans
18 AS
[446]
56
XPFs
XPF-St4
Silurana
tropicalis
Anti-Gram+ & Gram-
, antiparasitisch,
hämolytisch, S.
cerevisiae
25 AS
[447]
57
PGLas
PGLa-St2
Silurana
tropicalis
Anti-Gram+ & Gram-
, antiparasitisch,
hämolytisch, S.
cerevisiae
22 AS
[447]
58
Pseudhymenochiri
ne
Pseudhymenochi
rin-1Pb
Pseudhymenochi
rus merlini
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch,
zytostatisch, C.
albicans
29 AS, Helix
[448]
169
59
Frenatins
Frenatin 2.1S
Sphaenorhynchu
s lacteus
Anti-Gram+ & Gram-
, zytostatisch, C.
albicans
16 AS
[449]
60
Balteatides
Balteatide
Phyllomedusa
balte
Anti-Gram-, C.
albicans
10 AS
[450]
61
Hylaranins
Hylaranin-L1
Hylarana
latouchii
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
18 AS
[451]
62
Hylains
Hylain 1
Hyla simplex
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
14 AS
[452]
63
Limnochariin
Limnochariin-1
Rana limnochari
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans, C.
parapsilosis,
10 AS, Phe-reich
[453]
64
Megin
Megin 1
Megophrys
minor
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch, C.
albicans
18 AS
[454]
65
Cruzioseptins (CZS)
cruzioseptin-1
Cruziohyla
calcarifer
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
21 AS
[455]
66
Undricins
Undricin B
Undrias
davidianus
Anti-Gram+ & Gram-
, A. niger, C.
albicans, S.
cerevisiae
10 AS
[456]
67
Distinctin-ähnliche-
Peptide
Distinctin-
Ähnliche-Peptid-
PH
Phyllomedusa
hypochondrialis
Anti-Gram-,
zytostatisch, C.
albicans
36 AS
[457]
68
Oxysterlins
Oxysterlin 1
Oxysternon
conspicillatum
Anti-Gram+ & Gram-
, C. parapsilopsis
39 AS, Helix
[458]
Wirbellose
1
Halocidins
Halocidin
Halocynthia
aurantium
Anti-Gram+ & Gram-
, anti-MRSA
18 AS
[459]
2
Arenicins
Arenicin-1
Arenicola marina
Anti-Gram+ & Gram-
21 AS;
amphipathisch,
Bildet Oligomere in
Membranen
[460]
170
Beta-Strang
3
Lumbricins
Lumbricin I
Lumbricus
rubellus
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans, C.
neoformans, S.
cerevisiae
62 AS
[461]
4
Perinerins
Perinerin
Perinereis
aibuhitensis
Anti-Gram+ & Gram-
51 AS
[462]
5
Neuropeptid-
ähnliche Proteine
NLP-31
Caenorhabditis
elegans
Anti-Gram+ & Gram-
53 AS
6
Scolopins
Scolopin 1
Scolopendra
subspinipes
mutilans
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
21 AS
[463]
7
Ap-AMPs
A. purpuratus
AMP
Argopecten
purpuratus
Anti-Gram+
47 AS
[463]
8
Antibacterial
Faktoren (ABFs)
ASABF-alpha
Ascaris suum
Anti-Gram+ & Gram-
75 AS,
Disulfidbrücke
[464]
9
Mytimacins
Mytimacin-AF
Achatina fulica
Anti-Gram+ & Gram-
80 AS
[465]
10
Myticusins
Myticusin-1
Mytilus coruscus
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans, M.
albicans
104 AS,
Disulfidbrücke
[466]
11
Scolopendrasins
Scolopendrasin II
Scolopendra
subspinipes
mutilans
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
21 AS
[467]
12
Cms
Cm-p1
Cenchritis
muricatus
C. albicans.
10 AS, Helix
[468]
13
MMGPs
MMGP1
marine
metagenome
C. albicans, A. niger
36 AS, Helix
C-terminale Domäne
bindet Chitin
[469]
14
MytiChitins
MytiChitin-A
Mytilus coruscus
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
55 AS,
Disulfidbrücke
[470]
15
Treichoplaxins
Treichoplaxin
Treichoplax
adhaerens
Anti-Gram+ & Gram-
, anti-MRSA, C.
albicans, C.
22 AS, Helix
[471]
171
parasilosis
16
Scolopendins
Scolopendin 2
Scolopendra
subspinipes
mutilans
Anti-Gram+ & Gram-
, anti-MRSA, C.
albicans, C.
parapsilosis, T.
beigelii, T. rubrum
16 AS, Helix
Membranaktiv
[472]
17
Beta-thymosins
cgTBeta
Crassostrea
gigas
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
40 AS
[473]
18
Centrocins
EeCentrocin 1
Echinus
esculentus
Anti-Gram+ & Gram-
30 AS, besteht aus
Kette A und B
[474]
19
Cremycins
Cremycin-5
Caenorhabditis
remanei
41 AS
[475]
20
Japonicins
Japonicin-2LF
Limnonectes
fujianensis
Anti-Gram+ & Gram-
, anti-MRSA, anti-
Biofilm, C. albicans
20 AS, Helix, 95.2%
Ähnlichkeit mit
Japonicin-2OM1
Permeabilisiert
Membranen
[476]
Säugetiere
1
α-Defensine
HNP-1, HPN-2,
HPN-3
Homo sapiens
C. albicans; C.
neoformans
3kDa bis 5 kDa
Bilden
spannungsabhängige
Ionenkanäle
[477]
2
β-Defensine
tracheal
antiMIC90robial
Peptid (TAP)
Homo sapiens
C. albicans
Cys-reich; 3kDa bis 5
kDa
Bilden
spannungsabhängige
Ionenkanäle
[478]
3
Bactericidal/perme
ability-increasing
protein (BPI)
C. neoformans, F.
solani, C. krusei
55 kDa, basisch,
tubuläres Lipid
bindendes Protein
(TULIP); kationisch
Neutralisiert
endotoxische
Aktivität von
Lipopolysacchariden
[479]
4
Lactoferricins
Lactoferricin B
C. albicans
24 AS, 17. AS bis 41
AS von Lactoferrin
[480]
5
Histatins
menschliches
Histatin 5
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral, anti-HIV,
anti-MRSA, Enzym
Inhibitor, C.
24 AS, Helix;
Proteolytisches
Produkt aus Histatin
3
Zink bindendes
Protein
[481]
172
albicans; S. aureus,
P. aeruginosa, A.
baumannii, E.
cloacae, E. faecium
6
Cathelicidine
Tritrpticin;
K9CATH
Sus scrofa;
dog
Anti-Gram+ & Gram-
C. albicans
38 AS; Helix,
Sequenz homolog zu
LL-37
[482]
7
Hepcidin
Menschliche
Leber
exprimiertes
antimikrobielles
Peptid 1 (LEAP-1)
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, S. cerevisiae
84 AS, 4
Disulfidbrücken; 2
antiparallele Beta
Stränge
Involviert in
Eisenaufnahme und
vererbte
Hämochromatose
[483]
8
Seminalplasmine
Seminalplasmin
Bubalus bubalis
Anti-Gram+ & Gram-
, hämolytisch
81 AS
Bindet in der
Anwesenheit von
Calcium an
Calmodulin, Inhibiert
Peptidoglykan-
synthese in E. coli
[484]
9
Saposin-ähnliche
Proteine
Schweine NK-
Lysin
Sus scrofa
Anti-Gram+ & Gram-
, Antiparasitisch,
antimalarial,
zytostatisch; E. coli,
B. megaterium
78 AS; Helix
[485]
10
Dermcidine
Dermcidin-1
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
110 AS, Helix
Proteolytische
Aktivität (C-terminus
von Arg, Lys)
[486]
11
Alpha-
melanozyten-
stimulierende
Hormone (MSH)
Alpha-MSH
Homo sapiens
Anti-Gram+,
antiviral, anti-HIV, C.
albicans
13 AS
[487]
12
Human MUC7
20-Mer
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans, C.
20 AS, Helix, aus der
C-terminalen Region
[488]
173
glabrata, C. krusei,
C. neoformans, S.
cerevisiae
(32. AS-51. AS) von
MUC7 Domäne 1
13
Calcitermine
Human
Calcitermin
Homo sapiens
Anti-Gram-, C.
albicans
15 AS, Helix
[489]
14
Theta-defensine
(RTD)
Rhesus theta-
defensin 2
Macaca mulatta
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral, anti-HIV
18 AS; zirkulär
[490]
15
Drosomycin-
ähnliche Defensine
Human
drosomycin-
ähnliche
defensin
Homo sapiens
Aspergillus spp., F.
solani, F. oxysporum,
R. oryzae
43 AS,
Disulfidbrücke
[491]
16
Catestatine
Catestatin
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, Antioxidant
21 AS
Kann
Mastzelleinwanderun
g und Produktion von
Zytokinen und
Chemokinen
induzieren,
Antioxidant
[492]
17
Cateslytine
Cateslytin
Homo sapiens
C. albicans
15 AS, 57.1%
Ähnlichkeit zu
Catestatin
[493]
18
SP-Bs
SP-B
Schwein
21 AS, Pro-reich
[494]
19
Granulysine
Human
granulysin
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, antiparasitisch,
zytostatisch; C.
neoformans, C.
albicans
74 AS, Helix
[495]
20
Kinocidine
CXCL14
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
77 AS
Aktivität
salzempfindlich
[496]
21
NeuroPeptide
Substance P
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
11 AS, Helix
[497]
22
Elastase-
Elafin
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
57 AS
[498]
174
spezifischer
Inhibitor (Elafins)
, antiviral,
antiparasitisch, anti-
HIV, Enzym Inhibitor,
antimalarial
23
Beta-Amyloid
Peptids
Beta-Amyloid
Peptid
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral
40 AS, Helix
[499]
24
Glyceraldehyd-3-
phosphat
Dehydrogenase
Fragment
hGAPDH (2-32)
Homo sapiens
C. albicans
31 AS
Internalisiert in
Hefezellen, induziert
Apoptose
[499]
25
RNasen
Human RNase 5
Homo sapiens
Anti-Gram+
125 AS, Helix und
Beta Strang, N-
terminus
Pyroglutamat
Durch 50 mM NaCl
nicht beeinflusst
[500]
26
Makrophagen
Entzündungs-
Proteine
CCL20
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, antiparasitisch,
anti-Biofilm, C.
albicans
69 AS, Helix und
Beta Strang
Aktivität ist
salzabhängig.
[501]
27
IFN-induzierbare
Proteine
CXCL10
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, antiparasitisch, C.
albicans
77 AS, Helix und
Beta Strang
Interaktion mit
bakteriellem FtsE/X
Komplex,
Membranzerstörung
durch C-terminale
Helix, rekrutiert NK
Zellen durch GPCR
[501]
28
Angiogenine
Mouse Ang1
Mus musculus
Anti-Gram+
121 AS, Helix und
Beta Strang
[500]
29
Inhibitoren der
sekretorischen
Leukozytenproteas
e
SLPI
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral, anti-HIV,
Enzym Inhibitor, A.
fumigatus, C.
albicans
107 AS, Beta Strang
Aktivität in N-
terminaler Region,
Membranlyse, C-
terminale Region
sorgt für Inhibierung
[502]
175
30
CCLs
CCL28
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, antiparasitisch, C.
albicans
127 AS, Helix und
Beta Strang, C-
terminale 28- AS des
humanen CCL28
[503]
31
Retinsäure-
Rezeptor-
Responder-
Proteine
Chemerin
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
137 AS
Val(66) -Pro(85) für
antimikrobielle
Aktivität, Lyse von
Bakterien
[504]
32
Nukleosomale
Bindungsdomänen
mit hoher
Mobilität
HMGN2
Homo sapiens
Anti-Gram-,
antiviral, C. albicans
89 AS
[505]
33
Lectin-bindende
Enzymes
Lysozyme
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
130 AS, Helix und
Beta Strang
[506]
34
Vasostatine
Vasostatin-I,
Chromogranin A
Bos taurus
Anti-Gram+, N.
crassa, A. fumigatus,
A. brassicola, N.
haematococca, F.
culmorum, F.
oxysporum, T.
mentagrophytes, S.
cerevisiae, C.
albicans
76 AS, Helix, N-
terminales Fragment
von Chromogranin
A, 1 Disulfidbrücke
[507]
35
Trypsin Inhibitoren
Rind
pankreatischer
Trypsin Inhibitor
(BPTI)
Bos taurus
Enzym Inhibitor, C.
albicans, S.
cerevisiae
58 AS, Helix und
Beta Strang
Inhibiert
Calciumaufnahme
[508]
36
SRTAPs
SRTAP-40
Ovis aries
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
40 AS
[509]
37
Thymus-Stroma-
Lymphopoetin
sfTSLP
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
63 AS
[510]
38
His-reiche Peptide
GHH20
Homo sapiens
C. parapsilosis, C.
21 AS
Zerstört Liposomen
[511]
176
albicans
ähnlich dem
Holoprotein HRG, in
Aktivität, Bindung
und
Membranpermeabili-
sation
39
Menschliche alpha-
synukleine
Human alpha-
synuclein
Homo sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans, C.
tropicalis, F.
neoformans, A.
flavus, A. fumigatus,
A. parasiticus, R.
solani, T. harzianum
140 AS, Helix, AS 1-
60 sind aktiv, AS 1-
95 stärker aktiv
Greift Membranen an
[512]
40
Hämoglobin Reste
Hb 98–114
Rhipicephalus
(Boophilus)
MIC90roplus
C. albicans, C.
parapsilosis, C.
tropicalis, C.
neoformans, S.
cerevisiae, A. niger,
A. flavus, A.
fumigatus
17 AS, Helix, 50%
Ähnlichkeit zu
Alyteserin-2
[513]
Fische
1
Pleurocidine
Pleurocidin
Pleuronectes
americanus
68 AS, Helix
[514]
2
Piscidine
Piscidin 1
Morone saxatilis
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral, anti-HIV,
anti-MRSA,
hämolytisch,
zytostatisch;
22 AS; Helix
Positive Ladung und
flexible Konformation
wichtig für
Membranpenetration
, bindet an
Metallionen (Cu2+)
[515]
3
Piscidin-ähnliche
Peptide
OreochroMIC90in
s (Oreoch-1)
Oreochromis
niloticus
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
23 AS
[516]
4
Misgurine
Misgurin
Misgurnus
Anti-Gram+ & Gram-
21 AS; Helix
[517]
177
anguillicaudatus
5
NRCs
NRC-01
Pleuronectes
americanus
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
24 AS, Gly-reich
[518]
6
Epinecidine
Epinecidin-1
Epinephelus
coioides
Anti-Gram+ & Gram-
, antiviral, anti-
MRSA, zytostatisch
21 AS
[519]
7
Myxinidine
Myxinidin
Myxine glutinosa
L
Anti-Gram+ & Gram-
, anti-Biofilm, C.
albicans
12 AS, Helix
Nicht Salzsensitiv,
0,3M NaCl
[520]
8
Pelteobagrine
Pelteobagrin
Pelteobagrus
fulvidraco
Reichardson
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans
20 AS, 2,24 kDa
relativ Salzinsensitiv
(137 mM NaCl), wirkt
an bakteriellen
Membranen
[521]
9
Moronecidine
sb-Moronecidin
Morone saxatilis
Anti-Gram+ & Gram-
23 AS, Helix, wie
Piscidin 1, nur
zusätzliches Thr and
C-terminus
[522]
10
Moronecidin-
ähnliche Peptide
moroNC-NH2
Notothenia
coriiceps
Anti-Gram+ & Gram-
, C. tropicalis
22 AS, 47.8%
Ähnlichkeit mit
Chionodracine
[523]
11
Acipensine
Acipensin 1
Acipenser
gueldenstaedtii
Anti-Gram+ & Gram-
, anti-MRSA, C.
albicans
50 AS, 96.1%
Ähnlichkeit mit
Hipposin
[524]
Mehrere Reiche
1
Chitinasen
Pflanzen,
Bakterien, Pilze
[293]
2
Chitin bindende
Proteine
Pflanzen,
Bakterien,
Insekten,
Crustacea
[293]
3
Defensine
Säugetiere, Pilze,
[293]
178
Insekten,
Pflanzen
4
Cyclophiline
[37]
5
RIPs
Pilze, Pflanzen
[37]
6
LTPs
Säugetiere, Pilze,
Bakterien,
Pflanzen
8,7 kDa, 90 AS, 4
Disulfidbrücken,
zentraler
hydrophober
Hohlraum
Transferiert
Phospholipide
zwischen
Membranen; nach
Einbau in Membran
formt der
hydrophobe
Hohlraum eine Pore,
führt zum Ausfluss
von Ionen
[37]
7
Buforine
Buforin I
Bufo bufo
gargarizans,
Asia; Also in:
Homo sapiens;
Bos taurus; Sus
scrofa
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans, C.
neoformans, S.
cerevisiae
[525]
8
Histone
Parasin
Parasilurus
asotus
Oncorhynchus
mykiss, Fisch,
Tiere
A. salmonicida, C.
aquatilis, Y. ruckeri,
E. ictaluri, L.
garvieae
19 AS; Helix; N-
terminales Fragment
von Histon H2A
N-terminales Lys
wichtig für
Membranbindung
[526]
9
Hepcidine
Mensch, Fische,
Sparus aurata L.;
Acanthopagrus
schlegelii
Anti-Gram+ & Gram-
20 AS
[527]
10
Neuropeptide
Urechistachykini
n I
Urechis
unicinctus, homo
sapiens
Anti-Gram+ & Gram-
, C. albicans, T.
beigelii, M. furfur
10 AS
Membranzerstörung
[528]
179
11
Defensin-ähnliche
Toxine
Crotamine
Crotalus durissus
terrificus
Anti-Gram+ & Gram-
, antiparasitisch,
hämolytisch,
zytostatisch
42 AS, Helix und
Beta Strang, 3
Disulfidbrücken
Attackiert Lysosomen
und zerstört Zellen
[529]
12
GAPDH verwandt
SJGAP
Mensch, Fische,
Katsuwonus
pelamis
[530]
180
9. Referenzen:
1. Waghu FH, Barai RS, Gurung P, Idicula-Thomas S. CAMPR3: a database on sequences,
structures and signatures of antimicrobial peptides. Nucleic Acids Res. 2016;44(D1):D1094-
7. Epub 2015/10/13. doi: 10.1093/nar/gkv1051. PubMed PMID: 26467475; PubMed Central
PMCID: PMCPMC4702787.
2. Watkinson S, Boddy L, Money N. The fungi 3rd edition. 3rd ed: Academic Press; 2015. 466
p.
3. Esser K. Kryptogamen 1: Cyanobakterien Algen Pilze Flechten Praktikum und Lehrbuch:
Springer-Verlag; 2013.
4. Sterflinger K, Tesei D, Zakharova K. Fungi in hot and cold deserts with particular reference
to microcolonial fungi. Fungal ecology. 2012;5(4):453-62.
5. Schmidt S, Naff C, Lynch R. Fungal communities at the edge: ecological lessons from high
alpine fungi. Fungal Ecology. 2012;5(4):443-52.
6. Tojo M, Newsham KK. Snow moulds in polar environments. Fungal Ecology. 2012;5(4):395-
402.
7. Monastersky R. Ancient fungi found in deep-sea mud. Nature. 2012;492(7428):163. doi:
10.1038/492163a. PubMed PMID: 23235852.
8. Zakharova K, Marzban G, de Vera JP, Lorek A, Sterflinger K. Protein patterns of black fungi
under simulated Mars-like conditions. Sci Rep. 2014;4:5114. Epub 2014/05/29. doi:
10.1038/srep05114. PubMed PMID: 24870977; PubMed Central PMCID: PMCPMC4037706.
9. Newsham KK, Boddy L. Fungi in extreme environments. Fungal Ecology. 2012;5(4):379-479.
10. Checinska Sielaff A, Urbaniak C, Mohan GBM, Stepanov VG, Tran Q, Wood JM, et al.
Characterization of the total and viable bacterial and fungal communities associated with
the International Space Station surfaces. Microbiome. 2019;7(1):50. Epub 2019/04/08. doi:
10.1186/s40168-019-0666-x. PubMed PMID: 30955503; PubMed Central PMCID:
PMCPMC6452512.
11. Khosravi C, Benocci T, Battaglia E, Benoit I, de Vries RP. Sugar catabolism in Aspergillus and
other fungi related to the utilization of plant biomass. Adv Appl Microbiol. 2015;90:1-28.
Epub 2014/11/12. doi: 10.1016/bs.aambs.2014.09.005. PubMed PMID: 25596028.
12. Andersen SJ. Compositional Changes in Surface Mycoflora During Ripening of Naturally
Fermented Sausages. J Food Prot. 1995;58(4):426-9. doi: 10.4315/0362-028X-58.4.426.
PubMed PMID: 31137352.
13. Hymery N, Vasseur V, Coton M, Mounier J, Jany JL, Barbier G, et al. Filamentous fungi and
mycotoxins in cheese: a review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety.
2014;13(4):437-56.
14. Alberti F, Foster GD, Bailey AM. Natural products from filamentous fungi and production by
heterologous expression. Appl Microbiol Biotechnol. 2017;101(2):493-500. Epub
2016/12/13. doi: 10.1007/s00253-016-8034-2. PubMed PMID: 27966047; PubMed Central
PMCID: PMCPMC5219032.
15. Dufossé L, Fouillaud M, Caro Y, Mapari SA, Sutthiwong N. Filamentous fungi are large-scale
producers of pigments and colorants for the food industry. Curr Opin Biotechnol.
2014;26:56-61. Epub 2013/10/22. doi: 10.1016/j.copbio.2013.09.007. PubMed PMID:
24679259.
181
16. Punt PJ, van Biezen N, Conesa A, Albers A, Mangnus J, van den Hondel C. Filamentous fungi
as cell factories for heterologous protein production. Trends Biotechnol. 2002;20(5):200-6.
PubMed PMID: 11943375.
17. Mascarin GM, Jaronski ST. The production and uses of Beauveria bassiana as a microbial
insecticide. World J Microbiol Biotechnol. 2016;32(11):177. Epub 2016/09/15. doi:
10.1007/s11274-016-2131-3. PubMed PMID: 27628337.
18. Meyer V, Andersen MR, Brakhage AA, Braus GH, Caddick MX, Cairns TC, et al. Current
challenges of research on filamentous fungi in relation to human welfare and a sustainable
bio-economy: a white paper. Fungal Biol Biotechnol. 2016;3:6. Epub 2016/08/31. doi:
10.1186/s40694-016-0024-8. PubMed PMID: 28955465; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5611618.
19. Almeida F, Rodrigues ML, Coelho C. The Still Underestimated Problem of Fungal Diseases
Worldwide. Front Microbiol. 2019;10:214. Epub 2019/02/12. doi:
10.3389/fmicb.2019.00214. PubMed PMID: 30809213; PubMed Central PMCID:
PMCPMC6379264.
20. Hawksworth DL, Lücking R. Fungal Diversity Revisited: 2.2 to 3.8 Million Species. Microbiol
Spectr. 2017;5(4). doi: 10.1128/microbiolspec.FUNK-0052-2016. PubMed PMID: 28752818.
21. Berbee ML. The phylogeny of plant and animal pathogens in the Ascomycota. Physiological
and Molecular Plant Pathology. 2001;59(4):165-87.
22. Boddy L. Pathogens of Autotrophs. The Fungi: Elsevier; 2016. p. 245-92.
23. Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D, Gurr SJ. Worldwide emergence of resistance to
antifungal drugs challenges human health and food security. Science. 2018;360(6390):739-
42. doi: 10.1126/science.aap7999. PubMed PMID: 29773744.
24. Fisher MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL, et al. Emerging fungal
threats to animal, plant and ecosystem health. Nature. 2012;484(7393):186-94. Epub
2012/04/11. doi: 10.1038/nature10947. PubMed PMID: 22498624; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3821985.
25. Perfect JR. The antifungal pipeline: a reality check. Nat Rev Drug Discov. 2017;16(9):603-16.
Epub 2017/05/12. doi: 10.1038/nrd.2017.46. PubMed PMID: 28496146; PubMed Central
PMCID: PMCPMC5760994.
26. Richardson MD, Cole DC. Special Issue "Fungal Burden in Different Countries". J Fungi
(Basel). 2018;4(3). Epub 2018/07/03. doi: 10.3390/jof4030080. PubMed PMID: 29970860;
PubMed Central PMCID: PMCPMC6162550.
27. Brown GD, Denning DW, Gow NA, Levitz SM, Netea MG, White TC. Hidden killers: human
fungal infections. Sci Transl Med. 2012;4(165):165rv13. doi: 10.1126/scitranslmed.3004404.
PubMed PMID: 23253612.
28. Fisher MC, Gow NA, Gurr SJ. Tackling emerging fungal threats to animal health, food
security and ecosystem resilience. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2016;371(1709). doi:
10.1098/rstb.2016.0332. PubMed PMID: 28080997; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5095550.
29. Havlickova B, Czaika VA, Friedrich M. Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.
Mycoses. 2008;51 Suppl 4:2-15. doi: 10.1111/j.1439-0507.2008.01606.x. PubMed PMID:
18783559.
182
30. Zukiewicz-Sobczak WA. The role of fungi in allergic diseases. Postepy Dermatol Alergol.
2013;30(1):42-5. Epub 2013/02/20. doi: 10.5114/pdia.2013.33377. PubMed PMID:
24278044; PubMed Central PMCID: PMCPMC3834689.
31. Pitt JI, Basílico JC, Abarca ML, López C. Mycotoxins and toxigenic fungi. Med Mycol. 2000;38
Suppl 1:41-6. PubMed PMID: 11204163.
32. Pitt JI, Miller JD. A Concise History of Mycotoxin Research. J Agric Food Chem.
2017;65(33):7021-33. Epub 2016/12/27. doi: 10.1021/acs.jafc.6b04494. PubMed PMID:
27960261.
33. Kathiravan MK, Salake AB, Chothe AS, Dudhe PB, Watode RP, Mukta MS, et al. The biology
and chemistry of antifungal agents: a review. Bioorg Med Chem. 2012;20(19):5678-98.
Epub 2012/05/09. doi: 10.1016/j.bmc.2012.04.045. PubMed PMID: 22902032.
34. Nicola AM, Albuquerque P, Paes HC, Fernandes L, Costa FF, Kioshima ES, et al. Antifungal
drugs: New insights in research & development. Pharmacol Ther. 2019;195:21-38. Epub
2018/10/19. doi: 10.1016/j.pharmthera.2018.10.008. PubMed PMID: 30347212.
35. Matejuk A, Leng Q, Begum MD, Woodle MC, Scaria P, Chou ST, et al. Peptide-based
Antifungal Therapies against Emerging Infections. Drugs Future. 2010;35(3):197. PubMed
PMID: 20495663; PubMed Central PMCID: PMCPMC2873032.
36. De Lucca AJ, Walsh TJ. Antifungal peptides: novel therapeutic compounds against emerging
pathogens. Antimicrob Agents Chemother. 1999;43(1):1-11. PubMed PMID: 9869556;
PubMed Central PMCID: PMCPMC89011.
37. De Luca AJ, Walsh TJ. Antifungal peptides: Origin, activity, and therapeutic potential. Rev
Iberoam Micol. 2000;17(4):116-20. PubMed PMID: 15762805.
38. Gaglione R, Pirone L, Farina B, Fusco S, Smaldone G, Aulitto M, et al. Insights into the
anticancer properties of the first antimicrobial peptide from Archaea. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 2017;1861(9):2155-64.
39. Tossi A, Tarantino C, Romeo D. Design of synthetic antimicrobial peptides based on
sequence analogy and amphipathicity. Eur J Biochem. 1997;250(2):549-58. doi:
10.1111/j.1432-1033.1997.0549a.x. PubMed PMID: 9428709.
40. He J, Eckert R, Pharm T, Simanian MD, Hu C, Yarbrough DK, et al. Novel synthetic
antimicrobial peptides against Streptococcus mutans. Antimicrob Agents Chemother.
2007;51(4):1351-8. Epub 2007/02/12. doi: 10.1128/AAC.01270-06. PubMed PMID:
17296741; PubMed Central PMCID: PMCPMC1855471.
41. Wang G, Li X, Wang Z. APD3: the antimicrobial peptide database as a tool for research and
education. Nucleic Acids Res. 2016;44(D1):D1087-93. Epub 2015/11/23. doi:
10.1093/nar/gkv1278. PubMed PMID: 26602694; PubMed Central PMCID:
PMCPMC4702905.
42. Hammami R, Ben Hamida J, Vergoten G, Fliss I. PhytAMP: a database dedicated to
antimicrobial plant peptides. Nucleic Acids Res. 2009;37(Database issue):D963-8. Epub
2008/10/04. doi: 10.1093/nar/gkn655. PubMed PMID: 18836196; PubMed Central PMCID:
PMCPMC2686510.
43. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 2002;415(6870):389-
95. doi: 10.1038/415389a. PubMed PMID: 11807545.
44. Meneguetti BT, Machado LD, Oshiro KG, Nogueira ML, Carvalho CM, Franco OL.
Antimicrobial Peptides from Fruits and Their Potential Use as Biotechnological Tools-A
183
Review and Outlook. Front Microbiol. 2016;7:2136. Epub 2017/01/10. doi:
10.3389/fmicb.2016.02136. PubMed PMID: 28119671; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5223440.
45. Tavares LS, Santos MeO, Viccini LF, Moreira JS, Miller RN, Franco OL. Biotechnological
potential of antimicrobial peptides from flowers. Peptides. 2008;29(10):1842-51. Epub
2008/06/18. doi: 10.1016/j.peptides.2008.06.003. PubMed PMID: 18602431.
46. Das K, Datta K, Karmakar S, Datta SK. Antimicrobial Peptides - Small but Mighty Weapons
for Plants in the War against Phytopathogens. Protein Pept Lett. 2019. Epub 2019/06/19.
doi: 10.2174/0929866526666190619112438. PubMed PMID: 31215363.
47. Zasloff M. Antimicrobial peptides in health and disease. N Engl J Med. 2002;347(15):1199-
200. doi: 10.1056/NEJMe020106. PubMed PMID: 12374882.
48. De Smet K, Contreras R. Human antimicrobial peptides: defensins, cathelicidins and
histatins. Biotechnol Lett. 2005;27(18):1337-47. doi: 10.1007/s10529-005-0936-5. PubMed
PMID: 16215847.
49. Eisenbeiß DE. Untersuchungen zur Bedeutung des antimikrobiellen Peptids" Psoriasin" im
Serum von Psoriasispatienten: Christian-Albrechts Universität Kiel; 2011.
50. Epand RM, Vogel HJ. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action.
Biochim Biophys Acta. 1999;1462(1-2):11-28. doi: 10.1016/s0005-2736(99)00198-4.
PubMed PMID: 10590300.
51. Oren Z, Shai Y. Mode of action of linear amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides.
Biopolymers. 1998;47(6):451-63. doi: 10.1002/(SICI)1097-0282(1998)47:6<451::AID-
BIP4>3.0.CO;2-F. PubMed PMID: 10333737.
52. Pfalzgraff A, Brandenburg K, Weindl G. Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic
Potential for Bacterial Skin Infections and Wounds. Front Pharmacol. 2018;9:281. Epub
2018/03/28. doi: 10.3389/fphar.2018.00281. PubMed PMID: 29643807; PubMed Central
PMCID: PMCPMC5882822.
53. Galgóczy L, Marx F. Do Antimicrobial Proteins Contribute to Overcoming the Hidden
Antifungal Crisis at the Dawn of a Post-Antibiotic Era? Microorganisms. 2019;7(1). Epub
2019/01/11. doi: 10.3390/microorganisms7010016. PubMed PMID: 30641886; PubMed
Central PMCID: PMCPMC6352135.
54. Arranz-Trullén J, Lu L, Pulido D, Bhakta S, Boix E. Host antimicrobial peptides: The promise
of new treatment strategies against tuberculosis. Frontiers in immunology. 2017;8:1499.
55. Boelter JF, Brandelli A. Innovative bionanocomposite films of edible proteins containing
liposome-encapsulated nisin and halloysite nanoclay. Colloids Surf B Biointerfaces.
2016;145:740-7. Epub 2016/05/28. doi: 10.1016/j.colsurfb.2016.05.080. PubMed PMID:
27289315.
56. Cleveland J, Montville TJ, Nes IF, Chikindas ML. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for
food preservation. Int J Food Microbiol. 2001;71(1):1-20. doi: 10.1016/s0168-
1605(01)00560-8. PubMed PMID: 11764886.
57. Brogden KA. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat
Rev Microbiol. 2005;3(3):238-50. doi: 10.1038/nrmicro1098. PubMed PMID: 15703760.
58. Fatima S. Antimicrobial Peptides – an alternate for drug resistance. Technology Times.
2019.
59. Matsuzaki K. Antimicrobial Peptides: Springer; 2015.
184
60. Moyne AL, Shelby R, Cleveland TE, Tuzun S. Bacillomycin D: an iturin with antifungal activity
against Aspergillus flavus. J Appl Microbiol. 2001;90(4):622-9. PubMed PMID: 11309075.
61. Cools TL, Struyfs C, Cammue BP, Thevissen K. Antifungal plant defensins: increased insight
in their mode of action as a basis for their use to combat fungal infections. Future
Microbiol. 2017;12:441-54. Epub 2017/03/24. doi: 10.2217/fmb-2016-0181. PubMed PMID:
28339295.
62. Wu Q, Patočka J, Kuča K. Insect Antimicrobial Peptides, a Mini Review. Toxins (Basel).
2018;10(11). Epub 2018/11/08. doi: 10.3390/toxins10110461. PubMed PMID: 30413046;
PubMed Central PMCID: PMCPMC6267271.
63. Grogan LF, Robert J, Berger L, Skerratt LF, Scheele BC, Castley JG, et al. Review of the
Amphibian Immune Response to Chytridiomycosis, and Future Directions. Front Immunol.
2018;9:2536. Epub 2018/11/09. doi: 10.3389/fimmu.2018.02536. PubMed PMID:
30473694; PubMed Central PMCID: PMCPMC6237969.
64. Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway CA. A human homologue of the Drosophila Toll
protein signals activation of adaptive immunity. Nature. 1997;388(6640):394-7. doi:
10.1038/41131. PubMed PMID: 9237759.
65. Palm NW, Medzhitov R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity.
Immunol Rev. 2009;227(1):221-33. doi: 10.1111/j.1600-065X.2008.00731.x. PubMed PMID:
19120487.
66. Li Z, Lu G, Meng G. Pathogenic Fungal Infection in the Lung. Front Immunol. 2019;10:1524.
Epub 2019/07/03. doi: 10.3389/fimmu.2019.01524. PubMed PMID: 31333658; PubMed
Central PMCID: PMCPMC6616198.
67. Riera Romo M, Pérez-Martínez D, Castillo Ferrer C. Innate immunity in vertebrates: an
overview. Immunology. 2016;148(2):125-39. Epub 2016/04/05. doi: 10.1111/imm.12597.
PubMed PMID: 26878338; PubMed Central PMCID: PMCPMC4863567.
68. Paege N, Jung S, Schäpe P, Müller-Hagen D, Ouedraogo JP, Heiderich C, et al. A
Transcriptome Meta-Analysis Proposes Novel Biological Roles for the Antifungal Protein
AnAFP in Aspergillus niger. PLoS One. 2016;11(11):e0165755. Epub 2016/11/11. doi:
10.1371/journal.pone.0165755. PubMed PMID: 27835655; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5106034.
69. Meyer V. A small protein that fights fungi: AFP as a new promising antifungal agent of
biotechnological value. Appl Microbiol Biotechnol. 2008;78(1):17-28. Epub 2007/12/11. doi:
10.1007/s00253-007-1291-3. PubMed PMID: 18066545.
70. Olson B, Goerner GL. Alpha sarcin, a new antitumor agent: I. Isolation, purification,
chemical composition, and the identity of a new amino acid. Appl Environ Microbiol.
1965;13(3):314-21.
71. Olson B, Jennings J, Roga V, Junek A, Schuurmans D. Alpha sarcin, a new antitumor agent: II.
Fermentation and antitumor spectrum. Appl Environ Microbiol. 1965;13(3):322-6.
72. Kaiserer L, Oberparleiter C, Weiler-Görz R, Burgstaller W, Leiter E, Marx F. Characterization
of the Penicillium chrysogenum antifungal protein PAF. Archives of microbiology.
2003;180(3):204-10.
73. Gun Lee D, Shin SY, Maeng CY, Jin ZZ, Kim KL, Hahm KS. Isolation and characterization of a
novel antifungal peptide from Aspergillus niger. Biochem Biophys Res Commun.
1999;263(3):646-51. doi: 10.1006/bbrc.1999.1428. PubMed PMID: 10512732.
185
74. Kovács L, Virágh M, Takó M, Papp T, Vágvölgyi C, Galgóczy L. Isolation and characterization
of Neosartorya fischeri antifungal protein (NFAP). Peptides. 2011;32(8):1724-31. Epub
2011/06/30. doi: 10.1016/j.peptides.2011.06.022. PubMed PMID: 21741420.
75. Yount NY, Yeaman MR. Structural congruence among membrane-active host defense
polypeptides of diverse phylogeny. Biochim Biophys Acta. 2006;1758(9):1373-86. Epub
2006/04/19. doi: 10.1016/j.bbamem.2006.03.027. PubMed PMID: 16725105.
76. Yount NY, Yeaman MR. Multidimensional signatures in antimicrobial peptides. Proc Natl
Acad Sci U S A. 2004;101(19):7363-8. Epub 2004/04/26. doi: 10.1073/pnas.0401567101.
PubMed PMID: 15118082; PubMed Central PMCID: PMCPMC409924.
77. Boratyn GM, Camacho C, Cooper PS, Coulouris G, Fong A, Ma N, et al. BLAST: a more
efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Res. 2013;41(Web Server
issue):W29-33. Epub 2013/04/22. doi: 10.1093/nar/gkt282. PubMed PMID: 23609542;
PubMed Central PMCID: PMCPMC3692093.
78. Wnendt S, Ulbrich N, Stahl U. Molecular cloning, sequence analysis and expression of the
gene encoding an antifungal-protein from Aspergillus giganteus. Curr Genet.
1994;25(6):519-23. doi: 10.1007/bf00351672. PubMed PMID: 8082203.
79. Campos-Olivas R, Bruix M, Santoro J, Lacadena J, Martinez del Pozo A, Gavilanes JG, et al.
NMR solution structure of the antifungal protein from Aspergillus giganteus: evidence for
cysteine pairing isomerism. Biochemistry. 1995;34(9):3009-21. doi: 10.1021/bi00009a032.
PubMed PMID: 7893713.
80. Schrodinger L. The PyMOL molecular graphics system. Version. 2010;1(5):0.
81. Lacadena J, Martínez del Pozo A, Gasset M, Patiño B, Campos-Olivas R, Vázquez C, et al.
Characterization of the antifungal protein secreted by the mould Aspergillus giganteus.
Arch Biochem Biophys. 1995;324(2):273-81. doi: 10.1006/abbi.1995.0040. PubMed PMID:
8554319.
82. Theis T, Wedde M, Meyer V, Stahl U. The antifungal protein from Aspergillus giganteus
causes membrane permeabilization. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47(2):588-93.
Epub 2003/01/25. doi: 10.1128/aac.47.2.588-593.2003. PubMed PMID: 12543664; PubMed
Central PMCID: PMCPMC151754.
83. Martínez-Ruiz A, Martínez del Pozo A, Lacadena J, Mancheño JM, Oñaderra M, Gavilanes
JG. Characterization of a natural larger form of the antifungal protein (AFP) from Aspergillus
giganteus. Biochim Biophys Acta. 1997;1340(1):81-7. doi: 10.1016/s0167-4838(97)00038-1.
PubMed PMID: 9217017.
84. López-García B, Moreno AB, San Segundo B, De los Ríos V, Manning JM, Gavilanes JG, et al.
Production of the biotechnologically relevant AFP from Aspergillus giganteus in the yeast
Pichia pastoris. Protein Expr Purif. 2010;70(2):206-10. Epub 2009/11/05. doi:
10.1016/j.pep.2009.11.002. PubMed PMID: 19896535.
85. Barakat H, Spielvogel A, Hassan M, El-Desouky A, El-Mansy H, Rath F, et al. The antifungal
protein AFP from Aspergillus giganteus prevents secondary growth of different Fusarium
species on barley. Appl Microbiol Biotechnol. 2010;87(2):617-24. Epub 2010/03/10. doi:
10.1007/s00253-010-2508-4. PubMed PMID: 20217075.
86. Meyer V. Transcriptional regulation of the afp gene encoding the Antifungal Protein of
Aspergillus giganteus: TU Berlin; 2001.
186
87. Rogozhin E, Ryazantsev D, Smirnov A, Zavriev S. Primary Structure Analysis of Antifungal
Peptides from Cultivated and Wild Cereals. Plants (Basel). 2018;7(3). Epub 2018/09/12. doi:
10.3390/plants7030074. PubMed PMID: 30213105; PubMed Central PMCID:
PMCPMC6160967.
88. Theis T. Target site and mode of action of the Antifungal Protein from Aspergillus giganteus.
Berlin: TU Berlin; 2003.
89. Meyer V, Wedde M, Stahl U. Transcriptional regulation of the Antifungal Protein in
Aspergillus giganteus. Mol Genet Genomics. 2002;266(5):747-57. Epub 2001/11/16. doi:
10.1007/s00438-001-0609-6. PubMed PMID: 11810248.
90. Meyer V, Stahl U. The influence of co-cultivation on expression of the antifungal protein in
Aspergillus giganteus. J Basic Microbiol. 2003;43(1):68-74. doi: 10.1002/jobm.200390007.
PubMed PMID: 12596244.
91. Hagen S, Marx F, Ram AF, Meyer V. The antifungal protein AFP from Aspergillus giganteus
inhibits chitin synthesis in sensitive fungi. Appl Environ Microbiol. 2007;73(7):2128-34. Epub
2007/02/06. doi: 10.1128/AEM.02497-06. PubMed PMID: 17277210; PubMed Central
PMCID: PMCPMC1855660.
92. Hagen S. Identification of fungal constituents that determine the sensitivity of fungi
towards the antifungal protein (AFP) of Aspergillus giganteus. Berlin: TU Berlin; 2006.
93. Dijksterhuis J. Fungal spores: Highly variable and stress-resistant vehicles for distribution
and spoilage. Food Microbiol. 2019;81:2-11. Epub 2018/11/21. doi:
10.1016/j.fm.2018.11.006. PubMed PMID: 30910084.
94. Krijgsheld P, Bleichrodt R, van Veluw GJ, Wang F, Müller WH, Dijksterhuis J, et al.
Development in Aspergillus. Stud Mycol. 2013;74(1):1-29. Epub 2012/09/14. doi:
10.3114/sim0006. PubMed PMID: 23450714; PubMed Central PMCID: PMCPMC3563288.
95. Bleichrodt R, Vinck A, Krijgsheld P, van Leeuwen MR, Dijksterhuis J, Wösten HA. Cytosolic
streaming in vegetative mycelium and aerial structures of Aspergillus niger. Stud Mycol.
2013;74(1):31-46. Epub 2012/09/14. doi: 10.3114/sim0007. PubMed PMID: 23450745;
PubMed Central PMCID: PMCPMC3563289.
96. Steinberg G. Hyphal growth: a tale of motors, lipids, and the Spitzenkörper. Eukaryot Cell.
2007;6(3):351-60. Epub 2007/01/26. doi: 10.1128/EC.00381-06. PubMed PMID: 17259546;
PubMed Central PMCID: PMCPMC1828937.
97. Howard RJ, Ferrari MA, Roach DH, Money NP. Penetration of hard substrates by a fungus
employing enormous turgor pressures. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(24):11281-4. doi:
10.1073/pnas.88.24.11281. PubMed PMID: 1837147; PubMed Central PMCID:
PMCPMC53118.
98. Lew RR. How does a hypha grow? The biophysics of pressurized growth in fungi. Nat Rev
Microbiol. 2011;9(7):509-18. Epub 2011/06/06. doi: 10.1038/nrmicro2591. PubMed PMID:
21643041.
99. Bowman SM, Free SJ. The structure and synthesis of the fungal cell wall. Bioessays.
2006;28(8):799-808. doi: 10.1002/bies.20441. PubMed PMID: 16927300.
100. Yoshimi A, Miyazawa K, Abe K. Function and Biosynthesis of Cell Wall α-1,3-Glucan in Fungi.
J Fungi (Basel). 2017;3(4). Epub 2017/11/18. doi: 10.3390/jof3040063. PubMed PMID:
29371579; PubMed Central PMCID: PMCPMC5753165.
187
101. Latgé JP, Beauvais A. Functional duality of the cell wall. Curr Opin Microbiol. 2014;20:111-7.
Epub 2014/06/14. doi: 10.1016/j.mib.2014.05.009. PubMed PMID: 24937317.
102. Fontaine T, Simenel C, Dubreucq G, Adam O, Delepierre M, Lemoine J, et al. Molecular
organization of the alkali-insoluble fraction of aspergillus fumigatus cell wall. J Biol Chem.
2000;275(52):41528. PubMed PMID: 11134062.
103. Latgé JP. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Mol Microbiol.
2007;66(2):279-90. Epub 2007/09/14. doi: 10.1111/j.1365-2958.2007.05872.x. PubMed
PMID: 17854405.
104. Clavaud C, Beauvais A, Barbin L, Munier-Lehmann H, Latgé JP. The composition of the
culture medium influences the β-1,3-glucan metabolism of Aspergillus fumigatus and the
antifungal activity of inhibitors of β-1,3-glucan synthesis. Antimicrob Agents Chemother.
2012;56(6):3428-31. Epub 2012/03/05. doi: 10.1128/AAC.05661-11. PubMed PMID:
22391552; PubMed Central PMCID: PMCPMC3370737.
105. Loussert C, Schmitt C, Prevost MC, Balloy V, Fadel E, Philippe B, et al. In vivo biofilm
composition of Aspergillus fumigatus. Cell Microbiol. 2010;12(3):405-10. Epub 2009/11/04.
doi: 10.1111/j.1462-5822.2009.01409.x. PubMed PMID: 19889082.
106. Fontaine T, Beauvais A, Loussert C, Thevenard B, Fulgsang CC, Ohno N, et al. Cell wall
alpha1-3glucans induce the aggregation of germinating conidia of Aspergillus fumigatus.
Fungal Genet Biol. 2010;47(8):707-12. Epub 2010/05/04. doi: 10.1016/j.fgb.2010.04.006.
PubMed PMID: 20447463.
107. Walker LA, Munro CA, de Bruijn I, Lenardon MD, McKinnon A, Gow NA. Stimulation of chitin
synthesis rescues Candida albicans from echinocandins. PLoS Pathog. 2008;4(4):e1000040.
Epub 2008/04/04. doi: 10.1371/journal.ppat.1000040. PubMed PMID: 18389063; PubMed
Central PMCID: PMCPMC2271054.
108. Jiménez-Ortigosa C, Aimanianda V, Muszkieta L, Mouyna I, Alsteens D, Pire S, et al. Chitin
synthases with a myosin motor-like domain control the resistance of Aspergillus fumigatus
to echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 2012;56(12):6121-31. Epub 2012/09/10.
doi: 10.1128/AAC.00752-12. PubMed PMID: 22964252; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3497188.
109. Walker LA, Lenardon MD, Preechasuth K, Munro CA, Gow NA. Cell wall stress induces
alternative fungal cytokinesis and septation strategies. J Cell Sci. 2013;126(Pt 12):2668-77.
Epub 2013/04/19. doi: 10.1242/jcs.118885. PubMed PMID: 23606739; PubMed Central
PMCID: PMCPMC3687699.
110. Alsteens D, Aimanianda V, Hegde P, Pire S, Beau R, Bayry J, et al. Unraveling the nanoscale
surface properties of chitin synthase mutants of Aspergillus fumigatus and their biological
implications. Biophys J. 2013;105(2):320-7. doi: 10.1016/j.bpj.2013.05.040. PubMed PMID:
23870253; PubMed Central PMCID: PMCPMC3714923.
111. Beauvais A, Bozza S, Kniemeyer O, Formosa C, Balloy V, Henry C, et al. Deletion of the α-
(1,3)-glucan synthase genes induces a restructuring of the conidial cell wall responsible for
the avirulence of Aspergillus fumigatus. PLoS Pathog. 2013;9(11):e1003716. Epub
2013/11/14. doi: 10.1371/journal.ppat.1003716. PubMed PMID: 24244155; PubMed
Central PMCID: PMCPMC3828178.
188
112. Sant DG, Tupe SG, Ramana CV, Deshpande MV. Fungal cell membrane-promising drug
target for antifungal therapy. J Appl Microbiol. 2016;121(6):1498-510. Epub 2016/11/02.
doi: 10.1111/jam.13301. PubMed PMID: 27667746.
113. Dupont S, Lemetais G, Ferreira T, Cayot P, Gervais P, Beney L. Ergosterol biosynthesis: a
fungal pathway for life on land? Evolution. 2012;66(9):2961-8. Epub 2012/05/14. doi:
10.1111/j.1558-5646.2012.01667.x. PubMed PMID: 22946816.
114. Lingwood D, Simons K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science.
2010;327(5961):46-50. doi: 10.1126/science.1174621. PubMed PMID: 20044567.
115. Raghunathan K, Kenworthy AK. Dynamic pattern generation in cell membranes: Current
insights into membrane organization. Biochim Biophys Acta Biomembr.
2018;1860(10):2018-31. Epub 2018/05/09. doi: 10.1016/j.bbamem.2018.05.002. PubMed
PMID: 29752898; PubMed Central PMCID: PMCPMC6234104.
116. Zelles L. Phospholipid fatty acid profiles in selected members of soil microbial communities.
Chemosphere. 1997;35(1-2):275-94. doi: 10.1016/s0045-6535(97)00155-0. PubMed PMID:
9232001.
117. Martin SW, Konopka JB. Lipid raft polarization contributes to hyphal growth in Candida
albicans. Eukaryot Cell. 2004;3(3):675-84. doi: 10.1128/EC.3.3.675-684.2004. PubMed
PMID: 15189988; PubMed Central PMCID: PMCPMC420133.
118. Sonnino S, Prinetti A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Curr Med Chem.
2013;20(1):4-21. PubMed PMID: 23150999.
119. Leipelt M, Warnecke D, Zähringer U, Ott C, Müller F, Hube B, et al. Glucosylceramide
synthases, a gene family responsible for the biosynthesis of glucosphingolipids in animals,
plants, and fungi. J Biol Chem. 2001;276(36):33621-9. Epub 2001/07/06. doi:
10.1074/jbc.M104952200. PubMed PMID: 11443131.
120. Alonso A, Goñi FM. The Physical Properties of Ceramides in Membranes. Annu Rev Biophys.
2018;47:633-54. Epub 2018/04/04. doi: 10.1146/annurev-biophys-070317-033309.
PubMed PMID: 29618220.
121. Rittenour WR, Chen M, Cahoon EB, Harris SD. Control of glucosylceramide production and
morphogenesis by the Bar1 ceramide synthase in Fusarium graminearum. PLoS One.
2011;6(4):e19385. Epub 2011/05/12. doi: 10.1371/journal.pone.0019385. PubMed PMID:
21559419; PubMed Central PMCID: PMCPMC3084840.
122. Rego A, Trindade D, Chaves SR, Manon S, Costa V, Sousa MJ, et al. The yeast model system
as a tool towards the understanding of apoptosis regulation by sphingolipids. FEMS Yeast
Res. 2014;14(1):160-78. Epub 2013/10/10. doi: 10.1111/1567-1364.12096. PubMed PMID:
24103214.
123. Li S, Du L, Yuen G, Harris SD. Distinct ceramide synthases regulate polarized growth in the
filamentous fungus Aspergillus nidulans. Mol Biol Cell. 2006;17(3):1218-27. Epub
2006/01/04. doi: 10.1091/mbc.e05-06-0533. PubMed PMID: 16394102; PubMed Central
PMCID: PMCPMC1382311.
124. Fernandes CM, Goldman GH, Del Poeta M. Biological Roles Played by Sphingolipids in
Dimorphic and Filamentous Fungi. MBio. 2018;9(3). Epub 2018/05/17. doi:
10.1128/mBio.00642-18. PubMed PMID: 29764947; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5954224.
189
125. Zauner S, Zahringer U, Lindner B, Warnecke D, Sperling P. Identification and functional
characterization of the 2-hydroxy fatty N-acyl-Delta3(E)-desaturase from Fusarium
graminearum. J Biol Chem. 2008;283(52):36734-42. Epub 2008/11/05. doi:
10.1074/jbc.M807264200. PubMed PMID: 18981185; PubMed Central PMCID:
PMCPMC2662314.
126. Warnecke D, Heinz E. Recently discovered functions of glucosylceramides in plants and
fungi. Cell Mol Life Sci. 2003;60(5):919-41. Epub 2003/06/27. doi: 10.1007/s00018-003-
2243-4. PubMed PMID: 12827281.
127. Zhong W, Jeffries MW, Georgopapadakou NH. Inhibition of inositol phosphorylceramide
synthase by aureobasidin A in Candida and Aspergillus species. Antimicrob Agents
Chemother. 2000;44(3):651-3. doi: 10.1128/aac.44.3.651-653.2000. PubMed PMID:
10681333; PubMed Central PMCID: PMCPMC89741.
128. Zhu C, Wang M, Wang W, Ruan R, Ma H, Mao C, et al. Glucosylceramides are required for
mycelial growth and full virulence in Penicillium digitatum. Biochem Biophys Res Commun.
2014;455(3-4):165-71. Epub 2014/11/04. doi: 10.1016/j.bbrc.2014.10.142. PubMed PMID:
25449268; PubMed Central PMCID: PMCPMC4380128.
129. Ramamoorthy V, Cahoon EB, Thokala M, Kaur J, Li J, Shah DM. Sphingolipid C-9
methyltransferases are important for growth and virulence but not for sensitivity to
antifungal plant defensins in Fusarium graminearum. Eukaryot Cell. 2009;8(2):217-29. Epub
2008/11/21. doi: 10.1128/EC.00255-08. PubMed PMID: 19028992; PubMed Central PMCID:
PMCPMC2643601.
130. Shanklin J, Whittle E, Fox BG. Eight histidine residues are catalytically essential in a
membrane-associated iron enzyme, stearoyl-CoA desaturase, and are conserved in alkane
hydroxylase and xylene monooxygenase. Biochemistry. 1994;33(43):12787-94. doi:
10.1021/bi00209a009. PubMed PMID: 7947684.
131. Los DA, Murata N. Structure and expression of fatty acid desaturases. Biochim Biophys
Acta. 1998;1394(1):3-15. doi: 10.1016/s0005-2760(98)00091-5. PubMed PMID: 9767077.
132. Waksman SA, Geiger WB. The Nature of the Antibiotic Substances Produced by Aspergillus
fumigatus. J Bacteriol. 1944;47(4):391-7. PubMed PMID: 16560790; PubMed Central
PMCID: PMCPMC373929.
133. Wnendt S, Jacobs M, Stahl U. Transformation of Aspergillus giganteus to hygromycin B
resistance. Curr Genet. 1990;17(1):21-4. doi: 10.1007/bf00313244. PubMed PMID:
2178785.
134. Gouka RJ, van Hartingsveldt W, Bovenberg RA, van Zeijl CM, van den Hondel CA, van
Gorcom RF. Development of a new transformant selection system for Penicillium
chrysogenum: isolation and characterization of the P. chrysogenum acetyl-coenzyme A
synthetase gene (facA) and its use as a homologous selection marker. Appl Microbiol
Biotechnol. 1993;38(4):514-9. Epub 1993/01/01. PubMed PMID: 7765289.
135. Krijgsheld P, Nitsche BM, Post H, Levin AM, Müller WH, Heck AJ, et al. Deletion of flbA
results in increased secretome complexity and reduced secretion heterogeneity in colonies
of Aspergillus niger. J Proteome Res. 2013;12(4):1808-19. Epub 2013/03/22. doi:
10.1021/pr301154w. PubMed PMID: 23461488.
136. Carvalho ND, Arentshorst M, Jin Kwon M, Meyer V, Ram AF. Expanding the ku70 toolbox for
filamentous fungi: establishment of complementation vectors and recipient strains for
190
advanced gene analyses. Appl Microbiol Biotechnol. 2010;87(4):1463-73. Epub 2010/04/27.
doi: 10.1007/s00253-010-2588-1. PubMed PMID: 20422182; PubMed Central PMCID:
PMCPMC2892608.
137. Meyer V, Arentshorst M, El-Ghezal A, Drews AC, Kooistra R, van den Hondel CA, et al. Highly
efficient gene targeting in the Aspergillus niger kusA mutant. J Biotechnol. 2007;128(4):770-
5. Epub 2007/01/10. doi: 10.1016/j.jbiotec.2006.12.021. PubMed PMID: 17275117.
138. Miedaner T, Reinbrecht C, Schilling AG. Association among aggressiveness, fungal
colonization, and mycotoxin production of 26 isolates of Fusarium graminearum in winter
rye head blight / Beziehung zwischen Aggressivität, Myzelwachstum und
Mykotoxinproduktion von 26 Fusarium-graminearum-Isolaten bei der Ährenfusariose des
Winterroggens. Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz / Journal of Plant
Diseases and Protection. 2000;107(2):124-34.
139. Cregg JM, Barringer KJ, Hessler AY, Madden KR. Pichia pastoris as a host system for
transformations. Mol Cell Biol. 1985;5(12):3376-85. doi: 10.1128/mcb.5.12.3376. PubMed
PMID: 3915774; PubMed Central PMCID: PMCPMC369166.
140. Fradin EF, Zhang Z, Juarez Ayala JC, Castroverde CD, Nazar RN, Robb J, et al. Genetic
dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiol.
2009;150(1):320-32. Epub 2009/03/25. doi: 10.1104/pp.109.136762. PubMed PMID:
19321708; PubMed Central PMCID: PMCPMC2675724.
141. Arentshorst M, Ram AF, Meyer V. Using non-homologous end-joining-deficient strains for
functional gene analyses in filamentous fungi. Methods Mol Biol. 2012;835:133-50. Epub
2011/12/21. doi: 10.1007/978-1-61779-501-5_9. PubMed PMID: 22183652.
142. Nielsen ML, Albertsen L, Lettier G, Nielsen JB, Mortensen UH. Efficient PCR-based gene
targeting with a recyclable marker for Aspergillus nidulans. Fungal Genet Biol.
2006;43(1):54-64. Epub 2005/11/11. doi: 10.1016/j.fgb.2005.09.005. PubMed PMID:
16289954.
143. Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, et al. Primer3--new
capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 2012;40(15):e115. Epub 2012/06/22. doi:
10.1093/nar/gks596. PubMed PMID: 22730293; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3424584.
144. de Ruiter-Jacobs YM, Broekhuijsen M, Unkles SE, Campbell EI, Kinghorn JR, Contreras R, et
al. A gene transfer system based on the homologous pyrG gene and efficient expression of
bacterial genes in Aspergillus oryzae. Curr Genet. 1989;16(3):159-63. doi:
10.1007/bf00391472. PubMed PMID: 2688930.
145. Punt PJ, van den Hondel CA. Transformation of filamentous fungi based on hygromycin B
and phleomycin resistance markers. Methods Enzymol. 1992;216:447-57. doi:
10.1016/0076-6879(92)16041-h. PubMed PMID: 1479914.
146. Ram AF, Arentshorst M, Damveld RA, vanKuyk PA, Klis FM, van den Hondel CA. The cell wall
stress response in Aspergillus niger involves increased expression of the glutamine :
fructose-6-phosphate amidotransferase-encoding gene (gfaA) and increased deposition of
chitin in the cell wall. Microbiology. 2004;150(Pt 10):3315-26. Epub 2004/10/08. doi:
10.1099/mic.0.27249-0. PubMed PMID: 15470111.
147. Hong P, Koza S, Bouvier ES. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein
Biotherapeutics and their Aggregates. J Liq Chromatogr Relat Technol. 2012;35(20):2923-
191
50. Epub 2012/11/30. doi: 10.1080/10826076.2012.743724. PubMed PMID: 23378719;
PubMed Central PMCID: PMCPMC3556795.
148. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive
multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties
and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994;22(22):4673-80. doi:
10.1093/nar/22.22.4673. PubMed PMID: 7984417; PubMed Central PMCID:
PMCPMC308517.
149. Mousa WK, Raizada MN. The diversity of anti-microbial secondary metabolites produced by
fungal endophytes: an interdisciplinary perspective. Front Microbiol. 2013;4:65. Epub
2013/03/27. doi: 10.3389/fmicb.2013.00065. PubMed PMID: 23543048; PubMed Central
PMCID: PMCPMC3608919.
150. Meyer V, Stahl U. New insights in the regulation of the afp gene encoding the antifungal
protein of Aspergillus giganteus. Curr Genet. 2002;42(1):36-42. Epub 2002/09/18. doi:
10.1007/s00294-002-0324-9. PubMed PMID: 12420144.
151. Dutta D, Debnath DAS M. Biosynthesis of Low Molecular Weight Antifungal Protein from
Aspergillus giganteus in Batch Fermentation and In-Vitro Assay. Biocontrol Sci.
2018;23(2):41-51. doi: 10.4265/bio.23.41. PubMed PMID: 29910208.
152. Gibbs PA, Seviour RJ, Schmid F. Growth of filamentous fungi in submerged culture:
problems and possible solutions. Crit Rev Biotechnol. 2000;20(1):17-48. doi:
10.1080/07388550091144177. PubMed PMID: 10770226.
153. Meyer V, Wanka F, van Gent J, Arentshorst M, van den Hondel CA, Ram AF. Fungal gene
expression on demand: an inducible, tunable, and metabolism-independent expression
system for Aspergillus niger. Appl Environ Microbiol. 2011;77(9):2975-83. Epub 2011/03/04.
doi: 10.1128/AEM.02740-10. PubMed PMID: 21378046; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3126388.
154. Utesch T, de Miguel Catalina A, Schattenberg C, Paege N, Schmieder P, Krause E, et al. A
Computational Modeling Approach Predicts Interaction of the Antifungal Protein AFP from
Aspergillus giganteus with Fungal Membranes via Its gamma-Core Motif. mSphere.
2018;3(5). Epub 2018/10/05. doi: 10.1128/mSphere.00377-18. PubMed PMID: 30282755;
PubMed Central PMCID: PMCPMC6170789.
155. Thevissen K, Warnecke DC, Francois IE, Leipelt M, Heinz E, Ott C, et al. Defensins from
insects and plants interact with fungal glucosylceramides. J Biol Chem. 2004;279(6):3900-5.
Epub 2003/11/08. doi: 10.1074/jbc.M311165200. PubMed PMID: 14604982.
156. Thevissen K, de Mello Tavares P, Xu D, Blankenship J, Vandenbosch D, Idkowiak-Baldys J, et
al. The plant defensin RsAFP2 induces cell wall stress, septin mislocalization and
accumulation of ceramides in Candida albicans. Mol Microbiol. 2012;84(1):166-80. Epub
2012/03/05. doi: 10.1111/j.1365-2958.2012.08017.x. PubMed PMID: 22384976; PubMed
Central PMCID: PMCPMC3405362.
157. Levery SB, Momany M, Lindsey R, Toledo MS, Shayman JA, Fuller M, et al. Disruption of the
glucosylceramide biosynthetic pathway in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus by
inhibitors of UDP-Glc:ceramide glucosyltransferase strongly affects spore germination, cell
cycle, and hyphal growth. FEBS Lett. 2002;525(1-3):59-64. Epub 2002/08/07. PubMed
PMID: 12163162.
192
158. Andersen MR, Nielsen ML, Nielsen J. Metabolic model integration of the bibliome, genome,
metabolome and reactome of Aspergillus niger. Mol Syst Biol. 2008;4:178. Epub
2008/03/25. doi: 10.1038/msb.2008.12. PubMed PMID: 18364712; PubMed Central PMCID:
PMCPMC2290933.
159. Hagiwara D, Takahashi H, Kusuya Y, Kawamoto S, Kamei K, Gonoi T. Comparative
transcriptome analysis revealing dormant conidia and germination associated genes in
Aspergillus species: an essential role for AtfA in conidial dormancy. BMC Genomics.
2016;17:358. Epub 2016/05/17. doi: 10.1186/s12864-016-2689-z. PubMed PMID:
27185182; PubMed Central PMCID: PMCPMC4869263.
160. Pel HJ, de Winde JH, Archer DB, Dyer PS, Hofmann G, Schaap PJ, et al. Genome sequencing
and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88. Nat Biotechnol.
2007;25(2):221-31. Epub 2007/01/28. doi: 10.1038/nbt1282. PubMed PMID: 17259976.
161. Kasuga T, Glass NL. Dissecting colony development of Neurospora crassa using mRNA
profiling and comparative genomics approaches. Eukaryot Cell. 2008;7(9):1549-64. Epub
2008/08/01. doi: 10.1128/EC.00195-08. PubMed PMID: 18676954; PubMed Central PMCID:
PMCPMC2547062.
162. van Leeuwen MR, Krijgsheld P, Wyatt TT, Golovina EA, Menke H, Dekker A, et al. The effect
of natamycin on the transcriptome of conidia of Aspergillus niger. Stud Mycol.
2013;74(1):71-85. Epub 2012/09/24. doi: 10.3114/sim0013. PubMed PMID: 23449730;
PubMed Central PMCID: PMCPMC3563292.
163. Cairns TC, Feurstein C, Zheng X, Zheng P, Sun J, Meyer V. A quantitative image analysis
pipeline for the characterization of filamentous fungal morphologies as a tool to uncover
targets for morphology engineering: a case study using. Biotechnol Biofuels. 2019;12:149.
Epub 2019/06/15. doi: 10.1186/s13068-019-1473-0. PubMed PMID: 31223339; PubMed
Central PMCID: PMCPMC6570962.
164. Meyer V, Damveld RA, Arentshorst M, Stahl U, van den Hondel CA, Ram AF. Survival in the
presence of antifungals: genome-wide expression profiling of Aspergillus niger in response
to sublethal concentrations of caspofungin and fenpropimorph. J Biol Chem.
2007;282(45):32935-48. Epub 2007/09/05. doi: 10.1074/jbc.M705856200. PubMed PMID:
17804411.
165. Leipelt M, Warnecke D, Zahringer U, Ott C, Muller F, Hube B, et al. Glucosylceramide
synthases, a gene family responsible for the biosynthesis of glucosphingolipids in animals,
plants, and fungi. J Biol Chem. 2001;276(36):33621-9. Epub 2001/07/10. doi:
10.1074/jbc.M104952200. PubMed PMID: 11443131.
166. Rollin-Pinheiro R, Singh A, Barreto-Bergter E, Del Poeta M. Sphingolipids as targets for
treatment of fungal infections. Future Med Chem. 2016;8(12):1469-84. Epub 2016/08/10.
doi: 10.4155/fmc-2016-0053. PubMed PMID: 27502288; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5558548.
167. Hillig I, Warnecke D, Heinz E. An inhibitor of glucosylceramide synthase inhibits the human
enzyme, but not enzymes from other organisms. Biosci Biotechnol Biochem.
2005;69(9):1782-5. Epub 2005/10/01. doi: 10.1271/bbb.69.1782. PubMed PMID:
16195602.
168. Schäpe P, Kwon MJ, Baumann B, Gutschmann B, Jung S, Lenz S, et al. Updating genome
annotation for the microbial cell factory Aspergillus niger using gene co-expression
193
networks. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):559-69. doi: 10.1093/nar/gky1183. PubMed PMID:
30496528; PubMed Central PMCID: PMCPMC6344863.
169. Ouedraogo JP, Hagen S, Spielvogel A, Engelhardt S, Meyer V. Survival strategies of yeast and
filamentous fungi against the antifungal protein AFP. J Biol Chem. 2011;286(16):13859-68.
Epub 2011/02/24. doi: 10.1074/jbc.M110.203588. PubMed PMID: 21343301; PubMed
Central PMCID: PMCPMC3077587.
170. van Munster JM, Nitsche BM, Akeroyd M, Dijkhuizen L, van der Maarel MJ, Ram AF.
Systems approaches to predict the functions of glycoside hydrolases during the life cycle of
Aspergillus niger using developmental mutants ∆brlA and ∆flbA. PLoS One.
2015;10(1):e0116269. Epub 2015/01/28. doi: 10.1371/journal.pone.0116269. PubMed
PMID: 25629352; PubMed Central PMCID: PMCPMC4309609.
171. Dyer PS, O'Gorman CM. Sexual development and cryptic sexuality in fungi: insights from
Aspergillus species. FEMS Microbiol Rev. 2012;36(1):165-92. Epub 2011/10/06. doi:
10.1111/j.1574-6976.2011.00308.x. PubMed PMID: 22091779.
172. Drysdale MR, Kolze SE, Kelly JM. The Aspergillus niger carbon catabolite repressor encoding
gene, creA. Gene. 1993;130(2):241-5. doi: 10.1016/0378-1119(93)90425-3. PubMed PMID:
8359691.
173. Delmas S, Pullan ST, Gaddipati S, Kokolski M, Malla S, Blythe MJ, et al. Uncovering the
genome-wide transcriptional responses of the filamentous fungus Aspergillus niger to
lignocellulose using RNA sequencing. PLoS Genet. 2012;8(8):e1002875. Epub 2012/08/09.
doi: 10.1371/journal.pgen.1002875. PubMed PMID: 22912594; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3415456.
174. Andersen MR, Lehmann L, Nielsen J. Systemic analysis of the response of Aspergillus niger
to ambient pH. Genome Biol. 2009;10(5):R47. Epub 2009/05/01. doi: 10.1186/gb-2009-10-
5-r47. PubMed PMID: 19409083; PubMed Central PMCID: PMCPMC2718513.
175. Bhargava S, Wenger KS, Marten MR. Pulsed feeding during fed-batch Aspergillus oryzae
fermentation leads to improved oxygen mass transfer. Biotechnol Prog. 2003;19(3):1091-4.
doi: 10.1021/bp025694p. PubMed PMID: 12790687.
176. Vecht-Lifshitz SE, Magdassi S, Braun S. Pellet formation and cellular aggregation in
Streptomyces tendae. Biotechnol Bioeng. 1990;35(9):890-6. doi: 10.1002/bit.260350906.
PubMed PMID: 18592593.
177. Park HS, Nam TY, Han KH, Kim SC, Yu JH. VelC positively controls sexual development in
Aspergillus nidulans. PLoS One. 2014;9(2):e89883. Epub 2014/02/28. doi:
10.1371/journal.pone.0089883. PubMed PMID: 24587098; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3938535.
178. Martín JF. Key role of LaeA and velvet complex proteins on expression of β-lactam and PR-
toxin genes in Penicillium chrysogenum: cross-talk regulation of secondary metabolite
pathways. Journal of industrial microbiology & biotechnology. 2017;44(4-5):525-35.
179. Raman NM, Ramasamy S. Genetic validation and spectroscopic detailing of DHN-melanin
extracted from an environmental fungus. Biochem Biophys Rep. 2017;12:98-107. Epub
2017/08/19. doi: 10.1016/j.bbrep.2017.08.008. PubMed PMID: 28955797; PubMed Central
PMCID: PMCPMC5613234.
194
180. Esbelin J, Mallea S, Ram AF, Carlin F. Role of pigmentation in protecting Aspergillus niger
conidiospores against pulsed light radiation. Photochem Photobiol. 2013;89(3):758-61.
Epub 2013/01/29. doi: 10.1111/php.12037. PubMed PMID: 23278805.
181. Al Khatib M, Harir M, Costa J, Baratto MC, Schiavo I, Trabalzini L, et al. Spectroscopic
Characterization of Natural Melanin from a. Molecules. 2018;23(8). Epub 2018/08/01. doi:
10.3390/molecules23081916. PubMed PMID: 30071605; PubMed Central PMCID:
PMCPMC6222888.
182. Gonçalves RC, Lisboa HC, Pombeiro-Sponchiado SR. Characterization of melanin pigment
produced by Aspergillus nidulans. World J Microbiol Biotechnol. 2012;28(4):1467-74. Epub
2011/11/16. doi: 10.1007/s11274-011-0948-3. PubMed PMID: 22805928.
183. Choudhary M, Jayanand, Padaria JC. Transcriptional profiling in pearl millet (Pennisetum
glaucum L.R. Br.) for identification of differentially expressed drought responsive genes.
Physiol Mol Biol Plants. 2015;21(2):187-96. Epub 2015/04/15. doi: 10.1007/s12298-015-
0287-1. PubMed PMID: 25964713; PubMed Central PMCID: PMCPMC4411378.
184. Rost B, Yachdav G, Liu J. The PredictProtein server. Nucleic Acids Res. 2004;32(Web Server
issue):W321-6. doi: 10.1093/nar/gkh377. PubMed PMID: 15215403; PubMed Central
PMCID: PMCPMC441515.
185. Schoch CL, Sung GH, López-Giráldez F, Townsend JP, Miadlikowska J, Hofstetter V, et al. The
Ascomycota tree of life: a phylum-wide phylogeny clarifies the origin and evolution of
fundamental reproductive and ecological traits. Syst Biol. 2009;58(2):224-39. Epub
2009/06/04. doi: 10.1093/sysbio/syp020. PubMed PMID: 20525580.
186. Peberdy JF. Protein secretion in filamentous fungi--trying to understand a highly productive
black box. Trends Biotechnol. 1994;12(2):50-7. doi: 10.1016/0167-7799(94)90100-7.
PubMed PMID: 7764536.
187. Liu RS, Huang H, Yang Q, Liu WY. Purification of alpha-sarcin and an antifungal protein from
mold (Aspergillus giganteus) by chitin affinity chromatography. Protein Expr Purif.
2002;25(1):50-8. doi: 10.1006/prep.2001.1608. PubMed PMID: 12071698.
188. Marqusee S, Robbins VH, Baldwin RL. Unusually stable helix formation in short alanine-
based peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989;86(14):5286-90. doi:
10.1073/pnas.86.14.5286. PubMed PMID: 2748584; PubMed Central PMCID:
PMCPMC297606.
189. Fernández FJ, Gómez S, Vega MC. High-Throughput Protein Production in Yeast. Methods
Mol Biol. 2019;2025:69-91. doi: 10.1007/978-1-4939-9624-7_4. PubMed PMID: 31267449.
190. Binder U, Bencina M, Eigentler A, Meyer V, Marx F. The Aspergillus giganteus antifungal
protein AFPNN5353 activates the cell wall integrity pathway and perturbs calcium
homeostasis. BMC Microbiol. 2011;11:209. Epub 2011/09/23. doi: 10.1186/1471-2180-11-
209. PubMed PMID: 21943024; PubMed Central PMCID: PMCPMC3197501.
191. Wnendt S. Transformation von Aspergillus giganteus und molekulargenetische
Charakterisierung sekretierter, cytotoxischer Proteine. Berlin: TU Berlin; 1991.
192. Abdalla RE, Baker EA. A new focus of onchoceriasis in the Sudan. Trop Geogr Med.
1975;27(4):365-70. PubMed PMID: 1216316.
193. Zäuner S. Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Fettsäure-D3(E)-
Desaturasen [Fettsäure-Delta-3(E)-Desaturasen] aus Fusarium graminearum Schwabe und
195
Magnaporthe grisea (T. T. Hebert) M. E. Barr und einer Fettsäure-beta-Hydroxylase aus
Cytophaga hutchinsonii Winogradsky. Hamburg: Hamburg, Univ.; 2009.
194. Casadevall A, Pirofski LA. Host-pathogen interactions: redefining the basic concepts of
virulence and pathogenicity. Infect Immun. 1999;67(8):3703-13. Epub 1999/07/23. PubMed
PMID: 10417127; PubMed Central PMCID: PMCPMC96643.
195. Aerts AM, Francois IE, Meert EM, Li QT, Cammue BP, Thevissen K. The antifungal activity of
RsAFP2, a plant defensin from raphanus sativus, involves the induction of reactive oxygen
species in Candida albicans. J Mol Microbiol Biotechnol. 2007;13(4):243-7. Epub
2007/09/11. doi: 10.1159/000104753. PubMed PMID: 17827975.
196. Fernandes CM, de Castro PA, Singh A, Fonseca FL, Pereira MD, Vila TV, et al. Functional
characterization of the Aspergillus nidulans glucosylceramide pathway reveals that LCB
Delta8-desaturation and C9-methylation are relevant to filamentous growth, lipid raft
localization and Psd1 defensin activity. Mol Microbiol. 2016;102(3):488-505. Epub
2016/10/22. doi: 10.1111/mmi.13474. PubMed PMID: 27479571; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5074892.
197. Mylvaganam M, Hansen HC, Binnington B, Magnusson G, Nyholm PG, Lingwood CA.
Interaction of the verotoxin 1B subunit with soluble aminodeoxy analogues of globotriaosyl
ceramides. Biochem J. 2002;368(Pt 3):769-76. doi: 10.1042/BJ20020225. PubMed PMID:
12175338; PubMed Central PMCID: PMCPMC1223022.
198. Ramamoorthy V, Cahoon EB, Li J, Thokala M, Minto RE, Shah DM. Glucosylceramide
synthase is essential for alfalfa defensin-mediated growth inhibition but not for
pathogenicity of Fusarium graminearum. Mol Microbiol. 2007;66(3):771-86. Epub
2007/10/03. doi: 10.1111/j.1365-2958.2007.05955.x. PubMed PMID: 17908205.
199. Huber A, Oemer G, Malanovic N, Karl L, Kovács L, Salvenmoser W, et al. Membrane
sphingolipids regulate the fitness and antifungal protein susceptibility of Neurospora crassa.
Frontiers in Microbiology. 2019;10:605.
200. Pirofski LA, Casadevall A. The Damage-Response Framework as a Tool for the Physician-
Scientist to Understand the Pathogenesis of Infectious Diseases. J Infect Dis.
2018;218(suppl_1):S7-S11. Epub 2018/08/21. doi: 10.1093/infdis/jiy083. PubMed PMID:
30124977; PubMed Central PMCID: PMCPMC6093430.
201. Futerman AH, Riezman H. The ins and outs of sphingolipid synthesis. Trends Cell Biol.
2005;15(6):312-8. Epub 2005/06/15. doi: 10.1016/j.tcb.2005.04.006. PubMed PMID:
15953549.
202. Kusmakow OV. Versuche zur intrazellulären Lokalisierung der Sterol-Glucosyltransferase
und der Glucosylceramid-Synthase in Zellen von Allium fistulosum L. Hamburg: Staats- und
Universitätsbibliothek Hamburg; 2006.
203. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol
Biol. 1990;215(3):403-10. Epub 1990/10/05. doi: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2. PubMed
PMID: 2231712.
204. Huber A, Oemer G, Malanovic N, Lohner K, Kovács L, Salvenmoser W, et al. Membrane
Sphingolipids Regulate the Fitness and Antifungal Protein Susceptibility of. Front Microbiol.
2019;10:605. Epub 2019/04/11. doi: 10.3389/fmicb.2019.00605. PubMed PMID: 31031714;
PubMed Central PMCID: PMCPMC6471014.
196
205. Hannich JT, Umebayashi K, Riezman H. Distribution and functions of sterols and
sphingolipids. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2011;3(5):a004762.
206. Dickson RC. Roles for sphingolipids in Saccharomyces cerevisiae. Adv Exp Med Biol.
2010;688:217-31. Epub 2010/10/06. PubMed PMID: 20919657; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5612324.
207. Del Poeta M, Nimrichter L, Rodrigues ML, Luberto C. Synthesis and biological properties of
fungal glucosylceramide. PLoS Pathog. 2014;10(1):e1003832. Epub 2014/01/15. doi:
10.1371/journal.ppat.1003832. PubMed PMID: 24415933; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3887071.
208. Singh A, Del Poeta M. Sphingolipidomics: An Important Mechanistic Tool for Studying
Fungal Pathogens. Front Microbiol. 2016;7:501. Epub 2016/05/06. doi:
10.3389/fmicb.2016.00501. PubMed PMID: 27148190; PubMed Central PMCID:
PMCPMC4830811.
209. Arikawa J, Ishibashi M, Kawashima M, Takagi Y, Ichikawa Y, Imokawa G. Decreased levels of
sphingosine, a natural antimicrobial agent, may be associated with vulnerability of the
stratum corneum from patients with atopic dermatitis to colonization by Staphylococcus
aureus. J Invest Dermatol. 2002;119(2):433-9. doi: 10.1046/j.1523-1747.2002.01846.x.
PubMed PMID: 12190867.
210. Munshi MA, Gardin JM, Singh A, Luberto C, Rieger R, Bouklas T, et al. The Role of Ceramide
Synthases in the Pathogenicity of Cryptococcus neoformans. Cell Rep. 2018;22(6):1392-400.
Epub 2018/02/10. doi: 10.1016/j.celrep.2018.01.035. PubMed PMID: 29425496; PubMed
Central PMCID: PMCPMC5839121.
211. Schenck M, Carpinteiro A, Grassmé H, Lang F, Gulbins E. Ceramide: physiological and
pathophysiological aspects. Arch Biochem Biophys. 2007;462(2):171-5. Epub 2007/04/11.
doi: 10.1016/j.abb.2007.03.031. PubMed PMID: 17467652.
212. Briolay A, Bouzenzana J, Guichardant M, Deshayes C, Sindt N, Bessueille L, et al. Cell wall
polysaccharide synthases are located in detergent-resistant membrane microdomains in
oomycetes. Appl Environ Microbiol. 2009;75(7):1938-49. Epub 2009/02/05. doi:
10.1128/AEM.02728-08. PubMed PMID: 19201970; PubMed Central PMCID:
PMCPMC2663216.
213. Theis T, Marx F, Salvenmoser W, Stahl U, Meyer V. New insights into the target site and
mode of action of the antifungal protein of Aspergillus giganteus. Res Microbiol.
2005;156(1):47-56. Epub 2005/01/08. doi: 10.1016/j.resmic.2004.08.006. PubMed PMID:
15636747.
214. Liu R, Xu C, Zhang Q, Wang S, Fang W. Evolution of the chitin synthase gene family
correlates with fungal morphogenesis and adaption to ecological niches. Sci Rep.
2017;7:44527. Epub 2017/03/16. doi: 10.1038/srep44527. PubMed PMID: 28300148;
PubMed Central PMCID: PMCPMC5353729.
215. Muszkieta L, Aimanianda V, Mellado E, Gribaldo S, Alcàzar-Fuoli L, Szewczyk E, et al.
Deciphering the role of the chitin synthase families 1 and 2 in the in vivo and in vitro growth
of Aspergillus fumigatus by multiple gene targeting deletion. Cell Microbiol.
2014;16(12):1784-805. Epub 2014/08/15. doi: 10.1111/cmi.12326. PubMed PMID:
24946720.
197
216. Cabib E, Schmidt M. Chitin synthase III activity, but not the chitin ring, is required for
remedial septa formation in budding yeast. FEMS Microbiol Lett. 2003;224(2):299-305. doi:
10.1016/S0378-1097(03)00477-4. PubMed PMID: 12892896.
217. Shaw JA, Mol PC, Bowers B, Silverman SJ, Valdivieso MH, Durán A, et al. The function of
chitin synthases 2 and 3 in the Saccharomyces cerevisiae cell cycle. J Cell Biol.
1991;114(1):111-23. doi: 10.1083/jcb.114.1.111. PubMed PMID: 2050738; PubMed Central
PMCID: PMCPMC2289062.
218. Amaral VSG, Fernandes CM, Felicio MR, Valle AS, Quintana PG, Almeida CC, et al. Psd2 pea
defensin shows a preference for mimetic membrane rafts enriched with glucosylceramide
and ergosterol. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2019;1861(4):713-28. Epub 2019/01/15.
doi: 10.1016/j.bbamem.2018.12.020. PubMed PMID: 30639288.
219. Scheinpflug K, Wenzel M, Krylova O, Bandow JE, Dathe M, Strahl H. Antimicrobial peptide
cWFW kills by combining lipid phase separation with autolysis. Sci Rep. 2017;7:44332. Epub
2017/03/10. doi: 10.1038/srep44332. PubMed PMID: 28276520; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5343580.
220. Sheppard DC, Doedt T, Chiang LY, Kim HS, Chen D, Nierman WC, et al. The Aspergillus
fumigatus StuA protein governs the up-regulation of a discrete transcriptional program
during the acquisition of developmental competence. Mol Biol Cell. 2005;16(12):5866-79.
Epub 2005/10/05. doi: 10.1091/mbc.e05-07-0617. PubMed PMID: 16207816; PubMed
Central PMCID: PMCPMC1289428.
221. Ruijter GJ, Vanhanen SA, Gielkens MM, van de Vondervoort PJ, Visser J. Isolation of
Aspergillus niger creA mutants and effects of the mutations on expression of arabinases
and L-arabinose catabolic enzymes. Microbiology. 1997;143 ( Pt 9):2991-8. doi:
10.1099/00221287-143-9-2991. PubMed PMID: 9308182.
222. Aerts D, van den Bergh SG, Post H, Altelaar MAF, Arentshorst M, Ram AFJ, et al. FlbA-
Regulated Gene. Appl Environ Microbiol. 2019;85(2). Epub 2019/01/09. doi:
10.1128/AEM.02282-18. PubMed PMID: 30413474; PubMed Central PMCID:
PMCPMC6328776.
223. Aerts D, Hauer EE, Ohm RA, Arentshorst M, Teertstra WR, Phippen C, et al. The FlbA-
regulated predicted transcription factor Fum21 of Aspergillus niger is involved in fumonisin
production. Antonie Van Leeuwenhoek. 2018;111(3):311-22. Epub 2017/09/30. doi:
10.1007/s10482-017-0952-1. PubMed PMID: 28965153; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5816093.
224. Lee MK, Kwon NJ, Lee IS, Jung S, Kim SC, Yu JH. Negative regulation and developmental
competence in Aspergillus. Sci Rep. 2016;6:28874. Epub 2016/07/01. doi:
10.1038/srep28874. PubMed PMID: 27364479; PubMed Central PMCID: PMCPMC4929475.
225. Kovács B, Hegedűs N, Bálint M, Szabó Z, Emri T, Kiss G, et al. Penicillium antifungal protein
(PAF) is involved in the apoptotic and autophagic processes of the producer Penicillium
chrysogenum. Acta Microbiol Immunol Hung. 2014;61(3):379-88. doi:
10.1556/AMicr.61.2014.3.10. PubMed PMID: 25261948.
226. Nitsche BM, Jørgensen TR, Akeroyd M, Meyer V, Ram AF. The carbon starvation response of
Aspergillus niger during submerged cultivation: insights from the transcriptome and
secretome. BMC Genomics. 2012;13:380. Epub 2012/08/08. doi: 10.1186/1471-2164-13-
380. PubMed PMID: 22873931; PubMed Central PMCID: PMCPMC3527191.
198
227. Park BC, Park YH, Yi S, Choi YK, Kang EH, Park HM. Transcriptional regulation of fksA, a β-
1,3-glucan synthase gene, by the APSES protein StuA during Aspergillus nidulans
development. J Microbiol. 2014;52(11):940-7. Epub 2014/10/31. doi: 10.1007/s12275-014-
4517-y. PubMed PMID: 25359270.
228. Hu P, Wang Y, Zhou J, Pan Y, Liu G. AcstuA, which encodes an APSES transcription regulator,
is involved in conidiation, cephalosporin biosynthesis and cell wall integrity of Acremonium
chrysogenum. Fungal Genet Biol. 2015;83:26-40. Epub 2015/08/14. doi:
10.1016/j.fgb.2015.08.003. PubMed PMID: 26283234.
229. Yeung AT, Gellatly SL, Hancock RE. Multifunctional cationic host defence peptides and their
clinical applications. Cell Mol Life Sci. 2011;68(13):2161-76. Epub 2011/05/15. doi:
10.1007/s00018-011-0710-x. PubMed PMID: 21573784.
230. Coca M, Bortolotti C, Rufat M, Peñas G, Eritja R, Tharreau D, et al. Transgenic rice plants
expressing the antifungal AFP protein from Aspergillus giganteus show enhanced resistance
to the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Plant Mol Biol. 2004;54(2):245-59. doi:
10.1023/B:PLAN.0000028791.34706.80. PubMed PMID: 15159626.
231. Narvaez I, Khayreddine T, Pliego C, Cerezo S, Jiménez-Díaz RM, Trapero-Casas JL, et al.
Usage of the Heterologous Expression of the Antimicrobial Gene. Front Plant Sci.
2018;9:680. Epub 2018/05/23. doi: 10.3389/fpls.2018.00680. PubMed PMID: 29875785;
PubMed Central PMCID: PMCPMC5974197.
232. Guha S, Ghimire J, Wu E, Wimley WC. Mechanistic Landscape of Membrane-Permeabilizing
Peptides. Chem Rev. 2019;119(9):6040-85. Epub 2019/01/09. doi:
10.1021/acs.chemrev.8b00520. PubMed PMID: 30624911.
233. Hamal P, Nguyenhuu H, Subasinghege Don V, Kumal RR, Kumar R, McCarley RL, et al.
Molecular Adsorption and Transport at Liposome Surfaces Studied by Molecular Dynamics
Simulations and Second Harmonic Generation Spectroscopy. J Phys Chem B.
2019;123(36):7722-30. Epub 2019/08/29. doi: 10.1021/acs.jpcb.9b05954. PubMed PMID:
31407578.
234. Mongrand S, Morel J, Laroche J, Claverol S, Carde JP, Hartmann MA, et al. Lipid rafts in
higher plant cells: purification and characterization of Triton X-100-insoluble microdomains
from tobacco plasma membrane. J Biol Chem. 2004;279(35):36277-86. Epub 2004/06/09.
doi: 10.1074/jbc.M403440200. PubMed PMID: 15190066.
235. Mhammedi A, Peypoux F, Besson F, Michel G. Bacillomycin F, a new antibiotic of iturin
group: isolation and characterization. J Antibiot (Tokyo). 1982;35(3):306-11. doi:
10.7164/antibiotics.35.306. PubMed PMID: 6804427.
236. Bonmatin JM, Laprévote O, Peypoux F. Diversity among microbial cyclic lipopeptides: iturins
and surfactins. Activity-structure relationships to design new bioactive agents. Comb Chem
High Throughput Screen. 2003;6(6):541-56. PubMed PMID: 14529379.
237. Peypoux F, Besson F, Michel G, Lenzen C, Dierickx L, Delcambe L. Characterization of a new
antibiotic of iturin group: bacillomycin D. J Antibiot (Tokyo). 1980;33(10):1146-9. doi:
10.7164/antibiotics.33.1146. PubMed PMID: 7451365.
238. Arima K, Kakinuma A, Tamura G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by
Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.
Biochem Biophys Res Commun. 1968;31(3):488-94. doi: 10.1016/0006-291x(68)90503-2.
PubMed PMID: 4968234.
199
239. Grangemard I, Bonmatin JM, Bernillon J, Das BC, Peypoux F. Lichenysins G, a novel family of
lipopeptide biosurfactants from Bacillus licheniformis IM 1307: production, isolation and
structural evaluation by NMR and mass spectrometry. J Antibiot (Tokyo). 1999;52(4):363-
73. doi: 10.7164/antibiotics.52.363. PubMed PMID: 10395272.
240. Coronel-León J, Marqués AM, Bastida J, Manresa A. Optimizing the production of the
biosurfactant lichenysin and its application in biofilm control. J Appl Microbiol.
2016;120(1):99-111. doi: 10.1111/jam.12992. PubMed PMID: 26519210.
241. Malev VV, Schagina LV, Gurnev PA, Takemoto JY, Nestorovich EM, Bezrukov SM.
Syringomycin E channel: a lipidic pore stabilized by lipopeptide? Biophys J.
2002;82(4):1985-94. doi: 10.1016/S0006-3495(02)75547-1. PubMed PMID: 11916856;
PubMed Central PMCID: PMCPMC1301994.
242. Quigley NB, Gross DC. Syringomycin production among strains of Pseudomonas syringae pv.
syringae: conservation of the syrB and syrD genes and activation of phytotoxin production
by plant signal molecules. Mol Plant Microbe Interact. 1994;7(1):78-90. PubMed PMID:
7909458.
243. Ballio A, Bossa F, Collina A, Gallo M, Iacobellis NS, Paci M, et al. Structure of syringotoxin, a
bioactive metabolite of Pseudomonas syringae pv. syringae. FEBS Lett. 1990;269(2):377-80.
doi: 10.1016/0014-5793(90)81197-v. PubMed PMID: 2401362.
244. Fukuchi N, Isogai A, Nakayama J, Suzuki A. Structure of syringotoxin B, a phytotoxin
produced by citrus isolates of Pseudomonas syringae pv. syringae. Agric Biol Chem.
1990;54(12):3377-9. PubMed PMID: 1368646.
245. Lim Y, Suh JW, Kim S, Hyun B, Kim C, Lee CH. Cepacidine A, a novel antifungal antibiotic
produced by Pseudomonas cepacia. II. Physico-chemical properties and structure
elucidation. J Antibiot (Tokyo). 1994;47(12):1406-16. doi: 10.7164/antibiotics.47.1406.
PubMed PMID: 7531194.
246. Bormann C, Baier D, Hörr I, Raps C, Berger J, Jung G, et al. Characterization of a novel,
antifungal, chitin-binding protein from Streptomyces tendae Tü901 that interferes with
growth polarity. Journal of Bacteriology. 1999;181(24):7421-9.
247. Hector RF, Zimmer BL, Pappagianis D. Evaluation of nikkomycins X and Z in murine models
of coccidioidomycosis, histoplasmosis, and blastomycosis. Antimicrob Agents Chemother.
1990;34(4):587-93. doi: 10.1128/aac.34.4.587. PubMed PMID: 2344165; PubMed Central
PMCID: PMCPMC171648.
248. Mkrtchyan H, Gibbons S, Heidelberger S, Zloh M, Limaki HK. Purification, characterisation
and identification of acidocin LCHV, an antimicrobial peptide produced by Lactobacillus
acidophilus n.v. Er 317/402 strain Narine. Int J Antimicrob Agents. 2010;35(3):255-60. Epub
2009/12/31. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2009.11.017. PubMed PMID: 20045288.
249. Fredenhagen A, Fendrich G, Märki F, Märki W, Gruner J, Raschdorf F, et al. Duramycins B
and C, two new lanthionine containing antibiotics as inhibitors of phospholipase A2.
Structural revision of duramycin and cinnamycin. J Antibiot (Tokyo). 1990;43(11):1403-12.
doi: 10.7164/antibiotics.43.1403. PubMed PMID: 2125590.
250. Singh PK, Chittpurna, Ashish, Sharma V, Patil PB, Korpole S. Identification, purification and
characterization of laterosporulin, a novel bacteriocin produced by Brevibacillus sp. strain
GI-9. PLoS One. 2012;7(3):e31498. Epub 2012/03/05. doi: 10.1371/journal.pone.0031498.
PubMed PMID: 22403615; PubMed Central PMCID: PMCPMC3293901.
200
251. Lopes JL, Nobre TM, Siano A, Humpola V, Bossolan NR, Zaniquelli ME, et al. Disruption of
Saccharomyces cerevisiae by Plantaricin 149 and investigation of its mechanism of action
with biomembrane model systems. Biochim Biophys Acta. 2009;1788(10):2252-8. Epub
2009/07/23. doi: 10.1016/j.bbamem.2009.06.026. PubMed PMID: 19595988.
252. Kajimura Y, Kaneda M. Fusaricidin A, a new depsipeptide antibiotic produced by Bacillus
polymyxa KT-8. Taxonomy, fermentation, isolation, structure elucidation and biological
activity. J Antibiot (Tokyo). 1996;49(2):129-35. doi: 10.7164/antibiotics.49.129. PubMed
PMID: 8621351.
253. Huang Z, Hu Y, Shou L, Song M. Isolation and partial characterization of cyclic lipopeptide
antibiotics produced by Paenibacillus ehimensis B7. BMC Microbiol. 2013;13:87. Epub
2013/04/17. doi: 10.1186/1471-2180-13-87. PubMed PMID: 23594351; PubMed Central
PMCID: PMCPMC3637185.
254. Berditsch M, Jäger T, Strempel N, Schwartz T, Overhage J, Ulrich AS. Synergistic effect of
membrane-active peptides polymyxin B and gramicidin S on multidrug-resistant strains and
biofilms of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 2015;59(9):5288-96.
Epub 2015/06/15. doi: 10.1128/AAC.00682-15. PubMed PMID: 26077259; PubMed Central
PMCID: PMCPMC4538509.
255. Seghal Kiran G, Anto Thomas T, Selvin J, Sabarathnam B, Lipton AP. Optimization and
characterization of a new lipopeptide biosurfactant produced by marine Brevibacterium
aureum MSA13 in solid state culture. Bioresour Technol. 2010;101(7):2389-96. Epub
2009/12/02. doi: 10.1016/j.biortech.2009.11.023. PubMed PMID: 19959354.
256. Pesic A, Baumann HI, Kleinschmidt K, Ensle P, Wiese J, Süssmuth RD, et al. Champacyclin, a
new cyclic octapeptide from Streptomyces strain C42 isolated from the Baltic Sea. Mar
Drugs. 2013;11(12):4834-57. Epub 2013/12/02. doi: 10.3390/md11124834. PubMed PMID:
24317473; PubMed Central PMCID: PMCPMC3877890.
257. Roy A, Mahata D, Paul D, Korpole S, Franco OL, Mandal SM. Purification, biochemical
characterization and self-assembled structure of a fengycin-like antifungal peptide from
Bacillus thuringiensis strain SM1. Front Microbiol. 2013;4:332. Epub 2013/11/21. doi:
10.3389/fmicb.2013.00332. PubMed PMID: 24312083; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3836021.
258. Tareq FS, Lee MA, Lee HS, Lee JS, Lee YJ, Shin HJ. Gageostatins A-C, antimicrobial linear
lipopeptides from a marine Bacillus subtilis. Mar Drugs. 2014;12(2):871-85. Epub
2014/01/31. doi: 10.3390/md12020871. PubMed PMID: 24492520; PubMed Central
PMCID: PMCPMC3944520.
259. Tareq FS, Lee MA, Lee HS, Lee YJ, Lee JS, Hasan CM, et al. Gageotetrins A-C, noncytotoxic
antimicrobial linear lipopeptides from a marine bacterium Bacillus subtilis. Org Lett.
2014;16(3):928-31. Epub 2014/01/23. doi: 10.1021/ol403657r. PubMed PMID: 24502521.
260. Ramachandran R, Chalasani AG, Lal R, Roy U. A broad-spectrum antimicrobial activity of
Bacillus subtilis RLID 12.1. ScientificWorldJournal. 2014;2014:968487. Epub 2014/08/11.
doi: 10.1155/2014/968487. PubMed PMID: 25180214; PubMed Central PMCID:
PMCPMC4144302.
261. Nation RL, Velkov T, Li J. Colistin and polymyxin B: peas in a pod, or chalk and cheese? Clin
Infect Dis. 2014;59(1):88-94. Epub 2014/04/03. doi: 10.1093/cid/ciu213. PubMed PMID:
24700659; PubMed Central PMCID: PMCPMC4305129.
201
262. AINSWORTH GC, BROWN AM, BROWNLEE G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus
aerosporus Greer. Nature. 1947;159(4060):263. doi: 10.1038/160263a0. PubMed PMID:
20256217.
263. Osipov AN, Kulikov OA, Azizova OA. [Use of spin probe in the determination of oxygen
consumption in human neutrophils]. Biull Eksp Biol Med. 1989;108(11):561-3. PubMed
PMID: 2633819.
264. Roscetto E, Contursi P, Vollaro A, Fusco S, Notomista E, Catania MR. Antifungal and anti-
biofilm activity of the first cryptic antimicrobial peptide from an archaeal protein against
Candida spp. clinical isolates. Sci Rep. 2018;8(1):17570. Epub 2018/12/04. doi:
10.1038/s41598-018-35530-0. PubMed PMID: 30514888; PubMed Central PMCID:
PMCPMC6279838.
265. Hüttel W, Youssar L, Grüning BA, Günther S, Hugentobler KG. Echinocandin B biosynthesis:
a biosynthetic cluster from Aspergillus nidulans NRRL 8112 and reassembly of the
subclusters Ecd and Hty from Aspergillus pachycristatus NRRL 11440 reveals a single
coherent gene cluster. BMC Genomics. 2016;17:570. Epub 2016/08/08. doi:
10.1186/s12864-016-2885-x. PubMed PMID: 27502607; PubMed Central PMCID:
PMCPMC4977696.
266. Li Y, Lan N, Xu L, Yue Q. Biosynthesis of pneumocandin lipopeptides and perspectives for its
production and related echinocandins. Appl Microbiol Biotechnol. 2018;102(23):9881-91.
Epub 2018/09/25. doi: 10.1007/s00253-018-9382-x. PubMed PMID: 30255232.
267. Mizuno K, Yagi A, Satoi S, Takada M, Hayashi M. Studies on aculeacin. I. Isolation and
characterization of aculeacin A. J Antibiot (Tokyo). 1977;30(4):297-302. doi:
10.7164/antibiotics.30.297. PubMed PMID: 324959.
268. Bills GF, Yue Q, Chen L, Li Y, An Z, Frisvad JC. Aspergillus mulundensis sp. nov., a new species
for the fungus producing the antifungal echinocandin lipopeptides, mulundocandins. J
Antibiot (Tokyo). 2016;69(3):141-8. Epub 2015/10/14. doi: 10.1038/ja.2015.105. PubMed
PMID: 26464011.
269. Takesako K, Kuroda H, Inoue T, Haruna F, Yoshikawa Y, Kato I, et al. Biological properties of
aureobasidin A, a cyclic depsipeptide antifungal antibiotic. J Antibiot (Tokyo).
1993;46(9):1414-20. doi: 10.7164/antibiotics.46.1414. PubMed PMID: 8226319.
270. Arai T, Mikami Y, Fukushima K, Utsumi T, Yazawa K. A new antibiotic, leucinostatin, derived
from Penicillium lilacinum. J Antibiot (Tokyo). 1973;26(3):157-61. doi:
10.7164/antibiotics.26.157. PubMed PMID: 4783199.
271. Wang G, Liu Z, Lin R, Li E, Mao Z, Ling J, et al. Biosynthesis of Antibiotic Leucinostatins in
Bio-control Fungus Purpureocillium lilacinum and Their Inhibition on Phytophthora
Revealed by Genome Mining. PLoS Pathog. 2016;12(7):e1005685. Epub 2016/07/14. doi:
10.1371/journal.ppat.1005685. PubMed PMID: 27416025; PubMed Central PMCID:
PMCPMC4946873.
272. Martinez AF, Moraes LA. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry
characterization of five new leucinostatins produced by Paecilomyces lilacinus CG-189. J
Antibiot (Tokyo). 2015;68(3):178-84. Epub 2014/09/03. doi: 10.1038/ja.2014.120. PubMed
PMID: 25182486.
273. Gräfe U, Ihn W, Ritzau M, Schade W, Stengel C, Schlegel B, et al. Helioferins; novel
antifungal lipopeptides from Mycogone rosea: screening, isolation, structures and biological
202
properties. J Antibiot (Tokyo). 1995;48(2):126-33. doi: 10.7164/antibiotics.48.126. PubMed
PMID: 7706122.
274. Gessmann R, Brückner H, Berg A, Petratos K. The crystal structure of the
lipoaminopeptaibol helioferin, an antibiotic peptide from Mycogone rosea. Acta Crystallogr
D Struct Biol. 2018;74(Pt 4):315-20. Epub 2018/04/03. doi: 10.1107/S2059798318001857.
PubMed PMID: 29652258.
275. Hwu L, Huang K, Chen D, Lin A. The action mode of the ribosome-inactivating protein alpha-
sarcin. J Biomed Sci. 2000;7(5):420-8. doi: 10.1007/bf02255817. PubMed PMID: 10971140.
276. Marcus JP, Goulter KC, Green JL, Harrison SJ, Manners JM. Purification, characterisation and
cDNA cloning of an antimicrobial peptide from Macadamia integrifolia. Eur J Biochem.
1997;244(3):743-9. doi: 10.1111/j.1432-1033.1997.00743.x. PubMed PMID: 9108242.
277. Hajji M, Jellouli K, Hmidet N, Balti R, Sellami-Kamoun A, Nasri M. A highly thermostable
antimicrobial peptide from Aspergillus clavatus ES1: biochemical and molecular
characterization. J Ind Microbiol Biotechnol. 2010;37(8):805-13. Epub 2010/05/04. doi:
10.1007/s10295-010-0725-6. PubMed PMID: 20440534.
278. Fox RO, Richards FM. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure
of alamethicin at 1.5-A resolution. Nature. 1982;300(5890):325-30. doi: 10.1038/300325a0.
PubMed PMID: 6292726.
279. Osaki T, Omotezako M, Nagayama R, Hirata M, Iwanaga S, Kasahara J, et al. Horseshoe crab
hemocyte-derived antimicrobial polypeptides, tachystatins, with sequence similarity to
spider neurotoxins. J Biol Chem. 1999;274(37):26172-8. doi: 10.1074/jbc.274.37.26172.
PubMed PMID: 10473569.
280. Destoumieux D, Munoz M, Bulet P, Bachère E. Penaeidins, a family of antimicrobial
peptides from penaeid shrimp (Crustacea, Decapoda). Cell Mol Life Sci. 2000;57(8-9):1260-
71. PubMed PMID: 11028917.
281. Iijima R, Kisugi J, Yamazaki M. A novel antimicrobial peptide from the sea hare Dolabella
auricularia. Dev Comp Immunol. 2003;27(4):305-11. PubMed PMID: 12590964.
282. Stensvåg K, Haug T, Sperstad SV, Rekdal O, Indrevoll B, Styrvold OB. Arasin 1, a proline-
arginine-rich antimicrobial peptide isolated from the spider crab, Hyas araneus. Dev Comp
Immunol. 2008;32(3):275-85. Epub 2007/07/02. doi: 10.1016/j.dci.2007.06.002. PubMed
PMID: 17658600.
283. Kawabata S, Nagayama R, Hirata M, Shigenaga T, Agarwala KL, Saito T, et al. Tachycitin, a
small granular component in horseshoe crab hemocytes, is an antimicrobial protein with
chitin-binding activity. J Biochem. 1996;120(6):1253-60. doi:
10.1093/oxfordjournals.jbchem.a021549. PubMed PMID: 9010778.
284. Rolland JL, Abdelouahab M, Dupont J, Lefevre F, Bachère E, Romestand B. Stylicins, a new
family of antimicrobial peptides from the Pacific blue shrimp Litopenaeus stylirostris. Mol
Immunol. 2010;47(6):1269-77. Epub 2010/01/12. doi: 10.1016/j.molimm.2009.12.007.
PubMed PMID: 20061030.
285. Mitta G, Hubert F, Noël T, Roch P. Myticin, a novel cysteine-rich antimicrobial peptide
isolated from haemocytes and plasma of the mussel Mytilus galloprovincialis. Eur J
Biochem. 1999;265(1):71-8. doi: 10.1046/j.1432-1327.1999.00654.x. PubMed PMID:
10491159.
203
286. Somboonwiwat K, Marcos M, Tassanakajon A, Klinbunga S, Aumelas A, Romestand B, et al.
Recombinant expression and anti-microbial activity of anti-lipopolysaccharide factor (ALF)
from the black tiger shrimp Penaeus monodon. Dev Comp Immunol. 2005;29(10):841-51.
Epub 2005/03/18. doi: 10.1016/j.dci.2005.02.004. PubMed PMID: 15978281.
287. Herbinière J, Braquart-Varnier C, Grève P, Strub JM, Frère J, Van Dorsselaer A, et al.
Armadillidin: a novel glycine-rich antibacterial peptide directed against gram-positive
bacteria in the woodlouse Armadillidium vulgare (Terrestrial Isopod, Crustacean). Dev
Comp Immunol. 2005;29(6):489-99. Epub 2004/12/21. doi: 10.1016/j.dci.2004.11.001.
PubMed PMID: 15752546.
288. Sperstad SV, Haug T, Vasskog T, Stensvåg K. Hyastatin, a glycine-rich multi-domain
antimicrobial peptide isolated from the spider crab (Hyas araneus) hemocytes. Mol
Immunol. 2009;46(13):2604-12. Epub 2009/05/31. doi: 10.1016/j.molimm.2009.05.002.
PubMed PMID: 19487032.
289. Petit VW, Rolland JL, Blond A, Cazevieille C, Djediat C, Peduzzi J, et al. A hemocyanin-
derived antimicrobial peptide from the penaeid shrimp adopts an alpha-helical structure
that specifically permeabilizes fungal membranes. Biochim Biophys Acta. 2016;1860(3):557-
68. Epub 2015/12/17. doi: 10.1016/j.bbagen.2015.12.010. PubMed PMID: 26708991.
290. Jia Y-P, Sun Y-D, Wang Z-H, Wang Q, Wang X-W, Zhao X-F, et al. A single whey acidic protein
domain (SWD)-containing peptide from fleshy prawn with antimicrobial and proteinase
inhibitory activities. Aquaculture. 2008;284(1-4):246-59.
291. Shan Z, Zhu K, Peng H, Chen B, Liu J, Chen F, et al. The New Antimicrobial Peptide
SpHyastatin from the Mud Crab Scylla paramamosain with Multiple Antimicrobial
Mechanisms and High Effect on Bacterial Infection. Front Microbiol. 2016;7:1140. Epub
2016/07/21. doi: 10.3389/fmicb.2016.01140. PubMed PMID: 27493644; PubMed Central
PMCID: PMCPMC4954822.
292. Vigers AJ, Roberts WK, Selitrennikoff CP. A new family of plant antifungal proteins. Mol
Plant Microbe Interact. 1991;4(4):315-23. PubMed PMID: 1799695.
293. Selitrennikoff CP. Antifungal proteins. Appl Environ Microbiol. 2001;67(7):2883-94.
294. Gournelis DC, Laskaris GG, Verpoorte R. Cyclopeptide alkaloids. Natural product reports.
1997;14(1):75-82.
295. Boccardo NA, Segretin ME, Hernandez I, Mirkin FG, Chacón O, Lopez Y, et al. Expression of
pathogenesis-related proteins in transplastomic tobacco plants confers resistance to
filamentous pathogens under field trials. Scientific reports. 2019;9(1):2791.
296. Yamada S, Komori T, Myers PN, Kuwata S, Kubo T, Imaseki H. Expression of plasma
membrane water channel genes under water stress in Nicotiana excelsior. Plant Cell
Physiol. 1997;38(11):1226-31. doi: 10.1093/oxfordjournals.pcp.a029109. PubMed PMID:
9435139.
297. Fujimura M, Ideguchi M, Minami Y, Watanabe K, Tadera K. Purification, characterization,
and sequencing of novel antimicrobial peptides, Tu-AMP 1 and Tu-AMP 2, from bulbs of
tulip (Tulipa gesneriana L.). Biosci Biotechnol Biochem. 2004;68(3):571-7. doi:
10.1271/bbb.68.571. PubMed PMID: 15056889.
298. Segura A, Moreno M, Madueño F, Molina A, García-Olmedo F. Snakin-1, a peptide from
potato that is active against plant pathogens. Mol Plant Microbe Interact. 1999;12(1):16-23.
doi: 10.1094/MPMI.1999.12.1.16. PubMed PMID: 9885189.
204
299. Shao F, Hu Z, Xiong YM, Huang QZ, WangCG, Zhu RH, et al. A new antifungal peptide from
the seeds of Phytolacca americana: characterization, amino acid sequence and cDNA
cloning. Biochim Biophys Acta. 1999;1430(2):262-8. doi: 10.1016/s0167-4838(99)00013-8.
PubMed PMID: 10082954.
300. Gao N, Wadhwani P, Mühlhäuser P, Liu Q, Riemann M, Ulrich AS, et al. An antifungal
protein from Ginkgo biloba binds actin and can trigger cell death. Protoplasma.
2016;253(4):1159-74. Epub 2015/08/28. doi: 10.1007/s00709-015-0876-4. PubMed PMID:
26315821.
301. Wang H, Ng TB. Ginkbilobin, a novel antifungal protein from Ginkgo biloba seeds with
sequence similarity to embryo-abundant protein. Biochem Biophys Res Commun.
2000;279(2):407-11. doi: 10.1006/bbrc.2000.3929. PubMed PMID: 11118300.
302. Soedjanaatmadja UM, Hofsteenge J, Jeronimus-Stratingh CM, Bruins AP, Beintema JJ.
Demonstration by mass spectrometry that pseudo-hevein and hevein have ragged C-
terminal sequences. Biochim Biophys Acta. 1994;1209(1):144-8. doi: 10.1016/0167-
4838(94)90150-3. PubMed PMID: 7947977.
303. Park CJ, Park CB, Hong SS, Lee HS, Lee SY, Kim SC. Characterization and cDNA cloning of two
glycine- and histidine-rich antimicrobial peptides from the roots of shepherd's purse,
Capsella bursa-pastoris. Plant Mol Biol. 2000;44(2):187-97. doi: 10.1023/a:1006431320677.
PubMed PMID: 11117262.
304. Tailor RH, Acland DP, Attenborough S, Cammue BP, Evans IJ, Osborn RW, et al. A novel
family of small cysteine-rich antimicrobial peptides from seed of Impatiens balsamina is
derived from a single precursor protein. J Biol Chem. 1997;272(39):24480-7. doi:
10.1074/jbc.272.39.24480. PubMed PMID: 9305910.
305. Wong JH, Ng TB. Lunatusin, a trypsin-stable antimicrobial peptide from lima beans
(Phaseolus lunatus L.). Peptides. 2005;26(11):2086-92. Epub 2005/04/25. doi:
10.1016/j.peptides.2005.03.004. PubMed PMID: 16269344.
306. Craik DJ, Daly NL, Bond T, Waine C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted
proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. J Mol Biol. 1999;294(5):1327-
36. doi: 10.1006/jmbi.1999.3383. PubMed PMID: 10600388.
307. Huang RH, Xiang Y, Liu XZ, Zhang Y, Hu Z, Wang DC. Two novel antifungal peptides distinct
with a five-disulfide motif from the bark of Eucommia ulmoides Oliv. FEBS Lett. 2002;521(1-
3):87-90. doi: 10.1016/s0014-5793(02)02829-6. PubMed PMID: 12067732.
308. Yokoyama S, Kato K, Koba A, Minami Y, Watanabe K, Yagi F. Purification, characterization,
and sequencing of antimicrobial peptides, Cy-AMP1, Cy-AMP2, and Cy-AMP3, from the
Cycad (Cycas revoluta) seeds. Peptides. 2008;29(12):2110-7. Epub 2008/08/20. doi:
10.1016/j.peptides.2008.08.007. PubMed PMID: 18778743.
309. Mandal SM, Dey S, Mandal M, Sarkar S, Maria-Neto S, Franco OL. Identification and
structural insights of three novel antimicrobial peptides isolated from green coconut water.
Peptides. 2009;30(4):633-7. Epub 2008/12/06. doi: 10.1016/j.peptides.2008.12.001.
PubMed PMID: 19111587.
310. Zottich U, Da Cunha M, Carvalho AO, Dias GB, Silva NC, Santos IS, et al. Purification,
biochemical characterization and antifungal activity of a new lipid transfer protein (LTP)
from Coffea canephora seeds with α-amylase inhibitor properties. Biochim Biophys Acta.
205
2011;1810(4):375-83. Epub 2010/12/16. doi: 10.1016/j.bbagen.2010.12.002. PubMed
PMID: 21167915.
311. Nolde SB, Vassilevski AA, Rogozhin EA, Barinov NA, Balashova TA, Samsonova OV, et al.
Disulfide-stabilized helical hairpin structure and activity of a novel antifungal peptide
EcAMP1 from seeds of barnyard grass (Echinochloa crus-galli). J Biol Chem.
2011;286(28):25145-53. Epub 2011/05/11. doi: 10.1074/jbc.M110.200378. PubMed PMID:
21561864; PubMed Central PMCID: PMCPMC3137087.
312. Liu R, Mu L, Liu H, Wei L, Yan T, Chen M, et al. Two antimicrobial and nematicidal peptides
derived from sequences encoded Picea sitchensis. J Pept Sci. 2011;17(9):627-31. Epub
2011/06/06. doi: 10.1002/psc.1380. PubMed PMID: 21644248.
313. Mandal SM, Migliolo L, Franco OL, Ghosh AK. Identification of an antifungal peptide from
Trapa natans fruits with inhibitory effects on Candida tropicalis biofilm formation. Peptides.
2011;32(8):1741-7. Epub 2011/06/28. doi: 10.1016/j.peptides.2011.06.020. PubMed PMID:
21736910.
314. de Beer A, Vivier MA. Four plant defensins from an indigenous South African Brassicaceae
species display divergent activities against two test pathogens despite high sequence
similarity in the encoding genes. BMC Res Notes. 2011;4:459. Epub 2011/10/28. doi:
10.1186/1756-0500-4-459. PubMed PMID: 22032337; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3213222.
315. Astafieva AA, Rogozhin EA, Odintsova TI, Khadeeva NV, Grishin EV, Egorov TA. Discovery of
novel antimicrobial peptides with unusual cysteine motifs in dandelion Taraxacum officinale
Wigg. flowers. Peptides. 2012;36(2):266-71. Epub 2012/05/26. doi:
10.1016/j.peptides.2012.05.009. PubMed PMID: 22640720.
316. Hernandez-Lucas C, Fernandez de Caleya R, Carbonero P. Inhibition of brewer's yeasts by
wheat purothionins. Appl Microbiol. 1974;28(2):165-8. PubMed PMID: 4604612; PubMed
Central PMCID: PMCPMC186679.
317. Mandal SM. A novel hydroxyproline rich glycopeptide from pericarp of Datura stramonium:
proficiently eradicate the biofilm of antifungals resistant Candida albicans. Biopolymers.
2012;98(4):332-7. PubMed PMID: 23193597.
318. Ekramoddoullah AK, Liu JJ, Zamani A. Cloning and Characterization of a Putative Antifungal
Peptide Gene (Pm-AMP1) in Pinus monticola. Phytopathology. 2006;96(2):164-70. doi:
10.1094/PHYTO-96-0164. PubMed PMID: 18943919.
319. Verma SS, Yajima WR, Rahman MH, Shah S, Liu JJ, Ekramoddoullah AK, et al. A cysteine-rich
antimicrobial peptide from Pinus monticola (PmAMP1) confers resistance to multiple fungal
pathogens in canola (Brassica napus). Plant Mol Biol. 2012;79(1-2):61-74. Epub 2012/02/21.
doi: 10.1007/s11103-012-9895-0. PubMed PMID: 22351159.
320. Zottich U, Da Cunha M, Carvalho AO, Dias GB, Casarin N, Vasconcelos IM, et al. An
antifungal peptide from Coffea canephora seeds with sequence homology to glycine-rich
proteins exerts membrane permeabilization and nuclear localization in fungi. Biochim
Biophys Acta. 2013;1830(6):3509-16. Epub 2013/03/15. doi:
10.1016/j.bbagen.2013.03.007. PubMed PMID: 23500079.
321. Kim JY, Gopal R, Kim SY, Seo CH, Lee HB, Cheong H, et al. PG-2, a Potent AMP against
Pathogenic Microbial Strains, from Potato (Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley) Tubers
Not Cytotoxic against Human Cells. Int J Mol Sci. 2013;14(2):4349-60. Epub 2013/02/21.
206
doi: 10.3390/ijms14024349. PubMed PMID: 23429275; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3588103.
322. Kim JY, Park SC, Kim MH, Lim HT, Park Y, Hahm KS. Antimicrobial activity studies on a
trypsin-chymotrypsin protease inhibitor obtained from potato. Biochem Biophys Res
Commun. 2005;330(3):921-7. doi: 10.1016/j.bbrc.2005.03.057. PubMed PMID: 15809084.
323. Neukermans J, Inzé A, Mathys J, De Coninck B, van de Cotte B, Cammue BP, et al. ARACINs,
Brassicaceae-specific peptides exhibiting antifungal activities against necrotrophic
pathogens in Arabidopsis. Plant Physiol. 2015;167(3):1017-29. Epub 2015/01/15. doi:
10.1104/pp.114.255505. PubMed PMID: 25593351; PubMed Central PMCID:
PMCPMC4348783.
324. Utkina LL, Andreev YA, Rogozhin EA, Korostyleva TV, Slavokhotova AA, Oparin PB, et al.
Genes encoding 4-Cys antimicrobial peptides in wheat Triticum kiharae Dorof. et Migush.:
multimodular structural organization, instraspecific variability, distribution and role in
defence. FEBS J. 2013;280(15):3594-608. Epub 2013/06/18. doi: 10.1111/febs.12349.
PubMed PMID: 23702306.
325. Cao H, Ke T, Liu R, Yu J, Dong C, Cheng M, et al. Identification of a Novel Proline-Rich
Antimicrobial Peptide from Brassica napus. PLoS One. 2015;10(9):e0137414. Epub
2015/09/18. doi: 10.1371/journal.pone.0137414. PubMed PMID: 26383098; PubMed
Central PMCID: PMCPMC4575134.
326. Mulinari F, Staniscuaski F, Bertholdo-Vargas L, Postal M, Oliveira-Neto O, Rigden D, et al.
Jaburetox-2Ec: an insecticidal peptide derived from an isoform of urease from the plant
Canavalia ensiformis. Peptides. 2007;28(10):2042-50.
327. Vriens K, Peigneur S, De Coninck B, Tytgat J, Cammue BP, Thevissen K. The antifungal plant
defensin AtPDF2.3 from Arabidopsis thaliana blocks potassium channels. Sci Rep.
2016;6:32121. Epub 2016/08/30. doi: 10.1038/srep32121. PubMed PMID: 27573545;
PubMed Central PMCID: PMCPMC5004176.
328. Tantong S, Pringsulaka O, Weerawanich K, Meeprasert A, Rungrotmongkol T, Sarnthima R,
et al. Two novel antimicrobial defensins from rice identified by gene coexpression network
analyses. Peptides. 2016;84:7-16. Epub 2016/08/12. doi: 10.1016/j.peptides.2016.07.005.
PubMed PMID: 27527801.
329. Mandal SM, Porto WF, Dey P, Maiti MK, Ghosh AK, Franco OL. The attack of the
phytopathogens and the trumpet solo: Identification of a novel plant antifungal peptide
with distinct fold and disulfide bond pattern. Biochimie. 2013;95(10):1939-48. Epub
2013/07/05. doi: 10.1016/j.biochi.2013.06.027. PubMed PMID: 23835303.
330. Seyedjavadi SS, Khani S, Zare-Zardini H, Halabian R, Goudarzi M, Khatami S, et al. Isolation,
functional characterization, and biological properties of MCh-AMP1, a novel antifungal
peptide from Matricaria chamomilla L. Chem Biol Drug Des. 2019;93(5):949-59. Epub
2019/03/13. doi: 10.1111/cbdd.13500. PubMed PMID: 30773822.
331. DeLucca AJ, Bland JM, Jacks TJ, Grimm C, Cleveland TE, Walsh TJ. Fungicidal activity of
cecropin A. Antimicrob Agents Chemother. 1997;41(2):481-3. PubMed PMID: 9021214;
PubMed Central PMCID: PMCPMC163736.
332. Mak P, Chmiel D, Gacek GJ. Antibacterial peptides of the moth Galleria mellonella. Acta
Biochim Pol. 2001;48(4):1191-5. PubMed PMID: 11995991.
207
333. Landon C, Sodano P, Hetru C, Hoffmann J, Ptak M. Solution structure of drosomycin, the
first inducible antifungal protein from insects. Protein Sci. 1997;6(9):1878-84. doi:
10.1002/pro.5560060908. PubMed PMID: 9300487; PubMed Central PMCID:
PMCPMC2143780.
334. Mandard N, Sodano P, Labbe H, Bonmatin JM, Bulet P, Hetru C, et al. Solution structure of
thanatin, a potent bactericidal and fungicidal insect peptide, determined from proton two-
dimensional nuclear magnetic resonance data. Eur J Biochem. 1998;256(2):404-10. doi:
10.1046/j.1432-1327.1998.2560404.x. PubMed PMID: 9760181.
335. Lee SY, Moon HJ, Kurata S, Natori S, Lee BL. Purification and cDNA cloning of an antifungal
protein from the hemolymph of Holotrichia diomphalia larvae. Biol Pharm Bull.
1995;18(8):1049-52. doi: 10.1248/bpb.18.1049. PubMed PMID: 8535393.
336. Mandard N, Bulet P, Caille A, Daffre S, Vovelle F. The solution structure of gomesin, an
antimicrobial cysteine-rich peptide from the spider. Eur J Biochem. 2002;269(4):1190-8. doi:
10.1046/j.0014-2956.2002.02760.x. PubMed PMID: 11856345.
337. Lorenzini DM, da Silva PI, Fogaça AC, Bulet P, Daffre S. Acanthoscurrin: a novel glycine-rich
antimicrobial peptide constitutively expressed in the hemocytes of the spider
Acanthoscurria gomesiana. Dev Comp Immunol. 2003;27(9):781-91. PubMed PMID:
12818635.
338. Moghaddam MB, Gross T, Becker A, Vilcinskas A, Rahnamaeian M. The selective antifungal
activity of Drosophila melanogaster metchnikowin reflects the species-dependent inhibition
of succinate-coenzyme Q reductase. Sci Rep. 2017;7(1):8192. Epub 2017/08/15. doi:
10.1038/s41598-017-08407-x. PubMed PMID: 28811531; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5557811.
339. Moerman L, Bosteels S, Noppe W, Willems J, Clynen E, Schoofs L, et al. Antibacterial and
antifungal properties of alpha-helical, cationic peptides in the venom of scorpions from
southern Africa. Eur J Biochem. 2002;269(19):4799-810. doi: 10.1046/j.1432-
1033.2002.03177.x. PubMed PMID: 12354111.
340. Orivel J, Redeker V, Le Caer JP, Krier F, Revol-Junelles AM, Longeon A, et al. Ponericins, new
antibacterial and insecticidal peptides from the venom of the ant Pachycondyla goeldii. J
Biol Chem. 2001;276(21):17823-9. Epub 2001/02/22. doi: 10.1074/jbc.M100216200.
PubMed PMID: 11279030.
341. Lamberty M, Zachary D, Lanot R, Bordereau C, Robert A, Hoffmann JA, et al. Insect
immunity. Constitutive expression of a cysteine-rich antifungal and a linear antibacterial
peptide in a termite insect. J Biol Chem. 2001;276(6):4085-92. Epub 2000/10/26. doi:
10.1074/jbc.M002998200. PubMed PMID: 11053427.
342. Yang X, Wang Y, Lee WH, Zhang Y. Antimicrobial peptides from the venom gland of the
social wasp Vespa tropica. Toxicon. 2013;74:151-7. Epub 2013/09/03. doi:
10.1016/j.toxicon.2013.08.056. PubMed PMID: 24012601.
343. Hirai Y, Kuwada M, Yasuhara T, Yoshida H, Nakajima T. A new mast cell degranulating
peptide homologous to mastoparan in the venom of Japanese hornet (Vespa xanthoptera).
Chem Pharm Bull (Tokyo). 1979;27(8):1945-6. doi: 10.1248/cpb.27.1945. PubMed PMID:
540363.
344. Boulanger N, Munks RJ, Hamilton JV, Vovelle F, Brun R, Lehane MJ, et al. Epithelial innate
immunity. A novel antimicrobial peptide with antiparasitic activity in the blood-sucking
208
insect Stomoxys calcitrans. J Biol Chem. 2002;277(51):49921-6. Epub 2002/10/07. doi:
10.1074/jbc.M206296200. PubMed PMID: 12372834.
345. Yan L, Adams ME. Lycotoxins, antimicrobial peptides from venom of the wolf spider Lycosa
carolinensis. J Biol Chem. 1998;273(4):2059-66. doi: 10.1074/jbc.273.4.2059. PubMed
PMID: 9442044.
346. Donovan GR, Baldo BA, Sutherland S. Molecular cloning and characterization of a major
allergen (Myr p I) from the venom of the Australian jumper ant, Myrmecia pilosula. Biochim
Biophys Acta. 1993;1171(3):272-80. doi: 10.1016/0167-4781(93)90065-l. PubMed PMID:
7678752.
347. Souza BM, Mendes MA, Santos LD, Marques MR, César LM, Almeida RN, et al. Structural
and functional characterization of two novel peptide toxins isolated from the venom of the
social wasp Polybia paulista. Peptides. 2005;26(11):2157-64. Epub 2005/08/29. doi:
10.1016/j.peptides.2005.04.026. PubMed PMID: 16129513.
348. Corzo G, Escoubas P, Villegas E, Barnham KJ, He W, Norton RS, et al. Characterization of
unique amphipathic antimicrobial peptides from venom of the scorpion Pandinus
imperator. Biochem J. 2001;359(Pt 1):35-45. doi: 10.1042/0264-6021:3590035. PubMed
PMID: 11563967; PubMed Central PMCID: PMCPMC1222119.
349. Leem JY, Park DS, Suh EY, Hur JH, Oh HW, Park HY. Isolation and functional analysis of a 24-
residue linear alpha-helical antimicrobial peptide from Korean blackish cicada,
Cryptotympana dubia (Homoptera). Arch Insect Biochem Physiol. 2007;66(4):204-13. doi:
10.1002/arch.20213. PubMed PMID: 18000874.
350. Konno K, Rangel M, Oliveira JS, Dos Santos Cabrera MP, Fontana R, Hirata IY, et al.
Decoralin, a novel linear cationic alpha-helical peptide from the venom of the solitary
eumenine wasp Oreumenes decoratus. Peptides. 2007;28(12):2320-7. Epub 2007/09/29.
doi: 10.1016/j.peptides.2007.09.017. PubMed PMID: 17981364.
351. Cytryńska M, Mak P, Zdybicka-Barabas A, Suder P, Jakubowicz T. Purification and
characterization of eight peptides from Galleria mellonella immune hemolymph. Peptides.
2007;28(3):533-46. Epub 2006/12/27. doi: 10.1016/j.peptides.2006.11.010. PubMed PMID:
17194500.
352. Silva FD, Rezende CA, Rossi DC, Esteves E, Dyszy FH, Schreier S, et al. Structure and mode of
action of microplusin, a copper II-chelating antimicrobial peptide from the cattle tick
Rhipicephalus (Boophilus) microplus. J Biol Chem. 2009;284(50):34735-46. Epub
2009/10/14. doi: 10.1074/jbc.M109.016410. PubMed PMID: 19828445; PubMed Central
PMCID: PMCPMC2787336.
353. Brown SE, Howard A, Kasprzak AB, Gordon KH, East PD. The discovery and analysis of a
diverged family of novel antifungal moricin-like peptides in the wax moth Galleria
mellonella. Insect Biochem Mol Biol. 2008;38(2):201-12. Epub 2007/11/17. doi:
10.1016/j.ibmb.2007.10.009. PubMed PMID: 18207081.
354. Liu Z, Liu H, Liu X, Wu X. Purification and cloning of a novel antimicrobial peptide from
salivary glands of the hard tick, Ixodes sinensis. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.
2008;149(4):557-61. Epub 2007/10/16. doi: 10.1016/j.cbpb.2007.10.002. PubMed PMID:
18295522.
355. Kozlov SA, Vassilevski AA, Feofanov AV, Surovoy AY, Karpunin DV, Grishin EV. Latarcins,
antimicrobial and cytolytic peptides from the venom of the spider Lachesana tarabaevi
209
(Zodariidae) that exemplify biomolecular diversity. J Biol Chem. 2006;281(30):20983-92.
Epub 2006/05/30. doi: 10.1074/jbc.M602168200. PubMed PMID: 16735513.
356. Tomie T, Ishibashi J, Furukawa S, Kobayashi S, Sawahata R, Asaoka A, et al. Scarabaecin, a
novel cysteine-containing antifungal peptide from the rhinoceros beetle, Oryctes
rhinoceros. Biochem Biophys Res Commun. 2003;307(2):261-6. doi: 10.1016/s0006-
291x(03)01162-8. PubMed PMID: 12859949.
357. Landon C, Barbault F, Legrain M, Menin L, Guenneugues M, Schott V, et al. Lead
optimization of antifungal peptides with 3D NMR structures analysis. Protein Sci.
2004;13(3):703-13. doi: 10.1110/ps.03404404. PubMed PMID: 14978308; PubMed Central
PMCID: PMCPMC2286723.
358. Tanaka H, Sudo C, An Y, Yamashita T, Sato K, Kurihara M, et al. A specific peptide produced
during adult diapause of the leaf beetle, Gastrophysa atrocyanea Motschulsky (Coleoptera:
Chrysomelidae). Applied entomology and zoology. 1998;33(4):535-43.
359. Fontana R, Mendes MA, de Souza BM, Konno K, César LM, Malaspina O, et al. Jelleines: a
family of antimicrobial peptides from the Royal Jelly of honeybees (Apis mellifera).
Peptides. 2004;25(6):919-28. doi: 10.1016/j.peptides.2004.03.016. PubMed PMID:
15203237.
360. Chen W, Yang X, Zhai L, Lu Z, Liu J, Yu H. Antimicrobial peptides from the venoms of Vespa
bicolor Fabricius. Peptides. 2008;29(11):1887-92. Epub 2008/08/03. doi:
10.1016/j.peptides.2008.07.018. PubMed PMID: 18723059.
361. Fogaça AC, da Silva PI, Miranda MT, Bianchi AG, Miranda A, Ribolla PE, et al. Antimicrobial
activity of a bovine hemoglobin fragment in the tick Boophilus microplus. J Biol Chem.
1999;274(36):25330-4. doi: 10.1074/jbc.274.36.25330. PubMed PMID: 10464258.
362. Dang XL, Tian JH, Yang WY, Wang WX, Ishibashi J, Asaoka A, et al. Bactrocerin-1: a novel
inducible antimicrobial peptide from pupae of oriental fruit fly Bactrocera dorsalis Hendel.
Arch Insect Biochem Physiol. 2009;71(3):117-29. doi: 10.1002/arch.20308. PubMed PMID:
19479741.
363. Gao B, Sherman P, Luo L, Bowie J, Zhu S. Structural and functional characterization of two
genetically related meucin peptides highlights evolutionary divergence and convergence in
antimicrobial peptides. FASEB J. 2009;23(4):1230-45. Epub 2008/12/16. doi: 10.1096/fj.08-
122317. PubMed PMID: 19088182.
364. Lu X, Che Q, Lv Y, Wang M, Lu Z, Feng F, et al. A novel defensin-like peptide from salivary
glands of the hard tick, Haemaphysalis longicornis. Protein Sci. 2010;19(3):392-7. doi:
10.1002/pro.317. PubMed PMID: 20027626; PubMed Central PMCID: PMCPMC2866266.
365. Baek JH, Lee SH. Identification and characterization of venom proteins of two solitary
wasps, Eumenes pomiformis and Orancistrocerus drewseni. Toxicon. 2010;56(4):554-62.
Epub 2010/06/01. doi: 10.1016/j.toxicon.2010.05.014. PubMed PMID: 20561973.
366. Budnik BA, Olsen JV, Egorov TA, Anisimova VE, Galkina TG, Musolyamov AK, et al. De novo
sequencing of antimicrobial peptides isolated from the venom glands of the wolf spider
Lycosa singoriensis. J Mass Spectrom. 2004;39(2):193-201. doi: 10.1002/jms.577. PubMed
PMID: 14991689.
367. Fan Z, Cao L, He Y, Hu J, Di Z, Wu Y, et al. Ctriporin, a new anti-methicillin-resistant
Staphylococcus aureus peptide from the venom of the scorpion Chaerilus tricostatus.
Antimicrob Agents Chemother. 2011;55(11):5220-9. Epub 2011/08/29. doi:
210
10.1128/AAC.00369-11. PubMed PMID: 21876042; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3195061.
368. Monincová L, Budesínský M, Slaninová J, Hovorka O, Cvacka J, Voburka Z, et al. Novel
antimicrobial peptides from the venom of the eusocial bee Halictus sexcinctus
(Hymenoptera: Halictidae) and their analogs. Amino Acids. 2010;39(3):763-75. Epub
2010/03/03. doi: 10.1007/s00726-010-0519-1. PubMed PMID: 20198492.
369. Slaninová J, Mlsová V, Kroupová H, Alán L, Tůmová T, Monincová L, et al. Toxicity study of
antimicrobial peptides from wild bee venom and their analogs toward mammalian normal
and cancer cells. Peptides. 2012;33(1):18-26. Epub 2011/11/07. doi:
10.1016/j.peptides.2011.11.002. PubMed PMID: 22100226.
370. Monincová L, Slaninová J, Fučík V, Hovorka O, Voburka Z, Bednárová L, et al. Lasiocepsin, a
novel cyclic antimicrobial peptide from the venom of eusocial bee Lasioglossum laticeps
(Hymenoptera: Halictidae). Amino Acids. 2012;43(2):751-61. Epub 2011/10/29. doi:
10.1007/s00726-011-1125-6. PubMed PMID: 22038181.
371. Dai L, Corzo G, Naoki H, Andriantsiferana M, Nakajima T. Purification, structure-function
analysis, and molecular characterization of novel linear peptides from scorpion
Opisthacanthus madagascariensis. Biochem Biophys Res Commun. 2002;293(5):1514-22.
doi: 10.1016/S0006-291X(02)00423-0. PubMed PMID: 12054688.
372. Nie Y, Zeng XC, Yang Y, Luo F, Luo X, Wu S, et al. A novel class of antimicrobial peptides from
the scorpion Heterometrus spinifer. Peptides. 2012;38(2):389-94. Epub 2012/09/21. doi:
10.1016/j.peptides.2012.09.012. PubMed PMID: 23000095.
373. Zhu K, Gao B, Zhu S. Characterization of a chimeric antimicrobial peptide uncovers
evolutionary significance of exon-shuffling. Biochem Biophys Res Commun.
2012;428(3):360-4. Epub 2012/10/23. doi: 10.1016/j.bbrc.2012.10.059. PubMed PMID:
23103428.
374. Ayroza G, Ferreira IL, Sayegh RS, Tashima AK, da Silva Junior PI. Juruin: an antifungal
peptide from the venom of the Amazonian Pink Toe spider, Avicularia juruensis, which
contains the inhibitory cystine knot motif. Front Microbiol. 2012;3:324. Epub 2012/09/10.
doi: 10.3389/fmicb.2012.00324. PubMed PMID: 22973266; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3437525.
375. Rifflet A, Gavalda S, Téné N, Orivel J, Leprince J, Guilhaudis L, et al. Identification and
characterization of a novel antimicrobial peptide from the venom of the ant Tetramorium
bicarinatum. Peptides. 2012;38(2):363-70. Epub 2012/09/07. doi:
10.1016/j.peptides.2012.08.018. PubMed PMID: 22960382.
376. Čujová S, Slaninová J, Monincová L, Fučík V, Bednárová L, Štokrová J, et al. Panurgines,
novel antimicrobial peptides from the venom of communal bee Panurgus calcaratus
(Hymenoptera: Andrenidae). Amino Acids. 2013;45(1):143-57. Epub 2013/03/13. doi:
10.1007/s00726-013-1482-4. PubMed PMID: 23483218.
377. Zare-Zardini H, Fesahat F, Anbari F, Halvaei I, Ebrahimi L. Assessment of spermicidal activity
of the antimicrobial peptide sarcotoxin Pd: A potent contraceptive agent. Eur J Contracept
Reprod Health Care. 2016;21(1):15-21. Epub 2015/06/08. doi:
10.3109/13625187.2015.1052395. PubMed PMID: 26052043.
211
378. Zeng XC, Zhou L, Shi W, Luo X, Zhang L, Nie Y, et al. Three new antimicrobial peptides from
the scorpion Pandinus imperator. Peptides. 2013;45:28-34. Epub 2013/04/23. doi:
10.1016/j.peptides.2013.03.026. PubMed PMID: 23624072.
379. Liu Z, Deng M, Xiang J, Ma H, Hu W, Zhao Y, et al. A novel spider peptide toxin suppresses
tumor growth through dual signaling pathways. Curr Mol Med. 2012;12(10):1350-60.
PubMed PMID: 22882120.
380. Guo X, Ma C, Du Q, Wei R, Wang L, Zhou M, et al. Two peptides, TsAP-1 and TsAP-2, from
the venom of the Brazilian yellow scorpion, Tityus serrulatus: evaluation of their
antimicrobial and anticancer activities. Biochimie. 2013;95(9):1784-94. Epub 2013/06/14.
doi: 10.1016/j.biochi.2013.06.003. PubMed PMID: 23770440.
381. Almaaytah A, Zhou M, Wang L, Chen T, Walker B, Shaw C. Antimicrobial/cytolytic peptides
from the venom of the North African scorpion, Androctonus amoreuxi: biochemical and
functional characterization of natural peptides and a single site-substituted analog.
Peptides. 2012;35(2):291-9. Epub 2012/03/28. doi: 10.1016/j.peptides.2012.03.016.
PubMed PMID: 22484288.
382. Zeng XC, Wang S, Nie Y, Zhang L, Luo X. Characterization of BmKbpp, a multifunctional
peptide from the Chinese scorpion Mesobuthus martensii Karsch: gaining insight into a new
mechanism for the functional diversification of scorpion venom peptides. Peptides.
2012;33(1):44-51. Epub 2011/11/18. doi: 10.1016/j.peptides.2011.11.012. PubMed PMID:
22115565.
383. Du Q, Hou X, Wang L, Zhang Y, Xi X, Wang H, et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial
peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation,
molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues
with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 2015;7(2):219-37.
Epub 2015/01/23. doi: 10.3390/toxins7020219. PubMed PMID: 25626077; PubMed Central
PMCID: PMCPMC4344621.
384. de Melo ET, Estrela AB, Santos EC, Machado PR, Farias KJ, Torres TM, et al. Structural
characterization of a novel peptide with antimicrobial activity from the venom gland of the
scorpion Tityus stigmurus: Stigmurin. Peptides. 2015;68:3-10. Epub 2015/03/22. doi:
10.1016/j.peptides.2015.03.003. PubMed PMID: 25805002.
385. Zhu S, Tytgat J. The scorpine family of defensins: gene structure, alternative
polyadenylation and fold recognition. Cell Mol Life Sci. 2004;61(14):1751-63. doi:
10.1007/s00018-004-4149-1. PubMed PMID: 15241551.
386. Santos DM, Verly RM, Piló-Veloso D, de Maria M, de Carvalho MA, Cisalpino PS, et al. LyeTx
I, a potent antimicrobial peptide from the venom of the spider Lycosa erythrognatha.
Amino Acids. 2010;39(1):135-44. Epub 2009/11/28. doi: 10.1007/s00726-009-0385-x.
PubMed PMID: 19946788.
387. Riciluca KC, Sayegh RS, Melo RL, Silva PI. Rondonin an antifungal peptide from spider
(Acanthoscurria rondoniae) haemolymph. Results Immunol. 2012;2:66-71. Epub
2012/04/02. doi: 10.1016/j.rinim.2012.03.001. PubMed PMID: 24371568; PubMed Central
PMCID: PMCPMC3862377.
388. Ramírez-Carreto S, Jiménez-Vargas JM, Rivas-Santiago B, Corzo G, Possani LD, Becerril B, et
al. Peptides from the scorpion Vaejovis punctatus with broad antimicrobial activity.
212
Peptides. 2015;73:51-9. Epub 2015/09/04. doi: 10.1016/j.peptides.2015.08.014. PubMed
PMID: 26352292.
389. Liu Z, Yuan K, Zhang R, Ren X, Liu X, Zhao S, et al. Cloning and purification of the first
termicin-like peptide from the cockroach Eupolyphaga sinensis. J Venom Anim Toxins Incl
Trop Dis. 2016;22:5. Epub 2016/01/28. doi: 10.1186/s40409-016-0058-7. PubMed PMID:
26823660; PubMed Central PMCID: PMCPMC4730610.
390. Nešuta O, Hexnerová R, Buděšínský M, Slaninová J, Bednárová L, Hadravová R, et al.
Antimicrobial Peptide from the Wild Bee Hylaeus signatus Venom and Its Analogues:
Structure-Activity Study and Synergistic Effect with Antibiotics. J Nat Prod. 2016;79(4):1073-
83. Epub 2016/03/21. doi: 10.1021/acs.jnatprod.5b01129. PubMed PMID: 26998557.
391. Kim IW, Lee JH, Subramaniyam S, Yun EY, Kim I, Park J, et al. De Novo Transcriptome
Analysis and Detection of Antimicrobial Peptides of the American Cockroach Periplaneta
americana (Linnaeus). PLoS One. 2016;11(5):e0155304. Epub 2016/05/11. doi:
10.1371/journal.pone.0155304. PubMed PMID: 27167617; PubMed Central PMCID:
PMCPMC4864078.
392. Al Souhail Q, Hiromasa Y, Rahnamaeian M, Giraldo MC, Takahashi D, Valent B, et al.
Characterization and regulation of expression of an antifungal peptide from hemolymph of
an insect, Manduca sexta. Dev Comp Immunol. 2016;61:258-68. Epub 2016/03/11. doi:
10.1016/j.dci.2016.03.006. PubMed PMID: 26976231; PubMed Central PMCID:
PMCPMC4866881.
393. Guilhelmelli F, Vilela N, Smidt KS, de Oliveira MA, da Cunha Morales Álvares A, Rigonatto
MC, et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells
of. Front Microbiol. 2016;7:1844. Epub 2016/11/18. doi: 10.3389/fmicb.2016.01844.
PubMed PMID: 27917162; PubMed Central PMCID: PMCPMC5114273.
394. Sayegh RS, Batista IF, Melo RL, Riske KA, Daffre S, Montich G, et al. Longipin: An Amyloid
Antimicrobial Peptide from the Harvestman Acutisoma longipes (Arachnida: Opiliones) with
Preferential Affinity for Anionic Vesicles. PLoS One. 2016;11(12):e0167953. Epub
2016/12/20. doi: 10.1371/journal.pone.0167953. PubMed PMID: 27997568; PubMed
Central PMCID: PMCPMC5172563.
395. Stöcklin R, Favreau P, Thai R, Pflugfelder J, Bulet P, Mebs D. Structural identification by
mass spectrometry of a novel antimicrobial peptide from the venom of the solitary bee
Osmia rufa (Hymenoptera: Megachilidae). Toxicon. 2010;55(1):20-7. Epub 2008/12/14. doi:
10.1016/j.toxicon.2008.12.011. PubMed PMID: 19109988.
396. Čujová S, Bednárová L, Slaninová J, Straka J, Čeřovský V. Interaction of a novel antimicrobial
peptide isolated from the venom of solitary bee Colletes daviesanus with phospholipid
vesicles and Escherichia coli cells. J Pept Sci. 2014;20(11):885-95. Epub 2014/08/14. doi:
10.1002/psc.2681. PubMed PMID: 25123582.
397. Guo G, Tao R, Li Y, Ma H, Xiu J, Fu P, et al. Identification and characterization of a novel
antimicrobial protein from the housefly Musca domestica. Biochem Biophys Res Commun.
2017;490(3):746-52. Epub 2017/06/20. doi: 10.1016/j.bbrc.2017.06.112. PubMed PMID:
28645609.
398. Gao B, Zhu S. Venom-Derived Antimicrobial Peptides Possess Intrinsic Multifunctionality
and Differential Potential as Drugs. Front Microbiol. 2018;9:320. Epub 2018/02/27. doi:
213
10.3389/fmicb.2018.00320. PubMed PMID: 29599756; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5863496.
399. Mor A, Nguyen VH, Delfour A, Migliore-Samour D, Nicolas P. Isolation, amino acid
sequence, and synthesis of dermaseptin, a novel antimicrobial peptide of amphibian skin.
Biochemistry. 1991;30(36):8824-30. doi: 10.1021/bi00100a014. PubMed PMID: 1909573.
400. Conlon JM, Woodhams DC, Raza H, Coquet L, Leprince J, Jouenne T, et al. Peptides with
differential cytolytic activity from skin secretions of the lemur leaf frog Hylomantis lemur
(Hylidae: Phyllomedusinae). Toxicon. 2007;50(4):498-506. Epub 2007/05/03. doi:
10.1016/j.toxicon.2007.04.017. PubMed PMID: 17561225.
401. Vouldoukis I, Shai Y, Nicolas P, Mor A. Broad spectrum antibiotic activity of the skin-PYY.
FEBS Lett. 1996;380(3):237-40. doi: 10.1016/0014-5793(96)00050-6. PubMed PMID:
8601432.
402. Mor A, Chartrel N, Vaudry H, Nicolas P. Skin peptide tyrosine-tyrosine, a member of the
pancreatic polypeptide family: isolation, structure, synthesis, and endocrine activity. Proc
Natl Acad Sci U S A. 1994;91(22):10295-9. doi: 10.1073/pnas.91.22.10295. PubMed PMID:
7937944; PubMed Central PMCID: PMCPMC45006.
403. Zasloff M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation,
characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor. Proc Natl
Acad Sci U S A. 1987;84(15):5449-53. doi: 10.1073/pnas.84.15.5449. PubMed PMID:
3299384; PubMed Central PMCID: PMCPMC298875.
404. Mignogna G, Simmaco M, Kreil G, Barra D. Antibacterial and haemolytic peptides containing
D-alloisoleucine from the skin of Bombina variegata. EMBO J. 1993;12(12):4829-32.
PubMed PMID: 8223491; PubMed Central PMCID: PMCPMC413935.
405. Lai R, Zheng YT, Shen JH, Liu GJ, Liu H, Lee WH, et al. Antimicrobial peptides from skin
secretions of Chinese red belly toad Bombina maxima. Peptides. 2002;23(3):427-35. doi:
10.1016/s0196-9781(01)00641-6. PubMed PMID: 11835991.
406. Conlon JM, Halverson T, Dulka J, Platz JE, Knoop FC. Peptides with antimicrobial activity of
the brevinin-1 family isolated from skin secretions of the southern leopard frog, Rana
sphenocephala. J Pept Res. 1999;54(6):522-7. PubMed PMID: 10604597.
407. Basir YJ, Knoop FC, Dulka J, Conlon JM. Multiple antimicrobial peptides and peptides related
to bradykinin and neuromedin N isolated from skin secretions of the pickerel frog, Rana
palustris. Biochim Biophys Acta. 2000;1543(1):95-105. doi: 10.1016/s0167-4838(00)00191-
6. PubMed PMID: 11087945.
408. Park JM, Jung JE, Lee BJ. Antimicrobial peptides from the skin of a Korean frog, Rana rugosa.
Biochem Biophys Res Commun. 1994;205(1):948-54. doi: 10.1006/bbrc.1994.2757. PubMed
PMID: 7999137.
409. Conlon JM, Al-Dhaheri A, Al-Mutawa E, Al-Kharrge R, Ahmed E, Kolodziejek J, et al. Peptide
defenses of the Cascades frog Rana cascadae: implications for the evolutionary history of
frogs of the Amerana species group. Peptides. 2007;28(6):1268-74. Epub 2007/03/27. doi:
10.1016/j.peptides.2007.03.010. PubMed PMID: 17451843.
410. Conlon JM, Sonnevend A, Patel M, Camasamudram V, Nowotny N, Zilahi E, et al. A melittin-
related peptide from the skin of the Japanese frog, Rana tagoi, with antimicrobial and
cytolytic properties. Biochem Biophys Res Commun. 2003;306(2):496-500. doi:
10.1016/s0006-291x(03)00999-9. PubMed PMID: 12804591.
214
411. Moore KS, Bevins CL, Brasseur MM, Tomassini N, Turner K, Eck H, et al. Antimicrobial
peptides in the stomach of Xenopus laevis. J Biol Chem. 1991;266(29):19851-7. PubMed
PMID: 1717472.
412. Steinborner ST, Currie GJ, Bowie JH, Wallace JC, Tyler MJ. New antibiotic caerin 1 peptides
from the skin secretion of the Australian tree frog Litoria chloris. Comparison of the
activities of the caerin 1 peptides from the genus Litoria. J Pept Res. 1998;51(2):121-6.
PubMed PMID: 9516047.
413. Rozek T, Waugh RJ, Steinborner ST, Bowie JH, Tyler MJ, Wallace JC. The maculatin peptides
from the skin glands of the tree frog Litoria genimaculata: a comparison of the structures
and antibacterial activities of maculatin 1.1 and caerin 1.1. J Pept Sci. 1998;4(2):111-5. doi:
10.1002/(SICI)1099-1387(199804)4:2%3C111::AID-PSC134%3E3.0.CO;2-8. PubMed PMID:
9620615.
414. Wegener KL, Wabnitz PA, Carver JA, Bowie JH, Chia BC, Wallace JC, et al. Host defence
peptides from the skin glands of the Australian blue mountains tree-frog Litoria citropa.
Solution structure of the antibacterial peptide citropin 1.1. Eur J Biochem. 1999;265(2):627-
37. doi: 10.1046/j.1432-1327.1999.00750.x. PubMed PMID: 10504394.
415. Ali MF, Soto A, Knoop FC, Conlon JM. Antimicrobial peptides isolated from skin secretions
of the diploid frog, Xenopus tropicalis (Pipidae). Biochim Biophys Acta. 2001;1550(1):81-9.
doi: 10.1016/s0167-4838(01)00272-2. PubMed PMID: 11738090.
416. Olson L, Soto AM, Knoop FC, Conlon JM. Pseudin-2: an antimicrobial peptide with low
hemolytic activity from the skin of the paradoxical frog. Biochem Biophys Res Commun.
2001;288(4):1001-5. doi: 10.1006/bbrc.2001.5884. PubMed PMID: 11689009.
417. Park S, Park SH, Ahn HC, Kim S, Kim SS, Lee BJ. Structural study of novel antimicrobial
peptides, nigrocins, isolated from Rana nigromaculata. FEBS Lett. 2001;507(1):95-100. doi:
10.1016/s0014-5793(01)02956-8. PubMed PMID: 11682065.
418. Clark DP, Durell S, Maloy WL, Zasloff M. Ranalexin. A novel antimicrobial peptide from
bullfrog (Rana catesbeiana) skin, structurally related to the bacterial antibiotic, polymyxin. J
Biol Chem. 1994;269(14):10849-55. PubMed PMID: 8144672.
419. Rollins-Smith LA, King JD, Nielsen PF, Sonnevend A, Conlon JM. An antimicrobial peptide
from the skin secretions of the mountain chicken frog Leptodactylus fallax
(Anura:Leptodactylidae). Regul Pept. 2005;124(1-3):173-8. doi:
10.1016/j.regpep.2004.07.013. PubMed PMID: 15544856.
420. Mattute B, Knoop FC, Conlon JM. Kassinatuerin-1: a peptide with broad-spectrum
antimicrobial activity isolated from the skin of the hyperoliid frog, Kassina senegalensis.
Biochem Biophys Res Commun. 2000;268(2):433-6. doi: 10.1006/bbrc.2000.2136. PubMed
PMID: 10679222.
421. Kim SS, Shim MS, Chung J, Lim DY, Lee BJ. Purification and characterization of antimicrobial
peptides from the skin secretion of Rana dybowskii. Peptides. 2007;28(8):1532-9. Epub
2007/07/07. doi: 10.1016/j.peptides.2007.07.002. PubMed PMID: 17698251.
422. Wang X, Song Y, Li J, Liu H, Xu X, Lai R, et al. A new family of antimicrobial peptides from
skin secretions of Rana pleuraden. Peptides. 2007;28(10):2069-74. Epub 2007/07/22. doi:
10.1016/j.peptides.2007.07.020. PubMed PMID: 17764786.
215
423. Chen L, Li Y, Li J, Xu X, Lai R, Zou Q. An antimicrobial peptide with antimicrobial activity
against Helicobacter pylori. Peptides. 2007;28(8):1527-31. Epub 2007/07/14. doi:
10.1016/j.peptides.2007.07.007. PubMed PMID: 17698252.
424. Ma Y, Liu C, Liu X, Wu J, Yang H, Wang Y, et al. Peptidomics and genomics analysis of novel
antimicrobial peptides from the frog, Rana nigrovittata. Genomics. 2010;95(1):66-71. Epub
2009/09/22. doi: 10.1016/j.ygeno.2009.09.004. PubMed PMID: 19778602.
425. Vanhoye D, Bruston F, El Amri S, Ladram A, Amiche M, Nicolas P. Membrane association,
electrostatic sequestration, and cytotoxicity of Gly-Leu-rich peptide orthologs with differing
functions. Biochemistry. 2004;43(26):8391-409. doi: 10.1021/bi0493158. PubMed PMID:
15222751.
426. Conlon JM, Sonnevend A, Davidson C, Smith DD, Nielsen PF. The ascaphins: a family of
antimicrobial peptides from the skin secretions of the most primitive extant frog, Ascaphus
truei. Biochem Biophys Res Commun. 2004;320(1):170-5. doi: 10.1016/j.bbrc.2004.05.141.
PubMed PMID: 15207717.
427. Prates MV, Sforça ML, Regis WC, Leite JR, Silva LP, Pertinhez TA, et al. The NMR-derived
solution structure of a new cationic antimicrobial peptide from the skin secretion of the
anuran Hyla punctata. J Biol Chem. 2004;279(13):13018-26. Epub 2004/01/08. doi:
10.1074/jbc.M310838200. PubMed PMID: 14715660.
428. Mangoni ML, Papo N, Mignogna G, Andreu D, Shai Y, Barra D, et al. Ranacyclins, a new
family of short cyclic antimicrobial peptides: biological function, mode of action, and
parameters involved in target specificity. Biochemistry. 2003;42(47):14023-35. doi:
10.1021/bi034521l. PubMed PMID: 14636071.
429. Salmon AL, Cross LJ, Irvine AE, Lappin TR, Dathe M, Krause G, et al. Peptide leucine arginine,
a potent immunomodulatory peptide isolated and structurally characterized from the skin
of the Northern Leopard frog, Rana pipiens. J Biol Chem. 2001;276(13):10145-52. Epub
2000/11/30. doi: 10.1074/jbc.M009680200. PubMed PMID: 11099505.
430. Conlon JM, Al-Ghafari N, Coquet L, Leprince J, Jouenne T, Vaudry H, et al. Evidence from
peptidomic analysis of skin secretions that the red-legged frogs, Rana aurora draytonii and
Rana aurora aurora, are distinct species. Peptides. 2006;27(6):1305-12. Epub 2005/11/22.
doi: 10.1016/j.peptides.2005.10.018. PubMed PMID: 16307827.
431. Castro MS, Ferreira TC, Cilli EM, Crusca E, Mendes-Giannini MJ, Sebben A, et al. Hylin a1,
the first cytolytic peptide isolated from the arboreal South American frog Hypsiboas
albopunctatus ("spotted treefrog"). Peptides. 2009;30(2):291-6. Epub 2008/11/13. doi:
10.1016/j.peptides.2008.11.003. PubMed PMID: 19056441.
432. Lu Z, Zhai L, Wang H, Che Q, Wang D, Feng F, et al. Novel families of antimicrobial peptides
with multiple functions from skin of Xizang plateau frog, Nanorana parkeri. Biochimie.
2010;92(5):475-81. Epub 2010/02/12. doi: 10.1016/j.biochi.2010.01.025. PubMed PMID:
20153801.
433. Mechkarska M, Ahmed E, Coquet L, Leprince J, Jouenne T, Vaudry H, et al. Antimicrobial
peptides with therapeutic potential from skin secretions of the Marsabit clawed frog
Xenopus borealis (Pipidae). Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2010;152(4):467-
72. Epub 2010/07/23. doi: 10.1016/j.cbpc.2010.07.007. PubMed PMID: 20656059.
216
434. Zheng R, Yao B, Yu H, Wang H, Bian J, Feng F. Novel family of antimicrobial peptides from
the skin of Rana shuchinae. Peptides. 2010;31(9):1674-7. Epub 2010/05/27. doi:
10.1016/j.peptides.2010.05.014. PubMed PMID: 20553780.
435. Iwakoshi-Ukena E, Ukena K, Okimoto A, Soga M, Okada G, Sano N, et al. Identification and
characterization of antimicrobial peptides from the skin of the endangered frog Odorrana
ishikawae. Peptides. 2011;32(4):670-6. Epub 2010/12/28. doi:
10.1016/j.peptides.2010.12.013. PubMed PMID: 21193000.
436. Kim SR, Hong MY, Park SW, Choi KH, Yun EY, Goo TW, et al. Characterization and cDNA
cloning of a cecropin-like antimicrobial peptide, papiliocin, from the swallowtail butterfly,
Papilio xuthus. Mol Cells. 2010;29(4):419-23. Epub 2010/03/04. doi: 10.1007/s10059-010-
0050-y. PubMed PMID: 20213310.
437. Chen Z, Yang X, Liu Z, Zeng L, Lee W, Zhang Y. Two novel families of antimicrobial peptides
from skin secretions of the Chinese torrent frog, Amolops jingdongensis. Biochimie.
2012;94(2):328-34. Epub 2011/07/24. doi: 10.1016/j.biochi.2011.07.021. PubMed PMID:
21816202.
438. Yang X, Lee WH, Zhang Y. Extremely abundant antimicrobial peptides existed in the skins of
nine kinds of Chinese odorous frogs. J Proteome Res. 2012;11(1):306-19. Epub 2011/11/18.
doi: 10.1021/pr200782u. PubMed PMID: 22029824.
439. Suzuki H, Iwamuro S, Ohnuma A, Coquet L, Leprince J, Jouenne T, et al. Expression of genes
encoding antimicrobial and bradykinin-related peptides in skin of the stream brown frog
Rana sakuraii. Peptides. 2007;28(3):505-14. Epub 2006/12/14. doi:
10.1016/j.peptides.2006.10.016. PubMed PMID: 17174009.
440. Zhang S, Guo H, Shi F, Wang H, Li L, Jiao X, et al. Hainanenins: a novel family of antimicrobial
peptides with strong activity from Hainan cascade-frog, Amolops hainanensis. Peptides.
2012;33(2):251-7. Epub 2012/01/24. doi: 10.1016/j.peptides.2012.01.014. PubMed PMID:
22306820.
441. Mechkarska M, Prajeep M, Coquet L, Leprince J, Jouenne T, Vaudry H, et al. The
hymenochirins: a family of host-defense peptides from the Congo dwarf clawed frog
Hymenochirus boettgeri (Pipidae). Peptides. 2012;35(2):269-75. Epub 2012/04/03. doi:
10.1016/j.peptides.2012.03.029. PubMed PMID: 22497805.
442. He X, Yang S, Wei L, Liu R, Lai R, Rong M. Antimicrobial peptide diversity in the skin of the
torrent frog, Amolops jingdongensis. Amino Acids. 2013;44(2):481-7. Epub 2012/07/25. doi:
10.1007/s00726-012-1358-z. PubMed PMID: 22828809.
443. Liu D, Wang Y, Wei L, Ye H, Liu H, Wang L, et al. Snake venom-like waprin from the frog of
Ceratophrys calcarata contains antimicrobial function. Gene. 2013;514(2):99-104. Epub
2012/11/28. doi: 10.1016/j.gene.2012.11.007. PubMed PMID: 23200819.
444. Vilcinskas A, Mukherjee K, Vogel H. Expansion of the antimicrobial peptide repertoire in the
invasive ladybird Harmonia axyridis. Proc Biol Sci. 2013;280(1750):20122113. doi:
10.1098/rspb.2012.2113. PubMed PMID: 23173204; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3574431.
445. Wang H, Li R, Xi X, Meng T, Zhou M, Wang L, et al. Senegalin: a novel
antimicrobial/myotropic hexadecapeptide from the skin secretion of the African running
frog, Kassina senegalensis. Amino Acids. 2013;44(5):1347-55. Epub 2013/02/22. doi:
10.1007/s00726-013-1470-8. PubMed PMID: 23430307.
217
446. Xi X, Li R, Jiang Y, Lin Y, Wu Y, Zhou M, et al. Medusins: a new class of antimicrobial peptides
from the skin secretions of phyllomedusine frogs. Biochimie. 2013;95(6):1288-96. Epub
2013/02/14. doi: 10.1016/j.biochi.2013.02.005. PubMed PMID: 23415652.
447. Roelants K, Fry BG, Ye L, Stijlemans B, Brys L, Kok P, et al. Origin and functional
diversification of an amphibian defense peptide arsenal. PLoS Genet. 2013;9(8):e1003662.
Epub 2013/08/01. doi: 10.1371/journal.pgen.1003662. PubMed PMID: 23935531; PubMed
Central PMCID: PMCPMC3731216.
448. Conlon JM, Prajeep M, Mechkarska M, Coquet L, Leprince J, Jouenne T, et al.
Characterization of the host-defense peptides from skin secretions of Merlin's clawed frog
Pseudhymenochirus merlini: insights into phylogenetic relationships among the Pipidae.
Comp Biochem Physiol Part D Genomics Proteomics. 2013;8(4):352-7. Epub 2013/10/12.
doi: 10.1016/j.cbd.2013.10.002. PubMed PMID: 24212286.
449. Conlon JM, Mechkarska M, Radosavljevic G, Attoub S, King JD, Lukic ML, et al. A family of
antimicrobial and immunomodulatory peptides related to the frenatins from skin secretions
of the Orinoco lime frog Sphaenorhynchus lacteus (Hylidae). Peptides. 2014;56:132-40.
Epub 2014/04/04. doi: 10.1016/j.peptides.2014.03.020. PubMed PMID: 24704757.
450. Ge L, Chen X, Ma C, Zhou M, Xi X, Wang L, et al. Balteatide: a novel antimicrobial
decapeptide from the skin secretion of the purple-sided leaf frog, Phyllomedusa baltea.
ScientificWorldJournal. 2014;2014:176214. Epub 2014/06/26. doi: 10.1155/2014/176214.
PubMed PMID: 25054164; PubMed Central PMCID: PMCPMC4098985.
451. Lin Y, Hu N, Lyu P, Ma J, Wang L, Zhou M, et al. Hylaranins: prototypes of a new class of
amphibian antimicrobial peptide from the skin secretion of the oriental broad-folded frog,
Hylarana latouchii. Amino Acids. 2014;46(4):901-9. Epub 2013/12/31. doi: 10.1007/s00726-
013-1655-1. PubMed PMID: 24378871.
452. Wu J, Liu H, Yang H, Yu H, You D, Ma Y, et al. Proteomic analysis of skin defensive factors of
tree frog Hyla simplex. J Proteome Res. 2011;10(9):4230-40. Epub 2011/08/09. doi:
10.1021/pr200393t. PubMed PMID: 21740067.
453. Wang Y, Zhang Y, Lee WH, Yang X. Novel Peptides from Skins of Amphibians Showed Broad-
Spectrum Antimicrobial Activities. Chem Biol Drug Des. 2016;87(3):419-24. Epub
2015/11/13. doi: 10.1111/cbdd.12672. PubMed PMID: 26452973.
454. Yang HL, Shen ZQ, Liu X, Kong Y. Two novel antimicrobial peptides from skin venoms of
spadefoot toad Megophrys minor. Chin J Nat Med. 2016;14(4):294-8. doi: 10.1016/S1875-
5364(16)30030-9. PubMed PMID: 27114317.
455. Proaño-Bolaños C, Zhou M, Wang L, Coloma LA, Chen T, Shaw C. Peptidomic approach
identifies cruzioseptins, a new family of potent antimicrobial peptides in the splendid leaf
frog, Cruziohyla calcarifer. J Proteomics. 2016;146:1-13. Epub 2016/06/15. doi:
10.1016/j.jprot.2016.06.017. PubMed PMID: 27321580.
456. Pei J, Feng Z, Ren T, Sun H, Han H, Jin W, et al. Purification, characterization and application
of a novel antimicrobial peptide from Andrias davidianus blood. Lett Appl Microbiol.
2018;66(1):38-43. Epub 2017/12/11. doi: 10.1111/lam.12823. PubMed PMID: 29130500.
457. Wu D, Gao Y, Tan Y, Liu Y, Wang L, Zhou M, et al. Discovery of Distinctin-Like-Peptide-PH
(DLP-PH) From the Skin Secretion of. Front Microbiol. 2018;9:541. Epub 2018/03/23. doi:
10.3389/fmicb.2018.00541. PubMed PMID: 29628917; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5876494.
218
458. Toro Segovia LJ, Téllez Ramírez GA, Henao Arias DC, Rivera Duran JD, Bedoya JP, Castaño
Osorio JC. Identification and characterization of novel cecropins from the Oxysternon
conspicillatum neotropic dung beetle. PLoS One. 2017;12(11):e0187914. Epub 2017/11/29.
doi: 10.1371/journal.pone.0187914. PubMed PMID: 29186139; PubMed Central PMCID:
PMCPMC5706684.
459. Jang WS, Kim KN, Lee YS, Nam MH, Lee IH. Halocidin: a new antimicrobial peptide from
hemocytes of the solitary tunicate, Halocynthia aurantium. FEBS Lett. 2002;521(1-3):81-6.
doi: 10.1016/s0014-5793(02)02827-2. PubMed PMID: 12067731.
460. Ovchinnikova TV, Aleshina GM, Balandin SV, Krasnosdembskaya AD, Markelov ML, Frolova
EI, et al. Purification and primary structure of two isoforms of arenicin, a novel
antimicrobial peptide from marine polychaeta Arenicola marina. FEBS Lett. 2004;577(1-
2):209-14. doi: 10.1016/j.febslet.2004.10.012. PubMed PMID: 15527787.
461. Cho JH, Park CB, Yoon YG, Kim SC. Lumbricin I, a novel proline-rich antimicrobial peptide
from the earthworm: purification, cDNA cloning and molecular characterization. Biochim
Biophys Acta. 1998;1408(1):67-76. doi: 10.1016/s0925-4439(98)00058-1. PubMed PMID:
9784609.
462. Pan W, Liu X, Ge F, Han J, Zheng T. Perinerin, a novel antimicrobial peptide purified from
the clamworm Perinereis aibuhitensis grube and its partial characterization. J Biochem.
2004;135(3):297-304. doi: 10.1093/jb/mvh036. PubMed PMID: 15113828.
463. Peng K, Kong Y, Zhai L, Wu X, Jia P, Liu J, et al. Two novel antimicrobial peptides from
centipede venoms. Toxicon. 2010;55(2-3):274-9. Epub 2009/09/01. doi:
10.1016/j.toxicon.2009.07.040. PubMed PMID: 19716842.
464. Kato Y, Komatsu S. ASABF, a novel cysteine-rich antibacterial peptide isolated from the
nematode Ascaris suum. Purification, primary structure, and molecular cloning of cDNA. J
Biol Chem. 1996;271(48):30493-8. Epub 1996/11/29. doi: 10.1074/jbc.271.48.30493.
PubMed PMID: 8940016.
465. Zhong J, Wang W, Yang X, Yan X, Liu R. A novel cysteine-rich antimicrobial peptide from the
mucus of the snail of Achatina fulica. Peptides. 2013;39:1-5. Epub 2012/10/30. doi:
10.1016/j.peptides.2012.09.001. PubMed PMID: 23103587.
466. Liao Z, Wang XC, Liu HH, Fan MH, Sun JJ, Shen W. Molecular characterization of a novel
antimicrobial peptide from Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol. 2013;34(2):610-6.
Epub 2012/12/19. doi: 10.1016/j.fsi.2012.11.030. PubMed PMID: 23247103.
467. Park YJ, Kim HS, Lee HY, Hwang JS, Bae YS. A novel antimicrobial peptide isolated from
centipede Scolopendra subspinipes mutilans stimulates neutrophil activity through formyl
peptide receptor 2. Biochem Biophys Res Commun. 2017;494(1-2):352-7. Epub 2017/10/11.
doi: 10.1016/j.bbrc.2017.10.019. PubMed PMID: 28988115.
468. Lopez-Abarrategui C, Alba A, Silva ON, Reyes-Acosta O, Vasconcelos IM, Oliveira JT, et al.
Functional characterization of a synthetic hydrophilic antifungal peptide derived from the
marine snail Cenchritis muricatus. Biochimie. 2012;94(4):968-74. Epub 2012/01/03. doi:
10.1016/j.biochi.2011.12.016. PubMed PMID: 22210491.
469. Pushpanathan M, Rajendhran J, Jayashree S, Sundarakrishnan B, Jayachandran S,
Gunasekaran P. Identification of a novel antifungal peptide with chitin-binding property
from marine metagenome. Protein Pept Lett. 2012;19(12):1289-96. Epub 2012/06/08. doi:
10.2174/092986612803521620. PubMed PMID: 22670672.
219
470. Liu HH, Fan MH, Liu HH, Qi PZ, Zhi L. Production and Function of Different Regions from
Mytichitin-1 of Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol. 2019;84:1018-29. Epub
2018/11/06. doi: 10.1016/j.fsi.2018.10.081. PubMed PMID: 30395994.
471. Simunic J, Petrov D, Bouceba T, Kamech N, Benincasa M, Juretic D. Trichoplaxin - a new
membrane-active antimicrobial peptide from placozoan cDNA. Biochim Biophys Acta.
2014;1838(5):1430-8. Epub 2014/02/18. doi: 10.1016/j.bbamem.2014.02.003. PubMed
PMID: 24530880.
472. Lee H, Hwang JS, Lee J, Kim JI, Lee DG. Scolopendin 2, a cationic antimicrobial peptide from
centipede, and its membrane-active mechanism. Biochim Biophys Acta. 2015;1848(2):634-
42. Epub 2014/12/03. doi: 10.1016/j.bbamem.2014.11.016. PubMed PMID: 25462167.
473. Nam BH, Seo JK, Lee MJ, Kim YO, Kim DG, An CM, et al. Functional analysis of Pacific oyster
(Crassostrea gigas) beta-thymosin: Focus on antimicrobial activity. Fish Shellfish Immunol.
2015;45(1):167-74. Epub 2015/04/07. doi: 10.1016/j.fsi.2015.03.035. PubMed PMID:
25842181.
474. Solstad RG, Li C, Isaksson J, Johansen J, Svenson J, Stensvag K, et al. Novel Antimicrobial
Peptides EeCentrocins 1, 2 and EeStrongylocin 2 from the Edible Sea Urchin Echinus
esculentus Have 6-Br-Trp Post-Translational Modifications. PLoS One.
2016;11(3):e0151820. Epub 2016/03/24. doi: 10.1371/journal.pone.0151820. PubMed
PMID: 27007817; PubMed Central PMCID: PMCPMC4805251.
475. Zhu S, Gao B. Nematode-derived drosomycin-type antifungal peptides provide evidence for
plant-to-ecdysozoan horizontal transfer of a disease resistance gene. Nat Commun.
2014;5:3154. Epub 2014/01/18. doi: 10.1038/ncomms4154. PubMed PMID: 24434635.
476. Yuan Y, Zai Y, Xi X, Ma C, Wang L, Zhou M, et al. A novel membrane-disruptive antimicrobial
peptide from frog skin secretion against cystic fibrosis isolates and evaluation of anti-MRSA
effect using Galleria mellonella model. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2019;1863(5):849-
56. Epub 2019/02/26. doi: 10.1016/j.bbagen.2019.02.013. PubMed PMID: 30802593.
477. Lehrer RI, Ganz T, Szklarek D, Selsted ME. Modulation of the in vitro candidacidal activity of
human neutrophil defensins by target cell metabolism and divalent cations. J Clin Invest.
1988;81(6):1829-35. Epub 1988/06/01. doi: 10.1172/JCI113527. PubMed PMID: 3290255;
PubMed Central PMCID: PMCPMC442632.
478. Diamond G, Zasloff M, Eck H, Brasseur M, Maloy WL, Bevins CL. Tracheal antimicrobial
peptide, a cysteine-rich peptide from mammalian tracheal mucosa: peptide isolation and
cloning of a cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(9):3952-6. Epub 1991/05/01. doi:
10.1073/pnas.88.9.3952. PubMed PMID: 2023943; PubMed Central PMCID:
PMCPMC51571.
479. Bulow S, Zeller L, Werner M, Toelge M, Holzinger J, Entzian C, et al.
Bactericidal/Permeability-Increasing Protein Is an Enhancer of Bacterial Lipoprotein
Recognition. Front Immunol. 2018;9:2768. Epub 2018/12/26. doi:
10.3389/fimmu.2018.02768. PubMed PMID: 30581431; PubMed Central PMCID:
PMCPMC6293271.
480. Clare DA, Swaisgood HE. Bioactive milk peptides: a prospectus. J Dairy Sci. 2000;83(6):1187-
95. Epub 2000/07/06. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(00)74983-6. PubMed PMID: 10877382.
481. Oppenheim FG, Xu T, McMillian FM, Levitz SM, Diamond RD, Offner GD, et al. Histatins, a
novel family of histidine-rich proteins in human parotid secretion. Isolation,
220
characterization, primary structure, and fungistatic effects on Candida albicans. J Biol Chem.
1988;263(16):7472-7. Epub 1988/06/05. PubMed PMID: 3286634.
482. Sang Y, Teresa Ortega M, Rune K, Xiau W, Zhang G, Soulages JL, et al. Canine cathelicidin
(K9CATH): gene cloning, expression, and biochemical activity of a novel pro-myeloid
antimicrobial peptide. Dev Comp Immunol. 2007;31(12):1278-96. Epub 2007/04/28. doi:
10.1016/j.dci.2007.03.007. PubMed PMID: 17462733.
483. Park CH, Valore EV, Waring AJ, Ganz T. Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide
synthesized in the liver. J Biol Chem. 2001;276(11):7806-10. Epub 2000/12/13. doi:
10.1074/jbc.M008922200. PubMed PMID: 11113131.
484. Theil R, Scheit KH. Amino acid sequence of seminalplasmin, an antimicrobial protein from
bull semen. EMBO J. 1983;2(7):1159-63. Epub 1983/01/01. PubMed PMID: 16453469;
PubMed Central PMCID: PMCPMC555250.
485. Andersson M, Gunne H, Agerberth B, Boman A, Bergman T, Sillard R, et al. NK-lysin, a novel
effector peptide of cytotoxic T and NK cells. Structure and cDNA cloning of the porcine
form, induction by interleukin 2, antibacterial and antitumour activity. EMBO J.
1995;14(8):1615-25. Epub 1995/04/18. PubMed PMID: 7737114; PubMed Central PMCID:
PMCPMC398254.
486. Schittek B. The multiple facets of dermcidin in cell survival and host defense. J Innate
Immun. 2012;4(4):349-60. Epub 2012/03/30. doi: 10.1159/000336844. PubMed PMID:
22455996.
487. Cutuli M, Cristiani S, Lipton JM, Catania A. Antimicrobial effects of alpha-MSH peptides. J
Leukoc Biol. 2000;67(2):233-9. Epub 2000/02/12. doi: 10.1002/jlb.67.2.233. PubMed PMID:
10670585.
488. Bobek LA, Situ H. MUC7 20-Mer: investigation of antimicrobial activity, secondary structure,
and possible mechanism of antifungal action. Antimicrob Agents Chemother.
2003;47(2):643-52. Epub 2003/01/25. doi: 10.1128/aac.47.2.643-652.2003. PubMed PMID:
12543672; PubMed Central PMCID: PMCPMC151741.
489. Cole AM, Kim YH, Tahk S, Hong T, Weis P, Waring AJ, et al. Calcitermin, a novel antimicrobial
peptide isolated from human airway secretions. FEBS Lett. 2001;504(1-2):5-10. Epub
2001/08/28. doi: 10.1016/s0014-5793(01)02731-4. PubMed PMID: 11522286.
490. Leonova L, Kokryakov VN, Aleshina G, Hong T, Nguyen T, Zhao C, et al. Circular
minidefensins and posttranslational generation of molecular diversity. J Leukoc Biol.
2001;70(3):461-4. Epub 2001/08/31. PubMed PMID: 11527997.
491. Simon A, Kullberg BJ, Tripet B, Boerman OC, Zeeuwen P, van der Ven-Jongekrijg J, et al.
Drosomycin-like defensin, a human homologue of Drosophila melanogaster drosomycin
with antifungal activity. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52(4):1407-12. Epub
2008/01/24. doi: 10.1128/AAC.00155-07. PubMed PMID: 18212107; PubMed Central
PMCID: PMCPMC2292511.
492. Briolat J, Wu SD, Mahata SK, Gonthier B, Bagnard D, Chasserot-Golaz S, et al. New
antimicrobial activity for the catecholamine release-inhibitory peptide from chromogranin
A. Cell Mol Life Sci. 2005;62(3):377-85. Epub 2005/02/22. doi: 10.1007/s00018-004-4461-9.
PubMed PMID: 15723172.
493. Dartevelle P, Ehlinger C, Zaet A, Boehler C, Rabineau M, Westermann B, et al. D-Cateslytin:
a new antifungal agent for the treatment of oral Candida albicans associated infections. Sci
221
Rep. 2018;8(1):9235. Epub 2018/06/20. doi: 10.1038/s41598-018-27417-x. PubMed PMID:
29915284; PubMed Central PMCID: PMCPMC6006364.
494. Cabras T, Longhi R, Secundo F, Nocca G, Conti S, Polonelli L, et al. Structural and functional
characterization of the porcine proline-rich antifungal peptide SP-B isolated from salivary
gland granules. J Pept Sci. 2008;14(3):251-60. Epub 2007/09/22. doi: 10.1002/psc.914.
PubMed PMID: 17883246.
495. Stenger S, Hanson DA, Teitelbaum R, Dewan P, Niazi KR, Froelich CJ, et al. An antimicrobial
activity of cytolytic T cells mediated by granulysin. Science. 1998;282(5386):121-5. Epub
1998/10/02. doi: 10.1126/science.282.5386.121. PubMed PMID: 9756476.
496. Maerki C, Meuter S, Liebi M, Muhlemann K, Frederick MJ, Yawalkar N, et al. Potent and
broad-spectrum antimicrobial activity of CXCL14 suggests an immediate role in skin
infections. J Immunol. 2009;182(1):507-14. Epub 2008/12/26. doi:
10.4049/jimmunol.182.1.507. PubMed PMID: 19109182.
497. Kowalska K, Carr DB, Lipkowski AW. Direct antimicrobial properties of substance P. Life Sci.
2002;71(7):747-50. Epub 2002/06/21. doi: 10.1016/s0024-3205(02)01740-x. PubMed PMID:
12074933.
498. Marischen L, Wesch D, Schroder JM, Wiedow O, Kabelitz D. Human gammadelta T cells
produce the protease inhibitor and antimicrobial peptide elafin. Scand J Immunol.
2009;70(6):547-52. Epub 2009/11/13. doi: 10.1111/j.1365-3083.2009.02337.x. PubMed
PMID: 19906197.
499. Soscia SJ, Kirby JE, Washicosky KJ, Tucker SM, Ingelsson M, Hyman B, et al. The Alzheimer's
disease-associated amyloid beta-protein is an antimicrobial peptide. PLoS One.
2010;5(3):e9505. Epub 2010/03/09. doi: 10.1371/journal.pone.0009505. PubMed PMID:
20209079; PubMed Central PMCID: PMCPMC2831066.
500. Hooper LV, Stappenbeck TS, Hong CV, Gordon JI. Angiogenins: a new class of microbicidal
proteins involved in innate immunity. Nat Immunol. 2003;4(3):269-73. Epub 2003/01/28.
doi: 10.1038/ni888. PubMed PMID: 12548285.
501. Yang D, Chen Q, Hoover DM, Staley P, Tucker KD, Lubkowski J, et al. Many chemokines
including CCL20/MIP-3alpha display antimicrobial activity. J Leukoc Biol. 2003;74(3):448-55.
Epub 2003/09/02. doi: 10.1189/jlb.0103024. PubMed PMID: 12949249.
502. Miller KW, Evans RJ, Eisenberg SP, Thompson RC. Secretory leukocyte protease inhibitor
binding to mRNA and DNA as a possible cause of toxicity to Escherichia coli. J Bacteriol.
1989;171(4):2166-72. Epub 1989/04/01. doi: 10.1128/jb.171.4.2166-2172.1989. PubMed
PMID: 2467900; PubMed Central PMCID: PMCPMC209873.
503. Hieshima K, Ohtani H, Shibano M, Izawa D, Nakayama T, Kawasaki Y, et al. CCL28 has dual
roles in mucosal immunity as a chemokine with broad-spectrum antimicrobial activity. J
Immunol. 2003;170(3):1452-61. Epub 2003/01/23. doi: 10.4049/jimmunol.170.3.1452.
PubMed PMID: 12538707.
504. Banas M, Zabieglo K, Kasetty G, Kapinska-Mrowiecka M, Borowczyk J, Drukala J, et al.
Chemerin is an antimicrobial agent in human epidermis. PLoS One. 2013;8(3):e58709. Epub
2013/03/26. doi: 10.1371/journal.pone.0058709. PubMed PMID: 23527010; PubMed
Central PMCID: PMCPMC3604073.
222
505. Feng Y, Huang N, Wu Q, Wang B. HMGN2: a novel antimicrobial effector molecule of human
mononuclear leukocytes? J Leukoc Biol. 2005;78(5):1136-41. Epub 2005/10/06. doi:
10.1189/jlb.0505280. PubMed PMID: 16204630.
506. Abou Alaiwa MH, Reznikov LR, Gansemer ND, Sheets KA, Horswill AR, Stoltz DA, et al. pH
modulates the activity and synergism of the airway surface liquid antimicrobials beta-
defensin-3 and LL-37. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(52):18703-8. Epub 2014/12/17.
doi: 10.1073/pnas.1422091112. PubMed PMID: 25512526; PubMed Central PMCID:
PMCPMC4284593.
507. Lugardon K, Raffner R, Goumon Y, Corti A, Delmas A, Bulet P, et al. Antibacterial and
antifungal activities of vasostatin-1, the N-terminal fragment of chromogranin A. J Biol
Chem. 2000;275(15):10745-53. Epub 2001/02/07. doi: 10.1074/jbc.275.15.10745. PubMed
PMID: 10753865.
508. Bleackley MR, Hayes BM, Parisi K, Saiyed T, Traven A, Potter ID, et al. Bovine pancreatic
trypsin inhibitor is a new antifungal peptide that inhibits cellular magnesium uptake. Mol
Microbiol. 2014;92(6):1188-97. Epub 2014/04/23. doi: 10.1111/mmi.12621. PubMed PMID:
24750237.
509. Chen C, Ku C, Bo X, Wang X. Purification and characterization of a novel antimicrobial
peptide from sheep reproductive tract. Biotechnol Lett. 2015;37(2):327-32. Epub
2014/09/27. doi: 10.1007/s10529-014-1682-3. PubMed PMID: 25257597.
510. Bjerkan L, Schreurs O, Engen SA, Jahnsen FL, Baekkevold ES, Blix IJ, et al. The short form of
TSLP is constitutively translated in human keratinocytes and has characteristics of an
antimicrobial peptide. Mucosal Immunol. 2015;8(1):49-56. Epub 2014/05/23. doi:
10.1038/mi.2014.41. PubMed PMID: 24850429.
511. Rydengard V, Shannon O, Lundqvist K, Kacprzyk L, Chalupka A, Olsson AK, et al. Histidine-
rich glycoprotein protects from systemic Candida infection. PLoS Pathog.
2008;4(8):e1000116. Epub 2008/09/18. doi: 10.1371/journal.ppat.1000116. PubMed PMID:
18797515; PubMed Central PMCID: PMCPMC2537934.
512. Park SC, Moon JC, Shin SY, Son H, Jung YJ, Kim NH, et al. Functional characterization of
alpha-synuclein protein with antimicrobial activity. Biochem Biophys Res Commun.
2016;478(2):924-8. Epub 2016/08/16. doi: 10.1016/j.bbrc.2016.08.052. PubMed PMID:
27520375.
513. Belmonte R, Cruz CE, Pires JR, Daffre S. Purification and characterization of Hb 98-114: a
novel hemoglobin-derived antimicrobial peptide from the midgut of Rhipicephalus
(Boophilus) microplus. Peptides. 2012;37(1):120-7. Epub 2012/07/04. doi:
10.1016/j.peptides.2012.05.017. PubMed PMID: 22749988.
514. Douglas SE, Gallant JW, Gong Z, Hew C. Cloning and developmental expression of a family
of pleurocidin-like antimicrobial peptides from winter flounder, Pleuronectes americanus
(Walbaum). Dev Comp Immunol. 2001;25(2):137-47. Epub 2000/12/13. doi: 10.1016/s0145-
305x(00)00052-5. PubMed PMID: 11113283.
515. Silphaduang U, Noga EJ. Peptide antibiotics in mast cells of fish. Nature.
2001;414(6861):268-9. Epub 2001/11/20. doi: 10.1038/35104690. PubMed PMID:
11713517.
516. Acosta J, Carpio Y, Valdes I, Velazquez J, Zamora Y, Morales R, et al. Co-administration of
tilapia alpha-helical antimicrobial peptides with subunit antigens boost immunogenicity in
223
mice and tilapia (Oreochromis niloticus). Vaccine. 2014;32(2):223-9. Epub 2013/11/21. doi:
10.1016/j.vaccine.2013.11.009. PubMed PMID: 24252704.
517. Park CB, Lee JH, Park IY, Kim MS, Kim SC. A novel antimicrobial peptide from the loach,
Misgurnus anguillicaudatus. FEBS Lett. 1997;411(2-3):173-8. Epub 1997/07/14. doi:
10.1016/s0014-5793(97)00684-4. PubMed PMID: 9271200.
518. Patrzykat A, Gallant JW, Seo JK, Pytyck J, Douglas SE. Novel antimicrobial peptides derived
from flatfish genes. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47(8):2464-70. Epub 2003/07/25.
doi: 10.1128/aac.47.8.2464-2470.2003. PubMed PMID: 12878506; PubMed Central PMCID:
PMCPMC166104.
519. Pan CY, Chen JY, Cheng YS, Chen CY, Ni IH, Sheen JF, et al. Gene expression and localization
of the epinecidin-1 antimicrobial peptide in the grouper (Epinephelus coioides), and its role
in protecting fish against pathogenic infection. DNA Cell Biol. 2007;26(6):403-13. Epub
2007/06/16. doi: 10.1089/dna.2006.0564. PubMed PMID: 17570764.
520. Subramanian S, Ross NW, MacKinnon SL. Myxinidin, a novel antimicrobial peptide from the
epidermal mucus of hagfish, Myxine glutinosa L. Mar Biotechnol (NY). 2009;11(6):748-57.
Epub 2009/03/31. doi: 10.1007/s10126-009-9189-y. PubMed PMID: 19330556.
521. Su Y. Isolation and identification of pelteobagrin, a novel antimicrobial peptide from the
skin mucus of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco). Comp Biochem Physiol B Biochem
Mol Biol. 2011;158(2):149-54. Epub 2010/11/16. doi: 10.1016/j.cbpb.2010.11.002. PubMed
PMID: 21073979.
522. Lauth X, Shike H, Burns JC, Westerman ME, Ostland VE, Carlberg JM, et al. Discovery and
characterization of two isoforms of moronecidin, a novel antimicrobial peptide from hybrid
striped bass. J Biol Chem. 2002;277(7):5030-9. Epub 2001/12/12. doi:
10.1074/jbc.M109173200. PubMed PMID: 11739390.
523. Shin SC, Ahn IH, Ahn DH, Lee YM, Lee J, Lee JH, et al. Characterization of Two Antimicrobial
Peptides from Antarctic Fishes (Notothenia coriiceps and Parachaenichthys charcoti). PLoS
One. 2017;12(1):e0170821. Epub 2017/01/26. doi: 10.1371/journal.pone.0170821. PubMed
PMID: 28122029; PubMed Central PMCID: PMCPMC5266299.
524. Shamova OV, Orlov DS, Balandin SV, Shramova EI, Tsvetkova EV, Panteleev PV, et al.
Acipensins - Novel Antimicrobial Peptides from Leukocytes of the Russian Sturgeon
Acipenser gueldenstaedtii. Acta Naturae. 2014;6(4):99-109. Epub 2015/01/06. PubMed
PMID: 25558400; PubMed Central PMCID: PMCPMC4273097.
525. Park CB, Kim MS, Kim SC. A novel antimicrobial peptide from Bufo bufo gargarizans.
Biochem Biophys Res Commun. 1996;218(1):408-13. Epub 1996/01/05. doi:
10.1006/bbrc.1996.0071. PubMed PMID: 8573171.
526. Park IY, Park CB, Kim MS, Kim SC. Parasin I, an antimicrobial peptide derived from histone
H2A in the catfish, Parasilurus asotus. FEBS Lett. 1998;437(3):258-62. Epub 1998/11/21.
doi: 10.1016/s0014-5793(98)01238-1. PubMed PMID: 9824303.
527. Cuesta A, Meseguer J, Esteban MA. The antimicrobial peptide hepcidin exerts an important
role in the innate immunity against bacteria in the bony fish gilthead seabream. Mol
Immunol. 2008;45(8):2333-42. Epub 2008/01/01. doi: 10.1016/j.molimm.2007.11.007.
PubMed PMID: 18164062.
528. Sung WS, Park SH, Lee DG. Antimicrobial effect and membrane-active mechanism of
Urechistachykinins, neuropeptides derived from Urechis unicinctus. FEBS Lett.
224
2008;582(16):2463-6. Epub 2008/06/24. doi: 10.1016/j.febslet.2008.06.015. PubMed PMID:
18570895.
529. Yount NY, Kupferwasser D, Spisni A, Dutz SM, Ramjan ZH, Sharma S, et al. Selective
reciprocity in antimicrobial activity versus cytotoxicity of hBD-2 and crotamine. Proc Natl
Acad Sci U S A. 2009;106(35):14972-7. Epub 2009/08/27. doi: 10.1073/pnas.0904465106.
PubMed PMID: 19706485; PubMed Central PMCID: PMCPMC2736466.
530. Seo JK, Lee MJ, Go HJ, Kim YJ, Park NG. Antimicrobial function of the GAPDH-related
antimicrobial peptide in the skin of skipjack tuna, Katsuwonus pelamis. Fish Shellfish
Immunol. 2014;36(2):571-81. Epub 2014/01/15. doi: 10.1016/j.fsi.2014.01.003. PubMed
PMID: 24412436.
